Μέθοδοι μοριακής βιολογίας για τον έλεγχο της θρομβοφιλίας

Transcript

1 Η θρόμβωση είναι ένα πολυπαραγοντικό φαινόμενο που οφείλεται σε αλληλεπιδράσεις πολλαπλών γενετικών ή και περιβαλλοντικών παραγόντων, οι οποίοι συμμετέχουν στην ανάπτυξη της ασθένειας. Προς το παρόν γνωρίζουμε γενετικούς παράγοντες κινδύνου (που έχουν ενοχοποιηθεί για την συμμετοχή τους στο μηχανισμό θρόμβωσης). Εντούτοις όλοι αυτοί οι παράγοντες μαζί μπορούν να εξηγήσουν μόνο ένα μικρό μέρος από την κληρονομική θρομβοφιλία. Η συμμετοχή των γενετικών παραγόντων κινδύνου στο πρώτο επεισόδιο θρόμβωσης είναι ουσιαστική αφού στο 23% των ασθενών αυτών Εισαγωγή συμμετέχει ένας ή περισσότεροι γενετικοί παράγοντες. Στη διάρκεια των τελευταίων 35 ετών έχουν ταυτοποιηθεί και ενοχοποιηθεί ως παράγοντες κινδύνου σημαντικός αριθμός κληρονομικών αιτίων θρόμβωσης. Όπως π.χ. Egeberg 1965: έλλειψη της ΑΤ Griffin 1981: έλλειψη της PC Engesser 1984: έλλειψη της PS Dahlback 1993: αντίσταση στην apc Bertina 1994: FV Leiden Poort 1996: FII G20210A Makris 1997: αντίσταση στο αντιπηκτικό σύμπλεγμα ηπαρίνης/ατ Η κληρονομική θρομβοφιλία είναι ολιγογενετική ασθένεια Wautrecht 1998: επίπεδα FVIII/vWF Kanaji 1998: FXIIC46T Η κληρονομικότητα της θρομβοφιλίας είναι κυρίαρχη και σωματική. Αυτό έχει επιβεβαιωθεί σε οικογένειες με κληρονομική έλλειψη της Αντιθρομβίνης, της Πρωτεΐνης C ή και της πρωτεΐνης S, έχει όμως ατελή διεισδυτικότητα, κάτι που παρατηρείται στις μονογενετικές ασθένειες. Η εκδήλωση δε κλινικής θρόμβωσης εξαρτάται αποφασιστικά από την παρουσία και άλλων μεταλλάξεων ή εξωγενών παραγόντων. Η παρατήρηση αυτή αποτέλεσε και τη βάση όπου στηρίχθηκε η άποψη ότι η κληρονομική θρομβοφιλία ανήκει στις ολιγογενετικές ασθένειες. Η άποψη αυτή θεμελιώνεται με την ισχυρή απόδειξη ότι στις θρομβοφιλικές οικογένειες άτομα με δυο γενετικές διαταραχές έχουν πολύ πιο συχνά θρομβωτικά επεισόδια που τα εκδηλώνουν σε πολύ πιο μικρή ηλικία από αυτά που έχουν μια γενετική βλάβη. Έτσι η διεισδυτικότητα της θρόμβωσης είναι μικρή στα ασυμπτωματικά και υγιή μέλη οικογενειών με έλλειψη της Πρωτεΐνης C, ενώ η συχνότητα αυξάνει πολύ με την προσθήκη του αλλήλιου του παράγοντα V Leiden στο 45%, μολονότι η διεισδυτικότητά του στο γενικό πληθυσμό είναι 4%. Υπάρχει, επίσης, ισχυρή ένδειξη αλληλεπιδράσεων του αλλήλιου του FV Leiden και του παθολογικού γονιδίου της Πρωτεΐνης S. Έτσι στον πίνακα φαίνεται χαρακτηριστικά η αύξηση του κινδύνου των θρομβώσεων όταν συνυπάρχει και επιπρόσθετη γενετική βλάβη ή επίκτητοι παράγοντες (αντισυλληπτικά ή κύηση κ.ά). Σήμερα είναι γνωστό ότι 10% του γενικού πληθυσμού των Ελλήνων φέρουν και μια μετάλλαξη που ενοχοποιείται για θρομβώσεις ( FV LEIDEN & Κίνδυνος θρομβώσεων FV m/w FV m/m FV + HHC FV m/w + αντισυλληπτικά FV m/m + αντισυλληπτικά FV+κύηση FV+FII+κύηση 3-7x x 21x 34x 100x 7-16x 100x Η σημαντική πρόοδος που πραγματοποιήθηκε στον 20 ο αιώνα αφορούσε κυρίως στη δυνατότητα να μελετήσουμε το DNA απομονώνοντάς το. 1

2 Το DNA που χρησιμοποιείται για τη γενετική ανάλυση μπορεί να απομονωθεί με διάφορες διαδικασίες. Εδώ επιλέχθηκε η μέθοδος της σταδιακής εκχύλισης με οργανικούς διαλύτες. Η μέθοδος αυτή παρέχει κατάλληλο DNA τόσο για τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Απομόνωση γονιδιακού (genomic) DNA Chain Reaction- PCR) όσο και για τη μέθοδο ανάλυσης με ένζυμα περιορισμού (Restriction Fragment Length Polymorphisms- RFLPs). H εκχύλιση ή απομόνωση DNA (extraction DNA) από εμπύρηνα κύτταρα του οργανισμού (λευκά αιμοσφαίρια ή κύτταρα από νωπούς ή παραφινωμένους ιστούς) γίνεται με τη χρήση απορρυπαντικών για τη διάσπαση των κυτταρικών και πυρηνικών μεμβρανών και χρήση πρωτεολυτικών ενζύμων (πρωτεϊνάση Κ) για τη διάσπαση βασικών πρωτεϊνών (ιστόνες), οι οποίες συμμετέχουν στο (?) DNA του χρωμοσώματος (Maniatis et al, 1982). Οι πρωτεΐνες απομακρύνονται με διαδοχικές εκχυλίσεις με οργανικούς διαλύτες (φαινόλη, χλωροφόρμιο) ή πυκνό διάλυμα άλατος (6Μ NaCl, Miller et al, 1988). Τέλος, το DNA κατακρημνίζεται από την υδατική στιβάδα σε διάλυμα αλκοόλης, παρουσία άλατος. Ακολουθεί επαναδιάλυση του DNA και ποσοτικός προσδιορισμός του μακρομοριακού DNA φασματοφωτομετρικά σε μήκος κύματος 260nm και 280nm, μετά από αραίωση δείγματος DNA σε νερό (Sambrook et al, 1989). Από την οπτική πυκνότητα (OD) στα 260nm υπολογίζεται η συγκέντρωση του DNA σε μg/ml. Όταν η ένδειξη της οπτικής πυκνότητας είναι ίση με τη μονάδα αντιστοιχεί σε 50 μg/ml δίκλωνου DNA και 40 μg/ml μονόκλωνου DNA. Ο λόγος της OD 260/280 nm υπολογίζεται για να αξιολογηθεί η καθαρότητα του DNA από την απουσία πρωτεϊνικών προσμίξεων. Λόγος OD 1.8 υποδηλώνει δείγμα ικανοποιητικής καθαρότητας, ενώ εάν είναι χαμηλότερος από 1.2 υποβάλλεται σε νέο καθαρισμό (Sambrook et al, 1989). Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction- PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια από τις πιο πρόσφατες επαναστατικές τεχνικές του DNA, η οποία διευκόλυνε εξαιρετικά τη μελέτη και τις εφαρμογές της Μοριακής Γενετικής (Saiki et al, 1985). Η μέθοδος επιτρέπει την αντιγραφή τμήματος αλληλουχίας του DNA σε πολλαπλά αντίγραφα. Με τον τρόπο αυτόν διευκολύνεται η ανίχνευση και η μελέτη αλληλουχιών που είναι δυνατόν να βρίσκονται σε ένα αντίγραφο στο κυτταρικό δείγμα. Η PCR έδωσε μεγάλες δυνατότητες στη βιοϊατρική έρευνα και διαγνωστική, καθώς είναι γρήγορη και απλοποιεί τις διαδικασίες μελέτης και ανίχνευσης των αλληλουχιών του DNA. Με την PCR μπορεί θεωρητικά να γίνει μεγέθυνση μιας αλληλουχίας DNA, που βρίσκεται σε ένα αντίγραφο, περισσότερο από 106 φορές. Η PCR βασίζεται στην ιδιότητα των ενζύμων να αντιγράφουν το DNA, in vivo ή in vitro, με βάση γνωστές αφετηρίες που περιέχουν ελεύθερο υδροξύλιο στο 3 άκρο. Κυτταρικά ένζυμα, γνωστά και ως DNA πολυμεράσες, Αρχή της μεθόδου έχουν την ικανότητα να επιμηκύνουν τον έναν κλώνο δίκλωνου DNA προσθέτοντας αλληλοδιαδόχως νουκλεοτίδια στο 3 άκρο του (η έναρξη του πολυμερισμού σηματοδοτείται από ειδικές αλληλουχίες οι οποίες λειτουργούν ως εκκινητές-primers), που χρησιμεύει ως αφετηρία (primer) χρησιμοποιώντας τον άλλον κλώνο ως πρότυπο (template). Η αλληλουχία των νουκλεοτιδίων που συντίθεται είναι αντιπαράλληλη και συμπληρωματική προς την αλυσίδα πρότυπο. Τις ιδιότητες αυτές της DNA πολυμεράσης αξιοποιεί η τεχνική PCR, η οποία επιτυγχάνει την αντιγραφή in vitro μιας γονιδιακής περιοχής που αποτελεί το DNA στόχο. Η πολυμεράση που χρησιμοποιείται για το σκοπό αυτό είναι μια μορφή θερμοάντοχης DNA πολυμεράσης, η οποία έχει απομονωθεί από το βακτηρίδιο Thermus aquaticus (Taq). Επίσης χρησιμοποιούνται ως αλυσίδες αφετηρίες ή εκκινητές (primers) δύο συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια που έχουν δομή συμπληρωματική προς τις αλληλουχίες του DNA στόχου, το καθένα αντίστοιχα προς έναν κλώνο του DNA και με αντιπαράλληλη κατεύθυνση. Επιπλέον προστίθενται ισομοριακές συγκεντρώσεις τριφωσφορικών δεσοξυριβοζονουκλεοτιδίων (deoxyribonucleotide triphosphates- dntps), που αποτελούν και τις δομικές μονάδες του DNA, καθώς και ιόντα Mg. Saiki et al, 1985, Mullis, Fallona, 1987, Bell, Η αντίδραση PCR περιλαμβάνει 3 στάδια: 1. Αποδιάταξη (Μετουσίωση-denaturation) της διπλής έλικας του DNA σε δύο μονόκλωνες αλύσίδες. 2

3 2. Σύνδεση (annealing) των ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών στα δύο άκρα της ακολουθίας στόχου. Η σύνθεση των ολιγονουκλεοτιδίων είναι τέτοια, ώστε να είναι συπληρωματική προς την ακολουθία του DNA στόχου. Αυτά το ολιγονουκλεοτίδια προστίθενται στο διάλυμα σε περίσσεια, ώστε να μην υπάρχει έλλειψή τους κατά τα επόμενα βήματα της μεγέθυνσης. 3. σύνθεση (extension) νέων κλώνων DNA, συμπληρωματικών ως προς αυτούς του πρότυπου μετά την προσθήκη των τεσσάρων συστατικών νουκλεοτιδίων από τα οποία θα απαρτίζονται οι νέες ακολουθίες που θα προκύψουν, προσθέτοντας και μια πολυμεράση. Ένας κύκλος PCR αποτελείται από τα παραπάνω στάδια. Μετά το πέρας του κύκλου κάθε μια από τις μονόκλωνες ακολουθίες έχει μετατραπεί σε δίκλωνη από τη δράση της πολυμεράσης. Ο κύκλος αυτός επαναλαμβάνεται πολλές φορές και κάθε φορά συντίθεται μια νέα ακολουθία DNA. Με τη διαδικασία αυτήν, των επαναλαμβανόμενων κύκλων, αυξάνει εκθετικά ο αριθμός των αντιγράφων του DNA στόχου, διότι οι κλώνοι που σχηματίζονται χρησιμοποιούνται ως πρότυπο στον επόμενο κύκλο. Κάθε κύκλος περιλαμβάνει 3 διαφορετικές θερμοκρασίες για τα τρία στάδια που τον αποτελούν. Έτσι, η αποδιάταξη του DNA επιτυγχάνεται σε υψηλή θερμοκρασία 90-95ο C, και για χρονικό διάστημα sec. Στη θερμοκρασία των ο C για sec επιτυγχάνεται η σύνδεση των εκκινητών, ενώ στους ο C η Taq πολυμεράση συνθέτει το νέο DNA. Οι εναλλαγές αυτές της θερμοκρασίας επιτελούνται σε ειδικά αυτοματοποιημένες συσκευές που κυκλοφορούν στο εμπόριο και ονομάζονται θερμικοί κυκλοποιητές (thermocyclers). Τα αντίγραφα DNA που προκύπτουν από την παραπάνω διαδικασία μπορούν να γίνουν ορατά με πολλούς τρόπους. Ο απλούστερος είναι η ηλεκτροφόρησή τους και στη συνέχεια η χρώση τους με βρωμιούχο εθίδιο (ethidium bromide), που παρεμβάλλεται μεταξύ των νουκλεοτιδίων και φθορίζει κάτω από υπεριώδες φως. Ένας άλλος τρόπος είναι η χρήση ραδιοσημασμένων νουκλεοτιδίων κατά τα στάδια της PCR, οπότε τα μεγεθυσμένα αντίγραφα γίνονται ορατά με αυτοραδιογραφία. Ακόμη, τα προϊόντα της PCR μεταφέρονται σε μεμβράνες νάιλον (Southern blotting) και στη συνέχεια γίνονται ορατά μετά από υβριδοποίηση με τους αντίστοιχους ανιχνευτές τους. Τέλος, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν χρωματομετρικές μέθοδοι για την ανίχνευση των μεγεθυσμένων προϊόντων της PCR. Σε αυτήν την περίπτωση οι ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές, έχουν τροποποιηθεί, ώστε να μπορούν να σημανθούν με χημικές ουσίες, όπως η βιοτίνη και η φλουορεσκεΐνη. Repley et al, 1992, Templeton ) Εκκινητές (π.χ για τον F_V Leiden : FV3: 5 - CAT GAG AGA CAT CGT CTC TG- 3, FV6: 5 - GAC CTA ACA TGT TCT AGC CAG AAG -3 2) Μείγμα δεοξυνουκλεοτιδίων (dntps mix με ίσες ποσότητες datp, dgtp, dctp, dttp) 3) PCR master mix: (83.6 μl bd νερό, 10.0 μl buffer PCR και 3,0 μl MgCl 2 4) Τaq πολυμεράση (Biotaq polymerase), 5) 8μl Pre-mix διάλυμα (5,5μl bd νερό, 2,0μl buffer NE, 0,5μl BSA), και 2μl περιοριστικού ενζύμου) για την πέψη από το ειδικό περιοριστικό ένχυμο (π.χ. Mnl Ι.για τον FV-Leiden ) 6) Ειδικό περιοριστικό ένζυμο 7) λάδι (Sigma), 8) (TrisBorateEDTA) 9) Αγαρόζη, απλή και τύπου Metaphore, 10) Ethidium Bromide, 11) Loading Buffer. Αντιδραστήρια. To master-mix της PCR ετοιμάζεται σε όγκο 98μl περίπου, προστίθεται το DNA του προς εξέταση δείγματος σε συγκέντρωση 200ng. Κατόπιν προθερμαίνουμε το σωληνάριο της αντίδρασης σε μια συσκευή PCR στους 95 ο C και για 7 λεπτά και κατόπιν προσθέτουμε Εκτέλεση της Μέθοδος PCR την Taq polymerase. Ο προγραμματισμός της αντίδρασης είναι σχεδόν ο ίδιος με διαφορές στο χρόνο για τα διάφορα αναζητούμενα γονίδια. Ένα πρόγραμμα π.χ. είναι αυτό για τον FV- Leiden : 1) 95 ο C για 7 λεπτά (επιπλέον αποδόμηση του DNA), 2) 94 ο C για 1 λεπτό (αποδόμηση) 3) 57 ο C για 1 λεπτό (προσκολλάται η Taq), 4) 72 ο C για 1 λεπτό (Τα dntps συνθέτουν καινούριες έλικες DNA). Οι φάσεις 2, 3 και 4 επαναλαμβάνονται για 35 κύκλους και κατόπιν 72 ο C για 10 λεπτά (επιπλέον επιμήκυνση του DNA). Τέλος, τα δείγματα έρχονται στους 4 ο C μέχρι να επεξεργαστούν περαιτέρω. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. Η φάση αυτή είναι απαραίτητη για να διαπιστωθεί αν όντως η αντίδραση έδωσε το αναμενόμενο προϊόν και αν υπήρξε κάποια επιμόλυνση στα αντιδραστήρια. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης τύπου metaphore. 3

4 Στην πηκτή αυτή φορτώνονται 20 μl από το περιεχόμενο της προηγούμενης αντίδρασης, με προσοχή. Παράλληλα, φορτώνεται και κατάλληλο ladder (συνήθως μήκους 123 bp). Εκτελείται ηλεκτροφόρηση στα 100 Volts, για περίπου 2 ώρες. Ανίχνευση του παράγοντα V Leiden. O παράγοντας V Leiden προκύπτει από μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο του παράγοντα V (μια βάση γουανίνης- G αντικαθίσταται από αδενίνη- Α). Η μετάλλαξη επισυμβαίνει στο 10 ο εξόνιο και έχει ως αποτέλεσμα να αντικατασταθεί το αμινοξύ αργινίνη- Arg στη θέση 506 του παράγοντα V από το αμινοξύ γλουταμίνη- Gln (θέση όπου η ενεργοποιημένη PC- apc απενεργοποιεί τον παράγοντα Va διασπώντας τον).έτσι ο παράγοντας Va παραμένει ενεργοποιημένος για μακρύτερο χρονικό διάστημα με λειτουργικό αποτέλεσμα την αντίσταση στη δράση της ενεργοποιημένης PC (παθολογική apc-r, η δοκιμασία αυτή είναι επίσης παθολογική για τη μετάλλαξη ΗR2 και το FV-Cambridge) και καθυστέρηση στην αναστολή της ενεργοποίησης της πήξης- άρα δυνητικά θρομβοφιλική διάθεση. Ο παράγοντας V Leiden ανιχνεύεται με την τεχνική PCR, χρησιμοποιώντας κατάλληλους εκκινητές (primers) και Τaq πολυμεράση για να πολλαπλασιαστεί εκείνη η περιοχή του γονιδίου που περιέχει τη μετάλλαξη. Το περιοριστικό ένζυμο Mnl Ι διασπά το προϊόν της αντίδρασης όταν αναγνωρίζει τη συγκεκριμένη αλληλουχία βάσεων GAGG. Αν το προϊόν της αντίδρασης περιέχει τη μετάλλαξη Leiden, τότε η συγκεκριμένη αλληλουχία αντικαθίσταται από την AAGG, το περιοριστικό ένζυμο δεν την αναγνωρίζει και άρα δεν επέρχεται διάσπαση. Αντιδραστήρια. Εκκινητές (Primers), όπως έχουν περιγραφεί. Μέθοδος PCR (όπως περιγράφτηκε στις γενικές αρχές) Πέψη με περιοριστικό ένζυμο Mnl Ι. Τα αποτελέσματα ερμηνεύονται ως εξής: Απουσία παράγοντα Leiden: Διακρίνονται τρεις ζώνες, 25, 37 και 81 βάσεων. Ετεροζυγoτία στον παράγοντα Leiden: Διακρίνονται 4 ζώνες, 25, 37, 81 και 118 βάσεων. Ομοζυγωτία στον παράγοντα Leiden: Διακρίνονται δύο ζώνες, 25 και 118 βάσεων. Ηλεκτροφορητική κινητικότητα των προϊόντων της PCR από το DNA ΦΑ και ασθενών με τη μετάλλαξη Leiden. Ηλεκτροφορητική κινητικότητα των προϊόντων της PCR από το DNA ΦΑ και ασθενή με τη μετάλλαξη FII G20210A. Αναζήτηση του απλότυπου HR2. Αυτός σχετίζεται επίσης με παθολογική resistance to activated protein C (APC) και αυξημένο κίνδυνο θρόμβωσης. Η μεγάλη πλειοψηφία των ασθενών με παθολογική apcr φέρει την μετάλλαξη Factor V Leiden. Εντούτοις σε ένα ποσοστό 5-10% των ασθενών που έχουν παθολογική τη δοκιμασία αυτή δεν φέρουν και τη μετάλλαξη του FV-Leiden. Διερευνώντας την παραδοχή αυτή αποκαλύφθηκε η μετάλλαξη στο 13 ο εξόνιο του παράγοντα V η ΗR2 (Factor V A4070G αλλήλιο, R2 allele). Η μετάλλαξη αυτή επίσης συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο θρομβώσεων. Αντιδραστήρια.Τα ίδια που αναφέρονται στις γενικές αρχές. Διαφορά το περιοριστικό ένζυμο (Rsa I) Ανίχνευση του αλληλίου 20210Α του γονιδίου της προθρομβίνης Το αλλήλιο Α του γονιδίου της προθρομβίνης ανιχνεύεται πολλαπλασιάζοντας με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) τμήμα 142 bp του γονιδίου της προθρομβίνης, που περιλαμβάνει το νουκλεοτίδιο Στην προκειμένη περίπτωση γίνεται η χρήση δύο εκκινητών (primers): PT1: 5 - ATT GAT CAG TTT GGA GAG TAG GGG 3 PT2: 5 - AAT AGC ACT GGG AGC A GAA GCT 3 Οι δύο αυτοί εκκινητές πολλαπλασιάζουν το τμήμα του γονιδίου της προθρομβίνης της 3 μη μεταφρασμένης περιοχής, από τη θέση έως τη θέση Το primer PT2 διαφέρει στην αλληλουχία του από αυτήν του γονιδίου γιατί έχει στη θέση μια βάση Α (υπογραμμισμένη στις παραπάνω αλληλουχίες). Έτσι, αν υπάρχει Α στη θέση 20210, τότε δημιουργείται θέση αναγνώρισης για το περιοριστικό ένζυμο Hind III. Άρα, αν υπάρχει η μετάλλαξη τότε το προϊόν της αντίδρασης τέμνεται από το ένζυμο περιορισμού. 4

5 Αντιδραστήρια.Τα ίδια που αναφέρονται στις γενικές αρχές. Διαφορά το περιοριστικό ένζυμο (Hind III) Τα αποτελέσματα ερμηνεύονται ως εξής: (βλέπε εικόνα) Απουσία αλληλίου 20210Α: Διακρίνεται μια ζώνη 142 βάσεων. Ετεροζυγοτία στο αλλήλιο 20210Α: Διακρίνονται 3 ζώνες, 24, 118 και 142 βάσεων. Ομοζυγοτία στο αλλήλιο 20210Α: Διακρίνονται δύο ζώνες, 24 και 118 βάσεων. Στην εικόνα φαίνονται α) μετάλλαξη του FV-Leiden (κίτρινο βέλος), μετάλλαξη ΗR2 (κόκκινο) και της προθρομβίνης (μπλε τόξο) Ανίχνευση της μετάλλαξης G455A του γονιδίου της β-αλυσίδας του ινωδογόνου Η μετάλλαξη β-fibrinogen G455A ενοχοποιείται για τα αυξημένα επίπεδα του ινωδογόνου και ταυτόχρονα και την σημαντικά αυξημένη συχνότητα παρουσίας της σε αθηροθρόμβωση μεγάλων αρτηριών όπως και καρδιαγγειακών επεισοδίων. Η μέθοδος περιγράφηκε και τροποποιήθηκε από τον Thomas et al(1991). Αντιδραστήρια : Οι αφετηρίες που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο της παρουσίας ή όχι της μετάλλαξης G455A είναι 1 ον : 5'-AAG AAT TTG GGA ATG CAA TCT CTG CTA CCT-3'; και 2 ον : 5'- CTC CTC ATT GTC GTT GAC ACC TTG GGA C-3'. Συνθήκες PCR όπως περίπου έχουν περιγραφεί Πέψη με περιοριστικό ένζυμο το Hae Ⅲ. Ακολουθεί ηλεκτροφόρηση του προϊόντος αναζητούμενα κλάσματο από 343bp, 383bp και 575bp. Τα τμήματα αυτά καλούνται αλλήλια H1 (φυσιολογικό), ενώ το 343bp και το 957bp κλάσμα καλούνται Η2 αλλήλια και αντιπροσωπεύουν τη μετάλλαξη. Meade et al.. Lancet 1986;2: Thomas et al. Thromb Haemost 1991;65: Ανίχνευση της μετάλλαξης C677T του γονιδίου της μεθυλενοτετραϋδροφολικής ρεδουκτάσης (MTHFR C677T) Ο πολυμορφισμός C677T του γονιδίου της μεθυλενοτετραϋδροφολικής ρεδουκτάσης (MTHFR C677T), προκύπτει από μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο της MTHFR (μια βάση κυτοσίνης- C αντικαθίσταται από θυμιδίνη- Τ). Η μετάλλαξη αυτή έχει συσχετιστεί (η ομοζυγoτία), υψηλά επίπεδα ομοκυστεΐνης και θρομβοφιλία. Ο πολυμορφισμός MTHFR C677T ανιχνεύεται με την τεχνική PCR, χρησιμοποιώντας κατάλληλους εκκινητές (primers) και Τaq 1 πολυμεράση για να πολλαπλασιαστεί εκείνη η περιοχή του γονιδίου που περιέχει τη μετάλλαξη. Το περιοριστικό ένζυμο Hinf Ι διασπά το προϊόν της αντίδρασης όταν αναγνωρίζει τη συγκεκριμένη αλληλουχία βάσεων GAGG. Αν το προϊόν της αντίδρασης περιέχει τη μετάλλαξη Leiden, τότε η συγκεκριμένη αλληλουχία αντικαθίσταται από την AAGG, το περιοριστικό ένζυμο δεν την αναγνωρίζει και άρα δεν επέρχεται διάσπαση. Αντιδραστήρια.Αναφέρονται μόνο οι διαφορές. Εκκινητές (Primers): MTHFR-R: 5 - TGA AG GAGA AGG TGT CTG CGG GA-3 MTHFR-F: 5 - AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG- 3. Περιοριστικό ένζυμο Hinf Ι. Τα αποτελέσματα ερμηνεύονται ως εξής: MTHFR 677 CC (wild type): Διακρίνονται μία ζώνη, 198 βάσεων. MTHFR 677 CT: Διακρίνονται 3 ζώνες, 198, 175 και 23 βάσεων. MTHFR 677 TT: Διακρίνονται δύο ζώνες, 175 και 23 βάσεων. Frosst et al. Nat Genet 1995; 10: Grandone et al Thromb Haemost 1997; 77: Η μελέτη των μεταλλάξεων στη γλυκοπρωτεΐνη ΙΙΙa των αιμοπεταλίων πραγματοποιείται με PCR που χρησιμοποιεί ειδικές αφετηρίες όπως ήδη αυτό έχει περιγραφεί. Εν ολίγοις παραλαμβάνεται DNA από περιφερικό ολικό αίμα με το kit της QIAGEN. Ο πολυμορφισμός HPA-1 (η T1565C αντικατάσταση στο γονίδιο της GPⅢa) ελέγχεται με το MSP Ⅰ περιοριστικό ένζυμο στο αλλήλιο HPA-1b όχι όμως και στο αλλήλιο HPA-1a και HPA-3 polymorphism (T13959G αντικατάσταση στο γονίδιο της GPⅡb) Η ανίχνευση του ACE. Το γονίδιο που ελέγχει τα επίπεδα του ενζύμου στο πλάσμα των ασθενών και ταυτόχρονα την αρτιότητα του μετατρεπτικού ενζύμου της Αγγειοτενσίνης 1 έχει ενοχοποιηθεί για αυξημένη σχέση με στεφανιαία νόσο. Το πλήρες probe του ενδοθηλιακού ACE (clones p G19-22 και pg21-11) χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση της διαταραχής που έχει περιγραφεί στο ACE. Η ενοχοποίηση αυτή συσχετίστηκε με την παρουσία έλλειψης σε διπλή δόση, δηλαδή ομοζυγοτική παρουσία (Deletion, D/D). Η 5

6 ανίχνευση της γονιδιακής αυτής διαταραχής ελέγχεται με τη βοήθεια διαδοχικής διερεύνησης της διαταραχής (Ι/D, insertion/deletion) με ένα νουκλεοτιδικό τμήμα 584bp Ban I (αντιστοιχεί στις νουκλεοτιδικές θέσεις και 2707) της αλληλουχίας του cdna του ACE γονιδίου. Χρησιμοποιούνται τυχαίες αφετηρίες (kit Amersham co) και στο προϊόν της PCR επίδρασε το περιοριστικό ένζυμο Hind III Δεδομένα από τον υβριδισμό με το τμήμα BAN I. Στο προϊόν του υβριδισμού επέδρασε το περιοριστικό ένζυμο Hind III και τα αποτελέσματα της δράσης του φαίνονται στα μέλη οικογένειας. Το 1 είναι πατέρας το 2 η μητέρα και τα 3 και 4 δυο παιδιά τους. Στο 4 φαίνονται τμήματα μεγέθους 9,5 και 9,25 kilobases και ταυτόχρονα γίνεται φανερή η μεγάλη απουσία (έλλειψη) νουκλεοτιδικών βάσεων. Rigat et al. J Clin Inv Η ΑΡΟ-Ε επίσης και κυρίως το αλλήλιο 2 και 3 σχετίζονται περισσότερο με αυξημένα επίπεδα χοληστερόλης και καρδιαγγειακών επεισοδίων. Στην εικόνα φαίνονται οι διάφοροι συνδυασμοί γονοτύπων. Για την PCR ως περιοριστικά ένζυμα χρησιμοποιούνται τα Pvull και Fnu4H1 για τη διάκριση του Α- IV1 από το και το Hinf1. Hixson JE, Vernier DT. J Lipid Res. 1990;31: Στην εικόνα a την δράση των περιοριστικών ενζύμων Pvull και Fnu4H1με τα οποία διαχωρίζονται οι μεταλλάξεις (πλήρη παραλληλόγραμμα, σε ένα ομοζυγότη A-IV1/A-IV-1) και λαμβάνονται τα τμήματα στη γραμμή Α 222bp, στη γραμμή Β 192 bp, ενώ στη γραμμή C από την εφαρμογή του ίδιου ενζύμου σε ετεροζυγότη (λαμβάνονται τα τμήματα 222 και 192 bp ταυτόχρονα. Formatted Table Εναλλακτική μέθοδος μελέτης πολλαπλών μεταλλάξεων Το DNA stripassay βασίζεται στις αρχές της ανάστροφης υβριδοποίησης και περιλαμβάνει τρία διαδοχικά βήματα: 1 ον απομόνωση του DNA από το ολικό αίμα με ταχεία και εύκολη διαδικασία, 2 ον πολλαπλασιασμός των αλληλουχιών των ειδικών γονιδίων in vitro με την κλασική PCR και ταυτόχρονα σήμανση του προϊόντος με βιοτίνη. Τελικά 3 ον τα προϊόντα του πολλαπλασιασμού υβριδοποιούνται εκλεκτικά σε μια ειδική ταινία που περιέχει ειδικά αλλήλια (φυσιολογικά και μεταλλαγμένα) τα οποία ακινητοποιούνται σε παράλληλες γραμμές επί της ειδικής ταινίας. Ακολούθως οι συνδεδεμένες και σημασμένες με βιοτίνη αλληλουχίες ανιχνεύονται με streptavidin-alkaline phosphatase σε έγχρωμα υποστρώματα Στην εικόνα παρουσιάζονται τα ευρήματα από την εναλλακτική μέθοδο των strips. 6

7 7