ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ, ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΝΕΩΝ 2-ΑΡΥΛΟ-3- (ΒΕΝΖΟ[d]ΘΕΙΑΖΟΛ-/ΒΕΝΖΟ[d]ΙΜΙΔΑΖΟΛ-/ 4-ΑΔΑΜΑΝΤΥΛΟΘΕΙΑΖΟΛ-2-ΥΛΟ)ΘΕΙΑΖΟΛΙΔΙΝ-4-ΟΝΩΝ ΩΣ ΠΙΘΑΝΩΝ ΑΝΑΣΤΟΛΕΩΝ ΤΟΥ HIV-1 ΠΗΤΤΑ Π. ΕΛΕΝΗ Φαρμακοποιός ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Φαρμακοχημεία: Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Ενώσεων ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Γερονικάκη A. Αθηνά ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010

2 ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ: ΓΕΡΟΝΙΚΑΚΗ ΑΘΗΝΑ Αναπληρώτρια Καθηγήτρια ΜΕΛΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ: ΡΕΚΚΑ ΕΛΕΝΗ Αναπληρώτρια Καθηγήτρια ΠΑΠΑΓΙΑΝΝΟΠΟΥΛΟΥ ΔΙΟΝΥΣΙΑ Λέκτορας 1

3 Στους γονείς μου, Πασχάλη και Πασχαλιά Πήττα, και τα αδέρφια μου. 2

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...5 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ...7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σύνδρομο της Επίκτητης Ανοσολογικής Ανεπάρκειας (AID) Πρόελευση της ασθένειας Ιός της Ανθρώπινης Ανοσοανεπάρκειας (Human Immunodeficiency Virus) Ταξινόμηση του HIV Δομή του HIV Αναπαραγωγικός κύκλος του HIV ATI-HIV ΘΕΡΑΠΕΙΑ Στόχοι της αντι-hiv θεραπείας Αναστολείς της προσκόλλησης και εισόδου των ιών στα κύτταρα του ξενιστή...19 A. Ρυθμιστές έκφρασης κυτταρικών υποδοχέων CD Β. Δεσμευτές της ιικής γλυκοπρωτεΐνης gp Γ. Αναστολείς των συν-υποδοχέων CCR5 και CXCR4 (CRIs)...20 Δ. Αναστολείς σύντηξης (FΙs) Αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης (RTIs) Δομή της αντίστροφης μεταγραφάσης Ρόλος της αντίστροφης μεταγραφάσης Μηχανισμός δράσης της αντίστροφης μεταγραφάσης Νουκλεοσιδικοί αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης (RTIs) Μη-νουκλεοσιδικοί αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης (RTIs) Αναστολείς της ιντεγκράσης (ΙΝs) Αναστολείς της πρωτεάσης (PΙs) ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Όργανα, χημικά αντιδραστήρια και λοιπός εξοπλισμός Συνθετικό μέρος

5 Σύνθεση των αρχικών προϊόντων Σύνθεση των τελικών προϊόντων Βιολογικό μέρος Το φάσμα βιολογικής δράσης (PA) Προσδιορισμός της ανασταλτικής δράσης επί του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση...60 Α. Παράγωγα του βενζο[d]θειαζολίου και του βενζο[d]ιμαδαζολίου...60 Β. Παράγωγα του 4-αδαμαντυλοθειαζολίου Θεωρητικές μελέτες πρόσδεσης (docking) ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Συνθετικό μέρος Μελέτη της ανασταλτικής δράσης επί του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση Παράγωγα του βενζο[d]θειαζολίου και του βενζο[d]ιμιδαζολίου Παράγωγα του 4-αδαμαντυλοθειαζολίου Θεωρητικές μελέτες πρόσδεσης (docking) ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ UMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...87 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ (ΦΑΣΜΑΤΑ)

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η εργασία αυτή φέρει τον τίτλο «Σχεδιασμός, σύνθεση και μελέτη δραστικότητας νέων 2-αρυλο-3-(βενζο[d]θειαζολ-/βενζο[d]ιμιδαζολ-/4-αδαμαντυλo-θειαζολ-2-υλo) θειαζολιδιν-4-ονών ως πιθανών αναστολέων του HIV-1» και εκπονήθηκε στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών στην κατεύθυνση «Φαρμακοχημεία: Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Ενώσεων», που οργανώθηκε και λειτούργησε υπό την εποπτεία του Τομέα Φαρμακευτικής Χημείας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, τα ακαδημαϊκά έτη Μέσω του προλόγου αυτού θα ήθελα να επισημάνω τη σημαντική ευκαιρία που δίδεται στους φοιτητές να συμμετάσχουν στο συγκεκριμένο μεταπτυχιακό πρόγραμμα, ικανοποιώντας με αυτό το τρόπο τις πνευματικές, επιστημονικές και ερευνητικές ανησυχίες τους. Επιπλέον, θέτει τις βάσεις της ειδίκευσης και της εξειδίκευσης, προσφέροντας σωστή επιστημονική κατάρτιση και διευρύνοντας τους επαγγελματικούς μας ορίζοντες. Αν και οι ευχαριστίες συνήθως εντάσσονται στο τυπικό πλαίσιο μιας μεταπτυχιακής εργασίας, θα ήθελα να τονίσω τον ουσιαστικό ρόλο κάποιων ανθρώπων, επωνύμων και ανώνυμων που με βοήθησαν να φέρω εις πέρας αυτή την προσπάθεια. Πρώτα από όλα, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την κ. Γερονικάκη Αθηνά, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια και Διευθύντρια του Τομέα Φαρμακευτικής Χημείας του Α.Π.Θ. και επιβλέπουσα καθηγήτρια της διπλωματικής μου εργασίας για την υπόδειξη του θέματος, την ακούραστη συμπαράστασή της, την ουσιαστική συμβολή της σε όλα τα στάδια της εργασίας και τη δημιουργία φιλικού κλίματος και συνεργασίας μεταξύ μας. Επίσης, ευχαριστώ τον κ. Vaibhav Pravinchandra Mehta και τον κ. Erik Van der Eycken του Καθολικού Πανεπιστημίου του Leuven, για την πολύτιμη βοήθεια τους στην εκμάθηση της χρήσης της ακτινοβολίας μικροκυμάτων στη σύνθεση νέων ενώσεων και τη σημαντική βοήθεια που μου προσέφεραν καθ όλη την παραμονή μου στο Βέλγιο. Πολύ σημαντική ήταν και η βοήθεια της κ. Φαίδρας Ελευθερίου, Επίκουρης Καθηγήτριας του Αλεξάνδρειου Τεχνολογικού Εκπαιδευτικού Ιδρύματος Θεσσαλονίκης και της ofiko urmava, μεταπτυχιακής φοιτήτριας Εrasmus Mundus, στην πειραματική διαδικασία των βιολογικών δοκιμασιών αυτής της εργασίας, τις οποίες και ευχαριστώ ιδιαίτερα. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Giovanni Maga για τη σημαντική βοήθεια του στις κινητικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν και τον κ. Maurizio Botta και 5

7 την κ. Lucilla Angeli για την πολύτιμη βοήθεια τους στην εκμάθηση και χρήση του κατάλληλου λογισμικού για τη διεξαγωγή των θεωρητικών μελετών πρόσδεσης (docking). Ευχαριστώ όλα τα μέλη Δ.Ε.Π. του Τομέα Φαρμακευτικής Χημείας για τη βοήθειά τους σε οποιοδήποτε στάδιο της διπλωματικής μου εργασίας. Το Κοινωφελές Ίδρυμα «Αλέξανδρος Σ. Ωνάσης» ευχαριστώ θερμά για την επιλογή μου ως υπότροφο του Ιδρύματος και την οικονομική στήριξη που μου παρείχαν κατά το δεύτερο έτος των σπουδών μου. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς και τα αδέρφια μου για τη ψυχολογική και οικονομική αρωγή καθ όλη τη διάρκεια του μεταπτυχιακού μου και ιδιαίτερα για τις αξίες της ζωής που μου μεταλαμπάδευσαν, όντας απλοϊκοί άνθρωποι και αγωνιστές της ζωής. Ελένη Π. Πήττα 6

8 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ABT (2,29-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid): 2, 29-αζινοδισ-(3- αιθυλοβενζοθειαζόλινο-6-σουλφονικό οξύ) AID (Acquired Immune Deficiency yndrome): Σύνδρομο Επίκτητης Ανοσολογικής Ανεπάρκειας. ARV (AID associated Retrovirus): Ρετροϊός συνδεόμενος με το AID. dddp (2', 3'-dideoxynucleotide diphosphate): 2,3 -διδεοξυ-διφωσφορικό νουκλεοτίδιο. ddmp (2', 3'-dideoxynucleotide monophosphate): 2, 3 -διδεοξυ-μονοφωσφορικό νουκλεοτίδιο. ddtp (2',3'-dideoxynucleotide triphosphate): 2, 3 -διδεοξυ-τριφωσφορικό νουκλεοτίδιο. dds (Dideoxy-nucleotide analogues): Διδεοξυνουκλεοτιδικά ανάλογα. DA (Deoxyribonucleic acid): Δε(σ)οξυριβο(ζο)νουκλεϊνικό οξύ. dtp (Deoxynucleotide triphosphate): Δεοξυ-τριφωσφορικό νουκλεοτίδιο. HAART (Highly Active Anti-Retroviral Therapy): Συνδυασμένη αντιρετροϊική φαρμακευτική θεραπεία. HIV (Human Immunodeficiency Virus): Ιός της Ανθρώπινης Ανοσοανεπάρκειας. HRM (Ηigh-Resolution Mass pectrometry): Υψηλής Ανάλυσης Φασματομετρία Μάζας. IΝs (Integrase Inhibitors): Αναστολείς της Ιντεγκράσης. LAV (Lympadenopathy-associated virus): Ιός σχετιζόμενος με λεμφοαδενοπάθεια. LTR (Long Terminal Repeats): Μακρά Επαναλαμβανόμενα Τερματικά Στοιχεία. RTIs (on-ucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors): Μη-Νουκλεοσιδικοί Αναστολείς της Αντίστροφης Μεταγραφάσης. RTIs (ucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors): Νουκλεοσιδικοί Αναστολείς της Αντίστροφης Μετγραφάσης. PIs (Protease Inhibitors): Αναστολείς της Πρωτεάσης. RA (Ribonucleic acid): Ριβο(ζο)νουκλεϊνικό οξύ. RT (Reverse Transcriptase): Αντίστροφη Μεταγραφάση. TP (Template-Primer): Εκμαγείο-Εκκινητής. 7

9 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην εργασία αυτή σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν 25 νέες 2-αρυλο-3- (βενζο[d]θειαζολ-/βενζο[d]ιμιδαζολ-/4-αδαμαντυλοθειαζολ-2-υλο)θειαζολιδιν-4-όνες. Ο σχεδιασμός των παραπάνω ενώσεων έγινε με βάση τη βιβλιογραφία και τη βοήθεια του υπολογιστικού προγράμματος πρόβλεψης της βιολογικής δράσης, PA. Η σύνθεση των ενώσεων πραγματοποιήθηκε με την αντίδραση κυκλοποίησης σε ένα βήμα («one pot»), της κατάλληλης ετεροαρωματικής αμίνης με μία υποκατεστημένη βενζαλδεΰδη και θειογλυκολικό οξύ. Επιπλέον της «κλασσικής» μεθόδου, έγινε προσπάθεια ανάπτυξης ενός βελτιωμένου πρωτοκόλλου σύνθεσης σε περιβάλλον μικροκυμάτων, με ελαχιστοποίηση του απαιτούμενου χρόνου της αντίδρασης, αύξηση της απόδοσης καθώς και της καθαρότητας τους. Τα τελικά προϊόντα ταυτοποιήθηκαν τόσο με στοιχειακή ανάλυση (С, H, ) όσο και με φασματοσκοπικές μεθόδους (IR, 1 H-MR, 13 C-MR και HRM). Πραγματοποιήθηκε in vitro μελέτη για τη διαπίστωση εμφάνισης ανασταλτικής δράσης επί του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση του HIV-1, υπεύθυνου για το Σύνδρομο Επίκτητης Ανοσολογικής Ανεπάρκειας (AID). Επίσης, πραγματοποιήθηκαν κινητικές μελέτες για δύο ενώσεις (παράγωγα του αδαμαντανίου) με σκοπό την αξιολόγηση της ασυνήθιστης συμπεριφοράς τους κατά τη διάρκεια των in vitro δοκιμών αναστολής του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν θεωρητικές μελετές πρόσδεσης (docking) για ορισμένες από τις υπό μελέτη ενώσεις στο αλλοστερικό κέντρο του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση, χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Autodock

10 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Σύνδρομο της Επίκτητης Ανοσολογικής Ανεπάρκειας (AID) Ως ιογενή λοιμώδη νοσήματα ή ιογενείς λοιμώξεις (ιώσεις) χαρακτηρίζονται παθοφυσιολογικές διαταραχές που οφείλονται σε μολυσματικούς ιούς που προσβάλλουν τα ζώα και τον άνθρωπο και ευθύνονται για εκατομμύρια θανάτους ετησίως όχι μόνο στις πτωχές χώρες του τρίτου κόσμου αλλά και στις αναπτυγμένες κοινωνίες. Σημαντική θέση στις ιώσεις αυτές κατέχουν λοιμώξεις που εκδηλώνονται στο ανώτερο αναπνευστικό σύστημα, στο γαστρεντερικό, στο ήπαρ, στο κεντρικό νευρικό σύστημα (Κ.Ν.Σ.), στο ουροποιογεννητικό σύστημα, στο ανοσοποιητικό και άλλα συστήματα του οργανισμού. Ενώ ένα σημαντικό ποσοστό ιογενών λοιμώξεων αντιμετωπίζεται αποτελεσματικά με τη χρήση εμβολίων (πολυομυελίτιδα, ηπατίτιδα, γρίπη), για πολλές άλλες ιώσεις δυστυχώς ακόμη δεν υπάρχει ούτε αποτελεσματικό εμβόλιο αλλά ούτε και ριζική χημειοθεραπευτική αντιμετώπιση [1]. Στο τέλος της δεκαετίας του 1970 ο κόσμος ήρθε αντιμέτωπος με μια νέα ασθένεια ιογενούς προέλευσης, το Σύνδρομο Επίκτητης Ανοσολογικής Ανεπάρκειας ή AID (ακρωνύμιο του αγγλικού όρου Acquired Immune Deficiency yndrome). Η ονομασία AID δόθηκε από το Κέντρο Ελέγχου Λοιμώξεων CDC (Center for Disease Control, UA) ως ενδεικτική μίας νέας νόσου που οφείλεται στη μόλυνση και καταστροφή των Τ-λεμφοκυττάρων από ρετροϊό της ομάδας HIV. Χαρακτηριστικά κλινικά συμπτώματα του συνδρόμου αποτελούν η έντονη ανοσολογική ανεπάρκεια, η εμφάνιση ευκαιριακών λοιμώξεων, η εμφάνιση του σαρκώματος Kaposi επί του δέρματος καθώς και άλλες διαταραχές που προοδευτικά οδηγούν στο θάνατο [1]. Το σύνδρομο του AID πρωτοεμφανίστηκε στις Η.Π.Α. (Νέα Υόρκη, Λος Άντζελες) σε ομοφυλόφιλους, που εμφάνιζαν χαρακτηριστική κλινική συμπτωματολογία. Αν και η μετάδοση του ιού περιορίζεται στη σεξουαλική επαφή, τη μετάγγιση αίματος ή από τη μητέρα στο νεογνό, εξαιτίας της μαζικής μετακίνησης του πληθυσμού, επήλθε ταχεία εξάπλωση του ιού παγκοσμίως και στις μέρες μας η νόσος του AID έχει λάβει πια τη μορφή παγκόσμιας επιδημίας [1]. Στις αναπτυγμένες χώρες οι εκστρατείες για την πρόληψη της εξάπλωσης του ιού έχουν μειώσει σημαντικά την ανάπτυξη νέων μολύνσεων. Δυστυχώς όμως, σε πολλές αναπτυσσόμενες χώρες, παρατηρείται εκθετική αύξηση των νέων μολύνσεων παρά τις πολλές προσπάθειες που γίνονται ώστε να εκπαιδευτεί ο πληθυσμός και να υιοθετήσει έναν ασφαλέστερο τρόπο ζωής. 9

11 1.2. Πρόελευση της ασθένειας Η προέλευση του HIV έχει αποδοθεί σε διάφορες αιτίες όπως: σε μολυσμένα από HIV εμβόλια πολιομυελίτιδας, ευλογιάς, ηπατίτιδας και τετάνου, στον αφρικανικό πίθηκο, στους Αφρικανούς, στις γάτες, στους χοίρους, στα πρόβατα και στη CIA των ΗΠΑ. Οι περισσότεροι επιστήμονες συμφωνούν στο ότι η επιδημία του AID άρχισε όταν ένας ιός ανάλογος του ΗΙV από ένα χιμπατζή, πιθανότατα από την κεντρική και δυτική Αφρική μεταπήδησε στον άνθρωπο στο πρώτο μισό του περασμένου αιώνα [3-4]. Ωστόσο, η αναζήτηση της προέλευσης και της ιστορίας μιας πρωτοεμφανιζόμενης ασθένειας είναι κάτι παραπάνω από μια ακαδημαϊκή έρευνα. Έτσι, για την κατανόηση της προέλευσης του HIV θα πρέπει να ερευνηθεί ο τρόπος με τον οποίο ο ιός ανέπτυξε το μοναδικό σύνολο χαρακτηριστικών του που τελικά του δίνει την ικανότητα να καταστρέφει το ανθρώπινο ανοσοποιητικό σύστημα και να οδηγεί το προσβεβλημένο άτομο στο θάνατο Ιός της Ανθρώπινης Ανοσοανεπάρκειας (Human Immunodeficiency Virus) Ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) απομονώθηκε το 1983 από το L. Montagnier και τους συνεργάτες του, στο Ινστιτούτο Pasteur των Παρισίων. Ο ρετροϊός απομονώθηκε από έναν ασθενή με εμμένουσα γενικευμένη λεμφαδενοπάθεια και η αρχική του ονομασία ήταν «ιός σχετιζόμενος με λεμφαδενοπάθεια» (LAV) [5]. Λίγο αργότερα, ένας άλλος ρετροϊός απομονώθηκε από το Levy και τους συνεργάτες του από ασθενείς με AID και ονομάστηκε «ρετροϊός που σχετίζεται με το AID» (ARV) [6]. Το ίδιο έτος (1984), ο Gallo στις Η.Π.Α. απομόνωσε ιό τον οποίο ονόμασε «ανθρώπινο Τ-λεμφοκυτταρικό ιό τύπου ΙΙΙ» (HTLV-III) από πάσχοντες του συνδρόμου [7-9]. Η ονομασία αυτή δόθηκε στον ιό προς αντιδιαστολή από τους ιούς HTLV-I και HTLV-II οι οποίοι είχαν απομονωθεί επίσης από το Galo το Οι ιοί αυτοί, ιδιαιτέρως δε ο HTLV-I, συνδέονται αιτιολογικά με ορισμένες μορφές λεμφωμάτων [10]. Με τη μελέτη του λεμφοτροπισμού των CD4 + Τ-λεμφοκυττάρων, της κυτταροπαθολογικής φύσεως των ιών που προκαλούν το σύνδρομο του AID, τη μελέτη της μορφολογίας τους με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, με την εφαρμογή του μοριακού κλονισμού και άλλων μεθόδων, έγινε εμφανές, ότι όλοι αυτοί οι ιοί ήταν ίδιοι και έτσι το 1986 η διεθνής επιτροπή ταξινόμησης ιών πρότεινε να δοθεί στον ιό του AID το όνομα «ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας» (HIV) [11]. 10

12 Το 1986 απομονώθηκε στη Δυτική Αφρική ένας νέος ιός που προκαλεί AID ήπιας μορφής. Ονομάστηκε ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας τύπου 2 (HIV-2) και η εξάπλωσή του παγκοσμίως δεν είναι τόσο ευρεία όσο του αρχικά απομονωθέντος στελέχους, το οποίο προς αντιδιαστολή ονομάστηκε HIV-1 [12] Ταξινόμηση του HIV Ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) ανήκει στην οικογένεια των ρετροϊών. Το όνομα ρετροϊός (από τη λατινική λέξη retro) προέρχεται από το κλασσικό κριτήριο ταξινόμησης αυτών των ιών, που είναι η ύπαρξη του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση (reverse transcriptase). Αυτή η RA εξαρτώμενη DA πολυμεράση μεταγράφει το ιικό RA σε DA, αναστρέφοντας τη γενετική διαδικασία. Η οικογένεια Retroviridae περιλαμβάνει τρεις υποοικογένειες: την Oncovirinae που περιλαμβάνει ογκογόνους ιούς, τη pumavirinae που περιλαμβάνει ιούς οι οποίοι προκαλούν «αφρώδη» εκφύλιση των κυττάρων αλλά δε συνδέονται αιτιολογικά με νόσους και τη Lentivirinae που περιλαμβάνει παράγοντες οι οποίοι προκαλoύν χρόνιες λοιμώξεις χαρακτηριζόμενες από προϊούσα νευρολογική βλάβη. Στην υποοικογένεια αυτή υπάγεται και ο HIV [10] Δομή του HIV Σε ηλεκτρονική μικροσκοπική εξέταση το σωματίδιο του HIV-1 εμφανίζει τα δομικά χαρακτηριστικά των ιών Lenti. Έτσι εμφανίζει εικοσαεδρική συμμετρία με μέση διάμετρο nm [13] και αποτελείται από το περίβλημα και το πυρήνα (core). (Εικόνες 1, 2). Εικόνα 1. Δομή του ιού στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο [14]. Εικόνα 2. Σχηματική αναπαράσταση της δομής του ιού [15]. 11

13 Το περίβλημα αποτελείται από στοιχεία της μεμβράνης του κυττάρου ξενιστή και είναι μια λιποειδική μεμβράνη στην επιφάνεια της οποίας υπάρχουν γλυκοπρωτεϊνικές προεξοχές που περιέχουν τη γλυκοπρωτεΐνη 160 (gp160). H gp160 αποτελείται από δύο μη-ομοιοπολικά συνδεδεμένες πρωτεΐνες, τη gp120 (εξωτερική πρωτεΐνη του ιικού περιβλήματος) και τη gp41 (διαμεμβρανική πρωτεΐνη). Οι δύο αυτές πρωτεΐνες παίζουν πρωτεύοντα ρόλο στην προσκόλληση του ιού στα κύτταρα-στόχους. Επίσης, η λιποειδική μεμβράνη φέρει στοιχεία των κυττάρων του ξενιστή, όπως τη β2 μικροσφαιρίνη και ορισμένα αντιγόνα του μείζοντος συστήματος ιστοσυμβατότητας (MHC) [16-18]. Στο εσωτερικό του περιβλήματος ανευρίσκεται ο πυρήνας του σωματιδίου του ιού. Αποτελείται από την πρωτεΐνη p17 (μεσοκυττάριο πρωτεϊνική ουσία) που περιβάλει το καψίδιο και την καψιδική πρωτεϊνη p24. Επίσης, στον πυρήνα ανευρίσκεται το ιικό RA καθώς και τρία κυρίως ένζυμα [η αντίστροφη μεταγραφάση (RT), η ιντεγκράση (ΙΝ) και μια πρωτεάση (PR)] [16-18]. Το RA του ιού φέρει τα γονίδια gag, pol και env που κωδικοποιούν το σχηματισμό των δομικών πρωτεϊνών και των ενζύμων του ιού. Τα παραπάνω γονίδια συναντώνται σε όλους τους ρετροϊούς. Το gag κωδικοποιεί την πρόδρομη πρωτεΐνη p55, από την οποία προέρχονται οι πρωτεΐνες p24, p17, p7 και p6. Το γονίδιο pol κωδικοποιεί τα ένζυμα αντίστροφη μεταγραφάση, ιντεγκράση και πρωτεάση. Το γονίδιο env κωδικοποιεί την πρόδρομη γλυκοπρωτεΐνη gp160 από την οποία προέρχεται η εξωμεμβρανική πρωτεΐνη gp120 καθώς και η διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη gp41. Εκτός όμως από τα παραπάνω τρία γονίδια υπάρχουν και άλλα έξι γονίδια (vpr, rpu, tat, rev, vif, nef). Τα γονίδια αυτά κωδικοποιούν την παραγωγή ρυθμιστικών πρωτεϊνών και μπορούν να ομαδοποιηθούν σε δύο κατηγορίες: α) την κατηγορία των γονιδίων που παράγουν πρωτεΐνες που είναι ουσιώδεις για την αναδίπλωση του HIV (tat και rev) και β) την κατηγορία των γονιδίων που παράγουν πρωτεΐνες οι οποίες ενισχύουν την αντιγραφή και τη μολυσματικότητα του ιού (vif, nef, vpr και vpu) [19]. Τέλος, στα άκρα του γενώματος υπάρχουν αλληλουχίες νουκλεοτιδίων που ονομάζονται μακρά επαναλαμβανόμενα τερματικά στοιχεία (LTRs). Υπάρχουν LTR του 5 και του 3 -άκρου (5 -LTR και 3 -LTR ). Oι αλληλουχίες αυτές περιέχουν ειδικές περιοχές για τη σύνδεση των πολυμερασών και την αναπαραγωγή του ιού καθώς και περιοχές που ρυθμίζουν τον τερματισμό της αναπαραγωγής ή επιτρέπουν σε ορισμένα γονίδια να αντιγράφονται και να εκφράζονται συχνότερα [20]. 12

14 1.3.3 Αναπαραγωγικός κύκλος του HIV Ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV), όπως όλοι οι ιοί, χρησιμοποιεί το κύτταρο του ξενιστή για τον πολλαπλασιασμό του, αλλά αντίθετα από τους άλλους ιούς, οι ρετροϊοί χρησιμοποιούν ένα μοναδικό σύστημα με το οποίο αντιστρέφεται η συνήθης ροή της γενετικής πληροφορίας [21]. Η φυσιολογική έκφραση των γονιδίων προκύπτει όταν η γενετική πληροφορία που είναι αποθηκευμένη στο DA μεταγράφεται σε RΑ και αυτό το RA μεταφράζεται σε πρωτεΐνες. Όμως, οι ρετροϊοί έχουν RA ως γενετικό υλικό και όχι DA. Καταφέρνουν να αντιστρέψουν τη φυσιολογική ροή της γενετικής πληροφορίας με τη βοήθεια του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση. Η διαδικασία της αναπαραγωγής ξεκινάει με τη σύνδεση του ιού στο κύτταρο-στόχο, μέσω της γλυκοπρωτεΐνης gp120 του ιικού περιβλήματος στο CD4 + μόριο του κυττάρουξενιστή το οποίο λειτουργεί ως υποδοχέας του ιού. Τα κύτταρα που διαθέτουν CD4 + μόρια είναι τα ΤΗ (βοηθητικά) λεμφοκύτταρα, τα μονοκύτταρα και τα δενδριτικά κύτταρα. Εκτός του μορίου CD4 + για την είσοδο του HIV-1 στο κύτταρο είναι αναγκαία η παρουσία και άλλων υποδοχέων. Πρόκειται περί υποδοχέων χημειοκινών. Οι χημειοκίνες είναι διαλυτοί παράγοντες με ιδιότητες κυτταροκινών. Οι υποδοχείς αυτοί είναι ο CCR5 (υποδοχέας για τις χημειοκίνες RATE, MIP-1α και MIP-1β) στα μακροφάγα κύτταρα και ο CXCR4 (υποδοχέας για τη χημειοκίνη DF-1) στα λεμφοκύτταρα. Μετά τη σύνδεση της γλυκοπρωτεΐνης gp120 με το CD4 + υποδοχέα επέρχονται δομικές αλλαγές της που της επιτρέπουν τη σύνδεσή με τον συν-υποδοχέα. Η συνένωση αυτή προκαλεί τη μετατόπιση της περιοχής του Ν-πεπτιδίου της gp41 γλυκοπρωτεΐνης και «σύντηξη» με τη μεμβράνη του κυττάρου [10]. Υπάρχουν ενδείξεις ότι άτομα τα οποία στερούνται του υποδοχέως CCR5 προφυλάσσονται από τη λοίμωξη με τον HIV-1. Στη συνέχεια ακολουθούν τα εξής γεγονότα: έκδυση του ιού και μεταγραφή της γενετικής πληροφορίας που περιέχεται στο ιικό RΑ, αρχικά, σε μονόκλωνο DA και έπειτα σε δίκλωνο συμπληρωματικό DA με τη βοήθεια του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση. Το δίκλωνο πλέον DA μεταναστεύει στον πυρήνα και ενσωματώνεται με τη βοήθεια της ιντεγκράσης, στο γένωμα του κυττάρου ξενιστή. Το DA του ιού, που είναι ενσωματωμένο στο DA του κυττάρου, ονομάζεται προϊός. Από το σημείο αυτό, η μόλυνση είναι μη αντιστρεπτή, δηλαδή ενσωματώνεται δια βίου στο γενετικό υλικό και τα ιικά γονίδια είναι πια μέρος της γενετικής πληροφορίας του κυττάρου. Από αυτήν την άποψη, το AID μπορεί να θεωρηθεί ως μια επίκτητη μόνιμη γενετική ασθένεια. 13

15 Απαραίτητη προϋπόθεση της μεταγραφής του ενσωματωμένου DA σε ιικό RA και mra, της παραγωγής πρωτεϊνών και της σύνθεσης νέων σωματιδίων του ιού (δηλαδή πολλαπλασιασμό του ιού), αποτελεί η ενεργοποίηση του κυττάρου ξενιστή. Αυτό εξηγεί και την περίοδο της ασυμπτωματικής ή λανθάνουσας φάσης μέχρι την πλήρη κλινική εκδήλωση του συνδρόμου. Καθώς οι πρωτεΐνες του HIV συνενώνονται με τα αντίγραφα του RA νέα ιικά σωματίδια συναρμολογούνται. Μετά το τέλος αυτής της φάσης, τα καψίδια του ιού ως ενεργές μολυσματικές μονάδες μετακινούνται προς τη μεμβράνη και εξέρχονται προκαλώντας ρήξη και λύση του κυττάρου ξενιστή. Ο νεοσυντεθημένος ιός κατά την απελευθέρωση επικαλύπτεται από πρωτεΐνες, λιπίδια και γλυκοπρωτεΐνες που προέρχονται από την κυτταροπλασματική μεμβράνη του ξενιστή. Αυτές οι ιικές γλυκοπρωτεΐνες είναι απαραίτητες για την προσκόλληση του ιού στο CD4 + υποδοχέα. Τα νέα αντίγραφα του ιού μπορούν τώρα να μετακινηθούν και να μολύνουν άλλα κύτταρα (Εικόνα 3). Εικόνα 3. Ο κύκλος αναπαραγωγής του HIV [22]. Ο υψηλός βαθμός θνησιμότητας των πασχόντων από AID οφείλεται όχι μόνο στον αποτελεσματικό κύκλο αναπαραγωγής του ιού αλλά επίσης και στην γενετική του αστάθεια. Ο υψηλός βαθμός λαθών της αντίστροφης μεταγραφάσης (εξαιτίας της έλλειψης μιας 3-5 εξωνουκλεάσης με επιδιορθωτική ικανότητα και άρα αδυναμίας επιδιόρθωσης των λαθών που συμβαίνουν) και ο υψηλός ρυθμός αναπαραγωγής στα προσβεβλημένα κύτταρα [23-24] παράγει άπειρο αριθμό από διαφορετικούς μεταλλαγμένους ιούς και προσδίδει στο HIV την αξιοσημείωτη ικανότητα να αναπτύσσει ανθεκτικότητα στις φαρμακευτικές θεραπείες. 14

16 2. ATI-HIV ΘΕΡΑΠΕΙΑ Οι προσπάθειες για τον έλεγχο της επιδημίας του AID έχουν επικεντρωθεί τόσο στη μελέτη της βιολογίας, της βιοχημείας και της δομικής βιολογίας του HIV, όσο και στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ιικών μοριακών στόχων και των υποψήφιων νέων φαρμάκων. Δυστυχώς όμως, μέχρι σήμερα δεν έχει αναπτυχθεί κάποια φαρμακευτική θεραπεία ή εμβόλιο για τη ριζική αντιμετώπιση του HIV. Παρόλ αυτά, η αντιρετροϊική θεραπεία έχει μειώσει τη νοσηρότητα και τη θνησιμότητα στους ασθενείς που έχουν τη δυνατότητα πρόσβασης σε αυτή και σε σημαντικό ποσοστό περιπτώσεων ανέκοψαν τη μετάδοση του ιού από την προσβεβλημένη μητέρα στο νεογνό. Παρατεταμένη αναστολή της αντιγραφής του ιού έχει ως αποτέλεσμα τη μερική αναδόμηση του ανοσοποιητικού συστήματος στους περισσότερους ασθενείς, μειώνοντας ουσιαστικά τον κίνδυνο της κλινικής εξέλιξης της νόσου και το θάνατο. Μετά τη μόλυνση από το HIV παρατηρείται μείωση των κυττάρων που φέρουν CD4 + υποδοχείς και ειδικά των Τ-λεμφοκυττάρων (Τ4) του ανθρώπινου ανοσοποιητικού συστήματος. Αποτέλεσμα της ελάττωσης των CD4 + Τ-λεμφοκυττάρων είναι η εξαφάνιση της κυτταροεξαρτώμενης ανοσολογικής αντίδρασης. Η καταστολή του ανοσοποιητικού συστήματος, η αύξηση της ευαισθησίας στις ευκαιριακές λοιμώξεις και η ανάπτυξη καρκίνου δίνει στη νόσο μια πολυδιάστατη παθολογία. Γι αυτό το λόγο είναι απίθανο ένα μόνο φάρμακο να παρέχει επαρκή θεραπεία. Σήμερα περίπου 33,4 εκατομμύρια ανθρώπων είναι προσβεβλημένοι από το HIV. Τα 9,5 εκατομμύρια είναι στις ανεπτυγμένες χώρες και από αυτά τα άτομα υπολογίζεται ότι μόνο τα 4 εκατομμύρια λαμβάνουν αντιρετροϊική φαρμακευτική αγωγή [25]. Από το Μάρτιο του 1987 μέχρι της αρχές του 2008, 25 φαρμακευτικές ουσίες έχουν λάβει έγκριση από το FDA για κλινική χρήση σε άτομα προσβεβλημένα από τον ιό. Δώδεκα από τα είκοσι πέντε εγκεκριμένα φάρμακα κατά του HIV είναι αναστολείς του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση (επτά από αυτά είναι νουκλεοσιδικά ανάλογα, ένα είναι νουκλεοτιδικό ανάλογο και τέσσερα είναι μη-νουκλεοσιδικά ανάλογα). Υπάρχουν δέκα ακόμα φάρμακα που δρουν ως αναστολείς της πρωτεάσης και άλλα δύο ως αναστολείς της προσκόλλησης και εισόδου στο κύτταρο. Τέλος, ακόμα ένα λειτουργεί ως αναστολέας της ιντεγκράσης. (Πίνακας 1). 15

17 Πίνακας 1. Ταξινόμηση των φαρμακευτικών ουσιών που έχουν λάβει έγκριση από το FDA για κλινική χρήση, ανάλογα με τη διαδικασία που αναστέλλουν. Εμπορικό όνομα σκευάσματος Φαρμακευτική ουσία Εταιρία παρασκευής Ημερομηνία έγκρισης Συνδυασμός διαφορετικών φαρμακευτικών ουσιών διαφορετικών κατηγοριών Atripla efavirenz, emtricitabine and tenofovir disoproxil fumarate Bristol-Myers quibb and Gilead ciences 12-July-06 Νουκλεοσιδικοί αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης(rtis) zidovudine, azidothymidine, Retrivir GlaxomithKline 19-Mar-87 AZT, ZDV Videx didanosine, dideoxyinosine, ddi Bristol Myers-quibb 9-Oct-91 Hivid zalcitabine, dideoxycytidine, ddc (no longer marketed) Hoffmann-La Roche 19-Jun-92 Zerit stavudine, d4t Bristol Myers-quibb 24-Jun-94 Epivir lamivudine, 3TC GlaxomithKline 17-ov-95 Combivir lamivudine and zidovudine GlaxomithKline 27-ep-97 Ziagen abacavir sulfate, ABC GlaxomithKline 17-Dec-98 Videx EC Trizivir Viread enteric coated didanosine, ddi EC abacavir, zidovudine, and lamivudine tenofovir disoproxil fumarate, TDF Bristol Myers-quibb GlaxomithKline Gilead 31-Oct ov Oct-01 Emtriva emtricitabine, FTC Gilead ciences 02-Jul-03 Epzicom abacavir and lamivudine GlaxomithKline 02-Aug-04 Truvada tenofovir disoproxil fumarate and emtricitabine Gilead ciences, Inc. 02-Aug-04 Μη-νουκλεοσιδικοί αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης(rtis) Viramune nevirapine, VP Boehringer Ingelheim 21-Jun-96 Rescriptor delavirdine, DLV Pfizer 4-Apr-97 ustiva efavirenz, EFV Bristol Myers-quibb 17-ep-98 Intelence etravirine Tibotec Therapeutics 18-Jan-08 Αναστολείς πρωτεάσης (PIs) Invirase saquinavir mesylate, QV Hoffmann-La Roche 6-Dec-95 orvir ritonavir, RTV Abbott Laboratories 1-Mar-96 Crixivan indinavir, IDV, Merck 13-Mar-96 Viracept nelfinavir mesylate, FV Agouron Pharmaceuticals 14-Mar-97 Fortovase saquinavir (no longer marketed) Hoffmann-La Roche 7-ov-97 16

18 Ageneras amprenavir, APV GlaxomithKline 15-Apr-99 Kaletra lopinavir and ritonavir, LPV/RTV Abbott Laboratories 15-ep-00 Reyataz atazanavir sulfate, ATV Bristol-Myers quibb 20-Jun-03 Lexiva Fosamprenavir Calcium, FO- APV GlaxomithKline 20-Oct-03 Aptivus tipranavir, TPV Boehringer Ingelheim 22-Jun-05 Prezista darunavir Tibotec, Inc. 23-Jun-06 Αναστολείς σύντηξης (FIs) Hoffmann-La Roche Fuzeon enfuvirtide, T-20 & Trimeris 13-Mar-03 Αναστολείς του συν-υποδοχέα CCR5 elzentry maraviroc Pfizer 06-August-07 Αναστολείς Ιντεγκράσης Isentress raltegravir Merck & Co., Inc. 12-Oct-07 Το πρώτο αντιρετροϊικό φάρμακο που εισήλθε στη μάχη (1987) ενάντια του HIV είναι το Zidovudine (ή AZT όπως συχνά αναφέρεται). Ο ασθενής λάμβανε 12 δισκία ημερησίως, δύο δισκία κάθε τέσσερις ώρες. Αποτελεί ένα πολύ τοξικό φάρμακο αλλά για κάποιους πάσχοντες σήμαινε μια μικρή επιμήκυνση της διάρκειας ζωής τους. Όμως, η χρήση ενός και μόνου φαρμάκου κατά του HIV (μονοθεραπεία) σύντομα οδήγησε στην ανάπτυξη μεταλλαγμένων μορφών του ιού με ανθεκτικότητα στο φάρμακο [26-27]. Χρειάστηκαν να περάσουν επτά χρόνια έως ότου το 1995 «πέθανε» η μονοθεραπεία και «ανέτειλε» η ιδέα της συνδυασμένης φαρμακευτικής θεραπείας (HAART), δηλαδή της χρήσης τριών ή και περισσότερων φαρμάκων σε συνδυασμό [28-33]. Η συνδυασμένη φαρμακευτική θεραπεία είναι αποτελεσματικότερη επειδή το μονόκλωνο RA του ιού θα πρέπει να υποστεί πολλαπλές μεταλλάξεις προκειμένου το νέο στέλεχος να είναι ανθεκτικό σε καθένα από τα φάρμακα ξεχωριστά [34]. Επιπλέον, κατά τη συνδυασμένη φαρμακευτική θεραπεία ο ασθενής λαμβάνει χαμηλότερες δόσεις φάρμακων σε σύγκριση με την αυξημένη δόση που θα λάμβανε κατά τη μονοθεραπεία, με αποτέλεσμα την εμφάνιση λιγότερων ανεπιθύμητων ενεργειών. Τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται σήμερα κρίνονται ανεπαρκή εφόσον δεν οδηγούν στη θεραπεία αλλά επιβραδύνουν την εξέλιξη της νόσου. Είναι πολύπλοκα στο χειρισμό, απαιτούν στενή ιατρική παρακολούθηση και μπορούν να προκαλέσουν σημαντικές ανεπιθύμητες ενέργειες. Επίσης, είναι πολύ δαπανηρά, με αποτέλεσμα, να είναι απρόσιτα για την πλειοψηφία των ασθενών που πάσχουν από AID. 17

19 Για τους παραπάνω λόγους, τα φάρμακα της νέας γενιάς θα πρέπει να είναι ισχυρότερα και ευκολότερα στη λήψη τους. Επιπλέον, θα πρέπει να βελτιωθούν σε σχέση με τα προβλήματα που εμφανίζει η παρούσα γενιά φαρμάκων, όπως την εμφάνιση ανθεκτικότητας, τις σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες και την περιορισμένη βιοδιαθεσιμότητα. 2.1 Στόχοι της αντι-hiv θεραπείας Ο κύκλος αναπαραγωγής του ιού (Εικόνα 4) έχει μελετηθεί εκτενώς με σκοπό την ταυτοποίηση στόχων για το σχεδιασμό νέων εκλεκτικών αναστολέων που, ίσως, γίνουν θεραπευτικοί παράγοντες. Η εμφάνιση ανθεκτικών στελεχών HIV-1 τονίζει την ανάγκη για ανάπτυξη νέων αντιρετροϊικών φαρμάκων και τον προσδιορισμό νέων φαρμακευτικών στόχων. Τα φάρμακα που σήμερα είναι διαθέσιμα για τη θεραπεία του HIV μπορούν να διαιρεθούν στις παρακάτω κατηγορίες [34]: Ι. Αναστολείς της προσκόλλησης και εισόδου των ιών στα κύτταρα του ξενιστή. ΙΙ. Αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης [νουκλεοσιδικοί (RTIs) και μηνουκλεοσιδικοί (RTIs)]. ΙΙΙ. Αναστολείς της ιντεγκράσης (IIs). IV. Αναστολείς της πρωτεάσης (PIs). Εικόνα 4. Ο κύκλος αναπαραγωγής του HIV. Επισημαίνονται οι διαδικασίες που αποτελούν τους κυριότερους στόχους ανάπτυξης φαρμάκων: η αλληλεπίδραση με το(ν) (συν-) υποδοχέα, η ιική σύντηξη, η αντίστροφη μεταγραφή (από την αντίστροφη μεταγραφάση), η ενσωμάτωση του προϊικού DA στο γένωμα του κυττάρου ξενιστή (από την ιντεγκράση) και η πρωτεολυτική διαδικασία (από την ιική πρωτεάση) [35]. 18

20 2.2. Αναστολείς της προσκόλλησης και εισόδου των ιών στα κύτταρα του ξενιστή Το πρώτο στάδιο του κύκλου αναπαραγωγής του ιού το οποίο μπορεί να αποτελέσει στόχο ανάπτυξης φαρμάκων είναι η προσκόλληση και είσοδος του ιού στο κύτταρο. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται μια σειρά φαρμάκων που στοχεύουν στην αναστολή προσκόλλησης και εισόδου του ιού στα κύτταρα του ξενιστή και χωρίζονται γενικά στις εξής κατηγορίες: Α. Ρυθμιστές έκφρασης κυτταρικών υποδοχέων CD4 + Β. Δεσμευτές της ιικής γλυκοπρωτεΐνης gp120 Γ. Αναστολείς των συν-υποδοχέων CCR5 και CXCR4 (CRIs) Δ. Αναστολείς σύντηξης (FIs) Α. Ρυθμιστές έκφρασης κυτταρικών υποδοχέων CD4 + Το μόριο CD4 + της κυτταρικής επιφάνειας του κυττάρου ξενιστή αποτελεί τον κύριο υποδοχέα του HIV, και ως εκ τούτου, φάρμακα που στοχεύουν στον CD4 + υποδοχέα, αναστέλλουν την είσοδο του ιού στα κύτταρα και μπορούν να θεωρηθούν ως μια ελκυστική προσέγγιση για την πρόληψη της μόλυνσης από τον ιό. Το κυκλοτριαζαδισουλφοναμίδιο (CADA) (Σχήμα 1) όπως αποδείχθηκε αναστέλλει τη λοίμωξη παρεμποδίζοντας τη σύνθεση του κυτταρικού υποδοχέα CD4 + [36-37]. Πειράματα έδειξαν ότι το CADA δρά σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο και μπορεί να είναι αποτελεσματικό αν χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με RTIs ή RTIs, αναστολείς πρωτεάσης και αναστολείς σύντηξης. Σχήμα 1. Χημική δομή του CADA. Β. Δεσμευτές της ιικής γλυκοπρωτεΐνης gp120 Έχει αποδειχθεί ότι μια σειρά από ειδικές φυτικές λεκτίνες του υβριδίου των φυτών Galanthus nivalis (GA) και Hippeastrum (HHA), μπορεί να διακόψει τη 19

21 διαδικασία εισόδου του ιού συνδεόμενες με τη γλυκοπρωτεΐνη gp120 του ιικού περιβλήματος [38]. Επιπλέον, δεν έχει παρατηρηθεί καμία διασταυρούμενη ανθεκτικότητα με τους υπόλοιπους αναστολείς εισόδου και γι αυτό το λόγο οι λεκτίνες αυτές αντιπροσωπεύουν μια μοναδική κατηγορία κατά του HIV-1 με έναν εντελώς νέο σχήμα αντίστασης. Μια άλλη ενδιαφέρουσα ένωση της οποίας η δράση οφείλεται επίσης στην αλληλεπίδραση με τη γλυκοπρωτεΐνη gp120 είναι η κυανοβιρίνη-ν, μια πρωτεΐνη 11 kda η οποία αρχικά είχε απομονωθεί από το κυανοβακτηρίδιο ostoc ellipsosporumii [39]. Η κυανοβιρίνη- διαθέτει μοναδικά υψηλή συγγένεια για τη gp120 και ως εκ τούτου, παρεμποδίζει την είσοδο του ιού στα κύτταρα-στόχους [40]. Γ. Αναστολείς των συν-υποδοχέων CCR5 και CXCR4 (CRIs) Οι αναστολείς των συν-υποδοχέων (CRIs) αλληλεπιδρούν με τους συνυποδοχείς CCR5 ή CXCR4 που χρησιμοποιούνται από τις Μ-τροπικές (R5) και Τ- τροπικές (X4) ιικές σειρές αντίστοιχα, για να εισέλθουν στα κύτταρα-στόχους και με τον τρόπο αυτό εμποδίζουν την κυτταρική διείσδυση των ιών. Ανάλογα με τον συνυποδοχέα που στοχεύουν χαρακτηρίζονται ως CCR5 ή CXCR4 ανταγωνιστές. Το maraviroc είναι το μόνο κλινικά διαθέσιμο φάρμακο της κατηγορίας των CRI που έλαβε άδεια για κλινική χρήση το 2007 και είναι αναστολέας του CCR5 συνυποδοχέα (Σχήμα 2) [41]. F F H O Σχήμα 2. Χημική δομή του maraviroc (UK , elzentry ) Το μεγάλο πρόβλημα με τους CCR5 ανταγωνιστές είναι ότι είναι δραστικοί μόνο έναντι των R5 στελεχών του HIV και ότι από το μεικτό πληθυσμό των X4/R5 στελεχών υποβοηθούν την επικράτηση των X4 στελεχών. Στην ιδανική περίπτωση, ένας ανταγωνιστής CCR5 θα πρέπει να συνδυάζεται με έναν ανταγωνιστή CXCR4, ώστε να εμποδίζουν την ανάπτυξη τόσο των X4 όσο και των R5 ιικών σειρών του HIV. 20

22 Ένας πολύ ισχυρός και ειδικός ανταγωνιστής του CXCR4 που έχει περιγραφεί είναι το AMD3100 (Σχήμα 3) [42], αλλά δυστυχώς βιοαποικοδομείται όταν λαμβάνεται per os. Σχήμα 3. Χημική δομή του AMD3100 (MozobilTM). Δ. Αναστολείς σύντηξης (FIs) Η ενφουβιρτίδη (Εnfuvirtide, T20, DP-178, pentafuside, Fuzeon) είναι ο μοναδικός αναστολέας σύντηξης που έχει εγκριθεί από το FDA για κλινική χρήση και έχει εισέλθει στην κυκλοφορία (Σχήμα 4). Είναι ένα συνθετικό πεπτιδικό ανάλογο που αποτελείται από 36 αμινοξέα, αντίστοιχα των αμινοξέων της HR περιοχής της gp41 γλυκοπρωτεΐνης [43]. Η ενφουβιρτίδη συμπλέκεται με την HR περιοχή της ιικής γλυκοπρωτεΐνης gp41 με αποτέλεσμα την αναστολή της σύντηξης. Δυστυχώς όμως, το φάρμακο αυτό ως πεπτίδιο βιοαποικοδομείται κατά τη λήψη από το στόμα και γι αυτό το λόγο πρέπει να χορηγείται δύο φορές την ημέρα με υποδόρια ένεση. Αυτό οδηγεί αναπόφευκτα σε τοπικές αντιδράσεις όπως ερύθημα, σκλήρυνση, οζίδια και κύστεις. Ένα δεύτερο εξίσου σημαντικό πρόβλημα είναι το κόστος παραγωγής ενός πεπτιδίου 5000 Da όπως η ενφουβιρτίδη [34]. Σχήμα 4. Χημική δομή της ενφουβιρτίδης (Εnfuvirtide, T20, DP-178, pentafuside, Fuzeon) [34]. 21

23 2.3. Αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης (RTIs) Το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση είναι το μοναδικό ένζυμο που απαιτείται για το σχηματισμό του προ-ιικού DA από το ιικό RA. Συνεπώς, είναι ένας εξαιρετικός στόχος για το σχεδιασμό αντιρετροϊικών φαρμάκων [44-48]. Επιπλέον, ενώ η αντίστροφη μεταγραφάση είναι απολύτως απαραίτητη για την αντιγραφή και τον πολλαπλασιασμό των ρετροϊών, έχουν ταυτοποιηθεί ελάχιστα ευκαρυωτικά ένζυμα με ανάλογη δράση, γεγονός που υποδηλώνει σημαντική εκλεκτικότητα Δομή της Aντίστροφης Mεταγραφάσης H αντίστροφη μεταγραφάση είναι ένα ετεροδιμερές, που αποτελείται από δύο υπομονάδες 66 και 51 kda αντίστοιχα (p66 και p51) [49]. Η p51 υπομονάδα προκύπτει από την p66 υπομονάδα μετά από περιορισμένη πρωτεόλυση που απομακρύνει τη RΝaseH περιοχή του μορίου [50]. Η υπομονάδα p66 περιέχει πέντε υποπεριοχές, οι οποίες χαρακτηρίζονται ως «δάχτυλα», «παλάμη», «αντίχειρας», «συνδετήρας» και «RΝaseH». (Εικόνα 5). Και οι δύο υπομονάδες, περιέχουν περιοχές που είναι απαραίτητες για την επιμήκυνση του κλώνου DA αλλά μόνο η p66 υπομονάδα περιέχει καταλυτικές περιοχές. Εικόνα 5. Σχηματική απεικόνιση της αντίστροφης μεταγραφάσης (p66 και p51). Απεικονίζονται τα «δάχτυλα» (μπλε), η «παλάμη» (μωβ), η «αντίχειρας» (πράσινο), ο «συνδετήρας» (πορτοκαλί) και η περιοχή της «RΝaseH» (κόκκινο) [51] Ρόλος της αντίστροφης μεταγραφάσης H αντίστροφη μεταγραφάση επιτελεί τη λειτουργία της στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου-ξενιστή με τη βοήθεια ενός tra εκκινητή, ο οποίος δεσμεύεται στο γένωμα του 22

24 ρετροϊού στο 3 -τελικό άκρο (Εικόνα 6). Η αντίστροφη μεταγραφάση χρησιμοποιεί αυτόν τον εκκινητή για να συνθέσει ένα συμπληρωματικό κλώνο DA, σχηματίζοντας ένα υβρίδιο DA-RA. Επιπλέον, η αντίστροφη μεταγραφάση διαθέτει μια υποπεριοχή που της δίνει τη δυνατότητα να λειτουργεί και ως RΝάση. Έτσι, υδρολύει τον κλώνο του RA, επιτρέποντας το σχηματισμό δεύτερου συμπληρωματικού κλώνου, με αποτέλεσμα τη δημιουργία δίκλωνου μορίου DA. Μία μικρή αλληλουχία πουρινών λειτουργεί ως εκκινητής για τη σύνθεση αυτού του δεύτερου κλώνου. Όταν η σύνθεση ολοκληρωθεί, το ένζυμο με τη δράση RΝaseH απομακρύνει τον t-ra εκκινητή που χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή του πρώτου κλώνου DA [52-53]. Εικόνα 6. Μεταγραφή του μονόκλωνου RA προς συμπληρωματικό δίκλωνο DA με τη βοήθεια του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση[54] Μηχανισμός δράσης της αντίστροφης μεταγραφάσης Ο ρόλος της αντίστροφης μεταγραφάσης είναι ο πολυμερισμός, δηλαδή η ενσωμάτωση νουκλεοτιδίων στον επιμηκούμενο κλώνο του DA. Όπως φαίνεται και από την αντίδραση στο κάτω μέρος της Εικόνας 7, η διαδικασία του πολυμερισμού μπορεί να χωριστεί σε διακριτά στάδια και μάλιστα υπάρχουν κρυσταλλογραφικές εικόνες που αντιστοιχούν στα στάδια αυτά. Σύγκριση αυτών των κρυσταλλικών δομών δείχνει ότι η αντίστροφη μεταγραφάση (RT) είναι ένα πολύ εύκαμπτο ένζυμο και τμήματά της υφίστανται σημαντικές κινήσεις καθώς προχωρά η αντίδραση του πολυμερισμού. Οι περισσότερες κινήσεις αφορούν τα «δάχτυλα» και την «παλάμη» της p66 υπομονάδας. 23

25 Όπως περιγράφεται και στην Εικόνα 7, στο μη συνδεδεμένο ένζυμο (a), η «παλάμη» (πράσινο) είναι κοντά στα «δάχτυλα» (μπλε). Στο επόμενο στάδιο, η «παλάμη» κινείται μακριά από τα «δάχτυλα» για να διευκολύνει τη διευθέτηση του υποστρώματος (νουκλεϊκό οξύ) (b-c). Όταν το εισερχόμενο dtp δεσμευτεί στο σύμπλοκο, τα «δάχτυλα» του p66 κλείνουν δεσμεύοντας το dtp (b-c). Αυτή η αλλαγή στη διαμόρφωση θεωρείται το αργό στάδιο του πολυμερισμού. Από τη στιγμή που τα «δάχτυλα» κλείσουν, το ένζυμο μπορεί να πραγματοποιήσει το χημικό βήμα του πολυμερισμού, ενώνοντας το εισερχόμενο dtp στο άκρο του επιμηκούμενου κλώνου, με απελευθέρωση πυροφωσφορικού [55]. Εικόνα 7. Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας πολυμερισμού της αντίστροφης μεταγραφάσης [55]. Λόγω της σημασίας της αντίστροφης μεταγραφάσης για τον κύκλο αναπαραγωγής των ρετροϊών, η αναστολή της είναι θεμελιώδης στόχος για την ανάπτυξη φαρμάκων. Υπάρχουν δύο κατηγορίες φαρμάκων που δρουν ως αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης: οι νουκλεοσιδικοί (RTIs) και οι μη-νουκλεοσιδικοί αναστολείς (RTIs). 24

26 Νουκλεοσιδικοί αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης (RTIs) Το πρώτο φάρμακο που χρησιμοποιήθηκε κλινικά κατά του AID ήταν το AZT (zidovudine, azidothymidine), ένας νουκλεοσιδικός αναστολέας της αντίστροφης μεταγραφάσης [56]. Το AZT και τα παράγωγά του είναι δι-δεοξυνουκλεοσιδικά ανάλογα (dds), στο μόριο των οποίων απουσιάζει το υδροξύλιο της 3 -θέσης της ριβόζης ή υπάρχουν στη θέση αυτή άλλοι υποκαταστάτες. Ως αποτέλεσμα αυτού παρεμποδίζεται ο σχηματισμός του 3'-5' φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ του επιμηκούμενου κλώνου DA και του εισερχόμενου 5 -τριφωσφορικού νουκλεοσιδίου. Οι νουκλεοσιδικοί αναστολείς αλληλεπιδρούν με το ενεργό κέντρο του ενζύμου, που χαρακτηρίζεται από την καταλυτική τριάδα (Asp110, Asp185, Asp186), όπου φυσιολογικά δεσμεύονται τα dtps. Έτσι μετά την ενσωμάτωσή τους στον αναπτυσσόμενο κλώνο του DA εμποδίζουν την περαιτέρω επιμήκυνσή του. Τα dds, προκειμένου να δράσουν στο ένζυμο-στόχο πρέπει να φωσφορυλιωθούν διαδοχικά δίνοντας 5 -μονοφωσφορικά (ddmp), 5 -διφωσφορικά (dddp) και 5 -τριφωσφορικά παράγωγα (ddtp) (Εικόνα 8). Η φωσφορυλίωση αυτή είναι ουσιώδης για την ενδοκυττάρια ενεργοποίηση των dds. Εικόνα 8. Σχηματική αναπαράσταση της φωσφορυλίωσης του AZT και της αναστολής της αντίστροφης μεταγραφάσης [34]. Δυστυχώς, μερικά dd ανάλογα, όπως η DDU (2,3 -διδεοξυουριδίνη), έχουν χαμηλή συγγένεια με τις κινάσες νουκλεοτιδίων (όπως την κινάση θυμιδίνης) που είναι 25

27 υπεύθυνες για την αρχική φωσφορυλίωση. Επιπλέον, η νουκλεοσιδική κινάση μερικών κυττάρων όπως είναι τα μακροφάγα ίσως να είναι ανεπαρκής για να φωσφορυλιώσει ικανοποιητικά ακόμη και εκείνα τα dd ανάλογα (όπως είναι το ΑΖΤ) που έχουν υψηλή συγγένεια ως προς το ένζυμο. Μετά την εισαγωγή του ΑΖΤ στην κλινική πράξη ακολούθησαν και άλλοι νουκλεοσιδικοί αναστολείς όπως: το didanosine (Videx ), το zalcitabine (Hivid ), το stavudine (Zerit ), το lamivudine (Epivir ), το abacavir (Ziagen ) και το emtricitabine (Emtriva ) που είναι το έβδομο 2,3-διδεοξυνουκλεοσιδικό ανάλογο το οποίο (στις 2 Ιουλίου 2003) επισήμως εγκρίθηκε για τη θεραπεία του AID (Σχήμα 5). Σχήμα 5. Χημικές δομές νουκλεοσιδικών αναστολέων της αντίστροφης μεταγραφάσης Μη-Νουκλεοσιδικοί Αναστολείς της Αντίστροφης Μεταγραφάσης (RTIs) Το βασικό μειονέκτημα της θεραπείας με νουκλεοσιδικούς αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης είναι οι τοξικές ανεπιθύμητες ενέργειες που παρουσιάζουν, οι οποίες αποδίδονται στην ανάμειξη των μεταβολιτών τους (5'- μονο-, δι- και τριφωσφορυλιωμένων) με το φυσιολογικό μεταβολισμό των 2'-δεοξυνουκλεοσιδίων και με τη διαδικασία πολυμερισμού του DA στα κύτταρα. Συνεπώς, ανάλογα που δεν αποτελούν υποστρώματα και άρα δεν αντιδρούν με το ενεργό κέντρο της DA πολυμεράσης, είτε της DAεξαρτώμενης, είτε της RA-εξαρτώμενης, αναμένεται να μην προκαλούν τις ανεπιθύμητες ενέργειες που υποβαθμίζουν την κλινική χρησιμότητα των dd αναλόγων [57, 58]. Οι μη-νουκλεοσιδικοί αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης (RTIs) αλληλεπιδρούν μη συναγωνιστικά με το αλλοστερικό κέντρο του ενζύμου και έμμεσα 26

28 εμποδίζουν τη λειτουργία του ενεργού του κέντρου [59]. Η αλληλεπίδραση τους με το ένζυμο οδηγεί σε δομικές αλλαγές που έχουν ως αποτέλεσμα τη μείωση της συγγένειάς του με το υπόστρωμα. Από την άλλη πλευρά, τα RTIs είναι δραστικά μόνο ενάντια στην αντίστροφη μεταγράφαση του HIV-1 και όχι του HIV-2 ή κάποιου άλλου ρετροϊού. Αυτή η εξειδίκευση των RTIs οφείλεται στην ύπαρξη μιας ιδιαίτερα ελαστικής υδροφοβικής κοιλότητας (αλλοστερικό κέντρο), στην οποία εισέρχονται οι RTIs [53, 60, 61]. Το αλλοστερικό κέντρο βρίσκεται στην p66 υπομονάδα του ενζύμου και σε απόσταση περίπου σε 10 Å από το ενεργό κέντρο (Εικόνα 9) [62-64]. Μερικά από τα αμινοξέα που εμπλέκονται στο σχηματισμό της κοιλότητας αυτής είναι τα εξής: Tyr181, Tyr188, Val106, Phe227, Trp229, εκ των οποίων σημαντικότερα για τη δέσμευση των RTIs είναι η Tyr181 και η Tyr188. Η απουσία αυτών των τυροσινικών αμινοξέων στην HIV-2 RT εξηγεί την έλλειψη δραστικότητας των RTIs σε αυτή [65]. Εικόνα 9. Επάνω δεξιά: Κρυσταλλική δομή της αντίστροφης μεταγραφάσης. Σημειώνεται το αλλοστερικό κέντρο του ενζύμου. Αριστερά: Μεγένθυνση του αλλοστερικού κέντρου. Υπέρθεση των κρυσταλλικών δομών τριών σημαντικών αναστολέων, του TIBO (πράσινο), του α-αρα (κίτρινο) και της νεβιραπίνης (μωβ) [66]. Οι μη-νουκλεοσιδικοί αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης μπορούν να ταξινομηθούν στις ακόλουθες κατηγορίες: (1) Παράγωγα υδροξυαιθοξυμεθυλοφαινυλοθειοθυμίνης (HEPT) [67-68]. (2) Παράγωγα τετραυδροϊμιδαζοβενζοδιαζεπινόνης (TIBO) [69-70]. (3) Παράγωγα διυδροπυριδοδιαζεπινόνης όπως η νεβιραπίνη [71]. (4) Παράγωγα πυριδινόνης [72]. 27

29 (5) Παράγωγα δισ(ετεροαρυλο)πιπεραζίνης (BHAP) [73]. (6) Τεταρτοταγή βουτυλοδιμεθυλοσιλυλοσπειροαμινοξαθειολοδιοξειδικά (TAO) νουκλεοσίδια της πυριμιδίνης [74]. (7) R-ανιλινοφαινυλακεταμιδο παράγωγα (R-APA) [75]. (8) Παράγωγα του 1H,3H-θειαζολο[3,4-a]βενζιμιδαζολίου (TBZs) [76-79]. (9) Παράγωγα της 2,3-διαρυλο-1,3-θειαζολιδιν-4-όνης [80-85]. (10) Παράγωγα της διαρυλοπυριμιδίνης όπως το rilpivirine [86] (Σχήμα 6). Σχήμα 6. Χημικές δομές μη-νουκλεοσιδικών αναστολέων της αντίστροφης μεταγραφάσης. 28

30 Τα παραπάνω RTIs είναι ικανά να αναστείλουν την αναπαραγωγή του ιού στις κυτταροκαλλιέργειες για τουλάχιστον τρεις μήνες (και πιθανόν περισσότερο), ενώ υπό τις ίδιες συνθήκες, τα dd ανάλογα δεν μπορούν να εμποδίσουν την αναπαραγωγή του ιού ακόμη και για λίγες μέρες [87-88]. Κρυσταλλογραφικές μελέτες έδειξαν ότι τα ΝRTIs δεσμεύονται στην αντίστροφη μεταγραφάση λαμβάνοντας τη μορφή «πεταλούδας» με δύο υδρόφοβα «φτερά» γωνίας περίπου 110 μοιρών [89]. Η θέση του αλλοστερικού κέντρου δέσμευσης των RTIs φαίνεται στην Εικόνα 8 επάνω δεξιά, και μεγέθυνσή της συγκρίνοντας τον τρόπο πρόσδεσης τριών γνωστών RTIs, του TIBO, του alpha-apa και της νεβιραπίνης φαίνονται στα αριστερά (Εικόνα 8). Οι πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων που σχηματίζουν την αλλοστερική κοιλότητα απεικονίζονται με μπλε. Η πλειοψηφία της κοιλότητας προέρχεται από την p66 υπομονάδα (κόκκινος σκελετός), παρολ αυτά, ένα μικρό μέρος προέρχεται από την p51 υπομονάδα (μπλε σκελετός) Αναστολείς της ιντεγκράσης (Is) Το ένζυμο ιντεγκράση (I) (Εικόνα 10) καταλύει την ενσωμάτωση του προϊικού DA στα χρωμοσώματα του προσβεβλημένου κυττάρου [90-91]. Το προϊικό DA μετά την εισαγωγή του μπορεί να μεταγραφεί ικανοποιητικά σε νέα αντίγραφα. Η ιντεγκράση είναι μια πρωτεΐνη 32 kda που αποτελείται από 288 αμινοξέα και διακρίνονται σε αυτή τρεις περιοχές: το H 2 -τελικό άκρο, η κεντρική καταλυτική περιοχή και το COOH-τελικό άκρο. Εικόνα 10. Κρυσταλλική δομή της ιντεγκράσης (αμινοξέα ), προσδιορίστηκε στα 2,8 Å [92]. 29

31 Η αμινοτελική περιοχή (αμινοξέα 1-49) έχει την ικανότητα να δεσμεύει Zn 2+, υποδεικνύοντας ότι ίσως δημιουργείται τετραμερές του ενζύμου. Αυτή η περιοχή φαίνεται να εμπλέκεται στην αναγνώριση των άκρων του προϊικού DA [93]. Η κεντρική περιοχή (αμινοξέα ) περιέχει την καταλυτική τριάδα αμινοξέων Asp64, Asp116 και Glu152. Η κατάλυση πραγματοποιείται με τη συμμετοχή και δισθενών μεταλλικών ιόντων (Mg 2+ ή Mn 2+ ). Μετάλλαξη σε οποιοδήποτε από αυτά τα τρία αμινοξέα οδηγεί σε απώλεια της δραστικότητας του ενζύμου [94]. Το καρβοξυ-τελικό άκρο (αμινοξέα ) είναι απαραίτητο για τη μεταφορά των κλώνων και γενικά περιγράφεται ως η περιοχή δέσμευσης του DA του ξενιστή. Η ιντεγκράση εκτελεί την ενσωμάτωση του DA μέσω μιας αντίδρασης δύο σταδίων (Εικόνα 11). Εικόνα 11. Σχηματική αναπαράσταση της ενσωμάτωσης του DA από την ιντεγκράση [35]. Στο πρώτο στάδιο, που ονομάζεται «3'-διαδικασία», δύο νουκλεοτίδια (GT) απομακρύνονται από κάθε 3 -άκρο του δίκλωνου μορίου του DA. Στο δεύτερο στάδιο, που ονομάζεται «μεταφορά κλώνου», ενσωματώνονται τα άκρα του προϊικού DA στο γένωμα του ξενιστή. Μέχρι σήμερα έχει ταυτοποιηθεί σημαντικός αριθμός ενώσεων που αναστέλλουν την ιντεγκράση [95-99] αλλά μόνο μία κατάφερε, το 2007, να λάβει έγκριση για κλινική χρήση, το raltegravir (Σχήμα 7) και αναστέλλει τη διαδικασία της 30

32 «μεταφοράς κλώνου». Την ίδια διαδικασία αναστέλλει και το elvitegravir που βρίσκεται στο στάδιο των κλινικών δοκιμών (φάση ΙΙΙ) (Σχήμα 7). Σχήμα 7. Χημικές δομές των Raltegravir και Elvitegravir Αναστολείς της πρωτεάσης (PΙs) Η διάσπαση των μεγάλων πρόδρoμων πολυπεπτίδιων σε μικρότερες λειτουργικές πρωτεΐνες που είναι απαραίτητες για τη συναρμολόγηση και τη μολυσματικότητα του ιού, απαιτεί τη δράση της πρωτεάσης του HIV (PR). Η πρωτεάση είναι μία ομοδιμερής πρωτεΐνη και οι καταλυτικές τριάδες Asp-Thr-Gly που συνεισφέρει το κάθε μονομερές συνθέτουν την ενεργή περιοχή του ενζύμου (Εικόνα 12). Η in vitro αναστολή του ενζύμου έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή ιών που είναι ανώριμοι και μη-μολυσματικοί [ ]. Η πρωτεάση του HIV έχει γίνει ελκυστικός στόχος για το σχεδιασμό φαρμάκων με τη βοήθεια υπολογιστικών μεθόδων [ ]. Εικόνα 12. Δομή της πρωτεάσης συμπλοκοποιημένης με τον αναστολέα BEA369. Οι υπομονάδες του ενζύμου είναι χρωματισμένες με πράσινο και κυανό, ενώ το ενεργό κέντρο με κόκκινο. Ο αναστολέας απεικονίζεται πολύχρωμος (άτομα άνθρακα - λευκό, αζώτου - μπλε, οξυγόνου - κόκκινο) [104]. 31

33 Μια πληθώρα πεπτιδικών και μη πεπτιδικών αναστολέων της πρωτεάσης του HIV-1 έχει περιγραφεί [105]. Το FDA έχει εγκρίνει αρκετούς από αυτούς για τη θεραπεία του HIV, όπως για παράδειγμα το saquinavir, το ritanovir, το indinavir, το nelfinavir και το amprenavir (Σχήμα 8). Ωστόσο, η ανάγκη για ανάπτυξη αντι-hiv χημειοθεραπευτικών που αναστέλλουν την πρωτεάση είναι συνεχής διότι ο ιός έχει την ικανότητα να παράγει ταχέως μεταλλαγμένα στελέχη τα οποία είναι ανθεκτικά [106]. O H H 2 O H O OH aquinavir Invirase O H H H CH 3 H 3 C CH3 O O O H OH H 3 C O O AmpenavirAgenerase CH 3 H 2 OH OH H H 3 C CH 3 CH 3 O O H O O H HO H H H 3 C CH OH 3 CH3 H Indinavir Crixivan elfinavir Viracept H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 O O H O H H CH 3 O OH Ritonavirorvir Σχήμα 8. Χημικές δομές αναστολέων της πρωτεάσης. 32

34 3. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Παρά την τεράστια πρόοδο στην κατανόηση του κύκλου αναπαραγωγής του HIV-1 και των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την παθογένεια του AID, δεν είναι ακόμη δυνατόν να ελεγχθεί πλήρως ο ιός HIV-1 για μεγάλο χρονικό διάστημα. Δεδομένου ότι είναι ακόμη ασαφές κατά πόσον ένα αποτελεσματικό εμβόλιο θα μπορούσε να αναπτυχθεί σε σύντομο χρονικό διάστημα, οι θεραπευτικές προσεγγίσεις με βάση το συνδυασμό διαφόρων ισχυρών αντιρετροϊικών φαρμάκων εξακολουθούν να είναι η καλύτερη επιλογή που έχουν οι ιατροί για τον έλεγχο της λοίμωξης από τον HIV-1. Για το λόγο αυτό, η ανάπτυξη νέων μορίων που είναι ισχυρότερα φάρμακα αλλά ταυτόχρονα και λιγότερο ευαίσθητα στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε σχέση με τα διαθέσιμα φάρμακα είναι υποχρεωτική. Οι αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης αποτελούν την πλειοψηφία των κλινικά χρησιμοποιούμενων αντι-hiv φαρμακών και συνιστούν τον κύριο κορμό της συνδυασμένης χημειοθεραπείας. Μεταξύ αυτών, οι μη-νουκλεοσιδικοί αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης (RTIs) είναι πολύ αποτελεσματικά φάρμακα για τη θεραπεία της νόσου όταν χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα [107]. Δυστυχώς όμως, ο HIV έχει την ικανότητα να αναπτύσσει ανθεκτικές ιικές σειρές και μάλιστα να εμφανίζει «διασταυρούμενη ανθεκτικότητα» σε όλα τα φάρμακα της ίδιας κατηγορίας. Για το λόγο αυτό, είναι επιτακτική η ανάγκη ανάπτυξης νέων RT αναστολέων. Σύμφωνα με την πρόσφατη βιβλιογραφία, έχουν συντεθεί αρκετά παράγωγα 2,3-διαρυλο-θειαζολιδιν-4-όνης τα οποία αναστέλλουν ισχυρά το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση, παρουσιάζοντας ταυτόχρονα χαμηλή τοξικότητα. Λαμβάνοντας υπόψιν το σύνολο των 2,3-διαρυλο-θειαζολιδιν-4-ονών που έχουν συντεθεί, θεωρείται απαραίτητη η παρουσία 2,6-διαλογονοφαινυλίου στη θέση 2 του δακτυλίου της θειαζολιδινόνης, καθώς αυτό βοηθάει το μόριο να λάβει τη διαμόρφωση «πεταλούδας» και να αναστείλλει την αντίστροφη μεταγραφάση. Από την άλλη πλευρά, στη θέση 3 του δακτυλίου της θειαζολιδινόνης έχει δοκιμαστεί μια ποικιλία υποκαταστατών όπως: παράγωγα φαινυλίου [80, 108, 109], πυριδίνης [80, 81, 108, 110], πυριμιδίνης [82, 83, 108, 111], θειαζολίου [83], διθειαζολίου [83], φουρανίου, πυρρολίου και το αδαμαντάνιο [112, 113]. Ισχυρότερη ανασταλτική δράση παρουσίασαν τα παράγωγα της πυριδίνης, της πυριμιδίνης και του θειαζολίου. 33

35 Λαμβάνοντας υπ όψιν όλα τα παραπάνω βιβλιογραφικά δεδομένα, όπως επίσης και το γεγονός ότι το αλλοστερικό κέντρο της αντίστροφης μεταγραφάσης είναι μια ιδιαίτερα λιπόφιλη κοιλότητα, θεωρήσαμε ενδιαφέρον να σχεδιάσουμε σειρά βενζοθειαζολικών, βενζοϊμιδαζολικών και 4-αδαμαντυλοθειαζολικών παραγώγων της 1,3-θειαζολιδιν-4-όνης. Επίσης, έγινε υπολογιστική πρόβλεψη του φάσματος βιολογικής δράσης των ενώσεων που σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα PA, το οποίο προέβλεψε την αντιρετροϊκή δράση τους. Στο παρακάτω σχήμα φαίνεται η χημική δομή των παραγώγων που συντέθηκαν: όπου Ζ= Για Ζ = βενζο[d]θειαζόλιο: 1. R = H, X = 2,6-δι F 2. R = H, X= 2-F και 6-Cl 3. R = 6-F, X = 2,6-δι F 4. R = 6-F, X= 2-F και 6-Cl 5. R = 6-F, X = 2,6-δι Cl 6. R = 4-Cl, X = 2,6-δι F 7. R = 4-Cl, X= 2-F και 6-Cl 8. R = 4-Cl, X = 2,6-δι Cl 9. R = 6-Cl, X = 2,6-δι F 10. R = 6-Cl, X= 2-F και 6-Cl 11. R = 6-Cl, X = 2,6-δι Cl 12. R = 4-OMe, X= 2,6-δι F 13. R = 4-OMe, X= 2-F και 6-Cl 14. R = 4-OMe, X = 2,6-δι Cl 15. R = 6-OMe, X = 2,6-δι F 16. R = 6-OMe, X= 2-F και 6-Cl 17. R = 6-OMe, X = 2,6-δι Cl 18. R = 6-OEt, X = 2,6-δι Cl 19. R = 6-OEt, X= 2-F και 6-Cl 20. R = 6-OEt, X = 2,6-δι F Για Ζ = βενζο[d]ιμιδαζόλιο: 21. R = H, X = 2,6-δι F 22. R = H, X = 2-F και 6-Cl Για Ζ = 4- αδαμαντυλοθειαζόλιο: 23. X = 2,6-δι Cl 24. X = 2,5-δι OMe 25. X = 4-Br Σχήμα 9. Xημικοί τύποι των ενώσεων που συντέθηκαν. Όλες οι ενώσεις εξετάστηκαν in vitro ως πιθανοί μη-νουκλεοσιδικοί αναστολείς της αντίστροφης μεταγραφάσης του HIV-1. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν κινητικές μελέτες για δύο παράγωγα του αδαμαντανίου με σκοπό την αξιολόγηση της ασύνηθιστης συμπεριφοράς τους κατά τη διάρκεια των in vitro δοκιμών αναστολής του ενζύμου. Καθορίστηκαν οι παράμετροι 34

36 V max, K m και K cat των δύο αναστολέων καθώς και ο μηχανισμός αναστολής της αντίστροφης μεταγραφάσης. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν θεωρητικές μελετές πρόσδεσης (docking) για ορισμένες από τις υπό μελέτη ενώσεις στο αλλοστερικό κέντρο του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση, χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Autodock

37 4. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 4.1. ΟΡΓΑΝΑ, ΧΗΜΙΚΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΛΟΙΠΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ Για τον προσδιορισμό των σημείων τήξης χρησιμοποιήθηκε συσκευή υάλινων ανοικτών τριχοειδών τύπου MEL-TEMP II (Labοratory devices UA). Tα φάσματα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού 1 H και 13 C MR ελήφθησαν με φασματόμετρο τύπου Bruker Avance στα 300 MHz. Οι τιμές χημικής μετατόπισης δίδονται σε μέρη ανά εκατομμύριο (ppm/δ), ενώ ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε το τετραμεθυλοσιλάνιο (δ TM =0). Για τη λήψη των φασμάτων μαζών (M) χρησιμοποιήθηκαν τα φασματόμετρα τύπου Kratos M50TC και Kratos Mach III (ΕΙ). Η θερμοκρασία της πηγής ιονισμού ήταν C. Η λήψη των φασμάτων HRM πραγματοποιήθηκε με φασματοφωτόμετρο τύπου HP5989A M (EI). Για τα φάσματα υπερύθρου (IR) χρησιμοποιήθηκαν φασματοφωτόμετρα διπλής δέσμης Perkin Elmer pectrum BX και DR-8001 himadzu. Οι στοιχειακές αναλύσεις έγιναν με αναλυτές τύπου Perkin-Elmer 240B CH (The Perkin-/Elmer Corporation Ltd., Lane Beaconsfield, Bucks, UK) Για τη χρωματογραφία λεπτής στιβάδας, κανονικής φάσης, χρησιμοποιήθηκαν αναλυτικές πλάκες TLC (Alugram IL G/UV 254 ). Όλα τα αντιδραστήρια χρησιμοποιήθηκαν χωρίς περαιτέρω καθαρισμό και ήταν υψηλής αναλυτικής καθαρότητας ή της υψηλότερης ποιότητας που ήταν δυνατόν να βρεθεί στο εμπόριο. Όλα τα αντιδραστήρια και οι διαλύτες αγοράστηκαν από την εταιρεία Aldrich Chemie (teinheim Germany). Η ανασταλτική δράση των βενζοθειαζολικών και βενζοϊμιδαζολικών παραγώγων επί του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση του HIV-1 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την ανοσοενζυμική χρωματομετρική δοκιμασία που παρέχεται από την εταιρεία Roche. Για τον προσδιορισμό της ανασταλτικής δράσης των αδαμαντυλο-παραγώγων χρησιμοποιήθηκαν αντιδραστήρια αναλυτικής καθαρότητας, προϊόντα των εταιρειών igma-aldrich (t. Louis, MO, UA), Merck harp & Dohme (Readington, J; UA), IC (Research Products Division, Costa Mesa, CA UA) και AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany). Η παρασκευή του υβριδίου RA-ολίγοdT πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας νουκλεοτίδια από την εταιρεία Pharmacia & Upjohn Inc.-Pfizer, 36

38 Peapack, J, Η.Π.Α και ο καθαρισμός της ανασυνδυασμένης αντίστροφης μεταγραφάσης έγινε χρησιμοποιώντας στήλη νικελίου ita superflow της Qiagen, Η.Π.Α. Η ραδιενεργή 5-τριφωσφορική 2-δεοξυθυμιδίνη [3H]dTTP (40 Ci/mmol), που χρησιμοποιήθηκε ως νουκλεοτίδιο (dtp) για την αντίδραση πολυμερισμού ήταν της εταιρείας Amersham Bio-ciences (GE Healthcare, Buckinghamshire, GB), ενώ το μη επισημασμένο dtps ήταν της εταιρείας Boehringer Ingelheim GmbH (Ingelheim, Germany). Τέλος,οι ηθμοί GF/C ήταν της εταιρίας Whatman Int. Ltd (Maidstone, England) και το σπινθηριστικό υγρό που χρησιμοποιήθηκε ήταν EcoLume (IC, Research Products Division, Costa Mesa, CA, ΗΠΑ), ενώ προκειμένου να προσδιιοριστεί η ραδιενέργεια που καθηλώθηκε στο φίλτρο χρησιμοποιήθηκε υγρός σπινθηριστής PerkinElmer Trilux MicroBeta 1450 Counter ΣΥΝΘΕΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ ΑΡΧΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Σύνθεση της 4-αδαμαντυλοθειαζολ-2-αμίνης Η 1-αδαμαντυλο-βρωμομεθυλο κετόνη, (1 mmol) διαλύεται σε 5ml ισοπροπανόλης και προστίθενται 10ml αιωρήματος θειουρίας (2 mmol) σε ισοπροπανόλη. Το μίγμα αναδεύεται για 30 λεπτά. Ακολουθεί ανάμειξη του παραπάνω μίγματος με διάλυμα 5% ανθρακικού νατρίου και το σχηματιζόμενο ίζημα διηθείται και ξηραίνεται. Τέλος, το λαμβανόμενο προϊόν ανακρυσταλλώνεται από οξικό αιθυλεστέρα. Απόδοση: 94% R f : 0,76 (βενζόλιο/αιθανόλη: 8/2) Σ.τ.: ,5 o C Φασματοσκοπική εξέταση IR (KBr): v= 3050 cm -1 (-H), 1650 cm -1 (C=O). Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 1,65-2,00 (m, 15H), 6,00 (s, 1H), 6,75 (s, 2H). 37

39 4.2.2 ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ ΤΕΛΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Γενική μέθοδος σύνθεσης των 2-αρυλο-3-ετεροαρυλο-θειαζολιδιν-4-ονών Για τη σύνθεση των ενώσεων ακολουθήθηκαν δύο διαφορετικές προσεγγίσεις. Η Α μέθοδος αποτελεί την «κλασσική» οδό παρασκευής 2,3-διαρυλο-θειαζολιδιν-4- ονών, ενώ η Β μέθοδος βασίζεται στη χρήση της ακτινοβολίας μικροκυμάτων. Α. Σύμφωνα με την «κλασσική» μέθοδο σύνθεσης των 2,3-διαρυλο-θειαζολιδιν-4- ονών [73, 114] η κατάλληλη (ετερο)αρωματική αμίνη (1,0 mmol) και η κατάλληλα υποκατεστημένη βενζαλδεΰδη (1,2 mmol) αναδεύονται υπό βρασμό σε ξηρό τολουόλιο, ενώ ακολουθεί προσθήκη του θειογλυκολικού οξέος (2,0 mmol). Η θέρμανση συνεχίζεται για ώρες μέχρι την πλήρη κατανάλωση της (ετερο)αρωματικής αμίνης. Μετά την απομάκρυνση του διαλύτη υπό κενό το υπόλειμμα παραλαμβάνεται με οξικό αιθυλεστέρα. Ακολουθεί πλύση της οργανικής στοιβάδας με υδατικό διάλυμα 5% κιτρικού οξέος, νερό και υδατικό διάλυμα 5% όξινου ανθρακικού νατρίου. Η οργανική στοιβάδα ξηραίνεται με θειικό νάτριο και o διαλύτης απομακρύνεται υπό ελαττωμένη πίεση. Λαμβάνεται στερεό υπόλειμμα το οποίο πλένεται με αιθανόλη. Το τελικό προϊόν αφήνεται προς ξήρανση. Β. Για την πραγματοποίηση των αντιδράσεων με τη βοήθεια ακτινοβολίας μικροκυμάτων χρησιμοποιήθηκε το όργανο CEM-Discover Monomode, με συχνότητα 2,45 GHz και συνεχόμενη ακτινοβόληση μέγιστης ισχύος W. Σύμφωνα με τη μέθοδο Β, η κατάλληλη (ετερο)αρωματική αμίνη (1 mmol) τοποθετείται στον ειδικό σωλήνα χωρητικότητας 10 ml μαζί με την κατάλληλα υποκατεστημένη βενζαλδεΰδη (1,3 mmol) και θειογλυκολικό οξύ (5 mmol). Προστίθενται 2-3 ml απόλυτης αιθανόλης, ο σωλήνας καλύπτεται με το ειδικό πώμα από τεφλόν και τοποθετείται στην υποδοχή του οργάνου (CEM). Ακτινοβολείται για λεπτά στους C χρησιμοποιώντας ως μέγιστη πίεση 250 psi. Το δείγμα αναδεύεται καθ όλη τη διάρκεια της αντίδρασης και μετά το πέρας της, ο σωλήνας ψύχεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Το ίζημα που λαμβάνεται, διηθείται, πλένεται με μεθανόλη και αφήνεται προς ξήρανση. 38

40 Δοκιμές για την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών διεξαγωγής της αντίδρασης με τη βοήθεια μικροκυμάτων Για την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών διεξαγωγής της αντίδρασης με τη βοήθεια μικροκυμάτων πραγματοποιήθηκαν σειρά δοκιμών, οι οποίες περιγράφονται παρακάτω: 1. Στην πρώτη δοκιμή, προστέθηκε η κατάλληλη ετεροαρωματική αμίνη (1 mmol) και διαλογονο-βενζαλδεΰδη (1,2 mmol) σε 3-4 ml διμεθυλοφορμαμιδίου και το διάλυμα ακτινοβολήθηκε για 10 λεπτά στους 100 o C και μέγιστη ισχύ τα 100W. Έπειτα προστέθηκε το θειογλυκολικό οξύ (2 mmol) και η ακτινόβοληση συνεχίστηκε για ακόμη 10 λεπτά στους 120 o C υπό τις παρούσες συνθήκες. Η απόδοση του προϊόντος ήταν μηδαμινή (ίχνη μόνο). 2. Στην επόμενη προσπάθεια πραγματοποιήθηκε ακτινοβόληση της αμίνης (1 mmol) και αντίστοιχης βενζαλδεΰδης (1,2 mmol) σε 3-4ml μεθανόλης με μέγιστη ισχύ 50W, στους 70 o C για 20 λεπτά, με σκοπό την παρασκευή της ενδιάμεσης ιμίνης. Ελήφθησαν μόνο ίχνη ιμίνης και πρώτες ύλες. 3. Συνεχίζοντας τις προσπάθειές μας για σχηματισμό της ενδιάμεσης ιμίνης, η αντίδραση πραγματοποιήθηκε παρουσία καταλυτικής ποσότητας πυριδίνης σε όμοιες με πριν συνθήκες. Το αποτέλεσμα πάλι ήταν ο σχηματισμός της ιμίνης σε ίχνη. 4. Έτσι, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση της ενδιάμεσης ιμίνης σύμφωνα με τη συμβατική μέθοδο (αζεοτροπική απόσταξη) και απομονώθηκε. Έπειτα, η ιμίνη μαζί με το θειογλυκολικό οξύ ακτινοβολήθηκαν χρησιμοποιώντας ως διαλύτη το τολουόλιο, μέγιστη ισχύ 250W, θερμοκρασία 140 o C για 10 λεπτά. Σχηματίστηκε το επιθυμητό προϊόν. Παρολ αυτά, επειδή ο στόχος μας ήταν η ανάπτυξη ενός συνθετικού πρωτοκόλλου βελτιωμένου σε σχέση με την «κλασσική» μέθοδο, όπου ο απαιτούμενος χρόνος θα είναι σημαντικά μειωμένος, κάτι που δεν επιτυγχάνεται στην περίπτωση της αρχικής σύνθεσης της ιμίνης με αζεοτροπική απόσταξη, συνεχίσαμε τις προσπάθειες μας. 5. Η σύνθεση του τελικού προϊόντος πραγματοποιήθηκε με ακτινοβόληση του μίγματος της αντίστοιχης αμίνης (1,0 mmol), αλδεΰδης (1,2 mmol) και του θειογλυκολικού οξέος (2 mmol) σε 3-4 ml μεθανόλης, για 30 λεπτά, με μέγιστη ισχύ 50W στους 80 o C. Ως αποτέλεσμα πήραμε το προϊόν με ίχνη ιμίνης. Δεν παρατηρήθηκαν πρώτες ύλες, μόνο ίχνη ιμίνης και το μεγαλύτερο μέρος του προϊόντος ήταν το επιθυμητό προϊόν. 6. Τέλος, σε μια προσπάθεια βελτίωσης της απόδοσης της αντίδρασης χρησιμοποιήθηκε θειογλυκολικό οξύ σε περίσσεια (5 mmol), ως διαλύτης χρησιμοποιήθηκε απόλυτη αιθανόλη και αυξήθηκε η θερμοκρασία στους 90 ή 100 o C. 39

41 Σύνθεση των 2-(2,6-διαλογονοφαινυλο)-3-(βενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-ονών Σύνθεση της 2-(2,6-διφθοροφαινυλo)-3-(βενζο[d]θειαζολ-2-υλo)θειαζολιδιν-4-όνης (1) Η σύνθεση της ένωσης αυτής πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 100 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 40 λεπτά. Απόδοση: 43% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,62 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 8.02 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,63 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,43 7,34 (m, 3H), 7,16 7,06 (m, 3H), 4,32 4,16 (m, 2H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,2, 161,5, 161,4, 158,2, 158,0, 155,9, 147,5, 131,1, 131,0, 130,8, 130,7, 126,4, 124,4, 122,0, 121,3, 116,8, 116,6, 112,4, 112,1, 53,6, 30,7. HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 16 H 10 O 2 2 F 2 [M + ]: 348,0203, ευρεθέν: 348,0217, m/z: M +, 348,02179 (100,00), 307,00998 (10,47), 306,00969 (33,86), 276,04922 (10,29), 275,04563 (52,98), 273,02906 (15,69), 255,03959 (58,94) 172,01425(14,21), 161,01866 (10,66), 135,01427 (10,64), 127,03717 (17,46), 108,00173 (10,97). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 55,16%, H: 2,89%, : 8,04%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 54,74%, H: 2,98%, : 7,99%. Σύνθεση της 2-(2-χλωρο-6-φθοροφαινυλo)-3-(βενζο[d]θειαζο-2-υλo)θειαζολιδιν-4-όνης (2) 40

42 Η σύνθεση της ένωσης αυτής πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 100 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 60 λεπτά. Απόδοση: 59% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,69 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 8,01 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,61 7,56 (m, 1H), 7,46 7,31 (m, 4H), 7,19 7,14 (m, 2H), 4,31 4,16 (m, 2H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,3, 156,0, 147,5, 132,9, 131,1, 130,8, 126,4, 126,1, 125,9, 124,4, 121,9, 121,2, 116,0, 115,7, 57,8, 30,7. HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 16 H 10 O 2 2 ClF [M + ]: 363,9907, ευρεθέν: 363,9901, m/z: M +, 363,99009 (27,93), 330,02581 (14,57), 329,02340 (83,62), 321,98061 (9,37), 292,00805 (7,39), 291,01561 (16,29), 290,00813 (21,66), 289,00180 (13,81), 287,01220 (23,79), 274,01502 (9,51), 273,00722 (12,57), 272,01342 (6,35), 271,00958 (35,30), 256,04291 (18,01), 255,03962 (100,00), 172,96318 (8,21), 161,01887 (5,28), 153,01848 (16,33), 144,99626 (5,31), 135,00948 (19,85), 134,00250 (9,54), 109,00980 (7,06), 108,00274 (14,60). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 52,67%, H: 2,76%, : 7,68%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 52,44%, H: 2,42%, : 7,62%. Σύνθεση της 2-(2,6-διφθοροφαινυλo)-3-(6-φθοροβενζο[d]θειαζολ-2-υλo)θειαζολιδ- 4-όνης (3) F F O F Η σύνθεση της ένωσης αυτής πραγματοποιήθηκε και με τις δύο μεθόδους. Στη μέθοδο (Α) ο χρόνος της αντίδρασης ήταν 22 ώρες. Στη μέθοδο (Β), η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 90 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 30 λεπτά. Απόδοση Α μεθόδου: 39% Απόδοση Β μεθόδου: 45% Σ.τήξεως: ºC 41

43 R f : 0,61 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 7,93 (d, J = 10.1, 1H), 7,66 7,61 (m, 1H), 7,46 7,36 (m, 1H), 7,28 7,22 (t, J = 20,3, 10,1 Hz, 1H), 7,16 7,09 (t, J = 20,3, 10,1, Hz, 2H), 7,03 (s, 1H), 4,32 4,16 (m, 2H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,4, 161,4, 161,3, 160,6, 158,1, 158,0, 157,4, 155,9, 144,2, 132,5, 132,3, 131,0, 130,9, 130,7, 122,6, 122,4, 116,7, 114,8, 114,5, 112,4, 112,1, 108,6, 108,3, 73,5, 53,6, 32,9. HRM (EI): m/z ευρεθέν για C 16 H 9 O 2 2 F 3 [M + ]: 366,0108, ευρεθέν: 366,0114, m/z: M +, 366,01140 (100,00), 324,00101 (21,36), 294,03862 (8,94), 293,03600 (55,60), 292,02548 (5,42), 291,02047 (13,97), 274,03363 (8,19), 273,03025 (45,39), 214,01355 (5,90), 179,00741 (8,14), 172,01662 (14,35), 171,00762 (6,05), 153,00635 (13,51), 127,03535 (17,46). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 52,45%, H: 2,48%, : 7,65%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 52,27%, H: 2,21%, : 7,54%. Σύνθεση της 2-(2-χλωρο-6-φθοροφαινυλo)-3-(6-φθοροβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδ-4-όνης (4) F F O Cl Η σύνθεση της ένωσης αυτής πραγματοποιήθηκε και με τις δύο μεθόδους. Στη μέθοδο (Α) ο χρόνος της αντίδρασης ήταν 21 ώρες. Στη μέθοδο (Β), η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 100 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 40 λεπτά. Απόδοση Α μεθόδου: 35% Απόδοση Β μεθόδου: 37% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,70 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 7,93 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,61 7,43 (m, 1H), 7,39 7,11 (m, 5H), 4,32 4,16 (m, 2H). HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 16 H 10 O 2 2 ClF 2 [M + ]: 381,9813, ευρεθέν: 381,9822, m/z: M +, 381,98223 (67,99), 366,01084 (44,08), 364,97862 (17,35), 362,

44 (36,61), 348,01402 (20,91), 347,01273 (97,93), 343,98047 (15,58), 339,97045 (17,84), 320,97260 (19,60), 316,98481 (44,86), 312,98688 (18,72), 310,99992 (15,50), 309,00392 (32,45), 300,98755 (25,55), 293,03548 (24,08), 292,00647 (15,54), 290,99869 (26,66), 289,00106 (47,74), 274,03407 (18,66), 273,03041 (100,00), 266,98430 (41,56), 250,99026 (20,38), 235,98538 (26,98), 232,99958 (19,00), 224,99274 (18,99), 219,98779 (16,74), 216,98737 (24,61), 212,99179 (36,95), 198,99215 (33,50), 185,98882 (17,26), 184,97660 (16,85), 183,00347 (18,15), 172,96118 (22,05), 169,99001 (25,93), 163,00071 (43,15), 154,99375 (23,44), 153,01607 (48,05), 151,99686 (27,68), 133,00631 (32,25), 125,99445 (23,24), 119,99320 (20,40). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 50,20%, H: 2,37%, : 7,32%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 50,31%, H: 2,08%, : 7,17%. Σύνθεση της 2-(2,6-διχλωροφαινυλo)-3-(6-φθοροβενζο[d]θειαζολ-2-υλo) θειαζολιδιν-4-όνης (5) Η σύνθεση της ένωσης αυτής πραγματοποιήθηκε και με τις δύο μεθόδους. Στη μέθοδο (Α) ο χρόνος της αντίδρασης ήταν 25 ώρες. Στη μέθοδο (Β), η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 100 ºC, ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 60 λεπτά και η μέγιστη ισχύς 75 W. Απόδοση Α μεθόδου: 33% Απόδοση Β μεθόδου: 41% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,67 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 7,92 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 7,60 7,49 (m, 2H), 7,35 7,25 (m, 3H), 7,20 (t, J = 10,1 Hz, 1H), 4,32 4,18 (m, 2H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,7, 160,6, 155,9, 144,2, 134,6, 133,5, 132,1, 130,5, 129,0, 122,5, 122,4, 114,7, 114,4, 108,5, 108,2, 59,2, 33,8. Φασματοσκοπική εξέταση μαζών (M): m/z: M +, 398(17), 363(88), 321(29), 289(100), 262(3), 227(4), 199(8), 169(11), 126(15), 108(10). 43

45 HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 16 H 10 O 2 2 Cl 2 F [M + ]: 397,9517, ευρεθέν: 397,9524, m/z: M +, 397,95247 (15,66), 364,98055 (24,74), 363,98710 (17,00) 324,97630 (12,44), 322,96758 (12,88), 290,99874 (53,52), 320,97384 (22,89), 290,00442 (23,32), 289,00047 (100,00), 153,00593 (16,00), 151,99817 (10,47), 125,99518 (11,37). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 48,13%, H: 2,27%, : 7,02%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 48,21%, H: 2,20%, : 6,89%. Σύνθεση της 2-(2,6-διφθοροφαινυλο)- 3-(4-χλωροβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης (6) Η σύνθεση της ένωσης αυτής πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 100 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 60 λεπτά. Απόδοση: 58% Σ.τήξεως: 193 ºC R f : 0,72 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 8,00 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,51 7,30 (m, 3H), 7,15 7,05 (m, 3H), 4,35 4,19 (m, 2H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,3, 161,8, 158,5, 158,4, 156,5, 144,4, 132,7, 131,1, 130,9, 130,8, 126,4, 125,4, 125,1, 121,1, 116,7, 116,5, 116,3, 112,2, 111,9, 53,5, 33,0. HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 16 H 9 O 2 2 ClF 2 [M + ]: 381,9813, ευρεθέν: 381,9818, m/z: M +, 381,98184 (100,00), 341,96766 (16,49), 339,97064 (33,77), 311,00408 (30,23), 310,00950 (14,65), 309,00743 (79,99), 306,99194 (10,94), 289,00096 (16,34), 214,96253 (28,64), 200,94769 (16,34), 156,9919 (17,27), 127,03657 (20,91). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 50,20%, H: 2,37%, : 7,32%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 50,35%, H: 2,55%, : 7,39%. 44

46 Σύνθεση της 2-(2-χλωρο-6-φθοροφαινυλο)-3-(4-χλωροβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδ-4-όνης (7) Η σύνθεση της ένωσης αυτής πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 100 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 60 λεπτά. Απόδοση: 64% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,65 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 8,17 (s, 1H), 7,60 7,11 (m, 6H), 4,31 4,16 (m, 2H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,5, 156,8, 146,3, 132,8, 130,8, 130,7, 128,5, 126,8, 126,1, 125,6, 122,5, 121,6, 116,0, 115,7, 57,7, 32,9. HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 16 H 9 O 2 2 Cl 2 F [M + ]: , ευρεθέν: , m/z: M +, 397,95242 (100,00), 364,98112 (13,06), 357,94010 (29,80), 355,94317 (40,06), 326,97421 (46,10), 325,97884 (10,89), 324,97682 (69,14), 288,99952 (52,92), 214,96341 (46,67), 200,94718 (18,33), 153,01844 (49,17), 134,00224 (14,17), 106,99537 (5,83). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 48,13%, H: 2,27%, : 7,02%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 48,08%, H: 2,25%, : 6,98%. Σύνθεση της 2-(2,6-διχλωροφαινυλο)-3-(4-χλωροβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης (8) 45

47 Η σύνθεση της ένωσης αυτής πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 100 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 60 λεπτά. Απόδοση: 45% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,63 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 8,15 (s, 1H), 7,58 7,47 (m, 1H), 7,39 7,36 (m, 1H), 7,34 7,32 (m, 4H), 4,31 4,19 (m, 2H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,8, 156,7, 146,3, 134,6, 133,4, 132,7, 132,1, 130,6, 130,5, 129,0, 128,4, 126,7, 122,4, 121,6, 59,2, 33,8. HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 16 H 9 O 2 2 Cl 3 [M + ]: 413,9222, ευρεθέν: 413,9229, m/z: M +, 413,92299 (100,00), 382,94966 (16,38), 379,95666 (15,24), 378,95520 (80,19), 375,90682 (46,23), 373,90997 (46,52), 371,91318 (39,15), 350,95693 (13,21), 336,94264 (69,34), 306,97436 (74,53), 294,99813 (6,60), 245,95436 (5,66), 214,96269 (64,15), 188,93331 (28,30), 170,97521 (27,36), 134,0157 (33,02), 106,9959 (8,49). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 46,22%, H: 2,18%, : 6,74%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 46,18%, H: 2,13%, : 6,65%. Σύνθεση της 2-(2,6-διφθοροφαινυλο)-3-(6-χλωροβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης (9) Η σύνθεση της ένωσης αυτής πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 100 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 30 λεπτά. Απόδοση: 38% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,66 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 8,17 (s, 1H), 7,62 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 7,44 7,41 (m, 2H), 7,16 7,10 (t, J = 10,1 Hz, 2H), 7,04 (s, 1H), 4,33 4,17 (m, 2H). 46

48 Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,4, 161,4, 161,3, 158,2, 158,0, 156,7, 146,3, 132,8, 131,1, 130,9, 130,7, 128,5, 121,7, 116,8, 116,6, 112,4, 112,1, 53,6, 32,9. HRM (EI): ): m/z υπολογισθέν για C 16 H 9 O 2 2 ClF 2 [M + ]: 381,9813, ευρεθέν: , m/z: M +, 381,98227 (100,00), 339,97304 (25,48), 311,00413 (21,65), 310,00868 (10,52), 309,00678 (68,72), 306,99055 (17,76), 290,99763 (19,51), 289,00065 (50,50), 214,96349 (17,35), 214,01484 (10,16), 172,01407 (23,33), 156,99283 (17,17), 127,03530 (19,57). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 50,20%, H: 2,37%, : 7,32%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 50,13%, H: 2,20%, : 7,26%. Σύνθεση της 2-(2-χλωρο-6-φθοροφαινυλο)-3-(6-χλωροβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης (10) Η σύνθεση της ένωσης αυτής πραγματοποιήθηκε και με τις δύο μεθόδους. Στη μέθοδο (Α) ο χρόνος της αντίδρασης ήταν 20 ώρες. Στη μέθοδο (Β), η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 90 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 30 λεπτά. Απόδοση Α μεθόδου: 54% Απόδοση Β μεθόδου: 52% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,72 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 7,99 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,59 7,56 (m, 1H), 7,48 7,43 (m, 2H), 7,34 7,28 (m, 3H), 4,35 4,20 (m, 2H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,5, 158,6, 156,6, 144,4, 133,5, 132,7, 130,8, 130,7, 126,9, 126,5, 125,8, 125,7, 125,3, 125,1, 121,1, 115,8, 115,5, 114,7, 57,6, 33,0. HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 16 H 9 O 2 2 ClF 2 [M + ]: 397,9517, ευρεθέν: 397,9524, m/z: M +, 397,95328 (71,99), 365,98490 (11,57), 364,98049 (47,05), 363,98659 (21,77), 357,94014 (13,18), 355,94316 (16,53), 326,97406 (23,25), 324,97626 (35,72), 322,96592 (22,45), 320,97276 (38,83), 307,98296 (15,25), 306,97520 (14,30), 290,99685 (35,94), 47

49 290,00330 (19,08), 288,99991 (100,00), 216,97239 (11,31), 214,96356 (22,37), 200,95651 (13,11), 172,96358 (21,75), 153,01858 (49,35), 141,95222 (15,80). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 48,13%, H: 2,27%, : 7,02%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 47,99%, H: 2,13%, : 7,05 %. Σύνθεση της 2-(2,6-διχλωροφαινυλο)-3-(6-χλωροβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης (11) Η σύνθεση της ένωσης αυτής πραγματοποιήθηκε και με τις δύο μεθόδους. Στη μέθοδο (Α) ο χρόνος της αντίδρασης ήταν 26 ώρες. Στη μέθοδο (Β), η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 90 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 30 λεπτά. Απόδοση Α μεθόδου: 23% Απόδοση Β μεθόδου: 44% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,68 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): ): δ = 7,99 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,50 7,29 (m, 4H), 7,23 7,12 (m, 2H), 4,35 4,19 (m, 2H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,7, 156,4, 144,3, 135,3, 133,2, 132,6, 132,3, 130,5, 130,4, 128,8, 126,4, 125,3, 125,1, 121,0, 59,1, 33,9. HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 16 H 9 O 2 2 Cl 3 [M + ]: 413,9222, ευρεθέν: 413,9228, m/z: M +, 413,92294 (38,24), 382,97043 (32,76), 379,98024 (43,47), 373,92139 (14,20), 371,91840 (15,70), 342,94294 (16,49), 340,93900 (25,07), 338,93870 (54,75), 337,94601 (15,10), 336,94136 (66,30), 325,94342 (14,87), 323,94742 (18,63), 308,97477 (30,17), 307,98062 (21,44), 306,97830 (100,00), 226,94896 (12,67), 214,96316 (20,21), 194,97978 (10,79), 190,93123 (18,22), 188,93255 (22,08), 170,97635 (18,87), 167,96986 (13,11), 141,96491 (15,07). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 46,22%, H: 2,18%, : 6,74%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 46,31%, H: 2,09%, : 6,53%. 48

50 Σύνθεση της 2-(2,6-διφθοροφαινυλο)-3-(4-μεθοξυβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης (12) Η σύνθεση της ένωσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 100 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 40 λεπτά. Απόδοση: 71% Σ.τήξεως: ,5 ºC R f : 0,5 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 7,57 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,44 7,40 (m, 1H), 7,37 7,30 (t, J = 25,3, 12,2 Hz, 1H), 7,14 7,06 (m, 3H), 6,96 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 4,30 4,15 (m, 2H), 3,81 (s, 3H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,1, 161,4, 158,2, 154,1, 152,1, 137,6, 132,9, 130,8, 130,6, 125,5, 116,7, 113,8, 112,4, 112,0, 109,3, 56,5, 53,6, 32,9, 30,7. HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 17 H 12 O F 2 [M + ]: 378,0308, ευρεθέν: 378,0317, m/z: M +, 378,03176 (100,00), 377,02386 (12,47), 349,02837 (8,11), 336,01351 (8,86), 306,00284 (6,18), 304,00686 (6,51), 303,00558 (19,65), 287,01790 (5,53), 275,03568 (8,91), 274,00042 (7,24), 211,01265 (6,86), 172,01605 (8,07), 171,00735 (6,25), 152,02720 (8,91), 127,03574 (12,57). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 53,96%, H: 3,20%, : 7,40%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 53,70%, H: 2,92%, : 7,38%. Σύνθεση της 2-(2-χλωρο-6-φθοροφαινυλο)-3-(4-μεθοξυβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης (13) 49

51 Η σύνθεση της ένωσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 90 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 30 λεπτά. Απόδοση: 49% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,55 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 7,56 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 7,41 7,14 (m, 5H), 6,94 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 4,28 4,15 (m, 2H), 3,77 (s, 3H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): 171,2, 154,2, 152,0, 137,6, 132,9, 130,7, 130,6, 126,0, 125,7, 125,5, 115,9, 115,7, 113,9, 109,6, 57,8, 56,6, 32,9. HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 17 H 12 O ClF [M + ]: 394,0013, ευρεθέν 393,9996, m/z: M +, 393,99959 (100,00), 359,03143 (22,94), 351,98880 (10,13), 323,00405 (11,38), 321,00321 (31,18), 316,99680 (20,64), 285,04920 (16,46), 266,98433 (10,35), 211,01022 (16,40), 196,99583 (11,82), 172,96307 (11,38), 153,01712 (29,01). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 51,71%, H: 3,06%, : 7,09%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 52,26%, H: 3,27%, : 7,07%. Σύνθεση της 2-(2,6-διχλωροφαινυλο)-3-(4-μεθοξυβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης (14) Η σύνθεση της ένωσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 90 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 10 λεπτά. Απόδοση: 38% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,57 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 7,56 (d, J = 6,3 Hz, 2H), 7,38 7,22 (m, 4H), 6,92 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 4,29 4,18 (m, 2H), 3,73 (s, 3H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,5, 154,0, 152,0, 137,6, 134,7, 133,6, 132,9, 131,9, 130,6, 130,4, 128,9, 125,4, 113,9, 110,1, 59,2, 56,9, 33,9. 50

52 HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 17 H 12 O Cl 2 [M + ]: 409,9717, ευρεθέν: 409,9701, m/z: M +, 409,97015 (100,00), 377,00100 (24,88), 376,00606 (14,95), 375,00356 (61,74), 338,99476 (15,24), 334,98591 (33,92), 333,99594 (10,55), 332,99348 (54,74), 319,99585 (10,93), 303,01675 (20,22), 301,02044 (49,40), 284,98860 (15,22), 223,00004 (11,01), 211,01477 (24,94), 190,93027 (12,10), 188,93330 (16,02), 170,98387 (11,85), 167,99534 (10,17), 134,01844 (16,77). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 49,64%, H: 2,94%, : 6,81%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 49,54%, H: 2,81%, : 6,86%. Σύνθεση της 2-(2,6-διφθοροφαινυλο)-3-(6-μεθοξυβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης (15) Η σύνθεση της ένωσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 100 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 30 λεπτά. Απόδοση: 37% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,60 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 7,60 (s, 1H), 7,52 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 7,43 7,35 (m, 1H), 7,15 7,09 (t, J = 20,3, 10,1 Hz, 2H), 7,00 (d, J = 13,2 Hz, 2H), 4,29 4,13 (m, 2H), 3,78 (s, 3H) HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 17 H 12 O F 2 [M + ]: 378,0308; ευρεθέν: , m/z: M +, 378,03091 (100,00), 367,01393 (11,73), 366,01028 (49,28), 305,05587 (40,92), 304,04497 (10,86), 293,03694 (34,03), 289,02484 (13,35), 285,04963 (17,72), 273,02810 (28,02), 172,01611 (20,82), 153,00633 (11,25), 152,02589 (16,86), 127,03640 (25,73). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 53,96%, H: 3,20%, : 7,40%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 53,78%, H: 3,11%, : 7,31%. 51

53 Σύνθεση της 2-(2-χλωρο-6-φθοροφαινυλo)-3-(6-μεθοξυβενζο[d]θειαζολ-2-υλo) θειαζολιδιν-4-όνης (16) Η σύνθεση της ένωσης αυτής πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 80 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 30 λεπτά. Απόδοση: 69% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,54 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 7,57 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 7,25 6,85 (m, 6H), 4,23 (d, J = 18,2 Hz, 1H), 3,91 3,83 (m, 4H). HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 17 H 12 O ClF [M + ]: 394,0013, ευρεθέν: 394,0013, m/z: M +, 394,00132 (100,00), 359,03245 (26,54), 323,00598 (10,10), 321,00652 (25,53), 301,01352 (10,83), 286,03651 (12,07), 285,05071 (48,27), 242,03204 (14,07), 211,01277 (16,72), 168,00127 (10,17), 165,02149 (13,31), 160,01131 (18,37), 153,01752 (49,27). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 51,71%, H: 3,06%, : 7,09%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 51,45%, H: 3,09%, : 7,03%. Σύνθεση της 2-(2,6-διχλωροφαινυλο)-3-(6-μεθοξυβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης (17) Η σύνθεση της ένωσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 80 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 30 λεπτά. Απόδοση: 54% Σ.τήξεως: ºC 52

54 R f : 0,65 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 7,59 (s, 2H), 7,41 7,34 (m, 4H), 6,96 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 4,28 4,15 (m, 2H), 3,77 (s, 3H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,3, 156,6, 141,6, 134,6, 133,7, 132,0, 130,6, 130,5, 128,9, 121,8, 115,2, 104,7, 59,1, 55,6, 33,9. HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 17 H 12 O Cl 2 [M + ]: 409,9717, ευρεθέν: 409,9739, m/z: M +, 409,97396 (35,92), 376,99865 (13,87), 375,00022 (30,85), 332,99208 (15,32), 303,01804 (14,16), 301,01920 (37,17), 258,00178 (10,86), 211,01224 (10,13). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 49,64%, H: 2,94%, : 6,81%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 49,50%, H: 2,75%, : 6,69%. Σύνθεση της 2-(2,6-διφθοροφαινυλο)-3-(6-αιθοξυβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης (18) Η σύνθεση της ένωσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 100 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 40 λεπτά. Απόδοση: 51% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,60 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 7,58 (s, 1H), 7,50 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,43 7,37 (m, 1H), 7,15 7,09 (t, J = 21,3, 10,2 Hz, 2H), 7,07 6,96 (t, J = 21,2, 10,1 Hz, 2H), 4,29 4,13 (m, 2H), 4,08 4,00 (m, 2H) 1,35 1,30 (t, J = 15,2, 7,6 Hz, 3H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 170,9, 155,9, 153,8, 141,6, 132,5, 130,8, 121,9, 115,6, 112,4, 112,1, 106,2, 105,4, 73,5, 63,6, 56,0, 53,6, 33,0, 14,6. HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 18 H 14 O F 2 [M + ]: 392,0465, ευρεθέν: 392,0457, m/z: M +, 392,04572 (78,50), 346,06017 (5,40), 320,07343 (7,69), 319,07160 (28,06), 318,06433 (9,13), 299,06479 (7,48), 290,03046 (8,63), 289,02547 (20,27), 271,03410 (7,54), 225,02923 (6,29), 211,01320 (8,90), 172,01558 (13,40), 171,00783 (7,83), 127,03645 (12,36). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 55,09%, H: 3,60%, : 7,14%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 55,17%, H: 3,71%, : 6,99%. 53

55 Σύνθεση της 2-(2-χλωρο-6-φθοροφαινυλο)-3-(6-αιθοξυβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης (19) Η σύνθεση της ένωσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 90 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 30 λεπτά. Απόδοση: 65% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,61 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 7,58 (s, 1H), 7,49 7,34 (m, 3H), 7,23 7,09 (m, 2H), 6,96 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 4,28 4,13 (m, 2H), 4,07 4,00 (m, 2H) 1.32 (t, J = 14,2, 7,1 Hz, 3H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 179,6, 171,0, 141,5, 132,6, 130,8, 130,6, 126,0, 121,9, 116,0, 115,6, 105,4, 63,6, 57,7, 32,9, 14,6. HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 18 H 14 O ClF [M + ]: 408,0169, ευρεθέν: , m/z: M +, 408,01616 (100,00), 392,04682 (11,84), 373,04843 (21,34), 335,03987 (15,49), 331,03858 (12,34), 299,06556 (19,46), 271,03323 (12,69), 225,02821 (14,78), 211,01197 (16,00), 153,01714 (33,79). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 52,87%, H: 3,45%, : 6,85%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 52,44%, H: 2,96%, : 6,70%. Σύνθεση της 2-(2,6-διχλωροφαινυλο)-3-(6-αιθοξυβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης (20) Η σύνθεση της ένωσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 80 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 30 λεπτά. 54

56 Απόδοση: 55% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,66 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 7,58 (d, J = 7,12 Hz, 2H), 7,40 7,34 (m, 4H), 6,94 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 4,28 4,15 (m, 2H), 4,07 4,00 (m, 2H), 1,32 (t, J = 14,2, 7,1 Hz, 3H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,3, 155,8, 153,8, 141,5, 134,6, 133,7, 132,5, 132,0, 130,6, 130,4, 128,9, 121,8, 115,5, 105,3, 63,2, 59,1, 33,9, 14,6. HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 18 H 14 O Cl 2 [M + ]: 423,9874, ευρεθέν: 423,9868, m/z: M +, 423,98682 (100,00), 408,01564 (19,41), 391,01645 (26,81), 390,02126 (12,69), 389,01893 (65,88), 353,00886 (10,42), 351,00938 (15,72), 349,00313 (18,89), 347,99205 (12,33), 347,00833 (34,14), 334,01336 (11,35), 331,98278 (15,71), 322,96222 (10,57), 320,96650 (13,11), 316,03864 (14,90), 315,03618 (56,56), 289,00206 (10,76), 287,00379 (26,36), 258,00040 (17,02), 225,01959 (26,86), 211,01316 (19,66), 190,93169 (12,06), 188,93389 (16,75), 170,98453 (13,04), 134,01837 (20,14). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 50,83%, H: 3,32%, : 6,59%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 50,72%, H: 3,20%, : 6,30% Σύνθεση των 2-(2,6-διαλογονοφαινυλo)-3-(1Η-βενζο[d]ιμιδαζολ-2-υλo) θειαζολιδιν-4-ονών Σύνθεση της 2-(2,6-διφθοροφαινυλο)-3-(1H-βενζο[d]ιμιδαζολ-2-υλο)θειαζολιδιν-4-όνης (21) Η σύνθεση της ένωσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 100 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 60 λεπτά. Απόδοση: 24% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,82 (πετρελαϊκός αιθέρας/μεθανόλη: 2/8) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 12,42 (s, 1H), 7,52-6,63 (m, 8H), 4,25 4,09 (m, 2H). 55

57 Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,6, 161,7, 144,7, 140,1, 133,0, 131,0, 122,1, 121,9, 118,1, 112,3, 53,0, 40,7, 39,0, 31,0. HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 16 H 11 O 3 F 2 [M + ]: 331,0590, ευρεθέν: 331,0596, m/z: M +, 331,05969 (57,13), 289,04810 (11,61), 286,07466 (6,98), 285,07192 (35,87), 276,05426 (6,64), 271,00914 (10,15), 258,08329 (10,94), 257,07595 (21,14), 256,07009 (24,53), 239,08159 (24,86), 238,07823 (100), 237,07015 (25,44), 230,06460 (6,30), 172,01589 (6,77), 127,03553 (10,09), 118,05285 (10,93). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 58,00%, H: 3,35%, : 12,68%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 58,16%, H: 3,47%, : 12,75%. Σύνθεση της 2-(2-χλωρο-6-φθοροφαινυλο)-3-(1H-βενζο[d]ιμιδαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης (22) Η σύνθεση της ένωσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 90 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 30 λεπτά. Απόδοση: 61% Σ. τήξεως: ºC R f : 0,73 (πετρελαϊκός αιθέρας/μεθανόλη: 2/8) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 7,58 (d, J = 7,12 Hz, 2H), 7,40 7,34 (m, 4H), 6,94 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 4,28 4,15 (m, 2H), 4,07 4,00 (m, 2H), 1,32 (t, J = 14,2, 7,1 Hz, 3H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 171,6, 153,5, 152,9, 137,5, 132,5, 130,7, 125,9, 121,6, 119,9, 115,7, 112,3, 111,2, 55,3, 42,0, 39,8, 39,5, 38,9, 34,8, 26,7. Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 55,26%, H: 3,19%, : 12,08%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 55,30%, H: 3,17%, : 12,12%. 56

58 Σύνθεση των 2-αρυλο-3-[4-(2-αδαμαντυλο)θειαζολ-2-υλο] θειαζολιδιν-4-ονών Σύνθεση της 2-(2,6-διχλωροφαινυλο)-3-[4-(2-αδαμαντυλο)θειαζολ-2-υλο] θειαζολιδιν-4-όνης (23) Η σύνθεση της ένωσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 100 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 40 λεπτά. Απόδοση: 46% Σ. τήξεως: ºC R f : 0,65 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 7,54 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,33 7,28 (t, J = 17,0, 9,1 Hz, 3H), 6,72 (s, 1H), 4,16 (s, 2H), 1,90 (s, 3H), 1,68 1,46 (m, 12H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 170,2, 159,9, 154,6, 134,9, 133,7, 132,5, 130,4, 130,2, 128,7, 105,4, 58,9, 40,9, 36,2, 35,7, 33,8, 27,7. HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 22 H 22 O 2 2 ClF [M + ]: 464,0551, ευρεθέν: 464,0553, m/z: M +, 464,05525 (100,00), 429,05724 (7,00), 424,03901 (14,54), 422,04257 (16,49), 393,04305 (38,06), 392,07896 (11,59), 391,07861 (38,18), 265,09535 (76,07), 232,01181 (5,13), 188,93313 (14,10), 134,01857 (8,55), 91,05521 (5,13). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 56,77%, H: 4,76%, : 6,02%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 56,78%, H: 4,80%, : 5,97%. Σύνθεση της 2-(2,5-διμεθοξυφαινυλο)-3-[4-(2-αδαμαντυλο)θειαζολ-2-υλο] θειαζολιδιν-4-όνης (24) 57

59 Η σύνθεση της ένωσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 100 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 80 λεπτά. Απόδοση: 54% Σ. τήξεως: ºC R f : 0,59 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): δ = 6,92 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 6,80 (d, J = 7,1 Hz, 2H), 6,72 (d, J = 5,1 Hz, 2H), 4,17 3,94 (m, 2H), 3,77 (s, 3H), 3,65 (s, 3H), 1,93 (s, 3H), 1,70 1,59 (m, 12H). Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 170,6, 160,2, 154,9, 152,7, 150,6, 129,5, 113,7, 112,6, 105,4, 56,3, 55,3, 41,1, 36,2, 35,7, 32,9, 27,8 HRM (EI): m/z υπολογισθέν για C 24 H 28 O [M + ]: 456,1541, ευρεθέν: 456,1548, m/z: M +, 456,15484 (100,00), 425,13505 (21,31), 383,17676 (28,72), 382,16583 (28,70), 381,16162 (91,68), 277,08386 (16,32), 266,0989 (11,47), 265,09664 (69,05), 238,05421 (20,04), 165,03746(18,52), 149,06006 (7,41). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 63,13%, H: 6,18%, : 6,13%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 62,82%, H: 5,86%, : 6,05%. Σύνθεση της 2-(4-βρωμοφαινυλο)-3-[4-(2-αδαμαντυλο)θειαζολ-2-υλ]θειαζολιδιν-4-όνης (25) Η σύνθεση της ένωσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την γενική μέθοδο (Β). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία 100 ºC και ο απαιτούμενος χρόνος ήταν 50 λεπτά. Απόδοση: 51% Σ.τήξεως: ºC R f : 0,74 (πετρελαϊκός αιθέρας/οξικός αιθυλεστέρας: 8/2) Φασματοσκοπική εξέταση 1 Η-MR (300 MHz, DMO): ): δ = 7,50-7,59 (d, 2H, J=8,25), 7,38-7,44 (d, 2H, J=8,31) 6,77 (s, 1H), 6,65 (s, 1H), 3,98-4,32(m, 2H), 1,59-1,94 (m, 15H). 58

60 Φασματοσκοπική εξέταση 13 C MR (75 MHz, DMO): δ = 170,6, 160,6, 155,2, 141,4, 132,9, 131,5, 129,1, 121,3, 106,0, 62,7, 56,4, 41,6, 40,7, 40,4, 39,8, 39,6, 39,0 36,6, 36,1 32,6, 28,2. HRM (EI): ): m/z υπολογισθέν για C 23 H 25 Br 2 O [M + ]: 476,0415, ευρεθέν: 476,0426, m/z: M +, 476,04263 (100,00), 475,04619 (25,49), 474,04385 (93,46), 435,03382 (7,32), 434,03095 (34,00), 433,03624 (7,19), 432,03214 (32,67), 404,07018 (9,84), 403,06688 (39,47), 402,06218 (20,89), 401,06584 (39,44), 400,06066 (18,11), 399,05450 (15,67), 277,08362 (17,79), 274,11349 (17,02), 267,00331 (11,56), 266,09902 (16,27), 265,09485 (87,36), 264,08773 (13,72), 261,10504 (6,02), 259,09057 (6,74), 252,08423 (8,04), 251,08131 (50,20), 246,11876 (5,92), 220,10014 (5,32), 135,02676 (25,71), 134,01844 (8,01). Στοιχειακή ανάλυση: Υπολογισθέντα στοιχεία: C: 55,57%, H: 4,88%, : 5,89%. Ευρεθέντα στοιχεία: C: 55,42%, H: 4,54%, : 5,68% ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΤΟ ΦΑΣΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ (PA) Το υπολογιστικό πρόγραμμα PA (Prediction of Activity pectra for ubstances) χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη του φάσματος βιολογικής δράσης (αντιρετροϊική, ανασταλτική της αντίστροφης μεταγραφάσης) των ενώσεων που σχεδιάστηκαν. Η συγκεκριμένη έκδοση του προγράμματος (PA 9.1) προβλέπει 3750 είδη βιολογικών δράσεων με ακρίβεια 95%. Ο γενικός λίστα των ειδών δράσης που προβλέπονται από την παρούσα έκδοση του προγράμματος PA δίνεται στο διαδίκτυο [115]. Για την αναπαράσταση της δομής των ενώσεων, το PA χρησιμοποιεί ΜΝΑ παραμέτρους (multilevel neighborhoods of atoms, πολυεπίπεδη γειτνίαση ατόμων) [116]. Η βάση δεδομένων PA περιλαμβάνει ενώσεις, οι οποίες εκπροσωπούνται από διαφορετικούς MA descriptors. Ο υπολογισμός του φάσματος των βιολογικών δράσεων βασίζεται στις σχέσεις δομής-δράσης που είναι αποθηκευμένες σε μια βάση δεδομένων AR. Στο πρόγραμμα αυτό η βιολογική δράση περιγράφεται ποιοτικά (ναι ή όχι). Συμπληρωματικά τα αποτελέσματα της πρόβλεψης δίνονται με τη μορφή καταστάσεων που εκφράζουν τις πιθανότητες (στο όριο από 0 έως 1) ύπαρξης δράσης (Pa) και της απουσίας της (Pi) για κάθε είδους δράση. Επειδή οι πιθανότητες κάθε δράσης υπολογίζονται ανεξάρτητα, το άθροισμα τους δεν ισούται με τη μονάδα. 59

61 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΕΠΙ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΑΣΗ Α. Παράγωγα του βενζο[d]θειαζολίου και του βενζο[d]ιμιδαζολίου Η ανασταλτική δράση των ενώσεων επί του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση του HIV-1 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ανοσοενζυμική χρωματομετρική μέθοδο. Ο υπολογισμός της δραστικότητας της αντίστροφης μεταγραφάσης προϋποθέτει τον ποσοτικό προσδιορισμό του DA που συντίθεται από το ένζυμο σε συγκεκριμένο χρονικό διάστημα. Χρόνος επώασης: 2 ώρες στους 37 o C. Μέθοδος προσδιορισμού της ανασταλτικής δράσης των υπό εξέταση ενώσεων επί της αντίστροφης μεταγραφάσης Αρχικά 2,2 μg/ml ενός υβριδίου PolyA:oligodT όπου το PolyA αποτελεί το εκμαγείο RA και το oligodt αποτελεί τον εκκινητή, επωάζεται με 31 nm καθαρής ανασυνδυασμένης HIV-1 αντίστροφης μεταγραφάσης σε 50 μl μίγματος επώασης που περιέχει 50 mm Tris-HCl ph 7,8, 160 mm KCl, 11 mm MgCl 2, 5,3 mm διθρειοτόλης, 0,5 mm EDTA, 0,3% Triton-X 100 και 5 μm dttp παρουσία dutp συνδεδεμένου με διγοξιγενίνη (dutp-dig) και dutp συνδεδεμένου με βιοτίνη (dutp-biotin). Σε επόμενο στάδιο, το νεοσυντεθιμένο DA που περιέχει ενσωματωμένη βιοτίνη και διγοξιγενίνη δεσμεύεται στην επιφάνεια των επικαλυμμένων με στρεπταβιδίνη πλακών ELIA. Μετά την απομάκρυνση του αδέσμευτου υλικού προστίθενται αντισώματα της διγοξυγενίνης συνδεδεμένα με υπεροξειδάση (anti-dig-pod), τα οποία δεσμεύονται στη διγοξιγενίνη. Μετά από ένα στάδιο πλύσης προστίθεται υπόστρωμα ABT και η υπεροξειδάση καταλύει τη μετατροπή του υποστρώματος, ABT, σε ένα κίτρινο προϊόν το οποίο μετράται σε φωτόμετρο κατάλληλο για πλάκες μικροτιτλοδότησης ELIA. Για τον υπολογισμό της ανασταλτικής δράσης, η αντίστροφη μεταγραφάση επωάζεται παρουσία του αναστολέα για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την προσθήκη των υποστρωμάτων (προεπώαση). Η μετρούμενη δραστικότητα συγκρίνεται με τη συνολική δραστικότητα του ενζύμου απουσία αναστολέα. Για τη μέτρηση της ολικής δραστικότητας το στάδιο της προεπώασης πραγματοποιείται με προσθήκη μόνο του διαλύτη στον οποίο είναι διαλυμένες οι προς έλεγχο ενώσεις. Ως διαλύτης των ενώσεων χρησιμοποιήθηκε το DMO. 60

62 Β. Παράγωγα του 4-αδαμαντυλοθειαζολίου Παρασκευή του εκκινητή των νουκλεϊκών οξέων Ένα υβρίδιο RA-ολίγοdT που θα χρησιμοποιηθεί ως μήτρα-εκκινητής για την αντίδραση πολυμερισμού δημιουργείται με ανάμιξη ομοπολυριβονουκλεοτιδίου poly(ra) και ολιγονουκλεοτιδίου oligo(dt) σε κατά βάρος αναλογίες 10:1 σε 25 mm Tris (ph 8,0) που περιέχει 22 mm KCl. Το διάλυμα θερμαίνεται για 5 min στους 70 ºC και αφήνεται να ψυχθεί σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Κλωνοποίηση, έκφραση και καθαρισμός της ανασυνδυασμένης αντίστροφης μεταγραφάσης Το ανασυνδυασμένο ετεροδιμερές p66/p51 της αντίστροφης μεταγραφάσης του HIV-1 εκφράζεται και καθαρίζεται όπως περιγράφεται παρακάτω. Το πλασμίδιο p6hrt που περιέχει το γονίδιο της αντίστροφης μεταγραφάσης (wild type) συνδεδεμένο με μια μικρή αλληλουχία έξι αμινοξέων ιστιδίνης καθώς και το ιικό γονίδιο της πρωτεάσης για την αποτελεσματική επεξεργασία του p66, χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή του ενζύμου σε βακτηριακά κύτταρα Ε.coli (BL21). Το ανασυνδυασμένο ένζυμο p66/p51 που διαθέτει την αλληλουχία polyhis καθαρίστηκε στη συνέχεια με υγρή χρωματογραφία (F- PLC), χρησιμοποιώντας στήλη νικελίου. Το ένζυμο απομονώθηκε με καθαρότητα >95%, όπως επιβεβαιώθηκε από την ηλεκτροφόρηση σε δωδεκυλοσουλφονικό νάτριο και βαφή με την κυανή χρωστική Gelcode blue. Η δράση του ενζύμου ελέγχθηκε με χρήση υποστρώματος poly(ra): oligo(dt). Επιπλέον, η ταυτότητα του προϊόντος επιβεβαιώθηκε με Western blot με χρήση ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων. Ως μία ενζυμική μονάδα ορίστηκε η ποσότητα του ενζύμου που ενσωματώνει 1 nmol dmp σε ολιγονουκλεοτίδιο σε 60 min στους 37 ºC. Μέθοδος προσδιορισμού της ανασταλτικής δράσης των υπό εξέταση ενώσεων επί της αντίστροφης μεταγραφάσης Το υβρίδιο poly(ra)/oligo(dt) χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα-εκκινητής (TP) για την αντίδραση πολυμερισμού της αντίστροφης μεταγραφάσης. Για τον προσδιορισμό, 25 μl μίγματος επώασης που περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα TDB (50 mm Tris-HCl ph 8,0, 1 mm διθειοθρεϊτόλης (DTT), 0,2 mg / ml αλβουμίνης από ορό βοός (BA), 2% γλυκερόλη), 10 mm MgCl 2, 0,5 μg poly(ra):oligo(dt) 10:1 (0,3 μm 3 '-ΟΗ άκρα), 10 μμ 3 [H] dttp 61

63 (1 Ci / mmol) και διαφορετικές συγκεντρώσεις ενζύμου (5 έως 10 nm RT) επωάστηκαν στους 37 C. Στη συνέχεια 20μl από το μίγμα αντίδρασης προστέθηκαν στους ηθμούς ινών γυαλιού, GF/C και βυθίστηκαν σε 5% παγόψυχρο τριχλωροξικό οξύ (TCA). Οι ηθμοί πλύθηκαν τρεις φορές με 5% TCA και μια φορά με αιθανόλη για 5 λεπτά. Ακολούθησε ξήρανση και, τέλος, οι ηθμοί τοποθετήθηκαν σε σπινθηριστικό υγρό EcoLume προκειμένου να προσδιοριστεί η ραδιενέργεια που καθηλώθηκε στο φίλτρο με χρήση υγρού σπινθηριστή PerkinElmer ΘΕΩΡΗΤΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ (DOCKIG) Οι δομές των υπό εξέταση μορίων δημιουργήθηκαν με το πρόγραμμα Maestro 3D-sketcher [117] και η ενέργεια τους ελαχιστοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Polak-Ribiere conjugated gradient, κριτήριο σύγκλισης 0,001 kj/å mol και πεδίο δυνάμεων (force field) OPL_2005 [118]. Όλα τα μόρια νερού απομακρύνθηκαν από το αλλοστερικό κέντρο της πρωτεΐνης πριν από τις μελέτες πρόσδεσης. Οι μελέτες πρόσδεσης πραγματοποιήθηκαν με το πρόγραμμα Autodock 4.2 [119] που χρησιμοποιεί ένα υβριδικό σύστημα του γενετικού αλγόριθμου (Genetic Algoritm GA) με τον αλγόριθμο τοπικής αναζήτησης (Local earch L). Για το παρόν σύστημα χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες ρυθμίσεις: αρχικός πληθυσμός: 300, μέγιστος αριθμός αξιολογήσεων της ενέργειας: και μέγιστος αριθμός γενεών: Το βήμα ήταν 1,0 Å, ενώ το quaternion και το torsion βήμα ρυθμίστηκαν στους 5,0 βαθμούς. Οι τιμές που χρησιμοποιήθηκαν για το ρυθμό μετάλλαξης και το ποσοστό crossover ήταν 0,02 και 0,8 αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα από τους υπολογισμούς του Autodock ομαδοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια τιμή απόκλισης RMD της τάξης του 1,5 Å, ενώ η διαμόρφωση με τη χαμηλότερη ενέργεια από τη μεγαλύτερη πληθυσμιακά ομάδα επιλέχθηκε ως η πιο πιθανή διαμόρφωση πρόσδεσης. Για κάθε ένωση, παρήχθησαν 200 διαμορφώσεις. Για την απεικόνιση των αποτελεσμάτων και επεξεργασία των διαμορφώσεων με την υψηλότερη βαθμολόγηση πρόσδεσης, χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Pymol Molecular Graphic ystem. 62

64 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 5.1. ΣΥΝΘΕΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σύνθεση των 2-αρυλο-3-(βενζο[d]θειαζολ-/βενζο[d]ιμιδαζολ-/4- αδαμαντυλοθειαζολ-4-υλο)θειαζολιδιν-4-ονών Η δομή των ενώσεων του τίτλου φαίνεται στο παρακάτω σχήμα 10: O Z όπου Ζ= X Για Ζ = βενζοθειαζόλιο: 1. R = H, X = 2,6-δι F 2. R = H, X= 2-F, 6-Cl 3. R = 6-F, X = 2,6-δι F 4. R = 6-F, X= 2-F, 6-Cl 5. R = 6-F, X = 2,6-δι Cl 6. R = 4-Cl, X = 2,6-δι F 7. R = 4-Cl, X= 2-F, 6-Cl 8. R = 4-Cl, X = 2,6-δι Cl 9. R = 6-Cl, X = 2,6-δι F 10. R = 6-Cl, X= 2-F, 6-Cl 11. R = 6-Cl, X = 2,6-δι Cl 12. R = 4-OMe, X= 2,6-δι F 13. R = 4-OMe, X= 2-F, 6-Cl 14. R = 4-OMe, X = 2,6-δι Cl 15. R = 6-OMe, X = 2,6-δι F 16. R = 6-OMe, X= 2-F, 6-Cl 17. R = 6-OMe, X = 2,6-δι Cl 18. R = 6-OEt, X = 2,6-δι Cl 19. R = 6-OEt, X= 2-F, 6-Cl 20. R = 6-OEt, X = 2,6-δι F Για Ζ = βενζοϊμιδαζόλιο: 21. R = H, X = 2,6-δι F 22. R = H, X = 2-F, 6-Cl Για Ζ = 4-αδαμαντυλο-θειαζόλιο: 23. X = 2,6-δι Cl 24. X = 2,5-δι OMe 25. X = 4-Br Σχήμα 10. Δομή των ενώσεων του τίτλου. Οι παραπάνω ενώσεις συντέθηκαν σύμφωνα με την αντίδραση που φαίνεται στο Σχήμα 11. Είναι μία αντίδραση ενός βήματος («one pot») μεταξύ τριών συστατικών, μιας ετεροαρωματικής αμίνης, μιας υποκατεστημένης βενζαλδεΰδης και του θειογλυκολικού οξέος. 63

65 O Z H 2 + X + H COOH a b O Z X Σχήμα 11. Γενικό σχήμα σύνθεσης των 2,3-διαρυλ-θειαζολιδιν-4-ονών. Αντιδραστήρια και συνθήκες: (α) «Κλασσική» μέθοδος: τολουόλιο, βρασμός για h, (β) Microwave τεχνική: απόλυτη αιθανόλη, o C, 50W, min. O μηχανισμός σχηματισμού των 1,3-θειαζολιδιν-4-ονών παρουσιάζεται στο Σχήμα 12. Ως ενδιάμεσο μη απομονώσιμο προϊόν σχηματίζεται η αντίστοιχη ιμίνη. Σχήμα 12. Μηχανισμός της αντίδρασης σχηματισμού των 1,3-θειαζολιδιν-4-ονών. Σύμφωνα με την «κλασσική» μέθοδο, η αντίδραση πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας ως διαλύτη το τολουόλιο, είναι ιδιαίτερα χρονοβόρα (24-48 ώρες), απαιτεί διαδικασία καθαρισμού και έχει χαμηλή απόδοση (23%- 54%). Για τους παραπάνω λόγους έγινε προσπάθεια βελτίωσης της μεθόδου χρησιμοποιώντας την ακτινοβολία μικροκυμάτων. Τα μικροκύματα αντιπροσωπεύουν έναν εναλλακτικό τρόπο προσφοράς ενέργειας σε χημικές αντιδράσεις και η λειτουργία με την οποία η ύλη απορροφά τη μικροκυματική ενέργεια λέγεται διηλεκτρική θέρμανση. Μέσω της διηλεκτρικής θέρμανσης τα μίγματα των αντιδράσεων θερμαίνονται χωρίς επαφές με θερμές επιφάνειες και σε σύγκριση με τους συνήθεις τρόπους θέρμανσης οι χρόνοι αντίδρασης μειώνονται σημαντικά. 64

66 Στο σχήμα 13 παρουσιάζεται μια απλοποιημένη περιγραφή του μηχανισμού θέρμανσης των πολικών διαλυτών από τη μικροκυματική ακτινοβολία, με παράδειγμα το μόριο του νερού. Το ταχέως μεταβαλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο προκαλεί περιστροφή των μορίων του νερού με αποτέλεσμα να λαμβάνει χώρα μια «εσωτερική τριβή» στο εσωτερικό του μέσου, η οποία έχει σαν αποτέλεσμα την άμεση θέρμανση του μίγματος της αντίδρασης. Ανακλάσεις και διαθλάσεις σε ορισμένες περιοχές οδηγούν στις καλούμενες θερμές κηλίδες (hot spot) και στα ευρέως συζητούμενα φαινόμενα υπερθέρμανσης (superheating effects) [120]. Σχήμα 13. Σχηματική αναπαράσταση της μεταφοράς από τα μικροκύματα στα μόρια νερού. Πραγματοποιήθηκαν διάφορες προσπάθειες για την ανεύρεση των βέλτιστων συνθηκών διεξαγωγής της αντίδρασης με τη βοήθεια μικροκυμάτων, όπως: αύξηση του χρόνου ακτινοβόλησης, αλλαγή του διαλύτη, αύξηση της θερμοκρασίας, χρήση καταλύτη, ξεχωριστή σύνθεση με την «κλασσική» μέθοδο της ενδιάμεσης ιμίνης. Μετά από πολλές προσπάθειες κατορθώθηκε η βελτιστοποίηση των συνθηκών της αντίδρασης, σύμφωνα με τις οποίες η αντίστοιχη (ετερο)αρωματική αμίνη μαζί με την κατάλληλα υποκατεστημένη βενζαλδεΰδη και θειογλυκολικό οξύ σε περίσσεια σε απόλυτη αιθανόλη, ακτινοβολούνται σε θερμοκρασία ºC για λεπτά. Συγκριτικά με την «κλασσική» μέθοδο, η χρήση της ακτινοβολίας μικροκυμάτων προσφέρει καθαρότερα προϊόντα, πολλές φορές χωρίς να είναι απαραίτητη η διαδικασία καθαρισμού από τις πρώτες ύλες, όπως πλύσεις με 5% υδατικό διάλυμα κιτρικού νατρίου, νερό και 5% υδατικό διάλυμα όξινου ανθρακικού νατρίου, που χρησιμοποιείται στην «κλασσική» μέθοδο, καθώς εξαιτίας παρατηρείται κρυστάλλωση του προϊόντος στην 65

67 αιθανόλη. Επίσης, το προϊόν λαμβάνεται σε μεγαλύτερες αποδόσεις και σε σημαντικά μειωμένο χρόνο. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η ένωση 11, στην οποία παρατηρήθηκε μείωση του χρόνου της αντίδρασης από 26 ώρες σε 30 λεπτά και σχεδόν διπλασιασμός της απόδοσης, από 23% σε 44%. Η ταυτοποίηση των προϊόντων έγινε με φασματοσκοπική μελέτη (IR, 1 HΝΜR, 13 CMR, M και HRM) και με στοιχειακή ανάλυση. Στη φασματοσκοπική εξέταση των ενώσεων με IR παρατηρήθηκε ισχυρή απορρόφηση στην περιοχή 1700 cm -1 χαρακτηριστική της δόνησης του καρβονυλίου καθώς και απορρόφηση στα 1600 cm -1 και 1540 cm -1 που αντιστοιχεί στο δεσμό C-C του αρωματικού δακτυλίου. Περίπου στα 3000 cm -1 φαίνεται να απορροφά ασθενώς ο δεσμός C-H του αρωματικού δακτυλίου ενώ τα αλογόνα Cl και F του φαινυλίου φαίνεται να απορροφούν ασθενώς περίπου στα cm -1 και cm -1 αντίστοιχα. Το F στη θέση 6 του βενζοθειαζολίου απορροφά περίπου στα 1230 cm -1 ενώ στην περίπτωση των βενζοϊμιδαζολικών παραγώγων, παρατηρήθηκε ασθενής απορρόφηση του δεσμού Ν- Η στα cm -1. Στα φάσματα 1 H MR των ενώσεων παρατηρήθηκε συντονισμός στις αντίστοιχες περιοχές του φάσματος και ο ακριβής αριθμός πρωτονίων βρέθηκε από την ολοκλήρωση. Σε δ = 8,10-7,00 παρατηρείται κορυφή που αντιστοιχεί στα αρωματικά πρωτόνια. Σε λίγο μικρότερα δ = 6,72-7,20 παρατηρείται κορυφή του πρωτονίου της θέσης 2 του δακτυλίου της θειαζολιδινόνης, ενώ τα δύο πρωτόνια της θέσης 5 εμφανίζονται σε δ = 4,40-4,10. Είναι χαρακτηριστικό ότι παρατηρούνται δύο κορυφές και μάλιστα η κάθε μία είναι διπλά σχασμένη επειδή τα δύο πρωτόνια δεν είναι ούτε χημικά, ούτε μαγνητικά ισοδύναμα και συνεπώς σχάζονται μεταξύ τους. Στις ενώσεις που ο βενζοθειαζολικός δακτύλιος είναι υποκατεστημένος με μεθοξυ-ομάδα, παρατηρείται κορυφή στα 3,75-3,85 δ που οφείλεται στα τρία πρωτόνια. Στις περιπτώσεις όπου υπάρχει αιθοξυ-ομάδα παρατηρούνται κορυφές στα 4,10-4,00 και 1,35-1,30 δ, που αντιστοιχούν σε δύο και τρία πρωτόνια αντίστοιχα. Τέλος, για τα αδαμαντυλο-παράγωγα παρατηρούνται δύο κορυφές στα 1,90-1,45 δ που αντιστοιχούν στο αδαμαντάνιο. Η πρώτη κορυφή, εντάσεως τριών πρωτονίων οφείλεται στα πρωτόνια των τριών τριτοταγών ατόμων άνθρακα ενώ η δεύτερη κορυφή, εντάσεως δώδεκα πρωτονίων αντιστοιχεί στα δώδεκα πρωτόνια των έξι δευτεροταγών ατόμων άνθρακα του αδαμαντανίου. Αναλυτικά οι κορυφές που παρατηρούνται παρουσιάζονται στην ενότητα 4 για κάθε ένωση ξεχωριστά. Στα φάσματα 13 C MR των ενώσεων παρατηρήθηκε συντονισμός στις αντίστοιχες περιοχές του φάσματος. Χαρακτηριστική είναι η κορυφή που οφείλεται στο άτομο άνθρακα 66

68 του καρβονυλίου στα δ. Ακολουθούν οι κορυφές των ατόμων άνθρακα στη θέση 2 του βενζοθειαζολικού συστήματος περίπου στα δ και των ατόμων άνθρακα του αρωματικού συστήματος που είναι συνδεδεμένα με F στα δ. Όλα τα υπόλοιπα άτομα άνθρακα που συμμετέχουν σε αρωματικά συστήματα παρουσιάζουν κορυφές στα δ. Το άτομο άνθρακα της θέσης 2 του δακτυλίου της θειαζολιδινόνης παρουσιάζει κορυφή στα δ ενώ το άτομο άνθρακα της θέσης 5 στα δ. Το άτομο άνθρακα της μεθοξυ-ομάδας εμφανίζει κορυφή περίπου στα 55 δ και τα άτομα άνθρακα της αιθοξυομάδας έχουν κορυφή στα και στα 14,8 δ. Τέλος, τα άτομα άνθρακα του αδαμαντανίου παρουσιάζουν κορυφή σε 41-43, 35,5-36,8 και 27-28,5 δ. Αναλυτικά, οι κορυφές που παρατηρούνται παρουσιάζονται στην ενότητα 4 για κάθε ένωση ξεχωριστά. Στην φασματοσκοπική εξέταση μαζών (Μ) εμφανίζονται μοριακά ιόντα και η ύπαρξη των θυγατρικών ιόντων δικαιολογείται με τους προτεινόμενους μηχανισμούς διάσπασης που βρίσκονται σε συμφωνία με τα βιβλιογραφικά δεδομένα των φασμάτων μαζών πολλών θειαζολικών παραγώγων [ ]. Στο πίνακα 2 δίνονται οι σχετικές εντάσεις των κυριότερων κορυφών των φασμάτων μάζης των ενώσεων που συντέθηκαν ενώ, στα σχήματα 14 και 15 δίνονται αναλυτικά οι διασπάσεις δύο ενώσεων. Πίνακας 2. Οι σχετικές εντάσεις των κυριότερων κορυφών των φασμάτων μαζών των ενώσεων που συντέθηκαν. R O X 1 X 2 R, X 1, X 2 m/z (I%) 1 H, F, F M +, 348(100), 306(45), 275(44), 255(74), 193(10), 181(26), 157(21), 127(28). 2 H, F, Cl M +, 364(20), 329(100), 287(27), 255(73), 228(2), 193(4), 181(9), 153(13), 108(14). 3 6-F, F, F M +, 366(100), 324(32), 293(52), 273(60), 253(1), 199(18). 4 6-F, F, Cl M +, 382(49), 347(100), 305(32), 273(92), 230(3), 199(14), 173(12), 153(46), 126(18). 5 6-F, Cl, Cl M +, 398(17), 363(88), 321(29), 289(100), 262(3), 227(4), 199(8), 169(11), 126(15), 108(10). 9 6-Cl, F, F M +, 382(100), 340(31), 289(58), 282(3), 227(7), 215(20), 157(19), 127(23), 84(29). 67

69 10 6-Cl, F, Cl 11 6-Cl, Cl, Cl 12 4-OMe, F, F 13 4-OMe, F, Cl 14 4-OMe, Cl, Cl 15 6-OMe, F, F 16 6-OMe, F, Cl 17 6-OMe, Cl, Cl 18 6-OEt, F, F 19 6-OEt, F, Cl 20 6-OEt, Cl, Cl M +, 398(39), 363(100), 321(31), 289(85), 254(3), 227(10), 215(22), 169(24), 153(61), 107(21). M +, 416(16), 379(100), 337(40), 305(98), 270(7), 243(4), 215(17), 169(51), 134(43), 107(14). M +, 378(100), 349(23), 336(16), 305(38), 269(16), 223(6), 197(15), 157(22), 127(26), 95(5). M +, 394(100), 359(38), 321(36), 317(33), 285(50), 255(12), 211(34), 173(27), 153(79), 109(24). M +, 410(88), 375(100), 333(68), 301(96), 285(33), 248(9), 211(44), 169(64), 134(69), 123(22). M +, 378(100), 336(14), 285(63), 270(5), 238(7), 197(25), 152(34), 127(30). M +, 394(100), 359(56), 321(25), 285(83), 270(11), 242(28), 197(41), 165(29), 153(85), 109(19). M +, 410(62), 375(78), 333(38), 301(100), 286(14), 258(35), 197(27), 169(59), 134(49), 108(19). M +, 392(100), 350(7), 319(38), 289(29), 252(5), 211(14), 172(11), 152(11), 127(16). M +, 408(100), 373(45), 335(22), 299(55), 271(26), 242(19), 211(38), 173(22), 153(83), 109(15). M +, 424(67), 389(83), 347(44), 315(100), 287(50), 258(44), 211(50), 169(72), 134(67), 123(11). O H X 1 X 2 X 1, X 2 m/z (I%) 21 F, F M +, 331(57), 289(12), 286(7), 285(36), 276(7), 271(10), 258(11), 257(21), 256(25), 239(25), 238(100), 237(25), 230(6), 172(8), 127(10), 118(11). 22 F, Cl M +, 347(1), 312(11), 273(41), 254(100), 238(99), 191(4), 159(4), 133(57), 118(12). Ad O R R m/z (I%) 25 4-Br M +, 476(84), 434(52), 401(44), 345(9), 343(7), 265(100), 251(66), 219(17), 169(5), 135(38). 68

70 F Cl O Cl m/z = 398 (17%) Cl m/z = 169 (11%) F O Cl F Cl O H Cl m/z = 363 (88%) m/z = 321 (29%) F H H Cl - CH 2 =C=O m/z = 325 (11%) F m/z = 126 (15%) _ Cl F Cl F H H m/z = 323 (16%) m/z = 290 (22%) _ H m/z = 289 (100%) Σχήμα 14. Θραυσματοποίηση της 2-(2,6-διχλωροφαινυλο)-3-(6-φθοροβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης. 69

71 H 3 CO Cl O F m/z = 394(100%) H 3 CO H H F H 3 CO O F H 3 CO F m/z = 321 (25%) m/z = 359 (56%) m/z 285 (83%) O H H 3 CO m/z =165 (29%) F O F F m/z = 153 (85%) m/z = 270 (11%) m/z =197 (27%) m/z = 135 H H - CO -HC F H m/z = 109 (19%) m/z = 244 m/z = 242 (28%) Σχήμα 15. Θραυσματοποίηση της 2-(2-χλωρο-6-φθοροφαινυλο)-3-(6-μεθοξυβενζο[d]θειαζολ- 2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνης. 70

72 5.2. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΕΠΙ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΑΣΗ Στη μελέτη αυτή εκτιμήθηκε η ανασταλτική δράση σειράς νέων θειαζολιδινονικών παραγώγων, τα οποία διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες με βάση τον υποκαταστάτη στη θέση 3. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν υποκατεστημένα παράγωγα του βενζοθειαζολίου, στη δεύτερη κατηγορία παράγωγα του βενζοϊμιδαζολίου και στην τελευταία κατηγορία παράγωγα του 4-αδαμαντυλο-θειαζολίου Παράγωγα του βενζο[d]θειαζολίου και του βενζο[d]ιμιδαζολίου Τα αποτελέσματα της ανασταλτικής δράσης των υπό μελέτη ενώσεων που ανήκουν στις δύο πρώτες κατηγορίες παρουσιάζονται στον πίνακα 3. Από τα αποτελέσματα αυτά συμπεραίνεται ότι η παρουσία κατάλληλου αλογονο- ή αλκοξυ- υποκαταστάτη στις θέσεις 4 ή 6 του φαινολικού δακτυλίου του βενζοθειαζολικού συστήματος είναι ικανή να μετατρέψει ένα πρακτικά αδρανές μη-υποκατεστημένο παράγωγο σε έναν δραστικό αναστολέα. Έτσι, ενώ η ένωση 2, το 2-(2-χλωρο-6- φθοροφαινυλο)-3-βενζο[d]θειαζολ-2-υλικό παράγωγο πρακτικά δεν παρουσιάζει δράση υπό τις παρούσες πειραματικές συνθήκες, παρατήρηση που βρίσκεται σε συμφωνία και με την αναφορά του Rawal και των συνεργατών του [83], το 4-χλωρο-βενζο[d]θειαζολ-2- υλικό ανάλογο του, 7, εμφανίζει σημαντική δράση, με τιμή IC 50 : 0,04 μμ (0,016 μg/ml). Η ένωση 19, το 6-αιθοξυ-βενζο[d]θειαζολ-2-υλικό ανάλογο της ένωσης 2, επίσης παρουσίαζει αξιοσημείωτη δράση με τιμή IC 50 : 3,4 μμ (1,39 μg/ml). Όλοι οι υπόλοιποι υποκαταστάτες (6-Cl-, 6-F-, 6-MeO-, 4-MeO-) με την εισαγωγή τους στο βενζοθειαζολικό σύστημα μόνον ελαφρώς αυξάνουν την ανασταλτική δράση συγκριτικά με το μηυποκατεστημένο παράγωγο 2, ωστόσο οι τιμές IC 50 παραμένουν πάνω από τα 40 μμ. Όλα τα 2,6-διφθορο-φαινυλο-παράγωγα (1, 3, 6, 9, 15, 18) παρουσιάζουν χαμηλή δραστικότητα, αν και η υποκατάσταση του βενζοθειαζολικού συστήματος αυξάνει ελαφρώς την ανασταλτική τους δράση στις τέσσερις (3, 6, 9, 18) από τις πέντε ενώσεις. Πιθανότατα το γεγονός αυτό να εξηγείται από το μικρότερο όγκο του φθορίου, το οποίο επιτρέπει την περιστροφή του φαινολικού δακτυλίου και δεν σταθεροποιεί τόσο καλά τη διαμόρφωση «πεταλούδας» του μορίου που είναι απαραίτητη για τη δέσμευση του στο αλλοστερικό κέντρο του ενζύμου. 71

73 Πίνακας 3. Ανασταλτική δράση (% αναστολή) επί του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση. Αναστολή % α (4 μm) IC 50 β (μm) Pa γ R X 1 X H, 6-H F F 22,7 >40 0, H, 6-H F Cl 2,1 >40 0, H, 6-F F F 36,9 >40 0, H, 6-F F Cl 34,5 >40 0, H, 6-F Cl Cl 60,1 0,25 0, Cl, 6-H F F 29,2 >40 0, Cl, 6-H F Cl 68,5 0,04 0, Cl, 6-H Cl Cl 27,6 >40 0, H, 6-Cl F F 36,5 >40 0, H, 6-Cl Cl F 35,5 >40 0, H, 6-Cl Cl Cl 33,0 >40 0, MeO, 6-H F Cl 44,0 >40 0, MeO, 6-H Cl Cl 56,0 3,0 0, H, 6-MeO F F 17,0 >40 0, H, 6-MeO Cl F 46,0 >40 0, H, 6-MeO Cl Cl 38,0 >40 0, H, 6-EtO F F 36,4 >40 0, H, 6-EtO F Cl 53,0 3,4 0, H, 6-EtO Cl Cl 43,0 >40 0,419 Αναστολή % a (4 μm) b IC 50 c (μm) Pa Ν Χ 1 Χ 2 21 F F 11,0 >40 0, F Cl 58,6 2,0 0,345 Οι τιμές είναι μέσος όρος τριών πειραμάτων με απόκλιση <10%. α συγκέντρωση dtp: 1,25μM, β συγκέντρωση dtp: 5 μm, γ Pa = πιθανότητα εμφάνισης της συγκεκριμένης δράσης. 72

74 Η προσθήκη διαφόρων υποκαταστατών στο φαινύλιο του βενζοθειαζολικού δακτυλίου στα 2,6-διχλωροφαινυλο- παράγωγα είχε επίσης ως αποτέλεσμα μεγάλες διαφορές στην ανασταλτική τους δράση. Έτσι, η ένωση 5, 6-φθορο-βενζο[d]θειαζολ-2- υλικό παράγωγο είναι η δεύτερη πιο δραστική ένωση με IC 50 : 0,25 μμ (0,099 μg/ml) ενώ το 6-χλωρο-βενζο[d]θειαζολ-2-υλικό παράγωγο, ένωση 11, εμφανίζει μικρή ανασταλτική δράση με IC 50 >40 μμ. Από την άλλη πλευρά, αντικατάσταση του βενζοθειαζολικού συστήματος με βενζοϊμιδαζολικό έχει θετική επίδραση στη HIV-1 RT ανασταλτική δράση στην περίπτωση της 2-(2-χλωρο-6-φθοροφαινυλο)-3-(βενζο[d]ιμιδαζολ-2-υλο)θειαζολιδον- 4-όνης, ένωση 22 (IC 50 : 2 μμ). Οι δραστικότερες ενώσεις παρουσιάζουν δράση συγκρίσιμη με αυτήν των RTIs που αναφέρονται στη βιβλιογραφία [111, 124] Για λόγους σύγκρισης, δίνεται η IC 50 της νεβιραπίνης ίση με 0,3 μμ στο ίδιο σύστημα επώασης. Όλες οι ενώσεις διαθέτουν τον ετεροκυκλικό δακτύλιο της θειαζολιδινόνης όπως επίσης και ένα δέυτερο βενζο[d]θειαζολικό ή βενζο[d]ιμιδαζολικό ετεροκυκλικό σύστημα προσφέροντας τη δυνατότητα σχηματισμού δεσμού υδρογόνου με τη Lys101 ή τη Lys103, ο οποίος σταθεροποιεί τα περισσότερα RTI-RT σύμπλοκα. Επιπλέον, διαθέτουν δύο υδρόφοβα συστήματα, το διαλογονο-φαινύλιο στη θέση 2 του δακτυλίου της θειαζολιδινόνης και το βενζοθειαζολικό ή βενζοϊμιδαζολικό σύστημα στη θέση 3 του ίδιου δακτυλίου. Και τα δύο συστήματα προσφέρουν στο μόριο τη δυνατότητα να καταλάβει την υδρόφοβη κοιλότητα του αλλοστερικού κέντρου, περιοχή δέσμευσης όλων των παραδοσιακών RTIs. Παρόλ αυτά θα πρέπει να σημειωθεί ότι η μέτρηση της ανασταλτικής δράσης των ενώσεων 7 και 19 παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων του νουκλεοτιδικού υποστρώματος (dtps), αποκάλυψε ισχυρότερη ανασταλτική δράση σε υψηλότερες συγκεντρώσεις υποστρώματος, μειωμένη K m και V max παρουσία του αναστολέα, που είναι χαρακτηριστικά των ανταγωνιστικών αναστολέων. Αυτή η παρατήρηση διαφοροποιεί τους παρόντες αναστολείς από τους ήδη χρησιμοποιούμενους, οι οποίοι είναι γνωστό ότι δρούν ως μη-συναγωνιστικοί αναστολείς και ίσως να παραπέμπει σε ένα διαφορετικό τρόπο σύνδεσης με το ένζυμο. 73

75 Παράγωγα του 4-αδαμαντυλοθειαζολίου Οι υπό εξέταση ενώσεις 23 και 25 επέδειξαν ανασταλτική δράση έναντι της αντίστροφης μεταγραφάσης στις in vitro μελέτες. Η ένωση 25, 2-(4-βρωμοφαινυλο)-3- [4-(2-αδαμαντυλο)θειαζολ-2-υλο] θειαζολιδιν-4-όνη εμφάνισε μεγαλύτερη δράση με IC 50 =70 μμ, σε σχέση με την ένωση 25, 2-(2,6-διχλωροφαινυλο)-3-[4-(2-αδαμαντυλο) θειαζολ-2-υλο] θειαζολιδιν-4-όνη, με IC 50 =120 μμ. Κινητικές μελέτες Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν κινητικές μελέτες για την αξιολόγηση της δραστικότητας της αντίστροφης μεταγραφάσης παρουσία σταθερών συγκεντρώσεων των επιλεγμένων αναστολέων και μεταβλητών συγκεντρώσεων του ενός από τα δύο υποστρώματα (TP ή dtp), ενώ το άλλο προστέθηκε σε συγκεντρώσεις κορεσμού [125]. Οι συγκεντρώσεις του dtp κυμαίνονταν από 0,2 έως 20 μμ, ενώ του TP κυμαίνονταν από 25 έως 400 nm. Οι μελέτες αυτές οδήγησαν στον καθορισμό των V max, K m και k cat που προκύπτουν από την καμπύλη Michaelis Menten, όπως αναφέρεται στην ενότητα «υπολογισμός των κινητικών παραμέτρων». Οι τιμές είναι ο μέσος όρος των τριών ανεξάρτητων επαναλήψεων ± τις τυπικές αποκλίσεις (.D.). Κινητικό πρότυπο Σύμφωνα με το μηχανισμό της αντίδρασης πολυμερισμού αρχικά δεσμεύεται στο σύμπλοκο RA εκμαγείου-εκκινητή (TP) και ακολουθεί η προσθήκη του dtp. Η αντίστροφη μεταγραφάση μπορεί να υπάρχει σε τρεις διαφορετικές καταλυτικές μορφές, όπως αναφέρεται στο σχήμα 16Α: ως ελεύθερο ένζυμο (RT), σε ένα σύμπλοκο με το TP (RT/TP), και σε ένα τριμερές σύμπλοκο με το TP και το dtp (RT/TP/dTP). Η προκύπτουσα εξίσωση για ένα τέτοιο σύστημα είναι εξαιρετικά πολύπλοκη και μη πρακτική. Γι αυτούς τους λόγους, η κινητική μελέτη απλοποιήθηκε, κρατώντας σταθερό ένα από τα υποστρώματα (είτε TP ή dtp) και μεταβάλλοντας το άλλο. 74

76 Σχήμα 16. Απλοποιημένη κινητική οδός για την αντίδραση της αντίστροφης μεταγραφάσης. Α: Σχηματικό διάγραμμα των ισορροπιών στην αντίδραση πολυμερισμού που καταλύεται από την αντίστροφη μεταγραφάση, η οποία μπορεί να υπάρχει σε τρεις διαφορετικές καταλυτικές μορφές: ως ελεύθερο ένζυμο (RT), σε ένα σύμπλοκο με το TP (RT/TP) και σε ένα τριμερές σύμπλοκο με το TP και το dtp (RT/TP/dTP). Β (αριστερό μέρος): επιδράσεις στη διαδικασία αναστολής σε διαφορετικές συγκεντρώσεις dtp και ΤΡ σε επίπεδα κορεσμού, στη σταθερή κατάσταση η RT είναι με τη μορφή του RT/TP και μόνο οι μορφές RT/TP και RT/TP/dTP μπορούν να αντιδράσουν με τον αναστολέα. Β (δεξί μέρος): επιδράσεις στη διαδικασία αναστολής σε διαφορετικές συγκεντρώσεις TP και επίπεδα κορεσμού του dτρ. Σε αυτή την περίπτωση, το ένζυμο είναι παρόν είτε με την ελεύθερη μορφή του είτε με τη μορφή του RT/TP/dTP συμπλόκου. Κρατώντας τη συγκέντρωση του υποστρώματος TP σταθερή σε συγκεντρώσεις κορεσμού, μελετήθηκε η διαδικασία της αναστολής σε διαφορετικές συγκεντρώσεις dtps. Στη σταθερή κατάσταση, η RT είναι στη μορφή RT/TP συμπλόκου ενώ μόνο δύο μορφές του ενζύμου (RT/TP και RT/TP/dTP) μπορούν να αντιδράσουν με τον αναστολέα, όπως φαίνεται από το αριστερό μέρος του σχήματος 16Β. Από την άλλη πλευρά, κρατώντας τη συγκέντρωση του dtp σταθερή σε επίπεδα κορεσμού, μελετήθηκε η αναστολή σε διαφορετικές συγκεντρώσεις TP. Σ αυτή την περίπτωση το 75

77 ένζυμο είναι παρόν είτε με την ελεύθερη μορφή του, είτε με τη μορφή του RT/TP/dTP συμπλόκου, όπως φαίνεται από το δεξί μέρος του σχήματος 16Β. Ανάλυση δεδομένων και στατιστική Τα δεδομένα που ελήφθησαν αναλύθηκαν με γραμμική ή/και μη γραμμική παλινδρόμηση χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad oftware (an Diego, CA, UA). Υπολογισμός κινητικών παραμέτρων Οι τιμές υπολογίστηκαν μέσω μη-ελάχιστων-τετραγώνων υπολογιστική τοποθέτηση (non-least-squares computer fitting) των πειραματικών δεδομένων στις κατάλληλες εξισώσεις. Η δέσμευση του αναστολέα στη σταθερή κατάσταση αναλύθηκε σύμφωνα με την παρακάτω εξίσωση που περιγράφει ένα μικτό τύπο συναγωνιστικής αναστολής. (1) v=[v max /(1+I/K i )] /[1+(K m /)]. [(1+I/K i )/(1+I/K i )] όπου V max = μέγιστη ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης και = η συγκέντρωση του υποστρώματος. Όπως περιγράφεται στο σχήμα 16Β, όταν το ΤΡ είναι σε επίπεδα κορεσμού (αριστερό μέρος) Κ i = K free i, ενώ όταν το dtp βρίσκεται σε επίπεδα κορεσμού (δεξί μέρος), K i =K bin i. Σε όλες τις περιπτώσεις, K i = K ter i. Προκύπτει ότι, εάν Κ i > K i, τότε το K m και το V max μειώνονται αυξάνοντας τις συγκεντρώσεις του αναστολέα και η εξίσωση που περιγάφει έναν ανταγωνιστικό μηχανισμό μπορεί να απλοποιηθεί ως εξής: (2) v=[v max /(1+I/K i )] / 1+[(K m /(1+I/K i )]/ Οι σταθερές ισορροπίας της αντίδρασης διάστασης (K i και K i ) υπολογίστηκαν από την απόκλιση των τιμών Κ m και V max ως συνάρτηση της συγκέντρωσης του αναστολέα σύμφωνα με τις εξισώσεις: (3) K i = Ι/[K p (1+I/K i )/K m ]-1 (4) K i = I/[(V max /V p )-1] Στη περίπτωση του συναγωνιστικού μηχανισμού, η εξίσωση έγινε: (5) v = V max /[(1+K m /). (1+I/K i )] 76

78 Από τη στιγμή που ένας συναγωνιστικός αναστολέας συνδέεται με το ένζυμο μόνο όταν αυτό είναι με τη μορφή του συμπλόκου RT/TP, συνεπάγεται ότι K free bin i = K i, και συνεπώς η πραγματική σταθερά Κ i θεωρείται ότι είναι αυτή που αντιστοιχεί στη σταθερά ter ισορροπίας της αντίδρασης διάστασης του τριμερούς συμπλόκου K i που υπολογίζεται από τη γραμμική εξίσωση: (6) K p = K m [1+(I/K i )] Συμπεράσματα κινητικών μελετών Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η K m και η V max, που υπολογίστηκαν για την ένωση 23, σε διαφορετικές συγκεντρώσεις ΤΡ, παρουσίασαν αύξηση καθώς οι συγκεντρώσεις του αναστολέα αυξάνονταν (Σχήμα 17Α). Τα ευρήματα αυτά είναι ενδεικτικά ανταγωνιστικού μηχανισμού αναστολής. Στην περίπτωση αυτή ο αναστολέας εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια με το ένζυμο όταν αυτό βρίσκεται σε μορφή συμπλόκου με τα υποστρώματα του. Η σταθερά K i υπολογίστηκε από την ασύμπτωτη που ελήφθη από την απόκλιση της φαινομενικής σταθεράς αναστολής (Κ i app ) ως μη γραμμική συνάρτηση των αυξανόμενων συγκεντρώσεων του ΤΡ όπως φαίνεται στο σχήμα 17Β. Σύμφωνα με την κινητική οδό (σχήμα 16) η τιμή αυτή αντιστοιχεί στη σταθερά ισορροπίας της αντίδρασης διάστασης από το τριπλό σύμπλοκο (K ter i ). Μελέτη της ταχύτητας της ενζυμικής αντίδρασης σε συνάρτηση με την συγκέντρωση των dtps παρουσία της ένωσης 23, δεν έδειξε σημαντική μείωση της V max, ενώ έδειξε μείωση της K m, καθώς αυξάνονταν οι συγκεντρώσεις του αναστολέα, γεγονός που παραπέμπει σε συναγωνιστική αναστολή (σχήμα 17C). Στην περίπτωση αυτή, η σταθερά K i υπολογίστηκε από τις αποκλίσεις της φαινομενικής συγγένειας των τιμών του νουκλεοτιδικού υποστρώματος K m app ως γραμμική συνάρτηση των επιπέδων του αναστολέα όπως φαίνεται από το σχήμα 17Β. Σύμφωνα με την κινητική οδό του σχήματος 16, αυτή η τιμή αντιστοιχεί στη συγγένεια του αναστολέα για το διμερές RT/TP (k bin i ). Συμπερασματικά, η ένωση 23 έδειξε έναν ανταγωνιστικό μηχανισμό αναστολής, σε σχέση με το διμερές ενζύμου-νουκλεϊκού οξέος και ένα συναγωνιστικό μηχανισμό αναστολής σε σχέση με το νουκλεοτιδικό υπόστρωμα. 77

79 Σχήμα 17. Κινητική μελέτη σταθερής κατάστασης της ένωσης 23 αναστέλλοντας τη HIV-1 αντίστροφη μεταγραφάση. Α. Η HIV-1 RT μελετήθηκε παρουσία σταθερών συγκεντρώσεων της ένωσης 23 και διάφορων συγκεντρώσεων του υποστρώματος ΤΡ. Β. Μεταβολή των τιμών K i app της ένωσης 23 σε σχέση με της αυξανόμενες συγκεντρώσεις του ΤΡ. C. Όμοια με το Α, αλλά με μεταβλητές συγκεντρώσεις του υποστρώματος dtp. D. Μεταβολή των τιμών K m app για το dtp ως γραμμική συνάρτηση της συγκέντρωσης του αναστολέα. Οι τιμές αντιστοιχούν στο μέσο όρο τριών ανεξάρτητων επαναλήψεων. Μελέτη της ενζυμικής αντίδρασης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος TP παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων της ένωσης 25, έδειξε μείωση της V max και αύξηση της K m (Σχήμα 18Α), γεγονός που παραπέμπει σε μερικώς μικτού-τύπου συναγωνιστική αναστολή. Η συγγένεια K i για το ελεύθερο ένζυμο υπολογίστηκε από τις αποκλίσεις του K i app ως γραμμική συνάρτηση των συγκεντρώσεων του TP (συναγωνιστικό μέρος) όπως φαίνεται στο σχήμα 18Β, ενώ η συγγένεια της ένωσης για το τριμερές σύμπλοκο του ενζύμου με τα υποστρώματα του, που ανταποκρίνεται στη K i (μη-συναγωνιστική πλευρά), προήλθε από την ανάλυση της μείωσης των τιμών V max app όπως φαίνεται από το σχήμα 18C, ως μη γραμμική συνάρτηση των συγκεντρώσεων του αναστολέα (πίνακας 4). Μελέτη της ταχύτητας της ενζυμικής αντίδρασης σε συνάρτηση με τη συγκέντρωση των dtps παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων της ένωσης 25, έδειξε αύξηση των τιμών K m, ενώ τα επίπεδα του V max δεν επηρεάστηκαν, υποδεικνύοντας πλήρως συναγωνιστική αναστολή (σχήμα 18D). Πέραν τούτου, η παρουσία του νουκλεοτιδικού υποστρώματος μείωσε σημαντικά τη συγγένεια του 78

80 αναστολέα για το ένζυμο. Η σταθερά K i (πίνακας 4) υπολογίστηκε αναπαριστώντας τις αποκλίσεις των τιμών K m app ως γραμμική συνάρτηση των συγκεντρώσεων του αναστολέα όπως φαίνεται από το σχήμα 18Ε. Σύμφωνα με την κινητική οδό του σχήματος 16, αυτή η τιμή αντιστοιχεί στη συγγένεια του αναστολέα για το διμερές RT/TP. Συμπερασματικά, η ένωση 25 έδειξε μικτό τύπο συναγωνιστικής αναστολής σε σχέση με το υπόστρωμα του νουκλεϊκού οξέος και πλήρως συναγωνιστική αναστολή σε σχέση με το νουκλεοτίδιο. Σχήμα 18. Κινητική μελέτη σταθερής κατάστασης της ένωσης 25 αναστέλλοντας τη HIV-1 αντίστροφη μεταγραφάση. Α. Η HIV-1 RT μελετήθηκε παρουσία σταθερών συγκεντρώσεων της ένωσης 25 και διάφορες συγκεντρώσεις του υποστρώματος ΤΡ. Β. Μεταβολή των τιμών K i app της ένωσης 25 συναρτήσει των αυξανόμενων συγκεντρώσεων του ΤΡ. C. Μεταβολή των τιμών V max app ως συνάρτηση της συγκέντρωσης του αναστολέα. D. Όμοια με το Α, αλλά με μεταβλητές συγκεντρώσεις του dtp υποστρώματος. Ε. Μεταβολή των τιμών K m app για το dtp ως γραμμική συνάρτηση της συγκέντρωσης του αναστολέα. Από τον πίνακα 4, φαίνεται ότι η ένωση 23 κατά προτίμηση δεσμεύεται στο τριμερές σύμπλοκο της RT. Αντιθέτως, η ένωση 25 δεσμεύεται με μεγαλύτερη συγγένεια στο ελεύθερο ένζυμο. Ο μηχανισμός τους σαφώς απέχει από το πρότυπο μηχανισμό των 79

81 RTIs, όπως νεβιραπίνη, η οποία δρά ως καθαρά μη-συναγωνιστικός αναστολέας, με την ίδια συγγένεια για όλες τις ενζυματικές μορφές (Πίνακας 4). Πίνακας 4. Tιμές Ki ή Ki (μμ) για τις ενώσεις 23 και 25 που παρουσιάζουν διαφορετικό μηχανισμό αναστολής σε σχέση με μεταβαλλόμενες συγκεντρώσεις του εκκινητή (ΤΡ) ή του νουκλεοτιδικού υποστρώματος (dtp) αντίστοιχα. Ένωση Μεταβαλλόμενο Υπόστρωμα Ki (μμ) K i (μμ) α Ενζυματική μορφή Μηχανισμός 23 ΤΡ 78±5 τριμερή ανταγωνιστικός dtp 164±10 διμερή συναγωνιστικός 25 ΤΡ 68±6 152±10 ελεύθερο μικτός τύπος (τριμερή) β συναγωνιστικού dtp 92±9 διμερή συναγωνιστικός Νεβιραπίνη ΤΡ 0,4±0,05 όλες μη- συναγωνιστικός dtp 0,45±0,05 όλες μη- συναγωνιστικός α Τιμή για το μη-συναγωνιστικό μέρος του μικτού μηχανισμού, β Για τα συναγωνιστικά (Ki) και μη-συναγωνιστικά (K i) μέρη του μικτού τύπου μηχανισμού αντίστοιχα. Με βάση τα παραπάνω δεδομένα γίνεται δυνατός ο σχεδιασμός μορίων που επιλεκτικά στοχεύουν σε διαφορετικές ενζυματικές μορφές. Αυτή η προσέγγιση θα μπορούσε να επιτρέψει την αποτελεσματικότερη δράση φαρμάκων που χορηγούνται σε συνδυασμό ΘΕΩΡΗΤΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ (DOCKIG) Πραγματοποιήθηκαν θεωρητικές μελέτες πρόσδεσης των θειαζολιδιν-4-ονών στο ενεργό κέντρο του ενζύμου της αντίστροφης μεταγραφάσης και μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις με τα αμινοξέα της πρωτεΐνης. Χρησιμοποιήθηκε η κρυσταλλογραφική δομή του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση συγκρυσταλλωμένου με τον αναστολέα TMC125, (PDB: 1UQ) [89]. Αρχικά διεξήχθη ένας δοκιμαστικός υπολογισμός προκειμένου να αξιολογήσει το πρωτόκολλο και να επιβεβαιωθεί ότι θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να αναπαράγει το τρόπο δέσμευσης των μορίων. Για το σκοπό αυτό, επιχειρήθηκε η πρόσδεση του TMC125, με χρήση του λογισμικού Autodock και τα αποτελέσματα της πρόσδεσης συγκρίθηκαν με 80

82 αυτά της κρυσταλλογραφίας. Συγκεκριμένα, εξετάστηκε ο προσανατολισμός και η θέση του αναστολέα που παρατηρείται τόσο στο μοντέλο πρόβλεψης από το λογισμικό όσο και στην κρυσταλλική δομή. Τα αποτελέσματα της δοκιμαστικής μελέτης έδειξαν ότι το Autodock ήταν σε θέση να καθορίσει τον προσανατολισμό και τις αλληλεπιδράσεις του αναστολέα με απόκλιση (RMD) 0,58 Å (βλ. Εικόνα 13). Εικόνα 13. Υπέρθεση της θεωρητικά προβλεπόμενης διαμόρφωσης πρόσδεσης TMC125 (πράσινο), σε σύγκριση με την κρυσταλλική διαμόρφωση (κυανό). Οι τριάδα των ενώσεων που μελετήθηκε παρουσιάζεται στο Σχήμα 19. Μεταξύ των τριών παραγώγων του 4-χλωρο-βενζοθειαζολίου περιλαμβάνεται η δραστικότερη ένωση 7 με IC 50 = 0,04 μμ. Οι άλλες δύο ενώσεις είναι πρακτικά αδρανείς (IC 50 > 40 μμ). Cl Cl O Cl Cl Cl O F Cl F O F Σχήμα 19. Χημική δομή των ενώσεων που μελετήθηκαν. Παρατηρήθηκε ότι η δραστικότερη ένωση 7, 2-(2-χλωρο-6-φθοροφαινυλο)-3-(4- χλωροβενζο[d]θειαζολ-2-υλο) θειαζολιδιν-4-όνη λαμβάνει παρόμοια διαμόρφωση με τον αναστολέα TMC125 και σχηματίζει δεσμό υδρογόνου με το αμινοξύ Lys101. Ειδικότερα, το CH 2 - τμήμα του δακτυλίου της θειαζολιδιν-4-όνης προσανατολίζεται προς ένα «κανάλι» που σχηματίζεται από τα αμινοξέα Lys101, Val179 (της p66 υπομονάδα) και Glu138 (της p51 υπομονάδας). Το άτομο αζώτου της Lys101 αλληλεπιδρά με το άτομο 81