Μικροβιολογία Τροφίμων II. Δρ. Ιωάννης Γιαβάσης Μικροβιολόγος-Βιοτεχνολόγος Τροφίμων Eπίκουρος Καθηγητής ΤΕΙ Θεσσαλίας Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων

Transcript

1 II Δρ. Ιωάννης Γιαβάσης Μικροβιολόγος-Βιοτεχνολόγος Τροφίμων Eπίκουρος Καθηγητής ΤΕΙ Θεσσαλίας Τμήμα Τεχνολογίας Τροφίμων 1

2 Περίγραμμα ύλης της Μικροβιολογίας Τροφίμων ΙΙ Επίδραση των επεξεργασιών συντήρησης τροφίμων στη μικροχλωρίδα και την μικροβιολογική ποιότητα και ασφάλεια τροφίμων Βιοπροστασία (χρήση προστατευτικών μικροοργανισμών) Τεχνολογικά ωφέλιμοι Μικροοργανισμοί Προβιοτικοί-βιοδραστικοί μικροοργανισμοί Εκτίμηση Διάρκεια Ζωής και Μικροβιολογικής Τροφίμων Κινητική Μικροβιακής ανάπτυξης και Ποσοτική Μικροβιολογία 2

3 Περίγραμμα ύλης της Μικροβιολογίας Τροφίμων ΙΙ Επίδραση των επεξεργασιών συντήρησης τροφίμων στη μικροχλωρίδα και την μικροβιολογική ποιότητα και ασφάλεια τροφίμων Τεχνολογικά ωφέλιμοι Μικροοργανισμοί Προβιοτικοί-βιοδραστικοί μικροοργανισμοί Εκτίμηση Διάρκεια Ζωής και Μικροβιολογικής Τροφίμων Κινητική Μικροβιακής ανάπτυξης και Ποσοτική Μικροβιολογία 3

4 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΣΥΝΤΗΡΗΤΙΚΑ Χημικά συντηρητικά : Αναστολή ανάπτυξης μ/ο (βακτηριοστατικά, μυκοστατικά) ή Καταστροφή μ/ο (βακτηριοκτόνα, μυκητοκτόνα, ιοκτόνα, σποριοκτόνα) Μηχανισμός δράσης Προσβολή του γενετικού συστήματος των μ/ο (αναστολή σύνθεσης πρωτεϊνών, RNA,DNA) Προσβολή (διαπερατότητα) κυτταρικής μεμβράνης Αναστολή δράσης ενζύμων (π.χ. λόγω μεταβολής ph ή οξειδώσεων) Αποτελεσματικότητα δράσης εξαρτάται από Συγκέντρωση και διαλυτότητα συντηρητικού Είδος μ/ο (πιο ανθεκτικά τα σπόρια βακτηρίων, μυκήτων) Πληθυσμό μ/ο Φάση ανάπτυξης μ/ο (ευαίσθητη στη φάση λογαριθμικής ανάπτυξης, ανθεκτικοί στη φάση στασιμότητας) Το ph και η φυσική κατάσταση του τροφίμου ( ph => δράση, υγρασίας => δράση) Θερμοκρασία τροφίμου και χρόνος δράσης) 4

5 Ανεπιθύμητες δράσεις Μειωμένη διαλυτότητα στα τρόφιμα Επικίνδυνα για την υγεία Υποβαθμίζουν χρώμα/άρωμα/γεύση Προσοχή: πρέπει να χρησιμοποιούνται μόνο όταν οι υπόλοιποι μέθοδοι συντήρησης δεν επαρκούν! 5

6 Αντιμικροβιακό φάσμα οργανικών οξέων Συντηρητικό Συγκέντρωση % του αδιάστατου οξέος που απαιτείται Κύρια χρήση ΖΥΜΕΣ ΜΥΚΗΤΕΣ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤ. ΒΑΚΙΛΛΟΙ Οξικό Ζύμες βακτήρια σε σάλτες-τουρσί Βενζοϊκό Ζύμες-μύκητες Κιτρικό Δράση, οξίνιση Εστέρες υδροξυβενζοϊκού Ευρύ φάσμα σε ουδετ. Τρόφιμα Προπιονικό Μύκητες σε ψωμίάλευρα Σορβικό Ευρύ φάσμα δράσης αναστολή τοξίνης Cl. botulinum Φωσφορικό Γαλακτικό Μέσο οξίνισης Μέσο οξίνισης 6

7 ΝΙΤΡΙΚΑ ΚΑΙ ΝΙΤΡΩΔΗ ΑΛΑΤΑ Μικροβιολογία Τροφίμων Δραστική αναστολή μ/ο (βλαστικών μορφών) και σπορίων σε θερμαινόμενα ή μη τρόφιμα Αναστολή ανάπτυξης και παραγωγής τοξίνης από Cl. botulinum Ανθεκτικά τα γαλακτικά βακτήρια και οι σταφυλόκοκκοι Συνδυασμός με : NaCl, ασκορβικό, ph => αύξηση δραστικότητας Αναγωγή νιτρικών vιτρώδη από Micrococcus, ζύμες : (NO 3- ) (NO 2- ) Μέγιστη συγκέντρωση σε τρόφιμα : NO 2-200ppm, NO 3-500ppm Πρόβλημα : σχηματισμός νιτροζαμινών (καρκινογόνες) με τη θέρμανση 7

8 ΣΟΥΛΦΙΔΙΑ SO 2, SO 3, HSO 3-, κτλ Αναστολή μυκήτων (κυρίως), ζυμών και βακτηρίων σε κρασί, αναψυκτικά, χυμούς, φρούτα, λαχανικά Maximum 350 ppm SO 2 σε κρασιά (ΗΠΑ) Σταθεροποίηση χρώματος Όχι σε κονσερβοποιημένα τρόφιμα (παραγωγή H 2 S => μαύρο χρώμα-ίζημα) Προσοχή στη χρήση : διαβρωτικά-ερεθιστικά 8

9 ΕΠΟΞΕΙΔΙΑ (Αιθυλενοξειδιο, Προπυλειοξείδιο) Ευρεία αντιμικροβιακή δράση Κατάλληλα για προϊόντα ευαίσθητα σε θέρμανση για ξηρά τρόφιμα και υλικά συσκευασίας Αέρια μορφή διεισδυτικότητα τοξικότητα και είναι εύφλεκτα Απαραίτητος ο αερισμός (εξάτμιση πριν την κατανάλωση των τροφίμων) ΟΖΟΝ (Ο 3 ) Μόνο επιφανειακή δράση αποστειρ. αέρα (διαλύεται στο H 2 O) αποστειρ. φιαλών αποστειρ. νερού Έντονα οξειδωτικό τάγγισμα, οξίνιση αδράνεια ενζύμων Αυξημένη δραστικότητα σε ph, T o C, RH ή %H 2 O ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΊΟ ΤΟΥ ΥΔΡΟΓΟΝΟΥ (Η202) Ευρεία αντιμικροβιακή δράση Σε υγρό διάλυμα 3-10%, σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις είναι ερεθιστικό και όξινο Για αποστείρωση φιαλών, εργαλείων, επιφανειών 9

10 ANTIBIOTIKA Μικροβιολογία Τροφίμων Ναταμυκίνη : (από το Streptomyces natalensis) μυκοστατική δράση (τυριά, αλλαντικά) διαλυτότητα σε νερό ΒΑΚΤΗΡΙΟΣΙΝΕΣ Νισίνη : από Lactococcus lactis δρα ενάντια σε Gram + κυρίως (όχι ζυμομύκητες) ανθεκτική σε θέρμανση κατάλληλος συνδυασμός χρήση σε κονσέρβες λαχανικών (ph > 4.6) και μαλακά τυριά, μπύρα και κρασιά Κουρβασίνη (curvacin): από Lactobacillus curvatus Δράση ενάντια σε Listeria monocytogenes και άλλα Gram+ παθογόνα (π.χ. Clostridium) και αλλοιογόνα (π.χ. Brochothrix) Πεδιοσίνες (pediocin): Από Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus Δράση ενάντια σε Listeria monocytogenes και άλλα Gram+ παθογόνα (π.χ. Clostridium) και αλλοιογόνα (π.χ. Brochothrix) 10

11 ΦΥΣΙΚΕΣ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Φαινολικές ουσίες, φλαβονοειδή (σε πικρά-στυφά φυτικά προϊόντα-ελιές, στέμφυλα, καφέ, φλοιός φρούτων-λαχανικών) Αιθέρια έλαια Λοιπά φυτικά εκχυλίσματα Ένζυμα (λυζοζύμη, υπεροξειδάση, λακτοφερρίνη, κλπ) Μέτρια δράση, κατάλληλα για συνδυαστική δράση με άλλες ήπιες αντιμικροβιακές ουσίες (hurdle technology) 11

12 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΟΥ ΣΥΝΤΗΡΟΥΝΤΑΙ ΜΕ ΨΥΞΗ/ΚΑΤΑΨΥΞΗ Ψύξη => επιβράδυνση μεταβολισμού => παράταση συντήρησης μέσω της μείωσης ρυθμού ανάπτυξης μ/ο και δράσης ενζύμων Κατάψυξη => αδρανοποίηση μικροοργανισμών (όχι ενζύμων), τραυματισμός κυττάρων, μεταβολή υφής τροφίμων Ψυχρόφιλοι μ/ο : ανάπτυξη σε (-2) έως 20 ο C (εξαιρέσεις : βακτ. -20 ο C, 12 o C, μυκητ. -12 ο C, ζύμες -18 ο C,-34 o C Ψυχρότροφοι μ/ο : ανάπτυξη 0-7 ο C Ψυχρότροφα Gram - Ψυχρότροφα Gram + Pseudomonas Brochothrix Ψυχροτροφοι μύκητες (μούχλες) Ψυχρότροφες Ζύμες Shewanalla Vibrio Acinetobacter Carnobacterium Enterococcus Bacillus Penicillium Mucor Cladosporium Debaryomyces Candida Rhodotorula Aeromonas Alteromonas Enterobacter Erwinia Flavobacterium Clostridium Lactococcus Lactobacillus Listeria Micrococcus Botrytis Geotrichum Moraxella Psychrobacter Serratia Vagococcus 12

13 Παράγοντες που επηρεάζουν την ελάχιστη θερμοκρασία ανάπτυξης Διαθέσιμα θρεπτικά συστατικά (έλλειψη θρεπτικών ουσιών αυξάνει την ελάχιστη θερμοκρασία ανάπτυξης) aw: μείωση aw αυξάνει την ελάχιστη θερμοκρασία ανάπτυξης). Εξαίρεση : αλόφιλοι μ/ο) ph: μείωση ph αυξάνει την ελάχιστη θερμοκρασία ανάπτυξης Φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων (ανάλογα με το αν είναι σε φάση ανάπτυξης ή στασιμότητας, τραυματισμένα ή όχι, αν υπάρχει συνδυασμός με θέρμανση/ακτινοβολία) ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΨΥΞΗΣ ΣΕ Μ/Ο επιβράδυνση ή και αναστολή μεταβολισμού, άρα επιμήκυνση περιόδου προσαρμογής (τείνει στο ) Υπό συνθήκες ψύξης : μεγαλύτερη αναλογία ψυχρότροφων μ/ο στις ψυχρές χώρες (αλλά και χαμηλότερη ΟΜΧ) 13

14 Ανάπτυξη αερόβιων βακτηρίων (ΟΜΧ) σε βοδινό κρέας υπό διαφορετικές θερμοκρασίες απόψυξης Επίδραση θερμοκρασίας στη συντήρηση λαχανικών Επίδραση θερμοκρασίας στο ρυθμό ανάπτυξης μεσόφιλων μικροοργανισμών 14

15 Ελάχιστες βέλτιστες και μέγιστες θερμοκρασίες ανάπτυξης παθογόνων βακτηρίων 15

16 Μεταβολή του χρόνου γενεάς ανάλογα με τη θερμοκρασία ανάπτυξης Μικροοργανικοί δείκτες σε τρόφιμα υπό ψύξη E. Coli 8 έως 10 Klebsiella sp., Enterobacter sp. 0 Enterococcus faecalis 0 16

17 Επίδραση κατάψυξης ανάπτυξη μικροβίων Πάγωμα νερού, διόγκωση κυττάρων και έντονος τραυματισμός κυττάρων (κάποια κύτταρα πεθαίνουν) Σταματάει εντελώς ο μεταβολισμός σε θερμοκρασίες <-5 C Μειώνεται σημαντικά η ενεργότητα νερού (οσμωτικό σοκ) Ψυχρότροφα παθογόνα που αναπτύσσονται στους -2 έως 0 C: Yersinia enterocolytica, Listeria monocytogenes 17

18 Συντήρηση τροφίμων υπό κατάψυξη (-20 C): δεν υπάρχει μικροβιολογική αλλοίωση, παρά μόνο ενζυμική (λιπόλυση, πρωτεόλυση, οξείδωση χρώματος) Βαθειά κατάψυξη (-40 έως -80 C): δεν υπάρχει ενζυμική δράση, ούτε αλλοίωση του DNA (καλύτερη μέθοδος για συντήρηση μικροοργανισμών) Ρυθμός κατάψυξης: πολύ αργός ρυθμός (<1 /min) τραυματίζει/θανατώνει περισσότερα κύτταρα (δημιουργία μεγάλων παγοκρυστάλλων εξωκυτταρικά και μεγάλος χρόνος έκθεσης σε υψηλή οσμωτική πίεση) απ ότι ο ταχύς ρυθμός κατάψυξης (5-10 /min) Κρυοπροστατευτικές ουσίες που βοηθούν την επιβίωση μικροοργανισμών στην κατάψυξη: - γλυκερόλη, - γλουταμινικό νάτριο - σακχαρόζη, σορβιτόλη, δεξτράνες 18

19 Διάρκεια συντήρησης τροφίμων υπό κατάψυξη 19

20 Συντήρηση τροφίμων με θερμικές επεξεργασίες Α. Παστερίωση: σκοτώνει τα μη σπορογόνα παθογόνα βακτήρια, και τα ψυχρόφιλα, ψυχρότροφα και τα περισσότερα μεσόφιλα βακτήρια, καθώς και ζύμες, μύκητες, ιούς παράσιτα. Προσοχή: δεν σκοτώνει θερμόφιλα (π.χ. Streptococcus thermophillus) και σπορογόνα (Bacillus, Clostridium) - Χαμηλή παστερίωση: 65x20 (βραδεία) ή 72 C x 15 (ταχεία) για γάλα ή C x 2 (για αλλαντικά), - Υψηλή παστερίωση: C x 1-15 (UHT γάλα) Β. Αποστείρωση (121 C x 15 ) ή ισοδύναμη μείωση κατά 12D στα σπόρια του C. botulinum Γ. Blanching (ζεμάτισμα): C για λίγα λεπτά (αδρανοποίηση ενζύμων σε μαλακά/φυλλώδη λαχανικα πριν την κατάψυξη) 20

21 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΡΜΙΚΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Θέρμανση κυττάρων μ/ο αποικοδόμηση πρωτεϊνών, DNA, RNA και αδρανοποίηση ενζύμων θάνατος μ Καμπύλες καταστροφής μ/ών: D values, Z values Tιμή D: χρόνος θερμικής επεξεργασία που χρειάζεται για να πετύχουμε μείωση κατά 1log (υποδεκαπλασιασμός) στον πληθυσμό μ/ών σε μια συγκεκριμένη θ o C. Υψηλό D υψηλή θερμοαντοχή Tιμή Ζ: η θερμοκρασιακή διαφορά (αύξηση/μείωση θερμοκρασίας) που χρειάζεται για να αλλάξει κατά 10 φορές (να μειωθεί ή να αυξηθεί αντίστοιχα) η τιμή D. Υψηλό Ζ χαμηλή θερμοαντοχή 21

22 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΡΜΙΚΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ D values, Z values, F values Τιμή F: ο χρόνος που χρειάζεται ώστε να μειωθεί ο αρχικός πληθυσμός μικροβίων κατά ένα ποσό σε μια συγκεκριμένη θερμοκρασία και εξαρτάται από την ρυθμό θανάτωσης (Lethal rate vs processing time) Ρυθμός θανάτωσης (lethal rate) = Lethal rate = 10 (T-Tr)/z Yπολογισμός F values: 22

23 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΡΜΙΚΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Παράγοντες που επηρεάζουν την θερμοανθεκτικότητα μ/ο Χρόνος και θερμοκρασία θέρμανσης Αριθμός μ/ο, συσσωματώματα (υψηλός αριθμος ή συσσωμάτωμα μεγαλύτερη θερμοανθεκτικότητα Είδος μ/ο (ψυχρόφιλα < ψυχρότροφα < μεσόφιλα < θερμόφιλα < σπόρια) ζύμες μύκητες ιοί ο C x o C x o C Μορφολογία (κόκκοι-ραβδιά) Φάση ανάπτυξης (ευαίσθητα κατά τη φάση log phase) ph (εφαρμογή σε όξινα τρόφιμα που απιτούν χαμηλότερη θέρμανση), ( οργανικά οξέα πιο αποτελεσματικά) aw ( χαμηλή aw υψηλή επιβίωση) Σύνθεση προϊόντος: σάκχαρα, λίπη, πρωτεΐνες αυξάνουν την θερμοαντοχή Προσθήκη συντηρητικών (νιτρωδών) και νισίνης προκαλούν αναστολή σπορίων Πάχος και σχήμα τροφίμου και είδος θέρμανσης Υλικό συσκευασίας Ρόλος ασβεστίου στα σπόρια (αυξάνει θερμοαντοχή) Θερμοκρασία επώασης τροφίμων 23

24 D-τιμές διαφόρων μικροοργανισμών (Banwart, 1981) Μικροοργανισμός Υπόστρωμα Θερμοκρασία ( ο C) D-τιμή (min) Βλαστικά κύτταρα Salmomnella senftenberg 775W Κρέμα κοτόπουλο με σάλτσα Salmonella manhattan Κρέμα κοτόπουλο με σάλτσα Staphylococcus aureus Κρέμα κοτόπουλο με σάλτσα Escherichia coli Νωπό γάλα Μίγμα παγωτού Σπόρια Aspergillus flavus Clostridium botulinum τύπος Α τύπος Β τύπος Ε Bacillus stearothermophilus Φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα ph 7.0 Φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα ph 7.0 Χυμός τομάτας ph 4.2 φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα ph 7.0 Νερό 4% NaCl ρυθμιστικό διάλυμα ph 7.0 ρυθμιστικό διάλυμα ph

25 ΚΟΝΣΕΡΒΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΤΡΟΦΙΜΑ Εμπορική αποστείρωση (πλήρης αποστείρωση): Καταστροφή παθογόνων και θερμόφιλων, Καταστροφή σπορίων Για αναστολή ανάπτυξης κατά την συντήρηση: χαμηλό ph, θ ο C, υγρασία, αποφυγή διαρροών, πλύσιμο φρούτων-λαχανικών πριν την κονσερβοποίηση Α) Χαμηλής οξύτητας κονσερβοποιημένα τρόφιμα (ph>4.6) Επεξεργασία 12-D για Cl. botulinum (εξαίρεση προϊόντα με συντηρητικά ή με χαμηλή aw) Αλλοιώσεις: σπόρια, Bacillus, Clostridium, μη σπορογόνα Β) Όξινα κονσερβοποιημένα τρόφιμα (ph<4,6) ο C για Καταστροφή ζυμών-μυκήτων, αναστολή σπορίων και θερμόφιλων μ/ο (λόγω όξινου ph) Αλλοιώσεις: σπόρια, Bacillus, Clostridium, ζύμες-μύκητες Αερόβια σπορογόνα βακτήρια Bacillus stearothermophilus επίπεδη οξίνιση B. coagulans, B. circulans επίπεδη οξίνιση B. cereus, B. subtilis δυσάρεστες οσμές (πρωτεόλυση) + αποχρωματισμός + μαλακή υφή (πρωτεόλυση) B. polymyxa, B. macerans αέριο διόγκωση Αναερόβια σπορογόνα Cl. Thermosaccharolyticum (σακχαρόλυση), Cl. butyricum, Cl. perfingens CO 2 (διόγκωση), H 2, βουτυρικό Cl. sporogenes, Cl. bifermentans, Cl. pasterianum, Cl. botulinum πρωτεολυτικά [H 2 S (διόγκωση), NH 3,ινδόλιο] Desulfotomaculum nigrificans (θερμοευαίσθητο) σακχαρόλυση, πρωτεόλυση διόγκωση Μη σπορογόνα θερμοάντοχα: (Enterococcus οξίνιση, Micrococcus, Enterobacteriacae αέριο) ( Ζύμες-μύκητες: οξίνιση-διόγκωση:turulopsis Aspergillus) Θερμοανθεκτικά ένζυμα από : Byssochamys (πηκτινολυτικά), Rhizopus, Mucor 25

26 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΟΝΣΕΡΒΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Στάδια κονσερβοποίησης 26

27 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΟΝΣΕΡΒΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Αλλοιώσεις κονσερβοποιημένων τροφίμων 27

28 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΗΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ D-τιμές στην ακτινοβολία ιονισμού ορισμένων μικροοργανισμών Μικροοργανισμός D-τιμή (kgy) Βακτήρια Σπόρια Clostridium botulinum τύπου Α 2.79 Clostridium botulinum τύπου B 2.38 Clostridium botulinum τύπου E Clostridium butyricum 1.5 Clostridium perfingens τύπου A 1.2 Clostridium sporogenes 2.2 Βλαστικά κύτταρα Clostridium botulinum τύπου E 0,8 Escherichia coli 0,2 Listeria monocytogenes 0,42-0,55 Pseudomonas aeruginosa 0,13 Salmonella typhimurium 0,5 Staphylococcus aureus 0,16 Yersinia enterocolitica 0,19 Τοξίνες Clostridium botulinum τύπου Α Staphylococcus aureus εντεροτοξίνη Α Μύκητες Aspergillus flavus 0.66 Penicillium citrinum 0.88 Ζύμες Saccharomyces cerevisiae 0,36 Ιοί Ιός Coxsackie 4,1-5,0 Αδενοϊός 4,1-4,9 28

29 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΗΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Α. ΜΙΚΡΟΚΥΜΑΤΑ Μηχανισμός δράσης: θερμική μετουσίωση πρωτεϊνών, νουκλεοτιδίων, μέσω της θέρμανσης μορίων νερού Προβλήματα ανομοιογενούς δράσης (ανάλογα με συγκέντρωση σε υγρασία, λίπος, αλάτι, σχήμα) Ευαίσθητα: ζύμες-μύκητες Ανθεκτικά: βακτήρια (ιδίως τα σπόρια) Εφαρμογές: τσιπς, ψωμί, μπύρα Μειονέκτημα: προκαλούν θέρμανση των τροφίμων Β. ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ ΙΟΝΙΣΜΟΥ [ ακτίνες -γ, -Χ, -β (e - ) ] Ακτίνες γ (ραδιενεργά ισότοπα Co, Cs): υψηλή διείσδυση, κίνδυνος ραδιενέργιες για χειριστές μηχανημάτων, ανάγκη αντικατάστασης Ακτίνες ηλεκτρονίων: χαμηλή διείσδυση, υχηλή ασφάλεια Για ψυχρή παστερίωση:1-10 kgy Για ψυχρή αποστείρωση: kgy Ευαίσθητα: βλαστικά κύτταρα βακτηριών, ζυμών, μυκήτων Ανθεκτικά: σπόρια, τοξίνες, ιοί (υψηλή τιμή D) Μειωμένο Ο 2 και Η 2 Ο αύξηση ανθεκτικότητας μ/ο 29

30 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΗΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ ΙΟΝΙΣΜΟΥ [ ακτίνες -γ, -Χ, -β (e - ) ] Low doses, < 1 kgy Control insects in grains and fruits Inhibit sprouting in tubers Delay the ripening of some fruits/vegetables Reduce the problems of parasites in products of animal origin, (e.g., trichinella spiralis in pork) Medium doses, (1-10 kgy) Control Salmonella, Shigella, Campylobacter, Yersinia, Listeria and E. coli in meat, poultry, and fish Delay mold growth on strawberries and other fruits High doses, (> than 10 kgy) Kill microorganisms and insects in spices Commercially sterilize foods, destroying all microorganisms of public health concern (i.e., special diets for people with weakened immune systems) 30

31 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΗΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ 31

32 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ/ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΗΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ 32

33 ΔΟΣΕΙΣ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑΣ ΓΙΑ ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΗΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ 33

34 ΜΗΧΑΝΗΜΑΤΑ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑΣ ΓΙΑ ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΗΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ 34

35 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΗΣΗΣ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ 35

36 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΦΥΔΑΤΩΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Μέθοδοι αφυδάτωσης: - σε δίσκους ή τύμπανα (εναλλάκτες) με εξάτμιση (evaporation) - με εκνέφωση (spay-drying) - με λυοφιλίωση (freeze-drying) Αφυδατωμένα τρόφιμα: υγρασία 25%, aw 0.6 Συμπυκνωμένα τρόφιμα (μέσης περιεκτικότητας σε νερό): υγρασία 50%, aw 0.85 Πριν την αφυδάτωση: - επιλογή α ύλης καλής ποιότητας, μείωση ΟΜΧ με: - blanching (ζεμάτισμα για αδρανοποίηση ενζύμων) - εμβάπτιση σε διάλυμα SO 2 ή αλκάλεως 0.1% Κατά την αφυδάτωση: απώλεια υγρασίας, όχι καταστροφή μ/ο, όχι αδρανοποίηση πολλών ενζύμων Διαφορές αφυδάτωσης σε πολύ χαμηλή/υψηλή ο θ: αρνητική επίδραση θέρμανσης στην ποιότητα Κατά την αποθήκευση: αλλοίωση από μύκητες (αν προσληφθεί υγρασία) Μετά από ενυδάτωση: ευαλλοίωτο συντήρηση σε ψύξη Ελάχιστες τιμές aw για ανάπτυξη μ/ο: 0,62, αλλά παραγωγή μυκοτοξινών σε aw >0.81 Ωσμώφιλες ζύμες: Zygosaccharomyces (rouxii) Ωσμώφιλοι μύκητες: Eurotium, Aspergillus Πιθανότητα επιβίωσης σπορίων μετά την αφυδάτωση Πρόληψη αλλοιώσεων: χαμηλή τιμή RH, ph, θ ο C, συσκευασία αεροστεγής/κενού, μυκοστατικές ουσίες 36

37 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΦΥΔΑΤΩΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Ενδεικτικές ελάχιστες τιμές aw για την ανάπτυξη βακτηρίων, ζυμών και μυκήτων Ξηραντήρας τύπου ραφιών spray-drying 37

38 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΦΥΔΑΤΩΜΕΝΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Πίνακας: Ελάχιστες τιμές ενεργότητας νερού aw για την ανάπτυξη ορισμένων βακτηρίων (Troller, 1987) Ελάχιστες τιμές aw στα υποστρώματα στα οποία η ρύθμιση έγινε με: Μικροοργανισμός NaCl Γλυκερόλη Pseudomonas flurescens Salmonella oranienburg Escherichia coli Clostridium botulinum ** Bacillus megaterium ** Micrococcus lysodeikticus Bacillus cereus ** Bacillus subtilis ** Staphylococcus aureus ** Πίνακας: Ελάχιστες τιμές για aw για την ανάπτυξη ζυμών και μυκήτων που προκαλούν αλλοιώσεις στα τρόφιμα Μικροοργανισμός Ελάχιστη τιμή aw Candida utilis 0.94 Botrytis cinerea 0.93 Rhizopus stolonifer 0.93 Mucor spinosus 0.93 Candida scottii 0.92 Trichosporom pullulans 0.91 Candida zeylanoides 0.90 Saccharomyces vernalis 0.89 Alternaria citri 0.84 Aspergillus glaucus * 0.70 Aspergillus echinulatus * 0.64 Zygosaccharomyces rouxii 0.62 Xeromuces bisporus 0.61 *ελάχιστη aw για εκβλάστηση σπορίων: λίγο πιο χαμηλή από ελάχιστη aw για ανάπτυξη, ελάχιστη aw για παραγωγή τοξίνων: λίγο πιο υψηλή από aw για ανάπτυξη, ελάχιστη aw για ανάπτυξη μυκοτοξινών: 0.81 Αφυδάτωση δεν θανατώνει μ/ο: προσοχή σε μολύνσεις από κακής ποιότητας α ύλης (π.χ. επιβίωση Salmonella) Για aw : αλλοίωση σε 1-2 εβδομάδες από μύκητες (Eurotium, Aspergillus, Zygosaccharomyces) Για aw <0.70: συντήρηση για χρόνια 38

39 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΛΑΧΙΣΤΗΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ Προϊόντα `sous-vide` συσκευασμένα σε κενό ή ΜΑΡ (έτοιμα φαγητά, έτοιμες σάλτσες και σαλάτες, ψάρια, κρέας, αλλαντικά) Χαρακτηριστικά φρέσκου προϊόντος υψηλή θρεπτική αξία Μικροβιακή σταθερότητα ενζυμική σταθερότητα για αρκετές μέρες-εβδομάδες Συντήρηση για 4-5 μέρες μέχρι 3-4 βδομάδες Εφαρμογή hurdle technology (τεχνολογία συνδυασμού παρεμποδιστών) Διαδικασία παραγωγής τρoφίμων sous-vide : Νωπό προϊόν (μαγείρεμα-επεξεργασία) συσκευασία υδατόλουτρο ο C(π.χ 70 ο Cx100 ) ψύξη διακίνηση υπό ψύξη Σημαντικό: καλής ποιότητας α ύλη (χαμηλή ΟΜΧ) και συνεχής ψύξη Ήπια θέρμανση: υψηλή ΟΜΧ (επιβίωση κυρίως σπορίων, καταστροφή Gram + ) Συσκευασία κενού: αναστολή ανάπτυξη αερόβιων μ/ο, αναστολή οξειδώσεων Συσκευασία ΜΑΡ: κενό + αέρια (CO 2 +N 2 ). To CO 2 αναστέλλει ένζυμα και μ/ούς Αλλοιώσεις: γαλακτικά βακτήρια (ευνοούνται από CO 2 ), Βrochothrix παραγωγή οξέων κτλ Παθογόνα: τοξίνες B. cereus και S. aureus: ανθεκτικές (>100 ο C), Cl. botulinum (ευνοϊκό περιβάλλον, σε θ ο 3 ο C αναστολή όλων των τοξίνων από Cl. botulinum), Cl. perfingens, L. monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila Για ασφαλή τρόφιμα sous-vide Μείωση θερμοκρασίας σε Τ<10 ο C μέσα σε 4 ώρες μετά την παστερίωση Συντήρηση και διακίνηση σε 3 ο C Προσθήκη χρονοθερμοκρασιακών δεικτών Προσθήκη συντηρητικών Οξίνιση (προσοχή σε αλλαγές ph χαμηλή aw (π.χ με προσθήκη NaCl) Δείκτης παστερίωσης: μείωση πληθυσμού του Enterococcus faecalis κατά 12-13D, ή/και Listeria monocytogenes κατά 4-6D Προσοχή σε νωπά ΜΑΡ τρόφιμα: πιθανότητα παρουσίας παθογόνων χωρίς εμφανή αλλοίωση 39

40 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΛΑΧΙΣΤΗΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ Προϊόντα `sous-vide` 40

41 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΛΑΧΙΣΤΗΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ Ελάχιστες τιμές ph, aw, θερμοκρασίας και δυνατότητα αναερόβιας ανάπτυξης για διαφορετικούς μικροοργανισμούς (μπορούν να χρησιμοποιηθούν για το σχεδιασμό μια τεχνολογίας συνδυασμού παρεμποδιστών (hurdle technology) 41

42 Ενζυμικες αλλοιώσεις τροφίμων Προέρχονται από ενδογενή ένζυμα του τροφίμου ή ένζυμα μικροοργανισμών που αναπτύχθηκαν πριν την επεξεργασία Η θέρμανση (ακόμα και η αποστείρωση) μπορεί να μην αδρανοποιήσει πλήρως κάποια ένζυμα Η ψύξη, κατάψυξη, συμπύκνωση, αφυδάτωση, υψηλές πιέσεις, κλπ. δεν αδρανοποιούν όλα τα ένζυμα Η ενζυμική αλλοίωση είναι αργή και δεν ελλοχεύει κινδύνους για τη δημόσια υγεία, απλώς υποβαθμίζει τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των τροφίμων 42

43 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΟΥ ΕΠΕΞΕΡΓΑΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΥΠΕΡΥΨΗΛΕΣ ΠΙΕΣΕΙΣ Προϊόντα που παστεριώνονται σε πολύ υψηλή πίεση ( bar ή ΜΡa) χωρίς θέρμανση με τη βοήθεια εμβόλων που πιέζουν το νερό σε ένα κλειστό κύκλωμα στο κέντρο του οποίου υπάρχει προσυσκευασμένο τρόφιμο (σε συσκευασία κενού συνήθως ή ΜΑΡ) Αποτέλεσμα: τα κύτταρα των μικροβίων καταστρέφονται (σκάνε) ακαριαία λόγω της πολύ υψηλής πίεσης που προκαλεί διάρρηξη της κυτταρικής μεμβράνης Ομοιόμορφη καταστροφή μικροβίων άσχετα με το μέγεθος ή το σχήμα του τροφίμου Δεν υπάρχει οργανοληπτική ή θρεπτική υποβάθμιση των τροφίμων (διατηρούν τα χαρακτηριστικά του φρέσκου προϊόντος) Τα βλαστικά κύτταρα καταστρέφονται πιο εύκολα, ενώ τα σπόρια βακτηρίων είναι πιο ανθεκτικά (απαιτούν τουλάχιστον 600ΜΡa για μείωση 1log, ενώ τα βλαστικά κύτταρα καταστρέφονται σημαντικά με ΜΡa μείωση 5-6 log) Mια επεξεργασία 400ΜPa για 10 μειώνει την ΟΜΧ και ζύμες-μύκητες σε βραστά αλλαντικά ~ 5log Η καταστροφή σπορίων διευκολύνεται αν υπάρχει όξινο ph ή γίνει συνδυασμός με ήπια θέρμανση Γενικά η μέθοδος μπορεί να αντικαταστήσει την παστερίωση αλλά δεν συστήνεται για αποστείρωση 43

44 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΟΥ ΕΠΕΞΕΡΓΑΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΥΠΕΡΥΨΗΛΕΣ ΠΙΕΣΕΙΣ 44

45 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΟΥ ΕΠΕΞΕΡΓΑΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΥΠΕΡΥΨΗΛΕΣ ΠΙΕΣΕΙΣ Προϊόντα που εφαρμόζεται οι υπερυψηλές πιέσεις (ΗΡΡ-High Pressure Pasteurization): Υγρά ή ρευστά τρόφιμα σε εύκαμπτη συσκευασία (π.χ. χυμοί, σάλτσες) Νωπό κρέας και αλλαντικά συσκευασμένα Γιαούρτι, κρέμες και άλλα ημίρευστα προϊόντα Συνδυάζεται πάντα με αναερόβια συσκευασία (κενού/μαρ) και ψύξη Τα ένζυμα δεν αδρανοποιούνται (αντίθετα μπορεί να αυξηθεί η ευαισθησία σε ενζυμική αλλοίωση), εκτός και αν συνδυαστεί με ήπια θέρμανση (π.χ C) Το όξινο ph αυξάνει την αποτελεσματικότητα του HPP 45

46 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΟΥ ΕΠΕΞΕΡΓΑΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΠΑΛΛΟΜΕΝΑ ΗΛΕΚΤΡΙΚΑ ΠΕΔΙΑ Pulsed Electric Fields pasteurization: μη θερμική μέθοδος παστερίωση με χρήση ηλεκτροδίων υψηλής τάσης Τα κύτταρα φορτίζονται έντονα με ηλεκτρικό φορτίο και συμπεριφέρονται ως δίπολα Τα κύτταρα (η κυτταρική μεμβράνη) διαστέλλονται υπάρχει απώλεια ιόντων και διάρρηξη της μεμβράνης Κατάλληλη για υγρά τρόφιμα (γάλα, χυμοί, κλπ) με εψηλή συγκέντρωση νερού που είναι καλός αγωγός του ρεύματος Μειονέκτημα : η αποτελεσματική και ομοιόμορφη παστερίωση εξαρτάται από τη συγκέντρωση και την κατανομή υγρασίας στο τρόφιμο Χρησιμοποιείται τάση ισχύος 30-35kV/cm για λίγα δευτερόλεπτα (διοχετεύονται σε ~30 παλμούς σε 2 sec) Σκοτώνονται βλαστικά κύτταρα, αλλά όχι ενδοσπόρια βακτηρίων Τα Gram αρνητικά βακτήρια είναι πιο ευαίσθητα Το προϊόν διατηρεί τα οργανοληπτικα-θρεπτικά χαρακτηριστικά του φρέσκου προϊόντος για μέρες έως αρκετές εβδομάδες υπό ψύξη Αν συνδυαστεί με θέρμανση ~70C επέρχεται και θανάτωση σπορίων 46

47 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΟΥ ΕΠΕΞΕΡΓΑΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΠΑΛΛΟΜΕΝΑ ΗΛΕΚΤΡΙΚΑ ΠΕΔΙΑ Διάρρηξη κυτταρικής μεμβράνης με Pulsed Electric Fields συσκευή PEF 47

48 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΟΥ ΣΥΝΤΗΡΟΥΝΤΑΙ ΜΕ ΖΥΜΩΣΗ (ΖΥΜΟΥΜΕΝΑ ΤΡΟΦΙΜΑ) ΖΥΜΟΥΜΕΝΑ ΤΡΟΦΙΜΑ: ΣΥΝΤΗΡΟΥΝΤΑΙ ΧΑΡΗ ΣΤΙΣ ΩΦΕΛΙΜΕΣ ΔΡΑΣΕΙΣ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΠΟΥ ΚΑΝΟΥΝ ΤΗ ΖΥΜΩΣΗ Ζύμωση (τροφίμων): η βιομετατροπή ενός ή περισσοτέρων συστατικών των τροφίμων (σάκχαρα, πρωτεΐνες, λίπη, κλπ) σε άλλα οργανικά συστατικά (οργανικά οξέα, απλούστερα σάκχαρα, αρωματικές ουσίες, αέριο CO2, κλπ) χάρη στο μεταβολισμό των μικροοργανισμών Οι μικροοργανισμοί ζύμωσης μπορεί να είναι αυτόχθονοι (μέρος της φυσικής μικροχλωρίδας) ή να προστίθενται ως καθαρή καλλιέργεια εκκίνησης για να διασφαλιστεί η ομαλή πορεία της ζύμωσης Πλεονέκτημα καλλιεργειών εκκίνησης: τυποποίηση προϊόντος (σταθερά ποιοτικά χαρακτηριστικά), μείωση αλλιώσεων και σφαλμάτων ζύμωσης, αποτελεσματική ανάπτυξη αρώματος, γεύσης, υφής, κλπ. Μειονέκτημα: ομοιομορφία μεταξύ των προϊόντων διαφορετικών εταιριών, ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΕΚΚΙΝΗΣΗΣ ΓΑΛΑΚΤΙΚΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ Lactococcus Streptococcus ομοζυμωτικά: Λακτόζη γαλακτικό οξύ Pediococcus, Vagococcus Lactobacillus ομοζυμωτικά + ετεροζυμωτικά είδη Leuconostoc ετεροζυμωτικά: Λακτόζη γαλακτικό οξύ, οξικό οξύ, αιθανόλη, CO 2 Carnobacterium Παραγωγή αρωματικών ουσιών (ακεταλδεΰδη, διακετύλιο) Χρήση γαλακτικών βακτηρίων σε ζυμούμενα γαλακτοκομικά, αλλαντικά, λαχανικά, φρούτα-ποτά μοναδικά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, καλύτερη συντήρηση λόγω οξίνησης και παραγωγής αντιμικροβιακών ουσιών (βακτηριοσίνες, διακετύλιο, υπεροξείδιο του υδρογόνου, διοξείδιο του άνθρακα) 48

49 Καλλιέργειες εκκίνησης 49

50 ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΑΠΟ ΓΑΛΑΚΤΙΚΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ H 2 O 2 : συσσώρευση από Lactobacillus (catalase - ), ανασταλτικό για Staphylococcus, Pseudomonas λακτοϋπεροξειδάση + H 2 O 2 + SKn - οξειδωτικό σύμπλοκο λακτοϋπεροξειδάσης στο γάλα Διακετύλιο : από αποικοδόμηση πυρουβικού βουτυρικό άρωμα, αντιμικροβιακή δράση: 200ppm-ζύμες,Gram -, 300ppm-Gram +, 350ppmγαλακτικά Βακτηριοσίνες (πεπτίδια που μοιάζουν με ήπια αντιβιοτικά) Ρευτερίνη: από Lactobacillus reuterii ΜΒ, υδατοδιαλυτή, ουδέτερο ph αναστολή βακτηρίων, ζυμών, μυκήτων (ευρεία δράση αντιβιοτικών) Νισίνη: από Lactococcus lactis κ Διπλοκοκκίνη: αναστολή Gram +, χρήση στα τρόφιμα για αναστολή: σπορίων Clostridium, Bacillus, Listeria σε συνδυασμό με χαμηλό ph Πεδιοσίνες: Pediococcus acidilacti, P. pentosaceus αντιλιστεριακή δράση και γενικά κατά των Gram + Κουρβασίνη: από Lactobacillus curvatus: αντιλιστεριακή δράση, δρά ενάντια Clostridium Λοιπές βακτηριοσίνες: Lactobacillus fermentum, helreticus, acidophilus, plantarum, Leuconostoc dextranicum 50

51 Α. ΖΥΜΟΥΜΕΝΑ ΚΡΕΑΤΟΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ (ΑΛΛΑΝΤΙΚΑ) Κρέας: ευαλλοίωτο Προσθήκη NaCl, ζάχαρης, NO 2 - αναστολή παθογόνων επικράτηση γαλακτικών Καπνισμός και συσκευασία κενού ή MAP Παραγωγή γαλακτικών μείωση ph (~5,0), αναστολή Pseudomonas, Acinetobacter (ευαίσθητα σε χαμηλό ph) Όξινο ph, αλάτι ~3%, χαμηλό Ο 2, νιτρώδη αναστολή Enterobacteriacae Παραγωγή αντιμικροβικών ουσιών Δυνατότητα φυσικής (βραδείας) ή ταχείας ζύμωσης (με καλλιέργεια εκκίνησης, πιο συμφέρουσα οικονομικά) προσοχη σε: τοξίνες, Salmonella, ισταμίνη Ρόλος βακτηρίων καλλιέργειας: γεύση-άρωμα, τυποποιημένα, σύντομη, ελεγχόμενη ωρίμανση, ασφάλεια και συντήρηση Micrococcus και Staphyloccosus αναγωγή ΝΟ 3 - σε ΝΟ 2 - και παραγωγή καταλάσης, σταθεροποίηση χρώματος διάσπαση υπεροξειδίων, αποφυγή τάγγισης λίπους Staphylococcus carnosus, S. griseus Enterococcus: παραγωγή οξέων, αντοχή σε NaCl, θέρμανση Lactobacillus: παραγωγή οξέων, αρώματος, βακτηριοσίνες, μείωση ΝΟ 3 - σε ΝΟ 2 - Debaryomyces hansenii: βελτίωση χρώματος-αρώματος, αντοχή σε NaCl Penicillium nalgiovense: βελτίωση χρώματος-αρώματος, αντοχή σε NaCl προσοχή σε μυκοτοξίνες! 51

52 Παραγωγή εντεροτοξίνης από Staphylococcus σε ζυμούμενα αλλαντικά σε θ ο C ο C (Niskanen και Nurmi, 1976) Χωρίς καλλιέργειες εκκινήσεως Με καλλιέργειες εκκινήσεως Μετά 3 μέρες Μετά 7 μέρες 10g Staphylococcus που παράγουν κοαγκουλάση ph Εντεροτοξίνη 10g Staphylococcus που παράγουν κοαγκουλάση ph Εντεροτοξίνη Ανάλυση του μπέϊκον που παρήχθηκε με/ή χωρίς την προσθήκη καλλιεργειών εκκινήσεως μετά από τη διατήρηση του στους 4 ο C για 21 μέρες (Bacus and Brown, 1981) μπέϊκον Χωρίς καλλιέργειες εκκινήσεως Με καλλιέργειες εκκινήσεως Ελεύθερα νιτρώδη(ppm) Ολική μεσόφιλη χλωρίδα ph Νιτροζοπυρρολιδίνη(ppb) Πίνακας Παραγωγή τοξίνης του βοτουλισμού σε μπέϊκον που διατηρήθηκε στους 27 ο C (Tanaka και συν., 1980) Νιτρώδη (ppm) Σακχαρόζη Γαλακτοβάκιλλοι Αριθμός δειγμάτων που παρήχθηκε τοξίνη/ αριθμός δειγμάτων που εξετάσθηκαν / / / / / / /192 52

53 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΖΥΜΟΥΜΕΝΩΝ ΓΑΛΑΚΤΟΚΟΜΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Α. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΕΚΚΙΝΗΣΗΣ: παραγωγή οξέων (γαλακτικό, οξικό, προπιονικό), αρώματος (διακετύλιο, ακετοΐνη, ακετύλιο), εξυγίανση Γαλακτικά βακτήρια Streptococcus (Lactococcus) lactis : παραγωγή οξέως (γαλακτικού) Str. Cremoris παραγωγή οξέως + αρώματος Str. Thermophillus παραγωγή οξέως Str. Diacetylactis παραγωγή αρώματος Lactobacillus bulgaricus παραγωγή οξέως + αρώματος Lb. lactis/lb. casei παραγωγή οξέως / αρώματος Lb. helreticus παραγωγή αερίου CO 2 + άρωμα Leuconostoc cremoris παραγωγή αερίου CO 2 + άρωμα Leuconostoc citrovorum παραγωγή αερίου CO 2 + άρωμα Leuconostoc mesenteroides παραγωγή αερίου CO 2 + άρωμα Ρόλος γαλακτικών βακτηρίων: Η οξίνιση και η παραγωγή αρωματικών ουσιών + βακτηριοσινών. Γεύση-άρωμα-υφή, αναστολή ανεπιθύμητης μικροχλωρίδας Μύκητες Penicilium roqueforti, P. camembertii P. candidum, caseicolum, glaucum πρωτεόλυση λιπόλυση έντονη γεύση-οσμή Ζύμες Candida lypolytica, curvata Torulopsis, Debaryomyces Ρόλος ζυμων-μυκήτων: Λιπόλυση, πρωτεόλυση, συμβολή στη γεύση τυριών 53

54 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΖΥΜΟΥΜΕΝΩΝ ΓΑΛΑΚΤΟΚΟΜΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Β. ΣΦΑΛΜΑΤΑ ΖΥΜΟΥΜΕΝΩΝ ΓΑΛΑΚΤΟΚΟΜΙΚΩΝ Τυριά: πρώιμο φούσκωμα κολοβακτηρίδια (E. Coli, Citrobacter) (παραγωγή CO 2, H 2 ) Bacillus polymyxa, macerans Ζύμες (Turulopsis) μαλάκωμα υφής+ γλίτζα Τυριά-γιαούρτι: όψιμο φούσκωμα Clostridium butyricum, perfingens, Cl. tyrobutyricum, Cl. sporogenes, Ζύμες Kluyveromyces, Saccharomyces Τυριά-βούτυρο: δυσοσμίες πρωτεόλυσης-λιπόλυσης Pseud. Fluorescens, fragi, Flavobacterium, Aeromonas, Clostridium, Mucor, Penicillium Τυρί-γιαούρτι: αποχρωματισμοί κηλίδες ζύμες-μύκητες 54

55 καλλιέργειες που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή γαλακτοκομικών προϊόντων Προϊόν Καλλιέργεια Κεφίρ Κόκκοι του Κεφίρ (περιέχουν ζύμη, στρεπτόκοκκους, μικρόκοκκους και βακίλλους). Acidophilus milk L. acidophilus (5% εμβόλιο). Βουτυρόγαλα (Βουλγαρία) L. bulgaricus (2% εμβόλιο). Βουτυρόγαλα (Cultured buttermilk) S. lactis ή S. cremoris + L. citrovorum, L. dextramicum ή S. diacetylactis (0.5% δραστική γαλακτική καλλιέργεια). Ξυνή κρέμα (Sour or cultured cream) Στρεπτόκοκκοι γαλακτικού οξέος + αρωματογόνα Leuconostoc (1% δραστική γαλακτική καλλιέργεια). Γιαούρτι S. thermophilus + L. bulgaricus (2.5% εμβόλιο) Τυρί Cottage S. lactis ή S. cremoris + L. citrovorum (5% εμβόλιο). Τυρί cream δραστική γαλακτική καλλιέργεια (5% εμβόλιο). Τυρί Mozzarella δραστική γαλακτική καλλιέργεια (0.5% εμβόλιο). Τυρί Pizza L. bulgaricus ή S. thermophilus (1% εμβόλιο). Τυρί Provolone L. bulgaricus (1-1.5% εμβόλιο) Τυρί Romano L. bulgaricus ή S. thermophilus (1-1.5% εμβόλιο). Τυρί Cheddar S. cremoris συνήθως (0.5% καλλιέργεια) Τυρί Swiss S. thermophilus + L. bulgaricus + Pr. Shermanii (150ml +150ml +25ml αντίστοιχα/1000 lb). Τυρί Brick δραστική γαλακτική καλλιέργεια (0.25%) Τυρί Blue δραστική γαλακτική καλλιέργεια (0.5%) + P. roqueforti ή P. glaucum Τυρί Camembert δραστική γαλακτική καλλιέργεια (2%) + P. camembertii. Τυρί Φέτα (πειραματικό) S. lactis + L. bulgaricus, αναλογία 3:1 (0.5% δραστική καλλιέργεια). Τυρί Κεφαλοτύρι (πειραματικό) S. thermophiles + L. bulgaricus, αναλογία 4:1 (1% δραστική καλλιέργεια). S. thermophiles +S. diacetylactis +S. durans, αναλογία 4:4:2 (1% δραστική καλλιέργεια). 55

56 ΖΥΜΟΥΜΕΝΑ ΤΡΟΦΙΜΑ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΛΑΧΑΝΙΚΑ (ΤΟΥΡΣΙ) Σε νωπά λαχανικά: ΟΜΧ από Gram - (αρχική ζύμωση) και Gram + + ζύμες Με προσθήκη NaCl (π.χ. 8%) και καλό πλύσιμο α ύλης: επικράτηση γαλακτικών βακτηρίων (κυρίως ζύμωση) και ζυμών E. faecalis, Lc. mesenteroides, Lb. brevis, Lb. plantarum, P. cerevisiae ζύμωση σακχάρων, οξίνιση, επικράτηση ζυμών (μόνο σε αερόβιο περιβάλλον, δευτερογενής ζύμωση) Η ζύμωση εξαρτάται από: %NaCl, % σάκαχαρα, ph, φως, θερμοκρασία ζύμωσης, παρουσία Ο 2, καλλιέργεια εκκίνησης Ρόλος NaCl : Αναστολή μ/ο και ενζύμων Γεύση Διαλυτοποίηση σακχάρων Προσοχή στο μαλάκωμα φυτ. Ιστού υπεροξίνιση - πολυγαλακτουρονάσες μυκήτων (από επιφαν. ανάπτυξη σε άλμη και τις ανεπιθύμητες ζυμώσεις (π.χ. παραγωγή CO 2, οξικού, αλκοόλης) Δυνατότητα προσθήκης συντηρητικών (π.χ. βενζοϊκό-na για μύκητες) ή παστερίωσης Σπάνια τροφικές δηλητηριάσεις από ζυμούμενα, πρόβλημα μόνο οι βιογενείς αμίνες(π.χ. Pediococcus cerevisiae) ΤΟΥΡΣΙ ΛΑΧΑΝΟ Προσθήκη 2.5%NaCl αναστολή Gram -, επικράτηση Leuconostoc mesenteroides Θερμοκρασία ο C Ζύμωση σακχάρων γαλακτικό, οξικό, CO 2, μείωση ph Αναστολή ανεπιθύμητων μ/ο και ενζύμων (πηκτινολυτικών) CO 2 μερικώς αναερόβιο περιβάλλον επικράτηση γαλακτικών, αποφυγή οξείδωσης (π.χ. βιτ.c ή χρώμα) Σταδιακή ανάπτυξη L. brevis (ε/ζ), L. plantarum (ο/ζ), P. cerevisiae (ο/ζ) και αναστολή L. mesenteroides (λόγω όξινου ph) Ολοκλήρωση ζύμωσης σε 1-2 μήνες, ανάλογα με θ ο C, NaCl Επικράτηση ζυμών-μυκήτων ανεπιθύμητη γεύση οσμή, αποχρωματισμός, μαλάκωμα 56

57 ΖΥΜΟΥΜΕΝΑ ΤΡΟΦΙΜΑ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΑΓΓΟΥΡΑΚΙΑ ΤΟΥΡΣΙ Φυσική ζύμωση: αρχική άλμη 5%, σταδιακά σε 6-9 εβδομάδες άλμη έως 16% NaCl Επικράτηση Lb. plantarum, P. cerevisiae Ανεπιθύμητος ο Lb. brevis λόγω παραγωγής αερίου CO2 Ελεγχόμενη ζύμωση: Προσθήκη καλλιέργειας Lb. plantarum, P. cerevisiae Χλωριωμένη άλμη και όξινη 6.4% NaCl, 80ppm Cl - προσθήκη οξικού οξέος και οξικού Na ΕΛΙΕΣ Ολοκλήρωση ζύμωσης σε 7-12 μέρες στους ο C α) Πράσινες ισπανικού τύπου: (επεξεργασία με αλκάλι για ξεπίκρισμα, μαλάκωμα, διάχυση άλμης) ζύμωση με γαλακτικά βακτήρια Πληθυσμός Gram - (coliforms, Pseudomonas) τις πρώτες μέρες, μέχρι 15 η μέρα Πληθυσμός Pediococcus από 1 η 2 η μέρα, μετά επικράτηση Leuconostoc, - Lactobacillus Λίγες ζύμες καθ όλη τη ζύμωση (2-3 μήνες) Στο τέλος της ζύμωσης: ph , αλάτι 7-8% β) Μαύρες- Ελληνικού τύπου: ζύμωση με ζύμες (Saccharomyces, Hansenula, Candida, Τurulopsis, Debaryomyces, Pichia κτλ.) Διάχυση άλμης αργή, βραδεία ζύμωση Μικρή ανάπτυξη γαλακτικών (κυρίως στην άλμη <7-8%) :λιγότερη οξίνιση Στο τέλος της ζύμωσης: ph , σταδιακή αύξηση άλμης σε 10% 57

58 MΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΡΑΣΙΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΡΑΣΙΟΥ Α ύλη (σταφύλια) - ph - ΟΜΧ και κυρίως ζύμες-βακτήρια - μύκητες από επιμολύνσεις από μηχανήματα ή σάπια σταφύλια Αλκοολική ζύμωση γλεύκους από ζύμες (S. cerevisiae) παραγωγή αλκοόλης +CO 2 σε αναερόβιες συνθήκες αναστολή βακτηρίων σε >10% αλκοόλη και επιβίωση ζυμών S. cerevisiae, S. uvarum, Kluyveromyces Εκτός από αλκοολική έχουμε και μηλογαλακτική ζύμωση (με γαλακτικά βακτήρια Oenococcus, Leuconostoc) - μηλικό γαλακτικό + CO 2 από Leuconostoc oenos, Lb. brevis, Lb. plantarum Αλλοιώσεις κρασιού: Gluconobacter, Acetobacter οξίνιση (σε ph) και αερόβια (οξικό οξυ) Leuconostoc, Lb. brevis (αναερόβια) οξίνιση (γαλακτικό, οξικό, τρυγικό) - θόλωμα, CO 2, αλλοίωση οσμής Leuc. mesenteroides, dextranicum γλίτσα-δεξτράνες (σε κρασιά με % αλκοόλης) Μύκητες θόλωμα, αλλοίωση οσμής-γεύσης Mucor, Penicillium, Aspergillus Προστατευτικοί παράγοντες CO 2, Αιθανόλη(12%), οξέα(ph<3), SO 2 (200ppm) Ταννίνες, ζελατίνη χαμηλό % σακχάρων στο κρασί (<0,5%) μετά τη ζύμωση Προσοχή σε θ ο C αποθήκευσης, απουσία Ο 2, καθαρισμό α ύλης και μηχανημάτων. 58

59 MΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΑΡΤΟΥ Μικροβιολογία Τροφίμων S. cerevisiae ζύμωση σακχάρων + CO 2 (διόγκωση) διόγκωση ζυμαριού σε 2-4 ώρες πορώδη (αφράτη) υφή, γεύση-αρωματικές ουσίες Ενίσχυση-επιτάχυνση ζύμωσης με προσθήκη υψηλής ποσότητας ζύμης προσθήκη αλάτων αμμωνίου προσθήκη επιπλέον σακχάρων επιλογή θερμοκρασίας ανάλογα με καλλιέργεια Ετεροζυμωτικά-Σακχαρολυτικά γαλακτικά βακτήρια (Lactobacillus, Leuconostoc) παραγωγή αρωματικών ουσιών (διακετύλιο, ακεταλδεΰδη, αλκοόλη, οργικά οξέα) σε ξινισμένο ζυμάρι (προζύμι) Αλλοίωση ψωμιού από μύκητες σε αερόβιες και θερμές συνθήκες Συντηρητικά που επιτρέπονται (αντιμυκητιακά): προπιονικά άλατα, σορβικά άλατα 59

60 ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΑ (ΒΑΚΤΗΡΙΑ) Βακτήρια που προκαλούν μέσω της δράσης τους(στον εντερικό σωλήνα)ωφέλειες για την ανθρώπινη υγεία ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΩΝ Μη παθογόνα ( μη τοξικά βακτήρια, με ωφέλιμες δράσεις) Ζώντες οργανισμοί(σε υψηλούς πληθυσμούς) Ικανότητα πρόσδεσης στο επιθύλιο του εντέρου Ικανότητα τροποποίησης της εντερικής μικροχλώριδας καταπολέμηση παθογόνων του εντέρου μέσω παραγωγής οργανικών οξέων, Η2Ο2, ακεταλδεϋδης Μείωση χοληστερίνης στο αίμα μέσω δέσμευσης χολικών αλάτων Αποτροπή εκδήλωσης καρκίνου στο έντερο ΓΕΝΗ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΩΝ Lactobacillus(acidophilus, casei, κλπ) : προαιρετικά αναερόβια Lactococcus : προαιρετικά αναερόβια Streptococcus : προαιρετικά αναερόβια Bifidobacterium (infantis, longum, bifidum animalis, lactis, κλπ) : αναερόβια 60

61 ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΑ (ΒΑΚΤΗΡΙΑ) ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ Έλεγχος αντιμικροβιακής, αντικαρκινικής, υποχοληστεριναιμικής δράσης σε πειραματόζωα και ανθρώπους Αντοχή σε πολύ όξινο ph=2 (στομάχου) Αντοχή σε χολικά άλατα Ικανότητα προσκόλλησης στην επιφάνεια του εντέρου ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΩΝ Έλεγχος αλληλεπίδρασης με ξενιστή Φαρμακοκινητικές μελέτες Τοξικολογικές μελέτες Απόδειξη της προβιοτικής δράσης με κλινικές μελέτες ώστε να υπάρχει ισχυρισμός υγείας (health claim) ΠΡΕΒΙΟΤΙΚΑ:φυτικές αδιάσπαστες ίνες (φρουκτοολιγοσακχαρίτες όπως ινουλίνη, γαλακτοολιγοσακχαρίτες όπως λακτουλόζη, άλλοι ολιγο/πολυσακχαρίτες) που ευνοούν την ανάπτυξη προβιοτικών μικροοργανισμών) 61

62 Μέθοδοι μικροβιολογικής ανάλυσης Συμβατικές μέθοδοι μικροβιολογικής ανάλυσης Χαρακτηριστικά: ευρύ φάσμα εφαρμογών, αξιόπιστες αλλά χρονοβόρες και σχετικά επίπονες (αποτελέσματα μετά από 1-5 μέρες) Προσδιορισμός αποικιών σε στερεό υπόστρωμα (Καταμέτρηση/ανίχνευση σε τρυβλία έπειτα από επώαση) Μέθοδος ΜΡΝ (Most probable number technique) (ανίχνευση ανάπτυξης σε δοκιμαστικούς σωλήνες διαδοχικών αραιώσεων με υγρό/στερεό υπόστρωμα, και στατιστική εκτίμηση του πιο πιθανού πληθυσμού) Βιοχημικά τεστ (για τον προσδιορισμό συγκεκριμένων γενών/ειδών μικροβίων, με βάση της βιοχημικές/φυσιολογικές τους ιδιότητες, π.χ. τεστ οξειδάσης, καταλάσης, κοαγκουλάσης, υδρόλυση σακχάρων, τεστ ινδόλης, ανάπτυξη σε διαλύματα αλάτων, χολικών οξέων, διαφορετικές θερμοκρασίες, κλπ) 62

63 Συμβατικές μέθοδοι ανάλυσης (σχηματική αναπαράσταση) 63

64 Σύγχρονες/έμμεσες μέθοδοι μικροβιακής ανάλυσης Χαρακτηριστικά: πολύ γρήγορες μέθοδοι (αποτελέσματα εντός λίγων ωρών ή λεπτών), με ελάχιστα αναλώσιμα αλλά ακριβό εξοπλισμό, περιορισμένη εφαρμογή, κυρίως για παθογόνα μικρόβια και ΟΜΧ Μέτρηση ATP/φθορισμού/οπτικής πυκνότητας : Για καταμέτρηση ΟΜΧ, ή εκτίμηση του συνολικού μικροβιακού φορτίου, ή της αποτελεσματικότητας της απολύμανσης σε επιφάνειες. Ανοσολογικά τεστ τύπου ELISA (Immunological assays) : Ανίχνευση βακτηριακών τοξινών ή μυκοτοξινών, (καθώς και φυτοφαρμάκων και αλλεργιογόνων) Μοριακά τεστ (DNA-based assays and probes (με τη χρήση PCRpolymerase chain reaction) : ανίχνευση παθογόνων, ταξινόμησηταυτοποίηση βακτηρίων σε επίπεδο είδους API tests: συνδυαστικό πολυδιαγνωστικό τεστ βασισμένο σε ταυτόχρονες πολλαπλές βιοχημικές δοκιμές, ξεχωριστές για κάθε μικροοργανισμό Latex coagulation tests: για την ανίχνευση παθογόνων μ/ών με βάση ανοσολογικό τεστ συγκόλλησης αντιγόνων-αντισωμάτων 64

65 Σύγχρονες/έμμεσες μέθοδοι μικροβιακής ανάλυσης Απλά ανοσολογικά τεστ για ανίχνευση E. coli 65

66 TESTS SUBSTRATE REACTION TESTED ONPG ONPG beta-galactosidase ADH arginine arginine dihydrolase LDC lysine lysine decarboxylase Σύγχρονες/έμμεσες μέθοδοι μικροβιακής ανάλυσης ODC ornithine ornithine decarboxylase CIT Citrate citrate utilization H2S Na thiosulfate H2S production URE Urea urea hydrolysis TDA tryptophan deaminase API τεστ για E. coli IND tryptophan indole production VP Na pyruvate acetoin production GEL charcoal gelatin gelatinase GLU Glucose fermentation/oxidation MAN Mannitol fermentation/oxidation INO Inositol fermentation/oxidation SOR Sorbitol fermentation/oxidation RHA Rhamnose fermentation/oxidation SAC Sucrose fermentation/oxidation MEL Melibiose fermentation/oxidation AMY amygdalin fermentation/oxidation ARA Arabinose fermentation/oxidation OX Oxidase oxidase - Σε κάθε κυψελίδα προστίθεται ο υπό μελέτη μικροοργανισμός - Κάθε κυψελίδα αντιστοιχεί σε διαφορετική βιοχημική δοκιμή - Κάθε θετική/αρνητική βιοχημική δοκιμή αντιστοιχεί σε συγκεκριμένο χρωματικό αποτέλεσμα 66

67 Σύγχρονες/έμμεσες μέθοδοι μικροβιακής ανάλυσης Μέθοδοι Elisa, π.χ. μηχάνημα τύπου VIDAS Πως δουλεύει? 1. Πρόσδεση αντισώματος με τα αντιγόνα του παθογόνου-στόχου (antigen capture) 2. Ένα δεύτερο αντίσωμα ενωμένο με κατάλληλο φθορίζον ένζυμο συνδέεται με το αντιγόνο του παθογόνου-στόχου (sandwich assay) 3. H ένταση του φθορισμού προκύπτει από την διπλή ένωση αντιγόνου με τα δύο αντισώματα μετριέται στο φωτόμετρο ELISA (Detection) 67

68 Mικροβιακή αύξηση-ανάπτυξη Η αύξηση του αριθμού των κυττάρων (κατά την εκθετική φάση) με βάση το χρόνο είναι μια γεωμετρική πρόοδος που περιγράφεται από τον τύπο: N=N ο 2 n, όπου: N ο ο αρχικός πληθυσμός, Ν ο πληθυσμός μετά από χρόνο t, n ο αριθμός των γενεών που ολοκληρώθηκαν κατά το χρόνο t Χρόνος διπλασιασμού (Generation time G ή doubling time) : ο χρόνος που χρειάζεται ένα κύτταρο για να αναπαραχθεί υπό συγκεκριμένες συνθήκες Ο χρόνος γενεάς g (generation time) περιγράφεται από τον τύπο: g = t/n ή G=0.3t/(log 10 N log 10 N o ), όπου N o =αρχικός πληθυσμός, N=τελικός πληθυσμός έπειτα από χρόνο t (min) Π.χ. αν ένα κύτταρο φτάνει από 100 σε κύτταρα (10 2 σε 10 4 cfu/ml) σε120min, G=0.3x120/(4-2)=18min Ο χρόνος G εξαρτάται από τα διαθέσιμα θρεπτικά συστατικά σε ένα υπόστρωμα, τη θερμοκρασία, το ph, τη συγκέντρωση O 2 /CO 2, την ενεργότητα νερού a w, το μικροβιακό ανταγωνισμό και άλλους παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη O ρυθμός ανάπτυξης (Growth rate, μ) ισούται με την αύξηση/μείωση των κυττάρων ανά μονάδα χρόνου (cfu/g/h). Μπορεί να μετρηθεί με καταμέτρηση αποικιών σε τρυβλία, φασματοφωτομετρικά, ή με ξήρανση και ζύγιση της μικροβιακής βιομάζας. 68