Δοµή και ιδιότητες του DNA. 23/02/ Μοριακή Βιολογία Κεφ. 1 Καθηγητής Δρ. Κ. Ε. Βοργιάς

Transcript

1 Δοµή και ιδιότητες του DNA 23/02/2014 1

2 23/02/2014 2

3 Τόσο τα νεκρά (µε θερµική επεξεργασία) βακτήρια S όσο και τα ζωντανά βακτήρια R δεν µπορούν να θανατώσουν ποντικούς. Όµως, η ταυτόχρονη µόλυνση µε αυτά τα δύο µπορεί να θανατώσει ποντικούς εξίσου αποτελεσµατικά µε τα ζωντανά βακτήρια S. 23/02/2014 3

4 DNA από βακτήρια S µπορεί να µετασχηµατίσει βακτήρια R σε S. 23/02/2014 4

5 Το γενετικό υλικό του φάγου Τ7 είναι DNA. 23/02/2014 5

6 Τα ευκαρυωτικά κύτταρα µπορούν να αποκτήσουν νέο φαινότυπο µε διαµόλυνση µε εξωγενές DNA. 23/02/2014 6

7 Η ποσότητα του DNA σε κάθε οργανισµό είναι σταθερή και ανεξάρτητη του περιβάλλοντος του Η ποσότητα του DNA/κύτταρο είναι ανάλογη µε την πολυπλοκότητα του κυττάρου (?) (C-παράδοξο) Τα γαµετικά κύτταρα των ανωτέρων οργανισµών. ως απλοειδή, περιέχουν την µισή ποσότητα DNA. Η αναλογία των βάσεων σχετίζεται µε το είδος: Διαφέρει απο είδος σε είδος Ιδια σε διαφορετικούς ιστούς του ίδιου οργανισµού Δεν αλλάζει µε την ηλικία, περιβάλλον κλπ. (Α=Τ, G=C) Είναι παρόµοια σε εξελικτικά συγγενή είδη. 23/02/2014 7

8 Η ποσότητα του DNA στο απλοειδές γονιδίωµα ονοµάζεται τιµή C και είναι χαρακτηριστική για κάθε οργανισµό. (C: pg, bp, daltos) 23/02/2014 8

9 Η έκφραση C-παράδοξο αναφέρεται στην αδυναµία µας να συσχετίσουµε το µέγεθος του γονιδιώµατος µε τις λειτουργίες του: Μεγάλη ασυµφωνία ανάµεσα στο µέγεθος του γονιδιώµατος και στη µορφολογική πολυπλοκότητα του οργανισµού Μεγάλο εύρος τιµών C ανάµεσα σε ορισµένα συγγενικά είδη. 23/02/2014 9

10 1 αµινοξύ = 3 βάσεις = 110 daltons daltons (µέση πρωτείνη) = 330 αα = 1000 βάσεις Μικρός ιός: 4 5 γονίδια E. coli: γονίδια Ανώτεροι οργανισµοί: γονίδια??? To DNA δεν κωδικοποιεί µόνο πρωτείνες µέσω mrna, αλλά trna, rrna, snrna κλπ, αλλά και περιέχει και άλλες περιοχές µε ρυθµιστικό ρόλο στην αντιγραφή και µεταγραφή. Τα περισσότερα ευκαρυωτικά γονίδια είναι διακεκοµµένα (split genes): Κωδικές περιοχές, τα εξώνια (exons) Παρεµβαλλόµενες περιοχές, τα εσώνια (introns) 3 και 5 (UTR) µη µεταφραζόµενες περιοχές = δεν κωδικοποιούν αµινοξέα 23/02/

11 Η πλήρης διαλεύκανσης της πρωτοδιάταξης του γονιδιώµατος του ανθρώπου περιγράφεται από τον όρο: Human Genome Project. Το κόστος ξεπέρασε το 1 δις $ και σταδιακά µειώνεται. Υπολογίζεται µε τις νέες τεχνολογίες να κατέβει στα $ και απώτερος στόχος είναι 1$! 23/02/

12 Πυρηνικό DNA ~3000 Mb Μιτοχονδριακό DNA ~17 Mb Ενδογονιδιακό ~20% Εξωγονιδιακό ~80% Κωδικές αλληλουχίες <10% <2% Μη κωδικές αλληλουχίες >90% DNA µοναδικό ή µε λίγα αντίγραφα ~70-80 % DNA ενδιάµεσο πολύ επαναλαµβανόµενο ~20-30 % Γειτονικά οµαδοποιηµένα αντίγραφα αλληλουχιών ~60% Διασκορπισµένα αντίγραφα αλληλουχιών ~40% 23/02/

13 Τύποι πλεονάζοντος DNA Εσώνια (introns): Δορυφορικό DNA (satellite DNA) µικρή συχνότητα συµµετοχής σε διαφορετικές µορφές γονιδίων (exon shuffling, alternative splicing) Αρκετά εσώνια κωδικοποιούν snrnas, snornas (O-methylation) Εντοπίζεται στα άκρα των χρωµοσωµάτων και στο κεντροµερίδιο Εξασφαλίζει τη δοµική σταθερότητα στο χρωµόσωµα. hnrna Oνοµάζεται επίσης και pre-mrna. Από το συνολικό του µήκος µόνο 25% έχει κάποια πιθανή λειτουργία. 23/02/

14 SINES: short interspersed elements Άγνωστης λειτουργίας αλληλουχίες µήκους 300 bp. Επαναλαµβάνονται δεκάδες και εκατοντάδες φορές χιλιάδες φορές. Τυπικό παράδειγµα η οικογένεια των µεταθετών στοιχείων Alu LINES: long interspersed elements Τα ίδια στοιχεία µε τις SINES αλλά αντί για 300 bp έχουν µήκος περίπου 7000 bp. Ψευδογονίδια (Pseudogenes) Εκφυλισµένα αντίγραφα γονιδίων µεταγραφικά ανενεργά. Κάποια δεν περιέχουν εσώνια. Μάλλον προήλθαν από mrna που µεταγράφη αντίστροφα σε DNA και ενσωµατώθηκε στο γονιδίωµα. 23/02/

15 Είναι απαραίτητη διαδικασία για να γίνει κατανοητή η γονιδιακή πληροφορία. Η βασική αρχή της συγκριτικής γονιδιωµατικής είναι ή σύγκριση 2 ή και περισσοτέρων γονιδιωµάτων, να εντοπίζει κοινά γνωρίσµατα, διαφορές κλπ και να τα συσχετίζει µε την φυσιολογία των οργανισµών µε απώτερο στόχο να τα συσχετίζει πιθανόν µε µια λειτουργία. 23/02/

16 Η συγκριτική γονιδιωµατική είναι πολύ βασικό εργαλείο για τον εντοπισµό σηµαντικών παραγόντων (κυρίως σε απλά µοντέλλα συστήµατα) και είναι πιθανόν να εντοπίσει κοµβικούς παράγοντες και να περιορίσει τον αριθµό των γονιδίων που συµµετέχουν στην διαφοροποίηση. Κύριο στοιχείο είναι η εξελικτική συντήρηση διαδικασιών στη διαδικασία της εξέλιξης. Πιθανές διαταραχές των διαδικασιών αυτών δυνητικά µπορεί να οδηγήσει σε ασθένειες. 23/02/

17 Το πλάτος της διπλής έλικας διατηρείται σταθερό, διότι στα συµπληρωµατικά ζεύγη βάσεων Α-Τ και G-C οι πουρίνες βρίσκονται πάντα απέναντι από τις πυριµιδίνες. Η αλληλουχία στην Εικόνα είναι T-A, C-G, A-T, G-C. 23/02/

18 Οι δύο αλυσίδες του DNA σχηµατίζουν διπλή έλικα. Franklin: Kings College, UK 23/02/

19 Watson and Crick: Cambridge, UK Οι δύο αλυσίδες του DNA σχηµατίζουν διπλή έλικα. Franklin: Kings College, UK 23/02/

20 Συνήθης στερεοδιάταξη του DNA είναι η Β. Βήµα της έλικας είναι 10 bp/στροφή, 3.4 nm (34 Å) Mεγάλο αυλάκι της έλικας (major groove) Σηµαντικό σηµείο της στερεοδιάταξης του DNA που αλληλεπιδρούν µε πρωτεϊνες Mκρό αυλάκι της έλικας (minor groove) 23/02/

21 Η συµπληρωµατικότητα των αλυσίδων υποδηλώνει οτι η νουκλεοτιδική αλληλουχία της µιας αλυσίδας καθορίζει τη νουκλεοτιδική αλυσίδα της άλλης. 23/02/

22 Συνήθης στερεοδιάταξη του DNA in vivo είναι η Β. Kάτω από υψηλό αλάτι και σε αλληλουχίες εναλλασσοµένων πουρινών και πυριµιδινών εµφανίζεται η Ζ-µορφή, αριστερόστροφη, 12 bp/στροφή, λιγότερο ελικωµένο απο το Β, ένα µόνο αυλάκι. 23/02/

23 Χαρακτηριστικά Α Β Ζ 25.5 Å 23.7 Å 18.4 Å Δεξιόστροφη Δεξιόστροφη Δεξιόστροφη Å 33.2 Å 45.6 Å Μεγάλη αύλακα Βαθειά/πολύ στενή Ενδιάµεσου βάθους/ευρεία Επίπεδη Μικρή αύλακα Ευρεία/ρηχή Ενδιάµεσου βάθους/στενή Πολύ βαθειά/ πολύ στενή Διάµετρος έλικας Φορά έλικας bp/στροφή Βήµα έλικας 23/02/

24 Το DNA είναι χηµικά πολύ σταθερό. Θερµοκρασία: ->100 0 C ph: ακραίες τιµές <2 και >12 Το DNA απορροφά στα 260 nm: ssdna ~ +30% dsdna Υπερχρωµικότητα λόγω διατάραξης των στοιβάδων των βάσεων που απορροφούν ενέργεια = UV. 23/02/

25 23/02/

26 Από τι εξαρτάται; GC%, Buffer, ιοντική ισχύ, GCεπαναλαµβανόµενες ακολουθίες κλπ. Σε τι χρησιµεύει; Πειράµατα υβριδισµού, PCR, γενετική µηχανική κλπ. Ποιά είναι η φυσιολογική σηµασία; Γενετική διαγνωστική, δοµικές αλλαγές του DNA: κάµψη, άνοιγµα κλπ. 23/02/

27 Οι αποδιαταγµένες αλυσίδες DNA µπορούν να επαναδιαταχθούν και να σχηµατίσουν τη δίκλωνη µορφή. 23/02/

28 Προκαρυωτικοί: κυκλικό DNA: όχι ελεύθερα άκρα Ευκαρυωτικοί: γραµµικό DNA: ελεύθερα άκρα 23/02/

29 Ενα χαλαρωµένο κυκλικό DNA µετατρέπεται σε αρνητικά υπερελικωµένο µε τη δράση της γυράσης +ATP. Η αντίστροφη αντίδραση µε τη δράση της Τοποϊσοµεράσης Ι (S->R) ATP. Το αρνητικά υπερελικωµένο DNA έχει περισσότερη ενέργεια και έτσι µπορεί να υποστεί δοµικές µεταπτώσεις που το χαλαρό δεν θα µπορούσε. 23/02/