ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Φ.ΚΑΛΦΑΡΕΝΤΖΟΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Φ.ΚΑΛΦΑΡΕΝΤΖΟΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΑΓΕΝΝΗΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΜΕΡΙΚΗ ΗΠΑΤΕΚΤΟΜΗ» ΧΑΒΕΛΕΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΙΑΤΡΟΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΔΙΟΝΥΣΙΟΣ Δ. ΚΑΡΑΒΙΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΠΑΤΡΑ 2012

2

3 Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή 1. Διονύσιος Καραβίας Καθηγητής Χειρουργικής Πανεπιστημίου Πατρών (Επιβλέπων Καθηγητής) 2. Ιωάννης Χαμπαίος Επίκουρος Καθηγητής Παθολογίας, Ενδοκρινολογίας και Μεταβολικών Νοσημάτων Πανεπιστημίου Πατρών 3. Ιωάννης Μαρούλης Επίκουρος Καθηγητής Χειρουργικής Πανεπιστημίου Πατρών Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή 1. Διονύσιος Καραβίας Καθηγητής Χειρουργικής Πανεπιστημίου Πατρών 2. Ιωάννης Χαμπαίος Επίκουρος Καθηγητής Παθολογίας, Ενδοκρινολογίας και Μεταβολικών Νοσημάτων Πανεπιστημίου Πατρών 3. Ιωάννης Μαρούλης Επίκουρος Καθηγητής Χειρουργικής Πανεπιστημίου Πατρών 4. Κωνσταντίνος Παναγόπουλος Επίκουρος Καθηγητής Χειρουργικής Πανεπιστημίου Πατρών 5. Ιωάννης Κεχαγιάς Επίκουρος Καθηγητής Χειρουργικής Πανεπιστημίου Πατρών 6. Κωνσταντίνος Θωμόπουλος Επίκουρος Καθηγητής Γαστρεντερολογίας Πανεπιστημίου Πατρών 7. Αθανάσιος Τσαμαντάς Επίκουρος Καθηγητής Παθολογικής Ανατομικής Πανεπιστημίου Πατρών

4

5 Στον δάσκαλό μου και συμπαραστάτη στον αγώνα μου, Καθηγητή Διονύσιο Δ. Καραβία, με ευγνωμοσύνη και σεβασμό!

6

7 Στους γονείς μου, που στερήθηκαν πολλά, για να τα έχω όλα!

8

9 ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ ΠΡΟΣΩΠΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ: Ονοματεπώνυμο: Όνομα πατρός: Όνομα μητέρας: Ιωάννης Χαβελές Γεώργιος Νικολέτα Ημερομηνία Γέννησης: 19 Σεπτεμβρίου 1979 Τόπος Γέννησης: Σπάρτη, Λακωνία ΣΠΟΥΔΕΣ: 1997.Απόφοιτος 2 ου Γενικού Λυκείου Σπάρτης με βαθμό Λίαν Καλώς Απόφοιτος του Τμήματος Ιατρικής του Δημοκριτείου Πανεπιστημίου Θράκης με βαθμό Λίαν Καλώς 2008.Διδακτορικός φοιτητής του Πανεπιστημίου Πατρών Κτήση τίτλου ειδικότητας Χειρουργικής ΣΗΜΑΝΤΙΚΑ COURSES ΚΑΙ WORKSHOPS: ATLS provider Μετεκπαιδευτικά μαθήματα χειρουργικής παχέος εντέρου 3 ος κύκλος 1 η συνάντηση Ρέθυμνο η συνάντηση Βόλος η Εβδομάδα Άσκησης στη Μικροχειρουργική Εργαστήριο Μικροχειρουργικής, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων

10 ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΘΕΣΕΙΣ: έως : Τρίμηνη υποχρεωτική εκπαίδευση ιατρών υπηρεσίας υπαίθρου στο Γεν. Νομαρχιακό Νοσοκομείο Σπάρτης έως : Υπηρεσία υπαίθρου στο Π.Ι. Σελλασίας Λακωνίας έως Ιατρός άνευ ειδικότητας στον Ε.Σ. (πλήρης θητεία) έως : Ειδικευόμενος Χειρουργικής στο Περιφερειακό Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Πατρών (Εκπλήρωση των δύο εξάμηνων εκπαιδεύσεων στην αγγειοχειρουργική και στην πλαστική χειρουργική) ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΟ: Κατά τη φοίτηση στο Δ.Π.Θ. συμμετοχή στις εργασίες του Πειραματικού Χειρουργείου υπό την επίβλεψη του υπεύθυνου Πειραματικής Χειρουργικής Επικ.Καθ. Μιχαήλ Πιτιακούδη, προς απόκτηση εμπειρίας στην έρευνα με πειραματόζωα Ένταξη σε ερευνητική ομάδα του Πανεπιστημίου Πατρών με τέλεση χειρουργικών επεμβάσεων σε πειραματικά πρωτόκολλα με χρήση μυών και επίμυων ως πειραματόζωα Ανάληψη της παρούσης διδακτορικής διατριβής 2011 Συμμετοχή στο Πανελλαδικό Πρωτόκολλο Επείγουσας Χειρουργικής που διοργάνωσε η Ελληνική Εταιρία Τραύματος και Επείγουσας Χειρουργικής ΕΛΕΓΚΤΙΚΕΣ - ΔΙΟΙΚΗΤΙΚΕΣ ΘΕΣΕΙΣ Τακτικό μέλος του Επιστημονικού Συμβουλίου του Π.Γ.Ν. Πατρών Τακτικό μέλος της Επιτροπής Έρευνας, Ηθικής και Δεοντολογίας του Π.Γ.Ν. Πατρών

11 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΕΚ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Στοιχεία που συμπεριλαμβάνονται στην παρούσα διατριβή, έχουν προηγουμένως δημοσιευτεί ή παρουσιαστεί ως ακολούθως: 1. Μάρτιος 2010: Αναρτημένη ανακοίνωση με ερευνητικό επιστημονικό υλικό της διατριβής, σε διεθνές συνέδριο: MicroRNAs in mouse liver regeneration I.G. Habeos, P.G. Ziros, I. Chaveles, D. Chartoumpekis, I. Maroulis, D. Karavias EASL International Liver Congress 2010, VIENNA, AUSTRIA 2. Φεβρουάριος 2012: Δημοσιευμένη εργασία με ερευνητικό επιστημονικό υλικό της διατριβής σε αναγνωρισμένο ξενόγλωσσο περιοδικό, με σύστημα κριτών, το οποίο ευρετηριάζεται στο PubMed: MicroRNA profiling in murine liver after partial hepatectomy IOANNIS CHAVELES1, APOSTOLOS ZARAVINOS2, IOANNIS G. HABEOS3, DIMITRIOS D. KARAVIAS1, IOANNIS MAROULIS1, DEMETRIOS A. SPANDIDOS2 and DIONISIOS KARAVIAS1 1Surgical Department, Medical School, University of Patras, Patras; 2Laboratory of Virology, Medical School, University of Crete, Heraklion, Crete; 3Medical Department, Medical School, University of Patras, Patras, Greece INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE 29: , 2012 *Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από το Τμήμα Ιατρικής δεν υποδηλώνει αποδοχή των απόψεων του συγγραφέα (Νόμος 5343/32, άρθρο 202, παρ.2)

12

13 ΠΡΟΛΟΓΟΣ -Είναι η εκπόνηση μίας διδακτορικής διατριβής σαν το ταξίδι προς την Ιθάκη; -Και ναι και όχι Ο στόχος του διδακτορικού ερευνητή είναι πολύ πιο απτός από αυτό που συμβολίζει μία φευγαλέα «Ιθάκη». Απαιτεί κόπο, μελέτη, με διάθεση χρόνου από το πολύτιμο υστέρημά του. Ειδικά για έναν κλινικό γιατρό, συνεπάγεται την βουτιά στα άγνωστα και θολά νερά της βασικής επιστημονικής έρευνας και του πειραματισμού. Ως αντάλλαγμα, του προσφέρει οξύνοια, βελτίωση επιστημονικού υποβάθρου, καταξίωση και κατ επέκτασιν, εφόδια για τον μετέπειτα «αγκαθόσπαρτο» επαγγελματικό βίο, στους χαλεπούς αυτούς καιρούς που διανύουμε. Ωστόσο, πέραν των αυτονόητων, υπάρχουν και πλευρές πιο άδηλες, σχεδόν μυστικιστικές, που κάνουν τη διαδικασία εκπόνησης της διατριβής να μοιάζει όντως με την αναζήτηση της Ιθάκης. Μόνο που δεν το γνωρίζεις εκ των πρότερων εφόσον κανείς δεν μπορεί να σου το διδάξει, παρά μόνο το ίδιο το ταξίδι. Τώρα που στο δικό μου ταξίδι αχνοφαίνεται η στεριά, μπορώ να παρατηρήσω τα εξής: Δεν θα ήμουν ολοκληρωμένος επιστήμων χωρίς αυτή την πολύτιμη εμπειρία ζωής. Δεν θα είχα ποτέ πριν εκτιμήσει τη γραμμή ή την παράγραφο ή και τη σελίδα, ενός ογκώδους βιβλίου αναφοράς. Δεν θα μπορούσα να ξέρω τι σημαίνουν αυτές οι λέξεις και πόσοι καθηγητές και πόσοι ακόμα ερευνητές αφήνουν στην άκρη τη ζωή τους, τον ύπνο, τους φίλους, την ξεγνοιασιά, έως ότου τυπωθούν οι γραμμές αυτές. Η εμπειρία μου αυτή όμως με έκανε να συνειδητοποιήσω τη βαρύτητα των προαναφερθέντων. Επίσης, δεν είναι δυνατόν να διδάξεις, σε όποιον δεν το ζήσει, πόσο επίπονη και απαιτητική είναι η διαδικασία παραγωγής της γνώσης. Ως φοιτητής ιατρικής, θυμάμαι, ότι η «γνώση» φαινόταν στα μάτια μου σαν ένας μεγάλος συμπαγής βράχος από γρανίτη, ήτοι παντοτινή και απαράλλακτη στο πέρασμα του χρόνου. Έρχεται όμως μια μέρα που κάποιος έχοντας εμπιστοσύνη στις δυνάμεις σου, σού προτείνει να συμμετάσχεις στην παραγωγή γνώσης. Σαστισμένος, αρχικά παρατηρείς τον βράχο να ραγίζει και με τον καιρό τον βλέπεις να διαλύεται σε μικροσκοπικούς κόκκους

14 σκόνης, να γίνεται ευμετάβλητος και αεικίνητος όσο μία αμμοθίνη της ερήμου σε αέναο στροβιλισμό. Και τότε είναι που πρέπει να αποδεχθείς όλες εκείνες τις προσπάθειες και τις θυσίες για έναν από αυτούς τους κόκκους. Ίσως γι αυτό τελικά μοιάζει με το ταξίδι στην Ιθάκη. Δεν γίνεσαι επαΐων στο στενό θέμα της διατριβής σου, απλώς. Αλλά, σε ωριμάζει, σου ανοίγει τα μάτια και σε αναγκάζει να δεις με βλέμμα διαπεραστικό ώστε να πιστέψεις ότι μπορείς να φύγεις από τη θέση του παθητικού αποδέκτη της γνώσης και όχι μόνο πιστεύεις ότι έχεις τη δύναμη και τη θέληση να αλλάξεις το ρου του ποταμού. Έστω και αν ο ποταμός, παρατηρώντας τον από μακριά, μοιάζει με μικρό ρυάκι. Φυσικά, είμαι ευγνώμων γιατί μου δόθηκε η δυνατότητα να κάνω αυτό το μακρύ ταξίδι. Θέλω, λοιπόν, να ευχαριστήσω από καρδίας τον μεγαλύτερο δάσκαλό μου στη χειρουργική, όπως και στην πειραματική χειρουργική, επιβλέποντα της παρούσας διατριβής, καθηγητή Διονύσιο Καραβία, ο οποίος με -σχεδόν- «πατρική» στάση απέναντί μου στα χρόνια της ειδικότητας, μου προσέφερε επιστημονική και ψυχολογική υποστήριξη σε κάθε δύσκολη στιγμή. Μαζί περάσαμε πολλές ώρες, είτε στο χειρουργείο, είτε στα πειραματόζωα, με πολλή κούραση, αλλά με ανέλπιστη ευδαιμονία τροφοδοτούμενη από το ιδιότυπο και πηγαίο συνάμα χιούμορ του. Τον ευχαριστώ για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε με την ανάθεση αυτής της διατριβής καθώς και την επιμονή στην υποστήριξή μου ως το τέλος. Για τον επίκουρο καθηγητή Ιωάννη Χαμπαίο έχω να δηλώσω εντυπωσιασμένος από την προσήλωσή του στην ειλικρίνεια, στην αρτιότητα και εγκυρότητα κάθε πειραματικής διεργασίας και τον ευχαριστώ για αυτό το μάθημα ζωής. Η συνεισφορά του στην παρούσα διατριβή δεν υπήρξε απλά καίρια απεδείχθη ζωτική αφού στα χρόνια αυτά ήταν ο στυλοβάτης του εργαστηρίου. Με χαρακτηριστική αυτοθυσία συχνά επωμίστηκε δικές μου ευθύνες και εργασίες αγόγγυστα, όταν οι άγρυπνες εφημερίες με κρατούσαν μακριά από το εργαστήριο. Τον ευχαριστώ πιότερο από θερμά, αφού χωρίς τη βοήθειά του δεν θα έφτανα ως το τέλος του ταξιδιού μου. Κάποτε, όντας νεαρός ειδικευόμενος, κάποιος με πλησίασε και με ρώτησε: «Έχεις όρεξη για δουλειά;» Του απάντησα με παρρησία: «Αν είναι να πιάσει τόπο, έχω!» Έτσι, κατόπιν προτροπής του επίκουρου καθηγητή Ιωάννη Μαρούλη ξεκίνησα την ενασχόλησή μου με το πειραματικό εργαστήριο του Πανεπιστημίου Πατρών. Τον

15 ευχαριστώ για την πρόσκληση και τη μετέπειτα σημαντική υποστήριξη στα χρόνια προετοιμασίας της διατριβής. Τον επίκουρο καθηγητή Κωνσταντίνο Παναγόπουλο ευχαριστώ θερμά για την συμβολή του στην διαμόρφωσή μου ως «μάχιμος» χειρουργός με απεριόριστο όμως σεβασμό και σύνεση στο εγχειρητικό πεδίο, καθώς και για τις καίριες παρατηρήσεις του στην διαμόρφωση και παρουσίαση της διατριβής. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επίκουρο καθηγητή Ιωάννη Κεχαγιά, που εκτός από την σημαντικότατη συμβολή του στην χειρουργική μου παιδεία συνέβαλε στην διδαχή της τέχνης της επαγωγικής σκέψης η οποία συνιστά πολύτιμο σύμμαχο στο ερευνητικό και το κλινικό έργο μου. Οι, επί της ουσίας, παρατηρήσεις του ήταν κρίσιμες για το παρόν αποτέλεσμα. Οφείλω στο σημείο αυτό να ευχαριστήσω τον επίκουρο καθηγητή Κωνσταντίνο Θωμόπουλο για τις πολύτιμες διευκρινήσεις του πάνω σε εξειδικευμένα θέματα ηπατολογίας, που η μακροσκοπική ματιά μου ως χειρουργός δεν είχε τη δυνατότητα να αντιληφθεί. Η καθοδήγησή του και οι παρατηρήσεις του βοήθησαν στην διαμόρφωση του πονήματός μου. Πολύτιμη υπήρξε και η συμβολή του επίκουρου καθηγητή Αθανάσιου Τσαμαντά, ο οποίος με ξενάγησε τόσο στον δαίδαλο των ανοσοϊστοχημικών πρωτοκόλλων και διαδικασιών, όσο και στην σωστή ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Τον ευχαριστώ θερμά. Δεν θα παραλείψω να αναφερθώ στον πρώτο μου μέντορα της χειρουργικής και του πειραματισμού, τον αναπληρωτή καθηγητή του Δ.Π.Θ. Μιχαήλ Πιτιακούδη, που πρώτος μου εμπιστεύθηκε, ενώ ήμουν ακόμη φοιτητής, νυστέρι και grasper στο χειρουργείο, καθώς και την τύχη κάποιων κονίκλων του εργαστηρίου του. Ας αποτελέσει παράδειγμα και για άλλους «δασκάλους». Στη βάση όλης της προσπάθειας και της ίδιας μου της ύπαρξης, βέβαια, βρίσκεται η οικογένειά μου. Με, υπέρ του δέοντος, υπομονή απέναντι στην «παρατεταμένη εφηβεία» μου, με στήριξαν πάντα. Μακάρι να σταθώ άξιος, κάποτε, να το ανταποδώσω στα δικά μου παιδιά.

16 Τους συναδέλφους και φίλους Εύη και Δημήτρη ευχαριστώ πολύ για την επιστημονική τους συνδρομή και την φιλική υποστήριξή τους στην δύσκολη περίοδο συγγραφής της παρούσας διατριβής. Την Αθηνά επιθυμώ να ευχαριστήσω, γιατί προσπάθησε με ένα ζωοδόχο χαμόγελο και ειλικρίνεια να ομορφύνει την καθημερινότητά μου, τα τελευταία χρόνια, μαχόμενη με διάφορες αντιξοότητες. Τέλος, μάλλον οφείλω μία συγγνώμη σε όσους παραμέλησα όλα αυτά τα χρόνια του τόσο φορτωμένου προγράμματός μου. Λυπάμαι, αλλά έκανα ό,τι μπορούσα. Όπως όλοι μας, άλλωστε

17 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ i. Αφιέρωση ii. Βιογραφικό σημείωμα iii. Δημοσιεύσεις εκ της παρούσης διατριβής iv. Πρόλογος ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κεφάλαιο 1 ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ιστορική αναδρομή. 2 Κεφάλαιο 2 ο - ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ, ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ Στοιχεία ανατομικής και ιστολογίας του ήπατος Ανατομικολειτουργική διαίρεση του ηπατικού παρεγχύματος Το ηπατοκύτταρο Κολποειδικά τριχοειδή και περικολποειδικά κύτταρα Στοιχεία φυσιολογίας της ηπατικής λειτουργίας.10 Κεφάλαιο 3 ο - ΗΠΑΤΙΚΗ ΑΝΑΓΕΝΝΗΣΗ ΚΑΙ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΗΠΑΤΕΚΤΟΜΗ Πειραματικά μοντέλα ηπατικής αναγέννησης σε ζώα Χειρουργικά μοντέλα ηπατικής αναγέννησης Φαρμακολογικά μοντέλα.15

18 3.4 Σύγκριση λοιπών πειραματικών μοντέλων με τη μερική ηπατεκτομή και επιλογή του κατάλληλου μοντέλου για την παρούσα μελέτη Κλασική χειρουργική τεχνική ηπατεκτομής σε τρωκτικά Κλασική τεχνική 2/3 μερικής ηπατεκτομής στον επίμυ Παραλλαγές έκτασης της ηπατεκτομής στον επίμυ Πειραματικό μοντέλο 2/3 PHx στον μυ Ανατομία του ήπατος του μυός..21 Κεφάλαιο 4 ο - ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΗΠΑΤΙΚΗΣ ΑΝΑΓΕΝΝΗΣΗΣ 4.1 Κυτταρικός πολλαπλασιασμός κατά την αναγέννηση μετά χειρουργική ηπατεκτομή σε φυσιολογικό ήπαρ: Κυριαρχία ώριμων κυττάρων Κυτταρικός πολλαπλασιασμός κατά την αναγέννηση μετά από μοντέλα με ιστική ηπατική βλάβη: Εμφάνιση του Oval Cell του ήπατος στο προσκήνιο Αναπαραγωγικό δυναμικό των ηπατοκυττάρων Οι τρεις φάσεις της αναγέννησης μετά από μερική ηπατεκτομή Μιτογόνες ουσίες Ο ρόλος της πυλαίας κυκλοφορίας στην έναρξη της αναγέννησης του ήπατος μετά από ηπατεκτομή Ο ρόλος της γενικής κυκλοφορίας στην έναρξη της αναγέννησης του ήπατος μετά από ηπατεκτομή Χρονολόγιο Πρώιμων Σηματοδοτικών Γεγονότων (εντός της πρώτης ώρας) μετά μερική ηπατεκτομή Ρόλος και δράσεις των αυξητικών παραγόντων και των κυτταροκινών στην αναγέννηση του ήπατος μετά μερική ηπατεκτομή Ηπατοκυτταρικός αυξητικός παράγων (HGF) και ο υποδοχέας αυτού (cmet) Προσδέτες του EGFR. 40

19 4.9.3 Tumor Necrosis Factor Ιντερλευκίνη Νορεπινεφρίνη και α-1 αδρενεργικός υποδοχέας Χολικά άλατα και ξενοβιοτικές ουσίες Σεροτονίνη Συστατικά του συμπληρώματος Notch και Jagged Ινσουλίνη Σηματοδοτικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των διάφορων κυτταρικών πληθυσμών του ήπατος: Παρακρινικές και αυτοκρινικές δράσεις Μεταβολικές αλλαγές κατά την αναγέννηση Τερματισμός της αναγέννησης: Υπάρχει ηπατοστάτης; 49 Κεφάλαιο 5 ο MicroRNAs RNA MicroRNAs Ιστορία των micrornas Βιοσύνθεση των micrornas Μηχανισμός δράσης των micrornas Κλινική σημασία των micrornas Φυσιολογικό ήπαρ και micrornas Μεταβολισμός λιπιδίων και micrornas 63 Σκοπός της παρούσας μελέτης 65

20 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κεφάλαιο 6 ο ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Βελτιστοποίηση της μεθόδου 2/3 μερικής ηπατεκτομής Πειραματόζωα Αναισθησιολογική τεχνική και ανάνηψη Αρχική χειρουργική τεχνική Τροποποιημένη χειρουργική τεχνική Απαιτούμενα υλικά Εγχειρητική μέθοδος Χρονική αλληλουχία της πορείας της αναγέννησης με έλεγχο του Ki-67 και της συσσώρευσης λίπους Υλικά ανοσοϊστοχημικής μεθόδου για την έκφραση του δείκτη Ki-67 στα ηπατοκύτταρα Προετοιμασία των διαλυμάτων Πρωτόκολλο ανοσοϊστοχημικής μεθόδου για το αντιγόνο Ki Μορφομετρική ανάλυση Έλεγχος της μεταβολής της έκφρασης των mi-rnas την 12 η ώρα μετά μερική ηπατεκτομή Πειραματόζωα και εγχειρητική διαδικασία Εξαγωγή του RNA του ηπατικού ιστού Υλικά και μέθοδος χρήσης του αντιδραστηρίου TRIzol Προφίλ έκφρασης των micrornas Υλικά και Μέθοδος χρήσης του mircury LNA microrna Array Hi-Power labeling kit Φιλτράρισμα της πληροφορίας των μικροσυστοιχιών (microarrays), διόρθωση υποβάθρου και κανονικοποίηση 86

21 6.3.5 Έλεγχος της ποιότητας των slides με χρήση των spike-in controls Ομαδοποίηση Κατάθεση δεδομένων στο Gene Expression Omnibus (GEO) Παρασκευή cdna από ολικό RNA και ποσοτική real time PCR RT και qpcr με τη χρήση του συστήματος mircury LNA Universal RT mirna PCR: Περιγραφή υλικών RT και qpcr με τη χρήση του συστήματος mircury LNA Universal RT mirna PCR: Πρωτόκολλο Διαδικασίας Χρονική αλληλουχία έκφρασης του mir-21 με τη χρήση της μεθόδουrt-qpcr Χρονική αλληλουχία έκφρασης του mir-21 με τη μέθοδο του in situ υβριδισμού Αντιδραστήρια για τον in situ υβριδισμό Εξοπλισμός για τον in situ υβριδισμό Διαδικασία in situ υβριδισμού TargetScan, Gene Ontology (GO) και αναλύσεις εμπλουτισμού Στατιστική ανάλυση.98 Κεφάλαιο 7 ο ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Βελτιστοποίηση της χειρουργικής μεθόδου ηπατεκτομής Χρονική εξέλιξη του ρυθμού κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της συσσώρευσης λίπους στα ηπατοκύτταρα κατά την αναγέννηση Χρονική αλληλουχία της έκφρασης του Ki Χρονική αλληλουχία της συσσώρευσης λίπους Αποτελέσματα του ελέγχου της μεταβολής της έκφρασης των mirnas την 12 η ώρα μετά μερική ηπατεκτομή...105

22 7.3.1 Προφίλ έκφρασης micrornas με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών (Microarray Profiling) Ιεραρχική ομαδοποίηση Επιβεβαίωση της έκφρασης των mirnas με RT-qPCR Συσχετισμός μεταξύ μικροσυστοιχιών και qpcr TargetScan και ανάλυση εμπλουτισμού GO Ποσοτικός προσδιορισμός της έκφρασης του mir-21 με τη μέθοδο της RT-qPCR Αποτελέσματα ελέγχου της χρονικής αλληλουχίας του mir-21 με τη μέθοδο του in situ υβριδισμού. 115 Κεφάλαιο 8 ο ΣΥΖΗΤΗΣΗ Κεφάλαιο 9 ο ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ. 139 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΕΙΚΟΝΩΝ, ΠΙΝΑΚΩΝ, ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΩΝ..141 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT.. 147

23

24

25 Κεθάιαην 1 ΕΘΑΓΩΓΗ Σν ήπαξ ραξαθηεξίδεηαη απφ κία κνλαδηθή, εμαηξεηηθά ελδηαθέξνπζα ηδηφηεηα: ηην αναγέννηζη. Δίλαη ην κφλν φξγαλν ηνπ ζψκαηνο πνπ κπνξεί, αλαγελλψκελν απφ ηα ώξηκα θύηηαξα πνπ ην απαξηίδνπλ, λα απνθαηαζηαζεί κεηά απφ βιάβε πνπ έρεη σο απνηέιεζκα ηελ εθζεζεκαζκέλε απψιεηα κάδαο. Μάιηζηα, δχλαηαη λα νινθιεξψζεη απηή ηε δηεξγαζία ζε πνιχ κηθξφ ρξνληθφ δηάζηεκα (κία εβδνκάδα ζηα ηξσθηηθά κεηά απφ απψιεηα ησλ 2/3 ηεο κάδαο ηνπ) (Higgins GM 1931) ρσξίο ηαπηφρξνλα λα εγθαηαιείςεη ηηο πνιχπινθεο θαη αλαγθαίεο γηα ηε δσή ιεηηνπξγίεο ηνπ θαηά ηε δηάξθεηα ηεο αλαγέλλεζήο ηνπ. Πεξηνξηζκέλε αλαγελλεηηθή ηθαλφηεηα επηδεηθλχνπλ θαη άιινη ηζηνί, φπσο ην δέξκα, ην κπνθάξδην (Bergmann, Bhardwaj et al. 2009) θαη ην θεληξηθφ λεπξηθφ ζχζηεκα (Brill, Ninkovic et al. 2009). Καλέλα άιιν φκσο φξγαλν δελ κπνξεί λα αλαγελλεζεί ζε ηφζε έθηαζε, απνθαζηζηψληαο πιήξσο ηελ ηζηνινγηθή ηνπ δνκή, κε πνιιαπιαζηαζκφ φισλ ησλ θαηεγνξηψλ ψξηκσλ θπηηάξσλ πνπ ην απαξηίδνπλ. Δηθάδεηαη φηη εμειηθηηθά ε δπλαηφηεηα απηή πξνέθπςε ιφγσ ηεο αλάγθεο γηα επηβίσζε ησλ δψσλ πνπ ζπρλά πξνζειάκβαλαλ ηνμίλεο κε ην θαγεηφ. Σηο ηνμίλεο απηέο, κεηά ηελ θαηάπνζή ηνπο, αλαιακβάλεη ην ήπαξ λα αδξαλνπνηήζεη γηα λα δηαθπιάμεη ηε δσή ηνπ δψνπ, κε θφζηνο φκσο, άιινηε άιιεο έθηαζεο επαηνθπηηαξηθή θαηαζηξνθή (Michalopoulos and DeFrances 1997). Σελ επηβίσζε κεηά απφ βαξχ ηξαχκα ήπαηνο ή θαη ηε δπλαηφηεηα ρεηξνπξγηθήο παξέκβαζεο ζην φξγαλν, φπσο ηελ ρεηξνπξγηθή εμαίξεζε ησλ φγθσλ ηνπ ήπαηνο ζε φξηα πγηνχο παξεγρχκαηνο ή ηελ κεηακφζρεπζε ήπαηνο απφ δψληα δφηε (δειαδή κεηακφζρεπζε ηκήκαηνο ήπαηνο), ραξίδεη ζηνλ άλζξσπν ε ζαπκαζηή απηή ηθαλφηεηα ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο. 1

26 1.1 Ιζηνξηθή αλαδξνκή Δηθόλα 1.1: Peter Paul Rubens and Frans Snyders, Prometheus Bound, Philadelphia Museum of Art «Προμηθεὺς δὲ ἐξ ὕδατος καὶ γῆς ἀνθρώπους πλάσας ἔδωκεν αὐτοῖς καὶ πῦρ, λάθρᾳ Διὸς ἐν νάρθηκι κρύψας. ὡς δὲ ᾖσθετο Ζεύς, ἐπέταξεν Ἡφαίστῳ τῷ Καυκάσῳ ὄρει τὸ σῶμα αὐτοῦ προσηλῶσαι. Tοῦτο δὲ Σκυθικὸν ὄρος ἐστίν. ἐν δή τούτῳ προσηλωθεὶς Προμηθεὺς πολλῶν ἐτῶν ἀριθμὸν ἐδέδετο. καθ ἑκάστην δὲ ἡμέραν ἀετὸς ἐφιπτάμενος αὐτῷ τοὺς λοβοὺς ἐνέμετο τοῦ ἥπατος αὐξανομένου διὰ νυκτός. Kαὶ Προμηθεὺς μὲν πυρὸς κλαπέντος δίκην ἔτινε ταύτην, μέχρις Ἡρακλῆς αὐτὸν ὕστερον ἔλυσεν, ὡς ἐν τοῖς καθ Ἡρακλέα δηλώσομεν.» (Ἀπολλόδωρος Βιβλιοθήκη Α' 7) 2

27 Μπνξεί ε ζχγρξνλε ηαηξηθή λα κειεηά ζπζηεκαηηθά ηελ επαηηθή αλαγέλλεζε γηα ιηγφηεξν απφ έλαλ αηψλα, αιιά είλαη πηζαλφ ε γλψζε ηνπ θαηλνκέλνπ ηεο αλαγέλλεζεο λα εθηείλεηαη ρηιηάδεο ρξφληα πξηλ. Απφ ηνπο αξραίνπο ρξφλνπο ζην ήπαξ απνδίδεηαη ε κεγαιχηεξε, ζε ζρέζε κε ηα ππφινηπα ζπιάρλα, απνθξπθηζηηθή ζεκαζία. Με ηελ επηζθφπεζε ησλ νπιψλ ηνπ ήπαηνο ησλ ηειεηνπξγηθψλ ζθαγίσλ (επαηνζθφπεζε), ζηελ αξραία Ρψκε θαη Βαβπιψλα, νη κάληεηο έδηλαλ ρξεζκνχο γηα ηα κειινχκελα (Power and Rasko 2008). Άιινη ιανί έθηαλαλ λα ζεσξνχλ φηη ην ήπαξ είλαη ε ζέζε ηεο ςπρήο ζην ζψκα (Chen and Chen 1994). Η πην άκεζε αλαθνξά ζηελ αλαγέλλεζε, φκσο, δφζεθε κε ηνλ αξραίν ειιεληθφ κχζν ηνπ Πξνκεζέα. χκθσλα κε ηνλ κχζν, ν Πξνκεζέαο έλαο επηθαλήο ηηηάλαο, γηνο ηνπ ηηηάλα Ιαπεηνχ θαη ηεο Αζίαο, σο κέγαο επεξγέηεο ηνπ αλζξψπηλνπ είδνπο (αθνχ πξσηνζηάηεζε ζηελ δεκηνπξγία ηνπ αλζξψπνπ) μεγέιαζε ηνλ Γία γηα λα εμαζθαιίζεη ζηνλ άλζξσπν ηξνθή, μεγέιαζε ηελ ζεά Αζελά γηα λα ηνπ πξνζθέξεη ηηο επηζηήκεο θαη ηνλ Ήθαηζην γηα λα ηνπ δψζεη ηε θσηηά. Χο ηηκσξία γηα ηελ ππέξκεηξε αγάπε ηνπ πξνο ηνπο αλζξψπνπο, κε ηε βνήζεηα ηνπ Κξάηνπο θαη ηεο Βίαο, ν Γίαο ηνλ έδεζε κε αηζάιηλεο αιπζίδεο επάλσ ζηνλ Καχθαζν θη έζηεηιε έλαλ αεηφ, ηέθλν ηνπ Σπθψλα θαη ηεο Έρηδλαο, λα ηνπ ηξψεη θάζε κέξα ην ζπθψηη, ην νπνίν, ζχκθσλα κε ηνλ κχζν, θάζε λχρηα αλαγελληφηαλ. Γηα άγλσζην ρξνληθφ δηάζηεκα ζπλερίζηεθε ην καξηχξην απηφ θαζψο θαη ε αέλαε αλαγέλλεζε ηνπ ήπαηνο ηνπ Πξνκεζέα, έσο φηνπ ηνλ έιπζε απφ ηα δεζκά ηνπ ν Ηξαθιήο, αθνχ ηφμεπζε ηνλ αεηφ (Ἀπνιιόδσξνο Βηβιηνζήθε Α' 7). Παξφηη είλαη ακθηζβεηνχκελν αλ ε πεξηγξαθή απηή αληαλαθιά πξάγκαηη γλψζε ηεο ηεξάζηηαο αλαγελλεηηθήο ηθαλφηεηαο ηνπ ήπαηνο, ή αλ ρξεζηκνπνηήζεθε ζπκβνιίδνληαο ηελ αζαλαζία (Power and Rasko 2008), κνιαηαχηα, ψζεζε ηνπο επηζηήκνλεο αλά ηνπο αηψλεο λα εμεηάζνπλ ηελ νξζφηεηά ηεο, επηβεβαηψλνληάο ηελ παλεγπξηθά. 3

28 4

29 Κεθάιαην 2 ΣΟΘΥΕΘΑ ΑΝΑΣΟΜΘΚΗ, ΘΣΟΛΟΓΘΑ ΚΑΘ ΦΤΘΟΛΟΓΘΑ ΣΟΤ ΗΠΑΣΟ 2.1 ηνηρεία αλαηνκηθήο θαη ηζηνινγίαο ηνπ ήπαηνο Σφζν ζηνλ άλζξσπν, φζν θαη ζηνλ κπ, πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε ζαλ πεηξακαηηθφ κνληέιν, ην ήπαξ είλαη ην κεγαιχηεξν ζπκπαγέο φξγαλν ηνπ νξγαληζκνχ, ν κεγαιχηεξνο αδέλαο θαη έλα απφ ηα ζεκαληηθφηεξα φξγαλα απηνχ. Καηαιακβάλεη ην δεμηφ ππνρφλδξην, ην ηδίσο ππνρφλδξην θαη εθηείλεηαη σο ην αξηζηεξφ ππνρφλδξην (άββαο 1996). εκαληηθή δηαθνξά κεηαμχ ήπαηνο αλζξψπνπ θαη κπφο, είλαη φηη ην ηειεπηαίν έρεη δνκή πνιπινβσηή (εηθφλα 2.1), ελψ ην πξψην είλαη εληαίν (εηθφλα 2.2). Ο παξαπέξα δηαρσξηζκφο ζε ινβνχο θαη ηκήκαηα ζηνλ άλζξσπν είλαη ιεηηνπξγηθφο θαη φρη αλαηνκηθφο. Δηθόλα 2.1: Απεηθνλίδνληαη νη ινβνί ηνπ ήπαηνο ηνπ κπόο θαζώο θαη ηα πνζνζηά επί ηνπ επαηηθνύ παξεγρύκαηνο πνπ αληηζηνηρνύλ ζε θαζέλα από απηνύο. ην πξόζζην ρείινο ηνπ κέζνπ ινβνύ επηζεκαίλεηαη ε ρνιεδόρνο θύζηε. Από (Doerr RJ 1990) 5

30 Σν ήπαξ ιακβάλεη αηκαηηθή παξνρή απφ δχν αγγεία: ηελ επαηηθή αξηεξία (25%) εθ ηνπ θνηιηαθνχ άμνλα θαη ηελ ππιαία θιέβα (75%) δειαδή ηελ εμεξρφκελε θπθινθνξία απφ ην ζχλνιν ζρεδφλ ηνπ εληέξνπ, απφ ηνλ ζπιήλα θαη ην πάγθξεαο. Σν αίκα απφ ην ήπαξ παξνρεηεχεηαη κε ηηο δηάθνξεο επαηηθέο θιέβεο, ζηελ θάησ θνίιε θιέβα. ην ήπαξ παξάγεηαη ε ρνιή (εμσθξηλήο ιεηηνπξγία), ε νπνία παξνρεηεχεηαη κε ηα ελδνεπαηηθά θαη ηα εμσεπαηηθά ρνιεθφξα ζην δσδεθαδάθηπιν, κεηά απφ παξνδηθή απνζήθεπζε ζηε ρνιεδφρν θχζηε. Δληφο ηνπ παξεγρχκαηνο, παξάιιεια κε ηα ππφινηπα αγγεηαθά ζηνηρεία πνξεχνληαη θαη ηα ιεκθαγγεία ηνπ ήπαηνο. Δμσηεξηθά ην φξγαλν θαιχπηεηαη ζην κεγαιχηεξν κέξνο ηνπ απφ πεξηηφλαην. Κάησ απφ ην πεξηηφλαην ππάξρεη κία ζηηβάδα ραιαξνχ ζπλδεηηθνχ ηζηνχ πνπ ζηνλ άλζξσπν νλνκάδεηαη θάςα ηνπ Glisson. Δίλαη ηδηαηηέξσο αλεπηπγκέλε ζηηο πχιεο θαη απνιήγεη ζε πξνζεθβνιέο κέζα ζην παξέγρπκα, ηα έιπηξα. Απηά, ελδνπαξεγρπκαηηθά, πεξηβάιινπλ ηνπο θιάδνπο ηεο επαηηθήο αξηεξίαο, ηεο ππιαίαο θιέβαο, ησλ ρνιαγγείσλ θαη ιεκθαγγείσλ. Σν επαηηθφ παξέγρπκα δηαρσξηδφκελν απφ ηα έιπηξα θαη ηνπο δηάθνξνπο αγγεηαθνχο ζρεκαηηζκνχο παξνπζηάδεη ραξαθηεξηζηηθή κηθξνζθνπηθή ηζηνινγηθή εηθφλα (εηθφλεο 2.3, 2.4). Δηθφλα 2.2: Η βαζηθή αλαηνκία ηνπ αλζξψπηλνπ ήπαηνο κε ηηο βαζηθφηεξεο αγγεηαθέο θαη ρνιαγγεηαθέο ηνπ δνκέο Απφ 6

31 Δηθφλα 2.3: Φπζηνινγηθή αλαηνκία θαη ηζηνινγηθή δνκή ηνπ ήπαηνο Απφ Αλαηνκηθνιεηηνπξγηθή δηαίξεζε ηνπ επαηηθνύ παξεγρύκαηνο Τπάξρνπλ ηξία κνληέια πνπ πεξηγξάθνπλ ηε κηθξνζθνπηθή δνκή ηνπ επαηηθνχ παξεγρχκαηνο, αλαιφγσο ηε ιεηηνπξγία ζηελ νπνία ζέινπκε λα δψζνπκε έκθαζε: i. Σν θιαζηθφ ιφβην, κε έκθαζε ζηελ αλαηνκηθή πεξηγξαθή ii. Σν ππιαίν ιφβην, κε έκθαζε ζηελ έθθξηζε ρνιήο iii. Σελ επαηηθή αδελνθπςέιε, κε έκθαζε ζηελ αηκαηηθή ξνή θαη ηνλ κεηαβνιηζκφ Δηθφλα 2.4: Ιζηνινγηθή δνκή ήπαηνο, ε ππιαία ηξηάδα θαη ε αξρή ηνπ θνιπoεηδηθνχ ηξηρνεηδνχο Απφ hopkins-gi.org 7

32 Σν θιαζηθφ ιφβην έρεη εμαγσληθφ ζρήκα, κε ηηο έμη γσλίεο λα αληηζηνηρνχλ ζε έμη ππιαίεο ηξηάδεο (θιάδνο ππιαίαο, θιάδνο επαηηθήο θαη ρνιαγγείν πνπ πνξεχνληαη παξάιιεια εληφο ειχηξνπ) (εηθφλα 2.5) θαη ζην θέληξν αληηζηνηρεί ε θεληξηθή θιέβα (θιάδνο επαηηθήο). Η αηκαηηθή ξνή έρεη θεληξνκφιν θνξά ελψ ε εθθξηλφκελε ρνιή παξνρεηεχεηαη αληίζεηα. Μεηαμχ πεξηθέξεηαο θαη θέληξνπ, ηα επαηνθχηηαξα είλαη ραξαθηεξηζηηθψο αθηηλσηά δηαηεηαγκέλα ζε δνθίδεο, ζρεκαηίδνληαο κεηαμχ ηνπο ρψξνπο αηκαηηθήο ξνήο, ηα θνιπνεηδηθά ηξηρνεηδή (εηθφλα 2.4). Δηθφλα 2.5: Σα δηάθνξα κνληέια αλαηνκηθνιεηηνπξγηθήο δηαίξεζεο ηνπ επαηηθνχ παξεγρχκαηνο: iii. i. Κιαζηθφ ιφβην ii. Ππιαίν ιφβην Ηπαηηθή αδελνθπςέιε (θαη νη ηξεηο δψλεο νμπγφλσζεο) Απφ Αλ, ηψξα, θαληαζηνχκε πεξηζζφηεξα γεηηνληθά ιφβηα (εηθφλα 2.5), θαη ελψζνπκε ηα θέληξα ηξηψλ γεηηνληθψλ ινβίσλ, θαηαιήγνπκε ζε κία ηξηγσληθή πεξηνρή κε θέληξν κία ππιαία ηξηάδα. Απηή είλαη ε βαζηθή αλαηνκηθνιεηηνπξγηθή κνλάδα έθθξηζεο ηεο ρνιήο, ην ππιαίν ιφβην (Mall 1906). Σέινο, ελψλνληαο ελαιιάμ δχν γεηηνληθέο θεληξηθέο θιέβεο θαη δχν ππιαίεο ηξηάδεο, θαηαιήγνπκε ζε ξνκβνεηδέο ζρήκα (εηθφλα 2.5) πνπ θαηά ηνλ Rappaport (Rappaport 1958), απνηειεί ηελ αλαηνκηθνιεηηνπξγηθή κνλάδα ησλ κεηαβνιηθψλ ιεηηνπξγηψλ ηνπ ήπαηνο, ηελ επαηηθή αδελνθπςέιε. ε απηή ηε δνκηθή κνλάδα δηαθξίλνπκε ηξεηο δψλεο απφ πιεπξάο νμπγφλσζεο (ηελ Ι- πεξηππιαία ζέζε, πςειήο νμπγφλσζεο, ηελ ΙΙ ελδηάκεζε θαη ηελ ΙΙΙ- πεξηθιεβηθή, ρακειήο νμπγφλσζεο) 8

33 2.3 Σν επαηνθύηηαξν Σν ζχλνιν ησλ θπηηάξσλ ηνπ ήπαηνο κπνξεί λα δηαθξηζεί ζε: επηζειηαθά (επαηνθχηηαξα θαη επηζειηαθά θχηηαξα ρνιεθφξσλ) θαη κε-επηζειηαθά (αζηεξνεηδή, Kuppfer, ελδνζειηαθά θχηηαξα θαη θχηηαξα Pit) (Michalopoulos 2011). Σα επαηνθχηηαξα απνηεινχλ ην 70% ησλ θπηηάξσλ ηνπ ήπαηνο. Γηαηάζζνληαη ζε κνλφζηνηβεο δνθίδεο νη νπνίεο ρσξίδνληαη απφ θνιπνεηδηθά ηξηρνεηδή. Δίλαη πνιπγσληθά θχηηαξα επηζειηαθνχ ηχπνπ δηακέηξνπ πεξί ηα 25 κm. Η θπηηαξηθή ηνπο κεκβξάλε έρεη δηαθνξεηηθέο πιεπξέο, ηελ θνιπνεηδηθή, ηελ ρνιηθή θαη ηελ πιάγηα, θαζεκία κε δηαθνξεηηθέο ηδηφηεηεο. Έρνπλ ππξήλεο κε ππξήληα, νη νπνίνη πνηθίινπλ ζε κέγεζνο αλαιφγσο ηεο πινεηδηθφηεηάο ηνπο (Feldmann 1992). Γηα ηελ εμππεξέηεζε ησλ πνιιαπιψλ κεηαβνιηθψλ ιεηηνπξγηψλ ηνπ ήπαηνο, ην θπηηαξφπιαζκά ηνπο είλαη άθζνλν, πεξηέρνλ πνιιά κηηνρφλδξηα, ιπζνζψκαηα θαη άθζνλν ελδνπιαζκαηηθφ δίθηπν (MacSween 2002). 2.4 Κνιπνεηδηθά ηξηρνεηδή θαη πεξηθνιπνεηδηθά θύηηαξα Όπσο ήδε αλαθέξζεθε ηα θνιπνεηδηθά ηξηρνεηδή βξίζθνληαη κεηαμχ ησλ δνθίδσλ ησλ επαηνθπηηάξσλ. ρεκαηίδνληαη απφ δχν θαηεγνξίεο θπηηάξσλ: ηα ελδνζειηαθά θαη ηα θχηηαξα Kuppfer (επαηηθά καθξνθάγα πνπ αλήθνπλ ζην δηθηπνελδνζειηαθφ ζχζηεκα) (30%). Σα θχηηαξα απηά ππαιείθνπλ ηα θνιπνεηδηθά ηξηρνεηδή αθήλνληαο αλνίγκαηα, ηηο ραξαθηεξηζηηθέο ζπξίδεο (fenestrae) (Arias 1990), δηακέηξνπ 0,1κm. Απηά απνηεινχλ ζεκεία επξείαο επηθνηλσλίαο ηνπ απινχ ησλ ηξηρνεηδψλ (άξα ηνπ αίκαηνο) κε ηνλ ρψξν Disse θαη θαη επέθηαζε κε ηα επαηνθχηηαξα, δηεπθνιχλνληαο ηελ πξφζιεςε θαη ηνλ κεηαβνιηζκφ δηάθνξσλ καθξνκνξίσλ. (MacSween 2002) 9

34 Υψξνο ηνπ Disse νλνκάδεηαη ν ρψξνο κεηαμχ ελδνζειίνπ θαη επαηνθπηηάξσλ. ε απηφλ ππάξρνπλ ηα πεξηθνιπνεηδηθά θχηηαξα: ηα αζηεξνεηδή (θχηηαξα Ito) (Ramadori 1991) (πεξηβάιινπλ ηα επαηνθχηηαξα κε καθξηέο πξνζεθβνιέο, απνζεθεχνπλ βηηακίλε Α, ζπλζέηνπλ πξσηεΐλεο ηνπ ζπλδεηηθνχ ηζηνχ θαη εθθξίλνπλ δηάθνξνπο απμεηηθνχο παξάγνληεο) (Michalopoulos and DeFrances 1997) θαη ηα θχηηαξα Pit (natural killer cells ιεκθνθχηηαξα) (Wisse, van't Noordende et al. 1976). Δηθφλα 2.6: Φσηνγξαθία ειεθηξνληθνχ κηθξνζθνπίνπ κε απεηθφληζε ησλ ζπξίδσλ ησλ θνιπνεηδηθψλ ηξηρνεηδψλ θαη ηνπ ρψξνπ ηνπ Disse Απφ: soidal_space 2.5 ηνηρεία θπζηνινγίαο ηεο επαηηθήο ιεηηνπξγίαο Σν ήπαξ είλαη έλα φξγαλν κε πνιιέο θαη ζχλζεηεο ιεηηνπξγίεο, απφιπηα αλαγθαίεο γηα ηε δσή. Η επαηηθή αλεπάξθεηα επηθέξεη ηνλ ζάλαην εληφο εκεξψλ θαη δελ έρεη βξεζεί απνηειεζκαηηθφο ηξφπνο καθξνπξφζεζκεο ηερλεηήο ππνθαηάζηαζεο ηεο επαηηθήο ιεηηνπξγίαο, φπσο ππάξρεη γηα ηελ ππνθαηάζηαζε ηεο λεθξηθήο ιεηηνπξγίαο. Η αλαηνκηθή ζέζε ηνπ ήπαηνο θαη ν ηξφπνο αηκάησζήο ηνπ (ππιαία θιέβα) είλαη πιήξσο ελαξκνληζκέλεο κε ηελ πνιππινθφηεηα απηή ησλ ιεηηνπξγηψλ (Michalopoulos 2007). Γερφκελν ην ήπαξ ην ζχλνιν ζρεδφλ ηνπ αίκαηνο απφ ην έληεξν, άξα φια ηα ζπζηαηηθά πνπ έρνπλ απνξξνθεζεί κε ηελ ηξνθή, θαζψο θαη ην αίκα απφ ην πάγθξεαο, άξα κε φιεο ηηο νξκφλεο πνπ απηφ εθθξίλεη, κπνξεί λα παίμεη 10

35 γεληθφ ξπζκηζηηθφ ξφιν ζηνλ κεηαβνιηζκφ θαη ζηε ζξέςε. Οη επηκέξνπο ιεηηνπξγίεο έρνπλ σο εμήο: χλζεζε: Απνδφκεζε: - Ακηλνμέσλ - Πξσηετλψλ (αιβνπκίλε, παξάγνληεο πήμεο, πξσηεΐλεο πιάζκαηνο) - Δπεμεξγαζία ιηπψλ θαη ζχλζεζε ρνιεζηεξφιεο θαη ηξηγιπθεξηδίσλ - Μεηαβνιηζκφο γιπθφδεο, κε γιπθνλενγέλεζε, γιπθνγνλνγέλεζε θαη γιπθνγνλφιπζε - Καηά ην 1 ν ηξίκελν ηεο εκβξπτθήο δσήο έρεη αηκνπνηεηηθφ ξφιν - Δλδνθξηληθή ιεηηνπξγία κε ζχλζεζε ζξνκβνπνηεηίλεο (ξχζκηζε παξαγσγήο αηκνπεηαιίσλ), ΙGF-1 (ηλζνπιηλφκνξθνπ απμεηηθνχ παξάγνληα 1, κε απμεηηθή δξάζε ζηα παηδηά θαη αλαβνιηθή ζηνλ ελήιηθα, αγγεηνηελζηλνγφλνπ θ.α. - Δμσθξηληθή ιεηηνπξγία κε παξαγσγή ρνιήο, εληφο ηεο νπνίαο απεθθξίλεηαη γιπθνπξνληδησκέλε ε ρνιεξπζξίλε - Δθθαζάξηζε ησλ ηνμηθψλ νπζηψλ απφ ην αίκα (ηνμηλψλ πνπ ιήθζεθαλ κε ηελ ηξνθή) - Μεηαβνιηζκφο θαξκαθεπηηθψλ νπζηψλ - Μεηαηξνπή ακκσλίαο ζε νπξία - Απνδφκεζε νξκνλψλ (πρ. ηλζνπιίλεο) Απνζήθεπζε: - Βηηακίλεο (A, D, B12) - Μέηαιια (Fe, Cu) Αλνζνπνίεζε: - πκκεηνρή ζην δηθηπνελδνζειηαθφ ζχζηεκα κε ηα επαηηθά καθξνθάγα (Kuppfer) θαη ηα Pit cells (ιεηηνπξγία NK cells) 11

36 12

37 Κεθάιαην 3 Ηπαηική Αναγέννηζη και Υειρουργική Ηπαηεκηομή 3.1 Πεηξακαηηθά κνληέια επαηηθήο αλαγέλλεζεο ζε δώα ην ζρήκα παξαθάησ παξνπζηάδνληαη ηα δηάθνξα πεηξακαηηθά κνληέια επαηηθήο αλαγέλλεζεο πνπ έρνπλ εθαξκνζηεί ζε δψα, δηαθξηλφκελα θπξίσο ζε ρεηξνπξγηθά θαη ζε θαξκαθνινγηθά κνληέια, εθαξκνδφκελα είηε ζε πγηή πεηξακαηφδσα, είηε ζε πεηξακαηφδσα κε πξνυπάξρνπζα επαηηθή βιάβε. ρήκα 3.1: Μνληέια επαηηθήο αλαγέλλεζεο 13

38 3.2 Υεηξνπξγηθά κνληέια επαηηθήο αλαγέλλεζεο ε απηή ηελ θαηεγνξία κνληέισλ εληάζζνληαη νη επξέσο ρξεζηκνπνηνχκελεο κεξηθέο επαηεθηνκέο (άιινηε άιιεο έθηαζεο ηνπ παξεγρχκαηνο), ε απνιίλσζε δηάθνξσλ θιάδσλ ππιαίαο, ε δηελέξγεηα ππιαηνζπζηεκαηηθήο αλαζηφκσζεο θαη ε άκεζε αληηζηαζκηζηηθή ππεξπιαζία. Με ηηο ρεηξνπξγηθέο παξεκβάζεηο πξνθαιείηαη κείσζε ηεο επαηηθήο κάδαο άκεζα ή έκκεζα θαη εμαλαγθάδεηαη ην ππνιεηπφκελν ήπαξ ζε θπηηαξηθφ πνιιαπιαζηαζκφ θαη αλαγέλλεζε εληφο 1-2 εβδνκάδσλ, ππφ «θαζαξέο» ζπλζήθεο, ρσξίο πξφθιεζε βιάβεο ζην ελαπνκείλαλ παξέγρπκα. ηνλ παξαθάησ πίλαθα εκθαλίδνληαη νη πξναλαθεξζείζεο κέζνδνη θαη ηα είδε πεηξακαηνδψσλ ζηα νπνία ηηο έρνπλ ρξεζηκνπνηήζεη δηάθνξνη εξεπλεηέο. Μονηέλο Πειραμαηόζωο Ενδεικηική αναθορά Μεξηθή Ηπαηεθηνκή Μπο (Sakamoto, Ezure et al. 2000) Δπίκπο (Higgins GM 1931) θχινο (Ku, Tominaga et al. 2002) Υνίξνο (Kahn, Hickman et al. 1988) Πίζεθνο (Gaglio, Liu et al. 2002) Απνιίλσζε Μπο (Iwakiri, Cadelina et al. 2002) Κιάδνπ Ππιαίαο Δπίκπο (Rozga, Jeppsson et al. 1986) θχινο (Ueno, Aikou et al. 1996) Υνίξνο (Krupski, Broring et al. 2002) Κφληθινο (Nishida, Yano et al. 1991) Ππιαηνζπζηεκαηηθή θχινο (Murphy, Ellison et al. 2001) Αλαζηφκσζε (Meyer, Rothuizen et al. 1999) 14

39 Άκεζε Αληηζηαζκηζηηθή Τπεξπιαζία Μπο/Δπίκπο (Columbano and Shinozuka 1996) Μεξηθή επαηεθηνκή κε θαη ρσξίο ηζραηκία Δπίκπο (Karavias, Tsamandas et al. 2002) ζε ρνινζηαηηθφ ήπαξ (Karavias, Tsamandas et al. 2003) Πίλαθαο 3.2: Παξαδείγκαηα ρεηξνπξγηθώλ πεηξακαηηθώλ κνληέισλ επαγσγήο ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο 3.3 Φαξκαθνινγηθά κνληέια Βαζίδνληαη ζηελ επαγσγή ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο κεηά απφ κεξηθή επαηνθπηηαξηθή θαηαζηξνθή κέζσ ρνξήγεζεο ζπγθεθξηκέλσλ ρεκηθψλ νπζηψλ, φπσο: ηεηξαρισξάλζξαθαο, D-γαιαθηνδακίλε, ζεηναθεηακίδε, αθεηακηλνθαίλε, αηζαλφιε. ηνλ παξαθάησ πίλαθα (πίλαθαο 2) παξνπζηάδνληαη ηα θαξκαθνινγηθά κνληέια επαηηθήο αλαγέλλεζεο θαη ηα είδε πεηξακαηφδσσλ ζηα νπνία ηα έρνπλ ρξεζηκνπνηήζεη νη δηάθνξνη εξεπλεηέο. Μονηέλο Πειραμαηόζωο Ενδεικηική αναθορά CCl4 Μπο (Bruccoleri, Gallucci et al. 1997) Δπίκπο (Liu, Kato et al. 1993) 15

40 θχινο (Voros, Albert et al. 1997) Υνίξνο (Alp and Hickman 1987) Πίζεθνο (Kawakami, Tsubouchi et al. 1994) D-γαιαθηνδακίλε Μπο (Koniaris, Zimmers-Koniaris et al. 2001) Δπίκπο (Grun, Liehr et al. 1977) θχινο (Diaz-Buxo, Blumenthal et al. 1997) Υνίξνο (Ho, Fan et al. 2002) Κφληθινο (Blitzer, Waggoner et al. 1978) ΣΑΑ Δπίκπο (Albrecht and Hilgier 1986) Υνίξνο (Metzner, Hartig et al. 1987) Αθεηακηλνθαίλε Μπο (Gardner, Laskin et al. 2002) Δπίκπο (Leonard, Morgan et al. 1985) θχινο (Francavilla, Makowka et al. 1989) Υνίξνο (Miller, Hickman et al. 1976) Κφληθινο (Shakoori, Cheema et al. 1984) Αηζαλφιε Μπο (Diehl 1999) Δπίκπο (Morales-Gonzalez, Gutierrez-Salinas et al. 1999) CCl4 + AAF + allyl alcohol Δπίκπο (Petersen, Zajac et al. 1998) (Tsamandas 1999) (Kalogeropoulou 2002) 16

41 Πξνεγνύκελε ζειίδα - Πίλαθαο 3.3: Παξαδείγκαηα θαξκαθνινγηθώλ πεηξακαηηθώλ κνληέισλ επαγσγήο ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο 3.4 ύγθξηζε ινηπώλ πεηξακαηηθώλ κνληέισλ κε ηε κεξηθή επαηεθηνκή θαη επηινγή ηνπ θαηάιιεινπ κνληέινπ γηα ηελ παξνύζα κειέηε Σα δηάθνξα θιηληθά ζελάξηα επαηηθψλ λνζεκάησλ ζηνλ άλζξσπν ζπλήζσο είλαη ζχλζεηα, ππφ ηελ έλλνηα φηη ηα άηνκα πνπ πξέπεη λα απνθαηαζηήζνπλ ηνλ φγθν ηνπ ήπαηφο ηνπο, ζπρλά έρνπλ ππφβαζξν επαηηθήο παζνινγίαο (θίξξσζε, επαηίηηδεο, ζηεάησζε). Αθφκα θαη ηα δψα πνπ ζηε θχζε ππφθεηληαη ζε επαηηθή αλαγέλλεζε, απηή επέξρεηαη θαηφπηλ βξψζεο επαηνηνμηθψλ νπζηψλ κε ηελ ηξνθή ή ζπλεπεία ηνγελνχο επαηηθήο ινίκσμεο. ηα ζελάξηα απηά θαίλεηαη πσο νη θαξκαθνινγηθέο κέζνδνη πξνζνκνηάδνπλ πεξηζζφηεξν (θαζψο ζπκπεξηιακβάλνπλ in situ επαηνθπηηαξηθή θαηαζηξνθή θαη θιεγκνλή), παξά ε επαηεθηνκή (θαζαξή, αθξηβήο κέζνδνο ζε πγηέο ππφζηξσκα). Απηφ φκσο, είλαη ην κφλν πιενλέθηεκα ησλ θαξκαθνινγηθψλ κεζφδσλ. Η κεξηθή επαηεθηνκή παξακέλεη ε κέζνδνο εθινγήο γηα εξεπλεηηθή απνζαθήληζε ησλ δηεξγαζηψλ πνπ θξχβνληαη πίζσ απφ ηελ αλαγέλλεζε ηνπ ήπαηνο, έρνληαο ηα παξαθάησ πιενλεθηήκαηα: ρεηηθά απιή κέζνδνο Δπαλαιεςηκφηεηα κε ζρεηηθή αθξίβεηα ζηα δηάθνξα εξγαζηήξηα παγθνζκίσο, πνπ εγγπάηαη ζπγθξίζηκα απνηειέζκαηα Απφιπηνο θαζνξηζκφο ηνπ ρξνληθνχ ζεκείνπ έλαξμεο ηεο επαγσγήο ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο (ε ρξνληθή ζηηγκή αθαίξεζεο ηνπ επαηηθνχ παξεγρχκαηνο) 17

42 Γελ πξνυπνζέηεη ηνλ ρεηξηζκφ επηθίλδπλσλ ρεκηθψλ νπζηψλ Γελ ζπκπεξηιακβάλεη επαηηθή θιεγκνλή ή επαηηθή λέθξσζε (φπσο ηα θαξκαθνινγηθά κνληέια) πνπ είλαη άιινηε άιιεο έθηαζεο ζηα δηάθνξα πεηξακαηφδσα, επεξεάδνληαο, έηζη, θαηά ηξφπν απξφβιεπην ηα απνηειέζκαηα ησλ εξεπλψλ. Γηα ηνπο παξαπάλσ ιφγνπο απνθαζίζηεθε ε ρξήζε ηεο κεξηθήο επαηεθηνκήο σο πεηξακαηηθφ κνληέιν θαη ζηελ παξνχζα έξεπλα. 18

43 3.5 Κιαζηθή ρεηξνπξγηθή ηερληθή επαηεθηνκήο ζε ηξσθηηθά Σα κηθξά ηξσθηηθά (κχεο θαη επίκπεο) είλαη ηα ζπλεζέζηεξα ρξεζηκνπνηνχκελα πεηξακαηφδσα ζηε ρεηξνπξγηθή έξεπλα ηνπ ήπαηνο. Οη επαηεθηνκέο ρξεζηκνπνηνχληαη γηα πξσηφθνιια επαηηθήο αλαγέλλεζεο, νμείαο επαηηθήο αλεπάξθεηαο θαη επαηηθήο κεηάζηαζεο. Έρνπλ, θαηά θαηξνχο, ρξεζηκνπνηεζεί ζπκβαηηθέο κέζνδνη πνπ απαηηνχλ βαζηθέο ρεηξνπξγηθέο δεμηφηεηεο, έσο θαη κηθξνρεηξνπξγηθέο κέζνδνη πνπ απαηηνχλ ρεηξνπξγηθφ κηθξνζθφπην ή κεγεζπληηθά γπαιηά (ρεηξνπξγηθέο ινχπεο) Κιαζηθή ηερληθή 2/3 κεξηθήο επαηεθηνκήο ζηνλ επίκπ Σν 1931 νη Higgins θαη Anderson δεκνζίεπζαλ κία εξγαζία κε ηίηιν «Απνθαηάζηαζε ηνπ ήπαηνο ζηνλ επίκπ κεηά απφ κεξηθή ρεηξνπξγηθή εθηνκή». Δθεί παξνπζίαδαλ ηελ πεηξακαηηθή κέζνδν κεξηθήο επαηεθηνκήο πνπ έκειιε λα γίλεη ζπλήζεο πξαθηηθή έσο θαη ηηο κέξεο καο. πλίζηαηαη ζηελ εθηνκή ησλ δχν πξφζζησλ ινβψλ ηνπ ήπαηνο ηνπ επίκπνο (ΜΛ θαη ΑΛ), νη νπνίνη απνηεινχλ ζπλνιηθά ην 70% πεξίπνπ ηνπ επαηηθνχ παξεγρχκαηνο (Δηθφλα 3.4). Δηθόλα 3.4: Οη πξόζζηνη ινβνί ηνπ ήπαηνο ηνπ επίκπνο πνπ αθαηξνύληαη θαηά ηελ PHX θαηά Higgins θαη Anderson Από (Martins, Theruvath et al. 2008) Η εθηεηακέλε ρξήζε ηνπ πεηξακαηηθνχ απηνχ κνληέινπ νδήγεζε ζε εθηελή κειέηε ηεο αλαηνκίαο ηνπ ήπαηνο ζηνλ επίκπ (Gershbein and Elias 1954; Kogure, 19

44 Ishizaki et al. 1999; Morioka, Watanabe et al. 2006; Martins and Neuhaus 2007) (εηθφλα 3.5) Δηθόλα 3.5: Υεηξνπξγηθή αλαηνκία ηνπ ήπαηνο ηνπ επίκπνο (ζπιαρληθή επηθάλεηα): Α. Πνζνζηά επί ηεο επαηηθήο κάδαο ησλ επηκέξνπο ινβώλ Β. Πνξεία επαηηθώλ θιεβώλ C. Κιάδνη ππιαίαο D. Πνξεία ρνιεθόξσλ Από (Martins, Theruvath et al. 2008) Παξαιιαγέο έθηαζεο ηεο επαηεθηνκήο ζηνλ επίκπ Γηα ηηο αλάγθεο δηαθνξεηηθψλ πξσηνθφιισλ, εθηφο ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο (πρ. πξφθιεζε νμείαο επαηηθήο αλεπάξθεηαο), είλαη δπλαηή ε ηέιεζε άιινπ πνζνζηνχ κεξηθήο επαηεθηνκήο, έσο θαη νιηθήο επαηεθηνκήο αθαηξψληαο δηαθνξεηηθνχο ζπλδπαζκνχο ινβψλ (Madrahimov, Dirsch et al. 2006; Martins, Theruvath et al. 2008), φπσο θαίλεηαη ζηελ παξαθάησ εηθφλα (εηθφλα 3.6): 20

45 Πξνεγνύκελε ζειίδα - Δηθόλα 3.6: Παξαιιαγέο έθηαζεο επαηεθηνκήο ζηνλ επίκπ Από (Martins, Theruvath et al. 2008) Πεηξακαηηθό κνληέιν 2/3 PHx ζηνλ κπ Ο κπο είλαη έλα δψν 20 θνξέο κηθξφηεξν απφ ηνλ επίκπ, βάξνπο πεξίπνπ 20 γξακκάξησλ, γεγνλφο πνπ δπζρεξαίλεη ηε δηελέξγεηα νπνηνπδήπνηε ρεηξνπξγηθνχ ρεηξηζκνχ. Γηα ην ιφγν απηφ, δελ είρε ρξεζηκνπνηεζεί θαη κειεηεζεί ζηελ ίδηα έθηαζε κε ηνλ επίκπ. Η άκεζε παξαιιαγή ηεο κεζφδνπ ησλ Higgins θαη Anderson θαη ε ζπλήζεο επαηεθηνκή γηα ηε κειέηε ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο ζηνλ κπ είλαη ε 2/3 κεξηθή επαηεθηνκή, πνπ αληηζηνηρεί ζε πνζνζηφ πεξίπνπ 66% ηνπ ζπλνιηθνχ επαηηθνχ παξεγρχκαηνο. Απηφ επηηπγράλεηαη κε ρεηξνπξγηθή εμαίξεζε ησλ ΜΛ (40%) θαη ΑΛ (26%) Αλαηνκία ηνπ ήπαηνο ηνπ κπόο Όπσο έρνπκε αλαθέξεη, ην ήπαξ ηνπ κπφο είλαη πνιπινβσηφ. Απνηειείηαη απφ ηέζζεξηο ινβνχο: ηνλ δεμην (ΓΛ) ηνλ κέζν (ΜΛ), ηνλ αξηζηεξφ (ΑΛ) θαη ηνλ ηεηξάπιεπξν (ΣΛ). Η αδξή δηάηαμή ηνπο, φπσο θαη ην πνζνζηφ επαηηθνχ παξεγρχκαηνο πνπ αληηπξνζσπεχεη έθαζηνο, θαίλεηαη ζηελ παξαθάησ εηθφλα (εηθφλα 3.7). Δηθόλα 3.7: πιαρληθή όςε ήπαηνο κπόο: Λνβνί θαη ην πνζνζηό επαηηθήο κάδαο πνπ αληηπξνζσπεύνπλ Από (Doerr RJ 1990) 21

46 Κάζε ινβφο δηαζέηεη μερσξηζηφ δεκάηην αγγείσλ θαη ρνιαγγείσλ, γεγνλφο πνπ δηεπθνιχλεη ηελ αθαίξεζε ησλ ινβψλ κε ηνπνζέηεζε κίαο απνιίλσζεο ζηε βάζε θάζε ινβνχ πξνο εμαίξεζε. Σν ήπαξ ηνπ κπφο, ζε αληίζεζε κε ηνλ επίκπ, δηαζέηεη ρνιεδφρν θχζηε, ε νπνία θείηαη ζην κέζν ηνπ πξφζζηνπ ρείινπο ηνπ ΜΛ (40%), κε ηνλ θπζηηθφ πφξν λα ρσξίδεη λνεηά ηνλ κεγαιχηεξν απηφλ ινβφ ζε δχν ππνηκήκαηα: ηνπο ΓΜΛ (20%) θαη ΑΜΛ (20%). Η βάζε ηνπ ΜΛ είλαη επξεία, θαιχπηνληαο πεξηζζφηεξν απφ ηα 2/3 ηεο πεξηθέξεηαο ηεο ΚΚΦ πνπ ζεσξείηαη, ζην ζεκείν απηφ, ελδνεπαηηθή. Αληηζέησο, νη βάζεηο ησλ ππφινηπσλ ινβψλ είλαη κηθξέο θαη δελ πεξηβξνγρίδνπλ ηελ ΚΚΦ. Δηθόλα 3.8: Πξόζζηα όςε ηνπ ήπαηνο ηνπ κπόο: Γ - Γξεπαλνεηδήο ζύλδεζκνο, ΥΚ - Υνιεδόρνο θύζηε, ΓΜΛ Γεμηό ηκήκα κέζνπ ινβνύ, ΑΜΛ Αξηζηεξό ηκήκα κέζνπ ινβνύ ΑΛ Αξηζηεξόο ινβόο Απηνί είλαη νη ινβνί πνπ αθαηξνύληαη ζηελ 2/3 PHx Από (Martins, Theruvath et al. 2008) 22

47 Κεθάιαην 4 ΜΗΥΑΝΘΜΟΘ ΗΠΑΣΘΚΗ ΑΝΑΓΕΝΝΗΗ 4.1 Κπηηαξηθόο πνιιαπιαζηαζκόο θαηά ηελ αλαγέλλεζε κεηά ρεηξνπξγηθή επαηεθηνκή ζε θπζηνινγηθό ήπαξ: Κπξηαξρία ώξηκσλ θπηηάξσλ ην πξνεγνχκελν θεθάιαην αλαιχζεθαλ νη ιφγνη γηα ηνπο νπνίνπο ε επηζηεκνληθή θνηλφηεηα μερψξηζε ηελ κεξηθή επαηεθηνκή σο ηε ζπλεζέζηεξε κέζνδν γηα ηε κειέηε ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο. Πνηα είλαη, φκσο ηα θχηηαξα πνπ πνιιαπιαζηάδνληαη κεηά ηελ επαηεθηνκή; ε αληίζεζε κε ηνπο ππφινηπνπο κεξηθψο αλαπαξαγφκελνπο ηζηνχο (βιελλνγφλν εληέξνπ θαη δέξκα), ε αχμεζε ηνπ αξηζκνχ ησλ θπηηάξσλ ζην ήπαξ δελ εμαξηάηαη απφ θάπνην βιαζηηθφ αξρέγνλν θχηηαξν (stem cell), αιιά απφ ηνλ πνιιαπιαζηαζκφ φισλ ησλ θαηεγνξηψλ ηνπ ελαπνκείλαληνο θπηηαξηθνχ πιεζπζκνχ (Stocker and Heine 1971; Michalopoulos and DeFrances 1997). Καζψο ε θαηά ηα 2/3 επαηεθηνκή αθαηξεί ηα 2/3 ηεο επαηηθήο κάδαο, ηα ελαπνκείλαληα θχηηαξα (1/3 ηεο κάδαο) πξέπεη λα ππνζηνχλ θαηά κέζν φξν 1,66 θχθινπο πνιιαπιαζηαζκνχ γηα λα απνθαηαζηαζεί ε κάδα ηνπ ήπαηνο. ηελ πξάμε, φια ηα θχηηαξα πνιιαπιαζηάδνληαη κία θνξά, θζάλνληαο ηε κάδα ζην 60% ηνπ επηζπκεηνχ θαη θάπνηα απφ απηά εηζέξρνληαη ζε δεχηεξν κηησηηθφ θχθιν, ελψ άιια φρη. Μεηά ην πέξαο ησλ θπηηαξηθψλ δηαηξέζεσλ αθνινπζεί έλα θχκα θπηηαξηθήο απφπησζεο γηα έιεγρν ηπρφλ ππεξβάιινληνο 23

48 πνιιαπιαζηαζκνχ (Sakamoto, Liu et al. 1999). Η δηαδηθαζία απηή δηαξθεί ιηγφηεξν απφ κία εβδνκάδα ζηα ηξσθηηθά θαη ιηγφηεξν απφ δχν εβδνκάδεο ζηνλ άλζξσπν. Υξνληθά, ηα πξψηα θχηηαξα πνπ επηδεηθλχνπλ ζχλζεζε DNA (έλδεημε πξνεηνηκαζίαο γηα κίησζε) είλαη ηα επαηνθχηηαξα. ηνλ κπ εκθαλίδεηαη peak ζχλζεζεο DNA ζηηο 36 ψξεο. Η κίησζε ησλ επαηνθπηηάξσλ μεθηλά πξψηα απφ ηηο πεξηππιαίεο πεξηνρέο (δψλε Ι ησλ επαηηθσλ βνζξχσλ) θαη πξνρσξά ζηαδηαθά πξνο Δηθόλα 4.1: Υξνληθή αιιεινπρία ηεο ζύλζεζεο DNA (κίησζεο) κεηά PHx, ησλ δηάθνξσλ θπηηαξηθώλ νκάδσλ ηνπ ήπαηνο Από (Michalopoulos and DeFrances 1997) ηηο πεξηθεληξηθέο (δψλε ΙΙΙ) ζαλ θχκα κηηψζεσλ (Rabes 1977). Έηζη, ηα επαηνθχηηαξα πνπ πεξηβάιινπλ ηηο θεληξηθέο θιέβεο ησλ ινβίσλ είλαη απηά πνπ δηαηξνχληαη ηειεπηαία (Gebhardt, Baldysiak-Figiel et al. 2007). Όπσο θαίλεηαη θαη ζηελ εηθφλα 1, ηα ρνιεθφξα επηζειηαθά θχηηαξα αθνινπζνχλ ιίγν κεηά ηα επαηνθχηηαξα θαη έπνληαη ηα κε επηζειηαθά θχηηαξα ηνπ ήπαηνο, κε ηειεπηαία ηα ελδνζειηαθά θχηηαξα ησλ ηξηρνεηδψλ. Μεηά απφ ηξείο έσο ηέζζεξηο εκέξεο αλαγέλλεζεο ηα λέα επαηνθχηηαξα ζρεκαηίδνπλ ζπζηάδεο εληφο ησλ ινβίσλ. Αθνινπζεί κία πεξίνδνο αξγήο ινβηαθήο αλαδηνξγάλσζεο, δηάξθεηαο κεξηθψλ εβδνκάδσλ, πνπ επαλαθέξεη ηελ ηζηνινγία ηνπ ήπαηνο ζε απφιπηα θπζηνινγηθή εηθφλα. Σα θχηηαξα ηνπ Ito εθπέκπνπλ πξνζεθβνιέο πνπ εηζέξρνληαη ζηηο ζπζηάδεο επαηνθπηηάξσλ θαη ηηο νξγαλψλνπλ παξάγνληαο ζηξψζεηο ιακηλίλεο. Έηζη επαλεκθαλίδεηαη ζηαδηαθά ε δνκή ησλ επαηνθπηηαξηθψλ δνθίδσλ. Σα άηππα ηξηρνεηδή ησλ ζπζηάδσλ απηψλ δηαθνξνπνηνχληαη ζε ηππηθά επαηηθά ηξηρνεηδή, κε αξαηή εμσθπηηάξηα νπζία θαη επελδχνληαη κε fenestrae θαη επαηηθά καθξνθάγα Kupfer. Η πινχζηα ζε ιακηλίλε εμσθπηηάξηα νπζία δηαθνξνπνηείηαη ζε ηππηθή ηνπ ψξηκνπ ήπαηνο, ε νπνία πεξηέρεη θπξίσο θηκπξνλεθηίλε θαη θνιιαγφλν ηχπσλ Ι θαη ΙV θαη δηάθνξεο άιιεο πξσηεΐλεο θαη, ιηγφηεξν, γιπθνδακηλνγιπθάλεο (Martinez-Hernandez and Amenta 1995; Michalopoulos and DeFrances 1997). Έσο ηελ έβδνκε εκέξα ηα επαηηθά ιφβηα είλαη 24

49 κεγαιχηεξα απφ φηη πξηλ ηελ αλαγέλλεζε θαη νη δνθίδεο είλαη πηα δίζηνηρεο αληί κνλφζηνηρεο φπσο ζην θπζηνινγηθφ ήπαξ (Wagenaar, Chamuleau et al. 1993). Σειηθά ην αλαγελλεκέλν ήπαξ, εκθαλίδεη αχμεζε, ηφζν ζηνλ ζπλνιηθφ αξηζκφ ησλ ινβίσλ, φζν θαη ζην κέγεζνο ηνπ εθάζηνηε ινβίνπ (Iashina 1970). 4.2 Κπηηαξηθόο πνιιαπιαζηαζκόο θαηά ηελ αλαγέλλεζε κεηά από κνληέια κε ηζηηθή επαηηθή βιάβε: Δκθάληζε ηνπ Oval Cell ηνπ ήπαηνο ζην πξνζθήλην Ο πνιιαπιαζηαζκφο φισλ ησλ εηδψλ ησλ θπηηάξσλ ηνπ ήπαηνο, φπσο αλαθέξακε, είλαη ε θπζηθή νδφο γηα επίηεπμε ηεο αλαγέλλεζεο, κεηά απφ PHx, αλ ην επαηηθφ παξέγρπκα είλαη θπζηνινγηθφ. Ση γίλεηαη, φκσο, αλ ππάξρεη επαηνθπηηαξηθή βιάβε ή λφζνο ή πεηξακαηηθά πξνθαινχκελε αδπλακία πνιιαπιαζηαζκνχ ησλ επαηνθπηηάξσλ θαη ρξεηαζηεί λα γίλεη αλαγέλλεζε; Χο «απφ κεραλήο ζεφο» εκθαλίδεηαη έλα πνιπδχλακν θχηηαξν, ηθαλφ λα δψζεη γέλεζε ζηα δχν είδε επηζειηαθψλ θπηηάξσλ ηνπ ήπαηνο: ηα επαηνθχηηαξα θαη ηα επηζειηαθά θχηηαξα ησλ ρνιεθφξσλ. Σν θχηηαξν απηφ νλνκάζηεθε Oval Cell (OC) απφ ηνλ E.Farber (Tatematsu, Ho et al. 1984). Η νλνκαζία απηή νθείιεηαη ζην ζρήκα ηνπ ππξήλα ηνπο πνπ είλαη νβάι θαη έξρεηαη ζε αληίζεζε κε απηφλ ησλ επαηνθπηηάξσλ πνπ είλαη ραξαθηεξηζηηθά ζηξνγγπιφο (Michalopoulos 2011). Σν ζπλεζέζηεξν πεηξακαηηθφ κνληέιν επαγσγήο ησλ OC είλαη ν εμαλαγθαζκφο ζε αλαγέλλεζε κε επαηεθηνκή κεηά απφ ρνξήγεζε AAF, πνπ θαηαζηέιιεη ηελ αλαπαξαγσγηθή ηθαλφηεηα ησλ επαηνθπηηάξσλ, ζηνλ επίκπ (Evarts, Nagy et al. 1989). Σα OC εκθαλίδνληαη κεξηθέο κέξεο κεηά ηελ επαηεθηνκή, ζηελ πεξηππιαία πεξηνρή (Ι) θαη επεθηείλνληαη πξνο ηηο πεξηθεληξηθέο πεξηνρέο (ΙΙ θαη ΙΙΙ), θηάλνληαο ζην κέγηζην ηεο παξνπζίαο ηνπο ζηηο 7-9 εκέξεο (Michalopoulos 2011). Η αθξηβήο θηλεηηθή ηνπ πνιιαπιαζηαζκνχ ησλ OC πνηθίιιεη ειαθξά ζηα δηάθνξα πξσηφθνιια φπνπ έρεη κειεηεζεί, (Sell 1983; Tatematsu, Ho et al. 1984; Sirica, Mathis et al. 1990; Shiojiri, Lemire et al. 1991; Paku, Schnur et al. 2001; Pi, Oh et al. 2005; Grozdanov, Yovchev et al. 2006). 25

50 Αληίζηνηρν πξσηφθνιιν ζηνλ κπ δελ πθίζηαηαη, αιιά ε παξνπζία ησλ OC κπνξεί λα επαρζεί κε ρνξήγεζε ηεο ρεκηθήο νπζίαο dipin (Factor, Radaeva et al. 1994) ή κεηά ηε ρνξήγεζε επαηνηνμηθήο δίαηηαο (Shinozuka, Lombardi et al. 1978; Sells, Katyal et al. 1979). Η ηζηνρεκηθή θαη βηνρεκηθή ηνπο αλάιπζε δείρλεη φηη ηα OC έρνπλ κνηίβν γνληδηαθήο έθθξαζεο ελδηάκεζν κεηαμχ επαηνθπηηάξνπ θαη επηζειηαθνχ θπηηάξνπ ησλ ρνιεθφξσλ (Evarts, Nagy et al. 1989; Evarts, Hu et al. 1996). Δλψ ππεξεθθξάδνληαη ζε θάζε πεξίπησζε καδηθήο απψιεηαο επαηνθπηηάξσλ θαη θπξίσο θεληξνινβηαθήο (κεηά απφ ρνξήγεζε CCl 4 ), εμαίξεζε απνηειεί ε πεξίπησζε ηεο ζνβαξήο πεξηππιαίαο ινβηαθήο ηνμηθφηεηαο (κεηά απφ ρνξήγεζε allyl alcohol) νπφηε δελ είλαη δπλαηή ε ππεξαλάπηπμε ησλ OC (Petersen, Zajac et al. 1998). Δηθόλα 4.2: Απεηθόληζε ησλ Oval Cells: Δληόπηζή ηνπο ζην Καλάιη ηνπ Hering, ζσιελώδεο δηάηαμή ηνπο, ζπκβαηή κε ηε ζεσξία ηεο ρνιαγγεηαθήο ηνπο πξνέιεπζεο. Σξνπνπνηεκέλε από World Journal of Gastroenterology (wjgnet.com) Η επηθξαηέζηεξε ζεσξία πξνέιεπζεο θαη εληφπηζεο ησλ OC απεηθνλίδεηαη ζηελ εηθφλα 4.2. Δληνπίδνληαη πεξηππιαία θαη θπξίσο επελδχνπλ ηνλ αγσγφ ηνπ Hering. Ο 26

51 αγσγφο ηνπ Hering (Theise, Nimmakayalu et al. 2000; Roskams, Theise et al. 2004) είλαη έλα βξαρχ ρνιεθφξν ηξηρνεηδέο πνπ ζπλδέεη ηα ινβηαθά ρνιεθφξα ζσιελάξηα κε ηνπο πεξηιφβηνπο ρνιεθφξνπο πφξνπο (ζηελ ππιαία ηξηάδα). ε φ,ηη αθνξά ζηελ πξνέιεπζε ησλ OC, ε πιεηνςεθία ησλ ελδείμεσλ ππνδεηθλχνπλ ηελ ρνιαγγεηαθή πξνέιεπζή ηνπο. Ήδε αλαθέξακε ην ραξαθηεξηζηηθφ κνηίβν γνληδηαθήο έθθξαζήο ηνπο. Σν ίδην δείρλεη ε ηζηνινγηθή ζσιελψδεο δηάηαμή ηνπο (Hayner, Braun et al. 1984; Sirica, Mathis et al. 1990). Σέινο, ρνξήγεζε ρνιαγγεηαθήο ηνμίλεο DARM πξηλ ην πεηξακαηηθφ πξσηφθνιιν, εμαιείθεη ηελ αληίδξαζε ησλ OC (Petersen, Zajac et al. 1997). Σα παξαπάλσ, θαζψο θαη ε παξνπζία δηάθνξσλ ηζηνρεκηθψλ δεηθηψλ (Michalopoulos 2011) ππνζηεξίδνπλ φηη ηα πνιπδχλακα oval cells είλαη ρνιαγγεηνθπηηαξηθήο πξνέιεπζεο, αιιά δηαηεξνχλ ηε δπλαηφηεηα δηαθνξνπνίεζεο θαη ζε επαηνθχηηαξα, ζε θαηαζηάζεηο δηάρπηεο επαηνθπηηαξηθήο βιάβεο ή αδπλακίαο πνιιαπιαζηαζκνχ. ηνλ άλζξσπν, ηα oval cells έρεη βξεζεί φηη ππάξρνπλ θπζηνινγηθά, αιιά θαη φηη επάγνληαη θαηά ηελ εμέιημε δηάθνξσλ ρξφλησλ επαηηθψλ λφζσλ, φπσο ζε πεξηπηψζεηο θίξξσζεο (Tsamandas, Antonacopoulou et al. 2007), επαηίηηδαο C (Tsamandas, Syrokosta et al. 2006), επαηνθπηηαξηθνχ θαξθηλψκαηνο θαη ρνιαγγεηνθαξθηλψκαηνο (Duncan, Dorrell et al. 2009; Gilgenkrantz and Collin de l'hortet 2011). 27

52 Δηθφλα 4.3: Σα δχν ζχγρξνλα κνληέια επαηηθήο αλαγέλλεζεο πλνςίδνληαο ηα κνηίβα επαηηθήο αλαγέλλεζεο αλαιφγσο ηνπ ηχπνπ ηεο βιάβεο, έρνπκε: (a) ηνλ πνιιαπιαζηαζκφ ψξηκσλ επαηνθπηηάξσλ κεηά PHx θαη (b) ηνλ πνιιαπιαζηαζκφ ησλ oval cells πνπ απνηθίδεη ην ήπαξ ζαλ θχκα απφ ηελ πεξηνρή Ι (πεξηππιαία) πξνο ηελ ΙΙΙ (πεξηθεληξηθή). (Gilgenkrantz and Collin de l'hortet 2011) 4.3 Αλαπαξαγσγηθό δπλακηθό ησλ επαηνθπηηάξσλ Έγηλε λσξίο αληηιεπηφ φηη ε επηζηήκε κπνξεί λα «επαιεζεχζεη» ηνλ κχζν ηνπ Πξνκεζέα. Σν ήπαξ σο φξγαλν κπνξεί λα αλαγελλεζεί πνιιάθηο κεηά απφ κεξηθή επαηεθηνκή. ε πεηξάκαηα ζε επίκπεο, έγηλε δπλαηή ε δηελέξγεηα δψδεθα επαηεθηνκψλ -κεηαμχ ησλ νπνίσλ δηλφηαλ ρξφλνο γηα αλαγέλλεζε- ζην ίδην πεηξακαηφδσν (Stocker, Wullstein et al. 1973). Αιιά, πνηα ήηαλ ε αληίιεςε ζρεηηθά κε ην επαηνθχηηαξν; Μέρξη ην 1994 ζεσξνχληαλ πνιχ πεξηνξηζκέλε ε δπλαηφηεηα πνιιαπιαζηαζκνχ ησλ επαηνθπηηάξσλ. Γηα παξάδεηγκα, κε ηα έσο ηφηε δεδνκέλα, ηα επαηνθχηηαξα ζε θαιιηέξγεηα δελ κπνξνχζαλ λα ππνβιεζνχλ ζε πεξηζζφηεξνπο απφ δχν θχθινπο πνιιαπιαζηαζκνχ (Michalopoulos 2011). Η αληίιεςε απηή, φκσο, δηαςεχζηεθε απφ ηηο κειέηεο πνπ αθνινχζεζαλ. Οη Rhim et al. (Rhim, Sandgren et al. 1994) δεκηνχξγεζαλ έλα πξσηφθνιιν ζε κχεο ησλ νπνίσλ -θαηφπηλ γελεηηθήο ηξνπνπνίεζεο- ηα επαηνθχηηαξα ππεξεμέθξαδαλ νπξνθηλάζε θαη απνδνκνχληαλ νδεγψληαο ζε επαηηθή αλεπάξθεηα. ην ήπαξ απηψλ ησλ πεηξακαηνδψσλ ελέζεθε αξηζκφο θπζηνινγηθψλ επαηνθπηηάξσλ πνπ απνίθηζαλ ην ήπαξ θαη απέηξεςαλ ηελ εκθάληζε επαηηθήο αλεπάξθεηαο. Γηα λα επηηεπρζεί απηφ, ζχκθσλα κε ππνινγηζκνχο θάζε κεηακνζρεπκέλν επαηνθχηηαξν είρε ππνζηεί 12 δηαηξέζεηο (Rhim, Sandgren et al. 1995). ηα δεδνκέλα απηά ζπκθψλεζαλ ηα ζεκαληηθά πεηξάκαηα ησλ Grompe et al. Υξεζηκνπνίεζαλ κχεο κε ζπγγελή ηπξνζηλαηκία ιφγσ έιιεηςεο FAH 28

53 (fumarylacetoacetate hydrolase). Απηά ηα πεηξακαηφδσα έρνπλ αλάγθε ηε ρεκηθή νπζία NCTB (πξνζηίζεηαη ζην πφζηκν λεξφ) γηα λα επηβηψζνπλ. Υσξίο απηή ηελ νπζία επέξρεηαη επαηηθή αλεπάξθεηα. ην ήπαξ κπψλ ζηνπο νπνίνπο δελ δηλφηαλ ε νπζία, ελέζεθαλ 1000 ψξηκα θπζηνινγηθά επαηνθχηηαξα. Δπήιζε απνηθηζκφο ηνπ ήπαηνο θαη απνθαηαζηάζεθε θπζηνινγηθή επαηηθή ιεηηνπξγία. Απφ απηά ηα πεηξακαηφδσα ιήθζεθαλ επαηνθχηηαξα, ηα νπνία κεηακνζρεχζεθαλ ζε άιια φκνηα πεηξακαηφδσα. Η δηαδηθαζία απηή επαλαιήθζεθε επηηπρψο δέθα θνξέο. Τπνινγίζηεθε φηη έλα επαηνθχηηαξν κπφο είλαη ηθαλφ κε ηηο δηαηξέζεηο ηνπ λα απνηθίζεη ηξηάληα θνξέο έλα ήπαξ κπφο (Overturf, al-dhalimy et al. 1997). Με ηελ πνιππινεηδία λα είλαη ηφζν ζπρλφ θαηλφκελν ζηα επαηνθχηηαξα (έλδεημε πςειήο δηαθνξνπνίεζεο θαη εμεηδίθεπζεο ησλ θπηηάξσλ), δεκηνπξγείηαη ην εξψηεκα πψο απηή επεξεάδεη ην αλαγελλεηηθφ δπλακηθφ ησλ επαηνθπηηάξσλ. χκθσλα κε ηνπο Grompe et al. (Overturf, Al-Dhalimy et al. 1999) ηα δηπινεηδηθά θαη πνιππινεηδηθά επαηνθχηηαξα έρνπλ ηηο ίδηεο ηθαλφηεηαο πνιιαπιαζηαζκνχ κε ηα αλεππινεηδηθά επαηνθχηηαξα. Αληίζηνηρεο κειέηεο, κε αληίζηνηρα απνηειέζκαηα έρνπλ γίλεη θαη γηα ηνλ επίκπ (Laconi, Pillai et al. 2001). Η κεγάιε in vitro ηθαλφηεηα πνιιαπιαζηαζκνχ επηηεχρζεθε κε ηε βνήζεηα ηεο ρνξήγεζεο EGF θαη HGF (Block, Locker et al. 1996). Αιιά, είλαη ηα αλζξψπηλα επαηνθχηηαξα ηφζν δξαζηήξηα φζν απηά ησλ ηξσθηηθψλ; ε πξφζθαηε κειέηε θάλεθε φηη ηα αλζξψπηλα επαηνθχηηαξα ήηαλ ην ίδην ηθαλά ζηνλ απνηθηζκφ ηνπ ήπαηνο ηνπ κπφο, φζν ζρεδφλ θαη ηα επαηνθχηηαξα ηνπ κπφο (Azuma, Paulk et al. 2007). Με βάζε ηα δεδνκέλα απηά, ηα επαηνθχηηαξα έρνπλ αμηνζαχκαζηε ηθαλφηεηα πνιιαπιαζηαζκνχ, πνπ ππεξβαίλεη απηή φισλ ησλ γλσζηψλ επηζειηαθνχ ηχπνπ θπηηάξσλ (Michalopoulos 2011) θαη δελ απαηηεί ηελ χπαξμε πξνγνληθψλ θπηηάξσλ, αιιά κπνξεί λα δηελεξγεζεί απφ ηα ίδηα ηα ψξηκα θχηηαξα. 29

54 4.4 Οη ηξείο θάζεηο ηεο αλαγέλλεζεο κεηά από κεξηθή επαηεθηνκή ηελ πξνζπάζεηα απνθσδηθνπνίεζεο ησλ πνιχπινθσλ ζεκάησλ θαη δηεξγαζηψλ πνπ ιακβάλνπλ ρψξα θαηά ηελ αλαγέλλεζε ηνπ ήπαηνο, ε δηαδηθαζία ρσξίδεηαη ζε ηξεηο θάζεηο: 1) Έλαξμε/Priming: Ξεθηλά ηε ζηηγκή ηεο επαηεθηνκήο. εκαληηθέο αηκνδπλακηθέο αιιαγέο ιακβάλνπλ ρψξα, μεθηλά ε παξαγσγή κηηνγφλσλ νπζηψλ θαη ελδνθπηηαξηθά πξνθαιείηαη έλαο θαηαξξάθηεο γεγνλφησλ. Η Δηθφλα 4.4: Οη θάζεηο ηνπ θπηηαξηθνχ θχθινπ Απφ aces.com/6)+cell+cycle πιεηνςεθία ησλ επαηνθπηηάξσλ εμέξρεηαη ηεο θάζεο εξεκίαο (G0) θαη εηζέξρεηαη ζηνλ θπηηαξηθφ θχθιν (G1), ελψ γίλνληαη δεθηηθά ζηε δξάζε ησλ απμεηηθψλ παξαγφλησλ (Fausto, Campbell et al. 2006; Gilgenkrantz and Collin de l'hortet 2011). Δπάγεηαη ε έθθξαζε πεξηζζφηεξσλ απφ 100 γνληδίσλ απφ ιεπηά έσο ιίγεο ψξεο κεηά ηελ PHx (Taub 1996; Taub 2004), ελψ ε αδξαλνπνίεζε θάπνηνπ απφ απηά απιψο θαζπζηεξεί, παξά εκπνδίδεη ηελ αλαγέλλεζε (Latasa, Couton et al. 2007). χληνκα πεξλνχλ ην θξίζηκν φξην G1/S κε έλαξμε ηεο ζχλζεζεο DNA. Η εμσθπηηάξηα νπζία αξρίδεη λα δηαιχεηαη. Η θάζε απηή ζηνλ επίκπ δηαξθεί ψξεο (Ha ussinger 2011). Παξφηη είλαη ε ζπληνκφηεξε ησλ ηξηψλ θάζεσλ, είλαη ε πεξηζζφηεξν κειεηεκέλε, ζε κία πξνζπάζεηα λα βξεζεί ην πξσηεχνλ ελεξγνπνηφ εξέζηζκα ηεο αλαγέλλεζεο. Μεηά απφ πνιιέο κειέηεο, αλαδείρζεθαλ πνιιέο άκεζεο ηξνπνπνηήζεηο, ζε κεγάιν αξηζκφ ζεκαηνδνηηθψλ κνλνπαηηψλ, πνπ δξνπλ 30

55 ζπλεξγηθά γηα ην επηζπκεηφ απνηέιεζκα ηεο αλαγέλλεζεο. Κακία απφ απηέο ηηο αιιαγέο δε θαίλεηαη λα ππεξηζρχεη. Γξα απιψο ε κία επηθνπξηθά ηεο άιιεο κε ζθνπφ ηελ ηαρχηαηε αλαγέλλεζε πξηλ εκθαληζηεί επαηηθή αλεπάξθεηα πνπ ζα βάιεη ζε θίλδπλν ηε δσή ηνπ δψνπ. (Michalopoulos 2010). 2) Πνιιαπιαζηαζκφο (κεηαβνιηθή θάζε): Δίλαη ε θάζε φπνπ παξαηεξνχληαη απμεκέλεο κεηαβνιηθέο αλάγθεο ιφγσ πνιιαπιαζηαζκνχ, ππφ ηελ επήξεηα ησλ δηάθνξσλ κηηνγφλσλ νπζηψλ. Λακβάλνπλ ρψξα ζεκαληηθέο κεηαβνιηθέο αιιαγέο (ππνγιπθαηκία, ιηπφιπζε, ζπζζψξεπζε ιηπηδίσλ ζην επαηνθχηηαξν. (Michalopoulos and DeFrances 1997; Gazit, Weymann et al. 2010; Gilgenkrantz and Collin de l'hortet 2011). Σα επαηνθχηηαξα ζπλζέηνπλ DNA (θάζε S) θαη ππνβάιινληαη ζηνλ πξψην θχθιν κηηψζεσλ. Σφηε έλα πνζνζηφ απφ απηά εηζέξρεηαη ζε θάζε εξεκίαο G0 θαη ηα ππφινηπα ζπλερίδνπλ γηα δεχηεξε ζπλερή θνξά ηνλ θχθιν σο ηε κίησζε, κε αλαπιήξσζε ηεο ρακέλεο επαηηθήο κάδαο. Σα ινηπά θχηηαξα ηνπ ήπαηνο επίζεο δηαηξνχληαη ζηνλ βαζκφ πνπ απηφ είλαη αλαγθαίν. Η δηαίξεζε ησλ ρνιαγγεηνθπηηάξσλ θνξπθψλεηαη ζηε 2 ε κε 3 ε κέξα, ελψ νη ηζρπξέο ζπλδέζεηο κεηαμχ ησλ επαηνθπηηάξσλ αξρίδνπλ λα απνθαζίζηαληαη θαη ε έθθξηζε ρνιήο μαλαξρίδεη ηελ 3 ε εκέξα. εκαληηθά παξαθξηληθά ζήκαηα απνζηέιινληαη κεηαμχ ησλ επαηηθψλ θπηηάξσλ θαηά ηε θάζε απηή, γηα παξάδεηγκα ηα επαηνθχηηαξα εθθξίλνπλ VEGF (θπξίσο 3 ε εκέξα) πνπ επάγεη ηνλ πνιιαπιαζηαζκφ ησλ ελδνζειηαθψλ θπηηάξσλ ησλ επαηηθψλ ηξηρνεηδψλ (ηελ 4 ε εκέξα) (Shimizu, Miyazaki et al. 2001). Δπίζεο ηα ελδνζειηαθά θχηηαξα (Ping, Xiaoling et al. 2006) θαη ηα αζηεξνεηδή θχηηαξα (ηνπ Ito) (Takeishi, Hirano et al. 1999) εθθξίλνπλ HGF πνπ είλαη πηζαλά ππεχζπλν γηα ηελ επαγσγή ηνπ δεχηεξνπ θχθινπ δηαίξεζεο ησλ επαηνθπηηάξσλ (3 ε εκέξα). Η αλαδηνξγάλσζε ηεο εμσθπηηάξηαο νπζίαο ζπλερίδεηαη. Η θάζε απηή δηαξθεί ζηα ηξσθηηθά απφ ηηο ψξεο έσο ηελ 4 ε εκέξα πεξίπνπ (Ha ussinger 2011). 31

56 3) Λήμε (termination) Δίλαη κία θάζε εμίζνπ ζεκαληηθή κε ηελ έλαξμε, αιιά ιηγφηεξν κειεηεκέλε θαη θαηαλνεηή. Σν ππφινηπν ηνπ ρξφλνπ αλαγέλλεζεο (κεηά απφ ηελ 4 ε εκέξα) εκθαλίδνληαη ηα ζήκαηα ιήμεο ηεο αλαγέλλεζεο. Πεξαηψλεηαη ε απνθαηάζηαζε ηεο δνκήο ηεο εμσθπηηάξηαο νπζίαο. Σν ήπαξ ζηαδηαθά αλαθηά ηε θπζηνινγηθή ηνπ ηζηνινγηθή δνκή θαη νκνηφζηαζε, φπσο έρνπκε ήδε αλαθέξεη (Michalopoulos 2007). Καηά ηελ θάζε πνιιαπιαζηαζκνχ (2 ε ) παξάγνληαη ζπλήζσο πεξηζζφηεξα ησλ αλαγθαίσλ επαηνθχηηαξα. Απηφ ειέγρεηαη κε ην θχκα απφπησζεο πνπ παξαηεξείηαη ζηελ 3 ε θάζε (Sakamoto, Liu et al. 1999) ε νπνία επαλαθέξεη ην βάξνο ησλ ππεξηξνθηθψλ ινβψλ πνπ απνκέλνπλ, ζην ίδην επίπεδν κε ην βάξνο ηνπ ήπαηνο πξν ηεο επέκβαζεο, ζηα ηξσθηηθά (Michalopoulos 2007). Σν ήπαξ πνπ κεηακνζρεχηεθε απφ κεγάια δψα ζε κηθξά (ζθχινη) κηθξαίλεη θαη, αληίζεηα, ην small for size κηθξφ ήπαξ ζε κεγάιν δψν (απφ κηθξφ ζθχιν ζε κεγάιν ή απφ κπακπνπίλν ζε άλζξσπν) κεγαιψλεη, ζε κέγεζνο αλάινγν ηνπ ιήπηε (Starzl, Fung et al. 1993). Απηή ε αθξηβέζηαηε ξχζκηζε κεγέζνπο ήπαηνο-δψνπ ζέηεη ηνλ πξνβιεκαηηζκφ χπαξμεο ελφο κεραληζκνχ «επαηνζηάηε» 4.5 Μηηνγόλεο νπζίεο Γηα ηνλ αζθαιή εληνπηζκφ ησλ νπζηψλ πνπ επάγνπλ ή ξπζκίδνπλ ηελ αλαγέλλεζε έρνπλ γίλεη πνιιέο έξεπλεο, ηφζν in vivo (νιηζηηθή πξνζέγγηζε κε πεξηζψξην ιάζνπο ιφγσ ηεο παξνπζίαο θαη ησλ άιισλ επαηηθψλ θπηηάξσλ πνπ κπνξεί λα αιινηψζνπλ ην απνηέιεζκα), φζν in vitro (πξσηνγελείο θαιιηέξγεηεο επαηνθπηηάξσλ ζε απφιπηα ειεγρφκελν κηθξνπεξηβάιινλ) (Michalopoulos 2010). Οη νπζίεο απηέο ρσξίδνληαη ζε δχν νκάδεο: Σα πιήξε θαη ηα επηθνπξηθά κηηνγφλα: 1. Πιήξε κηηνγόλα 32

57 Δίλαη νπζίεο πνπ έρνπλ απφ κφλεο ηνπο κηηνγφλν δξάζε επί ησλ επαηνθπηηάξσλ ζε θαιιηέξγεηεο. Δπίζεο, πξνθαινχλ ζχλζεζε DNA θαη δηφγθσζε ηνπ ήπαηνο αλ ρνξεγεζνχλ ζε επαξθή πνζφηεηα ζε δψα (Bucher, Patel et al. 1977; Patijn, Lieber et al. 1998; Yamada, Webber et al. 1998). Καηάξγεζε ηνπο πξνθαιεί ζνβαξά θσιχκαηα ζηελ αλαγέλλεζε ηνπ ήπαηνο. ε απηή ηελ νκάδα αλήθνπλ δχν ζεκαηνδνηηθά κνλνπάηηα: α) ν HGF (επαηνθπηηαξηθφο απμεηηθφο παξάγνληαο) θαη ν ππνδνρέαο ηνπ c-met θαη β) νη πξνζδέηεο ηνπ EGF-R (ππνδνρέα ηνπ επηδεξκηθνχ απμεηηθνχ παξάγνληα), νη νπνίνη είλαη ν EGF, o TGFα (transforming growth factor, o Heparin Binding-EGF θαη ε νπζία amphiregulin (Michalopoulos 2010) 2. Δπηθνπξηθά κηηνγόλα Οη νπζίεο απηέο δελ έρνπλ κηηνγφλν δξάζε απφ κφλεο ηνπο, νχηε ζε θπηηαξηθέο θαιιηέξγεηεο, νχηε θαη in vivo δχλαληαη λα πξνθαιέζνπλ ζχλζεζε DNA ζηα επαηνθχηηαξα. Έρνπλ φκσο ζεκαληηθή ζπλεξγηθή δξάζε κε ηα πιήξε κηηνγφλα απμάλνληαο ηελ αληίδξαζε ησλ επαηνθπηηάξσλ ζε απηά (Block, Locker et al. 1996). Απηά είλαη: Ννξεπηλεθξίλε θαη α-1 αδξελεξγηθφο ππνδνρέαο (Cruise, Houck et al. 1985; Cruise, Knechtle et al. 1987) TNF θαη TNFR1 (Yamada, Webber et al. 1998) Ιληεξιεπθίλε 6 (IL6) (Cressman, Greenbaum et al. 1996; Sakamoto, Liu et al. 1999) Notch θαη Jagged (Kohler, Bell et al. 2004) VEGF, VEGFR- I θαη VEGFR-II (LeCouter, Moritz et al. 2003) Υνιηθά νμέα (Huang, Ma et al. 2006), εξνηνλίλε (Lesurtel, Graf et al. 2006) Πξσηεΐλεο ηνπ ζπκπιεξψκαηνο (DeAngelis, Markiewski et al. 2006) Λεπηίλε (Yamauchi, Uetsuka et al. 2003)Ιλζνπιίλε (Starzl, Porter et al. 1976) FGF 1 θαη FGF 2 (Kan, Huang et al. 1989; Steiling, Wustefeld et al. 2003) 33

58 4.6 Ο ξόινο ηεο ππιαίαο θπθινθνξίαο ζηελ έλαξμε ηεο αλαγέλλεζεο ηνπ ήπαηνο κεηά από επαηεθηνκή Καηά ηε κεξηθή επαηεθηνκή αθαηξνχληαη ινβνί πνπ αληηζηνηρνχλ ζηα 2/3 ηεο ζπλνιηθήο κάδαο ηνπ ήπαηνο, αθήλνληαο ηνπο ππφινηπνπο ινβνχο ρσξίο βιάβε (Higgins GM 1931). Οη ππνιεηπφκελνη ινβνί ιακβάλνπλ αξηεξηαθφ αίκα κε ηνλ ίδην ξπζκφ φπσο θαη πξηλ ηελ επέκβαζε. Δληνχηνηο, δελ ηζρχεη ην ίδην θαη γηα ηελ ππιαία αηκάησζή ηνπο. Ο φγθνο ηεο ππιαίαο θπθινθνξίαο είλαη ζηαζεξφο, κε απνηέιεζκα φηαλ απνκέλεη 1/3 ηεο κάδαο ηνπ ήπαηνο λα ηξηπιαζηάδεηαη ε ππιαία αηκάησζή ηνπ (φγθνο ππιαίνπ αίκαηνο αλά κνλάδα επαηηθήο κάδαο). ην ήπαξ, κφιηο 15 ιεπηά κεηά ηελ επαηεθηνκή ζπκβαίλνπλ κεηαβνιέο ζε ελδνθπηηάξηνπο ζεκαηνδφηεο (Michalopoulos 2010): Αχμεζε ηεο δξαζηεξηφηεηαο ηεο νπξνθηλάζεο (5 ιεπηά) Μεηαλάζηεπζε ηεο β-θαηελίλεο ζηνλ ππξήλα (5 ιεπηά) Μεηαλάζηεπζε ηνπ ελδνθπηηάξηνπ ηνκέα ηνπ Notch 1 ζηνλ ππξήλα (15 ιεπηά) Η ηφζν γξήγνξε εκθάληζε ησλ γεγνλφησλ απηψλ καο επηηξέπεη δχν ππνζέζεηο: α) Η άκεζε αχμεζε ηνπ ιφγνπ ηνπ φγθνπ ηνπ ππιαίνπ αίκαηνο αλά κνλάδα κάδαο ήπαηνο παξέρεη έλα αξθεηά ηζρπξφ εξέζηζκα ψζηε λα ελεξγνπνηεζνχλ νη παξαπάλσ κεραληζκνί ή β) Σν ππιαίν αίκα πεξηέρεη κηηνγφλα κφξηα θαη ε απφηνκε απμεζε ζην ηξηπιάζην ηεο δηαζεζηκφηεηαο απηψλ αλά επαηνθχηηαξν είλαη ην εξέζηζκα. Φπζηθά νη δχν απηέο ππνζέζεηο δελ είλαη ακνηβαία απνθιεηφκελεο. Κάπνηεο κειέηεο έρνπλ δείμεη φηη ε απμεκέλε ππιαία ξνή πξνθαιεί επαγσγή ηεο έθθξαζεο ηνπ γνληδίνπ ηνπ urokinase plasminogen activator (Marubashi, Sakon et al. 2004) θαη ελεξγνπνίεζε ηνπ HGF. Δίλαη, φκσο, αδχλαην λα απνδεηρζεί φηη απηφ κπνξεί λα εμεγήζεη ην κέγεζνο ηεο αλαγελλεηηθήο απάληεζεο. Απφ ηελ άιιε, είλαη γλσζηφ φηη ην ππιαίν αίκα πεξηέρεη απμεκέλε πνζφηεηα ηλζνπιίλεο (απφ ην πάγθξεαο) θαη EGF (απφ ηνπο αδέλεο ηνπ Brunner ζην δσδεθαδάθηπιν) (Skov Olsen, Boesby et al. 1988). Δπηπιένλ, ε επαηεθηνκή πξνθαιεί έθιπζε λνξεπηλεθξίλεο, ε 34

59 νπνία κε ηε ζεηξά ηεο επηδξά ζηνπο αδέλεο ηνπ Brunner πνπ παξάγνπλ θαη εθθξίλνπλ αθφκε πεξηζζφηεξν EGF (Olsen, Kirkegaard et al. 1984). Ο EGF, φπσο αλαθέξακε είλαη έλα πιήξεο κηηνγφλν θαη ε ηλζνπιίλε θαη ε λνξεπηλεθξίλε επηθνπξηθά κηηνγφλα. Καη πάιη, φκσο, είλαη αδχλαηε ε απφδεημε φηη κφλα απηά κπνξνχλ λα πξνθαιέζνπλ ηελ αληίδξαζε ηεο αλαγέλλεζεο ζε ηέηνηα θιίκαθα. 4.7 Ο ξόινο ηεο γεληθήο θπθινθνξίαο ζηελ έλαξμε ηεο αλαγέλλεζεο ηνπ ήπαηνο κεηά από επαηεθηνκή Η ζεκαζία ηεο γεληθήο θπθινθνξίαο ζηελ αλαγέλλεζε αλαδείρζεθε φηαλ ζε επίκπεο ελσκέλνπο ζε παξαβηνηηθή θπθινθνξία, ε δηελέξγεηα επαηεθηνκήο ζην έλα κέινο ηνπ δεχγνπο είρε ζαλ απνηέιεζκα ζχλζεζε DNA ζην ήπαξ ηνπ άιινπ κέινπο (Moolten and Bucher 1967). Δπηπξφζζεηα, ζχλζεζε DNA παξνπζηάζηεθε ζε εηεξφηνπα απηνκνζρεχκαηα επαηηθνχ ηζηνχ (Leong, Grisham et al. 1964) θαη ζε επαηνθχηηαξα απηνκεηακνζρεπκέλα ζηνλ ιηπψδε ηζηφ (Jirtle and Michalopoulos 1982) κεηά απφ επαηεθηνκή ζην δψν. Όιεο απηέο νη κειέηεο δείρλνπλ φηη ε επαηεθηνκή έρεη ζαλ απνηέιεζκα ηελ παξαγσγή κηηνγφλσλ ζεκάησλ πνπ κπνξνχλ λα επάγνπλ ηελ ζχλζεζε DNA ζε επαηνθχηηαξα νπνπδήπνηε ζην ζψκα (Michalopoulos 2010). Πξνζπάζεηεο αλαγλψξηζεο ησλ ζεκάησλ απηψλ νδήγεζαλ ζηελ απνκφλσζε ηνπ HGF (Nakamura, Nishizawa et al. 1989; Zarnegar and Michalopoulos 1989). Δίλαη πηα γλσζηφ φηη ν HGF απμάλεηαη ζην πεξηθεξηθφ αίκα κία ψξα κεηά ηελ PHx (Lindroos, Zarnegar et al. 1991), ζηελ ελεξγή εηεξνδηκεξή κνξθή ηνπ (Pediaditakis, Lopez-Talavera et al. 2001) Η πεγή ηνπ πξψηκα θπθινθνξνχληνο HGF είλαη νη επαηηθέο εμσθπηηάξηεο γιπθνδακηλνγιπθάλεο πνπ πεξηέρνληαη ζηελ εμσθπηηάξηα νπζία ζηηο πεξηππιαίεο πεξηνρέο ησλ ινβίσλ (πεξηνρή Ι) (Masumoto and Yamamoto 1991; Liu, Mars et al. 1994). Η εμσθπηηάξηα απνζήθε ηνπ HGF εμαληιείηαη εληφο ηξηψλ σξψλ θαζψο ε ζπγθέληξσζή ηνπ ζην πιάζκα θζάλεη ζε επίπεδα 10πιάζηα έσο 20πιάζηα ηνπ θπζηνινγηθνχ (Pediaditakis, Lopez-Talavera et al. 2001). Νέα ζχλζεζε HGF ιακβάλεη ρψξα ζην ήπαξ θαη ηνπο πλεχκνλεο, αιιά δελ παίδεη ξφιν ζηελ πξσηνγελή απάληεζε, θαζψο αξρίδεη ηξεηο ψξεο κεηά ηελ επαηεθηνκή. 35

60 Μεηαγελέζηεξεο κειέηεο έδεημαλ φηη πνιιά επηθνπξηθά κηηνγφλα επίζεο απμάλνληαη ζην πεξηθεξηθφ αίκα κεηά ηε κεξηθή επαηεθηνκή: IL6 (Cressman, Greenbaum et al. 1996) Ννξεπηλεθξίλε (Michalopoulos and DeFrances 1997) TNF (Yamada, Kirillova et al. 1997) Υνιηθά νμέα (Huang, Ma et al. 2006) Ιλζνπιίλε (Leffert, Koch et al. 1979) Δπίζεο, ε αλαδηνξγάλσζε ηεο εμσθπηηάξηαο νπζίαο έρεη σο απνηέιεζκα ηελ απειεπζέξσζε: παινπξνληθνχ νμένο (Michalopoulos and DeFrances 1997) TGFβ1 (Michalopoulos and DeFrances 1997) Σέινο, ζην πεξηθεξηθφ αίκα, ζεκαληηθφ ξπζκηζηηθφ ξφιν επί ηεο αλαγέλλεζεο παίδεη ε γιπθφδε. Η ζπζηεκαηηθή ππνγιπθαηκία πνπ εκθαλίδεηαη κεηά ηελ επαηεθηνκή, επηθέξεη κεηαβνιηθέο αιιαγέο πνπ επνδψλνπλ ηελ αλαγέλλεζε ζε ηέηνην βαζκφ πνπ ε θαηάξγεζή ηεο κε ρνξήγεζε γιπθφδεο επηβξαδχλεη ζεκαληηθά ηελ αλαγέλλεζε (Weymann, Hartman et al. 2009). 36

61 4.8 Υξνλνιόγην Πξώηκσλ εκαηνδνηηθώλ Γεγνλόησλ (εληόο ηεο πξώηεο ώξαο) κεηά κεξηθή επαηεθηνκή i. Αχμεζε δξαζηεξηφηεηαο νπξνθηλάζεο (5 ιεπηά) (Mars, Liu et al. 1995) ii. Μεηαλάζηεπζε ηνπ Notch ICD ζηνλ ππξήλα (15 ιεπηά) (Kohler, Bell et al. 2004) iii. Μεηαλάζηεπζε ηεο beta-θαηελίλεο ζηνλ ππξήλα (5 ιεπηά 6 ψξεο) (Monga, Pediaditakis et al. 2001) iv. Απειεπζέξσζε HGF κε ηελ ιχζε ηεο εμσθπηηάξηαο νπζίαο (απφ 30 ιεπηά), απνζήθε πνπ εμαληιείηαη ζε 3 ψξεο (Pediaditakis, Lopez-Talavera et al. 2001) v. Δλεξγνπνίεζε ηνπ ππνδνρέα ηνπ HGF (30-60 ιεπηά) (Stolz, Mars et al. 1999) vi. Δλεξγνπνίεζε ηνπ ππνδνρέα ηνπ EGF (30-60 ιεπηά) (Stolz, Mars et al. 1999) vii. Αχμεζε ησλ: HGF, λνξεπηλεθξίλε, IL6, TNFa, TGFb1θαη παινπξνληθνχ νμένο ζην πιάζκα (1-2 ψξεο) viii. Δθηεηακέλνο επαλαπξνγξακκαηηζκφο ηεο γνληδηαθήο έθθξαζεο ησλ επαηνθπηηάξσλ (επφδσζε γνληδίσλ κίησζεο: c-jun, c-fos, c-myc, K-Ras) (30 ιεπηά) (Mohn, Laz et al. 1991; Haber, Mohn et al. 1993; Haber, Naji et al. 1995) ix. Δθπφισζε κεκβξάλεο HCs (5-10 ιεπηά) (Minuk, Kren et al. 1997) x. Δλεξγνπνίεζε κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ: Stat-3 (Cressman, Diamond et al. 1995) θαη NF-kB ((Karin, Yamamoto et al. 2004) 37

62 4.9 Ρόινο θαη δξάζεηο ησλ απμεηηθώλ παξαγόλησλ θαη ησλ θπηηαξνθηλώλ ζηελ αλαγέλλεζε ηνπ ήπαηνο κεηά κεξηθή επαηεθηνκή Ηπαηνθπηηαξηθόο απμεηηθόο παξάγσλ (HGF) θαη ν ππνδνρέαο απηνύ (cmet) Απηφο ν απμεηηθφο παξάγνληαο απνκνλψζεθε ζην πιάζκα επίκπσλ πνπ είραλ ππνζηεί επαηεθηνκή (Michalopoulos, Houck et al. 1984; Zarnegar and Michalopoulos 1989). Δίλαη ν κφλνο απφ ηνπο απμεηηθνχο παξάγνληεο νη νπνίνη απμάλνληαη ζην πιάζκα κεηά ηελ επαηεθηνκή, ν νπνίνο είλαη πιήξεο κηηνγφλν (πξνθαιεί ζχλζεζε DNA ζε θαιιηέξγεηεο επαηνθπηηάξσλ) (Michalopoulos and DeFrances 2005). Βξίζθεηαη ζε κεγάιεο πνζφηεηεο ζηελ εμσθπηηάξηα νπζία ζην ήπαξ, αιιά θαη ζηνπο πλεχκνλεο, πιαθνχληα, εγθέθαιν (Matsumoto and Nakamura 1996; Stella and Comoglio 1999). Ο ζπζηεκαηηθά ρνξεγνχκελνο HGF απνξξνθάηαη ζην ήπαξ, παξά ζηα ππφινηπα φξγαλα (Appasamy, Tanabe et al. 1993). Ο ππνδνρέαο ηνπ, cmet, εθθξάδεηαη ζηα πεξηζζφηεξα επηζειηαθά θχηηαξα θαη λεπξψλεο θαη δηακεζνιαβεί ζε φιεο ηηο δξάζεηο ηνπ HGF (Naldini, Vigna et al. 1991). Οη δξάζεηο ηνπ HGF είλαη ε κηηνγφλνο, ε κνηνγφλνο (επάγεη ηελ θπηηαξηθή θηλεηηθφηεηα, δξάζε γηα ηελ νπνία είλαη γλσζηφο θαη σο Scatter Factor) (Gherardi, Sharpe et al. 1993), θαη ε αληηαπνπησηηθή (Wang, DeFrances et al. 2002). Η γλψζε καο γηα ζπκκεηνρή ηνπ ζηελ επαηηθή αλαγέλλεζε βαζίδεηαη ζηηο παξαθάησ παξαηεξήζεηο: i. Σα επίπεδά ηνπ ζην πιάζκα 10 έσο 20πιαζηάδνληαη κεηά ηελ επαηεθηνκή (Lindroos, Zarnegar et al. 1991) ii. Τπάξρνπλ απνζήθεο HGF ζην ήπαξ (εμσθπηηάξηα νπζία) πνπ απνδεζκέπνληαη άκεζα γηα ηελ επίηεπμε ηεο πξναλαθεξζείζαο αχμεζεο θαη δηαξθνχλ έσο 3 ψξεο, νπφηε θαη ελεξγνπνηείηαη ε ζχλζεζε HGF πνπ ζα ζπλερίζεη λα θξαηά πςειή ηε ζπγθέληξσζε ηνπ HGF απφ ηηο 3 έσο ηηο ψξεο κεηά επαηεθηνκή (Pediaditakis, Lopez-Talavera et al. 2001). 38

63 iii. Δίλαη πιήξεο κηηνγφλν in vitro, ζε θαιιηέξγεηα επαηνθπηηάξσλ (Stolz, Mars et al. 1999) iv. Δίλαη πιήξεο κηηνγφλν θαη in vivo, κεηά απφ έλεζε ζηελ ππιαία θιέβα ηξσθηηθψλ, πξνθαιψληαο αχμεζε ηνπ κεγέζνπο ηνπ ήπαηνο (Liu, Mars et al. 1994; Patijn, Lieber et al. 1998) v. Ο ππνδνρέαο ηνπ (cmet) ελεξγνπνηείηαη κε θσζθνξπιίσζε ζηα ιεπηά κεηά PHx (Stolz, Mars et al. 1999) vi. Η ελεξγνπνίεζε ηνπ cmet νδεγεί ζε ελεξγνπνίεζε ηεο βήηα-θαηελίλεο θαη επάγεη ηε κεηαλάζηεπζή ηεο ζηνλ ππξήλα ηνπ επαηνθπηηάξνπ (Monga, Mars et al. 2002) vii. Γελεηηθή ηξνπνπνίεζε κε εμάιεηςε ηνπ cmet απφ ην ήπαξ νδεγεί ζε ειαρηζηνπνίεζε έσο θαη εμάιεηςε ηεο αλαγελλεηηθήο απάληεζεο (Borowiak, Garratt et al. 2004; Huh, Factor et al. 2004) viii. RNA interference ελαληίνλ ηνπ cmet κπινθάξεη πιήξσο ηελ πξφνδν ηνπ θπηηαξηθνχ θχθινπ (Paranjpe, Bowen et al. 2007) ix. Η νπξνθηλάζε είλαη ππεχζπλε γηα ηελ ελεξγνπνίεζε ηνπ HGF θαη κχεο κε γελεηηθφ έιιεηκκα νπξνθηλάζεο έρνπλ επεξεαζκέλν ξπζκφ επαηηθήο αλαγέλλεζεο (Roselli, Su et al. 1998) x. Δκπιέθεηαη ζηα δηαθπηηαξηθά κηηνγφλα ζήκαηα. Η παξαγσγή ηνπ ζην ήπαξ γίλεηαη απφ ηα αζηεξνεηδή (Schirmacher, Geerts et al. 1993) θαη ηα ελδνζειηαθά (LeCouter, Moritz et al. 2003) θχηηαξα, σο απάληεζε απηψλ ζηα ζήκαηα πνπ παξάγνπλ ηα επαηνθχηηαξα (VEGF, TGFα, Angs I&II) (Michalopoulos and DeFrances 2005). Ο HGF αληηκεησπίζηεθε ζην παξειζφλ σο ν εθθηλεηήο ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο. Όκσο, φπσο είδακε ζην ρξνλνιφγην ησλ κηησηηθψλ ζεκάησλ ππάξρνπλ θαη άιιεο πξσηκφηεξεο δηεξγαζίεο απφ ηελ έθθξηζε ηνπ HGF. Πάλησο απφ ην ζχλνιν ησλ ελδείμεσλ πνπ δηαζέηνπκε, ν HGF αλαδεηθλχεηαη σο ην πην αλαληηθαηάζηαην κηηνγφλν ζήκα (Michalopoulos 2007). 39

64 4.9.2 Πξνζδέηεο ηνπ EGFR Ο EGFR θαη νη πξνζδέηεο ηνπ είλαη κέιε ηεο νηθνγέλεηαο ζεκαηνδνηηθψλ κνλνπαηηψλ ERB, ε νπνία γεληθά εκπιέθεηαη ζε κηηνγφλα ζήκαηα (Michalopoulos and Khan 2005). Σν ζχζηεκα EGFR θαη πξνζδεηψλ είλαη κεξηθψο αιιεινεπηθαιππηφκελν (redundant), κε απνηέιεζκα ε έιιεηςε TGFα λα κελ επεξεάδεη ηελ αλαγέλλεζε, αληίζεηα κε ηελ έιιεηςε ακθηξεγθνπιίλεο θαη ΗΒ-EGF. Ο EGFR θσζθνξπιηψλεηαη ιεπηά κεηά ηελ επαηεθηνκή, ηαπηφρξνλα κε ηνλ cmet, γελλψληαο ππνςίεο γηα αιιειεπίδξαζε ησλ ππνδνρέσλ πηζαλψο θαηλφκελν crosstalk (Stolz, Mars et al. 1999; Michalopoulos and DeFrances 2005). Όινη νη πξνζδέηεο ηνπ EGFR είλαη πιήξε κηηνγφλα (Michalopoulos 2007). i. EGF: Παξάγεηαη απφ ηνπο αδέλεο Brunner ζην δσδεθαδάθηπιν θαη γίλεηαη δηαζέζηκνο ζην ήπαξ δηα ηεο ππιαίαο θπθινθνξίαο. Δπηπξνζζέησο, παξάγεηαη ζηνπο κχεο θαη ζηνπο ζηεινγφλνπο αδέλεο (Skov Olsen, Boesby et al. 1988; Jones, Tran-Patterson et al. 1995). Δίλαη πιήξεο κηηνγφλν, πξνθαιψληαο πνιιαπιαζηαζκφ ησλ επαηνθπηηάξσλ ζε θαιιηέξγεηα (McGowan, Strain et al. 1981) θαη δηφγθσζε ηνπ ήπαηνο in vivo (πξνθαιεί πνιιαπιαζηαζκφ ησλ πεξηππιαίσλ επαηνθπηηάξσλ) (Bucher, Patel et al. 1977; Bucher, Patel et al. 1977). Η ππεξέθθξηζε θαηερνιακηλψλ κεηά ηελ επαηεθηνκή απμάλεη ηελ παξαγσγή ηνπ EGF (Olsen, Kirkegaard et al. 1984), αιιά ε δξάζε ηνπ δελ εμαξηάηαη απφ ηελ ζπγθέληξσζή ηνπ, αιιά απφ ηελ ελεξγνπνίεζε ηνπ ππνδνρέα ηνπ (Michalopoulos and DeFrances 2005). ii. TGFα: Παξάγεηαη απφ ηα επαηνθχηηαξα θαηά ηε δηάξθεηα ηεο αλαγέλλεζεο, μεθηλψληαο 2-3 ψξεο κεηά ηελ επαηεθηνκή θαη παξακέλνληαο ζε πςειά επίπεδα γηα ηηο επφκελεο 48 ψξεο (Mead and Fausto 1989). Η πξφδξνκε κνξθή κεηαηξέπεηαη ζηελ ελεξγή κε ηε βνήζεηα ελδχκσλ φπσο ην TACE (Lee, Sunnarborg et al. 2003). Γελεηηθά ηξνπνπνηεκέλνη κχεο κε ππεξπαξαγσγή TGFα εκθαλίδνπλ επαηηθή δηφγθσζε θαη φγθνπο (Webber, Wu et al. 1994). Αληίζεηα, φκσο, κχεο κε αδπλακία παξαγσγήο TGFα εκθαλίδνπλ θπζηνινγηθή 40

65 αλαγέλλεζε (Russell, Dempsey et al. 1993; Russell, Kaufmann et al. 1996). Φαίλεηαη φηη ν TGFα έρεη θαη παξαθξηληθή δξάζε, ζπκκεηέρνληαο ζηα ζεκαηνδνηηθά κνλνπάηηα κεηαμχ ησλ επαηνθπηηάξσλ θαη ησλ ππφινηπσλ θπηηάξσλ ηνπ ήπαηνο (ελδνζειηαθά θαη αζηεξνεηδή) iii. Heparin-Binding-EGF Παξάγεηαη απφ ηα ελδνζειηαθά θαη ηα θχηηαξα Kupffer (Kiso, Kawata et al. 1995). Η παξαγσγή ηνπ απμάλεηαη 1,5 ψξα κεηά ηελ επαηεθηνκή. Γελεηηθά ηξνπνπνηεκέλνη κχεο κε απμεκέλε παξαγσγή HB EGF έρνπλ ηαρχηεξε αλαγέλλεζε (Kiso, Kawata et al. 2003). Αληίζεηα, κχεο HB EGF knockout έρνπλ κεησκέλε αλαγελλεηηθή αληίδξαζε (Mitchell, Nivison et al. 2005) iv. Ακθηξεγθνπιίλε Δίλαη έλαο αθφκε πξνζδέηεο ηνπ EGFR. Η παξαγσγή ηεο ειαηηψλεηαη κε ρνξήγεζε δεμακεζαδφλεο (Michalopoulos, Bowen et al. 2003). Μχεο κε ειαηησκαηηθή έθθξηζε ακθηξεγθνπιίλεο έρνπλ κεησκέλε αλαγελλεηηθή απάληεζε (Berasain, Garcia-Trevijano et al. 2005) Tumor Necrosis Factor (TNF) Δίλαη κία πξσηεΐλε κε πνιιέο ιεηηνπξγίεο επί δηαθνξεηηθψλ ηζηψλ. ην ήπαξ παξάγεηαη απφ ηα καθξνθάγα (θχηηαξα Kupffer) (Michalopoulos 2007). Δληάζζεηαη ζηα επηθνπξηθά κηηνγφλα, θαζψο κφλν ηνπ δελ επάγεη ηελ ζχλζεζε DNA, παξά απμάλεη ηε κηηνγφλν δξάζε ησλ HGF θαη TGFα θαη in vivo θαη in vitro (Webber, Bruix et al. 1998). Σν αλ ζα έρεη απηή ηελ πξνκηηνγφλν δξάζε επί ησλ επαηνθπηηάξσλ, εμαξηάηαη απφ ηελ θαηάζηαζε ελεξγνπνίεζεο ηνπ NFkB (Kirillova, Chaisson et al. 1999). Η ελεξγνπνίεζε ηνπ NFkB απφ ηνλ TNF έρεη ζαλ απνηέιεζκα ηελ κεηαλάζηεπζε ηνπ NFkB ζηνλ ππξήλα θαη εκθάληζε κηηνγφλσλ δξάζεσλ. ε αληίζεηε πεξίπησζε (κε ελεξγνπνίεζεο ηνπ NFkB) ν TNF έρεη απνπησηηθή δξάζε (Iimuro, Nishiura et al. 1998). Η ελεξγνπνίεζε ηνπ NFkB κε θσζθνξπιίσζε θαη αθαίξεζε ηεο πξσηεΐλεο IkB πνπ ην απελεξγνπνηεί γίλεηαη απφ ηελ θηλάζε IKK (Karin, Yamamoto et al. 2004; Luo, Kamata et al. 2005; Park, Greten et al. 2005). Η ελεξγνπνίεζε ή φρη ηνπ NFkB εμαξηάηαη απφ δηάθνξνπο ελδνθπηηάξηνπο παξάγνληεο 41

66 φπσο ηηο ειεχζεξεο ξίδεο (Pierce, Campbell et al. 2000), θαη ην ζεκαηνδνηηθφ ζχζηεκα ηεο ηληεγθξίλεο πνπ νδεγεί πξνο ηελ πξνκηηνγφλν δξάζε ηνλ TNF (Chen, Young et al. 2007). Δμάιεηςε ηνπ TNF (Akerman, Cote et al. 1992) ή ηνπ ππνδνρέα ηνπ TNFR I (Yamada, Kirillova et al. 1997; Yamada and Fausto 1998; Yamada, Webber et al. 1998), έρνπλ σο απνηέιεζκα ηελ κεγάιε κείσζε ηνπ ξπζκνχ ηεο αλαγέλλεζεο, πνπ νινθιεξψλεηαη κελ, αιιά κε κεγάιε θαζπζηέξεζε. O ΣΝF εκπιέθεηαη θαη ζηελ επαγσγή ηνπ TACE, ηεο πξσηεάζεο πνπ ελεξγνπνηεί ηνλ TGFα θαη αζθεί ελεξγνπνηεηηθή δξάζε επί ηνπ EGFR (Argast, Campbell et al. 2004). Ο TNF αζθεί ξπζκηζηηθή δξάζε θαη επί ηνπ inos (Nussler, Di Silvio et al. 1995) θαη είλαη γλσζηφ φηη ε αλεπάξθεηα ηνπ inos νδεγεί ζε κείσζε ηεο αλαγελλεηηθήο απάληεζεο ζε κχεο (Rai, Lee et al. 1998) Interleukin 6 (IL6) H ηληεξιεπθίλε 6 παξάγεηαη απφ ηα επαηηθά καθξνθάγα Κupffer. Έξεπλεο έδεημαλ φηη παξάγεηαη θαη απφ επαηψκαηα, αθήλνληαο αλνηρηφ ην ελδερφκελν παξαγσγήο ηεο θαη απφ ηα επαηνθχηηαξα (Northemann, Hattori et al. 1990). Η ηληεξιεπθίλε δεκηνπξγεί έλα ζχκπινθν κφξην κε έλαλ πδαηνδηαιπηφ ππνδνρέα θαη ην ζχκπινθν ζπλδέεηαη κε ηνλ ππνδνρέα gp130, ηνλ νπνίν ε IL6 κνηξάδεηαη κε άιιεο θηηνθίλεο (νγθνζηαηίλε Μ, CNTF, LIF θ.α.) (Benigni, Fantuzzi et al. 1996). χκθσλα κε κία έξεπλα (Cressman, Greenbaum et al. 1996) κχεο κε αλεπάξθεηα IL6 έρνπλ ειαηησκέλε αλαγελλεηηθή ηθαλφηεηα, ιφγσ ειαηησκαηηθήο ελεξγνπνίεζεο ηνπ Stat3. Άιιεο κειέηεο, φκσο, παξφηη επαιεζεχνπλ ηελ ειαηησκαηηθή ελεξγνπνίεζε ηνπ Stat3, δείρλνπλ φηη, κνιαηαχηα, ε επαηηθή αλαγέλλεζε είλαη θπζηνινγηθή (Sakamoto, Liu et al. 1999). Μχεο κε ππεξέθθξαζε ηεο ηληεξιεπθίλεο θαη ηνπ πδαηνδηαιπηνχ ππνδνρέα ηεο έρνπλ πεξηνρέο πεξηππιαίαο ππεξπιαζίαο (Maione, Di Carlo et al. 1998). Μχεο κε γελεηηθή εμάιεηςε ηνπ gp130 είλαη πην επαίζζεηνη ζηε ρνξήγεζε ηνμηθψλ νπζηψλ, αιιά ηειηθά ε αλαγέλλεζή ηνπ ήπαηφο ηνπο νινθιεξψλεηαη θαλνληθά (Streetz, Tacke et al. 2003). πκπεξαζκαηηθά, ε ηληεξιεπθίλε 6 δελ είλαη έλα πιήξεο κηηνγφλν γηα ηα επαηνθχηηαξα θαη νχηε απμάλεη ην κηηνγφλν δπλακηθφ άιισλ απμεηηθψλ παξαγφλησλ. Δίλαη, φκσο, πιήξεο κηηνγφλν γηα ηα επηζειηαθά ρνιεθφξα θχηηαξα (Liu, Sakamoto et al. 1998) θαη έρεη ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ νκνηφζηαζε ηνπ ελδνεπαηηθνχ ρνιεθφξνπ δέληξνπ, ξπζκίδνληαο ηελ παξαγσγή 42

67 κηθξψλ πξσηετλψλ πινχζησλ ζε πξνιίλε απφ ηα ρνιαγγεηνθχηηαξα (Nozaki, Lunz et al. 2005; Demetris, Lunz et al. 2006). Σα επίπεδα IL6 απμάλνληαη ζην πιάζκα κεηά ηελ επαηεθηνκή (Michalopoulos 2007). Η ηληεξιεπθίλε 6 αζθεί ξπζκηζηηθφ ξφιν ζηελ επαηηθή αλαγέλλεζε, ρσξίο λα είλαη κία απφ ηηο νπζίεο-εθθηλεηέο ηεο δηαδηθαζίαο Ννξεπηλεθξίλε θαη α-1 αδξελεξγηθόο ππνδνρέαο Μαδί κε ηελ επηλεθξίλε απνηεινχλ ηηο θαηερνιακίλεο, λεπξνδηαβηβαζηέο ηνπ λεπξηθνχ ζπζηήκαηνο πνπ απειεπζεξψλνληαη απφ ηνλ κπειφ ησλ επηλεθξηδίσλ ζην αίκα γηα λα αζθήζνπλ ηελ δξάζε ηνπο πεξηθεξηθά. Ο ξφινο ηνπο ζηελ επαηηθή αλαγέλλεζε αλαδείρζεθε φηαλ θάλεθε φηη ε λνξεπηλεθξίλε βειηηψλεη ζεκαληηθά ην κηηνγφλν δπλακηθφ ησλ EGF θαη HGF ζε θαιιηέξγεηα επαηνθπηηάξσλ θαη παξάιιεια κεηψλεη ηε κηηνζηαηηθή δξάζε ηνπ TGFbI (Cruise, Houck et al. 1985; Houck, Cruise et al. 1988; Houck and Michalopoulos 1989). Η λνξεπηλεθξίλε επάγεη ηε ζχλζεζε HGF ζηνπο κπντλνβιάζηεο (Broten, Michalopoulos et al. 1999). Παξάγεηαη θαη απφ ηα αζηεξνεηδή θχηηαξα θαη είλαη αλαγθαία γηα ηε ζχλζεζε DNA ζε απηά, in vitro θαη in vivo (Oben, Yang et al. 2003). Μία άιιε έκκεζε αιιά πνιχ ζεκαληηθή δξάζε ηεο επηλεθξίλεο είλαη φηη επάγεη ηε ζχλζεζε EGF απφ ηνπο αδέλεο Brunner ζην δσδεθαδάθηπιν (Olsen, Poulsen et al. 1985). ε ζπλδπαζκφ κε ηελ άκεζε αχμεζε ηεο ζπγθέληξσζήο ηεο ζην πιάζκα κεηά ηελ επαηεθηνκή, έρεη ξφιν λα εμαζθαιίζεη απμεκέλε δηαζεζηκφηεηα EGF ζην αλαγελλψκελν ήπαξ. Σέινο, ην κπινθάξηζκα ηνπ α-1 αδξελεξγηθνχ ππνδνρέα κε πξαδνζίλε, αλαζηέιιεη ηε ζχλζεζε DNA κεηά PHx γηα 72 ψξεο (Cruise, Knechtle et al. 1987). Γελ είλαη δηεπθξηληζκέλν αλ ε ζεκαληηθφηεξε δξάζε αζθείηαη απφ ηελ ζπζηεκαηηθά θπθινθνξνχζα λνξεπηλεθξίλε ή απφ ηελ ηνπηθά παξαγφκελε απφ ηα αζηεξνεηδή θχηηαξα Υνιηθά νμέα θαη Ξελνβηνηηθέο νπζίεο Δίλαη γλσζηφ φηη ε επαηηθή ρνιφζηαζε (ρεκηθά επαγφκελε ή απνθξαθηηθνχ ηχπνπ) ζρεηίδεηαη κε επαηνθπηηαξηθφ πνιιαπιαζηαζκφ (Michalopoulos 2007). ε πξφζθαηε κειέηε θάλεθε φηη ηα ρνιηθά νμέα απμάλνληαη ζηελ θπθινθνξία κεηά ηελ PHx θαη φηη εμάληιεζε θαη έιιεηςε ρνιηθψλ νμέσλ νδεγεί ζε κεησκέλε επαηηθή 43

68 αλαγέλλεζε (Huang, Ma et al. 2006). Η αχμεζή ηνπο ζην πιάζκα εθδειψλεηαη ιίγεο ψξεο κεηά ηελ PHx, θαη επνκέλσο δελ θαίλεηαη λα δηαδξακαηίδνπλ ξφιν ζηελ έλαξμε ηεο αλαγέλλεζεο. ηελ ίδηα κειέηε (Huang, Ma et al. 2006) θάλεθε φηη κχεο κε γελεηηθή εμάιεηςε ηνπ FXR κεηαγξαθηθνχ παξάγνληα (επί ηνπ νπνίνπ δξνχλ ηα ρνιηθά νμέα) έρνπλ κεησκέλε αλαγελλεηηθή δπλαηφηεηα. Τπάξρνπλ θάπνηα παξαδείγκαηα μελνβηνηηθψλ πνπ δξνπλ ζπλδεφκελα κε κεηαγξαθηθνχο παξάγνληεο ή ππξεληθνχο νξκνληθνχο ππνδνρείο ζηα επαηνθχηηαξα θαη πξνθαινχλ επαηηθή ππεξηξνθία. ε απηά ζπκπεξηιακβάλνληαη: Η ηξηησδνζπξνλίλε (Σ3) (Short, Wedmore et al. 1980; Ledda-Columbano, Perra et al. 2000) Αγσληζηέο ηνπ PPARα (Reddy and Chu 1996)Οηζηξνγφλα (Yager, Zurlo et al. 1994) Βαξβηηνπξηθά (δξνπλ επί ησλ CAR θαη PXR ππνδνρέσλ) (Columbano, Ledda- Columbano et al. 2005) Δίλαη αθφκα άγλσζηνο ν αθξηβήο ηξφπνο δξάζεο ησλ πεξηζζφηεξσλ απφ ηηο παξαπάλσ νπζίεο. Ο FXR είλαη ν πξψηνο ππξεληθφο νξκνληθφο ππνδνρέαο πνπ απνδεηθλχεηαη λα έρεη ζρέζε κε ηελ αλαγέλλεζε ηνπ ήπαηνο θαη αθήλεη πεξηζψξην γηα αλαθάιπςε θαη άιισλ αλάινγσλ ππνδνρέσλ κε παξφκνηα δξάζε (Michalopoulos 2007) εξνηνλίλε Οη κχεο κε κεησκέλν αξηζκφ αηκνπεηαιίσλ, έρνπλ επεξεαζκέλε επαηηθή αλαγέλλεζε (Michalopoulos 2007). Σα αηκνπεηάιηα πεξηέρνπλ πνιιέο βηνελεξγέο νπζίεο, φπσο HGF, TGFβ1 θαη ζεξνηνλίλε. Μία κειέηε (Lesurtel, Graf et al. 2006) έδεημε φηη ε εμσγελήο ρνξήγεζε ζεξνηνλίλεο ζε ζξνκβνθπηηαξνπεληθνχο κχεο αληέζηξεςε ηηο πεξηζζφηεξεο ζπλέπεηεο έιιεηςεο αηκνπεηαιίσλ. Η ζεξνηνλίλε δελ έρεη νχηε πιήξε, νχηε επηθνπξηθή κηηνγφλν δξάζε επί ησλ επαηνθπηηάξσλ in vitro. Ο κεραληζκφο ζπκκεηνρήο ηεο ζηελ αλαγέλλεζε είλαη άγλσζηνο. Δηθάδεηαη πσο κπνξεί λα παίδεη ξπζκηζηηθφ ξφιν επί ηεο απειεπζέξσζεο ησλ ινηπψλ παξαγφλησλ απφ ηα αηκνπεηάιηα (HGF, TGFβ1). 44

69 4.9.8 πζηαηηθά ηνπ πκπιεξώκαηνο Μχεο κε έιιεηςε ησλ ζπζηαηηθψλ C3 θαη C5 ηνπ ζπκπιεξψκαηνο έρνπλ κεησκέλε αλαγελλεηηθή απάληεζε θαη ζε επαηεθηνκή θαη ζε ρεκηθή βιάβε κε CCl4. Η ρνξήγεζε ησλ ζπζηαηηθψλ πνπ ιείπνπλ αληηζηξέθεη ηελ αδπλακία απηή (Strey, Markiewski et al. 2003; DeAngelis, Markiewski et al. 2006; Tsonis, Lambris et al. 2006). Ο κεραληζκφο δξάζεο ηνπο είλαη άγλσζηνο Notch θαη Jagged Απνηεινχλ κέιε κίαο νηθνγέλεηαο πξσηετλψλ πνπ ζρεκαηίδνπλ έλα πνιχπινθν ζεκαηνδνηηθφ δίθηπν κεηαμχ θπηηάξσλ ζε θάζεηο δηαθνξνπνίεζεο θαη πνιιαπιαζηαζκνχ (Mumm and Kopan 2000; Baron, Aslam et al. 2002; Baron 2003). Οη πξσηεΐλεο Notch είλαη νη ππνδνρείο. Σφζν νη Notch φζν θαη νη Jagged πξσηεΐλεο είλαη αγθπξνβνιεκέλεο ζηελ θπηηαξηθή κεκβξάλε κε έλα δηακεκβξαληθφ ηκήκα. Δίλαη φκσο ην ελδνθπηηάξην ηκήκα ησλ Notch (NICD) πνπ απειεπζεξψλεηαη κεηά ηελ ζχλδεζε Notch θαη Jagged, κεηαλαζηεχεη ζηνλ ππξήλα, φπνπ δξα ζαλ κεηαγξαθηθφο παξάγνληαο, επάγνληαο ηελ έθθξαζε νξηζκέλσλ γνληδίσλ πνπ ζρεηίδνληαη κε ηνλ θπηηαξηθφ θχθιν, φπσο ηα Myc θαη Cyclin D1(Ronchini and Capobianco 2001). Όπσο έρεη ήδε αλαθεξζεί, ε κεηαλάζηεπζε ηνπ NICD ζηνλ ππξήλα είλαη απφ ηα ακεζφηεξα γεγνλφηα, ζπκβαίλνληαο κφιηο 15 ιεπηά κεηά ηελ επαηεθηνκή (Kohler, Bell et al. 2004). Η ζχλζεζε ησλ Notch θαη Jagged είλαη απμεκέλε απφ ηηο 3 ψξεο έσο ηηο 4 εκέξεο κεηά ηελ επαηεθηνκή. Υνξήγεζε RNAi θαηά ησλ Notch θαη Jagged πξνθαιεί επηβξάδπλζε ηεο αλαγέλλεζεο ελψ ε ρνξήγεζε αλαζπλδπαζκέλνπ Jagged πξνθαιεί ζχλζεζε DNA ζε επαηνθπηηαξηθέο θαιιηέξγεηεο. Δπίζεο, γελεηηθή εμάιεηςε ηνπ Notch ζε κχεο, έρεη ζαλ απνηέιεζκα ηελ αλεπαξθή αλαγελλεηηθή απάληεζε κεηά απφ επαηεθηνκή (Croquelois, Blindenbacher et al. 2005) Ιλζνπιίλε Σν ήπαξ είλαη ν ιήπηεο ηνπ ζπλφινπ ηεο παξαγφκελεο ζην πάγθξεαο ηλζνπιίλεο, κέζσ ηεο ππιαίαο θιέβαο. Ο ζαθραξψδεο δηαβήηεο (είηε ιφγσ κεησκέλεο παξαγσγήο ηλζνπιίλεο, είηε ιφγσ αληίζηαζεο ζηελ ηλζνπιίλε) πξνθαιεί ζηεαηνεπαηίηηδα πνπ 45

70 κπνξεί λα νδεγήζεη κέρξη θαη ζε θίξξσζε. Παξάθακςε ηεο ξνήο ηεο ππιαίαο ζηελ θάησ θνίιε θιέβα (ΚΚΦ) (ππιαηνζπζηεκαηηθή παξάθακςε) έρεη ζαλ απνηέιεζκα ε ηλζνπιίλε λα κελ δηέξρεηαη άκεζα απφ ην ήπαξ. Σφηε ην ήπαξ αηξνθεί θαηά ην 1/3 ηνπ κεγέζνπο ηνπ (Bucher, Patel et al. 1977; Bucher, Patel et al. 1977; Thompson, Porter et al. 1983; Evarts, Raab et al. 1986). Υνξήγεζε ηλζνπιίλεο απεπζείαο ζην ήπαξ, ζε πεηξακαηφδσα πνπ έρνπλ ππνβιεζεί ζε ππιαηνζπζηεκαηηθή παξάθακςε, αληηζηξέθεη ηελ επαηηθή αηξνθία, πξνθαιψληαο ζχληνκα επαηνθπηηαξηθφ πνιιαπιαζηαζκφ. Σα επαηνθχηηαξα ζε θαιιηέξγεηεο έρνπλ κηθξή αληαπφθξηζε ζηα ππφινηπα κηηνγφλα ζε απνπζία ηλζνπιίλεο (Cruise, Houck et al. 1985). Η ηλζνπιίλε δελ είλαη έλα άκεζν κηηνγφλν, αιιά αζθεί ζεκαληηθή ξπζκηζηηθή δξάζε θαη είλαη πηζαλφ φηη εκπιέθεηαη ζηηο κεηαβνιηθέο δηεξγαζίεο πνπ ζπκπεξηιακβάλνληαη ζηελ δηαδηθαζία ηεο αλαγέλλεζεο εκαηνδνηηθέο αιιειεπηδξάζεηο κεηαμύ ησλ δηάθνξσλ θπηηαξηθώλ πιεζπζκώλ ηνπ ήπαηνο: Παξαθξηληθέο θαη απηνθξηληθέο δξάζεηο Αθνχ θαηά ηελ πξψηε θάζε ηεο αλαγέλλεζεο, νη εθθηλεηέο έρνπλ ππξνδνηήζεη ηηο εμειίμεηο, θαηά ηελ δεχηεξε θάζε ηνπ πνιιαπιαζηαζκνχ ζεκαληηθφ ξπζκηζηηθφ ξφιν παίδνπλ ηα ζήκαηα κεηαμχ ησλ θπηηαξηθψλ νκάδσλ (παξαθξηληθά) θαη ίζσο θαη απηνξπζκηζηηθά (απηνθξηληθά). Η δηεξγαζία ηεο αλαγέλλεζεο πξνζνκνηάδεη ζε απηέο ηεο επνχισζεο ηξαχκαηνο θαη ηεο αχμεζεο ελφο φγθνπ. Σα βαζηθά επηζειηαθά θχηηαξα (επαηνθχηηαξα) απμάλνληαη πξψηα θαη ζηέιλνπλ παξαθξηληθά ζήκαηα γχξσ ηνπο, ψζηε θαη ηα πέξημ ζηξσκαηηθά (αζηεξνεηδή θαη ελδνζειηαθά) θχηηαξα λα πνιιαπιαζηαζηνχλ, παξέρνληαο ζπλδεηηθφ ηζηφ θαη λεναγγείσζε (Michalopoulos 2007). Σα επαηνθχηηαξα παξάγνπλ κηα ζεηξά απφ απμεηηθνχο παξάγνληεο γηα ην ζθνπφ απηφ: TGFα, VEGF, FGF1, FGF2, αγγεηνπνηεηίλεο 1 θαη 2, PDGF, HB-EGF. Κάπνηεο απφ απηέο ηηο νπζίεο είλαη κηηνγφλεο γηα ηα ινηπά θχηηαξα (αζηεξνεηδή, ελδνζειηαθά θαη επηζειηαθά ρνιεθφξσλ) αζθψληαο παξαθξηληθή δξάζε θαη θάπνηεο είλαη κηηνγφλεο γηα ηα ίδηα ηα επαηνθχηηαξα πνπ ηηο παξάγνπλ, αζθψληαο 46

71 απηνθξηληθή δξάζε (Michalopoulos and DeFrances 2005). Με ηε ζεηξά ηνπο θαη ηα πέξημ θχηηαξα εθθξίλνπλ δηάθνξα κηηνγφλα πνπ επάγνπλ ηελ δηαίξεζε ησλ επαηνθπηηάξσλ (HGF, TGFα, TGFβ1, TNF, IL6). Σα αζηεξνεηδή θχηηαξα παξάγνπλ θαη λνξεπηλεθξίλε (Oben, Yang et al. 2003) ρεκαηηθά ηα παξαπάλσ ζήκαηα κεηαμχ θπηηάξσλ απεηθνλίδνληαη ζην ζρήκα 5. ηελ αξρή ηεο αλαγέλλεζεο, ηα επαηνθχηηαξα ιακβάλνπλ HGF απφ ηελ απνδφκεζε ηεο εμσθπηηάξηαο νπζίαο απφ ηελ νπξνθηλάζε. Απφ ηελ 3 ε ψξα θαη εθεμήο ηελ παξαγσγή HGF αλαιακβάλνπλ ηα Δηθόλα 4.5: Σα θπξηόηεξα παξαθξηληθά ζήκαηα κεηαμύ ησλ δηάθνξσλ θπηηαξηθώλ νκάδσλ ηνπ ήπαηνο θαηά ηελ θάζε πνιιαπιαζηαζκνύ ηεο αλαγέλλεζεο Από (Michalopoulos 2007) αζηεξνεηδή θαη ηα ελδνζειηαθά Σα θχηηαξα. επαηνθχηηαξα εθθξίλνπλ κηηνγφλα γηα ηα αζηεξνεηδή θχηηαξα (PDGF) (Pinzani 2002) θαη γηα ηα ελδνζειηαθά θχηηαξα (VEGF, FGF1, FGF2, SCF, αγγεηνπνηεηίλεο 1 θαη 2, TGFα) (Ross, Sander et al. 2001; Sato, El-Assal et al. 2001; Yu, Wang et al. 2003; Shimizu, Mitsuhashi et al. 2005; Papastefanou, Bozas et al. 2007). Ο πνιιαπιαζηαζκφο ησλ ελδνζειηαθψλ θπηηάξσλ θαη ε εγθαηάζηαζε ηεο λεναγγείσζεο δηαξθεί απφ ηελ 3 ε έσο ηελ 6 ε εκέξα κεηά ηελ επαηεθηνκή. Φαίλεηαη φηη ηα ελδνζειηαθά θχηηαξα πξνζειθχνληαη απφ ηνλ VEGF θαη ηηο αγγεηνπνηεηίλεο πνπ παξάγνπλ νη ζπζηάδεο ησλ δηαηξνχκελσλ επαηνθπηηάξσλ, θαη εηζεξρφκελα ζε απηέο δεκηνπξγνχλ ηελ αγγείσζή ηνπο (Ross, Sander et al. 2001). Η ρνξήγεζε VEGF ζε πεηξακαηφδσα νδεγεί ζε πνιιαπιαζηαζκφ εθηφο απφ ηα ελδνζειηαθά θχηηαξα θαη ηα επαηνθχηηαξα, κνινλφηη ν VEGF δελ έρεη κηηνγφλν δπλακηθφ επί ησλ επαηνθπηηάξσλ. Απηφ εμεγείηαη απφ ην γεγνλφο φηη ηα 47

72 ελδνζειηαθά θχηηαξα φηαλ δηεγεξζνχλ απφ ηνλ VEGF παξάγνπλ HGF, πιήξεο κηηνγφλν ησλ επαηνθπηηάξσλ (LeCouter, Moritz et al. 2003). Γελ είλαη ζαθέο αλ ηα θχηηαξα Kupffer δηαηξνχληαη ζην ήπαξ ή αλ εγθαζίζηαληαη λέα θχηηαξα, πξνεξρφκελα απφ ηνλ αηκνπνηεηηθφ κπειφ. Πάλησο ζπκκεηέρνπλ ζηα παξαθξηληθά ζήκαηα παξάγνληαο TNF θαη ηληεξιεπθίλε 6. Δμάιεηςε ησλ θπηηάξσλ Kupffer πξνθαιεί θαζπζηέξεζε ηεο αλαγέλλεζεο (Webber, Bruix et al. 1998) Μεηαβνιηθέο αιιαγέο θαηά ηελ αλαγέλλεζε Η δεχηεξε θάζε ηεο αλαγέλλεζεο (θάζε πνιιαπιαζηαζκνχ/κεηαβνιηθή), είλαη ε πην απαηηεηηθή απφ κεηαβνιηθήο άπνςεο, ιφγσ ησλ κεγάισλ αλαγθψλ ησλ πνιιαπιαζηαδφκελσλ θπηηάξσλ. Γχν βαζηθέο κεηαβνιηθέο ηδηαηηεξφηεηεο έρνπλ αλαγλσξηζηεί θαηά ηε δηάξθεηα ηεο αλαγέλλεζεο: i. Μεηαβνιηζκόο γιπθόδεο Καηά ηε θάζε πνιιαπιαζηαζκνχ εκθαλίδεηαη εκκέλνπζα ζπζηεκαηηθή ππνγιπθαηκία, ε νπνία κάιηζηα θαίλεηαη λα παίδεη βαζηθφ ξπζκηζηηθφ ξφιν γηα ηελ πνξεία ηεο αλαγέλλεζεο. Η αληηζηξνθή ηεο ππνγιπθαηκίαο κε ρνξήγεζε γιπθφδεο ζηα πεηξακαηφδσα κέζσ ηνπ πφζηκνπ λεξνχ, εκπνδίδεη ζεκαληηθά ηελ αλαγέλλεζε (Weymann, Hartman et al. 2009). Η ππνγιπθαηκία είλαη ην εξέζηζκα γηα λα αθνινπζήζνπλ δηαθνξνπνηήζεηο ζηνλ κεηαβνιηζκφ ησλ ιηπψλ, φπσο ζα δνχκε παξαθάησ. ii. Μεηαβνιηζκόο ιηπώλ Η ζπζηεκαηηθή ππνγιπθαηκία θαίλεηαη φηη επάγεη ηε ζπζηεκαηηθή ιηπφιπζε, ψζηε λα ππάξρεη άθζνλε ελέξγεηα δηαζέζηκε ζην αλαγελλψκελν ήπαξ. (Gilgenkrantz and Collin de l'hortet 2011) ηα επαηνθχηηαξα εκθαλίδεηαη παξνδηθή ζπζζψξεπζε ιηπνζηαγνληδίσλ ηξηγιπθεξηδίσλ πνπ δηαξθεί απφ ηελ 48

73 1 ε έσο ηελ 3 ε εκέξα θαη εμαθαλίδεηαη απηφκαηα (Michalopoulos and DeFrances 1997). Απηή είλαη κηα κεηαβνιηθή πξνζαξκνγή ζηελ πςειή ελεξγεηαθή αλάγθε θαη ζηελ κεγάιε δήηεζε σο πξψηε χιε γηα θπηηαξηθέο κεκβξάλεο θιπ, πνπ είλαη απνιχησο απαξαίηεηε ζην ήπαξ. Η δηαηαξαρή ηεο ζπζζψξεπζεο ιίπνπο επηβξαδχλεη ζεκαληηθά ηελ αλαγέλλεζε (Shteyer, Liao et al. 2004). ηε δηεξγαζία απηή εκπιέθεηαη ε θαβενιίλε θαη κχεο knockout ζηελ θαβενιίλε έρνπλ πξνβιεκαηηθή αλαγέλλεζε (Fernandez, Albor et al. 2006). Μπνξεί ε παξνδηθή ζηεάησζε λα είλαη ζεκαληηθφ θαη αλαπφζπαζην θνκκάηη ηεο αλαγέλλεζεο, αιιά ε πξνυπάξρνπζα ζηεάησζε ζαθψο εκπνδίδεη ηελ αλαγέλλεζε (Torbenson, Yang et al. 2002; Diehl 2005). Μχεο κε αλεπάξθεηα ιεπηίλεο, πνπ έρνπλ θαη ζηεαησηηθφ ήπαξ, έρνπλ κεησκέλε αλαγελλεηηθή δπλαηφηεηα (Yamauchi, Uetsuka et al. 2003). ε αλάινγν κνληέιν, ε αλαγελλεηηθή ηθαλφηεηα δελ επαλέξρεηαη κε δηφξζσζε ηεο ζηεάησζεο ή ρνξήγεζε ιεπηίλεο (Leclercq, Vansteenberghe et al. 2006) 4.12 Σεξκαηηζκόο ηεο αλαγέλλεζεο: Τπάξρεη επαηνζηάηεο; Όπσο έρνπκε ήδε αλαθέξεη, ν κεραληζκφο ηνπ ηεξκαηηζκνχ ηεο αλαγέλλεζεο είλαη ην ιηγφηεξν γλσζηφ θνκκάηη, πνπ κάιηζηα επηδεηθλχεη πςειφ επίπεδν αθξίβεηαο, κε επαλαθνξά ηνπ ήπαηνο ζην πξνεγρεηξεηηθφ ηνπ βάξνο κεηά ηελ επαηεθηνκή, κε ηαρχηαηε πξνζαξκνγή ηνπ κεγέζνπο ηνπ ήπαηνο ζην κέγεζνο ηνπ δψνπ (είηε απηφ ζπλεπάγεηαη αχμεζε (Starzl, Fung et al. 1993), είηε ζκίθξπλζε ηνπ ήπαηνο), κε πξνζαξκνγή ζηηο θπζηνινγηθέο αλάγθεο, φπσο ε ππεξηξνθία ηνπ ήπαηνο ζηελ εγθπκνζχλε (Michalopoulos 2007) θαη ηέινο, κε ην απνπησηηθφ θχκα πνπ αθνινπζεί ηελ θάζε πνιιαπιαζηαζκνχ ησλ επαηνθπηηάξσλ (Sakamoto, Liu et al. 1999). Απηή ε πξνζαξκνζηηθφηεηα ηνπ κεγέζνπο ηνπ ήπαηνο γέλλεζε ηελ ηδέα ελφο κεραληζκνχ «επαηνζηάηε». Αληί ελφο, φκσο, κεραληζκνχ, έρνπλ βξεζεί κία ζεηξά απφ παξάγνληεο πνπ επεξεάδνπλ ηνλ ηεξκαηηζκφ ηεο αλαγέλλεζεο. 49

74 i. TGFβ1 Ο παξάγνληαο απηφο, πνπ εθθξίλεηαη απφ ηα αζηεξνεηδή θχηηαξα (Ikeda, Nagoshi et al. 1998), έρεη πνιχπιεπξε κηηνζηαηηθή δξάζε. Γχλαηαη λα αλαζηείιεη ηνλ πνιιαπιαζηαζκφ ησλ επαηνθπηηάξσλ ζε θαιιηέξγεηα (Houck and Michalopoulos 1989), κεηψλεη ηελ παξαγσγή ηνπ HGF (Gohda, Matsunaga et al. 1992), ειαηηψλεη ηελ έθθξαζε ηεο νπξνθηλάζεο θαη ηελ ελεξγνπνίεζε ηνπ HGF (Mars, Kim et al. 1996). Παξαδφμσο εθθξίλεηαη ζε κεγάιε πνζφηεηα ζηελ αξρή ηεο αλαγέλλεζεο, αιιά ηελ πεξίνδν εθείλε ηα επαηνθχηηαξα είλαη αλζεθηηθά ζηε κηηνζηαηηθή δξάζε ηνπ θαη δελ εκπνδίδεη ηελ έλαξμε ηεο αλαγέλλεζεο (Houck and Michalopoulos 1989). Χο ηηο 48 ψξεο κεηά επαηεθηνκή ε έθθξηζή ηνπ κεηψλεηαη γηα λα απμεζεί εθ λένπ κεηά απφ ην πέξαο ηεο ζχλζεζεο DNA ησλ επαηνθπηηάξσλ (Ha ussinger 2011). Σα πεηξακαηηθά δεδνκέλα γηα ηε δξάζε ηνπ ζηνλ ηεξκαηηζκφ ηεο αλαγέλλεζεο είλαη ακθηιεγφκελα. Μχεο κε γνληδηαθή ππεξέθθξηζε TGFβ1, έρνπλ θπζηνινγηθή αλαγέλλεζε (Sanderson, Factor et al. 1995). Απφ ηελ άιιε, κχεο knockout ζηνλ ππνδνρέα TGFβR II πνπ ππνβάιινληαη ζε PHx, επηδεηθλχνπλ απμεκέλν αξηζκφ επαηνθπηηάξσλ πνπ εηζέξρνληαη ζηελ θάζε S (Oe, Lemmer et al. 2004) θαη κεγαιχηεξν ιφγν βάξνπο ήπαηνο πξνο βάξνο ζψκαηνο ζηε κία εβδνκάδα θαη ζηνλ έλα κήλα κεηά ην ρεηξνπξγείν (Romero-Gallo, Sozmen et al. 2005). ii. Integrin linked kinase (ILK) Δίλαη έλαο ελδνθπηηάξηνο αγγειηνθφξνο πνπ αιιειεπηδξά κε ηηο ηληεγθξίλεο. Φαίλεηαη λα έρεη ηδηαίηεξε ζεκαζία ζηνλ ηεξκαηηζκφ κεηά επαηεθηνκή. Όηαλ κχεο κε επαηνθπηηαξηθή έιιεηςε ILK ππνβιεζνχλ ζε επαηεθηνκή, ηφηε, κεηά ηελ αλαγελλεηηθή απάληεζε, θαηά ηελ 14 ε κεηεγρεηξεηηθή εκέξα, ην ήπαξ θαηαιήγεη κία θαη κηζή (1,5x) θνξά κεγαιχηεξν απφ ην πξνεγρεηξεηηθφ. Η ζχλζεζε DNA ζε απηά ηα πεηξακαηφδσα είλαη επίζεο πην παξαηεηακέλε (Apte, Gkretsi et al. 2009). Απηφ ζα κπνξνχζε λα νθείιεηαη ηφζν ζε δηαθνξνπνίεζε ηεο έθθξηζεο ηληεγθξηλψλ (Gkretsi, Bowen et al. 2007) φζν θαη ζηελ επφδσζε ηεο ζεκαηνδφηεζεο Met (Apte, Gkretsi et al. 2009). 50

75 iii. Glypican-3 Δίλαη κία γλσζηε πξσηενγιπθάλε πνπ ππεξεθθξάδεηαη ζην HCC. Μεηά ηελ επαηεθηνκή απμάλεηαη ζηηο κεηεγρεηξεηηθέο εκέξεο 4 ε -6 ε, δίδνληαο ηελ εληχπσζε φηη ζπκκεηέρεη ζηελ ξχζκηζε ηνπ ηεξκαηηζκνχ. Απηφ επηβεβαηψλεη κειέηε ζηελ νπνία κχεο κε ππεξέθθξηζε Glypican-3 πνπ ππνβιήζεθαλ ζε επαηεθηνκή δελ είραλ νινθιεξψζεη ηελ αλαγέλλεζε ηνπ ήπαηνο θαηά ηελ 6 ε κεηεγρεηξεηηθή εκέξα (Liu, Paranjpe et al. 2009). iv. C/EBPα Δίλαη έλαο κεηαγξαθηθφο παξάγνληαο, ηνπ νπνίνπ ε DNA-δεζκεπηηθή ηθαλφηεηα απμάλεηαη βξαρέσο θαη άκεζα κεηά ηελ επαηεθηνκή, κεηψλεηαη ζην κεζνδηάζηεκα θαη απμάλεηαη εθ λένπ θαηά ηνλ ηεξκαηηζκφ ηεο αλαγέλλεζεο. Οη δξάζεηο ηνπ είλαη αληηκηησηηθέο (Wang, Iakova et al. 2001) θαη επαγσγηθέο ηεο δηαθνξνπνίεζεο, φρη ηνπ πνιιαπιαζηαζκνχ (Greenbaum, Cressman et al. 1995). v. Μνλνπάηη Hippo (Mst1/2 ζηα ζειαζηηθά)/yap Απηφ ην ζεκαηνδνηηθφ κνλνπάηη αλαθαιχθζεθε φηη είλαη ν θχξηνο ξπζκηζηήο ηνπ κεγέζνπο ηνπ ήπαηνο ζηε δξνζφθηια (Tordjmann 2011). Σν φηη ην κνλνπάηη απηφ ζρεηίδεηαη κε ην κέγεζνο ηνπ ήπαηνο θαη ηελ θαξθηλνγέλεζε είρε θαλεί θαη ζε πξνεγνχκελεο κειέηεο (Dong, Feldmann et al. 2007). Όηαλ ζε κχεο απελεξγνπνηεζεί ην Μst1/2 ζην ήπαξ, επάγεηαη ε ελεξγνπνίεζε ηεο YAP θηλάζεο θαη ηα επαηνθχηηαξα εηζέξρνληαη ζε πνιιαπιαζηαζκφ, κε θαηάιεμε ζεκαληηθή επαηηθή ππεξηξνθία (Dong, Feldmann et al. 2007; Zhao, Li et al. 2010). vi. Ιληεξιεπθίλεο IL-1α θαη IL-1β Αλαζηέιινπλ ηελ ζχλζεζε DNA πνπ έρεη πξνθιεζεί απφ κηηνγφλα θαη εκθαλίδνληαη κεηά ηελ θάζε πνιιαπιαζηαζκνχ (2 ε θάζε) ηεο αλαγέλλεζεο (Boulton, Woodman et al. 1997) 51

76 vii. Αθηηβίλε-Α Δίλαη αλαζηνιέαο ηεο κίησζεο πνπ ζρεηίδεηαη κε ηνλ TGFβ. Υνξήγεζε θνιιηζηαηίλεο, ελφο αλαζηνιέα ηεο αθηηβίλεο-α έρεη ζαλ απνηέιεζκα ηελ ππεξβνιηθή αχμεζε ηνπ ήπαηνο κεηά απφ επαηεθηνκή (Kogure, Omata et al. 1995). viii. Δμσθπηηάξηα νπζία εκαληηθφ ξπζκηζηηθφ ξφιν θαη ζπκβνιή ζηνλ ηεξκαηηζκφ ηεο αλαγέλλεζεο έρεη ε εμσθπηηάξηα νπζία ηνπ ήπαηνο. Πξνθαιεί αιιαγέο ζηελ ζπγθέληξσζε ησλ κηηνγφλσλ θαη κηηνζηαηηθψλ ζεκάησλ, θαζψο φζν παξάγεηαη λέα εμσθπηηάξηα νπζία ζηελ αλαγέλλεζε, ηφζν δεζκεχνληαη ζε απηή πνζφηεηεο HGF (δέζκεπζε ζηηο γιπθνδακηλνγιπθάλεο) θαη TGFβ1 (δέζκεπζε ζηελ ληεθνξίλε) (Mars, Kim et al. 1996) Άξα, ν απαηειφο επαηνζηάηεο κάιινλ δελ είλαη κία κφλν νπζία ή έλα κφλν ζεκαηνδνηηθφ κνλνπάηη, αιιά ε ιεπηή ηζνξξνπία κεηαμχ κηηνγφλσλ θαη κηηνζηαηηθψλ ζεκάησλ πνπ φηαλ βξίζθνληαη ζε πιήξε ηζνξξνπία κεηαμχ ηνπο δηαηεξνχλ ην ήπαξ ζε θάζε εξεκίαο, ελψ ζε επηθξάηεζε κίαο απφ ηηο δχν νκάδεο ζεκάησλ επάγεηαη ε αλαγέλλεζε ή ν ηεξκαηηζκφο ηεο αληίζηνηρα. 52

77 Κεθάιαην 5 MicroRNAs 5.1 RNA Σν RNA (ξηβνλνπθιετθφ νμχ) αλήθεη ζηα λνπθιετθά νμέα, πνπ καδί κε ηηο ππφινηπεο ηξείο νκάδεο καθξνκνξίσλ (ιηπίδηα, πδαηάλζξαθεο θαη πξσηεΐλεο) ζπληζηνχλ ηα απαξαίηεηα καθξνκφξηα γηα φιεο ηηο γλσζηέο κνξθέο δσήο. Όπσο ην DNA, έηζη θαη ην RΝΑ απνηειείηαη απφ καθξηέο αιχζνπο ησλ βαζηθψλ δνκηθψλ ηνπο κνλάδσλ, ησλ λνπθιενηηδίσλ, απνηεινχκελσλ κε ηε ζεηξά ηνπο απφ: i. Μία λνπθιετθή βάζε (κία πνπξίλε: αδελίλε Α ή γνπαλίλε G ή κία ππξηκηδίλε: θπηνζίλε C ή νπξαθίιε U) ii. Έλα ζάθραξν: Ρηβφδε iii. Φσζθνξηθή Οκάδα Η δνκή ησλ λνπθιετθψλ νμέσλ (RNA θαη DNA) ηνπο επηηξέπεη λα θσδηθνπνηνχλ γελεηηθή πιεξνθνξία, ππφ ηε κνξθή ηεο αθνινπζίαο ησλ βάζεσλ A-G- U-C. Δλψ ην DNA ζπλαληάηαη ζπλήζσο ππφ ηε κνξθή ησλ καθξηψλ δηπιψλ ειίθσλ (double helix strands), ε κνξθή ηνπ RNA είλαη εμαηξεηηθά πνηθηιφκνξθε, αλαιφγσο κε ηε ιεηηνπξγία πνπ έρεη λα επηηειέζεη. Παξαθάησ παξνπζηάδνληαη ηα βαζηθά είδε RNA θαη ε βαζηθή δνκή θαη ιεηηνπξγία απηψλ: 53

78 1. Αγγειηνθόξν RNA mrna (Messenger RNA) Δθηειεί ηε κεηαθνξά ηεο γελεηηθήο πιεξνθνξίαο απφ ην DNA (ζηνλ ππξήλα) πξνο ην ξηβφζσκα (ζην θπηηαξφπιαζκα) γηα λα αθνινπζήζεη ε κεηάθξαζε. 2. Μεηαθνξηθό RNA trna (Transfer RNA) Έλα κε θσδηθνπνηεηηθφ RNA πνπ έρεη σο ξφιν ηε κεηαθνξά ησλ θαηάιιεισλ ακηλνμέσλ ζηε ζέζε ζχλζεζεο ησλ πξσηετλψλ ζην ξηβφζσκα. 3. Ρηβνζσκηθό RNA rrna (Ribosomal RNA) Η βαζηθή θαηαιπηηθή κνλάδα ησλ ξηβνζσκάησλ πνπ ρξεζηκνπνηεί ηελ πιεξνθνξία πνπ θνκίδεη ην mrna θαη ζπλζέηεη ηελ πξσηετληθή άιπζν ελψλνληαο ηα ακηλνμέα πνπ ηνπ παξέρεη ην trna. 4. Καηαιπηηθό RNA Catalytic RNA (ribozyme) Έσο ηελ αλαθάιπςή ηνπο ζεσξήην φηη ηα κφλα καθξνκφξηα κε ελδπκηθή δξάζε είλαη νη πξσηεΐλεο. Σα RNA απηά θαηαιχνπλ ηε ίδηα ηε ζχλζεζή ηνπο ή ηε ζχλζεζε άιισλ κνξίσλ. 54

79 5. Με θσδηθνπνηεηηθό RNA (Non-coding RNA) Δίλαη κία νκάδα απφ δηάθνξα κφξηα RNA πνπ δελ θσδηθνπνηνχλ πξσηεΐλεο, αιιά αζθνχλ άιινπο ξπζκηζηηθνχο ξφινπο ζην θχηηαξν. Απνηεινχλ πεδίν εληαηηθήο έξεπλαο, κε λέα κφξηα θαη λέεο δξάζεηο λα αλαθαιχπηνληαη θαζεκεξηλά. Η νκάδα απηή ζπκπεξηιακβάλεη ηα παξαθάησ: 5-α. snornas (small nucleolar RNAs): Δπεκβαίλνπλ ζηε ζχλζεζε ηνπ rrna 5-β. sirnas (short interfering RNAs ή silencing RNAs): Παίδνπλ βαζηθφ ξφιν ζην θαηλφκελν RNA Interference πνπ ηξνπνπνηεί ηελ έθθξαζε νξηζκέλσλ γνληδίσλ κε ζπκπιεξσκαηηθή πξνο απηά αιιεινπρία βάζεσλ, θαζψο θαη ζην θαηλφκελν PTGS (Post Transcriptional Gene Silencing) 5-γ. pirnas (Piwi-interacting RNA): Αιιειεπηδξνχλ κε ηηο πξσηεΐλεο Piwi θαη δεκηνπξγνχλ ζχκπινθα κφξηα πνπ επεκβαίλνπλ ζηελ έθθξαζε γνληδίσλ. 55

80 5-δ Long ncrnas: Mφξηα RNA κε ξπζκηζηηθφ ξφιν επί ηεο έθθξαζεο γνληδίσλ, απηά κε ην κεγαιχηεξν κέγεζνο απφ ηα ξπζκηζηηθά RNAs (>200 λνπθιενηίδηα) 5-ε. MicroRNAs (mirnas): Μηθξά (θαηά κέζν φξν 22 λνπθιενηίδηα), ξπζκηζηηθά ηεο έθθξαζεο γνληδίσλ, κφξηα RNA. 56

81 5.2 Micro RNAs Σα micro RNAs είλαη κηθξά κφξηα RNA, κήθνπο πεξί ηα 22 λνπθιενηίδηα (17-27), πνπ βξίζθνληαη ζηα επθαξπσηηθά θχηηαξα. Σα mirnas είλαη κεηακεηαγξαθηθνί αξλεηηθνί ηξνπνπνηεηέο ηεο έθθξαζεο γνληδίσλ. πλδένληαη ζε ζπκπιεξσκαηηθέο ζέζεηο ηνπ mrna ζηφρνπ, κε απνηέιεζκα είηε ηελ απνηξνπή ηεο κεηάθξαζεο ή θαη ηελ πιήξε δηάζπαζε ηνπ ελ ιφγσ mrna. Σν γνληδίσκα ηνπ αλζξψπνπ θαίλεηαη λα θσδηθνπνηεί πεξηζζφηεξα απφ mirnas, ηα νπνία δχλαληαη λα δξάζνπλ ζην 60% ηνπ ζπλφινπ ησλ γνληδίσλ. Μέζα απφ πνιπάξηζκεο κειέηεο θαίλεηαη πσο εκπιέθνληαη ζηηο πεξηζζφηεξεο βηνινγηθέο δηαδηθαζίεο. Κάζε ηχπνο θπηηάξνπ θαη ηζηνχ εθθξάδεη ζπγθεθξηκέλεο νκάδεο mirnas (Bartel 2004) Ιζηνξία ησλ micrornas Σν πξψην mirna αλαθαιχθζεθε ην 1993 απφ ηνπο Victor Ambros, Rosalind Lee θαη Rhonda Feinbaum, θαηά ηελ έξεπλα ηεο έθθξαζεο ηνπ γνληδίνπ lin-14 ηνπ Caenorhabditis elegans (λεκαηψδεο ζθψιεθαο). Βξήθαλ έλα κφξην RNA 22 λνπθιενηηδίσλ, ην lin-14 mirna. Υξεηάζηεθε λα πεξάζνπλ επηά ρξφληα (2000) γηα ηελ αλαθάιπςε ηνπ δεχηεξνπ mirna, νπφηε θαη γελλήζεθαλ ππνςίεο γηα ηελ χπαξμε απηνχ ηνπ κεραληζκνχ Βηνζύλζεζε ησλ micrornas Σα γνλίδηα ησλ mirnas κπνξεί λα είλαη απηφλνκα γνλίδηα κεηαμχ ζέζεσλ θσδηθνπνίεζεο πξσηετλψλ ή λα εληνπίδνληαη ζε εζψληα (introns). Μπνξνχλ επίζεο είηε λα ππάξρνπλ σο αλεμάξηεηεο κεηαγξαθηθέο κνλάδεο, είηε λα βξίζθνληαη κέζα ζην γνληδίσκα νξγαλσκέλα ζε ζπζηνηρία παξαγσγήο πνιπθηζηξνληθψλ κεηαγξάθσλ (Rodriguez, Griffiths-Jones et al. 2004). ην πξψην ζηάδην ηεο ζχλζεζήο ηνπο, ε RNA πνιπκεξάζε ΙΙ κεηαγξάθεη ην γνλίδηφ ηνπο παξάγνληαο ηα πξσηνγελή mirnas (primary, pri-mirnas), κήθνπο κεξηθψλ εθαηνληάδσλ λνπθιενηηδίσλ. Η ηππηθή κνξθή ελφο pri-mirna είλαη κία 57

82 αηειψο δίθισλε πεξηνρή πνπ θαηαιήγεη ζην έλα άθξν ζε ζειηά θαη ζην άιιν ζε δχν αθξαία κνλφθισλα ηκήκαηα (Cai, Hagedorn et al. 2004). Σν δεχηεξν ζηάδην ηεο ζχλζεζεο ησλ mirnas ιακβάλεη ρψξα, φπσο θαη ην πξψην ζηάδην, εληφο ηνπ ππξήλα ηνπ θπηηάξνπ. ρεκαηίδεηαη έλα ζχκπιεγκα κε ζπκκεηνρή ηεο RNaseIII-like λνπθιεάζεο Drosha θαη ηεο dsrna-δεζκεπφκελεο πξσηεΐλεο Pasha, ην νπνίν απνθφπηεη ηα δχν αθξαία κνλφθισλα ηκήκαηα ηνπ primirnα, απειεπζεξψλνληαο κία δνκή ζε ζρήκα θνπξθέηαο, κήθνπο 65 nt πεξίπνπ, πνπ νλνκάδεηαη πξφδξνκν mirnα (precursor, pre-mirnα) (Lee, Ahn et al. 2003; Han, Lee et al. 2004; Han, Lee et al. 2006). Δηθόλα 5.1: ρεκαηηθή αλαπαξάζηαζε ηεο βηνζύλζεζεο ησλ mirnas Από: (Joshi, McLendon et al. 2011) Αθνινπζεί ε κεηαθνξά ηνπ pre-mirnα απφ ηνλ ππξήλα ζην θπηηαξφπιαζκα κε ηε βνήζεηα κίαο πξσηεΐλεο-κεηαθνξέα ηεο ππξεληθήο κεκβξάλεο, ηεο Exportin-5. Η 58

83 απαηηνχκελε ελέξγεηα γηα ηε κεηαθνξά απηή παξέρεηαη απφ ηελ GTP κεηά ηε ζχλδεζή ηεο κε ηελ πξσηεΐλε Ran (Bohnsack, Czaplinski et al. 2004). ην θπηηαξνπιαζκαηηθφ ζηάδην ηεο βηνγέλεζεο ησλ mirnαs, κία RNaseIII (ελδνλνπθιεάζε), ε Dicer απνθφπηεη ηε δνκή ηεο ζειεηάο, θαηαιείπνληαο ην δίθισλν ψξηκν mirnα (mirnα*) (Forstemann, Horwich et al. 2007). Απηφ, ελ ζπλερεία, δηαζπάηαη θαη ε κία άιπζνο απηνχ ζα είλαη ην ελεξγφ mirnα πνπ ζα ελζσκαησζεί ζην RISC γηα λα αιιειεπηδξάζεη κε ην ζηφρν ηνπ, ελψ ε άιιε απνδνκείηαη απφ ην θχηηαξν (Ke, Liu et al. 2003; Bartel 2004; Joshi, McLendon et al. 2011) Μεραληζκόο δξάζεο ησλ mirnαs Σν πξψην βήκα γηα ηελ εκθάληζε ηεο δξάζεο ησλ mirnαs είλαη ν ζρεκαηηζκφο ηνπ ζπκπιέγκαηνο RISC (RNA-induced silencing complex). Σν βαζηθφ ζπζηαηηθφ ηνπ RISC είλαη κία πξσηεΐλε ηεο νηθνγέλεηαο Αξγνλαχηεο (Ago). Οη πξσηεΐλεο απηέο δηαζέηνπλ κία ζέζε ζπγθξάηεζεο ηνπ κνξίνπ ηνπ mirnα, ην νπνίν ρξεζηκνπνηείηαη γηα ηελ αλαγλψξηζε ηνπ mrnα-ζηφρνπ. Οη Ago εκθαλίδνπλ άιινηε άιινπ βαζκνχ ελδπκηθή δξαζηεξηφηεηα RNάζεο (ελδνλνπθιεάζεο), θπξίσο ε Ago2 θαη δεπηεξεπφλησο ε Ago1. ην ζχκπιεγκα κπνξεί λα πεξηέρνληαη θαη άιιεο πξσηετληθέο δνκέο, φπσο Dicer, TRBP, PACT, FMRP, MOV10, TNRC6B θ.α. Ο ηξφπνο επίηεπμεο ηεο RNA ζίγεζεο (RNA silencing) εμαξηάηαη θαηά θχξην ιφγν απφ ηνλ βαζκφ ζπκπιεξσκαηηθφηεηαο κεηαμχ ηεο αιιεινπρίαο ηνπ mirnα κε ην mrnα-ζηφρν: ε απφιπηε ζπκπιεξσκαηηθφηεηα ηνπ mirnα κε ηνλ ζηφρν, ην mrna δηαιχεηαη, ζπλήζσο κε απεπζείαο δξάζε ελδνλνπθιεάζεο ηεο Ago2. 59

84 ε κεξηθή ζπκπιεξσκαηηθφηεηα ε ζίγαζε επηηπγράλεηαη κε παξεκπφδηζε ηεο κεηάθξαζεο (Forstemann, Horwich et al. 2007; Tomari, Du et al. 2007). Αλεμαξηήησο ζπκπιεξσκαηηθφηεηαο, νξηζκέλεο θνξέο ε δξάζε αζθείηαη κέζσ ηεο απνθνπήο βάζεσλ αδελίλεο απφ ην κφξην ζηφρν ηνπ mrna (mrna Deadenylation) Σειεπηαία εξεπλάηαη ε πηζαλφηεηα, κέζσ άιισλ κεραληζκψλ, θάπνηα mirnas λα δξνπλ ζεηηθά ζηε κεηάθξαζε κνξίσλ mrna (Sacco and Adeli 2012). Μεηά απφ εμέηαζε ηεο νκνινγίαο ησλ ηφπσλ ζχλδεζεο ησλ mirnas κε ηνπο ηφπνπο ζχλδεζεο ζην mrna θαη ιακβάλνληαο ππφςε ηελ δπλαηφηεηα ζχλδεζεο κε αηειή ζπκπιεξσκαηηθφηεηα, πξνθχπηεη φηη: α) Έλα mirna κπνξεί λα ξπζκίδεη πνιχ πεξηζζφηεξα ηνπ ελφο (έσο 1.000) γνλίδηα. Απηφ ην θαηλφκελν νλνκάδεηαη Απνθιίλνπζα Ρχζκηζε. β) Πνιιά mirnas κπνξεί λα ζπκκεηέρνπλ ηαπηφρξνλα ζηε ξχζκηζε ηεο έθθξαζεο ελφο γνληδίνπ, πγθιίλνπζα Ρχζκηζε. 60

85 (Ke, Liu et al. 2003; Bartel 2004; Joshi, McLendon et al. 2011) Κιηληθή ζεκαζία ησλ micrornas Μεγάιν εξεπλεηηθφ ελδηαθέξνλ έρεη πξνθαιέζεη ε ξπζκηζηηθή ηθαλφηεηα θαη ν έιεγρνο πνπ αζθνχλ ηα mirnas ζε πνιιαπιέο θπζηνινγηθέο θαη παζνινγηθέο θαηαζηάζεηο ζηνλ αλζξψπηλν νξγαληζκφ. Πνιιαπιέο ζχγρξνλεο έξεπλεο έρνπλ αλαδείμεη θάπνην ξφιν ησλ mirnas θαη αλαδεηνχλ ηελ πηζαλφηεηα θαη ζεξαπεπηηθήο παξέκβαζεο κε ρξήζε mirnas ζηηο θάησζη θαηαζηάζεηο: Οληνγέλεζε Φπζηνινγηθή αλάπηπμε ησλ ηζηψλ θαη πνιιαπιαζηαζκφο ησλ θπηηάξσλ Καξθίλνο θαη θαθφεζεο κεηαζηαηηθφ δπλακηθφ (Τπφ κειέηε ν ξφινο ησλ mirnas κε πνιιά είδε θαξθίλνπ: Π.ρ. παρένο εληέξνπ, επαηνθπηηαξηθφο, πξνζηάηε, νπξνδφρνπ θχζηεο, λεθξνχ, πλεχκνλα, ζπξενεηδή, κειάλσκα, εγθεθάινπ θ.α.) Νεπξνινγηθέο παζήζεηο (Altzheimer s, πνιιαπιή ζθιήξπλζε, επηιεςία) Μπηθέο (κπνηνληθή δπζηξνθία) Υνλδξνγέλεζε νζηεναξζξίηηδα- απηνάλνζα ξεπκαηηθά λνζήκαηα (ΔΛ) Αηκαηνινγηθέο λφζνη (ιέκθσκα) Μεηαβνιηζκφο (δηαβήηεο, ιηπίδηα) Αζεξνζθιήξπλζε πεξηθεξηθή αγγεηνπάζεηα Αληηηηθή δξάζε (ππφ έξεπλα γηα HIV, HPV, H-Z, HCV) Υξήζε σο Biomarkers ησλ mirnas πνπ θπθινθνξνχλ ζην αίκα (γηα θαξθίλν ή θαινήζεηο παζήζεηο ή θαηαζηάζεηο φπσο ΟΔΜ) ή ζην ΔΝΤ (γηα εγθεθαιηθέο παζήζεηο). 61

86 5.2.5 Φπζηνινγηθό ήπαξ θαη micrornas Σα mirnas παίδνπλ ζεκαληηθφ ξφιν ζηελ επηβίσζε, ηελ αλάπηπμε, ηνλ κεηαβνιηζκφ θαη ηελ θαθνήζε εμαιιαγή ησλ θπηηάξσλ ηνπ ήπαηνο. Με δηαγξαθή ηεο Dicer απφ ηα επαηνθχηηαξα, αξρηθά κεηψζεθε ε βησζηκφηεηά ηνπο, ελψ απηά πνπ επηδνχλ εκθαλίδνπλ απμεκέλε θαξθηλνγέλεζε. Έξεπλεο ζε Dicer Ι knockout πνληηθνχο έδεημαλ φηη ε επαηηθή ιεηηνπξγία δηαηεξείηαη ελψ ε έιιεηςε ελφο βαζηθνχ mirna γηα ην ήπαξ, ηνπ mir-122 νδεγεί ζε επαηηθή ιεηηνπξγηθή αλεπάξθεηα. Απηφ ππνλνεί φηη ππάξρεη θαη άιιε νδφο βηνγέλεζεο ησλ mirnas εθηφο απφ ηε γλσζηή πνπ παξνπζηάζηεθε παξαπάλσ (Mott 2009). Μεηαμχ ησλ mirnas πνπ εθθξάδνληαη ηδηαίηεξα ζην ήπαξ, ην mir-122 ζεσξείηαη ν αθξνγσληαίνο ιίζνο. Παξεκπφδηζε ηεο δξάζεο ηνπ mir-122 νδεγεί ζε αλεμέιεγθηε έθθξαζε εθαηνληάδσλ γνληδίσλ πνπ ππφ θπζηνινγηθέο ζπλζήθεο δελ εθθξάδνληαη ζην ψξηκν επαηνθχηηαξν (Krutzfeldt, Rajewsky et al. 2005). Απψιεηα ηεο έθθξαζεο ηνπ mir-122 ζηνλ επαηνθπηηαξηθφ θαξθίλν ζρεηίδεηαη κε απψιεηα ηνπ επαηηθνχ θαηλνηχπνπ θαη αχμεζε ηνπ θαθνήζνπο θαη ηνπ κεηαζηαηηθνχ δπλακηθνχ (Coulouarn, Factor et al. 2009). Η έθθξαζε ησλ mirnas αιιάδεη αλάινγα κε ην ζηάδην ηεο αλάπηπμεο πνπ βξίζθεηαη ην ήπαξ. ην ήπαξ ηνπ ελήιηθα εθηφο ηνπ mir-122 εθθξάδνληαη θαη άιια micrornas, φπσο mir-1, mir-16, mir-27b, mir-30d, mir-126, mir-133, mir-143, θαη ε νηθνγέλεηα mirnas let-7. Αληί απηψλ, ζην εκβξπηθφ ήπαξ εθθξάδνληαη θπξίσο ην mir-92a θαη ην mir-483 (Girard, Jacquemin et al. 2008). 62

87 5.2.6 Μεηαβνιηζκόο ιηπηδίσλ θαη micrornas Δπεηδή, φπσο έρεη αλαθεξζεί, ε παξνδηθή ζηεάησζε είλαη αλαπφζπαζην θνκκάηη ηεο δηαδηθαζίαο ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο, αμίδεη λα αλαθεξζνχκε ζηα δεδνκέλα πνπ ππάξρνπλ γηα ηε ζπκκεηνρή mirnas ζηε ξχζκηζε ηνπ κεηαβνιηζκνχ ησλ ιηπηδίσλ. Δίλαη πνιχ ελδηαθέξνλ φηη ην mir-122 παίδεη ζεκαληηθφ ξφιν ζηνλ κεηαβνιηζκφ ησλ ιηπηδίσλ. Αδξαλνπνίεζε ηνπ mir-122 έρεη σο απνηέιεζκα ηελ απμεκέλε επαηηθή νμείδσζε ησλ ιηπαξψλ νμέσλ θαη ηε κεησκέλε επαηηθή ζχλζεζε ιηπαξψλ νμέσλ θαη ρνιεζηεξφιεο. Δπίζεο ε κείσζε ηνπ mir-122 έρεη δνζνεμαξηψκελν απνηέιεζκα ζηε κείσζε ηεο ηηκήο ηεο ρνιεζηεξφιεο ζην πιάζκα. Γηακέζνπ ηνπ mir-122 δξα θαη ην mir-370, πνπ απμάλεη ηελ έθθξαζε ηνπ πξψηνπ. Η έθθξαζε ελφο άιινπ mirna, ηνπ mir-33 ζρεηίδεηαη κε κείσζε ηεο ζπγθέληξσζεο ζην πιάζκα ησλ ηξηγιπθεξηδίσλ θαη ηνπ θιάζκαηνο VLDL θαη ηελ αχμεζε ηνπ θιάζκαηνο HDL. Αληηζηνίρσο κεηψλεηαη ε ελδνθπηηάξηα ζπγθέληξσζε ρνιεζηεξφιεο. Πνιιά αθφκε mirnas ελέρνληαη ζηνλ κεηαβνιηζκφ ησλ ιηπηδίσλ. πλνπηηθά ε δξάζε ηνπο παξνπζηάδεηαη ζηνλ παξαθάησ πίλαθα (Sacco and Adeli 2012). microrna Βηνινγηθή δξάζε ζηνλ κεηαβνιηζκφ ησλ ιηπηδίσλ mir-33 mir-122 Βηνγέλεζε HDL θαη θπθινθνξνχζαο ρνιεζηεξφιεο Δλδνθπηηάξηα κεηαθνξά ρνιεζηεξφιεο Δθξνή ρνιεζηεξφιεο Ομείδσζε ιηπαξψλ νμέσλ Τδξφιπζε VLDL-TG χλζεζε ιηπαξψλ νμέσλ χλζεζε ρνιεζηεξφιεο 63

88 mir-370 Βηνζχλζεζε ιηπαξψλ νμέσλ θαη ηξηγιπθεξηδίσλ mir-378 Βηνζχλζεζε ιηπαξψλ νμέσλ θαη ηξηγιπθεξηδίσλ mir-27 χλζεζε ιηπαξψλ νμέσλ Γξαζηεξηφηεηα ιηπνπξσηετληθήο ιηπάζεο mir-29α Γξαζηεξηφηεηα ιηπνπξσηετληθήο ιηπάζεο Κπηηαξηθή πξφζιεςε ιηπηδίσλ mir-302α χλζεζε ιηπαξψλ νμέσλ mir-613 χλζεζε ιηπαξψλ νμέσλ mir-168α Clearance LDL ρνιεζηεξφιεο Πίλαθαο 5.2: Η ζπλεηζθνξά ησλ micrornas ζηνλ κεηαβνιηζκό ησλ ιηπηδίσλ Από: (Sacco and Adeli 2012) 64

89 ΚΟΠΟ ΣΗ ΠΑΡΟΤΑ ΜΕΛΕΣΗ Η παξνχζα κειέηε είρε ζθνπφ ηελ πεξαηηέξσ δηαιεχθαλζε ηεο δηεξγαζίαο ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο ζηνλ κπ, φπσο απηή εμειίζζεηαη κεηά απφ ρεηξνπξγηθή επαηεθηνκή, δειαδή φηαλ ππάξρεη πγηήο ππνιεηκκαηηθφο επαηηθφο ηζηφο. Καζψο ν κπο ρξεζηκνπνηείην ζαθψο ιηγφηεξν ζηα ρεηξνπξγηθά κνληέια ηεο αλαγέλλεζεο, νπφηε δελ ππήξρε ηθαλνπνηεηηθή, ηππνπνηεκέλε εγρεηξεηηθή δηεξγαζία. Πξψην κέιεκα ησλ εξεπλεηψλ ήηαλ ε βειηηζηνπνίεζε ηεο εγρεηξεηηθήο δηαδηθαζίαο. ηε ζπλέρεηα έγηλε παξαθνινχζεζε ηεο αλαγελλεηηθήο δηεξγαζίαο κε εληνπηζκφ ησλ κηηψζεσλ ησλ επαηνθπηηάξσλ, κε αλνζντζηνρεκηθή ρξψζε θαζψο θαη κε αμηνιφγεζε ηνπ ππφ έξεπλα θαηλνκέλνπ ηεο παξνδηθήο επαηηθήο ζηεάησζεο θαηά ηε δεχηεξε θάζε ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο, ζε πνιιαπιά ρξνληθά ζεκεία θαηά ηελ αλαγελλεηηθή δηαδηθαζία κεηά απφ κεξηθή επαηεθηνκή. Καηά ηελ εηο βάζνο κειέηε ηνπ θαηλνκέλνπ ηεο αλαγέλλεζεο, δηαπηζηψζεθε φηη ηα ηειεπηαία, κφιηο, ρξφληα άξρηζε λα δηαθαίλεηαη έλα λέν πεδίν έξεπλαο, κε πνιιέο άγλσζηεο πηπρέο: Σα micrornas θαη ε πηζαλή ζπκκεηνρή ηνπο ζηελ επαηηθή αλαγέλλεζε. Ση φκσο, νδήγεζε ζηε ζθέςε φηη ηα micrornas κπνξεί λα ζπκκεηέρνπλ ζηελ επαηηθή αλαγέλλεζε; Δίλαη γλσζηφ απφ πξνεγνχκελεο κειέηεο φηη ηα micrornas ελέρνληαη ζηε δηαδηθαζία αλαγέλλεζεο άιισλ ηζηψλ, φπσο ησλ πηεξπγίσλ ηνπ zebrafish (Thatcher, Paydar et al. 2008), ζηελ αλαγέλλεζε ησλ πιαηπεικίλζσλ ηνπ γέλνπο Planaria (Palakodeti, Smielewska et al. 2006) θαη ζηε δηαδηθαζία ηεο επνχισζεο ηνπ ηξαχκαηνο (Bostjancic and Glavac 2008). Γεκηνπξγήζεθαλ γνληδηαθά ηξνπνπνηεκέλνη κχεο κε εθιεθηηθή απελεξγνπνίεζε ζηα επαηνθχηηαξα ηνπ DGCR8, ην νπνίν είλαη απαξαίηεην γηα ηε ζχλζεζε ησλ mirnas. Οη κχεο απηνί, 65

90 αλαπηχζζνληαη θπζηνινγηθά σο ηελ ελειηθίσζε, αιιά κεηά απφ κεξηθή επαηεθηνκή, ηα επαηνθχηηαξά ηνπο αδπλαηνχλ λα εηζέιζνπλ ζηε θάζε S ηνπ θπηηαξηθνχ θχθινπ (Ke, Liu et al. 2003). Καηά ηελ δηάξθεηα εθηέιεζεο ηεο παξνχζεο δηαηξηβήο, δεκνζηεχηεθε κειέηε πνπ αθξηβψο εκπιέθεη ην mir-21ζηε δηαδηθαζία ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο. ηε κειέηε απηή ην mir-21 βξέζεθε φηη ζηνρεχεη ην Pellino-1 θαη αλαζηέιιεη ηε ζεκαηνδνζία ηνπ NF-θΒ (Marquez, Wendlandt et al. 2010). Δπίζεο, έρεη αλαγλσξηζηεί ν ξφινο ησλ mirnas ζηνλ κεηαβνιηζκφ ησλ ιηπηδίσλ ζην ήπαξ. Η επαηηθή αλαγέλλεζε εμάιινπ πεξηιακβάλεη ακέζσο κεηά ηελ αξρηθή θάζε (priming phase), κία κεηαβνιηθή θάζε πνπ ραξαθηεξίδεηαη απφ ζπζζψξεπζε ηξηγιπθεξηδίσλ απαξαίηεησλ γηα ηελ φιε δηεξγαζία (Michalopoulos and DeFrances 1997). Δθφζνλ πξφζθαηεο κειέηεο έρνπλ αλαγλσξίζεη ηα mirnas σο ξπζκηζηέο ηεο έθθξαζεο γνληδίσλ, ξπζκηζηέο θξίζηκσλ θπηηαξηθψλ δηεξγαζηψλ, φπσο ν πνιιαπιαζηαζκφο, ε νγθνγέλεζε, ε απφπησζε θαη ν κεηαβνιηζκφο ησλ ιηπηδίσλ, είλαη ινγηθφ λα ππνζέζεη θαλείο φηη ελέρνληαη θαη ζηελ επαηηθή αλαγέλλεζε. Δπφκελνο ζθνπφο ηεο παξνχζαο κειέηεο είλαη ε δηεξεχλεζε ηνπ πξνηχπνπ έθθξαζεο ησλ mirnas θαηά ηε δηαδηθαζία ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο θαη ηνπ ξπζκηζηηθνχ ξφινπ πνπ ηπρφλ ππεξεηνχλ. Γλσξίδνληαο φηη ε κέγηζηε αλαγελλεηηθή δξαζηεξηφηεηα ησλ επαηνθπηηάξσλ ζηνλ κπ εληνπίδεηαη ζηηο 36 ψξεο, γηα ηε κειέηε επηιέρζεθε έλα ζρεηηθά πξψηκν ρξνληθφ ζεκείν (12 ψξεο κεηά ηελ επαηεθηνκή) γηα ηελ αλίρλεπζε ηπρφλ δηαθνξηθήο έθθξαζεο ξπζκηζηηθψλ mirnas πνπ δπλεηηθά ζα κπνξνχζαλ λα επεξεάζνπλ κεηέπεηηα θπηηαξηθέο δηεξγαζίεο ηνπ πνιιαπιαζηαζκνχ. Η έθθξαζε φισλ ησλ mirnas ειέγρζεθε κε ηηο κεζφδνπο ηνπ πξνθίι κηθξνζπζηνηρηψλ θαη επαιεζεχηεθε κε πνζνηηθή real time PCR ζε δείγκαηα επαηηθψλ ηζηψλ πνπ ειήθζεζαλ 12 ψξεο κεηά απφ 2/3 κεξηθή επαηεθηνκή. 66

91 Κεθάιαην 6 Τλικά και Μέθοδοι 6.1 Βειηηζηνπνίεζε ηεο κεζόδνπ 2/3 κεξηθήο επαηεθηνκήο Έρνπκε ήδε αλαθεξζεί ζηελ επηινγή καο γηα κειέηε ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο, ησλ κπψλ σο πεηξακαηνδψσλ θαη ηεο 2/3 PHx σο πεηξακαηηθνχ κνληέινπ. Η ρεηξνπξγηθή κέζνδνο 2/3 PHx άξρηζε λα εθαξκφδεηαη ην 2007, νπφηε έγηλαλ θαηά ηε δηάξθεηα ηνπ έηνπο απηνχ πεξί ηηο 100 ηέηνηεο επεκβάζεηο. Αξρηθά ρξεζηκνπνηήζεθαλ αλαηζζεηηθέο θαη εγρεηξεηηθέο ηερληθέο φπσο παξνπζηάδνληαλ σο ηφηε ζηε δηεζλή βηβιηνγξαθία, κε πησρά απνηειέζκαηα απφ πιεπξάο επηβίσζεο ησλ δψσλ. Με ηε ζπζζψξεπζε εκπεηξίαο έγηλαλ αξθεηέο ηξνπνπνηήζεηο πνπ είραλ σο απνηέιεζκα ηελ κεγάιε αχμεζε ηεο επηβίσζεο ησλ πεηξακαηνδψσλ σο ην ηειηθφ πνζνζηφ επηβίσζεο ζηα πιαίζηα ηνπ % Πεηξακαηόδσα ε φια ηα πεηξάκαηα πνπ αθνξνχλ ζηελ παξνχζα κειέηε ρξεζηκνπνηήζεθαλ αξζεληθνί κχεο άγξηνπ ηχπνπ C57BL6J ειηθίαο νθηψ εβδνκάδσλ πνπ ζηηίδνληαλ κε standard θξνθέηεο ηξσθηηθψλ. Σα δψα ζηεγάδνληαλ ζην δσνηξνθείν ηνπ Παλεπηζηεκίνπ Παηξψλ, ζε ζπλζήθεο ειεγρφκελεο ζεξκνθξαζίαο, πγξαζίαο, θαη θσηηζκνχ, κε 12σξν θχθιν εκέξαο/λχρηαο. Όιεο νη δηαδηθαζίεο πνπ αθνξνχζαλ ζηα δψα εγθξίζεθαλ απφ ην Δπηηξνπή Έξεπλαο θαη Γενληνινγίαο ηεο Ιαηξηθήο ρνιήο ηνπ Παλεπηζηεκίνπ Παηξψλ θαη ήηαλ ζε ζπκθσλία κε ηελ 86/609/ΔΔC νδεγία ηεο ΔΔ. 67

92 Οη εγθαηαζηάζεηο δηαζέηνπλ πεηξακαηηθφ ρεηξνπξγείν, πιήξσο εμνπιηζκέλν κε ρεηξνπξγηθφ ηξαπέδη, ρεηξνπξγηθφ θσηηζκφ, ρεηξνπξγηθφ κηθξνζθφπην θαη ζπζθεπή ρνξήγεζεο εηζπλεφκελεο αλαηζζεζίαο Αλαηζζεζηνινγηθή ηερληθή θαη αλάλεςε ηελ πξψηε θάζε ησλ πεηξακάησλ, ην 2007, ζχκθσλα κε ηελ δηεζλή βηβιηνγξαθία, ε πην επξέσο ρξεζηκνπνηνχκελε κέζνδνο ρνξήγεζεο αλαηζζεζίαο ήηαλ ε ελδνπεξηηνλατθή ρνξήγεζε θαξκάθσλ, ζπλεζέζηεξα ν ζπλδπαζκφο θεηακίλεο (αλαηζζεηηθφ κε πξφζζεηε αλαιγεηηθή δξάζε) κε μπιαδίλε (αλαηζζεηηθφ κε πξφζζεηε αλαιγεηηθή θαη κπνραιαξσηηθή δξάζε). Σνλ ζπλδπαζκφ απηψλ ησλ θαξκάθσλ ρνξεγνχζακε ζε δφζεηο 80 mg/kg θαη 6 mg/kg αληίζηνηρα. Σν ζεκαληηθφ πιενλέθηεκα πνπ έθαλε ηελ ελδνπεξηηνλατθή αλαηζζεζία ηφζν δεκνθηιή είλαη φηη δελ απαηηεί ηελ ρξήζε θάπνηνπ εηδηθνχ εμνπιηζκνχ. Έρεη φκσο ηα κεηνλεθηήκαηα ηνπ παξαηεηακέλνπ θαη αλνκνηνγελνχο κεηαμχ ησλ δηάθνξσλ πεηξακαηφδσσλ ρξφλνπ αθχπληζεο, θαζψο θαη ηεο απμεκέλεο επαηνηνμηθφηεηαο ζε ζρέζε κε ηα πηεηηθά αλαηζζεηηθά. Αληηζέησο, ζηελ ζεξαπεπηηθή θηεληαηξηθή ρεηξνπξγηθή ε κέζνδνο εθινγήο γηα ρνξήγεζε αλαηζζεζίαο είλαη ε ρξήζε πηεηηθνχ αλαηζζεηηθνχ, ζπλήζσο ηζνθινπξαλίνπ. ε αλαδήηεζε θαιχηεξσλ ζπλζεθψλ αλαηζζεζίαο, πηνζεηήζακε ηελ ρνξήγεζε ηζνθινπξαλίνπ ζε δφζεηο 4% γηα εηζαγσγή ζηελ αλαηζζεζία θαη 2% δφζε ζπληήξεζεο. Απηφ είρε άκεζε επίδξαζε ζηελ αχμεζε ηεο επηβίσζεο ησλ πεηξακαηνδψσλ, φπσο θαίλεηαη ζην ζρεηηθφ δηάγξακκα ζηελ παξάγξαθν 7.1 Γξάθεκα 6.1: Η κεησκέλε επαηνηνμηθόηεηα ηνπ πηεηηθνύ αλαηζζεηηθνύ (Mitchell and Willenbring 2008) 68

93 ε κία κεηαγελέζηεξε κειέηε, ηελ δηαθνξά ζηελ επαηνηνμηθφηεηα κεηαμχ δηάθνξσλ κνξθψλ αλαηζζεζίαο, κέζσ ηεο κέηξεζεο ηεο ALT κεηά επαηεθηνκή αλαδεηθλχεη θαη ην παξαθάησ δηάγξακκα (Mitchell and Willenbring 2008) Μεηεγρεηξεηηθά, φια ηα δψα αθήλνληαλ λα αλαλήςνπλ ζε ζεξκαηλφκελν, ζηαζεξήο ζεξκνθξαζίαο θισβφ κε παξνρή λεξνχ θαη ηξνθήο ad libitum γηα ην ρξφλν κέρξη ηε ζαλάησζή ηνπο. Μεηά ηελ πάξνδν απηνχ ηνπ θαηά πεξίπησζε ρξνληθνχ δηαζηήκαηνο, ιακβαλφηαλ ην δείγκα ήπαηνο θαηφπηλ ρνξήγεζεο εθ λένπ αλαηζζεζίαο θαη ην δψν ζαλαησλφηαλ κε αθαίκαμε Αξρηθή Υεηξνπξγηθή Σερληθή Χο ηηο αξρέο ηνπ 2007 ζηε δηεζλή βηβιηνγξαθία ππήξραλ ιίγα ζηνηρεία γηα ηελ επαηεθηνκή ζε κχεο θαη αθφκα ιηγφηεξα γηα ηελ εγρεηξεηηθή ηερληθή, ζε αληίζεζε κε ηνπο επίκπεο. Δηθόλα 6.2: Πξνηεηλόκελε (πεξηνξηζκέλε) ηνκή γηα δηελέξγεηα PHx (Doerr RJ 1990) ηηο ζρεηηθέο αλαθνξέο (Doerr RJ 1990) πξνηεηλφηαλ κηθξή ππνμηθνεηδηθή κέζε ηνκή (εηθφλα 1), δηαηνκή ηνπ δξεπαλνεηδνχο ζπλδέζκνπ, εθζπιάρλσζε ηνπ ήπαηνο δηα ηεο ηνκήο θαηφπηλ ζπκπίεζεο ηνπ ζσξαθηθνχ ηνηρψκαηνο, απνιίλσζε ησλ δχν ινβψλ (ζρήκα 2) θαη ζπξξαθή ηνπ ηξαχκαηνο. Με ηε κέζνδν απηή μεθίλεζαλ νη επεκβάζεηο θαη δηαπηζηψζεθε κεηεγρεηξεηηθή επηβίσζε ησλ πεηξακαηφδσσλ πεξίπνπ 65% - ζηα πιαίζηα ηεο βηβιηνγξαθίαο (Doerr et al). Πάλησο ζλεηφηεηα ηεο 69

94 ηάμεο ηνπ 35% ζεσξήζεθε πνιχ πςειή. Δηθόλα 6.3: Δθζπιάρλσζε ηνπ ήπαηνο δηα κηθξήο ηνκήο, κε ζπκπίεζε ηνπ ζσξαθνθνηιηαθνύ ρώξνπ (Doerr RJ 1990) Μηθξφηεξε ζλεηφηεηα (17%) αλέθεξαλ κειέηεο πνπ ρξεζηκνπνηνχζαλ κηθξνρεηξνπξγηθέο κεζφδνπο θαη ρεηξνπξγηθφ κηθξνζθφπην (ή ινχπεο). Γνθηκάζηεθε θαη απηή ε κέζνδνο, αιιά εγθαηαιείθζεθε δηφηη νδεγνχζε ζε απαγνξεπηηθά κεγάιν ρεηξνπξγηθφ ρξφλν. Όηαλ αλαδεηήζεθαλ ηα αίηηα ηεο πςειήο ζλεηφηεηαο, εληνπίζηεθαλ θάπνηα αδχλακα ζεκεία ζηε κέζνδν, ηα νπνία θαη ηξνπνπνηήζεθαλ: Σξφπνο αλαηζζεζίαο θαη αλαηζζεηηθφο παξάγνληαο Μηθξή απνθάιπςε ηνπ εγρεηξεηηθνχ πεδίνπ ιφγσ κηθξήο ηνκήο Βιαπηηθή επίδξαζε απφ κε αλαγθαίεο ηάζεηο πάλσ ζηα αλαηνκηθά ζηνηρεία ιφγσ εθζπιάρλσζεο ήπαηνο θαη ex situ επαηεθηνκήο Καθή νξαηφηεηα θαη αδπλακία ειέγρνπ ηεο εγγχηεηαο ηεο ηνπνζεηνχκελεο απνιίλσζεο ζηελ ΚΚΦ θίλδπλνο ζηξαγγαιηζκνχ ηεο ελδνεπαηηθήο ΚΚΦ απφ ηελ απνιίλσζε ηνπ κέζνπ ινβνχ Πηζαλή πξφθιεζε πλεπκνληθήο βιάβεο ιφγσ ηεο ζσξαθηθήο ζπκπίεζεο Υεηξνπξγηθφο ρξφλνο (αχμεζε αθπδάησζεο, αχμεζε ρνξεγνχκελνπ αλαηζζεηηθνχ θαη άξα αχμεζε ηνπ ζπλνιηθνχ stress) Χο απάληεζε ζηα παξαπάλσ, σο ην ηέινο ηνπ 2007 ηππνπνηήζεθε κία ηξνπνπνηεκέλε δηαδηθαζία in situ επαηεθηνκήο πνπ εμαζθάιηζε πνιχ κεγαιχηεξε επηβίσζε ησλ πεηξακαηφδσσλ, φπσο θαίλεηαη ζηελ παξάγξαθν

95 6.1.4 Σξνπνπνηεκέλε ρεηξνπξγηθή ηερληθή Απαηηνύκελα Τιηθά Υεκηθά θαη αλαιψζηκα: o Ιζνθινπξάλην IsoFlo (isoflurane, USP) o Αηζαλφιε 70% o Βetadine βάκκα 10% o Φπζηνινγηθφο νξφο 0,9% NaCl o Απνζηεηξσκέλεο γάδεο o Βακβαθνθφξνη ζηεηιενί o Τπφζηξσκα αθξψδνπο πιαζηηθνχ (ηχπνπ felizol) o Υαξηνηαηλία o Υεηξνπξγηθφ πεδίν κίαο ρξήζεο o Απνιηλψζεηο silk 4.0 o Ράκκα silk ή dexon 4.0 Τιηθφο εμνπιηζκφο: o πζθεπή ρνξήγεζεο εηζπλεφκελεο αλαηζζεζίαο o Βεινλνθάηνρν (κηθξνχ κεγέζνπο) o Αλαηνκηθή ιαβίδα (ιεπηή) x2 o Φαιίδη θπξηφ παξαζθεπήο ηζηψλ (κηθξνχ κεγέζνπο) o Απηνζρέδηα ζπξκάηηλα άγθηζηξα Δγρεηξεηηθή κέζνδνο 1. χιιεςε ηνπ δψνπ θαη εθαξκνγή ηεο κάζθαο ρνξήγεζεο αλαηζζεζίαο 2. Μεηά ηελ αλαηζζεηνπνίεζή ηνπ, ην δψν κεηαθέξεηαη ζην ππφζηξσκα αθξψδνπο πιαζηηθνχ, φπνπ κε ηε βνήζεηα ηεο ηαηλίαο ζηεξεψλεηαη ζε χπηηα, ζπκκεηξηθή ζέζε αιιά ρσξίο ηάζε ζηα άθξα. ηεξέσζε θαη ηεο κάζθαο παξνρήο αλαηζζεζίαο. 71

96 3. Σνκή επί ηνπ δέξκαηνο θαηά ηε κέζε γξακκή, απφ ηνλ ζψξαθα σο ην ππνγάζηξην 4. Σνκή κέζεο γξακκήο, ζηε ιεπθή γξακκή, εθηεηλφκελε απφ ην δηάθξαγκα σο πξηλ απφ ηελ νπξνδφρν θχζηε ηνπ δψνπ. 5. Σνπνζέηεζε ησλ αγγίζηξσλ κε ηάζε ζηα έμσ θαη θεθαιηθά ζην πιάγην θνηιηαθφ ηνίρσκα θαη ην θάησ πέξαο ηνπ ζψξαθα. Σα άγγηζηξα κεηά ηνλ θαζνξηζκφ ηεο επηζπκεηήο ζέζεο ζηεξεψλνληαη εληφο ηνπ αθξψδνπο πιαζηηθνχ. 6. Γηαηνκή ηνπ δξεπαλνεηδνχο ζπλδέζκνπ έσο 2-3mm απφ ηελ ΚΚΦ, κε θπξηφ ςαιίδη, κεηά απφ θαηάζπαζε ηνπ ΜΛ κε βακβαθνθφξν ζηεηιεφ πνπ έρεη πγξαλζεί ζε θπζηνινγηθφ νξφ. 7. Αλάζπαζε ηνπ ΜΛ πξνο ην δηάθξαγκα. Απνθαιχπηεηαη έηζη ν ΑΛ. Με αλάζπαζε θαη ηνπ ΑΛ αλαδεηθλχεηαη έλαο ιεπηφο ζχλδεζκνο κεηαμχ ηνπ ΑΛ θαη ηνπ ΣΛ. Γηαηνκή ηνπ ζπλδέζκνπ απηνχ κε θπξηφ ςαιίδη ηζηψλ. 8. Σνπνζέηεζε απνιίλσζεο πέξημ ηνπ αγγεην-ρνιεθφξνπ δεκαηίνπ ηνπ ΑΛ (φζν ν ΑΛ είλαη ζε αλάζπαζε, ηνπνζέηεζε ηεο απνιίλσζεο απφ θάησ, αθνινπζεί θαηάζπαζε θαη πέξαζκα ηεο απνιίλσζεο θαη χπεξζελ ηνπ δεκαηίνπ). 9. Γεκηνπξγία ηνπ θφκπνπ πιεζίνλ ηεο ΚΚΦ (δελ ππάξρεη θφβνο ζηξαγγαιηζκνχ απηήο ζην επίπεδν απηφ) γηα παξακνλή ειάρηζηνπ ππνιεηπφκελνπ ηζηνχ. Ο θφκπνο δέλεηαη κε ηε βνήζεηα ηεο αλαηνκηθήο ιαβίδαο θαη ηνπ βεινλνθαηφρνπ κε πξνζνρή γηα απνθπγή δεκηνπξγίαο ηάζεο θαη ξήμεο (ζαλαηεθφξαο) ηεο ΚΚΦ. Γηαηνκή ηνπ ινβνχ άκεζα πεξηθεξηθά ηεο απνιίλσζεο κε ην ςαιίδη ηζηψλ. 10. Σνπνζέηεζε ηνπ θφκπνπ ηνπ ΜΛ. Καζψο ν ινβφο βξίζθεηαη ζε αλάζπαζε, ηνπνζέηεζε απνιίλσζεο ππφ απηνχ, θαηάζπαζε ηνπ ινβνχ θαη πέξαζκα ηεο απνιίλσζεο χπεξζελ απηνχ. 11. Γέζηκν ηνπ θφκπνπ. Πξνζνρή, θαζψο ζην ζεκείν απηφ ε ΚΚΦ είλαη ελδνεπαηηθή θαη ππάξρεη θίλδπλνο ζηξαγγαιηζκνχ. Η ζηέλσζε απηή ηεο ΚΚΦ κπνξεί λα έρεη σο απνηέιεζκα ηνλ άκεζν ζάλαην ηνπ δψνπ ή ηελ παξεκπφδηζε ηεο αλαγέλλεζεο θαη θαζπζηεξεκέλν ζάλαηφ ηνπ. Ο θφκπνο απηφο λα δέλεηαη ζε απφζηαζε 2-3mm απφ ηελ ΚΚΦ. Σν θνιφβσκα πνπ παξακέλεη δελ κεηψλεη ην πνζνζηφ ηεο επαηεθηνκήο δηφηη ε αγγείσζή ηνπ δηαηαξάζζεηαη θαη δελ 72

97 είλαη βηψζηκν, άξα δελ ζπκκεηέρεη ζηελ επαηηθή αλαγέλλεζε. Γηαηνκή κε ην ςαιίδη ηζηψλ θαη απνκάθξπλζε ηνπ ινβνχ πεξηθεξηθά ηεο απνιίλσζεο. 12. Έιεγρνο ηεο αηκφζηαζεο ζηα δχν θνινβψκαηα ησλ ινβψλ. 13. Σνπνζέηεζε 5ml θπζηνινγηθνχ νξνχ ελδνπεξηηνλατθά γηα κεηεγρεηξεηηθή ελπδάησζε ηνπ δψνπ. 14. χγθιεηζε ηεο ρεηξνπξγηθήο ηνκήο ζε δχν ζηξψκαηα (κπτθφ θαη δέξκα) κε ξάκκα silk ή dexon Άξζε αλαηζζεζίαο θαη ηνπνζέηεζε ηνπ δψνπ ζε ζεξκαηλφκελν θισβφ γηα ηηο πξψηεο κεηεγρεηξεηηθέο ψξεο. Γηα ηελ νινθιήξσζε απηήο ηεο επέκβαζεο απφ έλαλ έκπεηξν ρεηξνπξγφ απαηηνχληαη min θαζαξνχ ρεηξνπξγηθνχ ρξφλνπ γηα θάζε πεηξακαηφδσν, ελψ ζπκπεξηιακβάλνληαο ηνλ ρξφλν εηζαγσγήο ζηελ αλαηζζεζία, απαηηνχληαη min γηα θάζε πεηξακαηφδσν. Γηα χπαξμε control, ρξεζηκνπνηήζεθε ε sham επέκβαζε πνπ πεξηειάκβαλε ιαπαξνηνκία ίδηαο έθηαζεο κε ηελ PHx, θηλεηνπνίεζε ησλ ελ ιφγσ ινβψλ ηνπ ήπαηνο (ΜΛ θαη ΑΛ), κεηά δηαηνκήο ησλ ζπλδέζκσλ (ηνπ δξεπαλνεηδή ζηνλ κέζν ινβφ θαη ηνπ ζπλδέζκνπ ηνπ αξηζηεξνχ ινβνχ) θαη ζπξξαθή ηνπ θνηιηαθνχ ηνηρψκαηνο ζε δχν ζηξψκαηα. Οη sham επεκβάζεηο είλαη αλαγθαίεο δηφηη ε ρνξήγεζε αλαηζζεζίαο, ην ρεηξνπξγηθφ stress θαη νη ρεηξηζκνί επί ηνπ ήπαηνο κπνξεί λα πξνθαιέζνπλ θάπνηα κηθξή αλαγελλεηηθή αληίδξαζε (Moolten, Oakman et al. 1970). Η κέζνδνο ηππνπνηήζεθε ζε φιεο ηηο παξακέηξνπο ηεο, γηα άξηζηε επαλαιεςηκφηεηα θαη ζπγθξηζηκφηεηα ησλ απνηειεζκάησλ. Όπσο αλαθέξεηαη σο απαηηνχκελν ζηελ βηβιηνγξαθία (Palmes and Spiegel 2004), ηππνπνηήζεθαλ: νη πξνεγρεηξεηηθέο δηαδηθαζίεο (ζηαζεξέο ζπλζήθεο ζηέγαζεο θαη δηαηξνθήο ηνπ πεηξακαηνδψνπ) αλαηζζεζηνινγηθή ηερληθή ρεηξνπξγηθή κέζνδνο ψξα (θηξθάδηνο ξπζκφο) θαη ρξνληθή δηάξθεηα ηεο επέκβαζεο 73

98 κεηεγρεηξεηηθή θξνληίδα (ζε ζηαζεξά ζεξκαηλφκελεο ζπλζήθεο, δηαζεζηκφηεηα λεξνχ θαη ηξνθήο) Αλάινγε ηππνπνίεζε θαη ησλ sham επεκβάζεσλ Μεηέπεηηα, ην 2008, δεκνζηεχηεθε πξσηφθνιιν κε θάπνηεο αληίζηνηρεο παξαηεξήζεηο θαη ηξνπνπνηήζεηο ηεο παξαδνζηαθήο κεζφδνπ, φπνπ αλαθέξεηαη σο κεδεληθή ε ζλεηφηεηα κεηά 2/3 PHx κε ηε κέζνδν πνπ αθνινπζήζεθε (Mitchell and Willenbring 2008). εκαληηθά θνηλά ζεκεία ηεο κεζφδνπ απηήο θαη ηεο κεζφδνπ πνπ αθνινπζήζακε εκείο είλαη: i. Η πξαγκαηνπνίεζε ηεο επαηεθηνκήο in situ ii. Η ζέζπηζε νξίνπ αζθαιείαο απφ ηελ ΚΚΦ θαηά ηελ ηνπνζέηεζε ηεο απνιίλσζεο ηνπ ΜΛ. iii. Πξνηείλεηαη ε ρνξήγεζε πηεηηθνχ αλαηζζεηηθνχ 74

99 6.2 Υξνληθή αιιεινπρία ηεο πνξείαο ηεο αλαγέλλεζεο κε έιεγρν ηνπ Ki-67 θαη ηεο ζπζζώξεπζεο ιίπνπο Γηα ην πείξακα απηφ, ρξεζηκνπνηήζεθαλ 56 κχεο άγξηνπ ηχπνπ, φπσο απηνί πεξηγξάθνληαη ζηελ παξάγξαθν Πεηξακαηφδσα. Σελ ψξα 0 ηα κηζά (28) πεηξακαηφδσα ππνβιήζεθαλ ζε 2/3 κεξηθή επαηεθηνκή θαη ηα ππφινηπα 28 ζε επέκβαζε sham, φπσο απηέο πεξηγξάθνληαη ζηελ παξάγξαθν Δπηιέρζεθε λα ειεγρζνχλ νη παξαθάησ ρξφλνη αλαγέλλεζεο: 1 ψξα, 3, 6, 12, 24, 36, 48. Αθνινχζσο, ζε θάζε έλα απφ ηα πξναλαθεξφκελα ρξνληθά ζεκεία ζαλαηψλνληαλ 4 κχεο απφ ηελ νκάδα PHx θαη 4 απφ ηε sham θαη ιακβαλφηαλ ην ήπαξ ηνπο πξνο πεξαηηέξσ εμέηαζε. Η αλαγελλεηηθή δηαδηθαζία ζην ήπαξ, κπνξεί λα παξαηεξεζεί θαη λα αμηνινγεζεί κε βάζε ηνλ αξηζκφ ησλ θπηηάξσλ πνπ βξίζθνληαη ζε δηαδηθαζία κίησζεο, ή πξνεηνηκαζίαο γηα κίησζε. Γηα ην ιφγν απηφ επηιέρζεθε λα γίλεη αλίρλεπζε ηεο πξσηεΐλεο Ki-67. Η πξσηεΐλε Ki-67 είλαη κία πξσηεΐλε ηνπ ππξήλα ησλ θπηηάξσλ πνπ ζρεηίδεηαη απζηεξά κε ηνλ θπηηαξηθφ πνιιαπιαζηαζκφ. Δίλαη παξνχζα ζε φιεο ηηο ελεξγέο θάζεηο ηνπ θπηηαξηθνχ θχθινπ (G 1, S, G 2 θαη ζηε κίησζε), αιιά απνπζηάδεη ζηα θχηηαξα ζε θάζε εξεκίαο (G 0 ). Απηή ε ηδηφηεηά ηεο ηελ θάλεη εμαηξεηηθφ δείθηε ηνπ θπηηαξηθνχ πνιιαπιαζηαζκνχ. Η ζπζζψξεπζε ιίπνπο εληφο ηνπ επαηνθπηηάξνπ, θαηλφκελν αλαγθαίν γηα ηελ επαηηθή αλαγέλλεζε, εθηηκήζεθε κε εκηπνζνηηθή κέζνδν (έλαλ έσο ηξεηο ζηαπξνχο: +, ++, +++) κεηά απφ ηζηνινγηθή ρξψζε ξνπηίλαο Αηκαηνμπιίλεο Ησζίλεο. Γηα λα αληρλεχζνπκε ηελ έθθξαζε ηνπ Ki-67 ζηα επαηνθχηηαξα, ρξεζηκνπνηήζακε ηελ αλνζντζηνρεκηθή ηερληθή ζηξεπηαβηδίλεο βηνηίλεο πεξνμεηδάζεο (Biogenex, San Ramon, CA, USA). 75

100 6.2.1 Τιηθά αλνζντζηνρεκηθήο ηερληθήο γηα ηελ έθθξαζε ηνπ δείθηε Ki-67 ζηα επαηνθύηηαξα 1. Μνληκνπνηεηηθφ πιηθφ: 10% νπδέηεξε θνξκφιε. 2. Μηθξνζθνπηθά πιαθίδηα (Polylysine, microscopic slides, US Pat , , Menzel-Glaser, Germany). 3. Απεζηαγκέλν λεξφ. 4. Καιππηξίδεο, (Knittel Glaser, Germany). 5. Ξπιφιε. 6. Αηζαλφιε. 7. Ρπζκηζηηθφ δηάιπκα Tris. 8. Τπεξνμείδην ηνπ πδξνγφλνπ 30%. 9. Κηηξηθφ λάηξην. 10. Βφεηνο αιβνπκίλε, θιάζκα V, ζε ιπνθηινπνηεκέλε κνξθή θαη ειεχζεξε απφ ιηπαξά νμέα (13257, Serva, Germany). 11. Αληίζσκα anti-ki67 (SantaCruz, USA) 12. Super sensitive Ready-to-Use Detection kit, (Catalog No QP900-CL, Biogenex, San Ramon, CA, USA). 13. Υξσκνγφλν: Σακπιέηεο DAB (Sigma Fast DAB D-4293, St Louis, MO, USA). 14. Αηκαηνμπιίλε Harris, δηάιπκα Papanikolaou 1a, ( , Merck). 15. Τιηθφ επηθάιπςεο ησλ ηνκψλ: Entellan, neu, rapid mounting media for microscopy, ( , Merck). 76

101 6.2.2 Πξνεηνηκαζία ησλ δηαιπκάησλ 1. Γηάιπκα θηηξηθνχ λαηξίνπ (ph6): 500 ml απεζηαγκέλν λεξφ θαη 1.05 γξ θηηξηθφ λάηξην. 2. Ρπζκηζηηθφ δηάιπκα Tris (ph: 7.6): 6.1g Tris ζε 1000 ml απεζηαγκέλν λεξφ θαη 37 ml 1N HCl. 3. Ρπζκηζηηθφ δηάιπκα TBS: 1800 ml NaCl θαη 200 ml Tris. 4. Γηάιπκα γηα ηελ θαηαλάισζε ηεο ελδνγελνχο πεξνμεηδάζεο: 98 ml κεζαλφιε θαη 2 ml H 2 O Γηαιχκαηα αξαίσζεο (γηα ηα πξσηνγελή αληηζψκαηα θαη ηνπο άιινπο παξάγνληεο) θαη blocking serum: 30 ml TBS θαη 0.3 γξ αιβνπκίλε. 6. Αληίζσκα anti-ki-67 αξαίσζε 1:50, ζε δηάιπκα TBS/BSA 7. Η πξνεηνηκαζία ηνπ ρξσκνγφλνπ έγηλε ζχκθσλα κε ηηο νδεγίεο ηνπ θαηαζθεπαζηή Πξσηόθνιιν αλνζντζηνρεκηθήο κεζόδνπ γηα ην αληηγόλν Ki Μνληκνπνίεζε ηνπ ηζηνχ ζε δηάιπκα 10% νπδέηεξεο θνξκαιίλεο γηα 16 ψξεο. 2. Δκπέδσζε ηνπ ηζηνχ ζε παξαθίλε. 3. Λήςε ηνκψλ απφ ην κηθξνηφκν, πάρνπο 4 κm θαη ηνπνζέηεζε απηψλ ζε πδαηφινπηξν ην νπνίν δελ πεξηέρεη πξσηεΐλε. 4. Σνπνζέηεζε ησλ ηνκψλ ζηα πιαθίδηα πνπ είλαη επηζηξσκέλα κε πνιπιπζίλε. 5. Απνπαξαθίλσζε ησλ ηνκψλ ζε θιίβαλν (16 ψξεο ζηνπο 37 C). 6. Απνπαξαθίλσζε ησλ ηνκψλ κε εκβάπηηζε ζε μπιφιε γηα 20 ιεπηά. 7. Δλπδάησζε ησλ ηνκψλ ζε θαηηνχζα αιθννιψλ. a. 100% αηζαλφιε γηα 2 ιεπηά b. 100% αηζαλφιε γηα 2 ιεπηά c. 96% αηζαλφιε γηα 1 ιεπηφ d. 80% αηζαλφιε γηα 1 ιεπηφ e. 70% αηζαλφιε γηα 1 ιεπηφ 8. Έθπιπζε ησλ ηνκψλ κε απεζηαγκέλν λεξφ γηα 5 ιεπηά. 9. Απνθάιπςε αληηγφλσλ: Οη ηνκέο ηνπνζεηνχληαη ζε δηάιπκα θηηξηθνχ 77

102 νμέσο θαη ζηε ζπλέρεηα επσάδνληαη ζε θνχξλν κηθξνθπκάησλ ζηα 750 W, ηξεηο θνξέο, 5 ιεπηά ηε θνξά. Κάζε 5 ιεπηά ειέγρεηαη ην επίπεδν ηνπ δηαιχκαηνο θαη πξνζηίζεηαη δηάιπκα αλ απηφ είλαη αλαγθαίν. 10. Έθπιπζε ησλ ηνκψλ κε απεζηαγκέλν λεξφ γηα 5 ιεπηά. 11. Δπψαζε ησλ ηνκψλ κε ην δηάιπκα H O γηα ηελ θαηαλάισζε ηεο ελδνγελνχο 2 2 ππεξνμεηδάζεο, γηα 20 ιεπηά. 12. Έθπιπζε ησλ ηνκψλ κε απεζηαγκέλν λεξφ γηα 5 ιεπηά. 13. θνππίδεηαη ην δηάιπκα κε πξνζνρή γχξσ απφ ηνλ ηζηφ. 14. Πξνζηίζεηαη ην blocking serum επάλσ ζε θάζε ηνκή θαη νη ηνκέο επσάδνληαη ζε πγξφ πεξηβάιινλ γηα 20 ιεπηά. 15. ηε ζπλέρεηα αθαηξείηαη κε κεγάιε πξνζνρή ην blocking serum γχξσ απφ θάζε ηνκή θαη ρσξίο λα μεπιπζνχλ νη ηνκέο, ηνπνζεηείηαη ην δηάιπκα ηνπ πξσηνγελνχο αληηζψκαηνο. Οη ηνκέο επσάδνληαη ζηνπο 37 o C γηα 1 ψξα. 16. Έθπιπζε ησλ ηνκψλ επί 5 ιεπηά κε δηάιπκα TBS επί 3 θνξέο. 17. ηε ζπλέρεηα ζθνππίδεηαη κε πξνζνρή ην δηάιπκα γχξσ απφ θάζε ηνκή, πξνζέρνληαο λα κελ θαηαζηξαθεί ε ηνκή θαη ηνπνζεηείηαη ην δηάιπκα ηνπ βηνηπληιησκέλνπ αληηζψκαηνο (biotynilated anti- immunoglobulins- Super sensitive Ready-to-Use Detection kit). Οη ηνκέο επσάδνληαη γηα 20 ιεπηά ζε ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ. 18. Έθπιπζε ησλ ηνκψλ επί 5 ιεπηά κε δηάιπκα TBS επί 3 θνξέο. 19. ηε ζπλέρεηα ζθνππίδεηαη κε πξνζνρή ην δηάιπκα γχξσ απφ θάζε ηνκή, πξνζέρνληαο λα κελ θαηαζηξαθεί ε ηνκή θαη ηνπνζεηείηαη ην δηάιπκα ζηξεπηαβηδίλεο (enzyme-conjugated streptavidin- Super sensitive Ready-to-Use Detection kit). Οη ηνκέο επσάδνληαη γηα 20 ιεπηά ζε ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ. 20. Έθπιπζε ησλ ηνκψλ επί 5 ιεπηά κε δηάιπκα TBS επί 3 θνξέο. 21. Σνπνζέηεζε ησλ ηνκψλ ζην δηάιπκα ρξσκνγφλνπ (DAB). 22. Η εκθάληζε ηνπ ρξψκαηνο παξαηεξείηαη κε θσηνληθφ κηθξνζθφπην. ε θακία πεξίπησζε δελ επσάδνληαη νη ηνκέο γηα πεξηζζφηεξν απφ 7 ιεπηά. 23. Έθπιπζε κε λεξφ βξχζεο γηα 1 ιεπηφ. 24. Έθπιπζε κε απεζηαγκέλν λεξφ γηα 5 ιεπηά. 25. Υξψζε κε αηκαηνμπιίλε Harris γηα 2 ιεπηά. 26. Έθπιπζε κε λεξφ βξχζεο. 78

103 27. Αθπδάησζε ησλ ηνκψλ ζε αληνχζα αιθννιψλ: 70% 1 ιεπηφ, 80% 1 ιεπηφ, 96% 1 ιεπηφ, 100% 1 ιεπηφ, 100% 1 ιεπηφ. 28. Δκβάπηηζε ησλ ηνκψλ ζε μπιφιε 2 θνξέο απφ 1 ιεπηφ. 29. Δπηθφιιεζε ησλ θαιππηξίδσλ κε Entellan. Χο αξλεηηθνί κάξηπξεο ρξεζηκνπνηήζεθαλ νη ίδηεο ηνκέο θαη ε ίδηα κέζνδνο ζηξεπηαβηδίλεο - βηνηίλεο ππεξνμεηδάζεο αιιά ην πξσηνγελέο αληίζσκα αληηθαηαζηάζεθε απφ δηάιπκα 1% BSA in ΣBS. Η ππξεληθή ρξψζε γηα ην Ki67 ζεσξήζεθε ζεηηθή Μνξθνκεηξηθή αλάιπζε Η εθηίκεζε ησλ θπηηάξσλ πνπ παξνπζίαζαλ ζεηηθή αλνζντζηνρεκηθή ρξψζε ζην αληηγφλν Ki-67, βαζίζηεθε ζε θαιψο εθαξκνζκέλε κέζνδν (Salakou, Tsamandas et al. 2001). Όιεο νη ηνκέο εθηηκήζεθαλ ζε θσηνληθφ κηθξνζθφπην ζε κηθξή κεγέζπλζε θαη επηιέρζεθαλ νη πεξηνρέο ζε θάζε ηνκή πνπ εκθάληζαλ ζεηηθή ρξψζε γηα ην αληηγφλν. Η κέζνδνο ππνινγηζκνχ έγηλε σο εμήο: 1. ε θάζε ηνκή εθαξκφζζεθε έλα κηθξνζθνπηθφ πιέγκα 10x10 (121 ζεκεία). 2. Αθνινχζσο θαη ζε κεγέζπλζε x400 κεηξήζεθαλ ηα θχηηαξα πνπ έδσζαλ ζεηηθή αλνζνρξψζε (γηα ην αληίζσκα πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε) αιιά θαη ν ζπλνιηθφο αξηζκφο ησλ ζπγθεθξηκέλσλ θπηηάξσλ πνπ πεξηέρνληαη ζην πιέγκα (ηνπιάρηζηνλ 500 θχηηαξα). ηε ζπλέρεηα ν αξηζκφο ησλ ζεηηθψλ θπηηάξσλ δηαηξέζεθε κε ην ζπλνιηθφ αξηζκφ ησλ θπηηάξσλ θαη θαηεγξάθε έλα πνζνζηφ. Η εθηίκεζε απηή εθαξκφζζεθε ζε 15 δηαθνξεηηθά ΜΟΠ γηα θάζε ηνκή. Οη ηηκέο δελ δηέθεξαλ κεηαμχ ηνπο πεξηζζφηεξν απφ 10%. 79

104 6.3 Έιεγρνο ηεο κεηαβνιήο ηεο έθθξαζεο ησλ mi-rnas ηελ 12 ε ώξα κεηά κεξηθή επαηεθηνκή Με γλψκνλα ηελ αλάγθε παξαηήξεζεο ησλ mirnas ζε κία ζρεηηθά αξρηθή θάζε, ψζηε λα δνζεί έκθαζε ζηνλ ηπρφλ ξπζκηζηηθφ ηνπο ξφιν ζηελ έλαξμε ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο, επηιέρζεθε ε 12 ε κεηεγρεηξεηηθή ψξα γηα έιεγρν ησλ mirnas. Ο ρξφλνο απηφο απνηειεί έλαλ ζπκβηβαζκφ κεηαμχ: i) ησλ πνιχ αξρηθψλ ζηαδίσλ ηεο αλαγέλλεζεο (κία ψξα έσο 6 ψξεο), φπνπ ππήξρε ην ξίζθν λα κελ έρεη ελεξγνπνηεζεί αθφκε ν κεραληζκφο έθθαζεο ησλ mirnas θαη ii) ηνπ γλσζηνχ ζεκείνπ κέγηζηεο αλαγελλεηηθήο δηαδηθαζίαο ησλ 36 σξψλ Πεηξακαηόδσα θαη εγρεηξεηηθή δηαδηθαζία Υξεζηκνπνηήζεθαλ 20 αξζεληθνί κχεο φπσο απηνί πεξηγξάθνληαη ζηελ παξάγξαθν Σα 10 εθ ησλ πεηξακαηνδψσλ ππνβιήζεθαλ ζε 2/3 κεξηθή επαηεθηνκή (νκάδα L12), κε ην πξσηφθνιιν πνπ πεξηγξάθεηαη ζηελ παξάγξαθν πλνπηηθά, έγηλε αθαίξεζε ηνπ κέζνπ θαη ηνπ αξηζηεξνχ ινβνχ ηνπ ήπαηνο ησλ δψσλ, πνπ αληηζηνηρνχλ ζε 66% ηεο επαηηθήο κάδαο. Σα ππφινηπα ππνβιήζεθαλ ζε sham επέκβαζε (βι. παξάγξαθνο 6.1.4) (νκάδα L0). Ο ηξφπνο αλαηζζεζίαο ήηαλ φπσο Μεηεγρεηξεηηθά, φια ηα δψα αθέζεθαλ λα αλαλήςνπλ (ζε ζπλζήθεο πνπ αλαθέξνληαη ζην 6.1.2) γηα 12 ψξεο. Μεηά ηελ πάξνδν απηνχ ηνπ ρξνληθνχ δηαζηήκαηνο ηα δψα ζπζηάζηεθαλ. Λήθζεθαλ δείγκαηα ήπαηνο θαη απφ ηηο δχν νκάδεο, ηα sham ρεηξνπξγεκέλα (L0) θαη απηά πνπ είραλ ππνβιεζεί ζε 2/3 κεξηθή επαηεθηνκή (L12). Καηά ηε 12 ε ψξα φια ηα πεηξακαηφδσα ήηαλ δσληαλά θαη κε πνιχ θαιφ επίπεδν δξαζηεξηφηεηαο, γεγνλφο πνπ θαλέξσλε νκαιή κεηεγρεηξεηηθή πνξεία θαη άξα απξφζθνπηε πξφνδν ησλ δηεξγαζηψλ ηεο επαηηθήο αλαγέλλεζεο. Οπφηε φια ηα δψα ζπκπεξηειήθζεζαλ ζηελ κειέηε. 80

105 6.3.2 Δμαγσγή ηνπ RNA ηνπ επαηηθνύ ηζηνύ Ο επαηηθφο ηζηφο ακέζσο κεηά ηελ ιήςε ηνπ εκβαπηηδφηαλ ζε δηάιπκα RNAlater (Ambion, Foster City, CA), ελφο πδαηηθνχ δηαιχκαηνο κνληκνπνίεζεο θαη δηαθχιαμεο ηνπ RNA λσπψλ ηζηψλ, πνπ δελ απαηηεί άκεζε ςχμε ηνπ ηζηνχ. Γηα ηε δηελέξγεηα ηνπ mirna profiling ρξεζηκνπνηήζεθε νιηθφ RNA ην νπνίν πξνέθπςε απφ ηελ αλάκεημε ησλ επηκέξνπο δεηγκάησλ RNAησλ πεηξακαηνδψσλ ηεο εθάζηνηε νκάδαο (L0 θαη L12 κχεο). Αληίζεηα, γηα ηελ δηαδηθαζία qpcr ρξεζηκνπνηήζεθε νιηθφ RNA μερσξηζηά απφ θάζε πεηξακαηφδσν ηεο νκάδαο. Γηα ηελ εμαγσγή ηνπ νιηθνχ RNA απφ ηνλ επαηηθφ ηζηφ ρξεζηκνπνηήζεθε ην αληηδξαζηήξην TRIzol (Invitrogen, Carlsbad CA). Σν TRIzol είλαη έλα αληηδξαζηήξην πνπ ρξεζηκνπνηείηαη γηα ηελ απνκφλσζε ηνπ RNAαπφ θχηηαξα θαη ηζηνχο. Η αθξηβήο δηαδηθαζία θαη ηα πιηθά πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ αλαθέξνληαη ζηελ παξάγξαθν Η πνηφηεηα ηνπ νιηθνχ RNA πηζηνπνηήζεθε κε ηε βνήζεηα ελφο αλαιπηή Agilent 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) Τιηθά θαη κέζνδνο ρξήζεο ηνπ αληηδξαζηεξίνπ TRIzol Τιηθά 1. Αληηδξαζηήξην TRIzol 2. Υισξνθφξκην 3. Ιζνπξνππιηθή αιθνφιε 4. 75% Αηζαλφιε 5. Ύδσξ ειεχζεξν RNάζεο Μέζνδνο 1. Οκνγελνπνίεζε Ιζηνχ Οκνγελνπνίεζε ησλ ηζηηθψλ δεηγκάησλ ζε 1ml TRIzol αλά 0,1 gr ηζηνχ κε ρξήζε glass-teflon. Ο φγθνο ηνπ ηζηνχ δελ πξέπεη λα μεπεξλάεη ην 10% ηνπ TRIzol πνπ ρξεζηκνπνηείηαη ζηελ νκνγελνπνίεζε. 81

106 2. Γηαρσξηζκφο θάζεο Δπψαζε ησλ νκνγελνπνηεκέλσλ δεηγκάησλ γηα 5 ιεπηά ζηνπο ν C ψζηε λα επηηξαπεί ν πιήξεο δηαρσξηζκφο ησλ λνπθιενπξσηετληθψλ ζπκπιφθσλ. Πξνζζήθε 0,2 ml ρισξνθνξκίνπ γηα θάζε 1 ml TRIzol Έληνλε αλαθίλεζε γηα 15 sec Δπψαζε γηα 2-3 ιεπηά ζηνπο 20 ν C Φπγνθέληξεζε ζηα x g γηα 15 ιεπηά ζηνπο 4 ν C Σν κείγκα δηαρσξίδεηαη ζε δχν θάζεηο. Η άλσ άρξσκε πδαξήο θάζε πεξηέρεη ην RNA θαη είλαη ζε φγθν ην 60% ηνπ ρξεζηκνπνηεζέληνο TRIzol 3. Καηαθξήκληζε ηνπ RNA Πξνζζήθε ηζνπξνππιηθήο αιθνφιεο ζε δφζε 0,5 ml γηα θάζε 1 ml TRIzol Δπψαζε γηα 10 ιεπηά ζηνπο 20 ν C Φπγνθέληξεζε ζηα x g ζηνπο 4 ν C γηα 10 ιεπηά Σν θαζίδεκα ηνπ RNA παξακέλεη ππφ ηε κνξθή ζθαηξηδίνπ γέιεο ζηνλ ππζκέλα ηνπ ζσιήλα 4. Έθπιπζε ηνπ RNA Έθπιπζε ηνπ ζθαηξηδίνπ RNA κε 75% αηζαλφιε ζε πνζφηεηα ηνπιάρηζηνλ 1 ml αηζαλφιεο αλά 1 ml TRIzol πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε ζηελ αξρηθή νκνγελνπνίεζε Αλάκεημε κε ζηξνβηιηζκφ Φπγνθέληξεζε ζηα x g ζηνπο 4 ν C γηα 5 ιεπηά 5. Δπαλαδηάιπζε ηνπ RNA Διαθξά μήξαλζε ηνπ ζθαηξηδίνπ RNA (μήξαλζε ζηνλ αέξα γηα 5 ιεπηά) Γηάιπζε ηνπ ζθαηξηδίνπ RNA ζε χδσξ ειεχζεξν RNάζεο Αλάκεημε κε δηαδνρηθέο αλαξξνθήζεηο ζηελ πηπέηα Δπψαζε γηα 10 ιεπηά ζηνπο 60 ν 82

107 6.3.3 Πξνθίι έθθξαζεο ησλ micrornas Σν νιηθφ RNA (1κg) απφ ηνπο L12 θαη L0 κχεο ζεκάλζεθε κε Hy3 θαη Hy5 αληηζηνίρσο, ρξεζηκνπνηψληαο ην mircury LNA Array power labeling kit (Exiqon, Vedbaek, Denmark). Σα ζεκαζκέλα κε Hy3 θαη Hy5 δείγκαηα, αλακείρζεθαλ ζε δεχγε θαη δηελεξγήζεθε πβξηδηζκφο ζε έλα mircury LNA Array version10.0 (Exiqon), ην νπνίν πεξηέρεη ζηφρνπο γηα φια ηα mirnas πνπ θαηαγξάθνληαλ ζηελ βάζε δεδνκέλσλ mirbase version 11.0 ηνπ Sanger Institute. Ο πβξηδηζκφο πξαγκαηνπνηήζεθε ζχκθσλα κε ην πξσηφθνιιν πνπ ππνδεηθλχεη ν θαηαζθεπαζηήο θαη παξνπζηάδεηαη ζηνλ πίλαθα 2. Γηα ηνλ πβξηδηζκφ ρξεζηκνπνηήζεθε έλα hybridization station Tecan HS4800 (Tecan, Grodig, Aystria). Μεηά ηνλ πβξηδηζκφ, ηα slides ηεο κηθξνζπζηνηρίαο ζαξψζεθαλ θαη θπιάρζεθαλ ζε πεξηβάιινλ ειεχζεξν φδνληνο (επίπεδα φδνληνο κηθξφηεξα ησλ 2,0 ppb γηα λα απνθεπρζεί ε θζνξά ησλ θσζθνξηδνπζψλ ρξσζηηθψλ. Η ζάξσζε ησλ mircury LNA Array microarray slides πξαγκαηνπνηήζεθε κε ρξήζε ηνπ Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies, Inc.) θαη ε αλάιπζε ησλ εηθφλσλ πξαγκαηνπνηήζεθε κε ρξήζε ηνπ ImaGene 8.0 (Biodiscovery, El Segundo, CA) Τιηθά θαη Μέζνδνο ρξήζεο ηνπ mircury LNA microrna Array Hi- Power labeling kit Τιηθά: mircury LNA microrna Array Hi-Power labeling kit: o Αιθαιηθή θσζθαηάζε εληέξνπ κφζρνπ (CIP) o CIP buffer o Hy5 Φζνξίδνπζα ρξσζηηθή o Hy3 Φζνξίδνπζα ρξσζηηθή o Hi-power έλδπκν ζήκαλζεο o DMSO o Hi-power buffer ζήκαλζεο o Ύδσξ ειεχζεξν RNάζεο o Spike-in mirna kit v2 (52 spike-in control probes) 83

108 Σν νιηθφ RNA πνπ έρνπκε ιάβεη απφ ηνπο ηζηνχο θαη πεξηέρεη ηα mrnas 0.5 ml ζσιελάξηα κηθξνθπγνθεληξεηή ειεχζεξα RNάζεο Μηθξνθπγνθεληξεηήο Ύδσξ ειεχζεξν RNάζεο Μέζνδνο 1. Απφςπμε ηνπ kit Με παξακνλή επί πάγνπ, ζε ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ γηα ιεπηά Μεηά ηελ απφςπμε αλαθαηεχνληαη κε ζηξνβηιηζκφ φια ηα πιηθά πιελ ησλ ελδχκσλ 2. Αλάκεημε ζπζηαηηθψλ επί πάγνπ ε ζσιελάξηα κηθξνθπγνθεληξεηή ειεχζεξα RNάζεο 0,5 ml Δπαξθή αλάκεημε κε δηαδνρηθέο αλαξξνθήζεηο κε ηελ πηπέηα Η αλάκεημε λα γίλεη κε ηηο παξαθάησ αλαινγίεο i. Οιηθφ RNA 3 κl ii. Spike-in mirna kit v2 1 κl iii. CIP buffer 0.5 κl iv. CIP enzyme 0.5 κl 3. Δπψαζε 30 ιεπηά ζηνπο 37 ν C Με ρξήζε PCR cycler κε ζεξκαηλφκελν ζθέπαζκα 4. Δπψαζε 5 ιεπηά ζηνπο 95 ν C Σεξκαηίδεηαη ε ελδπκηθή αληίδξαζε θαη κεηνπζηψλεηαη ην RNA κε ηελ πςειή ζεξκνθξαζία ην ηέινο ηνπ ζηαδίνπ απηνχ πξνθαιείηαη απφηνκε ςχμε κε εκβάπηηζε ζε πάγν 84

109 5. Δπψαζε 2-15 ιεπηά ζηνλ πάγν Μεηά ηελ παξακνλή ζηνλ πάγν, ζηξνβηιίδνπκε ην κείγκα 6. Γεχηεξν ζηάδην αλάκεημεο πιηθψλ ζην κείγκα Σα λέα πιηθά πξνζηίζεληαη ζηηο παξαθάησ πνζφηεηεο i. Δθ ηνπ ππάξρνληνο κείγκαηνο 5 κl ii. Hi-power buffer ζήκαλζεο 3 κl iii. Φζνξίδνπζα ρξσζηηθή (Hy5 ή H y3 ) 1.5 κl iv. DMSO 2 κl v. Hi-power έλδπκν ζήκαλζεο 3 κl 7. Αλάκεημε θαη θπγνθέληξεζε Αλάκεημε κε ζηξνβηιηζκφ ή κε δηαδνρηθέο αλαξξνθήζεηο ζε πηπέηα 8. Δπψαζε γηα 2 ψξεο ζηνπο 16 ν C Με ρξήζε PCR cycler Πξνζηαζία απφ ην θσο 9. Δπψαζε γηα 15 ιεπηά ζηνπο 65 ν C Παχζε ηεο αληίδξαζεο Αλάκεημε κε ζηξνβηιηζκφ Έηνηκν ην δείγκα γηα πβξηδηζκφ επί ηεο κηθξνζπζηνηρίαο 85

110 6.3.4 Φηιηξάξηζκα ηεο πιεξνθνξίαο ησλ κηθξνζπζηνηρηώλ (microarrays), δηόξζσζε ππνβάζξνπ θαη θαλνληθνπνίεζε Σν θηιηξάξηζκα έγηλε βάζεη ηεο ηζρχνο ηνπ ζήκαηνο. Σα ζεκεία ρσξίο ζήκα πάλσ ζην ππφβαζξν (flags 1 θαη 2) αλεπξέζεθαλ θαη εμαηξέζεθαλ. Έγηλε δηφξζσζε ηνπ ππνβάζξνπ γηα λα εμαηξεζνχλ θαη ηπρφλ κε βηνινγηθέο ζπλεηζθνξέο ζην κεηξνχκελν ζήκα. Απηφ πξαγκαηνπνηήζεθε αθαηξψληαο ηελ ηζρχ ηνπ κέζνπ γεληθνχ ζήκαηνο ππνβάζξνπ απφ ηελ ηζρχ ηνπ ζήκαηνο ηνπ ηνπηθνχ ππνβάζξνπ ηεο εθάζηνηε πεξηνρήο. Θεζπίζηεθε νπδφο ηηκήο 1,5 (L12 vs L0) θαη ηέζεθε ζαλ ηηκή cut-off. Η θαλνληθνπνίεζε πξαγκαηνπνηήζεθε κε ηε ρξήζε ηνπ αιγφξηζκνπ παιηλδξφκεζεο LOESS, ψζηε λα αθαηξεζνχλ νη ζπζηεκαηηθέο ηάζεηο απφθιηζεο ηεο πιεξνθνξίαο ησλ κηθξνζπζηνηρηψλ, φπσο νη εληαζνεμαξηψκελεο επηδξάζεηο ησλ ρξσζηηθψλ. Η ζεηηθή επίδξαζε ηεο θαλνληθνπνίεζεο απεηθνλίδεηαη ζην ζρήκα 1 κε έλα δηάγξακκα Μ-Α γηα θάζε κηθξνζπζηνηρία πξηλ θαη κεηά ηελ θαλνληθνπνίεζε. Μεηά ηελ θαλνληθνπνίεζε ηα ζεκεία ζην δηάγξακκα εκθαλίδνληαη ζπκκεηξηθά δηεζπαξκέλα γχξσ απφ ηελ νξηδφληηα γξακκή Μ=0. Σα θαλνληθνπνηεκέλα δεδνκέλα ιήθζεθαλ θαη κεηά ην πξψην ζηάδην επεμεξγαζίαο ηαμηλνκήζεθαλ ζην Microsoft Excel Έιεγρνο ηεο πνηόηεηαο ησλ slides κε ρξήζε ησλ spike-in controls Οη ηηκέο ηνπ ζπληειεζηή δηαθχκαλζεο (CV) ησλ spike-in ππνινγίζηεθαλ κεηαμχ 48 αληηγξάθσλ γηα θάζε έλα απφ ηα spike-in ζεκεία ειέγρνπ ζε θάζε slide. Οη ηηκέο ηνπ CV δελ ππεξέβαηλαλ ην 30%, κε αλαδεηθλχνληαο ηελ χπαξμε ρσξηθψλ επηδξάζεσλ επί ηνπ array (θειίδεο ζην slide) ή ιάζνο ηνπνζέηεζε ηνπ πιέγκαηνο γηα αλαγλψξηζε ησλ ζεκείσλ. 86

111 ρήκα 6.4: Παξνπζηάδεηαη ε ζεηηθή επίδξαζε ηεο νκαινπνίεζεο ζε θάζε slide, κε έλα δηάγξακκα Μ-Α γηα θάζε νκάδα (L0 θαη L12) πξηλ θαη κεηά ηελ νκαινπνίεζε. Μεηά ηελ νκαινπνίεζε ηα ζεκεία εκθαλίδνληαη κε ζπκκεηξηθή δηαζπνξά εθαηέξσζελ ηεο κέζεο γξακκήο Μ=0 Μεηά ηελ νκαινπνίεζε ε δηαθνξά κεηαμύ ησλ δύν θαλαιηώλ (Μ) είλαη αλεμάξηεηε από ην επίπεδν κέζεο έληαζεο ησλ δύν θαλαιηώλ. Σα πξάζηλα ζεκεία είλαη ζεκεία ειέγρνπ Hy3 ηνπνζεηεκέλα επί ηεο επηθάλεηαο ηνπ array. Ta πνξηνθαιί/ξoδ ζεκεία είλαη ηα ελζσκαησκέλα spike-in controls 87

112 6.3.6 Οκαδνπνίεζε Σα mirnas κεηαμχ ησλ L0 θαη L12 νκάδσλ κπψλ, νκαδνπνηήζεθαλ κε ηε ρξήζε ηεξαξρηθήο νκαδνπνίεζεο θαη νκαδνπνίεζεο κε ρξήζε ηνπ αιγνξίζκνπ k-means, φπσο έρεη δεκνζηεπηεί θαη πξνεγνχκελα (Zaravinos, Lambrou et al. 2011; Zaravinos, Lambrou et al. 2011) Καηάζεζε δεδνκέλσλ ζην Gene Expression Omnibus (GEO) Σα δεδνκέλα ησλ κηθξνζπζηνηρηψλ θαηαηέζεθαλ ζην National Center for Biotechnology Information κε αξηζκνχο έληαμεο GSM έσο GSM (GSE35128). 88

113 6.4 Παξαζθεπή cdna από νιηθό RNA θαη πνζνηηθή real time PCR Μεηά απφ ηελ αμηνιφγεζε ησλ απνηειεζκάησλ ηνπ πεηξάκαηνο screening ησλ mirnas (6.3), επηιερζεθαλ ηα αθφινπζα 8 mirnas γηα επηθχξσζε ηεο έθθξαζήο ηνπο κε qpcr: mmu-mir-21 mmu-mir-101a mmu-mir-101b mmu-mir-669f mmu-mir-207 mmu-mir-451 mmu-mir-582-3p mmu-mir-34c Η δηαδηθαζία έρεη σο εμήο: Φάζε 1: Σν mirna εληφο ηνπ νιηθνχ RNA ηνπ δείγκαηνο κεηαζρεκαηίζηεθε ζε cdna κε ηε δηαδηθαζία ηεο αληίζηξνθεο κεηαγξαθήο. Υξεζηκνπνηψληαο ην ζχζηεκα mircury LNA mirna PCR, ην θηη First-strand cdna synthesis θαη έλαλ mirna-specific primer. Υξεζηκνπνηήζεθε απηφκαηνο ξνκπνηηθφο ζηαζκφο εξγαζίαο γηα δηαζθάιηζε ηεο άξηζηεο επαλαιεςηκφηεηαο. Φάζε 2: Σν cdna εληζρχζεθε κε real time PCR κε ρξήζε SYRB Green master mix θαη LNA mirna-specific primers, ζε έλαλ PCR cycler LightCycler 1.5 (Roche Applied Science). Υξεζηκνπνηήζεθαλ 32-well carousels θαη ηξηρνεηδή φγθνπ 25κL. Μία 5απιή ζεηξηαθή δηάιπζε ησλ ζπγθεληξσκέλσλ δεηγκάησλ cdna δεκηνπξγήζεθε γηα θάζε δνθηκαζία, νχησο ψζηε λα ππνινγηζηεί ε απνηειεζκαηηθφηεηα ηεο qpcr. Όιεο νη αληηδξάζεηο εθηειέζηεθαλ εηο ηξηπινχλ. Πξηλ ε δηαδηθαζία πξνρσξήζεη ζηελ νκαινπνίεζε ησλ δεδνκέλσλ, δηελεξγήζεθε ηερληθή αμηνιφγεζεο ηεο πνηφηεηαο βαζηζκέλε ζηα απνηειέζκαηα ηεο θακπχιεο ηήμεο, ηεο θακπχιεο ζεηξηαθήο αξαίσζεο θαη ησλ controls. Η ζηαζεξφηεηα θαη ε θαηάηαμε ησλ ελδνγελψλ controls επίζεο ππνινγίζηεθε κε ηνλ αιγφξηζκν SLqPCR. 89

114 Γηα θάζε ελδνγελέο control γνλίδην ε θαηά δεχγε παξαιιαγή κε φια ηα ππφινηπα ελδνγελή controls νξίζηεθε ζαλ κέηξν ηεο γνληδηαθήο ζηαζεξφηεηαο Μ. Η ηηκή ηνπ Μ θάησ απφ 1,5 πξνηηκήζεθε θαη γνλίδηα κε ζηαζεξφηεηα έθθξαζεο πάλσ απφ 1,5 ζεσξήζεθαλ αζηαζή ζηα δείγκαηα θαη αθαηάιιεια γηα ελδνγελή έιεγρν ζε απηφ ην πείξακα. Σα mmu-mir-103 θαη mmu-mir-let-7b ζεσξήζεθαλ απνδεθηά θαη ρξεζηκνπνηήζεθαλ γηα ηελ θαλνληθνπνίεζε, ελψ αληίζεηα, ην mmu-mir-191 απνθιείζηεθε ιφγσ πνιχ πςειψλ ηηκψλ Cp γηα έλα απφ ηα αξλεηηθά controls (Vandesompele, De Preter et al. 2002) (ζρήκα 2). Η ζρεηηθή έθθξαζε ππνινγίζηεθε φπσο έρεη πξνεγνχκελα πεξηγξαθεί (Livak and Schmittgen 2001; Radojicic, Zaravinos et al. 2011), ρξεζηκνπνηψληαο ηε κέζνδν ΓΓCt σο αθνινχζσο: ρήκα 6.5: ηαζεξόηεηα ησλ ελδνγελώλ controls Γηα θάζε ελδνγελέο control γνλίδην ε θαηά δεύγνο παξαιιαγή κε όια ηα άιια ελδνγελή controls νξίδεηαη ζαλ ην κέγεζνο ηεο ζηαζεξόηεηαο ηνπ γνληδίνπ (Μ) θαη ππνινγίδεηαη κε ηνλ αιγόξηζκν SLqPCR. Η ηηκή ηνπ Μ γηα ηελ ζηαζεξόηεηα έθθξαζεο πάλσ από 1,5 ζεσξείηαη αζηαζήο ζηα δείγκαηα θαη αθαηάιιειε γηα ρξήζε ζαλ ελδνγελέο control. 90

115 6.4.1 RT θαη qpcr κε ηε ρξήζε ηνπ ζπζηήκαηνο mircury LNA Universal RT mirna PCR: Πεξηγξαθή πιηθώλ 1) χζηεκα mircury LNA Universal RT mirna PCR a) Universal cdna synthesis kit i) Buffer αληίδξαζεο ii) Μείγκα ελδχκσλ iii) Ύδσξ ειεχζεξν λνπθιεάζεο iv) RNA spike-in b) SYBR Green master mix, Universal RT i) SYBR Green master mix ii) Ύδσξ ειεχζεξν λνπθιεάζεο iii) Control Primer Set c) MicroRNA LNA PCR primer set i) LNA Forward Primer ii) LNA Reverse Primer d) Reference Gene Primer set i) PCR Primer mix 2) Λνηπά απαξαίηεηα πιηθά: a) PCR tubes θαη plates, ειεχζεξα λνπθιεάζεο b) Aerosol barrier pipette tips ειεχζεξα λνπθιεάζεο c) Tubes κηθξνθπγνθεληξεηή κε επίζηξσζε ζηιηθφλεο, ειεχζεξα λνπθιεάζεο d) Μεκβξάλεο ζθξαγίζκαηνο ησλ PCR plates e) Μηθξνθπγνθεληξεηήο θαη plate θπγνθεληξεηήο f) PCR cycler 91

116 6.4.2 RT θαη qpcr κε ηε ρξήζε ηνπ ζπζηήκαηνο mircury LNA Universal RT mirna PCR: Πξσηόθνιιν Γηαδηθαζίαο Η δηαδηθαζία ρσξίδεηαη ζε δχν κέξε: 1. Σε ζχλζεζε ηνπ cdna (βήκαηα 1-5) 2. Σελ Real-Time PCR Amplification (βήκαηα 6-11) 1) χλζεζε ηνπ cdna a) Βήκα 1 ν : Γηάιπζε ηνπ δείγκαηνο RNA ζε ζπγθέληξσζε 5ng/κL b) Βήκα 2 ν : Πξνεηνηκαζία ησλ αληηδξαζηεξίσλ (δηάιπζε, αλάδεπζε θιπ) c) Βήκα 3 ν : Δηνηκαζία ηνπ κείγκαηνο ηεο αληίδξαζεο αληίζηξνθεο κεηαγξαθήο: (i) Buffer αληίδξαζεο 4 κl (ii) Ύδσξ ειεχζεξν λνπθιεάζεο 9 κl (iii) Μείγκα ελδχκσλ 2 κl (iv) Spike-in 1 κl (v) Γείγκα νιηθνχ RNA (δηαιπκέλν) 4 κl d) Βήκα 4 ν : Καιή αλάκεημε ησλ παξαπάλσ κε ήπην ζηξνβηιηζκφ ή αλαξξνθήζεηο κε πηπέηα. e) Βήκα 5 ν : Δπψαζε θαη απελεξγνπνίεζε κε ζέξκαλζε (i) Δπψαζε γηα 60 ιεπηά ζηνπο 42 ν C (ii) Θέξκαλζε ζηνπο 95 ν C γηα 5 ιεπηά (iii) Άκεζε ςχμε ζηνπο 4 ν C 2) Real-Time PCR Amplification a) Βήκα 6 ν : Πξνεηνηκαζία ησλ αληηδξαζηεξίσλ (δηάιπζε, αλάδεπζε θιπ) b) Βήκα 7 ν : 80 x δηάιπζε ηνπ δείγκαηνο cdna 92

117 c) Βήκα 8 ν : Πξνεηνηκαζία κείγκαηνο αληίδξαζεο Real-Time PCR (i) SYBR Green Master Mix 5 κl (ii) PCR Primer mix 1 κl (iii) Γηάιπκα δείγκαηνο RNA 4 κl d) Βήκα 9 ν : Καιή αλάκεημε ησλ παξαπάλσ κε ήπην ζηξνβηιηζκφ ή αλαξξνθήζεηο κε πηπέηα, ζθξάγηζκα ησλ tubes ή plates e) Βήκα 10 ν : Real-Time PCR Amplification κε ηηο παξαθάησ ξπζκίζεηο: i) Δλεξγνπνίεζε/Μεηνπζίσζε Πνιπκεξάζεο: 10 ιεπηά 95 ν C ii) Amplification: 40 θχθινη 95 ν C, 10s 60 ν C, 1 min, ramp-rate 1.6 ν C/s, optical read iii) Melting curve Analysis: Yes f) Βήκα 11 ν : Αλάιπζε δεδνκέλσλ 93

118 6.5 Υξνληθή αιιεινπρία έθθξαζεο ηνπ mir-21 κε ηε ρξήζε ηεο κεζόδνπ RT-qPCR Γηα ηε δηελέξγεηα απηήο ηεο εμέηαζεο ρξεζηκνπνηήζεθαλ ηζηνί απφ ην πείξακα πνπ πεξηγξάθεηαη ζην 6.2. Γειαδή ρξνληθά ζεκεία 0, 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 ψξεο θαη δχν νκάδεο κπψλ (PHx θαη Sham), κε 4 πεηξακαηφδσα αλά ρξνληθφ ζεκείν, αλά νκάδα. Σα πιηθά θαη νη κέζνδνη πνπ ρξεζηκνπνηήζεθαλ είλαη παλνκνηφηππα κε απηά ηεο παξαγξάθνπ 6.4 θαη δελ ζα αλαθεξζνχλ εθ λένπ. 6.6 Υξνληθή αιιεινπρία έθθξαζεο ηνπ mir-21 κε ηε κέζνδν ηνπ in situ πβξηδηζκνύ Γηα ηε δηελέξγεηα απηήο ηεο εμέηαζεο ρξεζηκνπνηήζεθαλ ηζηνί απφ ην πείξακα πνπ πεξηγξάθεηαη ζην 6.2. Γειαδή ρξνληθά ζεκεία 0, 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 ψξεο θαη δχν νκάδεο κπψλ (PHx θαη Sham), κε 4 πεηξακαηφδσα αλά ρξνληθφ ζεκείν, αλά νκάδα. Ο in situ πβξηδηζκφο δηεμήρζε φπσο έρεη πξνεγνχκελα πεξηγξαθεί, κε ειάρηζηεο δηαθνξνπνηήζεηο (Nuovo, Elton et al. 2009). Δλ ζπληνκία, εηνηκάζηεθαλ ηνκέο παξαθίλεο πάρνπο 4 κm. Έγηλε πέςε κε πεςίλε γηα 30 ιεπηά ζε ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ. Γηα ηνλ πβξηδηζκφ ρξεζηκνπνηήζεθαλ ηρλεζέηεο (probes) λνπθιετθψλ νμέσλ ζεζεκαζκέλoi κε δηγνμηγελίλε (2 pmol/κl) (Exiqon, Woburn, MA). Η παξνπζία ηνπο αλαδείρζεθε κε antidigoxigenin-alkaline phosphatase conjugate (1:150 δηάιπζε). Ο εληνπηζκφο έγηλε κε NBT/BCIP chromogen ζηνπο 37 C. 94

119 6.6.1 Αληηδξαζηήξηα γηα ηνλ in situ πβξηδηζκό 1) Φνξκφιε, 10%, neutral-buffered (Fisher Scientific, ) 2) Diethylprocarbonate (DEPC) water (Fluka, 32490) 3) 3 -End tailing oligonucleotide kit (Enzo Diagnostics, 42730) 4) Biotin-modified dutp (Enzo Diagnostics, 42721) 5) Streptavidin alkaline phosphatase detection kit (Enzo Diagnostics, 32895), i) washes ii) alkaline phosphatase conjugate iii) NBT, BCIP chromogen iv) counterstain, v) proteinase K vi) silane-coated glass slides 6) 20 SSC (Ventana Medical Systems, ) 7) Antidigoxigenin alkaline phosphatase conjugate (Roche Diagnostics, ) 8) RNase-free DNase (Roche Diagnostics, ) 9) RNase inhibitor (Roche Diagnostics, ) 10) Βφεηνο Αιβνπκίλε (MP Biomedicals, ICN820451) 11) In situ hybridization buffer (Enzo Diagnostics, 33808) 12) Pepsin powder (Dako, S3002) 95

120 13) Digoxigenin-11-dUTP (Roche, ) 14) EZ rtth kit (Applied Biosystems, N ) 15) Proteinase K solution (Ventana Medical Systems, ) 16) Antibodies for immunohistochemistry: Digoxigenin-labeled locked nucleic acid probes (2 pmol/κl) (Exiqon, Woburn, MA) Δμνπιηζκόο γηα ηνλ in situ πβξηδηζκό 1) Μηθξνζθνπηθά πιαθίδηα κε επηθάιπςε Silane (Fisher Scientific, ) 2) Καιππηξίδεο (Fisher Scientific, M) 3) Protocol mounting media (Fisher Scientific, SP15 100) 4) Incubator (Fisher Scientific, E) 5) Hot plate (up to 100 C) (Enzo Diagnostics) 6) Μηθξνζθφπην κε ςεθηαθή θάκεξα 7) Απηνκαηνπνηεκέλε ζπζθεπή αλνζντζηνρεκείαο θαη in situ πβξηδηζκνχ 96

121 6.6.3 Γηαδηθαζία in situ πβξηδηζκνύ 1) Πξνεηνηκαζία ησλ πιαθηδίσλ κε επηθάιπςε silane ψζηε λα πεξηέρεη έθαζην πιαθίδην 2-3 ηνκέο παξαθίλεο πάρνπο 4 κm, πιηθνχ κνληκνπνηεκέλνπ ζε θνξκφιε. 2) Πέςε ζε πξσηεάζε κε ρξήζε δηαιχκαηνο πεςίλεο 1,3 mg/ml, γηα 30 ιεπηά ζε ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ (20-22 C) 3) Δπψαζε ηνπ ηζηνχ θαη ηνπ probe ζηνπο 60 C γηα 5 ιεπηά 4) Τβξηδηζκφο ηνπ ηζηνχ θαη ηνπ probe ζηνπο 37 C γηα 7-15 ψξεο 5) Έθπιπζε ησλ πιαθηδίσλ ζε 0,2x SSC θαη 2% δηάιπκα Βνείνπ Αιβνπκίλεο ζηνπο 4 C γηα 5 ιεπηά 6) Δπψαζε ζην antidigoxigenin-alkaline phosphatase conjugate (1:150 δηάιπζε) ζηνπο 37 C γηα 30 ιεπηά 7) Δπψαζε ζην NBT, BCIP chromogen ζηνπο 37 C γηα 30 ιεπηά έσο 7 ψξεο 8) Δξκελεία ησλ απνηειεζκάησλ 97

122 6.7 TargetScan, Gene Ontology (GO) θαη αλαιύζεηο εκπινπηηζκνύ Έλα mirna ζπλδέεηαη ζην 3 UTR ηνπ mrna-ζηφρνπ δηά ηεο seed πεξηνρήο ηνπ ψξηκνπ mirna, κήθνπο 2-7 λνπθιενηηδίσλ. Γηα ηα 8 mirnas κε ηελ πην δηαθνξνπνηεκέλε έθθξαζε, ρξεζηκνπνηήζεθε ε TargetScan αλάιπζε ( release 5.0), ψζηε λα αλαγλσξηζηνχλ νη πηζαλνί γνληδηαθνί ζηφρνη ησλ mirnas. ηε ζπλέρεηα ρξεζηκνπνηήζεθε ε GO αλάιπζε γηα λα ιεθζεί κία επηζθφπεζε ησλ βαζηθψλ ηνκέσλ βηνινγηθψλ δξάζεσλ ησλ γνληδίσλ πνπ πξνεγνπκέλσο είραλ αλαγλσξηζηεί σο ζηφρνη απηψλ ησλ mirnas. Η GO αλάιπζε πξαγκαηνπνηήζεθε κε ρξήζε ηνπ WebGestalt web-tool ( (Zhang, Kirov et al. 2005). Η GO αλάιπζε πξαγκαηνπνηήζεθε θαη γηα ηα γνλίδηα ζεσξνχκελα σο ζηφρνη ησλ mirnas. Καη ζε απηή ηελ αλάιπζε ρξεζηκνπνηήζεθε ην TargetScan ( release 5.0). Σν hypergeometric test κε δηφξζσζε Bonferroni ρξεζηκνπνηήζεθε γηα ηελ αλάιπζε αμηνιφγεζεο εκπινπηηζκνχ. Σν R function adjp ρξεζηκνπνηήζεθε γηα λα πξνζαξκφζεη ηελ νλνκαζηηθή ηηκή ηνπ p γηα ηνλ κεγάιν αξηζκφ θαηεγνξηψλ. Σν επίπεδν ζεκαληηθφηεηαο, γηα ηηο πξνζαξκνζκέλεο ηηκέο p, ηέζεθε ζην 0,01 θαη ν ειάρηζηνο αξηζκφο γνληδίσλ αλά θαηεγνξία ηέζεθε ζηα ηαηηζηηθή αλάιπζε Η θαλνληθφηεηα ηεο δηαζπνξάο ησλ δεδνκέλσλ ειέγρζεθε κε ην test Kolmogorov- Smirnov. Οη δηαθνξέο ζηα επίπεδα έθθξαζεο ζην ήπαξ κεηαμχ ησλ L0 θαη L12 κπψλ, εμεξεπλήζεθαλ κε ηε ρξήζε ηνπ t-test. Οη αξηζκεηηθέο ηηκέο εθθξάδνληαη σο ν κέζνο φξνο +/- ηελ ηππηθή απφθιηζε (SD). Η ζηαηηζηηθή ζεκαληηθφηεηα ηέζεθε ζην επίπεδν ηνπ 95% (p<0.05). 98

123 Κεθάιαην 7 Αποηελέζμαηα 7.1 Βειηηζηνπνίεζε ηεο ρεηξνπξγηθήο κεζόδνπ επαηεθηνκήο ηελ αξρηθή θάζε ηεο κειέηεο, έγηλε πξνζεθηηθή παξαηήξεζε θαη αμηνιφγεζε πνηθίισλ παξαγφλησλ ζηνπο νπνίνπο ζα κπνξνχζε λα απνδνζεί ε ζρεηηθά κηθξή επηβίσζε (65%) ησλ κπψλ κεηά ηελ εγρεηξεηηθή απηή δηαδηθαζία. Παξφηη,φπσο έρεη ήδε αλαθέξεη, θαη ζηε βηβιηνγξαθία ηα πνζνζηά επηβίσζεο ήηαλ ρακειά, έγηλε δπλαηφ λα εληνπηζηνχλ θάπνηνη παξάγνληεο πνπ ζα κπνξνχζαλ λα ηξνπνπνηεζνχλ. Αξρηθά ζην ζηφραζηξν κπήθε ε αλαηζζεζηνινγηθή ηερληθή. Λακβάλνληαο σο ππφδεηγκα ηηο πην ζχγρξνλεο θηεληαηξηθέο πξαθηηθέο, εγθαηαιείθζεθε ε ελδνπεξηηνλατθή ρνξήγεζε αλαηζζεηηθψλ νπζηψλ, νη νπνίεο αληηθαηαζηάζεθαλ απφ εηζπλεφκελν ηζνθινπξάλην. Απηφ απέδσζε ηελ πξψηε κηθξή αχμεζε ηεο επηβίσζεο. Γεχηεξε αιιαγή ππήξμε ε θαηάξγεζε ηεο ζπλήζνπο πξαθηηθήο δηελέξγεηαο κηθξήο ηνκήο θαη εθζπιάρλσζεο ηνπ ήπαηνο κε ζπκπίεζε ηνπ ζσξαθνθνηιηαθνχ ρψξνπ. Σφζν ε ζσξαθηθή ζπκπίεζε, φζν θαη ε ηάζε ζηηο πχιεο ηνπ ήπαηνο θαη ζηελ ΚΚΦ ζεσξήζεθε φηη ζα κπνξνχζαλ λα δεκηνπξγνχλ βιάβεο ζηα δψα. Η ηξνπνπνίεζε ήηαλ ε δηελέξγεηα κεγάιεο ηνκήο θαη εθαξκνγή αγθίζηξσλ ψζηε λα γίλεη δπλαηή ε δηελέξγεηα ηεο επαηεθηνκήο in situ, κε λέα αχμεζε ζηελ επηβίσζε (5%). 99

124 Η ηξίηε θαη ζεκαληηθφηεξε αιιαγή έγηλε θαηφπηλ ηεο παξαηήξεζεο, θαηά ηε δηελέξγεηα ηεο επαηεθηνκήο, δηεγρεηξεηηθνχ ζαλάηνπ αξηζκνχ πεηξακαηφδσσλ άκεζα κεηά ηελ ηνπνζέηεζε ηεο απνιίλσζεο ζηνλ ΜΛ. ηα δψα απηά πξν ηνπ ζαλάηνπ ηνπο παξαηεξήζεθε εθζεζεκαζκέλε ηαρπθαξδία ρσξίο απψιεηα αίκαηνο θαη δηάηαζε ηεο πθεπαηηθήο ΚΚΦ. Σα επξήκαηα απηά έζεζαλ ηελ ππνςία παξεκπφδηζεο ηεο θιεβηθήο επαλαθνξάο νθεηιφκελεο ζε ζηέλσζε ηεο ΚΚΦ απφ ηελ απνιίλσζε ηνπ ΜΛ ιίαλ εγγχο απηήο. Τπελζπκίδεηαη φηη ν ΜΛ είλαη ην κνλαδηθφ ζεκείν φπνπ ε ΚΚΦ είλαη ελδνεπαηηθή. αλ απάληεζε ζε απηφ, δνθηκάζηεθε ε θαηάιεηςε θνινβψκαηνο ηνπ ΜΛ ζε απφζηαζε 2 mm απφ ηελ ΚΚΦ θαη ε αχμεζε ζηελ επηβίσζε ήηαλ ζεακαηηθή (πεξίπνπ 15%). Γελληέηαη ην εξψηεκα αλ ην θνιφβσκα απηφ είλαη ιεηηνπξγηθφ, νπφηε ζα κεηψλεηαη ην πνζνζηφ επαηεθηνκήο. Απηφ ειέγρζεθε, φηαλ κε ηε ζαλάησζε ησλ δψσλ απηψλ θαη απηνςία ηνπ ήπαηφο ηνπο, θάλεθε φηη ην ελ ιφγσ θνιφβσκα άκεζα κεηεγρεηξεηηθά λεθξψλεηαη, πξνθαλψο ιφγσ δηαθνπήο ηεο αηκάησζήο ηνπ, κε απνηέιεζκα λα κελ ζπκκεηέρεη ζηελ αλαγελλεηηθή δηαδηθαζία. Έηζη ε πξαθηηθή απηή πηνζεηήζεθε ρσξίο θφβν αιινίσζεο ησλ απνηειεζκάησλ. Σέινο, κε ηελ απφθηεζε εκπεηξίαο θαη ηαρχηεηαο ζηελ εθαξκνγή ηεο κεζφδνπ πνπ πεξηγξάςακε, θάλεθε κία αθφκε κηθξή αχμεζε ζηελ επηβίσζε, πξνθαλψο ιφγσ κηθξφηεξνπ ρεηξνπξγηθνχ stress ησλ δψσλ, κηθξφηεξνπ βαζκνχ αθπδάησζεο, απνθπγήο κηθξνηξαπκαηηζκψλ θαη κε αλαγθαίσλ ηάζεσλ ζηνπο ιεπηεπίιεπηνπο ηζηνχο ηνπ κπφο. Με ηελ εθαξκνγή ησλ πξναλαθεξζεηζψλ αιιαγψλ ε επηβίσζε ησλ πεηξακαηφδσσλ, απφ ην 65% αλήιζε ζην %, κε ζεκαληηθά κηθξφ ρξφλν εθηέιεζεο, πνπ αλαιφγσο ηελ εκπεηξία θπκαίλεηαη απφ 12 έσο 15 ιεπηά. 100

125 7.2 Υξνληθή εμέιημε ηνπ ξπζκνύ θπηηαξηθνύ πνιιαπιαζηαζκνύ θαη ηεο ζπζζώξεπζεο ιίπνπο ζηα επαηνθύηαξα θαηά ηελ αλαγέλλεζε Υξνληθή αιιεινπρία ηεο έθθξαζεο ηνπ Ki-67 Πξνο επηβεβαίσζε ηνπ ρεηξνπξγηθνχ κνληέινπ, κειεηήζεθε ε ρξνληθή αιιεινπρία ηνπ βαζκνχ πνιιαπιαζηαζκνχ ησλ επαηνθπηηάξσλ κεηά απφ κεξηθή επαηεθηνκή, θάησ απφ ηηο παξνχζεο ζπλζήθεο. Ο έιεγρνο έγηλε κε ηελ αλνζντζηνρεκηθή κέζνδν αλάδεημεο ηεο πξσηεΐλεο Ki-67 ζε δηάθνξα ρξνληθά ζεκεία κεηά απφ κεξηθή επαηεθηνκή. Σν κνληέιν επηβεβαηψζεθε, κε αλάδεημε ηνπ κέγηζηνπ πνιιαπιαζηαζκνχ ζηηο 36 ψξεο κεηά ηελ επαηεθηνκή, φπσο είλαη γλσζηφ απφ ηε βηβιηνγξαθία. Γηάγξακκα 7.1: Πνζνζηό ησλ επαηνθπηηάξσλ πνπ βξίζθνληαη ζε θάζε πνιιαπιαζηαζκνύ γηα θάζε ρξνληθό ζεκείν γηα ηηο δύν νκάδεο πεηξακαηόδσσλ (PHx, Sham) 101

126 Παξνπζηάδνληαη παξαθάησ δχν ελδεηθηηθέο ηζηνινγηθέο εηθφλεο ρξψζεο ηνπ Ki-67, απφ ηα ραξαθηεξηζηηθά ζεκεία ηεο ειάρηζηεο (ρξφλνο 0) θαη ηεο κέγηζηεο ρξψζεο (36 ψξεο) Δηθόλα 7.2: Δλδεηθηηθέο κηθξνθσηνγξαθίεο (400x) ηεο ειάρηζηεο θαη κέγηζηεο ρξώζεο γηα Ki-67 (κε βέιε ζεκαίλνληαη θάπνηνη εθ ησλ θερξσζκέλσλ ππξήλσλ) 102

127 7.2.2 Υξνληθή αιιεινπρία ηεο ζπζζώξεπζεο ιίπνπο Με απιή ηζηνινγηθή ρξψζε αηκαηνμπιίλεο-εσζίλεο, ην ζπζζσξεπκέλν ζην θπηηαξφπιαζκα ιίπνο αλαδεηθλχεηαη ζαλ θελνηφπην ρσξίο ρξψζε εληφο ηνπ θπηηαξνπιάζκαηνο. Έγηλε εκηπνζνηηθή εθηίκεζε ηεο ζπζζψξεπζεο ιίπνπο (+, ++, +++). Σα απνηειέζκαηα παξνπζηάδνληαη ζηνλ παξαθάησ πίλαθα Time Points PHx Sham Πίλαθαο 7.3: Ηκηπνζνηηθή αμηνιόγεζε ηεο παξνδηθήο επαηηθήο ζηεάησζεο ζε δηάθνξα ρξνληθά ζεκεία θαηά ηελ αλαγελλεηηθή δηεξγαζία. Η αμηνιόγεζε έγηλε θαηόπηλ ρξώζεο H-E. Καη κε ηνλ ηξφπν απηφ επηβεβαηψζεθε ε ζπγθξηζηκφηεηα ησλ απνηειεζκάησλ ηνπ αλαζεσξεκέλνπ ρεηξνπξγηθνχ κνληέινπ κε απηά ηεο δηεζνχο βηβιηνγξαθίαο. Η κέγηζηε επαηηθή ζηεάησζε παξνπζηάζηεθε ζην δηάζηεκα σξψλ, φπσο αλακελφηαλ. Παξνπζηάδνληαη ζηε ζπλέρεηα δχν ελδεηθηηθέο θσηνγξαθίεο απφ ην νπηηθφ κηθξνζθφπην ζε κεγέζπλζε 400x, πνπ αλαδεηθλχνπλ ηελ πξφνδν ηεο ζπζζψξεπζεο ιίπνπο κεηαμχ ηεο ψξαο 0 (ρσξίο ιίπνο) θαη ηεο 12 εο ψξαο (κέγηζηε ζπζζψξεπζε ιίπνπο). 103

128 Δηθόλα 7.4 Δλδεηθηηθέο κηθξνθσηνγξαθίεο ζε κεγέζπλζε 400x, επαηηθνύ ηζηνύ κε ρξώζε H-E. Παξνπζηάδεηαη ε ειάρηζηε (ώξα 0) θαη ε κέγηζηε (12 ε ώξα) ζπζζώξεπζε ιίπνπο ζηα επαηνθύηηαξα θαηά ηελ αλαγέλλεζε. 104

129 7.3 Απνηειέζκαηα ηνπ ειέγρνπ ηεο κεηαβνιήο ηεο έθθξαζεο ησλ mi-rnas ηελ 12 ε ώξα κεηά κεξηθή επαηεθηνκή ηελ παξνχζα κειέηε, εμεηάζακε ηα επίπεδα έθθξαζεο 598 mmu-mirnas ζε επαηηθφ ηζηφ πξνεξρφκελν απφ κχεο control (L0) θαη ηα ζπγθξίλακε κε ηελ αληίζηνηρε έθθξαζε ζηνλ επαηηθφ ηζηφ κεηά απφ 12 ψξεο αλαγελλεηηθήο δηαδηθαζίαο πνπ πξνθιήζεθε απφ 2/3 κεξηθή επαηεθηνκή (L12) Πξνθίι έθθξαζεο micrornas κε ηε κέζνδν ησλ κηθξνζπζηνηρηώλ (Microarray Profiling) Δθ ησλ 598 mmu-mirnas, ηα 8 πιεξνχζαλ ηα θξηηήξηα ηεο κεηαβνιήο: Delta Log Median Ratio (ΓLMR) >±0.58 equal to [Fold change] >1.5. Σα 8 mirna κε ηε κεγαιχηεξε κεηαβνιή ζηελ έθθξαζε (differential expression, DE) είλαη: mmu-mir-34c mmu-mir-21 mmu-mir-30b mmu-mir-144 mmu-mir-207 mmu-mir-451 mmu-mir-582-3p mmu-mir-290-5p Η δηαθνξά ζην ΓLMR κεηαμχ ησλ L12 θαη ησλ L0 κπψλ ππνινγίζηεθε. Δπηπιένλ, ην κέζν Log Mean Ratio κεηαηξάπεθε ζε fold change σο αθνινχζσο: Fold Change= 2 ΓLMR (βιέπε ζρήκα 7.5). 105

130 Σα mmu-mir-21 θαη mmu-mir-30b εκθάληζαλ κεγαιχηεξε έθθξαζε ζηηο 12 ψξεο, ζε ζρέζε κε ηελ νκάδα ειέγρνπ (L0), ελψ ηα ππφινηπα 6 mirnas (mmu-mir- 34c, mmu-mir-144, mmu-mir-207, mmu-mir-451, mmu-mir-582-3p, mmu-mir p) εκθάληζαλ κηθξφηεξε έθθξαζε ζηνπο L12 κχεο ζε ζρέζε κε ηνπο L0. ρήκα 7.5: Σν αλσηέξσ δηάγξακκα απεηθνλίδεη ηελ Log-fold κεηαβνιή (L12 vs. L0) ησλ micrornas πνπ πέξαζαλ ηα θξηηήξηα θηιηξαξίζκαηνο ησλ δεηγκάησλ. Γηα θαιύηεξε απεηθόληζε, ην θάησ δηάγξακκα δείρλεη ην Delta Log Median Ratio >±0.58 equal to (Fold change) >1.5 ησλ ίδησλ micrornas. Κάζε κπάξα αληηπξνζσπεύεη ην Log Median Ratio κεηαμύ ησλ L12 θαη L0 δεηγκάησλ. Θεηηθό ΓLMR δείρλεη αύμεζε έθθξαζεο ζην L12 δείγκα, ελώ αξλεηηθό ΓLMR δείρλεη κείσζε ζε ζρέζε κε ην L0 δείγκα. 106

131 7.3.2 Ιεξαξρηθή νκαδνπνίεζε Δθηειέζακε ηεξαξρηθή νκαδνπνίεζε ησλ mirs ρξεζηκνπνηψληαο ηελ Δπθιείδηα απφζηαζε. Έλα ιεπηνκεξέο δέληξν ησλ νκάδσλ απεηθνλίδεηαη ζην ζρήκα 4. Οθηψ (8) νκάδεο γνληδίσλ ζεκεηψλνληαη. ρεηηθά κε ηα mmu-mir πνπ εθθξάζηεθαλ δηαθνξεηηθά, ην mmu-mir-34c αλήθεη ζηελ πξψηε νκάδα, επηδεηθλχνληαο ζεκαληηθά πςειφηεξε έθθξαζε ζηνπο L0 ζε ζρέζε κε ηνπο L12 κχεο. Αληίζεηα, ηα mmumir-21 θαη mmu-mir-30b αχμεζαλ ζεκαληηθά ηελ έθθξαζή ηνπο ζηνπο L12 κχεο ζε ζρέζε κε ηνπο L0. ρήκα 7.6: Ιεξαξρηθή Οκαδνπνίεζε Γηάγξακκα αλάιπζεο ηεξαξρηθήο νκαδνπνίεζεο βαζηζκέλν ζε 598 probe sets, κε ηηο κεγαιύηεξεο δηαθνξνπνηήζεηο κεηαμύ L0 θαη L12 κπώλ. Ο ρξσκαηηθόο θνξεζκόο είλαη επζέσο αλάινγνο ηνπ κεγέζνπο ηεο έθθξαζεο. Οη ζηήιεο αληηπξνζσπεύνπλ ηα πεηξακαηηθά δείγκαηα L0 θαη L12. Οη θόθθηλεο κπάξεο ππνδεηθλύνπλ πςειή έθθξαζε θαη νη πξάζηλεο κπάξεο ππνδεηθλύνπλ κηθξή έθθξαζε. 107

132 7.4 Δπηβεβαίσζε ηεο έθθξαζεο ησλ mirnas κε RT-qPCR Απφ ηα 8 mmu-mirs κε ηε κεγαιχηεξε δηαθνξνπνίεζε έθθξαζεο (L0 vs. L12 ζηα δεδνκέλα απφ ηα microarrays), ηα 5 (mmu-mir-21, mmu-mir-34c *, mmu-mir- 207, mmu-mir-451, mmu-mir-582-3p) εμεηάζηεθαλ θαη κε qpcr. Σξία (3) αθφκε mmu-mirs (mmu-mir-101a, mmu-mir-101b θαη mmu-mir-669f), ηα νπνία έδεημαλ νξηαθή δηαθνξνπνίεζε έθθξαζεο κε ηα microarrays, ζπκπεξηειήθζεζαλ ζην πείξακα ηεο qpcr. Οη νξηαθέο ηηκέο ησλ ηξηψλ απηψλ mmu-mirs έρνπλ σο εμήο: Γηα ηα mmu-mir-101a θαη mmu-mir-101b, ην ΓLMR =0.50 κε fold change γηα L12 vs. L0 =1.41 Γηα ην mmu-mir-669f ην ΓLMR =-0.49, κε fold change γηα L12 vs. L0 =0.71 Σα επίπεδα έθθξαζεο θαλνληθνπνηήζεθαλ κε ηελ αληηζηνηρνχζα γεσκεηξηθή κέζε ηηκή ησλ γνληδίσλ αλαθνξάο (mmu-mir-191, mmu-mir-103 θαη mmu-mir-let- 7b) θαη ηα δείγκαηα ειέγρζεθαλ γηα χπαξμε αθξαίσλ ηηκψλ πνπ έπξεπε λα εμαηξεζνχλ. Η qpcr επηβεβαίσζε ην πξνθίι έθθξαζεο ησλ δηαθνξηθά εθθξαζκέλσλ mirs, φπσο είραλ δείμεη ηα δεδνκέλα απφ ηα microarrays. Σν πνζνζηφ κεηαβνιήο ηνπο (fold change) ππνινγίζηεθε κε ρξήζε ηεο ζπγθξηηηθήο κεζφδνπ πνζνηηθνπνίεζεο ΓΓCt. Σα δεδνκέλα δηνξζψζεθαλ κε δνθηκαζία εηδηθήο απφδνζεο PCR (microrna ή ελδνγελέο control) θαη θαλνληθνπνηήζεθαλ κε παξάγνληα θαλνληθνπνίεζεο βαζηζκέλν ζε 3 ελδνγελή controls: mmu-mir-191 mmu-mir-103 mmu-mir-let-7b 108

133 Η δηαθνξηθή έθθξαζε ησλ πξναλαθεξζέλησλ mmu-mirs, φπσο απηή πξνθχπηεη απφ ηελ qpcr, απεηθνλίδεηαη ζαλ ζρεηηθφ πνιιαπιάζην (relative fold change) ζην ζρήκα 7.7. ρήκα 7.7: Η δηαθνξηθή έθθξαζε ησλ 8 πην δηαθνξνπνηεκέλσλ mmu-mirs γηα ηελ νκάδα L12 vs.l0, όπσο απηή πξνθύπηεη από ηελ qpcr. Απφ ηελ qpcr αλάιπζε πνπ πξαγκαηνπνηήζακε, πξνθχπηεη φηη ην πην ζεκαληηθά δηαθνξνπνηεκέλν mmu-mir κεηαμχ απηψλ πνπ κειεηήζεθαλ, ήηαλ ην mmu-mir-21 (1.808-fold change; p<0.01; t-test). 109

134 7.5 πζρεηηζκόο κεηαμύ κηθξνζπζηνηρηώλ θαη qpcr Σα απνηειέζκαηα πνπ πξνέθπςαλ απφ ηηο δχν απηέο κεζφδνπο ήηαλ ζε ζπκθσλία. Οη ζρεηηθέο εθθξάζεηο ησλ mirs βαζίζηεθαλ ζε 4 ηερληθέο επαλαιήςεηο. Ο ζπζρεηηζκφο ηνπ Pearson (r) κεηαμχ microarrays θαη qpcr ήηαλ 0,881 (p=0,119) (ζρήκα 7). Η αλάιπζε ηεο qpcr γηα ηα mmu-mir-34c *, mmu-mir-30b *, mmu-mir- 144 θαη mmu-mir-290-5p έδεημε εμαηξεηηθά ρακειά επίπεδα έθθξαζεο. αλ απνηέιεζκα ζηα δεδνκέλα ΓLMR εκθαλίδνληαη σο κε δηαζέζηκα (Ν/Α). Με εμαίξεζε ην mmu-mir-30b, απηή ε ρακειή έθθξαζε έξρεηαη ζε ζπκθσλία κε ηα δεδνκέλα ησλ microarrays. 7.6 TargetScan θαη αλάιπζε εκπινπηηζκνύ GO Η GO (Gene Ontology) αλάιπζε ζπκπεξηιακβάλεη 3 δηαθνξεηηθέο ζπληζηψζεο πνπ πξνζθέξνπλ πιεξνθνξίεο θνηλέο γηα φινπο ηνπο έκβηνπο νξγαληζκνχο: Σελ ζπληζηψζα ηεο Κπηηαξηθήο Σνπνγξαθίαο (CC), πνπ πεξηγξάθεη ηα ζεκεία εληφο ηνπ θπηηάξνπ φπνπ κπνξνχλ λα βξεζνχλ ηα πξντφληα ησλ γνληδίσλ Σελ ζπληζηψζα ηεο Μνξηαθήο Λεηηνπξγίαο (MF) πεξηγξάθεη ηε βηνρεκηθή δξαζηεξηφηεηα ηνπ πξντφληνο ελφο γνληδίνπ, ρσξίο λα δηεπθξηλίδεη ηνλ ρξφλν θαη ηνλ ηφπν πνπ απηφ ζπκβαίλεη Σελ ζπληζηψζα ηεο Βηνινγηθήο Γηεξγαζίαο (BP) πνπ ζπλίζηαηαη ζε κία ή πεξηζζφηεξεο ηαμηλνκεκέλεο ζεηξέο δξάζεσλ MF. Τπάξρεη, δειαδή, άξξεθηε ζρέζε κεηαμχ MF θαη BP. Γελ θαηέζηε δπλαηφλ λα ιεθζνχλ απνηειέζκαηα κέζσ TargetScan αλάιπζεο γηα ηα mmu-mir-34c * θαη mmu-mir-30b *. Αλαδείρζεθαλ 78 δπλεηηθνί ζηφρνη γηα ην mmu-mir-21 (adjp<0.001). Απηνί ζπκκεηέρνπλ ζεκαληηθά ζε δηάθνξεο βηνινγηθέο δηεξγαζίεο (BPs), ήηνη: 110

135 Θεηηθή ξχζκηζε ηεο βηνινγηθήο δηεξγαζίαο Ρχζκηζε ηεο κεηαγξαθήο απφ ηνλ promoter ηεο RNA πνιπκεξάζεο II Μεηαβνιηθέο δηεξγαζίεο ησλ θπηηαξηθψλ καθξνκνξίσλ Θεηηθή ξχζκηζε ησλ κεηαβνιηθψλ δηεξγαζηψλ ηνπ θπηηάξνπ Θεηηθή ξχζκηζε ησλ δηεξγαζηψλ βηνζχλζεζεο ησλ θπηηαξηθψλ καθξνκνξίσλ Θεηηθή ξχζκηζε ηεο θπηηαξηθήο βηνζχλζεζεο Η ζπληζηψζα κνξηαθήο ιεηηνπξγίαο (MF) γηα ην mmu-mir-21, αλαγλψξηζε ιεηηνπξγίεο φπσο πξσηετληθή ζχλδεζε, θαη δξαζηεξηφηεηα κεηαγξαθηθψλ παξαγφλησλ (adjp<0.001). Όια ηα απνηειέζκαηα γηα ην mmu-mir-21 απεηθνλίδνληαη ζηνλ πίλαθα 1. Γηα ην mmu-mir-144 ε TargetScan αλάιπζε αλέδεημε 439 δπλεηηθνχο ζηφρνπο. Απηνί ζπκκεηέρνπλ ζε ζεκαληηθέο BPs (adjp<0.001): Αλάπηπμε αλαηνκηθψλ δνκψλ Ρχζκηζε κεηαβνιηζκνχ ηνπ RNA Ρχζκηζε πξσηεπφλησλ κεηαβνιηθψλ δηεξγαζηψλ Ρχζκηζε γνληδηαθήο έθθξαζεο Πνιπθπηηαξηθή νξγαληζκηθή αλάπηπμε DNA-αλεμάξηεηε ξχζκηζε ηεο κεηαγξαθήο Αλάπηπμε νξγάλσλ Ρχζκηζε κεηαβνιηθψλ δηεξγαζηψλ ησλ καθξνκνξίσλ Οη νληφηεηεο MF θαη CC αλέδεημαλ κηα πιεηνςεθία γνληδίσλ-ζηφρσλ επξηζθφκελσλ ζηνλ ππξήλα ηνπ επαηνθπηηάξνπ. Η αλάιπζε γηα ην mmu-mir-207 αλέδεημε 100 δπλεηηθά γνλίδηα-ζηφρνπο, ηα νπνία ζπκκεηέρνπλ ζε κνξηαθέο δξάζεηο ηξαλζθεξάζεο, φπσο κεηαθνξά γιπθνδπιηθψλ νκάδσλ, UDP-γιπθνδπι-ηξαλζθεξάζε θαη δξαζηεξηφηεηα γιπθνπξνληθήο ηξαλζθεξάζεο (adjp<0.001). Γηα ην mmu-mir-451 αλαδείρζεθαλ 6 δπλεηηθά γνλίδηα-ζηφρνη, αιιά ε GO αλάιπζε δελ απέθεξε ζηαηηζηηθά ζεκαληηθά απνηειέζκαηα. 111

136 Σν mmu-mir-582-3p θάλεθε λα έρεη 71 δπλεηηθνχο ζηφρνπο πνπ έρνπλ ζεκαληηθή ζπλεηζθνξά ζε δηάθνξεο BPs, φπσο ξχζκηζε θπηηαξηθψλ βηνζπλζεηηθψλ δηεξγαζηψλ θαη ξχζκηζε ηεο βηνζχλζεζεο καθξνκνξίσλ. Η νληφηεηα CC έδσζε σο εληνπίζεηο ηεο δξάζεο ηα γνλίδηα ζηνλ ππξήλα θαη ηνλ θπηηαξνζθειεηφ ηνπ ππξήλα (adjp<0.001). Σν mmu-mir-290-5p θάλεθε λα έρεη 122 δπλεηηθά γνλίδηα-ζηφρνπο, κε ζπκκεηνρή ζε: BPs φπσο κνξθνγέλεζε νξγάλσλ MFs φπσο δξαζηεξηφηεηεο ηξαλζθεξάζεο CCs φπσο ζηνλ ππξήλα θαη ζηα νξγαλίδηα ηεο θπηηαξηθήο κεκβξάλεο Δπόκελε ζειίδα - Πίλαθαο 7.8: Γπλεηηθά γνλίδηα-ζηόρνη ηνπ mmu-mir-21. Απεηθνλίδνληαη ν βηνινγηθέο δηεξγαζίεο ζηηο νπνίεο ζπκκεηέρνπλ απηά (BPs), θαζώο θαη νη κνξηαθέο ηνπο ιεηηνπξγίεο (MFs) 112

137 113