HercepTest για αυτοµατοποιηµένες πλατφόρµες Link

Transcript

1 HercepTest για αυτοµατοποιηµένες πλατφόρµες Link Κωδικός SK001 20η έκδοση ( ) P04083GR_01_SK / σ. 1/42

2 Περιεχόµενα Σελίδα Προοριζόµενη χρήση...3 Περίληψη και επεξήγηση - Μαστός...4 Αρχή της διαδικασίας - Μαστός...4 Παρεχόµενα υλικά - Μαστός...4 HercepTest Control Slides...5 Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται Μαστός...6 Προφυλάξεις - Μαστός...7 Αποθήκευση - Μαστός...9 Παρασκευή δείγµατος - Μαστός...9 Παρασκευή αντιδραστηρίου - Μαστός...9 ιαδικασία χρώσης Έλεγχος Ποιότητας - Μαστός...11 Ερµηνεία χρώσης - Μαστός...13 Περιορισµοί ειδικοί για το προϊόν - Μαστός...16 Χαρακτηριστικά απόδοσης - Μαστός...16 Αντιµετώπιση προβληµάτων - Μαστός...19 Περίληψη και επεξήγηση - Στόµαχος...21 Αρχή της διαδικασίας - Στόµαχος...21 Παρεχόµενα υλικά - Στόµαχος...22 HercepTest Control Slides...22 Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται - Στόµαχος...23 Προφυλάξεις - Στόµαχος...24 Αποθήκευση - Στόµαχος...25 Παρασκευή δείγµατος - Στόµαχος...25 Παρασκευή αντιδραστηρίου - Στόµαχος...26 ιαδικασία χρώσης - Στόµαχος...26 Έλεγχος ποιότητας - Στόµαχος...28 Ερµηνεία χρώσης - Στόµαχος...29 Γενικοί περιορισµοί - Στόµαχος...33 Περιορισµοί ειδικοί για το προϊόν - Στόµαχος...33 Χαρακτηριστικά απόδοσης - Στόµαχος...34 Αντιµετώπιση προβληµάτων - Στόµαχος...38 Αναφορές...40 Επεξήγηση συµβόλων...42 ( ) P04083GR_01_SK / σ. 2/42

3 Προοριζόµενη χρήση Για in vitro διαγνωστική χρήση. Το HercepTest είναι µια ηµι-ποσοτική ανοσοκυτταροχηµική δοκιµασία για τον καθορισµό της υπερέκθεσης της πρωτεΐνης HER2 σε καρκινικούς ιστούς του µαστού που υποβάλλονται σε επεξεργασία ρουτίνας για ιστολογική αξιολόγηση και σε ιστούς µονιµοποιηµένους µε φορµαλίνη και εγκλεισµένους σε παραφίνη από ασθενείς µε αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής. Το HercepTest ενδείκνυται ως επικουρικό µέσο για την αξιολόγηση ασθενών για τους οποίους εξετάζεται το ενδεχόµενο υποβολής τους σε θεραπεία µε Herceptin (trastuzumab) (βλ. ένθετο συσκευασίας του Herceptin ). ΣΗΜΕΙΩΣΗ για τον καρκίνο του µαστού µόνο: Όλοι οι ασθενείς που συµµετείχαν στις κλινικές δοκιµές του Herceptin επελέγησαν µε τη βοήθεια ενός διερευνητικού ανοσοκυτταροχηµικού προσδιορισµού κλινικών δοκιµών (Clinical Trial Assay, CTA). Στις εν λόγω δοκιµές, κανείς από τους ασθενείς δεν επελέγη µε τη βοήθεια του HercepTest. Το HercepTest συγκρίθηκε µε το CTA πάνω σε ένα ανεξάρτητο σύνολο δειγµάτων και διαπιστώθηκε ότι παρέχει αποτελέσµατα µε αποδεκτό βαθµό συµφωνίας. Η πραγµατική συσχέτιση των κλινικών αποτελεσµάτων του HercepTest µε εκείνα του Herceptin δεν έχει διαπιστωθεί. ΣΗΜΕΙΩΣΗ για τον καρκίνο του στοµάχου µόνο: Όλοι οι ασθενείς της µελέτης φάσης III BO18255 (ToGA) µε χορηγό τη Hoffmann-La Roche επελέγησαν µε χρήση των κιτ Dako HercepTest (IHC) και Dako HER2 FISH pharmdx (FISH). Η µελέτη διαπίστωσε την κλινική χρησιµότητα και των δύο εξετάσεων για την αξιολόγηση της κατάστασης του HER2 σε ασθενείς µε µη εγχειρίσιµο, τοπικά προχωρηµένο, υποτροπιάζον ή/και µεταστατικό αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου ή της γαστροοισοφαγικής συµβολής. Για το κιτ αυτό, µε κωδικό SK001, οι όγκοι των αντιδραστηρίων έχουν ρυθµιστεί ειδικά για χρήση µε τις αυτοµατοποιηµένες πλατφόρµες Link της Dako. Το αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, αναφέρεται στο παρόν έγγραφο και ως καρκίνος του στοµάχου. Τα HercepTest και Herceptin είναι εµπορικά σήµατα της Genentech, Inc. και είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν µετά από ειδική άδεια της Dako Denmark A/S και της F. Hoffmann-La Roche Ltd. Για την εφαρµογή στον καρκίνο του µαστού, ανατρέξτε στις σελίδες Για την εφαρµογή στον καρκίνο του στοµάχου, ανατρέξτε στις σελίδες Σηµαντικό: Σηµειώστε τις διαφορές ιστού καρκίνου του µαστού και ιστού καρκίνου του στοµάχου, ιδίως στις ενότητες ερµηνείας της χρώσης. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 3/42

4 Καρκίνος του µαστού Περίληψη και επεξήγηση - Μαστός Ιστορικό Το ανθρώπινο γονίδιο HER2 (γνωστό και ως ERBB2 ή NEU) κωδικοποιεί µια πρωτεΐνη που συχνά αναφέρεται ως πρωτεΐνη HER2 ή p185 HER2. Η πρωτεΐνη HER2 είναι µια τυροσινική κινάση υποδοχέα µεµβράνης µε οµολογία ως προς τον υποδοχέα παράγοντα επιδερµικής ανάπτυξης (EGFR ή HER1) (1-8). Η πρωτεΐνη HER2 είναι ένα φυσιολογικό συστατικό που εκφράζεται µε διάφορους τύπους επιθηλιακών κυττάρων (8). Σε ένα µέρος ασθενών που πάσχουν από καρκίνο του µαστού, η πρωτεΐνη HER2 υπερεκφράζεται στα πλαίσια της διαδικασίας κακοήθους µεταµόρφωσης και της προόδου του όγκου (9). Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 στην επιφάνεια των κυττάρων καρκίνου του µαστού υποδεικνύει ότι θα µπορούσε να αποτελέσει στόχο ενός αντισωµατικού θεραπευτικού παράγοντα. Το Herceptin (trastuzumab) είναι ένα εξανθρωποποιηµένο µονοκλωνικό αντίσωµα (10) που συνδέεται µε υψηλή συγγένεια µε την πρωτεΐνη HER2 και έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασµό των ανθρώπινων νεοπλασµατικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη HER2 τόσο in vitro όσο και in vivo (11-13). Χαρακτηριστικά Το HercepTest αναπτύχθηκε ως εναλλακτικό του διερευνητικού CTA που εφαρµόστηκε στις κλινικές µελέτες του Herceptin. Η απόδοση του HercepTest για τον προσδιορισµό της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης HER2 αξιολογήθηκε σε ανεξάρτητη µελέτη, όπου έγινε σύγκριση των αποτελεσµάτων του HercepTest µε εκείνα του CTA πάνω σε 548 δείγµατα όγκου του µαστού, εκ των οποίων κανένα δεν ελήφθη από ασθενή που συµµετείχε στις κλινικές µελέτες του Herceptin. Τα αποτελέσµατα έδειξαν συµφωνία σε ποσοστό 79% ανάµεσα στα αποτελέσµατα των δύο προσδιορισµών πάνω σε εκείνα τα ιστικά δείγµατα. Τα δεδοµένα συµφωνίας δείχνουν επίσης ότι ένα αποτέλεσµα 3+ µε το HercepTest ήταν πολύ πιθανό να αντιστοιχεί σε θετικό αποτέλεσµα µε το CTA, γεγονός που θα πληρούσε τα κριτήρια εισαγωγής στη δοκιµή (2+ ή 3+). Τα αποτελέσµατα 2+ µε το HercepTest δεν συσχετίζονταν το ίδιο καλά µε τα αποτελέσµατα µε το CTA. Το 42% περίπου (53/126) των αποτελεσµάτων 2+ µε το HercepTest αντιστοιχούσαν σε αρνητικά αποτελέσµατα µε το CTA (0-1+), γεγονός που δεν θα επέτρεπε την εισαγωγή στις κλινικές µελέτες µε Herceptin. Το HercepTest ερµηνεύεται ως αρνητικό (ένταση χρώσης 0 και 1+), ασθενώς θετικό (ένταση χρώσης 2+) και έντονα θετικό (ένταση χρώσης 3+) ως προς την υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2. Το HercepTest δεν προορίζεται για την παροχή προγνωστικών πληροφοριών στον ασθενή και στον ιατρό και δεν έχει επικυρωθεί για το σκοπό αυτό. Αρχή της διαδικασίας - Μαστός Παρεχόµενα υλικά - Μαστός Το HercepTest περιέχει αντιδραστήρια που απαιτούνται για την ολοκλήρωση µια διαδικασίας ανοσοκυτταροχηµικής χρώσης δύο σταδίων για δείγµατα που έχουν µονιµοποιηθεί µε το συνήθη τρόπο και έχουν εγκλειστεί σε παραφίνη. Μετά από την επώαση µε το πρωτεύον αντίσωµα κονίκλου για την ανθρώπινη πρωτεΐνη HER2, το κιτ αυτό χρησιµοποιεί ένα έτοιµο προς χρήση αντιδραστήριο οπτικοποίησης που βασίζεται στην τεχνολογία δεξτράνης. Το αντιδραστήριο αυτό αποτελείται τόσο από µόρια δευτερογενούς αντιανοσοσφαιρίνης κονίκλου από αίγα όσο και από µόρια υπεροξειδάσης χρένου συνδεδεµένα µε µια κοινή κεντρική αλυσίδα πολυµερούς δεξτράνης. Με τον τρόπο αυτό, εξαλείφεται η ανάγκη αλληλοδιάδοχης εφαρµογής αντισώµατος-συνδέσµου και συζευγµένου µε υπεροξειδάση αντισώµατος. Η πιθανότητα να λάβει χώρα διασταυρούµενη αντίδραση του αντιδραστηρίου οπτικοποίησης µε τις ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες και τον ορό εµβρύου µόσχου έχει εξαλειφθεί µε απορρόφηση στερεάς φάσης. Η ενζυµατική µετατροπή της επακόλουθα προστιθέµενης χρωµογόνου ουσίας έχει ως αποτέλεσµα το σχηµατισµό ενός ορατού προϊόντος αντίδρασης στη θέση του αντιγόνου. Στη συνέχεια, το δείγµα είναι δυνατό να υποβληθεί σε επίχρωση και να καλυφθεί µε καλυπτρίδα. Τα αποτελέσµατα ερµηνεύονται µε τη βοήθεια µικροσκοπίου φωτός. Για την επικύρωση των αναλύσεων χρώσης, παρέχονται αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα που περιέχουν τρεις κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του µαστού, καθηλωµένες σε φορµαλίνη και ενσωµατωµένες σε παραφίνη, µε βαθµολογία έντασης χρώσης 0, 1+ και 3+. Η ένταση χρώσης αυτών των κυτταρικών σειρών έχει συσχετιστεί µε τον αριθµό των υποδοχέων ανά κύτταρο. Το HercepTest for Automated Link Platforms, κωδικός SK001, είναι κατάλληλο για αυτοµατοποιηµένη χρώση χρησιµοποιώντας τις πλατφόρµες Dako Auto Link. Κωδικός SK001 Τα υλικά που αναφέρονται κατωτέρω επαρκούν για 50 εξετάσεις (50 αντικειµενοφόροι πλάκες επωασµένες µε πρωτεύον αντίσωµα για την πρωτεΐνη HER2 και 50 αντικειµενοφόροι πλάκες επωασµένες µε το αντίστοιχο αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα). Ο αριθµός των εξετάσεων στηρίζεται στη χρήση 200 µl από κάθε αντιδραστήριο ανά τοµή ιστού (22 mm x 22 mm), εκτός του Epitope Retrieval Solution. Το κιτ περιλαµβάνει υλικά που επαρκούν για 10 ανεξάρτητες αναλύσεις χρώσης το πολύ. Ποσότητα 1 x 22 ml Περιγραφή HercepTest Peroxidase-Blocking Reagent Υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%, που περιέχει αζίδιο του νατρίου (NaN 3) 15 mmol/l. 1 x 12 ml HercepTest Rabbit Anti-Human HER2 Protein Έτοιµο για χρήση αντίσωµα, αποµονωµένο βάσει συγγενείας. Παρέχεται σε Tris/HCl 0,05 mol/l, NaCl 0,1 mol/l, NaN 3, ph 7,2, containing stabilizing protein. Ανοσογόνο: Συνθετικό C-τελικό τµήµα (ενδοκυτταροπλασµατικό τµήµα) της πρωτεΐνης HER2, συζευγµένο σε αιµοκυανίνη πεταλίδας. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 4/42

5 Καρκίνος του µαστού Ειδικότητα: Πρωτεΐνη HER2. Μέθοδος καθαρισµού: Το αντίσωµα έχει αποµονωθεί βάσει συγγενείας µε τη βοήθεια ακινητοποιηµένου πεπτιδίου πρωτεΐνης HER2. 1 x 22 ml HercepTest Visualization Reagent ολυµερές δεξτράνης συζευγµένο µε υπεροξειδάση χρένου και αποµονωµένες βάσει συγγένειας αντιανοσοσφαιρίνες κονίκλου από αίγα. Παρέχεται σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris/HCl που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και έναν αντιµικροβιακό παράγοντα. 1 x 10 ml HercepTest Negative Control Reagent Τµήµα ανοσοσφαιρίνης φυσιολογικού ορού κονίκλου σε συγκέντρωση πρωτεΐνης ισοδύναµη µε εκείνη του αντισώµατος για την πρωτεΐνη HER2. Παρέχεται σε Tris/HCl 0,05 mol/l, NaCl 0,1 mol/l, NaN 3, ph 7,2, containing stabilizing protein. 2 x 22 ml HercepTest DAB Substrate Buffer Ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος, µε ph 7,5, που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου < 0,1%, σταθεροποιητές, βελτιωτικά και έναν αντιµικροβιακό παράγ ντα. 1 x 1 ml HercepTest DAB Chromogen Χρωµογόνο διάλυµα τετραϋδροχλωρικής 3,3'-διαµινοβενζιδίνης 5%. 3 x 500 ml HercepTest Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x) Ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικών 0,1 mol/l µε απορρυπαντικό. 2 x 5 αντικειµενοφ όροι πλάκες 10 x φιάλες HercepTest Control Slides Κάθε αντικειµενοφόρος πλάκα περιέχει τοµές τριών καθηλωµένων σε φορµαλίνη και ενσωµατωµένων σε παραφίνη κυτταρικών σειρών καρκινώµατος του µαστού που αντιπροσωπεύουν διαφορετικά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης HER2: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) και SK-BR-3 (3+). Οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα έχουν υποστεί επεξεργασία για καλύτερη πρόσφυση των τοµών πάνω στο κρύσταλλό τους. Τυχόν επιπρόσθετη θερµική επεξεργασία των αντικειµενοφόρων πλακών µάρτυρα µε σκοπό τη βελτίωση της πρόσφυσης των τοµών πάνω στο κρύσταλλό τους ενδέχεται να διακυβεύσει τα αποτελέσµατα χρώσης. Φιάλη αντιδραστηρίων για πλήρωση από τον χρήστη, χωρητικότητας 12 ml. Κάθε φιάλη µπορεί να περιέχει 12mL αντιδραστήριο. Οι φιάλες πρέπει να χρησιµοποιούνται για την µίξη και αποθήκευση του διαλύµατος υποστρώµατος-χρωµογόνου (βλ. επίσης την ενότητα Προετοιµασία αντιδραστηρίων) Παρέχονται σε ξεχωριστή σακούλα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα αντιδραστήρια έχουν παρασκευαστεί για χρήση ειδικώς µε την παρούσα εξέταση. Για να γίνει η δοκιµή, δεν πρέπει να γίνει καµία αντικατάσταση. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 5/42

6 Καρκίνος του µαστού Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται Μαστός Dako Wash Buffer, κωδικός S3006 Επίχρωση: Αιµατοξυλίνη, όπως το Hematoxylin for Automated Link Platforms, (κωδικός SK308) Καλυπτρίδες Απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό Φούρνος ξήρανσης, µε δυνατότητα διατήρησης θερµοκρασίας 60 C ή χαµηλότερη Αιθανόλη, απόλυτη και 95% Κοινό µικροσκόπιο (µε αντικειµενικούς φακούς µεγέθυνσης 4 40x) Υλικό στερέωσης όπως π.χ. το Faramount (αρ. κωδικού S3025) ή το Glycergel (αρ. κωδικού C0563) της Dako Θετικοί και αρνητικοί ιστοί, για χρήση ως µάρτυρες της διαδικασίας (βλ. ενότητα περί ποιοτικού ελέγχου) Αντικειµενοφόροι πλάκες, SuperFrost Plus, πλάκες επιστρωµένες µε πολυ-l-λυσίνη ή Dako Silanized Slides, αρ. κωδικού S3003 (βλ. ενότητα περί προετοιµασίας δειγµάτων) Ξυλένιο, τολουένιο ή υποκατάστατα ξυλενίου Το SK001 προορίζεται ειδικά για χρήση µε το Dako Auto Link. Ανατρέξτε στον Οδηγό χρήσης των αυτοµατοποιηµένων πλατφόρµων Link για πρόσθετες πληροφορίες. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 6/42

7 Καρκίνος του µαστού Προφυλάξεις - Μαστός 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Για επαγγελµατίες χρήστες. 3. Το προϊόν αυτό περιέχει αζίδιο του νατρίου (NaN 3), µια χηµική ουσία που είναι ιδιαίτερα τοξική σε καθαρή µορφή. Σε συγκεντρώσεις προϊόντος, παρότι δεν κατατάσσεται ως επικίνδυνο, το αζίδιο του νατρίου ενδέχεται να αντιδράσει µε τις υδραυλικές σωληνώσεις από µόλυβδο και χαλκό για το σχηµατισµό ιδιαίτερα εκρηκτικών συσσωρεύσεων αζιδίων µετάλλων. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε µε άφθονη ποσότητα νερού για την πρόλ ψη συσσώρευσης αζιδίων µετάλλων στις υδραυλικές σωληνώσεις (21, 22). 4. Το αντιδραστήριο αποκλεισµού υπεροξειδάσης HercepTest περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%. ιατίθεται δελτίο δεδοµένων ασφαλείας υλικού για τους επαγγελµατίες χρήστες, µετά από σχ τικό αίτηµα. 5. Η πρωτεΐνη HER2 Κουνελιού έναντι ανθρώπου HercepTest, το αντιδραστήριο εποπτικής παρουσίασης HercepTest και το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα HercepTest περιέχουν υλικό ζωικής προέλευσης.. Όπως συµβαίνει µε οποιοδήποτε προϊόν που ροέρχεται από βιολογικές πηγές, θα πρέπει να χρησιµοποιούνται σωστές διαδικασίες χειρισµού. 7. Πρέπει να τα µεταχειρίζεστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες των µαρτύρων και τα δείγµατα, τόσο πριν όσο και µετά τη µονιµοποίηση, καθώς και όλα τα υλικά που έχουν εκτεθεί σε αυτά, ως δυνητικά µολυσµατικά και να τα απορρίπτετε µε τις δέουσες προφυλάξεις (22). Μην αναρροφάτε µε πιπέτα τα αντιδραστήρια µε το στόµα και αποφεύγετε την επαφή του δέρµατος και των βλεννογόνων µε αντιδραστήρια και δείγµατα. Εάν τα αντιδραστήρια έλθουν σε επαφή µε ευαίσθητες περιοχές, πλύνετε µε άφθονες ποσότητες νερού. 8. Ελαχιστοποιήστε τη µικροβιακή µόλυνση των αντιδραστηρίων, διαφορετικά µπορεί να παρατηρηθεί αύξηση της µη ειδικής χρώσης. 9. Τυχόν εφαρµογή χρόνων, θερµοκρασιών ή µεθόδων επώασης διαφορετικών από εκείνων που καθορίζονται στις οδηγίες ενδέχεται να δώσει εσφαλµένα αποτελέσµατα. Η υπερβολική ξήρανση στους 60 C για πάνω από µία ώρα µπορεί να προκαλέσει σηµαντική µείωση ή απώλεια της ειδικής, συνδεόµενης µε τη µεµβράνη ανοσοδραστικότητας HER2 (17). 10. Τα αντιδραστήρια έχουν αραιωθεί µε βέλτιστο τρόπο. Κάθε περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να προκαλέσει µείωση της αντιγονικής χρώσης. 11. Όλα τα αντιδραστήρια έχουν παρασκευαστεί για χρήση ειδικώς µε την παρούσα εξέταση. Για να γίνει η δοκιµή, δεν πρέπει να γίνει καµία αντικατάσταση. 12. Το αντιδραστήριο εποπτικής παρουσίασης HercepTest και το DAB Χρωµογόνο HercepTest ενδέχεται να επηρεάζονται αρνητικά αν εκτεθούν σε υπερβολικό φως. Μη φυλάσσετε τα µέρη του συστήµατος και µην εκτε είτε χρώση σε έντονο φως, όπως π.χ. το άµεσο ηλιακό φως. 13. Πρέπει να φοράτε κατάλληλο εξοπλισµό προσωπικής προστασίας για να αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια και το δέρµα. 14. Όσο διάλυµα δεν χρησιµοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται σύµφωνα µε τους τοπικούς, κρατικούς και οµοσπονδιακούς κανονισµούς. 15. Το φύλλο δεδοµένων ασφαλείας διατίθεται σε επαγγελµατίες χρήστες κατόπιν αίτησης. 16. Η χρήση όγκων αντιδραστηρίων διαφορετικών από τους συνιστώµενους ενδέχεται να οδηγήσει σε απώλεια της ορατής ανοσοδραστικότητας HER2. Τοµές ιστών µεγαλύτερες από 22 mm x 22 mm απαιτούν την εφαρµογή 2-3x 200 µl αντιδραστηρίου σε 2-3 περιοχές αυτοµατοποιηµένης εφαρµογής. 17. To HercepTest DAB Chromogen περιέχει 1 5% 3,3 -τετραϋδροχλωριούχο διαµινοβενζιδίνη (διφαινυλο-3,3,4,4 - τετραχλωριούχο τετραϋλτετρααµµώνιο) και φέρει τη σήµανση: Κίνδυνος H350 Μπορεί να προκαλέσει καρκίνο. H341 Ύποπτο για πρόκληση γενετικών ελαττωµάτων. P201 Εφοδιαστείτε µε τις ειδικές οδηγίες πριν από τη χρήση. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτιαή το πρόσωπο. Να φοράτε προστατευτικά ενδύµατα. P308 + P313 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ έκθεσης ή πιθανής έκθεσης: Συµβουλευθείτε/Επισκεφθείτε γιατρό. P405 Φυλάσσεται κλειδωµένο. P501 ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. 18. Τα υπολείµµατα παραφίνης µπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αρνητικά αποτελέσµατα. Ως γενικός κανόνας, άτοµα ηλικίας κάτω των 18 ετών δεν επιτρέπεται να εργάζονται µε το προϊόν αυτό. Πρέπει να δίνονται προσεκτικές οδηγίες στους χρήστες σχετικά µε τη σωστή διαδικασία εργασίας, τις επικίνδυνες ιδιότητες του προϊόντος και τις απαραίτητες οδηγίες ασφαλείας (σύµφωνα µε την Οδηγία 94/33/ΕΚ της Ευρωπαϊκής Ένωσης). Παρακαλούµε ανατρέξτε στο δελτίο δεδοµένων ασφαλείας υλικού (MSDS) για επιπλέον πληροφορίες. Η.Π.Α.: Η 3,3 -διαµινο-βενζιδίνη (DAB) ενδέχεται να είναι επιβλαβής όταν εισπνέεται, σε επαφή µε το δέρµα και σε περίπτωση καταπόσεως. Το υλικό αυτό είναι ερεθιστικό για τα µάτια και το δέρµα. Σε περίπτωση επαφής µε το δέρµα, ξεπλύντε τις προσβεβληµένες περιοχές µε σαπούνι και νερό. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 7/42

8 Καρκίνος του µαστού ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Παρ' ότι η διαµινοβενζιδίνη σχετίζεται δοµικά µε τη βενζιδίνη, δεν υπάρχουν ενδείξεις ότι είναι καρκινογόνος. Συµβουλευτείτε τους τοπικούς, πολιτειακούς ή οµοσπονδιακούς κανονισµούς για την απόρριψή της. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 8/42

9 Καρκίνος του µαστού Αποθήκευση - Μαστός Παρασκευή δείγµατος - Μαστός Αποθηκεύστε σε θερµοκρασία 2 8 C όταν δεν χρησιµοποιείται σε αυτοµατοποιηµένες πλατφόρµες Dako Link. Αποθηκεύστε το HercepTest Peroxidase-Blocking Reagent, HercepTest Visualization Reagent, HercepTest DAB Substrate Buffer και το HercepTest DAB Chromogen στο σκοτάδι σε θερµοκρασία 2 8 C. Μη χρησιµοποιείτε το κιτ µετά την ηµεροµηνία λήξης, η οποία είναι σηµασµένη στο εξωτερικό της συσκευασίας. Εάν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται υπό οποιεσδήποτε συνθήκες εκτός από εκείνες που καθορίζονται στο ένθετο αυτής της συσκευασίας, οι συνθήκες πρέπει να επαληθεύονται από το χρήστη (14a, 14b). Σηµειώνεται ότι και οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα πρέπει να φυλάσσονται στους 2 8 C. εν υπάρχουν εµφανή σηµεία που να υποδεικνύουν αστάθεια του προϊόντος αυτού. Για το λόγο αυτό, οι θετικοί και αρνητικοί µάρτυρες πρέπει να εξετάζονται ταυτόχρονα µε τα δείγµατα ασθενών. Εάν παρατηρηθεί µη αναµενόµενη χρώση που δεν είναι δυνατό να επεξηγηθεί από διαφορές στις εργαστηριακές διαδικασίες και υποψιάζεστε πρόβληµα µε το HercepTest, επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία της Dako. Τα δείγµατα από βιοψία πρέπει να υποβάλλονται σε κατάλληλο χειρισµό για τη συντήρηση του ιστού για ανοσοκυτταροχηµική χρώση. Για όλα τα δείγµατα, πρέπει να εφαρµόζονται οι τυπικές µέθοδοι επεξεργασίας ιστών (15). Τοµές ενσωµατωµένες σε παραφίνη Κατάλληλοι για χρήση είναι ιστοί διατηρηµένοι σε ουδέτερα ρυθµισµένη φορµαλίνη ή σε καθηλωτικό του Bouin για αναλύσεις ρουτίνας και ενσωµάτωση σε παραφίνη. Για παράδειγµα, τα δείγµατα βιοψίας πρέπει να τεµαχίζονται µέχρι πάχους 3 ή 4 mm και να καθηλώνονται επί ώρες σε ουδέτερα ρυθµισµένη φορµαλίνη. Κατόπιν, οι ιστοί αφυδατώνονται µέσα σε µια σειρά διαλυµάτων αλκοόλης και ξυλενίου, και ακολουθεί εµποτισµός σε λιωµένη παραφίνη, που διατηρείται σε θερµοκρασία όχι µεγαλύτερη από 60 C. Κατάλληλα µονιµοποιηµένοι και εµφυτευµένοι ιστοί που εκφράζουν την πρωτεΐνη HER2 διατηρούνται επ' αόριστον πριν από τον τεµαχισµό και επικάλυψη σε αντικειµενοφόρους εφόσον φυλάσσονται σε δροσερό µέρος (15 25 C) (15,16). Στις Η.Π.Α., σύµφωνα µε το νόµο περί βελτίωσης κλινικών εργαστηρίων του 1988, στο 42 CFR (b), προβλέπεται ότι το εργαστήριο πρέπει να φυλάσσει κεχρωσµένες αντικειµενοφόρους πλάκες επί 10 έτη τουλάχιστον, καθώς και τεµάχια δειγµάτων 2 έτη τουλάχιστον, από την ηµεροµηνία εξέτασης (16). Τα δείγµατα των ιστών πρέπει να κόβονται σε τοµές πάχους 4 5 µm, να τοποθετούνται σε αντικειµενοφόρους και να στεγνώνουν στον αέρα σε θερµοκρασία δωµατίου για τουλάχιστον 12 ώρες (ή µέχρι να στεγνώσουν) ή στους 37 C καθόλη τη διάρκεια της νύκτας ή στους 60 C για µία ώρα. ΠΡΟΣΟΧΗ: Η υπερβολική θέρµανση για πάνω από µία ώρα στους 60 C µπορεί να προκαλέσει σηµαντική µείωση ή απώλεια της ειδικής, συνδεόµενης µε τη µεµβράνη ανοσοδραστικότητας HER2 (17). Για τη διατήρηση της αντιγονικότητας, οι τοµές των ιστών που έχουν τοποθετηθεί σε αντικειµενοφόρους (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine ή πυριτιωµένες), πρέπει να χρωµατίζονται εντός διαστήµατος 4 6 εβδοµάδων από τον τεµαχισµό τους όταν διατηρούνται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) (18). Οι αντικειµενοφόροι που απαιτούνται για την αξιολόγηση της πρωτεΐνης HER2 και την εξακρίβωση της παρουσίας όγκου πρέπει να παρασκευάζονται ταυτόχρονα. Προτείνονται 5 αντικειµενοφόροι τουλάχιστον, 1 αντικειµενοφόρος για την παρουσία όγκου, 2 αντικειµενοφόροι για την αξιολόγηση της πρωτεΐνης HER2 (µια αντικειµενοφόρος για επώαση της πρωτεΐνης HER2 κουνελιού έναντι ανθρώπου και µια αντικειµενοφόρος για επώαση µε το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα) και 2 εφεδρικές αντικειµενοφόροι. Για τη διατήρηση της αντιγονικότητας, οι τοµές των ιστών που έχουν τοποθετηθεί σε αντικειµενοφόρους (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine ή πυριτιωµένες), πρέπει να χρωµατίζονται εντός διαστήµατος 4 6 εβδοµάδων από τον τεµαχισµό τους όταν διατηρούνται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) (18). Η εφαρµογή της εξέτασης HercepTest σε απασβεστωµένους ιστούς δεν έχει εξακριβωθεί και δεν συνιστάται. Συµβουλευθείτε το Education Guide: Immunochemical Staining Methods (19) (Εκπαιδευτικός οδηγός: Μέθοδοι ανοσοχηµικής χρώσης) της Dako ή τις παραποµπές 15 και 16 για περαιτέρω λεπτοµέρειες σχετικά µε την παρασκευή των δειγµάτων. Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση Ειδική µέθοδος ανάκτησης επιτόπου, βρασµός σε ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικών 0,01 mol/l, πρέπει να χρησιµοποιηθεί για βέλτιστη απόδοση της εξέτασης. Το ιάλυµα Ανάκτησης Επιτόπου παρέχεται στο κιτ HercepTest. Η µέθοδος αυτή περιλαµβάνει θέρµανση των τοµών ιστών που έχουν τοποθετηθεί σε αντικειµενοφόρους βυθισµένες σε ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικών 0,01 mol/l (20), στην απαιτούµενη θερµοκρασία (95 99 C). Τα εργαστήρια που βρίσκονται σε µεγαλύτερο υψόµετρο πρέπει να καθορίσουν την καλύτερη µέθοδο για τη διατήρηση της απαιτούµενης θερµοκρασίας. Εξετάστηκαν και άλλες µέθοδοι για την ανάκτηση του επιτόπου αλλά δεν έδωσαν επαναλήψιµα αποτελέσµατα. Τυχόν αποκλίσεις από την περιγραφόµενη διαδικασία ενδέχεται να επηρεάσουν τα αποτελέσµατα. Παρασκευή αντιδραστηρίου - Μαστός Είναι βολικό να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια πριν από τη χρώση: ιάλυµα ανάκτησης επίτοπου Αραιώστε επαρκή ποσότητα από το HercepTest ιάλυµα ανάκτησης επίτοπου 1:10 σε αναλογία 1:10 µε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό, για την προγραµµατισµένη διαδικασία χρώσης. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο διάλυµα µπορεί να χρησιµοποιηθεί επί µια εβδοµάδα σε θερµοκρασία δωµατίου ή επί ένα µήνα εφόσον φυλάσσεται σε θερµοκρασία 2 8 C. Απορρίψτε το αραιωµένο διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. Ανατρέξτε στον οδηγό χρήσης των πλατφόρµων Dako Automated Link για επιπρόσθετες πληροφορίες. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 9/42

10 Καρκίνος του µαστού Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης Αραιώστε επαρκή ποσότητα Dako Wash Buffer (κωδικός S3006) 1:10 χρησιµοποιώντας αποσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο διάλυµα µπορεί να χρησιµοποιηθεί επί µια εβδοµάδα σε θερµοκρασία δωµατίου ή επί ένα µήνα εφόσον φυλάσσεται σε θερµοκρασία 2 8 C. Εάν το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα παρουσιάζει νεφέλωση, απορρίψτε το. Ανατρέξτε στον οδηγό χρήσης των πλατφόρµων Dako Automated Link για επιπρόσθετες πληροφορίες. ιάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) Ετοιµάστε το διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου στις φιάλες που γεµίζονται από τον χρήστη προσθέτοντας 25 µl DAB Chromogen για κάθε 1 ml DAB Substrate Buffer και αναµίξτε. Το παρασκευασµένο διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) παραµένει σταθερό επί 5 ηµέρες περίπου, όταν φυλάσσεται στους 2 8 C. Το διάλυµα αυτό πρέπει να αναµειγνύεται σχολαστικά πριν από τη χρήση. Τυχόν ίζηµα που έχει σχηµατιστεί στο διάλυµα δεν επηρεάζει δυσµενώς την ποιότητα της χρώσης. Η φιάλη που γεµίζεται από τον χρήστη και περιέχει ανακατεµένο διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου πρέπει να καθοριστεί στην πλατφόρµα Dako Automated Link πριν την χρήση. Ανατρέξτε στον οδηγό χρήσης των πλατφόρµων Dako Automated Link για επιπρόσθετες πληροφορίες. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το χρώµα του DAB Chromogen µπορεί να ποικίλει από διαυγές έως ανοιχτό µοβ-καφέ. Αυτό δεν επηρεάζει την απόδοση του προϊόντος. Αραιώστε σύµφωνα µε τις οδηγίες του ένθετου της συσκευασίας. Τυχόν προσθήκη περίσσειας χρωµογόνου DAB στο ρυθµισµένο υπόστρωµα DAB θα έχει ως αποτέλεσµα την αλλοίωση του θετικού σήµατος. Επίχρωση Το έγχρωµο τελικό προϊόν της αντίδρασης χρώσης DAB διαλύεται στην αλκοόλη και το νερό. Hematoxylin για αυτοµατοποιηµένες πλατφόρµες Link (κωδικός SK308) µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως αντίχρωση. Τα απαιτούµενα βήµατα και οι χρόνοι επώασης έχουν προγραµµατιστεί εκ των προτέρων στο λογισµικό του Dako Link. εν απαιτείται προετοιµασία αντιδραστηρίων. Υλικό στερέωσης Συνιστάται µη υδατικό µέσο µόνιµης επικάλυψης. Ωστόσο, και η χρήση υδατικού υλικού στερέωσης είναι επίσης αποδεκτή. Για υδατική επικάλυψη συνιστώνται τα Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Readyto-Use (κωδικός S3025) ή Dako Glycergel Mounting Medium (κωδικός C0563). Υγροποιήστε το Glycergel µε θέρµανση στους 40 (±5) C περίπου, πριν από τη χρήση. ιαδικασία χρώσης- Μαστός Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία Πριν από τη χρήση, ο χρήστης οφείλει να διαβάσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί µε όλα τα εξαρτήµατα και τον εξοπλισµό (βλ. ενότητα Προφυλάξεις ). Κατά τη διαδικασία της χρώσης, ανά πάσα στιγµή µην αφήνετε τις τοµές των ιστών να στεγνώσουν. Οι στεγνωµένες ιστικές τοµές ενδέχεται να εµφανίζουν αυξηµένη µη ειδική χρώση. Όλα τα απαιτούµενα βήµατα και χρόνοι επώασης για χρώση έχουν προγραµµατιστεί εκ των προτέρων στο λογισµικό του Dako Link. Για οδηγίες σχετικά µε τον προγραµµατισµό των πρωτοκόλλων και τη φόρτωση των αντικειµενοφόρων πλακών και των αντιδραστηρίων, ανατρέξτε στον Οδηγό χρήσης των πλατφόρµων Dako Automated Link. Εάν χρειαστεί να διακόψετε τη διαδικασία χρώσης, οι αντικειµενοφόροι πλάκες είναι δυνατό να φυλαχθούν σε λουτρό ρυθµιστικού διαλύµατος µετά από την επώαση µε το πρωτεύον αντίσωµα επί 1 ώρα το πολύ σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) χωρίς να επηρεαστεί δυσµενώς η απόδοση της χρώσης. Αποπαραφίνωση και επανυδάτωση Πριν από τη χρώση, πρέπει να αφαιρεθεί η παραφίνη από τις αντικειµενοφόρους πλάκες ιστών για την αποµάκρυνση του υλικού ενσωµάτωσης. Στη συνέχεια, οι πλάκες πρέπει να επανυδατωθούν. Αποφεύγετε την ατελή αφαίρεση της παραφίνης. Το υπολειµµατικό µέσο ενσωµάτωσης θα έχει ως αποτέλεσµα αυξηµένη µη ειδική χρώση. Το βήµα αυτό πρέπει να εκτελείται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). 1. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους σε λουτρό ξυλενίου και επωάστε επί 5 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 2. Κτυπήστε ελαφρά τις αντικειµενοφόρους πλάκες για να αποµακρύνετε την περίσσεια υγρού και κατόπιν τοποθετήστε τις µέσα σε απόλυτη αιθανόλη επί 3 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 3. Κτυπήστε ελαφρά τις αντικειµενοφόρους πλάκες για να αποµακρύνετε την περίσσεια υγρού και κατόπιν τοποθετήστε τις µέσα σε αιθανόλη κατά 95% επί 3(±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 4. Κτυπήστε ελαφρά τις αντικειµενοφόρους πλάκες για να αποµακρύνετε την περίσσεια υγρού και κατόπιν τοποθετήστε τις µέσα σε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό επί 30 δευτερόλεπτα τουλάχιστον. Ξεκινήστε τη διαδικασία χρώσης όπως αυτή περιγράφεται στο πρωτόκολλο χρώσης στο ανάκτηση επιτόπων. Τα διαλύµατα ξυλενίου και αλκοόλης πρέπει να αντικαθίστανται κάθε 40 αντικειµενοφόρους πλάκες. Στη θέση του ξυλενίου µπορούν να χρησιµοποιηθούν υποκατάστατα τολουενίου και ξυλενίου, όπως είναι το Histoclear. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται στο κιτ αυτό έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή µεταβολή των θερµοκρασιών επώασης ενδέχεται να δώσει εσφαλµένα ή ασύµφωνα αποτελέσµατα. Τυχόν διαφορές στην επεξεργασία και στις τεχνικές διαδικασίες στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να καταστήσει τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού µη έγκυρα για χρήση στην επιλογή ασθενών για θεραπεία µε Herceptin. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 10/42

11 Καρκίνος του µαστού Πρωτόκολλο χρώσης Όλα τα απαιτούµενα βήµατα και οι χρόνοι επώασης για τη χρώση έχουν προγραµµατιστεί εκ των προτέρων στο λογισµικό του Dako Automated Link. Μετά την αποπαραφίνωση, την επανυδάτωση, και την ανάκτηση επιτόπων το όργανο επεξεργάζεται τις αντικειµενοφόρους όπως περιγράφεται παρακάτω. Βήµα 1: Ανάκτηση επίτοπου Γεµίστε το δοχείο PT Link της Dako ή τα δοχεία χρώσης π.χ. τύπου Coplin, µε Epitope Retrieval Solution (βλ. Προετοιµασία αντιδραστηρίων). Για το PT Link της Dako: Προθερµάνετε το αραιωµένο Epitope Retrieval Solution στο δοχείο PT Link της Dako στους 85 C. Με τη θέρµανση, το διάλυµα ανάκτησης επιτόπου αποκτά νεφελώδη εµφάνιση. Τοποθετήστε τις αποπαραφινωµένες τοµές που βρίσκονται σε θερµοκρασία δωµατίου σε θήκες του αυτόµατου µηχανήµατος χρώσης και εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους στο προθερµασµένο Epitope Retrieval Solution. Αφήστε το Dako PT Link να ζεσταθεί έως τους 97 C και επωάστε επί 40 (±1) λεπτά στους 97 C. Αφήστε τις τοµές να κρυώσουν µέσα στο PT Link της Dako µέχρι τη θερµοκρασία των 85 C. Αφαιρέστε τα δοχεία PT Link που περιέχουν τις τοµές από το PT Link. Αφήστε τα δοχεία στο τραπέζι επί 10 λεπτά χωρίς το καπάκι για περαιτέρω ψύξη. Ξεπλύνετε τις τοµές µε Wash Buffer. Ανατρέξτε στον οδηγό χρήσης του Dako PT Link για περισσότερες πληροφορίες. Για δοχεία χρώσης τύπου Coplin: Τοποθετήστε τα δοχεία χρώσης που περιέχουν το αραιωµένο Epitope Retrieval Solution σε υδατόλουτρο. Θερµάνετε το υδατόλουτρο και το Epitope Retrieval Solution στους C. Με τη θέρµανση, το διάλυµα ανάκτησης επιτόπου αποκτά νεφελώδη εµφάνιση. Καλύψτε τα δοχεία µε το καπάκι τους, ώστε να σταθεροποιηθεί η θερµοκρασία και να αποφευχθεί η εξάτµιση. Βυθίστε τις τοµές, από τις οποίες έχετε αφαιρέσει την παραφίνη και οι οποίες βρίσκονται σε θερµοκρασία δωµατίου, στο προθερµασµένο διάλυµα ανάκτησης επίτοπου των δοχείων χρώσης. Επαναφέρετε τη θερµοκρασία του υδατόλουτρου και του Epitope Retrieval Solution στους C. Επωάστε επί 40 (±1) λεπτά στους C. Αφαιρέστε από το υδατόλουτρο ολόκληρο το δοχείο χρώσης, µαζί µε τις αντικειµενοφόρους. Αφήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες να κρυώσουν µέσα στο διάλυµα ανάκτησης επίτοπου επί 20 (±1) λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Αδειάστε το Epitope Retrieval Solution και ξεπλύνετε τις τοµές στο Wash Buffer. Για βέλτιστη απόδοση, µετά την ανάκτηση του επιτόπου και πριν από τη χρώση, αφήστε τις τοµές επί 5 λεπτά µέσα σε Wash Buffer. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου είναι σχεδιασµένο για µία µόνο χρήση. Μην το επαναχρησιµοποιείτε. Βήµα 2: ιαδικασία χρώσης Μετά την ανάκτηση του επιτόπου, οι αντικειµενοφόροι που έχουν τοποθετηθεί στα ράφια του οργάνου τοποθετούνται στις πλατφόρµες χρώσης Dako Automated Link. Το όργανο διεξάγει τη διαδικασία χρώσης χρησιµοποιώντας το κατάλληλο αντιδραστήριο, παρακολουθώντας το χρόνο επώασης και εκπλύνοντας τις αντικειµενοφόρους ανάµεσα σε διαδοχικά αντιδραστήρια. Οι χρόνοι επώασης του αντιδραστηρίου έχουν προγραµµατιστεί εκ των προτέρων στο λογισµικό του Dako Link. Βήµα 3: Επίχρωση Οι αντικειµενοφόροι µπορούν να αντιχρωµατιστούν µε τις Hematoxylin for Automated Link Platforms (κωδικός SK308). Υπάρχουν 2 πρωτόκολλα χρώσης που παρέχονται στο λογισµικό του Dako. Το πρώτο περιλαµβάνει και το δεύτερο δεν περιλαµβάνει αντίχρωση αιµατοξυλίνης. Ο χρόνος επώασης της αιµατοξυλίνης έχει προγραµµατιστεί εκ των προτέρων στο πρωτόκολλο που περιλαµβάνει αντίχρωση. Ανατρέξτε στον Οδηγό χρήσης του Dako Automated Link Staining System για περαιτέρω πληροφορίες για προγραµµατισµό των πρωτοκόλλων. Βήµα 4: Στερέωση Συνιστάται η χρήση µη υδατικού υλικού µόνιµης στερέωσης. Ωστόσο, και η χρήση υδατικού υλικού στερέωσης είναι επίσης αποδεκτή. Τα δείγµατα µπορούν να επικαλυφθούν και να καλυφθούν µε καλυπτρίδα µε υδατικό µέσο επικάλυψης, όπως το Dako Faramount (κωδικός S3025), ή το Dako Glycergel (κωδικός C0563). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η ανάγνωση των αντικειµενοφόρων πλακών είναι δυνατό να γίνει σε βολικό για σας χρόνο. Ωστόσο, εάν οι αντικειµενοφόροι πλάκες έχουν καλυφθεί µε καλυπτρίδα µε χρήση υδατικού υλικού στερέωσης και εκτεθούν σε έντονο φως επί χρονικό διάστηµα µίας εβδοµάδας, ενδέχεται να λάβει χώρα ξεθώριασµα σε κάποιο βαθµό. Για την ελαχιστοποίηση του ξεθωριάσµατος, φυλάσσετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στο σκοτάδι σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Έλεγχος Ποιότητας - Μαστός Τυχόν διαφορές στην καθήλωση, την επεξεργασία και την ενσωµάτωση των ιστών στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να οδηγήσει σε σηµαντική διακύµανση των αποτελεσµάτων, τέτοια που να χρειάζεται η τακτική εκτέλεση εσωτερικών ελέγχων εκτός των αντικειµενοφόρων πλακών µάρτυρα που παρέχονται από την Dako. τις Η.Π.Α., για πρόσθετες πληροφορίες, ανατρέξτε στις κατευθυντήριες οδηγίες ποιοτικού ελέγχου του προγράµµατος πιστοποίησης ανοσοκυτταροχηµείας του Κολεγίου Αµερικανών Παθολόγων (College of American Pathologists, CAP), την εγκεκριµένη κατευθυντήρια οδηγία (23) περί διασφάλισης ποιότητας στην ανοσοκυτταροχηµεία της CLSI (πρώην NCCLS) και τη βιβλιογραφική αναφορά 24. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 11/42

12 Καρκίνος του µαστού Πίνακας 1: Ο σκοπός του ηµερήσιου ποιοτικού ελέγχου. Ιστός: καθηλωµένος και επεξεργασµένος όπως τα δείγµατα ασθενών Θετικός µάρτυρας: Ιστός ή κύτταρα που περιέχουν το αντιγόνο-στόχος προς ανίχνευση (είναι δυνατό να βρίσκεται στον ιστό ασθενούς). Ο ιδανικός µάρτυρας είναι ασθενώς θετικός ιστός χρώσης, επειδή αυτός είναι ο πλέον ευαίσθητος στη διάσπαση αντισώµατος ή αντιγόνου Αρνητικός µάρτυρας: Ιστοί ή κύτταρα που αναµένονται να είναι αρνητικοί (είναι δυνατό να βρίσκονται στον ιστό ασθενούς ή στον ιστό θετικού µάρτυρα) Ιστός ασθενούς Αντικειµενοφόρος πλάκα που παρέχεται από την Dako Σύστηµα ειδικού αντισώµατος & ανίχνευσης Ελέγχει όλα τα στάδια της ανάλυσης. Επικυρώνει τα χρησιµοποιούµενα αντιδραστήρια και τις διαδικασίες που εφαρµόζονται για τη χρώση πρωτεΐνης HER2 Ανίχνευση µη επιδιωκόµενης διασταυρούµενης αντίδρασης αντισώµατος µε κύτταρα ή κυτταρικά συστατικά Ανίχνευση ειδικής χρώσης φόντου Ελέγχει µόνον τη διαδικασία χρώσης Μη ειδικό αντίσωµα* ή σύστηµα ανίχνευσης ρυθµιστικού διαλύµατος συν το ίδιο όπως χρησιµοποιείται µε το ειδικό αντίσωµα Ανίχνευση µη ειδικής χρώσης φόντου Ανίχνευση µη ειδικής χρώσης φόντου Ανίχνευση µη ειδικής χρώσης φόντου * Ορός από τα ίδια είδη µε το ειδικό αντίσωµα, αλλά µη κατευθυνόµενος ενάντια του ίδιου αντιγόνου-στόχο. Για την ανίχνευση µη ειδικής σύνδεσης αντιγόνου, π.χ. δέσµευση του τµήµατος Fc του αντιγόνου από τον ιστό. Αντικειµενοφόρος-µάρτυρας (παρέχεται) Καθεµιά από τις παρεχόµενες αντικειµενοφόρους πλάκες µάρτυρα περιέχει τρεις κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του µαστού, καθηλωµένες σε φορµαλίνη και ενσωµατωµένες σε παραφίνη, σε µορφή ιζήµατος, µε βαθµολογία έντασης χρώσης 0, 1+ και 3+. Σε κάθε ανάλυση χρώσης, µία αντικειµενοφόρος πλάκα πρέπει να υποβάλλεται σε χρώση. Με την αξιολόγηση των κυτταρικών σειρών της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα που παρέχεται από την Dako υποδεικνύεται η εγκυρότητα της ανάλυσης χρώσης. Ιστός θετικού µάρτυρα Οι µάρτυρες πρέπει να είναι νωπά δείγµατα αυτοψίας, βιοψίας ή χειρουργικά, τα οποία έχουν υποβληθεί σε καθήλωση, επεξεργασία και ενσωµάτωση στον ελάχιστο δυνατό χρόνο και µε τον ίδιο τρόπο όπως και το(α) δείγµα(τα) ασθενών. Οι ιστοί θετικού µάρτυρα υποδεικνύουν την ορθότητα της προετοιµασίας των ιστών και των τεχνικών χρώσης. Σε κάθε ανάλυση χρώσης, πρέπει να περιλαµβάνεται ένας ιστός θετικού µάρτυρα για κάθε σύνολο συνθηκών εξέτασης. Οι ιστοί θετικού µάρτυρα πρέπει να δίνουν ασθενώς θετική χρώση, προκειµένου να επιτρέπουν την ανίχνευση ακόµη και ανεπαίσθητων µεταβολών της ευαισθησίας του πρωτεύοντος αντισώµατος. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα που παρέχονται µαζί µε το κιτ αυτό ή τυχόν δείγµατα που υποβάλλονται σε επεξεργασία διαφορετική από το(α) δείγµα(τα) ασθενών επικυρώνουν µόνον την απόδοση των αντιδραστηρίων και δεν επαληθεύουν την ορθότητα της προετοιµασίας των ιστών. Ως ιδανικό ιστό θετικού µάρτυρα, χρησιµοποιήστε ανθρώπινο ιστό διηθητικού καρκινώµατος του µαστού που παρουσιάζει υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2, ο οποίος έχει υποβληθεί στο παρελθόν σε προσδιορισµό και έχει δώσει αποτέλεσµα 2+. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Γνωστός ιστός θετικού µάρτυρα πρέπει να χρησιµοποιείται µόνον για λόγους παρακολούθησης της ορθής απόδοσης των επεξεργασµένων ιστών και των αντιδραστηρίων εξέτασης και ΟΧΙ ως επικουρικό µέσο διατύπωσης ειδικής διάγνωσης δειγµάτων ασθενών. Εάν ο ιστός θετικού µάρτυρα δεν παρουσιάζει ορθή θετική χρώση, τα αποτελέσµατα για τα δείγµατα ασθενών πρέπει να θεωρούνται µη έγκυρα. Ιστός αρνητικού µάρτυρα Χρησιµοποιήστε ιστό αρνητικού µάρτυρα (γνωστού ως αρνητικού στην πρωτεΐνη HER2), καθηλωµένο, επεξεργασµένο και ενσωµατωµένο µε τρόπο πανοµοιότυπο µε το(α) δείγµα(τα) ασθενών, σε κάθε ανάλυση χρώσης για επαλήθευση της ειδικότητας του πρωτεύοντος αντισώµατος και την παροχή ένδειξης ειδικής χρώσης φόντου. Κατάλληλος για χρήση ως ιστός αρνητικού µάρτυρα είναι ιστός του κόλου, του ήπατος ή του θυρεοειδούς. Η ποικιλία διαφορετικών τύπων κυττάρων, που υπάρχει στις περισσότερες ιστικές τοµές, προσφέρει εσωτερικές θέσεις αρνητικού µάρτυρα (αυτό θα πρέπει να επαληθεύεται από το χρήστη). Φυσιολογικοί πόροι µαστού είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν ως εσωτερικοί αρνητικοί µάρτυρες. Εάν λάβει χώρα ειδική χρώση στον ιστό αρνητικού µάρτυρα ή στον ιστό εσωτερικού αρνητικού µάρτυρα, τα αποτελέσµατα για τα δείγµατα ασθενών θα πρέπει να θεωρηθούν µη έγκυρα και η εξέταση πρέπει να επανεκτελεστεί. Ανατρέξτε στον Οδηγό χρήσης της πλατφόρµας Dako Automated Link για περαιτέρω πληροφορίες για προγραµµατισµό των αντικειµενοφόρων-µαρτύρων. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 12/42

13 Καρκίνος του µαστού Μη ειδικό αρνητικό αντιδραστήριο µάρτυρας Χρησιµοποιήστε το παρεχόµενο αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα αντί του πρωτεύοντος αντισώµατος, σε µια τοµή από κάθε δείγµα ασθενούς, για την αξιολόγηση µη ειδικής χρώσης και τη διευκόλυνση της ερµηνείας της ειδικής χρώσης στη θέση του αντιγόνου. Η περίοδος επώασης για το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα πρέπει να αντιστοιχεί σε εκείνη του πρωτεύοντος αντισώµατος. Επαλήθευση δοκιµασίας Πριν το σύστηµα χρώσης χρησιµοποιηθεί σε διαγνωστικές διαδικασίες, ο χρήστης πρέπει να επαληθεύσει την απόδοση της δοκιµασίας, εξετάζοντάς την µε µια σειρά ιστών του εργαστηρίου που έχουν γνωστά χαρακτηριστικά απόδοσης σε τεχνικές IHC και οι οποίοι να αντιπροσωπεύουν γνωστούς θετικούς και αρνητικούς ιστούς. Για πρόσθετες πληροφορίες, ανατρέξτε στις κατευθυντήριες οδηγίες ποιοτικού ελέγχου που περιγράφηκαν παραπάνω στην ενότητα αυτή του ένθετου προϊόντος και στις απαιτήσεις ποιοτικού ελέγχου του προγράµµατος πιστοποίησης ανοσοκυτταροχηµείας του Κολεγίου Αµερικανών Παθολόγων (College of American Pathologists, CAP) ή/και την εγκεκριµένη κατευθυντήρια οδηγία (23) περί διασφάλισης ποιότητας στην ανοσοκυτταροχηµεία της CLSI (πρώην NCCLS). Αυτές οι διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου πρέπει να επαναλαµβάνονται για κάθε νέα παρτίδα αντισώµατος ή σε κάθε περίπτωση µεταβολής των παραµέτρων του προσδιορισµού. Καρκινώµατα του µαστού µε γνωστή ένταση χρώσης πρωτεΐνης HER2 που κυµαίνεται µεταξύ 0 και 3+, καθώς και αρνητικοί ιστοί, π.χ. του κόλου, του ήπατος ή του θυρεοειδούς, είναι κατάλληλοι για την επαλήθευση του προσδιορισµού. Ερµηνεία χρώσης - Μαστός Για τον προσδιορισµό της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης HER2, µόνον η ένταση και το σχήµα χρώσης της µεµβράνης πρέπει να αξιολογούνται µε την κλίµακα του Πίνακα 2. Η αξιολόγηση των αντικειµενοφόρων πλακών πρέπει να εκτελείται από παθολόγο µε τη βοήθεια µικροσκοπίου φωτός. Για την αξιολόγηση της ανοσοκυτταροχηµικής χρώσης και βαθµολογίας, κρίνεται κατάλληλη η χρήση αντικειµενικού φακού µεγέθυνσης 10x. Η χρήση αντικειµενικού φακού µεγέθυνσης 20 40x είναι χρήσιµη για την επιβεβαίωση της βαθµολογίας. Η χρώση του κυτταροπλάσµατος πρέπει να θεωρείται ως µη ειδική χρώση και δεν πρέπει να περιλαµβάνεται στην αξιολόγηση της έντασης χρώσης της µεµβράνης (8). Προς διευκόλυνση της διάκρισης ανάµεσα στις χρώσεις έντασης 0, 1+, 2+ και 3+, ανατρέξτε στο έγγραφο HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer (Εγχειρίδιο ερµηνειών HercepTest - Καρκίνος του µαστού) της Dako, όπου περιλαµβάνονται αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες διαφόρων εντάσεων χρώσης. Μόνο δείγµατα από ασθενείς που πάσχουν από διηθητικό καρκίνωµα του µαστού πρέπει να βαθµολογούνται. Σε περιπτώσεις µε καρκίνωµα in situ και διηθητικό καρκίνωµα στο ίδιο δείγµα, µόνον το διηθητικό συστατικό πρέπει να βαθµολογείται. Πίνακας 2: Κριτήρια έντασης χρώσης κυτταρικής µεµβράνης. Σχήµα χρώσης εν παρατηρείται καµία χρώση ή παρατηρείται χρώση µεµβράνης σε λιγότερα από το 10% των κυττάρων του όγκου Παρατηρείται ελαφριά, µόλις και µετά βίας αντιληπτή χρώση µεµβράνης σε περισσότερα από το 10% των κυττάρων του όγκου. Η χρώση των κυττάρων λαµβάνει χώρα µόνο σε ένα µέρος της µεµβράνης τους Παρατηρείται ασθενής έως µέτρια πλήρης χρώση µεµβράνης σε περισσότερα από το 10% των κυττάρων του όγκου Παρατηρείται έντονη πλήρης χρώση µεµβράνης σε περισσότερα από το 10% των κυττάρων του όγκου Βαθµολογία (να αναφερθεί στο θεράποντα ι τρό) Αποτίµηση υπερέκφρασης πρωτεΐνης HER2 (Αναφορά προς θεράποντα ιατρό) 0 Αρνητικό 1+ Αρνητικό 2+ Ασθενώς θετικό 3+ Έντονα θετικό Το HercepTest ερµηνεύεται ως αρνητικό (ένταση χρώσης 0 και 1+), ασθενώς θετικό (ένταση χρώσης 2+) και έντονα θετικό (ένταση χρώσης 3+) ως προς την υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2. Το HercepTest δεν προορίζεται για την παροχή προγνωστικών πληροφοριών στον ασθενή και στον ιατρό και δεν έχει επικυρωθεί για το σκοπό αυτό. Για κάθε ανάλυση χρώσης, οι αντικειµενοφόροι πλάκες πρέπει να εξετάζονται µε τη σειρά που αναφέρεται στον Πίνακα 3 για τον προσδιορισµό της εγκυρότητας της ανάλυσης χρώσης και την ηµιποσοτική αξιολόγηση της έντασης χρώσης στον ιστό του δείγµατος. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 13/42

14 Καρκίνος του µαστού Πίνακας 3: Σειρά αξιολόγησης αντικειµενοφόρων. Σειρά αξιολόγ σης των αντικειµενοφόρων πλακών 1. Αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα, που περιέχει τις τρεις κυτταρικές σειρές Αιτιολογία Παρουσία καστανής χρώσης κυτταρικής µεµβράνης 3+ (υπό µορφή στεφάνης) στην κυτταρική γραµµή µάρτυρα 3+ SK-BR-3, µερικώς φαιά στεφάνη στην κυτταρική γραµµή µάρτυρα 1+ MDA-175, και καµία χρώση στην κυτταρική γραµµή 0 MDA-231 φανερώνουν έγκυρη εξέταση. ιάστικτη και ασυνεχής χρώση µεµβράνης παρουσιάζεται σε ένα µικρό έως µέτριο αριθµό κυττάρων στην ασθενώς θετική κυτταρική σειρά- µάρτυρα 1+ MDA-175. Επίσης, διάστικτη ανοσοχρώση της περιοχής Golgi του κυτταροπλάσµατος µπορεί να παρατηρηθεί στη συγκεκριµένη κυτταρική σειρά. 2. Αντικειµενοφόρος πλάκα ιστού θετικού µάρτυρα 3. Αντικειµενοφόρος πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα 4. Αντικειµενοφόρος πλάκα µε ιστό ασθενούς κεχρωσµένο µε το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα 5. Αντικειµενοφόρος πλάκα µε ιστό ασθενούς κεχρωσµένο µε το πρωτεύον αντίσωµα Παρουσία καφέ χρώσης στο 0 Control Cell Line MDA-231 (αρνητικό για χρώση πρωτεΐνης HER2) υποδεικνύει ότι έλαβε χώρα µη ειδική χρώση κατά τον προσδιορισµό. Τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού ενδέχεται να µην είναι έγκυρα λόγω υπερβολικής χρώσης. Πρέπει να παρατηρηθεί παρουσία καφέ χρώσης µεµβράνης. Η χρώση του κυτταροπλάσµατος και των αρνητικών ιστών δεν πρέπει να υπερβαίνει το 1+. Η ΑΠΟΥΣΙΑ ειδικής χρώσης στην αντικειµενοφόρο πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα επιβεβαιώνει την απουσία διασταυρούµενης αντιδραστικότητας του κιτ µε κύτταρα ή κυτταρικά συστατικά. Εάν λάβει χώρα ειδική χρώση µεµβράνης στην αντικειµενοφόρο πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα, τα αποτελέσµατα για το δείγµα ασθενούς πρέπει να θεωρηθούν µη έγκυρα. Έλλειψη ειδικής µεµβρανικής χρώσης επαληθεύει την ειδική σήµανση του αντιγόνου-στόχου µε το κύριο αντίσωµα. Καστανή ή καστανόχρωµη χρώση που εµφανίζεται στο κυτταρόπλασµα του δείγµατος που έχει υποβληθεί σε επεξεργασία µε το αντιδραστήριο αρνητικό-µάρτυρα, όπως σε συνδετικό ιστό, λευκοκύτταρα, ερυθροκύτταρα, ή νεκρωτικό ιστό, πρέπει να θεωρείται µη ειδική χρώση υποβάθρου και να αναφέρεται στα σχόλια του φύλλου δεδοµένων. Όταν στο δείγµα ανιχνευθεί υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2, εµφανίζεται ως καστανόχρωµη στεφάνη εντοπισµένη στην κυτταρική µεµβράνη των κυττάρων όγκου που υπεβλήθησαν σε θεραπεία µε το πρωτοταγές αντίσωµα. 1. Αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα (παρέχεται): Η αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα, που είναι κεχρωσµένη µε HercepTest, πρέπει να εξετάζεται πρώτη προς επιβεβαίωση ότι όλα τα αντιδραστήρια λειτουργούν κανονικά. Η παρουσία καφέ προϊόντος αντίδρασης (3,3 -διαµινοβενζιδίνη, DAB) στην κυτταρική µεµβράνη υποδεικνύει θετική αντιδραστικότητα. Η παρουσία καφέ χρώσης κυτταρικής µεµβράνης (περιφερειακή χρώση) στο 3+ Control Cell Line SK-BR-3, µερικώς καφέ περιφερειακή χρώση στο 1+ Control Cell Line MDA-175 και καµία χρώση στο 0 Control Cell Line MDA-231 υποδεικνύουν έναν έγκυρο προσδιορισµό. Εάν οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές µάρτυρα δεν πληρούν τα κριτήρια αυτά, όλα τα αποτελέσµατα για τα δείγµατα ασθενών πρέπει να θεωρούνται µη έγκυρα. 2. Αντικειµενοφόρος πλάκα ιστού θετικού µάρτυρα: Αµέσως, µετά πρέπει να εξεταστεί η αντικειµενοφόρος πλάκα µε τον ιστό θετικού µάρτυρα. Αυτή η αντικειµενοφόρος πλάκα επαληθεύει ότι η µέθοδος καθήλωσης και η διαδικασία ανάκτησης επίτοπου είναι αποτελεσµατικές. Χρησιµοποιείτε άθικτα κύτταρα για την ερµηνεία των αποτελεσµάτων χρώσης, διότι τα νεκρωτικά ή εκφυλισµένα κύτταρα συχνά παρουσιάζουν µη ειδική χρώση (25). Η χρώση πρέπει να παρατηρείται στον ιστό του όγκου µε τη µορφή καφέ χρώσης κυτταρικής µεµβράνης. Η καφέ χρώση του κυτταροπλάσµατος και των αρνητικών ιστών στο δείγµα δεν πρέπει να υπερβαίνει τη βαθµολογία έντασης χρώσης του Ιστός αρνητικού µάρτυρα: Η αντικειµενοφόρος πλάκα µε τον ιστό αρνητικού µάρτυρα πρέπει να εξεταστεί αµέσως µετά, για επαλήθευση της ειδικότητας της σήµανσης του αντιγόνου-στόχου από το πρωτεύον αντίσωµα. Η απουσία ειδικής χρώσης στην αντικειµενοφόρο πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα επιβεβαιώνει την απουσία διασταυρούµενης αντιδραστικότητας του κιτ µε κύτταρα ή κυτταρικά συστατικά. Εάν λάβει χώρα ειδική χρώση στον ιστό αρνητικού µάρτυρα, τα αποτελέσµατα για το δείγµα ασθενούς πρέπει να θεωρηθούν µη έγκυρα. Εναλλακτικά, µπορείτε να χρησιµοποιήσετε αρνητικά µέρη του ιστού θετικού µάρτυρα ως ιστό αρνητικού µάρτυρα, αλλά αυτό πρέπει να επαληθευτεί από το χρήστη. Σηµειώστε ότι ασθενής αντίδραση (ένταση χρώσης 0 1+) µπορεί να παρατηρηθεί στους περισσότερους κανονικούς επιθηλιακούς ιστούς. Στους πιθανούς ιστούς αρνητικού µάρτυρα περιλαµβάνονται ιστοί από τα παρακάτω σηµεία: κόλον, ήπαρ και θυρεοειδής. Η µη ειδική χρώση, εάν υπάρχει, θα έχει διάχυτη όψη. Ενδέχεται επίσης να παρατηρηθεί σποραδική χρώση συνδετικού ιστού σε τοµές από ιστούς υπερβολικά καθηλωµένους σε φορµαλίνη. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 14/42

15 Καρκίνος του µαστού Ιστός ασθενή: Τελευταία εξετάζονται τα δείγµατα ασθενών, που είναι κεχρωσµένα µε HercepTest. Θα πρέπει να διαπιστωθεί θετική χρώση, ενδεχοµένως εντός µη ειδικής χρώσης φόντου του αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα. Όπως συµβαίνει µε κάθε ανοσοκυτταροχηµική εξέταση, ένα αρνητικό αποτέλεσµα σηµαίνει ότι δεν ανιχνεύτηκε αντιγόνο και όχι ότι δεν υπήρχε αντιγόνο στα κύτταρα ή στον ιστό που υποβλήθηκε στον προσδιορισµό. Για πιο συγκεκριµένες πληροφορίες σχετικά µε την ανοσοδραστικότητα του HercepTest ανατρέξτε στις ενότητες Περίληψη και επεξήγηση, Περιορισµοί και Χαρακτηριστικά απόδοσης. Πρόσθετες συστάσεις για την ερµηνεία χρώσης HercepTest Τα περισσότερα µεταστατικά καρκινώµατα του µαστού που υποβάλλονται σε εξέταση υπερέκφρασης της πρωτεΐνης HER2 βαθµολογούνται στην κλίµακα 0 έως 3+. Παρ' ότι η πλειοψηφία των περιπτώσεων αυτών είναι πέραν πάσης αµφιβολίας, ένα µικρό ποσοστό των υπόλοιπων δειγµάτων 1+ και 2+ ενδέχεται να παρουσιάζει µεγαλύτερη δυσκολία στην ερµηνεία. Για την ερµηνεία της χρώσης HercepTest στο εργαστήριό σας, εφαρµόστε τις παρακάτω κατευθυντήριες οδηγίες. 1. Για να επαληθεύσετε την απόδοση του προσδιορισµού, αξιολογήστε τις κυτταρικές σειρές µάρτυρα. 2. Αξιολογήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες θετικού και αρνητικού µάρτυρα. 3. Για την πρώτη αξιολόγηση, συνιστάται χρώση αιµατοξυλίνης και ηωσίνης (H&E) του ιστικού δείγµατος. (Ο όγκος ενδέχεται να µην είναι εµφανής όταν παρατηρείτε το κεχρωσµένο µε HercepTest δείγµα. Αντικειµενοφόρος που χρωµατίστηκε µε H&E απαιτείται προκειµένου ο παθολόγος να επαληθεύσει την παρουσία του όγκου.) Το HercepTest πρέπει να διεξάγεται σε τοµές κατά ζεύγη (σειριακές τοµές) από το ίδιο µπλοκ παραφίνης του δείγµατος. 4. Αξιολογήστε πρώτα τις κεχρωσµένες για υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 τοµές χαµηλής βαθµολογίας. Η πλειοψηφία των θετικών περιπτώσεων θα είναι προφανής σε µικρή µεγέθυνση. 5. Πρέπει να χρησιµοποιηθούν οι καλοδιατηρηµένες και καλά κεχρωσµένες περιοχές του δείγµατος, για τον εντοπισµό των επί τοις εκατό θετικών κυττάρων όγκου. 6. Γενικά, η βαθµολογία των περιπτώσεων θα πρέπει να είναι προφανής σε µικρή µεγέθυνση. Εάν η διάκριση µεταξύ των οριακών περιπτώσεων 1+/2+ είναι δύσκολη σε µικρή µεγέθυνση, η βαθµολογία συνήθως είναι Για επαλήθευση της µεµβρανικής χρώσης, χρησιµοποιήστε αντικειµενικό φακό µε µεγέθυνση 20 40x. 8. Εάν η πλειοψηφία των κυττάρων του όγκου παρουσιάζουν πλήρη χρώση µεµβράνης, η βαθµολογία χρώσης είναι είτε 2+ είτε 3+. Για την επιβεβαίωση της βαθµολογίας, χρησιµοποιήστε αντικειµενικό φακό µεγέθυνσης 20 40x. 9. Στην πλειοψηφία των περιπτώσεων 3+, ένα 80% τουλάχιστον των κυττάρων του όγκου είναι κεχρωσµένα και η χρώση µεµβράνης είναι έντονη. 10. Εάν το δείγµα είναι κοντά στο όριο του 10% θετικών κυττάρων του όγκου, συνιστάται η καταµέτρηση 100 κυττάρων του όγκου κατ' ελάχιστον για τον προσδιορισµό του επί τοις εκατό ποσοστού των κεχρωσµένων κυττάρων. 11. Εάν διαπιστωθεί πλήρης χρώση µεµβράνης ασθενούς έως µέτριας έντασης σε ποσοστό µεγαλύτερο του 10% των κυττάρων του όγκου, η βαθµολογία του δείγµατος είναι 2+. Αυτό συνοδεύεται συνήθως µε ατελή χρώση µεµβράνης για την πλειοψηφία των υπόλοιπων κυττάρων του όγκου. 12. Εάν λιγότερα από το 10% των κυττάρων του όγκου παρουσιάζουν πλήρη περιφερειακή χρώση µεµβράνης, παρ' ότι άλλα κύτταρα του όγκου ενδέχεται να παρουσιάζουν ατελή χρώση µεµβράνης, η βαθµολογία είναι Εάν λιγότερα από το 10% των κυττάρων του όγκου παρουσιάζουν πλήρη ή ατελή περιφερειακή χρώση µεµβράνης, η βαθµολογία είναι 0. Γενικοί περιορισµοί - Μαστός 1. Η ανοσοκυτταροχηµεία είναι µια πολυβάθµια διαγνωστική διαδικασία για την οποία απαιτείται εξειδικευµένη εκπαίδευση στην επιλογή των κατάλληλων αντιδραστηρίων, την επιλογή, καθήλωση και επεξεργασία των ιστών, την προετοιµασία της αντικειµενοφόρου πλάκας ανοσοκυτταροχηµείας και την ερµηνεία των αποτελεσµάτων χρώσης. 2. Η ιστική χρώση εξαρτάται από το χειρισµό και την επεξεργασία του ιστού πριν από τη χρώση. Τυχόν εσφαλµένη καθήλωση, κατάψυξη, απόψυξη, πλύση, ξήρανση, θέρµανση, τοµή ή µόλυνση από άλλους ιστούς ή υγρά είναι δυνατό να προκαλέσει τεχνήµατα, παγίδευση αντισώµατος ή εσφαλµένως αρνητικά αποτελέσµατα. Τυχόν ασυνεπή αποτελέσµατα ενδέχεται να οφείλονται σε παραλλαγές των µεθόδων µονιµοποίησης και ενσωµάτωσης ή σε εγγενείς ανωµαλίες εντός του ιστού. 3. Τυχόν υπερβολική ή ατελής επίχρωση ενδέχεται να διακυβεύσει την ορθότητα της ερµηνείας των αποτελεσµάτων. 4. Η κλινική ερµηνεία τυχόν θετικής χρώσης ή η απουσία της πρέπει να αξιολογείται στα πλαίσια της κλινικής παρουσίασης, της µορφολογίας και άλλων ιστοπαθολογικών κριτηρίων. Η κλινική ερµηνεία οποιασδήποτε χρώσης ή η απουσία της πρέπει να συµπληρώνεται από µορφολογικές µελέτες και κατάλληλους ελέγχους, καθώς και άλλες διαγνωστικές εξετάσεις. Η ερµηνεία του κεχρωσµένου παρασκευάσµατος αποτελεί ευθύνη κατάλληλα εκπαιδευµένου παθολόγου, που είναι εξοικειωµένος µε τα χρησιµοποιούµενα αντισώµατα και αντιδραστήρια και τις εφαρµοζόµενες µεθόδους. Η χρώση πρέπει να εφαρµόζεται σε εργαστήριο που διαθέτει τις κατάλληλες πιστοποιήσεις και άδειες λειτουργίας, υπό την επίβλεψη παθολόγου που θα φέρει την ευθύνη της εξέτασης των κεχρωσµένων αντικειµενοφόρων πλακών και θα διασφαλίζει την επάρκεια των θετικών και των αρνητικών µαρτύρων. 5. Ιστοί από άτοµα µολυσµένα από τον ιό της ηπατίτιδας Β, που περιέχουν επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας B (HBsAg), ενδέχεται να παρουσιάσουν µη ειδική χρώση µε την υπεροξειδάση του χρένου (26). 6. Τα αντιδραστήρια ενδέχεται να προκαλέσουν απροσδόκητες αντιδράσεις σε τύπους ιστών που δεν έχουν υποβληθεί σε εξέταση στο παρελθόν. Η πιθανότητα να λάβουν χώρα απροσδόκητες αντιδράσεις ακόµη και σε τύπους ιστών που έχουν υποβληθεί σε εξέταση στο παρελθόν δεν είναι δυνατό να εξαλειφθεί τελείως, λόγω της βιολογικής παραλλακτικότητας της έκφρασης αντιγόνου στα νεοπλάσµατα ή σε άλλους παθολογικούς ιστούς (27). Επικοινωνήστε µε την τεχνική υποστήριξη της Dako µε πιστοποιηµένες µη αναµενόµενες αντιδράσεις. 7. Ψευδώς θετικά αποτελέσµατα είναι δυνατό να προκύψουν λόγω µη ανοσολογικής δέσµευσης πρωτεϊνών ή προϊόντων αντίδρασης του υποστρώµατος. Επίσης, είναι δυνατό να προκύψουν από δραστηριότητα ψευδουπεροξειδάσης (ερυθροκύτταρα) και ενδογενούς υπεροξειδάσης (κυτόχρωµα C) (27). 8. Η διαδικασία χρώσης πρέπει να διεξάγεται στην εκ των προτέρων προγραµµατισµένη θερµοκρασία (20 25 C). ( ) P04083GR_01_SK / σ. 15/42

16 Καρκίνος του µαστού Περιορισµοί ειδικοί για το προϊόν - Μαστός Χαρακτηριστικά απόδοσης - Μαστός 1. Το αντιγόνο που υπάρχει στο 1+ Control Cell Line MDA-175 υπόκειται σε αποδόµηση µε την πάροδο του χρόνου. Αξιολογείτε τα αποτελέσµατα της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα σε συνδυασµό µε την ηµεροµηνία λήξης της. Τυχόν αρνητική χρώση των κυττάρων του MDA-175 υποδεικνύει µόνον ότι η αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα ενδέχεται να έχει αλλοιωθεί. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα πρέπει να φυλάσσονται στους 2 8 C. 2. Ψευδώς αρνητικά αποτελέσµατα είναι δυνατό να οφείλονται στην αποδόµηση του αντιγόνου στους ιστούς µε την πάροδο του χρόνου. Τα δείγµατα πρέπει να χρωµατίζονται εντός 4 6 εβδοµάδων από την τοποθέτηση των ιστών στις αντικειµενοφόρους και όταν φυλάσσονται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) (28). 3. Μην αντικαθιστάτε αντιδραστήρια του κιτ µε αντιδραστήρια άλλων αριθµών παρτίδας ή άλλων κατασκευαστών. 4. Ψευδή αποτελέσµατα είναι δυνατό να ληφθούν από την αξιολόγηση κυτοπλασµατικής χρώσης. Κατά την ερµηνεία αποτελεσµάτων, να λαµβάνετε υπόψη σας µόνον την ένταση της χρώσης στην κυτταρική µεµβράνη. 5. Οι κεχρωσµένες αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα πρέπει να χρησιµοποιούνται µόνο για επικύρωση της ανάλυσης χρώσης και δεν πρέπει να χρησιµοποιούνται ως οδηγός βαθµολόγησης της αντίδρασης χρώσης σε ιστικές τοµές. 6. Περιστασιακά, είναι δυνατό να παρατηρηθεί έντονη εστιασµένη χρώση (3+), τα λεγόµενα θερµά σηµεία. Αυτό ενδέχεται να είναι αποτέλεσµα ανοµοιόµορφης καθήλωσης ή/και επεξεργασίας του ιστού. Στην περίπτωση αυτή, συνιστάται η ανοσοχρώση δεύτερου τεµαχίου ιστού από το ίδιο δείγµα. 7. Η εφαρµογή του HercepTest σε δείγµατα καθηλωµένα σε καθηλωτικά διαφορετικά από την ουδέτερα ρυθµισµένη φορµαλίνη ή το καθηλωτικό του Bouin δεν έχει επικυρωθεί. 8. Το φυσιολογικό επιθήλιο του ιστού του µαστού πρέπει να παρουσιάζει χρώση µεταξύ 0 και 1+. Εάν διαπιστωθεί χρώση µεγαλύτερη από 1+ στο φυσιολογικό επιθήλιο, η εξέταση πρέπει να επαναληφθεί. Σηµειώνεται ότι τα φυσιολογικά επιθήλια αµυγδαλών και οισοφάγου ενδέχεται να παρουσιάσουν χρώση έντασης µέχρι και 2+. Ιστορικό Ο προσδιορισµός κλινικής δοκιµής (Clinical Trial Assay, CTA) που εφαρµόστηκε για τον εντοπισµό κατάλληλων ασθενών για τις κλινικές µελέτες Herceptin προοριζόταν για διερευνητική χρήση και δεν είναι πλέον διαθέσιµος. Το HercepTest αναπτύχθηκε µε σκοπό να αποτελέσει µια συγκρίσιµη εναλλακτική λύση του CTA. Η ασφάλεια και η αποτελεσµατικότητα του Herceptin αξιολογήθηκαν σε µια τυχαιοποιηµένη ελεγχόµενη κλινική δοκιµή και σε µια µεγάλη δοκιµή ανοικτής σήµανσης (βλ. ένθετο συσκευασίας του Herceptin ). Όλοι οι ασθενείς που επελέγησαν για τις κλινικές δοκιµές του Herceptin παρουσίασαν υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2, όταν υποβλήθηκαν σε ανοσοκυτταροχηµικές εξετάσεις οι οποίες εκτελέστηκαν µαζί µε τον CTA σε κεντρικό εργαστήριο. Οι ασθενείς κρίθηκαν κατάλληλοι για αγωγή µε Herceptin εφ' όσον ο όγκος τους παρουσίαζε υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 επιπέδου 2+ ή 3+ (µε βάση την κλίµακα 0 έως 3+, όπου το 3+ αντιπροσώπευε το υψηλότερο επίπεδο). (2+). Η ανάλυση υποοµάδων των αποτελεσµάτων των µελετών αυτών υπέδειξε ότι οι ασθενείς των οποίων οι ιστοί είναι έντονα θετικοί (3+) ως προς την υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 ενδέχεται να ωφεληθούν περισσότερο από το Herceptin απ' ό,τι οι ασθενείς µε ασθενώς θετικούς ιστούς (2+). Ο βαθµός υπερέκφρασης της πρωτεΐνης HER2 αποτελεί δυνητικώς ένα σηµαντικό παράγοντα πρόβλεψης των επιπτώσεων της αγωγής µε Herceptin. Λόγω του γεγονότος ότι κανείς από τους ασθενείς στις µελέτες Herceptin δεν επελέγη µε το HercepTest, η συσχέτιση ανάµεσα στο βαθµό θετικότητας και την πιθανότητα κλινικού οφέλους από την αγωγή µε Herceptin είναι άγνωστη. Συγκριτικές µελέτες Για το χαρακτηρισµό του HercepTest, διενεργήθηκαν δύο µελέτες. 1) Σύγκριση µε τον προσδιορισµό κλινικής δοκιµής (CTA). 2) Ακρίβεια κατά τη σύγκριση µε πέντε επιπρόσθετους προσδιορισµούς. Σύγκριση µε τον προσδιορισµό κλινικής δοκιµής (CTA) Το HercepTest συγκρίθηκε µε το CTA που εφαρµόστηκε για τον εντοπισµό κατάλληλων ασθενών για αγωγή µε Herceptin, σε 274 δείγµατα ιστού µε καρκίνο του µαστού θετικά στην πρωτεΐνη HER2 (2+ ή 3+) και ισάριθµα αρνητικά στην πρωτεΐνη HER2. Στον Πίνακα 4 παρατίθενται τα αποτελέσµατα σε διάγραµµα 2 x 2, όπου οι βαθµολογίες 0 και 1+ θεωρήθηκαν αρνητικές, ενώ οι 2+ και 3+ θεωρήθηκαν θετικές. Πίνακας 4: Συµφωνία 2 x 2 του HercepTest µε την ανάλυση κλινικών δοκιµών (CTA) (αριθµός δειγµάτων). Ανάλυση κλινικών δοκιµών Θετική Αρνητική Σύνολο HercepTest Θετικό Αρνητικό Σύνολο Συµφωνία: ιάστηµα εµπιστοσύνης 95% ίσο µε 79% (76 82%). ( ) P04083GR_01_SK / σ. 16/42

17 Καρκίνος του µαστού Η συνολική δυαδική συµφωνία του HercepTest συγκρινόµενου µε το CTA ήταν 79% (431/548), µε αµφίπλευρο διάστηµα εµπιστοσύνης 95% ίσο µε 76 82%. Το είκοσι ένα τοις εκατό (21%) των αποτελεσµάτων παρουσίαζε διαφωνία ανάµεσα στις δύο αυτές µεθόδους. Τα αποτελέσµατα του HercepTest αναφέρθηκαν στην κλίµακα 0 έως +3 και ερµηνεύθηκαν ως αρνητικά (ένταση χρώσης 0 και 1+), ασθενώς θετικά (ένταση χρώσης 2+) και έντονα θετικά (ένταση χρώσης 3+) ως προς την υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2. Πίνακας 5: Συµφωνία 3 x 3 για το HercepTest και την ανάλυση κλινικών δοκιµών. Ανάλυση κλινικών δοκιµών Σύνολο HercepTest Σύνολο Αυτή η παρουσίαση 3 x 3 της µελέτης συµφωνίας δείχνει ότι ένα αποτέλεσµα 3+ µε το HercepTest είναι πολύ πιθανό να αντιστοιχεί σε θετικό αποτέλεσµα µε το CTA, γεγονός που πληροί τα κριτήρια εισαγωγής στη δοκιµή Herceptin (2+ ή 3+). Τα αποτελέσµατα 2+ µε το HercepTest δεν συσχετίζονταν το ίδιο καλά µε τα αποτελέσµατα µε το CTA. Το 42% περίπου (53/126) των αποτελεσµάτων 2+ µε το HercepTest αντιστοιχούσαν σε αρνητικά αποτελέσµατα µε το CTA (0-1+), γεγονός που δεν θα επέτρεπε την εισαγωγή στις κλινικές µελέτες µε Herceptin. Ακρίβεια Το HercepTest ελέγχθηκε επίσης σε δύο αντικειµενοφόρους πλάκες µικροσκοπίου µε τοµές ιστού ενσωµατωµένες σε παραφίνη, από 168 όγκους του µαστού. Οι όγκοι αυτοί είχαν ήδη χαρακτηριστεί µε 5 διαφορετικές µεθόδους προσδιορισµού της ενίσχυσης των γονιδίων HER2 και της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης HER2, τις εξής: εσωτερικό ανοσοαποτύπωµα Southern, υβριδίωση in situ µε φθορισµό (FISH) για την ενίσχυση του DNA, ανάλυση RNA ανοσοαποτυπώµατος Northern, ανοσοαποτύπωµα Western και ανοσοκυτταροχηµεία (ICC) σε κατεψυγµένους ιστούς (28). Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στον Πίνακα 6. Πίνακας 6: Σύγκριση του HercepTest µε τα συνδυασµένα αποτελέσµατα (OE) από εξετάσεις για γονιδιακή ενίσχυση και υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2. Κατάταξη αναφοράς OE + - Σύνολο HercepTest Συµφωνία θετικών: 43/69 = 62% Συµφωνία αρνητικών: 99/99 = 100% Σύνολο Τα αποτελέσµατα έδειξαν επίπεδο συµφωνίας 85% (142/168) (µε διάστηµα εµπιστοσύνης 95% ίσο µε 78 89%) ανάµεσα στην ένταση θετικής χρώσης (2+ και 3+) και την ένταση αρνητικής χρώσης (0 και 1+) µε το HercepTest. από τα δείγµατα που καταδείχθηκαν ως αρνητικά µε τις 5 διαφορετικές µεθόδους δεν καταδείχθηκε ως θετικό µε το HercepTest, ενώ τα συνδυασµένα αποτελέσµατα από τις 5 διαφορετικές µεθόδους έδειξαν υψηλότερο αριθµό θετικών περιπτώσεων. Αναπαραγωγιµότητα Επαναληψιµότητα εντός κύκλων Η αναπαραγωγιµότητα για τον ίδιο προσδιορισµό ελέγχθηκε σε ένα εργαστήριο µε 5 δείγµατα διαφορετικής βαθµολογίας έντασης χρώσης ICC. Κάθε δείγµα αναλύθηκε εις τριπλούν σε µασκαρισµένη τυχαιοποιηµένη µορφή. Το πρωτόκολλο αυτό εφαρµόστηκε σε αυτοµατοποιηµένη χρώση. Όλα τα δείγµατα έδωσαν 100% αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα. Επαναληψιµότητα µεταξύ κύκλων Η αναπαραγωγιµότητα µεταξύ διαφορετικών προσδιορισµών ελέγχθηκε σε τρία εργαστήρια κατά τη διάρκεια 4 ηµερών µε 5 δείγµατα διαφορετικής βαθµολογίας έντασης χρώσης ICC, τυχαιοποιηµένα και µασκαρισµένα σύµφωνα µε την αυτοµατοποιηµένη µεθοδολογία. ιαπιστώθηκε εξαιρετική αναπαραγωγιµότητα για τα θετικά σε σύγκριση µε τα αρνητικά αποτελέσµατα (0 και 1+ σε σύγκριση µε 2+ και 3+), µε εξαίρεση δύο δείγµατα σε ένα εργαστήριο, τα οποία κυµάνθηκαν µεταξύ 1+ και 2+. ιαπιστώθηκε αναπαραγωγιµότητα 100% για τα δείγµατα 2+ και 3+. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 17/42

18 Καρκίνος του µαστού Επαναληψιµότητα µεταξύ εργαστηρίων Η αναπαραγωγιµότητα µεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων ελέγχθηκε σε τρία γεωγραφικώς αποµονωµένα εργαστήρια, µε 40 πανοµοιότυπα τυχαιοποιηµένα και µασκαρισµένα δείγµατα ποικίλης βαθµολογίας έντασης χρώσης ICC. Φρεσκοπαρασκευασµένες αντικειµενοφόροι πλάκες προωθήθηκαν σε κάθε εργαστήριο ελέγχου για αυτοµατοποιηµένη χρώση και αξιολόγηση από παθολόγο. Η επί τοις εκατό ποσοστιαία συµφωνία µεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων κυµάνθηκε από 83% έως 90% για ένα διχοτοµικό προσδιορισµό θετικών/αρνητικών, όπου τα 0 και 1+ θεωρήθηκαν ως αρνητικά και τα 2+ και 3+ θεωρήθηκαν ως θετικά ως προς την υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2. Μετά από σύγκριση µε τα αποτελέσµατα που ελήφθησαν στο εργαστήριο αναφοράς που είχε εκτελέσει το CTA, ένα ποσοστό 12,5% (15/120) των συγκριτικών αποτελεσµάτων παρουσίασε διαφωνία ανάµεσα στον αρνητικό (0 ή 1+) και το θετικό (2+ ή 3+) προσδιορισµό. Ένα πρόσθετο 10% (12/120) παρουσίασε διαφωνία ανάµεσα στις βαθµολογίες 2+ και 3+. Ανοσοαντιδραστικότητα Ένα πρόσθετο 10% (12/120) παρουσίασε διαφωνία ανάµεσα στις βαθµολογίες 2+ και 3+. Όλοι οι ιστοί ήταν καθηλωµένοι στη φορµαλίνη και ενσωµατωµένη σε παραφίνη και είχαν υποβληθεί σε χρώση µε HercepTest σύµφωνα µε τις οδηγίες του ένθετου συσκευασίας. Πίνακας 7. Σύνοψη της αντιδραστικότητας του HercepTest µε φυσιολογικούς ιστούς. Τύπος ιστών (πλήθος εξετασθέντων) Επινεφρίδιο (3) Μυελός των οστών (3) Εγκέφαλος/Παρεγκεφαλίδα (3) Εγκέφαλος/Κύριο τµήµα εγκεφάλου (3) Μαστός (3) Τράχηλος της µήτρας (3) Κόλον (3) Οισοφάγος (3) Καρδιά (3) Νεφρός (3) Ήπαρ (3) Πνεύµονας (3) Μεσοθηλιακά κύτταρα (3) Ωοθήκη (3) Πάγκρεας (3) Παραθυρεοειδής (3) Περιφερικό νεύρο (3) Υπόφυση (3) Προστάτης (3) Σιελογόνος αδένας (3) Σκελετικός µυς (3) έρµα (3) Λεπτό έντερο (3) Σπλήνας (3) Στόµαχος (3) Όρχις (3) Θύµος αδένας (3) Θυρεοειδής (3) Αµυγδαλή (3) Μήτρα (3) Στοιχεία του ιστού µε θετική χρώση και σχήµα χρώσης Μαστικός αδένας (1/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+) Σωληνάρια του νεφρικού µυελού (3/3 ιστών, 1 2+ σε 5 50% των κυττάρων, κυτταροπλασµατικής) Προστατικός αδένας/αγωγοί (3/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+, 50% των κυττάρων, κυτταροπλασµατικής) Ιδρωτοποιοί αδένες (1/3 ιστών, 1+, 30% των κυττάρων, κυτταροπλασµατικής) Κυλινδρικό επιθήλιο, επιφάνεια (1/3 ιστών, ένταση χρώσης 2+, 25% των κυττάρων) Επιθήλιο (1/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+, 25% των κυττάρων) Πλακώδες επιθήλιο (3/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+), 80% των κυττάρων) Η αναφερθείσα χρώση σε όλους τους ιστούς ήταν χρώση µεµβράνης, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Και τα τρία δείγµατα από κάθε τύπο ιστού είχαν την ίδια ένταση χρώσης εκτός αν σηµειώνεται διαφορετικά. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 18/42

19 Καρκίνος του µαστού Αντιµετώπιση προβληµάτων - Μαστός Για τις ενδεδειγµένες διορθωτικές ενέργειες, ανατρέξτε στο τµήµα αντιµετώπισης προβληµάτων του Handbook (19) της Dako που αναφέρθηκε προηγουµένως ή επικοινωνήστε µε το τµήµα Τεχνικής Υποστήριξης της εταιρίας για να αναφέρετε ασυνήθιστη χρώση. Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 1. Καµία χρώση των αντικειµενοφόρων πλακών. 1α. Σφάλµα προγραµµατισµού. Τα αντιδραστήρια δεν χρησιµοποιήθηκαν µε τη σωστή σειρά. 1α. Ελέγξτε το ηµερολόγιο των αντικειµενοφόρων για να βεβαιωθείτε ότι έχει επιλεγεί το σωστό πρόγραµµα. 1β. Αζίδιο του νατρίου στο διάλυµα 1β. Χρησιµοποιείτε µόνο Dako Wash 2. Ασθενής χρώση των αντικειµενοφόρων πλακών. πλύσης. 1γ. Η υπερβολική θέρµανση των τοποθετηµένων τοµών ιστού πριν από την αποπαραφίνωση και τη θερµική ανάκτηση του αντιγόνου µπορεί να οδηγήσει σε απώλεια της ορατής ανοσοδραστικότητας HER2. Buffer, κωδικός S γ. Στεγνώστε τις τοµές ιστού στον αέρα σε θερµοκρασία δωµατίου για τουλάχιστον 12 ώρες ή µέχρι να στεγνώσουν. Εναλλακτικά, στεγνώστε στους 37 C καθόλη τη διάρκεια της νύκτας ή στεγνώστε στους 60 C για µέγιστο χρονικό διάστηµα µίας ώρας. Το στέγνωµα των τοµών ιστού σε αυξηµένες θερµοκρασίες πρέπει να διενεργείται µόνο σε βαθµονοµηµένο φούρνο µε οµοιόµορφη κατανοµή θερµότητας (17). 2α. Ανεπαρκής ανάκτηση επίτοπου. 2α. Ανασκοπήστε το ηµερολόγιο αντικειµενοφόρων για να επαληθεύσετε ότι η ανάκτηση επιτόπου πραγµατοποιήθηκε σωστά. 2β. Ανεπαρκείς χρόνοι επώασης µε τα αντιδραστήρια. 2γ. Εφαρµογή εσφαλµένης µεθόδου καθήλωσης. 2δ. Η υπερβολική θέρµανση των τοποθετηµένων τοµών ιστού πριν από την αποπαραφίνωση και τη θερµική ανάκτηση του αντιγόνου µπορεί να οδηγήσει σε σηµαντική µείωση της ορατής ανοσοδραστικότητας HER2. 2β. Ανασκοπήστε το ηµερολόγιο αντικειµενοφόρων για να επιβεβαιώσετε ότι οι χρόνοι επώασης αντιδραστηρίων είναι σωστοί. 2γ. Βεβαιωθείτε ότι ο ιστός του ασθενούς δεν έχει υποβληθεί σε υπερβολική καθήλωση, καθώς και ότι δεν χρησιµοποιήθηκε εναλλακτικό καθηλωτικό. 2δ. Στεγνώστε τις τοµές ιστού στον αέρα σε θερµοκρασία δωµατίου για τουλάχιστον 12 ώρες ή µέχρι να στεγνώσουν. Εναλλακτικά, στεγνώστε στους 37 C καθόλη τη διάρκεια της νύκτας ή στεγνώστε στους 60 C για µέγιστο χρονικό διάστηµα µίας ώρας. Το στέγνωµα των τοµών ιστού σε αυξηµένες θερµοκρασίες πρέπει να διενεργείται µόνο σε βαθµονοµηµένο φούρνο µε οµοιόµορφη κατανοµή θερµότητας (17). 3. Εκτεταµένη χρώση φόντου των αντικειµενοφόρων πλακών. 2ε. Εφαρµόστηκε ανεπαρκής όγκος αντιδραστηρίου 3α. Η παραφίνη δεν έχει αφαιρεθεί εντελώς. 3β. Χρησιµοποιήθηκαν πρόσθετα αµύλου κατά την επικάλυψη των τοµών στις αντικειµενοφόρους. 3γ. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες δεν εκπλύθηκαν σχολαστικά. 3δ. Οι τοµές στέγνωσαν κατά τη διαδικασία χρώσης. 2ε. Ελέγξτε το µέγεθος της τοµής ιστού (22 mm x 22 mm) και τον όγκο του αντιδραστηρίου που εφαρµόστηκε 3α. Χρησιµοποιήστε νωπά διαλύµατα αποπαραφίνωσης. 3β. Αποφύγετε τη χρήση πρόσθετων αµύλου για την πρόσφυση των τοµών στο κρύσταλλο των αντικειµενοφόρων πλακών. Πολλά πρόσθετα είναι ανοσοδραστικά. 3γ. Ανασκοπήστε το ηµερολόγιο αντικειµενοφόρων για να επιβεβαιώσετε ότι οι αντικειµενοφόροι εκπλύθηκαν κανονικά. 3δ. Επαληθεύστε ότι εφαρµόζεται ο σωστός όγκος αντιδραστηρίου στις αντικειµενοφόρους πλάκες. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 19/42

20 Καρκίνος του µαστού Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 3ε. Εφαρµογή εσφαλµένης µεθόδου καθήλωσης. 3ε. Βεβαιωθείτε ότι έχει χρησιµοποιηθεί εγκεκριµένο καθηλωτικό. Η τυχόν χρήση εναλλακτικού καθηλωτικού ενδέχεται να προκαλέσει 4. Ο ιστός αποκολλάται από τις αντικειµενοφόρους πλάκες 5. Yπερβολικά έντονη ειδική χρώση. 6. Ασθενής χρώση της κυτταρικής σειράς της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρ Το διάλυµα ανάκτησης επιτόπου αποκτά νεφελώδη εµφάνιση όταν θερµαίνεται 8. Το διάλυµα ανάκτησης επιτόπου αποκτά νεφελώδη εµφάνιση όταν αποθηκεύεται (πριν θερµανθεί) 3στ. Μη ειδική δέσµευση αντιδραστηρίων στον ιστό. 4α. Χρήση εσφαλµένων αντικειµενοφόρων πλακών. 5α. Εφαρµογή εσφαλµένης µεθόδου καθήλωσης. 5β. Υπερβολικά µεγάλοι χρόνοι επώασης µε τα αντιδραστήρια. 5γ. Χρήση εσφαλµένου διαλύµατος πλύσης. 6α. Εφαρµογή εσφαλµένου πρωτοκόλλου ανάκτησης επίτοπου. 6β. Καµία αντίδραση µε το διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB). 6γ. Αλλοίωση της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα. 7. Όταν θερµαίνεται, το διάλυµα αποκτά νεφελώδη εµφάνιση 8. Το διάλυµα αποθηκεύτηκε σε λανθασµένες συνθήκες ή έχει παρέλθει η ηµεροµηνία λήξης του διαλύµατος εκτεταµένη χρώση φόντου. 3στ. Ελέγξτε τη µέθοδο καθήλωσης του δείγµατος και τυχόν παρουσία νέκρωσης. 4α. Χρησιµοποιήστε silanized slides, όπως Dako Silanized Slides, (κωδικός S3003), SuperFrost Plus ή αντικειµενοφόρους καλυµµένες µε πολυ-l-λυσίνη. 5α. Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιήθηκαν µόνο εγκεκριµένα µονιµοποιητικά και µέθοδοι µονιµοποίησης. 5β. Ανασκοπήστε το ηµερολόγιο αντικειµενοφόρων για να επιβεβαιώσετε ότι οι χρόνοι επώασης αντιδραστηρίων είναι σωστοί. 5γ. Χρησιµοποιείτε µόνο Dako Wash Buffer, κωδικός S α. Ανασκοπήστε το ηµερολόγιο αντικειµενοφόρων για να επαληθεύσετε ότι η ανάκτηση επιτόπου πραγµατοποιήθηκε σωστά. 6β. Ανασκοπήστε το ηµερολόγιο εργαστηρίου για να επιβεβαιώσετε ότι το χρωµογόνο προετοιµάστηκε σωστά. Ανασκοπήστε το ηµερολόγιο αντικειµενοφόρων για να επιβεβαιώσετε ότι ο χρόνος επώασης χρωµογόνου είναι σωστός. 6γ. Ελέγξτε την ηµεροµηνία λήξης του κιτ και τις συνθήκες φύλαξής του, που αναγράφονται στο εξωτερικό της συσκευασίας. 7. Αυτό είναι φυσιολογικό και δεν επηρεάζει τη χρώση 8. Ελέγξτε την ηµεροµηνία λήξης του κιτ και τις συνθήκες φύλαξής του, που αναγράφονται στο εξωτερικό της συσκευασίας. Απορρίψτε το διάλυµα ανάκτησης επιτόπου ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν το πρόβληµα δεν µπορεί να αποδοθεί σε οποιαδήποτε από τις παραπάνω αιτίες ή αν η προτεινόµενη επανορθωτική δράση δεν καταφέρει να επιλύσει το πρόβληµα, καλέστε το Τµήµα Τεχνικής Υποστήριξης της Dako για περαιτέρω βοήθεια. Μπορείτε να βρείτε πρόσθετες πληροφορίες σχετικά µε τις τεχνικές χρώσης και την προετοιµασία δειγµάτων στο προαναφερθέν εγχειρίδιο της Dako (19) (που διατίθεται από την Dako), στο Atlas of Immunohistology (29) και στο Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (30). ( ) P04083GR_01_SK / σ. 20/42

21 Καρκίνος του στοµάχου Περίληψη και επεξήγηση - Στόµαχος Ιστορικό Το ανθρώπινο γονίδιο HER2 (γνωστό και ως ERBB2 ή NEU) κωδικοποιεί µια πρωτεΐνη που συχνά αναφέρεται ως πρωτεΐνη HER2 ή p185 HER2. Η πρωτεΐνη HER2 είναι µια τυροσινική κινάση υποδοχέα µεµβράνης µε οµολογία ως προς τον υποδοχέα παράγοντα επιδερµικής ανάπτυξης (EGFR ή HER1) (1-8). Η πρωτεΐνη HER2 είναι ένα φυσιολογικό συστατικό που εκφράζεται µε διάφορους τύπους επιθηλιακών κυττάρων (8). Πολλές µελέτες έδειξαν ότι υπάρχει υπερέκθεση της πρωτεΐνης HER2 και ενίσχυση του γονιδίου HER2 στις περιπτώσεις καρκίνου του στοµάχου (31). Η θετικότητα σχετικά µε το HER2 µπορεί να ανιχνευθεί σε περίπου 20% των ασθενών είτε µε IHC είτε µε FISH (31). Προκλινικές µελέτες in vitro και in vivo έδειξαν ότι το trastuzumab (Herceptin ) είναι αποτελεσµατικό σε διάφορους τύπους καρκίνου του στοµάχου, δίνοντας έτσι αφορµή για την έναρξη πολλών κλινικών µελετών (31-35). Σε µια µελέτη BO18255 φάσης ΙΙΙ, τη δοκιµή ToGA, οι ασθενείς που παρουσίασαν θετικό HER2 µε µη εγχειρίσιµο, τοπικά προχωρηµένο, υποτροπιάζον ή/και µεταστατικό αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου ή της γαστροοισοφαγικής συµβολής τυχαιοποιήθηκαν για να λάβουν 5-FU ή καπεσιταβίνη και σισπλατίνη, είτε µεµονωµένα είτε σε συνδυασµό µε το trastuzumab. Ένα στατιστικά σηµαντικό κέρδος στη συνολική βιωσιµότητα (OS) εµφανίστηκε στους ασθενείς που έλαβαν συνδυασµένη θεραπεία µε trastuzumab και χηµειοθεραπεία (36, 37). Το Herceptin (trastuzumab) είναι ένα εξανθρωποποιηµένο µονοκλωνικό αντίσωµα (10) που συνδέεται µε υψηλή συγγένεια µε την πρωτεΐνη HER2 και έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασµό των ανθρώπινων νεοπλασµατικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη HER2 τόσο in vitro όσο και in vivo (32-35). Χαρακτηριστικά 3803 ασθενείς εξετάστηκαν για κατάσταση HER2 προκειµένου να ενταχθούν στη µελέτη ToGA. Σε αυτή τη µελέτη, µετρήθηκαν τόσο η υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 µε τη µέθοδο IHC (HercepTest, Dako) όσο και η ενίσχυση του γονιδίου HER2 µε τη µέθοδο FISH (HER2 FISH pharmdx, Dako). Έγκυρα αποτελέσµατα ελήφθησαν από 3665 δείγµατα είτε µε τη δοκιµασία IHC είτε µε τη δοκιµασία FISH, καθώς και από 3280 δείγµατα και µε τις δύο δοκιµασίες. Τα αποτελέσµατα της µελέτης ToGA κατέδειξαν ότι 22,1% των ασθενών µε προχωρηµένο καρκίνο του στοµάχου ήταν θετικοί σε HER2, όπως καθορίστηκε είτε µέσω IHC είτε µέσω FISH, σύµφωνα µε τον ορισµό των κριτηρίων επιλογής HER2 της ToGA (37). Αναφορικά µε τη χρήση του HercepTest στην αξιολόγηση των ασθενών για τους οποίους µελετάται η πιθανότητα αγωγής µε trastuzumab, ανατρέξτε στο ένθετο της συσκευασίας του Herceptin για περισσότερες πληροφορίες. Αρχή της διαδικασίας - Στόµαχος Το HercepTest περιέχει αντιδραστήρια που απαιτούνται για την ολοκλήρωση µια διαδικασίας ανοσοκυτταροχηµικής χρώσης δύο σταδίων για δείγµατα που έχουν µονιµοποιηθεί µε το συνήθη τρόπο και έχουν εγκλειστεί σε παραφίνη. Μετά από την επώαση µε το πρωτεύον αντίσωµα κονίκλου για την ανθρώπινη πρωτεΐνη HER2, το κιτ αυτό χρησιµοποιεί ένα έτοιµο προς χρήση αντιδραστήριο οπτικοποίησης που βασίζεται στην τεχνολογία δεξτράνης. Το αντιδραστήριο αυτό αποτελείται τόσο από µόρια δευτερογενούς αντιανοσοσφαιρίνης κονίκλου από αίγα όσο και από µόρια υπεροξειδάσης χρένου συνδεδεµένα µε µια κοινή κεντρική αλυσίδα πολυµερούς δεξτράνης. Με τον τρόπο αυτό, εξαλείφεται η ανάγκη αλληλοδιάδοχης εφαρµογής αντισώµατος-συνδέσµου και συζευγµένου µε υπεροξειδάση αντισώµατος. Η πιθανότητα να λάβει χώρα διασταυρούµενη αντίδραση του αντιδραστηρίου οπτικοποίησης µε τις ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες και τον ορό εµβρύου µόσχου έχει εξαλειφθεί µε απορρόφηση στερεάς φάσης. Η ενζυµατική µετατροπή της επακόλουθα προστιθέµενης χρωµογόνου ουσίας έχει ως αποτέλεσµα το σχηµατισµό ενός ορατού προϊόντος αντίδρασης στη θέση του αντιγόνου. Στη συνέχεια, το δείγµα είναι δυνατό να υποβληθεί σε επίχρωση και να καλυφθεί µε καλυπτρίδα. Τα αποτελέσµατα ερµηνεύονται µε τη βοήθεια µικροσκοπίου φωτός. Για την επικύρωση των αναλύσεων χρώσης, παρέχονται αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα που περιέχουν τρεις κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του µαστού, καθηλωµένες σε φορµαλίνη και ενσωµατωµένες σε παραφίνη, µε βαθµολογία έντασης χρώσης 0, 1+ και 3+. Η ένταση χρώσης αυτών των κυτταρικών σειρών έχει συσχετιστεί µε τον αριθµό των υποδοχέων ανά κύτταρο. Το HercepTest for Automated Link Platforms, κωδικός SK001, είναι κατάλληλο για αυτοµατοποιηµένη χρώση χρησιµοποιώντας τις πλατφόρµες Dako Auto Link.. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 21/42

22 Καρκίνος του στοµάχου Παρεχόµενα υλικά - Στόµαχος Κωδικός SK001 Τα υλικά που αναφέρονται κατωτέρω επαρκούν για 50 εξετάσεις (50 αντικειµενοφόροι πλάκες επωασµένες µε πρωτεύον αντίσωµα για την πρωτεΐνη HER2 και 50 αντικειµενοφόροι πλάκες επωασµένες µε το αντίστοιχο αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα). Ο αριθµός των εξετάσεων στηρίζεται στη χρήση 200 µl από κάθε αντιδραστήριο ανά τοµή ιστού (22 mm x 22 mm), εκτός του Epitope Retrieval Solution. Το κιτ περιλαµβάνει υλικά που επαρκούν για 10 ανεξάρτητες αναλύσεις χρώσης το πολύ. Ποσότητα Περιγραφή 1 x 22 ml HercepTest Peroxidase-Blocking Reagent Υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%, που περιέχει αζίδιο του νατρίου (NaN 3) 15 mmol/l. 1 x 12 ml HercepTest Rabbit Anti-Human HER2 Protein Έτοιµο για χρήση αντίσωµα, αποµονωµένο βάσει συγγενείας. Παρέχεται σε Tris/HCl 0,05 mol/l, NaCl 0,1 mol/l, NaN 3, ph 7,2, containing stabilizing protein. Ανοσογόνο: Συνθετικό C-τελικό τµήµα (ενδοκυτταροπλασµατικό τµήµα) της πρωτεΐνης HER2, συζευγµένο σε αιµοκυανίνη πεταλίδας. Ειδικότητα: Πρωτεΐνη HER2. Μέθοδος καθαρισµού: Το αντίσωµα έχει αποµονωθεί βάσει συγγενείας µε τη βοήθεια ακινητοποιηµένου πεπτιδίου πρωτεΐνης HER2. 1 x 22 ml HercepTest Visualization Reagent Πολυµερές δεξτράνης συζευγµένο µε υπεροξειδάση χρένου και αποµονωµένες βάσει συγγένειας αντιανοσοσφαιρίνες κονίκλου από αίγα. Παρέχεται σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris/HCl που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και έναν αντιµικροβιακό παράγοντα. 1 x 10 ml HercepTest Negative Control Reagent Τµήµα ανοσοσφαιρίνης φυσιολογικού ορού κονίκλου σε συγκέντρωση πρωτεΐνης ισοδύναµη µε εκείνη του αντισώµατος για την πρωτεΐνη HER2. Παρέχεται σε Tris/HCl 0,05 mol/l, NaCl 0,1 mol/l, NaN 3, ph 7,2, containing stabilizing protein. 2 x 22 ml HercepTest DAB Substrate Buffer Ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος, µε ph 7,5, που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου < 0,1%, σταθεροποιητές, βελτιωτικά και έναν αντιµικροβιακό παράγοντα. 1 x 1 ml HercepTest DAB Chromogen Χρωµογόνο διάλυµα τετραϋδροχλωρικής 3,3'-διαµινοβενζιδίνης 5%. 3 x 500 ml HercepTest Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x) Ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικών 0,1 mol/l µε απορρυπαντικό. 2 x 5 αντικειµενοφ όροι πλάκες HercepTest Control Slides Κάθε αντικειµενοφόρος πλάκα περιέχει τοµές τριών καθηλωµένων σε φορµαλίνη και ενσωµατωµένων σε παραφίνη κυτταρικών σειρών καρκινώµατος του µαστού που αντιπροσωπεύουν διαφορετικά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης HER2: MDA-231 (0), MDA- 175 (1+) και SK-BR-3 (3+). Οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα έχουν υποστεί επεξεργασία για καλύτερη πρόσφυση των τοµών πάνω στο κρύσταλλό τους. Τυχόν επιπρόσθετη θερµική επεξεργασία των αντικειµενοφόρων πλακών µάρτυρα µε σκοπό τη βελτίωση της πρόσφυσης των τοµών πάνω στο κρύσταλλό τους ενδέχεται να διακυβεύσει τα αποτελέσµατα χρώσης. 10 x φιάλες Φιάλη αντιδραστηρίων για πλήρωση από τον χρήστη, χωρητικότητας 12mL. Κάθε φιάλη µπορεί να περιέχει 12mL αντιδραστήριο. Οι φιάλες πρέπει να χρησιµοποιούνται για την µίξη και αποθήκευση του διαλύµατος υποστρώµατος-χρωµογόνου (βλ. επίσης την ενότητα Προετοιµασία αντιδραστηρίων) Παρέχονται σε ξεχωριστή σακούλα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα αντιδραστήρια έχουν παρασκευαστεί για χρήση ειδικώς µε την παρούσα εξέταση. Για να γίνει η δοκιµή, δεν πρέπει να γίνει καµία αντικατάσταση. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 22/42

23 Καρκίνος του στοµάχου Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται - Στόµαχος Dako Wash Buffer, κωδικός S3006 Επίχρωση: Αιµατοξυλίνη, όπως το Hematoxylin for Automated Link Platforms, (κωδικός SK308) Καλυπτρίδες Απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό Φούρνος ξήρανσης, µε δυνατότητα διατήρησης θερµοκρασίας 60 C ή χαµηλότερη Αιθανόλη, απόλυτη και 95% Κοινό µικροσκόπιο (µε αντικειµενικούς φακούς µεγέθυνσης 4 40x) Υλικό στερέωσης όπως π.χ. το Faramount (αρ. κωδικού S3025) ή το Glycergel (αρ. κωδικού C0563) της Dako Θετικοί και αρνητικοί ιστοί, για χρήση ως µάρτυρες της διαδικασίας (βλ. ενότητα περί ποιοτικού ελέγχου) Αντικειµενοφόροι πλάκες, SuperFrost Plus, πλάκες επιστρωµένες µε πολυ-l-λυσίνη ή Dako Silanized Slides, αρ. κωδικού S3003 (βλ. ενότητα περί προετοιµασίας δειγµάτων) Ξυλένιο, τολουένιο ή υποκατάστατα ξυλενίου Το SK001 προορίζεται ειδικά για χρήση µε το Dako Auto Link. Ανατρέξτε στον Οδηγό χρήσης των αυτοµατοποιηµένων πλατφόρµων Link για πρόσθετες πληροφορίες. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 23/42

24 Καρκίνος του στοµάχου Προφυλάξεις - Στόµαχος 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Για επαγγελµατίες χρήστες. 3. Το προϊόν αυτό περιέχει αζίδιο του νατρίου (NaN 3), µια χηµική ουσία που είναι ιδιαίτερα τοξική σε καθαρή µορφή. Σε συγκεντρώσεις προϊόντος, παρότι δεν κατατάσσεται ως επικίνδυνο, το αζίδιο του νατρίου ενδέχεται να αντιδράσει µε τις υδραυλικές σωληνώσεις από µόλυβδο και χαλκό για το σχηµατισµό ιδιαίτερα εκρηκτικών συσσωρεύσεων αζιδίων µετάλλων. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε µε άφθονη ποσότητα νερού για την πρόληψη συσσώρευσης αζιδίων µετάλλων στις υδραυλικές σωληνώσεις (21, 22). 4. Το αντιδραστήριο αποκλεισµού υπεροξειδάσης HercepTest περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%. ιατίθεται δελτίο δεδοµένων ασφαλείας υλικού για τους επαγγελµατίες χρήστες, µετά από σχετικό αίτηµα. 5. Η πρωτεΐνη HER2 Κουνελιού έναντι ανθρώπου HercepTest, το αντιδραστήριο εποπτικής παρουσίασης HercepTest και το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα HercepTest περιέχουν υλικό ζωικής προέλευσης. 6. Όπως συµβαίνει µε οποιοδήποτε προϊόν που προέρχεται από βιολογικές πηγές, θα πρέπει να χρησιµοποιούνται σωστές διαδικασίες χειρισµού. 7. Πρέπει να τα µεταχειρίζεστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες των µαρτύρων και τα δείγµατα, τόσο πριν όσο και µετά τη µονιµοποίηση, καθώς και όλα τα υλικά που έχουν εκτεθεί σε αυτά, ως δυνητικά µολυσµατικά και να τα απορρίπτετε µε τις δέουσες προφυλάξεις (22). Μην αναρροφάτε µε πιπέτα τα αντιδραστήρια µε το στόµα και αποφεύγετε την επαφή του δέρµατος και των βλεννογόνων µε αντιδραστήρια και δείγµατα. Εάν τα αντιδραστήρια έλθουν σε επαφή µε ευαίσθητες περιοχές, πλύνετε µε άφθονες ποσότητες νερού. 8. Ελαχιστοποιήστε τη µικροβιακή µόλυνση των αντιδραστηρίων, διαφορετικά µπορεί να παρατηρηθεί αύξηση της µη ειδικής χρώσης. 9. Τυχόν εφαρµογή χρόνων, θερµοκρασιών ή µεθόδων επώασης διαφορετικών από εκείνων που καθορίζονται στις οδηγίες ενδέχεται να δώσει εσφαλµένα αποτελέσµατα. Η υπερβολική ξήρανση στους 60 C για πάνω από µία ώρα µπορεί να προκαλέσει σηµαντική µείωση ή απώλεια της ειδικής, συνδεόµενης µε τη µεµβράνη ανοσοδραστικότητας HER2 (17). 10. Τα αντιδραστήρια έχουν αραιωθεί µε βέλτιστο τρόπο. Κάθε περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να προκαλέσει µείωση της αντιγονικής χρώσης. 11. Όλα τα αντιδραστήρια έχουν παρασκευαστεί για χρήση ειδικώς µε την παρούσα εξέταση. Για να γίνει η δοκιµή, δεν πρέπει να γίνει καµία αντικατάσταση. 12. Το αντιδραστήριο εποπτικής παρουσίασης HercepTest και το DAB Χρωµογόνο HercepTest ενδέχεται να επηρεάζονται αρνητικά αν εκτεθούν σε υπερβολικό φως. Μη φυλάσσετε τα µέρη του συστήµατος και µην εκτελείτε χρώση σε έντονο φως, όπως π.χ. το άµεσο ηλιακό φως. 13. Για ακριβή ερµηνεία των αποτελεσµάτων του HercepTest σε κεχρωσµένα δείγµατα βιοψίας από αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, συνιστάται µια συστάδα τουλάχιστον 5 κεχρωσµένων κυττάρων όγκου. Μια συστάδα τουλάχιστον 5 κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου αποτελείται από 5 συνδεόµενα κύτταρα όγκου κεχρωσµένα για HER Εξαιτίας του ετερογενούς χαρακτήρα των δειγµάτων βιοψίας καρκίνου του στοµάχου, είναι σηµαντική η εκτέλεση της εξέτασης IHC για HER2 σε πολλαπλά τεµάχια (7-8) βιοψίας από διαφορετικές περιοχές του όγκου ώστε να επιτευχθεί αξιόπιστο αποτέλεσµα. 15. Συνιστάται η εξέταση περισσότερων του ενός τεµαχίων ιστού από εξαιρέσεις καρκίνου του στοµάχου όταν το δείγµα παρουσιάζει υψηλό επίπεδο ετερογένειας (40). 16. Πρέπει να φοράτε κατάλληλο εξοπλισµό προσωπικής προστασίας για να αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια και το δέρµα. 17. Όσο διάλυµα δεν χρησιµοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται σύµφωνα µε τους τοπικούς, κρατικούς και οµοσπονδιακούς κανονισµούς. 18. Το φύλλο δεδοµένων ασφαλείας διατίθεται σε επαγγελµατίες χρήστες κατόπιν αίτησης. 19. Η χρήση όγκων αντιδραστηρίων διαφορετικών από τους συνιστώµενους ενδέχεται να οδηγήσει σε απώλεια της ορατής ανοσοδραστικότητας HER2. Τοµές ιστών µεγαλύτερες από 22 mm x 22 mm απαιτούν την εφαρµογή 2-3x 200 µl αντιδραστηρίου σε 2-3 περιοχές αυτοµατοποιηµένης εφαρµογής. 20. To HercepTest DAB Chromogen περιέχει 1 5% 3,3 -τετραϋδροχλωριούχο διαµινοβενζιδίνη (διφαινυλο-3,3,4,4 - τετραχλωριούχο τετραϋλτετρααµµώνιο) και φέρει τη σήµανση: Κίνδυνος H350 Μπορεί να προκαλέσει καρκίνο. H341 Ύποπτο για πρόκληση γενετικών ελαττωµάτων. P201 Εφοδιαστείτε µε τις ειδικές οδηγίες πριν από τη χρήση. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτιαή το πρόσωπο. Να φοράτε προστατευτικά ενδύµατα. P308 + P313 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ έκθεσης ή πιθανής έκθεσης: Συµβουλευθείτε/Επισκεφθείτε γιατρό. P405 Φυλάσσεται κλειδωµένο. P501 ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. 21. Τα υπολείµµατα παραφίνης µπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αρνητικά αποτελέσµατα. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 24/42

25 Καρκίνος του στοµάχου Ως γενικός κανόνας, άτοµα ηλικίας κάτω των 18 ετών δεν επιτρέπεται να εργάζονται µε το προϊόν αυτό. Πρέπει να δίνονται προσεκτικές οδηγίες στους χρήστες σχετικά µε τη σωστή διαδικασία εργασίας, τις επικίνδυνες ιδιότητες του προϊόντος και τις απαραίτητες οδηγίες ασφαλείας (σύµφωνα µε την Οδηγία 94/33/ΕΚ της Ευρωπαϊκής Ένωσης). Παρακαλούµε ανατρέξτε στο δελτίο δεδοµένων ασφαλείας υλικού (MSDS) για επιπλέον πληροφορίες. Η.Π.Α.: Η 3,3 -διαµινο-βενζιδίνη (DAB) ενδέχεται να είναι επιβλαβής όταν εισπνέεται, σε επαφή µε το δέρµα και σε περίπτωση καταπόσεως. Το υλικό αυτό είναι ερεθιστικό για τα µάτια και το δέρµα. Σε περίπτωση επαφής µε το δέρµα, ξεπλύντε τις προσβεβληµένες περιοχές µε σαπούνι και νερό. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Παρ' ότι η διαµινοβενζιδίνη σχετίζεται δοµικά µε τη βενζιδίνη, δεν υπάρχουν ενδείξεις ότι είναι καρκινογόνος. Συµβουλευτείτε τους τοπικούς, πολιτειακούς ή οµοσπονδιακούς κανονισµούς για την απόρριψή της. Αποθήκευση - Στόµαχος Αποθηκεύστε σε θερµοκρασία 2 8 C όταν δεν χρησιµοποιείται σε αυτοµατοποιηµένες πλατφόρµες Dako Link. Αποθηκεύστε το HercepTest Peroxidase-Blocking Reagent, HercepTest Visualization Reagent, HercepTest DAB Substrate Buffer και το HercepTest DAB Chromogen στο σκοτάδι σε θερµοκρασία 2 8 C. Μη χρησιµοποιείτε το κιτ µετά την ηµεροµηνία λήξης, η οποία είναι σηµασµένη στο εξωτερικό της συσκευασίας. Εάν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται υπό οποιεσδήποτε συνθήκες εκτός από εκείνες που καθορίζονται στο ένθετο αυτής της συσκευασίας, οι συνθήκες πρέπει να επαληθεύονται από το χρήστη (14a, 14b). Σηµειώνεται ότι και οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα πρέπει να φυλάσσονται στους 2 8 C. εν υπάρχουν εµφανή σηµεία που να υποδεικνύουν αστάθεια του προϊόντος αυτού. Για το λόγο αυτό, οι θετικοί και αρνητικοί µάρτυρες πρέπει να εξετάζονται ταυτόχρονα µε τα δείγµατα ασθενών. Εάν παρατηρηθεί µη αναµενόµενη χρώση που δεν είναι δυνατό να επεξηγηθεί από διαφορές στις εργαστηριακές διαδικασίες και υποψιάζεστε πρόβληµα µε το HercepTest, επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία της Dako. Παρασκευή δείγµατος - Στόµαχος είγµατα αδενοκαρκινώµατος του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, από βιοψίες, εκτοµές ή εξαιρέσεις πρέπει να υποβάλλονται σε σωστό χειρισµό έτσι ώστε να διατηρείται ο ιστός για ανοσοκυτταροχηµική χρώση. Για όλα τα δείγµατα, πρέπει να εφαρµόζονται οι τυπικές µέθοδοι επεξεργασίας ιστών (15). Για τις δοκιµές σε µικρά δείγµατα βιοψίας, βεβαιωθείτε ότι η µορφολογία του όγκου είναι άθικτη και ότι υπάρχουν αρκετά κύτταρα του όγκου για αξιολόγηση IHC. Αν γίνει ανάλυση HercepTest σε ένα δείγµα βιοψίας, πρέπει να αναλυθούν πολλαπλές βιοψίες (7-8) από διαφορετικές περιοχές του όγκου για να διασφαλιστεί ο αξιόπιστος προσδιορισµός της κατάστασης HER2. Τοµές ενσωµατωµένες σε παραφίνη Κατάλληλοι για χρήση είναι οι ιστοί που διατηρούνται σε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµόλης και ενσωµατωµένοι σε παραφίνη. Τα δείγµατα πρέπει π.χ. να κόβονται σε τοµές πάχους 3 ή 4 mm και να καθηλώνονται για ώρες σε ουδέτερα ρυθµισµένη φορµαλίνη. είγµατα βιοψίας µονιµοποιήθηκαν επί 6-8 ώρες στη δοκιµή ToGA (για παραποµπή στη µελέτη, ανατρέξτε στο (36)). Κατόπιν, οι ιστοί αφυδατώνονται µέσα σε µια σειρά διαλυµάτων αλκοόλης και ξυλενίου, και ακολουθεί εµποτισµός σε λιωµένη παραφίνη, που διατηρείται σε θερµοκρασία όχι µεγαλύτερη από 60 C. Κατάλληλα µονιµοποιηµένοι και εµφυτευµένοι ιστοί που εκφράζουν την πρωτεΐνη HER2 διατηρούνται επ' αόριστον πριν από τον τεµαχισµό και επικάλυψη σε αντικειµενοφόρους εφόσον φυλάσσονται σε δροσερό µέρος (15 25 C) (15,16). Στις Η.Π.Α., σύµφωνα µε το νόµο περί βελτίωσης κλινικών εργαστηρίων του 1988, στο 42 CFR (b), προβλέπεται ότι το εργαστήριο πρέπει να φυλάσσει κεχρωσµένες αντικειµενοφόρους πλάκες επί 10 έτη τουλάχιστον, καθώς και τεµάχια δειγµάτων 2 έτη τουλάχιστον, από την ηµεροµηνία εξέτασης (16). Τα δείγµατα των ιστών πρέπει να κόβονται σε τοµές πάχους 4 5 µm, να τοποθετούνται σε αντικειµενοφόρους και να στεγνώνουν στον αέρα σε θερµοκρασία δωµατίου για τουλάχιστον 12 ώρες (ή µέχρι να στεγνώσουν) ή στους 37 C καθόλη τη διάρκεια της νύκτας ή στους 60 C για µία ώρα. ΠΡΟΣΟΧΗ: Η υπερβολική θέρµανση για πάνω από µία ώρα στους 60 C µπορεί να προκαλέσει σηµαντική µείωση ή απώλεια της ειδικής, συνδεόµενης µε τη µεµβράνη ανοσοδραστικότητας HER2 (17). Για τη διατήρηση της αντιγονικότητας, οι τοµές των ιστών που έχουν τοποθετηθεί σε αντικειµενοφόρους (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine ή πυριτιωµένες), πρέπει να χρωµατίζονται εντός διαστήµατος 4 6 εβδοµάδων από τον τεµαχισµό τους όταν διατηρούνται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) (18). Οι αντικειµενοφόροι που απαιτούνται για την αξιολόγηση της πρωτεΐνης HER2 και την εξακρίβωση της παρουσίας όγκου πρέπει να παρασκευάζονται ταυτόχρονα. Προτείνονται 5 αντικειµενοφόροι τουλάχιστον, 1 αντικειµενοφόρος για την παρουσία όγκου, 2 αντικειµενοφόροι για την αξιολόγηση της πρωτεΐνης HER2 (µια αντικειµενοφόρος για επώαση της πρωτεΐνης HER2 κουνελιού έναντι ανθρώπου και µια αντικειµενοφόρος για επώαση µε το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα) και 2 εφεδρικές αντικειµενοφόροι. Για τη διατήρηση της αντιγονικότητας, οι τοµές των ιστών που έχουν τοποθετηθεί σε αντικειµενοφόρους (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine ή πυριτιωµένες), πρέπει να χρωµατίζονται εντός διαστήµατος 4 6 εβδοµάδων από τον τεµαχισµό τους όταν διατηρούνται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) (18). Η εφαρµογή της εξέτασης HercepTest σε απασβεστωµένους ιστούς δεν έχει εξακριβωθεί και δεν συνιστάται. Συµβουλευθείτε το Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (Εκπαιδευτικός οδηγός: Μέθοδοι ανοσοχηµικής χρώσης) (19) της Dako ή τις παραποµπές 15 και 16 για περαιτέρω λεπτοµέρειες σχετικά µε την παρασκευή των δειγµάτων. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 25/42

26 Καρκίνος του στοµάχου Επεξεργασία ιστών πριν από τη χρώση Ειδική µέθοδος ανάκτησης επιτόπου, βρασµός σε ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικών 0,01 mol/l, πρέπει να χρησιµοποιηθεί για βέλτιστη απόδοση της εξέτασης. Το ιάλυµα Ανάκτησης Επιτόπου παρέχεται στο κιτ HercepTest. Η µέθοδος αυτή περιλαµβάνει θέρµανση των τοµών ιστών που έχουν τοποθετηθεί σε αντικειµενοφόρους βυθισµένες σε ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικών 0,01 mol/l (20), στην απαιτούµενη θερµοκρασία (95 99 C). Τα εργαστήρια που βρίσκονται σε µεγαλύτερο υψόµετρο πρέπει να καθορίσουν την καλύτερη µέθοδο για τη διατήρηση της απαιτούµενης θερµοκρασίας. Εξετάστηκαν και άλλες µέθοδοι για την ανάκτηση του επιτόπου αλλά δεν έδωσαν επαναλήψιµα αποτελέσµατα. Τυχόν αποκλίσεις από την περιγραφόµενη διαδικασία ενδέχεται να επηρεάσουν τα αποτελέσµατα. Παρασκευή αντιδραστηρίου - Στόµαχος Είναι βολικό να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια πριν από τη χρώση: ιάλυµα ανάκτησης επίτοπου Αραιώστε επαρκή ποσότητα από το HercepTest ιάλυµα ανάκτησης επίτοπου 1:10 σε αναλογία 1:10 µε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό, για την προγραµµατισµένη διαδικασία χρώσης. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο διάλυµα µπορεί να χρησιµοποιηθεί επί µια εβδοµάδα σε θερµοκρασία δωµατίου ή επί ένα µήνα εφόσον φυλάσσεται σε θερµοκρασία 2 8 C. Απορρίψτε το αραιωµένο διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. Ανατρέξτε στον οδηγό χρήσης των πλατφόρµων Dako Automated Link για επιπρόσθετες πληροφορίες. Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης Αραιώστε επαρκή ποσότητα Dako Wash Buffer (κωδικός S3006) 1:10 χρησιµοποιώντας αποσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο διάλυµα µπορεί να χρησιµοποιηθεί επί µια εβδοµάδα σε θερµοκρασία δωµατίου ή επί ένα µήνα εφόσον φυλάσσεται σε θερµοκρασία 2 8 C. Εάν το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα παρουσιάζει νεφέλωση, απορρίψτε το. Ανατρέξτε στον οδηγό χρήσης των πλατφόρµων Dako Automated Link για επιπρόσθετες πληροφορίες. ιάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) Ετοιµάστε το διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου στις φιάλες που γεµίζονται από τον χρήστη προσθέτοντας 25 µl DAB Chromogen για κάθε 1 ml DAB Substrate Buffer και αναµίξτε. Το παρασκευασµένο διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB) παραµένει σταθερό επί 5 ηµέρες περίπου, όταν φυλάσσεται στους 2 8 C. Το διάλυµα αυτό πρέπει να αναµειγνύεται σχολαστικά πριν από τη χρήση. Τυχόν ίζηµα που έχει σχηµατιστεί στο διάλυµα δεν επηρεάζει δυσµενώς την ποιότητα της χρώσης. Η φιάλη που γεµίζεται από τον χρήστη και περιέχει ανακατεµένο διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου πρέπει να καθοριστεί στην πλατφόρµα Dako Automated Link πριν την χρήση. Ανατρέξτε στον οδηγό χρήσης των πλατφόρµων Dako Automated Link για επιπρόσθετες πληροφορίες. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το χρώµα του DAB Chromogen µπορεί να ποικίλει από διαυγές έως ανοιχτό µοβ-καφέ. Αυτό δεν επηρεάζει την απόδοση του προϊόντος. Αραιώστε σύµφωνα µε τις οδηγίες του ένθετου της συσκευασίας. Τυχόν προσθήκη περίσσειας χρωµογόνου DAB στο ρυθµισµένο υπόστρωµα DAB θα έχει ως αποτέλεσµα την αλλοίωση του θετικού σήµατος. Επίχρωση Το έγχρωµο τελικό προϊόν της αντίδρασης χρώσης DAB διαλύεται στην αλκοόλη και το νερό. Hematoxylin για αυτοµατοποιηµένες πλατφόρµες Link (κωδικός SK308) µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως αντίχρωση. Τα απαιτούµενα βήµατα και οι χρόνοι επώασης έχουν προγραµµατιστεί εκ των προτέρων στο λογισµικό του Dako Link. εν απαιτείται προετοιµασία αντιδραστηρίων. Υλικό στερέωσης Συνιστάται µη υδατικό µέσο µόνιµης επικάλυψης. Ωστόσο, και η χρήση υδατικού υλικού στερέωσης είναι επίσης αποδεκτή. Για υδατική επικάλυψη συνιστώνται τα Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Readyto-Use (κωδικός S3025) ή Dako Glycergel Mounting Medium (κωδικός C0563). Υγροποιήστε το Glycergel µε θέρµανση στους 40 (±5) C περίπου, πριν από τη χρήση. ιαδικασία χρώσης - Στόµαχος Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία Πριν από τη χρήση, ο χρήστης οφείλει να διαβάσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί µε όλα τα εξαρτήµατα και τον εξοπλισµό (βλ. ενότητα Προφυλάξεις ). Κατά τη διαδικασία της χρώσης, ανά πάσα στιγµή µην αφήνετε τις τοµές των ιστών να στεγνώσουν. Οι στεγνωµένες ιστικές τοµές ενδέχεται να εµφανίζουν αυξηµένη µη ειδική χρώση. Όλα τα απαιτούµενα βήµατα και χρόνοι επώασης για χρώση έχουν προγραµµατιστεί εκ των προτέρων στο λογισµικό του Dako Link. Για οδηγίες σχετικά µε τον προγραµµατισµό των πρωτοκόλλων και τη φόρτωση των αντικειµενοφόρων πλακών και των αντιδραστηρίων, ανατρέξτε στον Οδηγό χρήσης των πλατφόρµων Dako Automated Link. Εάν χρειαστεί να διακόψετε τη διαδικασία χρώσης, οι αντικειµενοφόροι πλάκες είναι δυνατό να φυλαχθούν σε λουτρό ρυθµιστικού διαλύµατος µετά από την επώαση µε το πρωτεύον αντίσωµα επί 1 ώρα το πολύ σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) χωρίς να επηρεαστεί δυσµενώς η απόδοση της χρώσης. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 26/42

27 Καρκίνος του στοµάχου Αποπαραφίνωση και επανυδάτωση Πριν από τη χρώση, πρέπει να αφαιρεθεί η παραφίνη από τις αντικειµενοφόρους πλάκες ιστών για την αποµάκρυνση του υλικού ενσωµάτωσης. Στη συνέχεια, οι πλάκες πρέπει να επανυδατωθούν. Αποφεύγετε την ατελή αφαίρεση της παραφίνης. Το υπολειµµατικό µέσο ενσωµάτωσης θα έχει ως αποτέλεσµα αυξηµένη µη ειδική χρώση. Το βήµα αυτό πρέπει να εκτελείται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). 1. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους σε λουτρό ξυλενίου και επωάστε επί 5 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 2. Κτυπήστε ελαφρά τις αντικειµενοφόρους πλάκες για να αποµακρύνετε την περίσσεια υγρού και κατόπιν τοποθετήστε τις µέσα σε απόλυτη αιθανόλη επί 3 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 3. Κτυπήστε ελαφρά τις αντικειµενοφόρους πλάκες για να αποµακρύνετε την περίσσεια υγρού και κατόπιν τοποθετήστε τις µέσα σε αιθανόλη κατά 95% επί 3 (±1) λεπτά. Αλλάξτε τα λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. 4. Κτυπήστε ελαφρά τις αντικειµενοφόρους πλάκες για να αποµακρύνετε την περίσσεια υγρού και κατόπιν τοποθετήστε τις µέσα σε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό επί 30 δευτερόλεπτα τουλάχιστον. Ξεκινήστε τη διαδικασία χρώσης όπως αυτή περιγράφεται στο πρωτόκολλο χρώσης στο ανάκτηση επιτόπων. Τα διαλύµατα ξυλενίου και αλκοόλης πρέπει να αντικαθίστανται κάθε 40 αντικειµενοφόρους πλάκες. Στη θέση του ξυλενίου µπορούν να χρησιµοποιηθούν υποκατάστατα τολουενίου και ξυλενίου, όπως είναι το Histoclear. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται στο κιτ αυτό έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή µεταβολή των θερµοκρασιών επώασης ενδέχεται να δώσει εσφαλµένα ή ασύµφωνα αποτελέσµατα. Τυχόν διαφορές στην επεξεργασία και στις τεχνικές διαδικασίες στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να καταστήσει τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού µη έγκυρα για χρήση στην επιλογή ασθενών για θεραπεία µε Herceptin. Πρωτόκολλο χρώσης Όλα τα απαιτούµενα βήµατα και οι χρόνοι επώασης για τη χρώση έχουν προγραµµατιστεί εκ των προτέρων στο λογισµικό του Dako Automated Link. Μετά την αποπαραφίνωση, την επανυδάτωση, και την ανάκτηση επιτόπων το όργανο επεξεργάζεται τις αντικειµενοφόρους όπως περιγράφεται παρακάτω. Βήµα 1: Ανάκτηση επίτοπου Γεµίστε το δοχείο PT Link της Dako ή τα δοχεία χρώσης π.χ. τύπου Coplin, µε Epitope Retrieval Solution (βλ. Προετοιµασία αντιδραστηρίων). Για το PT Link της Dako: Προθερµάνετε το αραιωµένο Epitope Retrieval Solution στο δοχείο PT Link της Dako στους 85 C. Με τη θέρµανση, το διάλυµα ανάκτησης επιτόπου αποκτά νεφελώδη εµφάνιση. Τοποθετήστε τις αποπαραφινωµένες τοµές που βρίσκονται σε θερµοκρασία δωµατίου σε θήκες του αυτόµατου µηχανήµατος χρώσης και εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους στο προθερµασµένο Epitope Retrieval Solution. Αφήστε το Dako PT Link να ζεσταθεί έως τους 97 C και επωάστε επί 40 (±1) λεπτά στους 97 C. Αφήστε τις τοµές να κρυώσουν µέσα στο PT Link της Dako µέχρι τη θερµοκρασία των 85 C. Αφαιρέστε τα δοχεία PT Link που περιέχουν τις τοµές από το PT Link. Αφήστε τα δοχεία στο τραπέζι επί 10 λεπτά χωρίς το καπάκι για περαιτέρω ψύξη. Ξεπλύνετε τις τοµές µε Wash Buffer. Ανατρέξτε στον οδηγό χρήσης του Dako PT Link για περισσότερες πληροφορίες. Για δοχεία χρώσης τύπου Coplin: Τοποθετήστε τα δοχεία χρώσης που περιέχουν το αραιωµένο Epitope Retrieval Solution σε υδατόλουτρο. Θερµάνετε το υδατόλουτρο και το Epitope Retrieval Solution στους C. Με τη θέρµανση, το διάλυµα ανάκτησης επιτόπου αποκτά νεφελώδη εµφάνιση. Καλύψτε τα δοχεία µε το καπάκι τους, ώστε να σταθεροποιηθεί η θερµοκρασία και να αποφευχθεί η εξάτµιση. Βυθίστε τις τοµές, από τις οποίες έχετε αφαιρέσει την παραφίνη και οι οποίες βρίσκονται σε θερµοκρασία δωµατίου, στο προθερµασµένο διάλυµα ανάκτησης επίτοπου των δοχείων χρώσης. Επαναφέρετε τη θερµοκρασία του υδατόλουτρου και του Epitope Retrieval Solution στους C. Επωάστε επί 40 (±1) λεπτά στους C. Αφαιρέστε από το υδατόλουτρο ολόκληρο το δοχείο χρώσης, µαζί µε τις αντικειµενοφόρους. Αφήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες να κρυώσουν µέσα στο διάλυµα ανάκτησης επίτοπου επί 20 (±1) λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Αδειάστε το Epitope Retrieval Solution και ξεπλύνετε τις τοµές στο Wash Buffer. Για βέλτιστη απόδοση, µετά την ανάκτηση του επιτόπου και πριν από τη χρώση, αφήστε τις τοµές επί 5 λεπτά µέσα σε Wash Buffer. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το διάλυµα ανάκτησης επίτοπου είναι σχεδιασµένο για µία µόνο χρήση. Μην το επαναχρησιµοποιείτε. Βήµα 2: ιαδικασία χρώσης Μετά την ανάκτηση του επιτόπου, οι αντικειµενοφόροι που έχουν τοποθετηθεί στα ράφια του οργάνου τοποθετούνται στις πλατφόρµες χρώσης Dako Automated Link. Το όργανο διεξάγει τη διαδικασία χρώσης χρησιµοποιώντας το κατάλληλο αντιδραστήριο, παρακολουθώντας το χρόνο επώασης και εκπλύνοντας τις αντικειµενοφόρους ανάµεσα σε διαδοχικά αντιδραστήρια. Οι χρόνοι επώασης του αντιδραστηρίου έχουν προγραµµατιστεί εκ των προτέρων στο λογισµικό του Dako Link. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 27/42

28 Καρκίνος του στοµάχου Βήµα 3: Επίχρωση Οι αντικειµενοφόροι µπορούν να αντιχρωµατιστούν µε τις Hematoxylin for Automated Link Platforms (κωδικός SK308). Υπάρχουν 2 πρωτόκολλα χρώσης που παρέχονται στο λογισµικό του Dako. Το πρώτο περιλαµβάνει και το δεύτερο δεν περιλαµβάνει αντίχρωση αιµατοξυλίνης. Ο χρόνος επώασης της αιµατοξυλίνης έχει προγραµµατιστεί εκ των προτέρων στο πρωτόκολλο που περιλαµβάνει αντίχρωση. Ανατρέξτε στον Οδηγό χρήσης του Dako Automated Link Staining System για περαιτέρω πληροφορίες για προγραµµατισµό των πρωτοκόλλων. Βήµα 4: Στερέωση Συνιστάται η χρήση µη υδατικού υλικού µόνιµης στερέωσης. Ωστόσο, και η χρήση υδατικού υλικού στερέωσης είναι επίσης αποδεκτή. Τα δείγµατα µπορούν να επικαλυφθούν και να καλυφθούν µε καλυπτρίδα µε υδατικό µέσο επικάλυψης, όπως το Dako Faramount (κωδικός S3025), ή το Dako Glycergel (κωδικός C0563). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η ανάγνωση των αντικειµενοφόρων πλακών είναι δυνατό να γίνει σε βολικό για σας χρόνο. Ωστόσο, εάν οι αντικειµενοφόροι πλάκες έχουν καλυφθεί µε καλυπτρίδα µε χρήση υδατικού υλικού στερέωσης και εκτεθούν σε έντονο φως επί χρονικό διάστηµα µίας εβδοµάδας, ενδέχεται να λάβει χώρα ξεθώριασµα σε κάποιο βαθµό. Για την ελαχιστοποίηση του ξεθωριάσµατος, φυλάσσετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στο σκοτάδι σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 ). Έλεγχος ποιότητας - Στόµαχος υχόν διαφορές στην καθήλωση, την επεξεργασία και την ενσωµάτωση των ιστών στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να οδηγήσει σε σηµαντική διακύµανση των αποτελεσµάτων, τέτοια που να χρειάζεται η τακτική εκτέλεση εσωτερικών ελέγχων εκτός των αντικειµενοφόρων πλακών µάρτυρα που παρέχονται από την Dako. τις Η.Π.Α., για πρόσθετες πληροφορίες, ανατρέξτε στις κατευθυντήριες οδηγίες ποιοτικού ελέγχου του προγράµµατος πιστοποίησης ανοσοκυτταροχηµείας του Κολεγίου Αµερικανών Παθολόγων (College of American Pathologists, CAP), την εγκεκριµένη κατευθυντήρια οδηγία (23) περί διασφάλισης ποιότητας στην ανοσοκυτταροχηµεία της CLSI (πρώην NCCLS) και τη βιβλιογραφική αναφορά 24. Πίνακας 8: Ο σκοπός του ηµερήσιου ποιοτικού ελέγχου. Ιστός: καθηλωµένος και επεξεργασµένος όπως τα δείγµατα ασθενών Θετικός µάρτυρας: Ιστός ή κύτταρα που περιέχουν το αντιγόνο-στόχος προς ανίχνευση (είναι δυνατό να βρίσκεται στον ιστό ασθενούς). Ο ιδανικός µάρτυρας είναι ασθενώς θετικός ιστός χρώσης, επειδή αυτός είναι ο πλέον ευαίσθητος στη διάσπαση αντισώµατος ή αντιγόνου Αρνητικός µάρτυρας: Ιστοί ή κύτταρα που αναµένονται να είναι αρνητικοί (είναι δυνατό να βρίσκονται στον ιστό ασθενούς ή στον ιστό θετικού µάρτυρα) Ιστός ασθενούς Αντικειµενοφόρος πλάκα που παρέχεται από την Dako Σύστηµα ειδικού αντισώµατος & ανίχνευσης Ελέγχει όλα τα στάδια της ανάλυσης. Επικυρώνει τα χρησιµοποιούµενα αντιδραστήρια και τις διαδικασίες που εφαρµόζονται για τη χρώση πρωτεΐνης HER2 Ανίχνευση µη επιδιωκόµενης διασταυρούµενης αντίδρασης αντισώµατος µε κύτταρα ή κυτταρικά συστατικά Ανίχνευση ειδικής χρώσης φόντου Ελέγχει µόνον τη διαδικασία χρώσης Μη ειδικό αντίσωµα* ή σύστηµα ανίχνευσης ρυθµιστικού διαλύµατος συν το ίδιο όπως χρησιµοποιείται µε το ειδικό αντίσωµα Ανίχνευση µη ειδικής χρώσης φόντου Ανίχνευση µη ειδικής χρώσης φόντου Ανίχνευση µη ειδικής χρώσης φόντου * Ορός από τα ίδια είδη µε το ειδικό αντίσωµα, αλλά µη κατευθυνόµενος ενάντια του ίδιου αντιγόνου-στόχο. Για την ανίχνευση µη ειδικής σύνδεσης αντιγόνου, π.χ. δέσµευση του τµήµατος Fc του αντιγόνου από τον ιστό. Αντικειµενοφόρος-µάρτυρας (παρέχεται) Καθεµιά από τις παρεχόµενες αντικειµενοφόρους πλάκες µάρτυρα περιέχει τρεις κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του µαστού, καθηλωµένες σε φορµαλίνη και ενσωµατωµένες σε παραφίνη, σε µορφή ιζήµατος, µε βαθµολογία έντασης χρώσης 0, 1+ και 3+. Σε κάθε ανάλυση χρώσης, µία αντικειµενοφόρος πλάκα πρέπει να υποβάλλεται σε χρώση. Με την αξιολόγηση των κυτταρικών σειρών της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα που παρέχεται από την Dako υποδεικνύεται η εγκυρότητα της ανάλυσης χρώσης. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 28/42

29 Καρκίνος του στοµάχου Ιστός θετικού µάρτυρα Οι µάρτυρες πρέπει να είναι νωπά δείγµατα αυτοψίας, βιοψίας ή χειρουργικά, τα οποία έχουν υποβληθεί σε καθήλωση, επεξεργασία και ενσωµάτωση στον ελάχιστο δυνατό χρόνο και µε τον ίδιο τρόπο όπως και το(α) δείγµα(τα) ασθενών. Οι ιστοί θετικού µάρτυρα υποδεικνύουν την ορθότητα της προετοιµασίας των ιστών και των τεχνικών χρώσης. Σε κάθε ανάλυση χρώσης, πρέπει να περιλαµβάνεται ένας ιστός θετικού µάρτυρα για κάθε σύνολο συνθηκών εξέτασης. Οι ιστοί θετικού µάρτυρα πρέπει να δίνουν ασθενώς θετική χρώση, προκειµένου να επιτρέπουν την ανίχνευση ακόµη και ανεπαίσθητων µεταβολών της ευαισθησίας του πρωτεύοντος αντισώµατος. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα που παρέχονται µαζί µε το κιτ αυτό ή τυχόν δείγµατα που υποβάλλονται σε επεξεργασία διαφορετική από το(α) δείγµα(τα) ασθενών επικυρώνουν µόνον την απόδοση των αντιδραστηρίων και δεν επαληθεύουν την ορθότητα της προετοιµασίας των ιστών. Ως ιδανικό ιστό θετικό-µάρτυρα, χρησιµοποιήστε ιστό από αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, στον οποίο έχει προηγουµένως εξακριβωθεί υπερέκφραση 2+ της πρωτεΐνης HER2. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Γνωστός ιστός θετικού µάρτυρα πρέπει να χρησιµοποιείται µόνον για λόγους παρακολούθησης της ορθής απόδοσης των επεξεργασµένων ιστών και των αντιδραστηρίων εξέτασης και ΟΧΙ ως επικουρικό µέσο διατύπωσης ειδικής διάγνωσης δειγµάτων ασθενών. Εάν ο ιστός θετικού µάρτυρα δεν παρουσιάζει ορθή θετική χρώση, τα αποτελέσµατα για τα δείγµατα ασθενών πρέπει να θεωρούνται µη έγκυρα. Ιστός αρνητικού µάρτυρα Χρησιµοποιήστε ιστό αρνητικού µάρτυρα (γνωστού ως αρνητικού στην πρωτεΐνη HER2), καθηλωµένο, επεξεργασµένο και ενσωµατωµένο µε τρόπο πανοµοιότυπο µε το(α) δείγµα(τα) ασθενών, σε κάθε ανάλυση χρώσης για επαλήθευση της ειδικότητας του πρωτεύοντος αντισώµατος και την παροχή ένδειξης ειδικής χρώσης φόντου. Κατάλληλος για χρήση ως ιστός αρνητικού µάρτυρα είναι ιστός του κόλου, του ήπατος ή του θυρεοειδούς. Η ποικιλία διαφορετικών τύπων κυττάρων, που υπάρχει στις περισσότερες ιστικές τοµές, προσφέρει εσωτερικές θέσεις αρνητικού µάρτυρα (αυτό θα πρέπει να επαληθεύεται από το χρήστη). Εάν λάβει χώρα ειδική χρώση στον ιστό αρνητικού µάρτυρα, τα αποτελέσµατα για τα δείγµατα ασθενούς πρέπει να θεωρηθούν µη έγκυρα και η δοκιµή να ξαναγίνει. Ανατρέξτε στον Οδηγό χρήσης της πλατφόρµας Dako Automated Link για περαιτέρω πληροφορίες για προγραµµατισµό των αντικειµενοφόρων-µαρτύρων. Μη ειδικό αρνητικό αντιδραστήριο µάρτυρας Χρησιµοποιήστε το παρεχόµενο αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα αντί του πρωτεύοντος αντισώµατος, σε µια τοµή από κάθε δείγµα ασθενούς, για την αξιολόγηση µη ειδικής χρώσης και τη διευκόλυνση της ερµηνείας της ειδικής χρώσης στη θέση του αντιγόνου. Η περίοδος επώασης για το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα πρέπει να αντιστοιχεί σε εκείνη του πρωτεύοντος αντισώµατος. Επαλήθευση δοκιµασίας Πριν το σύστηµα χρώσης χρησιµοποιηθεί σε διαγνωστικές διαδικασίες, ο χρήστης πρέπει να επαληθεύσει την απόδοση της δοκιµασίας, εξετάζοντάς την µε µια σειρά ιστών του εργαστηρίου που έχουν γνωστά χαρακτηριστικά απόδοσης σε τεχνικές IHC και οι οποίοι να αντιπροσωπεύουν γνωστούς θετικούς και αρνητικούς ιστούς. Για πρόσθετες πληροφορίες, ανατρέξτε στις κατευθυντήριες οδηγίες ποιοτικού ελέγχου που περιγράφηκαν παραπάνω στην ενότητα αυτή του ένθετου προϊόντος και στις απαιτήσεις ποιοτικού ελέγχου του προγράµµατος πιστοποίησης ανοσοκυτταροχηµείας του Κολεγίου Αµερικανών Παθολόγων (College of American Pathologists, CAP) ή/και την εγκεκριµένη κατευθυντήρια οδηγία (23) περί διασφάλισης ποιότητας στην ανοσοκυτταροχηµεία της CLSI (πρώην NCCLS). Αυτές οι διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου πρέπει να επαναλαµβάνονται για κάθε νέα παρτίδα αντισώµατος ή σε κάθε περίπτωση µεταβολής των παραµέτρων του προσδιορισµού. Αδενοκαρκινώµατα του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, µε γνωστή ένταση χρώσης πρωτεΐνης HER2 που κυµαίνεται µεταξύ 0 και 3+, καθώς και αρνητικοί ιστοί, π.χ. του παχέος εντέρου, του ήπατος ή του θυρεοειδούς, είναι κατάλληλοι για την επαλήθευση του προσδιορισµού. Ερµηνεία χρώσης - Στόµαχος Για τον προσδιορισµό της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης HER2, µόνον η ένταση και το σχήµα χρώσης της µεµβράνης πρέπει να αξιολογούνται µε την κλίµακα του Πίνακα 9. Η αξιολόγηση των αντικειµενοφόρων πλακών πρέπει να εκτελείται από παθολόγο µε τη βοήθεια µικροσκοπίου φωτός. Για την αξιολόγηση της ανοσοκυτταροχηµικής χρώσης και βαθµολογίας, κρίνεται κατάλληλη η χρήση αντικειµενικού φακού µεγέθυνσης 10x. Η χρήση µεγέθυνσης 5 40x στον αντικειµενικό φακό είναι χρήσιµη για την επιβεβαίωση της βαθµολογίας. Η χρώση του κυτταροπλάσµατος πρέπει να θεωρείται ως µη ειδική χρώση και δεν πρέπει να περιλαµβάνεται στην αξιολόγηση της έντασης χρώσης της µεµβράνης (8). Προς διευκόλυνση της διάκρισης ανάµεσα στις χρώσεις έντασης 0, 1+, 2+ και 3+, ανατρέξτε στο έγγραφο HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer της Dako, όπου περιλαµβάνονται αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες διαφόρων εντάσεων και σχηµάτων χρώσης. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 29/42

30 Καρκίνος του στοµάχου Μόνο δείγµατα από ασθενείς που πάσχουν από αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, πρέπει να βαθµολογούνται. Σε περιπτώσεις εντερικής µεταπλασίας in situ και γαστρικού αδενοκαρκινώµατος στο ίδιο δείγµα, µόνον το συστατικό του γαστρικού αδενοκαρκινώµατος πρέπει να βαθµολογείται. Για ερµηνεία των κεχρωσµένων βιοψιών HercepTest συνιστάται συστάδα τουλάχιστον 5 κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου. Μια συστάδα τουλάχιστον 5 κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου αποτελείται από 5 συνδεόµενα κύτταρα όγκου κεχρωσµένα για HER2. Πίνακας 9. Ερµηνεία και βαθµολόγηση της ανοσοκυτταρικής χρώσης του HER2 Βαθµολο γία Χειρουργικό δείγµα - Σχήµα χρώσης Καµία αντιδραστικότητα ή καµία µεµβρανική αντιδραστικότητα σε < 10% των κυττάρων του όγκου Αµυδρή/σχεδόν ανεπαίσθητη αντιδραστικότητα σε 10% των κυττάρων του όγκου, τα κύτταρα αντιδρούν µόνο σε µέρος της µεµβράνης Ασθενής ως µέτρια πλήρη, βασοπλευρική ή πλευρική µεµβρανική αντιδραστικότητα σε 10% των κυττάρων του όγκου Ισχυρή πλήρης, βασοπλευρική ή πλευρική µεµβρανική αντιδραστικότητα σε 10% των κυττάρων του όγκου είγµα βιοψίας - Σχήµα χρώσης Καµία αντιδραστικότητα ή καµία µεµβρανική αντιδραστικότητα σε κανένα κύτταρο του όγκου (ή συστάδα < 5 κυττάρων) Συστάδα κυττάρων όγκου ( 5 κύτταρα) µε αµυδρή/σχεδόν ανεπαίσθητη µεµβρανική αντιδραστικότητα ανεξάρτητα από το ποσοστό των κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου Συστάδα κυττάρων όγκου ( 5 κύτταρα) µε ασθενή ως µέτρια πλήρη, βασοπλευρική ή πλευρική µεµβρανική αντιδραστικότητα ανεξάρτητα από το ποσοστό των κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου Συστάδα κυττάρων όγκου ( 5 κύτταρα) µε ισχυρή πλήρη, βασοπλευρική ή πλευρική µεµβρανική αντιδραστικότητα ανεξάρτητα από το ποσοστό των κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου Αξιολόγηση υπερέκφρασης HER2 Αρνητική Αρνητική ιφορούµενη Θετική Οδηγίες βάσει των Hofmann et al. (39). Το HercepTest ερµηνεύεται ως αρνητικό (βαθµολόγηση IHC 0 και 1+), διφορούµενο (βαθµολόγηση IHC 2+) και θετικό (βαθµολόγηση IHC 3+) ως προς την υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2. Το HercepTest δεν προορίζεται για την παροχή προγνωστικών πληροφοριών στον ασθενή και στον ιατρό και δεν έχει επικυρωθεί για το σκοπό αυτό. Για κάθε ανάλυση χρώσης, οι αντικειµενοφόροι πλάκες πρέπει να εξετάζονται µε τη σειρά που αναφέρεται στον Πίνακα 10 για τον προσδιορισµό της εγκυρότητας της ανάλυσης χρώσης και την ηµιποσοτική αξιολόγηση της έντασης χρώσης στον ιστό του δείγµατος. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 30/42

31 Καρκίνος του στοµάχου Πίνακας 10: Σειρά αξιολόγησης αντικειµενοφόρων. Σειρά αξιολόγησης των αντικειµενοφόρων πλακών 1. Αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα, που περιέχει τις τρεις κυτταρικές σειρές Αιτιολογία Παρουσία καστανής χρώσης κυτταρικής µεµβράνης 3+ (υπό µορφή στεφάνης) στην κυτταρική γραµµή µάρτυρα 3+ SK-BR-3, µερικώς φαιά στεφάνη στην κυτταρική γραµµή µάρτυρα 1+ MDA-175, και καµία χρώση στην κυτταρική γραµµή 0 MDA-231 φανερώνουν έγκυρη εξέταση. ιάστικτη και ασυνεχής χρώση µεµβράνης παρουσιάζεται σε ένα µικρό έως µέτριο αριθµό κυττάρων στην ασθενώς θετική κυτταρική σειρά- µάρτυρα 1+ MDA-175. Επίσης, διάστικτη ανοσοχρώση της περιοχής Golgi του κυτταροπλάσµατος µπορεί να παρατηρηθεί στη συγκεκριµένη κυτταρική σειρά. 2. Αντικειµενοφόρος πλάκα ιστού θετικού µάρτυρα 3. Αντικειµενοφόρος πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα 4. Αντικειµενοφόρος πλάκα µε ιστό ασθενούς κεχρωσµένο µε το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα 5. Αντικειµενοφόρος πλάκα µε ιστό ασθενούς κεχρωσµένο µε το πρωτεύον αντίσωµα Παρουσία καφέ χρώσης στο 0 Control Cell Line MDA-231 (αρνητικό για χρώση πρωτεΐνης HER2) υποδεικνύει ότι έλαβε χώρα µη ειδική χρώση κατά τον προσδιορισµό. Τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού ενδέχεται να µην είναι έγκυρα λόγω υπερβολικής χρώσης. Πρέπει να παρατηρηθεί παρουσία καφέ χρώσης µεµβράνης. Η χρώση του κυτταροπλάσµατος και των αρνητικών ιστών δεν πρέπει να υπερβαίνει το 1+. Η ΑΠΟΥΣΙΑ ειδικής χρώσης στην αντικειµενοφόρο πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα επιβεβαιώνει την απουσία διασταυρούµενης αντιδραστικότητας του κιτ µε κύτταρα ή κυτταρικά συστατικά. Εάν λάβει χώρα ειδική χρώση µεµβράνης στην αντικειµενοφόρο πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα, τα αποτελέσµατα για το δείγµα ασθενούς πρέπει να θεωρηθούν µη έγκυρα. Έλλειψη ειδικής µεµβρανικής χρώσης επαληθεύει την ειδική σήµανση του αντιγόνου-στόχου µε το κύριο αντίσωµα. Καστανή ή καστανόχρωµη χρώση που εµφανίζεται στο κυτταρόπλασµα του δείγµατος που έχει υποβληθεί σε επεξεργασία µε το αντιδραστήριο αρνητικό-µάρτυρα, όπως σε συνδετικό ιστό, λευκοκύτταρα, ερυθροκύτταρα, ή νεκρωτικό ιστό, πρέπει να θεωρείται µη ειδική χρώση υποβάθρου και να αναφέρεται στα σχόλια του φύλλου δεδοµένων. Όταν στο δείγµα ανιχνευθεί υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2, εµφανίζεται ως καστανόχρωµη στεφάνη εντοπισµένη στην κυτταρική µεµβράνη των κυττάρων όγκου που υπεβλήθησαν σε θεραπεία µε το πρωτοταγές αντίσωµα. 1. Αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα (παρέχεται): Η αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα, που είναι κεχρωσµένη µε HercepTest, πρέπει να εξετάζεται πρώτη προς επιβεβαίωση ότι όλα τα αντιδραστήρια λειτουργούν κανονικά. Η παρουσία καφέ προϊόντος αντίδρασης (3,3 -διαµινοβενζιδίνη, DAB) στην κυτταρική µεµβράνη υποδεικνύει θετική αντιδραστικότητα. Η παρουσία καφέ χρώσης κυτταρικής µεµβράνης (περιφερειακή χρώση) στο 3+ Control Cell Line SK-BR-3, µερικώς καφέ περιφερειακή χρώση στο 1+ Control Cell Line MDA-175 και καµία χρώση στο 0 Control Cell Line MDA-231 υποδεικνύουν έναν έγκυρο προσδιορισµό. Εάν οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές µάρτυρα δεν πληρούν τα κριτήρια αυτά, όλα τα αποτελέσµατα για τα δείγµατα ασθενών πρέπει να θεωρούνται µη έγκυρα. 2. Αντικειµενοφόρος πλάκα ιστού θετικού µάρτυρα: Αµέσως, µετά πρέπει να εξεταστεί η αντικειµενοφόρος πλάκα µε τον ιστό θετικού µάρτυρα. Αυτή η αντικειµενοφόρος πλάκα επαληθεύει ότι η µέθοδος καθήλωσης και η διαδικασία ανάκτησης επίτοπου είναι αποτελεσµατικές. Χρησιµοποιείτε άθικτα κύτταρα για την ερµηνεία των αποτελεσµάτων χρώσης, διότι τα νεκρωτικά ή εκφυλισµένα κύτταρα συχνά παρουσιάζουν µη ειδική χρώση (25). Η χρώση πρέπει να παρατηρείται στον ιστό του όγκου µε τη µορφή καφέ χρώσης κυτταρικής µεµβράνης. Η καφέ χρώση του κυτταροπλάσµατος και των αρνητικών ιστών στο δείγµα δεν πρέπει να υπερβαίνει τη βαθµολογία έντασης χρώσης του Ιστός αρνητικού µάρτυρα: Η αντικειµενοφόρος πλάκα µε τον ιστό αρνητικού µάρτυρα πρέπει να εξεταστεί αµέσως µετά, για επαλήθευση της ειδικότητας της σήµανσης του αντιγόνου-στόχου από το πρωτεύον αντίσωµα. Η απουσία ειδικής χρώσης στην αντικειµενοφόρο πλάκα ιστού αρνητικού µάρτυρα επιβεβαιώνει την απουσία διασταυρούµενης αντιδραστικότητας του κιτ µε κύτταρα ή κυτταρικά συστατικά. Εάν λάβει χώρα ειδική χρώση στον ιστό αρνητικού µάρτυρα, τα αποτελέσµατα για το δείγµα ασθενούς πρέπει να θεωρηθούν µη έγκυρα. Εναλλακτικά, µπορείτε να χρησιµοποιήσετε αρνητικά µέρη του ιστού θετικού µάρτυρα ως ιστό αρνητικού µάρτυρα, αλλά αυτό πρέπει να επαληθευτεί από το χρήστη. Σηµειώστε ότι ασθενής αντίδραση (ένταση χρώσης 0 1+) µπορεί να παρατηρηθεί στους περισσότερους κανονικούς επιθηλιακούς ιστούς. Στους πιθανούς ιστούς αρνητικού µάρτυρα περιλαµβάνονται ιστοί από τα παρακάτω σηµεία: κόλον, ήπαρ και θυρεοειδής. Η µη ειδική χρώση, εάν υπάρχει, θα έχει διάχυτη όψη. Ενδέχεται επίσης να παρατηρηθεί σποραδική χρώση συνδετικού ιστού σε τοµές από ιστούς υπερβολικά καθηλωµένους σε φορµαλίνη. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 31/42

32 Καρκίνος του στοµάχου Ιστός ασθενή: Τελευταία εξετάζονται τα δείγµατα ασθενών, που είναι κεχρωσµένα µε HercepTest. Θα πρέπει να διαπιστωθεί θετική χρώση, ενδεχοµένως εντός µη ειδικής χρώσης φόντου του αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα. Όπως συµβαίνει µε κάθε ανοσοκυτταροχηµική εξέταση, ένα αρνητικό αποτέλεσµα σηµαίνει ότι δεν ανιχνεύτηκε αντιγόνο και όχι ότι δεν υπήρχε αντιγόνο στα κύτταρα ή στον ιστό που υποβλήθηκε στον προσδιορισµό. Για πιο συγκεκριµένες πληροφορίες σχετικά µε την ανοσοδραστικότητα του HercepTest ανατρέξτε στις ενότητες Περίληψη και επεξήγηση, Περιορισµοί και Χαρακτηριστικά απόδοσης. Πρόσθετες συστάσεις για την ερµηνεία χρώσης HercepTest Αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου, συµπεριλαµβανοµένης της γαστροοισοφαγικής συµβολής, που εξετάζονται για υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 βαθµολογούνται από 0 ως 3+. Παρ' ότι οι περιπτώσεις 0 και 3+ είναι πέραν πάσης αµφιβολίας, ένα µικρό ποσοστό των υπόλοιπων δειγµάτων 1+ και 2+ ενδέχεται να παρουσιάζει µεγαλύτερη δυσκολία στην ερµηνεία. Για την ερµηνεία της χρώσης HercepTest στο εργαστήριό σας, εφαρµόστε τις παρακάτω κατευθυντήριες οδηγίες. 1. Για να επαληθεύσετε την απόδοση του προσδιορισµού, αξιολογήστε τις κυτταρικές σειρές µάρτυρα. 2. Αξιολογήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες θετικού και αρνητικού µάρτυρα. 3. Για την πρώτη αξιολόγηση, συνιστάται χρώση αιµατοξυλίνης και ηωσίνης (H&E) του ιστικού δείγµατος. (Ο όγκος ενδέχεται να µην είναι εµφανής όταν παρατηρείτε το κεχρωσµένο µε HercepTest δείγµα. Αντικειµενοφόρος που χρωµατίστηκε µε H&E απαιτείται προκειµένου ο παθολόγος να επαληθεύσει την παρουσία του όγκου.) Το HercepTest πρέπει να διεξάγεται σε τοµές κατά ζεύγη (σειριακές τοµές) από το ίδιο µπλοκ παραφίνης του δείγµατος. 4. Αξιολογήστε πρώτα τις κεχρωσµένες για υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 τοµές χαµηλής βαθµολογίας. Η πλειοψηφία των θετικών περιπτώσεων θα είναι προφανής σε µικρή µεγέθυνση. 5. Για τις περιπτώσεις 1 +, χρησιµοποιήστε αντικειµενικό φακό µεγέθυνσης 40x για την επιβεβαίωση της βαθµολογίας. 6. Για τις περιπτώσεις 2+, χρησιµοποιήστε αντικειµενικό φακό µεγέθυνσης 10x-20x για την επιβεβαίωση της βαθµολογίας. Χειρουργικά δείγµατα 1. Πρέπει να χρησιµοποιηθούν οι καλοδιατηρηµένες και καλά κεχρωσµένες περιοχές του δείγµατος, για τον εντοπισµό των επί τοις εκατό θετικών κυττάρων όγκου. 2. Εάν η πλειοψηφία των κυττάρων του όγκου παρουσιάζουν πλήρη, βασοπλευρική ή πλευρική χρώση µεµβράνης, η βαθµολογία χρώσης είναι είτε 2+ είτε Εάν διαπιστωθεί πλήρης, βασοπλευρική ή πλευρική χρώση µεµβράνης ισχυρής έντασης σε ποσοστό ίσο ή µεγαλύτερο του 10% των κυττάρων του όγκου, η βαθµολογία του δείγµατος είναι Εάν διαπιστωθεί πλήρης, βασοπλευρική ή πλευρική χρώση µεµβράνης ασθενούς ως µέτριας έντασης σε ποσοστό ίσο ή µεγαλύτερο του 10% των κυττάρων του όγκου, η βαθµολογία του δείγµατος είναι Αν ένα ποσοστό ίσο ή µεγαλύτερο του 10% των κυττάρων του όγκου στα χειρουργικά δείγµατα, τα κεχρωσµένα µόνο σε µέρος της µεµβράνης, έχουν αµυδρή/σχεδόν ανεπαίσθητη ένταση, η βαθµολογία του δείγµατος είναι Εάν λιγότερο από το 10% των κυττάρων του όγκου στα χειρουργικά δείγµατα παρουσιάζουν χρώση, ανεξάρτητα από το πρότυπο χρώσης (π.χ. πλήρης, βασοπλευρική ή πλευρική ή χρώση µέρους της µεµβράνης), η βαθµολογία είναι Αν δεν παρατηρηθεί χρώση, η βαθµολογία του χειρουργικού δείγµατος είναι 0. είγµατα βιοψίας 1. Μια συστάδα τουλάχιστον 5 κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου αποτελείται από 5 συνδεόµενα κύτταρα όγκου κεχρωσµένα για HER2. 2. Αν υπάρχει συστάδα κυττάρων όγκου µε τουλάχιστον 5 κεχρωσµένα κύτταρα όγκου µε ισχυρή πλήρη, βασοπλευρική ή πλευρική µεµβρανική χρώση, η βαθµολογία του δείγµατος βιοψίας είναι 3 +, ανεξάρτητα από το ποσοστό των κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου. 3. Αν υπάρχει συστάδα κυττάρων όγκου µε τουλάχιστον 5 κεχρωσµένα κύτταρα όγκου µε ασθενή ως µέτρια πλήρη, βασοπλευρική ή πλευρική µεµβρανική χρώση, η βαθµολογία του δείγµατος βιοψίας είναι 2 +, ανεξάρτητα από το ποσοστό των κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου. 4. Αν υπάρχει συστάδα κυττάρων όγκου µε τουλάχιστον 5 κεχρωσµένα κύτταρα όγκου µε αµυδρή/σχεδόν ανεπαίσθητη πλήρη, βασοπλευρική ή πλευρική µεµβρανική χρώση και τα κύτταρα είναι κεχρωσµένα µόνο σε µέρος της µεµβράνης τους, η βαθµολογία του δείγµατος βιοψίας είναι 1+, ανεξάρτητα από το ποσοστό των κεχρωσµένων κυττάρων του όγκου. 5. Αν δεν παρατηρηθεί χρώση, η βαθµολογία του δείγµατος βιοψίας είναι Αν παρατηρηθεί µεµβρανική χρώση (ανεξαρτήτως έντασης χρώσης) σε συστάδα λιγότερων από 5 κυττάρων του όγκου, η βαθµολογία του δείγµατος βιοψίας είναι 0. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 32/42

33 Καρκίνος του στοµάχου Γενικοί περιορισµοί - Στόµαχος Περιορισµοί ειδικοί για το προϊόν - Στόµαχος 1. Η ανοσοκυτταροχηµεία είναι µια πολυβάθµια διαγνωστική διαδικασία για την οποία απαιτείται εξειδικευµένη εκπαίδευση στην επιλογή των κατάλληλων αντιδραστηρίων, την επιλογή, καθήλωση και επεξεργασία των ιστών, την προετοιµασία της αντικειµενοφόρου πλάκας ανοσοκυτταροχηµείας και την ερµηνεία των αποτελεσµάτων χρώσης. 2. Η ιστική χρώση εξαρτάται από το χειρισµό και την επεξεργασία του ιστού πριν από τη χρώση. Τυχόν εσφαλµένη καθήλωση, κατάψυξη, απόψυξη, πλύση, ξήρανση, θέρµανση, τοµή ή µόλυνση από άλλους ιστούς ή υγρά είναι δυνατό να προκαλέσει τεχνήµατα, παγίδευση αντισώµατος ή εσφαλµένως αρνητικά αποτελέσµατα. Τυχόν ασυνεπή αποτελέσµατα ενδέχεται να οφείλονται σε παραλλαγές των µεθόδων µονιµοποίησης και ενσωµάτωσης ή σε εγγενείς ανωµαλίες εντός του ιστού. 3. Τυχόν υπερβολική ή ατελής επίχρωση ενδέχεται να διακυβεύσει την ορθότητα της ερµηνείας των αποτελεσµάτων. 4. Η κλινική ερµηνεία τυχόν θετικής χρώσης ή η απουσία της πρέπει να αξιολογείται στα πλαίσια της κλινικής παρουσίασης, της µορφολογίας και άλλων ιστοπαθολογικών κριτηρίων. Η κλινική ερµηνεία οποιασδήποτε χρώσης ή η απουσία της πρέπει να συµπληρώνεται από µορφολογικές µελέτες και κατάλληλους ελέγχους, καθώς και άλλες διαγνωστικές εξετάσεις. Η ερµηνεία του κεχρωσµένου παρασκευάσµατος αποτελεί ευθύνη κατάλληλα εκπαιδευµένου παθολόγου, που είναι εξοικειωµένος µε τα χρησιµοποιούµενα αντισώµατα και αντιδραστήρια και τις εφαρµοζόµενες µεθόδους. Η χρώση πρέπει να εφαρµόζεται σε εργαστήριο που διαθέτει τις κατάλληλες πιστοποιήσεις και άδειες λειτουργίας, υπό την επίβλεψη παθολόγου που θα φέρει την ευθύνη της εξέτασης των κεχρωσµένων αντικειµενοφόρων πλακών και θα διασφαλίζει την επάρκεια των θετικών και των αρνητικών µαρτύρων. 5. Ιστοί από άτοµα µολυσµένα από τον ιό της ηπατίτιδας Β, που περιέχουν επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας B (HBsAg), ενδέχεται να παρουσιάσουν µη ειδική χρώση µε την υπεροξειδάση του χρένου (26). 6. Τα αντιδραστήρια ενδέχεται να προκαλέσουν απροσδόκητες αντιδράσεις σε τύπους ιστών που δεν έχουν υποβληθεί σε εξέταση στο παρελθόν. Η πιθανότητα να λάβουν χώρα απροσδόκητες αντιδράσεις ακόµη και σε τύπους ιστών που έχουν υποβληθεί σε εξέταση στο παρελθόν δεν είναι δυνατό να εξαλειφθεί τελείως, λόγω της βιολογικής παραλλακτικότητας της έκφρασης αντιγόνου στα νεοπλάσµατα ή σε άλλους παθολογικούς ιστούς (27). Επικοινωνήστε µε την τεχνική υποστήριξη της Dako µε πιστοποιηµένες µη αναµενόµενες αντιδράσεις. 7. Ψευδώς θετικά αποτελέσµατα είναι δυνατό να προκύψουν λόγω µη ανοσολογικής δέσµευσης πρωτεϊνών ή προϊόντων αντίδρασης του υποστρώµατος. Επίσης, είναι δυνατό να προκύψουν από δραστηριότητα ψευδουπεροξειδάσης (ερυθροκύτταρα) και ενδογενούς υπεροξειδάσης (κυτόχρωµα C) (27). 8. Η διαδικασία χρώσης πρέπει να διεξάγεται στην εκ των προτέρων προγραµµατισµένη θερµοκρασία (20 25 C). 1. Το αντιγόνο που υπάρχει στο 1+ Control Cell Line MDA-175 υπόκειται σε αποδόµηση µε την πάροδο του χρόνου. Αξιολογείτε τα αποτελέσµατα της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα σε συνδυασµό µε την ηµεροµηνία λήξης της. Τυχόν αρνητική χρώση των κυττάρων του MDA-175 υποδεικνύει µόνον ότι η αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα ενδέχεται να έχει αλλοιωθεί. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα πρέπει να φυλάσσονται στους 2 8 C. 2. Ψευδώς αρνητικά αποτελέσµατα είναι δυνατό να οφείλονται στην αποδόµηση του αντιγόνου στους ιστούς µε την πάροδο του χρόνου. Τα δείγµατα πρέπει να χρωµατίζονται εντός 4 6 εβδοµάδων από την τοποθέτηση των ιστών στις αντικειµενοφόρους και όταν φυλάσσονται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) (28). 3. Μην αντικαθιστάτε αντιδραστήρια του κιτ µε αντιδραστήρια άλλων αριθµών παρτίδας ή άλλων κατασκευαστών. 4. Ψευδή αποτελέσµατα είναι δυνατό να ληφθούν από την αξιολόγηση κυτοπλασµατικής χρώσης. Κατά την ερµηνεία αποτελεσµάτων, να λαµβάνετε υπόψη σας µόνον την ένταση της χρώσης στην κυτταρική µεµβράνη. 5. Οι κεχρωσµένες αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα πρέπει να χρησιµοποιούνται µόνο για επικύρωση της ανάλυσης χρώσης και δεν πρέπει να χρησιµοποιούνται ως οδηγός βαθµολόγησης της αντίδρασης χρώσης σε ιστικές τοµές. 6. Περιστασιακά, είναι δυνατό να παρατηρηθεί έντονη εστιασµένη χρώση (3+), τα λεγόµενα θερµά σηµεία. Αυτό ενδέχεται να είναι αποτέλεσµα ανοµοιόµορφης καθήλωσης ή/και επεξεργασίας του ιστού. Στην περίπτωση αυτή, συνιστάται η ανοσοχρώση δεύτερου τεµαχίου ιστού από το ίδιο δείγµα. 7. Η εφαρµογή του HercepTest σε δείγµατα καθηλωµένα σε καθηλωτικά διαφορετικά από την ουδέτερα ρυθµισµένη φορµαλίνη δεν έχει επικυρωθεί. 8. Σηµειώνεται ότι τα φυσιολογικά επιθήλια αµυγδαλών και οισοφάγου ενδέχεται να παρουσιάσουν χρώση έντασης µέχρι και Η χρήση συνθλιµµένων δειγµάτων καρκίνου του στοµάχου και η ερµηνεία τεχνηµάτων γύρω από τα άκρα της βιοψίας πρέπει να αποφεύγονται. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 33/42

34 Καρκίνος του στοµάχου Χαρακτηριστικά απόδοσης - Στόµαχος Ιστορικό Η ασφάλεια και η αποτελεσµατικότητα του (Herceptin ) αποδείχθηκε σε κλινική µελέτη (τη δοκιµή ToGA) (37, 38). Η µελέτη σχεδιάστηκε ως µελέτη ανοιχτής επισήµανσης, φάσης III, τυχαιοποιηµένη, πολυκεντρική, σε ασθενείς που ανιχνεύθηκαν µε θετικό HER2 και µη εγχειρίσιµο, τοπικά προχωρηµένο, υποτροπιάζον ή/και µεταστατικό αδενοκαρκίνωµα του στοµάχου ή της γαστροοισοφαγικής συµβολής. Στη δοκιµή ToGA, η θετικότητα σε HER2 ορίστηκε ως θετική µε IHC (3+) (HercepTest, Dako) ή/και θετική µε HER2 FISH (HER2/CEN17 2,0) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako). Αφού συµπεριλήφθησαν στη µελέτη, οι ασθενείς τυχαιοποιήθηκαν για να υποβληθούν σε χηµειοθεραπεία (5-FU ή καπεσιταβίνη και σισπλατίνη) ή χηµειοθεραπεία σε συνδυασµό µε trastuzumab. Το βασικό τελικό σηµείο στη µελέτη ήταν η συνολική βιωσιµότητα (OS). Στη µελέτη, τυχαιοποιήθηκε ένα σύνολο 594 ασθενών και 584 ασθενείς έλαβαν τη φαρµακευτική αγωγή της µελέτης και συµπεριλήφθηκαν στο σύνολο των αναλύσεων (FAS). Για το βασικό τελικό σηµείο, ο συνδυασµός χηµειοθεραπείας και trastuzumab απεδείχθη στατιστικά ανώτερος από τη χηµειοθεραπεία από µόνη της. Η µέση συνολική βιωσιµότητα OS αυξήθηκε από 11,1 σε 13,8 µήνες (p=0,0046) µε αναλογία κινδύνου 0,74 (95% CI: ). Οι καµπύλες Kaplan-Meier για την OS φαίνονται στο Σχήµα 1. Πιθανότητα επιβίωσης 1,0 0,9 0,8 0,7 Έλεγχος ηµερολογίου κατάταξης P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 11,1 13,8 Χρόνος (µήνες) Αριθ. από αριστερά Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Οµάδα θεραπείας Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Βήµα 1. Καµπύλη Kaplan-Meier για την OS (n=584). Όταν τα δεδοµένα ήταν διαθέσιµα, έγιναν ερευνητικές αναλύσεις και, ως αποτέλεσµα, ορίστηκαν δύο νέες υπο- οµάδες HER2 βάσει της βαθµολογίας IHC: Οµάδα 1 ( οµάδα χαµηλής έκφρασης HER2 ): IHC 0/FISH+ και IHC 1+/FISH+ (n=131) Οµάδα 2 ( οµάδα υψηλής έκφρασης HER2 ): IHC 2+/FISH+ και IHC 3+ including IHC 3+/FISH αρνητικό ή IHC 3+/FISH κανένα αποτέλεσµα (n=446) Όταν έγινε επανάληψη της βασικής ανάλυσης της OS για την οµάδα υψηλής έκφρασης HER2 (n=446), το όφελος υπέρ της συνδυασµένης θεραπείας ήταν ακόµα µεγαλύτερο. Η µέση OS για την οµάδα των ασθενών που είχαν υποβληθεί σε χηµειοθεραπεία σε συνδυασµό µε το trastuzumab παρουσίασε αύξησης 16,0 µηνών σε σύγκριση µε τους 11,8 µήνες (p=0,0005) που ίσχυε για τους ασθενείς που υποβλήθηκαν µόνο σε χηµειοθεραπεία. Η αναλογία κινδύνου για αυτή την ανάλυση µειώθηκε στο 0,65 (95% CI: ). Οι καµπύλες Kaplan-Meier για την OS για την οµάδα υψηλής έκφρασης HER2 φαίνονται στο Σχήµα 2. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 34/42

35 Καρκίνος του στοµάχου Πιθανότητα επιβίωσης 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Χρόνος (µήνες) Αριθ. από αριστερά Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Οµάδα θεραπείας Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Σχήµα 2. Καµπύλη Kaplan-Meier για την OS για την οµάδα υψηλής έκφρασης HER2 (n=446). Η δοκιµή ToGA έδειξε ότι ο συνδυασµός των µεθόδων IHC και FISH είναι προβλεπτικός για το αποτέλεσµα της συνδυασµένης θεραπείας µε χηµειοθεραπεία και trastuzumab, ωστόσο οι διερευνητικές post hoc αναλύσεις φαίνεται να δείχνουν ότι ασθενείς µε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης HER2 (IHC2+/FISH+ και IHC3+) αποκοµίζουν το µεγαλύτερο όφελος. Αυτό µπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός ότι η πρωτεΐνη αποτελεί το στόχο για το trastuzumab. Για περισσότερες πληροφορίες για τη δοκιµή ToGA, ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας του Herceptin. Αναπαραγωγιµότητα Επαναληψιµότητα εντός κύκλων Η αναπαραγωγιµότητα για τον ίδιο προσδιορισµό ελέγχθηκε σε ένα εργαστήριο µε 3 δείγµατα διαφορετικής βαθµολογίας χρώσης IΗC. Κάθε δείγµα αναλύθηκε εις τριπλούν. Το πρωτόκολλο αυτό εφαρµόστηκε σε αυτοµατοποιηµένη χρώση. Όλα τα δείγµατα έδωσαν 100% αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα. Η αναπαραγωγιµότητα για τον ίδιο προσδιορισµό ελέγχθηκε σε ένα εργαστήριο µε 11 δείγµατα διαφορετικής βαθµολογίας χρώσης IΗC. Κάθε δείγµα αναλύθηκε εις τριπλούν. Το πρωτόκολλο αυτό εφαρµόστηκε στη µη αυτοµατοποιηµένη χρώση. Όλα τα δείγµατα έδωσαν 100% αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα. Επαναληψιµότητα µεταξύ κύκλων και µεταξύ εργαστηρίων Έγινε ανάλυση HercepTest σε 60 διαφορετικά δείγµατα καρκίνου του στοµάχου που ελήφθησαν από περιοχές του στοµάχου ή της γαστροοισοφαγικής συµβολής, προερχόµενα από χειρουργικές εξαιρέσεις και βιοψίες, επί πέντε µη διαδοχικές ηµέρες σε τρία κέντρα µελέτης. Τα 60 δείγµατα της µελέτης διανεµήθηκαν ισοµερώς σε τρεις κατηγορίες κατάστασης HER2. ιεξήχθησαν συνολικά 2040 βαθµολογήσεις HER2 από έξι παθολογοανατόµους. Η µεταξύ ηµερών συµφωνία (αρνητική, διφορούµενη, θετική) κυµάνθηκε από 83,1% έως 98,3%. Σε 47 από τις 60 πιθανές συγκρίσεις, η συµφωνία ήταν 90,0% ή παραπάνω. Στον Πίνακα 11, παρουσιάζονται συγκεκριµένα παραδείγµατα των συγκρίσεων µεταξύ ηµερών µε τη µέση συµφωνία να είναι 91,2%, 92,5% και 92,5% για τα τρία κέντρα. Η συµφωνία µεταξύ κέντρων ήταν 82,7%, 75,0% και 88,0%, αντίστοιχα για σύγκριση κέντρων κατά ζεύγη (βλ. Πίνακα 12). Σύµφωνα µε τον έλεγχο Fisher s exact test, τα αποτελέσµατα δεν διέφεραν µεταξύ κέντρων. Η συµφωνία µεταξύ των παρατηρητών παθολογοανατόµων σε κάθε κέντρο ήταν 88,0%, 83,6% και 81,0% για τα τρία κέντρα µελέτης, αντίστοιχα (Πίνακας 13). Συµπερασµατικά, η ανάλυση HercepTest των δειγµάτων καρκίνου του στοµάχου σε τρία κέντρα µελέτης διαπίστωσε καλή συµφωνία παρατηρήσεων µεταξύ ηµερών, κέντρων και παρατηρητών. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 35/42

36 Καρκίνος του στοµάχου Πίνακας 11. Συνολικά ποσοστά συµφωνίας µεταξύ ηµερών - Υποσύνολο 12 εκ των 60 συγκρίσεων Παρατηρητής 1 Παρατηρητής 2 Μέσος όρος Συµφωνία CI95 LL 1 Συµφωνία CI95 LL 1 συµφωνίας Κέντρο 1 Ηµέρα 1 έναντι Ηµέρας 2 85,0 74,4 93,3 84,9 91,2 Ηµέρα 3 έναντι Ηµέρας 4 93,3 84,9 93,3 84,9 Κέντρο 2 Ηµέρα 1 έναντι Ηµέρας 2 95,0 87,3 83,1 72,0 92,5 Ηµέρα 3 έναντι Ηµέρας 4 96,7 89,7 95,0 87,3 Κέντρο 3 Ηµέρα 1 έναντι Ηµέρας 2 90,0 80,5 91,7 82,7 92,5 Ηµέρα 3 έναντι Ηµέρας 4 96,7 89,7 91,7 82,7 1 CI95 LL: 95% διάστηµα εµπιστοσύνης κατώτατου ορίου. Πίνακας 12. Συνολικά ποσοστά συµφωνίας µεταξύ κέντρων Συµφωνία CI95 LL 1 Μέσος όρος συµφωνίας Κέντρο 1 έναντι Κέντρου 2 Ηµέρα 1 έναντι Ηµέρας 1 83,3 72,4 Ηµέρα 2 έναντι Ηµέρας 2 85,0 74,4 Ηµέρα 3 έναντι Ηµέρας 3 85,0 74,4 Ηµέρα 4 έναντι Ηµέρας 4 81,7 70,5 Ηµέρα 5 έναντι Ηµέρας 5 78,3 66,7 Κέντρο 1 έναντι Κέντρου 3 Ηµέρα 1 έναντι Ηµέρας 1 80,0 68,6 Ηµέρα 2 έναντι Ηµέρας 2 73,3 61,2 Ηµέρα 3 έναντι Ηµέρας 3 78,3 66,7 Ηµέρα 4 έναντι Ηµέρας 4 68,3 55,9 Ηµέρα 5 έναντι Ηµέρας 5 75,0 63,0 Κέντρο 2 έναντι Κέντρου 3 Ηµέρα 1 έναντι Ηµέρας 1 88,3 78,5 Ηµέρα 2 έναντι Ηµέρας 2 86,7 76,4 Ηµέρα 3 έναντι Ηµέρας 3 90,0 80,5 Ηµέρα 4 έναντι Ηµέρας 4 86,7 76,4 Ηµέρα 5 έναντι Ηµέρας 5 88,3 78,5 1 CI95 LL: 95% διάστηµα εµπιστοσύνης κατώτατου ορίου. 82,7 75,0 88,0 ( ) P04083GR_01_SK / σ. 36/42

37 Καρκίνος του στοµάχου Πίνακας 13. Ποσοστά συµφωνίας µεταξύ παραητρητών Κέντρο 1 Κέντρο 2 Κέντρο 3 1 Μέσος όρος Συµφωνία CI 95 LL συµφωνίας Ηµέρα 1 91,7 82,7 Ηµέρα 2 91,7 82,7 Ηµέρα 3 93,3 84,9 Ηµέρα 4 83,3 72,4 Ηµέρα 5 80,0 68,6 Ηµέρα 1 86,4 76,0 Ηµέρα 2 83,3 72,4 Ηµέρα 3 83,3 72,4 Ηµέρα 4 83,3 72,4 Ηµέρα 5 81,7 70,5 Ηµέρα 1 80,0 68,6 Ηµέρα 2 78,3 66,7 Ηµέρα 3 80,0 68,6 Ηµέρα 4 78,3 66,7 Ηµέρα 5 90,0 80,5 1 CI95 LL: 95% διάστηµα εµπιστοσύνης κατώτατου ορίου. 88,0 83,6 81,0 Ανοσοαντιδραστικότητα Στον Πίνακα 14 παρατίθεται περιληπτικά η ανοσοαντιδραστικότητα του HercepTest µε το συνιστώµενο σύνολο φυσιολογικών ιστών. Όλοι οι ιστοί ήταν καθηλωµένοι στη φορµαλίνη και ενσωµατωµένη σε παραφίνη και είχαν υποβληθεί σε χρώση µε HercepTest σύµφωνα µε τις οδηγίες του ένθετου συσκευασίας. Πίνακας 14. Σύνοψη της αντιδραστικότητας του HercepTest µε φυσιολογικούς ιστούς. Τύπος ιστών (πλήθος εξετασθέντων) Επινεφρίδιο (3) Μυελός των οστών (3) Εγκέφαλος/Παρεγκεφαλίδα (3) Εγκέφαλος/Κύριο τµήµα εγκεφάλου (3) Μαστός (3) Τράχηλος της µήτρας (3) Κόλον (3) Οισοφάγος (3) Καρδιά (3) Νεφρός (3) Ήπαρ (3) Πνεύµονας (3) Μεσοθηλιακά κύτταρα (3) Ωοθήκη (3) Πάγκρεας (3) Παραθυρεοειδής (3) Περιφερικό νεύρο (3) Υπόφυση (3) Προστάτης (3) Σιελογόνος αδένας (3) Σκελετικός µυς (3) έρµα (3) Λεπτό έντερο (3) Σπλήνας (3) Στόµαχος (3) Όρχις (3) Θύµος αδένας (3) Θυρεοειδής (3) Αµυγδαλή (3) Μήτρα (3) Στοιχεία του ιστού µε θετική χρώση και σχήµα χρώσης Μαστικός αδένας (1/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+) Σωληνάρια του νεφρικού µυελού (3/3 ιστών, 1 2+ σε 5 50% των κυττάρων, κυτταροπλασµατικής) Προστατικός αδένας/αγωγοί (3/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+, 50% των κυττάρων, κυτταροπλασµατικής) Ιδρωτοποιοί αδένες (1/3 ιστών, 1+, 30% των κυττάρων, κυτταροπλασµατικής) Κυλινδρικό επιθήλιο, επιφάνεια (1/3 ιστών, ένταση χρώσης 2+, 25% των κυττάρων) Επιθήλιο (1/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+, 25% των κυττάρων) Πλακώδες επιθήλιο (3/3 ιστών, ένταση χρώσης 1+), 80% των κυττάρων) Η αναφερθείσα χρώση σε όλους τους ιστούς ήταν χρώση µεµβράνης, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Και τα τρία δείγµατα από κάθε τύπο ιστού είχαν την ίδια ένταση χρώσης εκτός αν σηµειώνεται διαφορετικά. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 37/42

38 Καρκίνος του στοµάχου Αντιµετώπιση προβληµάτων - Στόµαχος Για τις ενδεδειγµένες διορθωτικές ενέργειες, ανατρέξτε στο τµήµα αντιµετώπισης προβληµάτων του Handbook (19) της Dako που αναφέρθηκε προηγουµένως ή επικοινωνήστε µε το τµήµα Τεχνικής Υποστήριξης της εταιρίας για να αναφέρετε ασυνήθιστη χρώση. Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 1. Καµία χρώση των αντικειµενοφόρων πλακών. 1α. Σφάλµα προγραµµατισµού. Τα αντιδραστήρια δεν χρησιµοποιήθηκαν µε τη σωστή σειρά. 1α. Ελέγξτε το ηµερολόγιο των αντικειµενοφόρων για να βεβαιωθείτε ότι έχει επιλεγεί το σωστό πρόγραµµα. 1β. Αζίδιο του νατρίου στο διάλυµα 1β. Χρησιµοποιείτε µόνο Dako Wash 2. Ασθενής χρώση των αντικειµενοφόρων πλακών. πλύσης. 1γ. Η υπερβολική θέρµανση των τοποθετηµένων τοµών ιστού πριν από την αποπαραφίνωση και τη θερµική ανάκτηση του αντιγόνου µπορεί να οδηγήσει σε απώλεια της ορατής ανοσοδραστικότητας HER2. Buffer, κωδικός S γ. Στεγνώστε τις τοµές ιστού στον αέρα σε θερµοκρασία δωµατίου για τουλάχιστον 12 ώρες ή µέχρι να στεγνώσουν. Εναλλακτικά, στεγνώστε στους 37 C καθόλη τη διάρκεια της νύκτας ή στεγνώστε στους 60 C για µέγιστο χρονικό διάστηµα µίας ώρας. Το στέγνωµα των τοµών ιστού σε αυξηµένες θερµοκρασίες πρέπει να διενεργείται µόνο σε βαθµονοµηµένο φούρνο µε οµοιόµορφη κατανοµή θερµότητας (17). 2α. Ανεπαρκής ανάκτηση επίτοπου. 2α. Ανασκοπήστε το ηµερολόγιο αντικειµενοφόρων για να επαληθεύσετε ότι η ανάκτηση επιτόπου πραγµατοποιήθηκε σωστά. 2β. Ανεπαρκείς χρόνοι επώασης µε τα αντιδραστήρια. 2γ. Εφαρµογή εσφαλµένης µεθόδου καθήλωσης. 2δ. Η υπερβολική θέρµανση των τοποθετηµένων τοµών ιστού πριν από την αποπαραφίνωση και τη θερµική ανάκτηση του αντιγόνου µπορεί να οδηγήσει σε σηµαντική µείωση της ορατής ανοσοδραστικότητας HER2. 2β. Ανασκοπήστε το ηµερολόγιο αντικειµενοφόρων για να επιβεβαιώσετε ότι οι χρόνοι επώασης αντιδραστηρίων είναι σωστοί. 2γ. Βεβαιωθείτε ότι ο ιστός του ασθενούς δεν έχει υποβληθεί σε υπερβολική καθήλωση, καθώς και ότι δεν χρησιµοποιήθηκε εναλλακτικό καθηλωτικό. 2δ. Στεγνώστε τις τοµές ιστού στον αέρα σε θερµοκρασία δωµατίου για τουλάχιστον 12 ώρες ή µέχρι να στεγνώσουν. Εναλλακτικά, στεγνώστε στους 37 C καθόλη τη διάρκεια της νύκτας ή στεγνώστε στους 60 C για µέγιστο χρονικό διάστηµα µίας ώρας. Το στέγνωµα των τοµών ιστού σε αυξηµένες θερµοκρασίες πρέπει να διενεργείται µόνο σε βαθµονοµηµένο φούρνο µε οµοιόµορφη κατανοµή θερµότητας (17). 3. Εκτεταµένη χρώση φόντου των αντικειµενοφόρων πλακών. 2ε. Εφαρµόστηκε ανεπαρκής όγκος αντιδραστηρίου 3α. Η παραφίνη δεν έχει αφαιρεθεί εντελώς. 3β. Χρησιµοποιήθηκαν πρόσθετα αµύλου κατά την επικάλυψη των τοµών στις αντικειµενοφόρους. 3γ. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες δεν εκπλύθηκαν σχολαστικά. 3δ. Οι τοµές στέγνωσαν κατά τη διαδικασία χρώσης. 2ε. Ελέγξτε το µέγεθος της τοµής ιστού (22 mm x 22 mm) και τον όγκο του αντιδραστηρίου που εφαρµόστηκε 3α. Χρησιµοποιήστε νωπά διαλύµατα αποπαραφίνωσης. 3β. Αποφύγετε τη χρήση πρόσθετων αµύλου για την πρόσφυση των τοµών στο κρύσταλλο των αντικειµενοφόρων πλακών. Πολλά πρόσθετα είναι ανοσοδραστικά. 3γ. Ανασκοπήστε το ηµερολόγιο αντικειµενοφόρων για να επιβεβαιώσετε ότι οι αντικειµενοφόροι εκπλύθηκαν κανονικά. 3δ. Επαληθεύστε ότι εφαρµόζεται ο σωστός όγκος αντιδραστηρίου στις αντικειµενοφόρους πλάκες. ( ) P04083GR_01_SK / σ. 38/42

39 Καρκίνος του στοµάχου Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 3ε. Εφαρµογή εσφαλµένης µεθόδου καθήλωσης. 3ε. Βεβαιωθείτε ότι έχει χρησιµοποιηθεί εγκεκριµένο καθηλωτικό. Η τυχόν χρήση εναλλακτικού καθηλωτικού ενδέχεται να προκαλέσει 4. Ο ιστός αποκολλάται από τις αντικειµενοφόρους πλάκες 5. περβολικά έντονη ειδική χρώση. 6. Ασθενής χρώση της κυτταρικής σειράς της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα Το διάλυµα ανάκτησης επιτόπου αποκτά νεφελώδη εµφάνιση όταν θερµαίνεται 8. Το διάλυµα ανάκτησης επιτόπου αποκτά νεφελώδη εµφάνιση όταν αποθηκεύεται (πριν θερµανθεί) 3στ. Μη ειδική δέσµευση αντιδραστηρίων στον ιστό. 4α. Χρήση εσφαλµένων αντικειµενοφόρων πλακών. 5α. Εφαρµογή εσφαλµένης µεθόδου καθήλωσης. 5β. Υπερβολικά µεγάλοι χρόνοι επώασης µε τα αντιδραστήρια. 5γ. Χρήση εσφαλµένου διαλύµατος πλύσης. 6α. Εφαρµογή εσφαλµένου πρωτοκόλλου ανάκτησης επίτοπου. 6β. Καµία αντίδραση µε το διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου (DAB). 6γ. Αλλοίωση της αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα. 7. Όταν θερµαίνεται το διάλυµα αποκτά νεφελώδη εµφάνιση 8. Το διάλυµα αποθηκεύτηκε σε λανθασµένες συνθήκες ή έχει παρέλθει η ηµεροµηνία λήξης του διαλύµατος εκτεταµένη χρώση φόντου. 3στ. Ελέγξτε τη µέθοδο καθήλωσης του δείγµατος και τυχόν παρουσία νέκρωσης. 4α. Χρησιµοποιήστε silanized slides, όπως Dako Silanized Slides, (κωδικός S3003), SuperFrost Plus ή αντικειµενοφόρους καλυµµένες µε πολυ-l-λυσίνη. 5α. Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιήθηκαν µόνο εγκεκριµένα µονιµοποιητικά και µέθοδοι µονιµοποίησης. 5β. Ανασκοπήστε το ηµερολόγιο αντικειµενοφόρων για να επιβεβαιώσετε ότι οι χρόνοι επώασης αντιδραστηρίων είναι σωστοί. 5γ. Χρησιµοποιείτε µόνο Dako Wash Buffer, κωδικός S α. Ανασκοπήστε το ηµερολόγιο αντικειµενοφόρων για να επαληθεύσετε ότι η ανάκτηση επιτόπου πραγµατοποιήθηκε σωστά. 6β. Ανασκοπήστε το ηµερολόγιο εργαστηρίου για να επιβεβαιώσετε ότι το χρωµογόνο προετοιµάστηκε σωστά. Ανασκοπήστε το ηµερολόγιο αντικειµενοφόρων για να επιβεβαιώσετε ότι ο χρόνος επώασης χρωµογόνου είναι σωστός. 6γ. Ελέγξτε την ηµεροµηνία λήξης του κιτ και τις συνθήκες φύλαξής του, που αναγράφονται στο εξωτερικό της συσκευασίας. 7. Αυτό είναι φυσιολογικό και δεν επηρεάζει τη χρώση 8. Ελέγξτε την ηµεροµηνία λήξης του κιτ και τις συνθήκες φύλαξής του, που αναγράφονται στο εξωτερικό της συσκευασίας. Απορρίψτε το διάλυµα ανάκτησης επιτόπου ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν το πρόβληµα δεν µπορεί να αποδοθεί σε οποιαδήποτε από τις παραπάνω αιτίες ή αν η προτεινόµενη επανορθωτική δράση δεν καταφέρει να επιλύσει το πρόβληµα, καλέστε το Τµήµα Τεχνικής Υποστήριξης της Dako για περαιτέρω βοήθεια. Μπορείτε να βρείτε πρόσθετες πληροφορίες σχετικά µε τις τεχνικές χρώσης και την προετοιµασία δειγµάτων στο προαναφερθέν εγχειρίδιο της Dako (19) (που διατίθεται από την Dako), στο Atlas of Immunohistology (29) και στο Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (30). ( ) P04083GR_01_SK / σ. 39/42

40 Αναφορές 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985; 230: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985; 229: Semba K, Kamata N, Toyoshima K, Yamamoto T. A v-erbb-related protooncogene, c-erbb-2, is distinct from the c-erbb-1/epidermal growth factor-receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1985; 82: Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, et al. Similarity of protein encoded by the human c-erb-b-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986; 319: Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang-Feng TL, Francke U, et al. The neu gene: an erbb-homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985; 229: Bargmann CI, Hung M-C, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein. Nature 1986; 319: Natali PG, Nicotra MR, Bigotti A, Venturo I, Slamon DJ, Fendly BM, et al. Expression of the p185 encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues. Int J Cancer 1990; 45: Press MF, Cordon-Cardo C, Slamon DJ. Expression of the HER-2/neu proto-oncogene in normal human adult and fetal tissues. Oncogene 1990; 5: Lonardo F, Di Marco E, King CR, Pierce JH, Segatto O, Aaronson SA, et al. The normal erbb-2 product is an atypical receptor-like tyrosine kinase with constitutive activity in the absence of ligand. New Biologist 1990; 2: Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JBB, Henner D, Wong WLT, et al. Humanization of an anti-p185her2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: Hudziak RM, Lewis GD, Winget M, Fendly BM, Shepard HM, Ullrich A. p185her2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol Cell Biol 1989; 9: Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185her2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 1993; 37: Baselga J, Norton L, Albanell J, Kim Y-M, Mendelsohn J. Recombinant humanized anti-her2 antibody (Herceptin ) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res 1998; 58: a. Medical Laboratories Particular requirements for quality and competence, ISO 15189:2003 b. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57CFR7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory & practice. New York: Pergamon Press Lundgaard Hansen B, Winther H, Moller K. Excessive section drying of breast cancer tissue prior to deparaffinisation and antigen retrieval causes a loss in HER2 immunoreactivity, Immunocytochemistry 2008;6, Dako California Inc., Data on file 19. Key M. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Fourth Edition. Dako, Carpinteria, California; Leong AS-Y, Milios J, Leong FJ. Epitope retrieval with microwaves. A comparison of citrate buffer and EDTA with three commercial retrieval solutions. Appl Immunohistochem 1996; 4: Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A ( ) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA; Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, et al. Special report: quality control in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 1989; 92: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: Part I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983; 14: Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980; 73: Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994; 54: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986 ( ) P04083GR_01_SK / σ. 40/42

41 31. Jørgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78: Tanner M, Hollmén M, Junttila TT, Kapanen AI, Tomola S, SoiniY et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase II alpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005; 27: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mor K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh DY, Im S-A, Lee D et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008; 32: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastroesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomized controlled trial. Lancet Bang Y, Chung J, Xu J, Lordick F, Sawaki A, Lipatov O et al. Pathological features of advanced Gastric Cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global screening programme of the ToGA trial. J Clin Oncol 2009; 27:15s (suppl; abstr 4556). 38. Van Cutsem E, Kang YK, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, et al. Efficacy results from the ToGA trial: a phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy in first-line human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive advanced gastric cancer. (presentation ASCO 2009). 39. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Büttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopath 2008;52: Asioli S, Maletta F, Verdun di Cantogno L, Satolli MA, Schena M, Pecchioni C, et al. Προσέγγιση της ετερογένειας υποδοχέα ανθρώπινου παράγοντα επιδερµικής ανάπτυξης 2 σε χειρουργικά δείγµατα καρκίνου του στοµάχου. Human Pathol 2012; 43;11: ( ) P04083GR_01_SK / σ. 41/42

42 Επεξήγηση συµβόλων Αριθµός καταλόγου Περιορισµοί θερµοκρασίας Κωδικός παρτίδας Εύθραυστο: να το µεταχειρίζεστε µε προσοχή Ιατρική συσκευή in vitro διαγνωστικών εξετάσεων Αποθηκεύστε στο σκοτάδι Ηµεροµηνία λήξης Εικονοσύµβολο επικινδυνότητας GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Συµβουλευθείτε τις οδηγίες χρήσης Περιέχει αρκετό για <n> τεστ Κατασκευαστής Κατασκευάζεται από την: ιανέµεται στις ΗΠΑ από την: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Τηλ Φαξ Dako North America, Inc Via Real Carpinteria, California 93013, USA Τηλ. 805/ , ωρεάν: 800/ Πληροφορίες για παραγγελίες: Τηλ. 800/ Φαξ 805/ Τεχνική Υπηρεσία: Τηλ. 800/ ( ) P04083GR_01_SK / σ. 42/42