ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ. Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Φαρμακευτικής. Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας & Ανοσολογίας

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Φαρμακευτικής Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας & Ανοσολογίας Έκφραση, απομόνωση και χαρακτηρισμός της εξωκυτταρικής περιοχής της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης Γεωργοστάθη Ασημίνα Πάτρα 2010

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Σωκράτης Τζάρτος ΕΠ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Κωνσταντίνος Πουλάς ΕΠ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γεώργιος Πατρινός 2

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή διεκπεραιώθηκε στο εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας & Ανοσολογίας του τμήματος Φαρμακευτικής, του Πανεπιστημίου Πατρών, κατά το χρονικό διάστημα Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον καθηγητή κ. Σωκράτη Τζάρτο, για την άρτια και ολοκληρωμένη επιστημονική καθοδήγηση και επίβλεψη σε όλη την πορεία της εργασίας και για την ευκαιρία που μου παρείχε να αποκομίσω σημαντική εμπειρία στην έρευνα. Θερμές ευχαριστίες οφείλω να εκφράσω και στον επίκουρο καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Πουλά για την πολύτιμη υποστήριξη που μου παρείχε σε πολλαπλά επίπεδα. Θα ήθελα ακόμη να ευχαριστήσω τον επίκουρο καθηγητή κ. Γιώργο Πατρινό, για την πρόθυμη συμμετοχή του στη τριμελή εξεταστική επιτροπή. Ένα μεγάλο ευχαριστώ από καρδιάς οφείλω να εκφράσω σε όλα τα μέλη του εργαστηρίου για το ευχάριστο κλίμα συνεργασίας καθ όλη τη διάρκεια της διατριβής μου. Ιδιαίτερα, ευχαριστώ τον φίλο και συνεργάτη Θανάση Νιάρχο, όχι μόνο για την βοήθειά του και τις αποδοτικές ερευνητικές συνεργασίες που διεκπεραιώσαμε, αλλά πολύ περισσότερο για το πολύ ευχάριστο κλίμα μέσα στο οποίο πραγματοποιήθηκαν οι συνεργασίες αυτές, καθώς επίσης και τον φίλο και συνεργάτη Γρηγόρη Κόρδα για την πολύπλευρη βοήθειά του. Κλείνοντας, θα ήθελα να πω ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου αλλά και στους φίλους μου για την αμέριστη και πολυδιάστατη υποστήριξή τους, καθώς και για τη συνεχή ενθάρρυνσή τους καθ όλη την πορεία των σπουδών μου. 3

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΣ ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ Ιοντικοί δίαυλοι-γενικά Χημειοελεγχόμενοι ιοντικοί δίαυλοι Υποδοχείς της ακετυλοχολίνης Νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης Μυϊκού τύπου nachr Νευρικού τύπου nachrs Η δομή του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Πρωτοταγής δομή Δευτεροταγής και τριτοταγής δομή του νικοτινικού υποδοχέα της Ακετυλοχολίνης Τεταρτοταγής δομή Λειτουργία του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Οι νευρομυϊκές συνάψεις και η νευροδιαβίβαση μέσω των συνάψεων Αλλοστερικές καταστάσεις και λειτουργία του nachr Υποκαταστάτες που προσδένονται στον nachr Αγωνιστές που προσδένονται στον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Ανταγωνιστές που προσδένονται στον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Μεταβολισμός του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΜΥΑΣΘΕΝΕΙΑ Γενικά Ιστορική αναδρομή Κλινικά χαρακτηριστικά Παθογένεση της μυασθένειας Παθοφυσιολογία της μυασθένειας Διάγνωση της μυασθένειας

5 2.7 Θεραπευτικές προσεγγίσεις της μυασθένειας ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Το ετερόλογο σύστημα έκφρασης Pichia pastors Το ετερόλογο σύστημα έκφρασης: κύτταρα εντόμων High Five...46 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ...48 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΥΛΙΚΑ Εργαστηριακός εξοπλισμός Αναλώσιμα Αντιδραστήρια Αντισώματα Διαλύματα Θρεπτικά υλικά ΜΕΘΟΔΟΙ Ετερόλογη έκφραση του ανασυνδυασμένου ECD της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου, μυϊκού τύπου nachr, στον ζυμομύκητα Pichia pastors Απομόνωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών από το υπερκείμενο καλλιέργειας Pichia pastors Ετερόλογη έκφραση του ανασυνδυασμένου ECD της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου, μυϊκού τύπου nachr, σε κύτταρα εντόμων High Five Απομόνωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών από καλλιέργεια κυττάρων εντόμων High Five Καθαρισμός ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Καθαρισμός με χρωματογραφία συγγένειας από στήλη Ni-NTAαγαρόζης Χρωματογραφία μοριακής διήθησης. 63 5

6 2.6 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου SDS (SDS- PAGE) Ανοσοαποτυπώματα πρωτεϊνών (Western blot) Ανάλυση πρωτεϊνών με ανοσοαποτύπωση κουκίδας (dot blot) Φασματοσκοπικές μέθοδοι για την ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών Χρωματομετρική μέθοδος Bradford για την ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών Πρόσδεση ραδιενεργού μπουγκαροτοξίνη στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη (Filter assay) Πειράματα ανταγωνισμού Ανοσοενζυμική μέθοδος προσδιορισμού πρόσδεσης μονοκλωνικών αντισωμάτων στα ανασυνδυασμένα πολυπεπτίδια (ELISA) Ραδιοανοσολογική μέθοδος (RIA) In vitro απογλυκοζυλίωση ανασυνδυασμένων α1-ecd πρωτεϊνών Κυκλικός διχρωϊσμός Δυναμική σκέδαση του φωτός..72 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ετερόλογη έκφραση και απομόνωση του ανασυνδυασμένου ECD της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου, μυϊκού τύπου nachr, σε κύτταρα εντόμων High Five Μελέτη αύξησης του επιπέδου έκφρασης της α1 ECD σε κύτταρα εντόμων Ηigh Five Έκφραση, απομόνωση, καθαρισμός και χαρακτηρισμός του ανασυνδυασμένου α1-ecd σε καλλιέργεια κυττάρων εντόμων High Five μεγάλης κλίμακας Υπολογισμός του μεγέθους των εκφραζόμενων High Five α1 ECD μορίων με μελέτες δυναμικής σκέδασης του φωτός (DLS, Dynamic Light Scattering) Ετερόλογη έκφραση, απομόνωση και καθαρισμός του ανασυνδυασμένου ECD της α1 υπομονάδας του ανθρώπινου, μυϊκού τύπου nachr, στον ζυμομύκητα Pichia pastoris σε καλλιέργεια μεγάλης κλίμακας Ποσοτικοποίηση των α1 ECD πρωτεϊνών που απομονώθηκαν από τις καλλιέργειες Απογλυκοζυλίωση των ανασυνδυασμένων α1 ECD πρωτεϊνών

7 6. Μελέτη της δευτεροταγούς δομής του High Five και Pichia pastoris α1 ECD με φασματοσκοπία κυκλικού διχρωϊσμού Μελέτη της πρόσδεσης ραδιενεργούς μπουγκαροτοξίνης στα Pichia pastoris και High Five α1 ECDs μόρια με Filter assay Μελέτη της πρόσδεσης διάφορων χολινεργικών προσδετών στα Pichia pastoris και High Five α1 ECDs μόρια Έλεγχος της πρόσδεσης αντί-nachr μονοκλωνικών αντισωμάτων στα Pichia pastoris και High Five α1 ECDs Σύγκριση της δέσμευσης παθολογικών αυτοαντισωμάτων στα Pichia pastoris και High Five α1 ECDs ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ.112 7

8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 8

9 1. Ο ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΣ ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ 1.1 Ιοντικοί δίαυλοι-γενικά Η κυτταρική μεμβράνη αποτελεί φραγμό διαπερατότητας ανάμεσα στο κυτταρόπλασμα και στο εξωκυττάριο υγρό. Η αναγκαιότητα διακίνησης ιόντων από και προς το εσωτερικό του κυττάρου εξυπηρετείται από την ύπαρξη ειδικών πρωτεϊνών στη μεμβράνη, οι οποίες είναι γνωστές ως ιοντικοί δίαυλοι. Οι ιοντικοί δίαυλοι σχηματίζουν πόρους στην κυτταρική μεμβράνη, επιτρέποντας την παθητική μετακίνηση των διαφόρων ιόντων σύμφωνα με την ηλεκτροχημική τους κλίση. Η κοινή δομή τους περιλαμβάνει έναν κεντρικό υδατοπληρούμενο πόρο, διαμέσου του οποίου διακινούνται τα ιόντα. Ο πόρος σχηματίζεται συνήθως από τέσσερις έως πέντε διαμεμβρανικές δομές α-έλικας, οι οποίες μπορεί να ανήκουν και σε διαφορετικές υπομονάδες και διευθετούνται κατά τρόπο που θυμίζει τη διάταξη των σανίδων που σχηματίζουν τα πλευρικά τοιχώματα βαρελιού. Οι σχηματιζόμενοι πόροι ανοίγουν με σήμα που προέρχεται από μηχανικό, χημικό ή ηλεκτρικό ερέθισμα. Τα γενικά δομικά χαρακτηριστικά των ιοντικών διαύλων, η θέση τους στο κύτταρο και ο σημαντικός λειτουργικός τους ρόλος τα καθιστούν στόχους για την ανάπτυξη φαρμακευτικών ουσιών (Kalamida et al., 2007). 1.2 Χημειοελεγχόμενοι ιοντικοί δίαυλοι Οι χημειοελεγχόμενοι ιοντικοί δίαυλοι αποτελούν μια κατηγορία των ιοντικών καναλιών οι οποίοι μεταφέρουν ιόντα υπό την επίδραση χημικών μορίωννευροδιαβιβαστών (Ligand-Gated Ion Channels LGICs). Κοινό δομικό χαρακτηριστικό τους αποτελεί η ύπαρξη θέσεων ικανών να δεσμεύουν σηματοδοτικά χημικά μόρια. Τα χημειοελεγχόμενα κανάλια ιόντων μπορούν να διακριθούν ανάλογα με το νευροδιαβιβαστή που τα ενεργοποιεί ή τον οργανισμό ή τον ιστό στον οποίο απαντώνται. Στην παραπάνω υπεροικογένεια ανήκουν οι υποδοχείς της 5- υδρόξυτρυπταμίνης (5-ΗΤ) ή σεροτονίνης (Maricq et al., 1991), της γλυκίνης (Gly) (Grenningloh et al., 1987), του γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABA) (Schofield et al., 1987), και οι υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (ACh) (Stroud et al., 1990; Betz, 1990a). 9

10 Οι τελευταίοι διαδραματίζουν σπουδαίο ρόλο στη νευρομυϊκή σύναψη, στην περιοχή δηλαδή όπου ο νευράξονας των νευρώνων αλληλεπιδρά με την μυϊκή ίνα. Εικόνα 1: Οι ομοιότητες στα δομικά χαρακτηριστικά των μελών της υπεροικογένειας διαύλων που ελέγχονται από προσδέτες. Οι διαφορετικοί υποδοχείς-μέλη της υπεροικογένειας εμφανίζουν κοινά δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά και υποστηρίζεται πως τα γονίδια που εμπλέκονται στην κωδικοποίηση των ομόλογων περιοχών τους, προέρχονται όλα τους από ένα κοινό προγονικό γονίδιο (Betz, 1990b; Ortells and Lunt, 1995). Μεταξύ των ιοντικών καναλιών που ενεργοποιούνται από χημικούς προσδέτες, οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nachrs) αποτελούν την εκτενέστερα μελετημένη υποοικογένεια και για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται ως οδηγός για την κατανόηση της λειτουργίας και των υπόλοιπων μελών της υπεροικογένειας (Changeux et al., 1987; Karlin and Akabas, 1995). 10

11 1.3 Υποδοχείς της ακετυλοχολίνης Oι χολινεργικοί υποδοχείς, δηλαδή οι υποδοχείς που ενεργοποιούνται από τον νευροδιαβιβαστή ακετυλοχολίνη, είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες και διακρίνονται σε δυο κατηγορίες, ανάλογα με τις φαρμακολογικές τους ιδιότητες και τη συγγένεια πρόσδεσης που εμφανίζουν σε διάφορα μόρια-προσδέτες: Α. Νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nachrs), οι οποίοι διαθέτουν υψηλή ευαισθησία απόκρισης στη νικοτίνη (Changeux and Edelstein, 2001; Lindstrom 1997). Β. Μουσκαρινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (machrs), οι οποίοι διαθέτουν υψηλή ευαισθησία απόκρισης στη μουσκαρίνη και αποτελούν μέλη της υπεροικογένειας των υποδοχέων που συνδέονται με G-πρωτεΐνες (G-protein coupled receptors) (Wess, 1996; Ishii and Kurachi, 2006). 1.4 Νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες, όπως και τα υπόλοιπα μέλη της υπερ-οικογένειας, οι οποίες σχηματίζουν τον ιοντικό δίαυλο. Οι υπομονάδες αυτές, διατάσσονται περιμετρικά ενός μεμβρανικού κεντρικού υδατο-πληρούμενου πόρου στην κυτταρική μεμβράνη, διαμέσου του οποίου διακινούνται ιόντα σύμφωνα με την ηλεκτροχημική τους κλίση. Κάθε υπομονάδα των ιοντικών αυτών καναλιών, αποτελείται από μια εξωκυττάρια αμινο-τελική περιοχή (ECD-ExtraCellular Domain) μήκους ~210 αμινοξικών κατάλοιπων, στην οποία βρίσκεται η χαρακτηριστική Cys θηλιά της υπεροικογένειας ανάμεσα σε δύο συντηρημένα κατάλοιπα κυστεΐνης (Cys), τέσσερις διαμεμβρανικές α-έλικες (M1-M4), μια κυτταροπλασματική περιοχή (ΚΠ) μεταξύ της M3 και M4 έλικας και το υδρόφιλο καρβοξυτελικό άκρο της υπομονάδας, μήκους 4-28 αμινοξέων (Le Novere and Changeux, 1999). Επειδή οι διαφορετικοί υποδοχείς-μέλη της υπερ-οικογένειας εμφανίζουν κοινά δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά, υποστηρίζεται πως τα γονίδια που κωδικοποιούν τις ομόλογες υπομονάδες τους, προέρχονται εξελικτικά από το ίδιο αρχέγονο γονίδιο (Betz, 1990; Ortells and Lunt, 1995). Ανάλογα με την τοπολογία και τα φαρμακολογικά τους χαρακτηριστικά, οι nachrs διακρίνονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες, στους μυϊκούς (και μυϊκού τύπου) και στους νευρικούς nachrs. 11

12 Εικόνα 2: Σχηματική αναπαράσταση της δομής του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. a) Ο υποδοχέας αποτελείται από πέντε υπομονάδες, διευθετημένες κανονικά γύρω από ένα κεντρικό άξονα b) Κάθε υπομονάδα διαθέτει μια αμινοτελική εξωκυττάρια περιοχή, τέσσερις υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές (Μ1-Μ4) και μία κυτταροπλασματική περιοχή μεταξύ της M3 και M4 έλικας(a) (Karlin, 2002) Μυϊκού τύπου nachr Οι μυϊκοί υποδοχείς είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες, μάζας 290 kda και εντοπίζονται στη περιοχή των μετασυναπτικών μεμβρανών των σκελετικών μυών των σπονδυλωτών. Στα ηλεκτρικά όργανα ιχθύων του γένους Torpedo και Electrophorus απαντώνται οι μυϊκού τύπου nachrs οι οποίοι είναι ομόλογοι των μυϊκών. Οι μυϊκοί και μυϊκού τύπου nachrs, σχηματίζουν ένα πενταμερές από τέσσερις διαφορετικές υπομονάδες, τις α1, β1, γ ή ε και δ, ονομασία κατά σειρά αυξανόμενου μοριακού βάρους, με σταθερή στοιχειομετρία (α1)2(β1)εδ στον ενήλικο και (α1)2(β1)γδ στον εμβρυϊκό οργανισμό και στους νικοτινικούς υποδοχείς των ηλεκτρικών οργάνων των ψαριών (α2βγδ) (Wess, 1996; Ishiiand and Kurachi, 2006) (Εικόνα 3). Η αντικατάσταση της γ από την ε υπομονάδα ξεκινά αμέσως μετά τη γέννηση και ολοκληρώνεται μέσα στις δύο πρώτες εβδομάδες (Martinou and Merlie, 1991; Missias et al., 1996). Αξίζει να σημειωθεί ότι στους εξωτερικούς οφθαλμικούς μύες των ενήλικων θηλαστικών εκφράζονται τόσο η γ όσο και η ε υπομονάδα (Horton et al., 1993). Οι μυϊκοί και μυϊκού τύπου nachrs διαθέτουν δύο θέσεις πρόσδεσης της ACh και 12

13 άλλων χολινεργικών προσδετών στα ECD τμήματά τους. Η μία θέση πρόσδεσης σχηματίζεται μεταξύ της μίας α και της γ υπομονάδας (ή ε στα ενήλικα άτομα), ενώ η άλλη σχηματίζεται μεταξύ της δεύτερης α και της δ υπομονάδας, καθιστώντας έτσι τις δύο α υπομονάδες μη ισότιμες (Blount and Merlie, 1989). Μάλιστα, η θέση πρόσδεσης μεταξύ της α και γ (ε) υπομονάδας εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης για τον ανταγωνιστή d-τουμποκουραρίνη από την θέση πρόσδεσης μεταξύ της α και δ υπομονάδας (Sine et al., 1995; Miyazawa et al., 1999). Στην α-ecd εδράζει επίσης η κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR), έναντι της οποίας κατευθύνονται τα αντι-nachr αντισώματα στην περίπτωση της μυασθένειας. Κάθε υπομονάδα του μυϊκού και μυϊκού τύπου nachr κωδικοποιείται από διαφορετικό γονίδιο. Τα γονίδια των α1, γ και δ υπομονάδων του ανθρώπινου μυϊκού nachr βρίσκονται στο χρωμόσωμα 2 (Beeson et al., 1990a; Cohen-Haguenauer et al., 1988; Shibahara et al., 1985), ενώ τα γονίδια των β1 και ε υπομονάδων στο χρωμόσωμα 17 (Beeson et al., 1993). Eικόνα 3. Σχηματική αναπαράσταση μυϊκού nachr. Αναπαράσταση της διάταξης των υπομονάδων του μυϊκού nachr περιμετρικά του κεντρικού πόρου του ιοντικού καναλιού (Lindstrom, 2000). Ο μυϊκού τύπου nachr αποτελεί το πλέον γνωστό και μελετημένο μέλος της υπεροικογένειας των χημειοελεγχόμενων ιοντικών διαύλων. Σημαντικοί παράγοντες οι οποίοι συνέβαλαν στην εκτεταμένη μελέτη του είναι η δυνατότητα απομόνωσης μεγάλων ποσοτήτων λειτουργικού μυϊκού τύπου υποδοχέα από τα ηλεκτρικά όργανα ιχθύων του γένους Torpedo και Electrophorus, καθώς και η ύπαρξη ειδικών μορίωνπροσδετών (νευροτοξίνες φιδιών) για τη σήμανση και καθαρισμό του μορίου. 13

14 1.4.2 Νευρικού τύπου nachrs Οι νευρικού τύπου nachrs σχηματίζονται με τη συμμετοχή υπομονάδων τύπου α και β αποκλειστικά και μπορεί να είναι ομο- ή ετεροπενταμερή, ενώ αξίζει να σημειωθεί πως δεν εμφανίζουν σταθερή σύσταση υπομονάδων, όπως συμβαίνει με τον μυϊκού τύπου υποδοχέα. Εκφράζονται ευρέως στο κεντρικό νευρικό σύστημα, στα περιφερικά γάγγλια, καθώς και σε μη διεγέρσιμα κύτταρα όπως είναι τα επιθηλιακά κύτταρα και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος (κυρίως σε μακροφάγα κύτταρα). Η ταξινόμηση των υπομονάδων νευρικού τύπου σε α και β έγινε με κριτήριο την αμινοξική ομολογία που παρουσιάζει η κάθε υπομονάδα με τις αντίστοιχες υπομονάδες του υποδοχέα μυϊκού τύπου ενώ η αρίθμησή τους έγινε βάσει της χρονολογικής απομόνωσης και ανάλυσης της αμινοξικής τους αλληλουχίας. Μέχρι σήμερα έχουν κλωνοποιηθεί εννέα διαφορετικές υπομονάδες νευρικού τύπου α (α2- α10) και τρεις υπομονάδες τύπου β (β2 - β4), προερχόμενες από διαφορετικά είδη, μεταξύ αυτών και ανθρώπινης προέλευσης (McGehee and Role, 1995). Η ύπαρξη πολλών και διαφορετικών τύπων του νευρικού υποδοχέα είναι αποτέλεσμα της ποικιλίας συνδυασμών μεταξύ των διάφορων α και β υπομονάδων ως ομο- ή ετεροπενταμερή με αναλογία α/β 2/3 ή 3/2 (Εικόνα 4) (Role, 1992). Στους ετεροπενταμερείς νευρικούς nachrs σχηματίζονται δύο θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών μεταξύ των α και β υπομονάδων, ενώ στους ομοπενταμερείς σχηματίζονται πέντε θέσεις πρόσδεσης μεταξύ των α υπομονάδων τους. Οι ετεροπενταμερείς και ομοπενταμερείς νευρικοί nachrs διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους ως προς τις φαρμακολογικές τους ιδιότητες. Έτσι, οι ετεροπενταμερείς νευρικοί nachrs [(αχ)2(βψ)3], εμφανίζουν υψηλή συγγένεια πρόσδεσης αγωνιστών (της τάξεως των nm), ενώ δεν προσδένουν τον ανταγωνιστή α-μπουγκαροτοξίνη (αbgtx), σε αντίθεση με τους ομοπενταμερείς νευρικούς nachrs (α7-α9), οι οποίοι εμφανίζουν χαμηλότερη μεν συγγένεια πρόσδεσης αγωνιστών (της τάξεως των μm), αλλά υψηλή συγγένεια πρόσδεσης α-bgtx (της τάξεως των nm) (Lindstrom, 2000). Μάλιστα, για αυτό το λόγο, οι ομοπενταμερείς νευρικοί nachrs αναφέρονται και ως α-bgtx AChRs. 14

15 Εικόνα 4. Σχηματική αναπαράσταση νευρικών nachrs. Αναπαράσταση της διάταξης των υπομονάδων ετεροπενταμερών και ομοπενταμερών νευρικών nachr περιμετρικά του κεντρικού πόρου του ιοντικού καναλιού (Lindstrom, 2000). Κάθε υπότυπος της οικογένειας των νευρικού τύπου υποδοχέων παρουσιάζει διαφορετικές φυσιολογικές και φαρμακολογικές ιδιότητες, γεγονός που δικαιολογεί την εμπλοκή τους σε πολλές και διαφορετικές λειτουργίες του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος, όπως είναι ο έλεγχος των εκούσιων κινήσεων, η ρύθμιση της θερμοκρασίας του σώματος, ο έλεγχος της έκκρισης νευροδιαβιβαστικών ουσιών, καθώς και η ρύθμιση πολύπλοκων ανώτερων πνευματικών διεργασιών, όπως η αντίληψη, η μνήμη, η μάθηση και η συμπεριφορά (Gotti et al., 1997). Οι νευρικού τύπου υποδοχείς έχει βρεθεί ότι εμπλέκονται σε σειρά παθολογικών καταστάσεων και δυσλειτουργιών του νευρικού συστήματος, όπως είναι η νόσος του Alzheimer, η νόσος του Parkinson, η κατάθλιψη, η σχιζοφρένεια και ορισμένοι τύποι επιληψίας, ενώ έχουν συσχετιστεί και με τον εθισμό στη νικοτίνη (Lindstrom, 1997). 15

16 1.5 Η δομή του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Πρωτοταγής δομή Οι νουκλεοτιδικές και αμινοξικές ακολουθίες των διαφόρων nachr υπομονάδων αποκαλύφθηκε με την χρήση της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA και τον προσδιορισμό του cdnas των α (Noda et al., 1982), β (Noda et al., 1983b), γ (Claudio et al., 1983) και δ (Noda et al., 1983b) υπομονάδων του Torpedo nachr. Στη συνέχεια, αυτά τα cdnas χρησιμοποιήθηκαν ως ιχνηθέτες για την απομόνωση cdna και γενομικού DNA των μυϊκών και νευρικών nachr υπομονάδων από διάφορα είδη οργανισμών, μεταξύ των οποίων και του ανθρώπου. Η σύγκριση των αμινοξικών αλληλουχιών των τεσσάρων υπομονάδων (α, β, γ και δ) του Torpedo californica, στο επίπεδο των 56 αμινο-τελικών αμινοξέων, αποκάλυψε τον υψηλό βαθμό ομολογίας μεταξύ των υπομονάδων (35-50%), υποδεικνύοντας την εξελικτική συγγένεια των πρωτεϊνών (Raftery et al., 1980; Noda et al., 1983b). Μεγαλύτερα ποσοστά ομολογίας προκύπτουν από την σύγκριση αμινοξικών αλληλουχιών της ίδιας υπομονάδας σε διαφορετικά είδη, με χαρακτηριστικό παράδειγμα τις α1 υπομονάδες του Torpedo και ανθρώπινου μυϊκού nachr (ποσοστό ομολογίας περίπου 80% ) (Hucho et al., 1996). Υψηλά είναι επίσης τα ποσοστά ομολογίας μεταξύ υπομονάδων των νευρικών nachrs του ίδιου είδους αλλά και μεταξύ διαφορετικών ειδών, όσο και μεταξύ υπομονάδων των μυϊκών και νευρικών nachrs (Sargent, 1993). Κοινό χαρακτηριστικό όλων των υπομονάδων του υποδοχέα (μυϊκού και νευρικού τύπου) αποτελεί η ύπαρξη δυο αυστηρά συντηρημένων κατάλοιπων κυστεΐνης, τα οποία αντιστοιχούν στις κυστεΐνες των θέσεων 128 και 142 της α υπομονάδας του Torpedo. Οι δυο κυστεΐνες σχηματίζουν δισουλφιδικό δεσμό, δημιουργώντας έτσι μια θηλιά 15 αμινοξικών κατάλοιπων εκ των οποίων τα 13 είναι αρκετά συντηρημένα και στους άλλους υποδοχείς ιοντικών καναλιών και εμφανίζουν σε σημαντικό βαθμό υδρόφοβο χαρακτήρα (Stroud et al., 1990). Στην παρουσία της θηλιάς αυτής οφείλεται και ο χαρακτηρισμός των μελών αυτής της υπερ-οικογένειας ως υποδοχείς Cys-θηλιάς (Cys-loop receptors) (Karlin et al., 1995). Οι α υπομονάδες του υποδοχέα, διαθέτουν ένα επιπλέον ζεύγος γειτονικών κατάλοιπων κυστεΐνης στις θέσεις 192 και 193, τα οποία συνδέονται με έναν ασυνήθιστο δισουλφιδικό δεσμό (Kao et al., 1986). 16

17 Η παρουσία ή απουσία τους στις νευρικές υπομονάδες, είναι υπεύθυνη για τον διαχωρισμό αυτών σε α και β αντίστοιχα. Στο αμινοτελικό άκρο όλων των υπομονάδων υπάρχουν θέσεις γλυκοζυλίωσης, ο αριθμός και η θέση των οποίων διαφέρει ανάλογα με την υπομονάδα. Στον ανθρώπινο υποδοχέα διακρίνεται μια θέση γλυκοζυλίωσης στις γ, δ, ε, α3 και β2, ενώ οι α2, α5, α7 και β3 διαθέτουν από δύο και η β4 τέσσερις θέσεις γλυκοζυλίωσης (Mattson and Heilbronn, 1975). Ο ρόλος των θέσεων αυτών, είναι πολλές φορές σημαντικός για τη σωστή ωρίμανση και δομή των υπομονάδων. Η σημασία της γλυκοζιλίωσης αποδεικνύεται και από το γεγονός ότι απογλυκοζυλιωμένες α- υπομονάδες παρουσιάζουν πολύ μικρότερη συγγένεια για την μπουγκαροτοξίνη σε σχέση με τις αντίστοιχες μη-απογλυκοζυλιωμένες. Το κύριο συστατικό των ολιγοσακχαριτικών αλυσίδων είναι η μανόζη και σε ορισμένες περιπτώσεις το σιαλικό οξύ (Nomoto et al., 1986; Poulter et al., 1989; Shoji et al., 1992; Strecker et al., 1994). Όλες οι υπομονάδες του υποδοχέα έχουν το ίδιο πρότυπο υδροφιλικότηταςυδροφοβικότητας, σύμφωνα με το οποίο κάθε υπομονάδα αποτελείται από: (α) το υδρόφιλο αμινοτελικό άκρο της υπομονάδας μήκους αμινοξέων που βρίσκεται εξωκυτταρικά (ECD). Σε αυτή την περιοχή προσδένονται οι αγωνιστές και οι ανταγωνιστές των υποδοχέων, (β) τέσσερις μικρές υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές, με διαμόρφωση α-έλικας, που συμβολίζονται συνήθως με Μ1-Μ4 (15-20 αμινοξέων), (γ) δύο πολύ μικρές υδρόφιλες θηλιές που ενώνουν τις περιοχές Μ1-Μ2 και Μ2-Μ3 μεταξύ τους και μια μεγαλύτερη θηλιά αμινοξέων που ενώνει τις Μ3-Μ4 περιοχές (δ) το υδρόφιλο καρβοξυτελικό άκρο της υπομονάδας, μήκους 4-28 αμινοξέων, που βρίσκεται εξωκυτταρικά (DiPaola et al., 1989). Μεταξύ των Μ3 και Μ4 περιοχών εντοπίζονται και οι θέσεις φωσφορυλίωσης των nachr υπομονάδων, ενώ η πιο συντηρημένη περιοχή μεταξύ των υπομονάδων είναι η Μ2 (Finer-Moore and Stroud, 1984; Yee and Huganir, 1987). 17

18 1.5.2 Δευτεροταγής και τριτοταγής δομή του νικοτινικού υποδοχέα της Ακετυλοχολίνης Πληροφορίες για την δευτεροταγή δομή των υπομονάδων του nachr προέκυψαν με την χρήση διάφορων τεχνικών, όπως φασματοσκοπία κυκλικού διχρωϊσμού, συντονισμό Raman (Hucho et al., 1996) και από υπέρυθρη φασματοσκοπία μετασχηματισμού Fourier. Επειδή η έκφραση, η απομόνωση και ο καθαρισμός, περιλαμβάνουν πολλά και δύσκολα στάδια, ο πρώτος nachr που μελετήθηκε ήταν ο Torpedo. Τα ποσοστά για την δευτεροταγή δομή δεν ήταν κοινά μεταξύ των διαφόρων τεχνικών, γιατί τα παρασκευάσματα διέφεραν μεταξύ τους, αλλά κυρίως γιατί οι παραπάνω τεχνικές δεν ήταν άμεσα συγκρίσιμες. Όλες όμως κατέληξαν στο ότι κατά το μεγαλύτερο μέρος τους, οι nachr αποτελούνται από α-έλικες και β- πτυχωτές επιφάνειες. Οι CD μελέτες έδειξαν σύσταση δευτεροταγούς δομής ~24-45% α-έλικα και ~24-40% β-πτυχωτή δομή, οι μελέτες συντονισμού Raman κατέδειξαν σύσταση ~40% α- έλικα και ~34% β- δομή, ενώ μελέτες FTIR έδειξαν πως ο υποδοχέας αποτελείται από δομές α-έλικας σε ποσοστό 32-33% και από β-πτυχωτές επιφάνειες σε ποσοστό 36-43% και 14-24% β-στροφές, ενώ το υπόλοιπο 0-18% αντιστοιχεί σε τυχαίες αναδιπλώσεις (Naumann et al., 1993). Εικόνα 5: Η τριτοταγής δομή μιας τυπικής υπομονάδας ενός πενταμερούς χημειοελεγχόμενου ιοντικού καναλιού. Διακρίνονται: (Α) Το αμινοτελικό άκρο και (α1) η α-έλικα κοντά σε αυτό (β1-β10) οι δέκα β-πτυχωτές δομές. Οι δομές Cys loop και double Cys και (Κ) το καρβοξυτελικό άκρο της υπομονάδας (Brejc et al., 2002). 18

19 Η χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας δισδιάστατων κρυστάλλων (2D), αρχικά σε ανάλυση 9Ǻ και στη συνέχεια σε 4Ǻ (Unwin, 1993), έδειξε τη διαμεμβρανική περιοχή ως ένα δακτύλιο πέντε α-ελίκων, περιβαλλόμενο από πλαίσιο β-πτυχωτών επιφανειών, έτσι ώστε η προκύπτουσα σύνθετη δομή να προσομοιάζει σε βαρέλι (Unwin, 1993). Οι παραπάνω 5 α-έλικες συγκροτούν τον πόρο του ιοντικού καναλιού και αντιστοιχούν στις Μ2 περιοχές των υπομονάδων (Hucho et al., 1996; Imoto et al., 1988; Leonard et al., 1988), ενώ οι α-έλικες των υπολοίπων διαμεμβρανικών περιοχών (Μ1, Μ3 και Μ4) σχηματίζουν την εξωτερική περιοχή του πόρου (τον εξωτερικό δακτύλιο), προστατεύοντας τον εσωτερικό από τα λιπίδια της μεμβράνης. Η άποψη αυτή ενισχύθηκε και από αποτελέσματα φασματοσκοπικών μελετών, (Görne-Tschelnokow et al., 1994) καθώς και μιας σειράς πειραμάτων ομοιοπολικής τροποποίησης αμινοξικών κατάλοιπων του nachr διαμεμβρανικού τμήματος (Claudio et al., 1983; Devillers-Thiery et al., 1983). Εικόνα 6: Κάτοψη και εγκάρσια τομή του υποδοχέα. Διακρίνονται οι 5 α-έλικες των Μ2 περιοχών (Unwin, 2005). 19

20 Όσον αφορά τα εξωκυτταρικά αμινοτελικά άκρα των nachr υπομονάδων, είχε βρεθεί με μελέτες CD και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας ότι αποτελούνται κυρίως από β-πτυχωτές επιφάνειες, με τη συνεισφορά τριών α-ελίκων. Οι περιοχές αυτές περιελίσσονται μεταξύ τους και στην περίπτωση της α υπομονάδας σχηματίζουν μια κοιλότητα (επτά περιελισσόμενες β-δομές) για την πρόσδεση της ακετυλοχολίνης (West et al., 1997; Schrattenholz et al., 1998; Alexeev et al., 1999; Grant et al., 1999; Yao et al., 2002; Tsetlin et al., 2002) Τεταρτοταγής δομή Όλες οι παραπάνω μελέτες, οδήγησαν σε μία υποθετική σύσταση δευτεροταγούς δομής ολόκληρου ή τμημάτων του nachr, καθώς και σε μία πολύ απλουστευμένη αναπαράσταση της τριτοταγούς και τεταρτοταγούς δομής του nachr, λόγω της περιορισμένης αναλυτικής ικανότητας των χρησιμοποιούμενων αυτών μεθόδων. Η ακριβέστερη μέθοδος για καθορισμό τεταρτοταγούς δομής είναι η χρήση κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ. Τα μεγαλύτερα επιτεύγματα, όσον αφορά την κατανόηση της δομής του nachr σε ατομικό επίπεδο, πραγματοποιήθηκαν μόλις τα τελευταία χρόνια. Αυτά είναι τα εξής: Α. Η λύση της δομής του Torpedo nachr με χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, αρχικά σε ανάλυση 9Å (Unwin et al., 1993) και αργότερα σε σχετικά χαμηλή ανάλυση (4 Å) (Unwin, 2005). Η μελέτη αυτή αποκάλυψε την δευτεροταγή δομή των υπομονάδων του μυϊκού τύπου nachr, καθώς και την αρχιτεκτονική της διάταξης των nachr υπομονάδων περιμετρικά του ιοντικού καναλιού με μεγαλύτερη ακρίβεια, σε σχέση με παλαιότερες μελέτες τέτοιου είδους. 20

21 Εικόνα 7: Απεικόνιση της ηλεκτρονικής πυκνότητας του nachr, όπως έχει προκύψει από ηλεκτρονική μικροσκοπία στα 9 Å (Unwin, 1993). Β. Ομόλογες πρωτεΐνες που δεσμεύουν ακετυλοχολίνη εκφράστηκαν και κρυσταλλώθηκαν. Πρώτα κρυσταλλώθηκε η AChBP με διακριτικότητα 2,7Å, μία πενταμερής υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη, η οποία απομονώθηκε από γλοία κύτταρα του γαστερόποδου μαλακίου Lymnaea stagnalis (Smit et al 2001). Ακολούθησε η κρυστάλλωση και άλλων ομόλογων πρωτεϊνών από είδη σαλιγκαριών όπως το Bulinus truncatus και το Aplysia californica με παρόμοια διακριτικότητα (Patrick et al., 2005; Hansen et al., 2005; Brejcet et al., 2001). Την ίδια χρονική περίοδο, εμφανίστηκαν και οι αντίστοιχες κρυσταλλικές δομές των παραπάνω πρωτεϊνών σε σύμπλοκα με ορισμένους αγωνιστές και ανταγωνιστές (Patrick et al., 2004; Hansen et al., 2004; Ulens et al., 2006). Οι δομές αυτών των πρωτεϊνών μοιάζουν με αυτές του ανθρώπινου και του T. nachr. Γ. Η λύση της δομής του συμπλόκου της ECD της α1 υπομονάδας του nachr επίμυος με α-μπουγκαροτοξίνη επετεύχθη το 2007, με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ (Dellisanti et al., 2007). Με την μελέτη αυτή αποκαλύφθηκε σε ατομικό επίπεδο η διαμόρφωση σημαντικών περιοχών της α1-ecd, όπως ο MIR επίτοπος, καθώς και οι αλληλεπιδράσεις της με τον ανταγωνιστή α- μπουγκαροτοξίνη. Δ. Η λύση της δομής με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ ενός πρόδρομου προκαρυωτικού πενταμερούς καναλιού της υπερ-οικογένειας LGIC, που απομονώθηκε από το βακτήριο Erwinia chrysanthemi (Hilf and Dutzler, 2008). 21

22 Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τα παραπάνω πειράματα, σε συνδυασμό με παλαιότερα, οδήγησαν σε ένα μοντέλο της τεταρτοταγούς δομής του nachr, σύμφωνα με το οποίο οι πέντε υπομονάδες είναι τοποθετημένες γύρω από ένα άξονα σχηματίζοντας ένα κυλινδρικό διαμεμβρανικό δίαυλο που προσδίδει σχετική πενταγωνική δομή στον υποδοχέα. Ο δίαυλος αυτός έχει υψηλή συμμετρία και ύψος 120Å (τα 60Ǻ εκ των οποίων εκτείνονται στην εξωκυτταρική πλευρά ενώ 30Ǻ διαπερνούν την μεμβράνη), διάμετρο 80Å και διάμετρο πόρου 20Å. Ο πόρος του καναλιού, ο οποίος σχηματίζεται κυρίως από την Μ2 έλικα της κάθε υπομονάδας, παρουσιάζει μεγαλύτερο εύρος στην κυτταροπλασματική και εξωκυτταρική περιοχή, το οποίο και μικραίνει σημαντικά στην περιοχή της διπλοστοιβάδας. Αξιοσημείωτο είναι ότι ο δίαυλος αυτός του υποδοχέα εκτείνεται αρκετά στο εξωκυττάριο περιβάλλον. Εικόνα 8: Σχηματική αναπαράσταση της δομής του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης. Ο υποδοχέας έχει σχήμα περίπου κυλινδρικό. Αποτελείται από τις υπομονάδες (α1) 2 β1εδ οι οποίες σχηματίζουν ένα δίαυλο, τα τοιχώματα του οποίου είναι οι Μ2 έλικες των υπομονάδων. Κάθε υπομονάδα διαθέτει μια μεγάλη υδρόφιλη αμινοτελική εξωκυτταρική περιοχή και τέσσερις υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές (Μ1-Μ4)(Changeux et al., 1993). Κάθε υπομονάδα συνδέεται με τις διπλανές τις με μια μεγάλη και μια μικρή πλευρά. Από τις μελέτες για τον ακριβή προσδιορισμό του τρόπου διευθέτησης των υπομονάδων, προκύπτει μια ποικιλία δομών, ανάλογα με την προέλευση του nachr. Συγκεκριμένα, στον μυϊκού τύπου υποδοχέα διακρίνονται πέντε διαφορετικές 22

23 διευθετήσεις (ααγδβ, ααγβδ, αγαβδ, αβαγδ, αδαβγ), καθώς και οι κατοπτρικές τους γύρω από το δίαυλο. Οι δύο πρώτες, ααγδβ και ααγβδ, απορριφθήκαν βάσει πειραματικών δεδομένων (Schiebler and Hucho, 1980; Wise et al., 1981). Από μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας αποκλείστηκε και η πέμπτη πιθανή διαμόρφωση, δηλαδή αδαβγ (Wise et al., 1981). Για τις δύο εναπομείναντες διαμορφώσεις, υπάρχουν πειραματικά δεδομένα που τις στηρίζουν (Kurosaki et al., 1987; Blound and Merlie, 1989; Pedersen, 1990; Sine and Claudio, 1991). Οι θέσεις πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης είναι δύο και εντοπίζονται μεταξύ των α/γ και α/δ υπομονάδων (Changeux et al., 1993). Μαζί με τον υποδοχέα, από τις μεμβράνες του Torpedo απομονώνεται και μια περιφερική μεμβρανική πρωτεΐνη, σε στοιχειομετρία 1:1, η ραψίνη (Sealock, 1982; LaRochelle and Froehner, 1986). Η πρωτεΐνη αυτή έχει μοριακό βάρος 43kDa και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη συνάθροιση και αγκυροβόληση του υποδοχέα στη μεμβράνη, καθώς και στη σύνδεσή του με στοιχεία του κυτταροσκελετού (Frail et al., 1988; Froehner et al., 1990; Phillips et al., 1991, 1993; Apel et al., 1995). Όσο αφορά τον νευρικό nachr, τα δεδομένα είναι πολύ περιορισμένα, καθώς είναι ιδιαίτερα δύσκολη η απομόνωση του. Υπολογίζεται ότι διαθέτει παραπλήσιο μοριακό βάρος με τον μυϊκού τύπου υποδοχέα, ενώ το γεγονός ότι και ο αριθμός των αμινοξικών κατάλοιπων των νευρικών υπομονάδων είναι περίπου 600αμινοξέα (αα), αριθμός περίπου ίσος με τις μυϊκού τύπου υπομονάδες, υποδεικνύει την πιθανότητα σχηματισμού πενταμερών νευρικών υποδοχέων. Δεν είναι όμως γνωστές όλες οι πιθανές στοιχειομετρίες και η διευθέτηση των υπομονάδων γύρω από τον ιοντικό δίαυλο. 23

24 1.6 Λειτουργία του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Οι νευρομυϊκές συνάψεις και η νευροδιαβίβαση μέσω των συνάψεων Η ταχεία επικοινωνία μεταξύ των νευρώνων και των κυττάρων με τα οποία αυτοί αλληλεπιδρούν επιτυγχάνεται χάρη στην ύπαρξη των νευρομυϊκών συνάψεων. Με τον όρο νευρομυϊκή σύναψη αναφερόμαστε στην σύνδεση ανάμεσα στους νευράξονες των κινητικών νευρώνων και τις ίνες του σκελετικού μυός. Αναλυτικότερα, οι μυϊκές ίνες των σκελετικών μυών δέχονται νεύρωση από εμμύελες νευρικές ίνες. Κοντά στη νευρομυϊκή σύναψη, οι κινητικές ίνες χάνουν το μυελώδες έλυτρό τους και διαιρούνται σε λεπτούς τελικούς κλάδους. Οι τελικοί κλάδοι των κινητικών νευραξόνων κείνται σε συναπτικές κοιλότητες στην επιφάνεια ων μυϊκών κυττάρων. Η κυτταρική μεμβράνη του μυϊκού κυττάρου που επενδύει την κοιλότητα, σχηματίζει πολλές συναπτικές πτυχές. Στις νευραξονικές απολήξεις βρίσκονται πολλά συναπτικά κυστίδια των 40 nm, με λεία επιφάνεια, τα οποία περιέχουν ακετυλοχολίνη, τον νευροδιαβιβαστή που χρησιμοποιείται στην σύναψη αυτή. Την νευραξονική απόληξη και το μυϊκό κύτταρο τα χωρίζει η συναπτική σχισμή, ένα σταθερού εύρους μεσοκυττάριο διάστημα (περίπου 500 Å), που περιέχει ένα πλούσιο σε υδατάνθρακες άμορφο υλικό (Robert et al., 2006). Στις ακρολοφίες των πτυχώσεων της μετασυναπτικής μεμβράνης βρίσκονται οι υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (acetylcholine receptors-achrs), σε συγκέντρωση υποδοχείς ανά μm 2 πλασματικής μεμβράνης. Ένα δυναμικό ενέργειας άγεται κατά μήκος του κινητικού νευράξονα μέχρι την προσυναπτική νευραξονική απόληξη. Όταν φτάσει στα συναπτικά κομβία του νευράξονα προκαλεί διάνοιξη των καναλιών ασβεστίου (Ca +2 ) της προσυναπτικής μεμβράνης. Η διάνοιξη αυτή οδηγεί σε είσοδο ιόντων Ca +2 στο κύτταρο λόγω ηλεκτροχημικής κλίσης. Η αύξηση της συγκέντρωσης των ιόντων Ca +2 οδηγεί σε μετακίνηση και σύντηξη των συναπτικών κυστιδίων με την προσυναπτική μεμβράνη και απελευθέρωση της ακετυλοχολίνης στη συναπτική σχισμή. Η διαχεόμενη στη συναπτική σχισμή ακετυλοχολίνη, προσδένεται στους υποδοχείς της στη μετασυναπτική μεμβράνη του μυϊκού κυττάρου και προκαλεί με τη σειρά της διάνοιξη των υποδοχέων της και είσοδο ιόντων νατρίου (Na + ) στο μυϊκό κύτταρο. Η αύξηση της συγκέντρωσης των ιόντων οδηγεί στη δημιουργία ενός δυναμικού ενέργειας που μεταβιβάζεται καθ όλο το μήκος της ίνας, με τη δράση των 24

25 τασεοεξαρτώμενων καναλιών Na +. Προκαλείται μια αλυσίδα γεγονότων που τελικά οδηγεί στην μυϊκή συστολή. Εικόνα 9: Η Νευρομυϊκή σύναψη σε λεπτομέρεια. Διακρίνεται η τελική κινητική πλάκα και το σημείο επαφής μεταξύ της τελικής απόληξης του νευράξονα και της μεμβράνης της μυϊκής ίνας. Απεικονίζονται οι υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nachr) στην πλασματική μεμβράνη του μυϊκού κυττάρου και τα απελευθερωμένα μόρια της ακετυλοχολίνης (ACh) από τα συναπτικά κομβία του νευρικού κυττάρου στη συναπτική σχισμή. Τροποποιημένη, από J Clin Invest. 116, (2006) Αλλοστερικές καταστάσεις και λειτουργία του nachr Οι nachr στη νευρομυϊκή σύναψη εμπλέκονται σε μία συνεχή διαδικασία δέσμευσης-αποδέσμευσης της Ach, με επακόλουθο το άνοιγμα και κλείσιμο του πόρου του διαύλου και τη μεταβολή του δυναμικού της μετασυναπτικής μεμβράνης. Ο nachr, ανταποκρινόμενος στο προσυναπτικό ερέθισμα μεταπίπτει σε διαφορετικές λειτουργικές καταστάσεις, οι οποίες ισοδυναμούν με διαφορετικές δομικές καταστάσεις, διακρινόμενες από μικρές αλλά σαφείς και αμφίδρομες δομικές τροποποιήσεις, καθώς το μόριο αυτό είναι μία αλλοστερική πρωτεΐνη (Karlin and Akabas, 1995; Lena and Changeux, 1993). Υπάρχουν τρεις βασικές αλλοστερικές καταστάσεις του nachr, οι οποίες μπορούν να παρατηρηθούν υπό την επίδραση διαφόρων υποκαταστατών (Εικόνα 10). 25

26 I. Κατάσταση ηρεμίας Χαρακτηρίζεται η κατάσταση απουσίας του υποκαταστάτη. Η κατάσταση αυτή είναι η πιο σταθερή και οι περισσότερες πιθανές διαμορφώσεις περιγράφονται από κλειστή μορφή του υποδοχέα. Ο δίαυλος μπορεί να ενεργοποιηθεί με τη δέσμευση δύο μορίων ACh. II. Ενεργή κατάσταση Ο δίαυλος είναι ανοιχτός. Ο nachr είναι προσδεδεμένος με δύο μόρια ACh. Η μετάβαση στην ενεργή κατάσταση από την κατάσταση ηρεμίας, είναι μία εξαιρετικά γρήγορη διαδικασία ( μs). III. Απευαισθητοποιημένη κατάσταση Χαρακτηρίζεται το μεσοδιάστημα μεταξύ της πρόσδεσης του αγωνιστή (ACh) στον υποδοχέα και τη μετάβαση στην κατάσταση ηρεμίας. Η διάρκειά τους είναι μεγαλύτερη από αυτή των ενεργών καταστάσεων (υπολογίζεται σε δέκατα του s). Σε αυτή την κατάσταση, ο AChR παρουσιάζει αυξημένη συγγένεια για την ACh, με την μόνη διαφορά ότι ο δίαυλος είναι κλειστός. Η σταθερότητα της αργής έναρξης της κατάστασης απευαισθητοποίησης ενισχύεται παρουσία του αγωνιστή (ACh). α β γ Εικόνα 10: Οι αλλαγές στη διαμόρφωση του υποδοχέα. α) Φάση ηρεμίας β) Ενεργοποίηση από πρόσδεση αγωνιστή γ) Απενεργοποίηση ( 26

27 Κατά την προσέγγιση της ακετυλοχολίνης στις θέσεις πρόσδεσής της αρχίζει μια διαδικασία περιστροφής προς την αντίθετη κατεύθυνση των αλυσίδων της εισόδου, η οποία μεταδίδεται αλλοστερικά αρχικά στην α-έλικα της Μ2 περιοχής της α υπομονάδας. Η κίνηση αυτή, μεταδίδεται σειριακά και στις υπόλοιπες υπομονάδες, οδηγώντας στην αλλαγή της χωροδιάταξης και το άνοιγμα του διαύλου. Όταν ολοκληρωθούν αυτές οι αλλαγές, ακολουθούν μικρές μεταβολές-μετατοπίσεις, παράλληλα προς το επίπεδο της μεμβράνης, για τη σωστή λειτουργία του πόρου. Το διαμεμβρανικό τμήμα του διαύλου παρουσιάζει απόλυτη συμμετρία, ενώ οι υπομονάδες στην περιοχή αυτή είναι πολύ κοντά η μια στην άλλη. Οι παραπάνω ιδιότητες οφείλονται σε συγκεκριμένα αμινοξέα που αποτελούν τις έλικες των Μ2 τμημάτων, τα οποία είναι υδρόφοβα και ογκώδη και έρχονται σε στενή επαφή. Τα αμινοξέα που αλληλεπιδρούν είναι η λευκίνη 251 με τη γειτονική της αλανίνη ή σερίνη και η βαλίνη ή ισολευκίνη 255 με τη γειτονική της φαινυλαλανίνη (Miyazawa et al., 2003). Στην ανοιχτή του μορφή ο υδρόφιλος πόρος, με διάμετρο στο στενότερο σημείο του μόλις 7 Å, επιτρέπει την εκλεκτική διαπερατότητα των μορίων της εξωκυτταρικής περιοχής, τα οποία και εισέρχονται στο εσωτερικό του κυττάρου. Το μέγεθος των μορίων περιορίζεται σε αυτό των αφυδατωμένων ιόντων (Auerbach et al., 1993; Katz et al., 1957; Sakmann et al., 1980; Neubig et al., 1982; Heidmann et al., 1983; Jackson et al., 1989; Hess et al., 1993; Colquhoun et al., 1985). Οι διαφορετικού τύπου nachrs χαρακτηρίζονται και από ξεχωριστές ιδιότητες για τον καθένα. Για παράδειγμα, οι μυϊκού τύπου nachrs που φέρουν την γ υπομονάδα στο μόριο τους, έχουν διαφορετική κινητική και αγωγιμότητα του καναλιού, καθώς και διαφορετικές φαρμακολογικές και μεταβολικές ιδιότητες, από τον υποδοχέα που φέρει την ε υπομονάδα (Owens et al., 1993; Anderson and Blobel, 1981). 27

28 1.6.3 Υποκαταστάτες που προσδένονται στον nachr Υπάρχουν πολλά μόρια που προσδένονται στους nachrs, εκ των οποίων το μοναδικό μόριο που εκκρίνει ο ανθρώπινος οργανισμός είναι η ακετυλοχολίνη. Τα υπόλοιπα μόρια είναι είτε φυσικά προϊόντα, είτε χημικές ενώσεις. Ανάλογα με τη θέση πρόσδεσης και τον τρόπο που επηρεάζουν τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού, τα χημικά αυτά μόρια κατατάσσονται σε τρεις κατηγορίες: A) Αγωνιστές: αλληλεπιδρούν με τον υποδοχέα στην ίδια ή παραπλήσια θέση με αυτή της πρόσδεσης της ACh, επάγοντας την ενεργοποίηση του ιοντικού καναλιού. Β) Ανταγωνιστές: Η θέση δέσμευσής τους είναι η ίδια ή παραπλήσια με αυτή της ACh, έχουν όμως αντίθετη δράση, αναστέλλοντας τη λειτουργία του ιοντικού διαύλου και παρεμποδίζοντας τη συναπτική διαβίβαση και Γ) Αλλοστερικοί τροποποιητές: Η θέση δέσμευσης είναι διαφορετική από αυτή της ACh. Είναι μια ετερογενής ομάδα, τα μέλη της οποίας έχουν την ικανότητα είτε να ενεργοποιούν, είτε να αναστέλλουν τη λειτουργία του καναλιού. Αξίζει να σημειωθεί ότι υπάρχουν μόρια όπως η κυτισίνη, τα οποία δρούν άλλοτε ως αγωνιστές και άλλοτε ως ανταγωνιστές του nachr (Papke and Heinemann, 1994) Αγωνιστές που προσδένονται στον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Ακετυλοχολίνη Αποτελεί τον ενδογενή αγωνιστή του υποδοχέα. Η δράση της είναι διεγερτική για ορισμένα μετασυναπτικά κύτταρα και ανασταλτική για κάποια άλλα, καθώς ο υποδοχέας είναι εκείνος που καθορίζει εάν μια χολινεργική σύναψη είναι διεγερτική ή ανασταλτική. Ένας δεύτερος ρόλος του nachr είναι και ο καθορισμός της απευθείας ή της έμμεσης ενεργοποίησης του διαύλου από την νευροδιαβιβαστική ουσία ή μέσω ενός δεύτερου μεταβιβαστικού μορίου (πρώτη και δεύτερη περίπτωση αντίστοιχα). Στα σπονδυλωτά, η ACh προκαλεί τη διέγερση του μετασυναπτικού νευρώνα στη νευρομυϊκή σύναψη, αλληλεπιδρώντας με τον nachr. Σε περίπτωση αλληλεπίδρασης με τον μουσκαρινικό υποδοχέα, προκαλεί επιβράδυνση του καρδιακού ρυθμού. 28

29 Εικόνα 11: Σχηματική αναπαράσταση της θέσης πρόσδεσης της ACh στον nachr. Οι θέσεις πρόσδεσης του νευροδιαβιβαστή σχηματίζονται κυρίως από αμινοξικά κατάλοιπα των α υπομονάδων. Κατάλοιπα από τις γ και δ υπομονάδες συμβάλλουν επίσης στην πρόσδεση της ακετυλοχολίνης. ( Η αρχική εκτίμηση για το ότι η θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης ήταν αποκλειστικά στην α υπομονάδα γρήγορα εγκαταλείφθηκε, καθώς εμφανίστηκαν μελέτες που έδειχναν ότι η θέση αυτή σχηματίζεται στις μεσεπιφάνειες μιας α υπομονάδας και της γειτονικής της, με τη συμμετοχή αμινοξικών κατάλοιπων και από τις δυο υπομονάδες (Kurosaki et al., 1987; Karlin et al., 1995). Στις μελέτες αυτές, αναδείχθηκε ο ρόλος αρωματικών και υδρόφοβων κατάλοιπων και ιδιαίτερα του συντηρημένου δισουλφιδικού δεσμού ανάμεσα στις β9 και β10 πτυχωτές δομές (Kao et al., 1984). Επίσης, αναδείχθηκε και ο ρόλος 4 ακόμα συντηρημένων κατάλοιπων, των Tyr93, Trp149, Tyr190 και Tyr198 στην α υπομονάδα ως πιθανούς συμμετόχους στο σχηματισμό της θέσης πρόσδεσης. Όσο για τις γ και δ υπομονάδες, σημαντικά κατάλοιπα βρέθηκαν να είναι τα Asp174 και Trp55 για την πρώτη και τα Asp180, Trp57 και Glu189 για τη δεύτερη. Η παραπάνω αρίθμηση αφορά τον T. nachr (Dennis et al., 1988; Abramson et al., 1989; Galzi et al., 1990; Cohen et al., 1991; Middleton et al., 1991; Mishina et al., 1986). Σήμερα πιστεύεται πως αμινοξικά κατάλοιπα από τρεις διακριτές περιοχές-θηλιές (A, B, C) στις α υπομονάδες είναι εκείνα που κυρίως συνεισφέρουν στη συγκρότηση της θέσης πρόσδεσης, ενώ κατάλοιπα γειτονικών υπομονάδων, οργανωμένα επίσης 29

30 σε τρεις διακριτές περιοχές-θηλιές (D, E, F), αποτελούν δευτερευούσης σημασίας συστατικά στοιχεία της θέσης πρόσδεσης. Η διαμόρφωση των θέσεων πρόσδεσης της ACh τροποποιείται κατά την πρόσδεση των αγωνιστών και κατά συνέπεια κατά τις μεταπτώσεις του μορίου του υποδοχέα μεταξύ των διαφορετικών λειτουργικών καταστάσεων του. Νικοτίνη Πρόκειται για ένα αλκαλοειδές μόριο, που προέρχεται από το φυτό Nicotiana tabacum. Αποτελεί τυπικό εξωγενή αγωνιστή των nachrs. Προσδένεται σε μυϊκούς nachrs καθώς και σε ορισμένους νευρικούς. Οι ομοπενταμερείς νευρικού τύπου υποδοχείς εμφανίζουν υψηλότερη χημική συγγένεια για τη νικοτίνη, συγκριτικά με την ACh (Corringer et al., 1998). Καρβαμυλοχολίνη Αποτελεί ιδιαίτερα σταθερό αγωνιστή, τόσο των νικοτινικών όσο και των μουσκαρινικών υποδοχέων της ACh, ο οποίος παρεμποδίζει τη δράση του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση (AChE). Επιβατιδίνη Πρόκειται για φυσικό προϊόν, που απομονώθηκε από το δέρμα του δηλητηριώδους βατράχου Epipedobates tricolor. Έχει τη δυνατότητα να προσδένεται με υψηλή συγγένεια σε ετερομερείς και ομοπενταμερείς υπότυπους του νευρικού υποδοχέα (Badio and Daly, 1994) Ανταγωνιστές που προσδένονται στον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης α-μπουγκαροτοξίνη (α-bungarotoxin, α-bgtx) Είναι συστατικό του δηλητηρίου του φιδιού Bungarus multicinctus. Έχει την ιδιότητα να παραλύει και να προκαλεί, μαζί με άλλα συστατικά, το θάνατο του θηράματος. Η α-μπουγκαροτοξίνη είναι ένα πολυπεπτίδιο που αποτελείται από 74 αμινοξέα με μοριακό βάρος περίπου 8 kda. Το μόριο αυτό προσδένεται σε πολλούς νευρικούς nachr, αλλά έχει τη μέγιστη χημική συγγένεια για τους μυϊκούς nachrs (Kd 5X X10-11 ). Λειτουργεί ως ανταγωνιστής της ACh και δύναται να 30

31 αναστείλει τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού (Karlin et al., 1986; Arias, 1997). Με την εφαρμογή συστημάτων ετερόλογης έκφρασης για υπομονάδες του νευρικού nachr, διαπιστώθηκε πως ο ανταγωνιστής αλληλεπιδρά και συνδέεται με τους ομοπενταμερείς α7, α8, α9 nachrs και μάλιστα με αρκετά υψηλή συγγένεια (Kd ~10-9 M), ενώ αντίθετα δε συνδέεται με τους ετεροπενταμερείς νευρικούς αχ/βy και α7/α8 nachrs. Η α-μπουγκαροτοξίνη βρέθηκε να έχει την ικανότητα να προσδένεται και σε αποδιατεταγμένη με απορρυπαντικό α υπομονάδα του υποδοχέα από Torpedo, έστω και με μικρότερη συγγένεια σε σχέση με τον ανέπαφο υποδοχέα. Κάτι τέτοιο δεν ισχύει φυσικά για το μόριο της ACh και η παρατήρηση αυτή οδηγεί στο συμπέρασμα πως το κυριότερο τμήμα της περιοχής πρόσδεσης της α-μπουγκαροτοξίνης βρίσκεται εντός της α υπομονάδας. Για τον ακριβέστερο εντοπισμό της θέσης πρόσδεσης του ανταγωνιστή στην α υπομονάδα, χρησιμοποιήθηκαν πεπτίδια της υπομονάδας προερχόμενα από πρωτεόλυση του μορίου (Tzartos and Changeux, 1983, 1984; Wilson et al., 1985; Neumann et al., 1986), ανασυνδυασμένα τμήματα της συγκεκριμένης υπομονάδας (Barkas et al., 1986, 1987, 1988; Aronheim et al., 1988), καθώς και συνθετικά πεπτίδια (Wilson and Lentz, 1988; Gotti et al., 1988; Lentz, 1995). Από τις μελέτες αυτές, προέκυψε ότι η βασική περιοχή πρόσδεσης του ανταγωνιστή βρίσκεται σε μια μικρή αλληλουχία της α υπομονάδας, η οποία συμπεριλαμβάνει και τις γειτονικές κυστεΐνες Cys192 και Cys193. Λεπτομερέστερες μελέτες, έδειξαν ότι το επταπεπτίδιο α του Torpedo είναι αναγκαίο και ταυτόχρονα επαρκές για την πρόσδεση του ανταγωνιστή (Tzartos and Remoundos, 1990). Με τη χρήση πεπτιδικών αναλόγων του παραπάνω επταπεπτιδίου και τροποποιημένων ανασυνδυασμένων τμημάτων του, αποκαλύφθηκε τελικά ότι τα αμινοξικά κατάλοιπα Tyr189, Tyr190, Cys192, Cys193 και Asp185 είναι απαραίτητα για την πρόσδεση της α-μπουγκαροτοξίνης, ενώ ο δεσμός Cys192-Cys193 όχι (Tzartos and Remoundos, 1990; Chaturvedi et al., 1993; Vincent et al., 1998). Η πρόσφατη λύση της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου α1-ecd/α-bgtx (Dellisanti et al., 2007) επιβεβαίωσε τα προηγούμενα πειραματικά δεδομένα και αποκάλυψε σε ατομικό επίπεδο και με μεγάλη ακρίβεια τη συγκρότηση της κυρίως πλευράς της θέσης πρόσδεσης της α-bgtx. 31

32 Εικόνα 12: Δομή του συμπλόκου της ECD της α1 υπομονάδας του μυϊκού nachr με την α-bgtx. Με βαθύ πράσινο είναι η nachr α1-ecd, με πορτοκαλί η α-bgtx και με κόκκινο η υδατανθρακική αλυσίδα, η οποία εκτείνεται από τη Cys θηλιά της α1-ecd έως της θηλιά C. Απεικονίζονται επίσης τα πτυχωτά φύλλα (β1-β10) που συνιστούν τον υδρόφοβο πυρήνα της α1-ecd, ο MIR επίτοπος, καθώς και οι θηλιές I, II και III του μορίου της α-bgtx (Delissanti et al., 2007). κ-μπουγκαροτοξίνη (κ-bungarotoxin, κ-bgtx) Η κ-μπουγκαροτοξίνη αποτελεί ένα πολυπεπτίδιο μοριακού βάρους 6,5 kda και υπάρχει στο δηλητήριο του φιδιού Bungarus multisinctus, αλλά σε πολύ μικρότερες ποσότητες από την α-μπουγκαροτοξίνη (Chiappinelli, 1983). Η κ-μπουγκαροτοξίνη αναστέλλει τη συναπτική διαβίβαση σε γάγγλια του αυτόνομου νευρικού συστήματος, στα οποία εντοπίζονται διάφοροι ετερο-ολιγομερείς α/β υπότυποι του νευρικού τύπου nachr (Chiappineli, 1993; Gotti et al., 1997). D-τουμποκουραρίνη (κοινώς κουράριο) Είναι φυσικό προϊόν, συστατικό του κουράριου, το οποίο παράγεται από το φυτό Chondrodendron tomentosum. Χρησιμοποιήθηκε και χρησιμοποιείται ακόμα από ιθαγενείς του Αμαζονίου για να παραλύουν τα θηράματά τους, καθώς αποκλείει συναγωνιστικά τους μυϊκούς nachrs. Στη σύγχρονη θεραπευτική, χρησιμοποιείται ως μυοχαλαρωτικό στην αναισθησία, μειώνοντας έτσι τη δόση του αναισθητικού που απαιτείται. Εκτός από τους μυϊκούς nachrs, η α-τουβοκουραρίνη προσδένεται και σε κάποιους νευρικούς. 32

33 Μεθυλκακονιτίνη (MLA) Οι ομοπενταμερείς α7 υποδοχείς έχει δειχθεί να διαθέτουν πέντε θέσεις πρόσδεσης για το μόριο του συναγωνιστικού αυτού ανταγωνιστή (Palma et al., 1996). Η ακριβής θέση πρόσδεσής της αποκαλύφθηκε σε ατομικό επίπεδο από τη λύση της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου της με την AChBP (Hansen et al., 2005). Γκαλάμινη Ανήκει στους μη συναγωνιστικούς (αλλοστερικούς) ανταγωνιστές των μυϊκών nachrs, ενώ δεν προσδένεται σε νευρικούς nachrs. 1.7 Μεταβολισμός του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Οι διάφορες υπομονάδες του nachr συντίθενται σαν διακριτές πολυπεπτιδικές αλυσίδες στα ριβοσωμάτια του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου. Ακολουθούν μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις στο εσωτερικό του δικτύου. Ακολούθως και αφού προηγηθούν η πρωτεολυτική απομάκρυνση του σηματοδοτικού πεπτιδίου, η γλυκοζυλίωση, η φωσφορυλίωση και η δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών, οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες αναδιπλώνονται, συγκροτώντας το λειτουργικό πενταμερές μόριο του υποδοχέα. Ο πενταμερής πλέον υποδοχέας περνάει στο σύμπλεγμα Golgi, για να ολοκληρωθούν οι μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις. Μετά από μια διαδικασία περίπου 1,5-2 ωρών, ο ώριμος πλέον υποδοχέας μεταφέρεται στην επιφάνεια της μετασυναπτικής μεμβράνης (Kao and Karlin, 1986; Blount and Merlie, 1990; Anderson and Blobel, 1981; Anderson et al., 1982; Merlie et al., 1982; Merlie and Lindstrom, 1983; Olson et al., 1984; Smith et al., 1987; Green et al., 1991). Τα διάφορα στάδια της διαδικασίας βιοσύνθεσης του υποδοχέα μελετήθηκαν με τη χρήση ραδιοσημασμένης α-μπουγκαροτοξίνης ( 125 I-α-bgtx). Δύο διαφορετικά μοντέλα έχουν μέχρι σήμερα προταθεί σχετικά με τη σειρά με την οποία οι διάφορες υπομονάδες συμμετέχουν στη συγκρότηση λειτουργικών πενταμερών μορίων του υποδοχέα. Σύμφωνα με το πρώτο μοντέλο, αρχικά σχηματίζεται η ώριμη α υπομονάδα (μετά τη δημιουργία θέσης πρόσδεσης της α-μπουγκαροτοξίνης), η οποία αλληλεπιδρώντας με τα αμινοτελικά τμήματα των εξωκυτταρικών περιοχών των υπομονάδων οδηγεί στο σχηματισμό των ετεροδιμερών συμπλόκων αγ και αδ, τα οποία στη συνέχεια αλληλεπιδρούν τόσο μεταξύ τους όσο και με τη β υπομονάδα, 33

34 προς σχηματισμό του πλήρους πενταμερούς μορίου (Blount and Merlie, 1990; Gu et al., 1991; Merlie et al., 1983; Saedi et al., 1991). Σύμφωνα με το δεύτερο μοντέλο, οι δύο θέσεις πρόσδεσης της ACh δεν δημιουργούνται ταυτόχρονα (Εικόνα 13Β). Έτσι, κατ αρχήν σχηματίζεται ένα τριμερές αβγ, οπότε και συγκροτείται η πρώτη θέση δέσμευσης της ACh μεταξύ της α και γ υπομονάδας. Στη συνέχεια, σε αυτό το τριμερές προστίθενται διαδοχικά η δ υπομονάδα και η δεύτερη α υπομονάδα, η οποία μαζί με τη γειτονική της δ συγκροτούν και τη δεύτερη θέση πρόσδεσης της ACh (Green and Claudio, 1993; Green and Wanamaker, 1998; Kreienkamp et al., 1995; Nicke et al., 1999). Η εξειδικευμένη συνάθροιση των υπομονάδων κατά τα πρώιμα στάδια σχετίζεται με σήματα αναγνώρισης που περιέχουν οι Ν-τελικές περιοχές των υπομονάδων του nachr (Kreienkamp et al., 1995; Verrall and Hall, 1992). Η αποικοδόμηση μορίων του nachr πραγματοποιείται στα λυσοσωμάτια, μέσω ενδοκύττωσης και ταυτόχρονης κατανάλωσης ενέργειας. Τα προκύπτοντα ελεύθερα αμινοξέα απελευθερώνονται από τα κύτταρα περίπου 1 1/2 ώρα μετά το πέρας της ενδοκύττωσης. Οι χρόνοι ημιζωής είναι περίπου μια μέρα για τον υποδοχέα εμβρυϊκού τύπου και ημέρες για τον υποδοχέα ενηλίκων (Steinbach et al., 1979). Εικόνα 13: Μοντέλα συνάθροισης των υπομονάδων του nachr. (Α) Σχηματίζονται διμερή αγ και αδ, τα οποία συνδέονται στη συνέχεια με τη β-υπομονάδα. (Β) Σχηματίζεται τριμερές υπομονάδων αβγ, στο οποίο προστίθεται η δ-υπομονάδα και τέλος η δεύτερη α- υπομονάδα. Ο δείκτης (ΤΧ) δηλώνει ότι η α-υπομονάδα προσδένει α-bgtx (Karlin and Akabas, 1995). 34