Μελέτη της επίδρασης της νιασίνης στη φαρμακολογική δράση της μετφορμίνης

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ Δ.Μ.Π.Σ. ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Μελέτη της επίδρασης της νιασίνης στη φαρμακολογική δράση της μετφορμίνης Νικιάννα N. Διαμαντή Βιολόγος Επιβλέπων καθηγητής Κυριάκος Η. Κυπραίος Καθηγητής Φαρμακολογίας Πάτρα 2016

2 UNIVERSITY OF PATRAS SCHOOL OF SCIENCE- DEPARTMENT OF CHEMISTRY M.Sc. MEDICINAL CHEMISTRY MASTER THESIS Study of the effect of niacin on the pharmacological action of metformin Nikianna N. Diamanti Biologist Thesis Supervisor Kyriakos E. Kypreos Professor of Pharmacology Patras

3 Η τριμελής επιτροπή Κυριάκος Κυπραίος (Επιβλέπων), Καθηγητής Φαρμακολογίας, Τμήματος Ιατρικής, Σχολής Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών Γεώργιος Παναγιωτακόπουλος (Μέλος), Επίκουρος Καθηγητής Φαρμακολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών Νικόλαος Τσοπάνογλου (Μέλος), Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακολογίας, Τμήματος Ιατρικής, Σχολής Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών Kyriakos Kypreos (Thesis Supervisor), Professor of Pharmacology, Pharmacology Department, University of Patras Medical School George Panayiotakopoulos (Member), Assistant Professor of Pharmacology, Pharmacology Department, University of Patras Medical School Nikolaos Tsopanoglou (Member), Associate Professor of Pharmacology, Pharmacology Department, University of Patras Medical School 3

4 Πρόλογος Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του τμήματος Ιατρικής του πανεπιστημίου Πατρών κατά το διάστημα στο πλαίσιο του Διατμηματικού Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Ιατρική Χημεία: σχεδιασμός και ανάπτυξη φαρμακευτικών προϊόντων». Ο σκοπός ήταν να διερευνηθεί η φαρμακολογική δράση που ασκεί η νιασίνη πάνω σε αυτή της μετφορμίνης σε πειραματικό μοντέλο μυών. Αρχικά θα ήθελα να θερμοευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Κυριάκο Κυπραίο για την ευκαιρία που μου παρέσχε να συνεργαστώ μαζί του και να εισέλθω σε ένα τόσο καλό επιστημονικό περιβάλλον όπως το εργαστήριό του. Εκτός αυτού, τον ευχαριστώ για την αμέριστη συμπαράσταση, κατανόηση και συγχωρητικότητα απέναντι σε αστοχίες μου κατά τη διάρκεια των πειραμάτων μου και της συγγραφής της παρούσας εργασίας. Επίσης ευχαριστώ τους καθηγητές κ.παναγιωτακόπουλο και κ. Τσοπάνογλου που δέχθηκαν να είναι μέλη της τριμελούς επιτροπής και για τις συμβουλές τους κατά τη διάρκεια της συγγραφής της παρούσας εργασίας. Δεν θα μπορούσα να παραλείψω την πολύτιμη βοήθεα της διδακτορικής φοιτήτριας του εργαστηρίου μας κ. Ευστρατίας Ξεπαπαδάκη για την τεχνική καθοδήγηση, την υπομονή, επιμονή και εμπιστοσύνη της στο πρόσωπο μου κάθε φορά που δίσταζα ή έκανα κάποιο λάθος. Με βοήθησε σε πολύ μεγάλο βαθμό όχι μόνο ως επιστήμων αλλά και ως άνθρωπος και αισθάνθηκα ιδιαίτερα τυχερή για την συνεργασία μας. Επίσης σημαντική ήταν και η βοήθεια της διδακτορικής φοιτήτριας κ. Ευαγγελίας Ζβίντζου κατά τη διάρκεια των πειραμάτων. Ακόμη ευχαριστώ πολύ την μεταδιδακτορική συνεργάτρια του εργαστηρίου μας κ. Κατερίνα Κωνσταντίνου για τις συμβουλές και την βοήθεια που έλαβα στα πρώτα μου βήματα στο εργαστήριο καθώς και για την υπομονή και τις πολύτιμες συμβουλές και παρατηρήσεις της πάνω στη συγγραφή της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας. Φυσικά ευχαριστώ και όλα τα υπολοιπα μέλη του εργαστηρίου με τα οποία επίσης συνεργάστηκα άψογα. Ακόμη θα ήθελα να ευχαριστήσω από την καρδιά μου την οικογένειά μου, τον Αναστάση και τους αδελφικούς μου φίλους Βασίλη, Δήμητρα και Χρήστο. 4

5 Περίληψη Η ευρεία αύξηση επιπολασμού των καρδιαγγειακών νοσημάτων, των δυσλιπιδαιμιών και του διαβήτη έχουν καταστήσει επιτακτική την ανάγκη εύρεσης πιο αποδοτικών φαρμακολογικών προσεγγίσεών τους. Για να γίνει όμως αυτό εφικτό, απαιτείται η διαλεύκανση των μηχανισμών δράσης των φαρμάκων που χρησιμοποιούνται μέχρι τώρα για την αντιμετώπιση των παραπάνω ασθενειών. Η μετφορμίνη χρησιμοποιείται κυρίως για την αντιμετώπιση του σακχαρώδους διαβήτη τύπου 2 καθώς έχει δειχθεί ότι η κύρια δράση της αφορά στην αναστολή της γλυκονεογένεσης στο ήπαρ. Η νιασίνη μέχρι πρότινος, χρησιμοποιούνταν ως το κατ εξοχήν φάρμακο για την αντιμετώπιση των δυσλιπιδαιμιών λόγω της ιδιότητάς της να αυξάνει τα επίπεδα της HDL-χοληστερόλης αν και προκαλεί συχνά δυσανεξία στη γλυκόζη. Σε προηγούμενες μελέτες στο εργαστήριό μας φάνηκε πως η φαρμακολογική δράση της μετφορμίνης αναστέλλεται απουσία της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι σε ποντίκια που ήταν γενετικώς μεταλλαγμένα ώστε να μην την εκφράζουν (apoa-i -/- ). Αυτό μας οδήγησε στο να διερευνήσουμε το αν η χρήση νιασίνης, που έχει την ιδιότητα να αυξάνει τα ποσοστά της HDL, θα μπορούσε να βελτιώσει ή να ενισχύσει την φαρμακολογική δράση της μετφορμίνης. Για να μελετηθεί η παραπάνω υπόθεση, έγιναν πειράματα σε θηλυκούς μυς C57BL/6 οι οποίοι έλαβαν για 22 εβδομάδες ειδική διαίτα πλούσια σε λιπαρά. Οι ομάδες χωρίσθηκαν ανάλογα με το φάρμακο που τους χορηγήθηκε μέσω της τροφής. Η πρώτη ομάδα αποτέλεσε την ομάδα ελέγχου, η δεύτερη την ομάδα της νιασίνης και η τρίτη την ομάδα συνδυασμού δηλαδή συγχορήγησης νιασίνης και μετφορμίνης. Όπως φάνηκε από τα αποτελέσματα των πειραμάτων που διεξήχθησαν στο πλάσμα και σε ιστούς των πειραματοζώων, η συγχορήγηση μετφορμίνης και νιασίνης φαίνεται να ευνοεί τη δράση της μετφορμίνης ενώ παράλληλα μειώνει τις παρενέργειες της νιασίνης. Περαιτέρω έρευνα απαιτείται προκειμένου να διαλευκανθεί ο μηχανισμός με τον οποίο αλληλεπιδρούν τα δύο αυτά φάρμακα και κυρίως προς όφελος των δράσεων της μετφορμίνης. 5

6 Abstract The widespread increase of cardiovascular diseases (CVDs), dyslipidemias and diabetes prevalence has set of primary priority to find pharmacological approaches for tackling with these diseases. To this end, further research towards unraveling the mechanisms of action of drugs used for their treatment. Metformin is mainly used to treat type 2 diabetes because it inhibits liver gluconeogenesis. Niacin on the other hand was used, until recently, as a first line medicine for the treatment of dyslipidemias due to its ability to increase the levels of HDL-cholesterol. A very important side effect of niacin is the impairement of the glycemic profile. Previous studies in our laboratory, have shown that the absence of apolipoprotein A-I, the main apolipoprotein of HDL, ablates the pharmacological action of metformin in mice. Towards the delineation of the mechanism underline the effects of HDL on metformin action, in the present study we investigated whether niacin, could result in improvement of the pharmacological action of metformin. (by increasing HDL-C levels) Our experiments were performed in female C57BL/6 mice which received western type diet for 22 weeks. Three animal groups were used. The first group (control) did not receive any drug. The second one received niacin and the third one received a combination of niacin and metformin. Assays were performed in blood plasma and tissues. The results showed that, coadministration of niacin and metformin reinforced the action of metformin while attenuated the adverse effects of niacin. However further research is needed towards the clarification of the pharmacological interaction of metformin and niacin in favor of metformin pharmacological action in diabetes. 6

7 Περιεχόμενα Η τριμελής επιτροπή... 3 Πρόλογος... 4 Περίληψη... 5 Abstract... 6 Περιεχόμενα... 7 Ευρετήριο συντμήσεων Εισαγωγή Το μεταβολικό σύνδρομο Παθογένεια και αντιμετώπιση του μεταβολικού συνδρόμου Μηχανισμοί ανάπτυξης της αθηρωματικής νόσου Λιποπρωτεΐνες Χυλομικρά Πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL) Ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (IDL) Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL) Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) Απολιποπρωτεΐνες Απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (apoa-i) Απολιποπρωτεΐνη Α-ΙΙ (apoa-ii) Απολιποπρωτεΐνη Α-ΙV (apoa-iv) Απολιποπρωτεΐνη Β (apob) Απολιποπρωτεΐνη C-I (apoc-i) Απολιποπρωτεΐνη C-II (apoc-ii) Απολιποπρωτεΐνη C-III (apoc-iii) Απολιποπρωτεΐνη J (apoj) Απολιποπρωτεΐνη Ε (apoe) Λιποπρωτεΐνη Lp(a) Διατροφικά λιπίδια

8 1.7 Μονοπάτια μεταβολισμού των λιποπρωτεϊνών Το μονοπάτι μεταβολισμού των χυλομικρών Το μονοπάτι καταβολισμού των VLDL σε IDL και LDL Το μονοπάτι των HDL σωματιδίων Οι λειτουργίες της HDL Η αντίστροφη μεταφορά της χοληστερόλης Η αντιοξειδωτική δράση της HDL Η αντιφλεγμονώδης δράση της HDL Ο ρόλος της HDL στην ομοιόσταση της γλυκόζης HDL: ποσότητα ή ποιότητα Διαβήτης και δυσλιπιδαιμίες H διαβητική δυλιπιδαιμία Υπερτριγλυκεριδιαιμία νηστείας Μεταγευματική υπερτριγλυκεριδιαιμία Χαμηλή HDL-χοληστερόλη Θεραπευτική αγωγή για τον διαβήτη τύπου Μετφορμίνη Αυξημένη απορρόφηση γλυκόζης από τους σκελετικούς μυς Μοριακοί στόχοι των αντιδιαβητικών επιδράσεων Νιασίνη Βασικοί μηχανισμοί με τους οποίους η νιασίνη μειώνει τα λιπίδια και τις λιποπρωτεΐνες που περιέχουν απολιποπρωτεΐνη Β Μηχανισμός δράσης της νιασίνης για ρύθμιση της λιπόλυσης των τριγλυκεριδίων στον λιπώση ιστό Αύξηση της apoα-ι και της HDL μέσω του μηχανισμού δράσης της νιασίνης Καινοτόμος μη σχετιζόμενη με τα λιπίδια δράση της νιασίνης που επηρεάζει την ανάπτυξη αγγειακών φλεγμονοδών και οξειδωτικών καταστάσεων που εμπλέκονται στην αθηρογένεση Σκοπός Μέθοδοι και Υλικά Πειραματόζωα - Χειρισμοί και πειραματικές διαδικασίες Λήψη αίματος από την ουραία φλέβα των πειραματόζωων Μέτρηση σωματικού βάρους μυών Μέτρησης ημερήσιας κατανάλωσης τρoφής των ποντικών Δοκιμασία Ανοχής Γλυκόζης Δοκιμασία Αντίστασης στην Ινσουλίνη Θυσίες και λήψη ιστών από τα πειραματόζωα

9 3.2 Αναλύσεις στο πλάσμα των πειραματοζώων Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων στο πλάσμα Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα Κλασματοποίηση λιποπρωτεϊνών του πλάσματος με υπερφυγοκέντρηση διαβαθμισμένης πυκνότητας Διαπίδυση στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Ανάλυση απολιποπρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Ανοσοαποτύπωση κατά Western (Western Βlot) Αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης Αντιοξειδωτικό δυναμικό της HDL Αναλύσεις στους ιστούς των πειραματοζώων Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων στον ήπατικό ιστό Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στον ηπατικό ιστό Προσδιορισμός αντίστασης στην ινσουλίνη στον υποκνημίδιο μυ Αποτελέσματα Μέτρηση κατανάλωσης τροφής, σωματικού βάρους, λιπιδίων και γλυκοζης Αναλύσεις στον ηπατικό ιστό Χαρακτηρισμός λιποπρωτεινικών κλασμάτων στην κυκλοφορία του αίματος Κατανομή ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Αναλύσεις κατά Western στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Λειτουργικότητα της HDL Αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης Αντιοξειδωτικό δυναμικό της HDL Προσδιορισμός της ανοχής στην γλυκόζη και της ευαισθησίας στην ινσουλίνη Προσδιορισμός αντίστασης στην ινσουλίνη στον υποκνημίδιο μυ Συζήτηση Βιβλιογραφία

10 Ευρετήριο συντμήσεων 4-ΑΑΡ 4-αμινοαντιπυρίνη ABCA1 A1 μεταφορέας της κασέτας που δεσμεύει την ATP (ATP-binding cassette transporter A1) ACAT2 Ισομορφή 2 της ακυλμεταφοράσης της Ακυλο-CoA χοληστερόλης (Acyl CoA cholesterol acyltransferase isoform-2) ADP Διφωσφορική αδενοσίνη (Adenosine diphosphate) AICAR 5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide AMP Μονοφωσφορική αδενοσίνη (Αdenosine monophosphate) AMPK Πρωτεϊνική κινάση που ενεργοποιείται από 5 -ΑΜP ApoA Απολιποπρωτεΐνη A ApoB Απολιποπρωτεΐνη B ApoC Απολιποπρωτεΐνη C ApoE Απολιποπρωτεΐνη Ε ApoH Απολιποπρωτεΐνη Η ApoJ Απολιποπρωτεΐνη J ApoM Απολιποπρωτεΐνη Μ APS Υπερθειικό αμμώνιο ATP Τριφωσφορική αδενοσίνη (Adenosine triphosphate) CCR2 Τύπος 2 του υποδοχέα C-C των χημοκινών (C-C Chemokine receptor type 2) CD36 Cluster of differentiation 36 CETP Πρωτεΐνη μεταφοράς των εστέρων χοληστερόλης (Cholesteryl ester transfer protein) CM Χυλομικρά CoA Aκέτυλο-συνένζυμο Α CREB-1 Πρωτεΐνη 1 που δεσμεύεται στο στοιχείο απόκρισης του camp (camp responsive element binding protein 1) CRP C-αντιδρώσα πρωτεΐνη CRTC2 Μεταγραφικός συνενεργοποιητής 2 που ρυθμίζεται από την CREB (CREB regulated transcription coactivator 2) DAP Φωσφορική διυδροξϋακετόνη ddh2o Δις-απεσταγμένο νερό DDP-4 Διπεπτιδική πεπτιδάση 4 (Dipeptidyl Peptidase 4) 10

11 DGAT2 Ο-ακυλομεταφοράση 2 της διακυλ-γλυκερόλης (Diacylglycerol O-Acyltransferase 2) DHR Διϋδροροδαμίνη 123 DTT Δυ-θειοθρεϊτόλη (Dithiothreitol) EDTA Αιθυλενο-διαμινο-τετρα-οξικό οξύ (Ethylene-diamino-tetra-acetic acid) enos Συνθετάση του οξειδίου του αζώτου ESPA Νατρική Ν-αιθυλο-Ν-(3-θειοπροπυλο)-m-ανισιδίνη FADH2 Φλαβινο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο (Flavin adenine dinucleotide) FBP1 Διφωσφατάση 1 της 1,6-Ρ φρουκτόζης (Fructose-1,6-bisphosphatase 1) FBS Εμβρυικός Βόειος Ορός (Fetal Bovine Serum) FFAs Ελεύθερα λιπαρά οξέα G-1-P 1-φωσφορική γλυκερόλη G6Pase Φωσφατάση της 6Ρ-γλυκόζης (Glucose 6-phosphatase) GK Kινάση Γλυκερολης GLP-1 Πεπτίδιο 1 τύπου γλυκαγόνου (Glucagon like peptide 1) GLUT-1 Μεταφορέας 1 της γλυκόζης (Glucose transporter 1) GPO Οξειδάση της φωσφορικής γλυκερόλης GPR Υποδοχέας που δεσμεύεται με G-πρωτεΐνες (G protein coupled receptor) HBS Ρυθμιστικός με HEPES φυσιολογικός ορός (Hepes Buffered Saline) HDL Λιποπρωτεΐνη υψηλής πυκνότητας (High density lipoprotein) hent Human Equilibrative Nucleotide Transporter HEPES Ν-2-υδροξυαιθυλο πιπεραζινο-ν -2 αιθανο θειικό οξύ (N-2-hydroxyethylpiperazine-N -2- ethanesulfonic acid) HL Ηπατική Λιπάση IDL Λιποπρωτεΐνη Ενδιάμεσης Πυκνότητας (Intermediate Density Lipoprotein) IRS-2 Υπόστρωμα 2 του υποδοχέα της ινσουλίνης (Insulin receptor substrate 2) KBr Βρωμιούχο κάλιο LCAT Λεκιθινο-Χοληστερολική Ακυλοτρανσφεράση (Lecithin-Cholesterol Acyltransferase) LDL Λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας (Low density lipoprotein) LDLr Υποδοχέας LDL LKB1 Ηπατική κινάση Β1 Lp(a) Λιποπρωτεΐνη a LpL Λιποπρωτεϊνική λιπάση 11

12 MATE Πολλαπλός μεταφορέας εξόδου φαρμάκων και τοξινών (Multidrug and Toxin Extrusion Transporter) MCP-1 Χημειοτακτικός παράγοντας 1 προσέλκυσης μονοκυττάρων (Monocyte chemoattractant protein-1) MI Έμφραγμα μυοκαρδίου (Myocardial infarction) MTTP Μικροσωμική πρωτεΐνη μεταφοράς τριγλυκεριδίων NADH Νικοτιναμιδο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο(Nicotinamide adenine dinucleotide) NEA Μη απαραίτητα αμινοξέα (Non-essential amino acids) NF-kβ Ο ενισχυτής της ελαφριάς αλυσίδας του κάπα πυρηνικού υποδοχέα των ενεργοποιημένων Β-κυττάρων (Νuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) NPC1-L1 Nieman-Pick C1 like 1 OCT Πρωτεΐνη δέσμευσης οκταμερών (Octamer-binding Protein) OCTN1 Πρωτότυπος τύπος 1 του μεταφορέα οργανικών κατιόντων (Organic Cation Transporter Novel type 1) PBS Φωσφορικό Ρυθμιστικό Διάλυμα Άλατος (Phosphate Buffer Saline) Pen-Strep Πενικιλλίνη / Στρεπτομυκήνη (Penicillin Streptomycin) Συνενεργοποιητής 1-άλφα του γ-υποδοχέα που ενεργοποιείται από τον πολλαπλασιαστή PGC-1α των υπεροξειδιοσωμάτων (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1- alpha) PKB Πρωτεϊνική Κινάση Β (Protein kinase B) PLTP Μεταφορική πρωτεΐνη των φωσφολιπιδίων (Phospholipid Transfer Protein) PMAT Μεμβρανικός μεταφορέας των μονοαμινών (Plasma Membrane Monoamine Transporter) POD Υπεροξειδάση PPARγ γ υποδοχέας που ενεργοποιείται από τον πολλαπλασιαστή των υπεροξειδιοσωμάτων PVDF membrane Μεμβράνη φθωριούχου πολυβινυλδενίου (Polyvinylidene fluoride) rpm Στροφές ανά λεπτό (Revolutions per minute) SDS Δωδέκυλοθειϊκό Νάτριο (Sodium Dodecyl Sulfate) SGLT2 Συμμεταφορέας 2 νατρίου/γλυκόζης (Sodium-glucose cotransporter 2) SLC22A 22Α διαλυτός μεταφορέας (Solute Carrier Family 22Α) SNP Πολυμορφισμός απλού νουκλεοτιδίου (Single nucleotide polymorphism) SRAI Υποδοχέας-εκκαθαριστής ΑΙ (Scavenger receptor AI) 12

13 SR-B1 Υποδοχέας Εκκαθαριστής Τάξης Β, Τύπου 1 (Scavenger Receptor, Class B, Type 1) SU Θειονυλουρεία (Sulfonylurea) TEMED N,N, N,N - Tetramethylethylenediamine TNFα Παράγοντας νέκρωσης όγκων α TZD Thiazolidinediones VLDL Λιποπρωτεΐνη Πολύ Χαμηλής Πυκνότητας (Very Low Density Lipoprotein) WAT Λευκός λιπώδης Ιστός (White Adipose Tissue) WTD Western Type Diet Η2Ο2 Ι3ΡR ΝΟ ΡΚΑ Υπεροξείδιο του υδρογόνου Υποδοχέας της 1,4,5-τριφωσφορικής ινοσιτόλης Μονοξείδιο του αζώτου Πρωτεϊνική κινάση Α Λέξεις κλειδιά Key words Απολιποπρωτεΐνη Α-Ι Apolipoprotein A-I Απολιποπρωτεΐνη Ε Apolipoprotein E Διαβήτης Diabetes Διαβήτης τύπου 2 Diabetes type 2 Δυσλιπιδαιμία Dyslipidemia Μεταβολικό σύνδρομο Metabolic syndrome Μετφορμίνη Metformin Νιασίνη Niacin Φαρμακολογική δράση Pharmacological action HDL-χοληστερόλη HDL-cholesterol 13

14 1. Εισαγωγή 1.1 Το μεταβολικό σύνδρομο Το μεταβολικό σύνδρομο είναι ένα πολυπαραγοντικό πρόβλημα υγείας που έχει έντονα αυξηθεί ως αποτέλεσμα του σύγχρονου τρόπου ζωής, ο οποίος χαρακτηρίζεται κυρίως από έλλειψη σωστών διατροφικων συνηθειών και φυσικής άσκησης. Οι παράγοντες που συμβάλλουν στην ανάπτυξη του μεταβολικού συνδρόμου είναι: η δυσλιπιδαιμία (αυξημένα ποσά τριγλυκεριδίων σε συνδυασμό με μειωμένα ποσά HDL χοληστερόλης), η αυξημένη αρτηριακή πίεση, η διαταραγμένη ανοχή στη γλυκόζη, η υπερινσουλιναιμία καθώς και η κεντρική παχυσαρκία 1. Η συχνότητα εμφάνισης του συνδρόμου φτάνει το 25% στους ενηλίκες εκ των οποίων το 78% είναι άντρες και το 74% γυναίκες 2. Το 2009 ορίστηκαν τα κριτήρια τρία εκ των οποίων πρέπει να πληρούνται για την διάγνωση του Μεταβολικού Συνδρόμου: αυξημένη περίμετρος μέσης (Ευρώπη: Άνδρες > 102cm / Γυναίκες > 88cm). τριγλυκερίδια 150mg/dl ή λήψη φαρμάκων για την αντιμετώπιση αυξημένων επιπέδων τριγλυκεριδίων. ελαττωμένα επίπεδα HDL (Άνδρες < 40mg/dl / Γυναίκες < 50mg/dl) ή λήψη φαρμάκων για την αντιμετώπιση ελαττωμένων επιπέδων HDL. συστολική Αρτηριακή Πίεση (ΣΑΠ) 130mmHg ή Διαστολική Αρτηριακή Πίεση (ΔΑΠ) 85mmHg ή λήψη φαρμάκων για την αντιμετώπιση αυξημένης ΣΑΠ ή ΔΑΠ. γλυκόζη νηστείας 100 mg/dl ή λήψη φαρμάκων για την αντιμετώπιση των αυξημένων επιπέδων γλυκόζης Παθογένεια και αντιμετώπιση του μεταβολικού συνδρόμου Ο πολυπαραγοντικός χαρακτήρας του μεταβολικού συνδρόμου δυσχεραίνει τον προσδιορισμό των αιτιών της εμφάνισής του, καθώς οι συνιστώσες που οδηγούν σε αυτό είναι συνδυασμός γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων. Κάποιες μελέτες εμφανίζουν την παχυσαρκία κεντρικού τύπου 4 8 σαν την βασική αιτία του μεταβολικού συνδρόμου ενώ άλλες ορίζουν σαν βασικό αίτιο την αντίσταση στην ινσουλίνη 9,10. Εκτός αυτών, άλλοι παράγοντες όπως είναι η έλλειψη φυσικής δραστηριότητας 5 8, το γήρας 11 και οι ορμονικές διαταραχές 12 φαίνεται επίσης να συμβάλλουν. 14

15 Η ινσουλίνη παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των επιπέδων της γλυκόζης στο αίμα. Συγκεκριμένα: διεγείρει την πρόσληψη της γλυκόζης από τα σκελετικά μυϊκά κύτταρα και τα λιποκύτταρα αναστέλλει την ηπατική παραγωγή της γλυκόζης διεγείρει την λιπογένεση στον λιπώδη ιστό, την σύνθεση γλυκογόνου στα σκελετικά μυϊκά κύτταρα, και την σύνθεση πρωτεϊνών στα ηπατικά κύτταρα αναστέλλει την γλυκογονόλυση, τη λιπόλυση και τον καταβολισμό των πρωτεϊνών. Όταν τα όργανα στόχοι (ήπαρ, σκελετικά μυϊκά κύτταρα και λιπώδης ιστός) αδυνατούν να ανταποκριθούν στα φυσιολογικά επίπεδα της ινσουλίνης στο πλάσμα, σημαίνει πως υπάρχει αντίσταση στην ινσουλίνη. Η κατάσταση αυτή προάγει την αντισταθμιστική αύξηση της παραγωγής της ινσουλίνης από τα β-κύτταρα του παγκρέατος οδηγώντας στην εμφάνιση της υπερινσουλιναιμίας 13. Αν και τα αίτια της αντίστασης στην ινσουλίνη δεν έχουν ακόμα εξακριβωθεί πλήρως, γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες όπως παχυσαρκία η και η έλλειψη φυσικής δραστηριότητας φαίνεται να συνεισφέρουν 13. Από την άλλη πλευρά, άλλοι ερευνητές υποστηρίζουν πως η παχυσαρκία κεντρικού τύπου είναι το βασικό αίτιο του μεταβολικού συνδρόμου. Η επιταχυνόμενη λιπολυτική δραστηριότητα που σχετίζεται με το σπλαχνικό λίπος, έχει ως αποτέλεσμα τόσο την αυξημένη παραγωγή ελεύθερων λιπαρών οξέων και λιποκινών όσο και την διαταραχή της δράσης της ινσουλίνης. Υποστηρίζεται ότι η αυξημένη πρόσληψη των ελεύθερων λιπαρών οξέων στους μύς και στο ήπαρ προκαλεί αυξημένη συγκέντρωση τριγλυκεριδίων με αποτέλεσμα να δυσχερένεται η μετάδοση του σήματος της ινσουλίνης και/ή για την δράση της στους ιστούς αυτούς. Η αυξημένη μεταφορά των ελεύθερων λιπαρών οξέων στο ήπαρ προάγει την έκκριση των πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (VLDL) και κατά συνέπεια αυξάνονται τα επίπεδα τριγλυκεριδίων (TG) στην κυκλοφορία του αίματος ενώ μειώνονται τα επίπεδα των λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας (HDL) ευνοώντας την εμφάνιση της δυσλιπιδαιμίας του μεταβολικού συνδρόμου 13. Επίσης τα λιποκύτταρα εκτός από ελεύθερα λιπαρά οξέα απελευθερώνουν και άλλα μόρια που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ομοιόστασης της γλυκόζης είτε μέσω σηματοδότησης (λιποκίνες) είτε επηρεάζωντας την δράση της ινσουλίνης (λεπτίνη, αδιπονεκτίνη, του παράγοντα α νέκρωσης όγκων α (TNF-a,) και ιντερλευκίνη 6 (IL-6) ) 13. Ακόμη άλλοι παράγοντες που φαίνεται να συμβάλλουν στην εμφάνιση του μεταβολικού συνδρόμου είναι γενετικές μεταλλάξεις στο μονοπάτι μεταβίβασης σημάτων για την ινσουλίνη, διάφορες διαταραχές του λιπώδους ιστού, έλλειψη φυσικής δραστηριότητας 5, μιτοχονδριακές δυσλειτουργίες, φυλετικές ποικιλομορφίες, το 15

16 γήρας, οι ορμονικές διαταραχές, προφλεγμονώδεις καταστάσεις καθώς και συγκεκριμένα φάρμακα 8,14, Μηχανισμοί ανάπτυξης της αθηρωματικής νόσου Η στεφανιαία νόσος είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου στις δυτικές κοινωνίες. Επηρεάζει τους άντρες και τις γυναίκες σχεδόν εξίσου και υπολογίζονται περίπου θάνατοι ετησίως στις ΗΠΑ μόνο 16. Η αθηροσκλήρυνση αποτελεί παράγοντα ανάπτυξης της στεφανιαίας νόσου και οφείλεται σε αλλαγές που προκαλούνται στον έσω χειτώνα των αρτηριών με αποτέλεσμα την δημιουργία ινώδους ιστού. Οι αλλαγές αυτές προκύπτουν από την αλληλεπίδραση των δομικών και μεταβολικών ιδιοτήτων του αρτηριακού τοιχώματος που εξαρτώνται από τη σύσταση του αίματος και την αιμοδυναμική κατάσταση του ατόμου. Η ανάπτυξη του ινώδους συνδετικού ιστού και η εναπόθεση αλάτων ασβεστίου στις αθηρωματικές πλάκες μπορεί να οδηγήσει σε σκλήρυνση του αρτηριακού τοιχώματος. Υπάρχουν πολλοί παράγοντες που συμβάλλουν στην εμφάνιση της αθηροσκλήρυνσης με τη δυσλιπιδαιμία να χαρακτηρίζεται ως η κυριότερη αιτία της καρδιαγγειακής νόσου 17,18. Μελέτες έχουν δείξει ότι αυξημένα ποσά LDL χοληστερόλης και μειωμένα ποσά HDL χοληστερόλης αποτελούν κίνδυνο ανάπτυξης καρδιαγγειακής νόσου 19. Ωστόσο εκτός από αυτή την γενική παρατήρηση, έμφαση δίνεται στην λειτουργικότητα της HDL. Η λειτουργικότητα των σωματιδίων της HDL, όπως αυτή καθορίζεται από την αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση της αλλά και την αποτελεσματικότητά της στην αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης, εξαρτάται από την πρωτεϊνική (απολιποπρωτεΐνες) και λιπιδική της σύσταση και κατά συνέπεια από τη δομή των σωματιδίων HDL. Μεταβολές στα επίπεδα των απολιποπρωτεϊνών έχει ως αποτέλεσμα την μεταβολή της λειτουργικότητας της HDL γεγονός που επηρεάζει τον κίνδυνο ανάπτυξης αθηροσκλήρυνσης. Αρκετά χρόνια πριν, προτάθηκε ότι οι απολιποπρωτεΐνες αποτελούν τη βάση της ετερογένειας των σωματιδίων της HDL 20. Προκειμένου να προσδιοριστεί ο ρόλος των απολιποπρωτεϊνών στη λειτουργικότητα της HDL, έγιναν πολλές μελέτες μία εκ των οποίων έδειξε πως η αναλογία των επιπέδων της apob και apoa-i αποτελεί έναν πολύ καλύτερο προγνωστικό δείκτη για την εμφάνιση καρδιαγγειακών νοσημάτων, από ότι η αυτή καθαυτή μέτρηση των επιπέδων γενικά HDL-χοληστερόλης (HDL- C 21 ). Σε άλλη μελέτη 22, ασυμπτωματικοί ασθενείς οι οποίοι υπέστησαν το πρώτο τους έμφραγμα του μυοκαρδίου (MI) σε ηλικία μικρότερη των 35 ετών, παρουσίασαν διαφορές στην πρωτεϊνική δομή και τη λειτουργικότητα της HDL σε σχέση με τους υπόλοιπους ασθενείς καθώς και σε σχέση με τα υγιή άτομα. Συγκεκριμένα φάνηκε ότι, η μείωση του λόγου apoa-i/apoc-iii και apoa- 16

17 I/apoE στο μόριο της HDL, συσχετίστηκε με προαθηρογενετικές αλλαγές στην κατανομή των υποπληθυσμών της HDL καθώς και με μειωμένο αντιοξειδωτικό δυναμικό της HDL. Έτσι φαίνεται πως αλλαγές στη λιποπρωτεϊνική σύσταση της HDL, οδηγούν στο σχηματισμό HDL σωματιδίων με διαφορετική βιολογική λειτουργικότητα. Για αυτόν τον λόγο, προτείνεται ότι ο προσδιορισμός των παραπάνω λόγων στο πλαίσιο εξέτασης ρουτίνας, θα μπορούσε να αποδώσει πιο σαφείς πληροφορίες για την λειτουργικότητα της HDL 23. Κατά την έναρξη δημιουργίας πρόδρομων αθηρωματικών καταστάσεων όπως αυτές που προκαλούνται από τη δυσλιπιδαιμία, μονοκύτταρα δεσμεύονται σε μόρια προσκόλλησης στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στη συνέχεια μεταναστεύουν στον υποενδοθηλιακό χώρο, όπου μια προφλεγμωνώδης διέγερση επάγει τη διαφορροποίηση των κυττάρων αυτών σε μακροφάγα 24. Η οξειδωμένη LDL 25 και ένας χημειοτακτικός παράγοντας προσέλκυσης των μονοκυττάρων, ο χημειοτακτικός παράγοντας 1 προσέλκυσης μονοκυττάρων (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1) 26 ο οποίος δεσμεύεται στον MCP-1 υποδοχέα, τον τύπος 2 του υποδοχέα C-C των χημοκινών (C-C chemokine receptor type 2, CCR2), είναι αυτά που υποκινούν την επιστράτευση και μετανάστευση των μονοκυττάρων. Αυτές οι πρωτεΐνες εκφράζονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα λεία μυϊκά κύτταρα και τα μονοκύτταρα/μακροφάγα 27,28. Τα μονοκύτταρα, με τη βοήθεια του υποδοχέα-εκκαθαριστή ΑΙ (SRAI), SRAII, και CD36 28,29, δεσμεύουν με εστέρες χοληστερόλης, οι οποίοι ύστερα αποδεσμεύονται και εναποτίθενται στη θέση του τραύματος οπότε έτσι συνεισφέρουν στην εξέλιξη της αθηροσκληρωτικής πλάκας 30. Στην αρχή δημιουργείται ένα τραύμα από τα μακροφάγα το οποίο ονομάζεται λιπώδης γράμμωση και είναι αντιστρέψιμο 30,31. Η αύξηση των τραυμάτων ίσως οφείλεται στην επιστράτευση επιπλέον μονοκυττάρων και Τ-κυττάρων και στη μετανάστευσή τους μέσα στην εσωτερική κυτταρική στοιβάδα. Τα άωρα κύτταρα αίματος όπως επίσης και τα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα στέλνουν μηνύματα τα οποία υποκινούν την μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων από το μέσο στην εσωτερική στοιβάδα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα η εσωτερική στοιβάδα να διεγείρεται και να συνθέτει συστατικά της μεσοκυττάριας ουσίας όπως το κολλαγόνο και οι πρωτεογλυκάνες 30. Όσο η ανάπτυξη των τραυμάτων προοδεύει, μονοκύτταρα/μακροφάγα τα οποία είναι φορτωμένα με εστέρες χοληστερόλης και λεία μυϊκά κύτταρα στην πλάκα, πεθαίνουν. Σε αυτό το στάδιο δημιουργείται νεκρωτικός πυρήνας επενδυμένος με κρυστάλλους χοληστερόλης, στάδιο το οποίο χαρακτηρίζει τις προχωρημένες αθηρωματικές νόσους 32. Λεία μυικά κύτταρα σχηματίζουν ένα ινώδες κάλυμμα μέσω του οποίου σταθεροποιούν την πλάκα και μαζί με συστατικά της εξωκυττάριας ύλης και περιοχές απασβέστωσης, καλύπτουν την επιφάνεια του 17

18 τραύματος. Το έμφραγμα του μυοκαρδίου, συνήθως συμβαίνει από τη ρήξη των ασταθών πλακών, οι οποίες είναι εμπλουτισμένες με γεμάτα από λιπίδια μακροφάγα και έχουν αδύναμα ινώδη καλύμματα, ή από ενδοπλακική αιμορραγία η οποία οδηγεί στην ανάπτυξη θρομβογενετικού γεγονότος το οποίο θα φράξει την αρτηρία 33,34. Θεωρείται ότι οι αθηρωματικές λιποπρωτεΐνες όπως οι LDL και τα υπολείμματα χυλομικρών, υποκινούν την αθηροσκλήρυνση και οι αντιαθηρωματικές λιποπρωτεΐνες όπως οι HDL προστατεύουν από την αθηροσκλήρυνση. Τις τελευταίες δεκαετίες, έχει αποδειχθεί ότι η HDL παίζει αθηροπροστατευτικό ρόλο στη μάχη ενάντια στην καρδιαγγειακή νόσο. Παλαιότερα πιστευόταν ότι η χαμηλή συγκέντρωση της HDL-C στο πλάσμα είναι ένας ισχυρός ανεξάρτητος παράγοντας πρόβλεψης της στεφανιαίας νόσου 35, ωστόσο πρόσφατες μελέτες δείχνουν πως όχι μόνο η ποσότητα της HDL-C, αλλά κυρίως η ποιότητά της 36 και άρα η λειτουργικότητά της, καθορίζουν την αθηροπροστατευτική δράση της. 1.3 Λιποπρωτεΐνες Οι λιποπρωτεΐνες είναι υδατοδιαλυτά σφαιρικά συμπλέγματα αποτελούμενα από λιπίδια (χοληστερόλη, τριγλυκερίδια, φωσφολιπίδια) και πρωτεΐνες (απολιποπρωτεΐνες Α, Β, C, E, J, M, Η και a). O πυρήνας των λιποπρωτεϊνών αποτελείται από εστεροποιημένη χοληστερόλη και τριγλυκερίδια. Περιβάλλεται από ελεύθερη χοληστερόλη και ένα στρώμα φωσφολιπιδίων με τα λιπόφιλα άκρα τους στραμμένα προς τον πυρήνα και τα υδρόφιλα προς το πλάσμα. Οι απολιποπρωτεΐνες βρίσκονται στο εξωτερικό περίβλημα των λιποπρωτεϊνών όπου προς τον πυρήνα αυτών, διαθέτουν ένα άκρο πλούσιο σε μη πολικά αμινοξέα ενώ στο άλλο άκρο το οποίο έρχεται σε επαφή με το υδατικό περιβάλλον είναι πλούσιο σε πολικά αμινοξέα (Εικόνα 1). Οι λιποπρωτεΐνες είναι υπεύθυνες για τη μεταφορά των λιπιδίων και την ανταλλαγή τους μεταξύ των ιστών. Συγκεκριμένα μεταφέρονται τριγλυκερίδια, χοληστερόλη φωσφολιπίδια και άλλα λιποδιαλυτά μόρια όπως βιταμίνες και κάποιες φαρμακευτικές ουσίες. Τα τριγλυκερίδια αποτελούν την κύρια πηγή ενέργειας του λιπώδους και μυϊκού ιστού, η χοληστερόλη δομικό συστατικό των κυτταρικών μεμβρανών καθώς επίσης χρησιμοποιείται για την βιοσύνθεση των Εικόνα 1 Γραφική αναπαράσταση της δομής και της σύστασης των λιποπρωτεϊνών στεροειδών ορμονών και χολικών αλάτων. Οι απολιποπρωτεΐνες δρουν σαν τροποποιητές της 18

19 δράσης των ενζύμων του πλάσματος ή σαν συνδέτες μεμβρανικών υποδοχέων των κυττάρων με αποτέλεσμα να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην μεταφορά και στον μεταβολισμό των λιπιδίων. Οι λιποπρωτεΐνες διαφέρουν μεταξύ τους ως προς το μέγεθος και την πυκνότητά τους, αναλόγως της σύστασής τους σε απολιποπρωτεΐνες και λιπίδια. Για την ακρίβεια, υπάρχουν πέντε γενικές κατηγορίες λιποπρωτεϊνών οι οποίες σύμφωνα με την πυκνότητα τους και ξεκινώντας από αυτές με την χαμηλότερη πυκνότητα, είναι τα χυλομικρά (CM), οι λιποπρωτεΐνες πολύ χαμηλής πυκνότητας (VLDL), οι λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας (IDL), οι λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (LDL) και οι λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας (HDL). Οι μεγαλύτερες σε μέγεθος είναι τα CM και οι VLDL, οι οποίες είναι πλούσιες σε τριγλυκερίδια. Οι μικρότερες σε μέγεθος όπως οι LDL και οι HDL είναι πλούσιες σε εστεροποιημένη χοληστερόλη Χυλομικρά Τα χυλομικρά είναι μεγαλομοριακά συμπλέγματα με πυκνότητα μικρότερη από 0,95 g/ml και περιέχουν 98-99,5% λιπίδια (η πλειοψηφία αυτών είναι τριγλυκερίδια ενώ σε μικρότερη ποσότητα είναι η χοληστερόλη και τα φωσφολιπίδια) και 0,5-2% πρωτεΐνες. Κύρια απολιποπρωτεΐνη χυλομικρών στον άνθρωπο είναι η apoβ-48 (48% apob-100), μια μεγάλη πρωτεΐνη μεγέθους 240kDa, που σχηματίζει ένα αμφίφυλο σφαιρικό εξωτερικό περίβλημα, η εξωτερική επιφάνεια του οποίου είναι υδρόφιλη. Άλλες απολιποπρωτεΐνες που συναντώνται είναι η apoe, η apoa-iv και η apoc-ii. Τα χυλομικρά συντίθενται στα επιθηλιακά κύτταρα του εντερικού σωλήνα και εκκρίνονται στην λεμφική κυκλοφορία, έτσι μεταφέρονται τα διατροφικά λιπίδια από το έντερο, στην συστηματική κυκλοφορία και από κει στους περιφερικούς ιστούς. Στην κυκλοφορία μεταβολίζονται μερικώς από τη λιποπρωτεϊνική λιπάση (LpL), που βρίσκεται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων των τριχοειδών και ακολούθως καταβολίζονται από την ηπατική λιπάση (HL) σε υπολείμματα χυλομικρών τα οποία προσλαμβάνουν apoe και εν συνεχεία απομακρύνονται από την κυκλοφορία μέσω των υποδοχέων της LDL (LDLr) Πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL) Οι πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες είναι μεγάλα σωμάτια με πυκνότητα μεταξύ 0,95-1,006 g/ml και περιέχουν 85-90% λιπίδια και 10-15% πρωτεΐνες. Το μέγεθός τους κυμαίνεται από Å. Η λιπιδική τους σύσταση περιλαμβάνει 45-65% τριγλυκερίδια, 15-20% φωσφολιπίδια και 20-30% χοληστερόλη (ελεύθερη και εστεροποιημένη). Οι απολιποπρωτεΐνες 19

20 που συναντώνται στις VLDL είναι οι apob-100 (με μοριακό βάρος 550kDa η οποία αναγνωρίζεται από τα κύτταρα-στόχους), apoe, apoc-i, apoc-ii και apoc-iii. Οι VLDL συντίθενται στο ήπαρ από όπου εκκρίνονται με σκοπό την διανομή λιπιδίων στους περιφερικούς ιστούς. Ως εκ τούτου η σύνθεση και η έκκρισή τους εξαρτώνται από τις ανάγκες των περιφερικών ιστών, για λιπίδια Ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (IDL) Από τον καταβολισμό των VLDL λιποπρωτεϊνών προκύπτουν οι λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας (IDL), οι οποίες αποτελούν πρόδρομες μορφές των LDL. Η LpL υδρολύει τα τριγλυκερίδια που υπάρχουν στα VLDL σωμάτια με αποτέλεσμα να προκύπτουν σωμάτια πλούσια σε εστέρες χοληστερόλης και κατ επέκταση μεγαλύτερης πυκνότητας. Συγκεκριμένα η πυκνότητά των IDL είναι μεταξύ 1,006-1,019 g/ml. Φυσιολογικά βρίσκονται σε πολύ χαμηλή συγκέντρωση και το μέγεθός τους κυμαίνεται στα Å. Βασικός ρόλος των IDL είναι είτε η μεταφορά λιπιδίων στο ήπαρ και σε άλλους περιφερικούς ιστούς για περαιτέρω επεξεργασία, είτε η μετατροπή τους σε LDL λιποπρωτεΐνες μέσω υδρόλυσης περισσότερων τριγλυκεριδίων Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL) Οι λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας προκύπτουν από τον καταβολισμό των IDL και αποτελούν τον κύριο φορέα χοληστερόλης στο αίμα. Η πυκνότητα τους είναι g/ml, περιέχουν 75% λιπίδια (κυρίως εστεροποιημένη χοληστερόλη και ελάχιστα τριγλυκερίδια) και 25% πρωτεΐνες και το μέγεθος τους κυμαίνεται από Å. Το σωμάτιο των LDL περιέχει ένα μοναδικό αντίγραφο της apob-100. Σε μικρότερο βαθμό απαντώνται οι απολιποπρωτεΐνες apoc-i, apoc-ii και apoc-iii. Βασικός ρόλος των LDL είναι η μεταφορά χοληστερόλης από το ήπαρ στα κύτταρα των περιφερικών ιστών για την εξυπηρέτηση των βιοσυνθετικών αναγκών τους καθώς επίσης και την σύνθεση στεροειδών ορμονών Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) Οι λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας (HDL) έχουν πυκνότητα 1,063-1,21 g/ml και το μέγεθος τους είναι Å 38. Αποτελούνται από 50% πρωτεΐνες και διαχωρίζονται σε διάφορους υποπληθυσμούς, ανάλογα με το λιπιδικό, πρωτεϊνικό τους περιεχόμενο και το στάδιο βιογένεσής τους 39. Υπάρχουν τα HDL πρόδρομα σωματίδια preβ-1, preβ-2 και preβ-3 που περιέχουν apoa-i σε συνδυασμό με τις 20

21 σφιγγομυελίνες και φωσφατιδυλοχολίνες, έχουν δισκοειδές σχήμα και χαρακτηρίζονται ως «ανώριμα σωματίδια HDL». Στα δισκοειδή σωματίδια, δρα το ένζυμο LCAT που εστεροποιεί την ελεύθερη χοληστερόλη, μετατρέποντάς τα σε σφαιρικά. Έτσι, σχηματίζονται τα ώριμα α-hdl σωματίδια, τα οποία διακρίνονται σε HDL2 και HDL3. Η ώριμη σφαιρική HDL περιέχει 45-55% πρωτεΐνες, 26-32% φωσφολιπίδια, 15-20% εστεροποιημένη χοληστερόλη, 3-5% ελεύθερη χοληστερόλη, και περίπου 5% τριγλυκερίδια. H κύρια πρωτεΐνη που συναντάται στις λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας είναι η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (apoa-i). Αυτή αποτελεί το πρώτο βήμα για τη βιοσύνθεση των λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας 38. Άλλες πρωτεΐνες που συναντώνται στην HDL είναι οι: apoa-ii, apoci, apocii, apociii και apoe. Κατά μέσο όρο η ανθρώπινη HDL, το 70% του βάρους της, περιέχει 70% apoa-i, το 25% apoα-ιι και 10% άλλες απολιποπρωτεΐνες Απολιποπρωτεΐνες Όπως αναφέρθηκε ήδη, βασικό συστατικό των λιποπρωτεϊνών, εκτός των λιπιδίων, είναι οι απολιποπρωτεΐνες. Οι κυριότερες κατηγορίες είναι οι A, B, C, E και a, καθώς και οι Μ, Η και η J. Το μέγεθός τους ποικίλει από 6kDa (apoc-i) έως και 500kDa (apob, apoα). Οι βασικές τους λειτουργίες είναι να δεσμεύουν λιπίδια, να τα μεταφέρουν διαμέσου της κυκλοφορίας και να αναγνωρίζουν ειδικούς υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης όπου δρουν ως ενεργοποιητές ή αναστολείς των ενζύμων που συμμετέχουν στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών Απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (apoa-i) Η apoa-i είναι πρωτεΐνη που αποτελείται από 223 αμινοξέα με μοριακό βάρος 28kDa, η οποία συντίθεται και εκκρίνεται από το ήπαρ και το έντερο. Αποτελεί δομικό συστατικό της HDL και κατέχει μεγάλο ρόλο στη βιοσύνθεση και στη λειτουργία της. Κατά την έκκρισή της, είναι ελεύθερη από λιπίδια και αλληλεπιδρά με τον διαμεμβρανικό A1 μεταφορέα της κασέτας που δεσμεύει την ATP (ATP-Binding Cassette A1, ABCA1), γεγονός που προωθεί την αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης και φωσφολιπιδίων από τα κύτταρα, στην apoa-i 41. Έτσι δημιουργείται ένα σύμπλοκο λιπιδίων με apoa-i (λιπιδιωμένη apoa-i), το οποίο αποτελεί το πρόδρομο σωματίδιο της HDL. Η λιπιδιωμένη apoa-i πυροδοτεί την ενεργοποίηση του ενζύμου Λεκιθινοχοληστερολική ακυλοτρανσφεράση (Lecithin cholesterol acyltransferase, LCAT) που είναι υπεύθυνο για την εστεροποίηση της χοληστερόλης στο μόριο της HDL. Επίσης αλληλεπιδρά με τον διαμεμβρανικό υποδοχέα εκκαθαριστή τάξης Β, τύπου 1 (Scavenger Receptor class B member 21

22 1, SR-B1), γεγονός που οδηγεί στην εκλεκτική μεταφορά εστέρων χοληστερόλης από την HDL στα κύτταρα 37,42. Άλλος ένας υποδοχέας της apoa-i είναι η εκτοπικά εκφρασμένη στην μεμβράνη των ηπατοκυττάρων β αλυσίδα της ΑΤΡ συνθάσης και συμμετέχει στην ηπατική ενδοκυττάρωση της HDL Απολιποπρωτεΐνη Α-ΙΙ (apoa-ii) Η απολιποπρωτεΐνη Α-ΙΙ έχει τη μορφή ομοδιμερούς όπου το κάθε μόριο αποτελείται από 77 αμινοξέα και συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικό δεσμό. Το μοριακό βάρος της κάθε πολυπεπτιδικής αλυσίδας είναι 8.7 kda 44. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν πως στα δισκοειδή σωματίδια της HDL, η apoa-ii προσαρμόζεται στο χώρο τρόπο τινά ως ζώνη, παρόμοια με την apoa-i και την apoe 45. Η apoa-ii διατηρεί σε υψηλά ποσοστά τα σωματίδια της HDL αναστέλλωντας την HL 46. Ωστόσο ο επακριβής ρόλος της apoa-ii στην HDL παραμένει υπό διερεύνηση Απολιποπρωτεΐνη Α-ΙV (apoa-iv) Η apoa-iv είναι γλυκοπρωτεΐνη η οποία συντίθεται στο έντερο. Φαίνεται πως η έκφρασή της στο ήπαρ των ποντικών, αυξάνει την έκκριση των τριγλυκεριδίων ενώ μειώνει το περιεχόμενο του ήπατος σε λιπίδια μέσω παραγωγής VLDL 47. Επίσης έχει φανεί ότι ενεργοποιεί και την LCAT 48. Ωστόσο χρειάζεται περεταίρω διερεύνηση του ρόλου της στην φυσιολογία της HDL Απολιποπρωτεΐνη Β (apob) H apob είναι η κυριότερη απολιποπρωτεΐνη των χυλομικρών, των VLDL, IDL, και LDL σωματιδίων και είναι αυτή που καθορίζει τον σχηματισμό των σωματιδίων αυτών. Στο πλάσμα υπάρχουν δύο ισομορφές της apob, η apob-48 και apob-100. H apob-48 παράγεται στο έντερο ενώ η apob-100 στο ήπαρ. Η apob-100 είναι η μεγαλύτερη και αποτελείται από 4563 αμινοξέα 49. H apob λειτουργεί ως σηματοδοτικό μόριο μέσω του οποίου γίνεται η σύνδεση των LDL σωματιδίων με τον υποδοχέα της LDL. Η apob-100 θεωρείται δείκτης κινδύνου για ανάπτυξη αθηροσκλήρυνσης καθώς οι υψηλές συγκεντρώσεις της apob έχουν συσχετιστεί με αντίστοιχα υψηλές συγκεντρώσεις των LDL σωματιδίων. Για αυτόν τον λόγο θεωρείται ότι οι συγκεντρώσεις της apob, αποτελούν δείκτη ανάπτυξης καρδιαγγειακής νόσου 50,51. 22

23 1.4.5 Απολιποπρωτεΐνη C-I (apoc-i) Η apoc-i αποτελείται από 55 αμινοξέα σε δομή φουρκέτας με μοριακό βάρος 6.6 kda 52. Η apoc-i σε φυσιολογικά επίπεδα ενεργοποιεί την LCAT, ενώ πειράματα σε ποντίκια έδειξαν ότι αυξημένα επίπεδα της apoc-i οδηγούν σε αναστολή της ενεργότητας της LpL, με αποτέλεσμα τα επίπεδα τριγλυκεριδίων του πλάσματος να είναι αυξημένα 53. Όπως και με την προηγούμενη απόλιποπρωτεΐνη, ο ρόλος της apoc-i στην φυσιολογία του μορίου της HDL δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως Απολιποπρωτεΐνη C-II (apoc-ii) H apoc-ii αποτελείται από 78 αμινοξέα και έχει μοριακό βάρος 8.5 kda 54. Σε φυσιολογικά επίπεδα, η apoc-ii ενεργοποιεί την LpL 55, ενώ υπερβολικά υψηλά επίπεδα apoc-ii οδηγούν στο αντίθετο αποτέλεσμα αναστέλλοντας την LpL 55. Ο ρόλος της στην φυσιολογία της HDL είναι επίσης άγνωστος ακόμα Απολιποπρωτεΐνη C-III (apoc-iii) H apoc-iii αποτελείται από 79 αμινοξέα και έχει μοριακό βάρος 8.7 kda 56. Υψηλά επίπεδα apoc-iii πιθανώς αναστέλλει την ενεργοποίηση της LpL από την ApoC-II 55. Πρόσφατα φάνηκε ότι η apoc-iii είναι ικανή να προάγει την de novo βιοσύνθεση της HDL με τη συμμετοχή του ABCA1 χωρίς όμως τη συμμετοχή και της apoa-i 57. Ωστόσο και αυτής της απολιποπρωτεΐνης παραμένει άγνωστος ο ρόλος στην φυσιολογία της HDL Απολιποπρωτεΐνη J (apoj) H apoj είναι ετεροδιμερής γλυκοπρωτεΐνη που αποτελείται από kda και τα δύο μόρια συνδέονται με δισουλφιδικό δεσμό 58. Ωστόσο αν και προς το παρόν δεν έχει αποδοθεί κάποιος ρόλος στην apoj για την λειτουργικότητα της HDL, έχει φανεί ότι συμμετέχει σε πολλές διαδικασίες όπως στην απόπτωση και στην απομάκρυνση κυτταρικών θραυσμάτων Απολιποπρωτεΐνη Ε (apoe) Η apoe είναι γλυκοπρωτεΐνη η οποία αποτελείται από 299 αμινοξέα, έχει μοριακό βάρος 34.5 kda και συντίθεται κυρίως στο ήπαρ αλλά και σε άλλους ιστούς όπως τον εγκέφαλο και στον λιπώδη ιστό 37,60. Η apoe είναι μόριο σύνδεσης για τον υποδοχέα apoe receptor 2 (apoer2), την LDLr-σχετιζόμενη πρωτεΐνη, τον υποδοχέα VLDL και άλλους λιποπρωτεϊνικούς υποδοχείς 61,62. 23

24 Ο ρόλος της πάνω στην λειτουργικότητα της HDL παραμένει σε διερεύνηση ωστόσο έχει δειχθεί ότι είναι ικανή να προάγει τη de novo βιογένεση των HDL-όμοιων σωματιδίων με τη συμμετοχή των ABCA1 και LCAT ανεξαρτήτως της apoa-i, ωστόσο ακόμα γίνεται προσπάθεια προσδιορισμού της συμμετοχής αυτών των όμοιων με την HDL σωματιδίων στην αθηροπροστασία 63. Επίσης σε in vitro μελέτες η apoe έχει φανεί να είναι συμπαράγοντας για την LCAT 48, ενώ προάγει επίσης και την μέσω ABCA1 εκροή της χοληστερόλης Λιποπρωτεΐνη Lp(a) Η λιποπρωτεΐνη a, Lp(a) προκύπτει από τη σύνδεση σωματίων LDL με την απολιποπρωτεΐνη a. Προς το παρόν δεν έχει προσδιοριστεί ο μηχανισμός καταβολισμού τους, αλλά σύμφωνα με μελέτες, συμμετέχει ο νεφρικός ιστός 65,66. Επίσης έχει φανεί πως όταν η Lp(a) ξεπερνά τα φυσιολογικά όρια, προάγει την αθηρωμάτωση Διατροφικά λιπίδια Τα περισσότερα λιπίδια προσλαμβάνονται με τη μορφή τριγλυκεριδίων και χοληστερόλης μέσω της διατροφής. Η πέψη των τριγλυκεριδίων ξεκινά από τον στόμαχο με τις γαστρικές λιπάσες. Όταν αποικοδομηθούν σε λιπαρά οξέα απορροφώνται από το εντερικό επιθήλιο. Στον αυλό του λεπτού εντέρου ενσωματώνονται σε μικύλια με τη βοήθεια των χολικών αλάτων. Τα χολικά άλατα είναι αμφιπαθή μόρια, παράγονται στο ήπαρ και εκκρίνονται μέσω της χοληδόχου κύστεως. Η διάταξη των τριγλυκεριδίων στην επιφάνεια των μικυλίων διευκολύνει την πρόσβαση των παγκρεατικών λιπασών, οι οποίες υδρολύουν τους εστερικούς δεσμούς τους. Στη συνέχεια με τη βοήθεια λιπασών, πέπτονται σε ελεύθερα λιπαρά οξέα και σε 2-μονοακυλογλυκερόλη και μεταφέρονται στα εντερικά κύτταρα. Εκεί τα τριγλυκερίδια ανασυντίθενται και εσωκλείονται σε λιποπρωτεϊνικά σωματίδια μεταφοράς, τα χυλομικρά. Η χοληστερόλη στους ανθρώπους προέρχεται, είτε από de novo σύνθεση είτε από τη διατροφή. Η de novo σύνθεση αποτελεί και την κυριότερη πηγή προέλευσης αν και διαφέρει από άνθρωπο σε άνθρωπο ανάλογα με τους γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες 68. Μόνο το 50% της προσλαμβανόμενης χοληστερόλης απορροφάται από το έντερο, ενώ το υπόλοιπο αποβάλλεται. Ομοίως με τα τριγλυκερίδια, η εξωγενής χοληστερόλη συνδέεται με τα μικύλια στον εντερικό αυλό. Απαραίτητη προϋπόθεση όμως για να συμβεί αυτό είναι να βρίσκεται σε μη εστεροποιημένη μορφή. Στη συνέχεια γίνεται η πρόσληψή της από τα κύτταρα του εντέρου, αλλά 24

25 ο μηχανισμός ακόμη δεν έχει προσδιοριστεί ακριβώς. Στα φαινόμενα αυτά συμμετέχει ένας ενεργητικός μεταφορέας, καθώς και η παθητική διάχυση και μεταφορά 69. Στην ενεργητική μεταφορά της χοληστερόλης διαμεσολαβούν ο μεταφορέας Niemann-Pick C1 like 1 (NPC1-L1) και οι πρωτεΐνες ABCG5 και ABCG8. Στο εσωτερικό, πλέον, των κυττάρων του εντέρου η χοληστερόλη μετατρέπεται σε εστέρες με τη βοήθεια της ισομορφής 2 της ακυλμεταφοράσης της Ακυλο-CoA χοληστερόλης (Acyl CoA cholesterol acyltransferase isoform-2, ACAT2) και με τη δομή αυτή μπορεί να εισέλθει στα νεοσυντιθέμενα χυλομικρά και να εκκριθεί στη λεμφική κυκλοφορία με τα υπόλοιπα λιπίδια 70 (Εικόνα 2). Στην περίπτωση που υπάρχει ανάγκη για ενέργεια από τους περιφερικούς ιστούς τότε χρησιμοποιούνται οι αποθήκες λιπιδίων (λευκός λιπώδης ιστός) μέσω τριών σταδίων. Αρχικά, τα λιποκύτταρα σηματοδοτούν την αποικοδόμηση των τριακυλογλυκερολών σε ελεύθερα λιπαρά οξέα και γλυκερόλη και έτσι μεταφέρονται στους ιστούς που τα έχουν ανάγκη. Στη συνέχεια, τα ελεύθερα λιπαρά οξέα μεταφέρονται στα μιτοχόνδρια όπου θα οξειδωθούν 71. Τέλος, τα λιπαρά οξέα καταβολίζονται σε μόρια του ακετυλο-συνενζύμου Α (CoA) και με αυτόν τον τρόπο εισέρχονται στον κύκλο του κιτρικού οξέος, παράγοντας ενέργεια με την μορφή της ATP. Σε περίοδο νηστείας εκκρίνονται οι ορμόνες επινεφρίνη και γλυκαγόνη, οι οποίες προάγουν τη Εικόνα 2 Ενεργητική μεταφορά της χοληστερόλης από τα μικύλια στο εντερικό κύτταρο και ο μηχανισμός απέκκρισής της με τη μορφή χυλομικρών 70 25

26 λιπόλυση, με αποτέλεσμα τα επίπεδα των ελεύθερων λιπαρών οξέων να αυξάνουν, ενώ αντιθέτως η ινσουλίνη δρα ανασταλτικά στο μονοπάτι της λιπόλυσης Μονοπάτια μεταβολισμού των λιποπρωτεϊνών Το μονοπάτι μεταβολισμού των χυλομικρών Τα χυλομικρά σχηματίζονται στο έντερο από τα διατροφικά λιπίδια, ώστε να μεταφερθούν από εκεί στους διάφορους ιστούς. Τα διατροφικά λίπη (λιπαρά οξέα, μονογλυκερίδια, λυσολεκιθίνη και ελεύθερη χοληστερόλη) μετατρέπονται σε τριγλυκερίδια, φωσφολιπίδια και εστεροποιημένη χοληστερόλη και συνδέονται με την apob-48 με την βοήθεια του ενζύμου μικροσωμικής πρωτεΐνης μεταφοράς τριγλυκεριδίων (microsomal triglycerides transfer protein, MTTP), με την apoe και την apoc-iι, σχηματίζοντας τα χυλομικρά 73. Αυτά εισέρχονται στο λεμφικό σύστημα, από εκεί, μέσω του θωρακικού πόρου, εισέρχονται στην κυκλοφορία. Η apoc-ii αποτελεί συνένζυμο για την LpL, η οποία υδρολύει τα τριγλυκερίδια των χυλομικρών στο ενδοθήλιο των τριχοειδών αγγείων 74, επιτρέποντας έτσι στα διάφορα όργανα να προσλάβουν διατροφικά λιπίδια. Τα προϊόντα της υδρόλυσης είναι τα υπολείμματα χυλομικρών, τα οποία έχουν χάσει το 90% των τριγλυκεριδίων. Από την υδρόλυση απελευθερώνονται λιπαρά οξέα και μονογλυκερίδια, τα οποία είτε χρησιμοποιούνται από διάφορους ιστούς ως ενέργεια, είτε εστεροποιούνται και αποθηκεύονται στον λευκό λιπώδη ιστό (white adipose tissue, WAT) ως τριγλυκερίδια 73. Τα υπολείμματα χυλομικρών απομακρύνονται από το ήπαρ μέσω των υποδοχέων που αναγνωρίζουν την apoe και καταβολίζονται περαιτέρω από την ΗL και την LpL Το μονοπάτι καταβολισμού των VLDL σε IDL και LDL Οι VLDL λιποπρωτεΐνες συντίθενται στο ήπαρ από τα τριγλυκερίδια που προέρχονται από τον μεταβολισμό των υδατανθρακών και της ελεύθερης χοληστερόλης. Ο ρόλος τους είναι η μεταφορά των τριγλυκεριδίων από το ήπαρ στους περιφερικούς ιστούς και κυρίως στο λιπώδη και μυϊκό και η μεταφορά της χοληστερόλης μέσω των LDL σωματιδίων που σχηματίζονται στη συνέχεια 75. Αρχικά, η ΜΤΤΡ μεταφέρει ηπατικά τριγλυκερίδια στην νεοσυντιθέμενη apob-100, η οποία αποτελεί το κύριο πρωτεϊνικό συστατικό των VLDL. Έπειτα, προσλαμβάνονται apoe και apoc- ΙΙ, καθώς και χοληστερόλη και εστέρες χοληστερόλης. Ομοίως με τον μηχανισμό υδρόλυσης των χυλομικρών, οι VLDL έρχονται σε επαφή με το τοίχωμα των τριχοειδών, ενεργοποιούν την LpL 26

27 μέσω της apoc-ιι και αυτή υδρολύει τα τριγλυκερίδια, απελευθερώνοντας ελεύθερα λιπαρά οξέα. Αυτά προσλαμβάνονται από τον λιπώδη ή τον μυϊκό ιστό, και χρησιμοποιούνται είτε για καύσεις είτε για αποθήκευση. Τα υπολείμματα των VLDL που προκύπτουν από την υδρόλυσή τους, είναι οι IDL 76. Οι IDL στην συνέχεια, είτε καταβολίζονται περαιτέρω με την βοήθεια της HL σε LDL, είτε απομακρύνονται από την κυκλοφορία στο ήπαρ (Εικόνα 3). Εικόνα 3 Σχηματική αναπαράσταση του μεταβολισμού των VLDL, IDL και LDL (TGs: Τριγλυκερίδια, CE: Εστεροποιημένη χοληστερόλη, Β-100: apob-100, E: apo-e, C-II: apoc-ii) Το μονοπάτι των HDL σωματιδίων Αρχικά εκκρίνονται από το ήπαρ και το έντερο οι μη λιπιδιωμένες apoa-i και apoa-ii, αυτές ενώνονται με τις υπάρχουσες λιποπρωτεΐνες ή με αυτές που υφίστανται υδρόλυση και δεσμεύουν φωσφολιπίδια και χοληστερόλη που εκρέουν από τα κύτταρα μέσω των υποδοχέων ABCA 77,78. Με τον τρόπο αυτό σχηματίζονται HDL πρόδρομα σωματίδια (preβ-1 HDL) που περιέχουν apoa- I σε συνδυασμό με τις σφιγγομυελίνες και τις φωσφατιδυλοχολίνες. Αυτά στην συνέχεια, μέσω μοριακών διαδικασιών που δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως, μετατρέπονται σε preβ-2 HDL και Εικόνα 4 Σχηματική αναπαράσταση του μεταβολισμού της HDL (PL-Φωσφολιπίδια, FC-Ελεύθερη) preβ-3 HDL σωματίδια, με δισκοειδές σχήμα 79,80. Στην δισκοειδή HDL δρα το ένζυμο LCAT που εστεροποιεί την ελεύθερη χοληστερόλη, η οποία εισέρχεται στον πυρήνα των δισκοειδών 27

28 σωματιδίων, προκειμένου να τα μετατρέψει σε σφαιρικά. Έτσι, σχηματίζονται τα ώριμα α-hdl σωματίδια, τα οποία διακρίνονται σε HDL2 και HDL3. Τα HDL3 μόρια συγκεντρώνουν εστεροποιημένη χοληστερόλη και μεταπίπτουν σε HDL2 μόρια που έχουν μεγαλύτερο μέγεθος. Αυτά ύστερα ανταλλάσουν τη χοληστερόλη με τριγλυκερίδια και φωσφολιπίδια μέσω της δράσης της πρωτεΐνης μεταφοράς των εστέρων χοληστερόλης (Cholesteryl Ester Transfer Protein, CETP) και της μεταφορικής πρωτεΐνης των φωσφολιπιδίων (Phospholipid Transfer Protein, PLTP), τα οποία υδρολύονται από την HL δίνοντας μικρότερα μόρια HDL 79. Οι μηχανισμοί μέσω των οποίων καταβολίζεται η HDL 79, είναι είτε με εκλεκτική απομάκρυνση των λιπιδίων από το σωμάτιο της HDL, μέσω του υποδοχέα SR-B1 είτε με αποικοδόμηση ολόκληρου του σωματιδίου της HDL στα κύτταρα του ήπατος, μέσω των SR-B1. Στην πρώτη περίπτωση, ο SR-B1 συνδέεται με την HDL μέσω των apoa-i και apoa-ii, προσλαμβάνει τους εστέρες χοληστερόλης και τους μεταφέρει ενδοκυττάρια για αποικοδόμηση. Η διεργασία αυτή, σε αντίθεση με τον δεύτερο μηχανισμό, πραγματοποιείται χωρίς να αποδομείται το σωματίδιο, το οποίο επιστρέφει στην κυκλοφορία για να ξεκινήσει ένας νέος κύκλος συλλογής λιπιδίων από τους ιστούς. Ένας άλλος μηχανισμός απομάκρυνσης της χοληστερόλης από τα ώριμα σωματίδια της HDL, είναι η αλληλεπίδραση της HDL με την CETP, με αποτέλεσμα την μείωση του μεγέθους τους και του λιπιδικού τους φορτίου 81. Εξαιτίας αυτής της αλληλεπίδρασης ανταλλάσσονται εστέρες χοληστερόλης της HDL με τριγλυκερίδια των χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (χυλομικρά, VLDL, LDL, IDL). Τα τρωκτικά όμως, δεν εκφράζουν την CETP διαφοροποιώντας έτσι την φυσιολογία τους ως προς τον μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών από εκείνη του ανθρώπου. Τα VLDL και LDL μεταφέρονται από την κυκλοφορία του αίματος στο ήπαρ, μέσω του LDLr. Η ενδοθηλιακή λιπάση και η HL, υδρολύουν τα τριγλυκερίδια της HDL σε ελεύθερα λιπαρά οξέα, τα οποία προσλαμβάνονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα ηπατοκύτταρα. Έτσι μειώνεται το μέγεθος και το λιπιδικό φορτίο των HDL σωματιδίων και δημιουργούνται νέα πρόδρομα σωματίδια HDL που μπορούν πλέον να συνεχίσουν να προσλαμβάνουν λιπίδια από τους ιστούς (Εικόνα 4). 1.8 Οι λειτουργίες της HDL Μέχρι πρόσφατα τα επίπεδα της HDL-χοληστερόλης στο πλάσμα, αποτελούσαν το κύριο κριτήριο κινδύνου εμφάνισης στεφανιαίας νόσου και αθηροπροστασίας. Ωστόσο η περεταίρω έρευνα σχετικά με την HDL υποδεικνύει πως, εκτός από την ποσότητα της χοληστερόλης, σπουδαίο ρόλο διαδραματίζει και η λειτουργικότητα της HDL. Όλο και περισσότερες μελέτες τα 28

29 τελευταία χρόνια εστιάζουν στις λειτουργίες της HDL και την συσχέτισή τους με την αθηροπροστασία, με την αντίστροφη μεταφορά της χοληστερόλης να είναι η πιο καλά τεκμηριωμένη 82,83. Άλλες επίσης σημαντικές ιδιότητες της HDL-χοληστερόλης είναι η de novo σύνθεση των χολικών οξέων 84, η άμεση ή έμμεση αντιοξειδωτική προστασία της LDL 85 87, η εξασθένιση της φλεγμονώδους απόκρισης, η ενεργοποίηση του αμυντικού συστήματος 88 και η μείωση της ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας 89. Επίσης διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην διατήρηση της ομοιόστασης των VLDL 57, διεγείρει την πρόσληψη γλυκόζης και την διέγερση των λιπαρών οξέων 90 καθώς επίσης συμβάλλει στην βελτίωση της λειτουργικότητας των β-κυττάρων σε ασθενείς με διαβήτη τύπου Η αντίστροφη μεταφορά της χοληστερόλης Σύμφωνα με μελέτες έχει δειχθεί ότι υπάρχει αντίστροφη συσχέτιση ανάμεσα στα επίπεδα της HDL-C και στον κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακής νόσου και αθηροσκλήρωσης 79. Αυτό οφείλεται στην ικανότητα της HDL να μεταφέρει την χοληστερόλη από τους περιφερικούς ιστούς στο ήπαρ για καταβολισμό, μια διεργασία που ονομάζεται αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης. Διακοπή της διεργασία αυτής, οδηγεί στην εναπόθεση χοληστερόλης στο αγγειακό τοίχωμα και έτσι προωθείται η ανάπτυξη της αθηρωματικής νόσου 94. Αρχικά ελεύθερη χοληστερόλη μεταφέρεται από τους περιφερικούς ιστούς στις πρόδρομες μορφές της HDL μέσω του ABCA1, στην συνέχεια η LCAT την εστεροποιεί, η CETP δρα συμμετέχωντας στην ανταλλαγή αυτών των εστέρων με τριγλυκερίδια των VLDL, IDL, LDL και χυλομικρών και τέλος η HDL-χοληστερόλη καταβολίζεται στο ήπαρ Η αντιοξειδωτική δράση της HDL Μία επιπλέον λειτουργία της HDL-χοληστερόλης είναι να αναστέλλει είτε άμεσα είτε έμεσα την οξείδωση της LDL. Η παρουσία οξειδωμένης LDL στο αρτηριακό τοίχωμα είναι ένας παράγοντας που συμβάλλει στη ανάπτυξη αθηρωματικών πλακών. Τα οξειδωμένα φωσφολιπιδία της LDL, διεγείρουν την παραγωγή κυτταροκινών και συμβάλουν στην προσκόλληση μονοπύρηνων στην επιφάνεια του ενδοθηλίου, οδηγώντας στην δημιουργία αθηρωματικής πλάκας 95. Συγκεκριμένα in vitro μελέτες έδειξαν ότι η παρουσία της apoa-i στην HDL, καθιστά την LDL ανθεκτική απέναντι στην οξείδωση που προκαλεί η λιποξυγενάση, ένα ένζυμο που συμμετέχει στην οξείδωση των λιπαρών οξέων. Για την ακρίβεια, η HDL και συγκεκριμένα η apoa-i απομακρύνει από την ανθρώπινη LDL, μόρια που είναι ευάλωτα στην οξέιδωση. Αυτό 29

30 έχει ως αποτέλεσμα, in vitro η LDL να καθίσταται ανθεκτική στην οξείδωση από τα κύτταρα του αρτηριακού τοιχώματος 87. Επιπλέον, η ΗDL περιέχει αντιοξειδωτικά μόρια που δεσμεύουν τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου αποτρέπωντας την οξείδωση της LDL. Πιο ειδικά, η παραοξονάση (ΡΟΝ), η οποία μεταφέρεται από την apoa-i, καταλύει τον καταβολισμό των οξειδωμένων φωσφολιπιδίων της LDL 96 και έτσι παρεμποδίζεται η δημιουργία αθηρωματικών πλακών Η αντιφλεγμονώδης δράση της HDL Μια επιπλέον συνεισφορά της HDL, είναι η προστασία που παρέχει έναντι της φλεγμονής, η οποία είναι ένα από τα σημαντικότερα στοιχεία της παθογένειας της αθηροσκλήρωσης. Η προσκόλληση των μονοκυττάρων στο αγγειακό επιθήλιο αποτελεί την έναρξη της αθηρωματικής βλάβης. Τα μόρια προσκόλλησης βρίσκονται σε μεγάλη συγκέντρωση στην αθηρωματική πλάκα. Η έκφρασή τους αυξάνεται από την οξειδωμένη LDL και από κυτταροκίνες, όπως η ιντερλευκίνη 1, η ιντερλευκίνη 6 και ο παράγοντας νέκρωσης όγκων TNFa 97. Η έκφραση των συγκεκριμένων μορίων προσκόλλησης των ενδοθηλιακών κυττάρων εξαρτάται από την ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων όπως του ενισχυτή της ελαφριάς αλυσίδας του κάπα πυρηνικού υποδοχέα των ενεργοποιημένων Β-κυττάρων (NF-kβ) 98. Ο NF-kβ ενεργοποιείται από ενεργές μορφές οξυγόνου, οι οποίες προέρχονται από οξειδωμένα LDL σωματίδια, ή σε απόκριση στα επίπεδα του TNFa 99 και παραμένει σε ενεργή μορφή παρουσία χαμηλών επιπέδων ΝΟ 100. Από τη στιγμή που τα μονοκύτταρα προσδένονται στα κυτταρικά μόρια προσκόλλησης στο αγγειακό επιθήλιο, δρομολογείται η είσοδός τους στον υποενδοθηλιακό χώρο με τη βοήθεια χημειοκινών, κυρίως της MCP Ο αντιφλεγμονώδης ρόλος της HDL οφείλεται στο γεγονός ότι αναστέλλει την έκφραση των μορίων κυτταρικής προσκόλλησης και της MCP-1. Εκτός αυτού, έχει δειχθεί σε in vitro μελέτες ότι η HDL παρεμποδίζει την προφλεγμονώδη δράση της C-αντιδρώσας πρωτεΐνης CRP 101 και αναστέλλει την έκφραση προσταγλανδινών από τα μονοκύτταρα στην αθηρωματική πλάκα 38. Ένα επιπλέον σημαντικό γεγονός είναι ότι, τόσο ο βαθμός ωρίμανσης όσο και η σύσταση της HDL σε φωσφολιπίδια και απολιποπρωτεΐνες επηρεάζουν την ικανότητα του λιποπρωτεϊνικού σωματιδίου να επιδρά στην έκφραση των κυτταρικών μορίων προσκόλλησης, με πιο αποτελεσματικά τα σωματίδια εκείνα της HDL που είναι σφαιρικά και περιέχουν apoa-ι, λινελαϊκό οξύ και φωσφολιπίδια

31 Αν και πολλές μελέτες έχουν επιστήσει την προσοχή τους στην apoa-i και την ώριμη HDL χοληστερόλη , δεν υπάρχει μεγάλη βιβλιογρφία πάνω στον ρόλο της ώριμης μέσω LCAT HDL-χοληστερόλης ως δυνητικό αντιφλεγμονώδες. Ωστόσο έχουν πραγματοποιηθεί πειράματα 107 σε Lcat / αρσενικά ποντίκια, στα οποία απουσίαζε η ώριμη HDL-χοληστερόλη, Συγκεκριμένα στην μελέτη αυτή έγινε σύγκριση της ανώριμης HDL-χοληστερόλης από ποντίκια Lcat / σε σχέση με την ανώριμη HDL-χοληστερόλη ποντικών Apoa1 / mice και την φυσιολογική HDLχοληστερόλη ποντικών αγρίου τύπου. Όπως φάνηκε, η απουσία LCAT αυξάνει την συστημική φλεγμονώδη απάντηση σε λιποπολυσακχαρίτες της E. coli in vivo, μειώνει την ικανότητα εξουδετέρωσης της HDL-χοληστερόλης απέναντι στην επίδραση των λιποπολυσακχαριτών και αυξάνει των αριθμό των μονοκυττάρων του αίματος. Έτσι φάνηκε ότι η ωρίμανση της HDL μέσω της LCAT παίζει σπουδαίο ρόλο στην εξουδετέρωση λιποπολυσακχαριτών στην κυκλοφορία του αίματος και στον καθορισμό του αριθμού και του φαινοτύπου των μονοκυττάρων και των μακροφάγων Παρουσία οιστρογόνων στην HDL Το ένζυμο LCAT, το οποίο είναι υπεύθυνο για την εστεροποίηση της χοληστερόλης και τη μεταφορά μεταξύ των λιποπρωτεϊνών, ρυθμίζει επίσης την εστεροποίηση και την μεταφορά της οιστραδιόλης 108,109. Έχει φανεί ότι η σχετιζόμενη με την HDL οιστραδιόλη αυξάνει την αθηροπροστατευτική δράση της HDL διεγείροντας τη δράση της συνθετάσης του οξειδίου του αζώτου (enos) και αυξάνοντας έτσι τη βιοδιαθεσιμότητα του NO Ρυθμιστική δράση στην κατανομή των απολιποπρωτεϊνών στις λιποπρωτεΐνες του πλάσματος Η HDL επίσης αποτελεί κεντρικό ρυθμιστή της κατανομής των απολιποπρωτεϊνών (πέρα από την apob) στις διάφορες λιποπρωτεΐνες του πλάσματος και κυρίως των VLDL, έτσι μπορεί να επηρεάζει τη δράση της LPL και ρυθμίζει τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων του πλάσματος Ο ρόλος της HDL στην ομοιόσταση της γλυκόζης H HDL εκτός από αθηροπροστατευτική δράση, έχει φανεί ότι συμβάλλει και στην ομοιόσταση της γλυκόζης του αίματος 23. Όπως έχει αναφερθεί παραπάνω, η apoa-i αποτελεί την κυριότερη απολιποπρωτεΐνη της HDL, καθώς παίζει σημαντικό ρόλο στην βιοσύνθεση και την λειτουργικότητά της 110. Πειράματα σε ποντίκια που δεν εξέφραζαν την apoa-i (apoa-i -/- ), έδειξαν ότι η απουσία της apoa-i-hdl, είχε ως αποτέλεσμα την μειωμένη αντίσταση στην γλυκόζη και μειωμένη ευαισθησία στην ινσουλίνη 111. Επιπλέον, τα αποτελέσματα στα ίδια ποντίκια, έδειξαν 31

32 πως η μειωμένη ανοχή στη γλυκόζη και η μειωμένη ευαισθησία στην ινσουλίνη, σχετίζονταν με αυξημένη εναπόθεση τριγλυκεριδίων στο ήπαρ 111. Σε ό,τι αφορά τον μοριακό μηχανισμό δράσης της apoa-i στην ομοιόσταση της γλυκόζης, έχει δειχθεί ότι η apoa-i εισερχόμενη σε C2C12 κύτταρα, έχει τη δυνατότητα να ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση AMPK επηρεάζοντας τον μεταβολισμό της γλυκόζης 112. Η ενεργοποίηση αυτή οδηγεί σε αύξηση της απορρόφησης της γλυκόζης από τα σκελετικά μυϊκά κύτταρα και σε μείωση της γλυκονεογένεσης στο ήπαρ. Με αυτόν τον τρόπο η apoa-i ρυθμίζει την ομοιόσταση της γλυκόζης και βελτιώνει την αντίσταση των περιφερικών ιστών στην ινσουλίνη. Για τον λόγο αυτό, η apoa-i θα μπορούσε ενδεχομένως να αποτελεί φαρμακευτικό στόχο για τη θεραπεία του διαβήτη τύπου 2 και του μεταβολικού συνδρόμου 112. Ένας άλλος ρόλος της HDL είναι η συμβολή της στην προστασία των β-κυττάρων. Οι Hao et all, έδειξαν πως η αυξημένη συγκέντρωση χοληστερόλης, ελαττώνει την λειτουργικότητα των β- κυττάρων οπότε και η έκκριση της ινσουλίνης από αυτά μειώνεται 113. Οπότε η απομάκρυνση των μεγάλων συγκεντρώσεων χοληστερόλης από τα κύτταρα αυτά, θα μπορούσε να βοηθήσει στην αποκατάσταση και διατήρηση της λειτουργικότητάς τους. Εφόσον οι υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL), έχουν την ιδιότητα να απομακρύνουν την χοληστερόλη, θα μπορούσαν να αποτελούν έναν τρόπο προστασίας και διατήρησης της φυσιολογικής λειτουργικότητας των β- κυττάρων. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι οι HDL αναστέλλουν την απόπτωση των β-κυττάρων και προάγουν την επιβίωσή τους Προς αυτήν την κατεύθυνση, χορήγηση των apoa-i και apoa- II είτε αυτούσιων είτε ως τμήματα των δισκοειδών ανασυνδυασμένων πληθυσμών της HDL (rhdl), αύξησαν δραματικά την ικανότητα έκκρισης ινσουλίνης των β-παγκρεατικών κυττάρων. Αυτό υποδεικνύει πως η αύξηση των επιπέδων της HDL, μέσω φαρμακολογικών παρεμβάσεων, θα μπορούσε να αυξήσει την εκκριτική ικανότητα των β-κυττάρων οπότε και να οδηγήσει σε καλύτερο γλυκαιμικό έλεγχο 117. Είναι προφανές ότι η ομοιόσταση της γλυκόζης εξαρτάται άμεσα και από την ίδια την λειτουργικότητα των β-κυττάρων. Τα β-κύτταρα σε κάποια άτομα, μετά από ένα παρατεταμένο διάστημα αντίστασης στην ινσουλίνη, ξεκινούν και υπολειτουργούν εκκρίνοντας λιγότερη ινσουλίνη, όμως, ο λόγος για τον οποίο συμβαίνει αυτό δεν έχει διαλευκανθεί πλήρως. Είναι γνωστό ότι, η λιποτοξικότητα λόγω αυξημένης συγκέντρωσης ελεύθερων λιπαρών οξέων στα β- κύτταρα, οδηγεί σε μειωμένη ικανότητα έκκρισης ινσουλίνης από αυτά και σε αυξημένο κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης 118. Είναι ωστόσο εντυπωσιακό ότι β-κύτταρα που εκτέθηκαν in vitro σε οξειδωμένη LDL, παρουσίασαν μειωμένη προ-ινσουλίνη, κάτι το οποίο αντιστράφηκε 32

33 παρουσία της HDL 115, υποδεικνύοντας ότι, η ρύθμιση των επιπέδων της HDL στα β-κύτταρα, θα μπορούσε να βελτιώσει τον γλυκαιμικό έλεγχο των ατόμων που πάσχουν από διαβήτη τύπου Η πρώτη έρευνα που απέδειξε πως θεραπείες που στηρίζονται στην HDL μπορούν να έχουν θετικό αποτέλεσμα στην λειτουργικότητα των β-κυττάρων, έγινε με χρήση ανασυνδιασμένης HDL (rhdl) 119. Συγκεκριμένα, rhdl χορηγήθηκε ενδοφλεβίως σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 2. Αυτό οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων HDL-χοληστερόλης του πλάσματος, μειωμένα επίπεδα γλυκόζης του πλάσματος καθώς και αυξημένα επίπεδα ινσουλίνης τέσσερεις ώρες μετά την έγχυση. Η λειτουργικότητα των β-κυττάρων βελτιώθηκε, αν και η ευαισθησία στην ινσουλίνη παρέμεινε ίδια. Αυτό υποδεικνύει έναν άμεσο συσχετισμό της αύξησης των επιπέδων της HDL με την μειωμένη γλυκόζη του αίματος. Αν και ο ακριβής μηχανισμός επίδρασης της HDL στα β- κύτταρα δεν έχει προσδιοριστεί πλήρως, σε βιοψίες σκελετικών μυϊκών κυττάρων φάνηκε πως μετά από έγχυση rhdl αυξήθηκε η ενεργοποίηση της AMPK 119. Επιπλέον, δημοσιευμένες μελέτες επιβεβαιώνουν την σημαντικότητα του ρόλου που διαδραματίζουν οι λιποπρωτεΐνες στην λειτουργικότητα των β-κυττάρων, με την HDL να κατέχει τον προστατευκό ρόλο. Ωστόσο δεν αρκεί μόνο η υψηλή ποσότητα, αλλά και η σύσταση της HDL αφού τα HDL σωματίδια είναι αρκετά διαφοροποιημένα μεταξύ τους 93. Η κυριότερη ανωμαλία που εντοπίζεται στην σύσταση της HDL των ατόμων που πάσχουν από διαβήτη τύπου 2 είναι η μεγάλη συγκέντρωση τριγλυκεριδίων στον πυρήνα των σωματιδίων και η απουσία του εστέρα της χοληστερόλης καθώς και άλλες μεταβολές όπως η γλυκοζυλίωση της apoa-i και apoa-ii 120. Οι αλλαγές αυτές, έχουν ως αποτέλεσμα η apoa-i ή η HDL ατόμων με διαβήτη τύπου 2 να παρουσιάζουν μειωμένη ικανότητα εκροής χοληστερόλης 121,122 και διαταραγμένη αντιοξειδωτική δράση 123. Επίσης, απομονωμένη HDL3 από ασθενείς με μεταβολικό σύνδρομο, είχε μειωμένη αντιαποπτωτική δράση σε κύτταρα του ενδοθηλίου 124. Εκτός από την εκροή χοληστερόλης, σημασία έχει και η πρόσληψη της χοληστερόλης από τα κύτταρα μέσω των ειδικών για κάθε λιποπρωτεΐνη υποδοχέων. Σε ποντίκια apoe -/- όπου τα επίπεδα χοληστερόλης του αίματος ήταν υψηλά, η χοληστερόλη των β-κυττάρων ήταν αυξημένη ενώ η λειτουργικότητά τους σημαντικά μειωμένη 125. Όπως αναφέρεται και παρακάτω, η σημασία της ποιότητας του μορίου της HDL, έρχεται να επιβεβαιώσει πως η ομοιόσταση της γλυκόζης δεν είναι αποτέλεσμα μόνο επίτευξης των επιθυμητών επιπέδων της HDL-χοληστερόλης, αλλά ένα σύνολο παραγόντων που την καθιστούν μόριο κλειδί στην αντιμετώπιση του μεταβολικού συνδρόμου και του διαβήτη τύπου 2. 33

34 1.9 HDL: ποσότητα ή ποιότητα Γενικά είναι αποδεκτό ότι η LDL-χοληστερόλη έχει αντίστροφη συσχέτιση με τον κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων, καθώς η ποσότητά της είναι ανάλογη του κινδύνου ενώ η ποσότητα της HDL-χοληστερόλης, αντιστρόφως ανάλογη 126. Τα αυξημένα επίπεδα της HDLχοληστερόλης στο πλάσμα έχουν συσχετιστεί, με τον πιο αργό ρυθμό σχηματισμού της αθηροσκληρωτικής βλάβης και με τη σταθεροποίηση των ασταθών αθηρωματικών πλακών. Έτσι πολλοί ερευνητές εστίασαν την προσοχή τους στην προσαρμογή της ποσότητας της HDLχοληστερόλης και LDL-χοληστερόλης με διάφορα φαρμακευτικά παρασκευάσματα, με σκοπό τον έλεγχο του κινδύνου εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες φανερώνουν ότι η συσχέτιση ποσότητας HDL-χοληστερόλης και κινδύνου εμφάνισης καρδιαγγειακής νόσου, δεν είναι τόσο απλή. Συγκεκριμένα, βρέθηκε ότι η αύξηση της ποσότητας της HDL μέσω των πολυμορφισμών απλών νουκλεοτιδίων (SNPs), που σχετίζονται με το μεταβολικό της μονοπάτι για παράδειγμα, δεν μείωσε τον κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων 127. Επίσης ενώ έχουν επιτευχθεί αυξημένα επίπεδα της HDL στο πλάσμα μέσω μειωμένου καταβολισμού της και συγκεκριμένα μέσω παρεμπόδισης της ροής της HDL από τους περιφερικούς ιστούς στο ήπαρ, αυτό δεν φαίνεται να λειτουργεί πάντα αθηροπροστατευτικά 128. Επιπλέον, η λειτουργικότητα και η κατανομή των διαφόρων υποπληθυσμών της HDL κατέχουν πολύ σημαντικό ρόλο στην προστασία από την αθηρωματική νόσο. Όπως έχει αναφερθεί παραπάνω, τα σωματίδια της HDL διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθος, την πυκνότητα και την πρωτεϊνική σύσταση σε υποπληθυσμούς. Τα σωματίδια των υποπληθυσμών αυτών διαφέρουν επίσης ως προς τα ένζυμα που μεταφέρουν και με τα οποία αλληλεπιδρούν οπότε και κατά συνέπεια ως προς τις δράσεις τους (π.χ. αντιφλεγμονώδης, αντιοξειδωτική δράση). Συγκεκριμένα έχει βρεθεί ότι στα ώριμα σωματίδια HDL3 (a-hdl) τα ένζυμα αυτά είναι ιδιαίτερα αυξημένα 129,130. Αυτά τα στοιχεία υποδεικνύουν ότι η λειτουργικότητα της HDL έγκειται στην κατανομή των υποπληθυσμών της. Πιστεύεται ότι αυτοί θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες του κίνδυνου εμφάνισης καρδιαγγειακής νόσου. Συνεπώς τα δεδομένα υποδεικνύουν πως ο θεραπευτικός στόχος για τις αθηρωματικές νόσους θα μπορούσε να είναι η «ποιότητα» της HDL έναντι της ποσότητάς της. 34

35 1.10 Διαβήτης και δυσλιπιδαιμίες Πολλοί ασθενείς με διαβήτη τύπου 2 πάσχουν και από δυσλιπιδαιμία δηλαδή από αυξημένα επίπεδα στο αίμα, τριγλυκεριδίων, LDL χοληστερόλης και χαμηλά επίπεδα HDL χοληστερόλης. Έχει φανεί πως ο μηχανισμός που οδηγεί στην ανάπτυξη δυσλιπιδαιμιών είναι άμεσα σχετιζόμενος με την ανάπτυξη αντίστασης στην ινσουλίνη 131. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την υπερπαραγωγή, από το ήπαρ, λιποπρωτεϊνών που είναι πλούσιες σε τριγλυκερίδια, μειωμένη κάθαρση των λιποπρωτεϊνών αυτών και σε κάποιες περιπτώσεις και με αλλαγμένο μεταγευματικό μεταβολισμό λιπιδίων. Η αιτία των χαμηλών επιπέδων της HDL και των αυξημένων επιπέδων της LDL είναι η αύξηση των τριγλυκεριδίων. Ωστόσο αν και αυτές οι δύο διαταραχές είναι συνδεδεμένες με την ανάπτυξη αθηροσκλήρυνσης, παραμένει άγνωστο το αν ένα μόνο μόριο είναι το κυρίως υπεύθυνο ή ο συνδυασμός των ανωμαλιών που αφορούν τα λιπίδια, για την ανάπτυξη της καρδιαγγειακής νόσου. Παρόλη την αβεβαιότητα των παραπάνω, η θεραπεία που ακολουθείται πια, είναι κατ εξοχήν η χρήση στατινών για την μειώση των επιπέδων LDL. Μέσα στην θεραπευτική αγωγή περιλαμβάνονται όχι μόνο η χρήση φαρμάκων αλλά και ο τρόπος ζωής και ο γλυκαιμικός έλεγχος. Στους περισσότερους ασθενείς που πάσχουν από διαβήτη οι στατίνες χρήζουν άμεσης πρόσληψης ως φάρμακα μείωσης των επιπέδων των λιπιδίων. Σε ασθενείς μεγάλου ρίσκου ανάπτυξης καρδιαγγειακών επεισοδίων, συστήνεται συνδυασμός χρήσης φαρμάκων προκειμένου να μειωθούν τα επίπεδα των LDL και των τριγλυκεριδίων αλλά και την αύξηση των επιπέδων της HDL. Πολλές μελέτες υποστηρίζουν πως η διάγνωση σακχαρώδους διαβήτη αποτελεί μια ισχυρή ένδειξη ρίσκου ανάπτυξης εμφράγματος του μυοκαρδίου σε σχέση με εκείνα τα άτομα που πάσχουν από στεφανιαία νόσο 132,133. Παρόλο που αυτό δεν επιβεβαιώνεται από όλες τις ερευνητικές ομάδες 134,135, δεν τίθεται αμφιβολία πως οι διαβητικοί ασθενείς αποτελούν ομάδα μεγάλου κινδύνου εμφάνισης επεισοδίων αθηροσκλήρυνσης 136. Για αρκετά χρόνια υπήρχε η πεποίθηση πως η υπεργλυκαιμία ήταν άμεσα συνδεδεμένη με την ανάπτυξη αθηροσκλήρωσης, ενώ πλέον σύμφωνα με νέα δεδομένα, η αθηροσκλήρυνση συνδέεται περισσότερο με την διαβητική δυσλιπιδαιμία ή/και με την υπέρταση παρά με την υπεργλυκαιμία αυτή καθ αυτή 137,138. Προς την ίδια κατεύθυνση, δείχνουν και μελέτες κατά τις οποίες ο αυστηρός γλυκαιμικός έλεγχος αποκλειστικά, δεν συνέβαλε σημαντικά στην μείωση των καρδιαγγειακών επεισοδίων ή στη θνησιμότητα από καρδιαγγειακή νόσο 139,140. Επίσης φαίνεται πως οι παράγοντες που προκαλούν μεταβολικό σύνδρομο είναι πολύ σημαντικοί τόσο για την πρόγνωση της καρδιαγγειακής νόσου όσο και ως πιθανοί στόχοι αντιμετώπισης της νόσου. Ένας από τους παράγοντες αυτούς, η 35

36 δυσλιπιδαιμία, κατέχει ρόλο κλειδί καθώς φαίνεται πως η στόχευση σε ανωμαλίες που αφορούν λιπίδια παρουσιάζει μεγάλο πλεονέκτημα H διαβητική δυλιπιδαιμία Ασθενείς με διαβήτη τύπου 2 παρουσιάζουν διάφορα λιπιδαιμικά προφίλ, κάτι το οποίο υποδεικνύει πως είναι πολλοί οι παράγοντες που επηρεάζουν τα επίπεδα των λιπιδίων του πλάσματος. Οι γενετικοί παράγοντες, ο τρόπος ζωής, συνυπάρχουσες ασθένειες, θεραπείες για άλλες ασθένειες και άλλοι παράγοντες, συμβάλλουν στα επίπεδα των λιπιδίων οπότε και στο λιπιδαιμικό προφίλ των ασθενών με διαβήτη. Πολλοί διαβητικοί ασθενείς τύπου 2, παρουσιάζουν έναν συνδυασμό δυσλιπιδαιμίας οπότε και υπερτριγλυκεριδιαιμίας, χαμηλά επίπεδα HDL και αυξημένα επίπεδα LDL, ενώ εντύπωση προκαλεί το γεγονός ότι η συνολική χοληστερόλη συνήθως είναι φυσιολογική ή αυξημένη. Τα επίπεδα των LDL είναι ελαφρώς αυξημένα και συνήθως δεν αποτελούν το κύριο χαρακτηριστικό κάποιας ανωμαλίας. Ωστόσο δεν είναι μόνο σημαντική η μη φυσιολογική συγκέντρωση, αλλά η αλλαγμένη σύνθεση των λιποπρωτεϊνών. Για την ακρίβεια, η σύνθεση της HDL και της LDL μπορεί να είναι τροποποιημένη Υπερτριγλυκεριδιαιμία νηστείας Oι μηχανισμοί που οδηγούν σε αυξημένα επίπεδα τριγλυκεριδίων νηστείας, δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως. Σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 2 είναι αυξημένη η ροή ελεύθερων λιπαρών οξέων και γλυκόζης στο ήπαρ. Η ενδοηπατική διαθεσιμότητα των ελεύθερων λιπαρών οξέων και της γλυκόζης, ρυθμίζει την έκκριση των VLDL 143. Ως γνωστόν, η ανθρώπινη apob100 συντίθεται με τρόπο τέτοιο που δεν παρουσιάζει ιδιαίτερες διαμορφώσεις 144,145. Όμως τελικά αυτή η πρωτεΐνη θα αποσυντεθεί. Ο ρυθμός αποσύνθεσης εξαρτάται από τη διαθεσιμότητα του υποστρώματος καθώς και πυρηνικούς υποδοχείς, τη λειτουργικότητα των υποδοχέων της LDL και την ινσουλίνη. Η apob που δεν αποσυντείθεται, πιθανώς εκκρίνεται στο πλάσμα με τη μορφή των VLDL, IDL ή LDL. Παρουσία μεγάλων συγκεντρώσεων ελεύθερων λιπαρών οξέων και τριγλυκεριδίων, κάτι το οποίο συμβαίνει στον διαβήτη τύπου 2, εκκρίνονται μεγάλα σε μέγεθος VLDL-1 146,147. Ωστόσο παραμένει άγνωστο το αν αυτά τα VLDL έχουν τον ίδιο μεταβολισμό όπως τα μικρότερα σε μέγεθος VLDL-2. Εκτός από τη διαθεσιμότητα του υποστρώματος, η έκκριση των VLDL ίσως να ρυθμίζεται και από άλλους παράγοντες όπως η ινσουλίνη η οποία παίζει σημαντικότατο ρόλο στη ρύθμιση του μεταβολισμού των λιπιδίων και καταστέλλει την ηπατική έκκριση των VLDL 148. Έτσι, η αντίσταση στην ισουλίνη είναι υπεύθυνη για την αυξημένη εκροή των ελεύθερων λιπαρών οξέων από το ήπαρ, αφού μέσω της μειωμένης 36

37 κατασταλτικής δράσης της στην ορμονοευαίσθητη λιπάση στον λιπώδη ιστό οδηγεί σε αυξημένη λιπόλυση, ενώ επίσης η αντίσταση αυτή ευθύνεται και για την μη καταστολή της έκκρισης των VLDL 148. Επιπλέον, μια φλεγμονώδης κατάσταση και χαμηλή συγκέντρωση αδιπονεκτίνης, καταστάσεις που χαρακτηρίζουν τον διαβήτη τύπου 2, έχουν ως αποτέλεσμα την αυξημένη παραγωγή VLDL συμβάλλοντας με αυτόν τον τρόπο στην υπερτριγλυκεριδιαιμία 149,150. Παρόλη την αυξημένη παραγωγή λιποπρωτεϊνών πλούσιων σε τριγλυκερίδια, η κύρια αιτία της υπερτριγλυκεριδιαιμίας στους διαβητικούς φαίνεται να είναι, ο διαταραγμένος καταβολισμός των VLDL. Σε έρευνες υποδεικνύεται πως η αδιπονεκτίνη παίζει ρόλο κλειδί στη διαδικασία αυτή Έτσι, η υπερτριγλυκεριδιαιμία νηστείας στους διαβητικούς, δεν είναι τόσο απλή αφού είναι αποτέλεσμα αυξημένης παραγωγής λιποπρωτεϊνών και μειωμένου καταβολισμού τους Μεταγευματική υπερτριγλυκεριδιαιμία Εκτός από την υπερτριγλυκεριδιαιμία νηστείας όπως αναφέρθηκε παραπάνω, χαρακτηριστικό των διαβητικών είναι επίσης και τα αυξημένα επίπεδα πλούσιων σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεϊνών και μεταγευματικά. Μελέτες έχουν δείξει πως αυτή η αύξηση σχετίζεται άμεσα με την αθηροσκλήρυνση Η αύξηση αυτή προκύπτει αθροιστικά τόσο από τις πλούσιες σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεΐνες που προέρχονται από το έντερο όσο και από το ήπαρ. Αξιοσημείωτο είναι πως η παραγωγή της apob48 είναι αυξημένη σε διαβητικούς ασθενείς τύπου 2 και σχετίζεται με τα επίπεδα της ινσουλίνης 156,157. Φυσιολογικά, η ινσουλίνη που εκκρίνεται μεταγευματικά καταστέλλει την ηπατική έκκριση των VLDL. Στους διαβητικούς ασθενείς τύπου 2, η apob100 συνεχίζει και παράγεται μεταγευματικά οπότε και τα VLDL συνεχίζουν να εκκρίνονται. Η παρουσία αυξημένων επιπέδων λιποπρωτεϊνών πλούσιων σε τριγλυκερίδια, ακόμα και μετά από αρκετή ώρα με το πέρας του γεύματος, οφείλεται στο γεγονός ότι υπάρχει ήδη απορύθμιση των ενδογενών και των εξωγενών μονοπατιών λιπιδίων καθώς οι λιποπρωτεΐνες που περιέχουν είτε apob100 είτε apoβ48 ανταγωνίζονται για κοινούς μηχανισμούς εκκάθαρσης. Αθροιστικά του γεγονότος αυτού, η μη επαναφορά των επιπέδων των τριγλυκεριδίων στο φυσιολογικό έχει ως αποτέλεσμα την συνεχή αύξηση των επιπέδων τριγλυκεριδίων νηστείας και μεταγευματικά Χαμηλή HDL-χοληστερόλη Αν και τα άτομα που έχουν υψηλότερα επίπεδα HDL χοληστερόλης είναι σε πιο ευνοϊκή θέση όσον αφορά την αθηροσκλήρυνση από ότι εκείνα τα ατομα που έχουν χαμηλότερη 159,160, αυτό δεν 37

38 συνεπάγεται ότι η οποιαδήποτε ποσοτική αύξηση της HDL θα έχει και επικοδομητικά αποτελέσματα. Οι διαβητικοί ασθενείς παρουσιάζουν χαμηλές συγκεντρώσεις HDL κάτι το οποίο έχει άμεσα συσχετιστεί με τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων καθώς υπάρχει η πεποίθηση ότι η υψηλή συγκέντρωση των πλούσιων σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεϊνών είναι η αιτία των χαμηλών συγκεντρώσεων της HDL. Συγκεκριμένα, οι μηχανισμοί ανταλλαγής μεταξύ των πλούσιων σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεϊνών και της HDL έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό μορίων HDL πλούσιων σε τριγλυκερίδια, τα οποία έχουν μικρό χρόνο ημιζωής. Αυτό συμβαίνει επειδή παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων λιπορωτεϊνών πλούσιων σε τριγλυκερίδια, γίνεται ανταλλαγή μέσω της CETP του εστέρα της HDL χοληστερόλης με τριγλυκερίδια, οπότε και τελικά τον σχηματισμό HDL χοληστερόλης πλούσιων σε τριγλυκερίδια. Επίσης, κινητικές μελέτες έδειξαν ότι στους διαβητικούς υπάρχει μεγαλύτερος καταβολισμός των μορίων της HDL που περιέχουν apoa-i σε σχέση με τα φυσιολογικά άτομα 161. Επιπλέον, αν και οι διαβητικοί ασθενείς δεν παρουσιάζουν απαραιτήτως υψηλές συγκεντρώσεις LDL χοληστερόλης, έχουν περισσότερα LDL σωματίδια από τα φυσιολογικά άτομα με το να επιβεβαιώνεται η άποψη ότι ο αριθμός των σωματιδίων LDL και όχι τόσο οι συγκεντρώσεις της LDL είναι εγκυρότερος δείκτης ρίσκου ανάπτυξης καρδιαγγειακής νόσου 162. Επίσης μελέτες έχουν δείξει πως τα μικρά σωματίδια υποβοηθούν περισσότερο την ανάπτυξη αθηροσκλήρυνσης από ότι τα φυσιολογικού μεγέθους καθώς έχουν μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής στο πλάσμα, δεν αλληλεπιδρούν αρκετά με τον υποδοχέα LDL και είναι πιο επιρρεπή σε οξείδωση 163,164. Επίσης, τα VLDL-1 σωματίδια (πλούσια σε τριγλυκερίδια) παράγονται περισσότερο στα διαβητικά άτομα και μεταβολίζονται σε μικρής πυκνότητας LDL, ενώ ο καταβολισμός των VLDL-2 σωματιδίων (με λιγότερα τριγλυκερίδια) παράγονται περισσότερο στα φυσιολογικά άτομα και προάγουν μέσω του καταβολισμού τους, φυσιολογικού μεγέθους LDL σωματιδίων 147. Ακόμη, οι λιποπρωτεΐνες που περιέχουν apob100 απολιπιδιώνονται σε μέτριου και τελικά μικρού μεγέθους LDL 165. Τα τελευταία στάδια του γεγονότος αυτού, στους διαβητικούς διαρκούν περισσότερο λόγω του ότι η μετρίας πυκνότητας LDL ίσως να μην αλληλεπιδρά τόσο καλά με τον υποδοχέα, όπως συμβαίνει φερειπείν κατά την γλυκοζυλίωση. Επιπλέον έχει φανεί ότι η μείωση των αυξημένων επιπέδων γλυκόζης του αίματος, βελτιώνει κατά κάποιο τρόπο την δυλιπιδαιμία. Αυτό υποδεικνύει πως η υπερτριγλυκεριδιαιμία χειροτερεύει παρουσία αυξημένης γλυκόζης χωρίς όμως αυτό να έχει διαλευκανθεί πλήρως για το πώς συμβαίνει. Ενδεχομένως η αυξημένη ροή γλυκόζης στο ήπαρ (συστατικό απαραίτητο για τη σύνθεση VLDL) να παίζει ρόλο. Επίσης η έκφραση της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης ρυθμίζεται από 38

39 την ινσουλίνη οπότε και αυτό ίσως εξηγεί τον χαμηλό καταβολισμό των τριγλυκεριδίων όταν υπάρχει χαμηλή αποτελεσματικότητα της χρήσης της ινσουλίνης 166. Ο ρόλος της διαβητικής δυσλιπιδαιμίας στην αθηροσκλήρυνση είναι σημαντικός αφού έχει φανεί ότι αυξημένος αριθμός λιποπρωτεϊνών με apob (VLDL ή LDL ή μικρής πυκνότητας LDL) προάγει τον σχηματισμό των αφρωδών κυττάρων οπότε και της αθηρογένεσης λόγω αυξημένης αλληλεπίδρασης των μικρής πυκνότητας LDL σωματιδίων με τον υποδοχέα SRB 164. Ο ρόλος της HDL είναι πολύ σημαντικός καθώς έχει την ικανότητα αντίστροφης μεταφοράς της χοληστερόλης, ωστόσο αυτό το χαρακτηριστικό δεν αποδίδεται γενικά 167,168 σε όλα τα σωματίδια της HDL αλλά σε εκείνα κυρίως που περιέχουν apoa-i 169. Ωστόσο αν και τα περισσότερα δείχνουν πως η αύξηση των τριγλυκεριδίων είναι ο κυριότερος λόγος σχηματισμού των μικρής πυκνότητας LDL σωματιδίων, κλινικά η μείωση των επιπέδων της LDL έχει φανεί σαφώς αποτελεσματικότερη της μείωσης των τριγλυκεριδίων 170. Για αυτό το λόγο, η φαρμακολογική θεραπεία που ακολουθείται έχει στόχο τα επίπεδα της LDL να είναι κάτω από 100 mg/dl. Θεραπεία χωρίς φάρμακα ακολουθείται προκειμένου να επέλθει μείωση του βάρους (συγκεκριμένα του λιπώδους ιστού) και επαναφορά του στα φυσιολογικά επίπεδα οπότε έτσι να αυξηθεί η ευαισθησία στην ινσουλίνη. Ο κυριότερος στόχος στην δυσλιπιδαιμία δεν είναι η μεμονωμένη πτώση των επιπέδων της γλυκόζης αυτή καθεαυτής αλλά η επίτευξη σωστού δείκτη μάζας σώματος 171,172. Όσον αφορά τον έλεγχο της υπογλυκαιμίας, αυτός επιτυγχάνεται μέσω χρήσης φαρμακευτικών ουσιών που στοχεύουν στην μείωση της αντίστασης στην ινσουλίνη όπως για παράδειγμα η πιογλυταζόνη η οποία βελτιώνει το λιπιδαιμικό προφίλ του ασθενούς ανεξαρτήτως της μείωσης των επιπέδων γλυκόζης

40 Θεραπευτική αγωγή για τον διαβήτη τύπου 2 Ο κύριος θεραπευτικός στόχος στον διαβήτη τύπου 2 παραμένει ο έλεγχος των επιπέδων της γλυκόζης ο οποίος επιτυγχάνεται όχι μονο ακολουθώντας μια φαρμακευτική αγωγή, αλλά αθροιστικά με αυτή λαμβάνονται υπόψιν και ο τρόπος ζωής του κάθε ατόμου, ο έλεγχος της πίεσης του αίματος καθώς και η παρουσία και άλλων ασθενειών όπως οι δυσλιπιδαιμίες στις οποίες η κύρια γραμμή αντιμετώπισης γίνεται, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, μέσω χρήσης των στατινών. Μελέτες δείχνουν πως η μείωση της υπεργλυκαιμίας έχει θετικά αποτελέσματα στην μείωση των μικροαγγειακών επιπλοκών 174,175. Η νοοτροπία και η στάση του ασθενούς, οι προσπάθειες θεραπείας καθώς και οικονομικοί παράγοντες όπως τα ασφαλιστικά ταμεία, λαμβάνονται υπόψιν για την καλύτερη επιλογή της φαρμακευτικής αγωγής που θα ακολουθήσει ένας ασθενής. Ο κυριότερος στόχος όλων των θεραπειών είναι το ποσοστό της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης (HbA1c) να είναι κάτω από 7% 176. Στον Πίνακας 1 που ακολουθεί, συνοψίζονται όλες οι τελευταίες οδηγίες από το 2015 που ακολουθούνται από τις Η.Π.Α. και την Ευρώπη για την χορήγηση της κατάλληλης φαρμακευτικής αγωγής είτε από του στόματος είτε ενέσιμης, ή και συνδυασμού των δύο τρόπων για την καλύτερη αντιμετώπιση της υπεργλυκαιμίας στον διαβήτη τύπου 2. Πίνακας 1 Αλγόριθμος θεραπείας διαβήτη τύπου SU: Σουλφονυλουρίες, TZD: Θειαζολιδινεδιόνες (γλυταζόνες), DPP-4-i: Αναστολείς διπεπτιδικής πεπτιδάσης 4, SGLT2-i: αναστολείς του υπότυπου 2 του συμμεταφορέα νατρίου και γλυκόζης, GLP- 1RA: Αγωνιστές του υποδοχέα του παρόμοιου της γλυκαγόνης πεπτιδίου 1 40

41 1.11 Μετφορμίνη Η παρουσία του διαβήτη τύπου 2 έχει λάβει επιδημικές διαστάσεις παγκοσμίως και προάγει την πυθανότητα ανάπτυξης καρδιαγγειακών παθήσεων και τη θνησιμότητα σε νεαρές ηλικίες. Αυτό καθιστά τόσο την πρόληψη όσο και την αντιμετώπιση του διαβήτη, πρωτεύουσας σημασίας. Η μετφορμίνη (1,1-δυμεθυλδιγουανίδη) είναι παράγωγο της διιγουανίδης και το 1920 πρώτη φορά ανακαλύφθηκε σε εκχυλίσματα του φυτού Gallega officinalis. Τα εκχυλίσματα αυτά είχαν χρησιμοποιηθεί για αιώνες στη Gallega officinalis θεραπεία του σακχαρώδους διαβήτη. Το 1957 χρησιμοποιήθηκε στην Ευρώπη επισήμως ως φάρμακο για την μείωση της γλυκόζης του αίματος ενώ το από το 1995 στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής 177. Ωστόσο η χρήσης της μετφορμίνης έχει διευρυνθεί και σε άλλες περιπτώσεις όπως τον διαβήτη κυήσεως, το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών, το μεταβολικό σύνδρομο καθώς και την πρόληψη του διαβήτη 178. Οι κυριότερες δράσεις της μετφορμίνης αφορούν στη μείωση των επιπέδων γλυκόζης στο αίμα και η αύξηση της ευαισθησίας των κυττάρων στην ινσουλίνη 179. Επιπλέον φαίνεται πως η μετφορμίνη έχει και άλλες δράσεις όπως μείωση πρόσληψης φαγητού 180 και βάρους 179, επηρεάζει θετικά πολλαπλούς δείκτες ανάπτυξης καρδιαγγειακής νόσου συμπεριλαμβανομένων του λιπιδαιμικού προφίλ 179,181 και του λιπώδους ήπατος 182, ρυθμίζει διάφορους δείκτες φλεγμονής 183,184 και φαίνεται να μειώνει το ρίσκο ανάπτυξης καρκίνου 185. Ωστόσο πολλά αποτελέσματα ερευνών δεν είναι άνευ αμφιβολίας, καθώς αν και άρθρα ανασκόπησης υποδεικνύουν μια γενικευμένη μείωση ρίσκου ανάπτυξης καρδιαγγειακών ασθένειών αλλά και της θνησιμότητας με θεραπεία μετφορμίνης 186, δύο μεταναλύσεις δεν αποδίδουν εξ ολοκλήρου τα οφέλη σε αυτήν 187,188. Η ανθυπεργλυκαιμική δράση των διγουανιδών οφείλεται κυρίως σε μειωμένη παραγωγή γλυκόζης λόγω καταστολής της ηπατικής γλυκονεογένεσης 189 και πιθανώς σε μικρότερο βαθμό, σε αυξημένη, διαμεσολαβούμενη από την ινσουλίνη, πρόσληψη γλυκόζης από τους σκελετικούς μύς 190. Τόσο η φαρμακοκινητική του φαρμάκου αλλά και η απάντηση σε αυτό, υποδεικνύουν ένα ευρύ φάσμα ατομικών διακυμάνσεων. Η πολικότητα της μετφορμίνης την καθιστά εξαρτώμενη από τους μεταφορείς που υπάρχουν στην μεμβράνη για κυτταρική πρόσληψη. Οι κύριοι μεταφορείς της μετφορμίνης είναι από την οικογένεια 22Α του διαλυτού μεταφορέας (Solute Carrier Family 22Α, SLC22A) τα μέλη 1 και 4 (γνωστά και ως πρωτεΐνη δέσμευσης οκταμερών, Octamer transcription factor 1, OCT1 και πρωτότυπος τύπος 1 του μεταφορέα οργανικών κατιόντων, Organic cation transporter1, OCTN1 αντιστοίχως) 191, ο πολλαπλός μεταφορέας 41

42 εξόδου φαρμάκων και τοξινών (Multidrug and toxin extrusion transporter 1, MATE1) και ο MATE2, o Equilibrative nucleotide transporter 4 (hεντ4) (γνωστός ως μεμβρανικός μεταφορέας των μονοαμινών, Plasma membrane monoamine transporter, PMAT). Οι λειτουργίες των πρωτεϊνών αυτών συνοψίζονται στον Πίνακας 2. Μεταφορέας μετφορμίνης Λειτουργία SLC22A1 (γνωστός ως Ο κύριος μεταφορέας που είναι υπεύθυνος για την πρόσληψη της OCT1) μετφορμίνης 192 Εκφράζεται στο ήπαρ και στους νεφρούς Μερικά SNPs φάνηκε να σχετίζονται με μειωμένη πρόσληψη μετφορμίνης, αυξημένη αποβολή μετφορμίνης λόγω της μειωμένης επαναπορρόφησης από τα νεφρικά σωληνάρια και χαμηλότερη θεραπευτική απάντηση η οποία οφείλεται στην ελαττωμένη δράση της μετφορμίνης στο ήπαρ 193 Ευρεία απόκλιση στην συχνότητα κατανομής των SNPs μεταξύ διαφορετικών εθνικοτήτων 192 SLC22A2 (γνωστός ως Διαμεσολαβεί στην έκκριση της μετφορμίνης μέσω των νεφρών OCT2) Υπεύθυνος για το 80% της συνολικής κάθαρσης της μετφορμίνης 194 SLC22A3 (γνωστός ως Εκφράζεται σε πολλούς ιστούς (ήπαρ, νεφροί, καρδιά, σκελετικοί OCT3) μυς, εγκέφαλος, πλακούντας) Πιθανώς παίζει σημαντικό ρόλο στην πρόσληψη της μετφορμίνης από τους μύς 195 SLC22A4 (γνωστός ως Συμμετέχει στην γαστρεντερική απορρόφηση της μετφορμίνης 196 OCTN1) MATE1 Διαμεσολαβεί στην έκκριση της μετφορμίνης (νεφροί, ηπατική απέκκριση στην χολή) Ο Rs πολυμορφισμός έχει συσχετιστεί με ενισχυμένη μείωσης της γλυκόζης η οποία οφείλεται στην δράση της μετφορμίνης, σε διαβητικούς ασθενείς 197 MATE2 Διαμεσολαβεί στην έκκριση της μετφορμίνης από τους νεφρούς hent4 (γνωστός ως PMAT) Διαμεσολαβεί στην νεφρική και στην εντερική απορρόφηση της μετφορμίνης 198 Πίνακας 2 Μεμβρανικοί μεταφορείς που συμμετέχουν στην φαρμακοκινητική της μετφορμίνης 42

43 Αυξημένη απορρόφηση γλυκόζης από τους σκελετικούς μυς Το ήπαρ, στο οποίο εκφράζονται υψηλά ποσοστά του SLC22A1, θεωρείται πως αποτελεί τον κυριότερο ιστό δράσης της μετφορμίνης. Η μεγαλύτερη συγκέντρωση της μετφορμίνης συναντάται στην ηπατική κυκλοφορία, κάτι το οποίο συμβάλλει στην συσσώρευση της μετφορμίνης στο ήπαρ 192. Εκεί, θεωρείται πως η μετφορμίνη έχει επίδραση στη ρύθμιση της πρόσληψης γλυκόζης, της γλυκονεογένεσης, της γλυκόλυσης και της σύνθεσης γλυκόζης (Εικόνα 5 Οι δράσεις της γλυκαγόνης και των διγουανιδινών στην γλυκονεογένεση και την ροή της γλυκόλυσηςεικόνα 5). Η μετφορμίνη αυξάνει την δραστικότητα του υποδοχέα της ινσουλίνης και του υποστρώματος 2 του υποδοχέα της ινσουλίνης (Insulin receptor substrate 2, IRS-2) και ενισχύει την πρόσληψη της γλυκόζης μέσω αυξημένης μετατόπισης των μεταφορέων της γλυκόζης όπως ο μεταφορέας 1 της γλυκόζης (Glucose transporter 1, GLUT-1, γνωστός επίσης και ως SLCA1) στην πλασματική μεμβράνη. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα, η μετφορμίνη να ενισχύει την διαμεσολαβούμενη από την ινσουλίνη καταστολή της γλυκονεογένεσης 199. Επιπρόσθετα, αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι η Εικόνα 5 Οι δράσεις της γλυκαγόνης και των διγουανιδινών στην γλυκονεογένεση και την ροή της γλυκόλυσης

44 μετφορμίνη αντιτίθεται στην δράση γλυκονεογένεσης της πετιδικής ορμόνης, της γλυκαγόνης Το τελικό αποτέλεσμα αυτών των αλληλεπιδράσεων είναι πως η μετφορμίνη όχι μόνο καταστέλλει τα ένζυμα που συμμετέχουν στην γλυκονεογένεση αλλά και διεγείρει την γλυκόλυση μέσω τροποποίησης ενζύμων που συμμετέχουν σε αυτά τα μονοπάτια 202 (Εικόνα 5). Η γλυκονεογένεση αποτελεί το 28-97% της συνολικής ηπατικής παραγωγής γλυκόζης και εξαρτάται από τον τρόπο διατροφής σε μη διαβητικούς, ενώ το ποσοστό αυξάνεται στους ασθενείς που πάσχουν από σακχαρώδη διαβήτη τύπου Σε αυτή την τελευταία κατηγορία πληθυσμού, η μετφορμίνη φάνηκε να μειώνει την ηπατική παραγωγή γλυκόζης σε ποσοστό μεγαλύτερο του 75% 204. Η πρόσληψη των γλυκονεογενετικών υποστρωμάτων, όπως η αλανίνη και η λακτάση, είναι μειωμένη παρουσία μετφορμίνης, πιθανώς λόγω της εκπόλωσης της μεμβράνης των ηπατικών κυττάρων διεγειρόμενα από τη μετφορμίνη 205. Αν και οι δράσεις της μετφορμίνης στον ηπατικό μεταβολισμό του γλυκογόνου δεν είναι καλά προσδιορισμένες, in vitro πειράματα σε ηπατοκύτταρα δείχνουν πως η σύνθεση του γλυκογόνου μειώνεται Αύξηση πρόσληψης γλυκόζης από τους σκελετικούς μυς Η μετφορμίνη βελτιώνει την ευαισθησία στην ινσουλίνη και της διαμεσολαβούμενης από την ινσουλίνη πρόσληψη γλυκόζης από τους σκελετικούς μυς. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω αύξησης της δραστικότητας τυροσινικής κινάσης του υποδοχέα της ινσουλίνης 207 και μέσω της ενισχυμένης δραστικότητας και μετατόπισης των μεταφορέων της γλυκόζης όπως ο GLUT-4 (γνωστός και ως SLC2A4), στην πλασματική μεμβράνη 208. Επίσης, η αυξημένη έκφραση του ινσουλινικού υποδοχέα 207,209 και η ενισχυμένη ικανότητα να αποκαθίστανται ενζυματικά μονοπάτια που εμπλέκονται στην σηματοδότηση μέσω ινσουλίνης 210, αποδίδονται στην μετφορμίνη Αλλαγμένη ενδοκρινική λειτουργία του παγκρέατος Αξίζει να σημειωθεί πως η αντιδιαβητική δραστικότητα της μετφορμίνης δεν οφείλεται σε αυξημένα επίπεδα ινσουλίνης 211,212, αλλά σε μειωμένα επίπεδα ινσουλίνης στην κυκλοφορία 213,214. Για αυτόν τον λόγο, θεραπεία μόνο με μετφορμίνη έχει ελάχιστες πυθανότητες πρόκλησης υπογλυκαιμίας 215. Μελέτες σε μη διαβητικά άτομα που τους χορηγήθηκε μετφορμίνη, υποδεικνύουν ότι η μείωση των επιπέδων γλυκόζης οδηγούσε σε μείωση έκκρισης ινσουλίνης και αύξηση έκκρισης γλυκογόνου 216. Ωστόσο αυτός ο μηχανισμός ίσως να είναι λιγότερο αποτελεσματικός σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 2, ο οποίος μπορεί να είναι υπεύθυνος για πιο σπάνιες περιπτώσεις υπογλυκαιμίας σε σχέση με τους διαβητικούς που λαμβάνουν μετφορμίνη μόνο 204,216. Αξιοσήμαντο είναι το γεγονός ότι, η μετφορμίνη φαίνεται να αλληλεπιδρά με τον άξονα των ινκρετινών, σαν ένας ενισχυτής και επαγωγέας της ευαισθητοποίησης των δράσεων 44

45 του πεπτιδίου 1 τύπου γλυκαγόνου (GLP-1) 217. Το GLP-1, απαντώντας στην αύξηση της γλυκόζης, αυξάνει την έκκριση της ινσουλίνης, μειώνει την έκκριση της γλυκαγόνης και έχει πολλές εξειδικευμένες επιδράσεις σε διάφορους ιστούς 218. Η μετφορμίνη διεγείρει την έκφραση του υποδοχέα του GLP-1 στο πάγκρεας και αυξάνει τα επίπεδα του GLP-1 στο πλάσμα 218,219. Ακόμη, τα επίπεδα της διπεπτιδικής πεπτιδάσης 4 (DDP-4) στην κυκλοφορία, η οποία είναι γνωστή για την ικανότητά της να διασπά ινκρετίνες, ήταν μειωμένα στους ασθενείς που έλαβαν μετφορμίνη σε σχέση με ασθενείς που δεν έλαβαν 220. Όμως, in vitro έχει φανεί ότι η μετφορμίνη δεν αναστέλλει άμεσα την δραστικότητα της DDP-4 219,221. O συνδυασμός DDP-4 αναστολέων με μετφορμίνη, βελτίωσε τον έλεγχο της γλυκόζης σε ασθενείς με διαβήτη τύπου Η ολοκληρωμένη κλινική συσχέτιση της επίδρασης της μετφορμίνης με το GLP-1 δεν έχει ακόμα προσδιοριστεί. Μελέτες δείχνουν πως η μετφορμίνη δεν προστατεύει την λειτουργικότητα των β- κυττάρων 223. Συνοψίζοντας, η ικανότητα της μετφορμίνης να μειώνει τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα των ασθενών με διαβήτη τύπου 2, μπορεί να αιτιολογηθεί με πολλαπλούς μηχανισμούς, όπως αυτόν της αυξημένης πρόσληψης γλυκόζης από το ήπαρ και τους μυς, της μειωμένης γλυκονεογένεσης, βελτιωμένης λειτουργικότητας του GLP-1 και μειωμένης λειτουργικότητας της γλυκαγόνης. Ωστόσο, ο μοριακός τρόπος δράσης της μετφορμίνης, παραμένει αμφιλεγόμενος και συνεχίζει να αναζητάται Μοριακοί στόχοι των αντιδιαβητικών επιδράσεων Μιτοχόνδρια ο κύριος στόχος δράσης Ο κύριος στόχος της μετφορμίνης εντός του κυττάρου, είναι το μιτοχόνδριο όπου εκεί, η μετφορμίνη παροδικά αναστέλλει το σύμπλεγμα I της μιτοχονδριακής αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων, προκαλώντας μια πτώση του ενεργειακού φορτίου Αυτή η αναστολή έχει παρατηρηθεί περισσότερο εμφανώς in vitro παρά in vivo 226. Το αποτέλεσμα της μειωμένης παραγωγής ATP και των αυξημένων επιπέδων AMP πυθανόν να οδηγούν σε δύο κύρια μονοπάτια: αναστολή της διαμεσολαβούμενης από γλυκογόνο σύνθεσης camp, όπως προσδιορίστηκε στο ήπαρ 200 ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης που ενεργοποιείται από το 5'-AMP (ΑΜPΚ) 228 Η κινάση αυτή χαρακτηρίζεται σαν ένας ενεργειακός αισθητήρας και ένας κύριος συντονιστής ενός ολοκληρωμένου δικτύου σηματοδότησης, το οποίο περιλαμβάνει μεταβολικά και αναπτυξιακά μονοπάτια όπου πραγματοποιούνται συγχρόνως, προκειμένου να αποκατασταθεί η 45

46 ενεργειακή ισορροπία του κυττάρου. Όταν ενεργοποιηθεί, η AMPK ενεργοποιεί καταβολικά μονοπάτια που οδηγούν στην παραγωγή ATP και απενεργοποιεί αναβολικά μονοπάτια που καταναλώνουν ATP. Ο ακριβής μοριακός μηχανισμός που εμπλέκεται στην αναστολή του μιτοχονδριακού συμπλέγματος I παραμένει νεφελώδης. Έχει φανεί πως η μεταβολική δράση της μετφορμίνης επηρεάζεται σημαντικά από μια αλληλεπίδραση που συμβαίνει μεταξύ των διγουανιδών και των μιτοχονδριακών ιόντων χαλκού 229. Σε φυσιολογικό ph, η μετφορμίνη είναι θετικά φορτισμένη οπότε, με αυτόν τον τρόπο η μεταφορά της στο εσωτερικό του κυττάρου, εξαρτάται από τους μεταφορείς κατιόντων. Το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης πιθανώς έλκει την συσσώρευση της θετικά φορτισμένης μετφορμίνης στη μιτοχονδριακή μήτρα. Η αναστολή του συμπλέγματος I από τη μετφορμίνη ελαττώνει την οξείδωση του NADH. Επίσης, άμεση αναστολή της απαμινάσης του AMP, η οποία πέπτει το AMP, από την μετφορμίνη, πιθανώς να αυξάνει τα επίπεδα του AMP 230. Τα αυξημένα επίπεδα ΑΜΡ αναστέλλουν την αδενυλική κυκλάση, ένα ένζυμο που βρίσκεται συνδεδεμένο στην μεμβράνη και καταλύει την μετατροπή του ΑΤΡ σε camp. Έτσι, η μετφορμίνη μειώνει τα επίπεδα camp. Ωστόσο υπάρχει μια συσχέτιση της μειωμένης σύνθεσης camp και της σηματοδότησης της γλυκαγόνης με την αντιδιαβητική δράση της μετφορμίνης 200. Ακόμη έχει παρατηρηθεί ότι αν και τα μιτοχόνδρια αποτελούν τον κύριο στόχο της μετφορμίνης, εκτός αυτών, επηρεάζει και τα ερυθροκύτταρα τα οποία στερούνται μιτοχονδρίων, πιθανώς επηρεάζοντας την μεμβρανική ρευστότητα 231. Ωστόσο αναμένεται περαιτέρω έρευνα πάνω σε αυτή την παρατήρηση Σηματοδότηση γλυκαγόνης και μετφορμίνη Σε άτομα που πάσχουν από διαβήτη, οι συγκεντρώσεις της γλυκαγόνης στην κυκλοφορία είναι παραπάνω από το φυσιολογικό επειδή η υπεργλυκαιμία αμβλύνει την καταστολή των α- κυττάρων του παγκρέατος που είναι υπεύθυνα για την έκκριση γλυκαγόνου. Η γλυκαγόνη προάγει την γλυκονεογένεση, γλυκογονόλυση και την κετογένεση ενώ μειώνει την γλυκογένεση και την γλυκόλυση (Εικόνα 5). Αυτά τα γεγονότα οδηγούν σε αυξημένη ηπατική παραγωγή γλυκόζης κατά τη διάρκεια νηστείας και σε εξασθενημένη μείωση σύνθεσης ηπατικής γλυκόζης μεταγευματικά 232. Η κύρια δράση της γλυκαγόνης εμφανίζεται μέσω της ενεργοποίησης της αδενυλικής κυκλάσης. Το camp που προέρχεται από την αδενυλική κυκλάση ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση Α (Protein kinase A, ΡΚΑ), η οποία με τη σειρα της φωσφορυλιώνει μεταγενέστερους στόχους, όπως το δυλειτουργικό ένζυμο 6-φωσφοφρουκτοκινάση-2 / διφωσφατάση της 2,6-φρουκτόζης (6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 1 46

47 (PFK/FBPase 1). Η φωσφορυλίωση της PFK/FBPase 1 αναστέλλει την δράση της PFK και διεγείρει της FBPάσης 1 (Εικόνα 7Σφάλμα! Το αρχείο προέλευσης της αναφοράς δεν βρέθηκε.σφάλμα! Το αρχείο προέλευσης της αναφοράς δεν βρέθηκε.). Το ένζυμο αυτό είναι Εικόνα 7 Η δράση της σηματοδότησης της γλυκαγόνης και των διγουανιδίων στην διφωσφατάση της 2,6-φρουκτόζης 289 Εικόνα 6 Μοντέλο δράσης της μετφορμίνης στο ηπατοκύτταρο 289 ένας αλλοστερικός αναστολέας της γλυκόλυσης και ενεργοποιητής της γλυκονεογένεσης, εφόσον 47

48 τροποποιεί την δραστικότητα πολλών ενζύμων σε αυτά τα στάδια (Εικόνα 5 και Εικόνα 7).Εικόνα 5 Επίσης η ενεργοποίηση της PKA οδηγεί σε αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση, αλλά αυτή η επίδραση είναι κατά κάποιο τρόπο πιο αργή από εκείνη της ενζυματικής δράσης. Παραδείγματος χάριν, αυξάνει τη σύνδεση της πρωτεΐνης αυτής στα στοιχεία απόκρισης του camp εντός του υποκινητή των γλυκονεογενετικών γονιδίων όπως το PEPCK και το G6PC (Εικόνα 6) 233,234. Κατά τη διάρκεια της νηστείας η PKA φωσφορυλιώνει τους υποδοχείς της 1,4,5-τριφωσφορικής ινοσιτόλης (Inositol 1,4,5-triphosphate receptors, I3PRs) προκαλώντας έτσι μια αύξηση των επιπέδων ενδοκυττάριων κατιόντων ασβεστίου 235. Αυτή η αύξηση με τη σειρά της, ενεργοποιεί τον μεταγραφικό συνενεργοποιητή 2 που ρυθμίζεται από την CREB (CREB regulated transcription coactivator 2, CRTC2) κάνοντας έτσι δυνατή την αλληλεπίδραση μεταξύ του CRTC2 και της πρωτεΐνης 1 που δεσμεύεται στο στοιχείο απόκρισης του camp (CAMP Responsive Element Binding Protein 1, CREB-1) ώστε να ενεργοποιηθεί η γονιδιακή έκφραση για γλυκονεογένεση (Εικόνα 6) 236. Αυτή η διαδικασία είναι μειωμένη κατά τη λήψη τροφής χάρη στην αυξημένη σηματοδότηση ινσουλίνης η οποία προκαλείται από την απενεργοποίηση του I3PR μέσω της AKT (γνωστή και ως Πρωτεϊνική κινάση Β, Protein kinase B, PKB) 236. Βασισμένοι σε αποτελέσματα και άλλων μελετών 201, οι Miller et al. πραγματοποίησαν in vitro και in vivo πειράματα στα οποία απέδειξαν πως τα διγουανίδια έχουν δράση τέτοια, που μειώνουν τα επίπεδα της γλυκόζης κυρίως εμποδίζοντας την μετάδοση της σηματοδότησης της γλυκαγόνης (Εικόνα 6) 200. Τα διγουανίδια φάνηκε πως αναχετίζουν ραγδαία την διεγερτική δράση της γλυκαγόνης στα επίπεδα του camp στα ηπατοκύτταρα, διαταράσσοντας την δραστικότητα της PKA και καταστέλλοντας την φωσφορυλίωση της PFK/FBPάσης 1, I3PR και CREB Έτσι, προτάθηκε πως σε θεραπευτικές συγκεντρώσεις, η μετφορμίνη οδηγεί σε αναστολή σηματοδότησης της γλυκαγόνης, πιθανώς αυξάνοντας τα επίπεδα AMP μέσω αναστολής του μιτοχονδριακού συμπλέγματος I (Εικόνα 6). Το AMP προσδένεται στη ρυθμιστική ενδοκυττάρια ανασταλτική P-θέση (σε μια θέση πουρίνης) της αδενυλικής κυκλάσης 237 και με αυτόν τον τρόπο αναστέλλεται η μέσω γλυκαγόνης ενεργοποίηση της αδενυλικής κυκλάσης και μειώνεται η ενδογενής σύνθεση του camp και η ενεργότητα της PKA. Αυτή η δράση φθάνει στο μέγιστο κατά τη μείωση γλυκόζης (Εικόνα 6). Επίσης φάνηκε πως ο AMPK αν και ενεργοποιήθηκε από τη μετφορμίνη, ήταν περιττός για την παραπάνω διαδικασία και η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ παρέμεινε αναλλοίωτη αμέσως μετά την χορήγηση μετφορμίνης 200 κάτι το οποίο υποδεικνύει ότι η μετφορμίνη δεν επηρεάζει άμεσα την ανταπόκριση με ινσουλίνη. Όμως, το πώς η μετφορμίνη δρα σε υψηλότερες συγκεντρώσεις παραμένει αδιευκρίνιστο, καθώς επιπρόσθετα της 48

49 ανασταλτικής δράσης της στην σηματοδότηση της γλυκαγόνης, μειώνει και την παραγωγή γλυκόζης σε απάντηση ενός αναλόγου του camp που είναι διαπερατό από τη μεμβράνη παρακάμπτοντας την αδενυλική κυκλάση 200. Ακόμη, αν και ποντίκια που ήταν ομόζυγα ώστε να μην εκφράζουν τον υποδοχέα της γλυκαγόνης 238, εμφάνισαν υπογλυκαιμία, αυτό είναι ασυνήθιστο σε ασθενείς που λαμβάνουν μονοθεραπεία με μετφορμίνη. Αυτό υποδηλώνει πως είτε η μετφορμίνη αναστέλλει ανεπαρκώς την σηματοδότηση γλυκαγόνης στους ανθρώπους είτε άλλοι αντισταθμιστικοί μηχανισμοί υπάρχουν Ο ρόλος της AMPK στην ηπατική γλυκονεογένεση Τα διγουανίδια αναγνωρίζονται ως έμμεσοι ενεργοποιητές της ΑΜΡΚ 228. Περίπου για μια δεκαετία η ΑΜΡΚ εθεωρείτο ως ο κύριος διαμεσολαβητής για την δράση της μετφορμίνης. Όπως έχει προαναφερθεί, η μετφορμίνη μπορεί να ενεργοποιήσει την ΑΜΡΚ προάγωντας την συσσώρευση του ΑΜΡ. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι το φάρμακο αυτό ενεργοποιεί την ΑΜΡΚ χωρίς να επιφέρει οποιαδήποτε αξιοπρόσεκτη αλλαγή στα AMP, ADP και ATP 239,240. Η συσχέτιση μεταξύ μετφορμίνης και ενεργοποίησης της ΑΜΡΚ υποστηρίχθηκε από πειράματα που έδειχναν πως οι δράσεις της μετφορμίνης προς μείωση της παραγωγής γλυκόζης και μείωση της λιπογένεσης αμβλύνονταν όταν γινόταν χρήση του AMPK ανασταλτικού στοιχείου C47 (παρόλο που αργότερα θεωρήθηκε μη εκλεκτικό) 241. Επιπλέον, η γλυκονεογένεση φάνηκε πως ανεστάλη από τον ενεργοποιητή της ΑΜΡΚ, το 5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR) 242 ενώ μειώθηκε επίσης σε ένα μεταλλαγμένο τρωκτικό μοντέλο το οποίο εξέφραζε μια μόνιμα ενεργή μορφή του ΑΜΡΚ 243. Στο ήπαρ, η αποσιώπηση της ηπατικής κινάσης Β1 (LKB1), η οποία φωσφορυλιώνει την καταλυτική α περιοχή της ΑΜΡΚ, ανέστειλε την ενεργοποίηση της ΑΜΡΚ και αναίρεσε την αντιδιαβητική δράση της μετφορμίνης σε ποντίκια που ακολούθησαν δίαιτα πλούσια σε λιπαρά 189. Πολλές μελέτες έδειξαν πως η ΑΜΡΚ εμπλέκεται στην απενεργοποίηση του CRTC2 189, , ο οποίος διαδραματίζει σημαντικότατο ρόλο στην ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης των γονιδίων της γλυκονεογένεσης. Ωστόσο, διατηρούνται επιφυλάξεις όσον αφορά την υπόθεση που θέλει την ΑΜΡΚ να είναι η κύρια αιτία πίσω από την μειωμένη ηπατική γλυκονεογένεση, λόγω της έλλειψης συσχέτισης μεταξύ της γονιδιακής έκφρασης για τη γλυκονεογένεση με την ηπατική παραγωγή γλυκόζης 247,248. Η δράση της μετφορμίνης μέσω της ΑΜΡΚ αμφισβητήθηκε αρκετά όταν φάνηκε πως η μετφορμίνη μείωσε την παραγωγή γλυκόζης σε ποντίκια που ήταν γενετικά τροποποιημένα ώστε να μην εκφράζουν την ΑΜΡΚ ή τον ενεργοποιητή της, την LKB Οι ερευνητές αυτής της 49

50 μελέτης, έδειξαν πως η μετφορμίνη αναστέλλει την ηπατική γλυκονεογένεση στα ποντίκια αυτά, ανεξαρτήτως της παρουσίας του ΑΜΡΚ και της LKB Σε έρευνες έχει αποδειχθεί ότι η ικανότητα της μετφορμίνης να μειώνει την παραγωγή της γλυκόζης, διατηρήθηκε κάτω από εξαναγκασμένη υπερέκφραση, συνενεργοποιητή 1α του γάμμα υποδοχέα που ενεργοποιείται από τον πολλαπλασιαστή των υπεροξειδιοσωμάτων (Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1 alpha, PGC-1α) και με αύξηση στα επίπεδα πρωτεϊνών των ενζύμων της γλυκονεογένεσης, όπως η φωσφο-ενολο-πυροσταφυλική καρβοξυκινάση και η φωσφατάση της 6Ρ-γλυκόζης (Glucose 6-phosphatase, G6Pase), καταλήγοντας στο ότι η μετφορμίνη διαταράσσει την δραστικότητα των ενζύμων της γλυκονεογένεσης και όχι της γονιδιακής έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν αυτά 249. Ο προτεινόμενος ρόλος της μετφορμίνης στην σηματοδότηση της γλυκαγόνης (το αυξημένο ΑΜΡ μειώνει τα επίπεδα των camp) 200 στηρίζει και την ΑΜΡΚ-ανεξάρτητη ανθυπεργλυκαιμική δράση της. Μολαταύτα, κάποιες δράσεις της μετφορμίνης ακόμα αποδίδονται στην ΑΜΡΚ. Η AMPK φωσφορυλιώνει και αυξάνει την δράση του ινσουλινικού υποδοχέα και του IRS-2 και ενισχύει την μετατόπιση των μεταφορέων της γλυκόζης (Εικόνα 6) 207. H ΑΜΡΚ είναι επίσης υπεύθυνη για την δράση της μετφορμίνης στον μεταβολισμό των λιπαρών οξέων (Εικόνα 6) 228. Η ενεργοποιημένη ΑΜΡΚ αναστέλλει τη σύνθεση των λιπαρών οξέων και ενισχύει την β-οξείδωση 250 (ρυθμίζοντας την ενεργότητα της καρβοξυλάσης του ακετυλοσυνενζύμου Α 228 και την έκφραση πολλών ενζύμων που εμπλέκονται στην λιπογένεση 228,243 και στην β-οξείδωση 202 ). Αυτός ο μηχανισμός είναι σύμφωνος με τις παρατηρήσεις τροποποιημένου μεταβολισμού λιπαρών οξέων και βελτιωμένης ηπατικής στεάτωσης σε ποντίκια που λάμβαναν μετφορμίνη 182. Τα ελεύθερα λιπαρά οξέα μπορούν να μειώσουν την μεταφορά της γλυκόζης, παρεμποδίζοντας την σηματοδότηση της ινσουλίνης 183 και έχουν θεωρηθεί ως τα κύρια υπεύθυνα μόρια για την διαταραγμένη έκκριση ινσουλίνης από τα β- κύτταρα Άμεση διαμόρφωση μέσω του ενεργειακού φορτίου Δεδομένα από έρευνες δείχνουν πως υπάρχει μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της αύξησης του ΑΜΡ μέσω της μετφορμίνης και της πτώσης των επιπέδων του camp και της γλυκόζης 200. Επιπλέον της 2,6-διφωσφορικής φρουκτόζης, η οποία ρυθμίζει την φωσφο-φρουκτο-κινάση 1 και την διφωσφατάση 1 της 1,6 Ρ-φρουκτόζης (Fructose-1,6-bisphosphatase 1, FBP1), πολλοί άλλοι παράγοντες διαμορφώνουν την ενεργότητα των ενζύμων της γλυκονεογένεσης και της γλυκόλυσης ανεξάρτητα από τη σηματοδότηση της γλυκαγόνης και της ΑΜΡΚ, 50

51 συμπεριλαμβανομένων μεταβολιτών (όπως το κιτρικό), την αναλογία AMP:ATP 227,252,253 και την ισορροπία NADH:NAD (Εικόνα 5Εικόνα 5). Το μιτοχονδριακό σύμπλεγμα I και άλλα ένζυμα που τροποποιούνται από αλλαγές του ενεργειακού φορτίου, όπως η αδενυλική κυκλάση η οποία αναστέλλεται από αυξημένα επίπεδα ΑΜΡ καθώς επίσης και η επηρεασμένη σηματοδότηση γλυκαγόνης και της ΑΜΡΚ η οποία διεγείρεται από αυξημένη αναλογία AMP:ATP, αποτελούν μοριακούς στόχους της μετφορμίνης Νιασίνη Το νικοτινικό οξύ ή αλλιώς νιασίνη είναι ένα σύμπλεγμα βιταμίνης (βιταμίνη Β3). Το 1955 ήταν η πρώτη φορά, που οι Altschul et all 254, παρατήρησαν ότι η νιασίνη μείωσε τα επίπεδα της χοληστερόλης του πλάσματος, τόσο σε φυσιολογικά άτομα όσο και σε αυτά που έπασχαν από υπερχοληστερολαιμία. Αυτή η παρατήρηση, αποτέλεσε σταθμό ανάπτυξης θεραπειών για την στεφανιαία νόσο που στηρίζονται στα λιπίδια. Αρκετές ύστερες κλινικές μελέτες εδραίωσαν τη χρήση της νιασίνης ως ευρέως φάσματος φαρμακευτική ουσία για τη ρύθμιση των λιπιδίων και πρώτη γραμμή άμυνας για την πρόληψη της καρδιαγγειακής νόσου και του θανάτου από αυτήν 255,256. Σε φαρμακολογικές δόσεις, η νιασίνη μειώνει την συνολική χοληστερόλη του πλάσματος, τα τριγλυκερίδια, τις VLDL, LDL καθώς και την Lp(a), η οποία προκύπτει από τη σύνδεση σωματίων τύπου LDL μαζί με την απολιποπρωτεΐνη a, ενώ αυξάνει τα ποσοστά της HDL 255,256. Επίσης έχει φανεί ότι η νιασίνη αυξάνει τα ποσοστά των HDL2 υποκλασμάτων και μειώνει τα LDL σωματίδια Ακόμη έχει δειχθεί ότι, η νιασίνη αυξάνει ειδικά τα HDL σωματίδια που περιέχουν μόνο apoa-i και όχι apoa-ii, που αποτελούν ένα καρδιοπροστατευτικό υποκλάσμα και έναν αποτελεσματικό διαμεσολαβητή στην αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης 263. Πολλές κλινικές μελέτες έχουν δείξει πως, η θεραπεία με νιασίνη μόνο, ή και σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα για την μειώση των λιπιδίων, μειώνει αισθητά την συνολική θνησιμότητα και τα καρδιακά επεισόδια και καθυστερεί την ανάπτυξη της αθηροσκληρωσης ενώ επηρεάζει με θετικό τρόπο την επαναφορά πιο πρώιμων σταδίων της νόσου 255,256,264,265. Μετά από 50 χρόνια κλινικής χρήσης της νιασίνης για τη θεραπεία της δυσλιπιδαιμίας και της αθηροσκλήρωσης, τα 10 τελευταία χρόνια έχουν γίνει νέες ανακαλύψεις όσον αφορά τον μηχανισμό δράσης της. Αυτές αφορούν δεδομένα πάνω στον ρόλο της νιασίνης ως ρυθμιστής στον μεταβολισμό των λιπιδίων και των λιποπρωτεϊνών στο ήπαρ. Επίσης τα δεδομένα αυτά αναφέρονται και στους υποδοχείς της νιασίνης στα λιποκύτταρα και τον ρόλο τους στην λιπόλυση των τριγλυκεριδίων. Οι ανακαλύψεις αυτές αφορούν ακόμη και κύτταρα του ανοσοποιητικού 51

52 συστήματος και την ερυθρότητα του δέρματος που έπεται της χρήσης της νιασίνης, λόγω διαστολής των αγγείων. Σε συνδυασμό με ευρήματα πάνω στον ρόλο της νιασίνης για την ρύθμιση των επιπέδων των λιπιδίων, έρχονται να προστεθούν και αποτελέσματα ερευνών όπου φαίνεται πως η νιασίνη διαθέτει αντιφλεγμονώδεις και αντιοξειδωτικές ιδιότητες, βοηθώντας στην περαιτέρω αποσαφήνιση του πλειοτροπικού τρόπου δράσης της στην μείωση ανάπτυξης της αθηροσκλήρωσης. Μελέτες έχουν παρουσιάσει την ύπαρξη ενός ειδικού συστήματος μεταφοράς της νιασίνης στο ανθρώπινο ήπαρ και στα επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου 266,267. Υπάρχουν συγκεκριμένα χαρακτηριστικά που αποδίδονται στο σύστημα μεταφοράς της νιασίνης στα ανθρώπινα ηπατικά κύτταρα: η αναλογία μεταφοράς μορίων νιασίνης, μέσω του συστήματος μεταφοράς της στα ανθρώπινα ηπατικά κύτταρα, εξαρτάται από το ph, την θερμοκρασία και την ενέργεια όμως, είναι ανεξάρτητη από τα ιόντα νατρίου. Επίσης δεδομένα υποδεικνύουν πως για τη μεταφορά της νιασίνης στα ηπατικά κύτταρα εμπλέκονται και διαμεσολαβούμενα μονοπάτια καλμοδουλίνης Βασικοί μηχανισμοί με τους οποίους η νιασίνη μειώνει τα λιπίδια και τις λιποπρωτεΐνες που περιέχουν απολιποπρωτεΐνη Β Μελέτες έχουν δείξει δύο κύριους μηχανισμούς μέσω των οποίων η νιασίνη επηρεάζει τα τριγλυκερίδια του πλάσματος και την έκκριση λιποπρωτεΐνών που περιέχουν απολιπρωτεΐνη Β, συμπεριλαμβανομένων των VLDL και LDL σωματιδίων, στο ήπαρ. Ο ένας μηχανισμός αφορά σε αλλαγές της σύνθεσης τριγλυκεριδίων στο ήπαρ, όπου οδηγεί σε αυξημένη ενδοκυττάρια αποδόμηση της απολιποπρωτεΐνης Β, και ο άλλος αφορά στην αλλαγή της λιπόλυσης των τριγλυκεριδίων στον λιπώδη ιστό Μηχανισμός δράσης της νιασίνης πάνω στην διαμόρφωση της σύνθεσης των τριγλυκεριδίων και της έκκρισης των VLDL και LDL σωματιδίων από το ήπαρ Το ήπαρ είναι το κύριο όργανο για την παραγωγή και την έκκριση της apob και τις σχετιζόμενες με αυτήν λιποπρωτεΐνες, όπως τα VLDL, LDL και Lp(a) σωματίδια. Μελέτες από τους Grundy et al 268 σε ανθρώπους, έδειξαν πως η νιασίνη μείωσε τα ποσοστά σύνθεσης των VLDL-TGs, υποδεικνύοντας πως ο κύριος στόχος της νιασίνης είναι η σύνθεση των τριγλυκεριδίων μέσω των οποίων επηρεάζεται και η έκκριση των VLDL και των LDL. Ωστόσο για να διερευνηθεί περαιτέρω ο τρόπος δράσης της νιασίνης στα ηπατοκύτταρα πάνω στην σύνθεση των τριγλυκεριδίων και τον μεταβολισμό των VLDL και LDL, οι Jin et al 52

53 επικεντρώθηκαν στον τρόπο μέσω του οποίου ασκεί δράση η νιασίνη στην σύνθεση των τριγλυκεριδίων και στις ρυθμιστικές διαδικασίες που σχετίζονται με την ενδοκυττάρια αποδόμηση της apob και την έκκρισή της στην ανθρώπινη ηπατική κυτταρική σειρά (Hep G2 cells). Τα δεδομένα των ερευνών τους έδειξαν πως, η νιασίνη αύξησε την ενδοκυττάρια αποδόμηση της apob και μείωσε την επακόλουθη έκκριση της apob στο θρεπτικό μέσο των Hep G2 κυττάρων 269. Επίσης, έχει δειχθεί ότι η νιασίνη μειώνει την αναστολή αποδόμησης μέσω ελαϊκού, της apob, υποδεικνύοντας έτσι πως η επαγόμενη από τη νιασίνη, αποδόμηση της apob, ίσως να εξαρτάται από τα μονοπάτια που περιλαμβάνουν την σύνθεση και την συσχέτιση με τα τριγλυκερίδια πριν από την επεξεργασία της apob (Εικόνα 8). Σε μελέτες που ακολούθησαν, παρατηρήθηκε ότι η νιασίνη ανέστειλε άμεσα και μη ανταγωνιστικά, την δραστικότητα της Ο-ακυλομεταφοράσης 2 της διακυλ-γλυκερόλης (Diacylglycerol O-Acyltransferase 2, DGAT2), ένα εξαιρετικά σημαντικό ένζυμο το οποίο καταλύει την τελική αντίδραση στη σύνθεση τριγλυκεριδίων καθορίζοντάς το, σαν κύριο στόχο στον οποίο ασκεί την δράση της η νιασίνη 270. Συνοψίζοντας, όπως φαίνεται στην Εικόνα 8, η νιασίνη αναστέλλοντας την ηπατική DGAT2, μειώνει τη σύνθεση των τριγλυκεριδίων και την διαθεσιμότητά τους για την συγκρότηση των VLDL σωματιδίων, με αποτέλεσμα την αυξημένη μεταμεταφραστική ενδοηπατική αποδόμηση της apob. Η αυξημένη ηπατοκυτταρική αποδόμηση της apob από την νιασίνη, θα μπορούσε να μειώσει τον αριθμό των VLDL σωματιδίων και τα καταβολικά τους προϊόντα, τα LDL σωματίδια, Εικόνα 8 Μηχανισμός δράσης νιασίνης

54 των οποίων και οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις παρατηρήθηκαν κλινικά μετά από θεραπεία με νιασίνη Μηχανισμός δράσης της νιασίνης για ρύθμιση της λιπόλυσης των τριγλυκεριδίων στον λιπώση ιστό Τα κύτταρα του λιπώδους ιστού είναι εξειδικευμένα για την αποθήκευση των τριγλυκεριδίων καθώς και την κινητοποίησή τους στο ήπαρ ως καύσιμο για τον σχηματισμό των ελεύθερων λιπαρών οξέων (FFAs) και γλυκερόλης. Έχουν γίνει εκτενείς μελέτες 256 πάνω στον εμπλεκόμενο ρόλο της λιπόλυσης των τριγλυκεριδίων από τον λιπώδη ιστό, σαν μηχανισμός δράσης της νιασίνης ώστε να μειώνει τα ποσοστά των τριγλυκεριδίων του πλάσματος. Συγκεκριμένα έχει φανεί πως μέσα σε λίγα λεπτά, η νιασίνη μείωσε την συγκέντρωση των FFA του πλάσματος ενώ μετά από μία ώρα επανήλθαν στα αρχικά επίπεδα 271. Μια ένδειξη ακόμα του τρόπου δράσης της νιασίνης είναι, η μείωση των FFAs που προκλήθηκε σε in vitro μελέτες με επιθέματα επιδιδυμικού λίπους αρουραίων, μέσω αναστολής της λιπόλυσης των TG 272. Η ταυτοποίηση δύο υποδοχέων συνδεδεμένων με G πρωτεΐνες, τον109a και 109B (HM74A and HM74, αντιστοίχως) ως υποδοχείς του νικοτινικού οξέος, στα λιποκύτταρα και σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, έχουν προσφέρει σημαντική γνώση για την κατανόηση της δράσης της νιασίνης στον μεταβολισμό των TGs από τα λιποκύτταρα. Συγκεκριμένα ο υποδοχέας που δεσμεύεται με G-πρωτεΐνες (GPR109A, στα ποντίκια χαρακτηρίζεται ως PUMA-G) έχει χαρακτηριστεί ως υποδοχέας υψηλής συγγένειας (250 nmol/l) με τη νιασίνη (στα μακροφάγα η συγγένεια αυξάνεται ως απόκριση στην ιντερφερόνη-γ) ενώ ο GPR109B σαν χαμηλής συγγένειας (96 nmol/l) Σε ποντίκια που δεν εξέφραζαν την PUMA-G, η νιασίνη δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα των FFAs του πλάσματος 273. Συγκεκριμένα, τα ποντίκια είχαν τραφεί για δύο εβδομάδες με δίαιτα πλούσια σε λιπαρά και λάμβαναν νιασίνη και το ίδιο ίσχυε και για την ομάδα ελέγχου, δηλαδή ποντίκια που εξέφραζαν την PUMA-G. Σε αυτά τα πειράματα δεν φάνηκε καμία διαφορά στα επίπεδα των τριγλυκεριδίων ενώ στα άγριου τύπου υπήρξε μείωση αυτών κατά 30%. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν πως στους μύς η PUMA-G εμπλέκεται στον μηχανισμό δράσης της νιασίνης στον μεταβολισμό των ελεύθερων λιπαρών οξέων και στην επακόλουθη μειωμένη διαθεσιμότητα αυτών ως υπόστρωμμα για τη σύνθεση των τριγλυκεριδίων. Ωστόσο, το αν ο μηχανισμός αυτός είναι όντως αντίστοιχος με τον ανθρώπινο είναι αμφιλεγόμενο, καθώς μπορεί να μην αποτελεί μια πλήρη και σαφή εξήγηση σε όλες τις δράσεις που ασκεί ενδεχομένως η νιασίνη στα λιπίδια του ανθρώπου. Στους ανθρώπους, έχει φανεί πως η 54

55 νιασίνη προκαλεί ανάκαμψη της λιπόλυσης, με αποτέλεσμα τα επίπεδα των ελεύθερων λιπαρών οξέων του πλάσματος, να είναι αυξημένα μετά από 24 ώρες. Αυτή η αυξημένη διαθεσιμότητα των λιπαρών οξέων της κυκλοφορίας στους μυς μπορεί να προκαλέσει αύξηση αντίστασης στην ινσουλίνη 276. Επίσης, δεν υπάρχει κάποια απόδειξη πως η πιο μακροπρόθεσμη μεταφορά (ποσοστό ροής) των μη εστεροποιημένων λιπαρών οξέων μειώνεται μετά από θεραπεία με νιασίνη. Ακόμη, το εύρος των 250 και 96 nmol/l που αναφέρθηκαν παραπάνω, είναι μικρό αν αναλογιστεί κανείς πως αυτές οι φαρμακολογικές συγκεντρώσεις είναι αρκετά μικρές σε σχέση με αυτές που απαιτούνται για τον άνθρωπο προκειμένου να έχουν κάποια επίδραση. Για αυτόν τον λόγο ίσως η νιασίνη να μην παίζει κύριο ρόλο στην μείωση των VLDL και LDL, αλλά η κυριότερη δράση της να ακείται στην DGAT2 στο ήπαρ, οπότε και να παρεμβαίνει αναστέλλωντας άμεσα τη σύνθεση των TGs Αύξηση της apoα-ι και της HDL μέσω του μηχανισμού δράσης της νιασίνης Το ήπαρ και το έντερο είναι τα κύρια όργανα σύνθεσης και έκκρισης της apoa-i και της HDL. Προηγούμενες μελέτες σε πλάσμα ανθρώπων, υποδεικνύουν πως η νιασίνη μειώνει κυρίως το ποσοστό εκείνου του κλάσματος της HDL που αφορά την apoa-i χωρίς όμως να μεταβάλλει τα ποσοστά σύνθεσης της apoa-i 277,278. Σε in vitro μελέτες σε ηπατοκύτταρα (Hep G2), φάνηκε ο τρόπος με τον οποίο επιδρά η νιασίνη σε μονοπάτια σύνθεσης και καταβολισμού. Συγκεκριμένα, η νιασίνη ανέστειλε ειδικά την πρόσληψη της HDL-apoA-I αλλά όχι των εστέρων της HDL χοληστερόλης, χωρίς να επηρεάζει την de novo σύνθεση της apoa-i στα Hep G2 κύτταρα 279. Προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος της νιασίνης στο μονοπάτι του καταβολικού υποδοχέα του σωματιδίου της HDL, έγιναν μελέτες πάνω στην β αλυσίδα της συνθάσης της τριφωσφορικής αδενοσύνης, η οποία μεσολαβεί στην ηπατική ενδοκυττάρωση του HDL σωματιδίου (πρωτεΐνη μαζί με λιπίδια) 43. Επώαση των κυττάρων Hep G2 με νιασίνη, οδήγησε σε μειωμένη έκφραση στην κυτταρική επιφάνεια της β αλυσίδας της συνθάσης της τριφωσφορικής αδενοσύνης, υποδεικνύοντας πως η νιασίνη μειορυθμίζει την έκφραση της β αλυσίδας της συνθάσης της τριφωσφορικής αδενοσύνης, με αποτέλεσμα και την μειωμένη ηπατική απομάκρυνση της HDL μέσω της ενδοκυττάρωσής της, Αυτό ίσως μας δίνει έναν πιθανό κυτταρικό υποδοχέα δράσης της νιασίνης προκειμένου να αυξηθούν τα επίπεδα της HDL-χοληστερόλης στο πλάσμα 280. Επειδή τα υποκλάσματα της HDL, αυτά δηλαδή που έχουν μόνο apoa-i και αυτά που έχουν apoa-i και apoa-ii, έχουν διαφορετικό καρδιοπροστατευτικό ρόλο, έγινε έρευνα πάνω στην δράση που μπορεί να ασκήσει η νιασίνη στα επίπεδα αυτών των υποπληθυσμών σε άτομα που είχαν ήδη χαμηλά ποσοστά HDL-χοληστερόλης 263. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα αυτής της 55

56 μελέτης, η νιασίνη αναστέλλωντας ειδικά, την ηπατική απομάκρυνση και πρόσληψη των υποκλασμάτων εκείνων που είχαν μόνο apoa-i, ίσως να οδηγεί σε αυξημένη διατήρηση των σωματιδίων αυτών στην κυκλοφορία και μια ευρύτερη επίδραση στην αντίστροφη μεταφορά της χοληστερόλης. Πιθανώς, όπως φαίνεται και στην Εικόνα 8, η νιασίνη αναστέλλωντας την β αλυσίδα της τριφωσφορικής αδενοσίνης, ίσως αναστέλλει την ηπατική ενδοκυττάρωση της HDL apoa-i. Κάτι τέτοιο, θα μπορούσε να αυξάνει τον χρόνο ημίσεας ζωής της HDL και τις συγκεντρώσεις των HDL-apoA-I υποκλασμάτων στην κυκλοφορία. Επιπλέον, πειράματα δείχνουν πως η νιασίνη αυξάνει την έκφραση του γ υποδοχέα που ενεργοποιείται από τον πολλαπλασιαστή των υπεροξειδιοσωμάτων (Ρeroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ), συντηρεί την πρωτεΐνη CD36 των μονοκυττάρων και των μακροφάγων και διεγείρει την ABCA1, η οποία εμπλέκεται σε μονοπάτια αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης Καινοτόμος μη σχετιζόμενη με τα λιπίδια δράση της νιασίνης που επηρεάζει την ανάπτυξη αγγειακών φλεγμονοδών και οξειδωτικών καταστάσεων που εμπλέκονται στην αθηρογένεση Εκτός από ρόλο ρυθμιστή λιπιδίων, η νιασίνη φαίνεται να έχει και αντιφλεγμονώδεις δράσεις κατά της αθηροσκλήρωσης. Συγκεκριμένα, πειράματα 282 in vitro σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα αορτής, έδειξαν πως η νιασίνη αναστέλλει την ανάπτυξη φλεγμονής στα αγγεία μειώνοντας την παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου, την οξείδωση της LDL και της αναμενόμενης προσκόλλησης στα αγγειακά κύτταρα του μορίου 1 και της έκφρασης της χημειοτακτικής πρωτεΐνης 1 των μονοκυττάρων, οδηγώντας σε μειωμένη προσκόλληση και συγκέντρωση των μονοκυττάρων και των μακροφάγων, στάδια σημαντικότητα στην αρχή ανάπτυξης της αθηρογένεσης. 56

57 2. Σκοπός Τα τελευταία χρόνια, ο επιπολασμός του μεταβολικού συνδρόμου αυξάνεται αγγίζωντας περίπου το 25% του πληθυσμού παγκοσμίως. Τα άτομα που πάσχουν από μεταβολικό σύνδρομο έχουν αυξημένη πυθανότητα θανάτου ή προσβολής από καρδιακό επεισόδιο κατά δύο και τρεις φορές αντιστοίχως, σε σχέση με τα υγιή άτομα. Επίσης τα άτομα αυτά, έχουν πέντε φορές μεγαλύτερη πυθανότητα ανάπτυξης διαβήτη τύπου 2 ενώ από τα 200 εκατομμύρια διαβητικών ασθενών παγκοσμίως, περισσότερο από το 80% αυτών θα πεθάνει από κάποιο καρδιαγγειακό νόσημα. Αυτά τα ποσοστά επιτάσσουν όλο και εντονότερα την πρόληψη και την αντιμετώπιση τόσο των δυσλιπιδαιμιών όσο και του διαβήτη. Η νιασίνη χρησιμοποιούνταν για περισσότερο από 50 χρόνια ως φάρμακο πρώτης γραμμής άμυνας για τα καρδιαγγειακά νοσήματα. Μελέτες έχουν δείξει πως η νιασίνη αυξάνει τα επίπεδα της HDL και δη των υποπληθυσμών αυτής που περιέχουν apoa-i 261,263. Η μετφορμίνη αν και είναι η πιο μακροχρόνια και συχνής χρήσης αντιδιαβητική φαρμακευτική ουσία, δεν έχει προσδιοριστεί πλήρως ο μηχανισμός δράσης της. Σύμφωνα με πρόσφατα δημοσιευμένα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας, φάνηκε πως απουσία της apoa-i, η φαρμακολογική δράση της μετφορμίνης παρεμποδίζεται 283. Επίσης, η δράση της μετφορμίνης βελτιώνεται από την αύξηση της HDL και συγκεκριμένα με την αύξηση της apoa-i 284. Έτσι, στην παρούσα εργασία προσπαθήσαμε να απαντήσουμε στο ερώτημα για το εάν και πώς σε πειραματόζωα ποντίκια C57BL/6, με ολόκληρο γονιδίωμα, η αύξηση της apoa-i, μέσω χορήγησης νιασίνης, επιδρά στην φαρμακολογική δράση της μετφορμίνης. 57

58 3. Μέθοδοι και Υλικά 3.1 Πειραματόζωα - Χειρισμοί και πειραματικές διαδικασίες Τα πειραματόζωα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν μοντέλα ποντικών που εξέφραζαν όλο το γονιδίωμα, του γένους C57BL/6. Η προμήθεια των πειραματόζωων έγινε από την εταιρεία Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, Σε αυτή τη μελέτη, τα ποντίκια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν θηλυκού γένους και ηλικίας εβδομάδων κατά την έναρξη της μελέτης. Η δίαιτα που λάμβαναν πριν την έναρξη των πειραμάτων (μηδενική εβδομάδα) ήταν η τυπική, μη υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά δίαιτα (standard chow diet 1324 TPF, Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG) και στη συνέχεια κάποιες από τις ομάδες εκτέθηκαν σε δίαιτα πολύ πλούσια σε λιπαρά (WTD, Western Typed Diet, Mucedola SRL, Milano, Italy) για 22 εβδομάδες. Η WTD που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από 17.3% πρωτεΐνη, 48.5% υδατάνθρακα, 21.2% λίπος, 0.2% χοηστερόλη και περιέχει 4.5 Kcal/g. Κάποιες από τις ομάδες των πειραματοζώων εκτέθηκαν επίσης σε συγκεκριμένες δόσεις φαρμάκων τα οποία εμπεριέχονταν στην τροφή. Οι ομάδες ήταν τρεις και αποτελούνταν από πέντε πειραματόζωα η κάθε μία: δίαιτας δυτικού τύπου (WTD), δίαιτας δυτικού τύπου με νιασίνη (WTD+niacin) και δίαιτας δυτικού με νιασίνη και μετφορμίνη ταυτόχρονα(wtd+niacin+metformin). Η δόση της νιασίνης που λάμβανε κάθε πειραματόζωο καθημερινά ήταν 90mg/kg/ημέρα και της μετφορμίνης 300mg/kg/ημέρα. Οι ίδιες δόσεις ακολουθήθηκαν και κατά τον συνδυασμό των δύο αυτών φαρμάκων. Οι πειραματικές μελέτες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες της Ευρωπαϊκής Ένωσης και το Πρωτόκολλο προστασίας και ορθής μεταχείρισης των ζώων το οποίο έχει λάβει την έγκριση της επιτροπής πειραματόζωων της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών. Α Control Β Niacin Γ Niacin Metformin Πίνακας 3 Σχηματική απεικόνιση ομάδων πειραματοζώων 58

59 3.1.1 Λήψη αίματος από την ουραία φλέβα των πειραματόζωων Υλικά Ειδικές θήκες παγίδευσης μυών (Mouse Restrainer adult mice & neonate rats, IITC.84, Campden Instruments Ltd., UK) Ειδικά τριχοειδή σωληνάκια λήψης αίματος (Microvette for capillary blood collection, CB 300, Sarstedt, D Numbrecht, Germany) Πλαστικά σωληνάκια 1.5 ml (Reaction Tubes, , Greiner Bio-One) Πειραματική πορεία Πριν από κάθε λήψη αίματος, οι μύες μπήκαν σε νέους καθαρούς κλωβούς χωρίς τροφή για 16 ώρες. Αφού τα ζώα ακινητοποιήθηκαν στις ειδικές κυλινδρικές παγίδες, έγινε μια μικρή τομή στο άκρο της ουράς και με μαλάξεις από το πάνω μέρος της μέχρι το τέλος, έγινε συλλογή 30-50μl αίματος στα ειδικά CB300 τριχοειδή σωληνάκια σαν αυτά της εικόνας παραπλεύρως. Τα σωληνάκια αυτά περιέχουν αντιπηκτικό παράγοντα EDTA, οπότε κάθε φορά με το πέρας της αιματοληψίας, γινόταν ανακίνηση προκειμένου να αναδευθεί το αίμα με αυτό και φυλασσόταν σε πάγο ώσπου να φυγοκεντρηθεί στα 1.500g, για 10 λεπτά, στους 4 o C και να απομονωθεί το πλάσμα (υπόλευκο υγρό-εικόνα 9). Το πλάσμα συλλέχθηκε σε πλαστικά σωληνάκια 1,5ml και φυλάχθηκε στους - 20 ο C για περεταίρω αναλύσεις. Το σημείο όπου έγινε η τομή στην ουρά των πειραματόζωων καυτηριάστηκε αμέσως μετά την λήψη του αίματος ώστε να διακοπεί η αιμορραγία Μέτρηση σωματικού βάρους μυών Υλικά Ηλεκτρονικός ζυγός (Mettler precision microscale, Τολέδο, Ισπανία) Πειραματική πορεία Ύστερα από 16 ώρες νηστείας, οι μύες τοποθετήθηκαν στον ηλεκτρονικό ζυγό, ο οποίος είχε πρώτα μηδενιστεί Μέτρησης ημερήσιας κατανάλωσης τρoφής των ποντικών Υλικά Ηλεκτρονικός ζυγός (Mettler precision microscale, Τολέδο, Ισπανία) Εικόνα 9 Τριχοειδή σωληνάκια αίματος Τυπική Δίαιτα (Standard chow diet 1324 TPF, Altromin Spezialfutter GmbH & Co.KG) 59

60 Πειραματική πορεία Αρχικά τοποθετήθηκε σε κάθε κλωβό τροφή ίση με 30gr. Στη συνέχεια, κάθε 24 ώρες για τρεις μέρες ζυγιζόταν η τροφή που απέμεινε στον κλωβό και αφαιρώντας την τιμή αυτή από αυτή της προηγούμενης ημέρας, προσδιορίστηκε η ημερήσια κατανάλωση της τροφής σε κάθε κλωβό. Η ημερήσια κατανάλωση τροφής ανά πειραματόζωο προσδιορίστηκε με την διαίρεση της ημερήσιας κατανάλωσης τροφής ανά κλωβό με το πλήθος των μυών που φυλάσσονταν στον κάθε κλωβό. Η μέση κατανάλωση τροφής ανά ζώο ήταν ο μέσος όρος για την διάρκεια των εφτά ημερών εκφρασμένη ως μέση κατανάλωση τροφής ± S.E.M Δοκιμασία Ανοχής Γλυκόζης Υλικά Ειδικές θήκες παγίδευσης μυών (Mouse Restrainer adult mice & neonate rats, IITC.84, Campden Instruments Ltd., UK) Ειδικά τριχοειδή σωληνάκια λήψης αίματος (Microvette for capillary blood collection, CB 300, Sarstedt, D Numbrecht, Germany) Πλαστικά σωληνάκια 1.5 ml (Reaction Tubes, , Greiner Bio-One) Κιτ προσδιορισμού επιπεδων γλυκόζης (Glucose GOD FS, DiaSys) Διάλυμα δεξτρόζης (0.25mg / ml PBS 1x) PBS 10X ph7.4 (800 ml dd H2O + 80 g NaCl + 2 g KCl g Na2HPO g KH2PO4) PBS 1X ( 50 ml PBS 10X ml dd H2O) Πειραματική πορεία Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε 16 ώρες νηστείας και ακολούθως μετρήθηκαν τα βασικά επίπεδα γλυκόζης στο αίμα. Η μέτρηση των επιπέδων της γλυκόζης έγινε με το κιτ Glucose GOD FS, DiaSys με παρόμοιο τρόπο όπως έγινε και ο προσδιορισμός των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα του αίματος, όπως περιγράφεται παρακάτω.στη συνέχεια χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά διάλυμα δεξτρόζης δόσης 2g δεξτρόζης / Kg σωματικού βάρους (200 μl /25 g ποντικού), και μετρήθηκαν τα επίπεδα της γλυκόζης στο αίμα στα 15, 30, 60, 120 λεπτά μετά την χορήγηση Δοκιμασία Αντίστασης στην Ινσουλίνη Υλικά Ειδικές θήκες παγίδευσης μυών (Mouse Restrainer adult mice & neonate rats, IITC.84, Campden Instruments Ltd., UK) 60

61 Ειδικά τριχοειδή σωληνάκια λήψης αίματος (Microvette for capillary blood collection, CB 300, Sarstedt, D Numbrecht, Germany) Πλαστικά σωληνάκια 1.5 ml (Reaction Tubes, , Greiner Bio-One) Κιτ προσδιορισμού επιπεδων γλυκόζης (Glucose GOD FS, DiaSys) Ινσουλίνη (Humulin Regular, Lilly) Διάλυμα ινσουλίνης ( U / ml PBS 1x) PBS 10X (800 ml dd H2O + 80 g NaCl + 2 g KCl g Na2HPO g KH2PO4) PBS 1X ( 50 ml PBS 10X ml dd H2O) Πειραματική πορεία Αρχικά, παρασκευάστηκε διάλυμα ινσουλίνης συγκέντρωσης 0.125u/ml PBS 1X. Στα ποντίκια μετρήθηκαν τα βασικά επίπεδα της γλυκόζης του αίματος ύστερα από νηστεία 16 ωρών, όπως έχει περιγραφεί παραπάνω. Στη συνέχεια, τους χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά δόση διαλύματος 0,5 U / Kg (200 μl διαλύματος ινσουλίνης/25 g σωματικού βάρους ποντικού) και μετρήθηκαν τα επίπεδα της γλυκόζης στα 15, 30, 60, 120 λεπτά μετά την χορήγηση Θυσίες και λήψη ιστών από τα πειραματόζωα Υλικά Ισοφλουράνιο (AEranne Isoflurane, USP, NDC , Baxter, USA) Σωληνάκια συλλογής αίματος (Microtubes for pediatric blood collection CB1000, Sarstedt, D Numbrecht, Germany) 70% αιθανόλη (Ethanol, K , Merck, Germany) (70ml αιθανόλης 100% + 30 ml ddh2o) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Υγρό άζωτο Πλαστικά σωληνάκια 1.5 ml (Reaction Tubes, , Greiner Bio-One) Πειραματική πορεία Τα πειραματόζωα νήστεψαν για 16 ώρες. Η αναισθησία έγινε βάζοντας το ζώο σε γυάλλινο δοχείο με βαμβάκι εμποτισμένο σε ισοφλουράνιο. Στη συνέχεια, αφαιρέθηκε ο οφθαλμός με λαβίδα και λήφθηκε αίμα μέσω του περικογχικού φλεβικού κόλπου (περίπου μl) σε ειδικά σωληνάκια που περιείχαν EDTA αντιπηκτικό. Έπειτα, τα ναρκωμένα πειραματόζωα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με αυχενική μετατόπιση. Το αίμα φυλάχθηκε σε πάγο έως την στιγμή της απομόνωσης του πλάσματος με φυγοκέντρηση στα 1.500g για 10 λεπτά, στους 4 o C. Το 61

62 πλάσμα συλλέχθηκε σε πλαστικά σωληνάκια και φυλάχθηκε στους -20 ο C για περαιτέρω αναλύσεις. Το ζώο τοποθετήθηκε με την ραχιαία πλευρά προς τα πάνω σε χειρουργικό τραπέζι. Η περιοχή αποστειρώθηκε με διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης 70% και έγινε μια τομή, με αποστειρωμένο χειρουργικό ψαλίδι, στο μέσω της ραχιαίας περιοχής έως τον αυχένα ώστε να αποκαλυφθεί ο φαιός λιπώδης ιστός. Αυτός απομονώθηκε αποκόβοντάς τον από τους συνδέσμους που το συγκρατούν, ξεπλύθηκε σε τρυβλίο με διάλυμα PBS 1x, τοποθετήθηκε σε πλαστικά σωληνάκια, ψύχθηκε άμεσα σε υγρό άζωτο και φυλάχθηκε στους -80 o C για μελλοντική χρήση. Kαθώς το ζώο βρισκόταν με την ραχιαία πλευρά εκτεθειμένη, έγινε απομόνωση του υποκνημιδίου μυός (soleus). Αποστειρώθηκε η περιοχή του μηρού και της κνήμης με διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης 70% και με αποστειρωμένο χειρουργικό ψαλίδι, έγινε μια τομή στο κάτω μέρος της γάμπας. Ταυτόχρονα με αποστειρωμένη λαβίδα και βελόνα έγινε η αποκάλυψη του υποκνημιδίου μυός ο οποίος εκφύεται με δύο εκφύσεις, την κνημιαία από την κνήμη και την περονιαία από τη περόνη και καταφύεται στην πτέρνα μετά το σχηματισμό του αχίλλειου τένοντα. Στην συνέχεια το ζώο τοποθετήθηκε με την κοιλιακή πλευρά προς τα πάνω, η οποία αποστειρώθηκε με διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης 70% και στην συνέχεια ανοίχθηκε με αποστειρωμένο χειρουργικό ψαλίδι. Με νυστέρι σκίστηκε το περιτόναιο και αφαιρέθηκε το ήπαρ, αποκόβοντάς το από τα αγγεία και τους συνδέσμους που το συγκρατούν. Ξεπλύθηκε σε τρυβλίο με διάλυμα PBS 1x και κόπηκε σε μικρότερα τμήματα, τα οποία τοποθετήθηκαν σε πλαστικά σωληνάκια, ψύχθηκαν άμεσα σε υγρό άζωτο και τοποθετήθηκαν στους -80 o C για μελλοντική χρήση. 3.2 Αναλύσεις στο πλάσμα των πειραματοζώων Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων στο πλάσμα Αρχή της μεθόδου Ο προσδιορισμός των επιπέδων των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα έγινε με το Serum Triglyceride Determination Kit (Sigma, TR 0100). Το kit αυτό μας δίνει την δυνατότητα να προσδιορίσουμε τα επίπεδα γλυκερόλης, πραγματικών τριγλυκεριδίων και ολικών τριγλυκεριδίων σε πλάσμα ή ορό. Τα τριγλυκερίδια, οι εστέρες λιπαρών οξέων και η γλυκερόλη είναι υδρόφοβα μόρια και η κυκλοφορία τους στο πλάσμα, είναι εφικτή μόνο όταν προσδένονται με τις απολιποπρωτεΐνες. Για τον προσδιορισμό τους είναι απαραίτητη η υδρόλυση των τριγλυκεριδίων σε γλυκερόλη και ελεύθερα λιπαρά οξέα και στη συνέχεια η ενζυματική μέτρηση της γλυκερόλης. 62

63 Η διαδικασία περιλαμβάνει την υδρόλυση των τριγλυκεριδίων από την LpL. Στη συνέχεια η γλυκερόλη φωσφορυλιώνεται από το ATP με τη βοήθεια της κινάσης της γλυκερόλης (GK) σε 1- φωσφορική γλυκερόλη (G-1-P) και οξειδώνεται σε φωσφορική διυδρόξυακετόνη (DAP) με τη βοήθεια της οξειδάσης της φωσφορικής γλυκερόλης (GPO), με ταυτόχρονη απελευθέρωση υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2). Τέλος καταλύεται η σύνδεση του Η2Ο2 με την 4- αμινοαντιπυρίνη (4-AAP) και την νατριϊκή Ν-αιθυλο-Ν-(3-θειοπροπυλο)-m-ανισιδίνη (ESPA) από την υπεροξειδάση (POD) και παράγεται η χρωστική κινονιμίνη, της οποίας η απορρόφηση μετράται στα 540nm. Υλικά Serum Triglyceride Determination Kit (Sigma, TR 0100, Missouri USA) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Μικροπλάκες 96 κελιών (microwell plate, Thermo Fisher Scientific Nunc, Denmark) Φωτόμετρο (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) Πειραματική πορεία Αρχικά, προετοιμάστηκαν τα πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης μέσω διαδοχικών αραιώσεων του πρότυπου διαλύματος με PBS 1x. Συγκεκριμένα παρασκευάστηκαν έξι αραιώσεις από το πρότυπο διάλυμα συγκέντρωσης S. Οι S/2, S/4, S/8, S/16, S/32 και S/64. Στα πρώτα κελιά των δύο τελευταίων σειρών της μικροπλάκας φορτώθηκαν 7,5μl τυφλό διάλυμα που είναι καθαρό PBS 1x ph 7,4 και στα υπόλοιπα κελιά από 7,5μl πρότυπων διαλυμάτων ξεκινώντας από το πιο αραιό (S/64) και καταλήγοντας στο πιο πυκνό (S) (Εικόνα 10). Στα υπόλοιπα πηγαδάκια προστέθηκαν 7,5μl από τα δείγματά μας τα οποία είχουμε αραιώσει με PBS 1x σε μια αναλογία 1:3. Στη συνέχεια προστέθηκαν 100μl από το αντιδραστήριο Α και η μικροπλάκα τοποθετήθηκε στην μηχανή ανάδευσης για 10 λεπτά. Φωτομετρήσαμε με το ειδικό φασματοφωτόμετρο στα 540nm και προσθέσαμε 30μl από το αντιδραστήριο Β. Τοποθετήσαμε την πλάκα στην μηχανή ανάδευσης για 45 λεπτά και φωτομετρήσαμε ξανά με το ειδικό φασματοφωτόμετρο στα 540nm. Η συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων στα άγνωστα δείγματα προκύπτει από την απορρόφηση τους με βάση την πρότυπη καμπύλη που δημιουργείται από τις απορροφήσεις των αραιώσεων του πρότυπου διαλύματος. Εικόνα 10: Μικροπλάκα 96 κελιών όπου προσδιορίστηκαν τα επίπεδα τριγλυκεριδίων του πλάσματος 63

64 Η επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε αφαιρώντας από τη δεύτερη μέτρηση, η οποία περιλαμβάνει την ολική γλυκερόλη (ελεύθερη γλυκερόλη του πλάσματος συν αυτή που αποδεσμεύτηκε από τα τριγλυκερίδια), την πρώτη που αφορά στην ελεύθερη γλυκερόλη που κυκλοφορεί στο αίμα. Η τιμή που παίρνουμε αντιστοιχεί στα επίπεδα των τριγλυκεριδίων εκφρασμένα σε mg λιπιδίων/dl πλάσματος Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα Αρχή της μεθόδου Ο προσδιορισμός των επιπέδων ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα έγινε με την χρήση του Infinity Cholesterol Liquid Stable Reagent. Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι η υδρόλυση των εστέρων χοληστερόλης με την εστεράση της χοληστερόλης (CE) σε χοληστερόλη και ελεύθερα λιπαρά οξέα. Στη συνέχεια οξειδώνεται η χοληστερόλη με την οξειδάση της χοληστερόλης (CO) και απελευθερώνεται Η2Ο2. Τέλος, το Η2Ο2 αντιδρά με το υδροξυ-βενζοϊκό οξύ και την 4-αμινοαντιπυρίνη μέσω της υπεροξειδάσης (POD) σχηματίζοντας τη χρωστική κυνομιμίνη, που απορροφά φως και βάσει αυτής της απορρόφησης και συγκριτικά με την απορρόφηση των προτύπων γίνεται ο υπολογισμός της συγκέντρωσης των δειγμάτων. Υλικά Infinity Cholesterol Liquid Stable Reagent (TR , Thermo Electron, Melbourne, Australia) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Μικροπλάκες 96 κελλίων (microwell plate, Thermo Fisher Scientific Nunc, Denmark) Φωτόμετρο (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) Πειραματική πορεία Αρχικά, προετοιμάστηκαν τα πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης μέσω διαδοχικών αραιώσεων του πρότυπου διαλύματος με PBS 1x. Συγκεκριμένα παρασκευάστηκαν έξι αραιώσεις από το πρότυπο διάλυμα συγκέντρωσης S. Οι S/2, S/4, S/8, S/16, S/32 και S/64. Στα πρώτα κελιά των δύο τελευταίων σειρών της μικροπλάκας φορτώθηκαν 7,5μl τυφλό διάλυμα που είναι καθαρό PBS 1x, ph 7,4 και στα υπόλοιπα κελιά από 7,5μl πρότυπων διαλυμάτων ξεκινώντας από το πιο αραιό (S/64) και καταλήγοντας στο πιο πυκνό (S). Στα υπόλοιπα πηγαδάκια προστέθηκαν 7,5μl από τα δείγματά μας τα οποία έχουμε αραιώσει με PBS 1x σε μια αναλογία 1:3. Στη συνέχεια προστέθηκαν 100μl του αντιδραστηρίου Infinity και τοποθετήσαμε την μικροπλάκα σε μηχανή ανάδευσης για 20 λεπτά. Τέλος, φωτομετρήσαμε στο ειδικό φασματοφωτόμετρο στα 490nm. Η συγκέντρωση της χοληστερόλης στα άγνωστα 64

65 δείγματα προκύπτει από την απορρόφηση της με βάση την πρότυπη καμπύλη που δημιουργείται από τις απορροφήσεις των αραιώσεων του πρότυπου διαλύματος Κλασματοποίηση λιποπρωτεϊνών του πλάσματος με υπερφυγοκέντρηση διαβαθμισμένης πυκνότητας Αρχή της μεθόδου Οι λιποπρωτεΐνες διαφέρουν μεταξύ τους ως προς το μέγεθος και την πυκνότητά τους, χαρακτηριστικά που εξαρτώνται από την σύστασή τους σε απολιποπρωτεΐνες και λιπίδια, όπως έχει ήδη αναφερθεί. Με την μέθοδο της υπερφυγοκέντρησης διαβαθμισμένης πυκνότητας επιτυγχάνεται η επίπλευσή τους σε διαφορετικές πυκνότητες αλατούχου διαλύματος. Συνήθως για την κλασματοποίηση των λιποπρωτεϊνών του ανθρώπινου πλάσματος χρησιμοποιείται διάλυμα βρωμιούχου καλίου (ΚΒr). Στα διάφορα κλάσματα που συλλέγονται μετά την υπερφυγοκέντρηση, αρχικά απομονώνονται τα χυλομικρά με πυκνότητα <0,95 g/ml και οι VLDL με 0,94-1,006 g/ml. Οι λιποπρωτεΐνες IDL και LDL βρίσκονται στα κλάσματα με πυκνότητα 1,019-1,063 g/ml IDL και τις LDL και τέλος οι ΗDL στα κλάσματα με πυκνότητα 1,063-1,21 g/ml. Σε πυκνότητες άνω του 1,21 g/ml εντοπίζονται οι μη λιπιδιωμένες πρωτεΐνες του πλάσματος. Ο υπολογισμός της μάζας του KBr που απαιτείται για την επιθυμητή πυκνότητα στην οποία θα επιπλεύσει το κάθε κλάσμα λιποπρωτεϊνών γίνεται με τη βοήθεια του εξής τύπου: Υλικά Final Volume (target density 1) 1 (0.298 target density) Βρωμιούχο Κάλιο (KBr, P , Fisher Scientific, New Jersey) 1,21 g/ml KBr (16.4g KBr σε 50 ml ddh2o) 1,063 g/ml KBr (4.61g KBr σε 50 ml ddh2o) 1,019 g/ml KBr (1.365g KBr σε 50 ml ddh2o) Ψυχόμενη υπερφυγόκεντρος (Beckman) Κεφαλή υπερφυγοκέντρου SW60 Σωλήνες διαβάθμισης (Ultra-Clear Centrifuge Tubes, Beckman, USA) SW60 ultracentrifugation rotor buckets (Beckman) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 65

66 Πειραματική πορεία Το δείγμα του πλάσματος πρέπει να έχει πυκνότητα 1,23 g/ml και τελικό όγκο 400μl οπότε προστέθηκε στο δείγμα 0,145g KBr και εν συνεχεία τοποθετήθηκε πρώτο μέσα στο σωλήνα διαβάθμισης. Έπειτα προστέθηκαν όλα τα διαλύματα του KBr, ξεκινώντας από το πιο πυκνό και καταλήγοντας στο πιο αραιό, πολύ αργά με πιπέτα ώστε τα διαλύματα να μην αναμιχθούν και να σχηματιστεί μια διακριτή επιφάνεια (διεπιφάνεια) μεταξύ των διαλυμάτων διαφορετικής πυκνότητας. Συγκεκριμένα, προστέθηκαν 0.8ml διαλύματος KBr (1,21 g/ml) και στη συνέχεια 2ml KBr (1,063 g/ml). Έπειτα, προστέθηκε 0,4ml KBr (1.019 g/ml) και τέλος 0,4ml PBS 1x ph 7,4 (Εικόνα 11). Οι σωλήνες ισοζυγίστηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στους 15 o C στις g για 20 ώρες. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης, συλλέχθηκαν σε σωληνάκια, δέκα κλάσματα των 400μl προσεκτικά, ώστε να μην αναμιχθούν τα κλάσματα. Από το κάθε κλάσμα τέλος, θα πρέπει να απομακρυνθεί το KBr ώστε να μπορέσουν να γίνουν οι απαραίτητες για την μελέτη βιοχημικές αναλύσεις. Ο καθαρισμός των κλασμάτων γίνεται με την μέθοδο της διαπίδυσης όπως περιγράφεται παρακάτω. Εικόνα 11: Σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας κλασματοποίησης λιποπρωτεϊνών του πλάσματος με υπερφυγοκέντρηση διαβαθμισμένης πυκνότητας Διαπίδυση στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Αρχή της μεθόδου Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό μικρών μορίων από μεγάλα μακρομόρια διαμέσου μεμβράνης εκλεκτικής διαπερατότητας. Βρίσκει κυρίως εφαρμογή στον διαχωρισμό μορίων από διαλύματα τα οποία περιέχουν μεγάλη συγκέντρωση αλάτων. Το διάλυμα που πρόκειται να υποστεί διαπίδυση, τοποθετείται σε σωλήνα ο οποίος σφραγίζεται με την ειδική μεμβράνη διαπίδυσης και βυθίζεται σε δοχείο με ρυθμιστικό διάλυμα ή ddh2o. Τα άλατα έρχονται σε ισορροπία μεταξύ των δύο πλευρών της μεμβράνης και διευκολύνεται η μετακίνησή τους. Οι 66

67 μεμβράνες που χρησιμοποιούνται είναι ειδικά κατασκευασμένες ώστε οι πόροι που διαθέτουν να εμποδίζουν την μετακίνηση μορίων που υπερβαίνουν κάποιο συγκεκριμένο μοριακό βάρος και να επιτρέπουν μόνο την μετακίνηση των αλάτων. Υλικά Μεμβράνη διαπύδησης με μοριακό βάρος αποκλεισμού τα 10κDa (Dialysis Membrane, , Medicell International LtD, neolab, London, England) Σωληνάκια (Fisherbrand Disposable Culture Tubes, , Fisher Scientific, USA) Καπάκια (Fisher brand, Tainer Top Safety, Fisher Scientific, USA) Μαγνητικός αναδευτήρας (Chimarec 2, Thermolyne) Δις-απεσταγμένο νερό (ddh2o) Αέριο Άζωτο Paraffin film (Parafilm, Pechiney Plastic Packaging Company, USA) Πειραματική πορεία Τα σωληνάκια που συλλέχθηκαν μετά την υπερφυγοκέντρηση, σκεπάστηκαν με την μεμβράνη διαπίδυσης και κλείστηκαν με τα καπάκια tainer top safety. Πριν χρησιμοποιηθεί η μεμβράνη, τοποθετήθηκε σε διάλυμα EDTA σε ddh2o που έβραζε ώστε να απομακρυνθεί η λιπαρή ουσία με την οποία είναι επεξεργασμένη. Τα σωληνάκια βυθίστηκαν με τα καπάκια προς τα κάτω σε ένα ποτήρι ζέσεως που περιείχε ddh2o και τοποθετήθηκαν στους 4 o C πάνω σε μαγνητικό αναδευτήρα για 24 ώρες, ενώ σε τακτά χρονικά διαστήματα το ddh2o ανανεωνόταν. Τέλος, τα κλάσματα μεταφέρθηκαν σε σωληνάκια 1,5ml. Τα κλάσματα, τοποθετούνται για περίπου ένα λεπτό κάτω από συνεχή ροή αέριου αζώτου, ώστε να απομακρυνθεί το οξυγόνο, στην συνέχεια σφραγίζονται με parafilm και αποθηκεύονται στους -20 ο C. O λόγος για τον οποίο απομακρύνεται το οξυγόνο, είναι ότι στα κλάσματα γίνονται αναλύσεις της αντιοξειδωτικής ικανότητας της HDL, όπως θα αναφερθεί παρακάτω, ως εκ τούτου η HDL δεν θα πρέπει να έρχεται σε επαφή με οξυγόνο μέχρι να γίνουν οι αναλύσεις Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Υλικά Infinity Cholesterol Liquid Stable Reagent (TR , Thermo Electron, Melbourne, Australia) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Μικροπλάκες 96 κελλίων (microwell plate, Thermo Fisher Scientific Nunc, Denmark) 67

68 Φωτόμετρο (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) Συσκευή ξήρανσης (Speed-vac, Savant) Πειραματική πορεία Ο προσδιορισμός των επιπέδων της ολικής χοληστερόλης στα κλάσματα των λιποπρωτεϊνών έγινε, όπως περιγράφηκε παραπάνω στον προσδιορισμό των επιπέδων των τριγλυκεριδίων. Η διαφορά είναι ότι στην μικροπλάκα φορτώθηκαν 20μl από τα πρότυπα διαλύματα και 20μl δείγματος συμπυκνωμένο 2 φορές. Συγκεκριμένα 40μl από το κάθε κλάσμα μεταφέρθηκαν σε σωληνάκια 1,5ml και φορτώθηκαν στο Speed-vac. Μόλις τα δείγματα ξηράνθηκαν, επαναδιαλύθηκε το ίζημα σε 20μl PBS 1x ph 7,4. Σε αυτά τα 20μl προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της ολικής χοληστερόλης Ανάλυση απολιποπρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Αρχή της μεθόδου Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικές συνθήκες (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών, βάσει του μοριακού τους βάρους, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου σταθερής τάσης. Συγκεκριμένα οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες αποδιατάσσονται με την προσθήκη του απορρυπαντικού SDS, το οποίο σχηματίζει σύμπλοκα με τις πρωτεΐνες και καλύπτει την επιφάνειά τους με μόρια SDS, προσδίδοντάς τους ένα ισχυρά αρνητικό ηλεκτρικό φορτίο. Επίσης, προστίθεται ένας αναγωγικός παράγοντας η δυ-θειοθρεϊτόλη (Diothreitol, DTT) για τη διάσπαση των δισουλφιδικών δεσμών (S-S). Κάτω από αυτές τις συνθήκες οι πρωτεΐνες μεταναστεύουν με ταχύτητα ανάλογη του μοριακού τους βάρους. Το μοριακό βάρος μιας πρωτεΐνης υπολογίζεται σε σχέση με την ηλεκτροφορητική μετανάστευση πρωτεϊνών γνωστού μοριακού βάρους. Οι πηκτές πολυακρυλαμιδίου σχηματίζονται με πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου με το αντιδραστήριο διασταύρωσης Ν,Ν μεθυλένο-δισ-ακρυλαμίδιο. Ο πολυμερισμός καταλύεται από το υπερθειικό αμμώνιο (APS), που προκαλεί την δημιουργία ελευθέρων ριζών, και τον καταλύτη N,N τετραμεθυλ-ενο-αιθυλ-ενο-διαμίνη (TEMED), που καταλύει την μετάδοση ελευθέρων ριζών στο σύστημα. Η πυκνότητα της πηκτής εξαρτάται από το μέγεθος των πρωτεϊνών που θέλουμε να διαχωρίσουμε. Η πηκτή αποτελείται από δύο τμήματα, την πηκτή διαχωρισμού (separating gel), που διαχωρίζει τις πρωτεΐνες, και την πηκτή επιστοίβαξης (stacking gel), όπου γίνεται η 68

69 εναπόθεση των δειγμάτων, ώστε όλες οι πρωτεΐνες να ξεκινήσουν από το ίδιο σημείο και να αυξηθεί η διακριτική ικανότητα διαχωρισμού (Εικόνα 12). Εικόνα 12 Γραφική απεικόνιση της πορείας της SDS-page. 1) Αποδιάταξη των πρωτεϊνών με τη χρήση του αποδιατακτικού παράγοντα SDS. 2) Φόρτωση του μίγματος των λιποπρωτεϊνών στο πήκτωμα και εφαρμογή ηλεκτρικού ρεύματος. Οι πρωτεΐνες μετακινούνται προς το θετικό πόλο Υλικά Συσκευή κατακόρυφης ηλεκτροφόρησης (Biorad) και τροφοδοτικό σταθερής έντασης (E-C, Apparatus Corporation) Glass Plates (Spacer Plates with 1.5 mm spacer, , Bio-Rad, USA) Glass Plates (Short Plates, , Bio-Rad, USA) 20% (w/v) Sodium Dodecyl Sulfate (SDS, ART. NR , Carl Roth GmbH) (20g SDS + 80 ml ddh2o) Tris-HCl 1.5 M ph 8,8 Tris-HCl 1.5 M ph 6,8 30% (w/v) ακρυλαμίδιο / 0.8% (w/v) δις-ακρυλαμίδιο (75g high grade acrylamide + 2g bisacrylamide + ddh2o μέχρι τα 250ml) 20% (w/v) Υπερθειϊκό αμμώνιο (Ammonium Persulfate, APS, BP , Fisher Scientific, USA) (20 g APS ml ddh2o) N,N, N,N - Tetramethylethylenediamine (TEMED, T7024, Sigma-Aldrich, USA) 10X Running Buffer (30 g Tris g Glycine + 10 g SDS + ddh2o μέχρι το 1L) 1X Running Buffer (50 ml 10X Running Buffer ml ddh2o) 69

70 Διάλυμα φόρτωσης δειγμάτων (Sample loading buffer) (50 mm Tris.Cl ph mm Dithiothreitol + 2% SDS + 0.1% Bromophenol Blue + 10% Glycerol) Prestained Protein Marker, Broad Range (#P7708S, Biolabs, New England) Ισοπροπανόλη (2-Propanol, , Panreac Quimica Sau, Barcelona, Spain) Συσκευή ξήρανσης (Speed-vac, Savant) Πειραματική πορεία Η πηκτή διαχωρισμού και η πηκτή επιστοίβαξης προετοιμάστηκαν σε δύο σωλήνες falcon των 50ml, όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα. Το TEMED προστέθηκε τελευταίο εφόσον με την προσθήκη του ξεκινά ο πολυμερισμός. Πηκτή Διαχωρισμού 12% Πηκτή επιστοίβαξης 5% Ακρυλαμίδιο / δις-ακρυλαμίδιο (12ml) Ακρυλαμίδιο / δις-ακρυλαμίδιο (1,660ml) ddh2o (9,8ml) ddh2o (6,8ml) Tris-HCl ph8,8 (7,6ml) Tris-HCl ph6,8 (1,260ml) SDS 10% (300μl) SDS 10% (100μl) APS 10% (300μl) APS 10% (100μl) TEMED (12μl) TEMED (10μl) Πίνακας 4 Συστατικά των πηκτών επιστοίβαξης και διαχωρισμού Η πηκτή διαχωρισμού προστέθηκε ανάμεσα στις δύο γυάλινες πλάκες και απομακρύνθηκαν τυχόν φυσαλίδες με την προσθήκη ισοπροπανόλης. Μόλις πολυμερίστηκε η πηκτή διαχωρισμού αφαιρέθηκε η ισοπροπανόλη με διηθητικό χαρτί και προστέθηκε η πηκτή επιστοίβαξης μαζί με μια οδοντωτή μήτρα με 15 εσοχές, που σχηματίζουν τα κελιά για το φόρτωμα των δειγμάτων. Στην συνέχεια οι πλάκες με τις πηκτές μεταφέρθηκαν στη συσκευή ηλεκτροφόρησης στην οποία τοποθετήθηκε το ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης 1x Running Buffer. Σε σωληνάκια 1,5ml προστέθηκαν 100μl δέιγματος από το κάθε κλάσμα και μεταφέρθηκαν στο Speed-vac έως ότου ξηρανθούν. Στην συνέχεια επαναδιαλύθηκε το ίζημα σε 20μl ddh2o και προστέθηκαν 5μl Sample Loading Buffer. Προκειμένου να αποδιαταχθούν τα μόρια των πρωτεϊνών, τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε συσκευή θέρμανσης στους 100 o C για 4 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για λιγότερο από 1 λεπτό σε μέγιστη ταχύτητα (spindown). Τέλος φορτώθηκαν τα δείγματα στην συσκευή ηλεκτροφόρησης ξεκινώντας με 5μl από τον μάρτυρα στο πρώτο κελάκι και στην συνέχεια τα δείγματα. Η ηλεκτροφόρηση έγινε στα 70 Volt για περίπου 90 λεπτά. Για τον εντοπισμό των πρωτεϊνικών ζωνών γίνεται ανοσοαποτύπωση κατά Western όπως περιγράφεται ακολούθως. 70

71 3.2.7 Ανοσοαποτύπωση κατά Western (Western Βlot) Αρχή της μεθόδου Η τεχνική περιλαμβάνει την μεταφορά πρωτεϊνών από την πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη PVDF με την εφαρμογή ηλεκτρικού ρεύματος. Οι πρωτεΐνες δεσμεύονται πάνω στη μεμβράνη μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, αλλά διατηρούν τις αντιγονικές τους ιδιότητες. Έτσι μπορούν να αναγνωριστούν από τα αντισώματα. Χρησιμοποιείται ένα αντίσωμα το οποίο αναγνωρίζει την πρωτεΐνη, και ένα δεύτερο που αναγνωρίζει μία περιοχή του πρώτου. Στο δεύτερο αντίσωμα επίσης, βρίσκεται ομοιοπολικά συνδεδεμένο το ένζυμο της υπεροξειδάσης, το οποίο όταν αντιδράσει με το υπεροξείδιο του υδρογόνου, προκαλεί χημειοφωταύγεια. Έτσι εμφανίζεται φωτεινό σήμα στο σημείο όπου βρίσκεται η πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει. Υλικά 10Χ Transfer Buffer (10.1g Tris Base + 72 g Glycine + ddh20 μέχρι τα 500 ml) 1X Transfer Buffer (50 ml 10X Transfer Buffer ml ddh2o) Συσκευή και κασέτα μεταφοράς Μεμβράνη μεταφοράς (Μεμβράνη φθωριούχου πολυβινυλδενίου, Porablot PVDF membrane, REF , Macherey-Nagel, Germany) Μεθανόλη (Methanol for analysis, I557009, Merck, Germany) Διηθητικό χαρτί (Whatmann) 5% Blotting milk (10 g Blotting grade blocker-non-fat dry milk, Biorad σε 200 ml PBS 1x) Πρωτοταγές αντίσωμα για την ανίχνευση της apoa-i (αραίωση: 1:1000 σε 5ml blotting milk 5%). Polyclonal Antibody to ApoA-I (N-term) Rabbit IgG (Acris antibodies, cat # AP23390PU- N) Πρωτοταγές αντίσωμα για την ανίχνευση της apoa-ii (αραίωση: 1:1000 σε 5ml blotting milk 5%). Polyclonal Antibody to apoa-ii (N-term) Human IgG (Acris antibodies, cat # AP23390PU-N) Πρωτοταγές αντίσωμα για την ανίχνευση της apoe (αραίωση: 1:1000 σε 5ml blotting milk). Polyclonal Antibody to apoe (N-term)(6c5) Human IgG (Acris antibodies, cat # AP23390PU- N) Δευτεροταγές αντίσωμα (αραίωση: 1:4000 σε 8 ml blotting milk 5%) anti-goat IgG, (Santa Cruz Biotechnology Inc.) Washing buffer (5 ml NP-40 IGEPAL, Sigma σε1 L PBS 1x) Κασέτα εμφάνισης του φιλμ 71

72 ECL (10 ml Luminol 1.25 mm ph μl p-coumaric acid 68 mm + 30 μl hydrogen peroxide 3%) Developer (P7042-1GA, Sigma-Aldrich, USA) Διάλυμα Developer (828 ml Developer L ddh2o) Fixer (P7167-1GA, Sigma-Aldrich, USA) Διάλυμα Fixer (828 ml Fixer L ddh2o) Kodak film 13cm x 18cm (Biomax Xar Film) Πειραματική πορεία Α. Μεταφορά των πρωτεϊνών από την πηκτή πολυακρυλαμιδίου στη μεμβράνη PVDF Η μεμβράνη PVDF αρχικά ενεργοποιήθηκε με εμβάπτιση σε μεθανόλη. Έπειτα σε ένα δοχείο που περιέχει 1x Transfer Buffer τοποθετήθηκαν στην κασέτα μεταφοράς, με κατεύθυνση από την κάθοδο προς την άνοδο, τα ακόλουθα : Σφουγγαράκι - τρία κομμάτια διηθητικού χαρτιού - Πηκτή - Μεμβράνη PVDF - τρία κομμάτια διηθητικού χαρτιού Σφουγγαράκι (Εικόνα 13). Αφαιρέθηκαν τυχόν φυσαλίδες και η κασέτα μεταφοράς τοποθετήθηκε στην ειδική συσκευή, η οποία περιείχει ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς 1x. Εφαρμόστηκε ηλεκτρικό ρεύμα σταθερής έντασης 30 Volt για 24 ώρες στους 4 o C. Σφουγγαράκια Διηθητικά χαρτιά Gel _ + Μεμβράνη Gel Μεμβράνη PVDF Κασέτα Εικόνα 13 Μεταφορά πρωτεϊνικού δείγματος από την πηκτή στη μεμβράνη PVDF Β. Ανοσοαποτύπωση Η μεμβράνη PVDF που πλέον περιείχει τις πρωτεΐνες επωάστηκε σε 5ml blotting milk 5% για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου πάνω σε μηχάνημα ήπιας ανάδευσης. Στη συνέχεια απομακρύνθηκε το blotting milk και η μεμβράνη επωάστηκε υπό ανάδευση με 5ml πρωτοταγούς αντισώματος (αραίωση 1:1000) για 24 ώρες στους 4 o C. Ακολούθησαν τρείς πλύσεις της μεμβράνης με 100ml washing buffer για 15 λεπτά υπό ανάδευση. Προστέθηκε το δευτεροταγές αντίσωμα (αραίωση 1:4000) και η μεμβράνη επωάστηκε υπο ανάδευση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (Εικόνα 14Εικόνα 14). Τέλος, ακολούθησαν τρείς πλύσεις με washing buffer για 15 72

73 λεπτά και η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε διάλυμα PBS 1x, ώσπου να γίνει η αυτοραδιογραφία όπως περιγράφεται παρακάτω. Γ. Αυτοραδιογραφία Η μέθοδος της αυτοραδιογραφίας βασίζεται στην χημική αντίδραση των οπτικών φωτονίων με τους κόκκους αλογονούχου Ag του φιλμ. Τα οπτικά φωτόνια μετατρέπουν τα ιόντα αργύρου σε μεταλλικό άργυρο. Κατά την εμφάνιση του φιλμ, οι κόκκοι αλογονούχου αργύρου που δεν αντέδρασαν απομακρύνονται, ενώ ο μεταλλικός άργυρος μαυρίζει στα σημεία αλληλεπίδρασης με την ακτινοβολία. Μέσα σε σκοτεινό θάλαμο, η μεμβράνη επωάστηκε για 1 λεπτό σε διάλυμα ΕCL που περιείχε υπεροξείδιο του υδρογόνου. Στην συνέχεια τοποθετήθηκε στην κασέτα εμφάνισης ανάμεσα σε δύο πλαστικές διαφάνειες, επάνω από τις διαφάνειες τοποθετήθηκε το φιλμ και έκλεισε η κασέτα εμφάνισης. Το κάθε φιλμ έμεινε στην κασέτα 1-4 λεπτά και στη συνέχεια βυθίστηκε σε διάλυμα developer (περίπου 1 λεπτό), ξεπλύθηκε σε νερό και βυθίστηκε σε διάλυμα fixer μέχρι να γίνει διαυγές και να μονιμοποιηθεί. Δευτεροταγές αντίσωμα HRP + ECL Χημειοφωταύγεια Πρωτοταγές αντίσωμα Μεμβράνη Πρωτεΐνη Εικόνα 14: Επώαση με blotting milk και αντισώματα (πρωτοταγές και δευτεροταγές) Αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης Αρχή της μεθόδου Η παρακάτω μέθοδος στόχο έχει την ποσοτικοποίηση του ποσοστού ανάστροφης μεταφοράς χοληστερόλης, από κύτταρα που βρίσκονται σε καλλιέργεια. Συγκεκριμένα μετράται η ικανότητα των κυττάρων να απελευθερώνουν την περίσσεια ενδοκυττάριας ραδιοσημασμένης χοληστερόλης, παρουσία της HDL του πλάσματος των πειραματόζωων. Υλικά για τον προσδιορισμό της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης από την HDL Κυτταρική σειρά HTB-13 (ATCC) (4-14 C) χοληστερόλη, S.A. 50mCi/mmol (American Radiolabeled Chemicals Inc.) 73

74 Καθαρή ανθρώπινη Απολιποπρωτεϊνη Α-Ι (Millipore) Θρεπτικό μέσο Leibovitz s L-15 (Biochrome AG) Εμβρυϊκός Βόειος Ορός (Fetal Bovine Serum - FBS) (Biochrom AG) Μη απαραίτητα αμινοξέα (Non essential aminoacids, NEA) (Biochrome AG) L-Glutamine (Biochrome AG) Πενικιλλίνη / Στρεπτομυκήνη (Penicillin / Streptomycin, Pen-Strep) (Biochrome AG) Trypsin / EDTA Solution (Biochrome AG) Triton X-100 (MP Biomedicals, LLC) NaOH (Sigma) NaCl (Sigma) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Πιάτο καλλιέργειας 12 κελιών (12-well plate) (Greiner bio-one, CELLSTAR) Πλαστικά φιαλίδια μέτρησης ραδιενέργειας 20ml (Sigma) Επωαστής 37 o C (Thermo Scientific) Μετρητης σπινθηρισμού υγρών β-ακτινοβολίας (LS 6500 Multi-Purpose, Scintillation Counter, Beckman) Υγρό σπινθηρισμού (Scintillation liquid) (Quicksafe A, Zinsser Analytic, Germany) Ξέστρο κυττάρων (Cell scraper) (Sigma) Διαλύματα: Complete medium Serum free medium Συστατικά Συγκέντρωση Συγκέντρωση (Ποσότητα) διαλύματος (Ποσότητα) Leibovitz s L-15 (500ml) (500ml) FBS 10% (50ml) - NEA 1% (5ml) 1% (5ml) L-glutamine 1% (5ml) 1% (5ml) Pen-Strep 1% (5ml) 1% (5ml) Πίνακας 5 Σύσταση Θρεπτικού μέσου με ορό (Complete medium) και Θρεπτικού μέσου χωρίς ορό (Serum free medium) 74

75 Labeling medium Συγκέντρωση (Ποσότητα / Συστατικά διαλύματος κελί) Complete medium (1ml) (4-14 C) χοληστερόλη, 50mCi/mmol 1 (1μl) Πίνακας 6 Σύσταση Διαλύματος σήμανσης (Labeling medium). Efflux solution Συγκέντρωση (Ποσότητα / Συστατικά διαλύματος κελί) Serum free medium (250μl) Πλάσμα αίματος πειραματόζωων 2% (5μl) Πίνακας 7: Σύσταση Διαλύματος efflux (Efflux solution). Διάλυμα λύσης κυττάρων Συστατικά διαλύματος Συγκέντρωση (Ποσότητα) PBS 1x (1.000ml) NaOH 0,2M (8g) NaCl 0,15M (8,76μl) Πίνακας 8 Σύσταση Διαλύματος λύσης κυττάρων. Πειραματική Πορεία Καλλιέργεια Κυττάρων Για τον προσδιορισμό της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης, χρησιμοποιήθηκαν ΗΤΒ- 13 κύτταρα, τα οποία ισομοιράστηκαν στα κελιά ενός πιάτου 12 κελιών (12-well plate), έπειτα από τρυψινοποίηση και ανακαλλιέργειά τους. Χρησιμοποιήθηκαν φλάσκες Τ-75 και όταν η πληρότητα των κυττάρων πλησίαζε το 80%, τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν. Αρχικά απομακρύνθηκε από τις φλάσκες το θρεπτικό υλικό (10% FBS, 1% ΝΕΑ, 1% pen-strep, 1% L- glutamine σε Leibovitz s L-15). Ακολούθησαν δύο πλύσεις με PBS 1x ώστε να απομακρυνθεί ο αναστολέας της τρυψίνης, που περιέχεται στα φυσικά συστατικά του ορού FBS. Έπειτα προστέθηκε 1ml διάλυμα τρυψίνης 1x (Trypsin-EDTA 10x σε PBS 1x). Οι φλάσκες τοποθετήθηκαν στον επωαστήρα για 5 λεπτά, ώστε το ένζυμο τρυψίνη να ενεργοποιηθεί και να 75

76 υδρολύσει τις πρωτεΐνες του υποστρώματος των κυττάρων προκειμένου να αποκολληθούν από την επιφάνεια καθώς και μεταξύ τους. Αμέσως μετά, ακολούθησε προσθήκη θρεπτικού υλικού ώστε να ανασταλεί η δράση του ενζύμου. Σε όρθια θέση της φλάσκας και με τη βοήθεια πιπέτας το θρεπτικό μέσο που περιείχε τα αποκολλημένα κύτταρα αναρροφήθηκε και εκχύθηκε αρκετές φορές, ώστε να διαλυθούν τα συσσωματώματα των κυττάρων. Τέλος, το περιεχόμενο κάθε φλάσκας μοιράστηκε σε δύο νέες φλάσκες Τ-75, συμπληρώθηκε επιπλέον θρεπτικό υλικό στην κάθε μια από αυτές και τοποθετήθηκαν εκ νέου στον επωαστήρα. Όταν συμπληρώθηκε ο απαραίτητος αριθμός κυττάρων, τότε αυτά μοιράστηκαν στα κελιά του πιάτου, για να ξεκινήσει η πειραματική πορεία προσδιορισμού της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης. Προσδιορισμός αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης από την HDL Αρχικά τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πιάτο 12 κελιών (12-well plate) με complete medium και μεταφέρθηκαν σε επωαστή (37 o C) ώσπου η πληρότητά τους να είναι 80-90%. Στην συνέχεια το θρεπτικό μέσο αντικαταστάθηκε με labeling comple medium (1ml / κελί) και τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες. Μετά το πέρας των 48 ωρών έγινε απόχυση του θρεπτικού μέσου και τα κελιά πλύθηκαν τρεις φορές με αποστειρωμένο διάλυμα PBS 1x. Προστέθηκαν 500μl serum free medium/κελί και το πιάτο μεταφέρθηκε στον επωαστή για 18 ώρες. Ακολούθησαν τρεις πλύσεις με PBS 1x και προστέθηκαν 250μl efflux solution/κελί. Σαν αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν κελιά που περιείχαν 250μl serum free medium. Στην συνέχεια έγινε δειγματοληψία (50μl) από κάθε κελί, σε χρονικό διάστημα 30 λεπτών, 2 και 6 ωρών, από την προσθήκη του efflux solution. Το κάθε δείγμα φυγοκεντρήθηκε στις g για 5 λεπτά και συλλέχθηκαν 40μl από το υπερκείμενο. Έπειτα προστέθηκαν 330μl διαλύματος λύσης κυττάρων σε κάθε κελί και έγινε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν από την επιφάνεια των κελιών με τη χρήση ξέστρου κυττάρων και συλλέχθηκαν 100μl / κελί. Κάθε ένα από τα δείγματα των 30 λεπτών, 2 και 6 ωρών (40μl) καθώς και τα 100μl που συλλέχθηκαν μετά την λύση των κυττάρων, μεταφέρθηκαν σε πλαστικά φιαλίδια μέτρησης ραδιενέργειας, τα οποία περιείχαν 10ml υγρό σπινθηρισμού. Η ποσότητα της ραδιοσημασμένης χοληστερόλης μετρήθηκε σε μετρητή σπινθηρισμού υγρών β-ακτινοβολίας. Το ποσοστό της ανάστροφης μεταφοράς χοληστερόλης υπολογίστηκε με βάση την ποσότητα της χοληστερόλης που μεταφέρθηκε από τα κύτταρα στην HDL. Η αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης υπολογίστηκε βάσει του τύπου: 76

77 Sample efflux Α / (A+B) *100% Blank efflux Γ / (Γ+Δ) *100% % Final Cholesterol Efflux % Sample efflux - % Blank efflux Όπου: Α = Οι κρούσεις που μετρήθηκαν στο θρεπτικό μέσο κάθε δείγματος (30min, 2h και 6h) * την αραίωση του δείγματος στο υγρό σπινθηρισμού. Β = Οι κρούσεις που μετρήθηκαν από την λύση των κυττάρων * την αραίωση του δείγματος λύσης κυττάρων, στο υγρό σπινθηρισμού. Γ = Οι κρούσεις που μετρήθηκαν στο θρεπτικό μέσο κάθε αρνητικού μάρτυρα (30min, 2h και 6h) * την αραίωση του δείγματος στο υγρό σπινθηρισμού. Δ = Οι κρούσεις που μετρήθηκαν από την λύση των κυττάρων του αρνητικού μάρτυρα * την αραίωση του δείγματος λύσης κυττάρων, στο υγρό σπινθηρισμού Αντιοξειδωτικό δυναμικό της HDL Αρχή της μεθόδου Η μέθοδος βασίζεται στην ικανότητα της διϋδροροδαμίνης 123 (DHR) να οξειδώνεται, με γραμμικό ρυθμό μεταξύ 10 και 50 λεπτών της ώρας, όταν έρχεται σε επαφή με τον ατμοσφαιρικό αέρα. Με την οξείδωση μετατρέπεται στο φθορίζον προϊόν (ροδαμίνη 123), του οποίου ο φθορισμός αυξάνει με τον ρυθμό της οξείδωσης (Εικόνα 15). Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η ταχύτητα οξείδωσης της DHR επηρεάζεται από τις ιδιότητες της HDL, τα δείγματα HDL ελέγχθηκαν για την επίδραση τους στο ρυθμό οξείδωσης DHR. Εικόνα 15: Μετατροπή της μη φθορίζουσας διϋδροροδαμίνης 123 σε φθορίζουσα ροδαμίνη 123 μετά από οξείδωση. 77

78 Υλικά Διϋδροροδαμίνη 123 (DHR) 50 mm σε DMSO, (Cayman Chemical) Ν-2-υδροξυαιθυλο πιπεραζινο-ν -2 αιθανο θειικό οξύ (HEPES, N-2- hydroxyethylpiperazine-n -2-ethanesulfonic acid), (Sigma) NaCl (Sigma) Ρυθμιστικός με HEPES φυσιολογικός ορός (HBS buffer) (5,2 g HEPES και 8,766 g NaCl διαλύθηκαν σε ddh2o μέχρι 1L) ddh2o Μικροπλάκα 96 κελιών (polypropylene, flat bottom, black, Fisher Scientific) VICTOR3 Multilabel Plate Readers (Perkin Elmer) Πειραματική Πορεία Αρχικά η DHR αραιώθηκε 1000 φορές (1:1000) σε HBS για την παρασκευή 50 μm working solution. Δείγμα πλάσματος των πειραματόζωων και από τις τρεις ομάδες ενώθηκε, ώστε να προκύψουν τρεις δεξαμενές πλάσματος. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και υπέστησαν διαπίδυση, όπως περιγράφεται στις παραγράφους και Τα δείγματα διατηρήθηκαν σε ατμόσφαιρα αζώτου. Σε μικροπλάκα 96 κελιών φορτώθηκε σε κάθε κελί ανάλογη ποσότητα δείγματος ώστε η τελική ποσότητα της HDL χοληστερόλης να είναι 5μg / κελί. Το κάθε δείγμα φορτώθηκε τέσσερις φορές και στην συνέχεια προστέθηκε διάλυμα HBS έως τελικό όγκο 150μl / κελί. Στη συνέχεια προστέθηκαν 25µl 50µM DHR με τελική συγκέντρωση της DHR 7µM. Επίσης, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα κελιά, στα οποία προστέθηκε μόνο 150μl HBS και 25μl DHR. Αμέσως μετά την προσθήκη της DHR, η μικροπλάκα προστατεύθηκε από το φως και τοποθετήθηκε στο μηχάνημα μέτρησης φθορισμού. Ο φθορισμός μετρήθηκε στα 10 λεπτά αφότου προστέθηκε η DHR στα δείγματα και στα 60 λεπτά. Τα φίλτρα που χρησιμοποιήθηκαν είναι στα 485/538nm διέγερση/εκπομπή. Το οξειδωτικό δυναμικό της HDL υπολογίστηκε ως ο μέσος όρος των τιμών των τεσσάρων κελιών για κάθε δείγμα, εκφρασμένο σε μονάδες φθορισμού ανά λεπτό (FU minute -1 ) και επί τοις εκατό του φθορισμού που μετρήθηκε από τα κελιά που περιείχαν μονάχα την DHR. 3.3 Αναλύσεις στους ιστούς των πειραματοζώων Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων στον ήπατικό ιστό Υλικά 78

79 Serum Triglyceride Determination Kit (Sigma, TR 0100, Missouri USA) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Μικροπλάκες 96 κελιών (microwell plate, Thermo Fisher Scientific Nunc, Denmark) Φωτόμετρο (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) Διάλυμα HB (5M KOH, 50% etoh διαλυμένη σε ddh2o) Πυκνό διάλυμα HCl (37% ChemLab) Πειραματική Πορεία Αρχικά παρασκευάστηκε το διάλυμα ΗΒ το οποίο αποτελείται από ανάμειξη σε ίσους όγκους των διαλυμάτων KOH 10M και αιθανόλης 100%. Οι ιστοί ζυγίστηκαν μόλις είχαν βγει από τους -80 o C, και τοποθετήθηκαν σε eppendorfs των 1.5 ml. Ύστερα στον απαγωγό προστέθηκαν στους ιστούς 500μl HB αντιδραστηρίου και στη συνέχεια μπήκαν σε φούρνο στους 65 o C για 16 ώρες. Την επόμενη μέρα βγήκαν από το φούρνο και τοπόθετήθηκαν στον απαγωγό. Αφού ήρθαν σε θερμοκρασία δωματίου, προστέθηκαν αργά αργά 500μl HCl προκειμένου να γίνει εξουδετέρωση του διαλύματος ΗΒ. Στη συνέχεια έγινε φυγοκέντρηση των δειγμάτων στα 3500g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Σε καινούρια eppendorfs έγινε η συλλογή του υπερκείμενου του οποίου και μετρήθηκε ο όγκος. Από αυτά τα δείγματα έγινε αραίωση 1:20 σε PBS 1x. Στην συνέχεια προσδιορίζονται τα επίπεδα τριγλυκεριδίων όπως περιγράφηκε παραπάνω στην ενότητα στο ομογενοποιήμα του ιστού και εκφράζονται ως mg τριγλυκεριδίων/g ιστού Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στον ηπατικό ιστό Από τα δείγματα που είχαμε ακριβώς προηγουμένως έγινε και ο προσδιορισμός της ολικής χοληστερόλης/g ιστού για το κάθε ζώο. Η μέτρηση έγινε με τον ίδιο τρόπο που περιγράφεται στην ενότητα Προσδιορισμός αντίστασης στην ινσουλίνη στον υποκνημίδιο μυ Αρχή της μεθόδου Μέσω της μεθόδου γίνεται προσδιορισμός της περιφερικής αντίστασης στην ινσουλίνη. Ο υποκνημίδιος μυς (soleus muscle) έχει αρκετά χαρακτηριστικά που τον καθιστούν κατάλληλο για in vitro πειράματα. Είναι ένας σκελετικός κυλινδρικός μυς και εκφύεται από την κνήμη και την περόνη μέσω δύο αποφύσεων της κνημιαίας και της περονιαίας αντιστοίχως. Καταφύεται στην πτέρνα μετά τον αχίλλειο τένοντα. Στον άνθρωπο αποτελείται από 70% ίνες βραδείας συστολής 79

80 (αερόβιου μεταβολισμού) ενώ στα ποντίκια αποτελείται από 30-50%. Ο ρόλος του είναι η πελματιαία κάμψη των κάτω άκρων συμβάλλοντας στην ορθοστασία και την βάδιση. Ο μυς μπορεί να απομακρυνθεί από το πειραματόζωο ολόκληρος και ακέραιος με τους δύο τένοντές του. Εφόσον σε κάθε ζώο υπάρχουν δύο συνολικά υποκνημίδιοι μύες, αυτό προσφέρει τη δυνατότητα ο ένας να χρησιμοποιείται ως μυς ελέγχου, να επωάζεται σε βασικές συνθήκες, σύμφωνα με τις οποίες θα γίνουν οι αναλύσεις για τον άλλον. Επίσης η ιστολογική του δομή επιτρέπει την ομοιόμορφη διάχυση και διήθηση του διαλύματος (ραδιοϊσοτόπου) στον μυ 286,287. Υλικά Πλαστικά φιαλίδια μέτρησης ραδιενέργειας 20ml (Sigma) Επωαστής 37 o C (Thermo Scientific) Μετρητης σπινθηρισμού υγρών β-ακτινοβολίας (LS 6500 Multi-Purpose, Scintillation Counter, Beckman) Υγρό σπινθηρισμού (Scintillation liquid) (Quicksafe A, Zinsser Analytic, Germany) Neoprene stoppers (Sigma) Επωαστής στους 65 ο C (Thermo Scientific) NaOH 1M (Sigma) HCl 10M (Sigma) Βελόνες 19G για αερισμό των vials Αέριο (95% Ο2-5% CO2) Υγρό άζωτο KRBH ph 7.4 KRBH Τελική C (mm) NaCl KCl 4.8 KH2PO4 1.2 MgSO4 1.2 CaCl2 2.5 NaHCO3 5 HEPES 10 H2O 80

81 Διάλυμα επώασης με και χωρίς ινσουλίνη (28 o C) σε KRBH Επώαση Τελική C BSA 0.5% w/v Actrapic 500nM insulin 1000 U/ml Radioactive solution σε KRBH (28 o C) Ραδιενεργός ουσία Τελική C 2-deoxy-D-glucose 100 nm [ 3 H]2-deoxy-D-glucose 10 μci/ml 100μΜ Διάλυμα πλύσεων σε KRBH (28 o C) Διάλυμα πλύσεων (Φωτοευαίσθητο) Γλυκόζη HgCl2 Κυτοχαλασίνη Β 10mg/ml DMSO Τελική C 0.3% w/v 0.054% w/v 30μM Ραδιενεργό διάλυμα για μη ειδική (NS) απορρόφηση σε KRBH (28 o C) Ραδιενεργό διάλυμα επώασης μη ειδικής (NS) απορρόφησης Τελική C (Φωτοευαίσθητο) Γλυκόζη 0.3% w/v HgCl % w/v BSA 0.5% w/v 81

82 Κυτοχαλασίνη Β 30μM 10mg/ml DMSO Από το παραπάνω διάλυμα χρησιμοποιήθηκαν 5ml ως incubation solution και 2ml ως radioactive solution έπειτα από την προσθήκη 20μl [ 3 H]2-deocy-D-glucose. Διαδικασία για μέτρηση απορρόφησης γλυκόζης: Από κάθε ζώο οι δύο μύες έχουν διαφορετικούς πειραματικούς χειρισμούς. Συγκεκριμένα ο ένας επωάστηκε σε διαλύμα επώασης με ινσουλίνη (+ins) ενώ ο άλλος σε διαλύμα επώασης χωρίς ινσουλίνη ( ins) και αποτέλεσε τον μυ ελέγχου (control). Μέσα σε επωαστή-σέικερ στους 28 o C, με παροχή 95% Ο2 / 5% CO2 έγιναν τα παρακάτω: ο ένας μυς επωάστηκε σε φιαλίδιο με 5ml διαλύματος επώασης +ins ενώ ο άλλος σε φιαλίδιο με 5ml διαλύματος επώασης ins για 20. Στη συνέχεια μεταφέρθηκε ο κάθε ένας σε διαφορετικά φιαλίδια τα οποία περιέχουν ραδιενεργό διάλυμα γλυκόζης και επωάστηκαν για 5. Ύστερα οι μύες τοποθετήθηκαν σε διάλυμα πλύσεων τρεις φορές και μετά για 5 σε 3ml διαλύματος πλύσεων, υπό ανακίνηση σε πάγο. Σε αυτό το σημείο, συλλέχθηκαν 10μl από κάθε φιαλίδιο στο οποίο ήταν ο κάθε μυς με το ραδιενεργό διάλυμα, τα οποία και αποτελούν το δείγμα πρόσληψης για κάθε μυ. Αυτό ήταν απαραίτητο προκειμένου να μπορούμε να γνωρίζουμε την ενεργότητα της ραδιενέργειας την συγκεκριμένη στιγμή κατά την οποία επωάστηκαν. Η αλλαγή του όγκου και η εξάτμιση μεταβάλλουν τη συγκέντρωση του διαλύματος οπότε και η ενεργότητα της ραδιενέργειας. Οι μύες αφού στεγνώθηκαν καλά σε χαρτί, πάγωσαν σε υγρό άζωτο και ζυγίστηκαν. Στη συνέχεια, σε νέο φιαλίδιο που περιείχε 1ml NaOH 1M για 16 ώρες σε φούρνο με θερμοκρασία 65 o C. Την επόμενη μέρα αφού το NaOH ήρθε σε θερμοκρασία δωματίου, έγινε εξουδετέρωση με 110μl HCl 10M και προστέθηκαν 10ml διαλύματος σπινθηρισμού, οπότε και έγινε η μέτρηση στον β-counter. Με παρόμοιο τρόπο έγινε και η διαδικασία για την μέτρηση μη ειδικής απορρόφησης της γλυκόζης, με τη διαφορά ότι οι δύο μύες που επιλέχθηκαν για τη συγκεκριμένη διαδικασία, δεν μπήκαν σε ξεχωριστά φιαλίδια. Αφού ζυγίσθηκαν τότε ο κάθε μυς φυλάχθηκε σε ξεχωριστό φιαλίδιο με 1ml NaOH 1M και την επόμενη μέρα ακολουθήθηκε η ίδία διαδικασία όπως σημειώθηκε ακριβώς παραπάνω. Επεξεργασία αποτελεσμάτων: Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν σε nmol 2-deoxy-D-glucose/mg μυ/min. Αρχικά υπολογίστηκε η μη ειδική πρόσληψη γλυκόζης (NS uptake)/mg μυ η οποία ήταν cpm/mg για κάθε μυ που χρησιμοποιήθηκε για την NS μέτρηση και χρησιμοποιήθηκε ο μέσος όρος των τιμών. Στην συνέχεια αφαιρέθηκε η τιμή αυτή, της μη ειδικής πρόσληψης προκειμένου να 82

83 υπολογισθεί η ειδική πρόσληψη για κάθε μυ (SA) από την τιμή cpm που έδωσε το φιαλίδιο όπου είχε αποθηκευτεί ο κάθε μυς. Εφόσον στο ραδιενεργό διάλυμα είχε προστέθει 100μM ραδιενεργούς γλυκόζης, τα 10μl δείγματος πρόσληψης περιείχαν 1nmol ραδιενεργούς γλυκόζης. Άρα για κάθε μυ η τιμή cpm που έδωσε το δείγμα πρόσληψης των 10μl αντιπροσώπευε τα cpm/nmol για το ραδιενεργό διάλυμα τη στιγμή που ο συγκεκριμένος μυς επωάστηκε σε αυτό. 83

84 4. Αποτελέσματα 4.1 Μέτρηση κατανάλωσης τροφής, σωματικού βάρους, λιπιδίων και γλυκοζης Κατά την έναρξη του πειράματος και πριν εκτεθούν οι ομάδες των μυών σε οποιοδήποτε αλλαγή, είτε τροφής είτε χορήγησης φαρμάκου, προσδιορίστηκε η βασική τους κατάσταση. Για αυτό τον λόγο, μετρήθηκε η ημερήσια κατανάλωση τροφής, καθώς ήταν απαραίτητο για τον υπολογισμό της δόσης του φαρμάκου όπως περιγράφηκε στην ενοτητα Η ημερήσια κατανάλωση υπολογίστηκε στα 3,2±0,09gr. Επίσης μετρήθηκε το βάρος, τα επίπεδα τριγλυκεριδίων, ολικής χοληστερόλης και γλυκόζης στο πλάσμα του αίματος, όπως περιγράφηκε παραπάνω στις ενότητες 3.1.2, 3.2.1, Ομοίως έγινε και στο τέλος του πειράματος, αφότου οι μύες είχαν λάβει τα φάρμακα. Όπως φαίνεται και στο διάγραμμα Α της Εικόνα 16 Χαρακτηρισμός των ομάδων μελέτης την μηδενική εβδομάδα σε σύγκριση με την έκθεση σε νιασίνη και νιασίνη μαζί με μετφορμίνη για 22 εβδομάδες. Μέσος όρος βάρους σώματος (Α). Επίπεδα γλυκόζης νηστείας (Β). Επίπεδα τριγλυκεριδίων (Γ) και ολικής χοληστερόλης (Δ) στο πλάσμα του αίματος.εικόνα 16Εικόνα 16, ο συνδυασμός των φαρμάκων διατηρεί το βάρος των ζώων σε σταθερά επίπεδα των 27±1,82 gr σε σχέση με την ομάδα ελέγχου που ήταν στα 26,17±0,89 gr ενώ η ομάδα της νιασίνης σημείωσε αύξηση στα 35,25±5,65 gr (p 0,05). Επίσης στο διάγραμμα Β η γλυκόζη νηστείας στην ομάδα ελέγχου ήταν στα 86,2±5,88 mg/dl ενώ στην ομάδα της νιασίνης αυξήθηκε σημαντικά σε σχέση με την ομάδα Εικόνα 16 Χαρακτηρισμός των ομάδων μελέτης την μηδενική εβδομάδα σε σύγκριση με την έκθεση σε νιασίνη και νιασίνη μαζί με μετφορμίνη για 22 εβδομάδες. Μέσος όρος βάρους σώματος (Α). Επίπεδα γλυκόζης νηστείας (Β). Επίπεδα τριγλυκεριδίων (Γ) και ολικής χοληστερόλης (Δ) στο πλάσμα του αίματος. 84

85 ελέχου, στα 152,5±12,5 mg/dl (p 0,01). Στην ομάδα που έκανε χρήση συνδυασμού φαρμάκων παρατηρήθηκε βελτίωση του γλυκαιμικού προφίλ σε σχέση με αυτή της νιασίνης, με την γλυκόζη νηστείας να είναι στα 109,8±9 mg/dl (p 0,05). Όπως αναδεικνύεται στο διάγραμμα Γ τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων παραμένουν σε φυσιολογικά επίπεδα (ομάδα ελέγχου 91,54±7,54 mg/dl, ομάδα νιασίνης 78,49±3,65 mg/dl και ομάδα συνδυασμού 87,4±2,2 mg/dl) ενώ στο διάγραμμα Δ η ολική χοληστερόλη σημείωσε σημαντική αύξηση στην ομάδα που λάμβανε τον συδυασμό φαρμάκων στα 104,9±10,17 mg/dl σε σχέση με την ομάδα ελέγχου που ήταν στα 45,55±5,66 mg/dl (p 0,01). 4.2 Αναλύσεις στον ηπατικό ιστό Όταν τα ζώα την 22 η εβδομάδα θυσιάστηκαν, έγιναν μετρήσεις προκειμένου να προσδιοριστεί το βάρος του ήπατος κάθε ζώου, καθώς επίσης και προσδιορισμός των επιπέδων των τριγλυκεριδίων και της ολικής χοληστερόλης που περιέχονταν στο ήπαρ. Η διαδικασία προσδιορισμού περιγράφεται στην ενότητα και στην Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 17 στο διάγραμμα Α, στην ομάδα ελέγχου ο μέσος όρος του βάρους των ηπάτων ήταν στα 845±39,64 mg ενώ στην ομάδα της νιασίνης το βάρος του ήπατος ήταν στα 1360±340 mg Εικόνα 17 Επίπεδα βάρους του ηπατικού ιστού στην 22 η εβδομάδα (Α), Επίπεδα τριγλυκεριδίων του ηπατικού ιστού στην 22 η εβδομάδα (Β) και ολικής χοληστερόλης (Γ). 85

86 (p 0,05). Το βάρος των ηπάτων στην ομάδα του συνδυασμού φαρμάκων έφτασε τα 1020±65,19 mg χωρίς να έχει στατιστικώς σημαντική διαφορά από τις υπόλοιπες ομάδες. Στο διάγραμμα Β φαίνεται πως η ομάδα της νιασίνης παρουσίασε αυξημένα επίπεδα τριγλυκεριδίων στα 172,8±30 mg/gr ιστού σε σχέση με την ομάδα ελέγχου που ήταν στα 105,5±12,75 mg/gr ιστού (p 0,05). Η ομάδα που έλαβε τον συνδυασμό των φαρμάκων έφτασε 131±5,89 mg/gr χωρίς στατιστικώς σημαντική διαφορά από τις υπόλοιπες ομάδες. Ωστόσο στο διάγραμμα Γ, η ομάδα που έλαβε τον συνδυασμό φαρμάκων είχε πολύ μεγαλύτερα επίπεδα χοληστερόλης στα 2,45±0,17 mg/gr ιστού σε σχέση με την ομάδα ελέγχου που ήταν στα 0,9±0,31 (p 0,01) ενώ η ομάδα που έλαβε νιασίνη έφτασε τα 1,18±0,11 mg/gr χωρίς στατιστικώς σημαντική διαφορά από τις υπόλοιπες ομάδες. 4.3 Χαρακτηρισμός λιποπρωτεινικών κλασμάτων στην κυκλοφορία του αίματος Κατανομή ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Προκειμένου να προσδιορίσουμε την φαρμακολογική δράση που ασκεί η νιασίνη στη μετφορμίνη προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε την κατανομή της χοληστερόλης στα διάφορα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα και συγκεκριμένα την ποσότητα εκείνη, της ώριμης HDL. Για αυτό λοιπόν το λόγο, σε ποσότητα πλάσματος κάθε πειραματοζώου από κάθε ομάδα, έγινε υπερφυγοκέντρηση διαβαθμισμένης πυκνότητας, διαπίδυση των κλασμάτων όπως περιγράφηκε στην παράγραφο και και προσδιορισμός των επιπέδων ολικής χοληστερόλης σε κάθε λιποπρωτεϊνικό κλάσμα με τη μέθοδο που περιγράφηκε στην παράγραφο Η χρήση της νιασίνης μεμονωμένα, δεν φαίνεται να επηρέασε την ποσότητα των ώριμων κλασμάτων της HDL (δηλαδή τα 7 και 8) αφού τα επίπεδα αυτών, παρέμειναν παρόμοια με της ομάδας ελέγχου. Σε αντίθεση, τα ώριμα κλάσματα της HDL, είναι σημαντικά πιο αυξημένα στην ομάδα που έλαβε τον συνδυασμό των φαρμάκων σε σχέση με τις άλλες δύο ομάδες (Εικόνα 18), γεγονός που T o ta l C h o le s te r o l (m g /d l) 2 0 C o n tro l U C F F r a c t io n n u m b e r N ia c in N ia c in + M e tfo rm in Εικόνα 18 Κατανομή ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα των ομάδων μελέτης 86

87 ερμηνεύει την αύξηση στην ολική χοληστερόλη που παρατηρήθηκε κατά την συγχορήγηση των δύο φαρμακων στο γράφημα της Εικόνα 16Δ Αναλύσεις κατά Western στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Προκειμένου να προσδιορισθεί η κατανομή των απολιποπρωτεϊνών apoα-ι, apoα-ιι και apoε, από το πλάσμα που είχε συλλεχθεί από κάθε ζώo, μετά τη συλλογή των κλασμάτων από την φυγοκέντρηση διαβαθμισμένης πυκνότητας, έγινε ανάλυση αυτών με SDS-PAGE και Western blot όπως περιγράφηκε παραπάνω στην ενότητα και Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 19, η apoa-i είναι παρόμοια ανάμεσα στην ομάδα ελέγχου και αυτήν που έλαβε μονοθεραπεία νασίνης. Σε αντίθεση η ομάδα που έλαβε τον συνδυασμό των φαρμάκων σημείωσε εξαιρετική αύξηση της ποσότητας της apoa-i. Η apoa-ii δεν φαίνεται να παρουσίασε κάποια ποσοτική αλλαγή σε καμία ομάδα ενώ αύξηση και της apoe, παρατηρήθηκε και στην ομάδα που έλαβε και τα δύο φάρμακα. Εικόνα 19 Κατανομή της apoa-i, apoa-ii και apoe στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα των τριών ομάδων μελέτης. Αριστερά: ομάδα ελέγχου, Κέντρο: ομάδα νιασίνη,ς Δεξιά: ομάδα νιασίνης + μετφορμίνης 4.4 Λειτουργικότητα της HDL Ένας τρόπος προσδιορισμού της λειτουργικότητας της HDL είναι μέσω της ικανότητας αντίστροφης μεταφοράς της χοληστερόλης από την HDL καθώς και η αντιοξειδωτική της δράση Αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης Το ποσοστό της ανάστροφης μεταφοράς χοληστερόλης (efflux) υπολογίστηκε με βάση την ποσότητα της χοληστερόλης που μεταφέρθηκε από τα κύτταρα στην HDL. Η πειραματική 87