ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Έκφραση και ρόλος των πρωτεογλυκανών neurocan και phosphacan κατά την ανάπτυξη του πρώϊμου εμβρύου Neurocan Phosphacan ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Γεωργαδάκη Κατερίνα ΠΑΤΡΑ Ιούλιος 2009

2 ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Επιβλέπων Καθηγητής: Καθηγητής Ν. Ζάγκρης Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Μέλη: Γ. Κίλιας Αναπληρωτής καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Ν. Σταμάτης Επίκουρος καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Π. Γιομπρές Αναπλ. Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Α. Δερμών Αναπλ. Καθηγήτρια Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Ν. Δημόπουλος Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Ν. Ζάγκρης Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Γ. Κίλιας Αναπληρωτής καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Ν. Σταμάτης Επίκουρος καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Γ. Στεφάνου Καθηγήτρια Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Η έγκριση της διατριβής για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης (Διδακτορικής Διατριβής) από το Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν. 5343/1392, άρθρο 202.

3 H παρούσα διδακτορική διατριβή έχει εκπονηθεί στον Τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης του Πανεπιστημίου Πατρών, με την επίβλεψη του Καθηγητή κ. Νικόλα Ζάγκρη Η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο (ΕΚΤ), Επιχειρησιακό Πρόγραμμα Εκπαίδευση και Αρχική Επαγγελματική Κατάρτιση (ΕΠΕΑΕΚ ΙΙ), και ειδικότερα το Πρόγραμμα ΠΥΘΑΓΟΡΑΣ ΙI

4 Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Νικόλα Ζάγκρη για την συνεχή καθοδήγηση και επίβλεψη του κατά την εκπόνηση της παρούσης διδακτορικής διατριβής. Επίσης ευχαριστώ τα μέλη της συμβουλευτικής επιτροπής και της εξεταστικής επιτροπής της διατριβής μου. Η οικογένειά μου ήταν και θα είναι το στήριγμά μου σε κάθε μου προσπάθεια ή δυσκολία και τους αξίζει ένα μεγάλο ευχαριστώ. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τους μεταπτυχιακούς φοιτητές Νικολίτσα Σουλιντζή, Κωνσταντίνο Κωνσταντόπουλο, Αλέξανδρο Δημηρόπουλο και Ελένη Καπόλου συνοδοιπόρους στην έρευνα - για την άψογη συνεργασία και το φιλικό κλίμα που επικρατούσε στο εργαστήριο. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στους φίλους μου που ήταν δίπλα μου.

5 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 Α. Η εξωκυττάρια ουσία Κολλαγόνο Γλυκοπρωτεϊνες Πρωτεογλυκάνες / Γενική δομή Πρωτεϊνικός κορμός Γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs) Βιοσύνθεση πρωτεογλυκανών Οικογένειες των πρωτεογλυκανών Υαλεκτίνες: Δομή του πρωτεϊνικού κορμού Neurocan H N-τελική περιοχή της neurocan Η κεντρική περιοχή της neurocan.25 Η C-τελική περιοχή της neurocan Αλληλεπιδράσεις με άλλα μόρια Έκφραση της neurocan Phosphacan Έκφραση της phosphacan Ρόλος των πρωτεογλυκανών και των γλυκοζαμινογλυκανών Πρωτεογλυκάνες και μοντέλα ασθενειών...46 B. Στοιχεία της εμβρυϊκής ανάπτυξης της όρνιθας Η όρνιθα σαν πρότυπο σύστημα μελέτης Αρχικά στάδια ανάπτυξης του εμβρύου Έναρξη οργανογένεσης Νευριδίωση...55 Σκοπός της Εργασίας..57 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Απομόνωση και Καλλιέργεια εμβρύων Υλικά / Συσκευές / Διαλύματα...59

6 Μεθοδολογία Ρόλος των neurocan και phosphacan στο πρώιμο έμβρυο / Έκθεση σε αντισώματα Μονιμοποίηση εμβρύων Υλικά / Διαλύματα..63 Μεθοδολογία Μικροτόμηση εμβρύων Συσκευές / Διαλύματα Μεθοδολογία Αποπαραφινοποίηση-Χρώση με Alcian Blue Υλικά / Συσκευές / Διαλύματα...66 Μεθοδολογία Χωρο-χρονική ανίχνευση πρωτεϊνών / Ανοσοφθορισμός Υλικά / Συσκευές Διαλύματα..70 Μεθοδολογία Ανοσοκατακρήμνιση της πρωτεΐνης Neurocan Συσκευές Διαλύματα..75 Μεθοδολογία Ηλεκτροφόρηση / SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)...79 Συσκευές / Διαλύματα..79 Μεθοδολογία Έκθεση εμβρύων σε αντισώματα έναντι της neurocan ή της phosphacan Ανίχνευση neurocan και phosphacan mrna με RT-PCR Απομόνωση εμβρύων Απομόνωση RNA Μέτρηση της οπτικής απορρόφησης απομονωμένου RNA Σύνθεση cdna με RT-PCR Ηλεκτροφόρηση προϊόντων RT-PCR. 91 Υλικά / Συσκευές / Διαλύματα...91 Μεθοδολογία Αποστειρώσεις...93

7 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Έκφραση του mrna της neurocan Ταυτοποίηση της neurocan στο πρώιμο έμβρυο με ανοσοκατακρήμνιση Χωρο-χρονική έκφραση της πρωτεΐνης neurocan Αναστολή λειτουργίας της neurocan Έκφραση του mrna της phosphacan Χωρο-χρονική έκφραση της πρωτεΐνης phosphacan Αναστολή λειτουργίας της phosphacan.123 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 130 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 139 ABSTRACT 141 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 144

8 Εισαγωγή Ένας καλά ανεπτυγμένος ανθρώπινος οργανισμός αποτελείται από περίπου 1 x κύτταρα. Καθένα από τα κύτταρα αυτά κατέχει τη δική του θέση και παίζει το δικό του ιδιαίτερο ρόλο μέσα στο ανθρώπινο σώμα. Χωρίς όμως τον αυτονόητο συντονισμό όλων των κυτταρικών δραστηριοτήτων, θα επικρατούσε χάος. Η μορφογένεση, η δημιουργία της εμβρυϊκής μορφής, εξαρτάται από τις κοινές δραστηριότητες πολλών διαφορετικών τύπων κυττάρων. Στο έμβρυο κατά την ανάπτυξή του, κύτταρα συχνά πρέπει να διανύσουν, σχετικά μεγάλες αποστάσεις, μετακινούμενα από το σημείο της αρχικής τους προέλευσης μέχρι τις τελικές θέσεις προορισμού τους. Μόλις το πετύχουν αυτό αρχίζουν να εγκαθιδρύουν σταθερές πολυκυτταρικές δομές με συγκεκριμένες μορφολογίες και λειτουργίες. Όμως, όλες αυτές οι δραστηριότητες προϋποθέτουν πως τα κύτταρα έχουν την ικανότητα να ρυθμίζουν τη μορφή τους και να αλληλεπιδρούν αποτελεσματικά με το περιβάλλον τους. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές των κυττάρων, τόσο με το μικροπεριβάλλον τους, όσο και με άλλα κύτταρα, είναι βασικές για τον απαραίτητο, σωστό συντονισμό όλων των κυτταρικών δραστηριοτήτων. Για να μπορούν ειδικότερα τα κύτταρα να αλληλεπιδρούν με το περιβάλλον τους, πρέπει να μπορούν να αντιλαμβάνονται τα σήματα που προέρχονται από αυτό και να έχουν στη συνέχεια τη δυνατότητα να αποκριθούν κατάλληλα. Τα σήματα αυτά συχνά είναι μεγάλα μόρια, όπως πεπτίδια ή μεγάλες πρωτεΐνες που δεν μπορούν να εισέλθουν στο κύτταρο-στόχο τους. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα πρέπει να φέρουν στην επιφάνειά τους υποδοχείς για να ανιχνεύουν αυτά τα μόρια στο περιβάλλον τους και να μετατρέπουν τα εξωτερικά σήματα, που εκπροσωπούν τα μόρια αυτά, σε σήματα που μπορούν να διαβιβαστούν στο εσωτερικό των κυττάρων. Μέσα στο κύτταρο, τα σήματα περνούν συχνά από ένα μόριο στο άλλο, προτού φθάσουν στον τελικό τους προορισμό, ο οποίος θα μπορούσε να είναι είτε ο πυρήνας είτε κάποιο από τα κυτταροπλασματικά οργανίδια. Αυτό αναφέρεται ως μονοπάτι μεταγωγής σήματος (signal transduction pathway). Παράδειγμα αποτελεί η φωσφοριλίωση, η οποία μπορεί να παρομοιαστεί με ένα δυαδικό διακόπτη, που αλλάζει τη μοριακή λειτουργία. Κάθε μέλος του μονοπατιού που φωσφοριλιώνεται, στη συνέχεια φωσφοριλιώνει το επόμενο μέλος. Μια αλλαγή στα κύτταρα μπορεί να - 1 -

9 Εισαγωγή προκληθεί, όταν το σήμα που φθάνει στον πυρήνα, είτε ενεργοποιεί, είτε καταστέλλει την έκφραση ενός συγκεκριμένου γονιδίου. Τέτοια είναι η συνέπεια της σηματοδότησης από τους αυξητικούς παράγοντες κατά τη διάρκεια της εμβρυικής επαγωγής. A. Η ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑ ΟΥΣΙΑ Η εξωκυττάρια ουσία (extracellular matrix/ecm) είναι ένα σύνθετο δίκτυο πρωτεϊνών και υδατανθράκων που δημιουργεί ένα ειδικό περιβάλλον στα διαστήματα μεταξύ των κυττάρων. Συχνά αναφέρεται και ως συνδετικός ιστός. Η εξωκυττάρια ουσία (ecm) δεσμεύει τα κύτταρα στους ιστούς και αποτελεί μια δεξαμενή αυξητικών παραγόντων/oρμoνών με τις οποίες ελέγχει την αύξηση και τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Παρέχει επίσης ένα δικτυωτό πλέγμα μέσω του οποίου τα κύτταρα μπορούν να κινηθούν ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια των αρχικών σταδίων της μορφογένεσης. Ο ρόλος του δικτύου της εξωκυττάριας ουσίας είναι σημαντικός στα φαινόμενα αναγνώρισης και αλληλεπίδρασης μεταξύ κυττάρων. Οι αλληλεπιδράσεις των κυττάρων μεταξύ τους αλλά και με την εξωκυττάρια ουσία ενεργοποιούν ποικίλα μονοπάτια μεταγωγής σήματος, τροποποιούν τη ρύθμιση συγκεκριμένων γονιδίων και έχουν ως αποτέλεσμα τις διαφορικές αποκρίσεις των κυττάρων, οι οποίες επηρεάζουν την προσκόλληση, τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, και απαιτούνται για τη συντήρηση της κατάλληλης αρχιτεκτονικής του ιστού στο αναπτυσσόμενο έμβρυο (England, 1982, 1984 Harrisson, 1989 Adams και Watt, 1993 DeSimone, 1994 Timpl και Brown, 1994 Chung, 1995 Zagris και Stavridis, 1995 Zagris, 2001). Η εξωκυττάρια ουσία αποτελείται από μόρια που εκκρίνονται από κύτταρα στο άμεσο περιβάλλον τους (Eικόνα 1, Πίνακας 1) και αρχίζει να συντίθεται από το πολύ πρώιμο στάδιο ανάπτυξης του εμβρύου, το μορίδιο. Στο στάδιο του βλαστιδίου, έχει ήδη δομηθεί η πρώτη βασική μεμβράνη, μια λεπτή, σύνθετη, ειδικά τροποποιημένη μορφή της εξωκυττάριας ουσίας, στο κοιλιακό μέρος της επιβλάστης ενώ μόρια της εξωκυττάριας ουσίας ανιχνεύονται και στο - 2 -

10 Εισαγωγή χώρο ανάμεσα στην επιβλάστη και την υποβλάστη (περιοχή ομόλογη με τον βλαστόκοιλο των αμφιβίων) (Zagris, 2001). Με την έναρξη των μορφογενετικών κινήσεων της γαστριδίωσης, παρατηρείται σχηματισμός πλέγματος της εξωκυττάριας ουσίας (Ζagris, 2001). Πίνακας 1. Συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας και ο ρόλος τους Συστατικό Δομή Λειτουργία Κολλαγόνο Γλυκοπρωτεϊνη με μορφή τριπλής έλικας. Μόρια πλούσια σε προλίνη, υδροξυπρολίνη και γλυκίνη. Δύναμη, στήριξη και δομή για όλους τους ιστούς και όργανα. Ελαστίνη Γλυκοπρωτεϊνες Ελαστική υδρόφοβη πρωτεΐνη που άλληλεπιδρά με γλυκοζυλιωμένα μικροϊνίδια. Ειδικές γλυκοπρωτεϊνες προσκόλλησης (φιβρονεκτίνη), σε σχήμα σταυρού (λαμινίνη) Επιτρέπει σε ιστούς και δομές να επιμυκήνονται και να συμπιέζονται. Μεσολαβεί στη προσκόλληση κυττάρων και εξωκυττάριας ουσίας. Πρωτεογλυκάνες Μεγάλες αλυσίδες γλυκοζαμινογλυκανών που συνδέονται ομοιοπολικά στο πρωτεϊνικό κορμό. Ενυδάτωση, απορρόφηση κραδασμών, απομάκρυνση κυτοκινών, κυτταρική προσκόλληση. Υαλουρονικό οξύ Μη θειωμένη γλυκοζαμινογλυκάνη Παρέχει ένα υγρό περιβάλλον για κυτταρική μετακίνηση και διαφοροποίηση, αλλά και πρόσδεση κυτοκινών - 3 -

11 Εισαγωγή Εικόνα 1. Σχηματική αναπαράσταση της βασικής μεμβράνης και των αλληλεπιδράσεων μεταξύ μορίων που την δομούν και μορίων της επιφάνειας του κυττάρου ooooooooooooooooooo ( 1. ΚΟΛΛΑΓΟΝΟ Το κολλαγόνο (collagen) είναι ένα σημαντικό πρωτεϊνικό συστατικό της εξωκυττάριας ουσίας του δέρματος και αποτελεί το 60-80% του ξηρού βάρους της. Ο ρόλος του είναι σημαντικός στην τροποποίηση της συμπεριφοράς των κυττάρων που έρχονται σε επαφή μαζί του και επίσης δρα ως δεξαμενή αυξητικών παραγόντων και των ενζύμων. Αποτελείται από τρεις άλφα αλυσίδες οι οποίες έχουν ένα κοινό επαναλαμβανόμενο μοτίβο Gly-X-Y, που επιτρέπει τη δημιουργία μιας τριπλής έλικας. Συχνά το Χ είναι η προλίνη και το Υ η υδροξυπρολίνη. Τριάντα δύο ευδιάκριτες άλφα αλυσίδες είναι γνωστές, επιτρέποντας την ύπαρξη περισσοτέρων των είκοσι διαφορετικών τύπων κολλαγόνων στα σπονδυλωτά (Hulmes, 2002 Bosman και Stamenkovic, 2003). Από αυτούς μόνο επτά βρίσκονται σε σημαντικές ποσότητες στο δέρμα. Η τριπλή έλικα δίνει στο κολλαγόνο μια άκαμπτη δομή, διατηρώντας τη μηχανική ακεραιότητα των ιστών. Η τρισδιάστατη δομή των ινών κολλαγόνου καθορίζει τις μηχανικές ιδιότητες των ιστών, για παράδειγμα, σπειροειδείς σχηματισμοί στο κόκκαλο στους όποιους συνδέεται το υδροξυαπατίτη (hydroxyapetite), ή παράλληλη διάταξη στον τένοντα για προώθηση της ευελιξίας. Η τριπλή έλικα είναι επίσης ανθεκτική στην πρωτεόλυση. ( 20- %206.htm) - 4 -

12 Εισαγωγή Οι κύριοι τύποι κολλαγόνου φαίνονται στον Πίνακα 2. Το κολλαγόνο Ι, ΙΙ και ΙΙΙ είναι σε ινιδιακή μορφή. Το κολλαγόνο ΙV είναι το μόνο που συντίθεται στο πρώιμο έμβρυο (Adamson και Ayers, 1979 Leivo et al., 1980), και εμφανίζει δίκτυο, ομοιοπολικά σταθεροποιημένο, που αποτελεί το σκελετό της βασικής μεμβράνης. Επιπλέον παίζει ρόλο και στην αλληλεπίδραση των βασικών μεμβρανών με τα κύτταρα. Πολυάριθμες μεταλλάξεις έχουν παρατηρηθεί στα γονίδια κολλαγόνου (Prockop και Kivirikko, 1995). Μεταλλάξεις μάλιστα στο γονίδιο του κολλαγόνου τύπου Ι αναφέρονται ως αιτία μιας σοβαρής σκελετικής ανωμαλίας στον άνθρωπο, γνωστής με το όνομα osteogenesis imperfecta (ατελής οστεογένεση). Eιδικότερα η ουσιαστική γενετική βλάβη στην ανωμαλία αυτή είναι μια επικρατούσα αρνητική μετάλλαξη (dominant negative mutation) που προσβάλλει τα αλλήλόμορφα COL1A1 και COL1A2, τα οποία εκφράζουν τις αλυσίδες του κολλαγόνου τύπου I (Prockop et al., 2005). Άλλες πάλι από αυτές τις μεταλλάξεις οδηγούν στην αντικατάσταση της γλυκίνης από ένα αμινοξύ με μια ογκώδη πλευρική αλυσίδα, συχνά κυστεϊνη, που διαταράσσει τη δομή της α-έλικας, οδηγώντας σε άλλες σκελετικές ανωμαλίες. Τέτοιες μεταλλάξεις για παράδειγμα στο γονίδιο του κολλαγόνου τύπου ΙΙ (χόνδρος) οδηγούν στα κοινά σε εμάς αρθριτικά προβλήματα. (Warburton lecture tutorial, ECMI.html) Πίνακας 2. κατανομή τους Μερικές χαρακτηριστικές μορφές κολλαγόνου, σύσταση και Τύποι Αλυσίδες Μορφή Κατανομή σε ιστούς Ι [a1(i)] 2 a2(i) Ινιδιακή μορφή Δέρμα, κόκκαλο, τένοντας, κερατοειδής χιτώνας, σύνδεσμοι, όργανα (90% του συνολικού κολλαγόνου) ΙΙ [a1(ii)] 3 Ινιδιακή μορφή Χόνδρος ΙΙΙ [a1(iii)] 3 Ινιδιακή μορφή Δέρμα, αιμοφόρα αγγεία, εσωτερικά όργανα ΙV [a1(iv)] 2 a2(iv) Δίκτυο Βασική μεμβράνη V Μια οικογένεια αποτελούμενη από συνδυασμό των a1(v), a2(v), a3(v), a4(v) Άγνωστο, εάν έχει ινιδιακή μορφή ή σχηματίζει δίκτυο Σε όλους τους συνδετικούς ιστούς (10% ή λιγότερο του συνολικού κολλαγόνου) - 5 -

13 Εισαγωγή 2. ΓΛΥΚΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Η εξωκυττάρια ουσία περιέχει ποικιλία γλυκοπρωτεϊνων όπως, για παράδειγμα, η φιβρονεκτίνη, η τενάση, η εντακτίνη, και η λαμινίνη, οι οποίες συμμετέχουν στις διαδικασίες μετανάστευσης, προσκόλλησης, πολλαπλασιασμού, επιβίωσης κυττάρων και στη μορφογένεση ιστών και οργάνων. Τα μόρια αυτά έχουν πολλές ενεργές περιοχές (domains) και αλληλεπιδρούν μεταξύ τους, με άλλα μόρια της εξωκυττάριας ουσίας, αλλά και με την κυτταρική επιφάνεια (Zagris, 2001). Οι γλυκοπρωτεϊνες περιέχουν υδατάνθρακες σε ποσοστό από 1% έως 60% κατά βάρος και οι αλυσίδες των ολιγοσακχαριτών είναι διακλαδιζόμενες. Η λαμινίνη είναι από τις πρώτες γλυκοπρωτεϊνες που εμφανίζεται στην εξωκυττάρια ουσία στο αναπτυσσόμενο έμβρυο (Leivo et al, 1980 Cooper και Mac Queen, 1983 Dziadek και Timpl, 1985 Martin και Timpl, 1987 reviewed by Zagris και Stavridis, 1995 Zagris, 2001). Το μόριο της λαμινίνης αποτελείται από τρεις πολυπεπτιδικές αλυσίδες (ετεροτριμερές), τις α1 (400 kda), β1 (210 kda), γ1 (210 kda) (Chung et al., 1979 Timpl et al., 1979), που συνδέονται με δισουλφιδικούς δεσμούς και σχηματίζουν ένα μοναδικό μόριο σε σχήμα σταυρού (Eικόνα 2). Η λαμινίνη περιέχει πολλές ενεργές περιοχές για τη πρόσδεση με την εντακτίνη, κολλαγόνο IV, πρωτεογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης (perlecan), την ίδια τη λαμινίνη, με άλλα μόρια της εξωκυττάριας ουσίας και με μόρια της κυτταρικής επιφάνειας όπως είναι οι ιντεγκρίνες (Εικόνα 2) (Mecham, 1991 Hynes, 1992 Haas και Plow, 1994 Giancotti, 1997). Έχουν αναγνωριστεί 8 γενετικά διακριτές αλυσίδες, οι οποίες ανασυνδιαζόμενες ανά τρεις σχηματίζουν διαφορετικά είδη λαμινίνης όπως, για παράδειγμα, η α1β1γ1 που είναι η κλασική μορφή λαμινίνης, ή η α3β3γ2 (λαμινίνη 5/kalinin) όπου απουσιάζει ο κοντός βραχίονας της α αλυσίδας και μέρος των κοντών βραχιόνων των β και γ αλυσίδων και έτσι μπορεί να μην αυτοπολυμερίζεται, να μην αλληλεπιδρά με την εντακτίνη αλλά είναι γνωστό ότι ο ρόλος της είναι σημαντικός. Το μόριο της λαμινίνης αυτοπολυμερίζεται και σχηματίζει ένα αντιστρεπτό πολυμερές, συμβάλλοντας έτσι στη δόμηση της βασικής μεμβράνης. Τα δίκτυα λαμινίνης αλληλεπιδρούν με τα δίκτυα κολλαγόνου IV ειδικότερα μέσω της εντακτίνης - 6 -

14 Εισαγωγή σχηματίζοντας έτσι ένα πολύπλοκο πλέγμα (scaffold) που είναι ο σκελετός της βασικής μεμβράνης. Η αλληλεπίδραση κυττάρων με τη λαμινίνη διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στην προσκόλληση, κατευθυντική μετανάστευση, πολλαπλασιασμό και επιβίωση κυττάρων, και τη μορφογένεση ιστών και οργάνων (reviewed by Engel, 1992 Adams και Watt, 1993 Timpl και Brown, 1994 Yurchenco και O' Rear, 1994 Chung, 1995 Streuli et al., 1995 Luckenbill- Edds, 1997 Zagris, 2001). Εικόνα 2 Κλασική μορφή του μορίου της λαμινίνης (Από Lodish et al., 2000 με τροποποιήσεις) 3. ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΕΣ / ΓΕΝΙΚΗ ΔΟΜΗ Οι πρωτεογλυκάνες αναγνωρίστηκαν στις αρχές της δεκαετίας του 1960 ως σημαντικά δομικά συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας του χόνδρου και πίστευαν ότι είναι συγκεκριμένες για εκείνο τον ιστό. Σήμερα έχει γίνει σαφές ότι βρίσκονται στη εξωκυττάρια ουσία όλων των ιστών, συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου, και ότι το μέγεθος και η δομή τους ποικίλλουν. Η βασική δομή κάθε πρωτεογλυκάνης αποτελείται από μια πολυπεπτιδική αλυσίδα (πρωτεϊνικός κορμός) και τουλάχιστον μια ή περισσότερες (μέχρι δεκάδες ή εκατοντάδες) γραμμικές αλυσίδες υδατανθράκων τις αποκαλούμενες γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs), οι οποίες συνδέονται ομοιοπολικά με την πολυπεπτιδική αλυσίδα

15 Εισαγωγή Εικόνα 3 Σχηματική απεικόνιση μιας τυπικής πρωτεογλυκάνης. Διακρίνεται ο πρωτεϊνικός της κορμός και οι προσδεδεμένες σε αυτόν αλυσίδες γλυκοζαμινογλυκανών (GAGs). (Aπό webanatomy.net/anatomy/gags.htm με τροποποιήσεις) Πρωτεϊνικός κορμός Οι πρωτεϊνικοί κορμοί πρωτεογλυκανών μπορεί να ποικίλουν σε μοριακή μάζα από περίπου 10 κda σε υψηλότερο από 500 κda (Iozzo και Murdoch, 1996). Μέσα στον πρωτεϊνικό κορμό πρωτεογλυκανών υπάρχουν περιοχές που είναι ομόλογες με περιοχές του κορμού άλλων πρωτεϊνών. Για παράδειγμα, ο πρωτεϊνικός κορμός της neurocan έχει περιοχή που είναι ομόλογη με τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF), η agrin έχει μια περιοχή που είναι ομόλογη της γλυκοπρωτεϊνης λαμινίνης (Iozzo και Murdoch, 1996). Οι λειτουργίες αυτών των ομόλογων περιοχών δεν είναι ακόμα γνωστές. Εντούτοις, υπάρχει μια κεντρική πρωτεϊνική περιοχή κοινή σε διάφορες πρωτεογλυκάνες της οποίας η λειτουργία είναι καθιερωμένη. Αυτή η περιοχή (Ν-τελικό άκρο) μεσολαβεί σε μια μη-ομοιοπολική αλληλεπίδραση μεταξύ της πρωτεογλυκάνης και της γλυκοζαμινογλικάνης του υαλουρονικού οξέος με τη βοήθεια των πρωτεϊνικών συνδέσμων (link proteins) (Wight et al, 1991 Iozzo και Murdoch, 1996). Κατ' αυτό τον τρόπο, είναι δυνατό να δεθούν πολλά μονομερή πρωτεογλυκανών διαμορφώνοντας συσσωματώματα. Πρωτεογλυκάνες εκκρίνονται από τα κύτταρα και συμμετέχουν στη δόμηση της εξωκυττάριας ουσίας ενώ άλλες ανιχνεύονται στην κυτταρική επιφάνεια ως διαμεμβρανικά μόρια ή συνδέονται με την κυτταρική επιφάνεια μέσω των GPI (glycosyl-phosphatidylinositol) και είναι υποδοχείς αυξητικών παραγόντων μεταβιβάζοντας σήματα στα ενδοκυτταρικά μόρια

16 Εισαγωγή Γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs) Οι γλυκοζαμινογλυκάνες είναι μεγάλα μη διακλαδιζόμενα πολυμερή που αποτελούνται από ~ επαναλαμβανόμενες μονάδες δισακχαριτών που προσκολλώνται συνήθως στους πρωτεϊνικούς κορμούς μέσω ενός κατάλοιπου σερίνης και χαρακτηριστικών υδατανθρακικών περιοχών σύνδεσης (Εικόνα 4) (Bandtlow και Zimmermann, 2000). Εικόνα 4: Η σύνδεση της γλυκοζαμινογλυκανικής αλυσίδας με τον πρωτεϊνικό κορμό περιλαμβάνει έναν ειδικό τρισακχαρίτη σύνδεσμο (trisaccharide linker). (Aπό με τροποποιήσεις) Οι διαφορετικοί τύποι των γλυκοζαμινογλυκανών μπορούν να δημιουργηθούν ως αποτέλεσμα της θειίκωσης (sulphation) και του επιμερισμού (epimerization) που πραγματοποιούνται στα σάκχαρα. Το μήκος των αλυσίδων των γλυκοζαμινογλυκανών μπορεί επίσης να ποικίλει, από μια πολυπεπτιδική αλυσίδα 10 kda έως 400 kda, και η ίδια η κύρια πρωτεΐνη μπορεί να έχει ποικίλο και διαφορετικό αριθμό (από μια έως πάνω από 100) αλυσίδων γλυκοζαμινογλυκανών που συνδέονται με αυτή, με συνέπεια τη δημιουργία μιας διαφορετικής σειράς πρωτεογλυκανών, που έχουν διαφορετική λειτουργία. Η μεγάλη τους περιεκτικότητα σε θειομάδες προσδίδει στις γλυκοζαμινογλυκάνες υψηλό αρνητικό φορτίο και τους επιτρέπει αλληλεπίδραση με πρωτεογλυκάνες, με άλλα μόρια της εξωκυττάριας ουσίας και με υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας (Ayad et al., 1994). Οι γλυκοζαμινογλυκανικές αλυσίδες φέρουν μεγάλα φορτία θειικών και καρβοξυλικών ομάδων και καθορίζουν τις φυσικές ιδιότητες της πρωτεΐνης στην οποία προσδένονται. Μαζί με το υψηλό ιξώδες των γλυκοζαμινογλυκανών συνυπάρχει χαμηλή συμπιεστικότητα, ιδιότητα που - 9 -

17 Εισαγωγή κάνει τα μόρια αυτά ιδανικά για τη λίπανση του υγρού στις ενώσεις (Hardingham και Bayliss, 1990). Επιπρόσθετα, η ακαμψία τους παρέχει τη δομική ακεραιότητα στα κύτταρα και δημιουργεί διόδους μεταξύ των κυττάρων, επιτρέποντας τη κυτταρική μετανάστευση. Υπάρχουν πέντε οικογένειες γλυκοζαμινογλυκανών, οι ηπαρίνη/ ηπαράνη, χονδροϊτίνη, δερματάνη, κερατάνη και υαλουρονικό οξύ. Τα σάκχαρα των περισσοτέρων γλυκοζαμινογλυκανών υφίστανται περαιτέρω τροποποίηση, για παράδειγμα. με Ο- και Ν- θειικωση αναφέρονται ως θειική χονδροϊτίνη (CS), θειική δερματάνη (DS), θειική κερατάνη (KS) και θειική ηπαρίνη/ηπαράνη (HS). Το υαλουρονικό οξύ (ΗΑ) θεωρείται ελεύθερη γλυκοζαμινογλυκάνη και αλληλεπιδρά με πρωτεογλυκάνες με τη βοήθεια των πρωτεϊνικών συνδέσμων (link proteins) σχηματίζοντας δίκτυα και οι πρωτεογλυκάνες μπορεί να αλληλεπιδρούν με το κολλαγόνο σχηματίζοντας συσσωματώματα/δίκτυα ινών ζελατίνης (gel fiber network) (Εικόνα 5). Βρίσκεται με τη μορφή ελεύθερης γλυκοζαμινογλυκάνης στις κυτταρικές επιφάνειες και την εξωκυττάρια ουσία (Toole, 1991). Δομικά μοιάζει με τις άλλες γλυκοζαμινογλυκάνες. Πιο συγκεκριμένα, είναι ένα πολυμερές χιλιάδων επαναλήψεων του δισακχαριδίου D-γλυκερινικού οξέος (D-glucuronic acid) και N- ακετυλογλυκοζαμίνης (Ν-acetylglucosamine), που ενώνεται με β1-3 δεσμό, δημιουργώντας ένα μόριο με αρνητικά φορτισμένες COOH-ομάδες. To υαλουρονικό οξύ προσλαμβάνει μια ελικοειδή μορφή, καταλαμβάνοντας μεγάλο όγκο σε υδατικά διαλύματα (Ayad et al., 1994). Το υαλουρονικό οξύ αλληλεπιδρά με το κολλαγόνο σχηματίζοντας υπερωριακά συσσωματώματα (Ayad et al., 1994) (Εικόνα 5). Το υαλουρονικό οξύ αποτελεί μια κυρίαρχη γλυκοζαμινογλυκάνη στο πρώιμο έμβρυο (Solursh, 1976 Fisher και Solrush, 1977 Derby, 1978 Vanroelen et al., 1980 Brown και Papaioannou, 1993 Fenderson et al., 1993 Sherman et al., 1994) που αλληλεπιδρά με θειωμένες πρωτεογλυκάνες και κολλαγόνο, σχηματίζοντας δίκτυα πηκτώματος-ινών (gel fiber). Τα ένυδρα διαλύματα του υαλουρονικού οξέος καταλαμβάνουν όγκο 1000 φορές μεγαλύτερο σε σχέση με τα άνυδρα (Laurent και Fraser, 1992 Zagris, 2001). Θεωρείται ότι η επέκτασή του πλέγματος της εξωκυττάριας ουσίας κατά την ενυδάτωση του υαλουρονικού οξέος επιτρέπει στα κύτταρα να μεταναστεύουν σε περιοχές που διαφορετικά δεν θα είχαν πρόσβαση (Tool et al., 1972 Zagris, 2001)

18 Εισαγωγή Εικόνα 5. Απεικόνιση μιας τρι-συστατικής δομής υαλουρονικoύ οξέος (ΗΑ), ίνες κολλαγόνου (collagen) και πρωτεογλυκάνες (PG). Οι πρωτεογλυκάνες αποτελούν τη γέφυρα των ινών κολλαγόνου μέσω εξειδικευμένων θέσεων πρόσδεσης. Οι πρωτεογλυκάνες συγκρατούνται ξεχωριστά μέσω του δικτύου του υαλουρονικού οξέος το οποίο αλληλεπιδρά με συστατικά θειική χονδροϊτίνης των γεφυρών των πρωτεογλυκανών (Scott, 1992). Η πλειοψηφία των γλυκοζαμινογλυκανών συνδέονται με τον πρωτεϊνικό κορμό, δημιουργώντας πρωτεογλυκάνες (καλούνται επίσης βλεννώδεις πολυσακχαρίτες). Τα μόρια των γλυκοζαμινογλυκανών επεκτείνονται κάθετα από τον πρωτεϊνικό κορμό σε μια δομή βούρτσας. Ο σύνδεσμος της γλυκοζαμινογλυκάνης στον πρωτεϊνικό κορμό περιλαμβάνει συγκεκριμένο τρισακχαρίτη που αποτελείται από δύο υπολείμματα γαλακτόζης και ένα υπόλειμμα ξυλόζης (Gal-Gal-Xyl-O-CH2-protein). Ο τρισακχαρίτης-συνδετικός κρίκος συνδέεται με τον πρωτεϊνικό κορμό μέσω ενός O-γλυκοζιτικού δεσμού σε ένα υπόλειμμα της σερίνης στον πρωτεϊνικό κορμό, ο οποίος είναι πλούσιος στα αμινοξέα σερίνη και θρεονίνη που επιτρέπουν την πολλαπλάσια σύνδεση των γλυκοζαμινογλυκανών. Κάθε σάκχαρο προσδένεται στον πρωτεϊνικό κορμό με τη βοήθεια ειδικών ενζύμων (glycosyltransferases), επιτρέποντας πολλαπλά επίπεδα ελέγχου της σύνθεσης των γλυκοζαμινογλυκανών (Εικόνα 4). Σε αναπτυσσόμενους ιστούς το υαλουρονικό οξύ μπορεί να είναι το κύριο δομικό μακρομόριο και να ρυθμίζει ποικίλες αναπτυξιακές διεργασίες όπως η μετανάστευση και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων (Ayad et al., 1994). Τα κύτταρα αλληλεπιδρούν με το υαλουρονικό οξύ μέσω υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας, όπως ο CD44 και o RHAMM (Sherman et al., 1994). Αυτή η αλληλεπίδραση δείχνει ότι ο ρόλος αυτού του μορίου δεν είναι μόνο

19 Εισαγωγή δομικός/μηχανικός αλλά και λειτουργικός (Zagris, 2001). Μια πολύ ενδιαφέρουσα ιδιότητα του υαλουρονικού οξέος έγκειται στο γεγονός ότι κυτταρικοί πληθυσμοί καλύπτονται από ένα παχύ στρώμα υαλουρονικού οξέος (Laurent και Fraser, 1992) κατά τη διάρκεια συγκεκριμένων σταδίων ανάπτυξης του εμβρύου. Αυτό το στρώμα υαλουρονικού οξέος πιθανόν να παίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των κυττάρων. Οι γλυκοζαμινογλυκάνες και οι αλυσίδες ολιγοσακχαριτών που συνδέονται με την κεντρική πρωτεΐνη μπορούν να ποικίλουν ανάλογα με την αναπτυξιακή κατάσταση του ιστού στον οποίο οι πρωτεογλυκάνες υπάρχουν. Για παράδειγμα, η phosphacan, πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροιτίνης που εκφράζεται στο νευρικό ιστό φέρει θειική κερατάνη στην παρεγκεφαλίδα εμβρύων αρουραίων (Grumet et al., 1994), αλλά δεν φέρει καμιά γλυκοζαμινογλυκάνη στους αμφιβληστροειδικούς ιστούς αρουραίων (Inatani et al., 2000). Η περιεκτικότητα τους σε υαλουρονικό οξύ αυξάνεται παροδικά κατά τη μετάσταση των ογκογόνων κυττάρων και διαμερισματοποιούνται στο χώρο μεταξύ της καρκινικής μάζας και του ιστού του ξενιστή. Εκτός από το ρόλο του στη μετάσταση, το υαλουρονικό οξύ εμπλέκεται σε πολλές κυτταρικές λειτουργίες όπως είναι η μετανάστευση των κυττάρων των νευρικών κρηπίδων (Εικόνα 6) ( ) Εικόνα 6. Α) Διαγραμματική απεικόνιση της προτεινόμενης κατευθυνόμενης μετανάστευσης των κυττάρων των νευρικών κρηπίδων (NC) κατά την ανάπτυξη του εμβρύου. Β) H πρόσδεση της aggrecan στο υαλουρονικό οξύ αναστέλλει την μετανάστευση των ΝC από το νευρικό σωλήνα στην εξωκυττάρια ουσία και οδηγεί σε συσσώρευση της aggrecan στην κυτταρική επιφάνεια. C) Πρωτεολυτικά ένζυμα που ελευθερώνονται από τα κύτταρα αναστέλλουν τη δράση της aggrecan και τα κύτταρα συνεχίζουν τη μετανάστευσή τους. (Cattaruzza και Perris, 2006)

20 Εισαγωγή 3.1 ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΩΝ Η βιοσύνθεση του πρωτεϊνικού κορμού των πρωτεογλυκανών ακολουθεί το γενικό σχέδιο όλων των πρωτεϊνών με τη μετάφραση του mrna στα πολυσώματα. Το πολυπεπτίδιο μεταφέρεται στο αδρό ενδπλασματικό δίκτυο και η ξυλόζη αρχίζει να προσδένεται σ αυτό. Στη συνέχεια το πολυπεπτίδιο μεταφέρεται στο σύστημα Golgi, όπου λαμβάνει χώρα η προσθήκη των υδατανθράκων, καθώς και η θειοποίηση των γλυκοζαμινογλυκανών στο τέλος της βιοσύνθεσης. Η ξυλόζη αρχίζει να προσδένεται στη πρωτεΐνη όντας στο ενδοπλασματικό δίκτυο, ενώ τα υπόλοιπα σάκχαρα στο σύστημα Golgi. H σύνθεση των γλυκοζαμινογλυκανικών αλυσίδων (εκτός της θειικής κερατάνης, Baker et al., 1975 Stein et al., 1982) ξεκινά με διαδοχική προσθήκη τεσσάρων μονοσακχαριτών [ξυλόζης (xyl), γαλακτόζης (Gal), γαλακτόζης και γλυκουρουνικού οξέος (GlcA)] (Εικόνα 7). Από αυτόν τον τετρασακχαρίτη πρόσδεσης (linker) οι αλυσίδες σακχάρων εκτείνονται με την προσθήκη δύο μεταβαλλόμενων μονοσακχαριτών, ενός αμινοσακχάρου (Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (GlcNAc) στην περίπτωση της ηπαρίνης και θειικής χονδροϊτίνης/ δερματάνης και του γλυκουρονικού οξέος (GlcA). H έκταση του επιμερισμού του γλυκουρουνικού οξέος σε ιδουρονικό οξύ (ΙdoA) και το πρότυπο θείωσης των μονάδων του δισακχαρίτη διαχωρίζουν την ηπαρίνη από τη θειική ηπαράνη και τη θειική δερματάνη από τη θειική χονδροϊτίνη. Στη θειική κερατάνη οι γλυκοζαμινογλυκανικές αλυσίδες ξεκινούν ως Ν- ή Ο-συνδεδεμένοι ολιγοσακχαρίτες και εκτείνονται με την προσθήκη Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης (GlcNAc) και γαλακτόζης (Gal). Εικόνα 7. Η σύνθεση των γλυκοζαμινογλυκανικών αλυσίδων αρχίζει με διαδοχική προσθήκη Xyl-Gal-Gal-GlcA (Prydz και Dalen, 2000)

21 Εισαγωγή Μετά την ολοκλήρωση του τετρασακχαρίτη πρόσδεσης, η προσθήκη του 5 ου σακχάρου καθορίζει αν η γλυκοζαμινογλυκανική αλυσίδα θα γίνει θειική χονδροϊτίνη/ θειική δερματάνη ή θειική ηπαράνη/ηπαρίνη. Αυτό το σάκχαρο όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, είναι Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (GlcNAc) στην περίπτωση της θειική ηπαράνης/ηπαρίνης και Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνη (GalNAc) στις θειική χονδροϊτίνη/θειική δερματάνη. Τα ένζυμα GlcNAc transferase I (Fitz et al., 1997) και GalNAc transferase I ενέχονται στην προσθήκη αυτών των σακχάρων και φαίνεται να διακρίνονται από τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται στην επιμήκυνση των γλυκοζαμινογλυκανικών αλυσίδων τόσο της θειικής χονδροϊτίνης (Rohrmann et al., 1985) όσο και της θειικής ηπαράνης (Fitz et al., 1994). O Nadanaka και οι συνεργάτες του (1999) ωστόσο παρέχουν στοιχεία ότι το ίδιο ένζυμο καταλύει τόσο την προσθήκη του 5 ου σακχάρου (Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνη) στον τετρασακχαρίτη πρόσδεσης όσο και την προσθήκη Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνης κατά τη διάρκεια πολυμερισμού της θειικής χονδροϊτίνης. Ο σχηματισμός της θειικής χονδροιτίνης/θειικής δερματάνης και θειικής ηπαράνης/ηπαρίνη απαιτεί UDP-xyl, UDP-Gal, UDP- GlcNAc και UDP-GalNAc στο σύστημα Golgi και/ή στις κοιλότητες του ενδοπλασματικού δικτύου. Έχουν βρεθεί αρκετές τροποποιήσεις στην περιοχή πρόσδεσης: φωσφορυλίωση του C-2 της ξυλόζης, θείωση σε διάφορες θέσεις και πολυμερισμό του τελευταίου σακχάρου του τετρασακχαρίτη πρόσδεσης. Ο C-2 της ξυλόζης είναι μια βασική θέση φωσφορυλίωσης, τόσο στις πρωτεογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης (Oegma et al., 1984 Sugahara et al., 1992a,b,c) όσο και στις πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης (Fransson et al., 1985) σε συγκεκριμένους ιστούς. Ωστόσο, η ξυλόζη γενικά δε φωσφορυλιώνεται στις πρωτεογλυκάνες που προέρχονται από ιστούς που έχουν άφθονη εξωκυττάρια ύλη (Sugahara et al., 1995a,b Cheng et al., 1996). Η φωσφορυλίωση του C-2 στην ξυλόζη είναι κυρίαρχη μετά την προσθήκη των δύο καταλοίπων γαλακτόζης (Moses et al., 1999), ενώ η προσθήκη του πρώτου κατάλοιπου γλυκουρουνικού οξέος συνοδεύεται από ταχεία αποφωσφορυλίωση (Moses et al., 1997). Ο ρόλος της φωσφορυλίωσης του C-2 δεν είναι σαφής αν και είναι πιθανό να παρέχει ένα σήμα για εκκριτική μεταφορά των πρωτεογλυκανών ή για περαιτέρω τροποποιήσεις της αναπτυσσόμενης σακχαριδικής αλυσίδας (Moses et al., 1997, 1999). Η φωσφορυλίωση των συνδετικών καταλοίπων μπορεί να

22 Εισαγωγή συμβαίνει στο ενδοπλασματικό δίκτυο, στο σύστημα Golgi ή και στα δυο διαμερίσματα, αφού οι λειτουργικοί μεταφορείς του ΑΤΡ βρίσκονται και στα δυο μεμβρανικά συστήματα (Guillen και Hirshberg, 1995 Puglielli et al., 1999). H θείωση της περιοχής συνδέτη έχει παρατηρηθεί μόνο στις θειική χονδροϊτίνη/θειική δερματάνη και όχι στις θειική ηπαράνη/ηπαρίνη. Τόσο η θειική χονδροϊτίνη όσο και η θειική δερματάνη μπορούν να θειώνονται στον C-4 της δεύτερης γαλακτόζης (Sugahara et al., 1988) και στον C-4 ή C-6 της πρώτης Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνης μετά την περιοχή συνδέτη (Sugahara et al., 1991). Η τροποποίηση με τη θείωση μπορεί να επηρεάζει το βαθμό της σύνθεσης των θειικής χονδρϊτίνης/θειικής δερματάνης έναντι των θειικής ηπαράνης/ηπαρίνης. Η διάκριση μεταξύ μιας θέσης θειικής χονδροϊτίνης από μια θέση θειικής δερματάνης και μιας θέσης θειικής ηπαράνης από μια θέση ηπαρίνης έγκειται πιθανόν στη ρύθμιση των ενζύμων που ενέχονται στην επιμήκυνση των γλυκοζαμινογλυκανών στο σύμπλεγμα Golgi. Η ρύθμιση της σύνθεσης της θειικής ηπαράνης ενάντια στη σύνθεση της ηπαρίνης είναι μια πολύπλοκη διαδικασία και πιθανόν καθορίζεται από τις αναλογίες των διαφορετικών θειοτρανσφερασών (sulfotransferases) και επιμερασών (epimerases) (Aikawa και Esko, 1999). Οι θειική χονδροϊτίνη και θειική δερματάνη διαφέρουν μεταξύ τους στον κρίσιμο C5 επιμερισμό του γλυκουρονικού οξέος σε ιδουρονικό (Ido) στην θειική δερματάνη. Από τη στιγμή που θα σχηματιστεί το πρώτο ιδουρονικό, η C5 επιμεράση παράγει ακόμα περισσότερο (Malmstroem et al., 1993). Η πρώτη αντίδραση επιμερισμού μπορεί να αποτελεί τον εκκινιτή για τη σύνθεση της θειικής χονδροϊτίνης και θειικής ηπαράνης. Αν και η σύνθεση του τετρασακχαρίτη συνδέτη φαίνεται να αποτελεί ένα κοινό μονοπάτι για τη σύνθεση τόσο της θειικής ηπαράνη όσο και της θειικής χονδροϊτίνης αυτό δε συμβαίνει. Στην πραγματικότητα, όχι μόνο η επιμήκυνση και η τροποποίηση των αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης/θειικής δερματάνης και θειικής ηπαράνης/ηπαρίνης καταλύονται από διαφορετικές ομάδες ενζύμων, αλλά επιπρόσθετα αυτά τα γεγονότα συμβαίνουν και σε διαφορετικές υποπεριοχές (subdomains) του συστήματος Golgi

23 Εισαγωγή 3.2 ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΕΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΩΝ Η υπεροικογένεια των πρωτεογλυκανών περιέχει πάνω από τριάντα μόρια. Πρόκειται για πρωτεογλυκάνες της εξωκυττάριας ουσίας, της κυτταρικής επιφάνειας και ενδοκυτταρικές (Πίνακας 3) (Kolset και Salmivirta, 1999). Στις πρωτεογλυκάνες της εξωκυττάριας ουσίας, η πρώτη οικογένεια περιλαμβάνει τις υαλεκτίνες ή λεκτικάνες που ονομάζονται έτσι επειδή αλληλεπιδρούν με το υαλουρονικό οξύ. Οι aggrecan, versican, neurocan, και brevican είναι υαλεκτίνες και ο πρωτεϊνικός κορμός τους αποτελείται από την Ν- τελική σφαιρική περιοχή που άλληλεπιδρά με το υαλουρονικό οξύ, την C-τελική περιοχή που μοιάζει με λεκτίνη και την κεντρική περιοχή που φέρει θέσεις δέσμευσης αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης αν και αλυσίδες θειικής κερατάνης ή θειικής δερματάνης μπορεί να είναι επίσης παρούσες. Η παροχή ανθεκτικότητας στους ιστούς έναντι συμπιεστικής δύναμης θεωρούνταν ως μια κύρια λειτουργία των υαλεκτίνων. Η δεύτερη οικογένεια των πρωτεογλυκανών της εξωκυττάριας ουσίας είναι οι καλούμενες μικρές πρωτεογλυκάνες/γλυκοπρωτεϊνες οι πλούσιες σε λευκίνη (εξού και το ακρονύμιο SLRPs/small leucine rich proteoglycans) που φέρουν αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης και θειικής δερματάνης/κερατάνης. Μέλη τους είναι οι decorin, biglycan, fibromodulin και lumican. Σύμφωνα με την πιο παλιά βιβλιογραφία, τα μόρια αυτά θεωρούνταν οργανωτές των δικτύων κολλαγόνου. Πιο πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει και άλλους σημαντικούς ρόλους. για τις πρωτεΐνες αυτές. Για παράδειγμα, η decorin εμπλέκεται στη μεταγωγή σημάτων μέσω του EGF υποδοχέα και στην ενεργοποίηση του MAPK μονοπατιού κατά τη διαφοροποίηση επιθηλιακών και ενδοθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, ο TGF-β αλληλεπιδρά με τη decorin και με άλλα μέλη της οικογένειας αυτής, αλλά η λειτουργική σημασία αυτής της αλληλεπίδρασης παραμένει ασαφής μέχρι σήμερα (Hildebrand et al., 1994 Lamoureux et al., 2007). Η τρίτη οικογένεια πρωτεογλυκανών της εξωκυττάριας ουσίας είναι πρωτεογλυκάνες όπως οι perlecan και agrin που συμμετέχουν στη δόμηση της βασικής μεμβράνης (τροποποιημένη μορφή της εξωκυττάριας ουσία)

24 Εισαγωγή Στις πρωτεογλυκάνες της κυτταρικής επιφάνειας ανήκουν οι syndecans και glypicans. Οι syndecans είναι διαμεμβρανικά μόρια ενώ οι glypicans προσδένονται στην κυτταρική μεμβράνη μέσω ενός συνδέσμου γλυκοζυλοφωσφατιδυλοινοσιτόλης (glycosylphosphatidylinisotol). Οι πρωτεογλυκάνες αυτού του τύπου έχουν μελετηθεί εκτενώς και είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρούν με αυξητικούς παράγοντες και ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό κυττάρων (Bernfield et al., 1999 Lin και Perrimon, 2000 Rapraeger, 2000). Στις ενδοκυτταρικές πρωτεογλυκάνες ανήκει η serglycin. Χαρακτηριστικό γνώρισμα της serglycin είναι το επαναλαμβανόμενο μοτίβο των αμινοξέων σερίνης/γλυκίνης στην κεντρική περιοχή του μορίου, στην οποία συνδέονται οι γλυκοζαμινογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης/θειικής ηπαράνης. Η λειτουργία της serglycin δεν είναι ακόμα γνωστή αλλά είναι πιθανόν να συμμετέχει στη συσκευασία των πρωτεϊνών σε εκκριτικά κυστίδια ή/και στην κατευθυνόμενη έκκριση μορίων όπως οι κυτοκίνες (cytokines) και χυμάσες (chymases) (Schick et al., 2001). Στη βιβλιογραφία έχει αρχίσει και συζητείται μια ομάδα part-time ( μερικής απασχόλησης ) πρωτεογλυκανών που ανιχνεύονται στην κυτταρική επιφάνεια και στην εξωκυττάρια ουσία που δεν έχουν καταχωρηθεί σε οικογένειες, όπως οι phosphacan, neuroglycan, CD44 και διάφορες μορφές κολλαγόνου (ΙΧ, ΧΙΙ, XIV, και XVIII). Στα μόρια αυτά μπορούν να προσδεθούν γλυκοζαμινογλυκάνες ή όχι. Οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί που ευθύνονται για την εκλεκτική πρόσδεση των γλυκοζαμινογλυκανών στα μόρια αυτά και ο ρόλος τους παραμένουν αδιευκρίνιστοι. Στη συνέχεια, εστιάζουμε την προσοχή μας στις υαλεκτίνες και ειδικότερα στην neurocan και επίσης στην part-time πρωτεογλυκάνη phosphacan

25 Εισαγωγή Πίνακας 3 : Οικογένειες πρωτεογλυκανών Πρωτεογλυκάνες της εξωκυττάριας ουσίας Agrrecan family (υαλεκτίνες) Aggrecan, Versican, neurocan, brevican Small leucine rich proteoglycan family (μικρές πλούσιες σε λευκίνη) Biglycan, decorin, lumican, fibromodulin, collagen IX Πρωτεογλυκάνες της βασικής μεμβράνης Perlecan, agrin Πρωτεογλυκάνες της κυτταρικής επιφάνειας Integral membrane types Syndecan 1,2,3 and 4, betaglycan, CD44, CSF-1, thrombomodulin, NG-2 GPI-linked Ενδοκυτταρικές πρωτεογλυκάνες Serglycin 3.3 ΥΑΛΕΚΤΙΝΕΣ: Δομή του πρωτεϊνικού κορμού Οι περισσότερες πρωτεογλυκάνες που είναι συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας στον ώριμο εγκέφαλο, είναι οι υαλεκτίνες και φέρουν κυρίως πλευρικές αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης (Bandtlow και Zimmermann, 2000). Οι υαλεκτίνες είναι μόρια που εκκρίνονται και συμμετέχουν στο σχηματισμό της εξωκυττάριας ουσίας. Όμως, μια μορφή της brevican που είναι προϊόν εναλλακτικού ματίσματος προσδένεται στο GPI (GlycosylPhoshatidyl-Inositol) στην κυτταρική επιφάνεια (Seidenbecher et al., 1995). Στη βιβλιογραφία συζητείται ότι η neurocan και η brevican φαίνεται να περιορίζουν την έκφρασή τους μόνο στο νευρικό σύστημα ενώ οι aggrecan και versican ανιχνεύονται επίσης και στους συνδετικούς ιστούς (Grumet et al., 1996). Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των υαλεκτίνων είναι η παρουσία σφαιρικών περιοχών στο Ν-τελικό (G1 περιοχή) και C-τελικό (G3 περιοχή) άκρο του πρωτεϊνικού κορμού (Εικόνα 8), ενώ στην κεντρική περιοχή του πρωτεϊνικού κορμού προσδένονται οι πλευρικές αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης. Το Ν-τελικό άκρο προσδένει το υαλουρονικό οξύ. Το C-τελικό άκρο περιλαμβάνει μια περιοχή που μοιάζει με λεκτίνη (C-type lectin motif), δύο επαναληπτικά τμήματα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) και ένα CRP (complementary regulatory protein) τμήμα. Η περιοχή του μορίου που μοιάζει με λεκτίνη καθορίζει τη πρόσδεση με άλλες πρωτεΐνες της εξωκυττάριας

26 Εισαγωγή ουσίας, συνεισφέροντας έτσι στο σχηματισμό ενός δικτύου που συνεργεί στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Evanko et al., 1999 Olin et al., 2001). Επιπλέον, τα επαναλαμβανόμενα EGF τμήματα καθιστούν τις υαλεκτίνες υποψήφιες πρωτεογλυκάνες για την άμεση ανάμειξη τους στον έλεγχο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Δεν είναι γνωστό εάν οι EGF επαναλήψεις στον κορμό των υαλεκτίνων αλληλεπιδρούν άμεσα με μέλη της οικογένειας των ΕGF υποδοχέων που εκφράζονται στην επιφάνεια ενός κυττάρου που αποκρίνεται στον αυξητικό παράγοντα (Kresse και Schonherr, 2001). Οι περισσότερες έρευνες αναφορικά με τον πολλαπλασιασμό κυττάρων και το ρόλο των υαλεκτίνων επικεντρώνονται στη versican. Έχει παρατηρηθεί ότι η υπέρ-έκφραση της versican υποκινεί τη διαφοροποίηση των ινοβλαστών και των χονδροκυττάρων (chondrocyte) (Zhang et al., 1998, 1999) καθώς και τα κύτταρα που σηματοδοτούν τις διαδικασίες αύξησης των τριχών (dermal papilla) (Kishimoto et al., 1999). Ν-τελική σφαιρική περιοχή Η Ν-τελική σφαιρική περιοχή (G1 domain) των υαλεκτικανών αποτελείται από μια Ig-like θηλιά και δύο περιοχές τις ονομαζόμενες PTR (protein tandem repeats). Η aggrecan φέρει μια επιπλέον σφαιρική περιοχή, την G2, αποτελούμενη από δύο PTR περιοχές. Οι versican, neurocan και brevican δεν φέρουν τη G2 περιοχή. Μια κεντρική μη σφαιρική περιοχή συνδέει τις G1 και G2. Η Ig θηλιά έχει μόνο 40% ομοιότητα σε επίπεδο αμινοξέων ανάμεσα στα μέλη των υαλεκτινών ενώ οι PTR περιοχές είναι περισσότερο συντηρημένες (60%) και παρουσιάζουν 50% ομολογία με τις PTR περιοχές που βρίσκονται στις συνδετικές πρωτεΐνες στον χόνδρο. Η κεντρική περιοχή Η κεντρική περιοχή των υαλεκτίνων είναι διαφορετική σε μέγεθος και ακολουθία. H versican έχει τη μεγαλύτερη κεντρική περιοχή με περίπου 1700 αμινοξέα, ενώ η brevican τη μικρότερη με περίπου 300 αμινοξέα. Όλες οι θέσεις πρόσδεσης των γλυκοζαμινογλυκανών εντοπίζονται στην κεντρική περιοχή και ποικίλουν ανάμεσα στα μέλη της οικογένειας-στην aggrecan υπάρχουν

27 Εισαγωγή θέσεις πρόσδεσης, στην versican 20 θέσεις, στην neurocan 7 θέσεις, και στην brevican 3 θέσεις πρόσδεσης γλυκοζαμινογλυκανών. Στη περίπτωση της aggrecan και της versican έχουν αναγνωριστεί υποπεριοχές μέσα στην κεντρική περιοχή με την πρώτη να αποτελείται από ένα επαναλαμβανόμενο εξαπεπτίδιο, κοντά στην G2 περιοχή. Αυτή η υποπεριοχή παρέχει σημεία πρόσδεσης των αλυσίδων θειικής κερατάνης. Δίπλα από το σημείο αυτό βρίσκονται οι θέσεις πρόσδεσης των αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης (Antonsson et al., 1989 Doege et al., 1991). H κεντρική περιοχή της versican χωρίζεται σε δύο υποπεριοχές, οι οποίες φέρουν σημεία πρόσδεσης των αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης. Η C-τελική σφαιρική περιοχή Η C-τελική σφαιρική περιοχή (G3 domain) αποτελείται από μια ή δύο EGF επαναλήψεις, μια C-lectin περιοχή και ένα CRP (complementary regulatory protein) τμήμα. Οι EGF επαναλήψεις και η C-lectin περιοχή είναι καλά συντηρημένες ανάμεσα στις υαλεκτίνες (60% ομοιότητα). Αντίθετα το CRP τμήμα είναι λιγότερο συντηρημένο (40% ομοιότητα). Η versican και η neurocan έχουν δύο EGF επαναλήψεις ενώ η brevican μία (Yamaguchi, 2000). Σ όλες τις υαλεκτίνες, η lectin περιοχή προσδένει θειωμένα γλυκολιπίδια της κυτταρικής επιφάνειας. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις εξαρτώνται από δισθενή κατιόντα (Mura et al., 1999). Εικόνα 8 Διαγραμματική απεικόνιση της δομής των υαλεκτίνων. Όλα τα μέλη περιέχουν ένα Ν-τελικό άκρο (G1 περιοχή) και ένα C- τελικό άκρο (G3 περιοχή). Μόνο η aggrecan φέρει μια G2 περιοχή. Όλες οι υαλεκτίνες αποτελούνται από αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης (CS / κίτρινo χρώμα) στη κεντρική περιοχή. Η aggrecan περιέχει επίσης και αλυσίδες θειικής κερατάνης (KS / ροζ χρώμα) στο Ν-τελικό άκρο της κεντρική περιοχή. (Από Yamaguchi, 2000 με τροποποιήσεις)

28 Εισαγωγή Βιολογικές λειτουργίες των υαλεκτίνων Ένας σημαντικός ρόλος των υαλεκτίνων είναι η αλληλεπίδραση τους με το υαλουρονικό οξύ στο Ν-τελικό άκρο τους και με λιγότερα σύνθετα σάκχαρα στο C-τελικό άκρο τους. Η εισαγωγή γλυκοζαμινογλυκανών στην εξωκυττάρια ουσία μέσω των υαλεκτίνων είναι ένας ακόμη σημαντικός ρόλος της οικογένειας αυτής. Για παράδειγμα, κάθε μονομερές της aggrecan φέρει υψηλή συγκέντρωση αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης και σχηματίζει συσσωματώματα με το υαλουρονικό οξύ καταλαμβάνοντας ένα μεγάλο ποσοστό του όγκου του χόνδρου. Η δυνατότητα των υαλεκτίνων να δεσμεύουν ταυτόχρονα γλυκοπρωτεΐνες που περιέχουν λεκτίνη και υαλουρονικό οξύ, το όποιο στη συνέχεια συνδέεται στην επιφάνεια κυττάρων μέσω του CD44 που είναι υποδοχέας του υαλουρονικού οξέος προσδίδει στις πρωτεογλυκάνες ρόλο σταθεροποιητών των μοριακών συμπλεγμάτων στην κυτταρική μεμβράνη. Οι υαλεκτίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στη συναρμολόγηση ενός οργανωμένου στρώματος υαλουρονικού οξέος στον εγκέφαλο ενηλίκου ατόμου με το να προσδένουν το υαλουρονικό οξύ και την τενάση R μέσω των G1 και G3 περιοχών τους αντίστοιχα. Σχηματίζουν έτσι ένα σύμπλεγμα ( hyaluronanlectican-tenascin-r/hlt complex ) όπως φαίνεται στην Εικόνα 9Α (όλα τα τενάση R μόρια παρουσιάζονται ως τριμερή). Το στρώμα αυτό γίνεται πιο χαλαρό, όταν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υαλεκτίνων και των προσδεμάτων τους διαταράσσονται ή όταν η ποσότητα του υαλουρονικού οξέος αυξάνεται σε σχέση μ άυτή των υαλεκτίνων και της τενάση-r (Εικόνα 9Β) (Yamaguchi et al., 2000). Εικόνα 9 Το HLT (Hyaluronan-Lectican-Tenascin R complex) μοντέλο στην εξωκυττάρια ουσία του εγκεφάλου. Ο Yamaguchi (2000) προτείνει ότι οι υαλεκτίνες παίζουν κυρίαρχο ρόλο στη συναρμολόγηση ενός υψηλά οργανωμένου στρώματος υαλουρονικού στην εξωκυττάρια ουσία του εγκεφάλου στον ενήλικα οργανισμό

29 Εισαγωγή Μια ενδιαφέρουσα λειτουργία των πρωτεογλυκανών θειικής χονδροϊτίνης είναι η συμμετοχή τους στην προέκταση/καθοδήγηση των αξόνων νευρικών κυττάρων σε συγκεκριμένα μονοπάτια. Πειράματα έχουν δείξει ότι η απομάκρυνση της θειικής χονδροϊτίνης (με τη χρήση του ενζύμου χονδροϊτινάση ABC) επιτρέπει την προέκταση αξόνων εκοπικά (Brittis et al., 1992). Παραμένει άγνωστο πιο είναι το συνολικό αποτέλεσμα των μορίων αυτών στην επέκταση των νευριτών in vivo. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι υπάρχουν υαλεκτίνες όπως, για παράδειγμα, η brevican, που μπορεί να μην φέρουν γλυκοζαμινογλυκάνες. Η V3 ισομορφή της brevican δεν φέρει την κεντρική περιοχή η οποία προσδένει τις γλυκοζαμινογλυκάνες. Αυτές οι μορφές των μη υαλεκτινών μπορούν να δράσουν ως προαγωγικές ουσίες για την αύξηση/προέκταση των νευριτών. Αυτή η V3 ισομορφή της brevican ανιχνεύεται σε περιοχές όπως ο ιππόκαμπος, όπου οι δενδρίτες και οι άξονες προεκτείνονται (Yamada et al., 1994 Zako et al., 1995 Yamaguchi, 1996). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης δεν έχουν πάντα ανασταλτικά αποτελέσματα στην νευρική προεπέκταση. Για παράδειγμα, οι αλυσίδες της πρωτεογλυκάνης DSD-1 που πρόσφατα ονομάζεται phosphacan προάγουν την προεπέκταση των νευριτών (Fraissner et al., 1994 Garwood et al., 1999). Τα παραδείγματα αυτά δείχνουν ότι ο ρόλος πρωτεογλυκανών θειικής χονδροϊτίνης στην προέκταση νευριτών δεν οφείλεται μόνο στις αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης αλλά και ότι ο πρωτεϊνικός κορμός τους παίζει σημαντικό ρόλο. Η phosphacan, μια σημαντική πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης που εκφράζεται και στο νευρικό σύστημα και που δεν ανήκει στις υαλεκτίνες, προάγει την επέκταση των νευριτών μέσω των αλληλεπιδράσεων της καρβονυλικής άνυδρης περιοχής (carbonic anhydrase domain) της και της contactin, ένα μόριο προσκόλλησης της οικογένειας των ανοσοσφαιρινών που εκφράζεται στους νευρώνες (Sakurai et al., 1997 Peles et al., 1995). Οι υαλεκτίνες εμποδίζουν και προάγουν την προεπέκταση των αξόνων των νευριτών προς συγκεκριμένα μονοπάτια. Τα ανασταλτικά αποτελέσματα αποδίδονται στις αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης, ενώ τα προωθητικά αποτελέσματα στον πρωτεϊνικό κορμό. Δεν είναι ακόμα γνωστό ποιο είναι το συνολικό αποτέλεσμα των μορίων αυτών στην προεπέκταση των νευριτών in vivo. Υπάρχουν ενδείξεις για πρωτεολυτική διάσπαση των υαλεκτίνων in vivo. Συγκεκριμένα σημεία πρωτεολυτικής διάσπασης έχουν αναγνωριστεί στη

30 Εισαγωγή περιοχή πρόσδεσης των γλυκοζαμινογλυκανών στον πρωτεϊνικό κορμό τόσο στη neurocan (Rauch et al., 1991 Rauch et al., 1992 Meyer-Puttlitz et al., 1995 Matsui et al., 1998) όσο και στην brevican (Yamada et al., 1994 Yamada et al., 1995) καθώς και στις σφαιρικές περιοχές G1-G2 της aggrecan (Sandy et al., 1991 Sandy et al., 1992). Το πρωτεολυτικό διασπασμένο Ν-τελικό κομμάτι (60-kDa) της versican είναι γνωστό ως GHBP (glia hyaluronate binding protein) (Perides et al., 1989). Σε έμβρυο αρουραίου η neurocan εμφανίζεται με 250 kda πρωτεϊνικό κορμό έπειτα από απομάκρυνση των αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης. Την 7 η ημέρα μεταγεννητικά εμφανίζονται δύο μορφές του μορίου με μοριακή μάζα 150 kda και 250 kda. Η 150 kda μορφή είναι μέρος της C- τελικής περιοχής του μορίου αποτέλεσμα πρωτεολυτικής διάσπασης (Rauch et al., 1991 Rauch et al., 1992 Meyer-Puttlitz et al., 1995 Matsui et al., 1998). Η αλληλουχία αμινοξέων στο σημείο της διάσπασης δεν παρουσιάζει ομολογία μεταξύ της versican και της neurocan. Αντίθετα με τα δύο παραπάνω μόρια, η aggrecan και η brevican υφίσταται πρωτεολυτική διάσπαση σε ίδια σημεία. Η aggrecan φαίνεται να διασπάται από πολλές μεταλοπρωτεάσες (ΜΜΡ 1,2,3,και 8) στη περιοχή μεταξύ της G1 και της G2 περιοχής σε πειράματα in vitro (Hardingham και Fosang, 1995). Οι πρωτεάσες που ευθύνονται για τη πρωτεολυτική διάσπαση της brevican είναι οι γλουταμινο-ενδοπεπτιδάσες (glutamyl-endopeptidase) και οι ADAMTS (adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs). Αποτέλεσμα αυτής της διάσπασης είναι η δημιουργία ισομορφών της brevican όπως για παράδειγμα μια μορφή με πρωτεϊνικό κορμό 145 kda που φέρει 1-3 αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης, μια μορφή 120 kda που συνδέεται με τη κυτταρική μεμβράνη μέσω GPi (glycosylphosphatidylinositol-linked) άγκυρας, μια μορφή με ένα Ν-τελικό τμήμα 55 kda και τέλος μια άλλη μορφή 80 kda (Ajmo et al., 2008). Τα πρωτεολυτικά κομμάτια της aggrecan έχουν ανιχνευτεί στο αρθρικό υγρό ασθενών με οστεοαρθρίτιδα και πιστεύεται ότι η αποικοδόμηση του πρωτεϊνικού κορμού της εμπλέκεται στη παθογένεση της οστεοαρθρίτιδας (Sandy et al., 1991, 1992). Στον Πίνακα 4 που ακολουθεί αναγράφονται τα μέλη των υαλεκτίνων και ορισμένες χαρακτηριστικές ιδιότητες τους

31 Εισαγωγή Πίνακας 4 Μερικά χαρακτηριστικά των υαλεκτίνων, πρωτεογλυκανών που αλληλεπιδρούν με υαλουρονικό οξύ και λεκτίνες. Πρωτεογλυκάνη Γονίδιο Θέση στο Χρωμόσωμα Πρωτεϊνικός κορμός Γλυκοζαμινογλυκάνη (αριθμός) Άνθρωπος Ποντικός (kda) Versican CSPG2 5q Θειική χονδροϊτίνη / δερματάνη (10-30) Aggrecan AGC1 15q Θειική χονδροϊτίνη ( 100) Neurocan NCAN 19p Θειική χονδροϊτίνη (3-7) Brevican BCAN 1q25-q Θειική χονδροϊτίνη (1-3) 3.4 NEUROCAN Ολόκληρο το μόριο της neurocan εμφανίζεται ως δύο σφαιρικές περιοχές που χωρίζονται με μια κεντρική γραμμική περιοχή (Retzler et al., 1996b) (Εικόνα 10). Η κεντρική περιοχή καλύπτει 600 αμινοξέα και περιέχει τους πολυάριθμους Ο-συνδεμένους και Ν-συνδεδεμένους ολιγοσακχαρίτες (Rauch et al., 1991 Rauch et al., 1992) δίνοντας στο μόριο το βλεννώδη χαρακτήρα του. Οι δυο σφαιρικές περιοχές της neurocan είναι καλά συντηρημένες και παρουσιάζουν 90% ομολογία σε επίπεδο αμινοξέων ανάμεσα στον αρουραίο, το ποντικό και τον άνθρωπο και περίπου 70% ομολογία με την neurocan στην όρνιθα (Pragne et al., 1998). Όμως, η αλληλουχία των αμινοξέων στην κεντρική γραμμική περιοχή του μορίου παρουσιάζει λιγότερο από 50% ομολογία ανάμεσα στα θηλαστικά. Με εξαίρεση το συνολικό μήκος, τη σύσταση των αμινοξέων και τον αριθμό των πιθανών σημείων πρόσδεσης των γλυκοζαμινογλυκανών, μικρή ομοιότητα παρατηρείται στην κεντρική περιοχή του μορίου στην όρνιθα. Συγκριτικά καλά συντηρημένη, είναι η C-τελική περιοχή των αμινοξέων με περισσότερο από 50% ομολογία στην όρνιθα (Rauch et al., 2001)

32 Εισαγωγή Η Ν-τελική περιοχή της neurocan Η Ν-τελική περιοχή της neurocan και χωρίς εξαίρεση σε όλες τις ισομορφές των υαλεκτίνων αποτελείται από μια περιοχή-όμοια ανοσοσφαιρινών (Ig) και δύο περιοχές πρόσδεσης (link modules) του υαλουρονικού οξέος (Εικόνα 10). Αυτή η πρόσδεση στο υαλουρονικό οξύ σταθεροποιείται με μια πρωτεΐνη (45 kda) που καλείται συνδετική πρωτεΐνη (link protein). Οι Ig περιοχές είναι διαδεδομένα δομικά συστατικά στα μόρια της εξωκυττάριας ουσίας, ενώ τα link modules έχουν παρατηρηθεί συνήθως στα μόρια που προσδένουν το υαλουρονικό οξύ. Μελέτες (ηλεκτρογραφήματα) έδειξαν γραμμική τοποθέτηση των τριών περιοχών (Perkins et al., 1991), με τα C και N άκρα των link modules να βρίσκονται δίπλα-δίπλα, δείχνοντας στην ίδια κατεύθυνση (Kohda et al., 1996). Η κεντρική περιοχή της neurocan Τα περίπου 600 αμινοξέα της κεντρικής περιοχής της neurocan χαρακτηρίζονται από υψηλή περιεκτικότητα σε σερίνη, θρεονίνη, προλίνη, και έλλειψη κυστεΐνης, με εξαίρεση το υπόλειμμα της κυστεϊνης στη neurocan στην όρνιθα. Σε αυτή την κεντρική περιοχή του μορίου έχουν αναγνωριστεί τρεις θέσεις πρόσδεσης αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης, μεγέθους 22 kda η καθεμιά, που θειώνονται κυρίως στην 4-θέση των υπολειμμάτων Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνης (GalNAc) (Εικόνα 10). Στο γονιδίωμα ποντικών, η κεντρική περιοχή της neurocan κωδικοποιείται από δύο εξόνια, 597 και 1209 νουκλεοτιδίων (Rauch et al., 1995). Σύγκριση της αλληλουχίας των αμινοξέων που κωδικοποιούνται από τα παραπάνω εξόνια στα τρωκτικά με αυτή στον άνθρωπο, φανερώνει 57% ομολογία στην αλληλουχία που κωδικοποιείται από το πρώτο εξόνιο (είναι πιο συντηρημένη) και 29% ομολογία από το δεύτερο εξόνιο (Pragne et al., 1998). Η παρουσία περιοχών σύνδεσης γλυκοζαμινογλυκανών στις θέσεις κοντά στις σφαιρικές περιοχές είναι χαρακτηριστικό της neurocan και φαίνεται να ελέγχει τις αλληλεπιδράσεις της C-τελικής περιοχής (Feng et al., 2000) αλλά όχι της Ν- τελικής περιοχής του μορίου (Li et al., 2000)