ΕΛΕΥΘΕΡΙΑ ΓΑΛΑΤΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΣ. ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥ ΡΑΣΗΣ ΕΝΟΣ ΣΥΝΘΕΤΙΚΟΥ ΣΥΝ ΕΤΗ ΤΟΥ PPARβ/δ ΣΤΑ ΚΑΡ ΙΟΜΥΟΚΥΤΤΑΡΑ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΚΑΙ ΙΑΒΗΤΙΚΩΝ ΕΠΙΜΥΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΖΩΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΙΑ ΓΑΛΑΤΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΥ ΡΑΣΗΣ ΕΝΟΣ ΣΥΝΘΕΤΙΚΟΥ ΣΥΝ ΕΤΗ ΤΟΥ PPARβ/δ ΣΤΑ ΚΑΡ ΙΟΜΥΟΚΥΤΤΑΡΑ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΚΑΙ ΙΑΒΗΤΙΚΩΝ ΕΠΙΜΥΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2 Στη µαµά µου

3 Ευχαριστίες Ευχαριστώ θερµά την επιβλέπουσα µου Καθηγήτρια κ.αντιγόνη Λάζου για την εµπιστοσύνη που µου έδειξε αναθέτοντας µου τη συγκεκριµένη θέµα, για την καθοδήγηση και τη στήριξη της σε όλη τη διάρκεια της µεταπτυχιακής µου εργασίας. Ευχαριστώ την Καθηγήτρια κ.μαργαρίτα Χατζοπούλου- Κλαδαρά και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ.γεώργιο Μόσιαλο για την τιµή που µου έκαναν να συµµετέχουν στην τριµελή µου επιτροπή και για τις πολύτιµες παρατηρήσεις τους κατά την παρουσίαση της εργασίας µου. Τέλος, ευχαριστώ πολύ όλα τα παιδιά του εργαστηρίου για τη βοήθειά τους στην εκµάθηση των τεχνικών και για όλες τις ώρες που περάσαµε µαζί στο εργαστήριο.

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ι.ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΑΡ ΙΑΚΗ ΥΠΕΡΤΡΟΦΙΑ ΙΑΒΗΤΙΚΟΜΥΟΚΑΡ ΙΟ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ PPARs (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors) Μεταγραφική δραστικότητα των PPARs α) Φυσικοί προσδέτες των PPARs β). Προτεινόµενοι συνδέτες του PPARβ/δ Η ισοµορφή των PPARs, PPARβ/δ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΟΥΜΕΝΕΣ ΑΠΟ ΜΙΤΟΓΟΝΑ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΕΣ KINAΣΕΣ (mitogen activated protein kinases MAPKs) Βασικά χαρακτηριστικά Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΜΑΡΚs ΣΤΗΝ ΚΑΡ ΙΑΚΗ ΥΠΕΡΤΡΟΦΙΑ Υποοικογένεια των ERKs (Extracellular signal-regulated kinases Υποοικογένεια της p38 MAPK Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΑΚΤ ΣΤΗΝ ΚΑΡ ΙΑΚΗ ΥΠΕΡΤΡΟΦΙΑ...26 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ...31 ΙΙ.ΥΛΙΚΑ...32 Ι. ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΥΛΙΚΟ...32 ΙΙ.ΧΗΜΙΚΑ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ...32 ΙΙΙ. ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΚΑ ΥΛΙΚΑ...35 ΙΙΙ.ΜΕΘΟ ΟΙ ΕΠΑΓΩΓΗ ΟΞΕΙΑΣ ΦΑΣΗΣ ΙΑΒΗΤΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΡ ΙΑΚΩΝ ΜΥΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΕΜΠΟΤΙΣΜΕΝΗ ΚΑΡ ΙΑ Προετοιµασία καρδιάς για τον εµποτισµό Αποµόνωση καρδιακών µυοκυττάρων ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΚΑΡ ΙΑΚΩΝ ΜΥΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ ΟΞΥΓΟΝΟΥ (ROS)...38

5 5. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ RNA ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΣ ΚΑΡ ΙΟΜΥΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΟΛΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΛΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ HΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΗ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙ ΙΟΥ Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών παρουσία SDS (SDS-PAGE) ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΑΝΟΣΟΕΝΤΟΠΙΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ ΣΤΗ ΝΙΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗ (immunoblotting) ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΛΟΓΙΣΜΙΚΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΩΝ...43 IV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΟΥ GW0742 ΣΤΗΝ ΥΠΕΡΤΡΟΦΙΑ ΤΩΝ ΚΑΡ ΙΟΜΥΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Καρδιοµυοκύτταρα φυσιολογικών επίµυων Καρδιοµυοκύτταρα διαβητικών επίµυων ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΕΝΕΡΓΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΟΞΥΓΟΝΟΥ(ROS) Ο ΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ ΜΕΣΩ ΤΩΝ α1-α ΡΕΝΕΡΓΙΚΩΝ ΥΠΟ ΟΧΕΩΝ Επίδραση του GW0742 στην επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη ενεργοποίηση των ERK1/2 σε καρδιοµυοκύτταρα φυσιολογικών επίµυων Επίδραση του GW0742 στην επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη ενεργοποίηση της p38 MAPK σε καρδιοµυοκύτταρ φυσιολογικών επίµυων Επίδραση του GW0742 στην επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη ενεργοποίηση της Αkt σε καρδιοµυοκύτταρα φυσιολογικών επίµυων Aπόκριση των ΜΑPK p38 και ERK1/2 στην επίδραση µε φαινυλεφρίνη ή GW0742 σε καρδιοµυοκύτταρα διαβητικών επίµυων Ο ΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ ΜΕΣΩ ΤΟΥ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΗΣ ΙΝΣΟΥΛΙΝΗΣ...61

6 4.1. Η επίδραση του GW0742 στην ενεργοποίηση του µονοπατιού που επάγεται από την ινσουλίνη σε καρδιοµυοκύτταρα φυσιολογικών επίµυων Η επίδραση του GW0742 στην ενεργοποίηση του µονοπατιού που επάγεται από την ινσουλίνη σε καρδιοµυοκύτταρα διαβητικών επίµυων...64 V. ΣΥΖΗΤΗΣΗ...67 VI. ΠΕΡΙΛΗΨΗ...77 VII. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...81

7 Ι. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι καρδιαγγειακές ασθένειες αποτελούν µία από τις κυριότερες αιτίες νοσηρότητας και θανάτου στις ανεπτυγµένες χώρες καθώς επίσης και στην Ελλάδα. Προκαλούν 12 εκατοµµύρια θανάτους ετησίως σε όλο τον κόσµο και ευθύνονται για ποσοστό που υπερβαίνει το 50% όλων των θανάτων στην Ευρώπη µεταξύ ατόµων µεγαλυτέρων των 65 ετών. Υπολογίζεται ότι το 2020 οι θάνατοι από καρδιακή ανεπάρκεια θα ξεπερνούν τα Οι ασθενείς µε διαβήτη ανήκουν στην οµάδα αυξηµένου κινδύνου αφού εµφανίζουν δυσλειτουργία της διαστολής της αριστερής κοιλίας. Η καρδιακή ανεπάρκεια, η αδυναµία της καρδιάς να τροφοδοτήσει µε αίµα τα διάφορα όργανα και να ικανοποιήσει τις ανάγκες τους για οξυγόνο, είναι µία µακροχρόνια πάθηση, η οποία συνήθως καθυστερεί να διαγνωσθεί και να αντιµετωπισθεί. Τα συµπτώµατα (δύσπνοια, εύκολη κόπωση και οιδήµατα) υποεκτιµούνται από τους ασθενείς, θεωρώντας ότι είναι φυσικά επακόλουθα είτε της γήρανσης είτε της κακής φυσικής τους κατάστασης. Επιπρόσθετα, δεν έχει γίνει κατανοητό στο ευρύ κοινό ότι πρόκειται για ένα κακόηθες σύνδροµο και µάλιστα µε χειρότερη πρόγνωση από αυτή του καρκίνου ή του AIDS. Στην πραγµατικότητα, 30-40% των ασθενών µε καρδιακή ανεπάρκεια πεθαίνουν στον πρώτο χρόνο από την πρώτη τους εισαγωγή στο νοσοκοµείο. Όσο νωρίτερα διαγνωσθεί η καρδιακή ανεπάρκεια και αρχίσει η κατάλληλη θεραπεία, τόσο περισσότερες είναι οι προοπτικές για καλύτερη ποιότητα ζωής των ασθενών στο µέλλον. 1. ΚΑΡ ΙΑΚΗ YΠΕΡΤΡΟΦΙΑ Τα καρδιοµυυοκύτταρα των θηλαστικών είναι διαφοροποιηµένα κύτταρα που έχουν χάσει την ικανότητα διαίρεσης κατά τη περιγεννητική περίοδο, συνεπώς η απόκριση σε ερεθίσµατα έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση του µεγέθους των προϋπαρχόντων κυττάρων (Sugden και Clerk 2006). Η κατάσταση αυτή είναι γνωστή ως «υπερτροφία». ιακρίνεται σε ολική υπερτροφία των κοιλιών (global hypertrophy), που παρουσιάζεται όταν υπάρχει αύξηση στο εξωτερικό έργο της καρδιάς και σε τοπική υπερτροφία των κοιλιακών τοιχωµάτων (localized hypertrophy), που ακολουθεί την απώλεια µυοκαρδίου λόγω εµφράγµατος. Μακροσκοπικά ευρήµατα προσδιορίζουν την καρδιακή υπερτροφία ως πάχυνση του

8 ενδοκοιλιακού τοιχώµατος (Liang et al., 1999). Μορφολογικά το κύτταρο χαρακτηρίζεται µε αύξηση του µεγέθους, µε αυξηµένη πρωτεϊνική σύνθεση και αλλαγές στην οργάνωση του σαρκοµεριδίου (Frey et al., 2004). Παρόλο που αρχικά η καρδιακή υπερτροφία αποτελεί µια αντισταθµιστική απόκριση του µυοκαρδίου που παροδικά οµαλοποιεί το µηχανικό στρες και βελτιστοποιεί τη λειτουργία της καρδιακής αντλίας, η παρατεταµένη υπερτροφία οδηγεί σε καρδιακή ανεπάρκεια (Levy et al., 1990, Ho et al., 1998). ιακρίνεται δηλαδή σε δύο µορφές: α) την «φυσιολογική» που προκύπτει ως απόκριση στην ανάγκη για αυξηµένη καρδιακή παροχή κατά την άσκηση και β) τη «παθολογική» που παρατηρείται σε καταστάσεις στρες όπου απαιτείται αυξηµένη καρδιακή παροχή και µακροπρόθεσµα σχετίζεται µε παθολογικές καταστάσεις όπως η καρδιακή ανεπάρκεια και αρρυθµίες. Βάση φαινότυπου, υπάρχουν δύο τύποι καρδιακής υπερτροφίας: η οµόκεντρη (concentric) η οποία έπεται της αυξηµένης πίεσης, οδηγεί σε µειωµένο όγκο της αριστερής κοιλίας και σε πάχυνση του τοιχώµατος και χαρακτηρίζεται µέσα στο κύτταρο από την οργάνωση των σαρκοµεριδίων παράλληλα. Η έκκεντρη υπερτροφία (eccentric) η οποία οφείλεται στoν αυξηµένο όγκο και προκαλεί διαστολή και λέπτυνση του καρδιακού τοιχώµατος, χαρακτηρίζεται από την οργάνωση των σαρκοµεριδίων σε σειρές, οδηγώντας σε επιµήκη κυτταρική αύξηση (Dorn et al., 2003, Wakatsuki, et al., 2004). Πέρα από την αύξηση του µεγέθους των µυοκυττάρων, παρατηρείται και αύξηση στον αριθµό των ινοβλαστών προκαλώντας ίνωση και αυξηµένη δυσκαµψία του µυοκαρδίου (Wakatsuki, et al., 2004). Η υπερτροφία είναι εύκολο να διαχωριστεί από τη φυσιολογική διαδικασία ωρίµανσης της ανάπτυξης τόσο in vivo όσο και σε καλλιέργειες καρδιοµυοκυττάρων (Chien et al., 1991). Πέρα από τα βασικά µορφολογικά χαρακτηριστικά που αφορούν τον αυξηµένο κυτταρικό όγκο, την συσσώρευση ολικής πρωτεΐνης,την αυξηµένη συνάθροιση µυϊκών ινιδίων και την αλλαγή στην οργάνωση των σαρκοµεριδίων, υπάρχουν και έντονα βιοχηµικά χαρακτηριστικά όπως αλλαγές στα πρότυπα των πρωτεϊνών και της γονιδιακής έκφρασης. Συγκεκριµένα παρατηρείται ένα σύνολο από διαδικασίες που στοχεύουν τελικά στην εκδήλωση της υπερτροφίας. Αρχικά παρατηρείται αυξηµένη παραγωγή συσταλτών πρωτεϊνών που σχετίζονται µε τη σύσπαση. Ιδιαίτερα βασική είναι η επανέκφραση ενός εµβρυϊκού προγράµµατος που περιλαµβάνει την έναρξη µεταγραφής γονιδίων, που είχε διακοπεί σε εµβρυϊκά στάδια όπως το ANP (κολπικό νατριουρητικό πεπτίδιο) στις κοιλίες και η ενίσχυση της έκφρασης της σκελετικής α-ακτίνης και της βαριάς αλυσίδας της β-µυοσίνης των

9 σκελετικών µυών (β-mhc) (Calderone et al., 1995). Τα συγκεκριµένα γονίδια αποτελούν χρήσιµους «δείκτες» της υπερτροφίας της καρδιάς, µε πιο εύχρηστο ίσως το γονίδιο του ANP. Η εκδήλωση του φαινοτύπου της υπερτροφίας προϋποθέτει ρύθµιση όχι µόνο στο επίπεδο της µεταγραφής, αλλά και της µετάφρασης. Πράγµατι, έχει διαπιστωθεί ότι ερεθίσµατα υπερτροφίας επάγουν αύξηση της πρωτεϊνοσύνθεσης, ενώ η ρύθµιση της υπερτροφίας σε άλλα επίπεδα, όπως είναι η έξοδος των mrna από τον πυρήνα καθώς και ο χρόνος ζωής τους στο κυτταρόπλασµα, δεν έχουν διευκρινιστεί ακόµα (Sugden και Clerk 1998, Sugden 1999). Τέλος παρατηρείται η άµεση επαγωγή πρώιµων γονιδίων που κωδικοποιούν µεταγραφικούς παράγοντες όπως c-jun, c-fos, Erg 1 (εικόνα 1). Η επαγωγή αυτή στοχεύει στην άµεση ταχύτατη και παροδική έκφραση αυτών των παραγόντων. (Calderone et al., 1995, Hannan και Rothblum 1995). Εικόνα 1. Σηµατοδοτικά µονοπάτια και µεταγραφικός έλεγχος της υπερτροφίας και η επαγοµένη επανέκφραση εµβρυονικών γονιδίων.( Grant et al, 2003) Σύµφωνα µε µια υπόθεση των Sugden και Clerk (1998) κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη της καρδιακής υπερτροφίας διαδραµατίζουν ουσίες νευροενδοκρινούς προέλευσης όπως οι κατεχολαµίνες και παρακρινείς παράγοντες που απελευθερώνονται από τα µυοκύτταρα ή άλλους κυτταρικούς τύπους στην καρδιά (αγγειοτενσίνη, ενδοθηλίνη). Αυτοί οι εξωκυτταρικοί παράγοντες δρουν στους µεµβρανικούς υποδοχείς τους όπου και προσδένονται και ενεργοποιούν διάφορα ενδοκυτταρικά σηµατοδοτικά µονοπάτια που καταλήγουν στην εκδήλωση της υπερτροφίας.

10 Οι καλύτερα µελετηµένοι παράγοντες υπερτροφίας περιλαµβάνουν τους αγωνιστές των συνδεδεµένων µε G πρωτεΐνες υποδοχέων όπως η ενδοθηλίνη, η αγγειοτενσίνη και οι α1-αδρενεργικοί αγωνιστές (Amin et al., 2001). Επιπλέον την υπερτροφία του µυοκαρδίου επάγουν αυξητικοί παράγοντες που δρουν µέσω υποδοχέων κινάσης τυροσίνης, όπως ο IGF-1 (insulin-like growth factor) (Sugden και Clerk 1998, Sugden 1999, Yamazaki et al., 2000, Singh et al., 2000) και µια σειρά ερεθισµάτων όπως η µηχανική διάταση (stretch) και η υποξία που προκαλούν έµµεσα υπερτροφία µέσω ενδοθηλίνης-αγγειοτενσίνης (Yamazaki et al., 2000, Sugden, 2001). Επίσης, διάφορες βιβλιογραφικές αναφορές υποστηρίζουν ότι οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (ROS) αποτελούν έναν από τους βασικούς παράγοντες που ενοχοποιείται για την υπερτροφία. (Kwon et al., 2003, Li et al., 2002., Date et al., 2002, Higuchi et al., 2002). Οι ενεργές µορφές οξυγόνου περιλαµβάνουν :τα ανιόντα του υπεροξειδίου (Ο - 2 ) και τα ελεύθερα υδροξύλια (ΟΗ - ) ενώ οι µη ενεργές το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) και παράγονται κατά την ατελή αναγωγή του µοριακού οξυγόνου από την επιτυχή µεταφορά µεµονωµένων ηλεκτρονίων (Giordano 2005). Συνολικά οι παραπάνω µορφές προκαλούν την οξείδωση των µεµβρανικών φοσφολιπιδίων, των πρωτεϊνών και του DNA. Οι πηγές της παραγωγής των ROS στην καρδιά περιλαµβάνουν τα καρδιοµυοκύτταρα, τα ενδοθηλιακά και τα φαγοκύτταρα. (McCord 1985). Oι ROS έχουν άµεσα αποτελέσµατα στην κυτταρική δοµή και λειτουργία των καρδιοµυοκυττάρων και ενδέχεται να λειτουργούν ως εσωτερικά σήµατα. (Tsutsui 2001). Η αυξηµένη παραγωγή ενεργών ριζών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species) προκαλεί δυσλειτουργία της συσταλτικότητας, και αλλοίωση της δοµικής ακεραιότητας του µυοκαρδίου και ενδέχεται να αποτελεί έναν από τους βασικότερους παράγοντες που συνεισφέρουν στην απόπτωση που παρατηρείται σε διάφορες καρδιοπάθειες (Tsutsui 2001) (εικόνα 2). Παρατηρήθηκε αύξηση των ROS στο µυοκάρδιο ασθενών και ζώων µε καρδιακή ανεπάρκεια (Αmin et al., 2001, Pimentel et al., 2001), γεγονός το οποίο µπορεί να οφείλεται σε δύο µηχανισµούς: σε µειωµένη αντιοξειδωτική ικανότητα ή σε αυξηµένη παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου. Παρόλο που ο πρώτος µηχανισµός είναι αµφισβητίσιµος, παρατηρήθηκε ότι η καρδιακή ανεπάρκεια συνοδεύεται από αύξηση των ελεύθερων ριζών, οι περισσότερες από τις οποίες προέρχονται από τα µιτοχόνδρια των καρδιοµυοκυττάρων (Kinugawa et al., 2000). Υπάρχουν επίσης και

11 κυτταροπλασµατικές πηγές ROS, κυρίως τα κυτταρικά οξειδωτικά σύµπλοκα όπως είναι η NADPH οξειδάση, η οξειδάση ξανθίνης και η οξειδάση νιτρικού οξέος (Griendling et al., 2000). Συµπερασµατικά, τα ερεθίσµατα που συµµετέχουν στην εκδήλωση της υπερτροφίας είναι πολλά και πιθανότατα δρουν σε διαφορετικά στάδια της εξέλιξής της. Όσον αφορά στους κόλπους της καρδιάς, τα δεδοµένα σχετικά µε τη συµµετοχή τους στην απόκριση της υπερτροφίας είναι περιορισµένα. Η εκδήλωση του φαινοτύπου της υπερτροφίας προϋποθέτει ρύθµιση όχι µόνο στο επίπεδο της µεταγραφής, αλλά και της µετάφρασης. Πράγµατι, έχει διαπιστωθεί ότι ερεθίσµατα υπερτροφίας επάγουν αύξηση της πρωτεϊνοσύνθεσης, ενώ η ρύθµιση της υπερτροφίας σε άλλα επίπεδα, όπως είναι η έξοδος των mrna από τον πυρήνα καθώς και ο χρόνος ζωής τους στο κυτταρόπλασµα, δεν έχουν διευκρινιστεί ακόµα (Sugden και Clerk 1998, Sugden 1999). Εικόνα 2. Ο ρόλος των ελεύθερων ριζών οξυγόνου στην ενδοκυτταρική σηµατοδότηση στο καρδιοµυοκύτταρο.

12 2. ΤΟ ΙΑΒΗΤΙΚΟ ΜΥΟΚΑΡ ΙΟ Ο διαβήτης αποτελεί ένα σύνολο µεταβολικών δυσλειτουργιών που χαρακτηρίζονται από υπεργλυκαιµία και µεταβολές στην δράση και την έκκριση της ινσουλίνης. Η χρόνια υπεργλυκαιµία προκαλεί δυσλειτουργία και τελικώς ανεπάρκεια των νεφρών, της καρδιάς και των αγγείων και χαρακτηρίζεται από αντίσταση στην ινσουλίνη. Το οξειδωτικό στρες αποτελεί ένα από τους µεγαλύτερους συντελεστές της παθογένεσης αυτών των καταστάσεων (Ηink et al., 2001). Έχει αποδειχθεί ότι πολλά βιοχηµικά µονοπάτια που επηρεάζονται αρνητικά από την υπεργλυκαιµία (οξείδωση της γλυκόζης, σχηµατισµός εξωγενών τελικών προϊόντων γλυκοσυλίωσης (AGE) και ενεργοποίηση µονοπατιών πολυόλης (polyol)), σχετίζονται µε τη δηµιουργία ελεύθερων ριζών οξυγόνου (ROS), που τελικά οδηγούν σε αυξηµένο οξειδωτικό στρες σε πολλούς ιστούς (Ceriello et al., 2003). Αν δεν αποκατασταθεί από το ενδογενές σύστηµα άµυνας, το αυξηµένο οξειδωτικό στρες οδηγεί στην ενεργοποίηση των ευαίσθητων σε στρες ενδοκυτταρικών σηµατοδοτικών µονοπατιών (ενεργοποίηση της PKC (protein kinase C), του NF-B και των JNK κινασών) και στο σχηµατισµό προϊόντων γονιδίων που προκαλούν κυτταρική βλάβη και συµβάλλουν στις συνέπειες του διαβήτη (Ηink et al., 2001, Ceriello et al., 2003). Πολλές µελέτες έχουν αναφέρει µειωµένη συγκέντρωση δισµουτάσης του υπεροξειδίου, καταλάσης, γλουταθειόνης και ασκορβικού οξέος στο πλάσµα ή στο ιστό σε διαβητικά ζώα και ανθρώπους και αυξηµένο οξειδωτικό στρες (Evans et al., 2002, Brownlee et al., 2001). Παρόλα αυτά, δεν είναι ακόµη γνωστός ο µηχανισµός της υπεργλυκαιµίας που οδηγεί σε αυξηµένο οξειδωτικό στρες. Πιθανώς, η αυξηµένη παραγωγή των ROS και η µειωµένη ικανότητα του κυτταρικού αντιοξειδωτικού µηχανισµού άµυνας δρουν συνεργαστικά µε αποτέλεσµα την παραγωγή οξειδωτικού στρες στο διαβήτη. Η υπεργλυκαιµία αυξάνει την παραγωγή οξειδωτικών παραγόντων µέσω πολλών µονοπατιών και όχι µόνο ενός κυρίαρχου µονοπατιού. Η γλυκόζη υφίσταται µη ενζυµατικές αντιδράσεις προς σχηµατισµό γλυκο-οξειδωτικών µέσων (Evans et al., 2002). Ο µεταβολισµός της αυξηµένης ενδοκυτταρικής γλυκόζης γίνεται µέσω της ρεδουκτάσης της αλδόζης, της µιτοχονδριακής οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και της ενεργοποίησης των NAD(P)H οξειδασών (Ceriello et al., 2003). Μοντέλα αρουραίων µε χρόνια φάση διαβήτη παρουσιάζουν ανωµαλίες στη διαστολική λειτουργία της αριστερής κοιλίας (Fang et al., 2004, Rodrigues et al., 1998, Severson, 2004) καθώς και υπερτροφία της αριστερής κοιλίας (Bertoni et al.,

13 2003). Επειδή δυσλειτουργία της διαστολής παρατηρείται και σε ασθενείς µε διαβήτη τύπου 1 και 2, προτάθηκε ότι ο διαβήτης µπορεί άµεσα να επάγει ανωµαλίες στον καρδιακό ιστό ανεξάρτητα των αγγειακών δυσλειτουργιών και δυσλειτουργίες πρωτεϊνών που ρυθµίζουν τη ροή ιόντων και κυρίως του ενδοκυτταρικού ασβεστίου (Golfman et al., 1996, Tahiliani et al., 1986). Οι δυσλειτουργίες αυτές οφείλονται στην αυξηµένη ακαµψία του τοιχώµατος της αριστερής κοιλίας σε συνδυασµό µε τη συσσώρρευση συνδετικού ιστού και αδιάλυτου κολλαγόνου (Anguera et al., 1998, Rodrigues et al., 1995, Saito et al., 2003) Εικόνα 3. Συνέπειες των µεταβολών στον καρδιακό µεταβολισµό στον διαβήτη. Μετά την επαγωγή της ασθένειας η αυξηµένη πρόσληψη λιπαρών οξέων ενισχύει την εκµετάλλευση και αποθήκευση των λιπαρών οξέων, γεγονός που συνεισφέρει στην µείωση της γλυκόλυσης και της οξείδωσης της γλυκόζης. Υψηλό ποσοστό οξείδωσης λιπαρών οξέων αυξάνει τη δηµιουργία ενεργών µορφών οξυγόνου, παράλληλα µε την αυξηµένη λιπιδική αποθήκευση, οδηγώντας σε λιποτοξικότητα και µιτοχονδριακή δυσλειτουργία. Υψηλό ποσό οξείδωσης των λιπαρών οξέων αυξάνει επίσης τις απαιτήσεις για οξυγόνο και µειώνει την καρδιακή επάρκεια. Όλα αυτά συνεισφέρουν στην ανάπτυξη καρδιοµυοπάθειας που επάγεται από το διαβήτη. (Ding An and Brian Rodrigues, 2006).

14 Οι υδατάνθρακες και τα λιπαρά οξέα αποτελούν την κυριότερη πηγή ενέργειας για την καρδιά. Σε φυσιολογικές συνθήκες, το 70% του ΑΤΡ που απαιτείται για το µυοκάρδιο, παράγεται µέσω οξείδωσης των λιπαρών οξέων και το υπόλοιπο 30% από τη γλυκόζη (Gertz et al., 1988, Saddik et al., 1991). Στο διαβήτη τύπου 1 και 2 οι µηχανισµοί της πρόσληψης γλυκόζης, της γλυκόλυσης και της οξείδωσης του πυροσταφυλικού δυσλειτουργούν. Επιπρόσθετα, η απουσία της λειτουργίας της ινσουλίνης αυξάνει τη λιπόλυση και την απελευθέρωση λιπαρών οξέων από τον λιπώδη ιστό (εικόνα 3). Κάτω από τις συνθήκες αυτές, η καρδιά προσαρµόζεται άµεσα να χρησιµοποιήσει τα λιπαρά οξέα αποκλειστικά για παραγωγή ενέργειας. Σε χρόνια φάση όµως, αυτή η µη φυσιολογική προσαρµοστικότητα της καρδιάς οδηγεί σε καρδιοµυοπάθεια. 3.ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ ΣΤΑ ΚΑΡ ΙΑΚΑ ΜΥΟΚΥΤΤΑΡΑ Η ενεργειακή και η λιπιδική οµοιόσταση στα καρδιοµυοκύτταρα βασίζεται στην συγχρονισµένη ρύθµιση της πρόσληψης λιπιδίων, της οξείδωσης της σύνθεσης τριγλυκεριδίων (TG) και της έκκρισης λιποπρωτεϊνών. Η αυξηµένη πρόσληψη λιπαρών οξέων, η µειωµένη οξείδωση λιπαρών οξέων (FAO) ή η µειωµένη έκκριση λιπιδίων συµβάλλουν στη συσσώρευση λιπιδίων στα καρδιοµυοκύτταρα. Σε φυσιολογικη κατάσταση, τα λιπαρά οξέα και οι υδατάνθρακες όπως είναι η γλυκόζη αποτελούν ενεργειακά υποστρώµατα για τον µετεµβρυικό καρδιακό µυ (van der Vusse et al., 1992). Μη φυσιολογική λειτουργία του ενεργειακού µεταβολισµού σχετίζεται µε την καρδιακή υπερτροφία αλλά και την ισχαιµία του µυοκαρδίου (Massie et al., 1995) (εικόνα 4).

15 Εικόνα 4. Σχηµατική απεικόνιση του λιπιδικού και ενεργειακού µεταβολισµού στα καρδιοµυοκύτταρα. Τα λιπαρά οξέα αποτελούν την κύρια πηγή υποστρωµάτων που χρησιµοποιούν τα καρδιοµυοκύτταρα για παραγωγή ενέργειας. Ελεύθερα λιπαρά οξέα (FFA),σύνθεση τριγλυκεριδίων (TG), λιποπρωτεΐνες χαµηλής πυκνότητας (LDL), λιποπρωτεΐνη πολύ χαµηλής πυκνότητας (VLDL), πρωτεΐνη πρόσδεσης λιπαρών οξέων ( FATP), συνθετάση της µεγάλης αλυσίδας του ακετυλο-coa (LACS), τρανσλοκάση λιπαρών οξέων (FAT/CD36), παλµιτοϋλ-τρανσφεράση-ι (CPT-1), τρανσλοκάση της καρνιτίνης-ακυλκαρνιτίνης (CACT), δεϋδρογονάση της µεγάλης αλυσίδας του ακυλο-coa (LCAD), δεϋδρογονάση της 3-υδροξυακυλο- CoA (HAD). Το πρωταρχικό υπόστρωµα για παραγωγή ΑΤΡ στο φυσιολογικό µυοκάρδιο είναι τα λιπαρά οξέα. Αντίθετα, η εµβρυική καρδιά, η οποία λειτουργεί σε ένα σχετικά υποξικό περιβάλλον, αντλεί ενέργεια από τον καταβολισµό της γλυκόζης και του γαλακτικού οξέος. Η µετάβαση στη χρησιµοποίηση των λιπαρών οξέων για την παραγωγή ενέργειας ξεκινά κατά τη µετεµβρυική περίοδο όταν η διατροφή αποτελείται πλήρως από γάλα υψηλών λιπαρών και συνοδεύεται από αύξηση της έκφρασης γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυµα του καρδιακού µιτοχονδριακού µονοπατιού της β-οξείδωσης λιπαρών οξέων. Στην καρδιά, η ικανότητα αποθήκευσης

16 λιπιδίων είναι περιορισµένη και υπό φυσιολογικές συνθήκες, τα περισσότερα λιπαρά οξέα που εισέρχονται στα µυοκύτταρα οξειδώνονται. Η είσοδος στα µυοκύτταρα γίνεται µέσω µεταφορέων: πρωτεΐνη µεταφοράς λιπαρών οξέων (FATP) και τρανσλοκάση λιπαρών οξέων (FAT/CD36). Η µεταφορά λιπαρών οξέων στα µιτοχόνδρια γίνεται µέσω τρανσεστεροποίησης από την παλµιτοϋλτρανσφεράση Ι της καρνιτίνης (CPT I) και συνεπώς µετατόπιση διαµέσω της εσωτερικής µιτοχονδριακής µεµβράνης από την τρανσλοκάση της καρνιτίνης/ακυλοκαρνιτίνης. Στο σηµείο αυτό οι ακυλοκαρνιτίνες επαναεστεροποιούνται σε παράγωγα του ακετυλο CoA από την CPT IΙ και έλικα της β-οξείδωσης η οποία καταλύεται από δεϋδρογονάσες (Barger et al., 2000). Οι διαταραχές της ενέργειας του µυοκαρδίου και της οµοιόστασης των λιπιδίων αποτελούν κοινό χαρακτηριστικό πολλών καρδιακών δυσλειτουργιών. Ο κυριότερος καθοριστής της ενέργειας του µυοκαρδίου και της λιπιδικής οµοιόστασης είναι ένα µεταγραφικό δίκτυο το οποίο ελέγχει τη ροή της ενέργειας επιδρώντας στα επίπεδα έκφρασης καθοριστικών πρωτεϊνών σε διάφορα µεταβολικά µονοπάτια. Η αλλαγή της έκφρασης των γονιδίων που στοχεύουν στο µεταβολισµό των λιπαρών οξέων στην καρδιά σχετίζεται µε αλλαγές υποστρωµάτων σε παθολογικές καταστάσεις. 4. PPARs (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors) Οι υποδοχείς που ενεργοποιούνται από πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωµάτων Οι PPARs αποτελούν τους κυριότερους µεταγραφικούς ρυθµιστές του µεταβολισµού των λιπαρών οξέων. Ανήκουν στην υπεροικογένεια των πυρηνικών ορµονικών υποδοχέων δηλαδή ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες εξαρτώµενες από συνδέτες οι οποίες προάγουν τη µεταγραφή εξειδικευµένων γονιδίων µέσω πρόσδεσης σε συγκεκριµένες DNA ακολουθίες έπειτα από ενεργοποίηση από τον κατάλληλο συνδέτη (Di Paola, 2007). Τα λιπαρά οξέα ή/ και οι µεταβολίτες λιπιδίων αποτελούν ενδογενείς συνδέτες των PPARs µεσολαβώντας στις προσαρµοστικές µεταβολικές αποκρίσεις λόγω αλλαγών της συστηµατικής παροχής ενέργειας (Kliewer et al., 2001). Μερικοί φυσικοί συνδέτες που έχουν αναγνωριστεί είναι το λευκοτριένιο Β 4, το 8-S-υδροξυεικοσατετρανοϊκό οξύ και το 15-δεοξυ- -προσταγλανδίνη J2 (15d-

17 PGJ 2 ) (Devchand et al., 1996). Τα φάρµακα φιµπράτες και στατίνες αποτελούν συνδέτες του PPAR-α και οι αντιδιαβητικές θειαζολιδινεδιόνες (TZDs) του PPAR-γ. Όσον αφορά την έκφρασή τους, ο PPAR-α εκφράζεται κατά κύριο λόγο στο ήπαρ (Auboeuf et al., 1997, Braissant et al., 1996), o PPAR-γ στο λιπώδη ιστό (Braissant et al., 1996, Fajas et al., 1997). O PPAR-β/δ εκφράζεται στους περισσότερους ιστούς (Escher et al., 2001) µε εξαιρετικά υψηλότερη έκφραση στο έντερο, τα κερατινοκύτταρα και το ήπαρ (Girroir et al., 2008b). Τα υπεροξειδιοσώµατα είναι κυτταροπλασµατικά οργανίδια διαµέτρου 0.2 έως 1 µμ, τα οποία περιβάλλονται από µια µεµβράνη, που τα διαχωρίζει από το εξωτερικό τους περιβάλλον και περιέχουν κυρίως υπεροξειδιοσωµατικά ένζυµα. Τα ένζυµα αυτά σχετίζονται µε καταβολικά και αναβολικά µονοπάτια κυρίως του µεταβολισµού των λιπιδίων, όπως η διάσπαση των λιπαρών οξέων και των παραγώγων τους µέσω της β- οξείδωσης και της σύνθεσης λιπιδίων ή χοληστερόλης. Υποστρώµατα για τη β- οξείδωση στα υπεροξειδιοσώµατα αποτελούν τα λιπαρά οξέα (µέχρι 20 άτοµα άνθρακα), τα δικαρβοξυλικά λιπαρά οξέα, οι προσταγλανδίνες, ξενοβιοτικές ουσίες κ.α. Στα υπεροξειδιοσώµατα πέρα από τη βασική λειτουργία τους που είναι η απενεργοποίηση των ανιόντων του υπεροξειδίου µε το ένζυµο καταλάση και το σχηµατισµό του υπεροξειδίου του υδρογόνου, επιτελείται και η οξειδωτική διάσπαση των πολυαµινών, των πουρινών, των D-αµινοξέων και των 2-L-υδροξυοξέων (Mannaerts and Veldhoven, 1993; Osmundsen et al., 1991). Στα τρωκτικά, µετά την έκθεση σε µια ποικιλία ουσιών, όπως υπολιπιδαιµικά φάρµακα, παρατηρείται δραµατική αύξηση στο µέγεθος και τον αριθµό των υπεροξειδιοσωµάτων στο ήπαρ και σε µικρότερο βαθµό στην καρδιά και στα νεφρά. Ο πολλαπλασιασµός των υπεροξειδιοσωµάτων στα τρωκτικά, συνοδεύεται από ηπατοµεγαλία και από αύξηση της µεταγραφής των γονιδίων που σχετίζονται µε τη µικροσωµική και υπεροξειδιοσωµατική β-οξείδωση των λιπαρών οξέων, καθώς και από τροποποιήσεις του µεταβολισµού των λιπιδίων, όπως η ελάττωση των επιπέδων των τριγλυκεριδίων και της χοληστερόλης στον ορό (Lazarow and deduve, 1976; Rao and Reddy, 1987). Υπό φυσιολογικές συνθήκες η β-οξείδωση στα υπεροξειδιοσώµατα αντιπροσωπεύει µόνο ένα µικρό τµήµα του καταβολισµού των λιπαρών οξέων σε σχέση µε τη µιτοχονδριακή β-οξείδωση. Η β-οξείδωση στα υπεροξειδιοσώµατα χρησιµοποιείται στα τρωκτικά κυρίως σε περιόδους που παρουσιάζεται συσσώρευση λιπιδίων (διατροφή πλούσια σε λίπη, ή µεταβολικές διαταραχές όπως στέρηση της τροφής και διαβήτης). Το φαινόµενο του

18 πολλαπλασιασµού των υπεροξειδιοσωµάτων δε συµβαίνει στους ανθρώπους και σε άλλα είδη, παρόλο που τα υπεροξειδιοσώµατα είναι σηµαντικά οργανίδια (Vamecq and Draye, 1989). Η µοριακή βάση αυτής της διαφοροποίησης ανάµεσα στα είδη δεν είναι γνωστή. Επειδή ο πολλαπλασιασµός των υπεροξειδιοσωµάτων, όπως προαναφέρθηκε, συνδέεται µε την επαγωγή της µεταγραφής γονιδίων που σχετίζονται µε τη µικροσωµική και υπεροξειδιοσωµατική β-οξείδωση, λογική ήταν η υπόθεση της ύπαρξης κάποιου µεταγραφικού παράγοντα που στηρίζει το συγκεκριµένο φαινόµενο. Οι Isseman και Green (1990) ανέφεραν την κλωνοποίηση και το χαρακτηρισµό ενός καινούριου πυρηνικού υποδοχέα από τον ποντικό, που ενεργοποιούνταν από αρκετούς από τους γνωστούς πολλαπλασιαστές των υπεροξειδιοσωµάτων. Αυτός ο καινούριος υποδοχέας ονοµάστηκε υποδοχέας που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωµάτων (Peroxisome Proliferator- Activated Receptor - PPAR) και σήµερα είναι γνωστό ότι αναφέρονταν συγκεκριµένα στον τύπο PPARα (NR1C1). Το 1992 στο εργαστήριο του W.Wahli κλωνοποιήθηκε από τον Xenopus laevis ο PPARα, όπως και άλλοι δυο τύποι υποδοχέων οι οποίοι ονοµάστηκαν PPARβ (NR1C2) και PPARγ (NR1C3) που παρουσίασαν µεγάλη οµοιότητα µε τον PPARα και κωδικοποιούνταν από δυο διαφορετικά γονίδια (Dreyer et al., 1992 Οι PPARα και PPARγ είναι αρκετά συντηρηµένοι ανάµεσα στα είδη, ενώ ο τρίτος τύπος PPAR παρουσιάζει αρκετές διαφοροποιήσεις ανάµεσα στα θηλαστικά και στον Xenopus laevis. Λόγω αυτών των διαφοροποιήσεων, δόθηκε η ονοµασία PPARδ στα θηλαστικά (Kliewer et al., 1994). Η κλωνοποίηση όµως του PPARβ από το κοτόπουλο έδωσε τη δυνατότητα της κατασκευής ενός εξελικτικού δέντρου, στο οποίο είναι φανερό ότι ο PPARβ από τον Xenopus laevis και ο PPARδ των θηλαστικών είναι οµόλογοι τύποι (Takada et al., 2000). Στο εξής θα αναφέρεται ο συγκεκριµένος τύπος ως PPARβ/δ. 4.1 Μεταγραφική δραστικότητα των PPARs Οι πυρηνικοί υποδοχείς ρυθµίζουν τη µεταγραφή γονιδίων λειτουργώντας ως µεταγραφικοί παράγοντες, που ενεργοποιούνται στις περισσότερες περιπτώσεις από προσδέτες και συνιστούν µια από τις µεγαλύτερες οικογένειες µεταγραφικών παραγόντων, την επονοµαζόµενη υπεροικογένεια των πυρηνικών ορµονικών υποδοχέων (NHR - Nuclear Hormone Receptors), στην οποία συµπεριλαµβάνονται

19 υποδοχείς όπως οι κλασσικοί ενδοκρινείς. Όπως και άλλοι µεταγραφικοί παράγοντες έχουν ενεργό ρόλο στην αναδιάταξη της χρωµατίνης και λειτουργούν είτε µόνοι τους, είτε σε συνεργασία µε συνενεργοποιητές και συγκαταστολείς για την ενεργοποίηση ή την καταστολή της έκφρασης γονιδίων, αντίστοιχα. Αρκετές ορµόνες, βιοενεργά λιπίδια και άλλα µικρά φυσικά ή συνθετικά οργανικά µόρια µπορούν να αποτελέσουν προσδέτες αυτών των υποδοχέων (Glass and Rosenfeld, 2000). Υπάρχουν δυο κατηγορίες πυρηνικών ορµονικών υποδοχέων σε σχέση µε τη θέση που βρίσκονται µέσα στο κύτταρο. Υπάρχουν οι πυρηνικοί υποδοχείς των οποίων η µετατόπιση στον πυρήνα προϋποθέτει την παρουσία προσδετών και αυτοί οι οποίοι είναι µόνιµα τοποθετηµένοι στον πυρήνα, ανεξάρτητα από την παρουσία προσδετών. Οι PPARs ανήκουν στη δεύτερη κατηγορία. Ετεροδιµερίζονται µε έναν άλλο πυρηνικό υποδοχέα, τον υποδοχέα του 9-cis-ρετινοϊκού οξέος RXR σχηµατίζοντας έτσι ένα σύµπλοκο το οποίο αλληλεπιδρά µε συγκεκριµένα στοιχεία απόκρισης DNA στις περιοχές των προαγωγέων των γονιδίων στόχων (εικόνα 6). Όταν ενεργοποιηθεί από τη πρόσδεση του συνδέτη, το ετεροδιµερές σύµπλοκο αποδεσµεύει τους συγκαταστολείς και στρατολογεί συνενεργοποιητές της µεταγραφής και ρυθµίζει τη µεταγραφή γονιδίων που εµπλέκονται στον έλεγχο του µεταβολισµού λιπιδίων και υδατανθράκων (Βerger et al., 2005). Πιο αναλυτικά, η περιοχή Α/Β καταλαµβάνει το αµινοτελικό τους άκρο και είναι η λιγότερη συντηρηµένη περιοχή ανάµεσα στα µέλη της υπεροικογένειας, µε ποικίλο µέγεθος και µε µια αυτόνοµη περιοχή ενεργοποίησης, την AF-1 (Activation- Function 1). Ακόµα πολλές φορές διαφοροποιείται µε µεταµεταφραστικές τροποποιήσεις, όπως φωσφορυλίωση, η οποία φαίνεται να διαδραµατίζει καθοριστικό ρόλο για τη µεταγραφική δραστικότητα της AF-1 περιοχής (Shao and Lazar, 1999). Η δέσµευση των πυρηνικών υποδοχέων στο DNA πραγµατοποιείται από τις δύο εξελικτικά συντηρηµένες περιοχές τους, που λειτουργούν ανεξάρτητα για να ρυθµίσουν τις αλληλεπιδράσεις DNA-πρωτεΐνης και τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνηςπρωτεΐνης. Οι αλληλεπιδράσεις DNA-πρωτεΐνης ρυθµίζονται από την C ή DBD (DNA-binding domain) περιοχή. Η συντηρηµένη DBD περιοχή, συνίσταται από δυο δακτύλους ψευδαργύρου και είναι η περιοχή µε την οποία προσδένονται οι υποδοχείς στο DNA.. Η D περιοχή, είναι λιγότερο εξελικτικά συντηρηµένη από τις γειτονικές περιοχές DBD και LBD και λειτουργεί ως συνδετικός κρίκος τους. Η LBD περιοχή αποτελεί το βασικό γνώρισµα των πυρηνικών υποδοχέων. Είναι υπεύθυνη για πολλές και διαφορετικές λειτουργίες, οι περισσότερες από τις οποίες πραγµατοποιούνται

20 εξαρτώµενες από την παρουσία προσδέτη. Έτσι στην LBD περιοχή αποδίδεται η µεταγραφική δραστικότητα των υποδοχέων που εξαρτάται από τους προσδέτες (AF- 2, Activation Function-2) και εντοπίζεται µια πολύ βασική επιφάνεια διµερισµού (Gronemeyer and Laudet, 1995; Chambon, 1996; Moras and Gronemeyer,1998). Ξεκινούν αλληλεπιδράσεις µε µια σειρά µεταγραφικών παραγόντων, µέσω των οποίων µεταβιβάζεται το σήµα στο βασικό σύµπλοκο της µεταγραφής, επάγοντας τη µεταγραφή του γονιδίου. Όπως η Α/Β περιοχή, οι LBD και F περιοχές είναι επίσης στόχοι µεταµεταφραστικών τροποποιήσεων, γεγονός το οποίο προσθέτει ακόµη ένα επίπεδο πολυπλοκότητας στη µεταγωγή µηνυµάτων από τους πυρηνικούς υποδοχείς, εφόσον τέτοιες διαδικασίες µπορούν να επηρεάσουν τις ιδιότητές τους. (Laudet and Gronemeyer, 2002, The Nuclear Receptor, Facts Book). Το αποκρινόµενο στοιχείο των ορµονών (HRE Hormone Response Element) είναι µια ειδική ακολουθία DNA στον προαγωγέα των γονιδίων που αναγνωρίζουν οι πυρηνικοί ορµονικοί υποδοχείς (εικόνα 5). Οι PPARs α και γ, όπως και άλλα µέλη της υπεροικογένειας των πυρηνικών ορµονικών υποδοχέων είναι φωσφοπρωτεΐνες. Εναλλακτικό µονοπάτι για την ενεργοποίηση της µεταγραφικής δραστικότητας των PPARs αποτελεί η φωσφορυλίωσή τους, που επάγεται από ορµόνες και αναπτυξιακούς παράγοντες. Εικόνα 5. Σχηµατική απεικόνιση της αλληλεπίδρασης των πυρηνικών υποδοχέων µε συνενεργοποιητές και το βασικό σύµπλοκο της µεταγραφής (Carlberg, 2004).

21 Εικόνα 6. Μεταγραφική ενεργοποίηση και δοµή των PPARs 4.2 α) Φυσικοί προσδέτες των PPARs Αν και αρκετές πληροφορίες σχετικά µε τη λειτουργία των PPARs αποκτήθηκαν από την εύρεση των συνθετικών ουσιών που αποτελούν προσδέτες γι αυτούς, για την πλήρη κατανόηση της φυσιολογίας τους είναι απαραίτητη η εύρεση των φυσικών προσδετών τους. Το εργαστήριο του Gustafsson ήταν το πρώτο που έδειξε ότι ο PPARα ενεργοποιείται από µικροµοριακές συγκεντρώσεις πολλών λιπαρών οξέων, που διαφοροποιούνται στο µέγεθος της αλυσίδας και το βαθµό του κορεσµού (Gottlicher et al., 1992). Η αναζήτηση για φυσικούς προσδέτες του PPARα στον ανθρώπινο ορό, οδήγησε στην αναγνώριση του παλµιτικού οξέος, του ολεϊκού οξέος, του λινολεϊκού οξέος και του αραχιδονικού οξέος, ως αγωνιστές του (Banner et al., 1993). Μετέπειτα εργασίες έδειξαν ότι και οι PPAR β και γ ενεργοποιούνται από λιπαρά οξέα. Οι τρεις τύποι PPAR ενεργοποιούνται από διαφορετικά λιπαρά οξέα. Ο PPARα παρουσιάζει το πιο ευρύ φάσµα, αλληλεπιδρώντας και µε κορεσµένα και πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Το γεγονός ότι µόνο ο PPARα µπορεί να δεσµεύει

22 τόσο ευρύ φάσµα κορεσµένων λιπαρών οξέων (Xu et al., 1999), οφείλεται στην πιο υδρόφοβη «τσέπη» της LBD περιοχής του. Το κανάλι εισόδου των προσδετών στον PPARα σφραγίζεται εν µέρει από την Tyr-334. Επιπρόσθετα, αρκετές από τις υδρόφιλες ακολουθίες του PPARγ που έρχονται σε επαφή µε τον προσδέτη, στον PPARα µετατρέπονται σε πιο υδρόφοβες ακολουθίες (Xu et al., 2001). Γι αυτό ίσως δεν µπορεί να δεσµεύσει κάποια υδροξυλιωµένα λιπαρά οξέα, τα οποία αποτελούν ειδικούς προσδέτες για τον PPARγ (Kliewer et al., 1997). Ο PPARγ είναι ο πιο επιλεκτικός τύπος αλληλεπιδρώντας µε µια ορισµένη οµάδα πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, περιλαµβάνοντας το ΕΡΑ (εικοσαπεντανοϊκό οξύ) και το αραχιδονικό οξύ. Κορεσµένα και ακόρεστα λιπαρά οξέα αποτελούν προσδέτες και του PPARβ, παρουσιάζοντας όµως µικρότερη συγγένεια σε σχέση µε τον PPARα. Τα αποτελέσµατα αυτά ήταν απρόσµενα γνωρίζοντας ότι τα εικοσανοειδή ρυθµίζουν τις περισσότερες από τις βιολογικές δράσεις τους µέσω αλληλεπιδράσεων µε τις πρωτεΐνες G που συνδέονται στις κυτταρικές µεµβράνες. Η 15d-PGJ2 είναι προσδέτης του PPARγ, ενώ το 8(S)-HETE του PPARα. Πιθανόν η ρυθµιζόµενη µετατροπή των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων σε εικοσανοειδή µέσω των µονοπατιών της κυκλοοξυγενάσης ή της λιποξυγενάσης, να αποτελεί ένα µηχανισµό που ρυθµίζει τις ενεργοποιήσεις ενός ή περισσοτέρων τύπων PPAR. 4.2 β). Προτεινόµενοι συνδέτες του PPARβ/δ Μελέτες έδειξαν ότι φυσικούς συνδέτες του PPARβ/δ αποτελούν τα λιπαρά οξέα όπως είναι το εικοσαπεντανοϊκό οξύ (Χu et al., 1999), το Ζ-οκταδεκανοϊκό οξύ, το παλµιτικό και το στεατικό οξύ (Fyffe et al., 2006). Με ενδιαφέρον παρατηρήθηκε ότι ενώ πολλά παράγωγα λιπαρών οξέων µπορούν να συνδεθούν στον συγκεκριµένο υποδοχέα, δεν λειτουργούν όλα ως ενεργοποιητές του. Βιολογικά σκευάσµατα τα οποία έχουν αναφερθεί ότι ενεργοποιούν τον PPARβ/δ, περιλαµβάνουν λευκοτριένια και προσταγλανδίνες όπως είναι η προσταγλανδίνη Α1 και η καρβαπροστακυκλίνη (Kersten et al., 2000). Επίσης, το ρετινοϊκό οξύ βρέθηκε ότι ενεργοποιεί τον PPARβ/δ και µάλιστα εµφανίζει µεγαλύτερη συγγένεια µε τη συγκεκριµένη ισοµορφή σε σύγκριση µε τις α και γ (Shaw et al., 2003). Το ρετινοϊκό οξύ ενισχύει την ικανότητα του PPARβ/δ να επάγει την έκφραση ενός γονιδίου αναφοράς που προέρχεται από τα PPRE (Shaw et al., 2003), προτείνοντας έτσι ότι λειτουργεί ως ειδικός συνδέτης του.

23 Το ρετινοϊκό οξύ διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο στην εµβρυονική ανάπτυξη αλλά και στην περαιτέρω ανάπτυξη διότι εµπλέκεται στον κυτταρικό µεταβολισµό, στον πολλαπλασιασµό, στη διαφοροποίηση και στην απόπτωση. (Αltucci et al., 2001, Donato et al., 2005). Όσον αφορά τους συνθετικούς συνδέτες, ο Sznaidman και οι συνεργάτες του το 2003 µέσω της συνδυαστικής χηµείας σχεδίασαν διάφορες δοµές λιπόφιλων καρβοξυλικών οξέων και κατέληξαν στις βελτιωµένες µορφές GW0742 και GW µε εξειδίκευση για τον PPARβ/δ 1000 φορές περισσότερο από τις άλλες συνθετικές µορφές. Εικόνα 7. Η χηµική δοµή του GW0742, του ειδικού συνθετικού συνδέτη του PPARβ/δ. 4-[2-(3-Fluoro-4-trifluoromethyl-phenyl)-4-methyl-thiazol-5-ylmethylsulfanyl]- 2methyl-phenoxy}-acetic acid (C 21 H 17 F 4 NO 3 S 2 ). Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκε ο εξειδικευµένος συνδέτης του PPARβ/δ GW0742 (εικόνα 7). Ο θειοφαινολικός δακτύλιος του µορίου του αποδίδει αντιοξειδωτικές και αντισηπτικές ιδιότητες Η ισοµορφή των PPARs, PPARβ/δ Ο PPARβ/δ εκφράζεται σε όλους τους ιστούς, όντας και ο κυρίαρχος τύπος PPAR σε αρκετούς από αυτούς. Το ευρύ ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του PPARβ/δ του αρουραίου δεν προσέφερε πληροφορίες για τους ρόλους που µπορεί να διαδραµατίζει στον οργανισµό. Γι αυτό το λόγο µελετήθηκε η έκφραση του σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια, µε σκοπό την εύρεση στοιχείων που θα ενέπλεκαν τον PPARβ/δ σε κάποιες συγκεκριµένες λειτουργίες. Παρόµοιες µελέτες στον Xenopus laevis και

24 στους ποντικούς έδειξαν ότι ο PPARβ/δ εκφράζεται από νωρίς κατά την ανάπτυξη (Dreyer et al., 1992; Kliewer et al., 1994). Στον αρουραίο, χρησιµοποιώντας την in situ υβριδοποίηση, µελετήθηκε από τους Braissant and Wahli, (1998), η έκφραση των τριών τύπων PPAR κατά τις εµβρυακές ηµέρες (Ε) Ε8.5, Ε11.5, Ε15.5 και Ε18.5. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι οι PPAR α και γ εµφανίζονται αργά κατά την ανάπτυξη (Ε13.5) και κυρίως στους ιστούς που θα εκφράζονται και στα ενήλικα άτοµα. Σε αντίθεση µε την περιορισµένη έκφραση των PPAR α και γ, ο PPARβ/δ εκφράζεται παντού και πολύ νωρίς κατά την εµβρυογένεση, µε µέγιστο βαθµό έκφρασης στο αναπτυσσόµενο νευρικό σύστηµα στην Ε13.5. Αργά κατά την ανάπτυξη (Ε18.5), τα επίπεδα της έκφρασης του PPARβ/δ µειώνονται σε εκείνα που θα παραµείνουν και στους ενήλικους ιστούς. Αυτή η έντονη έκφραση του PPARβ/δ κατά τα διάφορα στάδια της ανάπτυξης, προκάλεσε το ενδιαφέρον των ερευνητών και έτσι αποδείχτηκε ότι ο συγκεκριµένος τύπος PPAR είναι πολύ σηµαντικός για την ανάπτυξη του οργανισµού ελέγχοντας σηµαντικά µεταβολικά µονοπάτια, όπως αυτά που σχετίζονται µε τη σύνθεση των µεµβρανών, την πρόοδο (turnover) και τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Αυτό επιβεβαιώνεται από το γεγονός ότι knock-out µοντέλο για τον PPARβ/δ είναι πολύ δύσκολο να δηµιουργηθεί λόγω της µεγάλης θνησιµότητας που παρατηρείται στα πειραµατόζωα. Πρόσφατες µελέτες, έδειξαν ότι µπορεί να επάγει την αντίστροφη µεταφορά της χοληστερόλης και να διορθώσει τα πρότυπα των λιποπρωτεϊνών και των επιπέδων των τριγλυκεριδίων σε παχύσαρκους Rhesus πιθήκους (Oliver et al., 2001). Πιο πιθανό είναι ο PPARβ/δ να παίζει κάποιο ρόλο στη διαφοροποίηση των κυττάρων του λιπώδους ιστού (Bastie et al., 1999). Κατά την αναδιαµόρφωση της αριστερής κοιλίας, η σύνθεση και έκκριση των µεταλλοπρωτεασών ΜΜΡs (µέλη της οικογένειας των εξαρτώµενων από ψευδάργυρο ενζύµων που αποικοδοµούν την εξωκυττάρια ουσία) από τα µυοκύτταρα της αριστερής κοιλίας επιταχύνεται (Sakata et al., 2004). Μετά τη σύνθεση του ειδικού συνδέτη του PPARβ/δ GW0742 (Sznaidman et al., 2003 ), o Polak και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι η στοµατική χορήγηση του GW0742 µείωσε την αστρογλοιακή και µικρογλοιακή φλεγµονώδη ενεργοποίηση και τα επίπεδα της IL-1β σε ποντίκια C57BL/6 µε πειραµατική αυτοάνοση εγκεφαλοµυελίτιδα (Polak et al., 2005). ιάφορες µελέτες αναφέρουν ότι ο PPARβ/δ διαδραµατίζει κυρίαρχο ρόλο στη ρύθµιση του καρδιακού λιπιδικού µεταβολισµού και εποµένως αποτελεί πιθανό θεραπευτικό στόχο της λιποτοξικής καρδιοµυοπάθειας και άλλων καρδιαγγειακών ασθενειών (Cheng et al., 2004). Παρόλα αυτά, δεν έχει ακόµη διευκρινιστεί αν η

25 ενεργοποίηση του PPARβ/δ από το συνδέτη του έχει αντιφλεγµονώδη δράση στα καρδιακά µυοκύτταρα και η δράση του στη ρύθµιση της καρδιακής υπερτροφίας. Οι Sheng et al., 2007 παρατήρησαν µε την επίδραση του GW0742 αναστολή την επαγόµενης από AngII υπερτροφίας των καρδιοµυοκυττάρων, ανοδική ρύθµιση του mrna του PPARβ/δ και της πρωτεϊνικής έκφρασης καθώς και µειωµένη έκφραση των ΜΜΡ2, ΜΜΡ9 και IL-1β σε υπερτροφικά µυοκύτταρα. Προτάθηκε ότι ο GW0742 ίσως αποτελεί την έναρξη του σηµατοδοτικού µονοπατιού του PPARβ/δ και συνεπώς επιτυγχάνει την αντιυπερτροφική δράση του στο µυοκάρδιο αναστέλλοντας την φλεγµονώδη απόκριση (Sheng et al., 2007). 5. ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΟΥΜΕΝΕΣ ΑΠΟ ΜΙΤΟΓΟΝΑ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΕΣ ΚΙΝΑΣΕΣ (Mitogen activated protein kinases, MAPKs) 5.1 Βασικά χαρακτηριστικά Τα ευκαρυωτικά κύτταρα αντιδρούν σε διάφορα εξωτερικά ερεθίσµατα µε την ενεργοποίηση µηχανισµών κυτταρικής σηµατοδότησης. Είναι σηµαντικό ότι τα µονοπάτια µεταγωγής σήµατος µπορούν να συγκλίνουν ή να αποκλίνουν, επιτρέποντας έτσι σε διαφορετικές περιστάσεις την πυροδότηση διαφορετικών αλλά αλληλεπικαλυπτόµενων αποκρίσεων. Ένα από τα µείζονα συστήµατα που συµµετέχουν στη µεταγωγή σήµατος από την κυτταρική µεµβράνη στο πυρήνα και άλλους ενδοκυτταρικούς στόχους είναι η υψηλά συντηρηµένη υπεροικογένεια πρωτεϊνικών κινασών που ενεργοποιούνται από µιτογόνα (MAPKs). Τα µέλη της οικογένειας MAPK συµµετέχουν στη ρύθµιση ενός µεγάλου αριθµού κυτταρικών διαδικασιών όπως η κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση, ο κυτταρικός κύκλος, η επιβίωση και ο θάνατος. Εξάλλου η υψηλή συντηρητικότητα των κινασών αυτών στην εξελικτική κλίµακα υποδηλώνει την σηµασία τους. Τα µέλη της οικογένειας των ΜΑΡΚs είναι κινάσες Ser/Thr, η ενζυµική δραστικότητα των οποίων επάγεται µε τη διπλή φωσφορυλίωση τους σε αµινοξική ακολουθία, Thr-Χ-Tyr (όπου Χ µπορεί να είναι γλουταµινικό οξύ, γλυκίνη ή προλίνη), γνωστή ως βρόχος ενεργοποίησης (activation loop). Η ταυτότητα του X αµινοξέος καθορίζει τη ταξινόµηση των 12 µελών της οικογένειας, σε 3 επιµέρους υποοικογένειες: τις ERKs (extracellular signal-regulated kinase), τις p38 MAPK, και

26 τις JNKs (c-jun NH2-terminal kinase). Οι κινάσες των MAPKs (MAPK kinases) αναφέρονται ως MEKs και οι κινάσες των MEKs (MAPK kinase kinases) ως MEKKs. Οι ΜΑΡ κινάσες ενεργοποιούνται από ποικιλία ερεθισµάτων στα οποία συµπεριλαµβάνονται αυξητικοί παράγοντες, αγωνιστές των συζευγµένων µε G πρωτεΐνες υποδοχέων, κυτοκίνες καθώς και καταστάσεις στρες, όπως υπεριώδης ακτινοβολία, οξειδωτικό στρες, θερµικό σοκ, επίδραση επανεµποτισµού µετά από ισχαιµικό επεισόδιο, χηµικές ουσίες που προκαλούν βλάβες στο DNA, µηχανικό στρες, µεταβολές της ωσµωµοριακότητας κ.α. Η ενεργοποίηση των ΜΑΡ κινασών προϋποθέτει τη συντονισµένη και διαδοχική δραστηριοποίηση δυο κινασών, η οποία ακολουθεί το εξής χαρακτηριστικό πρότυπο: ΜΕΚΚ ΜΕΚ ΜΑΡΚ (Seger and Krebs 1995, Gutkind 1998, Gutkind 2000, Bogoyevitch 2000, Liebmann 2001, Michel 2001) (Εικονα 8). Η εξειδίκευση ανάµεσα στα εξωκυτταρικά ερεθίσµατα και τα διάφορα µόρια των MAPKs διασφαλίζεται αρχικά στο επίπεδο αλληλεπίδρασης των ΜΕΚs µε τις ΜΑΡΚs και στη συνέχεια κατά την αντίδραση των MAPKs µε τα υποστρώµατα τους. Η περιοχή των MEKs που σχετίζεται µε αυτή την εξειδίκευση εντοπίζεται στο αµινο- τελικό άκρο του µορίου τους και επιπλέον δε σχετίζεται µε τον βρόχο ενεργοποίησης στο µόριο των MAPKs. Όσον αφορά στις MAPKs, το αµινο-τελικό άκρο του µορίου τους φαίνεται να είναι υπεύθυνο για την υποδοχή του µηνύµατος από την ΜΕΚ, ενώ το καρβοξυτελικό άκρο τους είναι υπεύθυνο για την παράδοση του µηνύµατος στο υπόστρωµα. Έτσι, η πρωτοταγής δοµή των MAPKs και των υποστρωµάτων τους εξασφαλίζει την πυροδότηση συγκεκριµένης κυτταρικής απόκρισης από κάθε εξωκυτταρικό µήνυµα (Brunet and Pouyssιgur 1997). Επιπλέον, η πρόσφατη ταυτοποίηση µορίων ικανών να συνδέονται µε µέλη των σηµατοδοτικών οδών των MAPKs, γνωστές ως πρωτεΐνες σκαλωσιάς (scaffolding proteins), έδωσε δοµική υπόσταση στην εξειδίκευση κατά τη σηµατοδότηση των ευκαρυωτικών κυττάρων. Συγκεκριµένα, στην οδό των ERKs οι πρωτεΐνες Ksr και MP1 συνδέονται µε τις ERKs και την κινάση τους MEK1. Για την υποοικογένεια των JNKs, δυο πρωτεΐνες, µονοµερείς G πρωτεΐνες (Ras, Rho) αποτελούν κινάσες σερίνης/θρεονίνης, οι οποίες κατά την ενεργοποίηση τους φωσφορυλιώνουν την επόµενη κινάση του µοντέλου, ΜΕΚ. Οι ΜΕΚs συνιστούν πρωτεϊνικές κινάσες µε διπλή ειδικότητα για αµινοξικά κατάλοιπα Thr/Tyr, οι οποίες µε τη σειρά τους αναγνωρίζουν και φωσφορυλιώνουν τις MAPKs στην αλληλουχία Thr-Χ-Tyr (Brunet και Pouyssιgur 1997). Κρυσταλλογραφικές µελέτες έχουν δείξει ότι το µόριο των MAPKs αποτελείται από δυο βασικές περιοχές µεταξύ των οποίων βρίσκεται το

27 ενεργό τους κέντρο. Το ΑΤΡ συνδέεται σε αυτή τη σχισµή του ενεργού κέντρου τους, ενώ τα υποστρώµατα τους προσδένονται στο καρβοξυ-τελικό άκρο της ίδιας περιοχής (Knighton et al., 1991). Γνωστά υποστρώµατα τους είναι πληθώρα µεταγραφικών παραγόντων, άλλες πρωτεϊνικές κινάσες, φωσφολιπάσες και πρωτεΐνες που σχετίζονται µε τον κυτταρικό σκελετό. Λόγω της πολυπλοκότητας των βιοχηµικών οδών που ρυθµίζουν οι MAPKs είναι δύσκολο να προβλέψει κανείς τον τρόπο µε τον οποίο διασφαλίζεται η εξειδίκευση και η επιλεκτικότητα στη µεταγωγή των µηνυµάτων. Συνεπώς οι MAPKs συνιστούν σηµατοδοτικά µονοπάτια που καθορίζουν τόσο φυσιολογικές όσο και παθολογικές καταστάσεις στην καρδιά (αύξηση, διαφοροποίηση, υπερτροφία, ισχαιµίαεπανεµποτισµός, ανακοπή καρδιάς κτλ.) που συνδέονται άµεσα µεταξύ τους και ενεργοποιούνται από µια πληθώρα ενδo- και εξωκυτταρικών µηνυµάτων (εικόνα 8). Η αποσαφήνιση των µηχανισµών που ελέγχουν όλες τις παραπάνω διαδικασίες αποτελεί ερευνητική πρόκληση και παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω της συσχέτισης των κινασών µε παθοφυσιολογικές καταστάσεις της καρδιάς. Εικόνα 8. Οδοί σηµατοδότησης των MAPKs. ιακρίνονται τα τρία χαρακτηριστικά επίπεδα των οδών ERK1/2, JNKs και p38 MAPK (MEKKs, MEKs και MAPKs), καθώς και ορισµένα από τα υποστρώµατα τους (Sugden και Clerk 1998). RPTKs: Υποδοχείς µε ενδογενή δράση κινάσης τυροσίνης (Receptors protein tyrosine kinase), PMA: phorbol 12- myristate 13-acetate, MLKs: Mixed lineage kinases, TAOs: Thousand and one kinases.

28 5.2. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΜΑΡΚs ΣΤΗΝ ΚΑΡ ΙΑΚΗ ΥΠΕΡΤΡΟΦΙΑ ΥΠΟΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΤΩΝ ERKs (Extracellular signal-regulated (protein) kinases) Η ενεργοποίηση της υποοικογένειας των ERKs αποτελεί απόκριση σε αναπτυξιακούς παράγοντες οι οποίοι δρουν µέσω των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης ή µέσω των υποδοχέων των G-coupled πρωτεϊνών (Sudgen et al., 1995, Sadoshima et al., 1995). Έχει διαπιστωθεί ενεργοποίηση και µετατόπιση των ERK1/2 σε αποµονωµένη καρδιά αρουραίου ως απόκριση σε φυσική τάνηση η οποία επάγεται από την αύξηση της ενδοκοιλιακής πίεσης (Domingos et al., 2002). Σε αποµονωµένα καρδιοµυοκύτταρα αρουραίου, η ενεργοποίηση του µονοπατιού των ERK έχει αποδειχθεί ότι οφείλεται σε ενισχυµένη είσοδο ασβεστίου στα κύτταρα µέσω των καναλιών ασβεστίου τύπου-l και στους σηµατοδοτικούς µηχανισµούς που εµπλέκονται στη φωσφορυλίωση της κινάσης Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase 2) και του υποδοχέα του επιδερµικού αναπτυξιακού παράγοντα EGFR (Tahara et al., 2001). Η ΜΕΚ1/2 αποτελεί άµεσο ρυθµιστή των ERKs. Η ενεργοποίηση των ΜΕΚ περιλαµβάνει τη µικρή G πρωτεϊνη Ras, την 74kD κινάση σερίνης/ θρεονίνης, την κινάση Raf-1 και µερικές άλλες κινάσες που ανήκουν στην οικογένεια των PKC κινασών (Ahn et al., 1991, Warne et al., 1993, Kolch et al., 1993). Η ενεργοποίηση των ισοµορφών PKC από τη διακυλογλυκερόλη προϋποθέτει τη µετατόπιση τους από το κυτταρόπλασµα στη µεµβράνη. Φορβολεστέρες (phorbol esters), όπως το PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) δρουν ως ανάλογα της διακυλογλυκερόλης και επάγουν ισχυρή και εκτεταµένη ενεργοποίηση της PKC. Ειδικότερα, χρόνια διέγερση µε φορβολεστέρες οδηγεί σε µειορρύθµιση (downregulation) της PKC, γεγονός που πιθανώς οφείλεται σε αυξηµένη ευαισθησία των ενεργοποιηµένων PKC σε πρωτεολυτικά ένζυµα (Sugden and 1998). Ο τρόπος µε τον οποίο το µήνυµα µεταβιβάζεται από την PKC στις Raf πρωτεΐνες δεν είναι γνωστός. Σε ορισµένους κυτταρικούς τύπους, οι αγωνιστές των συζευγµένων µε Gq πρωτεΐνες υποδοχέων αυξάνουν τη συγγένεια της Ras για GTP, ενώ σε άλλες περιπτώσεις η PKC άµεσα φωσφορυλιώνει την Raf και επάγει την ενεργοποίηση των ERK1/2.Ο µηχανισµός ενεργοποίησης των ΜΕΚ βασίζεται στη φωσφορυλίωση στα δύο κατάλοιπα Ser στις υποπεριοχές των ΜΕΚ VII και VIII. Κατά την ενεργοποίησή τους, οι ERK1/2 φωσφορυλιώνονται στην αλληλουχία Thr-Glu-Tyr και στη συνέχεια λειτουργώντας ως προλίνο-κατευθυνόµενες κινάσες φωσφορυλιώνουν τα υποστρώµατα τους στο µοτίβο Leu-Ser/Thr-Pro. Ο µεγάλος αριθµός υποστρωµάτων που έχει διαπιστωθεί για

29 τις ERK1/2, αντικατοπτρίζει την πολλαπλότητα και πολυπλοκότητα που χαρακτηρίζει το ρόλο των συγκεκριµένων κινασών. Έτσι, ανάµεσα στα υποστρώµατα τους περιλαµβάνονται παράγοντες και ένζυµα που ρυθµίζουν τη γονιδιακή έκφραση, όπως οι µεταγραφικοί παράγοντες Elk1 και c-myc, η RNA πολυµεράση ΙΙ, καθώς και οι STATs (signal transducer and activator of transcription proteins). Σε αυτές τις περιπτώσεις, οι ERK1/2 κατά την ενεργοποίηση τους µετακινούνται στον πυρήνα, όπου αλληλεπιδρούν µε τα υποστρώµατα τους (Sugden και Clerk 1997, Brunet και Pouyssιgur 1997, Kolch 2000). Στο κυτταρόπλασµα, οι ERK1/2 φωσφορυλιώνουν την S6 κινάση p90rsk (90 kda ribosomal S6 kinase ή RSK) (Frodin και Gammeltoft 1999), τη φωσφολιπάση Α2 (PLA2) (Lin και συν.1993) καθώς και τις σχετιζόµενες µε τους µικροσωληνίσκους πρωτεΐνες MAP1/2/4 (Seger και Krebs 1995). Επιπλέον, οι ERK1/2 είναι δυνατό να συµµετέχουν σε ένα µηχανισµό αρνητικής ανάδρασης της λειτουργίας τους. Στην περίπτωση αυτή, αλληλεπιδρούν µε διάφορα µέλη της οδού ενεργοποίησης τους (Ras, Raf, MEK), επάγοντας µείωση της δραστικότητας τους (Sugden και Clerk 1997, Michel and al., 2001). Όσον αφορά στους ενδοκυτταρικούς µηχανισµούς που ευθύνονται για την υπερτροφία του µυοκαρδίου, κεντρικός είναι ο ρόλος των ΕRKs (Sugden 1999, Bogoyevitch 2000). ιέγερση των καρδιακών µυοκυττάρων µε αγωνιστές που επάγουν την υπερτροφία όπως οι φορβολεστέρες, η ενδοθηλίνη, η αγγειοτενσίνη και η νορεπινεφρίνη ενεργοποιεί τις ERKs (Bogoyevitch et al., 1993, Bogoyevitch et al., 1994, Yamazaki and Yazaki 2000). Επιπλέον, η επιµόλυνση των καρδιακών µυοκυττάρων µε διαρκώς ενεργοποιηµένες πρωτεΐνες της οδού των ERKs προκαλεί τις χαρακτηριστικές αλλαγές στη γονιδιακή ρύθµιση και τη µορφολογία των κυττάρων (Sugden 1999). Από την άλλη πλευρά, επιµόλυνση των καρδιακών µυοκυττάρων µε φωσφατάσες των ΕRKs αναιρεί το χαρακτηριστικό για την υπερτροφικό πρότυπο της γονιδιακής ρύθµισης (Fuller and al., 1997). Χρήση του αναστολέα των ΜΕΚ1/2, PD98059, στο ίδιο πειραµατικό µοντέλο αναιρεί την αναδιοργάνωση των µυοινιδίων που προκαλεί η ενδοθηλίνη ή η φαινυλεφρίνη, αν και υπάρχουν µελέτες στις οποίες η ίδια ουσία προκάλεσε µερική ή καµία αναστολή στην έκφραση του ΑΝΡ (Sugden and Clerk 1998).

30 5.2.2 ΥΠΟΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΤHΣ p38 MAPK Από τις διάφορες ισοµορφές της p38 ΜΑPK, οι p38α και p38β εκφράζονται στους περισσότερους ιστούς των θηλαστικών, ενώ η p38γ ανιχνεύεται κατά κύριο λόγο στους σκελετικούς µυς και η p38δ στους πνεύµονες, το πάγκρεας, στους νεφρούς και άλλους ενδοκρινείς αδένες (Forse et al., 1996, Obata et al., 2000, Ono and Han 2000). Τα ερεθίσµατα που επάγουν την ενεργοποίηση της p38 ΜΑΡΚ περιλαµβάνουν ποικίλες µορφές κυτταρικού στρες, (υπεριώδη ακτινοβολία, ωσµωτικό σοκ, ισχαιµία, αναστολείς της πρωτεϊνοσύνθεσης), ορισµένες κυτοκίνες (IL-1, TNF-α), αυξητικούς παράγοντες (PDGF, NGF, IGF κ.α.) καθώς και αγωνιστές των G-συζευγµένων υποδοχέων (Lazou et al., 1998, Clerk et al., 1998α, Clerk et al., 1998β, Bogoyevitch 2000). Χαρακτηριστική ιδιότητα ορισµένων µελών της υποοικογένειας p38 ΜΑΡΚ είναι η ικανότητα τους να συνδέονται µε µια οµάδα πυριδινυλο-ιµιδαζολίων, τα οποία χρησιµοποιούνται ως φάρµακα και αναφέρονται ως CSAIDs (cytokine-suppressive anti-inflammatory drugs). Σηµαντικότερος αντιπρόσωπος τους είναι ο SB (SmithKline Beecham) Οι συγκεκριµένοι χηµικοί παράγοντες έχουν τη δυνατότητα να αναστέλλουν την επαγόµενη από ενδοτοξίνες µεταγραφή των γονιδίων TNF (Lee et al., 1994). Ο αριθµός των κινασών που συµµετέχουν στη συγκεκριµένη οδό αυξάνεται συνεχώς και πιθανώς αντιστοιχεί στην πληθώρα των ερεθισµάτων που το ενεργοποιούν. Η υποοικογένεια της p38 MAPK συµµετέχει επίσης στην εκδήλωση της υπερτροφίας. Οι συγκεκριµένες κινάσες, όπως αναφέρθηκε, ενεργοποιούνται από αγωνιστές των συζευγµένων µε G πρωτεΐνες υποδοχέων, όπως είναι η ενδοθηλίνη και η φαινυλεφρίνη, παρά το γεγονός ότι η ενεργοποίηση είναι µικρότερη από αυτήν, που παρατηρείται υπό την επίδραση καταστάσεων στρες (Bogoyevitch et al., 1995, Lazou et al., 1998). Άλλοι παράγοντες που επάγουν την υπερτροφία και κινητοποιούν τις JNKs και p38 MAPK, περιλαµβάνουν την αγγειοτενσίνη και τη µηχανική διάταση (Yamazaki και Yazaki 2000). Επιπλέον, υπερέκφραση της ΜΕΚ των JNKs, ΜΕΚ7, σε καρδιακά µυοκύτταρα έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση του µεγέθους των κυττάρων, αναδιοργάνωση των µυοινιδίων και την έκφραση του ANF (Wang et al., 1998). Το πρόβληµα που σχετίζεται µε τη συµµετοχή των JNKs και p38 MAPK στην συγκεκριµένη απόκριση οφείλεται στην αδυναµία του PMA, που χαρακτηρίζεται ως ισχυρός παράγοντας υπερτροφίας, να ενεργοποιήσει τις κινάσες αυτές. Αυτό θα µπορούσε να οφείλεται στο γεγονός ότι η ισχυρή ενεργοποίηση των ERKs από το ΡΜΑ µπορεί να υπερβαίνει την ανάγκη για επιπρόσθετες σηµατοδοτικές οδούς

31 (Sugden and Clerk 1998, Sugden 1999). Σύµφωνα µε τα παραπάνω δεδοµένα, οι τρεις υποοικογένειες των MAPKs εµπλέκονται στην υπερτροφία του µυοκαρδίου, αν και ο ακριβής ρόλος τους δεν έχει αποσαφηνιστεί. Βασικό χαρακτηριστικό της υπερτροφίας είναι η αύξηση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών στα καρδιακά µυοκύτταρα, η οποία οφείλεται κατά κύριο λόγο στην αύξηση του ρυθµού πρωτεινοσύνθεσης. Η διαδικασία αυτή περιλαµβάνει την ενεργοποίηση της PI3K µε την επακόλουθη παραγωγή 3,4,5 φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (Sugden and Clerk 1998). Η φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη έχει διπλό ρόλο καθώς ενεργοποιεί τη PDK (PtdIns 3,4,5- dependent kinase) και επιπλέον επάγει την επιστράτευση της PKB/Αkt (Protein kinase B), η οποία τελικά φωσφορυλιώνεται από την PDK. Η PKB/Akt µε τη σειρά της διαµορφώνει τη δραστικότητα των πρωτεϊνών p70s6k (70 kda ribosomal S6 kinase) και PHAS-1 (Phosphorylatable heat and acid stable factor regulated by insulin). Η p70s6k αποτελεί τη βασική κινάση της µικρής ριβοσωµικής υποµονάδας S6. 6. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΑΚΤ ΣΤΗΝ ΚΑΡ ΙΑΚΗ ΥΠΕΡΤΡΟΦΙΑ Σηµατοδότηση της Αkt Η c-akt αποτελεί το κυτταρικό οµόλογο του ογκογονιδίου του Αkt8 ρετροϊού (Bellacosa et al., 1991). Το ογκογονίδιο αυτό, αποτελεί µία πρωτεΐνη σύντηξης µεταξύ του ιικού GAG και των κυτταρικών Αkt ακολουθιών. Έχουν προσδιοριστεί δύο ακόµη µέλη της οικογένειας Αkt (c-akt2 και c-akt3), οι οποίες εκφράζονται διαφορετικά στα επίπεδα mrna και πρωτεΐνης. Η πρωτεϊνική οικογένεια Αkt περιλαµβάνει µία κεντρική περιοχή κινάσης µε εξειδίκευση στα κατάλοιπα σερίνης και θρεονίνης στα πρωτεΐνες υποστρώµατα οι οποίες περιέχουν το συντηρηµένο µοτίβο αργινίνης/λυσίνης στις θέσεις 3 και 5 (Obata et al., 2000). Επίσης, το αµινοτελικό άκρο της Αkt περιλαµβάνει µία περιοχή οµολογίας πλεκστρίνης (pleckstrin omology) (PH) η οποία παρεµβαίνει στις αλληλεπιδράσεις λιπιδίου- πρωτεΐνης και/ή πρωτεΐνης- πρωτεΐνης (Bellacosa et al., 1993). Το καρβοξυτελικό άκρο περιλαµβάνει µία υδρόφοβη και πλούσια σε προλίνη περιοχή. Η ενεργοποίηση της Αkt κινάσης επάγεται µέσω φυσιολογικών ερεθισµάτων και κυρίως µέσω της της PI3K, η οποία ενεργοποιείται µέσω σύνδεσης των διαµεµβρανικών υποδοχέων. Οι υποδοχείς αυτοί είτε έχουν ενδογενή ενεργότητα

32 κινάσης τυροσίνης (για παράδειγµα, υποδοχέας ινσουλίνης ή IGF-1), είτε είναι έµµεσα συζευγµένοι σε κινάσες τυροσίνης (οικογένεια υποδοχέων IL-6) είτε είναι υποδοχείς συζευγµένοι µε G-πρωτεΐνες (β-αδρενεργικός υποδοχέας β-αr). Η ενεργοποίηση των συγκεκριµένων υποδοχέων έχει ως αποτέλεσµα την επιστράτευση ισοµορφών της ΡΙ3Κ στην εσωτερική επιφάνεια της πλασµατικής µεµβράνης λόγω της αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης- πρωτεΐνης που ρυθµίζεται από συνδέτες. Η ΡΙ3Κ µπορεί επίσης να ρυθµιστεί µέσω άµεσης αλληλεπίδρασης µε το πρωτοογκογονίδιο Ras (Datta et al., 1999). Λόγω τοποθέτησης τους στην πλασµατική µεµβράνη, οι ΡΙ3Κs παράγουν φωσφατιδυλινοσιτολ 3,4 διφωσφορικό οξύ (ΡΙ3,4Ρ) και φωσφατιδυλινοσιτολ 3,4,5 τριφωσφορικό οξύ (ΡΙ3,4,5Ρ). Τα λιπίδια αυτά λειτουργού στη συνέχεια ως σηµατοδοτικά ενδιάµεσα που ρυθµίζουν τους επόµενους «καταρράκτες» επαγωγής σηµάτων. Τα φωσφολιπίδια που παράγονται από τις ΡΙ3Κ ρυθµίζουν την ενεργότητα της Αkt µέσω πολλών µηχανισµών (Datta et al., 1999). Ένας µηχανισµός αποτελεί η άµεση πρόσδεση των φωσφοϊνοσιτιδίων στην ΡΗ περιοχή, µετατοπίζοντας την Αkt από το κυτταρόπλασµα στην εσωτερική επιφάνεια της πλασµατικής µεµβράνης. Η µετατόπιση αυτή είναι πολύ σηµαντική, διότι τα µεταλλάγµατα της Αkt που στοχεύουν πάντα στην πλασµατική µεµβράνη, παρουσιάζουν ουσιώδη ενεργότητα κινάσης και επίσης, φέρουν την Αkt σε εγγύτητα µε τις ρυθµιστικές κινάσες οι οποίες φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν την Αkt στις θέσεις θρεονίνη 308 και σερίνη 473. Προσδιορίστηκαν τέσσερα ένζυµα εξαρτώµενα από τα φωσφοϊνοσιτίδια για την ενεργότητα τους ως κινάσες (PDK) που φωσφορυλιώνουν την Αkt στην θρεονίνη 308, παρουσία του ΡΙ3,4,5Ρ. Ένας άλλος µηχανισµός που η φωσφορυλιωµένη µορφή των φωσφοϊνοσιτιδίων ελέγχει την ενεργότητα της Αkt, είναι ο έλεγχος της Αkt ως υπόστρωµα των PDKs. Στην πραγµατικότητα, µεταλλάξεις της ΡΗ περιοχής που διευκολύνουν την πρόσδεση, αυξάνουν τη φωσφορυλίωση που επάγεται από την PDK-1. Η ΡΙ3Κ λοιπόν φωσφορυλιώνει το φωσφατιδυλινοσιτολικό 4,5 διφωσφορικό οξύ (PtdlnsP 2 ) σε PtdlnsP 3 (εικόνα). Το σήµα µεταφέρεται µέσω της PDK1, η οποία φωσφορυλιώνει την PKB/Akt στην θρεονίνη 308 οδηγώντας στην ενεργοποίησή του. Η φωσφορυλίωση της PKB/Akt στη σερίνη 473 από µία άλλη κινάση επηρεάζει την ενεργότητά της ή την εξειδίκευση του υποστρώµατος. Τα υποστρώµατα της PKB/Akt περιλαµβάνει την κινάση 3 συνθάσης γλυκογόνου GSK-3 α και β τους µεταγραφικούς παράγοντες Forkhead (FKHR) όπως είναι ο Foxo 1 και 3α (van der Heide et al., 2004) οι οποίοι εξάγονται από τον πυρήνα στη φωσφορυλίωση. Η

33 ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ και της PKB/Akt σχετίζονται µε υψηλά ποσοστά πρωτεϊνικής σύνθεσης και κυτταροπροστασίας (Vanhaesebroeck and Alessi, 2000). Το προηγούµενο επηρεάζεται από αλλαγές στην ενεργότητα των παραγόντων µετάφρασης, παράλληλα µε την αύξηση της µεταφραστικής µηχανής. Η κυτταροπροστασία προκύπτει εν µέρει από τη φωσφορυλίωση των υπαρχόντων πρωτεϊνών ( για παράδειγµα, η οικογένεια των Bcl-2, Bad) µε στόχο την παρεµπόδιση της απόπτωσης, αλλά και από µεταβολές στη γονιδιακή έκφραση που µεσολαβείται από τους µεταγραφικούς παράγοντες Forkhead. O IGF-1 πιθανώς ενεργοποιεί την PKB/Akt στα καρδιακά µυοκύτταρα (Pharm et al., 2000, Clerk et al., 2006). Όπως και σε άλλα κύτταρα, η σηµατοδότηση µέσω της PKB/Akt στα καρδιοµυοκύτταρα εµπλέκεται στην πρωτεϊνική σύνθεση και την κυτταροπροστασία (Matsui and Rosenzweig, 2005). Η αναστολή της σηµατοδότησης µέσω της ΡΙ3Κ καταστέλλει το βασικό ρυθµό πρωτεϊνικής σύνθεσης στα καρδιοµυοκύτταρα και παρεµποδίζει την αύξηση που επάγεται από την ινσουλίνη (Pham et al., 2000), και η αναστολή του µονοπατιού in vivo αυξάνει την δυσλειτουργία της καρδιάς και την απόπτωση σε µοντέλα ζώων µε καρδιακή ανεπάρκεια (Matsui and Rosenzweig, 2005, Heineke and Molkentin, 2006). Λόγω αυτών των επιδράσεων, το σηµατοδοτικό µονοπάτι της ΡΙ3Κ και της PKB/Akt εµπλέκονται στην καρδιακή υπερτροφία. Σχετικά µε άλλους ιστούς, υπάρχει διαφωνία σχετικά µε το ότι ερεθίσµατα όπως η ΕΤ-1 ενεργοποιεί την PKB/Akt προς επαγωγή της απόκρισης, και ότι η ινσουλίνη που πιθανώς ενεργοποιεί το µονοπάτι προωθεί την υπερτροφία. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η υπερέκφραση της PKB/Akt σε διαγονιδιακά ζώα προστατεύει την καρδιά από βλάβες που επάγονται από ισχαιµία/επανεµποτισµό και αυξάνει το µέγεθος του µυοκαρδίου. Το ερώτηµα είναι αν αυτή η αυξητική απόκριση αποτελεί υπερτροφία ή κλίνει προς σε φυσιολογική αύξηση. Γνωρίζοντας το γενικό ρόλο της ινσουλίνης στο σώµα και τη διακύµανση της απελευθέρωσης ινσουλίνης, η σηµατοδότηση της PKB/Akt ρυθµίζει την φυσιολογική αύξηση της καρδιάς, ίσως για να συνδυάσει την αύξηση αυτή µε την διατροφική κατάσταση και όχι την παθολογική υπερτροφία. Τοξικά όµως επίπεδα του οξειδωτικού στρες ενεργοποιούν την PKB/Akt στα καρδιοµυοκύτταρα σε παρόµοιο βαθµό µε την ινσουλίνη (Pham et al., 2000). Οι συνέπειες στη λειτουργία δεν είναι ξεκάθαρες, αλλά αφού η µετάφραση πρωτεΐνης αναστέλλεται από το οξειδωτικό στρες, η κυτταροπροστασία αποτελεί την κυριότερη όψη της απόκρισης σε αυτό το περιβάλλον.

34 Για την PKB/Akt, η τοποθεσία του σήµατος είναι πολύ σηµαντική. Είναι γενικά αποδεκτό ότι η συσσώρευση PtdlnsP 3 στην πλασµατική µεµβράνη οδηγεί σε ενεργοποίηση της PKB/Akt στο κυτταρόπλασµα, αλλά η ΡΙ3Κ και η PKB/Akt λειτουργούν επίσης και στην πυρηνική µεµβράνη (Martelli et al., 2006). Σύµφωνα λοιπόν µε αυτές τις µελέτες η PKB/Akt συσσωρεύεται στους πυρήνες των καρδιοµυοκυττάρων (Camper-Kirby et al., 2001) όπου ρυθµίζει την έκφραση γονιδίων. Ο ρόλος της PKB/Akt στο κυτταρόπλασµα σε σχέση µε τον πυρήνα διαφέρει, και σε διαγονιδιακά ποντίκια, η αύξηση των καρδιοµυοκυττάρων επάγεται όταν η PKB/Akt προσδένεται στην πλασµατική µεµβράνη για ενεργοποίηση, ενώ η στοχευόµενη στον πυρήνα PKB/Akt αποτυγχάνει να επάγει την καρδιακή αύξηση αλλά προωθεί την κυτταροπροστασία. Σε όχι µυοκύτταρα, η PKB/Akt σχετίζεται µε στόχο ραπαµυκίνης θηλαστικών (mtor ) σε διαφορετικά σύµπλοκα (Polak and Hall, 2006, Wullschleger et al., 2006). Το mtorc1 σύµπλοκο εµπλέκεται στη ρύθµιση της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Το mtor ενεργοποιείται κάτω από την PKB/Akt. Το mtorc2 περιλαµβάνει τις πρωτεΐνες Rictor και Sin I, και το σύµπλοκο αυτό προωθεί τη φωσφορυλίωση της PKB/Akt στη σερίνη 473. η PKB/Akt ρυθµίζει τους µεταγραφικούς παράγοντες Forkhead Foxo 1/3a παρά την GSK-3 ή άλλα υποστρώµατα, προτείνοντας έτσι ότι το mtorc2 εµπλέκεται κυρίως στη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης µέσω του Foxo 1/3a (εικόνα 9). Ακόµη δεν έχει διερευνηθεί αν αυτό συµβαίνει στα καρδιοµυοκύτταρα. Οι GSK3α και β αποτελούν τα καλύτερα χαρακτηρισµένα υποστρώµατα της PKB/Akt και η φωσφορυλίωση της GSK-3 στις σερίνες 21 και 9 (απόκριση στην ινσουλίνη), αναστέλλει την ενεργότητά τους (Cohen and Frame, 2001, Frame and Cohen, 2001). Η Αkt µπορεί να φωσφορυλιωθεί ανεξάρτητα από την ΡΙ3Κ στα κατάλοιπα σερίνης 124 και θρεονίνης 450. Οι µηχανισµοί που ενεργοποιούν την Αkt χωρίς να είναι απαραίτητη η διέγερση της ΡΙ3Κ, περιλαµβάνουν την διέγερση της ΡΚΑ (Sable et al., 1997) και αυξάνουν το επίπεδο του κυτταροπλασµατικού ασβεστίου. Το ασβέστιο συνδέεται στη καλµοδουλίνη και στη συνέχεια το σύµπλοκο αυτό ενεργοποιεί την εξαρτώµενη από αυτό κινάση (CAMKK), η οποία στη συνέχεια ενεργοποιεί την Αkt (Yano et al., 1998). Η Αkt φωσφορυλιώνει ένα ευρύ φάσµα υποστρωµάτων όπως είναι µέλη του αποπτωτικού µονοπατιού (Bad και κασπάση 9) τα οποία απενεργοποιούνται, µεταγραφικοί παράγοντες όπως η οικογένεια FKHR,η οποία ρυθµίζει την έκφραση γονιδίων µε ακολουθία απόκρισης στην ινσουλίνη (IRS):

35 GSK3-β: η πρωτεΐνη αυτή έχει πολλαπλές λειτουργίες ρυθµίζοντας την πρωτεϊνική σύνθεση, την απόπτωση και τον κυτταρικό κύκλο (Hardt et al., 2002). Εικόνα 9. Σηµατοδοτικό µονοπάτι της Αkt.

36 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Σύµφωνα µε διάφορα ερευνητικά δεδοµένα, οι PPARs αποτελούν βασικούς ρυθµιστές της ενέργειας του µυοκαρδίου και της λιπιδικής οµοιόστασης. Η δυσλειτουργία του ενεργειακού µεταβολισµού συνδέεται άµεσα µε πολλές καρδιακές παθήσεις περιλαµβάνοντας την καρδιακή υπερτροφία, αλλά και τη διαβητική καρδιοµυοπάθεια. Στην παρούσα εργασία εξετάστηκε ο ρόλος ενός ειδικού συνθετικού συνδέτη του PPARβ/δ, ο GW0742, σε πρωτογενείς καλλιέργειες καρδιακών µυοκυττάρων φυσιολογικών και διαβητικών επίµυων. Βασική υπόθεση της έρευνας αποτέλεσε η διερεύνηση της επίδρασης του GW0742 στην καρδιακή υπερτροφία καθώς και στην παραγωγή των ελεύθερων ριζών οξυγόνου (ROS), που παράγονται κατά το οξειδωτικό στρες και σχετίζονται άµεσα µε διαταραχές του µεταβολισµού και καρδιαγγειακές ασθένειες. Επίσης, διερευνήθηκε ο µηχανισµός µε τον οποίο ο GW0742 επηρεάζει τα σηµατοδοτικά µονοπάτια που συµµετέχουν στην υπερτροφία τόσο σε καρδιακά µυοκύτταρα φυσιολογικών αλλά και επαγόµενων από στρεπτοζοτοσίνη διαβητικών επίµυων.

37 ΙΙ. ΥΛΙΚΑ Ι. ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΥΛΙΚΟ Ως βιολογικό υλικό χρησιµοποιήθηκε η καρδιά ενήλικου επίµυ. Τα πειραµατόζωα ήταν αρσενικοί επίµυες Ratus norvegicus της φυλής Wistar, βάρους gr. Τα ζώα εκτρέφονται σε ειδικό χώρο του τοµέα Φυσιολογίας Ζώων του Τµήµατος Βιολογίας του Α.Π.Θ. όπου φυλάσσονται µέσα σε κλωβούς µε ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Η µεταχείριση των ζώων ήταν σύµφωνη µε τις οδηγίες που εκδόθηκαν από την ελληνική κυβέρνηση, βάση ειδικών κανονισµών της Ευρωπαϊκής Ένωσης για τη φροντίδα και χρήση εργαστηριακών ζώων. ΙΙ. ΧΗΜΙΚΑ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ Τα κοινά χηµικά που χρησιµοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας και προέρχονταν από τις εταιρίες Sigma-Aldrich (Deisnhofen, Γερµανία), Merck (Darmstadt, Γερµανία) και Applichem. Χρησιµοποιήθηκε ο GW0742, ειδικός συνθετικός συνδέτης του PPAR-β/δ της εταιρείας Sigma-Aldrich (Deisnhofen, Γερµανία). Η κολλαγενάση που χρησιµοποιήθηκε για την αποµόνωση µυοκυττάρων από τις κοιλίες της καρδιάς ήταν του τύπου Ι της εταιρείας Biochrom. Η αλβουµίνη ορού βοδιού (κλάσµα V) ήταν από την εταιρεία Sigma-Aldrich (Deisnhofen, Γερµανία). Για τον ποσοτικό προσδιορισµό της πρωτεΐνης µε τη χρωµατοµετρική µέθοδο Bradford, χρησιµοποιήθηκε η χρωστική Biorad Protein assay (Biorad Laboratories GmbH). Μίγµα δεικτών γνωστού µοριακού βάρους για την ηλεκτροφόρηση (Prestained protein marker, broad range: kda) αγοράστηκε από την εταιρεία New England Biolabs (Beverly,USA). Το µίγµα περιέχει: β- γαλακτοσιδάση από Escherichia coli (ΜΒ: 175 kda), παραµυοσίνη από Escherichia coli (ΜΒ: 83 kda), αφυδρογονάση γλουταµινικού οξέος από ήπαρ βοδιού (ΜΒ: 62 kda), αλδολάση από µυ κουνελιού (ΜΒ: 47.5 kda),ισοµεράση της φωσφορικής τριόζης από µυ κουνελιού (ΜΒ: 32.5 kda), β-λακτοσφαιρίνη Α από γάλα βοδιού

38 . (ΜΒ: 25 kda), λυσοζύµη από τη λέκιθο αυγού κοτόπουλου (ΜΒ: 16.5 kda) και απροτινίνη από πνεύµονα βοδιού (ΜΒ: 6.5 kda). Η νιτροκυτταρίνη [Protran BA Nitrocellulose (0.45 µm)] που χρησιµοποιήθηκε για την ηλεκτροφορητική µεταφορά των πρωτεϊνών ήταν της εταιρείας Schleicer & Schluell (Keene, ΗΠΑ). Η φαινυλεφρίνη, ειδικός αγωνιστής των α1 αδρενεργικών υποδοχέων (Sigma-Aldrich,Deisnhofen, Γερµανία). Για την πρόκληση διαβήτη τύπου 2 χρησιµοποιήθηκε στρεπτοζοτοσίνη της εταιρίας Sigma-Aldrich (Deisnhofen, Γερµανία). Χρησιµοποιήθηκε ο κυτταροδιαπερατός µη φθορίζων ανιχνευτής DCFDA (Sigma-Aldrich,Deisnhofen, Γερµανία). Υλικά για RT-PCR και PCR (Polymerase Chain Reaction) Χρησιµοποιήθηκε TRI reagent για αποµόνωση RNA MRC Random primers της εταιρείας Takara Βιο INC RNAse inhibitor NE Biolabs RT enzyme Finnzymes dntp s NE Biolabs Taq polymerase NE Biolabs DEPC H 2 O της εταιρίας Applichem PCR marker NE Biolabs Υλικά για κυτταροκαλλιεργειες Το µέσο καλλιέργειας Medium Earle 199 (1x) ήταν της εταιρείας Biochrom AG Το FBS (Fetal Bovine Serum-εµβρυϊκός αγελαδινός ορός) είναι της εταιρίας Biochrom AG

39 Η πενικιλλίνη/στρεπτοµυκίνη ήταν της εταιρείας Biochrom AG Η καρνιτίνη, η ταυρίνη και η κρεατίνη που χρησιµοποιήθηκαν ήταν της εταιρείας Sigma Sigma-Aldrich (Deisnhofen, Γερµανία). Το Ηepes ήταν της εταιρίας Applichem Η λαµινίνη που χρησιµοποιήθηκε ήταν της εταιρίας Becton Dickinson Hellas, (Athens, Greece). Τα αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν, περιλαµβάνονται στον παρακάτω κατάλογο: Rabbit p38 MAPK: πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο αντιστοιχεί στα αµινοξικά κατάλοιπα της ανθρώπινης p38 MAPK (Cell Signaling, Beverly, USA). Το αντίσωµα ανιχνεύει τα ολικά επίπεδα της κινάσης (φωσφορυλιωµένη και µη). Rabbit phospho-p38 MAPK: πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο αναγνωρίζει τη φωσφορυλιωµένη στα αµινοξικά κατάλοιπα θρεονίνη180/τυροσίνη182 της ανθρώπινης p38 MAPK (Cell Signaling, Beverly, ΗΠΑ). Rabbit p42/p44: πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο ανιχνεύει τα ολικά επίπεδα της κινάσης (φωσφορυλιωµένη και µη) (Cell Signaling, Beverly, ΗΠΑ). Mouse phospho-p42/p44: µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο αναγνωρίζει τις φωσφορυλιωµένες στα αµινοξικά κατάλοιπα θρεονίνη202/τυροσίνη204 ERK1 και ERK2 του ανθρώπου (Cell Signaling, Beverly, ΗΠΑ). Pan-Actin: ανιχνεύει τα ενδογενή επίπεδα της ολικής ακτίνης (Cell Signaling, Beverly, ΗΠΑ). Rabbit phospho- AKT (Ser473): Πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι συνθετικού φωσφο-πεπτιδίου, το οποίο αναγνωρίζει τις φωσφορυλιωµένες στα αµινοξικά κατάλοιπα Ser473 Akt1 ποντικού.το αντίσωµα αυτό αναγνωρίζει επίσης τις Akt2 και Akt3 όταν φωσφορυλιώνεται στα αντίστοιχα κατάλοιπα. εν αναγνωρίζει φωσφορυλιωµένη ΑΚΤ σε άλλες θέσεις, ούτε φωσφορυλιωµένες µορφές σχετικών κινασών όπως η PKC και η p70 S6 κινάση.

40 ΙΙΙ. ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Φιλµ Kodak AR X-OMATic, 13 x 18 cm. Η επεξεργασία των φιλµ AR X-OMATic έγινε µε developer LX 24-KODAK. Η στερέωση των φιλµ έγινε µε fixer KODAK AL 4. ΙΙΙ. ΜΕΘΟ ΟΙ 1. EΠΑΓΩΓΗ ΟΞΕΙΑΣ ΦΑΣΗΣ ΙΑΒΗΤΗ Αρσενικοί αρουραίοι της φυλής Wistar βάρους gr αφέθηκαν σε νηστεία µία µέρα πριν τη χορήγηση στρεπτοζοτοσίνης (80mg/kg). Η στρεπτοζοτοσίνη αποτελεί µία χηµική ουσία η οποία είναι ιδιαίτερα τοξική για τα β-κύτταρα (παράγουν ινσουλίνη) του παγκρέατος. Η ουσία αραιώθηκε σε κιτρικό ρυθµιστικό διάλυµα 0,05 mol/l µε ph 4,5 και χορηγήθηκε σε ενέσιµη µορφή ενδοπεριτοναϊκά. Αµέσως µετά την έγχυση, χορηγήθηκε στα ζώα αντί για νερό γλυκόζη 5% για µία ηµέρα. 5 µέρες µετά την επαγωγή των παθολογικών καταστάσεων ακολούθησε η αποµόνωση των καρδιοµυοκυττάρων σύµφωνα µε τη πειραµατική διαδικασία που προαναφέρθηκε. Τα επίπεδα γλυκόζης στον ορό του αίµατος µετρήθηκαν µε την χρωµατοµετρική ποιοτική ανάλυση της οξειδάσης της γλυκόζης. Συλλέχθηκε µικρή ποσότητα αίµατος σε ηπαρίνη και ακολούθησε φυγοκέντρηση στις στροφές για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, 10µl ορού προστέθηκαν σε 1ml αντιδραστηρίου και επωάστηκαν σε υδατόλουτρο στους 37 ο C για 10 λεπτά. Ακολούθησε φωτοµέτρηση του δείγµατος στα 505nm. Ο λόγος της τιµής του δείγµατος προς την τιµή του πρότυπου δείγµατος αποτελεί τα επίπεδα της γλυκόζης, οι φυσιολογικές τιµές της οποίας είναι 5,7 - +0,1 mmol/lt. Τιµές µεγαλύτερες από 17mmol/lt επιβεβαιώνουν την επαγωγή της ασθένειας.

41 2. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΡ ΙΑΚΩΝ ΜΥΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΕΜΠΟΤΙΣΜΕΝΗ ΚΑΡ ΙΑ Στο σύνολο των πειραµάτων της παρούσας µελέτης χρησιµοποιήθηκαν µυοκύτταρα αποµονωµένα από εµποτισµένες καρδιές ενήλικων αρουραίων. υο βασικές µέθοδοι εµποτισµού της καρδιάς αναφέρονται στη διεθνή βιβλιογραφία (Depre 1998, Verdouw και συν 1998, Hearse και Sutherland 2000): α) η µέθοδος Langendorff και β) ο εµποτισµός της καρδιάς κάτω από συνθήκες παραγωγής έργου (working heart preparation). Στη παρούσα µελέτη εφαρµόστηκε η µέθοδος Langendorff, η οποία περιλαµβάνει διασωλήνωση της αορτής και άρδευση των στεφανιαίων αρτηριών µε οξυγονωµένο διάλυµα εµποτισµού. Το διάλυµα αυτό διοχετεύεται αντίθετα προς την in vivo ροή του αίµατος µε σταθερή ροή που εξασφαλίζεται είτε µε αντλία (constant flow preparation), είτε µε σταθερή υδροστατική πίεση (constant pressure preparation) ( mmhg). Και στις δυο περιπτώσεις το διάλυµα εµποτισµού διοχετεύεται µέσω της αορτής στα αγγεία της στεφανιαίας κυκλοφορίας. Ο όγκος του διαλύµατος που ρέει στα στεφανιαία αγγεία παροχετεύεται στο στεφανιαίο κόλπο και τελικά εξέρχεται από την καρδιά µέσω της πνευµονικής αρτηρίας.. Το φυσιολογικό διάλυµα εµποτισµού Krebs- Henseleit (KHB) που χρησιµοποιείται είναι ρυθµιστικό διάλυµα δισανθρακικών µε σύσταση: 25 mm NaHCO3, mm NaCl, 4.7 mm KCl, 1.2 mm MgSO4, 1.2 Mm KH2PO4 και 10 mm γλυκόζη, ph 7.4. Τα καρδιακά µυοκύτταρα αποµονώνονται από τις κοιλίες της καρδιάς µετά από εµποτισµό και πέψη του µυοκαρδίου µε διάλυµα κολλαγενάσης σύµφωνα µε τους Lazou et al., 1994, όπως αναφέρεται αναλυτικά στη συνέχεια Προετοιµασία καρδιάς για τον εµποτισµό Το ζώο αναισθητοποιείται µε ενδοπεριτοναϊκή έγχυση χλωράλης 100 mgr/kgr σωµατικού βάρους. Επίσης, χορηγείται ηπαρίνη (300 IU/Kgr) (Leo Pharmaceutical Products, Ballerup, Denmark) µέσω της µηριαίας φλέβας και η καρδιά αφαιρείται από το σώµα του ζώου µαζί µε τους γύρω ιστούς. Το παρασκεύασµα τοποθετείται αµέσως σε διάλυµα εµποτισµού KHB, θερµοκρασίας 0 o C (κρυοπληγικό διάλυµα), ώστε να σταµατήσει να συσπάται η καρδιά και να περιοριστούν οι συνέπειες της ισχαιµίας. Μετά την αποµάκρυνση των γύρω ιστών, η καρδιά προσαρµόζεται µέσω της αορτής σε ειδικά διαµορφωµένη κάνουλα της συσκευής εµποτισµού, όπου και στερεώνεται

42 µε τη χρήση ράµµατος. Ο χρόνος που µεσολαβεί από την αφαίρεση της καρδιάς µέχρι την ανάρτηση της στη συσκευή δε πρέπει να ξεπερνά τα 1-2 λεπτά Αποµόνωση καρδιακών µυοκυττάρων Η αποµόνωση των καρδιακών µυοκυττάρων στηρίζεται στον εµποτισµό της καρδιάς µε διάλυµα χαµηλής συγκέντρωσης Ca 2+ προκειµένου να αποδιοργανωθούν οι διακυτταρικοί σύνδεσµοι, ενζυµική πέψη του µυοκαρδίου για τη ρήξη της εξωκυττάριας ουσίας και τελικά µηχανική ανάδευση για το διαχωρισµό των κυττάρων µε κολλαγενάση (Mitcheson et al., 1998). Στο τέλος του εµποτισµού αφαιρούνται οι κόλποι και η αορτή και ο υπόλοιπος µαλακός ιστός της καρδιάς που µένει κόβεται σε µικρότερα κοµµάτια. Ακολουθεί η επώαση του ιστού σε διάλυµα κολλαγενάσης παράλληλα µε ανάδευση. Έπειτα αποµονώνονται τα καρδιοµυοκύτταρα και συλλέγονται σε δοκιµαστικό σωλήνα µε διήθηση. Αφού καθιζάνουν τα κύτταρα αφαιρείται το υπερκείµενο και γίνονται οι πλύσεις µε διάλυµα εµποτισµού στο οποίο υπάρχει ασβέστιο σε τελική συγκέντρωση 50µM.Τα κύτταρα επαναιωρούνται στο προηγούµενο διάλυµα οπού προστίθεται σταδιακά επιπλέον ασβέστιο µέχρι τελικής συγκέντρωσης 1 Mm (διάλυµα επώασης). Στο τέλος της διαδικασίας από κάθε καρδιά αποµονώνονται 3*10 6 µυοκύτταρα µε ραβδόµορφο σχήµα σε ποσοστό 70-90%. Πριν την έναρξη των επωάσεων τα κύτταρα παραµένουν σε κατάσταση ηρεµίας για λεπτά. 3. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΚΑΡ ΙΑΚΩΝ ΜΥΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Για τη διεξαγωγή των πειραµάτων που απαιτείται παρατεταµένη έκθεση σε φαινυλεφρίνη χρησιµοποιήθηκαν πρωτεογενείς καλλιέργειες καρδιακών µυοκυττάρων. Στην περίπτωση αυτή τα καρδιοµυοκύτταρα µετά την αποµόνωση µεταφέρονται σε µέσο καλλιέργειας M199 το οποίο περιέχει 100 U πενικιλίνη/στρεπτοµυκίνη, 25mM HEPES και 10% FBS (Fetal Bovine Serum) PAA Laboratories GmBH, (Pasching, Austria) Aκολουθεί επίστρωση των κυττάρων σε πυκνότητα 2x10 3 /mm 2 σε τριβλία που προηγουµένως έχουν επιστρωθεί µε λαµινίνη (Becton Dickinson Hellas, (Athens, Greece). Τέσσερις ώρες µετά την επίστρωση γίνεται αλλαγή του µέσου καλλιέργειας µε Μ199 που δεν περιέχει FBS. Με αυτό τον τρόπο αποµακρύνονται από τα τριβλία τα καρδιοµυοκύτταρα που δεν έχουν προσκολληθεί. 12 ώρες µετά τα

43 κύτταρα εκθέτονται στις υπό µελέτη ενώσεις. Τέλος τα τριβλία επωάζονται για 24 ώρες σε κλίβανο 5% CO 2 στους 37 0 C. 4. ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ ΟΞΥΓΟΝΟΥ (ROS) Το DCFDHA είναι ένας κυτταροδιαπερατός µη φθορίζων ανιχνευτής, ο οποίος αποεστεροποιείται ενδοκυτταρικά και µετατρέπεται σε φθορίζοντα κατά την οξείδωση. 3,5 ώρες µετά τις αντίστοιχες επιδράσεις τα καρδιοµυοκύτταρα επωάζονται µε DCFDHA για 30 λεπτά. Ακολουθούν 3 πλύσεις µε PBS και στη συνέχεια ο προσδιορισµός των ελεύθερων ριζών γίνεται ποιοτικά µε ψηφιακές απεικονίσεις από κάθε επίδραση. 5. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ RNA Μετά την 24ωρη επίδραση µε τον υπερτροφικό παράγοντα φαινυλεφρίνη (ΡΕ) ή/και µε τον ειδικό συνθετικό συνδέτη του PPARβ/δ GW0742, ακολουθεί η αφαίρεση του θρεπτικού από τα τριβλία και η διαδικασία του scrape (απόξυση της επιφάνειας) µε σκοπό την αποκόλληση των κυττάρων και τη µεταφορά τους σε eppendorfs. Στο σηµείο αυτό προστίθεται το αντιδραστήριο TRI, πεντάλεπτη επώαση σε θερµοκρασία δωµατίου και στη συνέχεια φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στους 4 ο C. Το TRI αποτελεί ένα οµογενές φαινολικό διάλυµα αποδιατακτών και αναστολέων RNAσών και χρησιµοποιείται σε διαδικασίες διαχωρισµού. Μετά τη φυγοκέντρηση προστίθεται στο υπερκείµενο χλωροφόρµιο, ακολουθεί επώση σε θερµοκρασία δωµατίου και νέα φυγοκέντρηση στους 4 ο C. Στο σηµείο αυτό το µίγµα έχει διαχωριστεί σε τρεις φάσεις. Το RNA κατακρηµνίζεται από την υδάτινη φάση µε την προσθήκη ισοπροπανόλης. Μετά από µια Τρίτη φυγοκέντρηση ακολουθούν τρεις πλύσεις µε αιθανόλη 75% µε σκοπό την αποµάκρυνση των αλάτων. Τέλος, στο καθαρό RNA προστίθεται DEPC H 2 O. Ακολουθεί ο ποσοτικός προσδιορισµός του RNA µε φωτοµέτρηση στα 260nm και στα 280nm και έλεγχος της καθαρότητας του RNA σε πηκτωµα αγαρόζης 1%. Ακολουθεί RT-PCR και στη συνέχεια PCR για το γονίδιο ANF (γονίδιο-δείκτης υπερτροφίας) και για το γονίδιο GAPDH (γονίδιο αναφοράς). ANP_For: 5 -CTGATGGATTTCAAGAACCTG-3 ANP_Rev: 5 -CTGTTATCTTCGGTACCGGA-3

44 6. ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΣ ΚΑΡ ΙΟΜΥΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Χρησιµοποιείται η «ψηφιακή πλανηµετρία» για την µέτρηση της επιφάνειας των καρδιοµυοκυττάρων. Για κάθε συνθήκη µετρήθηκαν περίπου 100 καρδιοµυοκύτταρα για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράµατα µε το πρόγραµµα µέτρησης επιφάνειας Scion Image. 7. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΟΛΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ Τα καρδιοµυοκύτταρα οµογενοποιούνται σε 100ul διαλύµατος λύσης (G Buffer) το οποίο περιέχει: 20 mm Hepes ph mm β-φωσφογλυκερινικό οξύ 50 mm NaF 2 mm EDTA 10 mm βενζαµιδίνη 0,2 mm Na 3 VO 4 Λευπεπτίνη 200 µμ Ε64 10 µμ DTT (dithiothreitol) 5 mm PMSF (phenyl methyl sulphonyl fluoride) 300 µμ Μετά την παραπάνω οµογενοποίηση τα δείγµατα παραµένουν στον πάγο για 20 λεπτά ώστε να εκχυλιστεί το σύνολο των κυτταρικών πρωτεϊνών. Στην συνέχεια φυγοκεντρούνται στις g για 10 λεπτά. Ένα µικρό ποσοστό του υπερκείµενου χρησιµοποιείται για τον προσδιορισµό της ολικής πρωτεΐνης ενώ στην υπόλοιπη ποσότητα όγκου V προστίθεται 0,33V αποδιατακτικού διαλύµατος ηλεκτροφόρησης (sample buffer) το οποίο περιέχει: Tris-HCL 330mM SDS 10% DTT 133 mm Glycerol 13% Bromophenol blue 0.2 mgr/ml Aκολουθεί βρασµός για 3 λεπτά και φύλαξη των δειγµάτων στη κατάψυξη.

45 8. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΛΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ Ο ποσοτικός προσδιορισµός βασίζεται στην χρωµατοµετρική µέθοδο Bradford η οποία στηρίζεται στην ιδιότητα της χρωστικής να συνδέεται µε πρωτεΐνες σε όξινο περιβάλλον και να αλλάζει το χρώµα της. Η ελεύθερη πρωτεΐνη έχει µέγιστο απορρόφησης στα 465 nm ενώ το σύµπλοκο χρωστικής πρωτεΐνης στα 595 nm. Το αντιδραστήριο που χρησιµοποιείται είναι το Biorad Protein Assay, το οποίο αραιώνεται σε απιονισµένο νερό (1:4 αραίωση). H περιεκτικότητα των δειγµάτων σε πρωτεΐνη υπολογίζεται µε την βοήθεια πρότυπης καµπύλης αναφοράς µε διαλύµατα που αντιστοιχούν σε αυξανόµενες ποσότητες αλβουµίνης ορού βοδιού (5, 10, 15, 25, 50 και 75 µl). Tα δείγµατα αραιώνονται µε απιονισµένο νερό ώστε οι τιµές της πρωτεΐνης να βρίσκονται µέσα στα όρια της πρότυπης καµπύλης. Σε κάθε περίπτωση 3 ul του αραιωµένου δείγµατος αναµιγνύονται µε 1 ml αντιδραστηρίου χρωστικής το οποίο έχει επίσης αραιωθεί 5 φορές µε απιονισµένο νερό. Ως τυφλό χρησιµοποιείται 1 ml του αραιωµένου διαλύµατος χρωστικής. Όλα τα δείγµατα αναδεύονται σε Vortex και µετά από λίγα λεπτά µετράται η απορρόφηση στα 595 nm. 9. HΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΗ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙ ΙΟΥ Η διαδικασία της ηλεκτροφόρησης βασίζεται στην ιδιότητα των πρωτεϊνών να µετακινούνται όταν βρεθούν σε ηλεκτρικό πεδίο και σε τιµές ph διαφορετικές από το ισοηλεκτρικό τους σηµείο. Η ταχύτητα µετατόπισης εξαρτάται από το λόγο του φορτίου που φέρουν προς τη µάζα τους. Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνικών µορίων επιτυγχάνεται σε πηκτώµατα πολυακρυλαµιδίου πορώδη µέσα που λειτουργούν ως µοριακοί ηθµοί. Το µέγεθος των πόρων του πηκτώµατος εξαρτάται από την απόλυτη συγκέντρωση του ακρυλαµιδίου και του δις ακρυλαµιδίου στα διαλύµατα του πηκτώµατος. H έναρξη του πολυµερισµού καθορίζεται από την προσθήκη του υπερθειικού αµµωνίου (APS) και επιταχύνεται παρουσία Ν,Ν,Ν,Ν-τετραµέθυλοαιθυλοδιαµίνης (TEMED). Tα συστήµατα ηλεκτροφόρησης διακρίνονται σε συνεχή και ασυνεχή καθώς επίσης σε αυτές που πραγµατοποιούνται παρουσία ή απουσία αποδιατακτικών παραγόντων όπως το απορρυπαντικό SDS.

46 9.1.Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών παρουσία SDS (SDS-PAGE) Χρησιµοποιείται το σύστηµα SDS ηλεκτροφόρησης σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου. Το SDS συγκεκριµένα είναι απορρυπαντικό που φορτίζει αρνητικά τις πρωτεΐνες µε τις οποίες συνδέεται, ώστε να τις κατευθύνει προς την ίδια κατεύθυνση στο ηλεκτρικό πεδίο µε αποτέλεσµα ο διαχωρισµός να γίνεται αποκλειστικά λόγω µοριακού βάρους. Για το σχηµατισµό του πηκτώµατος χρησιµοποιείται αρχικά το διάλυµα πηκτώµατος διαχωρισµού που αποτελείται από: 375 mm Tris-HCl ph 8, 0,275(w/v) δις-ακρυλαµίδιο, 0,1 % (v/v) SDS, 0,15%(w/v)APS, 0,007% (v/v) TEMED και 10% ή 12 % ακρυλαµίδιο ανάλογα µε το µοριακό βάρος της προς µελέτης πρωτεΐνης. Αφού ολοκληρωθεί ο πολυµερισµός του πηκτώµατος διαχωρισµού προστίθεται το διάλυµα του πηκτώµατος επιστίβαξης σύστασης:125 mm Tris-HCl, ph 6,8, 0,165% (w/v) δις-ακρυλαµίδιο, 6% ακρυλαµίδιο, 0,1% (v/v) SDS, 0,15% (w/v) APS, 0,007% (v/v) TEMED. Επιπλέον χρησιµοποιείται ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροδίων και η ηλεκτροφόρηση γίνεται µε παροχή ηλεκτρικού ρεύµατος σταθερής τάσης 200V και τερµατίζεται αµέσως µόλις η χρωστική που περιέχεται στα δείγµατα φτάσει στο τέλος του πηκτώµατος διαχωρισµού. Η όλη διαδικασία διαρκεί συνολικά λεπτά. 10. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Σε αυτό το στάδιο οι πρωτεΐνες µεταφέρονται σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης στην οποία και αποτυπώνονται όπως ακριβώς διαχωρίστηκαν στο πήκτωµα διαχωρισµού κατά την ηλεκτροφόρηση. Η διαδικασία αυτή πραγµατοποιείται σε ειδική συσκευή ηµίξηρης µεταφοράς για την οποία χρησιµοποιούνται χαρτιά Whatman (3mm) και µεµβράνες νιτροκυτταρίνης κοµµένα στις διαστάσεις του πηκτώµατος διαχωρισµού και εµποτισµένα στο διάλυµα µεταφοράς που αποτελείται από: 25 mm Tris-HCl ph 8.3, 192 mm γλυκίνη και 20% (v/v) µεθανόλη για 15 λεπτά. Το πήκτωµα και η νιτροκυτταρίνη τοποθετούνται στην συσκευή µεταφοράς µε την εξής διάταξη από την κάθοδο προς την άνοδο: 5 χαρτιά Whatman- νιτροκυτταρίνηπήκτωµα -5 χαρτιά Whatman. Είναι απαραίτητο κατά την επίστρωση πάνω στην συσκευή να µην εγκλωβίζονται φυσαλίδες µεταξύ χαρτιών πηκτωµάτων και νιτροκυτταρίνης. Η µεταφορά διαρκεί λεπτά σε σταθερή τάση των 10 V µε το ρεύµα να φτάνει τα 350 ma.

47 11. ΑΝΟΣΟΕΝΤΟΠΙΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ ΣΤΗ ΝΙΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗ (immunoblotting) Τα πρωτεϊνικά αντιγόνα που είναι συνδεδεµένα στη µεµβράνη της νιτροκυτταρίνης ανιχνεύονται µε την χρήση δύο αντισωµάτων. Το πρώτο αντίσωµα είναι ειδικό έναντι του πρωτεϊνικού αντιγόνου µε το οποίο σχηµατίζει ανοσοσύµπλοκα. Στα σύµπλοκα αυτά δεσµεύεται το δεύτερο αντίσωµα έναντι του πρώτου που είναι συνδεδεµένο µε ένζυµο (π.χ υπεροξειδάση).οι θέσεις πρόσδεσης του δευτέρου αντισώµατος προσδιορίζονται µε τη µέθοδο της ενισχυµένης χηµειοφωταύγειας (ECL). Πιο αναλυτικά, η µεµβράνη της νιτροκυτταρίνης επωάζεται αρχικά για 30 λεπτά σε διάλυµα TBST (20 mm Tris-HCL ph 7,6, 137mM NaCl και 0,1%(v/v) Tween- 20) το οποίο περιέχει 5% (w/v) σκόνη γάλακτος χαµηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά προκειµένου να δεσµευτούν οι µη ειδικές θέσεις σύνδεσης (Blocking). Aκολουθούν 3 πεντάλεπτες πλύσεις µε TBST και επώαση 12 ωρών στους 4 0 C µε το πρώτο αντίσωµα (αναγνωρίζει την προς µελέτη πρωτεΐνη) το οποίο είναι αραιωµένο σε διάλυµα TBST που περιέχει 5% (w/v) BSA. Μετά το τέλος της επώασης ακολουθούν τρεις πεντάλεπτες πλύσεις µε TBST ώστε να ακολουθήσει η επώαση µε το δεύτερο αντίσωµα το οποίο είναι συνδεµένο µε υπεροξειδάση. Το δεύτερο αντίσωµα είναι αραιωµένο σε διάλυµα 1% (w/v) σκόνης γάλακτος σε TBST για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολουθούν και πάλι 3 πεντάλεπτες πλύσεις σε TBST. Μετά το τέλος των επωάσεων µε τα αντισώµατα και τις αντίστοιχες πλύσεις ακολουθεί η εφαρµογή της ενισχυµένης χηµειοφωταύγειας µε το αντιδραστήριο ECL (CHEMICON INTERNATIONAL). Το τελευταίο είναι µίγµα Η 2 Ο 2 και λουµινόλης ώστε η υπεροξειδάση του δευτέρου αντισώµατος να διασπά το υπεροξείδιο του υδρογόνου και να απελευθερώνονται ρίζες Ο 2 οι οποίες αντιδρούν µε τη λουµινόλη και απελευθερώνουν φωτόνια που προσβάλλουν το φωτογραφικό φιλµ. Έπειτα από επώαση 3 λεπτών οι µεµβράνες τοποθετούνται σε ειδική κασετίνα και εκτίθενται σε φιλµ (Κοdak AR X-OMATic) για περίπου 10 λεπτά. Tέλος τα φιλµ εµφανίζονται και στερεώνονται µε φωτογραφικά υλικά της Kodak τα Developer και Fixer.

48 12. ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΛΟΓΙΣΜΙΚΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΩΝ Η ανάλυση και επεξεργασία των αποτελεσµάτων της παρούσας εργασίας πραγµατοποιείται µε την βοήθεια διαφόρων προγραµµάτων: Το λογισµικό Gel Pro Analyser της Media Cybernetics για την σάρωση των ανοσοστυπωµάτων και την επεξεργασία των αντίστοιχων αποτελεσµάτων. Το λογισµικό Prism της εταιρίας Graph Pad Software (San Diego, CA) για την προσαρµογή των αποτελεσµάτων σε διαγράµµατα. Το λογισµικό InStat της GraphPad Software (San Diego CA) για την στατιστική επεξεργασία των δεδοµένων Το λογισµικό ADOBE PHOTOSHOP και POWERPOINT για την επεξεργασία της εικόνας. Το λογισµικό Scion Image Beta 4.02, της εταιρίας Scion Corporation (USA) για την διεξαγωγή της µεθόδου της «πλανηµετρίας».

49 IV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΟΥ GW0742 ΣΤΗΝ ΥΠΕΡΤΡΟΦΙΑ ΤΩΝ ΚΑΡ ΙΟΜΥΟΚΥΤΤΑΡΩΝ 1.1 Καρδιοµυοκύτταρα φυσιολογικών επίµυων Για να διερευνηθεί αν η ενεργοποίηση του PPARβ/δ σχετίζεται µε την καρδιακή υπερτροφία, πρωτογενείς καλλιέργειες καρδιακών µυοκυττάρων εκτέθηκαν στον ειδικό συνθετικό συνδέτη του PPARβ/δ, GW nM για 24ώρες παρουσία ή απουσία της φαινυλεφρίνης (ΡΕ). Η φαινυλεφρίνη είναι αγωνιστής των α 1 αδρενεργικών υποδοχέων και αποτελεί ισχυρό υπερτροφικό παράγοντα. Η έκθεση στον GW0742 ανέστειλε την επαγόµενη από την φαινυλεφρίνη υπερτροφία των καρδιακών µυοκυττάρων (εικόνα 10). A ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΡΕ 100µΜ GW nM PE+GW nM

50 B Κυτταρική επιφάνεια (αυθαίρετες µονάδες) * # 0 Γ ΜΑΡΤΥΡΑΣ PE GW50nM PE+GW50nM Μείζων/ελάσσων άξονας (αυθαίρετες µονάδες) ΜΑΡΤΥΡΑΣ PE GW50nM PE+GW50nM Εικόνα 10. Eπίδραση του GW0742 στην αύξηση του µεγέθους των καρδιοµυοκυττάρων που επάγεται από τη φαινυλεφρίνη. Α. Καρδιοµυοκύτταρα ενήλικων επίµυων καλλιεργήθηκαν παρουσία του υπερτροφικού αγωνιστή φαινυλεφρίνη ή και του ειδικού συνδέτη GW0742. Η επιφάνεια των καρδιακών µυοκυττάρων προσδιορίστηκε ψηφιακά µε το λογισµικό Scion Image Beta 4.02 (Scion Corporation USA). Β. απεικόνιση των µετρήσεων. Γ. Απεικόνιση του λόγου των αξόνων της κυτταρικής επιφάνειας. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως µέσος όρος ± τριών διαφορετικών πειραµάτων. * P<0,05 σε σχέση µε τις τιµές του µάρτυρα και # P<0,05 σε σχέση µε τις τιµές της φαινυλεφρίνης.

51 Όπως προαναφέρθηκε, κατά την υπερτροφική αύξηση παρατηρείται επανέκφραση ενός εµβρυϊκού προγράµµατος που περιλαµβάνει την έναρξη µεταγραφής γονιδίων, που είχε διακοπεί σε εµβρυϊκά στάδια όπως το ANP (κολπικό νατριοδιουρητικό πεπτίδιο), η σκελετική α-ακτίνη και οι βαριές αλυσίδες της β-µυοσίνης των σκελετικών µυών (β-mhc) (Calderone et al., 1995). Τα συγκεκριµένα γονίδια αποτελούν χρήσιµους «δείκτες» της υπερτροφίας της καρδιάς, µε πιο εύχρηστο ίσως το γονίδιο του ANP. Αποµονώθηκε λοιπόν RNA από καλλιέργειες καρδιοµυοκυττάρων φυσιολογικών επίµυων στις οποίες είχε προηγηθεί επώαση µε φαινυλεφρίνη ή/και τον GW0742 και ακολούθησε RT-PCR για το γονίδιο ΑΝΡ (εικόνα 11). O GW0742 δεν ανέστειλε την επανέκφραση του ΑΝΡ που επάγεται από τη φαινυλεφρίνη. Α ANP GAPDH 2 Β ANP/GAPDH (arbitrary units) 1 * * 0 MAΡΤΥΡΑΣ PE GW0742 PE+GW0742 Εικόνα 11. Α. Η έκφραση του γονιδίου του ΑΝΡ σε επίπεδο έκφρασης του αντίστοιχου mrna. Β. Ποσοτικοποίηση µε το γονίδιο αναφοράς GAPDH. * P<0,05 σε σχέση µε τις τιµές του µάρτυρα

52 1.2 Καρδιοµυοκύτταρα διαβητικών επίµυων Πρωτογενείς καλλιέργειες καρδιακών µυοκυττάρων εκτέθηκαν στον ειδικό συνθετικό συνδέτη του PPARβ/δ, GW nM ή/και σε φαινυλεφρίνη (θετικός µάρτυρας της υπερτροφίας) για 24ώρες. Η επίδραση µε φαινυλεφρίνη και τον GW0742 ανέστειλε την επαγόµενη από την φαινυλεφρίνη καρδιακή υπερτροφία (εικόνα 12). Αξιοσηµείωτο είναι το γεγονός ότι η επιφάνεια των καρδιοµυοκυττάρων στο µάρτυρα είναι σχεδόν η ίδια µε αυτήν της φαινυλεφρίνης η οποία επάγει την υπερτροφία. Επίσης, η επώαση µε τον GW0742 ανέστειλε την υπερτροφία επαναφέροντας τα κύτταρα στα επίπεδα σχεδόν του µάρτυρα των φυσιολογικών ζώων (εικόνα 12). A MΑΡΤΥΡΑΣ PE 100µΜ GW50nM PE+GW 50nM

53 B cell area (arbitrary units) Γ CONTROL PE GW50nM PE+GW50nM Μείζων/ελάσσων άξονας (αυθαίρετες µονάδες) ΜΑΡΤΥΡΑΣ PE GW50nM PE+GW50nM Εικόνα 12. Eπίδραση του GW0742 στην αύξηση του µεγέθους των καρδιοµυοκυττάρων διαβητικών επίµυων που επάγεται από τη φαινυλεφρίνη. Α. Καρδιοµυοκύτταρα ενήλικων διαβητικών επίµυων καλλιεργήθηκαν παρουσία του υπερτροφικού αγωνιστή φαινυλεφρίνη ή/ και του ειδικού συνδέτη GW0742. Η επιφάνεια των καρδιακών µυοκυττάρων προσδιορίστηκε ψηφιακά µε το λογισµικό Scion Image Beta 4.02 (Scion Corporation USA). Β. Απεικόνιση των µετρήσεων. Γ. Απεικόνιση του λόγου των αξόνων της κυτταρικής επιφάνειας. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως µέσος όρος ± τριών διαφορετικών πειραµάτων. * P<0,05 σε σχέση µε τις τιµές του µάρτυρα και # P<0,05 σε σχέση µε τις τιµές της φαινυλεφρίνης.

54 2. ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΕΝΕΡΓΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΟΞΥΓΟΝΟΥ (ROS) ιάφορες βιβλιογραφικές αναφορές υποστηρίζουν ότι οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (ROS) αποτελούν έναν από τους βασικούς παράγοντες που ενοχοποιείται για την υπερτροφία. (Kwon, και συν. 2003, Li και συν 2002., Date και συν. 2002, Higuchi και συν 2002). Πρωτογενείς καλλιέργειες καρδιακών µυοκυττάρων φυσιολογικών και διαβητικών επίµυων επωάστηκαν για 3.5 ώρες µε φαινυλεφρίνη 100µΜ για επαγωγή υπερτροφίας ή/και µε τον συνδέτη GW nM. Μετά από τον χρόνο αυτό προστέθηκε ο ανιχνευτής ελεύθερων ριζών οξυγόνου DCFDA για 30 λεπτά. Όσον αφορά τα καρδιοµυοκύτταρα των φυσιολογικών ζώων παρατηρήθηκε αυξηµένος φθορισµός και παραγωγή ROS στην έκθεση µε τη φαινυλεφρίνη (PE) και πολύ µικρότερος στον µάρτυρα. Η έκθεση στον GW0742 αλλά και σε PE/GW0742 δεν οδήγησε σε παραγωγή ROS. Όσον αφορά στα καρδιοµυοκύτταρα διαβητικών ζώων παρατηρήθηκε παραγωγή ROS τόσο στον µάρτυρα όσο και στην επίδραση µε τη φαινυλεφρίνη (εικόνα 13).

55 Α ΜΑΡΤΥΡΑΣ PE GW0742 GW074250nM 50nM PE+GW0742 PE+GW nM 50nM ΗΟΕCHST DCFHDΑ B MΑΡΤΥΡΑΣ PE GW50nM PE+GW50nM ΗΟΕCHST DCFHDA Εικόνα 13. Έλεγχος των ελεύθερων ριζών οξυγόνου σε καρδιοµυοκύτταρα ενήλικων φυσιολογικών και διαβητικών επίµυων. Αντιπροσωπευτικές εικόνες µικροσκοπίου. A. Σε καρδιοµυοκύτταρα φυσιολογικών επίµυων παρατηρήθηκε παραγωγή ROS στην επώαση µε φαινυλεφρίνη (υπερτροφία) και µικρή παραγωγή στο µάρτυρα. Β. Σε καρδιοµυοκύτταρα διαβητικών επίµυων παρατηρήθηκε µεγάλη παραγωγή ROS στο µάρτυρα όπως και στην επίδραση µε φαινυλεφρίνη. Η παραγωγή των ROS µετρήθηκε µε το φθορίζον probe5-(6)-chloromethyl-2,7 dihydrofluorescein diacetate (DCFDA). Οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν µε τη χρωστική Hoechst.

56 3. Ο ΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ ΜΕΣΩ ΤΩΝ α 1 -Α ΡΕΝΕΡΓΙΚΩΝ ΥΠΟ ΟΧΕΩΝ 3.5 Επίδραση του GW0742 στην επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη ενεργοποίηση των ERK1/2 σε καρδιοµυοκύτταρα φυσιολογικών επίµυων Καρδιακά µυοκύτταρα επωάστηκαν µε 100 µμ φαινυλεφρίνης αλλά και µε φαινυλεφρίνη και GW nM για αυξανόµενους χρόνους : 2, 5, 15 και 30 λεπτά. Ακολούθησε λύση των κυττάρων, προετοιµασία ολικών κυτταρικών εκχυλισµάτων και 80 µgr ολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγµα χρησιµοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western. ιαπιστώθηκε ότι η φαινυλεφρίνη επάγει άµεσα τη φωσφορυλίωση των ERK1 και ERK2, µε το µέγιστο της απόκρισης (8.641±2.748 φορές σε σχέση µε τις τιµές του µάρτυρα), να εντοπίζεται στα 5 λεπτά διέγερσης των κυττάρων (Εικόνα 15). Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των δυο κινασών επέστρεψαν στις τιµές του µάρτυρα στα 15 λεπτά επώασης µε φαινυλεφρίνη. ιαπιστώθηκε επίσης ότι ο GW0742 αναστέλλει την επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση στους αντίστοιχους χρόνους. Στην ενεργοποίηση των ERK1/2 χρησιµοποιήθηκαν αντισώµατα ειδικά για τις διπλά φωσφορυλιωµένες στα κατάλοιπα Thr202 και Tyr204, ERK1 και ERK2 επίµυ. Παράλληλα, µε τη χρήση αντισώµατος ειδικού για τα ολικά επίπεδα των ERK1 και ERK2, ανεξάρτητα από το βαθµό φωσφορυλίωσης τους, επιβεβαιώθηκε ότι η ολική πρωτεΐνη ήταν παρόµοια σε όλα τα εξεταζόµενα δείγµατα (Εικόνα 14).

57 Α PE PE+GW p-erk1/ ERK1/2 Β φωσφο-erk1/2 (αυθαίρετες µονάδες) * * * - GW + GW # # # # Χρόνος (λεπτά) * Εικόνα 14. Χρονικό πρότυπο της επίδρασης του GW0742 στην επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση της ΕRK1/2 σε καρδιακά µυοκύτταρα επίµυ. Α. Μυοκύτταρα επωάστηκαν µε 100 µμ φαινυλεφρίνης και 50nΜ GW0742 για τους αντίστοιχους χρόνους. Ακολούθησε ανοσοεντοπισµός της φωσφορυλιωµένης µορφής των κινασών (πάνω) καθώς και των ολικών τους επιπέδων (κάτω) σε 80 µg ολικών κυτταρικών εκχυλισµάτων. Β. Ποσοτική έκφραση των δεδοµένων µε πυκνοµετρική ανάλυση των ζωνών για τις ERK1/2. Κάθε σηµείο στο διάγραµµα αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα. Το πείραµα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές µε παρόµοια αποτελέσµατα. * P<0.05 σε σχέση µε το µάρτυρα και #P<0,05 σε σχέση µε τους αντίστοιχους χρόνους επώασης µε την φαινυλεφρίνη.

58 3.2. Επίδραση του GW0742 στην επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη ενεργοποίηση της p38 MAPK σε καρδιοµυοκύτταρα φυσιολογικών επίµυων Παρά το γεγονός ότι οι διάφορες ισοµορφές της p38 ΜΑΡΚ ενεργοποιούνται κατεξοχήν από ποικίλες µορφές κυτταρικού στρες, έχει αποδειχθεί ότι αποκρίνονται επίσης σε διάφορους αυξητικούς παράγοντες, µιτογόνα και αγωνιστές των συζευγµένων µε G πρωτεΐνες υποδοχέων. Για τη διερεύνηση της επίδρασης του GW0742 στην ενεργοποίηση της p38 MAPK σε αποµονωµένα καρδιακά µυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου εφαρµόστηκε ανάλυση κατά Western και χρησιµοποιήθηκε αντίσωµα ειδικό για τη διπλά φωσφορυλιωµένη, στα αµινοξικά κατάλοιπα Thr180 και Tyr182, µορφή της κινάσης. Ακολουθήθηκε ένα συγκεκριµένο χρονικό πρότυπο (2, 5, 15 και 30 λεπτά) κατά το οποίο αποµονωµένα καρδιοµυοκύτταρα επωάστηκαν µε φαινυλεφρίνη (100 µμ) (υπερτροφικός παράγοντας) ή/ και µε τον συνδέτη GW0742. Ακολούθησε λύση των κυττάρων και ανάλυση κατά Western σε 100 µgr ολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγµα. ιαπιστώθηκε ότι η φαινυλεφρίνη επάγει τη φωσφορυλίωση της p38 MAPK, µε τη µέγιστη τιµή να εντοπίζεται στα 15 λεπτά διέγερσης (12,4 ±2,4 σε σχέση µε τις τιµές του µάρτυρα 2,6± 2) και επίσης ότι ο GW0742 αναστέλλει την επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση (Εικ. 15 Α και Β). Ανάλυση κατά Western στα ίδια δείγµατα χρησιµοποιώντας αντίσωµα ακτίνης έδειξε ότι η συνολική πρωτεΐνη ήταν παρόµοια στα εξεταζόµενα δείγµατα.

59 Α PE PE + GW Φωσφo- P38 MAPK Aκτίνη Β Φωσφο-p38 MAPK (αυθαίρετες µονάδες) * # -GW +GW 0 0' 5' 15' 30' χρόνος (λεπτά) Εικόνα 15. Χρονικό πρότυπο της επίδρασης του GW0742 στην επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση της p38 MAPK σε καρδιακά µυοκύτταρα επίµυ. (Α) Μυοκύτταρα επωάστηκαν µε 100 µμ φαινυλεφρίνης για τους αντίστοιχους χρόνους. Ακολούθησε ανοσοεντοπισµός της φωσφορυλιωµένης µορφής της κινάσης (πάνω), καθώς και της ακτίνης (κάτω) σε 80 µg ολικών κυτταρικών εκχυλισµάτων. (Β) Ποσοτική έκφραση των δεδοµένων µε πυκνοµετρική ανάλυση των ζωνών για τη φωσφορυλιωµένη p38 MAPK σε σχέση µε τον GW0742. Κάθε σηµείο στο διάγραµµα αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα. Το πείραµα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές µε παρόµοια αποτελέσµατα. * P<0.05 σε σχέση µε το µάρτυρα και # Ρ<0.05 σε σχέση µε τους αντίστοιχους χρόνους επώασης µε την φαινυλεφρίνη.

60 3.3. Επίδραση του GW0742 στην επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη ενεργοποίηση της Αkt σε καρδιοµυοκύτταρα φυσιολογικών επίµυων Η ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ και της PKB/Akt σχετίζονται µε υψηλά ποσοστά πρωτεϊνικής σύνθεσης και κυτταροπροστασίας αλλά επίσης και µε την καρδιακή υπερτροφία. Για τη µελέτη της Αkt σε αποµονωµένα καρδιακά µυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου εφαρµόστηκε ανάλυση κατά Western και χρησιµοποιήθηκε αντίσωµα ειδικό για τη φωσφορυλιωµένη, στα αµινοξικά κατάλοιπα Ser473, µορφή της κινάσης. Ακολουθήθηκε ένα συγκεκριµένο χρονικό πρότυπο (2, 5, 15 και 30 λεπτά) κατά το οποίο αποµονωµένα καρδιοµυοκύτταρα επωάστηκαν µε φαινυλεφρίνη (100 µμ) (υπερτροφικός παράγοντας) ή/ και µε τον συνδέτη GW0742. Ακολούθησε λύση των κυττάρων και ανάλυση κατά Western σε 80 µgr ολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγµα. ιαπιστώθηκε ότι η φαινυλεφρίνη επάγει σε µικρό βαθµό τη φωσφορυλίωση της Αkt µε τη µέγιστη τιµή να εντοπίζεται στα 2 λεπτά της διέγερσης ( ±23.78 σε σχέση µε τις τιµές του µάρτυρα ±6.992) και επίσης ότι ο GW0742 αναστέλλει πλήρως την επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση ακόµη και χαµηλότερα της τιµής του µάρτυρα (Εικόνα 16 Α και Β). Ανάλυση κατά Western στα ίδια δείγµατα µε αντίσωµα ακτίνης έδειξε ότι η συνολική πρωτεΐνη ήταν παρόµοια στα εξεταζόµενα δείγµατα.

61 Α PE PE+GW p-akt Aκτίνη Β φωσφο-akt(ser473) (αυθαίρετες µονάδες) * * GW + GW # # Χρόνος (λεπτά) Εικόνα 16. Χρονικό πρότυπο της επίδρασης του GW0742 στην επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση της Αkt σε καρδιακά µυοκύτταρα επίµυ. (Α) Μυοκύτταρα επωάστηκαν µε 100 µμ φαινυλεφρίνης και 50nΜ GW0742 για τους αντίστοιχους χρόνους. Ακολούθησε ανοσοεντοπισµός της φωσφορυλιωµένης µορφής των κινασών (πάνω) καθώς και της ακτίνης (κάτω) σε 80 µg ολικών κυτταρικών εκχυλισµάτων. (Β) Ποσοτική έκφραση των δεδοµένων µε πυκνοµετρική ανάλυση των ζωνών για την Αkt. Κάθε σηµείο στο διάγραµµα αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα. Το πείραµα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές µε παρόµοια αποτελέσµατα. * P<0.05 σε σχέση µε το µάρτυρα και #P<0,05 σε σχέση µε τους αντίστοιχους χρόνους επώασης µε την φαινυλεφρίνη.

62 3.4. Aπόκριση των p38 ΜΑPK και ERK1/2 µετά από επίδραση µε φαινυλεφρίνη ή/και τον GW0742 σε καρδιοµυοκύτταρα διαβητικών επίµυων Έπειτα από τη χορήγηση στρεπτοζοτοσίνης και την επαγωγή του διαβήτη, αποµονώθηκαν τα καρδιοµυοκύτταρα από διαβητικούς επίµυες και ακολούθησε ανάλυση κατά Western και αντισώµατα για τις κινάσες που χρησιµοποιήθηκαν στα φυσιολογικά ζώα. Ακολουθήθηκε το ίδιο χρονικό πρότυπο και για τις τρεις κινάσες. Όσον αφορά στην p38 ΜΑΡΚ, η έκθεση σε φαινυλεφρίνη αλλά και στον GW0742, δεν ενεργοποίησε τη συγκεκριµένη κινάση. Σε αντίθεση µε τα φυσιολογικά ζώα, δεν παρατηρήθηκε επαγωγή υπερτροφίας από τη φαινυλεφρίνη, ούτε αναστολή από την επώαση µε τον συνδέτη (εικόνα 17). Η διέγερση δηλαδή των α 1 αδρενεργικών υποδοχέων µε φαινυλεφρίνη σε καρδιακά µυοκύτταρα ενήλικου διαβητικού αρουραίου δεν επιφέρει στατιστικά σηµαντική αύξηση στα επίπεδα της φωσφορυλιωµένης p38 MAPK. Ανάλυση κατά Western στα ίδια δείγµατα µε αντίσωµα ακτίνης έδειξε ότι η συνολική πρωτεΐνη ήταν παρόµοια στα εξεταζόµενα δείγµατα. Για τις ERK1/2, παρατηρήθηκε φωσφορυλίωση που επάγεται από την φαινυλεφρίνη µε µέγιστο απόκρισης στα 5 λεπτά της διέγερσης (477±27 σε σχέση µε τις τιµές του µάρτυρα 228±49). Ανάλυση κατά Western στα ίδια δείγµατα µε αντίσωµα ειδικό για τα ολικά επίπεδα της κινάσης αποκάλυψε ότι η συνολική πρωτεΐνη ήταν παρόµοια στα εξεταζόµενα δείγµατα (εικόνα 18). Όσον αφορά στην Αkt, η επώαση µε φαινυλεφρίνη δεν τη φωσφορυλιώνει συνεπώς δεν επάγεται το συγκεκριµένο µονοπάτι. Η επίδραση και µε τον GW0742 δεν προκαλεί φωσφορυλίωση ούτε αποφωσφορυλίωση της κινάσης. Το χρονικό πρότυπο που ακολουθήθηκε ήταν το ίδιο µε το αντίστοιχο των φυσιολογικών ζώων. Η διέγερση δηλαδή των α 1 αδρενεργικών υποδοχέων µε φαινυλεφρίνη σε καρδιακά µυοκύτταρα ενήλικου διαβητικού αρουραίου δεν επιφέρει στατιστικά σηµαντική αύξηση στα επίπεδα της φωσφορυλιωµένης Αkt. Ανάλυση κατά Western στα ίδια δείγµατα µε αντίσωµα ακτίνης έδειξε ότι η συνολική πρωτεΐνη ήταν παρόµοια στα εξεταζόµενα δείγµατα (εικόνα 19).

63 A PE PE +GW0742 Φωσφop38 MAPK Aκτίνη B Φωσφο-p38 MAPK (αυθαίρετες µονάδες) GW -GW Χρόνος (λεπτά) Εικόνα 17. Χρονικό πρότυπο της επίδρασης του GW0742 στην επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση της p38 MAPK σε καρδιακά µυοκύτταρα επίµυ. (Α) Μυοκύτταρα επωάστηκαν µε 100 µμ φαινυλεφρίνης για τους αντίστοιχους χρόνους. Ακολούθησε ανοσοεντοπισµός της φωσφορυλιωµένης µορφής της κινάσης (πάνω), καθώς και της ακτίνης (κάτω) σε 80 µg ολικών κυτταρικών εκχυλισµάτων. (Β) Ποσοτική έκφραση των δεδοµένων µε πυκνοµετρική ανάλυση των ζωνών για τη φωσφορυλιωµένη p38 MAPK σε σχέση µε τον GW0742. Κάθε σηµείο στο διάγραµµα αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα. Το πείραµα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές µε παρόµοια αποτελέσµατα.

64 Α p-erk1/2 PE PE+GW ERK1/2 B Φωσφo-ERK1/2 (αυθαίρετες µονάδες) # * # * # +GW0742 -GW χρόνος λεπτά Εικόνα 18. Χρονικό πρότυπο της επίδρασης του GW0742 στην επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση των ERK1/2 σε καρδιακά µυοκύτταρα επίµυ. (Α) Μυοκύτταρα επωάστηκαν µε 100 µμ φαινυλεφρίνης και 50nΜ GW0742 για τους αντίστοιχους χρόνους. Ακολούθησε ανοσοεντοπισµός της φωσφορυλιωµένης µορφής των κινασών (πάνω) καθώς και των ολικών τους επιπέδων (κάτω) σε 80 µg ολικών κυτταρικών εκχυλισµάτων. (Β) Ποσοτική έκφραση των δεδοµένων µε πυκνοµετρική ανάλυση των ζωνών για τις ERK1/2. Κάθε σηµείο στο διάγραµµα αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα. Το πείραµα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές µε παρόµοια αποτελέσµατα. * P<0.05 σε σχέση µε το µάρτυρα και #P<0,05 σε σχέση µε τους αντίστοιχους χρόνους επώασης µε την φαινυλεφρίνη.

65 A PE PE+GW φωσφο-akt Ser-473 Ακτίνη B Φωσφο-AKT (αυθαίρετες µονάδες) 120 +GW -GW Χρόνος (λεπτά) Εικόνα 19. Χρονικό πρότυπο της επίδρασης του GW0742 στην επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση της Αkt σε καρδιακά µυοκύτταρα επίµυ. (Α) Μυοκύτταρα επωάστηκαν µε 100 µμ φαινυλεφρίνης και 50nΜ GW0742 για τους αντίστοιχους χρόνους. Ακολούθησε ανοσοεντοπισµός της φωσφορυλιωµένης µορφής των κινασών (πάνω) καθώς και της ακτίνης (κάτω) σε 80 µg ολικών κυτταρικών εκχυλισµάτων. (Β) Ποσοτική έκφραση των δεδοµένων µε πυκνοµετρική ανάλυση των ζωνών για την Αkt. Κάθε σηµείο στο διάγραµµα αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα. Το πείραµα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές µε παρόµοια αποτελέσµατα.

66 4. Ο ΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ ΜΕΣΩ ΤΟΥ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΗΣ ΙΝΣΟΥΛΙΝΗΣ 1. Η ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΟΥ GW0742 ΣΤΗΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΜΟΝΟΠΑΤΙΟΥ ΠΟΥ ΕΠΑΓΕΤΑΙ ΑΠΟ ΤΗΝ ΙΝΣΟΥΛΙΝΗ ΣΕ ΚΑΡ ΙΟΜΥΟΚΥΤΤΑΡΑ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΊΜΥΩΝ Προκειµένου να διερευνηθεί η επίδραση της ενεργοποίησης του µονοπατιού που επάγεται από τον υποδοχέα της ινσουλίνης, στις ΜΑΡΚ κινάσες, p38 και ERK1/2,αλλά και στην Αkt καρδιακά µυοκύτταρα ενήλικου επίµυ εκτέθηκαν στην ινσουλίνη και στον GW0742, τον ειδικό συνθετικό συνδέτη του PPARβ/δ. Η ενεργοποίηση των κινασών ανιχνεύθηκε µε αντισώµατα ειδικά, έναντι συνθετικών πεπτιδίων που αντιστοιχούν σε συγκεκριµένες αλληλουχίες των MAPKs. Όσον αφορά στην Αkt, αναµένουµε ενεργοποίηση µε την επώαση µε την ινσουλίνη αφού η ινσουλίνη ενεργοποιεί το σηµατοδοτικό µονοπάτι της ΡΙ3Κ. Εφαρµόστηκε ανάλυση κατά Western και χρησιµοποιήθηκε ειδικό αντίσωµα για τη φωσφορυλίωµένη στα κατάλοιπα Ser473, µορφή της κινάσης. Το χρονικό πρότυπο της ενεργοποίησης της Akt από την ινσουλίνη διερευνήθηκε σε καρδιακά µυοκύτταρα που είχαν επωαστεί µε την ινσουλίνη ή/και τον συνδέτη GW0742 στους χρόνους 5 και 15 λεπτά. Ακολούθησε λύση των κυττάρων και ανάλυση κατά Western σε 80 µgr ολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγµα. ιαπιστώθηκε ότι η ινσουλίνη επάγει τη φωσφορυλίωση της Αkt µε τη µέγιστη τιµή να εντοπίζεται στα 5 λεπτά της διέγερσης ( ±84 σε σχέση µε τις τιµές του µάρτυρα ±9.807) και επίσης ότι ο GW0742 µειώνει στατιστικά σηµαντικά την επαγόµενη από τη ινσουλίνη φωσφορυλίωση στα 5 λεπτά αλλά όχι στα 15 λεπτά (εικόνα 20). Ανάλυση κατά Western στα ίδια δείγµατα µε αντίσωµα ακτίνης έδειξε ότι η συνολική πρωτεΐνη ήταν παρόµοια στα εξεταζόµενα δείγµατα. Για τη µελέτη των ERK1/2 χρησιµοποιήθηκαν αντισώµατα ειδικά για τις διπλά φωσφορυλιωµένες στα κατάλοιπα Thr202 και Tyr204, ERK1 και ERK2 αρουραίου. Πιο αναλυτικά, καρδιακά µυοκύτταρα επωάστηκαν µε 100 µμ ινσουλίνης ή/και µε τον GW nM για τους χρόνους 5 και 15 λεπτά. Ακολούθησε λύση των κυττάρων, προετοιµασία ολικών κυτταρικών εκχυλισµάτων και 80 µgr ολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγµα χρησιµοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western. ιαπιστώθηκε ότι η ινσουλίνη επάγει τη φωσφορυλίωση των ERK1/2 στα 5 λεπτά

67 της διέγερσης. ιαπιστώθηκε επίσης ότι ο GW0742 αναστέλλει στατιστικά σηµαντικά την επαγόµενη από την ινσουλίνη φωσφορυλίωση (εικόνα 21). Α Φωσφo- AKT Aκτίνη INS GW0742 INS+GW Β Φωσφo-AKT(Ser473) (αυθαίρετες µονάδες) * * # 0 ΜΑΡΤΥΡΑΣ INS5' INS15' GW5' GW15' INS+GW5' INS+GW15' Εικόνα 20. Χρονικό πρότυπο της επίδρασης του GW0742 στην επαγόµενη από την ινσουλίνη φωσφορυλίωση της Αkt σε καρδιακά µυοκύτταρα επίµυ. (Α) Μυοκύτταρα επωάστηκαν µε 100 µμ ινσουλίνης και 50nΜ GW0742 για τους αντίστοιχους χρόνους. Ακολούθησε ανοσοεντοπισµός της φωσφορυλιωµένης µορφής των κινασών (πάνω) καθώς και της ακτίνης (κάτω) σε 80 µg ολικών κυτταρικών εκχυλισµάτων. (Β) Ποσοτική έκφραση των δεδοµένων µε πυκνοµετρική ανάλυση των ζωνών για την Αkt. Κάθε σηµείο στο διάγραµµα αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα. Το πείραµα επαναλήφθηκε τρεις φορές µε παρόµοια αποτελέσµατα. *P<0.05 σε σχέση µε τις τιµές του µάρτυρα και #Ρ<0.05 σε σχέση µε τις τιµές της ινσουλίνης στα 5 λεπτά.

68 Α Φωσφο- ERK1/2 GW0742 INS+GW0742 INS ΕRK1/2 Β 2000 * Φωσφο-ΕRK1/2 (αυθαίρετες µονάδες) # # * 0 MΑΡΤΥΡΑΣ GW5' GW15' INS+GW5' INS+GW15' INS5' INS15' Εικόνα 21. Χρονικό πρότυπο της επίδρασης του GW0742 στην επαγόµενη από την ινσουλίνη φωσφορυλίωση των ERK1/2 σε καρδιακά µυοκύτταρα επίµυ. (Α) Μυοκύτταρα επωάστηκαν µε 100 ινσουλίνης ή/και GW nΜ για τους αντίστοιχους χρόνους. Ακολούθησε ανοσοεντοπισµός της φωσφορυλιωµένης µορφής των κινασών σε 80 µg ολικών κυτταρικών εκχυλισµάτων. (Β) Ποσοτική έκφραση των δεδοµένων µε πυκνοµετρική ανάλυση των ζωνών για τις ERK1/2. Κάθε σηµείο στο διάγραµµα αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα. Το πείραµα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές µε παρόµοια αποτελέσµατα. * P<0.05 σε σχέση µε το µάρτυρα και # Ρ<0.05 σε σχέση µε την ινσουλίνη.

69 2. Η ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΟΥ GW0742 ΣΤΗΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΜΟΝΟΠΑΤΙΟΥ ΠΟΥ ΕΠΑΓΕΤΑΙ ΑΠΟ ΤΗΝ ΙΝΣΟΥΛΙΝΗ ΣΕ ΚΑΡ ΙΟΜΥΟΚΥΤΤΑΡΑ ΙΑΒΗΤΙΚΩΝ ΕΠΊΜΥΩΝ Για τον προσδιορισµό της ενεργοποίησης των ERK1/2 χρησιµοποιήθηκαν αντισώµατα ειδικά για τις διπλά φωσφορυλιωµένες στα κατάλοιπα Thr202 και Tyr204, ERK1 και ERK2 αρουραίου. Καρδιακά µυοκύτταρα διαβητικών επίµυων εκτέθηκαν σε 100 µμ ινσουλίνης ή/και µε τον GW nM για τους χρόνους 5 και 15 λεπτά. Ακολούθησε λύση των κυττάρων, προετοιµασία ολικών κυτταρικών εκχυλισµάτων και 80 µgr ολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγµα χρησιµοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western. ιαπιστώθηκε ότι η ινσουλίνη επάγει τη φωσφορυλίωση των ERK1/2 στα 5 και 15 λεπτά της διέγερσης. ιαπιστώθηκε επίσης ότι ο GW0742 αναστέλλει στατιστικά σηµαντικά την επαγόµενη από την ινσουλίνη φωσφορυλίωση στα 15 λεπτά της επίδρασης και όχι στα 5 λεπτά (εικόνα 22). Σε αποµονωµένα καρδιακά µυοκύτταρα διαβητικών επίµυων η Αkt ενεργοποιήθηκε µε την επώαση µε την ινσουλίνη αφού η ινσουλίνη ενεργοποιεί το σηµατοδοτικό µονοπάτι της ΡΙ3Κ. Εφαρµόστηκε ανάλυση κατά Western και χρησιµοποιήθηκε ειδικό αντίσωµα για τη φωσφορυλίωµένη στα κατάλοιπα Ser473, µορφή της κινάσης. Ακολουθήθηκε χρονικό πρότυπο 5 και 15 λεπτών επιδρώντας µε ινσουλίνη ή/και τον συνδέτη GW0742. ιαπιστώθηκε ότι η ινσουλίνη επάγει τη φωσφορυλίωση της Αkt µε τη µέγιστη τιµή να εντοπίζεται στα 5 λεπτά της διέγερσης ( ±84 σε σχέση µε τις τιµές του µάρτυρα ±9.807) και ότι ο GW0742 δεν αναστέλλει την επαγόµενη από τη ινσουλίνη φωσφορυλίωση της κινάσης (εικόνα 23). Ανάλυση κατά Western στα ίδια δείγµατα µε αντίσωµα ακτίνης έδειξε ότι η συνολική πρωτεΐνη ήταν παρόµοια στα εξεταζόµενα δείγµατα.

70 INS GW0742 INS+GW0742 A Φωσφo- ERK1/2 Ολική ERK1/2 B Φωσφο-ERK1/2 (αυθαίρετες µονάδες) * * # 0 ΜΑΡΤΥΡΑΣ INS5' INS15' GW5' GW15' INS+GW5' INS+GW15' Εικόνα 22. Χρονικό πρότυπο της επίδρασης του GW0742 στην επαγόµενη από την ινσουλίνη φωσφορυλίωση των ERK1/2 σε καρδιακά µυοκύτταρα διαβητικού επίµυ. Α. Μυοκύτταρα επωάστηκαν µε 100 µμ ινσουλίνης και 50nΜ GW0742 για τους αντίστοιχους χρόνους. Ακολούθησε ανοσοεντοπισµός της φωσφορυλιωµένης µορφής των κινασών (πάνω) καθώς και των ολικών τους επιπέδων (κάτω) σε 80 µg ολικών κυτταρικών εκχυλισµάτων. Β. Ποσοτική έκφραση των δεδοµένων µε πυκνοµετρική ανάλυση των ζωνών για τις ERK1/2. Κάθε σηµείο στο διάγραµµα αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα. Το πείραµα επαναλήφθηκε τρεις φορές µε παρόµοια αποτελέσµατα. *P<0.05 σε σχέση µε τις τιµές του µάρτυρα και #Ρ<0.05 σε σχέση µε τις τιµές της ινσουλίνης στα 15 λεπτά.

71 Α INS GW0742 INS+GW0742 Φωσφo- AKT Aκτίνη Β 2000 Φωσφo-AKT (Ser473) (αυθαίρετες µονάδες) * * 0 ΜΑΡΤΥΡΑΣ INS5' INS15' GW5' GW15' INS+GW5' INS+GW15' Εικόνα 23. Χρονικό πρότυπο της επίδρασης του GW0742 στην επαγόµενη από την ινσουλίνη φωσφορυλίωση της Αkt σε καρδιακά µυοκύτταρα διαβητικού επίµυ. (Α) Μυοκύτταρα επωάστηκαν µε 100 µμ ινσουλίνης και 50nΜ GW0742 για τους αντίστοιχους χρόνους. Ακολούθησε ανοσοεντοπισµός της φωσφορυλιωµένης µορφής των κινασών (πάνω) καθώς και της ακτίνης (κάτω) σε 80 µg ολικών κυτταρικών εκχυλισµάτων. (Β) Ποσοτική έκφραση των δεδοµένων µε πυκνοµετρική ανάλυση των ζωνών για την Αkt. Κάθε σηµείο στο διάγραµµα αντιπροσωπεύει το µέσο όρο ± τυπικό σφάλµα. Το πείραµα επαναλήφθηκε τρεις φορές µε παρόµοια αποτελέσµατα. *P<0.05 σε σχέση µε τις τιµές του µάρτυρα.

72 V. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ι. Μηχανισµός δράσης του ειδικού συνθετικού συνδέτη του PPARβ/δ, GW0742, στην υπερτροφία των καρδιακών µυοκυττάρων φυσιολογικών επίµυων H καρδιακή υπερτροφία αποτελεί µια αντισταθµιστική απόκριση του µυοκαρδίου που παροδικά οµαλοποιεί το µηχανικό στρες και βελτιστοποιεί τη λειτουργία της καρδιακής αντλίας. H παρατεταµένη υπερτροφία όµως µπορεί να οδηγήσει σε καρδιακή ανεπάρκεια (Levy et al., 1990, Ho et al., 1998). Η υπερτροφία συσχετίζεται µε αύξηση του µεταβολισµού της γλυκόζης και αντίστοιχη µείωση της οξείδωσης των λιπαρών οξέων, που αποτελεί χαρακτηριστικό της εµβρυικής καρδιάς. Αποτελεί ακόµα θέµα αµφισβήτησης εάν οι µεταβολές του ενδοκυτταρικού υποστρώµατος και τα επίπεδα των µεταβολιτών στα καρδιοµυοκύτταρα είναι το αποτέλεσµα ή η αιτία της καρδιακής υπερτροφίας. Παρόλα αυτά, πολλοί παράγοντες υποστηρίζουν το ρόλο του καρδιακού µεταβολισµού στην ανάπτυξη της υπερτροφίας. Επίσης έχει αναφερθεί αύξηση της ενεργότητας πολλών γλυκολυτικών ενζύµων πριν από την υπερτροφία (Taegtmeyer et al., 1988). Πολλές µελέτες αναφέρουν ότι οι ενεργοποιητές του PPARa και PPARγ αναστέλλουν την καρδιακή υπερτροφία (Jamshidi et al., 2002, van Empel VPM et al., 2004, Shioi et al., 1997, Hayashidani et al., 2003). Σε αντίθεση µε τις καλά µελετηµένες ισοµορφές α και γ, ο βιολογικός ρόλος της ενεργοποίησης του PPARβ/δ στην υπερτροφία δεν έχει αποσαφηνιστεί. Η διαθεσιµότητα ειδικών συνδετών του, όπως ο GW0742, έδωσε τη δυνατότητα διερεύνησης του ρόλου της συγκεκριµένης ισοµορφής στα καρδιακά µυοκύτταρα Πρόσφατες µελέτες αποκαλύπτουν ότι ο PPARβ/δ είναι η κυρίαρχη ισοµορφή στην καρδιά (Cheng et al., 2004) όπου συµµετέχει στην ρύθµιση της έκφρασης γονιδίων που εµπλέκονται στο µεταβολισµό των λιπαρών οξέων και της γλυκόζης (Cheng et al., 2004b, Planavila et al., 2005). Στα καρδιοµυοκύτταρα, ο PPARβ/δ ρυθµίζει τα γονίδια πρόσληψης λιπαρών οξέων και πιθανώς λειτουργεί ως ανιχνευτής των ενδοκυτταρικών επιπέδων λιπαρών οξέων, ρυθµίζει σηµαντικά µυοκαρδιακά µεταβολικά γονίδια που ενεργοποιούν την οξείδωση των λιπαρών οξέων, αυξάνει την αποσύζευξη της µιτοχονδριακής αναπνοής και καταστέλλει την οξείδωση της γλυκόζης (Glide et al., 2003). Στην παρούσα εργασία, καρδιοµυοκύτταρα φυσιολογικών επίµυων της φυλής Wistar καλλιεργήθηκαν παρουσία φαινυλεφρίνης (α 1 αδρενεργικός αγωνιστής και δείκτης της υπερτροφίας) ή/και του GW0742. Ο ειδικός συνδέτης GW0742 ανέστειλε

73 την επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη αύξηση του µεγέθους των καρδιακών µυοκυττάρων (εικόνα 10). Το αποτέλεσµα αυτό συµφωνεί µε την έρευνα των Planavila et al., 2004, οι οποίοι επίσης έδειξαν αναστολή της υπερτροφίας σε καρδιοµυοκύτταρα νεογνών επίµυων αλλά και µε αυτές των Planavila et al., 2005, Pesant et al., 2006 οι οποίοι βρήκαν ότι ένας ειδικός συνδέτης του PPARβ/δ ανέστειλε την επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη υπερτροφία και την επαγόµενη από το υπεροξείδιο του υδρογόνου κυτταρική απόπτωση σε καλλιέργειες καρδιοµυοκυττάρων. Οµοίως, βρέθηκε ότι η περιορισµένη στα καρδιοµυοκύτταρα απαλοιφή του γονιδίου του PPARβ/δ οδηγεί σε καρδιακή δυσλειτουργία, υπερτροφία και προοδευτική συσσώρευση λιπιδίων (Cheng et al., 2004b). Αναστολή της αύξησης έχει παρατηρηθεί και σε άλλα κύτταρα πέρα των καρδιακών. Για παράδειγµα, έχει παρατηρηθεί αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης σε πολλές κυτταρικές σειρές όπως είναι η ανθρώπινη κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώµατος του πνεύµονα (Fukumoto et al., 2005), η ανθρώπινη κυτταρική σειρά κερατινοκυττάρων (Martinasso et al., 2006) και οι πνευµονικοί ινοβλάστες ποντικού (Ali et al., 2005). Υπάρχουν όµως έρευνες σε άλλα κυτταρικά µοντέλα που είναι αντίθετες µε την άποψη ότι ο PPARβ/δ και οι συνδέτες του αναστέλλουν την κυτταρική ανάπτυξη. Πρόσφατες µελέτες έδειξαν ότι η ενεργοποίηση του PPARβ/δ επάγει την έκφραση του COX2 σε σειρές ανθρώπινων ηπατικών καρκινικών κυττάρων, το οποίο θεωρητικά προωθεί την κυτταρική ανάπτυξη και αναστέλλει την απόπτωση µέσω µηχανισµών που περιλαµβάνουν την παραγωγή προσταγλανδινών και/ή σηµατοδοτικών µονοπατιών εξαρτώµενα από τη φλεγµονή (Χu et al., 2006). Όπως έχει προαναφερθεί, κατά την ανάπτυξη της υπερτροφίας παρατηρείται επανέκφραση ενός εµβρυικού προγράµµατος γονιδίων, τα οποία αποτελούν υπερτροφικούς δείκτες (ΑΝΡ, ΒΝΡ, βmhc) (Calderone et al., 1995). Με βάση αυτά τα δεδοµένα, σε καλλιέργειες καρδιοµυοκυττάρων φυσιολογικών επίµυων µετά από επίδραση µε φαινυλεφρίνη ή/και τον ειδικό συνθετικό συνδέτη του PPARβ/δ GW0742, προσδιορίστηκε µε RT-PCR το κολπικό νατριουρητικό πεπτίδιο ΑΝΡ. Παρατηρήθηκε ότι η φαινυλεφρίνη αύξησε την έκφραση του γονιδίου ΑΝΡ, ενώ ο GW0742 δεν ανέστειλε την επανέκφραση του γονιδίου, παρόλο που ανέστειλε την αύξηση της κυτταρικής επιφάνειας (εικόνα 11). Θα πρέπει εποµένως να επαναληφθούν τα συγκεκριµένα πειράµατα καθώς επίσης να διερευνηθεί και η έκφραση και των υπόλοιπων γονιδίων του εµβρυικού προγράµµατος.

74 ΙΙ. Η δράση του GW0742 στην παραγωγή των ελεύθερων ριζών οξυγόνου (ROS) Η αυξηµένη παραγωγή ενεργών ριζών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species) προκαλεί δυσλειτουργία της συσταλτικότητας, και αλλοίωση της δοµικής ακεραιότητας του µυοκαρδίου και ενδέχεται να αποτελεί έναν από τους βασικότερους παράγοντες που συνεισφέρουν στην απόπτωση που παρατηρείται σε διάφορες καρδιοπάθειες (Tsutsui 2001). Υπό φυσιολογικές συνθήκες, η χρησιµοποίηση του οξυγόνου είναι άµεσα συνδεδεµένη µε την παραγωγή και δαπάνη της ενέργειας. Σε καταστάσεις υποξίας όµως, η παραγωγή των µιτοχονδριακών ελεύθερων ριζών οξυγόνου αυξάνεται λόγω της µείωσης του οξυγόνου ως δέκτης ηλεκτρονίων. Στην παρούσα έρευνα, παρατηρήθηκε µεγάλη παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου σε καλλιέργειες καρδιοµυοκυττάρων φυσιολογικών επίµυων µετά από την επίδραση µε τη φαινυλεφρίνη που αποτελεί υπερτροφικό παράγοντα και πολύ µικρότερη στο µάρτυρα. Στις επιδράσεις µε τον GW0742 η/και φαινυλεφρίνη δεν επάχθηκε η παραγωγή των ROS υποδεικνύοντας έτσι την αντιοξειδωτική δράση του συνδέτη (εικόνα 13Α). Τα αποτελέσµατα αυτά συµφωνούν µε ποικίλες µελέτες. Η αυξηµένη παραγωγή των ROS ρυθµίζεται αρνητικά από τους PPARs λόγω των αντιφλεγµονωδών ιδιοτήτων τους καθώς και των οξειδωµένων λιπαρών οξέων που αποτελούν πιθανούς συνδέτες των PPARs (Yoo et al., 1999). Το συµπέρασµα αυτό ενισχύεται από το γεγονός ότι η ενεργοποίηση των PPARs από συνδέτες φυσικούς ή συνθετικούς, αυξάνει την ενεργότητα αντιοξειδωτικών ενζύµων (καταλάση και δισµουτάση του υπεροξειδίου) (Becuwe et al., 1999, Inoue et al., 2001, Yoo et al., 1999) καθώς επίσης και την έκφραση των µιτοχονδριακών UCPs, των πρωτεϊνών δηλαδή που συµµετέχουν στην αποσύζευξη της µιτοχονδριακής αλυσίδας, µειώνοντας εποµένως την παραγωγή των ROS (Jezek et al., 2004). Σε αντίθεση µε τα αποτελέσµατα της παρούσας εργασίας, υπάρχουν µελέτες που αναφέρουν αύξηση των ROS έπειτα από την επίδραση µε συνδέτες κυρίως του PPARγ σε καρκινικά κύτταρα οδηγώντας εν τέλει σε µιτοχονδριακή δυσλειτουργία (Chen et al., 2005, Pandhare et al., 2006, Pignatelli et al., 2005).

75 ΙΙΙ. O ρόλος του GW0742 στα σηµατοδοτικά µονοπάτια των ΜΑPKs και Αkt Η απόκριση των ευκαρυωτικών κυττάρων στα διάφορα εξωκυτταρικά µηνύµατα επιτυγχάνεται µε τη διαµεσολάβηση µοριακών µηχανισµών που αποτελούνται κατά κύριο λόγο από πρωτεϊνικές κινάσες. Οι ενεργοποιούµενες από µιτογόνα πρωτεϊνικές κινάσες (MAPKs), όπως έχει αναφερθεί, συνιστούν µια ευρέως διαδεδοµένη υπεροικογένεια κινασών µε καθοριστικό ρόλο σε πληθώρα κυτταρικών διεργασιών. Ένας από τους καλύτερα µελετηµένους παράγοντες υπερτροφίας, η φαινυλεφρίνη, επάγουν την ενεργοποίηση πρωτεϊνικών κινασών και από τις τρεις υποοικογένειες των ΜΑΡKs µε τις επακόλουθες αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση και µορφολογία που χαρακτηρίζουν το υπερτροφικό µυοκάρδιο. Η πλειοψηφία των βιβλιογραφικών αναφορών για τη επίδραση του συγκεκριµένου αγωνιστή στις MAPKs προέρχονται από µελέτες που έχουν διεξαχθεί σε καλλιέργειες καρδιακών µυοκυττάρων από νεογνά επίµυων (Bogoyevitch και συν. 1994, Clerk και συν. 1994, Yamazaki και συν. 1997, Ramirez και συν 1997, Clerk και συν. 1998, Yue και συν. 2000, Taylor και συν. 2000) καθώς και σε αποµονωµένες εµποτισµένες καρδιές ενήλικων ατόµων (Lazou και συν 1998). Ωστόσο, οι οδοί σηµατοδότησης των συζευγµένων µε G πρωτεΐνες υποδοχέων που συµµετέχουν στην υπερτροφία δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως. Η πολυπλοκότητα της συγκεκριµένης παθολογικής απόκρισης, σε συνδυασµό µε την έλλειψη δεδοµένων για τα φυσιολογικά υποστρώµατα των MAPKs στην καρδιά, δυσχεραίνει τη διαµόρφωση ολοκληρωµένης άποψης σχετικά µε την ακολουθία γεγονότων που οδηγούν στην υπερτροφία. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας διερευνήθηκε η δράση του ειδικού συνδέτη του PPARβ/δ GW0742 στην ενεργοποίηση των ΜΑΡ κινασών ΕRK1/2 και p38 ΜΑΡΚ, και της Αkt από τον αγωνιστή των συζευγµένων µε G πρωτεΐνες υποδοχέων φαινυλεφρίνη σε αποµονωµένα καρδιοµυοκύτταρα φυσιολογικών επίµυων. Η φωσφορυλίωση/ενεργοποίηση των ERK1/2 έχει αποδειχτεί ότι επάγεται από ποικιλία ερεθισµάτων όπως είναι αυξητικοί παράγοντες και αδρενεργικοί αγωνιστές µε ισχυρότερο ενεργοποιητή το φορβολεστέρα ΡΜΑ (Bogoyevitch et al., 1994, Lazou et al., 1994α, Bogoyevitch et al., 1995b and 1995c). Στην παρούσα έρευνα διαπιστώθηκε ότι ο GW0742 ανέστειλε την επαγόµενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωσή των ERK1/2 από τα πρώτα 2 λεπτά της επίδρασης (εικόνα 14). Πολλές µελετες εµπλέκουν την οδό της PI3K (Phosphoinositide 3-kinase) στην ανάπτυξη της υπερτροφίας. Η ακριβής ακολουθία γεγονότων στη µεταγωγή

76 µηνυµάτων που εξαρτάται από τη ΡΙ3Κ δεν έχει αποσαφηνιστεί. Στην περίπτωση των υποδοχέων µε ενδογενή δράση κινάσης τυροσίνης, η ΡΙ3Κ αλληλεπιδρά µε τους υποδοχείς και τις κυτταροπλασµατικές κινάσες τυροσίνης µέσω της ρυθµιστικής της υποµονάδας, ενώ η καταλυτική περιοχή του µορίου της ενεργοποιεί τη Ras (Rotriguez-Viciana et al., 1994, Kodaki et l., 1994). Ωστόσο, υπάρχουν ενδείξεις ότι η δράση της ΡΙ3Κ στην οδό των ERK1/2 εντοπίζεται κάτω από τη Ras (Hawes και συν 1996). Όσον αφορά στους συζευγµένους µε G πρωτεΐνες υποδοχείς, οι ετεροτριµερείς G πρωτεΐνες ρυθµίζουν τις κυτταροπλασµατικές κινάσες τυροσίνης και κατ επέκταση τις ERK1/2, µέσω των µελών της τάξης ΙΒ. Ειδικότερα, η ΡΙ3Κ συµµετέχει στη µεταγωγή του µηνύµατος από τις βγ υποµονάδες των G πρωτεϊνών στις κινάσες Src-like, µε επακόλουθη πρόσδεση των µορίων Shc, Grb2 και Sos, που οδηγεί τελικά στην ενεργοποίηση της Ras. Στο συγκεκριµένο µοντέλο η ΡΙ3Κ είναι δυνατόν να δρα είτε ως πρωτεϊνική κινάση είτε ως πρωτεΐνη σκαλωσιάς (Gutkind 2000). Η άποψη αυτή ενισχύεται από µελέτες σε καλλιέργειες καρδιακών µυοκυττάρων ενήλικου επίµυ, όπου διέγερση των α1- αδρενεργικών υποδοχέων µε φαινυλεφρίνη επάγει την ενεργοποίηση της PI3K, µέσω µιας οδού που εξαρτάται από τη PKC (Schluter και συν. 1998, 1999). Οι κινάσες ΡΙ3Κ και η Αkt παίζουν σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση της κυτταρικής ανάπτυξης, ο οποίος είναι συντηρηµένος σε πολλούς κυτταρικούς τύπους και είδη. Στο µυοκάρδιο, η ενεργοποίηση της Akt ρυθµίζει το µέγεθος των καρδιοµυοκυττάρων κατά ένα τρόπο πρωτογενή και κυτταρικά αυτόνοµο και όχι δευτερογενώς µετά δηλαδή από τις αιµοδυναµικές αλλαγές ή τα σήµατα παρακρινούς προελεύσεως (Matsui et al., 2003). Στην παρούσα εργασία µελετήθηκε η επίδραση του GW0742 στη φωσφορυλίωση της Αkt κινάσης που επάγεται από τη φαινυλεφρίνη. Παρατηρήθηκε ενεργοποίηση της κινάσης µε µέγιστη απόκριση στα 2 λεπτά. Η δράση της φαινυλεφρίνης στη φωσφορυλίωση της Akt ήταν άµεση και παροδική, καθώς ακολούθησε φθίνουσα πορεία 5 λεπτά µετά την έναρξη της επώασης µε τον αγωνιστή. Αξιοσηµείωτο είναι το γεγονός ότι ο GW0742 ανέστειλε πλήρως τη φωσφορυλίωση της κινάσης (εικόνα 16 ). Οι διάφορες ισοµορφές της p38 MAPK ενεργοποιούνται από ποικίλες µορφές κυτταρικού στρες, ορισµένες κυτοκίνες, αυξητικούς παράγοντες καθώς και αγωνιστές των G-συζευγµένων υποδοχέων (Forse και συν. 1996, Obata και συν. 2000, Han και Ono Η επώαση και µε τον GW0742 ανέστειλε την ενεργοποίηση της κινάσης που επάγεται από τη φαινυλεφρίνη (Εικόνα 15). Η δράση της φαινυλεφρίνης στην

77 φωσφορυλίωση της κινάσης ήταν παρατεταµένη σε σχέση µε την αντίστοιχη στις ERKs. Ο ρόλος της PKC στη σηµατοδότηση µέσω της p38 ΜΑΡΚ είναι περιορισµένος, καθώς µελέτες σε πρωτογενείς καλλιέργειες καρδιακών µυοκυττάρων από νεογνά αρουραίου αποδεικνύουν περιορισµένη ενεργοποίηση της κινάσης κατά την επίδραση φορβολεστέρων (Clerk et al., 1998). Για να διερευνηθεί περαιτέρω ο πιθανός µηχανισµός δράσης του GW0742 και το πιθανό σηµείο παρεµβολής του στα σηµατοδοτικά µονοπάτια που συµµετέχουν στην εκδήλωση της καρδιακής υπερτροφίας, εξετάστηκε η επίδρασή του στην ενεργοποίηση των ERK1/2 και Akt µέσω του υποδοχέα της ινσουλίνης. Σε αποµονωµένα καρδιοµυοκύτταρα φυσιολογικών επίµυων, ο GW0742 ανέστειλε την επαγόµενη από την ινσουλίνη ενεργοποίηση των ERK1/2 και Akt κατά το χρονικό πρότυπο που ακολουθήθηκε (εικόνα 20 και 21). Εποµένως, η δράση του ειδικού συνδέτη GW0742 δεν αφορά σε επίπεδο υποδοχέα, αλλά σε κάποιο καθοδικό σηµείο των σηµατοδοτικών µονοπατιών. Ένας πιθανός στόχος του GW0742 είναι το ΡΤΕΝ, µία φωσφατάση η οποία διακόπτει την καθοδική ενεργοποίηση της Αkt, ρυθµίζει δηλαδή αρνητικά την ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ κινάσης (Hlobilkova et al., 2003). Συνοπτικά, το αποτέλεσµα της ενεργοποίησης της ΡΙ3 κινάσης είναι η φωσφορυλίωση της διφωσφορικής 4,5 φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (ΡΙΡ2) σε τριφωσφορική 3,4,5 φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη (ΡΙΡ3) (εικόνα 24). Ο µεταβολίτης αυτός είναι ένας δευτερογενής µηνύτορας ο οποίος ο οποίος συµµετέχει στην καθοδική σηµατοδότηση στρατολογώντας και ενεργοποιώντας την κινάση PDK1 που ακολουθείται από την ενεργοποίηση της PKB/Akt. O ΡΤΕΝ αποφωσφορυλιώνει την ΡΙΡ3 σε ΡΙΡ2, µπλοκάροντας τον καταρράκτη των γεγονότων που προκύπτουν ως συνέπεια της συσσώρευσης του δευτερογενούς µηνύτορα στην κυτταρική µεµβράνη. Αποτελεί εποµένως ένα σηµαντικό διακόπτη για τη διατήρηση της κυτταρικής οµοιόστασης και της φυσιολογικής ανάπτυξης (Mocanu et al., 2007). Πιθανολογείται ότι ο ΡΤΕΝ παίζει σηµαντικό ρόλο σε παθολογικές καταστάσεις που σχετίζονται µε καρδιακές ασθένειες, όπως είναι η διαβητική καρδιοµυπάθεια (Sasaoka et al., 2006). Εποµένως, η αναστολή της δράσης του ίσως αποδειχτεί σηµαντική για την επιβίωση του µυοκαρδίου έπειτα από ένα ισχαιµικό επεισόδιο (Oudit et al., 2004).

78 Εικόνα 24. Πιθανός µηχανισµός δράσης του ειδικού συνδέτη του PPARβ/δ, GW0742. ΙV. O ρόλος του GW0742 στο διαβητικό µυοκάρδιο Ο διαβήτης µπορεί να προκαλέσει καρδιακή βλάβη απουσία της στεφανιαίας νόσου. Η βλάβη αυτή, µπορεί να οδηγήσει σε καρδιοµυοπάθεια, η οποία χαρακτηρίζεται από δυσλειτουργία της συστολής και της διαστολής εξαιτίας της µειωµένης συσταλτικότητας, της παρατεταµένης χαλάρωσης και της µειωµένης προσαρµογής του µυοκαρδίου (An et al., 2006, Boudina et al., 2007). Η υπεργλυκαιµία και οι µεταβολές στην δράση και την έκκριση της ινσουλίνης αποτελούν σηµαντικό παράγοντα ανάπτυξης της επαγόµενης από διαβήτη καρδιοµυοπάθειας (Wold et al., 2005, Cai et al., 2001). Πειραµατικά, στον διαβήτη που επάγεται από στρεπτοζοτοσίνη παρατηρείται υποϊνσουλιναιµία. Η στρεπτοζοτοσίνη αποτελεί χηµική ουσία που καταστρέφει τα παγκρεατικά κύτταρα