ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ ΜΕΣΩ ΤΩΝ ΣΥΖΕΥΓΜΕΝΩΝ ΜΕ G ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΣΤΗΝ ΚΑΡΔΙΑ ΑΡΟΥΡΑΙΟΥ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΖΩΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΖΩΩΝ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ ΜΕΣΩ ΤΩΝ ΣΥΖΕΥΓΜΕΝΩΝ ΜΕ G ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΣΤΗΝ ΚΑΡΔΙΑ ΑΡΟΥΡΑΙΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΩΜΑΪΔΟΣ ΜΑΡΚΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2003

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΑΝΤΙΓΟΝΗ ΛΑΖΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΘΕΟΦΙΛΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΑΪΤΑΝΑΚΗ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΑΝΤΙΓΟΝΗ ΛΑΖΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΘΕΟΦΙΛΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ ΓΑΪΤΑΝΑΚΗ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΙΣΙΔΩΡΟΣ ΜΠΕΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΖΑΧΑΡΙΑΣ ΣΚΟΥΡΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΑΡΓΑΡΙΤΑ ΧΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΑΣΙΛΗΣ ΜΙΧΑΗΛΙΔΗΣ, ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ

3 Στη μητέρα μου

4 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ AMP: μονοφωσφορική αδενοσίνη ANP: κολπικό νατριοδιουρητικό πεπτίδιο ΑΝΣ: ανοσοκατακρήμνιση AP-1: πρωτεΐνη ενεργοποιητής-1 APS: υπερθειικό αμμώνιο ASK1: ρυθμιστική κινάση απόπτωσης ATP: τριφοσφωρική αδενοσίνη BSA: αλβουμίνη ορού βοδιού CBP: πρωτεΐνη που συνδέεται με CREB CRE: ακολουθία ενεργοποιούμενη από το camp CREB: πρωτεΐνη που συνδέεται σε ακολουθία ενεργοποιούμενη από το camp DTT: διθειοθρεϊτόλη E-64: L-trans-εποξυσουκινυλο-λευκιλαμίδιο (3-μεθυλ) βουτάνιο ECL: ενισχυμένη χημειοφωταύγεια EDTA: αιθυλενο-διαμινο-τετραοξικό οξύ EGF: επιδερμικός αυξητικός παράγοντας elf: ευκαρυωτικός παράγοντας έναρξης της μετάφρασης ERK: ρυθμιζόμενη από εξωκυτταρικά μηνύματα πρωτεϊνική κινάση ET-1: ενδοθηλίνη-1 FAK: κινάση εστιακών προσφύσεων GPCR: συζευγμένος με G πρωτεΐνη υποδοχέας GTP: τριφωσφορική γουανοσίνη HEPES: (Ν-[2-υδροξυαιθυλο]πιπεραζίνη-Ν -[2-αιθανοθειικό οξύ]) HRP: υπεροξειδάση HSP: πρωτεΐνη θερμικού σοκ Ig: ανοσοσφαιρίνη IL-1: ιντερλευκίνη-1 JIP: πρωτεΐνη συνδεόμενη με JNK JNK: κινάση του αμινοτελικού άκρου του c-jun MAP: πρωτεΐνη συνδεόμενη με μικροσωληνίσκους MAPKAPK: πρωτεϊνική κινάση που ενεργοποιείται από MAPKs MAPKs: πρωτεϊνικές κινάσες ενεργοποιούμενες από μιτογόνα MEF2: μεταγραφικός παράγοντας των μυοκυττάρων MEK: κινάση της ΜΑΡΚ

5 MEKK: κινάση της ΜΕΚ MKP: φωσφατάση της ΜΑΡΚ MSK: πρωτεϊνική κινάση ενεργοποιούμενη από μιτογόνα και στρες NES: σήμα εξόδου από τον πυρήνα NGF: νευρικός αυξητικός παράγοντας NLS: σήμα εισόδου στον πυρήνα PAGE: πήκτωμα ηλεκτροφόρησης πολυακρυλαμιδίου PDGF: αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων PI3K: κινάση φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3 PKA: πρωτεϊνική κινάση Α PKB: πρωτεϊνική κινάση B PKC: πρωτεϊνική κινάση C PLA2: φωσφολιπάση Α2 PLC: φωσφολιπάση C PLD: φωσφολιπάση D PMA: 4β-φορβολο 12 μυριστικός 13 οξικός φορβολεστέρας PMSF: φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθρίδιο Ras: μονομερής πρωτεΐνη με δραστικότητα GTPασης Rho: μονομερής πρωτεΐνη με δραστικότητα GTPασης RPTK: υποδοχέας με ενδογενή δραστικότητα κινάσης τυροσίνης RSK: ριβοσωμική πρωτεΐνη SAPK: πρωτεϊνική κινάση ενεργοποιούμενη από στρες SDS: λαουρο-θειικό νάτριο Sos: παράγοντας ανταλλαγής GTP/GDP TAK-1: κινάση ενεργοποιούμενη από τον παράγοντα TGF-β TAOs: χίλιες και μια κινάσες TEMED: Ν,Ν,Ν,Ν -τετραμεθυλοαιθυλενοδιαμίνη TGF: παράγοντας ανάπτυξης όγκων TNF: παράγοντας νέκρωσης όγκων

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ I. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 1. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ 1 2. ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΣΥΖΕΥΓΜΕΝΟΙ ΜΕ G ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ (G-protein coupled receptors, GPCRs) Αδρενεργικοί υποδοχείς Υποδοχείς ενδοθηλίνης Πουρινεργικοί υποδοχείς 8 3. ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΟΥΜΕΝΕΣ ΑΠΟ ΜΙΤΟΓΟΝΑ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΕΣ ΚΙΝΑΣΕΣ (Mitogen activated protein kinases MAPKs) Βασικά χαρακτηριστικά Υποοικογένεια των ERKs (Extracellular signal-regulated kinases) Μηχανισμοί ενεργοποίησης της σηματοδοτικής οδού των ERK1/ Υποοικογένεια της p38 MAPK Μηχανισμοί ενεργοποίησης της σηματοδοτικής οδού της p38 ΜΑΡΚ Υποοικογένεια των JNKs (c-jun NH 2 -terminal kinases) Μηχανισμοί ενεργοποίησης της σηματοδοτικής οδού των JNKs Φωσφατάσες των MAPKs Συνομιλία ανάμεσα στις σηματοδοτικές οδούς των ΜΑPKs ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΟΥΜΕΝΗ ΑΠΟ ΜΙΤΟΓΟΝΑ ΚΑΙ ΣΤΡΕΣ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΗ ΚΙΝΑΣΗ 1 (Mitogen and stress activated protein kinase 1, MSK1) CREB (camp responsive element binding protein) Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ MAPKs ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΚΑΡΔΙΑΣ Υπερτροφία της καρδιάς Ισχαιμία Απόπτωση ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 40 ΙΙ. ΥΛΙΚΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΧΗΜΙΚΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΡΑΔΙΟΧΗΜΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΓΙΑ EMSAs (Electrical mobility shift assays) ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΚΑ ΥΛΙΚΑ 47

7 III. ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΡΔΙΑΚΩΝ ΜΥΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΕΜΠΟΤΙΣΜΕΝΗ ΚΑΡΔΙΑ Προετοιμασία καρδιάς για τον εμποτισμό Απομόνωση καρδιακών μυοκυττάρων Επώαση κυττάρων με αγωνιστές/αναστολείς ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Προετοιμασία ολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων Διαχωρισμός κυτταροπλασματικών-πυρηνικών κλασμάτων Διαχωρισμός κυτταροπλασματικών-μεμβρανικών κλασμάτων ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΛΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών παρουσία SDS (SDS-PAGE) ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (blotting) Ημίξηρη (semidry) ηλεκτροφορητική μεταφορά ΑΝΟΣΟΕΝΤΟΠΙΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ ΣΤΗ ΝΙΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗ (immunoblotting) ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ (immunoprecipitation) ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ MSK1 (kinase assay) EMSAS (Electrical Mobility Shift Assays) Αναδιάταξη ολιγονουκλεοτιδίων (annealing) Σήμανση ολιγονουκλεοτιδίων 9.3. Αντιδράσεις σύνδεσης πρωτεϊνών-ολιγονουκλεοτιδίων Ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων Αυτοραδιογραφία ΧΡΗΣΗ ΛΟΓΙΣΜΙΚΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΩΝ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 62 IV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΟΔΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ ΜΕΣΩ ΤΩΝ α 1 -ΑΔΡΕΝΕΡΓΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ Επίδραση της φαινυλεφρίνης στην ενεργοποίηση των ERK1/ Επίδραση της φαινυλεφρίνης στην ενεργοποίηση της p38 MAPK 66

8 1.3. Υποκυτταρική κατανομή των ERK1/2 και p38 MAPK στα καρδιακά μυοκύτταρα αρουραίου Επίδραση της φαινυλεφρίνης στην ενεργοποίηση των JNKs Ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός της MSK1 (Mitogen and Stress activated Kinase 1) σε καρδιακά μυοκύτταρα αρουραίου Επίδραση της φαινυλεφρίνης στην ενεργοποίηση της MSK Υποκυτταρική κατανομή της MSK1 στα καρδιακά μυοκύτταρα αρουραίου Διερεύνηση των σηματοδοτικών οδών που συμμετέχουν στην ενεργοποίηση της MSK Διερεύνηση αναστολέων ειδικών για την MSK Επίδραση της φαινυλεφρίνης στην ενεργοποίηση του CREB (camp Responsive element binding protein) Επίδραση της φαινυλεφρίνης στη φωσφορυλίωση του CREB Επίδραση της φαινυλεφρίνης στη σύνδεση του CREB με το DNA Αλληλεπίδραση του CREB με την πρωτεΐνη CBP (CREB-binding protein) ΟΔΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ ΜΕΣΩ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗΣ Επίδραση της ενδοθηλίνης-1 στην ενεργοποίηση των ERK1/ Επίδραση της ενδοθηλίνης-1 στην ενεργοποίηση της p38 MAPK Επίδραση της ενδοθηλίνης-1 στην ενεργοποίηση των JNKs Επίδραση της ενδοθηλίνης-1 στην ενεργοποίηση της MSK ΟΔΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ ΜΕΣΩ ΤΩΝ ΠΟΥΡΙΝΕΡΓΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ Επίδραση του ATPγS στην ενεργοποίηση των ERK1/ Επίδραση του ATPγS στην ενεργοποίηση της p38 MAPK Επίδραση του ATPγS στην ενεργοποίηση της MSK Επίδραση του ATPγS στην ενεργοποίηση της cpla 2 (cytoplasmic Phospholipase A 2 ) 130 V. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΟΔΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ ΜΕΣΩ ΤΩΝ α 1 -ΑΔΡΕΝΕΡΓΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ Η οδός των ERK1/ Η οδός της p38 MAPK Υποκυτταρική κατανομή των ERK1/2 και p38 MAPK στα καρδιακά 142 μυοκύτταρα αρουραίου

9 1.4. Η οδός των JNKs Ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός της MSK1 (Mitogen and Stress activated Kinase 1) σε καρδιακά μυοκύτταρα αρουραίου Οδοί σηματοδότησης που συμμετέχουν στην ενεργοποίηση της MSK Η ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα CREB (camp responsive element binding protein) Η φωσφορυλίωση του CREB Η σύνδεση του CREB με το DNA Αλληλεπίδραση του CREB με την πρωτεΐνη CBP (CREB-binding protein) Προτεινόμενο μοντέλο για τη ρύθμιση CREB από τη φαινυλεφρίνη ΟΔΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ ΜΕΣΩ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΕΝΔΟΘΗΛΙΝΗΣ Οι οδοί των MAPKs Η ενεργοποίηση της MSK ΟΔΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ ΜΕΣΩ ΤΩΝ ΠΟΥΡΙΝΕΡΓΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ Η οδός των ERK1/ Η οδός της p38 MAPK Η ενεργοποίηση της MSK H cpla 2 (cytoplasmic Phospholipase A 2 ) ως πιθανός στόχος της MSK Προτεινόμενο μοντέλο για τη ρύθμιση της PLA 2 από το ATPγS ΟΙ ΟΔΟΙ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗΣ ΤΩΝ GPCRs ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΚΑΡΔΙΑΣ 171 VI. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 173 VII. ABSTRACT 175 VII. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 177

10 1 Ι. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ Όλοι οι οργανισμοί ανεξάρτητα από την φυλογενετική κατανομή τους έχουν την ικανότητα να αποκρίνονται σε διάφορα ερεθίσματα. Για το σκοπό αυτό, κάθε κύτταρο διαθέτει ένα πολύπλοκο σύστημα που του επιτρέπει να λαμβάνει και να επεξεργάζεται ένα πλήθος πληροφοριών-μηνυμάτων από το περιβάλλον. Το σύστημα αυτό περιλαμβάνει πρωτεΐνες-υποδοχείς που λειτουργούν ως δέκτες των μηνυμάτων, πρωτεϊνικές κινάσες, φωσφατάσες, καθώς και μια πληθώρα άλλων ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών. Το μήνυμα μπορεί να συνιστούν υδρόφοβες χημικές ενώσεις (στεροειδείς και θυρεοειδείς ορμόνες), ή αέριες ενώσεις (NO και CO), οι οποίες διαχέονται στο εσωτερικό των κυττάρων-στόχων διαμορφώνοντας έτσι την απόκριση τους. Στις περισσότερες περιπτώσεις όμως, το μήνυμα είναι μια υδρόφιλη χημική ένωση ικανή να αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα στην πλασματική μεμβράνη του κυττάρου-στόχου (Alberts και συν. 1994). Η σύνδεση του μηνύματος με τον αντίστοιχο υποδοχέα είναι αντιστρεπτή και αποτελεί ουσιαστικά το πρώτο βήμα μιας ακολουθίας γεγονότων, με την οποία επιτυγχάνεται η ενδοκυτταρική μεταβίβαση του μηνύματος προς ένα μόριο που λειτουργεί ως τελικός αποδέκτης (Hardie 1990, Barritt 1992). Η ακολουθία αυτή των γεγονότων, χάρη στην οποία ένα εξωκυτταρικό μήνυμα, επιδρά στα κύτταρα-στόχους προκαλώντας την εκδήλωση μιας συγκεκριμένης απόκρισης, ονομάζεται μηχανισμός μεταγωγής μηνυμάτων ή οδός σηματοδότησης. Ανάλογα με το μηχανισμούς σηματοδότησης που χρησιμοποιούν οι μεμβρανικοί υποδοχείς διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες (Nishizuka 1992): Υποδοχείς συζευγμένοι με κανάλια ιόντων (Ion-channel-linked receptors). Αποτελούν βασικό μοριακό συστατικό των συνάψεων που σχηματίζονται μεταξύ διεγέρσιμων κυττάρων και ενεργοποιούνται κατά κύριο λόγο από νευροδιαβιβαστές. Η σύνδεση των συγκεκριμένων υποδοχέων με νευροδιαβιβαστές προκαλεί το άνοιγμα ή το κλείσιμο των καναλιών, τροποποιώντας τη διαπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης για διάφορα ιόντα (Jan και Jan 1989, Krueger 1989, Montal 1990). Υποδοχείς συζευγμένοι με G πρωτεΐνες (G-protein-coupled receptors, GPCRs). Βασικό γνώρισμα των υποδοχέων της κατηγορίας αυτής είναι η σύζευξη τους με ετεροτριμερείς πρωτεΐνες, γνωστές ως G πρωτεΐνες, οι οποίες έχουν την ικανότητα να δεσμεύουν και να υδρολύουν μόρια τριφωσφορικής γουανοσίνης (GTP). Έτσι, οι συγκεκριμένοι υποδοχείς

11 2 ρυθμίζουν έμμεσα τη δράση πρωτεϊνών-στόχων στην κυτταρική μεμβράνη, οι οποίες μπορεί να είναι διάφορα ένζυμα ή ιοντικά κανάλια. Υποδοχείς συζευγμένοι με ένζυμα (Enzyme-linked receptors). Πρόκειται για διαμεμβρανικές πρωτεΐνες οι οποίες με την εξωκυτταρική τους περιοχή συνδέονται με το μήνυμα, ενώ η κυτταροπλασματική περιοχή τους είτε σχετίζεται άμεσα με κάποιο ένζυμο, είτε διαθέτει η ίδια ενδογενή ενζυμική δραστικότητα. Αν και αυτή η κατηγορία υποδοχέων παρουσιάζει μεγαλύτερη ετερογένεια συγκριτικά με τις προηγούμενες, τα ένζυμα είναι κατά κύριο λόγο πρωτεϊνικές κινάσες που φωσφορυλιώνουν συγκεκριμένες πρωτεΐνες (Waterfield 1989, Yuen και συν. 1992, Fantl και συν. 1993). Σε μια οδό σηματοδότησης τη διέγερση του υποδοχέα ακολουθούν αλληλεπιδράσεις μεταξύ διαφόρων πρωτεϊνών με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση ή αδρανοποίηση τους. Κεντρικό ρόλο στη συγκεκριμένη ακολουθία γεγονότων έχουν οι αντιδράσεις φωσφορυλίωσης. Η προσθήκη μιας ή περισσότερων φωσφορυλικών ομάδων στο μόριο μιας πρωτεΐνης οδηγεί κατά κύριο λόγο στην ενεργοποίηση της, ενώ η αδρανοποίηση μιας πρωτεΐνης συνήθως συμβαδίζει με αφαίρεση φωσφορικών ομάδων από το μόριο της. Ο βαθμός φωσφορυλίωσης μιας πρωτεΐνης εξαρτάται από τις σχετικές δραστικότητες της κινάσης που τη φωσφορυλιώνει και της φωσφατάσης που την αποφωσφορυλιώνει (Nishizuka 1992, Fantl και συν. 1993, Nishida και συν. 1993). Έτσι οι πρωτεϊνικές κινάσες, καθώς επίσης και οι πρωτεϊνικές φωσφατάσες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στις οδούς σηματοδότησης των κυττάρων, καθώς λειτουργούν ως ρυθμιστές διαφόρων βιολογικών διεργασιών. Οι πρωτεϊνικές κινάσες είναι ένζυμα που μεταφέρουν τη γ-φωσφορυλική ομάδα του ATP σε ομάδες υδροξυλίου, επάγοντας την τροποποίηση της δραστικότητας, ή της λειτουργίας του αποδέκτη/υποστρώματος τους. Ανάλογα με τα κατάλοιπα στα οποία μεταφέρουν τη φωσφορική ομάδα, οι πρωτεϊνικές κινάσες διακρίνονται σε κινάσες σερίνης-θρεονίνης και κινάσες τυροσίνης (Woodgett 1994, Johnson και συν. 1998). Η ειδικότητα των συγκεκριμένων αλληλεπιδράσεων καθορίζεται τόσο από την αμινοξική ακολουθία της περιοχής που φωσφορυλιώνεται, όσο και από τη δυνατότητα της να αλληλεπιδρά με το ενεργό κέντρο της κινάσης (Kemp και Pearson 1991). Αρκετές πρωτεϊνικές κινάσες παραμένουν ανενεργές μέσω μιας «ενδοστερικής» (intrasteric) αλληλεπίδρασης, όπου συγκεκριμένη ακολουθία του μορίου τους παρεμποδίζει την πρόσβαση στην καταλυτική αλληλουχία τους, ενεργώντας ως ενδογενής αναστολέας (ψευδοϋπόστρωμα). Έτσι, απαραίτητη προϋπόθεση για την ενεργοποίηση τους είναι είτε η πρόσδεση συγκεκριμένου

12 3 αλλοστερικού ρυθμιστή, είτε η φωσφορυλίωση τους από άλλη κινάση (Hurley και συν. 1990, Kemp και Pearson 1991). Ο τελικός αποδέκτης σε μια σηματοδοτική οδό, ο οποίος διαμορφώνει την τελική απόκριση του κυττάρου στο μήνυμα, μπορεί να είναι ένα γονίδιο, ένα ένζυμο του μεταβολισμού, μια ρυθμιστική ή δομική πρωτεΐνη. Στις περισσότερες περιπτώσεις, την άφιξη του μηνύματος στους υποδοχείς της πλασματικής μεμβράνης ακολουθεί μια σειρά αντιδράσεων φωσφορυλίωσης, η οποία οδηγεί το μήνυμα στον πυρήνα του κυττάρου όπου ρυθμίζει τη γονιδιακή έκφραση. Πολύπλοκες βιολογικές διεργασίες, όπως η κυτταρική ανάπτυξη και η διαφοροποίηση, δε ρυθμίζονται από μια μόνο οδό σηματοδότησης αλλά από συνδυασμό συγκεκριμένων οδών. Προκειμένου να διαμορφωθεί η κατάλληλη απόκριση σε κάποιο ερέθισμα, το κύτταρο θα πρέπει να έχει τη δυνατότητα αφενός να διακρίνει και αφετέρου να συνδυάζει εξωκυτταρικά μηνύματα. Αυτό επιτυγχάνεται με ένα πολύπλοκο σηματοδοτικό δίκτυο που σχηματίζουν οι επιμέρους, γραμμικές ή διακλαδισμένες, οδοί σηματοδότησης. Η αλληλεπίδραση μεταξύ των πολλαπλών στοιχείων, από τη μια πλευρά ευνοεί την ενίσχυση του μηνύματος και από την άλλη επιτρέπει τη δυναμική απόκριση του κυττάρου στα ερεθίσματα του περιβάλλοντος (Nishizuka 1992, Cohen 1992, Pelech 1993, Alberts και συν. 1994). 2. ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΣΥΖΕΥΓΜΕΝΟΙ ΜΕ G ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ (G-protein coupled receptors, GPCRs) Οι συζευγμένοι με G πρωτεΐνες υποδοχείς συνιστούν την μεγαλύτερη οικογένεια μεμβρανικών υποδοχέων που κωδικοποιείται από το γονιδίωμα των θηλαστικών (>1% των ανθρώπινων γονιδίων) (Gutkind 2000). Ενεργοποιούνται από μια μεγάλη ποικιλία αγωνιστών που περιλαμβάνουν τις βιογενείς αμίνες, αδρεναλίνη και νοραδρεναλίνη, μικρά πεπτίδια, όπως είναι οι εγκεφαλίνες και η ουσία Ρ, γλυκοπρωτεΐνες μεγάλου μοριακού βάρους, όπως η ωχρινοποιητική ορμόνη κ.α. (Casey και Gilman 1988, Limbirt 1988, Raymond και συν. 1990). Παρά τη μεγάλη ποικιλία των αγωνιστών τους, οι υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες έχουν παρόμοια δομή. Στην πραγματικότητα, πρόκειται για ένα μεμβρανικό, σηματοδοτικό σύστημα πρωτεϊνών που αποτελείται από τρία βασικά συστατικά: την πρωτεΐνηυποδοχέα, την G πρωτεΐνη που είναι συζευγμένη με τον υποδοχέα και την πρωτεΐνη-τελεστή (effector) (Forse 2000). Βασικό γνώρισμα των υποδοχέων είναι το μοτίβο των επτά διαμεμβρανικών ελίκων που σχηματίζουν επτά υδρόφοβα τμήματα της πολυπεπτιδικής αλυσίδας τους (Henderson και συν. 1990). Η περιοχή σύνδεσης του υποδοχέα με τον

13 4 αγωνιστή αντιστοιχεί στο εξωκυτταρικό αμινο-τελικό άκρο της πρωτεΐνης, ενώ η περιοχή αλληλεπίδρασης με την G πρωτεΐνη περιλαμβάνει το ενδοκυτταρικό καρβοξυ-τελικό άκρο, καθώς και τους ενδοκυτταρικούς βρόχους του διαμεμβρανικού τμήματος του υποδοχέα (Strader και συν. 1994, Forse 2000) Οι G πρωτεΐνες είναι ετεροτριμερείς πρωτεΐνες που εντοπίζονται στην κυτταροπλασματική πλευρά της πλασματικής μεμβράνης. Αποτελούνται από την α υπομονάδα που παρουσιάζει υψηλή συγγένεια για νουκλεοτίδια της γουανίνης, καθώς και τις β και γ υπομονάδες που συνδέονται στενά μεταξύ τους σχηματίζοντας διμερή. Οι G πρωτεΐνες ταξινομούνται σε τέσσερις υποοικογένειες: τις G s, G i/o, G q/11 και G 12/13 (Bourne και συν. 1990, Gutkind 1998). Η ταξινόμηση αυτή γίνεται με βάση την α υπομονάδα που συμμετέχει στη σύνθεση του ολιγομερούς τους. H α υπομονάδα ορισμένων G πρωτεϊνών παρουσιάζει ευαισθησία σε βακτηριακές τοξίνες. Συγκεκριμένα, μέλη της οικογένειας G s και ορισμένες πρωτεΐνες που ανήκουν στην οικογένεια G i, καθίστανται μόνιμα ενεργές από την τοξίνη του βακτηρίου της χολέρας, καθώς η α υπομονάδα τους χάνει τη δραστικότητα της GTΡάσης. Άλλες G πρωτεΐνες, μέλη της οικογένειας G i, χάνουν την ικανότητα ενεργοποίησης από τον αντίστοιχο υποδοχέα, εξαιτίας των δομικών τροποποιήσεων που υφίστανται από την τοξίνη βακτηρίων του γένους Pertussis. Στις περισσότερες περιπτώσεις, κάθε υποοικογένεια των G πρωτεϊνών σχετίζεται λειτουργικά με συγκεκριμένες πρωτεΐνες-τελεστές. Έτσι, οι G s πρωτεΐνες ενεργοποιούν την αδενυλική κυκλάση, ενώ οι G i/o την αναστέλλουν. Επιπλέον, οι G q/11 συμμετέχουν στην ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C, ενώ οι G 12/13 διεγείρουν την ανταλλαγή ιόντων και την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού (Hamm 1998, Gutkind 1998, Forse 2000). Η λειτουργία των G πρωτεϊνών χαρακτηρίζεται από δυο κύκλους που περιλαμβάνουν την ανταλλαγή νουκλεοτιδίων γουανίνης και τη διάσπαση/ επανασύνδεση των υπομονάδων τους. Όταν η G πρωτεΐνη είναι ανενεργή, η α υπομονάδα του ετεροτριμερούς συνδέεται με διφωσφορική γουανοσίνη (GDP). Η σύνδεση του υποδοχέα με τον αγωνιστή προκαλεί αλλαγές στην χωροδιάταξη του υποδοχέα και στις αλληλεπιδράσεις του με την G πρωτεΐνη. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αντικατάσταση της διφωσφορικής γουανοσίνης με τριφωσφορική (GTP) και την επακόλουθη ενεργοποίηση της G πρωτεΐνης. Η σύνδεση του GTP προκαλεί τη διάσταση του τριμερούς συμπλόκου στην α υπομονάδα και στο διμερές των βγ υπομονάδων. Η ελεύθερη α υπομονάδα αλληλεπιδρά με διάφορες πρωτεΐνες-τελεστές με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των τελευταίων και την παραγωγή δευτέρων μηνυμάτων (Berridge 1987, Casey και Gilman 1988, Schulz και συν. 1989). Η αύξηση της συγκέντρωσης του δεύτερου μηνύματος προκαλεί με

14 5 τη σειρά της τη μεταβολή της δραστικότητας πρωτεϊνικών κινασών που εξαρτώνται από αυτά. Στην ενδοκυτταρική μεταγωγή μηνυμάτων μέσω των G πρωτεϊνών συμμετέχουν επίσης τα διμερή βγ, τα οποία με τη σειρά τους αλληλεπιδρούν με διάφορες πρωτεΐνες-τελεστές (Clapman και Neer 1997, Gutkind 1998). Παράλληλα, η υπομονάδα α με την ενδογενή δράση GTPάσης που τη χαρακτηρίζει υδρολύει το δεσμευμένο GTP, αυτοκαταλύοντας έτσι την απενεργοποίηση της και την επαναφορά της στη βασική κατάσταση του ανενεργούς τριμερούς συμπλόκου που είναι δεσμευμένο με GDP (Forse 2000, Sugden 2001). Οι υποδοχείς που συνδέονται με G πρωτεΐνες μπορεί να βρεθούν σε μια κατάσταση μειωμένης ευαισθησίας που είναι γνωστή ως «απευαισθητοποίηση» (desensitization) (Hausdorff και συν. 1990). Στην περίπτωση αυτή, ο συζευγμένος με τον αγωνιστή υποδοχέας φωσφορυλιώνεται, γεγονός που οδηγεί σε μειωμένη σύζευξη του υποδοχέα με την G πρωτεΐνη. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση αυτή είναι δυνατό να επάγει τη σύνδεση του υποδοχέα με μια πρωτεΐνη που ονομάζεται αρεστίνη (arrestin) και η οποία μπλοκάρει τη μεταγωγή μηνυμάτων, εμποδίζοντας τη σύζευξη του υποδοχέα με την G πρωτεΐνη. (LeVine 1999, Forse 2000, Rockman και συν. 2002). Μια άλλη κατηγορία πρωτεϊνών που ρυθμίζουν τη λειτουργία των GPCRs είναι οι RGS (Regulators of the G-protein signaling). Οι συγκεκριμένες πρωτεΐνες, είτε συνδέονται με τις α(gtp) υπομονάδες των G πρωτεϊνών και αναστέλλουν την αλληλεπίδραση τους με τις πρωτεΐνες-τελεστές, είτε επάγουν την επανασύνδεση των βγ διμερών με τις α(gdp) υπομονάδες (Sugden 2001). Το αποτέλεσμα της δράσης των RGS και στις δυο περιπτώσεις είναι η απενεργοποίηση της μεταγωγής μηνυμάτων μέσω των G πρωτεϊνών. Στην κατηγορία των GPCRs υποδοχέων ανήκει ένα πλήθος διαφόρων υποδοχέων μεταξύ των οποίων είναι οι αδρενεργικοί υποδοχείς, οι υποδοχείς ενδοθηλίνης, οι πουρινεργικοί υποδοχείς και οι μουσκαρινικοί υποδοχείς (Πίνακας 1) Αδρενεργικοί υποδοχείς Οι αδρενεργικοί υποδοχείς συνδέονται ειδικά με τις βιογενείς αμίνες, αδρεναλίνη και νοραδρεναλίνη, καθώς και με συμπαθητικομιμητικές ουσίες όπως η φαινυλεφρίνη και η ισοπροτερενόλη. Η οικογένεια των αδρενεργικών υποδοχέων χαρακτηρίζεται από μεγάλη ετερογένεια και περιλαμβάνει διακριτούς τύπους υποδοχέων, καθένας από τους οποίους έχει ειδικούς αγωνιστές ή διαφορετική συγγένεια για τον ίδιο αγωνιστή, καθώς επίσης και διαφορετική φυσιολογική δράση. Έτσι, με βάση τις ιδιότητες τους, τις ομολογίες της δομής τους και τα συναφή μονοπάτια μεταγωγής σήματος οι αδρενεργικοί υποδοχείς διακρίνονται στις

15 6 Υποδοχέας β 1 β 2 β 3 α 1A/B/D /ΕΤ α 2 Μ 2 Πρωτεΐνη G G s G s/g i G s/g i G q/g 11 G i G i Κατανομή σε ιστούς Πρωτεΐνητελεστής Δεύτερα Μηνύματα Ενδογενής αγωνιστής καρδιά AC,κανάλια Ca 2+ camp (PKA) καρδιά, πνεύμονες, νεφροί, αγγεία καρδιά, λιπώδης ιστός καρδιά, αγγεία, λείοι μυς πάγκρεας, αιμοπετάλια, ΚΝΣ, στεφανιαία αγγεία καρδιά AC,κανάλια AC PLC-β AC AC,κανάλια Ca 2+ K + camp (PKA, MAPKs) camp (PKA) DAG/ΙnsP 3, (PKC, MAPKs) camp (PKA) camp NA, A NA, A NA, A NA, A, ΕΤ NA, A ACh (PKA, PI3K) Πίνακας 1. Υποδοχείς συζευγμένοι με G πρωτεΐνες. β 1/2/3: β 1-, β 2-, β 3-αδρενεργικοί υποδοχείς, α 1Α/Β/D: α 1Α-, α 1Β-, α 1D-αδρενεργικοί υποδοχείς, α 2: α 2-αδρενεργικοί υποδοχείς, ΕΤ: υποδοχείς ενδοθηλίνης, Μ 2: μουσκαρινικοί υποδοχείς 2, AC: αδενυλική κυκλάση, DΑG: διακυλογλυκερόλη, InsP 3: 1,4,5 τριφωσφορική ινοσιτόλη, PLCβ: φωσφολιπάση Cβ, ΡΚΑ: πρωτεϊνική κινάση Α, PKC: πρωτεϊνική κινάση C, MAPKs: ενεργοποιούμενες από μιτογόνα πρωτεϊνικές κινάσες, PI3K: κινάση φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3, ΝΑ: νοραδρεναλίνη, Α: αδρεναλίνη, Ach: ακετυλοχολίνη (Rockman και συν. 2002). ακόλουθες κατηγορίες: α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς με τρεις υποτύπους, α 1Α, α 1Β και α 1D, α 2 -αδρενεργικοί υποδοχείς που με τη σειρά τους υποδιαιρούνται σε τρεις υποτύπους, α 2Α, α 2Β, α 2C, και β-αδρενεργικοί υποδοχείς με τρεις επιμέρους τύπους β 1, β 2 και β 3 (Μinneman και Esbenshade 1994, Zhong και Minneman 1999). Δεδομένα που προκύπτουν από τη χρήση ραδιενεργά σημασμένων συνδετών αποδεικνύουν ότι οι αδρενεργικοί υποδοχείς εκφράζονται σε ένα μεγάλο πλήθος ιστών που προέρχονται από διάφορα είδη. Στην καρδιά των θηλαστικών εκφράζονται όλοι οι υποτύποι των α 1 - και β-αδρενεργικών υποδοχέων. Ο αριθμός των α-αδρενεργικών υποδοχέων σε σχέση με τον αριθμό των β-αδρενεργικών υποδοχέων στο ανθρώπινο μυοκάρδιο είναι πολύ μικρός με μια αναλογία β- προς α-αδρενεργικοί υποδοχείς 10:1 περίπου (Zhong και Minneman 1999, Rockman και συν. 2002). Ένας αδρενεργικός υποδοχέας ανεξάρτητα από την κατηγορία στην οποία ανήκει, συνδέεται ειδικά με τις ενδογενείς κατεχολαμίνες αδρεναλίνη και νοραδρεναλίνη. Ωστόσο, η συγγένεια των αγωνιστών αυτών διαφέρει μεταξύ των αδρενεργικών υποδοχέων του α- και του β- τύπου. Επιπλέον οι G πρωτεΐνες με τις οποίες είναι συζευγμένοι οι επιμέρους τύποι των αδρενεργικών υποδοχέων διαφέρουν. Γενικά, οι β-αδρενεργικοί υποδοχείς συνδέονται μέσω G s πρωτεϊνών με

16 7 την αδενυλική κυκλάση. Διέγερση των υποδοχέων αυτών ενεργοποιεί το συγκεκριμένο ένζυμο προκαλώντας την αύξηση της συγκέντρωσης του cαμρ, το οποίο δρα ως δεύτερο μήνυμα (Ζhong και Minneman 1999, Michelotti και συν. 2000) (Πίνακας 1). Οι α-αδρενεργικοί υποδοχείς έχουν παρόμοια συγγένεια για την αδρεναλίνη και την νοραδρεναλίνη. Από αυτούς, οι α 2 -αδρενεργικοί υποδοχείς είναι συζευγμένοι με την αδενυλική κυκλάση μέσω των ανασταλτικών G i πρωτεϊνών. Έτσι, διέγερση των α 2 -αδρενεργικών υποδοχέων έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης του cαμρ. Η διέγερση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων ενεργοποιεί μέσω των G q/11 πρωτεϊνών τη φωσφολιπάση C, η οποία υδρολύει την 4,5 διφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη, προκαλώντας την παραγωγή δυο δευτέρων μηνυμάτων, της 1,4,5,-τριφωσφορικής ινοσιτόλης και της διακυλογλυκερόλης (Berridge 1987, Berridge 1993) (Πίνακας 1). H 1,4,5- τριφωσφορική ινοσιτόλη που παράγεται διαχέεται στο κυτταρόπλασμα για να προσδεθεί τελικά σε ειδικούς υποδοχείς του ενδοπλασματικού δικτύου, προκαλώντας τη διάνοιξη των καναλιών Ca 2+ και την εκροή ιόντων Ca 2+. Τα απελευθερωμένα ιόντα Ca 2+ επηρεάζουν ποικίλες πρωτεΐνες μεταξύ των οποίων και την καλμοδουλίνη. H διακυλογλυκερόλη, το δεύτερο μήνυμα που παράγεται από δράση της φωσφολιπάσης C, παραμένει στη μεμβράνη όπου σε συνεργασία με τα ιόντα Ca 2+ συμβάλλει στην ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C (Cohen 1992, Nishizuka 1992). Οι αδρενεργικοί υποδοχείς φαίνεται ότι είναι ιδιαίτερα σημαντικοί για τη φυσιολογία της καρδιάς, καθώς η λειτουργία τους σχετίζεται άμεσα με τις συσταλτικές, ηλεκτροφυσιολογικές και μεταβολικές ιδιότητες της. Συγκεκριμένα, η διέγερση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων προκαλεί θετικό ινοτροπισμό δηλαδή αύξηση της καρδιακής συσταλτικότητας και θετικό χρονοτροπισμό. Επιπλέον, οι α 1 - αδρενεργικοί αγωνιστές επηρεάζουν το μεταβολισμό της γλυκόζης προκαλώντας αύξηση της πρόσληψης της, διέγερση της γλυκόλυσης και αναστολή της σύνθεσης του γλυκογόνου (Terzic και συν. 1993, Varma και Deng 2000). Επίσης σημαντική είναι η συμμετοχή των αδρενεργικών υποδοχέων σε διάφορες παθοφυσιολογικές καταστάσεις της καρδιάς όπως υπερτροφία, ισχαιμία και καρδιακή ανεπάρκεια (Li και συν. 1997, Ζhong και Minneman 1999, Rockman και συν. 2002). Όσον αφορά στην υπερτροφία, μια προσαρμοστική απόκριση του μυοκαρδίου σε καταστάσεις που υπάρχει ανάγκη για αυξημένη καρδιακή παροχή, ο ρόλος των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων δεν εξαρτάται από τη θετικά ινοτροπική δράση τους. Οι αγωνιστές των συγκεκριμένων υποδοχέων επάγουν αλλαγές στη γονιδιακή ρύθμιση και στη μορφολογία των καρδιακών μυοκυττάρων, που χαρακτηρίζουν την υπερτροφία (Li και συν. 1997).

17 Υποδοχείς ενδοθηλίνης Η ενδοθηλίνη συνιστά μια οικογένεια τριών πεπτιδίων (ΕΤ-1, -2 και 3) που συντίθεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων, αλλά και από μια πληθώρα άλλων ιστών. Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωρισθεί τρεις υποτύποι υποδοχέων ενδοθηλίνης: οι ΕΤ Α με υψηλή συγγένεια για την ΕΤ-1 και χαμηλότερη συγγένεια για τα πεπτίδια ΕΤ-2 και ΕΤ-3, οι ΕΤ Β που εμφανίζουν την ίδια συγγένεια για τα τρία πεπτίδια ενδοθηλίνης και οι ET C που συνδέονται ειδικά με την ΕΤ-3. Στην καρδιά των θηλαστικών εκφράζονται τόσο οι υποδοχείς ΕΤ Α όσο και οι ΕΤ Β, οι οποίοι μέσω των πρωτεϊνών G q/11 συνδέονται με τη φωσφολιπάση C. Έτσι, διέγερση των υποδοχέων ενδοθηλίνης οδηγεί στην υδρόλυση της 4,5 διφωσφορικής φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης και στην παραγωγή 1,4,5,-τριφωσφορικής ινοσιτόλης και διακυλογλυκερόλης (Luscher και συν. 1993, van Heugten και συν. 1996) (Πίνακας 1). Η διέγερση των υποδοχέων ενδοθηλίνης στην καρδιά προκαλεί θετικό ινοτροπισμό. Η δράση των συγκεκριμένων υποδοχέων στις συσταλτικές ιδιότητες της καρδιάς οφείλεται σε αύξηση του ενδοκυτταρικού Ca 2+, διαδικασία που πιθανώς να συμβάλλει στη ρύθμιση του ph. Η αύξηση στη συγκέντρωση του Ca 2+ επιτυγχάνεται μέσω της αντλίας Na + /H + ή/και μέσω των καναλιών Ca 2+. Τα πεπτίδια ενδοθηλίνης και οι υποδοχείς τους ρυθμίζουν επίσης την πρωτεϊνοσύνθεση καθώς και τη μεταγραφή γονιδίων συμμετέχοντας έτσι στην εκδήλωση της υπερτροφίας της καρδιάς (Sugden 2003) Πουρινεργικοί υποδοχείς Σύμφωνα με φαρμακολογικές μελέτες, η οικογένεια των πουρινεργικών υποδοχέων περιλαμβάνει δύο διακριτούς τύπους: τους Ρ 1 ή υποδοχείς αδενοσίνης και τους Ρ 2 με υψηλή συγγένεια για το ΑΤΡ. Οι υποδοχείς Ρ 2 διαιρούνται σε δυο επιμέρους υποτύπους τους Ρ 2Χ που είναι συζευγμένοι με κανάλια ιόντων και τους Ρ 2Υ που είναι συζευγμένοι με G πρωτεΐνες (Vassort και συν. 1992, Vassort 2001). Πουρινεργικοί υποδοχείς τόσο του τύπου Ρ 2Χ όσο και του τύπου Ρ 2Υ συνυπάρχουν στην καρδιά των θηλαστικών. Οι Ρ 2Υ πουρινεργικοί υποδοχείς συνδέονται μέσω G q/11 πρωτεϊνών με τη φωσφολιπάση C και την παραγωγή 1,4,5,-τριφωσφορικής ινοσιτόλης και διακυλογλυκερόλης (Ralevic και Burnstock 1998, Vassort 2001) (Πίνακας 1). Το εξωκυτταρικό ΑΤΡ που παράγεται από τις απολήξεις των συμπαθητικών και παρασυμπαθητικών νεύρων αλλά και από τα καρδιακά μυοκύτταρα κατά την

18 9 ισχαιμία (Vassort 2001), ασκεί την πολλαπλή δράση του μέσω των πουρινεργικών υποδοχέων. Το ΑΤΡ διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση του καρδιαγγειακού συστήματος, καθώς διαμορφώνει τη λειτουργία ποικίλλων ιοντικών καναλιών και αντλιών. Έτσι, αυξάνει την εισροή ιόντων ασβεστίου και εκδηλώνει θετική ινοτρόπο δράση, ενώ προκαλεί αρνητικό χρονοτροπισμό επιβραδύνοντας τον βηματοδότη του φλεβόκομβου. Στις ισχαιμικές καρδιές το ΑΤΡ αποτελεί αιτία αρρυθμιών, ενώ φαίνεται να μη συμμετέχει στην υπερτροφία της καρδιάς (Vassort και συν. 1992, Vassort 2001). 3. ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΟΥΜΕΝΕΣ ΑΠΟ ΜΙΤΟΓΟΝΑ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΕΣ ΚΙΝΑΣΕΣ (Mitogen activated protein kinases, MAPKs) 3.1 Βασικά χαρακτηριστικά Η υπεροικογένεια των ενεργοποιούμενων από μιτογόνα πρωτεϊνικών κινασών (Mitogen-Activated Protein Kinases/MAPKs) επικεντρώνει το επιστημονικό ενδιαφέρον την τελευταία δεκαετία εξαιτίας της ποικιλίας των κυτταρικών λειτουργιών στις οποίες εμπλέκεται. Εξάλλου, η υψηλή συντηρητικότητα των συγκεκριμένων κινασών στην εξελικτική κλίμακα υποδηλώνει τον πρωταρχικό ρόλο που αυτές διαδραματίζουν στην κυτταρική σηματοδότηση. Τα μέλη της οικογένειας των ΜΑΡΚs είναι κινάσες Ser/Thr, η ενζυμική δραστικότητα των οποίων επάγεται με τη διπλή φωσφορυλίωση τους σε αμινοξική ακολουθία, Thr-Χ-Tyr (όπου Χ μπορεί να είναι γλουταμινικό οξύ, γλυκίνη ή προλίνη), γνωστή ως βρόχος ενεργοποίησης (activation loop). Η ταυτότητα του X αμινοξέος καθορίζει τη ταξινόμηση των 12 μελών της οικογένειας, σε 3 επιμέρους υποοικογένειες: τις ERKs (extracellular signal-regulated kinase), τις p38 MAPK, και τις JNKs (c-jun NH 2 -terminal kinase) (Πίνακας 2). Η έλλειψη ουσιαστικά ενιαίας και καθολικά εφαρμοζόμενης ονοματολογίας για αυτές τις πρωτεϊνικές κινάσες δυσχεραίνει αρκετά τη μελέτη των σχετικά βιβλιογραφικών αναφορών. Στην παρούσα μελέτη οι MAPKs αναφέρονται με το όνομα που έχει αποδοθεί στις επιμέρους οικογένειες τους (ERKs, JNKs, p38 MAPK). Οι κινάσες των MAPKs (MAPK kinases) αναφέρονται ως MEKs και οι κινάσες των MEKs (MAPK kinase kinases) ως MEKKs. Οι ΜΑΡ κινάσες ενεργοποιούνται από ποικιλία ερεθισμάτων στα οποία συμπεριλαμβάνονται αυξητικοί παράγοντες, αγωνιστές των συζευγμένων με G πρωτεΐνες υποδοχέων, κυτοκίνες καθώς και καταστάσεις στρες, όπως υπεριώδης ακτινοβολία, οξειδωτικό στρες, θερμικό σοκ, επίδραση επανεμποτισμού μετά από

19 10 Υποοικογένεια Ακολουθία Ειδικοί MAPKs φωσφορυλίωσης Ισομορφές αναστολείς ERK1/p44 MAPK ERK2/p42 MAPK ERKs Thr-Glu-Tyr ERK3 ERK4 PD98059 U0126 ERK5/BMK p38-mapkα 1 /α 2 p38-mapkβ 1 /β 2 SB p38 MAPKs Thr-Gly-Tyr p38-mapkγ SB p38-mapkδ JNK1 JNKs Thr-Pro-Tyr JNK2 JNK3 Πίνακας 2. Υποοικογένειες των ΜΑPKs. ισχαιμικό επεισόδιο, χημικές ουσίες που προκαλούν βλάβες στο DNA, μηχανικό στρες, μεταβολές της ωσμωμοριακότητας κ.α. Η ενεργοποίηση των ΜΑΡ κινασών προϋποθέτει τη συντονισμένη και διαδοχική δραστηριοποίηση δυο κινασών, η οποία ακολουθεί το εξής χαρακτηριστικό πρότυπο: ΜΕΚΚ ΜΕΚ ΜΑΡΚ (Seger και Krebs 1995, Gutkind 1998, Gutkind 2000, Bogoyevitch 2000, Liebmann 2001, Michel 2001) (Εικ. 1). Πιο αναλυτικά, οι ΜΕΚΚs ενεργοποιούνται είτε μέσω της φωσφορυλίωσης τους από άλλη κινάση, είτε μέσω της αλληλεπίδρασης τους με μονομερείς G πρωτεΐνες (Ras, Rho). Πρόκειται για κινάσες σερίνης/θρεονίνης, οι οποίες κατά την ενεργοποίηση τους φωσφορυλιώνουν την επόμενη κινάση του μοντέλου, ΜΕΚ. Οι ΜΕΚs συνιστούν πρωτεϊνικές κινάσες με διπλή ειδικότητα για αμινοξικά κατάλοιπα Thr/Tyr, οι οποίες με τη σειρά τους αναγνωρίζουν και φωσφορυλιώνουν τις MAPKs στην αλληλουχία Thr-Χ-Tyr (Brunet και Pouysségur 1997). Κρυσταλλογραφικές μελέτες έχουν δείξει ότι το μόριο των MAPKs αποτελείται από δυο βασικές περιοχές μεταξύ των οποίων βρίσκεται το ενεργό τους κέντρο. Το ΑΤΡ συνδέεται σε αυτή τη σχισμή του ενεργού κέντρου τους, ενώ τα υποστρώματα τους προσδένονται στο καρβοξυ-τελικό άκρο της ίδιας περιοχής (Knighton και συν 1991). Γνωστά υποστρώματα τους είναι πληθώρα μεταγραφικών παραγόντων, άλλες πρωτεϊνικές κινάσες, φωσφολιπάσες και πρωτεΐνες που σχετίζονται με τον κυτταρικό σκελετό. Δεδομένης της πολυπλοκότητας των βιοχημικών οδών που ρυθμίζουν οι MAPKs, είναι αρκετά δύσκολο να φανταστεί κανείς τον τρόπο με τον οποίο

20 11 Μικρές G Πρωτεΐνες PMA, GPCRs αγωνιστές RPTKs Ras? κυτταρικό στρες, GPCRs αγωνιστές Rac/Cdc42/ Rho MΕKKs Raf (MEKKs, MLKs, ΤΑΟs) MΕK s MΕΚ1/2 MΕK4/7 MΕK3/6 MAPKs ERK1/2 JNKs p38 MAPKs Υποστρώματα c-jun ATF2 MEF2C MAPKAPK2 Εικ. 1. Οδοί σηματοδότησης των MAPKs. Διακρίνονται τα τρία χαρακτηριστικά επίπεδα των οδών ERK1/2, JNKs και p38 MAPK (MEKKs, MEKs και MAPKs), καθώς και ορισμένα από τα υποστρώματα τους (Sugden και Clerk 1998). RPTKs: Υποδοχείς με ενδογενή δράση κινάσης τυροσίνης (Receptors protein tyrosine kinase), PMA: phorbol 12-myristate 13-acetate, MLKs: Mixed lineage kinases, TAOs: Thousand and one kinases. διασφαλίζεται η εξειδίκευση και η επιλεκτικότητα στη μεταγωγή των μηνυμάτων. Η εξειδίκευση ανάμεσα στα εξωκυτταρικά ερεθίσματα και τα διάφορα μόρια των MAPKs διασφαλίζεται αρχικά στο επίπεδο αλληλεπίδρασης των ΜΕΚs με τις ΜΑΡΚs και στη συνέχεια κατά την αντίδραση των MAPKs με τα υποστρώματα τους. Η περιοχή των MEKs που σχετίζεται με αυτή την εξειδίκευση εντοπίζεται στο αμινοτελικό άκρο του μορίου τους και επιπλέον δε σχετίζεται με τον βρόχο ενεργοποίησης στο μόριο των MAPKs. Όσον αφορά στις MAPKs, το αμινο-τελικό άκρο του μορίου τους φαίνεται να είναι υπεύθυνο για την υποδοχή του μηνύματος από την ΜΕΚ, ενώ το καρβοξυτελικό άκρο τους είναι υπεύθυνο για την παράδοση του μηνύματος στο υπόστρωμα. Έτσι, η πρωτοταγής δομή των MAPKs και των υποστρωμάτων τους εξασφαλίζει την πυροδότηση συγκεκριμένης κυτταρικής απόκρισης από κάθε εξωκυτταρικό μήνυμα (Brunet και Pouysségur 1997). Επιπλέον, η πρόσφατη ταυτοποίηση μορίων ικανών να συνδέονται με μέλη των σηματοδοτικών οδών των MAPKs, γνωστές ως πρωτεΐνες σκαλωσιάς (scaffolding proteins), έδωσε δομική υπόσταση στην εξειδίκευση κατά τη σηματοδότηση των ευκαρυωτικών κυττάρων. Συγκεκριμένα, στην οδό των ERKs οι πρωτεΐνες Ksr και MP1 συνδέονται με τις ERKs και την κινάση τους MEK1. Για την υποοικογένεια των JNKs, δυο πρωτεΐνες,

21 12 οι JIP (JNK inhibitory protein) και JSAP (a novel JNK inhibitory protein) λειτουργούν ως σύνδεσμος ανάμεσα στις MEKKs, ΜΕΚs και JNKs (Gutkind 2000) Υποοικογένεια των ERKs (Extracellular signal-regulated kinases) Στις αρχές της δεκαετίας του 80, κατά την επίδραση αυξητικών παραγόντων (PDGF, EGF) σε διάφορους κυτταρικούς τύπους διαπιστώθηκε η παρουσία ενός πρωτεϊνικού μορίου με μοριακό βάρος 42 KDa, το οποίο φωσφορυλιωνόταν σε κατάλοιπο τυροσίνης (Cooper και συν και 1983). Αργότερα, διαπιστώθηκε ότι αντίστοιχα πρωτεϊνικά μόρια αποκρίνονται με τον ίδιο τρόπο, κατά την επίδραση φορβολεστέρων σε ωοκύτταρα Xenopus laevis (Kazlauskas και Cooper 1988, Cooper και συν. 1989). Τελικά, απομονώθηκε το cdna του μορίου από τους Boulton και συν. (1990), οι οποίοι και μετονόμασαν τη μέχρι τότε γνωστή ως ΜΑΡΚ (ενεργοποιούμενη από μιτογόνα πρωτεϊνική κινάση), σε ERK1 (extracellular signalregulated kinase/ρυθμιζόμενη από εξωκυτταρικά σήματα κινάση), εξαιτίας των ποικίλων εξωκυτταρικών μηνυμάτων που διαπιστώθηκε ότι ενεργοποιούν τη δραστικότητα της. Διάφορες μελέτες έχουν πιστοποιήσει την ύπαρξη συνολικά 5 διαφορετικών πρωτεϊνικών μορίων ERK1-5. Οι ισομορφές των ERK1 και 2 αποτελούν τα καλύτερα μελετημένα μέλη της υποοικογένειας με μοριακό βάρος 44 και 42 KDa αντίστοιχα (Seger και Krebs 1995, Sugden και Clerk 1997, Michel και συν. 2001). Οι κινάσες αυτές εμπλέκονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και την κυτταρική επιβίωση. Για τα υπόλοιπα λιγότερα μελετημένα μέλη ERK3, 4 και 5 τα δεδομένα είναι περιορισμένα, ενώ αντιπαραβολή της αμινοξικής ακολουθίας τους έδειξε ότι ανήκουν σε διαφορετικές υποοικογένειες (Boulton και συν. 1991, Cheng και συν. 1996, Peng και συν. 1996,Michel και συν. 2001). Η οδός σηματοδότησης των ERK1/2 ακολουθεί το βασικό μοντέλο ενεργοποίησης των MAPΚs, με τη διαδοχική δραστηριοποίηση των ΜΕΚΚs και MEKs που τελικά οδηγούν στην ενεργοποίηση των ERK1/2 (Εικ. 1). Στη σηματοδότηση των ERK1/2, τον κεντρικό ρόλο των MEKKs διαδραματίζουν τα μέλη της οικογένειας των Raf πρωτεϊνών, ενώ οι σημαντικότερες ΜΕΚs που συμμετέχουν είναι οι MEK1 και MEK2. Γι αυτό το λόγο η οδός των ERKs συχνά αναφέρεται ως Raf MEK1/2 ERK1/2. MEKKs : RAF Τα μέλη της οικογένειας των Raf πρωτεϊνών κωδικοποιούνται από πρωτοογκογονίδια και εκδηλώνουν δράση κινάσης με διπλή ειδικότητα για αμινοξικά

22 13 κατάλοιπα Ser/Thr. Στα θηλαστικά εκφράζονται οι ισομορφές c-raf (ή Raf-1), A-Raf και B-Raf, οι οποίες χαρακτηρίζονται από μεγάλη ομολογία στην πρωτοταγή ακολουθία τους (Daum και συν. 1994, Sugden και Clerk 1997, Kolch 2000). Το μόριο των πρωτεϊνών Raf περιλαμβάνει τη ρυθμιστική αμινο-τελική περιοχή όπου εντοπίζονται θέσεις αλληλεπίδρασης με μικρές G πρωτεΐνες και την καταλυτική καρβοξυ-τελική περιοχή με το ενεργό κέντρο του ενζύμου και τις ειδικές θέσεις πρόσδεσης ATP και υποστρώματος (Drugan και συν. 1996, Casey 1995). Όσον αφορά στη ρύθμιση των πρωτεϊνών Raf, οι περισσότερες πληροφορίες αφορούν το μηχανισμό ενεργοποίησης της c-raf ισομορφής από την πρωτεΐνη Ras (Sugden και Clerk 1997, Kolch 2000). Η πρωτεΐνη Ras ανήκει στις μονομορείς μικρές G πρωτεΐνες και εντοπίζεται στην ενδοκυτταρική επιφάνεια της πλασματικής μεμβράνης. Η ανενεργή Ras πρωτεΐνη που είναι δεσμευμένη με GDP, ενεργοποιείται καθώς το GDP αντικαθίσταται από GTP, μια διαδικασία που επάγεται από παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης (Guanine nucleotides exchange factors/gefs), όπως η πρωτεΐνη Sos (Clerk και Sugden 2000, Vatner και Kunze 2000). Η ανταλλαγή των νουκλεοτιδίων γουανίνης αυξάνει τη συγγένεια της Ras για την c-raf, με αποτέλεσμα τη μετατόπιση της c-raf από το κυτταρόπλασμα στην μεμβράνη. Ωστόσο, η σύνδεση της Ras(GTP) με την c-raf δεν είναι αρκετή για την πλήρη ενεργοποίηση της. Απαιτείται επιπλέον φωσφορυλίωση της c-raf, που πιθανόν να επιτυγχάνεται με τη διαμεσολάβηση των πρωτεϊνικών κινασών τυροσίνης, Src (Dent και συν. 1995, Sugden και Clerk 1997). Από την άλλη πλευρά, φωσφορυλίωση της c-raf από την πρωτεϊνική κινάση Α (PKA) σε διαφορετικά αμινοξικά κατάλοιπα εμποδίζει τη σύνδεση της με την Ras και κατ επέκταση αναστέλλει την ενεργοποίηση των ERK1/2 (Erhardt και συν. 1995, Sugden και Clerk 1997). Μια άλλη κατηγορία πρωτεϊνών που επίσης συμμετέχουν στη ρύθμιση της c-raf, είναι οι πρωτεΐνες ( proteins). Οι πρωτεΐνες αυτές επάγουν την ενεργοποίηση της c-raf, είτε αναστέλλοντας την αποφωσφορυλίωση της είτε αυξάνοντας τη συγκέντρωση της στη συγκεκριμένη μεμβρανική περιοχή (Sugden και Clerk 1997, Kolch 2000). Για τις υπόλοιπες, λιγότερο μελετημένες ισομορφές Raf, αναφέρεται ότι η Α-Raf ενεργοποιείται από ένα μηχανισμό ανάλογο της c-raf με διπλή απαίτηση για φωσφορυλίωση και σύνδεση με τη Ras, ενώ για την ενεργοποίηση της B-Raf αρκεί η αλληλεπίδραση της με την πρωτεΐνη Ras (Kolch 2000). Εκτός από τα μέλη της οικογένειας των πρωτεϊνών Raf υπάρχουν αναφορές σχετικά με την ύπαρξη κι άλλων μορίων με ρόλο MEKK, στη σηματοδότηση των ERK1/2. Ειδικότερα, αναφέρονται ο παράγοντας Tpl-2, ο mos, όπως και οι κινάσες

23 14 ΜΕΚΚ1, ΜΕΚΚ2 και ΜΕΚΚ3. Ωστόσο, η έκφραση αρκετών από αυτές τις ΜΕΚΚs φαίνεται να περιορίζεται σε κυτταρικούς τύπους όπως καρκινικά κύτταρα, λεμφοκύτταρα και αιματοποιητικά κύτταρα, με αποτέλεσμα η συμμετοχή τους στις σηματοδοτικές οδούς της καρδιάς να θεωρείται απίθανη (Denhardt 1996, Michel και συν. 2001). ΜΕΚs : ΜΕΚ1/2 Οι ΜΕΚs των ERK1/2 απαντώνται σε δυο μορφές: τις MEK1 και ΜΕΚ2. Πρόκειται για πρωτεϊνικές κινάσες Thr/Tyr που φωσφορυλιώνονται και ενεργοποιούνται από τις πρωτεΐνες Raf. Οι ΜΕΚ1/2 ενεργοποιούνται από διάφορα ερεθίσματα και συμμετέχουν σε οδούς σηματοδότησης που κινητοποιούνται από υποδοχείς με ενδογενή δραστικότητα τυροσίνης, άλλες κινάσες τυροσίνης, καθώς και από υποδοχείς συζευγμένους με G πρωτεΐνες (Marais και Marshall 1996, Sugden και Clerk 1997, Kolch 2000). Ωστόσο, υπάρχουν και αναφορές, στις οποίες έχει πιστοποιηθεί διαφορετική ρύθμιση των MEK1 και ΜΕΚ2. Για παράδειγμα επίδραση φορβολεστέρων και ενδοθηλίνης-1 σε καλλιέργειες καρδιακών μυοκυττάρων, όπως και επίδραση αυξητικών παραγόντων, διαπιστώθηκε ότι επάγει την ενεργοποίηση μόνο της ΜΕΚ1 (Marais και Marshall 1996). MAPKs: ERKs Κατά την ενεργοποίησή τους, οι ERK1/2 φωσφορυλιώνονται στην αλληλουχία Thr-Glu-Tyr και στη συνέχεια λειτουργώντας ως προλίνο-κατευθυνόμενες κινάσες φωσφορυλιώνουν τα υποστρώματα τους στο μοτίβο Leu-Ser/Thr-Pro. Ο μεγάλος αριθμός υποστρωμάτων που έχει διαπιστωθεί για τις ERK1/2, αντικατοπτρίζει την πολλαπλότητα και πολυπλοκότητα που χαρακτηρίζει το ρόλο των συγκεκριμένων κινασών. Έτσι, ανάμεσα στα υποστρώματα τους περιλαμβάνονται παράγοντες και ένζυμα που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση, όπως οι μεταγραφικοί παράγοντες Elk1 και c-myc, η RNA πολυμεράση ΙΙ, καθώς και οι STATs (signal transducer and activator of transcription proteins). Σε αυτές τις περιπτώσεις, οι ERK1/2 κατά την ενεργοποίηση τους μετακινούνται στον πυρήνα, όπου αλληλεπιδρούν με τα υποστρώματα τους (Sugden και Clerk 1997, Brunet και Pouysségur 1997, Kolch 2000). Στο κυτταρόπλασμα, οι ERK1/2 φωσφορυλιώνουν την S6 κινάση p90 rsk (90 kda ribosomal S6 kinase ή RSK) (Frödin και Gammeltoft 1999), τη φωσφολιπάση Α 2 (PLA 2 ) (Lin και συν.1993) καθώς και τις σχετιζόμενες με τους μικροσωληνίσκους πρωτεΐνες MAP1/2/4 (Seger και Krebs 1995). Επιπλέον, οι ERK1/2 είναι δυνατό να συμμετέχουν σε ένα μηχανισμό αρνητικής ανάδρασης της λειτουργίας τους. Στην περίπτωση αυτή, αλληλεπιδρούν με διάφορα μέλη της οδού ενεργοποίησης τους (Ras, Raf, MEK), επάγοντας μείωση της δραστικότητας τους (Sugden και Clerk 1997, Michel και συν. 2001).

24 Μηχανισμοί ενεργοποίησης της σηματοδοτικής οδού των ERK1/2 Διάφοροι τύποι μεμβρανικών υποδοχέων, όπως υποδοχείς κυτοκινών, οι συζευγμένοι με G πρωτεΐνες υποδοχείς και οι υποδοχείς με ενδογενή δράση τυροσίνης ενεργοποιούν την οδό Raf MEK1/2 ERK1/2. Ακόμη, έχει βρεθεί ότι οι ERK1/2 ενεργοποιούνται από μια πληθώρα παραγόντων χωρίς τη διαμεσολάβηση υποδοχέων όπως οξειδωτικό στρες, οσμωτικό σοκ κ.α. (Page και Doubell 1996, Aikawa και συν. 1997, Silberbach και συν. 1999). Οι υποοικογένειες των συζευγμένων με G πρωτεΐνες υποδοχέων ενεργοποιούν τη σηματοδοτική οδό των ERK1/2 με διαφορετικούς μηχανισμούς. Έτσι, οι αγωνιστές των συζευγμένων με G q πρωτεΐνες υποδοχέων κινητοποιούν την φωσφολιπάση C (PLC), με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της PKC και την αύξηση της συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού ασβεστίου. Η οικογένεια των PKC περιλαμβάνει 11 ισομορφές πρωτεϊνικών κινασών Ser/Thr που ταξινομούνται σε τρεις επιμέρους υποοικογένειες (classical cpkcs, novel npkcs και atypical apkcs) (Nishizuka 1995). Η ενεργοποίηση των ισομορφών PKC από τη διακυλογλυκερόλη προϋποθέτει τη μετατόπιση τους από το κυτταρόπλασμα στη μεμβράνη. Φορβολεστέρες (phorbol esters), όπως το PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) δρουν ως ανάλογα της διακυλογλυκερόλης και επάγουν ισχυρή και εκτεταμένη ενεργοποίηση της PKC. Ειδικότερα, χρόνια διέγερση με φορβολεστέρες οδηγεί σε μειορρύθμιση (downregulation) της PKC, γεγονός που πιθανώς οφείλεται σε αυξημένη ευαισθησία των ενεργοποιημένων PKC σε πρωτεολυτικά ένζυμα (Sugden και Clerk 1998). Ο τρόπος με τον οποίο το μήνυμα μεταβιβάζεται από την PKC στις Raf πρωτεΐνες δεν είναι γνωστός. Σε ορισμένους κυτταρικούς τύπους, οι αγωνιστές των συζευγμένων με G q πρωτεΐνες υποδοχέων αυξάνουν τη συγγένεια της Ras για GTP, ενώ σε άλλες περιπτώσεις η PKC άμεσα φωσφορυλιώνει την Raf και επάγει την ενεργοποίηση των ERK1/2. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι το φωσφατιδικό οξύ, που παράγεται από την υδρόλυση της φωσφατιδυχολίνης μέσω της φωσφολιπάσης D, συμμετέχει επίσης στην οδό των ERK1/2 που εξαρτάται από τη PKC (Sugden και Clerk 1997, Kolch 2000). Μια εναλλακτική οδός ενεργοποίησης των ERK1/2 από τους συζευγμένους με G q πρωτεΐνες υποδοχείς εξαρτάται από το ενδοκυτταρικό ασβέστιο. Στην περίπτωση αυτή η αύξηση του ενδοκυτταρικού ασβεστίου πυροδοτεί ένα καταρράκτη αντιδράσεων που περιλαμβάνει ενεργοποίηση της κινάσης Pyk2 (proline rich tyrosine kinase), φωσφορυλίωση και πρόσδεση των πρωτεϊνών-προσαρμοστών (adaptor proteins) Shc και Grb2 (growth-factor-receptor-bound protein 2) με την

25 16 πρωτεΐνη Sos. To σύμπλοκo των παραπάνω πρωτεϊνών επάγει την αντικατάσταση του GDP από GTΡ στο μόριο της Ras, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της και τη μεταγωγή του μηνύματος στις ERK1/2 (Gutkind 1998, Gutkind 2000, Liebmann 2001, Michel 2001). Ωστόσο, η ενεργοποίηση των ERK1/2 από τους συζευγμένους με G q πρωτεΐνες υποδοχείς δεν απαιτεί πάντα την αύξηση του ενδοκυτταρικού ασβεστίου (Bogoyevitch και συν. 1996). Οι αγωνιστές των συζευγμένων με G i πρωτεΐνες υποδοχέων, όπως ήδη αναφέρθηκε, οδηγούν σε αναστολή της αδενυλικής κυκλάσης. Ωστόσο η ενεργοποίηση των ERK1/2 από τους συγκεκριμένους υποδοχείς δε σχετίζεται με την αδενυλική κυκλάση και την επακόλουθη μείωση του camp. Οι συζευγμένοι με G i πρωτεΐνες υποδοχείς συμμετέχουν στη σηματοδοτική οδό των ERK1/2 μέσω των βγ υπομονάδων των G i πρωτεϊνών και της PI3K (phosphoinositide 3-kinase)(Lopez- Ilasaca 1997, Gutkind 1998, Gutkind 2000). Ο ρόλος των συζευγμένων με G s πρωτεΐνες υποδοχέων ποικίλει και φαίνεται να εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο. Έτσι, στα περισσότερα κύτταρα η ενεργοποίηση της αδενυλικής κυκλάσης και η αύξηση του camp που ακολουθεί τη διέγερση των συγκεκριμένων υποδοχέων έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή των ERK1/2. Ωστόσο, οι βγ υπομονάδες των G s πρωτεϊνών μπορούν να ενεργοποιήσουν τις ERK1/2 με τον ίδιο τρόπο που τις ενεργοποιούν και οι G i βγ. Το αποτέλεσμα των δυο αντίθετων αυτών οδών στους περισσότερους κυτταρικούς τύπους είναι η αναστολή των ERK1/2. Από αυτό το γενικό κανόνα όμως, εξαιρούνται κάποιοι κυτταρικοί τύποι συμπεριλαμβανομένων και των καρδιακών μυοκυττάρων (Michel 2001). Η ενεργοποίηση της οδού των ERK1/2 από υποδοχείς με ενδογενή δράση κινάσης τυροσίνης έχει διερευνηθεί εκτενέστερα. Συγκεκριμένα, έχει βρεθεί ότι κατά την πρόσδεση των αγωνιστών EGF και PDGF με τους αντίστοιχους υποδοχείς, επάγεται η φωσφορυλίωση καταλοίπων τυροσίνης τόσο του υποδοχέα όσο και άλλων πρωτεϊνών-στόχων. Με τον τρόπο αυτό, πυροδοτείται ένας καταρράκτης αντιδράσεων που περιλαμβάνει την πρόσδεση των πρωτεϊνών-προσαρμοστών Shc και Grb2 σε συγκεκριμένες αλληλουχίες των υποδοχέων και η επιστράτευση επιπλέον παραγόντων (Sos, Ras) με τελική συνέπεια την ενεργοποίηση της οδού των ERK1/2 (Sugden και Clerk 1997, Brunet και Pouysségur 1997, Liebmann 2001) 3.3. Υποοικογένεια της p38 MAPK Στις αρχές της δεκαετίας του 90, κατά την επίδραση λιποπολυσακχαριτών σε μακροφάγα κύτταρα, διαπιστώθηκε η παρουσία μιας πρωτεΐνης με μοριακό βάρος 38 KDa, η οποία φωσφορυλιωνόταν σε κατάλοιπο τυροσίνης. Η απομόνωση και κλωνοποίηση της πρωτεΐνης οδήγησε στο συμπέρασμα ότι πρόκειται για άλλο ένα

26 17 μέλος της οικογένειας των MAPKs (Han και συν 1994). Μέχρι σήμερα έχουν κλωνοποιηθεί 4 διαφορετικές μορφές της p38 στα θηλαστικά: p38α, p38β, p38γ και p38δ. Οι κινάσες αυτές παρουσιάζουν μεγάλο βαθμό ομολογίας με την αντίστοιχη κινάση Hog1 (high osmolarity glycerol responsive 1) στη ζύμη, η οποία ενεργοποιείται κατεξοχήν από υπερωσμωτικό στρες. Από τις διάφορες ισομορφές της p38 ΜΑPK, οι p38α και p38β εκφράζονται στους περισσότερους ιστούς των θηλαστικών, ενώ η p38γ ανιχνεύεται κατά κύριο λόγο στους σκελετικούς μυς και η p38δ στους πνεύμονες, το πάγκρεας, στους νεφρούς και άλλους ενδοκρινείς αδένες (Forse και συν 1996, Obata και συν. 2000, Ono και Han 2000). Τα ερεθίσματα που επάγουν την ενεργοποίηση της p38 ΜΑΡΚ περιλαμβάνουν ποικίλες μορφές κυτταρικού στρες, (υπεριώδη ακτινοβολία, ωσμωτικό σοκ, ισχαιμία, αναστολείς της πρωτεϊνοσύνθεσης), ορισμένες κυτοκίνες (IL-1, TNF-α), αυξητικούς παράγοντες (PDGF, NGF, IGF κ.α.) καθώς και αγωνιστές των G-συζευγμένων υποδοχέων (Lazou και συν. 1998, Clerk και συν. 1998α, Clerk και συν. 1998β, Bogoyevitch 2000). Χαρακτηριστική ιδιότητα ορισμένων μελών της υποοικογένειας p38 ΜΑΡΚ είναι η ικανότητα τους να συνδέονται με μια ομάδα πυριδινυλο-ιμιδαζολίων, τα οποία χρησιμοποιούνται ως φάρμακα και αναφέρονται ως CSAIDs (cytokine-suppressive anti-inflammatory drugs). Σημαντικότερος αντιπρόσωπος τους είναι ο SB (SmithKline Beecham) Οι συγκεκριμένοι χημικοί παράγοντες έχουν τη δυνατότητα να αναστέλλουν την επαγόμενη από ενδοτοξίνες μεταγραφή των γονιδίων TNF (Lee και συν. 1994). Η αποτελεσματικότητα της δράσης των CSAIDs αποδίδεται στην πρόσδεση τους στις διάφορες ισομορφές της p38 ΜΑΡΚ. In vitro αναλύσεις έδειξαν, ότι μόνο οι p38 ΜΑΡΚs α και β, αναστέλλονται από τα CSAIDs, λόγω στερεοδομικών διαφοροποιήσεων τους από τις γ και δ ισομορφές (Goedert και συν. 1997). Οι πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη μεταγωγή μηνυμάτων μέσω της p38 ΜΑΡΚ δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως (Εικ. 1). Ο αριθμός των κινασών που συμμετέχουν στη συγκεκριμένη οδό αυξάνεται συνεχώς και πιθανώς αντιστοιχεί στην πληθώρα των ερεθισμάτων που το ενεργοποιούν. MEKKs Oι κινάσες που δρουν ως ΜΕΚΚs στη σηματοδοτική οδό της p38 ΜΑΡΚ μπορούν να ταξινομηθούν σε τρεις κατηγορίες: α) τις MEKKs που περιλαμβάνουν τις MEKK1-4, ASK1 (apoptosis signal-regulating kinase 1), TAK1 (TGF-β-activated kinase 1) και Tpl2 (Tumor progression locus 2), β) τις MLKs (Mixed lineage kinases), στις οποίες ανήκουν οι MLK1-3, και γ) τις TAOs (Thousand and one kinases) με τις ισομορφές TAO1 και ΤΑΟ2 (Kyriakis και Avruch 2001). Οι περισσότερες από αυτές τις κινάσες

27 18 έχει αναφερθεί ότι ενεργοποιούν πρωτεΐνες που ανήκουν σε διαφορετικές υποοικογένειες των MAPKs. Ωστόσο οι TAK, MEKK4, TAO, και ΑSK-1 παρουσιάζουν μεγαλύτερη εξειδίκευση για το μονοπάτι της p38 ΜΑΡΚ (Obata και συν. 2000, Michel και συν. 2001). MEKs : MEK3/6 Οι πρωτεϊνικές κινάσες που ευθύνονται για την φωσφορυλίωση/ενεργοποίηση της p38 ΜΑΡΚ είναι οι ΜΕΚ3 και 6. Χαρακτηριστικό είναι ότι οι δυο κινάσες παρουσιάζουν εξειδίκευση ως προς τις ισομορφές της p38 ΜΑΡΚ που φωσφορυλιώνουν. Συγκεκριμένα, η ΜΕΚ6 φωσφορυλιώνει όλες τις ισομορφές της p38 ΜΑΡΚ, ενώ η ΜΕΚ3 ενεργοποιεί μόνο τις p38 α, γ και δ. Επιπλέον, οι ΜΕΚ3 και ΜΕΚ6 διαφέρουν ως προς τα ερεθίσματα που τις ενεργοποιούν. Έτσι, σε αντίθεση με την ΜΚΚ6 που κινητοποιείται από όλους τους γνωστούς ενεργοποιητές της p38 ΜΑΡΚ, η ΜΕΚ3 ενεργοποιείται μόνο από περιορισμένο αριθμό ερεθισμάτων (Enslen και συν. 1998, Obata και συν. 2000, Kyriakis και Avruch 2001). MAPKs: p38 ΜΑΡΚ Η ενεργοποίηση της p38 ΜΑΡΚ εξασφαλίζεται με τη φωσφορυλίωση της στην αλληλουχία Thr-Gly-Tyr, από τις MEK3 και 6. Η φωσφορυλιωμένη κινάση εντοπίζεται τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα όπου αλληλεπιδρά με τα διάφορα υποστρώματα της (Obata και συν. 2000). Ανάμεσα στα υποστρώματα της υποοικογένειας της p38 ΜΑΡΚ ανήκουν διάφοροι μεταγραφικοί παράγοντες καθώς και κινάσες. Ειδικότερα, έχει βρεθεί ότι οι ισομορφές α και β της p38 ΜΑΡΚ φωσφορυλιώνουν τις MAPKAPK 2 και 3 (MAPK-activated protein kinase), κινάσες Ser/Thr, οι οποίες επάγουν τη φωσφορυλίωση της μικρής πρωτεΐνης θερμικού σοκ Hsp27 (Stokoe και συν 1992, McLaughlin και συν. 1996). Στην ανενεργή της μορφή, η Hsp27 έχει βρεθεί ότι σχηματίζει σύμπλοκα μεγάλου μοριακού βάρους, τα οποία λειτουργούν ως πρωτεΐνες-συνοδοί (chaperones). Η φωσφορυλίωση των μορίων της Hsp27, επάγει το διαχωρισμό των συμπλόκων σε μονομερή και διμερή και την ταυτόχρονη ανακατανομή τους σε διάφορα μέρη του κυτταροσκελετού. Με αυτόν τον τρόπο οι p38 α και β είναι δυνατό να επιδρούν στην κινητικότητα των κυττάρων και πιθανώς να συντελούν στην επιδιόρθωση βλαβών του κυτταροσκελετού. Η p38 ΜΑΡΚ αλληλεπιδρά επίσης με μεταγραφικούς παράγοντες όπως οι MEF2 (myocyte enhancer factor 2), ATF2 και Elk1, οι οποίοι συνδέονται ως ομοδιμερή ή ετεροδιμερή στον υποκινητή διαφόρων γονιδίων. Η φωσφορυλίωση των συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων από την p38 ΜΑΡΚ έχει ως αποτέλεσμα την τροποποίηση είτε της ικανότητας τους για πρόσδεση στο DNA, είτε των αλληλεπιδράσεων τους με άλλες πρωτεΐνες, με τελικό αποτέλεσμα την ενίσχυση ή τη μείωση της μεταγραφής. Ο μεταγραφικός παράγοντας MEF2 προσδένεται σε

28 19 ακολουθίες του DNA, πλούσιες σε αδενίνη και θυμίνη, οι οποίες εντοπίζονται κυρίως σε υποκινητές μυο-ειδικών γονιδίων. Σε αντίθεση με τον MEF2, οι ATF2 και Elk1 δεν αποτελούν αποκλειστικά υποστρώματα της p38 ΜΑΡΚ, αφού η φωσφορυλίωση τους επιτυγχάνεται και από άλλα μέλη της οικογένειας των MAPKs. Ειδικότερα, ο ATF2 ενεργοποιείται επίσης από τις JNKs, ενώ ο Elk1 αποτελεί υπόστρωμα των ERKs και των JNKs (Forse και συν. 1996, Bogoyevitch 2000, Kyriakis και Avruch 2001) Μηχανισμοί ενεργοποίησης της σηματοδοτικής οδού της p38 ΜΑΡΚ Οι διάφορες ισομορφές της p38 ΜΑΡΚ ενεργοποιούνται κατεξοχήν από ποικίλες μορφές κυτταρικού στρες όπως υπεριώδη ακτινοβολία, ωσμωτικό σοκ, ισχαιμία, αναστολείς της πρωτεϊνοσύνθεσης, μηχανικό στρες κ.α. Ο μηχανισμός με τον οποίο τέτοιου είδους ερεθίσματα ενεργοποιούν σηματοδοτικές οδούς δεν είναι γνωστός. Σύμφωνα με ένα προτεινόμενο μοντέλο, διέγερση των κυττάρων με στρεσογόνους παράγοντες έχει ως αποτέλεσμα τη συνάθροιση των υποδοχέων αυξητικών παραγόντων και την ενεργοποίηση τους, απουσία των αγωνιστών τους. Στη συγκεκριμένη διαδικασία φαίνεται να εμπλέκονται κι άλλες πρωτεΐνες, όπως οι ιντεγκρίνες (intergrins) και η FAK (focal adhesion kinase) (Bogoyevitch 2000). Σύμφωνα με ένα άλλο μοντέλο, τα κύτταρα κατά την επίδραση καταστάσεων στρες απελευθερώνουν αυξητικούς παράγοντες, οι οποίοι στη συνέχεια συνδέονται με τους υποδοχείς τους στην κυτταρική μεμβράνη και ενεργοποιούν διάφορες σηματοδοτικές οδούς συμπεριλαμβανομένης και της p38 ΜΑΡΚ (Bogoyevitch 2000). Οι υποδοχείς που λειτουργούν ως αποδέκτες των μηνυμάτων στρες σε αυτήν την περίπτωση δεν είναι γνωστοί. Από τις διάφορες οικογένειες των συζευγμένων με G πρωτεΐνες υποδοχέων, στην ενεργοποίηση της p38 ΜΑΡΚ συμμετέχουν οι συζευγμένοι με G q, G i και G o υποδοχείς. Συγκεκριμένα, οι G q πρωτεΐνες συμμετέχουν με τις α και βγ υπομονάδες, ενώ οι G i και G o μόνο με τις βγ (Michel και συν. 2001, Gutkind 2000). Παρά το γεγονός ότι οι πρωτεΐνες που συνιστούν την οδό της p38 ΜΑΡΚ δεν έχουν διευκρινιστεί με ακρίβεια, οι περισσότερες μελέτες αποδεικνύουν την ενεργό συμμετοχή των μικρών G πρωτεϊνών. Οι μικρές G πρωτεΐνες λειτουργούν ως μοριακοί διακόπτες στα κύτταρα. Συγκεκριμένα, όταν είναι συνδεδεμένες με GDP είναι ανενεργές, ενώ ανταλλαγή του GDP με GTP έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση τους, μια διαδικασία που καταλύεται από τις GEFs (Guanine nucleotides exchange factors). Επιπλέον, οι πρωτεΐνες GAPs (GTPase-activating proteins) ενισχύουν την ενδογενή δραστικότητα GTPασης των μικρών G πρωτεϊνών, με αποτέλεσμα την υδρόλυση του δεσμευμένου GTP και την

29 20 επαναφορά τους στην ανενεργό μορφή τους. Οι μικρές G πρωτεΐνες διακρίνονται σε 5 υποοικογένειες: Ras, Rho, ADP ribosylation factors, Rab και Ran (Clerk και Sugden 2000, Vatner και Kunze 2000). Από αυτές, οι Ras, όπως αναφέρθηκε, συμμετέχουν στην ενεργοποίηση της Raf στο μονοπάτι των ERK1/2, ενώ οι Rho εμπλέκονται στην ενεργοποίηση της p38 ΜΑΡΚ. Η υποοικογένεια των Rho πρωτεϊνών περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες Rac1, RhoA και Cdc42. Ο μηχανισμός με τον οποίο οι πρωτεΐνες της υποοικογένειας Rho ενεργοποιούν τις ΜΕΚΚs στη σηματοδοτική οδό της p38 ΜΑΡΚ δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως. Κεντρικό ρόλο στη διαδικασία αυτή όμως, φαίνεται να διαδραματίζουν οι κινάσες Ser/Thr PAKs (p21-activated kinases), αν και δεν είναι γνωστό ακόμα αν οι συγκεκριμένες κινάσες ενεργοποιούν άμεσα τις ΜΕΚΚs (Clerk και Sugden 2000, Kyriakis και Avruch 2001, Clerk και συν. 2001). Όσον αφορά στους ενεργοποιητές των Rho πρωτεϊνών, πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν τη συμμετοχή της PI3K. Ειδικότερα, η ενεργοποίηση της PI3K από τη Ras, οδηγεί στο σχηματισμό 3,4,5-τριφωσφορικής φωσφατιδυλινοσιτόλης, η οποία επάγει την επιστράτευση ενός συμπλόκου πρωτεϊνών. Το συγκεκριμένο σύμπλοκο περιλαμβάνει την πρωτεΐνη Sos (GEF), η οποία καταλύει την αντικατάσταση του GDP από GTP στο μόριο της Rac1, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της τελευταίας (Nimmual και συν. 1998, Clerk και συν. 2001) Υποοικογένεια των JNKs (c-jun NH 2 -terminal kinases) Στις αρχές της δεκαετίας του 90, με τη χρήση κυκλοεξαμιδίου, διαπιστώθηκε η παρουσία μιας πρωτεΐνης με μοριακό βάρος 54 KDa, η οποία φωσφορυλιωνόταν σε αλληλουχία Thr-Pro-Tyr. H συγκεκριμένη πρωτεΐνη αρχικά ονομάστηκε p54map-2, καθώς είχε την ικανότητα να φωσφορυλιώνει τη σχετιζόμενη με τους μικροσωληνίσκους κινάση ΜΑΡ-2 (microtubule-associated protein-2). Χαρακτηριστική ήταν επίσης η ικανότητα της p54map-2 να φωσφορυλιώνει το αμινο-τελικό άκρο του μεταγραφικού παράγοντα c-jun, σε αντίθεση με τη φωσφορυλίωση της καρβοξυ-τελικής περιοχής του παράγοντα αυτού από τις ERKs (Kyriakis και συν. 1990). Μετά την κλωνοποίηση του γονιδίου, που κωδικοποιεί τη συγκεκριμένη κινάση (Kyriakis και συν 1994, Derijard και συν. 1994), η ομόλογη πρωτεΐνη του ανθρώπου ονομάστηκε JNK (c-jun NH 2 -terminal kinase), ενώ του αρουραίου SAPK (stress activated protein kinase). Ακολούθησε η κλωνοποίηση δυο ακόμη γονιδίων που κωδικοποιούν για τις JNKs. Έτσι διαπιστώθηκε, ότι οι JNKs κωδικοποιούνται από τρία τουλάχιστον διαφορετικά γονίδια, τα προϊόντα των οποίων αποτελούν οι JNK1/SAPKγ, JNK2/SAPKα και JNK3/SAPKβ (Kyriakis και συν. 1994). Η έκφραση κάθε γονιδίου διαφοροποιείται περαιτέρω με διαφορετικό

30 21 splicing, με αποτέλεσμα να προκύπτουν τουλάχιστον 12 ισομορφές των JNKs. Τα πολυπεπτίδια αυτά διαφέρουν τόσο ως προς την κατανομή τους στους διάφορους κυτταρικούς τύπους, όσο και ως προς τη ρύθμιση τους. Συγκεκριμένα, έχει βρεθεί ότι από τις καλύτερα μελετημένες JNK1, 2 και 3, οι μεν JNK1 (46kDa) και JNK2 (54kDa) έχουν ευρύτατη κατανομή, ενώ η JNK3 εκφράζεται αποκλειστικά σε κύτταρα του εγκεφάλου (Kyriakis και Avruch 2001). Οι JNKs, όπως και η p38 MAPK, συμμετέχουν στη σηματοδότηση διαφόρων μορφών κυτταρικού στρες. Επιπλέον, οι JNKs και η p38 MAPK ενεργοποιούνται σε ένα μεγάλο ποσοστό από τις ίδιες κινάσες (Εικ. 1). Η ενεργοποίηση των δύο υποοικογενειών από τα ίδια ερεθίσματα και από τις ίδιες κινάσες είναι ενδεικτική πιθανής λειτουργικής συσχέτισης των δυο αυτών σηματοδοτικών μονοπατιών. ΜΕΚΚs Κινάσες που ανήκουν στις κατηγορίες των MEKKs (MEKK1-4, ASK1, TAK1 και Tpl2), MLKs (MLK1-3) και TAOs (TAO1 και ΤΑΟ2) έχουν αναφερθεί ότι συμμετέχουν στην οδό των JNKs. Ειδικότερα, τα μέλη της οικογένειας των MLKs, καθώς και η ΜΕΚΚ1, χαρακτηρίζονται ως εξειδικευμένοι ενεργοποιητές των JNKs (Kyriakis και Avruch 2001). ΜΕΚs: MEK4/7 Η ενεργοποίηση των JNKs εξασφαλίζεται με τη φωσφορυλίωση τους στην αλληλουχία Thr-Pro-Tyr από τις κινάσες ΜΕΚ4 και ΜΕΚ7. Παρά το γεγονός ότι η δράση της ΜΕΚ4 στα περισσότερα συστήματα επικαλύπτει τη δράση της ΜΕΚ7, υπάρχουν δεδομένα που υποστηρίζουν ότι οι δυο κινάσες δρουν συνεργατικά στη φωσφορυλίωση των JNKs. Συγκεκριμένα, η ΜΕΚ4 φωσφορυλιώνει ειδικά το κατάλοιπο Tyr185 στο μόριο των JNKs και σε μικρότερο βαθμό το κατάλοιπο Thr183. Το αντίθετο φαίνεται να ισχύει για την ΜΕΚ7, στόχος της οποίας είναι η Thr183 παρά η Tyr185. Επιπλέον, αποδεικνύεται ότι όταν οι δυο κινάσες χρησιμοποιούνται ξεχωριστά, ενεργοποιούν τις JNKs σε μικρό βαθμό, ενώ συνδυασμός τους οδηγεί σε πλήρη φωσφορυλίωση των JNKs τόσο στα κατάλοιπα τυροσίνης όσο και στα κατάλοιπα θρεονίνης (Lawrel και συν. 1998, Kyriakis και Avruch 2001). MAPKs: JNKs Τα ερεθίσματα που ενεργοποιούν τις JNKs περιλαμβάνουν κατά κύριο λόγο διάφορες μορφές κυτταρικού στρες όπως, θερμικό σοκ, υπεριώδης ακτινοβολία, οξειδωτικό στρες (Η 2 Ο 2 ), χημικές ουσίες που προκαλούν βλάβες στο DNA (π.χ. αλκυλιωτικοί παράγοντες), επίδραση επανεμποτισμού μετά από ισχαιμικό επεισόδιο, μηχανικό στρες και συνθήκες υπερωσμωμοριακότητας. Αντίθετα, διάφοροι αυξητικοί παράγοντες (EGF, PDGF, FGF), μιτογόνα και αγωνιστές των G-

31 22 συζευγμένων υποδοχέων ενεργοποιούν τις JNKs σε μικρότερο βαθμό (Kyriakis και συν. 1994, Derijard και συν. 1994, Sugden και Clerk 1998, Kyriakis και Avruch 2001). Από τα καλύτερα μελετημένα μέλη της υποοικογένειας των JNKs, οι JNK1 και 2 συνήθως ακολουθούν το ίδιο πρότυπο ενεργοποίησης. Ωστόσο υπάρχουν και περιπτώσεις, όπως για παράδειγμα κατά την επίδραση TNF σε μακροφάγα κύτταρα στις οποίες ενεργοποιείται μόνο η JNK1 και όχι η JNK2 (Chan και συν. 1997). Μετά τη φωσφορυλίωση τους από τις ΜΕΚ4 και 7, οι ενεργοποιημένες JNKs αλληλεπιδρούν με διάφορα υποστρώματα τους, κυρίως με μεταγραφικούς παράγοντες. Χαρακτηριστικό υπόστρωμα των JNKs είναι ο μεταγραφικός παράγοντας ΑΡ-1 (activator protein 1). Ο ΑΡ-1 είναι ένα ετεροδιμερές, στη σύσταση του οποίου συμμετέχουν οι bzip μεταγραφικοί παράγοντες, c-jun και JunD, μέλη της οικογένειας ATF (συνήθως ATF2), καθώς και μέλη της οικογένειας των fos μεταγραφικών παραγόντων (συνήθως c-fos). Χαρακτηριστικό της δομής των bzip παραγόντων είναι τα «φερμουάρ» λευκίνης, τα οποία επιτρέπουν το σχηματισμό ομοδιμερών και ετεροδιμερών. Έτσι, τα συστατικά του ΑΡ-1 οργανώνονται σε διμερή Jun-Jun, Jun-Fos, ή Jun-ATF (Forse και συν. 1996, Κyriakis και Avruch 2001). Η ενεργοποίηση του ΑΡ-1 καθορίζεται τόσο από την άμεση φωσφορυλίωση των συστατικών του, όσο και από την κινητοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων, οι οποίοι ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων, που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες c-jun και c-fos. Η φωσφορυλίωση στην περιοχή ενεργοποίησης (transactivation domain) των ATF2 και c-jun σχετίζεται και στις δυο περιπτώσεις με αυξημένη μεταγραφική δραστικότητα των παραγόντων (Derijard και συν. 1994, Kyriakis και συν. 1994). Συγκεκριμένα, οι κινάσες που εξασφαλίζουν τη φωσφορυλίωση του ATF2 είναι οι JNKs και p38 MAPK, ενώ ο c-jun αποτελεί υπόστρωμα μόνο των JNKs (Forse και συν. 1996, Bogoyevitch 2000, Κyriakis και Avruch 2001). Η ρύθμιση της μεταγραφής από τον ΑΡ-1 μελετήθηκε για πρώτη φορά στο γονίδιο της κολλαγενάσης, κατά την επίδραση κυτοκινών (Karin 1995). Οι JNKs επάγουν τη μεταγραφή του συγκεκριμένου γονιδίου φωσφορυλιώνοντας τους c-jun και ATF2. Ετεροδιμερή των δυο παραγόντων προσδένονται στον υποκινητή του γονιδίου του c-jun, με αποτέλεσμα την αύξηση της πρωτεΐνης c-jun και κατά συνέπεια την αύξηση της δραστικότητας του AP-1. Παράλληλα, οι JNKs ενεργοποιούν τον μεταγραφικό παράγοντα Elk1, ο οποίος επάγει την έκφραση του γονιδίου c-fos. Έτσι, αυξάνεται ο σχηματισμός ετεροδιμερών Jun-Fos, γεγονός που συνοδεύεται από ενίσχυση της μεταγραφής ΑΡ-1-εξαρτώμενων γονιδίων, όπως αυτό της κολλαγενάσης (Forse και συν. 1996).

32 Μηχανισμοί ενεργοποίησης της σηματοδοτικής οδού των JNKs Αν και η ενεργοποίηση των JNKs από διάφορες μορφές κυτταρικού στρες έχει διερευνηθεί διεξοδικά, οι οδοί μεταγωγής μηνυμάτων που κινητοποιούνται σε αυτές τις περιπτώσεις δεν έχουν αποσαφηνιστεί. Βασική αιτία αποτελεί η αδυναμία ταυτοποίησης υποδοχέων που λειτουργούν ως αποδέκτες αυτών των ερεθισμάτων. Έτσι, τα βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με τους μηχανισμούς ενεργοποίησης των JNKs περιορίζονται στα ίδια υποθετικά μοντέλα που αναφέρθηκαν για την p38 ΜΑΡΚ (Bogoyevitch 2000). Εντούτοις, η απόκριση των JNKs σε άλλα ερεθίσματα (π.χ. ιντερλευκίνη, TNF, φαινυλεφρίνη, ενδοθηλίνη, αγγειοτενσίνη κ.α.) έχει διερευνηθεί εκτενέστερα και περιλαμβάνει διάφορους υποδοχείς, όπως υποδοχείς κυτοκινών, υποδοχείς με ενδογενή δράση κινάσης τυροσίνης, υποδοχείς οιστρογόνων και G-συζευγμένους υποδοχείς (Gutkind 1998, Bogoyevitch 2000, Κyriakis και Avruch 2001). Οι συζευγμένοι με G πρωτεΐνες υποδοχείς ενεργοποιούν την οδό των JNKs μέσω των βγ υπομονάδων, με εξαίρεση τους συζευγμένους με G 12/13 πρωτεΐνες υποδοχείς που σηματοδοτούν στις JNKs μέσω των α υπομονάδων (Coso και συν. 1996). Ο μηχανισμός, με τον οποίο οι συγκεκριμένες υπομονάδες δρουν, αφορά τη ρύθμιση των GEFs (Guanine nucleotides exchange factors) για τις μικρές G πρωτεΐνες Ras, Rac και Cdc42. Στη διαδικασία αυτή σημαντικό ρόλο διαδραματίζουν οι πρωτεΐνες RasGRF1 και 2 (Ras-guanine-nucleotide exchange factor). Συγκεκριμένα, η RasGRF1 συνδεόμενη με τις βγ υπομονάδες, δρα ως GEF και επάγει την ανταλλαγή του GDP με GTP στο μόριο της Rac (Kiyono και συν. 1999). Η RasGRF2 από την άλλη πλευρά, συμμετέχει στη μεταγωγή μηνυμάτων που σχετίζονται με τα ιόντα ασβεστίου στη Ras και Rac (Fan και συν. 1998). Άλλη μια κατηγορία πρωτεϊνών που εμπλέκεται στην κινητοποίηση των μικρών G πρωτεϊνών στη σηματοδοτική οδό των JNKs είναι οι Pyk και FAK. Οι συγκεκριμένες πρωτεΐνες ενεργοποιούν GEF των Rho πρωτεϊνών με τη διαμεσολάβηση πρωτεϊνών-προσαρμοστών (Gutkind 2000). Όσον αφορά στο ρόλο της PKC, άμεση ενεργοποίηση της από φορβολεστέρες προκαλεί πολύ μικρή ενεργοποίηση των JNKs (Sugden και Clerk 1998). Επιπλέον, μειορρύθμιση (down regulation) της PKC, σε συνδυασμό με μείωση του ενδοκυτταρικού Ca 2+ αναστέλλει την επαγόμενη από την αγγειοτενσίνη ενεργοποίηση των JNKs, γεγονός που υπονοεί τη συνεργατική δράση της PKC και του Ca 2+ στην οδό των JNKs (Kudoh και συν. 1997).

33 Φωσφατάσες των MAPKs Εφόσον η δραστικότητα των MAPKs εξαρτάται από διπλή φωσφορυλίωση Thr- Tyr, ο κύριος μηχανισμός απενεργοποίησης τους επιτυγχάνεται με τη δράση εξειδικευμένων φωσφατασών. Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωρισθεί έξι φωσφατάσες των MAPKs : MKP-1, MKP-2, MKP-3, MKP-4, hvh5 (γνωστή και ως Μ3-6) και PAC1. Οι MKP-X, hvh3 και B59 δρουν επίσης ως φωσφατάσες των ΜΑPKs, αλλά δεν έχει διευκρινιστεί η εξειδίκευση τους ως προς τα υποστρώματα τους (Haneda και συν. 1999, Michel και συν. 2001). Όσον αφορά στην υποκυτταρική κατανομή τους, οι συγκεκριμένες φωσφατάσες εντοπίζονται κατά κύριο λόγο στον πυρήνα. Εξαίρεση αποτελούν οι MKP-4 και hvh5, που ανιχνεύονται στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα, καθώς και η MKP-3, που θεωρείται κατεξοχήν κυτταροπλασματική. Σε επίπεδο ιστού, η MKP-1 παρουσιάζει ευρεία κατανομή, ενώ η έκφραση της PAC1 περιορίζεται στα αιματοποιητικά κύτταρα. In vitro μελέτες με τη χρήση ανασυνδυασμένων φωσφατασών αποδεικνύουν την εξειδίκευση της MKP-1 για την υποοικογένεια των ERKs, ενώ η hvh5 παρουσιάζει μεγαλύτερη εξειδίκευση για τις JNKs και p38 MAPK. Η εξειδίκευση των υπόλοιπων φωσφατασών δεν έχει αποσαφηνιστεί (Haneda και συν. 1999, Michel και συν. 2001). Όσον αφορά στη συμμετοχή των φωσφατασών στην υπερτροφία της καρδιάς έχει διαπιστωθεί ότι η MKP-1 αναστέλλει την επαγομένη από α 1 -αδρενεργική διέγερση έκφραση των γονιδίων, που σχετίζονται με την απόκριση (Thorburn και συν 1995). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι οι MAPKs είναι δυνατόν να επάγουν την ενεργοποίηση των φωσφατασών τους. Εξάλλου, έχει αναφερθεί ότι αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης αποτρέπει την απενεργοποίηση των MAPKs. Σύμφωνα με τα παραπάνω δεδομένα, οι ίδιες οι MAPKs εμπλέκονται στην επαγωγή των γονιδίων των φωσφατασών τους σε ένα μηχανισμό αρνητικής ανάδρασης, που ρυθμίζει τη λειτουργία τους (Bokemeyer και συν. 1996, Brondello και συν. 1997, Camps και συν. 1998). Επιπλέον, η επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων των φωσφατασών είναι δυνατό να επιτυγχάνεται μέσω των ακολουθιών CRE (cyclic- AMP responsive element) στον υποκινητή των γονιδίων τους. Έτσι η ανασταλτική δράση παραγόντων που αυξάνουν το cαμρ, (π.χ.g s -συζευγμένοι υποδοχείς) στο μονοπάτι των MAPKs είναι δυνατό να επιτυγχάνεται με τη διαμεσολάβηση των φωσφατασών (Haneda και συν. 1999). Τα δεδομένα που υπάρχουν, σχετικά με το μηχανισμό απενεργοποίησης των MAPKs από τις φωσφατάσες τους, περιορίζονται στην υποοικογένεια των ERK1/2. Σύμφωνα με ένα απλό μοντέλο (Εικ. 2), οι φωσφορυλιωμένες ERK1/2 μετατοπίζονται στον πυρήνα, όπου επάγουν την έκφραση διαφόρων γονιδίων, μεταξύ των οποίων και της οικογένειας των ΜΑΡΚ φωσφατασών. Φωσφατάσες των

34 25 Εξωκυτταρικό μήνυμα PP2A p MEK1/2 κυτταρόπλασμα p ERK1/2 MΚΡ3 p MKP-1 MKP-2 PAC-1 p ERK1/2 MΚΡ3 έκφραση γονιδίων πυρήνας Εικ. 2. Μηχανισμός απενεργοποίησης των ERK1/2. Οι ενεργοποιημένες ERK1/2 μετατοπίζονται στον πυρήνα, όπου επάγουν την έκφραση των γονιδίων των φωσφατασών τους, με αποτέλεσμα την αποφωσφορυλίωση τους. (Haneda και συν.1999) MAPKs, όπως οι MKΡ-1/2 και PAC-1 αποφωσφορυλιώνουν τις ERK1/2 στον πυρήνα, ενώ η MKP-3 μπορεί να συνδέεται με τις ERK1/2 και να τις απενεργοποιεί στο κυτταρόπλασμα. Ωστόσο, κάτω από διαφορετικές συνθήκες μπορεί να δρουν άλλες φωσφατάσες, όπως η ΡΡ2Α (protein phospatase 2A). Γενικά, ο μηχανισμός απενεργοποίησης των ERK1/2 μπορεί να είναι διαφορετικός, ανάλογα με τον τύπο των κυττάρων και το είδος της διέγερσης (Haneda και συν. 1999) Συνομιλία ανάμεσα στις σηματοδοτικές οδούς των ΜΑPKs Παρά το γεγονός ότι οι πρωτεΐνες-μέλη των MAPKs συμμετέχουν σε περισσότερες από μία οδούς σηματοδότησης, η χωροταξική οργάνωση τους από τις πρωτεΐνες σκαλωσιάς (scaffold proteins) αφήνει λίγα περιθώρια για «συνομιλία» (crosstalk) ανάμεσα στις οδούς. Ωστόσο, υπάρχουν δεδομένα που υποστηρίζουν ότι στα θηλαστικά είναι δυνατό από ένα συγκεκριμένο τύπο υποδοχέα να ενεργοποιηθούν πολλές οδοί σηματοδότησης και επιπλέον υπάρχουν ενδείξεις για τη συνομιλία ανάμεσα τους (Brunet και Pouyssegur 1997, Bogoyevitch 2000, Michel και συν. 2001). Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι υποοικογένειες των JNKs και p38 ΜΑΡΚ ενεργοποιούνται από τα ίδια ερεθίσματα, που κατεξοχήν περιλαμβάνουν καταστάσεις στρες (Bogoyevitch 2000, Κyriakis και Avruch 2001). Επιπλέον, η υποοικογένεια των ERKs αποκρίνεται σε διάφορες μορφές κυτταρικού στρες, ενώ

35 26 JNKs c-jun ATF-2 Elk MAPKAPK2 MSK Mnk MEF2 p38 MAPK RSK ERKs Εικ. 3. Υποστρώματα των ERKs, JNKs και p38 MAPK. Κάποια υποστρώματα όπως οι Elk, ATF-2, MSK και Mnk φωσφορυλιώνονται από περισσότερες από μια υποοικογένειες ΜΑΡ κινασών (Bogoyevitch 2000). αυξητικοί παράγοντες και αγωνιστές των συζευγμένων με G πρωτεΐνες υποδοχέων ενεργοποιούν τόσο τις ERKs, όσο και την p38 MAPK (Kyriakis και συν. 1994, Derijard και συν. 1994, Page και Doubell 1996, Aikawa και συν. 1997, Clerk συν.1998b, Sugden και Clerk 1998). Οι οδοί των MAPK υποοικογενειών είναι δυνατόν να «συνομιλούν» μεταξύ τους, με αποτέλεσμα την αναστολή, ή τη διέγερση τους (Michel και συν. 2001). Η «συνομιλία» ανάμεσα στις οδούς θεωρείται πιθανό να εντοπίζεται στο επίπεδο των μικρών G πρωτεϊνών Ras, Rac και Cdc42, που αποκρίνονται τόσο σε αυξητικούς παράγοντες, όσο και σε διάφορες μορφές στρες (Brunet και Pouyssegur 1997). Επιπλέον σε αρκετές περιπτώσεις, οι υποοικογένειες των MAPKs φωσφορυλιώνουν τα ίδια υποστρώματα (Εικ. 3). Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί ο μεταγραφικός παράγοντας Elk1, ο οποίος αποτελεί υπόστρωμα για τις τρεις υποοικογένειες MAPKs, ενώ άλλα μόρια, όπως ο μεταγραφικός παράγοντας ATF2 και οι κινάσες MSK1 και Mnk ενεργοποιούνται από τις ERKs και p38 MAPK (Brunet και Pouyssegur 1997, Bogoyevitch 2000). 4. ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΟΥΜΕΝΗ ΑΠΌ ΜΙΤΟΓΟΝΑ ΚΑΙ ΣΤΡΕΣ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΗ ΚΙΝΑΣΗ 1 (Mitogen and stress activated protein kinase 1, MSK1) Από όσα αναφέρθηκαν πιο πάνω, σε συνδυασμό με την πληθώρα των βιβλιογραφικών αναφορών που έχουν ως αντικείμενο μελέτης τις MAPKs, προκύπτει ότι η συγκεκριμένη υπεροικογένεια πρωτεϊνικών κινασών είναι ευρέως διαδεδομένη και ότι τα μέλη της παίζουν καθοριστικό ρόλο σε ποικίλες κυτταρικές

36 27 διεργασίες. Τα τελευταία χρόνια, το ερευνητικό ενδιαφέρον επικεντρώνεται στην αναγνώριση των φυσιολογικών υποστρωμάτων των MAPKs. Στις περισσότερες περιπτώσεις τα υποστρώματα τους είναι επίσης πρωτεϊνικές κινάσες, που με τη σειρά τους έχουν διάφορους φυσιολογικούς ρόλους. Πρόσφατα, τρεις διαφορετικές ερευνητικές ομάδες (Deak και συν. 1998, Pierrat και συν. 1998, New και συν. 1999) ταυτοποίησαν μια ακόμη πρωτεϊνική κινάση, 802 αμινοξέων, με μοριακό βάρος 89.9 KDa. Ανάλυση κατά Northern αποδεικνύει την παρουσία της συγκεκριμένης κινάσης σε διάφορους ανθρώπινους ιστούς όπως εγκέφαλος, καρδιά, ήπαρ, πνεύμονες, πάγκρεας, μυς και πλακούντας. Υψηλότερα επίπεδα της πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν στον εγκέφαλο, τους μυς και τον πλακούντα (Deak και συν. 1998). Η χαρακτηριστική ιδιότητα της πρωτεϊνικής κινάσης να ενεργοποιείται τόσο από αυξητικούς παράγοντες όσο και από διάφορες μορφές κυτταρικού στρες, είχε ως αποτέλεσμα να ονομαστεί Mitogen and stress-activated protein kinase 1 (MSK1). Παράλληλα, διαπιστώθηκε η παρουσία μιας πρωτεϊνικής κινάσης που παρουσιάζει 75% ομολογία με την MSK1. Πρόκειται για την ισομορφή MSK2, η οποία έχει παρόμοια κατανομή στους ιστούς με την MSK1 (Deak και συν. 1998). Χαρακτηριστικό γνώρισμα των MSK1 και 2 αποτελεί το γεγονός ότι η πολυπεπτιδική αλυσίδα τους παρουσιάζει 40% περίπου ομολογία με την p90 rsk (90 kda ribosomal S6 kinase ή RSK) (Deak και συν. 1998). H RSK ξεχωρίζει ανάμεσα στις κινάσες Ser/Thr, λόγω της ύπαρξης δυο λειτουργικών καταλυτικών περιοχών με δράση κινάσης στην πολυπεπτιδική αλυσίδα της. Πιο αναλυτικά, οι καταλυτικές περιοχές εντοπίζονται στο αμινο- και καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης, με μια μικρή συνδετική περιοχή να μεσολαβεί ανάμεσα τους (Εικ. 4). Η αμινο-τελική κινάση φωσφορυλιώνει τα υποστρώματα της RSK, ενώ η καρβοξυ-τελική σε συνδυασμό με τη συνδετική περιοχή εμπλέκεται στον μηχανισμό ενεργοποίησης της RSK (Dalby και συν. 1998, Frödin και Gammeltoft 1999). Ο φυσιολογικός ρόλος της RSK καθορίζεται από το γεγονός ότι μεταλλάξεις στο γονίδιο που την κωδικοποιεί, αποτελούν την αιτία για το σύνδρομο Coffin-Lowry, μια φυλοσύνδετη κληρονομική ασθένεια. Οι ασθενείς που πάσχουν από το συγκεκριμένο σύνδρομο χαρακτηρίζονται από διανοητική καθυστέρηση, προσωπικές και δακτυλικές δυσμορφίες, καθώς και από σκελετικές δυσπλασίες. Έτσι, διαπιστώνεται ότι η RSK εμπλέκεται στην οστεογένεση κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, καθώς και σε διάφορες λειτουργίες του εγκεφάλου (Frödin και Gammeltoft 1999). Οι MSK1 και 2 παρουσιάζουν παρόμοια δομή με την RSK, με δυο διακριτές περιοχές κινάσης και μια συνδετική περιοχή. Γι αυτό το λόγο, σύμφωνα με ορισμένους ερευνητές οι MSK1 και 2 συνιστούν μια νέα υποοικογένεια RSK-

37 28 PDK1 ERKs CTK ERKs Ser 222 Thr 360 Ser 364 Ser 381 Thr 574 P P P P P NTK συνδετική περιοχή CTK RSK Εικ. 4. Διαγραμματική απεικόνιση του μορίου της RSK. Διακρίνονται οι δυο καταλυτικές περιοχές (ΝΤΚ, CTK) και οι χαρακτηριστικές θέσεις φωσφορυλίωσης (Frödin και Gammeltoft 1999). σχετιζόμενων πρωτεϊνικών κινασών (RSK-related protein kinases) (Frödin και Gammeltoft 1999). Από την άλλη πλευρά, τόσο οι MSK1/2, όσο και η RSK υπάγονται στην ευρύτερη υπεροικογένεια των AGC πρωτεϊνικών κινασών (camp protein kinase/protein kinase G/ protein kinase C). Η συγκεκριμένη υπεροικογένεια περιλαμβάνει επίσης τις πρωτεϊνικές κινάσες PKB (protein kinase B), p70 S6K (70 kda ribosomal S6 kinase), PKC (protein kinase C), PKA (protein kinase A), SGK (Serum and glucocorticoid-induced kinase) και PDK1 (PtdIns 3,4,5-dependent kinase) (Williams και συν. 2000, Frödin και συν. 2002, Biondi και Nebreda 2003). Tα μέλη της οικογένειας των AGC κινασών παρουσιάζουν υψηλό βαθμό συντηρητικότητας των καταλυτικών περιοχών τους, ενώ έξω από αυτές οι ομοιότητες που υπάρχουν είναι λίγες (Parker και Parkinson 2001). Συγκεκριμένα, οι AGC κινάσες διαθέτουν μια θέση φωσφορυλίωσης στο βρόχο ενεργοποίησης της καταλυτικής περιοχής τους, που είναι απαραίτητη για την ενζυμική δραστικότητα τους. Επιπρόσθετα, τα περισσότερα μέλη της οικογένειας έχουν μια επιπλέον θέση φωσφορυλίωσης σε ένα υδρόφοβο μοτίβο (Phe-X-X-Phe-Ser/Thr(P)-Tyr) (Biondi και Nebreda 2003). Στην περίπτωση της RSK, το υδρόφοβο μοτίβο (hydrophobic motif) εντοπίζεται στη συνδετική περιοχή του μορίου ανάμεσα στις δυο κινάσες (Biondi και Nebreda 2003). Η έλλειψη ομολογίας ανάμεσα στις ρυθμιστικές περιοχές των συγκεκριμένων κινασών αντικατοπτρίζει τους διαφορετικούς μηχανισμούς ρύθμισης, στους οποίους υπόκεινται οι κινάσες (Parker και Parkinson 2001). Σε αντιστοιχία με πολλά άλλα ένζυμα, η φωσφορυλίωση στο βρόχο ενεργοποίησης των AGC κινασών είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την πλήρη ενεργοποίηση τους. Παρά το γεγονός ότι για κάθε κινάση-μέλος των AGC οι συγκεκριμένες αντιδράσεις φωσφορυλίωσης διαμορφώνονται από διαφορετικούς

38 29 μηχανισμούς, κεντρικό ρόλο φαίνεται να διαδραματίζει η PDK1. Έτσι έχει διαπιστωθεί ότι η PDK1 συνδέεται και φωσφορυλιώνει τις: PKB, ορισμένες ισομορφές της PKC, p70-s6k, SGK, και PKA (Vanhaesebroeck και Alessi 2000, Biondi και Nebreda 2003). Η φωσφορυλίωση των AGC κινασών από την PDK1 είναι συνηθισμένο φαινόμενο, αλλά δεν αποτελεί και το μοναδικό μηχανισμό ρύθμισης τους (Parker και Parkinson 2001). Ο μηχανισμός ενεργοποίησης της RSK περιλαμβάνει διαδοχικές αντιδράσεις φωσφορυλίωσης, ή αυτοφωσφορυλίωσης σε έξι διαφορετικά αμινοξικά κατάλοιπα του μορίου της, από τα οποία τέσσερα κρίνονται απαραίτητα για την ενζυμική δραστικότητα της (Εικ. 4). Πιο αναλυτικά, οι ERKs ενεργοποιούν την καρβοξυτελική κινάση (Thr574) της RSK και φωσφορυλιώνουν αμινοξικά κατάλοιπα στο υδρόφοβο μοτίβο (Thr360 και Ser364). Η ενεργοποιημένη καρβοξυ-τελική κινάση οδηγεί σε επιπλέον φωσφορυλίωση του υδρόφοβου μοτίβου στη συνδετική περιοχή (Ser381). Ακολουθεί φωσφορυλίωση της αμινο-τελικής κινάσης (Ser222) από την PDK1 και πλήρη ενεργοποίηση του μορίου της RSK (Dalby και συν. 1998, Frödin και Gammeltoft 1999). Έτσι, η πλήρης ενεργοποίηση της αμινο-τελικής κινάσης προϋποθέτει τη συνεργατική δράση τριών πρωτεϊνικών κινασών: των ERKs, της καρβοξυ-τελικής κινάσης και της PDK1 (Frödin και Gammeltoft 1999). Οι τέσσερις θέσεις φωσφορυλίωσης που έχουν καθοριστικό ρόλο στη δραστικότητα της RSK ανιχνεύονται στο μόριο της MSK1, γεγονός που υποδηλώνει παρόμοιο μηχανισμό ενεργοποίησης. Επιπλέον, δυο από αυτές τις θέσεις συνοδεύονται από κατάλοιπα προλίνης, χαρακτηριστικό της ακολουθίας αμινοξέων που φωσφορυλιώνουν οι MAPKs στα υποστρώματα τους (Deak και συν 1998). Πράγματι έχει διαπιστωθεί ότι η MSK1 ενεργοποιείται τόσο από την p38 ΜΑΡΚ, κατά την επίδραση διαφόρων καταστάσεων στρες, όσο και από την οδό των ERKs κατά την επίδραση αυξητικών παραγόντων (Deak και συν 1998, Ryder και συν. 2000, Arthur και Cohen 2000, Wiggin και συν. 2002). Αντίθετα οι JNKs δε φαίνεται να εμπλέκονται στην ενεργοποίηση της MSK1 (Deak και συν 1998). Όσον αφορά στο ρόλο της MSK, οι βιβλιογραφικές αναφορές είναι περιορισμένες. Χαρακτηριστικό είναι ότι το πρότυπο Arg-X-X-Ser στο οποίο η MSK φωσφορυλιώνει τα υποστρώματα της, είναι παρόμοιο με το αντίστοιχο της RSK, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι κινάσες αυτές είναι δυνατό να έχουν κοινά υποστρώματα (Deak και συν 1998). Σύμφωνα με τα δεδομένα που υπάρχουν μέχρι σήμερα, η MSK συμμετέχει στη γονιδιακή έκφραση ρυθμίζοντας τη δράση των μεταγραφικών παραγόντων ATF1 και CREB (Deak και συν 1998, Rolli και συν. 1999, Gupta και Ρrywes 2002, Wiggin και συν. 2002). Επιπλέον εμπλέκεται στην αναδιοργάνωση της

39 30 χρωματίνης που είναι απαραίτητη προκειμένου τα γονίδια να γίνουν προσβάσιμα στη «μεταγραφική μηχανή» (Thomson και συν. 1999, Zhong και συν. 2001). 5. CREB (camp responsive element binding protein) Η έκφραση των γονιδίων στα ευκαρυωτικά κύτταρα ρυθμίζεται από ένα μεγάλο αριθμό πυρηνικών πρωτεϊνών που ελέγχουν διάφορα στάδια της μεταγραφής του DNA. Στη διαδικασία αυτή κεντρικό ρόλο διαδραματίζουν οι μεταγραφικοί παράγοντες, πυρηνικές πρωτεΐνες, που βρίσκονται υπό των έλεγχο διάφορων μονοπατιών μεταγωγής σήματος. Έτσι, το εξωκυτταρικό σήμα μεταφέρεται από την μεμβράνη του κυττάρου στον πυρήνα, προκειμένου να διαμορφωθεί η κατάλληλη απόκριση. Ένας από τους καλύτερα μελετημένους μεταγραφικούς παράγοντες είναι ο CREB (camp responsive element binding protein), ο οποίος αρχικά αναγνωρίσθηκε ως πρωτεΐνη-στόχος της οδού του camp, γρήγορα όμως διαπιστώθηκε ότι συμμετέχει στη μεταγωγή μηνυμάτων από ποικίλα ερεθίσματα (Shaywitz και Greenberg 1999). Η αναγνώριση και ταυτοποίηση του CREB προέκυψε από μελέτες βιοσύνθεσης ορμονών και συγκεκριμένα της σωματοστατίνης. Στα θηλαστικά, ορμόνες όπως το γλουκαγόνο και η επινεφρίνη οδηγούν σε αύξηση του ενδοκυτταρικού camp στα κύτταρα-στόχους, το οποίο με τη σειρά του διεγείρει την απελευθέρωση σωματοστατίνης. Η προσπάθεια να διερευνηθεί η επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου της σωματοστατίνης οδήγησε στην αναγνώριση της ακολουθίας TGACGTCA στον υποκινητή του, που είναι γνωστή και ως CRE (camp responsive element) (Lalli και Sassone-Corsi 1994, Della Fazia και συν. 1997). Ο CREB ήταν η πρώτη πρωτεΐνη, ικανή να συνδέεται με CRE, που απομονώθηκε από πυρηνικά κλάσματα διαφόρων ιστών. Ακολούθησε κλωνοποίηση των ισομορφών CREBα, CREBΔ και CREBβ, οι οποίες παρουσιάζουν επίσης ευρεία κατανομή στα σωματικά κύτταρα των θηλαστικών. Επιπλέον, ταυτοποιήθηκαν οι μεταγραφικοί παράγοντες ATF1 (activating factor 1) και CREM (camp response element modulator) που συνδέονται με CRE ακολουθίες. Ειδικότερα, ο ATF1 παρουσιάζει 65% ομολογία με τον CREB ως προς την πρωτοταγή δομή του και εκφράζεται σε διάφορους τύπους ιστών. Όσον αφορά στον CREM, χαρακτηριστικό είναι ότι όλες οι ισομορφές του (CREMα, -β, -γ και -τ, ICER) προέρχονται από ένα γονίδιο με διαφορική συρραφή (splicing) των μορίων RNA που παράγονται. Σε αντίθεση με τον CREB, οι ισομορφές του CREM ανιχνεύονται σε ορισμένους μόνο κυτταρικούς τύπους. Συγκεκριμένα, ο CREMτ εκφράζεται κύριους στους όρχεις, ενώ οι άλλες ισομορφές εντοπίζονται στο νευροενδοκρινή άξονα (Shaywitz και Greenberg 1999, Servillo και συν. 2002).

40 31 ΠΕΡΙΟΧΗ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗ ΣΥΝΔΕΣΗΣ ΜΕ ΤΟ DNA ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Ser133 Q1 P-box Q2 Leucine zipper Ser117 Ser63 CREB CREM ATF-1 ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗΣ ICER ΚΑΤΑΣΤΟΛΕΑΣ Εικ. 5. Δομή και λειτουργία των μεταγραφικών παραγόντων CREB, CREM, ATF-1 και ICER. Διακρίνονται το κουτί φωσφορυλίωσης (P-box), οι πλούσιες σε γλουταμίνη περιοχές (Q1 και Q2) και η περιοχή σύνδεσης με το DNA (basic domain και lucine zipper) (Servillo και συν. 2002). Ο CREB συνδέεται στην ακολουθία-στόχο του DNA, ως διμερές. Ο σχηματισμός διμερών επιτυγχάνεται μέσω ενός εξαιρετικά συντηρημένου μοτίβου στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης, που αποτελείται από επαναλαμβανόμενα κατάλοιπα λευκίνης και είναι γνωστό ως «φερμουάρ» λευκίνης (leucine zipper) (Εικ. 5). Στη σύνδεση του CREB με το DNA συμμετέχει επίσης μια βασική περιοχή του μορίου (basic domain), πλούσια σε λυσίνη και αργινίνη. Η παρουσία της «βασικής περιοχής» και του «φερμουάρ λευκίνης» στο μόριο του CREB, τον τοποθετεί στην υπεροικογένεια των bzip μεταγραφικών παραγόντων, όπου ανήκουν οι c-fos και c- Jun, καθώς και οι ATF1 και CREM (Lalli και Sassone-Corsi 1994, Della Fazia και συν. 1997, Shaywitz και Greenberg 1999, Servillo και συν. 2002). Οι CREB, ATF1 και CREM εμφανίζουν εξαιρετικά υψηλό βαθμό ομολογίας στην bzip περιοχή τους, ενώ έξω από αυτήν οι ομοιότητες είναι περιορισμένες (Lalli και Sassone-Corsi 1994). Ωστόσο, διακρίνονται κοινά δομικά χαρακτηριστικά όσον αφορά στην οργάνωση της περιοχής ενεργοποίησης τους (transactivation domain). Συγκεκριμένα, δυο περιοχές στο μόριο των CREB, ATF1 και CREM κρίνονται ως απαραίτητες για την επαγωγή της μεταγραφής των γονιδίων-στόχων τους (Haus- Seuffert και Meisterernst 2000, Servillo και συν. 2002). Η πρώτη είναι γνωστή ως «κουτί φωσφορυλίωσης» (P-box, phosphorylation box), ή KID (kinase inducible domain) και φέρει μια σερίνη στη θέση 133 στο μόριο του CREB. Κατάλοιπα σερίνης υπάρχουν επίσης σε αντίστοιχες περιοχές στα μόρια των CREM και ATF-1 (Εικ. 5).

41 32 Επιπλέον, απαραίτητα δομικά στοιχεία για την ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων αποτελούν αλληλουχίες αμινοξέων, πλούσιες σε γλουταμίνη, που εντοπίζονται αμφίπλευρα στο κουτί φωσφορυλίωσης και συμβολίζονται ως Q1 και Q2. Ανάλογες περιοχές υπάρχουν σε διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες και θεωρείται ότι λειτουργούν ως επιφάνειες αλληλεπίδρασης με άλλα συστατικά της «μεταγραφικής μηχανής» (Servillo και συν. 2002). Η ομολογία που χαρακτηρίζει τις bzip περιοχές των CRE-συνδεόμενων πρωτεϊνών ενισχύει την άποψη για σχηματισμό ετεροδιμερών ανάμεσα τους. Ωστόσο, φαίνεται να υπάρχει κάποιος κώδικας διμερισμού (dimerization code) που επιτρέπει μόνο κάποιους συγκεκριμένους συνδυασμούς (Lalli και Sassone-Corsi 1994, Sassone-Corsi 1998, Servillo και συν. 2002). Ειδικότερα, ετεροδιμερή CREB/CREM έχουν ανιχνευτεί μόνο in vitro, ενώ η παρουσία ATF-1/CREB ετεροδιμερών έχει διαπιστωθεί σε διάφορους κυτταρικούς τύπους. Σε σύγκριση με τα ετεροδιμερή ATF-1/ATF-1, τα ATF-1/CREB έχουν μικρότερο χρόνο ημιζωής, ενώ το μεγαλύτερο έχουν τα ομοδιμερή CREB/CREB (10-20 λεπτά). Παρά το γεγονός ότι οι c-jun και c-fos είναι δυνατό να ετεροδιμερίζονται μεταξύ τους, αλλά και με τους μεταγραφικούς παράγοντες ATF2, 3 και 4, δε σχηματίζουν ετεροδιμερή με τους CREB και ATF-1 (Shaywitz και Greenberg 1999). Οι CRE-συνδεόμενοι μεταγραφικοί παράγοντες, με βάση την ικανότητα τους να επάγουν ή να αναστέλλουν τη μεταγραφή των γονιδίων, διακρίνονται σε ενεργοποιητές (activators) και καταστολείς (repressors) αντίστοιχα (Εικ. 5). Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι CREB, ATF1 και CREMτ, ενώ η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνει τις ισομορφές CREMα, -β, -γ καθώς και ICER (Lalli και Sassone- Corsi 1994). Η φωσφορυλίωση του CREB στη Ser133 αποτελεί κρίσιμο στάδιο για την ενεργοποίηση του, αν και ο τρόπος με τον οποίο η συγκεκριμένη αντίδραση επηρεάζει τη μεταγραφή δεν έχει αποσαφηνιστεί (Shaywitz και Greenberg 1999). Η πρώτη κινάση που θεωρήθηκε υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση του CREB είναι η πρωτεϊνική κινάση Α (ΡΚΑ). Όπως έχει αναφερθεί, διάφορα εξωκυτταρικά μηνύματα συνδεόμενα με τους αντίστοιχους υποδοχείς τους στην κυτταρική μεμβράνη ενεργοποιούν την αδενυλική κυκλάση. Η επακόλουθη αύξηση του ενδοκυτταρικού camp επηρεάζει άμεσα τη λειτουργία του τετραμερούς συμπλόκου της PKA. Πιο αναλυτικά, το camp συνδέεται με τις ρυθμιστικές υπομονάδες του μορίου της ΡΚΑ, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση των καταλυτικών υπομονάδων και τη μεταφορά τους στον πυρήνα όπου φωσφορυλιώνουν τα υποστρώματα της κινάσης (Lalli και Sassone-Corsi 1994, Della Fazia και συν. 1997, Shaywitz και Greenberg 1999, Servillo και συν. 2002). Στη φωσφορυλίωση του CREB συμβάλλουν επίσης

42 33 ενδοκυτταρικές οδοί που κινητοποιούνται από Ca +2. Τα ιόντα Ca +2, συνδεόμενα με την καλμοδουλίνη στο εσωτερικό του κυττάρου (CaM), είναι δυνατό να ενεργοποιήσουν Ca 2+ -εξαρτώμενες ισομορφές της αδενυλικής κυκλάσης με αποτέλεσμα τη αύξηση του camp και την επακόλουθη κινητοποίηση της ΡΚΑ. Επιπλέον, τα συνδεδεμένα με καλμοδουλίνη ιόντα Ca 2+ ενεργοποιούν τις κινάσες που εξαρτώνται από Ca +2 /καλμοδουλίνη (CaMK), οι οποίες φωσφορυλιώνουν τον CREB (Shaywitz και Greenberg 1999). Όσον αφορά στο ρόλο των MAPKs στην ενεργοποίηση του CREB, το μονοπάτι των ERKs εμπλέκεται μέσω της RSK, ενώ σύμφωνα με πρόσφατα δεδομένα η MSK1 επίσης δρα ως κινάση του CREB (Deak και συν 1998, Frödin και Gammeltoft 1999, Rolli και συν. 1999, Gupta και Ρrywes 2002, Wiggin και συν. 2002). Έτσι διαπιστώνεται ότι η Ser133 στο κουτί φωσφορυλίωσης του CREB αποτελεί το σημείο σύγκλισης ποικίλων σηματοδοτικών οδών που επάγουν την έκφραση διαφόρων γονιδίων. Ο βασικός μηχανισμός αρνητικής ρύθμισης της δράσης του CREB περιλαμβάνει όπως είναι αναμενόμενο την αποφωσφορυλίωση του μορίου του, η οποία επιτυγχάνεται in vitro από τις πρωτεϊνικές φωσφατάσες 1 και 2 (ΡΡ1 και 2). Επιπλέον, διακρίνονται δυο κατηγορίες καταστολέων της CRE-εξαρτώμενης μεταγραφής: οι καταστολείς που είναι διαρκώς παρόντες και η δράση τους εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση και εκείνοι που η σύνθεση τους επάγεται από το camp (Lalli και Sassone-Corsi 1994). Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι CREMα, -β και γ, οι οποίοι διαθέτουν το P-box άλλα στερούνται των περιοχών Q1 και 2, με αποτέλεσμα να συνδέονται με το DNA αλλά να μην διεγείρουν το βασικό μηχανισμό της μεταγραφής. Στη δεύτερη κατηγορία ανήκει η ισομορφή του CREM, ICER. Η συγκεκριμένη πρωτεΐνη παράγεται από εναλλακτικό υποκινητή σε ένα ιντρόνιο του γονιδίου CREM και διαθέτει μόνο την περιοχή σύνδεσης με το DNA. Έτσι, οι καταστολείς ICER απασχολούν τις θέσεις CRE ως ανενεργά ομοδιμερή ή μπλοκάρουν άλλους μεταγραφικούς παράγοντες σχηματίζοντας μαζί τους μη λειτουργικά ετεροδιμερή (Sassone-Corsi 1998). Η προσπάθεια να διευκρινιστεί ο τρόπος με τον οποίο η φωσφορυλίωση του CREB επηρεάζει τη μεταγραφή των γονιδίων, οδήγησε στην αναγνώριση μιας πρωτεΐνης 265 KDa. Η συγκεκριμένη πρωτεΐνη αλληλεπιδρά επιλεκτικά με τη φωσφορυλιωμένη μορφή του CREB και ονομάζεται CBP (CREB-binding protein) (Snowden και Perkins 1998). Η περιοχή της CBP που αλληλεπιδρά με το κουτί φωσφορυλίωσης του CREB είναι γνωστή ως περιοχή ΚΙΧ (KID interaction domain) και εντοπίζεται στο αμινο-τελικό άκρο της πρωτεΐνης (Shaywitz και Greenberg 1999). Έτσι, η φωσφορυλιωμένη μορφή του CREB συνδέεται με την CBP, γεγονός που διευκολύνει τη σύνδεση του συμπλόκου με τους βασικούς μεταγραφικούς

43 34 παράγοντες (TFIID, TFIIB) και την επιστράτευση της RNA πολυμεράσης ΙΙ. Επιπλέον, έχει αναγνωρισθεί η πρωτεΐνη p300, που εμφανίζει παρόμοια δράση με την CBP. Οι CBP/p300 αλληλεπιδρούν επίσης με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες και πυρηνικούς υποδοχείς (Snowden και Perkins 1998). Ο μεταγραφικός παράγοντας CREB συμμετέχει ενεργά σε πληθώρα φυσιολογικών διαδικασιών όπως η ανάπτυξη και ωρίμανση του νευρικού συστήματος, η σπερματογένεση, η αναγέννηση του ήπατος και η διαμόρφωση κιρκαδικών ρυθμών (Sassone-Corsi 1998, Shaywitz και Greenberg 1999, Servillo και συν. 2002). Αν και οι χαρακτηριστικές ακολουθίες CRE έχουν εντοπιστεί στους υποκινητές γονιδίων πρωταρχικής σημασίας για το καρδιαγγειακό σύστημα, τα δεδομένα σχετικά με το ρόλο του CREB στην καρδιά είναι περιορισμένα(müller και συν. 2000). Μελέτες σε διάφορα πειραματικά μοντέλα καρδιακών μυοκυττάρων υποστηρίζουν τη συμμετοχή του CREB στην καρδιακή ανεπάρκεια (Muller και συν. 1995, Frentzke και συν. 1998, Muller και συν. 1998). Τα αυξημένα επίπεδα κατεχολαμινών που χαρακτηρίζουν τη συγκεκριμένη παθολογική κατάσταση, επάγουν την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα μέσω της οδού του camp και της ΡΚΑ (Muller και συν. 2001). Αντίθετα, δεν υπάρχουν πληροφορίες σχετικά με το ρόλο του CREB στην υπερτροφία της καρδιάς. 6. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ MAPKs ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΚΑΡΔΙΑΣ 6.1. Υπερτροφία της καρδιάς Τα καρδιακά μυοκύτταρα στα ενήλικα άτομα είναι τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα, τα οποία έχουν χάσει την ικανότητα για διαίρεση κατά τη διάρκεια της περιγεννητικής περιόδου. Έτσι, κατά την επίδραση μηχανικού στρες, αυξητικών παραγόντων ή κυτοκινών, τα καρδιακά μυοκύτταρα αποκρίνονται αυξάνοντας το μέγεθος τους, μια κατάσταση γνωστή ως υπερτροφία. Η υπερτροφία είναι μια προσαρμοστική απόκριση του μυοκαρδίου και παρατηρείται in vivo σε περιπτώσεις που υπάρχει ανάγκη για αυξημένη καρδιακή παροχή. Διακρίνεται σε ολική υπερτροφία των κοιλιών (global hypertrophy), που παρουσιάζεται όταν υπάρχει αύξηση στο εξωτερικό έργο της καρδιάς και σε τοπική υπερτροφία των κοιλιακών τοιχωμάτων (localized hypertrophy), που ακολουθεί την απώλεια μυοκαρδίου λόγω εμφράγματος. Στα αρχικά στάδια, οι δυο μορφές υπερτροφίας παρουσιάζουν ομοιότητες με την αναστρέψιμη «φυσιολογική» υπερτροφία που αναπτύσσεται κατά την έντονη άσκηση και επιτρέπει στον οργανισμό να διατηρήσει ή να αυξήσει την καρδιακή παροχή. Μακροπρόθεσμα όμως, η υπερτροφία σχετίζεται με παθολογικές καταστάσεις όπως είναι η καρδιακή ανεπάρκεια και οι αρρυθμίες. Όσον αφορά

44 35 στους κόλπους της καρδιάς, τα δεδομένα σχετικά με τη συμμετοχή τους στην απόκριση της υπερτροφίας είναι περιορισμένα. Βασικά μορφολογικά χαρακτηριστικά της υπερτροφίας είναι η αύξηση του μεγέθους των καρδιακών μυοκυττάρων και οι μεταβολές στην οργάνωση των σαρκομεριδίων τους. Οι αλλαγές στη μορφολογία του μυοκαρδίου συνοδεύουν αλλαγές στη γονιδιακή ρύθμιση όπως είναι η έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν τους μεταγραφικούς παράγοντες c-jun, c-fos και Erg-1. Το πιο χαρακτηριστικό γνώρισμα της υπερτροφίας της καρδιάς αποτελεί η «επαναφορά» του εμβρυϊκού προγράμματος γονιδιακής ρύθμισης, με την έκφραση του γονιδίου του κολπικού νατριοδιουρητικού πεπτιδίου (ANΡ, atrial natriuretic peptide) στις κοιλίες και την ενίσχυση της έκφρασης της α-ακτίνης και της βαριάς αλυσίδας της β- μυοσίνης (Sugden και Clerk 1998, Sugden 1999, Yamazaki και Yazaki 2000, Singh και συν. 2000). Τα συγκεκριμένα γονίδια αποτελούν χρήσιμους «δείκτες» της υπερτροφίας της καρδιάς, με πιο εύχρηστο ίσως το γονίδιο του ANP. Η εκδήλωση του φαινοτύπου της υπερτροφίας προϋποθέτει ρύθμιση όχι μόνο στο επίπεδο της μεταγραφής, αλλά και της μετάφρασης. Πράγματι, έχει διαπιστωθεί ότι ερεθίσματα υπερτροφίας επάγουν αύξηση της πρωτεϊνοσύνθεσης, ενώ η ρύθμιση της υπερτροφίας σε άλλα επίπεδα, όπως είναι η έξοδος των mrna από τον πυρήνα καθώς και ο χρόνος ζωής τους στο κυτταρόπλασμα, δεν έχουν διευκρινιστεί ακόμα (Sugden και Clerk 1998, Sugden 1999). Τα ερεθίσματα που συμμετέχουν στην εκδήλωση της υπερτροφίας είναι πολλά και το πιο πιθανό είναι ότι δρουν σε διαφορετικά στάδια της εξέλιξης της. Σύμφωνα με μια υπόθεση που διατυπώθηκε από τους Sugden και Clerk (1998) κεντρικό ρόλο διαδραματίζουν ουσίες νευροενδοκρινούς προέλευσης (π.χ. κατεχολαμίνες) και παράγοντες που απελευθερώνονται τοπικά από τα μυοκύτταρα ή άλλους κυτταρικούς τύπους στην καρδιά (π.χ. αγγειοτενσίνη, ενδοθηλίνη). Οι συγκεκριμένοι εξωκυτταρικοί παράγοντες προσδένονται στους μεμβρανικούς υποδοχείς τους και ακολουθεί μια σειρά ενδοκυτταρικών γεγονότων που καταλήγουν στην υπερτροφία (Εικ. 6). Στη συγκεκριμένη διαδικασία εμπλέκονται διάφορες πρωτεϊνικές κινάσες οι οποίες με τη φωσφορυλίωση μεταγραφικών παραγόντων και πρωτεϊνών ρυθμίζουν τη μεταγραφή και τη μετάφραση. Οι καλύτερα μελετημένοι παράγοντες υπερτροφίας περιλαμβάνουν τους αγωνιστές των συζευγμένων με G πρωτεΐνες υποδοχέων, όπως είναι η ενδοθηλίνη, η αγγειοτενσίνη και οι α 1 -αδρενεργικοί αγωνιστές. Την υπερτροφία του μυοκαρδίου επάγουν επίσης αυξητικοί παράγοντες, που δρουν μέσω των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης, όπως είναι ο IGF-1 (Insulin-like growth factor) (Sugden και Clerk 1998, Sugden 1999, Yamazaki και Yazaki 2000, Singh και συν. 2000). Τέλος

45 36 GPCR αγωνιστές φαινυλεφρίνη, ενδοθηλίνη, αγγειοτενσίνη κ.α. Υδρόλυση PtdIns(4,5)P 2 PΙ3K PKC Μικρές G πρωτεΐνες (Ras, Rac, Cdc42) Φωσφορυλίωση PtdIns(4,5)P 2 MAPKs ERKs, JNKs, p38 MAPK PHAS-I, p70 S6k Μεταγραφικοί παράγοντες Μεταγραφή Μετάφραση Υπερτροφία Εικ. 6. Πιθανοί μηχανισμοί που οδηγούν στην εκδήλωση της υπερτροφίας της καρδιάς (Sugden και Clerk 1998). συγκαταλέγεται μια κατηγορία ερεθισμάτων όπως η μηχανική διάταση (stretch) και η υποξία που προκαλούν υπερτροφία έμμεσα, πιθανώς με την έκκριση ενδοθηλίνης και αγγειοτενσίνης (Yamazaki και Yazaki 2000, Sugden 2001). Όσον αφορά στους ενδοκυτταρικούς μηχανισμούς που ευθύνονται για την υπερτροφία του μυοκαρδίου, κεντρικός είναι ο ρόλος των ΕRKs (Sugden 1999, Bogoyevitch 2000). Διέγερση των καρδιακών μυοκυττάρων με αγωνιστές που επάγουν την υπερτροφία όπως οι φορβολεστέρες, η ενδοθηλίνη, η αγγειοτενσίνη και η νορεπινεφρίνη ενεργοποιεί τις ERKs (Bogoyevitch και συν. 1993, Bogoyevitch και συν. 1994, Yamazaki και Yazaki 2000). Επιπλέον, η επιμόλυνση των καρδιακών μυοκυττάρων με διαρκώς ενεργοποιημένες πρωτεΐνες της οδού των ERKs προκαλεί τις χαρακτηριστικές αλλαγές στη γονιδιακή ρύθμιση και τη μορφολογία των κυττάρων (Sugden 1999). Από την άλλη πλευρά, επιμόλυνση των καρδιακών μυοκυττάρων με φωσφατάσες των ΕRKs αναιρεί το χαρακτηριστικό για την υπερτροφ πρότυπο της γονιδιακής ρύθμισης (Fuller και συν. 1997). Χρήση του αναστολέα των ΜΕΚ1/2, PD98059, στο ίδιο πειραματικό μοντέλο αναιρεί την αναδιοργάνωση των μυοινιδίων που προκαλεί η ενδοθηλίνη ή η φαινυλεφρίνη, αν και υπάρχουν μελέτες στις οποίες η ίδια ουσία προκάλεσε μερική ή καμία αναστολή στην έκφραση του ΑΝΡ (Sugden και Clerk 1998).

46 37 Οι υποοικογένειες των JNKs και p38 MAPK συμμετέχουν επίσης στην εκδήλωση της υπερτροφίας. Οι συγκεκριμένες κινάσες, όπως αναφέρθηκε, ενεργοποιούνται από αγωνιστές των συζευγμένων με G πρωτεΐνες υποδοχέων, όπως είναι η ενδοθηλίνη και η φαινυλεφρίνη, παρά το γεγονός ότι η ενεργοποίηση είναι μικρότερη από αυτήν, που παρατηρείται υπό την επίδραση καταστάσεων στρες (Bogoyevitch και συν. 1995, Lazou και συν. 1998). Άλλοι παράγοντες που επάγουν την υπερτροφία και κινητοποιούν τις JNKs και p38 MAPK, περιλαμβάνουν την αγγειοτενσίνη και τη μηχανική διάταση (Yamazaki και Yazaki 2000). Επιπλέον, υπερέκφραση της ΜΕΚ των JNKs, ΜΕΚ7, σε καρδιακά μυοκύτταρα έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του μεγέθους των κυττάρων, αναδιοργάνωση των μυοινιδίων και την έκφραση του ANF (Wang και συν.1998). Το πρόβλημα που σχετίζεται με τη συμμετοχή των JNKs και p38 MAPK στην συγκεκριμένη απόκριση οφείλεται στην αδυναμία του PMA, που χαρακτηρίζεται ως ισχυρός παράγοντας υπερτροφίας, να ενεργοποιήσει τις κινάσες αυτές. Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στο γεγονός ότι η ισχυρή ενεργοποίηση των ERKs από το ΡΜΑ μπορεί να υπερβαίνει την ανάγκη για επιπρόσθετες σηματοδοτικές οδούς (Sugden και Clerk 1998, Sugden 1999). Σύμφωνα με τα παραπάνω δεδομένα, οι τρεις υποοικογένειες των MAPKs εμπλέκονται στην υπερτροφία του μυοκαρδίου, αν και ο ακριβής ρόλος τους δεν έχει αποσαφηνιστεί (Εικ. 6). Βασικό χαρακτηριστικό της υπερτροφίας είναι η αύξηση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών στα καρδιακά μυοκύτταρα, η οποία οφείλεται κατά κύριο λόγο στην αύξηση του ρυθμού πρωτεινοσύνθεσης. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της PI3K με την επακόλουθη παραγωγή 3,4,5 φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (Sugden και Clerk 1998) (Εικ. 6). Η φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη έχει διπλό ρόλο καθώς ενεργοποιεί τη PDK (PtdIns 3,4,5-dependent kinase) και επιπλέον επάγει την επιστράτευση της PKB (Protein kinase B), η οποία τελικά φωσφορυλιώνεται από την PDK. Η PKB με τη σειρά της διαμορφώνει τη δραστικότητα των πρωτεϊνών p70 S6K (70 kda ribosomal S6 kinase) και PHAS-1 (Phosphorylatable heat and acid stable factor regulated by insulin). Η p70 S6K αποτελεί τη βασική κινάση της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδας S6. Φωσφορυλίωση της S6 επάγει την επιλεκτική μετάφραση μορίων mrna που κωδικοποιούν για ριβοσωμικές πρωτεΐνες και παράγοντες επιμήκυνσης της μετάφρασης. Έτσι, ο ρόλος της p70 S6K φαίνεται να περιορίζεται στην ενίσχυση του μηχανισμού της μετάφρασης, προκειμένου να αυξηθεί ο ρυθμός πρωτεινοσύνθεσης. Ένας άλλος τρόπος ρύθμισης της μετάφρασης επιτυγχάνεται μέσω της PHAS-1 και των ανθρώπινων ομόλογων της elf4e-bp1 και 2 (eukaryotic initiation factor 4 Ε binding protein 1, 2). Στην αποφωσφορυλιωμένη μορφή της η PHAS-1 σχετίζεται με

47 38 τον ευκαρυωτικό παράγοντα έναρξης elf4e (eukaryotic initiation factor 4Ε) και αποτρέπει τη σύνδεση του με το 5 άκρο ορισμένων μορίων mrna. Η σύνδεση του elf4e στο 5 άκρο των mrna είναι απαραίτητη προϋπόθεση για το σχηματισμό του συμπλόκου έναρξης της μετάφρασης. Έτσι η φωσφορυλίωση της PHAS-1 την απομακρύνει από το σύμπλοκο της με τον elf4e, επιτρέποντας το σχηματισμό του συμπλόκου έναρξης της μετάφρασης (Sugden και Clerk 1998, Pham και συν. 2000, Pham και συν. 2001) Ισχαιμία Ο όρος ισχαιμία αναφέρεται στη διαταραχή του ισοζυγίου ανάμεσα στο ποσό του οξυγόνου που προσφέρεται στον καρδιακό μυ και στο ποσό που απαιτείται για τη διατήρηση της φυσιολογικής λειτουργίας. Μελέτες της ισχαιμίας σε διάφορα πειραματικά μοντέλα αποδεικνύουν τη συμμετοχή των JNKs και p38 MAPK στη συγκεκριμένη απόκριση. Ειδικότερα, σε μελέτες των Bogoyevitch και συν. (1996b), πιστοποιήθηκε ενεργοποίηση των JNKs κατά τον επανεμποτισμό της καρδιάς, η οποία είχε προηγουμένως υποβληθεί σε ισχαιμία. Αντίθετα, η p38 MAPK διαπιστώθηκε ότι ενεργοποιείται τόσο κατά την επίδραση ισχαιμίας, όσο και κατά τον επακόλουθο επανεμποτισμό (Bogoyevitch και συν. 1996b). Δεν είναι γνωστό σε ποιο ακριβώς επίπεδο της οδού των ΜΑPKs δρουν τα επαγόμενα από την ισχαιμία μηνύματα, ούτε και ποια ακριβώς είναι αυτά. Στις συγκεκριμένες σηματοδοτικές οδούς είναι πιθανό να συμμετέχουν οι ενεργές ρίζες οξυγόνου (ROS/reactive oxygen species), οι οποίες παράγονται κατά την επανοξυγόνωση της καρδιάς. Προσομοίωση των συνθηκών αυτών με την επίδραση υπεροξειδίου του υδρογόνου, σε απομονωμένη καρδιά, αλλά και σε καλλιέργειες καρδιακών μυοκυττάρων επάγει την ενεργοποίηση των ERKs, JNKs και p38 MAPKs (Clerk και συν. 1998). Ένα ισχαιμικό επεισόδιο είναι δυνατό να προκαλέσει το θάνατο των άμεσα «θιγόμενων» καρδιακών κυττάρων, αλλά και την υπερτροφία των γειτονικών τους, σε μια προσπάθεια να αντισταθμιστεί η απώλεια της συσταλτικότητας του καρδιακού μυός. Παρά το μεγάλο αριθμό των βιβλιογραφικών αναφορών για την ισχαιμία, δεν υπάρχει κάποια ξεκάθαρη άποψη για τον αν ο ρόλος των MAPKs στις δεδομένες συνθήκες είναι ωφέλιμος ή επιβλαβής. Έτσι, έχει διαπιστωθεί ότι, η χρήση αναστολέων της p38 MAPK προσφέρει στο μυοκάρδιο προστασία από τις βλάβες που προκαλεί η ισχαιμία σε συνδυασμό με τον επανεμποτισμό (Mackay και Mochly- Rosen 1999). Σε αντίθεση με αυτά τα δεδομένα που υπονοούν τη συμμετοχή της p38 ΜΑΡΚ στο θάνατο των ισχαιμικών κυττάρων, άλλες μελέτες υποστηρίζουν την καρδιοπροστατευτική δράση της p38 MAPK (Obata και συν. 2000). Οι αντίθετοι ρόλοι της p38 MAPK στην ισχαιμία είναι πιθανό να εξαρτώνται από τις διαφορετικές

48 39 ισομορφές της κινάσης που συμμετέχουν σε κάθε απόκριση. Έτσι, έχει αναφερθεί ότι η p38α προάγει τον κυτταρικό θάνατο, ενώ η p38β είναι πιθανό να ευνοεί την επιβίωση των κυττάρων (Wang και συν. 1998). Στην περίπτωση των JNKs, ο επανεμποτισμός που ακολουθεί την ισχαιμία επάγει την ενεργοποίηση τους, γεγονός που σχετίζεται με την επαγωγή της απόπτωσης (Bogoyevitch και συν. 1996b, Bogoyevitch 2000) Απόπτωση Ο όρος απόπτωση, αναφέρεται σε μια μορφή κυτταρικού θανάτου με ιδιαίτερα μορφολογικά χαρακτηριστικά, ο οποίος δε συνοδεύεται από φλεγμονή στους ιστούς που λαμβάνει χώρα. Σε αντιδιαστολή με την απόπτωση, ο όρος νέκρωση χρησιμοποιείται για να περιγράψει το θάνατο που προκαλούν επιβλαβή ερεθίσματα και οδηγεί σε φλεγμονώδη απόκριση (Haunstetter και Izumo 1997, Feuerstein και Young 2000, Elsässer και συν. 2001). Στην καρδιά, ο αποπτωτικός θάνατος, θεωρείται σημαντικός παράγοντας στα πρώτα εμβρυϊκά στάδια, κατά το σχηματισμό μεμβρανικών, βαλβιδικών και μυϊκών δομών (Haunstetter και Izumo 1997). Επιπλέον αποπτωτικά καρδιακά κύτταρα έχουν ανιχνευτεί σε διάφορα καρδιακά νοσήματα, όπως ισχαιμική και ιδιοπαθής μυοκαρδιοπάθεια, οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου και μυοκαρδίτιδα (Feuerstein και Young 2000). Ο αποπτωτικός θάνατος περιλαμβάνει διάφορα στάδια, με κεντρικό φαινόμενο την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια και την ενεργοποίηση μιας οικογένειας εξειδικευμένων πρωτεασών, που ονομάζονται κασπάσες (Haunstetter και Izumo 1997). Ανάμεσα στους διάφορους παράγοντες που ρυθμίζουν την απόπτωση κεντρικό ρόλο διαδραματίζουν οι πρωτεΐνες Βcl-2. Η οικογένεια των Bcl-2 περιλαμβάνει τις αποπτωτικές Bcl-2, Bcl- XL, Bcl- W, Bag-1 και BI-1, καθώς και τις προ-αποπτωτικές πρωτεΐνες Bax, Bad, Bak, Bid, και Bim (Zhao και Vinten-Johansen 2002). Οι Βcl-2 είναι δυνατό να αναστέλλουν την ενεργοποίηση των κασπασών, ή την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια. Επιπλέον, θεωρείται πιθανό ότι οι αντι-αποπτωτικές Βcl-2 δρουν αναστέλλοντας τη κυτταροτοξική δράση των προαποπτωτικών Βax και Βak (Zhao και Vinten-Johansen 2002). Όσον αφορά στο ρόλο των MAPKs στην αποπτωτική οδό, οι ERKs ασκούν αντίαποπτωτική δράση φωσφορυλιώνοντας την προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bad (Valks και συν 2002). Η φωσφορυλίωση της Bad αποτρέπει την αλληλεπίδραση της με τις αντί-αποπτωτικές Bcl-2, την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και κατ επέκταση την απόπτωση. Επιπλέον, η αντί-αποπτωτική δράση της πρωτεΐνης Βcl-2 εξαρτάται

49 40 από τη φωσφορυλίωση της, διαδικασία στην οποία φαίνεται να εμπλέκονται οι ERKs (Haunstetter και Izumo 1997). Η συμμετοχή της p38 MAPK στην απόπτωση εξαρτάται τόσο από τον κυτταρικό τύπο όσο και από το είδος του ερεθίσματος. Έτσι, μελέτες σε καρδιακά κύτταρα υποστηρίζουν ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού της p38 MAPK έχει μάλλον προαποπτωτική δράση (Ma και συν.1999) η οποία εντοπίζεται πριν ή μετά την ενεργοποίηση των κασπασών (Ono και Han 2000). Η ενεργοποίηση των JNKs εμπλέκεται επίσης στην επαγωγή της απόπτωσης από διαφορά ερεθίσματα. Ο προαποπτωτικός ρόλος του μονοπατιού των JNKs έχει διαπιστωθεί σε διάφορους κυτταρικούς τύπους (Haunstetter και Izumo 1997, Elsässer και συν. 2001, Zhao και Vinten-Johansen 2002), ενώ στην καρδιά τα δεδομένα είναι αμφιλεγόμενα. Συγκεκριμένα, η ενεργοποίηση των JNKs κατά τον επανεμποτισμό μετά την ισχαιμία επάγει την απόπτωση (Bogoyevitch 2000), ενώ φαίνεται να έχει καρδιοπροστατευτική δράση έναντι του αποπτωτικού θανάτου που προκαλεί το ΝΟ (Andreka και συν. 2001). Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι υπερέκφραση του ενεργοποιητή των JNKs, MEKK1, προκαλεί απόπτωση στα καρδιακά μυοκύτταρα, ενώ συνδυασμένη υπερέκφραση της MEKK1 και της MΕK6 που συμμετέχει στο μονοπάτι της p38 MAPK, προστατεύει από την απόπτωση (Obata και συν. 2000). Έτσι, η σηματοδότηση που επάγει την απόπτωση γίνεται ακόμα πιο πολύπλοκή δεδομένου ότι τα διάφορα μονοπάτια είναι δυνατό να δρουν ανταγωνιστικά στη διαμόρφωση της απόκρισης. 7. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Οι συζευγμένοι με G πρωτεΐνες υποδοχείς διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη φυσιολογία της καρδιάς επηρεάζοντας τις συσταλτικές, ηλεκτροφυσιολογικές και μεταβολικές ιδιότητες της. Επιπλέον συμμετέχουν σε διαδικασίες κυτταρικής αύξησης ρυθμίζοντας την έκφραση των γονιδίων. Η αποσαφήνιση των μηχανισμών μεταγωγής μηνυμάτων μέσω των συζευγμένων με G πρωτεΐνες υποδοχέων έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς οι συγκεκριμένοι υποδοχείς συμμετέχουν σε διαδικασίες κάτω από παθοφυσιολογικές καταστάσεις της καρδιάς, όπως είναι η υπερτροφία και η ισχαιμία. Οι τρεις καθιερωμένες υποοικογένειες των ενεργοποιούμενων από τα μιτογόνα κινασών (ERKs, p38 MAPKs, JNKs) εμπλέκονται επίσης σε παθολογικές αποκρίσεις της καρδιάς αφού ενεργοποιούνται από μια πληθώρα εξωκυτταρικών «μηνυμάτων» μεταξύ των οποίων είναι και η διέγερση των συζευγμένων με G πρωτεΐνες υποδοχέων. Ωστόσο, η ακριβής ακολουθία των γεγονότων που οδηγεί στην ενεργοποίηση των MAPKs από τους αγωνιστές των συγκεκριμένων

50 41 υποδοχέων δεν έχει αποσαφηνιστεί. Περιορισμένες είναι επίσης οι πληροφορίες σχετικά με τις πρωτεϊνες-στόχους των ΜΑPKs και με τον τρόπο που αυτές επηρεάζουν την γονιδιακή έκφραση. Έτσι, τα ερωτήματα που τίθενται στα πλαίσια της παρούσας εργασίας αφορούν αφενός στους μηχανισμούς ενεργοποίησης των MAPKs από τους αγωνιστές των συζευγμένων με G πρωτεΐνες υποδοχέων και αφετέρου στα υποστρώματα των κινασών αυτών και τη φυσιολογική σημασία τους στα καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου. Ένα σκέλος της εργασίας αφορούσε τη διέγερση υποδοχέων που εμπλέκονται στο φαινόμενο της υπερτροφίας της καρδιάς, όπως είναι οι α 1 -αδρενεργικοί υποδοχείς και οι υποδοχείς της ενδοθηλίνης-1. Αφενός χαρακτηρίστηκε η ενεργοποίηση των ΜΑΡΚ μέσω των υποδοχέων αυτών και αφετέρου, με τη χρήση κατάλληλων αναστολέων, διερευνήθηκαν οι οδοί σηματοδότησης που οδηγούν στην ενεργοποίηση αυτή. Επίσης, στα πλαίσια της διερεύνησης των μοριακών μηχανισμών που ευθύνονται για την εκδήλωση υπερτροφίας, κρίθηκε σκόπιμη η μελέτη της MSK1 μιάς κινάσης που αναγνωρίστηκε πρόσφατα σε διάφορους κυτταρικούς τύπους και θεωρείται ότι είναι υπόστρωμα των ERKs και p38 MAPK. Πρωταρχικός σκοπός ήταν η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός της φωσφορυλίωσης της κινάσης στα καρδιακά μυοκύτταρα καθώς και η διευκρίνηση των σηματοδοτικών οδών που συμμετέχουν στην ενεργοποίηση της. Η περαιτέρω διερεύνηση του φυσιολογικού ρόλου της MSK1 στην καρδιά εστιάστηκε στο μεταγραφικό παράγοντα CREB και στη λειτουργική σχέση του με την MSK1. Ρυθμιστικά στοιχεία CRE έχουν βρεθεί στους υποκινητές γονιδίων που παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθοφυσιολογία της καρδιάς. Επιπλέον, βιβλιογραφικές αναφορές υποστηρίζουν τη συμμετοχή του CREB κατά την καρδιακή ανεπάρκεια, ενώ δεν υπάρχουν δεδομένα σχετικά με την εμπλοκή του στην υπερτροφία της καρδιάς. Έτσι, διερευνήθηκε η φωσφορυλίωση του συγκεκριμένου μεταγραφικού παράγοντα καθώς και η ικανότητα του να συνδέεται με το DNA υπό την επίδραση φαινυλεφρίνης στα καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου. Παράλληλα κρίθηκε σκόπιμη η διερεύνηση της ενεργοποίησης των MAPKs και της MSK1 από αγωνιστές των συζευγμένων με G πρωτεΐνες υποδοχέων οι οποίοι όμως δεν εμπλέκονται στην υπερτροφία της καρδιάς. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε το μη υδρολυόμενο ανάλογο ΑΤΡ, ATPγS, το οποίο δρα μέσω των πουρινεργικών υποδοχέων. Το ΑΤΡ εκλύεται από τα μυοκύτταρα σε καταστάσεις όπως η ισχαιμία και προκαλεί διαταραχές στις ηλεκτροφυσιολογικές ιδιότητες του μυοκαρδίου. Ειδικότερα, η διέγερση των πουρινεργικών υποδοχέων προκαλεί την παραγωγή αραχιδονικού οξέος με επακόλουθη ενεργοποίηση ιοντικών καναλιών. Έτσι, κρίθηκε σκόπιμη η διερεύνηση της φωσφολιπάσης A 2 που καταλύει

51 42 την παραγωγή αραχιδονικού οξέος καθώς και η πιθανή λειτουργική σχέση της με την MSK1. Τα αποτελέσματά της εργασίας αυτής, ελπίζουμε ότι θα συμβάλλουν στην καλύτερη κατανόηση βασικών μοριακών μηχανισμών που οδηγούν σε διαταραχές της φυσιολογίας των καρδιακών μυοκυττάρων.

52 43 ΙΙ. ΥΛΙΚΑ 1. ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΥΛΙΚΟ Ως βιολογικό υλικό χρησιμοποιήθηκε η καρδιά ενήλικου αρουραίου. Τα πειραματόζωα ήταν αρσενικοί αρουραίοι της φυλής Wistar, βάρους gr. Τα ζώα εκτρέφονταν σε ειδικό χώρο του Τμήματος Φυσιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. και μεταφέρονταν στο Εργαστήριο Φυσιολογίας Ζώων του Τμήματος Βιολογίας. Εκεί φυλάσσονταν σε ειδικό χώρο του εργαστηρίου, μέσα σε κλωβούς με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Η μεταχείριση των ζώων ήταν σύμφωνη με τις οδηγίες που εκδόθηκαν από την ελληνική κυβέρνηση (160/1991), βάση ειδικών κανονισμών της Ευρωπαϊκής Ένωσης (86/609), για τη φροντίδα και χρήση εργαστηριακών ζώων. 2. ΧΗΜΙΚΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Τα κοινά χημικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας και προέρχονταν από τις εταιρίες Sigma-Aldrich (Deisnhofen, Γερμανία), Merck (Darmstadt, Γερμανία). Η κολλαγενάση που χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση μυοκυττάρων από τις κοιλίες της καρδιάς ήταν του τύπου Ι της εταιρείας Biochrom. Η αλβουμίνη ορού βοδιού (κλάσμα V ήταν από την εταιρεία Sigma-Aldrich (Deisnhofen, Γερμανία). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της πρωτεΐνης με τη χρωματομετρική μέθοδο Badford, χρησιμοποιήθηκε η χρωστική Coomasie Brilliant Blue G-250 (Biorad Protein assay). Μίγμα δεικτών γνωστού μοριακού βάρους για την ηλεκτροφόρηση (Prestained protein marker, broad range: kda) αγοράστηκε από την εταιρεία New England Biolabs (Beverly,USA). Το μίγμα περιέχει: β-γαλακτοσιδάση από Escherichia coli (ΜΒ: 175 kda), παραμυοσίνη από Escherichia coli (ΜΒ: 83 kda), αφυδρογονάση γλουταμινικού οξέος από ήπαρ βοδιού (ΜΒ: 62 kda), αλδολάση από μυ κουνελιού (ΜΒ: 47.5 kda), ισομεράση της φωσφορικής τριόζης από μυ κουνελιού (ΜΒ: 32.5 kda), β-λακτοσφαιρίνη Α από γάλα βοδιού (ΜΒ: 25 kda), λυσοζύμη από τη λέκιθο αυγού κοτόπουλου (ΜΒ: 16.5 kda) και απροτινίνη από πνεύμονα βοδιού (ΜΒ: 6.5 kda). Η νιτροκυτταρίνη [Protran BA Nitrocellulose (0.45 μm)] που χρησιμοποιήθηκε για την ηλεκτροφορητική μεταφορά των πρωτεϊνών ήταν της εταιρείας Schleicer & Schluell (Keene, ΗΠΑ).

53 44 Κατά την εφαρμογή του πρωτοκόλλου της ανοσοκατακρήμνισης, τα σχηματιζόμενα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος, συνδέθηκαν σε σφαιρίδια αγαρόζης-πρωτεΐνης G και σεφαρόζης-πρωτεΐνης Α της εταιρείας Sigma-Aldrich (Deisnhofen, Γερμανία). Ο φορβολεστέρας PMA (phorbol 12-myristate 13 acetate) ήταν της εταιρείας Sigma-Aldrich (Deisnhofen, Γερμανία). Η ένωση BAPTA-AM [1,2-bis(aminophenoxy)ethane-N,N,N,N -tetraacetic acid tetra (acetoxy methyl) exter] που χρησιμοποιήθηκε για την ρύθμιση της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης ιόντων Ca 2+, ήταν της εταιρείας Calbiochem (La Jolla, CA). Το πεπτίδιο Crosstide (Gly-Arg-Pro-Arg-Thr-Ser-Ser-Phe-Ala-Glu-Gly) που χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό ενζυμικής δραστικότητας της MSK1 ήταν της εταιρείας Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, ΗΠΑ). Οι αγωνιστές και ανταγωνιστές των G-συζευγμένων υποδοχέων που χρησιμοποιήθηκαν παρατίθενται παρακάτω: Φαινυλεφρίνη, ειδικός αγωνιστής των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (Sigma- Aldrich, Deisnhofen, Γερμανία). Ενδοθηλίνη-1, ειδικός αγωνιστής των ΕΤ Α υποδοχέων ενδοθηλίνης (Sigma- Aldrich, Deisnhofen, Γερμανία). Πραζοσίνη, ειδικός ανταγωνιστής των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων (Sigma- Aldrich, Deisnhofen, Γερμανία). Προπρανολόλη, ειδικός ανταγωνιστής των β-αδρενεργικών υποδοχέων (Sigma- Aldrich, Deisnhofen, Γερμανία). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν, περιλαμβάνονται στον παρακάτω κατάλογο: Rabbit p38 MAPK: πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο αντιστοιχεί στα αμινοξικά κατάλοιπα της ανθρώπινης p38 MAPK (Cell Signaling, Beverly, USA). Το αντίσωμα ανιχνεύει τα ολικά επίπεδα της κινάσης (φωσφορυλιωμένη και μη). Rabbit phospho-p38 MAPK: πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο αναγνωρίζει τη φωσφορυλιωμένη στα αμινοξικά κατάλοιπα θρεονίνη180/τυροσίνη182 της ανθρώπινης p38 MAPK (Cell Signaling, Beverly, ΗΠΑ). Rabbit ERKs: πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο αντιστοιχεί στα αμινοξικά κατάλοιπα της p42-erk αρουραίου (Cell

54 45 Signaling, Beverly, ΗΠΑ). Το αντίσωμα ανιχνεύει τα ολικά επίπεδα της κινάσης (φωσφορυλιωμένη και μη). Mouse phospho-erks: μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο αναγνωρίζει τις φωσφορυλιωμένες στα αμινοξικά κατάλοιπα θρεονίνη202/τυροσίνη204 ERK1 και ERK2 του ανθρώπου (Cell Signaling, Beverly, ΗΠΑ). Rabbit phospho-jnks: πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο αναγνωρίζει τις φωσφορυλιωμένες στα αμινοξικά κατάλοιπα θρεονίνη183/τυροσίνη185 JNK1, JNK2 και JNK3, του ανθρώπου (Cell Signaling, Beverly, ΗΠΑ). Rabbit phospho-msk1(thr581): πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο αναγνωρίζει τη φωσφορυλιωμένη σε Thr581 MSK1 ανθρώπου (Cell Signaling, Beverly, ΗΠΑ). Rabbit phospho-msk1(ser376): πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο αναγνωρίζει τη φωσφορυλιωμένη σε Ser376 MSK1 ανθρώπου (Cell Signaling, Beverly, ΗΠΑ). Rabbit phospho-msk1(ser360): πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο αναγνωρίζει τη φωσφορυλιωμένη σε Ser360 MSK1 ανθρώπου (Cell Signaling, Beverly, ΗΠΑ). Mouse cpla 2 : μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο αντιστοιχεί στα αμινοξικά κατάλοιπα της cpla 2 ανθρώπου (Santa Cruz Biotechnology, ΗΠΑ). Rabbit phospho-creb: πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο αναγνωρίζει το φωσφορυλιωμένο στη Ser133 CREB του ανθρώπου (Cell Signaling, Beverly, ΗΠΑ). Rabbit CBP: πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο αντιστοιχεί στα αμινοξικά κατάλοιπα του αμινοτελικού άκρου της CBP ανθρώπου (Santa Cruz Biotechnology, ΗΠΑ). Sheep MSK1: πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι συνθετικού πεπτιδίου, το οποίο αντιστοιχεί στα αμινοξικά κατάλοιπα της ανθρώπινης MSK1 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA). Το αντίσωμα ανιχνεύει τα ολικά επίπεδα της κινάσης (φωσφορυλιωμένη και μη). Mouse Histone1: Μονοκλωνικό αντίσωμα παρασκευασμένο μετά από την ανοσοποίηση με το πυρηνικό κλάσμα μυελωματικών λευχαιμικών κυττάρων (BioGeneX, MU209-UC, ΗΠΑ).

55 46 Anti-rabbit IgG-HRP conjugated: αντίσωμα, συζευγμένο με υπεροξειδάση, που αναγνωρίζει τις ανοσοσφαιρίνες τάξης G κουνελιού (DAKO, Glostrup, Δανία). Anti-mouse IgG-HRP conjugated: αντίσωμα, συζευγμένο με υπεροξειδάση, που αναγνωρίζει τις ανοσοσφαιρίνες τάξης G ποντικού (DAKO, Glostrup, Δανία). Επίσης, χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω αναστολείς: SB203580: Ειδικός αναστολέας της p38 MAPK (Calbiochem, La Jolla, CA). PD98059: Ειδικός αναστολέας της δραστικότητας των ΜΕΚ1/2 (ενεργοποιητές των ERKs), (Calbiochem, La Jolla, CA). U0126: Ειδικός αναστολέας των ΜΕΚ1/2, (Calbiochem, La Jolla, CA). GF109203X: Ειδικός αναστολέας της PKC, (Calbiochem, La Jolla, CA). Genistein: Γενικός αναστολέας των πρωτεϊνικών κινασών τυροσίνης, (Sigma- Aldrich, Deisnhofen, Γερμανία). LY294002: Ειδικός αναστολέας της PI3K (Calbiochem, La Jolla, CA). Wortmannin: Ειδικός αναστολέας της PI3K (Calbiochem, La Jolla, CA). RpcAMPs: Ειδικός αναστολέας της PKA H89: αναστολέας της ΡΚΑ και άλλων κινασών (Calbiochem, La Jolla, CA). Ro318220: αναστολέας της PKC και άλλων κινασών (Calbiochem, La Jolla, CA) PKI: αναστολέας της εξαρτώμενης από το cαμρ πρωτεϊνικής κινάσης (ΡΚΑ) New England Biolabs, Beverly, ΗΠΑ). 3. ΡΑΔΙΟΧΗΜΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Για τον προσδιορισμό της δραστικότητας κινασών και για τα EMSAs χρησιμοποιήθηκε ραδιενεργό [γ- 32 ΑΤΡ], ειδικής δραστικότητας Ci/mmole, της εταιρείας Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Σουηδία). 4. ΥΛΙΚΑ ΓΙΑ EMSAs (Electrical mobility shift assays) Τα ολιγονουκλεοτίδια 5 -CTAGCTCTCTGACGTCAGGCAATCTCT-3 και 3 - GATCGAGAGACTGCAGTCCGTTAGAGA-5 που χρησιμοποιήθηκαν συντέθηκαν από το εργαστήριο Μικροχημείας του Ινστιτούτου Μοριακής Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας (Κρήτη, Ελλάδα) Η T4 πολυνουκλεοτιδική κινάση (T4 polynucleotide kinase) ήταν της εταιρείας New England Biolabs (Beverly, MA, ΗΠΑ). Τα σφαιρίδια Sephadex-G 50 που χρησιμοποιήθηκαν στη χρωματογραφία στήλης ήταν της εταιρείας Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Σουηδία).

56 47 Για τη χρωματογραφία λεπτής στιβάδας χρησιμοποιήθηκαν πλάκες χρωματογραφίας Polygram CEL 300 PEI/UV 254 από τη Polygram (Düren Γερμανία) To poly di-dc που χρησιμοποιήθηκε ήταν της εταιρείας Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Σουηδία). 5. ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Φιλμ Kodak AR X-OMATic, 13 x 18 cm. Η επεξεργασία των φιλμ AR X-OMATic έγινε με developer LX 24-KODAK. Η στερέωση των φιλμ έγινε με fixer KODAK AL 4.

57 48 III. ΜΕΘΟΔΟΙ 1. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΡΔΙΑΚΩΝ ΜΥΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΕΜΠΟΤΙΣΜΕΝΗ ΚΑΡΔΙΑ Στο σύνολο των πειραμάτων της παρούσας μελέτης χρησιμοποιήθηκαν μυοκύτταρα απομονωμένα από εμποτισμένες καρδιές ενήλικων αρουραίων. Δυο βασικές μέθοδοι εμποτισμού της καρδιάς αναφέρονται στη διεθνή βιβλιογραφία (Depre 1998, Verdouw και συν 1998, Hearse και Sutherland 2000): α) η μέθοδος Langendorff και β) ο εμποτισμός της καρδιάς κάτω από συνθήκες παραγωγής έργου (working heart preparation). Στη παρούσα μελέτη εφαρμόστηκε η μέθοδος Langendorff, η οποία περιλαμβάνει διασωλήνωση της αορτής και άρδευση των στεφανιαίων αρτηριών με οξυγονωμένο διάλυμα εμποτισμού. Το διάλυμα αυτό διοχετεύεται αντίθετα προς την in vivo ροή του αίματος με σταθερή ροή που εξασφαλίζεται είτε με αντλία (constant flow preparation), είτε με σταθερή υδροστατική πίεση (constant pressure preparation) ( mmhg). Και στις δυο περιπτώσεις το διάλυμα εμποτισμού διοχετεύεται μέσω της αορτής στα αγγεία της στεφανιαίας κυκλοφορίας. Ο όγκος του διαλύματος που ρέει στα στεφανιαία αγγεία παροχετεύεται στο στεφανιαίο κόλπο και τελικά εξέρχεται από την καρδιά μέσω της πνευμονικής αρτηρίας. Η συσκευή εμποτισμού που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από δυο γυάλινα δοχεία Α και Β τοποθετημένα σε σταθερό ύψος από το εμποτιζόμενο όργανο. Τα δοχεία αυτά έχουν διπλά τοιχώματα όπου κυκλοφορεί νερό, ώστε να εξασφαλίζεται η επιθυμητή θερμοκρασία (37 o C). Η καρδιά τοποθετείται επίσης σε παρόμοιο διπλότοιχο δοχείο για να διατηρείται σταθερή η θερμοκρασία της σε όλη τη διάρκεια του πειράματος. Από κάθε δοχείο ξεκινά σωλήνας σιλικόνης που οδηγεί σε στρόφιγγα δύο δρόμων, συνδεδεμένη με μεταλλική κάνουλα, στην οποία προσαρμόζεται η αορτή της καρδιάς. Το φυσιολογικό διάλυμα εμποτισμού Krebs- Henseleit (KHB) που χρησιμοποιείται είναι ρυθμιστικό διάλυμα δισανθρακικών με σύσταση: 25 mm NaHCO 3, mm NaCl, 4.7 mm KCl, 1.2 mm MgSO 4, 1.2 mm KH 2 PO 4 και 10 mm γλυκόζη, ph 7.4. Η στάθμη του διαλύματος σε κάθε δοχείο διατηρείται σταθερή και σε ύψος 100 cm από την καρδιά, έτσι ώστε να εξασφαλίζεται σταθερή πίεση 75 mmhg (constant pressure preparation) κατά τη διάρκεια του εμποτισμού. Η οξυγόνωση των διαλυμάτων στα δοχεία Α και Β επιτυγχάνεται με παροχή μίγματος 95% O 2-5% CO 2, ενώ το διάλυμα που αντλείται από την καρδιά, είτε απομακρύνεται, είτε ανακυκλώνεται με περισταλτική αντλία. Τα καρδιακά μυοκύτταρα απομονώνονται από τις κοιλίες της καρδιάς μετά από εμποτισμό και

58 49 πέψη του μυοκαρδίου με διάλυμα κολλαγενάσης σύμφωνα με τους Lazou και συν. (1994), όπως αναφέρεται αναλυτικά στη συνέχεια Προετοιμασία καρδιάς για τον εμποτισμό Το ζώο αναισθητοποιείται με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση νατριούχου πεντοθάλης (Abbott Laboratories, Italy) 100 mgr/kgr σωματικού βάρους. Επίσης, χορηγείται ηπαρίνη (300 IU/Kgr) (Leo Pharmaceutical Products, Ballerup, Denmark) μέσω της μηριαίας φλέβας και η καρδιά αφαιρείται από το σώμα του ζώου μαζί με τους γύρω ιστούς. Το παρασκεύασμα τοποθετείται αμέσως σε διάλυμα εμποτισμού KHB, θερμοκρασίας 0 ο C (κρυοπληγικό διάλυμα), ώστε να σταματήσει να συσπάται η καρδιά και να περιοριστούν οι συνέπειες της ισχαιμίας. Μετά την απομάκρυνση των γύρω ιστών, η καρδιά προσαρμόζεται μέσω της αορτής σε ειδικά διαμορφωμένη κάνουλα της συσκευής εμποτισμού, όπου και στερεώνεται με τη χρήση ράμματος (silk 410). Ο χρόνος που μεσολαβεί από την αφαίρεση της καρδιάς μέχρι την ανάρτηση της στη συσκευή δε ξεπερνά τα 1-2 λεπτά Απομόνωση καρδιακών μυοκυττάρων Η απομόνωση των καρδιακών μυοκυττάρων σε γενικές γραμμές έγκειται στον εμποτισμό της καρδιάς με διάλυμα χαμηλής συγκέντρωσης Ca 2+ προκειμένου να αποδιοργανωθούν οι διακυτταρικοί σύνδεσμοι, ενζυμική πέψη του μυοκαρδίου για τη ρήξη της εξωκυττάριας ουσίας και τελικά μηχανική ανάδευση για το διαχωρισμό των κυττάρων (Mitcheson και συν. 1998). Πιο αναλυτικά, η καρδιά αρχικά εμποτίζεται για πέντε λεπτά με διάλυμα ΚΗΒ χαμηλής συγκέντρωσης Ca 2+ (10 μμ). Ο εμποτισμός συνεχίζεται με διάλυμα ΚΗΒ το οποίο περιέχει το πρωτεολυτικό ένζυμο κολλαγενάση (0.5 mgr/ml), αλβουμίνη ορού βοδιού (BSA) 0.1% και Ca 2+ σε τελική συγκέντρωση 50 μμ. Ο εμποτισμός με το διάλυμα κολλαγενάσης διαρκεί περίπου 45 λεπτά και γίνεται με ανακύκλωση του διαλύματος. Στο τέλος του εμποτισμού, αφαιρούνται από την καρδιά οι κόλποι και η αορτή και ο ιστός που είναι πλέον πολύ μαλακός κόβεται σε μικρότερα κομμάτια. Ακολουθεί επώαση του ιστού για λίγα λεπτά σε διάλυμα που περιέχει κολλαγενάση, υπό ταυτόχρονη ανακίνηση στους 37 ο C. Στη διάρκεια της επώασης το διάλυμα της κολλαγενάσης οξυγονώνεται με παροχή μίγματος 95% O 2-5% CO 2. Τα μυοκύτταρα που απομονώνονται με αυτόν τον τρόπο συλλέγονται σε δοκιμαστικό σωλήνα μετά από διήθηση. Αφού καθιζάνουν τα κύτταρα, αφαιρείται το υπερκείμενο και ξεπλένονται 2 φορές με διάλυμα ΚΗΒ που περιέχει 1% BSA και Ca 2+ σε τελική συγκέντρωση 50 μμ. Τελικά επαναιωρούνται σε ΚΗΒ χωρίς BSA, στο οποίο προστίθεται σταδιακά επιπλέον Ca 2+ μέχρι τελικής συγκέντρωσης 1mM (το

59 50 διάλυμα αυτό θα αναφέρεται στη συνέχεια ως διάλυμα επώασης). Από κάθε καρδιά απομονώνονται περίπου 3x10 6 μυοκύτταρα, τα οποία έχουν ραβδόμορφο σχήμα σε ποσοστό 70-90% και βρίσκονται σε κατάσταση ηρεμίας. Πριν από την έναρξη των πειραμάτων μεσολαβεί χρονικό διάστημα περίπου 15 λεπτών σε διάλυμα επώασης προκειμένου να σταθεροποιηθούν τα κύτταρα Επώαση κυττάρων με αγωνιστές/αναστολείς Τα καρδιακά μυοκύτταρα που απομονώθηκαν, όπως αναφέρθηκε πιο πάνω, διεγείρονται με την προσθήκη 100 μμ φαινυλεφρίνης (PE), ή 100 nm ενδοθηλίνης-1 (ET-1), ή 30 μμ ATPγS στο διάλυμα επώασης. Στην περίπτωση της φαινυλεφρίνης ως διαλύτης χρησιμοποιείται διάλυμα ασκορβικού οξέος 5 mm. Ακολουθεί επώαση για αυξανόμενους χρόνους σε θερμοκρασία 37 o C. Με τον τρόπο αυτό προσδιορίζεται το χρονικό πρότυπο απόκρισης των πρωτεϊνών στους παραπάνω αγωνιστές. Στην περίπτωση που χρησιμοποιούνται αναστολείς, αυτοί προστίθενται πριν από τον αντίστοιχο αγωνιστή και τα κύτταρα επωάζονται για 10 λεπτά. Ακολουθεί διέγερση για το χρονικό διάστημα που αντιστοιχεί στη μέγιστη τιμή απόκρισης των πρωτεϊνών. Επιπλέον, στα πειράματα που χρησιμοποιούνται αναστολείς συμπεριλαμβάνονται δείγματα-μάρτυρες, στα οποία τα κύτταρα επωάζονται μόνο με τους αναστολείς και δεν διεγείρονται με τους αγωνιστές. Στο τέλος της επώασης τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση (Eppendorf) για 1-2 δευτερόλεπτα και το υπερκείμενο διάλυμα επώασης αφαιρείται. 2. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ 2.1. Προετοιμασία ολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων Τα καρδιακά μυοκύτταρα ομογενοποιούνται σε 100 μl διαλύματος λύσης, το οποίο περιέχει: 20 mm Hepes, ph 7.5, 20 mm β-φωσφογλυκερινικό οξύ, 50 mm NaF, 2 mm EDTA, 10 mm βενζαμιδίνη, 0.2 mm Na 3 V0 4 και 1% Triton X-100, 200 μμ λευπεπτίνη, 10 μμ Ε64 [trans-epoxy succinyl-l-leucylamido-(4-guanidino)butane], 5 mm διθειοθρεϊτόλης (DTT, dithiothreitol) και 300 μμ PMSF (phenyl methyl sulphonyl fluoride). Τα δείγματα παραμένουν στον πάγο για 10 λεπτά ώστε να εκχυλιστεί το σύνολο των κυτταρικών πρωτεϊνών. Στη συνέχεια, φυγοκεντρούνται σε θερμοκρασία 4 ο C, στα g (Eppendorf), για 10 λεπτά και στο υπερκείμενο κάθε δείγματος όγκου V, προστίθεται 0.33V διαλύματος κατεργασίας δειγμάτων, το οποίο περιέχει: 330 mm Tris/HCl ph 6.8, 10% SDS, 133 mm DTT, 13% γλυκερόλη και 0.2 % (w/v) κυανούν της βρωμοφαινόλης. Ακολουθεί βρασμός για 3 λεπτά και φύλαξη των δειγμάτων στην κατάψυξη (-20 ο C).

60 Διαχωρισμός κυτταροπλασματικών-πυρηνικών κλασμάτων Ο διαχωρισμός του κυτταροπλασματικού από το πυρηνικό κλάσμα πραγματοποιήθηκε βάσει της μεθόδου των Dignam και συν. (1983), με ορισμένες τροποποιήσεις. Συγκεκριμένα απομονωμένα καρδιακά μυοκύτταρα ομογενοποιούνται με 100 μl διαλύματος Α που περιέχει 10 mm Hepes ph 7.9, 10 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.3 mm Na 3 V0 4, 200 μμ λευπεπτίνη, 10 μμ Ε64, 5 mm DTT και 300 μμ PMSF. Τα δείγματα επωάζονται στους 0-4 ο C προκειμένου να εκχυλιστούν οι πρωτεΐνες και στη συνέχεια φυγοκεντρούνται (4 ο C, g, 5 λεπτά). Στο υπερκείμενο κάθε δείγματος όγκου V, που συνιστά το κυτταροπλασματικό κλάσμα, προστίθεται 0.33V διαλύματος κατεργασίας δειγμάτων, ακολουθεί βρασμός και φύλαξη των κυτταροπλασματικών κλασμάτων στην κατάψυξη (-20 ο C). Από την άλλη πλευρά, στο ίζημα προστίθενται 100 μl διαλύματος Α, που επιπλέον περιέχει το μη ιονικό απορρυπαντικό Nonidet P-40 [0.1% (v/v)]. Μετά από επώαση 10 λεπτών στον πάγο με ταυτόχρονη ανάδευση, ακολουθεί δεύτερη φυγοκέντρηση (4 ο C, g, 5 λεπτά), το υπερκείμενο απορρίπτεται, ενώ στο ίζημα προστίθενται 100 μl διαλύματος Β, το οποίο περιέχει: 20 mm Hepes ph 7.9, 420 mm NaCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.2 mm EDTA, 25% (v/v) γλυκερόλη 0.3 mm Na 3 V0 4, 200 μμ λευπεπτίνη, 10 μμ Ε64, 5 mm DTT και 300 μμ PMSF. Τα δείγματα επωάζονται για 1 ώρα στους 4 ο C, με έντονη ανάδευση ανά 10 λεπτά, προκειμένου να επιτευχθεί εκχύλιση των πυρηνικών πρωτεϊνών και φυγοκεντρούνται (4 ο C, g, 5 λεπτά). Το υπερκείμενο αποτελεί το πυρηνικό κλάσμα και χρησιμοποιείται τόσο για ανάλυση κατά Western όσο και για EMSA. Στην πρώτη περίπτωση σε δείγμα όγκου V, προστίθεται 0.33V διαλύματος κατεργασίας δειγμάτων, ακολουθεί βρασμός για 3 λεπτά και φύλαξη των δειγμάτων στην κατάψυξη (-20 ο C). Αντίθετα, στην περίπτωση που τα πυρηνικά κλάσματα χρησιμοποιούνται για EMSA απλά φυλάσσονται στους 80 o C Διαχωρισμός κυτταροπλασματικών-μεμβρανικών κλασμάτων Απομονωμένα καρδιακά μυοκύτταρα ομογενοποιούνται σε 100 μl διαλύματος λύσης, το οποίο περιέχει τους αναστολείς πρωτεασών (200 μμ λευπεπτίνη, 10 μμ Ε64, 5 mm DTT και 300 μμ PMSF), ενώ δεν περιέχει Triton X-100. Τα δείγματα επωάζονται στους 0-4 ο C για 10 λεπτά προκειμένου να εκχυλιστούν οι πρωτεΐνες και στη συνέχεια φυγοκεντρούνται (4 ο C, g, 10 λεπτά). Στο υπερκείμενο κάθε δείγματος όγκου V, που συνιστά το κυτταροπλασματικό κλάσμα, προστίθεται 0.33V διαλύματος κατεργασίας δειγμάτων, ακολουθεί βρασμός και φύλαξη των κυτταροπλασματικών κλασμάτων στην κατάψυξη (-20 ο C). Από την άλλη πλευρά το

61 52 ίζημα πλένεται με 100 μl διαλύματος λύσης, ακολουθεί φυγοκέντρηση (4 ο C, g, 10 λεπτά), το υπερκείμενο απορρίπτεται, και τελικά το ίζημα επαναιωρείται σε 100 μl διαλύματος λύσης, το οποίο επιπλέον περιέχει 1% (v/v) Triton X-100. Τα δείγματα επωάζονται για 10 λεπτά στους 4 ο C, προκειμένου να επιτευχθεί εκχύλιση των μεμβρανικών πρωτεϊνών και φυγοκεντρούνται (4 ο C, g, 10 λεπτά). Το υπερκείμενο αποτελεί το μεμβρανικό κλάσμα στο οποίο προστίθεται διάλυμα κατεργασίας δειγμάτων όπως έχει ήδη αναφερθεί. 3. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΛΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΙΝΗΣ Για τον προσδιορισμό της ολικής πρωτεΐνης στα δείγματα εφαρμόστηκε η χρωματομετρική μέθοδος Bradford (1976), η οποία στηρίζεται στην ιδιότητα της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250, να συνδέεται με πρωτεΐνες σε όξινο περιβάλλον και να αλλάζει το χρώμα της. Η ελεύθερη πρωτεΐνη έχει μέγιστο απορρόφησης στα 465 nm, ενώ το σύμπλοκο πρωτεΐνης-χρωστικής στα 595 nm. Η μέθοδος αυτή πλεονεκτεί έναντι της χρωματομετρικής μεθόδου των Lowry και συν. (1951), καθώς είναι πιο ευαίσθητη (5-10 φορές) και επιπλέον απλούστερη. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε αντιδραστήριο Bradford της εταιρείας Biorad (Biorad Protein Assay). Για τον υπολογισμό της περιεκτικότητας των δειγμάτων σε πρωτεΐνη, κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη αναφοράς με διαλύματα που αντιστοιχούν σε αυξανόμενες ποσότητες αλβουμίνης ορού βοδιού (1-15 μgr).τα δείγματα αραιώνονται με απιονισμένο νερό, έτσι ώστε οι τιμές της πρωτεΐνης να βρίσκονται μέσα στα όρια της πρότυπης καμπύλης. Σε κάθε περίπτωση 2 μl αραιωμένου δείγματος αναμιγνύονται με 1 ml αντιδραστηρίου χρωστικής, το οποίο προηγουμένως έχει επίσης αραιωθεί 5 φορές με απιονισμένο νερό. Τα δείγματα αναδεύονται σε Vortex και μετά από λίγα λεπτά μετρείται η απορρόφηση στα 595 nm. Ως τυφλό κατά τη φωτομέτρηση χρησιμοποιείται 1 ml του αραιωμένου διαλύματος χρωστικής. 4. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ Η μέθοδος της ηλεκτροφόρησης στηρίζεται στην ιδιότητα των πρωτεϊνών να μετακινούνται όταν βρεθούν σε ηλεκτρικό πεδίο και σε τιμές ph διαφορετικές από το ισοηλεκτρικό τους σημείο. Η ταχύτητα μετατόπισης τους εξαρτάται από το λόγο του φορτίου που φέρουν προς τη μάζα τους. Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνικών μορίων επιτυγχάνεται σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου, πορώδη μέσα, που λειτουργούν ως μοριακοί ηθμοί. Ο σχηματισμός των πηκτωμάτων εξασφαλίζεται με τον πολυμερισμό μονομερών ακρυλαμιδίου (CH 2 =CH-CO-NH 2 ) σε μακριές αλυσίδες. Η διασύνδεση

62 53 των αλυσίδων αυτών επιτυγχάνεται με ουσίες όπως το Ν,Ν-μεθυλενοδισακρυλαμίδιο (CH=CH-CO-NH-CH 2 -NH-CO-CH=CH 2 ) και το μέγεθος των πόρων του πηκτώματος καθορίζεται από την απόλυτη συγκέντρωση του ακρυλαμιδίου και του διςακρυλαμιδίου στα διαλύματα του πηκτώματος. Η έναρξη του πολυμερισμού καθορίζεται από την προσθήκη υπερθειικού αμμωνίου (APS) και επιταχύνεται παρουσία Ν,Ν,Ν,Ν-τετραμεθυλο-αιθυλοδιαμίνης (TEMED). Τα συστήματα ηλεκτροφόρησης διακρίνονται σε συνεχή και ασυνεχή. Σε ένα συνεχές σύστημα χρησιμοποιείται ένα ομοιογενές πήκτωμα και ένα ρυθμιστικό διάλυμα, ενώ στο ασυνεχές σύστημα χρησιμοποιούνται δυο πηκτώματα (πήκτωμα επιστίβαξης και διαχωρισμού) και τρία διαφορετικά ρυθμιστικά διαλύματα (ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων, πηκτώματος επιστίβαξης και πηκτώματος διαχωρισμού). Σε ένα ασυνεχές σύστημα οι πρωτεΐνες του δείγματος συμπυκνώνονται στο πήκτωμα επιστίβαξης, ώστε να μετακινηθούν όλες μαζί στο πήκτωμα διαχωρισμού, όπου επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός τους σε λεπτές ζώνες. Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών πραγματοποιείται απουσία ή παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων όπως το απορρυπαντικό SDS. Στην πρώτη περίπτωση, η οποία χαρακτηρίζεται ως ηλεκτροφόρηση κάτω από μη μετουσιωτικές συνθήκες, οι πρωτεΐνες διατηρούν άθικτες τις ανώτερες διαμορφώσεις τους, παραμένουν ενεργές και διαχωρίζονται με βάση το φορτίο και το μοριακό τους βάρος. Στη δεύτερη περίπτωση που χαρακτηρίζεται ως ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και πραγματοποιείται παρουσία SDS (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS- PAGE), οι υπομονάδες των πρωτεϊνών αποδιατάσσονται, διαχωρίζονται με βάση αποκλειστικά το μοριακό τους βάρος και κάθε πολυπεπτίδιο αποκτά τυχαία διαμόρφωση Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών παρουσία SDS (SDS-PAGE) Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε ασυνεχές σύστημα SDS-ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. Η συσκευή ηλεκτροφόρησης (Mini Protein Electrophoresis Cell), καθώς και το τροφοδοτικό (Power Pac 300), ήταν της εταιρίας Biorad. Αρχικά παρασκευάζεται το διάλυμα πηκτώματος διαχωρισμού με σύσταση: 375 mm Tris/HCl, ph 8.8, (w/v) δις-ακρυλαμίδιο, 0.1% (v/v) SDS, 0.15% (w/v) APS, 0.007% (v/v) TEMED και 10% ή 8% ακρυλαμίδιο ανάλογα με το μοριακό βάρος της προς μελέτη πρωτεΐνης. Συγκεκριμένα διάλυμα με συγκέντρωση ακρυλαμιδίου 10% χρησιμοποιήθηκε για τις MAPKs, τον CREB και την CBP, ενώ πήκτωμα με 8% ακρυλαμίδιο χρησιμοποιήθηκε για τις MSK1 και PLA 2. Αφού ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός του πηκτώματος διαχωρισμού προστίθεται το διάλυμα του πηκτώματος επιστίβαξης το οποίο περιέχει 125 mm Tris/HCl, ph %

63 54 (w/v) δις-ακρυλαμίδιο, 6% ακρυλαμίδιο, 0.1% (v/v) SDS, 0.15% (w/v) APS και 0.007% (v/v) TEMED. Οι διαστάσεις του πηκτώματος διαχωρισμού, το οποίο χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη είναι 8.3 cm x 7 cm x 0.75 cm, ενώ η απόσταση που διανύουν τα δείγματα στο πήκτωμα επιστίβαξης είναι περίπου 1 cm. Το ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων (Running Buffer) που χρησιμοποιείται έχει σύσταση 25 mm Tris/HCl, 192 mm γλυκίνη και 0.1% (w/v) SDS. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται με την παροχή ηλεκτρικού ρεύματος σταθερής τάσης 200 V και τερματίζεται αμέσως μόλις η χρωστική, που περιέχεται στα δείγματα (bromophenol blue), φθάσει στο τέλος του πηκτώματος διαχωρισμού. Η συνολική διάρκεια της ηλεκτροφόρησης είναι περίπου λεπτά. 5. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (blotting) Στα πλαίσια της μεθόδου αυτής οι πρωτεΐνες του πηκτώματος διαχωρισμού μεταφέρονται ηλεκτροφορητικά πάνω σε νιτροκυτταρίνη στην οποία αποτυπώνονται, όπως ακριβώς έχουν διαχωριστεί στο πήκτωμα με την ηλεκτροφόρηση. Η συγκεκριμένη τεχνική εφαρμόζεται ευρέως για την ανίχνευση συγκεκριμένων αντιγονικών επιτόπων από το σύνολο των πρωτεϊνών του πηκτώματος, αφού τα πολυπεπτίδια που έχουν αποτυπωθεί στη νιτροκυτταρίνη εκτίθενται άμεσα στα μόρια του διαλύματος, στο οποίο εμβαπτίζεται η νιτροκυτταρίνη. Αντίθετα, στην περίπτωση του πηκτώματος τα πρωτεϊνικά μόρια περιβάλλονται από το πλέγμα του πολυακρυλαμιδίου γεγονός που δυσχεραίνει την ανοσοεντόπιση συγκεκριμένων πρωτεϊνών (Gershoni και Palade 1983). Δυο τεχνικές εφαρμόζονται ευρέως για την ηλεκτροφορητική μεταφορά των πρωτεϊνών. Σύμφωνα με την πρώτη το sandwich νιτροκυτταρίνης-πηκτώματος εμποτίζεται με διάλυμα μεταφοράς σε όλη τη διάρκεια της μεταφοράς (wet blotting), ενώ στη δεύτερη περίπτωση το sandwich απλά διαβρέχεται με το διάλυμα μεταφοράς και στη συνέχεια τοποθετείται μεταξύ των δυο πόλων (semidry blotting). Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε αποκλειστικά η δεύτερη μέθοδος, καθώς επιτρέπει εξοικονόμηση υλικών, χωρίς να υστερεί στην ποιότητα μεταφοράς των πρωτεϊνών στην νιτροκυτταρίνη Ημίξηρη (semidry) ηλεκτροφορητική μεταφορά Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης το πήκτωμα διαχωρισμού εξισορροπείται για 10 λεπτά σε διάλυμα μεταφοράς με σύσταση 25 mm Tris/HCl ph 8.3, 192 mm γλυκίνη και 20% (v/v) μεθανόλη. Επιπλέον χαρτιά Whatman (3 ΜΜ) και νιτροκυτταρίνη έχουν προηγουμένως κοπεί στις διαστάσεις του πηκτώματος και έχουν διαβραχεί για 15 λεπτά στο ίδιο διάλυμα. Στη συνέχεια το πήκτωμα και η

64 55 νιτροκυτταρίνη τοποθετούνται στην ειδική συσκευή ηλεκτροφορητικής μεταφοράς (Trans-blot Semidry, Biorad) με την εξής διάταξη από την κάθοδο προς την άνοδο: 5 χαρτιά Whatman-πήκτωμα-νιτροκυτταρίνη-5 χαρτιά Whatman. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας αυτής είναι σημαντικό να μην παγιδεύονται φυσαλίδες αέρα μεταξύ του πηκτώματος και της νιτροκυτταρίνης, αλλά ούτε και μεταξύ των χαρτιών. Η μεταφορά γίνεται για λεπτά σε σταθερή τάση 15 V, με το ρεύμα να φθάνει τα 260 ma. Μετά το τέλος της μεταφοράς η νιτροκυτταρίνη είναι έτοιμη για περαιτέρω επεξεργασία. 6. ΑΝΟΣΟΕΝΤΟΠΙΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ ΣΤΗ ΝΙΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗ (immunoblotting) Τα συνδεδεμένα στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης πρωτεϊνικά αντιγόνα ανιχνεύονται έμμεσα με τη χρήση δυο αντισωμάτων. Το πρώτο αντίσωμα είναι ειδικό έναντι του πρωτεϊνικού αντιγόνου με το οποίο σχηματίζει ανοσοσύμλποκα. Στα συγκεκριμένα σύμπλοκα δεσμεύεται δεύτερο αντίσωμα, έναντι του πρώτου, που είναι συζευγμένο με ένζυμο (π.χ. υπεροξειδάση). Οι θέσεις πρόσδεσης του δεύτερου αντισώματος προσδιορίζονται με την προσθήκη υποστρώματος κατάλληλου για το χρησιμοποιούμενο ένζυμο, είτε με χρωμογόνο, είτε με τη μέθοδο της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Enhanced Chemiluminescence- ECL). Η τεχνική της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας στηρίζεται στην επαγόμενη από την αλληλεπίδραση υπεροξειδάσης/h 2 O 2, οξείδωση της λουμινόλης, παρουσία χημικών ενισχυτών όπως είναι οι φαινόλες (Whitehead και συν. 1979). Στην παρούσα μελέτη εφαρμόστηκε αποκλειστικά η μέθοδος της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας, καθώς χαρακτηρίζεται από υψηλή ευαισθησία (ανιχνεύεται <1 pgr πρωτεΐνης), υψηλή διακριτικότητα και ταχύτητα, ενώ επιπλέον τα αποτελέσματα αποτυπώνονται σε φιλμ το οποίο στη συνέχεια είναι δυνατό να πυκνομετρηθεί. Πιο αναλυτικά, η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης επωάζεται αρχικά για 30 λεπτά (θερμοκρασία δωματίου) με διάλυμα TBST (Tris-buffered saline/tween-20: 20 mm Tris/HCl ph 7.6, 137 mm NaCl και 0.1% (v/v) Tween-20) το οποίο περιέχει 5% (w/v) σκόνη γάλακτος χαμηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά, προκειμένου να επιτευχθεί δέσμευση των μη ειδικών θέσεων. Ακολουθούν τρεις 5λεπτες εκπλύσεις με TBST υπό ανάδευση και επώαση για ώρες με το κατάλληλο πρώτο αντίσωμα στους 4 o C, με συνεχή ανακίνηση. Το αντίσωμα που χρησιμοποιείται στο στάδιο αυτό είναι αραιωμένο σε διάλυμα TBST που περιέχει 5 % (w/v) BSA. Μετά το τέλος της επώασης, αφού η νιτροκυτταρίνη ξεπλυθεί με TBST (3 x 5 λεπτά, υπό ανακίνηση), επωάζεται με δεύτερο αντίσωμα, έναντι του πρώτου, το οποίο είναι αραιωμένο σε

65 56 διάλυμα 1% (w/v) σκόνης γάλακτος σε TBST, για 1 ώρα, σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθούν εκπλύσεις της μεμβράνης με TBST (3 x 5 λεπτά, υπό ανακίνηση) και εφαρμογή της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) με αντιδραστήριο της εταιρείας Santa Cruz Biotechnology (Western Blotting Luminol Reagent) ή Amersham, Uppsala σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η νιτροκυτταρίνη εκτίθεται σε φιλμ (Kodak AR X-OMATic) για λίγα λεπτά. Τελικά τα φιλμ εμφανίζονται και στερεώνονται με φωτογραφικά υλικά της Kodak (Developer, Fixer). Με αυτό τον τρόπο τα πρωτεϊνικά αντιγόνα της νιτροκυτταρίνης αποτυπώνονται στα φιλμ, τα οποία σαρώνονται με το λογισμικό Gel-Pro Analyzer της Media Cybernetics για την ποσοτική έκφραση των αποτελεσμάτων. Η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης είναι δυνατό να ξαναχρησιμοποιηθεί, μετά την απομάκρυνση των ήδη δεσμευμένων σε αυτήν αντισωμάτων. Για το σκοπό αυτό, η νιτροκυτταρίνη ξεπλένεται με TBST (3 x 5 λεπτά, υπό ανάδευση) και στη συνέχεια επωάζεται με διάλυμα αποκόλλησης αντισωμάτων στους 50 o C, για 20 λεπτά, υπό συνεχή ανακίνηση. Το διάλυμα αποκόλλησης αντισωμάτων έχει σύσταση: 62.5 mm Tris/HCl ph 6.7, 2% SDS και 10 mm μερκαπτοαιθανόλη. Αφού ξεπλυθεί (3 x 10 λεπτά, υπό ανάδευση) η νιτροκυτταρίνη επωάζεται με διάλυμα 5% (w/v) σκόνης γάλακτος σε TBST για τη δέσμευση μη-ειδικών θέσεων. Ακολουθούν τα υπόλοιπα στάδια, όπως αυτά περιγράφηκαν παραπάνω. Έτσι, η ίδια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης μετά την πρώτη χρήση, αφού αφαιρεθούν τα δεσμευμένα αντισώματα, είναι δυνατόν να επωαστεί με διαφορετικό πρώτο αντίσωμα. Αυτή η δυνατότητα αποδεικνύεται ιδιαίτερα χρήσιμη σε περιπτώσεις, όπου απαιτείται συγκριτική μελέτη των θέσεων πρόσδεσης αντισωμάτων στην ίδια νιτροκυτταρίνη. 7. ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ (immunoprecipitation) Η συγκεκριμένη τεχνική στηρίζεται στην ιδιότητα των σφαιριδίων αγαρόζηςπρωτεΐνης G ή σεφαρόζης-πρωτεΐνης Α να αλληλεπιδρούν με το Fc τμήμα των ανοσοσφαιρινών τάξης G και να σχηματίζουν σύμπλοκα με πρωτεϊνικά αντιγόνα εξασφαλίζοντας την απομόνωση τους από διάφορα κυτταρικά εκχυλίσματα. Συγκεκριμένα, σχηματίζονται ανοσοσύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος-πρωτεΐνης G ή Α, τα οποία κατακρημνίζονται και είναι δυνατό να διαχωριστούν από τα μη δεσμευμένα μόρια και να απομονωθούν με φυγοκέντρηση. Κατά την πειραματική αυτή διαδικασία, σφαιρίδια αγαρόζης-πρωτεΐνης G ή σεφαρόζης-πρωτεΐνης Α επωάζονται για ώρες (4 o C, υπό ανακίνηση) με την κατάλληλη ποσότητα αντισώματος σε διάλυμα ανοσοκατακρήμνισης (διάλυμα ΑΝΣ) που περιέχει 20 mm Tris/HCl ph 7.5, 1 mm EDTA, 10% γλυκερόλη, 100 mm KCl, 5 mm NaF, 0.2 mm Na 3 VO 4, 5 mm MgCl 2, 10 mm β-φωσφογλυκερινικό οξύ και 0.05%

66 57 μερκαπτοαιθανόλη, προκειμένου να σχηματιστούν σύμπλοκα σφαιριδίων πρωτεΐνης G ή Α-αντισώματος. Μετά το τέλος της επώασης, ακολουθεί σύντομη φυγοκέντρηση (4 ο C, g, 30 δευτερόλεπτα), το ίζημα πλένεται δυο φορές με διάλυμα ΑΝΣ και τελικά επαναιωρείται στο ίδιο διάλυμα. Παράλληλα, απομονωμένα καρδιακά μυοκύτταρα ομογενοποιούνται με διάλυμα ΑΝΣ που επιπλέον περιέχει αναστολείς πρωτεασών (200 μμ λευπεπτίνη, 10 μμ Ε64, 5 mm DTT και 300 μμ PMSF) και 0.1% Triton-X. Τα δείγματα επωάζονται για 10 λεπτά στον πάγο προκειμένου να εκχυλιστούν οι πρωτεΐνες και φυγοκεντρούνται (4 ο C, g, 5 λεπτά). Το υπερκείμενο ίσου όγκου από κάθε δείγμα επωάζεται με τα ανοσοσύμπλοκα αντισώματος-σφαιριδίων για 2 ώρες, στους 4 ο C, υπό ανάδευση προκειμένου να προσδεθούν τα πρωτεϊνικά αντιγόνα. Ακολουθεί φυγοκέντρηση (4 ο C, g, 5 λεπτά) και στο υπερκείμενο προστίθεται διάλυμα κατεργασίας δειγμάτων όπως έχει αναφερθεί πιο πάνω. Το ίζημα αφού εκπλυθεί δυο φορές με διάλυμα ΑΝΣ είναι έτοιμο για τη χρήση του στα επόμενα στάδια προσδιορισμού της δραστικότητας κινάσης. Στην περίπτωση που το ίζημα προορίζεται για ανάλυση κατά Western, μετά από τις εκπλύσεις προστίθεται διάλυμα κατεργασίας δειγμάτων, ακολουθεί βρασμός και τα δείγματα διατηρούνται στους 20 ο C. 8. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ MSK1 (kinase assay) Η δραστικότητα της κινάσης MSK1 που απομονώθηκε με την ανοσοκατακρήμνιση προσδιορίζεται με τη χρήση του πεπτιδίου Crosstide ως υπόστρωμα, παρουσία [γ- 32 P] ATP. Συγκεκριμένα τα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος-σφαιριδίων που σχηματίστηκαν με την ανοσοκατακρήμνιση, πλένονται με διάλυμα προσδιορισμού δραστικότητας κινάσης (ΠΔΚ) που περιέχει 50 mm Tris/HCl ph 7.5, 0.1 mm EGTA, 10 mm MgCl 2, 3 mm DTT και 10 μμ PKI (αναστολέας της εξαρτώμενης από camp πρωτεϊνικής κινάσης). Στη συνέχεια το ίζημα επαναιωρείται σε 40 μl διαλύματος ΠΔΚ που περιέχει 30 μμ Crosstide, mm μη σημασμένο ATP και 2 μci [γ- 32 P] ATP. Τα δείγματα επωάζονται για 30 λεπτά στους 30 o C και οι αντιδράσεις τερματίζονται τοποθετώντας τα δείγματα στον πάγο. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι σε κάθε πείραμα συμπεριλαμβάνεται ένα δείγμα που περιέχει μόνο διάλυμα ΠΔΚ και [γ- 32 P] ATP. Στη συνέχεια τα δείγματα φυγοκεντρούνται (4 ο C, g, 30 δευτερόλεπτα) και 30 μl από το υπερκείμενο κάθε δείγματος τοποθετούνται σε χαρτί Ρ81 της εταιρείας Whatman. Ακολουθούν εκπλύσεις των χαρτιών (3 x 20 λεπτά) με 0.75 mm ορθοφωσφορικό οξύ και μέτρηση της ραδιενέργειας με τη μέθοδο Cerenkov σε φωτόμετρο υγρού σπινθηρισμού. Η μέτρηση κατά Cerenkov αφορά φορτισμένα σωματίδια, όπως σωματίδια β από 32 Ρ, σε διαυγές μέσο με ταχύτητα μεγαλύτερη από την ταχύτητα του φωτός. Η εμβέλεια της ακτινοβολίας στην περίπτωση αυτή

67 58 επιτρέπει τη μέτρηση απουσία υγρού σπινθηρισμού. Ως μονάδα δραστικότητας της κινάσης ορίζεται η ποσότητα του ενζύμου που καταλύει τη φωσφορυλίωση 1 nmole πεπτιδίου ανά λεπτό. 9. EMSAS (Electrical Mobility Shift Assays) Η συγκεκριμένη ανάλυση έγκειται στη σύνδεση πρωτεϊνών με σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια και επακόλουθη ανίχνευση των σχηματιζόμενων συμπλόκων. Ειδικότερα, η σύνδεση των πρωτεϊνών με τις σημασμένες ακολουθίες DNA επιβραδύνει την κινητικότητα των τελευταίων σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου, με αποτέλεσμα τη δημιουργία διακριτών ζωνών που αντιστοιχούν στα διάφορα σύμπλοκα πρωτεϊνών-dna. Πρόκειται για μια μέθοδο απλή, γρήγορη και ιδιαίτερα ευαίσθητη, που εφαρμόζεται σε απομονωμένες πρωτεΐνες ή ακατέργαστα εκχυλίσματα (crude extract) Αναδιάταξη ολιγονουκλεοτιδίων (annealing) Οι ακολουθίες DNA που χρησιμοποιούνται στα πλαίσια της συγκεκριμένης ανάλυσης είναι ολιγονουκλεοτίδια μήκους ζεύγη βάσεων. Αντίθετα αποφεύγεται η χρήση ακολουθιών μεγαλύτερου μήκους, καθώς είναι πιθανό να περιλαμβάνουν θέσεις πρόσδεσης για διάφορες πρωτεΐνες, γεγονός που δυσχεραίνει την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιούνται τα συνθετικά μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια 5 -CTAGCTCTCTGACGTCAGGCAATCTCT-3 και 3 - GATCGAGAGACTGCAGTCCGTTAGAGA-5 που περιλαμβάνουν τη συναινετική ακολουθία (consensus sequence) CRE (camp responsive element). Αρχικά, οι μονόκλωνες ακολουθίες αναδιατάσσονται προκειμένου να δημιουργηθούν δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια. Για το σκοπό αυτό 10 μg συμπληρωματικών μονόκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων επωάζονται στους 95 o C σε διάλυμα σύστασης 10 mm Tris-HCl, ph 7.5, 50 mm NaCl και 10 mm MgCl 2, για 2 λεπτά και η θερμοκρασία του μίγματος επανέρχεται στα επίπεδα θερμοκρασίας δωματίου αργά. Προκειμένου να επιβεβαιωθεί η υβριδοποίηση των ακολουθιών ng από το διάλυμα των μονόκλωνων και δίκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων ηλεκτροφορούνται σε πήκτωμα αγαρόζης 2.5%, σε διάλυμα που περιέχει 0,04Μ Tris-HCl, 0.01 M EDTA και 0.5 gr/ml βρωμιούχο εθίδιο. Το βρωμιούχο εθίδιο είναι μια φθορίζουσα χημική ένωση η οποία συνδέεται ανάμεσα στις βάσεις των νουκλεοτιδίων του DNA. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται με την παροχή ηλεκτρικού ρεύματος σταθερής τάσης 100 V

68 59 ss ds Εικ. 7. Φωτογραφία πηκτώματος αγαρόζης όπου διακρίνονται τα μονόκλωνα (ss) και δίκλωνα (ds) ολιγονουκλεοτίδια και διαρκεί για 45 λεπτά. Η παρουσία βρωμιούχου εθιδίου επιτρέπει τη φωτογράφηση του πηκτώματος υπό την επίδραση ακτινοβολίας UV (Εικ. 7). Τα δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια σε αντίθεση με τα μονόκλωνα μετακινούνται αργότερα κατά την ηλεκτροφόρηση καθώς έχουν μεγαλύτερη μοριακή μάζα. Με τον τρόπο αυτό ελέγχεται η επιτυχία της υβριδοποίησης και η παρουσία δίκλωνων ακολουθιών στο διάλυμα των ολιγονουκλεοτιδίων Σήμανση ολιγονουκλεοτιδίων Για τη σήμανση των ολιγονουκλεοτιδίων χρησιμοποιείται η Τ4 πολυνουκλεοτιδική κινάση, η οποία καταλύει τη μεταφορά και ανταλλαγή της φωσφορικής ομάδας από τη θέση γ του ΑΤΡ στο 5 άκρο πολυνουκλεοτιδίων (DNA ή RNA μονόκλωνο ή δίκλωνο). Στην παρούσα μελέτη για τη σήμανση των ακολουθιών DNA χρησιμοποιούνται 100 ng δίκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων τα οποία επωάζονται με 10 μci [γ- 32 P] ATP και 10 μονάδες Τ4 πολυνουκλεοτιδικής κινάσης σε διάλυμα σύστασης 70 mm Tris-HCl, ph 7.6, 10 mm MgCl 2, 5 mm διθειοθρεϊτόλη (DTT), για μια ώρα, στους 37 o C. Η αντίδραση τερματίζεται με την προσθήκη H 2 0 σε τελικό όγκο 100 μl. Προκειμένου να διαχωριστούν τα σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια από το ελεύθερο [γ- 32 P] ΑΤΡ εφαρμόζεται χρωματογραφία στήλης. Για την προετοιμασία της στήλης χρησιμοποιούνται αδρανή και πορώδη υλικά, όπως είναι οι δεξτράνες. Οι δεξτράνες με κατάλληλη επεξεργασία τροποποιούνται και με ενδομοριακές συνδέσεις αποκτούν τη δομή σφαιριδίων που είναι γνωστά στο εμπόριο ως Sephadex. Στα πλαίσια της παρούσας μελέτης προετοιμάζεται στήλη με σφαιρίδια Sephadex-G 50 και εξισορροπείται με διάλυμα ΤΕ που περιέχει 10 mm Tris HCl ph 8.0 και 1 mm EDTA. Τα συστατικά του μίγματος ολιγονουκλεοτιδίων-ατρ διαχωρίζονται μέσα στη στήλη ανάλογα με το μοριακό τους βάρος. Έτσι, τα σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια που έχουν μεγαλύτερο μοριακό βάρος θα κινηθούν πιο γρήγορα και θα φτάσουν στην

69 60 ελεύθερο [γ- 32 Ρ]ΑΤΡ σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια Εικ. 8. Χρωματογράφημα λεπτής στιβάδας. Τα κλάσματα 1, 2 που προέκυψαν από τη χρωματογραφία στήλης περιλαμβάνουν τα σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια, ενώ τα υπόλοιπα (3, 4 και 5) περιέχουν ελεύθερο [γ- 32 Ρ]ΑΤΡ. Το βέλος υποδηλώνει την κατεύθυνση ανάπτυξης της έκλουσης. έξοδο της στήλης πρώτα, ενώ τα μόρια ΑΤΡ με μικρότερο μοριακό βάρος θα φτάσουν τελευταία. Η στήλη εκλούεται 4 φορές με 100 μl διαλύματος ΤΕ, τα οποία συλλέγονται. Ο ποιοτικός έλεγχος των κλασμάτων που λαμβάνονται με την έκλουση της στήλης Sephadex επιτυγχάνεται με τη χρωματογραφία λεπτής στιβάδας. Η συγκεκριμένη μέθοδος συνίσταται στην τοποθέτηση μια μικρής ποσότητας από κάθε κλάσμα πάνω στην επιφάνεια πλακών χρωματογραφίας (ΤLC plates), οι οποίες είναι επιστρωμένες με κυτταρίνη. Τα χρωματογραφήματα αναπτύχθηκαν σε διάλυμα KH 2 PO Μ, ph 3.5 για 20 λεπτά περίπου. Η μετακίνηση των ενώσεων στην πλάκα χρωματογραφίας με διαφορετικές ταχύτητες οδηγεί στο διαχωρισμό των ολιγονουκλεοτιδίων από το ελεύθερα μόρια ΑΤΡ. Έτσι για το συγκεκριμένο διαλύτη τα λιγότερα πολικά μόρια ΑΤΡ μετακινούνται ταχύτερα και τα πιο πολικά ολιγονουκλεοτίδια μετακινούνται βραδύτερα. Ακολουθεί έκθεση των πλακών χρωματογραφίας σε φιλμ και αυτοραδιογραφία. Όπως φαίνεται σε ένα αντιπροσωπευτικό αυτοραδιογράφημα στην εικόνα 8, οι σημασμένες ακολουθίες ανιχνεύονται στα δύο πρώτα κλάσματα, ενώ τα υπόλοιπα κλάσματα περιλαμβάνουν επίσης ελεύθερο ΑΤΡ. Αν και η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας επιτρέπει τον ποιοτικό έλεγχο των κλασμάτων που προκύπτουν από τη χρωματογραφία στήλης, δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ποσοτικό έλεγχο της ραδιενέργειας που αυτά περιλαμβάνουν. Για αυτό το σκοπό, 1 μl από κάθε κλάσμα τοποθετείται σε χαρτί Ρ81 (Whatman) και η ραδιενέργεια μετράται σε φωτόμετρο υγρού σπινθηρισμού με τη μέθοδο Cerenkov. Το κλάσμα ολιγονουκλεοτιδίων που θα χρησιμοποιηθεί για τα επόμενα στάδια επιλέγεται βάσει

70 61 των αποτελεσμάτων της χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας και των μετρήσεων ραδιενέργειας Αντιδράσεις σύνδεσης πρωτεϊνών-ολιγονουκλεοτιδίων Τα πυρηνικά κλάσματα των καρδιακών μυοκυττάρων (10 μgr ολικής πρωτεΐνης) επωάζονται με 0.15 μgr/μl polydi/dc σε διάλυμα σύστασης 5 mm MgCl 2 και 34 mm KCl για 15 λεπτά στους 4 ο C, προκειμένου να επιτευχθεί δέσμευση των μη ειδικών θέσεων. Στη συνέχεια προστίθενται τα σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια ( cpm/αντίδραση) και τα δείγματα επωάζονται για 30 λεπτά, στους 4 ο C. Η τελική σύσταση του διαλύματος στο οποίο πραγματοποιούνται οι αντιδράσεις είναι 20mM Hepes, ph 7.9, 2 mm MgCl 2, 75 mm KCl, 20% (v/v) γλυκερόλη και 0.5 mm DTT. Ακολουθεί ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων κάτω από μη μετουσιωτικές συνθήκες. Σε κάθε πείραμα περιλαμβάνονται μάρτυρες που περιέχουν σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια, όχι όμως πυρηνικά κλάσματα. Επιπλέον, διεξάγονται πειράματα ανταγωνισμού προκειμένου να διερευνηθεί η εξειδίκευση των αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών-σημασμένων ολιγονουκλεοτιδίων (Carthew και συν 1985). Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιείται περίσσεια 100x μη σημασμένων ολιγονουκλεοτιδίων τα οποία επωάζονται με τα πυρηνικά κλάσματα για 15 λεπτά πριν από την προσθήκη των σημασμένων ολιγονουκλεοτιδίων. Η αναγνώριση των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στα σύμπλοκα με το DNA στηρίζεται στη χρήση αντισωμάτων. Η προσθήκη ενός αντισώματος ειδικού για κάποια από τις πρωτεΐνες των συμπλόκων θα έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της ηλεκτροφορητικής κινητικότητα του συμπλόκου DNAπρωτεϊνών (supershift). Στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιείται αντίσωμα έναντι του CREB, το οποίο επωάζεται με τα πυρηνικά κλάσματα για μια ώρα στους 4 ο C, πριν από την έναρξη των αντιδράσεων σύνδεσης Ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων Η ηλεκτροφόρηση των συμπλόκων πρωτεϊνών-ολιγονουκλεοτιδίων πραγματοποιείται κάτω από μη μετουσιωτικές συνθήκες. Το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου που χρησιμοποιείται έχει σύσταση 4% ακρυλαμίδιο, 0.165% (w/v) δις-ακρυλαμίδιο 0.05% (w/v) APS, 44.5 mm Tris-HCl ph 8.0, 2.75 mm boric acid, 1 mm EDTA και % (v/v) TEMED. Το ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων που χρησιμοποιείται έχει σύσταση 44.5 mm Tris-HCl ph 8.0, 44.5 mm boric acid, 1 mm EDTA. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται με την παροχή ηλεκτρικού ρεύματος σταθερής τάσης 120 V και τερματίζεται μετά από 3 περίπου ώρες.

71 Αυτοραδιογραφία Τα β-σωματίδια του 32 P, ο οποίος χρησιμοποιείται στο στάδιο της σήμανσης, προσβάλλουν το φωτογραφικό φιλμ στις θέσεις εκείνες όπου εντοπίζονται ελεύθερα σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια ή σύμπλοκα των ολιγονουκλεοτιδίων με πρωτεΐνες. Έτσι αφού ολοκληρωθεί η πειραματική διαδικασία EMSA, όπως περιγράφηκε πιο πάνω, το πήκτωμα ξηραίνεται πάνω σε χαρτί Whatman ανάλογων διαστάσεων, σε κατάλληλη συσκευή (Slab Gel Dryer), τοποθετείται σε κασέτα με οθόνη ανάκλασηςενίσχυσης του σήματος (Hyperscreen, Amersham) στους 80 oc (ώστε να μειώνεται η ενέργεια ενεργοποίησης η οποία ευθύνεται για το σχηματισμό σταθερής, λανθάνουσας εικόνας), όπου και εκτίθεται σε φωτογραφικό φιλμ (Kodak AR X- OMATic), για όσο χρόνο απαιτείται (24-96 ώρες). Ακολουθεί οπτική σάρωση (scanning) του αυτοραδιογραφήματος το οποίο προκύπτει και ανάλυση του με κατάλληλο υπολογιστικό πρόγραμμα. 11. ΧΡΗΣΗ ΛΟΓΙΣΜΙΚΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΩΝ Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν τα εξής λογισμικά προγράμματα: Το λογισμικό Prism της εταιρείας GraphPad Software (San Diego, CA) για την προσαρμογή των δεδομένων σε διαγράμματα. Το λογισμικό InStat της GraphPad Software (San Diego, CA) για τη στατιστική επεξεργασία των δεδομένων Το λογισμικό Gel-Pro Analyzer της Media Cybernetics για τη σάρωση των ανοσοστυπωμάτων και αυτοραδιογραφημάτων καθώς και για την επεξεργασία των αντίστοιχων αποτελεσμάτων. Για τη συγγραφή της παρούσας διατριβής χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό επεξεργασίας κειμένου WORD 9.0. Τα λογισμικά ADOBE PHOTOSHOP 6.0, COREL DRAW 10.0 και POWERPOINT για την επεξεργασία εικόνας. 12. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Τα αριθμητικά δεδομένα που περιλαμβάνονται στα διαγράμματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα και η στατιστική επεξεργασία των δεδομένων έγινε με τη χρήση του υπολογιστικού προγράμματος Instat (GraphPad Software). Συγκεκριμένα για τη σύγκριση της μέσης τιμής διαφορετικών ομάδων εφαρμόστηκε η ανάλυση διασποράς (ANOVA one way), συνοδευόμενη από το Dunnet test, ενώ στις περιπτώσεις που η σύγκριση αφορούσε δυο ομάδες μόνο έγινε το Student s t-test. Κάθε φορά ως στατιστικά σημαντικές κρίθηκαν τιμές για τις οποίες Ρ<0.05. Σε ότι

72 63 αφορά τις φωτογραφίες των ανοσοστυπωμάτων και αυτοραδιογραφημάτων που παρουσιάζονται στο επόμενο κεφάλαιο, είναι αντιπροσωπευτικές των αντίστοιχων πειραμάτων.

73 64 IV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. ΟΔΟΙ ΜΕΤΑΓΩΓΗΣ ΜΗΝΥΜΑΤΩΝ ΜΕΣΩ ΤΩΝ α 1 -ΑΔΡΕΝΕΡΓΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ Προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της α 1 -αδρενεργικής διέγερσης στις MAPKs, σε απομονωμένα καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου, χρησιμοποιήθηκε η φαινυλεφρίνη, ένας συνθετικός αγωνιστής των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων και αντισώματα ειδικά, έναντι συνθετικών πεπτιδίων που αντιστοιχούν σε συγκεκριμένες αλληλουχίες των MAPKs Επίδραση της φαινυλεφρίνης στην ενεργοποίηση των ERK1/2 Ειδικότερα, για τη μελέτη των ERK1/2 χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα ειδικά για τις διπλά φωσφορυλιωμένες στα κατάλοιπα Thr202 και Tyr204, ERK1 και ERK2 αρουραίου. Πιο αναλυτικά, καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν με 100 μμ φαινυλεφρίνης για αυξανόμενους χρόνους που κυμάνθηκαν από 1 λεπτό έως 30 λεπτά. Ακολούθησε λύση των κυττάρων, προετοιμασία ολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων και 100 μgr ολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western. Διαπιστώθηκε ότι η φαινυλεφρίνη επάγει άμεσα τη φωσφορυλίωση των ERK1 και ERK2, με το μέγιστο της απόκρισης (7.604±2.053 και 7.812±2.933 φορές σε σχέση με τις τιμές του μάρτυρα, για τις ERK1 και ERK2 αντίστοιχα), να εντοπίζεται στο πρώτο λεπτό διέγερσης των κυττάρων (Εικ. 1.1 Α επάνω και Β). Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των δυο κινασών επέστρεψαν στις τιμές του μάρτυρα στα 15 λεπτά επώασης με φαινυλεφρίνη. Παράλληλα, με τη χρήση αντισώματος ειδικού για τα ολικά επίπεδα των ERK1 και ERK2, ανεξάρτητα από το βαθμό φωσφορυλίωσης τους, επιβεβαιώθηκε ότι η ολική πρωτεΐνη ήταν παρόμοια σε όλα τα εξεταζόμενα δείγματα (Εικ. 1.1 Α κάτω). Προκειμένου να διευκρινιστούν τα μονοπάτια μεταγωγής σήματος που συμμετέχουν στην ενεργοποίηση των ERK1 και 2 από τη φαινυλεφρίνη, χρησιμοποιήθηκαν οι αναστολείς PD98059, GF109203X και Genistein. Σε κάθε περίπτωση, τα κύτταρα επωάστηκαν αρχικά με τους αναστολείς για 10 λεπτά και στη συνέχεια με 100 μμ φαινυλεφρίνης για το χρονικό διάστημα που αντιστοιχεί στο μέγιστο της απόκρισης, στη συγκεκριμένη περίπτωση για 1 λεπτό. Πιο αναλυτικά, καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν με τον αναστολέα PD98059 (10 μμ), μια φλαβόνη που έχει την ικανότητα να καταστέλλει τη δραστικότητα των ΜΕΚ1/2 παρεμποδίζοντας κατά συνέπεια τη φωσφορυλίωση των ERK1/2. O αναστολέας PD98059 οδήγησε σε πλήρη καταστολή της φωσφορυλίωσης των ERK1/2,

74 A PE 65 Χρόνος (λεπτά) p-erk1/2 ERK1/2 p-erk1/2 (αυθαίρετες μονάδες) * 40 ERK1 * * ERK χρόνος (λεπτά) Εικ Χρονικό πρότυπο της φωσφορυλίωσης των ERK1/2 που επάγεται από τη φαινυλεφρίνη σε καρδιακά μυοκύτταρα αρουραίου. (Α) Μυοκύτταρα επωάστηκαν με 100 μμ φαινυλεφρίνης για τους αντίστοιχους χρόνους. Ακολούθησε ανοσοεντοπισμός της φωσφορυλιωμένης μορφής των κινασών (πάνω) καθώς και των ολικών τους επιπέδων (κάτω) σε 100 μg ολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων. (Β) Ποσοτική έκφραση των δεδομένων με πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών για τις ERK1 ( ) και ERK2 ( ). Κάθε σημείο στο διάγραμμα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± τυπικό σφάλμα. Το πείραμα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. * P<0.05 σε σχέση με το μάρτυρα. Fig Time course of ERK1/2 phosphorylation by PE in adult rat ventricular myocytes. (A) Myocytes were exposed to 100 μμ PE for the times indicated. Whole cell extracts (100 μg) were immunoblotted with an antibody specific for phospho-erk1/2 (top panel). An antibody against total ERK1/2 was used to verify equal protein loading (bottom panel). (B) Immunoblots were quantified by laser scanning densitometry for ERK1 ( ) and ERK2 ( ) phosphorylation. Results are presented as means± SEM from four independent experiments. * P<0.05 compared to control values.

75 66 επιβεβαιώνοντας τη συμμετοχή των ΜΕΚ1/2 στην ενεργοποίηση των ERK1/2 από τη φαινυλεφρίνη (Εικ. 1.2 Α). Παρόμοια ήταν και η δράση των GF109203X (1 μμ) και Genistein (10 μμ), που αναστέλλουν την PKC (protein kinase C) και τις πρωτεϊνικές κινάσες τυροσίνης αντίστοιχα. Η επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση των ERK1/2 μειώθηκε και στις δυο περιπτώσεις, γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή τόσο της PKC όσο και πρωτεϊνικών κινασών τυροσίνης στο δεδομένο μονοπάτι μεταγωγής σήματος (Εικ. 1.2 Α). Ανάλυση κατά Western στα ίδια δείγματα με αντίσωμα εδικό για τα ολικά επίπεδα των κινασών αποκάλυψε ότι αυτά ήταν παρόμοια στα εξεταζόμενα δείγματα (Εικ. 1.2 Α). Επιπλέον, σε κάθε περίπτωση χρησιμοποιήθηκαν μάρτυρες στους οποίους τα κύτταρα επωάστηκαν με τους εκάστοτε αναστολείς χωρίς επακόλουθη διέγερση με φαινυλεφρίνη. Με τον τρόπο αυτό διαπιστώθηκε ότι οι συγκεκριμένοι χημικοί παράγοντες δεν οδηγούν στην ενεργοποίηση των ERK1/2 όταν χρησιμοποιηθούν μόνοι τους χωρίς περαιτέρω διέγερση. Θα πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι στη συγκεκριμένη σειρά πειραμάτων ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν καρδιακά μυοκύτταρα που είχαν επωαστεί με το φορβολεστέρα PMA (1μΜ) για 5 λεπτά, καθώς είναι γενικά αποδεκτό ότι οι φορβολεστέρες αποτελούν ισχυρούς ενεργοποιητές του μονοπατιού των ERK1/2. Πρόσφατες μελέτες προτείνουν τη σηματοδοτική οδό της PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) ως πιθανό ενδοκυτταρικό μηχανισμό ενεργοποίησης των ERK1/2. Προκειμένου να διερευνηθεί αυτή η πιθανότητα στο πειραματικό μοντέλο της παρούσας μελέτης, καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν με τους αναστολείς της ΡΙ3Κ, LY (100 μμ) και Wortmannin (10 nm), πριν από τη διέγερση τους με φαινυλεφρίνη. Ανάλυση κατά Western για τις φωσφορυλιωμένες μορφές των ERK1/2 αποκάλυψε ότι οι δεδομένοι αναστολείς αναιρούν πλήρως τη δράση της φαινυλεφρίνης (Εικ. 1.3 B). Παράλληλα, με τη χρήση αντισώματος ειδικού για τα ολικά επίπεδα των ERK1 και ERK2, ανεξάρτητα από το βαθμό φωσφορυλίωσης τους, επιβεβαιώθηκε ότι η ολική πρωτεΐνη ήταν παρόμοια σε όλα τα εξεταζόμενα δείγματα (Εικ. 1.3 Β). Σύμφωνα με τα παραπάνω δεδομένα διαπιστώνεται ότι η φαινυλεφρίνη επάγει τη φωσφορυλίωση των ERK1/2, γεγονός που απαιτεί τη δράση των ΜΕΚ1/2, PKC, πρωτεϊνικών κινασών τυροσίνης και επιπλέον της PI3K Επίδραση της φαινυλεφρίνης στην ενεργοποίηση της p38 MAPK Παρά το γεγονός ότι οι διάφορες ισομορφές της p38 ΜΑΡΚ ενεργοποιούνται κατεξοχήν από ποικίλες μορφές κυτταρικού στρες, έχει αποδειχθεί ότι αποκρίνονται επίσης σε διάφορους αυξητικούς παράγοντες, μιτογόνα και αγωνιστές των συζευγμένων με G πρωτεΐνες υποδοχέων. Για τη μελέτη της p38 MAPK σε

76 67 p-erk1/2 (αυθαίρετες μονάδες) p-erk1/ PE ΜΑΡΤΥΡΑΣ PE GF * * PD * Genistein * PMA ERK1/2 PE (100 μμ) GF109203X (1μΜ) PD98059 (10 μμ) GENISTEIN (50 μμ) PMA (1 μμ) Εικ Επίδραση των αναστολέων GF109203X, PD98059 και Genistein στην επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση των ERK1/2. Οι φωσφορυλιωμένες ERK1/2 (επάνω), καθώς και τα ολικά επίπεδα τους (κάτω) ανιχνεύθηκαν σε δείγματα καρδιακών μυοκυττάρων που επωάστηκαν με (+) ή χωρίς (-) αναστολείς, παρουσία (+) ή απουσία (-) φαινυλεφρίνης. Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα που επωάστηκαν με ΡΜΑ για 5 λεπτά. Τα δεδομένα που προέκυψαν από την πυκνομετρική ανάλυση των φωσφορυλιωμένων ERK1/2 εκφράστηκαν ποσοτικά ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (ανοικτές στήλες: απουσία φαινυλεφρίνης, κλειστές στήλες: παρουσία φαινυλεφρίνης). Το πείραμα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. * P<0.05 σε σχέση με τα κύτταρα που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη απουσία αναστολέα. Fig Effect of GF109203X, PD98059 and Genistein on PE-induced phosphorylation of ERK1/2. Cells were either not exposed to inhibitors (-) or pretreated for 10 min (+) with GF109203X, PD98059 or Genistein. Then they were incubated in the absence of agonist (open bars) or in the presence of PE (solid bars). Cell extracts were immunoblotted for phospho-erk1/2 (top panel) or total ERK1/2 (bottom panel). Cardiomyocytes treated with PMA for 5 min were used as positive control. Immunoblots were quantified by laser scanning densitometry. Results are presented as means± SEM from four independent experiments. *P<0.05 significant inhibition of ERK1/2 phosphorylation compared with identically treated cells in the absence of inhibitors.

77 68 p-erk1/2 (αυθαίρετες μονάδες) * ΜΑΡΤΥΡΑΣ PE * 0 PE LY WORTMANN p-erk1/2 ERK1/2 PE (100 μμ) LY (100 μμ) WORTMANNIN (10 nm) Εικ Επίδραση των αναστολέων LY και Wortmannin στην επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση των ERK1/2. Οι φωσφορυλιωμένες ERK1/2 (επάνω), καθώς και τα ολικά επίπεδα τους (κάτω) ανιχνεύθηκαν σε δείγματα καρδιακών μυοκυττάρων που επωάστηκαν με (+) ή χωρίς (-) αναστολείς, παρουσία (+) ή απουσία (-) φαινυλεφρίνης. Τα δεδομένα που προέκυψαν από την πυκνομετρική ανάλυση των φωσφορυλιωμένων ERK1/2 εκφράστηκαν ποσοτικά ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (ανοικτές στήλες: απουσία φαινυλεφρίνης, κλειστές στήλες: παρουσία φαινυλεφρίνης). Το πείραμα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. * P<0.05 σε σχέση με τα κύτταρα που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη απουσία αναστολέα. Fig Effect of LY and Wortmannin on PE-induced phosphorylation of ERK1/2. Cells were either not exposed to inhibitors (-) or pretreated for 10 min (+) with LY or Wortmannin. Then they were incubated in the absence of agonist (open bars) or in the presence of PE (solid bars). Cell extracts were immunoblotted for phospho-erk1/2 (top panel) or total ERK1/2 (bottom panel). Immunoblots were quantified by laser scanning densitometry. Results are presented as means± SEM from four independent experiments. *P<0.05 significant inhibition of ERK1/2 phosphorylation compared with identically cells treated in the absence of inhibitors.

78 69 απομονωμένα καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου εφαρμόστηκε ανάλυση κατά Western και χρησιμοποιήθηκε αντίσωμα ειδικό για τη διπλά φωσφορυλιωμένη, στα αμινοξικά κατάλοιπα Thr180 και Tyr182, μορφή της κινάσης. Το χρονικό πρότυπο της ενεργοποίησης της p38 MAPK από τη φαινυλεφρίνη (100 μμ) διερευνήθηκε σε καρδιακά μυοκύτταρα που είχαν επωαστεί με τον αγωνιστή σε διάφορους χρόνους (1-30 λεπτά). Ακολούθησε λύση των κυττάρων και ανάλυση κατά Western σε 100 μgr ολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγμα. Διαπιστώθηκε ότι η φαινυλεφρίνη επάγει τη φωσφορυλίωση της p38 MAPK, με τη μέγιστη τιμή να εντοπίζεται στα 15 λεπτά διέγερσης (8.540±1.991 φορές σε σχέση με τις τιμές του μάρτυρα), ενώ τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της κινάσης παρέμειναν υψηλά ακόμα και μετά από 30 λεπτά επώασης με φαινυλεφρίνη (8.735±2.305 φορές σε σχέση με τις τιμές του μάρτυρα) (Εικ. 1.4 Α επάνω και Β). Ανάλυση κατά Western στα ίδια δείγματα με αντίσωμα εδικό για τα ολικά επίπεδα της κινάσης αποκάλυψε ότι η συνολική πρωτεΐνη ήταν παρόμοια στα εξεταζόμενα δείγματα (Εικ. 1.4 Α κάτω). Περαιτέρω μελέτη για την αποσαφήνιση των μηχανισμών που συμμετέχουν στη σηματοδοτική οδό της p38 MAPK στηρίχθηκε στη χρήση των αναστολέων SB203580, U0126, PD98059 και GF109203X. Στα πλαίσια των συγκεκριμένων πειραμάτων τα κύτταρα επωάστηκαν 10 λεπτά με τους εκάστοτε αναστολείς και στη συνέχεια με 100 μμ φαινυλεφρίνης για το χρονικό διάστημα που αντιστοιχεί στο μέγιστο της απόκρισης, στη συγκεκριμένη περίπτωση για 15 λεπτά. Το ιμιδαζόλιο SB χρησιμοποιείται ευρέως ως αναστολέας της ενζυμικής δραστικότητας της p38 ΜAPK σε διάφορους κυτταρικούς τύπους. Παρ όλα αυτά, στα απομονωμένα καρδιακά κύτταρα ενήλικου αρουραίου, ο αναστολέας SB203580, σε τελική συγκέντρωση 10 μμ, οδήγησε επιπλέον σε πλήρη καταστολή της φωσφορυλίωσης της p38 MAPK. Αντίθετα ο ειδικός για τις ΜΕΚ1/2, PD98059 (10 μμ) δεν επηρέασε τη φωσφορυλίωση της κινάσης από τη φαινυλεφρίνη. Παρόμοια ήταν και η δράση ενός επίσης ειδικού αναστολέα των ΜΕΚ1/2 που παρασκευάστηκε πρόσφατα και είναι γνωστός ως U0126 (10 μμ) (Εικ. 1.5 επάνω). Σύμφωνα με τα συγκεκριμένα αποτελέσματα αποκλείεται η συμμετοχή των ΜΕΚ1/2 στην ενεργοποίηση της p38 MAPK από τη φαινυλεφρίνη. Προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος της PKC στη συγκεκριμένη απόκριση, καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν με τον αναστολέα GF109203X (1 μμ). Διαπιστώθηκε ότι η αναστολή της PKC δεν επηρεάζει τη φωσφορυλίωση της p38 MAPK (Εικ. 1.5 επάνω). Για κάθε ένα από τους παραπάνω αναστολείς χρησιμοποιήθηκαν μάρτυρες στους οποίους τα κύτταρα επωάστηκαν με τους εκάστοτε χημικούς παράγοντες χωρίς επακόλουθη διέγερση με φαινυλεφρίνη. Επιπλέον, με τη χρήση αντισώματος που ανιχνεύει τα ολικά επίπεδα της κινάσης πιστοποιήθηκε ότι η μείωση στα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης p38 παρουσία των

79 70 A PE Χρόνος (λεπτά) p-p38 MAPK p38 MAPK B p-p38 MAPK (αυθαίρετες μονάδες) 125 * * * χρόνος (λεπτά) Εικ Χρονικό πρότυπο της φωσφορυλίωσης της p38 MAPK από φαινυλεφρίνη σε καρδιακά μυοκύτταρα αρουραίου. (Α) Μυοκύτταρα επωάστηκαν με 100 μμ φαινυλεφρίνης για τους αντίστοιχους χρόνους. Ακολούθησε ανοσοεντοπισμός της φωσφορυλιωμένης μορφής της κινάσης (πάνω), καθώς και των ολικών της επιπέδων (κάτω) σε 100 μg ολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων. (Β) Ποσοτική έκφραση των δεδομένων με πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών για τη φωσφορυλιωμένη p38 MAPK. Κάθε σημείο στο διάγραμμα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± τυπικό σφάλμα. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. * P<0.05 σε σχέση με το μάρτυρα. Fig Time course of p38 MAPK phosphorylation by PE in adult rat ventricular myocytes. (A) Myocytes were exposed to 100 μμ PE for the times indicated. Whole cell (100 μg) extracts were subjected to SDS/PAGE and immunoblotted with an antibody selective for phospho-p38 MAPK (top panel). An antibody against total p38 MAPK was used to verify equal protein loading (bottom panel). (B) Immunoblots were quantified by laser scanning densitometry for p38 phosphorylation. Results are presented as means± SEM from three independent experiments. * P<0.05 compared to control values

80 71 p-p38 MAPK (αυθαίρετες μονάδες) ΜΑΡΤΥΡΑΣ PE * p-p38 MAPK p38 MAPK 0 PE SB PD98059 GF109203X Uo126 PE (100 μμ) SB (10 μμ) PD98059 (10 μμ) GF109203X (1 μμ) U0126 (10 μμ) Εικ Επίδραση των αναστολέων SB203580, PD98059, GF109203X και U0126 στην επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση της p38 MAPK. Καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν με (+) ή χωρίς (-) αναστολείς παρουσία (+) ή απουσία (-) φαινυλεφρίνης. Ακολούθησε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα ειδικό για τη φωσφορυλιωμένη p38 MAPK (επάνω), ή για τα ολικά επίπεδα της (κάτω) και πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών για τη φωσφορυλιωμένη κινάση. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (ανοικτές στήλες: απουσία φαινυλεφρίνης, κλειστές στήλες: παρουσία φαινυλεφρίνης). Το πείραμα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. * P<0.05 σε σχέση με τα κύτταρα που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη απουσία αναστολέα. Fig Effect of SB203580, PD98059, GF109203X and U0126 on PE-induced phosphorylation of p38 MAPK. Cells were either not exposed to inhibitors (-) or pretreated for 10 min (+) with SB203580, PD98059, GF109203X, or U0126. Then they were incubated in the absence of agonist (open bars) or in the presence of PE (solid bars). Cell extracts were immunoblotted for phospho-p38 MAPK (top panel) or total p38 MAPK (bottom panel). Immunoblots were quantified by laser scanning densitometry. Results are presented as means± SEM from four independent experiments. *P<0.05 significant inhibition of p38 MAPK phosphorylation compared with cells identically treated in the absence of inhibitors.

81 72 αναστολέων οφείλεται πράγματι σε αλλαγές του βαθμού φωσφορυλίωσης της κινάσης και όχι σε ηλεκτροφόρηση διαφορετικής ολικής πρωτεΐνης (Εικ κάτω). Επιπρόσθετα πειράματα με Genistein (10 μμ) αποκάλυψαν ότι η αναστολή πρωτεϊνικών κινασών τυροσίνης μειώνει σημαντικά την επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση της p38 MAPK (Εικ. 1. 6). Αντίθετα, οι αναστολείς της PI3K, LY και Wortmannin, δεν επηρέασαν τη φωσφορυλίωση τη p38 MAPK (Εικ. 1.6). Έτσι γίνεται φανερό ότι η φωσφορυλίωση της p38 MAPK από τη φαινυλεφρίνη στα καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου επιτυγχάνεται μέσω πρωτεϊνικών κινασών τυροσίνης ενώ είναι ανεξάρτητη από την PKC, καθώς και από τις οδούς σηματοδότησης των ΜΕΚ1/2 και PI3K Υποκυτταρική κατανομή των ERK1/2 και p38 MAPK στα καρδιακά μυοκύτταρα αρουραίου Οι MAPKs αφού ενεργοποιηθούν, αλληλεπιδρούν με υποστρώματα τους, τα οποία εντοπίζονται τόσο στο κυτταρόπλασμα όσο και στον πυρήνα. Κατά συνέπεια η μελέτη της υποκυτταρικής κατανομής των κινασών στα καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου είχε ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Για το σκοπό αυτό διαχωρίστηκε το κυτταροπλασματικό και πυρηνικό κλάσμα από καρδιακά μυοκύτταρα κάτω από φυσιολογικές συνθήκες ή υπό την επίδραση φαινυλεφρίνης. Όπως διαπιστώνεται από τα αποτελέσματα της εικόνας 1.7 Α, οι φωσφορυλιωμένες μορφές των ERK1/2 παρουσιάζουν διαφορετική κατανομή στα δυο κυτταρικά διαμερίσματα. Συγκεκριμένα, οι φωσφορυλιωμένες ERK1 και ERK2 ανιχνεύθηκαν κυρίως στα κυτταροπλασματικά κλάσματα με το χαρακτηριστικό για την υποοικογένεια χρονικό πρότυπο φωσφορυλίωσης. Στην περίπτωση των πυρηνικών κλασμάτων, δεν εντοπίστηκαν διαφορές στα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης ERK1 ανάμεσα στα διάφορα δείγματα, ενώ παρατηρήθηκε αύξηση στη φωσφορυλίωση της ERK2 μετά από 2-5 λεπτά διέγερσης. Όσον αφορά στη p38 MAPK, η κατανομή της ανάμεσα στα δυο κυτταρικά διαμερίσματα ήταν διαφορετική από εκείνη των ERKs. Η φωσφορυλιωμένη μορφή της κινάσης ανιχνεύθηκε αποκλειστικά στα κυτταροπλασματικά κλάσματα ακολουθώντας το χαρακτηριστικό για τη p38 MAPK χρονικό πρότυπο φωσφορυλίωσης (Εικ. 1.7 Β πάνω). Ανάλυση κατά Western στα ίδια δείγματα με αντίσωμα ειδικό για τα ολικά επίπεδα της κινάσης αποκάλυψε ότι η p38 MAPK στα καρδιακά μυοκύτταρα είναι κατά κύριο λόγο κυτταροπλασματική ενώ μόλις ανιχνεύσιμα επίπεδα εντοπίζονται στον πυρήνα (Εικ. 1.7 Β κάτω). Η καθαρότητα των πυρηνικών κλασμάτων στα παραπάνω δείγματα, πιστοποιήθηκε με ανοσοεντοπισμό της ιστόνης 1 (Εικ. 1.7 Γ).

82 73 p-p38 MAPK (αυθαίρετες μονάδες) PE ΜΑΡΤΥΡΑΣ * PE Gen Wort PE LY p-p38 MAPK PE (100 μμ) GENISTEIN (50 μμ) LY (10 μμ) WORTMANNIN (100nM) Εικ Επίδραση των αναστολέων Genistein, LY και Wortmannin στην επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση της p38 MAPK. Καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν με (+) ή χωρίς (-) αναστολείς παρουσία (+) ή απουσία (-) φαινυλεφρίνης. Ακολούθησε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα ειδικό για τη φωσφορυλιωμένη p38 MAPK και πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (ανοικτές στήλες: απουσία φαινυλεφρίνης, κλειστές στήλες: παρουσία φαινυλεφρίνης). Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. * P<0.05 σε σχέση με τα κύτταρα που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη απουσία αναστολέα. Fig Effect of Genistein, LY and Wortmannin on PE-induced phosphorylation of p38 MAPK. Cells were either not exposed to inhibitors (-) or pretreated for 10 min (+) with Genistein, LY or Wortmannin. Then they were incubated in the absence of agonist (open bars) or in the presence of PE (solid bars). Cell extracts were immunoblotted for phospho-p38 MAPK and blots were quantified by laser scanning densitometry. Results are presented as means± SEM from three independent experiments. *P<0.05 significant inhibition of p38 MAPK phosphorylation compared with cells treated with PE in the absence of inhibitors.

83 A 74 ΡΕ ΡΕ Χρόνος (λεπτά) p-erk1/2 πυρήνας κυτταρόπλασμα B ΡΕ ΡΕ Χρόνος (λεπτά) p-p38 MAPK p38 MAPK πυρήνας κυτταρόπλασμα Γ Ιστόνη 1 πυρήνας κυτταρόπλασμα Εικ Υποκυτταρική κατανομή των ERK1/2 και p38 MAPK σε καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου. (Α) Ανίχνευση των φωσφορυλιωμένων ΕΡΚ1/2 (πάνω), σε πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα κυττάρων που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη για τους αντίστοιχους χρόνους. (Β) Ανίχνευση της φωσφορυλιωμένης μορφής της p38 MAPK (πάνω), καθώς και των ολικών της επιπέδων (κάτω), σε πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα κυττάρων που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη για τους αντίστοιχους χρόνους. (Γ) Στα ίδια δείγματα ανιχνεύθηκαν επίσης τα ολικά επίπεδα της ιστόνης 1. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Fig Subcellular localization of ERK1/2 and p38 MAPK in adult rat ventricular myocytes. (Α) Cytosolic and nuclear extracts from cardiomyocytes exposed to PE were immunoblotted for phosphorylated ERK1/2. (B) Cytosolic and nuclear extracts from cardiomyocytes exposed to PE were immunoblotted for phosphorylated (upper panel) and total (lower panel) p38 MAPK. (Γ) An antibody against total histone 1 was used to verify the nuclear extraction. Similar results were obtained from three independent experiments.

84 Επίδραση της φαινυλεφρίνης στην ενεργοποίηση των JNKs Προκειμένου να διερευνηθεί η ενεργοποίηση των JNKs από τη φαινυλεφρίνη στα απομονωμένα καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου, χρησιμοποιήθηκε πολυκλωνικό αντίσωμα, το οποίο αναγνωρίζει τις φωσφορυλιωμένες στα αμινοξικά κατάλοιπα Thr183/Tyr185 JNK1, JNK2 και JNK3. Για το σκοπό αυτό καρδιακά κύτταρα επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη για αυξανόμενους χρόνους από 1 έως 30 λεπτά. Ακολούθησε λύση και προετοιμασία ολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων. 100 μgr από κάθε δείγμα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση παρουσία SDS και ανάλυση κατά Western με το συγκεκριμένο αντίσωμα. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα της εικόνας 1.8, η φαινυλεφρίνη οδήγησε σε μικρή αύξηση των φωσφορυλιωμένων JNK1 και JNK2, η οποία υπολογίζεται ενδεικτικά για τα 15 λεπτά διέγερσης ίση με 2.290±1.138 φορές σε σχέση με τις τιμές του μάρτυρα για τη JNK1 (Εικ.1.8 Β) και 1.292±0.183 φορές σε σχέση με τις τιμές του μάρτυρα για τη JNK2 (Εικ.1.8 Γ). Επιπλέον επεξεργασία των δεδομένων οδήγησε στο συμπέρασμα ότι διέγερση των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων με φαινυλεφρίνη σε καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου δεν επιφέρει στατιστικά σημαντική αύξηση στα επίπεδα των φωσφορυλιωμένων JNK1/ Ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός της MSK1 (Mitogen and Stress activated Kinase 1) σε καρδιακά μυοκύτταρα αρουραίου Πρόσφατα, τρεις διαφορετικές ερευνητικές ομάδες (Deak και συν. 1998, Pierrat και συν. 1998, New και συν. 1999) ταυτοποίησαν μια πρωτεϊνική κινάση που αποτελεί υπόστρωμα των MAPKs. Η συγκεκριμένη κινάση, γνωστή ως MSK1 (Mitogen and stress activated kinase 1), ενεργοποιείται από διάφορες μορφές κυτταρικού στρες αλλά και από αυξητικούς παράγοντες. Για την ταυτοποίηση της MSK1 στα καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου έγινε προσπάθεια ανοσοκατακρήμνισης της κινάσης σε ολικά κυτταρικά εκχυλίσματα, με τη χρήση αντισώματος ειδικού για τα ολικά επίπεδα της. Έτσι, δείγματα καρδιακών μυοκυττάρων είτε κάτω από φυσιολογικές συνθήκες (μάρτυρας Μ) είτε υπό την επίδραση φαινυλεφρίνης (PE), επωάστηκαν με 3 μgr του συγκεκριμένου αντισώματος και μετά την κατακρήμνιση των ανοσοσυμπλόκων, για την οποία χρησιμοποιήθηκε αγαρόζη-πρωτεΐνη G, εξετάστηκε η παρουσία της MSK1, τόσο στο υπερκείμενο (Υ), όσο και στο ίζημα των δειγμάτων (Ι). Με αυτόν τον τρόπο εντοπίστηκε και ταυτοποιήθηκε μια ισομορφή της MSK1 με

85 76 A PE Χρόνος (λεπτά) p-jnk1/2 B Γ p-jnk1 (αυθαίρετες μονάδες) p-jnk2 (αυθαίρετες μονάδες) χρόνος (λεπτά) χρόνος (λεπτά) Εικ Χρονικό πρότυπο της φωσφορυλίωσης των JNK1/2 από φαινυλεφρίνη σε καρδιακά μυοκύτταρα αρουραίου. (Α) Μυοκύτταρα επωάστηκαν με 100 μμ φαινυλεφρίνης για τους αντίστοιχους χρόνους. Ακολούθησε ανοσοεντοπισμός των φωσφορυλιωμένων JNK1/2 σε 100 μg ολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων. Ποσοτική έκφραση των δεδομένων με πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών για τη φωσφορυλιωμένη JNK1 (Β) και JNK2 (Γ). Κάθε σημείο στο διάγραμμα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± τυπικό σφάλμα. Το πείραμα επαναλήφθηκε πέντε φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Fig Time course of JNK1/2 phosphorylation by PE in adult rat ventricular myocytes. (A) Myocytes were exposed to 100 μμ PE for the times indicated. Whole cell extracts (100 μg) were subjected to SDS/PAGE and immunoblotted with an antibody selective for phospho-jnk1/2. Immunoblots were quantified by laser scanning densitometry for JNK1 (B), or JNK2 (Γ) phosphorylation. Results are presented as means± SEM from five independent experiments.

86 A PE 77 MSK1 Υ Ι Υ Ι 83 KDa B Ser376 Thr581 Ser360 p-msk1 83 KDa PE Εικ Ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός της MSK1 σε απομονωμένα καρδιακά μυοκύτταρα υπό την επίδραση φαινυλεφρίνης. (Α) Ανοσοκατακρήμνιση και ανίχνευση με ανάλυση κατά Western της MSK1 στο υπερκείμενο (Υ) και στο ίζημα (Ι) δειγμάτων από καρδιακά μυοκύτταρα κάτω από φυσιολογικές συνθήκες και υπό την επίδραση φαινυλεφρίνης (10 λεπτά). (Β) Ανοσοεντοπισμός της φωσφορυλιωμένης στα κατάλοιπα Ser376, Thr581 και Ser360 κινάσης, σε 100 μg ολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Fig.1.9. Identification and phosphorylation of MSK1 in samples taken from adult rat ventricular myocytes. Cardiomyocytes were either left unstimulated or they were treated with PE for 10 min. (A) Total MSK1 was immunoprecipitated and immunoblotted both in supernatant (Υ) and pellet (Ι). (B) Whole cell extracts (100 μg) were immunoblotted for phospho-msk1 using an antibody that recognizes the kinase when phosphorylated at Ser360, Ser376 and Thr581. Similar results were obtained from three independent experiments μοριακή μάζα περίπου 90 kda, η οποία ανοσοκατακρημνίζεται σε ποσοστό που προσεγγίζει το 90% (Εικ. 1.9A). Η MSK1 περιλαμβάνει τέσσερις θέσεις φωσφορυλίωσης στο μόριο της οι οποίες έχουν καθοριστικό ρόλο στη δραστικότητα της. Για το χαρακτηρισμό της φωσφορυλίωσης της MSK1 υπό την επίδραση α 1 -αδρενεργικής διέγερσης, χρησιμοποιήθηκαν 3 διαφορετικά αντισώματα ειδικά για τις φωσφορυλιωμένες μορφές της κινάσης στις θέσεις Ser360, Ser376 και Thr581. Πιο αναλυτικά, καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη (100 μμ) για δέκα λεπτά, προετοιμάστηκαν ολικά κυτταρικά εκχυλίσματα και 100 μgr πρωτεΐνης από κάθε δείγμα ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου 8%. Ακολούθησε ανάλυση κατά Western για τον ανοσοεντοπισμό της κινάσης με τα παραπάνω αντισώματα.

87 78 (Εικ. 1.9 B). Διέγερση των καρδιακών μυοκυττάρων με φαινυλεφρίνη που, όπως προαναφέρθηκε, επάγει την ενεργοποίηση των ERKs και της p38 MAPK, προκάλεσε τη φωσφορυλίωση της MSK1 στα αμινοξικά κατάλοιπα Ser376 και Thr581. Αντίθετα, αντίσωμα έναντι της φωσφορυλιωμένης κινάσης στη θέση Ser360 αποκάλυψε ότι η κινάση δε φωσφορυλιώνεται στο συγκεκριμένο κατάλοιπο, κάτω από τις δεδομένες πειραματικές συνθήκες (Εικ. 1.9 Β) Επίδραση της φαινυλεφρίνης στην ενεργοποίηση της MSK1 Μετά την ταυτοποίηση της MSK1 στα απομονωμένα καρδιακά κύτταρα και τη διαπίστωση ότι η κινάση φωσφορυλιώνεται υπό την επίδραση φαινυλεφρίνης, εξετάστηκε το χρονικό πρότυπο ενεργοποίησης της κινάσης στις δεδομένες πειραματικές συνθήκες. Έτσι, καρδιακά κύτταρα επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη για αυξανόμενους χρόνους από 1 έως 30 λεπτά και ακολούθησε ανάλυση κατά Western με το αντίσωμα που ανιχνεύει τη φωσφορυλιωμένη στη Thr581 κινάση. Η μέγιστη τιμή φωσφορυλίωσης της MSK1 παρατηρήθηκε στα λεπτά επώασης με φαινυλεφρίνη (6.520± και 7.499±1.440 φορές σε σχέση με τις τιμές του μάρτυρα, αντίστοιχα), ενώ τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης κινάσης μειώθηκαν μετά από 30 λεπτά διέγερσης (Εικ Α επάνω, Β). Παράλληλα, με τη χρήση αντισώματος που ανιχνεύει τα ολικά επίπεδα της κινάσης πιστοποιήθηκε ότι οι συγκεκριμένες αυξομειώσεις στα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης MSK1 οφείλονται πράγματι σε αλλαγές του βαθμού φωσφορυλίωσης της κινάσης και όχι σε ηλεκτροφόρηση διαφορετικής ολικής πρωτεΐνης (Εικ Α κάτω). Παρόμοια αποτελέσματα προέκυψαν επίσης με τη χρήση αντισώματος που ανιχνεύει τη φωσφορυλιωμένη στη Ser376 MSK1. Προκειμένου να διερευνηθεί αν η φωσφορυλίωση της MSK1 υπό την επίδραση της φαινυλεφρίνης συνοδεύεται από αύξηση της ενζυμικής δραστικότητας της εφαρμόστηκε η πειραματική διαδικασία για τον προσδιορισμό της δραστικότητας κινάσης. Για το σκοπό αυτό καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη για αυξανόμενους χρόνους που κυμάνθηκαν από 2 έως 30 λεπτά. Ακολούθησε ανοσοκαθίζηση της κινάσης και προσδιορισμός της δραστικότητας της χρησιμοποιώντας [ 32 P]ATP και το πεπτίδιο Crosstide (Gly-Arg-Pro-Arg-Thr-Ser-Ser- Phe-Ala-Glu-Gly) ως υπόστρωμα. Η δραστικότητα της MSK1 υπό την επίδραση φαινυλεφρίνης παρουσίασε χρονικό πρότυπο παρόμοιο με εκείνο της φωσφορυλίωσης της (Εικ. 1.11). Ειδικότερα, το μέγιστο της απόκρισης εντοπίστηκε στα 10 λεπτά επώασης με φαινυλεφρίνη (2.515±0.180 σε σχέση με τις τιμές μάρτυρα), ενώ μετά από 30 λεπτά διέγερσης η δραστικότητα του ενζύμου επανήρθε στις τιμές του

88 A PE Χρόνος (λεπτά) p-msk1 83 KDa MSK1 83 KDa B p-msk1 (αυθαίρετες μονάδες) * * χρόνος (λεπτά) Εικ Επίδραση της φαινυλεφρίνης στη φωσφορυλίωση της MSK1 σε συνάρτηση με το χρόνο. (Α) Καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν με 100 μμ φαινυλεφρίνης για τους αντίστοιχους χρόνους. Ακολούθησε ανοσοεντοπισμός της φωσφορυλιωμένης στο κατάλοιπο Thr581 μορφή της κινάσης (πάνω), καθώς και των ολικών της επιπέδων (κάτω) σε 100 μg ολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων. (Β) Ποσοτική έκφραση των δεδομένων με πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών για τη φωσφορυλιωμένη MSK1. Κάθε σημείο στο διάγραμμα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± τυπικό σφάλμα. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. * P<0.05 σε σχέση με το μάρτυρα. Fig Time course of MSK1 phosphorylation by PE in adult rat ventricular myocytes. (A) Myocytes were exposed to 100 μμ PE for the times indicated. Whole cell extracts (100 μg) were immunoblotted with an antibody selective for phospho-msk1 at Τhr581 (top panel). An antibody against total MSK1 was used to verify equal protein loading (bottom panel). (B) Immunoblots were quantified by laser scanning densitometry for MSK1 phosphorylation. Results are presented as means± SEM from tree independent experiments. * P<0.05 compared to control values

89 80 δραστικότητα MSK1 (μunits/mg πρωτεινης) * * χρόνος (λεπτά) Εικ Χρονικό πρότυπο της ενζυμικής δραστικότητας της MSK1 υπό την επίδραση φαινυλεφρίνης σε καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου. Η δραστικότητα της MSK1 προσδιορίστηκε σε μυοκύτταρα που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη για τους αντίστοιχους χρόνους. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα της δραστικότητας της κινάσης στον αντίστοιχο χρόνο. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. * P<0.05 σε σχέση με το μάρτυρα. Fig Time course of MSK1 activation in response to PE in adult rat ventricular myocytes. Cardiomyocytes were exposed to PE for the times indicated. After cell lysis, MSK1 was immunoprecipitated and assayed as described in the experimental section. The data are expressed as mean±sem from three independent experiments. * P<0.05 compared to control values μάρτυρα (Εικ. 1.11). Σύμφωνα με τα παραπάνω δεδομένα διαπιστώνεται ότι η διέγερση των καρδιακών μυοκυττάρων με φαινυλεφρίνη οδηγεί σε αύξηση της φωσφορυλίωσης της MSK1, στα κατάλοιπα Ser376 και Thr581, που συνοδεύεται από αυξημένη δραστικότητα της κινάσης. Η φαινυλεφρίνη, αν και αποτελεί ειδικό αγωνιστή των α 1 -αδρενεργικών υποδοχέων, έχει αναφερθεί ότι σε τελική συγκέντρωση 100 μμ είναι δυνατό να συζευχθεί και με β-αδρενεργικούς υποδοχείς. Προκειμένου να διευκρινιστεί ο τύπος των υποδοχέων που ευθύνεται για την επαγωγή της ενεργοποίησης της MSK1 στα καρδιακά μυοκύτταρα χρησιμοποιήθηκε η πραζοσίνη (1μΜ) και η προπρανολόλη (2μΜ), ειδικοί ανταγωνιστές των α 1 - και β-αδρενεργικών υποδοχέων αντίστοιχα. Η φωσφορυλιωμένη στη Thr581 MSK1 ανιχνεύθηκε με ανάλυση κατά Western σε καρδιακά μυοκύτταρα που επωάστηκαν αρχικά με τους ανταγωνιστές των αδρενεργικών υποδοχέων και στη συνέχεια με φαινυλεφρίνη. Τα αποτελέσματα που φαίνονται στην εικόνα 1.12 δείχνουν ότι η πραζοσίνη ανέστειλε πλήρως τη

90 A 81 p-msk1 PE (100 μμ) ΠΡΑΖΟΣΙΝΗ (1 μμ) B p-msk1 PE (100 μμ) ΠΡΟΠΡΑΝΟΛΟΛΗ (2 μμ) Εικ Επίδραση αδρενεργικών ανταγωνιστών στην επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση της MSK1. Ανίχνευση της φωσφορυλιωμένης μορφής της κινάσης (Thr581) σε καρδιακά μυοκύτταρα που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη παρουσία πραζοσίνης (Α), ή προπρανολόλης (Β). Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Fig Effect of adrenergic antagonists on MSK1 phosphorylation by PE. Cardiomyocytes were treated with prazosin (A) or propranolol (B) in the presence of PE. MSK1 was immunoblotted using an antibody, which recognizes the kinase when phosphorylated at Thr581. Similar results were obtained from three independent experiments. φωσφορυλίωση της κινάσης, σε αντίθεση με την προπρανολόλη που δεν την επηρέασε καθόλου. Διαπιστώνεται λοιπόν ότι η επίδραση της φαινυλεφρίνης στην ενεργοποίηση της MSK1 επιτυγχάνεται μέσω των α 1 - και όχι μέσω των β- αδρενεργικών υποδοχέων Υποκυτταρική κατανομή της MSK1 στα καρδιακά μυοκύτταρα αρουραίου Προκειμένου να διερευνηθεί η κατανομή της φωσφορυλιωμένης MSK1 στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των καρδιακών μυοκυττάρων εφαρμόσθηκε κατάλληλο πρωτόκολλο για το διαχωρισμό κλασμάτων σε κύτταρα κάτω από φυσιολογικές συνθήκες ή υπό την επίδραση φαινυλεφρίνης. Όπως διαπιστώνεται από τα αποτελέσματα της εικόνας 1.13 Α η φωσφορυλιωμένη στη Thr581 μορφή της κινάσης ανιχνεύθηκε αποκλειστικά στα κυτταροπλασματικά κλάσματα ακολουθώντας το χαρακτηριστικό για τη MSK1 χρονικό πρότυπο φωσφορυλίωσης. Η καθαρότητα των κλασμάτων στα παραπάνω δείγματα, πιστοποιήθηκε με ανοσοεντοπισμό της ιστόνης 1 (Εικ B).

91 A ΡΕ ΡΕ Χρόνος (λεπτά) p-msk1 πυρήνας κυτταρόπλασμα B Ιστόνη 1 πυρήνας κυτταρόπλασμα Εικ Υποκυτταρική κατανομή της MSK1 σε καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου. (Α) Ανίχνευση της φωσφορυλιωμένης MSK1(Thr581) σε πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα κυττάρων που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη για τους αντίστοιχους χρόνους. (Β) Στα ίδια δείγματα ανιχνεύθηκαν επίσης τα ολικά επίπεδα της ιστόνης 1. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Fig Subcellular localization of MSK1 in adult rat ventricular myocytes. (Α) Cytosolic and nuclear extracts from cardiomyocytes exposed to PE, were also immunoblotted for phosphorylated MSK1 (Thr581). (B) An antibody against total histone 1 was used to verify the nuclear extraction. Similar results were obtained from three independent experiments Διερεύνηση των σηματοδοτικών οδών που συμμετέχουν στην ενεργοποίηση της MSK1 Μελέτες σε διαφορετικά πειραματικά μοντέλα αναφέρουν την MSK1 ως υπόστρωμα των MAPKs και ειδικότερα των υποοικογενειών των ERK1/2 και p38 MAPK (Deak και συν 1998, Arthur και Cohen 2000, Wiggin και συν. 2002). Ο ρόλος των συγκεκριμένων κινασών στη φωσφορυλίωση της MSK1 από τη φαινυλεφρίνη στα καρδιακά μυοκύτταρα διερευνήθηκε με τη χρήση των SB και PD98059 αναστολέων. Για το σκοπό αυτό καρδιακά μυοκύτταρα αρχικά επωάστηκαν με τους δεδομένους αναστολείς και στη συνέχεια με φαινυλεφρίνη για 10 λεπτά. Όπως φαίνεται στην εικόνα 1.14 Α η αναστολή της σηματοδοτικής οδού της p38 MAPK με τον SB (10 μμ) οδήγησε σε πλήρη καταστολή της φωσφορυλίωσης της MSK1 στη Thr581. Ανάλογη ήταν και η δράση του αναστολέα των ERK1/2, PD98059 (10 μμ), ο οποίος παρεμπόδισε πλήρως την επίδράση της φαινυλεφρίνης στην MSK1. Έτσι διαπιστώνεται ότι η φωσφορυλίωση της MSK1 απαιτεί τη δράση τόσο των ERK1/2,

92 83 A p-msk1 (αυθαίρετες μονάδες) p-msk PE SB PE ΜΑΡΤΥΡΑΣ * * PD98059 PE GF109203X * PE (100 μμ) SB (10 μμ) PD98059 (10 μμ) GF109203X (1 μμ) B p-msk1 (αυθαίρετες μονάδες) c pe Rp p-msk1 PE (100 μμ) RpcAMP (10 μμ) - - +

93 84 όσο και της p38 MAPK. Ο ρόλος της PKC στη συγκεκριμένη απόκριση μελετήθηκε με τη χρήση του GF109203X (1 μμ). Η επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση της MSK1 μειώθηκε σημαντικά υπό την επίδραση του GF109203X, γεγονός που κάνει αδιαμφισβήτητη τη συμμετοχή της PKC στη συγκεκριμένη οδό (Εικ Α). Αντίθετα, ο αναστολέας της ΡΚΑ (protein kinase A), RpcAMP (10 μμ), δεν επηρέασε τη φωσφορυλίωση της MSK1, αποκλείοντας τη συμμετοχή της ΡΚΑ στη συγκεκριμένη απόκριση (Εικ Β). Μια παράλληλη σειρά πειραμάτων έλαβε μέρος προκειμένου να αποσαφηνιστεί η συμμετοχή των ERK1/2 και της p38 MAPK στην επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη δραστικότητα της MSK1. Συγκεκριμένα, καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου επωάστηκαν με SB203580, ή PD98059, ή με συνδυασμό των δυο αναστολέων για 10 λεπτά. Ακολούθησε 10λεπτη διέγερση με φαινυλεφρίνη, ανοσοκατακρήμνιση της MSK1 και προσδιορισμός της δραστικότητα της. Οι αναστολείς SB και PD98059 οδήγησαν σε πλήρη καταστολή της ενζυμικής δραστικότητας της MSK1 στις περιπτώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ανεξάρτητα ο ένας από τον άλλον. Επιπλέον, συνδυασμός των δυο αναστολέων δεν οδήγησε σε περαιτέρω μείωση της δραστικότητας της κινάσης (Εικ. 1.15). Διαπιστώνεται λοιπόν ότι η επαγόμενη από φαινυλεφρίνη αύξηση της δραστικότητας της MSK1 απαιτεί την ενεργοποίηση τόσο των ERKs όσο και της p38 MAPK. Αντίθετα, η ενεργοποίηση της MSK1 από τη φαινυλεφρίνη δεν εξαρτάται από την PKA, καθώς ο RpcAMP δε επηρέασε την ικανότητα της κινάσης να φωσφορυλιώνει το πεπτίδιο crosstide (Εικ. 1.15). Εικ Επίδραση των αναστολέων SB203580, PD98059, GF109203X και RpcAMP στην επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση της MSK1. Καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν με (+) ή χωρίς (-) αναστολείς παρουσία (+) ή απουσία (-) φαινυλεφρίνης. Ακολούθησε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα ειδικό για τη φωσφορυλιωμένη MSK1 (Thr581) και πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (ανοικτές στήλες: απουσία φαινυλεφρίνης, κλειστές στήλες: παρουσία φαινυλεφρίνης). Το πείραμα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. * P<0.05 σε σχέση με τα κύτταρα που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη απουσία αναστολέα. Fig Effect of SB203580, PD98059, GF109203X and RpcAMP on PE-induced phosphorylation of MSK1. Cells were either not exposed to inhibitors (-) or pretreated for 10 min (+) with the compounds indicated. Then they were incubated in the absence of agonist (open bars) or in the presence of PE (solid bars). Cell extracts were immunoblotted for phospho-msk1 (Thr581) and blots were quantified by laser scanning densitometry. Results are presented as means± SEM from four independent experiments. *P<0.05 significant inhibition of MSK1 phosphorylation compared with identically treated cells in the absence of inhibitors.

94 85 δραστικότητα MSK1 (μunits/mg πρωτεινης) * * * 0 C PE SB PD SB+PD Rp Εικ Επίδραση των αναστολέων SB203580, PD980 και RpcAMP στην ενζυμική δραστικότητα της MSK1. Η δραστικότητα της MSK1 προσδιορίστηκε, σε καρδιακά μυοκύτταρα που επωάστηκαν αρχικά με SB (SB), PD98059 (PD), με συνδυασμό των δυο αναστολέων (SB+PD), ή με RpcAMP (Rp) και στη συνέχεια με φαινυλεφρίνη. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα της δραστικότητας της κινάσης στην αντίστοιχη συνθήκη. * P<0.05 σε σχέση με τη δραστικότητα της κινάσης σε κύτταρα που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη απουσία αναστολέα. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Fig Effect of SB203580, PD98059 and RpcAMP on PE-induced MSK1 activation. Cardiomyocytes were exposed to SB (SB), PD98059 (PD), both inhibitors (SB+PD), or RpcAMP (Rp) followed by stimulation with PE. MSK1 was immunoprecipitated and assayed as described in the experimental section. The data are expressed as mean±sem from three independent experiments. *P<0.05 significant inhibition of MSK1 activity compared with identically treated cells in the absence of inhibitors Διερεύνηση αναστολέων ειδικών για την MSK1 Οι πληροφορίες σχετικά με το φυσιολογικό ρόλο της MSK1 είναι ιδιαίτερα περιορισμένες, γεγονός που κατά ένα μεγάλο ποσοστό οφείλεται στην έλλειψη κάποιου αναστολέα ειδικού για τη συγκεκριμένη πρωτεϊνική κινάση. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες χαρακτηρίζουν τους Ro και H89 ως ισχυρούς αναστολείς της MSK1 (Deak και συν 1998, Caivano και Cohen 2000). Προκειμένου να διερευνηθεί η ειδικότητα των συγκεκριμένων χημικών παραγόντων στο δεδομένο πειραματικό μοντέλο, καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν αρχικά με Ro (5μΜ) ή H89 (25 μμ) και στη συνέχεια, με φαινυλεφρίνη για 10 λεπτά. Ανάλυση κατά Western για τη φωσφορυλιωμένη στη Thr581 μορφή της MSK1 αποκάλυψε ότι οι συγκεκριμένοι αναστολείς δεν επηρεάζουν τη φωσφορυλίωση της κινάσης από τη φαινυλεφρίνη (Εικ Α). Επιπλέον, παρόμοια ήταν τα αποτελέσματα όταν ο Η89 χρησιμοποιήθηκε σε τελική συγκέντρωση 10 μμ (Εικ Β). Έτσι αποδεικνύεται

95 86 A p-msk1 (αυθαίρετες μονάδες) c pe Ro H89 p-msk1 PE (100 μμ) Ro (5 μμ) Η89 (25 μμ) B p-msk1 PE (100 μμ) Η89 (10 μμ) Εικ Επίδραση των αναστολέων Ro και H89 στην επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση της MSK1. Η φωσφορυλιωμένη κινάση (Thr581) ανιχνεύθηκε σε καρδιακά μυοκύτταρα κάτω από φυσιολογικές συνθήκες και σε δείγματα που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη παρουσία των αναστολέων Ro (5μΜ) ή H89 (25 μμ) (Α) και Η89 (10 μμ) (Β). Ακολούθησε πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών και ποσοτική έκφραση των δεδομένων. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Fig Effect of Ro and H89 on PE-induced phosphorylation of MSK1. Cells were either not exposed to inhibitors (-) or pretreated for 10 min (+) with Ro (5μΜ) or H89 (25 μμ) (Α) and Η89 (10 μμ) (B). Then they were incubated in the absence of agonist or in the presence of PE. Cell extracts were immunoblotted for phospho-msk1 (Τhr581). Blots were quantified by laser scanning densitometry. Results are presented as means± SEM from three independent experiments

96 87 δραστικότητα MSK1 (μunits/mg πρωτεινης) * * 0 c pe ro ro* h89 h89* ΠΡΟΕΠΩΑΣΗ - - Ro - H89 - PE (100 μμ) Ro (5 μμ) H89 (25 μμ) Εικ Επίδραση των αναστολέων Ro και H89 στην ενζυμική δραστικότητα της MSK1. Η δραστικότητα της MSK1 προσδιορίστηκε απουσία αναστολέα, σε μυοκύτταρα που προεπωάστηκαν με Ro (Ro) ή H89 και στη συνέχεια με φαινυλεφρίνη. Επιπλέον, μετρήσεις της δραστικότητας της κινάσης έγιναν παρουσία των Ro ή H89 σε κύτταρα που είχαν επωαστεί με φαινυλεφρίνη. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. * P<0.05 σε σχέση με τη δραστικότητα της κινάσης σε κύτταρα που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη απουσία αναστολέα. Fig Effect of Ro and H89 on PE-induced MSK1 activation. Cardiomyocytes were pretreated with Ro (Ro) or H89 followed by stimulation with PE. MSK1 was immunoprecipitated and assayed as described in the experimental section. The kinase activity was also assayed in PEstimulated cells with Ro or H89 added directly to the immunoprecipitated MSK1-crosstide reaction. The data are expressed as mean±sem from three independent experiments. *P<0.05 significant inhibition of MSK1 activity compared with identically treated cells in the absence of inhibitors. ότι πρόκειται για δυο αναστολείς, οι οποίοι στις δεδομένες τελικές συγκεντρώσεις δεν επεμβαίνουν στη σηματοδοτική οδό που φωσφορυλιώνει την MSK1. Περαιτέρω μελέτη για τη διερεύνηση της δράσης των Ro και H89 στηρίχθηκε στον προσδιορισμό της ενζυμικής δραστικότητας της MSK1. Για το σκοπό αυτό, καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν με Ro (5μΜ) ή H89 (25 μμ) για 10 λεπτά. Ακολούθησε διέγερση με φαινυλεφρίνη για 10 λεπτά, ανοσοκαθίζηση και προσδιορισμός της δραστικότητας της κινάσης απουσία αναστολέα. Η ενζυμική δραστικότητα της MSK1 δε μειώθηκε κάτω από τις δεδομένες πειραματικές συvθήκες, επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα της φωσφορυλίωσης και την υπόθεση σύμφωνα με την οποία οι Ro και Η89 δεν αναστέλλουν καμία κινάση στην οδό που οδηγεί στην ενεργοποίηση της MSK1 (Εικ. 1.17). Ωστόσο, παρατηρήθηκε πλήρης καταστολή της δραστικότητας της MSK1 όταν αυτή προσδιορίστηκε

97 88 παρουσία των συγκεκριμένων αναστολέων (Εικ. 1.17). Σε αυτή την περίπτωση, καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη για 10 λεπτά και η δραστικότητα της κινάσης μετρήθηκε παρουσία 5 μμ Ro ή 25 μμ H89. Σύμφωνα με αυτά τα δεδομένα, οι Ro και Η89 αποτελούν ισχυρούς αναστολείς της ενζυμικής δραστικότητας της MSK Επίδραση της φαινυλεφρίνης στην ενεργοποίηση του CREB (camp Responsive element binding protein) Ο μεταγραφικός παράγοντας CREB (camp responsive element binding protein), αρχικά αναγνωρίσθηκε ως πρωτεΐνη-στόχος της οδού του camp, γρήγορα όμως διαπιστώθηκε ότι συμμετέχει στη μεταγωγή μηνυμάτων από ποικίλα ερεθίσματα (Shaywitz και Greenberg 1999). Έτσι, στα πλαίσια της παρούσας μελέτης ελέγχθηκε αν ο συγκεκριμένος μεταγραφικός ενεργοποιείται από τη φαινυλεφρίνη στα καρδιακά μυοκύτταρα. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε αντίσωμα που ανιχνεύει τη φωσφορυλιωμένη στη Ser133 μορφή του CREB Επίδραση της φαινυλεφρίνης στη φωσφορυλίωση του CREB Η μελέτη του χρονικού πρότυπου φωσφορυλίωσης του μεταγραφικού παράγοντα έγινε σε δείγματα καρδιακών μυοκυττάρων που επωάστηκαν με τον αγωνιστή για διάφορους χρόνους. Ακολούθησε λύση των κυττάρων και προετοιμασία πυρηνικών κλασμάτων. 20 μgr πρωτεΐνης από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western με το συγκεκριμένο αντίσωμα. Διαπιστώθηκε ότι η φαινυλεφρίνη επάγει τη φωσφορυλίωση του CREB, η οποία ανιχνεύθηκε μετά από 5 λεπτά (6.193±1.170 φορές σε σχέση με τις τιμές του μάρτυρα), μεγιστοποιήθηκε στα 15 λεπτά διέγερσης με φαινυλεφρίνη (8.900±1,630 φορές σε σχέση με τις τιμές του μάρτυρα), ενώ ακολούθησε βαθμιαία μείωση με πλήρη επαναφορά στις τιμές του μάρτυρα μετά από 30 λεπτά επώασης (Εικ Α επάνω, Β). Προκειμένου να διευκρινιστεί ο τύπος των υποδοχέων που ευθύνεται για τη φωσφορυλίωση του CREB από τη φαινυλεφρίνη στα καρδιακά μυοκύτταρα, χρησιμοποιήθηκε η πραζοσίνη (1μΜ) και η προπρανολόλη (2μΜ). Όπως φαίνεται στα αποτελέσματα της εικόνας 1.19, τόσο η πραζοσίνη όσο και η προπρανολόλη προκάλεσαν μερική καταστολή της φωσφορυλίωσης του CREB όταν χρησιμοποιήθηκαν ανεξάρτητα. Αντίθετα, συνδυασμός των δυο αδρενεργικών ανταγωνιστών είχε ως αποτέλεσμα την πλήρη επαναφορά της φωσφορυλίωσης στα επίπεδα του μάρτυρα (Εικ.1.19). Έτσι σύμφωνα με τα συγκεκριμένα δεδομένα, η

98 89 A PE Χρόνος (λεπτά) p-creb 47.5 KDa B p-creb (αυθαίρετες μονάδες) * * * χρόνος (λεπτά) Εικ Επίδραση της φαινυλεφρίνης στη φωσφορυλίωση του CREB σε συνάρτηση με το χρόνο. (Α) Καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν με 100 μμ φαινυλεφρίνης για τους αντίστοιχους χρόνους. Ακολούθησε ανοσοεντοπισμός της φωσφορυλιωμένης μορφής (Ser133) του μεταγραφικού παράγοντα σε 20 μg πυρηνικών κλασμάτων (Β) Ποσοτική έκφραση των δεδομένων με πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών για το φωσφορυλιωμένο CREB. Κάθε σημείο στο διάγραμμα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο ± τυπικό σφάλμα. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. * P<0.05 σε σχέση με το μάρτυρα. Fig Time course of CREB phosphorylation by PE in adult rat ventricular myocytes. (A) Myocytes were exposed to 100 μμ PE for the times indicated. Nuclear cell extracts (20 μg) were immunoblotted with an antibody selective for phospho-creb at Ser133. (B) Immunoblots were quantified by laser scanning densitometry for CREB phosphorylation. Results are presented as means± SEM from tree independent experiments. * P<0.05 compared to control values

99 90 p-creb (αυθαίρετες μονάδες) * # * # * 0 p-creb c PE praz prop praz+prop PE (100 μμ) ΠΡΑΖΟΣΙΝΗ (1 μμ) ΠΡΟΠΡΑΝΟΛΟΛΗ (2 μμ) Εικ Eπίδραση αδρενεργικών ανταγωνιστών στην επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση του CREB. Ανίχνευση της φωσφορυλιωμένης μορφής του μεταγραφικού παράγοντα σε πυρηνικά κλάσματα καρδιακών μυοκυττάρων που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη παρουσία προπρανολόλης, πραζοσίνης, ή με συνδυασμό των δυο αδρενεργικών ανταγωνιστών. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα. Το πείραμα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές με παρόμοια αποτελέσματα.* P<0.05 σε σχέση με κύτταρα που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη απουσία ανταγωνιστή. # P<0.05 σε σχέση με τις τιμές του μάρτυρα. Fig Effect of adrenergic antagonists on CREB phosphorylation by PE. Cardiomyocytes were treated with propranolol, prazosin or both antagonists in the presence of PE. CREB was immunoblotted and the blots were quantified by laser scanning densitometry. Similar results were obtained from four independent experiments.*p<0.05 significant inhibition of CREB phosphorylation compared with identically treated cells in the absence of antagonists. # P<0.05 compared to control values. φωσφορυλίωση του CREB από τη φαινυλεφρίνη στα καρδιακά μυοκύτταρα επιτυγχάνεται μέσω των α 1 - και β-αδρενεργικών υποδοχέων. Μελέτες σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους αναφέρουν τον CREB ως πιθανό υπόστρωμα της MSK1. Για τη διερεύνηση της συγκεκριμένης υπόθεσης στα καρδιακά μυοκύτταρα χρησιμοποιήθηκαν οι Ro (5 μμ) και Η89 (25 μμ) που αποδείχτηκαν ότι είναι εξειδικευμένοι αναστολείς της MSK1 στο δεδομένο πειραματικό μοντέλο (Εικ. 1.20). Ανάλυση κατά Western σε δείγματα κυττάρων που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη παρουσία του Ro318220, αποκάλυψε ότι στις

100 91 δεδομένες πειραματικές συνθήκες η φωσφορυλίωση του CREB από τη φαινυλεφρίνη αναστέλλεται μόνο μερικώς (Εικ. 1.20). Παρόμοια ήταν και η δράση του εξίσου ειδικού αναστολέα της MSK1, H89 (Εικ. 1.20). Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν τη συμμετοχή της MSK1 στη φωσφορυλίωση του CREB. Επιπλέον, αποδεικτικά στοιχεία για τη συμμετοχή των ERK1/2 και της p38 MAPK στη φωσφορυλίωση του CREB προέκυψαν από πειράματα με τους SB (10 μμ) και PD98059 (10 μμ). Γι αυτό το σκοπό, χρησιμοποιήθηκαν πυρηνικά κλάσματα κυττάρων που επωάστηκαν με καθένα από τους αναστολείς ανεξάρτητα ή και με τους δυο. Σε κάθε περίπτωση, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση στη φωσφορυλίωση του CREB από τη φαινυλεφρίνη, αλλά ένα επίσης στατιστικά σημαντικό ποσοστό του μεταγραφικού παράγοντα παρέμεινε φωσφορυλιωμένο (Εικ. 1.20). Ο ρόλος της PKC στη συγκεκριμένη απόκριση μελετήθηκε με τη χρήση του GF109203X. Η επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση του CREB μειώθηκε μερικώς υπό την επίδραση του GF109203X, αποδεικνύοντας τη συμμετοχή της PKC στη δεδομένη σηματοδοτική οδό (Εικ. 1.21). Η επίδραση της φαινυλεφρίνης στα καρδιακά μυοκύτταρα περιλαμβάνει επίσης το μονοπάτι του camp. Πιο αναλυτικά, ο συγκεκριμένος αγωνιστής σε τελική συγκέντρωση 100 μμ συνδέεται με τους β-αδρενεργικούς υποδοχείς με αποτέλεσμα τη διέγερση της αδενυλικής κυκλάσης και την ενεργοποίηση της PKA. Έτσι, η μελέτη για την αποσαφήνιση των ενδοκυτταρικών μηχανισμών που συμμετέχουν στην ενεργοποίηση του CREB επικεντρώθηκε στη διερεύνηση του ρόλου της PKA. Ανάλυση κατά Western σε πυρηνικά κλάσματα κυττάρων που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη παρουσία του RpcAMP (10 μμ) αποκάλυψε ότι η αναστολή της ΡΚΑ οδηγεί σε μερική αναστολή της φωσφορυλίωσης του CREB (Εικ. 1.21). Επιπλέον διαπιστώθηκε ότι η φορσκολίνη, ένας ενεργοποιητής της αδενυλικής κυκλάσης και κατ επέκταση της οδού του camp, επάγει τη φωσφορυλίωση του CREB (2.139±0.309 φορές σε σχέση με τις τιμές του μάρτυρα) σε μικρότερο όμως βαθμό συγκριτικά με τη φαινυλεφρίνη (Εικ. 1.21). Συνοψίζοντας τα παραπάνω αποτελέσματα, διαπιστώνεται ότι η φωσφορυλίωση του CREB υπό την επίδραση φαινυλεφρίνης στα καρδιακά μυοκύτταρα επιτυγχάνεται με τη διαμεσολάβηση των ERK1/2, p38 MAPK, MSK1 και ΡΚΑ. Μελέτες σε διαφορετικά πειραματικά μοντέλα αναφέρουν ότι η φωσφορυλίωση του CREB στη σερίνη133 εξαρτάται επίσης από Ca +2 -εξαρτώμενες οδούς μεταγωγής μηνυμάτων. Προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος των ιόντων Ca +2, καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν με το χηλικό παράγοντα BAPTA (10μΜ) για 15 λεπτά πριν από τη διέγερση τους με φαινυλεφρίνη. Όπως φαίνεται στην εικόνα 1.21, η ρύθμιση

101 92 p-creb (αυθαίρετες μονάδες) * # * # * # * # * # 0 C PE Ro H89 C PE SB PD SB+PD p-creb PE (100 μμ) Ro (5 μμ) H89 (25 μμ) SB (10 μμ) PD98059 (10 μμ) Εικ Επίδραση των αναστολέων Ro318220, H89, SB και PD98059 στην επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση του CREB. Καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν με (+) ή χωρίς (-) αναστολείς παρουσία (+) ή απουσία (-) φαινυλεφρίνης. Ακολούθησε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα ειδικό για τον φωσφορυλιωμένο CREB και πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα. Το πείραμα επαναλήφθηκε 5-8 φορές με παρόμοια αποτελέσματα.* P<0.05 σε σχέση με τα κύτταρα που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη απουσία αναστολέα # P<0.05 σε σχέση με τις τιμές του μάρτυρα. Fig Effect of Ro318220, H89, SB and PD98059 on PE-induced phosphorylation of CREB. Cells were either not exposed to inhibitors (-) or pretreated for 10 min (+) with the compounds indicated. Then they were incubated in the absence of agonist (-) or in the presence of PE (+). Nuclear extracts were immunoblotted for phospho-creb and blots were quantified by laser scanning densitometry. Results are presented as means± SEM from 5-8 independent experiments. *P<0.05 significant inhibition of CREB phosphorylation compared with PE-stimulated cells # P<0.05 compared to control values.

102 93 p-creb (αυθαίρετες μονάδες) * # * # # 0 C PE GF Rp Bapta For p-creb PE (100 μμ) GF109203X (1 μμ) RpcAMP (10 μμ) BAPTA (10 μμ) FORSKOLIN (10 μμ) Εικ Επίδραση των GF109203X, RpcAMP, BAPTA και φορσκολίνη στην επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη φωσφορυλίωση του CREB. Καρδιακά μυοκύτταρα επωάστηκαν με τους αντίστοιχους αναστολείς για 10 λεπτά, παρουσία (+) ή απουσία (-) φαινυλεφρίνης. Ακολούθησε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα ειδικό για τον φωσφορυλιωμένο CREB και πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα.* P<0.05 σε σχέση με τα κύτταρα που επωάστηκαν αποκλειστικά με φαινυλεφρίνη # P<0.05 σε σχέση με τις τιμές του μάρτυρα. Fig Effect of GF109203X, RpcAMP, BAPTA and Forskolin on PE-stimulated CREB phosphorylation. Cells were either not exposed to inhibitors or pretreated for 10 min with the compounds indicated. Then they were incubated in the absence of agonist (-) or in the presence of PE (+). Nuclear extracts were immunoblotted for phospho-creb and blots were quantified by laser scanning densitometry. Results are presented as means± SEM from 3 independent experiments. *P<0.05 significant inhibition of CREB phosphorylation compared with PE-stimulated cells # P<0.05 compared to control values.

103 94 του ενδοκυτταρικού ασβεστίου στα καρδιακά μυοκύτταρα δεν επηρέασε τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης μορφής του CREB Επίδραση της φαινυλεφρίνης στη σύνδεση του CREB με το DNA Ο μεταγραφικός παράγοντας CREB ρυθμίζει τη έκφραση ποικίλων γονιδίων συνδεόμενος με την ακολουθία CRE (TGACGTCA) στον υποκινητή τους. Προκείμενου να διερευνηθεί η επίδραση της φαινυλεφρίνης στην ικανότητα σύνδεσης του CREB με την ακολουθία CRE εφαρμόστηκε η μέθοδος EMSA (electrical mobility shift assay), όπως περιγράφηκε στις Μεθόδους με τη χρήση ενός συνθετικού δίκλωνου ολιγονουκλεοτιδίου που περιλαμβάνει την εν λόγω ακολουθία. Επώαση πυρηνικών κλασμάτων από καρδιακά μυοκύτταρα με το σημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο οδήγησε στο σχηματισμό αρκετών συμπλόκων όπως διαπιστώθηκε μετά την ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου (Εικ 1.22). Η διέγερση των κύτταρων με φαινυλεφρίνη για 10 λεπτά προκάλεσε αύξηση στην ένταση της ζώνης με τη μικρότερη ηλεκτροφορητική ταχύτητα (Εικ 1.22, ένδειξη CREB, 1 η και 2 η διαδρομή). Σε πειράματα ανταγωνισμού που χρησιμοποιήθηκε περίσσεια (100x) μη σημασμένου ολιγονουκλεοτιδίου η συγκεκριμένη ζώνη εξαφανίστηκε, γεγονός που αποδεικνύει ότι πρόκειται για σύμπλοκο με την ακολουθίας CRE (Εικ 1.22, 4 η διαδρομή). Επιπλέον αποδεικτικά στοιχεία ότι η συγκεκριμένη ζώνη αντιστοιχεί σε σύμπλοκο του CREB προέκυψαν από πειράματα στα οποία χρησιμοποιήθηκε αντίσωμα εδικό για τον μεταγραφικό παράγοντα. Στην περίπτωση αυτή πυρηνικά κλάσματα επωάστηκαν με το αντίσωμα για 1 ώρα και στη συνέχεια προστέθηκε η σημασμένη ακολουθία. Ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων και επακόλουθη αυτοραδιογραφία αποκάλυψε ότι το αντίσωμα επιβράδυνε τη μετατόπιση της συγκεκριμένης ζώνης στο πήκτωμα ακρυλαμιδίου, ενισχύοντας την άποψη ότι πρόκειται για σύμπλοκο του CREB με το σημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο (Εικ. 1.22, 3 η διαδρομή, supershift). Διαπιστώνεται λοιπόν ότι η φαινυλεφρίνη επάγει τη σύνδεση του CREB με την ακολουθία CRE στα απομονωμένα καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου. Για τη μελέτη της επίδρασης της φαινυλεφρίνης σε συνάρτηση με το χρόνο, χρησιμοποιήθηκαν πυρηνικά κλάσματα καρδιακών κυττάρων που επωάστηκαν με τον αγωνιστή για διάφορους χρόνους. Η σύνδεση του CREB στα σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια παρουσίασε χρονικό πρότυπο (Εικ 1.23), ανάλογο με εκείνο της φωσφορυλίωσης του μεταγραφικού παράγοντα που προέκυψε από την ανάλυση κατά Western (Εικ 1.19). Ειδικότερα, η μέγιστη τιμή της απόκρισης εντοπίστηκε στα 10 λεπτά επώασης με φαινυλεφρίνη, ενώ μετά από 20 λεπτά διέγερσης ακολούθησε φθίνουσα πορεία.

104 95 supershift CREB μη ειδικά σύμπλοκα σημασμένο CRE πυρηνικά κλάσματα ΡΕ (100 μμ) αντίσωμα CREB μη σημασμένο CRE Εικ Επαγόμενη από φαινυλεφρίνη σύνδεση του CREB με την ακολουθία CRE στα καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου. Η ικανότητα του μεταγραφικού παράγοντα να προσδένεται στο DNA προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο EMSA σε πυρηνικά κλάσματα καρδιακών κυττάρων κάτω από φυσιολογικές συνθήκες ή υπό την επίδραση της φαινυλεφρίνης. Χαρακτηριστικό αυτοραδιογράφημα όπου διακρίνεται η ζώνη που αντιστοιχεί στα σύμπλοκα του παράγοντα με τη σημασμένη ακολουθία (ένδειξη: CREB), μη ειδικές ζώνες (ένδειξη: μη ειδικά σύμπλοκα), η επίδραση μη σημασμένης CRE (4 η διαδρομή) και η μείωση στην ηλεκτροφορητική ταχύτητα του συμπλόκου που προκαλεί αντίσωμα ειδικό για τα ολικά επίπεδα του CREB (ένδειξη: supershift, 3 η διαδρομή). Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Fig PE-induced CREB -binding activity in adult rat ventricular myocytes. CREB -binding activity was assayed in cardiomyocytes that were untreated or exposed to PE for 10 min. Representative EMSA showing the CRE-binding complex (middle arrow, CREB), nonspecific binding (lower arrow), the position of the band supershifted by anti-creb antibody (upper arrow, 3 rd lane) and the effect of a 100x molar excess of unlabelled oligo (4 th lane). Similar results were obtained from three independent experiments.

105 96 PE CREB Χρόνος (λεπτά) Εικ Χρονικό πρότυπο σύνδεσης του CREB με την ακολουθία CRE υπό την επίδραση φαινυλεφρίνης στα καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου. Η ικανότητα του μεταγραφικού παράγοντα να προσδένεται στο DNA προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο EMSA σε πυρηνικά κλάσματα καρδιακών κυττάρων που επωάστηκαν με φαινυλεφρίνη για τους αντίστοιχους χρόνους. Χαρακτηριστικό αυτοραδιογράφημα όπου διακρίνεται η ζώνη που αντιστοιχεί στα σύμπλοκα του CREB με τη σημασμένη ακολουθία (ένδειξη: CREB). Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Fig Time course of CREB-binding activity in response to PE in adult rat ventricular myocytes. CREB -binding activity was assayed in cardiomyocytes that were exposed to PE for the times indicated. Representative EMSA showing the PE-induced CRE-binding complex (CREB). Similar results were obtained from three independent experiments.

106 97 Η περαιτέρω διερεύνηση για την αποσαφήνιση των ενδοκυτταρικών μηχανισμών που συμμετέχουν στη συγκεκριμένη απόκριση στηρίχθηκε στη χρήση αναστολέων εδικών για διάφορες κινάσες. Στην περίπτωση αυτή προετοιμάστηκαν πυρηνικά κλάσματα από καρδιακά μυοκύτταρα που επωάστηκαν με SB20580 (10 μμ) ή PD98059 (10 μμ) και στη συνέχεια με φαινυλεφρίνη για 10 λεπτά. Η επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη σύνδεση του CREB με τα σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια μειώθηκε υπό την επίδραση του SB (Εικ 1.24), ο οποίος όπως προαναφέρθηκε αναστέλλει πλήρως την ενεργοποίηση της p38 MAPK. Παρόμοια ήταν και η δράση του αναστολέα της οδού των ERK1/2, PD98059 (Εικ 1.24). Διαπιστώνεται λοιπόν ότι η ικανότητα σύνδεσης του CREB με την ακολουθία CRE στα καρδιακά μυοκύτταρα, υπό την επίδραση της φαινυλεφρίνης, εξαρτάται από την ενεργοποίηση των ERK1/2 και p38 MAPK. Επιπλέον, αναστολή της MSK1 από τον Ro (5 μμ) οδήγησε σε μείωση της πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα με τα σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια (Εικ 1.24). Εξάλλου, η επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη σύνδεση του CREB με το ολιγονουκλεοτίδιο μειώθηκε σε πειράματα στα οποία χρησιμοποιήθηκε ο αναστολέας Η89 (25μΜ) (Εικ 1.25). Τα αποτελέσματα αυτά αποδεικνύουν τη συμμετοχή της MSK1 στη σηματοδοτική οδό που οδηγεί σε ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα Παράλληλα, διερευνήθηκε αν η επίδραση της φαινυλεφρίνης στο CREB εξαρτάται από την οδό σηματοδότησης του camp, το οποίο κινητοποιείται μέσω των β- αδρενεργικών υποδοχέων. Αναστολή της PKA από τον εδικό RpcAMP (10 μμ) μείωσε το σχηματισμό συμπλόκων του CREB με το σημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο, ενισχύοντας την άποψη για συμμετοχή της κινάσης στη συγκεκριμένη απόκριση (Εικ 1.25). Σύμφωνα με τα παραπάνω δεδομένα, η φαινυλεφρίνη επάγει τη σύνδεση του CREB με την ακολουθία CRE στα απομονωμένα καρδιακά μυοκύτταρα ενήλικου αρουραίου, γεγονός που απαιτεί την ενεργοποίηση τόσο των MAPKs/MSK1, όσο και της PKA Αλληλεπίδραση του CREB με την πρωτεΐνη CBP (CREB-binding protein) Η προσπάθεια να διευκρινιστεί ο τρόπος, με τον οποίο η φωσφορυλίωση του CREB επηρεάζει τη μεταγραφή των γονιδίων, οδήγησε στην αναγνώριση μιας πρωτεΐνης που αλληλεπιδρά επιλεκτικά με τη φωσφορυλιωμένη μορφή του CREB και ονομάζεται CBP (CREB-binding protein) (Snowden και Perkins 1998, Shaywitz

107 98 CREB PE (100 μμ) SB (10 μμ) PD98059 (10 μμ) Ro (5 μμ) Εικ Επίδραση των αναστολέων SB203580, PD98059 και Ro στην επαγόμενη από τη φαινυλεφρίνη σύνδεση του CREB με την ακολουθία CRE. Η ικανότητα του μεταγραφικού παράγοντα να προσδένεται στο DNA προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο EMSA σε πυρηνικά κλάσματα καρδιακών κυττάρων που επωάστηκαν με τους αναστολείς για 10 λεπτά και στη συνέχεια με φαινυλεφρίνη. Χαρακτηριστικό αυτοραδιογράφημα όπου διακρίνεται η ζώνη που αντιστοιχεί στα σύμπλοκα του CREB με τη σημασμένη ακολουθία (ένδειξη: CREB). Το πείραμα επαναλήφθηκε τέσσερις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Fig Effect of SB203580, PD98059 and Ro on PE-induced CREB-binding activity. CREB -binding activity was assayed in cardiomyocytes that were pretreated with the inhibitors and then exposed to PE. Representative EMSA showing the PE-induced CRE-binding complex (CREB). Similar results were obtained from four independent experiments.

108 99 CREB PE (100 μμ) H89 (25 μμ) RpcAMP (10 μμ) Εικ Επίδραση των αναστολέων H89 και RpcAMP στην επαγόμενη από φαινυλεφρίνη σύνδεση του CREB με την ακολουθία CRE. Η ικανότητα του μεταγραφικού παράγοντα να προσδένεται στο DNA προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο EMSA σε πυρηνικά κλάσματα καρδιακών κυττάρων που επωάστηκαν με τους αναστολείς για 10 λεπτά και στη συνέχεια με φαινυλεφρίνη. Χαρακτηριστικό αυτοραδιογράφημα όπου διακρίνεται η ζώνη που αντιστοιχεί στα σύμπλοκα του CREB με τη σημασμένη ακολουθία (ένδειξη: CREB). Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Fig Effect of H89 and RpcAMP on PE-induced CREB-binding activity. CREB -binding activity was assayed in cardiomyocytes that were pretreated with the inhibitors and then exposed to PE. Representative EMSA showing the PE-induced CRE-binding complex (CREB). Similar results were obtained from three independent experiments.

109 100 PE PE Χρόνος (λεπτά) p-creb 47.5 KDa Ι Υ Εικ Ανίχνευση συμπλόκων CREB-CBP σε καρδιακά μυοκύτταρα υπό την επίδραση φαινυλεφρίνης. Ανοσοκατακρήμνιση των συμπλόκων CREB-CBP με αντίσωμα ειδικό για το CBP, σε καρδιακά μυοκύτταρα κάτω από φυσιολογικές συνθήκες ή υπό την επίδραση φαινυλεφρίνης και ανίχνευση με ανάλυση κατά Western του φωσφορυλιωμένου CREB στο υπερκείμενο (Υ) και στο ίζημα (Ι). Fig Coimmunoprecipitation of CREB-CBP in response to PE in adult rat ventricular myocytes. Cardiomyocytes were either left unstimulated or they were treated with PE. Total CBP was immunoprecipitated and p-creb immunoblotted both in supernatant (Υ) and pellet (Ι). και Greenberg 1999). Προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανότητα σχηματισμού συμπλόκου CREB-CΡB στα καρδιακά μυοκύτταρα υπό την επίδραση φαινυλεφρίνης, έγινε προσπάθεια ανοσοκατακρήμνισης των δυο πρωτεϊνών με αντίσωμα που ανιχνεύει τα ολικά επίπεδα της πρωτεΐνης CBP. Πιο αναλυτικά, δείγματα καρδιακών μυοκυττάρων είτε κάτω από φυσιολογικές συνθήκες (0), είτε υπό την επίδραση φαινυλεφρίνης για 10 και 15 λεπτά, επωάστηκαν με σεφαρόζη-πρωτεΐνη Α και 10 μgr του αντισώματος. Μετά την κατακρήμνιση των ανοσοσυμπλόκων ακολούθησε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της φωσφορυλιωμένης μορφής του CREB τόσο στο ίζημα όσο και στο υπερκείμενο. Διαπιστώθηκε ότι με το συγκεκριμένο αντίσωμα έναντι του CBP ανοσοκατακρημνίζεται και η φωσφορυλιωμένη μορφή του CREB, γεγονός που αποδεικνύει την αλληλεπίδραση των δυο πρωτεϊνών στις δεδομένες πειραματικές συνθήκες (Εικ. 1.26). Θα πρέπει να σημειωθεί επίσης ότι η φαινυλεφρίνη ενισχύει σημαντικά το σχηματισμό συμπλόκων CREB-CBP στα καρδιακά μυοκύτταρα μετά από λεπτά διέγερσης.