ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΛΛΑΓΜΕΝΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΤΗΣ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ ΤΟΥ α4β2 ΝΕΥΡΩΝΙΚΟΥ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ: ΕΚΦΡΑΣΗ, ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ ΚΑΙ ΔΟΜΙΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΧΡΗΣΤΟΥ ΣΤΕΡΓΙΟΥ ΠΑΤΡΑ 2013

2 Βακτηρία εστί παιδεία βίου. Μένανδρος, 4ος αιώνας π.χ

3 Επταμελής εξεταστική επιτροπή 1. Ομότιμος Καθηγητής κ. Σωκράτης Τζάρτος, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 2. Αναπληρωτής Καθηγητής κ. Γεώργιος Σπυρούλιας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 3. Επίκουρος Καθηγητής κ. Κωνσταντίνος Πουλάς Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 4. Καθηγητής κ. Ανδρέας Παπαπετρόπουλος Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 5. Αναπλ. Καθηγήτρια κ. Ευαγγελία Παπαδημητρίου Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 6. Αναπληρωτής Καθηγητής κ. Γρηγόρης Σιβολαπένκο Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 7. Αναπληρωτής Καθηγητής κ. Γεώργιος Πατρινός Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών

4 Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Βιοχημείας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ. Θα ήθελα να ευχαριστήσω πολύ θερμά τον Ομότιμο Καθηγητή κ. Σωκράτη Τζάρτο, ο οποίος εκτός από την υλική και οικονομική υποστήριξη, μου πρόσφερε επίσης την έμπνευση αλλά και τη χαρά της έρευνας. Η πολύτιμη και πολύχρονη εμπειρία του που πλαισίωνε της συζητήσεις μας πολλές φορές διευκόλυναν στη λύση προβλημάτων τα οποία προέκυπταν κατά τον πειραματισμό. Θεωρώ πλέον τον εαυτό μου τυχερό που είχα την ευκαιρεία να συνεργαστώ με έναν επιστήμονα ο οποίος εκτός από τον θησαυρό γνώσεων που κατέχει, έχει επίσης την ικανότητα να διδάσκει και να εφαρμόζει την ομαδική συνεργασία με επιτυχία. Τη Δρ. Ζησιμοπούλου Παρασκευή ευχαριστώ ιδιαίτερα και ξεχωριστά. Πρόκειται για μία επιστήμονα με οξυδερκές πνεύμα, μεγάλο και πλούσιο πεδίο γνώσεων και σε συνδιασμό με την αγωνιστηκότητα η οποία την διακρίνει, συνιστούν έναν άνθρωπο τον οποίο μόνο ως πρότυπο θα μπορούσε να συγκρατήσει οποιοσδήποτε νέος ερευνητής συνεργαστεί μαζί της. Ευχαριστώ θερμά τα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιο Σπυρούλια και Επίκουρο Καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Πουλά για το ενδιαφέρον τους και τις πολύτιμες υποδείξεις τους κατά τη διάρκεια της εκπόνησης αλλά και συγγραφής της παρούσας διατριβής. Ευχαριστώ ακόμα τους ειδικούς επιστήμονες Άννα Κόκλα και Δρ. Νικόλαο Τράκα για την εξαιρετική τεχνική τους υποστήριξη. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά όλα τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου Βιοχημείας για το ενδιαφέρον, το εξαιρετικό κλίμα συνεργασίας και το φιλικό περιβάλλον. Ένα μεγάλο ευχαριστώ χρωστώ στους γονείς μου για τη συνεχή και αταλάντευτη συμπαράσταση και εμψύχωση που μου πρόσφεραν όλα αυτά τα χρόνια. Θέλω να ευχαριστήσω επίσης τον αγαπημένο μου αδερφό Βασίλη, ο οποίος αν και ανήκει σε εντελώς διαφορετικό ερευνητικό τομέα, η γνώμη του πάντα ήταν χρήσιμη και το αστείρευτο κέφι και χιούμορ του ήταν απαραίτητοι συνοδοιπόροι στο δύσκολο αυτό ταξίδι της έρευνας.

5 Περιεχόμενα ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΣ ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ Ο μυικός νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης Οι νευρικοί νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης Λειτουργία του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης μυϊκού τύπου Πρωτοταγής δομή των υπομονάδων του υποδοχέα Δευτεροταγής και τριτοταγής δομή Δομικά στοιχεία της AChBP Ατομική δομή της θέσης πρόσδεσης ACh Πρόσδεση αγωνιστών στη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών της AChBP Προβλεπόμενα δομικά στοιχεία του υποδοχέα α4β Λειτουργία του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης μυϊκού τύπου Διαβίβαση μηνύματος στη νευρομυϊκή σύναψη Αλλοστερικές καταστάσεις Πρόσδεση υποκαταστατών στον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Επιβατιδίνη Νικοτίνη Κυτισίνη Ακετυλοχολίνη α-μπουγγαροτοξίνη Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ Ασθένειες οφειλόμενες στον μυικού τύπου υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Βαριά μυασθένεια Συγγενή μυασθενικά σύνδρομα Ασθένειες οφειλόμενες σε νευρικού τύπου υποδοχείς της ακετυλοχολίνης Νόσος του Alzheimer Νόσος του Parkinson Σχιζοφρένεια Σύνδρομο Tourette i

6 Περιεχόμενα Εθισμός στη νικοτίνη ΣΚΟΠΟΣ 38 3 ΥΛΙΚΑ Εργαστηριακός εξοπλισµός Αναλώσιµα Αντιδραστήρια Εναρκτήρια µόρια Αντισώµατα Διαλύµατα Πλασµιδιακοί φορείς και κυτταρικά στελέχη που χρησιµοποιήθηκαν στο σύστημα έκφρασης Ρ. pαstoris ΜΕΘΟΔΟΙ Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) Παρασκευή πλασµιδιακού DNA από καλλιέργεια βακτηρίων Παρασκευή πλασµιδιακού DNA σε µεγάλη κλίµακα µε τη µέθοδο της αλκαλικής λύσης Παρασκευή πλασµιδιακού DNA σε μικρή κλίµακα µε τη µέθοδο της αλκαλικής λύσης Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA Με εκχύλιση µε οργανικούς διαλύτες Με "συστηµατοποιηµένες" χρωµατογραφικές µεθόδους Κατακρήµνιση του DNA Ποσοτική ανάλυση διαλύµατος DNA Ποιοτική ανάλυση δείγµατος DNA Πέψη DNA µε περιοριστικές ενδονουκλεάσες Αποφωσφορυλίωση γραµµικού πλασµιδιακού DNA Αντίδραση σύνδεσης µε τη χρήση Τ4 DNA λιγάσης Καλλιέργειες κυττάρων Υγρές και στερεές καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων E. Coli Υγρές και στερεές καλλιέργειες κυττάρων του ζυµοµύκητα Pichia pastoris Μετασχηµατισµός βακτηρίων με τη (χηµική) µέθοδο του 64 CaCl 2... ii

7 Περιεχόμενα 4.12 Μετασχηµατισµός κυττάρων του ζυµοµύκητα Pichia pastoris για τον οµόλογο ανασυνδυασµό του πλασµιδιακού DNA στο χρωµόσωµα της Pichia pastoris Έκφραση και παραλαβή των ανασυνδυασµένων εκκρινόμενων πρωτεϊνών από κύτταρα ζυµοµύκητα που περιέχουν µετασχηµατισµένα πλασµίδια της σειράς ppiczaα Συµπύκνωση και διαπίδυση των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών που εκκρίνονται στο υπερκείµενο καλλιέργειας του ζυµοµύκητα Pichia pastoris με υπερδιήθηση του υπερκειµένου της καλλιέργειας Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου-γλυκίνης παρουσία SDS (SDS-PAGE) Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών (Western blotting) Καθαρισµός ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών Καθαρισµός πρωτεϊνών µε χρωµατογραφία συγγένειας από στήλη Νί- ΝΤΑαγαρόζης Καθαρισμός πρωτεϊνών μέσω στήλης συγγενείας με συζευγμένο μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του FLAG οκταπεπτιδίου Καθαρισµός πρωτεϊνών µε υγρή χρωµατογραφία από στήλη µοριακής διήθησης Ποσοτική ανάλυση πρωτεϊνών Φασµατοσκοπικές µέθοδοι για την ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών Χρωµατοµετρική µέθοδος Bradford για την ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών Πρόσδεση 125 Ι-, [ 3 H]επιβατιδίνης και [ 3 H]νικοτίνης στις ανασυνδιασμένες πρωτεΐνες σε διάλυμα In vitro απογλυκοζυλίωση πρωτεϊνών που εκφράστηκαν στον Ρ. pαstoris σε. γλυκοζυλιωµένη µορφή Δυναμική σκέδαση φωτός ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Προσπάθεια παραγωγής λειτουργικού συμπλόκου εξωκυτταρικών τμημάτων των ανθρώπινων υπομονάδων α4 και β2 του νικοτινικού υποδοχέα Καθαρισμός του μορίου α4mecd με χρωματογραφία συγγενείας με συζευγμένο μονοκλωνικό αντίσωμα σε σφαιρίδια αγαρόζης έναντι του FLAG οκταπεπτιδίου Καθαρισμός του μορίου β2mecd με χρωματογραφία συγγενείας ακινητοποιημένου νικελίου σε σφαιρίδια αγαρόζης iii

8 Περιεχόμενα 5.4 Καθαρισμός με χρωματογραφία μοριακής διήθησης Προκαταρκτικός έλεγχος συνέκφρασης των ανασυνδιασμένων πρωτεϊνών στο στέλεχος Χ33 της P. pastoris σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας Καθαρισμός του προϊόντος συνέκφρασης των α4-mecd και β2-mecd Καθαρισμός του μείγματος των α4-mecd και β2-mecd με χρωματογραφία συγγενείας ακινητοποιημένου νικελίου Καθαρισμός του μείγματος των α4-mecd και β2-mecd με χρωματογραφία συγγενείας με συζευγμένο μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του FLAG οκταπεπτιδίου Καθαρισμός του μείγματος των α4-mecd και β2-mecd με χρωματογραφία μοριακής διήθησης Καθαρισμός των συγκαταμερών α4-24-β2 και β2-24-α Καθαρισμός των συγκαταμερών α4-24-β2 και β2-24-α4 με χρωματογραφία συγγενείας ακινητοποιημένου νικελίου Καθαρισμός των συγκαταμερών α4-24-β2 και β2-24-α4 με χρωματογραφία μοριακής διήθησης Πειράματα δέσμευσης 125 Ι-επιβατιδίνης, 3 Η-επιβατιδίνης και 3 Η-νικοτίνης Πειράματα συναγωνισμού μη σημασμένων αγωνιστών στο συγκαταμερές β2-24-α4- mecd χρησιμοποιώντας 125 Ι-επιβατιδίνη Χρήση μεγαλύτερων πεπτιδικών διασυνδετών για την κατασκευή των συγκαταμερών β2-33-α4 mecd και α4-33-β2 mecd Καθαρισμός των προϊόντων συνέκφρασης καθενός των συγκαταμερών α4-24-β2 και β2-24-α4 με τα ECDs των α4 και β2 υπομονάδων Καθαρισμός του προϊόντος συνέκφρασης των α4-24-β2-mecd και α4- mecd με χρωματογραφία μοριακής διήθησης Καθαρισμός προϊόντος συνέκφρασης των α4-24-β2-mecd και β2-mecd με χρωματογραφία μοριακής διήθησης Καθαρισμός προϊόντος συνέκφρασης των β2-24-α4-mecd και α4-mecd με χρωματογραφία μοριακής διήθησης Καθαρισμός προϊόντος συνέκφρασης των β2-24-α4-mecd και β2-mecd με χρωματογραφία μοριακής διήθησης Καθαρισμός των προϊόντων έκφρασης των συγκαταμερών β2-24-β2-24-α4 και β2-24-α4-24-β iv

9 Περιεχόμενα Καθαρισμός των συγκαταμερών β2-24-α4-24-β2 και β2-24-β2-24-α4 με χρωματογραφία μοριακής διήθησης In vitro απογλυκοζυλίωση του συγκαταμερούς β2-24-α4 mecd ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Α ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Β v

10 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

11 Εισαγωγή 1. Ο ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΣ ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ Οι υποδοχείς της ακετυλοχολίνης είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες οι οποίες ενεργοποιούνται κατόπιν δέσμευσης σε αυτές κατάλληλου υποκαταστάτη. Σύμφωνα με τις φαρμακολογικές τους ιδιότητες έναντι των υποκαταστατών μουσκαρίνη και νικοτίνη, διακρίνονται σε: i) Μουσκαρινικούς υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (machrs) με υψηλή συγγένεια πρόσδεσης για μουσκαρίνη και μέλη της ευρύτερης οικογένειας υποδοχέων οι οποίοι συνδέονται με G-πρωτεΐνες (1,2). ii) Νικοτινικούς υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nachrs) με υψηλή απόκριση παρουσία νικοτίνης (3,4). Ο nachr αποτελεί μέλος της υπεροικογένειας των ιοντικών καναλιών τα οποία τίθονται σε λειτουργία παρουσία νευροδιαβιβαστή (ligand-gated ion channels). Η οικογένεια αυτή, εκτός από τους nachrs νευρικού και μυϊκού τύπου, περιλαμβάνει τους υποδοχείς της 5-υδροξυτρυπταμίνης τύπου 3 (5-ΗΤ 3 ), τους υποδοχείς του γ- αμινοβουτυρικού οξέος τύπου Α και C (GABA A και GABA C ), τους υποδοχείς της γλυκίνης καθώς και τους υποδοχείς των σπονδυλωτών του γλουταμικού και της ιστιδίνης (5-7). Oι υπομονάδες των παραπάνω υποδοχέων φέρουν στο αμινοτελικό τους άκρο χαρακτηριστική θηλιά 13 αμινοξικών καταλοίπων μεταξύ δύο συντηρημένων καταλοίπων κυστεΐνης συνδεόμενων με δισουλφιδικό δεσμό (8-10). Οι nachrs μπορεί να είναι (α) μυϊκού τύπου και εντοπίζονται στις μετασυναπτικές μεμβράνες των νευρομυϊκών συνάψεων των σπονδυλωτών ή (β) νευρικού τύπου, εντοπιζόμενοι κυρίως στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα των σπονδυλωτών και των εντόμων αλλά και σε πολλούς άλλους ιστούς Ο μυικός νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης Ο μυϊκός nachr βρίσκεται στη μετασυναπτική μεμβράνη της νευρομυϊκής σύναψης. Πρόκειται για μία ετεροπενταμερή διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη μάζας 290 kda, η οποία απαντάται σε στοιχειομετρία α 2 βγδ στα ηλεκτρικά όργανα των ηλεκτρικών ψαριών και στους εμβρυϊκούς μύες των θηλαστικών και σε στοιχειομετρία α 2 βεδ στους μύες των ενηλίκων (11,12). Έτσι, κατά τα διάφορα αναπτυξιακά στάδια, ο nachr εμφανίζεται στους μύες των θηλαστικών με τη μορφή δύο υποτύπων, του εμβρυϊκού και του ενηλίκου υποτύπου (13-15). Η αντικατάσταση 1

12 Εισαγωγή της γ- από την ε- υπομονάδα ξεκινά αμέσως μετά τη γέννηση και ολοκληρώνεται μέσα στις δύο πρώτες εβδομάδες μετά από αυτή (16,17). Η παρουσία της γ- ή της ε- υπομονάδας στο πενταμερές μόριο του nachr προσδίδει στους αντίστοιχους υπότυπους ιδιαίτερα ηλεκτροφυσιολογικά χαρακτηριστικά. Συγκεκριμένα, ο εμβρυϊκός nachr παρουσιάζει χαμηλή αγωγιμότητα και μεγαλύτερη διάρκεια επαγόμενου ρεύματος, ενώ ο nachr ενηλίκου είναι κανάλι υψηλής αγωγιμότητας με επαγόμενο ρεύμα μικρότερης διάρκειας (11,18). Οι μυϊκοί nachrs διαθέτουν δύο θέσεις πρόσδεσης της ACh και άλλων χολινεργικών προσδετών στα εξωκυττάρια τμήματα (ECD). Η μία θέση πρόσδεσης σχηματίζεται μεταξύ της μίας α και της γ υπομονάδας (ή ε στα ενήλικα άτομα), ενώ η άλλη σχηματίζεται μεταξύ της δεύτερης α και της δ υπομονάδας, καθιστώντας έτσι τις δύο α υπομονάδες μη ισότιμες (19). Μάλιστα, η θέση πρόσδεσης μεταξύ της α και γ (ε) υπομονάδας εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης για τον ανταγωνιστή d τουμποκουραρίνη από την θέση πρόσδεσης μεταξύ της α και δ υπομονάδας (20,21). Στο α-ecd εδράζει επίσης η κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR), έναντι της οποίας κατευθύνονται τα αντι-nachr αντισώματα στην περίπτωση της βαριάς μυασθένειας. Κάθε υπομονάδα του nachr κωδικοποιείται από διαφορετικό γονίδιο. Ο παρατηρούμενος υψηλός βαθμός ομοιότητας μεταξύ των υπομονάδων υποδηλώνει ότι τα αντίστοιχα γονίδια προέκυψαν εξελικτικά από ένα κοινό προγονικό γονίδιο, πιθανόν μέσο διαδοχικών διπλασιασμών γονιδίων (22-24). Για τον ανθρώπινο nachr, τα γονίδια των α-, γ- και δ- υπομονάδων βρίσκονται στο χρωμόσωμα 2, τα δύο τελευταία σε στενή σύνδεση (25-27), ενώ τα γονίδια των β- και ε- υπομονάδων στο χρωμόσωμα 17 (25,28). Το γονίδιο της α-υπομονάδας περιλαμβάνει εννέα εξόνια (P1-P9), έχει ωστόσο εντοπιστεί σε ανθρώπινο μυϊκό ιστό και η ισομορφή Ρ3Α της α- υπομονάδας, η οποία κωδικοποιείται από ένα επιπλέον εξόνιο, το Ρ3Α, μεταξύ των εξωνίων Ρ3 και Ρ4. Το εξόνιο αυτό κωδικοποιεί 25 επιπλέον αμινοξέα παρεμβαλλόμενα μεταξύ των καταλοίπων α58 και α59 τα οποία βρίσκονται πολύ κοντά στην αλληλουχία α67-76 που συμμετέχει στο σχηματισμό της κύριας ανοσογόνου περιοχής (MIR), στην εξωκυτταρική περιοχή του μορίου. Η ισομορφή αυτή εκφράζεται σταθερά στους σκελετικούς μύες, στην καρδιά, στον εγκέφαλο, στους νεφρούς, στους πνεύμονες και στο θύμο αδένα ενώ η άλλη ισομορφή, που δεν περιέχει το εξόνιο P3A, εκφράζεται αποκλειστικά στους σκελετικούς μύες (29). Το γονίδιο της β-υπομονάδας αποτελείται από 11 εξόνια. Η β1 υπομονάδα του μυϊκού τύπου υποδοχέα των θηλαστικών εμφανίζει επίσης δύο ισομορφές, οι οποίες 2

13 Εισαγωγή προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα του mrna. Η διαφορά μεταξύ των δύο ισομορφών εντοπίζεται σε 9 βάσεις στο 5 άκρο της κωδικής περιοχής του mrna (30). Ο λειτουργικός ρόλος των διαφορετικών αυτών ισομορφών των υπομονάδων του υποδοχέα παραμένει ακόμη άγνωστος. Τέλος, το γονίδιο των γ-, δ- και ε-υπομονάδων αποτελείται από 12 εξόνια (13,25,27,28,31) Οι νευρικοί νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης Οι νευρικοί nachrs εκφράζονται ευρέως στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα σπονδυλωτών και εντόμων, στα περιφερικά γάγγλια, καθώς και σε μη διεγέρσιμα κύτταρα όπως είναι τα κύτταρα του επιθηλίου και του ανοσοποιητικού συστήματος. Μέχρι σήμερα έχουν κλωνοποιηθεί εννέα διαφορετικές νευρικές υπομονάδες τύπου α (α2-α10) και τρείς υπομονάδες τύπου β (β2-β4) (32,33). Εκτός από τις α8 και α9 υπομονάδες, οι οποίες έχουν βρεθεί μόνο σε όρνιθα και αρουραίο, αντίστοιχα (34), όλες οι άλλες υπομονάδες προέρχονται από διάφορα είδη, μεταξύ αυτών και του ανθρώπου. Η ταξινόμηση των υπομονάδων νευρικού τύπου σε α και β έγινε με κριτήριο την αμινοξική ομολογία που παρουσιάζει η κάθε υπομονάδα με τις αντίστοιχες υπομονάδες του υποδοχέα μυϊκού τύπου, ενώ η αρίθμηση των υπομονάδων αντικατοπτρίζει τη χρονική σειρά με την οποία αυτές απομονώθηκαν και αναλύθηκε η αμινοξική τους σύσταση. Oι νευρικοί nachrs απαντούν είτε ως ετεροπενταμερή, συγκροτούμενα συνήθως από δύο ή περισσότερες νευρικές υπομονάδες τύπουα (α2-α6) και από δύο ή περισσότερες νευρικές υπομονάδες τύπου β (β2-β4), είτε ως ομοπενταμερή, τα οποία συγκροτούνται από α-υπομονάδες (α7-α9) (Εικόνα 1). Oι νευρικές υπομονάδες τύπου α7-α9 σχηματίζουν επίσης ετεροπενταμερή σύστασης α7/α8 και α9/α10 (35). Η ύπαρξη πάντως πολλών και διαφορετικών τύπων του νευρικού υποδοχέα είναι κυρίως αποτέλεσμα της ποικιλίας συνδυασμών μεταξύ των α και β υπομονάδων (33). Στους ετεροπενταμερείς νευρικούς nachrs σχηματίζονται 3

14 Εισαγωγή Εικόνα 1. Σχηματική αναπαράσταση νευρικών nachrs. Αναπαράσταση της διάταξης των υπομονάδων ετεροπενταμερών και ομοπενταμερών νευρικών nachr περιμετρικά του κεντρικού πόρου του ιοντικού καναλιού (36). Οι θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών αναπαρίστανται με λευκά τρίγωνα. δύο θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών μεταξύ των α και β υπομονάδων, ενώ στους ομοπενταμερείς σχηματίζονται πέντε θέσεις πρόσδεσης μεταξύ των α υπομονάδων τους. Οι φαρμακολογικές ιδιότητες των ετεροπενταμερών και ομοπενταμερών νευρικών nachrs διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους. Έτσι, οι ετεροπενταμερείς νευρικοί nachrs, εμφανίζουν υψηλή συγγένεια πρόσδεσης αγωνιστών (της τάξεως των nm), ενώ δεν προσδένουν τον ανταγωνιστή α- μπουγκαροτοξίνη (α-bgtx), σε αντίθεση με τους ομοπενταμερείς νευρικούς nachrs (α7-α9), οι οποίοι εμφανίζουν χαμηλότερη μεν συγγένεια πρόσδεσης αγωνιστών (της τάξεως των μm), αλλά υψηλή συγγένεια πρόσδεσης α-bgtx (της τάξεως των nm) (36). Μάλιστα, για αυτό το λόγο, οι ομοπενταμερείς νευρικοί nachrs αναφέρονται και ως α-bgtx nachrs. Η μεγάλη ποικιλία των υπότυπων νευρικών nachrs, με διαφορετικές φυσιολογικές και φαρμακολογικές ιδιότητες, ευθύνεται για τη συμμετοχή τους σε 4

15 Εισαγωγή πολλές και διαφορετικές λειτουργίες του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος, όπως είναι ο έλεγχος της έκκρισης νευροδιαβιβαστικών ουσιών, ο έλεγχος των εκούσιων κινήσεων, η ρύθμιση της θερμοκρασίας του σώματος, καθώς και η ρύθμιση πολύπλοκων ανώτερων πνευματικών διεργασιών, όπως η μνήμη, η μάθηση και η συμπεριφορά (37). Το πρότυπο έκφρασης των διάφορων νευρικών υποδοχέων στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα έχει εντοπισθεί με τη χρήση μίας σειράς μεθόδων, όπως: 1) Ανοσοϊστοχημεία με χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι νευρικών nachr υπομονάδων: Η μέθοδος αυτή εμφανίζει μεγάλη ευαισθησία. Εν τούτοις, ο περιορισμός της έγκειται στην μη διαθεσιμότητα μέχρι σήμερα μονοκλωνικών αντισωμάτων ειδικών για κάθε νευρική υπομονάδα. 2) Πρόσδεση ραδιενεργά σημασμένων υποκαταστατών: Ραδιοσημασμένοι υποκαταστάτες έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση υποτύπων του νευρικού υποδοχέα σε ομογενοποιήματα ή ιστολογικές τομές από διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου. Ο περιορισμός της μεθόδου έγκειται στο ότι δεν υπάρχουν ειδικοί υποκαταστάτες για κάθε υπότυπο του νευρικού υποδοχέα. 3) In situ υβριδοποίηση με RNA ή DNA ιχνηθέτες: Η μέθοδος αυτή ανιχνεύει μόνο την ύπαρξη των mrnas των nachr υπομονάδων σε ιστούς και ομογενοποιήματα, αλλά δεν δίνει καμία πληροφορία σχετικά με την έκφρασή τους. Εν τούτοις, εμφανίζει τη μεγαλύτερη ειδικότητα και έχει χρησιμοποιηθεί ευρύτατα, καθώς είναι διαθέσιμες οι cdna αλληλουχίες για όλες τις μέχρι σήμερα γνωστές νευρικές υπομονάδες. Με τη χρήση αυτών των μεθόδων έχει βρεθεί ότι οι κύριοι νευρικοί ετεροπενταμερείς nachr στον εγκέφαλο των θηλαστικών είναι οι (α4) 2 (β2) 3, οι οποίοι χαρακτηρίζονται από υψηλή συγγένεια πρόσδεσης για την νικοτίνη (38,39), ενώ υπάρχουν και δευτερεύοντες υπότυποι με τη συμμετοχή και της β5 υπομονάδας (4) (Εικόνα 1). Επίσης, οι κύριοι νευρικοί ετεροπενταμερείς nachr στα γάγγλια των θηλαστικών είναι οι (α3) 2(β4) 3, ενώ έχουν εντοπισθεί και υπότυποι με την επιπλέον συμμετοχή β2, β4 και α5 υπομονάδων (40,41). Όσον αφορά στους ομοπενταμερείς νευρικούς nachr υπότυπους, οι οποίοι σχηματίζονται από α7, α8 και α9 υπομονάδες, και οι οποίοι χαρακτηρίζονται από την ικανότητα πρόσδεσης α-bgtx, όπως δηλαδή και οι μυϊκές α1 υπομονάδες, έχει βρεθεί ότι ο κύριος υπότυπος τόσο στον εγκέφαλο, όσο και στα γάγγλια είναι ο α7. Οι α7 nachrs χαρακτηρίζονται από 5

16 Εισαγωγή ευρεία κατανομή, σε προ-, μετα- και περισυναπτικές θέσεις στους νευρώνες (36,42) ενώ είναι παρόντες σε υψηλή συγκέντρωση στον ιππόκαμπο και κυρίως στους GABA νευρώνες του (43,44). Μάλιστα, α7 nachrs έχουν εντοπισθεί και σε μη νευρικά κύτταρα, όπως σε αναπτυσσόμενα μυϊκά (45), καθώς και σε μακροφάγα κύτταρα (46). Οι α8 nachrs έχουν εντοπιστεί στο νευρικό σύστημα όρνιθας ως ομοπενταμερή ή σε συνδυασμούς με α7 υπομονάδες, ενώ οι α9 nachrs εντοπίζονται στον κοχλία και στα αισθητικά γάγγλια του νευρικού συστήματος του αρουραίου (34). Χαρακτηριστικό γνώρισμα των α7-α9 ομοπενταμερών nachrs είναι η υψηλή διαπερατότητά τους σε ιόντα Ca 2+ (34,47). Οι νευρικοί nachrs εμπλέκονται σε μία πληθώρα παθολογικών καταστάσεων και δυσλειτουργιών του νευρικού συστήματος, όπως είναι η νόσος του Alzheimer, η νόσος του Parkinson, η κατάθλιψη, η σχιζοφρένεια και ορισμένοι τύποι επιληψίας, ενώ έχουν συσχετιστεί και με τον εθισμό στη νικοτίνη (48) Δομή του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Πρωτοταγής δομή των υπομονάδων του υποδοχέα Η σύγκριση των αμινοξικών αλληλουχιών των τεσσάρων υπομονάδων (α, β, γ και δ) του υποδοχέα του Torpedo έδειξε ότι υπάρχει μεγάλος βαθμός ομολογίας μεταξύ τους, ενώ η ομοιότητα των αμινοξικών καταλοίπων μεταξύ διαφορετικών υπομονάδων κυμαίνεται σε ποσοστό 40-50% (24). Οι αλληλουχίες των υπομονάδων του μυϊκού τύπου υποδοχέα από διάφορα είδη συμπεριλαμβανομένου και του ανθρώπου βρέθηκαν επίσης να είναι σε μεγάλο βαθμό ομόλογες μεταξύ τους (22,49-54). Ακόμη μεγαλύτεροι βαθμοί ομολογίας παρατηρούνται όταν συγκρίνονται ανάμεσα σε διαφορετικά είδη οι αμινοξικές αλληλουχίες για την ίδια υπομονάδα. Έτσι, η α1 υπομονάδα, η οποία είναι η πιο συντηρημένη υπομονάδα ανάμεσα στα διάφορα είδη, παρουσιάζει 80% ομολογία μεταξύ του ανθρώπινου μυϊκού τύπου υποδοχέα και του υποδοχέα από το ηλεκτρικό όργανο του Torpedo (55). Οι αμινοξικές αλληλουχίες των νευρικών υπομονάδων του υποδοχέα εμφανίζουν επίσης μεγάλη ομολογία τόσο μεταξύ τους όσο και με τις αντίστοιχες υπομονάδες του μυϊκού τύπου υποδοχέα μέσα στο ίδιο είδος (56,57). Για παράδειγμα, οι αμινοξικές αλληλουχίες διαφορετικών α και β υπομονάδων στον αρουραίο παρουσιάζουν 40-70% ομολογία (58). Τα παραπάνω αποτελούν ισχυρή απόδειξη για την κοινή προέλευση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις υπομονάδες του υποδοχέα. 6

17 Εισαγωγή Όλες οι υπομονάδες του υποδοχέα έχουν το ίδιο πρότυπο υδροφιλικότηταςυδροφοβικότητας: αποτελούνται από δύο μεγάλες υδρόφιλες περιοχές και από τέσσερις μικρές υδρόφοβες περιοχές. Η μεγαλύτερη και σχετικά πιο συντηρημένη υδρόφιλη περιοχή βρίσκεται στο αμινοτελικό άκρο της υπομονάδας. Η δεύτερη υδρόφιλη περιοχή ποικίλει σε μέγεθος και αμινοξική σύσταση μεταξύ των υπομονάδων και βρίσκεται ανάμεσα στην τρίτη και τέταρτη υδρόφοβη περιοχή. Χαρακτηριστικό όλων των υπομονάδων του υποδοχέα (μυϊκού και νευρικού τύπου) είναι η ύπαρξη δύο κυστεϊνών, οι οποίες αντιστοιχούν στις κυστεΐνες των θέσεων 128 και 142 της α υπομονάδας του Torpedo. Οι κυστεΐνες αυτές σχηματίζουν δισουλφιδικό δεσμό δημιουργώντας μια θηλιά 15 αμινοξικών καταλοίπων. Μεταξύ των δύο κυστεϊνών υπάρχει ένα συντηρημένο κατάλοιπο ασπαραγίνης (αντιστοιχεί στη θέση 141 της α υπομονάδας του Torpedo), το οποίο αποτελεί θέση γλυκοζυλίωσης. Η γλυκοζυλίωση αυτής της θέσης φαίνεται πως είναι απαραίτητη για τη σωστή ωρίμανση των υπομονάδων (59). Οι α υπομονάδες του υποδοχέα διαθέτουν δύο επιπλέον κυστεΐνες, οι οποίες είναι γειτονικές και αντιστοιχούν στις κυστεΐνες των θέσεων 192 και 193 της α υπομονάδας του Torpedo. Οι κυστεΐνες αυτές σχηματίζουν επίσης δισουλφιδικό δεσμό. Στην αμινοτελική περιοχή όλων των nachr υπομονάδων υπάρχουν επίσης ποικίλες θέσεις γλυκοζυλίωσης. Μάλιστα σε όλες τις μυϊκού τύπου, μυϊκές και νευρικές nachr υπομονάδες, εκτός από τις α7, α8 και α9 υπομονάδες υπάρχει μία συντηρημένη θέση γλυκοζυλίωσης μέσα στην χαρακτηριστική Cys θηλιά, η οποία αντιστοιχεί στην Asn141 της α1 υπομονάδας του μυϊκού nachr. Εκτός από τη θέση αυτή έχουν βρεθεί επιπλέον i) μία θέση γλυκοζυλίωσης στις υπομονάδες α3, α6, β2, β3, γ και δ, ii) δύο θέσεις γλυκοζυλίωσης στις υπομονάδες α4, α5, β και ε, και iii) τρείς θέσεις γλυκοζυλίωσης στην α2 υπομονάδα (60). Στην περίπτωση της α7 υπομονάδας υπάρχουν τρεις θέσεις γλυκοζυλίωσης, ενώ στις α8 και α9 υπομονάδες έχουν βρεθεί δύο θέσεις (60) Δευτεροταγής και τριτοταγής δομή Για τη συλλογή δεδομένων δευτεροταγούς δομής, χρησιμοποιήθηκαν διάφορες τεχνικές, όπως κυκλικός διχρωισμός (CD), φασματοσκοπία Raman και υπέρυθρη φασματοσκοπία μετασχηματισμών Fourier (FTIR) (61,62). Πλήθος πληροφοριών 7

18 Εισαγωγή έχουν προέλθει επίσης από εργασίες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας ολοένα και βελτιούμενης διακριτικής ικανότητας (20,63-66). Η εφαρμογή της τεχνικής FTIR σε μεμβράνες πλούσιες σε ανέπαφο nachr του Torpedo έδειξε ότι ο nachr αποτελείται κατά 36-43% από β-πτυχωτή επιφανεία, 32-33% από α-έλικα, 14-24% από β-στροφή, καθώς και από τυχαίες αναδιπλώσεις (62). Όσον αφορά στις διαμεμβρανικές περιοχές Μ1-Μ4, αυτές διασχίζουν τη λιπιδική στιβάδα με τη μορφή α-έλικας (23,67). Η Μ2 περιοχή κάθε υπομονάδας συμμετέχει στο σχηματισμό του διαύλου του καναλιού (55,68-70) ενώ σύμφωνα με τα δεδομένα ηλεκτρονικής μικροσκοπίας στα Å, 4μεταξύ της Μ2 και των Μ1 και Μ3 παρεμβάλλεται υδατικό περιβάλλον (63). Οι τέσσερις διαμεμβρανικές περιοχές διατάσσονται ελικοειδώς σύμφωνα με τη φορά των δεικτών του ρολογιού (Εικόνα 2), με τη Μ2 περιοχή να μην έρχεται σε επαφή με τη λιπιδική στοιβάδα και τη Μ4 να είναι πλήρως εκτεθειμένη προς αυτή (63,71,72). Εικόνα 2. Αναπαράσταση εγκάρσιας τομής του AChR στο μέσο της μεμβράνης, όπως φαίνεται από τη συναπτική σχισμή. Φαίνεται ότι η Μ2 σχηματίζει τον πόρο του καναλιού, ενώ η Μ4 είναι εκτεθειμένη προς τη λιπιδική μεμβράνη (63). Τεράστια ώθηση στη μελέτη της δομής του nachr έδωσε η κρυστάλλωση της AChΒΡ (acetylcholine-binding protein) καθώς και των συμπλόκων της με διάφορους χολινεργικούς προσδέτες (αγωνιστές και ανταγωνιστές) (73,74) η οποία απομονώθηκε από το σαλιγκάρι Limnaea Stagnalis και είναι ένα ομοπενταμερές διαλυτό μόριο στερούμενο διαμεμβρανικών περιοχών (75). Aυτές οι δομές 8

19 Εισαγωγή προσέγγισαν για πρώτη φορά τη δομή των θέσεων πρόσδεσης υποκαταστατών των nachrs σε ατομικό επίπεδο. Επίσης σημαντική ήταν η λύση της δομής του Torpedo nachr με χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (66) σε σχετικά όμως χαμηλή ανάλυση (4 Å). Με αυτή τη μελέτη αποκαλύφθηκε η αρχιτεκτονική της διάταξης των nachr υπομονάδων περιμετρικά του ιοντικού καναλιού με μεγαλύτερη ακρίβεια σε σχέση με παλαιότερες τέτοιου είδους μελέτες, καθώς και η δευτεροταγής δομή των υπομονάδων του μυϊκού τύπου nachr. Σημαντικές πληροφορίες συλλέχθηκαν επίσης κατά την λύση της δομής με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ του συμπλόκου του ECD της α1 υπομονάδας του μυικού nachr με α-bgtx (76), με την οποία αποκαλύφθηκε σε ατομικό επίπεδο η διαμόρφωση σημαντικών περιοχών του α1 ECD, όπως ο MIR επίτοπος, καθώς και οι αλληλεπιδράσεις της με τον ανταγωνιστή α-bgtx Δομικά στοιχεία της AChBP Η AChBP απομονώθηκε για πρώτη φορά από γλοία κύτταρα του γαστερόποδου μαλακίου Lymnaea stagnalis και είναι μία πενταμερής υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη (75). Η πρωτεΐνη αυτή απελευθερώνεται από τα γλοία κύτταρα που περιβάλλουν τη συναπτική σχισμή μεταξύ προ- και μετασυναπτικών κυττάρων, έπειτα από την πρόσδεση της ΑCh σε nachrs των γλοίων αυτών κυττάρων. Με αυτό τον τρόπο, η εκκρινόμενη από τα προσυναπτικά κύτταρα, ACh, απομακρύνεται από τη συναπτική σχισμή μετά την πρόσδεσή της στα μόρια AChBP, έτσι ώστε να μειώνεται ή να τερματίζεται απόκριση στην ACh των μετασυναπτικών κυττάρων. To 2001 έγινε γνωστή η τρισδιάστατη δομή της AChBP, η οποία λύθηκε σε ευκρίνεια 2,7 Å με κρυσταλλογραφία ακτίνων-χ (77). Το ώριμο μόριο της πρωτεΐνης αυτής έχει μήκος 210 αμινοξικών καταλοίπων και παρουσιάζει σχετικά υψηλή ομολογία με τις αμινο-τελικές ECDς των υπομονάδων των πενταμερών υποδοχέων-μελών της LGIC υπερ-οικογένειας. Μάλιστα, εμφανίζει μεγαλύτερη ομολογία με τις ECDς των α υπομονάδων του nachr, παρουσιάζοντας το μεγαλύτερο ποσοστό αμινοξικής ταύτισης με την ECD της νευρική α7 υπομονάδας του nachr (25% αμινοξική ταύτιση και 70% ομοιότητα). Το κάθε πρωτομερές της AChBP περιέχει όλα σχεδόν τα συντηρημένα αμινοξικά κατάλοιπα των 9

20 Εισαγωγή εξωκυτταρικών περιοχών των υπομονάδων της LGIC υπερ-οικογένειας, συμπεριλαμβανομένων και αυτών που σχετίζονται με την πρόσδεση χολινεργικών υποκαταστατών. Μάλιστα, η AChBP διαθέτει την ικανότητα πρόσδεσης, εκτός της ACh και άλλων χαρακτηριστικών αγωνιστών και ανταγωνιστών του nachr, όπως η Εικόνα 3. Δομή της AChBP. (A) Kάτοψη του ομοπενταμερούς μορίου AChBP. Κάθε πρωτομερές είναι χρωματισμένο διαφορετικά και συμβολίζεται με διαφορετικό γράμμα (Α-Ε). Στις διεπιφάνειες μεταξύ γειτονικών πρωτομερών δημιουργούνται οι θέσεις πρόσδεσης ACh, οι οποίες στη συγκεκριμένη περίπτωση καταλαμβάνονται από ένα μόριο HEPES, το οποίο εμπεριέχετο στο διάλυμα κρυστάλλωσης. (Β) Πλάγια άποψη του πρωτομερούς μορίου AChBP, όπως φαίνεται από την πλευρά εκτός του κεντρικού πόρου. Διακρίνεται το αμινο-τελικό και καρβοξυ-τελικό άκρο (N, C terminus), η χαρακτηριστική Cys θηλιά (Cys loop), το συντηρημένο, στις nachr α-ecdς, ζεύγος κυστεϊνών (Double Cys) και η περιοχή που αντιστοιχεί στο MIR επίτοπο του nachr. (Γ) Πλάγια άποψη της διεπιφάνειας και της θέσης πρόσδεσης ACh που σχηματίζεται από τα γειτονικά πρωτομερή Α και Β. (Δ) Τοπολογικό διάγραμμα του πρωτομερούς μορίου AChBP. Ν: αμινο-τελικό άκρο, α1: α-έλικα, β1 β10: πτυχωτά φύλλα, L1-10: θηλιές ακανόνιστης δομής, S-S: δισουλφιδικοί δεσμοί, C: καρβοξυ- τελικό άκρο (77). νικοτίνη, καρβαμυλοχολίνη, d-τουμποκουραρίνη και η α-bgtx (75). Επίσης, διαθέτει τη χαρακτηριστική Cys θηλιά της LGIC υπερ-οικογένειας, με τη διαφορά όμως ότι τα αμινοξικά κατάλοιπα της Cys θηλιάς της υπολλείπονται κατά ένα από τη Cys θηλιά του nachr, ενώ επίσης είναι πιο υδρόφιλη από αυτή των nachrs. Για τους λόγους αυτούς, η AChBP αποτελεί το ομόλογο των ECD τμημάτων κυρίως των α 10

21 Εισαγωγή υπομονάδων του nachr, και συνεπώς η λύση της δομής της σε υψηλή ευκρίνεια προσέγγισε σε ατομικό επίπεδο τη διαμόρφωση των τελευταίων στο χώρο. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 3Α, η AChBP συγκροτείται από πέντε μονομερή (Α-Ε), τα οποία διατάσσονται περιμετρικά γύρω από ένα κεντρικό πόρο, διαμέτρου ~18 Å. Η διάμετρος του μορίου της AChBP είναι 80 Å, ενώ το ύψος του είναι 62 Å (Εικόνες 3Β, Γ). Οι διαστάσεις αυτές του πενταμερούς μορίου της AchBP βρέθηκαν να είναι σε συμφωνία με τις διαστάσεις του αμινο-τελικού ECD τμήματος του Torpedo nachr, οι οποίες είχαν μέχρι εκείνη τη χρονική στιγμή αποκαλυφθεί με μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σε ανάλυση 4,6 Å (63), ενισχύοντας ακόμη περισσότερο την άποψη ότι η AChBP αποτελεί το δομικό ομόλογο των ECD του nachr. Στο πενταμερές μόριο, οι μόνες επαφές των υπομονάδων μεταξύ τους, λαμβάνουν χώρα στις διεπιφάνειες που σχηματίζονται μεταξύ δύο γειτονικών πρωτομερών. Έτσι, κάθε πρωτομερές μόριο AChBP διαθέτει δύο τέτοιες διεπιφάνειες μεταξύ των δύο άλλων παράπλευρων πρωτομερών, οι οποίες ονομάζονται συμβατικά θετικές (plus side) και αρνητικές πλευρές (minus side). Ως θετική, ονομάζεται εκείνη η πλευρά του κάθε μονομερούς που βρίσκεται σε επαφή με το γειτονικό του πρωτομερές κατά την αντίστροφη φορά από εκείνη των δεικτών του ρολογιού, ενώ ως αρνητική συμβολίζεται η αντιδιαμετρική του πλευρά που βρίσκεται σε επαφή με το δεύτερο γειτονικό του πρωτομερές. Έτσι, π.χ. στην διεπιφάνεια μεταξύ των Α και Β πρωτομερών, συμμετέχουν η θετική πλευρά της Α υπομονάδας με την αρνητική πλευρά της Β υπομονάδας (Εικόνες 3Α, Γ), ενώ η αρνητική πλευρά της Α υπομονάδας συνδέεται με την θετική πλευρά της Ε υπομονάδας (Εικόνα 3Α), κοκ Ατομική δομή της θέσης πρόσδεσης ACh Η λύση της δομής της AChBP αποκάλυψε για πρώτη φορά τη διαμόρφωση σε ατομικό επίπεδο της θέσης πρόσδεσης της ACh και διάφορων άλλων χολινεργικών προσδετών, στα ομόλογα ECD τμήματα των α υπομονάδων του nachr. Όπως προαναφέρθηκε, στο πενταμερές της AChBP σχηματίζονται πέντε διεπιφάνειες μεταξύ των θετικών και αρνητικών πλευρών των ισάριθμων πρωτομερών της (Εικόνα 3Α), στις οποίες σχηματίζονται και οι πέντε διαφορετικές θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών. Ο προσδιορισμός αυτών των θέσεων πρόσδεσης προέκυψε από την παρατήρηση της ύπαρξης μορίων HEPES (συστατικό του ρυθμιστικού διαλύματος στο οποίο ήταν διαλυμένη η AChBP), σε συγκεκριμένες θέσεις μέσα στις 11

22 Εισαγωγή διεπιφάνειες του πενταμερούς AChBP (Εικόνες 3Α, Γ). To μόριο HEPES περιέχει μία τεταρτοταγή θετικά φορτισμένη αμινομάδα, προσομοιάζοντας διάφορους χολινεργικούς προσδέτες του nachr. Για το λόγο αυτό, το μόριο HEPES λειτούργησε ως ένας «ψευδο»-προσδέτης της AChBP. Βρέθηκε λοιπόν ότι η θέση πρόσδεσης του μορίου HEPES, και άρα και των διάφορων χολινεργικών προσδετών, σχηματίζεται από τη συνεισφορά ενός πλήθους αρωματικών και υδρόφοβων αμινοξικών καταλοίπων που βρίσκονται σε θηλιές της θετικής πλευράς του ενός πρωτομερούς και σε β-πτυχωτά φύλλα της αρνητικής πλευράς του γειτονικού πρωτομερούς. Εικόνα 4. Δομή της θέσης πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών της AChBP. (A) Απεικόνιση των κύριων αλυσίδων α-ατόμων C των δύο πρωτομερών AChBP καθώς και των πλευρικών ομάδων τους που συγκροτούν τη θέση πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών. Τα γράμματα Α και Β που προηγούνται των απεικονιζόμενων αμινοξικών καταλοίπων αναφέρονται στα πρωτομερή μόρια AChBP στα οποία ανήκουν αυτά τα κατάλοιπα. (Β) Απεικόνιση του χάρτη ηλεκτρονιακής πυκνότητας της θέσης πρόσδεσης υποκαταστατών. Διακρίνεται (με μωβ χρώμα) το προσδεδεμένο μόριο HEPES. (Γ), (Δ) Απεικόνιση των θηλιών A, B, C της κύριας πλευράς της θέσης πρόσδεσης και των θηλιών D, E, F της συμπληρωματικής πλευράς της θέσης πρόσδεσης, αντίστοιχα (77). Μάλιστα, η θέση πρόσδεσης διακρίνεται στην κυρίως (θετική) και στην συμπληρωματική (αρνητική) πλευρά. Η κυρίως πλευρά σχηματίζεται από τη 12

23 Εισαγωγή συνεισφορά αμινοξικών καταλοίπων της θετικής πλευράς του ενός πρωτομερούς (πλευρά στην οποία βρίσκεται η χαρακτηριστική Cys θηλιά, βλ. Εικόνα 3Β), τα οποία εμφανίζουν υψηλό βαθμό συντήρησης μεταξύ των μελών της LGIC υπεροικογένειας και τα οποία συγκροτούν τις θηλιές Α (Tyr149), B (Trp143, Trp145) και C (Tyr185, Cys187, Cys188, Tyr192) (Εικόνα 4). Η συμπληρωματική πλευρά της θέσης πρόσδεσης σχηματίζεται από τη συνεισφορά λιγότερο συντηρημένων αμινοξικών καταλοίπων της αρνητικής πλευράς του γειτονικού πρωτομερούς, τα οποία συγκροτούν τις θηλιές D (Trp53, Gln55), E (Arg104, Val106, Leu112, Met114) και F (Tyr164) (Εικόνα 4). Αξίζει να σημειωθεί ότι όλα αυτά τα αμινοξικά κατάλοιπα που αποκαλύφθηκαν να συμμετέχουν στο σχηματισμό των θέσεων πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών στην AChBP, είχαν προηγουμένως βρεθεί με μελέτες μεταλλαξιγεννέσεων και σήμανσης με φθορισμό να συμμετέχουν στο σχηματισμό των αντίστοιχων θέσεων πρόσδεσης του nachr (78-81). Τέλος, το μόριο του HEPES βρέθηκε να καταλαμβάνει ίσες επιφάνειες μεταξύ της κύριας και συμπληρωματικής πλευράς της θέσης πρόσδεσης, ενώ η τεταρτοταγής αμινομάδα του βρέθηκε να αλληλεπιδρά με την Trp143 μέσω δεσμών κατιόντος-π, όπως θα αναμένονταν για nachr αγωνιστές (82). Για αυτό το λόγο η δομή αυτή της AChBP θεωρήθηκε πως αποτελούσε και μία υποτυπώδη δομή της θέσης πρόσδεσης του nachr, παρουσία αγωνιστή Πρόσδεση αγωνιστών στη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών της AChBP Την πρώτη λύση της δομής της AChBP σε ατομικό επίπεδο, ακολούθησαν και άλλες δομές υψηλής ευκρίνειας, στις οποίες η απομονωμένη AChBP από διάφορα είδη μαλακίων συγκρυσταλλώθηκε με γνωστούς nachr αγωνιστές, αποκαλύπτοντας έτσι τις ειδικές αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα μεταξύ των αγωνιστών και της θέσης πρόσδεσής τους. Πιο συγκεκριμένα, η AChBP του είδους Lymnaea stagnalis (L-AChBP) συγκρυσταλλώθηκε με τους αγωνιστές του nachr, νικοτίνη και καρβαμυλοχολίνη (73), ενώ αργότερα η AChBP του είδους Aplysia californica (A- AChBP) συγκρυσταλλώθηκε με τους αγωνιστές του nachr, λομπελίνη και επιβατιδίνη (74). Σε αυτό το σημείο αξίζει να τονισθεί ότι η αρχιτεκτονική της θέσης πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών με την συγκρότηση του αρωματικού πυρήνα να αποτελείται από τα κατάλοιπα Tyr93, Trp147, Tyr188 και Tyr195 της 13

24 Εισαγωγή κυρίως πλευράς και από την Tyr195 της συμπληρωματικής πλευράς (αρίθμηση κατά AAChBP), είναι ιδιαίτερα συντηρημένη μεταξύ των AChBPs προερχόμενων από διαφορετικά είδη (Eικόνα 5). Σε όλες αυτές τις δομές, ο αγωνιστής προσδένεται με την ανάπτυξη δεσμών υδρογόνου, αλληλεπιδράσεων κατιόντος-π, καθώς και δεσμών Vander- Waals. Μάλιστα, η εξαιρετικά συντηρημένη Trp143 (αρίθμηση κατά L- AChBP) της κύριας πλευράς της θέσης πρόσδεσης βρίσκεται στο κέντρο των συμπλόκων αυτών και αναπτύσσει ισχυρές αρωματικές αλληλεπιδράσεις κατιόντος-π με τους αγωνιστές. Εικόνα 5. Πρόσδεση χολινεργικών αγωνιστών στην AChBP. Σύμπλοκα L-AchBP με (Α) νικοτίνη (73), (Β) καρβαμυλοχολίνη (73). Σύμπλοκα Α-AChBP με (Γ) λομπελίνη (74) και (Δ) επιβατιδίνη (74) Το επίσης εξαιρετικά συντηρημένο κατάλοιπο Asp85 (αρίθμηση κατά L-AChBP) παίζει ένα σημαντικό δομικό ρόλο. Αυτό βρίσκεται ακριβώς πίσω από την κεντρική Trp143, πολώνοντας την κύρια καρβονυλική της ομάδα, κάτι που σταθεροποιεί περαιτέρω το θετικό φορτίο του καθενός από αυτούς αγωνιστές. Επίσης, το συντηρημένο σε όλες τις AChBPs, καθώς και στις α υπομονάδες του nachr, ζεύγος κυστεϊνών C187-C188 (αρίθμηση κατά L-AChBP) αλληλεπιδρά με όλους τους 14

25 Εισαγωγή αγωνιστές, αλλά η C187 κυρίως με την καρβαμυλοχολίνη (Eικόνα 5Β), ενώ η C188 με την νικοτίνη (Eικόνα 5Α). Η Tyr185 της L-AChBP (Tyr188 στην A-AChBP) σχηματίζει αρωματικές αλληλεπιδράσεις με την καρβαμυλοχολίνη και την επιβατιδίνη, αλλά όχι με τη νικοτίνη, ενώ σχηματίζει δεσμούς Van der Waals με τη μεθυλομάδα της λομπελίνης. Οι αγωνιστές λομπελίνη και επιβατιδίνη αναπτύσσουν και επιπλέον δεσμούς με την κεντρική Trp147 της A-AChBP (143 στη L-AChBP) (Eικόνες 5Γ, Δ) Προβλεπόμενα δομικά στοιχεία του υποδοχέα α4β2 Προκειμένου να αποκαλυφθούν οι πολύτιμες δομικές πληροφορίες του μορίου του α4β2 υποδοχέα, χρησιμοποιήθηκαν οι ήδη γνωστές δομές από τον Torpedo υποδοχέα, την AChBP, το ECD της α1 υπομονάδας. Τα βασικά δομικά χαρακτηριστικά της κάθε υπομονάδας δεν εμφανίζουν κάποια καινούργια πληροφορία. Τα ομόλογα των συντηρημένων αρωματικών αμινοξέων Trp 143, Tyr 89, 185 και 192 στην α4 υπομονάδα (θετική πλευρά) και Trp 53 της β2 υπομονάδας σχηματίζουν μία πολύ υδρόφοβη περιοχή στο εσωτερικό της εσοχής. Η συγκεκριμένη περιοχή εμπλέκεται σε αλληλεπιδράσεις κατιόντος-π (83). Επιπλέον, τα ομόλογα κατάλοιπα των μη συντηρημένων αμινοξέων Glu 55, Leu 112 και Met 114 βρίσκονται σε διαφορετικές β-πτυχές και καλύπτουν τη συγκεκριμένη αρωματική εσοχή ενώ εμπλέκονται περισσότερο σε δεσμούς υδρογόνου μεταξύ αμιδίων της κύριας αλυσίδας και του εκάστοτε υποκαταστάτη (84). Το σημείο πρόσδεσης της ACh εντοπίζεται στη μεσεπιφάνεια μεταξύ των δύο υπομονάδων ενώ είναι αναγκαίο να διεισδύσει αρκετά ώστε να αλληλεπιδράσει ειδικά με τον υποδοχέα (83). Η κυστινική θηλειά εντοπίζεται στην είσοδο της κοιλότητας αυτής ρυθμίζοντας με αυτό τον τρόπο την πρόσβαση υποκαταστατών στο σημείο πρόσδεσης (83-85). Με μία πιο αναλυτική ματιά, φάνηκε ότι τα υδρόφοβα αμινοξέα Trp 143, Tyr 185 και 192 αποτελούν δομικά στοιχεία της C θηλειάς, η κίνηση της οποία κατά τη δέσμευση αγωνιστή ή ανταγωνιστή, συνδέεται με το άνοιγμα ή κλείσιμο του πόρου του ιοντικού καναλιού μέσω της Μ1 (86). Παρατηρώντας την C θηλειά μίας α4 υπομονάδας και τη γειτονική της F θηλειά από τη β2 υπομονάδα, παρατηρείται μία στρέψη της C θηλειάς κατά 2-5 ο όταν ανοίγει το κανάλι κατά την πρόσδεση της νικοτίνης (87). Επιπλέον, αποκαλύπτεται μία αρνητικά φορτισμένη περιοχή γύρω από τα Trp 147 και Tyr 195 κατάλοιπα η οποία έλκει θετικά φορτισμένους προσδέτες 15

26 Εισαγωγή (88). Επίσης, ενδιαφέρουσες πληροφορίες προκύπτουν όσον αφορά τις ενδοκυττάριες θηλειές μεταξύ των διαμεμβρανικών τμημάτων Μ3 και Μ4. Αναλυτικότερα, στο μονομερές της α4 η συγκεκριμένη θηλειά αποτελεί ένα σημαντικά μεγάλο τμήμα του μορίου 270 καταλοίπων και χαρακτηρίζεται από σημαντική αφθονία σε α-έλικες. Στο κατώτερο τμήμα της θηλειάς, εντοπίζεται μία περιοχή από α-έλικες και β-πτυχές με τις πρώτες να βρίσκονται περισσότερο εκτεθειμένες ενώ οι β-πτυχές χαρακτηρίζονται από αφθονία σε κατάλοιπα Pro τα οποία συμβάλλουν στη σφαιρικότητα της περιοχής. Ωστόσο, η αντίστοιχη θηλειά της β2 υπομονάδας είναι μικρότερη (αποτελείται από 137 αμινοξέα) και δομείται αποκλειστικά από α-έλικες οι οποίες σταθεροποιούνται μέσω πολικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των υδρόφιλων καταλοίπων (88). 1.4 Λειτουργία του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης μυϊκού τύπου Διαβίβαση μηνύματος στη νευρομυϊκή σύναψη Στα περισσότερα είδη κυττάρων συμπεριλαμβανομένων των νευρικών και μυϊκών κυττάρων, η διαφορά δυναμικού μεταξύ του εσωτερικού και του εξωτερικού της πλασματικής μεμβράνης είναι αρνητική ενώ η ηλεκτροχημική βαθμίδωση συγκέντρωσης ευνοεί την εισροή ιόντων Na + και την εκροή Κ +. Φτάνοντας η νευρική ώση ή αλλιώς το δυναμικό ενέργειας στη νευρική απόληξη του κινητήριου άξονα προκαλεί ECDόλωση της μεμβράνης. Η κατά απόλυτη τιμή μείωση του μεμβρανικού δυναμικού ενεργοποιεί τα εξαρτώμενα από το δυναμικό κανάλια Ca 2+ οδηγώντας στην εισροή ιόντων Ca 2+. H αύξηση στη ενδοκυτταρική συγκέντρωση του Ca 2+ έχει ως αποτέλεσμα τη σύντηξη των συναπτικών κυστιδίων στις ενεργές ζώνες και την ταχύτατη απελευθέρωση του νευροδιαβιβαστή μέσα σε 0,2 ms-0,5 ms (89). Ωστόσο, η παρουσία στη σύναψη εξειδικευμένων ρυθμιστών εξαρτώμενων από τα ιόντα Ca 2+, όπως η συναπτοταγμίνη, μια διαμεβρανική πρωτεΐνη παρούσα στα συναπτικά κυστίδια των νευρώνων των ανώτερων θηλαστικών ικανή να επιταχύνει ή να διακόπτει την πορεία εξωκυττάρωσης, μετατρέπει τον κλασσικό μηχανισμό μεμβρανικής μεταφοράς στον ταχύτατο εξειδικευμένο μηχανισμό εξωκυττάρωσης των συνάψεων (90). Η ACh απελευθερώνεται στη συναπτική σχισμή κατά τρόπο ασυνεχή (quanta) περίπου 10 4 μόρια τη φορά (91). Κάθε quantum ACh ενεργοποιεί περισσότερα από 16

27 Εισαγωγή nachrs σε επιφάνεια ~0,1μm 2. Η κβαντική απελευθέρωση της ACh αποδείχθηκε από την ανάλυση του μεμβρανικού δυναμικού της τελικής κινητικής πλάκας, η οποία παρουσιάζει αυθόρμητη δραστηριότητα ακόμα και όταν το νευρικό της στοιχείο δεν είναι διηγερμένο, με εκπολωτικούς παλμούς ύψους 0,5 mv και διάρκειας περίπου 20 msec. Τα μικρά δυναμικά αυτά της τελικής κινητικής (ΜΕPP, miniature end-plate potential) συμβαίνουν τυχαία με σταθερή πιθανότητα εμφάνισης στο χρόνο και κάθε ένα προκαλείται από την απελευθέρωση ενός μόνο συναπτικού κυστιδίου (92). Η πλήρης εκπόλωση της μετασυναπτικής μεμβράνης απαιτεί τη σύντηξη έως και 300 συναπτικών κυστιδίων, η οποία προκαλεί αύξηση στη συγκέντρωση της ACh από 10-8 σε 0, M. Ο αριθμός των απελευθερωνόμενων πακέτων είναι ανάλογος του βαθμού εκπόλωσης της προσυναπτικής μεμβράνης, δηλ. του μεγέθους της νευρικής ώσης. Η ACh που απελευθερώνεται διασχίζει τη συναπτική σχισμή και δεσμεύεται από τους nachrs. Η δέσμευση, όπως έχει προαναφερθεί, επάγει αλλοστερικά μέσα σε 0,1 msec το άνοιγμα της πύλης του καναλιού, με αποτέλεσμα την εισροή ιόντων Na +. Παράλληλα, πραγματοποιείται και μια κατά πολύ μικρότερη εκροή Κ +, δεδομένου ότι το ιοντικό κανάλι του nachr είναι διαπερατό τόσο στα ιόντα Na + όσο και στα ιόντα Κ +. Ωστόσο, η πολύ πιο ισχυρή ηλεκτροχημική βαθμίδωση συγκέντρωσης για το Na + είναι αυτή που τελικά καθορίζει τη σχετική αγωγιμότητα του καναλιού σε Na + και Κ +. Η εισροή ιόντων Na + προκαλεί την εκπόλωση της μεμβράνης και την ανάπτυξη του δυναμικού της τελικής κινητικής πλάκας (το δυναμικό μεταβάλλεται από -90 mv σε - 20 mv). Αυτό προκαλεί με τη σειρά του ενεργοποίηση των εξαρτώμενων από το δυναμικό καναλιών Na +, περαιτέρω εισροή ιόντων Na + και πιο εκτεταμένη εκπόλωση σύμφωνα με μια επανατροφοδοτούμενη διαδικασία. Όταν το μετασυναπτικό δυναμικό ξεπεράσει το λεγόμενο κατώφλι δυναμικού, δημιουργείται το δυναμικό ενέργειας (+40 mv) και πυροδοτείται η ώση που θα οδηγήσει στη μυϊκή συστολή με την έκκριση Ca 2+ από το σαρκοπλασματικό δίκτυο της μυϊκής ίνας και τη δέσμευσή του από την τροπονίνη. Η επαναφορά της μετασυναπτικής μεμβράνης στην κατάσταση ηρεμίας λαμβάνει χώρα ταχύτατα, δεδομένου ότι οι συνάψεις μπορούν να μεταδίδουν νευρικούς παλμούς/sec μόνο εφόσον η τελική κινητική πλάκα επανέλθει στην κατάσταση ηρεμίας μέσα σε κλάσματα του msec. Έτσι, η ACh απομακρύνεται από τη συναπτική σχισμή κυρίως μέσω υδρόλυσης από το ένζυμο της ακετυλοχολινεστεράσης, το οποίο έχει πολύ υψηλό ρυθμό μετατροπής με μόρια/sec, και δευτερευόντως με 17

28 Εισαγωγή διάχυση. Σχετικά με την ακετυλοχολινεστεράση, η υψηλή απόδοση του ενζύμου είναι απαραίτητη κυρίως για την αποφυγή της μετάπτωσης του nachr στην απευαισθητοποιημένη κατάσταση. Η ακετυλοχολίνη διασπάται σε οξικό και χολίνη, η δε χολίνη επαναπροσλαμβάνεται από τη συναπτική απόληξη και ανακυκλώνεται για την εκ νέου σύνθεση ACh. Η αποκατάσταση του μεβρανικού δυναμικού πραγματοποιείται μέσω εξαρτώμενων από το δυναμικό καναλιών Κ +, τα οποία ενεργοποιούνται από την επιφερόμενη εκπόλωση της συναπτικής μεμβράνης, και επιτρέπουν την εκροή ιόντων Κ +, καθώς και από την Νa + -Κ + -ΑΤΡase η οποία αποκαθιστά την ηλεκτροχημική βαθμίδωση συγκέντρωσης. Η αποτελεσματικότητα της διαβίβασης του σήματος στη νευρομυϊκή σύναψη εξαρτάται από πολλούς παράγοντες και κυρίως από το συνολικό εμβαδόν των συναθροίσεων του nachr στις κορυφές των συναπτικών πτυχώσεων, από την πυκνότητα των ενεργών θέσεων απελευθέρωσης του νευροδιαβιβαστή αλλά όχι τόσο από το συνολικό μέγεθος της τελικής κινητικής πλάκας (93), καθώς και από τις διαστάσεις των συναπτικών πτυχώσεων και το βαθμό της διακλάδωσης του νευρικού άξονα, αφού απλουστευμένες πτυχώσεις συνεπάγονται περιορισμένες εκπολώσεις Αλλοστερικές καταστάσεις Η λειτουργία του nachr στη νευρομυϊκή σύναψη ενέχει μία συνεχή διαδικασία δέσμευσης -αποδέσμευσης της ACh με επακόλουθο το άνοιγμα και κλείσιμο του πόρου του καναλιού και τη μεταβολή του δυναμικού της μετασυναπτικής μεμβράνης. Ο nachr ανταποκρινόμενος στο προσυναπτικό ερέθισμα μεταπίπτει σε διαφορετικές λειτουργικές καταστάσεις, οι οποίες ισοδυναμούν με διαφορετικές δομικές καταστάσεις διακρινόμενες από μικρές αλλά σαφείς και αμφίδρομες δομικές τροποποιήσεις, καθώς το μόριο αυτό είναι μία αλλοστερική πρωτεΐνη (8,94). Υπάρχουν τρεις βασικές αλλοστερικές καταστάσεις του nachr, οι οποίες μπορούν να παρατηρηθούν υπό την επίδραση διαφόρων υποκαταστατών (αλλοστερικών τροποποιητών) (Εικόνα 6). i. Κατάσταση ηρεμίας. Το κανάλι είναι κλειστό, αλλά μπορεί να ενεργοποιηθεί με τη δέσμευση δύο μορίων ACh. 18

29 Εισαγωγή ii. Ενεργή κατάσταση. Το κανάλι είναι ανοιχτό. Ο nachr είναι προσδεδεμένος με δύο μόρια ACh. Η μετάβαση στην ενεργή κατάσταση από την κατάσταση ηρεμίας είναι μία εξαιρετικά γρήγορη διαδικασία ( μs). iii. Απευαισθητοποιημένη κατάσταση. Το κανάλι είναι κλειστό. Αν και ο nachr είναι προσδεδεμένος με δύο μόρια ACh δεν μπορεί να ενεργοποιηθεί. Η μετάβαση από την ενεργή στην απευαισθητοποιημένη κατάσταση είναι κατά τρεις τάξεις μεγέθους βραδύτερη διαδικασία. Η κατάσταση αυτή παρατηρείται μετά από παρατεταμένη έκθεση του nachr σε υψηλές συγκεντρώσεις υποκαταστάτη. Ωστόσο, ο φυσιολογικός της ρόλος δεν έχει διασαφηνιστεί δεδομένου ότι στη σύναψη η ακετυλοχολινεστεράση υδρολύει την ACh ταχύτατα, με αποτέλεσμα ο nachr να μην εκτίθεται παρατεταμένα σε αρκετά υψηλές συγκεντρώσεις ACh, ώστε να γίνει επαγωγή απευαισθητοποίησης. Εικόνα 6. Αλλοστερικές καταστάσεις του AChR (94). Κάποια χαρακτηριστικά του τρόπου λειτουργίας του nachr, όπως η συνεργική διαδικασία που λαμβάνει χώρα μεταξύ της πρόσδεσης του αγωνιστή και του ανοίγματος του πόρου του καναλιού, έρχονται σε συμφωνία με το κλασσικό αλλοστερικό πρότυπο των Monod-Wyman-Changeux (95). Ωστόσο, άλλα χαρακτηριστικά και κυρίως η μη-ισοδυναμία μεταξύ των δύο θέσεων πρόσδεσης της 19

30 Εισαγωγή ACh δεν είναι σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, το οποίο απαιτεί απόλυτη συμμετρία στις θέσεις πρόσδεσης του υποκαταστάτη (96). 1.5 Πρόσδεση υποκαταστατών στον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης Τα χημικά μόρια που προσδένονται στον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (υποκαταστάτες) διακρίνονται σε αγωνιστές, ανταγωνιστές και αλλοστερικούς υποκαταστάτες, ανάλογα με τη θέση πρόσδεσης και τον τρόπο που επηρεάζουν τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού. α. Οι αγωνιστές προσδένονται σε θέση ίδια με τη θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης και έχουν ίδια δράση με αυτή, δηλαδή επάγουν τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού, β. Οι ανταγωνιστές επίσης προσδένονται σε θέση ίδια με τη θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης αλλά έχουν αντίθετη δράση από αυτή, δηλαδή αναστέλλουν τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού και εμποδίζουν τη συναπτική διαβίβαση, και γ. Οι αλλοστερικοί υποκαταστάτες προσδένονται σε ρυθμιστικές θέσεις διαφορετικές από τη θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης και αποτελούν μια ετερογενή ομάδα μορίων, που μπορούν είτε να ενεργοποιούν είτε να αναστέλλουν τη λειτουργία του υποδοχέα Επιβατιδίνη Η επιβατιδίνη, ο πιο ισχυρός αγωνιστής της ακετυλοχολίνης που έχει αναφερθεί μέχρι σήμερα, είναι ένα αλκαλοειδές που έχει απομονωθεί από το δέρμα του δηλητηριώδους βατράχου Epipedobates tricolor. Η επιβατιδίνη έχει την ικανότητα να προσδένεται με μεγάλη συγγένεια τόσο σε ετερο-ολιγομερείς όσο και σε ομοολιγομερείς υπότυπους του νευρικού υποδοχέα. Πειράματα έκφρασης νευρικών υποδοχέων σε ωοκύτταρα Xenopus έδειξαν ότι, και οι δύο ισομερείς μορφές της επιβατιδίνης που υπάρχουν, συμπεριφέρονται ως πολύ ισχυροί αγωνιστές της ακετυλοχολίνης στους υπότυπους α3β2, α3β4, α4β2, α7 και α8 του υποδοχέα του κοτόπουλου (47). Η συγγένεια των παραπάνω υποτύπων του υποδοχέα για την επιβατιδίνη είναι 1000 φορές μεγαλύτερη από τη συγγένεια που εμφανίζουν οι υποδοχείς αυτοί για τη νικοτίνη ή την ακετυλοχολίνη. 20

31 Εισαγωγή Η επιβατιδίνη έχει χρησιμοποιηθεί ευρύτατα για το χαρακτηρισμό ετεροολιγομερών υποτύπων του ανθρώπινου νευρικού υποδοχέα. Σε μία από τις μελέτες αυτές ο Wang και οι συνεργάτες του (97) εκφράσανε σε ωοκύτταρα Xenopus τους υπότυπους α3β2, α3β2α5, α3β4 και α3β4α5 και μέτρησαν τη συγγένεια που εμφανίζουν οι υποδοχείς αυτοί για την 3 Η- επιβατιδίνη. Η σύγκριση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι, οι υπότυποι που περιέχουν τη β2 υπομονάδα (α3β2 και α3β2α5) εμφανίζουν συγγένεια για την 3 Η-επιβατιδίνη τουλάχιστον 10 φορές μεγαλύτερη από εκείνη που εμφανίζουν οι αντίστοιχοι υπότυποι που περιέχουν τη β4 υπομονάδα (α3β4 και α3β4α5), και ότι η προσθήκη της α5 υπομονάδας στις α3 και β2, ή στις α3 και β4 υπομονάδες, έχει αμελητέα επίδραση στη συγγένεια για την επιβατιδίνη. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν ότι, οι β υπομονάδες συμβάλλουν σημαντικά στο σχηματισμό των θέσεων πρόσδεσης των υποκαταστατών και καθορίζουν τα φαρμακολογικά χαρακτηριστικά των υποτύπων του νευρικού υποδοχέα Νικοτίνη Πρόκειται για αλκαλοειδές από το φυτό Nicotiana tabacum. Προσδένεται σε μυϊκούς καθώς και σε ορισμένους νευρικούς nachrs. Συγκεκριμένα προσδένεται με μεγαλύτερη συγγένεια σε νευρικούς υποδοχείς και ειδικότερα στους ετεροπενταμερείς τύπου α4β2 οι οποίοι μάλιστα συνεισφέρουν σημαντικά στην εξάρτηση που προκαλεί η νικοτίνη. Η υψηλή συγγένεια του μορίου της νικοτίνης για πρόσδεση με υποδοχείς τύπου α4β2 καθώς επίσης και το χαρακτηριστικό της να διασχίζει τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό, καθιστούν αυτό το μόριο δραστικό για το κεντρικό νευρικό σύστημα προκαλώντας ευφορία και εξάρτηση. Επιπλέον, οι υψηλής συγγένειας αλληλεπιδράσεις επιτρέπουν στην εισπνεόμενη νικοτίνη να δράσει ως εσωκυτταρικό συνοδό μόριο των α4β2 υποδοχέων επάγωντας με αυτό το τρόπο την αύξηση του αριθμού των συγκεκριμένων πρωτεϊνικών μορίων (98) Κυτισίνη Η κυτισίνη είναι ένα αλκαλοειδές που μοιάζει πολύ με τη νικοτίνη. Η κυτισίνη έχει την ικανότητα να προσδένεται με διαφορετική συγγένεια σε διάφορους ετεροολιγομερείς α/β υπότυπους του νευρικού υποδοχέα και να δρα άλλοτε ως αγωνιστής και άλλοτε ως ανταγωνιστής της ακετυλοχολίνης. Για το λόγο αυτό έχει 21