ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΝΗΕ 1 ΚΑΙ ΟΙ ΑΘΗΡΟΓΟΝΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΑΝΤΙΣΤΑΣΗ ΣΤΗΝ ΙΝΣΟΥΛΙΝΗ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ Β ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΜΑΡΙΑ ΡΑΠΤΟΠΟΥΛΟΥ ΓΙΓΗ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΝΗΕ 1 ΚΑΙ ΟΙ ΑΘΗΡΟΓΟΝΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΜΟΝΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΑΝΤΙΣΤΑΣΗ ΣΤΗΝ ΙΝΣΟΥΛΙΝΗ ΜΑΡΙΑΣ Β. ΣΑΡΗΓΙΑΝΝΗ ΙΑΤΡΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

2

3 ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Κωνσταντίνος Παλέτας, Αναπληρωτής Καθηγητής ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κωνσταντίνος Παλέτας, Αναπληρωτής Καθηγητής Χρύσανθος Ζαμπούλης, Καθηγητής Γεώργιος Κολιάκος, Αναπληρωτής Καθηγητής ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κωνσταντίνος Παλέτας, Αν. Καθηγητής, Επιβλέπων Χρύσανθος Ζαμπούλης, Καθηγητής Γεώργιος Κολιάκος, Αν. Καθηγητής Ραπτοπούλου Γιγή Μαρία, Καθηγήτρια Μαγούλα Παπαδοπούλου Ιφιγένεια, Καθηγήτρια Τσάπας Αποστόλος, Επ. Καθηγητής Καλογιάννη Μάρθα, Καθηγήτρια Τμ. Βιολογίας «Ή ἔγκρισης τῆς Διδακτορικῆς Διατριβῆς ύπό τῆς Ίατρικῆς Σχολῆς του Άριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δέν ύποδηλοῖ άποδοχήν τῶν γνωμῶν τοῦ συγγραφέως». (Νόμος 5343/32, ἄρθρ καί ν. 1268/82, ἄρθρ. 50 8)

4

5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΣΧΟΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ

6 Το έργο συγχρηματοδοτήθηκε 75% της Δημόσιας Δαπάνης από την Ευρωπαϊκή Ενωση Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο 25% της Δημόσιας Δαπάνης από το Ελληνικό Δημόσιο Υπουργείο Ανάπτυξης Γενική Γραμματεία Ερευνας και Τεχνολογίας και από τον Ιδιωτικό Τομέα στο πλαίσιο του Μέτρου 8.3 του Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα Γ Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης.

7 Στους γονείς μου στο σύζυγο μου

8

9 Πρόλογος ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H + 1 (ΝΗΕ1) είναι μία ευρέως διαδεδομένη πρωτεΐνη, υπεύθυνη για τη ρύθμιση του ενδοκυτταρικού ph και του κυτταρικού όγκου. Είναι γνωστό όμως ότι συμμετέχει και σε πλήθος άλλων κυτταρικών λειτουργιών όπως η προσκόλληση, η μετανάστευση, η ανάπτυξη και η διαφοροποίηση του κυττάρου. Οι λειτουργίες αυτές διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο κατά τη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης. Παρόλα αυτά, ο ρόλος της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + 1 στη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης δεν είναι πλήρως διευκρινισμένος. Η αθηροσκλήρωση αποτελεί την κυριότερη αιτία καρδιαγγειακών νοσημάτων, οι οποίες βρίσκονται στη δεύτερη θέση, από άποψη συχνότητας, στις αιτίες θανάτου στη χώρα μας. Η αθηρωμάτωση είναι μία διαδικασία που ξεκινά από την πρώιμη παιδική ηλικία και εξελίσσεται διαρκώς. Αποτελεί μία πολύπλοκη διαδικασία που ξεκινά με τη δυσλειτουργία του ενδοθηλίου, εδραιώνεται με τη μετανάστευση των μονοκυττάρων, το σχηματισμό των αφρωδών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων υπενδοθηλιακά και καταλήγει στο σχηματισμό και τη ρήξη της πλάκας με αποτέλεσμα την απόφραξη των αρτηριών. Η διαδικασία αυτή της αθηροσκλήρωσης είναι κοινή σε όλους τους ανθρώπους, όταν όμως συνυπάρχουν παράγοντες κινδύνου όπως η αντίσταση στην ινσουλίνη, ο σακχαρώδης διαβήτης, η παχυσαρκία, η αρτηριακή υπέρταση, η αθηρογόνος δυσλιπιδαιμία, το κάπνισμα, η γενετική προδιάθεση και το άρρεν φύλο τότε η όλη διαδικασία επιταχύνεται. Πιστεύεται ότι η επιτάχυνση της διαδικασίας από την αντίσταση στην ινσουλίνη μπορεί να οφείλεται είτε στην απευθείας δράση των αυξημένων συγκεντρώσεων της γλυκόζης, της ινσουλίνης και των ελευθέρων ριζών είτε στις διαταραχές των λιποκυτταροκινών. Είναι γνωστό ότι στην αντίσταση στην ινσουλίνη παρατηρείται δυσλειτουργία του ενδοθηλίου, προαγωγή του πολλαπλασιασμού των λείων μυϊκών κυττάρων στο αγγειακό τοίχωμα και σχηματισμός αθηρωματικής πλάκας που είναι επιρρεπής στη ρήξη. Δεν είναι όμως ξεκάθαρο εάν τα μονοκύτταρα στην αντίσταση στην ινσουλίνη παρουσιάζουν διαφορετική λειτουργία από ότι σε φυσιολογικές συνθήκες και αν αυτή προάγει τη διαδικασία της αθηρωμάτωσης. ix

10 Πρόλογος Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής μελετήθηκε εάν η δραστηριότητα του ΝΗΕ1 και οι λειτουργίες των μονοκυττάρων που σχετίζονται με την αθηρωμάτωση διαφέρουν ποιοτικά ή ποσοτικά, αφ εαυτού ή μετά την επίδραση ορμονών σε μονοκύτταρα που προέρχονται από ασθενείς με αντίσταση στην ινσουλίνη, σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς μάρτυρες. Επιπλέον, διερευνήθηκε ο ρόλος του ΝΗΕ1 στις λειτουργίες των μονοκυττάρων που σχετίζονται με την αθηρωμάτωση, δηλαδή της προσκόλλησής τους, της μετανάστευσής τους, της έκφρασης των επιφανειακών εκκαθαριστών υποδοχέων CD36 και τέλος της φαγοκυττάρωσης των οξειδωμένων LDL χοληστερολών. Δευτερεύοντες στόχο,ι ήταν η μελέτη των σηματοδοτικών μορίων που εμπλέκονται σε όλες αυτές τις διαδικασίες, καθώς και ο ρόλος των πυρηνικών υποδοχέων PPARγ. Τέλος, μελετήθηκαν οι μηχανισμοί μέσω των οποίων η αντίσταση στην ινσουλίνη και η παχυσαρκία είναι δυνατό να προάγουν τη διαδικασία της αθηρωμάτωσης, όπως είναι το οξειδωτικό στρες ή οι λιποκυτταροκίνες. Το κλινικό τμήμα της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε στη Β Παθολογική Κλινική του Ιπποκράτειου Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης και θα ήθελα να ευχαριστήσω τη Διευθύντρια Καθηγήτρια κ. Μ. Ραπτοπούλου Γιγή για τη θερμή φιλοξενία της. Το πειραματικό τμήμα εκπονήθηκε στο εργαστήριο Βιολογικής Χημείας της Ιατρικής Σχολής και θα ήθελα να ευχαριστήσω τη Διευθύντρια Καθηγήτρια κ. Ν. Βαβάτση Χρηστάκη για τη φιλοξενία της. Θεωρώντας μεγάλη μου τιμή την ανάθεση εκπόνησης αυτής της διδακτορικής διατριβής θα ήθελα να πω ένα μεγάλο ευχαριστώ στον επιβλέποντα Αν. Καθηγητή Παθολογίας κ. Κωνσταντίνο Παλέτα που με στήριξε, με συμβούλευσε και με καθοδήγησε τα τρία αυτά χρόνια. Τον ευχαριστώ για την απεριόριστη εμπιστοσύνη που μου έδειξε και το συνεχές του ενδιαφέρον. Τον ευχαριστώ για το χρόνο που αφιέρωσε για την επιτυχή ολοκλήρωση και την αρτιότερη εμφάνιση της παρούσας διατριβής, για τις συμβουλές του και τις ευκαιρίες που δημιούργησε ώστε να γίνω καλύτερη ως επιστήμονας και άνθρωπος. Τον Καθηγητή Παθολογίας κ. Χρύσανθο Ζαμπούλη ευχαριστώ για τη συμβολή του στη παρούσα διατριβή. Τον ευχαριστώ επίσης, για το χρόνο που αφιέρωσε για τη μελέτη και διόρθωση της παρούσας διατριβής. x

11 Πρόλογος Ευχαριστώ επίσης, θερμά τον Αναπληρωτή Καθηγητή Βιοχημείας της Ιατρικής Σχολής κ. Γεώργιο Κολιάκο για την ευκαιρία που μου έδωσε να δουλέψω πέντε χρόνια μαζί του σε ένα άρτια οργανωμένο εργαστήριο, παρέχοντάς μου όλα τα απαραίτητα εφόδια προκειμένου να πραγματοποιήσω την έρευνά μου. Τον ευχαριστώ για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε από την πρώτη στιγμή της γνωριμίας μας και μου έδωσε την ευκαιρία να εργαστώ σε ένα φιλικό περιβάλλον που συνέβαλε στην υλοποίηση της παρούσας διατριβής. Το πάθος του για την έρευνα και ο ανυποχώρητος ζήλος του με ενέπνευσαν και με έκαναν να αγαπήσω ακόμα περισσότερο την έρευνα. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την Καθηγήτρια του Τομέα Ζωολογίας κ. Μάρθα Καλογιάννη Δημητριάδη για την ανεκτίμητη προσφορά της και το συνεχές της ενδιαφέρον καθ όλη τη διάρκεια της παρούσας εργασίας. Την ευχαριστώ για τις παρατηρήσεις της και την αμέριστη υποστήριξή της κατά την πραγματοποίηση του πειραματικού σκέλους της μελέτης. Ένα θερμό ευχαριστώ στον Επίκουρο Καθηγητή Παθολογίας κ. Απόστολο Τσάπα για την αμέριστη υποστήριξή του και την πολύτιμη βοήθειά του οποτεδήποτε τη ζήτησα. Τον ευχαριστώ για τις πρακτικές και θεωρητικές γνώσεις που μου μετέδωσε για τη μέθοδο του ευγλυκαιμικού υπερινσουλιναιμικού αποκλεισμού και τη βοήθεια που μου προσέφερε ώστε να κατανοήσω την παθολογική κατάσταση της αντίστασης στην ινσουλίνη και το σακχαρώδη διαβήτη. Επιπλέον, τον ευχαριστώ για τα εφόδια που μου προσέφερε ώστε να πραγματοποιηθεί ευκολότερα η παρούσα διατριβή και τους νέους ορίζοντες που μου άνοιξε ώστε να αντιληφθώ μία διαφορετική πλευρά της ιατρικής και της έρευνας. Στο ερευνητικό δίκτυο Κ.Α.Μ.Ε. (Εντοπισμός Μοριακών Στόχων στην Κατανόηση και Αντιμετώπιση Μεταβολικών και Εκφυλιστικών Παθήσεων, MoltaMed) που απαρτίζεται από τον κ. Παλέτα, τον κ. Κολιάκο, την κ. Καλογιάννη και τον κ. Τσάπα εντάχθηκα και εγώ πριν από τρία χρόνια. Η παρούσα διατριβή υποβλήθηκε για χρηματοδότηση από το ερευνητικό δίκτυο Κ.Α.Μ.Ε. και χρηματοδοτήθηκε από το Πρόγραμμα Ενίσχυσης Νέου Επιστημονικού Δυναμικού (Π.Ε.Ν.Ε.Δ. 2003). Ο κ. Παλέτας, ο κ. Κολιάκος, η κ. Καλογιάννη και ο κ. Τσάπας υπήρξαν για μένα πολύτιμοι δάσκαλοι και καθοδηγητές, αλλά πάνω από όλα υπέροχοι άνθρωποι, πρόθυμοι να με διδάξουν, να με συμβουλέψουν και να με εμψυχώσουν. Έμαθα μαζί τους να xi

12 Πρόλογος ψάχνω σε βάθος, να θέτω ερευνητικά ερωτήματα και να μη μένω στην επιφάνεια των προς μελέτη φαινόμενων. Τα εφόδια που πήρα είναι ανεκτίμητα και θα με συντροφεύουν μια ζωή στη μετέπειτα ερευνητική μου πορεία. Τους ευχαριστώ θερμά Θα ήθελα να ευχαριστήσω και τα υπόλοιπα μέλη της ερευνητικής μας ομάδας για την πολύτιμη και καθοριστική τους βοήθεια. Ένα ιδιαίτερο ευχαριστώ στη φίλη μου Διδάκτορα Βιοχημικό κ. Έλενα Κωστίδου που με βοήθησε να κατανοήσω τους πολύπλοκους βιολογικούς μηχανισμούς, με συμβούλευε σε κάθε στάδιο των πειραμάτων μου αλλά κυρίως θέλω να την ευχαριστήσω που ήταν δίπλα μου σε κάθε δύσκολη στιγμή. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τη μεταπτυχιακή φοιτήτρια Βιολογίας κ. Χριστίνα Μπεφάνη, την υποψήφια Διδάκτορα Βιολόγο κ. Κωνσταντίνα Τοπουρίδου και τον υποψήφιο διδάκτορα Βιολογίας κ. Διαμαντή Κωνσταντινίδη για την καθοριστική τους βοήθεια και τις συμβουλές τους κατά τη διάρκεια του πειραματικού σκέλους. Τους ευχαριστώ για την ανιδιοτελή τους βοήθεια οποιαδήποτε στιγμή τη χρειάστηκα. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την Ιατρό κ. Τσιόκα Αγορίτσα, την Ιατρό κ. Μπέλου Αριστέα και το νοσηλευτικό προσωπικό της κλινικής για τη βοήθεια τους σε ορισμένες από τις δοκιμασίες του ευγλυκαιμικού υπερινσουλιναιμικού αποκλεισμού. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στους γονείς μου που με την αμέριστη συμπαράστασή τους, την αγάπη τους και τη βοήθειά τους συνέβαλαν καθοριστικά τόσο στην έναρξη όσο και στην υλοποίηση της παρούσας εργασίας. Τους ευχαριστώ που πίστεψαν σε μένα και για όλα τα απαραίτητα εφόδια που μου παρείχαν ώστε να φθάσω στην ολοκλήρωση της διατριβής. Ένα ιδιαίτερο ευχαριστώ στο σύζυγό μου κ. Στάθη Παπαδάκη που με στήριξε σε όλη τη διαδικασία και μία συγνώμη για τις ώρες που στέρησα από την οικογένειά μας. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους ασθενείς που δέχθηκαν πρόθυμα να συμμετέχουν στη μελέτη. xii

13 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Συντμήσεις... 5 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Αθηροσκλήρωση... 9 Ορισμός... 9 Επιδημιολογία... 9 Παθολογική φυσιολογία και παθογένεια... 9 Παράγοντες κινδύνου Αντίσταση στην Ινσουλίνη Παχυσαρκία Αρτηριακή Υπέρταση Δυσλιπιδαιμίες Κάπνισμα Απουσία φυσικής άσκησης Οικογενειακό ιστορικό στεφανιαίας νόσου Ηλικία Φύλο Κλινικές εκδηλώσεις Διάγνωση Πρόληψη και θεραπεία Η παθογένεια της αθηροσκλήρωσης σε μοριακό επίπεδο Εξωκυττάρια ουσία Βασική μεμβράνη Σηματοδοτικά μόρια και σηματοδότηση Ανταλλάκτης νατρίου/ υδρογόνου Κυτταροσκελετός Πρωτεϊνική κινάση C (Protein kinase C, PKC) Κινάσες του 3 φωσφοϊνοσιτιδίου (Phosphoinositide 3 kinases, PI3K) Υποδοχείς γ ενεργοποιημένοι από πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωμάτων (peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ) Οξειδωμένη LDL χοληστερόλη Οξειδωτικό στρες ως πιθανός σύνδεσμος μεταξύ της παχυσαρκίας, του σακχαρώδη διαβήτη, της αντίστασης στην ινσουλίνη και της αθηροσκλήρωσης Δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS) Οι κυριότερες μορφές ελεύθερων ριζών

14 Πηγές παραγωγής δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) Ο ρόλος του οξειδωτικού στρες στην αθηροσκλήρωση Μέθοδοι υπολογισμού του οξειδωτικού στρες Μέθοδοι υπολογισμού της αντίστασης στην ινσουλίνη Έμμεσες μέθοδοι Ινσουλίνη νηστείας Ομοιοστατικό μοντέλο (homeostatic model assessment of insulin resistance, HOMA) Per os και IV δοκιμασία ανοχής γλυκόζης Minimal Model IVGTT με πολλαπλές αιμοληψίες (FSIVGTT) Άμεσες μέθοδοι Δοκιμασία ανοχής ινσουλίνης Δοκιμασία καταστολής ινσουλίνης Δοκιμασία καταστολής ινσουλίνης με σωματοστατίνη Τεχνική διάχυσης αντιβραχίου Δοκιμασία ινσουλινικού αποκλεισμού (clamp) ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΜΕΛΕΤΗΣ Σχεδιασμός της μελέτης Άτομα που μελετήθηκαν Υλικά Μέθοδοι Μέτρηση της ισορροπίας οξειδωτικών αντιοξειδωτικών Μέτρηση των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών Προσδιορισμός της συγκέντρωσης της αδιπονεκτίνης στον ορό Ευγλυκαιμικός υπερινσουλιναιμικός αποκλεισμός Απομόνωση μονοκυττάρων από ολικό αίμα Κατάψυξη κυττάρων και φύλαξή τους στο υγρό άζωτο Απόψυξη κυττάρων που είχαν φυλαχτεί στο υγρό άζωτο Προσδιορισμός της δραστηριότητας του ΝΗΕ Απομόνωση λαμινίνης 1 από σάρκωμα Engelbreth Holm Swarm (EHS) Μέτρηση της συνολικής ποσότητας της πρωτεΐνης με τη χρήση Coomasie Plus 200 (Bradford method) Προσδιορισμός της καθαρότητας της λαμινίνης με ηλεκτροφόρηση Εμφάνιση film με τη χρήση της χρώσης Silver (Silver Staining)

15 8. Προσκόλληση μονοκυττάρων σε υπόστρωμα λαμινινης Μετανάστευση μονοκυττάρων διαμέσου υποστρώματος λαμινινης Εκτίμηση της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων Φαγοκυττάρωση των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από τα μονοκύτταρα Στατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ανθρωπομετρικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά του συνολικού δείγματος Ισορροπία οξειδωτικών αντιοξειδωτικών (Prooxidant antioxidant balance) Μέτρηση καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών Προσδιορισμός της συγκέντρωσης της αδιπονεκτίνης στον ορό Ανθρωπομετρικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των ατόμων που συμμετείχαν στο δεύτερο σκέλος της μελέτης Εκτίμηση της δραστικότητας του ΝΗΕ Προσκόλληση μονοκυττάρων σε υπόστρωμα λαμινίνης Μετανάστευση μονοκυττάρων διαμέσου υποστρώματος λαμινίνης Προσδιορισμός της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων Φαγοκυττάρωση των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από τα μονοκύτταρα ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

16 4

17 Συντμήσεις Συντμήσεις AGEs BCECF/AM BSA τελικά προϊόντα γλυκοζυλίωσης (advanced glycation end products) 2,7 bis(carboxylethyl) 5(6) carboxyfluorescein tetraacetoxymethylester λευκωματίνη ορού βοδιού (bovine serum albumin) CD36 cluster differentiation 36 DAG DIDS DMSO DNPH DPI EDTA EHS σάρκωμα ELISA ERK FCS FITC HEPES HRP LDL MAPK MCP 1 NADPH οξειδάση NFκΒ διακυλογλυκερόλη 4.4 diisothiocyanatostilbene 2.2 disulfonic acid διμεθυλοσουλφοξείδιο (dimethylsulfoxide) 2, 4 δινιτροφαινυλ υδραζίνη diphenyleneidonium αιθυλενο διαμινο τετραοξικό οξύ (ethylenediaminetetracetic acid) Engelbreth Holm Swarm σάρκωμα enzyme linked immunosorbent assay extracellular signal regulated kinase ορός εμβρύου μόσχου (fetal calf serum) fluorescein isothiocyanate Ν 2 υδροξυ αιθυλ πιπεραζινο Ν 2 αιθανοσουλφονικό οξύ (N 2 hidroxy ethyl piperazine Ν 2 ethanesulfonic acid) υπεροξειδάση από ραπανάκι (horseradish peroxidase) χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (low density lipoprotein) mitogen activated protein kinase NHE1 ανταλλάκτης Na + /H + 1 ΝΟ ox LDL PBS ΡΙ3Κ χημειοτακτική πρωτεΐνη μονοκυττάρων 1 (monocyte chemoattractant protein 1) οξειδάση του νικοτιναμινο αδενινο φωσφοδινουκλεοτιδίου πυρηνικός παράγοντας κβ (nuclear factor κβ) μονοξείδιο του αζώτου (nitric oxide) οξειδωμένη λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας (oxidized LDLcholesterol) ουδέτερο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (phosphate buffered saline) 3 κινάση του φωσφοϊνοσιτιδίου (phosphoinositide 3 kinase) PKC πρωτεϊνική κινάση C (protein kinase C) 5

18 Συντμήσεις PLC PPARγ ROS rpm SOD TGF β TMB φωσφολιπάση C Υποδοχείς γ ενεργοποιημένοι από πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωμάτων (peroxisome proliferator activated receptor γ) δραστικές μορφές οξυγόνου (reactive oxygen species) στροφές ανά λεπτό (rounds per minute) δισμουτάση του υπεροξειδίου (superoxide dismutase) transforming growth factor β 3, 3, 5, 5 tetramethylbenzidine dihydrochloride TNFα παράγων νέκρωσης όγκου α (Tumor necrosis factor α) 6

19 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 7

20 8

21 Εισαγωγή ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Αθηροσκλήρωση Ορισμός Η αθηροσκλήρωση αποτελεί μία μορφή αρτηριοσκλήρωσης που χαρακτηρίζεται από πάχυνση του τοιχώματος μέσου έσω χιτώνα, και κυρίως του έσω χιτώνα (αθήρωμα), των αρτηριών, μέσου και μεγάλου μεγέθους που είναι δυνατό να περιορίσει ή και να εμποδίσει την ροή του αίματος. Ο όρος αρτηριοσκλήρωση χρησιμοποιείται για να περιγράψει την πάχυνση του τοιχώματος των αρτηριών και την απώλεια της ελαστικότητας του τοιχώματος. Είναι δυνατό να οφείλεται και σε άλλες αιτίες πέραν της αθηροσκλήρωσης. Επιδημιολογία Η αθηροσκλήρωση απαντάται στον άνθρωπο για περισσότερα από χρόνια, καθώς εμφανίζεται με την ίδια παθολογία ακόμη και στις Αιγυπτιακές μούμιες [1]. Σήμερα, η αθηροσκλήρωση αποτελεί την κυριότερη αιτία καρδιαγγειακών βλαβών και μία από τις κυριότερες αιτίες θανάτου παγκοσμίως, προκαλώντας 19 εκατ. θανάτους ετησίως [2]. Στην Ελλάδα τα καρδιαγγειακά επεισόδια βρίσκονται στην δεύτερη θέση από άποψη συχνότητας στις αιτίες θανάτου ( Η επίπτωση των καρδιαγγειακών επεισοδίων στον Ελληνικό πληθυσμό είναι 11% στους άντρες και 6,1% στις γυναίκες [3]. Παθολογική φυσιολογία και παθογένεια Η αθηροσκλήρωση είναι μία χρόνια, ήπια φλεγμονώδης αντίδραση του τοιχώματος των αρτηριών. Ξεκινά με την εναπόθεση λιπιδίων, την οξείδωση και τροποποίησή τους με αποτέλεσμα μια χρόνια φλεγμονή. Οι αθηρωματικές βλάβες είναι δυνατό να προκαλέσουν στένωση και περιφερική ισχαιμία ή να πυροδοτήσουν την απόφραξη κύριων αρτηριών στην καρδιά, τον εγκέφαλο, 9

22 Εισαγωγή τα κάτω άκρα και σε άλλα όργανα. Η βλάβη ξεκινά στον έσω χιτώνα του τοιχώματος των αρτηριών και σταδιακά προσβάλλει ολόκληρο το αρτηριακό τοίχωμα, δηλαδή τον μέσο και έξω χιτώνα. Πριν από είκοσι με τριάντα έτη, εθεωρείτο ότι η αθηροσκλήρωση οφείλεται αποκλειστικά στην συσσώρευση λιπιδίων στην εσωτερική επιφάνεια των αρτηριών που αυξανόταν προοδευτικά μέχρι τη στένωση ή απόφραξη του αγγείου προκαλώντας καρδιαγγειακό επεισόδιο όπως έμφραγμα του μυοκαρδίου ή εγκεφαλικό επεισόδιο. Είναι πλέον γνωστό ότι η φλεγμονή παίζει κεντρικό ρόλο στην παθογένεια της νόσου, ενώ το ενδοθήλιο των αρτηριών πλέον θεωρείται όργανο που παράγει ουσίες και αλληλεπιδρά με το περιβάλλον του. Επιπλέον, η αθηρωματική βλάβη αναπτύσσεται εντός του τοιχώματος της αρτηρίας και τα κλινικά συμπτώματα οφείλονται στην ρήξη της πλάκας και τον σχηματισμό του θρόμβου. Το πρώτο γεγονός κατά την αθηρογένεση είναι η δυσλειτουργία του ενδοθηλίου. Πολλοί παράγοντες έχουν ενοχοποιηθεί για επίδραση στο ενδοθήλιο προκαλώντας τη δυσλειτουργία του. Μεταξύ αυτών είναι η αθηρογόνος δυσλιπιδαιμία (υψηλή συγκέντρωση των λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας, LDL, η αυξημένη συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων και η μειωμένη συγκέντρωση των υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών, HDL), η αυξημένη συγκέντρωση ελεύθερων ριζών που προκαλείται από τον σακχαρώδη διαβήτη, την αρτηριακή υπέρταση και το κάπνισμα, η γενετική προδιάθεση, τα αυξημένα επίπεδα ομοκυστεϊνης, λοιμώξεις από ερπητοϊούς ή χλαμύδια και συνδυασμός όλων των παραπάνω παραγόντων [4]. Φυσιολογικά τα ενδοθηλιακά κύτταρα που βρίσκονται στον έσω χιτώνα των αρτηριών δεν επιτρέπουν την προσκόλληση των λευκοκυττάρων. Η δυσλειτουργία του ενδοθηλίου οδηγεί σε αλλαγή των φυσιολογικών ιδιοτήτων του επιτρέποντας την προσκόλληση των λευκοκυττάρων και αιμοπεταλίων και αυξάνοντας την διαπερατότητά του στην LDL χοληστερόλη. Επιπλέον, προάγεται η παραγωγή κυτταροκινών, αυξητικών παραγόντων και δραστικών μορίων προσκόλλησης από το ενδοθήλιο. Εάν η φλεγμονώδης απάντηση δεν εξουδετερωθεί αποτελεσματικά ή δεν απομακρυνθεί ο αιτιολογικός παράγοντας, η φλεγμονώδης αυτή διαδικασία θα συνεχίσει επ αόριστον. Στην περίπτωση αυτή, η LDL χοληστερόλη που μεταφέρθηκε υπενδοθηλιακά τροποποιούνται προς την οξειδωμένη LDL (ox LDL). 10

23 Εισαγωγή Εικόνα 1. Φυσική εξέλιξη της αθηροσκλήρωσης. Το πρώτο στάδιο είναι η δυσλειτουργία του ενδοθηλίου και η οξείδωση της LDL που βρίσκεται υπενδοθηλιακά, χωρίς να είναι ξεκάθαρο ποιο είναι το γεγονός που προηγείται. Το ενδοθήλιο εκφράζει μόρια προσκόλλησης και τα μονοκύτταρα προσκολλώνται σε αυτό. Στη συνέχεια, τα μονοκύτταρα μεταναστεύουν υπενδοθηλιακά όπου μετατρέπονται σε μακροφάγα. Τα μακροφάγα φαγοκυτταρώνουν τις ox LDL και παράγουν κυτταροκίνες οι οποίες ενεργοποιούν τη μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων από τον μέσο χιτώνα. Τα λεία μυϊκά κύτταρα που βρίσκονται πια στον έσω χιτώνα, πολλαπλασιάζονται και παράγουν κυτταροκίνες και εξωκυττάρια ουσία αυξάνοντας τον όγκο της πλάκας. Η αυξημένη πίεση που ασκείται στην πλάκα οδηγεί στην ρήξη της ινώδους κάψας στα ευένδοτα σημεία και τον επακόλουθο σχηματισμό του θρόμβου. Επιπλέον, η φλεγμονώδης απάντηση προσελκύει μονοκύτταρα από το περιφερικό αίμα που προσκολλώνται στο ενδοθήλιο. Στη συνέχεια τα μονοκύτταρα μεταναστεύουν υπενδοθηλιακά όπου και διαφοροποιούνται σε μακροφάγα παράγοντας υδρολυτικά ένζυμα, κυτταροκίνες και αυξητικούς παράγοντες [5]. Τα μακροφάγα φαγοκυτταρώνουν τις οξειδωμένες LDL (ox LDL) και μετατρέπονται σε αφρώδη κύτταρα [6]. Παράλληλα, η φλεγμονώδης αντίδραση ενεργοποιεί την μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων από τον μέσο χιτώνα στην περιοχή της βλάβης και τον πολλαπλασιασμό τους. Τα λεία μυϊκά κύτταρα με την σειρά τους φαγοκυτταρώνουν τις ox LDL και μετατρέπονται, επίσης, σε αφρώδη κύτταρα. Τα λεία μυϊκά κύτταρα παράγουν εξωκυττάρια ουσία. Το σύνολο των κυττάρων και η παραγόμενη εξωκυττάρια ουσία υπεγείρει την ενδοθηλιακή στιβάδα προς το σημείο ευενδοτότητας, τον αυλό. Η πάχυνση του τοιχώματος αντισταθμίζεται μέχρις ενός σημείου από διάταση του τοιχώματος [7]. Η διαρκής μετανάστευση των μονοκυττάρων, των λείων μυϊκών κυττάρων, ο πολλαπλασιασμός των λείων μυϊκών κυττάρων και η παραγωγή 11

24 Εισαγωγή του ινώδους ιστού οδηγεί στο σχηματισμό της αθηρωματικής πλάκας. Η συνέχιση της βλάβης οδηγεί στην αναδιαμόρφωση της πλάκας και την παραγωγή μιας ινώδους κάψας. Η βλάβη στη φάση αυτή ονομάζεται επιπεπλεγμένη. Η αρτηρία δεν είναι πλέον δυνατό να αντισταθμίζει την βλάβη με διάταση με αποτέλεσμα την προβολή της εντός του αυλού προκαλώντας στένωση του αγγείου και μειωμένη αιματική ροή. Ιστολογικά, η αθηρωματική βλάβη ταξινομείται σε οκτώ τύπους [8 10]: I. Αποτελεί την πρώιμη βλάβη που γίνεται αντιληπτή μόνο με το μικροσκόπιο. Απαντάται σε βρέφη και παιδιά. Οι ιστολογικές αλλαγές του έσω χιτώνα είναι ελάχιστες και συνίστανται σε μεμονωμένες ομάδες μακροφάγων φορτωμένων με λίπος (lipid laden). II. Λιπώδεις ραβδώσεις που είναι ορατές με γυμνό μάτι ως κιτρινωπές ραβδώσεις ή κηλίδες στον έσω χιτώνα των αρτηριών. Απαντάται συνήθως σε παιδιά. Αποτελούνται από μακροφάγα αφρώδη κύτταρα τοποθετημένα σε παρακείμενες στιβάδες. Επιπλέον, τα λεία μυϊκά κύτταρα είναι φορτωμένα με λίπος, ενώ στην βλάβη βρίσκεται μικρός αριθμός Τ λεμφοκυττάρων και ιστιοκυττάρων. Τα λιπίδια της βλάβης βρίσκονται ενδοκυττάρια. III. Ενδιάμεση βλάβη ή προ αθήρωμα. Στο μικροσκόπιο διακρίνονται εξωκυττάρια σταγονίδια λίπους μεταξύ των λείων μυϊκών κυττάρων στα σημεία της πάχυνσης του τοιχώματος. Τα σταγονίδια λίπους βρίσκονται κάτω από την στιβάδα των μακροφάγων διαχωρίζοντας τα λεία μυϊκά κύτταρα μεταξύ τους. Αρκετά λεία μυϊκά κύτταρα εμφανίζουν συσσώρευση λιπιδίων στο κυτταρόπλασμά τους. IV. Αθήρωμα. Τα σταγονίδια λίπους καταλαμβάνουν μεγάλο τμήμα της βλάβης, ανευρίσκονται σε μια περιορισμένη περιοχή, και προκαλούν πάχυνση του τοιχώματος της αρτηρίας ορατής με γυμνό μάτι. Τα λεία μυϊκά κύτταρα είναι επιμηκυμένα, έχουν πεπαχυσμένη κυτταρική μεμβράνη και τα οργανίλια ορισμένων εξ αυτών εμφανίζουν επασβέστωση. Η βλάβη αυτή δεν προκαλεί ακόμη σημαντική στένωση του αρτηριακού αυλού. V. Χαρακτηρίζεται κυρίως από ινώδη συνδετικό ιστό ενώ τα λεία μυϊκά κύτταρα είναι πλούσια σε αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο. Μπορεί να υπάρχουν επασβεστώσεις στην πλάκα και να έχει ήδη αναπτυχθεί στένωση του αρτηριακού αυλού. 12

25 Εισαγωγή VI. Η πλάκα παρουσιάζει ρήξη στα σημεία ευενδοτότητας, δηλαδή στα τμήματα της πλάκας που εφάπτονται με φυσιολογικό ενδοθήλιο, όπου η ινώδης κάψα είναι λεπτή, προκαλώντας αιμάτωμα ή θρόμβωση και η βλάβη χαρακτηρίζεται επιπεπλεγμένη. VII. Χαρακτηρίζεται από επασβέστωση VIII. Χαρακτηρίζεται από αλλαγές του ινώδους ιστού. Η διαδικασία της αθηροσκλήρωσης και οι ιστολογικές αλλαγές είναι αρκετά πολύπλοκες και διαφέρουν μεταξύ διαφορετικών ατόμων αλλά ακόμα και στο ίδιο άτομο, την ίδια χρονική στιγμή. Στην φυσική πορεία της εξέλιξης της νόσου είναι δυνατό να παρατηρηθεί υποτροπή της αθηρωματικής βλάβης μόνο κατά το πρώιμο στάδιο των λιπωδών ραβδώσεων (τύπος Ι, ΙΙ, ΙΙΙ), ενώ τα επόμενα στάδια είναι μη αναστρέψιμα και διαρκώς επιδεινούμενα. Η πρώιμη αθηρωματική βλάβη δεν συνοδεύεται από κλινικά συμπτώματα ενώ η όψιμη βλάβη εμφανίζει κατά κανόνα χαρακτηριστικά συμπτώματα [11]. Επομένως, η αθηροσκλήρωση αποτελεί μία πολύπλοκη διαδικασία που ξεκινά, όπως προαναφέρθηκε, με την δυσλειτουργία του ενδοθηλίου, εδραιώνεται με την μετανάστευση των μονοκυττάρων, τον σχηματισμό των αφρωδών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων υπενδοθηλιακά και καταλήγει στη ρήξη της πλάκας και απόφραξη της αρτηρίας (Εικόνα 1). Δυσλειτουργία του ενδοθηλίου Το ενδοθήλιο αποτελεί τον κυριότερο διαπερατό φραγμό μεταξύ των εμμόρφων στοιχείων του αίματος και του τοιχώματος της αρτηρίας. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι διαταγμένα σε μια στιβάδα και επικάθονται σε μια βασική μεμβράνη καλύπτοντας ολόκληρο το αγγειακό σύστημα του σώματος. Η βασική μεμβράνη αποτελείται από κολλαγόνο και πρωτεογλυκάνες που συντίθενται από τα ίδια τα ενδοθηλιακά κύτταρα και χρησιμεύει αφενός για την στερέωση τους και αφετέρου για τον περιορισμό της διαπερατότητάς της. Είναι εξαιρετικά δύσκολο να προσδιορίσουμε πότε ξεκινά η δυσλειτουργία του ενδοθηλίου δεδομένου ότι η υπενδοθηλιακή μετακίνηση των λιπιδίων και η επακόλουθη μετανάστευση των μονοκυττάρων αποτελούν 13

26 Εισαγωγή τον φυσιολογικό χειρισμό των λιποπρωτεϊνών από τα ενδοθηλιακά κύτταρα [9]. Η χοληστερόλη αποτελεί βασικό συστατικό των κυτταρικών μεμβρανών και για να μεταφερθεί από το ήπαρ, όπου παράγεται, στα διάφορα όργανα ενώνεται με φωσφολιπίδια, πρωτεϊνικούς συμπαράγοντες και απολιποπρωτεΐνες σχηματίζοντας τις λιποπρωτεΐνες του ορού [12]. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε φυσιολογικές συνθήκες δεσμεύουν χοληστερόλη με ενδοκύττωση μορίων LDL χοληστερόλης μεγέθους 20 25nm μέσω πρωτεϊνικών υποδοχέων υψηλής συγγένειας που εντοπίζονται σε βοθρία της μεμβράνης τους και είναι καλυμμένα με κλαθρίνη [13]. Ο μηχανισμός αυτός είναι δυνατόν να κορεστεί καθώς η αυξημένη συγκέντρωση χοληστερόλης στο κυτταρόπλασμα οδηγεί σε κατιούσα ρύθμιση (down regulation) των LDLυποδοχέων και στην περίπτωση αυτή τα μόρια της LDL χοληστερόλης και των οξειδωμένων LDL περνούν υπενδοθηλιακά στον έσω χιτώνα. Κατά την διαδικασία αυτή είναι δυνατό τα ενδοθηλιακά κύτταρα να «τραυματιστούν» ήπια, να επιβιώσουν αλλά να αποκτήσουν διαφορετικές ιδιότητες και δράση. Δηλαδή, προσελκύουν περισσότερα μακροφάγα για να απομακρύνουν την περίσσεια των ox LDL και ενεργοποιούνται οι απαραίτητοι μηχανισμοί ώστε να περιοριστεί η βλάβη και να διατηρηθεί ακέραιο το ενδοθήλιο. Η φύση της βλάβης που προκαλεί η LDL χοληστερόλη στα ενδοθηλιακά κύτταρα δεν είναι ακριβώς γνωστή. Τα μόρια της LDL χοληστερόλης προσελκύουν μονοκύτταρα από την κυκλοφορία του αίματος με ρυθμό ανάλογο της συγκέντρωσης τους, ενώ η ox LDL προσελκύει τα μονοκύτταρα ταχύτερα. Κατά το στάδιο αυτό δεν παρατηρούνται ιστολογικές αλλοιώσεις στο ενδοθήλιο [14]. Οι LDL χοληστερόλες που έχουν μεταφερθεί στον υπενδοθηλιακό χώρο καθώς δεν μπορούν να έρθουν σε επαφή με τα αντίοξειδωτικά ένζυμα, την δισμουτάση του υπεροξειδίου, την καταλάση και την περοξειδάση της γλουταθειόνης οξειδώνονται από τις ελεύθερες ρίζες [15] προς ρίζες υπεροξειδίου. Η οξείδωση περισσότερων LDL χοληστερολών συνεχίζεται καθώς οι παραγόμενες ρίζες του υπεροξειδίου οξειδώνουν με την σειρά τους και άλλες LDL χοληστερόλες [16]. Η περίσσεια LDL χοληστερόλης εξουδετερώνεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα με τους εκκαθαριστές υποδοχείς (scavenger): cluster differentiation 36 (CD36) [17 19], lectin like oxidized LDL receptor 1 (LOX 1) [20], collectin placenta 1 (CL P1) [21]. Οι εκκαθαριστικοί (scavenger) LDL υποδοχείς των 14

27 Εισαγωγή ενδοθηλιακών κυττάρων όταν συνδεθούν με την LDL χοληστερόλη ασκούν βλαπτική δράση στα ενδοθηλιακά κύτταρα γιατί παρεμποδίζεται η κατιούσα ρύθμισή τους (down regulation) από την ενδοκυτταρική συγκέντρωση της χοληστερόλης [22]. Επιπλέον, η χοληστερόλη που απελευθερώνεται από τα λυσοσωμάτια λόγω της αποδόμησης των μορίων της LDL χοληστερόλης προκαλεί βλάβη στα ενδοθηλιακά κύτταρα μειώνοντας τις φυσιολογικές ιδιότητες της μεμβράνης. Αυτό συμβαίνει διότι η αποδόμηση των LDLχοληστερολών στα λυσοσωμάτια οδηγεί σε παραγωγή χοληστερόλης η οποία ενσωματώνεται στην πλασματική μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων. Τα μονοκύτταρα μεταναστεύουν από την κυκλοφορία του αίματος μέσω των δια κυτταρικών συνδέσμων του ενδοθηλίου υπενδοθηλιακά και επιστρέφουν στην κυκλοφορία μέσω της ίδιας οδού αφού έχουν φαγοκυτταρώσει τις LDL χοληστερόλες και έχουν μετατραπεί σε αφρώδη κύτταρα. Καθώς η βλάβη εξελίσσεται, αυξάνει τόσο ο αριθμός όσο και το μέγεθος των αφρωδών κυττάρων δυσχεραίνοντας την επαναδιέλευσή τους διαμέσου των ενδοθηλιακών κυττάρων, προκαλώντας βλάβες σε μικρές περιοχές του κυτταροπλάσματος και της κυτταρικής μεμβράνης τους [23]. Στη βλάβη είναι πιθανόν να συμβάλλει η ελαττωμένη λειτουργικότητα της κυτταρικής μεμβράνης των ενδοθηλιακών κυττάρων λόγω της αυξημένης περιεκτικότητάς της σε χοληστερόλη, όπως έχει ήδη περιγραφεί. Τα τραυματισμένα ενδοθηλιακά κύτταρα επικοινωνούν με τα υποκείμενα λεία μυϊκά κύτταρα με τρεις μηχανισμούς: τον άμεσο, τον ενδιάμεσο και τον επιβραδυσμένο. Κατά τον άμεσο μηχανισμό τα ενδοθηλιακά κύτταρα επικοινωνούν με την πρώτη σειρά των λείων μυϊκών κυττάρων μέσω κυτταροπλασματικών γεφυρών (gap junctions). Οι γέφυρες αυτές είναι εξάγωνες, αποτελούνται από πρωτεϊνικά ολιγομερή και επιτρέπουν την αμφίδρομη δίοδο ιόντων και νουκλεοτιδίων μεταξύ των κυττάρων μεταφέροντας σήματα βλάβης. Η δημιουργία και η λειτουργία των γεφυρών επιτείνονται στην αθηρωματική βλάβη λόγω αυξημένης συγκέντρωσης πρωτεογλυκανών καθώς είναι γνωστό ότι οι πρωτεογλυκάνες ευνοούν τον σχηματισμό των γεφυρών [24]. Επιπλέον, τα ενδοθηλιακά κύτταρα επικοινωνούν με τα λεία μυϊκά κύτταρα εκκρίνοντας τον αυξητικό παράγοντα του ενδοθηλίου (Endothelial Derived Growth Factor, EDGF). Ο τρόπος αυτός επικοινωνίας είναι πιο αργός από ότι η άμεση επικοινωνία μέσω των γεφυρών. Ο παράγοντας EDGF παράγεται σε χαμηλά επίπεδα από 15

28 Εισαγωγή τα φυσιολογικά ενδοθηλιακά κύτταρα ενώ τα κύτταρα που έχουν τραυματιστεί ή καταστραφεί παράγουν πολύ μεγάλες ποσότητές του [25]. Η δράση του EDGF είναι μικρής εμβέλειας γεγονός που συνάδει με την εστιακή αρχική εντόπιση της αθηροσκλήρωσης. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα, όπως προαναφέρθηκε, χρησιμοποιούν και έναν τρίτο τρόπο επικοινωνίας με τα λεία μυϊκά κύτταρα που είναι ακόμη πιο αργός από τους άλλους δύο, δηλαδή χρησιμοποιούν τα μονοκύτταρα ως μεταφορέα του χημικού σήματος με την μορφή των κυτταροκινών: IL 6, IL 1, MCP 1 (χημειοτακτική πρωτεΐνη μονοκυττάρων 1, monocyte chemoattractant protein 1), TNFα, TGF β [14, 26 32]. Όταν επιδράσουν οι βλαπτικοί παράγοντες στα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζονται από αυτά μόρια προσκόλλησης που επιτρέπουν την προσκόλληση των λευκοκυττάρων στο αρτηριακό τοίχωμα. Ένα από τα μόρια αυτά είναι το μόριο προσκόλλησης των αρτηριακών κυττάρων 1 (vascular cell adhesion molecule 1, VCAM) [33] το οποίο προσκολλάται στα μονοκύτταρα και Τ λεμφοκύτταρα, κύτταρα που απαντώνται στη πρώιμη αθηρωματική πλάκα. Πειραματόζωα με αθηρογόνο διατροφή εκφράζουν τον VCAM 1 στα ενδοθηλιακά κύτταρα σε περιοχές που είναι επιρρεπείς στην εμφάνιση αθηρωματικής πλάκας και στα ενδοθηλιακά κύτταρα των πρώιμων αθηρωματικών βλαβών [34]. Επιπλέον, η έκφραση του VCAM 1 προϋπάρχει της εμφάνισης των μονοκυττάρων στην αθηρωματική πλάκα η οποία εμφανίζεται μετά από 3 εβδομάδες [35]. Οι οξειδωμένες LDL προάγουν την έκφραση του VCAM 1 μέσω του πυρηνικού παράγοντα κβ (NF κβ) [36], της ιντερλευκίνης 1β (IL 1β) και του παράγοντα νέκρωσης όγκου α (TNFα). Η αθηρωματική πλάκα σχηματίζεται σε συγκεκριμένες αρτηρίες και σε συγκεκριμένα σημεία τους, που αποδίδεται στον τύπο της αιματικής ροής. Η γραμμική ροή του αίματος ενεργοποιεί μηχανισμούς προστατευτικούς κατά της αθηροσκλήρωσης όπως είναι η έκφραση του αντί οξειδωτικού ενζύμου δισμουτάση του σουπεροξειδίου και της συνθετάσης του μονοξειδίου του αζώτου [37]. Το μονοξείδιο του αζώτου αναστέλλει την έκφραση του VCAM 1 μέσω αναστολής του NF κβ [38]. Η αθηρωματική πλάκα εμφανίζεται στα σημεία όπου η αιματική ροή καθίσταται στροβιλώδης με αυξημένη διατμητική τάση (shear stress), γεγονός που μειώνει την δραστικότητα των προστατευτικών μηχανισμών. Σε κυτταρικές καλλιέργειες, ενδοθηλιακά 16

29 Εισαγωγή κύτταρα που εκτέθηκαν σε στροβιλώδη ροή εμφάνισαν αυξημένη έκφραση του NF κβ σε σύγκριση με τα κύτταρα που εκτέθηκαν σε γραμμική ροή [39]. Μετανάστευση μονοκυττάρων υπενδοθηλιακά και σχηματισμός αφρωδών κυττάρων Το μονοκύτταρο αποτελεί το μεγαλύτερο κύτταρο του αίματος (10 18μm) και η λειτουργία του αποσκοπεί στη φαγοκυττάρωση και ενδοκυττάρια υδρόλυση ξένων ουσιών που δημιουργούνται σε φλεγμονώδεις καταστάσεις. Όταν δημιουργούνται ιστικές φλεγμονές, ένας σημαντικός αριθμός μονοκυττάρων εξέρχεται από το αίμα προς τους ιστούς, όπου διαφοροποιείται στα μακροφάγα των ιστών. Στις περιπτώσεις που δεν υπάρχει δυσλειτουργία του ενδοθηλίου τα μονοκύτταρα προσελκύονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, μεταναστεύουν υπενδοθηλιακά και απομακρύνουν τα λιπίδια από τον έσω χιτώνα [40]. Αντίθετα, όταν υπάρχει δυσλειτουργία του ενδοθηλίου και αρχίζει η διαδικασία της αθηρωμάτωσης τα μονοκύτταρα που έχουν μεταναστεύσει υπενδοθηλιακά μεσολαβούν στην επικοινωνία των ενδοθηλιακών κυττάρων με τα λεία μυϊκά κύτταρα μέσω των κυτταροκινών IL 6, IL 1, MCP 1 (χημειοτακτική πρωτεΐνη των μονοκυττάρων 1, monocyte chemoattractant protein 1), TNFα, TGF β ([26 32]. Αρχικά, τα μονοκύτταρα προσκολλώνται χαλαρά στα ενδοθηλιακά κύτταρα μέσω των σελεκτινών. Στα μεν μονοκύτταρα η L σελεκτίνη ανευρίσκεται φυσιολογικά στην μεμβράνη τους [41], στα δε ενδοθηλιακά κύτταρα για να εκφρασθεί πρέπει να ενεργοποιηθεί από την IL 1 [42]. Η ασθενής αυτή σύνδεση μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων και των μονοκυττάρων δεν είναι ικανή να συγκρατήσει τα μονοκύτταρα προσκολλημένα στο ενδοθήλιο. Για να δημιουργηθεί μία σταθερή σύνδεση απαιτείται η έκφραση των ιντεγκρινών α m β 1 στα μονοκύτταρα και των ICAM 1 στα ενδοθηλιακά κύτταρα (Εικόνα 2). Η ιντεγκρίνη α m β 1 παράγεται στην ανενεργό μορφή της στα μονοκύτταρα, αποθηκεύεται στα κυτταροπλασματικά τους οργανίλλια [43] και μεταφέρεται στην μεμβράνη τους μετά από ενεργοποίησή της από προφλεγμονώδεις παράγοντες όπως TNFα, MCP 1 [41, 44]. 17

30 Εισαγωγή Το ICAM 1 [45] ανήκει στην οικογένεια των μορίων προσκόλλησης και για να εκφραστεί απαιτείται η ενεργοποίησή του από κυτταροκίνες όπως οι IL 1, TNFα, INF γ [42]. Ποντίκια που δεν εκφράζουν το ICAM 1 δεν εμφανίζουν αθηροσκλήρωση [46]. Παρουσία του MCP 1 τα μονοκύτταρα μεταναστεύουν ανάμεσα από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, με διαπίδυση, προς τον υπενδοθηλιακό χώρο [41, 47]. Κατά την έναρξη της διαδικασίας της μετανάστευσης, τα μονοκύτταρα πολώνονται, δηλαδή εκβάλλουν ψευδοπόδια προς την κατεύθυνση που υπάρχει μεγαλύτερη συγκέντρωση της χημειοτακτικής ουσίας, MCP 1 [48, 49]. Η MCP 1 αποτελείται από 76 αμινοξέα [50] και παράγεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα μετά από επαγωγή από τις κυτταροκίνες IL 1 και TNFα [51]. Όταν τα μονοκύτταρα μεταναστεύσουν υπενδοθηλιακά μετατρέπονται πλέον σε μακροφάγα και παράγουν MCP 1 [52] προσελκύοντας περισσότερα μονοκύτταρα στην περιοχή της βλάβης. Η έκφραση του MCP 1 είναι χαρακτηριστικό των μακροφάγων της αθηρωματικής βλάβης, δεδομένου ότι τα μακροφάγα άλλων ιστών δεν την εκφράζουν [51]. Ποντίκια επιρρεπή σε αθηροσκλήρωση, που έχουν απενεργοποιημένους τους LDL υποδοχείς και δεν εκφράζουν την MCP 1 εμφάνισαν 83% λιγότερα μακροφάγα και λιγότερη εναπόθεση λιπιδίων στα τοιχώματα της αορτής σε σύγκριση με ποντίκια που την εκφράζανε [53]. Σε παρόμοιο πείραμα, ποντίκια apoe / που δεν εκφράζουν το γονίδιο CCR2, τον υποδοχέα της MCP 1, παρουσιάζουν μικρότερη βλάβη σε σύγκριση με ποντίκια που το εκφράζουν [54]. Η ox LDL αποτελεί επίσης, χημειοτακτική ουσία για τα μακροφάγα, ενεργοποιώντας την φαγοκυττάρωσή της από αυτά [55]. Επιπλέον, τα μακροφάγα, εκφράζουν τους εκκαθαριστές υποδοχείς Α, τύπου Ι και ΙΙ (scavenger receptors A type I and type II, SRA I και ΙΙ) [56], τους CD36 (cluster differentiation 36) [57, 58], τους CD68 [59], τους τύπου λεκτίνης υποδοχείς 1 της οξειδωμένης LDL (lectin like ox LDL receptor 1) [60], τους εκκαθαριστές υποδοχείς για την φωσφατιδυλοσερίνη και τις οξειδωμένες λιποπρωτεΐνες (scavenger receptor for phosphatidylserine and oxidized lipoprotein, SR PSOX) [61] με τη βοήθεια των οποίων φαγοκυτταρώνουν τις ox LDL. Από το σύνολο των υποδοχέων που εκφράζονται στα μακροφάγα της αθηρωματικής πλάκας οι υποδοχείς CD36, SRA I και SRA II είναι οι σημαντικότεροι καθώς πειραματόζωα που δεν τους εκφράζουν εμφανίζουν επιβράδυνση στον σχηματισμό της αθηρωματικής πλάκας [62]. Οι εκκαθαριστές υποδοχείς 18

31 Εισαγωγή φαγοκυτταρώνουν τις ox LDL και τις μεταφέρουν στα λυσοσωμάτια των μακροφάγων όπου υδρολύονται σε ελεύθερη χοληστερόλη και λιπαρά οξέα. Η ελεύθερη χοληστερόλη μετατρέπεται σε χοληστερινικούς εστέρες. Οι χοληστερινικοί εστέρες συσσωρεύονται στο κυτταρόπλασμα και τα μακροφάγα μετατρέπονται σε αφρώδη κύτταρα. Ταυτόχρονα, τα μακροφάγα πολλαπλασιάζονται και απελευθερώνουν διάφορους αυξητικούς παράγοντες και κυτταροκίνες συντηρώντας με αυτό τον τρόπο την προ φλεγμονώδη κατάσταση. Σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των μακροφάγων παίζει ο διεγέρτης του σχηματισμού αποικιών των μονοκυττάρων (monocyte colony stimulating factor, Μ CSF). Ο M CSF υπερεκφράζεται στην αθηρωματική πλάκα τόσο του ανθρώπου όσο και των πειραματόζωων [63]. Ποντίκια επιρρεπή στην εμφάνιση αθηροσκλήρωσης λόγω μειωμένης έκφρασης των υποδοχέων LDL ή του γονιδίου apoe και ταυτόχρονα απουσία έκφρασης του M CSF παρουσίασαν επιβράδυνση στον σχηματισμό της αθηρωματικής πλάκας και ελαττωμένη συσσώρευση μακροφάγων σε σύγκριση με ποντίκια που εκφράζουν φυσιολογικά τον M CSF [64, 65] (Εικόνα 2). Τα Τ λεμφοκύτταρα, που είναι υπεύθυνα για την ανοσιακή απάντηση του οργανισμού, συμμετέχουν επίσης, στη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης. Τα Τ λεμφοκύτταρα προσελκύονται στο σημείο της βλάβης μέσω τριών κυτταροκινών (γ IP, MIG, I TAC) που επάγονται από την ιντερφερόνη γ (INF γ) [66]. Οι κυτταροκίνες αυτές συνδέονται με τον υποδοχέα CXR3, ο οποίος εκφράζεται στα Τ λεμφοκύτταρα της αθηρωματικής πλάκας. Τα Τ λεμφοκύτταρα παράγουν INF γ [6] η οποία είναι ικανή να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό των λείων μυϊκών κυττάρων [67], γεγονός που επιβεβαιώθηκε τόσο in vivo σε πειραματόζωα [68] όσο και in vitro σε κυτταρικές καλλιέργειες [69]. Τα ενεργοποιημένα μακροφάγα εκφράζουν ένα σύνολο από κυτταροκίνες που αποσκοπεί στην έναρξη της μετανάστευσης και στον πολλαπλασιασμό των λείων μυικών κυττάρων δηλαδή, την μετάβαση στο επόμενο στάδιο του σχηματισμού της αθηρωματικής πλάκας. Αναλυτικότερα, τα μακροφάγα παράγουν την IL 1 η οποία δρα στα λεία μυϊκά κύτταρα ενεργοποιώντας την έκφραση PDGF AA οδηγώντας στον πολλαπλασιασμό τους [70]. Η IL 1 προάγει την παραγωγή της IL 6 από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα λεία μυϊκά [71]. Η IL 6 στα λεία μυϊκά κύτταρα 19

32 Εισαγωγή ενεργοποιεί την σύνθεση του DNA ανεξάρτητα από την δράση του PDGF [72]. Επίσης, η IL 1 προάγει την μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων μέσω ενεργοποίησης τους στη σύνθεσης της κολλαγενάσης [70]. Τα μακροφάγα παράγουν IL 6 που έχει άμεση μιτογόνο δράση στα λεία μυϊκά κύτταρα [32]. Αντίθετα, η IL 6 ενεργοποιώντας την παραγωγή INF γ από τα Τ λεμφοκύτταρα, αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των λείων μυϊκών κυττάρων [27]. Ο TNFα παράγεται από τα μακροφάγα και δρα στα λεία μυϊκά κύτταρα ενεργοποιώντας την σύνθεση και απελευθέρωση της IL 1 [11]. Εικόνα 2. Σχηματισμός αφρωδών κυττάρων όπου κεντρικό ρόλο διαδραματίζουν οι οξειδωμένες LDL χοληστερόλες (ox LDL), οι δραστικές μορφές οξυγόνου και οι κυτταροκίνες. Μο, μονοκύτταρο. ROS, δραστικές μορφές οξυγόνου (reactive oxygen species). ICAM, intercellular adhesion molecule. VCAM, vascular adhesion molecule. CD, cluster differentiation. SR A1/2, scavenger receptor A1/2. Μετανάστευση και πολλαπλασιασμός των λείων μυϊκών κυττάρων Τα λεία μυϊκά κύτταρα εντοπίζονται ως επί το πλείστον στον μέσο χιτώνα των αρτηριών, ενώ στον έσω χιτώνα βρίσκεται ένας μικρός αριθμός τους. Τα 20

33 Εισαγωγή κύτταρα που βρίσκονται στον μέσο χιτώνα εκφράζουν κυρίως πρωτεΐνες που είναι υπεύθυνες για την συστολική λειτουργία του κυττάρου όπως είναι η μυοσίνη και η α ακτίνη. Ενώ τα λεία μυϊκά κύτταρα που βρίσκονται στον έσω χιτώνα έχουν κυρίως συνθετική δράση παράγοντας εξωκυττάρια θεμέλια ουσία, πρωτεάσες και κυτταροκίνες [73, 74]. Τα παραγωγικά λεία μυϊκά κύτταρα μεταναστεύουν και πολλαπλασιάζονται περισσότερο από ότι τα συστολικά λεία μυϊκά κύτταρα [73]. Το μεγαλύτερο τμήμα των λείων μυϊκών κυττάρων που βρίσκονται στον μέσο χιτώνα είναι στην G 0 φάση του κυτταρικού κύκλου, δεν απαντούν δηλαδή στα μιτογόνα ερεθίσματα [75]. Η μετάβαση των κυττάρων αυτών στη φάση G 1 εμποδίζεται από το σύμπλοκο της βασικής μεμβράνης που αποτελείται από λαμινίνη θειϊκή ηπαράνη πρωτεογλυκάνες κολλαγόνο τύπου IV [76]. Αρχικά, τα λεία μυϊκά κύτταρα διαμορφώνουν τον φαινότυπό τους, δηλαδή αρχίζουν να συνθέτουν συγκεκριμένες πρωτεΐνες [71]. Η αλλαγή αυτή συμβαίνει πρώτα στα κύτταρα που βρίσκονται κοντά στον έσω χιτώνα. Η φιμπρονεκτίνη δίνει το ερέθισμα για την φαινοτυπική αλλαγή των λείων μυϊκών κυττάρων κατά την αθηρωματική διαδικασία [77], ενώ σε φυσιολογικές συνθήκες μεταξύ της φιμπρονεκτίνης και των λείων μυϊκών κυττάρων παρεμβάλλεται η βασική μεμβράνη. Ο TGF β ενεργοποιεί την έκφραση της φιμπρονεκτίνης από τα συστολικά λεία μυϊκά κύτταρα [78]. O TGF β παράγεται κυρίως από τα μακροφάγα αλλά είναι ικανός να αυτοενεργοποιήσει την έκφραση του και στα λεία μυϊκά κύτταρα [79, 80]. Απαντάται στο φυσιολογικό αρτηριακό τοίχωμα σε πολύ μικρές ποσότητες, ενώ κατά την διαδικασία της αθηρωμάτωσης ανευρίσκεται σε πολύ μεγάλες συγκεντρώσεις [81]. Σε in vivo πειράματα o TGF β ενεργοποιεί τον πολλαπλασιασμό των λείων μυϊκών κυττάρων σε πολλαπλές στιβάδες, δηλαδή σε τρείς διαστάσεις [82]. Σε κυτταρικές καλλιέργειες λείων μυϊκών κυττάρων υπό την επίδραση του TGF β εμφανίζονται με τη μορφή «λόφωνκοιλάδων» [83]. Ταυτόχρονα, αναστέλλει τον PDGF, ο οποίος είναι υπεύθυνος για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε μία στιβάδα. Επιπλέον, ο TGF β ενεργοποιεί την παραγωγή εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας από τα λεία μυϊκά κύτταρα και παράλληλα αναστέλλει τα ένζυμα που την αποδομούν [84]. Τα νέα παραγωγικά λεία μυϊκά κύτταρα υπό την επίδραση του PDGF μεταναστεύουν προς τον υπενδοθηλιακό χώρο διαμέσου του έσω ελαστικού 21

34 Εισαγωγή πετάλου στον έσω χιτώνα. O PDGF παράγεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα μακροφάγα και είναι η μόνη απαραίτητη ουσία για την μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων [85]. Η μετακίνηση των λείων μυϊκών κυττάρων γίνεται με την προβολή ψευδοποδίων προς την κατεύθυνση του έσω χιτώνα [86]. Τα ψευδοπόδια δημιουργούνται με τον πολυμερισμό της ακτίνης και η έμπροσθεν κίνηση πραγματοποιείται με την αποδιοργάνωση της ακτίνης στην βάση των ψευδοποδίων και τον ανασχηματισμό της στο πρόσθιο τμήμα των νεοσχηματιζόμενων ψευδοποδίων [86]. Οι ιντεγκρίνες είναι μία οικογένεια 20 πρωτεϊνικών υποδοχέων [87] που καθεμία αποτελείται από 14 α και 8 β υπομονάδες. Στον άνθρωπο απαντάται η ιντεγκρίνη α 5 β 1 όπου η β 1 υπομονάδα συνδέεται με την ακτίνη του κυτταροσκελετού ενώ η α 5 υπομονάδα είναι υπεύθυνη για την ρύθμιση της λειτουργίας της β 1 [44]. Η ιντεγκρίνη μεσολαβεί στον πολλαπλασιασμό, την προσκόλληση και τη μετανάστευση των κυττάρων. Η προσκόλληση και η μετανάστευση των λείων μυικών κυττάρων γίνεται σε τρία στάδια. Στο πρώτο στάδιο η φιμπρονεκτίνη συνδέεται με υποδοχέα στην επιφάνεια του κυττάρου. Κατά το δεύτερο στάδιο τα μονομερή της φιμπρονεκτίνης ενώνονται μεταξύ τους. Τέλος, στο τρίτο στάδιο τα ινίδια της φιμπρονεκτίνης επιμηκύνονται και σχηματίζεται σύμπλεγμα [88]. Στα λεία μυϊκά κύτταρα η ιντεγκρίνη α 5 β 1 ελέγχει την μετανάστευση τους καθώς είναι υπεύθυνη για την ενδοκυτταρική οργάνωση της ακτίνης ενώ η β 1 υπομονάδα της οργανώνει τα μονομερή της φιμπρονεκτίνης που συντίθενται σχηματίζοντας ινίδια της θεμέλιας ουσίας [89]. Τα λεία μυϊκά κύτταρα παράγουν ένα σύνολο πρωτεϊνών, αφού δεχτούν χημικά σήματα από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Αρχικά, παράγουν φιμπρονεκτίνη και αργότερα υπό την επίδραση του TGF β που εκκρίνεται από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα συνθέτουν μεγάλες ποσότητες θεμέλιας ουσίας όπως είναι το κολλαγόνο τύπου Ι και ΙΙΙ, η ελαστίνη, η φιμπρονεκτίνη [11] και οι πρωτεογλυκάνες [90] [91]. Επίσης, παράγουν IL 6 που ενεργοποιεί την παραγωγή της INF γ από τα Τ λεμφοκύτταρα. Η INF γ δρα στα λεία μυϊκά κύτταρα και ενεργοποιεί την παραγωγή της λαμινίνης [92] και ταυτόχρονα αναστέλλει την παραγωγή του κολλαγόνου και της φιμπρονεκτίνης [93]. Η λαμινίνη συνδέεται στα λεία μυϊκά κύτταρα με τις ιντεγκρίνες α 1 β 1, α 2 β 1. Πιθανόν η λαμινίνη να ρυθμίζει τον 22

35 Εισαγωγή φαινότυπο των λείων μυϊκών κυττάρων μέσω ρύθμισης του κυτταροσκελετού, καθώς αυτή είναι μία γνωστή ιδιότητα της β 1 υπομονάδας των ιντεγκρινών [11]. Ο πολλαπλασιασμός των λείων μυϊκών κυττάρων ξεκινά με την σύνδεση του PDGF στον σύνδεσμό του (ligand) και διακρίνεται σε τέσσερις διαφορετικές φάσεις: προετοιμασία για την σύνθεση του DNA (φάση G 1 ), αντιγραφή του DNA (φάση S), προετοιμασία για την μίτωση (φάση G 2 ), μίτωση και διαίρεση του κυττάρου (φάση Μ). Στην φάση G 1 ενεργοποιείται η πρωτεϊνική κινάση C (PKC) και με διαδοχικές φωσφορυλιώσεις της σερίνης/θρεονίνης ενεργοποιείται το μονοπάτι ras, raf 1, MAPK (mitogenactivated protein kinase) [94]. Για να προχωρήσει το κύτταρο στην επόμενη φάση απαιτείται η παρουσία παραγόντων όπως EGF, ινσουλίνη και IGF 1 (insulin like growth factor 1) [95]. Τα λεία μυϊκά κύτταρα εκφράζουν υποδοχείς πρόσληψης χοληστερόλης όπως είναι οι LDL υποδοχείς [96], οι VLDL υποδοχείς [97] και οι CD36 [98]. Μετά την πρόσληψη των LDL μετατρέπονται σε αφρώδη κύτταρα. Τα λεία μυϊκά κύτταρα παράγουν πληθώρα κυτταροκινών ικανών να προσελκύσουν και να ενεργοποιήσουν λευκοκύτταρα (μακροφάγα και Τ λεμφοκύτταρα). Επίσης, να προάγουν τον πολλαπλασιασμό άλλων λείων μυϊκών κυττάρων, καθώς και την παραγωγή εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας [91]. Επιπλέον, στην διαδικασία της αθηρογένεσης συμμετέχει το συνδεόμενο στο CD40 μόριο CD154. Μελέτες έδειξαν ότι η διακοπή του σήματος ανάμεσα στο CD40 και το CD154 καθυστερεί την έναρξη της αθηρογένεσης [99]. Ποντίκια με έλλειψη του υποδοχέα των LDL εμφάνισαν αθηρωματική πλάκα μετά από διατροφή πλούσια σε λίπη [100]. Όταν τα ποντίκια έλαβαν αγωγή με το αντίσωμα του CD154, ανεστάλη η μετάδοση του σήματος προς το CD40 και η αθηρωματική πλάκα που εξετάστηκε μετά από περίοδο 13 εβδομάδων παρουσίασε μείωση του μεγέθους της, ενώ στην ομάδα ελέγχου που δεν έλαβε το αντίσωμα εμφανίσθηκε αύξηση του μεγέθους της πλάκας κατά 4 5 φορές [100]. 23

36 Εισαγωγή Ρήξη της πλάκας και θρόμβωση Πρόσφατα δεδομένα αποδεικνύουν ότι τα κλινικά συμπτώματα της αθηροσκλήρωσης προκύπτουν από τη ρήξη της πλάκας και όχι από την στένωση της αρτηρίας όπως πιστεύονταν παλαιότερα. Η ελαστικότητα των αρτηριών οφείλεται στην ελαστίνη και την δύναμη εφελκυσμού (tensile strength) του κολλαγόνου των τοιχωμάτων τους. Η σχετική αναλογία ελαστίνης/κολλαγόνου ποικίλλει και εξαρτάται από τις λειτουργικές ανάγκες της κάθε αρτηρίας [101]. Η δύναμη εφελκυσμού της αρτηρίας εξαρτάται από την αναλογία αυτή. Στην αθηροσκλήρωση η πάχυνση του αρτηριακού τοιχώματος οφείλεται στην αυξημένη παραγωγή κολλαγόνου και ελαστίνης μετά από την επίδραση της IL 1 και του TGF β. Δεν παρατηρείται όμως αλλαγή της σχετικής αναλογίας μεταξύ ελαστίνης/κολλαγόνου [28]. Η πάχυνση του αρτηριακού τοιχώματος οδηγεί σε απώλεια της διατασιμότητάς του. Η διατμητική τάση που επιδρά στο αρτηριακό τοίχωμα οδηγεί στην ρήξη της αθηρωματικής πλάκας στα ευένδοτα σημεία της, δηλαδή στα τμήματα όπου η αθηρωματική πλάκα ενώνεται με το φυσιολογικό τοίχωμα. Στα σημεία αυτά η πλάκα είναι λεπτή καθώς δεν αναπτύσσεται πλήρως η ινώδης κάψα της [102]. Η ινώδης κάψα οφείλει την σταθερότητά της στο ενδιάμεσο κολλαγόνο. Οι πλάκες που έχουν υποστεί ρήξη και προκάλεσαν θανατηφόρα θρόμβωση έχουν λεπτή ινώδη κάψα [103]. Η φλεγμονή εμποδίζει την δημιουργία νέων ινών κολλαγόνου και προάγει την καταστροφή του υπάρχοντος κολλαγόνου. Το κολλαγόνο του αρτηριακού τοιχώματος παράγεται από τα λεία μυϊκά κύτταρα μέσω της διέγερσης των TGF β, PDGF, IL 1. Ενώ η INF γ που παράγεται από τα Τ λεμφοκύτταρα της πλάκας, αναστέλλει την παραγωγή του κολλαγόνου και την διεγερτική δράση των άλλων κυτταροκινών, TGF β, PDGF, IL 1 [28]. Φυσιολογικά το αρτηριακό τοίχωμα περιέχει κυρίως κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ ενώ το κολλαγόνο τύπου Ι αυξάνεται με την πάροδο της ηλικίας. Στην αθηρωματική πλάκα τα λεία μυϊκά κύτταρα παράγουν περισσότερο κολλαγόνο τύπου Ι προκαλώντας ελάττωση της διασταλτικής ικανότητας του αρτηριακού τοιχώματος [11]. Η συνεχιζόμενη συσσώρευση της κυτταροτοξικής οξειδωμένης LDLχοληστερόλης υπενδοθηλιακά οδηγεί στην νέκρωση των φαγοκυττάρων και 24

37 Εισαγωγή την επακόλουθη απελευθέρωση μεγάλων ποσοτήτων της LDL χοληστερόλης [104]. Τα ενδοκυττάρια λιπίδια μπορούν να απελευθερωθούν στον εξωκυττάριο χώρο και από φυσιολογικά κύτταρα αλλά, σε μικρότερες ποσότητες [105]. Τα ελεύθερα λιπαρά οξέα που απελευθερώνονται από την οξείδωση των λιπιδίων καθιστούν το τοίχωμα ευαίσθητο στην δράση των ελαστασών [106]. Το συνδεόμενο με το CD40 μόριο, CD 154 και η IL 1 που παράγονται από τα Τ λεμφοκύτταρα προάγουν την παραγωγή από τα μακροφάγα ενζύμων που διασπούν το κολλαγόνο, όπως είναι τα μέλη της οικογένειας των μεταλλοπρωτεασών της θεμέλιας ουσίας (ΜΜP) και κυρίως τις MMP 1, MMP 8, MMP 13 [107]. Επιπλέον, τα ιστιοκύτταρα που βρίσκονται στην πλάκα απελευθερώνουν TNFα που επάγει τις MMP και τις πρωτεάσες της σερίνης, τρυπτάση και χυμάση, οι οποίες με την σειρά τους μπορούν να ενεργοποιήσουν τις MMP [108]. Οι αθηρωματικές πλάκες που συγκεντρώνουν μεγάλο αριθμό αποπτωτικών κυττάρων κυρίως μακροφάγων και λείων μυϊκών κυττάρων είναι ιδιαίτερα επιρρεπείς σε ρήξη [109]. Καθώς καταστρέφονται τα μακροφάγα, σχηματίζεται η νεκρωτική εστία της πλάκας και ο λιπώδης πυρήνας της. Η απόπτωση των λείων μυϊκών κυττάρων οδηγεί σε έκπτωση της σύνθεσης ελαστίνης και κολλαγόνου. Η απόπτωση των κυττάρων οφείλεται στην μειωμένη οξυγόνωση της περιοχής. Επιπλέον, κατά την αθηροσκλήρωση, τα λεία μυϊκά κύτταρα πιθανόν να οδηγούνται στην απόπτωση και λόγω αυξημένης συγκέντρωσης μονοξειδίου του αζώτου που παράγεται από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα ή λόγω ενεργοποίησης αποπτωτικών μονοπατιών (Fas) [110, 111]. Η ρήξη της ινώδους κάψας φέρει σε επαφή τον λιπώδη πυρήνα της πλάκας με τα έμμορφα στοιχεία του αίματος, προκαλώντας τον σχηματισμό του θρόμβου και την ραγδαία επέκταση της πλάκας σε βαθμό που μειώνεται ή αναστέλλεται η αιματική ροή. Τα Τ λεμφοκύτταρα προάγουν την θρόμβωση μέσω της έκφρασης του συνδεόμενου στο CD40 μόριο CD154, το οποίο ενεργοποιεί την παραγωγή του ιστικού παράγοντα από τα μακροφάγα. Ο ιστικός παράγοντας θα ενεργοποιήσει τον πηκτικό μηχανισμό όταν έρθει σε επαφή με τον παράγοντα VII του αίματος [112]. Επομένως, η φλεγμονή δεν είναι υπεύθυνη μόνο για την έναρξη της αθηρωματικής πλάκας αλλά και για την εξέλιξή της σε 25

38 Εισαγωγή επιπεπλεγμένη βλάβη καθώς επίσης και για την λέπτυνση της ινώδους κάψας με τελικό αποτέλεσμα, τη ρήξη της και τη θρόμβωση της αρτηρίας. Παράγοντες κινδύνου Όπως προαναφέρθηκε, η διαδικασία της αθηρωμάτωσης ξεκινά από την πρώιμη εφηβική ηλικία και είναι συνεχής και εξελικτική. Όταν συνυπάρχουν παράγοντες κινδύνου όπως η αντίσταση στην ινσουλίνη, ο σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2, η παχυσαρκία, η αρτηριακή υπέρταση, η αθηρογόνος δυσλιπιδαιμία και το κάπνισμα τότε οι φυσιολογικοί μηχανισμοί της αθηρογένεσης επιταχύνονται αυξάνοντας τόσο τη νοσηρότητα όσο και τη θνητότητα από καρδιαγγειακά νοσήματα [113]. Αντίσταση στην Ινσουλίνη Η αντίσταση στην ινσουλίνη είναι μία κοινή παθολογική κατάσταση όπου τα όργανα στόχοι της ινσουλίνης δεν ανταποκρίνονται ικανοποιητικά στην ινσουλίνη, με αποτέλεσμα για να παραχθεί το απαραίτητο βιολογικό αποτέλεσμα να απαιτείται μεγαλύτερη ποσότητα ινσουλίνης. Η πρώτη διαταραχή που παρατηρείται κατά την αντίσταση στην ινσουλίνη είναι η μειωμένη πρόσληψη γλυκόζης κυρίως από τους σκελετικούς μυς και τον λιπώδη ιστό και η ελαττωμένη ικανότητα της ινσουλίνης να καταστείλει την ηπατική παραγωγή γλυκόζης [114]. Στο πρώτο στάδιο της παθογένειας, το παγκρεατικό β κύτταρο παράγει μεγαλύτερη ποσότητα ινσουλίνης για να υπερκεράσει την αντίσταση στην ινσουλίνη και να διατηρηθεί η βιολογική της δράση. Η χρόνια υπερινσουλιναιμία επιδεινώνει την αντίσταση στην ινσουλίνη και οδηγεί σε εξάντληση της παγκρεατικής ινσουλίνης, διαταραγμένη ανοχή στην γλυκόζη και τελικά σε κλινικό σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (ΣΔ2) (Σχήμα 1). 26

39 Εισαγωγή Αντίσταση στην ινσουλίνη Υπερινσουλιναιμία Αυξανόμενη αντίσταση στην ινσουλίνη Διαταραγμένη ανοχή στη γλυκόζη Έκπτωση της λειτουργίας του β κυττάρου Υπεργλυκαιμία/ Σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2 Υπο ινσουλιναιμία Σχήμα 1. Φυσική πορεία της αντίστασης στην ινσουλίνη και του ΣΔ2. Φυσιολογική δράση της ινσουλίνης Η ινσουλίνη είναι η κύρια ορμόνη που ρυθμίζει την ομοιόσταση και την μεταφορά της γλυκόζης στους ινσουλινο εξαρτώμενους ιστούς. Η κυκλοφορούμενη ινσουλίνη φθάνει γρήγορα στα όργανα στόχους κυρίως τους μυς, το ήπαρ και το λιπώδη ιστό και αντιδρά με τον υποδοχέα της. Ο υποδοχέας της ινσουλίνης (insulin receptor, IR) ανήκει σε μία ομάδα υποδοχέων της μεμβράνης που έχουν ενδογενή δράση τυροσινικής κινάσης. Ο IR αποτελείται από δύο εξωκυττάριες α υπομονάδες και δύο εξωκυττάριεςδιαμεμβρανικές ενδοκυττάριες β υπομονάδες αποτελούνται από τυροσίνη και ενώνονται με δυσουλφιδικούς δεσμούς. Η ινσουλίνη συνδέεται με το ένα σκέλος της α υπομονάδα και προάγει την αυτό φωσφορυλίωση της τυροσίνης των υποστρωμάτων του υποδοχέα (insulin receptor substrate, IRS 1, 2, 3, 4, IRS5/DOK4, IRS6/DOK5). Το φωσφορυλιωμένο IRS ενεργοποιεί τρεις οδούς μετάδοσης σήματος: της κινάσης του 3 φωσφατιδοϊνοσιτιδίου (PI3K), του CAP/Cb1/TC10 και της πρωτεϊνικής κινάσης που ενεργοποιεί την μίτωση (mitogen activated protein kinase, MAPK) [115, 116]. Η οδός της MAPK σχετίζεται με την ανάπτυξη, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση [116, 117]. Αντίθετα, η ενεργοποίηση της PI3K, κυρίως μέσω του IRS1, σχετίζεται με τις μεταβολικές δράσεις της ινσουλίνης. H ενεργοποίηση της TC10 οδού από την ινσουλίνη εμπλέκεται στην πρόσληψη 27

40 Εισαγωγή της γλυκόζης από τα λιποκύτταρα [118]. Στην οδό αυτή η πρωτεΐνη CAP (adapter protein) προσελκύει το πρώτο ογκογονίδιο Cbl στον φωσφορυλιωμένο υποδοχέα της ινσουλίνης ενισχύοντας τη μεταφορά των GLUT 4 προς την κυτταρική μεμβράνη. O IRS1 ανήκει στην οικογένεια των IRS μορίων. Η σύνδεση της ινσουλίνης με τον υποδοχέα της προκαλεί τυροσινική φωσφορυλίωση του IRS1, γεγονός που ενεργοποιεί την PI3Κ. Η ενεργοποιημένη PI3Κ προκαλεί την φωσφορυλίωση της 4,5 διφωσφορικής φωσφατιδύλοϊνοσιτόλης (phosphatidyl inositol 4,5 diphosphate, PIP 2 ) προς 3,4,5 τριφωσφορική φωσφατιδύλοϊνοσιτόλη (phosphatidyl inositol 3,4,5 triphosphate, PIP 3 ). H PIP 3 με την σειρά της, ενεργοποιεί την phosphoinositide dependent kinase 1 (PDK 1), η οποία φωσφορυλιώνει την πρωτεϊνική κινάση Β (ΡΚΒ) και τις άτυπες πρωτεϊνικές κινάσες C (PKC) [119]. Η PKB φωσφορυλιώνει και απενεργοποιεί την κινάση της συνθετάσης του γλυκογόνου 3 (glycogen synthase kinase 3, GSK 3), υπεύθυνης πρωτεΐνης για την σύνθεση του γλυκογόνου. Η ΡΚΒ συμμετέχει στην ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου της συνθετάσης των λιπαρών οξέων, την μετατόπιση του μεταφορέα της γλυκόζης GLUT4 προς την κυτταρική μεμβράνη [115, 116] και την σύνθεση πρωτεϊνών μέσω ενεργοποίησης του mtor (Μammalian Τarget Οf Ρapamycin) [120]. Η ινσουλίνη στο αρτηριακό τοίχωμα προκαλεί αύξηση της παραγωγής του μονοξειδίου του αζώτου και κατά συνέπεια αγγειοδιαστολή ενισχύοντας έτσι, τη μεταφορά της γλυκόζης στους σκελετικούς μυς [121, 122]. Η ενεργοποιημένη PKB από την ινσουλίνη ενεργοποιεί την ενδοθηλιακή συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου (endothelial NO synthase, enos). Η ενεργοποίηση της enos από την ινσουλίνη απαιτεί την παρουσία της καλμοδουλίνης και την σύνδεση της enos με την πρωτεΐνη θερμικού σοκ 90 (heat shock protein 90). H PKB ενεργοποιείται και από άλλους παράγοντες όπως ο PDGF β χωρίς όμως να μεσολαβήσει την ενεργοποίηση της enos. Είναι μία λειτουργία χαρακτηριστική για την ινσουλίνη και πιθανόν να οφείλεται στο σχηματισμό του συμπλέγματος enos/heat shock protein 90/PKB [123]. Στα ενδοθηλιακά κύτταρα η ινσουλίνη μειώνει ταυτόχρονα τη φωσφορυλίωση της enos στην θέση Thr495 και αυξάνει τη φωσφορυλίωση της στη θέση Ser117. Η φωσφορυλίωση της enos στην θέση Thr495 οδηγεί στην απενεργοποίησή της [124]. 28

41 Εισαγωγή Η ενδοθηλίνη 1 παράγεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και έχει αγγειοσυσπαστική δράση συμβάλλοντας στην παθογένεια της αρτηριακής υπέρτασης. Η ινσουλίνη ενεργοποιεί την παραγωγή της ενδοθηλίνης 1 μέσω της οδού των ΜΑΡΚ, αντισταθμίζοντας με αυτό τον τρόπο την αγγειοδιασταλτική δράση του ΝΟ [ ] (Σχήμα 2). Ινσουλίνη IRS 1 PI3K Υποδοχέας της Ινσουλίνης Ras Raf PDK 1 PKB MAPK Μετατόπιση των GLUT 4 Ενδοθηλιακή συνθετάση του ΝΟ Ανάπτυξη Μίτωση Ενδοθηλίνη 1 αγγειοσύσπαση Πρόσληψη γλυκόζης Σκελετικοί μύες αγγειοδιαστολή Ενδοθήλιο των αγγείων Ενδοθήλιο των αγγείων Σχήμα 2. Η οδός μετάδοσης σήματος της ινσουλίνης σε φυσιολογικές συνθήκες. IRS 1, υπόστρωμα του υποδοχέα της ινσουλίνης (insulin receptor substrate 1). PI3K, κινάση του 3 φωσφατιδυλοϊνοσιτιδίου. ΝΟ, μονοξείδιου του αζώτου. PDK 1, phosphoinositidedependent kinase 1. PKB, πρωτεϊνική κινάση Β. MAPK, mitogen activated protein kinase. Επιπλέον, η ινσουλίνη ενεργοποιεί την έκφραση του αναστολέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου 1 (plasminogen activator inhibitor 1, PAI 1), και των μορίων προσκόλλησης όπως ICAM, VCAM, E σελεκτίνη στα ενδοθηλιακά κύτταρα μέσω της οδού ΜΑΡΚ [128]. Η αναστολή της ΡΙ3Κ προκαλεί αύξηση της παραγωγής του ΡΑΙ 1 και των μορίων προσκόλλησης υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ/ΡΚΒ από την ινσουλίνη έχει προστατευτικό ρόλο ενάντια στην αθηρωμάτωση [128, 129]. Στο φυσιολογικό ενδοθήλιο, το αγγειοδιασταλτικό σήμα της ινσουλίνης, PI3K/PKB/NO είναι δυνατότερο από το αγγειοσυσπαστικό, ΜΑΡΚ/ενδοθηλίνη 29

42 Εισαγωγή 1. Η διατάραξη της ισορροπίας αυτής οδηγεί σε παθολογικές καταστάσεις όπως αρτηριακή υπέρταση και αθηρωμάτωση [130]. Παράγοντες που επηρεάζουν την αντίσταση στην ινσουλίνη Λεπτίνη Η λεπτίνη αποτελείται από 167 αμινοξέα και παράγεται από το ob γονίδιο. Εκφράζεται κυρίως στα λιποκύτταρα και σε μικρότερο βαθμό σε άλλα όργανα όπως το ήπαρ, τους σκελετικούς μυς, τα αγγεία, τον πλακούντα, τις ωοθήκες και το γαστρικό τοίχωμα [131]. Η λεπτίνη ρυθμίζει το κορεσμό, τη κατανάλωση ενέργειας και την ενεργοποίηση της γοναδοτροπίνης [132]. Συγκεκριμένα, αναστέλλει το αίσθημα της όρεξης και την αύξηση του σωματικού βάρους καταστέλλοντας τα ορεξιογόνα ερεθίσματα και προάγοντας την έκφραση των ανορεξιογόνων πεπτιδίων στον υποθάλαμο [133, 134]. Έχει καθοριστικό ρόλο στο μεταβολισμό των λιπιδίων. Στους μυς προάγει την οξείδωση των λιπαρών οξέων ενεργοποιώντας την 5 activated AMP κινάση. Η λεπτίνη επίσης προστατεύει από την λιποτοξικότητα καθώς δεν επιτρέπει την εναπόθεση του λίπους σε άλλους ιστούς πλην του λιπώδους ιστού. Επιπλέον, η λεπτίνη αναστέλλει την εναπόθεση των τριγλυκεριδίων στο ήπαρ ενεργοποιώντας την ΡΙ3Κ. Είναι ενδιαφέρον ότι η λεπτίνη έχει τόσο επιβλαβείς όσο και προστατευτικές δράσεις στο καρδιαγγειακό σύστημα. Ποντίκια με μετάλλαξη στο γονίδιο της λεπτίνης εμφανίζουν παχυσαρκία [135, 136]. Στον άνθρωπο, άτομα με έλλειψη λεπτίνης, μια εξαιρετικά σπάνια γενετική διαταραχή, εμφανίζουν παχυσαρκία με αντίσταση στην ινσουλίνη, υπερινσουλιναιμία, υπερλιπιδιαμία, ανοσοανεπάρκεια και μειωμένη απάντηση των Τ λεμφοκυττάρων [136, 137]. Η ασθένεια είναι δυνατό να θεραπευτεί με την χορήγηση λεπτίνης Τα επίπεδα λεπτίνης στο πλάσμα παρουσιάζουν κιρκάδιο κύκλο με χαμηλότερες τιμές κατά την διάρκεια της νύχτας και σχετίζονται άμεσα με την μάζα του λιπώδους ιστού. Η απώλεια σωματικού βάρους οδηγεί σε μείωση των επιπέδων λεπτίνης [138]. Η παραγωγή της λεπτίνης αυξάνεται υπό την επίδραση του TNFα, της ινσουλίνης, της γλυκόζης, των οιστρογόνων, ενώ κάποιες ουσίες όπως η ενδοθηλίνη και το αγγειοτενσινογόνο ΙΙ αυξάνουν τοπικά την παραγωγή της λεπτίνης [139]. 30

43 Εισαγωγή Οι υποδοχείς της λεπτίνης (OB R) εκφράζονται σε μία πλειάδα οργάνων υποδεικνύοντας τις πολλαπλές δράσεις της. Οι OB R διαφέρουν μεταξύ τους ανάλογα με το μέγεθος του ενδοκυτταρικού τμήματος του υποδοχέα, με κυριότερη την μακρά ισομορφή και ενεργοποιούν διαφορετικές οδούς μεταβίβασης σήματος. Η μακρά ισομορφή OBRb μεσολαβεί στις προφλεγμονώδεις δράσεις της λεπτίνης. Η λεπτίνη ενεργοποιεί την ανοσιακή απάντηση του οργανισμού μέσω ενεργοποίησης των μονοκυττάρων, των Τ λεμφοκυττάρων και των ουδετερόφιλων. Η επίδραση της λεπτίνης στα μονοκύτταρα οδηγεί στην ενεργοποίησή τους και τον πολλαπλασιασμό τους καθώς και την παραγωγή κυτταροκινών όπως IL 6 και TNFα [140]. Σημαντικές δράσεις της απαντώνται στο καρδιαγγειακό σύστημα [141]. Στα ενδοθηλιακά κύτταρα και στο αγγειακό τοίχωμα εκφράζεται ο υποδοχέας της λεπτίνης [142, 143]. Χρόνια υπερλεπτιναιμία οδηγεί σε δυσλειτουργία του ενδοθηλίου [142] που χαρακτηρίζεται από μειωμένη παραγωγή και δραστικότητα του ΝΟ. Σε πειραματικά μοντέλα φαίνεται ότι η ενεργοποίηση της NADPH οξειδάσης μεσολαβεί στις δράσεις της λεπτίνης που σχετίζονται με τους παράγοντες κινδύνου ανάπτυξης αθηροσκλήρωσης [ ]. Ο υποδοχέας της λεπτίνης εκφράζεται στην αθηρωματική βλάβη και η χορήγηση λεπτίνης σε ποντίκια ob/ob οδήγησε σε στένωση του αγγειακού αυλού αποδεικνύοντας την άμεση σχέση μεταξύ λεπτίνης και αθηροσκλήρωσης [147]. Κλινικές μελέτες απέδειξαν ότι η λεπτίνη αποτελεί ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη αθηροσκλήρωσης [148]. Σε παχύσαρκες γυναίκες βρέθηκε ότι τα επίπεδα λεπτίνης σχετίζονται με ορισμένους δείκτες αθηρωμάτωσης όπως είναι το VCAM 1 [149]. Σε άλλη μελέτη βρέθηκε ότι η λεπτίνη είναι ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για την εμφάνιση καρδιαγγειακού επεισοδίου σε άτομα με επιβεβαιωμένες αγγειογραφικά αλλοιώσεις των στεφανιαίων αγγείων [150]. Επιπλέον, η λεπτίνη πιθανόν να συμβάλλει στην εμφάνιση αθηροσκλήρωσης λόγω των προ θρομβωτικών και προ φλεγμονωδών ιδιοτήτων της. Αναλυτικότερα, ο OB R εκφράζεται στα αιμοπετάλια προάγοντας την συνάθροισή τους [151]. Επιπλέον, η λεπτίνη προάγει την οξείδωση των λιπαρών οξέων παράγοντας ελεύθερες ρίζες [152]. Η λεπτίνη σε φυσιολογικές συνθήκες προάγει την οξείδωση των λιπαρών οξέων μέσω ενεργοποίησης της έκφρασης του peroxisomal proliferationactivated receptor α (PPARα) [153]. Διαταραχές στην δράση της λεπτίνης 31

44 Εισαγωγή προκαλούν έκτοπη εναπόθεση τριγλυκεριδίων στους σκελετικούς μυς και το πάγκρεας. Η συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων στα όργανα αυτά προάγει την σύνθεση κεραμιδίου, το οποίο μέσω ενεργοποίησης της επαγώγιμης συνθετάσης του μονοξειδίου του αζώτου (inducible nitric oxide synthase) οδηγεί τα κύτταρα στην απόπτωση. Η λιποτοξικότητα που εμφανίζεται στους σκελετικούς μυς και το πάγκρεας προκαλεί την αντίσταση στην ινσουλίνη και η δυσλειτουργία των β κυττάρων προκαλεί τον σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 [154]. Αδιπονεκτίνη Η αδιπονεκτίνη περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Scherer et al. το 1995 [155] και εκφράζεται στον λιπώδη ιστό. Ενεργοποιεί την οξείδωση των λιπαρών οξέων, την πρόσληψη γλυκόζης από τους σκελετικούς μυς, καταστέλλει την ηπατική νεογλυκογένεση, αναστέλλει τη προσκόλληση των μονοκυττάρων, τη διαφοροποίηση τους σε μακροφάγα, το πολλαπλασιασμό τους και τη μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων στα αγγεία [156]. Οι δράσεις αυτές της αδιπονεκτίνης μεσολαβούνται από την ενεργοποίηση της κινάσης της μονοφωσφορικής αδενίνης (adenine monophosphate kinase, ΑΜΡΚ) και την τροποποίηση του NFκΒ. Τα επίπεδα της αδιπονεκτίνης στο πλάσμα είναι αντίστροφα με την μάζα του λιπώδους ιστού, την αντίσταση στην ινσουλίνη, την στεφανιαία νόσο και την δυσλιπιδαιμία τόσο στα πειραματόζωα όσο και στον άνθρωπο [156]. Ποντίκια με έλλειψη της αδιπονεκτίνης εμφανίζουν αντίσταση στην ινσουλίνη, δυσλιπιδαιμία και πάχυνση της έσω στοιβάδας των αγγείων ενώ η υπερέκφραση ή η εξωγενής χορήγησή της βελτιώνει την ευαισθησία στην ινσουλίνη και προστατεύει από την αθηροσκλήρωση [ ]. Πρόσφατες μελέτες προτείνουν ότι οι χαμηλές συγκεντρώσεις της αδιπονεκτίνης ορού προβλέπουν μελλοντικό κίνδυνο εμφάνισης ΣΔ2 [160]. Η έκφραση του mrna της αδιπονεκτίνης στον λιπώδη ιστό είναι μειωμένη σε καταστάσεις όπως η αντίσταση στην ινσουλίνη και ο ΣΔ2 [158]. Επιπλέον, η έκφραση της αδιπονεκτίνης αυξάνεται όσο βελτιώνεται η ευαισθησία στην ινσουλίνη και μειώνεται το σωματικό βάρος [161]. 32

45 Εισαγωγή Η αδιπονεκτίνη ενεργοποιεί την παραγωγή των αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών IL 10, IL1 στα μονοκύτταρα, στα μακροφάγα και στα δενδριτικά κύτταρα και αναστέλλει την παραγωγή της προ φλεγμονώδους κυτταροκίνης INFγ. Τέλος, μονοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν παρουσία αδιπονεκτίνης παρουσίασαν μειωμένη ικανότητα φαγοκυττάρωσης [162]. Η αδιπονεκτίνη ασκεί προστατευτική δράση στο αγγειακό σύστημα πιθανόν μέσω μείωσης της φλεγμονής των αγγείων. Ποντίκια που δεν εκφράζουν την αδιπονεκτίνη παρουσιάζουν αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων του έσω χιτώνα [161]. Ρεζιστίνη Η ρεζιστίνη είναι μία νέα πρωτεΐνη που εκκρίνεται από τον λιπώδη ιστό και αποτελείται από 114 αμινοξέα. Η ρεζιστίνη πλάσματος είναι αυξημένη στην παχυσαρκία. Η χορήγηση αντισωμάτων έναντι της ρεζιστίνης μειώνει τα επίπεδα γλυκόζης πλάσματος και αυξάνει την δράση της ινσουλίνης σε ποντίκια με παχυσαρκία κατόπιν παχυντικής διατροφής [163]. Το 2001 ο Stepan et al. ανέφερε ότι η έκφραση της ρεζιστίνης στον λευκό λιπώδη ιστό ήταν μεγαλύτερη από ότι στον καφέ λιπώδη ιστό, στην πραγματικότητα όμως η ποσότητα του αγγελιοφόρου RNA (mrna) στον καφέ λιπώδη ιστό ήταν μόλις ανιχνεύσιμη. Η ρεζιστίνη έχει σχετιστεί με την εμφάνιση του σακχαρώδη διαβήτη και των επιπλοκών του [164]. Επιπλέον, η χορήγηση ανασυνδυασμένης ρεζιστίνης σε φυσιολογικά ποντίκια προκάλεσε διαταραγμένη ανοχή στην γλυκόζη και μειωμένη δραστικότητα της ινσουλίνης. Η πρόσληψη της γλυκόζης από τα λιποκύτταρα αυξάνεται με την χορήγηση αντισωμάτων έναντι της ρεζιστίνης, ενώ η χορήγηση ρεζιστίνης προκαλεί μειωμένη πρόσληψη [163]. Η ρεζιστίνη είναι μία ορμόνη που παράγεται από τον λιπώδη ιστό και θεωρητικά θα έπρεπε να σχετίζεται με την μάζα του σωματικού λίπους ή του τοπικού λιπώδους ιστού, παρόλα αυτά, σειρά μελετών δεν απέδειξε αυτή σχέση. Τα λιποκύτταρα έχουν μικρότερες ποσότητες ρεζιστίνης από ότι ο λιπώδης ιστός ως σύνολο, πιθανολογώντας ότι η ρεζιστίνη προέρχεται και από άλλα κύτταρα που βρίσκονται μέσα στον λιπώδη ιστό [165]. 33

46 Εισαγωγή Παρατηρήθηκε in vitro αύξηση του mrna της ρεζιστίνης κατά 4 φορές σε μονοκύτταρα που διαφοροποιούνταν προς μακροφάγα [166]. Είναι γνωστό, ότι ο λιπώδης ιστός των παχύσαρκων ατόμων χαρακτηρίζεται από διήθηση μακροφάγων [167]. Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα αυτών των μελετών, τίθεται η υπόνοια ότι η ρεζιστίνη στον άνθρωπο δεν παράγεται μόνο από τα λιποκύτταρα και μάλιστα, ίσως αυτά να μην αποτελούν την κύρια πηγή παραγωγής της. Αυτό μπορεί να εξηγεί το γεγονός ότι δεν βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων της ρεζιστίνης και της μάζας του λιπώδους ιστού. Η παραγωγή και η απελευθέρωση της ρεζιστίνης από το λιπώδη ιστό, προάγεται από την φλεγμονή, την υπεργλυκαιμία, την IL 6, το λιποπολυσακχαρίδιο, τις γοναδικές ορμόνες και την αυξητική ορμόνη [168]. Δρώντας στα λιποκύτταρα συμβάλλει στην εμφάνιση αντίστασης της ινσουλίνης. Στα μονοκύτταρα προάγει την απελευθέρωση άλλων προφλεγμονωδών κυτταροκινών όπως IL 12, TΝFα μέσω της ενεργοποίησης του NFκΒ [169]. Επιπλέον, η ρεζιστίνη αυξάνει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης στο αρτηριακό τοίχωμα προάγοντας την μετανάστευση των λευκοκυττάρων [141]. Υποδοχείς γ ενεργοποιούμενοι από πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωμάτων (peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ) Ανήκει σε υπο οικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων, τους PPAR, που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων. Οι υποδοχείς PPAR βρίσκονται στον κυτταρικό πυρήνα με την μορφή ετεροδιμερούς, συνδεόμενοι με τον υποδοχέα του ρετινοεικού οξέος Χ [170]. Η σύνδεσή τους με ενεργοποιητές αλλάζει τη χωροδιάταξή τους, οδηγώντας στην ενεργοποίησή τους. Στον άνθρωπο απαντώνται οι εξής ισομορφές: PPARα, PPARδ και PPARγ. Ο PPARα εκφράζεται στο ήπαρ, τους σκελετικούς μυς, την καρδιά και το αγγειακό τοίχωμα [171]. Ο PPARδ εκφράζεται στο δέρμα, τον εγκέφαλο και τον λιπώδη ιστό [172]. Ο PPARγ απαντάται σε τέσσερις ισομορφές PPARγ1, PPARγ2, PPARγ3 και PPARγ4 που διαφέρουν μεταξύ τους στο Ν τελικό άκρο τους και έχουν διαφορετική κατανομή. Ο PPARγ1 απαντάται σχεδόν σε όλους τους ιστούς. Ο PPARγ2 απαντάται στον λιπώδη ιστό και παίζει καθοριστικό ρόλο στη διαφοροποίηση των λιποκυττάρων [173]. Ο PPARγ3 απαντάται κυρίως 34

47 Εισαγωγή στα μακροφάγα, το λιπώδη ιστό και το παχύ έντερο [174] ενώ για τον PPARγ4 δεν είναι ακόμη γνωστή η κατανομή του [175]. Επιπλέον, ο PPARγ εμπλέκεται στον μεταβολισμό των λιπιδίων και της γλυκόζης καθώς και σε άλλες φυσιολογικές λειτουργίες του οργανισμού [176] (Εικόνα 3). Ο PPARγ ενεργοποιείται από διάφορα λιπαρά οξέα και τους ενδογενείς μεταβολίτες του αραχιδονικού οξέος όπως είναι η 15 δεοξύ δ 12,14 προσταγλαδίνη Ι2 [176] ενώ ουσίες όπως ο TNFα [177] και η IL 6 [178] καταστέλλουν την έκφρασή του. Επιπλέον, ο PPARγ είναι ο στόχος των θειαζολιδινενδιονών που δρουν ως ευαισθητοποιητές της ινσουλίνης και χρησιμοποιούνται για την θεραπεία του σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 [179]. Στον άνθρωπο γονιδιακή μετάλλαξη που οδηγεί στη μείωση της δράσης του PPARγ προκαλεί αντίσταση στην ινσουλίνη [180]. Σε αντίθεση, άτομα που φέρουν την Pro12Ala μετάλλαξη έχουν μεγαλύτερη ευαισθησία στην ινσουλίνη, παρά το γεγονός ότι η μετάλλαξη μειώνει την δράση του υποδοχέα [181, 182]. Επιπλέον, τα ετερόζυγα ποντίκια με έλλειψη του PPARγ έχουν μεγαλύτερη ευαισθησία στην ινσουλίνη από ότι τα φυσιολογικά και δεν αναπτύσσουν αντίσταση στην ινσουλίνη όταν τους χορηγηθεί δίαιτα αυξημένη σε λιπαρά [183]. Εικόνα 3. Οι μηχανισμοί ρύθμισης της αντίστασης στην ινσουλίνη από τους πυρηνικούς υποδοχείς PPARγ. 35

48 Εισαγωγή Οι προσπάθειες για την καλύτερη κατανόηση των πολλαπλών ρόλων που έχει ο υποδοχέας αυτός στην ανάπτυξη και την λειτουργία των κυττάρων in vivo περιορίζονται από την εμβρυονική θνητότητα των μυών με ομόζυγη έλλειψη του PPARγ [184]. TNFα Ο TNFα αρχικά περιγράφηκε ως μία ενδοτοξίνη που προκαλεί νέκρωση στους όγκους [185]. Σήμερα, αναγνωρίζεται ως μία κυτταροκίνη με πολλαπλές δράσεις που εμπλέκεται στην φλεγμονώδη αντίδραση, στον μεταβολισμό των λιπιδίων, στην αντίσταση στην ινσουλίνη και στην απόπτωση. Ο TNF α προάγει την λιπόλυση, παρεμποδίζει την φωσφορυλίωση του IRS 1 (insulin receptor substrate) (Hostamisligil et al., 1996) και καταστέλλει την έκφραση του γονιδίου του GLUT 4 στα μυϊκά και λιπώδη κύτταρα. Ο TNFα ενεργοποιεί την οδό της c Jun αμινοτελικής κινάσης (c Jun N terminal kinase, JNK), η οποία αυξάνει τη φωσφορυλίωση της σερίνης του IRS 1 αναστέλλοντας την σύνδεσή του με τον υποδοχέα της ινσουλίνης με αποτέλεσμα, να αποτρέπεται η μετάδοση του σήματος της ινσουλίνης, γεγονός που απαιτεί την φωσφορυλίωση της τυροσίνης του IRS 1 [186, 187]. Ο TNFα καταστέλλει τον μεταγραφικό παράγοντα C/EBP α, ο οποίος ενεργοποιεί το γονίδιο του GLUT 4 [178, 188]. Επιπλέον, ο TNFα καταστέλλει την έκφραση του PPARγ [177]. Ο NFκΒ φαίνεται ότι είναι η κύρια πρωτεΐνη που ενεργοποιείται από τον TNFα και μεσολαβεί σε όλες τις δράσεις του σχετικά με την αντίσταση στην ινσουλίνη [189]. Έχει παρατηρηθεί αυξημένη έκφραση του TNFα σε διάφορα μοντέλα πειραματόζωων με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη [190]. Στον άνθρωπο το mrna του TNFα και η ίδια η πρωτεΐνη έχουν θετική συσχέτιση με την μάζα του λιπώδους ιστού και ελαττώνονται στα παχύσαρκα άτομα μετά την απώλεια βάρους. Επιπλέον, τα επίπεδα του TNFα πλάσματος είχαν θετική συσχέτιση με την βαρύτητα της υπερινσουλιναιμίας [191, 192]. 36

49 Εισαγωγή Ιντερλευκίνη 6 (IL 6) H IL 6 παράγεται από τα μακροφάγα, τα Β λεμφοκύτταρα, τα λιποκύτταρα και τα σκελετικά μυϊκά κύτταρα [193]. Το 30% της κυκλοφορούσας IL 6 εκκρίνεται από τον λιπώδη ιστό [194]. Η έκφραση της IL 6 στον λιπώδη ιστό καθώς και τα επίπεδά της στο πλάσμα αυξάνονται στην παχυσαρκία και την αντίσταση στην ινσουλίνη [ ], ενώ τα αυξημένα επίπεδά της στο πλάσμα αποτελούν ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου για την εμφάνιση ΣΔ2. Η IL 6 επηρεάζει την αντίσταση στην ινσουλίνη μέσω διάφορων μηχανισμών. Αναστέλλει την μεταγραφή του γονιδίου του IRS 1, του GLUT 4 και του PPARγ [178]. Η χορήγηση ανασυνδυασμένης IL 6 σε μοντέλα τρωκτικών και στον άνθρωπο in vivo προάγει την ηπατική νεογλυκογένεση και κατ επέκταση την υπεργλυκαιμία και την υπερινσουλιναιμία. Η IL 6 ενεργοποιεί την κατασταλτική πρωτεΐνη μετάδοσης σήματος των κυτταροκινών (suppressor of cytokine signaling 3, SOCS 3) η οποία σε κυτταρικές καλλιέργειες 3Τ3 L1 λιποκυττάρων καταστέλλει την μεταβίβαση του σήματος της ινσουλίνης οδηγώντας σε μειωμένη πρόσληψη γλυκόζης [195]. Ελεύθερα λιπαρά οξέα (ΕΛΟ) Η αυξημένη συγκέντρωση των ελεύθερων λιπαρών οξέων συχνά σχετίζεται με την αντίσταση στην ινσουλίνη [198]. Η οξεία αύξηση της συγκέντρωσής τους αυξάνει την έκκριση της ινσουλίνης ενώ η χρόνια αύξησή τους οδηγεί σε αντίσταση στην ινσουλίνη [199, 200]. Πρώτος ο Randle [201] πρότεινε ότι τα ΕΛΟ οδηγούν στην αντίσταση στην ινσουλίνη και ότι ο υπεύθυνος μηχανισμός είναι η οξείδωσή τους που προκαλεί μειωμένη οξείδωση της γλυκόζης, ελαττωμένη γλυκόλυση και τελικά αναστολή της μεταφοράς γλυκόζης στα καρδιακά μυϊκά κύτταρα (Εικόνα 4). Είναι πλέον γνωστό ότι τα ΕΛΟ οδηγούν στην αντίσταση στην ινσουλίνη μέσω της επίδρασής τους στην μετάδοση σήματος της ινσουλίνης στα σκελετικά μυϊκά κύτταρα [202] και στο ήπαρ. Η αυξημένη συγκέντρωση των ΕΛΟ του πλάσματος οδηγεί σε αύξηση της ενδοκυτταρικής τους συγκέντρωσης στα σκελετικά μυϊκά κύτταρα όπου και καταβολίζονται. Οι 37

50 Εισαγωγή μεταβολίτες των ΕΛΟ όπως η διακυλογλυκερόλη, το άκυλο συνένζυμο Α και το κεραμίδιο ενεργοποιούν την PKC. Εικόνα 4. Υπόθεση του Randle (πρώτη εικόνα) και ο πρόσφατα προτεινόμενος μηχανισμός (δεύτερη εικόνα) γα την ανάπτυξη αντίστασης στην ινσουλίνη λόγω αυξημένης συγκέντρωσης των λιπαρών οξέων Η πρώτη θεωρία ισχυρίζεται ότι η αυξημένη συγκέντρωση των λιπαρών οξέων αυξάνει την παραγωγή του άκυλο συνα στα μιτοχόνδρια το οποίο αυξάνει το κιτρικό οξύ και μειώνει τη δράση της πυρουβικής δεϋδρογονάσης. Στη συνέχεια το κιτρικό οξύ απενεργοποιεί τη φωσφοφρουκτοκινάση με αποτέλεσμα την αύξηση της 6 φωσφορο γλυκόζης. Γεγονός που αναστέλλει την εξοκινάση ΙΙ και οδηγεί σε αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης της γλυκόζης και αναστολή της πρόσληψης της γλυκόζης. Σύμφωνα με τη δεύτερη θεωρία, τα αυξημένα λιπαρά οξέα ενεργοποιούν τις οδούς της σερίνης/θρεονίνης οδηγώντας στη φωσφορυλίωση του υποστρώματος του υποδοχέα της ινσουλίνης 1/2 (IRS 1/2) στη σερίνη. Το τελικό αποτέλεσμα είναι να εμποδιστεί η μετάδοση του σήματος της ινσουλίνης και η πρόσληψη της γλυκόζης. PDH, pyruvate dehydrogenase. PFK, phosphofructokinase. HK, hexokinase ΙΙ. 38

51 Εισαγωγή H PKC φωσφορυλιώνει τον IRS 1 στη σερίνη μειώνοντας την φωσφορυλίωση της τυροσίνης. Η φωσφορυλίωση της σερίνης δεν μπορεί να ενεργοποιήσει την PI3K και τελικά αναστέλλεται η μετακίνηση των GLUT4 προς την κυτταρική μεμβράνη. Επιπλέον, τα ΕΛΟ αναστέλλουν την φωσφορυλίωση της ΡΚΒ [203]. Τα ΕΛΟ αναστέλλουν την λειτουργία του IRS 1 πιθανόν μέσω ενεργοποίησης της κινάσης αναστολής κβ (inhibitor κβ kinase, IKK) και της JNK [204]. Τα ΕΛΟ επομένως επιδρούν σε όλα στάδια της μετάδοσης του σήματος της ινσουλίνης. Η χρόνια έκθεση των β κύτταρων του παγκρέατος σε υψηλά επίπεδα ΕΛΟ οδηγεί σε αναστολή της έκφρασης του γονιδίου της ινσουλίνης προκαλώντας τη μειωμένη παραγωγή της [205]. Τέλος, στο ήπαρ η αντίσταση στην ινσουλίνη συνίσταται σε μειωμένη παραγωγή γλυκόζης λόγω αναστολής της γλυκογονόλυσης [206]. Τα ΕΛΟ ενεργοποιούν την PKCθ η οποία προκαλεί αντίσταση στην ινσουλίνη και έχει αθηρογόνο δράση καθώς προάγει τη δυσλειτουργία του ενδοθηλίου, την έκφραση μορίων προσκόλλησης, τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των λείων μυϊκών κυττάρων καθώς και τη φαγοκυττάρωση των ox LDL [207]. CREB binding protein (campresponse element binding protein), CBP H CBP πρωτεΐνη είναι συν ενεργοποιητής πολλών μεταγραφικών παραγόντων που παίζουν σημαντικό ρόλο στον μεταβολισμό των λιπιδίων και της γλυκόζης όπως είναι οι PPARγ [208, 209]. Ο ρόλος της μελετήθηκε σε μοντέλα πειραματόζωων με έλλειψη του γονιδίου της CBP πρωτεΐνης. Καθώς τα ποντίκια με ομόζυγη έλλειψη της CBP πρωτεΐνης πεθαίνουν κατά την εμβρυογένεση μελετήθηκαν μόνο ποντίκια με ετερόζυγη έλλειψη της CBPπρωτεΐνης [210]. Σε αυτά παρατηρήθηκε σημαντικά ελαττωμένη η μάζα του λευκού λιπώδους ιστού σε σύγκριση με την μάζα του λιπώδους ιστού των ποντικών άγριου τύπου. Ποντίκια με ετερόζυγη έλλειψη της CBP πρωτεΐνης δεν αύξησαν το σωματικό τους βάρος παρά την χορήγηση δίαιτας πλούσιας σε λιπαρά και είχαν μεγαλύτερη ευαισθησία στην ινσουλίνη και καλύτερη ανοχή στην γλυκόζη σε σύγκριση με φυσιολογικά ποντίκια. Επιπλέον, είχαν υψηλότερα επίπεδα αδιπονεκτίνης και καλύτερη ευαισθησία στην λεπτίνη. Ο 39

52 Εισαγωγή φαινότυπος αυτός εξηγείται μερικώς από την αυξημένη παραγωγή των ορμονών που προάγουν την ευαισθησία στην ινσουλίνη από τον λευκό λιπώδη ιστό και την μείωση των μορίων που προκαλούν αντίσταση στην ινσουλίνη όπως τα ελεύθερα λιπαρά οξέα και ο TNFα [210]. Μιτοχονδριακό DNA Ο πρωταρχικός ρόλος του μιτοχονδρίου είναι να παράγει ενέργεια, με τη μορφή κυρίως του ATP. Οι πρωτεΐνες του μιτοχονδρίου κωδικοποιούνται εν μέρει από το DNA του πυρήνα και εν μέρει από το δικό του DNA, το μιτοχονδριακό DNA (mtdna). Το μιτοχονδριακό DNA που κληρονομείται από το μητρικό ωάριο θεωρείται ως ένας από τους γενετικούς παράγοντες που συμβάλλουν στην παθογένεια του ΣΔ2. Έχει αποδειχθεί ότι περίπου το 0,5 1,5% των ασθενών με ΣΔ2 ηλικίας άνω των 40 ετών εμφανίζει ανωμαλίες στο μιτοχονδριακό DNA όπως αναδιπλασιασμοί, σημειακές μεταλλάξεις και αφαιρέσεις. Μία μετάλλαξη του μιτοχονδριακού DNA, 3243A G, οδηγεί σε διαβήτη και κώφωση. Κύριο χαρακτηριστικό του είναι η υποϊνσουλιναιμία [211]. Η οξειδωτική ικανότητα του κυττάρου που εξαρτάται κυρίως από τα μιτοχόνδρια, σχετίζεται άμεσα με την ευαισθησία στη ινσουλίνη. Διαπιστώθηκε μειωμένη οξειδωτική ικανότητα των σκελετικών μυών σε άτομα με αντίσταση στην ινσουλίνη και ΣΔ2 [212, 213]. Το γεγονός αυτό ενισχύει την άποψη ότι η διαταραγμένη λειτουργία των μιτοχονδρίων προκαλεί αντίσταση στην ινσουλίνη. Μελέτες σε απόγονους διαβητικών τύπου 2 δείχνουν ότι η αντίσταση στην ινσουλίνη συνυπάρχει τόσο με ποιοτική έκπτωση της λειτουργίας του μιτοχονδρίου όσο και με ποσοτική μείωση του μιτοχονδριακού DNA [214, 215]. Οι Le et al [216] πιθανολογούν ότι η ελάττωση του mtdna αποτελεί προδιαθεσικό παράγοντα για την εμφάνιση του ΣΔ2 καθώς διαπίστωσαν ποσοτική ελάττωση του mtdna των λεμφοκυττάρων πριν από την εκδήλωση της ασθένειας. Παρόλα αυτά δεν υπάρχουν ακόμη πειστικές αποδείξεις για την συσχέτιση της μείωσης του mtdna με την διαταραγμένη πρόσληψη γλυκόζης από τους περιφερειακούς ιστούς και την αντίσταση στην ινσουλίνη. Ένας πιθανός μηχανισμός για την ανάπτυξη της αντίστασης στην ινσουλίνη λόγω μείωσης του mtdna είναι η επακόλουθη μειωμένη οξείδωση των λιπιδίων που οδηγεί σε έκτοπη 40

53 Εισαγωγή ενδοκυττάρια συσσώρευσή τους. Η αυξημένη ενδοκυτταρική συγκέντρωση τους προκαλεί την αντίσταση στην ινσουλίνη [217]. Αναστολέας του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου 1 (plasminogen activator inhibitor 1, PAI 1) Ο αναστολέας του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου 1 (PAI 1) είναι ο κύριος ρυθμιστής της ινωδόλυσης και παράγεται και από το σπλαχνικό λιπώδη ιστό [218] υπό την επίδραση των TGFβ, TNFα [219], IL 1 [220], ινσουλίνης, ελεύθερων λιπαρών οξέων και γλυκοκορτικοειδών in vitro [221]. Αναστέλλει τη δημιουργία πλασμίνης και κατ επέκταση την ινωδόλυση. Είναι επομένως, ένας προ θρομβωτικός παράγοντας. Ο PAI 1 στο πλάσμα συνδέεται με την βιτρονεκτίνη, γεγονός που τον διατηρεί στην ενεργή του μορφή [222]. Εικόνα 5. Οι παράγοντες που εμπλέκονται στην αντίσταση στην ινσουλίνη και πώς αυτοί οδηγούν στην αθηρωμάτωση. Η δυσλειτουργία του λιποκυττάρου οδηγεί στην αθηροσκλήρωσης καθώς η αύξηση των συγκεντρώσεων των ελεύθερων λιπαρών οξέων (ΕΛΟ), του TNFα και της IL 6 προκαλεί δυσλειτουργία του ενδοθηλίου. Επιπλέον, η αυξημένη συγκέντρωση του cholesteryl ester transfer protein (CETP) που προέρχεται από τα λιποκύτταρα προκαλεί αύξηση της συγκέντρωσης των τριγλυκεριδίων και μείωση της HDL χοληστερόλης. Η αντίσταση στην ινσουλίνη μειώνει τη διαθεσιμότητα του ΝΟ οδηγώντας σε ελάττωση της αγγειοδιαστολής. Η χαμηλή συγκέντρωση της αδιπονεκτίνης δεν είναι ικανή να αναστείλει τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των λείων μυϊκών κυττάρων. Οι υψηλές συγκεντρώσεις του αναστολέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου 1 (ΡΑΙ 1) οδηγούν στο σχηματισμό πλάκας επιρρεπούς στη ρήξη. Τέλος, η λεπτίνη προάγει τη συνάθροιση των αιμοπεταλίων. 41

54 Εισαγωγή Τα επίπεδα του PAI 1 είναι αυξημένα στην αντίσταση στην ινσουλίνη [223] και θεωρούνται προγνωστικός δείκτης εμφάνισης ΣΔ2 [224]. Επιπλέον, τα επίπεδα του είναι ανάλογα των επιπέδων της ινσουλίνης και των τριγλυκεριδίων πλάσματος σε άτομα με παχυσαρκία [225], στεφανιαία νόσο [226] και ΣΔ2 [227]. Αυξημένα επίπεδα PAI 1 λόγω γενετικού πολυμορφισμού ή παχυσαρκίας σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακών επεισοδίων [228, 229]. Γεγονός που οφείλεται στην ικανότητα του PAI 1 να διαταράσσει την ισορροπία μεταξύ ινωδόλυσης και θρόμβωσης οδηγώντας στο σχηματισμό μικρο θρόμβων [230]. Επιπλέον, ο PAI 1 αναστέλλει την μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων στο αγγειακό τοίχωμα μέσω αναστολής του πλασμινογόνου και οδηγεί στον σχηματισμό αθηρωματικής πλάκας επιρρεπούς στη ρήξη με λεπτή ινώδη κάψα, νεκρωτική εστία και μεγάλο αριθμό μακροφάγων [231] (Εικόνα 5). Μηχανισμοί ανάπτυξης αντίστασης στην ινσουλίνη Η εμφάνιση αντίστασης στην ινσουλίνη μπορεί να οφείλεται σε διαταραχή οποιουδήποτε σημείου από την παραγωγή της, τη σύνδεση με τον υποδοχέα της έως την ενδοκυττάρια μετάδοση του σήματός της. Μία μετάλλαξη του γονιδίου που κωδικοποιεί την ινσουλίνη στο β κύτταρο του παγκρέατος μπορεί να παράγει ινσουλίνη με διαταραγμένη λειτουργικότητα [232]. Η δημιουργία αντισωμάτων έναντι της ινσουλίνης μπορεί να οδηγήσει σε διαταραγμένη λειτουργία της [233]. Επιπλέον, ορμόνες που ανταγωνίζονται την δράση της ινσουλίνης μπορούν να προκαλέσουν αντίσταση στην ινσουλίνη όπως είναι η αυξητική ορμόνη και η κορτιζόλη που απαντώνται στα αντίστοιχα κλινικά σύνδρομα ακρομεγαλίας και σύνδρομου Cushing [232]. Οι συχνότερες όμως διαταραχές στην δράση της ινσουλίνης είναι αυτές που συναντώνται μετά την σύνδεσή της με τον υποδοχέα και αφορούν τον υποδοχέα της ινσουλίνης, το IRS1 και τον GLUT4. 42

55 Εισαγωγή Αυξητική ορμόνη (Growth hormone (GH)) και αντίσταση στην ινσουλίνη Η αυξητική ορμόνη (GH) και η ινσουλίνη ρυθμίζουν τον κυτταρικό μεταβολισμό, τη σωματική ανάπτυξη και τη σύσταση του σώματος. Είναι γνωστό ότι υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο ορμονών. Αποδείχθηκε ότι αύξηση της GH προκαλεί αντίσταση στην ινσουλίνη και υπερινσουλιναιμία [234, 235]. Καταστάσεις με μειωμένη GH σχετίζονται με αυξημένη ευαισθησία στην ινσουλίνη, μειωμένη έκκριση ινσουλίνης και ελαττωμένα επίπεδα γλυκόζης νηστείας [ ]. H GH έχει βραχυχρόνια δράση που είναι παρόμοια με αυτή της ινσουλίνης και μακροχρόνια δράση αντίθετη από την ινσουλίνη. Δηλαδή, η χορήγηση της GH σε πειραματόζωα που εμφανίζουν έλλειψη της ορμόνης οδηγεί σε βραχυχρόνια ενδοκυττάρια μεταφορά γλυκόζης και αμινοξέων, λιπογένεση και πρωτεϊνοσύνθεση, με αδιευκρίνιστη βιολογική σημασία. Αντίθετα, οι μακροχρόνιες δράσεις της GH που εμφανίζονται λίγες ώρες αργότερα, περιλαμβάνουν αύξηση της συγκέντρωσης της γλυκόζης αίματος, αντίσταση στην ινσουλίνη, προαγωγή της λιπόλυσης και αναστολή της μεταφοράς της γλυκόζης [234, 235]. Οι οδοί μεταβίβασης σήματος της ινσουλίνης και της GH διαφέρουν μεταξύ τους όσον αφορά στο επίπεδο του υποδοχέα αλλά συμπίπτουν στο επίπεδο των πρωτεϊνών του IRS [237]. Σε καταστάσεις με ελαττωμένη ινσουλίνη, όπως η νηστεία, η GH χρησιμοποιεί τις οδούς που κάτω από φυσιολογικές συνθήκες ενεργοποιεί η ινσουλίνη (Εικόνα 6). Η GH μπορεί να ελαττώσει την ευαισθησία στην ινσουλίνη, προάγοντας γεγονότα που έχουν αρνητική ρύθμιση στην μετάδοση του σήματος της ινσουλίνης. Οι πρωτεΐνες αναστολείς του σήματος των κυτταροκινών (suppressor of cytokine signaling, SOCS) φαίνεται να είναι οι μεσολαβητές σ αυτή τη δράση [238]. Αντιδρούν με τον υποδοχέα της ινσουλίνης και αναστέλλουν in vivo την ενεργοποίηση από αυτή των κινασών που ρυθμίζονται από εξωκυττάριο σήμα 1/2 (extracellular signal regulated kinase, ERK1/2) και ΡΚΒ και in vitro την φωσφορυλίωση του IRS 1 [239]. 43

56 Εισαγωγή Εικόνα 6. Οι υποδοχείς της αυξητικής ορμόνης (GHR), της ινσουλίνης (IR), του insulin like growth factor 1 (IFG 1), ο υβριδικός υποδοχέας και οι οδοί που ενεργοποιούν προκαλώντας τη μεταγραφή γονιδίων, τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό του κυττάρου και τη μεταφορά της γλυκόζης. SOCS, suppressor of cytokine signaling. Ο ρόλος του αυξητικού παράγοντα τύπου ινσουλίνης (insulin like growth factor 1, IGF 1) στην ανάπτυξη αντίστασης στην ινσουλίνη Ο IGF 1 συντίθεται στο ήπαρ και έχει κυρίως μιτογόνο δράση. Επιπλέον, έχει ενδοκρινικές δράσεις επηρεάζοντας το μεταβολισμό των υδατανθράκων και των λιπιδίων [240]. Συγκεκριμένα, προάγει την πρόσληψη της γλυκόζης από τους περιφερικούς ιστούς και ελαττώνει τα επίπεδα της γλυκόζης στο πλάσμα αλλά με δράση ασθενέστερη από την αντίστοιχη της ινσουλίνης. Η χορήγηση ανασυνδυασμένου IGF 1 σε άτομα με σοβαρή αντίσταση στην ινσουλίνη ή με ΣΔ2 μείωσε την υπεργλυκαιμία και βελτίωσε την ευαισθησία στην ινσουλίνη [241]. Είναι πιθανό ο IGF 1 να διαδραματίζει ρυθμιστικό ρόλο στην ισορροπία μεταξύ των δράσεων της ινσουλίνης και της GH [242], [241]. Οι υποδοχείς της ινσουλίνης (IR) και του IGF 1 (IGFR) ανήκουν στην ίδια οικογένεια. Ο IGF 1 συνδέεται με τον IR αλλά ασθενέστερα από ότι η 44

57 Εισαγωγή ινσουλίνη [243]. Επομένως, οι περισσότερες δράσεις του IGF 1 οφείλονται στην σύνδεσή του στον υποδοχέα του, IGFR, [244] και στον υβριδικό υποδοχέα, που αποτελείται από μία αβ υπομονάδα του IR και μία αβυπομονάδα του IGFR. Ο IGFR ανευρίσκεται σε πολύ μικρές ποσότητες στο ήπαρ [245] υποδηλώνοντας το ρόλο του IGF 1 στην περιφερική πρόσληψη της γλυκόζης και όχι στην ηπατική νεογλυκογένεση. Η ινσουλίνη και ο IGF 1 μοιράζονται τις ίδιες οδούς σηματοδότησης, δηλαδή την οδό της ΡΙ3Κ και της Ras/Raf/MAPK [246]. Μελέτες σε πειραματόζωα με έλλειψη των IR και IGFR δείχνουν ότι για την ακέραιη μετάδοση του σήματος της ινσουλίνης απαιτείται η σωστή λειτουργία τόσο των δύο υποδοχέων όσο και των οδών που αυτοί ενεργοποιούν [247] (Εικόνα 6). Insulin receptor substrate 1 (IRS1) Σε μοριακό επίπεδο η ελαττωμένη πρόσληψη γλυκόζης μπορεί να σχετίζεται είτε με ελαττωμένη φωσφορυλιωτική ικανότητα του IRS1 και ενεργοποίηση της PI3Κ είτε με μειωμένη ποσότητα του IRS1. Η φωσφορυλίωση της σερίνης αποτρέπει την σύνδεση του IRS1 με τον IR [248] και επιπλέον επιταχύνει την αποικοδόμησή του από τα πρωτεοσώματα [115]. Υπάρχει επομένως μία εύθραυστη ισορροπία ανάμεσα στην «θετική» φωσφορυλίωση της τυροσίνης και στην «αρνητική» της σερίνης η οποία καθορίζει τη δράση του IRS1. Η διατάραξη της ισορροπίας αυτής οδηγεί σε παθολογικές καταστάσεις όπως είναι η αντίσταση στην ινσουλίνη που χαρακτηρίζεται από αναστολή της λειτουργίας του IRS1. Αποδείχθηκε ότι διάφοροι παράγοντες όπως ο TNFα, τα ελεύθερα λιπαρά οξέα, το οξειδωτικό στρες, η ενδοθηλίνη, η αγγειοτενσίνη ΙΙ και η υπερινσουλιναιμία μπορούν να ενεργοποιήσουν την κινάση της σερίνης/θρεονίνης που φωσφορυλιώνει το IRS1 και αναστέλλει την λειτουργία του. Η ινσουλίνη έχει την ικανότητα να φωσφορυλιώνει τόσο την τυροσίνη όσο και την σερίνη του IRS1 και με αυτό τον τρόπο ασκεί θετική και αρνητική δράση στην μετάδοση του σήματος (Εικόνα 7). 45

58 Εισαγωγή Εικόνα 7. Το υπόστρωμα του υποδοχέα της ινσουλίνης (IRS1) και οι οδοί που ενεργοποιεί ρυθμίζοντας με αυτό τον τρόπο, τις μεταβολικές λειτουργίες του κυττάρου καθώς και τη μίτωση. GLUT 4 Η ινσουλίνη ενεργοποιεί την μεταφορά της γλυκόζης ενδοκυτταρικά μέσω του υποδοχέα GLUT4 στους ινσουλινοεξαρτώμενους ιστούς όπως είναι οι σκελετικοί και καρδιακοί μύες και ο λιπώδης ιστός. Η οικογένεια των GLUT (GLUcose Transporter) υποδοχέων αποτελείται από 13 πρωτεΐνες εκ των οποίων μόνο ο GLUT4 έχει αναγνωριστεί ως ινσουλινοεξαρτώμενος. Σε φυσιολογικές συνθήκες ο GLUT4 εντοπίζεται κυρίως ενδοκυτταρικά, στη συσκευή του Golgi και σε ανακυκλούμενα ενδοσωμάτια, ενώ μόλις το 2 5% της ποσότητάς του βρίσκεται στην κυτταρική μεμβράνη [249]. Ο GLUT4 μετακινείται συνεχώς μεταξύ των ενδοκυτταρικών τμημάτων και της κυτταρικής μεμβράνης [250, 251] (Εικόνα 8). Η ινσουλίνη ενεργοποιώντας τον υποδοχέα της προκαλεί ανακατανομή του GLUT4, με αποτέλεσμα να 46

59 Εισαγωγή μετακινηθεί προς την επιφάνεια του κυττάρου. Αρχικά προσδένεται (docking) στην κυτταρική μεμβράνη, στη συνέχεια ενσωματώνεται σε αυτή και επιτρέπει την δίοδο γλυκόζης προς το κυτταρόπλασμα. Στο στάδιο αυτό η μεγαλύτερη ποσότητα του GLUT4 βρίσκεται στη επιφάνεια του κυττάρου [252, 253]. Η διαδικασία αυτή επιτυγχάνεται με αύξηση του ρυθμού της μετακίνησής του προς την κυτταρική μεμβράνη και μείωση την ενδοκύττωσής του [253, 254]. Μόλις τερματιστεί το ερέθισμα της ινσουλίνης, τότε ο GLUT4 εισέρχεται εντός του κυττάρου μέσω ενδοκύττωσης εξαρτώμενης από κλαθρίνη. Στη συνέχεια, αποθηκεύεται ενδοκυτταρικά για να ξαναχρησιμοποιηθεί στο επόμενο σήμα της ινσουλίνης. Στην διαδικασία της μετακίνησης του GLUT4 συμμετέχει ο κυτταροσκελετός της ακτίνης [ ]. Επιπλέον, στην όλη διαδικασία απαιτείται η ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ και της TC10, όπως έχει ήδη προαναφερθεί [258, 259]. Στην αντίσταση στην ινσουλίνη διαταράσσεται τόσο η ποσότητα όσο και η μετακίνηση του GLUT 4. Στα λιποκύτταρα ασθενών με παχυσαρκία, διαταραγμένη ανοχή γλυκόζης και ΣΔ2 η ποσότητα του GLUT 4 είναι μειωμένη όχι όμως και στα σκελετικά μυϊκά κύτταρα [260]. Σε άτομα με νοσογόνο παχυσαρκία είναι ελαττωμένη η έκφραση του GLUT 4 στα σκελετικά μυϊκά κύτταρα ενώ στα άτομα με ΣΔ2 χωρίς παχυσαρκία δεν παρατηρήθηκε ελάττωση της έκφρασής του [261]. Φαίνεται ότι η παχυσαρκία διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην έκφραση του GLUT4 και όχι ο διαβήτης. Στους διαβητικούς, ο GLUT 4 φαίνεται ότι παρουσιάζει κάποια διαταραχή στη λειτουργία ή στην μετακίνησή του, η οποία προκαλεί και την μειωμένη πρόσληψη της γλυκόζης από τα σκελετικά μυϊκά κύτταρα [262], ενώ δεν εμφανίζεται μειωμένη έκφρασή του. Επιπλέον, ο GLUT 4 παρουσιάζει διαφορετική ενδοκυτταρική κατανομή στους σκελετικούς μυς ατόμων με αντίσταση στην ινσουλίνη [261]. Συμπερασματικά, η αντίσταση στην ινσουλίνη στους σκελετικούς μυς προκαλεί διαταραχή της οδού μετάδοσης σήματος της ινσουλίνης, η οποία είναι υπεύθυνη για την μετακίνηση του GLUT 4 [263]. 47

60 Εισαγωγή Εικόνα 8. Μετακίνηση των υποδοχέων της γλυκόζης, GLUT 4, μεταξύ της κυτταρικής μεμβράνης και του κυτταροπλάσματος όπου παραμένει σε ενδοσωμάτια. Αξίζει να αναφερθεί ότι η ενδοκύττωση των GLUT 4 είναι εξαρτώμενη της κλαθρίνης. Αντίσταση στην ινσουλίνη, σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2 και αθηροσκλήρωση. Η αντίσταση στην ινσουλίνη συνυπάρχει με νόσους όπως είναι ο σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2, η παχυσαρκία, η πολυκυστική νόσος των ωοθηκών [264] και συχνά συνοδεύεται από νόσους όπως η αρτηριακή υπέρταση και η αθηρογόνος δυσλιπιδαιμία. Τα περισσότερα προαναφερθέντα συνοδά νοσήματα αποτελούν συστατικά του μεταβολικού συνδρόμου μαζί με την αντίσταση στην ινσουλίνη [265]. Είναι γνωστό ότι τόσο το μεταβολικό σύνδρομο όσο και η αντίσταση στην ινσουλίνη σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων [113, 264, ], συχνά δε σχετίζονται και με την παρουσία υποκλινικής αθηροσκλήρωσης [269]. Για πρώτη φορά πριν από μία δεκαετία, με τη μελέτη Insulin Resistance Atherosclerosis Study (IRAS), επιβεβαιώθηκε η σχέση μεταξύ της αντίστασης στην ινσουλίνη και του καρδιαγγειακού κινδύνου [270]. Η αντίσταση στην ινσουλίνη σχετίσθηκε με ενδοεγκεφαλική αθηροσκλήρωση σε άτομα χωρίς ΣΔ2 που υπέστησαν αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο [271] καθώς και με αθηροσκλήρωση των καρωτιδικών αρτηριών σε άτομα με ΣΔ2 [272]. Πρόσφατα γίνεται λόγος για τον καρδιομεταβολικό 48

61 Εισαγωγή κίνδυνο, δηλαδή για τον κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων πριν ή μετά την εμφάνιση σακχαρώδη διαβήτη [ ] υποδηλώνοντας ότι η αντίσταση στην ινσουλίνη είναι πιθανός κοινός παθογενετικός μηχανισμός. Η κυριότερη αιτία πρόκλησης καρδιαγγειακών συμβαμάτων είναι η αθηροσκλήρωση. Αξίζει να σημειωθεί ότι η διαδικασία της αθηροσκλήρωσης λαμβάνει χώρα με την παρουσία ή χωρίς την ύπαρξη προδιαθεσικών παραγόντων και ότι η αντίσταση στην ινσουλίνη απλώς επιταχύνει τη διαδικασία αυτή, όπως και οι υπόλοιποι προδιαθεσικοί παράγοντες. Οι διαταραχές που απαντώνται στην αντίσταση στην ινσουλίνη πέρα από την υπερινσουλιναιμία και την υπεργλυκαιμία είναι η δυσλιπιδαιμία, η προθρομβωτική και προ φλεγμονώδης κατάσταση, το σύνολο των οποίων επηρεάζουν τη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης. Η αντίσταση στην ινσουλίνη προάγει τη διαδικασία της αθηρωμάτωσης είτε μέσω των λιποκυτταροκινών του σπλαχνικού λίπους, είτε με απευθείας δράση της υπερινσουλιναιμίας και της υπεργλυκαιμίας. Είναι γνωστό, ότι η αντίσταση στην ινσουλίνη συχνά συνυπάρχει με την κεντρική παχυσαρκία. Δεν είναι όμως εξακριβωμένο ποια από τις δύο καταστάσεις προηγείται και προκαλεί την άλλη. Πάντως είναι δεδομένο ότι στην αντίσταση στην ινσουλίνη, παράγονται από το σπλαχνικό λιπώδη ιστό ουσίες όπως τα ελεύθερα λιπαρά οξέα, ο TNFα, η IL 6 σε μεγάλες ποσότητες, ενώ αναστέλλεται η παραγωγή άλλων, όπως η αδιπονεκτίνη, που όλα, ξεχωριστά ή από κοινού συμβάλλουν στη δυσλειτουργία του ενδοθηλίου [ ] και την έναρξη της διαδικασίας της αθηρωμάτωσης. Η αδιπονεκτίνη, που έχει κυρίως αντί αθηρογόνο δράση, μέσω αναστολής της έκφρασης μορίων προσκόλλησης, της προσκόλλησης των μονοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα, της φαγοκυττάρωσης των ox LDL, της δημιουργίας των αφρωδών κυττάρων και της μετανάστευσης και πολλαπλασιασμού των λείων μυϊκών κυττάρων, είναι ελαττωμένη στις καταστάσεις με αντίσταση στην ινσουλίνη και με αυτό τον τρόπο προάγει την αθηροσκλήρωση [280]. Η λεπτίνη, που είναι αυξημένη στην αντίσταση στην ινσουλίνη, προάγει την ανοσιακή απάντηση του οργανισμού και αυξάνει τη συσσώρευση της χοληστερόλης στα μακροφάγα [281]. Η παραγωγή αγγειοτενσινογόνου που αποτελεί το πρόδρομο πεπτίδιο της αγγειοτενσίνης ΙΙ, είναι αυξημένη στην αντίσταση στην ινσουλίνη. Η αγγειοτενσίνη ΙΙ, ως γνωστό, προάγει την έκφραση των ICAM 1, VCAM 1, MCP 1, MCSF στο αγγειακό τοίχωμα, το 49

62 Εισαγωγή σχηματισμό αφρωδών κυττάρων και το μεταβολισμό του μονοξειδίου του αζώτου προς ελεύθερες ρίζες [280]. Από την άλλη, είναι γνωστό ότι το ΝΟ δρα προστατευτικά στην έναρξη της διαδικασίας της αθηροσκλήρωσης αποτρέποντας την προσκόλληση των μονοκυττάρων στο ενδοθήλιο. Άλλη μία κυτταροκίνη που είναι αυξημένη στην αντίσταση στην ινσουλίνη είναι ο TNFα, ο οποίος ενεργοποιεί την έκφραση μορίων προσκόλλησης (ICAM 1, VCAM 1) στα ενδοθηλιακά και λεία μυϊκά κύτταρα και των MCP 1 και MCSF [282, 283]. Τέλος, η αυξημένη παραγωγή του ΡΑΙ 1 από το σπλαχνικό λίπος συμβάλλει στην ύπαρξη προ θρομβωτικής κατάστασης κατά την αντίσταση στην ινσουλίνη καθώς αναστέλλει την ινωδόλυση. Έτσι, διαδραματίζει κεντρικό ρόλο κατά τη ρήξη της αθηρωματικής πλάκας και το σχηματισμό του θρόμβου [224]. Στην αντίσταση στην ινσουλίνη, αρχικά δεν προκαλείται αύξηση των επιπέδων της γλυκόζης στο πλάσμα, εξαιτίας της αντισταθμιστικής υπερινσουλιναιμίας που παρατηρείται. Η υπερινσουλιναιμία είναι το αποτέλεσμα της προσπάθειας του οργανισμού να διατηρήσει τη μεταβολική λειτουργία των ινσουλινο εξαρτώμενων κυττάρων του στις καταστάσεις αντίστασης στην ινσουλίνη. Η ινσουλίνη επιτελεί τις ενδοκυττάριες δράσεις της κυρίως μέσω δύο οδών: της ΡΙ3Κ και της ΜΑΡΚ. Η ΡΙ3Κ είναι υπεύθυνη για τις μεταβολικές δράσεις της ινσουλίνης ενώ η ΜΑΡΚ για τη μιτογόνο δράση της. Κατά την αντίσταση στην ινσουλίνη η οδός της ΡΙ3Κ υπολειτουργεί, προκαλώντας την αντισταθμιστική υπερινσουλιναιμία. Η οδός της ΜΑΡΚ λειτουργεί κανονικά [284] και μάλιστα «υπερλειτουργεί» λόγω της αυξημένης συγκέντρωσης της ινσουλίνης. Οι διαταραχές που παρατηρούνται στην αντίσταση στην ινσουλίνη οφείλονται τόσο στην «υπολειτουργία» της οδού ΡΙ3Κ όσο και στην «υπερλειτουργία» της οδού ΜΑΡΚ [285] (Εικόνα 10). Φυσιολογικά, στα ενδοθηλιακά κύτταρα η ινσουλίνη μέσω της οδού της ΡΙ3Κ προάγει την πρόσληψη της γλυκόζης και την παραγωγή του ΝΟ. Το ΝΟ μειώνει την έκφραση των ICAM 1, VCAM 1, Ε σελεκτίνης, MCP 1 και TNFα στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Μέσω της οδού ΜΑΡΚ η ινσουλίνη προάγει την έκφραση γονιδίων που οδηγούν στη διαφοροποίηση και στον πολλαπλασιασμό όλων των κυττάρων. Συγκεκριμένα, στα ενδοθηλιακά κύτταρα αυξάνει την έκκριση ενδοθηλίνης 1 η οποία προκαλεί αγγειοσύσπαση, αυξάνει τη διαπερατότητα του αγγειακού τοιχώματος και προάγει την παραγωγή IL 6. Επιπλέον, αυξάνεται η παραγωγή IL 6 από τα 50

63 Εισαγωγή μονοκύτταρα, ενώ τέλος, αυξάνεται η σύνθεση πρωτεογλυκάνης από τα λεία μυϊκά κύτταρα [286, 287]. Φυσιολογικά, στα ενδοθηλιακά κύτταρα, η ινσουλίνη συνδέεται με τον υποδοχέα της ενεργοποιώντας τον IRS 1. Στη συνέχεια, ενεργοποιείται πρώτα η ΡΙ3Κ και μετά η ΡΚΒ η οποία, τέλος, φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την ενδοθηλιακή συνθετάση του ΝΟ (endothelial synthase of NO, enos). Η enos μετατρέπει την L αργινίνη σε ΝΟ και L κιτρουλίνη με την παρουσία του συμπαράγοντα ΒΗ 4 (tetrahydrobiopterin). Το ΝΟ που παράγεται στην αντίδραση αυτή έχει αντι οξειδωτική δράση καθώς εξουδετερώνει τις ελεύθερες ρίζες (ROS) που παράγονται στο ενδοθήλιο. Εάν δεν υπάρχει διαθέσιμη αργινίνη ή ΒΗ 4 ή αν δυσλειτουργεί η enos τότε από την δράση της enos παράγονται ανιόντα σουπεροξειδίου (Ο 2 ) και περοξυνιτρίτης. Η δυσλειτουργία του ενδοθηλίου που παρατηρείται στη αντίσταση στην ινσουλίνη μπορεί να οφείλεται είτε σε μειωμένη παραγωγή του ΝΟ, είτε στην ελαττωμένη δραστικότητά του είτε στην απενεργοποίησή του. Η ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της enos και την επακόλουθη παραγωγή του ΝΟ [288, 289]. Στην αντίσταση στην ινσουλίνη η μειωμένη λειτουργία της οδού ΡΙ3Κ [290] οδηγεί σε μειωμένη παραγωγή ΝΟ. Επιπλέον, η μειωμένη παραγωγή του ΝΟ μπορεί να οφείλεται σε αυξημένη συγκέντρωση της ασύμμετρης δυμεθυλαργινίνης (asymmetrical dimethylarginine, ADMA). Η ADMA ανταγωνίζεται την L αργινίνη ως υπόστρωμα της enos με αποτέλεσμα να μην παράγεται ΝΟ αλλά να παράγονται ROS. Η ADMA είναι αυξημένη σε άτομα με αντίσταση στην ινσουλίνη και πιθανόν σε αυτό να οφείλεται η δυσλειτουργία του ενδοθηλίου που παρατηρείται [291] (Εικόνα 9). Η μειωμένη βιοδιαθεσιμότητα και η αυξημένη απενεργοποίηση του ΝΟ μπορεί να οφείλονται στις ROS [292], όπως για παράδειγμα το υπεροξείδιο και ο περοξυνιτρίτης. Οι πιθανές πηγές των ROS είναι η οξειδάση της ξανθίνης, οι eνοs που δυσλειτουργούν, τα μιτοχόνδρια και η φαγοκυτταρικού τύπου NADPH οξειδάση [293]. Σε καταστάσεις όπως ο ΣΔ2 και η αντίσταση στην ινσουλίνη το ενδοθήλιο δυσλειτουργεί και παράγει ROS [294], οι οποίες βλάπτουν ακόμη περισσότερο το ενδοθήλιο. 51

64 Εισαγωγή ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Ινσουλίνη Υποδοχέας της Ινσουλίνης IRS 1 PI3K Ρ Ρ ΑΝΤΙΣΤΑΣΗ ΣΤΗΝ ΙΝΣΟΥΛΙΝΗ Ινσουλίνη Υποδοχέας της Ινσουλίνης IRS 1 Ρ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ PKB Ρ PI3K Ρ Ρ enos PKB L αργινίνη ΝΟ + L κιτρουλίνη enos ΒΗ 4 L αργινίνη Ο 2 ROS ADMA ΒΗ 4 Οξειδάση της ξανθίνης Μιτοχόνδρια Δυσλειτουργία των enos NADPH οξειδάση Εικόνα 9. Μεταβολισμός του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ). ADMA, asymmetrical dimethylarginine. ROS, reactive oxygen species. IRS 1, insulin receptor substrate 1. PI3K, 3 phosphatidylinositide kinase. PKB, protein kinase B. enos, endothelial NO synthase. BH 4, hd b Η σχέση της αντίστασης στην ινσουλίνη με την enos είναι αμφίδρομη καθώς πειραματόζωα που δεν εκφράζουν την enos εμφανίζουν αντίσταση στην ινσουλίνη, υπερλιπιδιαμία και αρτηριακή υπέρταση [295]. Ο φαινότυπος αυτός πιθανόν να οφείλεται στην απώλεια του ΝΟ που είναι αντι οξειδωτικό. 52

65 Εισαγωγή Στον άνθρωπο, ίσως ένας πολυμορφισμός που μειώνει τη δραστικότητα της enos να προκαλεί την αντίσταση στην ινσουλίνη. Σε συμφωνία με την υπόθεση αυτή, ένας πολυμορφισμός του γονιδίου της enos σε Ιαπωνικό πληθυσμό σχετίστηκε με αρτηριακή υπέρταση [296]. Το αυξημένο οξειδωτικό στρες των αρτηριών που παρατηρείται στην αντίσταση στην ινσουλίνη οδηγεί τα ενδοθηλιακά κύτταρα στην απόπτωση. Επιπλέον, το ενδοθήλιο που δυσλειτουργεί δεν παράγει ιστικό πλασμινογόνο (tissue plasminogen) προάγοντας με τον τρόπο αυτό την παραγωγή του προθρομβωτικού παράγοντα ΡΑΙ 1 [297, 298]. Στα λεία μυϊκά κύτταρα η ινσουλίνη μέσω της οδού ΡΙ3Κ μεσολαβεί στη διαφοροποίηση τους προς τον παραγωγικό φαινότυπο και στη διατήρησή τους στην κατάσταση αυτή [299, 300]. Σε καταστάσεις με αντίσταση στην ινσουλίνη η οδός της ΡΙ3Κ υπολειτουργεί. Η υπολειτουργία της οδού ΡΙ3Κ οδηγεί στη μετανάστευση και στον πολλαπλασιασμό των λείων μυϊκών κυττάρων μέσω της ενεργοποιημένης οδού της ΜΑΡΚ [301]. Η οδός της ΜΑΡΚ, είναι υπεύθυνη για την μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων γεγονός που επιβεβαιώθηκε πειραματικά όταν σε καλλιέργειες λείων μυϊκών κύτταρων η αναστολή της ΜΑΡΚ ανέστειλε την μετανάστευσή τους ενώ αναστολή της ΡΙ3Κ δεν είχε το ίδιο αποτέλεσμα [302, 303]. Συμπερασματικά, η αθηρογόνος δράση των λείων μυϊκών κυττάρων οφείλεται στην υπερλειτουργία της οδού της ΜΑΡΚ (Εικόνα 10). Η υπερινσουλιναιμία, που παρατηρείται στην αντίσταση στην ινσουλίνη, συμβάλλει και στη δημιουργία αθηρωματικής πλάκας επιρρεπούς στη ρήξη και στη θρόμβωση. Στη δημιουργία της επιρρεπούς πλάκας συμβάλλει η ύπαρξη νεκρωτικής εστίας. Η ινσουλίνη in vitro προάγει τη μετανάστευση των μονοκυττάρων και ουδετερόφιλων όταν συνυπάρχουν οι παράγοντες που παράγονται στην αθηρωματική πλάκα [304, 305]. Επιπλέον, η ινσουλίνη προάγει την απόπτωση των μακροφάγων [306] συμβάλλοντας στο σχηματισμό της νεκρωτικής εστίας. Ιn vivo, η ινσουλίνη προάγει την παραγωγή μεταλλοπρωτεασών, κυρίως της MMP 9, οι οποίες συμβάλλουν στη ρήξη της πλάκας μέσω αποδιοργάνωσης της δομής του κολλαγόνου και της ελαστίνης. Με τον τρόπο αυτό, δημιουργείται μία λεπτή ινώδης κάψα επιρρεπής στη ρήξη [ ]. Στη δημιουργία της θρόμβωσης συμβάλλουν παράγοντες όπως η αυξημένη παραγωγή του ΡΑΙ 1, του ινωδογόνου, και των παραγόντων VII και XII της πήξης [310], που λαμβάνει χώρα, ως γνωστό, στην 53

66 Εισαγωγή αντίσταση στην ινσουλίνη και προάγουν τη συγκόλληση των αιμοπεταλίων [311]. Η υπεργλυκαιμία, που συχνά συνοδεύει την αντίσταση στην ινσουλίνη δημιουργεί ελεύθερες ρίζες (reactive oxygen species, ROS), οι οποίες οδηγούν τα ενδοθηλιακά κύτταρα στην απόπτωση [312, 313] είτε άμεσα, στα μιτοχόνδρια [314, 315] είτε έμμεσα, μέσω της δημιουργίας των τελικών προϊόντων γλυκοζυλίωσης (advance glycosylation end products, AGEs). Επιπλέον, η γλυκόζη μέσω του μονοπατιού της πολυόλης παράγει δυακυλγλυκερόλη η οποία ενεργοποιεί την PKC [316]. Η υπεργλυκαιμία, τα AGEs και η PKC ενεργοποιούν την MAPK προάγοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό [317]. Τέλος, η υπεργλυκαιμία ενεργοποιεί την παραγωγή θεμέλιας ουσίας από τα ενδοθηλιακά κύτταρα οδηγώντας στην πάχυνση της βασικής μεμβράνης. Η διαδικασία αυτή γίνεται μέσω προαγωγής της σύνθεσης κολλαγόνου IV και φιμπρονεκτίνης (Cagliero et al., 1991). Τα λιπίδια και η υπεργλυκαιμία ενεργοποιούν την έκφραση μορίων προσκόλλησης που προσελκύουν και ενεργοποιούν λευκά αιμοσφαίρια και αιμοπετάλια [297, 318]. Οι παραπάνω διαδικασίες επιτυγχάνονται μέσω ενεργοποίησης της PKC και των υποδοχέων των AGEs (RAGEs) [207, 319, 320]. Η ενεργοποίηση της PKC προκαλεί αύξηση της φλεγμονής μέσω ενεργοποίησης του ΝFκΒ, θρόμβωση μέσω παραγωγής του ΡΑΙ 1 και αύξηση της διαπερατότητας των αγγείων μέσω παραγωγής του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (vascular endothelial growth factor) [321, 322]. Η συσσώρευση των AGEs στο αγγειακό τοίχωμα αυξάνει την προσκόλληση των μονοκυττάρων στο ενδοθήλιο και προκαλεί μηχανική δυσλειτουργία του τοιχώματος. Υποδοχείς των AGEs εκφράζονται στα μακροφάγα, στα λεία μυϊκά κύτταρα και στα ενδοθηλιακά κύτταρα όπου ενεργοποιούν την παραγωγή του ΝFκΒ και κατ επέκταση τη φλεγμονή [323]. 54

67 Εισαγωγή Εικόνα 10. Η αντίσταση στην ινσουλίνη προάγει τη δυσλειτουργία του ενδοθηλίου και την αθηροσκλήρωση. Στην αντίσταση στην ινσουλίνη εμφανίζεται αντισταθμιστική υπερινσουλιναιμία η οποία ενεργοποιεί την οδό της ΜΑΡΚ ενώ η οδός της ΡΙ3Κ δεν ανταποκρίνεται στο σήμα της ινσουλίνης. Επιπλέον, παράγοντες της αντίστασης στην ινσουλίνη που συμβάλλουν στην επιτάχυνση της διαδικασίας της αθηροσκλήρωσης είναι η υπεργλυκαιμία, η αυξημένη συγκέντρωση των λιπιδίων και η φλεγμονή. Παχυσαρκία Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας η παχυσαρκία αποτελεί την επιδημία του αιώνα που διανύουμε [324]. Η επίπτωση της παχυσαρκίας παγκοσμίως ανέρχεται στα 315 εκατομμύρια άτομα (ΔΜΣ 30kg/m 2 ) ενώ οι υπέρβαροι ανέρχονται στα 750 εκατομμύρια άτομα (ΔΜΣ 25kg/m 2 ). Η παχυσαρκία είναι προδιαθεσικός παράγοντας για μια πληθώρα νοσημάτων όπως ο σακχαρώδης διαβήτης, η αρτηριακή υπέρταση, η δυσλιπιδαιμία, τα καρδιαγγειακά συμβάματα, η υπνική άπνοια, παθήσεις της χοληδόχου, καρκίνος του παχέος εντέρου, ουρική αρθρίτιδα, οστεοαρθρίτιδα και ορμονικές διαταραχές. 55

68 Εισαγωγή Πίνακας 1. Ταξινόμηση του σωματικού βάρους βάσει του δείκτη μάζας σώματος σύμφωνα με τις οδηγίες του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (World Health Organization, WHO) [325]. Δείκτης Σώματος (kg/m 2 ) <18.5 < Μάζας Ταξινόμηση Ελλιπές σωματικό βάρος Φυσιολογικό σωματικό βάρος Υπερβάλλον σωματικό βάρος Παχυσαρκία Νοσογόνος παχυσαρκία Η παχυσαρκία ταξινομείται με βάση το δείκτη μάζας σώματος [325], ο οποίος υπολογίζεται ως ο λόγος του βάρους (kg) προς το τετράγωνο του ύψους (m) (Πίνακας 1). Μετά την εισαγωγή του μεταβολικού συνδρόμου στην κλινική πράξη δόθηκε περισσότερη βαρύτητα στη κατανομή του λιπώδους ιστού λόγω της διαφορετικής σύστασης και λειτουργίας του σπλαχνικού λίπους, και όχι στην παχυσαρκία καθαυτή. Πραγματικά, ένας σημαντικός αριθμός μελετών δεν κατάφερε να αποδείξει την ύπαρξη ιδιαίτερα ισχυρής συσχέτισης μεταξύ του ΔΜΣ και του κινδύνου εμφάνισης ΣΔ2 και καρδιαγγειακών νοσημάτων [326, 327]. Αντίθετα, αποδείχθηκε ισχυρή συσχέτιση τόσο με την περίμετρο μέσης όσο και το λόγο περιμέτρου μέσης/ισχίων (waist to hip ratio, WHR) [328, 329]. Με βάσει τα δεδομένα αυτά, η παχυσαρκία διαχωρίζεται σε κεντρική ή κοιλιακή ή σπλαχνική παχυσαρκία, όπου η περίμετρος μέσης είναι αυξημένη [>102 εκ. στους άνδρες και >88 εκ. στις γυναίκες, σύμφωνα με τις οδηγίες του NCEP/ATP III (National Cholesterol Education Program/ Adult Treatment Panel III) [ ] λόγω συσσώρευσης του λιπώδους ιστού στην κοιλιακή χώρα, και περιφερική παχυσαρκία, όπου είναι αυξημένη η περίμετρος των ισχίων [WHR <0,9 στους άνδρες και <0,85 στις γυναίκες [333]]. Όπως προαναφέρθηκε, ο λιπώδης ιστός ανάλογα με τη κατανομή του έχει διαφορετική σύσταση και λειτουργία. Συγκεκριμένα, ο σπλαχνικός λιπώδης ιστός παράγει μεγαλύτερες ποσότητες λιποκυτταροκινών και προ φλεγμονωδών παραγόντων και σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων [334]. 56

69 Εισαγωγή Η παχυσαρκία είναι μία πολυπαραγοντική νοσογόνος οντότητα που περιλαμβάνει εκτός από τους βασικούς μηχανισμούς της ενεργειακής ισορροπίας του οργανισμού και την ρύθμισή τους (γονίδια, όρεξη, κατανάλωση ενέργειας και ενδοκρινικούς παράγοντες), τη βιολογική βάση για την δημιουργία της, τη λειτουργία του λιπώδους ιστού, την περιγραφή των προσαρμογών που λαμβάνουν χώρα στην παχυσαρκία και τις επιπλοκές της, στα οποία θα αναφερθούμε λεπτομερώς παρακάτω. Η παχυσαρκία αποτελεί κατά βάση, ένα πρόβλημα ενεργειακής ισορροπίας. Επομένως, για να εκδηλωθεί απαιτείται η ενεργειακή πρόσληψη να ξεπερνά την κατανάλωσή της, με αποτέλεσμα να αυξάνεται το ενεργειακό υπόλοιπο που εναποτίθεται στις ενεργειακές αποθήκες, με τη μορφή λιπώδους ιστού. Η γενετική ανάλυση σε οικογένειες, σε δίδυμα και σε υιοθετημένα παιδιά αποδεικνύει τη γενετική βάση της παχυσαρκίας [ ]. Η γονιδιακή χαρτογράφηση πληθυσμών έδειξε ότι ορισμένα γονίδια όπως το FTO (fat mass and obesity associated) και το MC4R (melanocortin 4 receptor) γονίδιο σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης παχυσαρκίας [ ]. Επιπλέον, ο πρόσφατος χάρτης γονιδίων της ανθρώπινης παχυσαρκίας (Human Obesity Gene Map) καταδεικνύει 253 τόπους ποιοτικών χαρακτηριστικών (Qualitative Trait Loci, QTL) που σχετίζονται με την παχυσαρκία [341]. Πέρα από τις μελέτες γονιδιακής χαρτογράφησης πληθυσμών οι ερευνητές ασχολήθηκαν με τη μελέτη γονιδίων που έχουν βιολογική σημασία στην παχυσαρκία όπως είναι οι PPARγ, οι ασύνδετες πρωτεΐνες (uncoupling proteins 1, 2, 3, UCP1, UCP2, UCP3) και οι β αδρενεργικοί υποδοχείς 1 και 2 και βρέθηκε ότι σχετίζονται με την εμφάνιση της παχυσαρκίας [342]. Η παχυσαρκία που οφείλεται σε ένα μόνο γονίδιο (μονογονιδιακή) αποτελεί ένα πολύ μικρό ποσοστό των παχύσαρκων ατόμων και χαρακτηρίζεται από πρόωρη εμφάνιση και μεγάλη βαρύτητα. Κατά κανόνα, η παχυσαρκία οφείλεται σε συνδυασμούς πολυμορφισμών διαφόρων γονιδίων και παραγόντων. Συμπερασματικά, η παχυσαρκία είναι μία πολυπαραγοντική νόσος με γενετική βάση αλλά για να εκδηλωθεί είναι απαραίτητη τόσο η επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων όπως είναι η απουσία φυσικής άσκησης όσο και διατροφικών παραγόντων όπως η αυξημένη κατανάλωση λιπών, υδατανθράκων και πρωτεϊνών για μεγάλο χρονικό διάστημα. 57

70 Εισαγωγή Στη ρύθμιση του αισθήματος της όρεξης κεντρικό ρόλο παίζει ο εντεροεγκεφαλικός άξονας (gut brain axis). Ο εγκέφαλος δέχεται ενδοκρινικά και νευρικά ερεθίσματα από το γαστρεντερικό σωλήνα μετά την λήψη τροφής και συνδυάζοντάς τα με ερεθίσματα που λαμβάνει από άλλα όργανα, ρυθμίζει το αίσθημα της όρεξης. Ο υποθάλαμος διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της όρεξης. Ο τοξοειδής πυρήνας του υποθαλάμου περιέχει δύο κατηγορίες νευρώνων: τους νευρώνες νευροπεπτίδιο Υ/ Agouti related proteins (Neuropeptide Y, NPY/ Agouti related proteins, AgRP), οι οποίοι αυξάνουν το αίσθημα της όρεξης και τους νευρώνες propiomelanocortin (POMC)/ cocaineamphetamine related transcript (CART), οι οποίοι μειώνουν το αίσθημα της όρεξης. Οι δύο αυτοί νευρώνες, «πρώτης τάξης», επικοινωνούν απευθείας με νευρώνες «δεύτερης τάξης» που βρίσκονται σε ανώτερα κέντρα του εγκεφάλου δηλαδή την πλάγια περιοχή του υποθαλάμου (lateral hypothalamic area) και τον παρακοιλιακό πυρήνα του υποθάλαμου. Στην πλάγια περιοχή του υποθαλάμου δημιουργούν μονοσυναπτικές συνδέσεις με νευρώνες που εκφράζουν τη melanocortin stimulating hormone (MSH) και τις ορεξίνες Α και Β. Στον παρακοιλιακό πυρήνα δημιουργούν συνάψεις με νευρώνες που εκφράζουν την οξυτοκίνη, την thyrotrophin releasing hormone (TRH) και την corticotrophin releasing hormone (CRH). Επιπλέον, οι νευρώνες NPY/AgRP και POMC/CART επικοινωνούν και με άλλα εγκεφαλικά κέντρα όπως για παράδειγμα τον πυρήνα του tractus solitarius στο εγκεφαλικό στέλεχος. Ο υποθάλαμος πέρα από τα ερεθίσματα που δέχεται από το γαστρεντερικό σωλήνα, δέχεται ερεθίσματα από κέντρα του κεντρικού νευρικού συστήματος όπως είναι το οπτικό κέντρο [343] και από άλλα όργανα όπως είναι ο λιπώδης ιστός. Τα ερεθίσματα που δέχεται ο εγκέφαλος από το γαστρεντερικό σωλήνα είναι ενδοκρινικά όπως γκρελίνη, παγκρεατικό πεπτίδιο, πεπτίδιο ΥΥ, χολοκυστοκινίνη, glucagon like peptide 1 (GLP 1), οξειδομοντουλίνη (ΟΧΜ), ινσουλίνη και νευρικά μέσω του πνευμονογαστρικού νεύρου, το οποίο επικοινωνεί με το εγκεφαλικό στέλεχος. Μετά τη λήψη τροφής αυξάνεται το περιεχόμενο του εντερικού αυλού και εκκρίνονται ουσίες όπως χολοκυστοκινίνη, σεροτονίνη [344], παγκρεατικό πεπτίδιο, glucagon like peptide 1 από τα κύτταρα του βλεννογόνου του εντέρου. Οι ουσίες αυτές διεγείρουν το πνευμονογαστρικό νεύρο ρυθμίζοντας έτσι την καταστολή του αισθήματος της όρεξης. Το πνευμονογαστρικό 58

71 Εισαγωγή διεγείρεται επίσης από τη λεπτίνη που εκκρίνεται από τα λιπώδη κύτταρα [345]. Η οξεία ρύθμιση της όρεξης δηλαδή ο καθορισμός της έναρξης και της λήξης του γεύματος οφείλεται τόσο στα ενδοκρινικά και νευρικά ερεθίσματα του γαστρεντερικού σωλήνα όσο και στα μεταβολικά προϊόντα της τροφής όπως είναι η γλυκόζη, τα αμινοξέα και τα λιπαρά οξέα που κυκλοφορούν στο αίμα μετά την απορρόφησή τους από το έντερο. Αντίθετα, η χρόνια ρύθμιση της όρεξης καθορίζεται από ορμόνες όπως η λεπτίνη και η ινσουλίνη που είναι ικανές να μεταβάλλουν τις αποθήκες του λίπους [346]. Στην κατάσταση της νηστείας εκκρίνεται η γκρελίνη η οποία διεγείρει το πνευμονογαστρικό νεύρο και το προσαγωγό ερέθισμα καταλήγει στον τοξοειδή πυρήνα του υποθαλάμου με τελικό αποτέλεσμα την πρόσληψη τροφής. Μετά τη λήψη τροφής, εκκρίνονται από το γαστρεντερικό σωλήνα ουσίες όπως το παγκρεατικό πεπτίδιο, το πεπτίδιο ΥΥ, η χολοκυστοκινίνη, η οξειδομοντουλίνη και το GLP 1. Οι ουσίες αυτές διεγείρουν το πνευμονογαστρικό νεύρο το οποίο μεταφέρει το σήμα στον τοξοειδή πυρήνα του εγκεφάλου και δημιουργείται το αίσθημα του κορεσμού με τελικό σκοπό τον τερματισμό του γεύματος. Τα ενδοκρινικά ερεθίσματα που ρυθμίζουν το αίσθημα της όρεξης διακρίνονται σε αυτά που αυξάνουν την όρεξη, και ονομάζονται ορεξιογόνα, όπως η γκρελίνη, το νευροπεπτίδιο W, το νευροπεπτίδιο Υ, το παγκρεατικό πεπτίδιο, το πεπτίδιο ΥΥ, και η οξειδομοντουλίνη και σε αυτά που μειώνουν την όρεξη, τα ανορεξιογόνα, όπως η χολοκυστοκινίνη, η λεπτίνη και το GLP 1. Η γκρελίνη είναι ένα πολυπεπτίδιο με 29 αμινοξέα που ανακαλύφθηκε το Εκκρίνεται κυρίως από τον στόμαχο και το εγγύς τμήμα του λεπτού εντέρου [347, 348]. Το πεπτίδιο αυτό οδηγεί στη πρόσληψη τροφής και η χρόνια χορήγηση του οδηγεί σε παχυσαρκία [349]. Το νευροπεπτίδιο W εκφράζεται στον υποθάλαμο, στο στόμαχο, στο λεπτό έντερο και στην υπόφυση και ενεργοποιεί την λήψη τροφής σε πειραματόζωα που εκτίθενται στο φώς [350]. Οι πρωτεΐνες ΡΡ (polypeptide fold proteins, PP) αποτελούνται από το νευροπεπτίδιο Υ (neuropeptide Y, NPY), το παγκρεατικό πεπτίδιο (ΡΡ) και το πεπτίδιο ΥΥ (ΡΥΥ). Το νευροπεπτίδιο Υ εκφράζεται κυρίως στο κεντρικό νευρικό σύστημα και η χορήγησή του προάγει την πρόσληψη τροφής [351]. Το ΡΡ συντίθεται στο πάγκρεας και στο παχύ έντερο μετά τη λήψη τροφής [352]. 59

72 Εισαγωγή Καθυστερεί την γαστρική κένωση και αναστέλλει τη μεταγευματική αύξηση της ινσουλίνης [353] μέσω διέγερσης του πνευμονογαστρικού νεύρου. Το πεπτίδιο ΥΥ εκκρίνεται από τα L κύτταρα του γαστρεντερικού σωλήνα μετά τη λήψη τροφής και σχετίζεται με καταστολή της πρόσληψης τροφής μόλις το περιεχόμενο του γαστρεντερικού αυλού φθάσει στον ειλεό. Η χορήγηση του ΡΥΥ στις κοιλίες του εγκέφαλου πειραματόζωων οδήγησε σε αύξηση της πρόσληψης τροφής [354]. Η οξειδομοντουλίνη απελευθερώνεται στη κυκλοφορία μετά τη λήψη τροφής και οδηγεί σε αύξηση της προσλαμβανόμενης τροφής [355]. Η χολοκυστοκινίνη (cholecystokinin, CCK) συντίθεται από τα Ι κύτταρα του λεπτού εντέρου [356] σε απάντηση στη λήψη τροφής και περιορίζει την πρόσληψη τροφής [357]. Η χολοκυστοκινίνη αναστέλλει τη γαστρική κένωση διεγείροντας άμεσα το πνευμονογαστρικό νεύρο και πιθανόν έμμεσα μέσω μηχανικών υποδοχέων τάσης του στομάχου. Το glucagon like peptide 1 (GLP 1) παράγεται μετά από διάσπαση του προ προ γλουκαγόνου στο γαστρεντερικό σωλήνα. Η παραγωγή του GLP 1 διεγείρεται από τη γλυκόζη των τροφών και έχει ινσουλινοτρόπες δράσεις, ενώ παράλληλα αναστέλλει τη γαστρική κένωση, αυξάνει τη μάζα των β κυττάρων του παγκρέατος και αναστέλλει την πρόσληψη τροφής [358]. Το καλύτερα αναγνωρισμένο και μελετημένο περιφερικό σήμα που σχετίζεται με την όρεξη είναι η λεπτίνη. Εκκρίνεται από τον λευκό (σπλαχνικό) λιπώδη ιστό κυρίως, αλλά και από άλλους ιστούς όπως ο πλακούντας [359, 360]. Η ορμόνη αυτή αντιδρά με πολλά ορεξιογόνα και ανορεξιογόνα ερεθίσματα στον υποθάλαμο. Ειδικότερα, η λεπτίνη αναστέλλει τη δράση των ορεξιογόνων, αναστέλλοντας την έκκριση του νευροπεπτιδίου Υ, της ορμόνης melanin concentrating, της ορεξίνης Α, του πεπτιδίου agouti related και των κανναβινοειδών [ ]. Αντίθετα, η λεπτίνη επάγει το ανορεξιογόνο σύστημα (POMC/CART και CRH) [361, 363]. Ο συνδυασμός όλων αυτών των δράσεων της λεπτίνης οδηγεί σε καταστολή της πρόσληψης τροφής. Πράγματι, έχει αποδειχθεί ότι σε παχύσαρκους μύες (ob/ob), όπου δεν συντίθεται η ορμόνη, η χορήγηση ανασυνδυασμένης λεπτίνης ελαττώνει την ποσότητα της προσλαμβανόμενης τροφής στο ένα τέταρτο [364]. Η γαλανίνη είναι ένα πεπτίδιο που αξίζει να αναφερθεί, μολονότι ο ρόλος της στη ρύθμιση της όρεξης δεν είναι πλήρως εξακριβωμένος στον άνθρωπο. Η γαλανίνη παράγεται στους νευρώνες του τοξοειδούς πυρήνα του 60

73 Εισαγωγή υποθαλάμου και η χορήγησή της σε πειραματόζωα αυξάνει την πρόσληψη τροφής [365, 366]. Η δράση της γαλανίνης στη αύξηση της πρόσληψης τροφής πιθανόν να μεσολαβείται από την έκκριση ενός ενδογενούς οπιοειδούς πεπτιδίου, της β ενδορφίνης. Και τούτο γιατί είναι γνωστό ότι οι νευρώνες της γαλανίνης δημιουργούν συνάψεις με τους νευρώνες της β ενδορφίνης [367]. Επιπλέον, η χορήγηση ναλοξόνης, που είναι ανταγωνιστής των οπιοειδών υποδοχέων, πριν τη χορήγηση γαλανίνης σε πειραματόζωα ελάττωσε την αύξηση της πρόσληψης τροφής με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, αποδεικνύοντας ότι η δράση της γαλανίνης μεσολαβείται εν μέρει τουλάχιστον από τους νευρώνες της β ενδορφίνης [368]. Θερμογένεση Η θερμογένεση είναι ο δεύτερος ρυθμιστικός παράγοντας, μετά την αυξημένη πρόσληψη τροφής, για την πρόκληση της παχυσαρκίας. Όπως έχει ήδη αναφερθεί η παχυσαρκία εμφανίζεται όταν η πρόσληψη υπερτερεί της κατανάλωσής ενέργειας. Παρομοίως, οι ενεργειακές αποθήκες μειώνονται μόνο όταν η κατανάλωση υπερτερεί της προσλαμβανόμενης ενέργειας. Η ενεργειακή ισορροπία καθορίζεται από τρείς παράγοντες: το βασικό μεταβολισμό (basal metabolic rate), το θερμικό αποτέλεσμα της τροφής (thermic effect of food) και την θερμογένεση λόγω δραστηριότητας (activity thermogenesis). Στην κατανάλωση ενέργειας πιθανόν να συμβάλλουν σε μικρό ποσοστό και άλλοι παράγοντες όπως τα συναισθήματα και η φαρμακευτική αγωγή. Ο βασικός μεταβολισμός ορίζεται ως η ενέργεια που καταναλώνει ο οργανισμός όταν το άτομο βρίσκεται σε ύπτια θέση σε πλήρη ηρεμία, το πρωί μετά τον ύπνο και μετά την απορρόφηση της τροφής (postabsorptive state). Σε άτομα με καθιστικό τρόπο ζωής ο βασικός μεταβολισμός αντιστοιχεί στο 60% περίπου της ημερήσιας κατανάλωσης ενέργειας. Ενώ η κατανάλωση ενέργειας σε ηρεμία αντιστοιχεί στην ενέργεια που καταναλώνεται όταν το άτομο βρίσκεται σε απόλυτη ηρεμία οποιαδήποτε στιγμή της ημέρας. Το θερμικό αποτέλεσμα της τροφής προκαλείται από το ποσοστό ενέργειας που καταναλώνεται για την πέψη, την απορρόφηση και την 61

74 Εισαγωγή αποθήκευση της τροφής. Αντιστοιχεί στο 10 15% της συνολικής ημερήσιας ενεργειακής κατανάλωσης. Η από τη δραστηριότητα θερμογένεση διακρίνεται στην θερμογένεση αφενός λόγω φυσικής άσκησης και αφετέρου λόγω μη φυσικής άσκησης (ή «αυτόματη» φυσική άσκηση) (non exercise activity thermogenesis, NEAT). Στις ανεπτυγμένες χώρες η θερμογένεση λόγω φυσικής άσκησης είναι πολύ μειωμένη έως σχεδόν μηδενική ενώ η θερμογένεση από αυτόματη φυσική άσκηση αποτελεί την κύρια πηγή θερμογένεσης, ακόμη και στα άτομα που γυμνάζονται τακτικά. Ως αυτόματη θερμογένεση χαρακτηρίζεται η ενέργεια που καταναλώνεται κατά τη διάρκεια της εργασίας, του ελεύθερου χρόνου, του περπατήματος, της ομιλίας, του χορού, των αγορών και γενικότερα όλων των καθημερινών δραστηριοτήτων του ανθρώπου. Είναι προφανές, ότι η αυτόματη θερμογένεση εξαρτάται από τον τρόπο ζωής του καθενός και παρουσιάζει μεγάλη διακύμανση στον πληθυσμό. Η ΝΕΑΤ μπορεί να ευθύνεται για το 15% έως το 50% ή περισσότερο της συνολικής ημερήσιας ενεργειακής κατανάλωσης σε δραστήρια άτομα [369] (Εικόνα 11). Είναι φανερό λοιπόν ότι ο τρόπος ζωής, δηλαδή το καθιστικό επάγγελμα και η αστικοποίηση του πληθυσμού, είναι πιθανό να συμβάλλει στην εμφάνιση της παχυσαρκίας. Στη ρύθμιση της κατανάλωσης της ενέργειας σημαντικό ρόλο διαδραματίζει το κεντρικό νευρικό σύστημα. Τα ΚΝΣ δέχεται ερεθίσματα από την περιφέρεια σχετικά με τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος και την πρόσληψη της τροφής, τα οποία επεξεργάζεται και μέσω του συμπαθητικού νευρικού συστήματος τροποποιεί το ενδοκρινικό σύστημα και τη συμπεριφορά του ατόμου με απώτερο σκοπό τη διατήρηση της ομοιόστασης του οργανισμού. 62

75 Εισαγωγή Ημερήσια κατανάλωση ενέργειας Kcal/ημέρα Θερμογένεση λόγω «αυτόματης» φυσικής άσκησης Θερμικό αποτέλεσμα της τροφής Βασικός μεταβολισμός Εικόνα 11. Η συνολική ημερήσια κατανάλωση ενέργειας αποτελείται από το βασικό μεταβολισμό κατά περίπου 60%, από το θερμικό αποτέλεσμα της προσλαμβανόμενης τροφής κατά περίπου 10 15% και από τη θερμογένεση λόγω «αυτόματης» φυσικής άσκησης κατά περίπου 15 50% ανάλογα με τον τρόπο ζωής του κάθε ατόμου. Το κυριότερο περιφερικό ερέθισμα που φθάνει στον εγκέφαλο είναι η λεπτίνη, η οποία, όπως έχει ήδη αναφερθεί, αναστέλλει την πρόσληψη της τροφής και αυξάνει τη θερμογένεση και την κατανάλωση ενέργειας [370]. Επιπλέον, στο ΚΝΣ καταφθάνουν προσαγωγά ερεθίσματα και από το γαστρεντερικό σωλήνα όπως της ινσουλίνης και της χολοκυστοκινίνης που επιδρούν στη ρύθμιση της θερμογένεσης [371, 372]. Τα κέντρα του εγκεφάλου που είναι υπεύθυνα για τη ρύθμιση της θερμογένεσης είναι οι μεσο πλάγιοι πυρήνες της άνω θωρακικής μοίρας του νωτιαίου μυελού και οι πυρήνες του εγκεφαλικού στελέχους με σημαντικότερο τον raphe pallidus, του υποθαλάμου με σημαντικότερο τον τοξοειδή πυρήνα και της προ οπτικής περιοχής [ ]. Οι νευρώνες των πυρήνων αυτών που είναι υπεύθυνοι για τη θερμογένεση ανήκουν στο κεντρικό σύστημα της μελανοκορτίνης [376, 377]. Το κεντρικό σύστημα της μελανοκορτίνης αποτελείται από τους νευρώνες που εκφράζουν τους αγωνιστές των υποδοχέων της μελανοκορτίνης, α και β (melanocyte stimulating hormone α MSH και β MSH) και τον ανταγωνιστή των υποδοχέων της μελανοκορτίνης, AgRP, καθώς και τους νευρώνες στόχους τους που εκφράζουν τους υποδοχείς της 63

76 Εισαγωγή μελανοκορτίνης 4 και 3 (melanocortin 4 receptor, MC4R, MC3R) [378, 379]. Οι νευρώνες αυτοί δημιουργούν συνάψεις με τους νευρώνες του συμπαθητικού νευρικού συστήματος μεταφέροντας τα απαγωγά ερεθίσματα στα περιφερικά όργανα. Τα περιφερικά όργανα που συμμετέχουν στη ρύθμιση της θερμογένεσης είναι ο φαιός λιπώδης ιστός, οι σκελετικοί μύες και το ήπαρ. Ο φαιός λιπώδης ιστός στον άνθρωπο είναι αυξημένος μόνο κατά την νεογνική ηλικία ενώ στους ενήλικες απαντάται μόνο ως μεμονωμένες μικρές ποσότητες φαιού λιπώδους ιστού μέσα στο λευκό λιπώδη ιστό [380]. Στα κύτταρα του φαιού λιπώδους ιστού υπάρχουν μεγάλα μιτοχόνδρια που εκφράζουν την ασύνδετη πρωτεΐνη 1 (uncoupling protein 1, UCP 1). Η UCP 1 επιτρέπει τη μεταφορά των πρωτονίων εντός της θεμέλιας ουσίας του μιτοχονδρίου, αποτρέποντας τη σύνθεση της τριφωσφορικής αδενοσίνης (adenosine triphosphate, ΑΤΡ). Η οξείδωση λοιπόν των λιπαρών οξέων οδηγεί σε απώλεια ενέργειας μέσω θερμότητας και όχι στη παραγωγή της ΑΤΡ. Φυσιολογικά, τα μιτοχόνδρια είναι η κύρια πηγή παραγωγής ενέργειας μέσω της ταυτόχρονης οξείδωσης των λιπαρών οξέων, του νικοτιναμινο αδενινο δινουκλεοτιδίου (NAD) και του φλαβινο αδενινο δινουκλεοτιδίου (FAD). Στην αναπνευστική αλυσίδα του μιτοχονδρίου τα πρωτόνια μεταφέρονται προς το οξυγόνο με ταυτόχρονη παραγωγή του ΑΤΡ υπό την επίδραση της μιτοχονδριακής ΑΤΡσυνθετάσης. Μέρος της παραγόμενης ενέργειας μετατρέπεται σε θερμότητα δεδομένου ότι η σύνδεση (coupling) της αναπνευστικής αλυσίδας με την παραγωγή του ΑΤΡ είναι κάτω του 100%. Στον ενήλικα άνθρωπο, οι σκελετικοί μύες είναι η κύρια πηγή παραγωγής θερμότητας και κύρια συνιστώσα της καταναλωμένης ενέργειας κατά την ηρεμία [381]. Επιπλέον, στα ασύνδετα πρωτόνια (uncoupling) των σκελετικών μυών και του ήπατος οφείλεται το 20% του βασικού μεταβολισμού στα πειραματόζωα [382]. Τέλος, η θερμογενετική ικανότητα των σκελετικών μυών και του ήπατος σε πειραματόζωα, καθορίζεται από τις θυρεοειδικές ορμόνες και ειδικότερα την τριιωδοθυρονίνη (Τ 3 ). Πράγματι, αποδείχθηκε ότι η θυρεοειδεκτομή μειώνει το βασικό μεταβολικό ρυθμό [382]. Μελέτες σε πειραματόζωα καταδεικνύουν τον ρόλο της θερμογένεσης στην παχυσαρκία. Μελετώντας δύο ομάδες πειραματόζωων, εκ των οποίων η μία αποτελείται από αδύνατα ποντίκια και η άλλη από ποντίκια ομόζυγα για το ob/ob γονίδιο, παρατηρήθηκε ότι όταν έλαβαν την ίδια ποσότητα τροφής, τα παχύσαρκα ποντίκια εμφάνισαν 3 φορές περισσότερη εναπόθεση 64

77 Εισαγωγή ενέργειας από ότι τα αδύνατα [383]. Τα ποντίκια ob/ob, που δεν συνθέτουν λειτουργική λεπτίνη, έχουν μειωμένη την ικανότητα για θερμογένεση μετά από την λήψη τροφής. Αποδεικνύεται, έτσι, ο ρόλος των περιφερικών ερεθισμάτων στη ρύθμιση της θερμογένεσης. Όσον αφορά τους νευρώνες τους υπεύθυνους για τη ρύθμιση της θερμογένεσης, βρέθηκε ότι μετάλλαξη στα γονίδια POMC και MC4R σχετίζεται με σοβαρή παχυσαρκία και αποτελεί τη σημαντικότερη αιτία μονογονιδιακής παχυσαρκίας στον άνθρωπο [ ]. Συμπαθητικό νευρικό σύστημα Το συμπαθητικό νευρικό σύστημα (ΣΝΣ) διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της μεταβολικής και καρδιαγγειακής ομοιόστασης. Η μειωμένη λειτουργία του ΣΝΣ θεωρήθηκε ως προδιαθεσικός παράγοντας εμφάνισης της παχυσαρκίας [387], ενώ η αυξημένη ενεργοποίηση του ΣΝΣ σχετίζεται με νόσους που συχνά συνυπάρχουν με την παχυσαρκία. Οι κινητικοί νευρώνες του ΣΝΣ ξεκινούν από την μεσο πλάγια δέσμη (intermediolateral cell collumn) της θωρακικής και άνω οσφυϊκής μοίρας του νωτιαίου μυελού και φθάνοντας στα συμπαθητικά γάγγλια δημιουργούν συνάψεις με τους μεταγαγγλιακούς νευρώνες. Ο κύριος νευροδιαβιβαστής προγαγγλιακά είναι η ακετυλοχολίνη ενώ μεταγαγγλιακά είναι η νοραδρεναλίνη. Οι μεταγαγγλιακοί νευρώνες νευρώνουν τα όργανα στόχους όπως είναι τα αγγεία, οι νεφροί, η καρδιά και άλλα όργανα. Η απαγωγός λειτουργία (outflow) του ΣΝΣ εξαρτάται από το κάθε όργανο στόχο [388]. Στα παχύσαρκα άτομα, η λειτουργία του ΣΝΣ είναι μειωμένη στην καρδιά, στους νεφρούς [389] και στο λευκό λιπώδη ιστό [390] σε σύγκριση με τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Αντίθετα, η λειτουργία του συμπαθητικού νευρικού συστήματος στους μύες είναι περίπου 50% περισσότερη στα παχύσαρκα άτομα [391]. Συνολικά, η ενεργοποίηση του ΣΝΣ πιθανόν να μην είναι αυξημένη στην παχυσαρκία, σε ολόκληρο το ανθρώπινο σώμα [389]. Εντούτοις, βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ της ενεργοποίησης του ΣΝΣ των μυών και της μάζας του σπλαχνικού λιπώδους ιστού τόσο στα παχύσαρκα όσο και στα αδύνατα άτομα [392]. Επιπλέον, σε άτομα φυσιολογικού βάρους που αύξησαν το βάρος τους λόγω αυξημένης πρόσληψης τροφής, διαπιστώθηκε 65

78 Εισαγωγή ότι η ενεργοποίηση του ΣΝΣ των μυών αυξάνεται με ρυθμό ανάλογο της αύξησης του σωματικού βάρους [392]. Σε συμφωνία με τα παραπάνω είναι και η διαπίστωση ότι, η απώλεια σωματικού βάρους ακολουθείται από μείωση της ενεργοποίησης του ΣΝΣ στους μυς [393]. Πολλοί μηχανισμοί έχουν προταθεί για την ενεργοποίηση του ΣΝΣ στην παχυσαρκία. Μεταξύ αυτών, η ινσουλίνη, η λεπτίνη και το αγγειοτενσινογόνο ΙΙ, για κανένα όμως δεν υπάρχουν ακλόνητα στοιχεία που να υποστηρίζουν την ύπαρξη αιτιολογικής σχέσης. Η επικρατέστερη θεωρία είναι ότι η αυξημένη πρόσληψη τροφής ενεργοποιεί το ΣΝΣ με σκοπό να αυξηθεί η θερμογένεση και η κατανάλωση ενέργειας. Καθώς η πρόσληψη τροφής είναι διαρκώς αυξημένη, το ΣΝΣ παραμένει διαρκώς ενεργοποιημένο στην προσπάθεια του οργανισμού να διατηρήσει, κατά το δυνατό, την ομοιόστασή του [394]. Λευκός λιπώδης ιστός Σημαντικό ρόλο στην ισορροπία ανάμεσα στην πρόσληψη της ενέργειας και την κατανάλωσή της διαδραματίζει ο λευκός λιπώδης ιστός μέσω της εναπόθεσης και της απελευθέρωσης της τριακυλογλυκερόλης. Ο ρόλος αυτός αποδεικνύεται από το γεγονός ότι ως παχυσαρκία ορίζεται κυρίως η αύξηση της μάζας του λευκού λιπώδους ιστού. Πέραν του ρόλου του ως ενεργειακή αποθήκη, ο λευκός λιπώδης ιστός έχει και ενδοκρινική λειτουργία παράγοντας ουσίες όπως η λεπτίνη που έχουν άμεση σχέση με την ενεργειακή ισορροπία [360, 395] καθώς και άλλους παράγοντες, κυρίως κυτταροκίνες που εμπλέκονται στην παθολογία της παχυσαρκίας [395, 396]. Για αρκετό καιρό ο λευκός λιπώδης ιστός θεωρούνταν αποκλειστικά, ως αποθήκη της επιπλέον ενέργειας δεδομένου ότι το λιποκύτταρο αποτελείται κατά το 80% από τριακυλογλυκερόλη και από ένα πολύ μικρό υπολειπόμενο τμήμα κυτταροπλάσματος μεταξύ της κυτταρικής μεμβράνης και της «σταγόνας» λίπους. Η θεωρία αυτή της αποκλειστικής αποθηκευτικής λειτουργίας, διαψεύδεται από το γεγονός ότι στο λιποκύτταρο εκφράζεται ένα σύνολο υποδοχέων μεταφοράς της γλυκόζης. Το λιποκύτταρο εκφράζει 8 από τους 14 μεταφορείς: GLUT1, GLUT3, GLUT4, GLUT5, GLUT8, GLUT10, GLUT12, H + coupled μυοϊνοσιτόλη [397]. Επομένως, ακόμη και στην απλή 66

79 Εισαγωγή διαδικασία της μεταφοράς γλυκόζης εμπλέκονται διάφορες πρωτεΐνες που είναι ινσουλινοεξαρτώμενες (GLUT4). Λιποκυτταροκίνες Ο λιπώδης ιστός εκτός από τα λιπαρά οξέα, που είναι το σημαντικότερο ποσοτικά προϊόν του, απελευθερώνει επίσης χοληστερόλη, ρετινόλη, στεροειδείς ορμόνες και προσταγλανδίνες [398]. Οι ουσίες αυτές δεν συντίθενται de novo στον λιπώδη ιστό, μολονότι κάποιες μετατροπές λαμβάνουν χώρα. Η ανακάλυψη της λεπτίνης το 1994 οδήγησε στην αναγνώριση του λιπώδους ιστού ως ενδοκρινές όργανο [132] παρόλο ότι παλαιότερα ήταν γνωστή η ικανότητα του να παράγει ορισμένες πρωτεΐνες όπως την αδιπσίνη, την λιποπρωτεϊνική λιπάση και τον TNFα [190, 399]. Είναι γενικώς αποδεκτό ότι ο λιπώδης ιστός εκκρίνει ένα μεγάλο αριθμό ουσιών που ονομάζονται λιποκυτταροκίνες [395, 396]. Οι λιποκυτταροκίνες παρουσιάζουν μεγάλη ετερογένεια τόσο στην δομή όσο και στην λειτουργία τους. Μεταξύ αυτών συγκαταλέγονται οι κλασσικές κυτταροκίνες όπως η IL 6 και ο TNFα, ο αυξητικός παράγων μετασχηματισμού (transforming growth factor β, TGFβ), οι πρωτεΐνες της εναλλακτικής οδού του συμπληρώματος όπως η αδιπσίνη, οι πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην ομοιόσταση του πηκτικού/ινωδολυτικού μηχανισμού όπως ο ΡΑΙ 1 και ο ιστικός παράγοντας (tpa), στην ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης όπως το αγγειοτενσινογόνο, στο μεταβολισμό των λιπιδίων (cholesterol ester transfer protein, retinol binding protein), στην ομοιόσταση της γλυκόζης όπως η αδιπονεκτίνη, και στην αγγειογένεση όπως ο παράγοντας ανάπτυξης του ενδοθηλίου των αγγείων, αλλά και οι πρωτεΐνες οξείας φάσης και του στρες (απτοσφαιρίνη, μεταλλοθειονίνη). Ο μεγάλος αριθμός και η πολυπλοκότητα των ουσιών που παράγονται από τον λευκό λιπώδη ιστό αποδεικνύει το ρόλο του σε ένα σημαντικό αριθμό φυσιολογικών και παθολογικών μεταβολικών λειτουργιών των θηλαστικών [395, 396]. Ο λευκός λιπώδης ιστός επικοινωνεί με πληθώρα άλλων οργάνων. Σε καλλιέργειες κυττάρων αποδείχθηκε ότι τα λιποκύτταρα επικοινωνούν μέσω χυμικών σημάτων με άλλους ιστούς όπως είναι οι σκελετικοί μυς και ο φλοιός των επινεφριδίων [400, 401]. Επιπλέον, υπάρχει άμεση επικοινωνία 67

80 Εισαγωγή ανάμεσα στο λευκό λιποκύτταρο και τον εγκέφαλο μέσω της λεπτίνης και του συμπαθητικού νευρικού συστήματος [360]. Μία άλλη νεότερη λιποκυτταροκίνη είναι ο παράγοντας ανάπτυξης των νεύρων (NGF) που πιθανόν να αποτελεί το κλειδί στην επικοινωνία μεταξύ του λιποκυττάρου και του συμπαθητικού νευρικού συστήματος χωρίς όμως να έχει αποδειχθεί. Ο νευροτροφικός αυτός παράγοντας εκφράζεται στα ώριμα λιποκύτταρα των ποντικών και στις αποθήκες λίπους του ανθρώπου [402]. Σε καλλιέργειες λιποκυττάρων βρέθηκαν παράγοντες που επηρεάζουν την παραγωγή του NGF. Ανασταλτική δράση στην παραγωγή του NGF στον φαιό λιπώδη ιστό έχουν η αδρεναλίνη και η ισοπρεναλίνη, ενώ στον λευκό λιπώδη ιστό έχουν ελάχιστη επίδραση. Αναστολείς του NGF είναι επίσης, η ινσουλίνη, η δεξαμεθαζόνη και η ροσιγλιταζόνη, πιθανόν μέσω της αντιφλεγμονώδους δράσης τους. Επαγωγική δράση στην έκφραση και την παραγωγή του NGF έχει η προ φλεγμονώδης κυτταροκίνη TNFα. Ο NGF συμμετέχει στην φλεγμονώδη διαδικασία στον λευκό λιπώδη ιστό [402]. Φλεγμονή Ο λευκός λιπώδης ιστός εκκρίνει πολλές λιποκυτταροκίνες που σχετίζονται με την φλεγμονή όπως NGF, TNFα, IL 6, IL 8, IL 10, απτοσφαιρίνη, αμυλοειδές Α, και ΡΑΙ 1 [396, 403]. Σε πρόσφατες μελέτες φαίνεται ότι ο TNFα στο λευκό λιποκύτταρο επάγει την έκφραση του NGF και της MCP 1 σε πολύ μεγαλύτερο βαθμό από ότι οι υπόλοιπες λιποκυτταροκίνες. Η διαπίστωση αυτή εξηγεί την παρουσία μακροφάγων στον λευκό λιπώδη ιστό κατά την παχυσαρκία [404]. Η παχυσαρκία αναγνωρίζεται ως μια χρόνια φλεγμονή όπως και ο σακχαρώδης διαβήτης [405, 406]. Αυτό αποδεικνύεται από τα αυξημένα επίπεδα των κυκλοφορούντων παραγόντων της φλεγμονής όπως IL 6, C αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) και η απτοσφαιρίνη, στην παχυσαρκία, και τα οποία ελαττώνονται μετά την απώλεια βάρους [405, 406]. Δεν είναι γνωστό εάν τα αυξημένα επίπεδα ορισμένων φλεγμονωδών παραγόντων που παρατηρούνται στην παχυσαρκία οφείλονται στην αυξημένη παραγωγή τους από τον λευκό λιπώδη ιστό ή είναι αποτέλεσμα της αυξημένης μάζας του. 68

81 Εισαγωγή Καταστάσεις όπως η αντίσταση στην ινσουλίνη και το μεταβολικό σύνδρομο σχετίζονται με την παχυσαρκία [407, 408]. Δεν είναι όμως γνωστό ποιο είναι το πρώτο συμβάν, πιθανόν η σχέση να είναι αμφίδρομη. Εάν θεωρήσουμε ότι ο αυξημένος λιπώδης ιστός είναι η πρώτη διαταραχή, τότε εξηγούνται τα αυξημένα επίπεδα πλάσματος και η αυξημένη έκφραση των λιποκυτταροκινών που παρατηρούνται τόσο στα παχύσαρκα άτομα όσο και στα άτομα με αντίσταση στην ινσουλίνη και μεταβολικό σύνδρομο [194, 409, 410]. Δεν είναι γνωστό, μέχρι σήμερα, αν η αυξημένη συγκέντρωση των λιποκυτταροκινών οφείλεται στην αυξημένη μάζα του λιπώδους ιστού ή στην αυξημένη παραγωγή τους ανά λιποκύτταρο. Ένα σημαντικό ερώτημα που τίθεται είναι γιατί να παράγονται οι κυτταροκίνες σε τόσο μεγάλη ποσότητα όταν αυξάνεται η μάζα του λιπώδους ιστού. Μία πιθανή απάντηση είναι ότι λόγω της αυξανόμενης μάζας των λιποκυττάρων επικρατούν καταστάσεις σχετικής υποξίας στα κύτταρα που βρίσκονται μακριά από τα αγγεία. Η υποξία αποτελεί το ερέθισμα για την παραγωγή του hypoxia inducible factor 1β (HIF 1β) [411, 412]. Ο παράγοντας αυτός προάγει την μεταγραφή πολλών γονιδίων, μεταξύ των οποίων της λεπτίνης στα προ λιποκύτταρα του ανθρώπου [413] και της IL 6 και του VEGF στα λιποκύτταρα [414]. Αξίζει να σημειωθεί ότι η υποξία οδηγεί σε αντίσταση στην ινσουλίνη στα λιποκύτταρα [415] μέσω του παράγοντα HIF και αποτελεί τον πιθανό παθογενετικό σύνδεσμο μεταξύ της παχυσαρκίας και της αντίστασης στην ινσουλίνη. Η φλεγμονή φαίνεται ότι είναι ένας πιθανός συνδετικός κρίκος μεταξύ της παχυσαρκίας και της αντίστασης στην ινσουλίνη. Πρώτοι οι Crook et al. [416] και Pickup et al. [417] αναφέρουν τον σακχαρώδη διαβήτη ως φλεγμονώδη κατάσταση που χαρακτηρίζεται από αυξημένες συγκεντρώσεις παραγόντων της φλεγμονής στο πλάσμα όπως είναι το σιαλικό οξύ και η IL 6. Οι μελέτες στράφηκαν στη δυνατότητα πρόβλεψης της εμφάνισης του σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 χρησιμοποιώντας ως δείκτες τους παράγοντες της φλεγμονής. Οι Schmidt et al. [418] αποδεικνύουν ότι η παρουσία των μεσολαβητών της φλεγμονής προβλέπει την εμφάνιση του ΣΔ2 σε ενήλικα άτομα. Μία πιο πρόσφατη δημοσίευση αποτελεσμάτων της ίδιας μελέτης καταλήγει ότι τα αυξημένα επίπεδα πλάσματος της CRP, IL 6, του orosomucoid και του σιαλικού οξέος προβλέπουν την εμφάνιση ΣΔ2 και χρησιμοποιώντας ένα συνολικό δείκτη φλεγμονής με αυτές τις 4 παραμέτρους 69

82 Εισαγωγή μαζί με τον συνολικό αριθμό των λευκών αιμοσφαιρίων και το ινωδογόνο πλάσματος δείχνουν ότι έχουν αυξημένο κίνδυνο για την εμφάνιση του ΣΔ2 κατά 3,7 φορές (σε σχέση με το υψηλότερο και χαμηλότερο τριτημόριο) σε καυκάσιους μη καπνιστές [419]. Η συνύπαρξη κάποιων πολυμορφισμών των μορίων της φλεγμονής και της παχυσαρκίας αυξάνει τον κίνδυνο για την εμφάνιση της αντίστασης στην ινσουλίνη και του ΣΔ2. Ειδικότερα η εμφάνιση των μεταλλάξεων G 308A του TNFα και C 124G της IL 6 στα παχύσαρκα άτομα συνοδεύεται από διπλάσιο κίνδυνο εμφάνισης ΣΔ2 σε σύγκριση με τους υπόλοιπους γονότυπους. Η μετάλλαξη G 308A του TNFα σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα του TNFα στο πλάσμα και έχει 1,8 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο για την εμφάνιση ΣΔ2. Η μετάλλαξη C 124G της IL 6 αυξάνει τον κίνδυνο εμφάνισης αντίστασης στην ινσουλίνη [420]. Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις βρίσκεται το γεγονός ότι η συγκέντρωση της αδιπονεκτίνης πλάσματος, η οποία ως γνωστό παρουσιάζει αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες, εμφανίζει αρνητική συσχέτιση με την αντίσταση στην ινσουλίνη, τη διαστολική πίεση, τη συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων, τη σχέση περιμέτρου μέσης/περιμέτρου ισχίων, και την συγκέντρωση των υποδοχέων του TNFα [421]. Η λεπτίνη, μία άλλη λιποκυτταροκίνη που είναι αυξημένη στα παχύσαρκα άτομα, έχει προ θρομβωτική δράση στα αιμοπετάλια και πιθανόν ελέγχει την ανοσολογική απάντηση μέσω ενεργοποίησης της απάντησης στην φλεγμονή. Σε καταστάσεις μειωμένης πρόσληψης τροφής, η χαμηλή συγκέντρωση της λεπτίνης πιθανόν να ευθύνεται για την μειωμένη ανοσολογική απάντηση του οργανισμού. Μια υπόθεση που υποστηρίζεται σε πειράματα όπου ομόζυγοι μύες (ob/ob), που δεν παράγουν λεπτίνη και ομόζυγοι μύες (db/db), που δεν έχουν τους υποδοχείς της λεπτίνης είναι ιδιαίτερα ευάλωτοι στις λοιμώξεις [422]. Επιπλέον οι ob/ob μύες δεν πάσχουν από αυτοάνοσα νοσήματα. Οι παραπάνω διαταραχές αποκαθίστανται μετά τη μακροχρόνια χορήγηση λεπτίνης. Ο TNFα αναστέλλει την αυτο φωσφορυλίωση της τυροσίνης του υποδοχέα της ινσουλίνης και επάγει την φωσφορυλίωση της σερίνης του υποστρώματος του υποδοχέα της ινσουλίνης (IRS 1, IRS 2) γεγονός που με την σειρά του εμποδίζει την φωσφορυλίωση της τυροσίνης, προκαλώντας έτσι, αντίσταση στην ινσουλίνη [248]. Στα ενδοθηλιακά κύτταρα της αορτής 70

83 Εισαγωγή διαπιστώθηκε ότι ο TNFα αναστέλλει όχι μόνο την φωσφορυλίωση της τυροσίνης αλλά και την έκφραση του υποδοχέα της ινσουλίνης [423]. Η IL 6 αναστέλλει την μετάδοση του σήματος της ινσουλίνης στα ηπατοκύτταρα μέσω της δράσης των SOCS 3 (suppressor of cytokine signaling 3). Η πρωτεΐνη SOCS 3 συνδέεται με τον υποδοχέα της ινσουλίνης και αναστέλλει την φωσφορυλίωση της τυροσίνης του IRS 1 και κατ επέκταση την σύνδεση του με την κινάση του 3 φωσφατιδοϊνοσιτιδίου (ΡΙ3Κ) [424]. Ψυχολογικό στρες Παχυσαρκία Λεπτίνη Ενεργοποίηση του NFκΒ Φλεγμονή Κάπνισμα Πρόσληψη τροφής Γλυκόζης πλάσματος Ελεύθερα λιπαρά οξέα Ελεύθερες ρίζες Κυτταροκίνες (TNFα, IL 6) και CRP Μετάδοση του σήματος της ινσουλίνης Γενετικοί παράγοντες Καταστροφή του β κυττάρου Γενετικοί παράγοντες (ΣΔ2, ΣΔ1) Εικόνα 12. Η αυξημένη πρόσληψη τροφής αυξάνει τη παραγωγή των ελευθέρων ριζών και την ενεργοποίηση του NFκB με τελικό αποτέλεσμα τη διαταραχή στη μετάδοση του σήματος της ινσουλίνης. Πρόσληψη τροφής και φλεγμονή Είναι γνωστό ότι η πρόσληψη γλυκόζης προάγει το οξύ οξειδωτικό στρες και την φλεγμονή σε μοριακό επίπεδο για τις επόμενες τρεις ώρες περίπου [425]. Αντίθετα ο περιορισμός της τροφής σε παχύσαρκα άτομα για 4 εβδομάδες οδηγεί σε σημαντική μείωση του οξειδωτικού στρες [426]. Νηστεία 48 ωρών οδηγεί σε μείωση κατά 50% της παραγωγής των ελεύθερων ριζών από τα λευκοκύτταρα και ελάττωση της έκφρασης της NADPΗ οξειδάσης, το 71

84 Εισαγωγή ένζυμο που μετατρέπει το μόριο του οξυγόνου σε ρίζα υπεροξειδίου. Η ρίζα του υπεροξειδίου ενεργοποιεί τον προ φλεγμονώδη μεταγραφικό παράγοντα NFκB, ο οποίος ενεργοποιεί την μεταγραφή των περισσότερων γονιδίων που σχετίζονται με τη φλεγμονή. Επομένως, η προ οξειδωτική και προφλεγμονώδης επίδραση της αυξημένης πρόσληψης της τροφής στα φυσιολογικά άτομα είναι παρόμοια με την βασική κατάσταση των παχύσαρκων ατόμων [422] (Εικόνα 12). Είναι πιθανόν η προ φλεγμονώδης κατάσταση στην παχυσαρκία να οφείλεται στην χρόνια αυξημένη πρόσληψη της τροφής. Πράγματι, οι αυξημένες συγκεντρώσεις των παραγόντων της φλεγμονής όπως ινωδογόνο, ceruloplasmin, orosomucoid, x antitrypsin προδικάζει την μελλοντική εμφάνιση παχυσαρκίας [427]. Έτσι, και στο ΣΔ2 η χρόνια υπεργλυκαιμία επιδεινώνει αυτή την προ φλεγμονώδη κατάσταση. Αντι φλεγμονώδης δράση της ινσουλίνης Η κατάσταση της αντίστασης στην ινσουλίνη προάγει την φλεγμονή. Εντούτοις, η ινσουλίνη καθαυτή έχει αντι φλεγμονώδη δράση σε μοριακό επίπεδο in vitro και in vivo. Χορήγηση μικρής ποσότητας ινσουλίνης μειώνει την παραγωγή των ROS από τα μονοκύτταρα, καταστέλλει την έκφραση της NADPΗ οξειδάσης, την ενδοκυττάρια σύνδεση του NFκB, προάγει την έκφραση του αναστολέα κβ (inhibitor of kappa B, ΙκΒ) και μειώνει τη συγκέντρωση στο πλάσμα του ICAM 1 και του MCP 1. Διακόπτοντας τη μετάδοση του σήματος της ινσουλίνης εμποδίζεται η αντί φλεγμονώδης δράση της. Συμπερασματικά, στην αντίσταση στην ινσουλίνη παρά την ύπαρξη υπερινσουλιναιμίας, η ινσουλίνη δεν μπορεί να ασκήσει την αντιφλεγμονώδη δράση της εξαιτίας της υπολειτουργίας της οδού ΡΙ3Κ, με αποτέλεσμα τη δημιουργία μιας προ φλεγμονώδους κατάστασης. Παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη Ο λιπώδης ιστός ρυθμίζει το μεταβολισμό του οργανισμού μέσω της απελευθέρωσης μη εστεροποιημένων λιπαρών οξέων (non esterified fatty acids, NEFAs), γλυκερόλης, ορμονών όπως λεπτίνης και αδιπονεκτίνης και 72

85 Εισαγωγή προ φλεγμονωδών κυτταροκινών όπως TNFα, IL 6 και MCP 1 [408, 428, 429]. Στην παχυσαρκία, πολλοί από αυτούς τους παράγοντες βρέθηκαν αυξημένοι. Στην παχυσαρκία παρουσιάζεται αυξημένη παραγωγή των φλεγμονωδών παραγόντων όπως ο TNFα και η IL 6 από τον λευκό λιπώδη ιστό, όπως έχει ήδη αναφερθεί. Ο TNFα και η IL 6 μέσω της ενεργοποίησης των οδών JNK και IKκβ/NFκΒ προάγουν άλλους φλεγμονώδεις παράγοντες που μπορούν να οδηγήσουν σε αντίσταση στην ινσουλίνη [408, 430]. Οι οδοί που πιθανόν εμπλέκονται στην ανάπτυξη αντίστασης στην ινσουλίνη μέσω ενεργοποίησης κυτταροκινών είναι των πρωτεϊνών SOCS [239] και της επαγώγιμης συνθετάσης του μονοξειδίου του αζώτου (inducible nitric oxide synthase, inos) [431]. Από την άλλη, η απελευθέρωση της MCP 1 από τα λιποκύτταρα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα μονοκύτταρα προσελκύει περισσότερα μονοκύτταρα συντηρώντας με αυτό τον τρόπο την φλεγμονώδη κατάσταση [404, 432]. Η απελευθέρωση των NEFAs αποτελεί τον σημαντικότερο παράγοντα ρύθμισης της ινσουλινοευαισθησίας. Αυξημένα επίπεδα NEFAs παρατηρούνται στην παχυσαρκία και το ΣΔ2, καταστάσεις που σχετίζονται με την αντίσταση στην ινσουλίνη [433, 434]. Στον άνθρωπο, η οξεία αύξηση των NEFAs στο πλάσμα ακολουθείται μετά από λίγες ώρες από παροδική αντίσταση στην ινσουλίνη [435]. Σε ακολουθία με τα παραπάνω, η πρόσληψη γλυκόζης από τους περιφερικούς ιστούς και η ινσουλινοευαισθησία αυξήθηκε μετά από ελάττωση των NEFAs στο πλάσμα που επιτεύχθηκε με λιπολυτική αγωγή με acipimox [436]. Ένας πιθανός μηχανισμός είναι τα NEFAs που συσσωρεύονται ενδοκυτταρικά, ανταγωνίζονται τη γλυκόζη ως οξειδωτικό υπόστρωμα. Το αποτέλεσμα είναι η αναστολή της πυρουβικής δεϋδρογονάσης, της φωσφοφρουκτοκινάσης και της εξοκινάσης (hexokinase) II [201]. Ένας άλλος πιθανός μηχανισμός είναι η αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης μεταβολιτών των NEFAs όπως, της διακυλογλυκερόλης, του ακυλο συνένζυμου Α και του κεραμίδιου, τα οποία ενεργοποιούν την κινάση της σερίνης/θρεονίνης, όταν υπάρχει αυξημένη προσφορά και μειωμένος μεταβολισμός των NEFAs. Όπως έχει ήδη περιγραφεί, η ενεργοποίηση της κινάσης αυτής οδηγεί στη φωσφορυλίωση της σερίνης του IRS1/2 με συνέπεια την αδυναμία του να ενεργοποιήσει την ΡΙ3Κ [437]. Το αποτέλεσμα είναι η μη μετάδοση του σήματος της ινσουλίνης ενδοκυτταρικά προς την οδό ΡΙ3Κ. 73

86 Εισαγωγή Η κατανομή του λιπώδους ιστού παίζει καθοριστικό ρόλο στην ινσουλινοευαισθησία. Αν και η αντίσταση στην ινσουλίνη χαρακτηρίζει την παχυσαρκία γενικότερα, η ινσουλινοευαισθησία στα ισχνά άτομα παρουσιάζει διαφορές, λόγω διαφορετικής κατανομής του λιπώδους ιστού [438, 439]. Ισχνά άτομα με περισσότερη εναπόθεση του λίπους στην περιφέρεια είναι περισσότερο ινσουλινοευαίσθητα από ότι ισχνά άτομα με κεντρική συσσώρευση του λίπους στην κοιλιακή χώρα. Γεγονός, που μπορεί να εξηγηθεί από τις διαφορετικές ιδιότητες του σπλαχνικού κοιλιακού λιπώδη ιστού από αυτές του υποδόριου. Ο σπλαχνικός λιπώδης ιστός εκφράζει, όπως προαναφέρθηκε, ένα σύνολο γονιδίων υπεύθυνων για τη σύνθεση πρωτεϊνών. Οι πρωτεΐνες αυτές είναι υπεύθυνες για την παραγωγή ενέργειας [440]. Επιπλέον, το σπλαχνικό λίπος έχει μεγαλύτερη λιπολυτική ικανότητα και είναι λιγότερο ευαίσθητο στην αντι λιπολυτική δράση της ινσουλίνης από ότι το υποδόριο λίπος [441]. Το σπλαχνικό λίπος βρίσκεται εγγύς του ήπατος και η θέση αυτή πιθανόν να σχετίζεται με αυξημένη έκθεση του ήπατος σε NEFAs σε σύγκριση με τους περιφερικούς ιστούς. Η υπόθεση αυτή μπορεί να εξηγήσει την αντίσταση στην ινσουλίνη του ήπατος όταν αυτή δεν παρατηρείται σε περιφερικούς ιστούς [442]. Παχυσαρκία και καρδιαγγειακό σύστημα Η κεντρική παχυσαρκία και η αντίσταση στην ινσουλίνη αυξάνουν το κίνδυνο για καρδιαγγειακά νοσήματα μέσω τόσο των κλασικών παραγόντων κινδύνου (αθηρογόνος δυσλιπιδαιμία, αρτηριακή υπέρταση και διαταραχές του μεταβολισμού της γλυκόζης), όσο και νεότερων παραγόντων όπως λιποκυτταροκίνες (λεπτίνη και αδιπονεκτίνη), προ φλεγμονώδεις κυτταροκίνες (IL 6 και CRP), ινωδολυτικοί παράγοντες (ΡΑΙ 1). Όλοι οι παράγοντες αυτοί προκαλούν αυξημένο οξειδωτικό στρες, δυσλειτουργία του ενδοθηλίου και τελικά αθηρογένεση (Εικόνα 13). Η δυσλιπιδαιμία στην παχυσαρκία χαρακτηρίζεται από αυξημένα επίπεδα των λιποπρωτεϊνών πολύ χαμηλής πυκνότητας (very low density lipoprotein, VLDL), της ολικής χοληστερόλης, των τριακυλογλυκερολών, των μικρών και πυκνών LDL χοληστερολών και χαμηλά επίπεδα της HDLχοληστερόλης [443]. Δεν είναι γνωστό αν η υπερχοληστεριναιμία αυξάνει 74

87 Εισαγωγή περισσότερο τον κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων στα άτομα με παχυσαρκία. Είναι γνωστό όμως ότι η αντίσταση στην ινσουλίνη που συνοδεύεται από κεντρική παχυσαρκία αυξάνει σημαντικά τον κίνδυνο καρδιαγγειακής νόσου σε άτομα με οικογενή υπερχοληστεριναιμία [444]. Επιπρόσθετα, η παχυσαρκία μειώνει την αποτελεσματικότητα της υπολιπιδαιμικής φαρμακευτικής αγωγής [445]. Στην αντίσταση στην ινσουλίνη παρατηρούνται μικρές και πυκνές LDLχοληστερόλες όπως και στην παχυσαρκία. Η LDL χοληστερόλη είναι εμπλουτισμένη με τριακυλογλυκερόλη, η οποία υδρολύεται στο ήπαρ από την ηπατική λιπάση και απελευθερώνεται στη κυκλοφορία μικρή και πυκνή LDLχοληστερόλη. Η δράση της ηπατικής λιπάσης είναι αυξημένη στην αντίσταση στην ινσουλίνη οδηγώντας στην παραγωγή των μικρών και πυκνών LDLχοληστερολών, που είναι επιρρεπή σε οξείδωση και γλυκοζυλίωση (glycation). Αυτή η LDL χοληστερόλη περνά ευκολότερα στον υπενδοθηλιακό χώρο των αγγείων όπου οξειδώνεται ευκολότερα και σηματοδοτεί την έναρξη της διαδικασίας της αθηρωμάτωσης [446]. Η κύρια διαταραχή των λιπιδίων που απαντάται στην παχυσαρκία είναι η αυξημένη παραγωγή της λιποπρωτεϊνης πολύ χαμηλής πυκνότητας (very low density lipoprotein, VLDL), ως αποτέλεσμα της ηπατικής στεάτωσης. Στην αντίσταση στην ινσουλίνη, η αποδόμηση της ApoB 100 είναι μειωμένη οδηγώντας σε αυξημένη σύνθεση της VLDL χοληστερόλης. Η δράση της λιποπωτεϊνικής λιπάσης είναι μειωμένη προκαλώντας ελάττωση της αποδόμησης της VLDL χοληστερόλης [447]. Σε αυτό πιθανόν να συμβάλλει και το γεγονός ότι στην αντίσταση στην ινσουλίνη είναι μειωμένη η δράση των υποδοχέων των υπεύθυνων για την απομάκρυνση της VLDL χοληστερόλης από την κυκλοφορία, LDL υποδοχείς (LDLR) [448]. Στην παχυσαρκία η παρατηρούμενη μειωμένη συγκέντρωση της HDLχοληστερόλης οφείλεται εν μέρει στην μειωμένη παραγωγή της και εν μέρει στην αυξημένη αποδόμησή της. Η μειωμένη παραγωγή οφείλεται στην μειωμένη λιπόλυση των πλούσιων σε τριακυλογλυκερόλη λιποπρωτεϊνών με αποτέλεσμα τη μειωμένη μεταφορά των φωσφολιπιδίων και απολιποπρωτεϊνών από αυτές προς την HDL χοληστερόλη. Η αυξημένη αποδόμηση της HDL χοληστερόλης οφείλεται στην αυξημένη δράση της ηπατικής λιπάσης που παρουσιάζεται σε καταστάσεις με αντίσταση στην ινσουλίνη όπως η παχυσαρκία [449]. 75

88 Εισαγωγή Η υπέρταση στην παχυσαρκία οφείλεται από τη μια πλευρά στην ύπαρξη μειωμένου ΝΟ (nitric oxide) λόγω αυξημένου οξειδωτικού στρες ή/και λόγω των προ φλεγμονωδών κυτταροκινών. Μειωμένη δραστικότητα του ΝΟ οδηγεί σε αγγειοσύσπαση και αυξημένες περιφερικές αντιστάσεις που πιθανόν προδιαθέτει σε παράγοντες κινδύνου για καρδιαγγειακά νοσήματα όπως η αρτηριακή υπέρταση. Η πλειονότητα των ασθενών με αρτηριακή υπέρταση είναι υπέρβαροι. Η αρτηριακή υπέρταση είναι περίπου 6 φορές πιο συχνή στα παχύσαρκα άτομα από ότι στα φυσιολογικά άτομα. Επιπλέον, η αύξηση σωματικού βάρους σε νεαρή ηλικία προδιαθέτει για την μετέπειτα εμφάνιση της αρτηριακής υπέρτασης. Όταν το σωματικό βάρος αυξάνεται κατά 10κιλά τότε η συστολική πίεση αυξάνεται κατά 3mmHg και η διαστολική πίεση κατά 2,3 mmhg. Οι αυξήσεις αυτές μεταφράζονται σε κατά 12% αύξηση του κινδύνου για στεφανιαία νόσο κατά 24% αύξηση του κινδύνου για αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο [450](The Evidence Report). Η αρτηριακή υπέρταση οφείλεται είτε σε αυξημένη καρδιακή παροχή αίματος είτε σε αυξημένες περιφερικές αντιστάσεις. Στην παχυσαρκία παρατηρείται αυξημένη καρδιακή παροχή λόγω των αυξημένων απαιτήσεων σε οξυγόνο του λιπώδους ιστού. Επομένως στην παχυσαρκία είναι αυξημένος ο κατά λεπτό όγκος αίματος και το κλάσμα εξωθήσεως. Εντούτοις, πολλοί παχύσαρκοι έχουν φυσιολογική αρτηριακή πίεση κυρίως λόγω ελαττωμένων περιφερικών αντιστάσεων. Έτσι, στα παχύσαρκα άτομα θα εμφανισθεί αρτηριακή υπέρταση όταν οι περιφερικές αντιστάσεις παραμένουν «φυσιολογικές» ή αυξηθούν. Συμπερασματικά, αν και η αυξημένη καρδιακή παροχή που παρατηρείται στην παχυσαρκία είναι δυνατόν να οδηγήσει σε αρτηριακή υπέρταση, στα παχύσαρκα άτομα η αύξηση της αρτηριακής πίεσης οφείλεται κυρίως στις αυξημένες περιφερικές αντιστάσεις. Από την άλλη πλευρά, ένας άλλος υποθετικός μηχανισμός που συνδέει την παχυσαρκία με την αρτηριακή υπέρταση είναι η ενεργοποίηση του συμπαθητικού νευρικού συστήματος (ΣΝΣ) [451]. Στα παχύσαρκα άτομα, όπως έχει ήδη αναφερθεί, παρατηρείται αυξημένη ενεργοποίηση του συμπαθητικού νευρικού συστήματος λόγω αυξημένης θερμογένεσης [452]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, στην ιδιοπαθή αρτηριακή υπέρταση παρατηρείται αυξημένη ενεργοποίηση του ΣΝΣ ειδικότερα στα νεαρά άτομα [453]. Επιπλέον, έχει παρατηρηθεί ότι ο περιορισμός της προσλαμβανόμενης τροφής συνοδεύεται από μείωση του σωματικού βάρους, της αρτηριακής 76

89 Εισαγωγή πίεσης και της ενεργοποίησης του ΣΝΣ [454]. Στα νορμοτασικά παχύσαρκα άτομα παρατηρείται εκλεκτική ενεργοποίηση του ΣΝΣ στους νεφρούς και τους σκελετικούς μύες η οποία με την πάροδο του χρόνου θα τα καταστήσει υπερτασικά. Σε συμφωνία με την παρατήρηση αυτή, η απονεύρωση των νεφρών, σε σκύλους στους οποίους προκλήθηκε παχυσαρκία λόγω αυξημένης πρόσληψης τροφής, απέτρεψε την εμφάνιση της αρτηριακής υπέρτασης [455]. Μία νεότερη άποψη είναι ότι τα παχύσαρκα υπερτασικά άτομα διαφέρουν από τα άτομα φυσιολογικού βάρους με αρτηριακή υπέρταση στη λειτουργία του ΣΝΣ δηλαδή έχουν περισσότερους νευρώνες που λειτουργούν φυσιολογικά ενώ τα υπερτασικά άτομα φυσιολογικού βάρους έχουν φυσιολογικό αριθμό νευρώνων που όμως υπερλειτουργούν (firing rate) [456]. Ανεξάρτητα πάντως από τους υπεύθυνους μηχανισμούς για την υπέρταση στην παχυσαρκία, η μείωση του σωματικού βάρους οδηγεί σε μείωση της αρτηριακής πίεσης [457]. Η παχυσαρκία μέσω του μηχανισμού της αντίστασης στην ινσουλίνη οδηγεί στην εμφάνιση αθηροσκλήρωσης και κατ επέκταση καρδιαγγειακών νοσημάτων. Τα αυξημένα επίπεδα NEFAs, η λιποτοξικότητα και οι διαταραχές έκκρισης των λιποκυτταροκινών είναι κάποια από τα χαρακτηριστικά της αντίστασης στην ινσουλίνη που εμπλέκονται στην διαδικασία. Οι λιποκυτταροκίνες που εμπλέκονται στη διαδικασία της αθηρωμάτωσης στην παχυσαρκία είναι η λεπτίνη, η αδιπονεκτίνη και η βισφατίνη. Η λειτουργία της λεπτίνης και της αδιπονεκτίνης έχει ήδη περιγραφεί. Ο ρόλος της λεπτίνης στη συγκεκριμένη διαδικασία είναι να προάγει τη συνάθροιση των αιμοπεταλίων και τη θρόμβωση [458], την αγγειογένεση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων [459]. Αντίθετα, η αδιπονεκτίνη έχει αντι αθηρογόνο, αντιδιαβητική και αντι φλεγμονώδη δράση και είναι μειωμένη στην παχυσαρκία [460, 461]. Η παραγωγή της από τα λιποκύτταρα πιθανόν να καταστέλλεται από την αυξημένη συγκέντρωση του TNFα. Η αδιπονεκτίνη αναστέλλει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης ICAM 1, VCAM 1, Ε σελεκτίνης και την απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων [462]. Η βισφατίνη παράγεται από το σπλαχνικό λιπώδη ιστό και τα επίπεδά της στο πλάσμα είναι ανάλογα της ποσότητας του σπλαχνικού λίπους. Συγκεκριμένα, η συγκέντρωση της βισφατίνης στο πλάσμα βρέθηκε αυξημένη σε άτομα με νοσογόνο παχυσαρκία σε σύγκριση με άτομα φυσιολογικού βάρους και μειώθηκε μετά 77

90 Εισαγωγή την απώλεια βάρους, που επιτεύχθηκε με γαστρική περίδεση [463]. Η βισφατίνη παράγεται κυρίως από το σπλαχνικό λιπώδη ιστό εντούτοις, ανευρίσκεται σε μικρές ποσότητες στο μυελό των οστών, στο ήπαρ, στα λεμφοκύτταρα και στους σκελετικούς μύες [464]. Σε κυτταρικές καλλιέργειες η βισφατίνη έχει δράση παρόμοια με αυτή της ινσουλίνης [465]. Πραγματικά, η βισφατίνη και η ινσουλίνη σε παρόμοιες συγκεντρώσεις έχουν την ίδια ικανότητα προαγωγής της πρόσληψης γλυκόζης και αναστολής της απελευθέρωσής της. Η βισφατίνη επιτελεί τις δράσεις της μέσω σύνδεσης με τον υποδοχέα της ινσουλίνης, σε διαφορετική θέση, όμως από αυτή της ινσουλίνης [465]. Επιπλέον, ο λιπώδης ιστός παράγει ένα σύνολο πεπτιδίων που μπορούν να επηρεάσουν το καρδιαγγειακό σύστημα. Η συγκέντρωση στο πλάσμα των PAI 1, CRP, TNFα, αγγειοτενσίνη ΙΙ σχετίζεται με τον δείκτη μάζας σώματος [405]. Σημαντική είναι η παρατήρηση ότι το 30% της κυκλοφορούμενης CRP παράγεται από τον λιπώδη ιστό. Η παραγωγή της ενεργοποιείται από τις κυτταροκίνες TNFα και IL 6. Η CRP Θεωρείται ένας υποψήφιος δείκτης της χρόνιας φλεγμονώδους κατάστασης που μπορεί να εμπλέκεται στην αθηρογένεση [466]. Η CRP αυξάνει την έκφραση και τη δράση του ΡΑΙ 1 στα ενδοθηλιακά κύτταρα του ανθρώπου [467]. Ο ΡΑΙ 1 είναι αυξημένος στα παχύσαρκα άτομα με μεταβολικό σύνδρομο [468]. Μελέτες έχουν δείξει συσχέτιση μεταξύ του δείκτη μάζας σώματος (ΔΜΣ), του λόγου της περιμέτρου μέσης προς την περίμετρο ισχίων και των αγγειακών εγκεφαλικών επεισοδίων (ΑΕΕ) [469]. Για κάθε 1 μονάδα αύξησης του ΔΜΣ ο κίνδυνος για πρόκληση ισχαιμικού αγγειακού επεισοδίου αυξάνεται κατά 4% και κατά 6% για αιμορραγικό εγκεφαλικό επεισόδιο. Η βαρύτητα όμως των ισχαιμικών εγκεφαλικών δεν συσχετίσθηκε με τον ΔΜΣ [469]. Ο αυξημένος κίνδυνος εμφάνισης ΑΕΕ στην παχυσαρκία πιθανόν να οφείλεται στη προ θρομβωτική και προ φλεγμονώδη κατάσταση που συνοδεύει την αυξημένη συσσώρευση του λιπώδους ιστού. 78

91 Εισαγωγή Εικόνα 13. Η παχυσαρκία και η αντίσταση στην ινσουλίνη ταυτόχρονα μπορεί να συμβάλλουν στην αθηρογένεση. Το σπλαχνικό λίπος προκαλεί δυσλειτουργία του ενδοθηλίου άμεσα μέσω των λιποκυτταροκινών (δηλαδή, της μειωμένης συγκέντρωσης της αδιπονεκτίνης, η οποία ως γνωστόν έχει αντι αθηρογόνο δράση) και έμμεσα μέσω των TNFα και IL 6 (των οποίων οι συγκεντρώσεις είναι αυξημένες στην παχυσαρκία). Η αντίσταση στην ινσουλίνη μέσω των NEFAs (non esterified fatty acids) και των κυτταροκινών προάγει το οξειδωτικό στρες και την δυσλειτουργία του ενδοθηλίου (αύξηση των ICAM 1 και ΡΑΙ 1). ROS, δραστικές μορφές οξυγόνου. MCP 1, χημειοτακτική πρωτεΐνη των μονοκυττάρων 1. Αρτηριακή Υπέρταση Σύμφωνα με την Αμερικανική Καρδιολογική εταιρεία (American Heart Association) η αρτηριακή υπέρταση αποτελεί ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου για την εμφάνιση καρδιαγγειακών νοσημάτων που οφείλονται στην αθηροσκλήρωση [470]. Είναι γνωστό ότι η μείωση της αρτηριακής πίεσης είτε με αλλαγή του τρόπου ζωής είτε με φαρμακευτική αγωγή, οδηγεί σε μείωση του κινδύνου εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων. Ένας πιθανός παθογενετικός μηχανισμός που συνδέει την αρτηριακή υπέρταση και την αθηροσκλήρωση είναι η αυξημένη μετακίνηση των LDL χοληστερολών προς τον υπενδοθηλιακό χώρο [471]. Συγκεκριμένα, η σχετική συγκέντρωση της LDL χοληστερόλης υπενδοθηλιακά είναι κατά 50 φορές περισσότερη όταν η αρτηριακή πίεση βρίσκεται στα 160mmHg συγκρίνοντάς τη με τη συγκέντρωσή της όταν η αρτηριακή πίεση είναι στα 70mmHg [472]. 79

92 Εισαγωγή Είναι ενδιαφέρον ότι συχνά συνυπάρχει η αρτηριακή υπέρταση με τη δυσλιπιδαιμία και ο συνδυασμός αυτός αυξάνει το κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων πιθανόν μέσω συνεργικών μηχανισμών [473, 474]. Δυσλιπιδαιμίες Η αθηρογόνος δυσλιπιδαιμία χαρακτηρίζεται από υψηλή συγκέντρωση των λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας, LDL, αυξημένη συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων και μειωμένη συγκέντρωση των υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών, HDL [330]. Πλήθος επιδημιολογικών και κλινικών μελετών καταδεικνύουν την αυξημένη LDL χοληστερόλη ως παράγοντα κινδύνου για την εμφάνιση καρδιαγγειακών νοσημάτων [ ]. Η συνύπαρξη της υψηλής LDL χοληστερόλης και των αυξημένων τριγλυκεριδίων σχετίζονται με μεγαλύτερο κίνδυνο καρδιαγγειακών νοσημάτων [476]. Η οξεία υπερτριγλυκεριδαιμία προκαλεί ενεργοποίηση των λευκών αιμοσφαιρίων οδηγώντας στην αθηρωμάτωση πιθανόν μέσω αύξησης του οξειδωτικού στρες [479]. Κάπνισμα Το κάπνισμα είναι ένας από τους κύριους παράγοντες κινδύνου για την εμφάνιση καρδιαγγειακών νοσημάτων. Το κάπνισμα αυξάνει την έκφραση μορίων προσκόλλησης όπως των ICAM 1 [480] και μειώνει τα επίπεδα της αδιπονεκτίνης [460, 481]. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου και η νικοτίνη καταστέλλουν την έκφραση της αδιπονεκτίνης στα λιποκύτταρα [481]. Επιπλέον, in vitro το κάπνισμα ρυθμίζει τη λειτουργία του λιποκυττάρου μέσω των νικοτινικών ακετυλοχολινεργικών υποδοχέων του [482]. Το κάπνισμα αυξάνει τα επίπεδα του TNFα, ο οποίος μειώνει τα επίπεδα της αδιπονεκτίνης και προάγει την αντίσταση στην ινσουλίνη. Επιπλέον, το κάπνισμα αυξάνει το οξειδωτικό στρες μέσω αύξησης των ελεύθερων ριζών [483]. Τέλος, στους χρόνιους καπνιστές έχει παρατηρηθεί δυσλειτουργία του ενδοθηλίου, χαρακτηριστικό της αθηροσκλήρωσης [480]. 80

93 Εισαγωγή Απουσία φυσικής άσκησης Η απουσία φυσικής άσκησης είναι ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για την εμφάνιση παχυσαρκίας και κατ επέκταση καρδιαγγειακής νοσηρότητας [484] και της θνητότητας [ ]. Γενικά, αύξηση του ΔΜΣ κατά 1 μονάδα αυξάνει το κίνδυνο καρδιαγγειακών νοσημάτων κατά 8%. Παράλληλα, αύξηση της φυσικής δραστηριότητας κατά 1 ώρα μεταβολικού ισοδύναμου (metabolic equivalent, MET) μειώνει το κίνδυνο κατά 8% [484]. Βάσει αυτών, οι πρόσφατες οδηγίες σχετικά με τη φυσική άσκηση συνιστούν 30 λεπτά καθημερινής φυσικής άσκησης μέτριας έντασης [488]. Η φυσική άσκηση βελτιώνει την ανοχή στη γλυκόζη και την ευαισθησία στην ινσουλίνη μέσω αύξησης της πρόσληψης γλυκόζης. Επιπλέον, βελτιώνει το λόγο HDL/LDL χοληστερόλης μέσω αύξησης της δραστικότητας της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης, μειώνει τις τριακυλγλυκερόλες, αυξάνει την ινωδόλυση, μειώνει τη συνάθροιση των αιμοπεταλίων και μειώνει την αρτηριακή πίεση [485]. Οικογενειακό ιστορικό στεφανιαίας νόσου Αφορά στα παιδιά ή αδελφούς ατόμων που έπαθαν οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου σε ηλικία κάτω των 60 ετών. Τα άτομα αυτά βρέθηκε να έχουν αυξημένη την ολική χοληστερόλη, μειωμένη την HDL χοληστερόλη και αυξημένη την λιποπρωτεΐνη α. Πρέπει να σημειωθεί ότι κληρονομείται η προδιάθεση και όχι η στεφανιαία νόσος. Ηλικία Στεφανιαία νόσος εμφανίζεται στις ηλικίες ετών χωρίς όμως να αποκλείονται μικρότερες ή μεγαλύτερες ηλικίες. Σε ηλικία μικρότερη των 30 ετών η στεφανιαία νόσος είναι σπάνια και εμφανίζεται σε άτομα με συγγενή δυσλιπιδαιμία, συγγενή στένωση ή ανώμαλη εκβολή των στεφανιαίων αγγείων. 81

94 Εισαγωγή Φύλο Η στεφανιαία νόσος είναι συχνότερη στους άνδρες με αναλογία 10/1 καθώς οι γυναίκες προστατεύονται από τις αυξημένες συγκεντρώσεις οιστρογόνων και τα υψηλότερα επίπεδα της HDL χοληστερόλης. Μετά την εμμηνόπαυση όμως η συχνότητα αυξάνεται και εξομοιώνεται με αυτή των ανδρών έως την ηλικία των 65 ετών. Κλινικές εκδηλώσεις Η αθηροσκλήρωση δεν εμφανίζει συμπτώματα μέχρι τη στιγμή που θα εμφανιστεί σημαντική στένωση του αγγείου, θρόμβωση, ανεύρυσμα ή παραγωγή εμβόλου. Τα αρχικά σημεία και συμπτώματα αντανακλούν τη μειωμένη αιματική ροή προς το προσβεβλημένο όργανο όταν απαιτείται αύξηση της προσφοράς, για παράδειγμα στηθάγχη και διαλείπουσα χωλότητα κατά τη κόπωση. Τα σημεία και συμπτώματα επιδεινώνονται σταδιακά και γίνονται σοβαρά με την απόφραξη της προσβεβλημένης αρτηρίας. Τα κλινικά σύνδρομα είναι το οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου, ισχαιμικό αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο, παροδικό ισχαιμικό αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο, αιφνίδιος θάνατος, καρδιακή ανεπάρκεια, ανεύρυσμα αριστερής κοιλίας, ανεπάρκεια μιτροειδούς βαλβίδας, ισχαιμική μυοκαρδιοπάθεια, καρδιακές αρρυθμίες, νεφρική ανεπάρκεια και απόφραξη των περιφερικών αρτηριών. Διάγνωση Η διάγνωση της αθηροσκλήρωσης βασίζεται στην εκτίμηση των παραγόντων κινδύνου και των σημείων και συμπτωμάτων εφόσον υπάρχουν. Η διάγνωση της στένωσης αρτηρίας επιβεβαιώνεται με αγγειογραφία και ηχωκαρδιογραφία. 82

95 Εισαγωγή Πρόληψη και θεραπεία Η αποτελεσματικότερη μέθοδος πρόληψης της αθηροσκλήρωσης είναι η αντιμετώπιση των τροποποιήσιμων παραγόντων κινδύνου για την πρόκλησή της δηλαδή του σακχαρώδη διαβήτη, της παχυσαρκίας, της αρτηριακής υπέρτασης, της δυσλιπιδαιμίας, του καπνίσματος και της απουσίας φυσικής άσκησης. Η θεραπεία της αθηροσκλήρωσης περιορίζεται στη θεραπεία των επιπλοκών της δηλαδή της στηθάγχης, του εμφράγματος του μυοκαρδίου, των αρρυθμιών, της καρδιακής ανεπάρκειας, του αγγειακού εγκεφαλικού επεισοδίου, της νεφρικής ανεπάρκειας και της περιφερικής απόφραξης. 83

96 Εισαγωγή 2. Η παθογένεια της αθηροσκλήρωσης σε μοριακό επίπεδο Εξωκυττάρια ουσία Βασική μεμβράνη Η βασική μεμβράνη είναι ένα σύμπλεγμα εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας καλά οργανωμένο που προσφέρει μηχανική στήριξη, σταθερότητα, διαμερισματοποίηση, ρυθμίζει κυτταρικές λειτουργίες και αποτελεί απόθεμα αυξητικών παραγόντων για ένα πλήθος κυττάρων όπως είναι τα επιθηλιακά, τα ενδοθηλιακά, τα νευρικά, τα μυϊκά και τα κύτταρα του λιπώδους ιστού. Παρόλο ότι, οι βασικές μεμβράνες διαφέρουν μεταξύ τους ανάλογα με τη λειτουργία που επιτελούν, εντούτοις, όλες έχουν την ίδια βασική δομή (Εικόνα 14). Μορφολογικά, η βασική μεμβράνη διαιρείται στις τρεις ακόλουθες στιβάδες: τη διαυγή (lamina lucida), την πυκνή (lamina densa) και σε ορισμένες περιπτώσεις υπάρχει και μια ακόμη με ίνες κολλαγόνου (lamina fibroreticularis). Η πυκνή στιβάδα αποτελείται κυρίως από κολλαγόνο και λαμινίνη που συνδέονται με νιδωγόνο και περλεκάνη [489]. Εικόνα 14. Μοντέλο των βασικών μεμβρανών. Η ακριβής σύσταση των βασικών μεμβρανών δεν είναι ίδια σε όλους τους ιστούς, αλλά το βασικό μοντέλο είναι κοινό. Η δομή τους είναι αποτέλεσμα απευθείας συνδέσεων ανάμεσα στην περλεκάνη, τη λαμινίνη, την εντακτίνη και το κολλαγόνο τύπου IV. 84

97 Εισαγωγή Η οικογένεια των γλυκοπρωτεϊνών της λαμινίνης ανακαλύφθηκε πριν από 3 δεκαετίες περίπου, ως το προϊόν του σαρκώματος EHS (Engelbreth Holm Swarm) σε ποντίκια [490]. Η λαμινίνη κατέχει σημαντική θέση στη δομή της βασικής μεμβράνης και διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της διαφοροποίησης των κυττάρων, στην προσκόλληση και στη μετανάστευσή τους [491]. Η λαμινίνη είναι εξωκυττάρια γλυκοπρωτεΐνη που σχηματίζει ετεροτριμερή. Αποτελείται από διάφορους συνδυασμούς α, β και γ αλυσίδων [492]. Στα θηλαστικά, πέντε α, τέσσερις β και τρεις γ αλυσίδες συνδυάζονται μεταξύ τους για τη δημιουργία των 16 γνωστών ειδών λαμινίνης [493]. Η λαμινίνη που περιγράφηκε πρώτη από τον Timpl ονομάζεται λαμινίνη 1 και είναι της μορφής α 1 β 1 γ 1. Η λαμινίνη 1 εντοπίζεται στους περισσότερους ιστούς, αλλά δεν απαντάται στο μυελό των οστών και στο τοίχωμα των περισσοτέρων αγγείων [494]. Αντίθετα, εκεί συναντώνται οι ισομορφές 8 και 10 που είναι της μορφής α4β1γ1 και α5β1γ1 αντίστοιχα [495]. Το κοινό αυτών των ισομορφών με τη λαμινίνη 1 είναι ότι έχουν ίδιες β και γ αλυσίδες (β1, γ1). Οι λειτουργίες που επιτελούν οι λαμινίνες είναι απόρροια της χαρακτηριστικής τους δομής. Σχετικά με την εύρεση των δομικών χαρακτηριστικών των μορίων λαμινίνης, το ενδιαφέρον επικεντρώθηκε στη λαμινίνη 1, η βασική δομή της οποίας υπάρχει σε όλες τις λαμινίνες με ορισμένες τροποποιήσεις. Οι κύριοι επιφανειακοί κυτταρικοί υποδοχείς της λαμινίνης είναι οι ιντεγκρίνες αλλά συνδέονται και με άλλους υποδοχείς όπως είναι η δυστρογλυκάνη, ο υποδοχέας της λαμινίνης 32/67kDa, ο υποδοχέας ελαστίνης λαμινίνης 67kDa, η λεκτίνη συνδεόμενη με τη γαλακτοσίδη, η γαλακτοσυλτρανσφεράση και η πρωτεογλυκάνη θειϊκής ηπαρίνης [496]. Η σύνδεση της λαμινίνης με την ιντεγκρίνη οδηγεί σε ενεργοποίηση της κινάσης τοπικής προσκόλλησης (focal adhesion kinase), των μικρών rho GTPασών και της οδού της ΜΑΡΚ από το ενδοκυτταρικό τμήμα της ιντεγκρίνης [497]. Συμπερασματικά, η λαμινίνη πέρα από το ρόλο της ως δομικό συστατικό των βασικών μεμβρανών αποτελεί σημαντικό παράγοντα για την μεταβίβαση του σήματος ενδοκυτταρικά, τη διαφοροποίηση, την προσκόλληση και τη μετανάστευση των κυττάρων. 85

98 Εισαγωγή Σηματοδοτικά μόρια και σηματοδότηση Ανταλλάκτης νατρίου/ υδρογόνου 1 Ο ανταλλάκτης Na + /H + (ΝΗΕ) είναι μία αρκετά διαδομένη πρωτεΐνη στα κύτταρα των θηλαστικών. Είναι μία πρωτεΐνη της μεμβράνης που ανταλλάσει ένα ενδοκυττάριο ιόν Η + με ένα εξωκυττάριο ιόν Νa +, με απώτερο σκοπό τη ρύθμιση ενδοκυττάριου ph [498]. Ο ΝΗΕ κλωνοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1989 από τον J. Pouysségur [499]. Ενεργοποιείται από διάφορους αυξητικούς παράγοντες και αποτελείται από 815 αμινοξέα που είναι διαταγμένα σε δύο τμήματα, το ένα είναι ενσωματωμένο στην βασική μεμβράνη ενώ το δεύτερο αποτελεί την κυτταροπλασματική «ουρά». Από την ανακάλυψη της ΝΗΕ1 μέχρι σήμερα ταυτοποιήθηκαν άλλες 8 ισομορφές του ανταλλάκτη (ΝΗΕ2 ΝΗΕ9) [498]. Οι ισομορφές αυτές έχουν περισσότερο εντοπισμένη κατανομή και μερικές όπως οι ΝΗΕ6 και ΝΗΕ7 βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα παρά στην μεμβράνη. Στον άνθρωπο, το γονίδιο του ΝΗΕ1 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 1. Υπάρχει μεγάλη ομολογία μεταξύ των ισομορφών του ΝΗΕ, η ομολογία του ΝΗΕ1 με τις άλλες ισομορφές κυμαίνεται από 20% έως 70%. Ο ΝΗΕ 1 είναι ευαίσθητος στην καταστολή από παράγωγα της αμιλορίδης [498]. Δομή Το Ν τελικό τμήμα του ΝΗΕ1 που βρίσκεται στην βασική μεμβράνη είναι υπεύθυνο για την μεταφορά των κατιόντων και αποτελείται από 12 μέρη ενσωματωμένα στην βασική μεμβράνη [500]. Πολλά από τα διαμεμβρανικά (ΔΜ) τμήματα της πρωτεΐνης είναι υπεύθυνα για την δράση του ΝΗΕ1: Διαμεμβρανικό (ΔΜ) τμήμα ΙV: το τμήμα αυτό είναι βασικό για την δράση του ΝΗΕ1, ειδικότερα για την ευαισθησία ή την αντίστασή του στους αναστολείς. Μεγαλύτερη σημασία έχουν τα Phe 161, Phe 162, Leu163, Gly173 [501] και τα αμινοξέα Pro167, Pro168 [502]. ΔΜ VI, VII: σημαντικά είναι τα αμινοξέα Glu262, Asp267 [503] τα οποία έχουν φορτίο. Μετάλλαξη που προκαλεί απώλεια του φορτίου στα σημεία 86

99 Εισαγωγή αυτά, αναστέλλει τη δράση του ΝΗΕ1, ενώ εάν υπάρχει φορτίο, τότε δεν επηρεάζεται η δράση του. ΔΜ IX: είναι υπεύθυνο για την ευαισθησία του ΝΗΕ1 στους ανταγωνιστές του [504]. Μετάλλαξη στη θέση His349 του τμήματος αυτού ελαττώνει την ευαισθησία της πρωτεΐνης στην αμιλορίδη [505]. ΔΜ ΧΙ: Μεταλλάξεις στις θέσεις Tyr454 και Arg458 δείχνουν ότι είναι σημαντικές για την τοποθέτηση του ΝΗΕ1 στην επιφάνεια του κυττάρου [506]. Το ΔΜ ΧΙ και το γειτονικό του ενδοκυττάριο τμήμα παίζουν σημαντικό ρόλο στην ευαισθησία του ΝΗΕ1 στο ph. Μετάλλαξη στη θέση Gly455 προκαλεί μετακίνηση της ευαισθησίας του ανταλλάκτη προς την αλκαλική πλευρά, χωρίς να επηρεάζεται η συγγένεια του ΝΗΕ1 με τα ιόντα Na + και H +. Το αντίθετο αποτέλεσμα έχει η μετάλλαξη στην θέση Arg440 στο ενδοκυττάριο τμήμα του ΝΗΕ1. Επιπλέον, με την απώλεια του θετικού φορτίου του τμήματος αυτού δημιουργείται ένας ΝΗΕ1 που δεν απαντά στις αλλαγές του ph [500]. Το μεγάλο κυτταροπλασματικό τμήμα του ΝΗΕ1 είναι το σημείο σύνδεσης με τις πρωτεϊνικές κινάσες και τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες και καθορίζει τη δράση του διαμεμβρανικού τμήματος (Εικόνα 15.). Πολλές πρωτεϊνικές κινάσες φωσφορυλιώνουν τον ΝΗΕ1, μεταξύ των οποίων οι ERK1/2, p90 rsk, p160rock, p38 [507] [508, 509]. Η φωσφορυλίωση αυτή ενεργοποιεί τον ΝΗΕ1 ώστε να απαντά περισσότερο σε αλκαλικό περιβάλλον. Ένα σύνολο ρυθμιστικών μορίων συνδέονται με το κυτταροπλασματικό τμήμα του ΝΗΕ1 μεταξύ των οποίων είναι η καλμοδουλίνη (calmodulin), η ομόλογη πρωτεΐνη της καλσινευρίνης (calcineurin homologous protein, CHP), η τεσκαλσίνη (tescalcin) και η καρβονική ανυδράση ΙΙ (carbonic anhydrase II, CaII). Οι πρωτεΐνες αυτές τροποποιούν την εξαρτώμενη από το ph δράση του ΝΗΕ1. Οι καλμοδουλίνη και CaII έχουν δράση ενεργοποιητή [510, 511] ενώ η τεσκαλσίνη έχει δράση αναστολέα [512]. 87

100 Εισαγωγή Λειτουργία Η βασική λειτουργία του ΝΗΕ1 είναι η ρύθμιση του ενδοκυττάριου ph και του όγκου του κυττάρου. Ενεργοποιείται και αναστέλλεται η λειτουργία του κυρίως από το ενδοκυττάριο ph αλλά και από ένα σύνολο ορμονών που ενεργοποιούν πρωτεϊνικές κινάσες. Ο όγκος του κυττάρου διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στο σύνολο κυτταρικών λειτουργιών. Μάλιστα, η σωστή λειτουργία του κυττάρου εξαρτάται από την διατήρηση του κυτταρικού του όγκου. Είτε η ενδοκυττάρια μείωση είτε η εξωκυττάρια αύξηση της οσμωτικότητας προκαλούν οσμωτική συρρίκνωση του κυττάρου. Το συρρικνωμένο κύτταρο ενεργοποιεί αντιρροπιστικούς μηχανισμούς, οι οποίοι απενεργοποιούνται μόλις αποκατασταθεί ο κυτταρικός όγκος. Οι κυριότεροι αντιρροπιστικοί μηχανισμοί είναι ο ΝΗΕ1 που δρα παράλληλα με τον ανταλλάκτη Cl /HCO 3 και ο συμμεταφορέας Na + K + 2Cl 1, που επαναφέρουν τον όγκο του κυττάρου στο φυσιολογικό μέσω αύξησης του ενδοκυττάριου [Na + ]. Η ενεργοποίηση του ΝΗΕ1 από ορμόνες ή αυξητικούς παράγοντες σε μη συρρικνωμένο κύτταρο οδηγεί τόσο στην ενδοκυττάρια αύξηση του [Na + ] όσο και στην είσοδο νερού στο κύτταρο. Αξίζει να σημειωθεί ότι στα φυσιολογικά κύτταρα η ενδοκυττάρια συγκέντρωση του [Na + ] παραμένει σταθερή χάρη στη λειτουργία της αντλίας Na + /K + ATPase [513]. Μία άλλη βασική παράμετρος για την κυτταρική λειτουργία είναι το ενδοκυττάριο ph (ph i ). Στα περισσότερα κύτταρα των θηλαστικών το ph i διατηρείται σταθερό μεταξύ 7 7,2, παρατηρούνται όμως και πολλές αποκλίσεις [514]. Μολονότι το εξωκυττάριο ph (ph o ) είναι περίπου 7,4, υπάρχει ηλεκτροχημική δύναμη που ευνοεί τη μετακίνηση των [Η + ] προς το εσωτερικό του κυττάρου. Επιπρόσθετα, οι μεταβολικές λειτουργίες του κυττάρου παράγουν [Η + ]. Η περίσσεια των [Η + ] αυτών πρέπει να απομακρυνθεί από το κύτταρο, και επιτυγχάνεται με την ενεργοποίηση του ΝΗΕ1, του ανταλλάκτη Na + coupled Cl /HCO 3 και του συνμεταφορέα Na + /HCO 3. Η ενεργοποίηση των μεταφορέων αυτών από το ενδοκυττάριο όξινο περιβάλλον έχει επομένως ως αποτέλεσμα την ενδοκυττάρια αύξηση τόσο του [Na + ] όσο και του κυτταρικού όγκου [513] (Εικόνα 15). 88

101 Εισαγωγή Εικόνα 15. Οι φυσιολογικές λειτουργίες του ΝΗΕ1. Α. Ρύθμιση του ph σε κατάσταση ηρεμίας του κυττάρου. Β. Ορμόνες, όπως ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (Epidermal growth factor, EGF) και το αγγειοτενσινογόνο ΙΙ, ενεργοποιούν τον ΝΗΕ1 οδηγώντας στην διαφοροποίηση. Στο μυοκάρδιο, η λειτουργία αυτή οδηγεί σε υπερτροφία των μυοκαρδιακών κυττάρων. Γ. Ενεργοποίηση του ΝΗΕ1 σε κατάσταση ισχαιμίας, οδηγεί σε αύξηση της ενδοκυττάριας [Na + ] (μέσω του ανταλλάκτη Na + /Ca + ) και τελικά στον κυτταρικό θάνατο. Δ. Σε ορισμένα είδη κυττάρων, ο ΝΗΕ1 βρίσκεται στα ψευδοπόδια και συνδεόμενος με τις πρωτεΐνες ERM διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην μετανάστευση των κυττάρων. Η ενεργοποίηση του ΝΗΕ1 συνδέεται με λειτουργίες του κυττάρου όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και η απόπτωση. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός είναι σημαντικά ελαττωμένος σε κύτταρα με έλλειψη του ΝΗΕ1 [515]. Η διαφοροποίηση του κυττάρου δεν λαμβάνει χώρα σε κύτταρα με έλλειψη ή καταστολή του ΝΗΕ1 [505]. Τα κύτταρα με ενεργοποιημένη ΝΗΕ1 παρουσιάζουν αντίσταση στα αποπτωτικά ερεθίσματα [515]. Ποντίκια με έλλειψη του ΝΗΕ1 επιζούν αλλά παρουσιάζουν καθυστέρηση στην ανάπτυξη και μειωμένα ποσοστά επιβίωσης. Επιπλέον, εμφανίζουν σοβαρές νευρολογικές διαταραχές με επιληψία και αταξία [516]. Ο ΝΗΕ1 κατέχει σημαντικό ρόλο στην οργάνωση του κυτταροσκελετού και τη μετανάστευση του κυττάρου. Σε μερικούς κυτταρικούς τύπους το τελικό τμήμα του ΝΗΕ1 αποτελεί το σημείο σύνδεσης με τα νημάτια της 89

102 Εισαγωγή ακτίνης μέσω των πρωτεϊνών ezrin, radixin και moesin (ERM) (Εικόνα 16). Μετάλλαξη των αμινοξέων στο σημείο αυτό ή αναστολή του ΝΗΕ1 αναστέλλει την προσκόλληση και μετανάστευση των κυττάρων [515, 517]. Εικόνα 16. Μορφολογία του NHE1. Τα απαραίτητα για την δράση του ΝΗΕ1 αμινοξέα απεικονίζονται με κόκκινο χρώμα. Σημειώνονται τα σημεία σύνδεσης με τις πρωτεΐνες καλμοντουλίνη (CaM), calcineurin homologous protein (CHP), tescalcin, carbonic anhydrase II (CaII). Ο ΝΗΕ1 χρησιμεύει ως σκαλωσιά (scaffold) για τον σχηματισμό συμπλεγμάτων μορίων σηματοδότησης. Το καρβοξυλικό άκρο του ΝΗΕ1 συνδέεται με ένα σύνολο πρωτεϊνών μεταβιβαστών με διαφορετική λειτουργία που όμως συνεργάζονται ώστε να ρυθμίζεται η ανταλλαγή των ιόντων Na + /H +. Το κυτταροπλασματικό τμήμα που βρίσκεται δίπλα στην μεμβράνη συνδέεται με την 4,5 διφωσφορική φωσφατιδύλοϊνοσιτόλη (PIP 2 ) [518], την CHP [519, 520] και τις πρωτεΐνες που συνδέονται με την ακτίνη (ezrin, radixin, moezin (ERM)) [521]. Το COOH τελικό τμήμα του ΝΗΕ1 καταλαμβάνεται από σερίνη που φωσφορυλιώνεται από κινάσες της σερίνης/θρεονίνης και οδηγούν σε μονοπάτια μεταβίβασης του σήματος. Σε απάντηση στην ενεργοποίηση των υποδοχέων από αυξητικούς παράγοντες φωσφορυλιώνεται το COOH τελικό τμήμα του ΝΗΕ1 από την κινάση 90

103 Εισαγωγή σχετιζόμενη με την ERK, p90rsk [522] και την Ste20 like Nck interacting kinase (NIK) [523]. Ο ΝΗΕ1 ενεργοποιείται από την κινάση Rho 1 (ROCK) μετά από ενεργοποίηση των υποδοχέων της ιντεγκρίνης [509] και των υποδοχέων G protein coupled για την θρομβίνη και το λυσοφωσφατιδικό οξύ [509, 515]. Η φωσφορυλίωση της σερίνης του COOH τελικού τμήματος αυξάνει την μετατόπιση των ιόντων από το διαμεμβρανικό τμήμα και η φωσφορυλίωση της Ser 703 από την p90rsk προάγει την απευθείας προσκόλληση της πρωτεΐνης β [524]. Η ΝΙΚ φωσφορυλίωνει το COOH τελικό τμήμα του ΝΗΕ1, γεγονός που εξαρτάται από την απευθείας σύνδεση του ρυθμιστικού τμήματος της ΝΙΚ με το τελικό τμήμα του ΝΗΕ1 [523]. Σε γειτνίαση βρίσκονται θέσεις σύνδεσης με την καλμοδουλίνη που χαρακτηρίζονται ως υψηλής και χαμηλής συγγένειας [525, 526]. Άλλες πρωτεΐνες που συνδέονται απευθείας με το COOH τελικό τμήμα του ΝΗΕ1 είναι η πρωτεΐνη heat shock 70 (HSP 70) [527] και η καρβονική ανυδράση ΙΙ [511], δεν έχουν καθοριστεί όμως επακριβώς τα σημεία σύνδεσης (Εικόνα 17). Εικόνα 17. Η δομή του ΝΗΕ1 και τα μόρια σηματοδότησης με τα οποία αλληλεπιδρά. Οι κινάσες που φωσφορυλιώνουν τις θέσεις της σερίνης απεικονίζονται με το κίτρινο χρώμα. Σε πολλά κύτταρα ο ΝΗΕ1 βρίσκεται μόνο σε συγκεκριμένες θέσεις της κυτταρικής μεμβράνης για παράδειγμα ο ΝΗΕ1 βρίσκεται στην πλευρική επιφάνεια των επιθηλιακών κυττάρων [528], στα ψευδοπόδια των ινοβλαστών [529]. Στα περισσότερα κύτταρα δεν έχουν ταυτοποιηθεί τα μόρια εκείνα που καθορίζουν την θέση του ΝΗΕ1 στην κυτταρική μεμβράνη, εντούτοις, στους ινοβλάστες είναι γνωστό ότι η τοποθέτηση του ΝΗΕ1 στα 91

104 Εισαγωγή ψευδοπόδια οφείλεται στη σύνδεση του με την πρωτεΐνη ERM [521]. Στη σύνδεση αυτή φαίνεται να εμπλέκεται η PIP 2 μέσω τροποποίησης του COOHτελικού τμήματος του ΝΗΕ1 ώστε να μπορεί να συνδεθεί η ERM και άλλες πρωτεΐνες [530] με τον ΝΗΕ1. Πολλά από τα μόρια σηματοδότησης που συνδέονται με τον ΝΗΕ1 τροποποιούν την δράση του ανταλλάκτη (κινάσες, καλμοδουλίνη, , PIP 2, CHP) και κάποια καθορίζουν την θέση του ΝΗΕ1 (πρωτεΐνες ERM, PIP 2 ) [530]. Ο ρόλος του ΝΗΕ1 στην αθηροσκλήρωση Οι κυριότερες κλινικές εκδηλώσεις της αθηροσκλήρωσης, όπως έχει ήδη αναφερθεί, αποτελούν τα καρδιαγγειακά συμβάματα όπως η στεφανιαία νόσος και το έμφραγμα του μυοκαρδίου. Χαρακτηριστικό των συμβαμάτων αυτών είναι η ισχαιμία του μυοκαρδίου και η επαναιμάτωσή του. Στη διαδικασία αυτή και την επακόλουθη βλάβη του μυοκαρδίου, πιστεύεται ότι ο ΝΗΕ1 διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο. Ο ΝΗΕ1 είναι η κύρια ισομορφή που απαντάται στο μυοκάρδιο. Αναλυτικότερα, στο μυοκάρδιο η ισχαιμία ενεργοποιεί το συμπαθητικό νευρικό σύστημα και την τοπική απελευθέρωση νορεπινεφρίνης [531]. Επιπλέον, ενεργοποιείται το σύστημα ρενίνηςαγγειoτενσίνης [532, 533], η παραγωγή ενδοθηλίνης [534, 535], κυτταροκινών, όπως της IL 8 [536], και ελεύθερων ριζών [537, 538]. Οι παραπάνω παράγοντες είναι γνωστό ότι ενεργοποιούν τον ΝΗΕ1 προκαλώντας αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης του [Na + ] [534, ]. Στη συνέχεια, ενεργοποιείται ο ανταλλάκτης Na + /Ca + οδηγώντας σε ενδοκυττάρια αύξηση του [Ca + ], διόγκωση του κυττάρου και τελικά κυτταρικό θάνατο. Ο μηχανισμός αυτός παρατηρείται τόσο κατά την ισχαιμία όσο και κατά την επαναιμάτωση του μυοκαρδίου [544, 545]. Η χορήγηση αναστολέων του ΝΗΕ1 είναι δυνατόν να περιορίσει τη διόγκωση των μυοκαρδιακών κυττάρων κατά την ισχαιμία και την επαναιμάτωση [546]. Είναι γνωστό, ότι ο ΝΗΕ1 εμπλέκεται στην παθογένεια της καρδιακής υπερτροφίας και ανεπάρκειας. Αν και ο μηχανισμός δεν είναι γνωστός, μία υπόθεση είναι ότι η αύξηση της συγκέντρωσης του νατρίου λόγω υπερλειτουργίας του ΝΗΕ1 οδηγεί στην αύξηση της λειτουργίας της πρωτεϊνικής κινάσης C καθώς και σε μεταγραφικές αλλαγές με συνέπεια την υπερτροφία του μυοκαρδίου [547]. 92

105 Εισαγωγή Σε μοριακό επίπεδο, ο ΝΗΕ1 συμβάλλει στη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης καθώς διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην προσκόλληση και στη μετανάστευση των κυττάρων. Κατά τη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης, όπως έχει ήδη αναφερθεί, τα μονοκύτταρα προσκολλώνται στο ενδοθήλιο και μεταναστεύουν στον υπενδοθηλιακό χώρο. Στη συνέχεια, τα λεία μυϊκά κύτταρα του μέσου χιτώνα μεταναστεύουν στον έσω χιτώνα όπου σχηματίζεται η αθηρωματική πλάκα. Επομένως, κατά τη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης είναι σημαντική τόσο η προσκόλληση όσο και η μετανάστευση των κυττάρων. Η κατευθυνόμενη μετανάστευση των κυττάρων αποτελείται από τα εξής διαδοχικά και επαναλαμβανόμενα στάδια: πόλωση του κυττάρου, σχηματισμός προεκβολών (protrusions), προσκόλληση και αποκόλληση (de adhesion). Ο ΝΗΕ1 εντοπίζεται στο πρόσθιο τμήμα των κυττάρων που μεταναστεύουν [517] διαδραματίζοντας καθοριστικό ρόλο, καθώς κύτταρα που δεν εκφράζουν τον ΝΗΕ1 λόγω μετάλλαξης χάνουν την ικανότητα της πόλωσης. Ο ΝΗΕ1 αυξάνοντας το phi, συμμετέχει στο σχηματισμό προεκβολών όπως για παράδειγμα των ψευδοποδίων. Μικρή αύξηση του phi ενεργοποιεί την πρωτεΐνη κοφιλίνη, η οποία είναι υπεύθυνη για τη συγκρότηση των νημάτων ακτίνης στο πρόσθιο τμήμα του κυττάρου που μεταναστεύει [548]. Επιπλέον, οι πρωτεΐνες ERM είναι απαραίτητες για το σχηματισμό ψευδοποδίων ορισμένων ειδών κυττάρων [549]. Οι ERM συνδέονται με τον ΝΗΕ1, όπως έχει ήδη αναφερθεί, όπου φωσφορυλιώνονται από την πρωτεΐνη ΝΙΚ (NFκΒ inducing kinase) [523]. Σύμφωνα με το μοντέλο που προτάθηκε για το ρόλο του ΝΗΕ1 στη μετανάστευση, ο κυτταρικός όγκος αυξάνεται με την ταυτόχρονη λειτουργία του ΝΗΕ1, του ανταλλάκτη Cl /HCO 3, της ακουαπορίνης και πιθανότατα του συμμεταφορέα Na + /Ca + [529, 550, 551]. Όλοι οι παραπάνω μεταφορείς εντοπίζονται στην πρόσθια περιοχή του κυττάρου που μεταναστεύει και η λειτουργία τους οδηγεί σε πρόσληψη νατρίου και νερού, στο πρόσθιο τμήμα του ψευδοποδίου. Καθώς μεγαλώνει το ψευδοπόδιο και ταυτόχρονα, αυξάνεται ο κυτταρικός όγκος, ασκείται μηχανική πίεση στην πλασματική μεμβράνη [552]. Το αποτέλεσμα της διαδικασίας αυτής, είναι η ενεργοποίηση των διαύλων Ca + και η επακόλουθη ενδοκυττάρια αύξηση της συγκέντρωσης Ca +, στο οπίσθιο τμήμα του κυττάρου. Ακολούθως, ενεργοποιούνται οι δίαυλοι Κ +, των οποίων η λειτουργία εξαρτάται από τη συγκέντρωση του Ca +. Τέλος, το οπίσθιο τμήμα του κυττάρου συρρικνώνεται, συστέλλεται το δίκτυο ακτίνης μυοσίνης [553], 93

106 Εισαγωγή αποδεσμεύονται οι τοπικές συνδέσεις που μεσολαβούνται από τις ιντεγκρίνες [554, 555], σταματά η είσοδος Ca +, αποκαθίσταται η ενδοκυττάρια συγκέντρωση Ca + και το κύτταρο είναι έτοιμο να επαναλάβει όλη την διαδικασία εκ νέου. Κυτταροσκελετός Ο κυτταροσκελετός είναι ένα περίπλοκο δίκτυο πρωτεϊνικών ινιδίων που εκτείνεται σε όλο το κυτταρόπλασμα. Παρέχει στήριξη στο κύτταρο και του δίνει την ικανότητα να προσλαμβάνει ποικίλα σχήματα, να πραγματοποιεί συγχρονισμένες κινήσεις και να οργανώνει τα οργανίλιά του εντός του κυτταροπλάσματος. Δομικά ο κυτταροσκελετός αποτελείται από ένα πολύμορφο πλέγμα μικροϊνιδίων, ενδιάμεσων ινιδίων και μικροσωληνίσκων. Τα διάφορα μέρη του αποσυναρμολογούνται διασπώμενα σε μονομερή και επανασυναρμολογούνται με πολυμερισμό πρωτεϊνών, ανάλογα με τις κυτταρικές ανάγκες. Τα μικροϊνίδια σχηματίζονται με τον πολυμερισμό της ακτίνης, τα ενδιάμεσα ινίδια αποτελούνται από διάφορες πρωτεΐνες όπως βιμεντίνη, δεσμίνη, κερατίνη και άλλες ανάλογα με το είδος του κυττάρου, και τέλος, οι μικροσωληνίσκοι είναι κοίλοι σωλήνες που αποτελούνται από τουμπουλίνη. Τα μικροϊνίδια της ακτίνης παρέχουν μηχανική στήριξη στο κύτταρο, διατηρούν το κυτταρικό σχήμα και επιτρέπουν την κίνησή του. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα ψευδοπόδια που σχηματίζονται κατά την κίνηση του κυττάρου, αποτελούνται από ινίδια ακτίνης. Τα ενδιάμεσα ινίδια οργανώνουν την εσωτερική δομή του κυττάρου. Οι μικροσωληνίσκοι είναι κυρίως υπεύθυνοι για το διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων κατά την μίτωση, ενώ σε ορισμένα είδη κυττάρων καθορίζουν το σχήμα του και επιτρέπουν τη μετακίνησή του [556]. Είναι επομένως φανερό ότι ο κυτταροσκελετός κατέχει κυρίαρχη θέση στη κίνηση του κυττάρου δηλαδή, τόσο στη μετανάστευση όσο και στην προσκόλλησή του. Οι κυτταρικές αυτές ιδιότητες εμπλέκονται σε όλη τη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης, όπως έχει ήδη αναφερθεί. Αναλυτικότερα, κατά την κατευθυνόμενη μετανάστευση του κυττάρου, η F ακτίνη πολυμερίζεται προς ινίδια ακτίνης στο πρόσθιο τμήμα του κυττάρου ενώ ταυτόχρονα, η ακτίνη μυοσίνη αποσυναρμολογείται στο οπίσθιο τμήμα του 94

107 Εισαγωγή κυττάρου. Η διαδικασία αυτή μεσολαβείται από την ενεργοποίηση των μελών της οικογένειας των Rho μικρών G πρωτεϊνών (εκ των οποίων οι Rho, Rac και Cdc42 είναι οι καλύτερα μελετημένες) και έχει ως αποτέλεσμα την προς τα εμπρός κίνηση του κυττάρου [557]. Ουσίες που αναστέλλουν τον πολυμερισμό των πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού όπως είναι η cytochalasin D και η κολχικίνη αναστέλλουν και την κίνηση του κυττάρου. Πρωτεϊνική κινάση C (Protein kinase C, PKC) Η πρωτεϊνική κινάση C είναι ένα ένζυμο που φωσφορυλίωνει υποστρώματα σε ακροτελεύτια αμινοξέα σερίνης και θρεονίνης [207]. Από τις δέκα μέχρι σήμερα γνωστές ισομορφές της που εντοπίζονται στα θηλαστικά, οι οκτώ ενεργοποιούνται από τη διακυλογλυκερόλη (DAG). Η PKC ενεργοποιείται όταν οι ενεργοποιητές της συνδέονται με τους συνδεόμενους με τις πρωτεΐνες G υποδοχείς (G coupled protein receptors) με αποτέλεσμα την υδρόλυση ενός φωσφολιπιδίου της μεμβράνης, της 4,5 διφωσφορικής φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (PIP2), με την επίδραση της φωσφολιπάσης C (PLC). Τα προϊόντα της αντίδρασης αυτής είναι η DAG και η 1,4,5 τριφωσφορική ινοσιτόλη (ΙΡ 3 ). Επιπλέον, η ΙΡ 3 ενεργοποιεί την PKC μέσω και ενός επιπλέον μηχανισμού, δηλαδή «ανοίγει» τους Ca + IP 3 gated διαύλους στο ενδοπλασματικό δίκτυο και αυξάνεται με αυτό τον τρόπο η ενδοκυττάρια συγκέντρωση Ca +. Αυτή η οδός είναι η κλασική οδός ενεργοποίησης της PKC με την επίδραση της αγγειοτενσίνης ΙΙ [558], της ενδοθηλίνης [559] και των α αδρενεργικών υποδοχέων [560]. Παρατηρείται επιπλέον, μία εναλλακτική οδός ενεργοποίησης της PKC που βασίζεται στην υδρόλυση της φωσφατιδυλοχολίνης από τη φωσφολιπάση D (PLD) [561]. Η PKC εκφράζεται σχεδόν σε όλα τα κύτταρα, παρατηρείται όμως διαφορετική κατανομή στην έκφραση των διάφορων ισομορφών της ανάλογα με το είδος του κυττάρου. Οι ισομορφές της ΡΚC ταξινομούνται σε τρεις κατηγορίες, ανάλογα με το αν περιέχουν περιοχές σύνδεσης είτε με την DAG, είτε με το Ca2+, είτε με άλλους παράγοντες που επάγουν την δραστικότητά τους. Σε αυτούς τους παράγοντες συγκαταλέγονται η φωσφατιδυλοσερίνη και λιπίδια όπως τα cis πολυακόρεστα λιπαρά οξέα και η λυσοφωσφατιδυλοσερίνη [562]. Επίσης, οι φορβολικοί εστέρες όπως ο ΡΜΑ 95

108 Εισαγωγή και ο ΤΡΑ [563]. Η αυτοφωσφορυλίωση της ΡΚC μπορεί επίσης να επηρεάσει τη δραστικότητα, καθώς και τη συγγένεια στα υποστρώματά της, εντούτοις όμως δεν είναι επαρκής για την ενεργοποίησή της [564]. Έτσι, οι ισομορφές της ΡΚC διακρίνονται στις κλασικές (conventional) (α, β 1, β 2 και γ) που συνδέονται τόσο με την DAG, όσο και με το Ca 2+, στις νεότερες (novel) (δ, ε, η και θ) που συνδέονται με την DAG αλλά όχι με το Ca 2+ και στις άτυπες (atypical) (ζ και ι) που δε συνδέονται με κανέναν από τους παραπάνω ενεργοποιητές [207]. Πέρα από τους ενεργοποιητές, είναι γνωστές και πολλές ουσίες που δρουν ανασταλτικά για τις ΡΚCs. Οι αναστολείς διακρίνονται σε αυτούς που δρουν στην καταλυτική περιοχή, ανταγωνίζονται με το ΑΤΡ και δεν είναι τόσο ειδικοί, και σε αυτούς που δρουν στη ρυθμιστική περιοχή, ανταγωνίζονται για την περιοχή σύνδεσης των φορβολικών εστέρων και της DAG ή της φωσφατιδυλοσερίνης και είναι πιο ειδικοί [565]. Μεταξύ των ουσιών που χρησιμοποιούνται για την αναστολή των ΡΚCs συγκαταλέγονται ο GF109203X και η καλφοστίνη, που αναστέλλουν όλες τις ισομορφές της, καθώς και ο Gö6976 που αναστέλλει μόνο τις κλασικές [207]. Η ΡΚC συμμετέχει σε πλήθος σηματοδοτικών μονοπατιών καθορίζοντας κυτταρικές αποκρίσεις [566]. Έχει βρεθεί ότι σχετίζεται με παθολογικές καταστάσεις, όπως η αθηρωμάτωση [207]. Μάλιστα η ΡΚC φαίνεται να μεσολαβεί τις προ αθηρωματικές διεργασίες προκαλώντας αυξημένη παραγωγή ROS [567] και ενδοθηλίνης 1 [568] καθώς και μειωμένη παραγωγή ΝΟ. O κεντρικός ρόλος της ΡΚC στη δυσλειτουργία του ενδοθηλίου έχει μελετηθεί in vivo τόσο σε πειραματόζωα, όσο και στον άνθρωπο. Σε ορισμένους τύπους κυττάρων η ΡΚC ενεργοποιεί την NADPH οξειδάση συμβάλλοντας έτσι στην εκτεταμένη παραγωγή ROS, ενώ προκαλεί και την αποσύζευξη της ΝΟ συνθετάσης μειώνοντας την παραγωγή ΝΟ και αυξάνοντας την παραγωγή Ο 2 [207]. Παράλληλα, μεσολαβεί τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των λείων μυϊκών κυττάρων καθώς και τις αλληλεπιδράσεις των λευκοκυττάρων με το ενδοθήλιο. Πιο συγκεκριμένα, η προσκόλληση των μονοκυττάρων στο ενδοθήλιο [569] και η διαφοροποίησή τους σε μακροφάγα [570], γεγονότα που σχετίζονται άμεσα με το σχηματισμό της αθηρωματικής πλάκας, εξαρτώνται από τη ενεργοποίηση της ΡΚC. Παράλληλα, η επαγόμενη από υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης έκφραση μορίων προσκόλλησης και η προσκόλληση των ουδετερόφιλων στα 96

109 Εισαγωγή ενδοθηλιακά κύτταρα μεσολαβείται από την ΡΚC και αναστέλλεται έπειτα από επώαση με αναστολείς της [571]. Τέλος, η ΡΚC μεσολαβεί και διεργασίες που επάγονται από τις ox LDL, όπως την έκφραση των υποδοχέων CD36 στα μακροφάγα [572], την προσκόλληση των λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο [573] και την ανάπτυξη μακροφάγων σε καλλιέργειες [574]. Επίσης, έχει βρεθεί πως εμπλέκεται στο σηματοδοτικό μονοπάτι που οδηγεί στην ενεργοποίηση του ΝΗΕ1 [575, 576]. Εικόνα 18. Σχηματική απεικόνιση της δράσης της PKC κατά τη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης. Κινάσες του 3 φωσφοϊνοσιτιδίου (Phosphoinositide 3 kinases, PI3K) Οι κινάσες του 3 φωσφοϊνοσιτιδίου (ΡΙ3Κs) συνθέτουν μια οικογένεια λιπιδιακών κινασών που συμμετέχουν στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, του πολλαπλασιασμού, της χημειοταξίας, της επιβίωσης, της 97

110 Εισαγωγή διαφοροποίησης και της μεταβολικής ομοιόστασης του κυττάρου [577]. Οι ΡΙ3Κs αποτελούν επίσης κύριο συστατικό της οδού μετάδοσης του σήματος της ινσουλίνης. Τα τελευταία χρόνια μελετάται ο ρόλος των ΡΙ3Κs στην παθογένεια και τη θεραπεία ασθενειών, όπως ο καρκίνος, η φλεγμονή και οι καρδιαγγειακές νόσοι. Η αντίδραση που καταλύουν οι ΡΙ3Κs είναι η φωσφορυλίωση του υδροξυλίου που βρίσκεται στη θέση 3 του δακτυλίου της ινοσιτόλης των φωσφοϊνοσιτιδίων [578]. Οι ΡΙ3Κs διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες (τάξης Ι, τάξης ΙΙ και τάξης ΙΙΙ) με βάση τη δομή τους, τον τύπο του λιπιδιακού υποστρώματός τους και τον τρόπο ρύθμισής τους [579]. Οι καλύτερα μελετημένες ΡΙ3Κs είναι της τάξης Ι, και διακρίνονται στις υποτάξεις ΙΑ και ΙΒ. Το βασικό υπόστρωμα των ΡΙ3Κs τάξης Ι είναι η 4, 5 διφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη, που έπειτα από φωσφορυλίωση δίνει 3, 4, 5 τριφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη που δρα ως δεύτερος αγγελιοφόρος στο συντονισμό πλήθους λειτουργιών. Κύριοι αναστολείς όλων των ΡΙ3Κs είναι η γουορτμαννίνη (wortmannnin) και ο LY [580], που ανταγωνίζονται για τη θέση δέσμευσης των ΡΙ3Κs με το ΑΤΡ. Οι ΡΙ3Κs εμπλέκονται σε όλα τα στάδια της αθηρωμάτωσης, από την δημιουργία των λιπωδών ραβδώσεων έως την σταθεροποίηση της αθηρωματικής πλάκας [577]. In vitro πειράματα αποδεικνύουν τον καθοριστικό ρόλο που διαδραματίζουν οι ΡΙ3Κs στη χημειοταξία των λευκών αιμοσφαιρίων [581]. Συγκεκριμένα, ποντίκια που δεν εκφράζουν τις ΡΙ3Κs παρουσίασαν μειωμένη συσσώρευση των ουδετερόφιλων κατά 40% μετά από ιστική βλάβη [582]. Είναι γνωστό, ότι τα μακροφάγα και τα Τ λεμφοκύτταρα που έχουν μεταναστεύσει στην αθηρωματική βλάβη παράγουν ελεύθερες ρίζες (ROS). Οι ΡΙ3Κs συμμετέχουν σε αυτή τη διαδικασία, γεγονός που αποδεικνύεται πειραματικά, όταν αναστολή των ΡΙ3Κs ανέστειλε την παραγωγή των ROS [583]. Τα αιμοπετάλια συμμετέχουν στο σχηματισμό του θρόμβου στα προχωρημένα στάδια της αθηροσκλήρωσης και η ρύθμιση της προσκόλλησής και της συσσώρευσής τους γίνεται μέσω των PI3Ks [577]. Τέλος, ο σημαντικός ρόλος των ΡΙ3Κs στη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης επιβεβαιώθηκε και με in vivo πειράματα σε ποντίκια, όπου η ενδοπεριτοναϊκή έγχυση ενός αναστολέα των ΡΙ3Κs περιόρισε την έκταση της αθηρωματικής βλάβης τόσο σε ApoE / όσο και σε LDLR / ποντίκια. Επιπλέον, η ανάλυση της κυτταρικής σύνθεσης της αθηρωματικής πλάκας σε ποντίκια 98

111 Εισαγωγή που τα κύτταρα του ανοσιακού συστήματος δεν εκφράζουν τις ΡΙ3Κs, έδειξε μείωση στη συγκέντρωση των μακροφάγων (κατά 30%) και των Τ λεμφοκυττάρων (κατά 50%), ενώ υπήρχε ταυτόχρονα αύξηση των λείων μυϊκών κυττάρων και του κολλαγόνου προσδίδοντας έτσι, μεγαλύτερη σταθερότητα στη πλάκα [584]. Εικόνα 19. Ο ρόλος των PI3Ks στην αθηροσκλήρωση και ειδικότερα στα κύτταρα που εμπλέκονται στη διαδικασία. Υποδοχείς γ ενεργοποιημένοι από πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωμάτων (peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ) Οι PPARγ ανήκουν στην υπο οικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων, PPAR, οι οποίοι ρυθμίζουν την έκφραση διάφορων γονιδίων. Είναι γνωστό ότι, οι PPAR σχηματίζουν ετεροδιμερή με τον ρετινοϊκό υποδοχέα Χ (retinoic X receptor, RXR) στον πυρήνα του κυττάρου [170]. Η λειτουργία των PPARγ έχει ήδη περιγραφεί, αξίζει όμως να αναφερθεί ο ρόλος τους κατά τη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης. Διάφοροι παράγοντες, όπως τα ελεύθερα λιπαρά οξέα και οι θειαζολιδινενδιόνες (όπως η τρογλιταζόνη, η ροσιγλιταζόνη και η πιογλιταζόνη), συνδέονται με τους PPARγ και τους ενεργοποιούν [585]. Στη 99

112 Εισαγωγή συνέχεια, οι ενεργοποιημένοι PPARγ συνδέονται με την περιοχή του προαγωγέα (promoter region) του κατάλληλου γονιδίου, ρυθμίζοντας με αυτό τον τρόπο την έκφρασή του. Ορισμένα από τα γονίδια που υπόκεινται σε θετική ρύθμιση (up regulation) από τους PPARγ διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης, όπως είναι το γονίδιο του υποδοχέα CD36 [19, 586] και τα γονίδια στόχοι της SREBP 2 (sterol response element binding protein 2), δηλαδή της συνθετάσης και της αναγωγάσης του 3 υδροξυ 3 μεθυλογλουτάρυλο συνένζυμου Α (3 hydroxy 3 methyl glutaryl CoA, HMG CoA) στα μονοκύτταρα [ ]. Εντούτοις, σε διαφορετικά είδη κυττάρων, όπως είναι τα κύτταρα HepG2 και Caco 2, οι αγωνιστές των PPARγ μειώνουν τη συγκέντρωση της SREBP 2 στον πυρήνα και τελικά καταστέλλουν τη σύνθεση χοληστερόλης. Με αυτό τον τρόπο συμβάλλουν στη θεραπεία της υπερχοληστερολαιμίας, ενός από τους παράγοντες κινδύνου για την εμφάνιση αθηροσκλήρωσης [590]. Αντίστροφα, η SREBP 1 προάγει τη σύνθεση των ενδογενών αγωνιστών των PPARγ [591]. Επιπλέον, η έκτοπη έκφραση του SREBP 1 σε κύτταρα 3T3 L1 και HepG2 προάγει τη σύνθεση του mrna του PPARγ [592]. Η χορήγηση αγωνιστών των υποδοχέων PPARγ, τόσο ενδογενών όσο και συνθετικών, καταστέλλει την παραγωγή των προ φλεγμονωδών κυτταροκινών [593] και του υποδοχέα των οξειδωμένων LDL χοληστερολών, SR A (scavenger receptor A) [594] στα ενεργοποιημένα μακροφάγα. Τέλος, η μακροχρόνια χορήγηση των θειαζολιδινενδιονών επιβραδύνει σημαντικά τη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης τόσο σε ποντίκια ApoE / όσο και σε ποντίκια LDLR / [595]. Οι θειαζολιδινενδιόνες αναστέλλουν τη δημιουργία των αφρωδών κυττάρων από τα μακροφάγα μέσω αναστολής της έκφρασης των υποδοχέων πρόσληψης των LDL χοληστερολών [596]. Επιπλέον, οι PPARγ διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στο σχηματισμό των λιποκυττάρων και είναι απαραίτητοι για τη συσσώρευση του λιπώδους ιστού [597] συμβάλλοντας πιθανόν στην εμφάνιση της παχυσαρκίας. Οξειδωμένη LDL χοληστερόλη Η LDL χοληστερόλη παράγεται στο ήπαρ και μεταφέρεται με την αιματική ροή στα διάφορα όργανα, όπως έχει ήδη αναφερθεί σε άλλο σημείο 100

113 Εισαγωγή αναλυτικά. Εν συντομία, η LDL χοληστερόλη περνά ανάμεσα από τα ενδοθηλιακά κύτταρα στον υπενδοθηλιακό χώρο, όπου οξειδώνεται προς οξειδωμένη LDL χοληστερόλη. Στη συνέχεια, προσλαμβάνεται από τους εκκαθαριστές υποδοχείς (για παράδειγμα τους CD36) των μακροφάγων, τα οποία τελικά μετατρέπονται σε αφρώδη κύτταρα. Είναι φανερό λοιπόν, ότι η οξειδωμένη LDL χοληστερόλη διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης. Η οξειδωμένη LDL χοληστερόλη (oxidized LDL cholesterol, ox LDL) ρυθμίζει ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες όπως είναι η απόπτωση, η προσκόλληση, η μετανάστευση, η έκφραση γονιδίων και η δημιουργία αφρωδών κυττάρων τόσο στα μονοκύτταρα όσο και σε άλλα είδη κυττάρων, όπως τα ενδοθηλιακά και τα λεία μυϊκά κύτταρα, που εμπλέκονται στη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης [598]. Η έκθεση μονοκυττάρων σε ox LDL προκαλεί αύξηση της έκφρασης του υποδοχέα CD36 [599]. Στη διαδικασία αυτή εμπλέκεται τόσο η φωσφορυλίωση της ΡΚΒ όσο και οι πυρηνικοί υποδοχείς PPARγ [599]. Ένα ακόμη μόριο που ενεργοποιείται μετά από έκθεση των κυττάρων J774 σε ox LDL, είναι η p38 ΜΑΡΚ, η αναστολή της οποίας, αναστέλλει τη μετατροπή των κυττάρων J774 σε αφρώδη κύτταρα [600]. Η διαδικασία αυτή μεσολαβείται, εν μέρει τουλάχιστον, από την αναστολή της έκφρασης των CD36. Οι οδοί των ERK και JNK δεν εμπλέκονται στη διαδικασία ή τουλάχιστον δεν είναι απαραίτητοι για την προαγωγή της έκφρασης των CD36 στα κύτταρα που εκτέθηκαν σε ox LDL [600]. Μία άλλη δράση των ox LDL είναι η ενεργοποίηση των PPARγ μέσω της οδού της ΜΑΡΚ, με απώτερο στόχο τη δημιουργία αφρωδών κυττάρων [601]. Οι υποδοχείς CD36 φαίνεται να εμπλέκονται σε καταστάσεις όπως η αντίσταση στην ινσουλίνη και ο σακχαρώδης διαβήτης [602] και πιθανόν να είναι υπεύθυνοι για την αυξημένη επίπτωση καρδιαγγειακών συμβαμάτων στα άτομα με μεταβολικό σύνδρομο [603]. Οι ενδείξεις που υποστηρίζουν αυτή την άποψη προέρχονται από μελέτες σε ποντίκια ob/ob όπου τα μακροφάγα παρουσιάζουν αυξημένη πρόσληψη ox LDL, πιθανόν λόγω μεταμεταγραφικής αύξησης των CD36. Ταυτόχρονα, τα ποντίκια αυτά εμφανίζουν αντίσταση στην ινσουλίνη με μειωμένη έκφραση και δράση των υποδοχέων ινσουλίνης [604]. Είναι γνωστό, ότι η αναστολή της μετάδοσης του σήματος της ινσουλίνης με τη χορήγηση αναστολέα της ΡΙ3Κ, σε μακροφάγα, προκάλεσε μείωση της έκφρασης των CD36. Επιπλέον, μακροφάγα που δεν 101

114 Εισαγωγή εκφράζουν τους υποδοχείς της ινσουλίνης, εμφανίζουν μετα μεταγραφική αύξηση της πρωτεΐνης CD36. Τέλος, η χορήγηση θειαζολιδινενδιονών σε ποντίκια ob/ob που εκφράζουν ή δεν εκφράζουν τους LDL υποδοχείς ανέστρεψε τη βλάβη των υποδοχέων της ινσουλίνης και αύξησε την έκφραση των CD36. Όλα αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν το ρόλο της οδού ΡΙ3Κ ΡΚΒ στη ρύθμιση των υποδοχέων της ινσουλίνης και τελικά στο σχηματισμό των αφρωδών κυττάρων μετά από έκθεση τους σε ox LDL [604]. 102

115 Εισαγωγή 3. Οξειδωτικό στρες ως πιθανός σύνδεσμος μεταξύ της παχυσαρκίας, του σακχαρώδη διαβήτη, της αντίστασης στην ινσουλίνη και της αθηροσκλήρωσης. Η οξείδωση των οργανικών ουσιών οδηγεί στην παραγωγή ενέργειας μέσω μεταφοράς ηλεκτρονίων μεταξύ των διαφόρων δραστικών μορφών οξυγόνου. Στον ανθρώπινο οργανισμό υπάρχει ισορροπία ανάμεσα στην οξείδωση και την αναγωγή που ονομάζεται οξειδοαναγωγική ισορροπία που σκοπό έχει την εξουδετέρωση των ασταθών ελεύθερων ριζών. Με τον όρο οξειδωτικό στρες αναφερόμαστε σε διαταραχή αυτής της ισορροπίας που είναι αποτέλεσμα είτε μεγαλύτερης παραγωγής οξειδωτικών ουσιών είτε μείωσης του συστήματος άμυνας των αντιοξειδωτικών ουσιών [605]. Διαταραχή της φυσιολογικής οξειδοαναγωγικής ισορροπίας μπορεί έχει τοξικές επιδράσεις μέσω της παραγωγής υπεροξειδίων και ελευθέρων ριζών τα οποία καταστρέφουν όλα τα στοιχεία του κυττάρου, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών, των λιπιδίων και του DNA του. Ειδικότερα, οξείδωση των λιπιδίων προκαλεί έκπτωση της λειτουργίας των κυτταρικών μεμβρανών, ενώ βλάβη του DNA οδηγεί στην εμφάνιση μεταλλάξεων και στον κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης. Τέλος, βλάβη των πρωτεϊνών οδηγεί σε διακοπή της μετάδοσης σημάτων των αντίστοιχων οδών και τη δημιουργία άκαμπτων και γηρασμένων πρωτεϊνών, κυρίως του κολλαγόνου της θεμέλιας ουσίας. Δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS) Κάθε μόριο, το οποίο μπορεί να φέρει ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια στην εξωτερική ηλεκτρονική στιβάδα του (τροχιακό δυναμικό), μπορεί να θεωρηθεί ως ελεύθερη ρίζα. Στην κατηγορία των ελεύθερων ριζών ανήκουν ορισμένες δραστικές μορφές οξυγόνου (Reactive oxygen species, ROS). Οι δραστικές μορφές οξυγόνου είναι ιόντα ή πολύ μικρά μόρια που περιλαμβάνουν ιόντα οξυγόνου, ελεύθερες ρίζες και υπεροξείδια, τόσο ανόργανα όσο και οργανικά. Είναι εξαιρετικά δραστικές καθώς περιέχουν ασύζευκτα ηλεκτρόνια. Οι ROS σχηματίζονται ως φυσικά παραπροϊόντα του 103

116 Εισαγωγή μεταβολισμού του οξυγόνου και έχουν κεντρικό ρόλο στη κυτταρική σηματοδότηση. Όμως, παρουσία περιβαλλοντικού στρες, όπως έκθεσης στη ζέστη ή στην υπεριώδη ακτινοβολία, τα επίπεδα των ROS αυξάνονται δραματικά οδηγώντας στην καταστροφή συστατικών του κυττάρου (οξειδωτικό στρες). Οι κυριότερες μορφές ελεύθερων ριζών Ανιόν σουπεροξειδίου (Ο 2 ) Το Ο 2 σχηματίζεται από αναγωγή του Ο 2 με ένα ηλεκτρόνιο. Η παραγωγή του γίνεται από την αναπνευστική αλυσίδα των μιτοχονδρίων, καθώς και από τη δράση των ενζύμων οξειδάση της ξανθίνης, λιποοξυγενάση, κυκλοοξυγενάση και NADPH οξειδάση. Δεδομένου του αρνητικού του φορτίου, το Ο 2 διαχέεται πολύ αργά διαμέσου των κυτταρικών μεμβρανών [606]. Διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη βιοχημεία των ελεύθερων ριζών καθώς παράγει πλήθος άλλων ROS, όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου και την υδροξυπεροξειδική ρίζα (ΗΟ 2 ). Υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) Το Η 2 Ο 2 σχηματίζεται από την αναγωγή του Ο 2 με δύο ηλεκτρόνια. Στα βιολογικά συστήματα όμως, το Η 2 Ο 2 παράγεται κυρίως από την αντίδραση δύο Ο 2 είτε αυθόρμητα, είτε ενζυμικά με τη δισμουτάση του υπεροξειδίου (SOD) σύμφωνα με την παρακάτω αντίδραση: 2Ο 2 + 2Η + Η 2 Ο 2 + Ο 2 Το Η 2 Ο 2 δεν έχει ελεύθερα ηλεκτρόνια και επομένως δε συγκαταλέγεται στις ελεύθερες ρίζες. Παρά το γεγονός ότι έχει μικρή δραστικότητα, είναι μια σημαντική ένωση δεδομένου του ότι διαχέεται πολύ γρήγορα μεταξύ των μεμβρανών, ενώ μπορεί να διασπαστεί παρουσία μεταβατικών μετάλλων και να δώσει γένεση στην υδροξυλική ρίζα που είναι ιδιαίτερα τοξική. Το Η 2 Ο 2 μόλις παραχθεί απομακρύνεται από τρία τουλάχιστον αντιοξειδωτικά ενζυμικά συστήματα, τις καταλάσες, τις υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης και τις υπεροξυρεδοξίνες [607]. 104

117 Εισαγωγή Υπεροξειδική ρίζα (ROO ) Οι υπεροξειδικές ρίζες σχηματίζονται από την προσθήκη μοριακού Ο 2 σε ρίζες που έχουν ως κέντρα τον άνθρακα (οργανικές ελεύθερες ρίζες). Κύριος ρόλος τους είναι η αφαίρεση ατόμων υδρογόνου από τα λιπίδια των κυτταρικών μεμβρανών προωθώντας την λιπιδική υπεροξείδωση. Υδροξυλική ρίζα (ΟΗ ) Η υδροξυλική ρίζα (ΟΗ ) έχει έντονη δραστικότητα και τοξικότητα καθώς έχει την ικανότητα να οξειδώνει σχεδόν όλα τα βιολογικά μόρια που υπάρχουν κοντά στον τόπο παραγωγής της. Κύρια λειτουργία της είναι η αφαίρεση ατόμων υδρογόνου από οργανικές ενώσεις παράγοντας έτσι πλήθος νέων ριζών. Στα βιολογικά συστήματα η ΟΗ παράγεται από τον δισθενή σίδηρο (Fe 2+ ) που δρα ως δότης ηλεκτρονίων, παρουσία Η 2 Ο 2, μέσω της αντίδρασης Fenton. Υποχλωριώδες οξύ Το υποχλωριώδες οξύ (HOCl) παράγεται κατά την ενεργοποίηση των ουδετερόφιλων. Πιο συγκεκριμένα, μόλις ενεργοποιηθούν τα ουδετερόφιλα, η μυελοπεροξειδάση που εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα των φαγοκυττάρων καταλύει το σχηματισμό του HOCl από Cl και H 2 O 2. Μονοξείδιο του αζώτου Το μονοξείδιο του αζώτου (NO ) είναι μια ιδιαίτερα σταθερή ελεύθερη ρίζα που παρουσιάζει έντονη κινητικότητα λόγω της έλλειψης φορτίου. Κύριο χαρακτηριστικό της είναι ότι συμμετέχει στην παραγωγή μιας σειράς ROS, όπως το διοξείδιο του αζώτου και ο υπεροξυνιτρίτης, που είναι ένα ιδιαίτερα ισχυρό οξειδωτικό [608]. Το NO συμμετέχει στη νευροδιαβίβαση, τη φλεγμονή και τον κυτταρικό θάνατο [609], ενώ μπορεί να οξειδώσει, να νιτρώσει ή να νιτροζυλιώσει πλήθος πρωτεϊνών. 105

118 Εισαγωγή Πηγές παραγωγής δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) Οι κυριότερες πηγές ROS στα αγγειακά κύτταρα είναι η NADPH οξειδάση, η αναπνευστική αλυσίδα, η μυελοπεροξειδάση, η οξειδάση της ξανθίνης, η συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου, οι λιποξυγενάσες και τα μεταβατικά μέταλλα [610]. NADPH οξειδάση Η οξειδάση του νικοτιναμινο αδενινο φωσφοδινουκλεοτιδίου (NADPH οξειδάση) αποτελεί μια από τις κυριότερες πηγές ROS στα αγγειακά κύτταρα και τα μυοκύτταρα της καρδιάς [611]. Μάλιστα εμπλέκεται και στην παθογένεια της αθηρωμάτωσης [612], γεγονός που την καθιστά σημαντικό εργαλείο για τη μελέτη της νόσου. Η αντίδραση που καταλύεται από τη ΝΑDPH οξειδάση και οδηγεί στην παραγωγή Ο 2 είναι: NADPH+2O 2 NADP + + H + + 2Ο 2 Η NADPH οξειδάση των μονοκυττάρων είναι ένα σύμπλοκο που αποτελείται από το κυτόχρωμα b558 που συντίθενται από τις μεμβρανικές υπομονάδες gp91phox και p22phox και τις κυτταροπλασματικές υπομονάδες p47phox, p67phox και Rac1 [613]. Η θέση σύνδεσης του NADPH βρίσκεται στην gp91phox υπομονάδα, ενώ η p67phox αντιδρά με τις μεμβρανικές υπομονάδες έτσι ώστε να διευκολύνεται η μεταφορά ηλεκτρονίων από το NADPH προς το οξυγόνο [614]. Έπειτα από ενεργοποίηση, τα κυτταροπλασματικά συστατικά μετατοπίζονται στην πλασματική μεμβράνη και συνθέτουν την ενεργή NADPH οξειδάση. Το γενικό μοντέλο της NADPH οξειδάσης στους διάφορους τύπους κυττάρων είναι το ίδιο, ενώ παρατηρούνται επιμέρους μόνο διαφορές όσον αφορά την παραγωγή Ο 2 και τη ρύθμιση του ενζύμου [613]. Η συνάθροιση των επιμέρους υπομονάδων και η ακόλουθη ενεργοποίηση της NADPH οξειδάσης ρυθμίζεται από την εισροή ασβεστίου, την απελευθέρωση ασβεστίου από ενδοκυττάριες αποθήκες, την PKC εξαρτώμενη ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης Α2 (cpla2) και την παραγωγή αραχιδονικού οξέος που ρυθμίζει τη μετατόπιση των p47phox και p67phox στη μεμβράνη [613]. 106

119 Εισαγωγή Αναπνευστική αλυσίδα Το μιτοχόνδριο αποτελεί μια σημαντική πηγή παραγωγής ROS [615] δεδομένου του ότι αντί να οδηγηθεί στην αναγωγή των μορίων Ο 2 σε νερό, το Ο 2 ανάγεται για να δώσει Ο 2 από τα σύμπλοκα Ι (NADH δεϋδρογονάση) [616], ΙΙ (σουξινική δεϋδρογενάση) [617] και ΙΙΙ (ουβικινόνη κυτόχρωμα bc1 αναγωγάση) που εντοπίζονται στην εσωτερική μεμβράνη του μιτοχονδρίου [618]. Το Ο 2 δεν είναι ιδιαίτερα τοξικό αλλά μπορεί να απενεργοποιήσει ειδικά ένζυμα και να προκαλέσει την υπεροξείδωση των λιπιδίων. Μυελοπεροξειδάση (myeloperoxidase, MPO) Η μυελοπεροξειδάση (ΜΡΟ) καταλύει τη μετατροπή των ιόντων Cl σε υποχλωριώδες οξύ (HOCl) σύμφωνα με την παρακάτω αντίδραση: Η 2 Ο 2 + Cl + H + HOCl + H 2 Ο Πρόκειται για ένα διμερές με μοριακό βάρος 150 kda που αποτελείται από δύο ελαφρές αλυσίδες των 15 kda και δύο βαριές αλυσίδες με μοριακό βάρος που ποικίλλει ανάλογα με το βαθμό γλυκοζυλίωσής τους. Οι αλυσίδες συνδέονται μεταξύ τους με μια προσθετική ομάδα αίμης. Επίσης, το ένζυμο περιέχει μια περιοχή πρόσδεσης με ασβέστιο που είναι σημαντική για τη δομή της ενεργής περιοχής του. Η ΜΡΟ εντοπίζεται κατά κύριο λόγο στα λευκοκύτταρα και είναι το μοναδικό ένζυμο που παράγει HOCl. Παράγει επίσης, μια σειρά προϊόντων, όπως 3 χλωροτυροσίνη, χλωροϋδρίνες και ρίζες τυροσίνης [619]. Τα τελευταία χρόνια μελετάται ο πιθανός ρόλος της ΜΡΟ στο σχηματισμό της αθηρωματικής πλάκας. Πιο συγκεκριμένα, βρέθηκε ότι η δραστικότητα του ενζύμου είναι αυξημένη σε αθηρωματικές πλάκες [620], ενώ σε απομονωμένες LDL αθηρωματικές πλάκες βρέθηκαν χλωριωμένα προϊόντα, που είναι ενδεικτικά της δράσης της ΜΡΟ. Τα παραπάνω δεδομένα είναι σε συμφωνία με κλινικές μελέτες που δείχνουν ότι τα επίπεδα της ΜΡΟ στην κυκλοφορία συμβαδίζουν με την πιθανότητα πρόκλησης καρδιαγγειακής νόσου [621]. 107

120 Εισαγωγή Οξειδάση της ξανθίνης Η οξειδάση της ξανθίνης είναι μια σιδηρο θειο μολυβδαινική φλαβοπρωτεΐνη με πολλαπλές λειτουργίες, που απαντάται σε δύο μορφές: τη δεϋδρογενάση της ξανθίνης και την οξειδάση της ξανθίνης. Η οξείδωση της ξανθίνης ή της υποξανθίνης σε ουρικό οξύ σχετίζεται με την παραγωγή NADH από τη δεϋδρογενάση, ενώ η οξειδάση παράγει Ο 2. Η δεϋδρογενάση μετατρέπεται σε οξειδάση μέσω πρωτεόλυσης ή οξείδωσης των θειϊκών της ομάδων. Ο ρόλος του ενζύμου στην παραγωγή Ο 2 από τα κύτταρα σχετίζεται με την παθογένεια της αγγειακής νόσου [622] και την ισχαιμία επαναιμάτωση [623]. Συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟS) Η συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ συνθετάση) καταλύει τη μετατροπή της L αργινίνης σε L κιτρουλίνη και ΝΟ. Διακρίνεται σε νευρωνική (nnos) που εντοπίζεται στο νευρικό ιστό, ενδοθηλιακή (enos) που βρίσκεται στο ενδοθήλιο και επαγόμενη (inducible) (inos) που απαντάται στο ανοσοποιητικό και καρδιαγγειακό σύστημα. Οι ενδοθηλιακές και επαγόμενες ΝΟ συνθετάσες εμπλέκονται περισσότερο με την παθογένεια της αθηρωμάτωσης [619]. Η δραστικότητα της ΝΟ συνθετάσης σχετίζεται έντονα με την πρόκληση της αγγειακής νόσου καθώς το παραγόμενο ΝΟ αντιδρά με μεταλλικά ιόντα, μεταλλοπρωτεΐνες και Ο 2 σχηματίζοντας δραστικές μορφές αζώτου. Η καλύτερα μελετημένη αντίδραση είναι αυτή ανάμεσα στο ΝΟ και το Ο 2 που οδηγεί στο σχηματισμό του υπεροξυνιτρίτη (ΟΝΟΟ ) που με τη σειρά του αντιδρά με το CO 2 δίνοντας ΝΟ 2. Το ΝΟ 2 στη συνέχεια επάγει τη νίτρωση των πρωτεϊνών και την υπεροξείδωση των λιπιδίων [624]. Με βάση τα παραπάνω, η ασύζευκτη ΝΟ συνθετάση είναι πηγή τόσο ΝΟ. όσο και Ο 2 και έχει σημαντικό ρόλο στην πρόκληση οξειδωτικού στρες στα αγγεία. Λιποξυγενάσες Οι λιποξυγενάσες είναι διοξυγενάσες που περιέχουν σίδηρο και καταλύουν την εισαγωγή οξυγόνου σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα παράγοντας μια σειρά βιολογικά ενεργών λιπιδίων, όπως οι προσταγλανδίνες, 108

121 Εισαγωγή οι θρομβοξάνες και τα λευκοτριένια. Υπάρχουν σαφείς ενδείξεις ότι οι λιποξυγενάσες εμπλέκονται στη διαδικασία σχηματισμού της αθηρωματικής πλάκας, καθώς συγκεκριμένοι τύποι τους εκφράζονται στην αθηρωματική βλάβη, ενώ απουσία κάποιων γονιδίων που τις κωδικοποιούν σε ποντίκια, τα προστατεύουν από την πρόκληση της νόσου [625]. Μεταβατικά μέταλλα Τα μεταβατικά μέταλλα, όπως ο χαλκός και ο σίδηρος έχουν μελετηθεί εκτενώς σε σχέση με τη συμμετοχή τους σε αντιδράσεις ριζών και την καταστροφή βιολογικών μορίων, καθώς αποτελούν καταλύτες σε αντιδράσεις οξείδωσης παρουσία υδατικών και λιπιδιακών υπεροξειδίων. Γενικά όμως η συγκέντρωσή των μεταβατικών μετάλλων in vivo είναι αμελητέα και έτσι δεν υπάρχουν πολλές ενδείξεις που να τα συνδέουν με την αθηρωμάτωση. Ο ρόλος του οξειδωτικού στρες στην αθηροσκλήρωση Οι ROS κατέχουν σημαντικό ρόλο στην ανοσιακή απάντηση του οργανισμού έναντι των μικροοργανισμών ως μόρια μετάδοσης σήματος. Εντούτοις, σε αυξημένες συγκεντρώσεις προκαλούν τόσο βλάβη στους ιστούς, όπως έχει ήδη αναφερθεί, όσο και ενεργοποίηση οδών μετάδοσης σήματος οδηγώντας σε διαταραγμένη κυτταρική λειτουργία ή σε κυτταρικό θάνατο. Οι οδοί μεταβίβασης σήματος όπου εμπλέκονται οι ROS αφορούν μεμβρανικούς υποδοχείς, διαύλους ιόντων, πρωτεϊνικές κινάσες και πυρηνικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Αύξηση της παραγωγής του Ο 2 προκαλεί αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωση του Ca 2+ που επιτυγχάνεται είτε με αύξηση της εισόδου του Ca 2+ στο κυτταρόπλασμα είτε με μείωση της πρόσληψής του από το ενδοπλασματικό δίκτυο [626]. Αναλυτικότερα, το Ο 2 αντιδρά με τις ομάδες θειόλης των διαύλων Ca 2+ τύπου L προκαλώντας αύξηση στην είσοδο του Ca 2+ στο κύτταρο [627]. Οι τύπου L δίαυλοι Ca 2+ φωσφορυλιώνονται και ενεργοποιούνται και με μία άλλη οδό, δηλαδή μέσω ενεργοποίησης της PKC από το Ο 2 [628]. Επιπλέον, οι ROS, πιθανόν μέσω οξείδωσης των ακροτελεύτιων μεθειονίνης των διαύλων Κ +, προκαλούν 109

122 Εισαγωγή έκπτωση της λειτουργίας τους στα λεία μυϊκά κύτταρα με τελικό αποτέλεσμα τη δυσλειτουργία του αγγείου [629]. Οι ROS εμπλέκονται τόσο στη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης όσο και στην επιτάχυνσή της, εξαιτίας της ύπαρξης παραγόντων κινδύνου όπως είναι η παχυσαρκία, η αντίσταση στην ινσουλίνη και ο σακχαρώδης διαβήτης. Αναλυτικότερα, κατά το πρώτο στάδιο της αθηροσκλήρωσης, που αφορά στη δυσλειτουργία του ενδοθηλίου, οι ROS παράγονται από την επίδραση των παραγόντων κινδύνου όπως η παχυσαρκία, η αρτηριακή υπέρταση και ο σακχαρώδης διαβήτης. Δηλαδή, παράγεται αυξημένη ποσότητα Ο 2 μέσω της ενδογενούς μιτοχονδριακής NADPH οξειδάσης μετά από έκθεση για παράδειγμα σε αυξημένη συγκέντρωση γλυκόζης, αγγειοτενσίνης ΙΙ, TNFα ή στην αυξημένη διατμητική τάση που ασκείται στο αγγείο. Στη συνέχεια, διασπάται το ΝΟ προκαλώντας μείωση της διασταλτικής ικανότητας του αγγείου [630]. Γεγονός αναστρέψιμο με τη χορήγηση αντιοξειδωτικών όπως είναι η δισμουτάση του υπεροξειδίου [631]. Επιπλέον, σε πειραματικά μοντέλα, βρέθηκε ότι ενδοθηλιακά κύτταρα που εκτέθηκαν σε αυξημένες συγκεντρώσεις ROS οδηγήθηκαν σε απόπτωση και δημιουργία προθρομβωτικής κατάστασης εντός του αυλού του αγγείου, γεγονότα που ανεστάλησαν με τη χορήγηση δισμουτάσης του υπεροξειδίου [632]. Το ενδοθήλιο που δυσλειτουργεί, εκφράζει ένα σύνολο μορίων προσκόλλησης όπως είναι τα VCAM 1 και τα ICAM 1, διευκολύνοντας με αυτό τον τρόπο την προσκόλληση των μονοκυττάρων σε αυτό. Η διαδικασία αυτή επηρεάζεται από την παρουσία των ROS και αναστέλλεται από τα αντιοξειδωτικά όπως είναι η Ν ακετυλο κυστεϊνη μέσω αναστολής της έκφρασης των γονιδίων των μορίων προσκόλλησης [633]. Μετά την προσκόλλησή τους στο ενδοθήλιο τα μονοκύτταρα μεταναστεύουν στον υπενδοθηλιακό χώρο όπου, μετατρεπόμενα σε φαγοκύτταρα φαγοκυτταρώνουν την οξειδωμένη LDL χοληστερόλη. Οι ROS οξειδώνουν την LDL προς οξειδωμένη LDL χοληστερόλη (ox LDL), γεγονός που διευκολύνει την πρόσληψή της. Τα μακροφάγα προσλαμβάνουν τη οξειδωμένη LDL και απελευθερώνουν ουσίες που αυξάνουν την έκφραση μορίων προσκόλλησης διευκολύνοντας την περαιτέρω προσκόλληση των λευκοκυττάρων [634]. Η θεωρία ότι οι ROS συμμετέχουν στην εμφάνιση της αθηροσκλήρωσης υποστηρίζεται από την παρουσία της ox LDL στην αθηρωματική πλάκα καθώς και στη συσχέτιση μεταξύ της ικανότητας της LDL 110

123 Εισαγωγή να οξειδώνεται και του καρδιαγγειακού κινδύνου [598]. Η αυξημένη συγκέντρωση της ox LDL καταστέλλει, ενδοκυτταρικά, την έκφραση της γλουταθειόνης, ενός ισχυρού αντιοξειδωτικού παράγοντα [634]. Τα μακροφάγα αφού φαγοκυτταρώσουν αρκετές ox LDL μετατρέπονται σε αφρώδη κύτταρα και απελευθερώνουν πρωτεάσες οι οποίες διασπούν τις πρωτεΐνες της θεμέλιας ουσίας δημιουργώντας τις κατάλληλες συνθήκες για τη μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων προς τη θέση της βλάβης. Σε πειραματικά μοντέλα, η μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων μετά από έκθεση στον παράγοντα PDGF ανεστάλη με την υπερέκφραση της καταλάσης, υποδεικνύοντας το ρόλο των ROS στη διαδικασία αυτή [635]. Οι ROS ενεργοποιούν την παραγωγή των μεταλλοπρωτεασών και ειδικότερα των MMP 2 και MMP 9, οι οποίες διασπούν το κολλαγόνο με αποτέλεσμα την λέπτυνση της ινώδους κάψας και τη δημιουργία πλάκας που είναι ευάλωτη στη ρήξη [636] (Εικόνα 21). Η παρουσία των κλασικών παραγόντων κινδύνου όπως είναι η παχυσαρκία, η αντίσταση στην ινσουλίνη και ο σακχαρώδης διαβήτης ενισχύουν το φαύλο κύκλο της αυξημένης παραγωγής των ROS και το σχηματισμό της αθηρωματικής βλάβης. Εικόνα 20. Ο ρόλος των ROS κατά τη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης. Σημειώνονται με * τα σημεία όπου επιδρούν οι ROS. 111

124 Εισαγωγή Ένας από τους προαναφερθέντες παράγοντες κινδύνου, η παχυσαρκία, τα τελευταία χρόνια θεωρείται ως μία κατάσταση χρόνιου οξειδωτικού στρες και ήπιας φλεγμονής. Ο λιπώδης ιστός πέρα από την λειτουργία του ως αποθήκη λίπους είναι ένα ενδοκρινικό όργανο όπως έχει ήδη αναφερθεί, ο οποίος, με την επίδραση λιποπολυσακχαριτών, κατεχολαμινών (επινεφρίνη και νορεπινεφρίνη) και ενδοκυττάριων τριγλυκεριδίων, παράγει κυτταροκίνες (IL 1,IL 6,TNF α) [638, 639]. Τα αυξημένα επίπεδα της IL 6 δρουν στο ήπαρ και παράγουν τις πρωτεΐνες οξείας φάσης (CRP), οι οποίες σχετίζονται με τα καρδιαγγειακά συμβάματα. Οι κυτταροκίνες ενεργοποιούν τα πολυμορφοπύρηνα και τα εοσινόφιλα τα οποία παράγουν τις ελεύθερες ρίζες (ROS) μέσω της δράσης των ενζύμων της μυελοπεροξειδάσης, της συνθετάσης του μονοξειδίου του αζώτου και της οξειδάσης του NADPH. Σύμφωνα με μία άλλη υπόθεση το αυξημένο οξειδωτικό στρες στην παχυσαρκία οφείλεται στην αυξημένη ενδοκυττάρια συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων [640]. Τα ενδοκυττάρια τριγλυκερίδια αυξάνουν το Ο 2ˉ στην αναπνευστική αλυσίδα αναστέλλοντας τον μεταφορέα της μιτοχονδριακής νουκλεοτιδιακής αδενίνης [640]. Η αναστολή του μεταφορέα αυτού οδηγεί σε μείωση της μιτοχονδριακής διφωσφορικής αδενοσίνης (adenosine diphosphate, ADP) η οποία με την σειρά της οδηγεί σε μείωση της εισόδου των πρωτονίων μέσω της συνθετάσης του ATP (η ATP συνθετάση χρειάζεται τη ADP ως υπόστρωμα). Το αποτέλεσμα είναι η παραγωγή πρωτονίων στην αναπνευστική αλυσίδα που ανάγουν το Ο 2, σε Ο 2ˉ. Η παχυσαρκία συχνά συνυπάρχει με αντίσταση στην ινσουλίνη, χρόνια υπερινσουλιναιμία, χρόνια υπεργλυκαιμία και σακχαρώδη διαβήτη, καταστάσεις που αποτελούν και ανεξάρτητους παράγοντες κινδύνου για την εμφάνιση της αθηροσκλήρωσης. Η υπεργλυκαιμία ελαττώνει το ΝΟ καταστέλλοντας την enos και αντιδρώντας με το ΝΟ. Το ΝΟ έχει κυτταροπροστατευτική δράση σε φυσιολογικά ερεθίσματα. Παράγεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα μετά από την επίδραση διαφόρων ερεθισμάτων όπως είναι η ακετυλοχολίνη, η βραδυκινίνη, η διατμητική τάση και οι διάφοροι κυκλοφορούντες παράγοντες όπως είναι τα οιστρογόνα, η ινσουλίνη και τα λιπίδια [641]. Το ΝΟ διαχέεται στα παρακείμενα κύτταρα και προκαλεί αγγειοδιαστολή, αναστέλλει την προσκόλληση των αιμοπεταλίων [642] και δίνει το ερέθισμα για την δημιουργία αντιοξειδωτικών παραγόντων, όπως της γλουταθειόνης και της δισμουτάσης του υπεροξειδίου. Η 112

125 Εισαγωγή υπερχοληστεριναιμία και η αντίσταση στην ινσουλίνη είναι μεταξύ των καταστάσεων που ευθύνονται για την αυξημένη παραγωγή των ελευθέρων ριζών. Οι ελεύθερες ρίζες παράγονται από ένζυμα όπως η ΝΑDPH οξειδάση, η οξειδάση της ξανθίνης, η λιποξυγενάση, και η μυελοπεροξειδάση και προκαλούν ελάττωση στην δραστικότητα του ΝΟ. Το ΝΟ αντιδρά με το Ο 2 σχηματίζοντας το ΟΝΟΟ το οποίο δεν έχει τις αγγειοδιασταλτικές ιδιότητες του ΝΟ. Η χρόνια υπεργλυκαιμία στο ΣΔ προκαλεί μη ενζυμική γλυκοζυλίωση πρωτεϊνών και λιπιδίων απελευθερώνοντας Ο 2 και υπεροξείδιο του υδρογόνου είτε έμμεσα μέσω της ενεργοποίησης των φαγοκυττάρων είτε απευθείας κατά την γλυκοζυλίωση. Τα τελικά γλυκοζυλιωμένα προϊόντα (advanced glycation end products, AGEs) δρουν άμεσα και έμμεσα στο ενδοθήλιο [643]. Οι άμεσες δράσεις τους αλλάζουν την αρχιτεκτονική δομή του αγγειακού τοιχώματος και αφορούν την αντίδραση των AGEs με δομικές πρωτεΐνες, οι οποίες δημιουργούν διασυνδέσεις με άλλα μόρια, και τελικό αποτέλεσμα την ελάττωση της ελαστικότητας του αγγείου [644]. Οι έμμεσες δράσεις των AGEs μεσολαβούνται από ειδικούς υποδοχείς των ενδοθηλιακών κυττάρων, τους RAGEs (receptor of advanced glycation end products) και μέσω ενεργοποίησης του NFκΒ παράγουν ελεύθερες ρίζες και TNFα, οι οποίοι στη συνέχεια ενεργοποιούν την παραγωγή περισσότερων ROS [645, 646]. Τέλος, οι ROS συνεχίζοντας το φαύλο κύκλο, παράγουν και άλλα AGEs. Τα AGEs συγκεντρώνονται γρηγορότερα στα αγγεία ασθενών με ΣΔ σε σύγκριση με τα υγιή άτομα [647]. Μέθοδοι υπολογισμού του οξειδωτικού στρες Ο in vivo υπολογισμός του οξειδωτικού στρες και ειδικότερα των ελεύθερων ριζών αποτελεί μία επιστημονική πρόκληση, καθώς οι ROS είναι μόρια με μικρή διάρκεια ζωής και διαρκώς μεταβαλλόμενα. Ο ex vivo προσδιορισμός της ικανότητας των ROS να οξειδώσουν την LDL χοληστερόλη είναι εφικτός και χρήσιμος, αλλά χρησιμότερο θα ήταν η εύρεση βιολογικών δεικτών ακριβείας του οξειδωτικού στρες, τόσο για τα πειραματικά μοντέλα όσο και για τον άνθρωπο. Είναι γνωστό, ότι οι δραστικές μορφές οξυγόνου αντιδρούν με τις πρωτεΐνες, τα λιπίδια και το DNA σχηματίζοντας σταθερά μόρια που είναι δυνατό να ανιχνευθούν με χημικές μεθόδους. 113

126 Εισαγωγή Το προϊόν της οξείδωσης των λιπιδίων, η μαλονυλδιαλδεϋδη μετράται με ακτινοσκόπηση (fluoroscopy). Επιπλέον, τα προϊόντα οξείδωσης του αραχιδονικού οξέος, τα ισοπροστάνια χρησιμοποιούνται ως έμμεσοι δείκτες του οξειδωτικού στρες στον άνθρωπο. Η συγκέντρωση των ισοπροστανίων στα ούρα μετρούνται με την φασματογραφία μάζας [633]. Μία άλλη μέθοδος μέτρησης του οξειδωτικού στρες, είναι ο προσδιορισμός της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας του πλάσματος. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην αρχή ότι η παραγωγή των ROS μειώνει την εκπομπή του φθορισμού. Οπότε σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή, συγκρίνεται η εκπομπή του φθορισμού του πλάσματος με καμπύλες αναφορών γνωστών αντι οξειδωτικών ουσιών όπως είναι ένα ανάλογο της βιταμίνη Ε (Trolox C) [648]. Η μέθοδος αυτή κυκλοφορεί εμπορικά και ορίζεται ως η αντι οξειδωτική αναγωγική ικανότητα του σιδήρου [649]. Εναλλακτικά, είναι δυνατό να υπολογιστούν στο πλάσμα οι συγκεντρώσεις γνωστών αντι οξειδωτικών ενζύμων όπως είναι η γλουταθειόνη, η καταλάση και η δισμουτάση του υπεροξειδίου. Τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιήθηκε η συγκέντρωση της LDL χοληστερόλης στο πλάσμα ως δείκτης του οξειδωτικού στρες [650]. Μία καινοτόμος μέθοδος για τον υπολογισμό της συνολικής ισορροπίας μεταξύ προ οξειδωτικών και αντι οξειδωτικών ουσιών χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη [651]. Η μέθοδος αυτή μετρά την ισορροπία προοξειδωτικών αντιοξειδωτικών ταυτόχρονα σε ένα πείραμα, και βασίζεται σε δύο τύπους αντιδράσεων: μία ενζυματική, όπου το χρωμογενές TMB (3,5,3 5 Tetramethylbenzidine) οξειδώνεται σε ένα έγχρωμο κατιόν υπό την επίδραση υπεροξειδασών, και μία χημική αντίδραση, όπου το κατιόν του TMB ανάγεται σε μία άχρωμη ουσία υπό την επίδραση των αντιοξειδωτικών. Τελικά, η φωτομετρική απορρόφηση του δείγματος συγκρίνεται με τις απορροφήσεις μίας σειράς πρότυπων διαλυμάτων τα οποία παρασκευάζονται αναμιγνύοντας διαφορετικές αναλογίες (0 100%) του υπεροξειδίου του υδρογόνου και του ουρικού οξέος. Η οξείδωση των πρωτεϊνών οδηγεί στο σχηματισμό καρβονυλίων, αλδεϋδών και κετονών στις πλευρικές αλυσίδες τους (κυρίως στη λυσίνη, στην αργινίνη, στην προλίνη και στην ιστιδίνη). Το πλεονέκτημα των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών ως δεικτών του οξειδωτικού στρες έναντι άλλων προϊόντων οξείδωσης είναι ο πρώιμος σχηματισμός τους και η σταθερότητά τους. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε η τροποποίηση 114

127 Εισαγωγή μίας παλαιότερης μεθόδου [652, 653], η οποία βασίζεται στη αρχή ότι η καρβονυλιωμένη ομάδα της πρωτεΐνης συνδέεται με το 2,4 dinitrophenylhydrazine (DNPH) δημιουργώντας ένα σταθερό προϊόν, το 4 dinitrophenylhydrazone (DNP). Η συγκέντρωση του τελικού αυτού προϊόντος στο δείγμα προσδιορίζεται με τη φασματοφωτομετρία η οποία μπορεί να συνδυαστεί, για τον πρωτεϊνικό διαχωρισμό, με HPLC, ELISA, ηλεκτροφόρηση μίας ή δύο διαστάσεων και ανοσοαποτύπωση. Στην συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της ELISA [654]. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε αντίσωμα έναντι της συζευγμένης πρωτεΐνης με DNPH και στη συνέχεια για την ποσοτικοποίηση, προστέθηκε ένα δεύτερο αντίσωμα, το οποίο ήταν προσδεμένο με υπεροξειδάση. Το δείγμα συγκρίθηκε με την πρότυπη καμπύλη η οποία σχηματίστηκε με οξειδωμένη αλβουμίνη και το εύρος της ήταν nmol καρβονύλια/mg πρωτεΐνης. 115

128 Εισαγωγή 4. Μέθοδοι υπολογισμού της αντίστασης στην ινσουλίνη Για τον προσδιορισμό της δράσης της ινσουλίνης έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες μέθοδοι. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία ανοχής γλυκόζης (ΔΑΓ), για την εκτίμηση του βαθμού υπερινσουλιναιμίας σε σχέση με τη γλυκόζη αίματος, ως ένδειξη της παρουσίας ινσουλινοαντοχής. Δεδομένης της χρονικής αλληλεξάρτησης όμως της ινσουλίνης και της γλυκόζης κατά τη διάρκεια αυτής της δοκιμασίας, είναι δύσκολο να διακριθούν οι διαταραχές στην έκκριση ινσουλίνης από τις διαταραχές στην ευαισθησία των ιστών στην ινσουλίνη. Κατόπιν, αναπτύχθηκε η δοκιμασία καταστολής ινσουλίνης σε μια προσπάθεια να αποφευχθούν οι συνέπειες της αλληλεπίδρασης μεταξύ γλυκόζης και ινσουλίνης, και να εκτιμάται έτσι μόνο η δράση της ινσουλίνης. Ο σκοπός της δοκιμασίας αυτής, είναι η αναστολή της ενδογενούς έκκρισης ινσουλίνης, με την έγχυση επινεφρίνης και προπρανολόλης (ή σωματοστατίνης). Ταυτόχρονα εγχέονται συγκεκριμένες ποσότητες γλυκόζης και ινσουλίνης, ώστε τα επίπεδα της γλυκόζης να αποτελούν μέτρο της ευαισθησίας στην ινσουλίνη. Εντούτοις και η δοκιμασία αυτή έχει πολλά μειονεκτήματα, όπως η αυξημένη συχνότητα εμφάνισης αρρυθμιών, η πιθανή αλληλεπίδραση της επινεφρίνης, της προπρανολόλης ή/και της σωματοστατίνης με την ινσουλίνη, και η μη ικανοποιητική καταστολή της ηπατικής παραγωγής της γλυκόζης. Επομένως, λόγω αυτών των μειονεκτημάτων, αναπτύχθηκε μια άλλη μέθοδος, η ευγλυκαιμική δοκιμασία ινσουλινικού αποκλεισμού (euglycemic insulin clamp), η οποία και υιοθετήθηκε στη σύγχρονη έρευνα της ινσουλινοαντοχής. Οι μέθοδοι που έχουν αναπτυχθεί για την in vivo εκτίμηση της δράσης της ινσουλίνης είναι πολλές. Ο λόγος για τον οποίο έχει σημασία ο προσδιορισμός του βαθμού αντίστασης στην ινσουλίνη είναι για να εκτιμήσουμε αν πρόκειται για μειωμένη έκκριση ή μειωμένη δράση της ινσουλίνης, για να ανακαλύψουμε τις καταστάσεις εκείνες που χαρακτηρίζονται από διαταραχή στη δράση της ινσουλίνης, για να ελέγξουμε την αποτελεσματικότητα των θεραπευτικών μας επιλογών, και λόγω της σημασίας που έχει η αντίσταση στην ινσουλίνη ως προάγγελος μελλοντικών μεταβολικών διαταραχών (κίνδυνος εμφάνισης διαβήτη σε άτομα με οικογενειακό ιστορικό διαβήτη τύπου 2). 116

129 Εισαγωγή Έμμεσες μέθοδοι Ινσουλίνη νηστείας Ως απλούστερη μέθοδο εκτίμησης της ευαισθησίας στην ινσουλίνη, πολλοί έχουν προτείνει τη συγκέντρωση της ινσουλίνης στο πλάσμα. Εντούτοις, η μέθοδος έχει αρκετά μειονεκτήματα, σημαντικότερα των οποίων είναι ότι είναι έμμεση μέθοδος και εμφανίζει ασθενή συσχέτιση με την in vivo δράση της ινσουλίνης, εξαρτάται από τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο μέτρησης της ινσουλίνης, καθώς το χρησιμοποιούμενο αντίσωμα μπορεί να αντιδρά και με άλλες ουσίες (για παράδειγμα, προϊνσουλίνη) και αντανακλά την ευαισθησία σε βασική κατάσταση, οπότε και η πρόσληψη γλυκόζης γίνεται κυρίως από ινσουλινοανεξάρτητους ιστούς. Ομοιοστατικό μοντέλο (homeostatic model assessment of insulin resistance, HOMA) Η μέθοδος HOMA είναι ένα μαθηματικό μοντέλο εκτίμησης της ευαισθησίας στην ινσουλίνη από απλές μετρήσεις γλυκόζης και ινσουλίνης νηστείας [655]. Βάσει των στοιχείων της βιβλιογραφίας έχουν σχεδιαστεί καμπύλες οι οποίες συνδέουν τη γλυκόζη βασικής κατάστασης με την έκκριση ινσουλίνης, σε άτομα με διάφορους βαθμούς διαταραχής της έκκρισης ινσουλίνης. Παρόμοιες καμπύλες σχεδιάστηκαν και για τη σχέση ρυθμού μεταβολισμού γλυκόζης με την ινσουλίνη πλάσματος. Έτσι για κάθε βαθμό ιστικής ευαισθησίας στην ινσουλίνη και εκκριτικής ικανότητας, το μοντέλο προβλέπει τις τιμές γλυκόζης και ινσουλίνης νηστείας και το αντίστροφο. Per os και IV δοκιμασία ανοχής γλυκόζης Οι πρώτες προσπάθειες εκτίμησης του ινσουλινοεξαρτώμενου μεταβολισμού της γλυκόζης έγιναν με τη δοκιμασία ανοχής γλυκόζης (ΔΑΓ). Η συγκέντρωση της γλυκόζης κατά τη διάρκεια της ΔΑΓ δίνει ένα μέτρο της ολικής ανοχής γλυκόζης, η οποία ταξινομείται ως φυσιολογική, διαταραγμένη (impaired glucose tolerance, IGT) ή διαβήτης. Για κάθε χρονική στιγμή υπολογίζεται ο λόγος γλυκόζη προς ινσουλίνη (G/I), και όσο μικρότερη η 117

130 Εισαγωγή αύξηση της γλυκόζης ανά μονάδα ινσουλίνης, τόσο πιο ευαίσθητος ο ασθενής στην ινσουλίνη. Εντούτοις η χρήση του λόγου G/I έχει αρκετά μειονεκτήματα. Η ΔΑΓ είναι μία εξέταση με χαμηλή επαναληψιμότητα, και σε επανειλημμένες μετρήσεις στο ίδιο άτομο τα αποτελέσματα διαφέρουν μεταξύ τους κατά 25 30%. Επιπλέον, ο ρυθμός απορρόφησης της γλυκόζης από το πεπτικό σωλήνα διαφέρει σημαντικά από άτομο σε άτομο, με αποτέλεσμα η συγκέντρωση της γλυκόζης να είναι διαφορετική και να μεταβάλλεται διαρκώς. Δεδομένης δε της ανεξάρτητης δράσης της γλυκόζης να καταστέλλει την ηπατική παραγωγή της, και να προκαλεί την περιφερική πρόσληψή της, είναι σχεδόν αδύνατο να έχουμε σωστό μέτρο της ινσουλινοεξαρτώμενης κατανάλωσης γλυκόζης [656]. Είναι γνωστό, ότι η συγκέντρωση της ινσουλίνης μεταβάλλεται διαρκώς, και είναι διαφορετική από άτομο σε άτομο λόγω αφενός μεν της διαρκώς μεταβαλλόμενης συγκέντρωσης γλυκόζης, αφετέρου δε του διαφορετικού ερεθίσματος από τον εντεροϊνσουλινικό άξονα στο β κύτταρο. Ένα ακόμη μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί η στενή αλληλεπίδραση μεταξύ της γλυκόζης και της ινσουλίνης, ενώ καμία δεν είναι σταθερή, με αποτέλεσμα τη δυσχέρεια ακριβούς εκτίμησης του λόγου G/I. Τέλος, η πρόσληψη γλυκόζης από τους περιφερικούς ιστούς επηρεάζεται ανεξάρτητα από την υπεργλυκαιμία και την υπερινσουλιναιμία, με αποτέλεσμα να μην μπορούμε να διακρίνουμε μεταξύ γλυκοζοπροκλητής και ινσουλινοπροκλητής ανθεκτικότητας στη γλυκόζη. Η ενδοφλέβια δοκιμασία ανοχής γλυκόζης επιλύει τα δύο πρώτα από τα προβλήματα που αναφέραμε, δεν αποφεύγει όμως τα υπόλοιπα. Για το λόγο αυτό αναπτύχθηκαν άλλες τεχνικές για καλύτερη εκτίμηση της ευαισθησίας στην ινσουλίνη. Minimal Model IVGTT με πολλαπλές αιμοληψίες (FSIVGTT) Οι Bergman και συν. [657] ανέπτυξαν ένα μαθηματικό μοντέλο για την εκτίμηση της ευαισθησίας στην ινσουλίνη κατά τη διάρκεια ενός FSIVGTT. Το μεγαλύτερο πλεονέκτημα της μεθόδου αυτής είναι η απλότητά της. Επίσης παρέχει ένα μέτρο της ευαισθησίας στην ινσουλίνη ανεξάρτητα της συγκέντρωσης γλυκόζης, όπως επίσης και ένα μέτρο της εκκριτικής ικανότητας του παγκρέατος (πρώτης και δεύτερης φάσης της έκκρισης). 118

131 Εισαγωγή Εντούτοις έχει και αρκετά μειονεκτήματα, όπως μικρή επαναληψιμότητα [658], εγγενή κακή εκτίμηση της ευαισθησίας στην ινσουλίνη σε διαβητικούς τύπου 1 και 2 [659], αδυναμία διάκρισης μεταξύ ιστικής πρόσληψης γλυκόζης και καταστολής ηπατικής παραγωγής γλυκόζης, με αποτέλεσμα, υποεκτίμηση της ευαισθησίας στην ινσουλίνη, και αδυναμία συνδυασμού της με άλλες ερευνητικές μεθόδους. Άμεσες μέθοδοι Δοκιμασία ανοχής ινσουλίνης Η πρώτη τεχνική που αναπτύχθηκε για άμεση in vivo εκτίμηση της ευαισθησίας στην ινσουλίνη, ήταν η δοκιμασία ανοχής ινσουλίνης. Σε αυτήν χορηγείται IV μία καθορισμένη ποσότητα ινσουλίνης, και στη συνέχεια καθορίζεται ο ρυθμός ελάττωσης της γλυκόζης, και το κατώτατο σημείο στο οποίο φθάνει. Η ελάττωση της γλυκόζης καθορίζεται από δύο παράγοντες: την καταστολή της ενδογενούς παραγωγής γλυκόζης και την ινσουλινοεξαρτώμενη πρόσληψη γλυκόζης από τους ιστούς. Όσο πιο γρήγορη η ελάττωση της γλυκόζης, τόσο πιο ευαίσθητοι οι ιστοί στην ινσουλίνη. Η δοκιμασία ανοχής ινσουλίνης, αν και είναι απλή μέθοδος, έχει ένα σοβαρό μειονέκτημα, που περιορίζει σημαντικά τη χρησιμότητά της. Η έγχυση ινσουλίνης, ειδικά σε νορμογλυκαιμικά άτομα, προκαλεί υπογλυκαιμία, η οποία μπορεί να προκαλέσει νευρολογικές και καρδιολογικές επιπλοκές, ειδικά σε ηλικιωμένους ή διαβητικούς με υποκείμενη αθηροσκληρυντική νόσο. Επιπλέον, η υπογλυκαιμία επάγει την έκκριση ανταγωνιστικών ορμονών (γλουκαγόνο, κατεχολαμίνες, αυξητική ορμόνη, κορτιζόλη), οι οποίες προκαλούν αύξηση της ηπατικής παραγωγής γλυκόζης και/ή αναστέλλουν την πρόσληψη γλυκόζης από τους περιφερικούς ιστούς. Έτσι είναι αδύνατη η εκτίμηση της ευαισθησίας των ιστών στην ινσουλίνη. Άλλα μειονεκτήματα της μεθόδου είναι η μεγάλη (φαρμακευτική) δόση της ινσουλίνης, η αδυναμία ποσοτικής εκτίμησης της ευαισθησίας στην ινσουλίνη, και η αδυναμία διάκρισης του σημείου της ινσουλινοαντοχής (περιφερική ή ηπατική). 119

132 Εισαγωγή Δοκιμασία καταστολής ινσουλίνης Κατά την εκτίμηση της ευαισθησίας του σώματος στην ινσουλίνη, όλοι οι ιστοί πρέπει να εκτίθενται στο ίδιο υπερινσουλιναιμικό ερέθισμα. Για το σκοπό αυτό, οι Shen S W και συν. [660] επινόησαν τη δοκιμασία καταστολής ινσουλίνης, σκοπός της οποίας είναι η διερεύνηση της ικανότητας συγκεκριμένου βαθμού υπερινσουλιναιμίας να προκαλεί το μεταβολισμό συγκεκριμένης ποσότητας εγχυόμενης γλυκόζης. Για την επίτευξη σταθερών επιπέδων ινσουλίνης, εγχύεται επινεφρίνη (προκειμένου να αναστείλει την ενδογενή έκκριση ινσουλίνης, λόγω της έγχυσης γλυκόζης). Η έγχυση επινεφρίνης επάγει την ηπατική παραγωγή γλυκόζης, για την αναστολή της οποίας εγχύεται και προπρανολόλη. Καθώς η τεχνική αυτή εκτιμά την πρόσληψη γλυκόζης υπό συνθήκες υπεργλυκαιμίας, δεν μας δίνει ακριβές μέτρο της ευαισθησίας των ιστών στην ινσουλίνη. Η επινόηση της μεθόδου αυτής ήταν πολύ σημαντική για την μελέτη της ινσουλινοαντοχής. Εντούτοις παρουσιάζει και μία σειρά από μειονεκτήματα: Η επινεφρίνη ανταγωνίζεται τη δράση της ινσουλίνης, τόσο στο ήπαρ όσο και στους περιφερικούς ιστούς [661]. Όπως όμως φάνηκε από τις μελέτες των Kimmerling και συν. η προπρανολόλη δεν αναστέλλει πλήρως την ηπατική παραγωγή γλυκόζης, με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατό να εκτιμηθεί με ακρίβεια η ινσουλινοεξαρτώμενη πρόσληψη γλυκόζης από τους ιστούς [662]. Επιπλέον, η έγχυση επινεφρίνης προκαλεί άλλο ένα πρόβλημα, καθώς δεν είναι γνωστή η ακριβής δράση της προπρανολόλης στους διαβητικούς. Επίσης, δεν είναι βέβαιο ότι η δράση των κατεχολαμινών (περιφερική πρόσληψη γλυκόζης, ιστική αιματική ροή) είναι ταυτόσημη σε φυσιολογικά και διαβητικά άτομα. Τέλος, και ίσως πιο σημαντικό, η επινεφρίνη, ακόμα και όταν συγχορηγείται με προπρανολόλη, μπορεί να προκαλέσει σοβαρές διαταραχές του ρυθμού [663], οι οποίες δεν είναι δυνατό να προβλεφθούν ούτε από το ηλεκτροκαρδιογράφημα ηρεμίας ούτε από τη δοκιμασία κόπωσης. Έτσι είναι αυτονόητο ότι αποφεύγεται σε άτομα με παθολογικό ΗΚΓ, στεφανιαία νόσο ή υπέρταση, και πάντοτε γίνεται υπό ηλεκτροκαρδιογραφικό έλεγχο. 120

133 Εισαγωγή Δοκιμασία καταστολής ινσουλίνης με σωματοστατίνη Προκειμένου να αποφευχθούν οι ανεπιθύμητες ενέργειες της επινεφρίνης, οι Ratzmann και συν. τροποποίησαν τη δοκιμασία καταστολής ινσουλίνης, αντικαθιστώντας την έγχυση επινεφρίνης και προπρανολόλης με έγχυση σωματοστατίνης [664]. Η σωματοστατίνη είναι ισχυρός αναστολέας της έκκρισης ινσουλίνης και γλυκογόνου, και δεν έχει επίδραση στην περιφερική πρόσληψη γλυκόζης. Παρόλο που η τροποποιημένη δοκιμασία καταστολής της ινσουλίνης αποφεύγει τα προβλήματα που εκπορεύονται από την ανταγωνιστική δράση της επινεφρίνης στον μεταβολισμό της γλυκόζης (ηπατική παραγωγή γλυκόζης και αναστολή περιφερικής πρόσληψης γλυκόζης) και τις κοιλιακές αρρυθμίες, δε λύνει τα υπόλοιπα προβλήματα της μεθόδου. Αντιθέτως, προσθέτει νέα, που έχουν να κάνουν με την αναστολή διάφορων ορμονών από τη σωματοστατίνη. Η δράση των ορμονών αυτών στον μεταβολισμό της γλυκόζης δεν είναι πλήρως διευκρινισμένη. Τεχνική διάχυσης αντιβραχίου Όλες οι παραπάνω μέθοδοι έχουν δύο βασικούς περιορισμούς: δεν επιτρέπουν τον ποσοτικό προσδιορισμό του ρυθμού μεταβολισμού της γλυκόζης, και δε διαχωρίζουν την ηπατική και μυϊκή συμμετοχή στην μετρούμενη αντίσταση στην ινσουλίνη. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της πρόσληψης γλυκόζης από περιφερικούς ιστούς, οι Zierler και συν. χρησιμοποίησαν για πρώτη φορά την τεχνική της διάχυσης αντιβραχίου [665]. Το βασικό πλεονέκτημα της μεθόδου αυτής είναι ότι εξετάζει άμεσα την επίδραση της ινσουλίνης στη μυϊκή πρόσληψη γλυκόζης. Όπως όμως όλες οι προηγούμενες μέθοδοι, έχει και αυτή τα μειονεκτήματα και τους περιορισμούς της, δηλαδή είναι επεμβατική, και απαιτεί καθετηριασμό της βραχιόνιας αρτηρίας, και δεν παρέχει πληροφορίες για την ηπατική ευαισθησία στην ινσουλίνη. 121

134 Εισαγωγή Δοκιμασία ινσουλινικού αποκλεισμού (clamp) Η ανάπτυξη και εφαρμογή της τεχνικής του ινσουλινικού αποκλεισμού, ήταν πολύ σημαντική για την in vivo μελέτη της αντίστασης στην ινσουλίνη [666]. Η μέθοδος συνίσταται στην έγχυση ινσουλίνης για την επίτευξη σταθερών επιπέδων υπερινσουλιναιμίας, ενώ η γλυκόζη σταθεροποιείται σε βασικά επίπεδα (υπερ, υπο, ή ευγλυκαιμίας). Αυτό επιτυγχάνεται με τη χορήγηση IV διαλύματος γλυκόζης με μεταβαλλόμενο ρυθμό, που τροποποιείται συνεχώς ανάλογα με τα επίπεδα της γλυκόζης πλάσματος. Η τεχνική αυτή επιτρέπει την εκτίμηση της ιστικής ευαισθησίας στην ινσουλίνη, αλλά και της ευαισθησίας του β κυττάρου στη γλυκόζη, κάτω από σταθερές συνθήκες γλυκαιμίας (Εικόνα 21). Μεταξύ γλυκόζης πλάσματος και έκκρισης ινσουλίνης από το πάγκρεας, υπάρχει μία αρνητική παλίνδρομη σχέση. Κάθε αλλαγή μιας από τις παραμέτρους, προκαλεί αντίθετη αλλαγή της άλλης μεταβλητής. Λόγω αυτής της αλληλεπίδρασης μεταξύ ινσουλίνης και γλυκόζης, ήταν σημαντική η ανάπτυξη ενός συστήματος στο οποίο οι υπό μελέτη μεταβλητές, δηλαδή γλυκόζη και ινσουλίνη, είναι δυνατόν να ελέγχονται ανεξάρτητα. Έχουν αναπτυχθεί τρεις παραλλαγές της τεχνικής αυτής. Η υπεργλυκαιμική, που επιτρέπει την εκτίμηση της παγκρεατικής απόκρισης στη γλυκόζη και τον ποσοτικό προσδιορισμό της ολικής σωματικής κατανάλωσης γλυκόζης υπό συνθήκες υπεργλυκαιμίας. Η υπογλυκαιμική και η ευγλυκαιμική, που επιτρέπει την μέτρηση της ολικής πρόσληψης γλυκόζης μετά από υπερινσουλιναιμικό ερέθισμα. Σε όλες τις περιπτώσεις ο προσδιορισμός της ολικής ευαισθησίας στην ινσουλίνη στηρίζεται στην αρχή ότι υπό σταθερές συνθήκες υπερινσουλιναιμίας και γλυκαιμίας, η προσλαμβανόμενη ποσότητα από τους ιστούς είναι ίση με το ρυθμό χορήγησης της γλυκόζης προκειμένου να διατηρούνται σταθερά τα επίπεδά της στο πλάσμα. Αυτό βέβαια προϋποθέτει ότι η ηπατική παραγωγή γλυκόζης είναι πλήρως κατεσταλμένη, ή μπορεί να προσδιορισθεί με τη χρήση έγχυσης επισημασμένης γλυκόζης. 122

135 Εισαγωγή Εικόνα 21. Δοκιμασία ευγλυκαιμικού ινσουλινικού αποκλεισμού. Η ινσουλίνη πλάσματος διατηρείται σε επίπεδα 100 μu/ml, ενώ η γλυκόζη πλάσματος σταθεροποιείται σε βασικά επίπεδα με την εξωγενή χορήγηση γλυκόζης. Υπό σταθερές συνθήκες ευγλυκαιμίας, η χορηγούμενη γλυκόζη («Μ») καταναλώνεται από τους ιστούς και αποτελεί μέτρο της ινσουλινοεξαρτώμενης κατανάλωσης γλυκόζης Ο ευγλυκαιμικός αποκλεισμός θεωρείται από όλους τους ερευνητές ως μέθοδος εκλογής για την μελέτη της ινσουλινοαντοχής. Εξ ορισμού γίνεται υπό συνθήκες ευγλυκαιμίας, οπότε αποφεύγονται οι κίνδυνοι της υπογλυκαιμίας και της συνακόλουθης νευροενδοκρινικής απάντησης. Επιπλέον παρέχει ένα ποσοτικό μέτρο της ευαισθησίας στην ινσουλίνη. Τέλος, μπορεί εύκολα να συνδυαστεί με άλλες μεθόδους, καθώς ουσιαστικά αποτελεί ένα εργαλείο μελέτης της φυσιολογίας του μεταβολισμού γλυκόζης, λιπιδίων, αμινοξέων, και ηλεκτρολυτών, παράλληλα με την έκκριση ινσουλίνης. 123

136 124

137 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 125

138 126

139 Υλικά μέθοδοι ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Η αντλία ανταλλαγής ιόντων Na + /H + 1 (ΝΗΕ1) είναι μία ευρέως διαδεδομένη πρωτεΐνη, υπεύθυνη για τη ρύθμιση του ενδοκυτταρικού ph και του κυτταρικού όγκου. Είναι γνωστό όμως ότι συμμετέχει και σε πλήθος άλλων κυτταρικών λειτουργιών όπως η προσκόλληση, η μετανάστευση, η ανάπτυξη και η διαφοροποίηση του κυττάρου. Οι λειτουργίες αυτές διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο κατά τη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης. Παρόλα αυτά, ο ρόλος της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + 1 στη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης δεν είναι πλήρως διευκρινισμένος. Η αθηροσκλήρωση αποτελεί την κυριότερη αιτία καρδιαγγειακών νοσημάτων, οι οποίες βρίσκονται στη δεύτερη θέση, από άποψη συχνότητας, στις αιτίες θανάτου στη χώρα μας. Η αθηροσκλήρωση αποτελεί μία πολύπλοκη διαδικασία που ξεκινά με τη δυσλειτουργία του ενδοθηλίου, εδραιώνεται με τη μετανάστευση των μονοκυττάρων, το σχηματισμό των αφρωδών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των λείων μυϊκών κυττάρων υπενδοθηλιακά και καταλήγει στο σχηματισμό και τη ρήξη της πλάκας με αποτέλεσμα την απόφραξη των αρτηριών. Η διαδικασία αυτή της αθηροσκλήρωσης είναι κοινή σε όλους τους ανθρώπους, όταν όμως συνυπάρχουν παράγοντες κινδύνου όπως η αντίσταση στην ινσουλίνη, ο σακχαρώδης διαβήτης, η παχυσαρκία, η αρτηριακή υπέρταση, η αθηρογόνος δυσλιπιδαιμία, το κάπνισμα, η γενετική προδιάθεση και το άρρεν φύλο τότε η όλη διαδικασία επιταχύνεται. Πιστεύεται ότι η επιτάχυνση της διαδικασίας από την αντίσταση στην ινσουλίνη μπορεί να οφείλεται είτε στην απευθείας δράση των αυξημένων συγκεντρώσεων της γλυκόζης, της ινσουλίνης και των ελευθέρων ριζών είτε στις διαταραχές των λιποκυτταροκινών. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι να διερευνηθούν οι μηχανισμοί μέσω των οποίων η αντίσταση στην ινσουλίνη επιταχύνει τη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης και ο πιθανός ρόλος της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + 1 στη διαδικασία αυτή. Οι μηχανισμοί που μελετήθηκαν ήταν : Η δραστικότητα της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + 1 στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη και σύγκρισή της με άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και άτομα φυσιολογικού βάρους. 127

140 Υλικά μέθοδοι Η επίδραση υψηλών συγκεντρώσεων γλυκόζης, ινσουλίνης, λεπτίνης και αδρεναλίνης στη δραστικότητα της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + 1 και τα σηματοδοτικά μόρια που εμπλέκονται και στις τρεις ομάδες ατόμων. Οι αθηρογόνες ιδιότητες των μονοκυττάρων δηλαδή, η προσκόλληση, η μετανάστευση, η πυκνότητα των CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων κα η φαγοκυττάρωση των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από αυτά. Η επίδραση των αυξημένων συγκεντρώσεων της γλυκόζης, της ινσουλίνης, της λεπτίνης και της αδρεναλίνης στις προαναφερθείσες ιδιότητες των μονοκυττάρων. Ο ρόλος της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Na + /H + 1 στις προαναφερθείσες ιδιότητες των μονοκυττάρων. Ο ρόλος των γνωστότερων σηματοδοτικών μορίων στις διαδικασίες αυτές. Τα επίπεδα του συστηματικού οξειδωτικού στρες σε άτομα με αντίσταση στην ινσουλίνη και παχυσαρκία και συγκρίθηκε με ινσουλινοευαίσθητα παχύσαρκα άτομα και άτομα φυσιολογικού βάρους. Δεδομένου ότι στην αθηρωματική πλάκα είναι αυξημένο το οξειδωτικό στρες που επιτείνεται με την παρουσία σακχαρώδη διαβήτη και της αντίστασης στην ινσουλίνη, ελέγξαμε κατά πόσο τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη παρουσιάζουν αυξημένο συστηματικό οξειδωτικό στρες. Η διαταραχή των λιποκυτταροκινών και ειδικότερα της μειωμένης αδιπονεκτίνης που συχνά παρουσιάζεται στα άτομα με αντίσταση στην ινσουλίνη και συγκρίναμε τα επίπεδά της σε ινσουλινοευαίσθητα και ινσουλινοάντοχα παχύσαρκα άτομα και σε άτομα φυσιολογικού βάρους. 128

141 Υλικά μέθοδοι ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΜΕΛΕΤΗΣ Σχεδιασμός της μελέτης Η παρούσα μελέτη αποτελείται από δύο σκέλη. Στο πρώτο σκέλος, μελετήθηκαν τα ανθρωπομετρικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά ατόμων με παχυσαρκία, η ισορροπία οξειδωτικών αντιοξειδωτικών, η συγκέντρωση των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών και της αδιπονεκτίνης στον ορό του αίματος, και συγκρίθηκαν με άτομα φυσιολογικού βάρους αντίστοιχης ηλικίας και φύλου. Στο δεύτερο σκέλος της μελέτης επιλέχθηκαν τυχαία 16 άτομα με παχυσαρκία και 10 υγιή άτομα φυσιολογικού βάρους αντίστοιχης ηλικίας και φύλου. Στα άτομα αυτά προσδιορίστηκε η ευαισθησία τους στην ινσουλίνη με τον ευγλυκαιμικό υπερινσουλιναιμικό αποκλεισμό (euglycemic hyperinsulinemic clamp) και εκτιμήθηκαν οι αθηρογόνες ιδιότητες των μονοκυττάρων. Στο πρώτο σκέλος της μελέτης αρχικά έγινε συλλογή ολικού αίματος μετά από 12ωρη νηστεία από όλους τους συμμετέχοντες για τον προσδιορισμό των βιοχημικών παραμέτρων (γλυκόζη πλάσματος, ινσουλίνη νηστείας, ολικήχοληστερόλη, τριγλυκερίδια, HDL χοληστερόλη, LDL χοληστερόλη, γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη (HbA 1c ), SGOT, SGPT, ουρία, κρεατινίνη ορού, ουρικό οξύ, γενική αίματος, ινωδογώνο, hs CRP, ταχύτητα καθίζησης των ερυθροκυττάρων (ΤΚΕ), TSH, FT 4, FT 3 ). Ο προσδιορισμός των βιοχημικών παραμέτρων έγινε σύμφωνα με τις εγκεκριμένες μεθόδους που χρησιμοποιούνται στο Εργαστήριο του Ιπποκράτειου Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης. Επιπλέον, προσδιορίστηκε η αντίσταση στην ινσουλίνη σύμφωνα με τον τύπο: HOMA IR = [ινσουλίνη νηστείας ορού (µu/ml)] Χ [γλυκόζη πλάσματος νηστείας (mmol/l)]/22,5 ( Από όλους τους συμμετέχοντες συλλέχθηκε πλάσμα για τον προσδιορισμό των επιπέδων της αδιπονεκτίνης και της ισορροπίας οξειδωτικών αντί οξειδωτικών (ΡΑΒ), ως άμεσος δείκτης του οξειδωτικού στρες και της συγκέντρωσης των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών, ως έμμεσος δείκτης του οξειδωτικού στρες. Τα άτομα που συμμετείχαν στο δεύτερο σκέλος της έρευνας υποβλήθηκαν σε επιπλέον συλλογή 25ml ολικού αίματος που χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση των μονοκυττάρων. Στην συνέχεια τα άτομα αυτά υπεβλήθησαν στην δοκιμασία του ευγλυκαιμικού υπερινσουλιναιμικού αποκλεισμού για τον ακριβή προσδιορισμό της 129

142 Υλικά μέθοδοι ευαισθησίας στην ινσουλίνη. Οι ασθενείς ανάλογα με την τιμή της ευαισθησίας στην ινσουλίνη χωρίστηκαν σε δύο ομάδες, σε εκείνους που είχαν ευαισθησία στην ινσουλίνη και εκείνους με αντίσταση στην ινσουλίνη. Στην συνέχεια, στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν μελετήθηκε η δραστικότητα του ΝΗΕ1, η προσκόλληση των μονοκυττάρων στην λαμινίνη 1, η μετανάστευση των μονοκυττάρων διαμέσου της λαμινίνης 1, η πυκνότητα των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων και η φαγοκυττάρωση των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από τα μονοκύτταρα. Άτομα που μελετήθηκαν Στην πρώτο σκέλος της μελέτης περιλήφθηκαν 55 παχύσαρκα άτομα (ΔΜΣ 30kg/m 2 ) ηλικίας >18 έτη και 21 υγιείς εθελοντές φυσιολογικού βάρους (ΔΜΣ<25kg/m 2 ) αντίστοιχης ηλικίας. Στο δεύτερο σκέλος της μελέτης συμμετείχαν 16 άτομα με παχυσαρκία (ΔΜΣ 30kg/m 2 ) ηλικίας ετών (14 γυναίκες, 2 άντρες) και 10 υγιείς εθελοντές ίδιας ηλικίας φυσιολογικού σωματικού βάρους (ΔΜΣ<25kg/m 2 ) (8 γυναίκες, 2 άντρες). Οι ασθενείς με παχυσαρκία παρακολουθούνταν στα εξωτερικά ιατρεία της Μονάδας Μελέτης Μεταβολικών Νοσημάτων της Β Παθολογικής Κλινικής του Ιπποκράτειου Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης. Κανένας από τους συμμετέχοντες δεν είχε ιστορικό σακχαρώδη διαβήτη, δυσλιπιδαιμίας, αρτηριακής υπέρτασης, πολυκυστικής νόσου των ωοθηκών. Τα περισσότερα άτομα με παχυσαρκία είχαν θετικό οικογενειακό ιστορικό για παχυσαρκία, σακχαρώδη διαβήτη, δυσλιπιδαιμία και αρτηριακή υπέρταση. Αντίθετα, τα άτομα φυσιολογικού βάρους είχαν αρνητικό οικογενειακό ιστορικό για τις νόσους αυτές. Τα παχύσαρκα άτομα που έπασχαν από υποθυρεοειδισμό βρισκόταν σε σταθερή αγωγή για τουλάχιστον 3 μήνες και ο ορμονικός τους έλεγχος ήταν μέσα στα φυσιολογικά όρια. Όλοι οι συμμετέχοντες υπέγραψαν συγκατάθεση αφού ενημερώθηκαν για την μελέτη, σύμφωνα με τις οδηγίες της Συνθήκης του Ελσίνκι (2000). Τα ανθρωπομετρικά χαρακτηριστικά του δείγματος (ύψος και βάρος σώματος, περίμετρος μέσης και ισχίων) μετρήθηκαν από τον υποψήφιο διδάκτορα. Για την μέτρηση των ανθρωπομετρικών χαρακτηριστικών οι συμμετέχοντες φορούσαν ελαφρύ ένδυμα και η μέτρηση του βάρους του σώματος έγινε χωρίς υποδήματα. Η περίμετρος μέσης μετρήθηκε στο 130

143 Υλικά μέθοδοι μεσοδιάστημα μεταξύ του πλευρικού τόξου και της άνω λαγόνιας ακρολοφίας. Η περίμετρος ισχίων μετρήθηκε στην μεγαλύτερη περίμετρο ισχίων. Οι δύο περίμετροι μετρήθηκαν με μεζούρα στο πλησιέστερο εκατοστό. Οι μετρήσεις έγιναν 3 φορές και υπολογίστηκε ο μέσος όρος των μετρήσεων. Ο δείκτης μάζας σώματος (ΔΜΣ) υπολογίστηκε με τον τύπο: βάρος σώματος (kg)/ ύψος σώματος 2 (m). Η αρτηριακή πίεση μετρήθηκε σε καθιστή θέση μετά από ανάπαυση 5 λεπτών και καταγράφηκε ο μέσος όρος τριών συνεχών μετρήσεων. Υλικά Ανασυνδυασμένη ανθρώπινη λεπτίνη (R&D systems, Minneapolis, MN, USA). Cariporide (Sanofi Aventis, Paris, France). Ficoll Paque Plus (1.077g/ml) και Percoll (1.130g/ml) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Iscove s Modified Dulbecco s Medium (IMDM) με NaHCO 3, πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη, and L γλουταμίνη και fetal calf serum (FCS) (Biochrom, Berlin, Germany). Diethylenetriamine pentaacetic acids (DTPA), περοξείδιο του υδρογόνου, hemacolor staining kit were (Merck, Darmstadt, Germany). Hepes, nigericin, methazolamide, iodoacetic acid, DPI (Diphenyleneiodonium chloride), L NAME (N ω Nitro L arginine methyl ester hydrochloride), hexadecyltrimethylammonium bromide and dianisidinedihydrochloride tablets (Sigma, St. Louis, MO, USA). LDL (low density lipoprotein, χαμηλής περιεκτικότητας λιποπρωτεΐνη) BSA (Bovine Serum Albumin) και BCECF/AM (Applichem, Darmstadt, Hesse, Germany). Anti human CD36 συνενωμένο με FITC αντίσωμα (Serotec, Kidlington, Oxfordshire, UK). DiI (1,1 dioctadecyl 3,3,3,3 tetramethyl indocarbocyanine perchlorate) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Cytochalasin D και wortmannin (Fluka, Seelze, Germany). GF109203X και Gö6976 (Alexis, Lausen, Switzerland). Ινσουλίνη Actrapid (Novo Nordisk, Denmark). Transwell culture inserts were supplied from Costar (Cambridge, MΑ). 131

144 Υλικά μέθοδοι Μέθοδοι 1. Μέτρηση της ισορροπίας οξειδωτικών αντιοξειδωτικών Η ισορροπία ανάμεσα σε οξειδωτικά και αντί οξειδωτικά μετρήθηκε από μία καινούργια μέθοδο των Alamdari και συν (Alamdari et al. 2007). Αρχικά παρασκευάσθηκαν τα διαλύματα αναφοράς διάφορων αναλογιών (1 100%) υπεροξειδίου του υδρογόνου συγκεντρώσεως 1mM με ουρικό οξύ συγκεντρώσεως 6mM. Ακολούθως, παρασκευάσθηκε το ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος (ρυθμιστικό φωσφορικού κιτρικού) με τον εξής τρόπο: 1,455gr άνυδρο φωσφορικό νάτριο (Na2HPO4) και 1,9gr άνυδρου κιτρικού οξέος (C6H8O7) διαλύθηκαν σε 180ml αποσταγμένο νερό, ph 5. O όγκος ρυθμίστηκε στα 200ml με αποστειρωμένο νερό και το διάλυμα φυλάχτηκε στους 4 C. Στην συνέχεια παρασκευάστηκε το διάλυμα του υδροχλωρικού οξέος (HCl:2N) με το εξής τρόπο: 40ml υδροχλωρικού οξέος (HCl) 37% προστέθηκαν σε 150 dh2o κα ο όγκος διορθώθηκε στα 200ml με dh2o. Η παρασκευή του θειικού αμμωνίου (0,4%) έγινε με προσθήκη 0,04gr θειικού αμμωνίου σε 10ml αποστειρωμένο νερό και φυλάχτηκε στους 20 C. Ακολούθησε η παρασκευή του ρυθμιστικού διαλύματος,3,5,5 Tetramethylbenzidine (TMB) με την προσθήκη ενός δισκίου ΤΜΒ.2HCl σε κωνικό φιαλίδιο (Falcon των 15ml, καλυμμένο με αλουμινόχαρτο) που περιείχε 10ml από το ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος, που παρασκευάσθηκε νωρίτερα. Από το διάλυμα αυτό, 1ml μεταφέρθηκε σε κωνικό φιαλίδιο (eppendorf), ενώ τα υπόλοιπα 9ml παραμένουν στο πρώτο φιαλίδιο. Στη συνέχεια, τοποθετήθηκαν 10µl από κάθε δείγμα που έπρεπε να μετρηθεί, από διαλύματα αναφοράς και από αποστειρωμένο νερό στις αντίστοιχες υποδοχές πινακίου πολυεστερενίου 96 υποδοχών (96 well ELISA plate). Ακολούθησε η προετοιμασία του διαλύματος κατιόντος TMB ως εξής: προσθήκη 10µl υπερθειϊκού αμμωνίου (0,4%) στο 1ml διαλύματος TMB που είχε τοποθετηθεί νωρίτερα σε φιαλίδιο eppendorf και στη συνέχεια επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Παράλληλα, προστέθηκαν 1,1µl ενζύμου της υπεροξειδάσης στα 9ml διαλύματος TMB που είχε παρασκευαστεί νωρίτερα, αναδεύτηκαν ήπια και χρησιμοποιήθηκαν αμέσως (η δραστικότητα του ενζύμου του διαλύματος είναι 25 mu/ml). Στη 132

145 Υλικά μέθοδοι συνέχεια αναμίχθηκαν τα δύο διαλύματα, δηλαδή το διάλυμα της ΤΜΒυπεροξειδάσης με το διάλυμα του κατιόντος TMB και ακολούθησε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 4 λεπτά. Στη συνέχεια, 200 µl από το τελευταίο διάλυμα TMB προστέθηκαν σε κάθε πηγαδάκι και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 12 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. Ακολούθησε προσθήκη 100µl υδροχλωρικού οξέος (2N) σε κάθε πηγαδάκι και η αναλυτική πλάκα επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. Τέλος, η ισορροπία μεταξύ οξειδωτικών και αντί οξειδωτικών (ΡΑΒ) των δειγμάτων προσδιορίστηκε μετρώντας την οπτική απορρόφηση των δειγμάτων με φασματοφωτόμετρο (Stat Fax 2100 Awareness Technology Inc) σε μήκος κύματος 450nm έχοντας σημεία αναφοράς τα μήκη κύματος 620 ή 570nm. Παράλληλα, δημιουργήθηκε μία καμπύλη αναφοράς με την οπτική απορρόφηση των δειγμάτων αναφοράς γνωστής περιεκτικότητας, όπου η απορρόφηση (άξονας y) αντιπαρατέθηκε με τις τιμές της ισορροπίας των οξειδωτικών αντί οξειδωτικών (PAB) (στον άξονα x, οι τιμές της PAB είναι το ποσοστό του υπεροξειδίου του υδρογόνου πολλαπλασιασμένο με το 6 (mm του ουρικού οξέος). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν με μία αυθαίρετη μονάδα, HK. Το αποτέλεσμα εκφράσθηκε ως η οπτική απορρόφηση του κάθε πειραματικού δείγματος συγκριτικά με τις τιμές της ΡΑΒ βάσει της καμπύλης αναφοράς. 2. Μέτρηση των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών είναι καινοτόμος και χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά από τους Alamdari και συν. [654]. Βασίζεται στην προσθήκη ενός αντισώματος συζευγμένου με DNPH (2,4 Dinitrophenylhydrazine), το οποίο συνδέεται με τις καρβονυλικές ομάδες των πρωτεϊνών και στη συνέχεια προστίθεται ένα δεύτερο αντίσωμα έναντι του πρώτου και τελικά μετράται η απορρόφηση σε φασματοφωτόμετρο. Αναλυτικότερα, το ανηγμένο BSA (bovine serum albumin) παρασκευάστηκε με τον ακόλουθο τρόπο: 1gr BSA διαλύθηκε σε 100 ml PBS και προστέθηκαν 0,1gr στερεού NaBH 4 και επωάστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, το διάλυμα αυτό ουδετεροποιήθηκε με 133

146 Υλικά μέθοδοι τη προσθήκη HCl (2N) και ακολούθησε διαπίδυση 12 ωρών έναντι του PBS, στους 4 C. Κατά τη διάρκεια της διαπίδυσης, το ρυθμιστικό διάλυμα αλλάχθηκε δύο φορές, τέλος, μοιράστηκε σε μικρότερα φιαλίδια και αποθηκεύτηκε στους 80 C. Το οξειδωμένο BSA προετοιμάστηκε με τον ακόλουθο τρόπο: 50mg BSA διαλύθηκαν σε 1ml PBS και προστέθηκαν 20µl EDTA (100mM), 57µl ασκορβικού οξέος (833mM) και 2µl σιδηρούχο θειικό αμμώνιο (100mM) και επωάστηκε για 90 λεπτά στους 37 C. Ακολούθησε διαπίδυση 12 ωρών έναντι του PBS στους 4 C, έγιναν δύο αλλαγές του ρυθμιστικού διαλύματος, μοιράστηκε σε μικρότερα φιαλίδια και έπειτα αποθηκεύτηκε στους 80 C. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης του ανηγμένου και του οξειδωμένου BSA μετρήθηκαν με τη μέθοδο Bradford. Στη συνέχεια, η συγκέντρωση της πρωτεΐνης ρυθμίστηκε με PBS σε 5μg/ml. Τέλος, προετοιμάστηκαν τα δείγματα για την πρότυπη καμπύλη, αναμιγνύοντας οξειδωμένο και ανηγμένο BSA σε διαφορετικές αναλογίες, από 0 μέχρι 100%, διατηρώντας ταυτόχρονα σταθερή την ολική συγκέντρωση της πρωτεΐνης (5μg/ml). Για τη μέθοδο της ELISA αρχικά, προετοιμάστηκαν τα απαραίτητα διαλύματα. Το διάλυμα DNPH (2,4 Dinitrophenylhydrazine) (0,05mM, ph 6,2) παρασκευάστηκε ως εξής: 1,2mg DNPH διαλύθηκαν σε 333μl φωσφορικό οξύ (85%) και προστέθηκαν σε 40ml dh 2 O. Το ph ρυθμίστηκε στο 6,2 και ο τελικός όγκος στα 50 ml. Το διάλυμα αυτό, πριν τη χρήση είναι απαραίτητο να διηθηθεί με φίλτρο 0,2 μm. Αξίζει να αναφερθεί ότι το διάλυμα δεν διατηρείται για περισσότερες από 24 ώρες, λόγω της καθίζησης του DNPH και πρέπει να προετοιμάζεται εκ νέου κάθε φορά. Το διάλυμα τερματισμού (5%) (blocking buffer) παρασκευάστηκε ως εξής: 2,5g αποβουτυρωμένου γάλακτος διαλύθηκαν σε 50ml PBS. Για το πρώτο αντίσωμα (φρέσκο), 7,5 μl αντισώματος αντι DNPH και 20μl Tween 20 προστέθηκαν σε 20ml διαλύματος τερματισμού. Για το δεύτερο αντίσωμα (φρέσκο), 7,5μl αντισώματος αντιrabbit HRP συνδεμένο IgG και 20μl Tween 20 προστέθηκαν σε 20ml διαλύματος τερματισμού. Για το διάλυμα υποστρώματος (φωσφορικό κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα), 1,455g Na 2 HPO 4 και 1,91g κιτρικού οξέος (C 6 H 8 O 7 ) προστέθηκαν σε 150ml dh 2 O. Το ph ρυθμίστηκε στο 5 και ο όγκος στα 200ml με dh 2 O και αποθηκεύτηκε στους 4 C. Για το διάλυμα υποστρώματος, 2 ταμπλέτες TMB και 4μl υπεροξειδίου του υδρογόνου (30%) προστέθηκαν σε 20 ml ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος. 134

147 Υλικά μέθοδοι Κατά τη μέθοδο αυτή 200μl από τα πρότυπα διαλύματα που παρασκευάσθηκαν νωρίτερα, από τα δείγματα (5μg πρωτεΐνης σε 1 ml PBS) και από PBS χωρίς πρωτεΐνη προστέθηκαν στις αντίστοιχες οπές της πλάκας. Ακολούθησε επώαση 12 ωρών στους 4 C. Στη συνέχεια έγιναν 3 πλύσεις με 300μl PBS. Ακολούθως, προστέθηκαν 200μl από το διάλυμα DNPH και επωάστηκαν για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, σε σκοτεινό μέρος. Στη συνέχεια, έγιναν 5 πλύσεις με 300μl PBS:αιθανόλη (1:1) και 1 πλύση με 300μl PBS. Αφού προστέθηκαν 260μl από το διάλυμα τερματισμού, η πλάκα επωάστηκε για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθησαν 3 πλύσεις με 300μl PBS (0,1% Tween 20) και προστέθηκαν 200μl από το αντι DNPH διάλυμα που είχε παρασκευασθεί νωρίτερα. Στη συνέχεια, η πλάκα επωάστηκε για 1 h στους 37 C και έγιναν 5 πλύσεις με 300μl PBS (0,1% Tween 20). Ακολούθως, προστέθηκαν 200μl από το δεύτερο αντίσωμα και επώαση για 1 h στους 37 C. Στη συνέχεια έγιναν 5 πλύσεις με 300μl PBS (0,1% Tween 20) και προστέθηκαν 200μl από το διάλυμα υποστρώματος. Η αντίδραση σταμάτησε μετά από 3 5 λεπτά με την προσθήκη 100μl HCl 2 N. Τέλος, μετρήθηκε η απορρόφηση στα 450nm. Οι τιμές των άγνωστων δειγμάτων υπολογίστηκαν βάσει της πρότυπης καμπύλης, η οποία κατασκευάστηκε από τις τιμές των παραπάνω πρότυπων δειγμάτων. 3. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης της αδιπονεκτίνης στον ορό Χρησιμοποιήθηκε το εμπορικό πακέτο αντιδραστηρίων της εταιρίας R&D systems (Minneapolis, MN, USA) και μετρήθηκε με τη μέθοδο της ELISA. Το εύρος των τιμών ήταν 3,9 250ng/mL και ειδικότητα <0,891ng/mL. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην αρχή ότι προσθέτοντας στο δείγμα ένα αντίσωμα έναντι της αδιπονεκτίνης, ενώνεται με αυτή. Αφού απομακρυνθεί η περίσσεια του μη δεσμευμένου αντισώματος, προστίθεται ένα διάλυμα υποστρώματος ΤΜΒ και αλλάζει το χρώμα του δείγματος ανάλογα με την ποσότητα της αδιπονεκτίνης που περιέχει. Στη συνέχεια, προστίθεται ένα διάλυμα τερματισμού της αντίδρασης το οποίο αλλάζει το χρώμα από κίτρινο σε μπλε και τέλος, μετράται η ένταση του χρώματος στα 450nm. 135

148 Υλικά μέθοδοι 4. Ευγλυκαιμικός υπερινσουλιναιμικός αποκλεισμός Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας στην ινσουλίνη είναι o ευγλυκαιμικός υπερινσουλιναιμικός αποκλεισμός. Με βάση τη μέθοδο αυτή τα άτομα της μελέτης ταξινομήθηκαν σε τρεις ομάδες: 1. παχύσαρκα άτομα με αντίσταση στην ινσουλίνη 2. παχύσαρκα άτομα χωρίς αντίσταση στην ινσουλίνη και 3. υγιείς μάρτυρες φυσιολογικού βάρους και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Η μέθοδος αυτή έχει ως σκοπό τον προσδιορισμό της ευαισθησίας στην ινσουλίνη. Η ινσουλίνη πλάσματος αυξάνεται και διατηρείται σε υψηλά επίπεδα (100μU/ml) με εξωγενή συνεχή χορήγηση κρυσταλλικής ινσουλίνης. Παράλληλα, η συγκέντρωση της γλυκόζης πλάσματος διατηρείται σταθερή σε βασικά επίπεδα με την βοήθεια συνεχούς μεταβαλλόμενης ροής. Στην σταθερή αυτή κατάσταση της ευγλυκαιμίας ο ρυθμός χορήγησης της γλυκόζης ισούται με την γλυκόζη που μεταβολίζεται συνολικά από όλους τους ιστούς του σώματος του ασθενή. Είναι επομένως ένα μέτρο εκτίμησης της ευαισθησίας στην εξωγενώς χορηγούμενη γλυκόζη. Αναλυτικότερα, ο ασθενής προετοιμάζεται με την τοποθέτηση ενός φλεβικού καθετήρα στην βραχιόνια φλέβα από όπου χορηγείται το διάλυμα της ινσουλίνης ταυτόχρονα με το διάλυμα γλυκόζης μέσω αντλίας με ακρίβεια έως 0,1ml/h. Παράλληλα, στο άλλο χέρι τοποθετείται ένας φλεβικός καθετήρας με παλίνδρομη φορά σε φλέβα της άκρας χειρός από όπου θα συλλέγεται το αίμα για τον προσδιορισμό της γλυκόζης ορού. Για να διασφαλιστεί η βατότητα του καθετήρα αυτού χορηγείται διαρκώς φυσιολογικός ορός. Το αντιβράχιο αυτό είναι τοποθετημένο σε θερμαινόμενο κλωβό ιδιοκατασκευής που διατηρεί την άκρα χείρα στην σταθερή θερμοκρασία των 60 ο C με απώτερο σκοπό την διάνοιξη των αρτηριοφλεβικών αναστομώσεων και την λήψη αρτηριοποιημένου φλεβικού αίματος από τον καθετήρα. Η μέτρηση της γλυκόζης του ολικού αίματος γίνεται με τον αναλυτή YSI2300 κάθε 10 λεπτά για τα πρώτα 100 λεπτά της εξέτασης, ενώ κατά τα τελευταία 20 λεπτά, η γλυκόζη αίματος προσδιορίζεται κάθε 5 λεπτά. Όλοι οι υπολογισμοί κατά την διάρκεια της μελέτης γίνονται με την βοήθεια των υπολογιστικών φύλλων του Excell όπου η ομάδα μας έχει ενσωματώσει όλους τους απαραίτητους υπολογιστικούς τύπους και συναρτήσεις ώστε ανά πάσα στιγμή να γνωρίζουμε την αντιστοιχία του ρυθμού έγχυσης της γλυκόζης με την συνολική από τον οργανισμό μεταβολιζόμενη γλυκόζη. 136

149 Υλικά μέθοδοι Αρχικά χορηγούνται υψηλές συγκεντρώσεις ινσουλίνης για να παρεμποδιστεί η ενδογενής ηπατική παραγωγή γλυκόζης, δηλαδή τα πρώτα 5 λεπτά της εξέτασης ο ρυθμός έγχυσης της ινσουλίνης είναι 100mU/m 2 min και στο 5 ο λεπτό μειώνεται στα 60mU/m 2 min. Από το 10 ο λεπτό της εξέτασης και για τα υπόλοιπα 110 λεπτά, ο ρυθμός έγχυσης της ινσουλίνης παραμένει σταθερός. Ο ρυθμός αυτός εξαρτάται από την επιφάνεια σώματος του ασθενή και αντιστοιχεί σε 40mU/m 2 min. Στο 5 ο λεπτό της εξέτασης αρχίζει η παράλληλη έγχυση διαλύματος γλυκόζης (20%) με ρυθμό 2,0 mg/(kg min). Ο ρυθμός έγχυσης γλυκόζης αυξάνεται στο 10 ο λεπτό σε 2,5 mg/(kg min) και καθ όλη την διάρκεια της εξέτασης μεταβάλλουμε τον ρυθμό έγχυσης της γλυκόζης ανάλογα με τα επίπεδα της γλυκόζης του αρτηριοποιημένου φλεβικού αίματος ώστε να επιτευχθεί μία σταθερή κατάσταση ευγλυκαιμίας τα τελευταία 40 λεπτά της μελέτης. Είναι απαραίτητο στο διάστημα αυτό να παραμένουν σταθερά τόσο ο ρυθμός έγχυσης της γλυκόζης όσο και η γλυκόζη πλάσματος η οποία πρέπει να είναι 92mg/dl. Η ποσότητα της εγχεόμενης γλυκόζης κατά την περίοδο της σταθερής κατάστασης αντιπροσωπεύει τη μεταβολιζόμενη στο ίδιο διάστημα γλυκόζη από τον ασθενή και αποτελεί το αποτέλεσμα της εξέτασης (M, mg/min). Η ινσουλίνη πλάσματος μετράται και αντιπροσωπεύει την απάντηση του β κυττάρου στην εξωγενώς χορηγούμενη γλυκόζη. Επιπλέον, υπολογίστηκε ο λόγος του Μ προς τη μέση συγκέντρωση της ινσουλίνης κατά τη διάρκεια της σταθερής κατάστασης (Μ/Ι), ο οποίος αντιπροσωπεύει την ποσότητα της γλυκόζης που μεταβολίζεται για κάθε μία μονάδα ινσουλίνης πλάσματος και είναι δείκτης της ευαισθησίας των ιστών στην παραγόμενη ινσουλίνη. Ο μεταβολικός ρυθμός κάθαρσης (metabolic clearance rate, MCR, l/min) της γλυκόζης ορίζεται ως ο λόγος του Μ προς τη συγκέντρωση της εγχεόμενης γλυκόζης κατά τη διάρκεια της σταθερής κατάστασης. Οι δείκτες αυτοί, για να είναι συγκρίσιμοι, ομαλοποιούνται με το σωματικό βάρος (Μ bw, M/I bw, MCR bw ) διαιρώντας τις αντίστοιχες τιμές με το σωματικό βάρος. 5. Απομόνωση μονοκυττάρων από ολικό αίμα Τα μονοκύτταρα απομονώθηκαν από ολικό αίμα με κάποιες τροποποιήσεις της μεθόδου των Seager Danciger και συν. Η μέση τελική καθαρότητα σε μονοκύτταρα, όπως μετρήθηκε με χρήση κυτταρομετρίας 137

150 Υλικά μέθοδοι ροής, ήταν 90,6%. Αναλυτικότερα, 25ml ολικού αίματος τοποθετήθηκαν σε πλαστικούς κωνικούς δοκιμαστικούς σωλήνες περιεκτικότητας 50ml (falcon) που περιείχε αντιπηκτικό CPDA (3,4ml και αποτελούνταν από 2,63gr/dL dihydro sodium citrate, 327mg/dL monohydro citrate, 2,9g/dL anhydrous glucose, 251mg/dL dihydro sodium phosphate, 27,5mg/dL αδενίνης) και 2,6 ml θρεπτικού υλικού (CM) [(IMDM και NaHCO3, L glutamine, 100U/ml πενικιλλίνη, 100U/ml στρεπτομυκίνη, 25mM N 2 hydroxyethylpiperazine N 2 ethanesulfonic acid (HEPES) ph 7.5 και 10% fetal calf serum (FCS)]. Προστέθηκαν 6 ml ουδέτερου φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (phosphate buffered saline PBS ph 7,2) που περιείχε 1 mm αιθυλενο διαμινοτετραοξικoύ οξύ (EDTA). Τοποθετήθηκαν 10 ml φικόλης (Ficoll Paque Plus) πυκνότητας 1,077g/ml κάτω από το διάλυμα με την βοήθεια 18 gauge βελόνης (spinal needle). Φυγοκεντρήθηκαν στα 400 g για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT), χωρίς τη χρήση φρένου. Τα μονοκύτταρα που εμφανίζονται ως μία υπόλευκη στοιβάδα μεταξύ πλάσματος και φικόλης απομακρύνθηκαν και διαλύθηκαν σε PBS. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 150g για 10λεπτά σε RT. Απομακρύνθηκε το υπερκείμενο που περιέχει τα αιμοπετάλια, και τα μονοκύτταρα διαλύθηκαν σε 35ml PBS 1x με 1mM EDTA. Ακολούθησαν άλλες δύο ίδιες πλύσεις. Τα μονοπύρηνα στη συνέχεια αναδιαλύθηκαν σε 25 ml θρεπτικό υλικό Iscove (IMDM) που περιείχε 10% ορό εμβρύου μόσχου (fetal calf serum FCS), 1% Hepes, 1% πενικιλλίνη/ στρεπτομυκίνη και 1% γλουταμίνη. Κατόπιν επιστοιβάχθηκαν σε 25 ml 46% ισο οσμωτικού διαλύματος περκόλης που είχε προηγουμένως τοποθετηθεί σε πλαστικούς κωνικούς δοκιμαστικούς σωλήνες περιεκτικότητας 50ml (falcon) και περιείχε 23ml ισο οσμωτικής περκόλης (21,275ml Percoll + 1,725ml PBS 10x) και 27ml θρεπτικό υλικό IMDM (10% FCS). Φυγοκέντρηση σε 550g RT για 30 λεπτά. Απομακρύνθηκαν 15 ml από την υπόλευκη στοιβάδα και αναδιαλύθηκαν σε 35 ml PBS. Φυγοκέντρηση στα 400 g για 10 λεπτά RT. Απομακρύνθηκε το υπερκείμενο και τα κύτταρα διαλύονται σε ψυκτικό υλικό (75% IMDM, 15% FCS, 10% DMSO) και φυλάσσονται σε υγρό άζωτο. Η βιωσιμότητα και ο αριθμός των κυττάρων προσδιορίζεται μετά από αποκλεισμού των νεκρών. Συγκεκριμένα, ο αριθμός των μονοκυττάρων υπολογίστηκε με τη χρήση πλάκας αιμοκυττομέτρου (Neubauer) μετά από 1:1 αραίωσή τους με διάλυμα 0,4% trypan blue. 10μl εναιωρήματος μονοκυττάρων αναμείχθηκαν με 10 μl διαλύματος 0,4% trypan blue και 138

151 Υλικά μέθοδοι ακολούθως παραλήφθηκαν 10 μl από το παραπάνω μείγμα και τοποθετήθηκαν στην πλάκα αιμοκυττομέτρου. Η παραπάνω χρωστική βάφει τα νεκρά κύτταρα σκούρα μαύρα, ενώ αντίθετα τα ζωντανά κύτταρα λαμπυρίζουν. Για τον προσδιορισμό του αριθμού των κυττάρων ανά ml εναιωρήματος έγινε καταμέτρηση των κυττάρων στα τέσσερα τεταρτημόρια της πλάκα και στη συνέχεια εφαρμόστηκε ο παρακάτω τύπος: μονοκύτταρα/ml εναιωρήματος= [(συνολικός αριθμός μονοκυττάρων/4)x2] x 10 4 Κάθε φορά απομονώνονταν 3 4x106 κύτταρα/ml. Το ποσοστό βιωσιμότητας ήταν 98%. Τα δείγματα επεξεργάστηκαν και με κυτταρομετρία ροής (Beckman Coulter Epics, Inc) όπου με τη χρήση του ειδικού μονοκλωνικού αντισώματος για μονοκύτταρα, το CD14, που ήταν συνδεδεμένο με φυκοερυθρίνη (phycoerythrin) επιβεβαιώθηκε ότι σε ποσοστό >85% ο πληθυσμός των κυττάρων που απομονώθηκε αποτελούνταν από μονοκύτταρα. Κατάψυξη κυττάρων και φύλαξή τους στο υγρό άζωτο Μετά την απομόνωσή τους τα μονοκύτταρα που δε χρησιμοποιήθηκαν άμεσα καταψύχθηκαν και φυλάχτηκαν στο υγρό άζωτο ( C) για μελλοντική χρήση. Τα μονοκύτταρα αναδιαλύθηκαν σε ειδικό διάλυμα που περιείχε θρεπτικό υλικό IMDM, 15% FCS και 10% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), ώστε η συγκέντρωση των κυττάρων να είναι 10 6 /ml. Στη συνέχεια τα μονοκύτταρα μοιράστηκαν σε δοχεία κρυοκατάψυξης (biofreeze vials) και φυλάχτηκαν για τρεις ώρες στους 70 ο C σε ειδικό δοχείο στο οποίο η θερμοκρασία μειώνονταν σταδιακά 1 0 C/λεπτό (freezing container Nalgene). Έπειτα τα δοχεία που περιείχαν τα μονοκύτταρα μεταφέρθηκαν στο υγρό άζωτο όπου και φυλάχτηκαν μέχρι τη χρήση τους. Απόψυξη κυττάρων που είχαν φυλαχτεί στο υγρό άζωτο Τα ειδικά δοχεία κρυοκατάψυξης που περιείχαν τα μονοκύτταρα μεταφέρθηκαν με λαβίδα από το υγρό άζωτο σε υδατόλουτρο στους 37 ο C προκειμένου να ξεπαγώσουν. Στη συνέχεια το εναιώρημα κυττάρων μεταφέρθηκε σε πλαστικούς κωνικούς δοκιμαστικούς σωλήνες 139

152 Υλικά μέθοδοι περιεκτικότητας 15ml και προστέθηκαν 2 3 ml θρεπτικό υλικό IMDM (10% FCS). Έπειτα τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις 1500rpm για 10 λεπτά, έγινε ρίψη του υπερκείμενου και επαναδιάλυσή τους σε θρεπτικό υλικό. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν 2 ακόμα πλύσεις φυγοκεντρήσεις στις ίδιες συνθήκες. Τελικά, τα κύτταρα αναδιαλύθηκαν σε θρεπτικό υλικό IMDM (10% FCS) σε συγκέντρωση 10 6 /ml. 6. Προσδιορισμός της δραστηριότητας του ΝΗΕ1 Όπως έχει ήδη αναφερθεί ο ΝΗΕ1 είναι υπεύθυνος για τη ρύθμιση του ενδοκυτταρικού ph (phi). Για να προσδιορίσουμε τη δραστηριότητα του ΝΗΕ1 χρησιμοποιήσαμε μία καθιερωμένη μέθοδο που βασίζεται στην αρχή ότι αναστέλλοντας τις υπόλοιπες αντλίες που είναι υπεύθυνες για τη ρύθμιση του phi τότε οποιαδήποτε μεταβολή διαπιστώσουμε στο phi αυτή θα οφείλεται στη δραστηριότητα του ΝΗΕ1. Ο προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ph (phi) έγινε με τη χρήση της φθορίζουσας ουσίας 2,7 bis(carboxylethyl) 5(6) carboxyfluorescein tetraacetoxymethylester (BCECF/AM) σύμφωνα με την μέθοδο των Incerpi και συν. [667]. Σύμφωνα με τη μέθοδο, εναιώρημα μονοκυττάρων σε ουδέτερο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) επωάστηκε με BCECF/AM στους 37 o C σε απόλυτο σκοτάδι για 45 λεπτά ( 1 2 μg BCECF/AM/10 6 κύτταρα). Το BCECF/AM χαρακτηρίζεται από έντονη λιποδιαλυτότητα και διαπερατότητα της πλασματικής μεμβράνης, ενώ διασπάται από τις ενδοκυτταρικές εστεράσες και παραμένει εγκλωβισμένη στο εσωτερικό του κυττάρου. Ο όγκος της προστιθέμενης ποσότητας της φθορίζουσας ουσίας υπολογίστηκε κάθε φορά, έπειτα από καταμέτρηση των κυττάρων που υπήρχαν στο κυτταρικό εναιώρημα. Ακολούθησαν τρεις φυγοκεντρήσεις πλύσεις των κυττάρων στις 1500 rpm για 10 λεπτά προκειμένου να απομακρυνθεί η εξωκυττάρια φθορίζουσα ουσία και αναδιάλυση των κυττάρων σε PBS (2 3 x 10 6 κύτταρα/3ml δείγματος). Έπειτα έγινε έκθεση των κυττάρων για 15 λεπτά στους 37 o C στους αναστολείς γνωστών μορίων που εμπλέκονται στο μονοπάτι μετάδοσης σήματος ορμονών που σχετίζονται με την παχυσαρκία. Ακολούθησε προσθήκη των επαγωγέων και επώαση για 30 λεπτά στους 37 o C. Παράλληλα, κάποια δείγματα επωάστηκαν χωρίς την επίδραση αναστολέων και χρησιμοποιήθηκαν ως δείγματα ελέγχου ενώ υπήρχαν δείγματα που 140

153 Υλικά μέθοδοι επωάστηκαν μόνο παρουσία των επαγωγέων. Σε όλα τα δείγματα συμπεριλαμβανομένου και του δείγματος ελέγχου (control) προστέθηκαν 1mM ιωδοξικό νάτριο που είναι αναστολέας της γλυκόλυσης, 0,4 mm μεθαζολαμίδη που είναι αναστολέας της καρβονικής ανυδράσης καθώς και 0,125mM 4.4 diisothiocyanatostilbene 2.2 disulfonic acid (DIDS) ενός αναστολέα της αντλίας ανταλλαγής ιόντων Cl /HCO 3, προκειμένου να παρεμποδιστεί η παρεμβολή συστημάτων που επηρεάζουν την τιμή του ενδοκυτταρικού ph. Η ποσοτική εκτίμηση του φθορισμού των δειγμάτων έγινε σε ειδικό φασματοφωτόμετρο, FL WINLab (PerkinElmer) σε μαύρα πινάκια πολυεστερυνίου 96 υποδοχών (ELISA plate) με μήκος διέγερσης 440 nm, (ph αδρανές) και 495nm (ph ευαίσθητο μήκος διέργερσης) ενώ είναι σταθερό στα 530 nm το μήκος εκπομπής της φθορίζουσας ουσίας. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ο λόγος της απορρόφησης στα δύο μήκη διέγερσης (495nm/440nm). Στα πλαίσια του πειράματος κατασκευάστηκε πρότυπη καμπύλη προκειμένου να γίνει η αντιστοίχηση των τιμών φθορισμού των δειγμάτων με τιμές ph. Για το λόγο αυτό τα κύτταρα αναδιαλύθηκαν σε ρυθμιστικά διαλύματα γνωστού ph (6,7, 7,0 και 7,5) που περιείχαν 30 mm HEPES (ph 6,5), 130 mm KCl, και 1 mm MgCl2 και στη συνέχεια μετρήθηκε ο φθορισμός τους. Η δημιουργία της πρότυπης καμπύλης φθορισμού ph έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο των Thomas και συν. [668] χρησιμοποιώντας τον ιονοφόρο πολυαιθέρα νιγερισίνη, ενός ιονοφόρου που έχει την ικανότητα να ανταλλάσσει ιόντα Κ + με ιόντα Η + διαμέσου της πλασματικής μεμβράνης. Η υψηλή συγκέντρωση Κ + των παραπάνω ρυθμιστικών διαλυμάτων σε συνδυασμό με τη δράση της νιγερισίνης επέφερε την εξισορρόπηση της ενδοκυτταρικής τιμής του ph με αυτή του εξωκυττάριου μέσου. 141

154 Υλικά μέθοδοι Πίνακας 2. Επαγωγείς και αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό του ενδοκυτταρικού pη. Όνομα ουσίας Ιδιότητα Τελική Διαλύτης συγκέντρωση (C) Γλυκόζη επαγωγέας 20mM Η 2 0 Ινσουλίνη επαγωγέας 50μU/ml PBS Λεπτίνη επαγωγέας 160ng/ml PBS Αδρεναλίνη επαγωγέας 520pM PBS cariporide GF109203X Gö6976 L Name Diphenyleneidonium (DPI) αναστολέας του ανταλλάκτη ιόντων Να + /Η + (ΝΗΕ1) αναστολέας όλων των ισομορφών της PKC αναστολέας των κλασσικών ισομορφών της PKC (α, β1, β2) αναστολέας της ΝΟ συνθάσης αναστολέας της NADPH οξειδάσης 20nM 10μM 500nM 100μM 10μM 1% DMSO DMSO DMSO DMSO DMSO Wortmannin αναστολέας της ΡΙ3Κ 50nM 1% DMSO Κυτοχαλαζίνη D (cytochalasin D) Αναστολέας του πολυμερισμού της ακτίνης 2μΜ DMSO 7. Απομόνωση λαμινίνης 1 από σάρκωμα Engelbreth Holm Swarm (EHS) Η λαμινίνη 1 απομονώθηκε από σάρκωμα Engelbreth Holm Swarm (EHS) που φυλάχθηκε στους 80 ο C σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 3,4 Μ NaCl, 50 mm Tris και 1 mm EDTA, (ph 7,4) και προστέθηκαν 50μg/ml PMSF (αναστολέας των πρωτεασών σερίνης) και 50 μg/ml PHMB (Διάλυμα A). Για κάθε απομόνωση απαιτήθηκαν περίπου 200gr σαρκώματος. Ο όγκος ξεπάγωνε αργά σε πάγο για 15 ώρες (overnight) και κατόπιν ζυγίζονταν. 50gr όγκου ομογενοποιήθηκαν με 100 ml φρέσκου Διαλύματος A. Στη συνέχεια ο 142

155 Υλικά μέθοδοι ομογενοποιημένος όγκος φυγοκεντρήθηκε στις 3750rpm στους 4 ο C για 30 λεπτά και ακολούθησε αναδιάλυση του ιζήματος σε 100ml Διαλύματος A. Το παραπάνω βήμα επαναλήφθηκε συνολικά πέντε φορές με αποτέλεσμα το τελικό ίζημα να έχει άσπρο χρώμα. Ακολούθησε αναδιάλυση του ιζήματος σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 1,7 Μ NaCl, 50 mm Tris και mm EDTA (ph 7,4) και προστέθηκαν 50μg/ml PMSF και 50μg/ml PHMB (Διάλυμα Β) με ανάδευση για 6 12 ώρες στους 4 ο C. Την επόμενη μέρα το υλικό φυγοκεντρήθηκε στις 375rpm για 30 λεπτά στους 4 ο C, το υπερκείμενο φυλάχθηκε σε πάγο, το ίζημα αναδιαλύθηκε σε Διάλυμα Β και αναδεύτηκε εκ νέου στους 4 ο C για 6 12 ώρες. Έπειτα το υλικό φυγοκεντρήθηκε στις 3750rpm στους 4 ο C για 30 λεπτά και το υπερκείμενο που περιείχε ακατέργαστη λαμινίνη, εντακτίνη και πρωτεογλυκάνες φυλάχθηκε σε πάγο και ενώθηκε με το αντίστοιχο που απομονώθηκε την προηγούμενη μέρα. Στη συνέχεια έγινε διαπίδυση του υπερκείμενου που περιείχε τη λαμινίνη με Διάλυμα A στους 4 ο C. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 3750rpm στους 4 ο C για 30 λεπτά. Το ίζημα αναδιαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 2Μ ουρία, 50mM Tris και 1mM EDTA (ph 8.6) και προστέθηκαν 50μg/ml PMSF και 50 μg/ml PHMB (Διάλυμα Γ) και αναδεύονταν αργά για 6 12 ώρες στους 4 ο C. Στη συνέχεια το ίζημα προστέθηκε σε στήλη DEAE κυτταρίνης και αναδεύτηκε γρήγορα στους 4 ο C για 8 12 ώρες. H DEAE κυτταρίνη είναι μια θετικά φορτισμένη ρητίνη που χρησιμοποιείται στη χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων και συμβάλει στον καθαρισμό και διαχωρισμό των πρωτεϊνών. Αποτέλεσμα της θετικής φόρτισής της είναι να δεσμεύει αρνητικά φορτισμένες πρωτεΐνες και να τις διαχωρίζει από όλες τις υπόλοιπες που συμπεριλαμβάνονται στο δείγμα. Την επόμενη μέρα το δείγμα φυγοκεντρήθηκε στις 1000rpm για 10 λεπτά και φυλάχτηκε το υπερκείμενο το οποίο περιείχε την θετικά φορτισμένη λαμινίνη. Στη συνέχεια το δείγμα συμπυκνώθηκε και ρυθμίστηκε η συγκέντρωσή του στα 100gr όγκου/50 ml διαλύματος με την προσθήκη aquacide. Πιο συγκεκριμένα, το aquacide τοποθετήθηκε υπό μορφή σκόνης πάνω από μεμβράνη που περιείχε το δείγμα μας για δύο μέρες. Ακολούθησε διαπίδυση με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 500mM NaCl, και 50 mm Tris, ενώ μετά τη ρύθμιση του ph του διαλύματος στο 7,4 με HCl προστέθηκαν 50μg/ml PMSF (Διάλυμα Δ) στους 4 ο C και ανά 6 12 ώρες γίνονταν αλλαγή του διαλύματος (συνολικά έγιναν τέσσερις αλλαγές). Στη συνέχεια έγινε φυγοκέντρηση στις rpm στους 143

156 Υλικά μέθοδοι 4 ο C για 30 λεπτά προκειμένου να απομακρυνθούν τυχόν συσσωματώματα και το υπερκείμενο περιείχε την καθαρή λαμινίνη. Πριν τη χρήση έγινε διαπίδυση με PBS και προσδιορισμός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης του δείγματος με τη μέθοδο Bradford. Παράλληλα, προκειμένου να προσδιοριστεί η καθαρότητα του δείγματος λαμινίνης έγινε ηλεκτροφόρηση αυτού του δείγματος σε συσκευή Pharmacia LKB Phastsystem. Σε περίπτωση χρησιμοποίησης της λαμινίνης σε πειράματα μελέτης διεργασιών προσκόλλησης πριν από τη διαπίδυση με PBS έγινε διαπίδυση στους 4 ο C με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 50mM Tris, ενώ μετά τη ρύθμιση του ph στο 7,4 με HCl προσθέτονταν 50μg/ml PMSF (Διάλυμα Ε) (συνολικά γίνονταν δύο αλλαγές). Στη συνέχεια ακολούθησε διαπίδυση στους 4 ο C με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 1Μ CaCl 2 και 50mM Tris, ενώ μετά τη ρύθμιση του ph του διαλύματος στο 7,4 με HCl προστέθηκαν 50μg/ml PMSF (Διάλυμα Ζ) (συνολικά γίνονταν μία αλλαγή), και τέλος διαπίδυση στους 4 ο C με Διάλυμα Ζ. Ο λόγος που έγιναν οι παραπάνω διαπιδύσεις ήταν για να γίνει ανάκτηση ασβεστίου από τη λαμινίνη, καθώς το είχε δεσμεύσει το EDTA, και να μπορεί έτσι να προσκολλάται στις εκάστοτε επιφάνειες. Η λαμινίνη φυλάχτηκε στους 80 ο C, ενώ πριν τη χρήση της αφήνονταν να ξεπαγώσει αργά σε πάγο. Μέτρηση της συνολικής ποσότητας της πρωτεΐνης με τη χρήση Coomasie Plus 200 (Bradford method) Για τη μέτρηση της συγκέντρωσης της λαμινίνης χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Bradford με τη χρήση του αντιδραστηρίου Coomasie Plus 200. Πιο συγκεκριμένα κατασκευάστηκε πρότυπη καμπύλη με δείγματα γνωστής συγκέντρωσης αλβουμίνης: 1000μg/ml, 500μg/ml, 250μg/ml, 125μg/ml, 62,5μg/ml, 30μg/ml και 0μg/ml, ενώ το δείγμα λαμινίνης αραιώθηκε 1/10, 1/30 και 1/50 με PBS. Στη συνέχεια σε κάθε υποδοχή πλάκας ELISA προστέθηκαν 25μl από καθένα από τα παραπάνω διαλύματα (πρότυπα διαλύματα BSA και αραιώσεις λαμινίνης) μαζί με 250μl Coomasie Plus 200 και ακολούθησε ελαφριά ανάδευση για 2 λεπτά σε αναδευτήρα. Μετά τον προσδιορισμό της οπτικής απορρόφησης σε φασματοφωτόμετρο (Stat Fax 2100 Awareness Technology Inc) στα 592nm και με βάση την πρότυπη καμπύλη προσδιορίστηκε η συγκέντρωση της λαμινίνης. 144

157 Υλικά μέθοδοι Προσδιορισμός της καθαρότητας της λαμινίνης με ηλεκτροφόρηση Για τον προσδιορισμό της καθαρότητας της λαμινίνης που απομονώθηκε χρησιμοποιήθηκε η ηλεκτροφόρηση σε συσκευή Pharmacia LKB Phastsystem. Για την προετοιμασία των δειγμάτων ακολουθήθηκε η παρακάτω διαδικασία. Σε 950μl διαλύματος που περιείχε 3% SDS, 0,08M Tris HCl ph 6,8, 15% γλυκερόλη και 0,01% της χρωστικής μπλε της βρωμοφαινόλης (loading buffer 1X) προστέθηκαν 50μl μερκαπτοαιθανόλης. Στη συνέχεια, 5μl από το παραπάνω μείγμα προστέθηκαν σε 5μl από τα αραιωμένα δείγματα λαμινίνης (1,1/2, 1/5, 1/10) και επωάστηκαν για 3 λεπτά στους C προκειμένου να σπάσουν οι δισουλφιδικοί δεσμοί. Στη συνέχεια σε ειδική πλάκα που περιείχε τις υποδοχές των δειγμάτων (sample well stamp) τοποθετήθηκε ειδική μεμβράνη (parafilm) και κατόπιν 4 5μl από το κάθε δείγμα. Έπειτα προστέθηκαν 50μl Η 2 Ο στην κεφαλή (bed) της συσκευής ηλεκτροφόρησης (Pharmacia LKB Phastsystem), μετά το gel με προσοχή και κατόπιν τα ηλεκτρόδια στις ειδικές υποδοχές που είχαν προηγουμένως τοποθετηθεί πάνω από το gel. Τέλος προστέθηκε στη συσκευή το ειδικό χτενάκι ηλεκτροφόρησης που είχαμε προηγουμένως ακουμπήσει στην πλάκα που είχαν τοποθετηθεί τα δείγματα και κατόπιν ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων χρησιμοποιώντας ειδικό πρόγραμμα για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών στα 400V 4mA 1,6W για λεπτά στους 18 0 C. Εμφάνιση film με τη χρήση της χρώσης Silver (Silver Staining) Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης ακολούθησε χρώση Silver (Silver Staining). Αρχικά το gel επωάστηκε με ανάδευση με διάλυμα που περιείχε 11,4ml H 2 O, 15ml μεθανόλη και 3,6ml οξικό οξύ (fixative solution) για 10 λεπτά. Ακολούθησαν 2 πλύσεις με H 2 O για 5 λεπτά και στη συνέχεια το gel επωάζονταν με 0,02% θειοθειικό νάτριο για ένα λεπτό. Μετά από μια πλύση με H 2 O για περίπου 20 δευτερόλεπτα το gel επωάστηκε με ανάδευση με 0,2% διαλύματος νιτρικού αργύρου (AgNO 3 ) για 10 λεπτά. Ακολούθησε μία πλύση με H 2 O και στη συνέχεια επώαση με διάλυμα που περιείχε 0,75gr ΝαCΟ 3, 25ml H 2 O, 20μl 0,02% διαλύματος thiosulfate sodium και στο 12,5μl φορμαλίνης (developer solution) μέχρι να εμφανιστούν οι ταινίες του gel. Έπειτα το παραπάνω διάλυμα απομακρύνθηκε και ακολούθησε επώαση 145

158 Υλικά μέθοδοι αρχικά με 10% οξικό οξύ για 10 λεπτά και στη συνέχεια με 75% διαλύματος γλυκερόλης για 10 λεπτά. 8. Προσκόλληση μονοκυττάρων σε υπόστρωμα λαμινινης 1 Ο ποσοτικός προσδιορισμός της προσκόλλησης μονοκυττάρων σε υπόστρωμα λαμινίνης 1 έγινε και σύμφωνα με τη μέθοδο των Verdegaal και συν. [669] με κάποιες τροποποιήσεις. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην εκτίμηση των επιπέδων του ενζύμου μυελοπεροξειδάση (MPO) που υπάρχει στα μονοκύτταρα. Πινάκιο πολυεστερενίου 96 υποδοχών (πλάκα ELISA) επιστρώθηκε με 50μl λαμινίνη 1 (37,5μg/ml) υδατικού διαλύματος λαμινίνης και αφέθηκε ακάλυπτη να στεγνώσει σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες (overnight). Σε κάθε υποδοχή προστέθηκαν 100μl εναιωρήματος μονοκυττάρων σε συγκέντρωση 10 5 /ml επωάστηκαν με πλήρες θρεπτικό υλικό (IMDM, 10% FCS). Διατηρήθηκαν 2 4 κωνικά φιαλίδια (eppendorf) εναιωρήματος μονοκυττάρων ώστε να χρησιμοποιηθούν αργότερα ως δείγματα ελέγχου της μυελοπεροξιδάσης (100% myeloperoxidase control samples). Στις αντίστοιχες υποδοχές προστέθηκαν οι αναστολείς και ακολούθησε επώαση 15min στους 37 o C. Στην συνέχεια προστέθηκαν οι επαγωγείς και ακολούθησε επώαση 30min στους 37 o C με ανάδευση. Απομακρύνθηκαν τα μη προσκολλημένα μονοκύτταρα με μικροπιπέτα και ακολούθησε πλύση με 100μl PBS ph 6. Τα φιαλίδια των δειγμάτων ελέγχου της μυελοπεροξιδάσης φυγοκεντρήθηκαν, απομακρύνθηκε το υπερκείμενο, προστέθηκαν 100μl PBS ph 6 και το εναιώρημα μεταφέρθηκε σε υποδοχές της πλάκας χωρίς λαμίνη. Σε κάθε υποδοχή της πλάκας προστέθηκαν 50μl 0,5% w/v hexadecyltrimethylammonium bromide σε PBS (ph 6.0) και ακολούθησε επώαση 30min στους 37 o C για να λυθούν τα κύτταρα. Στην συνέχεια σε κάθε υποδοχή της πλάκας προστέθηκαν 50μl 0,2mg/ml dianisidinedihydrochloride με 0,4mΜ H 2 O 2 που περιείχε όλα τα απαραίτητα υποστρώματα για τη δράση της MPO και έγινε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά με ελαφριά ανάδευση. Τέλος, η δραστικότητα της MPO των μονοκυττάρων προσδιορίστηκε με τη μέτρηση της οπτικής απορρόφησης των δειγμάτων σε φασματοφωτόμετρο (Stat Fax 2100 Awareness Technology Inc) στα 405nm. Η 146

159 Υλικά μέθοδοι τιμή απορρόφησης αντιπροσωπεύει τη δραστικότητα της μυελοπεροξειδάσης του κυτταρολύματος. Πίνακας 3. Επαγωγείς και αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της προσκόλλησης των μονοκυττάρων. Όνομα ουσίας Ιδιότητα Τελική Διαλύτης συγκέντρωση (C) Λεπτίνη επαγωγέας 160ng/ml PBS Αδρεναλίνη επαγωγέας 520pM PBS cariporide GF109203X Gö6976 L Name Diphenyleneidonium (DPI) αναστολέας του ανταλλάκτη ιόντων Να + /Η + (ΝΗΕ1) αναστολέας όλων των ισομορφών της PKC αναστολέας των κλασσικών ισομορφών της PKC (α, β1, β2) αναστολέας της ΝΟ συνθάσης αναστολέας της NADPH οξειδάσης 20nM 10μM 500nM 100μM 10μM 1% DMSO DMSO DMSO DMSO DMSO Wortmannin αναστολέας της ΡΙ3Κ 50nM 1% DMSO Κυτοχαλαζίνη D (cytochalasin D) Αναστολέας του πολυμερισμού της ακτίνης 2μΜ DMSO 9. Μετανάστευση μονοκυττάρων διαμέσου υποστρώματος λαμινινης 1 Μια ακόμα ιδιότητα των μονοκυττάρων που μελετήθηκε ήταν η ικανότητά τους να μεταναστεύουν σε υπόστρωμα λαμινίνης 1..Η ποσοτική εκτίμηση της μεταναστευτικής ικανότητας των μονοκυττάρων διαμέσου υποστρώματος λαμινίνης 1 έγινε με τη μέθοδο των Pedraza και συν. (2000) [670] με κάποιες τροποποιήσεις. Συγκεκριμένα, η ποσοτική εκτίμηση της μεταναστευτικής ικανότητας των μονοκυττάρων στηρίχθηκε στην ιδιότητα των μονοκυττάρων να κινούνται από μέσο χωρίς θρεπτικά συστατικά προς το μέσο με θρεπτικά συστατικά. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της 147

160 Υλικά μέθοδοι μετανάστευσης των μονοκυττάρων χρησιμοποιήθηκε το Hemacolor staining kit. Αναλυτικότερα, χρησιμοποιήθηκαν πλάκες με υποδοχείς διαμέτρου 6.5 mm (Transwell culture inserts) οι οποίες περιείχαν φίλτρα με πόρους μεγέθους 5μm. Τα φίλτρα καλύφθηκαν με 150 μl (20 μg/ml) λαμινίνης 1 και αφέθηκαν να στεγνώσουν στους 4 0 C για 24 ώρες. Στην συνέχεια απομακρύνθηκε το υπερκείμενο με τη βοήθεια πιπέτας και προστέθηκαν 150 μl BSA (0.5%) προκειμένου να δεσμευτούν οι μη ειδικές θέσεις σύνδεσης. Μετά από επώαση στους 37 0 C για 1 ώρα απομακρύνθηκε το υπερκείμενο με πιπέτα και στη συνέχεια προστέθηκαν 500 μl πλήρες θρεπτικού υλικού (IMDM, 10% FCS) στις υποδοχές της πλάκας κάτω από τα φίλτρα. Παράλληλα, πάνω από τα φίλτρα προστέθηκαν 250 μl εναιωρήματος μονοκυττάρων σε θρεπτικό υλικό IMDM (χωρίς FCS) που περιείχε 2x10 6 κύτταρα/ml. Ακολούθησε επώαση στους 37 0 C για 30 λεπτά ώστε να πραγματοποιηθεί κατευθυνόμενη μετακίνηση των μονοκυττάρων από το μέσο χωρίς FCS στο αντίστοιχο μέσο με FCS. Στη συνέχεια απομακρύνθηκε το υπερκείμενο και τα μονοκύτταρα που δεν είχαν μεταναστεύσει από την πάνω επιφάνεια των φίλτρων. Τα φίλτρα στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με εμβάπτιση σε διαλύματα μονιμοποίησης (Hemacolor staining kit) και αφέθηκαν να στεγνώσουν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 200μl υδατικού διαλύματος 10% οξικού οξέος στις υποδοχές της πλάκας κάτω από τα φίλτρα προκειμένου να αποκολληθούν τα κύτταρα που είχαν μονιμοποιηθεί στα φίλτρα και ακολούθησε ήπια ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για 3 4 λεπτά. Τέλος, μετρήθηκε η απορρόφηση του κυτταροδιαλύματος με φασματοφωτόμετρο (Stat Fax 2100 Awareness Technology) σε μήκος κύματος 590nm. Η τιμή απορρόφησης ήταν αντιπροσωπευτική του αριθμού των μονοκυττάρων που μετανάστευσαν διαμέσου υποστρώματος λαμιίνης

161 Υλικά μέθοδοι Πίνακας 4. Επαγωγείς και αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της προσκόλλησης των μονοκυττάρων. Όνομα ουσίας Ιδιότητα Τελική Διαλύτης συγκέντρωση (C) Λεπτίνη επαγωγέας 160ng/ml PBS Αδρεναλίνη επαγωγέας 520pM PBS cariporide Κυτοχαλαζίνη D (cytochalasin D) αναστολέας του ανταλλάκτη ιόντων Να + /Η + (ΝΗΕ1) Αναστολέας του πολυμερισμού της ακτίνης 20nM 2μΜ 1% DMSO DMSO Ροσιγλιταζόνη (rosiglitazone) αγωνιστής των υποδοχέων PPARγ 10μΜ PBS 10. Εκτίμηση της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων. Η εκτίμηση της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων έγινε χρησιμοποιώντας μονοκλωνικό αντίσωμα συνδεδεμένο με fluorescein isothiocyanate (FITClinked monoclonal antibody) έναντι του υποδοχέα CD36. Αναλυτικότερα, 3ml εναιωρήματος μονοκυττάρων (συγκέντρωση 10 6 /ml) σε πλήρες θρεπτικό υλικό (IMDM, 10%FCS) φυγοκεντρήθηκαν για 8 λεπτά στις 1500rpm σε θερμοκρασία δωματίου. Στην συνέχεια απομακρύνθηκε το υπερκείμενο και προστέθηκαν 3ml PBS 1x, ph 7. Ακολούθησαν δύο φυγοκεντρήσεις για 8 λεπτά στις 1500rpm η καθεμία σε θερμοκρασία δωματίου. Στην συνέχεια προστέθηκαν οι αναστολείς (Πίνακας 5) και τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 0 C για 30 λεπτά. Προστέθηκαν οι επαγωγείς (Πίνακας 5) και ακολούθησε επώαση στους 37 0 C για 30 λεπτά. Στην συνέχεια προστέθηκαν 10μl του αντισώματος (FITC linked anti CD36 monoclonal antibody) σε κάθε δείγμα και επωάστηκαν στους 37 0 C για 10 λεπτά. Ακολούθησαν 3 πλύσεις με PBS 1x ph 7 για να απομακρυνθεί το μη συνδεδεμένο αντίσωμα. Στο τέλος, το εναιώρημα μεταφέρθηκε σε μαύρο πινάκιο πολυεστερενίου 96 υποδοχών και μετρήθηκε ο φθορισμός σε ειδικό φασματοφωτόμετρο, FL WINLab (PerkinElmer) με μήκος διέγερσης 495nm (εύρος σχισμής 2,5mm) και μήκος εκπομπής 525nm (εύρος σχισμής 20mm). 149

162 Υλικά μέθοδοι Πίνακας 5. Επαγωγείς και αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της προσκόλλησης των μονοκυττάρων. Όνομα ουσίας Ιδιότητα Τελική Διαλύτης συγκέντρωση (C) Γλυκόζη επαγωγέας 20mM Η 2 0 Ινσουλίνη επαγωγέας 50μU/ml PBS Λεπτίνη επαγωγέας 160ng/ml PBS Αδρεναλίνη επαγωγέας 520pM PBS cariporide Ροσιγλιταζόνη (rosiglitazone) αναστολέας του ανταλλάκτη ιόντων Να + /Η + (ΝΗΕ1) αγωνιστής των υποδοχέων PPARγ 20nM 10μΜ 1% DMSO PBS 11. Φαγοκυττάρωση των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από τα μονοκύτταρα Η εκτίμηση της φαγοκυττάρωσης των οξειδωμένων LDL από τα μονοκύτταρα έγινε σύμφωνα με την μέθοδο των (Stephan and Yurachek 1993) με κάποιες τροποποιήσεις (Itabe 2003) και βασίζεται στην μέτρηση του φθορισμού μετά από επώαση των μονοκυττάρων με LDL σημασμένη με την υδρόφοβη φθορίζουσα ουσία 1,1' dioctadecyl 3,3,3'3' tetramethylindocarbocyanine perchlorate (C 59 H 89 ClN 2 O 4 ) (DiI). Αρχικά, απομονώθηκε LDL από ολικό δείγμα υγιούς δότη. Το ολικό αίμα φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στις 1500rpm σε θερμοκρασία δωματίου και έγινε συλλογή του πλάσματος. Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 18 ώρες στις rpm σε θερμοκρασία δωματίου με την χρήση ειδικής υπερφυγόκεντρου και απομακρύνθηκε το υπερκείμενο που ουσιαστικά περιείχε VLDL. Στην συνέχεια επιστοιβάχτηκε διάλυμα KBr συγκέντρωσης 1,063gr/ml στο ελεύθερο από VLDL πλάσμα και ακολούθησε άλλη μία φυγοκέντρηση στις ίδιες συνθήκες για 24 ώρες. Τελικά το εναιώρημα περάστηκε από ειδικά φίλτρα με πόρους διαμέτρου των 0,45μm και με την 150

163 Υλικά μέθοδοι μέθοδο Bradford (περιγράφηκε νωρίτερα) ρυθμίστηκε η τελική συγκέντρωση των LDL στο 1mg/ml. Ακολούθησε η οξείδωση της LDL προς οξειδωμένες LDL. Σε 3ml διαλύματος που περιείχε PBS 1x και CuSO 4, 5μΜ προστέθηκαν 7,2μl LDL συγκέντρωσης 0,083mg/μl και επωάστηκαν για 3 ώρες στους 37 o C. Το τελικό αποτέλεσμα της αντίδρασης αυτής ήταν η παραγωγή των οξειδωμένων LDL (oxi LDL 3 ). Η προσθήκη EDTA σε τελική συγκέντρωση των 250μΜ είναι απαραίτητη για να σταματήσει η αντίδραση την επιθυμητή στιγμή. Ακολούθησε η σήμανση των οξειδωμένων LDL με DiI με ταυτόχρονη επώαση των δύο αυτών ουσιών σε αναλογία 1mg/300μg για 18 ώρες στους 37 o C σε PBS 1x. Στην συνέχεια το διάλυμα υπέστη 3 διαδοχικές διαπιδύσεις διάρκειας 24 ωρών η κάθε μία στους 14 o C. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της παραγόμενης DiI oxi LDL έγινε με την μέθοδο Bradford (περιγράφηκε νωρίτερα). Τα μονοκύτταρα επωάστηκαν παρουσία των αναστολέων (Πίνακας) σε θρεπτικό υλικό (IMDM) για 30 λεπτά στους 37 o C. Ακολούθησε προσθήκη των επαγωγέων (Πίνακας) και DiI oxi LDL σε τελική συγκέντρωση 100ng/ml και τα μονοκύτταρα επωάστηκαν στους 37 o C είτε για μία ώρα είτε για τρεις ώρες. Στην συνέχεια απομακρύνθηκε το υπερκείμενο με την φθορίζουσα ουσία που δεν δεσμεύτηκε και έγιναν 2 πλύσεις με PBS 1x. Τελικά, μετρήθηκε ο φθορισμός του εναιωρήματος σε ειδικό φασματοφωτόμετρο, FL WINLab (PerkinElmer) με μήκος απορρόφησης 520nm (εύρος σχισμής 5mm) και μήκος εκπομπής 578nm (εύρος σχισμής 20mm). 151

164 Υλικά μέθοδοι Πίνακας 6. Επαγωγείς και αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της προσκόλλησης των μονοκυττάρων. Όνομα ουσίας Ιδιότητα Τελική Διαλύτης συγκέντρωση (C) Γλυκόζη επαγωγέας 20mM Η 2 0 Ινσουλίνη επαγωγέας 50μU/ml PBS Λεπτίνη επαγωγέας 160ng/ml PBS Αδρεναλίνη επαγωγέας 520pM PBS cariporide Ροσιγλιταζόνη (rosiglitazone) αναστολέας του ανταλλάκτη ιόντων Να + /Η + (ΝΗΕ1) αγωνιστής των υποδοχέων PPARγ 20nM 10μΜ 1% DMSO PBS 12. Στατιστική ανάλυση Για την στατιστική ανάλυση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο για τα Windows SPSS ver 15.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois). Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. Ο έλεγχος της κανονικότητας έγινε με την δοκιμασία Shapiro Wilk για τα δείγματα με τιμές λιγότερες από 50 και για τα υπόλοιπα δείγματα χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία Kolomogorov Smirnov. Στις συνεχείς μεταβλητές κανονικής κατανομής για να ελεγχθεί η διαφορά τους ανάμεσα στις ομάδες που εξετάσθηκαν χρησιμοποιήθηκαν οι παραμετρικές δοκιμασίες: one way analysis of variance (ANOVA) για την σύγκριση ανάμεσα σε τρεις ομάδες, Student s t test για την σύγκριση ανάμεσα σε δύο ομάδες ή paired t test για να συγκρίνω την μεταβολή στον ίδιο ασθενή μετά την παρέμβαση (προσθήκη επαγωγέα ή αναστολέα). Στην δοκιμασία ANOVA εφαρμόστηκε η ρύθμιση Bonferroni για να διερευνηθεί ποιες από τις ομάδες διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους. Η συσχέτιση μεταξύ συνεχών μεταβλητών έγινε με την δοκιμασία Pearson correlation analysis. Στις μεταβλητές με μη κανονική κατανομή χρησιμοποιήθηκαν οι μηπαραμετρικές μέθοδοι: Mann Whitney για την σύγκριση των μέσων τιμών 152

165 Υλικά μέθοδοι μεταξύ δύο ομάδων ενώ για να συγκριθούν οι μέσες τιμές των μεταβλητών πριν και μετά την παρέμβαση (προσθήκη επαγωγέα ή αναστολέα) χρησιμοποιήθηκε η μη παραμετρική δοκιμασία Wilcoxon Signed Ranks και για την σύγκριση ανάμεσα σε περισσότερες των δύο ομάδες χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία Kruskal Wallis. Η σχέση μεταξύ μη κανονικά κατανεμημένων μεταβλητών εξετάσθηκε με τον συντελεστή συσχέτισης Spearman s Rank order. Το επίπεδο της στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο p<0,

166 154

167 Αποτελέσματα ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Ανθρωπομετρικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά του συνολικού δείγματος Στο πρώτο σκέλος της μελέτης συμμετείχαν 55 άτομα (6 άντρες και 49 γυναίκες) με παχυσαρκία (δείκτης μάζας σώματος, ΔΜΣ 30kg/m 2 ) και 21 άτομα (3 άντρες και 18 γυναίκες) φυσιολογικού βάρους (ΔΜΣ < 25kg/m 2 ). Όλα τα άτομα είχαν ελεύθερο ατομικό ιστορικό. Η μέση ηλικία του δείγματος ήταν 43,8±12,7 έτη και δε διέφερε μεταξύ της ομάδας των ατόμων με παχυσαρκία και των ατόμων φυσιολογικού βάρους (p=0,5) (Πίνακας 7). Πίνακας 7. Ανθρωπομετρικά χαρακτηριστικά του δείγματος Όπου p, αντιπροσωπεύει την στατιστική πιθανότητα να είναι ίδιες οι ομάδες των ατόμων φυσιολογικού βάρους και των ατόμων με παχυσαρκία. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο ± σταθερή απόκλιση. Άτομα φυσιολογικού βάρους (n=21) Άτομα με παχυσαρκία (n=55) Ηλικία (έτη) 41,81 ±14,5 44,27±12,16 0,5 Φύλο (Α/Γ) 3/18 6/49 p value ΔΜΣ (kg/m 2 ) 23,3±1,4 36,3±5,5 <0,001 Περίμετρος μέσης 89,21±7,4 111,7±14,9 <0,001 (cm) Περίμετρος ισχίων 110±7,9 124,5±12,2 <0,001 (cm) ΣΑΠ (mmhg) 125±15,7 130,5±12,6 0,2 ΔΑΠ (mmhg) 78±9,5 85,1±7,7 0,03 Μελετήθηκαν τα ανθρωπομετρικά και βιοχημικά τους χαρακτηριστικά (Πίνακας 7 και 8). Διαπιστώθηκε όμως, κατά την ένταξή τους στη μελέτη, ότι στην ομάδα των 55 παχύσαρκων ατόμων, οι 13 (25,5%) εμφάνιζαν αρτηριακή υπέρταση, οι 18(36,7%) υπερτριγλυκεριδαιμία, οι 2 (4,2%) σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 και οι 11 (22,9%) διαταραγμένη γλυκόζη νηστείας. Από τα άτομα αυτά, τα 5 εμφάνιζαν ταυτόχρονα διαταραγμένη γλυκόζη νηστείας και αρτηριακή υπέρταση, τα 3 διαταραγμένη γλυκόζη νηστείας και υπερτριγλυκεριδαιμία, τα 3 αρτηριακή υπέρταση και υπερτριγλυκεριδαιμία 155

168 Αποτελέσματα και το 1 σακχαρώδη διαβήτη και υπερτριγλυκεριδαιμία. Όλα τα άτομα της ομάδας φυσιολογικού βάρους δεν παρουσίαζαν κανένα παθολογικό εύρημα. Πίνακας 8. Βιοχημικά χαρακτηριστικά του δείγματος και της κάθε υπο ομάδας χωριστά. Όπου p, αντιπροσωπεύει την στατιστική πιθανότητα να είναι ίδιες οι ομάδες των ατόμων φυσιολογικού βάρους και των ατόμων με παχυσαρκία. ΗΟΜΑ IR: homeostatic model of assessment insulin resistance. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο ± σταθερή απόκλιση. Άτομα φυσιολογικού βάρους (n=21) Άτομα με παχυσαρκία (n=55) Χοληστερόλη (mg/dl) 194,93±38 205,1±38,4 0,4 p value Τριγλυκερίδια (mg/dl) 97,8±31,8 143,2±77,8 0,065 HDL Χοληστερόλη (mg/dl) 47,2±10,3 48,2±9,9 0,7 LDL Χοληστερόλη (mg/dl) 125,6±32,6 128,9±34,9 0,8 HOMA IR 1,73±1,5 3,48±1,6 0,005 Ινσουλινη (μu/ml) 7,6±6,7 14,53±6,2 0,006 Γλυκόζη (mg/dl) 93,3±9,5 94,4±14 0,9 HbA1c (%) 5,04±0,9 5,4±0.7 0,2 Οξαλοξεική τρανσαμινάση 18,58±4,7 21,35±8,7 0,4 (SGOT) (U/L) Πυροσταφυλική τρανσαμινάση 19,7±10,2 27,1±15,9 0,1 (SGPT) (U/L) γ γλουταμυλοτρανσφεράση 17,4±8,2 23±18,7 0,4 (γgt) (U/L) Αλκαλική φωσφατάση (ALP) 67,8±21,6 106,5±63 0,09 (U/L) Ουρία (mg/dl) 26,1±5,1 27,71±6,8 0,4 Κρεατινίνη ορού(mg/dl) 0,81±0,09 0,88±0,18 0,075 Ολικά λευκώματα ορού (g/dl) 7,06±0,8 7,18±0,58 0,8 TSH (μu/ml) 2,02±1,2 2,82±2,3 0,4 Λευκά αιμοσφαίρια (x10 3 /μl) 7,08±2,9 6,98±1,6 0,6 156

169 Αποτελέσματα Πίνακας 9. Τα ανθρωπομετρικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των δύο υπο ομάδων των ατόμων με παχυσαρκία, δηλαδή των ατόμων με ευαισθησία στην ινσουλίνη και των ατόμων με αντίσταση στην ινσουλίνη. Όπου p, αντιπροσωπεύει την στατιστική πιθανότητα να είναι ίδιες οι ομάδες των ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και των ατόμων με παχυσαρκία και αντίσταση στην ισνουλίνη. Όπου, ΔΜΣ= δείκτης μάζας σώματος, ΣΑΠ= συστολική αρτηριακή πίεση, ΔΑΠ= διαστολική αρτηριακή πίεση, HOMA IR= Homeostatic model of assessment of insulin resistance. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο ± σταθερή απόκλιση. Άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (n=27) Άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (n=28) Ηλικία 43,7±12,3 44,9±12,3 0,7 Φύλο (Α/Γ) 2/25 4/24 ΔΜΣ (Kg/m 2 ) 34,9±5,2 37,6±5,5 0,9 Περίμετρος μέσης (cm) 108,1±13,7 115,1±15,5 0,1 p value Περίμετρος ισχίων (cm) 121,9±9,9 127,1±13,7 0,14 ΣΑΠ (mmhg) 126,5±11,3 134±12,8 0,008 ΔΑΠ (mmhg) 84,2±6,4 86±8,9 0,4 Χοληστερόλη (mg/dl) 209,7±42,2 200,8±34,8 0,4 Τριγλυκερίδια (mg/dl) 124,7±65 161,1±85,9 0,14 HDL Χοληστερόλη 51±9,9 45,6±9,3 0,052 (mg/dl) LDL Χοληστερόλη 135±41,1 123,2±27,6 0,25 (mg/dl) HOMA IR 2,6±1 4±1,7 0,008 Ινσουλινη (μu/ml) 11,8±4,2 16,24±6,7 0,038 Γλυκόζη (mg/dl) 90,1±15 98,7±11,9 0,005 HbA1c (%) 5,37±0,52 5,39±0,8 0,7 Στη συνέχεια, βάσει της γλυκόζης και ινσουλίνης νηστείας, υπολογίστηκε η HOMA IR. Ακολούθως, βρέθηκε η διάμεσος τιμή της ΗΟΜΑ ΙΡ (3,2086) για το σύνολο των ατόμων με παχυσαρκία και χωρίστηκαν σε δύο υπο ομάδες, δηλαδή στην ομάδα των ατόμων με ευαισθησία στην ινσουλίνη με τιμές μικρότερες της διαμέσου (27 άτομα) και αυτών με αντίσταση στην ινσουλίνη με τιμές μεγαλύτερες αυτής (28 άτομα). Οι δύο αυτές υπο ομάδες δεν διέφεραν μεταξύ τους, όσον αφορά το φύλο, την ηλικία (t test, p=0,7), το ΔΜΣ (t test, p=0,09) και τις περιμέτρους μέσης (Kruskal Wallis test, p=0,1) και 157

170 Αποτελέσματα ισχίων (t test, p=0,14). Επομένως, οι δύο ομάδες ήταν συγκρίσιμες. Επιπλέον, τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη δεν διέφεραν από τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη όσον αφορά τη διαστολική αρτηριακή πίεση (Kruskal Wallis test, p=0,4). Οι μόνες διαφορές μεταξύ τους αφορούσαν της γλυκόζη νηστείας (p=0,005), την ινσουλίνης νηστείας (p=0,038), τη HOMA IR (p=0,008) και τη συστολική αρτηριακή πίεση (p=0,008). Τέλος, τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στη ινσουλίνη είχαν υψηλότερες τιμές HDL χοληστερόλης από ότι τα άτομα με αντίσταση στην ινσουλίνη αν και η διαφορά δεν ήταν σημαντική (p=0,052). 2. Ισορροπία οξειδωτικών αντιοξειδωτικών (Prooxidant antioxidant balance) Στο σύνολο των ατόμων, προσδιορίστηκε η ισορροπία οξειδωτικών αντίοξειδωτικών (pro oxidant anti oxidant balance, PAB) και η σύγκριση μεταξύ των ομάδων έδειξε ότι τα άτομα φυσιολογικού βάρους έχουν χαμηλότερες τιμές PAB (71,1±9,7) από τα άτομα με παχυσαρκία (p=0,004), ιδιαίτερα, με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (95,9±26,5, p=0,003) και λιγότερο με τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (90,6±20,9, p=0,037). Επιπλέον, στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία οι τιμές τις ΡΑΒ δεν διέφεραν στατιστικά μεταξύ των ινσουλινοανθεκτικών και των ινσουλινοευαίσυητων (p>0,1), μολονότι οι τιμές των ατόμων με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη έτειναν να είναι υψηλότερες (Πίνακας 9). Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε και με τη σύγκριση των τιμών του ινωδογόνου, της CRP και του ουρικού οξέος μεταξύ των δύο υπο ομάδων. Συμπερασματικά, τα άτομα με παχυσαρκία παρουσιάζουν υψηλότερο οξειδωτικό στρες, με βάση τις τιμές της ΡΑΒ και της CRP, από τα άτομα φυσιολογικού βάρους ανεξάρτητα της ευαισθησίας στην ινσουλίνη. 158

171 Αποτελέσματα Πίνακας 10. Δείκτες φλεγμονής και προσδιορισμός του οξειδωτικού στρες με τη μέθοδο προσδιορισμού της ισορροπίας μεταξύ οξειδωτικών και αντί οξειδωτικών (ΡΑΒ) και των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών. Όπου p, αντιπροσωπεύει την στατιστική πιθανότητα να είναι ίδιες οι ομάδες των ατόμων φυσιολογικού βάρους και των ατόμων με παχυσαρκία. Τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη δεν διέφεραν από τα άτομα με ευαισθησία στην ινσουλίνη (p>0,1). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο ± σταθερή απόκλιση. Άτομα φυσιολογικο ύ βάρους (n=21) Άτομα με παχυσαρκία (n=55) Άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (n=27) Άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (n=28) p value ΡΑΒ 71,1±9,7 93,7±24,3 90,6±20,9 95,9±26,5 0,004 Καρβονυλιωμέν 4,2±1,5 4,08±1,1 4,2±1,1 4±1,1 1 ες πρωτεΐνες Ινωδογόνο 342,7±70 357,5±65,2 346,3±48 367±77 0,5 (mg/dl) CRP (μg/ml) 2,07±1,3 4,3±3 3,33±2 4,96±3,5 0,029 ΤΚΕ (mm/h) 18,7±10,3 16,7±12,8 16,6±10,1 16,9±14,9 1 Ουρικό οξύ 4,7±1,09 4,8±1,4 4,6±1,2 4,98±1,6 0,7 Τέλος, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ των τιμών της ΡΑΒ και γνωστών δεικτών φλεγμονής καθώς και βιοχημικών παραμέτρων. Έτσι, οι τιμές της ΡΑΒ συσχετίστηκαν με το ινωδογόνο, το ουρικό οξύ και τον αριθμό των λευκοκυττάρων, αποδεικνύοντας ότι οι τιμές της ΡΑΒ αντιπροσωπεύουν έναν αξιόπιστο δείκτη του οξειδωτικού στρες. Επιπλέον, διαπιστώθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ των τιμών της ΡΑΒ και των τριγλυκεριδίων και αρνητική συσχέτιση με τις τιμές της HDL χοληστερόλης. Τέλος, οι τιμές της ΡΑΒ έχουν θετική συσχέτιση και με ανθρωπομετρικούς δείκτες, δηλαδή το δείκτη μάζας σώματος και τις περιμέτρους μέσης και ισχίων (Πίνακας 11). Συμπερασματικά, η θετική συσχέτιση της ΡΑΒ με το ΔΜΣ επιβεβαιώνει τη διαφορά που διαπιστώθηκε κατά τη σύγκριση μεταξύ των ατόμων φυσιολογικού βάρους και ατόμων με παχυσαρκία. Μάλιστα, όσο αυξάνεται ο ΔΜΣ τόσο αυξάνονται οι τιμές της ΡΑΒ, δηλαδή το οξειδωτικό στρες. 159

172 Αποτελέσματα Πίνακας 11. Συσχέτιση Spearman μεταξύ των τιμών της ΡΑΒ και των βιοχημικών παραμέτρων καθώς και των δεικτών φλεγμονής. Όπου ΔΜΣ= δείκτης μάζας σώματος, ΣΑΠ= συστολική αρτηριακή πίεση. Συσχέτιση Spearman μεταξύ Ισορροπιά μεταξύ προ οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών (ΡΑΒ) rho p Value Περίμετρος μέσης 0,28 0,033 Περίμετρος ισχίων 0,298 0,024 Ηλικία 0,278 0,033 ΔΜΣ 0,316 0,013 Ουρικό οξύ 0,399 0,003 Ινωδογόνο 0,324 0,034 Λευκά αιμοσφαίρια 0,288 0,031 Τριγλυκερίδια 0,426 0,001 HDL χοληστερόλη 0,257 0,05 3. Μέτρηση καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών Οι καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες του ορού αποτελούν έναν έμμεσο δείκτη του οξειδωτικού στρες, όχι ιδιαίτερα ευαίσθητο, καθώς όσο περισσότερα οξειδωτικά υπάρχουν, τόσο περισσότερες πρωτεΐνες καρβονυλιώνονται. Πράγματι, ο μέσος όρος των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών δε διέφερε μεταξύ των ατόμων φυσιολογικού βάρους και ατόμων με παχυσαρκία (p>0,3) (Πίνακας 9). Επιπλέον, στην ομάδα των παχυσάρκων οι τιμές των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών δε διέφεραν μεταξύ των ατόμων με αντίσταση στην ινσουλίνη και των ατόμων με ευαισθησία (p>0,1). Δηλαδή, οι καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες δεν εμφανίζουν διαφορά σε σχέση με την ινσουλινοευαισθησία. Τέλος, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ των τιμών των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών και των δεικτών φλεγμονής καθώς και των βιοχημικών παραμέτρων. Δεν επιβεβαιώθηκε όμως, καμία συσχέτιση μεταξύ τους, παρά μόνο με τις τιμές των ολικών λευκωμάτων του πλάσματος (Spearman s correlation rho=0,627, p=0,039), το οποίο και ήταν αναμενόμενο. 160

173 Αποτελέσματα Σχήμα 3. Απεικονίζεται η πρότυπη καμπύλη που δημιουργήθηκε βάσει των πρότυπων διαλυμάτων και η συνάρτηση που χρησιμοποιήθηκε για τη μετατροπή των τιμών των δειγμάτων ώστε να εκφράζουν τη ποσότητα των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών. 4. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης της αδιπονεκτίνης στον ορό Ο προσδιορισμός ορισμένων δεικτών του οξειδωτικού στρες δεν έδειξε διαφορά μεταξύ των ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και των ατόμων με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Επομένως, η προαγωγή της διαδικασίας της αθηροσκλήρωσης στα άτομα με αντίσταση στην ινσουλίνη δεν οφείλεται μάλλον σε αυξημένη ισορροπία μεταξύ των οξειδωτικών αντί οξειδωτικών ούτε σε αυξημένη συγκέντρωση καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών. Στην παχυσαρκία όμως, όπως έχει ήδη αναφερθεί, απαντώνται διαταραχές στις συγκεντρώσεις αρκετών λιποκυτταροκινών. Μία από αυτές είναι η αδιπονεκτίνη. Για το λόγο αυτό προσδιορίσαμε τη συγκέντρωση της αδιπονεκτίνης στον ορό ατόμων φυσιολογικού βάρους και ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία ή αντίσταση στην ινσουλίνη. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι τα άτομα φυσιολογικού βάρους εμφανίζουν, όπως αναμένεται, τις υψηλότερες τιμές (12,12±6,4μg/ml) σε σύγκριση με την ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (7,89±4,6 και p=0,021) και με την ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (6,79±3,2 και p<0,001). Στη συνέχεια, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ των τιμών της αδιπονεκτίνης και της αντίστασης στην ινσουλίνη, των ανθρωπομετρικών χαρακτηριστικών και των δεικτών του οξειδωτικού στρες. Όντως, η αδιπονεκτίνη εμφανίζει ισχυρή αρνητική συσχέτιση με το δείκτη μάζας σώματος (Spearman s correlation, rho= 0,376, 161

174 Αποτελέσματα p=0,002), την περίμετρο μέσης (Spearman s correlation, rho= 0,373, p=0,004), την αντίσταση στην ινσουλίνη, όπως αυτή προσδιορίστηκε με τον τύπο HOMA IR, (Spearman s correlation, rho= 0,515, p<0,001) και την ισορροπία οξειδωτικών αντί οξειδωτικών (Spearman s correlation, rho= 0,303, p=0,015). 5. Ανθρωπομετρικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των ατόμων που συμμετείχαν στο δεύτερο σκέλος της μελέτης 26 άτομα συμμετείχαν στο δεύτερο σκέλος της μελέτης και χωρίστηκαν βάσει του δείκτη μάζας σώματος σε δύο ομάδες, 10 άτομα φυσιολογικού βάρους (ομάδα ελέγχου) και 16 άτομα με παχυσαρκία. Να σημειωθεί ότι όλα τα άτομα ήταν υγιή και δε λάμβαναν φαρμακευτική αγωγή για κανένα λόγο. Η μέση ηλικία των δύο ομάδων δε διέφερε σημαντικά μεταξύ τους (p>0,1) και ήταν περίπου 28,6 έτη (Πίνακας 12). Επιπλέον, οι δύο ομάδες δε διέφεραν όσον αφορά την κατανομή του φύλου. Ακολούθως, τα άτομα με παχυσαρκία, βάσει των αποτελεσμάτων του ευγλυκαιμικού υπερινσουλιναιμικού αποκλεισμού, χωρίστηκαν σε δύο υπό ομάδες, την πρώτη αποτελούσαν 8 άτομα με ευαισθησία στην ινσουλίνη και τη δεύτερη 8 άτομα με αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι δύο αυτές υπο ομάδες δε διέφεραν μεταξύ τους στην ηλικία, το φύλο, το ΔΜΣ και τις περιμέτρους μέσης και ισχίων. Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν μεταξύ των ατόμων φυσιολογικού βάρους και των ατόμων με παχυσαρκία ήταν ότι τα παχύσαρκα άτομα είχαν υψηλότερες τιμές συστολικής και διαστολικής αρτηριακής πίεσης (p<0,05), μεγαλύτερο δείκτη μάζας σώματος (ΔΜΣ) και περίμετρο μέσης (p<0.001). Επιπλέον, τα παχύσαρκα άτομα είχαν υψηλότερες τιμές λιπιδίων ολικής χοληστερόλης και LDL χοληστερόλης, ενώ οι τιμές ΗDL χοληστερόλης ήταν χαμηλότερες (p<0,05). Ο ρυθμός κατανάλωσης της γλυκόζης (Μ) ήταν υψηλότερος στην ομάδα ελέγχου (p<0,001) (Πίνακας 13), ενώ στα άτομα με παχυσαρκία ήταν οριακά αυξημένες οι τιμές της HOMA ir, της γλυκόζης πλάσματος και της ινσουλίνης πλάσματος χωρίς να είναι στατιστικά σημαντική η διαφορά με την ομάδα ελέγχου (p=0,076, 0,069, 0,067, αντίστοιχα). 162

175 Αποτελέσματα Πίνακας 12. Ανθρωπομετρικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά των ομάδων και των υποομάδων που μελετήθηκαν. Όπου ΔΜΣ= δείκτης μάζας σώματος, ΣΑΠ= συστολική αρτηριακή πίεση, ΔΑΠ= διαστολική αρτηριακή πίεση, HOMA IR= Homeostatic model of assessment of insulin resistance. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο ± σταθερή απόκλιση. Άτομα φυσιολογικού βάρους (n=10) Άτομα με παχυσαρκία (n=16) Άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (n=8) Άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (n=8) Ηλικία 28,63 ±2,77 28,57±3,8 28,5±3,7 29,4±4,4 >0,1 p Value Φύλο (Α/Γ) 2/8 3/13 2/6 1/7 ΔΜΣ (kg/m 2 ) 23,84±0,9 37,9±7,1 36.2±7,7 40.2±6,2 <0,001 Περίμετρος μέσης 85,5±1,9 112,1±12,5 104,5±6,6 122±11,2 <0,001 (cm) ΣΑΠ (mmhg) 114.2±5,1 127,8±10 125,5±11 130,8±8,4 0,006 ΔΑΠ (mmhg) 75,2±4,4 86,3±14 83,9±16,8 89,5±9,2 0,015 Χοληστερόλη 161,8±13 184,4±24,6 191,4±20 175,2±28,7 0,05 (mg/dl) Τριγλυκερίδια 95,5±12,9 124,7±38,5 109,4±14,8 145,2±51,7 0,021 (mg/dl) HDL Χοληστερόλη 49,7±5,3 41,4±7,1 39,4±5,2 44±8,9 0,02 (mg/dl) LDL Χοληστερόλη 112,4±21 122,9±27,3 131,6±23,5 111,3±29,7 >0,1 (mg/dl) HOMA IR 1,6±0,35 4,76±4 3,87±0,2 5,4±5,4 0,076 Ινσουλίνη (μu/ml) 6,67±2,4 21±17,65 17,5±1,7 23,7±23,6 0,067 Γλυκόζη 81,2±9,6 92,6±13 94,8±16,5 89,7±5,9 0,069 (mg/dl) HbA1c (%) 4,87±0,12 5,07±0,4 4,84±0,14 5,38±0,5 >0,1 163

176 Αποτελέσματα Πίνακας 13. Δείκτες του ευγλυκαιμικού υπερινσουλιναιμικού αποκλεισμού στις ομάδες που μελετήθηκαν. Όπου p, αντιπροσωπεύει τη πιθανότητα οι ομάδες που εξετάσθηκαν να είναι ίδιες (one way ANOVA). M, Μ bw, M επιφάνεια σώματος ο συνολικός ρυθμός κατανάλωσης της γλυκόζης σε απόλυτη τιμή και ομαλοποιημένος με το σωματικό βάρος και την επιφάνεια σώματος. Μ/Ι, αντιπροσωπεύει την ποσότητα της γλυκόζης που μεταβολίζεται για κάθε μία μονάδα ινσουλίνης πλάσματος. MCR, ο μεταβολικός ρυθμός κάθαρσης ομαλοποιημένος με το σωματικό βάρος και την επιφάνεια σώματος. Άτομα φυσιολογικού βάρους (n=10) Άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (n=8) Άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (n=8) p value M (mmol min 1 ) 3,5±0,7 3,41±1,1 1,49±0,7 <0,001 Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 10,32±0,9 7,04±2 2,61±1,2 <0,001 M επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) 375,5±30 309,9±92,8 122,6±53,5 <0,001 M/I (mmol min 1 nmol 1 ml 1 ) 18,7±14,6 58,32±48,5 13,81±7,9 <0,001 MCR bw (ml kg 1 min 1 ) 10,9±1 7,87±2,4 3,38±1,8 <0,001 MCR επιφάνεια σώματος (ml m 2 min 1 ) 3,99±0,9 3,46±1,1 1,58±0,8 <0, Εκτίμηση της δραστικότητας του ΝΗΕ1 Προκειμένου να εκτιμηθεί η δραστικότητα του ΝΗΕ1 προσδιορίστηκε το ενδοκυτταρικό ph (phi) ως έμμεσος δείκτης. Η βασική αρχή του συγκεκριμένου πειράματος είναι ότι απενεργοποιώντας όλα τα γνωστά συστήματα που εμπλέκονται στην ρύθμιση του phi, κάθε αλλαγή που παρατηρείται στο phi οφείλεται στη λειτουργία του ΝΗΕ1. Χρησιμοποιήθηκαν ως επαγωγείς της δραστικότητας του ΝΗΕ1 οι εξής ουσίες: γλυκόζη, ινσουλίνη, λεπτίνη και αδρεναλίνη. Η επώαση των μονοκυττάρων με γλυκόζη αύξησε σημαντικά το phi σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου και στις δύο ομάδες (p=0,003 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους και p=0,035 για τα άτομα με παχυσαρκία) (Διάγραμμα 1). Η ποσοστιαία αύξηση του phi που παρατηρήθηκε με την προσθήκη της γλυκόζης δεν είχε διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων (p>0,1). Στη συνέχεια, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ του phi και της ινσουλινοευαισθησίας που υπολογίστηκε με τον ευγλυκαιμικό υπερινσουλιναιμικό αποκλεισμό 164

177 Αποτελέσματα εκφρασμένη ως Μ bw (mg kg 1 min 1 ), χωρίς όμως να επιβεβαιωθεί συσχέτιση. Ομοίως, δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ των παχύσαρκων ατόμων με και χωρίς αντίσταση στην ινσουλίνη. Για το λόγο αυτό, στο συγκεκριμένο πείραμα το σύνολο των ατόμων με παχυσαρκία θεωρήθηκε ως μία ενιαία ομάδα. Διάγραμμα 1. Προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ph (phi) σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν με γλυκόζη. Οι λευκές στήλες αντιστοιχούν στην ομάδα ελέγχου, δηλαδή τα άτομα φυσιολογικού βάρους, ενώ οι σκούρο γκρι στήλες αντιστοιχούν στα άτομα με παχυσαρκία. ** υποδηλώνει p<0,05 στη σύγκριση μεταξύ του δείγματος ελέγχου (control) και του δείγματος μετά από επίδραση της γλυκόζης για την κάθε ομάδα χωριστά. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους του phi ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο. ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Το πείραμα επαναλήφθηκε μετά την επώαση των μονοκυττάρων με cariporide, το οποίο αναστέλλει τον ΝΗΕ1, και το αποτέλεσμα ήταν να αποτραπεί η αύξηση του phi που παρατηρήθηκε με τη γλυκόζη και στις δύο ομάδες (p=0.005 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους και p=0.03 για τα άτομα με παχυσαρκία), υποδηλώνοντας ότι η αύξηση του phi που παρατηρήθηκε παρουσία γλυκόζης οφείλεται στην αυξημένη λειτουργία του ΝΗΕ1 (Διάγραμμα 2). 165

178 Αποτελέσματα Διάγραμμα 2. Προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ph (phi) σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν με γλυκόζη και σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν αρχικά με cariporide και στη συνέχεια προστέθηκε η γλυκόζη. Οι λευκές στήλες αντιστοιχούν στην ομάδα ελέγχου, δηλαδή τα άτομα φυσιολογικού βάρους, ενώ οι σκούρο γκρι στήλες αντιστοιχούν στα άτομα με παχυσαρκία. * υποδηλώνει p<0,05 στη σύγκριση μεταξύ του δείγματος γλυκόζης και του δείγματος μετά από ταυτόχρονη επίδραση του cariporide και της γλυκόζης για την κάθε ομάδα χωριστά. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους του phi ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο. ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου, Γλυκ+Cari, υποδηλώνει γλυκόζη και cariporide. Η ταυτόχρονη επώαση των μονοκυττάρων με γλυκόζη και κάθε έναν από τους αναστολείς GF109203X, L name και Cytochalasin D μαζί με την γλυκόζη ανέστειλε την αύξηση του phi που παρατηρήθηκε παρουσία γλυκόζης τόσο στην ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους όσο και στην ομάδα των παχύσαρκων ατόμων (p<0,04) (Διάγραμμα 3). Αποτέλεσμα που υποδεικνύει ότι η γλυκόζη ενεργοποιεί τον ΝΗΕ1 και στις δύο αυτές ομάδες μέσω όλων των ισομορφών της PKC, της συνθετάσης του ΝΟ και του πολυμερισμού της ακτίνης. 166

179 Αποτελέσματα Διάγραμμα 3. Προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ph (phi) σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν με γλυκόζη και σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν αρχικά με έναν από τους αναστολείς GF109203X (αναστολέας όλων των ισομορφών της PKC), Lname (αναστολέας της συνθετάσης του ΝΟ) και Cytochalasin D (αναστολέας του πολυμερισμού της ακτίνης) και στη συνέχεια προστέθηκε η γλυκόζη. Οι λευκές στήλες αντιστοιχούν στην ομάδα ελέγχου, δηλαδή τα άτομα φυσιολογικού βάρους, ενώ οι σκούρο γκρι στήλες αντιστοιχούν στα άτομα με παχυσαρκία. * υποδηλώνει p<0,05 στη σύγκριση μεταξύ του δείγματος γλυκόζης και του δείγματος μετά από ταυτόχρονη επίδραση του αναστολέα και της γλυκόζης για την κάθε ομάδα χωριστά. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους του phi ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο. ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου, Γλυκ+Gf, υποδηλώνει γλυκόζη και GF109203X. Γλυκ+Lname, υποδηλώνει λεπτίνη και Lname. Γλυκ+CytD, υποδηλώνει γλυκόζη και Cytochalasin D. Αντίθετα, η προσθήκη των αναστολέων Gö6976 και wortmannin ανέστειλε ικανοποιητικά (p=0,008 και p=0,034, αντίστοιχα) την αύξηση του phi που παρατηρήθηκε με την προσθήκη της γλυκόζης μόνο στην ομάδα των ατόμων με φυσιολογικό βάρος, υποδηλώνοντας τον ρόλο των κλασσικών ισομορφών της PKC και της PI3K στη συγκεκριμένη ομάδα (Διάγραμμα 4). Τέλος, η προσθήκη του αναστολέα DPI δεν ανέστειλε την αύξηση του phi που παρατηρήθηκε με την επώαση των μονοκυττάρων παρουσία μόνο γλυκόζης και στις δύο ομάδες. Ωστόσο, αξίζει να αναφερθεί ότι στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία, η προσθήκη του DPI ανέστειλε μερικώς την αύξηση του phi που προκλήθηκε από τη γλυκόζη μόνο, με μία οριακή στατιστική σημαντικότητα (p=0,061). 167

180 Αποτελέσματα Διάγραμμα 4. Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν κατά τον προσδιορισμό του ph (phi) μεταξύ των ατόμων με παχυσαρκία και των υγιών εθελοντών αφορούν τη συμμετοχή των κλασικών ισομορφών της PKC και της ΡΙ3Κ στη μεταβίβαση του σήματος της γλυκόζης προς τον ΝΗΕ1 μόνο στην ομάδα των υγιών μαρτύρων, ενώ δεν φαίνεται να εμπλέκονται στην ίδια οδό στα άτομα με παχυσαρκία. Οι λευκές στήλες αντιστοιχούν στην ομάδα ελέγχου, δηλαδή τα άτομα φυσιολογικού βάρους, ενώ οι σκούρο γκρι στήλες αντιστοιχούν στα άτομα με παχυσαρκία. * υποδηλώνει p<0,05 στη σύγκριση μεταξύ του δείγματος γλυκόζης και του δείγματος μετά από ταυτόχρονη επίδραση του αναστολέα και της γλυκόζης για την κάθε ομάδα χωριστά. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους του phi ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο. ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου, Γλυκ+Gö, υποδηλώνει γλυκόζη και Gö6976 και Γλυκ+Wort, υποδηλώνει γλυκόζη και wortmannin. Μία ορμόνη που βρίσκεται συχνά αυξημένη στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη είναι η ινσουλίνη και για το λόγο αυτό θέλαμε να μελετήσουμε την επίδραση υψηλών συγκεντρώσεων ινσουλίνης στο phi και έμμεσα, στον ΝΗΕ1. Η επώαση των μονοκυττάρων με ινσουλίνη αύξησε το phi σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου όπου δεν επέδρασε κανένας παράγοντας, τόσο στην ομάδα των ατόμων με φυσιολογικό βάρος (p=0,02) όσο και στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία (p=0,003) (Διάγραμμα 5). Η ποσοστιαία αύξηση που παρατηρήθηκε ήταν παρόμοια και στις δύο ομάδες (p>0,1) και δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση της αλλαγής του phi με την ινσουλινοευαισθησία. Επιπλέον, δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και των ατόμων με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη και για το λόγο αυτό στο συγκεκριμένο πείραμα η ομάδα των παχύσαρκων θεωρείται ομοίως ως ενιαίο σύνολο. 168

181 Αποτελέσματα Διάγραμμα 5. Προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ph (phi) σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν με ινσουλίνη, η οποία προκάλεσε αύξηση του phi. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο. ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Οι λευκές στήλες υποδηλώνουν την ομάδα ελέγχου, δηλαδή τα άτομα φυσιολογικού βάρους και οι σκούρο γκρι στήλες υποδηλώνουν τα παχύσαρκα άτομα. Όπου ** υποδηλώνει στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος ελέγχου (control) και του δείγματος μετά από επίδραση της ινσουλίνης σε κάθε ομάδα χωριστά. Το πείραμα επαναλήφθηκε μετά την επώαση των μονοκυττάρων με cariporide, που είναι εκλεκτικός αναστολέας του ΝΗΕ1, και στη συνέχεια προστέθηκε η ινσουλίνη. Το αποτέλεσμα ήταν να μην παρατηρηθεί αύξηση του ενδοκυτταρικού ph και στις δύο ομάδες, υποδηλώνοντας ότι η αύξηση του phi που παρατηρήθηκε παρουσία ινσουλίνης οφείλονταν στην αυξημένη λειτουργία του ΝΗΕ1 τόσο στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία (p= 0,039) όσο και στα άτομα με φυσιολογικό βάρος (p=0,03) (Διάγραμμα 6). 169

182 Αποτελέσματα Διάγραμμα 6. Προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ph (phi) σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν αρχικά με cariporide και στη συνέχεια προστέθηκε ινσουλίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο. ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Οι λευκές στήλες υποδηλώνουν την ομάδα ελέγχου, δηλαδή τα άτομα φυσιολογικού βάρους και οι σκούρο γκρι στήλες υποδηλώνουν τα παχύσαρκα άτομα. Όπου * υποδηλώνει στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος της ινσουλίνης και του δείγματος μετά από επίδραση του cariporide και της ινσουλίνης σε κάθε ομάδα χωριστά. Όπου Ινσουλ+Cari, υποδηλώνει ινσουλίνη και cariporide. Αφού επιβεβαιώθηκε η ενεργοποίηση του ΝΗΕ1 από την ινσουλίνη χρησιμοποιήθηκαν οι αναστολείς γνωστών σηματοδοτικών μορίων που ως γνωστό, είτε ενεργοποιούν τον ΝΗΕ1 είτε ενεργοποιούνται από την ινσουλίνη, για να ελεγχθούν πιθανές διαφορές στη σηματοδοτική οδό της ινσουλίνης μεταξύ των υγιών ατόμων και των ατόμων με παχυσαρκία. Οι αναστολείς Gö6976 και Lname ανέστειλαν την αύξηση του phi που προκλήθηκε από την επίδραση της ινσουλίνης και στις δύο ομάδες (p<0,05), υποδηλώνοντας ότι και στις δύο ομάδες συμμετέχουν οι κλασικές ισομορφές της PKC και η συνθετάση του ΝΟ (Διάγραμμα 7). 170

183 Αποτελέσματα Διάγραμμα 7. Προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ph (phi) σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν αρχικά με Gö6976 ή Lname και στη συνέχεια προστέθηκε ινσουλίνη. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν κοινά σηματοδοτικά μόρια (κλασικές ισομορφές PKC και η συνθετάση του ΝΟ) στις δύο ομάδες που μελετήθηκαν. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο. ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Οι λευκές στήλες υποδηλώνουν την ομάδα ελέγχου, δηλαδή τα άτομα φυσιολογικού βάρους και οι σκούρο γκρι στήλες υποδηλώνουν τα παχύσαρκα άτομα. Όπου * υποδηλώνει στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος της ινσουλίνης και του δείγματος όπου επέδρασε ταυτόχρονα ο αναστολέας και η ινσουλίνη σε κάθε ομάδα χωριστά. Όπου Ινσουλ+Gö υποδηλώνει ινσουλίνη και Gö6976 και Ινσουλ+Lname υποδηλώνει ινσουλίνη και Lname. Ωστόσο, παρατηρήθηκαν και διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων στη δράση ορισμένων αναστολέων. Αναλυτικότερα, ο αναστολέας της ΡΙ3Κ, wortmannin, ανέστειλε στατιστικά σημαντικά την αύξηση του phi που προκλήθηκε από την ινσουλίνη μόνο στα άτομα με φυσιολογικό βάρος (p=0,04), ενώ στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία ήταν οριακά σημαντικό (p=0,06). Αντίθετα, ο αναστολέας της οξειδάσης του NADPH, DPI, ανέστειλε την αύξηση του phi μόνο στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία (p=0,037) και όχι στην ομάδα των υγιών ατόμων (p=0,22) (Διάγραμμα 8). Τέλος, οι αναστολείς GF109203X (αναστέλλει όλες τις ισομορφές της PKC) και Cytochalasin D (αναστέλλει τον πολυμερισμό της ακτίνης) δεν ανέστειλαν την αύξηση του phi που προκάλεσε η ινσουλίνη (p>0,1). Συμπερασματικά, η ΡΙ3Κ εμπλέκεται στην οδό μετάδοσης του σήματος της ινσουλίνης προς τον ΝΗΕ1 μόνο στα άτομα φυσιολογικού βάρους, ενώ στα άτομα με παχυσαρκία εμπλέκεται η οξειδάση του NADPH. 171

184 Αποτελέσματα Διάγραμμα 8. Προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ph (phi) σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν αρχικά με DPI ή wortmannin και στη συνέχεια προστέθηκε η ινσουλίνη διαφορές που παρατηρήθηκαν μεταξύ των δύο ομάδων υποδεικνύουν ότι στη μετάδοση του σήματος της ινσουλίνης προς τον ΝΗΕ1 μεσολαβείται από την NADPH οξειδάση στα άτομα με παχυσαρκία ενώ στα άτομα με φυσιολογικό βάρος μεσολαβείται από την PI3K. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Οι λευκές στήλες υποδηλώνουν την ομάδα ελέγχου, δηλαδή τα άτομα φυσιολογικού βάρους και οι σκούρο γκρι στήλες υποδηλώνουν τα παχύσαρκα άτομα. Όπου: * υποδηλώνει σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με ινσουλίνη και του δείγματος που επωάστηκε αρχικά με κάποιο αναστολέα και μετά προστέθηκε η ινσουλίνη. Όπου: Ινσουλ+DPI υποδηλώνει ινσουλίνη και DPI και Ινσουλ+Wort, υποδηλώνει ινσουλίνη και wortmannin. Η παχυσαρκία συχνά συνοδεύεται και από αντίσταση στην λεπτίνη και υπερλεπτιναιμία. Για το λόγο αυτό αποφασίσαμε να μελετήσουμε την επίδραση υψηλών συγκεντρώσεων λεπτίνης σε μονοκύτταρα ατόμων φυσιολογικού βάρους και παχύσαρκων με ή χωρίς αντίσταση στην ινσουλίνη. Η επώαση των μονοκυττάρων με λεπτίνη αυξάνει το ενδοκυτταρικό ph (phi) σημαντικά τόσο στην ομάδα των ατόμων με φυσιολογικό βάρος όσο και στην ομάδα των παχύσαρκων συγκρίνοντάς το με το αντίστοιχο δείγμα ελέγχου (p=0.016, p=0.04, αντίστοιχα) (Διάγραμμα 9). Η ποσοστιαία αύξηση του phi που παρατηρήθηκε παρουσία της λεπτίνης δεν διέφερε στις δύο ομάδες. Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση με την ινσουλινοευαισθησία καθώς τα παχύσαρκα άτομα με αντίσταση στην ινσουλίνη δεν διέφεραν στην απάντησή τους σε σύγκριση με τα παχύσαρκα άτομα με ευαισθησία στην ινσουλίνη, επομένως, τα παχύσαρκα άτομα θεωρούνται ως ενιαίο σύνολο και για το συγκεκριμένο πείραμα. 172

185 Αποτελέσματα Διάγραμμα 9. Προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ph (phi) σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν με λεπτίνη και παρατηρήθηκε αύξηση του τόσο στην ομάδα των ατόμων με φυσιολογικό βάρος (λευκές στήλες) όσο και στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία (σκούρο γκρι στήλες). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου ** παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος ελέγχου (control) και του δείγματος μετά από επίδραση της λεπτίνης. Στη συνέχεια, το πείραμα επαναλήφθηκε μετά επώαση των μονοκυττάρων και των δύο ομάδων με cariporide και στη συνέχεια προστέθηκε η λεπτίνη. Αποτέλεσμα ήταν να μην παρατηρηθεί αύξηση του phi στα συγκεκριμένα δείγματα και στις δύο ομάδες, υποδηλώνοντας ότι ο ΝΗΕ1 είναι υπεύθυνος για την παρατηρούμενη αύξηση του phi και ότι ο ΝΗΕ1 ενεργοποιείται και από τη λεπτίνη (Διάγραμμα 10). 173

186 Αποτελέσματα Διάγραμμα 10. Προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ph (phi) σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν με λεπτίνη και σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν με cariporide και στη συνέχεια προστέθηκε η λεπτίνη. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η λεπτίνη ενεργοποιεί τον ΝΗΕ1 τόσο στα υγιή άτομα όσο και στα άτομα με παχυσαρκία. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.. από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Οι λευκές στήλες υποδηλώνουν την ομάδα ελέγχου, δηλαδή τα άτομα φυσιολογικού βάρους ενώ οι σκούρο γκρι στήλες υποδηλώνουν την ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία. Όπου * παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και του δείγματος που επωάστηκε αρχικά με cariporide και μετά προστέθηκε η λεπτίνη. Όπου: Λεπτ+Cari, υποδηλώνει λεπτίνη και cariporide. Στη συνέχεια, για να μελετηθεί η οδός μετάδοσης του σήματος από τη λεπτίνη στον ΝΗΕ1 προστέθηκαν οι αναστολείς των γνωστών σηματοδοτικών μορίων. Η προσθήκη του αναστολέα των κλασσικών ισομορφών της PKC, Gö6976, μαζί με λεπτίνη στα μονοκύτταρα και των δύο ομάδων αναστέλλει την αύξηση του phi που παρατηρήθηκε όταν τα μονοκύτταρα επωάστηκαν παρουσία μόνο λεπτίνης. Η ταυτόχρονη επώαση των μονοκυττάρων με λεπτίνη με καθέναν από τους υπόλοιπους αναστολείς (GF109203X, L Name, DPI και Wortmannin) δεν ανέστειλε την αύξηση του phi που προκαλεί η λεπτίνη και στις δύο υπό μελέτη ομάδες που σημαίνει ότι στην οδό μετάδοσης του σήματος της λεπτίνης δεν συμμετέχουν όλες οι ισομορφές της PKC, η συνθετάση του ΝΟ, η οξειδάση του NADPH και η ΡΙ3Κ (Διάγραμμα 11). Αξίζει να σημειωθεί ότι στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία, η προσθήκη του GF109203X και του Lname παρουσίασαν οριακά σημαντική αναστολή της αύξησης του phi (p=0,052 και p=0,058, αντίστοιχα) που αποδίδεται μάλλον στον μικρό αριθμό του μελετηθέντος δείγματος. 174

187 Αποτελέσματα Διάγραμμα 11. Ο προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ph (phi) παρουσία αναστολέων γνωστών σηματοδοτικών μορίων υποδεικνύει ότι τόσο τα άτομα φυσιολογικού βάρους όσο και τα άτομα με παχυσαρκία χρησιμοποιούν ή όχι, κοινές οδούς στη μετάδοση του σήματος της λεπτίνης προς τον ΝΗΕ1. Χρησιμοποιούν τις κλασσικές ισομορφές της PKC ενώ δεν χρησιμοποιούν τη συνθετάση του ΝΟ, την οξειδάση του NADPΗ και τη ΡΙ3Κ. Επιπλέον, η αναστολή όλων των ισομορφών της PKC ανέστειλε την αύξηση του phi που προκάλεσε η λεπτίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν την ομάδα ελέγχου (άτομα φυσιολογικού βάρους), ενώ οι σκούρο γκρι στήλες, τα παχύσαρκα άτομα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και του δείγματος που επωάστηκε αρχικά με κάποιο αναστολέα και μετά προστέθηκε η λεπτίνη σε κάθε ομάδα ξεχωριστά. Όπου, Λεπτ+Gö, υποδηλώνει λεπτίνη και Gö6976. Λεπτ+Gf, υποδηλώνει λεπτίνη και GF109203X. Λεπτ+Lname, υποδηλώνει λεπτίνη και Lname. Λεπτ+DPI, υποδηλώνει λεπτίνη και DPI. Λεπτ+Wort, υποδηλώνει λεπτίνη και wortmannin. Η μόνη διαφορά που παρατηρήθηκε μεταξύ των δύο ομάδων που μελετήθηκαν, αφορά τον πολυμερισμό της ακτίνης, ο οποίος εμπλέκεται μόνο στα άτομα με παχυσαρκία κατά τη μετάδοση του σήματος της λεπτίνης. Δηλαδή, η ταυτόχρονη επώαση των μονοκυττάρων με Cytochalasin D και λεπτίνη αναστέλλει την αύξηση του phi που προκαλείται από τη λεπτίνη, μόνο στα παχύσαρκα άτομα (p=0.032), υποδηλώνοντας ένα διαφορετικό ρόλο του πολυμερισμού της ακτίνης ανάμεσα στα παχύσαρκα και τα άτομα φυσιολογικού βάρους (Διάγραμμα 12). Τέλος, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ των αλλαγών του phi και της ευαισθησίας στην ινσουλίνη όπως αυτή εκτιμήθηκε με τον ευγλυκαιμικό υπερινσουλιναιμικό αποκλεισμό και εκφράσθηκε ως Μ bw (mg kg 1 min 1 ). Η μόνη συσχέτιση που παρατηρήθηκε είναι μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και του phi, όταν τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με Lname και λεπτίνη ταυτόχρονα (Pearson s correlation, r=0,809, p=0,005). Γεγονός που δεν 175

188 Αποτελέσματα μπορούμε να ερμηνεύσουμε με τα πειράματα αυτά και με τα σημερινά δεδομένα. Κάποιο μελλοντικό πείραμα θα μπορούσε να το εξηγήσει. Διάγραμμα 12. Η διαφορά που παρατηρήθηκε κατά τον προσδιορισμό του ενδοκυτταρικού ph (phi) μεταξύ των ατόμων με φυσιολογικό βάρος (λευκές στήλες) και των ατόμων με παχυσαρκία (σκούρο γκρι στήλες) αφορά τον πολυμερισμό της ακτίνης, ο οποίος αναστέλλεται από την Cytochalasin D. Όπου * παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και του δείγματος που επωάστηκε αρχικά με Cytochalasin D και μετά προστέθηκε η λεπτίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου, Λεπτ+CytD, υποδηλώνει λεπτίνη και Cytochalasin D. Είναι γνωστό ότι στην παχυσαρκία υπάρχει ενεργοποίηση του συμπαθητικού συστήματος και πιθανόν αυξημένες συγκεντρώσεις αδρεναλίνης. Για το λόγο αυτό μελετήσαμε την επίδραση υψηλών συγκεντρώσεων αδρεναλίνης σε μονοκύτταρα από υγιή άτομα με φυσιολογικό βάρος και από άτομα με παχυσαρκία. Η επώαση των μονοκυττάρων παρουσία αδρεναλίνης αύξησε το ενδοκυτταρικό ph και στις δύο ομάδες (p=0,006) και η ποσοστιαία αύξηση του phi δεν εμφάνισε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων, αν και η αύξηση που παρατηρήθηκε στα άτομα φυσιολογικού βάρους έτεινε να είναι μεγαλύτερη από τα άτομα με παχυσαρκία. Γεγονός που πιθανόν αντανακλά το διαρκώς ενεργοποιημένο συμπαθητικό σύστημα των ατόμων με παχυσαρκία Στην συνέχεια ελέγχθηκε αν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ των αλλαγών του phi και της ινσουλινοευαισθησίας, η οποία εκτιμήθηκε με τον ευγλυκαιμικό υπερινσουλιναιμικό αποκλεισμό, αλλά δεν επιβεβαιώθηκε συσχέτιση. Η σύγκριση μεταξύ των ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και των ατόμων με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη δεν 176

189 Αποτελέσματα παρουσιασε σημαντικές διαφορές. Επομένως και στην περίπτωση αυτή, τα άτομα με παχυσαρκία θεωρήθηκαν ως ενιαία ομάδα. Διάγραμμα 13. Προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ph (phi) σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν με αδρεναλίνη. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αδρεναλίνη αυξάνει το phi και στις δύο ομάδες. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν την ομάδα ελέγχου (άτομα φυσιολογικού βάρους) ενώ οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία. Όπου **, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05), μεταξύ του δείγματος ελέγχου (control) και του δείγματος που επωάστηκε παρουσία αδρεναλίνης. Ακολούθως, επαναλήφθηκε το πείραμα μετά επώαση των μονοκυττάρων με τον αναστολέα του ΝΗΕ1, το cariporide, και μετά, προστέθηκε η αδρεναλίνη. Το αποτέλεσμα ήταν να ανασταλεί η προκαλούμενη από την αδρεναλίνη αύξηση του phi και στις δύο ομάδες (p=0,01 για την ομάδα ελέγχου και p=0,047 για την ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία). Το συμπέρασμα είναι ότι η αύξηση του phi που προκάλεσε η αδρεναλίνη οφείλεται σε ενεργοποίηση του ΝΗΕ1 από την αδρεναλίνη (Διάγραμμα 14). 177

190 Αποτελέσματα Διάγραμμα 14. Προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ph (phi) σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν αρχικά με cariporide και στη συνέχεια προστέθηκε η αδρεναλίνη και σύγκριση αυτών με μονοκύτταρα που επωάστηκαν παρουσία μόνο αδρεναλίνης. Η προσθήκη του αναστολέα του ΝΗΕ1 ανέστειλε την προκαλούμενη από την αδρεναλίνη αύξηση και στις δύο ομάδες. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν την ομάδα ελέγχου (άτομα φυσιολογικού βάρους) ενώ οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05), μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε ταυτόχρονα με cariporide και αδρεναλίνη και του δείγματος που επωάστηκε παρουσία αδρεναλίνης. Όπου Αδρεν+Cari, υποδηλώνει αδρεναλίνη και cariporide. Στη συνέχεια, μελετήθηκαν τα μόρια που εμπλέκονται στην οδό μετάδοσης του σήματος της αδρεναλίνης προς τον ΝΗΕ1. Αναλυτικότερα, τα μονοκύτταρα επωάστηκαν αρχικά με έναν από τους αναστολείς Gö6976 (αναστολέας των κλασικών ισομορφών της PKC), GF109203X (αναστολέας όλων των ισομορφών της PKC), L name (αναστολέας της συνθετάσης του ΝΟ), DPI (αναστολέας της οξειδάσης του NADPH), wortmannin (αναστολέας της ΡΙ3Κ) και Cytochalasin D (αναστολέας του πολυμερισμού της ακτίνης) και στη συνέχεια προστέθηκε η αδρεναλίνη. Στις δύο ομάδες που μελετήθηκαν, κατά τη μετάδοση του σήματος της αδρεναλίνης προς τον ΝΗΕ1, συμμετέχουν μόνο οι κλασικές ισομορφές της PKC (p=0,024 για τους υγιείς εθελοντές και p=0,017 για τα άτομα με παχυσαρκία) ενώ η επώαση των μονοκυττάρων με GF109203X και DPI δεν ανέστειλε την προκαλούμενη από την αδρεναλίνη αύξηση του phi (Διάγραμμα 15). 178

191 Αποτελέσματα Διάγραμμα 15. Σο διάγραμμα παρουσιάζονται οι ομοιότητες στη μετάδοση σήματος της αδρεναλίνης μεταξύ των ατόμων με φυσιολογικό βάρος (λευκές στήλες) και των ατόμων με παχυσαρκία (σκούρο γκρι στήλες). Προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ph (phi) σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν με έναν από τους αναστολείς Gö6976, GF109203X ή DPI και στη συνέχεια προστέθηκε η αδρεναλίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με αδρεναλίνη και του δείγματος που επωάστηκε αρχικά με κάποιο αναστολέα και μετά προστέθηκε η αδρεναλίνη. Όπου: Αδρεν+Gö: υποδηλώνει αδρεναλίνη και Gö6976, Αδρεν+Gf, υποδηλώνει αδρεναλίνη και GF109203X και Αδρεν+DPI: υποδηλώνει αδρεναλίνη και DPI. Ταυτόχρονα, παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων και αφορούν τον αναστολέα της συνθετάσης του ΝΟ (Lname), τον αναστολέα της ΡΙ3Κ (wortmannin) και τον αναστολέα του πολυμερισμού της ακτίνης (Cytochalasin D), οι οποίοι ανέστειλαν την προκαλούμενη από την αδρεναλίνη αύξηση του phi μόνο στην ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους (p=0,0044, p=0,003 και p=0,031, αντίστοιχα). Οι αναστολείς αυτοί στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία δεν ανέστειλαν την αύξηση του phi, υποδηλώνοντας ότι η συνθετάση του ΝΟ, η ΡΙ3Κ και ο πολυμερισμός της ακτίνης συμμετέχουν στη μετάδοση του σήματος της αδρεναλίνης προς τον ΝΗΕ1 μόνο στα άτομα με φυσιολογικό βάρος (Διάγραμμα 16). 179

192 Αποτελέσματα Διάγραμμα 16. Σο διάγραμμα παρουσιάζονται οι διαφορές στη μετάδοση σήματος της αδρεναλίνης μεταξύ των ατόμων με φυσιολογικό βάρος (λευκές στήλες) και των ατόμων με παχυσαρκία (σκούρο γκρι στήλες). Προσδιορισμός του ενδοκυτταρικού ph (phi) σε μονοκύτταρα που επωάστηκαν με έναν από τους αναστολείς Lname, wortmannin ή Cytochalasin D και στη συνέχεια προστέθηκε η αδρεναλίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με αδρεναλίνη και του δείγματος που επωάστηκε αρχικά με κάποιο αναστολέα και μετά προστέθηκε η αδρεναλίνη. Όπου Αδρεν+Lname υποδηλώνει αδρεναλίνη και Lname, Αδρεν+DPI υποδηλώνει αδρεναλίνη και DPI και Αδρεν+Wort υποδηλώνει αδρεναλίνη και wortmannin. Τέλος, ελέγχθηκε η συσχέτιση μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και των αλλαγών του phi. Οι συσχετίσεις που επιβεβαιώθηκαν αφορούν τα δείγματα που επωάστηκαν ταυτόχρονα με Gö6976 και λεπτίνη (Spearman s correlation r=0,664, p=0,026), με wortmannin και λεπτίνη (Spearman s correlation r= 0,676, p=0,032) και με cariporide και αδρεναλίνη (Spearman s correlation r=0,593, p=0,042). Συμπερασματικά, ο ΝΗΕ1 ενεργοποιείται από όλες τις ουσίες που χρησιμοποιήσαμε, οι οποίες είναι γνωστό ότι βρίσκονται σε αυξημένη συγκέντρωση στη παχυσαρκία, δηλαδή από τη γλυκόζη, την ινσουλίνη, τη λεπτίνη και την αδρεναλίνη. Όσον αφορά την ενεργοποίηση του ΝΗΕ1 στα παχύσαρκα άτομα με αντίσταση στην ινσουλίνη δεν παρατηρήθηκε διαφορά από τα παχύσαρκα άτομα με ευαισθησία στην ινσουλίνη. Τα σηματοδοτικά μόρια που συμμετέχουν στην οδό μετάδοσης σήματος για το καθένα από τους προαναφερθέντες επαγωγείς είναι κοινά σε όλα τα άτομα που μελετήθηκαν, ωστόσο παρατηρήθηκαν κάποιες σημαντικές διαφορές, που έχουν ήδη αναλυθεί. 180

193 Αποτελέσματα 7. Προσκόλληση μονοκυττάρων σε υπόστρωμα λαμινίνης 1 Στο προηγούμενο πείραμα αποδείχθηκε η ενεργοποίηση του ΝΗΕ1 από τη γλυκόζη, την ινσουλίνη, τη λεπτίνη και την αδρεναλίνη. Στη συνέχεια, τέθηκε το ερώτημα αν οι ουσίες αυτές αυξάνουν τις αθηρογόνες ιδιότητες των μονοκυττάρων. Ένα από τα πρώτα στάδια σχηματισμού της αθηρωματικής πλάκας περιλαμβάνει την προσκόλληση των μονοκυττάρων στο ενδοθήλιο με απώτερο σκοπό τη μετανάστευσή τους στον υπενδοθηλιακό χώρο. Επομένως, το πρώτο πείραμα ήταν η μελέτη της προσκόλλησης των μονοκυττάρων στις ομάδες που μελετήσαμε, δηλαδή ατόμων με φυσιολογικό βάρος ή παχυσαρκία με ή χωρίς αντίσταση στην ινσουλίνη. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων επαγωγέων και ο ρόλος του ΝΗΕ1 στη διαδικασία αυτή. Τέλος, μελετήθηκε η οδός μετάδοσης του σήματος των επαγωγέων αυτών. Παλαιότερες μελέτες από την ερευνητική μας ομάδα ασχολήθηκαν με την επίδραση υψηλών συγκεντρώσεων γλυκόζης και ινσουλίνης στη διαδικασία της προσκόλλησης των μονοκυττάρων σε παχύσαρκα άτομα με αντίσταση στην ινσουλίνη [ ] και για το λόγο αυτό, στο συγκεκριμένο πείραμα ως επαγωγείς χρησιμοποιήθηκαν μόνο η λεπτίνη και η αδρεναλίνη. Η προσκόλληση των μονοκυττάρων που απομονώθηκαν από την ομάδα ελέγχου (υγιή άτομα φυσιολογικού βάρους) (0,2994±0,03) ήταν παρόμοια (p>0,05) με αυτή των μονοκυττάρων που απομονώθηκαν από τα άτομα με παχυσαρκία (0,3196±0,05). Επιπλέον, η προσκόλληση των μονοκυττάρων που απομονώθηκαν από τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη δεν διέφερε σημαντικά από αυτή των μονοκυττάρων που απομονώθηκαν από τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (0,32±0,01 και 0,334±0,07, αντίστοιχα. p>0,05). Αντίθετα, η προσκόλληση των μονοκυττάρων συσχετίστηκε με την ινσουλινοευαισθησία, η οποία προσδιορίστηκε με τη μέθοδο του ευγλυκαιμικού υπερινσουλιναιμικού αποκλεισμού και εκφράστηκαν ως Μ bw (mg kg 1 min 1 ). Στο σύνολο των ατόμων που εξετάσθηκαν βρέθηκε ότι όσο αυξάνεται η αντίσταση στην ινσουλίνη τόσο αυξάνεται και η προσκόλληση των μονοκυττάρων και μάλιστα η συσχέτιση που διαπιστώθηκε ήταν ισχυρή (Spearman s correlation rho= 0,478, p=0,03) (Σχήμα 1Α). Μία ακόμη επιβεβαίωση του αποτελέσματος αυτού προέκυψε όταν η ευαισθησία στην ινσουλίνη εκφράστηκε σε συνάρτηση με την επιφάνεια σώματος (Spearman s correlation rho= 0,543, p=0,013) (Σχήμα 1Β), 181

194 Αποτελέσματα με το βασικό μεταβολικό ρυθμό της γλυκόζης (Spearman s correlation για το MCR bw : rho= 0,565, p=0,009 και σε συνάρτηση με την επιφάνεια σώματος: rho= 0,574, p=0,008) (Σχήμα 1Γ και 1Δ). Σχήμα 4A. Συσχέτιση μεταξύ της ευαισθησίας στην ινσουλίνη και της προσκόλλησης των μονοκυττάρων σε υπόστρωμα λαμινίνης 1. Η ευαισθησία στην ινσουλίνη προσδιορίστηκε με τον ευγλυκαιμικό υπερινσουλιναιμικό αποκλεισμό και εκφράστηκε ως Μ bw (mg kg 1 min 1 ) (Σχήμα Α), Μ επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) (Σχήμα Β). 182

195 Αποτελέσματα Σχήμα 5B. Συσχέτιση μεταξύ της ευαισθησίας στην ινσουλίνη και της προσκόλλησης των μονοκυττάρων σε υπόστρωμα λαμινίνης 1. Η ευαισθησία στην ινσουλίνη προσδιορίστηκε με τον ευγλυκαιμικό υπερινσουλιναιμικό αποκλεισμό και εκφράστηκε ως βασικός μεταβολικός ρυθμός της γλυκόζης, MCR bw (ml kg 1 min 1 ) (Σχήμα Γ) και τέλος ως MCR επιφάνεια σώματος (ml m 2 min 1 ) (Σχήμα Δ). Η επώαση των μονοκυττάρων με λεπτίνη προκάλεσε αύξηση στην προσκόλληση των μονοκυττάρων τόσο στην ομάδα των υγιών μαρτύρων φυσιολογικού βάρους (από 0,299±0,03 σε 0,344±0,04, p=0,028) όσο και στη ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία (από 0,3196±0,05 σε 0,363±0,08, p=0,001). Ωστόσο, η ποσοστιαία αύξηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων που απομονώθηκαν από τα άτομα φυσιολογικού βάρους ήταν σημαντικά (p=0,048) υψηλότερη σε σύγκριση με την προσκόλληση των μονοκυττάρων που απομονώθηκαν από τα άτομα με παχυσαρκία (Διάγραμμα 17). 183

196 Αποτελέσματα Διάγραμμα 17. Προσδιορισμός της προσκόλλησης μονοκυττάρων που επωάστηκαν με λεπτίνη. Η λεπτίνη αυξάνει την προσκόλληση των μονοκυττάρων τόσο στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από τα υγιή άτομα φυσιολογικού βάρους (λευκές στήλες) όσο και σε αυτά που απομονώθηκαν από τα άτομα με παχυσαρκία (σκούρο γκρι στήλες). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου **, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος ελέγχου (control) και του δείγματος μετά από επίδραση της λεπτίνης στη κάθε ομάδα χωριστά. Όπου #, παρατηρήθηκε σημαντική (p<0,05) διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων, δηλαδή η ποσοστιαία αύξηση της προσκόλλησης στα μονοκύτταρα των ατόμων φυσιολογικού βάρους ήταν μεγαλύτερη σε σύγκριση με αύτη των μονοκυττάρων των ατόμων με παχυσαρκία. Όπου mpo (μυελοπεροξειδάση) αντιπροσωπεύει το θετικό δείγμα ελέγχου του πειράματος και δεν παρουσιάστηκε διαφορά μεταξύ των πειραμάτων. Ακολούθως, συγκρίθηκε η προσκόλληση των μονοκυττάρων μεταξύ των δύο υπο ομάδων των ατόμων με παχυσαρκία, δηλαδή μεταξύ των ατόμων με αντίσταση στη ινσουλίνη και αυτών με ευαισθησία στην ινσουλίνη. Το αποτέλεσμα ήταν η παρόμοια αύξηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων και στις δύο υπο ομάδες (από 0,33±0,01 σε 0,35±0,02 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη και από 0,334±0,07 σε 0,39±0,07 για τα άτομα με παχυσαρκία και ινσουλινοευαισθησία, p>0,05), όταν προστέθηκε η λεπτίνη (Διάγραμμα 18). Συμπερασματικά, η αυξημένη προσκόλληση των μονοκυττάρων οφείλεται στην αντίσταση στην ινσουλίνη και όχι στην παχυσαρκία αυτή καθ εαυτή. 184

197 Αποτελέσματα Διάγραμμα 18. Προσδιορισμός της προσκόλλησης μονοκυττάρων που επωάστηκαν με λεπτίνη και σύγκριση μεταξύ των μονοκυττάρων που απομονώθηκαν από τα υγιή άτομα φυσιολογικού βάρους (λευκές στήλες) και των μονοκυττάρων που απομονώθηκαν από τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (ανοιχτό γκρι στήλες) και από τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (σκούρο γκρι στήλες). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου **, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος ελέγχου (control) και του δείγματος μετά από επίδραση της λεπτίνης στη κάθε ομάδα χωριστά. Όπου mpo (μυελοπεροξειδάση) αντιπροσωπεύει το θετικό δείγμα ελέγχου του πειράματος και δεν παρουσιάστηκε διαφορά μεταξύ των πειραμάτων. Στη συνέχεια μελετήθηκε ο ρόλος του ΝΗΕ1 στη διαδικασία της προσκόλλησης των μονοκυττάρων. Για το λόγο αυτό επαναλήφθηκε το πείραμα αφού πρώτα τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με τον αναστολέα του ΝΗΕ1, το cariporide. Το αποτέλεσμα ήταν να μην παρατηρηθεί αύξηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων όταν προστέθηκε η λεπτίνη σε όλες τις υπό μελέτη ομάδες, εκτός από τα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από τα παχύσαρκα άτομα με αντίσταση στην ινσουλίνη (το δείγμα που επωάστηκε με cariporide και λεπτίνη διέφερε σημαντικά σε σύγκριση με το δείγμα που επωάστηκε μόνο με λεπτίνη: p=0,028 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους, p= 0,002 για το σύνολο των ατόμων με παχυσαρκία και p=0,012 για τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη, ενώ για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη, p=0,115). Συμπερασματικά, η ενεργοποίηση του ΝΗΕ1 από τη λεπτίνη οφείλεται για την αύξηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων που επωάστηκαν με τη λεπτίνη μόνο στα άτομα φυσιολογικού βάρους και στα παχύσαρκα άτομα με ευαισθησία στην ινσουλίνη. 185

198 Αποτελέσματα Διάγραμμα 19. Προσδιορισμός της προσκόλλησης μονοκυττάρων που επωάστηκαν πρώτα με cariporide και στη συνέχεια προστέθηκε η λεπτίνη. Ακολούθως, τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα δείγματα που επωάστηκαν με λεπτίνη στη κάθε ομάδα χωριστά. Το cariporide ανέστειλε την αύξηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων που προκαλεί η λεπτίνη στην ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους (λευκές στήλες), στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (ανοιχτό γκρι στήλες) και στο σύνολο των ατόμων με παχυσαρκία (μαύρες στήλες). Δεν την ανέστειλε όμως στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (σκούρο γκρι στήλες). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και του δείγματος μετά από ταυτόχρονη επίδραση λεπτίνης και cariporide, στη κάθε ομάδα χωριστά. Όπου mpo (μυελοπεροξειδάση) αντιπροσωπεύει το θετικό δείγμα ελέγχου του πειράματος και δεν παρουσιάστηκε διαφορά μεταξύ των πειραμάτων. Το πείραμα επαναλήφθηκε αφού προστέθηκαν αναστολείς γνωστών σηματοδοτικών μορίων που είτε εμπλέκονται στην οδό μετάδοσης του σήματος της λεπτίνης είτε ενεργοποιούν τον ΝΗΕ1, για να μελετηθεί η οδός μετάδοσης του σήματος της λεπτίνης προς τον ΝΗΕ1 στις ομάδες ατόμων που μελετήσαμε. Αναλυτικότερα, η επώαση των μονοκυττάρων με τον Gö6976 (p=0,028 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους, p=0,012 για τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και p=0,028 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στη ινσουλίνη), GF109203X (p=0,027 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους, p=0,017 για τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και p=0,043 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στη ινσουλίνη) και το Lname (p=0,028 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους, p=0,036 για τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και p=0,028 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στη ινσουλίνη) ανέστειλε 186

199 Αποτελέσματα την προκαλούμενη από τη λεπτίνη αύξηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων σε όλες τις ομάδες (Διάγραμμα 20). Συμπερασματικά, η PKC και η συνθετάση του ΝΟ συμμετέχουν στη μετάδοση του σήματος της λεπτίνης, με αποτέλεσμα την αύξηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων, που απομονώθηκαν από όλα τα άτομα που μελετήσαμε. Διάγραμμα 20. Προσδιορισμός της προσκόλλησης μονοκυττάρων που επωάστηκαν πρώτα με έναν από τους αναστολείς Gö6976, GF109203X ή Lname και στη συνέχεια προστέθηκε η λεπτίνη. Ακολούθως, τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα δείγματα που επωάστηκαν με λεπτίνη στη κάθε ομάδα χωριστά. Όλοι οι αναστολείς ανέστειλαν την αύξηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων που προκαλεί η λεπτίνη στην ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους (λευκές στήλες), στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (ανοιχτό γκρι στήλες), των ατόμων με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (σκούρο γκρι στήλες) και στο σύνολο των ατόμων με παχυσαρκία (μαύρες στήλες). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και του δείγματος μετά από ταυτόχρονη επίδραση λεπτίνης και ενός αναστολέα, στη κάθε ομάδα χωριστά. Όπου mpo (μυελοπεροξειδάση) αντιπροσωπεύει το θετικό δείγμα ελέγχου του πειράματος και δεν παρουσιάστηκε διαφορά μεταξύ των πειραμάτων. Όπου: Λεπτ + Gö, υποδηλώνει λεπτίνη και Gö6976. Λεπτ+Gf, υποδηλώνει λεπτίνη και GF109203X. Λεπτ+Lname, υποδηλώνει λεπτίνη και Lname. 187

200 Αποτελέσματα Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν μεταξύ των ομάδων που μελετήθηκαν αφορούν την ΡΙ3Κ, την οξειδάση του NADPH και τον πολυμερισμό της ακτίνης. Αναλυτικότερα, η αναστολή της οξειδάσης του NADPH και του πολυμερισμού της ακτίνης ανέστειλε την προκαλούμενη από τη λεπτίνη αύξηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων μόνο στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Δηλαδή το δείγμα που επωάστηκε με DPI και λεπτίνη διέφερε σημαντικά σε σύγκριση με το δείγμα που επωάστηκε μόνο με λεπτίνη στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (p=0,35 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους, p= 0,023 για το σύνολο των ατόμων με παχυσαρκία, p=0,24 για τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη, ενώ για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη p=0,028). Ανάλογο αποτέλεσμα προέκυψε από τη σύγκριση του δείγματος που επωάστηκε με cytochalasin D και λεπτίνη με το δείγμα που επωάστηκε μόνο με λεπτίνη (p=0,17 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους, p= 0,008 για το σύνολο των ατόμων με παχυσαρκία, p=0,12 για τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη, ενώ για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη p=0,028). Το συγκεκριμένο δείγμα διέφερε σημαντικά (p=0,014) μεταξύ των ατόμων με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη και των ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη καθώς και μεταξύ των ατόμων φυσιολογικού βάρους και των ατόμων με παχυσαρκία (p=0,048) (Διάγραμμα 21). Συμπερασματικά, η αναστολή του πολυμερισμού της ακτίνης εμποδίζει την αύξηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων μόνο στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη, υποδεικνύοντας ότι ο πολυμερισμός της ακτίνης διαδραματίζει διαφορετικό ρόλο στην ομάδα αυτή. 188

201 Αποτελέσματα Διάγραμμα 21. Προσδιορισμός της προσκόλλησης μονοκυττάρων που επωάστηκαν πρώτα με έναν από τους αναστολείς DPI ή Cytochalasin D και στη συνέχεια προστέθηκε η λεπτίνη. Ακολούθως, τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα δείγματα που επωάστηκαν με λεπτίνη στη κάθε ομάδα χωριστά. Οι αναστολείς ανέστειλαν την αύξηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων που προκαλεί η λεπτίνη μόνο στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (σκούρο γκρι στήλες) και στο σύνολο των ατόμων με παχυσαρκία (μαύρες στήλες). Τα άτομα φυσιολογικού βάρους απεικονίζονται ως λευκές στήλες και η ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη ως ανοιχτό γκρι στήλες. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και του δείγματος μετά από ταυτόχρονη επίδραση λεπτίνης και ενός αναστολέα, στη κάθε ομάδα χωριστά. Όπου mpo (μυελοπεροξειδάση) αντιπροσωπεύει το θετικό δείγμα ελέγχου του πειράματος και δεν παρουσιάστηκε διαφορά μεταξύ των πειραμάτων. Όπου Λεπτ+DPI, υποδηλώνει λεπτίνη και DPI. Λεπτ+CytD, υποδηλώνει λεπτίνη και Cytochalasin D. Μία ακόμη διαφορά που παρατηρήθηκε μεταξύ των ομάδων που μελετήθηκαν αφορά την ΡΙ3Κ, η οποία συμμετέχει στην οδό μετάδοσης του σήματος της λεπτίνης προς τον ΝΗΕ1 και απώτερο σκοπό την αύξηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων, μόνο στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από τα άτομα φυσιολογικού βάρους και τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Ειδικότερα, το δείγμα που επωάστηκε με wortmannin και λεπτίνη διέφερε σημαντικά σε σύγκριση με το δείγμα που επωάστηκε μόνο με λεπτίνη στα άτομα φυσιολογικού βάρους και στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη, ενώ είναι οριακά σημαντική η διαφορά στα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (p=0,042 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους, p= 0,006 για το σύνολο των ατόμων με παχυσαρκία, p=0,068 για τα άτομα με παχυσαρκία και 189

202 Αποτελέσματα ευαισθησία στην ινσουλίνη και p=0,046 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη) (Διάγραμμα 22). Διάγραμμα 22. Προσδιορισμός της προσκόλλησης μονοκυττάρων που επωάστηκαν πρώτα με wortmannin και στη συνέχεια προστέθηκε η λεπτίνη. Ακολούθως, τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα δείγματα που επωάστηκαν με λεπτίνη στη κάθε ομάδα χωριστά. Ο αναστολέας ανέστειλε την αύξηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων που προκαλεί η λεπτίνη στην ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους (λευκές στήλες), των ατόμων με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (σκούρο γκρι στήλες) και στο σύνολο των ατόμων με παχυσαρκία (μαύρες στήλες). Η ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη απεικονίζεται ως ανοιχτό γκρι στήλες. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και του δείγματος μετά από ταυτόχρονη επίδραση λεπτίνης και wortmannin, στη κάθε ομάδα χωριστά. Όπου mpo (μυελοπεροξειδάση) αντιπροσωπεύει το θετικό δείγμα ελέγχου του πειράματος και δεν παρουσιάστηκε διαφορά μεταξύ των πειραμάτων. Όπου Λεπτ+Wort, υποδηλώνει λεπτίνη και wortmannin. Τέλος, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ της ευαισθησίας στην ινσουλίνη και τις αλλαγές της προσκόλλησης των μονοκυττάρων που προηγουμένως επωάστηκαν με κάποιο αναστολέα και στη συνέχεια επέδρασε η λεπτίνη. Οι συσχετίσεις που επιβεβαιώθηκαν μεταξύ της ευαισθησίας στην ινσουλίνη που εκφράστηκε ως Μ/Ι (mmol min 1 nmol 1 ml 1 ) αφορούν τα δείγματα που επωάστηκαν με λεπτίνη και Lname (Spearman s correlation, rho=0,524, p=0,018), με λεπτίνη και DPI (Spearman s correlation, rho=0,735, p<0,001), με λεπτίνη και Cytochalasin D (Spearman s correlation, rho=0,456, p=0,043). Επιπλέον, επιβεβαιώθηκαν οι συσχετίσεις μεταξύ της ευαισθησίας στην ινσουλίνη που εκφράστηκε ως Μ bw (mg kg 1 min 1 ) και των δειγμάτων που επωάστηκαν με λεπτίνη και wortmannin (Spearman s correlation, rho=0,463, p=0,04), με λεπτίνη και Cytochalasin D (Spearman s correlation, rho=0,591, 190

203 Αποτελέσματα p=0,006). Τέλος, βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ της ευαισθησίας στην ινσουλίνη που εκφράστηκε ως Μ σε συνάρτηση με την επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) και των δειγμάτων που επωάστηκαν με λεπτίνη και Cytochalasin D (Spearman s correlation, rho=0,524, p=0,018) (Πίνακας 14). Πίνακας 14. Συσχετίσεις μεταξύ διαφόρων δεικτών της ευαισθησίας στην ινσουλίνη, όπως προσδιορίστηκε με τον ευγλυκαιμικό υπερινσουλιναιμικό αποκλεισμό, και των αλλαγών της προσκόλλησης των μονοκυττάρων μετά από ταυτόχρονη επώαση ενός αναστολέα και της λεπτίνης. Συσχέτιση Spearman μεταξύ Μ/Ι (mmol min 1 nmol 1 ml 1 ) rho p value Λεπτίνη και Lname 0,524 0,018 Λεπτίνη και DPI 0,735 <0,001 Λεπτίνη και Cytochalasin D 0,456 0,043 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Μ bw (mg kg 1 min 1 ) rho p value Λεπτίνη και wortmannin 0,463 0,04 Λεπτίνη και Cytochalasin D 0,591 0,006 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Μ επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) rho p value Λεπτίνη και Cytochalasin D 0,524 0,018 Όπως έχει ήδη προαναφερθεί, η αδρεναλίνη είναι άλλη μία ουσία που απαντάται σε υψηλές συγκεντρώσεις στη παχυσαρκία και ενεργοποιεί τον ΝΗΕ1 σύμφωνα με τα αποτελέσματα προηγούμενου πειράματος. Τέθηκε λοιπόν το ερώτημα αν η αδρεναλίνη προάγει την προσκόλληση των μονοκυττάρων, αν εμπλέκεται στη διαδικασία αυτή ο ΝΗΕ1 και αν υπάρχουν διαφορές μεταξύ των ομάδων που μελετήσαμε. Η επώαση των μονοκυττάρων με αδρεναλίνη αύξησε την προσκόλληση τους στην ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους (p=0,008), στο σύνολο των ατόμων με παχυσαρκία (p=0,03), και στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (p<0,001) ενώ στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη η αύξηση δεν ήταν σημαντική (p>0,1) (Διάγραμμα 23). Η ποσοστιαία αύξηση στην προσκόλληση των μονοκυττάρων που απομονώθηκαν από τα άτομα φυσιολογικού βάρους (από 0,299±0,03 σε 191

204 Αποτελέσματα 0,34±0,05) ήταν σημαντικά (p=0,013) υψηλότερη σε σύγκριση με την αύξηση που παρατηρήθηκε στα μονοκύτταρα των ατόμων με παχυσαρκία (από 0,3196±0,05 σε 0,344±0,04). Διάγραμμα 23. Προσδιορισμός της προσκόλλησης μονοκυττάρων που επωάστηκαν με αδρεναλίνη. Η αδρεναλίνη αυξάνει την προσκόλληση των μονοκυττάρων σε αυτά που απομονώθηκαν από τα υγιή άτομα φυσιολογικού βάρους (λευκές στήλες), από τα άτομα με παχυσαρκία (μαύρες στήλες) και τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (σκούρο γκρι στήλες). Τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη απεικονίζονται με ανοιχτό γκρι. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου **, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος ελέγχου (control) και του δείγματος μετά από επίδραση της αδρεναλίνης στη κάθε ομάδα χωριστά. Όπου mpo (μυελοπεροξειδάση) αντιπροσωπεύει το θετικό δείγμα ελέγχου του πειράματος και δεν παρουσιάστηκε διαφορά μεταξύ των πειραμάτων. Ακολούθως ελέγχθηκε η συμμετοχή του ΝΗΕ1 στην αύξηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων που προκαλείται με την επίδραση της αδρεναλίνης. Για το λόγο αυτό, επαναλήφθηκε το πείραμα μετά την επώαση των μονοκυττάρων με cariporide, γνωστό αναστολέα του ΝΗΕ1. Το αποτέλεσμα ήταν να ανασταλεί η προκαλούμενη από την αδρεναλίνη αύξηση της προσκόλλησης των μονοκυττάρων στην ομάδα ατόμων φυσιολογικού βάρους και στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη, υποδεικνύοντας ότι η αύξηση της προσκόλλησης μεσολαβείται από τον ΝΗΕ1 στις ομάδες αυτές. Ειδικότερα, το δείγμα που επωάστηκε πρώτα με cariporide και μετά προστέθηκε η αδρεναλίνη διέφερε σημαντικά από το δείγμα που επωάστηκε μόνο με αδρεναλίνη στην κάθε ομάδα χωριστά 192

205 Αποτελέσματα (p=0,01 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους και p=0,039 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη). Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και στο σύνολο των ατόμων με παχυσαρκία. Διάγραμμα 24. Προσδιορισμός της προσκόλλησης μονοκυττάρων που επωάστηκαν πρώτα με cariporide και μετά προστέθηκε η αδρεναλίνη. Η αδρεναλίνη δεν αύξησε την προσκόλληση των μονοκυττάρων σε αυτά που απομονώθηκαν από τα υγιή άτομα φυσιολογικού βάρους (λευκές στήλες), από τα άτομα με παχυσαρκία (μαύρες στήλες) και τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (σκούρο γκρι στήλες). Τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη απεικονίζονται με ανοιχτό γκρι. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος της αδρεναλίνης και του δείγματος με την ταυτόχρονη επίδραση του cariporide και της αδρεναλίνης στη κάθε ομάδα χωριστά. Όπου mpo (μυελοπεροξειδάση) αντιπροσωπεύει το θετικό δείγμα ελέγχου του πειράματος και δεν παρουσιάστηκε διαφορά μεταξύ των πειραμάτων. Όπου Αδρεν+Cari, υποδηλώνει αδρεναλίνη και cariporide. Τέλος, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ της προσκόλλησης των μονοκυττάρων που επωάστηκαν ταυτόχρονα με cariporide και αδρεναλίνη και της ινσουλινοευαισθησίας. Η συσχέτιση που επιβεβαιώθηκε αφορά τον δείκτη της ινσουλινοευαισθησίας Μ/Ι (mmol min 1 nmol 1 ml 1 ) (Σχήμα 6). 193

206 Αποτελέσματα Σχήμα 6. Απεικόνιση της θετικής συσχέτισης μεταξύ της προσκόλλησης των μονοκυττάρων που επωάστηκαν πρώτα με cariporide και μετά προστέθηκε η αδρεναλίνη και του δείκτη της ινσουλινοευαισθησίας Μ/Ι (mmol min 1 nmol 1 ml 1 ). Στη συνέχεια, μελετήθηκε η οδός μετάδοσης του σήματος της αδρεναλίνης προς τον ΝΗΕ1 με τη χρήση αναστολέων γνωστών σηματοδοτικών μορίων και συγκρίθηκαν οι ομάδες των ατόμων μεταξύ τους για να διαπιστωθεί αν συμμετέχουν τα ίδια σηματοδοτικά μόρια σε όλα τα άτομα. Όπως αποδείχθηκε από το προηγούμενο πείραμα, η αδρεναλίνη μέσω ενεργοποίησης του ΝΗΕ1, αυξάνει την προσκόλληση των μονοκυττάρων που απομονώθηκαν από τα άτομα φυσιολογικού βάρους και τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Η οδός μετάδοσης του σήματος της αδρεναλίνης προς τον ΝΗΕ1 χρησιμοποιεί όλες τις ισομορφές της PKC, την οξειδάση του NADPH, τη συνθετάση του ΝΟ και τον πολυμερισμό της ακτίνης, ενώ δεν χρησιμοποιεί την ΡΙ3Κ τόσο στα άτομα φυσιολογικού βάρους όσο και στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Αναλυτικότερα, το δείγμα που επωάστηκε με αδρεναλίνη μόνο παρουσίασε σημαντικά μεγαλύτερη προσκόλληση των μονοκυττάρων σε σύγκριση με το δείγμα που επωάστηκε πρώτα με έναν από τους αναστολείς GF109203X (p=0,022 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους και p=0,037 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη), Lname (p=0,005 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους και p=0,03 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη), DPI (p=0,024 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους και p=0,025 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη) ή Cytochalasin D (p=0,02 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους και p=0,042 για τα άτομα με 194

207 Αποτελέσματα παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη) και μετά προστέθηκε η αδρεναλίνη, ενώ δεν ήταν σημαντική η διαφορά όταν προστέθηκε η wortmannin (p=0,062 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους και p=0,076 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη) (Διάγραμμα 25). Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν μεταξύ των ατόμων φυσιολογικού βάρους και των ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη αφορούν όλα τα σηματοδοτικά μόρια που ελέγξαμε. Δηλαδή, η PKC, η συνθετάση του ΝΟ, η οξειδάση του NADPH, η ΡΙ3Κ, ο πολυμερισμός της ακτίνης συμμετέχουν στη μετάδοση του σήματος της αδρεναλίνης προς τον ΝΗΕ1 στα άτομα φυσιολογικού βάρους, ενώ δεν συμμετέχουν στα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Μία επιπλέον διαφορά που παρατηρήθηκε μεταξύ των ατόμων φυσιολογικού βάρους και αυτών με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη αφορά τον αναστολέα Gö6976. Ειδικότερα, το δείγμα που επωάστηκε με αδρεναλίνη μόνο παρουσίασε σημαντικά μεγαλύτερη προσκόλληση των μονοκυττάρων σε σύγκριση με το δείγμα που επωάστηκε πρώτα με Gö6976 μόνο στα άτομα φυσιολογικού βάρους (p=0,008 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους και p=0,8 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη), υποδεικνύοντας ότι οι κλασικές ισομορφές της PKC συμμετέχουν στη μετάδοση του σήματος της αδρεναλίνης μόνο στα άτομα φυσιολογικού βάρους και όχι στα παχύσαρκα άτομα με ή χωρίς αντίσταση στην ινσουλίνη (Διάγραμμα 26). 195

208 Αποτελέσματα Διάγραμμα 25. Προσδιορισμός της προσκόλλησης μονοκυττάρων που επωάστηκαν με αδρεναλίνη και έναν από τους ακόλουθους αναστολείς GF109203X (αναστολέας όλων των ισομορφών της PKC), Lname (αναστολέας της συνθετάσης του ΝΟ), DPI (αναστολέας της NADPH οξειδάσης), wortmannin (αναστολέας της PI3K), Cytochalasin D (αναστολέας του πολυμερισμού της ακτίνης). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν την ομάδα ελέγχου (άτομα φυσιολογικού βάρους) (Α). Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (Β). Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (Γ). Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική (p<0,05) διαφορά μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με αδρεναλίνη και του δείγματος που επωάστηκε αρχικά με κάποιο 196

209 Αποτελέσματα αναστολέα και μετά προστέθηκε η αδρεναλίνη. Όπου, Αδρεν+Gf, υποδηλώνει αδρεναλίνη και GF109203X. Αδρεν+Lname, υποδηλώνει αδρεναλίνη και Lname. Αδρεν+DPI, υποδηλώνει αδρεναλίνη και DPI. Αδρεν+Wort, υποδηλώνει αδρεναλίνη και wortmannin. Αδρεν+CytD, υποδηλώνει αδρεναλίνη και Cytochalasin D. Όπου mpo (μυελοπεροξειδάση) αντιπροσωπεύει το θετικό δείγμα ελέγχου του πειράματος και δεν παρουσιάστηκε διαφορά μεταξύ των πειραμάτων. Διάγραμμα 26. Προσδιορισμός της προσκόλλησης μονοκυττάρων που επωάστηκαν με αδρεναλίνη και Gö6976. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν την ομάδα ελέγχου (άτομα φυσιολογικού βάρους). Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική (p<0,05) διαφορά μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με αδρεναλίνη και του δείγματος που επωάστηκε αρχικά με Gö6976 και μετά προστέθηκε η αδρεναλίνη. Όπου, Αδρεν+Gö, υποδηλώνει αδρεναλίνη και Gö6976. Όπου mpo (μυελοπεροξειδάση) αντιπροσωπεύει το θετικό δείγμα ελέγχου του πειράματος και δεν παρουσιάστηκε διαφορά μεταξύ των πειραμάτων. Τέλος, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ της ευαισθησίας στην ινσουλίνη και της προσκόλλησης των μονοκυττάρων που επωάστηκαν πρώτα με κάποιο αναστολέα γνωστού σηματοδοτικού μορίου και μετά την προσθήκη αδρεναλίνης. Το αποτέλεσμα ήταν, η επιβεβαίωση της συσχέτισης μεταξύ της προσκόλλησης του δείγματος που επωάστηκε με αδρεναλίνη και Gö6976 και της ινσουλινοευαισθησίας, η οποία εκφράστηκε ως Μ bw (mg Kg 1 min 1 ) (Spearman s correlation, rho= 0,482, p=0,031), M/I (mmol min 1 nmol 1 ml 1 ) (Spearman s correlation, rho= 0,45, p=0,047), MCR bw (ml Kg 1 min 1 ) 197

210 Αποτελέσματα (Spearman s correlation, rho= 0,574, p=0,008) και MCR σε συνάρτηση με την επιφάνεια σώματος (ml m 2 min 1 ) (Spearman s correlation, rho= 0,54, p=0,014). Επιπλέον, παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας που εκφράστηκε ως M/I (mmol min 1 nmol 1 ml 1 ) με τα δείγματα που επωάστηκαν με αδρεναλίνη και έναν από τους παρακάτω αναστολείς: GF109203X (Spearman s correlation, rho=0,533, p=0,016), Lname (Spearman s correlation, rho=0,795, p<0,001), DPI (Spearman s correlation, rho=0,474, p=0,035), wortmannin (Spearman s correlation, rho=0,459, p=0,042), Cytochalasin D (Spearman s correlation, rho=0,46, p=0,042) και cariporide (Spearman s correlation, rho=0,718, p<0,001) (Πίνακας 15). Πίνακας 15. Συσχετίσεις μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας που εκφράστηκε ως M/I (mmol min 1 nmol 1 ml 1 ), Μ bw (mg kg 1 min 1 ), MCR bw (ml kg 1 min 1 ), MCR επιφάνεια σώματος (ml m 2 min 1 ) και της προσκόλλησης των μονοκυττάρων που επωάστηκαν με έναν από τους αναστολείς Gö6976 (αναστολέας των κλασικών ισομορφών της PKC), GF109203X (αναστολέας όλων των ισομορφών της PKC), Lname (αναστολέας της συνθετάσης του ΝΟ), DPI (αναστολέας της οξειδάσης του NADPH), wortmannin (αναστολέας της ΡΙ3Κ) και Cytochalasin D (αναστολέας του πολυμερισμού της ακτίνης) και στη συνέχεια προστέθηκε αδρεναλίνη. Συσχέτιση Spearman μεταξύ Μ/Ι (mmol min 1 nmol 1 ml 1 ) rho p value Αδρεναλίνη και Gö6976 0,45 0,047 Αδρεναλίνη και GF109203X 0,533 0,006 Αδρεναλίνη και Lname 0,795 <0,001 Αδρεναλίνη και DPI 0,474 0,035 Αδρεναλίνη και wortmannin 0,459 0,042 Αδρεναλίνη και Cytochalasin D 0,46 0,042 Αδρεναλίνη και cariporide 0,718 <0,001 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Αδρεναλίνη και Gö6976 rho p value Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,482 0,031 MCR bw (ml kg 1 min 1 ) 0,574 0,008 MCR επιφάνεια σώματος (ml m 2 min 1 ) 0,54 0,

211 Αποτελέσματα 8. Μετανάστευση μονοκυττάρων διαμέσου υποστρώματος λαμινίνης 1 Κατά τη διαδικασία της αθηρωμάτωσης, τα μονοκύτταρα μετά την προσκόλλησή τους στο ενδοθήλιο μεταναστεύουν στον υπενδοθηλιακό χώρο. Στην επόμενη φάση της μελέτης, προσδιορίστηκε η μετανάστευση των μονοκυττάρων διαμέσου του υποστρώματος της λαμινίνης 1 με την επίδραση της λεπτίνης και της αδρεναλίνης και διερευνήθηκε ο ρόλος του ΝΗΕ1 στη διαδικασία αυτή. Τέλος, μελετήθηκε η συμμετοχή του πολυμερισμού της ακτίνης στη διαδικασία αυτή. Στο συγκεκριμένο πείραμα χρησιμοποιήθηκε ο αναστολέας του πολυμερισμού της ακτίνης (Cytochalasin D) διότι τα αποτελέσματα των προηγούμενων πειραμάτων υποδεικνύουν ότι διαδραματίζει διαφορετικό ρόλο μεταξύ των ομάδων που μελετάμε. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε ο αγωνιστής των PPARγ, η ροσιγλιταζόνη με σκοπό να ελεγχθεί ο πιθανός προστατευτικός ρόλος της στο συγκεκριμένο στάδιο της αθηρωμάτωσης. Η μετανάστευση των μονοκυττάρων δεν διαφέρει μεταξύ των ατόμων φυσιολογικού βάρους και των παχύσαρκων ατόμων με ή χωρίς αντίσταση στην ινσουλίνη (one way ANOVA, p>0,1). Η επώαση των μονοκυττάρων με λεπτίνη αυξάνει την μετανάστευση των μονοκυττάρων σε όλες τις ομάδες. Αναλυτικότερα, το δείγμα που επωάστηκε με λεπτίνη παρουσίασε μετανάστευση περισσότερων μονοκυττάρων σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου, στην ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους (p=0,046), στα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (p=0,028) και τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (p=0,003). Η ποσοστιαία αύξηση της μετανάστευσης δεν διέφερε μεταξύ των υπο μελέτη ομάδων (p>0,1) (Διάγραμμα 27). 199

212 Αποτελέσματα Διάγραμμα 27. Προσδιορισμός της μετανάστευσης μονοκυττάρων που επωάστηκαν με λεπτίνη. Η ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους απεικονίζονται με λευκές στήλες, τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη με ανοιχτό γκρι και τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη με σκούρο γκρι. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου **, παρατηρήθηκε σημαντική (p<0,05) μεταξύ του δείγματος ελέγχου (control) και του δείγματος μετά από επίδραση της λεπτίνης σε κάθε ομάδα χωριστά. Στη συνέχεια, επαναλήφθηκε το πείραμα μετά την επώαση των μονοκυττάρων με cariporide, τον αναστολέα του ΝΗΕ1 για να ελεγχθεί αν η αύξηση της μετανάστευσης που προκλήθηκε από τη λεπτίνη μεσολαβείται από τον ΝΗΕ1. Αξίζει να σημειωθεί ότι η ενεργοποίηση του ΝΗΕ1 από τη λεπτίνη αποδείχθηκε σε προηγούμενο πείραμα. Η επώαση των μονοκυττάρων με cariporide αναστέλλει την προκαλούμενη από τη λεπτίνη αύξηση της μετανάστευσης τους, στα άτομα φυσιολογικού βάρους (p=0,028) και στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (p=0,002). Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι ο ΝΗΕ1 διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στη διαδικασία της μετανάστευσης των μονοκυττάρων μόνο στις δύο αυτές ομάδες ατόμων και όχι στην ομάδα με παχυσαρκία και ινσουλινοευαισθησία (Διάγραμμα 28). 200

213 Αποτελέσματα Διάγραμμα 28. Προσδιορισμός της μετανάστευσης μονοκυττάρων που επωάστηκαν με λεπτίνη και cariporide. Η ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους απεικονίζονται με λευκές στήλες, τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη με ανοιχτό γκρι και τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη με σκούρο γκρι. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου, * σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και του δείγματος που επωάστηκε αρχικά με cariporide και μετά προστέθηκε η λεπτίνη. Όπου, Λεπτ+Carip: υποδηλώνει λεπτίνη και cariporide. Ακολούθως, μελετήθηκε η συμμετοχή του πολυμερισμού της ακτίνης στη διαδικασία της μετανάστευσης όταν αυτή προάγεται με λεπτίνη. Τα μονοκύτταρα επωάστηκαν αρχικά με Cytochalasin D και στη συνέχεια προστέθηκε η λεπτίνη. Τα δείγματα αυτά συγκρίθηκαν με τα δείγματα που επωάστηκαν με λεπτίνη μόνο, σε κάθε ομάδα χωριστά. Το αποτέλεσμα της σύγκρισης ήταν σημαντικό μόνο στην ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους (p=0,002) ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (p=0,1) και στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (p=0,5) (Διάγραμμα 29). 201

214 Αποτελέσματα Διάγραμμα 29. Προσδιορισμός της μετανάστευσης μονοκυττάρων που επωάστηκαν με λεπτίνη και Cytochalasin D. Η ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους απεικονίζονται με λευκές στήλες, τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη με ανοιχτό γκρι και τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη με σκούρο γκρι. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου, * σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και του δείγματος που επωάστηκε αρχικά με Cytochalasin D και μετά προστέθηκε η λεπτίνη. Όπου, Λεπτ+Cyto: υποδηλώνει λεπτίνη και Cytochalasin D. Στη συνέχεια, ελέγχθηκε ο ρόλος της ροσιγλιταζόνης στη μετανάστευση των μονοκυττάρων. Τα μονοκύτταρα επωάστηκαν πρώτα με ροσιγλιταζόνη και μετά προστέθηκε η λεπτίνη. Τα δείγματα αυτά συγκρίθηκαν με τα δείγματα που επωάστηκαν με λεπτίνη μόνο, σε κάθε ομάδα χωριστά. Η προσθήκη της ροσιγλιταζόνης ανέστειλε την προκαλούμενη από τη λεπτίνη αύξηση της μετανάστευσης, στην ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους (p=0,028). Αντίθετα, η μετανάστευση αυξήθηκε στα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (p=0,028). Τέλος, η ροσιγλιταζόνη δεν είχε καμία επίδραση στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (p=0,5) (Διάγραμμα 30). 202

215 Αποτελέσματα Διάγραμμα 30. Προσδιορισμός της μετανάστευσης μονοκυττάρων που επωάστηκαν με λεπτίνη και ροσιγλιταζόνη. Η ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους απεικονίζονται με λευκές στήλες, τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη με ανοιχτό γκρι και τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη με σκούρο γκρι. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου, * σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και του δείγματος που επωάστηκε αρχικά με ροσιγλιταζόνη και μετά προστέθηκε η λεπτίνη. Όπου, Λεπτ+ροσιγ: υποδηλώνει λεπτίνη και ροσιγλιταζόνη. Τέλος, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της μετανάστευσης των μονοκυττάρων που επωάστηκαν με λεπτίνη και cariporide, Cytochalasin D ή ροσιγλιταζόνη. Η συσχέτιση που επιβεβαιώθηκε ήταν μεταξύ της μετανάστευσης των μονοκυττάρων που επωάστηκαν με λεπτίνη και Cytochalasin D και της ινσουλινοευαισθησίας που εκφράστηκε ως Μ bw (mg kg 1 min 1 ) (Spearman s correlation, rho= 0,479, p=0,045), Μ επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) (Spearman s correlation, rho= 0,533, p=0,023), MCR bw (ml kg 1 min 1 ) (Spearman s correlation, rho= 0,71, p=0,001) και MCR σε συνάρτηση με την επιφάνεια σώματος (ml m 2 min 1 ) (Spearman s correlation, rho= 0,819, p<0,001) (Πίνακας 16). 203

216 Αποτελέσματα Πίνακας 16. Συσχετίσεις μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της μετανάστευσης μονοκυττάρων που επωάστηκαν με λεπτίνη και Cytochalasin D. Συσχέτιση Spearman μεταξύ Μετανάστευση μονοκυττάρων που επωάστηκαν με λεπτίνη και Cytochalasin D rho p value Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,479 0,045 Μ επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) 0,533 0,023 MCR bw (ml kg 1 min 1 ) 0,71 0,001 MCR επιφάνεια σώματος (ml m 2 min 1 ) 0,819 <0,001 Η αδρεναλίνη είναι μία ακόμη ορμόνη που είναι αρκετά συχνά αυξημένη στην παχυσαρκία και για το λόγο αυτό ερευνήθηκε η επίδρασή της στη μετανάστευση των μονοκυττάρων. Τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με αδρεναλίνη και στη συνέχεια η μετανάστευσή τους συγκρίθηκε με τα αντίστοιχα δείγματα για την κάθε ομάδα χωριστά. Η αδρεναλίνη δεν επηρέασε τη μετανάστευση των μονοκυττάρων σε καμία ομάδα (p>0,1) (Διάγραμμα 31). Διάγραμμα 31. Προσδιορισμός της μετανάστευσης μονοκυττάρων που επωάστηκαν με αδρεναλίνη. Η ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους απεικονίζονται με λευκές στήλες, τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη με ανοιχτό γκρι και τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη με σκούρο γκρι. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.Ε.Μ.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. 204

217 Αποτελέσματα 9. Προσδιορισμός της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων Όπως έχει ήδη αναφερθεί, κατά τη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης τα μονοκύτταρα που έχουν μεταναστεύσει στον υπενδοθηλιακό χώρο εκφράζουν τους εκκαθαριστές υποδοχείς, CD36, στην επιφάνειά τους για να φαγοκυτταρώσουν τις οξειδωμένες LDL χοληστερόλες. Στο συγκεκριμένο πείραμα μελετήθηκε η επίδραση της γλυκόζης, της ινσουλίνης, της λεπτίνης και της αδρεναλίνης στην πυκνότητα των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων. Ακολούθως, μελετήθηκε ο ρόλος του ΝΗΕ1, του πολυμερισμού της ακτίνης και των πυρηνικών υποδοχέων PPARγ στη διαδικασία αυτή. Η πυκνότητα των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων είναι παρόμοια στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από τα άτομα φυσιολογικού βάρους και τα άτομα με παχυσαρκία με ή χωρίς αντίσταση στην ινσουλίνη (p>0,1). Μεταξύ των ομάδων όμως, διαπιστώθηκε διαφορά όταν προστέθηκε η γλυκόζη. Η επώαση των μονοκυττάρων με γλυκόζη αύξησε την πυκνότητα των υποδοχέων CD36 στην επιφάνειά τους σε σύγκριση με μονοκύτταρα που δεν επωάστηκαν παρουσία της γλυκόζης, μόνο στα άτομα φυσιολογικού βάρους (p=0,035). και τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη(p=0,002). (Διάγραμμα 32). Η ποσοστιαία αύξηση της πυκνότητας των CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων δεν διέφερε μεταξύ των ομάδων (p>0,1). Αντίθετα, στα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη δεν παρατηρήθηκε αύξηση της πυκνότητας των CD36 όταν προστέθηκε η γλυκόζη και η πυκνότητα των CD36 ήταν σημαντικά μικρότερη σε σύγκριση τόσο με τα άτομα φυσιολογικού βάρους (p=0,022) όσο και με τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (p=0,005). 205

218 Αποτελέσματα Διάγραμμα 32. Προσδιορισμός της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με γλυκόζη. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι μαύρες στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου **, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με γλυκόζη και του δείγματος ελέγχου. Στη συνέχεια, μελετήθηκε ο ρόλος του ΝΗΕ1 στη διαδικασία της προαγωγής της έκφρασης των επιφανειακών υποδοχέων CD36 μετά από επώαση με υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης. Αξίζει να σημειωθεί ότι σε προηγούμενο πείραμα αποδείχθηκε ότι η γλυκόζη ενεργοποιεί τον ΝΗΕ1. Επαναλήφθηκε λοιπόν το πείραμα αφού πρώτα επωάστηκαν τα μονοκύτταρα με τον αναστολέα του ΝΗΕ1, το cariporide, και μετά προστέθηκε η γλυκόζη. Το αποτέλεσμα ήταν η αναστολή της προκαλούμενης από τη γλυκόζη αύξησης των CD36 στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Αντίθετα, στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από τα παχύσαρκα άτομα η πυκνότητα των CD36 αυξήθηκε. Η περαιτέρω ανάλυση στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία, έδειξε ότι η παρατηρούμενη αύξηση της πυκνότητας των CD36 οφείλονταν αποκλειστικά στην αύξηση των CD36 στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη και μάλιστα διάφερε σημαντικά (p<0,001) τόσο από την ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους όσο και από τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. 206

219 Αποτελέσματα Διάγραμμα 33. Προσδιορισμός της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με γλυκόζη και cariporide. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι μαύρες στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με γλυκόζη και cariporide και του δείγματος που επωάστηκε με γλυκόζη μόνο. Όπου, Γλυκ+Cari, υποδηλώνει γλυκόζη και cariporide. Ακολούθως, μελετήθηκε ο ρόλος της ροσιγλιταζόνης, ενός αγωνιστή των πυρηνικών υποδοχέων PPARγ, στη διαδικασία της έκφρασης των επιφανειακών υποδοχέων CD36. Για το σκοπό αυτό, τα μονοκύτταρα επωάστηκαν πρώτα με ροσιγλιταζόνη και μετά προστέθηκε η γλυκόζη. Η ροσιγλιταζόνη δεν ανέστειλε την προκαλούμενη από τη γλυκόζη αύξηση της πυκνότητας των CD36 σε καμία ομάδα. Αξίζει να αναφερθεί ότι στην ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους και τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη η πυκνότητα των CD36 ήταν μικρότερη σε σύγκριση με τα δείγματα που επωάστηκαν με γλυκόζη χωρίς όμως να είναι σημαντική η διαφορά (p=0,075 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους και p=0,074 για τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (Διάγραμμα 34). 207

220 Αποτελέσματα Διάγραμμα 34. Ο προσδιορισμός της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με γλυκόζη και ροσιγλιταζόνη, έδειξε ότι η ροσιγλιταζόνη δεν επιδρά στην έκφραση των CD36. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι μαύρες στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου, Γλυκ+ροσιγ, υποδηλώνει γλυκόζη και ροσιγλιταζόνη. Τέλος, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της πυκνότητας των CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν είτε με γλυκόζη μόνο είτε με cariporide ή ροσιγλιταζόνη ταυτόχρονα με τη γλυκόζη. Επιβεβαιώθηκε αρνητική ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και των δειγμάτων που επωάστηκαν αρχικά με τον εκλεκτικό αναστολέα του ΝΗΕ1, cariporide ή τη ροσιγλιταζόνη, που είναι αγωνιστής των πυρηνικών υποδοχέων PPARγ και μετά προστέθηκε η γλυκόζη (Πίνακας 17). 208

221 Αποτελέσματα Πίνακας 17. Συσχέτιση Spearman μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας όπως προσδιορίστηκε με τον ευγλυκαιμικό υπερινσουλιναιμικό αποκλεισμό και της πυκνότητας των CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων στο σύνολο των ατόμων που μελετήθηκαν. Συσχέτιση Spearman μεταξύ Πυκνότητα CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με Γλυκόζη και cariporide rho p value M (mmol min 1 ) 0,712 <0,001 Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,663 <0,001 Μ επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) 0,72 <0,001 MCR bw (ml kg 1 min 1 ) 0,72 <0,001 MCR επιφάνεια σώματος (ml m 2 min 1 ) 0,565 <0,001 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Πυκνότητα CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με Γλυκόζη και ροσιγλιταζόνη rho p value M (mmol min 1 ) 0,351 0,036 Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,472 0,002 Μ επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) 0,398 0,016 Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η ινσουλίνη είναι μία ορμόνη που συχνά βρίσκεται αυξημένη σε καταστάσεις όπως η παχυσαρκία και η αντίσταση στην ινσουλίνη. Μελετήθηκε λοιπόν, η επίδραση της ινσουλίνης στην έκφραση των υποδοχέων CD36 στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από άτομα φυσιολογικού βάρους και από παχύσαρκα άτομα με ή χωρίς αντίσταση στην ινσουλίνη. Για το σκοπό αυτό, επωάστηκαν τα μονοκύτταρα με ινσουλίνη και συγκρίθηκε η πυκνότητα των CD36 στην επιφάνειά τους, με αυτή των μονοκυττάρων, στα οποία δεν επέδρασε καμία ορμόνη. Το αποτέλεσμα ήταν να αυξηθεί η πυκνότητα των CD36 στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από τα άτομα φυσιολογικού βάρους (p=0,004) και τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (p=0,006). Ενώ, στα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη δεν εμφάνισε αύξηση (p=0,8). Η ποσοστιαία αύξηση της πυκνότητας των CD36 στα άτομα φυσιολογικού βάρους ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε σύγκριση με αυτή των ατόμων με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (p=0,002) (Διάγραμμα 35). 209

222 Αποτελέσματα Διάγραμμα 35. Προσδιορισμός της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με ινσουλίνη. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι μαύρες στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου **, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με ινσουλίνη και του δείγματος ελέγχου. Ακολούθως, μελετήθηκε ο ρόλος του ΝΗΕ1 στην αύξηση της πυκνότητας των επιφανειακών υποδοχέων CD36. Για το σκοπό αυτό, το πείραμα επαναλήφθηκε αφού προηγούμενα τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με το cariporide, το οποίο αναστέλλει τον ΝΗΕ1. Το cariporide ανέστειλε την προκαλούμενη από την ινσουλίνη αύξηση της πυκνότητας των CD36 μόνο στην ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους (p=0,002). Αντίθετα, στα άτομα με παχυσαρκία η πυκνότητα των CD36 ήταν παρόμοια με αυτή των μονοκυττάρων που επωάστηκαν με ινσουλίνη μόνο (p>0,1) (Διάγραμμα 36). Συμπερασματικά, η ινσουλίνη αυξάνει τη πυκνότητα των CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων των ατόμων φυσιολογικού βάρους μέσω ενεργοποίησης του ΝΗΕ1, ενώ στα άτομα με παχυσαρκία εμπλέκεται κάποιος άλλος μηχανισμός. 210

223 Αποτελέσματα Διάγραμμα 36. Προσδιορισμός της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με ινσουλίνη και cariporide. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι μαύρες στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με ινσουλίνη και cariporide και του δείγματος που επωάστηκε με ινσουλίνη μόνο. Όπου, Ινσουλ+Car, υποδηλώνει ινσουλίνη και cariporide. Στη συνέχεια, το πείραμα επαναλήφθηκε αφού πρώτα τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με ροσιγλιταζόνη για να μελετηθεί ο ρόλος της στη διαδικασία της έκφρασης των CD36 υποδοχέων των μονοκυττάρων. Η ροσιγλιταζόνη δεν φαίνεται να έχει κάποια επίδραση στη διαδικασία αυτή. Δηλαδή, το δείγμα που επωάστηκε με ροσιγλιταζόνη πρώτα και μετά προστέθηκε η ινσουλίνη έχει παρόμοια πυκνότητα των CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων με το αντίστοιχο δείγμα που επωάστηκε με ινσουλίνη μόνο σε όλες τις υπο μελέτη ομάδες (Διάγραμμα 37). 211

224 Αποτελέσματα Διάγραμμα 37. Προσδιορισμός της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με ινσουλίνη και ροσιγλιταζόνη. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι μαύρες στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με ινσουλίνη και ροσιγλιταζόνη και του δείγματος που επωάστηκε με ινσουλίνη μόνο. Όπου, Ινσουλ+ροσιγ, υποδηλώνει ινσουλίνη και ροσιγλιταζόνη. Τέλος, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της πυκνότητας των CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν είτε με ινσουλίνη μόνο, είτε με cariporide ή ροσιγλιταζόνη ταυτόχρονα με την ινσουλίνη. Επιβεβαιώθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της πυκνότητας των CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με ινσουλίνη. Αντίθετα, διαπιστώθηκε αρνητική ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και των δειγμάτων που επωάστηκαν αρχικά είτε με τον εκλεκτικό αναστολέα του ΝΗΕ1, cariporide είτε με τη ροσιγλιταζόνη, που είναι αγωνιστής των πυρηνικών υποδοχέων PPARγ και μετά προστέθηκε η ινσουλίνη (Πίνακας 18). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα αυτά, όσο αυξάνεται η ινσουλινοευαισθησία τόσο αυξάνεται η πυκνότητα των CD36 στα μονοκύτταρα υπό την επίδραση της ινσουλίνης. Αντίθετα, αναστέλλοντας τον ΝΗΕ1 ή ενεργοποιώντας τους PPARγ τότε όσο αυξάνεται η αντίσταση στην ινσουλίνη τόσο αυξάνεται και η 212

225 Αποτελέσματα πυκνότητα των CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων υπό την επίδραση της ινσουλίνης. Πίνακας 18. Συσχέτιση Spearman μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας όπως προσδιορίστηκε με τον ευγλυκαιμικό υπερινσουλιναιμικό αποκλεισμό και της πυκνότητας των CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων στο σύνολο των ατόμων που μελετήθηκαν. Συσχέτιση Spearman μεταξύ Πυκνότητα CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με Ινσουλίνη rho p value Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,336 0,03 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Πυκνότητα CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με Ινσουλίνη και cariporide rho p value M (mmol min 1 ) 0,715 <0,001 Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,371 0,026 Μ επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) 0,748 <0,001 MCR επιφάνεια σώματος (ml m 2 min 1 ) 0,727 <0,001 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Πυκνότητα CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με Ινσουλίνη και ροσιγλιταζόνη rho p value M (mmol min 1 ) 0,606 <0,001 Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,3 0,048 Μ επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) 0,727 <0,001 Η λεπτίνη συχνά είναι αυξημένη στην παχυσαρκία, όπως έχει ήδη αναφερθεί. Μελετήθηκε, λοιπόν, η επίδραση της λεπτίνης στην έκφραση των υποδοχέων CD36 στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από άτομα φυσιολογικού βάρους και άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση ή ευαισθησία στην ινσουλίνη. Η λεπτίνη αυξάνει την πυκνότητα των CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που απομονώθηκαν από άτομα φυσιολογικού βάρους (p=0,006) και από άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (p=0,02). Ενώ, δεν παρατηρήθηκε ανάλογη αύξηση στα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (Διάγραμμα 38). 213

226 Αποτελέσματα Διάγραμμα 38. Προσδιορισμός της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με λεπτίνη. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι μαύρες στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου **, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και του δείγματος ελέγχου. Ακολούθως, το πείραμα επαναλήφθηκε αφού τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με τον αναστολέα του ΝΗΕ1, cariporide για να ελεγχθεί ο ρόλος του ΝΗΕ1 στη διαδικασία αυτή. Το αποτέλεσμα ήταν να ανασταλεί η προκαλούμενη από τη λεπτίνη αύξηση της πυκνότητας των CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων που απομονώθηκαν από άτομα φυσιολογικού βάρους (p=0,001). Ενώ, δεν είχε καμία επίδραση στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη και σε αυτά με ευαισθησία στην ινσουλίνη (p>0,1) (Διάγραμμα 39). 214

227 Αποτελέσματα Διάγραμμα 39. Προσδιορισμός της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με λεπτίνη και cariporide. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι μαύρες στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και cariporide και του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη μόνο. Όπου, Λεπτ+Cari, υποδηλώνει λεπτίνη και cariporide. Ανάλογα αποτελέσματα λάβαμε όταν τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με ροσιγλιταζόνη. Αναλυτικότερα, η ροσιγλιταζόνη ανέστειλε την προκαλούμενη από τη λεπτίνη αύξηση της πυκνότητας των CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων που απομονώθηκαν από άτομα φυσιολογικού βάρους (p=0,014), ενώ δεν ανεστάλη στα παχύσαρκα άτομα με ή χωρίς αντίσταση στην ινσουλίνη (p>0,1) (Διάγραμμα 40). Τέλος, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της πυκνότητας των CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν είτε με λεπτίνη μόνο είτε με cariporide ή ροσιγλιταζόνη μαζί με τη λεπτίνη. Διαπιστώθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και των δειγμάτων που επωάστηκαν αρχικά με τη ροσιγλιταζόνη, που είναι αγωνιστής των πυρηνικών υποδοχέων PPARγ και μετά προστέθηκε η λεπτίνη (Πίνακας 19). 215

228 Αποτελέσματα Διάγραμμα 40. Προσδιορισμός της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με λεπτίνη και ροσιγλιταζόνη. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι μαύρες στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και ροσιγλιταζόνη και του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη μόνο. Όπου, Λεπτ+ροσιγ, υποδηλώνει λεπτίνη και ροσιγλιταζόνη. 216

229 Αποτελέσματα Πίνακας 19. Συσχέτιση Spearman μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας όπως προσδιορίστηκε με τον ευγλυκαιμικό υπερινσουλιναιμικό αποκλεισμό και της πυκνότητας των CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων στο σύνολο των ατόμων που μελετήθηκαν. Συσχέτιση Spearman μεταξύ Πυκνότητα CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με Λεπτίνη rho p value Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,336 0,03 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Πυκνότητα CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με Λεπτίνη και cariporide rho p value M (mmol min 1 ) 0,715 <0,001 Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,371 0,026 Μ επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) 0,748 <0,001 MCR επιφάνεια σώματος (ml m 2 min 1 ) 0,727 <0,001 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Πυκνότητα CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με Λεπτίνη και ροσιγλιταζόνη rho p value M (mmol min 1 ) 0,606 <0,001 Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,3 0,048 Μ επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) 0,727 <0,001 Το συμπαθητικό νευρικό σύστημα είναι ενεργοποιημένο, ως γνωστό, στην παχυσαρκία και η συγκέντρωση της αδρεναλίνης είναι αυξημένη. Μελετήθηκε λοιπόν, η επίδραση της αδρεναλίνης στην έκφραση των υποδοχέων CD36 στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από άτομα φυσιολογικού βάρους και από παχύσαρκα άτομα με ή χωρίς αντίσταση στην ινσουλίνη. Για το σκοπό αυτό, επωάστηκαν τα μονοκύτταρα με αδρεναλίνη και συγκρίθηκε η πυκνότητα των CD36 στην επιφάνειά τους, με αυτή των μονοκυττάρων, στα οποία δεν επέδρασε καμία ορμόνη. Το αποτέλεσμα ήταν να αυξηθεί η πυκνότητα των CD36 στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (p=0,013). Ενώ, η αύξηση που παρατηρήθηκε στα άτομα φυσιολογικού βάρους δεν ήταν σημαντική (p=0,074) όπως και στα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη δεν εμφάνισε αύξηση (p>0,1). Η ποσοστιαία αύξηση της πυκνότητας των CD36 στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε σύγκριση με αυτή των ατόμων φυσιολογικού βάρους (p<0,001) (Διάγραμμα 41). 217

230 Αποτελέσματα Διάγραμμα 41. Προσδιορισμός της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με αδρεναλίνη. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι μαύρες στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου **, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με αδρεναλίνη και του δείγματος ελέγχου. Ακολούθως, μελετήθηκε ο ρόλος του ΝΗΕ1 στη διαδικασία της προαγωγής της έκφρασης των επιφανειακών υποδοχέων CD36 μετά από επώαση με υψηλές συγκεντρώσεις αδρεναλίνης. Αξίζει να σημειωθεί ότι όπως διαπιστώσαμε σε προηγούμενο πείραμα μας η αδρεναλίνη ενεργοποιεί τον ΝΗΕ1. Επαναλήφθηκε λοιπόν το πείραμα αφού πρώτα επωάστηκαν τα μονοκύτταρα με τον αναστολέα του ΝΗΕ1, το cariporide, και μετά προστέθηκε η αδρεναλίνη. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική (p>0,1) αλλαγή στην πυκνότητα των CD36 σε όλες τις ομάδες των ατόμων που μελετήθηκαν. Ίσως είναι αξιοσημείωτο το εύρημα της αύξησης της πυκνότητας των CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που απομονώθηκαν από τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη, μολονότι το αποτέλεσμα δεν ήταν στατιστικά σημαντικό (p=0,7) (Διάγραμμα 42). 218

231 Αποτελέσματα Διάγραμμα 42. Προσδιορισμός της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με αδρεναλίνη και cariporide. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι μαύρες στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου, Αδρεν+Carip, υποδηλώνει αδρεναλίνη και cariporide. Ο ρόλος των πυρηνικών υποδοχέων PPARγ μελετήθηκε με την επώαση των μονοκυττάρων αρχικά με ροσιγλιταζόνη και μετέπειτα προσθήκη αδρεναλίνης. Το αποτέλεσμα ήταν να αυξηθεί η πυκνότητα των επιφανειακών υποδοχέων CD36 στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (p<0,001), ενώ στις άλλες δύο ομάδες παρουσίασε τάση μείωσης, χωρίς όμως να είναι σημαντική (p>0,1) (Διάγραμμα 43). 219

232 Αποτελέσματα Διάγραμμα 43. Προσδιορισμός της πυκνότητας των υποδοχέων CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με αδρεναλίνη και ροσιγλιταζόνη. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι μαύρες στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με αδρεναλίνη και ροσιγλιταζόνη και του δείγματος που επωάστηκε με αδρεναλίνη μόνο. Όπου, Αδρεν+ροσιγ, υποδηλώνει αδρεναλίνη και ροσιγλιταζόνη. Τέλος, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της πυκνότητας των CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν είτε με αδρεναλίνη μόνο, είτε με cariporide ή ροσιγλιταζόνη ταυτόχρονα με την αδρεναλίνη. Επιβεβαιώθηκε αρνητική ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της πυκνότητας των CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με αδρεναλίνη και των δειγμάτων που επωάστηκαν αρχικά είτε με cariporide είτε με ροσιγλιταζόνη και μετά προστέθηκε η αδρεναλίνη (Πίνακας 20). 220

233 Αποτελέσματα Πίνακας 20. Συσχέτιση Spearman μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας όπως προσδιορίστηκε με τον ευγλυκαιμικό υπερινσουλιναιμικό αποκλεισμό και της πυκνότητας των CD36 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων στο σύνολο των ατόμων που μελετήθηκαν. Συσχέτιση Spearman μεταξύ Πυκνότητα CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με Αδρεναλίνη rho p value M (mmol min 1 ) 0,644 <0,001 M/I (mmol min 1 nmol 1 ml 1 ) 0,475 0,003 Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,333 0,031 Μ επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) 0,482 0,002 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Πυκνότητα CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με Αδρεναλίνη και cariporide rho p value M (mmol min 1 ) 0,594 0,002 Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,516 0,003 Μ επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) 0,602 0,001 MCR επιφάνεια σώματος (ml m 2 min 1 ) 0,51 0,009 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Πυκνότητα CD36 στην επιφάνεια μονοκυττάρων που επωάστηκαν με Αδρεναλίνη και ροσιγλιταζόνη rho p value M (mmol min 1 ) 0,484 0,003 Μ επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) 0,427 0,019 MCR επιφάνεια σώματος (ml m 2 min 1 ) 0,371 0, Φαγοκυττάρωση των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από τα μονοκύτταρα Κατά τη διαδικασία της αθηροσκλήρωσης, τα μονοκύτταρα εκφράζουν στην επιφάνειά τους εκκαθαριστές υποδοχείς, όπως είναι οι CD36, και μετατρέπονται σε μακροφάγα, ικανά να φαγοκυτταρώσουν τις οξειδωμένες LDL χοληστερόλες που βρίσκονται υπενδοθηλιακά. Η επόμενη λοιπόν, αθηρογόνος ιδιότητα των μονοκυττάρων που μελετήθηκε ήταν η φαγοκυττάρωση των οξειδωμένων LDL χοληστερολών (ox LDL). Τα μονοκύτταρα απομονώθηκαν από άτομα φυσιολογικού βάρους και από άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία ή αντίσταση στην ινσουλίνη. 221

234 Αποτελέσματα Μελετήθηκε η επίδραση της γλυκόζης, της ινσουλίνης, της λεπτίνης και της αδρεναλίνης στη φαγοκυττάρωση των ox LDL από τα μονοκύτταρα καθώς και ο ρόλος του ΝΗΕ1 και των πυρηνικών υποδοχέων PPARγ στη διαδικασία αυτή. Η φαγοκυττάρωση των ox LDL από τα μονοκύτταρα δεν διέφερε μεταξύ των ατόμων που εξετάσθηκαν, και δεν σχετιζόταν με την ινσουλινοευαισθησία. Αντίθετα, όταν τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με γλυκόζη είτε για μία ώρα είτε για 3 ώρες, αυξήθηκε η φαγοκυττάρωση των ox LDL μόνο στα άτομα φυσιολογικού βάρους (p=0,037 για τη μία ώρα και p=0,032 για τις 3 ώρες). Ομοίως, παρατηρήθηκε αύξηση της φαγοκυττάρωσης των ox LDL στα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη όταν τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με γλυκόζη για μία ώρα (p=0,002), ενώ στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη παρατηρήθηκε αύξηση μετά από επώαση τριών ωρών (p=0,011). Παρατηρήθηκε λοιπόν, διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων όσον αφορά τη χρονική έναρξη της φαγοκυττάρωσης, υπέρ των ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη, ενώ τα άτομα με αντίσταση στην ινσουλίνη έχουν καθυστερημένη έναρξη της διαδικασίας. Η αύξηση της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από τα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη ήταν μεγαλύτερη σε σύγκριση με τις δύο άλλες ομάδες, όταν η επώαση με τη γλυκόζη διήρκησε μία ώρα (one way ANOVA, p=0,043 μεταξύ ατόμων φυσιολογικού βάρους και ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και p=0,001 μεταξύ ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και αυτών με αντίσταση στην ινσουλίνη). Ανάλογο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη όταν η επώαση διήρκησε τρείς ώρες (one way ANOVA, p=0,041 μεταξύ ατόμων φυσιολογικού βάρους και ατόμων με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη και p=0,003 μεταξύ ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και αυτών με αντίσταση στην ινσουλίνη) (Διάγραμμα 44). 222

235 Αποτελέσματα Διάγραμμα 44. Προσδιορισμός της φαγοκυττάρωσης των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από μονοκύτταρα που επωάστηκαν παρουσία γλυκόζης για 1 και 3 ώρες. Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου **, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με γλυκόζη και του δείγματος ελέγχου. Ακολούθως, μελετήθηκε ο ρόλος του ΝΗΕ1 στη διαδικασία της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από τα μονοκύτταρα. Για το λόγο αυτό, το πείραμα επαναλήφθηκε αφού πρώτα τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με cariporide, τον ειδικό αναστολέα του ΝΗΕ1. Η αναστολή του ΝΗΕ1 ανέστειλε την προκαλούμενη από τη γλυκόζη αύξηση της φαγοκυττάρωσης των ox LDL, τόσο στην επώαση μίας ώρας όσο και στην τρίωρη επώαση των μονοκυττάρων με γλυκόζη, στην ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους (p= 0,011 για 1h και 3h επώαση) και αυτών με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (p=0,028 για την τρίωρη επώαση, όπου και είχε παρατηρηθεί, βάσει του προηγούμενου πειράματος, η αύξηση της φαγοκυττάρωσης των ox LDL στη συγκεκριμένη ομάδα ασθενών). Αντίθετα, στα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη δεν αποδείχθηκε η συμμετοχή του ΝΗΕ1 στην αύξηση της φαγοκυττάρωσης των ox LDL μετά από την επίδραση της γλυκόζης για μία ώρα στα μονοκύτταρα αυτά (Διάγραμμα 45). 223

236 Αποτελέσματα Διάγραμμα 45. Προσδιορισμός της φαγοκυττάρωσης των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από μονοκύτταρα που επωάστηκαν παρουσία cariporide (αναστολέας του ΝΗΕ1) και γλυκόζης για 1 (1h) και 3 ώρες (3h). Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με γλυκόζη και cariporide και του δείγματος που επωάστηκε με γλυκόζη μόνο. Όπου, Γλυκ+Cari, υποδηλώνει γλυκόζη και cariporide. Η επώαση των μονοκυττάρων με ροσιγλιταζόνη που ακολουθήθηκε από την προσθήκη γλυκόζης για μία ώρα επώαση είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της προκαλούμενης από τη γλυκόζη αύξησης της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από τα μονοκύτταρα των ατόμων φυσιολογικού βάρους (p=0,005) και αυτών με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (p=0,007). Κατά την τρίωρη επώαση των μονοκυττάρων με γλυκόζη, η προσθήκη της ροσιγλιταζόνης ανέστειλε την προκαλούμενη από τη γλυκόζη αύξηση της φαγοκυττάρωσης των ox LDL και στις δύο ομάδες (p=0,012 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους και p=0,022 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη). Επιπλέον, στην ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη, η ροσιγλιταζόνη προκάλεσε αυξητική τάση στην φαγοκυττάρωση των ox LDL, αν και δεν ήταν σημαντική η αύξηση αυτή (p=0,089) (Διάγραμμα 46). Τέλος, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από μονοκύτταρα που επωάστηκαν για μία ή τρεις ώρες με γλυκόζη ή γλυκόζη και cariporide ή γλυκόζη και ροσιγλιταζόνη, οι οποίες και επιβεβαιώθηκαν (Πίνακας 21). 224

237 Αποτελέσματα Διάγραμμα 46. Προσδιορισμός της φαγοκυττάρωσης των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από μονοκύτταρα που επωάστηκαν παρουσία ροσιγλιταζόνης και γλυκόζης για 1 (1h) και 3 ώρες (3h). Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με γλυκόζη και ροσιγλιταζόνη και του δείγματος που επωάστηκε με γλυκόζη μόνο. Όπου, Γλυκ+ροσιγ: υποδηλώνει γλυκόζη και ροσιγλιταζόνη. 225

238 Αποτελέσματα Πίνακας 21. Συσχετίσεις μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από τα μονοκύτταρα. Συσχέτιση Spearman μεταξύ Φαγοκυττάρωση ox LDL από μονοκύτταρα που επωάστηκαν με Γλυκόζη για μία ώρα rho p value M (mmol min 1 ) 0,41 0,014 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Φαγοκυττάρωση ox LDL από μονοκύτταρα που επωάστηκαν με Γλυκόζη και ροσιγλιταζόνη για μία ώρα rho p value M/I (mmol min 1 nmol 1 ml 1 ) 0,417 0,006 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Φαγοκυττάρωση ox LDL από μονοκύτταρα που επωάστηκαν με Γλυκόζη για 3 ώρες rho p value Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,331 0,049 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Φαγοκυττάρωση ox LDL από μονοκύτταρα που επωάστηκαν με Γλυκόζη και cariporide για 3 ώρες rho p value M/I (mmol min 1 nmol 1 ml 1 ) 0,367 0,039 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Φαγοκυττάρωση ox LDL από μονοκύτταρα που επωάστηκαν με Γλυκόζη και ροσιγλιταζόνη για 3 ώρες rho p value Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,419 0,021 Η δεύτερη ουσία που μελετήθηκε ως επαγωγέας της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από τα μονοκύτταρα ήταν η ινσουλίνη. Τα μονοκύτταρα επωάστηκαν παρουσία ινσουλίνης για μία ώρα και αυξήθηκε η φαγοκυττάρωση των ox LDL και στις τρείς ομάδες που μελετήθηκαν (p=0,023 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους, p=0,015 για τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και p=0,027 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη). Στο πείραμα όπου τα μονοκύτταρα επωάστηκαν για τρεις ώρες, δεν παρατηρήθηκε αύξηση της φαγοκυττάρωσης των ox LDL σε καμία ομάδα. Παρατηρήθηκε, όμως, σημαντική διαφορά μεταξύ της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από τα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από 226

239 Αποτελέσματα τα άτομα φυσιολογικού βάρους και τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (p=0,019) (Διάγραμμα 47). Διάγραμμα 47. Προσδιορισμός της φαγοκυττάρωσης των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από μονοκύτταρα που επωάστηκαν παρουσία ινσουλίνης για 1 (1h) και 3 ώρες (3h). Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου **, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με ινσουλίνη και του δείγματος ελέγχου. Στη συνέχεια, το πείραμα επαναλήφθηκε με την προσθήκη του cariporide για να ελεγχθεί ο ρόλος του ΝΗΕ1 στη διαδικασία αυτή. Στην επώαση μίας ώρας, η προσθήκη του cariporide ανέστειλε την προκαλούμενη από την ινσουλίνη αύξηση της φαγοκυττάρωσης των ox LDL μόνο στα άτομα φυσιολογικού βάρους (p=0,021) και στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (p=0,028). Στη τρίωρη επώαση, η ινσουλίνη όπως φάνηκε από το προηγούμενο πείραμα δεν αύξησε τη φαγοκυττάρωση των ox LDL αλλά όταν προστέθηκε το cariporide, η φαγοκυττάρωση μειώθηκε περισσότερο στα άτομα φυσιολογικού βάρους (από 209,54±16,2 σε 188,51±15,5, p=0,048), ενώ αυξήθηκε στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (από 177,74±26,3 σε 209,02±42,2, p=0,048) (Διάγραμμα 48). 227

240 Αποτελέσματα Διάγραμμα 48. Προσδιορισμός της φαγοκυττάρωσης των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από μονοκύτταρα που επωάστηκαν παρουσία cariporide (αναστολέας του ΝΗΕ1) και ινσουλίνης για 1 (1h) και 3 ώρες (3h). Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με ινσουλίνη και cariporide και του δείγματος που επωάστηκε με ινσουλίνη μόνο. Όπου, Ινσουλ+Cari, υποδηλώνει ινσουλίνη και cariporide. Ακολούθως, το πείραμα επαναλήφθηκε αφού πρώτα τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με ροσιγλιταζόνη και μετά προστέθηκε η ινσουλίνη. Στην επώαση μίας ώρας, η προσθήκη της ροσιγλιταζόνης ανέστειλε την προκαλούμενη από την ινσουλίνη αύξηση της φαγοκυττάρωσης των ox LDL και στις τρείς ομάδες (p=0,036 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους, p=0,037 για τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και p=0,046 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη). Στη τρίωρη επώαση, η ινσουλίνη, όπως φάνηκε από το προηγούμενο πείραμα, δεν αύξησε τη φαγοκυττάρωση των ox LDL, αλλά όταν προστέθηκε η ροσιγλιταζόνη, η φαγοκυττάρωση μειώθηκε περισσότερο στα άτομα φυσιολογικού βάρους (από 209,54±16,2 σε 190,91±19,8), χωρίς να είναι σημαντική η μείωση (p=0,078), ενώ αυξήθηκε σημαντικά στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (από 177,74±26,3 σε 205,75±27,6, p=0,027) (Διάγραμμα 49). 228

241 Αποτελέσματα Διάγραμμα 49. Προσδιορισμός της φαγοκυττάρωσης των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από μονοκύτταρα που επωάστηκαν παρουσία ροσιγλιταζόνης και ινσουλίνης για 1 (1h) και 3 ώρες (3h). Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με ινσουλίνη και ροσιγλιταζόνη και του δείγματος που επωάστηκε με ινσουλίνη μόνο. Όπου, Ινσουλ+ροσιγ, υποδηλώνει ινσουλίνη και ροσιγλιταζόνη. Τέλος, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από μονοκύτταρα που επωάστηκαν για μία ή τρεις ώρες με ινσουλίνη ή ινσουλίνη ταυτόχρονα είτε με cariporide είτε με ροσιγλιταζόνη. Διαπιστώθηκε ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας που προσδιορίστηκε με τον ευγλυκαιμικό υπερινσουλιναιμικό αποκλεισμό και της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από τα μονοκύτταρα που επωάστηκαν για 3 ώρες με ινσουλίνη ή με ινσουλίνη και ροσιγλιταζόνη ταυτόχρονα (Πίνακας 22). 229

242 Αποτελέσματα Πίνακας 22. Συσχετίσεις μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από τα μονοκύτταρα. Συσχέτιση Spearman μεταξύ Φαγοκυττάρωση ox LDL από μονοκύτταρα που επωάστηκαν με Ινσουλίνη για 3 ώρες rho p value M (mmol min 1 ) 0,515 0,001 M/I (mmol min 1 nmol 1 ml 1 ) 0,333 0,034 Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,578 <0,001 M επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) 0,578 <0,001 MCR bw (ml kg 1 min 1 ) 0,579 <0,001 MCR επιφάνεια σώματος (ml m 2 min 1 ) 0,62 <0,001 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Φαγοκυττάρωση ox LDL από μονοκύτταρα που επωάστηκαν με Ινσουλίνη και ροσιγλιταζόνη για 3 ώρες rho p value M/I (mmol min 1 nmol 1 ml 1 ) 0,644 <0,001 MCR επιφάνεια σώματος (ml m 2 min 1 ) 0,488 0,006 Μελετήθηκε ακόμη, η επίδραση της λεπτίνης στη φαγοκυττάρωση των ox LDL από τα μονοκύτταρα ατόμων και των τριών ομάδων. Η επώαση των μονοκυττάρων με λεπτίνη για μία ώρα αύξησε τη φαγοκυττάρωση των ox LDL μόνο στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από τα άτομα φυσιολογικού βάρους (p=0,047), ενώ η τρίωρη επώαση την αύξησε και στις τρείς ομάδες (p=0,032 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους, p=0,002 για τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και p<0,001 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη) (Διάγραμμα 50). Η αύξηση της φαγοκυττάρωσης των ox LDL κατά την επώαση των τριών ωρών ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη σε σύγκριση με τα άτομα φυσιολογικού βάρους (p=0,003) και τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (p=0,036). 230

243 Αποτελέσματα Διάγραμμα 50. Προσδιορισμός της φαγοκυττάρωσης των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από μονοκύτταρα που επωάστηκαν παρουσία λεπτίνης για 1 (1h) και 3 ώρες (3h). Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου **, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και του δείγματος ελέγχου. Στη συνέχεια, το πείραμα επαναλήφθηκε με την προσθήκη του cariporide για να ελεγχθεί ο ρόλος του ΝΗΕ1 στη διαδικασία αυτή. Στην ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους η προσθήκη του cariporide ανέστειλε την προκαλούμενη από την ινσουλίνη αύξηση της φαγοκυττάρωσης των ox LDL τόσο μετά από επώαση μίας ώρας (p=0,006), όσο και μετά από επώαση τριών ωρών (p<0,001). Επιπλέον, παρατηρήθηκε μείωση στη φαγοκυττάρωση των ox LDL κατά την τρίωρη επώαση σε όλα τα παχύσαρκα άτομα (p=0,036 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη και p=0,002 για τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη). Αξίζει να αναφερθεί ότι κατά την επώαση της μίας ώρας όταν προστέθηκε το cariporide, η φαγοκυττάρωση αυξήθηκε στα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη (από 199,14±13,5 σε 225,±30, p=0,048) (Διάγραμμα 51). Εύρημα που υποδηλώνει ότι στα άτομα αυτά η προκαλούμενη από τη λεπτίνη αύξηση της φαγοκυττάρωσης των ox LDL οφείλεται στη δράση κάποιου άλλου μηχανισμού διαφορετικού του ΝΗΕ1, ο οποίος μάλιστα έχει απενεργοποιηθεί στις τρεις ώρες. 231

244 Αποτελέσματα Διάγραμμα 51. Προσδιορισμός της φαγοκυττάρωσης των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από μονοκύτταρα που επωάστηκαν παρουσία cariporide (αναστολέας του ΝΗΕ1) και λεπτίνης για 1 (1h) και 3 ώρες (3h). Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και cariporide και του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη μόνο. Όπου, Λεπτ+Cari, υποδηλώνει λεπτίνη και cariporide. Η επώαση των μονοκυττάρων με ροσιγλιταζόνη που ακολουθήθηκε από την προσθήκη της λεπτίνης είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της προκαλούμενης από τη λεπτίνης αύξησης της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από τα μονοκύτταρα των ατόμων φυσιολογικού βάρους (p=0,005) μόνο κατά την επώαση της μίας ώρας και των ατόμων με παχυσαρκία μόνο κατά την τρίωρη επώαση (p=0,01 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη και p<0,001 για τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη) (Διάγραμμα 52). Ουσιαστικά, στο συγκεκριμένο πείραμα η προσθήκη της ροσιγλιταζόνης ανέστειλε την επίδραση της λεπτίνης όπως αυτή παρουσιάστηκε σε προηγούμενο πείραμα και μάλιστα, μόνο στις ομάδες όπου δρούσε η ορμόνη (Διάγραμμα 50). Τέλος, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από μονοκύτταρα που επωάστηκαν για μία ή τρεις ώρες με λεπτίνη ή λεπτίνη ταυτόχρονα είτε με cariporide είτε με ροσιγλιταζόνη. Διαπιστώθηκε ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας που προσδιορίστηκε με τον ευγλυκαιμικό υπερινσουλιναιμικό αποκλεισμό και της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από τα 232

245 Αποτελέσματα μονοκύτταρα που επωάστηκαν για 1 ώρα με λεπτίνη και cariporide, ενώ στις 3 ώρες η συσχέτιση ήταν αρνητική. Επιπλέον, αρνητική συσχέτιση διαπιστώθηκε μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από μονοκύτταρα που επωάστηκαν με λεπτίνη για 3 ώρες (Πίνακας 23). Διάγραμμα 52. Προσδιορισμός της φαγοκυττάρωσης των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από μονοκύτταρα που επωάστηκαν παρουσία ροσιγλιταζόνης και λεπτίνης για 1 (1h) και 3 ώρες (3h). Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη και ροσιγλιταζόνη και του δείγματος που επωάστηκε με λεπτίνη μόνο. Όπου, Λεπτ+ροσιγ, υποδηλώνει λεπτίνη και ροσιγλιταζόνη. 233

246 Αποτελέσματα Πίνακας 23. Συσχετίσεις μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από τα μονοκύτταρα στο σύνολο των ατόμων που μελετήθηκαν. Συσχέτιση Spearman μεταξύ Φαγοκυττάρωση ox LDL από μονοκύτταρα που επωάστηκαν με Λεπτίνη και cariporide για 1 ώρα rho p value M (mmol min 1 ) 0,484 0,002 Μ bw (mg kg 1 min 1 ) 0,366 0,026 M επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) 0,392 0,016 MCR bw (ml kg 1 min 1 ) 0,403 0,013 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Φαγοκυττάρωση ox LDL από μονοκύτταρα που επωάστηκαν με Λεπτίνη για 3 ώρες rho p value Μ bw (mg Kg 1 min 1 ) 0,555 0,003 M επιφάνεια σώματος (mg m 2 min 1 ) 0,591 0,003 MCR bw (ml kg 1 min 1 ) 0,546 0,004 Συσχέτιση Spearman μεταξύ Φαγοκυττάρωση ox LDL από μονοκύτταρα που επωάστηκαν με Λεπτίνη και cariporide για 3 ώρες rho p value Μ bw (mg Kg 1 min 1 ) 0,375 0,041 Στη συνέχεια, μελετήθηκε λοιπόν, η επίδραση της αδρεναλίνης στην φαγοκυττάρωση των ox LDL από τα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από άτομα φυσιολογικού βάρους και από παχύσαρκα άτομα με ή χωρίς αντίσταση στην ινσουλίνη. Για το σκοπό αυτό, τα μονοκύτταρα επωάστηκαν με αδρεναλίνη και συγκρίθηκε η φαγοκυττάρωση των ox LDL, με αυτή των μονοκυττάρων, στα οποία δεν επέδρασε καμία ορμόνη. Το αποτέλεσμα ήταν να αυξηθεί η φαγοκυττάρωση των ox LDL στα μονοκύτταρα που απομονώθηκαν από τα άτομα φυσιολογικού βάρους (p=0,033) και τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη (p=0,001) μόνο κατά την τρίωρη επώαση ενώ, στα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη αυξήθηκε τόσο κατά την επώαση μίας ώρας (p=0,014), όσο και κατά την τρίωρη επώαση (p=0,01). (Διάγραμμα 53). 234

247 Αποτελέσματα Διάγραμμα 53. Προσδιορισμός της φαγοκυττάρωσης των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από μονοκύτταρα που επωάστηκαν παρουσία αδρεναλίνης για 1 (1h) και 3 ώρες (3h). Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου **, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με αδρεναλίνη και του δείγματος ελέγχου. Ακολούθως, μελετήθηκε ο ρόλος του ΝΗΕ1 στη διαδικασία της προαγωγής της φαγοκυττάρωσης των ox LDL μετά από επώαση των μονοκυττάρων με υψηλές συγκεντρώσεις αδρεναλίνης. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η αδρεναλίνη ενεργοποιεί τον ΝΗΕ1. Επαναλήφθηκε λοιπόν το πείραμα, αφού πρώτα επωάστηκαν τα μονοκύτταρα με τον αναστολέα του ΝΗΕ1, το cariporide, και μετά προστέθηκε η αδρεναλίνη. Η φαγοκυττάρωση των ox LDL παρουσίασε σημαντική μείωση σε σύγκριση με το δείγμα που επωάστηκε με αδρεναλίνη, στην ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους και στα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη τόσο κατά την επώαση μίας ώρας (p=0,021 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους και p=0,013 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη), όσο και κατά την τρίωρη επώαση (p=0,043 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους και p=0,001 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη) (Διάγραμμα 54). Αξίζει να σημειωθεί ότι και στις δύο προαναφερθέντες ομάδες, η αδρεναλίνη δεν αύξησε την φαγοκυττάρωση των ox LDL κατά την επώαση της μίας ώρας. Παρόλα αυτά, το cariporide μείωσε τη φαγοκυττάρωση στο πείραμα αυτό. 235

248 Αποτελέσματα Διάγραμμα 54. Προσδιορισμός της φαγοκυττάρωσης των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από μονοκύτταρα που επωάστηκαν παρουσία cariporide (αναστολέας του ΝΗΕ1) και αδρεναλίνης για 1 (1h) και 3 ώρες (3h). Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με αδρεναλίνη και cariporide και του δείγματος που επωάστηκε με αδρεναλίνη μόνο. Όπου, Αδρεν+Cari, υποδηλώνει αδρεναλίνη και cariporide. Το πείραμα επαναλήφθηκε παρουσία της ροσιγλιταζόνης για να μελετηθεί ο ρόλος των πυρηνικών υποδοχέων PPARγ, στη διαδικασία της φαγοκυττάρωσης των ox LDL. Για το σκοπό αυτό, τα μονοκύτταρα επωάστηκαν πρώτα με ροσιγλιταζόνη και μετά προστέθηκε η αδρεναλίνη. Η φαγοκυττάρωση των ox LDL παρουσίασε σημαντική μείωση σε σύγκριση με το δείγμα που επωάστηκε με αδρεναλίνη μόνο, στην ομάδα των ατόμων φυσιολογικού βάρους κατά την επώαση μίας ώρας (p=0,028), και σε όλες τις ομάδες κατά την τρίωρη επώαση (p<0,001 για τα άτομα φυσιολογικού βάρους, p=0,03 για τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη και p<0,001 για τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη) (Διάγραμμα 55). 236

249 Αποτελέσματα Διάγραμμα 55. Προσδιορισμός της φαγοκυττάρωσης των οξειδωμένων LDL χοληστερολών από μονοκύτταρα που επωάστηκαν παρουσία ροσιγλιταζόνης και αδρεναλίνης για 1 (1h) και 3 ώρες (3h). Οι λευκές στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα φυσιολογικού βάρους. Οι ανοιχτό γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και ευαισθησία στην ινσουλίνη. Οι σκούρο γκρι στήλες αντιπροσωπεύουν τα άτομα με παχυσαρκία και αντίσταση στην ινσουλίνη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους ± τυπικό σφάλμα (Μ.Ο ± S.E.M.) από τουλάχιστον 6 ανεξάρτητα πειράματα. Όπου *, παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ του δείγματος που επωάστηκε με αδρεναλίνη και ροσιγλιταζόνη και του δείγματος που επωάστηκε με αδρεναλίνη μόνο. Όπου, Αδρεν+ροσιγ, υποδηλώνει αδρεναλίνη και ροσιγλιταζόνη. Τέλος, ελέγχθηκε η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ της ινσουλινοευαισθησίας και της φαγοκυττάρωσης των ox LDL από μονοκύτταρα που επωάστηκαν για μία ή τρεις ώρες με αδρεναλίνη ή αδρεναλίνη ταυτόχρονα είτε με cariporide είτε με ροσιγλιταζόνη. Οι συσχετίσεις που διαπιστώθηκαν αναγράφονται στον πίνακα