ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ Δ.Μ.Π.Σ ΧΗΜΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ Μεταπτυχιακή εργασία : «Μελέτη νέων συνδυαστικών θεραπειών για διαβήτη τύπου 2» Ελένη Φ. Μπιρλή Χημικός Επιβλέπων Καθηγητής Κυριάκος Η. Κυπραίος Καθηγητής Φαρμακολογίας Πάτρα

2 UNIVERSITY OF PATRAS SCHOOL OF SCIENCES DEPARTMENT OF CHEMISTRY CHEMICAL BIOLOGY Master thesis: «Investigation of new combination therapies for type 2 diabetes mellitus» Eleni F. Birli Chemist Thesis Advisor Kyriakos E. Kypreos Professor of Pharmacology Patras

3 Πρόλογος Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακολογίας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών κατά το διάστημα στο πλαίσιο του Διατμηματικού Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Χημική Βιολογία». Ο σκοπός ήταν να διερευνηθεί η πιθανή συνεργιστική φαρμακολογική δράση της φαινοφιβράτης και της μετφορμίνης σε πειραματικό μοντέλο μυών. Ολοκληρώνοντας την πειραματική μεταπτυχιακή μου εργασία, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους καθηγητές και φίλους μου που με βοήθησαν κατά τη διάρκεια της προσπάθειάς μου αυτής. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή της εργασίας μου, Καθηγητή Φαρμακολογίας, κ. Κυριάκο Κυπραίο, ο οποίος μου έδωσε την ευκαιρία να γνωρίσω περισσότερο τον κόσμο της έρευνας αναθέτοντάς μου αυτό το πολύ ενδιαφέρον θέμα. Μου έδωσε τη δυνατότητα να παρευρεθώ στο εργαστήριό του, προσελκύοντας το ενδιαφέρον μου για το συγκεκριμένο επιστημονικό αντικείμενο. Τον ευχαριστώ επίσης για τη βοήθεια και τις παρατηρήσεις του στην τελική διαμόρφωση του κειμένου αυτού καθώς και για τη συμπαράσταση, κατανόηση και συγχωρητικότητα απέναντι σε αστοχίες μου κατά τη διάρκεια των πειραμάτων μου. Οφείλω ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στην υποψήφια διδάκτορα και φίλη μου Χατζίρη Κατερίνα για την υπομονή της όλο αυτό τον καιρό που δουλέψαμε μαζί και τη συμβολή της στην εκπόνηση όλων των σταδίων της παρούσας εργασίας. Την ευχαριστώ επίσης για τον πολύτιμο χρόνο της που μου αφιέρωσε για τα όσα μου δίδαξε στο εργαστήριο, για τη βοήθεια, τις σωστές συμβουλές και την προθυμία της να με καθοδηγήσει σε οποιαδήποτε δυσκολία παρουσιάστηκε. Τέλος ένα μεγάλο ευχαριστώ αξίζει στην οικογένειά μου, στο Νίκο και στους φίλους μου τόσο για την στήριξη, όσο και την κατανόησή τους καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου. Τριμελής επιτροπή: Καθηγητής Κυπραίος Κυριάκος, Καθηγητής Παππαιωάννου Διονύσιος, επικ. Καθηγητής Ρασσιάς Γεράσιμος Three-member examination committee: Professor Kypreos Kyriakos, Professor Dionysios Papaioannou, Assistant Professor Rassias Gerry 3

4 Περίληψη Προηγούμενες μελέτες από το Εργαστήριο μας καθώς και από άλλες ερευνητικές ομάδες του εξωτερικού ανέδειξαν ένα σημαντικό ρόλο της απολιποπρωτεΐνης A1 (apoα1) στην πρόληψη της εμφάνισης νοσογόνου παχυσαρκίας, διαβήτη τύπου 2 (T2DM) και μη αλκοολικής στεατοηπατίτιδας (NAFLD). Σε συνέχεια αυτών των ευρημάτων μια πρόσφατη εργασία του Εργαστηρίου μας έδειξε πως η apoa1 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη δράση της μετφορμίνης ενός από τα πιο κοινά φάρμακα για την αντιμετώπιση του διαβήτη τύπου 2, καθώς πειραματόζωα με έλλειψη στην πρωτεΐνη έδειξαν σημαντικά μειωμένη απόκριση σε αυτή τη φαρμακευτική αγωγή. Απόρροια αυτών των ευρημάτων ήταν το βασικό ερώτημα της διπλωματικής μου εργασίας. Συγκεκριμένα, καθώς η απολιποπρωτεϊνη Α1 αποτελεί το βασικό δομικό συστατικό της λιποπρωτεϊνης HDL, διερευνήσαμε αν η φαρμακολογική αύξηση των επιπέδων της HDL χοληστερόλης στο αίμα προάγει τη δράση της μετφορμίνης κατά τη χορήγηση συνδυαστικών θεραπειών. Ένα γνωστό υπολιπιδαιμικό φάρμακο που προκαλεί σημαντική αύξηση στα επίπεδα της HDL χοληστερόλης με ταυτόχρονη μείωση των τριγλυκεριδίων του αίματος είναι η φαινοφιβράτη, ένας αγωνιστής των πυρηνικών υποδοχέων PPARα. Συνεπώς στην παρούσα διπλωματική εργασία εξετάσαμε αν η συνδυαστική δράση μετφορμίνης-φαινοφιβράτης οδηγεί σε καλύτερη γλυκαιμική ρύθμιση σε σχέση με την μονοθεραπεία με μετφορμίνη. Για την διεξαγωγή αυτών των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια που εκφράζουν όλο το γονιδίωμα (C57BL/6) και χωρίστηκαν σε τρεις διαφορετικές ομάδες. Στην πρώτη χορηγήθηκε μετφορμίνη, στην δεύτερη φαινοφιβράτη και στην τρίτη και τα δύο φάρμακα συνδυαστικά. Οι τρεις ομάδες ποντικών έλαβαν τα φάρμακα για διάστημα 22 εβδομάδων και στο τέλος της πειραματικής διαδικασίας πραγματοποιήθηκαν βιοχημικές και ιστολογικές αναλύσεις. Συγκεκριμένα μελετήσαμε την επίδραση της συνδυαστικής θεραπείας στη δυσανεξία στη γλυκόζη (Glucose tolerance test) και την ευαισθησία στην ινσουλίνη, στην γλυκονεογένεση, στην έκκριση ινσουλίνης, στην εναπόθεση ηπατικών τριγλυκεριδίων. Επίσης μελετήθηκε η έκφραση των επιπέδων των πρωτεϊνών apoai,apoaii apoe, apoc1, apoc2 με Western blot καθώς και η έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την παχυσαρκία με Real Time PCR. Όπως προέκυψε από τα αποτελέσματα των μελετών μας που διεξήχθησαν σε πλάσμα και σε ιστούς των πειραματοζώων, η συγχορήγηση μετφορμίνης και φαινοφιβράτης ευνοεί τη δράση της μετφορμίνης, βελτιώνει το γλυκαιμικό προφίλ και προάγει το φαρμακολογικό της αποτέλεσμα στην αντιμετώπιση του T2DM. 4

5 Λέξεις κλειδιά: σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2, μεταβολικό σύνδρομο, μετφορμίνη φαινοφιβράτη, HDL Abstract Previous studies by our laboratory and other research groups have highlighted an important role of apolipoprotein A1 (apoa1) in the prevention of morbid obesity, type 2 diabetes (T2DM) and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). Recent work in our laboratory showed that apoa1 plays an important role in the pharmacological effects of metformin, one of the most common drugs for the treatment of type 2 diabetes. Specifically, experimental animals lacking this protein demonstrated significantly reduced response to metformin. Since apoa1 is the major protein component of HDL, these findings shaped the main question of my thesis work, and in particular how pharmacological induction of HDL cholesterol levels in blood may promote the therapeutic effects of metformin in combination therapies. A well-known drug that causes a significant increase in HDL cholesterol levels while lowering blood triglycerides is fenofibrate, an agonist of nuclear receptors PPARα. In my thesis we examined whether combination of fenofibrate with metformin leads to a better glycemic control compared to metformin alone. To carry out these experiments we used C57BL/6 wild-type mice that where divided into three different groups. The first group was treated with metformin, the second with fenofibrate and the third with a combination of both drugs. The three groups of mice received the drugs for 22 weeks and at the end biochemical and histological analyses were carried out. Specifically, we studied the effect of the combination therapy on glucose tolerance (Glucose tolerance test) and insulin sensitivity, on hepatic gluconeogenesis, on insulin secretion, and on the deposition of hepatic triglycerides. Moreover, the effects of the three different treatments on the levels of plasma apolipoproteins apoa1, apoe, apoc1, apoc2 and apoc3 and the expression of obesity-related genes were studied. Our results show that, co-administration of fenofibrate and metformin improve the hypoglycemic effects of metformin in the treatment of T2DM. Key words: type 2 diabetes, metabolic syndrome, metformin, fenofibrate, HDL 5

6 Περιεχόμενα Πρόλογος... 3 Περίληψη... 4 Abstract... 5 Ευρετήριο συντμήσεων Εισαγωγή Το μεταβολικό σύνδρομο Παθογένεια και αντιμετώπιση του μεταβολικού συνδρόμου Σακχαρώδης Διαβήτης Εισαγωγή Τύποι διαβήτη- Σακχαρώδης διαβήτης τύπου Λιποπρωτεΐνες Χυλομικρά Πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL) Ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (IDL) Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL) Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) Απολιποπρωτεΐνες Απολιποπρωτεΐνη Α -I (apoa-i) Απολιποπρωτεΐνη Α-ΙΙ (apoa-ii) Απολιποπρωτεΐνη Α-IV (apoa-iv) Απολιποπρωτεΐνη Β (apob) Απολιποπρωτεΐνες C (apoc) Απολιποπρωτεΐνη J (apoj) Απολιποπρωτεΐνη Ε (apoe) Λιποπρωτεΐνη Lp(a) Διατροφικά λιπίδια Μονοπάτια μεταβολισμού των λιποπρωτεϊνών Το μονοπάτι μεταβολισμού των χυλομικρών Το μονοπάτι μεταβολισμού των VLDL Το μονοπάτι μεταβολισμού της HDL Οι λειτουργίες της HDL

7 1.8.1 Αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης Αντιοξειδωτική δράση της HDL Αντιφλεγμονώδης δράση της HDL Ο ρόλος της HDL στην ομοιόσταση της γλυκόζης HDL: ποσότητα ή ποιότητα Διαβήτης και δυσλιπιδαιμίες H διαβητική δυσλιπιδαιμία Υπερτριγλυκεριδιαιμία νηστείας Μεταγευματική υπερτριγλυκεριδιαιμία Χαμηλή HDL-χοληστερόλη Υψηλή LDL χοληστερόλη Θεραπευτική αγωγή για τον διαβήτη τύπου Μετφορμίνη Αντιυπεργλυκαιμική δράση μετφορμίνης Αυξημένη απορρόφηση γλυκόζης από τους σκελετικούς μυς Μοριακοί στόχοι των αντιδιαβητικών επιδράσεων Φαινοφιβράτη Μηχανισμοί δράσης των φιβρατών Ενεργοποίηση του PPAR-α μέσω φαινοφιβράτης και μεταβολισμός της HDL Ενεργοποίηση του PPAR-α μέσω φαινοφιβράτης και μεταβολισμός των πλούσιων σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεϊνών Έλλειψη της apoa-i αφαιρεί τη δραστικότητα της μετφορμίνης Σκοπός Υλικά και μέθοδοι Πειραματόζωα Χειρισμοί πειραματοζώων Λήψη αίματος Μέτρηση σωματικού βάρους ποντικών Μέτρησης ημερήσιας κατανάλωσης τρoφής των ποντικών Δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη (Glucose Tolerance Test) Λήψη ιστών από πειραματόζωα Βιοχημικές αναλύσεις πλάσματος Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων στο πλάσμα Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα

8 3.3.3 Κλασματοποίηση λιποπρωτεϊνών του πλάσματος με υπερφυγοκέντρηση διαβαθμισμένης πυκνότητας Διαπίδυση στα κλάσματα του πλάσματος Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Ανάλυση απολιποπρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Ανοσοαποτύπωση κατά Western (Western Blot) Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων και ολικής χοληστερόλης στον ηπατικό ιστό Αποτελέσματα Μέτρηση κατανάλωσης τροφής και σωματικού βάρους Μέτρηση λιπιδίων του πλάσματος Χαρακτηρισμός λιποπρωτεινικών κλασμάτων στην κυκλοφορία του αίματος Κατανομή ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Αναλύσεις κατά Western στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Μέτρηση γλυκόζης νηστείας Προσδιορισμός της ανοχής στην γλυκόζη Αναλύσεις στον ηπατικό ιστό Συζήτηση

9 Ευρετήριο συντμήσεων 4-ΑΑΡ 4-αμινοαντιπυρίνη ABCA1 A1 μεταφορέας της κασέτας που δεσμεύει την ATP (ATP-binding cassette transporter A1) ACAT2 Ισομορφή 2 της ακυλμεταφοράσης της Ακυλο-CoA χοληστερόλης (Acyl CoA cholesterol acyltransferase isoform-2) ACS Συνθετάση ακέτυλο Co-A ADP Διφωσφορική αδενοσίνη (Adenosine diphosphate) AICAR 5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide AMP Μονοφωσφορική αδενοσίνη (Αdenosine monophosphate) AMPK Πρωτεϊνική κινάση που ενεργοποιείται από 5 -ΑΜP ApoA Απολιποπρωτεΐνη A ApoB Απολιποπρωτεΐνη B ApoC Απολιποπρωτεΐνη C ApoE Απολιποπρωτεΐνη Ε ApoH Απολιποπρωτεΐνη Η ApoJ Απολιποπρωτεΐνη J ApoM Απολιποπρωτεΐνη Μ APS Υπερθειικό αμμώνιο ATP Τριφωσφορική αδενοσίνη (Adenosine triphosphate) CETP Πρωτεΐνη μεταφοράς των εστέρων χοληστερόλης (Cholesteryl ester transfer protein) CM Χυλομικρά CoA Aκετυλο-συνένζυμο Α CREB-1 Πρωτεΐνη 1 που δεσμεύεται στο στοιχείο απόκρισης του camp (camp responsive element binding protein 1) CRP C-αντιδρώσα πρωτεΐνη CRTC2 Μεταγραφικός συνενεργοποιητής 2 που ρυθμίζεται από την CREB (CREB regulated transcription coactivator 2) DAP Φωσφορική διυδροξυακετόνη ddh 2 O Δις-απεσταγμένο νερό DDP-4 Διπεπτιδική πεπτιδάση 4 (Dipeptidyl Peptidase 4) DTT Διθειοθρεϊτόλη (Dithiothreitol) 9

10 EDTA Αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (Ethylenediaminotetraacetic acid) enos Συνθετάση του οξειδίου του αζώτου ESPA Nατριϊκή Ν-αιθυλο-Ν-(3-θειοπροπυλο)-μ-ανισιδίνη FADH2 Φλαβινο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο (Flavin adenine dinucleotide) FATP Πρωτεΐνη μεταφορέας λιπαρών οξέων FBP1 Διφωσφατάση 1 της 1,6-Ρ φρουκτόζης (Fructose-1,6-bisphosphatase 1) FFAs Ελεύθερα λιπαρά οξέα G-1-P 1-φωσφορική γλυκερόλη G6Pase Φωσφατάση της 6Ρ-γλυκόζης (Glucose 6-phosphatase) GK Kινάση Γλυκερόλης GLP-1 Πεπτίδιο 1 τύπου γλυκαγόνου (Glucagon like peptide 1) GLUT-1 Μεταφορέας 1 της γλυκόζης (Glucose transporter 1) GPO Οξειδάση της φωσφορικής γλυκερόλης HBS Ρυθμιστικός με HEPES φυσιολογικός ορός (Hepes Buffered Saline) HDL Λιποπρωτεΐνη υψηλής πυκνότητας (High density lipoprotein) HEPES Ν-2-υδροξυαιθυλοπιπεραζινο-Ν -2-αιθανοσουλφονικό οξύ (N-2-hydroxyethylpiperazine-N - 2-ethanesulfonic acid) HL Ηπατική Λιπάση IDL Λιποπρωτεΐνη Ενδιάμεσης Πυκνότητας (Intermediate Density Lipoprotein) IRS-2 Υπόστρωμα 2 του υποδοχέα της ινσουλίνης (Insulin receptor substrate 2) LCAT Λεκιθινο-Χοληστερολική Ακυλοτρανσφεράση (Lecithin-Cholesterol Acyltransferase) LDL Λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας (Low density lipoprotein) LDLr Υποδοχέας LDL LKB1 Ηπατική κινάση Β1 Lp(a) Λιποπρωτεΐνη a LpL Λιποπρωτεϊνική λιπάση LRP1 Υποδοχέας που σχετίζεται με την πρωτεΐνη-1 MATE Πολλαπλός μεταφορέας εξόδου φαρμάκων και τοξινών (Multidrug and Toxin Extrusion Transporter) MCP-1 Χημειοτακτικός παράγοντας 1 προσέλκυσης μονοκυττάρων (Monocyte chemoattractant protein-1) MTTP Μικροσωμική πρωτεΐνη μεταφοράς τριγλυκεριδίων 10

11 NADH Νικοτιναμιδο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο(Nicotinamide adenine dinucleotide) NF-kβ Ο ενισχυτής της ελαφριάς αλυσίδας του κάπα πυρηνικού υποδοχέα των ενεργοποιημένων Β- κυττάρων (Νuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) NPC1-L1 Nieman-Pick C1 like 1 OCT Πρωτεΐνη δέσμευσης οκταμερών (Octamer-binding Protein) OCTN1 Πρωτότυπος τύπος 1 του μεταφορέα οργανικών κατιόντων (Organic Cation Transporter Novel type 1) PAI-1 Αναστολέας ενεργοποιητής πλασμινογόνου-1 PBS Φωσφορικό Ρυθμιστικό Διάλυμα Άλατος (Phosphate Buffer Saline) PGC-1α Συνενεργοποιητής 1-άλφα του γ-υποδοχέα που ενεργοποιείται από τον πολλαπλασιαστή των υπεροξυσωμάτων (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha) PKB Πρωτεϊνική Κινάση Β (Protein kinase B) PLTP Μεταφορική πρωτεΐνη των φωσφολιπιδίων (Phospholipid Transfer Protein) PMAT Μεμβρανικός μεταφορέας των μονοαμινών (Plasma Membrane Monoamine Transporter) POD Υπεροξειδάση PPARα α πυρηνικός υποδοχέας που ενεργοποιείται από τον πολλαπλασιαστή των υπεροξυσωμάτων PVDF membrane Μεμβράνη φθωριούχου πολυβινυλιδενίου (Polyvinylidene fluoride) rpm Στροφές ανά λεπτό (Revolutions per minute) SDS Δωδεκυλοθειϊκό Νάτριο (Sodium Dodecyl Sulfate) SGLT2 Συμμεταφορέας 2 νατρίου/γλυκόζης (Sodium-glucose cotransporter 2) SLC22A 22Α διαλυτός μεταφορέας (Solute Carrier Family 22Α) SNP Πολυμορφισμός απλού νουκλεοτιδίου (Single nucleotide polymorphism) SR-B1 Υποδοχέας Σαρωτής Τάξης Β, Τύπου 1 (Scavenger Receptor, Class B, Type 1) TAG Τριακυλογλυκερόλη TEMED N,N, N,N -Τετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνη (N,N, N,N -Tetramethylethylenediamine) TNFα Παράγοντας νέκρωσης όγκων α TZD Θειαζολιδινεδιόνες (Thiazolidinediones) VLDL Λιποπρωτεΐνη Πολύ Χαμηλής Πυκνότητας (Very Low Density Lipoprotein) WAT Λευκός λιπώδης Ιστός (White Adipose Tissue) WTD Western Type Diet ΡΚΑ Πρωτεϊνική κινάση Α 11

12 1. Εισαγωγή 1.1 Το μεταβολικό σύνδρομο Το μεταβολικό σύνδρομο είναι ένα σύμπλεγμα διαταραχών που έχουν ως αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση του κινδύνου για εμφάνιση διαβήτη και καρδιαγγειακής νόσου. Τις τελευταίες δεκαετίες, ο σύγχρονος τρόπος ζωής, ο οποίος χαρακτηρίζεται κυρίως από έλλειψη σωστών διατροφικών συνηθειών και φυσικής άσκησης, έχει καταστήσει το σύνδρομο αυτό μια από τις κυριότερες απειλές στην Παγκόσμια Δημόσια Υγεία. Συγκεκριμένα, παρατηρείται ότι τα άτομα ηλικίας που πάσχουν από μεταβολικό σύνδρομο έχουν τριπλάσια θνησιμότητα από καρδιαγγειακή νόσο από ότι τα φυσιολογικά (1). Μέχρι και σήμερα το αίτιο του συνδρόμου είναι υπό μελέτη αν και η ύπαρξή του ως πραγματικό σύνδρομο έχει αμφισβητηθεί από μερικούς (2). Οι παράγοντες που συμβάλλουν στην ανάπτυξη του μεταβολικού συνδρόμου είναι: η δυσλιπιδαιμία (αυξημένα ποσά τριγλυκεριδίων σε συνδυασμό με μειωμένα ποσά HDL χοληστερόλης), η αυξημένη αρτηριακή πίεση, η διαταραγμένη ανοχή στη γλυκόζη, η υπερινσουλιναιμία καθώς και η κεντρική παχυσαρκία (3). Υπάρχουν διάφορες προτάσεις τεκμηρίωσης του μεταβολικού συνδρόμου από μεγάλους οργανισμούς : WHO (Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας), NCEP ATP III (Αμερικάνικη Επιτροπή Ειδικών), IDF (Παγκόσμια Οργάνωση για τον Διαβήτη), (Πίνακας 1) NCEP-R (Αμερικανική Καρδιολογική Εταιρία και NHLBI). Πίνακας 1: Κριτήρια μεταβολικού συνδρόμου που προτάθηκαν από τους οργανισμούς WHO, ATP III και IDF Κλινικές μετρήσεις WHO(1998)(4) ATP III(2001)(5) IDF(2005) Αντίσταση στην ανοχή στη γλυκόζη Κανένα, αλλά κανένα ινσουλίνη (IGT), μειωμένη οποιαδήποτε 3 από τα γλυκόζη νηστείας παρακάτω πέντε (IFG), διαβήτης τύπου κριτήρια 2 ή μειωμένη αντίσταση στην ισουλίη με δύο από τους παρακάτω παράγοντες Σωματικό βάρος Περίμερος Περίμετρος μέσης 94 Αυξημένη περίπετρος 12

13 μέσης/ισχύων: >0.90 στις γυναίκες και >0,85 στους άνδρες και/ή δείκτης μάζας σώματος >30kg/m 2 cm στους άνδρες ή 80 cm στις γυναίκες μέσης συν οποιαδήποτε δύο από τα παρακάτω Λιπίδια TG 150 mg/dl και/ή TG 150 mg/dl και/ή TG 150 mg/dl HDL-C <35 mg/dl HDL-C <39 mg/dl HDL-C <40 mg/dl στους στους άνδρες ή <39 mg/dl στις γυναίκες στους άνδρε ή στις γυναίκες άνδρες ή <50 mg/dl στις γυναίκες Αρτηριακή πίεση 140/90 mm Hg 140/90 mm Hg 130 mm Hg συστολική or 85 mm Hg διαστολική Επίπεδα γλυκόζης IGT, IFG,ή T2DM IGT or IFG (αλλά όχι 100 mg/dl διαβήτης) (συμπεριλαμβανομένου του διαβήτη) Άλλα μικροαλβουμινουρία Το 2009 ορίστηκαν τα κριτήρια που πρέπει να πληρούνται για την διάγνωση του Μεταβολικού Συνδρόμου από τον οργανισμό ΑΗΑ/ΝΗLBI όπου περιέχονται τα κριτήρια της ATP III με κάποιες μικρές μεταβολές. (Πίνακας 2) 13

14 Πίνακας 2: Κριτήρια για τη διάγνωση του μεταβολικού συνδρόμου σύμφωνα με τον οργανισμό AHA/NHLBI ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΟΥ ΣΥΝΔΡΟΜΟΥ STATEMENT AHA-NHLBI (NCEP-R) Κριτήρια (3 από τα 5 συνιστούν το μεταβολικό σύνδρομο) 1. Αυξημένη περίμετρος μέσης Άνδρες > 102cm / Γυναίκες > 88cm 2. Αυξημένα τριγλυκερίδια 150mg/dl ή λήψη φαρμάκων για την αντιμετώπιση αυξημένων επιπέδων τριγλυκεριδίων. 3. Μειωμένη HDL Άνδρες < 40mg/dl / Γυναίκες < 50mg/dl) ή λήψη φαρμάκων για την αντιμετώπιση ελαττωμένων επιπέδων HDL. 4. Αυξημένη αρτηριακή πίεση 130/85mmHg ή λήψη αντιυπερτασικής αγωγής 5. Αυξημένο σάκχαρο νηστείας 100 mg/dl ή λήψη φαρμάκων για την αντιμετώπιση των αυξημένων επιπέδων γλυκόζης Παθογένεια και αντιμετώπιση του μεταβολικού συνδρόμου Το μεταβολικό σύνδρομο είναι μια κατάσταση χρόνιας φλεγμονής, ως συνέπεια της πολύπλοκης αλληλεπίδρασης μεταξύ γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων. Η αντίσταση στην ινσουλίνη, η παχυσαρκία κεντρικού τύπου, η αθηρογόνος δυσλιπιδαιμία, η ενδοθηλιακή δυσλειτουργία, η γενετική προδιάθεση, η αυξημένη πίεση του αίματος και το χρόνιο στρες είναι μερικοί από τους διάφορους παράγοντες που συνιστούν το σύνδρομο. Αντίσταση στην ινσουλίνη: Τα χαρακτηριστικά ενός φαινοτύπου ευαίσθητου στην ινσουλίνη περιλαμβάνουν ένα φυσιολογικό βάρος σώματος (6), χωρίς κοιλιακή ή σπλαχνική παχυσαρκία (7), που είναι μετρίως ενεργό (8), καταναλώνοντας μια διατροφή χαμηλή σε κορεσμένα λίπη (9). Όταν τα όργανα-στόχοι της ινσουλίνης (ήπαρ, σκελετικά μυϊκά κύτταρα και λιπώδης ιστός) αδυνατούν να ανταποκριθούν στα φυσιολογικά επίπεδά της στο πλάσμα, σημαίνει πως υπάρχει αντίσταση στην ινσουλίνη. Τα άτομα που έχουν αντίσταση στην ινσουλίνη επιδεικνύουν διαταραχές στο μεταβολισμό της γλυκόζης ή ανοχή μέσω μιας ανώμαλης απόκρισης στη γλυκόζη, μια αύξηση στα επίπεδα γλυκόζης νηστείας και / ή έκδηλη υπεργλυκαιμία, ή μία μείωση της δράσης της ινσουλίνης μετά από ενδοφλέβια 14

15 χορήγηση ινσουλίνης (ευγλυκαιμική τεχνική σφιγκτήρα) με μειωμένη κάθαρση γλυκόζης διαμεσολαβούμενη από ισουλίνη ή / και μειώσεις στην παραγωγή της ενδογενούς γλυκόζης. Στην κατάσταση αυτή, τα β-κύτταρα του παγκρέατος εκκρίνουν περισσότερη ινσουλίνη, (υπερινσουλιναιμία) για να ξεπεραστεί η υπεργλυκαιμία στα ινσουλινο-ανθεκτικά άτομα (10). Αν και τα άτομα αυτά δεν είναι απαραίτητο να είναι κλινικά παχύσαρκα, παρ 'όλα αυτά έχουν συνήθως μια ανώμαλη κατανομή λίπους που χαρακτηρίζεται από λίπος κυρίως στο πάνω μέρος του σώματος (κοιλιακό). Ανεξάρτητα από τις σχετική συνεισφορά του σπλαχνικού λίπους και του κοιλιακού υποδόριου λίπους στην αντίσταση στην ινσουλίνη, φαίνεται ότι η κοιλιακή παχυσαρκία συσχετίζεται πιο έντονα με την αντίσταση στην ινσουλίνη και το μεταβολικό σύνδρομο (ανδροειδής παχυσαρκία) από ό, τι η παχυσαρκία που εμφανίζεται στο κάτω μέρος του σώματος (γυναικοειδής παχυσαρκία) (11). Παχυσαρκία κεντρικού τύπου: Η παχυσαρκία οφείλεται κυρίως σε αυξημένη κατανάλωση τροφίμων πλούσιων σε θερμίδες καθώς και σε μειωμένη φυσική δραστηριότητα. Η επιταχυνόμενη λιπολυτική δραστηριότητα που σχετίζεται με το σπλαχνικό λίπος, έχει ως αποτέλεσμα την υπερπαραγωγή πάνω από διακοσίων βιολογικώς δραστικών μεταβολιτών γνωστών ως αδιποκυτοκίνες, οι οποίες περιλαμβάνουν γλυκερίνη, ελεύθερα λιπαρά οξέα (FFA), προφλεγμονώδεις μεσολαβητές (παράγοντα νέκρωσης όγκων άλφα (TNFa) και ιντερλευκίνη-6 (IL-6)), αναστολέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου-1 (ΡΑΙ-1), και C- αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) (12). Υποστηρίζεται ότι η αυξημένη πρόσληψη των ελεύθερων λιπαρών οξέων στους μύς και στο ήπαρ προκαλεί αυξημένη συγκέντρωση τριγλυκεριδίων με αποτέλεσμα να δυσχαιρένεται η μετάδοση του σήματος της ινσουλίνης και/ή η δράση της στους ιστούς αυτούς. Η αυξημένη μεταφορά των ελεύθερων λιπαρών οξέων στο ήπαρ προάγει την έκκριση των πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (VLDL) και κατά συνέπεια τα επίπεδα τριγλυκεριδίων (TG) στην κυκλοφορία του αίματος ενώ μειώνονται τα επίπεδα των λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας (HDL) ευνοώντας την εμφάνιση της χαρακτηριστικής δυσλιπιδαιμίας του μεταβολικού συνδρόμου (10). 15

16 1.2 Σακχαρώδης Διαβήτης Εισαγωγή Ο σακχαρώδης διαβήτης, ή απλά διαβήτης, είναι μία ομάδα μεταβολικών διαταραχών που χαρακτηρίζονται από υψηλά επίπεδα γλυκόζης στο αίμα τα οποία προκύπτουν λόγω μη σωστής διαχείρισης και παραγωγής ινσουλίνης από το σώμα. Πολλές παθογενετικές διαδικασίες εμπλέκονται στην εμφάνιση του διαβήτη. Αυτές περιλαμβάνουν διαδικασίες οι οποίες καταστρέφουν τα β-κύτταρα του παγκρέατος με συνέπεια την ανεπάρκεια ινσουλίνης, και άλλες οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα την αντίσταση στη δράση της ινσουλίνης. Οι διαταραχές στο μεταβολισμό των υδατανθράκων, των λιπών και των πρωτεϊνών συμβαίνουν λόγω μη επαρκούς δράσης ινσουλίνης στους ιστούς-στόχους που προκύπτει από μη ευαισθησία ή έλλειψη ινσουλίνης. Ο σακχαρώδης διαβήτης μπορεί να εμφανίσει συμπτώματα όπως δίψα, πολυουρία, θόλωση της όρασης, και απώλεια βάρους. Στην περίπτωση που η παραγωγή ινσουλίνης και η έκκρισή της μεταβάλλονται από τη νόσο, η δυναμική της γλυκόζης στο αίμα θα αλλάξει επίσης. Αν η παραγωγή της ινσουλίνης μειωθεί, η είσοδος της γλυκόζης στα κύτταρα θα παρεμποδίζεται με αποτέλεσμα την υπεργλυκαιμία. Αντίθετα, αν η έκκριση της ινσουλίνης αυξάνεται, τα επίπεδα γλυκόζης του αίματος ελαττώνονται σε μεγάλο βαθμό (υπογλυκαιμία), καθώς τεράστιες ποσότητες γλυκόζης εισέρχονται στα κύτταρα και πολύ μικρή ποσότητα παραμένει στην κυκλοφορία του αίματος. Πολλές ορμόνες ίσως επηρεάζουν τη γλυκαιμία. Η ινσουλίνη όμως είναι η μοναδική που μειώνει τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα. Άλλες ρυθμιστικές ορμόνες όπως το γλυκαγόνο, οι κατεχολαμίνες, η αυξητική ορμόνη, η θυροειδής ορμόνη και τα γλυκοκορτικοειδή δρουν προς αύξηση των επιπέδων γλυκόζης συγχρόνως με τις άλλες δράσεις τους (13). Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, τα κριτήρια διάγνωσης του διαβήτη είναι :1) η εύρεση τιμής συγκέντρωσης γλυκόζης στο πλάσμα μετά από ολονύκτια νηστεία πάνω από 7.0mmol/l και/ή 2) η εύρεση τιμής συγκέντρωσης της γλυκόζης στο πλάσμα μετά 2 ώρες από την από του στόματος φόρτιση με 75g πάνω από 11.0mmol/l (14-16). 16

17 1.2.2 Τύποι διαβήτη- Σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2 Η πρώτη ευρέως αποδεκτή κατηγοριοποίηση των τύπων του διαβήτη έγινε το 1980 από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (WHO). Οι κύριες κατηγορίες διαβήτη προτάθηκαν: ο ινσουλινο-εξαρτώμενος διαβήτης ή διαβήτης τύπου 1 και ο μη ινσουλινο-εξαρτώμενος διαβήτης ή διαβήτης τύπου 2, ο διαβήτης κύησης και ο νεανικός διαβήτης (Maturity inset diabetes, M.O.DI). Για το διαβήτη τύπου 1 ευθύνεται η καταστροφή των β-παγκρεατικών νησιδίων ενώ για το διαβήτη τύπου 2 η ανεπαρκής απόκριση των ινσουλινοευαίθητων ιστών στην ινσουλίνη του αίματος (17). Ο διαβήτης τύπου 2 είναι η πιο κοινή μορφή διαβήτη. Εκατομμύρια άνθρωποι παγκοσμίως έχουν διαγνωσθεί με διαβήτη τύπου 2. Τα άτομα που πάσχουν έχουν μεγαλύτερες πιθανότητες να αναπτύξουν καρδιαγγειακές νόσους όπως καρδιακή προσβολή και εγκεφαλικό επεισόδιο αν η ασθένεια παραμένει αδιάγνωστη ή ανεπαρκώς ελεγχόμενη. Έχουν επίσης αυξημένο κίνδυνο για απώλεια όρασης, για ακρωτηριασμό κάτω άκρων λόγω βλάβης στα νεύρα και στα αιμοφόρα αγγεία και για νεφρική ανεπάρκεια που απαιτεί αιμοκάθαρση ή μεταμόσχευση (18). Στο διαβήτη τύπου 2, η αρχική απώλεια ευαιθησίας στην ινσουλίνη και εφόσον ο διαβήτης παραμείνει ανεπαρκώς ρυθμισμένος για μεγάλο χρονικό διάστημα, ακολουθείται αρχικά από υπερπαραγωγή ινσουλίνης (υπερινσουλιναιμία) από τα παγκρεατικά β-κύτταρα, και στη συνέχεια από συνεχώς μειούμενη παραγωγή ινσουλίνης, λόγω απώλειας β-κυττάρων (απόπτωση). Εν τέλη τα β-κύτταρα καταστρέφονται και η ενδογενής παραγωγή ινσουλίνης καθίσταται αδύνατη. Η αντίσταση στην ινσουλίνη οφείλεται κυρίως σε διαταραχές μετά τη σύνδεση της με τον υποδοχέα ινσουλίνης. Η διαταραχή στην έκκριση της ινσουλίνης πιθανόν να οφείλεται στα αυξημένα επίπεδα της μιτοχονδριακής πρωτεΐνης αποσύζευξης 2 (UCP-2) και στην παρουσία της τοξικής αμυλίνης στα νησίδια. (19;20) Μεταγευματικά, ο οργανισμός διασπά όλα τα σάκχαρα και τα άμυλα σε γλυκόζη, η οποία είναι βασικό καύσιμο για τα κύτταρα. Η ινσουλίνη προάγει την απορρόφηση της γλυκόζης του αίματος από τα κύτταρα των ινσουλινοευαίσθητων ιστών. Όταν η γλυκόζη συσσωρεύεται στο αίμα αντί να μεταφέρεται στα κύτταρα, μπορεί να οδηγήσει σε επιπλοκές του διαβήτη. Οι καρδιαγγειακές παθήσεις είναι η κύρια αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας σε ασθενείς που πάσχουν από διαβήτη τύπου 2 και ο καρδιαγγειακός κίνδυνος είναι κατά δύο έως τεσσερις φορές αυξημένος σε σύγκριση με μη διαβητικά άτομα (21;22). Οι διαταραχές στο μεταβολισμό των λιπιδίων που παρατηρούνται σε αυτόν τον τύπο διαβήτη είναι ένας από τους κύριους παράγοντες που συμβάλλουν στον αγγειακό κίνδυνο (21-23). 17

18 Οι ασθενείς με διαβήτη τύπου 2 διαθέτουν σημαντική τροποποίηση των λιποπρωτεΐνών χαμηλής πυκνότητας (LDL) και των HDL σωματιδίων, τα οποία είναι πιθανόν να παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη αθηροσκλήρωσης. Πράγματι, έχει αποδειχθεί in vivo σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 2 ότι υπάρχει μία σημαντική μείωση κατά 28% του καταβολισμού της LDL που σχετίζεται με την μειωμένη παραγωγή της LDL (24). Mειωμένα επίπεδα HDL χοληστερόλης στο πλάσμα που σχετίζονται με μείωση της HDL2 έχουν συνδεθεί με το διαβήτη τύπου 2 (25). Η μειωμένη αυτή HDL έχει δειχθεί να συσχετίζεται με την υπερτριγλυκεριδαιμία και την παχυσαρκία (26). Έμφαση δίνεται στην λειτουργικότητα της HDL η οποία καθορίζεται από την αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση της αλλά και την αποτελεσματικότητά της στην αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης και εξαρτάται από την πρωτεϊνική (απολιποπρωτεΐνες) και λιπιδική της σύσταση και κατά συνέπεια από τη δομή των σωματιδίων HDL. (27) Μεταβολές στα επίπεδα των απολιποπρωτεϊνών έχουν ως αποτέλεσμα την μεταβολή της λειτουργικότητας της. Για παράδειγμα φαίνεται ότι η γλυκοζυλίωση της apo Α-Ι προκαλεί μία μείωση στη σταθερότητα της αλληλεπίδρασης μεταξύ λιπιδίων και αποπρωτεΐνης, επηρεάζοντας τη δομική συνοχή των σωματιδίων HDL (28). Μία μελέτη έδειξε πως η αναλογία των επιπέδων της apob και apoa-i αποτελεί έναν πολύ καλύτερο προγνωστικό δείκτη για την εμφάνιση καρδιαγγειακών νοσημάτων, από ότι η αυτή καθαυτή μέτρηση των επιπέδων γενικά HDL-χοληστερόλης (HDL-C) (29). Συμπερασματικά, οι ασθενείς με τύπου 2 διαβήτη παρουσιάζουν σημαντικές τροποποιήσεις των LDL και HDL λιποπρωτεϊνών. Παρά το γεγονός ότι τα επίπεδα της LDL χοληστερόλης στο πλάσμα είναι συνήθως φυσιολογικά στον διαβήτη τύπου 2, σημαντικές ποιοτικές και κινητικές ανωμαλίες των σωματιδίων LDL είναι παρούσες. Τα HDL σωματίδια στους ασθενείς παρουσιάζουν σημαντικές ποσοτικές αλλά και ποιοτικές και κινητικές ανωμαλίες. Όλες αυτές οι ανωμαλίες των δύο LDL και HDL λιποπρωτεϊνών είναι πιθανό να προωθήσουν την ανάπτυξη της αθηροσκλήρωσης και θα πρέπει να θεωρούνται ως θεραπευτικοί στόχοι σε ασθενείς με διαβήτη τύπου Λιποπρωτεΐνες Τα λιπίδια συνιστούν ένα από τα σημαντικά μόρια στο σώμα μας. Η μεταφορά τους σε όλο το σώμα αποτελεί ένα εμφανές πρόβλημα, χάρη στο γεγονός ότι είναι μη πολικά και κατά συνέπεια μη διαλυτά στο νερό. Μικρές ποσότητες λιπαρών οξέων μεταφέρονται στο αίμα 18

19 μετά τη σύνδεσή τους με πρωτεΐνες αίματος (ελεύθερα λιπαρά οξέα). Άλλα λιπίδια όμως, μεταφέρονται σε ειδικά σωματίδια που ονομάζονται λιποπρωτεΐνες. Οι λιποπρωτεΐνες δεν είναι μόρια, αλλά μακρομοριακά συσσωματώματα αποτελούμενα από λιπίδια (χοληστερόλη, τριγλυκερίδια, φωσφολιπίδια) και πρωτεΐνες (απολιποπρωτεΐνες Α, Β, C, E, J, M, Η και a). Ο υδρόφοβος πυρήνας τους αποτελείται από εστεροποιημένη χοληστερόλη και τριγλυκερίδια και περιβάλλεται από ελεύθερη χοληστερόλη και στρώμα φωσφολιπιδίων. Τα λιπόφιλα άκρα κάθε φωσφολιπιδίου βρίσκονται προς τον πυρήνα και τα υδρόφιλα προς το πλάσμα. Στο εξωτερικό τμήμα των λιποπρωτεΐνών εκτείνονται οι απολιποπρωτεΐνες οι οποίες-όπως και τα φωσφολιπίδια- διαθέτουν ένα άκρο πλούσιο σε μη πολικά αμινοξέα με κατεύθυνση προς των πυρήνα, και ένα άκρο πλούσιο σε πολικά αμινοξέα το οποίο έρχεται σε επαφή με το υδατικό περιβάλλον. (Εικόνα 1) (30) Εικόνα 1: Σχηματική αναπαράσταση της τυπικής δομής των λιποπρωτεϊνών Η βασικότερη λειτουργία των λιποπρωτεϊνών είναι η μεταφορά λιπιδίων διαμέσου της κυκλοφορίας, η οποία επιτυγχάνεται με διαλυτοποίησή τους μέσω των πρωτεϊνικών τμημάτων. Επιπρόσθετα, τα τμήματα αυτά διαθέτουν θέσεις αναγνώρισης και πρόσδεσης ειδικών υποδοχέων του κυττάρου, καθώς είναι και υπεύθυνα για ενεργοποίηση ή αναστολή ενζύμων του πλάσματος. Η διαφορετική σύσταση των λιποπρωτεϊνών σε απολιποπρωτεΐνες 19

20 και λιπίδια τις κατατάσσει σε πέντε κατηγορίες οι οποίες διαφέρουν ως προς το μέγεθος, την πυκνότητα αλλά και τη λειτουργικότητά τους. Πιο συγκεκριμένα, η περιεκτικότητα σε λιπίδια είναι ανάλογη με το μέγεθος και αντιστρόφως ανάλογη με την πυκνότητα που χαρακτηρίζει τα σωματίδια των λιποπρωτεϊνών. Σύνηθες ερώτημα αποτελεί το πώς γίνεται η ταυτοποίηση τους μεταξύ άλλων μορίων, το οποίο απαντάται εύκολα σκεπτόμενοι ότι η υψηλή σύστασή τους σε λιπίδια δηλαδή η ιδιαίτερα χαμηλή πυκνότητά τους διευκολύνει τον διαχωρισμό τους από άλλες πρωτεΐνες μέσω μεθόδων υπερφυγοκέντρησης και ηλεκτροφόρησης (30). Οι κατηγορίες των λιποπρωτεϊνών είναι: τα χυλομικρά (CM), οι πολύ χαμηλής πυκνότητας λιπορωτείνες (VLDL), οι ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (IDL), οι χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL), οι υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) και μια ιδιαίτερης δομής λιποπρωτεϊνη, η Lp(α) (31) Χυλομικρά Τα χυλομικρά είναι μεγαλομοριακά συμπλέγματα που αποτελούνται κατά 98% από λιπίδια (κυρίως τριγλυκερίδια) και 2% πρωτεΐνες. Η πυκνότητά τους είναι μικρότερη από 0,95 g/ml. Τα χυλομικρά συντίθενται στα επιθηλιακά κύτταρα του εντερικού σωλήνα και είναι υπεύθυνα για τη μεταφορά μετρίου και μεγάλου μεγέθους αλυσίδας λιπαρών οξέων μαζί με τη χοληστερόλη στη λεμφική κυκλοφορία. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η βασική τους λειτουργία μεταφοράς διατροφικών λιπιδίων από το έντερο προς τους περιφερικούς ιστούς (32). Στην κυκλοφορία μεταβολίζονται από τη λιποπρωτεϊνική λιπάση (LpL), που βρίσκεται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων σε υπολείμματα χυλομικρών τα οποία προσλαμβάνονται απ το ήπαρ και απομακρύνονται από την κυκλοφορία μέσω ειδικών υποδοχέων LDLr (31). Η απολιποπρωτεΐνη Β-48 με μέγεθος 240 kda είναι η κύρια απολιποπρωτεΐνη των χυλομικρών που σχηματίζει ένα αμφίφυλο σφαιρικό εξωτερικό περίβλημα, η εξωτερική επιφάνεια του οποίου είναι υδρόφιλη (στους μύς τα χυλομικρά περιέχουν και apob100). Άλλες απολιποπρωτεΐνες που συναντώνται είναι η apoe, η apoa-iv και η apoc-ii Πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL) Οι VLDL είναι οι λιποπρωτεΐνες που συντίθενται και εκκρίνονται από το ήπαρ. Είναι 20

21 μεγάλα σωμάτια αλλά όπως και στα χυλομικρά το μέγεθός τους αλλάζει ανάλογα με το πόσο αυξημένη είναι η παραγωγή τριγλυκεριδίων από το ήπαρ (33). Η πυκνότητά τους κυμαίνεται από 0,95-1,006 g/ml. Αποτελούν τις πιο πλούσιες λιποπρωτεΐνες σε τριγλυκερίδια και συγκεκριμένα η λιπιδική τους σύσταση περιλαμβάνει 45-65% τριγλυκερίδια, 15-20% φωσφολιπίδια και 20-30% χοληστερόλη (ελεύθερη και εστεροποιημένη). Οι πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες αποτελούν τις πρόδρομες ουσίες προς το σχηματισμό των χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (LDL) και ο σκοπός τους είναι η διανομή των λιπιδίων στους περιφερικούς ιστούς με αποτέλεσμα η σύνθεσή τους να εξαρτάται από τις ανάγκες αυτών (31). Οι απολιποπρωτεΐνες που συναντώνται στις VLDL είναι οι apob100, apoe, apoc-i, apoc-ii και apoc-iii. H apob100 αποτελεί τον πυρήνα δόμησης της πρωτεΐνης, έτσι κάθε VLDL περιέχει αυτή την απολιποπρωτεΐνη (33) Ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (IDL) Ουσιαστικά, μετά τον καταβολισμό των VLDL από την LpL, προκύπτει το υπόλλειμα των VLDL το οποίο ονομάζεται IDL. Το σωματίδιο αυτό έχει δύο βασικούς ρόλους: 1) μεταφέρει λιπίδια στο ήπαρ και στους περιφερικούς ιστούς και 2) μετατρέπεται περαιτέρω σε LDL με την προοδευτική αφαίρεση τριακυλογλυκερολών. Έχει δειχθεί ότι στους περισσότερους ανθρώπους τα μισά VLDL συμμετέχουν στην πρώτη διαδικασία και τα άλλα μισά στη δεύτερη (34). Η πυκνότητά τους κυμαίνεται μεταξύ 1,006-1,019 g/ml Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL) Η λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας είναι γνωστή και ως «κακή χοληστερόλη» επειδή η κύρια λειτουργία της είναι να μεταφέρει λιπίδια στους περιφερικούς ιστούς καθώς και στα τοιχώματα των αρτηριών. Υπό συνθήκες οξειδωτικού stress η LDL μπορεί να οξειδωθεί και να φαγοκυτταρωθεί από τα μακροφάγα που έχουν εισβάλει στο ενδοθυλιακό τοίχωμα των αρτηριών, μετατρέποντας τα έτσι σε αφρώδη κύτταρα των αθηρωματικών πλακών. Η πυκνότητά τους κυμαίνεται από g/ml και η σύστασή τους αποτελείται από 75% λιπίδια (κυρίως εστεροποιημένη χοληστερόλη και ελάχιστα τριγλυκερίδια) και 25% πρωτεΐνες. Το πρωτεϊνικό τμήμα της LDL περιέχει την απολιποπρωτεΐνη Β-100, την apoe και σε μικρότερο βαθμό απαντώνται οι apoc-i, apoc-ii και apoc-iii. Πέραν της μεταφοράς 21

22 χοληστερόλης από το ήπαρ σε περιφερικούς ιστούς η LDL συμμετέχει και στη ρύθμιση της de novo σύνθεσης της χοληστερόλης στο ήπαρ. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL), έχουν αντικαταστήσει σε μεγάλο βαθμό την ολική χοληστερόλη ως κύρια μέτρηση των λιπιδίων για την αξιολόγηση του κινδύνου λόγω αθηρογόνων λιποπρωτεΐνών. Οι πιο πρόσφατες κατευθυντήριες γραμμές περιλαμβάνουν τις LDL-C ως πρωταρχικούς στόχους για παρεμβάσεις με σκοπό τη μείωση των λιπιδίων. Υπάρχουν εξειδικευμένοι υποδοχείς σε κυτταρικές επιφάνειες οι οποίοι δεσμεύουν την LDL-C, που ονομάζονται LDL-υποδοχείς. Η έλλειψη των LDL-υποδοχέων μειώνει την πρόσληψη της χοληστερόλης από τα κύτταρα, αναγκάζοντας την να παραμένει στην κυκλοφορία, αυξάνοντας έτσι τα επίπεδά της στο αίμα. (35-38) Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) Οι HDL είναι ένα μείγμα λιποπρωτεϊνών, των οποίων οι πυκνότητες ποικίλουν από 1,063 ως 1,21 g/ml (39). Αποτελεί ένα πολύπλοκο σωματίδιο λόγω του μεγέθους του, της δομής του αλλά και των συστατικών που το απαρτίζουν. Ο κύριος ρόλος της είναι η αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης από τους περιφερικούς ιστούς στο ήπαρ. Η κύρια απολιποπρωτεΐνη της HDL είναι η apoa-ι. Η ApoA-I προσλαμβάνει λιπίδια για να σχηματίσει το δισκοειδές μόριο γνωστό ως pre-β HDL, μία πρώιμη μορφή HDL (40). Το σωμάτιο αυτό αλληλεπιδρά με το ένζυμο LCAT (ακυλοτρανσφεράση της λεκιθίνης) σχηματίζοντας τη σφαιρική ώριμη HDL (41). Υπάρχουν δύο κύριοι υποπληθυσμοί της ώριμης HDL, η HDL 2 με πυκνότητα to g/ml και η HDL 3 με to 1.21 g/ml. Εκτός από την ταξινόμησή τους λόγω μεγέθους και πυκνότητας, οι υποπληθυσμοί των HDL μπορούν να διαχωριστούν με ηλεκτροφόρηση λόγω διαφοράς του ηλεκτικού τους φορτίου (42). Εκτός από την κύρια απολιποπρωτεΐνη, στην ΗDL συναντώνται οι: apoa-ii, apoci, apocii, apociii και apoe. Κατά μέσο όρο το 70% του βάρους της ανθρώπινης HDL περιέχει 70% apoa-i, το 25% apoα-ιι και 10% άλλες απολιποπρωτεΐνες. Σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, η απολιποπρωτεϊμική δομή της HDL μπορεί να τροποποιηθεί, τροποποιώντας αντίστοιχα και τη λιπιδική της σύσταση (27). 22

23 1.4 Απολιποπρωτεΐνες Όπως προαναφέρθηκε, οι απολιποπρωτεΐνες αποτελούν το πρωτεϊνικό τμήμα των λιποπρωτεϊνών. Οι κυριότερες κατηγορίες είναι οι A, B, C, E και a, καθώς και οι Μ, Η και η J. Το μέγεθός τους ποικίλει από 6kDa (apoc-i) έως και 500kDa (apob, apoα). Οι βασικές τους λειτουργίες είναι η δέσμευση και μεταφορά λιπιδίων διαμέσου της κυκλοφορίας, η αναγνώριση ειδικών υποδοχέων μέσω ειδικών θέσεων στη δομή τους, καθώς και η δράση τους ως ενεργοποίητές ή αναστολείς ενζύμων Απολιποπρωτεΐνη Α -I (apoa-i) Η apoa-i αποτελεί την κύρια απολιποπρωτεΐνη της HDL και φαίνεται ότι με την απουσία της η κλασσική HDL δε σχηματίζεται. Το μοριακό της βάρος είναι 29,016 Da και η σύνθεση και η έκκρισή της γίνεται πρωτίστως στο ήπαρ και δευτερευόντως στο έντερο (43). Έχει αποδειχθεί ότι η ΑροΑ-Ι είναι ένας σημαντικός παράγοντας στον οποίο οφείλονται οι αθηροπροστατευτικές, αντιφλεγμονώδεις και αντιοξειδωτικές δράσεις της HDL, λόγω του κρίσιμου ρόλου που διαδραματίζει στη διαδικασία της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης αλλά και λόγω της ικανότητάς της να μπορεί να απομακρύνει οξειδωμένα φωσφολιπίδια από οξειδωμένα LDLs (oxldls) και από τα κύτταρα (44;45). Συγκεκριμένα η apoa-i συνθέτει τη βασική δομή της δισκοειδούς HDL (46) και αναγνωρίζεται από μερικές από τις πιο σημαντικές πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη διαδικασία της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης όπως το ένζυμο Λεκιθινο-χοληστερολική ακυλοτρανσφεράση (LCAT) (47), τον διαμεμβρανικό A1 μεταφορέα της κασέτας που δεσμεύει την ATP (ATP-Binding Cassette A1, ABCA1) (48) και τον διαμεμβρανικό υποδοχέα εκκαθαριστή τάξης Β, τύπου 1 (Scavenger Receptor class B member 1, SR-B1) (49). Συνεπώς, αυτή η απολιποπρωτεΐνη δεν αποτελεί απλά το βασικό δομικό συστατικό της HDL αλλά χρησιμοποιείται σαν το μόριο αναγνώρισης για τις περισσότερες πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με την HDL (50) Απολιποπρωτεΐνη Α-ΙΙ (apoa-ii) Στους ανθρώπους η απολιποπρωτεΐνη Α-ΙΙ είναι η δεύτερη κύρια απολιποπρωτεΐνη της HDL. Η σύνθεσή της γίνεται στο ήπαρ και έχει τη μορφή ομοδιμερούς με μοριακό βάρος 17.4 kda, όπου το κάθε μόριο αποτελείται από 77 αμινοξέα και συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικό δεσμό μέσω Cys6 (51). Πρόσφατες μελέτες της ομάδας του Gursky πρότειναν 23

24 τους ακόλουθους ρόλους της apoαιι στη δομή και την αναδιαμόρφωση της HDL: i) η ενδογενής apoα-ιι βοηθά στη μεταφορά των λιπιδίων της επιφάνειας κατά τη διάρκεια μετατροπής των δισκοειδών AI-HDL και ΑΙΙ-HDL σε ώριμα σφαιρικά apoai / apoaii- HDL εμποδίζοντας την επέκταση της διάπλασης apoai, ii) η ενδογενής apoα-ιι κυκλοφορεί κυρίως στην μεσαία σφαιρική ΑΙ / ΑΙΙ-HDL, iii) η εξωγενής apoαιι μπορεί να συνδεθεί με την HDL οποιουδήποτε μεγέθους, προκαλώντας ελαφρά αύξηση μεγέθους και σταθεροποίηση HDL(52). Ωστόσο ο επακριβής ρόλος της apoaii στην HDL παραμένει υπό διερεύνηση Απολιποπρωτεΐνη Α-IV (apoa-iv) Η απολιποπρωτεΐνη Α-IV (ΑροΑ-IV) είναι μία από τις βασικές απολιποπρωτεΐνες που απαιτείται για το σχηματισμό των χυλομικρών. Συντίθεται κυρίως στο έντερο και σε μικρότερα επίπεδα στο ήπαρ των ανθρώπων (53-56). Η έκκρισή της φαίνεται να συνδέεται με τα σωματίδια των χυλομικρών και των VLDL, σταθεροποιώντας την επιφάνεια του σωματιδίου και επιτρέποντας την ενσωμάτωση πρόσθετων μορίων τριακυλογλυκερόλης (TAG) προκαλώντας αύξηση του μεγέθους τους (53;56-59). Επίσης έχει δειχθεί ότι αυτή η απολιποπρωτεΐνη παίζει ρόλο στην παχυσαρκία και στο διαβήτη σε πειραματικά μοντέλα ζώων, ωστόσο ο ρόλος της στους ανθρώπους δεν έχει διευκρινιστεί (60) Απολιποπρωτεΐνη Β (apob) H apob αποτελεί την κυριότερη απολιποπρωτεΐνη των χυλομικρών, των VLDL, IDL, και LDL σωματιδίων. Οι δύο κύριες ισομορφές της είναι η Β-48 που συντίθεται στο έντερο και η Β-100 που συντίθεται στο ήπαρ. H apob48 αποτελεί το 48% αμινοτελικό άκρο της apoβ100. Διαδραματίζει σημαντικό ρόλο ως προσδέτης στα σωμάτια LDL για τους ειδικούς υποδοχείς LDL. Η apob100 θεωρείται δείκτης κινδύνου για ανάπτυξη αθηροσκλήρυνσης καθώς οι υψηλές συγκεντρώσεις της apob έχουν συσχετιστεί με αντίστοιχα υψηλές συγκεντρώσεις των LDL σωματιδίων αποτελώντας δείκτη ανάπτυξης καρδιαγγειακής νόσου (61-63) Απολιποπρωτεΐνες C (apoc) Οι απολιποπρωτεΐνες αυτές συντίθενται στο ήπαρ και υπάρχουν τρεις ισομορφές: apoc-i, apoc-ii και apoc-iii. Συμβάλλουν στη διαμόρφωση των LDL,VLDL και HDL και παίζουν ρόλο ως ενεργοποιητές ή αναστολείς στο μεταβολισμό των τριγλυκεριδίων. Για παράδειγμα η 24

25 apoc-i ενεργοποιεί την LCAT και αναστέλλει το ένζυμο CETP και η apoc-ιι απαιτείται για την αποτελεσματική λιπόλυση των λιποπρωτεϊνών πλούσιων σε τριγλυκεριδα (TG) μέσω της ενεργοποίησης της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης (61). Αντίθετα, η apoc-iii αναστέλλει την λιπόλυση των λιποπρωτεϊνών πλούσιων σε TG και σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα λιποπρωτεϊνών πλούσια σε TG και πιθανώς καρδιαγγειακές νόσους (64). Μία πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η apoc-iii προάγει και τον de novo σχηματισμό HDL μέσω του ABCA1.(65) Απολιποπρωτεΐνη J (apoj) H apoj είναι ετεροδιμερής γλυκοπρωτεΐνη kda και τα δύο μόρια συνδέονται με δισουλφιδικό δεσμό (66). Φαίνεται ότι εμπλέκεται σε πολλές φυσιολογικές διαδικασίες όπως στην κυτταρική διαφοροποίηση, στη μεταφορά λιπιδίων προς επιδιόρθωση του DNA, στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου κα τα επίπεδά της είναι αυξημένα σε συνθήκες κυτταρικού στρες και στην περίπτωση βλάβης των ιστών (66-68) Απολιποπρωτεΐνη Ε (apoe) Η απολιποπρωτεΐνη Ε είναι μία μεσαίου μεγέθους απολιποπρωτεΐνη που αποτελείται από 299 αμινοξέα, και αποτελεί συστατικό διαφόρων τύπων λιποπρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων χυλομικρών, VLDL, IDL και HDL. Η apoe παράγεται από ηπατοκύτταρα στο ήπαρ, από μακροφάγα σε περιφερικούς ιστούς, και από γλοιακά κυττάρα στον εγκέφαλο. Η κύρια λειτουργία της είναι ως προσδέτης υποδοχέων (LDLr) και του υποδοχέα που σχετίζεται με την πρωτεΐνη-1 (LRP1) προς την λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας (LDL) και παίζει σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό, προωθώντας την κυτταρική πρόσληψη των λιποπρωτεϊνών (69). Επιπλέον μελέτες έχουν δείξει ότι η apoe μπορεί επίσης να προάγει τη de novo βιογένεση των HDL σωματιδίων με τη συμμετοχή των ABCA1 και LCAT (70). 1.5 Λιποπρωτεΐνη Lp(a) Η Lp(a) αποτελείται από την απολιποπρωτεΐνη α [apo(a)] η οποία συνδέεται ομοιοπολικά με την apob της χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης (LDL) και είναι η κύρια 25

26 λιποπρωτεΐνη μεταφορέας των οξειδωμένων φωσφολιπιδίων (OxPL). Η apo(a) και η apob περιέχονται σε αναλογία 1:1 (71;72). Με τις μετρήσεις των επιπέδων της Lp (a) είναι δυνατή η προβλέψη περιστατικού εμφράγματος του μυοκαρδίου, στεφανιαίας νόσου (73), περιφερικής αρτηριακής νόσου (74), εγκεφαλικού επεισοδίου, ασθένειας της αορτικής βαλβίδας (75) και ταχύτερης εξέλιξης της προϋπάρχουσας στένωσης της αορτής (76). 1.6 Διατροφικά λιπίδια Τα περισσότερα λιπίδια προσλαμβάνονται με τη μορφή τριγλυκεριδίων και χοληστερόλης μέσω της διατροφής. Οι γαστρικές λιπάσες (GL) είναι τα ένζυμα που επιταχύνουν την πέψη των τριγλυκεριδίων στο στόμαχο αφού προηγηθεί η αποικοδόμησή τους σε λιπαρά οξέα και η απορρόφησή τους από το εντερικό επιθήλιο. Τα χολικά άλατα, τα οποία είναι αμφιπαθή μόρια που παράγονται στο ήπαρ και εκκρίνονται μέσω της χοληδόχου κύστεως, προκαλούν την ενσωμάτωση των τριγλυκεριδίων σε μικκύλια στον αυλό του λεπτού εντέρου. Τα τριγλυκεριδία διατάσσονται στην επιφάνεια των μικκυλίων με τέτοιο τρόπο ώστε να διευκολύνεται η πρόσβαση των παγκρεατικών λιπασών (ΗL), οι οποίες υδρολύουν τους εστερικούς δεσμούς τους. Στη συνέχεια με τη βοήθεια λιπασών, πέπτονται σε ελεύθερα λιπαρά οξέα και σε 2-μονοακυλογλυκερόλη και μεταφέρονται στα εντερικά κύτταρα, όπου τα τριγλυκερίδια ανασυντίθενται και συσκευάζονται σε λιποπρωτεϊνικά σωματίδια μεταφοράς, τα χυλομικρά. Η χοληστερόλη στους ανθρώπους συντίθεται de novo σε μεγαλύτερο ποσοστό στο ήπαρ και διαφέρει από άνθρωπο σε άνθρωπο ανάλογα με τους γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες (77). Σε μικρότερο ποσοστό, πηγή της χοληστερόλης αποτελεί η διατροφή. Μόνο το 50% της προσλαμβανόμενης χοληστερόλης απορροφάται από το έντερο, ενώ το υπόλοιπο αποβάλλεται μέσω μηχανισμών απομάκρυνσης. Η εξωγενής χοληστερόλη συνδέεται με τα μικκύλια στον εντερικό αυλό στη μη εστεροποιημένη μορφή της, αφού η δομή του εστέρα απορροφάται ελάχιστα. Στη συνέχεια γίνεται η πρόσληψή της από τα κύτταρα του εντέρου, αλλά ο μηχανισμός ακόμη δεν έχει προσδιοριστεί ακριβώς. Στη διαδικασία αυτή συμμετέχει ένας ενεργητικός μεταφορέας, καθώς και η παθητική διάχυση και μεταφορά (78). Στην ενεργητική μεταφορά της χοληστερόλης διαμεσολαβούν ο μεταφορέας Niemann-Pick C1 like 1 (NPC1-L1) και οι πρωτεΐνες ABCG5 και ABCG8. Αφού η χοληστερόλη εισχωρεί στο εσωτερικό των κυττάρων του εντέρου μετατρέπεται σε εστέρες με τη βοήθεια της ισομορφής 2 της ακυλμεταφοράσης της Ακυλο-CoA χοληστερόλης (Acyl CoA cholesterol 26

27 acyltransferase isoform-2, ACAT2) και με τη δομή αυτή μπορεί να εισέλθει στα νεοσυντιθέμενα χυλομικρά και να εκκριθεί στη λεμφική κυκλοφορία με τα υπόλοιπα λιπίδια (Εικόνα 2) (79). Εικόνα 2: Ενεργητική μεταφορά της χοληστερόλης από τα μικκύλια στο εντερικό κύτταρο και ο μηχανισμός απέκκρισής της με τη μορφή χυλομικρών Στην περίπτωση που υπάρχει ανάγκη για ενέργεια από τους περιφερικούς ιστούς τότε χρησιμοποιούνται οι αποθήκες λιπιδίων (λευκός λιπώδης ιστός, WAT) μέσω τριών σταδίων. Αρχικά, η αποικοδόμηση των τριακυλογλυκερολών σε ελεύθερα λιπαρά οξέα και γλυκερόλη τροφοδοτούν τους ιστούς που τα έχουν ανάγκη. Στη συνέχεια, τα ελεύθερα λιπαρά οξέα μεταφέρονται στα μιτοχόνδρια όπου θα οξειδωθούν (80). Τέλος, τα λιπαρά οξέα καταβολίζονται σε μόρια του ακετυλο-συνενζύμου Α (CoA) και με αυτόν τον τρόπο εισέρχονται στον κύκλο του κιτρικού οξέος, παράγοντας ενέργεια με την μορφή της ATP. Σε περίοδο νηστείας, λόγω έκκρισης των ορμονών επινεφρίνης και γλυκαγόνης, οι οποίες προάγουν τη λιπόλυση, προκαλείται αύξηση των επιπέδων των ελεύθερων λιπαρών οξέων, ενώ η έκκριση ινσουλίνης δρα αντίθετα, αναστέλλοντας το μονοπάτι της λιπόλυσης (81). Όπως φαίνεται στο σχήμα, τα χυλομικρά συντίθενται στο έντερο ενώ η βιογένεση των LDL 27

28 και HDL γίνεται στο πλάσμα. Για την απόκτηση λιπιδικής ομοιόστασης διάφορες πρωτεΐνες όπως απολιποπρωτεΐνες, ένζυμα του πλάσματος, υποδοχείς των λιποπρωτεϊνών, των λιπιδικών πρωτεϊνικών μεταφορέων και των λιπιδικών μεταφορέων συμμετέχουν στα παραπάνω μεταβολικά μονοπάτια. 1.7 Μονοπάτια μεταβολισμού των λιποπρωτεϊνών Το μονοπάτι μεταβολισμού των χυλομικρών Τα χυλομικρά είναι λιποπρωτεΐνες πλούσιες σε τριγλυκερίδια που συντίθενται στο έντερο με βασική απολιποπρωτεΐνη την apob48, τα οποία μεταφέρουν διατροφικά λιπίδια και λιποδιαλυτές βιταμίνες από τον εντερικό σωλήνα στο ήπαρ και στους περιφερικούς ιστούς, όπως στο λιπώδη ιστό και στους σκελετικούς μυς. Ο καταβολισμός των χυλομικρών περιλαμβάνει δύο βήματα: 1) την υδρόλυση των τριγλυκεριδίων από την λιποπρωτεϊνική λιπάση (LpL) στην ενδοθηλιακή επιφάνεια των τριχοειδών αγγείων και 2) την πρόσληψη των υπολειμμάτων των χυλομικρών μέσω του υποδοχέα της LDL, κυρίως στο ήπαρ (82). (Εικόνα 3 αριστερά) Η λιπόλυση προκαλείται από την απολιποπρωτεΐνη apoc-ii η οποία δρα ως συνένζυμο της LPL και τα προϊόντα της υδρόλυσης είναι τα υπολείμματα χυλομικρών, τα οποία προσλαμβάνονται από το ήπαρ μέσω ηπατικών υποδοχέων, συπεριλαμβανομένων των υποδοχέων λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας (LDLr) και της πρωτεΐνης υποδοχέα που σχετίζονται με LDL (83). Αυτά έχουν χάσει το 90% των τριγλυκεριδίων. Με τη διαδικασία της λιπόλυσης απελευθερώνονται μεγάλες ποσότητες λιπαρών οξέων για πρόσληψη από τα κύτταρα των γειτονικών ιστών. Η ηπατική λιπάση (HL) φαίνεται επίσης να συμμετέχει στο μεταβολισμό των υπολειμμάτων των χυλομικρών αλλά δεν εμφανίζει σημαντικό ρόλο στην υδρόλυση των τριγλυκεριδίων. Αυτή είναι κυρίως υπεύθυνη για τη διευκόλυνση της απομάκρυνσης των υπολειμμάτων από το ήπαρ με την παρουσία apoe (84). Καθοριστικό ρόλο στο μεταβολισμό των χυλομικρών αλλά και των VLDL που θα αναφερθούν παρακάτω, διαδραματίζει η πρωτεΐνη μικροσωμιακής μεταφοράς (microsomal triglycerides transfer protein, MTTP), η οποία επάγει την ταχεία ανταλλαγή τριγλυκεριδίων μεταξύ των διάφορων μεμβρανικών συστημάτων και εκφράζεται τόσο στο ήπαρ όσο και στα εντερικά κύτταρα (85). 28

29 1.7.2 Το μονοπάτι μεταβολισμού των VLDL Οι VLDL είναι οι λιποπρωτεΐνες που συντίθενται και εκκρίνονται από το ήπαρ. Κατά την απέκκρισή τους από το ήπαρ περιέχουν τις απολιποπρωτεΐνες apob100 και apoe. Αρχικά, η ΜΤTΡ μεταφέρει ηπατικά τριγλυκερίδια στην νεοσυντιθέμενη apob100. Σημαντικό ρόλο στον καταβολισμό των VLDL διαδραματίζει η λιποπρωτεϊνική λιπάση υδρολύοντας τις τριακυλογλυκερόλες (TAG) στα VLDL (86). Η υδρόλυσή τους συνοδεύεται από την ελευθέρωση επιφανειακών υλικών από την VLDL τα οποία μεταφέρονται στην ΗDL, όπου η VLDL μετατρέπεται σε μικρότερα υπολείμματα (IDL) τα οποία είτε λαμβάνονται από το ήπαρ ή καταβολίζονται περεταίρω προς LDL (87). (Εικόνα 3 δεξιά) Τα σωματίδια που απομακρύνονται από την VLDL κατά τη διάρκεια της υδρόλυσης είναι φωσφολιπίδια και ελεύθερη χοληστερόλη καθώς και απολιποπρωτεΐνες C,E, ενώ η apob100 παραμένει μέχρι το τέλος. Οι ApoC ρυθμίζουν τη δραστικότητα της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης (LpL) και συγκεκριμένα η apocii είναι ενεργοποιητής, ενώ η apociii είναι αναστολέας (88). Επίσης φαίνεται ότι οι apoc μειώνουν την προσκόλληση των VLDL σε ηπατικούς υποδοχείς (89). Η apoe συμμετέχει στην ηπατική κάθαρση λιποπρωτεϊνών πλούσιων σε τριακυλογλυκερόλες και των υπολειμμάτων τους, μέσω της αλληλεπίδρασής της με ηπατικούς υποδοχείς (90). Όμως, η ανασταλτική της δράση στη δραστικότητα της LPL ίσως εμποδίζει τη λιπόλυση των VLDL που μεσολαβείται από την LPL (91). Συμπερασματικά, οι συγκεντρώσεις των apoc και apoe καθώς και ο λόγος apoc/apoe φαίνονται να αποτελούν σημαντικούς παράγοντες στο μεταβολισμό λιποπρωτεϊνών πλούσιων σε τριακυλογλυκερόλες (91;92). 29

30 Εικόνα 3: Σχηματική αναπαράσταση μεταβολισμού χυλομικρών και VLDL Το μονοπάτι μεταβολισμού της HDL Το πρώτο βήμα για το σχηματισμό των HDL σωματιδίων είναι η βιοσύνθεση και η έκκριση της βασικής της απολιποπρωτεΐνης apoa-i από το ήπαρ στη μη λιπιδιωμένη μορφή της. Αφού αυτή μετατραπεί στη λιπιδιωμένη μορφή της προσλαμβάνοντας φωσφολιπίδια, συνθέτει τα μικρά δισκοειδή μόρια της HDL τα pre-β-hdl (93) και αναγνωρίζεται από το ένζυμο LCAT (94), από τη μεμβρανική πρωτεΐνη μεταφοράς (ABCA1) (95) και από τον υποδοχέα (SR-BI) (96). (Εικόνα 4) Συγκεκριμένα διαμέσου της ABCA1 η apoa-i προσλαμβάνει ελεύθερη (μη εστεροποιημένη) χοληστερόλη από κύτταρα περιφερικών ιστών και έτσι σχηματίζονται μεγαλύτερα δισκοειδή σωμάτια α-4-hdl (95). Στη συνέχεια, το ένζυμο LCAT που συντίθεται στο ήπαρ, εστεροποιεί την ελεύθερη χοληστερόλη σε εστέρες χοληστερόλης (CE) τα οποία εισέρχονται στον πυρήνα των σωματιδίων και έτσι σχηματίζονται τα ώριμα σφαιρικά HDL σωμάτια τύπου HDL3 (50;97). Η συνεχιζόμενη αύξηση του σωματιδίου, μέσω επιπλέον παραλαβής φωσφολιπιδίων και μη εστεροποιημένης 30

31 χοληστερόλης από τα κύτταρα, οδηγεί στο σχηματισμό μεγαλύτερων σφαιρικών σωματιδίων, των HDL2. Οι HDL2 θεωρούνται ως κατ εξοχήν αντιαθηρογόνες, διότι αποδομούν μεγάλη ποσότητα χοληστερόλης προς το ήπαρ. Το ένζυμο LCAT μπορεί να εστεροποιήσει τη χοληστερόλη σε LDL, αλλά λόγω της δράσης της apoa-i ως συμπαράγοντάς του, προτιμάται η HDL σαν λιποπρωτεϊνικό υπόστρωμα. Τα ώριμα πια μόρια HDL ανταλλάσσουν τους εστέρες χοληστερόλης με τα τριγλυκερίδια των αποτελούμενων από apob λιποπρωτεϊνών (VLDL,LDL,IDL), συμπεριλαμβανομένων των λιποπρωτεϊνών πλούσιων σε τριγλυκερίδια (TRLs). Η διαδικασία αυτή γίνεται μέσω της πρωτεΐνης μεταφοράς των εστέρων χοληστερόλης (Cholesteryl Ester Transfer Protein, CETP). Μία δεύτερη πρωτεΐνη πλάσματος για μεταφορά λιπιδίων είναι η πρωτεΐνη μεταφοράς των φωσφολιπιδίων (PLTP), η οποία ρυθμίζει το μέγεθος και τη σύνθεση των HDL μέσω μεταφοράς φωσφολιπιδίων από τις VLDL προς τις HDL αλλά και μέσω άμεσης ανακατασκευής των σωματιδίων. Συγκεκριμένα μεσολαβεί στη σύνδεση δύο ώριμων μορίων HDL που ονομάζονται HDL3, προς σχηματισμό ενός μεγαλύτερου σε μέγεθος HDL2. Τα ώριμα HDL σωματίδια υδρολύονται κυρίως με τη δράση της ηπατικής λιπάσης HL αλλά και με την ενδοθηλιακή λιπάση EL και την λιποπρωτεϊνική λιπάση LpL. Τέλος ο καταβολισμός των σωματίων αυτών γίνεται με τον υποδοχέα (SR-BI). Η κύρια λειτουργία του υποδοχέα αυτού είναι η πρόσληψη εστέρων χοληστερόλης από HDL πλούσια σε λιπίδια, μεταφέροντάς τους ενδοκυττάρια και μετατρέποντάς τους σε χολικά οξέα. Ο SR-BI μπορεί επίσης να επάγει τον καταβολισμό με την απομάκρυνση όλου του σωματιδίου της HDL μέσω των υποδοχέων της apoe ή της apoa-i στα κύτταρα του ήπατος. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει πως τόσο η πως τόσο η απολιποπρωτεΐνη Ε όσο και η απολιποπρωτεΐνη C-III προάγουν τη de novo βιοσύνθεση της HDL απουσία απολιποπρωτεΐνης A-Ι (65;98). 31

32 Εικόνα 4: Μονοπάτι βιοσύνθεσης της HDL (98) 1.8 Οι λειτουργίες της HDL Μελέτες έχουν δείξει ότι όσο αυξημένη είναι η «κακή» χοληστερόλη (LDL) και όσο μειωμένη είναι η «καλή» (HDL) χοληστερόλη, τόσο μεγαλύτερος είναι ο κίνδυνος για την εμφάνιση καρδιακών και εγκεφαλικών επεισοδίων. Ωστόσο περεταίρω έρευνα σχετικά με την HDL υποδεικνύει πως, εκτός από την ποσότητα της χοληστερόλης, σπουδαίο ρόλο διαδραματίζει και η λειτουργικότητα της HDL. Έρευνες έχουν συσχετίσει τις διάφορες λειτουργίες της HDL, με κύρια την αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης, με την αθηροπροστασία (99;100). Επιπλέον η HDL παρουσιάζει άμεση ή έμμεση αντιοξειδωτική προστασία της LDL (101;102). Εκτός από την αντιοξειδωτική της δράση, άλλες σημαντικές ιδιότητές της είναι η de novo σύνθεση των χολικών οξέων (103), η εξασθένιση της φλεγμονώδους απόκρισης, η ενεργοποίηση του αμυντικού συστήματος (104) και η μείωση της ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας (105), καθώς και η διατήρηση της ομοιόστασης των VLDL (106) και η διέγερση της πρόσληψης γλυκόζης και των λιπαρών οξέων (107). Επιπροσθέτως συμβάλλει στην βελτίωση της λειτουργικότητας των β-κυττάρων σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 2 ( ) Αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης Όλα τα κύτταρα του οργανισμού έχουν την ικανότητα αφ ενός να βιοσυνθέτουν μόνα τους χοληστερόλη, αφ ετέρου να την προσλαμβάνουν μέσω των λιποπρωτεϊνών LDL από τον εξωκυττάριο χώρο. Τα κύτταρα απαλλάσσονται από την περίσσεια χοληστερόλης μέσω 32

33 του ήπατος το οποίο αποτελεί το μοναδικό όργανο που είναι ικανό να απεκκρίνει σημαντικές ποσότητες χοληστερόλης. Συνεπώς, υπάρχει ένας συνεχής κύκλος μεταφοράς της χοληστερόλης από τα περιφερικά κύτταρα προς το ήπαρ, από όπου η χοληστερόλη θα απεκκριθεί στη χολή, είτε απ ευθείας είτε μέσω σχηματισμού των χολικών οξέων. Αυτός ο μεταβολικός δρόμος ονομάζεται ανάστροφη μεταφορά της χοληστερόλης και οι HDL είναι υπεύθυνες για τη μεταφορά αυτή (111). Μέσω της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης, περιορίζεται ο σχηματισμός αφρωδών κυττάρων και η πρόκληση αθηροσκλήρωσης (100). Στη διαδικασία αυτή περιλαμβάνονται τέσσερις διαδοχικές μεταβολικές οδοί. (Εικόνα 5) Αρχικά γίνεται ο σχηματισμός των πρωτογενών δισκοειδών HDL σωματιδίων και η παραλαβή ελεύθερης χοληστερόλης από τα περιφερικά κύτταρα. Ύστερα τα σωμάτια αυτά ωριμάζουν σταδιακά μέσω του ενζύμου LCAT. Στη συνέχεια τα ώριμα HDL διαφοροποιούνται και ανακατασκευάζονται μέσω των πρωτεϊνών μεταφοράς CETP, PLTP και της ηπατικής λιπάσης. Τέλος η διαδιακασία ολοκληρώνεται με την είσοδο της χοληστερόλης της HDL στο ηπατοκύτταρο (111). 33

34 Εικόνα 5: Μονοπάτι αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης C : μόρια χοληστερόλης, CE : εστέρες χοληστερόλης.(112) Αντιοξειδωτική δράση της HDL Έχει δειχθεί ότι η οξειδωμένη LDL παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη αθηρωματικών πλακών αφού τα οξειδωμένα φωσφολιπίδιά της διεγείρουν την παραγωγή κυτταροκινών και συμβάλουν στην προσκόλληση μονοπύρηνων στην επιφάνεια του ενδοθηλίου, οδηγώντας στην δημιουργία αθηρωματικής πλάκας (113). Έτσι μία από τις λειτουργίες της HDL-χοληστερόλης είναι να αναστέλλει είτε άμεσα είτε έμμεσα την οξείδωση της LDL. In vitro, η apoa-i καθιστά την LDL ανθεκτική στην οξείδωση από τη λιποοξυγενάση, ένα ένζυμο που συμμετέχει στην οξείδωση των λιπαρών οξέων. Ένας μηχανισμός που έχει προταθεί για να ερμηνεύσει αυτή την προστατευτική δράση της HDL είναι η απομάκρυνση μορίων από την LDL που υφίστανται οξείδωση, όπως των HPODE (hydroperoxyoctadecadienoic acid) και HPETE (hydroperoxyeicosate traenoic acid) (114). Επιπροσθέτως, η σύνδεσή της με μόρια που έχουν αντιοξειδωτικές ιδιότητες όπως το ένζυμο παραοξονάση 1 (PON 1), που μεταφέρεται από την apoa-i, συμβάλλει στη συγκεκριμένη δράση της. (Εικόνα 6) 34

35 Εικόνα 6:Αντιοξειδωτική δράση της HDL (115;116) Αντιφλεγμονώδης δράση της HDL Ένα ακόμα στοιχείο που παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη της αθηρωμάτωσης αποτελεί η φλεγμονή, έτσι η HDL έχει και αντιφλεγμονώδη δράση. Συγκεκριμένα η ώριμη σφαιρική HDL εμποδίζει την έκφραση προφλεγμονωδών μορίων προσκόλλησης και διεγείρει την έκφραση του αντιφλεγμονώδους παράγοντα TGF-2 στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η έκφραση των συγκεκριμένων μορίων προσκόλλησης των ενδοθηλιακών κυττάρων εξαρτάται από την ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων όπως του ενισχυτή της ελαφριάς αλυσίδας του κάπα πυρηνικού υποδοχέα των ενεργοποιημένων β- κυττάρων (NF-kβ) (117). Επίσης, η HDL εξουδετερώνει την προφλεγμονώδη δράση της C- αντιδρώσας πρωτεΐνης CRP (C-reactive protein) και αναστέλλει την παραγωγή προφλεγμονωδών προσταγλανδινών από μονοκύτταρα ενώ εμποδίζει τις προφλεγμονώδεις επιδράσεις της οξειδωμένης LDL στο ενδοθήλιο (104). Επιπλέον, περιορίζει την παραγωγή του χημειοτακτικού παράγοντα μονοκυττάρων (MCP-1) που επάγεται από την LDL (114). Σε πειραματικά ποντίκια με προχωρημένες βλάβες η υπερέκφραση ανθρώπινης apoa-i μειώνει την προσκόλληση μακροφάγων στο αγγειακό τοίχωμα (118). 35

36 Παρουσία οιστρογόνων στην HDL Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει πως η αθηροπροστατευτική δράση της HDL σχετίζεται με ιδιότητες που επηρεάζουν την εξέλιξη και όχι μόνο τη δημιουργία της αθηρωματικής νόσου. Η εστεράση LCAT η οποία μετατρέπει τα δισκοειδή μόρια HDL σε ώριμα σφαιρικά σωματίδια μέσω εστεροποίησης, φαίνεται να έχει την ικανότητα ρύθμισης της εστεροποίησης και μεταφοράς οιστραδιόλης (119;120). Η σχετιζόμενη με την HDL οιστραδιόλη αυξάνει την αθηροπροστατευτική δράση της HDL διεγείροντας τη δράση της συνθετάσης του οξειδίου του αζώτου (enos), που αποτρέπει τη δυσλειτουργία του αγγειακού ενδοθηλίου (μια από τις βασικές προϋποθέσεις για αθηρογένεση) αυξάνοντας έτσι τη βιοδιαθεσιμότητα του NO (121) Ρυθμιστική δράση στην κατανομή των απολιποπρωτεϊνών στις λιποπρωτεΐνες του πλάσματος Πέραν των άλλων ιδιοτήτων της, η HDL αποτελεί έναν ρυθμιστικό παράγοντα περιορισμού της συσσώρευσης της περίσσιας των μικρών ανταλλάξιμων απολιποπρωτεϊνών του πλάσματος στην VLDL, προφυλάσσοντας έτσι από δυσλιπιδαιμία και πιθανή εμφάνιση αθηρωματικής νόσου (106). Συγκεκριμένα η HDL λειτουργεί ως μια δεξαμενή απολιποπρωτεϊνών η οποία περιορίζει την εναπόθεση των μικρών, ανταλλάξιμων απολιποπρωτεϊνών όπως οι apoa-i, apoa-ii, apoe και apoc-iii στην VLDL αλλά και στα χυλομικρά, διατηρώντας την ομοιόσταση τριγλυκεριδίων του αίματος και προκαλώντας ταυτόχρονα μείωση της εμφάνισης υπερλιπιδαιμίας. Η ιδιότητα αυτή επιτυγχάνεται με τη ρύθμιση της δράσης της LPL Ο ρόλος της HDL στην ομοιόσταση της γλυκόζης Πιο πρόσφατα, η HDL έχει επίσης προταθεί να παίζει ένα παθογενετικό ρόλο στην ομοιόσταση της γλυκόζης (110;122). Φαίνεται ότι ανωμαλίες σε λειτουργικές ιδιότητες της HDL μπορούν να οδηγήσουν σε μειωμένη προστασία των παγκρεατικών β- κυττάρων από το οξειδωτικό στρες, την απόπτωση, τη φλεγμονή των νησιδίων και τη συσσώρευση χοληστερόλης (110). Όπως έχει αναφερθεί παραπάνω, η apoa-i αποτελεί την κυριότερη απολιποπρωτεΐνη της HDL, καθώς παίζει σημαντικό ρόλο στην βιοσύνθεση και 36

37 την λειτουργικότητά της (123). Πειράματα σε ποντίκια που δεν εξέφραζαν (knock-out) την apoa-i (apoa-i -/- ), έδειξαν ότι η απουσία της apoa-i-hdl είχε ως αποτέλεσμα την μειωμένη αντίσταση στην γλυκόζη και μειωμένη ευαισθησία στην ινσουλίνη που ταυτόχρονα σχετίζονταν με αυξημένη εναπόθεση τριγλυκεριδίων στο ήπαρ (124). In vitro μελέτες έχουν δείξει ότι η HDL προστατεύει τα παγκρεατικά β-κύτταρα, αναστέλλει την απόπτωσή τους και μπορεί να προάγει την επιβίωσή τους (125;126). Συγκεκριμένα, είναι γνωστό πως η αυξημένη συγκέντρωση χοληστερόλης, ελαττώνει την λειτουργικότητα των β-κυττάρων οπότε και η έκκριση της ινσουλίνης από αυτά μειώνεται (127). Συνεπώς, η συμβολή της HDL στην προστασία των κυττάρων αυτών γίνεται μέσω της ιδιότητάς τους να απομακρύνουν χοληστερόλη με σκοπό την αποκατάσταση και διατήρηση της λειτουργικότητάς τους. Επιπλέον, χορήγηση των apoa-i και apoa-ii είτε αυτούσιων είτε ως τμήματα των δισκοειδών ανασυνδυασμένων πληθυσμών της HDL (rhdl), είναι σε θέση να διεγείρουν την έκκριση ινσουλίνης από τα β-κύτταρα δείχνοντας πως η αύξηση των επιπέδων της HDL, μέσω φαρμακολογικών παρεμβάσεων, θα μπορούσε να αυξήσει την εκκριτική ικανότητα των β-κυττάρων οπότε και να οδηγήσει σε καλύτερο γλυκαιμικό έλεγχο (128). Εκτός από τη βελτίωση στην ικανότητα έκκρισης ινσουλίνης, η διατήρηση της ομοιόστασης της γλυκόζης γίνεται με τη βελτίωση της ικανότητας απόκρισης των σκελετικών μυών στην ινσουλίνη. Η διαδικασία αυτή γίνεται μέσω της apoa-1, η οποία έχει τη δυνατότητα να ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση AMPK επηρεάζοντας τον μεταβολισμό της γλυκόζης (129). Η ενεργοποίηση αυτή οδηγεί σε αύξηση της απορρόφησης της γλυκόζης από τα σκελετικά μυϊκά κύτταρα και σε μείωση της γλυκονεογένεσης στο ήπαρ. Η αντιοξειδωτική δράση της HDL αναφέρεται στον περιορισμό της γλυκοζυλίωσης της LDL, δηλαδή στην αναστολή της οξείδωσης αυτού του αθηρογενούς παράγοντα. In vitro έκθεση β-κυττάρων σε οξειδωμένη LDL, παρουσίασαν μειωμένη προ-ινσουλίνη, η οποία αποτελεί πρόδρομο μόριο της ινσουλίνης, κάτι το οποίο αντιστράφηκε παρουσία της HDL (130), υποδεικνύοντας ότι η ρύθμιση των επιπέδων της HDL στα β-κύτταρα, θα μπορούσε να βελτιώσει τον γλυκαιμικό έλεγχο των ατόμων που πάσχουν από διαβήτη τύπου 2 (131). Έρευνες έχουν αποδείξει ότι το μονοπάτι της έκκρισης ινσουλίνης είναι μειωμένο σε διακριτά knock-out μοντέλα είτε του διαμεμβρανικού A1 μεταφορέα της κασέτας που δεσμεύει την ATP (ABCA1) (132;133) ή του ABCG1 (134) μεταφορείς που παίζουν κρίσιμο ρόλο στην απομάκρυνση της χοληστερόλης από τα κύτταρα προς τον εξωκυττάριο χώρο (135) Άνθρωποι με έλλειψη ετερόζυγου ABCA1 εμφανίζουν μειωμένη απόκριση ινσουλίνης σε ενδοφλέβια ένεση γλυκόζης (136). Επιπλέον παρατηρήθηκε πως βραχυπρόθεσμη 37

38 χορήγηση ανασυνδιασμένης HDL προκαλεί αύξηση της ινσουλίνης του πλάσματος και μείωση της γλυκόζη σε πάσχοντες από σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 διαβήτη (T2DM) (137). Σύμφωνα με την αντίληψη ότι η HDL μπορεί να ασκήσει ευεργετική επίδραση στην ομοιόσταση της γλυκόζης, αρκετές επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι χαμηλότερα επίπεδα της HDL χοληστερόλης προσδίδουν μια υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης σακχαρώδους διαβήτη τύπου 2 (T2DM) ανεξάρτητα από μεταβολές σε λιποπρωτεΐνες που περιέχουν αροβ και την παχυσαρκία (138;139). Αξίζει να σημειωθεί ότι λίγα είναι σήμερα γνωστά για τη σχέση των παγκρεατικών β-κυττάρων σε συνάρτηση με τη λειτουργικότητα της HDL στον άνθρωπο. Συμπερασματικά, η ομοιόσταση της γλυκόζης δεν εξαρτάται μόνο από την επίτευξη των επιθυμητών επιπέδων της HDL-χοληστερόλης, αλλά από ένα σύνολο παραγόντων που καθιστούν το ρόλο της πολύ σημαντικό στην αντιμετώπιση του μεταβολικού συνδρόμου και του διαβήτη τύπου HDL: ποσότητα ή ποιότητα Η υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (HDL-C) έχει αναγνωρισθεί ως αντίστροφος προγνωστικός παράγοντας εμφάνισης αθηρωμάτωσης, αλλά ακόμη παραμένει αόριστη ως θεραπευτικός στόχος για τη μείωση της καρδιαγγειακής νόσου (140;141). Καθώς η στεφανιαία νόσος αποτελεί ένα φαινόμενο των πρόσφατων αιώνων, φαίνεται απίθανο ότι η HDL εξελίχθηκε ως συνάρτηση της ικανότητάς της να επιβραδύνει την εμφάνιση αθηροσκληρωτικής νόσου. Είναι πιο πιθανό, ο ρόλος της HDL στο έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα του σώματος να έχει δώσει ένα πλεονέκτημα επιβίωσης, και οι προστατευτικές καρδιαγγειακές επιδράσεις της να πηγάζουν από σύνθετη αλληλεπίδραση μεταξύ πολλών ενζύμων και άλλων πρωτεϊνών που δρουν ως υποκαταστάτες της, από τη λιπιδική σύνθεσή της, και από την αλληλεπίδρασή της με το αρτηριακό αγγειακό τοίχωμα και άλλες λιποπρωτεΐνες. Βέβαια είναι αξιοσημείωτο ότι ορισμένα είδη, όπως τα ποντίκια, έχουν μόνο HDL και παρουσιάζουν ανθεκτικότητα στην αθηρωμάτωση. Αυτά τα χαρακτηριστικά της HDL, συμπεριλαμβανομένου του περιεχομένου της σε χοληστερόλη, διαφοροποιούν την οξεία και χρόνια φλεγμονή. Αν και η επιδημιολογία της HDL-C και του καρδιαγγειακού κινδύνου ήταν αρκετά σταθερή, οι κλινικές δοκιμές φαρμακολογικών παρεμβάσεων για την αύξηση της HDL-C απέδωσαν απογοητευτικά αποτελέσματα (140;142). Επιπλέον, τα λειτουργικά 38

39 χαρακτηριστικά της HDL ήταν εξασθενημένα σε ασθενείς με αθηροσκλήρωση και φλεγμονώδεις νόσους (143). Έτσι γεννάται το ερώτημα για το αν ποσότητα HDL ή την ποιότητα HDL είναι ο πιο σχετικός στόχος για τη θεραπεία. Αρχικά ως προς την ποσότητα, βρέθηκε ότι η αύξηση της ποσότητας της HDL μέσω των πολυμορφισμών απλών νουκλεοτιδίων (SNPs), που σχετίζονται με το μεταβολικό της μονοπάτι για παράδειγμα, δεν μείωσε τον κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων (144). Ακόμα, δεν παρατηρείται αθηροπροστατευτική δράση με αύξηση των επιπέδων της HDL στο πλάσμα μέσω μειωμένου καταβολισμού της και συγκεκριμένα μέσω παρεμπόδισης της ροής της HDL από τους περιφερικούς ιστούς στο ήπαρ (145). Ως προς την ποιότητα της HDL, είναι γνωστό ότι τα σωματίδιά της διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθος, την πυκνότητα και την πρωτεϊνική σύσταση σε υποπληθυσμούς. Τα σωματίδια των υποπληθυσμών αυτών διαφέρουν επίσης ως προς τα ένζυμα που μεταφέρουν και με τα οποία αλληλεπιδρούν οπότε και κατά συνέπεια ως προς τις δράσεις τους (π.χ. αντιφλεγμονώδης, αντιοξειδωτική δράση). Συγκεκριμένα έχει βρεθεί ότι στα ώριμα σωματίδια HDL 3 (a-hdl) τα ένζυμα αυτά είναι ιδιαίτερα αυξημένα (146;147). Μέθοδοι για την αξιολόγηση των λειτουργιών HDL είναι διαθέσιμες (148) (αν και μπορεί να μην είναι εύκολα εφαρμόσιμες στην καθημερινή κλινική πρακτική). Για παράδειγμα, μια νέα μέθοδος για την ποσοτικοποίηση της εκροής χοληστερόλης από τα μακροφάγα έχει πρόσφατα ανακαλυφθεί (149). Η πρόσφατη έρευνα κατά την οποία η εκροή χοληστερόλης αξιολογείται με την παραπάνω μέθοδο, προβλέπει τόσο τη σοβαρότητα της στεφανιαίας νόσου (149) αλλά και την εμφάνισή της, ενώ η HDL-C δεν ήταν ικανή (150) και επιβεβαιώνει την υπόθεσή μας ότι η λειτουργία της HDL (ποιότητα) είναι πιο σημαντική από ό, τι τα επίπεδα της HDL-C (ποσότητα) Διαβήτης και δυσλιπιδαιμίες Η δυσλιπιδαιμία του σακχαρώδους διαβήτη χαρακτηρίζεται από i) αυξημένα επίπεδα τριγλυκεριδίων, ii)αυξημένα επίπεδα λιπαρών οξέων προς το ήπαρ, iii) αυξημένη συγκέντρωση μικρών πυκνών μορίων χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης LDL, iv) ελαττωμένη συγκέντρωση HDL χοληστερόλης ( ). Τα αυξημένα επίπεδα λιπαρών οξέων οφείλονται στη μειωμένη συγκράτηση των ελεύθερων λιπαρών οξέων από το λιπώδη ιστό. Υπό συνθήκες αντίστασης στην ινσουλίνη, η αυξημένη ροή των λιπαρών οξέων προς το ήπαρ οδηγεί σε ηπατική σύνθεση τριγλυκεριδίων με αποτέλεσμα την έκκριση λιποπρωτεϊνών 39

40 πλούσιων σε τριγλυκερίδια (VLDL). Επίσης, προκαλούν τοξικότητα του παγκρέατος, επιδεινώνοντας την αντίσταση στην ινσουλίνη. Η χαμηλή συγκέντρωση HDL αλλά και η υψηλή συγκέντρωση LDL σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη συχνά θεωρούνται συνέπεια των αυξημένων τριγλυκεριδίων. Μία άλλη πιθανή εξήγηση για τη διαμόρφωση χαμηλών επιπέδων HDL χοληστερόλης είναι ότι η αυξημένη ροή τριγλυκεριδίων στο ήπαρ που οφείλεται στην αντίσταση στην ινσουλίνη μπορεί να μειώσει την παραγωγή της βασικής απολιποπρωτεΐνης σχηματισμού της HDL, apoa-i ( ). Παρόλο που και οι δύο διαταραχές είναι συνδεδεμένες με την ανάπτυξη αθηροσκλήρυνσης, δεν έχει εξακριβωθεί αν ένα μόνο μόριο είναι το κυρίως υπεύθυνο ή ο συνδυασμός των ανωμαλιών που αφορούν τα λιπίδια, για την ανάπτυξη της καρδιαγγειακής νόσου. Η χρήση στατινών αποτελεί τη βασική θεραπεία για την μείωση των επιπέδων LDL. Μέσα στην θεραπευτική αγωγή περιλαμβάνονται όχι μόνο η χρήση φαρμάκων αλλά και ο τρόπος ζωής και ο γλυκαιμικός έλεγχος. Στους περισσότερους ασθενείς που πάσχουν από διαβήτη οι στατίνες προσλαμβάνονται ως φάρμακα μείωσης των επιπέδων των λιπιδίων. Στην αντιμετώπιση του υπολλειπόμενου καρδιαγγειακού κινδύνου που είναι πολύ σημαντικός σε διαβητικούς ασθενείς, μπορούν να συμβάλλουν οι συνδυασμοί υπολιπιδαιμικών φαρμάκων (στατίνης και φιμπράτης ή στατίνης και νιασίνης) προκειμένου να μειωθούν τα επίπεδα των LDL και των τριγλυκεριδίων με ταυτόχρονη αύξηση των επιπέδων της HDL. Χαρακτηριστικό είναι ότι ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη έχουν 2-4 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο ανάπτυξης καρδιαγγειακής νόσου συγκρινόμενοι με μη διαβητικούς, ενώ τα 2/3 περίπου των ασθενών θα καταλήξουν είτε εξαιτίας στεφανιαίας νόσου, ιδιαίτερα του οξέος εμφράγματος μυοκαρδίου, είτε εξαιτίας αγγειακού εγκεφαλικού επεισοδίου (159). Συνεπώς είναι αναμφίβολο πως οι διαβητικοί ασθενείς αποτελούν ομάδα μεγάλου κινδύνου εμφάνισης επεισοδίων αθηροσκλήρυνσης (160). Για αρκετά χρόνια υπήρχε η πεποίθηση πως η υπεργλυκαιμία ήταν άμεσα συνδεδεμένη με την ανάπτυξη αθηροσκλήρωσης, λόγω της αυξημένης επίπτωσης της παχυσαρκίας και της προκαλούμενης αντίστασης στην ινσουλίνη (161) ενώ πλέον σύμφωνα με νέα δεδομένα, η αθηροσκλήρυνση συνδέεται περισσότερο με την διαβητική δυσλιπιδαιμία ή/και με την υπέρταση παρά με την υπεργλυκαιμία αυτή καθ αυτή (162;163). Επιπλέον, οι υπάρχουσες μελέτες δεν έχουν απαντήσει πειστικά στο ερώτημα αν ο καλός και αυστηρός μεταβολικός έλεγχος προστατεύει απ' την εμφάνιση στεφανιαίας νόσου και γενικά αθηροσκλήρωσης και φαίνεται πως οι παράγοντες που προκαλούν μεταβολικό σύνδρομο είναι πολύ σημαντικοί τόσο για την πρόγνωση της καρδιαγγειακής νόσου όσο και ως πιθανοί στόχοι αντιμετώπισης της νόσου. Δεδομένης 40

41 λοιπόν της υψηλής επίπτωσης της δυσλιπιδαιμίας στους διαβητικούς ασθενείς, της αποδεδειγμένης σχέσης της με τα καρδιαγγειακά συμβάντα, της πολλαπλάσιας εμφάνισης αυτών και των προκαλούμενων από αυτά θανάτων (1,7 φορές περισσότεροι) σύμφωνα με τη National Diabetes Statistics Report στους διαβητικούς ασθενείς, η παγκόσμια ιατρική κοινότητα έχει συνεχώς στραμμένο το ενδιαφέρον της στη μελέτη και στην αποτελεσματική αντιμετώπιση της διαβητικής δυσλιπιδαιμίας H διαβητική δυσλιπιδαιμία Τα αυξημένα επίπεδα λιπιδίων στο πλάσμα σε διαβητικούς ασθενείς δεν είναι αποτέλεσμα ενός μόνο παράγοντα αλλά πολλών όπως γενετικών παραγόντων, του τρόπου ζωής, συνυπαρχουσών ασθενειών και θεραπειών για άλλες ασθένειες, συμβάλλοντας στο λιπιδαιμικό προφίλ των ασθενών αυτών. Πολλοί διαβητικοί ασθενείς τύπου 2, παρουσιάζουν έναν συνδυασμό δυσλιπιδαιμίας οπότε και υπερτριγλυκεριδιαιμίας, χαμηλά επίπεδα HDL και apoa-i και αυξημένα επίπεδα LDL, VLDL, apob, τριγλυκεριδίων και μεταγευματικών λιπιδίων. Εντύπωση προκαλεί το γεγονός ότι η συνολική χοληστερόλη συνήθως είναι φυσιολογική ή αυξημένη. Τα επίπεδα των LDL είναι ελαφρώς αυξημένα και συνήθως δεν αποτελούν το κύριο χαρακτηριστικό κάποιας ανωμαλίας. Ωστόσο δεν είναι μόνο σημαντική η μη φυσιολογική συγκέντρωση, αλλά η αλλαγμένη σύνθεση των λιποπρωτεϊνών. Για την ακρίβεια, η σύνθεση της HDL και της LDL μπορεί να είναι τροποποιημένη (25). Τα σωματίδια της μικρής και πυκνής LDL-C συνδέονται πιο ισχυρά με τις αρτηριακές πρωτεογλυκάνες και διαπερνούν ευκολότερα το αρτηριακό τοίχωμα. Είναι περισσότερο επιρρεπή στην οξείδωση από τα μεγαλύτερα σωματίδια και για τον λόγο αυτό είναι πιο πιθανό να κινητοποιήσουν τις αθηροσκληρωτικές φλεγμονώδεις διαδικασίες στο αγγειακό ενδοθήλιο. Τέλος, τα μικρά πυκνά σωματίδια LDL-C εμφανίζουν χαμηλότερη συγγένεια με τον LDL-υποδοχέα σε σχέση με τα μεσαίου μεγέθους σωματίδια, με αποτέλεσμα μειωμένη κυτταρική πρόσληψή τους και αυξημένης διάρκειας παραμονή τους στην κυκλοφορία (164). Για όλους τους παραπάνω λόγους, εξαιτίας του αυξημένου κινδύνου αθηροσκλήρωσης, η διαβητική δυσλιπιδαιμία θεωρείται πλέον συνώνυμο της αθηρογόνου δυσλιπιδαιμίας Υπερτριγλυκεριδιαιμία νηστείας Όπως έχει ήδη προαναφερθεί, η δυσλιπιδαιμία του σακχαρώδους διαβήτη χαρακτηρίζεται από αυξημένη ροή ελεύθερων λιπαρών η οποία οδηγεί σε ηπατική σύνθεση τριγλυκεριδίων που με τη σειρά της προκαλεί σύνθεση και έκκριση προς το αίμα μορίων 41

42 πλούσιων σε τριγλυκερίδια (VLDL). Είναι πιθανόν ότι η αύξηση των επιπέδων των τριγλυκεριδίων στον σακχαρώδη διαβήτη έχει πολλαπλές αιτίες και δεν προκαλείται απλώς από αυξημένη ροή ελεύθερων λιπαρών οξέων προς το ήπαρ. Μπορεί δηλαδή αυτή να αιτιολογείται εν μέρει από την αύξηση των επιπέδων της apoc-iii, που είναι αναστολέας της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης η οποία προκαλεί την υδρόλυση των τριγλυκεριδίων (165). Ως γνωστόν, η ανθρώπινη apob100 συντίθεται στο ήπαρ. Μέρος της απολιποπρωτεΐνης αυτής αποσυντίθεται εξαρτώμενη από πυρηνικούς υποδοχείς, τη λειτουργικότητα των υποδοχέων της LDL και την ινσουλίνη. Η apob που δεν αποσυντίθεται, πιθανώς εκκρίνεται στο πλάσμα με τη μορφή των VLDL, IDL ή LDL. Με την αυξημένη ροή ελεύθερων λιπαρών οξέων και τριγλυκεριδίων, εκκρίνονται VLDL και συγκεκριμένα τα μεγάλα σε μέγεθος VLDL (166;167). Έχει δειχθεί πως η ρύθμιση της έκκρισης των VLDL εξαρτάται από τη διαθεσιμότητα του υποστρώματος, αλλά και από άλλους παράγοντες όπως η ινσουλίνη η οποία παίζει σημαντικότατο ρόλο στη ρύθμιση του μεταβολισμού των λιπιδίων και καταστέλλει την ηπατική έκκριση των VLDL. Έτσι, η αντίσταση στην ινσουλίνη είναι υπεύθυνη για την αυξημένη εκροή των τριγλυκεριδίων από το ήπαρ, ενώ μέσω της ασθενούς αντιλιπολυτικής δράσης της στο λιπώδη ιστό οδηγεί σε αυξημένη λιπόλυση. Η αντίσταση αυτή επίσης μειώνει την έκφραση των LDL υποδοχέων και αυξάνει τη σύνθεση χοληστερόλης και την έκκριση των VLDL από το ήπαρ ( ). Επιπλέον, μια φλεγμονώδης κατάσταση και χαμηλή συγκέντρωση αδιπονεκτίνης, καταστάσεις που χαρακτηρίζουν τον διαβήτη τύπου 2, έχουν ως αποτέλεσμα την αυξημένη παραγωγή VLDL συμβάλλοντας με αυτόν τον τρόπο στην υπερτριγλυκεριδιαιμία (168;169). Συνοψίζοντας, φαίνεται πως η υπερτριγλυκεριδιαιμία στους διαβητικούς οφείλεται κυρίως στο διαταραγμένο καταβολισμό των VLDL με την αδιπονεκτίνη να παίζει κρίσιμο ρόλο στη διαδικασία αυτή ( ). Έτσι, η υπερτριγλυκεριδιαιμία νηστείας στους διαβητικούς, δεν είναι τόσο απλή αφού είναι αποτέλεσμα αυξημένης παραγωγής λιποπρωτεϊνών πλούσιων σε τριγλυκερίδια και μειωμένου καταβολισμού τους Μεταγευματική υπερτριγλυκεριδιαιμία Χαρακτηριστικό των διαβητικών ασθενών αποτελεί η μεταγευματική υπερτριγλικεριδαιμία, δηλαδή τα αυξημένα επίπεδα τριγλυκεριδίων μετά το γεύμα. Στη διαδικασία αυτή τα επίπεδα της apob48 είναι αυξημένα και σχετίζονται με τα επίπεδα της ινσουλίνης (172;173). Σε διαβητικούς ασθενής, η αντίσταση στην ινσουλίνη δεν προκαλεί 42

43 την καταστολή της ηπατικής έκκρισης των VLDL λόγω της συνεχούς παραγωγής apob100. Τα γεγονότα αυτά έχουν ως αποτέλεσμα την αύξηση του ανταγωνισμού μεταξύ των χυλομικρών και των υπολειμμάτων VLDL για τους ηπατικούς υποδοχείς. Με τον τρόπο αυτόν ελαττώνεται η αναρρόφηση των καταλοίπων των χυλομικρών, τα οποία αποτελούν τις λιποπρωτεΐνες που κυρίως σχηματίζονται μεταγευματικά με αποτέλεσμα την παρατεταμένη παραμονή τους στο αίμα και την εμφάνιση μεταγευματικής υπερτριγλικεριδαιμίας η οποία είναι εξαιρετικά αθηρογόνος (174) Χαμηλή HDL-χοληστερόλη Η μειωμένη συγκέντρωση της HDL χοληστερόλης είναι ένα από τα χαρακτηριστικά της δυσλιπιδαιμίας του σακχαρώδους διαβήτη και συχνά θεωρείται συνέπεια των αυξημένων τριγλυκεριδίων (αντιστρόφως ανάλογα μεγέθη). Μέσω της CEPT γίνεται ετεροανταλλαγή των τριγλυκεριδίων και των εστέρων χοληστερόλης μεταξύ VLDL και HDL μορίων, γεγονός που οδηγεί στην παραγωγή μορίων HDL πλούσιων σε τριγλυκερίδια. Αυτά τα μόρια είναι πιο επιρρεπή στον καταβολισμό και οδηγούν στα μικρά πυκνά HDL και στη χαμηλή συγκέντρωση. Μία πιθανή εξήγηση της χαμηλής συγκέντρωσης είναι ότι η αυξημένη ροή τριγλυκεριδίων στο ήπαρ λόγω αντίστασης στην ινσουλίνη, μπορεί να μειώσει την ηπατική παραγωγή apoa-i που αποτελεί την κύρια δομική πρωτεΐνη της HDL. Σε όλες τις περιπτώσεις δημιουργίας μη λειτουργικών ή μειωμένων HDL μορίων, προκαλείται ελαττωμένη αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης, η οποία συμβάλει στην παθογένεση της αθηροσκλήρωσης. ( ) Υψηλή LDL χοληστερόλη Τον εγκυρότερο δείκτη ρίσκου ανάπτυξης καρδιαγγειακής νόσου αποτελεί ο αυξημένος αριθμός των LDL σωματιδίων και όχι η χαμηλή συγκέντρωσή τους (175). Τα μικρά πυκνά μόρια LDL είναι αθηρογόνα και πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η αθηρογονικότητά τους οφείλεται όπως έχει ήδη αναφερθεί σε α) Μειωμένο ρυθμό απομάκρυνσής του από τους ειδικούς υποδοχείς LDLr β) Αυξημένη δέσμευση από το αρτηριακό τοίχωμα γ) Αυξημένη τάση προς οξείδωση δ) Αυξημένη διεισδυτικότητα στο αγγειακό ενδοθήλιο ( ;156;176). Τα LDL σωμάτια παράγονται είτε από υδρόλυση των VLDL-1 (πλούσια σε τριγλυκερίδια), είτε από απολιπιδίωση λιποπρωτεΐνών που περιέχουν apob100 (177). 43

44 Ο ρόλος της διαβητικής δυσλιπιδαιμίας στην αθηροσκλήρυνση είναι σημαντικός αφού έχει φανεί ότι αυξημένος αριθμός λιποπρωτεϊνών με apob (VLDL ή LDL ή μικρής πυκνότητας LDL) προάγει τον σχηματισμό των αφρωδών κυττάρων οπότε και της αθηρογένεσης λόγω αυξημένης αλληλεπίδρασης των μικρής πυκνότητας LDL σωματιδίων με τον υποδοχέα SRBI (178). Ο ρόλος της HDL είναι επίσης πολύ σημαντικός καθώς έχει την ικανότητα αντίστροφης μεταφοράς της χοληστερόλης, ωστόσο αυτό το χαρακτηριστικό δεν αποδίδεται γενικά (179;180) σε όλα τα σωματίδια της HDL αλλά σε εκείνα κυρίως που περιέχουν apoa-i (181). Ωστόσο αν και τα περισσότερα δείχνουν πως η αύξηση των τριγλυκεριδίων είναι ο κυριότερος λόγος σχηματισμού των μικρής πυκνότητας LDL σωματιδίων, κλινικά η μείωση των επιπέδων της LDL έχει φανεί σαφώς αποτελεσματικότερη της μείωσης των τριγλυκεριδίων (182). Για αυτό το λόγο, η φαρμακολογική θεραπεία που ακολουθείται έχει στόχο τα επίπεδα της LDL να είναι κάτω από 100 mg/dl. Θεραπεία χωρίς φάρμακα ακολουθείται προκειμένου να επέλθει μείωση του βάρους (συγκεκριμένα του λιπώδους ιστού) και επαναφορά του στα φυσιολογικά επίπεδα οπότε έτσι να αυξηθεί η ευαισθησία στην ινσουλίνη. Ο κυριότερος στόχος στην δυσλιπιδαιμία είναι η επίτευξη σωστού δείκτη μάζας σώματος (183;184). Τέλος, όσων αφορά τον έλεγχο της υπογλυκαιμίας, αυτός επιτυγχάνεται μέσω χρήσης φαρμακευτικών ουσιών που στοχεύουν στην μείωση της αντίστασης στην ινσουλίνη όπως για παράδειγμα η πιογλυταζόνη η οποία βελτιώνει το λιπιδαιμικό προφίλ του ασθενούς ανεξαρτήτως της μείωσης των επιπέδων γλυκόζης (185) Θεραπευτική αγωγή για τον διαβήτη τύπου 2 Είναι πιθανό κάποιοι διαβητικοί ασθενείς να πετύχουν τη ρύθμιση των επιπέδων της γλυκόζης στο αίμα τους με την κατάλληλη διατροφή και άσκηση, αλλά πολλοί χρήζουν φαρμακευτικής αγωγής ή θεραπείας με ινσουλίνη. Η απόφαση για το ποια θεραπεία είναι η κατάλληλη εξαρτάται από πολλούς παράγοντες όπως τα επίπεδα της γλυκόζης του αίματος σε κάθε ασθενή καθώς και η παρουσία πιθανών ασθενειών, όπως δυσλιπιδαιμίες, οι οποίες αντιμετωπίζονται με χρήση στατινών. Ο συνδυασμός φαρμακευτικών προϊόντων προς έλεγχο των επιπέδων γλυκόζης αποτελεί επίσης συχνό φαινόμενο. Τον Ιούνιο του 2009 η International Expert Committee πρότεινε ότι το σημείο κλειδί για τη διάγνωση του διαβήτη αποτελεί το επίπεδο της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης HbA 1c, το οποίο δεν πρέπει να ξεπερνά το 6.5% (186). Κλινικές μελέτες έχουν αποδείξει ότι η υπεγλυκαιμία σχετίζεται με μικροαγγειακές επιπλοκές του διαβήτη ( ). Πρόσφατα 44

45 στοιχεία υποστηρίζουν πως ο υπεργλυκαιμικός έλεγχος είναι απαραίτητος για την επίτευξη του ποσοστού-στόχου της HbA 1c (190). Ο παρακάτω πίνακας δείχνει τη συσχέτιση της συγκεκριμένης αιμογλοβίνης με την κατά μέσο όρο γλυκόζη του αίματος όπως φάνηκε από πειράματα, τα οποία οδήγησαν σε συσχέτιση μεγαλύτερη του 90% μεταξύ των δύο παραμέτρων (191). Γι τον υπολογισμό της γλυκόζης με βάση τα επίπεδα της HbA 1c χρησιμοποιήθηκε η εξίσωση: 28.7 hemoglobin A 1c value 46.7 (192). Πίνακας 3: Συσχέτιση αιμοσφαιρίνης HbA1c με τη γλυκόζη του αίματος (187;193) HbA 1c Μέσος όρος γλυκόζης(mg/ml) Ο αλγόριθμος που ακολουθείται παγκοσμίως είναι αυτός που συνοψίζεται στην παρακάτω εικόνα και προέρχεται από την Αμερικάνικη Διαβητολογική Εταιρία (American Diabetes Assosiation, ADA).(Εικόνα 7) Κάθε μία από τις θεραπείες έχει διαφορετική αποτελεσματικότητα, προκαλεί διαφορετικές μεταβολές στο βάρος, διαφορετικές επιπτώσεις και όπως είναι λογικό απαιτεί και διαφορετικό κόστος. 45

46 Εικόνα 7: Αλγόριθμος θεραπείας διαβήτη τύπου 2 SU: Σουλφονυλουρίες, TZD: Θειαζολιδινεδιόνες (γλυταζόνες), DPP-4-i: Αναστολείς διπεπτιδικής πεπτιδάσης 4, SGLT2-i: αναστολείς του υπότυπου 2 του συμμεταφορέα νατρίου και γλυκόζης, GLP- 1RA: Αγωνιστές του υποδοχέα του παρόμοιου της γλυκαγόνης πεπτιδίου 1 (194) 1.11 Μετφορμίνη Η μετφορμίνη (1,1-διμεθυλοδιγουανίδη) είναι παράγωγο της διγουανίδης και το 1920 πρώτη φορά ανακαλύφθηκε σε εκχυλίσματα του φυτού Gallega officinalis. Η διγουανίδη μετφορμίνη αρχικά εισήχθηκε για αντιμετώπιση του διαβήτη τύπου 2 στην Ευρώπη και στον Καναδά το 1957 και χρησιμοποιείται μέχρι και σήμερα για τη θεραπεία αυτής της ασθένειας (195). Όμως στις ΗΠΑ δεν αδειοδοτήθηκε πριν το 1995 λόγω φόβου πρόκλησης γαλακτικής οξέωσης, μιας σπάνιας αλλά μοιραίας επιπλοκής η οποία σχετίζεται με τη φαινφορμίνη, την πρώτη διγουανίδη που γνωρίζουμε. Η γαλακτική οξέωση υπολογίζεται ότι συμβαίνει σε 1 από τους ασθενείς που λαμβάνουν μετφορμίνη (196). 46

47 Η μετφορμίνη φαίνεται να βελτιώνει την περιφεριακή χρήση της γλυκόζης ενισχύοντας την ικανότητα πρόσληψης γλυκόζης των μυών. Επιπροσθέτως, αυξάνει την οξείδωση λιπαρών οξέων στο λιπώδη ιστό (197). Επίσης, αυξάνει τη δραστικότητα της κινάσης τυροσίνης που δρα ως υποδοχέας καθώς και ρυθμίζει τη μετατόπιση και μεταφορά του μεταφορέα της γλυκόζης glut-4, του οποίου η δράση θα εξεταστεί παρακάτω. Η μετφορμίνη ακόμα, καταστέλλει την ηπατική γλυκονεογένεση αναστέλλοντας τη δράση ενζύμων που κατέχουν ρόλο-κλειδί στο μονοπάτι αυτό (198). Εκτός από τη δράση του φαρμάκου στην ομοιόσταση της γλυκόζης σε διαβητικούς ασθενείς, εμφανίζει θετική φαρμακολογική δράση στη μη αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος (NAFLD) ( ), βελτιώνοντας το λιπιδαιμικό προφίλ του πλάσματος μειώνοντας τα επίπεδα της LDL χοληστερόλης (202;203) και αυξάνοντας αυτά της HDL-C ( ). Επιπλέον φαίνεται πως η μετφορμίνη έχει και άλλες δράσεις: μειώνει την πρόσληψη φαγητού (207) και βάρους (208) επηρεάζει θετικά πολλαπλούς δείκτες ανάπτυξης καρδιαγγειακής νόσου συμπεριλαμβανομένων του λιπιδαιμικού προφίλ (208;209) και του λιπώδους ήπατος (210), ρυθμίζει διάφορους δείκτες φλεγμονής (211;212) και φαίνεται να μειώνει το ρίσκο ανάπτυξης καρκίνου (213). Η χρήση της έχει διευρυνθεί και σε θεραπείες άλλων συνδρόμων που συνοδεύονται από αντίσταση στην ινσουλίνη, όπως στη μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα και στο σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών. Ωστόσο ο ακριβής μηχανισμός δράσης της δεν είναι ακόμα γνωστός Αντιυπεργλυκαιμική δράση μετφορμίνης Παρόλο που η μετφορμίνη παρουσιάζει τόσες διαφορετικές δράσεις, στοιχεία από κλινικές μελέτες και μοντέλα ζώων καθιστούν ως πρωταρχική δράση της την μείωση της ηπατικής παραγωγής γλυκόζης, (214) κυρίως αναστέλλοντας τη γλυκονεογένεση (215;216). Έχουν προταθεί διάφοροι μηχανισμοί για να εξηγήσουν την κατασταλτική δράση αυτή, ( ) συμπεριλαμβανομένων αλλαγών σε δραστικότητες ενζύμων ή μείωσης ηπατικής πρόσληψης των υποστρωμάτων (220). Η πολικότητα της μετφορμίνης την καθιστά εξαρτώμενη από τους μεταφορείς που υπάρχουν στην μεμβράνη για κυτταρική πρόσληψη. Η περιφερική δράση της στα ηπατοκύτταρα οφείλεται στην έκφραση της πρωτεΐνης δέσμευσης οκταμερών OCT1 που εκκρίνεται στο ήπαρ και στους νεφρούς, η οποία διευκολύνει την κυτταρική πρόσληψη του φαρμάκου (221). Μερικά SNPs (single-nucleotide polymorphism) φάνηκε να σχετίζονται με μειωμένη πρόσληψη μετφορμίνης, με αυξημένη αποβολή μετφορμίνης λόγω της μειωμένης επαναπορρόφησης από τα νεφρικά σωληνάρια και 47

48 χαμηλότερη θεραπευτική απάντηση η οποία οφείλεται στην ελαττωμένη δράση της μετφορμίνης στο ήπαρ (222). Ένας άλλος μεταφορέας της ίδιας οικογένειας που ονομάζεται OCT2, διαμεσολαβεί στην έκκριση της μετφορμίνης μέσω των νεφρών και συγκεκριμένα είναι υπεύθυνος για το 80% της συνολικής κάθαρσης της μετφορμίνης (223). Οι μύες προσλαμβάνουν το φάρμακο μέσω του OCT3 ο οποίος εκφράζεται σε διάφορους ιστούς (224). Η γαστρεντερική απορρόφησή του γίνεται μέσω του μεταφορέα οργανικών κατιόντων OCTN1 (225) και η νεφρική και εντερική απορρόφηση της μετφορμίνης διαμεσολαβείται από τον μεμβρανικό μεταφορέα των μονοαμινών PMAT (226). Τέλος, η έκκριση του φαρμάκου από τους νεφρούς γίνεται από τους δυο μεταφορείς εξόδου φαρμάκων και τοξινών MATE1, MATE Αυξημένη απορρόφηση γλυκόζης από τους σκελετικούς μυς Η γλυκονεογένεση αποτελεί το 28-97% της συνολικής ηπατικής παραγωγής γλυκόζης και εξαρτάται από τον τρόπο διατροφής σε μη διαβητικούς, ενώ το ποσοστό αυξάνεται στους ασθενείς που πάσχουν από σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (227). Όπως έχει προαναφερθεί, η σημαντικότερη δράση της μετφορμίνης είναι η αναστολή της ηπατικής γλυκονεογένεσης, βελτιώνοντας έτσι την υπεργλυκαιμία (228) και μειώνοντας την ηπατική παραγωγή γλυκόζης σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 2 σε ποσοστό μεγαλύτερο του 75% (229). Η μετφορμίνη συσσωρεύεται στο ήπαρ μέσω του μεταφορέα OCT1 (230) όπου και ρυθμίζει την απορρόφηση της γλυκόζης, τη γλυκόλυση καθώς και τη σύνθεση της γλυκόζης. Η διγουανίδη αυτή, ενισχύει την διαμεσολαβούμενη από την ινσουλίνη καταστολή της γλυκονεογένεσης (231) αυξάνοντας αρχικά την δραστικότητα του υποδοχέα της ινσουλίνης και του υποστρώματος 2 του υποδοχέα της ινσουλίνης (Insulin receptor substrate 2, IRS-2). Επίσης, προκαλεί αύξηση στην κινητοποίηση των μεταφορέων της γλυκόζης 4 (GLUT-4) ενισχύοντας την πρόσληψη της γλυκόζης. Το φάρμακο αυτό καταστέλλει την έκφραση ενζύμων που παίζουν κρίσιμο ρόλο στη διαδικασία της γλυκονεογένεσης όπως PEPCK και G6Pase (232) και διεγείρει την γλυκόλυση μέσω τροποποίησης ενζύμων που συμμετέχουν σε αυτά τα μονοπάτια. Μέσω των παραπάνω δράσεων, φαίνεται πως η μετφορμίνη αντιτίθεται στην δράση γλυκονεογένεσης της πετιδικής ορμόνης γλυκαγόνης (Εικόνα 8)(231;233;234). 48

49 Εικόνα 8: Οι δράσεις της γλυκαγόνης και των διγουανιδινών στην γλυκονεογένεση και την ροή της γλυκόλυσης (235) Αύξηση πρόσληψης γλυκόζης από τους σκελετικούς μυς Οι σκελετικοί μυς αποτελούν ένα από τα πιο σημαντικά όργανα για πρόσληψη γλυκόζης και αποθήκευσή της, που υπολογίζεται περίπου στο 75% της συνολικής γλυκόζης που προσλαμβάνει το σώμα διεγειρόμενη από ινσουλίνη (236;237). Το υπόστρωμα του υποδοχέα ινσουλίνης 1 (IRS1), και ο μεταφορέας γλυκόζης 4 (GLUT4) παίζουν κρίσιμο ρόλο ως ρυθμιστές στο μονοπάτι σηματοδότησης μέσω ινσουλίνης ( ). Μία από τις δράσεις της μετφορμίνης είναι η ενίσχυση πρόσληψης της διαμεσολαβούμενης από ινσουλίνη γλυκόζης από τους μυς καθώς και η βελτίωση στην ευαισθησία στην ινσουλίνη. Συγκεκριμένα, η μετφορμίνη ενεργοποιεί την AMPK για να ρυθμίσει τη σηματοδότηση της ινσουλίνης και να επάγει τη μετατόπιση του μεταφορέα 49

50 GLUT-4, διεγείροντας έτσι την πρόσληψη γλυκόζης για να διατηρηθεί ενεργειακή ισορροπία ( ). Επίσης προκαλεί αύξηση της δραστικότητας τυροσινικής κινάσης του υποδοχέα της ινσουλίνης (244) Αλλαγμένη ενδοκρινική λειτουργία του παγκρέατος Αξίζει να σημειωθεί πως η μονοθεραπεία με μετφορμίνη έχει ελάχιστες πιθανότητες πρόκλησης υπογλυκαιμίας (245) αφού η αντιδιαβητική δραστικότητά της δεν οφείλεται σε αύξηση της έκκρισης ινσουλίνης (246;247), αλλά σε μειωμένα επίπεδα ινσουλίνης στην κυκλοφορία (248;249). Μελέτες σε μη διαβητικά άτομα αλλά και σε πειραματόζωα που τους χορηγήθηκε μετφορμίνη, υποδεικνύουν ότι η μείωση των επιπέδων γλυκόζης οδηγούσε σε μείωση έκκρισης ινσουλίνης και αύξηση έκκρισης γλυκογόνου (250;251). Ωστόσο αυτός ο μηχανισμός ίσως να είναι λιγότερο αποτελεσματικός σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 2, ο οποίος μπορεί να είναι υπεύθυνος για πιο σπάνιες περιπτώσεις υπογλυκαιμίας σε σχέση με τους διαβητικούς που λαμβάνουν μόνο μετφορμίνη (229;250). Αξιοσήμαντο είναι το γεγονός ότι, η μετφορμίνη φαίνεται να αλληλεπιδρά με τον άξονα των ινκρετινών. Μέχρι σήμερα, στον άνθρωπο δύο είναι τα πεπτίδια που έχουν απομονωθεί και θεωρούνται υπεύθυνα για το 80% του φαινομένου της ινκρετίνης, δηλαδή της διαφορετικής ινσουλινικής απόκρισης έπειτα από χορήγησης γλυκοζης per os ή ενδοφλέβια: το γλυκοζοεξαρτώμενο ινσουλινοτρόπο πεπτίδιο (GIP) και το προσομοιάζον με τη γλυκαγόνη πεπτίδιο (GLP-1) (252;253). Η μετφορμίνη δρα σαν ένας ενισχυτής και επαγωγέας της ευαισθητοποίησης των δράσεων του πεπτιδίου 1 τύπου γλυκαγόνου (GLP-1) (254). Το GLP- 1, αυξάνει την έκκριση της ινσουλίνης με γλυκοζοεξαρτώμενο τρόπο, μειώνει την έκκριση της γλυκαγόνης, επάγει τη μεταγραφή του γονιδίου της ινσουλίνης καθώς και όλα τα στάδια της βιοσύνθεσής της αφού προάγει τη βιοσύνθεση της προινσουλίνης (252;253;255;256). Η μετφορμίνη διεγείρει την έκφραση του υποδοχέα του GLP-1 στο πάγκρεας και αυξάνει τα επίπεδα του GLP-1 στο πλάσμα (257;258). Ακόμη, τα επίπεδα της διπεπτιδικής πεπτιδάσης 4 (DDP-4) στην κυκλοφορία, η οποία είναι γνωστή για την ικανότητά της να διασπά ινκρετίνες, ήταν μειωμένα στους ασθενείς που έλαβαν μετφορμίνη σε σχέση με ασθενείς που δεν έλαβαν (259). Όμως, in vitro έχει φανεί ότι η μετφορμίνη δεν αναστέλλει άμεσα την δραστικότητα της DDP-4 (258;260). O συνδυασμός DDP-4 αναστολέων με μετφορμίνη, βελτίωσε τον έλεγχο της γλυκόζης σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 2 (261). Η ολοκληρωμένη κλινική συσχέτιση της επίδρασης της μετφορμίνης με το GLP-1 δεν έχει 50

51 ακόμα προσδιοριστεί. Μελέτες δείχνουν πως η μετφορμίνη δεν προστατεύει την λειτουργικότητα των β-κυττάρων (251;262). Συνοψίζοντας, η ικανότητα της μετφορμίνης να μειώνει τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα των ασθενών με διαβήτη τύπου 2, μπορεί να αιτιολογηθεί με πολλαπλούς μηχανισμούς, όπως αυτόν της αυξημένης πρόσληψης γλυκόζης από το ήπαρ και τους μυς, της μειωμένης γλυκονεογένεσης, βελτιωμένης λειτουργικότητας του GLP-1 και μειωμένης λειτουργικότητας της γλυκαγόνης. Ωστόσο, ο μοριακός τρόπος δράσης της μετφορμίνης, παραμένει αμφιλεγόμενος και συνεχίζει να αναζητάται Μοριακοί στόχοι των αντιδιαβητικών επιδράσεων Μιτοχόνδρια ο κύριος στόχος δράσης Ένα από τα πιο σημαντικά επιτεύγματα ήταν η κατανόηση του μοριακού μηχανισμού δράσης της μετφορμίνης που έγινε στις αρχές του 2000 από δυο ανεξάρτητες ερευνητικές ομάδες, οι οποίες διαπίστωσαν για πρώτη φορά ότι αυτή η διγουανίδη επάγει την αναστολή του συμπλέγματος I της μιτοχονδριακής αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων. (Εικόνα 9) Αυτή η παρατήρηση έγινε αρχικά σε ήπατα και απομονωμένα ηπατοκύτταρα από τρωκτικά (263;264) αλλά αργότερα επεκτάθηκε και σε άλλους ιστούς όπως σε σκελετικούς μυς (265), ενδοθηλιακά κύτταρα (266), β-παγκρεατικά κύτταρα (267) και νευρώνες (268). Επιπλέον, φαίνεται ότι η μιτοχονδριακή δράση της μετφορμίνης απαιτεί ακέραια κύτταρα (263;269;270) και δεν εμποδίζεται, τουλάχιστον σε ηπατοκύτταρα, ούτε από την αναστολή της συνθάσης νιτρικού οξειδίου ούτε από διάφορα χημικά είδη που περιέχουν οξυγόνο (reactive oxygen species (ROS) (263). Λόγω της υψηλής σταθεράς διάστασης οξέος (pka = 12.4) η μετφορμίνη είναι θετικά φορτισμένη κάτω από φυσιολογικές συνθήκες και, ως αποτέλεσμα, μπορεί να διασχίζει τη μεμβράνη του πλάσματος με παθητική διάχυση. Έτσι, η ενδοκυτταρική μεταφορά της διαμεσολαβείται από διαφορετικές ισομορφές των οργανικών μεταφορέων κατιόντων (OCT), ανάλογα με τον ιστό (π.χ. OCT1 στο ήπαρ ή OCT2 στο νεφρό). Μόλις εισαχθεί στο εσωτερικό του κυτταροπλάσματος, τα μιτοχόνδρια, στη συνέχεια, αποτελούν τον πρωταρχικό στόχο της μετφορμίνης. Το θετικό φορτίο της μετφορμίνης έχει θεωρηθεί ως υπεύθυνο για τη συσσώρευσή της εντός της μήτρας των ενεργοποιημένων μιτοχονδρίων, καθοδηγούμενο από το δυναμικό μεμβράνης (Δφ), ενώ η άπολη υδρογονανθρακική πλευρά της αλυσίδας του 51

52 φαρμάκου θα μπορούσε επίσης να προωθήσει την σύνδεση του με υδρόφοβες δομές, ειδικά των φωσφολιπιδίων των μιτοχονδριακών μεμβρανών (271). Εικόνα 9: το σύμπλεγμα I της μιτοχονδριακής αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων αποτελεί κύριο στόχο της μετφορμίνης (272) Η άμεση συνέπεια της αναστολής του μιτοχονδριακού συμπλέγματος μέσω του φαρμάκου, είναι η μειωμένη παραγωγή ATP και η ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης που ενεργοποιείται από το 5'-AMP (ΑΜPΚ) (273). Η κινάση αυτή χαρακτηρίζεται σαν ένας ενεργειακός αισθητήρας και ένας κύριος συντονιστής ενός ολοκληρωμένου δικτύου σηματοδότησης, το οποίο περιλαμβάνει μεταβολικά και αναπτυξιακά μονοπάτια όπου πραγματοποιούνται συγχρόνως, προκειμένου να αποκατασταθεί η ενεργειακή ισορροπία του κυττάρου. Όταν ενεργοποιηθεί, η AMPK ενεργοποιεί καταβολικά μονοπάτια που οδηγούν στην παραγωγή ATP και απενεργοποιεί αναβολικά μονοπάτια που καταναλώνουν ATP. Αν και ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο η μετφορμίνη δρα σε μοριακό επίπεδο παραμένει άγνωστος, έχει αποδειχθεί ότι το φάρμακο αναστέλλει το σύμπλεγμα I χωρίς να επηρεάζει οποιεσδήποτε άλλες βαθμίδες των μιτοχονδρίων. Αυτή η μοναδική ιδιότητα του φαρμάκου ελαττώνει την οξείδωση του NADH, μειώνει την βαθμίδωση πρωτονίων μεταξύ της εσωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων και της καθοδηγούμενης από πρωτόνια σύνθεσης ATP. Το αποτέλεσμα αυτού είναι, το ισοζύγιο ATP:ADP:AMP να μετατοπίζεται 52

53 προς αύξηση της σύνθεσης AMP από την αδενυλική κινάση (264) μειώνοντας έτσι, το δυναμικό ενέργειας του κυττάρου. Επίσης, άμεση αναστολή της απαμινάσης του AMP, η οποία πέπτει το AMP, από την μετφορμίνη, πιθανώς να αυξάνει τα επίπεδα του AMP (274). Τα αυξημένα επίπεδα ΑΜΡ αναστέλλουν την αδενυλική κυκλάση, ένα ένζυμο που βρίσκεται συνδεδεμένο στην μεμβράνη και καταλύει την μετατροπή του ΑΤΡ σε camp. Έτσι, η μετφορμίνη μειώνει τα επίπεδα camp. Ωστόσο υπάρχει μια συσχέτιση της μειωμένης σύνθεσης camp και της σηματοδότησης της γλυκαγόνης με την αντιδιαβητική δράση της μετφορμίνης (233). Ακόμη έχει παρατηρηθεί ότι αν και τα μιτοχόνδρια αποτελούν τον κύριο στόχο της μετφορμίνης, εκτός αυτών, επηρεάζει και τα ερυθροκύτταρα τα οποία στερούνται μιτοχονδρίων, πιθανώς επηρεάζοντας την μεμβρανική ρευστότητα (275). Περαιτέρω έρευνα αναμένεται πάνω σε αυτή την παρατήρηση Σηματοδότηση γλυκαγόνης και μετφορμίνη Η γλυκαγόνη είναι μια ορμόνη που εκκρίνεται από τα κύτταρα του παγκρέατος άλφα, και αντιτίθεται σε πολλές από τις δράσεις της ινσουλίνης που απαιτείται για την ομοιόσταση της γλυκόζης (276). Η ιδέα ότι η εξασθενημένη δράση της ινσουλίνης είναι η πρωταρχική αιτία για αντίσταση στην ινσουλίνη και την υπεργλυκαιμία στο διαβήτη έχει αμφισβητηθεί από τις αναδυόμενες αποδείξεις ότι η γλυκαγόνη μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της υπεργλυκαιμίας τόσο στο διαβήτη τύπου 1 όσο και στον τύπου 2 ( ). Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει βελτίωση του γλυκαιμικού προφίλ όταν καταστέλλεται η έκκριση γλυκαγόνης (279), όταν ο υποδοχέας γλυκαγόνης είναι σε έλλειψη σε ποντίκια (281), ή όταν αναστέλλεται είτε με αντισώματα είτε με ανταγωνιστές μικρού μορίου (282). Επιπλέον, η υπεργλυκαγοναιμία είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό και των δύο τύπων διαβήτη και οι ασθενείς με αυξημένα επίπεδα γλυκαγόνης έχουν επίσης ανεπάρκεια της δράσης της ινσουλίνης (283;284). Έτσι, φαίνεται ότι η γλυκαγόνη εμπλέκεται στη ρύθμιση της δυσλειτουργικής γλυκόζης που σχετίζεται με αντίσταση στην ινσουλίνη. Η σύνδεση της γλυκαγόνης με τον υποδοχέα της στην πλασματική μεμβράνη των ηπατοκυττάρων οδηγεί στην ενεργοποίηση της αδενυλικής κυκλάσης (AC),στην παραγωγή του δεύτερου αγγελιοφόρου κυκλικού ΑΜΡ (camp), και στη διέγερση της πρωτεϊνικής κινάσης Α (ΡΚΑ), (285) η οποία φωσφορυλιώνει πρωτεϊνικούς στόχους που εργάζονται από κοινού για να αυξηθεί η ηπατική παραγωγή όπως το δυλειτουργικό ένζυμο 6-53

54 φωσφοφρουκτοκινάση-2/διφωσφατάση της 2,6-φρουκτόζης (6-phosphofructo-2- kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 1 (PFK/FBPase 1). Η φωσφορυλίωση της PFK/FBPase 1 αναστέλλει την δράση της PFK και διεγείρει του ενζύμου FBPάσης 1 (Εικόνα 10) το οποίο είναι ένας αλλοστερικός αναστολέας της Εικόνα 10: Η δράση της σηματοδότησης της γλυκαγόνης και των διγουανιδίων στην διφωσφατάση της 2,6-φρουκτόζης (286) γλυκόλυσης και ενεργοποιητής της γλυκονεογένεσης, εφόσον τροποποιεί την δραστικότητα πολλών ενζύμων σε αυτά τα στάδια. Επίσης η ενεργοποίηση της PKA οδηγεί στην αύξηση της σύνδεσης της πρωτεΐνης αυτής στον υποκινητή των γλυκονεογενετικών γονιδίων όπως το PEPCK και το G6PC (Εικόνα 11) (287;288) τα οποία είναι στοιχεία απόκρισης του camp. Κατά τη διάρκεια της νηστείας η PKA φωσφορυλιώνει τους υποδοχείς της 1,4,5- τριφωσφορικής ινοσιτόλης (Inositol 1,4,5-triphosphate receptors, I3PRs) προκαλώντας έτσι μια αύξηση των επιπέδων ενδοκυττάριων κατιόντων ασβεστίου (289) ενεργοποιώντας τον μεταγραφικό συνενεργοποιητή 2 που ρυθμίζεται από την CREB (CREB regulated transcription coactivator 2, CRTC2) κάνοντας έτσι δυνατή την αλληλεπίδραση μεταξύ του CRTC2 και της πρωτεΐνης 1 που δεσμεύεται στο στοιχείο απόκρισης του camp (CAMP Responsive Element Binding Protein 1, CREB-1) ώστε να ενεργοποιηθεί η γονιδιακή έκφραση για γλυκονεογένεση (290). Αυτή η διαδικασία είναι μειωμένη κατά τη λήψη τροφής χάρη στην αυξημένη σηματοδότηση ινσουλίνης η οποία προκαλείται από την απενεργοποίηση του I3PR μέσω της AKT (γνωστή και ως Πρωτεϊνική κινάση Β, Protein kinase B, PKB). 54

55 Εικόνα 11: Δράση της μετφορμίνης στο ηπατοκύτταρο (291) Σφάλμα! Το αρχείο προέλευσης της αναφοράς δεν βρέθηκε. Η μετφορμίνη έχει δειχθεί ότι αναστέλλει την μεταγωγή σήματος γλυκαγόνης με τη μείωση παραγωγής 3'-5'- κυκλικής μονοφωσφορικής αδενοσίνης (camp) σε ηπατοκύτταρα. (233) Μειωμένη περιεκτικότητα camp οδηγεί σε μειωμένη δραστικότητα τόσο της πρωτεϊνικής κινάσης Α εξαρτώμενης από camp αλλά και της γλυκονεογένεσης που επάγεται από τη γλυκαγόνη. Μειωμένη camp αποδόθηκε στην άμεση αναστολή της αδενυλικής κυκλάσης από την αυξημένη ενδοκυτταρική περιεκτικότητα σε AMP μετά τη θεραπεία με μετφορμίνη και όχι στην ενεργοποίηση ΑΜΡΚ. Η αυξημένη περιεκτικότητα AMP θα μπορούσε να είναι ένα αποτέλεσμα της προαναφερθείσας αναστολής του μιτοχονδριακού συμπλόκου Ι και του μειωμένου ηπατικού ενεργειακού φορτίου με αγωγή με μετφορμίνη. Το AMP προσδένεται στη ρυθμιστική ενδοκυττάρια ανασταλτική P-θέση (σε μια θέση πουρίνης) της αδενυλικής κυκλάσης (292) και με αυτόν τον τρόπο αναστέλλεται η μέσω γλυκαγόνης ενεργοποίηση της 55

56 αδενυλικής κυκλάσης και μειώνεται η ενδογενής σύνθεση του camp και η ενεργότητα της PKA. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ένα νέο μηχανισμό δράσης της μετφορμίνης που σχετίζονται με τη σηματοδότηση γλυκαγόνης, και έναν πιθανό ρόλο της αδενυλικής κυκλάσης ως ένα νέο θεραπευτικό στόχο για την θεραπεία του διαβήτη τύπου 2. Όμως το πώς η μετφορμίνη δρα σε υψηλότερες συγκεντρώσεις παραμένει αδιευκρίνιστο, καθώς επιπρόσθετα της ανασταλτικής δράσης της στην σηματοδότηση της γλυκαγόνης, μειώνει και την παραγωγή γλυκόζης σε απάντηση ενός αναλόγου του camp που είναι διαπερατό από τη μεμβράνη παρακάμπτοντας την αδενυλική κυκλάση (233). Ακόμη, αν και ποντίκια που ήταν ομόζυγα ώστε να μην εκφράζουν τον υποδοχέα της γλυκαγόνης (293), εμφάνισαν υπογλυκαιμία, αυτό είναι ασυνήθιστο σε ασθενείς που λαμβάνουν μονοθεραπεία με μετφορμίνη. Αυτό υποδηλώνει πως είτε η μετφορμίνη αναστέλλει ανεπαρκώς την σηματοδότηση γλυκαγόνης στους ανθρώπους είτε άλλοι αντισταθμιστικοί μηχανισμοί υπάρχουν Ο ρόλος της AMPK στην ηπατική γλυκονεογένεση Η ΑΜΡΚ υπάρχει ως ένα ετεροδιμερές σύμπλεγμα το οποίο αποτελείται από μία καταλυτική υπομονάδα α και από δύο ρυθμιστικές υπομονάδες β και γ (294). Η ενεργοποίησή της γίνεται ως απάντηση σε διάφορες μεταβολικές αλλαγές οι οποίες επιφέρουν αλλαγές στη μοριακή αναλογία AMP:ATP, είτε μέσω αύξησης του ΑΤΡ (ενεργοποίηση μονοπατιών βιοσύνθεσης) είτε μέσω μείωσης της παραγωγής ΑΤΡ (295). Η δραστικότητα της ηπατικής ΑΜΡΚ ρυθμίζεται από ποικίλα φαρμακολογικά και φυσικά φάρμακα όπως το 5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR)(296) την ένωση A (297) τις πολυφαινόλες (298) και τα δύο αντιδιαβητικά φάρμακα, τη μετφορμίνη (299) και τις θειαζολιδινεδιόνες (TZDs) (300). Μέσω του κεντρικού ρόλου της ΑΜΡΚ στη ρύθμιση της γλυκόζης και του μεταβολισμού των λιπαρών οξέων, θεωρείται ως ένας μοριακός στόχος για τη θεραπεία του διαβήτη και του μεταβολικού συνδρόμου (301). Χάρη σ αυτό, η επίδραση της μετφορμίνης στη μείωση της γλυκόζης έχει αποδοθεί στην ενεργοποίηση της ΑΜΡΚ προάγοντας τη συσσώρευση του ΑΜΡ. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι το φάρμακο αυτό ενεργοποιεί την ΑΜΡΚ χωρίς να επιφέρει οποιαδήποτε αξιοπρόσεκτη αλλαγή στα AMP, ADP και ATP (302;303). Έρευνες έχουν δείξει ότι αποσιώπηση της ηπατικής κινάσης Β1 (LKB-1), η οποία φωσφορυλιώνει την καταλυτική περιοχή α της ΑΜΡΚ, καταστέλλει την ικανότητα του φαρμάκου να ενεργοποιεί την ΑΜΡΚ 56

57 in vivo και καταλήγει σε υπεργλυκαιμία καθώς και σε αυξημένη έκφραση γονιδίων για γλυκογενετικά ένζυμα (304). Όπως έχει ηδη αναφερθεί, η δραστικότητα της ΑΜΡΚ είναι σημαντική για τη δράση της μετφορμίνης ως μέσο ελάττωσης γλυκόζης. Όμως, υπάρχουν στοιχεία που δηλώνουν ότι η μετφορμίνη δεν δρα απευθείας ούτε στην LKB1 ούτε στην AMPK. Για παράδειγμα, ποντίκια που είχαν έλλειψη των καταλυτικών υπομονάδων της AMPK στο ήπαρ, εμφάνισαν επίπεδα γλυκόζης αίματος συγκρίσιμα με αυτά των wild-type, δηλαδή των μη γενετικά τροποποιημένων (305). Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι με χρήση μετφορμίνης διατηρείται η καταστολή της έκφρασης ενός ενζύμου της γλυκονεογένεσης, της φωσφατάσης της 6Ρ-γλυκόζης σε ηπατοκύτταρα ποντικών που οι AMPK και LKB1 έχουν εξαληφθεί (305). Τα παραπάνω, υποστηρίζουν ότι η μετφορμίνη αναστέλει την ηπατική γλυκονεογένεση μειώνοντας το ενεργειακό επίπεδο ανεξαρτήτως της παρουσίας του ΑΜΡΚ και της LKB1 (223;305;306). Βέβαια, κάποιες δράσεις της μετφορμίνης ακόμα αποδίδονται στην ΑΜΡΚ. Η AMPK φωσφορυλιώνει και αυξάνει την δράση του ινσουλινικού υποδοχέα και του IRS-2 και ενισχύει την μετατόπιση των μεταφορέων της γλυκόζης (Εικόνα 11)(307). Σε έρευνες έχει αποδειχθεί ότι η ικανότητα της μετφορμίνης να μειώνει την παραγωγή της γλυκόζης, διατηρήθηκε κάτω από εξαναγκασμένη υπερέκφραση, συνενεργοποιητή 1α του γάμμα υποδοχέα που ενεργοποιείται από τον πολλαπλασιαστή των υπεροξειδιοσωμάτων (Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1 alpha, PGC-1α) και με αύξηση στα επίπεδα πρωτεϊνών των ενζύμων της γλυκονεογένεσης, όπως η φωσφο-ενολοπυροσταφυλική καρβοξυ-κινάση και η φωσφατάση της 6Ρ-γλυκόζης (Glucose 6-phosphatase, G6Pase), καταλήγοντας στο ότι η μετφορμίνη διαταράσσει την δραστικότητα των ενζύμων της γλυκονεογένεσης και όχι της γονιδιακής έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν αυτά (305). Ο προτεινόμενος ρόλος της μετφορμίνης στην σηματοδότηση της γλυκαγόνης (το αυξημένο ΑΜΡ) μειώνει τα επίπεδα των camp (233) και στηρίζει την ΑΜΡΚ-ανεξάρτητη ανθυπεργλυκαιμική δράση της. Παρόλο που η ΑΜΡΚ δεν είναι απαραίτητη για τη βασική δράση της μετφορμίνης στη γλυκονεογένεση, θα μπορούσε να συμβάλει στις θεραπευτικές δράσεις του φαρμάκου επάγοντας επιθυμητές αλλαγές στο μεταβολισμό των λιπαρών οξέων που βοηθούν στην αύξηση στην ευαισθησία της ινσουλίνης. Στο ήπαρ, η ΑΜΡΚ ρυθμίζει τη δραστικότητα ενζύμων που παίζουν ρόλο στο μεταβολισμό των λιπαρών οξέων καθώς και στην β-οξείδωσή τους. Συγκεκριμένα, στο ήπαρ, η ΑΜΡΚ φωσφορυλιώνει και απενεργοποιεί την καρβοξυλάση του ακετυλοσυνενζύμου Α (ΑCC) (308) προκαλώντας μείωση της έκφρασης 57

58 του μαλονικού συνενζύμου Α, αύξηση της δραστικότητας της παλμιτοϋλοτρανσεράσης της καρνιτίνης 1 (carnitine palmitoyltransferase-1 (CPT-1)) και αυξημένη οξείδωση των λιπαρών οξέων (309). Αυτός ο μηχανισμός είναι σύμφωνος με τις παρατηρήσεις τροποποιημένου μεταβολισμού λιπαρών οξέων και βελτιωμένης ηπατικής στεάτωσης σε ποντίκια που λάμβαναν μετφορμίνη (310). Συνεπώς, η ενεργοποίηση της ΑΜΡΚ έχει ως στόχο την αύξηση της β-οξείδωσης και τη μείωση της σύνθεσης χοληστερόλης και τριγλυκεριδίων. Άνθρωποι που πάσχουν από διαβήτη τύπου 2 είναι πολύ συχνά δυσλιπιδαιμικοί, εμφανίζοντας αυξημένα επίπεδα χοληστερόλης και τριγλυκεριδίων τα οποία ενισχύουν την πιθανότητα εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων. Έτσι, η ενεργοποίηση της ΑΜΡΚ στο ήπαρ θα μπορούσε να ελαττώσει τον κίνδυνο αυτό, μειώνοντας τα επίπεδά τους (311) Άμεση διαμόρφωση μέσω του ενεργειακού φορτίου Δεδομένα από έρευνες δείχνουν πως υπάρχει μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της αύξησης του ΑΜΡ μέσω της μετφορμίνης και της πτώσης των επιπέδων του camp και της γλυκόζης (233). Επιπλέον της 2,6-διφωσφορικής φρουκτόζης, η οποία ρυθμίζει την φωσφοφρουκτο-κινάση 1 και την διφωσφατάση 1 της 1,6 Ρ-φρουκτόζης (Fructose-1,6- bisphosphatase 1, FBP1), πολλοί άλλοι παράγοντες διαμορφώνουν την ενεργότητα των ενζύμων της γλυκονεογένεσης και της γλυκόλυσης ανεξάρτητα από τη σηματοδότηση της γλυκαγόνης και της ΑΜΡΚ, συμπεριλαμβανομένων μεταβολιτών (όπως το κιτρικό), την αναλογία AMP:ATP (312;313) και την ισορροπία NADH:NAD+ (312). (Εικόνα 10) Το μιτοχονδριακό σύμπλεγμα I και άλλα ένζυμα που τροποποιούνται από αλλαγές του ενεργειακού φορτίου, όπως η αδενυλική κυκλάση η οποία αναστέλλεται από αυξημένα επίπεδα ΑΜΡ καθώς επίσης και η επηρεασμένη σηματοδότηση γλυκαγόνης και της ΑΜΡΚ η οποία διεγείρεται από αυξημένη αναλογία AMP:ATP, αποτελούν μοριακούς στόχους της μετφορμίνης Φαινοφιβράτη Η φαινοφιβράτη είναι ένα παράγωγο ινικού οξέος και ενδείκνυται για την αντιμετώπιση της δυσλιπιδαιμίας που σχετίζεται με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 ή με το μεταβολικό σύνδρομο. Μελέτες έχουν δείξει ότι ασκεί ένα ευρύ φάσμα 58

59 δράσεων τροποποίησης των λιπιδίων που επηρεάζουν την αθηρογόνο δυσλιπιδαιμία και συνήθως συνδέονται με αυτές τις καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένης της μείωσης των επιπέδων των τριγλυκεριδίων (μέχρι και 50%), των πολύ-χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνών (VLDL), των υπολειμμάτων VLDL, και των λιποπρωτεϊνών ενδιάμεσης πυκνότητας, καθώς και της αύξησης των επιπέδων της λιποπρωτεΐνης υψηλής πυκνότητας (HDL) χοληστερόλης στο πλάσμα 5-15% (314;315) και της μείωσης του ποσοστού των μικρών, πυκνών χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (LDL) σωματιδίων (314;316). Η φαινοφιβράτη είναι ένας πολύ καλός αγωνιστής του πολλαπλασιαστή των υπεροξειδιοσωμάτων PPAR-α, αλλά μία in vitro αξιολόγηση 209 συχνά συνταγογραφούμενων φαρμάκων και των συναφών ξενοβιοτικών υποδεικνύει ότι είναι επίσης ένας ισχυρός αναστολέας της εποξυγενάσης του κυτοχρώματος Ρ450 (CYP) 2C (317). Ο PPAR-α εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ, και σε μικρότερο βαθμό στους νεφρούς, στην καρδιά και στους μύς ( ), καθώς και σε κύτταρα του αρτηριακού τοιχώματος, μονοκύτταρα, μακροφάγα (323) και λεμφοκύτταρα (324). Ελέγχει τη μεταγραφή ρυθμιστικών γονιδίων του μεταβολισμού των λιπαρών οξέων και της χοληστερόλης. Η μείωση των τριγλυκεριδίων του πλάσματος που προκαλείται από τη φαινοφιβράτη, έχει συσχετιστεί με την καταστολή της σύνθεσης και έκκρισης των τριγλυκεριδίων από το ήπαρ και με τη διέγερση της αποικοδόμησης των πλούσιων σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεϊνών (325). Όσον αφορά τις λιποπρωτεΐνες που είναι πλούσιες σε τριγλυκερίδια και περιέχουν την απολιποπρωτεΐνη Β (apob), η φαινοφιβράτη και γενικά οι φιβράτες μειώνουν αποτελεσματικά τα σωματίδια που περιέχουν την apo-ciii (326;327), τα οποία είναι δείκτες αυξημένου κινδύνου αθηρογένεσης (328). Οι αυξημένες συγκεντρώσεις της HDL που επέρχονται με τη χρήση φιβρατών, είναι αποτέλεσμα αυξημένων επιπέδων apoa-i και apoa- II στο πλάσμα, μία μεταβολή που συνδέεται με την αύξηση του λόγου apoα-i/apoa-ii και με μείωση στη συγκέντρωση της LpA-I σε ασθενείς που έχει χορηγηθεί το φάρμακο.(εικόνα 12) (326;327) 59

60 Εικόνα 12: Η προσκόλληση της φαινοφιβράτης στον PPAR-α επηρεάζει το μεταβολισμό των λιπιδίων Μηχανισμοί δράσης των φιβρατών Στοιχεία από μελέτες σε τρωκτικά και σε ανθρώπους εμφανίζουν 5 κύριους μηχανισμούς για την κατανόηση της προαναφερθείσας δράσης των φιβρατών στο φαινότυπο των λιποπρωτεΐνών: 1. Επαγωγή της λιποπρωτεϊνικής υδρόλυσης. Η αυξημένη υδρόλυση των πλούσιων σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεϊνών (TRLs), θα μπορούσε να δημιουργήσει αλλαγές στη δραστικότητα της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης (LpL) (329) ή να αυξήσει τη διαθεσιμότητα των TRLs για υδρόλυση από την LpL που οφείλεται σε μείωση της apoc-iii. (330) 2. Επαγωγή της πρόσληψης των ηπατικών λιπαρών οξέων και μείωση της παραγωγής των ηπατικών τριγλυκεριδίων. Στα τρωκτικά, οι φιβράτες ενισχύουν την πρόσληψη των λιπαρών οξέων και τη μετατροπή τους σε ακυλο-coa από το ήπαρ 60

61 λόγω διέγερσης της δραστικότητας της πρωτεΐνης μεταφορέα λιπαρών οξέων (FATP) (331) και της συνθετάσης ακυλο-coa (ACS) (332). Επίσης, με την ενίσχυση του μονοπατιού της β-οξείδωσης με ταυτόχρονη μείωση της συνθεσης των λιπαρών οξέων με τη χρήση φιβρατών, έχει ως αποτέλεσμα τη μικρότερη διαθεσιμότητα των λιπαρών οξέων για σύνθεση τριγλυκεριδίων, μια διαδικασία η οποία ενισχύεται από την αναστολή της ορμονικά ευαίσθητης λιπάσης στο λιπώδη ιστό με τις φιβράτες (333) 3. Αυξημένη απομάκρυνση των LDL σωματιδίων. Η θεραπεία με φιβράτες οδηγεί στο σχηματισμό LDL σωματιδίων με μεγαλύτερη συγγένεια ως προς τον υποδοχέα τους, με αποτέλεσμα τον πιο γρήγορο καταβολισμό τους (334). 4. Μείωση της ανταλλαγής των ουδέτερων λιπιδίων (εστέρες χοληστερόλης και τριγλυκερίδια) μεταξύ των VLDL και HDL ίσως είναι αποτέλεσμα της ελλάτωσης των επιπέδων TRL στο πλάσμα. (335) 5. Αύξηση της παραγωγής HDL και διέγερση της διαδικασίας της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης. Οι φιβράτες αυξάνουν την παραγωγή των apoa-i και apoa-ii στο ήπαρ (336;337) συμβάλοντας στις αυξημένες συγκεντρώσεις HDL του πλάσματος και στην αποτελεσματικότητα της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης Ενεργοποίηση του PPAR-α μέσω φαινοφιβράτης και μεταβολισμός της HDL Όπως προαναφέρθηκε, οι φιβράτες αυξάνουν τα επίπεδα της λιποπρωτεΐνης υψηλής πυκνότητας (HDL) στο πλάσμα και των κύριων συστατικών της, της απολιποπρωτεΐνης Α-I και της Α-II, στους ανθρώπους (338;339). Η HDL αλλά και η apoa-i συνδέονται άμεσα με την εμφάνιση στεφανιαίας νόσου (340). Μελέτες έχουν δείξει ότι αυξάνοντας τα επίπεδα της HDL χοληστερόλης, χωρίς να μειώνονται αυτά της LDL, σε άνδρες με στεφανιαία νόσο, μειώνεται η συχνότητα εμφάνισης θανάτου από στεφανιαία νόσο και του μη θανατηφόρου εμφράγματος του μυοκαρδίου κατά 22% (341). Συνεπώς, το πλεονέκτημα αυτό της θεραπείας με φαινοφιβράτη φαίνεται να υπερέχει της επιρροής της στην HDL χοληστερόλη αποκλειστικά (342). Υπάρχουν πέντε γονίδια κλειδιά που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται στο μεταβολισμό της HDL, τα οποία επηρεάζονται από την ενεργοποίηση του PPAR-α (Εικόνα 13). Απολιποπρωτεΐνη Α-I και απολιποπρωτεΐνη Α-II: Μαζί με τα επίπεδα της HDL χοληστερόλης, οι φιβράτες αυξάνουν τα επίπεδα της apoa-i κατά 13-20% και της apoa-ii 61

62 κατά 30% (338;339). Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι στους ανθρώπους οι φιβράτες αυξάνουν τις συγκεντρώσεις της HDL χοληστερόλης στο πλάσμα, τουλάχιστον κατά ένα μέρος της, μέσω επαγωγής της έκφρασης των ανθρώπινων γονιδίων της apoa-i και apoa-ii (336;337;343). Φαίνεται ότι οι επιδράσεις στα επίπεδα του mrna της ανθρώπινης απολιποπρωτεΐνης Α-Ι συμβαίνουν λόγω της ενισχυμένης μεταγραφής. Επιπλέον, η θεραπεία των ανθρώπινων ηπατοκυττάρων με χρήση φιβρατών αυξάνει τα επίπεδα του mrna και την έκκριση της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι, υποστηρίζοντας την υπόθεση ότι η άμεση δράση των φιβρατών στην έκφραση της ανθρώπινης απολιποπρωτεΐνης Α-Ι στο ήπαρ οδηγεί σε μια αύξηση της απολιποπρωτεΐνη Α-Ι και της HDL-C στο πλάσμα. Οι φιβράτες επίσης επηρεάζουν και την ανθρώπινη apoa-ii, την άλλη κύρια πρωτεΐνη της HDL (336). Στα ανθρώπινα ηπατοκύτταρα, η επαγωγή των επιπέδων του mrna της apoa-ii ακολουθείται από μία αύξηση της έκκρισης της apoa-ii. Ο PPAR-α ενεργοποιεί τη μεταγραφή του γονιδίου της apoa-ii μέσω της σύνδεσής τους με τον PPRE (peroxisome proliferator response elements). Λιποπρωτεϊνική Λιπάση: Η ενεργοποίησης του PPAR-α μέσω φιβρατών επάγει την έκφραση της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης (LpL) στο ήπαρ, οδηγώντας σε αυξημένη υδρόλυση (344). Η αλλαγή αυτή στην έκφραση του ενζύμου γίνεται σε μεταγραφικό επίπεδο. Ο ενεργοποιημένος PPAR-α συνδέεται στον PPRE που βρίσκεται στον υποκινητή του γονιδίου του ενζύμου στον άνθρωπο και στα ποντίκια. Η αυξημένη υδρόλυση έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση σχηματισμού pre-hdl, το οποίο λειτουγεί ως δέκτης χοληστερόλης από περιφερικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης (345). Διαμεμβρανικός υποδοχέας σαρωτής τάξης Β, τύπου 1 (Scavenger Receptor class B member 1, SR-B1): Ο υποδοχέας αυτός και το ανθρώπινο ομόλογό του (CLA-1) είναι υποδοχείς τη κυτταρικής μεμβράνης που προσδένουν την HDL με μεγάλη συγγένεια και μεσολαβούν στην επιλεκτική πρόσληψη εστέρων χοληστερόλης από την HDL στο ήπαρ (346). Μελέτες έχουν δείξει ότι το ποσοστό της εκροής της χοληστερόλης που διαμεσολαβείται από την HDL συσχετίζεται με την κυτταρική έκφραση του SR-BI, (347) γεγονός που υποδηλώνει ότι SR-BI μπορεί να προωθήσει την απομάκρυνση της χοληστερόλης από τα περιφερικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των μακροφάγων. Έτσι, ο λόγος CLA-1/SR-BI ίσως παίζει καθοριστικό ρόλο στο μονοπάτι της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης (348). Αφού οι PPARs εκφράζονται στα ανθρώπινα μακροφάγα (349), οι Chinetti et al (350) διερεύνησαν τη ρύθμιση του CLA-1/SR-BI μέσω ενεργοποιητών του PPAR. Θεραπεία των διαφοροποιημένων ανθρώπινων μακροφάγων με τέτοιους 62

63 ενεργοποιητές, οδήγησε σε επαγωγή της έφρασης του CLA-1. Επιπροσθέτως, υπήρξε διέγερση του SR-BI σε αορές ποντικών που είχαν έλλειψη της apoe έπειτα από θεραπεία με φιβράτες. Διαμεμβρανικός A1 μεταφορέας της κασέτας που δεσμεύει την ATP (ABCA1): O ABCA1 παίζει σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό της HDL εξάγοντας μη εστεροποιημένη χοληστερόλη και φωσφολιπίδια από τα κύτταρα (351). Έχει αποδειχθεί ότι η ενεργοποίηση του PPAR-α από τη φαινοφιβράτη επάγει την έκφραση αυτού του μεταφορέα σε ανθρώπινα μακροφάγα (352). Μετά την ενεργοποίησή του PPAR-α, υπάρχει μία αύξηση του mrna του ABCA1 και μια επακόλουθη αύξηση της παραγωγής του. Εικόνα 13: Τα 5 γονίδια κλειδιά που παίζουν ρόλο στο μεταβολισμό της HDL (353) Ενεργοποίηση του PPAR-α μέσω φαινοφιβράτης και μεταβολισμός των πλούσιων σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεϊνών Εκτός από τη δράση της στα επίπεδα της HDL, η φαινοφιβράτη μειώνει τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα ελαττώνοντας την παραγωγή των VLDL, μέσω ενεργοποίησης του PPAR-α (354). Αυτή η επίδραση του PPARα αποδόθηκε στην επαγωγή των γονιδίων που εμπλέκονται στην οξείδωση των λιπαρών οξέων και τη συνακόλουθη μείωση της διαθεσιμότητας των λιπιδίων για την παραγωγή VLDL. Εκτός από την καταστολή της παραγωγής VLDL, η φαινοφιβράτη είναι γνωστό ότι διεγείρει την εκκαθάριση των λιποπρωτεϊνών πλούσιων σε TG (354). Η εκκαθάριση των VLDL και των χυλομικρών διαμεσολαβείται από το ένζυμο της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης 63

64 (LPL), το οποίο συνδέεται με το τριχοειδές ενδοθήλιο των μυών και του λιπώδους ιστού. Η έκφραση της LPL στο ήπαρ περιορίζεται σε κύτταρα Kupffer και αυξάνεται από ΡΡΑR-α (344;355). Αντίθετα, δεν υπάρχουν αποδεικτικά στοιχεία που δείχνουν μια διεγερτική επίδραση του PPAR-a στην έκφραση της LPL στην καρδιά και τους σκελετικούς μύες (344;356). Η δραστηριότητα της LPL κυρίως ρυθμίζεται μετα-μεταφραστικά μέσω αλλοιωμένης έκκρισης από το ήπαρ των LPL-διαμορφωτικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένης της απολιποπρωτεΐνης C-III (ApoC-III), της απολιποπρωτεΐνης AV (ApoA-V), της πρωτεΐνης 3 που προσομοιάζει την αγγειοποιητίνη (Angptl3), και της πρωτεΐνης 4 που προσομοιάζει την αγγειοποιητίνη 4 (Angptl4). Αρχικά, η φαινοφιβράτη μειώνει την έκφραση της apoc-iii που δρα ως αναστολέας της LPL. Δεύτερον, αυξάνει τα επίπεδα έκφρασης APOA5 στο ήπαρ και στο πλάσμα, η οποία είναι ένας θετικός ρυθμιστής της LPL (357). Τρίτον, ο ΡΡΑR-α ενισχύει τα επίπεδα έκφρασης της Angptl4 στο ήπαρ και στο πλάσμα, η οποία δρα ως αναστολέας της δραστικότητας LPL μετατρέποντας τα ενεργά διμερή LPL σε αδρανή μονομερή (358). Τέλος, ο ΡΡΑR-α διεγείρει την ηπατική έκφραση του υποδοχέα της VLDL (Vldlr) (359;360). Η λειτουργική σημασία της ρύθμισης του Vldlr στο ήπαρ είναι ασαφής, καθώς αυτός είναι έντονα εκφρασμένος στον λιπώδη ιστό, στην καρδιά και στους σκελετικούς μύες, όπου παίζει βοηθητικό ρόλο στην υδρόλυση των TG του πλασματος μέσω της LPL Έλλειψη της apoa-i αφαιρεί τη δραστικότητα της μετφορμίνης Καθώς η χαμηλή και δυσλειτουργική HDL έχει σχετιστεί με αυξημένη προδιάθεση για εμφάνιση διαβήτη τύπου II, σε έρευνα του Εργαστηρίου μας, μελετήθηκε ο ρόλος της apoa-i στις φαρμακολογικές δράσεις της μετφορμίνης στην ανοχή στη γλυκόζη και στην εναπόθεση των ηπατικών λιπιδίων. Συγκεκριμένα τα πειράματα διεξήχθησαν σε ποντίκια που εξέφραζαν όλο το γονιδίωμα (C57BL/6) καθώς και σε άλλα που είχαν έλλειψη της apoa-i (apoa-i -/- ) ώστε να συγκριθούν τα δύο είδη των μυών (361). Τα αποτελέσματα έδειξαν πως μετά από χορήγηση του φαρμάκου, η ομάδα C57BL/6 έδειξε μείωση των επιπέδων γλυκόζης καθώς και βελτίωση στην απόκριση ενδοπεριτοναικής πρόσληψης γλυκόζης, σε αντίθεση με τη δεύτερη ομάδα όπου φάνηκε πως η έλλειψη της apoa-i ανέστειλε τη φαρμακολογική δράση της μετφορμίνης ως προς την απόκριση των ποντικών στη λήψη γλυκόζης. Επιπλέον, η έλλειψη δραστικής apoa-i μείωσε τη δράση του φαρμάκου στην ευαισθησία των σκελετικών μυών στην ινσουλίνη, ενώ η χορήγησή του στην 64

65 ομάδα που εξέφραζε όλο το γονιδίωμα εμφανίστηκε αυξημένη ευαισθησία στην ινσουλίνη. Εν συνεχεία, ελέγχοντας την εναπόθεση ηπατικών λιπιδίων, η μετφορμίνη μείωσε την εναπόθεση λιπιδίων στα ηπατοκύτταρα, δείχνοντας σημαντική βελτίωση στην ηπατική ιστολογία στα C57BL/6. Αντίθετα, τα ζώα που δεν εξέφραζαν την apoa-i δεν εμφάνισαν βελτίωση στην ηπατική εναπόθεση των λιπιδίων ύστερα από χορήγηση μετφορμίνης. Επιπλέον με χρήση μετφορμίνης δε μειώθηκε το βάρος των ζώων apoai -/- και είναι αξιοσημείωτο το γεγονός ότι δεν εντοπίστηκαν διαφορές στο λιποπρωτεϊνικό προφίλ σε σχέση με τα ίδια ζώα τα οποία δεν είχαν λάβει το φάρμακο. Το βάρος των C57BL/6 ποντικών μετρήθηκε πολύ μικρότερο ύστερα από τη δόση του φαρμάκου και επίσης παρατηρήθηκε ελάττωση των επιπέδων χοληστερόλης σε κλάσματα LDL και HDL. Σύμφωνα με τις παραπάνω παρατηρήσεις είναι φανερό πως η έλλειψη της apoa-i μειώνει σημαντικά τις φαρμακολογικές δράσεις της μετφορμίνης. 65

66 2. Σκοπός Τα τελευταία χρόνια, ο επιπολασμός του μεταβολικού συνδρόμου αυξάνεται συνεχώς αγγίζοντας περίπου το 25% του πληθυσμού παγκοσμίως. Ο διαβήτης είναι πλέον μια χρόνια νόσος που έχει πάρει επιδημιολογικές διαστάσεις (καθώς ο αριθμός των πασχόντων παγκοσμίως ξεπερνά τα 200 εκατομμύρια), οι θάνατοι οφειλόμενοι στις καρδιαγγειακές επιπλοκές του ολοένα και αυξάνονται και ένα μεγάλο μέρος της θεραπείας του αφορά τη φαρμακευτική αγωγή που πρέπει να ακολουθήσουν οι ασθενείς. Η μετφορμίνη, αν και ο μηχανισμός δράσης της δεν έχει προσδιοριστεί πλήρως, είναι η πιο μακροχρόνια και συχνής χρήσης αντιδιαβητική φαρμακευτική ουσία. Σύμφωνα με πρόσφατα δημοσιευμένα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας, φάνηκε πως απουσία της apoa-i, η φαρμακολογική δράση της μετφορμίνης παρεμποδίζεται (361). Η φαινοφιβράτη είναι ένα γνωστό υπολιπιδαιμικό φάρμακο που προκαλεί σημαντική αύξηση στα επίπεδα της HDL χοληστερόλης με ταυτόχρονη μείωση των τριγλυκεριδίων του αίματος. Συνεπώς στην παρούσα εργασία μελετήσαμε κατά πόσο η αύξηση των επιπέδων της HDL με φαρμακευτική αγωγή προάγει την αντιδιαβητική δράση της μετφορμίνης και επίσης μελετήσαμε αν η συνδυαστική θεραπεία με φαινοφιβράτη, βελτιώνει αυτή τη δράση της μετφορμίνης. Τα πειράματα έγιναν με τη χρήση θηλυκών ποντικών C57BL/6, που εκφράζουν ολόκληρο το γονιδίωμα και η δράση της μετφορμίνης ως μονοθεραπεία ή σε συνδυασμό με φαινοφιβράτη αξιολογήθηκε πειραματικά. 66

67 3. Υλικά και μέθοδοι 3.1 Πειραματόζωα Η εταιρεία Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, μας προμήθευσε τα πειραματόζωα για τη διεξαγωγή των πειραμάτων, τα οποία συγκεκριμένα ήταν μοντέλα ποντικών που εξέφραζαν όλο το γονιδίωμα, C57BL/6. Θηλυκά ποντίκια ηλικίας μηνών χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Κατά την διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας, τα πειραματόζωα ανάλογα με την ομάδα που ανήκαν φυλάσσονταν σε κλουβιά, 5 ποντίκια σε κάθε κλουβί. Η δίαιτα που λάμβαναν όλα πριν την έναρξη της μελέτης ήταν η τυπική, μη υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά (standard chow diet 1324 TPF, Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG) ενώ στη συνέχεια οι ομάδες εκτέθηκαν σε δίαιτα πλούσια σε λιπαρά (δίαιτα δυτικού τύπου, 17.3% πρωτεΐνες, 48.5% υδατάνθρακες, 21.2% λίπος, 0.2% χοληστερόλη, 4.5 Kcal/g) για 22 εβδομάδες. Η πρώτη ομάδα έλαβε μετφορμίνη που εμπεριεχόταν στην τροφή, η δεύτερη ομάδα έλαβε φαινοφιβράτη που προστέθηκε στην τροφή, ενώ η τελευταία πεντάδα πειραματοζώων λάμβανε ταυτόχρονα μετφορμίνη και φαινοφιβράτη μέσω της τροφής. (Εικόνα 14) Οι δόσεις της μετφορμίνης και της φαινοφιβράτης που λάμβανε κάθε ζώο και στη μονοθεραπεία αλλά και στο συνδυασμό ήταν 300 mg/kg/day και 100 mg/kg/day αντίστοιχα. Οι πειραματικές μελέτες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες της Ευρωπαϊκής Ένωσης και το Πρωτόκολλο προστασίας και ορθής μεταχείρισης των ζώων το οποίο έχει λάβει την έγκριση της επιτροπής πειραματόζωων της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών. Εικόνα 14: Σχηματική απεικόνιση ομάδων πειραματοζώων 67

68 3.2 Χειρισμοί πειραματοζώων Λήψη αίματος Η ουριαία λήψη αίματος προϋπέθετε τη μεταφορά των πειραματοζώων σε νέους κλωβούς, καθώς και τη 16ωρη νηστεία τους. Με τη χρήση ειδικών θηκών που επιτυγχάνεται η ακινητοποίηση των μυών και η ταυτόχρονη διευκόλυνση στο χειρισμό της ουράς, γινόταν ένα μικρό κόψιμο με νυστέρι στο άκρο της και με μαλάξεις συλλέγονταν περίπου μl αίματος. Η περεταίρω αιμορραγία αποφεύγεται με τον καυτηριασμό της ουράς μετά από κάθε αιμοληψία. Η συλλογή γινόταν σε ειδικά σωληνάρια που περιέχουν EDTA ως αντιπηκτικό παράγοντα (Microvette for capillary blood collection, CB 300, Sarstedt, D Numbrecht, Germany) (Εικόνα 15). Εικόνα 15: Τριχοειδή σωληνάρια λήψης αίματος Αμέσως μετά τη λήψη, ήταν απαραίτητη η ανακίνηση του σωληναρίου ώστε να αναμιχθεί το αίμα με το EDTA, και η τοποθέτησή του σε πάγο. Ύστερα από τη λήψη αίματος από όλα τα πειραματόζωα, έγινε φυγοκέντριση στα g, για 10 λεπτά, στους 4 o C και να απομονωθεί το πλάσμα-υπερκείμενο. Το πλάσμα συλλέχθηκε σε eppendorf των 1,5 ml και φυλάχθηκε στους -20 ο C για περεταίρω αναλύσεις Μέτρηση σωματικού βάρους ποντικών Το ζύγισμα των μυών πραγματοποιήθηκε μετά από την 16ωρη νηστεία τους σε ειδικό ηλεκτρονικό ζυγό (Mettler precision microscale, Τολέδο, Ισπανία) ο οποίος μηδενιζόταν πριν από κάθε μέτρηση. 68

69 3.2.3 Μέτρησης ημερήσιας κατανάλωσης τρoφής των ποντικών Στην αρχή της πειραματικής διαδικασίας τοποθετήθηκαν σε κάθε κλωβό 30 gr τροφής. Στη συνέχεια, κάθε 24 ώρες για τρεις μέρες ζυγιζόταν η τροφή που απέμεινε στον κλωβό χρησιμοποιώντας τον ηλεκτρονικό ζυγό (Mettler precision microscale, Τολέδο, Ισπανία) και αφαιρώντας την τιμή αυτή από αυτή της προηγούμενης ημέρας, προσδιορίστηκε η ημερήσια κατανάλωση της τροφής σε κάθε κλωβό. Η ημερήσια κατανάλωση τροφής ανά πειραματόζωο προσδιορίστηκε με την διαίρεση της ημερήσιας κατανάλωσης τροφής ανά κλωβό με το αριθμό πέντε που εκφράζει το πλήθος των μυών που φυλάσσονταν στον κάθε κλωβό. Η μέση κατανάλωση τροφής ανά ζώο ήταν ο μέσος όρος για την διάρκεια των εφτά ημερών εκφρασμένη ως μέση κατανάλωση τροφής ± S.E.M Δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη (Glucose Tolerance Test) Πειραματική πορεία Αφού οι μύες παγιδεύτηκαν σε ειδικές θήκες παγίδευσης μυών (Mouse Restrainer adult mice & neonate rats, IITC.84, Campden Instruments Ltd., UK), έγινε η ουριαία λήψη αίματός τους σε ειδικά τριχοειδή σωληνάκια λήψης αίματος (Microvette for capillary blood collection, CB 300, Sarstedt, D Numbrecht, Germany) και στη συνέχεια η απομόνωση του πλάσματος σε Πλαστικά σωληνάκια 1.5 ml (Reaction Tubes, , Greiner Bio-One). Η μέτρηση επιπέδων γλυκόζης στο αίμα ποντικών έγινε με τη χρήση του κιτ προσδιορισμού επιπέδων γλυκόζης (Glucose GOD FS, DiaSys) έπειτα από την 16ωρη νηστεία τους. Στη συνέχεια χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά διάλυμα δεξτρόζης (0.25mg / ml PBS 1x) δόσης 2 g δεξτρόζης / Kg σωματικού βάρους (200 μl /25 g ποντικού), και μετρήθηκαν τα επίπεδα της γλυκόζης στο αίμα στα 15, 30, 60, 120 λεπτά μετά τη χορήγηση. Για το διάλυμα δεξτρόζης χρειάστηκε PBS 1X ( 50 ml PBS 10X ml dd H 2 O) και PBS 10X ph7.4 (800 ml dd H 2 O + 80 g NaCl + 2 g KCl g Na 2 HPO g KH 2 PO 4 ) Λήψη ιστών από πειραματόζωα Θυσίες 69

70 Διάλυμα ισοφλουρανίου (C 3 H 2 ClF 5 O) χρησιμοποιήθηκε ως αναισθητικό των μυών. Συγκεκριμένα, βαμβάκι εμποτισμένο με το υγρό αυτό τοποθετήθηκε σε γυάλινο δοχείο όπου κλείστηκε το πειραματόζωο το οποίο είχε υποστεί 16 ώρες νηστείας και ύστερα από κάποια δευτερόλεπτα παρατηρήθηκε αναισθησία του. Στη συνέχεια, αφαιρέθηκε ο οφθαλμός με λαβίδα και λήφθηκε αίμα μέσω του περικογχικού φλεβικού κόλπου (περίπου μl) σε ειδικά σωληνάκια συλλογής αίματος που περιείχαν EDTA αντιπηκτικό (Microtubes for pediatric blood collection CB1000, Sarstedt, D Numbrecht, Germany). Έπειτα, τα ναρκωμένα πειραματόζωα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με αυχενική μετατόπιση. Στη συνέχεια απομονώθηκε το πλάσμα με φυγοκέντρηση στα g για 10 λεπτά, στους 4 o C και φυλάχθηκε στους -20 ο C για περαιτέρω αναλύσεις σε Πλαστικά σωληνάκια 1.5 ml (Reaction Tubes, , Greiner Bio-One) Συλλογή ιστών Αρχικά το ποντίκι τοποθετήθηκε με την κοιλιακή πλευρά προς τα πάνω σε χειρουργικό τραπέζι, και αποστειρώθηκε με διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης 70% (Ethanol, K , Merck, Germany) (70 ml αιθανόλης 100% + 30 ml ddh 2 O). Στη συνέχεια ανοίχθηκε με αποστειρωμένο χειρουργικό ψαλίδι και με νυστέρι σκίστηκε το περιτόναιο και αφαιρέθηκε το ήπαρ, αποκόβοντάς το προσεκτικά από τα αγγεία και τους συνδέσμους που το συγκρατούν. Ξεπλύθηκε σε τρυβλίο με διάλυμα PBS 1x ph 7,4 και κόπηκε σε μικρότερα τμήματα, τα οποία τοποθετήθηκαν σε πλαστικά σωληνάκια 1.5 ml (Reaction Tubes, , Greiner Bio- One), ψύχθηκαν άμεσα σε υγρό άζωτο και τοποθετήθηκαν στους -80 o C για μελλοντική χρήση. Ύστερα, το ζώο τοποθετήθηκε με τη ραχιαία πλευρά προς τα πάνω ώστε να απομονωθούν ο υποκνημιδίος μυς (soleus) και ο φαιός λιπώδης ιστός. Αφού αποστειρώθηκε όλη η περιοχή του μηρού και της κνήμης με διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης 70% αλλά και το χειρουργικό ψαλίδι, έγινε μια τομή στο κάτω μέρος της γάμπας και με προσεκτικές κινήσεις της λαβίδας έγινε η αποκάλυψη του λεπτού υποκνημιδίου μυός. Ο soleus εκφύεται με δύο εκφύσεις, την κνημιαία από την κνήμη και την περονιαία από τη περόνη και καταφύεται στην πτέρνα μετά το σχηματισμό του αχίλλειου τένοντα. Στη συνέχεια με το χειρουργικό ψαλίδι έγινε μια τομή από το μέσο της ραχιαίας περιοχής έως τον αυχένα ώστε να αποκαλυφθεί ο φαιός λιπώδης ιστός. Αυτός απομονώθηκε αποκόβοντάς τον προσεκτικά από τους συνδέσμους που το συγκρατούν, ξεπλύθηκε σε τρυβλίο με διάλυμα PBS 1x, τοποθετήθηκε σε 70

71 πλαστικά σωληνάκια, ψύχθηκε άμεσα σε υγρό άζωτο και φυλάχθηκε στους -80 o C για μελλοντική χρήση. 3.3 Βιοχημικές αναλύσεις πλάσματος Όπως έχει προαναφερθεί, μετά από κάθε αιμοληψία το αίμα φυγοκεντρείται για 10 λεπτά στα 1500 g και έτσι γίνεται η απομόνωση του πλάσματος (υπόλευκο υγρό) το οποίο χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό επιπέδων τριγλυκεριδίων και ολικής χοληστερόλης Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων στο πλάσμα Τα τριγλυκερίδια, δηλαδή οι εστέρες χοληστερόλης με λιπαρά οξέα, οι εστέρες λιπαρών οξέων καθώς και η γλυκερόλη είναι υδρόφοβα μόρια συνεπώς η σύνδεσή τους με απολιποπρωτεΐνες είναι απαραίτητη για τη διευκόλυνση της κυκλοφορίας τους στο πλάσμα. Για τον προσδιορισμό των επιπέδων των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα, ο οποίος έγινε με το Serum Triglyceride Determination Kit (Sigma, TR 0100), χρειάστηκε η υδρόλυση των τριγλυκεριδίων σε γλυκερόλη και ελεύθερα λιπαρά οξέα και στη συνέχεια η ενζυματική μέτρηση της γλυκερόλης. Με το kit αυτό είναι εφικτός ο προσδιορισμός των επιπέδων γλυκερόλης, πραγματικών τριγλυκεριδίων και ολικών τριγλυκεριδίων σε πλάσμα ή ορό. Η διαδικασία περιλαμβάνει την υδρόλυση των τριγλυκεριδίων από την Λιποπρωτεϊνική Λιπάση LpL. Στη συνέχεια η γλυκερόλη φωσφορυλιώνεται από το ATP με τη βοήθεια της κινάσης της γλυκερόλης (GK) σε 1-φωσφορική γλυκερόλη (G-1-P) και οξειδώνεται σε φωσφορική διυδρόξυακετόνη (DAP) με τη βοήθεια της οξειδάσης της φωσφορικής γλυκερόλης (GPO), με ταυτόχρονη απελευθέρωση υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ). Στην τελευταία αντίδραση το Η 2 Ο 2 συνδέεται με την 4-αμινοαντιπυρίνη (4-AAP) και την νατριϊκή Ν-αιθυλο-Ν-(3-θειοπροπυλο)-m-ανισιδίνη (ESPA) από την υπεροξειδάση (POD) και παράγεται η χρωστική κινονιμίνη, της οποίας η απορρόφηση μετράται στα 540nm. (Εικόνα 16) 71

72 Εικόνα 16: Διαδικασία υδρόλυσης τριγλυκεριδιων προς παραγωγή χρωστικής κινονιμίνης Πειραματική πορεία Το κιτ που χρησιμοποιήθηκε για την διαδικασία αυτή είναι το Serum Triglyceride Determination Kit (Sigma, TR 0100, Missouri USA). Αρχικά με τη χρήση πρότυπου διαλύματος PBS 1x ph 7.4 κάναμε διαδοχικές αραιώσεις 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 και 1/64 ώστε να παρασκευαστούν έξι νέα πρότυπα αραιωμένα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης.τα διαλύματα φορτώθηκαν σε μικροπλάκες 96 κελιών (microwell plate, Thermo Fisher Scientific Nunc, Denmark) ως εξής: Στα πρώτα κελιά των δύο τελευταίων σειρών της μικροπλάκας φορτώθηκαν 7,5 μl τυφλό διάλυμα που είναι καθαρό PBS 1x ph 7,4 και στα υπόλοιπα κελιά από 7,5 μl πρότυπων διαλυμάτων ξεκινώντας από το πιο αραιό (S/64) και καταλήγοντας στο πιο πυκνό (S). Στα υπόλοιπα πηγαδάκια προστέθηκαν 7,5 μl από τα δείγματά μας τα οποία είχαμε αραιώσει με PBS 1x σε μια αναλογία 1:3. Στη συνέχεια με τη χρηση πολυπιπέτας προστέθηκαν 100 μl από το αντιδραστήριο Α, όπου παρατηρήθηκε η αλλαγή χρώματος, και η μικροπλάκα τοποθετήθηκε στην μηχανή ανάδευσης για 10 λεπτά. Φωτομετρήσαμε με το ειδικό φωτόμετρο (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) στα 540 nm και προσθέσαμε 30 μl από το αντιδραστήριο Β. Τοποθετήσαμε την πλάκα στην μηχανή ανάδευσης για 45 λεπτά και φωτομετρήσαμε ξανά με το ειδικό φασματοφωτόμετρο στα 540 nm. Η συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων στα άγνωστα δείγματα προκύπτει από την απορρόφηση τους με βάση την 72

73 πρότυπη καμπύλη που δημιουργείται από τις απορροφήσεις των αραιώσεων του πρότυπου διαλύματος. Η επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε αφαιρώντας από τη δεύτερη μέτρηση, η οποία περιλαμβάνει την ολική γλυκερόλη (ελεύθερη γλυκερόλη του πλάσματος συν αυτή που αποδεσμεύτηκε από τα τριγλυκερίδια), την πρώτη που αφορά στην ελεύθερη γλυκερόλη που κυκλοφορεί στο αίμα. Η τιμή που παίρνουμε αντιστοιχεί στα επίπεδα των τριγλυκεριδίων εκφρασμένα σε mg λιπιδίων/dl πλάσματος Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα Αρχικά, οι εστέρες χοληστερόλης υδρολύονται με την εστεράση της χοληστερόλης (CE) προς χοληστερόλη και ελεύθερα λιπαρά οξέα. Στη συνέχεια λαμβάνει χώρα η οξείδωση της χοληστερόλης με την οξειδάση της χοληστερόλης (CO) και απελευθερώνεται Η 2 Ο 2, το οποίο αντιδρά με το υδρόξυβενζοικό οξύ και την 4-αμινοαντιπυρίνη μέσω της υπεροξειδάσης (POD) και παράγεται η χρωστική κινονιμίνη, η οποία απορροφά φως. (Εικόνα 17) Με βάση αυτή την απορρόφηση γίνεται η σύγκριση με τις απορροφήσεις των προτύπων διαλυμάτων και έτσι υπολογίζονται οι συγκεντρώσεις τους. Εικόνα 17: Διαδικασία υδρόλυσης εστέρων χοληστερόλης προς παραγωγή χρωστικής κινονιμίνης 73

74 Πειραματική πορεία Ο προσδιορισμός των επιπέδων ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα έγινε με την χρήση του Infinity Cholesterol Liquid Stable Reagent(TR , Thermo Electron, Melbourne, Australia). Αρχικά με τη χρήση πρότυπου διαλύματος PBS 1x ph 7.4 έγιναν διαδοχικές αραιώσεις 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 και 1/64 ώστε να παρασκευαστούν έξι νέα πρότυπα αραιωμένα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης. Τα διαλύματα φορτώθηκαν σε μικροπλάκες 96 κελιών (microwell plate, Thermo Fisher Scientific Nunc, Denmark) ως εξής: Στα πρώτα κελιά των δύο τελευταίων σειρών της μικροπλάκας φορτώθηκαν 7,5 μl τυφλό διάλυμα που είναι καθαρό PBS 1x ph 7,4 και στα υπόλοιπα κελιά από 7,5 μl πρότυπων διαλυμάτων ξεκινώντας από το πιο αραιό (S/64) και καταλήγοντας στο πιο πυκνό (S). Στα υπόλοιπα πηγαδάκια προστέθηκαν 7,5 μl από τα δείγματά μας τα οποία ήταν αραιωμένα με PBS 1x σε μια αναλογία 1:3. Στη συνέχεια με τη χρηση πολυπιπέτας προστέθηκαν 100 μl από το αντιδραστήριο Infinity, και η μικροπλάκα τοποθετήθηκε στην μηχανή ανάδευσης για 20 λεπτά. Φωτομετρήσαμε με το ειδικό φωτόμετρο (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) στα 490 nm. Η συγκέντρωση της χοληστερόλης στα άγνωστα δείγματα προκύπτει από την απορρόφηση της με βάση την πρότυπη καμπύλη που δημιουργείται από τις απορροφήσεις των αραιώσεων του πρότυπου διαλύματος Κλασματοποίηση λιποπρωτεϊνών του πλάσματος με υπερφυγοκέντρηση διαβαθμισμένης πυκνότητας Αρχή της μεθόδου Οι λιποπρωτεΐνες, όπως έχει ήδη αναφερθεί, διαφέρουν ως προς τη σύστασή τους σε λιπίδια και πρωτεΐνες με αποτέλεσμα να διαφοροποιούνται με βάση το μέγεθος και την πυκνότητά τους. Έτσι, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της υπερφυγοκέντρισης διαβαθμισμένης πυκνότητας είναι εφικτός ο διαχωρισμός τους με βάση την πυκνότητα, γνωρίζοντας ότι σε διαφορετικές πυκνότητες αλατούχου διαλύματος βρωμιούχου καλίου (KBr) που χρησιμοποιείται, επιτυγχάνεται η επίπλευσή τους. Πιο συγκεκριμένα, αρχικά απομονώνονται τα χυλομικρά με πυκνότητα <0,95 g/ml και οι VLDL με 0,94-1,006 g/ml. Σε πυκνότητες 1,019-1,063 g/ml εντοπίζονται οι λιποπρωτεΐνες IDL και LDL και τέλος οι ΗDL βρίσκονται στα κλάσματα με πυκνότητα 1,063-1,21 g/ml. Σε πυκνότητες άνω του 1,21 g/ml εντοπίζονται οι μη λιπιδιωμένες πρωτεΐνες του πλάσματος. 74

75 Αξιοσημείωτο είναι το γεγονος ότι ο διαχωρισμός χυλομικρών και VLDL είναι δύσκολος λόγω της πολύ χαμηλής πυκνότητάς τους που είναι μικρότερη των 1,006 g/ml. Πειραματική πορεία Αρχικά, με τη χρήση του τύπου υπολογίζεται η μάζα του KBr (P , Fisher Scientific, New Jersey) που απαιτείται για την επιθυμητή πυκνότητα στην οποία θα επιπλεύσει το κάθε κλάσμα λιποπρωτεϊνών. Έτσι, για το δείγμα του πλάσματος που πρέπει να έχει πυκνότητα 1,23 g/ml και τελικό όγκο 0,4 ml προστέθηκε στο δείγμα 0,145 g KBr και τοποθετήθηκε πρώτο μέσα στο σωλήνα διαβάθμισης (Ultra-Clear Centrifuge Tubes, Beckman, USA). Στη συνέχεια προστέθηκαν όλα τα διαλύματα του άλατος, ξεκινώντας από το πιο πυκνό πυκνότητας 1,21 g/ml KBr (16.4g KBr σε 50 ml ddh2o), συνεχίζοντας με το χαμηλότερης πυκνότητας 1,063 g/ml KBr (4.61g KBr σε 50 ml ddh2o) και καταλήγοντας στο πιο αραιό με πυκνότητα 1,019 g/ml KBr (1.365g KBr σε 50 ml ddh2o). Η διαδικασία αυτή πρέπει να γίνεται πολύ αργά και προσεκτικά με πιπέτα ώστε τα διαλύματα να μην αναμιχθούν και να σχηματίζεται μια διακριτή επιφάνεια (διεπιφάνεια) μεταξύ των διαλυμάτων διαφορετικής πυκνότητας και να ξεχωρίζουν οι φάσεις. Συνεπώς, μετά την προσθήκη των 0,4 ml πλάσματος, προστέθηκαν 0,8 ml διαλύματος πυκνού KBr (1,21 g/ml) και στη συνέχεια 2 ml KBr (1,063 g/ml). Ακολούθησε η προσθήκη 0,4 ml αραιού KBr (1.019 g/ml) και τέλος 0,4 ml PBS 1x ph 7,4. Οι σωλήνες ισοζυγίστηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στους 15 o C στις g για 20 ώρες στην ψυχόμενη υπερφυγόκεντρος (Beckman) χρησιμοποιώντας την κεφαλή υπερφυγοκέντρου SW60. (Εικόνα 18) Μετά το κλείσιμο της φυγοκέντρου, έγινε η απομόνωση δέκα κλασμάτων των 400 μl προσεκτικά, ώστε να γίνει ομοιόμορφη παραλαβή της κάθε φάσης. Τα κλάσματα τοποθετήθηκαν σε ειδικά σωληνάκια διαπίδυσης. Τη μέθοδο αυτή της υπερφυγοκέντρισης ακολουθεί η μέθοδος της διαπίδυσης που περιγράφεται παρκάτω, με σκοπό την απομάκρυνση του άλατος KBr από τα κλάσματα με πολλές πλύσεις, ώστε να μπορέσουν να γίνουν οι απαραίτητες για την μελέτη βιοχημικές αναλύσεις. 75

76 Εικόνα 18: Σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας κλασματοποίησης των λιποπρωτεϊνών Διαπίδυση στα κλάσματα του πλάσματος Αρχή της μεθόδου Η διαπίδυση είναι η διαδικασία διαχωρισμού μορίων στο διάλυμα λόγω της διαφοράς διάχυσης του μέσω μίας ημιπερατής μεμβράνης. Στο πλαίσιο της έρευνας, η πιο κοινή εφαρμογή της μεθόδου είναι για την απομάκρυνση των ανεπιθύμητων μικρών μόρια όπως άλατα ή αναγωγικά μέσα από μεγαλύτερα μακρομόρια όπως πρωτεΐνες, DNA, ή πολυσακχαρίτες. Το διάλυμα που πρόκειται να υποστεί διαπίδυση, τοποθετείται σε σωλήνα ο οποίος σφραγίζεται με την ειδική μεμβράνη διαπίδυσης και βυθίζεται σε ποτήρι ζέσεως με ρυθμιστικό διάλυμα ή ddh 2 O. Οι πόροι που διαθέτει η μεμβράνη αυτή έχουν το κατάλληλο μέγεθος ώστε να επιτρέπεται η διέλευση μορίων συγκεκριμένου μεγέθους, με σκοπό τη διαφοροποίησή τους από άλλα μεγαλύτερου μοριακού βάρους. Συγκεκριμένα, το μέγεθος των πόρων εξαρτάται αποκλειστικά από το μέγεθος του μορίου ενδιαφέροντος (λιποπρωτεΐνες), απ το οποίο θα πρέπει να είναι πολύ μικρότερο. Με τη διαδικασία αυτή επιτυγχάνεται ισορροπία των μικρών διαλυτών μορίων μεταξύ των δύο πλευρών της μεμβράνης. Πειραματική πορεία Αρχικά, σε ποτήρι ζέσεως που περιείχε διάλυμα EDTA σε ddh 2 O έβρασε η μεμβράνη διαπίδυσης με μοριακό βάρος αποκλεισμού τα 10 κda (Dialysis Membrane, , Medicell 76

77 International LtD, neolab, London, England) ώστε να απομακρυνθεί η λιπαρή ουσία με την οποία είναι επεξεργασμένη. Τα δέκα σωληνάκια (Fisherbrand Disposable Culture Tubes, , Fisher Scientific, USA) που περιείχαν τις πρωτεΐνες και συλλέχθηκαν μετά την υπερφυγοκέντρηση, σκεπάστηκαν με την μεμβράνη διαπίδυσης χρησιμοποιώντας τα ειδικά καπάκια (Fisher brand, Tainer Top Safety, Fisher Scientific, USA). Στη συνέχεια τα σωληνάκια δέθηκαν με λαστιχάκι και βυθίστηκαν με τα καπάκια προς τα κάτω σε ένα ποτήρι ζέσεως που περιείχε ddh 2 O. Το ποτήρι τοποθετήθηκε στους 4 o C πάνω σε μαγνητικό αναδευτήρα (Chimarec 2, Thermolyne) για 24 ώρες, και ήταν απαραίτητη η συχνή αλλαγή του ddh 2 O προς απομάκρυνση του άλατος. Τέλος, τα κλάσματα μεταφέρθηκαν σε σωληνάκια (eppendorfs) των 1,5 ml τα οποία τοποθετούνται αμέσως σε πάγο. Τα κλάσματα, τοποθετούνται για περίπου ένα λεπτό κάτω από συνεχή ροή αέριου αζώτου, ώστε να σταματήσει η οξείδωση και να γίνει η ανταλλαγή οξυγόνου με άζωτο και στην συνέχεια σφραγίζονται με parafilm (Pechiney Plastic Packaging Company, USA) και αποθηκεύονται στους -20 ο C Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Πειραματική πορεία Αρχικά, μετά την υπερφυγοκέντρηση 40 μl δείγματος μεταφέρθηκαν σε δοκιμαστικά σωληνάκια των 1,5 ml και στέγνωσαν με φυγοκέντριση υπό κενό. Μετά το πέρας της διαδικασίας επαναδιαλήθηκαν σε 20 μl PBS 1x ph 7,4. Αυτά τα 20 μl χωρίς περεταίρω αραίωση και τα 20 μl των προτύπων διαλυμάτων γνωστής συγκέντρωσης φορτώθηκαν στη μικρόπλακα προς τον προσδιορισμό των επιπέδων ολικής χοληστερόλης. Συνεπώς όπως είναι φανερό, η πορεία που ακολουθήθηκε είναι ίδια με αυτή του προσδιορισμού των επιπέδων ολικής χοληστερόλης στα πλάσματα, με τη μόνη διαφορά που παρατηρείται να είναι στη ποσότητα των δειγμάτων που φορτώνονται στην ειδική μικρόπλακα Ανάλυση απολιποπρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Αρχή της μεθόδου 77

78 Η μέθοδος SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) είναι μια ευρέως διαδεδομένη τεχνική διαχωρισμού μακρομορίων (πχ πρωτεϊνών) σύμφωνα με το μοριακό τους βάρος, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου σταθερής τάσης. Το SDS, ένα ανιονικό απορρυπαντικό, προσδένεται στα υδρόφοβα τμήματα της πρωτεΐνης, καταστρέφοντας την τριτοταγή της δομή, ώστε διατηρείται στο διάλυμα της σε διαμόρφωση χαμηλότερης οργάνωσης. Το σύμπλεγμα του SDS με την αποδιατεταγμένη πια πρωτεΐνη, αποκτά σημαντικό αρνητικό φορτίο, που είναι ανάλογο με τη μοριακή μάζα της πρωτεΐνης, ενώ το φορτίο της αρχικής φυσικής δομής καθίσταται αμελητέο. Ως αποτέλεσμα, η μοριακή μάζα του συμπλόκου SDS-πρωτεΐνης είναι ανάλογη με το μέγεθος και κατ επέκταση με το μήκος της αλυσίδας. Επίσης, προστίθεται ένας αναγωγικός παράγοντας η δυ-θειοθρεϊτόλη (Diothreitol, DTT) για τη διάσπαση των δισουλφιδικών δεσμών (S-S) (Εικόνα 19). Κάτω από αυτές τις συνθήκες, τα μόρια διαχωρίζονται με βάση το μοριακό τους το οποίο υπολογίζεται σε σχέση με την ηλεκτροφορητική κινητικότητα πρωτεϊνών γνωστού μοριακού βάρους. Τα μικρότερα μόρια κινούνται ταχύτερα από εκέινα μεγαλύτερου μοριακού βάρους με τη μορφή χαρακτηριστικών ζωνών. Εικόνα 19: Αποδιάταξη πρωτεϊνικών μορίων Το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σχηματίζεται από μίγμα ακρυλαμιδίου και διςακρυλαμιδίου (Ν,Ν-μεθυλενο-δισ-ακρυλαμίδιο) το οποίο αφού πολυμεριστεί σχηματίζει ένα δίκτυο πόρων ορισμένης διαμέτρου. Ο πολυμερισμός αυτός απαιτεί την παρουσία APS για την έναρξή του καθώς και την παρουσία TEMED για την επιτάχυνση του αλλά και για τη μεταφορά των ελευθέρων ριζών που έχουν σχηματιστεί από το APS στο σύστημα πολυμερισμού. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η ηλεκτροφόρηση είναι ασυνεχής (discontinuous) επιτελείται δηλαδή σε διαδοχικά πηκτώματα: ένα πήκτωμα επιστοίβαξης (stacking gel) στο οποίο τοποθετούνται τα δείγματα έτσι ώστε όλες οι πρωτεΐνες να ξεκινήσουν από το ίδιο 78

79 σημείο και να αυξηθεί η διακριτική ικανότητα διαχωρισμού και ένα πήκτωμα διαχωρισμού (separating gel) το οπoίο ακολουθεί ακριβώς κάτω από το stacking gel, όπου διαχωρίζονται οι πρωτεΐνες. (Εικόνα 20) Εικόνα 20: SDS ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου Υλικά Συσκευή κατακόρυφης ηλεκτροφόρησης (Biorad) και τροφοδοτικό σταθερής έντασης (E-C, Apparatus Corporation) Glass Plates (Spacer Plates with 1.5 mm spacer, , Bio-Rad, USA) Glass Plates (Short Plates, , Bio-Rad, USA) 20% (w/v) Sodium Dodecyl Sulfate (SDS, ART. NR , Carl Roth GmbH) (20 g SDS + 80 ml ddh 2 O) Tris-HCl 1.5 M ph 8,8 Tris-HCl 1.5 M ph 6,8 30% (w/v) ακρυλαμίδιο / 0.8% (w/v) δις-ακρυλαμίδιο (75 g high grade acrylamide + 2 g bis-acrylamide + ddh 2 O μέχρι τα 250 ml) 79

80 20% (w/v) Υπερθειϊκό αμμώνιο (Ammonium Persulfate, APS, BP , Fisher Scientific, USA) (20 g APS ml ddh 2 O) N,N, N,N - Tetramethylethylenediamine (TEMED, T7024, Sigma-Aldrich, USA) 10X Running Buffer (30 g Tris g Glycine + 10 g SDS + ddh 2 O μέχρι το 1L) 1X Running Buffer (50 ml 10X Running Buffer ml ddh 2 O) Διάλυμα φόρτωσης δειγμάτων (Sample loading buffer) (50 mm Tris.Cl ph mm Dithiothreitol + 2% SDS + 0.1% Bromophenol Blue + 10% Glycerol) Prestained Protein Marker, Broad Range (#P7708S, Biolabs, New England) Ισοπροπανόλη (2-Propanol, , Panreac Quimica Sau, Barcelona, Spain) Συσκευή ξήρανσης (Speed-vac, Savant) Πειραματική πορεία Η πηκτή διαχωρισμού και η πηκτή επιστοίβαξης ετοιμάστηκαν σε ξεχωριστούς δοκιμαστικούς σωλήνες τύπου falcon των 50 ml και τα διαλύματα καθώς και οι ποσότητες των διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας 4: Συστατικά των πηκτών επιστοίβαξης και διαχωρισμού Διαλύματα Separating gel 12% Stacking gel 5% Ακρυλαμίδιο/δις-ακρυλαμίδιο 12 ml 1,660 ml ddh2o 9,8 ml 6,8 ml Tris-HCl ph8,8 7,6 ml - Tris-HCl ph6,8-1,260 ml SDS 10% 300 μl 100 μl APS 10% 300 μl 100 μl TEMED 12 μl 10 μl Το TEMED προστέθηκε τελευταίο και στα δύο falcon εφόσον με την προσθήκη του ξεκινά ο πολυμερισμός. Αρχικά ετοιμάστηκε η πηκτή διαχωρισμού η οποία γρήγορα ώστε να μην πήξει προστέθηκε ανάμεσα στις δύο γυάλινες πλάκες μέχρι ένα καθορισμένο σημείο. Με ισοπροπανόλη απομακρύνθηκαν τυχόν φυσαλίδες. Στη συνέχεια και μετά την πήξη του gel στις πλάκες, έγινε προσεκτική απόχυση της ισοπροπανόλης αλλά και ολική αφαίρεσή της με 80

81 τη χρήση διηθητικού χαρτιού, η οποία αντικαταστάθηκε από την πηκτή επιστοίβαξης. Αμέσως μετά της προσθήκη της τελευταίας, τοποθετήθηκε γρήγορα μια οδοντωτή μήτρα με 15 εσοχές, που σχηματίζουν τα κελιά για το φόρτωμα των δειγμάτων. Οι πλάκες με τις πηκτές μεταφέρθηκαν στη συσκευή ηλεκτροφόρησης στην οποία τοποθετήθηκε το ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης 1x Running Buffer και φορτώθηκαν τα δείγματα. Σε 100 μl των δειγμάτων αυτών είχε προηγηθεί η ξήρανσή τους στο Speed-vac σε σωληνάκια 1,5 ml και η επαναδιάλυση του ιζήματός τους σε 20 μl ddh 2 O. Ύστερα προστέθηκαν 5 μl Sample Loading Buffer. Προκειμένου να αποδιαταχθούν τα μόρια των πρωτεϊνών, τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε συσκευή θέρμανσης στους 100 o C για 4 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για λιγότερο από 1 λεπτό σε μέγιστη ταχύτητα (spindown). Τα δείγματα φορτώθηκαν ως εξής: 5 μl από τον μάρτυρα (marker) στο πρώτο κελάκι και 20 μl από κάθε δείγμα με συγκεκριμένη σειρά στα υπόλοιπα κελάκια. Η ηλεκτροφόρηση έγινε στα 70 Volt για περίπου 90 λεπτά Ανοσοαποτύπωση κατά Western (Western Blot) Αρχή της μεθόδου Για τον εντοπισμό των πρωτεϊνικών ζωνών, την SDS-PAGE ακολουθεί η τεχνική της ανοσοαποτύπωσης κατά Western. Στη μέθοδο αυτή οι πρωτεΐνες μεταφέρονται από την πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη PVDF (polyvinyl-difluoride), όπου δεσμεύονται και ακινητοποιούνται μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, διατηρώντας τις αντιγονικές τους ιδιότητες. Οι μεμβράνες αυτές συγκρατούν αποτελεσματικότερα τις πρωτεΐνες σε «σκληρές» συνθήκες (πχ παρουσία οργανικών διαλυτών ή σε ιδιαίτερα χαμηλά/υψηλά ph, αλλά το μεγαλύτερο πλεονέκτημά τους είναι ότι επιτρέπουν την επανανοσοεντόπιση. Το πρώτο αντίσωμα που εισάγεται αναγνωρίζει την πρωτεΐνη-στόχο προς την οποία είναι ειδικό, ενώ το δεύτερο αναγνωρίζει το πρώτο. Το δεύτερο αντίσωμα φέρει μια χημική ομάδα συνδεδεμένη ομοιοπολικά (πχ υπεροξειδάση) η οποία μπορεί να ανιχνευτεί με χημειοφωταύγεια. Υλικά 10Χ Transfer Buffer (10.1 g Tris Base + 72 g Glycine + ddh20 μέχρι τα 500 ml) 1X Transfer Buffer (50 ml 10X Transfer Buffer ml ddh2o) Συσκευή και κασέτα μεταφοράς 81

82 Μεμβράνη μεταφοράς (Μεμβράνη φθωριούχου πολυβινυλδενίου, Porablot PVDF membrane, REF , Macherey-Nagel, Germany) Μεθανόλη (Methanol for analysis, I557009, Merck, Germany) Διηθητικό χαρτί (Whatmann) 5% Blotting milk (10 g Blotting grade blocker-non-fat dry milk, Biorad σε 200 ml PBS 1x) Πρωτοταγές αντίσωμα για την ανίχνευση της apoa-i (αραίωση: 1:1000 σε 5 ml blotting milk 5%). Polyclonal Antibody to ApoA-I (N-term) Rabbit IgG (Acris antibodies, cat # AP23390PU-N) Πρωτοταγές αντίσωμα για την ανίχνευση της apoa-ii (αραίωση: 1:1000 σε 5 ml blotting milk 5%). Polyclonal Antibody to apoa-ii (N-term) Human IgG (Acris antibodies, cat # AP23390PU-N) Πρωτοταγές αντίσωμα για την ανίχνευση της apoe (αραίωση: 1:1000 σε 5 ml blotting milk). Polyclonal Antibody to apoe (N-term)(6c5) Human IgG (Acris antibodies, cat # AP23390PU-N) Δευτεροταγές αντίσωμα (αραίωση: 1:4000 σε 8 ml blotting milk 5%) anti-goat IgG, (Santa Cruz Biotechnology Inc.) Washing buffer (5 ml NP-40 IGEPAL, Sigma σε1 L PBS 1x) Κασέτα εμφάνισης του φιλμ ECL (10 ml Luminol 1.25 mm ph μl p-coumaric acid 68 mm + 30 μl hydrogen peroxide 3%) Developer (P7042-1GA, Sigma-Aldrich, USA) Διάλυμα Developer (828 ml Developer L ddh2o) Fixer (P7167-1GA, Sigma-Aldrich, USA) Διάλυμα Fixer (828 ml Fixer L ddh2o) Kodak film 13cm x 18cm (Biomax Xar Film) Πειραματική πορεία Η μεμβράνη PVDF αρχικά ενεργοποιήθηκε με εμβάπτιση σε μεθανόλη η οποία αυξάνει την ικανότητα πρόσδεσης των πρωτεϊνών στη μεμβράνη. Έπειτα σε ένα δοχείο που περιέχει το ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς 1x Transfer Buffer τοποθετήθηκαν στην κασέτα μεταφοράς, με κατεύθυνση από την κάθοδο προς την άνοδο, τα ακόλουθα με τη συγκεκριμένη σειρά: Σφουγγαράκι - τρία κομμάτια διηθητικού χαρτιού - Πηκτή - Μεμβράνη 82

83 PVDF - τρία κομμάτια διηθητικού χαρτιού Σφουγγαράκι (Εικόνα 21). Αφαιρέθηκαν τυχόν φυσαλίδες και η κασέτα μεταφοράς τοποθετήθηκε στην ειδική συσκευή, η οποία περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς 1x. Εφαρμόστηκε ηλεκτρικό ρεύμα σταθερής έντασης 30 Volt για 24 ώρες (over night) στους 4 o C. Εικόνα 21: Μεταφορά πρωτεϊνών από την πηκτή στη μεμβράνη PVDF Στη συνέχεια, η μεμβράνη PVDF με τις πρωτεΐνες επωάστηκε σε 5 ml blotting milk 5% για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου πάνω σε μηχάνημα ήπιας ανάδευσης. Μετά το τέλος των 2 ωρών απομακρύνθηκε με απόχυση το blotting milk και η μεμβράνη επωάστηκε με 5 ml πρωτοταγούς αντισώματος (αραίωση 1:1000) σε falcon των 50 ml για 18 ώρες στους 4 o C υπό ανάδευση. Ακολούθησαν τέσσερις πλύσεις της μεμβράνης με washing buffer (TBST) για 15 λεπτά υπό ανάδευση. Έπειτα, η μεμβράνη επωάστηκε με 4 ml δευτεροταγούς αντισώματος (αραίωση 1:4000) υπό ανάδευση για 1-1,5 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. (Εικόνα 22) Τέλος, ακολούθησαν τρείς πλύσεις με washing buffer για 15 λεπτά και η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε διάλυμα PBS 1x. Τελευταία διαδικασία προς εμφάνιση των πρωτεϊνικών ζωνών αποτελεί η αυτοραδιογραφία. Συγκεκριμένα, μέσα σε σκοτεινό θάλαμο (dark room), η μεμβράνη επωάστηκε για 1 λεπτό σε διάλυμα ΕCL που περιείχε υπεροξείδιο του υδρογόνου υπό ήπια χειροκίνητη ανάδευση. Στην συνέχεια τοποθετήθηκε στην κασέτα εμφάνισης ανάμεσα σε δύο πλαστικές διαφάνειες, επάνω από τις διαφάνειες τοποθετήθηκε το φιλμ και έκλεισε η κασέτα εμφάνισης. Το κάθε φιλμ έμεινε στην κασέτα 1-4 λεπτά και στη συνέχεια βυθίστηκε σε διάλυμα developer (περίπου 1 λεπτό), ξεπλύθηκε σε νερό και βυθίστηκε σε διάλυμα fixer μέχρι να γίνει διαυγές και να μονιμοποιηθεί. Η μέθοδος της αυτοραδιογραφίας βασίζεται στην χημική αντίδραση των οπτικών φωτονίων με τους κόκκους αλογονούχου Ag του φιλμ. Τα οπτικά φωτόνια μετατρέπουν τα ιόντα αργύρου σε μεταλλικό άργυρο. Κατά την εμφάνιση του φιλμ, οι κόκκοι αλογονούχου 83

84 αργύρου που δεν αντέδρασαν απομακρύνονται, ενώ ο μεταλλικός άργυρος μαυρίζει στα σημεία αλληλεπίδρασης με την ακτινοβολία. Εικόνα 22: Επώαση με blotting milk και αντισώματα (πρωτοταγές και δευτεροταγές) Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων και ολικής χοληστερόλης στον ηπατικό ιστό ΤΡΙΓΛΥΚΕΡΙΔΙΑ Για τη μέτρηση των τριγλυκεριδίων χρησιμοποιήθηκε το Serum Triglyceride Determination Kit (Sigma, TR 0100, Missouri USA). Αρχικά ζυγίστηκαν οι ιστοί μόλις που είχαν φυλαχθεί στους -80 o C, και τοποθετήθηκαν σε eppendorfs των 1.5 ml. Στη συνέχεια προστέθηκαν στους ιστούς 500 μl HB αντιδραστηρίου (5 M KOH, 50% etoh διαλυμένη σε ddh 2 O) το οποίο παρασκευάστηκε από ίσους όγκους διαλυμάτων ΚΟΗ και etoh. Οι ιστοί μπήκαν σε φούρνο στους 65 o C για 16 ώρες. Την επόμενη μέρα βγήκαν από το φούρνο και τοποθετήθηκαν στον απαγωγό. Αφού ήρθαν σε θερμοκρασία δωματίου, προστέθηκαν αργά αργά 500 μl πυκνού HCl (37% ChemLab) προκειμένου να γίνει εξουδετέρωση του αλκαλικού διαλύματος ΗΒ. Ακολούθως τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 3500 g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και το υπερκείμενο συλλέχθηκε σε καινούρια eppendorfs του οποίου και μετρήθηκε ο όγκος. Από αυτά τα δείγματα έγινε αραίωση 1:20 σε PBS 1x ph 7,4.Στην συνέχεια προσδιορίζονται τα επίπεδα τριγλυκεριδίων σε μικροπλάκες 96 κελιών (microwell 84

85 plate, Thermo Fisher Scientific Nunc, Denmark) με τη χρήση φωτομέτρου (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) όπως περιγράφηκε παραπάνω στο ομογενοποιήμα του ιστού και εκφράζονται ως mg τριγλυκεριδίων/g ιστού. ΟΛΙΚΗ ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗ Από τα δείγματα που είχαμε ακριβώς προηγουμένως έγινε και ο προσδιορισμός της ολικής χοληστερόλης/g ιστού για το κάθε ζώο. Η μέτρηση έγινε με τον ίδιο τρόπο που περιγράφεται στην ενότητα

86 4. Αποτελέσματα 4.1 Μέτρηση κατανάλωσης τροφής και σωματικού βάρους Η πειραματική πορεία ξεκίνησε με τη μέτρηση της ημερήσιας κατανάλωσης τροφής των μυών, ώστε να είναι εφικτός ο υπολογισμός της δόσης του φαρμάκου όπως περιγράφηκε στην ενότητα Η ημερήσια κατανάλωση υπολογίστηκε στα 3,2 ± 0,09 gr. Η διαδικασία αυτή προσδιορισμού της αρχικής βασικής κατάστασης των πειραματοζώων έγινε πριν αυτά εκτεθούν σε οποιοδήποτε αλλαγή, είτε τροφής είτε χορήγησης φαρμάκου. Επίσης μετρήθηκαν το βάρος, τα επίπεδα τριγλυκεριδίων, ολικής χοληστερόλης και γλυκόζης στο πλάσμα του αίματος, όπως περιγράφηκε παραπάνω στις ενότητες 3.2.2, 3.3.1, Ομοίως έγινε και στο τέλος του πειράματος, αφότου οι μύες είχαν λάβει τα φάρμακα. Εικόνα 23: Σύγκριση του μέσου όρου βάρους των ομάδων μελέτης την μηδενική εβδομάδα με την έκθεση σε μετφορμίνη, φαινοφιβράτη και μετφορμίμη μαζί με φαινοφιβράτη για 22 εβδομάδες. Όπως φαίνεται στην παραπάνω εικόνα (Εικόνα 23)Σφάλμα! Το αρχείο προέλευσης της αναφοράς δεν βρέθηκε.σφάλμα! Το αρχείο προέλευσης της αναφοράς δεν βρέθηκε., ο συνδυασμός των φαρμάκων φαίνεται να προκαλεί μία μικρή μείωση του βάρους των ζώων σε σχέση με αυτά που έλαβαν μετφορμίνη ή φαινοφιβράτη κατά περίπου 3 gr. Συγκεκριμένα οι μυς που έλαβαν σκέτη μετφορμίνη και σκέτη φαινοφιβράτη ζύγιζαν ± 1.4 gr και ± 1.15 gr αντίστοιχα ενώ η ομάδα του συνδυασμού 27.5 ± 0.53 gr. Συνεπώς, υπάρχει μία 86

87 πρώτη ένδειξη βελτίωσης της δράσης της μετφορμίνης έπειτα από συγχορήγηση με τη φαινοφιβράτη. 4.2 Μέτρηση λιπιδίων του πλάσματος Στην παρακάτω εικόνα (Εικόνα 24) παρατηρείται μία σημαντική μείωση των τριγλυκεριδίων στα ζώα που έλαβαν φαινοφιβράτη σε σχέση με αυτά που έλαβαν μετφορμίνη γεγονός που οφείλεται στην ικανότητα της δεύτερης να μειώνει τα TGs. Συγκεκριμένα από 70,63 ± 12,3 mg/dl έφτασαν τα 25,73 ± 3,78 mg/dl (p 0,01). Η ομάδα του συνδυασμού διατήρησε αυτή την πτώση με τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων να είναι 27,01 ± 5.37 mg/dl (p 0,01). Άρα η συγχορήγηση των δύο φαρμάκων δε βελτιώνει αλλά ούτε χειροτερεύει τα επίπεδα των TGs σε σχέση με τη φαινοφιβράτη. Κατά συνέπεια, είναι εμφανές πως η φαινοφιβράτη εξακολουθεί να δρα το ίδιο σε συνδυασμό με τη μετφορμίνη βελτιώνοντας το γλυκαιμικό προφίλ. Εικόνα 24: Επίπεδα τριγλυκεριδίων στο πλάσμα του αίματος των τριών ομάδων μελέτης τη μηδενική εβδομάδα σε σύγκριση με την έκθεση σε μετφορμίνη, φαινοφιβράτη και μετφορμίνη μαζί με φαινοφιβράτη για 22 εβδομάδες. Στην Εικόνα 25 φαίνεται ότι τα επίπεδα της ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα του αίματος δεν παρουσίασαν σημαντικές μεταβολές την 22 εβδομάδα σε καμία από τις τρεις ομάδες ζώων. Συγκεκριμένα η ολική χοληστερόλη στην ομάδα της μετφορμίνης υπολογίστηκε ± 5.73 mg/dl, της φαινοφιβράτης ± mg/dl και του συνδυασμού ± mg/dl. 87

88 Εικόνα 25: Επίπεδα ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα του αίματος των τριών ομάδων μελέτης τη μηδενική εβδομάδα σε σύγκριση με την έκθεση σε μετφορμίνη, φαινοφιβράτη και μετφορμίνη μαζί με φαινοφιβράτη για 22 εβδομάδες. 4.3 Χαρακτηρισμός λιποπρωτεινικών κλασμάτων στην κυκλοφορία του αίματος Κατανομή ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Η υπερφυγοκέντριση διαβαθμισμένης πυκνότητας, η διαπίδυση των κλασμάτων και ο προσδιορισμός των επιπέδων ολικής χοληστερόλης σε κάθε λιποπρωτεϊνικό κλάσμα που περιγράφηκαν στις ενότητες 3.3.3, και αντίστοιχα, έγιναν ώστε να προσδιοριστεί η φαρμακολογική δράση που ασκεί ο συνδυαμός των φαρμάκων στο λιποπρωτεϊνικό προφίλ σε σύγκριση με τη μονοθεραπεία μετφορμίνης. Συγκεκριμένα τα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα που χρήζουν διερεύνησης είναι κυρίως αυτά της HDL, δηλαδή τα

89 Εικόνα 26: : Κατανομή ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα των ομάδων μελέτης Στην Εικόνα 26 γίνεται αντιληπτό πως η θεραπεία με φαινοφιβράτη προκάλεσε την αναμενόμενη αύξηση στα επίπεδα της HDL, επιβεβαιώνοντας την αποτελεσματικότητα του θεραπευτικού σχήματος. Στα κλάσματα 5 και 6 τα επίπεδα της HDL αυξήθηκαν σημαντικά στην ομάδα που έλαβε φαινοφιβράτη αλλά και στο συνδυασμό φαρμάκων σε σύγκριση με αυτή που έλαβε μετφορμίνη. Στο 5 ο κλάσμα με πυκνότητα g/ml τα επίπεδα της ολικής χοληστερόλης ήταν 3.197, μg/dl πλάσματος στην ομάδα της μετφορμίνης και της φαινοφιβράτης αντίστοιχα και αυξήθηκαν κατά πολύ στην ομάδα του συνδυασμού αγγίζοντας τα μg/dl πλάσματος. Στο επόμενο κλάσμα με πυκνότητα g/ml, η ολική χοληστερόλη φαίνεται αύξημένη και στις τρεις ομάδες φτάνοντας τα μg/dl πλάσματος στην ομάδα της μετφορμίνης, 29,515 μg/dl πλάσματος στην ομάδα της φαινοφιβράτης και μg/dl πλάσματος στη ομάδα του συνδυασμού. Η αύξηση της HDL σχετίζεται με την αύξηση της apoa-i που παρατηρείται στα επόμενα αποτελέσματα (Εικόνα 27). Δε φαίνονται διαφορές στην ΗDL χοληστερόλη μεταξύ των τριών ομάδων στα κλάσματα 7 και 8 της ώριμης HDL, παρατηρώντας ότι τα επίπεδά της παρέμειναν παρόμοια και στην ομάδα της μετφορμίνης και της φαινoφιβράτης. Τα παραπάνω αποτελέσματα οδηγούν στο συμπέρασμα πως ο συνδυασμός φαινοφιβράτης με μετφορμίνη προκαλεί αύξηση της HDL χοληστερόλης βελτιώνοντας έτσι τη φαρμακολογική απόκριση της μονοθεραπείας με μετφορμίνη Αναλύσεις κατά Western στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Μετά το πέρας της φυγοκέντρησης διαβαθμισμένης πυκνότητας, συλλέχθηκαν τα κλάσματα και έγινε η ανάλυσή τους με SDS-PAGE και Western blot σύμφωνα με τις 89

90 ενότητες και Αυτές οι πειραματικές διαδικασίες ήταν απαραίτητες για τον προσδιορισμό της κατανομής των απολιποπρωτεϊνών apoα-ι, apoα-ιι,apoε,apoc-i και apoc- III στα κλάσματα 4-9 ώστε να ελεγχθούν κυρίως στην HDL. Όπως φαίνεται και στην παρακάτω εικόνα, η apoa-i είναι αρκετά αυξημένη στην ομάδα που έλαβε μόνο φαινοφιβράτη αλλά και στο συνδυασμό των φαρμάκων, σε αντίθεση με την ομάδα που έλαβε μόνο μετφορμίνη όπου παρατηρείται ξεκάθαρα μικρότερη ποσότητα της apoa-i. Η αύξηση της apoa-i στις δύο αυτές ομάδες βρίσκεται σε συμφωνία με την αύξηση των επιπέδων της HDL χοληστερόλης που παρατηρήθηκε στην Εικόνα 26. Η apoa-ii παρουσίασε αύξηση μόνο στην ομάδα των ζώων που έλαβαν το συνδυασμό μετφορμίνης και φαινοφιβράτης γεγονός που καθιστά την HDL αυτή πιο μεγάλο σωμάτιο με περισσότερη χοληστερόλη. Στις άλλες δύο ομάδες η apoa-ii απουσίαζε. Συνεπώς, αφού τα επίπεδα της apoa-i είναι ίδια στην ομάδα της φαινοφιβράτης και του συνδυασμού σημαίνει πως έχουν τον ίδιο αριθμό σωματιδίων HDL, ενώ η εμφάνιση και apoa-ii στο συνδυασμό υποδηλώνει πως το σωματίδιο της HDL έχει μεγαλύτερη χωρητικότητα σε αυτή την ομάδα. Δε φαίνεται κάποια σημαντική μεταβολή της ποσότητας της apoe μεταξύ των τριών ομάδων. Τέλος, καμία από τις ομάδες δεν περιέχει τις apoc-i και apoc-iii. Εικόνα 27: Κατανομή της apoa-i, apoa-ii,apoe,apoc-i και apoc-iii στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα των τριών ομάδων μελέτης. Αριστερά: ομάδα μετφορμίνης, Κέντρο: ομάδα φαινοφιβράτης Δεξιά: ομάδα μετφορμίνης + φαινοφιβράτης 90

91 4.4 Μέτρηση γλυκόζης νηστείας Εικόνα 28: Επίπεδα γλυκόζης νηστείας στο πλάσμα του αίματος των ομάδων μελέτης τη μηδενική εβδομάδα σε σύγκριση με την έκθεση σε μετφορμίνη, φαινοφιβράτη και μετφορμίνη μαζί με φαινοφιβράτη για 22 εβδομάδες. Στην παραπάνω εικόνα, τα υψηλότερα επίπεδα γλυκόζης νηστείας την 22 η εβδομάδα τα παρουσίασε η ομάδα της φαινοφιβράτης στα 158,9 ± 7,45 mg/dl. Τα επίπεδά της στην ομάδα της μετφορμίνης ήταν χαμηλότερα στα 121,52 ± 12,05 mg/dl και στην ομάδα που έλαβε συνδυασμό φαρμάκων ήταν 129,98 ± 6,05 mg/dl. Συνεπώς η υπογλυκαιμική δράση της φαινοφιβράτης δεν ενισχύει τα χαμηλά επίπεδα γλυκόζης νηστείας της μετφορμίνης, άρα συνδυαστικά η συγχορήγησή τους έχει την ίδια δράση στα επίπεδα νηστείας με τη μονοθεραπεία με μετφορμίνη. 4.5 Προσδιορισμός της ανοχής στην γλυκόζη Στο τέλος της πειραματικής διαδικασίας την 22 η εβδομάδα χορηγήθηκε συγκεκριμένη ποσότητα γλυκόζης δόσης 2 g δεξτρόζης / Kg σωματικού βάρους (200 μl /25 g ποντικού) και προσδιορίστηκαν τα επίπεδά της σε διάφορα χρονικά διαστήματα 0,15,30,60,120 min. Έτσι, μέσω της κινητικής κάθαρσής της μελετήθηκε η ανοχή στην γλυκόζη (GTT). Στα παρακάτω διαγράμματα παρουσιάζεται η ανοχή στη γλυκόζη που έδειξαν οι τρεις ομάδες στις χρονικές στιιγμές 0,15,30,60,120 min την μηδενική και την 22 η εβδομάδα. Αν και δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στη γλυκόζη νηστείας, παρατηρείται ελαφρά βελτίωση στην ανοχή της γλυκόζης με τη χορήγηση συνδυασμού φαρμάκων σε σχέση με τη μονοθεραπεία με μετφορμίνη ή φαινοφιβράτη την 22 η εβδομάδα. O χώρος των γραφικών παραστάσεων που βρίσκεται κάτω από τις καμπύλες απεικονίζεται στα κάτω διαγράμματα (area under curve 91

92 AUC ). Όπως φαίνεται, στη μηδενική και στην 22 η εβδομάδα τα επίπεδα της γλυκόζης και των τριών ομάδων ήταν υψηλότερα στα 15 λεπτά και επανήλθαν στα αρχικά τους επίπεδα σημειώνοντας σημαντική μείωση στα 120 λεπτά. Συγκεκριμένα, στην 22 η εβδομάδα η ομάδα που έλαβε μετφορμίνη είχε χαμηλότερα επίπεδα γλυκόζης σε σχέση με την ομάδα που έλαβε φαινοφιβράτη. Έτσι η ομάδα της μετφορμίνης είχε 121,52 ± 12,051 mg/dl, η ομάδα της φαινοφιβράτης 158,91 ± 7,45 mg/dl και του συνδυασμού 129,98 ± 6,05 mg/dl. Από τη μέτρηση της AUC η ομάδα του συνδυασμού φάνηκε να έχει μια μειωμένη τιμή σε σχέση με τις άλλες δύο ομάδες δείχνοντας πως η συγχορήγηση φαινοφιβράτης προάγει ελαφρά την αντιδιαβητική δράση της μετφορμίνης. Εικόνα 29: A)Επίπεδα γλυκόζης των τριών ομάδων μελέτης τη μηδενική και την 22η εβδομάδα στις χρονικές στιγμές 0,15,30,60,120 min. B) Ο χώρος των γραφικών παραστάσεων που βρίσκεται κάτω από τις καμπύλες τη μηδενική και την 22η εβδομάδα. 92

93 4.6 Αναλύσεις στον ηπατικό ιστό Ύστερα από τις θυσίες των ζώων την 22 η εβδομάδα, προσδιορίστηκε το βάρος του ήπατος κάθε ζώου και με βάση αυτές τις μετρήσεις έγινε ο προσδιορισμός των επιπέδων των τριγλυκεριδίων και της ολικής χοληστερόλης που περιέχονταν στο ήπαρ ανά γραμμάριο ιστού. Η διαδικασία προσδιορισμού περιγράφεται στην ενότητα Εικόνα 30: Επίπεδα τριγλυκεριδίων του ηπατικού ιστού στην 22η εβδομάδα (Α) και ολικής χοληστερόλης (Β) ανά mg ιστού. Στην Εικόνα 29 στο διάγραμμα Α δεν παρατηρείται στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών ομάδων μελέτης στα επίπεδα της ολικής χοληστερόλης. Τα επίπεδά της στην πρώτη ομάδα, της μετφορμίνης, υπολογίστηκαν 0,061 ± 0,028 mg/mg ιστού. Η ομάδα της φαινοφιβράτης παρουσίασε επίπεδα χοληστερόλης στα 0,157 ± 0,025 mg/mg ιστού και του συνδυασμού 0,137 ± 0,02 mg/mg ιστού. Αντίθετα στο διάγραμμα Β η ομάδα της φαινοφιβράτης αλλά και του συνδυασμού παρουσίασαν σημαντικά μειωμένα επίπεδα τριγλυκεριδίων σε σχέση με τη μετφορμίνη. Η μείωση των τριγλυκεριδίων ήταν αναμενόμενη στην ομάδα της φαινοφιβράτης. Συγκεκριμένα, ενώ τα επίπεδα των TGs στην ομάδα που έλαβε μετφορμίνη ήταν 126,07 ± 16,41 mg/mg ιστού, της φαινοφιβράτης εμφάνισαν μείωση στα 77,80 ± 4,69 mg/mg ιστού ενώ ο συνδυασμός οδήγησε σε ακόμα μεγαλύτερη μείωση στα 63,67 ± 12,84 mg/mg ιστού. 93