H EKΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ ΣΑΡΒΑΒΙΝΗΣ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΣΕΙΡΕΣ ΑΠΟ ΚΑΡΚΙΝΟ ΠΝΕΥΜΟΝΑ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ H EKΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ ΣΑΡΒΑΒΙΝΗΣ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΣΕΙΡΕΣ ΑΠΟ ΚΑΡΚΙΝΟ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΔΗΜΗΤΡΑ ΒΑΡΘΑΛΗ ΑΜ: ΕΠΙΒΛΕΠΟYΣΑ BAΣΙΛΙΚΗ ΑΛΕΠΟΡΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΙΟΧΗΜΙΚΗΣ & ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΑΘΗΝΑ 2016

2 Αφιερωμένη στο όνειρο...

3 Σας ευχαριστώ για την εμπειρία μάθησης που μου προσφέρατε.

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ι.ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.Καρκίνος του πνεύμονα...σελ Στατιστικά στοιχεία...σελ Ιστολογικά στοιχεία...σελ Σαρβαβίνη, ή επιβιωτίνη (survivin) και αντίστοιχο γονίδιο...σελ Πρωτεϊνική εντόπιση...σελ Γονιδιακή έκφραση σε φυσιολογικούς ιστούς...σελ Γονιδιακή έκφραση σε καρκινικούς ιστούς...σελ Κλινική σημασία...σελ Δομή και μοριακή οργάνωση...σελ Ισομορφές και οι διαφορετικές λειτουργίες τους...σελ Βασικές λειτουργίες της σαρβαβίνης...σελ Ο αντι-αποπτωτικός ρόλος της σαρβαβίνης στον καρκίνο του πνεύμονα...σελ Εξωγενές μονοπάτι απόπτωσης...σελ Ενδογενές μονοπάτι απόπτωσης...σελ Ρόλος της σαρβαβίνης στον κυτταρικό κύκλο...σελ Στοιχεία ρύθμισης του γονιδίου της σαρβαβίνης και αλληλεπιδράσεις...σελ Θεραπευτικές προσεγγίσεις...σελ.14-15

5 3.Σκοπός διπλωματικής εργασίας...σελ ΙΙ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.Υλικά και Μέθοδοι...σελ Aπομόνωση ολικού RNA...σελ Φωτομέτρηση ολικού RNA...σελ Ηλεκτροφόρηση ολικού RNA...σελ Σύνθεση cdna...σελ Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμερισμού σε πραγματικό χρόνο (RealTime-PCR)...σελ SYBR-Green I...σελ Αντίδραση qrt-pcr...σελ Ποσοτικοποίηση-κανονικοποίηση...σελ Ηλεκτροφόρηση προϊόντων qrt- PCR...σελ.33 2.Αποτελέσματα-Συζήτηση...σελ Φωτομέτρηση ολικού RNA...σελ Ηλεκτροφόρηση ολικού RNA...σελ qrt-pcr πραγματικού χρόνου για τα γονίδια ABL και σαρβαβίνη...σελ Hλεκτροφόρηση προϊόντων PCR...σελ.42 IΙΙ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

6 Ι.ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.Καρκίνος του πνεύμονα 1.1. Στατιστικά στοιχεία Ο όρος καρκίνος του πνεύμονα, ή βρογχογενής καρκίνος αναφέρεται στη νοσηρή διαδικασία ανάπτυξης και σχηματισμού κακοήθους όγκου στην περιοχή των πνευμόνων. O καρκίνος του πνεύμονα είναι η κυριότερη αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως και ο δείκτης πενταετούς επιβίωσης των ασθενών του είναι χαμηλός (1,2). Σύμφωνα με τα τελευταία στατιστικά στοιχεία παγκόσμιας κλίμακας, στα 8,2 εκατομμύρια θανάτους από καρκίνο, τα 1,59 εκατομμύρια οφείλονται σε καρκίνο του πνεύμονα (3), [Εικόνα 1, (4)]. Εικόνα 1: Ποσοστιαία θνησιμότητα κυριότερων μορφών νεοπλασίας, (Ιnternational Agency for Research on Cancer-World Health Organization) 1.2. Ιστολογικά στοιχεία Ο καρκίνος του πνεύμονα διακρίνεται σε δύο βασικές ιστολογικές κατηγορίες, βάση της πιθανότητας μετάστασης και της θεραπευτικής απάντησης (5): Α. Στο μη μικροκυτταρικό (Non-small-cell lung carcinoma) καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), ο οποίος εμφανίζει μικρή συχνότητα μετάστασης, αλλά μικρότερη απάντηση στη χημειοθεραπεία και περιλαμβάνει, α)το αδενοκαρκίνωμα (adenocarcinoma), β) το πλακώδες, ή ακανθοκυτταρικό (squamous carcinoma), γ) το αδενοπλακώδες (adenosquamous carcinoma), δ)το καρκινοειδές (carcinoid carcinoma), ε1) το μεγαλοκυτταρικό καρκίνωμα (large cell carcinoma), και ε2) το μεγαλοκυτταρικό νευροενδοκρινικό καρκίνωμα (large cell neuroendocrine carcinoma) (6). 1

7 Β. Στο μικροκυτταρικό (small cell lung carcinoma) (6) καρκίνο του πνεύμονα, (SCLC), ο οποίος εμφανίζει μεγαλύτερη συχνότητα μετάστασης και καλή, αρχικά, απάντηση στη χημειοθεραπεία (5).Αποτελεί την πιο επιθετική μορφή και με τη χειρότερη πρόγνωση (7). 2.Σαρβαβίνη, ή επιβιωτίνη (survivin) και αντίστοιχο γονίδιο 2.1. Πρωτεϊνική εντόπιση H πρωτεΐνη σαρβαβίνη βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα φυσιολογικών κυττάρων, σε ιδιαίτερα χαμηλές ποσότητες και στις αντίστοιχες δομές των νεοπλασματικών κυττάρων, σε αυξημένες ποσότητες, εμφανίζοντας διαφορετικά σημεία συσσώρευσης (pools), ανάλογα με τη λειτουργία που εξυπηρετεί (8,9). Για την μετακίνηση μεταξύ πυρήνα -όπου συσσωρεύεται κατά τη ρύθμιση της μίτωσηςκαι κυτταροπλάσματος -όπου ρυθμίζει και την απόπτωση-, διαθέτει σήματα πυρηνικής εντόπισης, NLS (nuclear localization signal) και πυρηνικής μεταφοράς, ΝES (nuclear export signal) (9). Για τη λειτουργική αντι-αποπτωτική δράση της μέσω του μιτοχονδριακού μονοπατιού απόπτωσης, συσσωρεύεται στα μιτοχόνδρια (10). Εκκρίνεται επίσης σε καρκινικά κύτταρα στον εξωκυττάριο χώρο μέσω κυστιδιακών εξωσωμάτων (10). Επίτοποι ενδοκυτταρικά επεξεργασμένων πεπτιδίων της, μπορούν να εκφράζονται σε ΗLA I μόρια επιφανείας νεοπλασματικών κυττάρων (11). Ποσοτικός εντοπισμός της μπορεί να γίνει και με ΕLISA σε κυτταρικά θραύσματα, σε υπερκείμενα καλλιεργειών, καθώς και σε πλάσμα,ορό (12) και ούρα ασθενών (13) Γονιδιακή έκφραση σε φυσιολογικούς ιστούς Το γονίδιο της σαρβαβίνης (SURVIVIN) εμφανίζει πολύ χαμηλή έκφραση σε τελικά διαφοροποιημένους ενήλικους ιστούς (14) και αυξημένη έκφραση σε εμβρυικούς και πολλαπλασιαζόμενους ενήλικους ιστούς (9). Ειδικότερα στα εμβρυικά κύτταρα πνεύμονα, εντοπίζονται υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης και του mrna τoυ γονίδιου που την κωδικοποιεί. Εκεί η σαρβαβίνη μέσω ρύθμισης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης των κυττάρων του ιστού, διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στη διαφοροποίηση, τη διατήρηση της ομοιόστασής τους και την οργανογένεση (15,16). Αυξημένη έκφραση του γονιδίου της σαρβαβίνης, παρατηρείται και κατά την αναγέννηση ιστών, όπως των επιθηλιακών του φυσιολογικού πνεύμονα, μετά από τραυματισμό (17). Φυσιολογικά, σε σωματικά κύτταρα εκφράζεται στη φάση G2-M του κυτταρικού κύκλου (18). 2

8 2.3.Γονιδιακή έκφραση σε καρκινικούς ιστούς Yπεραύξηση της πρωτεΐνης σαρβαβίνης και του mrna του γονιδίου που την κωδικοποιεί, παρατηρείται στις περισσότερες μορφές καρκίνου (14,19),όπως και στους τύπους νεοπλασίας πνεύμονα που εξετάζουμε, τον NSCLC (13) και τον SCLC (20). Υπερέκφραση του γονιδίου, εμφανίζεται σε όλα τα στάδια του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων και οφείλεται σε αποκαταστολή και υπερενεργοποίηση της μεταγραφής του. Τόσο σε διάφορους καρκινικούς τύπους όσο και στον (NSCLC), αιτία θεωρούνται αρκετοί πολυμορφισμοί του υποκινητή, με συχνότερη μια κοινή μετάλλαξη-πολυμορφισμός, τον (-31G/C) στη θέση CDE/CHR (cell cycle-dependent element/cell cycle genes homology region), η οποία μεταβάλλει το πρότυπο πρόσδεσης των καταστολέων μεταγραφής που συνδέονται στην περιοχή αυτή (19,21) Κλινική σημασία Η υπερέκφραση του γονιδίου της σαρβαβίνης, συνδέεται με απορύθμιση του κυτταρικού κύκλου, παρεμπόδιση της κυτταρικής απόπτωσης και ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των μετασχηματισμένων νεοπλασματικών κυττάρων, συμβάλλοντας στην καρκινογένεση. Υψηλές ποσότητες ενδοκυτταρικού εντοπισμού του μεταγράφου του γονιδίου και της πρωτεΐνης σαρβαβίνης, υποδεικνύoυν δυσμενή εξέλιξη (10) για όλες τις μορφές καρκίνου (22), συμπεριλαμβανομένου και του πνεύμονα (9).Τα αυξημένα επίπεδά τους ενοχοποιούνται για υποτροπή της νόσου του καρκίνου του πνεύμονα (23), επιθετικό καρκινικό φαίνοτυπο (9,24), στον οποίο συμβάλει και ο εξωκυτταρικός εντοπισμός της σαρβαβίνης (10) και μειωμένα ποσοστά επιβίωσης στον NSCLC (25,26). Υπάρχει επίσης συσχετισμός των υψηλών επιπέδων έκφρασης του γονιδίου, με την αντίσταση στη χημειοθεραπεία στον NSCLC (26,27), τη διαφυγή των καρκινικών κυττάρων από την ανοσοεπιτήρηση (10) και την ενίσχυση της αγγειογέννεσης των όγκων (28). Ο ποσοτικός προσδιορισμός της σαρβαβίνης και του mrna του γονιδίου της (29), έχει ιδιαίτερη κλινική σημασία, διότι φαίνεται να είναι εφικτός ο παραλληλισμός του σταδίου της καρκινικής νόσου με τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου, αναδεικνύοντας ένα νέο σημαντικό προγνωστικό μέσο και πιθανό διαγνωστικό δείκτη (22,30) για ΝSCLC ασθενείς (31). Για τους SCLC ασθενείς, πιθανολογείται θετική συσχέτιση της συγκέντρωσης της σαρβαβίνης με κακή πρόγνωση της νόσου (32) και παρόλο που 3

9 εμφανίζεται και στον SCLC υπεραύξηση της (33), η επίδραση στη συνολική επιβίωση παραμένει αμφισβητούμενη (32,34). Το γονίδιο της σαρβαβίνης σήμερα διευρευνάται ως νέος, ελπιδοφόρος, θεραπευτικός στόχος για την αντιμετώπιση όλων των μορφών καρκίνου του πνεύμονα (22,35,36). Οι πολυμορφισμοί του γονίδιου της αναδεικνύονται πολύτιμα εργαλεία μελέτης των μηχανισμών καρκινογένεσης, της διάγνωσης και πρόγνωσης της νόσου. (22) 2.5. Δομή και μοριακή οργάνωση Το γονίδιο της σαρβαβίνης (SURVIVIN) εδράζεται στο άκρο του μεγάλου βραχίονα του χρωμοσώματος 17 και ζώνη 25, (17q25.3), [(Εικόνα 2),(37)]. Eικόνα 2: (17q25.3) ( ) Aποτελείται από ζεύγη βάσεων (bp) και 5 εξόνια το pre-mrna του γονιδίου. Δεν περιέχει ΤΑΤΑ box, αλλά διαθέτει υποκινητή πλούσιο σε GC επαναλήψεις, υπεύθυνες για τη γονιδιακή ρύθμιση (38). Θραύσμα CpG νησίδας βρέθηκε στην κωδικοποιούσα περιοχή, υπεύθυνη για την ενίσχυση της δράσης του υποκινητή του γονιδίου της σαρβαβίνης στον καρκίνο του πνεύμονα (39). Κωδικοποιεί πρωτεΐνη μοριακού βάρους 16,5kDa (39), [(Εικόνα 3),(40)] η οποία εμφανίζεται με μορφή είτε μονομερούς, είτε σταθερού διμερούς, ανάλογα τη λειτουργία που εξυπηρετεί (41). Εικόνα 3: Στύπωμα Western για την επιβιωτίνη (16,5ΚDa). ( 4

10 Mε εναλλακτικό μάτισμα προκύπτουν διαφορετικά μετάγραφα που μεταφράζονται στις αντίστοιχες ισομορφές της πρωτεΐνης, με διαφορικές λειτουργίες η κάθε μια (42). Άλλες ονομασίες της επιβιωτίνης (survivin) είναι birc5 (Baculoviral IAP Repeat Containing 5 ), api4 (Apoptosis Inhibitor 4),iap4 (Inhibitor of Apoptosis 4), και αντιστοίχως του γονιδίου της ΒΙRC5,API4,IAP4 (43). Η σαρβαβίνη αποτελεί μέλος της οικογένειας των πρωτεϊνικών αναστολέων της απόπτωσης ΙΑP (Inhibitor of apoptosis proteins) (42), οι οποίες χαρακτηρίζονται από την παρουσία ενός ή περισσότερων επαναλήψεων μιας περιοχής δακτυλίων ψευδαργύρου (Ζn +2 ), 70 περίπου αμινοξικών καταλοίπων, η οποία ονομάζεται BIR (Βαculovirus IAP Repeat) και εντοπίστηκε αρχικά σε βακιλο'ι'ό, από όπου και προέρχεται το όνομά της (44). H ΒΙR περιοχή εντοπίζεται στο μέσον περίπου του αμινοτελικού άκρου και δημιουργείται από 3 κοντές α έλικες και 3 β πτυχωτές επιφάνειες, στο κέντρο των οποίων συνδέεται ο Ζn, ανάμεσα σε υδρόφοβο περιβάλλον συντηρητικών καταλοίπων αμινοξέων κυστε'ί'νης και ιστιδίνης (45). H συντηρητικής λειτουργίας περιοχή της ΒΙR, συμμετέχει στις αλληλεπιδράσεις με προαποπτωτικές πρωτεΐνες των μονοπατιών της απόπτωσης, με τους μικροσωληνίσκους της μιτωτικής ατράκτου και με το κεντρομερίδιο των χρωμοσωμάτων (46,47). Η πρωτεΐνη σχηματίζει διμερή τετραεδρική μορφή, στην οποία εμφανίζεται συνδεδεμένο και ένα άτομο κοβαλτίου [(Εικόνα 4)(46)].Η εκτεταμένη α έλικα του καρβοξυτελικού άκρου, φαίνεται να συμμετέχει στη σύνδεση της με τις δομές τουμπουλίνης της μιτωτικής ατράκτου (48). Εικόνα 4: Αναπαράσταση του ομοδιμερούς της σαρβαβίνης. β αλυσίδες: μωβ βέλη, α έλικες: πράσινες σπείρες, μαύρα τόξα: α έλικες του COOH, Ζn: γαλάζιες σφαίρες, Co: μαύρη σφαίρα. Τροποποίηση εικόνας (Molecular Cell,July, 2000,Cell Press ''Crystal Structure of Human Survivin Reveals a Bow Tie Shaped Dimer with Two Unusual a-helical Extensions'') 5

11 2.6 Ισομορφές και οι διαφορετικές λειτουργίες τους Οι εναλλακτικές ισομορφές της σαρβαβίνης προκύπτουν με εναλλακτικό μάτισμα και δημιουργούν ομοδιμερή και ετεροδιμερή (49), με διαφορετικές λειτουργίες, κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά και διαμερισματοποίηση στα καρκινικά κύτταρα (50,51). Συνήθως εντοπίζονται οι παρακάτω ισομορφές: α) Η φυσιολογική (wild type) πρωτεΐνη που αποτελείται από 142 αμινοξέα και προκύπτει από την αφαίρεση του εξωνίου 2Β του πρώιμου mrna της σαρβαβίνης (24), [(Εικόνα 5),(52)]. Η μορφή όταν βρίσκεται στον πυρήνα, συμβάλλει στα φυσιολογικά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα στην ολοκλήρωση της μίτωσης (9) και στα καρκινικά κύτταρα ασθενών με NSCLC, στην επιτάχυνση του πολλαπλασιασμού των όγκων (42). Αυτό συμβαίνει διότι η wild type διαθέτει σημείο σύνδεσης με τους μικροσωληνίσκους της ατράκτου (Εικόνα 6) και συμμετέχει στο σχηματισμό του συμπλέγματος χρωμοσωμικής διάβασης CPC (chromosomal passenger complex) που είναι απαραίτητο για την κυτοκίνηση (53). To κατάλοιπο Τhr 34 (Εικόνα 6), είναι σημείο φωσφορυλίωσης μέσω της p34cdc2 (cell division cycle protein 2 homolog,34kd), ή CDK1(Cyclin-dependent kinase 1), μιας κυκλινοεξαρτώμενης κινάσης, με ρόλο προώθησης του κυτταρικού κύκλου (54).Επίσης διαθέτει το κατάλοιπο Cys 84, απαραίτητο για το σχηματισμό δακτυλίων Ζn +2 και σημεία χρήσιμα για τον διμερισμό της και την μετακίνησή της από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα όπου επίσης εντοπίζεται [(Εικόνα 6)(55)]. Σε μελέτες ασθενών με NSCLC, η φυσικού τύπου κυρίως, εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα, να επιτελεί το βασικό της ρόλο που είναι η αναστολή της απόπτωσης του καρκινικού κυττάρου (42). Εικόνα 5: Από το pre-mrna στο mrna της φυσιολογικής σαρβαβίνης κατόπιν ματίσματος. Τροποποίηση εικόνας (Hugo Caldas, et al,molecular Cancer 2005, 4:11 '' Survivin 2α: a novel Survivin splice variant expressed in human malignancies '') 6

12 Eικόνα 6: Λειτουργική δομή φυσιολογικής σαρβαβίνης. 'Οπου microtubule binding=σημείο πρόσδεσης μικροσωληνίσκων, dimer interface=σημείο διμερισμού, nuclear export=σημείο για την εξόδο από τον πυρήνα.tροποποίηση εικόνας (Dario C. Altieri, Nature Reviews Cancer 3, 46-54,January 2003,''Validating survivin as a cancer therapeutic target'') β) Η survivin-2b (σαρβαβίνη-2β), 165 αμινοξέων (54), προκύπτει από την εισαγωγή του εξωνίου 2Β σε σχέση με το αρχικό μετάγραφο φυσικού τύπου (54),[(Εικόνα 7),(52)],[(Εικόνα 8),(55)]. Θεωρείται προ-αποπτωτική πρωτεΐνη (51), γιατί σε αντίθεση με τη γενική λειτουργία των ΙΑP πρωτεϊνών να αναστέλλουν την απόπτωση του κυττάρου, στον ΝSCLC αλλά και άλλες μορφές νεοπλασίας, η έκφρασή της δε φαίνεται να προωθεί την ογκογένεση και προάγει το μιτοχονδριακό μονοπάτι της απόπτωσης των νεοπλασματικών (56) κυττάρων και την καλύτερη πρόγνωση της νόσου (25). Εντοπίζεται συνήθως στο κυτταρόπλασμα (48), στα μιτοχόνδρια, αλλά και στο κέντρο οργάνωσης μικροσωληνίσκων της ατράκτου, ΜΤΟC (microtubule-organizing center). Η μορφή αυτή διεγείρει το ανοσοποιητικό των ασθενών με καρκίνο πνεύμονα θετικά, καθιστώντας την ικανό θεραπευτικό στόχο για πεπτιδιακό εμβολιασμό (57). Εικόνα 7 : mrna της ισομορφής 2Β μετά την προσθήκη του εξωνίου 2Β. Τροποποίηση εικόνας από (Hugo Caldas, et al, Molecular Cancer 2005, 4:11,'' Survivin 2α: a novel Survivin splice variant expressed in human malignancies'') Εικόνα 8: Λειτουργική δομή της ισομορφής 2Β. 'Οπου alternate exon- 2B=εναλλακτικό εξόνιο-2β, dimer interface=σημείο διμερισμού.tροποποίηση εικόνας από (Dario C. Altieri, Nature Reviews Cancer 3, 46-54,January 2003,''Validating survivin as a cancer therapeutic target'') 7

13 γ)η survivin-3b (σαρβαβίνη-3β), 120 αμινοξέων (54), με εισαγωγή του εξωνίου 3Β στο αρχικό μετάγραφο [(Εικόνα 9,(52)]. Συνδέεται με ανοσοδιαφυγή και χημειοαντίσταση καρκινικών κυττάρων στον ΝSCLC (58). Εικόνα 9 : Μετάγραφο 3Β. Τροποποίηση από Hugo Caldas,et al, (Molecular Cancer 2005, 4:11 ),''Survivin 2α: a novel Survivin splice variant expressed in human malignancies.'' δ)η survivin-dex-3 (σαρβαβίνη-δεχ-3), με 137 αμινοξέα (54). Προκύπτει με την αφαίρεση του εξωνίου 3 από το αρχικό μετάγραφο [(Εικόνα 10),(52)]. Διαθέτει σήμα πυρηνικής και μιτοχονδριακής εντόπισης, και μια 3 UTR περιοχή (52),αλλά εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα (48).. Στον ΝSCLC η ισομορφή αυτή είναι αντι-αποπτωτική, αποτελώντας ενδεικτικό παράγοντα δυσμενούς εξέλιξης της νόσου (25) και αντίστασής της σε γενοτοξικούς παράγοντες (59). Eικόνα 10 :Τροποποίηση εικόνας από Hugo Caldas,et al, (Molecular Cancer 2005, 4:11 ),''Survivin 2α: a novel Survivin splice variant expressed in human malignancies.'' ε)η survivin-2a (σαρβαβίνη-2α),με 74 αμινοξέα που προκύπτει από την αφαίρεση και του εξωνίου 3 και του εξωνίου 4 σε σχέση με το αρχικό μετάγραφο και με προσθήκη μιας 3 UTR [(Εικόνα 14),(52)]. Αλληλεπιδρά με την φυσικού τύπου ισομορφή, εξασθενώντας την αντι-αποπτωτική δράση του φυσικού τύπου και είναι υπεύθυνη για την ευαισθητοποίηση των καρκινικών όγκων πνεύμονα στη χημειοθεραπεία, κάνοντάς τους υποδεκτικότερους σε αυτήν (52). Eικόνα 14 :Μετάγραφο 2α της SURVIVIN.Τροποποίηση εικόνας από Hugo Caldas,et al, (Molecular Cancer 2005, 4:11 ), Survivin 2α: a novel Survivin splice variant expressed in human malignancies. 8

14 2.7 Βασικές λειτουργίες της σαρβαβίνης Ο ρόλος της σαρβαβίνης στο φυσιολογικό κύτταρο, σε νεοπλασματικά πνεύμονα και διάφορους τύπους καρκίνου, έγκειται στη σύνδεσή της με πολλαπλά μονοπάτια ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου, όταν τοπολογικά συσσωρεύεται στον πυρήνα και στην αντι-αποπτωτική της δράση, όταν συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα. Συνιστά έτσι απαραίτητο διακόπτη ελέγχου της βιωσιμότητας και του δυναμικού πολλαπλασιασμού ιστών και οργάνων. Μέσω μεταγραφικών, μεταμεταγραφικών και μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, ελέγχονται οι πολυσύνθετοι μηχανισμοί προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου και η κυττοκίνηση. Ως αποτέλεσμα, στο φυσιολογικό κύτταρο εξασφαλίζεται η ομοιόστασή του, ενώ στο καρκινικό κύτταρο, όπου υπερεκφράζεται το γονίδιο και εντοπίζεται αυξημένη η σαρβαβίνη, συντελείται ανεξέλεγκτη διαίρεση, παράκαμψη των αμυντικών μηχανισμών του ανοσοποιητικού που μεριμνούν για την καταστροφή του, επακόλουθος σχηματισμός όγκων και περεταίρω διήθηση του στον παρακείμενο ιστό (60,61) Ο αντι-αποπτωτικός ρόλος της σαρβαβίνης στον καρκίνο του πνεύμονα Η περιοχή ΒΙR της σαρβαβίνης είναι υπεύθυνη για την αντι-αποπτωτική της δράση. Δρα παρεμποδίζοντας τις ενδοκυτταρικές κασπάσες να μετατραπούν από ανενεργή σε ενεργή μορφή. Αυτές αποτελούν τις κυστε ι νικές πρωτεΐνες που επιτελούν την πρωτεολυτική αποικοδόμηση των συστατικών του κυττάρου μέσω δύο βασικών μονοπατιών δευτέρων μηνυμάτων και κυτταρικού θανάτου, του ενδογενούς (intrinsic pathway) και του εξωγενούς (extrinsic pathway), [(Εικόνα 15),(62)]. Yπάρχει διασύνδεση (crosstalk) μεταξύ των μονοπατιών αυτών, σε σχέση με τη λειτουργία της σαρβαβίνης και τον πολύπλοκο ρόλο της στην καρκινογένεση στον ΝSCLC και άλλους καρκίνους (63,64). 9

15 Εικόνα 15: Σαρβαβίνη και ενδογενές (intrinsic) - εξωγενές (extrinsic) μονοπάτι απόπτωσης.si Pai,et al, (Gene Therapy (2006) 13, ), Prospects of RNA interference therapy for cancer Εξωγενές μονοπάτι απόπτωσης Σε μελέτες στον ΝSCLC, η υπερέκφραση της σαρβαβίνης ανακόπτει το εξωγενές μονοπάτι μεταγωγής σήματος προγραμματισμένης απόπτωσης (Eικόνα 15), το οποίο ενεργοποιείται από εξωκυτταρικά σήματα-προσδέτες [FAS(CD95),TNFR1)], που συνδέονται σε διαμεμβρανικούς υποδοχείς κυτταρικού θανάτου ΤΝFR (Tumor Necrosis Factor Receptor) (64). H συνεπαγώμενη ενεργοποίηση της εναρκτήριας κασπάσης 8 μέσω του συμπλόκου έναρξης σηματοδότησης DISC (Death Initiation Signalling Complex), προκαλεί την ενεργοποίηση των τελεστικών αποικοδομητικών κασπασών 3 και 7,(62).Η σαρβαβίνη προσδένεται στις τελεστικές κασπάσες αποκόβωντας τετραπεπτίδια και απενεργοποιώντας τις, αναστέλλοντας συνεπώς την απόπτωση του καρκινικού κυττάρου (64,65) Ενδογενές μονοπάτι απόπτωσης Ονομάζεται και μιτοχονδριακό μονοπάτι απόπτωσης και λειτoυργεί φυσιολογικά σαν απόκριση των μιτοχονδρίων σε διάφορα προ-αποπτωτικά σήματα που μπορούν να προκαλέσουν βλάβες στο κύτταρο και ξεκινά από την ενεργοποίηση του BAX/BCL2 μονοπατιού απόπτωσης (22),(Εικόνα 15). Κατά την υπερέκφραση της σαρβαβίνης στον ΝSCLC, η ενδογενής απόπτωση αναστέλλεται πιο ισχυρά (64).Τα προ-αποπτωτικά σήματα, οδηγούν σε απελευθέρωση προ-αποπτωτικών 10

16 παραγόντων από το μιτοχόνδριο, όπως το κυτοχρώμα c, ο Αpaf1 και η smac-diablo, η οποία ρυθμίζει ανασταλτικά τη σαρβαβίνη σε έναν μηχανισμό βιοανάδρασης και διατήρησης της ομοιόστασης. Κατόπιν ενεργοποιείται λειτουργικά η εναρκτήρια κασπάση 9, η οποία και καθιστά ενεργές τις τελεστικές κασπάσες 3 και 7. Η σαρβαβίνη επιδρά ανασταλτικά στην κασπάση 9, εμποδίζοντας την ενεργοποίηση των τελεστικών κασπασών, ώστε το καρκινικό κύτταρο δύναται να επιβιώνει λόγω υπερλειτουργικότητας του γονιδίου της σαρβαβίνης [(Εικόνα 16)(66)],(64,66). Eικόνα 16: Σαρβαβίνη και ενδογενές (intrinsic) - εξωγενές (extrinsic) μονοπάτι απόπτωσης Xun Chen, et al(j Cancer 2016; 7(3): )''Survivin and Tumorigenesis: Molecular Mechanisms and Therapeutic Strategies'' Ρόλος της σαρβαβίνης στον κυτταρικό κύκλο Η σαρβαβίνη διαδραματίζει ρόλο κλειδί στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και ειδικότερα της μίτωσης. Εκφράζεται υπό φυσιολογικές συνθήκες κυρίως στη φάση G2-Μ (29,67). Σε μελέτες στον NSCLC η σαρβαβίνη υπερεκφράζεται σε όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου, ακολουθώντας τη μεταγραφική ενεργοποίηση του υποκινητή της (68). Κατά την έναρξη της μίτωσης φυσιολογικά η σαρβαβίνη συνδέεται με τους μικροσωληνίσκους της ατράκτου, που αποτελεί ένα από τα σημεία δεξαμενής εντοπισμού της, (Εικόνα 17) (69). Η σύνδεση με τις δομές τουμπουλίνης τους, υποβοηθά στον πολυμερισμό τους και τη σταθεροποίησή της μιτωτικής ατράκτου, εξασφαλίζοντας τη γενετική πιστότητα της μίτωσης. Αυτό επιτυγχάνεται παρεμποδίζοντας την αποικοδόμηση της ατράκτου, μέσω αναστολής των τελεστικών κασπασών και τελικά την απόπτωση, στη φάση ελέγχου G2M του κυτταρικού κύκλου. Στον καρκίνο όμως, δύναται να παρακάμπτεται εντελώς το σημείο μιτωτικού ελέγχου της G2M φάσης και να ευνοείται η αδιάκοπη διαίρεση των μετασχηματισμένων νεοπλασματικών κυττάρων, ανεξαρτήτως γενετικών λαθών, με επακόλουθο την ογκογένεση (67). 11

17 Εικόνα 17:Ρόλος της σαρβαβίνης στη μίτωση.τροποποίηση Alain C.et al, (Clin Cancer Res 2008;14: ), Survivin: Key Regulator of Mitosis and Apoptosis and Novel Target for Cancer Therapeutics. Μια δεύτερη δεξαμενή εντοπισμού της σαρβαβίνης, είναι τα κεντρομερίδια των μεταφασικών χρωμοσωμάτων, με τα οποία συνδέεται και σταθεροποιεί τους μικροσωληνίσκους στη δημιουργία των δύο πόλων της ατράκτου, (Εικόνα 17). Στο σημείο αυτό η σαρβαβίνη συσχετίζεται με πρωτεΐνες ρυθμιστές της κυτοκίνησης, την κινάση Αurora B, την INCENP και την Borealin, για τη δημιουργία του συμπλόκου χρωμοσωμικής μετάβασης (CPC), το οποίο είναι απαραίτητο για το σωστό διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων και την κυτοκίνηση. Η υπερέκφραση της σαρβαβίνης στη νεοπλασία, επιτρέπει σε κύτταρα με ελαττωματικές ατράκτους και μη στοιχισμένους κινητοχώρους, να προχωρούν στην κυτοκίνηση (67,69) Στοιχεία ρύθμισης του γονιδίου της σαρβαβίνης και αλληλεπιδράσεις Η ρύθμιση του γονιδίου της σαρβαβίνης στον καρκίνο του πνεύμονα, σε μελέτες στον ΝSCLC, υπόκειται στην επίδραση πολλών μεταγραφικών παραγόντων. Εντός του υποκινητή της, υπάρχει η Sp1 περιοχή που τον υπερενεργοποιεί, τρία κύκλο εξαρτώμενα στοιχεία CDE (cell cycle dependent elements) και μια κυκλοεξαρτώμενη CHR περιοχή (cell cycle homology region), από τις οποίες εξαρτάται η κυκλοεξαρτώμενη μεταγραφή της σαρβαβίνης. Έχει βρεθεί ότι η μεταγραφή του γονιδίου της σαρβαβίνης, καταστέλλεται από την p53 πρωτεΐνη και υπερεκφράζεται μέσω επιδράσεων με τους NF-κΒ, GATA-1 και STAΤ-3 μεταγραφικούς παράγοντες (70). H p53 αποτελεί προστάτη του γονιδιώματος κατά της ογκογέννεσης και μεταλλαγές της ευθύνονται για υπεραύξηση και της 12

18 σαρβαβίνης, λόγω αναστολής της κατασταλτικής της δράσης. Σημαντική είναι και η σύνδεση της μιτοχονδριακής σαρβαβίνης με την ΧΙΑP, η οποία ενισχύει τη σταθερότητα της αντι-αποπτωτικής δράσης της σαρβαβίνης στην αναστολή της κασπάσης 9, του μιτοχονδριακού μονοπατιού απότωσης (71). Γονιδιακή τροποποίηση στην οποία οφείλεται η υπερέκφραση στον καρκίνο του πνεύμονα, είναι κυρίως ο πολυμορφισμός -31G/C του υποκινητή της (72), όπως και η μεταγραφική ενεργοποίηση μέσω των μονοπατιών ελέγχου της ΜΑPK κινάσης (mitogen-activated protein kinase), ή του c-myc, ενώ οι πρωτεΐνες, Runx2 και RB/E2F, έχουν ανασταλτική επίδραση στην ενεργοποίηση του υποκινητή της σαρβαβίνης (73). Σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο έχει επίσης δειχθεί ότι ρυθμίζεται η ποσότητα της σαρβαβίνης και η αποσύνθεσή της, μέσω ουβικιτινίωσης από το πρωτεάσωμα κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου. Διαταραχές του μηχανισμού αυτού ευθύνονται επίσης για καρκινογενέσεις (74). Στον καρκίνο του πνεύμονα έχει βρεθεί ότι η κυκλοοξυγεννάση 2 (CΟΧ-2) προστατεύει τη σαρβαβίνη από την ουβικιτινίωση και την επακόλουθη αποδόμησή της (75). Επίσης η φωσφορυλίωση της σαρβαβίνης στο κατάλοιπο θρεονίνης 34 (Thr34) από την CDK1 κινάση (Cyclin-dependent kinase 1-κυκλοεξαρτώμενη κινάση 1) ή p34cdc2, η οποία είναι απαραίτητη για το πέρασμα του κυτταρικού κύκλου στην G2/M φάση και το σύμπλεγμα p34cdc2-cyclin-b1, μέσω του οποίου δρα, σταθεροποιεί τη σαρβαβίνη, την αντι-αποπτωτική της δράση και αυξάνει έκφρασή της σε καρκινικά κύτταρα (76). Παρεμπόδιση του μηχανισμού αυτού έχει βρεθεί σε μελέτες στον ΝSCLC να προωθεί την απόπτωση, αποτελώντας ένα θεραπευτικό στόχο στην καταπολέμηση της μορφής αυτής καρκίνου (77,78), ενώ έχει δειχθεί και συσχετισμός της υπερέκφρασης της κυκλίνης Β1 και της σαρβαβίνης στον ΝSCLC (79). Έχει υποστηριχθεί επίσης στον ΝSCLC, η συσχέτιση της σαρβαβίνης με την cdk4, την επακόλουθη ενεργοποίηση της Cdk2/Cyclin, τη φωσφορυλίωση και απενεργοποίηση της ογκοκατασταλτικής Rb (πρωτεΐνης ρετινοβλαστώματος) (80), ώστε να επιτάχυνεται η εισόδος στη φάση S του κύκλου, η αντίσταση στο σημείο ελέγχου της G1/S φάσης και ο ανεξέλεγκτος κυτταρικός πολλαπλασιασμός, που οδηγεί στην ογκογέννεση (81,82). Έχει επίσης βρεθεί ότι η έκφραση της σαρβαβίνης σε μελέτες ΝSCLC, σχετίζεται με την ανάπτυξη αγγειογένεσης στους όγκους καρκίνου του πνεύμονα - imvd (intratumoral microvessel density), μικροαγγειακή πυκνότητα όγκων- και ρυθμίζεται αυξητικά από τον VEGF (Vascular endothelial growth factor-αυξητικός παράγοντας ενδοθηλιακής αγγειογένεσης), ο οποίος συνεργιστικά παίζει σημαντικό 13

19 ρόλο στην αγγειογέννεση. Παράλληλα με τη σαρβαβίνη υπάρχει κατά την αγγειογέννεση αύξηση της έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Εlf-1 και της αγγειοποετίνης-2 (Αng-2), η σχέση τους όμως με τη σαρβαβίνη στον NSCLC είναι υπό διερεύνηση (83,84). Αλληλεπιδράσεις της σαρβαβίνης σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο έχουν δειχθεί με την πρωτεΐνη-μοριακό συνοδό Ηsp90 (Heat shock protein), σε συνθήκες κυτταρικού στρες, η οποία συνδέεται και προστατεύει τη σαρβαβίνη από ουβικιτινίωση και αποδόμηση στο πρωτεάσωμα, ενισχύοντας την αποπτωτική της δράση στον καρκίνο του πνεύμονα (85,86). Άλλοι οδοί μεταγωγής σήματος όπως ο Νοtch-1 σχετίζονται με την υπερέκφραση της σαρβαβίνης στον καρκίνο του πνεύμονα, με μηχανισμούς που ακόμα μελετώνται (87). Η σαρβαβίνη σε μελέτες στον SCLC φαίνεται να εμπλέκεται και σε μια άλλη οδό μεταγωγής σήματος την (PI3K)/Akt (phosphatidylinositol 3-kinase-), όπου αυξάνεται η έκφρασή της μέσω επίδρασης της Αkt (Protein kinase B-πρωτε'ι'νική κινάση Β) και ενισχύεται η αντιαποτπωτική της δράση (88) Θεραπευτικές προσεγγίσεις Τελευταία δοκιμάζονται μέθοδοι γονιδιακής θεραπείας με χρήση ολιγονουκλεοτιδικών τροποποιητών του γονιδίου της σαρβαβίνης και αναστολέων του υποκινητή του, με σκοπό την καταστολή της μεταγραφής του, ώστε να επιχειρηθεί η μείωση της έκφρασης της σαρβαβίνης στο καρκινικό κύτταρο. Σε μεταγραφικό επίσης επίπεδο, σε μελέτες στον ΝSCLC, εξετάζεται απενεργοποίηση του mrna της σαρβαβίνης, με τη χρήση si-rnas (small interfering RNA), ολιγονουκλεοτιδίων, ή ριβοενζύμων (89). Θεραπευτικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν και μικροί μοριακοί ανταγωνιστές κυκλινών, με ρόλο κλειδί στην προώθηση του κυτταρικού κύκλου, ή και ανταγωνιστές μοριακών συνοδών όπως της Ηsp90. Αναστολή της CDK1, για παράδειγμα, έχει σκοπό την αναστολή της φωσφορυλίωσης στη Thr34 και την τελική δυσλειτουργία της σαρβαβίνης στο καρκινικό κύτταρο (Εικόνα 18)(66). 14

20 Εικόνα 18: Μεταγραφικές και μετα-μεταφραστικές θεραπευτικές προσεγγίσεις,όπου transcriptional level=μεταγραφικό επίπεδο, post-translational=μετα-μεταφραστικό επίπεδο, Tροποποίηση από Xun Chen, et al ''Survivin and Tumorigenesis: Molecular Mechanisms and Therapeutic Strategies'', J Cancer 2016, Τέλος οι ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις έγκειται στην κατασκευή εμβολίων σαρβαβίνης, ή στην ειδική αναγνώριση από κυτοτοξικά Τ λεμφοκύτταρα, καρκινοειδικών επιτόπων σαρβαβίνης, που εκφράζουν καρκινικά κύτταρα με σκοπό της καταστροφή τους (66)[Εικόνα 19,(90)]. Εικόνα 19: Aνοσοθεραπεία με Τ λεμφοκύτταρα,όπου Cytolytic T cell=κυτοτοξικό Τ κύτταρο,cancer cell=καρκινικό κύτταρο και survivin peptide=επίτοπος πεπτίδιο σαρβαβίνης Τροποπίηση από Pennati M1 et al.''targeting survivin in cancer therapy: fulfilled promises and open questions'' Carcinogenesis Σκοπός διπλωματικής εργασίας Στόχος της παρούσης μελέτης είναι ο ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων του mrna του γονιδίου της σαρβαβίνης σε κυτταρικές σειρές από μικροκυτταρικό (SCLC) και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (ΝSCLC), συγκριτικά με φυσιολογικά κύτταρα ινοβλαστών πνεύμονα. H αυξημένη έκφραση 15

21 της σαρβαβίνης στα καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά, αναγνωρίζεται με μεθόδους μοριακής ανάλυσης που θα αναφερθούν παρακάτω, ως ενδεικτικό κριτήριο προχωρημένων σταδίων καρκίνου, μειωμένης επιβίωσης, πιθανής επανεμφάνιση της νόσου και διαφορικής επιθετικότητας μεταξύ των διαφορετικών μορφών καρκίνου του πνεύμονα που αντιπροσωπεύονται με τις διάφορες καρκινικές σειρές. Θα επιχειρηθεί σύγκριση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης της σαρβαβίνης στις κυτταρικές σειρές που αναφέρονται παρακάτω σε πίνακα, σύμφωνα με το παραπάνω κριτήριο και θα παραλληλιστεί με υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα που επιβεβαιώνουν την παραδοχή του. Ο ρόλος της σαρβαβίνης και του γονιδίου που την κωδικοποιεί σε μεγάλο αριθμό κυτταρικών μονοπατιών, τα καθιστούν υψηλής σημασίας θεραπευτικούς στόχους για την αντιμετώπιση της νεοπλασματικής νόσου του πνεύμονα, καθιστώντας σημαντικές τις συγκριτικές μελέτες διαφορικής έκφρασης (22,91). ΙΙ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 1: Κυτταρικές σειρές νεοπλασμάτων πνεύμονα σε Τrizol. Όπου ΝSCLC*¹ = Non small cell lung carcinoma - Mη μικροκυτταρικό καρκίνωμα πνεύμονα και: SCLC *² = Small cell lung carcinoma - Μικροκυτταρικό καρκίνωμα πνεύμονα, 2 a: αιωρούμενα κύτταρα, 2 b:προσκολημένα κύτταρα ΤΥΠΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΣΕΙΡΑΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ Α549C αδενοκαρκίνωμα επιθηλιακό (139) ΝCI-H1299B αδενοκαρκίνωμα-λεμφαδένα (140) ΝSLC*¹ ΝCI-H460A μεγαλοκυτταρικό-πλευρική συλλογή (140) NCI-H69A DMS 114 ΜRC5 K562 SCLC *²a SCLC *²b ινοβλάστες φυσιολογικού πνεύμονα Μυελογενής Λευχαιμία 16

22 1.1 Aπομόνωση ολικού RNA Μέθοδος Chomczynski P. H μέθοδος αυτή (92,93) χρησιμοποιείται για απομόνωση RNA με ισοθειοκυανικό γουανίδιο, φαινόλη και χλωροφόρμιο. Στηρίζεται στο διαχωρισμό, μέσω φυγοκέντρισης, σε PH=4, σε μία υπερκείμενη διαυγή υδατική φάση (aqueous phase) και σε μια υποκείμενη κόκκινου χρώματος οργανική φάση (organic phase). Στην οργανική φάση γίνεται συγκέντρωση των πρωτεϊνικών προσμίξεων και των διαλελυμένων λιπιδίων. Η διαδικασία αυτή απαιτεί τη χρήση αιθανόλης. Το DNA συσσωρεύεται στην ενδιάμεση φάση (interphase), ενώ το RNA στην υπερκείμενη υδατική φάση [(Εικόνα 20)(94)]. Το ισοθειοκυανικό γουανίδιο που περιέχει το αντιδραστήριο ΤRIZOL (95), είναι ένας χαοτροπικός παράγοντας, ο οποίος επιτρέπει τη λύση των κυττάρων και των κυτταρικών οργανιδίων, καθώς και την αποδιάταξη των πρωτεϊνών που προσδένονται στο RNA. Mε την παρουσία χλωροφορμίου-φαινόλης επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός των δύο φάσεων, υδατικής από οργανικής και η απομόνωση των λιπιδίων στην οργανική φάση. Η φαινόλη που περιέχει το αντιδραστήριο βοηθά επίσης στην συγκέντρωση των πρωτεϊνικών προσμίξεων στην κόκκινη οργανική φάση. Με τη χρήση ισοπροπανόλης γίνεται ανάκτηση του RNA, από την υπερκείμενη υδατική φάση, μέσω της μείωσης των υδροφιλικών αλληλεπιδράσεων του RNA με το διάλυμα, ώστε να παραλειφθεί ως ίζημα. Τέλος το ολικό RNA παραλαμβάνεται ως καθαρό ίζημα με τη χρήση αιθανόλης 70%,απαλλαγμένο από τις πιθανές προσμίξεις αλάτων και πρωτεϊνών (94,95,96). Εικόνα 20:Φάσεις διαχωρισμού κατά την απομόνωση RNA με TRIZOL 17

23 Υλικά Διαλύματα Χαοτροπικό αντιδραστήριο TRIzol (Sigma-Aldrich) Χλωροφόρμιο Ισοποροπανόλη Aιθανόλη 70% ddh 2 O RNAse FREE Πρωτόκολλο 1. Ξεπάγωμα σταδιακά των κυτταρικών σειρών που βρίσκονται σε Τrizol (1200μl) σε πάγο 4 ο C 2. Προσθήκη 250μl χλωροφόρμιο σε κάθε σωληνάριο με τα αντίστοιχα κύτταρα. 3. Διατήρηση δειγμάτων στους 4ºC για 15min, με ταυτόχρονο vortex σε τακτά χρονικά διαστήματα. 4. Φυγοκέντρηση στις rpm για κατακρήμνιση κυτταρικών μεμβρανών και οργανιδίων. 5. Μεταφορά υπερκείμενου σε σωληνάριο eppendorf των 2ml 6. Προσθήκη ίσης ποσότητας ισοπροπανόλης 7. Επώαση Ο/Ν στους -20 ο C 8.Φυγοκέντρηση στους 4 ο C, στις rpm, για 20min 9.Απόρριψη υπερκειμένου με πιπέτα Pasteur 10.Προσθήκη 800μl αιθανόλη 70% θερμοκρασίας ψυγείου και ανάδευση με πιπέτα 11.Φυγοκέντρηση στους 4 ο C,στις rpm, για 10 min 12.Aπόρριψη υπερκειμένου με πιπέτα Pasteur 13.Προσθήκη 800λ αιθανόλη 70% θερμοκρασίας ψυγείου και ανάδευση με πιπέτα 14.Φυγοκέντρηση στους 4 ο C,στις rpm, για 10 min 15.Απόρριψη υπερκειμένου 16.Επώαση Ο/Ν στους 4 ο C για την εξάτμιση της αιθανόλης. 17.Διάλυση με ddh 2 O RNAse free όγκου 35μl το ενυπάρχον ίζημα που αποτελεί το ολικό RNA 18

24 1.2 Φωτομέτρηση ολικού RNA O ποσοτικός και ποιοτικός προσδιορισμός του oλικού RNA επιτυγχάνεται με φωτομέτρηση. Γίνεται με τον υπολογισμό της συγκέντρωσής του ανά δείγμα και το χαρακτηρισμό της καθαρότητας του έναντι τυχόν πρωτεϊνικών προσμίξεων. Η μέθοδος στηρίζεται στην απορρόφηση (A 260 ) του διαλύματος RNA με μήκος κύματος 260nm. Σύμφωνα με το νόμο Βeer Lambert, η απορρόφηση είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του δείγματος, σύμφωνα με τον τύπο: Α=ε x l x C, όπου ε=συντελεστής απορρόφησης, l μήκος κυψελίδας (cm), C= συγκέντρωση δείγματος (μg/μl). Η μια μονάδα απορρόφησης στα 260nm αντιστοιχεί σε 40μg/ μl RNA σε ουδέτερο ph. Η καθαρότητα του RNA φαίνεται από το λόγο της απορρόφησης στα 260nm προς αυτήν στα 280nm (A260/A280) και κυμαίνεται στις τιμές 1,7-1,9. Η απορρόφηση στα 280nm αντιστοιχεί κυρίως σε πρωτεΐνες. (98,99,100). Υλικά Διαλύματα Ολικό RNA αραίωση 1/70 ddh 2 O RNAse FREE Πρωτόκολλο 1. Αραίωση του δείγματος προς φωτομέτρηση 1:70,προσθέτοντας σε σωληνάριο eppendorf 0,5 ml,1μl δείγματος RNA και 69μl αποστειρωμένου νερού ddh 2 O RNAse free. 2. Μηδενισμός του φωτομέτρου με 70μl ddh 2 O, RNAse free 3. Διαδοχική προσθήκη των δειγμάτων και καταγραφή των ενδείξεων του φωτομέτρου ανά δείγμα 19

25 1.3 Ηλεκτροφόρηση ολικού RNA Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης επιτρέπει το διαχωρισμό τμημάτων νουκλεϊκών οξέων (DNA, RNA) με βάση το μέγεθός τους και ελέγχει την ακεραιότητα και το μέγεθος διαμοίρασής τους. Κατά την ηλεκτροφόρηση με τη βοήθεια ηλεκτρικού ρεύματος μέσω της πηκτής αγαρόζης, τα προς ανάλυση δείγματα μετακινούνται από τις υποδοχές (''πηγαδάκια'') που έχουν τοποθετηθεί (Εικόνα 21). Το αποτέλεσμα είναι ότι τα αρνητικά φορτισμένα μόρια RNA κινούνται προς την κάθοδο, με ταχύτητες διαφορετικές, αντιστρόφως ανάλογα με το μέγεθος τους. Έτσι τα μικρότερα μόρια απομακρύνονται περισσότερο από το αρχικό σημείο, ενώ τα μεγαλύτερα, λιγότερο (101). Πιο συγκεκριμένα, το RNA ελέγχεται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 2% και χρώση βρωμιούχου αιθίδιου (EtBr) (10mg/ml). Το EtBr δεσμεύεται στις βάσεις των νουκλεϊκών οξέων και παρουσιάζει μήκος κύματος εκπομπής 600nm,με μήκος κύματος διέγερσης 525nm,σε διάλυμα Tris Borate/EDTA (TBE) συγκέντρωσης 10mM και ph=8. Για να φτιάξουμε το πτήκτωμα αγαρόζης, ζυγίζεται η κατάλληλη ποσότητα αγαρόζης και προστίθεται σε επαρκή ποσότητα διαλύματος Tris Borate Acid/EDTA (TBE) ώστε να πληρωθεί το εκμαγείο του πηκτώματος. Το διάλυμα θερμαίνεται σε φούρνο μικροκυμάτων μέχρι η αγαρόζη να διαλυθεί πλήρως και το διάλυμα να γίνει διαυγές. Στη συνέχεια η κωνική φιάλη ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου πριν την προσθήκη βρωμιούχου αιθίδιου (EtBr).Έπειτα γίνεται τοποθέτηση της ρευστής αγαρόζης στο εκμαγείο. Tο εκμαγείο έχει προετοιμαστεί κλείνοντας τις ανοικτές πλευρές του με χαρτοταινία και τοποθετώντας τα «χτένια», που χρησιμεύουν ώστε να δημιουργηθούν οι θέσεις υποδοχής των δειγμάτων (Εικόνα 21). Η ρευστή αγαρόζη χύνεται στο εκμαγείο με προσοχή, προκειμένου να αποφευχθεί ο σχηματισμός φυσαλίδων. Το πήκτωμα σχηματίζεται σε χρονικό διάστημα min και το χρώμα του γίνεται γαλακτόχρωμο. Στο τέλος αφαιρούνται προσεκτικά τα «χτένια», για να αποφευχθεί τυχόν διάτρηση του πυθμένα των θέσεων υποδοχής των δειγμάτων και τοποθετείται το πήκτωμα σε ψύξη 4 C. Συνήθως την επόμενη μέρα γίνεται η χρησιμοποίηση του τζελ, ώστε να έχει σταθεροποιηθεί αρκετά (102). 20

26 Εικόνα 21.Κατασκευή πηγαδιών σε πηκτή αγαρόζης Υλικά Διαλύματα Πηκτή αγαρόζης 2% Διάλυμα Tris Borate EDTA (TBE) συγκέντρωσης 10mM και ph=8 Χρώση βρωμιούχου αιθίδιου (EtBr) ( αρχικής συγκέντρωση στοκ 10mg/ml) και μπλε της βρωμοφαινόλης Πρωτόκολλο Ετοιμασία διαλύματος αγαρόζης (2%): 1. Σε διάλυμα 1xTBE μέσα σε κωνική φιάλη γίνεται διάλυση 2g αγαρόζη σκόνη σε 100ml TBE για να φτιάξουμε τζελ 2% 2. Θέρμανση σε φούρνο μικροκυμάτων μέχρι διαύγασης. 3. Προσθήκη EtBr (1μl ανα 10 ml διαλύματος αγαρόζης) 4.Τοποθέτηση του διαλύματος αγαρόζης σε κατάλληλη συσκευή με υποδοχείς για τα δείγματα και στερεοποίηση σε θερμοκρασία δωματίου (Eικόνα 21) 5.Προετοιμασία δειγμάτων RNA που θα φορτωθούν στην πηκτή ηλεκτροφόρησης (5μl χρωστικής μπλε της βρωμοφαινόλης και 3μl του δείγματος RNA) και φόρτωση σε κάθε θέση της πηκτής. 6. Ρύθμιση συσκευής ηλεκτροφόρησης στα 95 V. 7. Μεταφορά πηκτής, μετά το τέλος της ηλεκροφόρησης, σε πηγή υπεριώδους ακτινοβολίας και λήψη φωτογραφίας της. 21

27 1.4.Σύνθεση cdna Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμερισμού-αντίστροφης μεταγραφής (reverse transcription polymerase chain reaction)/(rt-pcr) αποτελεί έναν αξιόπιστο τρόπο να ελεγχθεί ποιοτικά η έκφραση ενός συγκεκριμένου γονιδίου. H αντίδραση γίνεται σε δύο στάδια: α) Στο πρώτο στάδιο αποδιατάσσεται το RNA στους 70 ο C,από τη δευτεροταγή δομή του, η οποία συνήθως περιέχει αρκετές θηλιές πλούσιες σε G+C και μεταπίπτει σε μια πρωτοταγή δομή, με σχεδόν ευθύγραμμη διάταξη. β) Στο δεύτερο στάδιο ακολουθεί η σύνθεση συμπληρωματικού DNA (cdna) από το ολικό απομονωμένο RNA, με τη διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής, αντίδραση που καταλύεται από το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση, μια RNA-εξαρτώμενη από DNA πολυμεράση (reverse transcriptase) του ρετρο'ι'ού Moloney που προκαλεί λευχαιμία σε ποντικούς (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase, M- MLV-RT). Τυχαία εξανουκλεοτίδια χρησιμοποιούνται στην αντίστροφη μεταγραφή ως εκκινητές (primers). Αρχικά γίνεται η επέκταση του cdna μέσω της αντίστροφης μεταγραφάσης στους 37 ο C και στη συνέχεια η απενεργοποίηση του ενζύμου, για τη λήξη της αντίδρασης στους 60 ο C (103,104)[(Εικόνα 22),(105)]. Εικόνα 22: RT-PCR,όπου Ν6 τυχαία εξανουκλεοτίδια = random primers,αντίστροφη μεταγραφή = reverse transcription,πολλαπλασιασμός με PCR = PCR amplification,(105) 22

28 Υλικά Διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα για cdna της invitrogen,(buffer 5x -250mM Tris-HCL, PH=8,3, 25 o C, 375mM KCL, 15mM MgCl 2 ),(104) Εκκινητές (primers) της invitrogen:τυχαία εξανουκλεοτίδια (3 μg/μl), σε buffer (3mM Tris-HCL,PH=7, 0,2 mm EDTA),(106) Eλέυθερα δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps) 10μM each: αδενίνη (Α), θυμίνη (Τ), γουανίνη (G), κυτοσίνη (C) Ένζυμο M-MLV-RT της invitrogen,αντίστροφη μεταγραφάση του ρετρο'ι'ού Moloney που προκαλεί λευχαιμία σε ποντικούς (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptanse),200 U/μl,δυναμικής 12,3kb cdna.(1 Unit ενσωματώνει 1nmole dttp σε 10min,στους 37 ο C,χρησιμοποιώντας poly(a),οligo(dt) ως μήτρα),(104) RNA 1μg ddh 2 O RNAse free Πρωτόκολλο (104) 1ο στάδιο: 1.1μg RNA σε τελικό όγκο 12μl από τα διαφορετικά δείγματα των κυτταρικών σειρών που χρησιμοποιούνται στην εργασία με βάση τη φωτομέτρηση των δειγμάτων Πίνακας 2: Κυτταρική σειρά, ποσότητα RNA, νερού και τελικός όγκος Kυτταρική σειρά C ng.μl -1 Ποσότητα RNA V ddh2o Vτελικό Α549C 500,45 2μl 10μl 12μl ΝCI-H1299B 257,59 4μl 8μl 12μl ΝCI-H460A 555,6 1,8μl 10,2μl 12μl NCI-H69A 833,4 1,2μl 10,8μl 12μl DMS ,2 0,8μl 10,4μl 12μl 23

29 2. Αποδιάταξη RNA, σε θερμικό κυκλοποιητή, στους 70 ο C για 10 min. 3. Φυγοκέντρηση στις 5000 rpm για 30'' και τοποθέτηση στον πάγο. 2ο στάδιο: 1. Προσθήκη των αντιδραστηρίων, όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα, για την παρασκευή cdna. Ο τελικός όγκος της αντίδρασης είναι 20μl σε eppendorf των 0,5ml, το μείγμα των αντιδραστηρίων το οποίο περιέχει, Buffer 5x, Random primers, dntps, ddh 2 O, ένζυμο RT-MMLV και διαμοίραση περιεχομένου ανάλογα με τον αριθμό των δειγμάτων στα eppendorf του προηγούμενου σταδίου που περιείχαν το αποδιαταγμένο RNA. Πίνακας 3: Προσθήκη των αντιδραστηρίων για την παρασκευή του cdna Αντιδραστήριο Αρχικός όγκος/δείγμα Τελικός όγκος για 6 δείγματα Buffer 5x 4μl 24μl Random primers 1μl 6μl dntps 1μl 6μl RT-MMLV 1μl 6μl RNA 12μl 12μl ddh 2 O 1μl 6μl 2. Εισαγωγή σε θερμικό κυκλοποιητή, σε πρόγραμμα 37 o C για 55min και στη συνέχεια στους 60 ο C για 5 min 24

30 1.5 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμερισμού σε πραγματικό χρόνο (RealTime-PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμερισμού σε πραγματικό χρόνο (RealTime- PCR) είναι μια μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού της έκφρασης ενός συγκεκριμένου γονιδίου-στόχου. Kατά την αντίδραση αυτή θα προκύψουν πολλαπλά αντίτυπα ενός καθορισμένου τμήματος mrna του γονιδίου της σαρβαβίνης, χρησιμοποιώντας hot start πολυμεράση και ειδικά σχεδιασμένους εκκινητές, οι οποίοι οριοθετούν συγκεκριμένο τμήμα DNA, προερχόμενο από το mrna του γονιδίου στόχου. Με αυτή τη μεθοδολογία γίνεται τόσο ενίσχυση όσο και ποσοτικοποίηση των mrna μεταγράφων του γονιδίου-στόχου (107,108). H αλυσιδωτή αντίδραση πολυμερισμού πραγματικού χρόνου, επιτρέπει την παρακολούθηση της παραγωγής των προϊόντων της PCR, δηλαδή των πολλαπλασιαζόμενων τμημάτων DNA που προκύπτουν από αντίστροφη μεταγραφή του mrnα του γονιδίου-στόχου. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της μέτρησης της έντασης του σήματος του εκπεμπόμενου φθορισμού ειδικών μορίων (SYBR green I, ανιχνευτές υδρόλυσης ή υβριδισμού) τα οποία προσδένονται στα προϊόντα της PCR σε κάθε κύκλο της. Η ενίσχυση του στόχου και η ανίχνευση του φθορισμού, γίνονται ταυτόχρονα, διότι καθώς αυξάνονται τα δίκλωνα μόρια που παράγoνται, συνδέονται με φθορίζουσα χρωστική-στην παρούσα μελέτη SYBR green I- και ο φθορισμός ανιχνεύεται από το οπτικό σύστημα του ειδικού κυκλοποιητή (Real-time PCR, CFX96, Biorad). O εκπεμπόμενος φθορισμός αντιστοιχεί στο ποσό του νέο-συντιθέμενου προϊόντος, ανά κύκλο. Έτσι προκύπτει η κινητική της αντίδρασης, ή αλλιώς καμπύλη ενίσχυσης (amplification plot) του γονιδίου στόχου (Εικόνα 22)(109). Η γραφική αυτή παράσταση, είναι η συνάρτηση του φθορισμού, σε σχέση με τον αριθμό του κύκλου της PCR όπου πρωτοανιχνεύτηκε επαρκής φθορισμός. Ο αριθμός αυτός των κύκλων χαρακτηρίζεται ως κατώφλι κύκλου (cycle threshold, Ct). Η σύγκριση των αρχικών ποσοτήτων των δειγμάτων μεταξύ τους μπορεί να γίνει στο σημείο Ct. Οι τιμές Ct εξαρτώνται απόλυτα από το αρχικό ποσό του δείγματος και είναι η βάση για τον υπολογισμό των cdna αντιγράφων, ή των επιπέδων έκφρασης του mrna. Ως baseline ορίζονται οι κύκλοι PCR κατά τους οποίους το σήμα συσσωρεύεται μεν, αλλά είναι κάτω από τα όρια ανίχνευσης από το μηχάνημα (Εικόνα 22)(109). 25

31 Εικόνα 22 : Kινητική της αντίδρασης Real time PCR. Στη χαρακτηριστική καμπύλη ενίσχυσης, διακρίνονται η εκθετική, η γραμμική και η φάση κορεσμού. Στον οριζόντιο άξονα παριστάνεται ο αριθμός των κύκλων της αντίδρασης, ενώ στον κατακόρυφο η τιμή των επιπέδων φθορισμού (109). Η καμπύλη ενίσχυσης διακρίνεται σε τρεις φάσεις: την εκθετική, τη γραμμική και τη φάση κορεσμού. Κατά την εκθετική φάση (exponential phase), σε κάθε κύκλο της αντίδρασης πραγματοποιείται ακριβής διπλασιασμός του προϊόντος, καθώς όλα τα απαραίτητα για την PCR συστατικά (π.χ. dntps, εκκινητές, πολυμεράση) βρίσκονται σε περίσσεια. Καθώς συνεχίζεται η αντίδραση, επέρχεται η γραμμική φάση κατά την οποία κάποια από τα αντιδραστήρια αρχίζουν να εξαντλούνται, ενώ παράλληλα συσσωρεύονται, σταδιακά, αναστολείς. Στη συγκεκριμένη φάση, η αντίδραση της ενίσχυσης επιβραδύνεται, καθώς μειώνεται η αποδοτικότητα της και τελικά σταματάει εντελώς, οπότε η καμπύλη φθορισμού φτάνει σε σημείο κορεσμού (plateau). Στην εργασία αυτή στα δείγματα καρκινικών σειρών, μελετήθηκαν οι περιοχές των εξωνίων 3 και 4 του γονιδίου σαρβαβίνης με τους αντίστοιχους εκκινητές (SURV_F, SURV_R), όπου ανιχνεύονται τα επίπεδα έκφρασης των μεταγράφων φυσιολογικής μορφής (Wild type) και 2Β: (Εικόνα 23),(107,108). Εικόνα 23: Σχηματική αναπαράσταση των mrna μεταγράφου 2Β του γονιδίου σαρβαβίνης και περιοχές που αντιστοιχούν και στη Wt και θα ενισχυθούν από τους αντίστοιχους εκκινητές 26

32 1.5.1.SYBR-Green I Ως σύστημα ανίχνευσης, χρησιμοποιείται η φθορίζουσα χρωστική SYBR green I (111,112), η οποία ενσωματώνεται σε δίκλωνο μόριο cdna (dsdna). Η ουσία αυτή διεγείρεται με ακτινοβολία μήκους κύματος 497 nm και εκπέμπει στα 520 nm. Ο τρόπος λειτουργίας της χρωστικής SYBR green I είναι ο εξής: Όταν η χρωστική βρίσκεται ελεύθερη στο διάλυμα δεν παράγεται φθορισμός. Η ενσωμάτωσή της στο DNA κατά τη σύνθεσή του, σε συνδυασμό με τη διέγερσή της με ακτινοβολία κατάλληλου μήκους κύματος, έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή φθορισμού. Η ένταση του φθορισμού αυτού είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του παραγόμενου προϊόντος [(Εικόνα 24),(113)](114). Το μεγαλύτερο πλεονέκτημα της SYBR green είναι η δυνατότητα χρήσης της με οποιοδήποτε ζευγάρι εκκινητών, για την ενίσχυση οποιασδήποτε αλληλουχίαςστόχου, γεγονός που την καθιστά πολύ πιο οικονομική μέθοδο από την χρήση ειδικού ανιχνευτή (probe). Επιπλέον, συνιστά μια ιδιαίτερα ευαίσθητη μέθοδο, καθώς σε κάθε μόριο DNA που συντίθεται δεσμεύονται πολλά μόρια χρωστικής, με αποτέλεσμα την ενίσχυση του προκύπτοντος σήματος. Αντίθετα, σημαντικό μειονέκτημα της SYBR green αποτελεί το γεγονός ότι προσδένεται σε όλα τα δίκλωνα μόρια DNA που συντίθενται κατά την αντίδραση ενίσχυσης, στα οποία συμπεριλαμβάνονται τα πιθανά διμερή των εκκινητών, καθώς και μη ειδικά προϊόντα που ενδέχεται να προκύπτουν. Το γεγονός αυτό, οδηγεί σε λανθασμένη υπερεκτίμηση της συγκέντρωσης της αλληλουχίας-στόχου. Ωστόσο, υπάρχει τρόπος να ξεπεραστούν αυτοί οι περιορισμοί. Η επιλογή των σωστών εκκινητών, όπως επίσης και η βελτιστοποίηση των συνθηκών της αντίδρασης, μπορούν να συμβάλλουν στην αποτροπή δημιουργίας διμερών των εκκινητών (115,116). Εικόνα 24 : Σχηματική περιγραφή της λειτουργίας της χρωστικής SYBR green I από : 27

33 1.5.2.Αντίδραση qrt-pcr Για να επιτευχθεί ακριβής ποσοτικός προσδιορισμός των μεταγράφων του γονιδίου-στόχου γίνεται χρήση του ένζυμου hot start Taq πολυμεράση, που είναι μια 94kDa πρωτεΐνη με 5'-3' δραστηριότητα πολυμερισμού, η οποία είναι η πλέον αποτελεσματική στους 70 C έως 80 C. Είναι ιδιαίτερα θερμοανθεκτική και ο χρόνος ημιζωής της είναι 100 κύκλους. Η Real-Time PCR ακολουθεί τα τρία βασικά βήματα της PCR, που είναι τα εξής: 1)Αποδιάταξη: Ο διαχωρισμός των δύο αλυσίδων του δίκλωνου cdna γίνεται με αύξηση της θερμοκρασίας στο πρώτο αυτό βήμα της PCR. 2)Υβριδοποίηση: Στο στάδιο αυτό οι εκκινητές ενώνονται λόγω συμπληρωματικότητας με τις αποδιατεταγμένες αλληλουχίες cdna. Τα σημεία που προσδένονται οι εκκινητές αποτελούν την έναρξη της αντιγραφής, οριοθετώντας ουσιαστικά το τμήμα που πρόκειται να ενισχυθεί. Στο στάδιο αυτό γίνεται πτώση της θερμοκρασίας, σε θερμοκρασία που ρυθμίζεται ανάλογα με την το σημείο τήξης του κάθε εκκινητή, το οποίο και εξαρτάται από την αλληλουχία του. 3) Επιμήκυνση: Σε αυτό το τελευταίο στάδιο των διαδοχικών κύκλων της PCR επεκτείνονται τα τμήματα DNA με την προσθήκη νουκλεοτιδίων από την DNA πολυμεράση, σύμφωνα με τον κανόνα της συμπληρωματικότητας. Μετά το πέρας της αντίδρασης προχωρούμε σε ποιοτική ανάλυση των προϊόντων της PCR μελετώντας τις καμπύλες αποδιάταξης (melting curves)(εικόνες 28 και 29) που μας δίνει η συσκευή, βάση της μεθοδολογίας τήξης υψηλής ανάλυσης (High Resolution Melting - HRM),(117).Αυτό επιτρέπει το διαχωρισμό του φθορισμού που προέκυψε από την ενίσχυση της αλληλουχίαςστόχου, από τους φθορισμούς που οφείλονται στα διμερή των εκκινητών, ή σε μη ειδικά προϊόντα και επιτρέπει την ταυτοποίηση μεταλλαγών στην αλληλουχία των νουκλεϊκών οξέων, μέσω ανίχνευσης μικρών αλλαγών στην καμπύλη τήξης (116,118). 28

34 1.5.3.Ποσοτικοποίηση-κανονικοποίηση Ο αριθμός των μεταγράφων του γονιδίου-στόχου της σαρβαβίνης στο δείγμα, ομαλοποιείται σύμφωνα με τον αριθμό των μεταγράφων ενός γονιδίου αναφοράς (housekeeping gene) που εκφράζεται στο ίδιο δείγμα, όπου στην παρούσα μελέτη είναι το γονίδιο ΑΒL. Η ποσοτικοποίηση του δείγματος γίνεται είτε απόλυτα, είτε σχετικά. Η απόλυτη ποσοτικοποίηση που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη αυτή, γίνεται με τη χρήση μιας πρότυπης καμπύλης διαδοχικών αραιώσεων 1/10 (10-fold), που δημιουργείται από δείγματα με γνωστή συγκέντρωση, για το γονίδιο του ABL στη κυτταρική σειρά Κ562. Επιπλέον χρησιμοποιήθηκε εσωτερικός μάρτυρας σε κάθε επανάληψη της αντίδρασης, έτσι ώστε τα αποτελέσματα να είναι συγκρίσιμα. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως λόγος των μεταγράφων του γονιδίου-στόχου προς τα μετάγραφα του γονιδίου αναφοράς ανά μl, δηλαδή SURVIVIN/ ΑΒL copies/ μl (116,117). Πρωτόκολλο απόλυτης ποσοτικοποίησης σε πραγματικό χρόνο των μεταγράφων του γονιδίου σαρβαβίνης (116) Αρχικά γίνεται έλεγχος της δυνατότητας σύγκρισης των αντιδράσεων για το γονίδιο στόχο SURVIVIN και το γονίδιο αναφοράς ABL. 1. Επιβεβαιώνεται ότι α) δεν μεταβάλλεται η έκφραση του ABL στις κυτταρικές σειρές και β) όλες οι αντιδράσεις PCR, της SURVIVIN καθώς και του γονιδίου αναφοράς ABL, είχαν την ίδια απόδοση (efficiencies). Για το σκοπό αυτό: Κατασκευάστηκε καμπύλη αναφοράς τεσσάρων διαδοχικών αραιώσεων 1/10 (10-fold) εκάστη, για το γονίδιο ABL και το γονιδίο στόχος στα cdnas των κυτταρικών σειρών. Υπολογίστηκε η απόδοση της κάθε real-time PCR αντίδρασης με βάση την κλίση της καμπύλης αναφοράς (slope) που θεωρητικά πρέπει να είναι σε απόλυτο αριθμό <3,3. Ο υπολογισμός της απόδοσης γίνεται από τον ακόλουθο τύπο: E = 1 0( 1/S) 1, όπου Ε: απόδοση, S: κλίση της καμπύλης αναφοράς υπολογίζεται από το λογισμικό Biorad 29

35 Π.χ. Εάν S= 3.322, τότε η απόδοση της PCR είναι 1, ή 100% 2. Όλα τα δείγματα cdna συντέθηκαν από την ίδια αρχική ποσότητα RNA (1μg) και διαλύθηκαν στον ίδιο όγκο έτσι ώστε τα αποτελέσματα της μελέτης να είναι συγκρίσιμα Υλικά Διαλύματα PCR Master Mix: Ρυθμιστικό διάλυμα (buffer) 2x Ελεύθερα δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps) Ένζυμο hot start Taq πολυμεράση (Thermus aquaticus) Eκκινητές (primers) για το γονίδιο αναφοράς ΑΒL και εκκινητές (primers) για το γονίδιο στόχος SURVIVIN Φθορίζουσα xρωστική SyberGreen Πίνακας 4:Οι c DNA εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν cdna εκκινητές ABL >NM_ Αλληλουχία Tm bp PCR product 185bp OLIGO1 GACCCGGAGCTTTTCACCTTTAGTT 60 OLIGO3 TTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTT 60 SURVIVIN >NM_ bp SURV_F 5 -AAAGAGCCAAGAACAAAATTGC- 3 SURV_R 5 - GAGAGAGAAGCAGCCACTGTTAC μl cdna ddh 2 O RNAse-DNAse free 1μl cdna της κυτταρικής σειράς Κ562 σε διαδοχικές αραιώσεις, για την κατασκευή καμπύλης αναφοράς 30

36 Πρωτόκολλο real-time PCR(116) Στις αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκε 1μl cdna για την ενίσχυση του γονιδίου σαρβαβίνης και ABL σε τελικό όγκο 10μl. Στα αντίστοιχα wells 4-22 προσθέσαμε 1μl cdna και 9μl mix για το ABL και 1μl cdna και 9μl mix για τη survivin στα 23-41, κατόπιν φυγοκέντρησης όλων στις 5000 rpm για 20sec. Στους αρνητικούς μάρτυρες της αντίδρασης, negative, λείπει το cdna. Αντίδραση για την ενίσχυση του γονιδίου ABL : Buffer 2x :5μl ABLprimers(oligo1) Forward : 0,4μl ABLprimers(oligo3)Reverse :0,4μl ddh 2 O :3,2μl cdna: 1μl Τελικός όγκος: 10μl Αντίδραση για την ενίσχυση του γονιδίου της σαρβαβίνης : Buffer 2x :5μl ABLprimers(oligo1) Forward :0,4μl ABLprimers(oligo3)Reverse :0,4μl ddh 2 O RNAse Free :3,2μl cdna:1μl Τελικός όγκος: 10μl 31

37 Πίνακας 5.Σχηματική διάταξη της αντίδρασης Real Time PCR για τα γονίδια ABL και σαρβαβίνης wells 1. K562 ( 10 6 ) 12. NCI-H1299B 23.NCI-H69A 34.DMS 114 S 2. K562 (10 5 ) 13.DMS NCI-H69A 35.NCI-H460A U 3. Κ562 (10 4 ) 14.DMS NCI-H69A S 36.NCI-H460A R 4.NCI-Η69A A 15.DMS 114 A 26. ΜRC5 U 37.NCI-H460A V 5. NCI-Η69A B 16.NCI-H460A B 27. ΜRC5 R 38.A549C I 6. NCI-Η69A L 17.NCI-H460A L 28. ΜRC5 V 39.A549C V 7. ΜRC5 18.NCI-H460A 29.NCI-H1299B I 40.A549C I 8. ΜRC5 M 19.A549C M 30.NCI-H1299B V 41.Negative N 9. ΜRC5 I 20.A549C I 31.NCI-H1299B I 10.NCI-H1299B X 21.A549C X 32.DMS 114 N 11.NCI-H1299B 22.Negative 33.DMS 114 Πίνακας 6:Στάδια εκτέλεσης της αντίδρασης της real time PCR στον κυκλοποιητή (CFX96, Biorad),(118) Στάδιο αντίδρασης Κύκλοι Θερμοκρασία ( ο C) Χρόνος (min:sec) Μέτρηση Ο.D. (640 nm) Eνεργοποίηση :30 - Ποσοτικοποίηση: Αποδιάταξη :05 - Yβριδοποίηση 60 00:10 - Επιμήκυνση 72 00:26 Μονή Καμπύλη τήξης: : : :01 Συνεχόμενη 0,5 ο C ανά κύκλο για 12'' Ψύξη: :00. 32

38 1.6 Ηλεκτροφόρηση προϊόντων qrt- PCR Η ηλεκτροφόρηση επιβεβαιώνει την ειδικότητα της αντίδρασης. Τα προϊόντα της qrt-pcr ηλεκτροφορούνται για 30min σε πηκτή αγαρόζης 3% στα 120V παράλληλα με έναν μάρτυρα γνωστού μοριακού βάρους (ladder 100bp), με σκοπό το χαρακτηρισμό των μοριακών βαρών των προϊόντων PCR και την αξιολόγηση της ειδικότητας της αντίδρασης PCR διακρίνοντας μια και μοναδική ζώνη και διαβαθμίσεις της έντασης της ζώνης των δειγμάτων των διαφορετικών συγκεντρώσεων, ανάλογα της συγκέντρωσης στην καμπύλη αναφοράς. Υλικά Διαλύματα Πηκτή αγαρόζης 3% Διάλυμα Tris Borate EDTA (TBE) συγκέντρωσης 10mM και ph=8 Χρώση βρωμιούχου αιθίδιου (EtBr) (10mg/ml) Μάρτυρας μοριακών βαρών (100bp ladder) Χρωστική μπλε της βρωμοφαινόλης 10x Πρωτόκολλο 1.Διάλυση agar 4,5gr σε 150ml TBE 2.Θέρμανση σε φούρνο μικροκυμάτων μέχρι διαύγασης 3.Προσθήκη βρωμιούχου αιθιδίου 1,5μl 4.Τοποθέτηση διαλύματος πηκτής σε ειδικό υποδοχέα με θέσεις για τα δείγματα και αφήνουμε να στερεοποιηθεί σε θερμοκρασία δωματίου 5.Προσθήκη 5μl από κάθε δείγμα της αντίδρασης PCR και 3,5μl χρωστικής μπλε της βρωμοφαινόλης σε κάθε θέση της πηκτής 6.Hλεκτροφόρηση στα 120V για 30min. 33

39 2.Αποτελέσματα-Συζήτηση 2.1 Φωτομέτρηση ολικού RNA Στον παρακάτω πίνακα αποτυπώνονται τα αποτελέσματα της φωτομέτρησης του ολικού RNA των διαφόρων κυτταρικών σειρών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία. Όπου C ο μέσος όρος της συγκέντρωσης των τιμών φωτομέτρησης και 260/280 ο δείκτης καθαρότητας (Α) του RNA. Το mrna που απομονώσαμε, προκύπτει με επαρκή καθαρότητα. Πίνακας 7: Η συγκέντρωση (C) και ο λόγος καθαρότητας (260/280) των RNA των δειγμάτων των διαφορετικών κυτταρικών σειρών. ΤΥΠΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΣΕΙΡΑΣ C: ng/μl Α:260/280 Α549C ,67 ΝCI-H1299B ΝCI H460A ,2 NCI H69A DMS ,48 ΜRC ,27 34

40 2.2 Ηλεκτροφόρηση ολικού RNA Ηλεκτροφόρηση ακέραιου και αποδομημένου ολικού RNA της NCI-1299 κυτταρικής σειράς όπου παίρνουμε καλύτερη εικόνα και εντοπισμός της ύπαρξης της ζώνης του ολικού mrna που έχει απομονωθεί επιτυχώς, μεταξύ των ζωνών 28S και 18S του rrna. Το μεταγραφικό RNA (mrna) και τα δύο μεγέθη ριβοσωμικών RNA (rrna), παρουσιάζονται σαν τρείς ξεχωριστές ζώνες (28S/18S=2/1 μπάντες) (Εικόνα 25). Εικόνα 25 :Φωτογραφία ηλεκτροφόρησης ολικού RNA της κυτταρικής σειράς NCI σε 1,5% agar. Πρώτη στήλη Ladder του 1kb=1000bp, δεύτερη στήλη αποδομημένο RNA,τρίτη στήλη ακέραιο RNA 35

41 2.3 qrt-pcr πραγματικού χρόνου για τα γονίδια ABL και σαρβαβίνη Παρουσιάζονται οι καμπύλες ενίσχυσης (amplification plot) του γονιδίου στόχου μας από τις διάφορες κυτταρικές σειρές. Oι γραφικές αυτές παραστάσεις, είναι η συνάρτηση του φθορισμού (RFU), σε σχέση με τον αριθμό του κύκλου της PCR όπου πρωτοανιχνεύτηκε επαρκής φθορισμός (Cycles) και προκύπτουν μετά από αυτόματη επεξεργασία των δεδομένων της αντίδρασης από το πρόγραμμα της Βiorad. Όσο υψηλότερος ο φθορισμός τόσο περισσότερο προϊόν παράγεται και όσο μικρότερος ο αριθμός των κύκλων που απαιτούνται για το κατώφλι Ct, τόσο μεγαλύτερο αριθμός cdna διαθέτει το δείγμα μας (116). Εικόνα 26: Kαμπύλη ενίσχυσης της real time PCR των cdna δειγμάτων μας από τις κυτταρικές μας σειρές, μετά από αυτόματη επεξεργασία των δεδομένων της αντίδρασης από το πρόγραμμα της Βiorad.RFU=φθορισμός,Cycles=κύκλος της αντίδρασης Παρακάτω απεικονίζουμε (Εικόνα 27) την καμπύλη αναφοράς που χρησιμοποιήσαμε στην απόλυτη ποσοτικοποίηση. Παρατηρούμε ότι η απόδοση Ε της αντίδρασης της real time PCR είναι αρκετά ικανοποιητική και τα αποτελέσματά μας ακολουθούν την γραμμικότητα σε μεγάλο βαθμό, ως ένδειξη της ακρίβειας της αντίδρασης (116,118). 36

42 Eικόνα 27: Kαμπύλη αναφοράς που προκύπτει μετά από αυτόματη επεξεργασία των δεδομένων της αντίδρασης από το πρόγραμμα της Βiorad και χρησιμοποιείται για την απόλυτη ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων, Cq=κατώφλι κύκλων (ή Ct), Ε = απόδοση της real time PCR,R= Συντελεστής προσδιορισμού, Slope=κλίση καμπύλης, y-int= σημείο τομής του y με την καμπύλη Παρακάτω παραθέτονται οι καμπύλες αποδιάταξης. Έχουμε χαμηλό εντοπισμό προσμίξεων στα δείγματά μας που εμφανίζεται με χαμηλές κορυφές στην εικόνα 29 ( 116,118). Εικόνα 28 :Kαμπύλη τήξης στο τέλος της αντίδρασης της real time PCR που προκύπτει μετά από αυτόματη επεξεργασία των δεδομένων της αντίδρασης από το πρόγραμμα της Βiorad, RFU = Φθορισμός, Τemparature = θερμοκρασία 37

43 Εικόνα 29: Kορυφές τήξης που προκύπτουν μετά από αυτόματη επεξεργασία των δεδομένων της καμπύλης τήξης από το πρόγραμμα της Βiorad. Η 1η κορυφή στους 81,5 Ο C αντιστοιχεί στο ABL. Η 2η κορυφή στους 86 Ο C αντιστοιχεί στο γονίδιο SURVIVIN.Στον κάθετο άξονα έχουμε την 1η παράγωγο του λόγου φθορισμού/θερμοκρασίας και οριζόντιο τη θερμοκρασία Παρακάτω παρατίθεται πίνακας με τα αναλυτικά αποτελέσματα της real time PCR για τις καρκινικές σειρές, μετά από στατιστική επεξεργασία του προγράμματος της Βiorad. 38

44 Πίνακας 4: Aποτελέσματα της real time PCR για τις καρκινικές σειρές, μετά από στατιστική επεξεργασία του προγράμματος της Βiorad. MEAN VALUE=η διάμεσος, SEM=τυπική απόκλιση και ΤΤΕST=αποδίδει την πιθανότητα που σχετίζεται με έναν έλεγχο t Student. CELL LINES SURVIVIN copies/μl ABL copies/μl SURV/ABL copies/μl MEAN VALUE ±SEM TTEST ΜRC5 1,02E+03 3,05E+08 3,34E-06 3,11E-02 6,22E-03 2,94E+15 1,17E+09 1,08E+09 3,60E+08 3,11E-02 1,24E+07 4,23E+08 2,93E-02 1,37E+07 4,25E+08 3,22E-02 1,44E+07 8,53E+05 1,69E+01 H69 2,25E+05 1,60E+08 1,41E-03 5,87E-01 8,39E-02 3,33E-02 5,46E+06 2,47E+08 2,21E-02 1,46E+08 1,23E+08 1,19E+00 6,15E+07 9,61E+07 6,40E-01 6,40E+07 1,15E+08 5,57E-01 6,30E+07 1,02E+08 6,18E-01 1,04E+07 1,65E+07 6,30E-01 H1299 9,11E+07 1,40E+09 6,51E-02 1,03E+00 1,48E-01 7,40E-03 7,87E+08 9,84E+08 8,00E-01 4,80E+08 7,90E+08 6,08E-01 4,68E+08 3,39E+08 1,38E+00 4,52E+08 3,56E+08 1,27E+00 5,67E+08 3,27E+08 1,73E+00 3,31E+07 3,45E+06 9,59E+00 DMS 6,14E+09 7,89E+08 7,78E+00 2,77E+00 3,96E-01 1,28E-02 3,56E+09 9,61E+08 3,70E+00 6,78E+09 1,74E+09 3,90E+00 1,51E+09 5,45E+08 2,77E+00 1,52E+09 6,88E+08 2,21E+00 1,34E+09 6,15E+08 2,18E+00 5,36E+07 3,54E+08 1,51E-01 H460 3,37E+04 2,29E+00 1,15E+00 1,02E+05 7,49E+04 7,99E+04 2,20E+04 3,63E+00 5,22E+07 5,50E+07 9,49E-01 A549 3,50E+09 1,68E+09 2,08E+00 1,48E+00 2,46E-01 1,65E-03 2,72E+09 1,63E+09 1,67E+00 6,93E+08 1,41E+09 4,91E-01 8,71E+08 5,57E+08 1,56E+00 7,82E+08 5,61E+08 1,39E+00 3,80E+07 5,63E+07 6,75E-01 39

45 Τα αποτελέσματα της απόλυτης κανονικοποίησης του λόγου των mrna SURV/ABL για τις κυτταρικές σειρές μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (ΝSLC) απεικονίζονται σε ιστόγραμμα. Εικόνα 30: Iστόγραμμα της διάμεσης τιμής (Μean value) του λόγου των mrna SURV/ABL μεταγράφων για τις κυτταρικές σειρές ΝSLC τιμές, = η απόκλιση +/- από την πραγματική τιμή = στατιστικά σημαντικές Τα αποτελέσματα της απόλυτης κανονικοποίησης του λόγου των mrna SURV/ABL για τις κυτταρικές σειρές μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SLC) απεικονίζονται σε ιστόγραμμα. Εικόνα 31: Iστόγραμμα της διάμεσης τιμής (Μean value) του λόγου των mrna SURV/ABL μεταγράφων για τις κυτταρικές σειρές SLC. = η απόκλιση +/- από την πραγματική τιμή = στατιστικά σημαντικές τιμές, 40

46 Σύμφωνα με το παραπάνο ιστογράμμα της εικόνας 30, στα αποτελέσματα του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC ή ΝSLC), η κυτταρική σειρά Η460, που αντιστοιχεί σε μεγαλοκυτταρικό καρκίνωμα-πλευρική συλλογή, εμφανίζει μεγαλύτερη έκφραση του γονιδίου της σαρβαβίνης σε σχέση με τις υπόλοιπες υπόλοιπες κυτταρικές σειρές, την Α549 που αντιστοιχεί σε αδενοκαρκίνωμα επιθηλιακό, την Η1299 που αντιστοιχεί σε αδενοκαρκίνωμα λεμφαδένα και αισθητά μεγαλύτερη σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα πνεύμονα, τους ινοβλάστες της ΜRC5 κυτταρικής σειράς. Παρατηρούμε φθίνουσα σειρά έκφρασης του γονιδίου της σαρβαβίνης στις κυτταρικές σειρές του ΝSCLC (Η460>Α549>Η1299). Βιβλιογραφικά αναμένεται ότι η έκφραση του γονιδίου της σαρβαβίνης είναι ελάχιστη στα φυσιολογικά κύτταρα πνεύμονα (14), καθώς η έκφραση της σαρβαβίνης εμφανίζεται υπεραυξημένη μόνο σε καρκινικά (13,14), ή πολλαπλασιαζόμενα και εμβρυικά κύτταρα (9). Δεδομένου ότι η έκφραση του γονιδίου της σαρβαβίνης σε καρκινικά κύτταρα αποτελεί δυσμενή προγνωστικό παράγοντα για την εξέλιξη της νόσου (10) και την υποτροπή της (23) και συνεπάγεται επιθετικό καρκινικό φαίνοτυπο (9,24), αντίσταση στη χημειοθεραπεία (26,27) και μειωμένη επιβίωση των ασθενών (25,26), μπορούμε να συμπεράνουμε τη σοβαρότητα του κάθε τύπου καρκινώματος ανάλογα με τα επίπεδα έκφρασης. Συνεπώς αν κρίνουμε από την ποσότητα της σαρβαβίνης, το μεγαλοκυτταρικό καρκίνωμα (Η460) εμφανίζει τη μεγαλύτερη σοβαρότητα ης νόσου και ακολουθούν το επιθηλιακό αδενοκαρκίνωμα (Α549) και το αδενοκαρκίνωμα λεμφαδένα (Η1299). Τα βιβλιογραφικά δεδομένα ενδεικτικά της σοβαρότητας των παραπάνω μορφών καρκίνου του πνεύμονα, πράγματι συνηγορούν στο ότι το μεγαλοκυτταρικό καρκίνωμα δίνει πιο γρήγορα μεταστάσεις, ενώ τα αδενοκαρκινώματα προχωρούν πιο αργά (120,121). Σύμφωνα με το ιστόγραμμα της εικόνας 31 όπου παραθέτονται τα αποτελέσματα του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SCLC ή SLC) η κυτταρική σειρά DMS από προσκολλημένα κύτταρα καλλιέργειας, εμφανίζει μεγαλύτερη έκφραση σαρβαβίνης από την Η69 (DMS>H69) από αιωρούμενα κύτταρα καλλιέργειας, ενώ η DMS εμφανίζει μεγαλύτερη έκφραση και από τις αντίστοιχες σειρές ΝSCLC και φυσικά αρκετά πιο αυξημένη σε σχέση με τους ινοβλάστες. Υπάρχουν λίγα βιβλιογραφικά δεδομένα που να υποστηρίζουν την κακή πρόγνωση του SCLC, σύμφωνα με τα επίπεδα έκφρασης της σαρβαβίνης (32,34). Όμως ο μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα εμφανίζεται πιο επιθετικός και μεγαλύτερης νοσηρότητας (120,121) από τον μη μικροκυτταρικό και ίσως αποτελεί μια ακόμα ένδειξη που ίσως 41

47 δικαιολογεί την μεγαλύτερη έκφραση της σαρβαβίνης στον SCLC σε σχέση με τον ΝSCLC (123,124). Τέλος υπάρχουν βιβλιογραφικά δεδομένα όπου η έκφραση της σαρβαβίνης σε ανάλογες καρκινικές σειρές πνεύμονα με αυτές που χρησιμοποιήσαμε στην παρούσα μελέτη, εμφανίζει παρόμοια διακύμανση (υψηλότερη-χαμηλότερη έκφραση), επιβεβαιώνοντας τις συγκριτικές μετρήσεις μας μεταξύ των δειγμάτων μας, ως προς τα επίπεδά της (125). 2.4 Hλεκτροφόρηση προϊόντων PCR H ηλεκτροφόρηση επιβεβαιώνει την ειδικότητα της αντίδρασης σύμφωνα με την φωτογραφία που πήραμε, η οποία αποτυπώνει τις διάφορες κυτταρικές σειρές (Εικόνα 32).Όσο πιο καθαρό είναι το προϊόν από προσμίξεις τόσο πιο ευδιάκριτη η μπάντα και τόσο πιο έντονη, όσο μεγαλύτερη παραγωγή προϊόντος έχουμε Εικόνα 32. Προϊόντα PCR:Σειρά 1 = K , 2 = Κ , 3 = αρνητικός μάρτυρας 4-11: αντιστοιχεί στο μετάγραφο του γονιδίου ABL μήκους 185bp,12-17 : προϊόν PCR που αντιστοιχεί στο μετάγραφο του γονιδίου SURVIVIN μήκους 338bp.12=DMS, 13=H460, 14=A549, 15=H1299, 16=H69, 17= MRC5, 19: Μάρτυρας 100bp (Molecular weight marker) 42