ΤΟΞΙΚΕΣ ΧΗΜΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ: ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΔΟΜΗΣ-ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΤΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ Εισαγωγή: Ποσοτική Εκτίμηση Τοξικότητας Χημικών Ουσιών

Transcript

1

2 ΤΟΞΙΚΕΣ ΧΗΜΙΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ: ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΔΟΜΗΣ-ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΤΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ 6.1. Εισαγωγή: Ποσοτική Εκτίμηση Τοξικότητας Χημικών Ουσιών Ο αριθμός των χημικών ουσιών που απελευθερώνονται στο περιβάλλον και ρυπαίνουν αέρα, νερά και έδαφος είναι αρκετά μεγάλος. Όπως έχει αναφερθεί και προηγούμενα υπάρχουν πάνω από χημικές ουσίες στο εμπόριο, εκ των οποίων ένα σημαντικό ποσοστό, με την παραγωγή, την χρήση ή ως απόβλητα, ρυπαίνουν το περιβάλλον. Επίσης, οι εκπομπές χημικών ρύπων από βιομηχανικές εγκαταστάσεις, κατά την παραγωγή ενέργειας, από τον γεωργικό-κτηνοτροφικό τομέα, και τις αστικές δραστηριότητες (τροχοφόρα, κεντρικές θερμάνσεις, οικιακά απορρίμματα) ρυπαίνουν σε σημαντικό βαθμό το φυσικό περιβάλλον. Ακόμη και σήμερα υπάρχουν σημαντικά κενά στις γνώσεις μας για τις διάφορες περιβαλλοντικές και τοξικές δράσεις χημικών ουσιών που ρυπαίνουν το περιβάλλον (για το 80 % των ουσιών που βρίσκονται στα απόβλητα ή ρυπαίνουν το περιβάλλον δεν υπάρχουν στοιχεία χρόνιας τοξικότητας και άλλες πληροφορίες περιβαλλοντικής σημασίας). Ο χρόνος και το κόστος των ερευνών και δοκιμασιών τοξικότητας δεν επιτρέπουν για την ολοκληρωμένη μελέτη τους. Υπάρχει πληθώρα τοξικολογικών παραμέτρων και περιβαλλοντικών δεικτών που πρέπει να διερευνηθούν καθώς και μεγάλη ποικιλία οικοσυστημάτων. Τα τελευταία χρόνια, λόγω της ύπαρξης πολλών τραπεζών τοξικολογικών δεδομένων και περιβαλλοντικών πληροφοριών, της χρήσης ηλεκτρονικών υπολογιστών, και μεγάλου αριθμού πειραματικών αποτελεσμάτων για τις τοξικές και επικίνδυνες δράσεις των χημικών ουσιών, γίνεται προσπάθεια να χρησιμοποιηθεί μέθοδος σύγκρισης της συντακτικής δομής των ουσιών με γνωστές ουσίες και μέσω αυτών να γίνει ποσοτική αξιολόγηση της πιθανής τοξικολογικής δράσης. Η μέθοδος εκτίμησης της τοξικής δράσης αγνώστων ουσιών με βάση την δομή τους και με την χρήση 95

3 τραπεζών δεδομένων καλείται: Ποσοτική Σχέση Δομής-Δραστικότητας (Quantitative Structure-Activity Relationship, QSAR). Ήδη η μέθοδος QSAR έχει γίνει αποδεκτή από την Ευρωπαϊκή Ένωση, ως μία εκ των μεθοδολογικών προσεγγίσεων για τη νέα REACH ταξινόμηση και έλεγχο βιομηχανικών χημικών ουσιών. Μετά από την συγκέντρωση στοιχείων για το Ευρωπαϊκό Μητρώο Εμπορικών Χημικών Ουσιών(ΕΙΝCS) για ενώσεις, υπολογίσθηκε ότι οι (περίπου) ενώσεις παρουσιάζουν κάποιο βαθμό κινδύνου, αλλά στοιχεία τοξικότητας και άλλες περιβαλλοντικές πληροφορίες υπάρχουν μόνο για Η ΕΕ έχει αρχίσει η συλλογή στοιχείων σε τράπεζα πληροφοριών, Harmonised Electronic Dataset (European Chemicals Bureau, Ίσπρα, Ιταλία) και έχει αναπτυχθεί κατάλληλο λογισμικό για την χρησιμοποίηση πληροφοριών ανάλογα με τις ανάγκες των επιστημόνων σε βιομηχανίες, ερευνητικά κέντρα και πανεπιστήμια. 2 Ορισμένες από τις παραμέτρους που έχουν συγκεντρωθεί για χημικές ουσίες και των οποίων η χρήση μπορεί να βοηθήσει στην εκτίμηση σχέσεων δομής-δραστικότητας παρουσιάζονται στον πίνακα 6.1. Οι προβλέψεις τοξικότητας με τη μέθοδο σχέσεων δομής-δραστικότητας (QSARs) είναι μαθηματικές εξισώσεις που συσχετίζουν τις βιολογικές επιδράσεις μιας ομάδας χημικών ουσιών με τις φυσικοχημικές και δομικές τους ιδιότητες. Εκείνο που έχει σημασία στην μέθοδο αυτή είναι ότι όλες οι χημικές ενώσεις πρέπει να επιδρούν στους βιολογικούς οργανισμούς ή στο περιβάλλον γενικά, με τους ίδιους μηχανισμούς. Το γεγονός αυτό συνδέεται άμεσα με τον τρόπο που επιδρούν οι χημικές ουσίες στους βιολογικούς οργανισμούς, δηλαδή in vivo μεταφορά-διάχυση και σύνδεση με τον υποδοχέα ( transport και receptor binding). Η μεταφορά είναι κυρίως διεργασία διάχυσης μέσω των βιολογικών μεμβρανών των κυττάρων και εξαρτάται από την κατανομή της χημικής ουσίας μεταξύ υδατικής και λιποειδούς φάσης. Η διαπερατότητα μέσω μεμβρανών εξαρτάται άμεσα από τα λιπίδια τους και οι ουσίες που είναι λιποδιαλυτές έχουν μεγαλύτερη ικανότητα διαπερατότητας. Το μοντέλο που χρησιμοποιείται στην περίπτωση αυτή είναι το μίγμα οκτανόλης-νερού. 96

4 Πίνακας 6.1. Ορισμένες παράμετροι που έχουν συγκεντρωθεί σε τράπεζες πληροφοριών και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εκτίμηση δομής-τοξικότητας. Τύποι παραμέτρων Παραδείγματα Οκτανόλη-νερό, συντελεστής κατανομής(p ή Kow) Διαλυτότητα στο νερό Φυσικοχημικοί Οργανικός άνθρακας, συντελεστής κατανομής (organic carbon partition coefficient, Κoc) Αέριο-νερό συντελεστής κατανομής (σταθερά του νόμου του Henry, H) Σταθερά διάστασης οξέος (pka) Παράμετροι περιβαλλοντικής σταθερότητας (βιοδιασπασιμότητας) Οικοτοξικολογικοί παράμετροι υδατική υδρόλυση τάση βιοδιασπασιμότητας Τοξικότητα σε φύκη (algal toxicity, EC 50, NOEC, no observed effect concentration) Τοξικότητα σε ασπόνδυλα (LC 50, NOEC) Τοξικότητα σε ψάρια (LC 50, NOEC) Βιοσυγκέντρωση (bioconcentration, BCF) Η σύνδεση με τον υποδοχέα εξαρτάται άμεσα με την δομή και το μέγεθος του μορίου της χημικής ουσίας. Ιδιαίτερη σημασία έχει η θέση και η φύση των δραστικών ομάδων που φέρει η ουσία και με τις οποίες αντιδρά σε κατάλληλες θέσεις του υδροφοβικού (ή λιποφιλικού) υποδοχέα. Οι παράμετροι αυτοί μπορούν να μοντελοποιηθούν με σειρά ηλεκτρονικών και στερεοχημικών ιδιοτήτων των ενώσεων, όπως είναι οι σταθερές υποκαταστατών Ηammett (Hammett substituent constants) και του μοριακού όγκου, και από 97

5 τοπολογικούς δείκτες όπως οι δείκτες μοριακής σύνδεσης (molecular connectivity indices). Για να αναπτυχθεί μία μελέτη ποσοτικής εκτίμησης δομήςδραστικότητας επιλέγονται σειρές χημικών ουσιών με παρόμοιους συντακτικούς τύπους. Για τις ενώσεις αυτές μετρούνται ή είναι γνωστές από την βιβλιογραφία οι σταθερές για υδρόφοβες ή λιπόφιλες ιδιότητες, καθώς και για ηλεκτρονικές ή στερεοχημικές διαμορφώσεις του μορίου. Κατόπιν μετράται ή λαμβάνεται από την βιβλιογραφία η κατάλληλη βιολογική επίπτωση (που έχει σημασία για την τοξικότητα ή τις περιβαλλοντικές επιδράσεις) για κάθε ένωση και συνδυάζεται με τις φυσικοχημικές και δομικές ιδιότητές της. με τη χρήση κατάλληλων στατιστικών τεχνικών και με την βοήθεια προγραμμάτων Η/Υ προσδιορίζονται οι παράμετροι που συσχετίζονται καλύτερα με την βιολογική δράση. Οι μαθηματικές εξισώσεις που μπορούν να προκύψουν από την εφαρμογή των στατιστικών συσχετίσεων QSAR είναι αρκετά ενδιαφέρουσες για μια ομάδα χημικών ουσιών. Για παράδειγμα, έχει γίνει συσχέτιση του συντελεστή κατανομής σε μίγμα οκτανόλης-νερού (Ρ) 50 χημικών ουσιών (που είναι χημικοί ρύποι από βιομηχανικές εγκαταστάσεις) με την θανατηφόρο δόση LC 50 (Lethal Dose 50%, δηλαδή της δόσης που θανατώνει το 50% των πειραματόζωων, guppy) σε ψάρια guppy. Η εξίσωση είναι: 4 Log (1/LC 50 ) = 0,871 logp - 4,87 98

6 Ο αριθμός των ουσιών είναι 50, ο συντελεστής συσχετισμού, r=0,988 (correlation coefficient) και το τυποποιημένο σφάλμα, s =0,247 (standard error). Tα αποτελέσματα της συσχέτισης των δύο παραμέτρων παρουσιάζονται στο Σχήμα 6.1. Σχήμα 6.1. Η συσχέτιση της LC 50 στο ψάρι Guppy (λεβιστής ο δικτυωτός, τροπικό ψάρι με ζωηρά χρώματα) και logp για 50 βιομηχανικούς χημικούς ρύπους με την μέθοδο της QSAR. Παρατηρείται καλή γραμμική συνάρτηση των δύο παραμέτρων. Υπάρχουν διάφορα πρότυπα (μοντέλα) τα οποία με την χρήση πληροφοριών γνωστών περιβαλλοντικών παραμέτρων για ορισμένες χημικές ουσίες να προεκτείνουν τις προβλέψεις σε άλλες άγνωστες χημικές ουσίες με την σχέση δομής-δραστικότητας. Οι ποσοτικές αυτές αξιολογήσεις μπορούν να προβλέψουν την χρόνια και οξεία τοξικότητα, την ικανότητα καρκινογένεσης, την μεταλλαξιγόνο δράση (αν και με μικρότερη επιτυχία), την επίδραση στο αναπαραγωγικό σύστημα σε διάφορα είδη που έχουν περιβαλλοντική σημασία. Με τον τρόπο αυτό μπορούν να δημιουργηθούν και τοξικολογικές σχέσεις κατά μήκος των ορίων διαφόρων ειδών. 99

7 6.2. Πρότυπα για Ποσοτικές Συσχετίσεις Δομής-αποτελέσματος (QSAR models) Υπάρχουν τρία κυρίως πρότυπα για συγκρίσεις και προβλέψεις τοξικότητας, τόσο για συγκεκριμένους ρύπους όσο και για ομάδες ρύπων με παρόμοια μοριακή δομή. Η πρώτη ομάδα προτύπων περιλαμβάνει τον συνδυασμό δεικτών που συνδέουν παρόμοιας μοριακής δομής ενώσεις (molecular connectivity indices), Κάππα περιβαλλοντικοί-περιγραφικοί παράμετροι (kappa environmental descriptors), ηλεκτρονικά φορτία (electronic charges) και τμήματα-κλειδιά χαρακτηριστικών υποδομικών ομάδων του μορίου (substructural keys). Ο συντελεστής κατανομής οκτανόλης/νερού (Log P) έχει χρησιμοποιηθεί όπως και άλλοι παράμετροι. Σχήμα 6.2. Πρότυπο γραμμικής συνάρτησης με συνεχή δεδομένα σε ανάλυση QSAR. Η γραφική παράσταση της τοξικότητας ως προς μία φυσική ή χημική παράμετρο. Τα πρότυπα αυτά έχουν αποδειχθεί πολύ επιτυχή για την πρόβλεψη της τοξικότητας σε διάφορες δοκιμασίες τοξικότητας: επίμυες, οξείας τοξικότητας από το στόμα LD 50, Daphnia EC 50, fathead minnow (είδος ψαριού) EC 50 κλπ. Η προσέγγιση αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για προβλέψεις μεταλλαξιγόνου και καρκινογόνου δράσης και για δερματικό ερεθισμό. 100

8 H δεύτερη ομάδα προτύπων έχει αναπτυχθεί για ομάδες χημικών ενώσεων που έχουν εξειδικευμένη δράση στους οργανισμούς, όπως οι οργανοφωσφορικές ενώσεις, και περιορίζονται σε ειδικές κατηγορίες επιδράσεων (δέσμευση ακετυλοχολινεστεράσης). Η τρίτη ομάδα προτύπων έχουν αναπτυχθεί για να προβλέπουν τοξικότητες μεταξύ των ειδών, δηλαδή με παρέκταση αποτελεσμάτων (interspecies moles by extrapolation) από επίμυες δοκιμασία τοξικότητας στην Daphnia m. ( rat oral LD 50 to Daphnia magna EC 50) Ανάπτυξη Τυποποιημένων Προτύπων για Ποσοτικές Σχέσεις Δομής-Δραστικότητας (QSAR) Για όλους τους τύπους προτύπων ακολουθείται παρόμοια μεθοδολογική προσέγγιση. Το πιο δύσκολο τμήμα της εργασίας αυτής είναι η απόκτηση ικανοποιητικών και αξιόπιστων τραπεζών δεδομένων για τοξικές δράσεις. Τα στοιχεία μπορούν να αντληθούν από ερευνητικές εργασίες, εκθέσεις κυβερνητικών υπηρεσιών, πληροφορίες από κατασκευαστές κλπ. Στις ΗΠΑ οι κατασκευαστές είναι υποχρεωμένοι να καταθέτουν φακέλους με στοιχεία σύμφωνα με τον νόμο για τις τοξικές ουσίες (Toxic Substances Control Act). Στην Ευρωπαϊκή Ένωση υπάρχουν αντίστοιχες οδηγίες για συλλογή στοιχείων, τόσο για τις υπάρχουσες χημικές ουσίες και παρασκευάσματα, όσο και για τις νέες μετά το 1981 (European Inventory of Existing Chemical Substances, Council Regulation 93/793 on the evaluation and control of the risks of existing substances, ; IUCLID: International Uniform Chemical Information Database; Η οδηγία 92/32/ΕΟΚ είναι η 7η τροποποίηση της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ περί προσεγγίσεως των νομοθετικών, κανονιστικών και διοικητικών διατάξεων που αφορούν την ταξινόμηση, συσκευασία και επισήμανση των επικίνδυνων ουσιών, αφορά τις νέες επικίνδυνες χημικές ουσίες και παρασκευάσματα). 101

9 Η Υπηρεσία Προστασίας του Περιβάλλοντος (ΕΡΑ) στις ΗΠΑ, και η Οργάνωση Οικονομικής Συνεργασίας και Ανάπτυξης (ΟΟΣΑ) έχουν δημοσίευση οδηγίες και κανόνες για την χρησιμοποίηση QSARs στην προσπάθεια πρόβλεψης της τοξικολογικής δράσης διαφόρων χημικών ουσιών. 6, Παράδειγμα Χρήσης Προτύπων Μεθόδων QSAR Υπάρχουν πολλά παραδείγματα υπολογισμού της τοξικότητας χημικών ουσιών σε διάφορους οργανισμούς (όπως η Δάφνια ). Στις ΗΠΑ υπάρχουν προγράμματα Η/Υ (όπως για παράδειγμα το TOPKAT, Health Designs,Inc. στις ΗΠΑ, και άλλα προγράμματα, όπως HAZARDEXPERT, Compudrug, CASETOX, Biphore) με τα οποία μπορούν να υπολογισθούν οι τοξικότητες απλών ουσιών Παράδειγμα : τοξικότητα Ισοπροπυλαμίνης σε Daphnia magna To παράδειγμα αυτό εφαρμόζεται με το πρόγραμμα ηλεκτρονικού υπολογιστή ΤΟΡΚΑΤ που αναπτύχθηκε από την εταιρία Ηealth Designs, Inc. στις ΗΠΑ. Η διεργασία των υπολογισμών είναι εύκολη όταν οι εξισώσεις ενσωματωθούν στο πρόγραμμα ΤΟΡΚΑΤ. Η δομή της χημικής ένωσης είναι εισαγόμενο στοιχείο στο λογισμικό του προγράμματος χρησιμοποιώντας γραμμική καταγραφή (linear notation, SMILES) για την διδιάστατη δομή του μορίου. Το πρότυπο που θα χρησιμοποιηθεί καθορίζεται και εισάγεται παράλληλα με την τράπεζα δεδομένων για επεξεργασία αξιολόγησης. Το πρόγραμμα ΤΟΡΚΑΤ ερευνά για παραμέτρους και υπολογίζει τo αποτέλεσμα της συνάρτησης (regression score) και το υπολογιζόμενο LD 50. Χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ΤΟΡΚΑΤ, γίνεται συγχρόνως μία εκτίμηση της επάρκειας (reliability) των υπολογισμών από την σύγκριση με παρόμοιες ενώσεις, που υπάρχουν στην τράπεζα δεδομένων. Τα αποτελέσματα εκφράζονται στο τέλος με κριτική των όρων που συντέλεσαν στο αποτέλεσμα 102

10 και μια σύγκριση με τους υπολογισμούς της βιβλιογραφίας για παρόμοιες ενώσεις. Το παράδειγμα του υπολογισμού της τοξικότητας σε Daphnia magna της ένωσης ισοπροπυλαμίνης είναι ενδεικτική. Η ένωση είναι γνωστή και έχει συγκεκριμένο αριθμό των Chemical Abstracts Service (CAS number) που καθιστά εύκολη την ταυτότητά της. Με το υποπρόγραμμα SMILES γίνεται η εισαγωγή στοιχείων του συντακτικού τύπου της δομής σε δύο διαστάσεις και συγχρόνως επιλέγεται το πρότυπο. Για λεπτομέρειες της μεθοδολογίας πρέπει κανείς να συμβουλευθεί την επιστημονική βιβλιογραφία όπου υπάρχουν αρκετά επιστημονικά άρθρα για τον προσδιορισμό της τοξικότητας χημικών ουσιών σε υδρόβιους οργανισμούς με την χρήση μεθόδων QSAR και τραπεζών δεδομένων (Βλέπε την επιλογή βιλιογραφίας στο τέλος των αναφορών) Νέες Τάσεις στον Έλεγχο της Τοξικότητας Χημικών Ουσιών Πρόσφατα ανακοινώθηκε ότι οι επιστήμονες του US Institutes of Health (NIH) και της Υπηρεσίας Προστασίας του Περιβάλλοντος (Environmental Protection Agency, EPA) θα αρχίσουν να εφαρμόζουν νέες τεχνικές δοκιμασιών τοξικότητας χημικών ουσιών με καλλιέργειες κυττάρων, αντικαθιστώντας τις πολυέξοδες έρευνες-δοκιμασίες σε πειραματόζωα (χρονοβόρα και ακριβές δοκιμές). Οι υπηρεσίες αυτές θα συνεργασθούν με τους επιστήμονες της ΕΕ για το πρόβλημα του ελέγχου των χημικών ουσιών της νέας νομοθεσίας REACH. Με τις δοκιμασίες in vitro εκτίθενται διάφορες σειρές κυττάρων του ανθρώπου (επιδερμικές, ηπατικές, κ.λπ) σε διάφορες συγκεντρώσεις χημικών ουσιών και για μικρό χρονικό διάστημα. Οι επιστήμονες ελέγχουν τις μεταβολές στα κύτταρα. Οι δοκιμασίες αυτές μπορούν να επιτευχθούν με αυτόματα μηχανήματα και σε μεγάλη κλίμακα και αργότερα μπορούν να γίνουν έλεγχοι με ηλεκτρονικούς υπολογιστές (EurActiv. Revolutionary techniques to speed up chemicaltesting , environment/revolutionary-techique. & US National Human Genome Research Institute (NHGRI). Memorandum of Understanding on High Throughput 103

11 Screening, Toxicity Pathway Profiling, and Biological Interpretation of Findings. Toxicity Testing Press Conference 14 February, 2008) Βιβλιογραφία 1. Commission of the European Community. Chemicals Control in the European Community. Royal Society of Chemistry, Cambridge, CEC. Harmonised Electronic Dataset. Official J EC, No 84, 36, Dearden JC, Calow P, Watts C. A predictable response? Chem Britain 30: , Konemann H. Fish toxicity test with mixtures of more than two chemicals: a proposal for a quantitative approach and experimental results.. Toxicol 19: , Landis WG, Yu M-H. Introduction to Environmental Toxicology. Impacts of Chemicals Upon Ecological Systems. Lewis Publishers, Boca Raton,FL, 1995, pp EPA. Report 560/ Guidelines for predicting ecological effects from chemicals. EPA, Cincinnati, OH, OECD. Draft guidance document for aquatic effects assessment. OECD, Paris, Blum DJW, Speece RE. Determining chemical toxicity to aquatic species. The use of QSARs and surrogate organisms. Environ Sci Technol 24: , Eπιλογή βιβλιογραφίας για την μεθοδολογία QSARs 1. Kier LB, Hall LH. Molecular Connectivity in Chemistry and Drug Research. Academic Press, New York, rd International Workshop on Quantitative Structure-Activity Relationships in Environmental Toxicology. Knoxville, TN, May

12 3. Cowgill UM, Williams LR, eds. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment. ASTM STP 1027, 12th volume, STM, Philadelphia, PA, Christensen ER, Chen CY. Modeling of combined effects of chemicals. Toxic Subst J, 11: 1-63, Kishino T, Kobyashi K. Studies of the mechanism of toxicity of chlorophenols found in fish through quantitative structure-activity relationships (QSARs). Water Res, 30: , Simkiss K. The application of controlled release and QSAR technology to sediment toxicity. Mar Bollut Bull, 31: 28-31, Pepin MP, Bohatier J, Grolliere CA. Comparison of six bioassays for assessing in vitro acute toxicity and structure-activity relationships (QSARs) for vinyl monomer, its main metabolites and derivatives. Sci Total Environ, 172: 79-92, Grindon C, Combes R, Cronin MT, et al. An integrated decision-tree testing strategy (QSAR) for skin sensitization with respect to the requirements of the EU REACH legislation. Altern Lab Anim, 35: , Zvinavashe E, van den Berg H, Soffers AE, et al. QSAR models for predicting in vivo aquatic toxicity of chlorinated alkanes to fish. Chem Res Toxicol, 2008 (Epub Jan.2008). 10. Benfenati E. Predicting toxicity through computers: a changing world. Chem Cent J 18:1-32, Patlewicz G, Aptula AO, Uriarte E, et al. An evaluation of selected global (Q)SARs/expert systems for the prediction of skin sensitization potential. SAR QSAR Environ Res 18: , Lu G, Wang C, Tang Z, Guo X. Joint toxicity of aromatic compounds to algae and QSAR study. Ecotoxicology, 16: ,