ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΦΑΙΝΟΤΥΠΩΝ ΤΟΥ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ D ΤΟΥ ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ RHESUS ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΑΣ ΤΟΥ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ ΣΤΑΜΝΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Ν. ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ ΠΑΝΕΠ.ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜ.2165 ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΦΑΙΝΟΤΥΠΩΝ ΤΟΥ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ D ΤΟΥ ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ RHESUS ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΑΣ ΤΟΥ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ ΣΤΑΜΝΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ν. ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Α. ΚΩΤΣΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ι. ΚΛΩΝΙΖΑΚΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ε. ΙΩΑΝΝΙΔΟΥ-ΠΑΠΑΓΙΑΝΝΑΚΗ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Θ. ΠΕΓΙΟΥ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Β. ΖΟΥΡΝΑΤΖΗ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Μ. ΑΡΒΑΝΙΤΙΔΟΥ-ΒΑΓΙΩΝΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ <<Η έγκρισις της Διδακτορικής διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως>> (Νόμος 5343/32, αρθρ και ν. 1268/82, αρθρ. 50 8) 2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ 3

4 4

5 Στους γονείς μου, Κλεοπάτρα-Γιώργο και στον αδελφό μου Τάσο Στον σύζυγο μου Γιώργο και στον γιο μας που έρχεται στη ζωή μας σε 3 μήνες 5

6 6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 9 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΟΜΑΔΩΝ ΑΙΜΑΤΟΣ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ RHESUS Ορολογία Μοριακή δομή αντιγόνων Rhesus Πολυπεπτίδια Rhesus Αντιγόνα και Φαινότυποι του συστήματος Rhesus Αντιγόνο D Αρνητικός RhD φαινότυπος Φαινότυπος weak D Partial D Φαινότυπος Del Φαινότυπος RoHar Rh D Επίτοποι ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ RHESUS ΜΟΡΙΑΚΗ ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΩΝ RH ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΙΑΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΑΝΤΙΓΟΝΑ ΣΤΟΝ ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΠΛΗΘΥΣΜΟ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Τυποποίηση σε ασθενείς και αιμοδότες των φαινοτύπων weak D partial D Αιμολυτική νόσος των νεογνών Γονοτυπική τυποποίηση εμβρυϊκού DNA ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ RhD ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ Ορολογικές τεχνικές Μοριακές τεχνικές Απομόνωση γονιδιωματικού (genomic) DNA Ποσοτικός προσδιορισμός DNA Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reactio-PCR) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με την χρήση ειδικών ολιγονουκλεοτιδικών αφετηριών (Sequence Specific Priming-PCR, PCR- SSP) Real-time PCR 56 7

8 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΥΛΙΚΟ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Πληθυσμιακή καταγραφή και μελέτη των τύπων weak D και των ποικιλιών partial D του αντιγόνου D του αντιγονικού συστήματος Rhesus, σε δείγμα Ελληνικού πληθυσμού Προσδιορισμός εμβρυικού DNA στο πλάσμα εγκύων γυναικών Rhesus αρνητικών ΜΕΘΟΔΟΙ Ορολογικές μέθοδοι Προσδιορισμός ομάδων αίματος ΑΒΟ και RhD Προσδιορισμός των Rh φαινοτύπων, C w και Kell Προσδιορισμός των ποικιλιών Rh D (Partial Rh D) ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Απομόνωση DNA Μέθοδος InstaGene TM Genomic DNA Kit, BIORAD Διαδικασία απομόνωσης DNA με τη μέθοδο των στηλών Qiagen (QIAamp DNA Mini Kit) Ποσοτικός προσδιορισμός DNA Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης με τη χρήση ειδικών ολιγονουκλεοτιδικών αφετηριών (Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primers, PCR-SSP) 75 Μοριακή τυποποίηση των weak D φαινοτύπων 75 Μοριακή τυποποίηση των CDE Ηλεκτροφόρηση αγαρόζης Real-time PCR Ορολογικός προσδιορισμός ομάδων αίματος ΑΒΟ και RhD νεογνών Στατιστική ανάλυση 83 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 84 Α. Πληθυσμιακή μελέτη 84 Α1. Ορολογική τυποποίηση των weak D φαινοτύπων 88 Α2. Γονοτυπική τυποποίηση των weak D φαινοτύπων 89 Α3. Μοριακή τυποποίηση των αρνητικών RhD φαινοτύπων 94 Β. RHD τυποποίηση του εμβρυϊκού DNA στο πλάσμα εγκύων γυναικών Rhesus αρνητικών 99 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 109 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 114 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 115 SUMMARY 117 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 119 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 139 8

9 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Το αντιγονικό σύστημα Rhesus είναι ένα από τα πιο πολύπλοκα γονιδιακά συστήματα στον ανθρώπινο οργανισμό και παράλληλα παρουσιάζει μεγάλη κλινική σημασία στην Ιατρική των μεταγγίσεων γιατί εμπλέκεται στην παθογένεση της αιμολυτικής νόσου των νεογνών, σε διάφορες αιμολυτικές αντιδράσεις μεταγγίσεων και σε ορισμένες αυτοάνοσες αιμολυτικές αναιμίες. Η πλήρης κατανόηση του αντιγονικού συστήματος Rhesus έγινε δυνατή από τη στιγμή που κλωνοποιήθηκαν τα γονίδια του στα τέλη της δεκαετίας του Από τη στιγμή εκείνη παρατηρήθηκε μία έκρηξη πληροφοριών σχετική με τα αντιγόνα Rhesus και τη διευκρίνιση της γενετικής βάσης των αντιγόνων και των φαινοτύπων. Όλες οι νέες αυτές πληροφορίες απαντούν σε ερωτήσεις που υπήρχαν επί μακράν για το σύστημα Rhesus και ειδικά για το αντιγόνο D και οδηγούν σε επανεμφάνιση συζητήσεων για τις κατάλληλες προσεγγίσεις όσον αφορούν την τυποποίηση του αντιγόνου D. Το πεδίο της μοριακής γενετικής όσον αφορά το σύστημα Rhesus τα τελευταία 5 χρόνια έχει μεταφερθεί από τον απλό καθορισμό της γενετικής βάσης του αντιγόνου D στην εφαρμογή συγκεκριμένων μοριακών μεθόδων σε επίπεδο ρουτίνας με απώτερο σκοπό σε βελτιωμένες στρατηγικές μετάγγισης καθώς επίσης και σε νέες προσεγγίσεις όσον αφορά τη μη επεμβατική προγεννητική διάγνωση. Μέχρι σήμερα οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται κατά κύριο λόγο για την τυποποίηση του αντιγόνου D και των διαφόρων φαινοτύπων του είναι οι κλασικές ορολογικές μέθοδοι. Ο ορολογικός καθορισμός του αντιγόνου D καθίσταται ορισμένες φορές όμως προβληματικός. Αυτό οφείλεται αρχικά στην ίδια τη φύση του αντιγόνου D, το οποίο χαρακτηρίζεται από πολυάριθμους επίτοπους. Ο δεύτερος παράγοντας αφορά τη χρησιμοποίηση πολλών και διαφορετικών μεθόδων και αντιδραστηρίων που αναπτύχθηκαν τα τελευταία χρόνια. Ερυθροκύτταρα με ασθενή ή τροποποιημένη D έκφραση είναι δυνατόν να αντιδρούν διαφορετικά ανάλογα με τη μέθοδο και τα anti-d αντισώματα. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η εφαρμογή μοριακών μεθόδων σε συνδυασμό με τις κλασσικές ορολογικές για τη γονοτυπική τυποποίηση των φαινοτύπων του αντιγόνου D του αντιγονικού συστήματος Rhesus και η πληθυσμιακή καταγραφή τους σε δείγμα Ελληνικού πληθυσμού καθώς επίσης και ο προσδιορισμός και η RhD τυποποίηση του εμβρυϊκού DNA στο πλάσμα εγκύων γυναικών Rhesus αρνητικών, με τη χρήση κατάλληλης μοριακής τεχνικής. Η μελέτη περιλαμβάνει τρία μέρη, το γενικό μέρος, το ειδικό μέρος και το παράρτημα. Στο γενικό μέρος αναφέρονται τα σχετικά με την ιστορία της ανακάλυψης του συστήματος Rhesus, την ορολογία, τη μοριακή δομή των αντιγόνων, τα πολυπεπτίδια Rhesus και τους φαινοτύπους του συστήματος, τα αντισώματα, τη μοριακή εξέλιξη των γονιδίων, τις πληθυσμιακές μελέτες και τις κλινικές εφαρμογές. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στην εργαστηριακή τυποποίηση του RhD αντιγόνου με τη βοήθεια τόσο των κλασσικών ορολογικών όσο και των μοριακών τεχνικών. Στο ειδικό μέρος περιγράφονται το υλικό και οι μέθοδοι της μελέτης, τα αποτελέσματα μας, καθώς και ο τρόπος ανάλυσης και αξιολόγησης των αποτελεσμάτων. Ακολουθεί συζήτηση των ευρημάτων και παρουσίαση των κυριότερων συμπερασμάτων που εξάγονται από τη μελέτη αυτή. Στο τέλος παρατίθενται η περίληψη της διατριβής και η βιβλιογραφία που χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη. Στο παράρτημα παρατίθενται οι φαινότυποι των αντιγονικών συστημάτων ABO, Rhesus και Kell σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ορολογικής τυποποίησης στους 4034 Έλληνες αιμοδότες που χρησιμοποιήθηκαν. 9

10 Η διατριβή αυτή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. Το υλικό της πληθυσμιακής μελέτης αποτέλεσαν αιμοδότες του Κέντρου Αιμοδοσίας του Γενικού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟ. Το υλικό για τη RHD τυποποίηση του εμβρυϊκού DNA στο πλάσμα εγκύων γυναικών, αποτέλεσαν έγκυες γυναίκες Rhesus αρνητικές που προσήλθαν στις Πανεπιστημιακές Μαιευτικές Κλινικές του Nοσοκομείου ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟ. Για τη συμβολή τους στην εκπόνηση της διατριβής, ευχαριστώ θερμά: Την επιβλέπουσα αυτής της διδακτορικής διατριβής Καθηγήτρια κ. Ν. Βαβάτση- Χριστάκη για τη δυνατότητα πραγματοποίησης της διατριβής αυτής, για τις πολύτιμες συμβουλές της, τη συνεχή καθοδήγηση και προσωπική υποστήριξη όλα αυτά τα χρόνια. Θα ήθελα να της εκφράσω την απέραντη ευγνωμοσύνη μου για την ευκαιρία που μου προσέφερε και την εμπιστοσύνη που μου έδειξε. Θα τη θυμάμαι πάντα με συγκίνηση ως Δασκάλα που με τις επιστημονικές γνώσεις της και την πολύτιμη βοήθεια της συνέβαλε στην πραγματοποίηση αυτής της διατριβής και τη διαμόρφωση της δικής μου κατάρτισης πάνω στον τομέα της Κλινικής Βιοχημείας. Τα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, τον Καθηγητή κ. Α. Κώτση και τον Καθηγητή κ. Ι. Κλωνιζάκη, για το ενδιαφέρον, τις πολύτιμες συμβουλές και υποδείξεις τους καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής. Το μέλος της επταμελούς συμβουλευτικής επιτροπής την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Β. Ζουρνατζή για την πολύτιμη βοήθεια της στη συλλογή των δειγμάτων των έγκυων γυναικών, την πολύτιμη υποστήριξη της και την επιστημονική βοήθεια που μου προσέφερε. Τα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Θ. Πέγιου, την Καθηγήτρια κ. Μ. Αρβανιτίδου- Βαγιωνά και την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Ε. Ιωαννίδου-Παπαγιαννάκη για τις εύστοχες παρατηρήσεις τους στο τελικό κείμενο της διατριβής. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την τ. Διευθύντρια του Κέντρου Αιμοδοσίας του Νοσοκομείου ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟ κ. Α. Μανίτσα, η οποία συνέβαλε κύρια στην επιλογή του θέματος της διατριβής, για την ενθάρρυνση και τη συμπαράσταση που έδειξε όλα τα χρόνια που εργαζόμουν στο Κέντρο Αιμοδοσίας αλλά και την ουσιαστική βοήθεια που μου προσέφερε στη διόρθωση της διατριβής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω, επιπλέον, όλα τα μέλη ΔΕΠ και το προσωπικό του Εργαστηρίου της Βιολογικής Χημείας για το ευχάριστο κλίμα συνεργασίας που μου δημιούργησαν κατά την εκπόνηση της διατριβής μου. Επίσης, είμαι ευγνώμων στους γονείς μου και στον αδελφό μου για τις αξίες που μου δίδαξαν, την πλήρη υποστήριξή τους και τον αγώνα που έκαναν μαζί μου και αυτοί όλα αυτά τα χρόνια. Τέλος θερμά ευχαριστώ τον σύζυγο μου για την αμέριστη συμπαράσταση, κατανόηση και αγάπη καθ όλη τη διάρκεια αυτής της μελέτης. 10

11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 11

12 12

13 1. ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ Η ανακάλυψη και ταξινόμηση των ομάδων αίματος του ανθρώπου έγινε στις αρχές του 20 ου αιώνα από τον Karl Landsteiner, ο οποίος προσδιόρισε για πρώτη φορά τα αντιγόνα Α και Β του αντιγονικού συστήματος ΑΒΟ. Για το λόγο αυτό, το 1930, τιμήθηκε ο ερευνητής με το βραβείο Νόμπελ 1. Το αντιγονικό σύστημα Rhesus (Rh) των ομάδων αίματος του ανθρώπου και ειδικότερα το αντιγόνο D (RhD), ανακαλύφθηκε αργότερα, το 1939, από τους Levine και Stetson, οι οποίοι περιέγραψαν με ακρίβεια την αιτιολογία μίας περίπτωσης αιμολυτικής νόσου των νεογνών (Hemolytic Newborn Disease, HDN), χωρίς όμως να δώσουν όνομα στο υπεύθυνο αντιγόνο 2. Η αιμολυτική αντίδραση προέκυψε κατά την μετάγγιση μιας γυναίκας με αίμα του συζύγου της, η οποία όμως πρόσφατα είχε γεννήσει ένα παιδί με HDN. Υπέθεσαν ότι η μητέρα είχε ανοσοποιηθεί από ένα αντιγόνο πατρικής προέλευσης, που υπήρχε στο έμβρυο και το αιμολυτικό επεισόδιο αποδόθηκε στο μητρικό αντίσωμα, το οποίο αντέδρασε με το ίδιο αντιγόνο στα κύτταρα του συζύγου της. Οι ανωτέρω ερευνητές απέδειξαν ότι αυτό το νέο αντιγόνο ήταν ανεξάρτητο από τα μέχρι τότε γνωστά των συστημάτων ΑΒΟ, ΜΝ και P 3. Το 1940, οι Landsteiner και Wiener περιέγραψαν αντισώματα, τα οποία είχαν παραχθεί σε ινδικά χοιρίδια και κουνέλια, που είχαν ενεθεί με ερυθροκύτταρα από πιθήκους της οικογένειας Rhesus (anti-rh), εξ ου και η ονομασία του αντιγονικού αυτού συστήματος. Υπεύθυνο για την παρουσία των αντισωμάτων θεωρήθηκε το αντιγόνο RhD, που μεταγενέστερα αποδείχθηκε ότι είχε την ίδια ειδικότητα με εκείνο που προκάλεσε την αιμολυτική νόσο των νεογνών στην περίπτωση που περιέγραψαν οι Levine και Stetson. Αμέσως μετά την ανακάλυψη των αντισωμάτων anti-rhd (anti-ro) έγινε φανερό ότι, όσον αφορά το σύστημα Rhesus η κατάσταση είναι περισσότερο περίπλοκη και ότι δεν φαίνεται να πρόκειται για ένα απλό αντιγονικό σύστημα ομάδων αίματος με ένα αντιγόνο και ένα αντίσωμα 2. Το 1941, ο Wiener και οι συνεργάτες του περιέγραψαν ένα νέο αντιγόνο, γνωστό σήμερα ως C (rh ). Παρατήρησαν μάλιστα ότι τα περισσότερα ερυθροκύτταρα τα οποία έφεραν το αντιγόνο αυτό ήταν θετικά και στο αντιγόνο D. Την ίδια χρονιά ο Levine και οι συνεργάτες του ανακάλυψαν το αντιγόνο c (rh ) και ταυτόχρονα παρατήρησαν ότι ήταν συχνή η παρουσία του στα θετικά στο αντιγόνο RhD ερυθροκύτταρα, ενώ δεν έλλειπε στις περισσότερες περιπτώσεις από τα RhD αρνητικά ερυθροκύτταρα. Το 1943, ο Race και οι συνεργάτες του καθώς επίσης και ο Wiener ανέφεραν την ύπαρξη του αντιγόνου Ε (rh ), το οποίο φάνηκε ότι ήταν μεν παρόν στα D θετικά ερυθροκύτταρα ειδικότερα όμως στα αρνητικά ως προς το αντιγόνο C. Τέλος, το 1945 ο Mourant και οι συνεργάτες του ανακάλυψαν το αντιγόνο e (hr ). Ο Fisher σε αυτό το σημείο έθεσε το γεγονός ότι τα αντιγόνα C και c έχουν αντιθετική σχέση, η οποία είναι ανεξάρτητη από την παρουσία των αντιγόνων D και E. Αργότερα ανακαλύφθηκε παρομοίως και η αντιθετική σχέση των αντιγόνων Ε και e. Όσον αφορά τα αντιγόνο D δεν βρέθηκε κανένα αντιγόνο αντιθετικό, τελικά δε ο όρος d χρησιμοποιήθηκε για να υποδηλώσει την απουσία D στα ερυθροκύτταρα. Περίπου μισό αιώνα αργότερα, με τη βοήθεια βιοχημικών και γενετικών αναλύσεων, αποδείχθηκε ότι στην πραγματικότητα, στις περισσότερες των περιπτώσεων, όταν το γονίδιο D απουσιάζει, δεν υπάρχει αλληλόμορφο γονίδιο να το αντικαταστήσει. Μια δεκαετία μετά από τα μέσα του προηγούμενου αιώνα, το1960, η ανακάλυψη του γεγονότος ότι η πρωτογενής ανοσοποίηση έναντι του αντιγόνου RhD, η οποία προκαλείται από ασύμβατη εγκυμοσύνη, μπορεί να αποφευχθεί με παθητική χορήγηση anti-d ανοσοσφαιρίνης τις πρώτες ημέρες από τον τοκετό, οδήγησε στην επιτυχή εφαρμογή της προληπτικής ιατρικής 3. 13

14 Το 1961, ο Levine και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν ότι τα αντισώματα έναντι του αντιγονικού συστήματος Rhesus (anti-rh), ανθρώπινης ή ζωικής προέλευσης, έχουν διαφορετική ειδικότητα. Τα αντισώματα anti-rh που προέρχονταν από τα ινδικά χοιρίδια ονομάστηκαν anti-lw προς τιμήν των Landsteiner και Wiener 3. Τα τελευταία 16 χρόνια με την πρόοδο της μοριακής βιολογίας και την κλωνοποίηση των γονιδίων έχει σημειωθεί αντίστοιχη σημαντική πρόοδος όσον αφορά τη μοριακή ταυτοποίηση των αντιγόνων Rh ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΟΜΑΔΩΝ ΑΙΜΑΤΟΣ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ Σύμφωνα με τη Διεθνή Εταιρεία Μεταγγίσεων από τα 29 συστήματα ομάδων αίματος του ανθρώπου που έχουν καταγραφεί έως σήμερα, αναγνωρίζονται 285 ειδικότητες. Κάθε σύστημα αντιπροσωπεύει είτε ένα γονίδιο είτε σύμπλεγμα (cluster) δύο ή τριών στενά συνδεδεμένων (closely- linked) ομόλογων γονιδίων. Ειδικότερα, 25 από τα συστήματα αντιπροσωπεύονται από ένα γονίδιο, τα συστήματα Rhesus, Xg και Chido/Rodgers από 2 γονίδια το καθένα, ενώ το σύστημα MNS από 3 γονίδια 14 ( Πίνακας 1). 14

15 Πίνακας 1. Συστήματα ομάδων αίματος του ανθρώπου. α/α ονομασία συστήματος σύμβολο αριθμός αντιγόνων ονομασία γονιδίου υπεύθυνο χρωμόσωμα 1 ABO ABO 4 ABO 9 2 MNS MNS 43 GYPA, 4 GYPB, GYPE 3 P P1 1 P Rh RH 49 RHD, 1 RHCE 5 Lutheran LU 20 LU 19 6 Kell KEL 25 KEL 7 7 LEWIS LE 6 FUT Duffy FY 6 FY 1 9 Kidd JK 3 SLC14A Diego DI 21 SLC4AE Yt YT 2 ACHE 7 12 Xg XG 2 XG,MIC2 13 Scianna SC 5 ERMAP 1 14 Dombrock DO 5 DO Colton CO 3 AQP Landsteiner- Wiener LW 3 LW Chido/Rodgers CH/RG 9 C4A, C4B 6 18 H H 1 FUT Kx XK 1 XK X 20 Gerbich GE 8 GYPC 2 21 Cromer CROM 12 DAF 1 22 Knops KN 8 CR Indian IN 2 CD Ok OK 1 CD Raph RAPH 1 CD John Milton JMH 1 SEMA7A 15 Hagen 27 I I 1 GCNT Globoside GLOB 1 B3GALT Gill GIL 1 AQP3 9 (Daniels G. The molecular genetics of blood group polymorphism. Transplant Immunology 2005; 14: ) 15

16 Τα αντιγόνα των ομάδων αίματος, εκτός από την κλινική τους σημασία στις μεταγγίσεις και στην αιμολυτική νόσο του νεογνού, χρησιμοποιούνται και ως δείκτες σε γενετικές και ανθρωπολογικές έρευνες. Επιπλέον, γνωστή είναι και η ρυθμιστική λειτουργία των αντιγόνων αυτών κατά την εμβρυική ανάπτυξη, την κυτταρική διαφοροποίηση, καθώς επίσης και την κακοήθη μετατροπή των κυττάρων 15. Υπεύθυνοι για τους πολυμορφισμούς των ομάδων αίματος φαίνεται ότι είναι διάφοροι γενετικοί μηχανισμοί όπως: Nουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί αντικατάστασης μίας βάσης (SNPs). Οι περισσότεροι πολυμορφισμοί των ομάδων αίματος προκύπτουν από ένα ή περισσότερους SNPs, οι οποίοι κωδικοποιούν αντικαταστάσεις αμινοξέων είτε στην εξωκυττάρια είτε στη γλυκοσυλοτρανσφεράση περιοχή της μεμβρανικής πρωτεΐνης. Γονιδιακές ελλείψεις. Ολική έλλειψη του γονιδίου συμβαίνει μόνο στο RHD γονίδιο. Νουκλεοτιδικές ελλείψεις μίας βάσης, οι οποίες εισάγουν αλλαγές στο πλαίσιο ανάγνωσης της τριπλέτας. Διπλασιασμοί αλληλουχιών. Διπλασιασμό αλληλουχίας σε συνδυασμό με μία χωρίς νόημα (nonsense) μετάλλαξη συναντάμε στο ανενεργό RHD γονίδιο (RHDΨ), το οποίο είναι συχνό στους Αφρικανούς. Ανασυνδυασμοί ενδογονιδιακοί, μεταξύ γειτονικών γονιδίων, οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για τη δημιουργία υβριδικών γονιδίων και πρωτεϊνών, όπως συμβαίνει στο σύστημα Rhesus 14, ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ RHESUS Το αντιγονικό σύστημα Rhesus (Rh) είναι ένα από τα πιο περίπλοκα συστήματα των ομάδων αίματος στους ανθρώπους. Μέχρι σήμερα 49 διαφορετικά αντιγόνα (Rh αντιγόνα) του συστήματος αυτού έχουν ανακαλυφθεί, σύμφωνα με την αναφορά της Διεθνούς Κοινότητας Μεταγγίσεων για την ονομασία των αντιγόνων επιφανείας των ερυθροκυττάρων που δημοσιεύτηκε το 2005 (International Society for Blood Transfusion Committee on Terminology for Red Cell Surface Antigens) 2. Πίνακας 2. Η σειρά αναφοράς τους είναι ανάλογη της χρονικής ανακάλυψης τους. 16

17 Πίνακας 2. Αντιγόνα του συστήματος Rhesus των ομάδων αίματος του ανθρώπου, ανάλογα με την χρονολογική τους ανακάλυψη. α/α αντιγόνο έτος ανακάλυψης % ποσοστό στον Καυκάσιο πληθυσμό α/α αντιγόνο έτος ανακάλυψης % ποσοστό στον Καυκάσιο πληθυσμό 1 D 1939/ Evans 1968 < 1 2 C Rh < 1 3 c Rh < 1 4 E Rh < 1 5 e HrB 1972 > 99 6 Cw hrb Hr > Tar 1975 < 1 8 f Rh > 99 9 Bea 1953 < 1 34 Rh Cx 1954 < 1 35 Rh < 1 11 Ew 1955 < 1 36 Crawford 1980 < 1 12 V 1955 < 1 37 Nou 1981 > Goa 1958 < 1 38 Dav 1982 > G Riv 1983 < 1 15 Ce(rhi) FPTT 1988 < 1 16 Hr 1960 > Sec 1989 > hrs BARC 1989 < 1 18 VS 1960 < 1 43 JAL 1990 < 1 19 ce STEM 1993 < 1 20 CE 1961 < 1 45 LOCR 1994 < 1 21 CG MAR 1994 > Dw 1962 < 1 47 JAHK 1995 < 1 23 Rh DAK 2003 < 1 24 hrh 1964 < 1 49 CENR 2004 < 1 25 Rh > 99 ISBT 2004 Committee on Terminology for Red Cell Surface Antigens. Vox Sang 2004; 87:

18 Από τα αντιγόνα αυτά λίγα είναι ανοσογόνα και έχουν κλινική σημασία. Σημαντικότερο είναι το αντιγόνο RhD, κυρίαρχο αντιγόνο στον άνθρωπο και ισχυρά ανοσογόνο που σχετίζεται με τις ανοσολογικού τύπου αιμολυτικές αναιμίες. Σύμφωνα με την παρουσία ή όχι του RhD αντιγόνου, τα ανθρώπινα ερυθροκύτταρα διακρίνονται σε Rh θετικά και Rh αρνητικά. Από μελέτες διαπιστώθηκε ότι 82%- 88% των Καυκάσιων, περίπου το 95% των μαύρων Αφρικανών και σχεδόν το 100% των ανθρώπων από την Ανατολική Ασία (Far East) είναι RhD θετικοί 14. Οι άλλοι κύριοι πολυμορφισμοί του αντιγονικού συστήματος Rhesus είναι οι C/c και E/e, δύο ζευγάρια αντιθετικών αντιγόνων 17. Το αντιγόνο C απαντάται με συχνότητα 70% και το αντιθετικό του αντιγόνο c με 80% στους Ευρωπαίους. Στους μαύρους Αφρικανούς η συχνότητα του αντιγόνου C είναι χαμηλή ~17%, αντίθετα στην ανατολική Ασία αγγίζει το 100%, ενώ η συχνότητα του αντιθετικού του αντιγόνου c στην περιοχή αυτή είναι υψηλότερη ~99%. Στους περισσότερους πληθυσμούς το αντιγόνο Ε παρουσιάζει μια συχνότητα ~34% και αντίστοιχα του αντιθετικού του αντιγόνου e ~98% 14. Όλα τα αντιγόνα του συστήματος αυτού αποτελούν ένα μοριακό σύμπλεγμα της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης, το οποίο δεν συνδέεται με τον σκελετό. Το σύμπλεγμα Rhesus φαίνεται να είναι μέρος ενός μεγαλύτερου συμπλέγματος που παίζει ρόλο στην κυτταρική προσκόλληση και το οποίο περιλαμβάνει την LW γλυκοπρωτεΐνη, τη γλυκοφορίνη B, την γλυκοπρωτεΐνη Duffy και την πρωτεΐνη CD Η λειτουργία του συμπλέγματος Rhesus δεν είναι πλήρως γνωστή ακόμη και σήμερα, αλλά επειδή η δομή του παρουσιάζει ομοιότητες με αυτήν των μεμβρανικών μεταφορέων, πιθανολογείται ότι δρα ως μεμβρανικός μεταφορέας. Επιπλέον, τα Rh πολυπεπτίδια φαίνεται ότι παίρνουν μέρος στη διατήρηση της συμμετρίας των φωσφολιπιδίων της μεμβράνης. Η δομή των πρωτεϊνών Rhesus μοιάζει με τη δομή μιας οικογένειας πρωτεϊνών που είναι γνωστή ως μεταφορέας ιόντων αμμωνίου. Δεν είναι γνωστός ο λόγος για τον οποίο τα ερυθροκύτταρα χρειάζονται ενεργούς μεταφορείς ιόντων αμμωνίου και η λειτουργία αυτή του συμπλέγματος Rhesus παραμένει προς διευκρίνηση 15, Ορολογία Η ορολογία του συστήματος Rhesus διαφοροποιείται ανάλογα με τα αντιγόνα, τα γονίδια και τις πρωτεΐνες. Τα αντιγόνα αναφέρονται με το γράμμα προσδιορισμού τους D, C, c, E, e και παρομοίως όλα τα υπόλοιπα. Τα γονίδια RH ορίζονται με κεφαλαία γράμματα RHD, RHCE και RHAG. Τα διαφορετικά αλληλόμορφα του γονιδίου RHCE αναφέρονται ως RHce, RHCe, RHcE ανάλογα με το αντιγόνο που κωδικοποιούν. Οι πρωτεΐνες δηλώνονται ως RhD και RhCE (Rhce, RhCe, RhcE)

19 3.2 Μοριακή δομή αντιγόνων Rhesus Δύο πρωτεΐνες Rhesus κωδικοποιούνται από δυο ομόλογα γονίδια, το RHD και το RHCE. Τα γονίδια αυτά, μαζί με εκείνα τα οποία είναι υπεύθυνα για την κωδικοποίηση των μη- ερυθροειδικών Rh πρωτεϊνών RHBG και RHCG, βρίσκονται στις χρωμοσωμικές θέσεις 1p34.1-1p36 (RHD- RHCE), 6p (RHAG), 1q21.3 (RHBG) και 15q25 (RHCG). Τα γονίδια RHD και RHCE αποτελούνται το καθένα από 10 εξόνια και παρά το γεγονός ότι οι κωδικές τους περιοχές παρουσιάζουν μεγάλο βαθμό ομοιογένειας (93,8%), η ανοσολογική ετερογένεια των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν είναι αξιοσημείωτη. Τα ανωτέρω γονίδια αποτελούν μια ομαδοποιημένη οικογένεια γονιδίων (gene cluster) και είναι το πλέον πολύπλοκο σύστημα γονιδίων στον άνθρωπο. Η προέλευση τους θεωρείται αποτέλεσμα διπλασιασμού ενός αρχέγονου γονιδίου περίπου πριν από 8 εκατομμύρια χρόνια, γεγονός που βασίζεται στη συσσώρευση των μεταλλάξεων μεταξύ των δυο υψηλά ομολόγων γονιδίων Η πολυπλοκότητα του συστήματος Rhesus δεν οφείλεται μόνο στην παρουσία των γονιδίων RHD και RHCE, τα οποία έχουν πολλές όμοιες περιοχές αλλά και στο γεγονός ότι η πολύ κοντινή απόσταση των δύο γονιδίων παρέχει τη δυνατότητα για πολυάριθμες ανταλλαγές μεταξύ τους. Με αυτό τον τρόπο δημιουργούνται νέες υβριδικές πρωτεΐνες, οι οποίες έχουν τμήματα και των δύο γονιδίων, κυρίως μέσω της γονιδιακής μετατροπής (gene conversion). Με τη διαδικασία αυτή, το ένα γονίδιο λειτουργεί ως δότης τμήματος, αλλά σε αντίθεση με τον ομόλογο ανασυνδυασμό, η αλληλουχία του δότη παραμένει αναλλοίωτη. Η περιοχή αυτή που ανταλλάσσεται, μπορεί να περιλαμβάνει μερικά ζεύγη βάσεων έως και ολόκληρα εξόνια. Με αυτές τις ανταλλαγές μεταξύ των RHD και RHCE γονιδίων προκύπτουν οι νέες πολυμορφικές πρωτεΐνες, οι οποίες είναι υπεύθυνες για τον τεράστιο αριθμό των αντιγόνων που παρατηρούνται στο σύστημα Rhesus 4. Αμφότερα τα γονίδια RHD και RHCE έχουν κατεύθυνση ουρά σε ουρά (tail-to tail orientation) (5 RHD3-3 RHCE5 ) και μεταξύ τους παρεμβάλλεται ένα μη σχετικό γονίδιο, το SMP1, το οποίο τα διαχωρίζει. Δύο ομόλογες περιοχές μήκους 9Kb, γνωστές ως Rhesus κουτιά (boxes), είναι τοποθετημένες δεξιά και αριστερά του RHD γονιδίου (Εικόνα 1). Το γονίδιο RHD κωδικοποιεί πολλούς επίτοπους του D αντιγόνου, ενώ το γονίδιο RHCE κωδικοποιεί τα αντιγόνα C/c και E/e και επιπλέον ορισμένα άλλα, όπως το C w, το Cx και το VS 14,19. 19

20 Εικόνα 1. Σχηματική απόδοση της δομής των γονιδίων RH του ανθρώπου. (α) Τα αντιγόνα του συστήματος Rhesus κωδικοποιούνται από τα γονίδια RHD και RHCE στο χρωμόσωμα 1p Τα δύο γονίδια είναι τοποθετημένα σε κατεύθυνση ουρά σε ουρά και διαχωρίζονται από το γονίδιο SMP1, το οποίο αποτελείται από επτά εξόνια. Δεξιά και αριστερά του γονιδίου RHD βρίσκονται δύο ομόλογα σε μεγάλο βαθμό γονιδιακά κομμάτια, γνωστά ως Rhesus κουτιά. (β) Στους Καυκάσιους, ο απλότυπος cde, στον οποίο ολόκληρο το γονίδιο RHD απουσιάζει, πιστεύεται ότι προκύπτει από άνισο διασκελισμό (crossover) μεταξύ των Rhesus κουτιών με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός υβριδικού Rhesus box. (γ) Σε ορισμένους Αφρικανούς, στον αρνητικό RhD φαινότυπο, παρατηρήθηκε ένα σημαντικό ανέπαφο RHD ψευδογονίδιο, το RHDy, που περιλαμβάνει πολλαπλές μεταλλάξεις (ένα διπλασιασμό 37 ζευγαριών βάσεων στη περιοχή μεταξύ του ιντρονίου 3 και εξονίου 4, μεταλλάξεις με αλλοίωση νοήματος (missense ) στο εξόνιο 5 και μία μετάλλαξη χωρίς νόημα (nonsense) στο εξόνιο 6). (Avent N.D, Madgett T.E, Lee Z.E, et al. Molecular biology of Rh proteins and relevance to molecular medicine. Expert Rev Mol Med 2006; 18 (13): 1-20) 20

21 3.3 Πολυπεπτίδια Rhesus Τα προϊόντα των γονιδίων RHD και RHCE είναι πρωτεΐνες 417 αμινοξέων η κάθε μία, οι οποίες περιέχουν παλμιτικό οξύ, αλλά διαφέρουν από τις υπόλοιπες διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που σχετίζονται με τα συστήματα ομάδων αίματος επειδή δεν περιέχουν υδατανθρακικές αλυσίδες. Οι πρωτεΐνες RhD και RhCcEe διαφέρουν μεταξύ τους μόνο σε αμινοξικά κατάλοιπα ανάλογα με τον φαινότυπο CcEe. Ανάλυση των αλληλουχιών των πρωτεϊνών, σε συνδυασμό με ανοσολογικά ευρήματα, καταδεικνύουν ότι οι Rh πρωτεΐνες διαπερνούν 12 φορές την κυτταρική μεμβράνη με 6 θηλιές, οι οποίες εκτείνονται στο εξωτερικό της μεμβράνης και τα 2 άκρα τους στο εσωτερικό του κυττάρου. Σύμφωνα με το μοντέλο του Cartron, όλοι οι D επίτοποι εξαρτώνται κυρίως από κατάλοιπα τοποθετημένα στις εξωκυττάριες θηλιές 3,4 και 6, αν και οι θηλιές 2 και 5 μπορεί περιστασιακά να εμπλέκονται. Οι επίτοποι epd3,4, D6/7 και 9 είναι τοποθετημένοι σε μια θηλιά, ενώ οι επίτοποι epd1, D2, D5 και D8 σε διαφορετικές (Εικόνα 2). Μέσα στη μεμβράνη του ερυθροκυττάρου τα Rh πολυπεπτίδια σχηματίζουν ένα σύμπλεγμα με μία γλυκοπρωτεΐνη, την Rh-συνδυασμένη γλυκοπρωτεΐνη (RhAG), η οποία: α) έχει μερική ομολογία (περίπου 40% ) με τα Rh πολυπεπτίδια, β) κωδικοποιείται από το γονίδιο RHAG που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6 και γ) είναι απαραίτητη για την έκφραση των Rh αντιγόνων. Η ομολογία των Rh και RhAG πρωτεϊνών καταδεικνύει μια αρχέγονη σχέση μεταξύ τους και γιαυτό το λόγο αναφέρονται ως οικογένεια Rh πρωτεϊνών 30,31 (Εικόνα 3). 21

22 Eικόνα 2. Μοντέλο της τοπολογίας των RhAG, RhCE και RhD πρωτεϊνών. Η πρωτεΐνη RhAG (Μ r 50000) αποτελείται από 409 αμινοξέα και κωδικοποιείται από το γονίδιο RHAG, το οποίο βρίσκεται στη χρωμοσωμική θέση 6p11-p21.1. Οι πρωτεΐνες RhCE και RhD (Μ r 30000) έχουν παρόμοια τοπολογία και βρίσκονται στη χρωμοσωμική θέση 1p34-p36. Το τμήμα της RhD πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από κάθε εξόνιο παρίσταται με αριθμημένα κουτιά, τα οποία αντιπροσωπεύουν την αρχή και το τέλος του κάθε εξονίου. Από τα D-ειδικά αμινοξέα, οκτώ είναι τοποθετημένα στην εξωκυττάρια πλευρά (κίτρινο χρώμα) και 24 βρίσκονται στη διαμεμβρανική και ενδοκυττάρια πλευρά (μαύρο χρώμα). Με κόκκινο χρώμα αναπαρίστανται τα αμινοξέα τα οποία είναι υπεύθυνα για τα αντιγόνα C/c (Ser103Pro) και E/e (Pro226Ala), ενώ με μωβ χρώμα τα Ser103 Ala226 στην RhD πρωτεΐνη. Οι ζιγκ- ζαγκ γραμμές αποτελούν τα μοτίβα Cys-Leu- Pro, τα οποία πιθανά εμπλέκονται στις θέσεις σύνδεσης με το παλμιτικό οξύ. Η Ν-γλυκάνη στην πρώτη θηλιά στην πρωτεΐνη RhAG παρίσταται με διακλάδωση από κόκκινους κύκλους. (Avent ND, Reid ME. The Rh blood group system: a review. Blood 2000; 95: ) 22

23 Όσον αφορά τις πρωτεΐνες RhCcEe, τέσσερις αμινοξικές αντικαταστάσεις είναι συνήθως υπεύθυνες για τους C/c πολυμορφισμούς στις θέσεις 16, 60, 68 και 103, αλλά κυρίως η Ser103Pro αντικατάσταση στη δεύτερη εξωκυτταρική θηλιά είναι καθοριστική για την C ή c ενεργότητα. Οι πολυμορφισμοί Ε/e προκύπτουν από Pro226Ala αντικατάσταση στην τέταρτη εξωκυττάρια θηλιά Από μελέτες σε Rh null ερυθροκύτταρα, στα οποία απουσιάζουν όλα τα Rh αντιγόνα, αποκαλύπτεται ότι οι Rh πρωτεΐνες αποτελούν μέρος ενός μεγάλου μεμβρανικού συμπλέγματος, όπου η παρουσία τους φαίνεται να είναι καθοριστική για τη σωστή έκφραση ή παρουσίαση των υπολοίπων μεμβρανικών πρωτεϊνών και γενικότερα στη φυσιολογία των ερυθροκυτταρικών μεμβρανών που δεν σχετίζεται με την αντιγονική τους δραστικότητα. Η απουσία σοβαρών κλινικών εκδηλώσεων υποδηλώνει ότι τα αντιγόνα Rh λειτουργούν ως ένα σύστημα λεπτής ρύθμισης της φυσιολογικής λειτουργίας της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης 37. Τα άτομα με τον σπάνιο Rhnull φαινότυπο εμφανίζουν διάφορες ανωμαλίες στη μεμβράνη των ερυθροκυττάρων τους. Χαρακτηριστικά, οι μεμβράνες έχουν αυξημένη δραστικότητα ATPασών και ελάττωση της χοληστερόλης με παθολογική κατανομή των φωσφολιπιδίων. Επίσης, τα ερυθροκύτταρα εμφανίζουν ποικιλομορφία, ενώ πάντοτε παρουσιάζεται σε κάποιο ποσοστό στοματοκυττάρωση, σφαιροκυττάρωση, χρόνια αιμολυτική αναιμία συνήθως ήπιας μέχρι και μέτριας βαρύτητας, αυξημένη ευαισθησία στην ωσμωτική λύση και μειωμένη περιεκτικότητα ύδατος και κατιόντων. Αν και τα αντιγόνα Rh διαδραματίζουν δομικό ρόλο στη μεμβράνη του ερυθροκυττάρου, όπως φαίνεται και από τις μορφολογικές αλλαγές στο σύνδρομο Rhnull, η λειτουργία τους παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Υπάρχει εντούτοις απόδειξη, ότι η γλυκοπρωτεΐνη RhAG συμβάλει στην μεταφορά αμμωνίου 37. Οι γλυκοπρωτεΐνες, οι οποίες προσδένονται στα αντιγόνα LW, Duffy και U, φαίνεται να χρειάζονται την παρουσία των Rh πρωτεϊνών για πλήρη έκφραση. Μελέτες της έκφρασης των Rh αντιγόνων στα προγονικά κύτταρα της ερυθράς σειράς υποδεικνύουν ότι τα αντιγόνα αυτά είναι παρόντα στις μεμβράνες των CFU-e προγονικών κυττάρων, ενώ απουσιάζουν από τις μεμβράνες των BFU-e κυττάρων. Φαίνεται δηλαδή ότι το σύστημα Rhesus πιθανά να διαδραματίζει κάποιο ρόλο και στη φυσιολογική διαφοροποίηση των κυττάρων της ερυθράς σειράς, ο οποίος όμως ακόμη δεν έχει διασαφηνιστεί

24 Εικόνα 3. Μοντέλο του Rh πρωτεϊνικού συμπλέγματος και της πρωτεΐνης band-3. Οι πρωτεΐνες Rh και band-3 είναι πιθανόν να σχηματίζουν ένα CO 2 /O 2 σύμπλεγμα μεταφοράς στη μεμβράνη των ερυθροκυττάρων. Η πρωτεΐνη band-3 (ανιοντοανταλλάκτης, anion exchanger) περιλαμβάνει ένα μεμβρανικό τμήμα (spanning domain), το οποίο ανταλλάσει ιόντα χλωρίου και διτανθρακικά (HCO 3 -), το καρβοξυ-τελικό κυτταροπλασματικό τμήμα, στο οποίο προσδένεται η καρβονική ανυδράση ( καταλύει την υδρόλυση του CO 2 και την αφυδρογόνωση του HCO 3 -) και το αμινοτελικό κυτταροπλασματικό τμήμα, το οποίο είναι μακρύ και σε αυτό προσδένονται η αιμοσφαιρίνη, γλυκολυτικά ένζυμα, η ανγκυρίνη, η πρωτεΐνη 4.2 και η σπεκτρίνη. Η λειτουργία αυτού του άκρου έγκειται στην αγκυροβόληση της μεμβράνης του ερυθροκυττάρου στον κυτταροσκελετό. Και οι δύο πρωτεΐνες, η Rh και η band 3 είναι γνωστό ότι σχετίζονται άμεσα με την αγκυρίνη μεταξύ του καρβοξυτελικού (Rh) και του αμινοτελικού (band 3) άκρου των δύο πρωτεϊνών και των D2 (Rh) και D3-D4 (band 3) τμημάτων της αγκυρίνης. Οι πρωτεΐνες band 3 και CD47 επίσης σχετίζονται με την πρωτεΐνη 4.2 με αλληλεπιδράσεις του καρβοξυτελικού (CD47) και του αμινοτελικού (band 3) άκρου τους. Η ικανότητα της πρωτεΐνης RhAG να μεταφέρει αμμώνιο αμφίδρομα, είναι ιδιαίτερα σημαντική για τη διατήρηση του ph στο εξωκυτταρικό και στο ενδοκυτταρικό διαμέρισμα. (N.D. Avent, T.E. Madgett,Z.E. Lee. Molecular biology of Rh proteins and relevance to molecular medicine. Expert Rev Mol Med 2006; 18 (13): 1-20) 24

25 3.4 Αντιγόνα και Φαινότυποι του συστήματος Rhesus Τα αντιγόνα Rhesus στον άνθρωπο αποτελούν ένα ισχυρά πολυμορφικό σύστημα ομάδων αίματος. Σε αντίθεση με όλα τα υπόλοιπα συστήματα, μόνο μερικά αλλήλια σχηματίζονται από μοναδικές άμινο αντικαταστάσεις. Η πλειοψηφία των Rh αλληλίων βασίζεται σε υβριδικά γονίδια προερχόμενα από ανταλλαγές εξονίων, οι οποίες καθοδηγούνται από γενετικές ανακατατάξεις στην RH περιοχή, μέσω μεταφοράς τμημάτων ή γονιδιακής μετατροπής Αντιγόνο D Όπως έχει αναφερθεί και προηγουμένως, το αντιγόνο D του συστήματος Rhesus είναι το κυρίως ανοσογόνο και πλέον σημαντικό από κλινική άποψη από τα υπόλοιπα αντιγόνα του συστήματος Rhesus και είναι παρόν στα ερυθροκύτταρα με γονότυπο D/D ή D/d. Ο γονότυπος ενός RhD θετικού ατόμου δεν μπορεί να προσδιοριστεί με τις κοινές ορολογικές μεθόδους η δε διάκριση ενός ετεροζυγώτη από έναν ομοζυγώτη γίνεται μόνο με σύγχρονες μοριακές μεθόδους 30,42. Η έκφραση του D αντιγόνου και επομένως ο αριθμός των D αντιγονικών θέσεων, ποικίλει ποσοτικά σε σημαντικό βαθμό ακόμη και μεταξύ των πιο συχνών φαινοτύπων 3 (Πίνακας 3). Εκτός από τις ποσοτικές διαφορές υπάρχουν και ποιοτικές διαφορετικές άτυπες μορφές του αντιγόνου D, οι ονομαζόμενες weak D και partial D ή variant D 43 (Εικόνα 4 και 5). Σήμερα, με τον όρο weak D τυποποιούνται όλες οι μορφές του αντιγόνου D με ασθενή έκφραση και με τον όρο partial D τυποποιούνται οι διάφορες ποικιλίες της δομής του αντιγόνου D. Όλα αυτά ερμηνεύουν τη μεγάλη ανοσογονικότητα (immunogenicity) των αντιγόνων RhD σε σχέση με τα υπόλοιπα Rhesus αντιγόνα. Πίνακας 3. Αριθμός D αντιγονικών θέσεων ανά ερυθροκύτταρο, σε διάφορους φαινοτύπους Rhesus. Φαινότυπος D αντιγονικές θέσεις ανά κύτταρο (range) DCe/dce Dce/dce DcE/dce DCe/Dce DCe/DcE DcE/DcE D--/D Daniels G. Rh blood group system: Human Blood Groups. Chapter 5. 1 st ed. Oxford: Blackwell Science,

26 Εικόνα 4. Γνωστά RHD αλλήλια. Ο κατά προσέγγιση αριθμός των δημοσιευμένων RHD αλληλίων που έχουν κατηγοριοποιηθεί σύμφωνα με τις ποικιλίες του D αντιγόνου που κωδικοποιούν. ( Flegel WA. Molecular genetics of RH and its clinical application. Tranfusion clinique et biologique 2006; 13: 4-12). Εικόνα 5. Αντιπροσωπευτικές μοριακές αλλαγές στα RHD αλληλόμορφα που θεωρούνται υπεύθυνες για τους διάφορους φαινοτύπους των D αντιγόνων. (Flegel WA. Molecular genetics of RH and its clinical application. Tranfusion clinique et biologique 2006;13: 4-12). 26

27 Αρνητικός RhD φαινότυπος Ο αρνητικός RhD φαινότυπος προκύπτει από την απουσία της RhD πρωτεΐνης από τη μεμβράνη των ερυθροκυττάρων. Στα RhD αρνητικά άτομα, το γονίδιο RHD δεν εκφράζεται. Έτσι ερμηνεύεται και το γεγονός ότι μέχρι σήμερα δεν έχουν προσδιοριστεί d γονίδιο και αντι-d αντισώματα αντίστοιχα 44. Μοριακές μελέτες απέδειξαν ότι ο RhD αρνητικός φαινότυπος παρουσιάζει ετερογένεια στους διάφορους πληθυσμούς. Στους Καυκάσιους, με απλότυπο dce, όπως έχει αναφερθεί και προηγουμένως, είναι αποτέλεσμα κατά κύριο λόγο έλλειψης ολόκληρου του RHD γονιδίου 45,46. Σε σπάνιες περιπτώσεις και συγκεκριμένα στους απλότυπους dce και dce, έχουν ανιχνευτεί RHD γονίδια ανέπαφα ή μερικώς ελλιπή, τα οποία δεν εκφράζονται, είναι δηλαδή μη λειτουργικά, εξαιτίας ενός μη ώριμου κωδικόνιου λήξης, νουκλεοτιδικής προσθήκης, σημειακών μεταλλάξεων ή δημιουργίας υβριδικού RHD/CE γονιδίου Σε αντίθεση με την ολοκληρωτική έλλειψη του RHD γονιδίου που συναντάμε στους Καυκάσιους, ο RhD αρνητικός φαινότυπος στους Αφρικανούς συχνά προκαλείται από ένα ανενεργό ή σιωπηρό γονίδιο RHD Τα δύο τρίτα των RhD αρνητικών Αφρικανών έχουν ένα ανενεργό γονίδιο, το ονομαζόμενο RHD ψευδογονίδιο (RHDy), το οποίο περιέχει μία προσθήκη 37 bp στο εξόνιο 4, με αποτέλεσμα αλλαγή στο πλαίσιο ανάγνωσης και πρώιμη λήξη της μετάφρασης. Από το υπόλοιπο ένα τρίτο των Αφρικανών RhD αρνητικών, οι μισοί φαίνεται να είναι ομόζυγοι ως προς μία RHD έλλειψη, ενώ οι υπόλοιποι έχουν ένα υβριδικό RHD-CE-D s γονίδιο, με απλότυπο (C)ce s και το οποίο παράγει τα αντιγόνα c, VS μη φυσιολογικά C και E, αλλά όχι το αντιγόνο D 53. Στους Ασιάτες, ο RhD αρνητικός φαινότυπος προκύπτει μέσω μεταλλάξεων στο γονίδιο RHD και συνήθως σχετίζεται με τον απλότυπο Cc, ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις στην πραγματικότητα πρόκειται για τον φαινότυπο D el Φαινότυπος weak D Το 1946 o Stratton περιέγραψε για πρώτη φορά μια ασθενή μορφή του φαινοτύπου RhD, η οποία ονομάστηκε αρχικά Du φαινότυπος. Ο όρος Du δεν χρησιμοποιείται πλέον και τα ερυθροκύτταρα με μειωμένη D έκφραση σήμερα κατηγοριοποιούνται ως RhD θετικά, ονομάζονται δε weak D. Στην πραγματικότητα δεν υπάρχει διαφορά στην ειδικότητα μεταξύ των φαινοτύπων D και Du, δεδομένου ότι ο weak D φαινότυπος χαρακτηρίζεται από σοβαρή μείωση της έκφρασης των D αντιγόνων στα ερυθροκύτταρα. Ο μέσος αριθμός των D αντιγονικών θέσεων διαπιστώθηκε ότι μειώνεται σε 5 10 % από τα κανονικά D ερυθροκύτταρα Ως σήμερα έχουν τυποποιηθεί 57 μεταλλάξεις στη μοριακή δομή των weak D φαινοτύπων Στην καυκάσια φυλή ο φαινότυπος weak D εμφανίζεται σε αναλογία 0,2% έως 1% και συνδυάζεται με έναν σπάνιο DCe ή DcE απλότυπο, ενώ στη μαύρη φυλή είναι πιο συνηθισμένος και συχνά συνδυάζεται με τον απλότυπο Dce 58 (Πίνακας 4). 27

28 Πίνακας 4. Μεταλλάξεις στη μοριακή δομή των weak D φαινοτύπων α/α Όνομα Αλλήλιο Νουκλεοτιδική αλλαγή 1 type 1 RHD(V270G) 809 T>G 2 type 1.1 RHD(L18V,V270G) 52 C>G; 809 G>A 3 type 2 RHD(G385A) 1154 G>C 4 type 3 RHD(S3C) 8 C>G 5 type 4.0 RHD(T201R,F223V) 602 C>G, 667 T>G, 819 G>A 6 type 4.1 RHD(W16C,T201R,F223V) 48G>C, 602 C>G, 667 T>G, 819 G>A 7 type 4.2 RHD(T201R,F223V,I342T) 602 C>G, 667 T>G,957 G>A, 1025 T->C 8 type 4.3 RHD(T201R,F223V,P291R) 602 C>G, 667 T>G, 819 G>A, 872 C>G 9 type 5 RHD(A149D) 446 C>A 10 type 6 RHD(R10Q) 29 G>A 11 type 7 RHD(G339E) 1016 G>A 12 type 8 RHD(G307R) 919 G>A 13 type 9 RHD(A294P) 880 G>C 14 type 10 RHD(W393R) 1177 T>C 15 type 11 RHD(M295I) 885 G>T 16 type 12 RHD(G277E) 830 G>A 17 type 13 RHD(A276P) 826 G>C 18 type 14 RHD(S182T,K198N,T201R) 544 T>A,594 A>T, 602 C>G 19 type 15 RHD(G282D) 845 G>A 20 type 16 RHD(W220R) 658 T>C 21 type 17 RHD(R114W) 340 C>T 22 type 18 RHD(R7W) 19 C>T 23 type 19 RHD(I204T) 611 T>C 24 type 20 RHD(F417S) 1250 T>C 25 type 21 RHD(P313L) 938 C>T 26 type 22 RHD(W408C) 1224 G>C 27 type 23 RHD(G212C) 634 G>T 28 type 24 RHD(L338P) 1013 T>C 29 type 25 RHD(R114Q) 341 G>A 30 type 26 RHD(V9D) 26 T>A 31 type 27 RHD(P221S) 661 C>T 32 type 28 RHD(T384T) 1152 A>C 33 type 29 RHD (I60L,S68N,K198N, F223V,I342T) 34 type 30 RHD(E340M) 1018 G>A, 1019 A>T 35 type 31 RHD(L6P) 17 C>T 36 type 32 RHD(I374N) 1121 A>T 37 type 33 RHD(V174M) 520 G>A 38 type 34 RHD(V270E) 809 T>A 39 type 35 RHD(G87D) 260 G>A 40 type 36 RHD(V281G) 842 T>G 41 type 37 RHD(K133N) 399 G>T 178A>C, 201G>A, 203G>A, 594A>T, 667T>G, 744C>T, 957G>A, 1025T>C 28

29 42 type 38 RHD(G278D) 833 G>A 43 type 39 RHD(G339R) 1015 G>A 44 type 40 RHD(T201R) 602 C>G 45 type 41 RHD(E398V) 1193 A>T 46 type 42 RHD(K409M) 1226 A>T 47 type 43 RHD(A202V) 605 T>C 48 type 44 RHD(Y243C) 728 A>G 49 type 45 RHD(A399T) 1195 G>A 50 type 46 RHD(F407L) 1221 C>A 51 type 47 RHD(R114G) 340 C>G 52 type 48 RHD(G61V) 182 G>T 53 type 49 RHD(S257F) 770 C>T 54 type 50 RHD(Y243N) 727 T>A 55 type 51 RHD(K198N, T201R) 594 A>T, 602 C>G 56 type 52 RHD(F31S) 92 T>C 57 type 53 RHD(V247G) 740 T>G Οι πρώτες μοριακές αναλύσεις των φαινοτύπων weak D, αποκάλυψαν ένα τυπικό RHD mrna με φυσιολογικό υποκινητή (promoter). Ωστόσο, αναλύσεις με ποσοτικές μεθόδους PCR έδειξαν μειωμένο ποσοστό των ειδικών RHD μεταγράφων στα weak D άτομα, συγκρινόμενα με φυσιολογικά. Τα αποτελέσματα αυτά αποδεικνύουν ότι, η μειωμένη έκφραση των D αντιγόνων δεν είναι συνέπεια ανακατατάξεων ή μεταλλάξεων στην κωδική περιοχή των RHD γονιδίων, αλλά πιθανά να προέρχεται από μια τροποποιημένη μεταγραφική λειτουργία των RHD γονιδίων, (μειωμένη mrna σταθερότητα ή τροποποιημένη pre-mrna διαδικασία) Πρόσφατες σχετικά μελέτες (Wagner et al, blood 93) παρόλα αυτά, αποδεικνύουν μια ετερογενή βάση στον φαινότυπο weak D, η οποία σχετίζεται με τεράστια ποικιλία μεταλλάξεων, που επιδρά τόσο στην ποιότητα όσο και στην ποσότητα του γονιδίου D. Η πλειοψηφία των μεταλλάξεων είναι χωρίς νόημα αλλαγές, οι οποίες οδηγούν σε μονές αντικαταστάσεις αμινοξέων και προκαλούν αλλαγές στην ενδοκυτταρική και διαμεμβρανική περιοχή των πρωτεϊνών, χωρίς όμως απώλεια των D επιτόπων 58, Οι αντικαταστάσεις αυτές πιθανά να εμποδίζουν την ακεραιότητα των πρωτεϊνών στη μεμβράνη ή ακόμη και την αγκυροβόληση τους στον κυτταρικό σκελετό 22,28,43 (Εικόνα 6 και 7). 29

30 Εικόνα 6. Εντοπισμός ορισμένων weak D αμινοξικών πολυμορφισμών. Φαίνεται ο μεμβρανικός εντοπισμός αμινοξέων υπεύθυνων για τη δημιουργία των weak D φαινοτύπων: τα περισσότερα εντοπίζονται στις μεμβρανικές έλικες και οι πλευρικές τους αλυσίδες πιθανά να εμπλέκονται στο σχηματισμό του Rh τριμερούς συμπλέγματος. Οι έλικες απεικονίζονται ως μπλε και λευκές ταινίες, οι εξωτερικές θηλιές στην κορυφή και οι εσωτερικές θηλιές στο πυθμένα με πράσινο χρώμα. Οι πλευρικές αλυσίδες των τροποποιημένων αμινοξέων στους weak D φαινοτύπους χρωματίζονται με μπλε, ενώ εκείνες των εξωτερικών θηλιών S102(loop 2), E233 (loop4) και G353 (loop6) με κίτρινο. Οι παρακάτω μεταλλάξεις τονίζονται ως weak D Type 1, V270G; Type 2, G385A; Type 4, T201R. F223V; Type 5, A149D; Type 7, G339E; Type 8, G307R; Type 9, A294P; Type 10, W393R; Type 11, M295I; Type 12, G277E. ( N.D. Avent, T.E. Madgett,Z.E. Lee. Molecular biology of Rh proteins and relevance to molecular medicine. Expert Rev Mol Med 2006; 18 (13):

31 Εικόνα 7. Σχηματική αναπαράσταση των αλλαγών στα αμινοξέα στις Rh πρωτεΐνες. (συμβολίζονται με κύκλους). Α) Weak D φαινότυποι. Οι αντικαταστάσεις των αμινοξέων αφορούν κυρίως τη διαμεμβρανική και την κυτταροπλασματική περιοχή της Rh πρωτεΐνης. Ο φαινότυπος weak D Type 1 (V270G) είναι ο κυρίαρχος τύπος στους Ευρωπαίους, ακολουθούν οι τύποι Type 2 και Type 3, οι οποίοι και οι τρεις μαζί αποτελούν την πλειοψηφία των weak D φαινοτύπων. Β) Partial D φαινότυποι. Οι αντικαταστάσεις αμινοξέων, οι οποίες προκαλούν τους περισσότερους partial D φαινοτύπους, παρατηρούνται στις εξωκυττάριες θηλιές. Ο φαινότυπος DNB είναι συχνός στους Ευρωπαίους. C) Del φαινότυπος. Η κυματοειδής γραμμή αναπαριστά την απώλεια του 3 άκρου, χαρακτηριστική στις Ασιατικές μεταλλάξεις και η Ευρωπαϊκή M295I μετάλλαξη φαίνεται στο ένατο διαμεμβρανικό τμήμα. (Westhoff CM. The structure and Function of the Rh antigens Complex. Semin Hematol. 2007; 44(1): 42-50) 31

32 Από τις ως σήμερα μελέτες φαίνεται ότι ερυθροκύτταρα με weak D φαινότυπο δεν παράγουν αντισώματα στις εγκυμοσύνες ή στις μεταγγίσεις όταν εκτίθενται σε D θετικά ερυθροκύτταρα. Στην πραγματικότητα, οι weak D φαινότυποι θεωρούνται ποσοτικές ποικιλίες της D αντιγονικής έκφρασης, στις οποίες δεν απουσιάζουν D επίτοποι 28. Επιπλέον, η πλειοψηφία των ατόμων με weak D φαινότυπο, μπορεί με ασφάλεια να μεταγγιστεί με D θετικά ερυθροκύτταρα, χωρίς να προκύψει πρόβλημα ευαισθητοποίησης. Παρόλα αυτά όμως, επειδή οι αντικαταστάσεις αμινοξέων είναι τοποθετημένες στην ενδοκυττάρια και στη διαμεμβρανική περιοχή, υπάρχει η πιθανότητα να μετατραπούν οι επίτοποι της επιφάνειας των ερυθροκυττάρων. Από τους 57 διαφορετικούς τύπους weak D, παραμένει ακόμη άγνωστο ποιοι έχουν τροποποιημένους D επιτόπους Βέβαια υπάρχουν και εξαιρέσεις, όπως οι τύποι: weak D type 15, weak D type 4.2 (ή όπως είναι αλλιώς γνωστός ως DAR) weak D type 7, οι φορείς των οποίων είναι ικανοί να παράγουν αλλοαντισώματα anti-d 4. Διάφορες μελέτες έχουν αποδείξει ότι συγκεκριμένοι weak D φαινότυποι και partial D σχετίζονται με την εθνικότητα. Ειδικότερα, κάποιοι φαινότυποι εμφανίζονται σε ορισμένες εθνικές ομάδες, ενώ κάποιοι άλλοι είναι περισσότερο διασκορπισμένοι Γενικά, η πλειοψηφία των ατόμων με weak D φαινότυπο στην Καυκάσια φυλή ανήκει στους τύπους weak D type 1 έως 5. Ο πιο συχνός είναι ο weak D type 1, προερχόμενος από αντικατάσταση μιας βάσης στο νουκλεοτίδιο 809 (T G), η οποία στη συνέχεια οδηγεί σε αντικατάσταση της βαλίνης σε γλυκίνη, στο κωδικόνιο 270 του εξονίου Ο weak D type 4 διαιρείται τουλάχιστον σε δυο υποκατηγορίες στους Καυκάσιους, στις weak D type 4.0 και weak D type 4.1. Ανάλογες κατανομές έχουν μέχρι τώρα βρεθεί σε όλους τους πληθυσμούς των Καυκάσιων, αν και ελάχιστες διαφοροποιήσεις είναι δυνατόν να παρατηρηθούν 69, Στην Πορτογαλία, για παράδειγμα, ο weak D type 2 είναι ο κυρίαρχος weak D φαινότυπος. Στους μη Καυκάσιους πληθυσμούς η κατανομή των weak D φαινοτύπων είναι διαφορετική. Στους Αφρικανούς, ο weak D 4.2 φαινότυπος (γνωστός και ως DAR) είναι ο κυρίαρχος φαινότυπος 66,72 (Εικόνα 8, Πίνακας 5). Εικόνα 8. Κατανομή των weak D φαινοτύπων στην Ευρώπη. Ορισμένοι weak D τύποι αποτελούν την πλειοψηφία των weak D φαινοτύπων στους Ευρωπαίους. Οι τύποι weak D types 1-4 αποτελούν το 94%, ενώ οι λιγότερο συχνοί τύποι (weak D types 5-11) οι οποίοι μόλις και συνιστούν το 6% του δείγματος. (Flegel WA. How I manage donors and patients with a weak D phenotype. Curr Opin Hematol 2006; 13: ) 32

33 Πίνακας 5. Κατανομή των weak D φαινοτύπων σε ορισμένες περιοχές της Ευρώπης Weak D Γερμανία Τυρόλο Τσεχία Γαλλία Ισπανία Πορτογαλία Type 1 60% 33% 58% 46% 49% 16% Type 2 27% 8% 10% 32% 33% 64% Type 3 4% 50% 20% 5% 9% 14% Type 4 4% 3% 4% 0% 9% 6% Αλλοι τύποι 5% 6% 8% 17% 0% 0% Araujo F, Rodrigues MJ, Monteiro F. Weak D type 2 is the post prevalent weak D type in Portugal Transfusion Medicine 2006; 16: Partial D Το γεγονός ότι RhD θετικά άτομα παράγουν αντί-d αντισώματα, ως απάντηση σε αλλοανοσοποίηση με RhD θετικό αίμα (μετά μετάγγιση ή κύηση), οδηγεί στο συμπέρασμα ότι το αντιγόνο D έχει δομή μωσαϊκού, που όπως αποδείχθηκε αποτελείται από 37 τουλάχιστον επιτόπους. Η έλλειψη έκφρασης συγκεκριμένων επιτόπων από την επιφάνεια των ερυθροκυττάρων καθορίζει τις ονομαζόμενες D ποικιλίες ή αλλιώς partial D, που προκύπτουν μέσω γονιδιακών ανακατατάξεων των RHD και RHCE γονιδίων ή μέσω σημειακών μεταλλάξεων στο ίδιο το RHD γονίδιο. Οι γονιδιακές ανακατατάξεις μεταξύ των γονιδίων RHD και RHCE προκύπτουν με γονιδιακή μετατροπή μεταξύ των 2 γονιδίων διαφόρου μήκους από ένα νουκλεοτίδιο έως και 5 εξόνια. Οι φαινότυποι αυτοί συχνά παρουσιάζουν ασθενή έκφραση του αντιγόνου D και για αυτό το λόγο είναι δύσκολος ο διαχωρισμός τους από τους D weak φαινοτύπους 41, Οι μοριακές τροποποιήσεις στους φαινοτύπους partial D γενικά επηρεάζουν τουλάχιστον ένα εξωκυττάριο αμινοξύ όπως φαίνεται στην Εικόνα Πολλοί από τους αλληλόμορφους partial D φαινοτύπους με διαφορετική RHD κωδική αλληλουχία, έχουν μεγάλη κλινική σημασία. Η διάκριση τους από τους κυρίαρχους RhD φαινοτύπους στις μεταγγίσεις, θα επέφερε σημαντικό πλεονέκτημα στις στρατηγικές της θεραπευτικής μετάγγισης

34 Εικόνα 9. Εντοπισμός των partial D αμινοξικών πολυμορφισμών. Φαίνεται η εξωκυττάρια θέση των αμινοξικών αλλαγών, οι οποίες είναι υπεύθυνες για τους partial D φαινοτύπους. Οι εξωκυττάριες RhD πρωτεϊνικές θηλιές στην κορυφή και οι ενδοκυττάριες στον πυθμένα φαίνονται με πράσινο χρώμα, ενώ οι θέσεις των 11 διαμεμβρανικών ελίκων με μπλε και λευκό. Οι παρακάτω μεταλλάξεις τονίζονται: exoloop 2: DVII-L110P, exoloop 3: DFW H 166P; DOL-1 M170T; exoloop 4: DOL -1 F223V; DHR R229K; exoloop 5: DHMi T283I; DLO S284L; exoloop 6: DNU G353R; DII A354D; DNB G355S; DWI M358T. ( N.D. Avent, T.E. Madgett,Z.E. Lee. Molecular biology of Rh proteins and relevance to molecular medicine. Expert Rev Mol Med 2006; 18 (13): 1-20) 34

35 Οι πιο συνηθισμένες μορφές των partial D είναι οι εξής 22 (Εικόνα 10): DII Χαρακτηρίζεται από μετάλλαξη μίας βάσης (μονοσημειακή) στο εξόνιο 7, η οποία έχει ως αποτέλεσμα μια αμινο αντικατάσταση (Ala354 Asp) 82, DIIIa Στον φαινότυπο αυτό έχουμε 4 νουκλεοτιδικές αλλαγές στα εξόνια (3: Α455 C, 4: C602 G και 5: C654 G και T667 G ), οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα αμινο αντικαταστάσεις, χαρακτηριστικές των RhCE πολυπεπτιδίων (Asn152 Thr, Thr201 Arg, Ile218 Met και Phe223 Val). Δεδομένου ότι κανένα από αυτά τα αμινοξέα δεν είναι τοποθετημένο σε θηλιά της εξωκυττάριας πλευράς της πρωτεΐνης, προφανώς αυτά επιδρούν στην τοποθέτηση των γειτονικών τους επιφανειακών θηλιών και επομένως τροποποιούν τον σχηματισμό των D επιτόπων 3. DIIIb Χαρακτηρίζεται από γονιδιακή ανακατάταξη και συγκεκριμένα ανταλλαγή τμήματος του εξόνιου 2 του RHD γονιδίου με το RHCE γονίδιο. Οι αμινοαντικαταστάσεις που προκύπτουν (Ile60 Leu, Ser68 Asn και Ser103 Pro) είναι χαρακτηριστικές του Rhc αλληλίου. Αφορά κυρίως τους Αφρικανούς 3. DIIIc Πρόκειται για υβριδικό RHD-CE-D αλλήλιο, στο οποίο το εξόνιο 3 του RHD γονιδίου έχει αντικατασταθεί από το εξόνιο 3 του RHCE. Στο πολυπεπτίδιο DIIIc προκύπτουν τέσσερις D ειδικές αμινοαντικαταστάσεις (Leu121 Met, Val127 Ala, Asp128 Gly και Asn152 Thr) 97. DIVa Προκύπτει από δυο ανεξάρτητες ανακατατάξεις, στις οποίες το εξόνιο 2 και μέρος των εξονίων 3 και 7 του RHD γονιδίου έχει αντικατασταθεί από τα αντίστοιχα του RHCE γονιδίου. Αυτή η αντικατάσταση σχετίζεται με την απώλεια των επιτόπων D1, 2, 3 και 9 εξαιτίας μιας αμινο αντικατάστασης στην εξωμεμβρανική επιφάνεια (His 350) και δυο στην διαμεμβρανική περιοχή (Phe 62 και Thr 152) 62. DIVb Στην ποικιλία αυτή ένα υβριδικό RHD-CE-D γονίδιο, στο οποίο τα εξόνια 7-9 (ή μέρος αυτών) έχουν αντικατασταθεί από αντίστοιχα τμήματα του RHCE γονιδίου 62. DVa Παρατηρείται ανταλλαγή τμήματος ή ολόκληρου του εξονίου 5 μεταξύ των γονιδίων RHD και RHCE, που οδηγεί σε δυο αμινο αντικαταστάσεις (Phe223 Val, Glu233 Gln. Μια ακόμη ποικιλία DVa (DVa like) χαρακτηρίζεται από δυο εναλλακτικές αμινο αντικαταστάσεις (Val238 Met και Val245 Leu )

36 DVI Χαρακτηρίζεται από ετερογένεια και προέρχεται από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα μοριακά γεγονότα, που οδηγούν όλα σε RHD-RHCE-RHD υβριδικά γονίδια. Τύποι: -DVI τύπος 1, σχετίζεται με τον cdvi απλότυπο, όπου παρατηρείται αντικατάσταση των εξονίων 4 και 5 του γονιδίου RHD από τα αντίστοιχα του γονιδίου RHCE. -DVI τύπος ΙΙ, σχετίζεται με τον CDVIe απλότυπο, όπου παρατηρείται γονιδιακή αντικατάσταση των εξονίων 4-6 του γονιδίου RHD από τα αντίστοιχα του γονιδίου RHCE. -DVI τύπος III, σχετίζεται επίσης με τον CDVIe απλότυπο, όπου παρατηρείται γονιδιακή αντικατάσταση των εξονίων 3-6 του γονιδίου RHD από τα αντίστοιχα του γονιδίου RHCE. Πρόκειται για την πιο συνηθισμένη ποικιλία 0,02% στους Καυκάσιους και 5% όλων των weak D τύπων) και την πιο σημαντική ως προς την κλινική της σημασία. Έχουν αναφερθεί περιπτώσεις αιμολυτικής νόσου των νεογνών σε RhD θετικά παιδιά, που έχουν γεννηθεί από μητέρες DVI με αντι- D αντισώματα 99,100. DVII Αυτή η ποικιλία οφείλεται σε μια σημειακή μετάλλαξη, T329 C στο εξόνιο 2 του RHD γονιδίου, η οποία οδηγεί σε αντικατάσταση της λευκίνης από προλίνη στη θέση 110, στο RHD πολυπεπτίδιο 101. DFR Πρόκειται για ένα υβριδικό γονίδιο RHD, στο οποίο το εξόνιο 4 ή μέρος του αντικαθίσταται από τα αντίστοιχα του γονιδίου RHCE DHR Προκύπτει από μια σημειακή μετάλλαξη (G686 A) στο εξόνιο 5 του RHD γονιδίου, η οποία οδηγεί σε αντικατάσταση της αργινίνης από λυσίνη στη θέση 229, στο πολυπεπτίδιο RHD 104. DBT Πρόκειται για ένα υβριδικό γονίδιο RHD-CE-D στο οποίο έχουν αντικατασταθεί τα εξόνια : 5, 6, 7 (και πιθανά μέρος από το εξόνιο 8) από αντίστοιχα τμήματα του γονιδίου RHCE = DBT-1 και 5-9 έχουν αντικατασταθεί από αντίστοιχα τμήματα του RHCE γονιδίου = DBT DNU Στον φαινότυπο αυτό μια σημειακή μετάλλαξη στο RHD γονίδιο οδηγεί σε αντικατάσταση της γλυκίνης σε αργινίνη στη θέση 353, στο RHD πολυπεπτίδιο 95. DHMi και DHMii Στον φαινότυπο DHMi παρατηρείται αντικατάσταση θρεονίνης από ισολευκίνη στη θέση ,106. Μελέτες οικογενειών αποδεικνύουν ότι οι ποικιλίες αυτές κληρονομούνται ως cde γονιδιακό σύμπλεγμα. 36