ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ. Βιοχημεία ΙΙ. ΣΥΝΘΕΣΗ RNA Διδάσκοντες: Καθ. Δ. Τσουκάτος, Αναπλ. Καθ. Α.-Ε.

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Βιοχημεία ΙΙ ΣΥΝΘΕΣΗ RNA Διδάσκοντες: Καθ. Δ. Τσουκάτος, Αναπλ. Καθ. Α.-Ε. Κούκκου

2 Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς.

3 Σύνθεση του RNA

4 Δομή και σύνθεση του RNA Τα γονίδια όλων των κυττάρων αλλά και πολλών ιών αποτελούνται από DNA Τα γονίδια καθορίζουν τα είδη των πρωτεϊνών που συντίθενται στα κύτταρα Το μόριο όμως που λειτουργεί ως εκμαγείο για την πρωτεϊνοσύνθεση δεν είναι το DNA Είναι μόρια RNA και ειδικά αγγελιαφόρα (messenger-mrna) Το mrna είναι ενδιάμεσος φορέας πληροφοριών από το DNA στον τόπο της πρωτεϊνοσύνθεσης Άλλα μόρια RNA όπως τα μεταφορικά (tranfer-trna) και τα ριβοσωματικά (ribosomal-rrna) αποτελούν μέρος της μηχανής της πρωτεϊνοσύνθεσης Όλα τα RNA συντίθενται από τα ένζυμα RNA πολυμεράσες που καθοδηγούνται από εκμαγεία DNA

5 Δομή και σύνθεση του RNA DNA: χημική αποθήκη γενετικών πληροφοριών Γονιδιακή έκφραση: απαιτεί ροή από DNA RNA πρωτεΐνες - Σύνθεση RNA = Μεταγραφή παράδειγμα σύνθεσης RNA στο βακτήριο E. coli Δομή και βιοχημικές ιδιότητες περιοχών έναρξης της μεταγραφής Αλληλεπιδράσεις μεταξύ RNA-πολυμεράσης, περιοχών έναρξης, εκμαγείου DNA και νεοσυντιθέμενης αλυσίδας RNA Τρόπος τερματισμού της μεταγραφής - Σύγκριση μεταξύ προκαρυωτικής και ευκαρυωτικής μεταγραφής - Αναστολείς της μεταγραφής

6 Μονόκλωνα μόρια RΝΑ μπορούν να λάβουν δίκλωνες τριδιάστατες διαμορφώσεις Δεν ισχύει ο κανόνας του Chargaff Δίκλωνη περιοχή μορφής Α Δομή στελέχους-θηλιάς

7 Τα μόρια RNA μπορούν να δρουν ως καταλύτες RNA καταλύτες:ριβοένζυμα Θεμελιώδεις ρόλους στην εξέλιξη της ζωής Σχετίζεται με την ικανότητά τους να αποκτούν ειδικές πολύπλοκες δομές Ταυτοποιήθηκε πρώτα σε φυτικούς ιστούς

8 Πολύπλοκη δομή ενός μορίου RNA Δευτεροταγής δομή μονόκλωνου RNA στο επίπεδο Συχνά σταθεροποιούνται από μεταλλικά ιόντα όπως το Mg 2+

9 Είδη RNA mrna: αγγελιοφόρο, εκμαγείο στην πρωτεϊνοσύνθεση, μέσο μήκος στο E. coli είναι περίπου 1.2 kb rrna: ριβοσωμικό, συστατικό ριβοσωμάτων (23S, 16S, 5S) trna: μεταφορικό (υπάρχει τουλάχιστον ένα για κάθε ένα από τα 20 αμινοξέα, πάνω από 40 διαφορετικά)

10 H έννοια του αγγελιοφόρου RNA Αναγκαιότητα παροδικών μηνυμάτων: Πρόταση Jacob και Monod To μήνυμα πρέπει να είναι ένα ενδιάμεσο πολυνουκλεοτίδιο που να αντανακλά την αλληλουχία βάσεων του DNA - To μέγεθος των μορίων του μηνύματος πρέπει να είναι ετερογενές γιατί τα γονίδια διαφέρουν μεταξύ τους - Το μήνυμα πρέπει να έχει παροδική παρουσία ώστε να είναι δυνατός ο έλεγχος της παραγωγής των πρωτεϊνικών μορίων. Άρα η σύνθεση και η αποικοδόμηση του μηνύματος πρέπει να πραγματοποιούνται πολύ γρήγορα trna, rrna πολύ σταθερά μόρια mrna εξαιρετικά ασταθές: στα προκαρυωτικά διάρκεια ζωής 2 min στα ευκαρυωτικά διάρκεια ζωής 10 min

11 Η σύνθεση του RNA (μεταγραφή) συνοπτικά Καταλύεται από ένα μεγάλο ένζυμο: RNA πολυμεράση Μηχανισμός σύνθεσης: παρόμοιος σε προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά Τρία στάδια: έναρξη, επιμήκυνση, τερματισμός Προκαρυωτική και ευκαρυωτική RNA πολυμεράση: παρόμοια δομή

12 Οι πολλαπλές λειτουργίες της RNA πολυμεράσης 1. Αναζητά θέσεις έναρξης επί του DNA (προαγωγείς) στοιχεία με δράση cis 2. Ξετυλίγει μικρό τμήμα δίκλωνου DNA (μονόκλωνο εκμαγείο) 3. Επιλέγει το σωστό NTP και καταλύει φωσφοδιεστερικό δεσμό Η κατάλυση αυτή επαναλαμβάνεται πολλές φορές προς κατεύθυνση 5 ->3. Το ίδιο ένζυμο ολοκληρώνει τη μεταγραφή και παράγει ένα μεταγράφημα 4. Ανιχνεύει σήματα τερματισμού 5. Αλληλεπιδρά με ενεργοποιητικές και κατασταλτικές πρωτεΐνες (έλεγχος έκφρασης στο μεταγραφικό επίπεδο) στοιχεία με δράση trans 6. Δεν διαθέτει διορθωτική δραστικότητα εξωνουκλεάσης

13 Η χημεία της σύνθεσης RNA Θεμελιώδης αντίδραση: σχηματισμός φωσφοδιεστερικού δεσμού, ίδια για όλa τα είδη RNA

14 Η RNA πολυμεράση του βακτηρίου E. coli Ένα μεγάλο και πολυσύνθετο ένζυμο 400 kd 4 υπομονάδες (α 2 ββ σ) σ: εύρεση θέσεων έναρξης (προαγωγούς) α 2 ββ : πυρήνας (περιέχει το καταλυτικό κέντρο)

15 Το καταλυτικό κέντρο της RNA πολυμεράσης Ομοιάζει με το καταλυτικό κέντρο της DNA πολυμεράσης Περιέχει δύο μεταλλικά ιόντα To ένα Μ +2 παραμένει στο ένζυμο, ενώ το άλλο εισέρχεται με το νουκλεοτίδιο και αποχωρεί με το ΡP i. Συμμετοχή τριών Asp του ενζύμου Οι τριδιάστατες δομές DNA και RNA πολυμερασών είναι τελείως διαφορετικές. (Παρόμοια ενεργά κέντρα είναι προϊόντα συγκλίνουσας εξέλιξης)

16 Απομόνωση περιοχών έναρξης της μεταγραφής Προαγωγοί: αλληλουχίες DNA που κατευθύνουν την RNA πολ. στην κατάλληλη θέση έναρξης μεταγραφής. Θέσεις που μπορούν να αναγνωριστούν και αναλυθούν με τη μέθοδο της αποτύπωσης Ένας κλώνος θραύσματος DNA επισημαίνεται στο ένα άκρο με 32 Ρ. Το δείγμα χωρίζεται και στο ένα προστίθεται RNA πολυμεράση. Στη συνέχεια και τα δύο δείγματα επιδρώνται με DNAάση. Ακολουθεί διαχωρισμός των θραυσμάτων με ηλεκτροφόρηση

17 Ανάλυση και σύγκριση αλληλουχιών περιοχών έναρξης μεταγραφής Περιοχές προαγωγών επικαλύπτονται από την RNA pol και δεν εμφανίζονται στο πήγμα μετά την ηλεκτροφόρηση Η σύγκριση πολλών τέτοιων περιοχών μεταξύ τους απεκάλυψε ένα κοινό σχήμα (-10, -35) Κωδικεύων κλώνος = νοηματικός Κλώνος εκμαγείο = αντινοηματικός Ασθενείς προαγωγοί: πολλές αποκλείσεις Η ισχύς του προαγωγού χρησιμεύει στη ρύθμιση της μεταγραφής Επίσης, η έκφραση ρυθμίζεται από ειδικές πρωτεΐνες Α: lac, B: gal, C: trp, D: λ, Ε: φχ ~17 bp TTGACA TATAAT θέση έναρξης Συναινετικές αλληλουχίες ισχυρών προαγωγών

18

19 Ο ρόλος της υπομονάδας σ της RNA πολυμεράσης - Μειώνει τη χημική συγγένεια της RNA πολυμεράσης για τυχαίες θέσεις επί του DNA κατά Δίνει τη δυνατότητα στην RNAπολυμεράση να αναγνωρίσει θέσεις προαγωγών - Μία α έλικα του παράγοντα σ αναγνωρίζει την περιοχή Το ολοένζυμο αναγνωρίζει περιοχές προαγωγών και δεσμεύεται σε αυτές με ταχύτητα Μ -1 s -1 ολισθαίνοντας και όχι με δεσμεύσεις-αποδεσμεύσεις Η υπομονάδα σ δρα καταλυτικά

20 Διαφορετικοί παράγοντες σ σ 70 : μοριακή μάζα 70 kd, αναγνωρίζει τον προαγωγό που περιγράφηκε ανωτέρω σ 32 : αναγνωρίζει προαγωγούς γονιδίων θερμικής καταπληξίας Προαγωγοί με διαφορετικές -10 αναγνωρίζονται από διαφορετικούς παράγοντες σ. Η υπομονάδα σ παίζει σημαντικό ρόλο στην αναγνώριση του σημείου έναρξης της μεταγραφής

21 Η RNA πολυμεράση έχει και δραστικότητα ελικάσης Μετά τη δέσμευση της RNA πολυμεράσης στην περιοχή του προαγωγού, το DNA πρέπει να αποδιαταχθεί, ώστε να αρχίσει σύνθεση RNA Εικόνα 28.7 Ο πυρήνας της RNA πολυμεράσης έχει δραστικότητα ελικάσης. Ξεδιπλώνει την έλικα του DNA κατά 17 bp (1,6 στροφές) σύμπλοκο κλειστού προαγωγού (δίκλωνο DNA) πυρήνας RNA πολυμεράσης σύμπλοκο ανοικτού προαγωγού (αποδιαταγμένο DNA)

22 Η σύνθεση RNA δεν απαιτεί εκκινητή Η έλλειψη διορθωτικής δραστικότητας εξωνουκλεάσης δίνει τη δυνατότητα στις RNA πολυμεράσες να αρχίσουν τη σύνθεση RNA συνδέοντας τα δύο πρώτα νουκλεοτίδια. Η σύνθεση προχωρά προς την κατεύθυνση 5 -> 3 Το πρώτο νουκλεοτίδιο είναι ΑΤΡ ή GTP και το 5 άκρο φέρει τρεις φωσφορικές ομάδες

23 Η φυσαλίδα της μεταγραφής (το στάδιο της επιμήκυνσης) Το στάδιο της επιμήκυνσης αρχίζει μετά το σχηματισμό του πρώτου φωσφοδιστερικού δεσμού. Μετά τη σύνθεση μερικών νουκλεοτιδίων ο παράγοντας σ αποδεσμεύεται από τον πυρήνα, ο οποίος δεσμεύεται με το εκμαγείο ισχυρότερα. Ο πυρήνας συνεχίζει να ξετυλίγει γλιστρώντας κατά μήκος του εκμαγείου. Η ξετυλιγμένη περιοχή συνεχίζει να έχει έκταση 17 bp (φυσαλίδα).

24 Η ταχύτητα της μεταγραφής Το νεοσυντιθέμενο RNA σχηματίζει υβριδική έλικα έκτασης 8 bp με τον κλώνο-εκμαγείο. Η 3 -ΟΗ έχει κατάλληλη τοποθέτηση ώστε να μπορεί να προσβάλει τον 5 α Ρ ενός εισερχόμενου νουκλεοτιδίου Ταχύτητα φυσαλίδας: 170 Å (17 nm)/s 50 n/s Μήκος υβριδίου: σταθερό Το υβρίδιο RNA-DNA περιστρέφεται με τη προσθήκη κάθε νουκλεοτιδίου ώστε το 3 ΟΗ του RNA παραμένει στο καταλυτικό κέντρο. Το RNA εξέρχεται από το ένζυμο καθώς συντίθεται (εικόνα 28.9) Εισαγωγή λαθών ~ (ανεκτό γιατί το RNA δεν κληρονομείται)

25 Ο τερματισμός της μεταγραφής Α: σχηματισμός δομής φουρκέτας Τερματισμός: - παύει η σύνθεση φωσφοδιεστερικών δεσμών - το υβρίδιο RNA-DNA αποσυνδέται - ο πυρήνας αφήνει το DNA και η αποδιάταξη αποκαθίσταται Οι μεταγραφόμενες περιοχές περιέχουν σήματα τερματισμού: παλινδρομικές περιοχές πλούσιες σε ζεύγη G-C ακολουθούμενες από περιοχές πλούσιες σε ζεύγη Α-Τ (σχηματισμός φουρκέτας) Η φουρκέτα αλληλεπιδρά με την RNA πολ.και σταματά η δράση της. Τα ζεύγη ru-da είναι ασταθή, και το δεσμευμένο υβρίδιο αποσυνδέεται Εικόνα 28.10

26 Ο τερματισμός της μεταγραφής Β: ο ρόλος της πρωτεΐνης ρ Η ανακάλυψη της πρωτεΐνης ρ

27 Ο μηχανισμός τερματισμού από την πρωτεΐνη ρ Η πρωτεΐνη nusa. ρ και nusa αναγνωρίζουν θέσεις εξασθενιστών Κοινό χαρακτηριστικό μηχανισμών τερματισμού: τα λειτουργικά σήματα τερματισμού βρίσκονται επί του νεοσυντιθέμενου RNA και όχι επί του εκμαγείου DNA

28 Μετα-μεταγραφική επεξεργασία προκαρυωτικών μορίων RNA mrna: ως έχει, μεταφράζεται κατά τη μεταγραφή rrna, trna: μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις 1. Πρωτογενή μεταγραφήματα Εξαιρετικά εξειδικευμένες νουκλεάσες 2. Μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις βάσεων Προσθήκη ουράς CCA στα 3 -ακρα των trna Τροποιήσεις ριβοζών rrna Τροποποιήσεις βάσεων

29 Ασυνήθεις βάσεις βρίσκονται σε όλα τα μόρια trna Σχηματίζονται από την ενζυμική τροποποίηση ενός κανονικού ριβονουκλεοτιδίου σε ένα πρόδρομο μόριο trna Π.χ. κατάλοιπα ουριδυλικού τροποποιούνται μετά τη μεταγραφή σχηματίζοντας ριβοθυμιδυλικό και ψευσδοουριδυλικό Οι τροποποιήσεις επιτρέπουν μεγαλύτερη δομική και λειτουργική προσαρμοστικότητα

30 Αντιβιοτικά - αναστολείς της προκρυωτικής μεταγραφής Ριφαμπικίνη: ημισυνθετικό παράγωγο ριφαμυκινών του Streptomyces (τύπος, εικόνα 28.14) Αναστέλλει την έναρξη της μεταγραφής εμποδίζοντας τη σύνθεση του πρώτου φωσφοδιεστερικού δεσμού. Το σύμπλοκο ριφαμπικίνης και προκαρυωτικής RNA πολυμεράσης φράσει το δίαυλο διόδου του υβριδίου RNA-DNA. Η επιμήκυνση της αλυσίδας δεν εμποδίζεται από τη ριφαμπικίνη, γιατί το υβρίδιο RNA-DNA παρεμποδίζει τη δέσμευση του αντιβιοτικού.

31 Ακτινομυκίνη D: Αντιβιοτικά - αναστολείς της μεταγραφής πολυπεπτιδικό αντιβιοτικό από άλλο στέλεχος Streptomyces. Δεσμεύεται ισχυρά σε δίκλωνο DNA εμποδίζοντας τη λειτουργία του ως εκμαγείο.παρεμβολή (intercalation): είσοδος φαινοξαζονικού δακτυλίου ακτινομυκίνης D μεταξύ γειτονικών βάσεων. Δεν επηρεάζει αντιγραφή ή μετάφραση, άρα εξειδικευμένος αναστολέας μεταγραφής προκαρυωτικών ή ευκαρυωτικών. Χρησιμοποιείται και ως αντικαρκινικός χημιοθεραπευτικός παράγοντας. Παρεμβολή φαινοξαζονικού δακτυλίου ακτινομυκίνης D μεταξύ δύο ζευγών βάσεων GC

32 Διαφορές μεταξύ προκαρυωτικής και ευκαρυωτικής μεταγραφής -Μεταγραφή και μετάφραση στα προκαρυωτικά είναι συζευγμένες, ενώ στα ευκαρυωτικά σε διαφορετικά διαμερίσματα - Η ρύθμιση της μεταγραφής στα ευκαρυωτικά πιο πολύπλοκη - Το mrna στα ευκαρυωτικά προκύπτει μετά από εκτεταμένη επεξεργασία εντός του πυρήνα. - Στα ευκαρυωτικά εναλλακτικό μάτισμα - Στα προκαρυωτικά όλα τα RNA από ένα είδος RNA-πολ. Στα ευκαρυωτικά τρεις τύποι RNA-πολ. - Τα ευκαρυωτικά εκτός από rrna trna και mrna περιέχουν και άλλα είδη RNA (snrna, κ.α)

33 ...διαφορετικό πρωτέωμα Ιδιο γονιδίωμα...

34 Το RNA των ευκαρυωτικών συντίθεται από τρεις διαφορετικές RNA πολυμεράσες - Ευκαρυωτικές RNA πολυμεράσες: μεγάλες πρωτεΐνες πολλών υπομονάδων (8 14, >500 kd) - Οι ευκαρυωτικές RNA πολυμεράσες αναστέλλονται διαφορετικά από το αντιβιοτικό α-αμανιτίνη. - Προκαρυωτική και ευκαρυωτικές RNA πολ. παρουσιάζουν ομολογία

35 Το κύπελλο του θανάτου α-αμανιτίνη Δεσμεύεται πολύ ισχυρά (K d =10 nm) RNA πολ ΙΙ Amanita phaloides

36 Ευκαρυωτικοί προαγωγοί και ενισχυτές - Οι ευκαρυωτικές RNA πολ αναγνωρίζουν διαφορετικές θέσεις έναρξης μεταγραφής - Οι ενισχυτές είναι επίσης θέσεις που δρουν in cis και αυξάνουν σημαντικά την αποτελεσματικότητα των προαγωγών. Οι θέσεις τους δεν είναι προκαθορισμένες - Οι θέσεις των ενισχυτών ποικίλουν σημαντικά και παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε ιστούς και κατά την ανάπτυξη - Ειδικές πρωτεΐνες παράγοντες μεταγραφής - αλληλεπιδρούν με προαγωγούς και ενισχυτές (δράση trans) και βοηθούν τη δέσμευση της κατάλληλης RNA πολυμεράσης

37 Πλαίσια ευκαρυωτικών προαγωγών Πλαίσιο ΤΑΤΑ: μεταξύ θέσεων -30 και 100 μεταλλάξεις μειώνουν τη δραστικότητα του προαγωγού Πλαίσιο CAAT: μεταξύ θέσεων -40 και 150, ή, Πλαίσιο GC: μεταξύ θέσεων -40 και 150 GC: σε προαγωγούς που εκφράζονται ιδιοσυστατικά ΤΑΤΑ: ανάλογο του ΤΑΤΑΑΤ στην 10 των προκαρυωτικών CAAT και GC: ανάλογα της 35 των προκαρυωτικών, αλλά η θέση τους ποικίλει. Επίσης αποτελεσματικά όταν βρίσκονται στον αντινοηματικό κλώνο (εκμαγείο), ενώ η 35 στον νοηματικό (κωδικεύοντα) κλώνο

38 Η συναρμολόγηση του ενεργού συμπλόκου μεταγραφής στους ευκαρυωτικούς προαγωγούς Η RNA πολ ΙΙ, οδηγείται στη θέση έναρξης με τη βοήθεια πολλών μεταγραφικών παραγόντων (TFII, Α,Β,D,E,F) Αρχικά δεσμεύεται o TFIID (700 kd) μέσω του συστατικού του ΤΒΡ (30 kd, η «καρδιά» του συμπλόκου, με μορφή σέλλας) Η ΤΒΡ υπάρχει και στα Αρχαία Η ΤΒΡ επάγει τη συναρμολόγηση και άλλων TFII Βασικός μηχανισμός μεταγραφής έχει εξελιχθεί από πρόγονο Αρχαίων ελικάση

39 Η επιφάνεια της σέλας της ΤΒΡ παρέχει θέσεις για την πρόσδεση και άλλων συστατικών

40 Πολλοί παράγοντες μεταγραφής αλληλεπιδρούν με ευκαριωτικούς προαγωγείς

41 Τέλος Ενότητας

42 Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

43 Σημειώματα

44 Σημείωμα Ιστορικού Εκδόσεων Έργου Το παρόν έργο αποτελεί την έκδοση 1.0. Έχουν προηγηθεί οι κάτωθι εκδόσεις: Έκδοση 1.0 διαθέσιμη εδώ.

45 Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκοντες: Καθ. Δ. Τσουκάτος, Αναπλ. Καθ. Α.-Ε. Κούκκου. «Βιοχημεία ΙΙ. ΣΥΝΘΕΣΗ RNA». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση:

46 Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά Δημιουργού - Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη. [1]