ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΔΟΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΜΗΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΝΙΚΟΤΙΝΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ ΤΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΥ ΜΑΡΙΟΥ ΖΟΥΡΙΔΑΚΗ ΠΑΤΡΑ 2009

2 Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή 1. Καθηγητής Σ. Τζάρτος (Επιβλέπων), Τμήμα Φαρμακευτικής, Παν. Πατρών 2. Επ. Καθηγητής Γ. Σπυρούλιας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Παν. Πατρών 3. Λέκτορας Κ. Πουλάς, Τμήμα Φαρμακευτικής, Παν. Πατρών 4. Καθηγητής Δ. Συνετός, Τμήμα Ιατρικής, Παν. Πατρών 5. Καθηγητής Η. Ηλιόπουλος, Τμήμα Γεωπονικής Βιοτεχνολογίας, Γεωπονικό Παν. Αθηνών 6. Αν. Καθηγητής Α. Παπαπετρόπουλος, Τμήμα Φαρμακευτικής, Παν. Πατρών 7. Επ. Καθηγητής Γ. Πατρινός, Τμήμα Φαρμακευτικής, Παν. Πατρών

3 Πρόλογος ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ο πρόλογος της εξιστόρησης μίας τόσο μακροχρόνιας και επίπονης πνευματικής, αλλά και σωματικής -λόγω της φύσης του πεδίου- προσπάθειας, συνηθίζεται να είναι το τελευταίο κεφάλαιο που γράφεται σε κάθε διατριβή. Είναι όμως ένα από τα σημαντικότερα, διότι εδώ κατατίθενται οι ευχαριστίες στους αρωγούς αυτής της προσπάθειας καθώς και κάποια προσωπικά συναισθήματα. Αυτές τις μέρες στέκομαι με ιδιαίτερη ικανοποίηση απέναντι στον απολογισμό των δρώμενων όλων αυτών των χρόνων που διήρκησε η εκπόνηση αυτής της διατριβής. Ικανοποίηση, διότι θεωρώ επιτυχή την συνεργασία με ένα τόσο πνευματώδη ερευνητή και άνθρωπο, τον επιβλέποντά μου Καθηγητή κ. Σωκράτη Τζάρτο. Είναι ο άνθρωπος, ο οποίος με ενέπνευσε να αφοσιωθώ στην Επιστήμη και να απολαμβάνω την καθημερινή ερευνητική δραστηριότητα, παρά τις δυσκολίες και τις αδιέξοδες πολλές φορές καταστάσεις. Είναι ο άνθρωπος που ακόμη και όταν βρέθηκα σε τέτοιου είδους καταστάσεις, φρόντισε άμεσα και χωρίς να του το έχω εκμηστυρευθεί να με καθοδηγήσει σε άλλη πορεία, η οποία οδήγησε στην επιτυχή έκβαση της παρούσης διατριβής. Και το πιο σημαντικό από όλα, εκτός από Επιστήμη, με δίδαξε το «ευ αγωνίζεσθαι» και το συλλογικό πνεύμα εργασίας, μέσα σε ένα περιβάλλον που από τη φύση του είναι ανταγωνιστικό. Ένα μεγάλο ευχαριστώ για όλα αυτά και άλλα πολλά. Ικανοποίηση, διότι η εκπόνηση της διατριβής αυτής συμβάδισε χρονικά με τα σημαντικότερα επιτεύγματα που διαδραματίστηκαν διεθνώς όσον αφορά την κατανόηση της δομής του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης από την στιγμή των πρώτων μελετών του. Έτσι, κάθε πειραματική μέρα ήταν από μόνη της ζωντανή, αγωνιώδης, και πολύ ενδιαφέρουσα, υπόκειντάς με σε εγρήγορση προκειμένου να αναβαθμίζω συνεχώς τις γνώσεις μου και να προσπαθώ ώστε να μην με προλάβουν οι εξελίξεις, τουλάχιστον όσον αφορά στη μικρή συνεισφορά της εργασίας αυτής στον τομέα του υποδοχέα. Αστείρευτη πηγή κουράγιου, θάρους, αισιοδοξίας, συμπαράστασης και θετικής ενέργειας, υπήρξε σε όλο αυτό το διάστημα ο Λέκτορας και φίλος Κώστας Πουλάς. Η συνεχής αναπτέρωση του ηθικού μου, οι πάντα εύστοχες υποδείξεις και η συνεχής διάνοιξη οριζόντων προοπτικής, δύσκολα ανταποδίδονται με ένα απλό Ευχαριστώ. Το τρίτο μέλος της συμβουλευτικής μου Επιτροπής, Επίκουρο Καθηγητή Γεώργιο Σπυρούλια, ευχαριστώ θερμά για τις εποικοδομητικές του συμβουλές κατά την τακτά χρονικά διαστήματα ενημέρωσή του για την πορεία της διδακτορικής διατριβής. Τα

4 Πρόλογος σχόλιά του με ωθούσαν πάντα σε μία πειραματική ανάπαυλα για κριτική ανασκόπηση των μέχρι της δεδομένης χρονικής στιγμής αποτελεσμάτων. Αισθάνομαι μεγάλη τύχη που είχα την ευκαιρία να γνωρίσω κατά τη διάρκεια της διατριβής τον Καθηγητή Ηλία Ηλιόπουλο. Πρόκειται για έναν άνθρωπο που σε κερδίζει από την πρώτη στιγμή με το γαλήνιο ύφος του. Η συνεργασία μαζί του για την κατασκευή τρισδιάστατων μοριακών μοντέλων, ήταν πάντα μία ευχάριστη νότα που αντηχούσε βαθιά μέσα μου και μου έδινε πνοή για την συνέχεια των πειραμάτων. Τον ευχαριστώ θερμά για τις πατρικές του συμβουλές και για την καταλυτική του συνεισφορά προκειμένου να έχει αίσιο αποτέλεσμα η διατριβή αυτή. Τον Καθηγητή Διονύσιο Συνετό ευχαριστώ πολύ για τα εφόδια με τα οποία με όπλισε, προκειμένου να συνεχίσω την ερευνητική μου δραστηριότητα σε επίπεδο Διδακτορικής διατριβής. Είναι ο άνθρωπος που εκτός από επιστημοσύνη, με δίδαξε ακαδημαϊκότητα και ήθος κατά την επίβλεψή του στην εκπόνηση της πτυχιακής, αλλά και της μεταπτυχιακής μου διπλωματικής εργασίας. Τους εγκάρδιους φίλους μου και συμφοιτητές, Κώστα Μποζονέλο, Σωτήρη Σιδέρη, Γρηγόρη Κόρδα και Θοδωρή Κωνσταντινίδη, ευχαριστώ από τα βάθη της καρδιάς μου για όλη την συμπαράσταση και το κουράγιο που με εμπότιζαν συνεχώς, και σε ιδιαίτερα δύσκολες προσωπικές στιγμές, προκειμένου να περατωθεί η διατριβή αυτή. Ένα μεγάλο ευχαριστώ για τους ίδιους λόγους και στην καλή φίλη Κική Κανινή. Την Παρασκευή Ζησιμοπούλου ευχαριστώ ιδιαίτερα για τη σημαντική της συνεισφορά στην εκπόνηση αυτής της διατριβής. Εκτός από τη βοήθειά της στους μοριακούς σχεδιασμούς, στάθηκε αρωγός καθ όλη την προσπάθεια που κατέβαλα για την επίτευξη αυτής της εργασίας. Χωρίς αυτήν θα ήταν αδύνατη η ολοκλήρωση της εργασίας στο δεδομένο χρονικό διάστημα. Τους Αλέξανδρο Σωτηριάδη, Γιώργο Λαγουμιντζή, Καλλιόπη Κωστελίδου, Αναστασία Σιδέρη, Κωνσταντίνο Λαζαρίδη, Πέτρο Γιάστα, Καλλιόπη Μπιτζοπούλου και Ειρήνη Παπαδάκη ευχαριστώ θερμά για την υποδειγματική συναδελφικότητα και για την αμέριστη συμπαράσταση και ενέσεις κουράγιου που μου προσέφεραν, πάντα με τα καλά και γλυκά τους λόγια. Τον Χρήστο Στεργίου ευχαριστώ ξεχωριστά για την άψογη συνεργασία και για τις αμέτρητες στιγμές συζητήσεων και αναζητήσεων που μοιραστήκαμε. Τον Νίκο Τράκα και την Άννα Κόκλα ευχαριστώ ιδιαίτερα για τη σημαντική τους πολύπλευρη βοήθεια καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της παρούσης διατριβής. Eυχαριστώ θερμά την Ευαγγελία που γέμισε με νόημα, χαρά και αισιοδοξία την ζωή μου όλα αυτά τα χρόνια, καθώς και για όλα αυτά που υπέφερε λόγω του βεβαρημένου

5 Πρόλογος καθημερινού προγράμματός μου. Της εύχομαι να ολοκληρώσει επιτυχώς και σύντομα τη δικιά της Διδακτορική διατριβή και να είναι πάντα ευτυχισμένη. Ένα μεγάλο και ηχηρό Ευχαριστώ στους γονείς μου και στον αδερφό μου για την ηθική συμπαράσταση και για το συνεχές αίσθημα ασφάλειας που μου παρείχαν με τη βοήθεια και το συνεχές τους ενδιαφέρον. Τους οργανισμούς FEBS και EMBO ευχαριστώ για τις χορηγηθείσες υποτροφίες για την παρακολούθηση διαλέξεων και πρακτικών σεμιναρίων κρυσταλλογραφίας και ιοντικών καναλιών. Η εκπόνηση αυτής της Διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ και στηρίχθηκε οικονομικά από προγράμματα της ΓΓΕΤ και της Ευρωπαϊκής Ένωσης («ΑΦΡΟΔΙΤΗ» & ΠΕΝΕΔ 2003). Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή αφιερώνεται στη μνήμη του αγαπημένου μου πατέρα Στυλιανού Ζουριδάκη, ο οποίος μας εγκατέλειψε ξαφνικά το περασμένο καλοκαίρι. Αιωνία η μνήμη του. Μάρτιος 2009

6 Περιεχόμενα 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Υποδοχείς της ακετυλοχολίνης Νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης Μυϊκός και μυϊκού τύπου nachr Νευρικοί nachrs Δομή του nachr Πρωτοταγής δομή των nachr υπομονάδων Ανώτερα επίπεδα οργάνωσης των nachrs Δομή της AChBP Ατομική δομή της θέσης πρόσδεσης ACh Πρόσδεση αγωνιστών στη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών της AChBP Πρόσδεση ανταγωνιστών στη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών της AChBP Επαγόμενες δομικές αλλαγές κατά την πρόσδεση υποκαταστατών Δομή του μυϊκού τύπου nachr Άνοιγμα του καναλιού του nachr Δομή της ΕΚΠ της α1 υπομονάδας του μυϊκού nachr Δομή προκαρυωτικών LGICs Μεταβολισμός του nachr Λειτουργία του nachr Λειτουργία νευρικών nachrs Λειτουργία μυϊκών nachrs Αλλοστερικές καταστάσεις του nachr Υποκαταστάτες που προσδένονται στον nachr Αγωνιστές του nachr Ανταγωνιστές του nachr Παθολογικές καταστάσεις που σχετίζονται με τους nachrs Βαριά μυασθένεια (myasthenia gravis) Θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη βαριά μυασθένεια Ασθένειες που σχετίζονται με τους νευρικούς nachrs Η Νόσος του Alzheimer Η Νόσος του Parkinson Επιληψία Σχιζοφρένεια Σύνδρομο Tourette Eθισμός στη νικοτίνη ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ ΥΛΙΚΑ Εργαστηριακά όργανα Αναλώσιµα Αντιδραστήρια Εναρκτήρια µόρια (primers) Αντισώµατα Θρεπτικά υλικά Διαλύµατα Πλασµιδιακός φορέας κλωνοποίησης (cloning vector) και κυτταρικά στελέχη Εscherichia coli που χρησιµοποιήθηκαν i

7 Περιεχόμενα Πλασµιδιακοί φορείς έκφρασης (expression vectors) και κυτταρικά στελέχη Ρichia pαstoris που χρησιµοποιήθηκαν ΜΕΘΟΔΟΙ Κατασκευή τρισδιάστατου μοντέλου (3 D model) των εξωκυτταρικών τμημάτων του ανθρώπινου νευρικού α7 nachr Υγρές και στερεές καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων Esherichia coli Παρασκευή πλασµιδιακού DNA σε μικρή κλίµακα (mini-prep) µε τη µέθοδο της αλκαλικής λύσης Παρασκευή πλασµιδιακού DNA από καλλιέργειες βακτηρίων σε µεγάλη κλίµακα (maxi-prep) µε τη µέθοδο της αλκαλικής λύσης Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA (DNA purification) Με εκχύλιση µε οργανικούς διαλύτες Με συστηµατοποιηµένες χρωµατογραφικές µεθόδους Κατακρήµνιση του DNA (DNA precipitation) Ποσοτική ανάλυση δείγματος DNA Ποιοτική ανάλυση δείγµατος DNA Υποκλωνοποίηση (subcloning) δίκλωνου τμήματος DNA σε πλασμιδιακό φορέα Πέψη DNA µε περιοριστικές ενδονουκλεάσες (Restriction reaction) Αποφωσφορυλίωση γραµµικού πλασµιδιακού DNA (DNA dephosphorylation) Αντίδραση σύνδεσης (ligation) Μετασχηµατισµός (Transformation) βακτηρίων με τη χηµική µέθοδο του CaCl Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) Υγρές και στερεές καλλιέργειες κυττάρων Pichia pastoris Μετασχηµατισµός κυττάρων P. pastoris με ηλεκτροδιάτρηση (electroporation) Έκφραση των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris (Protein expression) Απομόνωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών από υπερκείµενο καλλιέργειας P. pastoris (Protein isolation) Καθαρισµός ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών (Protein purification) Xρωµατογραφία συγγένειας (Affinity chromatography) Χρωµατογραφία µοριακής διήθησης (Size exclusion chromatography) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών υπό αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE electrophoresis) Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών (Western blotting) Ποσοτική ανάλυση καθαρισμένων πρωτεϊνών Φασµατοσκοπικές µέθοδοι για την ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών Χρωµατοµετρική µέθοδος Bradford για την ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών Σήμανση α-μπουγκαροτοξίνης με 125 Ι με τη μέθοδο της χλωραμίνης Τ Πρόσδεση 125 Ι-α-bgtx στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη σε διάλυμα In vitro απογλυκοζυλίωση ανασυνδυασμένων α7-εκπ πρωτεϊνών Μελέτες προσδιορισμού δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Μέθοδοι υπολογισμού του μεγέθους των μορίων των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών ii

8 Περιεχόμενα Ηλεκτρονική μικροσκοπία (Electron Microscopy) Δυναμική σκέδαση του φωτός (Dynamic Light Scattering) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τρισδιάστατο μοντέλο της ανθρώπινης α7-εκπ υπομονάδας του nachr και στρατηγική ορθολογικού σχεδιασμού μεταλλαξιγενέσεων Κατασκευή και χαρακτηρισμός συζευγμένων εξωκυττάριων τμημάτων του ανθρώπινου νευρικού α7 nachr με αμινο-τελική 6 His ετικέτα και επίτοπο αναγνώρισης TEV πρωτεάσης Κατασκευή κασέτας έκφρασης HisTEV-α7-ΕΚΠ μορίων Υποκλωνοποίηση της κασέτας έκφρασης HisTEV-α7-ΕΚΠ μορίων σε πλασμιδιακό φορέα κλωνοποίησης pβluescript Υποκλωνοποίηση της κασέτας έκφρασης HisTEV-α7-ΕΚΠ μορίων σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης ppic Έκφραση των ανασυνδυασμένων HisTEVα7-ΕΚΠ πολυπεπτιδικών τμημάτων σε κύτταρα P. pastoris Επιλογή μετασχηματισμένων κυττάρων P. pastoris με τα πλασμίδια ppic9-histevα7-εκπ-wt/dm για έκφραση Έλεγχος έκφρασης ανασυνδυασμένων HisTEVα7-ΕΚΠ πολυπεπτιδίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας Έκφραση ανασυνδυασμένων HisTEVα7-ΕΚΠ πολυπεπτιδίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Υποκλωνοποίηση κασέτας έκφρασης α7-εκπ μορίων σε πλασμιδιακό φορέα pbluescript Κατασκευή κασετών έκφρασης α7-εκπ μεταλλαγμάτων σε πλασμιδιακό φορέα pbluescript Υποκλωνοποίηση κασετών έκφρασης α7-εκπ μορίων σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης ppiczαα Έκφραση των ανασυνδυασμένων α7-εκπ πολυπεπτιδίων σε κύτταρα P. pastoris Επιλογή μετασχηματισμένων κυττάρων P. pastoris με τα πλασμίδια ppicζαα-α7-εκπ για έκφραση Έλεγχος έκφρασης ανασυνδυασμένων μεταλλαγμένων α7-εκπ μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας Έκφραση ανασυνδυασμένων α7-εκπ μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Έκφραση α7-εκπ μορίων αγρίου τύπου (wt) και διπλού μεταλλάγματος (dm) από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Έκφραση α7-εκπ-mut-1 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Έκφραση α7-εκπ-mut-2 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Έκφραση α7-εκπ-mut-3 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Έκφραση α7-εκπ-mut-4 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας iii

9 Περιεχόμενα Έκφραση α7-εκπ-mut-5 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Έκφραση α7-εκπ-mut-6 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Έκφραση α7-εκπ-mut-7 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Κατασκευή κασετών έκφρασης μεταλλαγμένων α7-εκπ μορίων σε συνδυασμό με τις μεταλλάξεις του α7-εκπ-dm σε πλασμιδιακό φορέα pbluescript Υποκλωνοποίηση κασετών έκφρασης α7-εκπ μορίων που φέρουν συνδυασμό μεταλλάξεων με αυτές του α7-εκπ-dm, σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης ppiczαα Έκφραση α7-εκπ-mut-8 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Έκφραση α7-εκπ-mut-9 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Έκφραση α7-εκπ-mut-10 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Απογλυκοζυλίωση α7-εκπ-mut-10 μορίων Προσδιορισμός της σταθεράς διάσπασης (K d ) συμπλόκων α7-εκπ με 125 Ι-αbgtx Έλεγχος πρόσδεσης διάφορων χολινεργικών προσδετών σε α7-εκπ μόρια Υπολογισμός του μεγέθους των εκφραζόμενων α7-εκπ μορίων με μελέτες δυναμικής σκέδασης του φωτός (DLS) Μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διερχόμενης δέσμης (TEM) για α7-εκπmut-10 μόρια Μελέτες κυκλικού διχρωϊσμού α7-εκπ μορίων Προσδιορισμός σύστασης δευτεροταγούς δομής α7-εκπ μορίων Ανίχνευση τριτοταγούς δομής α7-εκπ μορίων Μελέτες κυκλικού διχρωϊσμού ανασυνδυασμένων ΕΚΠ μορίων του ανθρώπινου μυϊκού nachr ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ A - ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Β iv

10 I. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

11 Εισαγωγή 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Υποδοχείς της ακετυλοχολίνης Οι υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (AChRs) είναι μεμβρανικές πρωτεΐνες, οι οποίες ενεργοποιούνται από την πρόσδεση σε αυτές του νευροδιαβιβαστή ακετυλοχολίνη (ACh), η οποία συντίθεται, αποθηκεύεται και εκκρίνεται από χολινεργικούς νευρώνες. Ανάλογα με τις φαρμακολογικές τους ιδιότητες και τη συγγένεια πρόσδεσης που εμφανίζουν σε διάφορα μόρια-προσδέτες, οι AChRs διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: Α. Νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nachrs), οι οποίοι διαθέτουν υψηλή ευαισθησία απόκρισης στη νικοτίνη (Changeux and Edelstein 2001, Lindstrom 1997). Β. Μουσκαρινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (machrs), οι οποίοι διαθέτουν υψηλή ευαισθησία απόκρισης στη μουσκαρίνη και αποτελούν μέλη της υπεροικογένειας των υποδοχέων που συνδέονται με G-πρωτεΐνες (G-protein coupled receptors) (Wess 1996, Ishii and Kurachi 2006) Νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης Οι nachrs ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των ιοντικών καναλιών που ενεργοποιούνται από την πρόσδεση σε αυτά κάποιου προσδέτη (LGICs: Ligand-gated ion channels), η οποία επίσης ονομάζεται και υπεροικογένεια των υποδοχέων Cys θηλιάς (Cys-loop receptors). Άλλα μέλη της υπερ-οικογένειας αποτελούν οι υποδοχείς της 5-υδροξυτρυπταμίνης (5-ΗΤ 3 ) ή σεροτονίνης (Maricq et al 1991), της γλυκίνης (Gly) (Grenningloh et al 1987) και του γ-αμινοβουτυρικού οξέος τύπου Α και C (GABA A, GABA C ) (Schofield et al 1987). Τα ιοντικά αυτά κανάλια συγκροτούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες, οι οποίες διατάσσονται περιμετρικά ενός μεμβρανικού κεντρικού υδατο-πληρούμενου πόρου στην κυτταρική μεμβράνη, διαμέσου του οποίου διακινούνται ιόντα σύμφωνα με την ηλεκτροχημική τους κλίση. Κάθε υπομονάδα των ιοντικών αυτών καναλιών αποτελείται από μία αμινο-τελική (μήκους ~210 αμινοξικών καταλοίπων στην περίπτωση των nachrs) εξωκυττάρια περιοχή (ΕΚΠ), στην οποία βρίσκεται η χαρακτηριστική Cys θηλιά της υπεροικογένειας μεταξύ δύο συντηρημένων καταλοίπων κυστεΐνης (Cys), από τέσσερεις διαμεμβρανικές α-έλικες (M1-M4) και από μία κυτταροπλασματική περιοχή (ΚΠ) μεταξύ της M3 και M4 έλικας (Le Novere and Changeux 1999) (Eικόνα 1). 1

12 Εισαγωγή Επειδή οι διαφορετικοί υποδοχείς-μέλη της υπερ-οικογένειας εμφανίζουν κοινά δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά, υποστηρίζεται πως τα γονίδια που κωδικοποιούν τις ομόλογες υπομονάδες τους, προέρχονται εξελικτικά από το ίδιο αρχέγονο γονίδιο (Betz 1990, Ortells and Lunt 1995). Οι nachrs αποτελούν την εκτενέστερα μελετημένη υπο-οικογένεια και χρησιμοποιούνται για το λόγο αυτό ως πρότυπο για την κατανόηση της δομής και λειτουργίας όλων των μελών της LGIC υπερ-οικογένειας (Changeux and Edelstein 1998, Karlin and Akabas 1995). Ανάλογα με την τοπολογία και τα φαρμακολογικά τους χαρακτηριστικά, οι nachrs διακρίνονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες, στους μυϊκούς (και μυϊκού τύπου) και στους νευρικούς nachrs. A. B. Eικόνα 1. Σχηματική αναπαράσταση υπομονάδων των υποδοχέων της LGIC υπερ-οικογένειας. (Α) Σχηματική αναπαράσταση της πρωτοταγούς δομής των α (α1-α9) και μη-α (β1-β4, γ, ε, δ) υπομονάδων του nachr, της 5-ΗΤ 3 Α L υπομονάδας του 5-ΗΤ 3 R, της α1 υπομονάδας του GABA A R και της α1 υπομονάδας του GlyR. (B) Σχηματική αναπαράσταση της δευτεροταγούς δομής μίας υπομονάδας του nachr. C-C: δισουλφιδικός δεσμός, Μ1-Μ4: διαμεμβρανικές περιοχές, ΕΚΠ: εξωκυττάρια περιοχή, ΚΜ: κυτταρική μεμβράνη, ΚΠ: κυτταροπλασματική περιοχή, Υ: θέσεις γλυκοζυλίωσης. (Arias 2000) Μυϊκός και μυϊκού τύπου nachr Οι μυϊκοί nachrs απαντώνται στις μετασυναπτικές μεμβράνες των νευρομυϊκών συνάψεων των σκελετικών μυών των σπονδυλωτών. Οι μυϊκού τύπου nachrs απαντώνται στα ηλεκτρικά όργανα ιχθύων του γένους Torpedo και Electrophorus και είναι ομόλογοι των μυϊκών. Οι μυϊκοί και μυϊκού τύπου nachrs σχηματίζουν ετεροπενταμερή με στοιχειομετρία υπομονάδων (α) 2 βγδ στο Torpedo και (α1) 2 β1γδ ή (α1) 2 β1εδ στα εμβρυϊκά ή ενήλικα άτομα θηλαστικών, αντίστοιχα (Wess 1996, Ishii 2

13 Εισαγωγή and Kurachi 2006) (Εικόνα 2). Η αντικατάσταση της γ από την ε-nachr υπομονάδα ξεκινά αμέσως μετά τη γέννηση και ολοκληρώνεται μέσα στις δύο πρώτες εβδομάδες μετά από αυτή (Martinou and Merlie 1991, Missias et al 1996). Αξίζει να σημειωθεί ότι στους εξωτερικούς οφθαλμικούς μύες των ενήλικων θηλαστικών εκφράζονται τόσο η γ όσο και η ε υπομονάδα (Horton et al 1993). Η μεταστροφή τύπου του υποδοχέα που χαρακτηρίζει τα θηλαστικά, συνεπάγεται και μια σειρά αλλαγών στα μεταβολικά και φαρμακολογικά χαρακτηριστικά του, καθώς και στην αγωγιμότητα του ιοντικού καναλιού. Έτσι, ο εμβρυϊκού τύπου μυϊκός nachr παρουσιάζει χαμηλή αγωγιμότητα και μεγαλύτερη διάρκεια επαγώμενου ρεύματος, ενώ ο ενήλικου τύπου nachr αποτελεί κανάλι υψηλής αγωγιμότητας με επαγώμενο ρεύμα μικρότερης διάρκειας (Bouzat et al 1994, Mishina et al 1986, Schuetze 1986). Οι μυϊκοί και μυϊκού τύπου nachrs διαθέτουν δύο θέσεις πρόσδεσης της ACh και άλλων χολινεργικών προσδετών στα ΕΚΠ τμήματά τους. Η μία θέση πρόσδεσης σχηματίζεται μεταξύ της μίας α και της γ υπομονάδας (ή ε στα ενήλικα άτομα), ενώ η άλλη σχηματίζεται μεταξύ της δεύτερης α και της δ υπομονάδας (Εικόνα 2 Β), καθιστώντας έτσι τις δύο α υπομονάδες μη ισότιμες (Blount and Merlie 1989). Μάλιστα, η θέση πρόσδεσης μεταξύ της α και γ (ε) υπομονάδας εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης για τον ανταγωνιστή d-τουμποκουραρίνη από την θέση πρόσδεσης μεταξύ της α και δ υπομονάδας (Sine et al 1995, Miyazawa et al 1999). Στην α-εκπ εδράζει επίσης η κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR), έναντι της οποίας κατευθύνονται τα αντι-nachr αντισώματα στην περίπτωση της βαριάς μυασθένειας. Κάθε υπομονάδα του μυϊκού και μυϊκού τύπου nachr κωδικοποιείται από διαφορετικό γονίδιο. Τα γονίδια των α1, γ και δ υπομονάδων του ανθρώπινου μυϊκού nachr βρίσκονται στο χρωμόσωμα 2 (Beeson et al 1990a, Cohen-Haguenauer et al 1988, Shibahara et al 1985), ενώ τα γονίδια των β1 και ε υπομονάδων στο χρωμόσωμα 17 (Beeson et al 1993). Το γονίδιο της α1 υπομονάδας περιλαμβάνει εννέα εξώνια (P1-P9). Ωστόσο, έχει εντοπιστεί και η ισομορφή Ρ3Α της α1 υπομονάδας σε ανθρώπινο μυϊκό ιστό, η οποία κωδικοποιείται από το επιπλέον εξώνιο Ρ3Α, μεταξύ των εξωνίων Ρ3 και Ρ4. Το εξώνιο αυτό κωδικοποιεί 25 επιπλέον αμινοξέα παρεμβαλλόμενα μεταξύ των καταλοίπων α58 και α59, τα οποία βρίσκονται πολύ κοντά στην αλληλουχία α67-76 που συμμετέχει στο σχηματισμό του MIR επίτοπου. Η ισομορφή αυτή εκφράζεται σταθερά στους σκελετικούς μύες, στην καρδιά, στον εγκέφαλο, στους νεφρούς, στους πνεύμονες και 3

14 Εισαγωγή στο θύμο αδένα, ενώ η άλλη ισομορφή εκφράζεται αποκλειστικά στους σκελετικούς μύες (Beeson et al 1990b). Το γονίδιο της β1 υπομονάδας αποτελείται από 11 εξώνια. Η β1 υπομονάδα εμφανίζει επίσης δύο ισομορφές, οι οποίες προκύπτουν από εναλλακτική ωρίμανση του mrna. Η διαφορά μεταξύ των δύο ισομορφών εντοπίζεται σε 9 βάσεις στο 5 άκρο της κωδικής περιοχής του mrna (Goldman and Tamai 1989). Ο λειτουργικός ρόλος των διαφορετικών αυτών ισομορφών των υπομονάδων του υποδοχέα παραμένει ακόμη άγνωστος. Τέλος, τα γονίδιο των γ, δ και ε υπομονάδων αποτελούνται από 12 εξώνια (Beeson et al 1993, Beeson et al 1990a, Buonanno et al 1989, Luther et al 1989, Shibahara et al 1985). Ο μυϊκού τύπου nachr αποτελεί το πλέον γνωστό και μελετημένο μέλος της υπεροικογένειας των μορίων-υποδοχέων νευροδιαβιβαστών. Σημαντικοί παράγοντες οι οποίοι συνέβαλαν στην εκτεταμένη μελέτη του είναι η δυνατότητα απομόνωσης μεγάλων ποσοτήτων λειτουργικού μυϊκού τύπου υποδοχέα από τα ηλεκτρικά όργανα ιχθύων του γένους Torpedo και Electrophorus, καθώς και η ύπαρξη ειδικών μορίωνπροσδετών (νευροτοξίνες φιδιών) για τη σήμανση και καθαρισμό του μορίου. Α. Β. Eικόνα 2. Σχηματική αναπαράσταση μυϊκού nachr. (Α) Αναπαράσταση της πρωτοταγούς δομής των υπομονάδων α1, β1, γ, δ και ε του μυϊκού nachr. ΕΚΠ: εξωκυττάρια περιοχή, C-C: δισουλφιδικός δεσμός, Μ1-Μ4: διαμεμβρανικές περιοχές, ΚΠ: κυτταροπλασματική περιοχή, : θέσεις γλυκοζυλίωσης (Lindstrom 2000). (B) Αναπαράσταση της διάταξης των υπομονάδων του μυϊκού nachr περιμετρικά του κεντρικού πόρου του ιοντικού καναλιού (Lindstrom 2000). Οι θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών αναπαρίστανται με λευκά τρίγωνα. 4

15 Εισαγωγή Νευρικοί nachrs Οι νευρικοί nachrs εκφράζονται ευρέως στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα σπονδυλωτών και εντόμων, στα περιφερικά γάγγλια, καθώς και σε μη διεγέρσιμα κύτταρα όπως είναι τα κύτταρα του επιθηλίου και του ανοσοποιητικού συστήματος. Μέχρι σήμερα έχουν κλωνοποιηθεί εννέα διαφορετικές νευρικές υπομονάδες τύπου α (α2-α10) και τρείς υπομονάδες τύπου β (β2-β4) (McGehee and Role 1995). Εκτός από τις α8 και α9 υπομονάδες, οι οποίες έχουν βρεθεί μόνο σε όρνιθα και αρουραίο, αντίστοιχα (Εlgoyhen et al 1994), όλες οι άλλες υπομονάδες προέρχονται από διάφορα είδη, μεταξύ αυτών και του ανθρώπου. Η ταξινόμηση των υπομονάδων νευρικού τύπου σε α και β έγινε με κριτήριο την αμινοξική ομολογία που παρουσιάζει η κάθε υπομονάδα με τις αντίστοιχες υπομονάδες του υποδοχέα μυϊκού τύπου, ενώ η αρίθμηση των υπομονάδων αντικατοπτρίζει τη χρονική σειρά με την οποία αυτές απομονώθηκαν και αναλύθηκε η αμινοξική τους σύσταση. Oι νευρικοί nachrs απαντούν είτε ως ετεροπενταμερή, συγκροτούμενα συνήθως από δύο νευρικές υπομονάδες τύπου α (α2-α6) και από τρείς νευρικές υπομονάδες τύπου β (β2-β4), είτε ως ομοπενταμερή, τα οποία συγκροτούνται από α-υπομονάδες (α7-α9) (Εικόνα 3). Oι νευρικές υπομονάδες τύπου α7-α9 σχηματίζουν επίσης ετεροπενταμερή σύστασης α7/α8 και α9/α10 (Plazas et al 2005). Η ύπαρξη πάντως πολλών και διαφορετικών τύπων του νευρικού υποδοχέα είναι κυρίως αποτέλεσμα της ποικιλίας συνδυασμών μεταξύ των α και β υπομονάδων (Role 1992). Στους ετεροπενταμερείς νευρικούς nachrs σχηματίζονται δύο θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών μεταξύ των α και β υπομονάδων, ενώ στους ομοπενταμερείς σχηματίζονται πέντε θέσεις πρόσδεσης μεταξύ των α υπομονάδων τους. Οι φαρμακολογικές ιδιότητες των ετεροπενταμερών και ομοπενταμερών νευρικών nachrs διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους. Έτσι, οι ετεροπενταμερείς νευρικοί nachrs [(α χ )2(β ψ )3], εμφανίζουν υψηλή συγγένεια πρόσδεσης αγωνιστών (της τάξεως των nm), ενώ δεν προσδένουν τον ανταγωνιστή α-μπουγκαροτοξίνη (α-bgtx), σε αντίθεση με τους ομοπενταμερείς νευρικούς nachrs (α7-α9), οι οποίοι εμφανίζουν χαμηλότερη μεν συγγένεια πρόσδεσης αγωνιστών (της τάξεως των μm), αλλά υψηλή συγγένεια πρόσδεσης α-bgtx (της τάξεως των nm) (Lindstrom 2000). Μάλιστα, για αυτό το λόγο, οι ομοπενταμερείς νευρικοί nachrs αναφέρονται και ως α-bgtxnachrs. 5

16 Εισαγωγή Α. Β. Εικόνα 3. Σχηματική αναπαράσταση νευρικών nachrs. (Α) Αναπαράσταση της πρωτοταγούς δομής των υπομονάδων τύπου α (α2-9) και β (β2-4) του νευρικού nachr. ΕΚΠ: εξωκυττάρια περιοχή, C-C: δισουλφιδικός δεσμός, Μ1-Μ4: διαμεμβρανικές περιοχές, ΚΠ: κυτταροπλασματική περιοχή, : θέσεις γλυκοζυλίωσης (Lindstrom 2000). (B) Αναπαράσταση της διάταξης των υπομονάδων ετεροπενταμερών και ομοπενταμερών νευρικών nachr περιμετρικά του κεντρικού πόρου του ιοντικού καναλιού (Lindstrom 2000). Οι θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών αναπαρίστανται με λευκά τρίγωνα. 6

17 Εισαγωγή Η μεγάλη ποικιλία των υπότυπων νευρικών nachrs, με διαφορετικές φυσιολογικές και φαρμακολογικές ιδιότητες, ευθύνεται για τη συμμετοχή τους σε πολλές και διαφορετικές λειτουργίες του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος, όπως είναι ο έλεγχος της έκκρισης νευροδιαβιβαστικών ουσιών, ο έλεγχος των εκούσιων κινήσεων, η ρύθμιση της θερμοκρασίας του σώματος, καθώς και η ρύθμιση πολύπλοκων ανώτερων πνευματικών διεργασιών, όπως η μνήμη, η μάθηση και η συμπεριφορά (Gotti et al 1997). Το πρότυπο έκφρασης των διάφορων νευρικών υποδοχέων στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα έχει εντοπισθεί με τη χρήση μίας σειράς μεθόδων, όπως: Α. Ανοσοϊστοχημεία με χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι νευρικών nachr υπομονάδων. Η μέθοδος αυτή εμφανίζει μεγάλη εξειδίκευση και ευαισθησία. Εν τούτοις, ο περιορισμός της έγκειται στην μη διαθεσιμότητα μέχρι σήμερα μονοκλωνικών αντισωμάτων ειδικών για κάθε νευρική υπομονάδα. Β. Πρόσδεση ραδιενεργά σημασμένων υποκαταστατών. Ραδιοσημασμένοι υποκαταστάτες έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση υποτύπων του νευρικού υποδοχέα σε ομογενοποιήματα ή ιστολογικές τομές από διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου. Ο περιορισμός της μεθόδου έγκειται στο ότι δεν υπάρχουν ειδικοί υποκαταστάτες για κάθε υπότυπο του νευρικού υποδοχέα. Γ. In situ υβριδοποίηση με RNA ή DNA ιχνηθέτες. Η μέθοδος αυτή ανιχνεύει μόνο την ύπαρξη των mrnas των nachr υπομονάδων σε ιστούς και ομογενοποιήματα, αλλά δεν δίνει καμία πληροφορία σχετικά με την έκφρασή τους. Εν τούτοις, εμφανίζει τη μεγαλύτερη ειδικότητα και έχει χρησιμοποιηθεί ευρύτατα, καθώς είναι διαθέσιμες οι cdna αλληλουχίες για όλες τις μέχρι σήμερα γνωστές νευρικές υπομονάδες. Με τη χρήση αυτών των μεθόδων έχει βρεθεί ότι οι κύριοι νευρικοί ετεροπενταμερείς υποδοχείς nachr στον εγκέφαλο των θηλαστικών είναι οι (α4) 2 (β2) 3, οι οποίοι χαρακτηρίζονται από υψηλή συγγένεια πρόσδεσης για την νικοτίνη (Picciotto et al 1995, Marubio et al 1999), ενώ υπάρχουν και δευτερεύοντες υπότυποι με τη συμμετοχή και της β5 υπομονάδας (Lindstrom 1997) (Εικόνα 3Β). Επίσης, οι κύριοι νευρικοί ετεροπενταμερείς υποδοχείς nachr στα γάγγλια των θηλαστικών είναι οι (α3) 2 (β4) 3, ενώ έχουν εντοπισθεί και υπότυποι με την επιπλέον συμμετοχή β2, β4 και α5 υπομονάδων (Conroy and Berg 1995, Sine and Quiram 1998). Όσον αφορά στους ομοπενταμερείς νευρικούς nachr υπότυπους, οι οποίοι σχηματίζονται από α7, α8 και α9 υπομονάδες, και οι οποίοι χαρακτηρίζονται από την ικανότητα πρόσδεσης α-bgtx, 7

18 Εισαγωγή όπως δηλαδή και οι μυϊκές και μυϊκού τύπου α1 υπομονάδες, έχει βρεθεί ότι ο κύριος υπότυπος τόσο στον εγκέφαλο, όσο και στα γάγγλια είναι ο α7. Οι α7 nachrs χαρακτηρίζονται από ευρεία κατανομή, σε προ-, μετα- και περισυναπτικές θέσεις στους νευρώνες (Lindstrom 2000, Frazier et al 1998) ενώ είναι παρόντες σε υψηλή συγκέντρωση στον ιππόκαμπο και κυρίως στους GABA νευρώνες του (Breese et al 1997, Chen and Patrick 1997, Kawai et al 2002). Μάλιστα, α7 nachrs έχουν εντοπισθεί και σε μη νευρικά κύτταρα, όπως σε αναπτυσσόμενα μυϊκά (Romano et al 1997), καθώς και σε μακροφάγα κύτταρα (Wang et al 2003). Οι α8 nachrs έχουν εντοπιστεί στο νευρικό σύστημα όρνιθας ως ομοπενταμερή ή σε συνδυασμούς με α7 υπομονάδες, ενώ οι α9 nachrs εντοπίζονται στον κοχλία και στα αισθητικά γάγγλια του νευρικού συστήματος του αρουραίου (Elgoyhen et al 1994). Χαρακτηριστικό γνώρισμα των α7-α9 ομοπενταμερών nachrs είναι η υψηλή διαπερατότητά τους σε ιόντα Ca 2+ (Seguela et al 1993, Elgoyhen et al 1994, Gerzanich et al 1994). Οι νευρικοί nachrs εμπλέκονται σε μία πληθώρα παθολογικών καταστάσεων και δυσλειτουργιών του νευρικού συστήματος, όπως είναι η νόσος του Alzheimer, η νόσος του Parkinson, η κατάθλιψη, η σχιζοφρένεια και ορισμένοι τύποι επιληψίας, ενώ έχουν συσχετιστεί και με τον εθισμό στη νικοτίνη (Gotti et al 2006) Δομή του nachr Πρωτοταγής δομή των nachr υπομονάδων Με την πρόοδο της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA κατέστη αρχικά δυνατός ο προσδιορισμός cdnas των α (Noda et al 1982), β (Noda et al 1983b), γ (Claudio et al 1983) και δ (Noda et al 1983b) υπομονάδων του Torpedo nachr. Στη συνέχεια, αυτά τα cdnas χρησιμοποιήθηκαν ως ιχνηθέτες για την απομόνωση cdna και γενομικού DNA των μυϊκών και νευρικών nachr υπομονάδων από διάφορα είδη οργανισμών, μεταξύ των οποίων και του ανθρώπου, έτσι ώστε σήμερα να είναι γνωστές οι νουκλεοτιδικές και αμινοξικές ακολουθίες των διαφόρων nachr υπομονάδων σε μια πληθώρα ειδών (Noda et al 1983a, Nef et al 1984, LaPolla et al 1984, Boulter et al 1986, Nef et al 1988, Claudio 1989). Η διαλεύκανση της πρωτοταγούς δομής των τεσσάρων υπομονάδων (α, β, γ, δ) του Torpedo nachr και η σύγκριση μεταξύ τους κατέδειξε ένα σημαντικό ποσοστό ομολογίας της τάξεως του 35-50%, που μαρτυρά πως πρόκειται για εξελικτικά συγγενείς πρωτεΐνες (Raftery et al 1980, Noda et al 1983a). Παρόμοια ποσοστά 8

19 Εισαγωγή ομολογίας ευρέθησαν και μεταξύ των διαφορετικών ανθρώπινων μυϊκών nachrs. Η σύγκριση αμινοξικών αλληλουχιών της ίδιας υπομονάδας μεταξύ διαφορετικών ειδών κατέδειξε ακόμα υψηλότερα ποσοστά ομολογίας. Έτσι η μυϊκού τύπου α υπομονάδα (από Torpedo) βρέθηκε να εμφανίζει ~80% ομολογία με την α1 του ανθρώπινου μυϊκού nachr (Hucho et al 1996). Σε αυτές τις υπομονάδες βρίσκεται και ο συντηρημένος MIR επίτοπος, μεταξύ των θέσεων 67 και 76. Υψηλά είναι επίσης τα ποσοστά ομολογίας μεταξύ υπομονάδων των νευρικών nachrs του ίδιου είδους αλλά και μεταξύ διαφορετικών ειδών, όσο και μεταξύ υπομονάδων του μυϊκού και νευρικών nachrs (Sargent 1993). Έτσι, π.χ., η ανθρώπινη νευρική α7 nachr υπομονάδα, παρουσιάζει ~93% ομολογία με την α7 όρνιθας και ~97% ομολογία την α7 αρουραίου, ενώ οι διαφορετικές α και β υπομονάδες αρουραίου εμφανίζουν 40-70% ομολογία μεταξύ τους (Boulter et al 1990). Τα παραπάνω σημαντικά ποσοστά ομολογίας ενισχύουν την άποψη περί ύπαρξης κοινού προγονικού γονιδίου από το οποίο προήλθαν μέσω εξελικτικών διεργασιών όλα τα γονίδια που κωδικοποιούν τις διάφορες nachr υπομονάδες. Κοινό χαρακτηριστικό όλων των υπομονάδων του nachr αποτελεί η ύπαρξη δύο συντηρημένων καταλοίπων Cys, τα οποία αντιστοιχούν στις θέσεις 128 και 142 της μυϊκού τύπου α1 υπομονάδας του Torpedo nachr, τα οποία ενώνονται μεταξύ τους με δισουλφιδική γέφυρα σχηματίζοντας μια χαρακτηριστική Cys θηλιά (Cys loop) 15 συνολικά αμινοξικών καταλοίπων (Stroud et al 1990) (Eικόνες 2Α, 3Α). Τα 13 παρεμβαλλόμενα αμινοξέα είναι επίσης συντηρημένα και στο συνολό τους εμφανίζουν υδρόφοβο χαρακτήρα. Η σχηματιζόμενη αυτή Cys θηλιά είναι συντηρημένη σε όλες τις υπομονάδες των υποδοχέων της LCIC υπερ-οικογένειας (Ortells and Lunt 1995) και σε αυτό οφείλεται και η εναλλακτική ονομασία αυτής της υπερ-οικογένειας (Cys loop receptors) (Lester et al 2004). Αξίζει να σημειωθεί ότι οι α-nachr υπομονάδες διαθέτουν ένα επιπλέον ζεύγος γειτονικών καταλοίπων Cys, τα οποία συνδέονται επίσης με δισουλφιδικό δεσμό (Eικόνες 2Α, 3Α). Τα κατάλοιπα αυτά αντιστοιχούν στις θέσεις 192 και 193 της α υπομονάδας του Torpedo nachr (Kao et al 1986). Μερικές υπομονάδες φέρουν στο αμινοτελικό τους άκρο επιπλέον κατάλοιπα κυστεΐνης για τα οποία δεν έχει αποσαφηνιστεί εάν συμμετέχουν στο σχηματισμό κάποιου ενδομοριακού δισουλφιδικού δεσμού. Συγκεκριμένα, υπάρχει ένα τέτοιο κατάλοιπο κυστεΐνης στις α1, α7, δ, και ε υπομονάδες, και τρία στη γ υπομονάδα. Στην αμινοτελική περιοχή όλων των nachr υπομονάδων υπάρχουν επίσης ποικίλες θέσεις γλυκοζυλίωσης. Μάλιστα σε όλες τις μυϊκού τύπου, μυϊκές και νευρικές nachr 9

20 Εισαγωγή υπομονάδες, εκτός από τις α7, α8 και α9 υπομονάδες υπάρχει μία συντηρημένη θέση γλυκοζυλίωσης μέσα στην χαρακτηριστική Cys θηλιά, η οποία αντιστοιχεί στην Asn141 της α1 υπομονάδας του μυϊκού nachr (Eικόνες 2Α, 3Α). Εκτός από τη θέση αυτή έχουν βρεθεί επιπλέον i) μία θέση γλυκοζυλίωσης στις υπομονάδες α3, α6, β2, β3, γ και δ, ii) δύο θέσεις γλυκοζυλίωσης στις υπομονάδες α4, α5, β και ε, και iii) τρείς θέσεις γλυκοζυλίωσης στην α2 υπομονάδα (Mattson and Heilbronn 1975). Στην περίπτωση της α7 υπομονάδας υπάρχουν τρεις θέσεις γλυκοζυλίωσης, ενώ στις α8 και α9 υπομονάδες έχουν βρεθεί δύο θέσεις (Mattson and Heilbronn 1975). Οι αλυσίδες των ολιγοσακχαριτών που προσδίδονται σε αυτές τις θέσεις έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε μαννόζη, ενώ κάποιες περιέχουν σιαλικό οξύ (Nomoto et al 1986, Poulter et al 1989, Shoji et al 1992, Strecker et al 1994). Oι διάφορες υπομονάδες του nachr διαθέτουν εξωκυτταρικές, διαμεμβρανικές και κυτταροπλασματικές περιοχές, όπως είχε δειχθεί από σχετικά νωρίς (Strader et al 1979). Η ανάλυση του διαγράμματος υδροφοβικότητας της α υπομονάδας του Torpedo nachr επιβεβαίωσε την αρχική πρόβλεψη για τη διαμεμβρανική τοπογραφία των διάφορων nachr υπομονάδων (Noda et al 1983a, Devillers-Thiery et al 1983, Finer- Moore and Stroud 1984). Έτσι, κάθε nachr υπομονάδα αποτελείται από τέσσερις διαμεμβρανικές υδρόφοβες περιοχές (Μ1-Μ4), μήκους ~15-20 αμινοξέα έκαστη, από μία αμινοτελική υδρόφιλη περιοχή μήκους ~210 αμινοξέων, από μία μικρή υδρόφιλη περιοχή μεταξύ των Μ3 και Μ4 περιοχών στην οποία εντοπίζονται και οι θέσεις φωσφορυλίωσης των nachr υπομονάδων (Finer-Moore and Stroud 1984, Yee and Huganir, 1987) και από ένα υδρόφιλο καρβόξυ-τελικό άκρο μήκους ~4-28 αμινοξικών καταλοίπων (DiPaola et al 1989) Ανώτερα επίπεδα οργάνωσης των nachrs Για τον προσδιορισμό της δευτεροταγούς δομής των nachr υπομονάδων χρησιμοποιήθηκαν αρχικά διάφορες μέθοδοι, όπως κυκλικός διχρωϊσμός (CD), υπέρυθρη φασματοσκοπία μετασχηματισμού Fourier (FTIR) και συντονισμός Raman Moore et al 1974, Mielke and Wallace 1988, Wu et al 1990, Fong and McNamee 1987, Naumann et al 1993, Hucho et al 1996). Οι παραπάνω μελέτες έγιναν κυρίως σε παρασκευάσματα Torpedo υποδοχέα και οδήγησαν σε αποκλίσεις όσον αφορά στα υπολογιζόμενα ποσοστά σύστασης δευτεροταγούς δομής, πιθανότατα διότι σε καθεμιά χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικής φύσεως παρασκευάσματα υποδοχέα. Οι CD μελέτες 10

21 Εισαγωγή έδειξαν σύσταση δευτεροταγούς δομής ~24-45% α-έλικα και ~24-40% β-πτυχωτή δομή, οι μελέτες συντονισμού Raman κατέδειξαν σύσταση ~40% α-έλικα και ~34% β- δομή, ενώ μελέτες FTIR έδειξαν πως ο υποδοχέας αποτελείται από δομές α-έλικας σε ποσοστό 32-33% και από β-πτυχωτές επιφάνειες σε ποσοστό 36-43%. Όσον αφορά τα διαμεμβρανικά τμήματα του nachr, αρχικά υπήρχε η άποψη ότι αυτά είχαν σχεδόν αποκλειστικά δομή α-έλικας (Noda et al 1983b, Devillers-Thiery et al 1983, Finer-Moore and Stroud 1984). Στη συνέχεια, με ηλεκτρονική μικροσκοπία δισδιάστατων κρυστάλλων (2D) Torpedo nachr σε ανάλυση 9 Å διατυπώθηκε η άποψη ότι τα διαμεμβρανικά τμήματα εκτός από α-έλικες αποτελούνται και από β- πτυχωτές επιφάνειες (Unwin 1993). Η άποψη αυτή ενισχύθηκε και από αποτελέσματα φασματοσκοπικών μελετών, τα οποία υποδήλωσαν την ύπαρξη επίσης β-πτυχωτών επιφανειών μαζί με α-έλικες στα διαμεμβρανικά τμήματα (Görne-Tschelnokow et al 1994). Επίσης, με μία σειρά πειραμάτων ομοιοπολικής τροποποίησης αμινοξικών καταλοίπων του nachr διαμεμβρανικού τμήματος (Claudio et al 1983, Devillers- Thiery et al 1983), δείχθηκε ότι το ποσοστό δομών α-έλικας στη διαμεμβρανική περιοχή είναι μικρότερο του 100% που θεωρήθηκε αρχικά και μεγαλύτερο από 25% που προβλέφθηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία σε ανάλυση 9 Å (Unwin 1993). Επίσης, όσον αφορά τα εξωκυτταρικά αμινοτελικά άκρα των nachr υπομονάδων, είχε βρεθεί με CD μελέτες ότι αυτά αποτελούνται κυρίως από β-πτυχωτές επιφάνειες με τη συνεισφορά α-ελίκων (West et al 1997, Schrattenholz et al 1998, Alexeev et al 1999, Grant et al 1999, Yao et al 2002, Tsetlin et al 2002). Όλες οι παραπάνω μελέτες οδήγησαν σε μία υποθετική σύσταση δευτεροταγούς δομής ολόκληρου ή τμημάτων του nachr, καθώς και σε μία πολύ απλουστευμένη αναπαράσταση της τριτοταγούς και τεταρτοταγούς δομής του nachr, λόγω της περιορισμένης αναλυτικής ικανότητας των χρησιμοποιούμενων αυτών μεθόδων. Ουσιαστικά, τα μεγαλύτερα επιτεύγματα, όσον αφορά την κατανόηση της δομής του nachr σε ατομικό επίπεδο, πραγματοποιήθηκαν μόλις τα τελευταία χρόνια. Επιγραμματικά, αυτά είναι τα εξής: Α. Η λύση της δομής με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ της ομόλογης των EKΠ τμημάτων του nachr, πρωτεΐνης δέσμευσης της ACh (AChBP) γαστεροπόδων (Brejc et al 2001), καθώς και των συμπλόκων της με διάφορους χολινεργικούς προσδέτες (αγωνιστές και ανταγωνιστές) (Celie et al 2004, Celie et al 2005a, Celie et al 2005b, Hansen et al 2005, Bourne et al 2005, Ulens et al 2006, Dutertre et al 2007). Aυτές οι 11

22 Εισαγωγή δομές προσέγγισαν για πρώτη φορά τη δομή των θέσεων πρόσδεσης υποκαταστατών των nachrs σε ατομικό επίπεδο. Β. Η λύση της δομής του Torpedo nachr με χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (Unwin 2005) σε σχετικά όμως χαμηλή ανάλυση (4 Å). Με αυτή τη μελέτη αποκαλύφθηκε η αρχιτεκτονική της διάταξης των nachr υπομονάδων περιμετρικά του ιοντικού καναλιού με μεγαλύτερη ακρίβεια σε σχέση με παλαιότερες τέτοιου είδους μελέτες, καθώς και η δευτεροταγής δομή των υπομονάδων του μυϊκού τύπου nachr. Γ. Η λύση της δομής με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ του συμπλόκου της ΕΚΠ της α1 υπομονάδας του nachr επίμυος με α-bgtx (Dellisanti et al 2007), με την οποία αποκαλύφθηκε σε ατομικό επίπεδο η διαμόρφωση σημαντικών περιοχών της α1-εκπ, όπως ο MIR επίτοπος, καθώς και οι αλληλεπιδράσεις της με τον ανταγωνιστή α-bgtx. Δ. Η λύση της δομής με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ ενός πρόδρομου προκαρυωτικού πενταμερούς καναλιού της υπερ-οικογένειας LGIC, που απομονώθηκε από το βακτήριο Erwinia chrysanthemi (Hilf and Dutzler 2008). Παρακάτω περιγράφονται αναλυτικά τα ευρήματα των τεσσάρων αυτών επιτευγμάτων, μέσα από τα οποία αποκαλύφθηκε σε μεγάλο βαθμό η δομή του nachr Δομή της AChBP To 2001 έγινε γνωστή η τρισδιάστατη δομή της AChBP, η οποία λύθηκε σε ευκρίνεια 2,7 Å με κρυσταλλογραφία ακτίνων-χ (Brejc et al 2001). Η AChBP πρωτοαπομονώθηκε από γλοία κύτταρα του γαστερόποδου μαλακίου Lymnaea stagnalis και είναι μία πενταμερής υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη (Smit et al 2001). Η πρωτεΐνη αυτή απελευθερώνεται από τα γλοία κύτταρα που περιβάλλουν τη συναπτική σχισμή μεταξύ προ- και μετασυναπτικών κυττάρων, έπειτα από την πρόσδεση της ΑCh σε nachrs των γλοίων αυτών κυττάρων. Με αυτό τον τρόπο, η εκκρινόμενη από τα προσυναπτικά κύτταρα, ACh, απομακρύνεται από τη συναπτική σχισμή μετά την πρόσδεσή της στα μόρια AChBP, έτσι ώστε να μειώνεται ή να τερματίζεται απόκριση στην ACh των μετασυναπτικών κυττάρων. Έτσι, η AChBP ρυθμίζει την διαβίβαση της νευρικής ώσης σε γαστερόποδα (Sixma and Smit 2003). Το ώριμο μόριο της πρωτεΐνης αυτής έχει μήκος 210 αμινοξικών καταλοίπων και παρουσίαζει σχετικά υψηλή ομολογία με τις αμινο-τελικές ΕΚΠς των υπομονάδων των πενταμερών υποδοχέων-μελών της LGIC υπερ-οικογένειας. Μάλιστα, εμφανίζει μεγαλύτερη ομολογία με τις ΕΚΠς των α υπομονάδων του nachr, παρουσιάζοντας το 12

23 Εισαγωγή μεγαλύτερο ποσοστό αμινοξικής ταύτισης με την ΕΚΠ της νευρική α7 υπομονάδας του nachr (25% αμινοξική ταύτιση και 70% ομοιότητα). Το κάθε πρωτομερές της AChBP περιέχει όλα σχεδόν τα συντηρημένα αμινοξικά κατάλοιπα των εξωκυτταρικών περιοχών των υπομονάδων της LGIC υπερ-οικογένειας, συμπεριλαμβανομένων και αυτών που σχετίζονται με την πρόσδεση χολινεργικών υποκαταστατών. Μάλιστα, η AChBP διαθέτει την ικανότητα πρόσδεσης, εκτός της ACh και άλλων χαρακτηριστικών αγωνιστών και ανταγωνιστών του nachr, όπως η νικοτίνη, καρβαμυλοχολίνη, d- τουμποκουραρίνη και η α-bgtx (Smit et al 2001). Επίσης, διαθέτει τη χαρακτηριστική Cys θηλιά της LGIC υπερ-οικογένειας, με τη διαφορά όμως ότι τα αμινοξικά κατάλοιπα της Cys θηλιάς της υπολλείπονται κατά ένα από τη Cys θηλιά του nachr, ενώ επίσης είναι πιο υδρόφιλη από αυτή των nachrs. Για τους λόγους αυτούς, η AChBP αποτελεί το ομόλογο των ΕΚΠ τμημάτων κυρίως των α υπομονάδων του nachr, και συνεπώς η λύση της δομής της σε υψηλή ευκρίνεια προσέγγισε σε ατομικό επίπεδο τη διαμόρφωση των τελευταίων στο χώρο. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4 Α, η AChBP συγκροτείται από πέντε μονομερή (Α- Ε), τα οποία διατάσσονται περιμετρικά γύρω από ένα κεντρικό πόρο, διαμέτρου ~18 Å. Η διάμετρος του μορίου της AChBP είναι 80 Å, ενώ το ύψος του είναι 62 Å (Εικόνες 4 Β, Γ). Οι διαστάσεις αυτές του πενταμερούς μορίου της AChBP βρέθηκαν να είναι σε συμφωνία με τις διαστάσεις του αμινο-τελικού ΕΚΠ τμήματος του Torpedo nachr, οι οποίες είχαν μέχρι εκείνη τη χρονική στιγμή αποκαλυφθεί με μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σε ανάλυση 4,6 Å (Miyazawa et al 2003), ενισχύοντας ακόμη περισσότερο την άποψη ότι η AChBP αποτελεί το δομικό ομόλογο των ΕΚΠ του nachr. Στο πενταμερές μόριο, οι μόνες επαφές των υπομονάδων μεταξύ τους, λαμβάνουν χώρα στις διεπιφάνειες που σχηματίζονται μεταξύ δύο γειτονικών πρωτομερών. Έτσι, κάθε πρωτομερές μόριο AChBP διαθέτει δύο τέτοιες διεπιφάνειες μεταξύ των δύο άλλων παράπλευρων πρωτομερών, οι οποίες ονομάζονται συμβατικά θετικές (plus side) και αρνητικές πλευρές (minus side). Ως θετική, ονομάζεται εκείνη η πλευρά του κάθε μονομερούς που βρίσκεται σε επαφή με το γειτονικό του πρωτομερές κατά την αντίστροφη φορά από εκείνη των δεικτών του ρολογιού, ενώ ως αρνητική συμβολίζεται η αντιδιαμετρική του πλευρά που βρίσκεται σε επαφή με το δεύτερο γειτονικό του πρωτομερές. Έτσι, π.χ. στην διεπιφάνεια μεταξύ των Α και Β πρωτομερών, συμμετέχουν η θετική πλευρά της Α υπομονάδας με την αρνητική πλευρά της Β υπομονάδας (Εικόνες 4 Α, Γ), ενώ η αρνητική πλευρά της Α υπομονάδας συνδέεται με την θετική πλευρά της Ε υπομονάδας (Εικόνα 4 Α), κοκ. 13

24 Εισαγωγή Θέσεις πρόσδεσης ACh Α. Β. Θέση πρόσδεσης ACh Γ. Δ. Εικόνα 4. Δομή της AChBP. (A) Kάτοψη του ομοπενταμερούς μορίου AChBP. Κάθε πρωτομερές είναι χρωματισμένο διαφορετικά και συμβολίζεται με διαφορετικό γράμμα (Α- Ε). Στις διεπιφάνειες μεταξύ γειτονικών πρωτομερών δημιουργούνται οι θέσεις πρόσδεσης ACh, οι οποίες στη συγκεκριμένη περίπτωση καταλαμβάνονται από ένα μόριο HEPES, το οποίο εμπεριέχετο στο διάλυμα κρυστάλλωσης. (Β) Πλάγια άποψη του πρωτομερούς μορίου AChBP, όπως φαίνεται από την πλευρά εκτός του κεντρικού πόρου. Διακρίνεται το αμινοτελικό και καρβοξυ-τελικό άκρο (N, C terminus), η χαρακτηριστική Cys θηλιά (Cys loop), το συντηρημένο, στις nachr α-εκπς, ζεύγος κυστεϊνών (Double Cys) και η περιοχή που αντιστοιχεί στο MIR επίτοπο του nachr. (Γ) Πλάγια άποψη της διεπιφάνειας και της θέσης πρόσδεσης ACh που σχηματίζεται από τα γειτονικά πρωτομερή Α και Β. (Δ) Τοπολογικό διάγραμμα του πρωτομερούς μορίου AChBP. Ν: αμινο-τελικό άκρο, α1: α-έλικα, β1-β10: πτυχωτά φύλλα, L1-10: θηλιές ακανόνιστης δομής, S-S: δισουλφιδικοί δεσμοί, C: καρβοξυτελικό άκρο (Brejc et al 2001). 14

25 Εισαγωγή Όσον αφορά το κάθε πρωτομερές της AChBP, αυτό έχει διαστάσεις 62x47x34 Å 3. Η δευτεροταγής του δομή έχει σύσταση ~5% α-έλικα και ~45% β-πτυχωτές επιφάνειες (Εικόνα 4 Β). Πιο αναλυτικά, το κάθε πρωτομερές συγκροτείται από μία αμινο-τελική α-έλικα, από δέκα πτυχωτά φύλλα (β1-β10), καθώς και από δέκα θηλιές (L1-L10), ακανόνιστης δομής, οι οποίες συνδέουν τα στοιχεία κανονικής δομής (α-έλικα και β- πτυχωτά φύλλα) μεταξύ τους (Εικόνες 4 Β, Δ). Η σύσταση αυτή της δευτεροταγούς δομής της AChBP βρίσκεται σε συμφωνία με CD μελέτες που είχαν πραγματοποιηθεί σε ΕΚΠ τμήματα των nachrs (West et al 1997, Schrattenholz et al 1998, Alexeev et al 1999, Grant et al 1999, Yao et al 2002, Tsetlin et al 2002), οι οποίες είχαν δείξει την κυριαρχία β-δομής στα ομόλογα αυτά τμήματα του nachr με την AChBP. Οι β- πτυχωτές επιφάνειες του κάθε πρωτομερούς AChBP αναδιπλώνονται μεταξύ τους, έτσι ώστε να σχηματίζεται ένας υδρόφοβος πυρήνας (β-sandwich core), ο οποίος χαρακτηρίζεται και από σχετική ακαμψία, σε αντίθεση με τις ευλύγιστες θηλιές L1- L10. Στην θηλιά L10, μεταξύ των β9 και β10 πτυχωτών φύλλων εδράζει το ζεύγος των συντηρημένων και συζευγμένων με δισουλφιδικό δεσμό καταλοίπων Cys (θέσεις 187 και 188), το οποίο χαρακτηρίζει και τα ΕΚΠ τμήματα των α υπομονάδων του nachr. Η θηλιά L7, η οποία συνδέει τα β6 και β7 πτυχωτά φύλλα αποτελεί την χαρακτηριστική Cys θηλιά της LGIC υπερ-οικογένειας (μεταξύ των καταλοίπων Cys στις θέσεις 128 και 142), και αυτή μαζί με τις θηλιές L2 και L9, μεταξύ των β1-β2 και β8-β9 πτυχωτών φύλλων, αντίστοιχα, βρίσκονται προς το κατώτερο τμήμα του κάθε πρωτομερούς. Οι ομόλογες θηλιές στα ΕΚΠ τμήματα του nachr αποδείχθηκε αργότερα ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη λειτουργία του, αφού βρίσκονται σε στενή επαφή με τα διαμεμβρανικά του τμήματα (Unwin 2005). Επίσης, μία σημαντική πληροφορία που προέκυψε για τον nachr από τη λύση της δομής της AChBP, αφορούσε στη διαμόρφωση της περιοχής της AChBP που αντιστοιχεί στο MIR επίτοπο της α υπομονάδας του μυϊκού nachr. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4 Β, η περιοχή αυτή στο κάθε πρωτομερές της AChBP βρίσκεται στην L3 θηλιά, μεταξύ των β2 και β3 πτυχωτών φύλλων και είναι πλήρως εκτεθειμένη στο περιβάλλον του μορίου. Αυτό δικαιολογεί και την υψηλού βαθμού αντιγονικότητά της στην περίπτωση του ανθρώπινου nachr που οδηγεί στη βαριά μυασθένεια, λόγω της εύκολης προσπελασιμότητάς της σε αντιγόνα κατευθυνόμενα εναντίον της. 15

26 Εισαγωγή Ατομική δομή της θέσης πρόσδεσης ACh Η λύση της δομής της AChBP αποκάλυψε για πρώτη φορά τη διαμόρφωση σε ατομικό επίπεδο της θέσης πρόσδεσης της ACh και διάφορων άλλων χολινεργικών προσδετών, στα ομόλογα ΕΚΠ τμήματα των α υπομονάδων του nachr. Όπως προαναφέρθηκε, στο πενταμερές της AChBP σχηματίζονται πέντε διεπιφάνειες μεταξύ των θετικών και αρνητικών πλευρών των ισάριθμων πρωτομερών της (Εικόνα 4 Α), στις οποίες σχηματίζονται και οι πέντε διαφορετικές θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών. Ο προσδιορισμός αυτών των θέσεων πρόσδεσης προέκυψε από την παρατήρηση της ύπαρξης μορίων HEPES (συστατικό του ρυθμιστικού διαλύματος στο οποίο ήταν διαλυμένη η AChBP), σε συγκεκριμένες θέσεις μέσα στις διεπιφάνειες του πενταμερούς AChBP (Εικόνες 4 Α, Γ). To μόριο HEPES περιέχει μία τεταρτοταγή θετικά φορτισμένη αμινομάδα, προσομοιάζοντας διάφορους χολινεργικούς προσδέτες του nachr. Για το λόγο αυτό, το μόριο HEPES λειτούργησε ως ένας «ψευδο»-προσδέτης της AChBP. Βρέθηκε λοιπόν ότι η θέση πρόσδεσης του μορίου HEPES, και άρα και των διάφορων χολινεργικών προσδετών, σχηματίζεται από τη συνεισφορά ενός πλήθους αρωματικών και υδρόφοβων αμινοξικών καταλοίπων που βρίσκονται σε θηλιές της θετικής πλευράς του ενός πρωτομερούς και σε β-πτυχωτά φύλλα της αρνητικής πλευράς του γειτονικού πρωτομερούς. Μάλιστα, η θέση πρόσδεσης διακρίνεται στην κυρίως (θετική) και στην συμπληρωματική (αρνητική) πλευρά. Η κυρίως πλευρά σχηματίζεται από τη συνεισφορά αμινοξικών καταλοίπων της θετικής πλευράς του ενός πρωτομερούς (πλευρά στην οποία βρίσκεται η χαρακτηριστική Cys θηλιά, βλ. Εικόνα 4Β), τα οποία εμφανίζουν υψηλό βαθμό συντήρησης μεταξύ των μελών της LGIC υπερ-οικογένειας και τα οποία συγκροτούν τις θηλιές Α (Tyr149), B (Trp143, Trp145) και C (Tyr185, Cys187, Cys188, Tyr192) (Εικόνα 5). Η συμπληρωματική πλευρά της θέσης πρόσδεσης σχηματίζεται από τη συνεισφορά λιγότερο συντηρημένων αμινοξικών καταλοίπων της αρνητικής πλευράς του γειτονικού πρωτομερούς, τα οποία συγκροτούν τις θηλιές D (Trp53, Gln55), E (Arg104, Val106, Leu112, Met114) και F (Tyr164) (Εικόνα 5). Αξίζει να σημειωθεί ότι όλα αυτά τα αμινοξικά κατάλοιπα που αποκαλύφθηκαν να συμμετέχουν στο σχηματισμό των θέσεων πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών στην AChBP, είχαν προηγουμένως βρεθεί με μελέτες μεταλλαξιγεννέσεων και σήμανσης με φθορισμό να συμμετέχουν στο σχηματισμό των αντίστοιχων θέσεων πρόσδεσης του 16

27 Εισαγωγή nachr (Kao and Karlin 1986, Dennis et al 1988, Galzi et al 1990, Galzi et al 1991, Fu and Sine 1994). Τέλος, το μόριο του HEPES βρέθηκε να καταλαμβάνει ίσες επιφάνειες μεταξύ της κύριας και συμπληρωματικής πλευράς της θέσης πρόσδεσης, ενώ η τεταρτοταγής αμινομάδα του βρέθηκε να αλληλεπιδρά με την Trp143 μέσω δεσμών κατιόντος-π, όπως θα αναμένονταν για nachr αγωνιστές (Dougherty 1996, Zhong et al 1998). Για αυτό το λόγο η δομή αυτή της AChBP θεωρήθηκε πως αποτελούσε και μία υποτυπώδη δομή της θέσης πρόσδεσης του nachr, παρουσία αγωνιστή. Εικόνα 5. Δομή της θέσης πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών της AChBP. (A) Απεικόνιση των κύριων αλυσίδων α-ατόμων C των δύο πρωτομερών AChBP καθώς και των πλευρικών ομάδων τους που συγκροτούν τη θέση πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών. Τα γράμματα Α και Β που προηγούνται των απεικονιζόμενων αμινοξικών καταλοίπων αναφέρονται στα πρωτομερή μόρια AChBP στα οποία ανήκουν αυτά τα κατάλοιπα. (Β) Απεικόνιση του χάρτη ηλεκτρονιακής πυκνότητας της θέσης πρόσδεσης υποκαταστατών. Διακρίνεται (με μωβ χρώμα) το προσδεδεμένο μόριο HEPES. (Γ), (Δ) Απεικόνιση των θηλιών A, B, C της κύριας πλευράς της θέσης πρόσδεσης και των θηλιών D, E, F της συμπληρωματικής πλευράς της θέσης πρόσδεσης, αντίστοιχα (Brejc et al 2001). 17

28 Εισαγωγή Πρόσδεση αγωνιστών στη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών της AChBP Την πρώτη λύση της δομής της AChBP σε ατομικό επίπεδο, ακολούθησαν και άλλες δομές υψηλής ευκρίνειας, στις οποίες η απομονωμένη AChBP από διάφορα είδη μαλακίων συγκρυσταλλώθηκε με γνωστούς nachr αγωνιστές, αποκαλύπτοντας έτσι τις ειδικές αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα μεταξύ των αγωνιστών και της θέσης πρόσδεσής τους. Πιο συγκεκριμένα, η AChBP του είδους Lymnaea stagnalis (L-AChBP) συγκρυσταλλώθηκε με τους αγωνιστές του nachr, νικοτίνη και καρβαμυλοχολίνη (Celie et al 2004), ενώ αργότερα η AChBP του είδους Aplysia californica (A-AChBP) συγκρυσταλλώθηκε με τους αγωνιστές του nachr, λομπελίνη και επιβατιδίνη (Hansen et al 2005). Σε αυτό το σημείο αξίζει να τονισθεί ότι η αρχιτεκτονική της θέσης πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών με την συγκρότηση του αρωματικού πυρήνα να αποτελείται από τα κατάλοιπα Tyr93, Trp147, Tyr188 και Tyr195 της κυρίως πλευράς και από την Tyr195 της συμπληρωματικής πλευράς (αρίθμηση κατά A- AChBP), είναι ιδιαίτερα συντηρημένη μεταξύ των AChBPs προερχόμενων από διαφορετικά είδη (Eικόνα 6). Σε όλες αυτές τις δομές, ο αγωνιστής προσδένεται με την ανάπτυξη δεσμών υδρογόνου, αλληλεπιδράσεων κατιόντος-π, καθώς και δεσμών Vander-Waals. Μάλιστα, η εξαιρετικά συντηρημένη Trp143 (αρίθμηση κατά L-AChBP) της κύριας πλευράς της θέσης πρόσδεσης βρίσκεται στο κέντρο των συμπλόκων αυτών και αναπτύσσει ισχυρές αρωματικές αλληλεπιδράσεις κατιόντος-π με τους αγωνιστές. Το επίσης εξαιρετικά συντηρημένο κατάλοιπο Asp85 (αρίθμηση κατά L-AChBP) παίζει ένα σημαντικό δομικό ρόλο. Αυτό βρίσκεται ακριβώς πίσω από την κεντρική Trp143, πολώνοντας την κύρια καρβονυλική της ομάδα, κάτι που σταθεροποιεί περαιτέρω το θετικό φορτίο του καθενός από αυτούς αγωνιστές. Επίσης, το συντηρημένο σε όλες τις AChBPs, καθώς και στις α υπομονάδες του nachr, ζεύγος κυστεϊνών C187-C188 (αρίθμηση κατά L-AChBP) αλληλεπιδρά με όλους τους αγωνιστές, αλλά η C187 κυρίως με την καρβαμυλοχολίνη (Eικόνα 6 Β), ενώ η C188 με την νικοτίνη (Eικόνα 6 Α). Η Tyr185 της L-AChBP (Tyr188 στην A-AChBP) σχηματίζει αρωματικές αλληλεπιδράσεις με την καρβαμυλοχολίνη και την επιβατιδίνη, αλλά όχι με τη νικοτίνη, ενώ σχηματίζει δεσμούς Van der Waals με τη μεθυλομάδα της λομπελίνης. Οι αγωνιστές λομπελίνη και επιβατιδίνη αναπτύσσουν και επιπλέον δεσμούς με την κεντρική Trp147 της A-AChBP (143 στη L-AChBP) (Eικόνες 6 Γ, Δ). 18

29 Εισαγωγή Σε όλες τις περιπτώσεις, η πρόσδεση των αγωνιστών ενισχύεται και από την ανάπτυξη δεσμών με διάφορα και λιγότερο συντηρημένα κατάλοιπα της συμπληρωματικής πλευράς της θέσης πρόσδεσης. Έτσι, στην περίπτωση της λομπελίνης αναπτύσσεται μεταξύ της τεταρτοταγούς αμινομάδας της και της καρβονυλομάδας της Trp147 ένας επιπλέον δεσμός υδρογόνου, ενώ η αμίνη της πυριδίνης της επιβατιδίνης προσδένεται στην Trp147 και Ile118 (Leu112 στην L- AChBP) μέσω ενός μορίου νερού. Επίσης, η Leu112 και η Met114 της L-AChBP (Met116 και Ile118 στην A-AChBP) σχηματίζουν υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με την νικοτίνη, καρβαμυλοχολίνη και τη λομπελίνη, ενώ η Ile118 εμπλέκεται στο σχηματισμό δεσμού υδρογόνου μεταξύ της επιβατιδίνης και της A-AChBP. Tέλος, τα κατάλοιπα Leu102 και Met114 της L-AChBP συνεισφέρουν σημαντικά στην πρόσδεση της νικοτίνης, αφού αναπτύσσουν ένα δεσμό υδρογόνου με το άζωτο N1 της πυριδίνης της νικοτίνης, μέσω ενός μορίου νερού. Νικοτίνη Α. Β. Καρβαμυλοχολίνη Λομπελίνη Γ. Δ. Επιβατιδίνη Εικόνα 6. Πρόσδεση χολινεργικών αγωνιστών στην AChBP. Σύμπλοκα L-AChBP με (Α) νικοτίνη (Celie et al 2004), (Β) καρβαμυλοχολίνη (Celie et al 2004). Σύμπλοκα Α-AChBP με (Γ) λομπελίνη (Hansen et al 2005) και (Δ) επιβατιδίνη (Hansen et al 2005). 19

30 Εισαγωγή Πρόσδεση ανταγωνιστών στη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών της AChBP Σχεδόν ταυτόχρονα με την επίτευξη της συγκρυστάλλωσης διάφορων AChBPs με αγωνιστές, πραγματοποιήθηκαν και συγκρυσταλλώσεις AChBPs με διάφορους ανταγωνιστές του nachr. Οι δομές υψηλής ευκρίνειας που ελήφθησαν για την L- AChBP παρουσία του ανταγωνιστή α-κομπρατοξίνη (α-cbtx) (Bourne et al 2005) και για την A-AChBP με α-κονοτοξίνες (α-ctxs) (Hansen et al 2005, Celie et al 2005a, Ulens et al 2006, Dutertre et al 2007), καθώς και με τον αλκαλοειδή ανταγωνιστή μεθυλ-κακονιτίνη (MLA) (Hansen et al 2005), αποκάλυψαν τα αμινοξικά κατάλοιπα που εμπλέκονται στην πρόσδεση ανταγωνιστών, αλλά και τις σημαντικές δομικές αλλαγές που επάγονται στην AChBP μετά την πρόσδεση χολινεργικών ανταγωνιστών. Η α-cbtx απομονώνεται από φίδια του είδους Naja sp. και ανήκει στις α- νευροτοξίνες, μέλος των οποίων αποτελεί και η α-bgtx (Εικόνα 7 Α). Εμφανίζει τη χαρακτηριστική αναδίπλωση στο χώρο του προτύπου των τριών δακτύλων (threefingered fold) (Tsetlin and Hucho 2004). Πιο συγκεκριμένα, η δομή της αποτελείται από ένα υδρόφοβο πυρήνα β-πτυχώσεων, ο οποίος σχηματίζεται από τέσσερεις δισουλφιδικούς δεσμούς μεταξύ διάφορων β-πτυχωτών φύλλων. Από τον πυρήνα αυτό του μορίου εξέρχονται τρεις θηλιές (Ι, ΙΙ και ΙΙΙ). Στην α-έλικα της θηλιάς ΙΙ εδράζει και ο πέμπτος χαρακτηριστικός δισουλφιδικός δεσμός των α-νευροτοξινών, ο οποίος παίζει πολύ σημαντικό ρόλο για την αναγνώριση και πρόσδεση σε νευρικούς nachrs (Servent et al 2000). Όπως φάνηκε στην κρυσταλλική δομή του συμπλόκου L- AChBP/α-Cbtx, η θηλιά ΙΙ της α-cbtx διεισδύει βαθιά μέσα στη θέση πρόσδεσης της AChBP, όπου συγκρατείται υπό γωνία ~45 σε σχέση με τον κεντρικό άξονα συμμετρίας της AChBP, κυρίως μέσω υδρόφοβων και αρωματικών αλληλεπιδράσεων (Εικόνα 8 Α). Tα κατάλοιπα Phe29 και Arg3 που βρίσκονται στην άκρη της θηλιάς ΙΙ της α-cbtx αλληλεπιδρούν με τα υψηλού βαθμού συντήρησης κατάλοιπα Trp53, Tyr185, Tyr192 και Trp143 της κύριας πλευράς της θέσης πρόσδεσης της L-AChBP. Επίσης, παρατηρούνται αλληλεπιδράσεις αμινοξικών καταλοίπων της θηλιάς ΙΙ της α- Cbtx με τα κατάλοιπα Glu163, Glu55, Leu112, Met114 και Tyr164 της συμπηρωματικής πλευράς της θέσης πρόσδεσης. Η πρόσδεση της α-cbtx στην AChBP επάγει μία σημαντική μετατόπιση των θηλιών C και F της θέσης πρόσδεσης κατά ~10 Å σε σχέση με την αρχική τους θέση, όπως φάνηκε από τη σύγκριση με την δομή της A-AChBP ελεύθερης προσδετών (Hansen et al 2005). 20

31 Εισαγωγή Oι α-κονοτοξίνες (α-ctxs) απομονώνονται από μαλάκια Conus sp. και ανήκουν στην κατηγορία των μικρών πεπτιδικών τοξινών. Η δομή τους (Εικόνα 7 Β) αποτελείται από μία α-έλικα, η οποία πλαισιώνεται από δύο συντηρημένους δισουλφιδικούς δεσμούς που σχηματίζουν ένα χαρακτηριστικό πλέγμα δύο θηλιών (two-loop framework) (Tsetlin and Hucho 2004). Α. Β. Εικόνα 7. Δομή χαρακτηριστικών μορίων τοξινών. (Α) α-bgtx, (B) α-ctx-imi. (Tsetlin and Hucho 2004). Οι α-ctxs εμφανίζουν ιδιαίτερη επιλεκτικότητα και εξειδίκευση πρόσδεσης σε διάφορους nachr υπότυπους. Έτσι, π.χ. η α-ctx PnIA, ένας συναγωνιστικός ανταγωνιστής των νευρικών nachrs, εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης για α3β2 nachrs σε σχέση με τον α7 nachr (McIntosh et al 1994). H μετάλλαξη όμως Ala10Leu αντιστρέφει την επιλεκτικότητά του προς τoν α7 nachr (Luo et al 1999). To διπλό μετάλλαγμα (Ala10Leu/Asp14Lys) αυξάνει περαιτέρω την επιλεκτικότητα για τον α7 nachr όρνιθας (Hogg et al 2003). Όσον αφορά την α-ctx-imi, ένα ειδικό αναστολέα του α7 nachr (McIntosh et al 1994), αυτή βρέθηκε πρόσφατα να εμφανίζει ακόμη μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης για τον ανθρώπινο α3β2 nachr (Elisson et al 2004). Όπως φάνηκε από τις κρυσταλλικές δομές των συμπλόκων του διπλού μεταλλάγματος PnIA, όσο και της ImI α-ctx με την A-AChBP, ο δισουλφιδικός δεσμός Cys2-Cys8 (θηλιά I) και των δύο α-ctxs αλλαηλεπιδρά με τον εξαιρετικά συντηρημένο δισουλφιδικό δεσμό της θηλιάς C της AChBP (Εικόνες 8 Β, Γ). Εντούτοις, οι δύο αυτές α-ctxs αναπτύσσουν διαφορετικές αλληλεπιδράσεις με τη θέση πρόσδεσης, κάτι που πιθανώς διαφοροποιεί την επιλεκτικότητά τους έναντι nachr υποτύπων. Το διπλό μετάλλαγμα PnIA αναπτύσσει κυρίως υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με τη θέση πρόσδεσης της AChBP, χρησιμοποιώντας τα κατάλοιπα 21

32 Εισαγωγή Pro7, Ala9 και Leu10, ενώ η ImI χρησιμοποιεί το τριπεπτίδιο Asp5-Pro6-Arg7 της θηλιάς I για να σχηματίσει μία γέφυρα άλατος καθώς και υδρογονικούς δεσμούς. Εικόνα 8. Πρόσδεση nachr χολινεργικών ανταγωνιστών στην AChBP. Σύμπλοκα (Α) L-AChBP με α-cbtx (Bourne et al 2005), (Β) Α-AChBP με α-ctx PnIA (Ala10Leu D14Lys) (Celie et al 2005a), (Γ) Α-AChBP με α-ctx ImI (Hansen et al 2005), (Δ) Α-AChBP με μεθυλ-κακονιτίνη (MLA) (Hansen et al 2005). Η πλευρική αλυσίδα της Leu10 της PnIA, η οποία είναι υπεύθυνη για την υψηλή συγγένεια πρόσδεσης στον α7 nachr βρίσκεται τοποθετημένη μέσα σε μία υδρόφοβη κοιλότητα που σχηματίζεται από τα κατάλοιπα Val146 (κυρίως πλευρά), Val106, Met114 και Ile116 (συμπληρωματική πλευρά) της Α-AChBP, ενώ η Lys14 του διπλού αυτού μεταλλάγματος δεν συμμετέχει στην πρόσδεση με την A-AChBP. Η 22

33 Εισαγωγή επιλεκτικότητα της πρόσδεσης της ImI σε διάφορους υπότυπους του nachr αντικατοπτρίζεται και στην ειδική αναστολή που προκαλεί στην A-AChBP σε σχέση με τη L-AChBP (Hansen et al 2004, Celie et al 2005b). H αδυναμία πρόσδεσης της ImI στη L-AChBP μπορεί εν μέρη να εξηγηθεί από την ύπαρξη ενός καταλοίπου Gln στη L-AChBP, αντί του Asp75 (A-AChBP), το οποίο τελευταίο σχηματίζει μία ιδιαίτερη αλληλεπίδραση με την Trp10 της ImI. Επίσης, η Ile116 της A-AChBP είναι παρόμοια της αντίστοιχης Leu119 του α3β2 nachr, η οποία βρέθηκε πρόσφατα να αποτελεί ένα κατάλοιπο-κλειδί για την πρόσδεση μορίων α-ctx (Dutertre et al 2005). Αντίθετα, στην L-AChBP, η θέση αυτή αντιστοιχεί στο μεγαλύτερο κατάλοιπο Met114, το οποίο μπορεί να παρεμποδίζει την πρόσδεση α-ctxs. Στα σύμπλοκα AChBP/Ctxs, τόσο το διπλό μετάλλαγμα PnIA, όσο και η ImI α-ctx βρέθηκαν να έχουν εισχωρήσει βαθιά μέσα στη θέση πρόσδεσης της AChBP, καλύπτοντας το 60% και 75% της προσπελάσιμης στο διαλύτη επιφάνειάς τους, αντίστοιχα (Εικόνες 8 Β, Γ). Κατά την πρόσδεση αυτών των α-ctxs, η θηλιά C της A- AChBP σταθεροποιείται σε μία «ανοικτή» διαμόρφωση, αντίστοιχη με αυτή που παρατηρείται στο σύμπλοκο A-AChBP/α-Cbtx (Βourne et al 2005). Αντιθέτως, η θηλιά F δεν μετατοπίζεται καθόλου, πιθανότατα επειδή οι α-ctxs είναι πολύ μικρότερα μόρια από την α-cbtx. Η σταθεροποίηση της θηλιάς C σε αυτή την διαμόρφωση παρατηρήθηκε επίσης και στην περίπτωση του συμλόκου Α-AChBP/MLA (Εικόνα 8 Δ) Επαγόμενες δομικές αλλαγές κατά την πρόσδεση υποκαταστατών Η σύγκριση των κρυσταλλικών δομών των συμπλόκων AChBPs/αγωνιστές με τη δομή του συμπλόκου L-AChBP/HEPES ή ακόμη καλύτερα με την απο-μορφή (απουσία προσδέτη ή οποιαδήποτε μορίου που να μοιάζει με προσδέτη) της A-AChBP (Hansen et al 2005), ανέδειξε σημαντικές δομικές αναδιευθετήσεις στην AChBP κατά την πρόσδεση των αγωνιστών, οι οποίες είναι πολύ πιθανό να πυροδοτούν το έναυσμα για τη διάνοιξη του ιοντικού καναλιού στην περίπτωση ολόκληρου του nachr, δεδομένου ότι οι AChBPs είναι τα δομικά ομόλογα των ΕΚΠ τμημάτων του nachr. Έτσι, κατά την πρόσδεση αγωνιστών φανερώθηκε η σημαντική μετακίνηση της θηλιάς C της κυρίως πλευράς της θέσης πρόσδεσης, έτσι ώστε να «κλείνει» την είσοδο της υδρόφοβης κοιλότητάς της και να περιβάλλει ταυτόχρονα τα μόρια των αγωνιστών. 23

34 Εισαγωγή Στην «ανοικτή» της διαμόρφωση (απουσία αγωνιστών), η συντηρημένη Tyr185 της θηλιάς C (αντιστοιχεί στην Tyr190 της α1 υπομονάδας του μυϊκού nachr) βρίσκεται σε απόσταση 8 Å από τη συντηρημένη Lys139 (αντιστοιχεί στην Lys145 της α1 υπομονάδας ) του β7-πτυχωτού φύλλου, η οποία σχηματίζει μία γέφυρα άλατος με το συντηρημένο κατάλοιπο Asp194 (αντιστοιχεί στο Asp200 της nachr α1 υπομονάδας) του β10-πτυχωτού φύλλου. Στα σύμπλοκα όμως της AChBP με αγωνιστές, η θηλιά C μετατοπίζεται ώστε η Tyr185 να έρχεται πλέον σε απόσταση 2-3 Å με τη Lys139, σπάζοντας ταυτόχρονα τη γέφυρα άλατος με το Asp194 (αρίθμηση κατά L-AChBP). Στην περίπτωση του nachr, έχει βρεθεί ότι μεταλλάξεις σε οποιαδήποτε από τα τρία αυτά κατάλοιπα παρεμποδίζουν το άνοιγμα του καναλιού (Mukhtasimova et al 2005). Eν κατακλείδι, κατά την πρόσδεση αγωνιστών, η θηλιά C της θέσης πρόσδεσης μετακινείται κατά τέτοιο τρόπο, ώστε να ευνοεί την ανάπτυξη ενός υδρογονικού δεσμού μεταξύ δύο συντηρημένων καταλοίπων Tyr και Lys, σταθεροποιώντας τη θηλιά C στην καινούρια της διαμόρφωση. Συμπερασματικά, όλες οι μέχρι στιγμής κρυσταλλικές δομές διάφορων AChBPs δύναται να καταταγούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες, ανάλογα με τη διευθέτηση της θηλιάς C της κυρίως πλευράς της θέσης πρόσδεσης: «ανοικτή» ή «κλειστή» (Εικόνα 9 Α). Η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνει τις δομές της απο-μορφής της A-AChBP καθώς και τις δομές όλων των συμπλόκων των AChBPs με ανταγωνιστές (α-cbtx, α-ctx- PnIA-double-mutant, α-ctx-imi και MLA), αντιπροσωπεύοντας την κατάσταση ηρεμίας των nachrs. Η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνει τις δομές των συμπλόκων της AChBP με αγωνιστές (νικοτίνη/l-achbp, καρβαμυλοχολίνη/l-achbp, λομπελίνη/a-achbp και επιβατιδίνη/a-achbp) ή με μόρια που προσομοιάζουν κατιονικούς αγωνιστές (HEPES/L-AChBP, HEPES/A-AChBP), αντιπροσωπεύοντας την ενεργή κατάσταση των nachrs. Μεταξύ των δομών των δύο αυτών κατηγοριών, η θηλιά C μετατοπίζεται ακόμη και κατά 11 Å, όπως παρατηρήθηκε κατά τη σύγκριση των δύο ακραίων καταστάσεων, δηλαδή μεταξύ των συμλόκων της AChBP με την α- Ctx-ImI και με την επιβατιδίνη (Εικόνα 9 Β) (Dutertre and Lewis 2006). Η υπέρθεση όλων αυτών των δομών υποδηλώνει επίσης, εκτός της μετατόπισης της θηλιάς C και σημαντικές μετακινήσεις των θηλιών β1-β2, β8-β9 και της Cys θηλιάς κατά την πρόσδεση αγωνιστών (Εικόνα 9 Γ) (Ulens et al 2006). 24

35 Εισαγωγή A. «Ανοικτή» διαμόρφωση «Κλειστή» διαμόρφωση Θηλιά C Θηλιά C Θηλιά C B. Θηλιά C Θηλιά C Θηλιά C α-ctx-imi Επιβατιδίνη Γ. Εικόνα 9. Επαγόμενες δομικές αλλαγές κατά την πρόσδεση υποκαταστατών στην AChBP. (A) Σχηματική αναπαράσταση της μετατόπισης της θηλιάς C του καθενός μονομερούς της AChBP παρουσία αγωνιστή και ανταγωνιστή (Hansen et al 2005). (Β) Αναπαράσταση της μετατόπισης της θηλιάς C μεταξύ 2 ακραίων καταστάσεων. Στο αριστερά απεικονιζόμενο διμερές (απεικονίζονται μόνο τα δύο από τα πέντε μονομερή της AChBP με πράσινο και μπλέ χρώμα, αντίστοιχα) έχει γίνει πρόσδεση του ανταγωνιστή α-ctx-imi (κόκκινο χρώμα), ενώ στο δεξιά απεικονιζόμενο διμερές έχει γίνει πρόσδεση του αγωνιστή επιβατιδίνη (κόκκινο χρώμα) (Dutertre and Lewis 2006) (Γ) Υπέρθεση των δομών των συμπλόκων της AChBP με HΕPES, καρβαμυλοχολίνη, νικοτίνη (αποχρώσεις του μπλε) με τις δομές των συμπλόκων της AChBP με α- Cbtx, α-ctx-pnia και α-ctx-imi (αποχρώσεις του κόκκινου) (Ulens et al 2006). 25

36 Εισαγωγή Δομή του μυϊκού τύπου nachr Η τρισδιάστατη δομή του μυϊκού τύπου nachr αποκαλύφθηκε το 2005, μετέπειτα δηλαδή της λύσης της δομής της AChBP, με μελέτες κρυο-ηλεκτρονιακής μικροσκοπίας σε απομονωμένες μετασυναπτικές μεμβράνες του ιχθύος Torpedo marmorata (Unwin 2005). Με τις μελέτες αυτές, κατασκευάσθηκε το μοντέλο του μυϊκού τύπου nachr στην κλειστή μορφή του σε ανάλυση 4 Å, πολύ πιο βελτιωμένη από αυτή προηγούμενων μελετών ηλεκτρονικής μικροσκοπίας που είχαν αποδώσει τη δομή του Torpedo nachr τόσο στην ανοικτή (κατά την πρόσδεση ACh), όσο και στην κλειστή του μορφή (Brisson and Unwin 1984, Toyoshima and Unwin 1990, Unwin 1993, Unwin 1995, Miyazawa et al 1999, Miyazawa et al 2003). Έτσι, αποκαλύφθηκε με μεγαλύτερη πλέον ακρίβεια η τρισδιάστατη δομή του nachr, απουσία χολινεργικών προσδετών. Σύμφωνα με το μοντέλο που προέκυψε από την τελευταία αυτή μελέτη ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, ο Torpedo nachr έχει ένα συνολικό μήκος ~160 Å με τις πέντε υπομονάδες του (2α, β, γ, δ) να διατάσσονται περιμετρικά του κεντρικού πόρου του ιοντικού καναλιού διαμέτρου ~20 Å. Η διάταξη των υπομονάδων εμφανίζει ένα κυκλικό συμμετρικό σχήμα κατά την άποψη του υποδοχέα από τη συναπτική σχισμή (Εικόνα 10 Α), ενώ παρουσιάζει ένα σφηνοειδές σχήμα στην πλάγια όψη του (Εικόνα 10 Β). Η κάθε υπομονάδα του έχει διαστάσεις 30x40x160 Å 3 και εμφανίζει την ίδια τρισδιάστατη δομή με τις υπόλοιπες (Εικόνα 10 Γ). Πιο αναλυτικά, η κάθε υπομονάδα του nachr αποτελείται από τρεις διακριτές περιοχές: α) μία αμινοτελική εξωκυτταρική περιοχή (ΕΚΠ), β) μία διαμεμβρανική περιοχή και γ) μία κυτταροπλασματική περιοχή. Η ΕΚΠ έκαστης υπομονάδας του nachr συγκροτείται από ένα υδρόφοβο πυρήνα, ο οποίος αποτελείται από την αναδίπλωση δέκα β- πτυχωτών φύλλων (β1-β10) μεταξύ τους, τα οποία διατάσσονται στα εξωτερικά (β4, β7-10) και στα ενδότερα β-φύλλα (β1-3, β5-6). Οι δύο αυτές κατηγορίες οργάνωσης των β-πτυχώσεων της ΕΚΠς ενώνονται μεταξύ τους μέσω της συντηρημένης, στην LGIC υπερ-οικογένεια, Cys θηλιάς. Επίσης, στο αμινο-τελικό άκρο της κάθε υπομονάδας βρίσκεται μία συντηρημένη α-έλικα. Με αυτή τη μελέτη επιβεβαιώθηκε ότι δομή της ΕΚΠ καθεμιάς nachr υπομονάδας είναι σε πολύ μεγάλο βαθμό όμοια με αυτή που είχε προηγουμένως αποκαλυφθεί για την ομόλογη AChBP. Στην ΕΚΠ του nachr σχηματίζονται και διάφορες θηλιές, πολλές εκ των οποίων, όπως οι θηλιές Α, B, C, καθώς και οι θηλιές Cys και β1-β2 παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στη λειτουργία 26

37 Εισαγωγή του υποδοχέα. Παλαιότερες βιοχημικές μελέτες είχαν υποδηλώσει ότι για το σχηματισμό των θέσεων πρόσδεσης αγωνιστών και ανταγωνιστών του nachr συμμετείχαν δύο διαφορετικά τμήματα, τα οποία αποτελούν την κυρίως και τη συμπληρωματική πλευρά των θέσεων πρόσδεσης ACh (Galzi et al 1991, Corringer et al 2000, Arias 2000). Μάλιστα, ήταν ήδη γνωστό ότι η κυρίως πλευρά της θέσης πρόσδεσης της ACh βρίσκεται σε καθεμιά από τις δύο α υπομονάδες, ενώ η συμληρωματική πλευρά βρίσκεται σε καθεμιά από τις γειτονικές γ και δ υπομονάδες, σχηματίζοντας έτσι δύο θέσεις πρόσδεσης ACh. Mε την αποκάλυψη της δομής του Torpedo nachr σε 4 Å, αποκαλύφθηκαν και τα δομικά στοιχεία που συμμετέχουν στη συγκρότηση των δύο αυτών θέσεων. Έτσι, αυτές σχηματίζονται από τη συνεισφορά των θηλιών A, B και C των ΕΚΠ των δύο α υπομονάδων (κυρίως πλευρά) καθώς και από τμήματα των β5 και β6 πτυχώσεων των ΕΚΠ των γειτονικών γ και δ υπομονάδων. Οι δύο θέσεις πρόσδεσης της ACh βρίσκονται σε απόσταση ~40Å από την κυτταρική μεμβράνη και σε αντιδιαμετρικά σημεία (Εικόνα 10 Α). Αποκαλύφθηκαν μάλιστα και μερικά από τα αμινοξικά κατάλοιπα των θηλιών της κύριας πλευράς που συμμετέχουν στο σχηματισμό των θέσεων πρόσδεσης. Αυτά βρέθηκε ότι είναι η Tyr190, η Cys192 και η Tyr198 της θηλιάς C, καθώς και η Trp149 της θηλιάς B (Εικόνα 11). Τα αμινοξικά αυτά κατάλοιπα είναι ιδιαίτερα συντηρημένα στα μέλη της LGIC υπεροικογένειας καθώς και στην AChBP, όπου επίσης είχαν προηγουμένως βρεθεί να συμμετέχουν στο σχηματισμό των πέντε θέσεων πρόσδεσης υποκαταστατών (Brejc et al 2001, Celie et al 2004). Επίσης, ο MIR επίτοπος, ο οποίος όπως ήταν ήδη γνωστό εδράζει στα ΕΚΠ τμήματα των α υπομονάδων (Barkas et al 1987, Tzartos et al 1988, 1991, 1998), βρέθηκε εκτεθειμένος στο εξωτερικό περιβάλλον του υποδοχέα, όπως είχε ήδη προβλεφθεί από τη λύση της δομής της ομόλογης AChBP (Brejc et al 2001), αφού ανήκει στη θηλιά β2-β3, η οποία εκτείνεται προς το διαλύτη (Εικόνα 10). Η διαμεμβρανική περιοχή της καθεμιάς υπομονάδας του nachr αποτελείται από τεσσερεις α-έλικες (M1-M4) (Εικόνα 10 Γ), οι οποίες στο σύνολό τους διατάσσονται συμμετρικά και περιμετρικά του κεντρικού πόρου του ιοντικού καναλιού (Εικόνα 10 Β). Πιο αναλυτικά, οι πέντε Μ2 α-έλικες όλων των υπομονάδων διατάσσονται έτσι ώστε να σχηματίζουν τα εσωτερικά τοιχώματα του καναλιού, ενώ οι υπόλοιπες 15 α- έλικες (Μ1, Μ3, Μ4) περιελίσσονται η μία της άλλης σχηματίζοντας τον εξωτερικό δακτύλιο του καναλιού, ο οποίος το θωρακίζει από τα μεμβρανικά λιπίδια. 27

38 Εισαγωγή Α. Θέσεις πρόσδεσης Β. ACh Γ. Β θηλιά C θηλιά Ε Ι Εικόνα 10. Δομή του μυϊκού τύπου nachr. (A) Άνωθεν άποψη του nachr, όπως παρατηρείται από τη συναπτική σχισμή. (Β) Πλάγια άποψη του nachr, κάθετα προς την κυτταρική μεμβράνη. (Γ) Πλάγια άποψη της α υπομονάδας. Η κάθε υπομονάδα του nachr είναι χρωματισμένη διαφορετικά. Με χρυσαφί χρώμα είναι η απεικόνιση της πλευρικής αλυσίδας της Trp149 (W149), η οποία υποδεικνύει και τη θέση πρόσδεσης της ACh. Eπίσης απεικονίζεται και ο MIR επίτοπος της α υπομονάδας. Στα (Β) και (Γ), με το γράμμα Ε συμβολίζεται ο εξωκυττάριος χώρος και με το γράμμα I, η εσωτερική πλευρά του κυττάρου. Στο (Γ) φαίνονται επίσης οι θηλιές Α, Β και C της α-εκπ, οι οποίες συγκροτούν την κυρίως πλευρά πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών, καθώς και οι θηλιές Cys, β1-β2 και β8-β9, οι οποίες βρίσκονται σε πολύ κοντινή απόσταση με την M2-M3 θηλιά της διαμεμβρανικής περιοχής (Unwin 2005). 28

39 Εισαγωγή Στην περίπτωση που το κανάλι είναι κλειστό, οι Μ2 έλικες βρίσκονται σε πιο κοντινή απόσταση μεταξύ τους, σχηματίζοντας περίπου στη μέση του ύψους της κυτταρικής μεμβράνης την λεγόμενη θύρα του καναλιού, η οποία αποτελεί στην ουσία ένα εμπόδιο για την ελεύθερη διακίνηση ιόντων διαμέσου αυτής. Εκτός από τις Μ1-Μ4 α-έλικες, στη διαμεμβρανική περιοχή εντάσσονται και οι μικρές θηλιές Μ1-Μ2 (ενδοκυτταρικές) και M2-M3 (εξωκυτταρικές) (Εικόνα 10 Γ). Μάλιστα, η θηλιά Μ2- Μ3 αλληλεπιδρά με τις θηλιές β1-β2 και Cys της ΕΚΠ, παίζοντας σημαντικό λειτουργικό ρόλο κατά τη μετάδοση των δομικών αλλαγών που επάγονται στην ΕΚΠ από την πρόσδεση αγωνιστών στη διαμεμβρανική περιοχή του υποδοχέα. Τέλος, η κυτταροπλασματική περιοχή καθεμιάς υπομονάδας του nachr αποτελείται από τη θηλιά M3-M4, η οποία περιέχει μία α-έλικα (MA) ακριβώς πρίν από την ένωση με την Μ4 περιοχή (Εικόνα 10 Γ). Το τμήμα της θηλιάς M3-M4 αμέσως μετά την Μ3 περιοχή δεν στάθηκε δυνατόν να αποκαλυφθεί από αυτή τη μελέτη ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, αλλά εικάζεται ότι δεν έχει κάποια γνωστού τύπου διαμόρφωση (Kottwitz et al 2004, Kukhtina et al 2006). Καθεμιά nachr υπομονάδα συνεισφέρει από μία ΜΑ έλικα, ώστε να σχηματιστεί το ενδοκυτταρικό τοίχωμα του καναλιού. Μάλιστα, οι πέντε αυτές έλικες φαίνεται να διατάσσονται έτσι ώστε να σχηματίζουν ένα ανεστραμμένο πενταγωνικό κώνο, στις πέντε πλευρές του οποίου υπάρχουν οπές («παράθυρα επιλεκτικότητας») διαμέτρου 8 Å (συγκρίσιμη με τη διάμετρο ενός ενυδατωμένου ιόντος Na + ή K + ), διαμέσου των οποίων πραγματοποιείται η επιλεκτική είσοδος ιόντων στο κυτταρόπλασμα. Επίσης, δεδομένου ότι τα «παράθυρα» αυτά περιβάλλονται από αρνητικά φορτισμένα αμινοξικά κατάλοιπα, αποτελούν επιλεκτικά φίλτρα αποκλεισμού μορίων τόσο λόγω μεγέθους, όσο και λόγω φορτίου. Αξίζει να σημειωθεί ότι εκτός από το ενδοκυτταρικό εσωτερικό τοίχωμα του καναλιού, και αυτό της εξωκυττάριας περιοχής περιβάλλεται από αρνητικά φορτισμένα φορτία επιτρέποντας έτσι την κίνηση κατιόντων του σωστού μεγέθους κατά μήκος του (π.χ. Na +, K + και Ca 2+ ) Άνοιγμα του καναλιού του nachr Η μελέτη της δομής του Torpedo nachr με ηλεκτρονική μικροσκοπία σε ανάλυση 4 Å επιβεβαίωσε την παρατήρηση που είχε καταγραφεί από προηγούμενη τέτοιου είδους μελέτη, ακόμη χαμηλότερης όμως ανάλυσης (Unwin et al 2002), όσον αφορά τη διαφορετική διευθέτηση στο χώρο, τόσο των ενδότερων, όσο και των εξωτερικών β- 29

40 Εισαγωγή πτυχώσεων των α υπομονάδων σε σχέση με τις μη-α υπομονάδες (β, γ, δ). Η υπέρθεση των θέσεων των αλυσίδων των α-ατόμων άνθρακα μεταξύ των α και των άλλων υπομονάδων αποκάλυψε την κατά 10 μετατόπιση των ενδότερων β-πτυχώσεων των α υπομονάδων αντίθετα προς τους δείκτες του ρολογιού σε σχέση με τα αντίστοιχα δομικά στοιχεία των άλλων υπομονάδων στην κάτοψη του nachr από τη συναπτική σχισμή. Επίσης, τα ενδότερα β-πτυχωτά φύλλα των α υπομονάδων εμφανίζονται σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις να εξέχουν περισσότερο προς τη πλευρά του κεντρικού πόρου σε σχέση με αυτά των μη α-υπομονάδων. Η ειδική αυτή διαμόρφωση των α υπομονάδων αναφέρεται ως «παραμορφωμένη», αφού όπως είχε δειχθεί παλαιότερα με μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας του ανοικτού καναλιού (Unwin 2002), αλλά και από τη συγκρυστάλλωση της AChBP με αγωνιστές (Celie et al 2004), οι α υπομονάδες μεταπίπτουν στη διαμόρφωση των μη-α υπομονάδων, κατά την πρόσδεση αγωνιστή. Η τεταμένη αυτή διαμόρφωση των α υπομονάδων, όταν το κανάλι είναι κλειστό, σταθεροποιείται από διάφορους δεσμούς που αναπτύσσονται μεταξύ των δύο πλευρών (θετική και αρνητική) των α υπομονάδων και των γειτονικών τους υπομονάδων και αφορούν κυρίως κατάλοιπα της θηλιάς Β, αλλά και των ενδότερων β-πτυχώσεων. Συγκρίνοντας τη διαμόρφωση των ΕΚΠ τμημάτων των α υπομονάδων του κλειστού καναλιού του nachr με τη διαμόρφωση του πρωτομερούς της AChBP κατά την πρόσδεση σε αυτή διάφορων αγωνιστών (Celie et al 2004, Hansen et al 2005), αποκαλύφθηκαν οι δομικές αναδιευθετήσεις που πιθανώς λαμβάνουν χώρα κατά την πρόσδεση ACh στο nachr, οι οποίες επιτρέπουν στις τεταμένες αυτές α υπομονάδες να χαλαρώσουν. Έτσι, στην κλειστή μορφή του καναλιού (Unwin 2005), η θηλιά C των α υπομονάδων προβάλλει μακριά από το «κυρίως σώμα» της α υπομονάδας, σε αντίθεση με τη θηλιά C του κάθε πρωτομερούς AChBP παρουσία αγωνιστή, όπου αυτή βρίσκεται πλεόν σε στενή επαφή με τις θηλιές Α και Β της θέσης πρόσδεσης (π.χ. η απόσταση των α-ατόμων άνθρακα μεταξύ της Cys192 της θηλιάς C και της Trp149 της θηλιάς B είναι κατά 6 Å μικρότερη στην περίπτωση της α υπομονάδας του κλειστού καναλιού του nachr σε σχέση με την αντίστοιχη απόσταση στο σύμπλοκο AChBP/αγωνιστής). Οι θηλιές Β των α υπομονάδων συγκρατούνται σε αυτή την τεταμένη θέση μέσω αλληλεπιδράσεων στις διεπιφάνειές τους (π.χ. σχηματισμός γέφυρας άλατος μεταξύ της αasp152 και γarg78 ή δarg81). Όλα αυτά υποδηλώνουν ότι οι θηλιές αυτές θα πρέπει να αναδιοργανωθούν έτσι ώστε να επιτρέψουν τη πρόσδεση της ACh στη θέση πρόσδεσής της. Έτσι, προκειμένου τα αμινοξικά κατάλοιπα των θηλιών Β και C που εμπλέκονται στην πρόσδεση αγωνιστών να 30

41 Εισαγωγή στοιχιθούν σωστά απέναντι στο μόριο της ACh και να το περιβάλλουν, θα πρέπει η θηλιά Β να περιστραφεί κατά τη φορά των δεικτών του ρολογιού, ενώ η θηλιά C κατά την αντίθετη κατεύθυνση (Εικόνα 11). Μάλιστα, η θηλιά Β παίζει και ένα σημαντικό ρόλο σε αυτές τις τοπικές διευθετήσεις, αφού ενώνει τα εξωτερικά με τα ενδότερα β- πτυχωτά φύλλα της ΕΚΠ της α υπομονάδας, μεταδίδοντας έτσι τις δομικές αλλαγές των εξωτερικών δομικών στοιχείων στον υδρόφοβο πυρήνα της ΕΚΠ. Α. Β. i. Θηλιά Β ii. Kαρβαμυλοχολίνη Θηλιά C iii. Εικόνα 11. Σχηματική αναπαράσταση της θέσης πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών του Torpedo nachr. (A) Απεικόνιση των θηλιών B και C της α-εκπ και των β5 και β6-πτυχώσεων της γειτονικής γ υπομονάδας. (Β) i. Απλοποιημένη απεικόνιση της κυρίως πλευράς πρόσδεσης της α υπομονάδας στο κλειστό κανάλι. ii. Απλοποιημένη απεικόνιση της αντίστοιχης περιοχής της L-AChBP μετά την πρόσδεση καρβαμυλοχολίνης (Celie et al 2004). Τα κόκκινα τόξα αναπαριστούν τις κινήσεις των αντίστοιχων περιοχών της L-AChBP. iii. Υπέρθεση των i και ii, η οποία φανερώνει τις κινήσεις των θηλιών B και C, ώστε να περιτυλίξουν τον προσδεδεμένο αγωνιστή. (Unwin 2005). Θεωρητικά, διάφορα δομικά στοιχεία της ΕΚΠ του nachr θα μπορούσαν να μεταδώσουν τις δομικές αναδιευθετήσεις της περιοχής αυτής παρουσία αγωνιστή στο διαμεμβρανικό τμήμα του υποδοχέα, προκειμένου να ανοίξει η πύλη του καναλιού. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 10 Γ, εκτός από το πτυχωτό φύλλο β10, το οποίο είναι ενωμένο με την αρχή της Μ1 διαμεμβρανικής περιοχής, διάφορα άλλα δομικά στοιχεία 31

42 Εισαγωγή της ΕΚΠ αλληλεπιδρούν με ορισμένα τμήματα της διαμεμβρανικής περιοχής. Πιο συγκεκριμένα, οι θηλιές Cys και β1-β2 των ΕΚΠ των α υπομονάδων, οι οποίες βρίσκονται κατά 2-3 Å πλησιέστερα προς τις Μ2-Μ3 θηλιές τους σε σχέση με τις μη-α υπομονάδες, αλληλεπιδρούν με την Μ2-Μ3 θηλιά της διαμεμβρανικής περιοχής της α υπομονάδας ως εξής: Η συντηρημένη σε όλες τις υπομονάδες, αλληλουχία Phe-Pro- Phe της θηλιάς C, αλληλεπιδρά με τα κατάλοιπα αile274, αtyr277 και αphe280 της M2-M3 θηλιάς (Εικόνα 12), και δύο συντηρημένα κατάλοιπα της θηλιάς β1-β2 (Val46 και Gln47) αλληλεπιδρούν με την M2-M3. Οι πλευρικές αλυσίδες των καταλοίπων αυτών που ανήκουν στις θηλιές Β και Cys των ΕΚΠ τμημάτων των α υπομονάδων σχηματίζουν ένα τόξο που πλαισιώνει το σκελετό της Μ2-Μ3 θηλιάς, κάτι που δεν ισχύει για τις μη-α υπομονάδες. Λαμβάνοντας όλα αυτά υπόψιν, το άνοιγμα του καναλιού μετά την πρόσδεση ACh ή άλλων αγωνιστών μπορεί να πραγματοποιηθεί με δύο πιθανούς τρόπους: α) ώς συνέπεια των δομικών αλλαγών που συμβαίνουν στα ΕΚΠ τμήματα των α υπομονάδων, οι θηλιές β1-β2 και Cys υποχωρούν προς τη μη τεταμένη διαμόρφωση που έχουν στις μη-α υπομονάδες, παύοντας να αλληλεπιδρούν με την Μ2-Μ3 θηλιά. Έτσι, η τελευταία μένει ελεύθερη να κινηθεί, λόγω της ευλιγισίας που της προσδίδεται από τη συντηρημένη αgly275 στο καρβοξυ-τελικό άκρο της Μ2-Μ3, επιτρέποντας κατ αυτό τον τρόπο την αναδιευθέτηση της Μ2 α- έλικας ώστε να ανοίξει το κανάλι (Εικόνα 12), ή β) η υποχώρηση των θηλιών Cys και β1-β2 των α υπομονάδων μακριά από την κυτταρική μεμβράνη, λόγω της χαλάρωσης των β-πτυχώσεών της παρασύρει επίσης την Μ2-Μ3 θηλιά μέσω των διατηρούμενων σε αυτή την περίπτωση αλληλεπιδράσεών τους, και αυτή με τη σειρά της παρασύρει την Μ2 έλικα μακριά από τον άξονα του καναλιού, ώστε να σπάσουν οι αλληλεπιδράσεις με τις γειτονικές Μ2 έλικες, ανοίγοντας έτσι την πύλη του καναλιού. Εικόνα 12. Σχηματική αναπαράσταση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ της ΕΚΠ με το τμήμα Μ2-Μ3 της διαμεμβρανικής περιοχής του Torpedo nachr. Η Cys θηλιά, η β1-β2 θηλιά, η τελική απόληξη του β10 πτυχωτού φύλλου και τα δομικά συστατικά της διαμεμβρανικής περιοχής είναι με κόκκινο, μπλε, πράσινο και γκρι χρώμα, αντίστοιχα (Unwin 2005). 32

43 Εισαγωγή Δομή της ΕΚΠ της α1 υπομονάδας του μυϊκού nachr Όπως προαναφέρθηκε, οι κρυσταλλικές δομές των διάφορων AChBPs παρουσία ή απουσία αγωνιστών ή ανταγωνιστών, καθώς και μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας του Torpedo nachr αποτέλεσαν δύο πολύ σημαντικά βήματα για την κατανόηση της δομής των θέσεων πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών, αλλά και για τον μηχανισμό ανοίγματος του ιοντικού καναλιού του nachr. Το τρίτο σημαντικό επίτευγμα στο πεδίο μελέτης των nachrs, αποτέλεσε η πρόσφατη επίλυση της δομής της ΕΚΠ της μυϊκής α1 υπομονάδας του nachr επίμυος (α1-εκπ) με κρυσταλλογραφία ακτίνων-χ σε ευκρίνεια 1,94 Å (Dellisanti et al 2007). Για την ακρίβεια, επετεύχθη η συγκρυστάλλωση ενός διαλυτού τριπλού μεταλλάγματος της α1-εκπ (Val8Glu, Trp149Arg, Val155Ala) με τον ανταγωνιστή α-bgtx (Εικόνα 13). Αποκαλύφθηκαν με αυτό τον τρόπο σε ατομικό επίπεδο τα αμινοξικά κατάλοιπα της θετικής πλευράς της θέσης πρόσδεσης nachr προσδετών, οι αλληλεπιδράσεις με τον ανταγωνιστή, ο σημαντικός ρόλος γλυκοζυλίωσης της α1 για την πρόσδεση της α- bgtx, καθώς και η ύπαρξη μίας υδρόφιλης κοιλότητας μέσα στον υδρόφοβο πυρήνα της ΕΚΠ περιοχής της α1 υπομονάδας με σημαντικό ρόλο στο μηχανισμό ανοίγματος του nachr. Επίσης, αποκαλύφθηκε σε ατομικό επίπεδο η διαμόρφωση του MIR επίτοπου. Η α1-εκπ αποτελείται από ένα υδρόφοβο πυρήνα, ο οποίος συγκροτείται από δέκα β-πτυχωτά φύλλα και από μία αμινοτελική α-έλικα, όπως είχε αποκαλυφθεί προηγουμένως από τις κρυσταλλικές δομές των ομόλoγων AChBPs, καθώς και από την ηλεκτρονική μικροσκοπία του Torpedo nachr. Τα πτυχωτά φύλλα διακρίνονται στα εξωτερικά (β4, β7, β9-10) και στα εσωτερικά (β1-3, β5-6, β8), και τα οποία ενώνονται μέσω της χαρακτηριστική Cys θηλιά της LGIC υπερ-οικογένειας που σχηματίζεται από δισουλφιδικό δεσμό μεταξύ της Cys128 (ανήκει στο β6-πτυχωτό φύλλο) και της Cys142 (ανήκει στο β7-πτυχωτό φύλλο). Οι θηλιές Α, Β και C μεταξύ εξωτερικών β- πτυχωτών φύλλων συμμετέχουν στην πρόσδεση της α-bgtx, σχηματίζοντας την κυρίως πλευρά της θέσης πρόσδεσης χολινεργικών υποκαταστατών, όπως είχε δειχθεί και στην περίπτωση του συμπλόκου AChBP/α-Cbtx. 33

44 Εισαγωγή Εικόνα 13. Δομή του συμπλόκου της ΕΚΠ της α1 υπομονάδας του μυϊκού nachr με την α-bgtx. Με βαθύ πράσινο είναι η nachr α1-εκπ, με πορτοκαλί η α-bgtx και με κόκκινο η υδατανθρακική αλυσίδα, η οποία εκτείνεται από τη Cys θηλιά της α1-εκπ εως της θηλιά C. Απεικονίζονται επίσης τα πτυχωτά φύλλα (β1-β10) που συνιστούν τον υδρόφοβο πυρήνα της α1-εκπ, ο MIR επίτοπος, καθώς και οι θηλιές I, II και III του μορίου της α-bgtx (Delissanti et al 2007). H πρόσδεση της α-bgtx στην α1 υπομονάδα επιτυγχάνεται μέσω αλληλεπιδράσεων των θηλιών Ι και ΙΙ της α-bgtx με τη θηλιά C και με τις θηλιές Α, Β και C της α1-eκπ, αντίστοιχα. Μάλιστα, όπως και στην περίπτωση του συμπλόκου AChBP/α-Cbtx, η θηλιά ΙΙ της α-bgtx εισέρχεται βαθιά μέσα στην κοιλότητα που ορίζεται από τις θηλιές Α, Β και C της α1 υπομονάδας. Η θηλιά ΙΙΙ της α-bgtx δεν συμμετέχει σε αλληλεπιδράσεις με την πρωτεΐνη. Μία σημαντική διαφορά με το σύμπλοκο AChBP/α- Cbtx είναι ότι στην περίπτωση του συμπλόκου α1-εκπ/α-bgtx, η θηλιά Ι της α-bgtx συνδέεται με την α1-εκπ κυρίως μέσω της υδατανθρακικής αλυσίδας της α1-εκπ, η οποία εκτείνεται από το συντηρημένο, σε όλες εκτός από τις νευρικές α7-9 nachr υπομονάδες, κατάλοιπο Asn141 (της Cys θηλιάς) προς το ανώτερο τμήμα του μορίου της α1-ekπ. H υδατανθρακική αυτή αλυσίδα αποτελείται από δύο Ν-ακετυλγλυκοζαμίνες (NAG2-3) και από οκτώ μαννόζες (ΜΑΝ4-11). Βέβαια, ακόμη και διαμέσου αυτού του μηχανισμού πρόσδεσης της α-bgtx, σημαντικό ρόλο παίζει η συντηρημένη Trp187 της θηλιάς C (αντίστοιχη της Trp184 της AChBP, η οποία αλληλεπιδρά άμεσα με την α-cbtx), αφού σταθεροποιεί μία συγκεκριμένη διαμόρφωση των μαννοζών MAN5 εως ΜΑΝ8, ώστε αυτές να αλληλεπιδρούν με διάφορα αμινοξικά κατάλοιπα της θηλιάς Ι της α-bgtx. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές μεταξύ της τοξίνης και 34

45 Εισαγωγή του σακχάρου της γλυκοζυλιωμένης α1-εκπ είναι τόσο σημαντικές, ώστε η απογλυκοζυλίωση της α1-εκπ να οδηγεί σε αδυναμία πρόσδεσης α-bgtx, επιβεβαιώνοντας προηγούμενα βιοχημικά δεδομένα (Psaridi-Linardaki et al 2002). Ένα πολύ σημαντικό επίσης εύρημα από τη λύση της δομής της α1-εκπ ήταν ο εντοπισμός μίας υδρόφιλης κοιλότητας μέσα στον υδρόφοβο πυρήνα του μορίου (Εικόνα 14 Α). Μέσα σε αυτή την κοιλότητα, η οποία οριοθετείται από τα υδρόφιλα κατάλοιπα Thr52 (β2-πτυχωτό φύλλο) και Ser126 (β6 -πτυχωτό φύλλο) εντοπίσθηκε ένα, προσδεδεμένο σε αυτά τα κατάλοιπα, μόριο νερού, το οποίο μέσω ενός άλλου μορίου ύδατος οδηγεί στην έμμεση αλληλεπίδραση των εσωτερικών β-πτυχώσεων με τη θηλιά Α της κυρίως πλευράς πρόσδεσης. Τα κατάλοιπα αυτά είναι εξαιρετικά συντηρημένα στα ΕΚΠ τμήματα και των άλλων nachr υπομονάδων, ενώ τα αντίστοιχα κατάλοιπα της ομόλογης AChBP, η οποία δεν συμμετέχει σε σχηματισμό ιοντικού καναλιού, είναι υδρόφοβα. Με μία σειρά μεταλλαξιγεννέσεων και ηλεκτροφυσιολογικών μελετών αποδείχθηκε ο σπουδαίος ρόλος των καταλοίπων αυτών για τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού, αφού η αντικατάστασή τους από τα αντίστοιχά τους στην AChBP οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη απόκριση του καναλιού του nachr μετά την πρόσδεση σε αυτό ACh (Dellisanti et al 2007). Έτσι, είναι πολύ πιθανό η σχηματιζόμενη από τα δύο αυτά συντηρημένα κατάλοιπα υδρόφιλη κοιλότητα να είναι ένας σημαντικός διαμεσολαβητής (μέσω μορίων ύδατος) της μετάδοσης των δομικών αλλαγών που συμβαίνουν στις θέσεις πρόσδεσης (όπως είχαν αποκαλυφθεί από τις προηγούμενες μελέτες δομών των AChBPs και του Torpedo nachr) μετά την πρόσδεση αγωνιστών (μετακινήσεις των θηλιών Α, Β και C, ώστε να «αγκαλιάζουν» τον αγωνιστή) προς τα εσωτερικά β-πτυχωτά φύλλα της α1-εκπ, τα οποία στη συνέχεια μετά τις αναδιευθετήσεις τους στο χώρο προκαλούν το άνοιγμα του καναλιού μέσω αλληλεπιδράσεών τους με διαμεμβρανικά τμήματα του υποδοχέα. Επίσης, μία σημαντικότατη πληροφορία που εξήγχθη από τη λύση της δομής της α1-εκπ ήταν η αποκάλυψη σε ατομικό επίπεδο της διαμόρφωσης του MIR επίτοπου (αμινοξικά κατάλοιπα 67-76) (Εικόνα 14 Β), έναντι του οποίου κατευθύνεται ένας μεγάλος αριθμός αυτοαντισωμάτων στη βαριά μυασθένεια, κάτι που είναι πολύ χρήσιμο για την ανάπτυξη ειδικών θεραπευτικών προσεγγίσεων για την αντιμετώπισή της. 35

46 Εισαγωγή Α. Β. Εικόνα 14. (Α) Απεικόνιση της υδρόφιλης κοιλότητας μέσα στον υδρόφοβο πυρήνα της δομής της α1-εκπ του μυϊκού nachr. Οι δύο κόκκινες σφαίρες απεικονίζουν δύο μόρια ύδατος. Επίσης, απεικονίζονται αλληλεπιδράσεις της υδατανθρακικής αλυσίδας (με μωβ χρώμα) με κατάλοιπα της α1-εκπ, καθώς και διάφορων περιοχών της α1-εκπ μεταξύ τους. (Β) Δομή σε ατομικό επίπεδο του MIR επιτόπου (αμινοξικά κατάλοιπα 67-76). (Dellisanti et al 2007) Δομή προκαρυωτικών LGICs Μόλις πρόσφατα αποκαλύφθηκε η ύπαρξη νουκλεοτιδικών αλληλουχιών σε βακτηριακά γονιδιώματα, οι οποίες κωδικοποιούν 15 πιθανούς ομόλογους υποδοχείς με αυτούς της LGIC υπερ-οικογένειας των ευκαρυωτικών (Tasneem et al 2005). Ακολούθως, επετεύχθη η κλωνοποίηση μίας τέτοιας νουκλεοτιδικής αλληλουχίας από το γονιδίωμα του κυανοβακτηριδίου Gloeobacter violaceous (Glvi) και η έκφραση της αντίστοιχης Glvi-πρωτεΐνης σε κυτταρικές σειρές θηλαστικών (Bocquet et al 2007). Με αυτή τη μελέτη αποδείχθηκε ότι η Glvi-πρωτεΐνη σχηματίζει πενταμερή και ότι λειτουργεί ως ένα κατιονικό κανάλι, το οποίο ενεργοποιείται από την πρόσδεση πρωτονίων σε αυτό. Έτσι, δεδομένης της σχετικά υψηλής ομολογίας της με κυρίως την α7 υπομονάδα του nachr (20% αμινοξική ταύτιση), θεωρείται ως ένας πρόγονος της υπερ-οικογένειας των ευκαρυωτικών LGICs. To τρισδιάστατο μοντέλο που κατασκευάσθηκε για τη δομή της Glvi πρωτεΐνης (Bocquet et al 2007) βασιζόμενο σε ένα μοντέλο του α7 nachr (Taly et al 2005), φανέρωσε μερικά δομικά χαρακτηριστικά εξαιρετικού ενδιαφέροντος (Εικόνα 15): Α. Η κάθε υπομονάδα της πενταμερούς αυτής πρωτεΐνης αποτελείται από μία εξωκυτταρική περιοχή (ΕΚΠ), τέσσερεις διαμεμβρανικές περιοχές (Μ1-Μ4), όπως δηλαδή και στην περίπτωση των ευκαρυωτικών LGICs. Μάλιστα, η ΕΚΠ αποτελείται 36

47 Εισαγωγή από ένα υδρόφοβο πυρήνα β-πτυχώσεων, καθώς και οι Μ1-Μ4 περιοχές φαίνεται να διατάσσονται σε α-έλικες, αντίστοιχα με τα ευκαρυωτικά LGICs. Β. Σε αντίθεση με τα ευκαρυωτικά LGICs, φαίνεται να απουσιάζει η αμινο-τελική α- έλικα στην ΕΚΠ της Glvi, καθώς επίσης και η κυτταροπλασματική θηλιά μεταξύ των Μ3-Μ4 διαμεμβρανικών περιοχών. Επίσης, απουσιάζει η χαρακτηριστική Cys θηλιά της υπερ-οικογένειας των ευκαρυωτικών LGICs, λόγω της έλλειψης στην περίπτωση της Glvi-πρωτεΐνης των δύο συντηρημένων κυστεϊνών που τη σχηματίζουν. Έτσι, η Glvi-πρωτεΐνη φαίνεται να αποτελεί μία προγονική μορφή των ευκαρυωτικών LGICs και χαρακτηρίζεται από μία «ελάχιστη δομή», η οποία κατά την εξέλιξη υπέστη κατάλληλες διαφοροποιήσεις, ώστε να οδηγήσει στην πιο περίπλοκη δόμηση των ευκαρυωτικών LGICs, όπως την γνωρίζουμε μέχρι σήμερα. Α. Β. ΕΚΠ Μ1-Μ4 Εικόνα 15. Μοντέλο της δομής της Glvi πρωτεϊνης. (A) Πλάγια όψη της διεπιφάνειας που σχηματίζεται μεταξύ δύο εκ των πέντε πρωτομερών της Glvi πρωτεϊνης. Οι σφαίρες απεικονίζουν κατάλοιπα με σημαντικό ρόλο και το βέλος υποδεικνύει τον σχηματιζόμενο ιοντικό πόρο. (Β) Σύκριση απλουστευμένων απεικονίσεων των δομών των προκαρυωτικών με τα ευκαρυωτικά LGICs. Στα προκαρυωτικά LGICs απουσιάζει η χαρακτηριστική Cys θηλιά (C- C), η N-τελική α-έλικα και η κυτταροπλασματική θηλιά. (Bocquet et al 2007) Ακόμα όμως πιο πρόσφατα κατέστη δυνατή η κρυστάλλωση και λύση της δομής με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ και σε ευκρίνεια 3,3 Å μίας προκαρυωτικής LGIC (ELIC) από το βακτήριο Erwinia crysanthemi (Hilf and Dutzler 2008). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 16, η δομή της ELIC επιβεβαίωσε το προαναφερόμενο προτεινόμενο μοντέλο για τη δομή των προκαρυωτικών LGICs. Η πρωτεΐνη αυτή είναι ένα κατιονικό κανάλι και μαζί με άλλες προκαρυωτικές LGIC πρωτεΐνες (Bocquet et al 2007) θεωρείται πως αποτελεί τον πρόγονο των nachrs. Η λύση της δομής της αποκάλυψε τη μεγάλη ομοιότητα της δομής του εξωκυττάριου τμήματός της (ELIC-ΕΚΠ) με τη δομή της AChBP καθώς και με τα ΕΚΠ τμήματα των υπομονάδων του Torpedo 37

48 Εισαγωγή nachr, αλλά και την έλλειψη της αμινο-τελικής α-έλικας και της Cys-θηλιάς (Εικόνα 16Β) (Hilf and Dutzler 2008). Όσον αφορά στη δομή της διαμεμβρανικής περιοχής αυτής της πρωτεΐνης, δείχθηκε ότι είναι παρόμοια με την αντίστοιχη των υπομονάδων του Torpedo nachr, αφού αποτελείται από τέσσερεις α-έλικες (α1 α4), κατ αντιστοιχία με τις M1-M4 διαμεμβρανικές περιοχές του nachr. Οι α2-έλικες των διαμεμβρανικών περιοχών και των πέντε πρωτομερών της ELIC πρωτεΐνης σχηματίζουν ένα εσωτερικό κύκλο, ο οποίος ορίζει την περίμετρο του καναλιού και ο οποίος περιβάλλεται και προστατεύται από το λιπόφιλο περιβάλλον από ένα εξωτερικό κύκλο που σχηματίζεται από τις έλικες α1 και α3 (Εικόνα 16 Α). Παρόλες τις υφιστάμενες διαφορές μεταξύ της διαμέτρου του ιοντικού πόρου των προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών LGICs, όπως αποκαλύφθηκαν από τη λύση της δομής της ELIC πρωτεΐνης, είναι συντηρημένη η ύπαρξη υδρόφοβου περιβάλλοντος στο κέντρο της μεμβράνης καθώς και η ύπαρξη αρνητικά φορτισμένων αμινοξικών καταλοίπων στην περιφέρεια του καναλιού, τα οποία προσδίδουν ιoντική επιλεκτικότητα. Είναι αξιοσημείωτο ότι στα προκαρυωτικά LGICs δεν υπάρχει η M3-M4 θηλιά (Εικόνα 16 Β) (Bocquet et al 2007, Hilf and Dutzler 2008), η οποία φαίνεται πως εμφανίσθηκε κατα τη διαδικασία της εξέλιξης στα ευκαρυωτικά LGICs, προκειμένου να εξυπηρετήσει συγκεκριμένες διεργασίες τους, όπως πχ στην περίπτωση του nachr, την ακόμη μεγαλύτερη επιλεκτικότητα στα διαπερατά ιόντα καθώς και τη διασύνδεσή του με τη κυτταροπλασματική πρωτεΐνη rapsyn, με την οποία επιτυγχάνεται η συνάθροιση του υποδοχέα πάνω σε διάφορα σημεία της κυτταρικής μεμβράνης (Feng et al 1998, Bruneau and Akaaboune 2007). Εικόνα 16. Δομή της προκαρυωτικής ELIC. (A) Άνωθεν άποψη (B) Πλάγια όψη. ΕΚΠ: Εξωκυττάρια περιοχή, ΔΜΠ: Διαμεμβρανική περιοχή (Hilf and Dutzler 2008) 38

49 Εισαγωγή 1.4. Μεταβολισμός του nachr Οι διάφορες υπομονάδες του nachr συντίθενται σαν διακριτές πολυπεπτιδικές αλυσίδες στα ριβοσωμάτια του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου. Στη συνέχεια οι αλυσίδες αυτές μεταφέρονται στο εσωτερικό του δικτύου, όπου και υφίστανται τις διάφορες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Έτσι, έπειτα από τη πρωτεολυτική απομάκρυνση του πεπτιδίου οδηγού (Anderson et al 1982), το σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών (Blount and Merlie 1990, Kao and Karlin 1986), Ν- γλυκοζυλίωση (Anderson and Blobel 1981) και φωσφορυλίωση (Green et al 1991), οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες αναδιπλώνονται συγκροτώντας το λειτουργικό πενταμερές μόριο του υποδοχέα. Το πρώϊμο πενταμερές μεταφέρεται σε στοιχεία του συμπλέγματος Golgi, όπου και υφίσταται περαιτέρω τροποποιήσεις. Με την ολοκλήρωση της διαδικασίας που διαρκεί περίπου 2 ώρες, ο ώριμος υποδοχέας μεταφέρεται στη συναπτική μεμβράνη. Η αποικοδόμηση των nachr μορίων πραγματοποιείται στα λυσοσσωμάτια, μέσω ενδοκύττωσης. Τα προκύπτοντα ελεύθερα αμινοξέα θα απελευθερωθούν από τα κύτταρα περίπου 1 1/2 h μετά το πέρας της ενδοκύττωσης. Οι χρόνοι ημιζωής είναι περίπου μια μέρα για τον υποδοχέα εμβρυϊκού τύπου και ημέρες για τον υποδοχέα ενηλίκων (Steinbach et al 1979). Τα διάφορα στάδια της διαδικασίας βιοσύνθεσης του nachr μελετήθηκαν με τη χρήση ραδιοσημασμένης α-bgtx ( 125 I-α-bgtx). Έχουν προταθεί δύο διαφορετικά μοντέλα σχετικά με τη σειρά με την οποία οι διάφορες υπομονάδες συμμετέχουν στη συγκρότηση λειτουργικών πενταμερών μορίων του υποδοχέα. Σύμφωνα με το πρώτο μοντέλο (Εικόνα 17 Α), αρχικά σχηματίζονται ετεροδιμερή υπομονάδων αγ και αδ, τα οποία στη συνέχεια αλληλεπιδρούν τόσο μεταξύ τους όσο και με τη β υπομονάδα προς σχηματισμό του πλήρους πενταμερούς μορίου (Blount and Merlie 1990, Gu et al 1991, Merlie et al 1983, Saedi et al 1991). Κατά το εναλλακτικό μοντέλο, οι δύο θέσεις πρόσδεσης της ACh δεν δημιουργούνται ταυτόχρονα (Εικόνα 17 Β). Έτσι, κατ αρχήν σχηματίζεται ένα τριμερές αβγ, οπότε και συκροτείται η πρώτη θέση δέσμευσης της ACh μεταξύ της α και γ υπομονάδας. Στη συνέχεια σε αυτό το τριμερές προστίθενται διαδοχικά η δ υπομονάδα και η δεύτερη α υπομονάδα, η οποία μαζί με τη γειτονική της δ συκροτούν και τη δεύτερη θέση πρόσδεσης της ACh (Green and Claudio 1993, Green and Wanamaker 1998, Kreienkamp et al 1995, Nicke et al 1999). Η εξειδικευμένη συνάθροιση των υπομονάδων κατά τα πρώιμα στάδια σχετίζεται με σήματα 39

50 Εισαγωγή αναγνώρισης που περιέχουν οι Ν-τελικές περιοχές των υπομονάδων του nachr (Kreienkamp et al 1995, Verrall and Hall 1992). Η μεταφορά από το ενδοπλασματικό δίκτυο στην κυτταρική μεμβράνη φαίνεται να ελέγχεται από το μοτίβο PL(Y/F)(F/Y)xxN στη διαμεμβρανική περιοχή Μ1, το οποίο είναι συντηρημένο σε όλες τις μυϊκές και μυϊκού τύπου nachr υπομονάδες και σε ορισμένες νευρικές (Yao et al 2002). Όταν η αλληλουχία αυτή είναι εκτεθειμένη, όπως συμβαίνει στην περίπτωση ατελούς αναδίπλωσης ή συνάθροισης των nachr υπομονάδων, το μοτίβο αυτό γίνεται αντιληπτό και οι πρωτεΐνες κατακρατώνται στο ενδοπλασματικό δίκτυο, όπου και επάγεται η ταχεία αποικοδόμησή τους. Σύμφωνα με πρόσφατη μελέτη (Christianson and Green 2004), μετά την είσοδο των nachr υπομονάδων στο ενδοπλασματικό δίκτυο, ένα μέρος τους αλληλεπιδρά με τις συμπληρωματικές υπομονάδες, καθώς και με συνοδά μόρια (chaperones) που διευκολύνουν την αναδίπλωση και ολιγομερισμό των nachr υπομονάδων σε ώριμα πενταμερή μόρια, τα οποία εξέρχονται του ενδοπλασματικού δικτύου. Οι υπομονάδες που δεν αναδιπλώνονται σωστά ή στερούνται κάποιου σταθεροποιητικού παράγοντα πολύ-ουβικιτινυλιώνονται, ενώ εξακολουθούν να είναι ενσωματωμένες στο ενδοπλασματικό δίκτυο, αποτελώντας έτσι στόχο αποικοδόμησής τους από το πρωτεάσωμα. Εικόνα 17. Μοντέλα συνάθροισης των υπομονάδων του AChR. (Α) Σχηματίζονται διμερή αγ και αδ, τα οποία συνδέονται στη συνέχεια με τη β-υπομονάδα. (Β) Σχηματίζεται τριμερές υπομονάδων αβγ, στο οποίο προστίθεται η δ-υπομονάδα και τέλος η δεύτερη α- υπομονάδα. Ο δείκτης ( ΤΧ ) δηλώνει ότι η α-υπομονάδα προσδένει α-bgtx (Karlin and Akabas 1995). 40

51 Εισαγωγή 1.5. Λειτουργία του nachr Λειτουργία νευρικών nachrs Οι νευρικοί nachrs συναντώνται σε πολλές περιοχές του εγκεφάλου, όπου κατανέμονται σε προ-, περι-, και μετα-συναπτικές θέσεις (Lena et al 1993, Wonnacott 1997) και ο ρόλος τους είναι στη μεταβίβαση των νευρικών ώσεων μεταξύ των νευρώνων (Εικόνα 18). Οι προ- και περι-συναπτικοί υποδοχείς ρυθμίζουν την έκλυση σειράς σημαντικών νευροδιαβιβαστών, όπως η ACh, η ντοπαμίνη, η νορεπινεφρίνη, το γλουταμινικό οξύ, η 5-υδρόξυ-τρυπταμίνη (5-HT 3 ) και το γ-αμινοβουτυρικό οξύ σε διάφορες θέσεις στο Κ.Ν.Σ. Αυτοί οι νευροδιαβιβαστές είναι υπεύθυνοι για τη μετάδοση των νευρικών ώσεων δια μέσου των συνάψεων. Η προσυναπτική μεμβράνη μίας σύναψης διαχωρίζεται από τη μετασυναπτική μεμβράνη με μία σχισμή (περίπου 50 nm), η οποία ονομάζεται συναπτική σχισμή. Αξίζει να σημειωθεί ότι η συναπτική απελευθέρωση συγκεκριμένου νευροδιαβιβαστή, σε διαφορετικές περιοχές του Κ.Ν.Σ, είναι δυνατόν να διαμεσολαβείται από διαφορετικό τύπο νευρικού nachr (Sher et al 2004, Jensen et al 2005). Εξαίρεση σε αυτό αποτελεί ο έλεγχος της απελευθέρωσης του γλουταμινικού οξέος που είναι αυστηρά ελεγχόμενος από τον α7 nachr (Sher et al 2004). Οι μετασυναπτικοί νευρικοί nachrs εμπλέκονται στην ταχεία διεγερτική νευροδιαβίβαση στο Κ.Ν.Σ., αλλά γενικά θεωρούνται μειωμένης σημαντικότητας συγκριτικά με τους προσυναπτικούς και περισυναπτικούς νευρικούς υποδοχείς. Παρόλο που είναι δύσκολος ο εντοπισμός θέσεων στον εγκέφαλο, όπου η απελευθέρωση ACh παράγει ταχείες μετασυναπτικές αποκρίσεις, εντούτοις έχει πιστοποιηθεί η παρουσία μετασυναπτικών α7, α4β2 και α3β4 νευρικών υποδοχέων σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου (Levy and Aoki 2002, Sher et al 2004). Η έκφραση μεγάλης ποικιλίας νευρικών nachrs κατα τα πρώϊμα στάδια της εμβρυογένεσης, καθώς και η ύπαρξη ενός πρωτογενούς μηχανισμού που επιτρέπει τόσο τη σύνθεση ΑCh όσο και την απόκριση σε αυτή, μαρτυρούν ένα σημαντικό ρόλο της χολινεργικής σηματοδότησης κατά τα πρώιμα στάδια ανάπτυξης του νευρικού συστήματος (Arenella et al 1993, Corriveau and Berg 1993, Devay et al 1994, Howard et al 1995). Η συμμετοχή των νευρικών nachrs στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων στα αρχικά αναπτυξιακά στάδια του οργανισμού, προτάθηκε με βάση την απόδειξη της Ca 2+ ρύθμισης του γονιδίου c-fos που προκλήθηκε από την ενεργοποίηση νευρικού τύπου υποδοχέων σε κύτταρα PC12 (Greenberg et al 1986). 41

52 Εισαγωγή Οι νευρικοί nachrs θεωρείται ότι εμπλέκονται και στις διάφορες γνωστικές διεργασίες, όπως αυτές της μάθησης και μνήμης. Στην περιοχή του ιππόκαμπου στον εγκέφαλο, όπου λαμβάνει χώρα η κωδικοποίηση και ανάκληση πληροφοριών έχουν εντοπιστεί τρείς τουλάχιστον λειτουργικά διακριτοί nachrs, με σημαντικότατη όπως φαίνεται λειτουργία (α7, α4β2, α3β4) (Alkondon and Albuquerque 2004). Πέρα απο τον αδιαμφισβήτητο ρόλο των νευρικών nachrs στο νευρικό σύστημα, έχει πιστοποιηθεί η έκφρασή τους και σε μη διεγέρσιμους κυτταρικούς τύπους, όπως είναι τα λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα, μακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα, λιποκύτταρα, κερατινοκύτταρα, ενδοθηλιακά και επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου και των πνευμόνων (Sharma and Vijayaraghavan 2002, Gahring and Rogers 2005, Skok et al 2006). Πειραματικά δεδομένα αποκαλύπτουν τη σημαντική συνεισφορά των νευρικών nachrs των μακροφάγων κυττάρων σε διαδικασίες καταστολής της φλεγμονώδους αντίδρασης (Borovikova et al 2000) καθώς και τη συμμετοχή τους στην αύξηση των ενδοθηλιακών αυτών κυττάρων και στις διεργασίες της αγγειογένεσης, συμπεριλαμβανομένης και της αγγειογένεσης σε καρκινικούς όγκους (Heeschen et al 2001, 2002). Εικόνα 18. Σχηματική αναπαράσταση μίας νευρικής σύναψης. Διακρίνονται: α) ο προ- και μετασυναπτικός νευρώνας, β) η συναπτική σχισμή μεταξύ τους, γ) τα συναπτικά κυστίδια στις απολήξεις του προσυναπτικού νευρώνα που μεταφέρουν μόρια νευροδιαβιβαστή (ACh) και δ) οι διάφορες θέσεις νευρικών nachrs (Kalamida et al 2007). 42

53 Εισαγωγή Λειτουργία μυϊκών nachrs Η νευρομυϊκή σύναψη των σκελετικών μυών των σπονδυλωτών είναι γνωστή και ως τελική κινητική πλάκα. Αυτή αποτελείται από εξειδικεύσεις της μεμβράνης του μετασυναπτικού κυττάρου, από την απόληξη του κινητικού νευρώνα και από κύτταρα Schwann (Peper et al 1974). Η απόληξη του νευράξονα υποδιαιρείται σε διακλαδώσεις με πάχος 2 μm που βρίσκονται σε μια επιμήκη κοιλότητα κατά μήκος της επιφάνειας της μυϊκής ίνας. Η μεμβράνη του μυϊκού κυττάρου που καλύπτει την παραπάνω κοιλότητα σχηματίζει πολλαπλές αναδιπλώσεις, γνωστές ως μετασυναπτικές πτυχές. Ακριβώς απέναντι από αυτές τις αναδιπλώσεις, η προσυναπτική μεμβράνη εμφανίζει περιοχές με μικρή πάχυνση, τις ενεργές ζώνες, πάνω από τις οποίες συσσωρεύονται τα συναπτικά κυστίδια (Εικόνα 19). Η απόληξη του νευράξονα περιέχει πλήθος μιτοχονδρίων τα οποία εξασφαλίζουν την ενέργεια που απαιτείται για τη σύνθεση του νευροδιαβιβαστή ACh. Τα μόρια της ACh σχηματίζονται αρχικά στο κυτταρόπλασμα της απόληξης και έπειτα προσροφώνται στο εσωτερικό των συναπτικών κυστιδίων. Κάθε συναπτικό κυστίδιο περιέχει συγκεκριμένη ποσότητα νευροδιβιβαστή, περίπου 10 4 μόρια (Kuffler and Yoshikami 1975). Η άφιξη δυναμικού ενεργείας στην απόληξη του προσυναπτικού νευρώνα ενεργοποιεί τα κανάλια ασβεστίου που υπάρχουν εκεί και τα ιόντα Ca 2+ εισέρχονται στη νευρική ίνα. Η αύξηση της συγκέντρωσης των Ca 2+ οδηγεί στην εξωκύττωση των κυστιδίων που περιέχουν ACh (Heuser et al 1979). H ACh δεσμεύεται στους μυϊκούς nachrs στις μετασυναπτικές πτυχές της μυϊκής μεμβράνης, προκαλώντας το άνοιγμα του καναλιού του μυϊκού nachr, οπότε και ακολουθεί η παθητική μεταφορά ιόντων με κινητήρια δύναμη την επικρατούσα ηλεκτροχημική κλίση, η οποία ευνοεί την εισροή ιόντων Na + ([Na + ] εντός <<[Na + ] εκτός ) και την εκροή Κ + ([Κ + ] εντός >>[ Κ + ] εκτός ). Κάθε ιοντικό κανάλι του μυϊκού nachr παραμένει ανοικτό για περίπου 1 ms επιτρέπoντας στο χρόνο αυτό τη διέλευση 5x10 4 κατιόντων. Η είσοδος ιόντων Na +, η οποία εξουδετερώνεται σε κάποιο βαθμό από τη μικρή έξοδο ιόντων Κ +, οδηγεί στη γένεση συναπτικού ρεύματος στην τελική κινητική πλάκα. Το συναπτικό ρεύμα εκπολώνει τοπικά τη μετασυναπτική μεμβράνη και δημιουργεί μετασυναπτικό δυναμικό γνωστό και ως δυναμικό τελικής κινητικής πλάκας. Η τοπική εκπόλωση, ξεπερνώντας το κατώφλιο δυναμικό προκαλεί την ενεργοποίηση των τασεοεξαρτώμενων καναλιών Na +, οπότε συμβαίνει περαιτέρω εισροή ιόντων Na + και πιο 43

54 Εισαγωγή εκτεταμένη εκπόλωση σύμφωνα με μια επανατροφοδοτούμενη διαδικασία. Όταν το μετασυναπτικό δυναμικό ξεπεράσει το λεγόμενο κατώφλι δυναμικού, δημιουργείται το δυναμικό ενέργειας (+ 40 mv) και πυροδοτείται η ώση που θα οδηγήσει στη μυϊκή συστολή με την έκκριση Ca 2+ από το σαρκοπλασματικό δίκτυο της μυϊκής ίνας και τη δέσμευσή του από την τροπονίνη. Η ACh αμέσως μετά την ενεργοποίηση των υποδοχέων της μετασυναπτικής μεμβράνης, υδρολύεται από το ένζυμο ακετυλοχολινεστεράση (AChE) σε οξικό οξύ και χολίνη. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η άμεση επαναπόλωση της μεμβράνης του μετασυναπτικού κυττάρου. Το μόριο της χολίνης επαναπροσλαμβάνεται από τις προσυναπτικές νευρικές απολήξεις και ανακυκλώνεται μέσω της σύνδεσής του με μόρια του ακέτυλο-συνενζύμου Α, οπότε σχηματίζονται νέα μόρια ACh. Εικόνα 19. Νευρομυϊκή σύναψη. Η νευρική ίνα διακλαδίζεται στο άκρο της και σχηματίζει ένα σύμπλεγμα από διακλαδιζόμενες νευρικές απολήξεις, εκτεινόμενες σε πτυχώσεις της μυϊκής ίνας (τελική κινητική πλάκα). Οι πτυχώσεις αυτές καλύπτονται από τη βασική μεμβράνη. Κάθε κλάδος της νευρικής ίνας σχηματίζει στο τέλος του τα συναπτικά κομβία που περιέχουν άφθονα μιτοχόνδρια, νευροϊνίδια και σφαιρικές κύστεις με ακετυλοχολίνη (συναπτικά κυστίδια). Ο χώρος που παρεμβάλλεται μεταξύ της νευρικής απόληξης και της μεμβράνης της μυϊκής ίνας ονομάζεται συναπτική σχισμή. Στις ακρολοφίες των πτυχώσεων της μετασυναπτικής μεμβράνης βρίσκονται οι nachrs. 44

55 Εισαγωγή Αλλοστερικές καταστάσεις του nachr Η λειτουργία του nachr στη νευρομυϊκή σύναψη ενέχει μία συνεχή διαδικασία δέσμευσης-αποδέσμευσης της ACh με επακόλουθο το άνοιγμα και κλείσιμο του πόρου του καναλιού και τη μεταβολή του δυναμικού της μετασυναπτικής μεμβράνης. Ο nachr, ανταποκρινόμενος στο προσυναπτικό ερέθισμα μεταπίπτει σε διαφορετικές λειτουργικές καταστάσεις, οι οποίες ισοδυναμούν με διαφορετικές δομικές καταστάσεις διακρινόμενες από μικρές αλλά σαφείς και αμφίδρομες δομικές τροποποιήσεις, καθώς το μόριο αυτό είναι μία αλλοστερική πρωτεΐνη (Karlin and Akabas 1995, Lena and Changeux 1993). Υπάρχουν τρεις βασικές αλλοστερικές καταστάσεις του nachr, οι οποίες μπορούν να παρατηρηθούν υπό την επίδραση διαφόρων υποκαταστατών (Εικόνα 20). Εικόνα 20. Σχηματική αναπαράσταση των αλλοστερικών καταστάσεων του nachr. I. Κατάσταση ηρεμίας. Το κανάλι είναι κλειστό, αλλά μπορεί να ενεργοποιηθεί με τη δέσμευση δύο μορίων ACh. II. Ενεργή κατάσταση. Το κανάλι είναι ανοιχτό. Ο nachr είναι προσδεδεμένος με δύο μόρια ACh. Η μετάβαση στην ενεργή κατάσταση από την κατάσταση ηρεμίας είναι μία εξαιρετικά γρήγορη διαδικασία ( μs). III. Απευαισθητοποιημένη κατάσταση. Το κανάλι είναι κλειστό. Αν και στο nachr είναι προσδεδεμένα δύο μόρια ACh, αυτός δεν μπορεί να ενεργοποιηθεί. Η μετάβαση 45

56 Εισαγωγή από την ενεργή στην απευαισθητοποιημένη κατάσταση είναι κατά τρεις τάξεις μεγέθους βραδύτερη διαδικασία. Η κατάσταση αυτή παρατηρείται μετά από παρατεταμένη έκθεση του nachr σε υψηλές συγκεντρώσεις υποκαταστάτη. Ωστόσο, ο φυσιολογικός της ρόλος δεν έχει διασαφηνιστεί, δεδομένου ότι στη σύναψη η AChE υδρολύει την ACh ταχύτατα, με αποτέλεσμα ο nachr να μην εκτίθεται παρατεταμένα σε αρκετά υψηλές συγκεντρώσεις ACh. Κάποια χαρακτηριστικά του τρόπου λειτουργίας του nachr, όπως η συνεργική διαδικασία που λαμβάνει χώρα μεταξύ της πρόσδεσης του αγωνιστή και του ανοίγματος του πόρου του καναλιού, έρχονται σε συμφωνία με το κλασσικό αλλοστερικό πρότυπο των Monod-Wyman-Changeux (Monod et al 1965). Ωστόσο, άλλα χαρακτηριστικά και κυρίως η μη-ισοδυναμία μεταξύ των δύο θέσεων πρόσδεσης της ACh δεν είναι σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, το οποίο απαιτεί απόλυτη συμμετρία στις θέσεις πρόσδεσης του υποκαταστάτη (Changeux and Edelstein 1994) Υποκαταστάτες που προσδένονται στον nachr Τα χημικά μόρια που προσδένονται στο nachr διακρίνονται σε αγωνιστές, ανταγωνιστές και αλλοστερικούς τροποποιητές, ανάλογα με τη θέση πρόσδεσης και τον τρόπο που επηρεάζουν τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού. A) Αγωνιστές: αλληλεπιδρούν με τον υποδοχέα στην ίδια ή παραπλήσια θέση με αυτή της πρόσδεσης της ACh, επάγοντας την ενεργοποίηση του ιοντικού καναλιού. B) Ανταγωνιστές: αλληλεπιδρούν με τον υποδοχέα, επίσης στην ίδια ή παραπλήσια θέση με αυτή της πρόσδεσης της ACh, αλλά δρούν ακριβώς αντίθετα, αναστέλλοντας τη λειτουργία του ιοντικού διαύλου και παρεμποδίζοντας τη συναπτική διαβίβαση. Γ) Αλλοστερικοί τροποποιητές: αλληλεπιδρούν με το nachr σε διαφορετικές περιοχές από τη θέση πρόσδεσης της ACh και επάγουν ή αναστέλλουν τη λειτουργία του υποδοχέα. Αξίζει να σημειωθεί ότι υπάρχουν μόρια όπως η κυτισίνη, τα οποία δρούν άλλοτε ως αγωνιστές και άλλοτε ως ανταγωνιστές του nachr (Papke and Heinemann 1994) Αγωνιστές του nachr Ακετυλοχολίνη: Το μόριο της ACh αποτελεί τον ενδογενή φυσιολογικό αγωνιστή του υποδοχέα και προκαλεί τη διέγερση του μετασυναπτικού νευρώνα στη νευρομυϊκή σύναψη, αλληλεπιδρώντας με τον nachr. 46

57 Εισαγωγή Αρχικά είχε θεωρηθεί ότι στη διαμόρφωση της θέσης πρόσδεσης της ACh συμμετέχουν αποκλειστικά αμινοξέα της α υπομονάδας. Αργότερα, η θεωρία αυτή καταρρίφθηκε, αφού έγινε γνωστό ότι οι θέσεις δέσμευσης της ACh σχηματίζονται στις μεσεπιφάνειες μιας α υπομονάδας και της γειτονικής της (γ ή/και δ), με τη συμμετοχή αμινοξικών καταλοίπων και από τις δυο υπομονάδες (Kurosaki et al 1987, Karlin et al 1995). Πειραματικά δεδομένα αποκάλυψαν πως το ζεύγος των γειτονικών κυστεϊνών (Cys192-Cys193) στην α υπομονάδα συμμετέχει στις θέσεις πρόσδεσης για μόρια αγωνιστών και ανταγωνιστών (Kao et al 1984). Επιπλέον πειράματα σήμανσης με παράγωγα αγωνιστών και ανταγωνιστών, κατέδειξαν τέσσερα ακόμα κατάλοιπα της α υπομονάδας (Tyr93, Trp149, Tyr190, Tyr198) ως σημαντικά για το σχηματισμό της θέσης πρόσδεσης (Dennis et al 1988, Abramson et al 1989, Galzi et al 1990, Middleton and Cohen 1991). Πειράματα μεταλλαξιγεννέσεων σε κάποια από τις γειτονικές κυστεΐνες (Cys192-Cys193) ή σε κάποιο από τα παραπάνω τέσσερα αρωματικά κατάλοιπα έδειξαν μια μείωση της συγγένειας για την ACh φορές (Mishina et al 1985, Galzi et al 1991, Tomaselli et al 1991, O Leary and White 1992, Aylwin and White 1994). Αντίστοιχες μελέτες έδειξαν πως τα αμινοξέα Asp174 στη γ υπομονάδα και Asp180 και Glu189 στη δ υπομονάδα, συμμετέχουν επίσης στο σχηματισμό της θέσης πρόσδεσης της ACh, (Czajkoski et al 1993, Martin et al 1996). Η πρόσφατη λύση των κρυσταλλικών δομών της AChBP παρουσία ή μη χολινεργικών προσδετών ( ), καθώς και οι πρόσφατες μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας του Torpedo nachr ( ), επιβεβαίωσαν πολλά από τα προαναφερθέντα πειραματικά δεδομένα. Επιπλέον, οι πρόσφατες αυτές μελέτες έδειξαν ότι διάφορα αμινοξικά κατάλοιπα που ανήκουν σε τρείς διακριτές θηλιές (A, B, C) των α1 υπομονάδων είναι εκείνα που συνεισφέρουν στη συγκρότηση της κυρίως πλευράς της θέσης πρόσδεσης, ενώ κατάλοιπα γειτονικών υπομονάδων, οργανωμένα επίσης σε τρείς διακριτές θηλιές (D, E, F), συνεισφέρουν στη συγκρότηση της συμπληρωματικής πλευράς της θέσης πρόσδεσης. Η διαμόρφωση των θέσεων πρόσδεσης της ACh τροποποιείται κατά την πρόσδεση των αγωνιστών και κατά συνέπεια κατά τις μεταπτώσεις του μορίου του υποδοχέα μεταξύ των διαφορετικών λειτουργικών καταστασεών του. Νικοτίνη: Αποτελεί τυπικό εξωγενή αγωνιστή των nachrs. Οι ομοπενταμερείς νευρικοί υποδοχείς εμφανίζουν υψηλότερη χημική συγγένεια για τη νικοτίνη, συγκριτικά με την ACh (Corringer et al 1998). Η λύση της κρυσταλλικής δομής του 47

58 Εισαγωγή συμπλόκου AChBP/νικοτίνη (Celie et al 2004) αποκάλυψε τη θέση πρόσδεσής της στους nachrs σε ατομικό επίπεδο (Εικόνα 6Α). Καρβαμυλοχολίνη: Αποτελεί ιδιαίτερα σταθερό αγωνιστή, τόσο των νικοτινικών όσο και των μουσκαρινικών AChRs, ο οποίος παρεμποδίζει τη δράση του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση (AChE). Η λύση της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου AChBP/καρβαμυλοχολίνη (Celie et al 2004) αποκάλυψε τη θέση πρόσδεσής της στους nachrs σε ατομικό επίπεδο (Εικόνα 6 Β), η οποία είναι η ίδια με αυτή της νικοτίνης, αλλά σε αυτή πατατηρούνται κάποιες μικρές διαφοροποιήσεις, όσον αφορά στα αμινοξικά κατάλοιπα της AChBP, που συμμετέχουν στη συγκρότησή της ( ). Επιβατιδίνη: Aποτελεί τον ισχυρότερο αγωνιστή του νευρικού nachr. Είναι αλκαλοειδές που έχει απομονωθεί από το δέρμα του δηλητηριώδους βατράχου Epipedobates tricolor και έχει τη δυνατότητα να προσδένεται με υψηλή συγγένεια σε ετερομερείς και ομοπενταμερείς υπότυπους του νευρικού nachr (Badio and Daly 1994). Η ακριβής θέση πρόσδεσής της αποκαλύφθηκε επίσης σε ατομικό επίπεδο από λύση της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου της με την AChBP (Hansen et al 2005) Ανταγωνιστές του nachr α-μπουγκαροτοξίνη (α-bgtx): Η α-bgtx απομονώθηκε από το δηλητήριο του φιδιού Bungarus multisinctus. Αποτελεί πολυπεπτίδιο 74 αμινοξέων με μοριακό βάρος ~8 KDa, και εμφανίζει πολύ υψηλή χημική συγγένεια (K d = 5x x10-11 Μ) για το μυϊκό nachr. Λειτουργεί ως ανταγωνιστής της ACh και δύναται να αναστείλλει τη λειτουργία του ιοντικού καναλιού (Karlin et al 1986, Arias 1997). Ο ανταγωνιστής προσδένεται και σε ορισμένους υποτύπους του νευρικού AChR. Με την εφαρμογή συστημάτων ετερόλογης έκφρασης για υπομονάδες του νευρικού nachr, διαπιστώθηκε πως ο ανταγωνιστής αλληλεπιδρά και συνδέεται με τους ομοπενταμερείς α7, α8, α9 nachrs και μάλιστα με αρκετά υψηλή συγγένεια (K d ~10-9 M), ενώ αντίθετα δε συνδέεται με τους ετεροπενταμερείς νευρικούς α χ /β y και α7/α8 nachrs. Για τον εντοπισμό της θέσης πρόσδεσης της α-bgtx στην α υπομονάδα του μυϊκού nachr, χρησιμοποιήθηκαν πεπτίδια προερχόμενα από πρωτεόλυση του α μορίου (Tzartos and Changeux 1983, 1984, Wilson et al 1985, Neumann et al 1986), ανασυνδυασμένα τμήματα της συγκεκριμένης υπομονάδας (Barkas et al 1986, 1987, 1988, Aronheim et al 1988), καθώς και συνθετικά πεπτίδια (Wilson and Lentz 1988, Gotti et al 1988, Lentz 1995). Από τις μελέτες αυτές προέκυψε ότι η βασική περιοχή 48

59 Εισαγωγή πρόσδεσης του ανταγωνιστή βρίσκεται σε μια μικρή αλληλουχία της α1 υπομονάδας, η οποία συμπεριλαμβάνει και τις γειτονικές κυστεΐνες Cys192 και Cys193. Πιο λεπτομερείς μελέτες έδειξαν ότι το επταπεπτίδιο α του Torpedo είναι αναγκαίο και ταυτόχρονα επαρκές για την πρόσδεση του ανταγωνιστή (Tzartos and Remoundos 1990). Με τη χρήση πεπτιδικών αναλόγων του παραπάνω επταπεπτιδίου και τροποποιημένων ανασυνδυασμένων τμημάτων του αποκαλύφθηκε τελικά ότι τα αμινοξικά κατάλοιπα Tyr189, Tyr190, Cys192, Cys193 και Asp185 είναι απαραίτητα για την πρόσδεση της α-bgtx, σε αντίθεση με το δεσμό Cys192-Cys193 (Tzartos and Remoundos 1990, Chaturvedi et al 1993, Vincent et al 1998). Η πρόσφατη λύση της κρυσταλλικής δομής του συμλόκου α1-εκπ/α-bgtx (Dellisanti et al 2007) επιβεβαίωσε τα προηγούμενα πειραματικά δεδομένα και αποκάλυψε σε ατομικό επίπεδο και με μεγάλη ακρίβεια τη συγκρότηση της κυρίως πλευράς της θέσης πρόσδεσης της α-bgtx (Εικόνα 13). κ-μπουγκαροτοξίνη (κ-bgtx): Πρόκειται για ένα πολυπεπτίδιο μοριακού βάρους ~6,5 KDa, το οποίο εμπεριέχεται στο δηλητήριο του φιδιού Bungarus multisinctus, σε πολύ μικρότερες ποσότητες όμως από την α-bgtx (Chiappinelli 1983). Η κ-bgtx αναστέλλει τη συναπτική διαβίβαση σε γάγγλια του αυτόνομου νευρικού συστήματος, όπου εντοπίζονται διάφοροι ετεροπενταμερείς α χ /β y υπότυποι του νευρικού nachr (Gotti et al 1997). Η ικανότητα της κ-bgtx να αναστέλλει τη λειτουργία νευρικών nachr στα γάγγλια, καταγράφηκε για πρώτη φορά σε μελέτες που έγιναν στα βλεφαριδικά γάγγλια οφθαλμών από κοτόπουλο (Chiappinelli 1983). Άλλοι ερευνητές ονόμασαν το ίδιο μόριο ως 3.1 bgtx (Ravdin and Berg 1979) ή ως τοξίνη F (Loring et al 1984). D-τουμποκουραρίνη: Αποτελεί τη δραστική ουσία που απομονώνεται από το κουράριο, ένα μίγμα φυτικών τοξινών στο οποίο οι ιθαγενείς ινδιάνοι της νοτίου Αμερικής εμβάπτιζαν τα βέλη τους για να γίνουν περισσότερο αποτελεσματικά στο κυνήγι αγρίων ζώων. Αλληλεπιδρά κυρίως με τον μυϊκό και μυϊκού τύπου nachr, αλλά εμφανίζει δράση και σε ορισμένους υποτύπους νευρικού υποδοχέα. Γκαλαμίνη: Αποτελεί μουσκαρινικό αλλοστερικό τροποποιητή, ο οποίος μπλοκάρει τη δράση του μυϊκού, όχι όμως και του νευρικού nachr. Μεθυλ-κακονιτίνη (MLA): Οι ομοπενταμερείς α7 nachrs έχει δειχθεί να διαθέτουν πέντε θέσεις πρόσδεσης για το μόριο του συναγωνιστικού αυτού ανταγωνιστή (Palma et al 1996). Η ακριβής θέση πρόσδεσής της αποκαλύφθηκε σε ατομικό επίπεδο από τη λύση της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου της με την AChBP (Hansen et al 2005). 49

60 Εισαγωγή 1.6. Παθολογικές καταστάσεις που σχετίζονται με τους nachrs Οι nachrs έχουν συσχετισθεί με αρκετές νόσους του ανθρώπινου οργανισμού, με γνωστότερη και εκτενέστερα μελετημένη την αυτοάνοση βαριά μυασθένεια, στην οποία εμπλέκεται άμεσα ο μυϊκός nachr. Η μυασθένεια χαρακτηρίζεται από διαταραχές στη φυσιολογική λειτουργία της νευρομυϊκής σύναψης, οι οποίες οφείλονται στην απώλεια nachrs. Επιπρόσθετα, διάφοροι νευρικοί nachrs εμπλέκονται σε πλήθος παθολογικών καταστάσεων του Κ.Ν.Σ., το κύριο χαρακτηριστικό των οποίων είναι διαταραχές της χημικής διαβίβασης στις νευρικές συνάψεις Βαριά μυασθένεια (myasthenia gravis) Η βαριά μυασθένεια είναι ένα αυτοάνοσο νόσημα, κατά το οποίο η ανοσολογική απόκριση κατευθύνεται κατά των μυϊκών nachrs στις νευρομυϊκές συνάψεις. Χαρακτηριστικά της νόσου είναι η αδυναμία και η κόπωση των σκελετικών μυών. Στο μεγαλύτερο ποσοστό των ατόμων που πάσχουν από μυασθένεια (~85%) παράγονται αυτοαντισώματα έναντι του nachr, τα οποία δεν ανιχνεύονται στο αίμα φυσιολογικών ατόμων. Έχει διαπιστωθεί ότι η πλειοψηφία των αντισωμάτων στοχεύει στην κύρια ανοσογόνο περιοχή (MIR) του nachr, η οποία εδράζει στην ΕΚΠ της α1 υπομονάδας, αλλά και ότι η αλληλεπίδραση της MIR περιοχής με ορισμένα αντισώματα εξαρτάται και από άλλες υπομονάδες (Vincent and Newsom-Davis 1985, Fostieri et al 2000). Στο υπόλοιπο 15% των μυασθενικών απουσιάζουν τα αντι-nachr αυτοαντισώματα, παρόλο που έχει αποδειχθεί ότι ο ορός τους προκαλεί συμπτώματα μυασθένειας όταν χορηγηθεί σε πειραματόζωα. Σε αυτή την κατηγορία ασθενών, η αυτοάνοση απόκριση κατευθύνεται είτε έναντι του nachr και τα αντισώματα για διάφορους λόγους δεν είναι ανιχνεύσιμα, είτε έναντι κάποιου άλλου συστατικού της νευρομυϊκής σύναψης (Vincent and Newsom-Davis 1985). Στον ορό του αίματος ενός μικρού ποσοστού μυασθενικών έχουν ανιχνευθεί αυτοαντισώματα IgG (κυρίως IgG 4 ) έναντι της ειδικής μυϊκής κινάσης MuSK, η οποία εντοπίζεται στη μεμβράνη του μετασυναπτικού κυττάρου. Τα αντι-musk αντισώματα συνοδεύουν σοβαρές περιπτώσεις μυασθένειας κυρίως οφθαλμικού τύπου, ενώ απουσιάζουν από τον ορό ασθενών με αντι-nachr αντισώματα (Vincent et al 2004). Τα αυτοαντισώματα που παράγονται στη μυασθένεια προκαλούν μείωση των διαθέσιμων nachrs στις νευρομυϊκές συνάψεις μέσω των ακόλουθων μηχανισμών: 50

61 Εισαγωγή A. Επιταχυνόμενη ενδοκυττάρωση και αποικοδόμηση των nachrs (αντιγονική τροποποίηση). Η αντιγονική τροποποίηση του nachr οφείλεται στην ικανότητα των αντισωμάτων να συνδέονται συγχρόνως σε δυο γειτονiκά nachr μόρια. Οι διασυνδεόμενοι υποδοχείς δημιουργούν σύμπλοκα, τα οποία ενδοκυτταρώνονται με ταχύτερους ρυθμούς σε σχέση με τα μεμονωμένα μόρια και οδηγούνται στα λυσοσώματα όπου αποικοδομούνται. Έχει δειχθεί ότι οροί μυασθενικών σε ποσοστό 90% επιταχύνουν το ρυθμό ενδοκυττάρωσης και αποικοδόμησης των υποδοχέων κατά 2-3 φορές (Kao and Drachman 1977, Stanley and Drachman 1978, Drachman et al 1978, 1982, Loutrari et al 1992). Πρόσφατα δείχθηκε ότι καθαρά αντισώματα που απομονώθηκαν από ορούς μυασθενικών και στοχεύουν διαφορετικές υπομονάδες του nachr προκαλούν δοσο-εξαρτώμενη απώλεια υποδοχέων κατά την προσθήκη τους σε κυταροκαλλιέργειες. Η μελέτη αυτή συνέδεσε άμεσα την απώλεια nachrs με συγκεκριμένες υποομάδες αντισωμάτων, προϊόντων της αυτοάνοσης αντίδρασης (Sideris et al 2007). B. Λύση της μετασυναπτικής μεμβράνης μέσω της δράσης του συμπληρώματος. Με τη βοήθεια της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας εντοπίστηκαν και μελετήθηκαν μορφολογικές αλλοιώσεις στη μετασυναπτική μεμβράνη νευρομυϊκών συνάψεων μυασθενικών, οι οποίες αποδόθηκαν στη δράση του συμπλήρώματος (Engel et al 1976). Με χρήση τεχνικών ανοσοϊστοχημείας ανιχνεύθηκαν συστατικά του συμπληρώματος στις νευρομυϊκές συνάψεις ασθενών (Engel et al 1979, Engel and Arahata 1987). Επιπλέον, με πειράματα παθητικής μεταφοράς της ασθένειας σε ποντικούς, δείχθηκε ότι τα στοιχεία του συμπληρώματος ενισχύουν την παθογόνο δράση των αυτοαντισωμάτων, ενώ η απομάκρυνσή τους επιφέρει το αντίθετο αποτέλεσμα (Toyka et al 1977). Γ. Άμεση παρεμπόδιση της λειτουργίας του nachr. Μικρό ποσοστό μυασθενικών διαθέτουν στον ορό τους αντισώματα τα οποία παρεμποδίζουν την πρόσδεση της ACh στον υποδοχέα, αναστέλλοντας με τον τρόπο αυτό τη λειτουργία του ιοντικού διαύλου. Λόγω του μεγάλου σχετικού μεγέθους των αντισωμάτων, πιστεύεται ότι αυτά εμποδίζουν την πρόσδεση της ACh μέσω στερεοχημικής παρεμπόδισης. Ενδέχεται όμως τα αντισώματα αυτά να προσδένονται και σε κάποια διαφορετική περιοχή του υποδοχέα, μακριά από τη θέσης πρόσδεσης, εκδηλώνοντας τη δράση τους μέσω αλλοστερικών φαινομένων (Drachman et al 1982, Pachner 1989). Επίσης, τα αντι- MuSK αντισώματα παρεμποδίζουν τη συνάθροιση μορίων υποδοχέα στη μεμβράνη (Vincent et al 2003), αφού παρεμποδίζουν τη λειτουργία της MuSK πρωτεΐνης, η οποία 51

62 Εισαγωγή μέσω φωσφορυλίωσης των nachr μορίων, συνεισφέρει στη συνάθροισή τους στη μετασυναπτική μεμβράνη και στη διαμόρφωση μιας τελικής λειτουργικής τους δομής Θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη βαριά μυασθένεια Μέχρι σήμερα δεν έχει αναπτυχθεί κάποια ειδική θεραπευτική μέθοδος για τη μυασθένεια. Οι θεραπείες που εφαρμόζονται στοχεύουν κυρίως στην ανακούφιση των συμπτωμάτων, είναι μη ειδικές, ενώ συχνά η εφαρμογή τους συνοδεύεται από την εμφάνιση παρενεργειών. Eφαρμόζονται κυρίως τέσσερις θεραπευτικές προσεγγίσεις για την ανακούφιση των μυασθενικών: Α. Χορήγηση αντιχολινεστερασικών φαρμάκων. Τα φάρμακα της κατηγορίας αυτής εμποδίζουν την υδρόλυση της ACh στις νευρομυϊκές συνάψεις, αναστέλλοντας τη δράση της AChE. Με τον τρόπο αυτό παρατείνεται ο χρόνος αλληλεπίδρασης της ACh με τους εναπομείναντες nachrs, και ενισχύεται η νευρομυϊκή διαβίβαση. Φάρμακα με αντιχολινεστερασική δράση αποτελούν το εδροφώνιο, η νεοστιγμίνη και η πυριδοστιγμίνη, τα οποία συνιστούν και την πρώτη μορφή αγωγής που χρησιμοποιείται σε όλες τις περιπτώσεις των μυασθενικών. Β. Θυμεκτομή. Χωρίς να έχει αποσαφηνιστεί πλήρως ο ρόλος του θύμου αδένα στη μυασθένεια, η θυμεκτομή υπολογίζεται ότι οδηγεί στην πλήρη υποχώρηση των συμπτωμάτων της νόσου σε ποσοστό περίπου 35% επί του συνόλου των ασθενών, ενώ φαίνεται πως βελτιώνει αισθητά την κλινική εικόνα στους μισούς περίπου από τους υπόλοιπους. Τα επίπεδα των αντι-nachr αντισωμάτων, μειώνονται τις περισσότερες φορές μετά τη θυμεκτομή. Γ. Χορήγηση ανoσοσοκατασταλτικών φαρμάκων. Τα φάρμακα αυτά παρέχονται σε ασθενείς που δεν ανταποκρίνονται στις παραπάνω θεραπείες. Οι παρενέργειες που προκύπτουν από τη χορήγηση τους είναι σοβαρές και για το λόγο αυτό η χρήση τους περιορίζεται μόνο σε περιπτώσεις που είναι απολύτως απαραίτητη. Η ανοσοκατασταλτική θεραπεία λόγω των σοβαρών παρενεργειών απαιτεί στενή ιατρική παρακολούθηση. Δ. Πλασμαφαίρεση και ενδοφλέβια χορήγηση ανθρώπινων ανοσοσφαιρινών. Με την πλασμαφαίρεση πραγματοποιείται άμεση απομάκρυνση των αντισωμάτων από την κυκλοφορία, με αποτέλεσμα τη γρήγορη αλλά παροδική βελτίωση της κλινικής κατάστασης των μυασθενικών. Η βελτίωση της κλινικής κατάστασης των ασθενών διαρκεί μερικές εβδομάδες, ενώ όταν η πλασμαφαίρεση συνοδεύεται από ταυτόχρονη 52

63 Εισαγωγή θεραπεία με ανοσοκατασταλτικά φάρμακα, η βελτίωση των συμπτωμάτων μπορεί να διαρκέσει 2-6 μήνες. Η ενδοφλέβια χορήγηση ανθρώπινων ανοσοσφαιρινών χρησιμοποιείται επίσης για τη γρήγορη βελτίωση της κλινικής κατάστασης των μυασθενικών. Η υποχώρηση των συμπτωμάτων αρχίζει 4-5 ημέρες μετά τη χορήγηση και η βελτίωση της κλινικής εικόνας διατηρείται για μερικές εβδομάδες ή και μήνες. Πιθανόν η θεραπεία αυτή δρα μέσω ενός μηχανισμού αρνητικής ρύθμισης των αντιnachr αντισωμάτων (Drachman 1998). Προοπτικές στη θεραπεία της μυασθένειας: Όλες οι θεραπείες που ήδη αναφέρθηκαν δεν είναι ειδικές και επιπλέον εμφανίζουν σοβαρές παρενέργειες έπειτα από παρατεταμένη εφαρμογή. Μια αναπτυσσόμενη και πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση στηρίζεται στην κατασκευή κατάλληλων ανοσοπροσροφητικών στηλών που κατακρατούν ειδικά τα αντι-nachr αντισώματα από τον ορό του αίματος μυασθενικών (αντιγονο-ειδική θεραπεία). Για τη δημιουργία της στήλης, ανασυνδυασμένα α1-, β1-, γ- και ε-ekπ μόρια του μυϊκού nachr παράγονται σε ετερόλογα συστήματα έκφρασης (πχ Pichia pastoris) και ακινητοποιούνται σε αδιάλυτο υπόστρωμα CΝΒrσεφαρόζης. Ο ορός που εκλούεται από τη στήλη είναι πλέον απαλλαγμένος από τα παθογόνα αυτοαντισώματα (Psaridi-Linardaki et al 2002, 2003, Kostelidou et al 2006, 2007) Ασθένειες που σχετίζονται με τους νευρικούς nachrs Η Νόσος του Alzheimer Η νόσος περιγράφηκε για πρώτη φορά από το νευρολόγο Alois Alzheimer το 1907 και αποτελεί την πιο κοινή μορφή άνοιας. Η νόσος διακρίνεται σε πρώιμης έναρξης (εκδηλώνεται πρίν το 65 ο έτος της ζωής του ασθενούς) και σε όψιμης έναρξης (εκδηλώνεται μετά το 65 ο έτος) και εκδηλώνεται με σταδιακή απώλεια μνήμης, διαταραχή στην ομιλία και τη συμπεριφορά, προοδευτική εξασθένιση της ικανότητας μάθησης, ανησυχία και φόβο, ατονία, κατάπτωση και κατάθλιψη. Τα ιστοπαθολογικά ευρήματα στον εγκέφαλο που χαρακτηρίζουν τη νόσο είναι κυρίως δυο ειδών: α) γεροντικές αμυλοειδείς πλάκες που σχηματίζονται στο εξωτερικό των κυττάρων και β) νευροϊνιδιακοί κόμβοι, που σχηματίζονται ενδοκυτταρικά σε διάφορες θέσεις (περικάρυο, νευράξονες, δενδρίτες) προαποπτωτικών κυττάρων. Οι γεροντικές πλάκες αποτελούνται κυρίως από τα συσσωματώματα ενός αδιάλυτου πεπτιδίου μικρού μεγέθους (40-42 αμινοξέα), του αμυλοειδούς β-πεπτιδίου, το οποίο 53

64 Εισαγωγή παράγεται από την πρωτεολυτική διάσπαση της πρόδρομης πρωτεΐνης του β- αμυλοειδούς. Ο σχηματισμός των αδιάλυτων αυτών αποθέσεων είναι το βασικό αίτιο για τις διαταραχές σε μια σειρά σημαντικών νοητικών λειτουργιών που συνδέονται με προσβληθείσες περιοχές όπως ο νεοφλοιός και ο ιππόκαμπος. Μεταξύ των αλλαγών που συμβαίνουν στον εγκέφαλο ασθενών με Alzheimer και που εμπλέκουν διαταραχές στη δράση και άλλων νευροδιαβιβαστών, έχει διαπιστωθεί και σημαντική εξασθένιση της χολινεργικής διαβίβασης. Η εξασθένιση οφείλεται στην εκτεταμένη απώλεια θέσεων που εμφανίζουν υψηλή συγγένεια πρόσδεσης για τη νικοτίνη, γεγονός που υποδηλώνει την απώλεια κάποιων νευρικών nachrs (Kihara et al 1997, Martin-Ruiz et al 1999, Wang et al 2000). Εξάλλου στον ιππόκαμπο και το νεοφλοιό έχει καταγραφεί ραγδαία μείωση στα επίπεδα του ενζύμου που καταλύει τη βιοσύνθεση της ACh (Kihara et al 1997, Hardy 1997, Li and Buccafusco 2003). Μέχρι σήμερα δεν έχουν προσδιοριστεί με σαφήνεια και βεβαιότητα οι υπότυποι των nachrs που προσβάλλονται περισσότερο από τη νόσο. Μια σειρά πειραμάτων έχει δείξει ότι ασθενείς με τη νόσο χαρακτηρίζονται από χαμηλά επίπεδα α4β2 nachr στην περιοχή του κροταφικού λοβού. Επιπλέον δείχθηκε ότι σε πάσχοντες από τη νόσο, τα επίπεδα των νευρικών κυττάρων που εκφράζουν α4 και α7 nachrs εμφανίζονται μειωμένα κατά ένα σημαντικό ποσοστό της τάξης του 30%. Αξίζει να σημειωθεί ότι στην ίδια μελέτη δεν παρατηρήθηκε καμία μη φυσιολογική μεταβολή σχετική με τα επίπεδα των μεταγράφων (mrnas) των υπομονάδων για τους υποδοχείς αυτούς (Warpman and Nordberg 1995, Martin-Ruiz et al 1999). Υποστηρίζεται ότι το β αμυλοειδές πεπτίδιο συνεντοπίζεται με τον α7 nachr σε μια ποικιλία νευρώνων του εγκεφαλικού φλοιού και αυτή η αλληλεπίδραση πιθανολογείται πως είναι υπαίτια για τον σχηματισμό των αμυλοειδικών πλακών στη νόσο του Alzheimer. H νικοτίνη έχει βρεθεί ότι προσφέρει αποτελεσματική προστασία σε καλλιέργειες νευρικών κυττάρων εγκεφαλικού φλοιού αρουραίου στις οποίες έχει χορηγηθεί το β αμυλοειδές πεπτίδιο. Επιπλέον, η προστατευτική δράση της νικοτίνης σε κύτταρα PC12 τα οποία εκφράζουν τον α7 nachr, παρεμποδίζεται τόσο από ανταγωνιστές του υποδοχέα, όσο και από το β αμυλοειδές πεπτίδιο (Kihara et al 1997, Li and Buccafusco 2003). Με δεδομένο ότι υπάρχει θετική επίδραση της νικοτίνης στις νοητικές διεργασίες της μάθησης και της μνήμης και επιπλέον ότι η μοναδική θεραπεία για την ανακούφιση των συμπτωμάτων της ασθένειας είναι η χορήγηση της τακρίνης (αναστολέας του ενζύμου AChE), η νικοτίνη και οι nachrs έχουν συγκεντρώσει το ερευνητικό ενδιαφέρον και αποτελούν στόχους για την ανάπτυξη φαρμάκων για την 54

65 Εισαγωγή καταπολέμηση της νόσου (Sahakian et al 1989, Benowitz 1996, Hardy et al 1997, Newhouse et al 2001). Τα φάρμακα αυτά είναι στην ουσία αγωνιστές ορισμένων νευρικών nachrs, οι οποίοι πρόκειται να ενισχύσουν τη νευροδιαβίβαση σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου και εκτός των λοιπών χαρακτηριστικών τους, θα πρέπει να μπορούν να εισέλθουν στο αυστηρά ελεγχόμενο περιβάλλον του εγκεφάλου και να έχουν χαμηλή συγγένεια για τους μυϊκούς nachrs (Arneric et al 1994). Η παρατεταμένη χορήγηση των αγωνιστών βέβαια ενέχει κινδύνους για τον οργανισμό, καθώς έχει δειχθεί ότι μπορεί να προκαλέσει απευαισθητοποίηση των υποδοχέων (αντιστρεπτή κατάσταση) αλλά και απενεργοποίηση αυτών, η οποία είναι μόνιμη, ενώ δύναται σε ορισμένες περιπτώσεις να επάγει την υπερέκφραση ορισμένων υποτύπων του υποδοχέα (Peng et al 1997) Η Νόσος του Parkinson Η νόσος του Parkinson αποτελεί ασθένεια του εξωπυραμιδικού κινητικού συστήματος, χαρακτηριζόμενη από δυσχέρεια στην έναρξη των διαφόρων κινήσεων και στην εκτέλεση λεπτών χειρισμών (Lloyd et al 1975). Ως παθοφυσιολογικό χαρακτηριστικό της νόσου θα μπορούσε να οριστεί η μεγάλης έκτασης απώλεια ντοπαμινεργικών νευρικών κυττάρων της φαιάς ουσίας και κατ επέκταση η ελάττωση του πλήθους των αδρενεργικών συνάψεων. Ένα άλλο σημαντικό γνώρισμα της ασθένειας αποτελεί η σημαντική απώλεια ορισμένων νευρικών nachrs, η οποία υποδηλώνεται από τη μείωση των θέσεων που εμφανίζουν υψηλή χημική συγγένεια για τη νικοτίνη. Για την συμπτωματική θεραπεία της νόσου χορηγείται ένα πρόδρομο μόριο της ντοπαμίνης η L-DOPA, της οποίας όμως η αποτελεσματικότητα μειώνεται με την παρατεταμένη χρήση (Coleman 1992). Το κάπνισμα, ως έμμεσος τρόπος χορήγησης νικοτίνης στον οργανισμό, έχει δειχθεί ότι προσφέρει σημαντική προστασία από τη νόσο του Parkinson (Morens et al 1995). Βέβαια, οι παρενέργειες από το καρδιαγγειακό και το γαστρεντερικό σύστημα δεν επιτρέπουν τη χορήγηση της νικοτίνης ως φαρμάκου επιλογής για την αντιμετώπιση της νόσου και οι ερευνητικές προσπάθειες εστιάζουν στην ανάπτυξη ειδικών αγωνιστών, οι οποίοι θα στοχεύουν σε διαφορετικούς νευρικούς nachrs, παρέχοντας παράλληλα προστασία στον οργανισμό από πιθανές παράπλευρες δράσεις τους. 55

66 Εισαγωγή Επιληψία Ο όρος επιληψία χρησιμοποιείται για να περιγράψει μια ανομοιογενή ομάδα ασθενειών με συναφή συμπτώματα και μη προσδιορισμένα παθοφυσιολογικά αίτια, που προσβάλλει περίπου το 2% του πληθυσμού. Μια σπάνια μορφή της ασθένειας, η αυτοσωμική επικρατής νυχτερινή επιληψία μετωπιαίου λοβού, σχετίζεται με μεταλλάξεις στο γονίδιο της νευρικής nachr α4 υπομονάδας. Τα χαρακτηριστικά της περιλαμβάνουν σύντομους πλήν βίαιους παροξυσμούς κατά τη διάρκεια του ύπνου, οι οποίοι σχετίζονται με διαταραχές στο μετωπιαίο λοβό (Scheffer et al 1995, Steinlein et al 1997). Οι νευρικοί nachrs είναι πολύ πιθανό να σχετίζονται και με άλλους τύπους της ασθένειας. Είναι πιθανό κάποια μεταλλαγμένα αλληλόμορφα ενός γενετικού τόπου να καθορίζουν την εμφάνιση επιληψίας με επικρατή τρόπο, ενώ διαφορετικά αλληλόμορφα του ιδίου τόπου να δημιουργούν μόνο προδιάθεση για την εκδήλωση της ασθένειας, λειτουργώντας ως υποτελή αλληλόμορφα. Yπάρχουν ενδείξεις για την εμπλοκή της χρωμοσωμικής περιοχής που περιλαμβάνει και το γονίδιο της νευρικής α7 nachr υπομονάδας (15q14) σε ορισμένες μορφές επιληψίας (Neubauer et al 1998) Σχιζοφρένεια Η σχιζοφρένεια είναι μια καταστρεπτική ετερογενής ψύχωση που εμφανίζεται σε προχωρημένη εφηβική ηλικία ή στα πρώτα στάδια της ενηλικίωσης και ακολουθεί μια συνεχώς επιδεινούμενη πορεία που χαρακτηρίζεται από παραισθήσεις, αυταπάτες, αλλόκοτη και ιδιότροπη συμπεριφορά, απάθεια, αδιαφορία και απότομη συγκίνηση (Arnold and Trojanowski 1996). Σύμφωνα με τη λεγόμενη υπόθεση ντοπαμίνης η σχιζοφρένεια προκαλείται από υπερβολική απελευθέρωση ντοπαμίνης στις αδρενεργικές συνάψεις του εγκεφάλου. Μερικά από τα παραπάνω συμπτώματα μπορούν επίσης να προκληθούν από φάρμακα, όπως το PCP, τα οποία δρουν ως αναστολείς των γλουταμινικών υποδοχέων και των υποδοχέων της ακετυλοχολίνης. Οι μηχανισμοί παθογένεσης της σχιζοφρένειας παραμένουν άγνωστοι. Έχει προταθεί ότι οι α7 nachrs είναι πιθανό να συνδέονται με αυτή την ασθένεια (Leonard et al 1996, Freedman et al 1997), αφού η έκφραση των α7 nachrs στην περιοχή του ιππόκαμπου εμφανίζεται μειωμένη στον εγκέφαλο των σχιζοφρενών (Freedman et al 1995). Επίσης, οι ασθενείς με σχιζοφρένεια παρουσιάζουν ένα χαρακτηριστικό σφάλμα στην 56

67 Εισαγωγή ακουστική απόκριση, το οποίο είναι κληρονομικό και χαρτογραφείται στο γονίδιο της α7 nachr υπομονάδας (Freedman et al 1997). Οι περισσότεροι σχιζοφρενείς είναι μανιώδεις καπνιστές και θεωρείται πιθανό ότι χρησιμοποιούν ασυνείδητα το κάπνισμα ως μορφή αυτοθεραπείας. Η επίδραση όμως της νικοτίνης είναι μάλλον παροδική, καθώς είναι γνωστό ότι οι α7 nachrs απευαισθητοποιούνται ταχύτατα Σύνδρομο Tourette Το σύνδρομο Tourette είναι μια ασθένεια του κινητικού συστήματος που χαρακτηρίζεται από ακούσιους σπασμούς κατά την κίνηση και την ομιλία. Τα συμπτώματα της νόσου εμφανίζονται από την παιδική ηλικία και συχνά συνοδεύονται από υπερδραστηριότητα, ανησυχία, φοβίες και αίσθημα ψυχαναγκασμού. Οι μηχανισμοί παθογένεσης της νόσου παραμένουν άγνωστοι. Κλινικές δοκιμές έχουν δείξει ότι η ουσία αλοπεριδόλη, που δρα ως ανταγωνιστής του υποδοχέα της ντοπαμίνης, βελτιώνει σε μικρό βαθμό την κλινική κατάσταση ορισμένων ασθενών. Αντίθετα, τα έμπλαστρα νικοτίνης, από μόνα τους ή σε συνδυασμό με άλλη φαρμακευτική αγωγή, μειώνουν σε σημαντικό βαθμό την επίπτωση των ακούσιων σπασμών σε πολλούς ασθενείς (Sanberg et al 1997), πιθανόν λόγω απευαισθητοποίησης ή και αδρανοποίησης των α4β2 και α7 nachrs (Hsu et al 1996) Eθισμός στη νικοτίνη Η σημαντικότερη ίσως αρνητική συνέπεια για τον άνθρωπο-από ιατρική άποψη-που συνδέεται με τη λειτουργία των nachrs, είναι ο ρόλος τους στον εθισμό στο κάπνισμα. Στατιστικές μελέτες έδειξαν πως το κάπνισμα ευθύνεται για περίπου πρόωρους θανάτους συνολικά στον πλανήτη μέχρι το τέλος του προηγούμενου αιώνα (Koop 1988, Peto et al 1992). Οι α4β2 nachrs έχουν τη μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης της νικοτίνης. Έχει διαπιστωθεί ότι η συνεχής έκθεση σε νικοτίνη οδηγεί σε υπερέκφραση των α4β2 nachrs στον εγκέφαλο, η οποία συνδέεται με την απελευθέρωση ντοπαμίνης στα μεσολυμβικά μονοπάτια (Balfour 2004). Το μεσομεταιχμιακό ντοπαμινεργικό σύστημα θεωρείται επίσης υπεύθυνο για την εξάρτηση του οργανισμού από τη νικοτίνη και άλλες ουσίες που προκαλούν εθισμό (Dani and Heinemann 1996, Pich et al 1997). Έχει διαπιστωθεί επίσης υπερέκφραση α7 nachrs σε καρκινώματα πνευμόνων καπνιστών (Sciamanna et al 1997), οι οποίοι υποδοχείς εμφανίζουν επίσης πολύ μεγάλη συγγένεια 57

68 Εισαγωγή πρόσδεσης για τη νικοτίνη. Μάλιστα, η αύξηση του όγκου κατέστη δυνατό να παρεμποδιστεί με τη χορήγηση α-νευροτοξινών ή α-κονοτοξινών, μεσω του μλοκαρίσματος των α7 nachrs (Sandall et al 2003). Η νικοτίνη έχει χρησιμοποιηθεί σε διάφορες μορφές συσκευασμάτων (έμπλαστρα, τσίχλες, σπρέϊ) ώς μία σχετικά επιτυχής προσέγγιση για τη διακοπή του καπνίσματος. Βέβαια, διάφορες ουσίες που δρούν ως αγωνιστές των α7 ή/και α4β2 nachrs αποτελούν πιο υποσχόμενες θεραπευτικές προσεγγίσεις. Η βαρενικλίνη (Varenicline), η οποία μόλις πρόσφατα εγκρίθηκε από τον οργανισμό FDA των ΗΠΑ, αποτελεί μία ουσία με αγωνιστικές και ανταγωνιστικές ιδιότητες για το νευρικό α4β2 nachr και εμφανίζει ιδιαίτερα ικανοποιητικά αποτελέσματα όσον αφορά στη προσπάθεια διακοπής του καπνίσματος (Tonstad 2006). 58

69 Σκοπός ΙΙ. ΣΚΟΠΟΣ 59

70 Σκοπός 2. ΣΚΟΠΟΣ Όπως έγινε αντιληπτό από το θεωρητικό μέρος της παρούσης διατριβής, μέχρι στιγμής έχει επιτευχθεί σημαντική πρόοδος, όσον αφορά την κατανόηση της δομής των νικοτινικών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης (nachr). Η κρυστάλλωση και λύση της δομής της ομόλογης προς τις εξωκυτταρικές περιοχές του nachr, πρωτεΐνης δέσμευσης της ακετυλοχολίνης (AChBP) διάφορων γαστερόποδων, απουσία και παρουσία χολινεργικών προδετών, ήταν ένα πολύ σημαντικό βήμα για την κατανόηση της διαμόρφωσης των θέσεων πρόσδεσης των αντίστοιχων προσδετών στους nachrs (Brejc et al 2001, Smit et al 2001, Celie et al 2004, Celie et al 2005a, Celie et al 2005b, Hansen et al 2005, Bourne et al 2005, Ulens et al 2006). Η λύση της δομής του Torpedo nachr με μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, αποτέλεσε επίσης ένα πολύ σημαντικό βήμα στην κατανόηση της δομής ολόκληρου του υποδοχέα (Unwin 2005). Λόγω όμως της σχετικά χαμηλής ανάλυσης (4 Å) αυτών των μελετών δεν κατέστη δυνατή η ανάλυση σε ατομικό επίπεδο των, μεγάλου φαρμακολογικού ενδιαφέροντος, θέσεων πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών του nachr. Ένα επίσης σημαντικό επίτευγμα αποτέλεσε η μεταγενέστερη αυτών των μελετών, συγκρυστάλλωση της εξωκυτταρικής περιοχής (ΕΚΠ) της α1 υπομονάδας του μυϊκού nachr επίμυος με τον nachr ανταγωνιστή α-bgtx, και η λύση της δομής αυτού του συμπλόκου σε ανάλυση 1,94 Å (Dellisanti et al 2007). Με αυτή τη μελέτη, εκτός του ότι επιβεβαιώθηκε ότι ήταν ήδη γνωστό για τη δομή της α1-εκπ του nachr από τις προηγούμενες μελέτες των ομόλογων AChBPs και του Torpedo nachr, αποκαλύφθηκαν επιπλέον τα αμινοξικά κατάλοιπα της α1-eκπ που είναι σημαντικά για την δημιουργία αλληλεπιδράσεων με τον ανταγωνιστή α-bgtx, καθώς επίσης και μία υδρόφιλη περιοχή μέσα στον υδρόφοβο πυρήνα της α1-εκπ, η οποία εμφανίζεται συντηρημένη σε όλες τις υπομονάδες του nachr και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο όσον αφορά την λειτουργικότητα του nachr. Η λύση της δομής της α1-εκπ του μυϊκού nachr, παρόλη την σπουδαιότητά της, εν τούτοις δεν στάθηκε ικανή να αποκαλύψει τη συγκρότηση των θέσεων πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών σε ατομικό επίπεδο, δεδομένου ότι για τη δημιουργία αυτών των θέσεων στον μυϊκό nachr είναι απαραίτητη και η συμμετοχή των ΕΚΠ τμημάτων των παράπλευρων γ (ε στα ενήλικα άτομα) ή δ υπομονάδων. Τέλος ένα σημαντικό επίτευγμα αποτέλεσε η λύση της δομής μίας προκαρυωτικής LGIC πρωτεΐνης (ELIC) (Hilf and Dutzler 2008), με την οποία αποκαλύφθηκε η προγονική 60

71 Σκοπός δομή του nachr καθώς και των άλλων ευκαρυωτικών LGICs. Η σύγκριση της δομής της με αυτή του nachr αποκάλυψε τις ομοιότητες και διαφορές που συντηρήθηκαν ή παρουσιάστηκαν, αντίστοιχα, κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, προκειμένου να προκύψουν οι συγκεκριμένες ιδιότητες και λειτουργίες του nachr. Έτσι, παρόλη τη σημαντική πρόοδο που έχει επιτευχθεί τα τελευταία χρόνια στην κατανόηση της δομής του nachr, είναι ακόμη αναγκαία η κρυστάλλωση και η λύση της δομής σε μεγάλη ανάλυση πενταμερών συμπλόκων (ή τουλάχιστον διμερών συμπλόκων μεταξύ κατάλληλων nachr υπομονάδων), έτσι ώστε να αποκαλυφθεί πλήρως η συγκρότηση σε ατομικό επίπεδο των θέσεων πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών. Aυτό θα αποτελέσει και το έναυσμα των προσπαθειών ορθολογικού σχεδιασμού φαρμάκων, κατευθυνόμενων από τη δομή του μορίου-στόχου, ώστε να αντιμετωπισθούν επιτυχώς διάφορες σημαντικές παθολογικές καταστάσεις στις οποίες ενέχονται οι nachrs (μυασθένεια, Alzheimer, Parkinson, σχιζοφρένεια, επιληψία, εθισμός στη νικοτίνη, κλπ). Η νευρική α7 υπομονάδα είναι η μόνη γνωστή ανθρώπινη υπομονάδα του nachr, η οποία συγκροτεί πενταμερή μόρια με 5 θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών (μία θέση πρόσδεσης σε κάθε α7 πρωτομερές). Έτσι, η ενδεχόμενη κρυστάλλωση και λύση της δομής της σε ατομικό επίπεδο θα αποκαλύψει με μεγάλη ακρίβεια τη δομή των θέσεων πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών, κάτι που θα είναι σημαντικού φαρμακολογικού ενδιαφέροντος για την αντιμετώπιση διάφορων νευρικών παθήσεων στον άνθρωπο. Επιπλέον, θα αποτελέσει μοντέλο μελέτης των άλλων υπότυπων μυϊκού και νευρικού τύπου nachrs, δεδομένης της πενταμερούς συγκρότησης των α7 μορίων. Ο κύριος στόχος της παρούσης διατριβής ήταν η κατασκευή και παραγωγή ανασυνδυασμένων ανθρώπινων νευρικών α7-εκπ μορίων, κατάλληλων για αναλυτικές δομικές μελέτες. Ο λόγος για τον οποίο θελήσαμε να μελετήσουμε τα εξωκυτταρικά τμήματα του α7 nachr και όχι ολόκληρο τον α7 υποδοχέα ήταν προκειμένου να ξεπεράσουμε τη μεγάλη δυσκολία που θα προέκυπτε όσον αφορά την κρυστάλλωση ολόκληρου του υποδοχέα, λόγω της παρουσίας μεγάλων υδρόφοβων διαμεμβρανικών περιοχών. Εξ άλλου, οι μεγάλου φαρμακολογικού ενδιαφέροντος θέσεις πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών εδράζουν στα ΕΚΠ τμήματα του α7 nachr. Για το σκοπό αυτό, είχε κατασκευασθεί και εκφρασθεί παλαιότερα στο Εργαστήριό μας η ΕΚΠ του αγρίου τύπου της α7 υπομονάδας του nachr από κύτταρα ζύμης P. pastoris. Τα παραγόμενα όμως α7-εκπ μόρια εκφράστηκαν με τη μορφή συσσωματωμάτων υψηλού μοριακού βάρους και με τη μορφή ολιγομερών με μοριακά βάρη σημαντικά 61

72 Σκοπός υψηλότερα από τα αναμενόμενα για πενταμερή α7-εκπ μόρια. Η υψηλή υδροφοβικότητα που εμφάνισαν τα α7-εκπ μόρια αγρίου τύπου μειώθηκε σημαντικά με την κατασκευή ενός διπλού μεταλλάγματος (α7-εκπ-dm), στο οποίο είχε γίνει η σημειακή κατευθυνόμενη μετάλλαξη Cys116Ser και η αντικατάσταση ολόκληρης της Cys θηλιάς του από την αντίστοιχη και πιο υδρόφιλη Cys θηλιά της ομόλογης πρωτεΐνης AChBP (Avramopoulou et al 2004). Το διπλό αυτό μετάλλαγμα, αν και σημείωσε μία σημαντική μείωση της υδροφοβικότητας των α7-εκπ μορίων, εν τούτοις διατήρησε σε κάποιο βαθμό την τάση δημιουργίας συσσωματωμάτων υψηλού μοριακού βάρους, ενώ τα ολιγομερή του μόρια, άν και εκφράζονταν πλέον σε μοριακά βάρη πολύ κοντά στα αναμενόμενα για πενταμερή α7-εκπ μόρια, ακόμη απείχαν από αυτά. Έτσι, προκειμένου να επιτευχθεί ο κύριος στόχος της παρούσης διατριβής, κρίθηκε απαραίτητη η κατασκευή και παραγωγή νέων μεταλλαγμένων νευρικού τύπου ανθρώπινων α7-εκπ μορίων, κατάλληλων για αναλυτικές δομικές μελέτες. Ο σχεδιασμός των καινούριων α7-εκπ μεταλλαγμάτων βασίστηκε στις συσσωρευμένες πληροφορίες που υπήρχαν τη δεδομένη χρονική στιγμή από τη λύση της κρυσταλλικής δομής της AChBP και από μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας του Torpedo nachr. Όλα τα καινούρια α7-εκπ μεταλλάγματα εκφράστηκαν στο ίδιο σύστημα έκφρασης με τα μόρια αγρίου τύπου και διπλά μεταλλαγμένα, το οποίο ήταν και αυτό που χρησιμοποιήθηκε για την έκφραση της α1-εκπ επίμυος, που κρυσταλλώθηκε μόλις πρόσφατα. Τα α7-εκπ μεταλλάγματα που κατασκευάσθηκαν ελέγχθηκαν όσον αφορά την διαλυτότητά τους, το μέγεθός τους, την ικανότητά τους να δεσμεύουν χολινεργικούς προσδέτες, τη σύσταση δευτεροταγούς δομής και την ύπαρξη τριτοταγούς δομής, ώστε να επιλεγχθεί το καλύτερο από αυτά για περαιτέρω δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης. Ένας άλλος στόχος της παρούσης διατριβής ήταν η πραγματοποίηση δομικών μελετών των εκφραζόμενων στο Εργαστήριό μας, από κύτταρα P. pastoris, ΕΚΠ τμημάτων του ανθρώπινου μυϊκού nachr (Psaridi-Linardaki et al 2002, Kostelidou et al 2006). Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν ανασυνδυασμένα α1-, β1-, γ- και ε- ΕΚΠ μόρια του μυϊκού nachr, στα οποία πραγματοποιήθηκαν μελέτες εύρεσης της δευτεροταγούς και τριτοταγούς τους δομής. Αυτές οι μελέτες έγιναν έτσι ώστε να αξιολογηθεί αφ ενός η ποιότητα αυτών των μυϊκών μορίων που χρησιμοποιούνται για μία αναπτυσσόμενη, από το Εργαστήριό μας, αντιγονο-ειδική θεραπεία των μυασθενικών, και αφ ετέρου η καταλληλότητά τους για περαιτέρω δομικές μελέτες υψηλότερης ανάλυσης. 62

73 ΙΙΙ. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 63

74 Υλικά & Μέθοδοι 3. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1. ΥΛΙΚΑ Εργαστηριακά όργανα Επωαστήρας για καλλιέργειες βακτηρίων υπό ανάδευση, GALLENΚAMP Επωαστήρες για καλλιέργειες ζυµοµυκήτων υπό ανάδευση, GALLENΚAMP Φυγόκεντρος Sorvall RC5C (κεφαλές GS3 και SS34) Φυγόκεντρος Sigma 2-ΜΚ Μικροφυγόκεντρος Eppendorf 5410 Επιτραπέζια φυγόκεντρος Juan CR422 Φασµατοφωτόµετρο ορατού/υπεριώδους PERΚIN ELMER Lambda Βio 10 Φασµατοφωτόµετρο ορατού/υπεριώδους Jenway 6305 Υδατόλουτρα Memmert και Digiterm Σύστημα μικροδιήθησης διαλυµάτων Millipore Σύστημα υπερδιήθησης διαλυµάτων Millipore Minitan system (περιλαμβάνει κασσέτα PALL, με μεμβράνες τέτοιου μεγέθους ώστε να αποκλείει είσοδο μορίων με μοριακή μάζα > 10 kda) Περισταλτική αντλία Millipore Συσκευή PCR (Θερµικός κυκλοποιητής), ΜJ Research PTC-200 Συσκευές οριζόντιας ηλεκτροφόρησης αγαρόζης Συσκευές κάθετης ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών Mini-Protean ΙΙ και Mini-Protean ΙΙΙ BIORAD και συσκευή µεταφοράς πρωτεϊνών σε νιτροκυτταρίνη Mini-Trans- Blot, BIORAD Συσκευή ξήρανσης πηκτωµάτων Gel Air Dryer, BIORAD Σύστηµα 3 συσκευών για µετασχηµατισµό κυττάρων µε ηλεκτροδιάτρηση: GENE PULSER, PULSE CONTROLLER και GENE TRANSFORMER, BIORAD Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας για μέτρηση μικρών ποσοτήτων, Mettler, model AESO Ηλεκτρονικός ζυγός, Kern EW Μαγνητικοί αναδευτήρες, Cimarec 3 Αναδευτήρες, Vortex-GENIE 2 Spyramix 64

75 Υλικά & Μέθοδοι Πεχάμετρο, HANNA Θερµαινόµενο λουτρό υπερήχων BRANSON 2200 Συσκευή FPLC ACTA purifier 90, Amersham Biosciences Συσκευή πλύσης ραδιενέργειας με 12 θέσεις υποδοχής φίλτρων, Millipore Μετρητής γ-ακτινοβολίας LKB Wallac CliniGamma 1272, Kontron, Analytical MDA212 Όργανο μέτρησης έντασης της δυναμικής σκέδασης φωτός Nano S, Malvern instruments, UK Φασματοπολωσίμετρο κυκλικού διχρωισμού Jasco Model J-715, Japan Spectroscopic Co., Tokyo, Japan Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διερχόμενης δέσμης Philips Αναλώσιµα Τρυβλία petri για στερεές καλλιέργειες βακτηρίων από Vive Κωνικές φιάλες 500 ml, 1 L, 2 L, ISOLAB Πλαστικοί σωλήνες φυγοκέντρησης 250 ml, Corning Πλαστικοί σωλήνες φυγοκέντρησης 250 ml και 500 ml, Sorvall Πλαστικοί και υάλινοι σωλήνες φυγοκέντρου, Corex Δοκιµαστικοί σωλήνες πολυπροπυλενίου µιας χρήσης 15 και 50 ml από Corning Πλαστικοί σωλήνες µιας χρήσης 1,5 ml από Greiner Πλαστικοί σωλήνες µιας χρήσης 0,25 ml από Costar Πλαστικά ακρορύγχια (tips), και πλαστικές αποστειρωµένες πιπέτες 1, 2, 5, 10 και 25 ml από Costar Πλαστικά ακρορύγχια (tips) για επαναληπτική πιπέτα από Eppendorf Κυψελίδες για ηλεκτροδιάτρηση 0,1 cm από BIORAD και 0,2 cm από Invitrogen Πλαστικές κυψελίδες µιας χρήσης από SARSTEDT Κυψελίδες χαλαζία (quartz cells) οπτικής διαδροµής 1, 0,25 και 0,1 cm, για µέτρηση οπτικής απορρόφησης διαλύµατος στην περιοχή του υπεριώδους Φίλτρα µε διάµετρο πόρου 0,22 και 0,45 µm Millex από Millipore Φίλτρα µε διάµετρο πόρου 0,22 µm, NALGENE Μεµβράνες νιτροκυτταρίνης Hybond P, Amersham Biosciences Ανιοντοανταλλακτικά φίλτρα κυτταρίνης DE 81 Χαρτί διήθησης 3 ΜΜ από Whatmann 65

76 Υλικά & Μέθοδοι Στήλες μοριακής διήθησης Superose 12 από Amersham για σύστημα ACTA Αντιδραστήρια Χρησιμοποιήθηκαν χηµικά αντιδραστήρια καθαρότητας αναλυτικού βαθµού από Sigma, Merck, Fluka και Applichem. Αγαρόζη από Sigma Taq DNA πολυµεράση από Minotech Molecular Biology Products (ΙΜΜΒ) Pfu DNA πολυµεράση, Promega Εναρκτήρια µόρια από MWG dntps από Promega Περιοριστικές ενδονουκλεάσες από Roche, Fermentas και New England Biolabs Μάρτυρες µοριακών µεγεθών DNA, Fermentas Αλκαλική φωσφατάση (CIAP, 26 U/μL), Fermentas Τ4 DNA λιγάση (1 U/μL), Fermentas Λυσοζύµη από Applichem και RNase Α από Sigma Bacto-tryptone, Bacto-peptone, Bacto yeast extract και Bacto agar, Difco Laboratories Αµπικιλλίνη από Bristol Mayers Squib Zεοσίνη από Invitrogen Τετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνη (TEMED), περοξυδιθειικό αμμώνιο (APS), διαμινοβενζιδίνη (DAB), διθειοθρειτόλη (DTT) και ιµιδαζόλιο από Sigma Αλβουµίνη από ορό βοδιού (BSA), Applichem AcTEV πρωτεάση από Invitrogen Έγχρωµοι µάρτυρες µοριακών µεγεθών πρωτεϊνών, Fermentas Νi 2+ -ΝΤΑ-αγαρόζη, Qiagen Πακεταρισμένες στήλες μοριακού αποκλεισμού Superose 12, και Superdex 200, Pharmacia α-µπουγκαροτοξίνη (α-bgtx), νικοτίνη, d-τουμποκουραρίνη, ακετυλοχολίνη και καρβαμυλοχολίνη από Sigma QIAquick Gel Extraction Kit που περιλαµβάνει στήλες QIA quick spin, ρυθµιστικά διαλύµατα QG (περιέχει χαοτροπικά άλατα) και ΡΕ (Wash buffer), Qiagen 66

77 Υλικά & Μέθοδοι QIAquick PCR Purification kit που περιλαµβάνει: στήλες QIA quick spin, ρυθµιστικά διαλύµατα ΡΒ (Binding buffer) και ΡΕ (Wash buffer), Qiagen Na l25 I για τη σήµανση α-bgtx, Amersham GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System, Invitrogen TEMED, Ακρυλαμίδιο, SDS, β-μερκαπταιθανόλη από Sigma Φαινόλη, ισο-προπανόλη, χλωροφόρμιο και ισο-αμυλική αλκοόλη από Sigma Εναρκτήρια µόρια (primers) Οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των εναρκτήριων µορίων (ή εκκινητών) που χρησιµοποιήθηκαν για την ενίσχυση του cdna του ΕΚΠ τμήματος του ανθρώπινου α7 nachr ήταν οι εξής: HisTEV α7α F (35 νουκλεοτίδια) HisTEV α7β F (46 νουκλεοτίδια) Stop α7 R (29 νουκλεοτίδια) Bam-pPIC9-F (24 νουκλεοτίδια) EcoRI R (22 νουκλεοτίδια) TEV-pPIC9-R (30 νουκλεοτίδια) gc gaa aac ctg tat ttt cag ggc gag ttc cag agg ggg cat cat cat cat cat cat ggt ggc ggc gaa aac ctg tat ttt c ggg tca tta cct gcg gcg cat ggt cac tg cta att att cga agg atc caa acg gaa gaa ttc acc aac acg tta g gaa ttc tac gta tcc ctg aaa ata cag ctt Για τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας τμημάτων DNA που υποκλωνοποιημένων στους πλασμιδιακούς φορείς ppiczαa και pbluescript, χρησιμοποιήθηκαν τα εξής εναρκτήρια μόρια: α factor: (21 νουκλεοτίδια) 3 ΑΟΧ1: (21 νουκλεοτίδια) tac tat tgc cag cat tgc tgc gca aat ggc att ctg aca tcc 67

78 Υλικά & Μέθοδοι Ο συνδυασμός των εναρκτήριων μορίων που χρησιμοποιήθηκε για τις κατευθυνόμενες σημειακές μεταλλάξεις στο cdna του α7-εκπ αγρίου τύπου (wt) και διπλού μεταλλάγματος (dm) ήταν ο εξής: Κατευθυνόμενη σημειακή μετάλλαξη (Site-directed mutation) Phe3Tyr Phe135Tyr-Phe137Tyr Val132Thr Phe187Tyr Val177Thr Val69Thr Ile165Thr Met41Lys Asn47Gln Asn53Gln Met41Lys-Asn47Gln 5 εκκινητής (Forward primer) at ttt cag ggc gag tac cag agg aag cta tac aag gag c tc gat gta cgc tgg tac ccc tac gat gtg cag cac tgc tcc tgc tac atc gat acc cgc tgg tac ccc tac ccc ggc aag agg agt gag cgc tat tat gag tgc tgc gga gaa tgg gac cta act gga atc ccc ggc tat tta cag tgg aat act agt gaa tat cca ggg atg cag gag gca gat act agt ggc tat atc agc ctc ctg cag atc aag gac gtc gat gag aag aac gac gtg gat gag aag cag caa gtt tta acc caa gtt tta acc acc cag att tgg ctg caa agc ctc ctg cag atc aag gac gtc gat gag aag cag 3 εκκινητής (Reverse primer) a ctc gcc ctg aaa ata cag gtt ttc gcc gcc a cca gcg tac atc gat gta gca gga act atc gat gta gca gga act ctt gaa tat gcc act cct ctt gcc ggg gat tcc cac tag tag gtc cca ttc tcc att ggg gat ata gcc att cca ctg taa ata gtg atc tgt cca atc tgc ctc ctg cat ctg cag atc caa gat ctg cag gag gct cag gga gaa gta ctt ctc atc cac gtc cat gat ctg cag ggt ggt taa aac ttg ctg ctt ctc atc gat ctg cag gag gct cag gga gaa gta Με έντονα γράμματα αναγράφονται οι τριπλέτες που κωδικοποιούν το εισαγόμενο μεταλλαγμένο αμινοξύ 68

79 Υλικά & Μέθοδοι Αντισώµατα Πολυκλωνικό αντίσωµα αντι-his (από Santa Cruiz), προερχόμενο από ανοσοποιημένα κουνέλια, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση της 6 His ετικέτας (tag) στο αμινο-τελικό άκρο των ανασυνδυασμένων EKΠ μορίων του α7 nachr που εκφράσθηκαν από μετασχηματισμένα με το πλασμίδιο pριc9 κύτταρα P. pastoris Μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-myc 9E10, προερχόμενο από την υβριδωματική σειρά ποντικού ATCC CRL 1729, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση του καρβοξυ-τελικού c-myc επίτοπου των ανασυνδυασμένων EKΠ μορίων του α7 nachr που εκφράσθηκαν από μετασχηματισμένα με το πλασμίδιο pριcζαα κύτταρα P. pastoris Πολυκλωνικό αντίσωμα goat anti-mouse-hrp (συζευγμένο με το ένζυμο υπεροξειδάση της ραπανίδος) από Darko, Denmark Θρεπτικά υλικά Τα θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για τις καλλιέργειες κυττάρων Ε. coli και Ρ. pαstoris ύστερα από υγρή αποστείρωση (20 min, 121 C, 2 Atm) ήταν της ακόλουθης σύστασης: LB (Luria Bertani) LB- άγαρ ± ampicillin LB χαµηλής αλατότητας ± zeocin LB χαµηλής αλατότητας άγαρ ± zeocin YPD ± zeocin YPD-άγαρ ± zeocin YPDS ± zeocin 1% κ.β. NaCl, 1% κ.β. πεπτόνη, 0,5% κ.β. εκχύλισµα ζύµης, pη 7,0 LB που περιέχει 1,5% κ.β. άγαρ ± 100 μg/ml αμπικιλλίνη 0,5% κ.β. NaCl, 1% κ.β. πεπτόνη, 0,5% κ.β. εκχύλισµα ζύµης, pη 7,0 ± 25 μg/ml ζεοσίνη LB χαµηλής αλατότητας που περιέχει 1,5% κ.β. άγαρ ± 25 μg/ml ζεοσίνη 1% κ.β. εκχύλισµα ζύµης, 2% κ.β. πεπτόνη, 2% κ.β. δεξτρόζη, ± 25 μg/ml ζεοσίνη YPD που περιέχει 1,5% κ.β. άγαρ ± 25 μg/ml ζεοσίνη 1% κ.β. εκχύλισµα ζύµης, 2% κ.β. πεπτόνη, 2% κ.β. δεξτρόζη, 1 Μ σορβιτόλη ± 25 μg/ml ζεοσίνη 69

80 Υλικά & Μέθοδοι YPDS-άγαρ ± zeocin RD RDH RDB RDBH YPDS που περιέχει 1,5% κ.β. άγαρ ± 25 μg/ml ζεοσίνη 1 M σορβιτόλη, 2% κ.β. δεξτρόζη, 1.34% κ.β. yeast nitrogen base, 4x10-5 % κ.β. βιοτίνη, 0.005% κ.β. για καθένα από τα αμινοξέα L-γλουταμικό οξύ, L-λυσίνη, L-μεθειονίνη, L- λευκίνη, L-ισολευκίνη Όπως RD και 0.004% κ.β. L-ιστιδίνης Όπως RD και 1,5% κ.β. άγαρ Όπως RDH και και 1,5% κ.β. άγαρ MD 1.34% κ.β. yeast nitrogen base, 4x10-5 % κ.β. βιοτίνη και 2% κ.β. δεξτρόζη MD-άγαρ MM MM-άγαρ BMGY ΒΜΜΥ Όπως MD και 1,5% κ.β. άγαρ 1.34% κ.β. yeast nitrogen base, 4x10-5 % κ.β. βιοτίνη και 1,5% κ.ο. μεθανόλη Όπως MM και 1,5% κ.β. άγαρ 1% κ.β. εκχύλισµα ζύµης, 2% κ.β. πεπτόνη, 100 mm ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών, pη 6,0, 1,34% κ.β. ΥΝΒ, 4x10-5 % κ.β. βιοτίνη, 1% κ.ο. γλυκερόλη 1% κ.β. εκχύλισµα ζύµης, 2% κ.β. πεπτόνη, 100 mm ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών, pη 6,0, 1,34% κ.β. ΥΝΒ, % κ.β. βιοτίνη, 0,5% κ.ο. μεθανόλη Διαλύµατα Για την παρασκευή όλων των διαλυµάτων χρησιµοποιήθηκε δις-απεσταγµένο και απιονισµένο νερό (ddh 2 0). TBE 89 mm Tris-H 3 BO 3, 2 mm EDTA, pη 8,0 TAE 40 mm Tris-CH 3 COOH, 5 mm EDTΑ, pη 8,0 TE (10:1) 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, pη 8,0 PBS 60 mm ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών ( PB), 137 mm (0,8% κ.β.) NaCl, 2,7 mm (0,02% κ.β.) KCl, pη 7,4 70

81 Υλικά & Μέθοδοι PBST 60 mm PB, 137 mm (0,8% κ.β.) NaCl, 2,7 mm (0,02% κ.β.) KCl 0.1% κ.ο. Tween-20, pη 7,4 GTE 50 mm γλυκόζη, 25 mm Tris-HCl, 10 mm EDTA, ph 8,0 Χρωματογραφίας μοριακού αποκλεισμού 10 mm PB, 100 mm NaCl, 1 mm DTT, ph 7,5 Πλύσης ραδιενέργειας 20 mm Tris, 0.05% Triton X-100, ph 7,5 Ηλεκτροφόρησης 25 mm Tris-base, 200 mm γλυκίνη, 1% κ.β. SDS, pη 8,5 Ηλεκτρομεταφοράς 25 mm Tris-base, 200 mm γλυκίνη, 20% κ.β. µεθανόλη, pη 8,5 Αποφωσφορυλίωσης 0,1 Μ Tris-HCl, 0,1 Μ MgCl 2, pη 7,5 Χρωµατισµού πηκτής πολυακρυλαμιδίου Αποχρωµατισµού πηκτής πολυακρυλαμιδίου Διάλυµα εµφάνισης µε υπόστρωµα DAB «Φόρτωσης» δείγματος πρωτεϊνών 0,1% κ.β. Coomassie R % κ.ο. µεθανόλη, 10% κ.ο. CH 3 COOH 10% κ.ο. CH 3 COOH, 40% κ.ο. µεθανολη 0,03% κ.β. DAB, 0,03% κ.β. NiC1 2, 0,009% κ.ο. Η 2 Ο 2 σε PBS 45 mm Tris-HCl, pη 6,8, 10% κ.ο. γλυκερόλη, 1% κ.β. SDS, 0,01% κ.β. κυανούν της βρωµοφαινόλης, 5% κ.ο. β- µερκαπτοαιθανόλη Πλασµιδιακός φορέας κλωνοποίησης (cloning vector) και κυτταρικά στελέχη Εscherichia coli που χρησιµοποιήθηκαν Τα στελέχη Ε. coli που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα TOP10F και DH5α. Τα στελέχη αυτά δεν έχουν την ικανότητα ανασυνδυασμού (reca1) και δεν παράγουν ενδονουκλεάση (enda1). Ο πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης των cdna μορίων της ΕΚΠ της ανθρώπινης nachr α7 υπομονάδας ήταν ο pbluescript (Εικόνα 21). 71

82 Υλικά & Μέθοδοι Εικόνα 21: Χάρτης του φορέα κλωνοποίησης pbluescript. Διακρίνονται: (i) ο υποκινητής του οπερονίου λακτόζης (P lac), (ii) η περιοχή πολλαπλών σημείων κλωνοποίησης (MCS), (iii) το οπερόνιο λακτόζης (lacz ), (iv) το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αμπικιλλίνη (ampicillin), (v) το σημείο έναρξης της αντιγραφής (puc ori) του πλασμιδιακού DNA Πλασµιδιακοί φορείς έκφρασης (expression vectors) και κυτταρικά στελέχη Ρichia pαstoris που χρησιµοποιήθηκαν Το σύστηµα που χρησιμοποιήθηκε για την ετερόλογη έκφραση των ανθρώπινων α7-εκπ μορίων του nachr, ήταν η ζύμη Ρichia pastoris. Πρόκειται για ένα µονοκύτταρο µεθυλοτροφικό ζυµοµύκητα, ο οποίος ως ευκαρυωτικός οργανισμός διαθέτει την ικανότητα µεταµεταφραστικών τροποποιήσεων, που οδηγούν σε επεξεργασία και αναδίπλωση των παραγόμενων πρωτεϊνικών µορίων. Σε σύγκριση µε άλλα ευκαρυωτικά συστήµατα ετερόλογης έκφρασης πρωτεϊνών, η Ρ. pastoris είναι ένα σύστηµα πιο γρήγορο, χαμηλότερου κόστους και υψηλότερου εππιπέδου έκφρασης ετερόλογων πρωτεϊνών. Επιπλέον, διαθέτει το πλεονέκτημα έναντι του S. cerevisiae, ότι δεν οδηγεί σε υπεργλυκοζυλίωση των εκκρινόμενων ετερόλογων πρωτεϊνών και ότι οι υδατανθρακικές αλυσίδες που προστίθενται σε οµάδες αζώτου των πρωτεϊνών ακολουθούν το πρότυπο γλυκοζυλίωσης ανώτερων ευκαρυωτικών κυττάρων (Cereghino et al 2000). Επίσης, η Ρ. pastoris παρουσιάζει φορές υψηλότερα επίπεδα έκφρασης ετερόλογων πρωτεϊνών σε σχέση με το S. cerevisiae, ενώ διατηρεί το κοινό τους χαρακτηριστικό, όσον αφορά στη σχετικά εύκολη χρήση τους για τεχνικές γενετικής και μοριακής βιολογίας. Η Ρ. pastoris µπορεί να αναπτύσσεται σε υλικό που περιέχει µεθανόλη ως µόνη πηγή άνθρακα. Το πρώτο βήµα στο μεταβολισμό της μεθανόλης είναι η οξείδωσή της 72

83 Υλικά & Μέθοδοι από μοριακό οξυγόνο σε φορµαλδεϋδη και υπεροξείδιο του υδρογόνου, η οποία καταλύεται από το ένζυµο της αλκοολικής οξειδάσης. Επειδή η αλκοολική οξειδάση έχει χαμηλή συγγένεια για το μοριακό οξυγόνο, το σύστημα της P. pastoris αναγκάζεται να παράγει μεγάλες ποσότητες αυτού του ενζύμου, όταν υπάρχει αυξημένη ποσότητα μεθανόλης στο θρεπτικό μέσο. Υπάρχουν δύο γονίδια που κωδικοποιούν την αλκοολική οξειδάση: τα ΑΟΧΙ και ΑΟΧ2, τα οποία παρουσιάζουν 97% ομολογία. Όμως, το ΑΟΧΙ είναι υπεύθυνο για το µεγαλύτερο µέρος της δράσης της αλκοολικής οξειδάσης στο κύτταρο. Ο υποκινητής που ρυθμίζει τη μεταγραφή του ΑΟΧΙ είναι και αυτός που χρησιμοποιείται για την ετερόλογη έκφραση πρωτεϊνών. Για την έκφραση στην Ρ. pαstoris χρησιµοποιήθηκαν δύο διαφορετικά στελέχη, τα Χ33 και GS115. Το στέλεχος X33 είναι αγρίου τύπου (wild-type), ενώ το GS115 φέρει μία μετάλλαξη στο γονίδιο της ιστιδινικής αφυδρογονάσης (his4), η οποία παρεμποδίζει την ικανότητα σύνθεσης ιστιδίνης. Ώς φορείς έκφρασης, χρησιµοποιήθηκαν το πλασµίδια ppiczαα και ppic9 (Εικόνα 22), τα οποία διαθέτουν τον υποκινητή του γονιδίου ΑΟΧΙ, καθώς και το γονίδιο που κωδικοποιεί το πεπτίδιο-οδηγό (α-factor) του S. cerevisiae, προκειμένου να γίνεται έκκριση της ετερόλογα εκφρασμένης πρωτεΐνης. Α. Β. Εικόνα 22: Χάρτης των πλασµιδίων έκφρασης. (Α) ppiczα. Διακρίνονται: (i) ο υποκινητής του γονιδίου ΑΟΧΙ (ii) το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό ζεοσίνη (Zeocin), (iii) το σηµείο έναρξης της αντιγραφής (puc ori), (iv) το γονίδιο του πεπτιδίου οδηγού (α-factor) για την έκκριση της ετερόλογης πρωτεΐνης (v) η περιοχή με τα πολλαπλά σημεία κλωνοποίησης (vi) το γονίδιο κωδικοποίησης του c-myc επίτοπου (c-myc epitope) και (νii) το γονίδιο κωδικοποίησης έξι συνεχόµενων καταλοίπων ιστιδίνης (6 His). (Β) ppic9. Διακρίνονται: (i) ο υποκινητής του γονιδίου ΑΟΧΙ (ii) το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αμπικιλλίνη (Ampicillin), (iii) το σηµείο έναρξης της αντιγραφής (pbr322), (iv) το γονίδιο κωδικοποίησης του πεπτιδίου οδηγού (S), το οποίο πεπτίδιο κατευθύνει την έκκριση της ετερόλογης πρωτεΐνης, (v) η περιοχή με τα πολλαπλά σημεία κλωνοποίησης και (vi) το γονίδιο HIS4, το οποίο κωδικοποιεί την ιστιδινική αφυδρογονάση. 73

84 Υλικά & Μέθοδοι 3.2. ΜΕΘΟΔΟΙ Κατασκευή τρισδιάστατου μοντέλου (3 D model) των εξωκυτταρικών τμημάτων του ανθρώπινου νευρικού α7 nachr Έγινε στοίχιση (sequence alignment) της αμινοξικής αλληλουχίας της ΕΚΠ της ανθρώπινης α7 υπομονάδας του nachr (α7-εκπ) με τις αμινοξικές αλληλουχίες των εξωκυτταρικών τμημάτων της μυϊκού τύπου α υπομονάδας (α-εκπ) προερχόμενης από Torpedo marmorata nachr και της μυϊκής α1 υπομονάδας του nachr επίμυος. Οι αμινοξικές στοιχίσεις έγιναν με τη χρήση του προγράμματος ClustalW (Thompson et al 1994). Στη συνέχεια κατασκευάστηκε το τρισδιάστατο μοντέλο της ανθρώπινης α7-εκπ χρησιμοποιώντας ως εκμαγεία για την κατασκευή του πρωτομερούς α7-εκπ τη τριτοταγή δομή της Torpedo α-εκπ (κωδικός pdb: 2BG9) (Unwin 2005) και ως εκμαγείο για την πενταμερή συμμετρία την τεταρτοταγή δομή της πρωτεΐνης δέσμευσης της ACh (AChBP) από το γαστερόποδο Lymnaea stagnalis (κωδικός pdb: 1I9B) (Brejc et al 2001). Για την κατασκευή του μοντέλου της α7-εκπ χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα MODELLER v.8.2 (Sali and Blundell 1993), ενώ για τον έλεγχο σφαλμάτων πακεταρίσματος και αναδίπλωσης των δευτεροταγών στοιχείων του προκύπτοντος μοντέλου χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα QUANTA-CHARMm (Brooks and Karplus 1983). Τα διάφορα μεταλλαγμένα α7-εκπ μόρια της παρούσης διατριβής ελέγχθηκαν για πιθανές αλλαγές στο πρότυπο υδροφοβικότητας και ηλεκτροστατικότητας με το πρόγραμμα QUANTA-CHARMm. Τα χωροταξικά μοντέλα σχεδιάστηκαν με τη χρήση του προγράμματος PyMOL (DeLano 2004) Υγρές και στερεές καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων Esherichia coli Χρησιµοποιήθηκαν στελέχη TOP10F' και DH5α της E. coli, τα οποία καλλιεργήθηκαν σε υγρό ή στερεό θρεπτικό µέσο LB ( ) παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού. Η ανάπτυξή τους πραγµατοποιήθηκε στους 37 C, σε επωαστικούς θαλάµους. Για τις υγρές καλλιέργειες, η επώαση πραγµατοποιήθηκε υπό ανάδευση (200 rpm) σε αποστειρωµένους πλαστικούς σωλήνες µιας χρήσης των 15 ml ή σε υάλινες κωνικές φιάλες των 2 L (καλλιέργειες σε µεγάλη κλίµακα). Για όλες τις καλλιέργειες πραγµατοποιήθηκε επώαση για χρόνο 16 h. Τα µετασχηµατισµένα και µη µετασχηµατισµένα βακτήρια διατηρούνται για µεγάλα χρονικά διαστήµατα στους

85 Υλικά & Μέθοδοι C στο κατάλληλο θρεπτικό µέσο παρουσία 20% γλυκερόλης Παρασκευή πλασµιδιακού DNA σε μικρή κλίµακα (mini-prep) µε τη µέθοδο της αλκαλικής λύσης Με την μέθοδο αυτή απομονώνεται μικρή ποσότητα μερικώς καθαρισμένου πλασμιδιακού DNA από υγρές καλλιέργειες μετασχηματισμένων βακτηρίων. Το πλασμιδιακό DNA ελέγχεται στην συνέχεια με πέψη από περιοριστικές ενδονουκλεάσες, για τον εντοπισμό των κλώνων που φέρουν το επιθυμητό ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Η διαδικασία έχει ως εξής: Γίνεται εμβολιασμός κυττάρων μίας αποικίας µετασχηµατισµένων βακτηρίων σε 5 ml θρεπτικού υλικού LB ή LB χαμηλής αλατότητας ( ) περιέχων το κατάλληλο αντιβιοτικό και ακολουθεί επώαση υπό ανάδευση, στους 37 C, 16 h. Από την παραπάνω καλλιέργεια, φυγοκεντρείται ποσότητα 3 ml στις rpm, για 1 min, σε θερµοκρασία δωµατίου. Το ίζηµα των βακτηριακών κυττάρων αναδιαλύεται σε 100 μl ρυθμιστικού διαλύµατος GTE ( ) υπό ανάδευση και το εναιώρηµα τοποθετείται σε πάγο. Για την καταστροφή του χρωμοσωμικού DNA και των κυτταρικών μεμβρανών, προστίθενται 200 μl πρόσφατα παρασκευασµένου διαλύµατος 0,2 Μ NaOH, l %κ.β. SDS, υπό ανάδευση, και το µίγµα επωάζεται στον πάγο για 10 min. Στη συνέχεια, προστίθενται 150 μl 3Μ ρυθµιστικού διαλύµατος οξικών (CH 3 COOH/CH 3 COOK), pη 5,5 και το µίγµα επωάζεται στον πάγο (0 ºC) για 10 min έπειτα από ανάδευση. Το ίζηµα των κυτταρικών υπολειµµάτων (µεµβρανικά θραύσµατα, πρωτεΐνες, χρωµοσωµικό DΝΑ και RNA) αποµακρύνεται µε φυγοκέντρηση στις rpm, για 10 min, στους 4 C, σε ψυχώμενη μικροφυγόκεντρο Eppendorf. Στο υπερκείμενο προστίθεται ισοπροπανόλη ποσότητας ίσης προς 0,8 V διαλύματος για την κατακρήμνιση του πλασμιδιακού DNA και του RNA. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm για 10 min και απομάκρυνση του υπερκειμένου. Tο ίζημα ξεπλένεται με αιθανόλη 70% κ.ο. και έπειτα από την πλήρη εξάτμισή της ακολουθεί αναδιάλυση σε 50 μl διαλύματος TE-RNAάσης. Στη συνέχεια γίνεται πέψη 10 μl διαλύματος του πλασμιδιακού DNA με περιοριστικές ενδονουκλεάσες ( ) και ανάλυση των προϊόντων της πέψης με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης ( Α). 75

86 Υλικά & Μέθοδοι Παρασκευή πλασµιδιακού DNA από καλλιέργειες βακτηρίων σε µεγάλη κλίµακα (maxi-prep) µε τη µέθοδο της αλκαλικής λύσης Με αυτή την μέθοδο απομονώνεται μεγάλη ποσότητα υψηλής καθαρότητας πλασμιδιακού DNA (της τάξεως των mg), που απαιτείται για κλωνοποίηση τμημάτων DNA και μετασχηματισμό βακτηριακών κυττάρων ή κυττάρων ζύμης. Η πορεία αυτής της διαδικασίας είναι η εξής: Γίνεται εμβολιασμός μίας αποικίας μετασχηματισμένων με πλασμίδιο βακτηρίων σε 5 ml θρεπτικού υλικού LB ( ) µε 100 µg/ml αμπικιλλίνη ή με 5 μg/ml τετρακυκλίνης ή εμβολιασμός σε 5 ml θρεπτικού υλικού LB χαμηλής αλατότητας ( ) με 100 µg/ml ζεοσίνη. Ακολουθεί επώαση υπό ανάδευση, στους 37 ºC, 16 h. Στη συνέχεια χρησιµοποιείται 1 ml από την παραπάνω καλλιέργεια για τον εµβολιασµό 1 L αντίστοιχου θρεπτικού υλικού και ακολουθεί επώαση υπό ανάδευση στους 37 ºC, 16 h. Μετά την επώασή τους, τα κύτταρα φυγοκεντρούνται σε φυγόκεντρο Sorvall, µε κεφαλή GS3 (5.000 rpm, 15 min, 4 ºC). Το ίζηµα των βακτηριακών κυττάρων αναδιαλύεται σε 40 ml ρυθμιστικού διαλύµατος GTE ( ) υπό ανάδευση και το εναιώρηµα τοποθετείται σε πάγο για την αναστολή της δράσης των ενζύµων, τα οποία ελευθερώνονται στο επόµενο στάδιο. Για τη λύση των κυτταρικών τοιχωµάτων, προστίθενται 200 mg λυσοζύµης υπό ήπια ανάδευση και ακολουθεί επώαση για 5 min, σε θερµοκρασία δωµατίου. Για την καταστροφή του χρωμοσωμικού DNA και των κυτταρικών μεμβρανών, προστίθενται 80 ml πρόσφατα παρασκευασµένου διαλύµατος 0,2 N NaOH, l% κ.β. SDS υπό ανάδευση και το µίγµα επωάζεται στον πάγο για 10 min. Στη συνέχεια, προστίθενται 60 ml ρυθµιστικού διαλύµατος 3 Μ οξικών (CH 3 COOH/CH 3 COOK), pη 5,5 και ακολουθεί ανάδευση και επώαση στον πάγο, για 10 min. Το ίζηµα των κυτταρικών υπολειµµάτων (µεµβρανικά θραύσµατα, πρωτεΐνες, χρωµοσωµικό DΝΑ και μέρος του RNA) αποµακρύνεται µε φυγοκέντρηση σε φυγόκεντρο Sorvall χρησιμοποιώντας κεφαλή GS3 ( rpm, 10 min, 4 C). Το υπερκείµενο διηθείται από υαλοβάµβακα και µεταφέρεται σε καθαρό σωλήνα. Τα νουκλεϊκά οξέα κατακρηµνίζονται µε την προσθήκη ισοπροπανόλης (0,6 όγκος υπερκείμενου), ανάδευση και επώαση σε θερµοκρασία δωµατίου για 15 min. Ακολουθεί φυγοκέντρηση σε φυγόκεντρο Sorνall µε κεφαλή GS3 ( rpm, θερµοκρασία δωµατίου, 15 min) και παραλαβή του ιζήματος (πλασμιδιακό DNA). Εν συνεχεία, γίνεται προσθήκη στο ίζημα 6 ml διαλύματος αιθανόλης 70% κ.ο. και εκ 76

87 Υλικά & Μέθοδοι νέου φυγοκέντρηση ( rpm, θερµοκρασία δωµατίου, 5 min). Έπειτα, γίνεται απόχυση του υπερκείμενου και στέγνωμα του ιζήματος σε θερμοκρασία δωματίου, ώστε να εξατμισθεί κάθε ίχνος αιθανόλης. Στη συνέχεια, το ίζημα (πλασμιδιακό DNA) αναδιαλύεται σε 16 ml ρυθµιστικού διαλύµατος ΤΕ (10:1) ( ) και µεταφέρεται σε προψυγμένο σωλήνα Corex. Ακολουθεί προσθήκη 6 ml προψυγμένου διαλύµατος 5 Μ LiCl για την κατακρήμνιση του RNA, ανάδευση και φυγοκέντρηση σε φυγόκεντρο Sorνall µε κεφαλή SS34 ( rpm, 10 min, 4 C). Το υπερκείµενο µεταφέρεται στη συνέχεια σε καθαρό σωλήνα Corex όπου προστίθεται ίσος όγκος ισοπροπανόλης και το µείγµα αναδεύεται και υποβάλλεται σε εκ νέου φυγοκέντρηση ( rpm, 10 min, θερµοκρασία δωµατίου). Ακολουθεί προσθήκη 8 ml διαλύματος αιθανόλης 70% κ.ο. στο ίζηµα του DNA, φυγοκέντρηση ( rpm, 10 min, θερµοκρασία δωµατίου) και απόχυση του υπερκείμενου. Στη συνέχεια το ίζημα στεγνώνει σε θερμοκρασία δωματίου και έπειτα αναδιαλύεται σε 1 ml ΤΕ (10:1) ( ) περιέχοντος παγκρεατική ριβονουκλεάση (RNase) σε συγκέντρωση 25 µg/ml. Ακολουθεί επώαση για 30 min, σε θερµοκρασία δωµατίου. Στη συνέχεια, προστίθεται 1 ml διαλύµατος 1,6 Μ NaCl, 13%κ.β. PEG 8.000, ανάδευση και φυγοκέντρηση στις rpm, για 5 min, στους 4 C. Τέλος, το ίζηµα (πλασµιδιακό DNA) αναδιαλύεται σε 800 μl ΤΕ (10:1) Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA (DNA purification) Με εκχύλιση µε οργανικούς διαλύτες Κατά την εκχύλιση µε βασικό διάλυµα φαινόλης, οι πρωτεΐνες αποµακρύνονται στην οργανική φάση, ενώ το καθαρό DNA παραλαµβάνεται στην υδατική φάση. Η µέθοδος είναι γρήγορη, εύκολη και µε χαµηλό κόστος. Επειδή τα προϊόντα οξείδωσης της φαινόλης µπορεί να καταστρέψουν τα νουκλεϊκά οξέα, επιβάλλεται η χρήση εξισσοροπηµένης φαινόλης. Η διαδικασία αυτή έχει ως εξής: Το υδατικό διάλυµα DNA εκχειλίζεται µε διαδοχική προσθήκη ίσων όγκων διαλύµατος φαινόλης, φαινόλης-χλωροφορµίου/ισοαμυλικής αλκοόλης 1:1 και χλωροφορµίου/ισοαμυλικής αλκοόλης. Οι δύο φάσεις αναµιγνύονται µε έντονη ανάδευση και διαχωρίζονται µετά από σύντοµη φυγοκέντρηση ( rpm, 5 min, θερμοκρασία δωματίου). 77

88 Υλικά & Μέθοδοι Με συστηµατοποιηµένες χρωµατογραφικές µεθόδους Ο διαχωρισµός του πλασµιδιακού DNA, από τις προσµίξεις άλλων µορίων, βασίζεται στις διαφορετικές φυσικές τους ιδιότητες. Έτσι: α. το αρνητικό φορτίο των νουκλεϊκών οξέων, επιτρέπει την αποµάκρυνση των προσµίξεων µε χρήση ανιοανταλλακτικής χρωµατογραφίας και β. το µεγάλο µέγεθος του πλασµιδιακού DNA επιτρέπει το διαχωρισµό του από µικρού µοριακού βάρους προσµίξεις µε χρωµατογραφία µοριακής διήθησης. Για εµπορικούς λόγους, οι ειδικές ιδιότητες για τις επί µέρους µήτρες που παρέχονται από τους προµηθευτές είναι άγνωστες, τυπικά όµως εκµεταλλεύονται µία από τις παραπάνω ιδιότητες. Οι πακεταρισµένες στήλες που παρέχονται από τις εταιρείες έχουν συγκεκριµένη χωρητικότητα, η οποία δεν ξεπερνά τα 10 µg πλασµιδιακού DNA. Με τη µέθοδο QIAquick Gel Extrαction Kit (Qiagen) Το προς καθαρισµό DΝΑ δεσµεύεται σε προπακεταρισµένη στήλη (QIAquick spin column), από όπου εκλούεται µε προσθήκη υδατικού διαλύµατος, αφού έχει προηγηθεί αποµάκρυνση των προσµίξεων, που επίσης έχουν δεσµευτεί στη στήλη, κατά την έκλουση µε ρυθµιστικό διάλυµα χαοτροπικών αλάτων GC. Η πορεία αυτής της μεθόδου είναι η ακόλουθη: Από το πήκτωµα αγαρόζης κόβεται και ζυγίζεται η επιθυµητή ζώνη DΝΑ. Προστίθεται ρυθµιστικό διάλυµα GC (η σύνθεση του οποίου δεν αναφέρεται από τον κατασκευαστή) σε όγκο τριπλάσιο από τη µάζα του πηκτώµατος αγαρόζης (π.χ. για κάθε 100 mg πηκτώµατος προστίθενται 300 μl διαλύµατος GC) και το µίγµα επωάζεται στους 55 C για 10 min, προκειµένου να διαλυθεί η αγαρόζη. Το διάλυµα τοποθετείται στη στήλη QIAquick spin και ακολουθεί φυγοκέντρηση σε µικροφυγόκεντρο Eppendorf ( rpm, 60 s), κατά την οποία το DΝΑ δεσµεύεται στη στήλη. Το έκλουσµα αποµακρύνεται και ακολουθεί έκπλυση της στήλης µε 0,75 ml ρυθµιστικού διαλύµατος ΡΕ (η σύνθεση του οποίου δεν αναφέρεται από τον κατασκευαστή), το οποίο περιέχει 80% κ.ο. αιθανόλη. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm για 60 s και απομάκρυνση του εκλούσματος περιέχοντος προσµίξεις. Η έκλουση του καθαρού DΝΑ από τη στήλη πραγµατοποιείται στη συνέχεια σε ρυθµιστικό διάλυµα 10 mm Tris/HCl, pη 8,0, µε φυγοκέντρηση στις rpm, για 60 s. Οι στήλες QIAquick που χρησιµοποιούνται είναι ικανές να δεσµεύσουν µέχρι 10 µg dsdna, µεγέθους 70 bp 10 kbp. Το καθαρό DΝΑ που ανακτάται αντιστοιχεί στο 78

89 Υλικά & Μέθοδοι 70-80% της αρχικής ποσότητας που χρησιµοποιήθηκε. Με τη µέθοδο QIAquick PCR purίficαtion Kit (Qiagen) Το προς καθαρισµό DΝΑ δεσµεύεται σε προπακεταρισµένη στήλη QIAquick, από την οποία εκλούεται µε προσθήκη υδατικού διαλύµατος, αφού προηγηθεί αποµάκρυνση των προσµίξεων. Η µέθοδος χρησιµοποιείται κυρίως για τον καθαρισµό προϊόντων αντίδρασης PCR από τα εναρκτήρια µόρια, τα ελεύθερα µονονουκλεοτίδια και την πολυµεράση. Η πορεία αυτής της μεθόδου είναι η εξής: Σε έναν όγκο διαλύµατος αντίδρασης PCR προστίθενται 5 όγκοι διαλύµατος ΡΒ (η σύνθεση του οποίου δεν αναφέρεται από τον κατασκευαστή) και το δείγµα τοποθετείται στη στήλη. Ακολουθεί αποµάκρυνση του εκλουόµενου κλάσµατος από φυγοκέντρηση ( rpm, 60 s, θερµοκρασία δωµατίου). Στη συνέχεια, η στήλη εκπλένεται µε 0,75 ml διαλύµατος ΡΕ και ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm για 60 s, σε θερµοκρασία δωµατίου. Το κλάσµα έκπλυσης (που περιέχει τις ανεπιθύµητες προσµίξεις) αποµακρύνεται και το DNA εκλούεται µε προσθήκη στη στήλη 55 μl ρυθµιστικού διαλύµατος 10 mm Tris-HCl, pη 8,0 και φυγοκέντρηση στις rpm, για 60 s, σε θερµοκρασία δωµατίου Κατακρήµνιση του DNA (DNA precipitation) Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για την συμπύκνωση των νουκλεϊκών οξέων ή για την απομάκρυνση αλάτων, ενζύμων και άλλων προσμίξεων από το υδατικό διάλυμα των νουκλεϊκών οξέων. Για την κατακρήμνιση των νουκλεϊκών οξέων χρησιμοποιούνται παράγοντες οι οποίοι μειώνουν τη διαλυτότητα των μορίων των νουκλεϊκών οξέων, όπως: α) η χαμηλή θερμοκρασία, β) τα κατιόντα, τα οποία αυξάνουν την ιοντική ισχύ του διαλύματος και γ. η αιθανόλη, η οποία απομακρύνει τα μόρια νερού από τα μόρια του νουκλεϊκού οξέος (αφυδατικό μέσο). Η πορεία αυτής της διαδικασίας είναι η ακόλουθη: Γίνεται προσθήκη 1/10 του όγκου διαλύµατος του απομονωμένου DNA διαλύματος 3 Μ οξικού νατρίου, pη 4,8 και διπλάσιου όγκου προψυγµένης απόλυτης αιθανόλης. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm για 5 min, στους 4 C και έκπλυση του ιζήµατος µε διάλυµα αιθανόλης 70% κ.ο. για την αποµάκρυνση αλάτων. Μετά την εξάτμιση του διαλύτη μέσω παραμονής στους 37 ο C, το ίζηµα αναδιαλύεται στον επιθυµητό όγκο ρυθµιστικού διαλύµατος ΤΕ (10 :1) ( ). 79

90 Υλικά & Μέθοδοι Ποσοτική ανάλυση δείγματος DNA Η συγκέντρωση (C) διαλύµατος δίκλωνου DNA προσδιορίζεται φωτοµετρικά µε µέτρηση της απορρόφησης του διαλύµατος στα 260 nm (Α 260 ), όπου απορροφούν οι αζωτούχες βάσεις του DNA (Kozutsumi et al 1989) και με τη χρήση της εξίσωσης: C DNA (μg/μl) = (Α παράγοντας αραίωσης)/1000 (Shirley et al 1995). Η καθαρότητα του DNA στο παρασκεύασμα προσδιορίζεται από το λόγο Α 260 /Α 280, ο οποίος για καθαρά παρασκευάσματα είναι ίσος προς 1,8. Τέλος, η ποιότητα του DNA ελέγχεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Ποιοτική ανάλυση δείγµατος DNA Τα µόρια DΝΑ είναι οµοιόµορφα αρνητικά φορτισµένα, λόγω του ιονισµού των φωσφορικών τους οµάδων. Έτσι, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου σε οριζόντιο πήκτωµα αγαρόζης (φυσικός πολυσακχαρίτης), τα μόρια DNA µετακινούνται προς το θετικό πόλο µε ταχύτητα αντιστρόφως ανάλογη προς το µέγεθός τους (McDonell et al 1977, Southern 1979). Άλλες παράµετροι, που επηρεάζουν τη µετανάστευση, είναι το µέγεθος των πόρων του πηκτώµατος, η εφαρµοζόµενη διαφορά δυναµικού, το ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης και η διαµόρφωση των νουκλεϊκών οξέων. Η θέση µετανάστευσης κάθε µορίου DNA προσδιορίζεται κατά την έκθεση του πηκτώµατος σε υπεριώδη ακτινοβολία ( nm), λόγω της ενσωµάτωσης πορτοκαλοκόκκινης φθορίζουσας χρωστικής (βρωµιούχο αιθίδιο) ανάµεσα στις αζωτούχες βάσεις της διπλής έλικας του DNA. Η µέθοδος παρέχει υψηλή ανάλυση και χρησιµοποιείται για την ταυτοποίηση, το διαχωρισµό και την αποµόνωση µορίων DNA µε βάση το µέγεθός τους. Μπορεί να χρησιµοποιηθεί για αναλυτικούς ή παρασκευαστικούς σκοπούς. Α. Παρασκευή πηκτώµατος αγαρόζης Κατάλληλη ποσότητα αγαρόζης (ώστε συνήθως η τελική της συγκέντρωση να είναι ίση προς 1 % κ.β.) διαλύεται πλήρως σε ρυθµιστικό διάλυµα ΤΒΕ με θέρμανση ( ). Ακολουθεί προσθήκη βρωµιούχου αιθίδιου σε τελική συγκέντρωση 0,5 µg/ml, ανάδευση του διαλύματος και απόχυσή του σε καλούπι σε κατάλληλη συσκευή, όπου αφήνεται να πήξει σε θερµοκρασία δωµατίου. Β. Ηλεκτροφόρηση DNA Μετά από προσθήκη διαλύµατος "φόρτωσης" δείγµατος DNA ( ), τα 80

91 Υλικά & Μέθοδοι δείγµατα τοποθετούνται σε οριζόντιο πήκτωµα 1% κ.β. αγαρόζης. Ακολουθεί ηλεκτροφόρηση σε ρυθµιστικό διάλυµα ΤΒΕ ( ) µε εφαρμογή ρεύµατος σταθερής τάσης 100 V και σε θερµοκρασία δωµατίου. Παράλληλα µε τα προς εξέταση δείγµατα, αναλύεται κατάλληλος µάρτυρας γνωστών µοριακών µεγεθών DNA. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, το πήκτωµα εκτίθεται σε υπεριώδη ακτινοβολία, οπότε διακρίνονται φθορίζουσες ζώνες στις θέσεις όπου έχουν µεταναστεύσει τα µόρια DNA. Το πήκτωµα αγαρόζης φωτογραφίζεται με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. Γ. Απομόνωση και καθαρισμός DNA από πήκτωμα αγαρόζης με gel extraction kit Για την απομόνωση και τον καθαρισμό μορίων DNA χρησιμοποιούνται παρασκευαστικά πηκτώματα αγαρόζης. Κατόπιν ηλεκτροφόρησης κόβεται από το παρασκευαστικό πήκτωμα το τμήμα της αγαρόζης, που περιέχει τη ζώνη του DNA που έχει το επιθυμητό μέγεθος και στη συνέχεια ακολουθεί ο καθαρισμός του DNA, με τη χρήση του gel extraction kit. Το τμήμα αγαρόζης ζυγίζεται και προστίθεται τριπλάσιος όγκος διαλύματος QG. Στη συνέχεια, γίνεται επώαση για 10 min στους 50 C και όταν γίνει πλήρης διαλυτοποίηση του πηκτώματος, προστίθεται 1 όγκος ισοπροπανόλης. Το δείγμα τοποθετείται μέσα σε ειδική κολώνα (QIAquick spin column) για πρόσδεση του DNA και φυγοκεντρείται. Ακολουθεί πλύσιμο της κολώνας με 0,75 ml διαλύματος PE και φυγοκέντρηση. Για την έκλουση του DNA, προστίθεται 50 μl dd H 2 O στο κέντρο της μεμβράνης της κολώνας και το DNA συλλέγεται με φυγοκέντρηση. Η συγκέντρωση και η ποιότητα του απομονωμένου ελέγχεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Υποκλωνοποίηση (subcloning) δίκλωνου τμήματος DNA σε πλασμιδιακό φορέα Πέψη DNA µε περιοριστικές ενδονουκλεάσες (Restriction reaction) Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι ένζυμα αποµονωµένα από φυσικές πηγές (βακτήρια), τα οποία αναγνωρίζουν µικρές αλληλουχίες DNA, πέπτοντας το δίκλωνο DNA σε συγκεκριµένες θέσεις εντός της αλληλουχίας αναγνώρισης ή σε γειτονικό της σηµείο. Για την αποτελεσµατική δράση των ενζύµων, απαιτούνται καθαρά δείγματα DNA, απαλλαγµένα από προσµίξεις. Μια µονάδα (1 U) περιοριστικής ενδονουκλεάσης ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύµου που απαιτείται για την πλήρη πέψη 1 µg καθαρού DNA. Επειδή πολλές φορές το DNA που χρησιμοποιείται για πέψη με περιοριστικά 81

92 Υλικά & Μέθοδοι ένζυμα είναι μερικώς καθαρισμένο, απαιτείται συνήθως μεγαλύτερη ποσότητα ενζύμου ή/και μεγαλύτερος χρόνος επώασης. Γενικά η σχέση που χρησιμοποιήθηκε ήταν 2-3 U περιοριστικού ενζύμου / 1 μg DNA / 20 μl (τελικός όγκος αντίδρασης). Οι αντιδράσεις πέψης πραγµατοποιήθηκαν σε συγκεντρώσεις άλατος και θερµοκρασίες που αναγράφονται κάθε φορά στα συνοδευτικά φυλλάδια των ενζύµων της κατασκευάστριας εταιρείας. Οι συνθήκες αυτές είναι ειδικές για κάθε περιοριστική ενδονουκλεάση και µπορεί να διαφέρουν από εταιρεία σε εταιρεία. Ωστόσο, κάποιες περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι δραστικές και σε διαφορετικές συγκεντρώσεις άλατος. Τέτοια ένζυµα χρησιµοποιήθηκαν αποτελεσµατικά για διπλή πέψη στο ίδιο ρυθµιστικό διάλυµα. Τα ένζυµα προστέθηκαν σε όγκο που δεν ξεπερνούσε κάθε φορά το 1/10 του τελικού όγκου της αντίδρασης, ώστε η τελική συγκέντρωση της γλυκερόλης, που περιέχεται στο διάλυµα αποθήκευσης του ενζύµου, να παραµένει χαµηλή και να µην µπορεί να επηρεάσει την αντίδραση. Επίσης, η ποσότητα πλασμιδιακού DNA ή η ποσότητα του προϊόντος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), η οποία προστίθεται κάθε φορά δεν ξεπερνά το 1/4 του τελικού όγκου της αντίδρασης. Ο έλεγχος των αντιδράσεων πέψης έγινε µε ηλεκτροφόρηση δείγματος από το διάλυµα της αντίδρασης σε πήκτωµα αγαρόζης 1% κ.β. ( Α) Αποφωσφορυλίωση γραµµικού πλασµιδιακού DNA (DNA dephosphorylation) Σε ορισμένες περιπτώσεις κλωνοποίησης, όπου το μόριο του πλασμιδιακού DNA έχει κοπεί με ένα περιοριστικό ένζυμο που δημιουργεί συμπληρωματικά κολλώδη άκρα (cohesive ends) ή ισοτελή άκρα (blunt ends), υπάρχει η πιθανότητα κατά την αντίδραση σύνδεσης (ligation) με το προς κλωνοποίηση τμήμα DNA, τα άκρα αυτά να επανασυνδεθούν (self-ligation), αποκλείοντας έτσι την κλωνοποίηση. Αυτό μπορεί να συμβεί και στην περίπτωση που το πλασµιδιακό DNA έχει υποστεί πέψη µε δύο περιοριστικά ένζυµα, από τα οποία όµως το ένα τουλάχιστον δεν έχει δράσει αποτελεσµατικά. Έτσι, σε αυτές τις περιπτώσεις προηγείται της αντίδρασης σύνδεσης, αποφωσφορυλίωση του γραμμικού μορίου DNA µε χρήση του ενζύµου της αλκαλικής φωσφατάσης από έντερο µοσχαριού (calf intestinal alkaline phosphatase, CIAP), το οποίο αποφωσφορυλιώνει τα 5 -άκρα του γραµµικού πλασµιδιακού DNA. Το προς κλωνοποίηση µόριο DNA µπορεί και συνδέεται µε το αποφωσφορυλιωµένο πλασµίδιο, σχηµατίζοντας σε κάθε άκρο φωσφοδιεστερικό δεσµό στη µία από τις δύο αλυσίδες. 82

93 Υλικά & Μέθοδοι Στη συνέχεια το βακτήριο Ε. coli επιδιορθώνει τα αποσφωφορυλιωµένα άκρα, οπότε δηµιουργούνται οι δεσµοί και στις δύο αλυσίδες και το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο διπλασιάζεται πλέον κανονικά. Η πορεία της αποφωσφορυλίωσης γραµµικού πλασµιδιακού DNA είναι η εξής: Γίνεται ανάμειξη 50 μl διαλύµατος 10 mm Tris-HCl, pη 8,3 περιέχοντος 10 µg καθαρού (καθαρισµένου από στήλη QIAquick) γραµµικού πλασµιδιακού DNA µε 10 μl ρυθµιστικού διαλύµατος αποφωσφορυλίωσης ( ). Στη συνέχεια προστίθενται 5 μl (0,5 U) διαλύµατος CIAP (Gibco BRL) και 35 μl ddh 2 O και το µίγµα επωάζεται στους 37 o C, για 60 min. Ακολουθεί επώαση στους 65 C για 10 min, ώστε να σταματήσει η αντίδραση, και καθαρισμός με στήλη QIAquick. Το DNA εκλούεται µε προσθήκη στη στήλη 40 μl ρυθµιστικού διαλύµατος 10 mm Tris-HCl, pη 8,0 και φυγοκέντρηση στις rpm για 60 s, σε θερµοκρασία δωµατίου Αντίδραση σύνδεσης (ligation) Η αντίδραση σύνδεσης των προς κλωνοποίηση µορίων DNA με μόρια πλασµιδιακού DNA πραγµατοποιείται με τη χρήση ποσότητας 100 ng από το καθένα από τα δύο αυτά αντιδρώντα και με την προσθήκη 2 μl (1U/μL) Τ4 DNA λιγάσης σε τελικό όγκο 22 μl ρυθµιστικού διαλύματος 50 mm Tris-HCl, pη 7,6, 10 mm MgCl 2, 1 mm ΑΤΡ, 1 mm DTT, 5% κ.β. ΡΕG Ακολουθεί επώαση των δειγµάτων σε θερμοκρασία δωματίου για 1 h. Τα προϊόντα των αντιδράσεων σύνδεσης χρησιµοποιούνται άµεσα για το µετασχηµατισµό βακτηρίων Μετασχηµατισµός (Transformation) βακτηρίων με τη χηµική µέθοδο του CaCl 2 Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια που προκύπτουν από την αντίδραση σύνδεσης χρησιμοποιούνται για το μετασχηματισμό βακτηρίων, ώστε να ακολουθήσει η παραγωγή και απομόνωσή τους σε μεγάλες ποσότητες ( ). Η χημική μέθοδος μετασχηματισμού βακτηριακών κυττάρων στηρίζεται στην απόδοση θετικού φορτίου στο τοίχωµά τους μετά από έκθεσή τους σε CaCl 2, έτσι ώστε να πραγματοποιείται η έλξη των αρνητικά φορτισμένων φωσφορικών ομάδων του ανασυνδυασµένου πλασμιδιακού DNA (Sambrook et al 1989) και να διευκολύνεται με αυτό τον τρόπο η είσοδός τους στο βακτηριακό κύτταρο. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα απομονώνονται σε θρεπτικό υλικό επιλογής (π.χ. εμποτισμένου με κατάλληλο αντιβιοτικό). Η 83

94 Υλικά & Μέθοδοι ικανότητα µετασχηµατισµού µε τη µέθοδο αυτή είναι περίπου 0,5-2, βακτήρια/µg υπερελικωµένου πλασµιδιακού DNA, η οποία είναι µικρότερη από τη μέθοδο μετασχηματισμού µε ηλεκτροδιάτρηση. Ωστόσο, παραμένει ικανοποιητική για τις συνήθεις περιπτώσεις κλωνοποίησης σε πλασµίδια. Η πορεία μετασχηματισμού των βακτηρίων με αυτή τη μέθοδο περιλαμβάνει τα εξής δύο στάδια: A. Προετοιµασία επιδεκτικών κυπάρων (competent cells) βακτηρίων µε χρήση χλωριούχου ασβεστίου (CaCl 2 ) Γίνεται εμβολιασμός μίας αποικίας βακτηρίων TOP10F ή DH5α σε 10 ml LB ( ) και ακολουθεί επώαση υπό ανάδευση, στους 37 o C για περίπου 16 h. Στη συνέχεια χρησιµοποιούνται 2 ml από αυτή την καλλιέργεια για εµβολιασµό 100 ml LB, τα οποία επωάζονται υπό ανάδευση στους 37 o C, µέχρις ότου O.D. 600 = 0,6-0,9 (~2 h). Ακολουθεί μεταφορά της υάλινης φιάλης, μέσα στην οποία βρίσκεται η καλλιέργεια, σε πάγο (0 C), όπου παραμένει για 30 min. Έπειτα γίνεται µεταφορά της καλλιέργειας σε δύο στείρους προψυγµένους πλαστικούς σωλήνες των 50 ml και φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο Juan (4.000 rpm, 10 min, 4 C). Το ίζηµα των βακτηρίων αναδιαλύεται σε 25 ml στείρου παγωµένου διαλύµατος 50 mμ CaCl 2. Το εναιώρημα φυγοκεντρείται στις rpm για 10 min, στους 4 C και το ίζηµα των βακτηρίων αναδιαλύεται σε 5 ml στείρου παγωµένου διαλύµατος 50 mμ CaCl 2. Στη συνέχεια, το εναιώρημα τοποθετείται στον πάγο για 2-3 h. Έπειτα, δύναται είτε να ακολουθήσει άμεσα ο μετασχηματισμός των επιδεκτικών πλέον βακτηριακών κυττάρων ή αυτά να καταψυχθούν ανά 100 μl στους -80 ºC παρουσία 20% γλυκερόλης για μελλοντική χρήση. B. Μετασχηµατισµός επιδεκτικών κυττάρων βακτηρίων Το εναιώρημα των επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων αφήνεται να ξεπαγώσει αργά σε πάγο, όταν χρησιμοποιούνται επιδεκτικά κύτταρα από -80 ºC. Στη συνέχεια γίνεται ανάμειξη 2 μl κατάλληλα αραιωμένου με ddh 2 0 ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού DNA (~5 ng/μl) 22 μl από τα προϊόντα αντίδρασης σύνδεσης ( ) με 100 μl εναιωρήματος επιδεκτικών βακτηρίων. Ακολουθεί επώαση του μείγματος στον πάγο (0 ºC) για 45 min και στη συνέχεια θερμικό σοκ με επώαση σε 42 ºC (μέσα σε υδατόλουτρο) αυστηρά για 90 s. Το μείγμα τοποθετείται άμεσα σε πάγο και επωάζεται για 2-5 min. Γίνεται εν συνεχεία, προσθήκη στο μείγμα 1 ml LB και επώαση, υπό ανάδευση στους 37 ºC για 1 h. Έπειτα, τα βακτήρια επιστρώνονται σε στερεό θρεπτικό μέσο (LB ή LB χαμηλής αλατότητας), μέσα σε τρυβλίο Petri, παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού (100 μg/ml αμπικιλλίνη στις περιπτώσεις 84

95 Υλικά & Μέθοδοι μετασχηματισμού με ανασυνδυασμένα και μη ppic9 και pbluescript πλασμίδια ή 25 μg/ml ζεοσίνη στην περίπτωση μετασχηματισμού με ανασυνδυασμένο και μη ppicζαα πλασμίδιο), και επωάζονται για ~16 h στους 37ºC, οπότε και εμφανίζονται αποικίες επιτυχώς μόνο μετασχηματισμένων βακτηρίων. Στις περιπτώσεις που το προς κλωνοποίηση µόριο DNA και το πλασµίδιο διαθέτουν ισοτελή άκρα ή συµπληρωµατικά κολλώδη άκρα, τα οποία έχουν προκύψει από πέψη µε το ίδιο περιοριστικό ένζυµο, η σύνδεση του προς κλωνοποίηση µορίου DNA πραγµατοποιείται µε την ίδια πιθανότητα και µε τους δύο προσανατολισµούς (5' 3' ή 3' 5'). Η εύρεση του σωστού προσανατολισµού σύνδεσης γίνεται µε τη χρήση περιοριστικών ενζύµων που πέπτουν ασύµµετρα µέσα στο κλωνοποιηµένο τµήµα DNA ( ) Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) Κατα την αντίδραση PCR, ενισχύεται µια νουκλεοτιδική αλληλουχία µεταξύ δύο περιοχών µιας µήτρας DNA (DNA template) γνωστής αλληλουχίας. Οι συνθετικές αντιδράσεις πραγµατοποιούνται µε τη βοήθεια δύο ολιγονουκλεοτιδίων, που χρησιµοποιούνται ως εναρκτήρια µόρια (primers) για τον πολυµερισµό συµπληρωµατικών προς τη µήτρα DNA, αλυσίδων, και µίας ανθεκτικής σε υψηλές θερµοκρασίες DNA πολυµεράσης (Chien et al 1976), η οποία καταλύει τη σύνθεση, παρουσία δεοξυριβονουκλεοτιδίων (Mullis and Faloona 1986, 1987, Saiki et al 1988). Κάθε ολιγονουκλεοτίδιο είναι συµπληρωµατικό µε µία διαφορετική αλυσίδα της µήτρας DNA και το ελεύθερο υδροξύλιο (-OH-) χρησιμοποιείται για τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού με τα ελεύθερα νουκλεοτίδια. Με αυτό τον τρόπο, η αλυσίδα συντίθεται από το 5 - στο 3 -άκρο. Το κύριο προϊόν της σειράς των συνθετικών αντιδράσεων είναι ένα τµήµα δίκλωνου DΝΑ, του οποίου τα άκρα ορίζονται από τα 5 -άκρα των δύο ολιγονουκλεοτιδίων, ενώ το µέγεθός του ορίζεται από την απόσταση μεταξύ των δύο εναρκτήριων µορίων στη µήτρα DNA. Στην παρούσα µελέτη, η PCR χρησιµοποιήθηκε για την ενίσχυση αλληλουχίων DNA για υποκλωνοποίησή τους σε κατάλληλους πλασµιδιακούς φορείς. Η αντίδραση λαµβάνει χώρα παρουσία µοριακής περίσσειας των δύο εναρκτήριων µορίων και των τεσσάρων dntps. Αρχικά, πραγµατοποιείται αποδιάταξη της µήτρας του δίκλωνου DNA µε θέρµανση, ώστε να παραχθούν µονόκλωνα µόρια DNA. Ακολουθεί ψύξη του µίγµατος της αντίδρασης σε θερµοκρασία που επιτρέπει την 85

96 Υλικά & Μέθοδοι υβριδοποίηση των εναρκτήριων µορίων µε τις συµπληρωµατικές αλυσίδες της µήτρας DNA και τέλος, πραγµατοποιείται επιµήκυνση των νέων αλυσίδων DNA µε την DNA πολυµεράση. Ο κύκλος των αντιδράσεων αποδιάταξη-υβριδοποίηση-επιµήκυνση επαναλαµβάνεται πολλές φορές και τα προϊόντα κάθε κύκλου ενίσχυσης χρησιµοποιούνται ως µήτρα DNA στον επόµενο κύκλο. Έτσι, σε κάθε κύκλο, θεωρητικά διπλασιάζεται η ποσότητα του επιθυµητού προϊόντος DNA, ώστε στο τέλος n κύκλων, το διάλυµα της αντίδρασης περιέχει θεωρητικά 2 n µόρια DNA-αντίγραφα της αλληλουχίας η οποία εντοπίζεται μεταξύ των εναρκτήριων µορίων. Στην παρούσα µελέτη, για την ενίσχυση cdna αλληλουχιών της ΕΚΠ του ανθρώπινου α7 nachr µε PCR, χρησιµοποιήθηκαν γενικά οι παρακάτω συνθήκες, εκτός αν ορίζονται διαφορετικά στις επιµέρους περιπτώσεις: Σε κάθε αντίδραση χρησιµοποιήθηκαν ng µήτρας DNA και 10 pmoles έκαστου εναρκτήριου µορίου και τα dntps προστέθηκαν στο µίγµα της αντίδρασης σε τελική συγκέντρωση 0,2 mm το καθένα. Η αντίδραση πραγµατοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μl ρυθµιστικού διαλύµατος 20 mm Tris-HCl, 10 mm KCl, 10 mm (NH 4 ) 2 SΟ 4, 2 mm MgS0 4, 0,1 % κ.ο. Triton Χ-100, pη 8,8. Χρησιµοποιήθηκε 1 U Taq DNA ή Pfu πολυµεράσης / αντίδραση. Τα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιµοποιήθηκαν, είχαν σχεδιαστεί ώστε να διαθέτουν αλληλουχίες αναγνώρισης από κατάλληλα περιοριστικά ένζυµα, προκειµένου η προς ενίσχυση αλληλουχία DNA να µπορεί κατόπιν να κλωνοποιηθεί σε κατάλληλο πλασµιδιακό φορέα έκφρασης. Οι αντιδράσεις πραγµατοποιήθηκαν σε θερµικό κυκλοποιητή ( ). Αρχικά, τα δείγματα θερµάνθηκαν στους 95 C για 2 min, προκειµένου να αποδιαταχθεί πλήρως το δίκλωνο µόριο του πλασµιδιακού DNA. Ακολούθησαν 25 κύκλοι ενίσχυσης µε τις ακόλουθες συνθήκες (εκτός αν κατά περίπτωση ορίζονται διαφορετικά): αποδιάταξης 95 C, 30 s υβριδοποίησης 56 C, 30 s πολυµερισµού 72 C, 1 min Μετά την ολοκλήρωση των 25 κύκλων ενίσχυσης, τα προϊόντα της PCR (5 μl από κάθε δείγµα) αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα 1% κ.β. αγαρόζης ( Α). 86

97 Υλικά & Μέθοδοι Υγρές και στερεές καλλιέργειες κυττάρων Pichia pastoris Χρησιµοποιήθηκαν τα στελέχη Χ-33 και GS115 της P. pastoris. Το στέλεχος X33 μπορεί να αναπτύσσεται σε ελάχιστο θρεπτικό μέσο MD, ενώ το GS115 αναπτύσσεται σε ελάχιστο θρεπτικό μέσο MDH με ιστιδίνη ( 3.1.6). Και τα δύο στελέχη αναπτύσσονται σε θρεπτικό υλικό YPD ( 3.1.6). Η ανάπτυξη των στελεχών αυτών σε υγρά και στερεά θρεπτικά μέσα επιτυγχάνεται µε επώαση στους 30 C. Ο χρόνος διπλασιασμού τους στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης είναι ~2 h. Για τη διατήρηση µετασχηµατισµένων και µη στελεχών της Ρ. pastoris για µεγάλα χρονικά διαστήµατα, τα στελέχη αναπτύσσονται σε υλικό YPD στους 30 C για 16 h και φυλάσσονται στους -80 C, παρουσία 20% κ.ο. γλυκερόλης. Οι στερεές καλλιέργειες διατηρούνται στους 4 C για διάστηµα αρκετών ηµερών έως και µερικών εβδοµάδων. Το θρεπτικό υλικό ανάπτυξης των κυττάρων (BMGY), όταν επρόκειτο να ακολουθήσει επαγωγή της έκφρασης της ετερόλογης πρωτεΐνης, περιείχε γλυκερόλη αντί για γλυκόζη ( ) Μετασχηµατισµός κυττάρων P. pastoris με ηλεκτροδιάτρηση (electroporation) Με την εφαρµογή ρεύματος υψηλής τάσης, κατάλληλα επεξεργασµένα κύτταρα ζύμης γίνονται διαπερατά σε πλασµίδια, οπότε ακολουθεί η εισαγωγή των πλασμιδίων στο εσωτερικό του κυττάρου. Για µεγαλύτερη ικανότητα µετασχηµατισµού, παραγματοποιείται η γραμμικοποίηση του πλασµιδίου (linearization) µε πέψη σε µοναδική θέση αναγνώρισης στην αλληλουχία 5 ΑΟΧ1 των πλασµιδίων (Εικόνα 22), πρίν τη διαδικασία της ηλεκτροδιάτρησης. Αυτό γίνεται, προκειμένου να ενισχυθεί η πιθανότητα δημιουργίας ομόλογου ανασυνδυασμού με την ομόλογη και συντηρηµένη αλληλουχία ΑΟΧΙ του χρωµοσώµατος της Ρ. pαstοrίs και η ενσωμάτωση των πλασμιδίων στο χρωμοσωμικό DNA της P. pastoris. Η µέθοδος έχει ικανότητα µετασχηµατισµού κύτταρα/µg γραµµικού DNA, χωρίς να καταστρέφει το κυτταρικό τοίχωµα της Ρ. Ραstοrίs και περιλαμβάνει τα εξής στάδια: A. Προετοιµασία επιδεκτικών κυττάρων P. pastoris Γίνεται εμβολιασμός κυττάρων µιας αποικίας του στέλεχους Χ33 ή GS115 από θρεπτικό υλικό YPD-άγαρ σε 10 ml θρεπτικού υλικού YPD ( ) και επώαση στους 30 C, υπό ανάδευση για περίπου 16 h. Στη συνέχεια χρησιµοποιούνται 50 μl από την παραπάνω καλλιέργεια για τον εµβολιασµό 500 ml YPD και γίνεται επώαση 87

98 Υλικά & Μέθοδοι στους 30 C, μέχρις ότου O.D. 600 = 1,3 (~16 h). Ακολουθούν τέσσερεις διαδοχικές φυγοκεντρήσεις (1500 g, 5 min, 4 C) και αναδιάλυση του πρώτου ιζήματος σε 500 ml αποστειρωμένου και προψυγµένου ddh 2 Ο, του δεύτερου ιζήματος σε 250 ml αποστειρωμένου και προψυγµένου ddh 2 Ο, του τρίτου ιζήματος σε 20 ml 1 M σορβιτόλης και τέλος του τέταρτου ιζήματος σε 1 ml σορβιτόλης 1 M, οπότε προκύπτει εναιώρηµα των κυττάρων τελικού όγκου περίπου 1,5 ml. Το εναιώρηµα αυτό των επιδεκτικών πλέον κυττάρων ζύμης χρησιµοποιείται για το µετασχηµατισµό. B. Μετασχηµατισµός επιδεκτικών κυττάρων Ρ. pαstoris Ποσότητα 80 μl εναιωρήµατος των επιδεκτικών κυττάρων X33 ή GS115 αναµειγνύεται µε 20 μl γραμμικών ανασυνδυασμένων και μη ppiczαα ή ppic9 πλασμιδίων, αντίστοιχα (κατάλληλης συγκέντρωσης ώστε τα 20 μl να αντιστοιχούν σε µg πλασμιδιακού DNA), τα οποία έχουν υποστεί πέψη µε ενδονουκλεάση σε µοναδική θέση αναγνώρισης μέσα στο 5 ΑΟΧ1 τόπο (Εικόνα 22). Ακολουθεί μεταφορά του µείγµατος σε προψυγμένη κυψελίδα 0,2 cm (ειδική για ηλεκτροδιάτρηση) και επώαση σε 4 C για 5 min. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται μετασχηματισμός με ηλεκτροδιάτρηση στη συσκευή GENE PULSER που έχει ρυθµιστεί σε 25 µf και 1,5 kv. Μετά την εφαρµογή ηλεκτρικού παλµού διάρκειας 4,4 4,6 ms, προστίθεται αµέσως 1 ml διαλύµατος 1 Μ σορβιτόλης και ακολουθεί η μεταφορά του μείγματος σε στείρο σωλήνα 1,5 ml και η επώασή του χωρίς ανάδευση στους 30 C για 1 h. Στη συνέχεια γίνεται επίστρωση των κυττάρων Χ33 σε στερεό θρεπτικό υλικό YPD ( 3.1.6) που περιέχει 25 µg/ml ζεοσίνη και των κυττάρων GS115 σε RDB και RDBH ( 3.1.6). Ακολουθεί επώαση σε 30 C, ώστε να γίνει η επιλογή των επιτυχώς μετασχηματισμένων κυττάρων X33 και GS115 με τα πλασμίδια ppiczαα και ppic9, αντίστοιχα. Η επιλογή των επιτυχώς μετασχηματισμένων X33 κυττάρων με ανασυνδυασμένο και μη πλασμίδιο ppiczαα στηρίζεται στην ικανότητά τους να αναπτύσσονται σε YPD + ζεοσίνη, ενώ η επιλογή των επιτυχώς μετασχηματισμένων GS115 κυττάρων με ανασυνδυασμένο και μη πλασμίδιο ppic9 στηρίζεται στην ικανότητά τους να αναπτύσσονται σε RDB (απουσία ιστιδίνης). Η ανάπτυξη αποικιών των επιτυχώς μετασχηματισμένων κυττάρων παρατηρείται συνήθως μέσα σε h. 88

99 Υλικά & Μέθοδοι Έκφραση των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris (Protein expression) Η έκφραση των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών, τα γονίδια των οποίων έχουν υποκλωνοποιηθεί σε pριcζα και ppic9 πλασµίδια, ώστε η μεταγραφή τους να βρίσκεται υπό τον έλεγχο του υποκινητή του γονιδίου της αλκοολικής οξειδάσης (ΑΟΧ1), επάγεται κατά την προσθήκη µεθανόλης στην καλλιέργεια. Η µεθανόλη ενεργοποιεί τον υποκινητή ΑΟΧ1 και οι ανασυνδυασµένες πρωτεΐνες οδηγούνται από το πεπτίδιο οδηγό («παράγοντας α» από S. cerevisiae) προς έκκριση στο θρεπτικό υλικό, από το οποίο συλλέγονται ( ). Ο προκαταρκτικός έλεγχος της έκφρασης πραγµατοποιείται σε καλλιέργειες µικρής κλίµακας. Από τον έλεγχο αυτό επιλέγονται οι ισχυροί κλώνοι για έκφραση σε καλλιέργεια µεγάλης κλίµακας. Α. Έκφραση σε καλλιέργειες µικρής κλίµακας (small scale cultures) Μεµονωµένες αποικίες µετασχηµατισµένων κυττάρων Χ33 και GS115 της P. pαstoris που φέρουν το γονίδιο της πρωτεΐνης για ετερόλογη έκφραση, χρησιµοποιούνται για τον εµβολιασµό 5 ml θρεπτικού υλικού BMGY ( ) σε στείρους δοκιµαστικούς σωλήνες µιας χρήσης των 50 ml. Ακολουθεί επώαση στους 30 C υπό έντονη ανάδευση (280 rpm) για h. Το θρεπτικό υλικό αποµακρύνεται µε φυγοκέvτρηση στις rpm, 10 min, 20 C. Ακολουθεί επαναδιάλυση των κυττάρων σε 1 ml θρεπτικού υλικού ΒΜΜΥ ( ) και μεταφορά κατάλληλου όγκου εναιωρήματος σε 5 ml θρεπτικού υλικού ΒΜΜΥ, ώστε αρχική O.D. 600 = 1,0, προς επαγωγή της έκφρασης. Πραγματοποιείται επώαση στους 30 C, υπό ανάδευση (280 rpm) για 48 h και με την προσθήκη μεθανόλης ανά 24 h σε τελική συγκέντρωση 0,5% (κ.ο.). Μετά τη διακοπή της επώασης γίνεται συλλογή του υπερκείμενου των καλλιεργειών με φυγοκέντρηση σε φυγόκεντρο Sorvall (5.000 rpm, 15 min, 4 C) και έλεγχος έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης µε ανοσοαποτύπωση σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες (dot-blot), χρησιμοποιώντας κατάλληλα αντισώματα ( ). H επιλογή των κλώνων (screening of clones) για έκφραση σε μεγαλύτερη κλίμακα στηρίζεται στην ένταση του σήματος ανοσοαποτύπωσης και στην ικανότητα δέσμευσης 125 I-α-μπουγκαροτοξίνης ( ) με τη χρήση δείγματος υπερκείμενου καλλιεργειών. Β. Έκφραση σε καλλιέργειες µεγάλης κλίµακας (large scale cultures) Μεµονωµένες αποικίες ισχυρά µετασχηµατισµένων κλώνων Χ33 ή GS115 χρησιµοποιούνται για τον εµβολιασµό 5 ml θρεπτικού υλικού BMGY και επωάζονται 89

100 Υλικά & Μέθοδοι σε 30 C, 16 h, 280 rpm. Ακολουθεί εμβολιασμός 0,5 ml της παραπάνω καλλιέργειας σε 500 ml BMGY και επώαση σε 30 C, 280 rpm, έως ότου O.D. 600 = 4,0. Γίνεται φυγοκέντρηση στις rpm, 10 min, 20 C και αναδιάλυση σε 4 x 500 ml (2 L) ΒΜΜΥ, ώστε αρχική O.D. 600 = 1,0 κατά την επαγωγή της έκφρασης, η οποία διαρκεί 48 h με την καθημερινή προσθήκη μεθανόλης 0,5 % κ.ο.. Επειδή για την ανάπτυξη των κυττάρων του ζυµοµύκητα P. pastoris απαιτείται καλός αερισµός της καλλιέργειας, στην παρούσα µελέτη χρησιµοποιήθηκαν καλλιέργειες των 500 ml σε κωνικές φιάλες χωρητικότητας 2 L και χρησιµοποιήθηκαν πώµατα από διπλή γάζα. Μετά το πέρας της επαγωγής της έκφρασης έγινε συλλογή του υπερκειμένου της καλλιέργειας, μέσα στο οποίο περιέχονται οι εκκρινόμενες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, με φυγοκέντρηση στις rpm, 15 min, 4 C, χρησιμοποιώντας φυγόκεντρο Sorvall και κεφαλή GS Απομόνωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών από υπερκείµενο καλλιέργειας P. pastoris (Protein isolation) Μετά τη συλλογή του υπερκείμενου των καλλιεργειών των μετασχηματισμένων κυττάρων X33 και GS115 έγινε προσθήκη νατραζιδίου (Να 3 Ν) και φαινυλ-μεθυλσουλφονυλ-φθοριδίου (PMSF) σε τελικές συγκεντρώσεις 0,05 % κ.β. και 0,1 mm αντίστοιχα. Ακολούθησε η απομόνωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, με μία διαδικασία η οποία χωρίζεται στα ακόλουθα δύο διακριτά στάδια: Α. Μικροδιήθηση (Microfiltration) Το συλλεγμένο υπερκείμενο της καλλιέργειας μετασχηματισμένων κυττάρων ζύμης X33 και GS115 μεταφέρεται σε μεταλλικό αποστειρωμένο καζάνι, το οποίο κλείνει ερμητικά. Γίνεται σύνδεση του καζανιού αυτού με φιάλη παροχής αέριου αζώτου, υπό πίεση, μέσω ενός λάστιχου (με εσωτερικό πόρο κατάλληλης διατομής) το οποίο εφαρμόζει σε ειδική οπή του άνωθεν μέρους του μεταλλικού καζανιού. Από μία άλλη αντιδιαμετρική οπή γίνεται σύνδεση, επίσης μέσω λάστιχου, με το άνωθεν τμήμα μίας μεταλλικής συσκευής μικροδιήθησης (Millipore), μέσα στην οποία έχουν τοποθετηθεί, σε οριζόντια διάταξη και από πάνω προς τα κάτω, διηθητικό χαρτί Watmann 3 ΜΜ, γάζα, φίλτρο με διάμετρο πόρου 0,45 μm, γάζα και φίλτρο με διάμετρο πόρου 0,2 μm. Σε μία οπή στο κάτω μέρος της συσκευής αυτής συνδέεται επίσης ένα λάστιχο, το οποίο καταλήγει σε μία μεγάλη κωνική φιάλη (10 L), προκειμένου να γίνει η συλλογή του φιλτραρισμένου πλέον υπερκείμενου των καλλιεργειών (μέσα στο οποίο βρίσκονται οι εκκρινόμενες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες), έπειτα από την διοχέτευση 90

101 Υλικά & Μέθοδοι αέριου N 2 υπό πίεση ~1 Atm στο αρχικό τμήμα συνδεσμολογίας του συστήματος. Β. Υπερδιήθηση (Ultrafiltration) Μετά το φιλτράρισμα του υπερκειμένου των καλλιεργειών, ακολουθεί η συµπύκνωσή του μέσω συσκευής εφαπτόμενης συνεχούς ροής της Millipore, στο εσωτερικό της οποίας υπάρχει µεµβράνη µε συγκεκριµένη διάµετρο, ώστε να αποκλείεται η διέλευση μορίων μεγέθους > 10 kda. Η ροή του, προς συμπύκνωση, πρωτεϊνικού διαλύματος εφάπτεται στην ειδική αυτή μεμβράνη, ενώ η συνεχής ροή εξασφαλίζεται μέσω περισταλτικής αντλίας. Η µεµβράνη συγκρατεί µόρια µεγαλύτερα από τη διάµετρο των πόρων της, ενώ τα µικρότερα µόρια διαφεύγουν της µεµβράνης µαζί µε το διάλυµα. Έτσι, τα υπό μελέτη ανασυνδυασμένα ανθρώπινα α7-εκπ μόρια του nachr, των οποίων τα πρωτομερή έχουν μοριακή μάζα ~37 kda δεν μπορούν να διαπεράσουν αυτή τη μεμβράνη της συσκευής και παγιδεύονται στο προς συμπύκνωση διάλυμα. Διατηρώντας σταθερή ογκομετρική ροή εξόδου ~35 ml/min, επιτυγχάνεται συμπύκνωση πρωτεϊνικού διαλύματος όγκου 1 L σε τελικό όγκο ~100 ml σε διάρκεια 25 min. Πρίν τη χρήση της, η συσκευή ξεπλένεται με 2 L ddh 2 Ο χωρίς ανακύκλωση, ώστε να απομακρυνθεί το διάλυμα 0,5 M NaOH αποθήκευσης της συσκευής. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται η ροή του πρωτεϊνικού διαλύματος διαμέσου της συσκευής υπερδιήθησης με ανακύκλωση, μέσω περισταλτικής αντλίας ρυθμιζόμενης ογκομετρικής παροχής ( ). Στο τέλος της διαδικασίας συµπύκνωσης του αρχικού διαλύματος, πραγµατοποιείται διαπίδυση έναντι 2 L ρυθμιστικού διαλύματος 50 mm φωσφορικών, 300mM NaCl, 1 mm DTT, pη 8,0 για κάθε 1 L αρχικού υπερκειμένου και εκ νέου συμπύκνωση. Ακολουθεί έκπλυση της συσκευής πρώτα με 2 L ddh 2 0 και στη συνέχεια µε 2 L 0,5 Μ NaOH και αποθήκευσή της µέχρι την επόµενη χρήση σε 4 C Καθαρισµός ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών (Protein purification) Xρωµατογραφία συγγένειας (Affinity chromatography) Το πρώτο στάδιο καθαρισμού των ανασυνδυασμένων α7-εκπ μορίων του nachr στηρίζεται στην ύπαρξη έξι συνεχόμενων καταλοίπων ιστιδίνης (6 Χ His tag) στο άμινο- ή στο καρβοξυ-τελικό άκρο τους. Σε αλκαλικό περιβάλλον, οι ανασυνδυασμένες αυτές πρωτεΐνες προσδένονται µε υψηλή συγγένεια (K d = 10-8 M) σε στήλη ρητίνης συζευγμένης με ιόντα νικελίου (Ni 2+ ), λόγω των αρνητικά φορτισμένων δακτυλίων 91

102 Υλικά & Μέθοδοι ιμιδαζολίου των ιστιδινών (Hochuli et al 1987). Η έκλουση των προσδεδεμένων στη στήλη Ni-NTA, πρωτεϊνών, πραγµατοποιείται με χρήση αυξανόμενων συγκεντρώσεων ιμιδαζολίου, το οποίο ανταγωνίζεται τα ιμιδαζόλια των ιστιδινών της πρωτεΐνης για πρόσδεση στα ιόντα Ni 2+ της στήλης. Η πορεία που ακολουθείται για αυτό το πρώτο στάδιο καθαρισμού των πρωτεϊνών μετά την υπερδιήθησή τους είναι η ακόλουθη: Κατάλληλος όγκος εναιωρήματος μέσα σε πλαστικούς δοκιμαστικούς σωλήνες 50 ml (Falcon) που περιέχει 50% κ.ο. σφαιρίδια Νί 2+ -ΝΤΑ-αγαρόζης (Qiagen), ώστε να τηρείται αναλογία 1 ml καθαρών σφαιριδίων / L αρχικής καλλιέργειας, φυγοκεντρείται σε επιτραπέζια φυγόκεντρο Juan (1.000 rpm, 5 min, 4 ο C). Ακολουθεί προσεκτική απομάκρυνση του υπερκείµενου και εξισορρόπηση του ιζήματος (σφαιρίδια Νί 2+ -ΝΤΑαγαρόζης) µε 50 mm ΡΒ, pη 8,0, υπό ήπια ανάδευση διάρκειας ~10 min. Ακολουθούν τρείς πλύσεις των σφαιριδίων με το παραπάνω διάλυμα µε φυγοκέντρηση κάθε φορά στις rpm, 5 min, 4 ο C. Μετά την τελευταία φυγοκέντρηση γίνεται αναδιάλυση του ιζήματος σε κατάλληλο όγκο 50 mm PB, pη 8,0. Στη συνέχεια γίνεται προσθήκη της κατάλληλης ποσότητας αναδιαλυμένων σφαιριδίων Ni-NTA-αγαρόζης μέσα σε πλαστικό σωλήνα 250 ml, στον οποίο βρίσκεται ήδη τοποθετημένο το διάλυμα του υπερκειμένου των καλλιεργειών μετά την διαδικασία υπερδιήθησης (1 ml καθαρών σφαιριδίων / L αρχικής καλλιέργειας) και ακολουθεί επώαση υπό ανάδευση σε 4 ºC κατά τη διάρκεια της νύκτας, προκειμένου να επιτευχθεί η πρόσδεση των πρωτεϊνών στα σφαιρίδια Ni-NTA-αγαρόζης. Την επομένη ακολουθεί διακοπή της επώασης και φυγοκέντρηση του διαλύματος σε επιτραπέζια φυγόκεντρο Juan (2.500 rpm, 5 min, 4 ºC). Το υπερκείμενο απομακρύνεται και φυλάσσεται σε 4 ºC προκειμένου να διαπιστωθεί στη συνέχεια άν σε αυτό παρευρίσκονται μη απομακρυσμένα μόρια πρωτεΐνης, ενώ το ίζημα αναδιαλύεται σε 10 πλάσιο όγκο διαλύματος πλύσης (50 mm ΡΒ, pη 8,0, 300 mμ NaCl, 10 mμ ιµιδαζόλιο). Ακολουθεί η απόχυση του αναδιαλυμένου αυτού διαλύματος σφαιριδίων Νί 2+ -ΝΤΑ-αγαρόζης µε τα προσδεµένα πλέον μόρια πρωτεΐνης σε υάλινη στήλη χρωµατογραφίας, οπότε με το πέρας του διαλύματος πλύσης αφ ενός αποµακρύνονται οι ασθενώς μη ειδικά προσδεδεμένες προσµίξεις και αφ ετέρου επιτυγχάνεται το πακετάρισμα της στήλης των σφαιριδίων. Στη συνέχεια πραγματοποιούνται δύο επιπλέον πλύσεις με τη χρήση δύο όγκων στήλης για καθένα από τα διαλύµατα 50 mm ΡΒ, pη, 8,0, 300 mμ NaCl, που περιέχουν 30 mm και 50 mm ιµιδαζολίου, αντίστοιχα. Τα ανασυνδυασμένα α7-εκπ μόρια εκλούονται σε τρείς όγκους στήλης διαλύματος έκλουσης 50 mm ΡΒ, pη, 8,0, 300 mμ NaCl, περιέχοντος 150 mm ιµιδαζολίου. Τέλος, γίνεται έκλουση με τη χρήση 92

103 Υλικά & Μέθοδοι δύο όγκων στήλης διαλύματος 50 mm ΡΒ, pη, 8,0, 300 mμ NaCl, περιέχων 1 M ιµιδαζόλιο για την απομάκρυνση τυχόν ισχυρότατα προσδεδεμένων μορίων α7-εκπ. Η παρουσία α7-εκπ μορίων στα διαλύματα έκλουσης πιστοποιείται µε SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ( ) και με πειράματα πρόσδεσης ραδιενεργώς σημασμένης 125 Ι-α-μπουγκαροτοξίνης ( ) Χρωµατογραφία µοριακής διήθησης (Size exclusion chromatography) Το δεύτερο στάδιο καθαρισμού των α7-εκπ μορίων πραγματοποιείται με χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (FPLC). Ο διαχωρισμός των α7-εκπ μορίων από άλλα μόρια-προσμίξεις που βρίσκονται στα δείγματα έκλουσης από τη στήλη Ni-NTA-αγαρόζης επιτυγχάνεται βάσει του διαφορετικού μεγέθους και σχήματός τους κατά τη διέλευσή τους από υλικό με συγκεκριμένη διάμετρο πόρων. Η στήλη μοριακού αποκλεισμού που χρησιμοποιήθηκε ήταν η Superose 12 (Amersham Biosciences), όγκου 24 ml και με διάμετρο πόρων 12 μm, διαχωριστικής ικανότητας μορίων με μοριακό μέγεθος kda. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για αυτό το δεύτερο στάδιο καθαρισμού ήταν η ακόλουθη: Τα εκλούσματα της στήλης Ni-NTA-αγαρόζης, περιέχοντα τις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, ενώθηκαν και συμπυκνώθηκαν σε τελικό όγκο 0,5 ml με τη χρήση φίλτρων υπερδιήθησης Amicon με διάμετρο πόρων 10 kda και με τουλάχιστον τρείς διαδοχικές φυγοκεντρήσεις σε επιτραπέζια φυγόκετρο Eppendorf (2.500 rpm, 10 min, 4 ºC). Κατά τη συμπύκνωση με αυτή τη διαδικασία έγινε και αλλαγή του διαλύματος της πρωτεΐνης με προσθήκη διαλύματος 10 mm PB, 100 mm NaCl, 1 mm DTT, ph 7,5 μετά το πέρας των διαδοχικών φυγοκεντρήσεων. Στη συνέχεια έγινε το φιλτράρισμα του δείγματος αυτού μέσω φίλτρου διαμέτρου πόρων 0,2 μm και ακολούθησε η ένεσή του με κατάλληλη σύριγγα του 1 ml στο σύστημα FPLC, στο οποίο είχε ήδη τοποθετηθεί και εξισορροπηθεί με το ίδιο διάλυμα (φιλτραρισμένο μέσω φίλτρων 0,2 μm και απαερωμένο με χρήση λουτρού υπερήχων) στήλη Superose 12. Ακολούθησε χρωματογραφία μοριακής διήθησης με ροή διαλύματος χρωματογραφίας μοριακού αποκλεισμού ίση με 0,5 ml/min και συλλογή κλασμάτων όγκου 0,5 ml έκαστο. Η ανίχνευση της εκλουόμενης α7-εκπ στα διάφορα κλάσματα αυτής της στήλης πραγματοποιήθηκε με πειράματα πρόσδεσης ραδιενεργώς σημασμένης 125 Ι-α-bgtx 93

104 Υλικά & Μέθοδοι ( ) και με την ανοσοενζυμική μέθοδο ανίχνευσης κατά Western ( ), ενώ ο καθαρισμός της επιβεβαιώθηκε µε SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση ( ) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών υπό αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE electrophoresis) Ο διαχωρισµός και η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος γίνεται µε ηλεκτροφόρηση σε κάθετο πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου, παρουσία θειικού δωδεκυλικού νατρίου (SDS) (Laemmli 1970). Οι πρωτεΐνες κατά την έκθεσή τους στο αρνητικά φορτισµένο απορρυπαντικό SDS αποκτούν αρνητικό φορτίο (σε κάθε αµινοξύ µιας πρωτεΐνης δεσµεύεται περίπου ένα µόριο SDS) και µετακινούνται προς το θετικό πόλο µε ταχύτητα αντιστρόφως ανάλογη προς το µέγεθός τους. Κατά τη µέθοδο της κάθετης ηλεκτροφόρησης, οι πρωτεΐνες τοποθετούνται αρχικά σε πήκτωµα χαµηλής περιεκτικότητας σε ακρυλαµίδιο (πήκτωµα συµπύκνωσης), ενώ ο διαχωρισµός πραγµατοποιείται, αφού οι πρωτεΐνες περάσουν σε πήκτωµα υψηλής περιεκτικότητας σε ακρυλαµίδιο (πήκτωµα διαχωρισµού). Α. Παρασκευή πηκτώµατος πολυακρυλαµιδίου Το πήκτωµα συµπύκνωσης (stacking gel) περιέχει 0,125 Μ Tris-HCl, pη 6,8, 0,1% κ.β. SDS και 4% κ.β. ακρυλαµίδιο. Το πήκτωµα διαχωρισµού (separating gel), περιέχει 0,375 Μ Tris-HCl, pη 8,8, 0,1 % κ.β. SDS και 12 % κ.β. ακρυλαµίδιο. Ο πολυµερισµός των πηκτωµάτων πραγµατοποιείται µε προσθήκη 1% κ.β. APS και 0,04% κ.ο. TEMED ως καταλύτη πολυμερισμού του ακρυλαμιδίου ( ). Β. Προετοιµασία δειγµάτων για ηλεκτροφόρηση Τα προς ηλεκτροφόρηση δείγµατα αναμειγνύονται με διάλυµα "φόρτωσης" πρωτεϊνών ( 3.1.7), που περιέχει SDS και β-µερκαπτοαιθανόλη και επωάζονται για 5 min σε θερμοκρασία βρασμού (100 C). Οι συνθήκες αυτές είναι αποδιατακτικές για τις πρωτεΐνες, καθώς ο βρασµός παρουσία SDS έχει ως αποτέλεσµα τη διάσπαση δεσµών (υδρογόνου, ιοντικών, υδρόφοβων και Van der Waals αλληλεπιδράσεων), ενώ η β-µερκαπτοαιθανόλη προκαλεί αναγωγή των οµοιοπολικών δισουλφιδικών δεσµών. Παράλληλα µε τα προς εξέταση δείγµατα, γίνεται ανάλυση µείγµατος πρωτεϊνών γνωστού µοριακού βάρους, που χρησιµοποιούνται ως µάρτυρες µοριακών µεγεθών. Γ. Ηλεκτροφόρηση και ανίχνευση των ζωνών Η ηλεκτροφόρηση πραγµατοποιείται υπό σταθερή τάση 120 V, σε ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών ( ), το οποίο περιέχει 0,1 % κ.β. SDS. Οι 94

105 Υλικά & Μέθοδοι ζώνες των πρωτεϊνών εµφανίζονται µετά από χρώση του πηκτώµατος µε ήπια ανάδευση σε διάλυµα χρωµατισµού ( ) για 30 min στους 37 o C και μετέπειτα αποχρωµατισµό με συνεχείς πλύσεις σε διάλυµα αποχρωµατισµού ( ) και σε θερμοκρασία δωματίου, έως ότου απομακρυνθεί η περίσσεια χρωστικής Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών (Western blotting) Οι πρωτεΐνες, µετά από το διαχωρισµό τους σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου, µεταφέρονται σε σταθερό µεµβρανικό υπόστρωµα νιτροκυτταρίνης µε εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου κάθετα προς τις δύο επιφάνειες. Οι πρωτεΐνες που έχουν μεταναστεύσει στη µεµβράνη νιτροκυτταρίνης ανιχνεύονται µε προσθήκη αντισώµατος, το οποίο δεσμεύεται ειδικά σε αυτές (Burnette 1981). Έπειτα, το προκύπτον σύµπλοκο αντιγόνου-αντισώµατος ανιχνεύεται µε προσθήκη ενός δεύτερου αντισώµατος, ειδικού για το πρώτο, που φέρει ένα οµοιοπολικά συζευγµένο ένζυµο. Μετά την προσθήκη κατάλληλου υποστρώµατος, το ένζυµο καταλύει µια αντίδραση, που δίνει έγχρωµο προϊόν, µε αποτέλεσµα να γίνεται ορατή η ζώνη της πρωτεΐνης, στο σηµείο όπου αυτή έχει µετακινηθεί κατά την ηλεκτροφόρηση. Η τεχνική αυτή χρησιµοποιείται για την ανίχνευση ακόµα και ίχνους µίας πρωτεΐνης σε ένα πρωτεϊνικό μείγμα (της τάξης των ng), καθώς και για τον προσδιορισµό της ταυτότητας ή του µεγέθους µιας πρωτεΐνης. Η πορεία αυτής της μεθόδου είναι η ακόλουθη: Α. Μεταφορά των πρωτεϊνών Για τη µετανάστευση των πρωτεϊνών από το πήκτωµα πολυακρυλαμιδίου στη µεµβράνη νιτροκυτταρίνης, χρησιµοποιείται κατάλληλο ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς (transfer buffer) µε ph 8,5 ( ). Στην τιµή αυτή του pη, οι πρωτεΐνες αποκτούν αρνητικό φορτίο και µετακινούνται µέσα στο ηλεκτρικό πεδίο προς το θετικό πόλο. Ακολουθεί η εμβάπτιση του πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου στο διάλυμα ηλεκτρομεταφοράς, ενώ παράλληλα κόβεται ένα κομμάτι μεμβράνης νιτροκυτταρίνης (Hybond-P, Amersham) και δύο κοµµάτια απορροφητικού χαρτιού Whatman 3 ΜΜ σε µέγεθος λίγο µεγαλύτερο από αυτό του πηκτώµατος, τα οποία επίσης εµβαπτίζονται στο διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς μαζί με δύο σφουγγαράκια προκαθορισμένου και ίδιου μεγέθους, τα οποία συνοδεύουν τη συσκευή ηλεκτρομεταφοράς. Κατά την διαδικασία αυτή γίνεται και η προεργασία της μεμβράνης νιτροκυτταρίνης Hybond P, προκειμένου να είναι επιτυχής η χρήση της. Έτσι, γίνεται ο εμποτισμός της σε διάλυμα μεθανόλης 100 % για 10 s, πλύση και 95

106 Υλικά & Μέθοδοι επώασή της σε ddh 2 0 για 10 min και εξισορρόπησή της στο διάλυμα ηλεκτρομεταφοράς για 10 min. Έπειτα, στην πλευρά της συσκευής (μαύρου χρώματος) όπου θα εφαρµοστεί ο αρνητικός πόλος του τροφοδοτικού, τοποθετούνται κατά σειρά: ένα σφουγγαράκι, ένα απορροφητικό χαρτί Whatmann 3 ΜΜ, το πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου, η νιτροκυτταρίνη, ένα απορροφητικό χαρτί Whatmann 3 ΜΜ, ένα σφουγγαράκι, η αναδιπλούμενη πλευρά της συσκευής (κόκκινου χρώματος) και τέλος, ένα κομμάτι πάγου στο εξωτερικό μέρος της κόκκινης πλευράς της συσκευής, στην οποία θα εφαρµοσθεί ο θετικός πόλος του τροφοδοτικού. Η τοποθέτηση γίνεται προσεκτικά, ώστε να αποφευχθεί ο εγκλωβισµός φυσαλίδων αέρα, που δύναται να εµποδίσουν τη µεταφορά. Η µεταφορά των πρωτεϊνών πραγµατοποιείται µε διαβίβαση ρεύµατος σταθερής έντασης 300 ma για 1 h στους 4 C. Εάν χρησιµοποιούνται έγχρωµοι µάρτυρες µοριακών βαρών, η επιτυχής µεταφορά των πρωτεϊνών µπορεί να ελεγχθεί γρήγορα από την παρουσία των μαρτύρων στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Β. Ανοσοενζυµική ανίχνευση των πρωτεϊνών Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας της ηλεκτρομεταφοράς, ακολουθεί επώαση της µεµβράνης νιτροκυτταρίνης σε διάλυµα PBS ( 3.1.7) με 5% κ.β. λυοφιλιωµένου γάλακτος, υπό ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για 45 min. Με τη διαδικασία αυτή γίνεται δέσµευση των ελεύθερων θέσεων της μεμβράνης νιτροκυτταρίνης από τις πρωτεΐνες του γάλακτος, έτσι ώστε να παρεµποδιστεί η επακόλουθη µη ειδική πρόσδεση των χρησιμοποιούμενων αντισωµάτων στις θέσεις αυτές. Ακολουθεί επώαση υπό ανάδευση της µεµβράνης µε το πρώτο αντίσωµα, το οποίο είναι κατάλληλα αραιωμένο σε διάλυµα PBS με 5 % κ.β. λυοφιλιωµένο γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 2 h ή σε 4 ºC κατά τη διάρκεια της νύκτας. Ώς πρώτο αντίσωμα χρησιμοποιείται το αντι-myc στην περίπτωση έκφρασης της πρωτεΐνης από μετασχηματισμένα με το πλασμίδιο ppiczαα κύτταρα X33, ενώ στην περίπτωση έκφρασης της πρωτεΐνης από μετασχηματισμένα με το πλασμίδιο ppic9 κύτταρα GS115, χρησιμοποιείται ως πρώτο αντίσωμα το αντι-his. Μετά την επώαση µε το πρώτο αντίσωµα, πραγµατοποιούνται τρείς διαδοχικές πλύσεις µε PBS, διάρκειας 10 min έκαστη. Ακολουθεί επώαση της µεµβράνης για 2 h, σε θερµοκρασία δωµατίου και υπό ανάδευση µε το δεύτερο αντίσωμα, το οποίο είναι αντι-mοuse IgG-HRP (συζευγµένο µε υπεροξειδάση της ραπανίδος (HRP)) και είναι αραιωµένο 1:2.000 σε PBS. Στη συνέχεια, πραγµατοποιούνται τρεις διαδοχικές πλύσεις µε PBS, 0,02 % κ.β. Tween 20, διάρκειας 10 min έκαστη. Ακολουθεί επώαση της µεµβράνης νιτροκυτταρίνης σε ρυθµιστικό διάλυµα εµφάνισης µε υπόστρωµα DΑΒ ( ). Η DΑΒ δρα ως υπόστρωµα για το 96

107 Υλικά & Μέθοδοι ένζυµο της υπεροξειδάσης, και παρουσία Η 2 Ο 2, οξειδώνεται προς σκούρο καφέ ίζηµα. Η αντίδραση πραγµατοποιείται παρουσία ιόντων Ni 2+ (NiCl 2 ), που αυξάνουν την ευαισθησία της, µε αποτέλεσµα την παραγωγή εντονότερου χρώµατος. Οι ζώνες των πρωτεϊνών εµφανίζονται ~40 s µετά την εµβάπτιση της νιτροκυτταρίνης στο ρυθµιστικό διάλυµα εµφάνισης. Η αντίδραση διακόπτεται µε εµβάπτιση της µεµβράνης σε ddh 2 Ο, οπότε αποφεύγεται περαιτέρω µη ειδική χρώση της µεµβράνης. Ακολουθεί αποθήκευση της μεμβράνης σε ηλεκτρονική μορφή μέσω ηλεκτρονικού σαρωτή (scanner) και στέγνωµά της µε εναπόθεση σε χαρτί Whatmann 3 ΜΜ. Σε µια παραλλαγή της µεθόδου, η ανοσοαποτύπωση µπορεί να πραγµατοποιηθεί σε δείγµα πρωτεϊνών προσροφημένων σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες (dot blot). Στην περίπτωση αυτή, η προσρόφηση πραγµατοποιείται σε ειδική συσκευή, υπό κενό και η ανίχνευση των πρωτεϊνών γίνεται όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β. Η μέθοδος αυτή είναι πολύ χρήσιμη κατά την επιλογή ισχυρών μετασχηματισμένων κλώνων κατά την έκφραση σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας ( A) Ποσοτική ανάλυση καθαρισμένων πρωτεϊνών Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της καθαρισμένης πρωτεΐνης μέσα στο διάλυμά της χρησιμοποιούνται φασματοσκοπικές ή χρωματομετρικές μέθοδοι Φασµατοσκοπικές µέθοδοι για την ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών Η συγκέντρωση µιας πρωτεΐνης σε ένα διάλυµα προσδιορίζεται βάσει ενός εµπειρικού τύπου που στηρίζεται στην μέτρηση της απορρόφησης του πρωτεϊνικού διαλύµατος στην περιοχή του υπεριώδους του ηλεκτροµαγνητικού φάσµατος (280 nm), όπου απορροφούν τα αρωµατικά αµινοξικά κατάλοιπα των πρωτεϊνών. Η µέθοδος αυτή είναι σύντομη, µη καταστρεπτική για την πρωτεΐνη και απαιτεί µικρή ποσότητα δείγµατος. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: Μετράται σε φασματοφωτόμετρο και με τη χρήση κυψελίδας χαλαζία οπτικής διαδρομής 1 cm, η απορρόφηση του πρωτεϊνικού δείγµατος στα 280 nm (Α 280 ) έπειτα από το μηδενισμό της Α 280 με τη χρήση του ίδιου διαλύματος, απουσία όμως πρωτεΐνης. Στη συνέχεια, η συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο δείγμα υπολογίζεται με τον τύπο: A 280 (1 mg / ml) = (5500 n Trp n Tyr n Cys ) M -1 (Pace et al 1995), 97

108 Υλικά & Μέθοδοι όπου n Trp, n Tyr και n Cys, ο αριθμός των αμινοξικών καταλοίπων τρυπτοφάνης, τυροσίνης και κυστεΐνης, αντίστοιχα, μέσα στην δεδομένη πρωτεΐνη, και Μ η μοριακή συγκέντρωση του πρωτεϊνικού δείγματος Χρωµατοµετρική µέθοδος Bradford για την ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα της όξινης χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 να προσδένεται κυρίως σε βασικά και αρωματικά αμινοξικά κατάλοιπα και ειδικότερα σε κατάλοιπα αργινίνης (Arg), παράγοντας έγχρωµο προϊόν, έντασης ανάλογης της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης (Bradford 1976). Η τιμή της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης προκύπτει από την τιμή απορρόφησης του συμπλόκου πρωτεΐνηχρωστική στα 595 nm και τη σύγκριση της μετρούμενης αυτής τιμής με πρότυπη καμπύλη που έχει προκύψει από τιμές απορρόφησης στα 595 nm συμπλόκου χρωστικής με γνωστές συγκεντρώσεις αλβουμίνης ορού βοός (BSA). H πειραματική πορεία αυτής της μεθόδου είναι η ακόλουθη: Αρχικά κατασκευάζεται πρότυπη καµπύλη βαθµονόµησης με χρήση διάφορων συγκεντρώσεων BSA. Η κατασκευή της καμπύλης είναι γρήγορη και εύκολη και η γραµµική της περιοχή είναι µεταξύ 0,2 με και 0,9 mg/ml. Για την καµπύλη βαθµονόµησης παρασκευάζονται 100 μl διαλυµάτων 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 και 1 mg/ml BSA σε ddh 2 0. Στη συνέχεια, 20 μl των παραπάνω δειγμάτων προστίθενται σε 1 ml διαλύµατος Biorad protein assay, αραιωμένου 1:4 με ddh 2 O, και µετράται η απορρόφηση των διαλυµάτων αυτών στα 595 nm µετά από 5 min. Ακολουθεί η κατασκευή πρότυπης καμπύλης που συσχετίζει τις μετρούμενες τιμές Α 595 με τις γνωστές συγκεντρώσεις των δειγμάτων BSA. Τέλος, 20 μl του κατάλληλα αραιωμένου και προς μέτρηση δείγματος προστίθενται σε 1 ml αραιωμένου διαλύµατος Biorad protein assay και από την τιμή απορρόφησης στα 595 nm υπολογίζεται και η συγκέντρωση (mg/ml) του πρωτεϊνικού δείγματος με τη χρήση της πρότυπης καµπύλης αναφοράς Σήμανση α-μπουγκαροτοξίνης με χλωραμίνης Τ 125 Ι με τη μέθοδο της Η ιωδίωση του ανταγωνιστή του nachr, α-μπουγκαροτοξίνη (α-bgtx), πραγματοποιείται παρουσία χλωραμίνης Τ ως οξειδωτικού για την οξείδωση του Na 125 I 98

109 Υλικά & Μέθοδοι σε 125 Ι 2, το οποίο στη συνέχεια μπορεί και συνδέεται με αμινοξικά κατάλοιπα τυροσίνης (Tyr). Η πορεία αυτής της διαδικασίας έχει ως εξής: Α. Αντίδραση σήμανσης Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν είναι: 100 mci/ml Νa 125 I σε NaOH ph 7-11 (Amersham IMS 30, 100 mci/ml) 1 mg/ml α-bgtx σε 0.3 Μ PB. 2 mg/ml χλωραμίνη-τ σε διάλυμα ΡΒ 2 mg/ml μεταθειϊκό νάτριο σε απεσταγμένο νερό Κορεσμένο υδατικό διάλυμα ΚΙ 3 mg/ml αλβουμίνης ορού βοδιού (BSA) σε PBS Σε 10 μl διαλύματος α-bgtx προστίθενται διαδοχικά 5 μl διαλύματος Na 125 I και 5 μl διαλύματος χλωραμίνης-τ, στους 4 ºC. Μετά από επώαση διάρκειας 2 min γίνεται διακοπή της αντίδρασης με προσθήκη 5 μl διαλύματος μεταθειϊκού νατρίου. Για τη σταθεροποίηση του ελεύθερου 125 I 2 προστίθενται 10 μl διαλύματος ΚΙ και τέλος προστίθενται 100 μl διαλύματος BSA για εμπλουτισμό σε πρωτεΐνη. B. Απομόνωση σημασμένης τοξίνης Ο διαχωρισμός της ιωδιωμένης πρωτεΐνης από το ελεύθερο 125 Ι 2 γίνεται με στήλη μοριακής διήθησης Sephadex G-25. Το διάλυμα της αντίδρασης σήμανσης (135 μl) τοποθετείται στο επάνω μέρος της στήλης και στη στήλη διοχετεύεται διάλυμα 1 mg/ml BSA σε PBS. Συλλέγονται κλάσματα όγκου 0,5 ml. Από τη στήλη εκλούεται πρώτα η ιωδιωμένη πρωτεΐνη (δι- και μονο-ιωδιωμένη τοξίνη) και αργότερα το μικρού μοριακού βάρους ελεύθερο 125 Ι. Η μέτρηση της ραδιενέργειας γίνεται σε μετρητή γ ακτινοβολίας και εκφράζεται σε cpm/μl. Τα κλάσματα έκλουσης που περιέχουν την ιωδιωμένη τοξίνη ενώνονται, και το παρασκεύασμα φυλάσσεται ανά 100 μl στους -20 ºC για 8-12 εβδομάδες, καθώς ο χρόνος ημιζωής του 125 Ι είναι 60 ημέρες. Γ. Υπολογισμός συγκέντρωσης, ενεργότητας και ειδικής ενεργότητας της ιωδιωμένης τοξίνης Προκειμένου να εξαγχθεί η συκέντρωση της απομονωμένης μονο-ιωδιωμένης τοξίνης, η οποία είναι αυτή που χρησιμοποιείται αργότερα σε πειράματα πρόσδεσης σε μόρια α7-εκπ, λόγω της μεγαλύτερης συγγένειας για nachr σε σχέση με την διιωδιωμένη, χρησιμοποιείται γνωστής συγκέντρωσης μεμβρανικός υποδοχέας Torpedo nachr (pmoles/μl). Η πορεία αυτής της διαδικασίας είναι η εξής: Γίνονται διαδοχικές αραιώσεις του αρχικού παρασκευάσματος μεμβρανικού υποδοχέα Torpedo nachr με τη χρήση 20 mm Tris, 0,05 % Triton X-100, ph 7,5. Στη 99

110 Υλικά & Μέθοδοι συνέχεια, 30 μl από έκαστο αραιωμένο δείγμα nachr επωάζονται με ποσότητα μονοιωδιωμένης τοξίνης (άγνωστης συγκέντρωσης) που αντιστοιχεί σε cpm, αραιωμένης σε τελικό όγκο 20 μl με το ίδιο διαλύτη που χρησιμοποιήθηκε για τις αραιώσεις του nachr, ώστε ο τελικός όγκος της αντίδρασης να είναι 50 μl. Ακολουθεί επώαση των δειγμάτων μέσα σε πλαστκούς σωλήνες μίας χρήσης του 1,5 ml για 3 h, 4 ºC. Ώς αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιείται ποσότητα 30 μl σκέτου Tris-Triton η οποία επωάζεται με 20 μl αραιωμένης μονο-ιωδιωμένης τοξίνης που αντιστοιχεί σε cpm. Μετά το πέρας της επώασης γίνεται προσθήκη 1 ml διαλύματος πλύσης της ραδιενέργειας ( ) σε έκαστο δείγμα και ακολουθεί η τοποθέτηση των δειγμάτων επάνω σε ανιοντοανταλλακτικά DEAE φίλτρα κυττταρίνης, εφαρμοσμένα στο ειδικό στόμιο συσκευής παγίδας κενού. Τα φίλτρα αυτά (DE 81) έχουν την ικανότητα να συγκρατούν το σύμπλοκο της 125 Ι-α-bgtx με τον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης ( 125 Ι-α-bgtx/nAChR), αλλά όχι την ελεύθερη 125 Ι-α-bgtx. Μετά τη διέλευση του δείγματος, τα φίλτρα πλένονται δύο φορές με 1 ml διαλύματος πλύσης της ραδιενέργειας και έπειτα γίνεται μέτρηση της ραδιενέργειας, που αυτά έχουν συγκρατήσει, σε μετρητή γ-ακτινοβολίας. Από τις τιμές cpm που μετρώνται, αφαιρείται η τιμή cpm του αρνητικού μάρτυρα, οπότε προκύπτουν τα καθαρά cpm (Δcpm) που αντιστοιχούν στη ραδιενέργεια που έχει προσδεθεί στα μόρια Torpedo nachr. Ακολουθεί κατασκευή καμπύλης που συνδέει τα μετρούμενα Δcpm με την ποσότητα (fmoles) του χρησιμοποιούμενου υποδοχέα Torpedo και ευρίσκεται εκείνη η ποσότητα nachr που αντιστοιχεί στο πλατώ δέσμευσης της τοξίνης. Έτσι, με την παραδοχή ότι ένα μόριο υποδοχέα δεσμεύει ένα μόριο τοξίνης, υπολογίζεται η συγκέντρωση της χρησιμοποιούμενης μονο-ιωδιωμένης τοξίνης (fmoles/μl). H ενεργότητά της (cpm/fmole) υπολογίζεται από το κλάσμα των χρησιμοποιούμενων cpm προς την ποσότητα (fmoles) της τοξίνης στην οποία παρατηρήθηκε το πλατώ δέσμευσης της ραδιενέργειας. Τέλος, η ειδική ενεργότητα της μονο-ιωδιωμένης τοξίνης (cpm/fmole) προκύπτει από το κλάσμα των Δcpm που αντιστοιχούν στη μετρούμενη προσδεδεμένη ραδιενέργεια στο πλατώ της αντίδρασης (< cpm) προς την ποσότητα (fmoles) της τοξίνης στην οποία παρατηρήθηκε το πλατώ δέσμευσης της ραδιενέργειας. 100

111 Υλικά & Μέθοδοι Πρόσδεση διάλυμα 125 Ι-α-bgtx στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη σε Η σημασμένη 125 Ι-α-bgtx προσδένεται ειδικά στην θέση πρόσδεσης της α7-εκπ και το σύμπλοκο 125 Ι-α-bgtx/α7-ΕΚΠ διαχωρίζεται από την ελεύθερη τοξίνη με διήθηση υπό κενό και με τη χρήση ανιονανταλλακτικών φίλτρων DE81. Η ποσότητα της 125 Ι-αbgtx που έχει προσδεθεί ειδικά στην πρωτεΐνη προσδιορίζεται με μέτρηση της ραδιενέργειας σε μετρητή γ-ακτινοβολίας. Α. Πειράματα απ ευθείας πρόσδεσης (Filter assay) και εξαγωγής της σταθεράς διάσπασης (K d ) συμπλόκων α7-εκπ / 125 I-α-bgtx Ποσότητα 125 Ι-α-bgtx που αντιστοιχεί σε cpm (~5 nm) επωάζεται με την πρωτεΐνη σε τελικό όγκο 50 μl ρυθμιστικoύ διαλύματος 10 mm PB, 0.2% BSA, ph 7,5 για 3h, 4ºC. Ακολουθεί προσρόφηση του συμπλόκου α7-εκπ / 125 Ι-α-bgtx σε φίλτρα DE81, υπό κενό, τα οποία έχουν διαβραχεί με 1 ml διαλύματος πλύσης της ραδιενέργειας ( ). Ακολουθούν 3 εκπλύσεις των προσδεδεμένων στα φίλτρα συμπλόκων, με 1 ml διαλύματος πλύσης της ραδιενέργειας κάθε φορά, και τελικά η προσδεδεμένη τοξίνη στην πρωτεΐνη, προσδιορίζεται με μέτρηση της ραδιενέργειας που έχει προσροφηθεί στα φίλτρα χρησιμοποιώντας μετρητή γ-ακτινοβολίας. Για τον προσδιορισμό της ραδιενέργειας υποβάθρου, πραγματοποιείται παράλληλα μια αντίδραση, στην οποία δεν έχει προστεθεί πρωτεΐνη (αντίδραση-μάρτυρας). Από τις τιμές cpm που μετρώνται για τα δείγματα με πρωτεΐνη, αφαιρείται η τιμή cpm του αρνητικού μάρτυρα, οπότε προκύπτουν τα καθαρά cpm (Δcpm) που αντιστοιχούν στη ραδιενέργεια που έχει προσδεθεί στα μόρια. Προκειμένου να προσδιορισθεί η σταθερά διάσπασης (K d ) του συμπλόκου α7- ΕΚΠ/ 125 Ι-α-bgtx, έγινε επώαση 20 ng (~11 nm) καθαρισμένων με μοριακή διήθηση α7- ΕΚΠ μορίων με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ( nm) 125 Ι-α-bgtx (ειδική ενεργότητα 200 cpm/fmol) σε τελικό όγκο 50 μl ρυθμιστικoύ διαλύματος 10 mm PB, 0.2% BSA, ph 7,5 για 3h, 4ºC. Η μέτρηση της προσδεδεμένης ραδιενέργειας (Δcpm) σε κάθε αντίδραση έγινε όπως περιγράφηκε παραπάνω και η σταθερά διάστασης προέκυψε από ανάλυση κατά Scatchard. Β. Πειράματα ανταγωνισμού (competition experiments) Στα πειράματα ανταγωνισμού έγινε συνεπώαση διαφορετικών ποσοτήτων μη σημασμένου χολινεργικού προσδέτη (ανταγωνιστές: α-bgtx, d-τουμποκουραρίνη και αγωνιστές: νικοτίνη, ακετυλοχολίνη (ACh), καρβαμυλοχολίνη (CCh)) με 125 I-α-bgtx 101

112 Υλικά & Μέθοδοι ( cpm) και 20 ng α7-εκπ μορίων σε τελικό όγκο 50 μl ρυθμιστικoύ διαλύματος 10 mm PB, 0.2% BSA, ph 7,5 για 3h, 4ºC. Η μέτρηση της προσδεδεμένης ραδιενέργειας (Δcpm) έγινε όπως περιγράφηκε στην παράγραφο A., και εκφράσθηκε ως το επί τοις % ποσοστό των Δcpm που μετρώνται κατά την επώαση ίδιας ποσότητας α7-εκπ μορίων με 125 I-α-bgtx ( cpm) απουσία μη σημασμένου προσδέτη και τα οποία ορίζονται ως τιμή 100 %. Οι σταθερές παρεμπόδισης (inhibition constant, K i ) δέσμευσης της 125 I-α-bgtx στα μόρια α7-εκπ από τον κάθε φορά χρησιμοποιούμενο μη σημασμένο προσδέτη υπολογίσθηκαν από την εξίσωση: K i = IC 50 /(1+[ 125 I-α-bgtx]/K d ) (Cheng and Prusoff 1973), όπου: IC 50 (inhibition concentration) είναι η συγκέντρωση του μη σημασμένου προσδέτη που προκαλεί το 50 % της παρεμπόδισης δέσμευσης της 125 I-α-bgtx, ευρισκόμενη από καμπύλες αναστολής, [ 125 I-α-bgtx] είναι η συγκέντρωση της 125 I-α-bgtx που χρησιμοποιήθηκε και K d είναι η σταθερά διάσπασης του συμπλόκου α7-εκπ / 125 Ι-α-bgtx, όπως υπολογίζεται με ανάλυση κατα Scatchard In vitro απογλυκοζυλίωση ανασυνδυασμένων α7-εκπ πρωτεϊνών Τα ανασυνδυασμένα μόρια α7-εκπ διαθέτουν τρία σημεία Ν-γλυκοζυλίωσης, τα οποία είναι τρία αμινοξικά κατάλοιπα ασπαραγίνης (Asn) που βρίσκονται στις θέσεις 24, 68 και 111 του ώριμου μορίου α7-εκπ και ανήκουν στο πρότυπο Ν- γλυκοζυλίωσης, αφού συμμετέχουν στο σχηματισμό της χαρακτηριστικής αλληλουχίας Asn-X-Ser (X είναι οποιοδήποτε αμινοξικό κατάλοιπο). Προκειμένου να παραχθούν α7-εκπ μόρια υψηλού βαθμού ομοιογένειας, έγινε απογλυκοζυλίωση των παραγόμενων αυτών από P. pastoris ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών με τη χρήση της ενδογλυκοσιδάσης PNGase F (New EngIand Biolabs). Αυτό, διότι κατά την έκφραση των α7-εκπ μορίων δύναται να λαμβάνει χώρα διαφορετικού βαθμού γλυκοζυλίωση, η οποία οδηγεί σε ετερογένεια των εκφραζόμενων μορίων, μη επιθυμητή για χρήση των μορίων για δομικές μελέτες. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για την απογλυκοζυλίωση των α7-εκπ μορίων ήταν η εξής: Γίνεται προσθήκη κατάλληλης ποσότητας PNGase F ( units/ml) σε γλυκοζυλιωµένα μόρια α7-εκπ, συνήθως μετά το πρώτο στάδιο καθαρισμού με στήλη Ni-NTA-αγαρόζης, σε τελικό όγκο αντίδρασης 500 μl ρυθµιστικoύ διαλύµατος 50 mm PB, pη 7,5 και ακολουθεί επώαση κατά τη διάρκεια της νύκτας στους 4 C και 102

113 Υλικά & Μέθοδοι υπό ανάδευση. Η ποσότητα του χρησιμοποιούμενου κάθε φορά ενζύμου καθορίζεται από την ποσότητα της προς απογλυκοζυλίωση α7-εκπ πρωτεΐνης, αφού μία μονάδα ενζύμου (1 unit) απογλυκοζυλιώνει ~10 μg RNάσης Β. Ο έλεγχος της επιτυχούς απογλυκοζυλίωσης γίνεται µε SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων και ανίχνευση µε ανοσοαποτύπωση (Western blotting) ( , ) Μελέτες προσδιορισμού δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Προκειμένου να προσδιορισθεί η σύσταση της δευτεροταγούς δομής και να διερευνηθεί η ύπαρξη τριτοταγούς δομής των εκφραζόμενων α7-εκπ μορίων, πραγματοποιήθηκαν πειράματα κυκλικού διχρωϊσμού (circular dichroism). Τα πειράματα αυτά έλαβαν χώρα στο Εργαστήριο κυκλικού διχρωϊσμού στο ΕΚΕΦΕ ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ, με τη χρήση φασματοπολωσίμετρου Jasco J-715 (Japan Spectroscopic co., Jasco). Η σύσταση δευτεροταγούς δομής προκύπτει από λήψη φασμάτων κυκλικού διχρωϊσμού στην περιοχή nm του υπεριώδους φωτός (far-uv region), ενώ το «αποτύπωμα» της τριτοταγούς δομής (tertiary structure fingerprint) προκύπτει από λήψη φασμάτων στην περιοχή nm του υπεριώδους φωτός. Η πειραματική διαδικασία που ακολουθήθηκε για τα πειράματα κυκλικού διχρωϊσμού ήταν η ακόλουθη: Χρησιμοποιήθηκαν καθαρισμένα, με χρωματογραφία μοριακής διήθησης, ανασυνδυασμένα εξωκυτταρικά τμήματα της ανθρώπινης α7 νευρικής υπομονάδας nachr, καθώς και των υπομονάδων α1, β1, γ και ε του ανθρώπινου μυϊκού nachr. Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών αυτών ήταν 0,25 mg/ml σε ρυθμιστικό διάλυμα 10 mm PB, 50 mm φθοριούχο νάτριο (NaF), ph 7,5. Τα φάσματα κυκλικού διχρωϊσμού ελήφθησαν σε 20 ºC και το φασματοπολωσίμετρο ρυθμίστηκε ώστε η ταχύτητα σάρωσης να είναι 50 nm/min, ο χρόνος απόκρισης 2 s και το εύρος σάρωσης nm ή nm για τις μελέτες στην far- και near-uv περιοχή, αντίστοιχα. Το μήκος της οπτικής διαδρομής της κυψελίδας χαλαζία (qartz cell), μέσα στην οποία τοποθετήθηκαν τα πρωτεϊνικά δείγματα, ήταν 1 mm ή 10 mm για μετρήσεις στην farκαι near-uv περιοχή, αντίστοιχα. Το τελικό φάσμα προκύπτει από το μέσο όρο 10 διαδοχικών σαρώσεων και έπειτα από διόρθωση σκέδασης του φωτός με αφαίρεση της συνεισφοράς του φάσματος του διαλύματος. 103

114 Υλικά & Μέθοδοι Η μετρούμενη οπτική ενεργότητα σε μονάδες ελλειπτικότητας {θ} λ εκφράσθηκε σε μονάδες μέσης ελλειπτικότητας καταλοίπων {θ} MRW,λ (degrees cm 2 decimol -1 ), με βάση το μέσο βάρος των αμινοξικών καταλοίπων (MRW) των AChR-ΕΚΠ μορίων, χρησιμοποιώντας τη σχέση: {θ} MRW,λ = (MRW θ λ )/(10 d c), όπου MRW είναι το μέσο βάρος καταλοίπων, d είναι το μήκος της οπτικής διαδρομής της κυψελίδας σε cm και c είναι περιεκτικότητα πρωτεΐνης σε g/ml. Το MRW υπολογίζεται από την εξίσωση: MRW = M / (N-1), όπου Μ είναι το μοριακό βάρος του πρωτομερούς του πρωτεϊνικού μορίου (Da) και Ν ο αριθμός των αμινιξικών του καταλοίπων. Tα far-uv φάσματα κυκλικού διχρωϊσμού των AChR-EΚΠ μορίων συγκρίθηκαν με φάσματα κυκλικού διχρωϊσμού 43 πρωτεϊνών γνωστής δομής που περιέχονται στο CDPro πρόγραμμα (Sreerama and Woody 2000) και η σύσταση δευτεροταγούς δομής των ανασυνδυασμένων ανθρώπινων nachr-εκπ μορίων υπολογίσθηκε με τη χρήση των αλγορίθμων CDSSTR, CONTIN και SELCON3 που περιλαμβάνονται σε αυτό το πρόγραμμα. Επίσης, προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση διάφορων χολινεργικών προσδετών στη δευτεροταγή και τριτοταγή δομή της α7-εκπ, έγινε επώαση 7 μm (~0,25 mg/ml) της α7-εκπ (αγρίου τύπου και μεταλλαγμένης) με κατάλληλες συγκεντρώσεις προσδέτη (10 μm α-bgtx ή 10 nm, 10 μm και 1 mm ACh, CCh ή νικοτίνης) για 30 min, 20 ºC. Ακολούθησε η μέτρηση του far- και near-uv φάσματος των συμπλόκων α7-εκπ/προσδέτης και το τελικό φάσμα της α7-εκπ μετά την επίδραση του καθενός προσδέτη προέκυψε από την αφαίρεση του φάσματος του ελεύθερου προσδέτη στην ίδια συγκέντρωση που αυτός χρησιμοποιήθηκε στις επωάσεις με την α7-εκπ, από το φάσμα του συμπλόκου. Επίσης, ως αρνητικός μάρτυρας σε αυτά τα πειράματα πρόσδεσης χολινεργικών προσδετών χρησιμοποιήθηκε ισομοριακή ποσότητα BSA πρωτεΐνης προς την χρησιμοποιούμενη α7-εκπ Μέθοδοι υπολογισμού του μεγέθους των μορίων των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Προκειμένου να εξαγχθεί το μέγεθος των εκφραζόμενων α7-εκπ μορίων έγιναν μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας και δυναμικής σκέδασης φωτός. 104

115 Υλικά & Μέθοδοι Ηλεκτρονική μικροσκοπία (Electron Microscopy) Έγινε επίστρωση ενός κολλοειδούς υμενίου που έφερε πλέγματα χαλκού (400 mesh, TAAB Laboratories Equipment Ltd.) με μία λεπτή στοιβάδα άνθρακα και ακολούθησε πυράκτωσή του για 2 min. Ακολούθησε η προσθήκη δείγματος καθαρισμένης, με χρωματογραφία μοριακής διήθησης, α7-εκπ πρωτεΐνης (~0,3 mg/ml) στο πλέγμα άνθρακα και η εμβάπτισή του σε διάλυμα οξικού ουρανίου 2 % κ.β., το οποίο χρησιμεύει για αρνητική χρώση. Οι εικόνες των μορίων α7-εκπ ελήφθησαν σε μεγέθυνση Χ, χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διερχόμενης δέσμης (TEM) με τάση λειτουργίας 80 kv (μοντέλο Philips 208). Οι μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας πραγματοποιήθηκαν από τον Dr Nigel Unwin (MRC, Cambridge) Δυναμική σκέδαση του φωτός (Dynamic Light Scattering) Τα πειράματα δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση συσκευής NanoS ZEN 1600 (Malvern Instruments Co.), η οποία παράγει μονοχρωματικό φώς (laser He-Ne) ακτινοβολίας στα 633 nm και έχει ανιχνευτή οπισθοσκέδασης του φωτός (backscattering) σε γωνία 173º σε σχέση με την αρχική κατεύθυνση της μονοχρωματικής ακτινοβολίας. H συσκευή αυτή έχει την ικανότητα μέτρησης διαμέτρου σωματιδίων από 0,6 nm μέχρι 6 μm. Με την τεχνική DLS, υπολογίζεται η υδροδυναμική διάμετρος σωματιδίων μέσα σε ένα δείγμα. Το μέγεθος των σωματιδίων προκύπτει από την μέτρηση σε χρονικά διαστήματα της τάξης των μs της διακύμανσης της έντασης του σκεδαζόμενου φωτός που προκύπτει κατά τη διέλευση του λέιζερ από το δείγμα που περιέχει τα προς μέτρηση σωματίδια και από τη συσχέτισή της με τη μονάδα του χρόνου. Η διακύμανση της έντασης του σκεδαζόμενου φωτός στη μονάδα του χρόνου κατά τη διέλευση του λέιζερ από το δείγμα οφείλεται στη κίνηση Brown των σωματιδίων μέσα στο διάλυμα. Έτσι, εφ όσον η ταχύτητα της κίνησης Brown των σωματιδίων μέσα σε ένα διάλυμα είναι αντιστρόφως ανάλογη του μεγέθους τους, υπάρχει μία άμεση σχέση μεταξύ της διακύμανσης της έντασης του σκεδαζόμενου φωτός στη μονάδα του χρόνου με το μέγεθος των σωματιδίων, η οποία είναι γνωστή ως εξίσωση Stokes-Einstein και είναι η εξής: R H = k T / 6 π D. Σε αυτή την εξίσωση, R H είναι η υδροδυναμική ακτίνα των σωματιδίων, k η σταθερά Boltzmann, T η θερμοκρασία μέτρησης, n το ιξώδες του διαλύτη και D ο συντελεστής διάχυσης των σωματιδίων μέσα στο διάλυμά τους, ο οποίος υπολογίζεται από τη 105

116 Υλικά & Μέθοδοι συκευή NanoS. Η συκευή αυτή συνοδεύεται από κατάλληλο λογισμικό (DTS v.4.1), το οποίο χρησιμοποιεί διάφορους αλγόριθμους για την εξαγωγή διαγραμμάτων κατανομής του μεγέθους των σωματιδίων μέσα στο διάλυμα με βάση την ένταση του σκεδαζόμενου φωτός (intensity distribution) ή την κατ όγκον περιεκτικότητά τους μέσα στο δείγμα (volume distribution) ή τoν αριθμό τους μέσα στο δείγμα (number distribution). Η πορεία που ακολουθήθηκε για τον υπολογισμό της υδροδυναμικής διαμέτρου των α7-εκπ μορίων ήταν η ακόλουθη: Αρχικά γίνεται καθαρισμός της κυβέττας χαλαζία μέσα στην οποία τοποθετούνται τα προς μέτρηση δείγματα στη συσκευή NanoS με φιλτραρισμένο, από φίλτρο 0,22 μm, ddh 2 0, έτσι ώστε να απομακρυνθεί κάθε ίχνος σκόνης που μπορεί να δημιουργήσει θόρυβο κατά τις μετρήσεις. Στη συνέχεια, το επίσης φιλτραρισμένο από φίλτρο 0,22 μm, πρωτεϊνικό δείγμα α7-εκπ μορίων, τοποθετείται μέσα στη κυβέττα και αυτή ακολούθως τοποθετείται μέσα στην ειδική υποδοχή της συσκευής. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε 25 C και με αυτόματα καθορισμένη χρονική διάρκεια. 106

117 ΙV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 107

118 Αποτελέσματα 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1. Τρισδιάστατο μοντέλο της ανθρώπινης α7-εκπ υπομονάδας του nachr και στρατηγική ορθολογικού σχεδιασμού μεταλλαξιγενέσεων Η έκφραση της ανασυνδυασμένης εξωκυτταρικής περιοχής της α7 υπομονάδας του ανθρώπινου nachr (α7-εκπ) στο ετερόλογο σύστημα έκφρασης Pichia pastoris είχε οδηγήσει στο παρελθόν σε υδρόφοβα μόρια, τα οποία ήταν ακατάλληλα για πειράματα κρυσταλλώσεων (Avramopoulou et al 2004). Η κατασκευή και έκφραση ενός διπλού μεταλλάγματος (dm) της α7-εκπ οδήγησε στην αύξηση της υδροφιλικότητας των παραγόμενων α7-εκπ-dm μορίων, αλλά όχι στον επιθυμητό βαθμό για αναλυτικές δομικές μελέτες. Αυτό το διπλό μετάλλαγμα περιείχε τη σημειακή κατευθυνόμενη μετάλλαξη Cys116Ser και την αντικατάσταση της χαρακτηριστικής Cys θηλιάς της α7- ΕΚΠ από την αντίστοιχη και περισσότερο υδρόφιλη θηλιά της ομόλογης πρωτεΐνης δέσμευσης της ACh από Lymnaea stagnalis (L-AChBP). Προκειμένου να βελτιωθεί η υδροφιλικότητα των εκφραζόμενων α7-εκπ μορίων και να ενισχυθεί η έκφρασή τους υπό πενταμερή μορφή, προχωρήσαμε σε μία στρατηγική ορθολογικού σχεδιασμού μεταλλαξιγενέσεων στο cdna της ανθρώπινης α7-εκπ. Οι μεταλλάξεις αυτές προέκυψαν από τη μελέτη του τρισδιάστατου μοντέλου της ανθρώπινης α7-εκπ, το οποίο προέκυψε χρησιμοποιώντας ως εκμαγεία την τριτοταγή δομή της εξωκυτταρικής περιοχής της μυϊκής τύπου α υπομονάδας του Torpedo nachr (Unwin 2005) και την τεταρτοταγή δομή της πρωτεΐνης L-AChBP (Brejc et al 2001), και έπειτα από την στοίχιση των αμινοξικών τους αλληλουχιών ( , Εικόνα 23). Το μοντέλο της α7-εκπ αποκάλυψε τη θέση των αμινοξικών καταλοίπων του κάθε πρωτομερούς α7-εκπ στο χώρο (Εικόνα 24). Έτσι, προσδιορίστηκαν τα αμινοξικά κατάλοιπα του κάθε πρωτομερούς α7-εκπ, τα οποία βρίσκονται εκτεθειμένα στο εξωτερικό περιβάλλον, καθώς και αυτά που βρίσκονται στη διεπιφάνεια μεταξύ δύο γειτονικών μορίων α7-εκπ του πενταμερούς μορίου. Η τριτοταγής δομή του μοντέλου του πρωτομερούς α7-εκπ μορίου είναι παρόμοια με αυτή των ομόλογων α-εκπ του Torpedo nachr (Unwin 2005) και της L- AChBP (Brejc et al 2001) και χαρακτηρίζεται από έναν υδρόφοβο πυρήνα αποτελούμενο από δέκα πτυχώσεις, από μία αμινο-τελική α-έλικα και από χαρακτηριστικές θηλιές μεταξύ των πτυχώσεων (Εικόνα 24 Β). 108

119 Αποτελέσματα Εικόνα 23. Αμινοξική στοίχιση της ΕΚΠ της ανθρώπινης α7 υπομονάδας του nachr (hα7wt) με την L-AChBP και τα ΕΚΠ τμήματα των μυϊκών α υπομονάδων του nachr επίμυος (mα1) και Torpedo sp. (Tα1). H αμινοξική ταυτότητα (sequence identity) της ανθρώπινης α7-εκπ με τα μόρια α1-εκπ και L-AChBP είναι ~39% και 25.5%, αντίστοιχα, με ομοιότητες (sequence similarity) ~76% και 70%. Τα δύο συντηρημένα κατάλοιπα Cys, τα οποία σχηματίζουν τη χαρακτηριστική Cys θηλιά της υπερ-οικογένειας απεικονίζονται πλαισιωμένα. Στην εικόνα αυτή περιλαμβάνεται και η στοίχιση με την αμινοξική ακολουθία ενός μεταλλάγματος (hα7mut-10) της παρούσης διατριβής, στην οποία απεικονίζονται με έντονα γράμματα τα μεταλλαγμένα αμινοξικά κατάλοιπα. Οι απεικονιζόμενες αμινοξικές αλληλουχίες αφορούν τα ώριμα πολυπεπτιδικά τμήματα των αντίστοιχων πρωτεϊνών μετά την αποκοπή του πεπτιδίου-οδηγού τους από το κύτταρο. Η μελέτη του προκύπτοντος μοντέλου της α7-εκπ (Εικόνα 24) υπέδειξε μερικά υδρόφοβα αμινοξικά κατάλοιπα, τα οποία ήταν πολύ πιθανό να συμμετέχουν στο σχηματισμό διαμοριακών υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, μέσω των εκτειθέμενων, στο εξωτερικό περιβάλλον του πενταμερούς μορίου, πλευρικών τους αλυσίδων. Η ιδιαίτερη θέση των αμινοξικών αυτών υδρόφοβων καταλοίπων στο μοντέλο της α7- ΕΚΠ θα μπορούσε εν μέρη να δικαιολογήσει το σχηματισμό συσσωματωμάτων μεγάλου μοριακού βάρους (~2000 kda) και ολιγομερών με μοριακό βάρος μεγαλύτερο από αυτό που αντιστοιχεί στην επιθυμητή πενταμερή μορφή, κατά την έκφραση της ανασυνδυασμένης αγρίου τύπου α7-εκπ (α7-wt) στο ζυμομύκητα P. pastoris (Avramopoulou et al 2004). 109

120 Αποτελέσματα Α. Β. Εικόνα 24. Mοντέλο κορδέλας της ανθρώπινης υπομονάδας του νευρικού α7 nachr. (Α) Άνω όψη του μοντέλου του πενταμερούς α7-εκπ μορίου. Το καθένα από τα πέντε πρωτομερή αναπαρίσταται με διαφορετικό χρώμα. Οι κόκκινες σφαίρες συμβολίζουν κάποια από τα αμινοξικά κατάλοιπα που μεταλλάγχθησαν στην παρούσα διατριβή και τα οποία βρίσκονται είτε εκτεθειμένα προς το εξωτερικό περιβάλλον του μορίου, είτε στη διεπιφάνεια μεταξύ δύο γειτονικών πρωτομερών α7-εκπ. Οι μπλέ σφαίρες συμβολίζουν τρία κατάλοιπα Asn (θέσεις 24, 68 και 111), στα οποία πραγματοποιείται N-γλυκοζυλίωση. (Β) Πλάγια όψη του μοντέλου του διμερούς α7-εκπ. Το καθένα από τα δύο πρωτομερή αναπαρίσταται με διαφορετικό χρώμα. Στο δεξιά αναπαριστάμενο πρωτομερές α7-εκπ απεικονίζονται οι πλευρικές ομάδες όλων των καταλοίπων που μεταλλάγχθησαν, ενώ οι μπλέ σφαίρες συμβολίζουν τις τρείς θέσεις N-γλυκοζυλίωσης. Για λόγους απλότητας, οι θέσεις των αμινοξικών καταλοίπων που μεταλλάγχθησαν απεικονίζονται μόνο στο ένα πρωτομερές. Έτσι, αποφασίσαμε ώστε το πρώτο βήμα της στρατηγικής μεταλαξιγενέσεων στην α7-εκπ να περιλάμβανε την αντικατάσταση οκτώ υδρόφοβων αμινοξικών καταλοίπων (Phe3, Val69, Val132, Phe135, Phe137, Ile165, Val177, Phe187), εκτεθειμένων στο εξωτερικό περιβάλλον του μοντέλου, (Εικόνα 24Β) από λιγότερο υδρόφοβα, και τη μελέτη του αντικτύπου των μεταλλάξεων αυτών στην υδροφιλικότητα/υδροφοβικότητα των εκφραζόμενων α7-εκπ μορίων. Οι προτεινόμενες, με βάση το μοντέλο, σημειακές μεταλλάξεις ομαδοποιήθηκαν ανάλογα με τα στοιχεία δευτεροταγούς δομής στα οποία ανήκουν τα προς αντικατάσταση αμινοξικά κατάλοιπα, οδηγώντας έτσι στην κατασκευή τεσσάρων μεταλλαγμένων α7-εκπ μορίων με ονομασίες mut-1, mut-2, mut-3 και mut-4. Πιο συγκεκριμένα, το μετάλλαγμα mut-1 θα περιλάμβανε μία μόνο σημειακή κατευθυνόμενη μετάλλαξη στην αμινο-τελική α-έλικα του μορίου, το mut-2 θα 110

121 Αποτελέσματα περιείχε τέσσερεις σημειακές κατευθυνόμενες μεταλλάξεις στον πυρήνα β- πτυχώσεων, το mut-3 θα περιλάμβανε τρείς σημειακές κατευθυνόμενες μεταλλάξεις στη συντηρημένη Cys θηλιά και τέλος το mut-4 θα συγκροτούνταν από το συνδυασμό των προαναφερθεισών μεταλλάξεων (Πίνακας 1). Η μελέτη του μοντέλου της α7-εκπ κατέδειξε επίσης τρία αμινοξικά κατάλοιπα (Met41, Asn47, Asn53) για κάθε α7-εκπ μονομερές, τα οποία βρίσκονταν σε δυνητικά αλληλεπιδρώσες αποστάσεις με αντικρυστά κατάλοιπα του γειτονικού μονομερούς στη διεπιφάνεια μεταξύ δύο α7 υπομονάδων που συμμετέχουν στο σχηματισμό πενταμερούς μορίου (Εικόνα 24). Με την υπόθεση ότι η αντικατάσταση των αμινοξικών αυτών καταλοίπων από μεγαλύτερα ή φορτισμένα κατάλοιπα, θα μπορούσε να οδηγήσει στην εισαγωγή νέων αλληλεπιδράσεων ομοιοπολικής ή ετεροπολικής φύσης με αντικρυστά κατάλοιπα του γειτονικού μονομερούς, προχωρήσαμε στον σχεδιασμό άλλων τριών μεταλλαγμένων μορφών α7-εκπ (mut-5, mut-6 και mut-7) (Πίνακας 1). Εξ αυτών, το μετάλλαγμα mut-5 θα περιλάμβανε την μετάλλαξη Met41Lys, έτσι ώστε η εισαγωγή θετικού φορτίου στη θέση αυτή να οδηγήσει θεωρητικά στο σχηματισμό ηλεκτροστατικού δεσμού με το αντικρυστό Asp97 από το οποίο απέχει 5 Å. Το μετάλλαγμα mut-6 επρόκειτο να περιέχει την αντικατάσταση δύο καταλοίπων Asn στις θέσεις 47 και 53 από τη μεγαλύτερη Gln, ώστε να ενισχυθεί η πιθανότητα δημιουργίας υδρογονικού δεσμού με τα απέχοντα κατά 7 και 6 Å αντικρυστά τους κατάλοιπα Asp42 και Ser95, αντίστοιχα, και το μετάλλαγμα mut-7 επρόκειτο να φέρει το συνδυασμό αυτών των μεταλλάξεων με τη μετάλλαξη Met41Lys. α7-εκπ Σημειακά κατευθυνόμενες μεταλλάξεις mut-1 Phe3Tyr (N-τελική α-έλικα) mut-2 Val69Thr (β2-β3 θηλιά), Ile165Thr (β8-β9 θηλιά), Val177Thr (β9 πτυχωτό φύλλο), Phe187Tyr (β9 πτυχωτό φύλλο) mut-3 Val132Thr (Cys θηλιά), Phe135Tyr (Cys θηλιά), Phe137Tyr (Cys θηλιά) mut-4 Phe3Tyr, Val69Thr, Val132Thr, Phe135Tyr, Phe137Tyr, Ile165Thr, Val177Thr, Phe187Tyr 111

122 Αποτελέσματα mut-5 Met41Lys (β1 πτυχωτό φύλλο) mut-6 Asn47Gln (β1-β2 θηλιά), Asn53Gln (β2 πτυχωτό φύλλο) mut-7 Met41Lys, Asn47Gln, Asn53Gln Πίνακας 1. Περιγραφή των υπό μελέτη μεταλλαγμένων μορίων α7-εκπ. Η θέση των μεταλλαγμένων αμινοξικών καταλοίπων σε στοιχεία δευτεροταγούς δομής του μοντέλου της α7-εκπ αναγράφεται μέσα σε παρενθέσεις και προκύπτει από την αντιστοίχιση με την κρυσταλλογραφική δομή της ομόλογης L-AChBP (Brejc et al 2001) και τη δομή ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σε 4 Å της ΕΚΠ της μυϊκού τύπου α υπομονάδας του Torpedo nachr. (Unwin 2005). Το μετάλλαγμα mut-4 φέρει το συνδυασμό των μεταλλάξεων των μορίων mut-1, mut-2 και mut-3, ενώ το mut-7 φέρει το συνδυασμό των μεταλλάξεων στα μόρια mut-5 και mut Κατασκευή και χαρακτηρισμός συζευγμένων εξωκυττάριων τμημάτων του ανθρώπινου νευρικού α7 nachr με αμινο-τελική 6 His ετικέτα και επίτοπο αναγνώρισης TEV πρωτεάσης Στο εργαστήριό μας είχε πραγματοποιηθεί στο παρελθόν, η κλωνοποίηση του cdna της α7-εκπ αγρίου τύπου (α7-εκπ-wt), όσο και ενός διπλού μεταλλάγματός της (α7-εκπ-dm), στον πλασμιδιακό φορέα έκφρασης ppiczαa ( , Εικόνα 22 Α) (Avramopoulou et al 2004). Το α7-εκπ-dm έφερε τη σημειακή κατευθυνόμενη μετάλλαξη Cys116Ser καθώς και την αντικατάσταση της Cys θηλιάς (Cys128-Cys142) από την αντίστοιχη και περισσότερο υδρόφιλη περιοχή (Cys123-Cys136) της ομόλογης L-AChBP (Εικόνα 23). Τα δύο αυτά ανασυνδυασμένα α7-εκπ μόρια έφεραν στο καρβοξυ-τελικό τους άκρο τον επίτοπο c-myc και την ετικέτα 6 His, που προσδίδονται από το πλασμίδιο ppiczαa (Εικόνα 22Α) και είναι χρήσιμα για την ανίχνευση και τον καθαρισμό τους, αντίστοιχα. Εν τούτοις, προκειμένου να προχωρήσουμε σε δομικές μελέτες των α7-εκπ μορίων, κρίναμε σκόπιμο να κατασκευάσουμε κατάλληλες μοριακές κατασκευές που θα επέτρεπαν την απομάκρυνση αυτών των επιπλέον αμινοξικών αλληλουχιών, μετά την έκφραση και τον καθαρισμό των παραγόμενων πολυπεπτιδικών τμημάτων, αφού αυτές θα μπορούσαν δυνητικά να παρεμποδίζουν μελλοντικές προσπάθειες κρυστάλλωσης και άλλες δομικές μελέτες. Έτσι, αποφασίσαμε να εισάγουμε την ετικέτα 6 His στο αμινο-τελικό πλέον άκρο των α7-εκπ μορίων, ώστε αυτή να μπορεί να αποκόβεται παρουσία του ενζύμου AcTEV πρωτεάση (Invitrogen) από τα α7-εκπ μόρια, λόγω του ακολουθούμενου 112

123 Αποτελέσματα στην αμινοξική αλληλουχία νεο-εισαγόμενου επίτοπου αναγνώρισης της πρωτεάσης αυτής (Εικόνα 25). Πιο συγκεκριμένα, η AcTEV πρωτεάση αποτελεί μία ενισχυμένη μορφή του φυσικού ενζύμου TEV πρωτεάσης, το οποίο αποτελεί την καταλυτική περιοχή μίας πρωτεΐνης του ιού της μωσαϊκής του καπνού. Το ένζυμο αυτό αναγνωρίζει την συνεχόμενη αμινοξική αλληλουχία Glu-Asn-Leu-Tyr- Phe-Gln-Gly, την οποία πέπτει μεταξύ Gln-Gly. Ο λόγος που επιλέξαμε να εισάγουμε την 6 His ετικέτα και την ακολουθούμενη αλληλουχία αναγνώρισης της AcTEV πρωτεάσης στο αμινο- και όχι στο καρβοξυ-τελικό άκρο των εκφραζόμενων α7- ΕΚΠ μορίων ήταν ώστε μετά την πέψη με AcTEV πρωτεάση να μην προστίθενται στα μόρια α7-εκπ έξι εναπομείναντα αμινοξικά κατάλοιπα της αλληλουχίας αναγνώρισης της AcTEV πρωτεάσης, όπως θα γίνονταν στην περίπτωση προσθήκης του AcTEV επίτοπου στο καρβοξυ-τελικό άκρο. Επίσης, οι μοριακές κατασκευές που ακολούθησαν σχεδιάστηκαν με τέτοιο τρόπο ώστε το τελικό αμινοξικό κατάλοιπο Gly του αμινοτελικού AcTEV επίτοπου να αποτελεί και το πρώτο κατάλοιπο των εκφραζόμενων α7-εκπ μορίων. Εικόνα 25: Σχηματική απεικόνιση των παραγόμενων HisTEV-α7-ΕΚΠ μορίων. Στο σχήμα αυτό απεικονίζεται το ανασυνδυασμένο αγρίου τύπου μόριο α7-εκπ, το οποίο φέρει μία αμινο-τελική ετικέτα 6 His, ακολουθούμενη από τον επίτοπο αναγνώρισης της AcTEV πρωτεάσης. Το σημείο αναγνώρισης του επίτοπου αυτού από την AcTEV πρωτεάση αναπαρίσταται με το βέλος. Η επίδραση της AcTEV πρωτεάσης οδηγεί σε μόρια α7-εκπ χωρίς επιπλέον αμινοξικές αλληλουχίες. Μέσα σε παρένθεση φαίνεται ο αριθμός των αμινοξικών καταλοίπων της α7-εκπ-wt, ο οποίος στην περίπτωση του διπλού μεταλλάγματος α7-εκπ-dm είναι μειωμένος κατά ένα κατάλοιπο Κατασκευή κασέτας έκφρασης HisTEV-α7-ΕΚΠ μορίων Προκειμένου να γίνει η εισαγωγή της 6 His ετικέτας και του επίτοπου αναγνώρισης της AcTEV πρωτεάσης στο αμινο-τελικό άκρο των α7-εκπ μορίων (wt και dm), χρησιμοποιήσαμε τα ήδη κλωνοποιημένα, στο ppiczα πλασμίδιο, cdna τμήματα των α7-εκπ-wt και α7-εκπ-dm. Τα ανασυνδυασμένα αυτά πλασμιδιακά DNAs χρησιμοποιήθηκαν ως μήτρες για την ενίσχυση με αντίδραση PCR ( ) των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών των αντίστοιχων ενθεμάτων με 113

124 Αποτελέσματα τις επιπλέον νουκλεοτιδικές αλληλουχίες που κωδικοποιούν τους αμινο-τελικούς επίτοπους 6 His και AcTEV. Η αντίδραση PCR έλαβε χώρα σε δύο στάδια, χρησιμοποιώντας κάθε φορά τον ίδιο 3 -εκκινητή, αλλά διαφορετικό 5 -εκκινητή (Εικόνα 26). Κατά το δεύτερο στάδιο (PCR II), χρησιμοποιήθηκαν ως μήτρες DNA τα προϊόντα του πρώτου σταδίου (PCR I). Εικόνα 26. Σχηματική αναπαράσταση της αντίδρασης PCR δύο σταδίων για την παρασκευή κασέτας έκφρασης HisTEV-α7-ΕΚΠ μορίων. Για λόγους απλότητας, απεικονίζονται μόνο οι κωδικές αλυσίδες των τμημάτων DNA. Οι μήτρες DNA που χρησιμοποιήθηκαν στο 1 ο στάδιο των PCR αντιδράσεων ήταν ανασυνδυασμένα πλασμίδια ppiczαa ( , Εικόνα 22Α) με cdna τμήματα α7-εκπ μορίων (wt και dm). Οι ονομασίες 6 His και TEV αναφέρονται στις νουκλεοτιδικές βάσεις που κωδικοποιούν έξι κατάλοιπα ιστιδίνης και τον επίτοπο αναγνώρισης της AcTEV πρωτεάσης, αντίστοιχα. Η ονομασία Stop αναφέρεται σε δύο κωδίκια Ochre και Opal, ώστε η διαδικασία της μετάφρασης αυτής της κασέτας να διακόπτεται αμέσως μετά το τελευταίο προστιθέμενο αμινοξικό κατάλοιπο των παραγόμενων HisTEV-α7-ΕΚΠ μορίων. Το γράμμα P μέσα σε κύκλο συμβολίζει φωσφορικές ομάδες. Τα προϊόντα του δεύτερου σταδίου της αντίδρασης PCR (PCR II), προορίζονταν για κλωνοποίηση στους πλασμιδιακούς φορείς pbluescript και ppic9 ( , Εικόνα 21 και , Εικόνα 22 Β). Ώς κατάλληλες θέσεις κλωνοποίησης σε αυτούς τους πλασμιδιακούς φορείς κρίθηκαν οι θέσεις περιορισμού SmaI και SnabI, αντίστοιχα, στις περιοχές πολλαπλής κλωνοποίησής τους, οι οποίες δημιουργούν δίκλωνα μόρια DNA με ισοτελή άκρα ( & ). Τα μόρια των 3 -εκκινητών και του 5 -εκκινητή του δεύτερου σταδίου της PCR που χρησιμοποιήθηκαν έφεραν φωσφορυλιωμένα 5 -άκρα (Εικόνα 26), ώστε η 114

125 Αποτελέσματα κλωνοποίηση των προϊόντων της PCR II και στους δύο πλασμιδιακούς φορείς να μπορεί να γίνει εύκολα, χωρίς επιπλέον επεξεργασία ( ). Απαραίτητη προϋπόθεση ήταν η χρησιμοποίηση κατά τη διαδικασία της PCR, πολυμεράσης που διαθέτει μηχανισμό επιδιόρθωσης των λαθών κατά την αντιγραφή του DNA και που δεν προσθέτει poly-a ουρές στα 5 άκρα των προϊόντων. Επιλέγχθηκε λοιπόν η Pfu πολυμεράση, η οποία ικανοποιεί και τις δύο αυτές προϋποθέσεις. Ο 3 -εκκινητής που χρησιμοποιήθηκε ήταν ο φωσφορυλιωμένος Stop-α7-R ( ), του οποίου 20 νουκλεοτιδικές βάσεις ήταν συμπληρωματικές προς τις βάσεις του 3 -άκρου της κωδικής αλυσίδας του α7-εκπ-dna, ενώ οι υπόλοιπες βάσεις αντιστοιχούσαν σε δύο συνεχόμενα κωδίκια λήξης της μετάφρασης (Ochre και Opal stop codons) και σε τρείς βάσεις G, προκειμένου να γίνεται αναγέννηση της θέσης της περιοριστικής ενδονουκλεάσης SmaI ( 4.3., Εικόνα 28) κατά την υποκλωνοποίηση των προκύπτοντων DNA τμημάτων στη θέση SmaI του φορέα κλωνοποίησης pbluescript ( ). O 5 -εκκινητής που χρησιμοποιήθηκε κατά το πρώτο στάδιο της PCR αντίδρασης ήταν ο HisTEV α7α F ( ), του οποίου 15 βάσεις ήταν συμπληρωματικές προς τις βάσεις του 3 -άκρου της μη κωδικής αλυσίδας του α7- ΕΚΠ-DNA και οι ακόλουθες 18 βάσεις κωδικοποιούν τα πρώτα έξι αμινοξικά κατάλοιπα του TEV επίτοπου. Το τελευταίο κατάλοιπο του TEV επίτοπου (Gly) συμπίπτει με το πρώτο αμινοξικό κατάλοιπο της αλληλουχίας των ώριμων α7-εκπ μορίων (wt και dm). Στο πρώτο στάδιο της PCR χρησιμοποιήθηκαν 10 pmoles από τον κάθε εκκινητή και 10 ng μήτρας DNA. O 5 -εκκινητής που χρησιμοποιήθηκε κατά το δεύτερο στάδιο της PCR ήταν ο φωσφορυλιωμένος HisTEV α7β F ( ), του οποίου 18 βάσεις ήταν συμπληρωματικές προς τις βάσεις του 3 -άκρου της μη κωδικής αλυσίδας του προκύπτοντος από το πρώτο στάδιο της PCR προϊόντος και 3 κωδίκια ήταν υπεύθυνα για την κωδικοποίηση τριών συνδετικών μορίων Gly (linker) με την κωδικοποιούμενη από τις 18 ακόλουθες βάσεις αμινο-τελική ετικέτα 6 His. Τέλος, ο HisTEV α7β F έφερε στο 5 -άκρο του τρείς βάσεις G, προκειμένου να γίνεται αναγέννηση της θέσης της περιοριστικής ενδονουκλεάσης SmaI ( 4.3., Εικόνα 28) κατά την υποκλωνοποίηση των προκύπτοντων DNA τμημάτων στη θέση SmaI του φορέα κλωνοποίησης pbluescript ( ). Σε αυτό το δεύτερο στάδιο της PCR χρησιμοποιήθηκαν 10 pmoles από τον κάθε εκκινητή και 5 μl από τα προϊόντα του πρώτου σταδίου. 115

126 Αποτελέσματα Οι συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν για τις δύο συνεχόμενες PCR αντιδράσεις ήταν οι εξής: αποδιάταξης 95 C, 2 min αποδιάταξης 95 C, 30 s υβριδοποίησης 48 C, 30 s πολυµερισµού 72 C, 50 s αποδιάταξης 95 C, 30 s υβριδοποίησης 68 C, 30 s πολυµερισµού 72 C, 50 s πολυµερισµού 72 C, 5 min X 5 κύκλοι X 20 κύκλοι Η παραγωγή προϊόντων (προϊόντα PCR II) σωστού μεγέθους (678 bp στην περίπτωση του HisTEV-α7-EKΠ-wt και 675 bp στην περίπτωση του HisTEV-α7-ΕΚΠdm) επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση δειγμάτων ( ) από τα προϊόντα της αντίδρασης σε πήκτωμα 1% κ.β. αγαρόζης (Εικόνα 27). Στη συνέχεια έγινε ο καθαρισμός των παραγόμενων τμημάτων DNA από αυτές τις PCR αντιδράσεις με τη µέθοδο QIAquick PCR purίficαtion Kit ( ), ώστε αυτά να υποκλωνοποιηθούν στη συνέχεια στο φορέα κλωνοποίησης pbluescript (Εικόνα 21) και στον φορέα έκφρασης ppic9 (Εικόνα 22 Β). bp Εικόνα 27. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% κ.β. προϊόντων PCR αντίδρασης δεύτερου σταδίου (PCR II). Διαδρομές: (1) μάρτυρας μοριακών μεγεθών DNA ( bp), (2) προϊόν HisTEV-α7-ΕΚΠ-wt DNA και (3) προϊόν HisTEV-α7-ΕΚΠ-dm DNA. 116

127 Αποτελέσματα 4.3. Υποκλωνοποίηση της κασέτας έκφρασης HisTEV-α7-ΕΚΠ μορίων σε πλασμιδιακό φορέα κλωνοποίησης pβluescript Οι κασέτες έκφρασης των μορίων HisTEV-α7-ΕΚΠ-wt και HisTEV-α7-ΕΚΠ-dm ( ) υποκλωνοποιήθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα κλωνοποίησης pβluescript (Εικόνα 21), όπου και επρόκειτο να λάβουν χώρα οι προβλεπόμενες μεταλλαξιγενέσεις με κατάλληλες PCR αντιδράσεις. Ο λόγος για τον οποίο οι σημειακές μεταλλάξεις θα πραγματοποιούνταν σε ανασυνδυασμένα πλασμίδια pβluescript (pbs) με τα cdna ενθέματα για α7-εκπ-wt & α7-εκπ-dm και όχι στους αντίστοιχους ανασυνδυασμένους φορείς έκφρασης ppic9, ήταν διότι οι τυχόν τυχαίες μεταλλάξεις που ενδέχονταν να πραγματοποιηθούν στο πλασμιδιακό DNA κατα τις αντιδράσεις PCR δεν θα είχαν καμία επίπτωση όσον αφορά τη μεταγενέστερη έκφραση των αντίστοιχων πολυπεπτιδίων, αντίθετα με την περίπτωση στην οποία θα χρησιμοποιούνταν για την εισαγωγή των μεταλλάξεων κατευθείαν ο φορέας έκφρασης ppic9. Προκειμένου να γίνει η υποκλωνοποίηση των HisTEV-α7-ΕΚΠ-wt και HisTEV-α7-ΕΚΠ-dm cdnas σε πλασμίδιο pβs, αυτό υπέστη πέψη ( ) με την περιοριστική ενδονουκλεάση SmaI, η οποία αναγνωρίζει μία μοναδική θέση περιορισμού στην περιοχή πολλαπλής κλωνοποίησής του (MCS), οδηγώντας στην παραγωγή δίκλωνου DNA με ισοτελή άκρα (Εικόνα 28). Εικόνα 28. Θέση περιορισμού SmaI. Οι άκρες των τόξων απεικονίζουν το σημείο πέψης της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας που αναγνωρίζεται από το ένζυμο περιορισμού SmaI. Μετά από την αποφωσφορυλίωση του γραμμικού πλέον πλασμιδίου pβluescript ( ) και τον καθαρισμό του με τη µέθοδο QIAquick PCR purίficαtion Kit ( ), ακολούθησε αντίδραση σύνδεσης ( ) με τα καθαρισμένα προϊόντα DNA της αντίδρασης PCR II ( ) και μετασχηματισμός επιδεκτικών κυττάρων TOP10F ( ). Αξίζει να σημειωθεί, ότι κατά την αντίδραση σύνδεσης των τμημάτων DNA που κωδικοποιούν τα HisTEVα7-ΕΚΠ-wt και HisTEVα7-ΕΚΠ-dm με το pbs πλασμίδιο, αναγεννάται η θέση περιορισμού SmaI και στις δύο άκρες του ενθέματος (Εικόνα 29), αφού είχε γίνει προσθήκη κατάλληλων άκρων στα προϊόντα της 117

128 Αποτελέσματα PCR II ( ). H παρουσία, με αυτό τον τρόπο, της θέσης περιορισμού SmaI και στα δύο άκρα των ενθεμάτων (α7-εκπ-wt και α7-εκπ-dm cdnas) επρόκειτο να διευκολύνει στη συνέχεια τη μεταφορά των μεταλλαγμένων ενθεμάτων στο φορέα έκφρασης ppic9. Ακολούθησε παραγωγή πλασμιδιακού DNA σε μικρή κλίμακα ( ) από τις αποικίες που αναπτύχθηκαν σε στερεό θρεπτικό υλικό επιλογής LB+ampicillin ( ) και έλεγχος της ένθεσης των τμημάτων DNA (HisTEV-α7- ΕΚΠ-wt/dm) στα πλασμίδια αυτά (Εικόνα 29) με πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα SmaI και EcoRV ( ). Έτσι, η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων πέψης με το ένζυμο SmaI σε πήκτωμα 1% κ.β. αγαρόζης έδειξε την παρουσία ζώνης μεγέθους ~700 bp, πιστοποιώντας την σύνδεση των DNA τμημάτων HisTEV-α7-ΕΚΠ-wt/dm με το pbs πλασμίδιο, κάτι που επιβεβαιώθηκε και από το μέγεθος των προϊόντων πέψης με τη χρήση του ενζύμου EcoRV. Το μέγεθος των προϊόντων πέψης με EcoRV έδειξε επίσης την ένθεση των DNA τμημάτων HisTEV-α7-ΕΚΠ-wt/dm στο pbs πλασμίδιο και με τους δύο προσανατολισμούς (5 3 και 3 5 ), όπως αναμένονταν λόγω κλωνοποίησης με ισοτελή άκρα (blunt end cloning) (Εικόνα 29). Τέλος, τα σωστά προϊόντα ελέγχθηκαν με προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής τους αλληλουχίας με τη χρήση των εκκινητών T3 και T7. A. B. 118

129 Αποτελέσματα Γ. Δ. Εικόνα 29. Χάρτες περιορισμού ανασυνδυασμένων πλασμιδίων pbluescript (PBS). (Α) Ένθεση DNA τμήματος για HisTEV-α7-ΕΚΠ-wt με προσανατολισμό 5 3 (Β) Ένθεση DNA τμήματος για HisTEV-α7-ΕΚΠ-wt με τον αντίθετο προσανατολισμό 3 5 (rev) (Γ) Ένθεση DNA τμήματος για HisTEV-α7-ΕΚΠ-dm με προσανατολισμό 5 3 (Δ) Ένθεση DNA τμήματος για HisTEV-α7-ΕΚΠ-dm με τον αντίθετο προσανατολισμό 3 5 (rev). Η υποκλωνοποίηση αυτών των DNA τμημάτων έγινε στη θέση SmaI του pbs πλασμιδίου, η οποία και αναγεννάται στα δύο άκρα του ενθέματος. Ο έλεγχος της ένθεσης των τμημάτων DNA (προϊόντα PCR II, ) στο ppic9 έγινε με τη χρήση των ενζύμων SmaI και EcoRV Υποκλωνοποίηση της κασέτας έκφρασης HisTEV-α7-ΕΚΠ μορίων σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης ppic9 Μετά την πιστοποίηση της ορθής νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των κλωνοποιημένων προϊόντων της PCR II ( ) στο φορέα κλωνοποίησης pbluescript ( 4.3.), ακολούθησε η μεταφορά των ενθεμάτων (HisTEV-α7-ΕΚΠ-wt και HisTEV-α7-ΕΚΠ-dm cdnas) σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης ppic9, ώστε αυτά να εκφρασθούν στα αντίστοιχα πολυπεπτιδικά τμήματα. Αναλυτικότερα, τα cdna ενθέματα των HisTEV-α7-ΕΚΠ μορίων απομονώθηκαν από τα αντίστοιχα pbs πλασμίδια (Εικόνα 29) με πέψη με το ένζυμο SmaI και στη συνέχεια συνδέθηκαν ( ) με αποφωσφορυλιωμένο φορέα έκφρασης ppic9 ( ), ο οποίος είχε υποστεί πέψη με το ένζυμο περιορισμού SnabI ( ). Tο ένζυμο αυτό αναγνωρίζει τη μοναδική θέση SnabI στην περιοχή πολλαπλής κλωνοποίησης του πλασμιδίου ppic9 (Εικόνα 22 Β), οδηγώντας σε δίκλωνο DNA με ισοτελή άκρα (Εικόνα 30). 119

130 Αποτελέσματα Εικόνα 30. Θέση περιορισμού SnabI. Οι άκρες των τόξων απεικονίζουν το σημείο πέψης της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας που αναγνωρίζεται από το ένζυμο περιορισμού SnabI. Ακολούθησε η επιλογή των μετασχηματισμένων TOP10F επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων ( ) με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο ppic9 (συνδεδεμένο με τμήματα DNA που κωδικοποιούν τα HisTEVα7-ΕΚΠ-wt ή HisTEVα7-ΕΚΠ-wt πολυπεπτιδικά τμήματα) σε στερεό θρεπτικό υλικό επιλογής LB+ampicillin ( ) και έλεγχος της ένθεσης, αλλά και του σωστού προσανατολισμού ένθεσης των τμημάτων DNA (HisTEV-α7-ΕΚΠ-wt/dm) στα πλασμίδια αυτά, με αντίδραση PCR. Για αυτή την PCR αντίδραση χρησιμοποιήθηκαν μικρές ποσότητες από τους κλώνους των αποικιών που είχαν επιλεγεί σε LB+ampicillin και η Taq πολυμεράση. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ο 5 -εκκινητής με την ονομασία Bam-pIC9-F και ο 3 -εκκινητής με την ονομασία EcoRI-R ( ). Ο εκκινητής Bam-pPIC9-F είναι συμπληρωματικός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (3 5 ) που περιέχει την περιοχή που αντιστοιχεί στη μοναδική θέση περιορισμού BamHI του πλασμιδίου ppic9, ενώ ο EcoRI-R είναι συμπληρωματικός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (5 3 ) στην περιοχή που περιλαμβάνει τη θέση περιορισμού EcoRI στο cdna των α7-εκπ-wt και α7-εκπ-dm τμημάτων (Εικόνα 31). Οι συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν για τις PCR αντιδράσεις ήταν οι εξής: Αρχικά, τα δείγµατα θερµαίνονται στους 94 C για 3 min, προκειµένου να σπάσουν τα κυτταρικά τοιχώματα και να αποδιαταχθούν τα δίκλωνα τμήματα DNA και ακολουθούν 35 κύκλοι ενίσχυσης µε τις ακόλουθες συνθήκες: αποδιάταξης 94 C, 30 s υβριδοποίησης 60 C, 30 s πολυµερισµού 72 C, 1 min Τέλος, ακολούθησε πολυμερισμός στους 72 C για 5 min. Στη συνέχεια έγινε ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων από τα προϊόντα της αντίδρασης σε πήκτωμα 1% κ.β. αγαρόζης ( ). Επιλέγχθηκαν για παραγωγή πλασμιδιακού 120

131 Αποτελέσματα DNA σε μικρή κλίμακα ( ), οι κλώνοι εκείνοι των οποίων τα PCR προϊόντα έδειξαν μία ζώνη μεγέθους ~700 bp (658 bp στην περίπτωση του HisTEV-α7-wt και HisTEV-α7-dm). Στην περίπτωση αυτή αποδεικνύεται και ο σωστός προσανατολισμός των ενθεμάτων (5 3 ), έτσι ώστε αυτά στη συνέχεια να εκφραστούν στα επιθυμητά πολυπεπτιδικά τμήματα (Εικόνα 31). A. B. ppic9-histev-α7-εκπ-wt 8701 bp ppic9-histev-α7-εκπ-wt-rev 8701 bp Γ. Δ. ppic9-histev-α7-εκπ-dm 8698 bp ppic9-histev-α7-εκπ-dm-rev 8698 bp Εικόνα 31. Χάρτες περιορισμού ανασυνδυασμένων πλασμιδίων ppic9. (Α) Ένθεση DNA τμήματος για HisTEV-α7-ΕΚΠ-wt με σωστό προσανατολισμό 5 3 (Β) Ένθεση DNA τμήματος για HisTEV-α7-ΕΚΠ-wt με τον αντίθετο προσανατολισμό 3 5 (rev) (Γ) Ένθεση DNA τμήματος για HisTEV-α7-ΕΚΠ-dm με σωστό προσανατολισμό 5 3 (Δ). Ένθεση DNA τμήματος για HisTEV-α7-ΕΚΠ-dm με τον αντίθετο προσανατολισμό 3 5 (rev). Η υποκλωνοποίηση των τμημάτων αυτών DNA (αναπαρίστανται ως μικρά τόξα σκουροπράσινου χρώματος) έγινε στη θέση SnabI του ppic9 πλασμιδίου. Ο έλεγχος της ένθεσης των τμημάτων DNA (προϊόντα PCR II, ) στο pbs έγινε με τη χρήση των ενζύμων EcoRV και HindIII. 121

132 Αποτελέσματα Στη συνέχεια, τα απομονωμένα πλασμιδιακά DNA υπέστησαν κατεργασία πέψης με τη χρήση των ενζύμων περιορισμού EcoRV και HindIII ( ). Τα προϊόντα πέψης με EcoRV έδειξαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα 1% κ.β. αγαρόζης μία ζώνη μεγέθους ~700 bp και τα προϊόντα πέψης με HindIII έδειξαν μία ζώνη μεγέθους ~1000 bp, επιβεβαιώνοντας έτσι την ένθεση των cdna τμημάτων των α7-εκπ-wt και α7- ΕΚΠ-dm με το σωστό προσανατολισμό, αφού στην αντίθετη περίπτωση (ένθεση με προσανατολισμό 3 5 ) θα περιμέναμε ζώνες μεγέθους ~1000 bp και ~400 bp, αντίστοιχα (Εικόνα 31). Ακολούθησε η παραγωγή πλασμιδιακού DNA σε μεγάλη κλίμακα ( ) από αυτούς τους κλώνους Έκφραση των ανασυνδυασμένων HisTEVα7-ΕΚΠ πολυπεπτιδικών τμημάτων σε κύτταρα P. pastoris Οι ανασυνδυασμένοι πλασμιδιακοί φορείς ppic9 ( 4.4.) στους οποίους έγινε η ένθεση cdna τμημάτων για HisTEV-α7-wt και HisTEV-α7-dm μόρια με το σωστό προσανατολισμό (5 3 ), χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για το μετασχηματισμό επιδεκτικών κυττάρων P. pastoris, ώστε να ακολουθήσει η επιλογή σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας των κλώνων εκείνων που θα οδηγούνταν σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας προκειμένου να εκφρασθούν τα αντίστοιχα πολυπεπτιδικά τμήματα Επιλογή μετασχηματισμένων κυττάρων P. pastoris με τα πλασμίδια ppic9-histevα7-εκπ-wt/dm για έκφραση Οι ανασυνδυασμένοι φορείς έκφρασης ppic9 με τα ενθέματα HisTEVα7-ΕΚΠwt και HisTEVα7-ΕΚΠ-dm cdnas σωστού 5 3 προσανατολισμού (Εικόνα 31 Α, Γ), χρησιμοποιήθηκαν για το μετασχηματισμό επιδεκτικών στελεχών GS115 P. pastoris ( ). Η γραμμικοποίηση των ανασυνδυασμένων αυτών πλασμιδίων έγινε με τη χρήση του ενζύμου περιορισμού SacI (Εικόνα 31) και επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της αντίδρασης σε πήκτωμα 1% κ.β. αγαρόζης. Μετά τον καθαρισμό των προϊόντων γραμμικοποίησης με εκχύλιση με οργανικούς διαλύτες ( ) ακολούθησε ο μετασχηματισμός επιδεκτικών κυττάρων GS115, οπότε τα ανασυνδυασμένα πλασμιδιακά DNAs ενσωματώθηκαν στο γονιδίωμα αυτών των κυττάρων P. pastoris με ομόλογο ανασυνδυασμό ( ). Οι επιτυχώς μετασχηματισμένοι κλώνοι GS115 με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια ppic9-histevα7-εκπ-wt και ppic9-histevα7-εκπ-dm 122

133 Αποτελέσματα επιλέγχθηκαν βάση της ικανότητάς τους να αναπτύσσονται απουσία ιστιδίνης σε θρεπτικό μέσο επιλογής RDB ( ), αφού πλέον μόνο τα επιτυχώς μετασχηματισμένα κύτταρα φέρουν το γενετικό τόπο HIS4 στο γονιδίωμά τους (Εικόνα 31). Στη συνέχεια έγινε μεταφορά των αναπτυγμένων σε RDB θρεπτικό μέσο κλώνων στα θρεπτικά μέσα MD και MM ( ) και ακολούθησε η επώασή τους σε 30 C. Με αυτό τον τρόπο παρατηρήθηκε η ικανότητα ανάπτυξης των αποικιών στα τρυβλία petri με MM θρεπτικό μέσο, το οποίο περιέχει την απαραίτητη για την επαγωγή της έκφρασης, μεθανόλη ( ), και αυτή συγκρίθηκε με την ικανότητα ανάπτυξης των παρατηρούμενων αποικιών στα τρυβλία petri με MD θρεπτικό μέσο (περιέχει γλυκόζη ως πηγή άνθρακα αντί μεθανόλης). Οι κλώνοι των μετασχηματισμένων GS115 κυττάρων με ppic9- HisTEV-α7-ΕΚΠ-wt/dm cdnas, των οποίων οι αποικίες εμφάνισαν μεγαλύτερη ικανότητα ανάπτυξης σε MM θρεπτικό μέσο σε σχέση με άλλους, επιλέχθηκαν στη συνέχεια για την έκφραση των επιθυμητών πολυπεπτιδικών τμημάτων. Αυτό, διότι τα μετασχηματισμένα κύτταρα GS115 με τα ανασυνδυασμένα ppic9 πλασμίδια εμφανίζουν αυξημένα επίπεδα μεταβολισμού της μεθανόλης και άρα αυξημένα επίπεδα ανάπτυξης και έκφρασης στη συνέχεια των ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδικών τμημάτων, υπό τον έλεγχο του υποκινητή της αλκοολικής οξειδάσης (5 ΑΟΧ1) (Εικόνες 22 Α, 31) Έλεγχος έκφρασης ανασυνδυασμένων HisTEVα7-ΕΚΠ πολυπεπτιδίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας Οι επελεγμένοι με την προηγούμενη διαδικασία μετασχηματισμένοι κλώνοι GS115 ελέγχθηκαν για τα επίπεδα έκφρασης των HisTEVα7-ΕΚΠ-wt και HisTEVα7-ΕΚΠ-dm μορίων σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας ( Α), με πειράματα απ ευθείας πρόσδεσης 125 Ι-α-bgtx ( ) σε δείγματα υπερκειμένων των καλλιεργειών αυτών. Έτσι, μετά από 48 h επαγωγής της έκφρασης των αντίστοιχων πολυπεπτιδικών τμημάτων από διάφορους κλώνους σε 5 ml BMMY ( Α) ακολούθησε 20 φορές συμπύκνωση των υπερκείμενων των με ταυτόχρονη διαπίδυση έναντι 10 mm PB, 100 mm NaCl, 1 mm DTT, ph 7,5 και έλεγχος της ικανότητας πρόσδεσης 2 μl από το κάθε συμπυκνωμένο υπερκείμενο σε 125 Ι-α-bgtx. Ώς μέτρο σύγκρισης των επιπέδων έκφρασης των HisTEVα7-ΕΚΠ-wt και HisTEVα7-ΕΚΠ-dm 123

134 Αποτελέσματα μορίων, χρησιμοποιήθηκε ίδια ποσότητα μορίων α7-εκπ-dm που εκφράσθηκαν με τις ίδιες συνθήκες από κύτταρα X33 με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο ppiczα. Το πρώην χαρακτηρισμένο μόριο α7-εκπ-dm (διπλό μετάλλαγμα) έφερε, σε αντίθεση με τα HisTEVα7-ΕΚΠ-wt και HisTEVα7-ΕΚΠ-dm της παρούσης μελέτης, την ετικέτα 6 His στο καρβοξυτελικό άκρο (Avramopoulou et al 2004). Από τον προκαταρκτικό αυτό έλεγχο των επιπέδων έκφρασης των HisTEVα7- ΕΚΠ-wt και HisTEVα7-ΕΚΠ-dm μορίων από διάφορους κλώνους έγινε η επιλογή των κλώνων εκείνων που εξέφραζαν αυτά τα μόρια σε αντίστοιχα επίπεδα έκφρασης με το μόριο α7-εκπ-dm για έκφραση σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας, αφού ίσες ποσότητες υπερκειμένου καλλιεργειών από τους κλώνους αυτούς με την ποσότητα του χρησιμοποιούμενου α7-εκπ-dm έδειξαν ίδια περίπου ικανότητα πρόσδεσης του σημασμένου ανταγωνιστή 125 Ι-α-bgtx (~1700 Δcpm) Έκφραση ανασυνδυασμένων HisTEVα7-ΕΚΠ πολυπεπτιδίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Οι μετασχηματισμένοι κλώνοι GS115 με τα πλασμίδια ppic9-histevα7-εκπ-wt και ppic9-histevα7-εκπ-dm, οι οποίοι βρέθηκαν να εκφράζουν τα αντίστοιχα HisTEVα7-ΕΚΠ μόρια σε ικανοποιητικό βαθμό, οδηγήθηκαν για την επαγωγή έκφρασης σε καλλιέργειες BMMY μεγάλης κλίμακας (2 L) ( Β). Στη συνέχεια ακολούθησε η απομόνωση των εκφραζόμενων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών από το υπερκείμενο της καλλιέργειας ( ) και το 1 ο στάδιο καθαρισμού τους σε στήλη ρητίνης συζευγμένης με ιόντα νικελίου (Ni 2+ ) ( ). Ο έλεγχος με πειράματα απ ευθείας πρόσδεσης 125 Ι-α-bgtx ( ) στα κλάσματα πλύσης και έκλουσης, αλλά και του αρχικού διαλύματος της πρωτεΐνης μετά την θεωρητική απομάκρυνσή της από αυτό έδειξε τα εξής: Α. Τα μόρια HisTEVα7-ΕΚΠ-wt και HisTEVα7-ΕΚΠ-dm εκλούσθηκαν σε ένα μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων ιμιδαζολίου (30 mm, 50 mm και 150 mm) B. Στο υπερκείμενο της ρητίνης συζευγμένης με ιόντα νικελίου (Ni 2+ ) μετά την ολονύκτια πρόσδεση των HisTEVα7-ΕΚΠ-wt και HisTEVα7-ΕΚΠ-dm μορίων ( ) εντοπίσθηκε σημαντικό μέρος τους μη προσδεδεμένο στα ιόντα Ni 2+, το οποίο αντιστοιχούσε περίπου στο ήμισυ της ολικής προς δέσμευση πρωτεΐνης. 124

135 Αποτελέσματα Τα αποτελέσματα αυτά, σε συνδυασμό με την αδυναμία ανίχνευσης των εκφραζόμενων HisTEVα7-ΕΚΠ-μορίων με ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας το αντι-his αντίσωμα ( ) υποδηλώνουν τα εξής: I. Κατά την έκφραση των παραγόμενων HisTEVα7-ΕΚΠ-μορίων, είναι πολύ πιθανό να γίνεται αποκοπή του αμινο-τελικού άκρου τους σε διαφορετικά σημεία, οπότε προκύπτουν μόρια με διαφορετικό αριθμό ιστιδινικών καταλοίπων, τα οποία εμφανίζουν διαφορετικό βαθμό συγγένειας πρόσδεσης με τη χρησιμοποιούμενη στήλη Ni 2+ -NTA. Αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει την έκλουσή τους από τη στήλη σε ένα σχετικά μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων ιμιδαζολίου. ΙΙ. Ενδέχεται σε ένα σημαντικό κλάσμα του πληθυσμού τους να συμβαίνει και πλήρης αποκοπή της 6 His ετικέτας, οπότε αυτά δεν είναι δυνατό να προσδεθούν στη στήλη και για αυτό ανιχνεύονται στο υπερκείμενο της ρητίνης ακόμη και μετά την ολονύκτια πρόσδεση σε αυτή. Εν τούτοις, προχωρήσαμε στην in vitro απογλυκοζυλίωση των εκλουσμάτων 150 mm ιμιδαζολίου ( ) και στο 2 ο στάδιο καθαρισμού των εκφραζόμενων HisTEVα7-ΕΚΠ-μορίων με χρωµατογραφία µοριακής διήθησης ( ) (Εικόνα 32). Ο λόγος για τον οποίο απογλυκοζυλιώσαμε τα HisTEVα7-ΕΚΠ-μόρια ήταν αφ ενός μεν διότι αυτό είναι επιθυμητό για δομικές μελέτες και αφ ετέρου δε, διότι θέλαμε να συγκρίνουμε το χρωματογράφημα μοριακού αποκλεισμού του HisTEVα7- ΕΚΠ-dm με αυτό του ήδη μελετημένου απογλυκοζυλιωμένου α7-εκπ-dm μορίου (Avramopoulou et al 2004). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 32, τα HisTEVα7-ΕΚΠ μόρια (wt και dm) εκφράζονται με τη μορφή συσσωματωμάτων υψηλού μοριακού βάρους (~2000 kda) και με τη μορφή ολιγομερών με μοριακά βάρη που ξεπερνούν το αναμενόμενο ΜΒ για πενταμερή μόρια, δεδομένου του γεγονότος ότι το ΜΒ των μη γλυκοζυλιωμένων πρωτομερών α7 είναι ~30 kda και άρα το ΜΒ των απογλυκοζυλιωμένων πενταμερών που θα επιθυμούσαμε είναι ~150 kda. Βέβαια, το μόριο HisTEVα7-ΕΚΠ-wt είναι πιο υδρόφοβο από το HisTEVα7-ΕΚΠ-dm, αφού αφ ενός μεν ο λόγος της ποσότητας των υψηλού μοριακού βάρους συσσωματωμάτων προς την ποσότητα των ολιγομερών είναι μεγαλύτερος από τον αντίστοιχο για HisTEVα7-ΕΚΠ-dm (Εικόνα 32) και αφ ετέρου δε τα HisTEVα7-ΕΚΠ-wt ολιγομερή του εκλούονται σε περιοχές που αντιστοιχούν σε ΜΒ~440 kda σε αντίθεση με τα ολιγομερή του HisTEVα7-ΕΚΠ-dm (440 kda >ΜΒ> 232 kda). 125

136 Αποτελέσματα A. 0,3 A 280 Δcpm 2000 kda HisTEVα7-ΕΚΠ-wt A 280 0,2 0,1 158 kda Δcpm / 2μL 440 kda 232 kda 200 0, Όγκος έκλουσης (ml) B. 0,10 A 280 HisTEVα7-ΕΚΠ-dm ,08 Δcpm 1200 A 280 0,06 0, kda Δcpm / 2μL 0, kda 232 kda 158 kda , Όγκος έκλουσης (ml) Εικόνα 32. Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης σε σύστημα Akta FPLC purifier με τη χρήση στήλης Superose 12. (A) HisTEVα7-ΕΚΠ-wt, (B) HisTEVα7-ΕΚΠ-dm. Τα χρωματογραφήματα των HisTEVα7-ΕΚΠ-μορίων (απογλυκοζυλιωμένα μόρια) απεικονίζονται με τη συνεχή γραμμή, ενώ με τη διακεκομένη γραμμή συνδέονται τα σημεία (ανεστραμμένα τρίγωνα) που αντιστοιχούν στις μετρούμενες κρούσεις (Δcpm) της δεσμευμένης 125 Ι-α-bgtx (χρησιμοποιούμενη ποσότητα: cpm) χρησιμοποιώντας 2 μl από το καθένα από τα εκλούσματα της χρωματογραφίας μετά την αφαίρεση της μη ειδικής δέσμευσης ( ). Τα τόξα δείχνουν τους όγκους έκλουσης πρωτεϊνών του εμπορίου με γνωστά μοριακά βάρη. Οι συνθήκες της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης περιγράφονται στην παράγραφο

137 Αποτελέσματα Η παρατήρηση αυτή επιβεβαιώνει την αύξηση της υδροφιλικότητας που είχε επιτευχθεί στο παρελθόν με το συνδυασμό της αντικατάστασης της Cys θηλιάς της α7- ΕΚΠ από την αντίστοιχη και πιο υδρόφιλη Cys θηλιά από L-AChBP και της μετάλλαξης σημείου Cys116Ser (Avramopoulou et al 2004) στο διπλό μετάλλαγμα α7- ΕΚΠ (dm) σε σχέση με το αγρίου τύπου μόριο α7-εκπ-wt. Παρόλα αυτά, το επίπεδο έκφρασης των HisTEVα7-ΕΚΠ-wt και HisTEVα7-ΕΚΠdm πρωτεϊνών υπό τη μορφή ολιγομερών (δηλαδή η ποσότητα των μορίων που αντιστοιχεί στην δεύτερη από αριστερά κορυφή του χρωματογραφήματος της Εικόνας 32) υπολογίσθηκε με τη μέθοδο Bradford ότι είναι ~0,0225 mg/l καλλιέργειας. Αυτή η απόδοση έκφρασης των ανασυνδυασμένων α7-εκπ μορίων είναι ιδιαίτερα χαμηλή, προκειμένου να ακολουθήσουν δομικές μελέτες (NMR, κρυσταλλογραφία) και πιθανότατα οφείλεται στην αλλαγή της θέσης της 6 His ετικέτας από το καρβοξυ- στο αμινο-τελικό άκρο των νεοεκφραζόμενων μορίων ( 4.2.). Αυτό, διότι ειδικά για το διπλό μετάλλαγμα α7-εκπ-dm, στο οποίο η ετικέτα αυτή βρίσκονταν στο καρβοξυ- τελικό άκρο, η απόδοση της έκφρασής του στο ίδιο σύστημα ήταν ~0,5 mg/l (Avramopoulou et al 2004), δηλαδή 25 φορές μεγαλύτερη από αυτή του HisTEVα7- ΕΚΠ-dm της παρούσης μελέτης. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν αποθαρρυντικά για την μελέτη των προτεινόμενων από το μοντέλο της α7-εκπ μεταλλάξεων σε συνδυασμό με την παρουσία αμινοτελικής 6 His ετικέτας. Για το λόγο αυτό αποφασίσαμε ώστε οι μεταλλαξιγενέσεις να γίνουν σε συνδυασμό με την παρουσία καρβοξυ-τελικής πλέον 6 His ετικέτας Υποκλωνοποίηση κασέτας έκφρασης α7-εκπ μορίων σε πλασμιδιακό φορέα pbluescript Tα cdna τμήματα που κωδικοποιούν τα εξωκυτταρικά τμήματα των μορίων α7-wt και α7-dm ήταν κλωνοποιημένα στις θέσεις EcoRI και XbaI του φορέα έκφρασης ppiczα ( , Εικόνα 22 A) (Avramopoulou et al 2004). Προκειμένου να ακολουθήσουν οι προτεινόμενες, με βάση το μοντέλο της ανθρώπινης α7-εκπ, μεταλλάξεις, έγινε πέψη των ανασυνδυασμένων με αυτά τα cdna τμήματα ppiczα πλασμιδίων, χρησιμοποιώντας τα ένζυμα περιορισμού XhoI και XbaI, ώστε να δύναται η υποκλωνοποίηση των αντίστοιχων cdna ενθεμάτων στις ίδιες θέσεις περιορισμού της περιοχής πολλαπλής κλωνοποίησης του φορέα κλωνοποίησης pbluescript (Εικόνα 33). Η θέση περιορισμού XhoI βρίσκεται μέσα στη νουκλεοτιδική αλληλουχία του 127

138 Αποτελέσματα πεπτιδίου-οδηγού (α-factor) του πλασμιδίου ppiczα, ενώ η θέση XbaI βρίσκεται στο 3 άκρο του ενθέματος (α7-εκπ-wt ή α7-εκπ-dm) (Εικόνες 34 Α, Β). Εικόνα 33. Περιοχή πολλαπλής κλωνοποίησης (MCS) του πλασμιδιακού φορέα κλωνοποίησης pbluescript. Μετά την πέψη των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων ppiczα με XhoI και XbaI και προκειμένου να επιτευχθεί η απομόνωση των ενθεμάτων, ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των προϊόντων πέψης σε πήκτωμα 1% κ.β. αγαρόζης. Έπειτα από τον καθαρισμό των ζωνών των πηκτωμάτων αγαρόζης που αντιστοιχούσαν στα ενθέματα (~650 bp) έγινε αντίδραση σύνδεσής τους με πλασμίδια pbluescript (pbs) που είχαν υποστεί πέψη επίσης με ένζυμα περιορισμού XhoI και XbaI (Εικόνες 34 Γ, Δ). Α. Β. ppiczαα-α7-εκπ-wt 4159 bp ppiczαα-α7-εκπ-dm 4156 bp 128

139 Αποτελέσματα Γ. Δ. α7-εκπ-wt α7-εκπ-dm pbs-α7-εκπ-wt 3551 bp pbs-α7-εκπ-dm 3548 bp Εικόνα 34. Χάρτες περιορισμού ανασυνδυασμένων πλασμιδίων ppiczαα και pbluescript (pbs). (Α), (Β) Ανασυνδυασμένα πλασμίδια ppiczαα με τα cdna τμήματα των α7-εκπ-wt και α7-εκπ-dm μορίων, αντίστοιχα. Τα ενθέματα των πλασμιδίων αυτών απομονώθηκαν με πέψη στις θέσεις περιορισμού XhoI και XbaI, οι οποίες αναγράφονται με έντονα γράμματα. (Γ), (Δ) Ανασυνδυασμένα πλασμίδια pbs, στα οποία έχουν υποκλωνοποιηθεί στις θέσεις XhoI και XbaI της περιοχής πολλαπλής κλωνοποίησης (Εικόνα 33) cdna τμήματα των α7-εκπ-wt και α7-εκπ-dm μορίων, αντίστοιχα, τα οποία απομονώθηκαν από ανασυνδυασμένα πλασμίδια ppiczαα (Α, Β). Με έντονα γράμματα, εκτός από τις θέσεις κλωνοποίησης, απεικονίζονται επίσης και χαρακτηριστικές θέσεις περιορισμού των ενθεμάτων, οι οποίες χρησιμεύουν για την ταυτοποίησή τους Κατασκευή κασετών έκφρασης α7-εκπ μεταλλαγμάτων σε πλασμιδιακό φορέα pbluescript Τo ανασυνδυασμένο με το α7-εκπ-wt cdna πλασμίδιο pbluescript ( 4.3., Εικόνα 34 Γ), χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για την κατασκευή των προτεινόμενων, με βάση το μοντέλο της α7-εκπ, σημειακών μεταλλάξεων ( 4.1.). Οι μεταλλάξεις αυτές πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του συστήματος GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), το οποίο περιλάμβανε επιδεκτικά κύτταρα DH5 α βακτηρίων E. coli, ένζυμο μεθυλίωσης πλασμιδιακού DNA (DNA μεθυλάση), ένζυμο SAM, dntps και υλικό SOC. Η δημιουργία σημειακών μεταλλάξεων γίνεται με PCR αντιδράσεις και το σύστημα στηρίζεται στις ιδιότητες τoυ ενζύμου DNA μεθυλάσης και της ενδογενούς στα DH5 α βακτηριακά κύτταρα ενδονουκλεάσης McrBC. Πιο συγκεκριμένα, η DNA μεθυλάση δρα μεθυλιώνοντας τις νουκλεοτιδικές βάσεις κυτοσίνης του δίκλωνου μορίου DNA, το οποίο στη συνέχεια διασπάται από την ενδονουκλεάση McrBC των μετασχηματισμένων βακτηριακών κυττάρων DH5 α. Έτσι, 129

140 Αποτελέσματα τα μόνα πλασμίδια που υφίστανται σε ακέραια μορφή μέσα στα μετασχηματισμένα κύτταρα είναι τα μη μεθυλιωμένα πλασμιδιακά DNA και κατά επέκταση τα προϊόντα των PCR αντιδράσεων που φέρουν τις σημειακές μεταλλάξεις. Στην Εικόνα 35 απεικονίζεται σχηματικά η πορεία της μεταλλαξιγένεσης με το σύστημα αυτό. Εικόνα 35. Σχηματική απεικόνιση της πορείας μεταλλαξιγένεσης. Τα αρχικά πλασμίδια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα ανασυνδυασμένα pbluescript με α7-εκπ-wt και με α7-εκπ-dm cdnas ( 4.3.) Η εισηγμένη μετάλλαξη σε αυτό το παράδειγμα συμβολίζεται με το γράμμα Χ και βρίσκεται στον 5 εκκινητή (F) που χρησιμοποιήθηκε κάθε φορά. Προκειμένου να πραγματοποιηθούν οι σημειακές μεταλλάξεις, ώστε να προκύψουν τα μεταλλάγματα που περιγράφονται στην παράγραφο 4.1., χρησιμοποιήθηκαν 100 ng ανασυνδυασμένου πλασμιδίου pbluescript με α7-εκπ-wt cdna. Ο όγκος της αντίδρασης μεθυλίωσης ήταν 16 μl, περιέχοντα 1 μl DNA μεθυλάσης (4 units/μl), 1,6 μl SAM (stock 200X), 1,6 μl διαλύματος μεθυλίωσης και τον απαραίτητο όγκο dd- H 2 0. H μεθυλίωση επετεύχθη με επώαση στους 37 C για 1 h. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκαν ng μεθυλιωμένου πλασμιδιακού DNA ως εκμαγείο για την κάθε PCR αντίδραση, ώστε να γίνει η εισαγωγή των επιθυμητών μεταλλάξεων. Ο όγκος της αντίδρασης PCR ήταν 50 μl, περιείχε τα εξής συστατικά: 130

141 Αποτελέσματα Συστατικά PCR αντιδράσεων 10 μl ανασυνδυασμένου και μεθυλιωμένου πλασμιδίου pbluescript Τελική συγκέντρωση ng / 50 μl 1,5 μl dntps 0,3 mm έκαστο dntp 5 μl διαλύματος Pfu πολυμεράσης (10X) 1X 1,5 μl Pfu πολυμεράση (U/μL) units 1,5 μl 5 εκκινητής (10 pmoles/μl) 15 pmoles / 50 μl 1,5 μl 3 εκκινητής (10 pmoles/μl) 15 pmoles / 50 μl 29 μl dd-h 2 0 Τα ζεύγη των 5 και 3 εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν, προκειμένου να προκύψουν οι σημειακές μεταλλάξεις στο cdna των μεταλλαγμάτων του Πίνακα 1 ( 4.1.) αναγράφονται στην παράγραφο Κατά αντιστοιχία με την Εικόνα 35, ο 5 εκκινητής (F) κάθε χρησιμοποιούμενου ζεύγους εκκινητών αποτελείτο από μία συμπληρωματική νουκλεοτιδική αλληλουχία bp με το 5 -άκρο του 3 εκκινητή, από κωδίκιο για την δημιουργία σημειακής μετάλλαξης και από μία νουκλεοτιδική αλληλουχία τουλάχιστον 10 bp, συμπληρωματική με την μη κωδική αλυσίδα του δίκλωνου πλασμιδιακού DNA. O 3 εκκινητής (R) αποτελείτο από τη συμπληρωματική νουκλεοτιδική αλληλουχία bp με το άκρο 3 του 5 εκκινητή και από μία νουκλεοτιδική αλληλουχία τουλάχιστον 10 bp, συμπληρωματική με την κωδική αλυσίδα του δίκλωνου πλασμιδιακού DNA. Προκειμένου για μεταλλάγματα, στα οποία έπρεπε να δημιουργηθούν παραπάνω από μία σημειακές κατευθυνόμενες μεταλλάξεις, πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές PCR αντιδράσεις (Πίνακας 2), χρησιμοποιώντας κάθε φορά το κατάλληλο ζεύγος εκκινητών για την νεο-εισαγόμενη μετάλλαξη ( ) και τα προϊόντα της προηγούμενης κάθε φορά PCR αντίδρασης ως μήτρα DNA. Οι συνθήκες των αντιδράσεων PCR για τις περιγραφόμενες μεταλλαξιγενέσεις ήταν οι ακόλουθες: Αρχικά, τα δείγµατα θερµάνθηκαν στους 95 C για 2 min, προκειµένου να αποδιαταχθεί το μεθυλιωμένο δίκλωνο πλασµιδιακό DNA και ακολούθησαν 20 κύκλοι ενίσχυσης µε τις ακόλουθες συνθήκες: αποδιάταξης 95 C, 50 s υβριδοποίησης 55 C, 30 s 131

142 Αποτελέσματα πολυµερισµού 72 C, 3 min, 30 s Τέλος, ακολούθησε πολυμερισμός στους 72 C για 10 min και μετασχηματισμός επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων DH5 α με τα τελικά προϊόντα των PCR αντιδράσεων, ως εξής (διαφοροποίηση από περιγραφή μεθόδου της παραγράφου ): Έγινε ανάμειξη 2 μl από τα τελικά προϊόντα της καθεμιάς PCR αντίδρασης με 100 μl επιδεκτικών DH5 α κυττάρων. Ακολούθησε θερμικό σοκ του μείγματος (42 C, 30 s) και επώαση σε πάγο για 1 min. Στη συνέχεια έγινε προσθήκη 200 μl διαλύματος SOC στο κάθε μείγμα και επώαση αυτού σε 37 C, 1 h, υπό ανάδευση (225 rpm). Έπειτα, τα βακτήρια επιστρώθηκαν σε στερεό θρεπτικό μέσο LB + ampicillin ( ) και επωάστηκαν για ~16 h στους 37ºC, οπότε και εμφανίστηκαν οι αποικίες των επιτυχώς μετασχηματισμένων βακτηρίων. Ακολούθησε παρασκευή πλασμιδιακού DNA σε μεγάλη κλίμακα ( ) και επιβεβαίωση των εισαγόμενων μεταλλάξεων με προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των ανασυνδυασμένων pbluescript πλασμιδίων, χρησιμοποιώντας τους εκκινητές Τ3 και Τ7. Αξίζει να σημειωθεί ότι στην περίπτωση του μεταλλάγματος mut- 1 εξαλείφθηκε μία θέση περιορισμού, ενώ στις περιπτώσεις των μεταλλαγμάτων mut-2 και mut-3 δημιουργήθηκαν κάποιες νέες θέσεις περιορισμού στο cdna τους, χρήσιμες για τον έλεγχο των σωστών προϊόντων με πέψη με τις αντίστοιχες ενδονουκλεάσες (Πίνακας 2, Εικόνα 36). Μεταλλάγματα α7-εκπ mut-1 PCR I PCR II PCR III PCR IV Phe3Tyr (HindIII) mut-2 Phe187Tyr (Eco47III) Val177Thr Val69Thr (SpeI) Ile165Thr (SpeI) mut-3 Phe135Tyr / Phe137Tyr (KpnI) Val132Thr mut-5 Met41Lys mut-6 Asn47Gln Asn53Gln mut-7 Asn47Gln Asn53Gln Met41Lys/Asn47Gln Πίνακας 2. Ακολουθία αλυσιδωτών PCR αντιδράσεων για την εισαγωγή πολλαπλών σημειακών μεταλλάξεων στο α7-εκπ-wt cdna. Οι 5 και 3 εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την δημιουργία της καθεμιάς αναγραφόμενης σημειακής μετάλλαξης απεικονίζονται στην παράγραφο Η περιγραφή του καθενός α7-εκπ-μεταλλάγματος αναγράφεται στον Πίνακα 1 ( 4.1.). 132

143 Αποτελέσματα Εικόνα 36. Σχηματική αναπαράσταση των cdnas των α7-εκπ-wt και μεταλλαγμάτων. Το α7-εκπ-wt cdna είναι υποκλωνοποιημένο στο πλασμίδιο pbluescript στις θέσεις XhoI και XbaI. Οι σημειακές μεταλλάξεις που πραγματοποιήθηκαν συμβολίζονται με αστερίσκους, ενώ σε σύγκριση με το cdna της α7-εκπ-wt φαίνονται οι θέσεις περιορισμού που δημιουργήθηκαν ή εξαλείφθηκαν στα απεικονιζόμενα μεταλλάγματα. Για λόγους απλότητας αναπαρίσταται η μία εκ των δύο αλυσίδων (κωδική αλυσίδα) του α7-εκπ-cdna Υποκλωνοποίηση κασετών έκφρασης α7-εκπ μορίων σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης ppiczαα Προκειμένου να ακολουθήσει η έκφραση των μεταλλαγμένων μορίων α7-εκπ του Πίνακα 1 σε κύτταρα Pichia pastoris, τα cdnas που κωδικοποιούν τα μόρια αυτά μεταφέρθηκαν από τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια pbluescript ( 4.7.) σε πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης ppiczαα, οι οποίοι στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για μετασχηματισμό επιδεκτικών κυττάρων του στελέχους X33 ( ). Έτσι, τα cdna ενθέματα που κωδικοποιούν τα αντίστοιχα μεταλλαγμένα α7-εκπ μόρια απομονώθηκαν από τα πλασμίδια pbluescript με πέψη με τη χρήση των ενζύμων περιορισμού XhoI και XbaI, τα οποία αναγνωρίζουν τις αντίστοιχες θέσεις περιορισμού που οριοθετούν τα άκρα των ενθεμάτων (Εικόνα 34 Γ) και υποκλωνοποιήθηκαν με αντίδραση σύνδεσης ( ) σε πλασμίδια ppiczαα, τα οποία είχαν επίσης υποστεί πέψη με τα ίδια ένζυμα. Σε αυτή την περίπτωση ο προσανατολισμός ένθεσης των αντίστοιχων ενθεμάτων στα ppiczαα πλασμίδια είναι μόνο ένας (5 3 ), λόγω της 133

144 Αποτελέσματα ύπαρξης συμπληρωματικών (κολλώδων) άκρων των ενθεμάτων αυτών με πλασμίδια ppiczαα μετά την πέψη τους με τα ένζυμα περιορισμού XhoI και XbaI (Εικόνα 37). A. B. Εικόνα 37. Θέσεις πέψης περιοριστικών ενζύμων που δημιουργούν συμληρωματικά άκρα. (Α) XhoI, (B). XbaI. Τα ανεστραμμένα τρίγωνα δεικνύουν τις θέσεις αναγνώρισης και πέψης του δίκλωνου μορίου DNA από τα αντίστοιχα ένζυμα περιορισμού. Η επιβεβαίωση της πραγματοποίησης των αντιδράσεων σύνδεσης των μεταλλαγμένων α7-εκπ cdna ενθεμάτων με πλασμίδια ppiczαα πραγματοποιήθηκε με την ανάπτυξη μετασχηματισμένων TOP10F βακτηριακών κυττάρων με τα αντίστοιχα μετασχηματισμένα πλασμίδια σε θρεπτικό υλικό επιλογής LB + zeocin ( ). Τα επιτυχώς μόνο μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια ppiczαα στα οποία έχει πετύχει η αντίδραση σύνδεσης μπορούν να αναπτύσσονται παρουσία ζεοσίνης, λόγω της ανθεκτικότητας που τους προσδίδεται έναντι του αντιβιοτικού αυτού από τα ενσωματωμένα πλασμίδια ppiczαα. Ακολούθησε η ανάπτυξη κλώνων από τις ανεπτυγμένες αποικίες σε αυτό το μέσο επιλογής και η παραγωγή πλασμιδιακού DNA σε μικρή κλίμακα. Στη συνέχεια ακολούθησαν αντιδράσεις πέψης των πλασμιδιακών DNAs με τη ταυτόχρονη χρήση των ενζύμων XhoI και XbaI. H ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων από τα προϊόντα αυτών των αντιδράσεων σε πήκτωμα 1% κ.β. αγαρόζης επιβεβαίωσε την ύπαρξη των α7-εκπ ενθεμάτων, αφού προέκυψαν ζώνες που αντιστοιχούσαν στο αναμενόμενο μέγεθος ~650 bp, που αντιστοιχεί στην απόσταση μεταξύ των δύο θέσεων περιορισμού XhoI και XbaI στην περίπτωση επιτυχούς σύνδεσης των ενθεμάτων αυτών με το πλασμίδιο ppiczαα (Εικόνα 34 Α). Στην περίπτωση των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων ppiczαα με μεταλλαγμένα α7-εκπ cdna τμήματα, στα οποία είχαν δημιουργηθεί χαρακτηριστικές θέσεις περιορισμού (Πίνακας 2, Εικόνα 36), πραγματοποιήθηκε περαιτέρω επιβεβαίωση με τη χρήση ενζύμων που αναγνωρίζουν τις νέες αυτές θέσεις ταυτόχρονα με τη χρήση ενζύμων XhoI ή XbaI. Οι μετασχηματισμένοι βακτηριακοί κλώνοι, οι οποίοι έφεραν τα επιθυμητά ανασυνδυασμένα πλασμιδιακά DNAs, χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για παρασκευή ανασυνδυασμένων ppiczαα πλασμιδίων σε μεγάλη κλίμακα ( ). 134

145 Αποτελέσματα 4.9. Έκφραση των ανασυνδυασμένων α7-εκπ πολυπεπτιδίων σε κύτταρα P. pastoris Τα ανασυνδυασμένα πλέον ppiczαα πλασμίδια με τα μεταλλαγμένα α7-εκπ cdna ενθέματα που κωδικοποιούν τα α7-εκπ μόρια του Πίνακα Ι (mut1 έως mut-7), χρησιμοποιήθηκαν για το μετασχηματισμό κυττάρων X33 της P. pastoris, ώστε να ακολουθήσει η επιλογή σε μικρής κλίμακας καλλιέργειες των κλώνων που θα οδηγούνταν σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας προκειμένου να εκφρασθούν τα αντίστοιχα πολυπεπτιδικά τμήματα Επιλογή μετασχηματισμένων κυττάρων P. pastoris με τα πλασμίδια ppicζαα-α7-εκπ για έκφραση Οι ανασυνδυασμένοι φορείς έκφρασης ppicζαα με τα μεταλλαγμένα α7-εκπ cdna ενθέματα ( 4.8.), χρησιμοποιήθηκαν για το μετασχηματισμό επιδεκτικών στελεχών Χ33 του μύκητα P. pastoris ( ). Η γραμμικοποίηση των ανασυνδυασμένων αυτών πλασμιδίων ( ) έγινε με τη χρήση του ενζύμου περιορισμού SacI (Εικόνα 34 Α), το οποίο αναγνωρίζει μία μοναδική θέση περιορισμού στο γενετικό τόπο 5 ΑΟΧ1 του ppiczαα, και επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της αντίδρασης σε πήκτωμα 1% κ.β. αγαρόζης. Μετά τον καθαρισμό των προϊόντων γραμμικοποίησης με εκχύλιση με οργανικούς διαλύτες ( ) ακολούθησε ο μετασχηματισμός επιδεκτικών κυττάρων Χ33, οπότε τα ανασυνδυασμένα πλασμιδιακά DNAs ενσωματώθηκαν στο γενετικό τόπο ΑΟΧ1 του γονιδιώματος αυτών των κυττάρων με ομόλογο ανασυνδυασμό ( ) Οι επιτυχώς μετασχηματισμένοι κλώνοι Χ33 με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια ppicζαα-α7-εκπ-mut-1 έως mut-7 (Πίνακας 1), επιλέγχθηκαν σε θρεπτικό μέσο YPDS-άγαρ + zeocin ( ), αφού πλέον μόνο τα επιτυχώς μετασχηματισμένα κύτταρα με το ppiczαα πλασμίδιο φέρουν το γενετικό τόπο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό ζεοσίνη στο γονιδίωμά τους (Εικόνα 34 Α). Οι αναπτυγμένοι κλώνοι στο θρεπτικό μέσο επιλογής, οδηγήθηκαν στη συνέχεια για έκφραση σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας, ώστε να επιλεγούν για έκφραση σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας εκείνοι οι κλώνοι που θα παρουσίαζαν καλύτερα επίπεδα έκφρασης των ανασυνδυασμένων μεταλλαγμένων α7-εκπ πρωτεϊνών. 135

146 Αποτελέσματα Έλεγχος έκφρασης ανασυνδυασμένων μεταλλαγμένων α7- ΕΚΠ μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας Οι επιλεγμένοι με την προηγούμενη διαδικασία μετασχηματισμένοι κλώνοι Χ33 ελέγχθηκαν για τα επίπεδα έκφρασης των μεταλλαγμένων α7-εκπ μορίων σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας ( Α). Ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε σε δείγματα υπερκειμένων των καλλιεργειών αυτών και στηρίχθηκε στην ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες (dot blot) ( ) με τη χρήση αντι-myc αντισώματος και σε πειράματα απ ευθείας πρόσδεσης 125 Ι-α-bgtx ( ). Χρησιμοποιήθηκε το αντι-myc αντίσωμα, επειδή τα εκφρασμένα μόρια α7-εκπ φέρουν πλέον τον επίτοπο c-myc, προς το καρβοξυ-τελικό τους άκρο, ο οποίος προσδίδεται σε αυτά από το φορέα έκφρασης ppiczαα (Εικόνες 22 Α, 38). Ώς μέτρο σύγκρισης των επιπέδων έκφρασης των μεταλλαγμένων, με βάση το μοντέλο α7-εκπ, α7-εκπ μορίων, χρησιμοποιήθηκε το προϋπάρχον διπλό μετάλλαγμα α7-εκπ (α7-εκπ-dm), καθώς και το α7-εκπ-wt, τα οποία ήταν ήδη κλωνοποιημένα σε πλασμίδια ppiczα. Έτσι, τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια ppiczαα-α7-εκπ-wt και ppiczαα-α7-εκπ-dm (Εικόνες 34 Α, Β) χρησιμοποιήθηκαν επίσης για το μετασχηματισμό κυττάρων X33 με τις ίδιες συνθήκες και παράλληλα με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια ppiczαα-α7-εκπmut-1 έως mut-7 ( ). Στη συνέχεια οι αντίστοιχοι επιλεγμένοι μετασχηματισμένοι κλώνοι εκφράσθηκαν σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας παράλληλα με τους κλώνους που εξέφραζαν τα καινούρια μεταλλαγμένα α7-εκπ μόρια της παρούσης μελέτης. Εικόνα 38. Σχηματική απεικόνιση των εκφραζόμενων αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων α7-εκπ μορίων. Ο c-myc επίτοπος και η ετικέτα έξι ιστιδινικών καταλοίπων που βρίσκονται στο καρβοξυ-τελικό άκρο των εκραζόμενων μορίων, προσδίδονται σε αυτά από τον πλασμιδιακό φορέα έκφρασης ppiczαα (Εικόνα 22 Α). Ο αριθμός των αμινοξικών καταλοίπων των ώριμων α7-εκπ μορίων, μετά την αποκοπή του πεπτιδίου-οδηγού (α-factor) απεικονίζεται μέσα στην παρένθεση. Έτσι, μετά από 48 h επαγωγής της έκφρασης των αντίστοιχων πολυπεπτιδικών τμημάτων από διάφορους κλώνους σε 5 ml BMMY ( ), απομονώθηκαν 136

147 Αποτελέσματα ποσότητες υπερκειμένων των 100 και 200 μl και ακολούθησε ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες (dot blot) ( ) με τη χρήση αντι-myc αντισώματος. Με τον τρόπο αυτό συγκρίθηκε η ένταση των κηλίδων ανοσοαποτύπωσης για τα δείγματα υπερκειμένου διάφορων κλώνων καθενός από τα μετασχηματισμένα X33 κύτταρα με ανασυνδυασμένο ppiczαα πλασμίδιο που έφερε το cdna για καθένα από τα μεταλλαγμένα α7-εκπ μόρια. Στη συνέχεια επιλέγχθηκαν εκείνοι οι κλώνοι των οποίων τα υπερκείμενα έδειξαν κηλίδες μεγαλύτερης έντασης σε σχέση με άλλους μετασχηματισμένους κλώνους με το ίδιο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο (Εικόνα 39), ώστε αυτοί να οδηγηθούν σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας. Μάλιστα, η ένταση των κηλίδων τους συγκρίθηκε και με την ένταση της κηλίδας που προήλθε από αναοσοαποτύπωση ίδιας ποσότητας δείγματος υπερκειμένου από καλλιέργεια σε μικρή κλίμακα κλώνου X33 μετασχηματισμένου με ppiczαα-α7-εκπ-dm, διότι από προηγούμενες μελέτες είχε διαπιστωθεί ότι η έκφραση του διπλού μεταλλάγματος α7-εκπ βρίσκονταν σε υψηλότερα επίπεδα από αυτήν του α7-εκπ-wt (Avramopoulou et al 2004). Με αυτό τον τρόπο έγινε και μία προεκτίμηση των επιπέδων έκφρασης των μεταλλαγμένων α7- ΕΚΠ μορίων της παρούσης μελέτης. Εικόνα 39. Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών υπερκειμένου καλλιεργειών μικρής κλίμακας σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες (dot blot) με τη χρήση αντι-myc αντισώματος. Σε αυτή την εικόνα απεικονίζονται οι κηλίδες ανοσοαποτύπωσης με χρήση 200 και 100 μl δείγματος υπερκειμένου από 20 διαφορετικούς κλώνους (1-20) μετασχηματισμένους με το ίδιο πλασμίδιο ppiczαα και στο οποίο, στην προκειμένη περίπτωση, είχε κλωνοποιηθεί το cdna που κωδικοποιεί την έκφραση του α7-εκπ-mut-2 (Πίνακας 1, 4.1.). Η κηλίδα με τον αριθμό 21 αντιπροσωπεύει ίδια ποσότητα δείγματος υπερκειμένου από κλώνο ο οποίος χρησιμοποιείται για την έκφραση του προϋπάρχοντος διπλού μεταλλάγματος (α7-εκπ-dm) γνωστών επιπέδων έκφρασης. H άχρωμη κηλίδα μετά από αυτή με τον αριθμό 21, αντιστοιχεί σε ίδια ποσότητα σκέτου θρεπτικού υλικού BMMY με αυτή των δειγμάτων υπερκειμένων, στο οποίο δεν υπάρχει έκφραση α7-εκπ μορίων και χρησιμοποιείται ως αρνητικός μάρτυρας για την μη ειδική δέσμευση του αντιmyc αντισώματος σε μόρια που δεν φέρνουν το c-myc επίτοπο. Στο συγκεκριμένο αντιπροσωπευτικό παράδειγμα, οι κλώνοι με τους αριθμούς 6 και 11, επιλέγχθηκαν για έκφραση σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας. 137

148 Αποτελέσματα Ένας επιπλέον έλεγχος του επιπέδου έκφρασης των καινούριων μεταλλαγμένων α7- ΕΚΠ μορίων, πραγματοποιήθηκε με πειράματα απ ευθείας πρόσδεσης 125 Ι-α-bgtx ( ) σε δείγματα υπερκειμένων τους μετά από 48 h επαγωγής τους σε ΒΜΜΥ. Προκειμένου να πραγματοποιηθεί αυτός ο έλεγχος, ακολούθησε 20 φορές συμπύκνωση των υπερκείμενων των με ταυτόχρονη διαπίδυση έναντι 10 mm PB, 100 mm NaCl, 1 mm DTT, ph 7,5, ώστε να απομακρυνθούν τα άλατα που υπάρχουν στο θρεπτικό υλικό των καλλιεργειών και παρεμποδίζουν την πρόσδεση α-bgtx. Στη συνέχεια, ελέγχθηκε η ικανότητα πρόσδεσης 2 μl από το κάθε συμπυκνωμένο υπερκείμενο σε 125 Ι-α-bgtx, ενώ ώς μέτρο σύγκρισης των επιπέδων έκφρασης των μεταλλαγμένων α7-εκπ μορίων, χρησιμοποιήθηκε ίδια ποσότητα μορίων α7-εκπ-dm που εκφράσθηκαν με τις ίδιες συνθήκες από κατάλληλα μετασχηματισμένα κύτταρα X33. Έτσι, επιλέγχθηκαν για έκφραση σε μεγαλύτερη κλίμακα, εκείνοι οι κλώνοι του καθενός από τα μετασχηματισμένα X33 κύτταρα με συγκεκριμένο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο, οι οποίοι έδειξαν υψηλότερες τιμές Δcpm προσδεδεμένης 125 Ι-α-bgtx, και άρα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης, σε σχέση με άλλους. Αξίζει να σημειωθεί, ότι τα αποτελέσματα επιλογής των μετασχηματισμένων κλώνων με αυτό τον τρόπο επιβεβαίωσαν τα αποτελέσματα επιλογής με τα πειράματα ανοσοαποτύπωσης υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες Έκφραση ανασυνδυασμένων α7-εκπ μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Οι μετασχηματισμένοι κλώνοι X33 με τα πλασμίδια ppiczαα, στα οποία ήταν κλωνοποιημένα τα cdnas των α7-εκπ μεταλλαγμάτων, και οι οποίοι βρέθηκαν να εκφράζουν τα αντίστοιχα α7-εκπ μόρια σε ικανοποιητικό βαθμό ( ), οδηγήθηκαν για την επαγωγή έκφρασης σε καλλιέργειες BMMY μεγάλης κλίμακας (καλλιέργειες BMMY, όγκου 2 L) ( Β). Στη συνέχεια ακολούθησε η απομόνωση των εκφραζόμενων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών από το υπερκείμενο της καλλιέργειας ( ) και το 1 ο στάδιο καθαρισμού τους σε στήλη ρητίνης συζευγμένης με ιόντα νικελίου (Ni 2+ ) ( ). Ο έλεγχος δειγμάτων από τα κλάσματα πλύσης και έκλουσης, αλλά και του αρχικού διαλύματος της πρωτεΐνης μετά την θεωρητική απομάκρυνσή της από αυτό, πραγματοποιήθηκε με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση ( ), καθώς και με πειράματα απ ευθείας πρόσδεσης 125 Ι-α-bgtx 138

149 Αποτελέσματα ( ), και έδειξε τα εξής: Α. Τα εκφρασμένα στο υπερκείμενο μόρια α7-εκπ απομακρύνθηκαν πλήρως από αυτό μετά την ολονύκτια δέσμευσή τους σε στήλη Ni 2+ -ΝΤΑ. Β. Τα προσδεδεμένα στη στήλη Ni 2+ -ΝΤΑ μόρια α7-εκπ εκλούσθηκαν από αυτή με τη χρήση συγκέντρωσης 150 mm του ανταγωνιστή ιμιδαζολίου για τις θέσεις πρόσδεσης στις ομάδες Ni 2+ της στήλης. Τα αποτελέσματα αυτά σε σχέση με τα αντίστοιχα που είχαν παρατηρηθεί κατά την έκφραση των μορίων HisTEVα7-ΕΚΠ-wt και HisTEVα7-ΕΚΠ-dm ( ), τα οποία έφεραν την ετικέτα 6 His στο αμινο-τελικό τους άκρο, επιβεβαίωσαν την αρνητική επίπτωση της παρουσίας 6 His ετικέτας στο αμινο-τελικό άκρο, όσον αφορά στην έκφραση των αντίστοιχων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Στη συνέχεια προχωρήσαμε στην συνένωση των κλασμάτων έκλουσης με 150 mm ιμιδαζολίου των γλυκοζυλιωμένων α7-εκπ πρωτεϊνών και στο 2 ο στάδιο καθαρισμού τους με χρωµατογραφία µοριακής διήθησης ( ). Προκειμένου να έχουμε ένα μέτρο σύγκρισης των εκφραζόμενων καινούριων α7-εκπ μεταλλαγμάτων (mut-1 έως mut-7), κρίθηκε απαραίτητη η παράλληλη μελέτη των α7-εκπ μορίων αγρίου τύπου και διπλού μεταλλάγματος Έκφραση α7-εκπ μορίων αγρίου τύπου (wt) και διπλού μεταλλάγματος (dm) από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Η έκφραση των μορίων α7-εκπ-wt και α7-εκπ-dm σε κύτταρα P. pastoris από το πλασμίδιο ppiczαα είχε μελετηθεί στο παρελθόν στο εργαστήριό μας (Avramopoulou et al 2004). Παρόλα αυτά, για λόγους σύγκρισης με τα α7-εκπ μεταλλάγματα της παρούσης μελέτης που επρόκειτο να εκφρασθούν στη συνέχεια, κρίθηκε απαραίτητος ο εκ νέου χρακτηρισμός τους με τις ίδιες ακριβώς συνθήκες και διαδικασίες που θα ακολουθούνταν και για τα καινούρια μεταλλαγμένα α7-εκπ μόρια. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 40, τα α7-εκπ μόρια (wt και dm) εκλούσθηκαν από τη στήλη ρητίνης συζευγμένης με ιόντα Ni 2+ με τη χρήση διαλύματος περιέχοντος 150 mm ιμιδαζολίου ( ), υπό τη μορφή διπλής μπάντας που αντιστοιχεί σε μοριακό βάρος ~38 kda, υποδηλώνοντας την γλυκοζυλίωση των εκφραζόμενων μορίων, αφού το αναμενόμενο μοριακό βάρος των πολυπεπτιδικών αυτών τμημάτων με βάση τον αριθμό των αμινοξικών τους καταλοίπων είναι ~27 kda. Η παρουσία της διπλής αυτής 139

150 Αποτελέσματα μπάντας υποδηλώνει πιθανότατα διαφορετικό βαθμό γλυκοζυλίωσης των παραγόμενων αυτών πολυπεπτιδικών τμημάτων. Η ύπαρξη των α7-εκπ μορίων στα κλάσματα έκλουσης 150 mm ιμιδαζολίου επιβεβαιώθηκε με πειράματα απ ευθείας πρόσδεσης 125 Ι-α-bgtx σε κατάλληλες ποσότητες δειγμάτων από τα εκλούσματα αυτά (χρήση δειγμάτων 0,1 και 0,01 μl). Ακολούθησε η συνένωση των κλασμάτων έκλουσης 150 mm ιμιδαζολίου, η συμπύκνωσή τους σε όγκο 500 μl με ταυτόχρονη διαπίδυση με κατάλληλο διάλυμα χρωματογραφίας μοριακού αποκλεισμού ( ) και το 2 ο στάδιο καθαρισμού τους με χρωματογραφία μοριακής διήθησης ( ). mm ιμιδαζολίου kda Εικόνα 40. SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνικών δειγμάτων από διαφορετικά στάδια του 1 ου σταδίου καθαρισμού μορίων α7-εκπ-wt ή α7-εκπ-dm. Το κύριο κλάσμα έκλουσης των α7-εκπ μορίων αντιστοιχεί στα 150 mm ιμιδαζολίου. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 41, τα α7-εκπ μόρια (wt και dm) εκφράζονται με τη μορφή συσσωματωμάτων υψηλού μοριακού βάρους (~2000 kda) και με τη μορφή ολιγομερών με μοριακά βάρη που ξεπερνούν το αναμενόμενο ΜΒ για πενταμερή μόρια, δεδομένου του γεγονότος ότι το ΜΒ των γλυκοζυλιωμένων πρωτομερών α7 είναι ~38 kda και άρα το ΜΒ των γλυκοζυλιωμένων πενταμερών που θα επιθυμούσαμε είναι ~190 kda. Βέβαια, το διπλό μετάλλαγμα α7-εκπ-dm είναι πιο υδρόφιλο από το α7-εκπ-wt, αφού αφ ενός μεν ο λόγος της ποσότητας των υψηλού μοριακού βάρους συσσωματωμάτων προς την ποσότητα των ολιγομερών (1:2,5) είναι μειωμένος σε σχέση με τον αντίστοιχο για α7-εκπ-wt (1:1,25) και αφ ετέρου δε τα προκύπτοντα ολιγομερή του εκλούονται σε περιοχές που αντιστοιχούν σε μικρότερο μοριακό βάρος (232 kda < ΜΒ < 440 kda) από αυτό που αντιστοιχεί στην περιοχή έκλουσης των ολιγομερών μορίων α7-εκπ-wt (ΜΒ = 440 kda). Επίσης, το επίπεδο έκφρασης των α7-εκπ-wt και α7-εκπ-dm πρωτεϊνών υπό τη μορφή ολιγομερών (δηλαδή η ποσότητα των μορίων που αντιστοιχεί στην δεύτερη από αριστερά κορυφή του 140

151 Αποτελέσματα χρωματογραφήματος της Εικόνας 41) υπολογίσθηκε με τη μέθοδο Bradford ότι είναι ~0,2 mg/l και ~0,5 mg/l καλλιέργειας, αντίστοιχα, επιβεβαιώνοντας παλαιότερες μελέτες (Avramopoulou et al 2004). Αυτή η απόδοση έκφρασης των ανασυνδυασμένων α7-εκπ-wt και α7-εκπ-dm είναι σημαντικά αυξημένη σε σχέση με την αντίστοιχη που είχε παρατηρηθεί για τα HisTEVα7-ΕΚΠ-wt και HisTEVα7-ΕΚΠ-dm μόρια ( ), τα οποία έφεραν την ετικέτα 6 His στο αμινο-τελικό τους άκρο. Επίσης, όπως φαίνεται από τις κηλίδες ανοσοαποτύπωσης υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες πρωτεϊνών από κατάλληλα δείγματα έκαστου εκλούσματος χρωματογραφήματος με τη χρήση αντι-myc αντισώματος, τα εκφρασμένα α7-εκπ μόρια (wt και dm) ανιχνεύονται σε όλο το εύρος των εκλουσμάτων, επιβεβαιώνοντας τις καμπύλες δέσμευσης 125 I-α-bgtx που συνοδεύουν το κάθε χρωματογράφημα (Εικόνα 41). Έτσι, το αποτέλεσμα έκφρασης μορίων α7-εκπ αγρίου τύπου και διπλά μεταλλαγμένων οδηγεί σε ένα αρκετά ετερογενή πληθυσμό α7-εκπ μορίων με διαφορετικό βαθμό ολιγομερούς σύστασης. Προκειμένου να βρεθεί εκείνη η ποσότητα δείγματος από το κάθε έκλουσμα των αντίστοιχων χρωματογραφημάτων μοριακής διήθησης που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση των δραστικών εκλουόμενων α7-εκπ μορίων, προηγήθηκε η κατασκευή δοσο-εξαρτώμενης καμπύλης πρόσδεσης της 125 I-α-bgtx με χρησιμοποιούμενες αυξανόμενες ποσότητες πρωτεϊνικού δείγματος από το έκλουσμα των χρωματογραφημάτων που αντιστοιχεί στο μέγιστο της οπτικής απορρόφησης (Α 280 ) των εκλουόμενων ολιγομερών. Έτσι, όπως φαίνεται στην Εικόνα 42 για το παράδειγμα των α7-εκπ-wt μορίων, βρέθηκε ότι το πλατώ δέσμευσης 125 I-α-bgtx αντιστοιχούσε σε ποσότητες δειγμάτων αντίστοιχου εκλούσματος (Εικόνα 41 Α) μεγαλύτερες από 1 μl. Έτσι, για την κατασκευή καμπύλης πρόσδεσης της 125 I-α-bgtx καθ όλο το εύρος του αντίστοιχου χρωματογραφήματος των wt μορίων, χρησιμοποιήθηκε ποσότητα δείγματος από το κάθε έκλουσμα ίση προς 0,2 μl, που αντιστοιχούσε στην περιοχή της λογαριθμικής φάσης της κατασκευαζόμενης καμπύλης της Εικόνας 42, που περιγράφηκε προηγουμένως. Προκειμένου για όλα τα άλλα εκφραζόμενα α7-εκπ μόρια, των οποίων τα χρωματογραφήματα παρουσιάζονται στη συνέχεια, ακολουθήθηκε η ίδια πορεία για την έυρεση της ποσότητας του δείγματος από κάθε έκλουσμα μοριακής τους διήθησης, η οποία χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή των αντίστοιχων καμπυλών πρόσδεσης 125 I-α-bgtx που συνοδεύουν τα αντίστοιχα χρωματογραφήματα. 141

152 Αποτελέσματα A. 1,0 A 280 Δcpm α7-εκπ-wt kda 2000 A 280 0, kda 232 kda 158 kda Δcpm/ 0.2μL 500 0, Όγκος έκλουσης (ml) 5 μl / έκλουσμα 25 μl / έκλουσμα B. 1,0 A 280 Δcpm 440 kda 232 kda α7-εκπ-dm A 280 0, kda 158 kda Δcpm / 0.1μL , Όγκος έκλουσης (ml) 1 μl / έκλουσμα 5 μl / έκλουσμα Εικόνα 41. Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης σε σύστημα Akta FPLC purifier με τη χρήση στήλης Superose 12. (A) α7-εκπ-wt. (B) α7-εκπ-dm. Τα χρωματογραφήματα των α7-εκπ-μορίων (γλυκοζυλιωμένα μόρια) απεικονίζονται με τη συνεχή γραμμή, ενώ με τη διακεκομένη γραμμή συνδέονται τα σημεία (ανεστραμμένα τρίγωνα) που αντιστοιχούν στις μετρούμενες κρούσεις (Δcpm) της δεσμευμένης 125 Ι-α-bgtx (χρησιμοποιούμενη ποσότητα: cpm) μετά την αφαίρεση της μη ειδικής δέσμευσης ( ), χρησιμοποιώντας 0,2 μl και 0,1 μl από το καθένα από τα εκλούσματα των α7-εκπ-wt και α7-εκπ-dm, αντίστοιχα. Τα τόξα δείχνουν τους όγκους έκλουσης πρωτεϊνώνμαρτύρων με γνωστά μοριακά βάρη. Στο κάτω μέρος του καθενός χρωματογραφήματος απεικονίζονται κηλίδες ανοσοαποτύπωσης υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση αντι-myc αντισώματος και κατάλληλης ποσότητας δείγματος από το κάθε έκλουσμα. 142

153 Αποτελέσματα Bound 125I-α-bgtx (Δcpm) ,001 0,01 0, μl δείγματος Εικόνα 42. Δοσο-εξαρτώμενη καμπύλη πρόσδεσης 125 Ι-α-bgtx σε α7-εκπ-wt μόρια. To δείγμα των α7-εκπ-wt μορίων προέρχεται από το έκλουσμα του χρωματογραφήματός του, το οποίο αντιστοιχεί στο μέγιστο της απορρόφησης (Α 280 ) των εκλουόμενων ολιγομερών (Εικόνα 41 Α) Έκφραση α7-εκπ-mut-1 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Το μετάλλαγμα mut-1 περιείχε μία σημειακή κατευθυνόμενη μετάλλαξη στo αμινοτελικό άκρο του α7-εκπ μορίου (Πίνακας 1). Η μετάλλαξη αυτή, αφορά στην αντικατάσταση ενός υδρόφοβου αμινοξέος, το οποίο βρέθηκε από το τρισδιάστατο α7- ΕΚΠ μοντέλο ( 4.1.) να εκτείνεται προς το εξωτερικό περιβάλλον του α7-εκπ μορίου από ένα πιο υδρόφιλο αμινοξύ (Phe3Tyr) και το οποίο ανήκει στην αμινο-τελική α- έλικα του μοντέλου (Εικόνα 24). Ο σκοπός πραγματοποιήσής της ήταν προκειμένου να μειωθεί η πιθανότητα σχηματισμού υδρόφοβων διαμοριακών αλληλεπιδράσεων και άρα και η πιθανότητα έκφρασης ολιγομερών και συσσωματωμάτων υψηλού μοριακού βάρους. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 43, τα mut-1 μόρια εκφράζονται υπό τη μορφή συσσωματωμάτων υψηλού μοριακού βάρους (~2000 kda) και με τη μορφή ολιγομερών με μοριακό βάρος ~440 kda. Έτσι, η μοναδική αυτή μετάλλαξη δεν στάθηκε από μόνη της ικανή να μειώσει σημαντικά την υδροφοβικότητα των α7-εκπ μορίων. Εν τούτοις, σε σχέση με το α7-εκπ-wt μόριο (Εικόνα 41 Α), παρατηρήθηκε μία μείωση του ποσοστού έκφρασης συσσωματωμάτων / ολιγομερή, αφού αυτός ο λόγος πλέον είναι 1:2 έναντι του λόγου 1:1,25 στην περίπτωση του α7-εκπ-wt. Επίσης, η απόδοση έκφρασης ολιγομερών α7-εκπ-mut-1 μορίων βρέθηκε ελαφρώς αυξημένη (~0,3 mg/l) 143

154 Αποτελέσματα από αυτή των μορίων αγρίου τύπου (~0,2 mg/l), γεγονός που μπορεί να οφείλεται στην σχετικά πιο υδρόφιλη μορφή των παραγόμενων α7-εκπ-mut-1 μορίων από αυτή των α7-εκπ-wt. Επίσης, όπως φαίνεται από τις κηλίδες ανοσοαποτύπωσης πρωτεϊνών υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση αντι-myc αντισώματος για καθένα από τα εκλούσματα του χρωματογραφήματος (Εικόνα 43), τα εκφρασμένα α7-εκπ-mut-1 μόρια ανιχνεύονται, επίσης όπως και στην περίπτωση των α7-εκπ-wt μορίων, σε όλο το εύρος των εκλουσμάτων, επιβεβαιώνοντας τις καμπύλες δέσμευσης 125 I-α-bgtx που συνάδουν με την καμπύλη οπτικής απορρόφησης (Α 280 ). Συμπερασματικά, η μετάλλαξη Phe3Tyr οδήγησε σε ελαφρώς πιο υδρόφιλα α7- ΕΚΠ μόρια από αυτά του αγρίου τύπου, αλλά όχι στον βαθμό που θα επιθυμούσαμε, προκειμένου να παρασκευάσουμε α7-εκπ μόρια, κατάλληλα για δομικές μελέτες. 1,00 A 280 Δcpm 440 kda α7-εκπ-mut , kda 2000 A 280 0, kda 158 kda Δcpm / 0,2 μl 0, , Όγκος έκλουσης (ml) 1 μl / έκλουσμα 5 μl / έκλουσμα Εικόνα 43. Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης mut-1 μορίων. Τo χρωματογράφημα των α7-εκπ-mut-1 μορίων (γλυκοζυλιωμένα μόρια) απεικονίζεται με τη συνεχή γραμμή, ενώ με τη διακεκομένη γραμμή συνδέονται τα σημεία (ανεστραμμένα τρίγωνα) που αντιστοιχούν στις μετρούμενες κρούσεις (Δcpm) της δεσμευμένης 125 Ι-α-bgtx (χρησιμοποιούμενη ποσότητα: cpm) μετά την αφαίρεση της μη ειδικής δέσμευσης ( ), χρησιμοποιώντας 0,2 μl από το καθένα από τα εκλούσματα. Τα τόξα δείχνουν τους όγκους έκλουσης πρωτεϊνών-μαρτύρων με γνωστά μοριακά βάρη. Στο κάτω μέρος του χρωματογραφήματος απεικονίζονται κηλίδες ανοσοαποτύπωσης υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση αντι-myc αντισώματος και κατάλληλης ποσότητας δείγματος από το κάθε έκλουσμα. 144

155 Αποτελέσματα Έκφραση α7-εκπ-mut-2 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Το μετάλλαγμα mut-2 περιείχε τέσσερεις σημειακές κατευθυνόμενες μεταλλάξεις που αφορούσαν επίσης την αντικατάσταση υδρόφοβων αμινοξικών καταλοίπων που βρίσκονταν σε διάφορες β-πτυχωτές επιφάνειες του μοντέλου της α7-εκπ και εκτείνονταν στο εξωτερικό του μοντέλου από υδρόφιλα κατάλοιπα (Εικόνα 24, Πίνακας 1). Οι μεταλλάξεις αυτές πραγματοποιήθηκαν ώστε να επιχειρηθεί η μείωση της πιθανότητας σχηματισμού υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων μεταξύ των εκφραζόμενων μορίων μέσω αυτών των αμινοξικών καταλοίπων. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 44, τα mut-2 μόρια εμφάνισαν μία σημαντική μείωση της μορφής έκφρασής τους ως συσσωματώματα υψηλού μοριακού βάρους (~2000 kda), σε σχέση με τα μόρια α7-εκπ-wt (Εικόνα 41 Α). Παράλληλα, τα εκφραζόμενα ολιγομερή των mut-2 μορίων εκλούσθηκαν σε περιοχές που αντιστοιχούν σε χαμηλότερο μοριακό βάρος από αυτό το οποίο αντιστοιχεί στα αντίστοιχα εκλούσματα των α7-εκπ-wt ολιγομερών μορίων (440 kda). Επίσης, ο λόγος των ποσοτήτων των εκφραζόμενων συσσωματωμάτων προς ολιγομερή μόρια βρέθηκε να είναι σημαντικά μειωμένος σε σχέση με τον αντίστοιχο των α7-εκπ-wt (1:1,25), αλλά και των α7- ΕΚΠ-dm (1:2,5) μορίων, αφού αυτός υπολογίστηκε στην προκειμένη περίπτωση να είναι ίσος με 1:4. Εν τούτοις, τα εκφραζόμενα mut-2 ολιγομερή μόρια εκλούσθηκαν σε περιοχές που αντιστοιχούσαν σε παραπλήσια μοριακά βάρη σε σχέση με τα α7-εκπ-dm μόρια (Εικόνα 41 Β). Έτσι, οι νεο-εισαγόμενες αυτές τέσσερεις μεταλλάξεις ενώ οδήγησαν στη σημαντική άυξηση της υδροφιλικότητας των παραγόμενων α7-εκπ μορίων, παρόλα αυτά δεν οδήγησαν στην παραγωγή ολιγομερών με μοριακό βάρος χαμηλότερο από αυτό του καλύτερου προς στιγμήν προϋπάρχοντος διπλού μεταλλάγματος. Όσον αφορά στο επίπεδο έκφρασης ολιγομερών mut-2 μορίων, αυτό βρέθηκε σημαντικά αυξημένο (~0,4 mg/l) από αυτό των μορίων αγρίου τύπου (~0,2 mg/l) και λίγο πιο χαμηλό από αυτό των α7-εκπ-dm μορίων, σε συμφωνία με την παρατηρούμενη διαλυτότητά τους. Όπως φαίνεται από τις κηλίδες ανοσοαποτύπωσης πρωτεϊνών υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση αντι-myc αντισώματος για καθένα από τα εκλούσματα του χρωματογραφήματος (Εικόνα 44), τα εκφρασμένα mut-2 μόρια ανιχνεύονται σε σχετικά μικρότερο εύρος εκλουσμάτων από τα αντίστοιχα των α7-145

156 Αποτελέσματα ΕΚΠ-wt και α7-εκπ-dm μορίων (Εικόνα 41), υποδηλώνοντας μία αύξηση στο βαθμό ομοιογένειας των παραγόμενων α7-εκπ μορίων. Η καμπύλη δέσμευσης 125 I-α-bgtx είναι επίσης σε συμφωνία με την καμπύλη οπτικής απορρόφησης (A 280 ), όπως και στις περιπτώσεις των προαναφερθεισών α7-εκπ μορίων. Συμπερασματικά, οι τέσσερεις νεο-εισαγόμενες μεταλλάξεις που αντιστοιχούν στο μετάλλαγμα mut-2 (Πίνακας 1), οδήγησαν σε μία σημαντική βελτίωση της διαλυτότητας των α7-εκπ μορίων, η οποία όμως δεν συνοδεύτηκε από σημαντική βελτίωση του μοριακού βάρους των εκλουόμενων ολιγομερών σε σχέση με τα α7- ΕΚΠ-dm μόρια ( ). Παρόλα αυτά, φάνηκε πως η επιλογή των αμινοξικών αυτών καταλοίπων ήταν ιδιαίτερα επιτυχής και υποσχόμενη, προκειμένου να ακολουθήσει η μελέτη τους σε συνδυασμό με άλλες εξίσου πετυχημένες μεταλλάξεις, προς το σχηματισμό επιθυμητών για δομικές μελέτες α7-εκπ μορίων. 1,0 A 280 Δcpm 440 kda 232 kda α7-εκπ-mut A 280 0, kda 158 kda Δcpm / 0,1 μl 500 0, Όγκος έκλουσης (ml) 1 μl / έκλουσμα 5 μl / έκλουσμα Εικόνα 44. Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης mut-2 μορίων. Τo χρωματογράφημα των mut-2 μορίων (γλυκοζυλιωμένα μόρια) απεικονίζεται με τη συνεχή γραμμή, ενώ με τη διακεκομένη γραμμή συνδέονται τα σημεία (ανεστραμμένα τρίγωνα) που αντιστοιχούν στις μετρούμενες κρούσεις (Δcpm) της δεσμευμένης 125 Ι-α-bgtx (χρησιμοποιούμενη ποσότητα: cpm) μετά την αφαίρεση της μη ειδικής δέσμευσης ( ), χρησιμοποιώντας 0,1 μl από το καθένα από τα εκλούσματα. Τα τόξα δείχνουν τους όγκους έκλουσης πρωτεϊνών-μαρτύρων με γνωστά μοριακά βάρη. Στο κάτω μέρος του χρωματογραφήματος απεικονίζονται κηλίδες ανοσοαποτύπωσης υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση αντι-myc αντισώματος και κατάλληλης ποσότητας δείγματος από το κάθε έκλουσμα. 146

157 Αποτελέσματα Έκφραση α7-εκπ-mut-3 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Στα πλαίσια μελέτης του αντίκτυπου της αντικατάστασης υδρόφοβων και εκτειθέμενων αμινοξικών καταλοίπων στο εξωτερικό περιβάλλον του α7-εκπ μορίου, κατασκευάσθηκε και εκφράσθηκε επίσης το μετάλλαγμα mut-3. Αυτό περιείχε τρείς σημειακές κατευθυνόμενες μεταλλάξεις καταλοίπων (Πίνακας 1) που βρίσκονται στη συντηρημένη Cys θηλιά της υπερ-οικογένειας LGICs (Εικόνα 24). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 45, η ολιγομερής μορφή των εκφραζόμενων α7-εκπmut-3 μορίων αντιστοιχεί σε μοριακό βάρος χαμηλότερο από τα 440 kda των αντίστοιχων α7-εκπ-wt ολιγομερών, ενώ ο λόγος των ποσοτήτων έκφρασης συσσωματωμάτων υψηλού ΜΒ (~2000 kda) προς ολιγομερή (1:2,1) είναι σημαντικά μειωμένος σε σχέση με τον αντίστοιχο των α7-εκπ-wt μορίων (1:1,25). Είναι αξιοσημείωτο το γεγονός, ότι ο λόγος αυτός είναι παρόμοιος με αυτόν που παρατηρήθηκε στα α7-εκπ-dm μόρια, τα οποία φέρουν μία μετάλλαξη που σχετίζεται επίσης με τη συντηρημένη Cys θηλιά ( ). Η μετάλλαξη σε αυτή την περίπτωση αφορά στην πλήρη αντικατάσταση της Cys θηλιάς από την αντίστοιχη και πιο υδρόφιλη περιοχή του μορίου της ομόλογης προς την α7-εκπ, πρωτεΐνης L-AChBP (Εικόνα 23). Έτσι, επιβεβαιώνεται για άλλη μία φορά ο πολύ σημαντικός ρόλος, όσον αφορά στη διαλυτότητα των α7-εκπ μορίων της περιοχής αυτής, αφού και στην περίπτωση των α7-εκπ-dm μορίων είχε διαπιστωθεί σημαντική αύξηση της υδροφιλικότητας των παραγόμενων α7-εκπ μορίων σε σχέση με αυτά του αγρίου τύπου ( ). Εν τούτοις, αν και το ΜΒ των mut-3 ολιγομερών βρέθηκε χαμηλότερο από το αντίστοιχο των μορίων αγρίου τύπου, αυτό είναι υψηλότερο από το αντίστοιχο των μορίων του διπλού μεταλλάγματος α7-εκπ-dm. H απόδοση έκφρασης των ολιγομερών mut-3 μορίων βρέθηκε επίσης αυξημένη (~0,35 mg/l) από αυτή των μορίων αγρίου τύπου (~0,2 mg/l), γεγονός που μπορεί να οφείλεται στην σχετικά αυξημένη υδροφιλικότητά τους από αυτή των α7-εκπ-wt μορίων. Η καμπύλη πρόσδεσης 125 I-α-bgtx ακολουθεί επίσης όπως και στις περιπτώσεις των προαναφερθεισών α7-εκπ μορίων την καμπύλη οπτικής απορρόφησης (A 280 ) και βρίσκεται σε συμφωνία με τις κηλίδες ανοσοαποτύπωσης πρωτεϊνών υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση αντι-myc αντισώματος για καθένα από τα εκλούσματα του χρωματογραφήματος (Εικόνα 45). 147

158 Αποτελέσματα Συμπερασματικά, οι τρείς σημειακές κατευθυνόμενες μεταλλάξεις του μεταλλάγματος mut-3 (Πίνακας 1, Εικόνα 24) οδήγησαν σε σαφώς πιο υδρόφιλα α7- ΕΚΠ μόρια από αυτά του αγρίου τύπου και παραπλήσιας διαλυτότητας με αυτά του διπλού μεταλλάγματος με τα οποία έχουν το κοινό γνώρισμα τροποποιημένης Cys θηλιάς. Έν τούτοις, η διαλυτότητά τους δεν ήταν τόσο θεαματικά αυξημένη όπως στην περίπτωση των mut-2 μορίων ( ), συγκρίνοντας τους αντίστοιχους λόγους των συσσωματωμάτων προς τα ολιομερή, ενώ ακόμη δεν κατέστη δυνατή η παρασκευή ολιγομερών με παραπλήσιο προς το ΜΒ των επιθυμητών πενταμερών μορίων. Βέβαια, οι μεταλλάξεις αυτές θα μπορούσαν σε συνδυασμό με τις προαναφερθείσες να οδηγήσουν σε κάποια σημαντική και αθροιστικά αυξανόμενη διαλυτότητα των α7-εκπ μορίων. 0,8 A 280 Δcpm 440 kda α7-εκπ-mut ,6 232 kda 1500 A 280 0, kda 158 kda 1000 Δcpm / 0,2 μl 0, , Όγκος έκλουσης (ml) 1 μl / έκλουσμα 5 μl / έκλουσμα Εικόνα 45. Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης mut-3 μορίων. Τo χρωματογράφημα των mut-3 μορίων (γλυκοζυλιωμένα μόρια) απεικονίζεται με τη συνεχή γραμμή, ενώ με τη διακεκομένη γραμμή συνδέονται τα σημεία (ανεστραμμένα τρίγωνα) που αντιστοιχούν στις μετρούμενες κρούσεις (Δcpm) της δεσμευμένης 125 Ι-α-bgtx (χρησιμοποιούμενη ποσότητα: cpm) μετά την αφαίρεση της μη ειδικής δέσμευσης ( ), χρησιμοποιώντας 0,2 μl από το καθένα από τα εκλούσματα. Τα τόξα δείχνουν τους όγκους έκλουσης πρωτεϊνώνμαρτύρων με γνωστά μοριακά βάρη. Στο κάτω μέρος του χρωματογραφήματος απεικονίζονται κηλίδες ανοσοαποτύπωσης υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση αντι-myc αντισώματος και κατάλληλης ποσότητας δείγματος από το κάθε έκλουσμα. 148

159 Αποτελέσματα Έκφραση α7-εκπ-mut-4 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Όπως προαναφέρθηκε στις παραγράφους έως , η έκφραση τριών καινούριων μεταλλαγμένων μορίων α7-εκπ της παρούσης μελέτης (mut-1 έως mut-3), οδήγησε σε μόρια αυξημένης διαλυτότητας σε σχέση με του αγρίου τύπου και σε μερικές περιπτώσεις καλύτερης (mut-2) ή παραπλήσιας διαλυτότητας (mut-3) με το προϋπάρχον στο Εργαστήριό μας διπλό μετάλλαγμα (α7-εκπ-dm). Εν τούτοις, τα ολιγομερή των μεταλλαγμάτων αυτών βρέθηκαν να έχουν ένα μοριακό βάρος υψηλότερο από αυτό για αναμενόμενα και επιθυμητά πενταμερή μόρια α7-εκπ. Προκειμένου να διαπιστωθεί άν ο συνδυασμός των μεταλλάξεων που εμπεριέχονται στα μεταλλαγμένα αυτά μόρια θα μπορούσε να οδηγήσει στην έκφραση α7-εκπ ολιγομερών μορίων με τις επιθυμητές ιδιότητες, κατασκευάστηκε το μετάλλαγμα mut-4 ( 4.1.). Έτσι, το μετάλλαγμα αυτό συνδυάζει σημειακές κατευθυνόμενες μεταλλάξεις σε υδρόφοβα αμινοξικά κατάλοιπα που βρίσκονται εκτεθειμένα στο εξωτερικό περιβάλλον του μορίου α7-εκπ και τα οποία ανήκουν στην αμινο-τελική α-έλικα, σε β-πτυχωτές επιφάνειες, καθώς και σε διάφορες θηλιές συμπεριλαμβανόμενης και της Cys θηλιάς (Πίνακας 1, Εικόνα 24). Η έκφραση των μορίων αυτών οδήγησε, όπως φαίνεται από το χρωματογράφημα μοριακής τους διήθησης (Εικόνα 46), σε ολιγομερή μόρια με ΜΒ ίσο προς αυτό του προϋπάρχοντος διπλού μεταλλάγματος α7-εκπ-dm (Εικόνα 41 Β) και σαφώς χαμηλότερου από αυτό των ολιγομερών α7-εκπ αγρίου τύπου (Εικόνα 41 Α). Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώνει για άλλη μία φορά το σημαντικό ρόλο που διαδραματίζουν ορισμένα υδρόφοβα αμινοξικά κατάλοιπα της Cys θηλιάς, όσον αφορά στη διαλυτότητα των παραγόμενων α7-εκπ μορίων, αφού η αντικατάστασή τους από περισσότερο υδρόφιλα οδηγεί σε αυξημένη διαλυτότητα, κάτι που είχε παρατηρηθεί και στην περίπτωση των mut-3 μορίων (Εικόνα 45) που περιείχαν μόνο αυτές τις μεταλλάξεις, αλλά και στην περίπτωση των μορίων α7-εκπ-dm (Εικόνα 41 Β), στα οποία ολόκληρη η Cys θηλιά είχε αντικατασταθεί από την αντίστοιχη περιοχή της ομόλγης πρωτεΐνης L-AChBP (Avramopoulou et al 2004). Μάλιστα, ο συνδυασμός των τριών σημειακών κατευθυνόμενων μεταλλάξεων της Cys θηλιάς (mut-3) με τις μεταλλάξεις τεσσάρων υδρόφοβων αμινοξικών καταλοίπων σε β-πτυχωτά φύλα και σε άλλες θηλιές (mut-2), καθώς και με μία μετάλλαξη σε ένα υδρόφοβο κατάλοιπο της αμινο-τελικής α-έλικας (mut-1), οδήγησε και στη μείωση του λόγου των εκφραζόμενων 149

160 Αποτελέσματα συσσωματωμάτων προς ολιγομερή του μεταλλάγματος α7-εκπ-mut-4 (1:4,3) σε σχέση με τον αντίστοιχο λόγο του προϋπάρχοντος διπλού μεταλλάγματος α7-εκπ-dm (1:2,5). Συμπερασματικά, το μετάλλαγμα mut-4, το οποίο έφερε το συνδυασμό των παρόντων μεταλλάξεων στα mut-1 έως και mut-3, αποδείχθηκε ως το βέλτιστο προς στιγμήν προκύπτων μετάλλαγμα, όσον αφορά στη διαλυτότητα των παραγόμενων μορίων. Παρόλα αυτά, ακόμη δεν κατέστη δυνατή η πλήρης εξάλειψη της μορφής των εκφραζόμενων α7-επ-μορίων ως συσσωματώματα και ούτε η έκφραση ολιγομερών με ΜΒ πλησιέστερο προς το επιθημητό που να αντιστοιχεί σε πενταμερή α7-εκπ μόρια. 1,0 0,8 A 280 Δcpm 440 kda 232 kda 158 kda α7-εκπ-mut A 280 0,6 0, kda Δcpm / 0,2 μl 0, , Όγκος έκλουσης (ml) 1 μl / έκλουσμα 5 μl / έκλουσμα Εικόνα 46. Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης mut-4 μορίων. Τo χρωματογράφημα των mut-4 μορίων (γλυκοζυλιωμένα μόρια) απεικονίζεται με τη συνεχή γραμμή, ενώ με τη διακεκομένη γραμμή συνδέονται τα σημεία (ανεστραμμένα τρίγωνα) που αντιστοιχούν στις μετρούμενες κρούσεις (Δcpm) της δεσμευμένης 125 Ι-α-bgtx (χρησιμοποιούμενη ποσότητα: cpm) μετά την αφαίρεση της μη ειδικής δέσμευσης ( ), χρησιμοποιώντας 0,2 μl από το καθένα από τα εκλούσματα. Τα τόξα δείχνουν τους όγκους έκλουσης πρωτεϊνώνμαρτύρων με γνωστά μοριακά βάρη. Στο κάτω μέρος του χρωματογραφήματος απεικονίζονται κηλίδες ανοσοαποτύπωσης υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση αντι-myc αντισώματος και κατάλληλης ποσότητας δείγματος από το κάθε έκλουσμα. 150

161 Αποτελέσματα Έκφραση α7-εκπ-mut-5 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Σε μία παράλληλη στρατηγική με αυτή του σχεδιασμού κατασκευής και έκφρασης α7-εκπ μεταλλαγμάτων με αυξημένη διαλυτότητα, μελετήθηκε η δυνατότητα κατασκευής α7-εκπ μορίων με δυνητικά ενισχυμένη ικανότητα συγκρότησης πενταμερών. Το πρώτο μετάλλαγμα που κατασκευάσθηκε ( 4.7.) και εκφράσθηκε για το σκοπό αυτό ήταν το mut-5 (Πίνακας 1). Αυτό περιλάμβανε τη σημειακή κατευθυνόμενη μετάλλαξη Met41Lys, ώστε θεωρητικά με βάση τη μελέτη του κατασκευασμένου μοντέλου της α7-εκπ ( 4.1.) να επιτευχθεί η επιπλέον εισαγωγή ενός δεσμού ηλεκτροστατικής φύσεως με το αντικρυστό κατάλοιπο Asp97 (απόσταση 5 Å) της διπλανής υπομονάδας του κάθε πρωτομερούς μορίου α7-εκπ (Εικόνα 47). Η έκφραση των mut-5 μορίων οδήγησε, όπως φαίνεται από το χρωματογράφημα μοριακής τους διήθησης (Εικόνα 48), σε μόρια παραπλήσιας συμπεριφοράς, όσον αφορά στη διαλυτότητα και στα επίπεδα έκφρασης, με αυτά του αγρίου τύπου (Εικόνα 41 Α). Έτσι, φάνηκε πως η μετάλλαξη αυτή από μόνη της δεν κατέστη δυνατό να βελτιώσει το αποτέλεσμα έκφρασης των α7-εκπ μορίων. Για το λόγο αυτό αποφασίσθηκε ώστε να μην υπάρξει περαιτέρω χαρακτηρισμός των mut-5 μορίων, και η μετάλλαξη αυτή να συνδυαστεί με άλλες που αφορούν επίσης σε αμινοξικά κατάλοιπα που εντοπίζονται στην διεπιφάνεια μεταξύ δύο πρωτομερών μορίων, και τα οποία βρίσκονται σε δυνητικά αλληλεπιδρώσες αποστάσεις, όπως αυτά αποκαλύφθηκαν στο α7-εκπ μοντέλο ( 4.1.). Εικόνα 47. Σχηματική απεικόνιση μέρους του σκελετού του α7-εκπ μοντέλου. Αναπαρίστανται τα τμήματα του πρωτεϊνικού σκελετού δύο αντικρυστών πρωτομερών α7-εκπ μορίων που συμμετέχουν στη συγκρότηση του πενταμερούς α7-εκπ μορίου και στα οποία βρίσκονται τα αντικρυστά κατάλοιπα Met41 και Asp97 με δυνητικά αλληλεπιδρώσες αποστάσεις. 151

162 0,6 A 280 Δcpm α7-εκπ-mut-5 Αποτελέσματα A 280 0,4 0, kda 440 kda 232 kda 158 kda Δcpm / 0,5 μl , Όγκος έκλουσης (ml) Εικόνα 48. Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης mut-5 μορίων. Τo χρωματογράφημα των mut-5 μορίων (γλυκοζυλιωμένα μόρια) απεικονίζεται με τη συνεχή γραμμή, ενώ με τη διακεκομένη γραμμή συνδέονται τα σημεία (ανεστραμμένα τρίγωνα) που αντιστοιχούν στις μετρούμενες κρούσεις (Δcpm) της δεσμευμένης 125 Ι-α-bgtx (χρησιμοποιούμενη ποσότητα: cpm) μετά την αφαίρεση της μη ειδικής δέσμευσης ( ), χρησιμοποιώντας 0,5 μl από το καθένα από τα εκλούσματα. Τα τόξα δείχνουν τους όγκους έκλουσης πρωτεϊνώνμαρτύρων με γνωστά μοριακά βάρη Έκφραση α7-εκπ-mut-6 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Στα πλαίσια της στρατηγικής σχεδιασμού μορίων α7-εκπ με θεωρητικά αυξημένη ικανότητα συγκρότησης πενταμερών μορίων κατασκευάστηκε επίσης το μετάλλαγμα mut-6 ( 4.7.). Αυτό περιείχε την αντικατάσταση δύο καταλοίπων Asn στις θέσεις 47 και 53 από το μεγαλύτερο κατάλοιπο Gln (Πίνακας 1). Ο στόχος αυτών των μεταλλάξεων ήταν να μειωθούν οι υπάρχουσες αποστάσεις (7 και 6 Å) μεταξύ των δύο αυτών αμινοξικών καταλοίπων με τα αντικρυστά κατάλοιπα Asp42 και Ser95 του διπλανού α7-εκπ πρωτομερούς που συμμετέχει στη συγκρότηση πενταμερών α7-εκπ μορφών (Εικόνα 49), ώστε εισαχθούν δύο επιπλέον δεσμοί υδρογόνου στις διεπιφάνειες μεταξύ των πρωτομερών μορίων. 152

163 Αποτελέσματα Εικόνα 49. Σχηματική απεικόνιση μέρους του σκελετού του α7-εκπ μοντέλου. Αναπαρίστανται τα τμήματα του πρωτεϊνικού σκελετού δύο αντικρυστών πρωτομερών α7-εκπ μορίων που συμμετέχουν στη συγκρότηση του πενταμερούς α7-εκπ μορίου και στα οποία βρίσκονται τα αντικρυστά κατάλοιπα Asp42 και Ser95 με τα κατάλοιπα Asn47 και Asn53 με δυνητικά αλληλεπιδρώσες αποστάσεις. Η έκφραση των μεταλλαγμένων mut-6 μορίων οδήγησε, όπως και στην περίπτωση των mut-5 σε μόρια με παραπλήσια συμπεριφορά, όσον αφορά στη διαλυτότητα και στα επίπεδα έκφρασης, με αυτή του αγρίου τύπου (Εικόνα 41 Α), όπως φαίνεται από το χρωματογράφημα μοριακής τους διήθησης (Εικόνα 50). Έτσι, οι μεταλλάξεις αυτές επίσης δεν βελτίωσαν το αποτέλεσμα έκφρασης των α7-εκπ μορίων, αφού ο στόχος θεωρητικής ενίσχυσης μέσω αυτών της έκφρασης α7-εκπ μορίων υπό πενταμερή μορφή δεν κατέστη εφικτός. Για το λόγο αυτό αποφασίσθηκε ώστε να μην υπάρξει περαιτέρω χαρακτηρισμός των mut-6 μορίων, όπως και στην περίπτωση των mut-5. Κρίθηκε όμως σκόπιμο, οι μεταλλάξεις των mut-6 μορίων να συνδυαστούν στη συνέχεια με τη μετάλλαξη στα mut-5 μόρια, που επίσης αφορά σε αμινοξικό κατάλοιπο εκτειθέμενο στη διεπιφάνεια μεταξύ δύο γειτονικών α7-εκπ πρωτομερών, ώστε να μελετηθεί πιθανό συνεργιστικό φαινόμενο. 153

164 Αποτελέσματα 0,4 A 280 Δcpm 440 kda 232 kda α7-εκπ-mut A 280 0, kda 158 kda Δcpm / 0,5 μl 250 0, Όγκος έκλουσης (ml) Εικόνα 50. Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης mut-6 μορίων. Τo χρωματογράφημα των mut-6 μορίων (γλυκοζυλιωμένα μόρια) απεικονίζεται με τη συνεχή γραμμή, ενώ με τη διακεκομένη γραμμή συνδέονται τα σημεία (ανεστραμμένα τρίγωνα) που αντιστοιχούν στις μετρούμενες κρούσεις (Δcpm) της δεσμευμένης 125 Ι-α-bgtx (χρησιμοποιούμενη ποσότητα: cpm) μετά την αφαίρεση της μη ειδικής δέσμευσης ( ), χρησιμοποιώντας 0,5 μl από το καθένα από τα εκλούσματα. Τα τόξα δείχνουν τους όγκους έκλουσης πρωτεϊνώνμαρτύρων με γνωστά μοριακά βάρη Έκφραση α7-εκπ-mut-7 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Προκειμένου να μελετηθεί το αντίκτυπο του συνδυασμού των μεταλλάξεων, που αφορούν σε αμινοξικά κατάλοιπα που βρίσκονται εκτεθειμένα στη διεπιφάνεια μεταξύ πρωτομερών α7-εκπ μορίων, στην έκφραση των α7-εκπ μορίων κατασκευάστηκε το μετάλλαγμα mut-7 ( 4.7.). Αυτό το μετάλλαγμα περιείχε τις μεταλλάξεις των προαναφερθεισών μεταλλαγμάτων mut-5 και mut-6 (Πίνακας 1). Η έκφραση των mut-7 μορίων οδήγησε όπως φαίνεται από το χρωματογράφημα μοριακής τους διήθησης (Εικόνα 51), σε μόρια με παραπλήσια συμπεριφορά, όσον αφορά στη διαλυτότητα και στα επίπεδα έκφρασης, με αυτή του αγρίου τύπου (Εικόνα 41 Α), όπως δηλαδή συνέβη και στην περίπτωση τωνmut-5 καιmut-6, από τις μεταλλάξεις των οποίων αποτελούνται τα mut-7 μόρια,. Έτσι, ο συνδυασμός των μεταλλάξεων των mut-5 και mut-6 μορίων δεν οδήγησε σε κάποια βελτίωση της εικόνας έκφρασης των προκύπτοντων mut-7 μορίων σε σχέση με τα μόρια α7-εκπ-wt, οπότε αποκλείστηκε και το ενδεχόμενο κάποιου πιθανού συνεργιστικού φαινομένου 154

165 Αποτελέσματα μεταξύ των μεταλλαγμένων καταλοίπων που εκτείθενται στις διεπιφάνειες των α7-εκπ πενταμερών. Συμπερασματικά, ενώ το κατασκευασμένο α7-εκπ μοντέλο ( 4.1.) ήταν εύστοχο στην υπόδειξη των υδρόφοβων αμινοξικών καταλοίπων που εκτείνενται στο εξωτερικό περιβάλλον του πενταμερούς α7-εκπ μορίου, λόγω των επιτυχών αντίστοιχων μεταλλάξεων ( ), εν τούτοις, φαίνεται πως ήταν άστοχο όσον αφορά στην πρόβλεψη της θέσης των αμινοξικών καταλοίπων που εκτείνονται προς την διεπιφάνεια μεταξύ γειτονικών α7-εκπ πρωτομερών μορίων, λόγω των μη επιτυχών μεταλλάξεων, όσον αφορά το προσδοκώμενο αποτέλεσμα ( ). 0,8 0,6 A 280 Δcpm 440 kda α7-εκπ-mut kda 1500 A 280 0, kda 158 kda 1000 Δcpm / 0,5 μl 0, , Όγκος έκλουσης (ml) Εικόνα 51. Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης mut-7 μορίων. Τo χρωματογράφημα των mut-7 μορίων (γλυκοζυλιωμένα μόρια) απεικονίζεται με τη συνεχή γραμμή, ενώ με τη διακεκομένη γραμμή συνδέονται τα σημεία (ανεστραμμένα τρίγωνα) που αντιστοιχούν στις μετρούμενες κρούσεις (Δcpm) της δεσμευμένης 125 Ι-α-bgtx (χρησιμοποιούμενη ποσότητα: cpm) μετά την αφαίρεση της μη ειδικής δέσμευσης ( ), χρησιμοποιώντας 0,5 μl από το καθένα από τα εκλούσματα. Τα τόξα δείχνουν τους όγκους έκλουσης πρωτεϊνώνμαρτύρων με γνωστά μοριακά βάρη. 155

166 Αποτελέσματα Κατασκευή κασετών έκφρασης μεταλλαγμένων α7-εκπ μορίων σε συνδυασμό με τις μεταλλάξεις του α7-εκπ-dm σε πλασμιδιακό φορέα pbluescript Όπως προαναφέρθηκε, από τα μέχρι στιγμής μεταλλαγμένα μόρια της παρούσης μελέτης, αυτά που οδήγησαν σε σημαντική βελτίωση της διαλυτότητας των εκφραζόμενων α7-εκπ μορίων σε σχέση με τα μόρια αγρίου τύπου ήταν τα mut-1 έως και mut-4 ( ). Βέβαια, παρόλο το σημαντικό και θετικό αντίκτυπο των μεταλλάξεων αυτών, που αφορούν στην αντικατάσταση υδρόφοβων, εκτειθέμενων στο εξωτερικό περιβάλλον του α7-εκπ μοντέλου αμινοξικών καταλοίπων,,από λιγότερο υδρόφοβα, εν τούτοις δεν κατέστη δυνατή η παραγωγή και έκφραση υδατοδιαλυτών α7-εκπ μορίων υπό τη μορφή ολιγομερών μοριακού βάρους πλησιέστερα του αναμενόμενου για πενταμερή μόρια. Προκειμένου λοιπόν να πετύχουμε το στόχο μας, θεωρήσαμε σκόπιμο να συνδυάσουμε τις μεταλλάξεις στο προϋπάρχον και σχετικά επιτυχές διπλό μετάλλαγμα α7-εκπ-dm ( ) με τις μεταλλάξεις στα καινούρια μεταλλαγμένα μόρια mut-1 και mut-2 ( & ). Επειδή, το α7-εκπ-dm φέρει την αντικατάσταση της Cys θηλιάς του α7 nachr από την αντίστοιχη και πιο υδρόφιλη Cys θηλιά της ομόλογης L-AChBP, δεν ήταν δυνατός ο συνδυασμός των επίσης επιτυχών mut-3 και mut-4 μορίων (φέρουν σημειακές κατευθυνόμενες μεταλλάξεις στην Cys θηλιά του α7 nachr). Τα τρία καινούρια μεταλλάγματα α7-εκπ που επρόκειτο να κατασκευαστούν ονομάστηκαν mut-8, mut-9 και mut-10 (Πίνακας 3). Το mut-8 επρόκειτο να φέρει το συνδυασμό των μεταλλάξεων του α7-εκπ-dm με τη μοναδική σημειακή κατευθυνόμενη μετάλλαξη του mut-1, το mut-9 επρόκειτο να φέρει το συνδυασμό των μεταλλάξεων του α7-εκπ-dm με τις τέσσερεις σημειακές κατευθυνόμενες μεταλλάξεις του mut-2 και τέλος το mut-10 επρόκειτο να φέρει το συνδυασμό των μεταλλάξεων του α7-εκπ-dm με τις μεταλλάξεις των mut-1 και mut-2 μορίων. Προκειμένου να κατασκευάσουμε αυτούς τους συνδυασμούς μεταλλάξεων, χρησιμοποιήσαμε ως εκμαγείο το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pbluescript με το α7- ΕΚΠ-dm cdna (Εικόνα 34 Δ), στο οποίο είχαν ήδη πραγματοποιηθεί οι μεταλλάξεις του α7-εκπ-dm (Avramopoulou et al 2004). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η εισαγωγή των κατάλληλων σημειακών μεταλλάξεων με τη χρήση του συστήματος GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), ώστε να προκύψουν τα cdna τμήματα που κωδικοποιούν τα μεταλλαγμένα α7-εκπ μόρια του Πίνακα

167 Αποτελέσματα α7-εκπ Μεταλλάξεις mut-8 Phe3Tyr (N-τελική α-έλικα), Cys116Ser (β6 πτυχωτό φύλλο), AChBP Cys θηλιά mut-9 Val69Thr (β2-β3 θηλιά), Ile165Thr (β8-β9 θηλιά), Val177Thr (β9 πτυχωτό φύλλο), Phe187Tyr (β9 πτυχωτό φύλλο), Cys116Ser, AChBP Cys θηλιά mut-10 Phe3Tyr, Val69Thr, Ile165Thr, Val177Thr, Phe187Tyr, Cys116Ser, AChBP Cys θηλιά Πίνακας 3. Περιγραφή των υπό μελέτη μεταλλαγμένων μορίων α7-εκπ που έφεραν συνδυασμούς με τις μεταλλάξεις του α7-εκπ-dm. Η θέση των μεταλλαγμένων αμινοξικών καταλοίπων σε στοιχεία δευτεροταγούς δομής του μοντέλου της α7-εκπ αναγράφεται μέσα σε παρενθέσεις. Οι μεταλλάξεις του προϋπάρχοντος διπλού μεταλλάγματος α7-εκπ-dm (Avramopoulou et al 2004), με τις οποίες συνδυάστηκαν οι μεταλλάξεις των mut-1 και mut-2 μορίων (Πίνακας 1) είναι η μετάλλαξη Cys116Ser, καθώς και η αντικατάσταση της α7-nachr Cys θηλιάς από την αντίστοιχη και πιο υδρόφιλη Cys θηλιά της ομόλογης πρωτεϊνης LsAChBP. Η τελευταία μετάλλαξη (αντικατάσταση νουκλεοτιδικής περιοχής) συμβολίζεται ως AChBP Cys θηλιά. Η διαδικασία PCR που ακολουθήθηκε ώστε να πραγματοποιηθούν οι σημειακές μεταλλάξεις στο α7-εκπ-dm cdna ήταν ακριβώς η ίδια που περιγράφηκε στην παράγραφο 4.7. Τα ζεύγη των 5 και 3 εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν, προκειμένου να προκύψουν οι σημειακές μεταλλάξεις στο cdna των μεταλλαγμάτων του Πίνακα 3 αναγράφονται στην παράγραφο Προκειμένου για τα α7-εκπ μεταλλάγματα mut-9 και mut-10, στα οποία έπρεπε να δημιουργηθούν παραπάνω από μία σημειακές κατευθυνόμενες μεταλλάξεις, πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές PCR αντιδράσεις (Πίνακας 4), χρησιμοποιώντας κάθε φορά το κατάλληλο ζεύγος εκκινητών για την νεο-εισαγόμενη μετάλλαξη ( ) και τα προϊόντα της προηγούμενης κάθε φορά PCR αντίδρασης ως μήτρα DNA. Ακολούθησε μετασχηματισμός επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων DH5 α με τα τελικά προϊόντα των PCR αντιδράσεων, όπως ακριβώς περιγράφηκε στην παράγραφο 4.7 και παρασκευή πλασμιδιακού DNA σε μεγάλη κλίμακα ( Β). Η επιβεβαίωση των εισαγόμενων μεταλλάξεων πραγματοποιήθηκε με προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των ανασυνδυασμένων pbluescript πλασμιδίων, χρησιμοποιώντας τους εκκινητές Τ3 και Τ7. Αξίζει να σημειωθεί ότι στις περιπτώσεις των μεταλλαγμάτων mut-9 και mut-10 δημιουργήθηκαν κάποιες νέες θέσεις 157

168 Αποτελέσματα περιορισμού στο cdna τους, χρήσιμες για τον έλεγχο των σωστών προϊόντων με πέψη με τις αντίστοιχες ενδονουκλεάσες (Πίνακας 4). Μεταλλάγματα α7-εκπ mut-8 PCR I PCR II PCR III PCR IV PCR V Phe3Tyr mut-9 Phe187Tyr (Eco47III) Val177Thr Val69Thr (SpeI) Ile165Thr (SpeI) mut-10 Phe3Tyr (HindIII) Phe187Tyr (Eco47III) Val177Thr Val69Thr (SpeI) Ile165Thr (SpeI) Πίνακας 4. Ακολουθία αλυσιδωτών PCR αντιδράσεων για την εισαγωγή πολλαπλών σημειακών μεταλλάξεων στο α7-εκπ-wt cdna. Οι 5 και 3 εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την δημιουργία της καθεμιάς αναγραφόμενης σημειακής μετάλλαξης περιγράφονται στην παράγραφο Η περιγραφή του καθενός προκύπτοντος α7-εκπμεταλλάγματος αναγράφεται στον Πίνακα 3. Μέσα στις παρενθέσεις αναγράφονται οι δημιουργούμενες καινούριες θέσεις περιορισμού από τις νεο-εισαγόμενες στο α7-εκπ-dm cdna μεταλλάξεις Υποκλωνοποίηση κασετών έκφρασης α7-εκπ μορίων που φέρουν συνδυασμό μεταλλάξεων με αυτές του α7-εκπ-dm, σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης ppiczαα Προκειμένου να ακολουθήσει η έκφραση των μεταλλαγμένων μορίων α7-εκπ του Πίνακα 3 σε κύτταρα P. pastoris, τα cdnas που κωδικοποιούν τα μόρια αυτά μεταφέρθηκαν από τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια pbluescript ( 4.7.) σε πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης ppiczαα, οι οποίοι στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για μετασχηματισμό επιδεκτικών κυττάρων του στελέχους X33 ( ). Έτσι, τα cdna ενθέματα που κωδικοποιούν τα αντίστοιχα μεταλλαγμένα α7-εκπ μόρια απομονώθηκαν από τα πλασμίδια pbluescript με πέψη χρησιμοποιώντας τα ένζυμα περιορισμού XhoI και XbaI, τα οποία αναγνωρίζουν τις αντίστοιχες θέσεις περιορισμού που οριοθετούν τα άκρα των ενθεμάτων (Εικόνα 13 Δ) και υποκλωνοποιήθηκαν με αντίδραση σύνδεσης ( ) σε πλασμίδια ppiczαα, τα οποία είχαν επίσης υποστεί πέψη με τα ίδια ένζυμα, ακριβώς όπως περιγράφηκε στην παράγραφο 4.8. Η επιβεβαίωση της πραγματοποίησης των αντιδράσεων σύνδεσης των μεταλλαγμένων α7-εκπ cdna ενθεμάτων με πλασμίδια ppiczαα πραγματοποιήθηκε ύστερα από παραγωγή πλασμιδιακού DNA σε μικρή κλίμακα ( ) μετά το 158

169 Αποτελέσματα μετασχηματισμό επιδεκτικών TOP10F βακτηριακών κυττάρων με τα αντίστοιχα μετασχηματισμένα πλασμίδια ( ) και την επιλογή τους σε θρεπτικό υλικό LB + zeocin ( ). Τα επιτυχώς μόνο μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια ppiczαα μπορούν να αναπτύσσονται παρουσία ζεοσίνης, λόγω της ανθεκτικότητας που τους προσδίδεται έναντι του αντιβιοτικού αυτού από τα ενσωματωμένα πλασμίδια ppiczαα. Ακολούθησε η ανάπτυξη κλώνων από τις ανεπτυγμένες αποικίες σε αυτό το μέσο επιλογής και η παραγωγή πλασμιδιακού DNA σε μικρή κλίμακα. Στη συνέχεια ακολούθησαν αντιδράσεις πέψης των πλασμιδιακών DNAs με τη ταυτόχρονη χρήση των ενζύμων XhoI και XbaI. H ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων από τα προϊόντα αυτών των αντιδράσεων σε πήκτωμα 1% κ.β. αγαρόζης επιβεβαίωσε την ύπαρξη των α7-εκπ ενθεμάτων, αφού προέκυψαν ζώνες που αντιστοιχούσαν στο αναμενόμενο μέγεθος ~650 bp, που αντιστοιχεί στην απόσταση μεταξύ των δύο θέσεων περιορισμού XhoI και XbaI στην περίπτωση επιτυχούς σύνδεσης των ενθεμάτων αυτών με το πλασμίδιο ppiczαα (Εικόνα 34 Β). Στην περίπτωση των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων ppiczαα με μεταλλαγμένα α7-εκπmut-9 και mut-10 cdna τμήματα, στα οποία είχαν δημιουργηθεί χαρακτηριστικές θέσεις περιορισμού (Πίνακας 4), πραγματοποιήθηκε περαιτέρω επιβεβαίωση με τη χρήση ενζύμων που αναγνωρίζουν τις νέες αυτές θέσεις ταυτόχρονα με τη χρήση ενζύμων XhoI ή XbaI. Οι μετασχηματισμένοι βακτηριακοί κλώνοι, οι οποίοι έφεραν τα επιθυμητά ανασυνδυασμένα πλασμιδιακά DNAs, χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για παρασκευή ανασυνδυασμένων ppiczαα πλασμιδίων σε μεγάλη κλίμακα ( ). Στην Εικόνα 52, απεικονίζεται σχηματικά το ανασυνδυασμένο ppiczαα πλασμίδιο μετά την ένθεση του cdna τμήματος που κωδικοποιεί την έκφραση mut-10 μορίων. Τα ανασυνδυασμένα πλέον ppiczαα πλασμίδια με τα μεταλλαγμένα α7-εκπ cdna ενθέματα που κωδικοποιούν τα α7-εκπ μόρια του Πίνακα 3, χρησιμοποιήθηκαν για το μετασχηματισμό κυττάρων X33 της P. pastoris, ώστε να ακολουθήσει η επιλογή σε καλλιέργειες μικρής κλίμακας των κλώνων που θα οδηγούνταν σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας προκειμένου να εκφρασθούν τα αντίστοιχα πολυπεπτιδικά τμήματα. Η επιλογή των κλώνων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε στις παραγράφους και

170 Αποτελέσματα Εικόνα 52. Χάρτης περιορισμού ανασυνδυασμένου πλασμιδίου ppiczαα με α7-εκπmut-10 cdna ένθεμα. Η υποκλωνοποίηση του cdna τμήματος που κωδικοποιεί α7-εκπmut-10 μόρια πραγματοποιήθηκε στις θέσεις περιορισμού XhoI και XbaI του ppiczαα πλασμιδίου. Με έντονα γράμματα εκτός από τις θέσεις κλωνοποίησης απεικονίζονται επίσης και χαρακτηριστικές θέσεις περιορισμού Eco47III, HindIII, SpeI του συγκεκριμένου ενθέματος (Πίνακας 4), οι οποίες χρησιμεύουν για την ταυτοποίησή του Έκφραση α7-εκπ-mut-8 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Όπως είχαμε δεί στην παράγραφο , τα εκφραζόμενα mut-1 μόρια, τα οποία έφεραν τη μοναδική μετάλλαξη Phe3Tyr στην αμινο-τελική α-έλικα του α7-εκπ μορίου, παρουσίασαν μία σχετικά αυξημένη διαλυτότητα έναντι του μορίου α7-εκπwt, που αντικατοπτρίζεται στη μείωση του λόγου συσσωματώματα υψηλού ΜΒ / ολιγομερή σε σχέση με τον αντίστοιχο λόγο των μορίων αγρίου τύπου. Ο συνδυασμός της σημειακής αυτής κατευθυνόμενης μετάλλαξης με τις μεταλλάξεις του διπλού μεταλλάγματος α7-εκπ-dm ( ) οδήγησε στο μετάλλαγμα mut-8, το οποίο όπως φαίνεται από το χρωματογράφημα μοριακής του διήθησης (Εικόνα 53) παρουσίασε παραπλήσια διαλυτότητα σε σχέση με το προϋπάρχον α7-εκπ-dm μόριο και μία σημαντικά αυξημένη διαλυτότητα σε σχέση με το α7-εκπ-wt μόριο. Πιο συγκεκριμένα, η ολιγομερής μορφή των εκφραζόμενων mut- 8 μορίων αντιστοιχεί σε ΜΒ χαμηλότερο από 440 kda, το οποίο χαρακτηρίζει τα α7- ΕΚΠ-wt ολιγομερή μόρια (Εικόνα 41 Α) και παραπλήσιο με αυτό των ολιγομερών α7- ΕΚΠ-dm μορίων (Εικόνα 41 Β), ενώ η τιμή του λόγου των εκφραζόμενων συσσωματωμάτων προς τα ολιγομερή βρέθηκε σχεδόν ίση με την αντίστοιχη για τα α7-160

171 Αποτελέσματα ΕΚΠ-dm μόρια (1:3). Επίσης, το επίπεδο έκφρασης των εκφραζόμενων ολιγομερών α7- mut-8 μορίων (0,4 mg/l) βρέθηκε να κυμαίνεται μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των μορίων αγρίου τύπου και διπλού μεταλλάγματος. Παρόλα αυτά, διαφάνηκε σε αυτό το σημείο μία σχετικά αυξημένη ικανότητα πρόσδεσης 125 Ι-α-bgtx των mut-8 μορίων σε σχέση με τα α7-εκπ-dm μόρια, όπως προκύπτει από τη σύγκριση των τιμών Δcpm των καμπυλών πρόσδεσης 125 Ι-α-bgtx που συνοδεύουν τα αντίστοιχα χρωματογραφήματα (Εικόνες 41 Β & 53, αντίστοιχα), δεδομένου ότι χρησιμοποιήθηκε σε αυτή την περίπτωση ποσότητα ίδιου όγκου από το κάθε έκλουσμα των αντίστοιχων χρωματογραφημάτων. Συμπερασματικά, ο συνδυασμός των μεταλλάξεων του mut-1 με αυτές του α7- ΕΚΠ-dm, οδήγησε σε μόρια αυξημένης διαλυτότητας σε σχέση με τα μόρια αγρίου τύπου και παραπλήσιας διαλυτότητας με αυτά των α7-εκπ-dm, αλλά και σε μία αυξημένη ικανότητα πρόσδεσης 125 Ι-α-bgtx σε σχέση με τα α7-εκπ-dm μόρια, η οποία επιβεβαιώθηκε στη συνέχεια με μελέτες εξαγωγής της σταθεράς διάσπασης του συμπλόκου mut-8/ 125 Ι-α-bgtx (βλ ). A 280 1,0 0,8 0,6 0,4 A 280 Δcpm 2000 kda 440 kda 232 kda 158 kda α7-εκπ-mut Δcpm / 0,1 μl 0, , Όγκος έκλουσης (ml) 1 μl / έκλουσμα 2,5 μl / έκλουσμα Εικόνα 53. Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης mut-8 μορίων. Τo χρωματογράφημα των mut-8 μορίων (γλυκοζυλιωμένα μόρια) απεικονίζεται με τη συνεχή γραμμή, ενώ με τη διακεκομένη γραμμή συνδέονται τα σημεία (ανεστραμμένα τρίγωνα) που αντιστοιχούν στις μετρούμενες κρούσεις (Δcpm) της δεσμευμένης 125 Ι-α-bgtx (χρησιμοποιούμενη ποσότητα: cpm) μετά την αφαίρεση της μη ειδικής δέσμευσης, χρησιμοποιώντας 0,1 μl από το καθένα από τα εκλούσματα. Τα τόξα δείχνουν τους όγκους έκλουσης πρωτεϊνών-μαρτύρων με γνωστά μοριακά βάρη. Στο κάτω μέρος του χρωματογραφήματος απεικονίζονται κηλίδες ανοσοαποτύπωσης υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση αντι-myc αντισώματος και κατάλληλης ποσότητας δείγματος από το κάθε έκλουσμα. 161

172 Αποτελέσματα Έκφραση α7-εκπ-mut-9 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Όπως είχαμε δεί στην παράγραφο , τα εκφραζόμενα mut-2 μόρια, τα οποία έφεραν τέσσερεις σημειακές κατευθυνόμενες μεταλλάξεις του α7-εκπ μορίου, παρουσίασαν μία σημαντικά αυξημένη διαλυτότητα έναντι του μορίου α7-εκπ-wt και μία σχετικά αυξημένη διαλυτότητα έναντι του α7-εκπ-dm κρίνοντας από τη μείωση του λόγου συσσωματώματα υψηλού ΜΒ / ολιγομερή σε σχέση με τους αντίστοιχους λόγους των μορίων αγρίου τύπου και διπλού μεταλλάγματος. Ο συνδυασμός των μεταλλάξεων του mut-2 με τις μεταλλάξεις του διπλού μεταλλάγματος α7-εκπ-dm ( ) οδήγησε στο μετάλλαγμα mut-9, το οποίο όπως φαίνεται από το χρωματογράφημα μοριακής του διήθησης (Εικόνα 54) παρουσίασε μία σημαντικά αυξημένη διαλυτότητα σε σχέση με το α7-εκπ-wt (Εικόνα 41 Α) καθώς και με τα mut-2 (Εικόνα 44) και α7-εκπ-dm μόρια (Εικόνα 41 Β). Η ολιγομερής μορφή των εκφραζόμενων α7-εκπ-mut-9 μορίων (Εικόνα 54) αντιστοιχεί σε ΜΒ παραπλήσιο με αυτό των ολιγομερών α7-εκπ-dm μορίων (Εικόνα 41 Β), ενώ η τιμή του λόγου των εκφραζόμενων συσσωματωμάτων προς ολιγομερή βρέθηκε σημαντικά μειωμένη (1:6) σε σχέση με τις αντίστοιχες των α7-εκπ-dm (1:2,5) και mut-2 (1:4) μορίων. Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει μία αθροιστική επίδραση του συνδυασμού των μεταλλάξεων του mut-2 με τις μεταλλάξεις του α7-εκπ-dm όσον αφορά στη διαλυτότητα των εκφραζόμενων mut-9 μορίων. Επίσης, το επίπεδο έκφρασης των εκφραζόμενων ολιγομερών mut-9 μορίων (1 mg/l) βρέθηκε να είναι 2 και 4 φορές αυξημένο σε σχέση με τα επίπεδα έκφρασης των μορίων αγρίου τύπου και διπλού μεταλλάγματος ( ), αντίστοιχα. Διαφάνηκε επίσης μία σημαντικά αυξημένη ικανότητα πρόσδεσης 125 Ι-α-bgtx των mut-9 μορίων σε σχέση με τα α7-εκπ-wt και α7- ΕΚΠ-dm μόρια, όπως προκύπτει από τη σύγκριση των τιμών Δcpm των καμπυλών πρόσδεσης 125 Ι-α-bgtx που συνοδεύουν τα αντίστοιχα χρωματογραφήματα (Εικόνες 41 και 54, αντίστοιχα), κάτι που επιβεβαιώθηκε στη συνέχεια με μελέτες εξαγωγής της σταθεράς διάσπασης του συμπλόκου mut-9/ 125 Ι-α-bgtx (βλ ). Συμπερασματικά, ο συνδυασμός των ήδη επιτυχών, όσον αφορά στην αύξηση της υδροφιλικότητας των α7-εκπ μορίων, μεταλλάξεων του mut-2 ( ) με τις μεταλλάξεις του επίσης σχετικά υδρόφιλου α7-εκπ-dm μορίου, οδήγησε σε ακόμη πιο υδατοδιαλυτά α7-εκπ μόρια συνοδευόμενα από μία παρατηρούμενη αύξηση ικανότητας πρόσδεσης του ραδιοσημασμένου nachr ανταγωνιστή 125 Ι-α-bgtx. 162

173 Αποτελέσματα 2, A 280 1,5 1,0 0,5 A 280 Δcpm 2000 kda 440 kda 232 kda 158 kda α7-εκπ-mut Δcpm / 0.1μl 500 0, Όγκος έκλουσης (ml) 1 μl / έκλουσμα 5 μl / έκλουσμα Εικόνα 54. Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης mut-9 μορίων. Τo χρωματογράφημα των mut-9 μορίων (γλυκοζυλιωμένα μόρια) απεικονίζεται με τη συνεχή γραμμή, ενώ με τη διακεκομένη γραμμή συνδέονται τα σημεία (ανεστραμμένα τρίγωνα) που αντιστοιχούν στις μετρούμενες κρούσεις (Δcpm) της δεσμευμένης 125 Ι-α-bgtx (χρησιμοποιούμενη ποσότητα: cpm) μετά την αφαίρεση της μη ειδικής δέσμευσης ( ), χρησιμοποιώντας 0,1 μl από το καθένα από τα εκλούσματα. Τα τόξα δείχνουν τους όγκους έκλουσης πρωτεϊνών-μαρτύρων με γνωστά μοριακά βάρη. Στο κάτω μέρος του χρωματογραφήματος απεικονίζονται κηλίδες ανοσοαποτύπωσης υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση αντι-myc αντισώματος και κατάλληλης ποσότητας δείγματος από το κάθε έκλουσμα Έκφραση α7-εκπ-mut-10 μορίων από μετασχηματισμένα κύτταρα P. pastoris σε καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας Όπως είδαμε στην παράγραφο , τα εκφραζόμενα mut-9 μόρια, τα οποία έφεραν το συνδυασμό των μεταλλάξεων του mut-2 με τις μεταλλάξεις του α7-εκπ-dm, παρουσίασαν μία σημαντικά αυξημένη υδροφιλικότητα σε σχέση με όλα τα μέχρι στιγμής μελετούμενα α7-εκπ μόρια, συνοδευόμενη και από μία σημαντική αύξηση των επιπέδων έκφρασης των mut-9 ολιγομερών. Ο περαιτέρω συνδυασμός των μεταλλάξεων στα mut-9 μόρια με τη μετάλλαξη του mut-1 μορίου οδήγησε στο μετάλλαγμα mut-10 (Πίνακας 3), το οποίο αποδείχθηκε ως 163

174 Αποτελέσματα το πιο υδατοδιαλυτό από όλα τα υπό μελέτη α7-εκπ μόρια. Πιο συγκεκριμένα, όπως φαίνεται στην Εικόνα 55, τα mut-10 μόρια εκφράσθηκαν αποκλειστικά υπό μορφή ολιγομερών με μοριακό βάρος χαμηλότερο από όλα τα προαναφερθέντα α7-εκπ μόρια, πλησιάζοντας σημαντικά στο ΜΒ των επιθυμητών πενταμερών μορίων (~200 kda). Το κλάσμα των συσσωματωμάτων υψηλού μοριακού βάρους, το οποίο ήταν φανερό σε όλα τα προηγούμενα α7-εκπ μόρια, ουσιαστικά εκμηδενίστηκε στην περίπτωση των mut-10 μορίων, αντικατοπτρίζοντας την θεαματική αύξηση της διαλυτότητάς τους. Επίσης, το επίπεδο έκφρασης των παραγόμενων ολιγομερών βρέθηκε να είναι το υψηλότερο από όλα τα άλλα α7-εκπ μόρια της παρούσης μελέτης, αφού αυτό υπολογίσθηκε να είναι ίσο προς 1,2 mg/l, δηλαδή περισσότερο από 2 και 4 φορές αυξημένο σε σχέση με τα μόρια αναφοράς α7-εκπ-dm και α7-εκπ-wt, αντίστοιχα ( ). Επίσης, όπως φαίνεται από τις κηλίδες ανοσοαποτύπωσης πρωτεϊνών υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση αντι-myc αντισώματος για καθένα από τα εκλούσματα του χρωματογραφήματος, τα mut-10 μόρια ανιχνεύονται σε ένα μικρό εύρος εκλουσμάτων, σε αντίθεση με όλα τα άλλα προαναφερθέντα α7-εκπ μόρια, το οποίο αντιστοιχεί αποκλειστικά στην περιοχή έκλουσης των ολιγομερών μορίων, επιβεβαιώνοντας την μορφή της καμπύλης οπτικής απορρόφησης (Α 280 ) και υποδηλώνοντας την αύξηση του βαθμού ομοιογένειας των εκφραζόμενων mut-10 μορίων σε σχέση με όλα τα προαναφερθέντα α7-εκπ μόρια. Συμπερασματικά, ο συνδυασμός των μεταλλάξεων του διπλού μεταλλάγματος α7- ΕΚΠ-dm με τις μεταλλάξεις των mut-1 και mut-2 μορίων, οι οποίες αφορούν την αντικατάσταση εξωτερικά εκτειθέμενων υδρόφοβων αμινοξικών καταλοίπων από υδρόφιλα (Πίνακας 1), οδήγησε σε ένα σημαντικά διαλυτό mut-10 μετάλλαγμα (Πίνακας 3). Αυτό το αποτέλεσμα, σε συνδυασμό με τη διαφαινόμενη αύξηση ικανότητας πρόσδεσης α-bgtx σε σχέση με τα μόρια αναφοράς της παρούσης μελέτης α7-εκπ-wt και α7-εκπ-dm, η οποία προκύπτει από τη σύγκριση των τιμών Δcpm των καμπυλών πρόσδεσης 125 Ι-α-bgtx που συνοδεύουν τα αντίστοιχα χρωματογραφήματα (Εικόνες 41 και 55), καθιστά το mut-10 μετάλλαγμα ως το πλέον κατάλληλο και υποσχόμενο α7-εκπ μόριο για δομικές μελέτες υψηλής ανάλυσης. 164

175 Αποτελέσματα 2, A 280 2,0 1,5 1,0 A 280 Δcpm 440 kda 232 kda 158 kda α7-εκπ-mut Δcpm / 0.1 μl 0, kda , μl / έκλουσμα 2,5 μl / έκλουσμα 5 μl / έκλουσμα Όγκος έκλουσης (ml) Εικόνα 55. Χρωματογράφημα μοριακής διήθησης mut-10 μορίων. Τo χρωματογράφημα των mut-10 μορίων (γλυκοζυλιωμένα μόρια) απεικονίζεται με τη συνεχή γραμμή, ενώ με τη διακεκομένη γραμμή συνδέονται τα σημεία (ανεστραμμένα τρίγωνα) που αντιστοιχούν στις μετρούμενες κρούσεις (Δcpm) της δεσμευμένης 125 Ι-α-bgtx (χρησιμοποιούμενη ποσότητα: cpm) μετά την αφαίρεση της μη ειδικής δέσμευσης ( ), χρησιμοποιώντας 0,1 μl από το καθένα από τα εκλούσματα. Τα τόξα δείχνουν τους όγκους έκλουσης πρωτεϊνώνμαρτύρων με γνωστά μοριακά βάρη. Στο κάτω μέρος του χρωματογραφήματος απεικονίζονται κηλίδες ανοσοαποτύπωσης υπο μη αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρήση αντι-myc αντισώματος και κατάλληλης ποσότητας δείγματος από το κάθε έκλουσμα Απογλυκοζυλίωση α7-εκπ-mut-10 μορίων Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο , το μετάλλαγμα mut-10 βρέθηκε να είναι το πιο επιτυχές της παρούσης μελέτης, όσον αφορά στη διαλυτότητα, αλλά και στην ικανότητα πρόσδεσης 125 Ι-α-bgtx. Προκειμένου να προχωρήσουμε σε αναλυτικές δομικές μελέτες των mut-10 μορίων, και συγκεκριμένα σε προσπάθειες κρυστάλλωσης των μορίων αυτών με σκοπό την λύση της κρυσταλλογραφικής δομής της εξωκυτταρικής περιοχής του ανθρώπινου α7 nachr, θεωρήσαμε σκόπιμο να ελέγξουμε και την συμπεριφορά των απογλυκοζυλιωμένων mut-10 μορίων. Αυτό, διότι συνήθως οι γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες είναι δύσκολο να κρυσταλλωθούν, λόγω του 165