ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΓΟΝΙΔΙΟΤΟΞΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΝΕΩΝ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΜΕ ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ in vitro ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΑΡΓΑΡΙΤΑ ΑΘΑΝΑΣΙΑ ΑΡΓΥΡΟΠΟΥΛΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ, Σεπτέμβριος 2016

2

3 ΜΕΛΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΕΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΥΠΟΓΡΑΦΕΣ Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Στεφάνου Γεωργία Καθηγήτρια Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών. Γεωργίου Χρήστος Καθηγητής Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών. Νικολαρόπουλος Σωτήριος. Αναπληρωτής Καθηγητής Εργαστήριο Φαρμακευτικής Χημείας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών. Η Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Στεφάνου Γεωργία... Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών. Η έγκριση της διατριβής για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης από το Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν. 5343/1392, άρθρο

4

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Γενετικής του Τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, κατά το Ακαδημαϊκό Έτος , στο πλαίσιο του προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών του τμήματος Βιολογίας με ειδίκευση στη Βιολογική Τεχνολογία. Η κ. Γεωργία Στεφάνου, Καθηγήτρια του Τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης του Πανεπιστημίου Πατρών, είχε την επίβλεψή της. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω την κ. Γεωργία Στεφάνου, για τη δυνατότητα που μου έδωσε να πραγματοποιήσω τη διπλωματική μου εργασία στο εργαστήριό της. Την ευχαριστώ θερμά για τη βοήθεια που μου παρείχε όλο αυτό το διάστημα, για όλη την καθοδήγηση και τις συμβουλές της τόσο κατά το σχεδιασμό των πειραμάτων, όσο και κατά τη συγγραφή της εργασίας. Η εμψύχωση, η στήριξή της και η εμπιστοσύνη που μου έδειξε αποτέλεσαν κίνητρο για την ολοκλήρωση της παρούσας μελέτης. Να ευχαριστήσω επίσης την ερευνητική ομάδα του Εργαστηρίου Φαρμακευτικής Χημείας και ιδιαίτερα τον κ. Σωτήριο Νικολαρόπουλο, Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για τη σύνθεση και παραχώρηση των χημικών ενώσεων που μελετήθηκαν, καθώς και για τη συμμετοχή του στην Εξεταστική Επιτροπή. Επιπλέον, οφείλω να ευχαριστήσω τον κ. Χρήστο Γεωργίου, Καθηγητή του Τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης του Πανεπιστημίου Πατρών, για την τιμή που μου έκανε να είναι μέλος της Εξεταστικής Επιτροπής. Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Γεώργιο Κίλια, Αναπληρωτή Καθηγητή του Τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης του Πανεπιστημίου Πατρών, για την παραχώρηση του εργαστηρίου του όποτε υπήρξε ανάγκη και τον κ. Στέφανο Νταϊλιάνη, Επίκουρο Καθηγητή του Τομέα Βιολογίας Ζώων του Πανεπιστημίου Πατρών, για τις εποικοδομητικές συζητήσεις σχετικά με τη μέθοδο Comet assay. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω και στους δότες βιολογικού υλικού, χωρίς τη συμβολή των οποίων δεν θα ήταν δυνατή η πραγματοποίηση αυτής της εργασίας. Τέλος, ευχαριστώ πολύ την οικογένειά μου, ιδιαίτερα την αδερφή μου, για όλη τη στήριξη. 5

6

7 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT...15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΑΡΚΙΝΟΣ Βασικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων Αιτίες που προκαλούν καρκίνο Καρκίνος και ανευπλοειδία Θεραπεία του καρκίνου ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ Κατηγορίες αντικαρκινικών φαρμάκων Φάρμακα που δρουν στο DNA των καρκινικών κυττάρων Φάρμακα που δρουν στο RNA των καρκινικών κυττάρων Φάρμακα που δρουν σε πρωτεΐνες των καρκινικών κυττάρων Φάρμακα που δρουν στο ενδοθήλιο και στην εξωκυττάρια ύλη Αλκυλιωτικοί παράγοντες Μελφαλάνη Χημικά παράγωγα μελφαλάνης ΒΛΑΒΕΣ ΤΟΥ DNA Γενικά Χρωμοσωματικά ρήγματα..39 7

8 Μονόκλωνα χρωμοσωματικά ρήγματα Δίκλωνα χρωμοσωματικά ρήγματα Απουρινικές/ Απυριμιδινικές θέσεις Χιαστί δεσμοί Οξείδωση των βάσεων του DNA ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΒΛΑΒΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Επιδιορθωτικοί μηχανισμοί Επιδιόρθωση με εκτομή βάσεων (Base Excision Repair, BER) Κυτοσίνη της αραβινοσίδης ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ Γενικά Απόπτωση Νέκρωση Διάκριση της απόπτωσης από τη νέκρωση ΜΙΚΡΟΠΥΡΗΝΕΣ Γενικά Μηχανισμοί δημιουργίας μικροπυρήνων Χρωμοσωματική θραύση (chromosome breakage) Χρωμοσωματική καθυστέρηση ή απώλεια (chromosome loss) Μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης (Cytokinesis Block Micronucleus CBMN Assay) Κυτταροχαλασίνη-Β Πλεονεκτήματα της μεθόδου αναστολής της κυτταροκίνησης Μειονεκτήματα της μεθόδου αναστολής της κυτταροκίνησης

9 6.7. Εφαρμογές της μεθόδου αναστολής της κυτταροκίνησης Μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης σε συνδυασμό με την κυτοσίνη της αραβινοσίδης (CBMN/ARA-C) ΜΕΘΟΔΟΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΜΟΝΑΔΙΑΙΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ (SINGLE CELL GEL ELECTROPHORESIS, SCGE/ COMET ASSAY) Αρχή της μεθόδου Διαφορετικές μορφές της μεθόδου Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της μεθόδου Εφαρμογές της μεθόδου Διμέθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και εφαρμογές του Αντιοξειδωτική δράση του DMSO 82 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ..84 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΥΛΙΚΟ Ανθρώπινα λεμφοκύτταρα Κυτταρική καλλιέργεια ανθρώπινων λεμφοκυττάρων Πλεονεκτήματα της χρήσης των λεμφοκυττάρων ως βιολογικό υλικό Μειονεκτήματα της χρήσης των λεμφοκυττάρων ως βιολογικό υλικό ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΗΣΗΣ Πηγή λεμφοκυττάρων Καλλιέργεια ανθρώπινων λεμφοκυττάρων Απομόνωση και μονιμοποίηση των λεμφοκυττάρων Χρώση και μονιμοποίηση των παρασκευασμάτων Μικροσκοπική παρατήρηση

10 Κριτήρια αναγνώρισης διπύρηνων κυττάρων Κριτήρια αναγνώρισης μικροπυρήνων Κριτήρια αναγνώρισης αποπτωτικών κυττάρων Κριτήρια αναγνώρισης νεκρωτικών κυττάρων Δείκτης πολλαπλασιασμού των κυττάρων (CBPI) Δείκτης πυρηνικής διαίρεσης (NDI) Κυτταροτοξικότητα Στατιστική ανάλυση ΜΕΘΟΔΟΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΜΟΝΑΔΙΑΙΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ (SCGE/ COMET ASSAY) Πειραματική πορεία Μικροσκοπική παρατήρηση και λήψη φωτογραφιών Υπολογισμός παραμέτρων και στατιστική ανάλυση 113 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΧΗΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΛΦΑΛΑΝΗΣ Μελέτη του ρυθμού του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταροτοξικότητας Επαγωγή μικροπυρήνων και πρόκληση απόπτωσης ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΘΡΑΥΣΜΑΤΟΓΟΝΟΥ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΧΗΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΛΦΑΛΑΝΗΣ Έλεγχος της δημιουργίας ρηγμάτων στο DNA μέσω της μεθόδου ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΒΛΑΒΩΝ ΣΤΟ DNA ΠΟΥ ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΝΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΟ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟ ΕΚΤΟΜΗΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΒΑΣΕΩΝ

11 13.1. Μελέτη του ρυθμού του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταροτοξικότητας Επαγωγή μικροπυρήνων Βαθμός συνεργιστικότητας.161 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Συζήτηση Συμπεράσματα 174 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ..175 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΕΙΚΟΝΩΝ

12 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT

13 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε η ικανότητα τεσσάρων νέων στεροειδών παραγώγων της μελφαλάνης να προκαλούν χρωμοσωματική αστάθεια σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος. Η μελφαλάνη ανήκει στην κατηγορία των αλκυλιωτικών παραγόντων με κυτταροστατική ικανότητα. Παρουσιάζει θεραπευτική δράση σε διάφορες μορφές κακοήθειας, όπως πολλαπλό μυέλωμα, λεμφώματα των ωοθηκών και καρκίνο του μαστού. Οι ενώσεις SN-A, SN-B, SN-C και SN-D συντέθηκαν μέσω προσθήκης ενός στεροειδικού σκελετού στο μόριο της μελφαλάνης, με κύριο σκοπό τη βελτίωση της δραστικότητάς της. Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης (Cytokinesis-Block Micronucleus Assay, CBMN). Αναπτύχθηκαν καλλιέργειες λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος in vitro, από δύο υγιείς, νεαρής ηλικίας και μη καπνιστές δότες, αρσενικού και θηλυκού φύλου, στις οποίες επιδράσαμε με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις των τεσσάρων παραγώγων. Κατά τη μέθοδο αυτή αναστέλλεται η κυτταροκίνηση που λαμβάνει χώρα μετά την πρώτη πυρηνική διαίρεση των λεμφοκυττάρων, με τη χρήση κατάλληλου αναστολέα, χωρίς να παρεμποδίζεται η πυρηνική διαίρεση. Αποτέλεσμα αυτής της αναστολής είναι κύτταρα που έχουν διαιρεθεί μια φορά να εμφανίζονται ως μεγάλα διπύρηνα κύτταρα. Στα κύτταρα αυτά ανιχνεύεται η χρωμοσωματική βλάβη που ενδεχομένως έχουν υποστεί. Ως γενετικός δείκτης της χρωμοσωματικής βλάβης, χρησιμοποιήθηκαν οι μικροπυρήνες (MN). Πρόκειται για εξωπυρηνικό υλικό, προερχόμενο από χρωμοσωματική θραύση ή απώλεια χρωμοσωμάτων. Με την ίδια μέθοδο διερευνήθηκε ο ρυθμός προόδου του κυτταρικού κύκλου και η κυτταροτοξικότητα. Επίσης, μελετήθηκε η πρόκληση της απόπτωσης και της νέκρωσης των κυττάρων, καθώς είναι δυνατή η ταυτόχρονη ανίχνευση αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων. Επιπλέον, εξετάστηκε η θραύση του DNA υπό την επίδραση των παραγώγων της μελφαλάνης, με τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (Single Cell Gel Electrophoresis assay, SCGE/ comet assay) κάτω από αλκαλικές συνθήκες. Σε αυτές τις συνθήκες οι υπερέλικες του DNA χαλαρώνουν και ξεδιπλώνονται, με αποτέλεσμα να είναι δυνατή η ανίχνευση ρηγμάτων στο DNA καθώς και θέσεων ασταθών σε αλκαλικές συνθήκες (alkali labile sites) κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης, οι οποίες εμφανίζονται σαν ουρές ενός κομήτη. Για την ποσοτικοποίηση των ρηγμάτων στο DNA 13

14 εκτιμήθηκαν οι παράμετροι % DNA in head, % DNA in tail, tail intensity, tail length, tail moment και olive tail moment. Επίσης, έγινε έλεγχος για το αν οι βλάβες που προκαλούνται στο DNA λόγω αλκυλίωσης επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής βάσεων. Η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης σε συνδυασμό με την κυτοσίνη της αραβινοσίδης (ARA-C) επιτρέπει την ανίχνευση βλαβών στο DNA που επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής. Η ARA-C δρα αναστέλλοντας τον πολυμερισμό του DNA, κατά την επιδιόρθωση των τροποποιημένων βάσεων, δημιουργώντας έτσι ρήγματα στο DNA, τα οποία μετατρέπονται σε μικροπυρήνες μετά από την αντιγραφή του DNA. Σύμφωνα με τα ευρήματά μας, τα τέσσερα χημικά παράγωγα της μελφαλάνης παρουσιάζουν αυξημένη κυτταροτοξική δράση, όπως υποδεικνύει η μείωση του δείκτη CBPI και η αύξηση του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας. Επιπλέον, προκαλούν αυξημένη χρωμοσωματική αστάθεια, όπως φαίνεται από την αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων, η οποία σχετίζεται θετικά με την αύξηση της συγκέντρωσης των χημικών ενώσεων. Ωστόσο, δεν υπάρχουν σαφή ευρήματα για την επαγωγή της απόπτωσης. Η χημική ένωση SN-D επάγει τη δημιουργία ρηγμάτων στο DNA, όπως προκύπτει από τη μετακίνηση του DNA στην ουρά του κομήτη κατά την ηλεκτροφόρηση σε αλκαλικές συνθήκες, υποδεικνύοντας ότι η θραύση του DNA αποτελεί τουλάχιστον έναν από τους μηχανισμούς που προκαλούν την εμφάνιση μικροπυρήνων στα μεσοφασικά κύτταρα. Τέλος, διαπιστώθηκε ότι η χημική ένωση SN-D δημιουργεί βλάβες στο DNA, οι οποίες επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής βάσεων, BER (Base Excision Repair). 14

15 ABSTRACT In this study we investigated the ability of four new steroid derivatives of melphalan to induce chromosomal instability in human peripheral blood lymphocytes. Melphalan belongs to the class of alkylating agents with cytostatic ability. It shows a therapeutic effect in various forms of malignancy, such as multiple myeloma, ovarian lymphomas and breast cancer. The SN-A, SN-B, SN-C and SN-D compounds were synthesized by adding a steroid skeleton in the molecule of melphalan, with the main purpose of improving its effectiveness. The Cytokinesis-Block Micronucleus Assay (CBMN assay) was conducted. We established cultures of peripheral blood lymphocytes in vitro, from two young, healthy and non-smoking donors, male and female, which we treated with three different concentrations of the four derivatives. Through this method, the cytokinesis that takes place after the first nucleus division of the lymphocytes is blocked, by using a proper inhibitor, without interfering with nuclear division. As a result of this inhibition, cells that have undergone one division, appear as large binucleated cells. In these cells it is possible to detect the chromosomal damage they might have experienced. Micronuclei (MN) are used as a genetic indicator of chromosomal damage. They are extranuclear material, that may come from either chromosome breakage or chromosome loss. With the same method we investigated the cell proliferation rate, as well as the cytotoxicity. We also studied the induction of apoptosis and necrosis, as it is possible to detect apoptotic and necrotic cells at the same time. Furthermore, the DNA breakage under the effect of the melphalan derivatives, was examined using the Single Cell Gel Electrophoresis assay (SCGE, comet assay) under alkaline conditions. In these conditions, the DNA supercoils relax and unwind, thus being possible to detect DNA breaks or alkali labile sites, which appear as comet tails during electrophoresis. In order to quantify DNA breaks we evaluated the following parameters: % DNA in head, % DNA in tail, tail intensity, tail length, tail moment and olive tail moment. Moreover, we investigated whether the DNA alkylation lesions are being repaired by the Base Excision Repair mechanism (BER). The Cytokinesis-Block Micronucleus Assay in combination with cytosine arabinoside (ARA-C) allows the detection of excision repairable DNA lesions. ARA-C acts by inhibiting DNA polymerization, during the repair of modified bases, thereby generating DNA breaks, which are converted into micronuclei after DNA replication. 15

16 According to our findings, the four chemical derivatives of melphalan exhibit enhanced cytotoxic activity, as indicated by the decrease of CBPI index and the increase in the percentage of cytotoxicity. Moreover, they cause increased chromosomal instability, as shown by the increased frequency of micronuclei, which is positively correlated with the increase in the concentration of the compounds. However, there are no clear findings about the induction of apoptosis. The chemical compound SN-D induces DNA fragmentation, as shown by the DNA migration in the comet tail during electrophoresis under alkaline conditions, indicating that DNA breakage is at least one of the mechanisms that cause the appearance of micronuclei in interphase cells. Finally, it was found that the chemical compound SN-D creates excision repairable DNA lesions. 16

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

18 1. ΚΑΡΚΙΝΟΣ 1.1. Βασικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων Ο όρος «καρκίνος» αποδίδεται σε μια ομάδα ασθενειών που χαρακτηρίζονται από τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Πρόκειται για μια πολυσταδιακή εξελικτική διαδικασία, κατά την οποία τα κύτταρα υφίστανται γενετικές αλλαγές που τους προσδίδουν συγκεκριμένα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, όπως ο ανεξέλεγκτος πολλαπλασιασμός, η αντίσταση στον κυτταρικό θάνατο, η μετάσταση και ο εκτοπισμός των γειτονικών κυττάρων (Giam & Rancati, 2015). Σε αντίθεση με τα φυσιολογικά κύτταρα στο σώμα μας, τα οποία αυξάνονται, διαιρούνται και πεθαίνουν με έναν αυστηρά ελεγχόμενο τρόπο, τα καρκινικά κύτταρα διαφέρουν διότι συνεχίζουν να διαιρούνται ανεξέλεγκτα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη μιας μάζας κυττάρων, που ονομάζεται όγκος. Οι όγκοι μπορεί να είναι καλοήθεις ή κακοήθεις. Οι καλοήθεις όγκοι, των οποίων τα κύτταρα περιβάλλονται από συνδετικό ιστό, δεν είναι επεκτατικοί, δηλαδή δεν εισβάλλουν στους γύρω ιστούς και δεν εξαπλώνονται σε άλλα σημεία του σώματος. Γενικά, δεν προκαλούν σοβαρή βλάβη στο σώμα, εκτός εάν λόγω του μεγέθους τους ασκούν πίεση σε ζωτικά όργανα. Αντίθετα, στους κακοήθεις όγκους τα κύτταρα εμφανίζουν διαφορετική μορφολογία σε σχέση με τα φυσιολογικά, εισβάλλουν στους γειτονικούς ιστούς, ενώ μέσω της κυκλοφορίας του αίματος ή της λέμφου είναι δυνατόν να μεταφερθούν σε άλλα σημεία του σώματος και να σχηματίσουν δευτερογενείς όγκους, φαινόμενο που ονομάζεται μετάσταση. Ο καρκίνος αναπτύσσεται λόγω αλλαγών που προσδίδουν μη φυσιολογικές λειτουργίες στα φυσιολογικά κύτταρα. Οι αλλαγές αυτές είναι συχνά απόρροια κληρονομούμενων μεταλλάξεων ή επάγονται από περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως η υπεριώδης ακτινοβολία (UV), οι ακτίνες Χ, διάφοροι χημικοί παράγοντες, παράγωγα του καπνού, καθώς επίσης και κάποιοι ιοί. Οι περισσότερες περιπτώσεις καρκίνου οφείλονται στη δράση ενός συνδυασμού γεγονότων, που έχουν ως αποτέλεσμα το μετασχηματισμό των φυσιολογικών κυττάρων σε κακοήθη καρκινικά κύτταρα. Ο καρκίνος πλέον θεωρείται γενετική ασθένεια, εφόσον τις τελευταίες δεκαετίες έχει γίνει γνωστό ότι τα καρκινικά κύτταρα αποκτούν τα χαρακτηριστικά τους σε διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης του καρκίνου, σε διαφορετικά μικροπεριβάλλοντα, και με ποικίλους μηχανισμούς (Langie et al., 2015). 18

19 Η μεγάλη ποικιλία των καρκινικών γενοτύπων θεωρείται ότι αποτελεί συνέπεια διαφορετικών αλλαγών της κυτταρικής φυσιολογίας. Οι κυριότερες αλλαγές που συνεπάγονται ανάπτυξη κακοηθειών, είναι οι εξής: 1. Αυτάρκεια σε αυξητικά σήματα. Τα φυσιολογικά κύτταρα βρίσκονται σε κατάσταση ηρεμίας και απαιτούν τη δέσμευση μιτογόνων αυξητικών σημάτων (growth signals GS) σε διαμεμβρανικούς υποδοχείς, προκειμένου να εισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο. Τα σήματα αυτά παράγονται από αυξητικούς παράγοντες και ογκογονίδια, που διεγείρουν τα κύτταρα να πολλαπλασιασθούν. Τα καρκινικά κύτταρα γίνονται αυτόνομα εφόσον διαθέτουν ογκογονίδια, πολλαπλασιάζονται χάρη στην ικανότητά τους να παράγουν τα ίδια τους αυξητικούς τους παράγοντες, εκφράζουν σε υπερβολικό βαθμό υποδοχείς αυξητικών παραγόντων, ενώ η υπερέκφραση των ογκογονιδίων διεγείρει με τη σειρά της τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Sonnenschein & Soto, 2013). Επιπρόσθετα, οι διαδικασίες που σχετίζονται με τους επιφανειακούς κυτταρικούς υποδοχείς οι οποίοι μεσολαβούν στη μεταγωγή των αυξητικών σημάτων, ή μόρια της εξωκυττάριας ύλης, απορρυθμίζονται σε καρκινικούς φαινοτύπους (Hanahan & Weinberg, 2000). 2. Αντίσταση σε αναστολείς αύξησης. Εκτός από αυξητικά σήματα, τα κύτταρα δέχονται την επίδραση ενδογενών και εξωγενών αναστολέων της κυτταρικής αύξησης και του πολλαπλασιασμού, με στόχο τη διατήρηση της ομοιόστασης των ιστών. Οι αναστολείς αυτοί αποτελούν έναν αποτελεσματικό τρόπο για τη ρύθμιση του ανεξέλεγκτου πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από τους αυξητικούς παράγοντες και τα ογκογονίδια (Sonnenschein & Soto, 2013). Τα καρκινικά κύτταρα διαφεύγουν τη δράση αυτών των αναστολέων και συνεχίζουν τον πολλαπλασιασμό. Σε μοριακό επίπεδο στα περισσότερα σήματα αναστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού συμμετέχουν οι πρωτεΐνες TP53, prb και οι p107 and p130. Η πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος prb, φυσιολογικά βρίσκεται σε μη φωσφορυλιωμένη μορφή, έχοντας δεσμευμένους σε αυτή μεταγραφικούς παράγοντες που δεν επιτρέπουν τη συνέχιση του κυτταρικού κύκλου. Η φωσφορυλίωση της prb με την επίδραση κάποιου εξωτερικού σήματος, οδηγεί σε απελευθέρωση των μεταγραφικών παραγόντων και συνέχιση του κυτταρικού κύκλου. Απενεργοποίηση του prb μονοπατιού έχει ως αποτέλεσμα την απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και την αύξηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού (Hanahan & Weinberg, 2000). 3. Διαφυγή από τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (απόπτωση). Η σταδιακή συσσώρευση μεταλλάξεων σε βασικά γονίδια που είναι υπεύθυνα για την αύξηση και την 19

20 επιβίωση του κυττάρου οδηγεί σε καρκινογένεση. Το κύτταρο ενεργοποιεί την απόπτωση ή τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, όταν μια μετάλλαξη δεν μπορεί να επιδιορθωθεί από το ίδιο το κύτταρο. Τα καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από την ικανότητα τους να πολλαπλασιάζονται ταχύτατα και να αυξάνονται δραματικά σε αριθμό. Αυτό καθορίζεται από το ρυθμό πολλαπλασιασμού τους, αλλά και από την αδυναμία του κυττάρου να οδηγηθεί σε απόπτωση. Στα καρκινικά κύτταρα, η απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων, όπως είναι το γονίδιο p53, δεν οδηγεί σε απόπτωση. Η απενεργοποίηση της λειτουργίας του προϊόντος του γονιδίου αυτού, της πρωτεΐνης p53, έχει παρατηρηθεί σε ποσοστό μεγαλύτερο από το 50% των καρκίνων στον άνθρωπο (Hanahan & Weinberg, 2000). 4. Απεριόριστη αντιγραφή του γενετικού υλικού. Η γήρανση που επέρχεται από τη συνεχή αντιγραφή του γενετικού υλικού αποτελεί προστατευτικό φραγμό στην καρκινική εξάπλωση που μπορεί να πυροδοτείται από διάφορες ανωμαλίες που σχετίζονται με την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, όπως π.χ. υψηλά επίπεδα έκφρασης ογκογονιδίων ή προοδευτική μείωση των τελομερών (Hanahan & Weinberg, 2011). Τα τελομερή αποτελούνται από χιλιάδες επαναλήψεις μίας μικρής ακολουθίας έξι ζευγών βάσεων, στα άκρα των χρωμοσωμάτων. Η προοδευτική μείωση του μεγέθους των περιοχών αυτών σε κάθε κύκλο αντιγραφής αποτελεί έναν αυτόνομο μηχανισμό που ρυθμίζει την αντιγραφή του γενετικού υλικού, οδηγώντας παράλληλα σε γενετική αστάθεια. Η ικανότητα συνεχούς διαίρεσης των καρκινικών κυττάρων έχει δειχθεί ότι οφείλεται στην απώλεια των τελομερικών ακολουθιών. Το 85%-90% των καρκινικών κυττάρων διατηρούν τις τελομερικές τους περιοχές σε μήκος λίγο μεγαλύτερο από ένα κρίσιμο σημείο, γεγονός που επιτρέπει κύκλους αντιγραφής χωρίς περιορισμό (Hanahan & Weinberg, 2000). 5. Αγγειογένεση. Καθώς σχηματίζεται ένας ιστός, τα αιμοφόρα αγγεία τροφοδοτούν τα κύτταρα με θρεπτικά συστατικά και οξυγόνο. Η δημιουργία νέων αγγείων (αγγειογένεση) είναι μια διαδικασία που βρίσκεται κάτω από αυστηρό έλεγχο. Υπάρχουν θετικοί και αρνητικοί ρυθμιστές της αγγειογένεσης, οι οποίοι προάγουν και μπλοκάρουν την διαδικασία αυτή, αντίστοιχα. Καθώς ο όγκος μεγαλώνει, τα υπάρχοντα αγγεία δεν επαρκούν για την αιμάτωση των κυττάρων του, με αποτέλεσμα τα καρκινικά κύτταρα να ενεργοποιούν τη διαδικασία της αγγειογένεσης, τροποποιώντας την φυσιολογική ισορροπία των επαγωγέων και των αναστολέων. Αυτό επιτυγχάνεται με την έκκριση διαφόρων αυξητικών παραγόντων, όπως είναι ο παράγοντας VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). Σε αρκετούς όγκους, έχει παρατηρηθεί υπερέκφραση των παραγόντων VEGF ή/και FGF (Fibroblast Growth Factor) και μειωμένη έκφραση ενδογενών αναστολέων, όπως είναι η θρομβοσπονδίνη-1 ή η ιντερφερόνη-β (Hanahan & Weinberg, 2000). 20

21 6. Μετάσταση των κυττάρων. Η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να μεταναστεύουν, η μετάσταση, αποτελεί αιτία θανάτου για το 90% των καρκινοπαθών. Το χαρακτηριστικό της εισβολής και της μετάστασης καθιστά τα καρκινικά κύτταρα ικανά να απομακρύνονται από την αρχική καρκινική μάζα (εστία καρκίνου) και να μετακινούνται, με την κυκλοφορία του αίματος και της λέμφου, σε παρακείμενους ιστούς δημιουργώντας άλλες καρκινικές εστίες. Αρκετές πρωτεΐνες που σχετίζονται με τις κυτταρικές προσδέσεις σε έναν ιστό, όπως είναι οι πρωτεΐνες CAMs (Cell-cell Adhesion Molecules) παρουσιάζουν διαφοροποιήσεις σε κύτταρα που έχουν την ικανότητα μετάστασης (Hanahan & Weinberg, 2000). Η επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετατροπή (epithelial-mesenchymal transition EMT) αποτελεί μια από τις πλέον επικρατέστερες θεωρίες για την ανάπτυξη του καρκίνου. Σύμφωνα με τη θεωρία αυτή τα επιθηλιακά κύτταρα αποκτούν την ικανότητα εισβολής στους παρακείμενους ιστούς, αντίστασης στην απόπτωση και μετάστασης και διαφοροποιούνται έτσι σε μεσεγχυματικά (Hanahan & Weinberg, 2011). Αξίζει να σημειωθεί ότι σύμφωνα με τους Hanahan και Weinberg (2011), οι φαινότυποι που εμφανίζουν μεγάλο βαθμό κακοήθειας δεν προκύπτουν σε αυστηρά αυτόνομα κύτταρα καθώς και ότι ορισμένα καρκινικά κύτταρα αποκτούν ικανότητα μετάστασης χωρίς να υποστούν περαιτέρω μεταλλάξεις, εκτός από αυτές που οδήγησαν στην αρχική τους μετατροπή σε καρκινικά. Επιπλέον, η διαδικασία της ΕΜΤ (επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετατροπή) μπορεί να συμβεί και αντίστροφα, δηλαδή να γίνει μεσεγχυματική προς επιθηλιακή μετατροπή (ΜΕΤ). Η πλαστικότητα αυτή των κυττάρων εξηγεί το φαινόμενο της αντίστροφης μετάστασης, κατά την οποία τα κύτταρα μεταναστεύουν από τα σημεία της μετάστασης στα αρχικά σημεία του όγκου. Ένα τελευταίο χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων είναι ότι η μεταστατική τους ικανότητα ενισχύεται σημαντικά από τους ινοβλάστες, στρωματικά επιθηλιακά κύτταρα, τα οποία μεταναστεύουν μαζί με τα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα και τα περιβάλλουν, προάγοντας την αύξηση και διαφοροποίησή τους (Duda et al., 2010). 21

22 1.2. Αιτίες που προκαλούν καρκίνο Όπως αναφέρθηκε ήδη, πλέον γίνεται ολοένα πιο σαφές ότι οι φαινοτυπικές παραλλαγές που παρατηρούνται στις διάφορες μορφές καρκίνων, προέρχονται από αλληλεπιδράσεις των πολυάριθμων περιβαλλοντικών και γενετικών παραγόντων, που συμβαίνουν σε μεγάλα χρονικά διαστήματα (Langie et al., 2015). Στους γενετικούς ή ενδογενείς παράγοντες που συμβάλλουν στην εμφάνιση καρκίνου περιλαμβάνονται η κληρονομικότητα, τα μη φυσιολογικά επίπεδα ορισμένων ορμονών στην κυκλοφορία του αίματος, καθώς και η εξασθένιση ή καταστολή του ανοσοποιητικού συστήματος. Όσον αφορά τους περιβαλλοντικούς ή εξωγενείς παράγοντες, οι κυριότεροι από αυτούς συνδέονται με συνήθειες του σύγχρονου τρόπου ζωής, όπως το κάπνισμα, το αλκοόλ, η κακή διατροφή, η παχυσαρκία, κλπ. Σ αυτούς περιλαμβάνονται επίσης οι παθογόνοι μικροοργανισμοί, οι ακτινοβολίες, διάφορα βιομηχανικά προϊόντα και παράγοντες που συμβάλλουν στη ρύπανση του περιβάλλοντος (Anand et al., 2008). Η καρκινογένεση μπορεί να οφείλεται σε γενετικές ή επιγενετικές αλλοιώσεις σε ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια που ρυθμίζουν διεργασίες, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, ο κυτταρικός θάνατος, η κυτταρική διαφοροποίηση και η σταθερότητα του γονιδιώματος. Τα περισσότερα ογκογονίδια προκύπτουν από πρωτο-ογκογονίδια που είναι φυσιολογικά λειτουργικά γονίδια. Όταν ένα πρωτο-ογκογονίδιο υποστεί μετάλλαξη σε κρίσιμες αλληλουχίες του DNA του ή αυξηθεί η έκφραση του, μετατρέπεται σε ογκογονίδιο, προκαλώντας καρκίνο. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται ενεργοποίηση ογκογονιδίου. Τα ογκογονίδια γενικά ενεργοποιούνται μέσω μεταλλάξεων, γονιδιακής ενίσχυσης ή αναδιατάξεις χρωμοσωμάτων. Αρκεί να ενεργοποιηθεί μόνο το ένα από τα δύο αλληλόμορφα ενός πρωτο-ογκογονιδίου, εφόσον οι μεταλλάξεις που υφίστανται είναι υπερέχουσες (Langie et al., 2015). Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια, από την άλλη πλευρά, είναι φυσιολογικά γονίδια που αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων, σταματούν την κυτταρική διαίρεση και προωθούν την επιδιόρθωση του DNA ή την απόπτωση όταν το DNA ενός κυττάρου έχει υποστεί βλάβη. Όταν συμβούν μεταλλάξεις στα γονίδια αυτά, τα κύτταρα διαιρούνται ανεξέλεγκτα, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε καρκίνο. Δομικές μεταλλάξεις σε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες συχνά οδηγούν σε ανεξέλεγκτη δραστηριότητα της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης. Για παράδειγμα, μεταλλάξεις στο γονίδιο της πρωτεΐνης RAS προκαλούν ανεξέλεγκτο κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η γονιδιακή ενίσχυση συμβαίνει μέσω αντιγραφής μιας περιοχής του DNA, η οποία 22

23 περιλαμβάνει ένα ογκογονίδιο και μπορεί να οδηγήσει στη δημιουργία πολλών χιλιάδων αντιγράφων του ογκογονιδίου. Με τον τρόπο αυτό, αυξάνονται τα επίπεδα έκφρασης του ογκογονιδίου, γεγονός που ευνοεί τον επιλεκτικό κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Περίπου στο % των καρκίνων του εγκεφάλου και των ωοθηκών παρατηρείται ενίσχυση του c-myc γονιδίου (Langie et al., 2015). Οι χρωμοσωματικές αναδιατάξεις περιλαμβάνουν μετατοπίσεις και ενθέσεις. Τέτοιες αναδιατάξεις μπορεί να έχουν ως αποτέλεσμα τη μετατόπιση ενός πρωτο-ογκογονιδίου κοντά σε γονίδιο κάποιας αιμοσφαιρίνης ή σε κάποιο γονίδιο υποδοχέα των Τ- λεμφοκυττάρων. Η μεταγραφή του πρωτο-ογκογονιδίου στη συνέχεια, ελέγχεται από ρυθμιστικά στοιχεία της περιοχής της αιμοσφαιρίνης ή του υποδοχέα των Τ- λεμφοκυττάρων, γεγονός που οδηγεί σε απορρύθμιση της έκφρασης του πρωτο-ογκογονιδίου. Μια από τις πιο καλά χαρακτηρισμένες περιπτώσεις μετατόπισης αφορά στα BCR ABL γονίδια. Η συνένωση των δύο αυτών γονιδίων, που εδράζονται στο χρωμόσωμα Φιλαδέλφεια, έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός υβριδικού ογκογονιδίου, το οποίο συναντάται στις περισσότερες περιπτώσεις χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας. Εφόσον οι μεταλλάξεις που λαμβάνουν χώρα σε ογκογονίδια επηρεάζουν γενικά διάφορα μονοπάτια που οδηγούν σε καρκίνο (όπως π.χ. η αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, όπως περιγράψαμε), δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί κατά πόσο τα ογκογονίδια επάγουν τη γονιδιακή αστάθεια. Ωστόσο, έχει αναφερθεί ότι η ενεργοποίηση των ογκογονιδίων και η ακόλουθη ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών που επάγουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, σχετίζεται με την απώλεια της ετεροζυγωτίας και την ύπαρξη γονιδιακής αστάθειας σε αρκετά μοντέλα in vitro και in vivo, μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει και το οξειδωτικό στρες που προκαλείται λόγω λανθασμένης αντιγραφής του DNA (Langie et al., 2015). Σε αντίθεση με τα ογκογονίδια, τα ογκοκατασταλτικά γονίδια προκαλούν καρκίνο όταν καταστέλλονται. Εφόσον φυσιολογικά υπάρχουν δύο αντίγραφα ενός ογκοκατασταλτικού γονιδίου σε κάθε κύτταρο, μεταλλάξεις που συμβαίνουν μόνο στο ένα αντίγραφο δεν μπορούν να καταστείλουν εντελώς τη δράση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου, επειδή το φυσιολογικό αντίγραφο του γονιδίου συνεχίζει να παράγει λειτουργικές πρωτεΐνες. Ως εκ τούτου, οι μεταλλάξεις που συμβαίνουν σε ογκοκατασταλτικά γονίδια θεωρούνται υποτελείς. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η απώλεια ενός χρωμοσωματικού τμήματος στο οποίο εδράζεται το ένα αντίγραφο του ογκοκατασταλτικό γονίδιο, μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη γονιδιακή έκφραση και αρκεί για να συμβάλλει στην καρκινογένεση. Η ενεργοποίηση των ογκογονιδίων και η καταστολή των ογκοκατασταλτικών γονιδίων τείνουν να επάγουν την καρκινογένεση συνεργιστικά. Εκτός από τους γενετικούς μηχανισμούς, αξίζει να σημειωθεί 23

24 ότι ενεργοποίηση των ογκογονιδίων και καταστολή των ογκοκατασταλτικών γονιδίων ενδέχεται να προκληθεί και μέσω επιγενετικής τροποποίησης (Langie et al., 2015) Καρκίνος και ανευπλοειδία Οι αλλαγές στο γονιδίωμα των καρκινικών κυττάρων ποικίλουν από απλές αλλαγές σε επίπεδο νουκλεοτιδίων, μέχρι και μεγάλης κλίμακας κυτταρογενετικές αλλαγές ως αποτέλεσμα αυξημένης χρωμοσωματικής αστάθειας. Η χρωμοσωματική αστάθεια αποτελεί μια κατάσταση που χαρακτηρίζεται από αυξημένη συχνότητα συσσώρευσης γενετικών αλλαγών ως απόρροια μεταλλάξεων οι οποίες επηρεάζουν: 1) μονοπάτια που ρυθμίζουν την πιστότητα της αντιγραφής του DNA στην S φάση (καθώς και τη διατήρηση των τελομερών), 2) την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και των σημείων ελέγχου, 3) τον σωστό αποχωρισμό των χρωμοσωμάτων στη μίτωση, και 4) την επιδιόρθωση σποραδικών βλαβών του DNA (Giam & Rancati, 2015). Όπως ήδη έχει αναφερθεί, μια από τις κύριες συνέπειες της χρωμοσωματικής αστάθειας είναι η ανευπλοειδία. Υπάρχουν πολλές αιτίες που προκαλούν χρωμοσωματική αστάθεια, με κυριότερες τις εξής: ύπαρξη πολυπολικής ατράκτου, ανεπαρκής συμπύκνωση ή αναποτελεσματική σύνδεση των χρωμοσωμάτων, ατελής συναρμολόγηση της μιτωτικής ατράκτου, λάθη στα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, φθορά των τελομερών, ανεξέλεγκτη αντιγραφή και αναποτελεσματικές συνδέσεις του κινητοχώρου των χρωμοσωμάτων με τους μικροσωληνίσκους της ατράκτου. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η ανευπλοειδία μπορεί να αποτελέσει και αιτία χρωμοσωματικής αστάθειας, υποδεικνύοντας την ύπαρξη μιας θετικής ανατροφοδότησης, έχοντας ως αποτέλεσμα ακόμα πιο αυξημένα επίπεδα ανευπλοειδίας (Giam & Rancati, 2015). Ο Boveri το 1914, ήταν ο πρώτος που διατύπωσε την υπόθεση ότι η ανισοκατανομή των χρωμοσωμάτων ενδέχεται να αποτελεί αιτία ανάπτυξης όγκων και γενετικών ανωμαλιών. Το αν η ανευπλοειδία αποτελεί αιτία ή συνέπεια της καρκινογένεσης έχει αποτελέσει θέμα διαμάχης για αρκετά χρόνια, ωστόσο σήμερα είναι πλέον αποδεκτά και τα δύο σενάρια. Οι ανευπλοειδίες στα σωματικά κύτταρα υποδεικνύουν αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού με πιθανή καταστολή της ογκογένεσης, από την άλλη όμως πλευρά, συνδέονται με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης συγκεκριμένων μορφών καρκίνου, και ως εκ τούτου υποστηρίζουν μια συσχέτιση της ανευπλοειδίας με τον καρκίνο. Η ανευπλοειδία συναντάται με πολύ μεγάλη συχνότητα στον καρκίνο του ανθρώπου, χαρακτηρίζει περίπου το 90% των συμπαγών όγκων και περισσότερο από το 50% των 24

25 καρκίνων του αίματος. Παρά το γεγονός ότι ο βαθμός και το φάσμα ανευπλοειδιών ποικίλλουν σημαντικά στους διάφορους τύπους όγκων, σε πολλούς όγκους απαντώνται επαναλήψεις ολόκληρων χρωμοσωμάτων. Ο ρόλος της ανευπλοειδίας στην ογκογένεση έχει αναλυθεί σε αρκετές μελέτες. Αν και η ανευπλοειδία συσχετίζεται με το μετασχηματισμό των κυττάρων σε καρκινικά, εμπειρικές δοκιμές της υπόθεσης ότι η ανευπλοειδία επάγει την ογκογένεση έχουν παρεμποδιστεί από τη δυσκολία πρόκλησης ανευπλοειδίας χωρίς να προκαλούνται άλλες κυτταρικές ανωμαλίες, ιδιαίτερα βλάβες του DNA. Σύμφωνα με τις μέχρι σήμερα γνώσεις μας, φαίνεται πιθανό ότι η ανευπλοειδία μπορεί να συμβάλει στην καρκινογένεση, χωρίς να αποτελεί επαρκή προϋπόθεση για κακοήθη μετασχηματισμό (Langie et al., 2015) Θεραπεία του καρκίνου Υπάρχουν πολλές διαφορετικές θεραπείες για την αντιμετώπιση του καρκίνου. Ο τρόπος αντιμετώπισης εξαρτάται κάθε φορά από τον τύπο του καρκίνου, τη θέση του και το στάδιο εξέλιξής του. Η χειρουργική επέμβαση συνήθως αποτελεί την πρωταρχική θεραπεία, και χρησιμοποιείται για την αφαίρεση συμπαγών όγκων. Χρησιμοποιείται σε καρκίνους που βρίσκονται σε αρχικό στάδιο και σε καλοήθεις όγκους. Η χρήση ακτινοβολίας υψηλής ενέργειας στοχεύει με μεγάλη ακρίβεια και σκοτώνει τα καρκινικά κύτταρα στην περιοχή του όγκου. Δρα προκαλώντας κυρίως βλάβες στο DNA, εμποδίζοντας την αντιγραφή του, και ως εκ τούτου βλάπτει μόνο κύτταρα που διαιρούνται, τα οποία στην πλειονότητά τους είναι καρκινικά. Η χειρουργική επέμβαση συνήθως χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με τη χρήση ακτινοβολίας. Ένας άλλος τρόπος αντιμετώπισης του καρκίνου είναι η χρήση χημειοθεραπείας. Τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη χημειοθεραπεία εμποδίζουν τη σύνθεση πρόδρομων μορίων που απαιτούνται για την αντιγραφή του DNA και επηρεάζουν την ικανότητα του κυττάρου να ολοκληρώσει τη φάση αντιγραφής του γενετικού υλικού (S φάση). Άλλα φάρμακα προκαλούν εκτεταμένη βλάβη στο DNA, σταματώντας την αντιγραφή του πριν την ολοκλήρωση της μίτωσης, και για το λόγο αυτό ονομάζονται αναστολείς της μίτωσης. Τα φάρμακα αυτά εμποδίζουν το σχηματισμό των μικροσωληνίσκων της μιτωτικής ατράκτου, οδηγώντας έτσι σε λανθασμένο αποχωρισμό των χρωμοσωμάτων. Τα περισσότερα υγιή κύτταρα του οργανισμού δεν διαιρούνται συχνά, επομένως πλήττονται λιγότερο από τα χημειοθεραπευτικά φάρμακα σε σχέση με τα καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, κύτταρα όπως 25

26 αυτά του γαστρεντερικού σωλήνα, του μυελού των οστών και των θυλάκων των τριχών διαιρούνται ταχύτατα, γεγονός που εξηγεί τις παρενέργειες της χημειοθεραπείας, όπως η πρόκληση ναυτίας, η μείωση του αριθμού των λευκών αιμοσφαιρίων και η απώλεια μαλλιών. Οι σύγχρονες θεραπείες περιλαμβάνουν την ορμονική θεραπεία, δηλαδή τη χρήση φαρμάκων που αναστέλλουν την ενεργότητα ή τη σύνθεση ορμονών που είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Άλλα φάρμακα στοχεύουν συγκεκριμένες πρωτεΐνες που συμμετέχουν στα μονοπάτια μεταγωγής σημάτων, όπως υποδοχείς, αυξητικούς παράγοντες, επαγωγείς απόπτωσης ή κινάσες, με την ελπίδα ότι τα φάρμακα αυτά θα είναι λιγότερο τοξικά απέναντι στα υγιή κύτταρα, σε σύγκριση με τα συμβατικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Μια πολλά υποσχόμενη θεραπεία περιλαμβάνει την αναστολή της αγγειογένεσης, χρησιμοποιώντας ακόμη και φάρμακα με φυσική προέλευση, όπως η αγγειοστατίνη και η ενδοστατίνη. Τα φάρμακα αυτά προλαμβάνουν την αγγειογένεση στα καρκινικά κύτταρα, περιορίζοντας έτσι την αύξηση του όγκου και τη μετάσταση. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν λιγότερες πιθανότητες να αποκτήσουν ανθεκτικότητα στα φάρμακα αυτά, εφόσον οι αναστολείς της αγγειογένεσης δεν στοχεύουν άμεσα τα καρκινικά κύτταρα. Μια ακόμη μορφή θεραπείας του καρκίνου είναι η ανοσοθεραπεία. Τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία αυτή (ιντερλευκίνες, ιντερφερόνες και άλλες κυτοκίνες) έχουν στόχο να διεγείρουν ή να ενισχύσουν το ανοσοποιητικό σύστημα ώστε να επιτεθεί ενάντια στα καρκινικά κύτταρα. Κάποιες παραλλαγές της ανοσοθεραπείας περιλαμβάνουν τη χρήση αντισωμάτων, στα οποία συνδέονται χημειοθεραπευτικά φάρμακα (chemoimmunotherapy) ή ραδιενεργά άτομα (radioimmunotherapy). Με τον τρόπο αυτό τα φάρμακα ή τα ραδιενεργά υλικά μεταφέρονται απευθείας στα καρκινικά κύτταρα, χωρίς να επηρεάζουν τα υγιή κύτταρα. Τέλος, μια άλλη ανοσολογική μέθοδος περιλαμβάνει αντισώματα που συνδέονται ειδικά με αυξητικούς παράγοντες και υποδοχείς των καρκινικών κυττάρων, καταστέλλοντας έτσι τη λειτουργία τους. ( 26

27 2. ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ 2.1. Κατηγορίες αντικαρκινικών φαρμάκων Tα αντικαρκινικά φάρμακα, με βάση το κλασικό σύστημα ταξινόμησης, ομαδοποιούνται στις κατηγορίες της χημειοθεραπείας, της ορμονικής θεραπείας και της ανοσοθεραπείας. Ειδικότερα, τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη χημειοθεραπεία με βάση τη χημική τους δομή και το μηχανισμό δράσης τους διακρίνονται στους αλκυλιωτικούς παράγοντες, στα βαρέα μέταλλα, στους αντιμεταβολίτες, στα αντιβιοτικά, σε αναστολείς της μίτωσης (spindle poisons) και σε αναστολείς των τοποϊσομερασών (Parnell & Woll, 2003). Τα αντικαρκινικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα μπορούν επίσης να ταξινομηθούν ανάλογα με τη φάση του κυτταρικού κύκλου στην οποία βρίσκονται τα κύτταρα που στοχεύουν. Διακρίνονται έτσι οι εξής κατηγορίες: 1. Φάρμακα που στοχεύουν κύτταρα σε συγκεκριμένες φάσεις του κυτταρικού κύκλου (Phase-specific chemotherapy). Στην κατηγορία αυτή ανήκουν αντιμεταβολίτες, όπως η μεθοτρεξάτη, οι οποίοι στοχεύουν κύτταρα που βρίσκονται στην φάση S της μίτωσης (εμποδίζοντας τη σύνθεση του DNA), ενώ τα αλκαλοειδή της Vinca εμποδίζουν το σχηματισμό της μιτωτικής ατράκτου και την ευθυγράμμιση των χρωμοσωμάτων, που λαμβάνουν χώρα κατά τη φάση M της μίτωσης. 2. Φάρμακα που στοχεύουν κύτταρα που διαιρούνται (Cell cycle-specific chemotherapy). Τα περισσότερα φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη χημειοθεραπεία του καρκίνου δρουν ενάντια σε κύτταρα που διαιρούνται ενεργά, ανεξάρτητα από τη φάση του κυτταρικού κύκλου στην οποία βρίσκονται, όπως π.χ. οι ανθρακυκλίνες. 3. Φάρμακα που στοχεύουν κύτταρα που διαιρούνται και κύτταρα που βρίσκονται σε κατάσταση ηρεμίας (Cell cycle-nonspecific chemotherapy). Τα φάρμακα αυτά, όπως οι αλκυλιωτικοί παράγοντες και τα σύμπλοκα του λευκόχρυσου (Pt), επιδρούν τόσο στα καρκινικά όσο και στα υγιή κύτταρα που βρίσκονται σε κατάσταση ηρεμίας. Εμφανίζουν γραμμική συσχέτιση δόσης-αποτελέσματος, δηλαδή είναι περισσότερο αποτελεσματικά όταν χορηγούνται σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις (Payne and Miles, 2008). Τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη χημειοθεραπεία μπορούν να επιδρούν άμεσα στα καρκινικά κύτταρα ή σε άλλα στοιχεία που σχετίζονται με την καρκινογένεση, το ενδοθήλιο, την εξωκυττάρια ύλη και το ανοσοποιητικό σύστημα. Επομένως, το πλέον προτιμότερο σύστημα ταξινόμησης των αντικαρκινικών φαρμάκων χρησιμοποιεί ως κριτήριο το είδος του στόχου του φαρμάκου. Ο στόχος της δράσης τους μπορεί να είναι το DNA, το 27

28 RNA ή κάποια πρωτεΐνη. Έτσι λοιπόν, τα Espinosa et al. (2003) ταξινομούνται στις ακόλουθες κατηγορίες: αντικαρκινικά φάρμακα σύμφωνα με τους Φάρμακα που δρουν στο DNA των καρκινικών κυττάρων Τα φάρμακα μπορούν να δρουν στο γενετικό υλικό δημιουργώντας ρήγματα στην έλικα του DNA, αλληλεπιδρώντας με πρωτεΐνες που δεσμεύονται στο DNA ή τροποποιώντας την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων. Οι αλκυλιωτικοί παράγοντες είναι οι πρώτοι χημικοί παράγοντες που διαπιστώθηκε πως είναι χρήσιμοι στη θεραπεία του καρκίνου. Σχηματίζουν μια ποικιλία διαμοριακών ομοιοπολικών χιαστί δεσμών, τροποποιώντας τη δομή και τη λειτουργία του DNA, οδηγώντας στη δημιουργία ρηγμάτων. Δρουν μεταφέροντας αλκυλομάδες στις μεθυλ- ή αίθυλ- ομάδες του DNA, στο RNA και στις πρωτεΐνες. Η αλκυλίωση συμβαίνει σε νουκλεόφιλα κέντρα στο μόριο του DNA και των άλλων μακρομορίων, με συνηθέστερες τις θέσεις Ν7 και Ο6 της γουανίνης. Στους αλκυλιωτικούς παράγοντες ανήκουν οι υπερίτες του αζώτου, οι νιτροζουρίες, οι τριαζίνες, τα σύμπλοκα του λευκόχρυσου και κάποια αντιβιοτικά, όπως η μιτομυκίνη-c. Οι αναστολείς των τοποϊσομερασών I και II και οι αντιμεταβολίτες αποτελούν μια άλλη κατηγορία, εφόσον πρόκειται για φάρμακα που δεν συνδέονται άμεσα με το DNA, αλλά με σύμπλοκα DNA-πρωτεϊνών. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν και οι ανθρακυκλίνες, όπως η δοξορουβικίνη και τα παράγωγά της, οι οποίες έχουν την ικανότητα να αναστέλλουν τη δράση της τοποϊσομεράσης ΙΙ και να σχηματίζουν ελεύθερες ρίζες. Οι ορμονικοί παράγοντες, όπως τα στεροειδή και τα ρετινοειδή έχουν κοινό μηχανισμό δράσης, εφόσον τροποποιούν την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων. Παραδείγματος χάριν, οι στεροειδείς ορμόνες, όπως τα γλυκοκορτικοειδή, δένουν σε πρωτεΐνες-υποδοχείς που βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα ή στον πυρήνα, σχηματίζοντας ένα σύμπλοκο ορμόνηςπρωτεϊνικού υποδοχέα, το οποίο έχει την ικανότητα να ενεργοποιεί ρυθμιστικές αλληλουχίες του DNA Φάρμακα που δρουν στο RNA των καρκινικών κυττάρων Ένας μεγάλος αριθμός αντικαρκινικών φαρμάκων όπως είναι οι φθοροπυριμιδίνες (fluoropyrimidines) και τα σύμπλοκα του λευκόχρυσου (platinum compounds) επηρεάζουν τη σύνθεση του RNA, κυρίως μέσω πρόσδεσής τους στο RNA. Οι κυριότεροι αντιπρόσωποι 28

29 αυτής της ομάδας μορίων είναι τα αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια (antisense oligonucleotides), τα οποία συνδέονται ειδικά με συγκεκριμένα mrnas Φάρμακα που δρουν σε πρωτεΐνες των καρκινικών κυττάρων Τα μονοκλωνικά αντισώματα και τα μικρομόρια συνδέονται με πρωτεΐνες-υποδοχείς της πλασματικής μεμβράνης των καρκινικών κυττάρων. Τα μονοκλωνικά αντισώματα μπλοκάρουν τις εξωκυτταρικές περιοχές πρωτεϊνικών υποδοχέων, ενώ τα μικρομόρια διαπερνούν την πλασματική μεμβράνη και αναστέλλουν τις ενδοκυτταρικές πρωτεϊνικές περιοχές, που συνήθως αποτελούν οι κινάσες τυροσίνης. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν επίσης φάρμακα που συνδέονται με αυξητικούς παράγοντες που συμμετέχουν σε ενδοκυτταρικά μεταβολικά μονοπάτια, μεταφέροντας σήματα πολλαπλασιασμού στον πυρήνα των κυττάρων, όπως π.χ. αναστολείς της πρωτεΐνης Ras, της φωσφατιδυλο-ινοσιτόλης, του πρωτεασώματος και κυκλινοεξαρτώμενων κινασών. Τέλος, τα αλκαλοειδή της Vinca προσδένονται σε συγκεκριμένες θέσεις της τουμπουλίνης των μικροσωληνίσκων, εμποδίζοντας τον πολυμερισμό των διμερών τουμπουλίνης και επομένως το σχηματισμό των μικροσωληνίσκων. Αντίθετα, οι ταξάνες σταθεροποιούν τους μικροσωληνίσκους, εφόσον έχουν διαφορετική θέση πρόσδεσης στην τουμπουλίνη, με αποτέλεσμα να εμποδίζεται η φυσιολογική αναδιοργάνωση του δικτύου των μικροσωληνίσκων κατά τη διαίρεση του κυττάρου. Οι παράγοντες αυτοί θεωρούνται αναστολείς της μιτωτικής ατράκτου, εφόσον δρουν αναστέλλοντας τη συγκρότηση των μικροσωληνίσκων Φάρμακα που δρουν στο ενδοθήλιο και στην εξωκυττάρια ύλη Πρόκειται για παράγοντες οι οποίοι στοχεύουν το ενδοθήλιο, αναστέλλοντας είτε τους αυξητικούς παράγοντες του ενδοθηλίου είτε τους υποδοχείς τους. Χαρακτηριστικό φάρμακο της κατηγορίας αποτελεί η θαλιδομίδη (thalidomide) που αναστέλλει τους κύριους αυξητικούς παράγοντες του ενδοθηλίου VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) και bfgf (basic Fibroblast Growth Factor). Τα περισσότερα φάρμακα που δρουν στην εξωκυττάρια ύλη αναστέλλουν τις μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs), εμποδίζοντας έτσι την αγγειογένεση. Εκτός από τις μεταλλοπρωτεϊνάσες, τα φάρμακα αυτά είναι δυνατό να στοχεύουν και άλλα στοιχεία της 29

30 εξωκυττάριας ύλης, όπως για παράδειγμα τις ιντεγκρίνες, την ενδοθηλίνη και τη θρομβοσπονδίνη Αλκυλιωτικοί παράγοντες Τα πρώτα φάρμακα που χρησιμοποιήθηκαν αποτελεσματικά στη θεραπεία του καρκίνου ήταν αλκυλιωτικοί παράγοντες. Τα τοξικά αέρια που χρησιμοποιήθηκαν ως όπλα κατά τη διάρκεια του Α Παγκοσμίου Πολέμου περιείχαν υπερίτες του θείου, και προκαλούσαν ερεθισμό του δέρματος, τύφλωση και αναπνευστική ανεπάρκεια. Η γνώση για την αντικαρκινική τους δράση ωστόσο, προήλθε όταν παρατηρήθηκε ότι οι στρατιώτες που έρχονταν σε επαφή με τους παράγοντες αυτούς, εμφάνιζαν λευκοπενία, απλασία του μυελού των οστών και έλκος του γαστρεντερικού σωλήνα (Adair & Bagg, 1931). Οι λιγότερο τοξικοί υπερίτες του αζώτου που χρησιμοποιήθηκαν στον Β Παγκόσμιο Πόλεμο τέθηκαν υπό περαιτέρω μελέτη. Δοκιμές σε ασθενείς με λέμφωμα, έδειξαν ότι οι υπερίτες του αζώτου προκαλούσαν μείωση του όγκου και υποχώρηση των συμπτωμάτων (Goodman et al., 1946). Τα αποτελέσματα αυτά ευνόησαν τη χρήση των υπεριτών του αζώτου έναντι αυτών του θείου, λόγω της μικρότερης τοξικότητας σε συνδυασμό με την αποτελεσματικότητά τους, και ενθάρρυναν τις προσπάθειες για εύρεση άλλων χημικών παραγόντων με αντικαρκινική δράση (Holland & Frei et al., 2003). Οι παράγοντες αυτοί βρίσκονται σε αφθονία τόσο στο εξωτερικό, όσο και στο εσωτερικό περιβάλλον των κυττάρων. Υπάρχουν στον αέρα, στο νερό, σε διάφορες τροφές, καθώς και σε ρύπους, όπως ο καπνός και τα προϊόντα καύσης διαφόρων καυσίμων. Στο εσωτερικό των κυττάρων, οι αλκυλιωτικοί παράγοντες αποτελούν κυρίως παραπροϊόντα της οξειδωτικής βλάβης. Οι αλκυλιωτικοί παράγοντες έχουν κυτταροτοξική, τερατογόνο και καρκινογόνο δράση και ως εκ τούτου θεωρούνται εξαιρετικά επικίνδυνοι για την υγεία του ανθρώπου. Παρά το γεγονός αυτό, συγκεκριμένοι τοξικοί αλκυλιωτικοί παράγοντες συχνά χρησιμοποιούνται ως φάρμακα στη συστηματική χημειοθεραπεία του καρκίνου. Συνεπώς, οι αλκυλιωτικοί παράγοντες ευθύνονται για την πρόκληση καρκίνου, αλλά χρησιμοποιούνται επίσης και στη θεραπεία του (Fu et al., 2012). Αποτελούν ηλεκτρόφιλα μόρια που αντιδρούν με ισχυρά πυρηνόφιλες θέσεις, με συνέπεια το σχηματισμό ομοιοπολικών δεσμών. Όσον αφορά το μηχανισμό δράσης τους διακρίνονται δύο τύποι αλκυλιωτικών παραγόντων: (1) αυτοί που αντιδρούν απευθείας με τα βιολογικά μόρια και (2) αυτοί που σχηματίζουν ένα ενδιάμεσο προϊόν, το οποίο με τη σειρά 30

31 του, αντιδρά με τα βιολογικά μόρια. Αυτοί οι δύο μηχανισμοί δράσης χαρακτηρίζονται αντίστοιχα ως αντίδραση SN1 και SN2, και παρουσιάζονται στην ακόλουθη εικόνα. Εικόνα 2.2.: SN1 and SN2 μηχανισμοί δράσης των αλκυλιωτικών παραγόντων. (Holland & Frei et al., 2003). Η ταχύτητα της αντίδρασης στον SN1 μηχανισμό εξαρτάται μόνο από τη συγκέντρωση του αντιδρώντος αλκυλιωτικού παράγοντα, ενώ η ταχύτητα της αντίδρασης στον SN2 μηχανισμό εξαρτάται από τη συγκέντρωση του αντιδρώντος αλκυλιωτικού παράγοντα και από αυτή του ενδιάμεσου προϊόντος. Η κατηγοριοποίηση των αλκυλιωτικών παραγόντων σύμφωνα με το μηχανισμό δράσης τους συμβάλλει στην κατανόηση της κυτταρικής και μοριακής φαρμακολογίας κάθε παράγοντα ξεχωριστά (Holland & Frei et al., 2003). Οι αλκυλιωτικοί παράγοντες συνιστούν μια μεγάλη οικογένεια χημικών παραγόντων που μεταφέρουν αλκυλομάδες (R-CH2) σε διάφορα βιολογικά μόρια (πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα). Οι παράγοντες οι οποίοι αντιδρούν με το γενετικό υλικό θεωρούνται αποτελεσματικότεροι για τη θεραπεία του καρκίνου. Οι περισσότεροι αλκυλιωτικοί παράγοντες διαθέτουν δύο ομάδες με τις οποίες μπορούν να αλληλεπιδρούν με το DNA. Μπορούν έτσι να συνδέονται με έναν ή και με δύο διαφορετικούς κλώνους DNA, αναστέλλοντας τη δράση διαφόρων ενζύμων που συμμετέχουν στην αντιγραφή του DNA. Τα κύτταρα επομένως είναι ανίκανα να διαιρεθούν ή οδηγούνται σε απόπτωση (Payne and Miles, 2008). Δρουν είτε προκαλώντας αλκυλίωση στις βάσεις του DNA, είτε σχηματίζοντας ενδομοριακούς χιαστί δεσμούς (cross-links) με αποτέλεσμα να εμποδίζεται η αντιγραφή και η μεταγραφή του DNA. Η θέση αλκυλίωσης και ο αριθμός των χιαστί δεσμών που προκύπτουν, ποικίλουν ανάλογα με την οικογένεια στην οποία ανήκει ο αλκυλιωτικός παράγοντας, με πιο κοινή θέση αλκυλίωσης τη θέση Ν-7 της γουανίνης. Αξίζει να αναφερθεί ότι είναι υπεύθυνοι και για την πρόκληση μεταλλάξεων, καθώς η αλκυλίωση των βάσεων ενδέχεται να οδηγήσει σε λανθασμένα ζεύγη βάσεων (π.χ. G-Τ) τα οποία αν δεν επιδιορθωθούν οδηγούν σε μόνιμες μεταλλάξεις. 31

32 Όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενη ενότητα, δρουν σε όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου και χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση πολλών διαφορετικών μορφών καρκίνου, μεταξύ των οποίων η λευχαιμία, το λέμφωμα, η νόσος Hodgkin, το πολλαπλό μυέλωμα, το σάρκωμα, ο καρκίνος του πνεύμονα, του μαστού και των ωοθηκών. Οι κυριότεροι αλκυλιωτικοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται ως φάρμακα στη χημειοθεραπεία, περιλαμβάνουν: υπερίτες του αζώτου (μελφαλάνη, χλωραμπουκίλη), νιτροζουρίες (καρμουστίνη, λομουστίνη), θειϊκά αλκύλια (βουσουλφάνη), τριαζίνες (προκαρβαζίνη, τεμοζολαμίδη), αιθυλενιμίνες (μιτομυκίνη C) και σύμπλοκα του λευκόχρυσου (Payne and Miles, 2008). Οι αλκυλιωτικοί παράγοντες αντιδρούν με το νερό και υδρολυόμενοι απενεργοποιούνται. Η απενεργοποίησή τους είναι επίσης δυνατή και μέσω της σύνδεσής τους με θειόλες, όπως η γλουταθειόνη, με τη βοήθεια ενζύμων που ονομάζονται τρανσφεράσες της γλουταθειόνης. Ακόμη, είναι δυνατός ο ενδοκυτταρικός ή ξενοβιοτικός μεταβολισμός τους (Hill et al., 1975). Αξίζει τέλος να αναφερθεί, ότι η αποτελεσματικότητα της θεραπείας του καρκίνου εξαρτάται από την ανθεκτικότητα των καρκινικών κυττάρων στους αλκυλιωτικούς παράγοντες. Σύμφωνα με τους Holland και Frei (2013) τα κύτταρα αντιστέκονται στους αλκυλιωτικούς παράγοντες με τους εξής τρόπους: (1) μειωμένη πρόσληψή τους ή αυξημένη αποβολή τους από τα κύτταρα (μέσω σύνδεσής τους με τη γλουταθειόνη), (2) αδρανοποίησή τους στο εσωτερικό των κυττάρων, (3) επιδιόρθωση των βλαβών του DNA που προκαλούνται από τους αλκυλιωτικούς παράγοντες και (4) απουσία ενδοκυτταρικών μηχανισμών που επάγουν τη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ως απόκριση στις βλάβες του DNA Μελφαλάνη Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενοι αλκυλιωτικοί παράγοντες είναι οι υπερίτες του αζώτου. Αποτελούν αζωτούχα ανάλογα του υπερίτη του θείου και περιλαμβάνουν στο μόριο τους τη χαρακτηριστική δι-χλωροαιθυλ-ομάδα. Παρόλο που έχουν συντεθεί και δοκιμαστεί χιλιάδες χημικά παράγωγα υπεριτών του αζώτου, μόνο πέντε από αυτά χρησιμοποιούνται στη θεραπεία του καρκίνου. Πρόκειται για τις ενώσεις μεχλωραιθαμίνη, κυκλοφωσφαμίδιο, ισοφωσφαμίδιο, μελφαλάνη και χλωραμπουκίλη (Holland & Frei et al., 2003). 32

33 Εικόνα: 2.3.α.: Χημική δομή των υπεριτών του αζώτου που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία του καρκίνου. (Holland & Frei et al., 2003). Η αντίδραση αλκυλίωσης περιλαμβάνει μια αντίδραση κυκλοποίησης (SN1) της μιας εκ των δυο χλωροαιθυλομάδων, και το σχηματισμό ενός ιόντος αιθυλενιμμωνίου, με την ταυτόχρονη απελευθέρωση ενός ιόντος χλωρίου. Το αιθυλενιμμώνιο μπορεί να αντιδράσει αργά με πυρηνόφιλες ομάδες Χ, μέσω ενός SN2 μηχανισμού αλκυλίωσης. Η ταχύτητα της αντίδρασης εξαρτάται τόσο από τη συγκέντρωση της πυρηνόφιλης, όσο και από τη συγκέντρωση της ηλεκτρονιόφιλης ομάδας (Holland & Frei et al., 2003). Εικόνα 2.3.β.: Μηχανισμός αλκυλίωσης των υπεριτών του αζώτου. (Holland & Frei et al., 2003). Η μελφαλάνη (L-phenylalanine mustard, L-PAM) είναι ένας αλκυλιωτικός παράγοντας που ανήκει στην οικογένεια των υπεριτών του αζώτου και χρησιμοποιείται στην θεραπεία του πολλαπλού μυελώματος, του καρκίνου των ωοθηκών, του καρκίνου του μαστού, του λεμφώματος, καθώς και του νευροβλαστώματος. Κλινικές δοκιμές έχουν δείξει ότι η 33

34 μελφαλάνη είναι περισσότερο δραστική στην αντιμετώπιση του πολλαπλού μυελώματος σε συνδυασμό με τη βορτεζομίμπη, τη θαλιδομίδη ή την πρεδνιζολόνη (Spicka, 2014). Εικόνα 2.3.γ.: Χημική δομή μελφαλάνης (Jones, 2002). Πρόκειται για ένα ανάλογο αμινοξέος που εισέρχεται στα κύτταρα και διαπερνά τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό μέσω συστημάτων ενεργητικής μεταφοράς. Τα φυσικά υποστρώματα για τα συστήματα αυτά είναι τα αμινοξέα και η είσοδος της μελφαλάνης στα κύτταρα και το κεντρικό νευρικό σύστημα (Κ.Ν.Σ.) είναι δυνατόν να τροποποιηθεί από την παρουσία συγκεκριμένων αμινοξέων στο εξωκυττάριο υγρό (Holland & Frei et al., 2003). Η μελφαλάνη δρα προκαλώντας αλκυλίωση στο DNA, δημιουργώντας έτσι ρήγματα στο DNA, η πλειονότητα των οποίων είναι μονόκλωνα. Κάποια από αυτά τα ρήγματα στη συνέχεια σχηματίζουν χιαστί δεσμούς μεταξύ τους, με αποτέλεσμα να προκύπτουν διαμοριακοί χιαστί δεσμοί (interstrand crosslinking), οι οποίοι όπως έχει αποδειχθεί είναι υπεύθυνοι για την επαγόμενη κυτταροτοξικότητα in vitro (Spanswick et al., 2002). Επιπλέον, η μελφαλάνη έχει την ικανότητα να σχηματίζει ενδομοριακούς χιαστί δεσμούς με το μόριο του DNA, προκαλώντας αλκυλίωση στις θέσεις N-7 της γουανίνης και N-3 της αδενίνης, καθώς επίσης και χιαστί δεσμούς μεταξύ DNA και πρωτεϊνών. Σε κάθε περίπτωση, οι διαμοριακοί χιαστί δεσμοί εμποδίζουν τόσο την αντιγραφή όσο και τη μεταγραφή του DNA, οδηγώντας τελικά τα κύτταρα στο θάνατο. Τα επιδιορθωτικά ένζυμα δεν επιδιορθώνουν πάντα τις βλάβες, με αποτέλεσμα να δημιουργούνται ελλείψεις βάσεων, μονόκλωνα ή δίκλωνα ρήγματα, καθώς και απουρινικές ή απυριμιδινικές θέσεις (Frei et al., 1993). Η μελφαλάνη χορηγείται είτε από το στόμα είτε με ενδοφλέβια ένεση, και δεν απορροφάται πλήρως από τον οργανισμό, καθώς η συγκέντρωσή της στο πλάσμα του αίματος μειώνεται γρήγορα με γεωμετρική πρόοδο. Εμφανίζει υψηλό ποσοστό σύνδεσης με διάφορες πρωτεΐνες του πλάσματος (60-90%), κυρίως με την αλβουμίνη. Αποβάλλεται από το πλάσμα κυρίως με χημική υδρόλυση σε μονο- και διυδροξυ- παράγωγα και έπειτα απεκκρίνεται από τους νεφρούς χωρίς να τροποποιηθεί. ( 34

35 Παρουσιάζει χρόνο ημιζωής 1,5 ώρα σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα στους 37 C, και ακολούθως μετατρέπεται αυθόρμητα σε δραστικά ενδιάμεσα προϊόντα. Η υδρόλυσή της επηρεάζεται από το ph, τη θερμοκρασία και τη συγκέντρωση των ιόντων χλωρίου του διαλύματος. Όταν η συγκέντρωση του χλωριούχου νατρίου στο υδατικό διάλυμα της μελφαλάνης είναι 3%, η μελφαλάνη σταθεροποιείται για 6 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, επιτρέποντας έτσι βραδεία ενδοφλέβια χορήγηση στους ασθενείς (Stout & Riley, 1985). Σε διάλυμα μεθανόλης, η μελφαλάνη παραμένει σταθερή για περισσότερες από 12 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, και για τουλάχιστον 4 εβδομάδες σε θερμοκρασία 20 C (Stout & Riley, 1987). Η τοξική δράση της μελφαλάνης, όπως προαναφέρθηκε, οφείλεται στην ικανότητά της να αντιδρά με τα νουκλεϊκά οξέα, αναστέλλοντας έτσι τις διαδικασίες της πρωτεϊνοσύνθεσης και της κυτταρικής διαίρεσης, οδηγώντας τελικά στο θάνατο των κυττάρων και τη νέκρωση των ιστών που εμφανίζουν ευαισθησία στη δράση της. Στους ιστούς αυτούς ανήκουν ο λεμφικός ιστός, ο μυελός των οστών, το σπερματικό επιθήλιο, το εντερικό επιθήλιο, οι ωοθήκες, και ο μαστικός αδένας. Η μελφαλάνη σε υψηλές δόσεις προκαλεί κατά κύριο λόγο μυελοκαταστολή, λευκοπενία και θρομβοπενία, καταστάσεις που μπορούν να οδηγήσουν στο θάνατο, αν δεν γίνει μεταμόσχευση μυελού των οστών. Οι παρενέργειες που μπορεί να προκαλέσει περιλαμβάνουν βλεννογονίτιδα, αλωπεκία, διάρροια, πρόκληση ναυτίας και εμετού. Τέλος, όπως όλοι σχεδόν οι αλκυλιωτικοί παράγοντες, μπορεί να συμβάλλει στην εμφάνιση μόνιμης ή παροδικής στειρότητας στους άντρες (Jones, 2002) Χημικά παράγωγα μελφαλάνης Το ερευνητικό ενδιαφέρον εστιάζεται συνεχώς στο σχεδιασμό νέων δραστικότερων και αποτελεσματικότερων αντικαρκινικών φαρμάκων που στοχεύουν αποκλειστικά τα καρκινικά κύτταρα, περιορίζοντας συγχρόνως τις κυτταροτοξικές τους παρενέργειες στα φυσιολογικά κύτταρα. Η σχεδίαση και χρήση προφαρμάκων έπαιξε καθοριστικό ρόλο στην προσπάθεια βελτίωσης των φυσικοχημικών, φαρμακευτικών και φαρμακοκινητικών ιδιοτήτων των χημικών ενώσεων που χρησιμοποιούνται ως αντικαρκινικά φάρμακα. Πρόκειται για τροποποιημένες ανενεργές μορφές των δραστικών φαρμάκων που υφίσταται αυθόρμητα ενζυμική διάσπαση in vivo, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση του ενεργού φαρμάκου. Με τον τρόπο αυτό ξεπερνώνται βασικά προβλήματα του σχεδιασμού αντικαρκινικών φαρμάκων, όπως η μικρή διαλυτότητα σε υδατικά διαλύματα, η χημική αστάθεια, η ανεπαρκής απορρόφηση, η γρήγορη απέκκριση, η αδυναμία διείσδυσης στον 35

36 αιματοεγκεφαλικό φραγμό, η αυξημένη τοξικότητα και η μη εξειδικευμένη δράση των φαρμάκων (Rautio et al., 2008). Οι πιο κοινές λειτουργικές ομάδες που υφίστανται τροποποιήσεις για το σχεδιασμό προφαρμάκων περιλαμβάνουν καρβοξυλομάδες, υδροξυλομάδες, αμινομάδες, φωσφορικές/ φωσφονικές ομάδες και καρβονυλομάδες. Τα προφάρμακα που παράγονται μέσω της τροποποίησης των ομάδων αυτών είναι συνήθως εστέρες, ανθρακικά άλατα, καρβαμιδικά, αμίδια, φωσφορικά άλατα και ιμίνες (Rautio et al., 2008). Όπως αναφέρθηκε στην προηγούμενη ενότητα, η χρήση της μελφαλάνης στη χημειοθεραπεία του καρκίνου περιορίζεται από ανεπιθύμητες παρενέργειες, οι οποίες σχετίζονται με τη χημική της ενεργότητα in vivo. Για το λόγο αυτό, έγινε προσπάθεια παρασκευής νέων φαρμακευτικών στεροειδών παραγώγων της μελφαλάνης, με σκοπό τη βελτίωση της βιοδιαθεσιμότητάς της, την αύξηση της επιλεκτικότητας της δράσης της και τη μείωση της τοξικότητας απέναντι στα υγιή κύτταρα. Τα καινοτόμα αυτά βιοδραστικά προϊόντα είναι αποτέλεσμα ορθολογικού σχεδιασμού φαρμάκων και εμπεριέχουν την εμπειρία της σχεδόν τριακονταετούς ερευνητικής πορείας της ερευνητικής ομάδας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Συντέθηκαν στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών και μετά την επιβεβαίωση των τελικών δομών με σύγχρονες φασματοσκοπικές μεθόδους οι ενώσεις μελετήθηκαν ως προς τις αντινεοπλαστικές τους ιδιότητες. Οι μελέτες έγιναν στο Θεαγένειο Αντικαρκινικό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης. Τόσο από in vivo (P388, L1210, adv. L1210), όσο και από in vitro πειράματα καταγράφηκε σαφέστατη και σημαντική μείωση της τοξικότητάς τους, ενώ ταυτόχρονα η αποτελεσματικότητά τους ήταν ιδιαίτερα αυξημένη. Η χημική σύνθεση, η ταυτοποίηση και οι φαρμακολογικές ιδιότητες αυτών των ενώσεων αποτέλεσαν αντικείμενο συγγραφής μιας ενιαίας μελέτης για την οποία η διεκδίκηση της κατοχύρωσης των πνευματικών δικαιωμάτων βρίσκεται σε εξέλιξη (Προσωπική επικοινωνία με Σ. Νικολαρόπουλο). Η βασική τροποποίηση περιλαμβάνει την πρόσδεση ενός στεροειδικού σκελετού μέσω εστερικών δεσμών στο μόριο της μελφαλάνης. Ο στεροειδικός σκελετός αποτελεί έναν φορέα για την αποτελεσματικότερη μεταφορά της αλκυλιωτικής ομάδας στις θέσεις στόχους του DNA, ενισχύοντας έτσι την αντινεοπλασματική δράση της μελφαλάνης. Με επιπλέον τροποποιήσεις σε συγκεκριμένους δακτύλιους του στεροειδικού σκελετού προέκυψαν τα τέσσερα νέα χημικά ανάλογα της μελφαλάνης SN-A, SN-B, SN-C και SN-D. 36

37 Εικόνα 2.4.: Σύνθεση των SN-A, SN-B, SN-C, SN-D. (Η χημική δομή των τελικών προϊόντων που μελετήθηκαν δεν παρουσιάζεται με ακρίβεια στην παρούσα μελέτη, καθότι τα παράγωγα αυτά ανήκουν σε μια ευρύτερη κατηγορία νεοσυντεθέντων και καινοτόμων προϊόντων, για τη σύνθεση και τις φαρμακολογικές ιδιότητες των οποίων πρόκειται να διεκδικηθεί η κατοχύρωση των πνευματικών δικαιωμάτων.) 37

38 3. ΒΛΑΒΕΣ ΤΟΥ DNA 3.1. Γενικά Οι βλάβες στο DNA αποτελούν τη σοβαρότερη συνέπεια του οξειδωτικού στρες στον οργανισμό, οδηγώντας σε εκφυλιστικές διαδικασίες, όπως η γήρανση και ο καρκίνος (Boiteux & Guillet, 2004). Το DNA μπορεί να τροποποιηθεί με πολλούς τρόπους, οι οποίοι οδηγούν σε μεταλλάξεις και γονιδιωματική αστάθεια. Οι βλάβες του DNA διαφέρουν από τις μεταλλάξεις εφόσον δεν πρόκειται για αλλαγές στην αλληλουχία των βάσεων, αλλά για ανωμαλίες που διαταράσσουν τη χημική δομή του DNA. Οι διάφορες μορφές βλαβών του DNA προκαλούνται από εξωγενείς ή ενδογενείς χημικούς παράγοντες. Οι βλάβες που συμβαίνουν ενδογενώς προκύπτουν από μεταβολικές ή υδρολυτικές διαδικασίες που συμβαίνουν φυσιολογικά στα κύτταρα. Στην πλειονότητά τους ωστόσο, προκαλούνται από έκθεση σε εξωγενείς παράγοντες, όπως η ακτινοβολία, οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες που περιέχονται σε ατμοσφαιρικούς ρύπους (καπνός του τσιγάρου, καυσαέρια) και οι χημικές φαρμακευτικές ενώσεις. Οι βλάβες του DNA περιλαμβάνουν μονόκλωνα ρήγματα, δίκλωνα ρήγματα, απουρινινκές/απυριμιδινικές θέσεις, οξείδωση ή αλκυλίωση των βάσεων, προσθήκη ογκωδών χημικών ομάδων στο DNA, μέσω ομοιοπολικής σύνδεσης με τις βάσεις του, δημιουργία χιαστί δεσμών στη μια αλυσίδα του DNA (όπως π.χ. διμερισμός των γειτονικών πυριμιδίνων), δημιουργία χιαστί ομοιοπολικών δεσμών ανάμεσα στις αλυσίδες του DNA, καθώς και ομοιοπολικών δεσμών ανάμεσα στο DNA και τις πρωτεΐνες. Επιπλέον, μπορεί να συμβούν λανθασμένες συνδέσεις λόγω μη σωστής ευθυγράμμισης των μικρο-δορυφορικών επαναλήψεων και λόγω λαθών κατά την αντιγραφή, ιδιαίτερα όταν προκύψει μια απουρινική/απυριμιδινική θέση ή μια τροποποιημένη βάση (λόγω οξείδωσης, αλκυλίωσης ή προσθήκης σε αυτήν κάποιας χημικής ομάδας) κατά την αντιγραφή του DNA (Langie et al., 2015). Παρακάτω γίνεται συνοπτική αναφορά στα κυριότερα είδη των βλαβών του DNA. 38

39 3.2. Χρωμοσωματικά ρήγματα Μονόκλωνα χρωμοσωματικά ρήγματα Τα μονόκλωνα χρωμοσωματικά ρήγματα (Single-Strand Breaks, SSBs) αποτελούν τον πιο συχνό τύπο βλάβης στο DNA, αν αναλογιστεί κανείς ότι καθημερινά δημιουργούνται χιλιάδες τέτοια ρήγματα σε κάθε κύτταρο. Προκύπτουν από λάθη που συμβαίνουν κατά την επιδιόρθωση βλαβών με το μηχανισμό εκτομής βάσεων και συνδέονται με κληρονομικές νευροεκφυλιστικές ασθένειες. Ακόμη μπορεί να προκύψουν από τη δράση ελεύθερων ριζών που παράγονται ως μεταβολίτες, είτε από αυθόρμητη φθορά του DNA. Η έκθεση σε ιονίζουσες ακτινοβολίες, αντικαρκινικά φάρμακα, περιβαλλοντικούς τοξικούς παράγοντες και αναστολείς της τοποϊσομεράσης Ι οδηγούν επίσης στη δημιουργία αυτών των ρηγμάτων (Caldecott, 2008) Δίκλωνα χρωμοσωματικά ρήγματα Αν και λιγότερο συχνά σε σύγκριση με τα μονόκλωνα ρήγματα, τα δίκλωνα χρωμοσωματικά ρήγματα (Double-Strand Breaks, DSBs) αποτελούν μια από τις πιο κυτταροτοξικές μορφές βλάβης του γενετικού υλικού, εφόσον πλήττονται ταυτόχρονα και οι δύο κλώνοι του DNA. Προκαλούν βλάβες στην αντιγραφή του DNA, οι οποίες αν δεν επιδιορθωθούν οδηγούν σε γονιδιωματική αστάθεια (Mehta & Haber, 2014). Οι βλάβες αυτές μπορεί να οδηγήσουν σε καρκίνο, νευροεκφυλιστικές ασθένειες, ανοσοανεπάρκεια και στειρότητα (Polo & Jackson, 2011). Δημιουργούνται ως αποτέλεσμα έκθεσης των κυττάρων σε ελεύθερες ρίζες, ιονίζουσες ακτινοβολίες, χημικά αντικαρκινικά φάρμακα που παράγουν δραστικές μορφές οξυγόνου και σε αναστολείς της τοποϊσομεράσης ΙΙ. Η ιονίζουσα ακτινοβολία, όπως αναφέρθηκε, οδηγεί στο σχηματισμό μονόκλωνων χρωμοσωματικών ρηγμάτων, τα οποία είναι δυνατό να μετατραπούν σε δίκλωνα όταν υπάρχουν δύο εγκοπές στους συμπληρωματικούς κλώνους του DNA μέσα σε μια στροφή της έλικας, κάτι που παρατηρείται σε υψηλές δόσεις ακτινοβολίας (Milligan et al. 1995). Επίσης, δίκλωνα ρήγματα σχηματίζονται και κατά την αντιγραφή του DNA, ως αποτέλεσμα της επιδιόρθωσης κάποιας βλάβης, κατά τον ανασυνδυασμό των ομόλογων χρωμοσωμάτων στη μείωση, καθώς και κατά τον ανασυνδυασμό V(D)J των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών και των υποδοχέων των T- λεμφοκυττάρων, που λαμβάνει χώρα κατά την ωρίμανση των λεμφοκυττάρων (Sancar et al., 2004). Μπορούν ακόμη να σχηματιστούν και 39

40 κατά την απόπτωση, την ενσωμάτωση ρετροϊών στο γενετικό υλικό ή στα άκρα των χρωμοσωμάτων λόγω ατελούς βράχυνσης των τελομερών (Polo & Jackson, 2011) Απουρινικές/Απυριμιδινικές θέσεις Οι απουρινικές/απυριμιδινικές θέσεις (apurinic/apyrimidinic sites, ΑΡ sites) αποτελούν μία από τις πιο συχνές βλάβες στο DNA. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, τουλάχιστον βάσεις χάνονται κάθε μέρα σε ένα κύτταρο θηλαστικού, ενώ μελέτες δείχνουν ότι στο γονιδίωμα των φυσιολογικών ηπατικών κυττάρων του ανθρώπου απαντώνται περίπου (ΑΡ) θέσεις (Nakamura & Swenberg, 1999). Σχηματίζονται αυθόρμητα μέσω υδρόλυσης του Ν- γλυκοζιτικού δεσμού που συνδέει τις βάσεις με την πεντόζη. Επιπλέον, δημιουργούνται λόγω της απομάκρυνσης αλκυλιωμένων, οξειδωμένων και γενικά τροποποιημένων βάσεων από τις DNA N- γλυκοζυλάσες, κατά την επιδιόρθωση με το μηχανισμό εκτομής βάσεων (Boiteux and Guillet, 2004). Ευθύνονται για την πρόκληση μεταλλάξεων, όπως π.χ. αντικαταστάσεις βάσεων, μπλοκάρουν την αντιγραφή και τη μεταγραφή του DNA, ενώ μπορεί να οδηγήσουν και στο θάνατο. Είναι επίσης υπεύθυνες για τη δημιουργία μονόκλωνων χρωμοσωματικών ρηγμάτων, χάρη στη δράση AP ενδονουκλεασών, τα οποία στη συνέχεια ενδέχεται να μετατραπούν σε πολύ τοξικά δίκλωνα ρήγματα (Boiteux and Guillet, 2004) Χιαστί δεσμοί Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι χιαστί δεσμοί (cross-links) μπορεί να δημιουργηθούν είτε στον ίδιο κλώνο DNA (ενδομοριακοί, intrastrand cross-links), είτε ανάμεσα σε δύο συμπληρωματικούς κλώνους DNA (διαμοριακοί, interstrand cross-links), είτε ανάμεσα σε μια βάση του DNA και την ενεργή ομάδα μιας πρωτεΐνης (DNA-protein cross-links). Οι χιαστί δεσμοί οφείλονται σε μια ποικιλία παραγόντων, όπως περιβαλλοντικοί παράγοντες, ανεπιθύμητα προϊόντα του μεταβολισμού, καθώς και θραυσματογόνες ενώσεις. Οι θραυσματογόνες ενώσεις προκαλούν σοβαρές βλάβες στα χρωμοσώματα, όπως χρωμοσωματικά ρήγματα, χρωμοσωματικές αναδιατάξεις, ανταλλαγές μεταξύ αδελφών χρωματιδίων και απώλειες χρωμοσωμάτων. Στις θραυσματογόνες ενώσεις ανήκουν οι αλκυλιωτικοί παράγοντες, οι οποίοι σχηματίζουν σύμπλοκα με το DNA μέσω ομοιοπολικής 40

41 σύνδεσής τους σε βάσεις και των δύο κλώνων, οδηγώντας τελικά στη δημιουργία διαμοριακών χιαστί δεσμών (interstrand cross-links). Οι δεσμοί αυτοί εμποδίζουν τον αποχωρισμό των δύο κλώνων του DNA, εμποδίζοντας έτσι την αντιγραφή και τη μεταγραφή του, οδηγώντας ακόμη και στο θάνατο. Έχει υπολογιστεί ότι μόλις 20 χιαστί δεσμοί μπορεί να αποβούν θανατηφόροι αν δεν επιδιορθωθούν (Noll et al., 2006) Οξείδωση των βάσεων του DNA Η οξειδωτική βλάβη του DNA είναι μια αναπόφευκτη συνέπεια του κυτταρικού μεταβολισμού. Οι μη παθολογικές κυτταρικές διαδικασίες του μεταβολισμού αποτελούν την κύρια πηγή ενδογενών δραστικών μορφών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS) που ευθύνονται για την πρόκληση οξειδωτικού στρες στα υγιή κύτταρα. Οι δραστικές μορφές οξυγόνου σχετίζονται με διάφορες παθολογικές καταστάσεις όπως ο καρκίνος, η γήρανση, νευροεκφυλιστικές παθήσεις, η ρευματοειδής αρθρίτιδα κλπ. (Jena, 2012). Οι βασικότερες δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS) που παράγονται ενδογενώς ως παραπροϊόντα του μεταβολισμού των κυττάρων είναι τα ανιόντα σουπεροξειδίου ( Ο2 - ), το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) και η ρίζα υδροξυλίου ( ΟΗ). Η κυριότερη πηγή ROS στον άνθρωπο είναι η διαρροή ενεργοποιημένου οξυγόνου από τα μιτοχόνδρια, το οποίο φυσιολογικά εμφανίζεται ως ενδιάμεσο κατά τη διάρκεια της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και η τελική του τύχη είναι ο σχηματισμός μορίων νερού. Οι αλυσίδες μεταφοράς ηλεκτρονίων προκαλούν διαρροή ηλεκτρονίων στο μοριακό οξυγόνο (O2), με αποτέλεσμα το σχηματισμό ανιόντων σουπεροξειδίου ( Ο2 - ). Τα ανιόντα αυτά στη συνέχεια μετατρέπονται σε υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) μέσω μιας αντίδρασης που καταλύεται από το ένζυμο δισμουτάση του σουπεροξειδίου (Jena, 2012). Δραστικές μορφές οξυγόνου απελευθερώνονται επίσης και από τα φαγοκύτταρα, προκειμένου να καταστρέψουν κύτταρα που έχουν μολυνθεί από ιούς ή βακτήρια, επηρεάζοντας πολλές φορές και παρακείμενους ιστούς. Τα υπεροξειδιοσώματα ευθύνονται για την παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου (H2O2), έχουν ωστόσο την ικανότητα να αδρανοποιούν αυτήν την ένωση με την βοήθεια ενζύμου που την μετατρέπει σε νερό (H2O). Υπεροξείδιο του υδρογόνου παράγεται επίσης και από διάφορα ένζυμα του κυττάρου, μεταξύ των οποίων αρκετές οξειδάσες. Οι ROS επίσης μπορούν να δημιουργηθούν λόγω έκθεσης σε ιονίζουσα ή υπεριώδη ακτινοβολία ή σε χημικές ενώσεις που συμμετέχουν σε αντιδράσεις οξειδοαναγωγής (Cooke et al., 2003). 41

42 Ανεξάρτητα από την προέλευσή τους οι ROS, μπορούν να αλληλεπιδρούν με διάφορα βιομόρια, όπως το DNA, προκαλώντας τροποποιήσεις στις βάσεις του, με δυνητικά σοβαρές συνέπειες για το κύτταρο. Προκαλούν οξειδωτική βλάβη τόσο στο πυρηνικό, όσο και στο μιτοχονδριακό DNA. Οι ελεύθερες ρίζες υδροξυλίου είτε αποσπούν ένα άτομο Η από τις βάσεις ή τα σάκχαρα του DNA είτε προστίθενται στους διπλούς δεσμούς ανάμεσα στις βάσεις του DNA. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ασταθών ενδιάμεσων προϊόντων, τα οποία μετά από διαδοχικές μοριακές μετατροπές οδηγούν στη δημιουργία σταθερών τροποποιημένων βάσεων. Οι τροποποιημένες βάσεις που δημιουργούνται με αυτόν τον τρόπο ενδέχεται να αλληλεπιδρούν με αμινοξέα γειτονικών πρωτεϊνών, με τις οποίες συνδέονται με ομοιοπολικούς χιαστί δεσμούς (DNA-protein cross-links). H επιδιόρθωση των βλαβών αυτών είναι πολύ σημαντική για την αποφυγή μεταλλάξεων που οδηγούν σε καρκινογένεση (Kryston et al., 2011). 42

43 4. ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΒΛΑΒΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ 4.1. Επιδιορθωτικοί μηχανισμοί Για να μπορέσουν τα κύτταρα να αντιμετωπίσουν τις πολυάριθμες βλάβες και τροποποιήσεις που υφίσταται το γενετικό υλικό, έχουν αναπτύξει διάφορους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς. Τα λάθη και οι βλάβες που δεν επιδιορθώνονται, συνήθως οδηγούν στην εμφάνιση ασθενειών, αλλά μακροπρόθεσμα μπορεί να συμβάλλουν σε διεργασίες όπως η εξέλιξη και η φυσική επιλογή, μέσα από τη συσσώρευση πολλών μεταλλάξεων (Clancy, 2008). Υπάρχουν πολλές γενετικές ασθένειες του ανθρώπου που σχετίζονται με λάθη που συμβαίνουν κατά την επιδιόρθωση των βλαβών του γενετικού υλικού, οι οποίες επηρεάζουν πολλά συστήματα του οργανισμού και όλες συνδέονται με προδιάθεση για εμφάνιση καρκίνου. Σ αυτές συμπεριλαμβάνονται η αταξία-τηλαγγειεκτασία (ΑΤ), μια νευροεκφυλιστική πάθηση που οφείλεται στην αδυναμία επιδιόρθωσης της οξειδωτικής βλάβης στην παρεγκεφαλίδα, καθώς και η μελαγχρωματική ξηροδερμία (Χeroderma Pigmentosum, XP) που χαρακτηρίζεται από φωτοευαισθησία και συνδέεται με ελαττωματική επιδιόρθωση των διμερών πυριμιδινών που προκύπτουν από τη δράση της υπεριώδους ακτινοβολίας. Αξίζει ακόμη να σημειωθεί ότι τα γονίδια της οικογένειας RAD, τα οποία εμπλέκονται στην εμφάνιση καρκίνου, κωδικοποιούν πρωτεΐνες που συμμετέχουν στα επιδιορθωτικά συστήματα των βλαβών του DNA (Clancy, 2008). Παρακάτω περιγράφονται οι κύριοι μηχανισμοί επιδιόρθωσης του DNA: 1. Άμεση επιδιόρθωση (Direct Repair). Ο μηχανισμός αυτός περιλαμβάνει την άμεση απομάκρυνση της βάσης που έχει υποστεί βλάβη, με τη συμμετοχή ενζύμων που απομακρύνουν αλκυλιωτικές ομάδες από τις βάσεις του DNA και ονομάζονται ακυλοτρανσφεράσες (Sancar et al., 2004). Χαρακτηριστικά παραδείγματα είναι η αφαίρεση της μεθυλομάδας από την Ο 6 -μεθυλγουανίνη (O 6 MeGua) μέσω μιας ειδικής μεθυλοτρανσφεράσης που υπάρχει σχεδόν σε όλα τα είδη, και η απομάκρυνση των διμερών θυμίνης που δημιουργούνται από τη δράση της υπεριώδους ακτινοβολίας, με τη βοήθεια της φωτολυάσης, ενός ενζύμου που υπάρχει κατά κύριο λόγο στα βακτήρια (Sinha & Hader, 2002). 2. Επιδιόρθωση με εκτομή βάσεων (Base Excision Repair, BER). Σ αυτόν τον τύπο επιδιόρθωσης συμμετέχουν ειδικά ένζυμα που καλούνται DNA γλυκοζυλάσες και είναι υπεύθυνες για την απομάκρυνση τροποποιημένων βάσεων από το DNA, οδηγώντας στη 43

44 δημιουργία απουρινικής/απυριμιδινικής θέσης (AP site). Οι DNA γλυκοζυλάσες αναγνωρίζουν μια μεγάλη ποικιλία τροποποιήσεων που μπορεί να υποστούν οι βάσεις, όπως οξείδωση ή αναγωγή, αλκυλίωση (συνήθως μεθυλίωση), απαμίνωση, υδροξυλίωση, καθώς και περιπτώσεις λανθασμένου ζευγαρώματος των βάσεων. Υπάρχουν π.χ. γλυκοζυλάσες που αναγνωρίζουν ενσωματωμένες ουρακίλες στο DNA (uracil-dna glycosylase), αλκυλιωμένες πουρίνες (methyl-purine glycosylase) κλπ. (Sancar et al., 2004). 3. Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίων (Nucleotide Excision Repair, NER). Πρόκειται για το κυριότερο σύστημα επιδιόρθωσης βλαβών σε σχετικά μεγάλες περιοχές του DNA, είτε λόγω έκθεσης σε ακτινοβολίες ή εξωγενείς χημικούς παράγοντες είτε λόγω σύνδεσης κάποιας πρωτεΐνης στο DNA. Οι τροποποιημένες βάσεις απομακρύνονται από ειδικές νουκλεάσες, ένζυμα με πολλές υπομονάδες, που δημιουργούν εγκοπές στις περιοχές εκατέρωθεν της βλάβης. Οι νουκλεάσες αυτές απομακρύνουν επίσης και βλάβες που αφορούν μεμονωμένες βάσεις. Λόγω του μεγάλου φάσματος υποστρωμάτων, αυτός ο μηχανισμός επιδιόρθωσης δεν αναγνωρίζει τις συγκεκριμένες χημικές ομάδες που ευθύνονται για την πρόκληση των βλαβών, ωστόσο πιστεύεται ότι αναγνωρίζει τις τροποποιήσεις που προκαλούνται στα νουκλεοτίδια (Sancar et al., 2004). 4. Επιδιόρθωση λανθασμένων ζευγών βάσεων (MisMatch Repair MMR). Αυτό το σύστημα επιδιόρθωσης αφορά την απομάκρυνση βάσεων οι οποίες δεν έχουν συζευχθεί σωστά είτε λόγω τροποποίησής τους (μεθυλίωση, οξείδωση, απαμίνωση), είτε από λάθη που προκύπτουν κατά την αντιγραφή του DNA, είτε λόγω φαινομένων ανασυνδυασμού. Οι λανθασμένες βάσεις αναγνωρίζονται και απομακρύνονται από ένα σύστημα νουκλεασών, οι οποίες δημιουργούν εγκοπές στον έναν κλώνο του DNA και στη συνέχεια γίνεται πλήρωση του κενού με τα σωστά νουκλεοτίδια (Fu et al., 2012). 5. Επιδιόρθωση δίκλωνων ρηγμάτων (Double-Strand Break Repair DSBR). Τα δίκλωνα ρήγματα του DNA επιδιορθώνονται είτε με ομόλογο ανασυνδυασμό (Homologous Recombination HR) είτε με μη ομόλογο ανασυνδυασμό με ένωση των άκρων (Non Homologous End Joining NHEJ) (Sancar et al., 2004). Στον ομόλογο ανασυνδυασμό (HR) τα τμήματα του DNA που έχουν προκύψει από τη δημιουργία του ρήγματος, μπορούν να επιδιορθωθούν χρησιμοποιώντας ως μήτρα τα άθικτα συμπληρωματικά τμήματα της αδελφής χρωματίδας, του ομόλογου χρωμοσώματος, είτε του ίδιου του χρωμόσωματος στο οποίο ανήκουν, σε περίπτωση που υπάρχουν αντίγραφά τους στο ίδιο χρωμόσωμα, προσανατολισμένα σε αντίθετες κατευθύνσεις. Ο μη ομόλογος ανασυνδυασμός με ένωση των άκρων (NHEJ) περιλαμβάνει την άμεση σύνδεση των κομμένων τμημάτων του DNA. Αυτό επιτυγχάνεται με την πρόσδεση μιας 44

45 ομάδας ενζύμων και στα δύο άκρα του σπασμένου μορίου του DNA, τα οποία σχηματίζουν μια μοριακή γέφυρα που τα φέρνει σε επαφή. Τα άκρα ακολούθως ενώνονται με τη βοήθεια μιας λιγάσης ( Επιδιόρθωση με εκτομή βάσεων (Base Excision Repair, BER) Η επιδιόρθωση με εκτομή βάσεων (Base Excision Repair, BER) αποτελεί τον κύριο μηχανισμό επιδιόρθωσης βλαβών που οφείλονται στον κυτταρικό μεταβολισμό, όπως π.χ. οι βλάβες που δημιουργούνται από τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου. Επιπλέον, όπως αναφέρθηκε και στην προηγούμενη ενότητα, έχει μεγάλη σημασία για την επιδιόρθωση του αλκυλιωμένου γενετικού υλικού και κατ επέκταση για την προστασία του κυττάρου από μεταλλάξεις. Συγκεκριμένα, οι τροποποιημένες βάσεις σε θέσεις οξυγόνου που προκύπτουν από τη δράση αλκυλιωτικών παραγόντων μπορεί να ζευγαρώσουν λανθασμένα κατά την αντιγραφή του γενετικού υλικού, με συνέπεια την εμφάνιση μεταλλάξεων. Επίσης, η αλκυλίωση πουρινών στις θέσεις N 7 G και N 3 A οδηγεί στο σχηματισμό απουρινικών θέσεων, εξαιτίας του ασθενούς γλυκοζιτικού δεσμού, κάτι που μπορεί να προκαλέσει μεταλλάξεις όταν στις θέσεις αυτές γίνει λανθασμένη αντικατάσταση βάσης (Jenkins et al., 2005). Τα κυριότερα βήματα του μηχανισμού επιδιόρθωσης με εκτομή βάσεων σύμφωνα με τους Kim και Wilson (2012), είναι τα εξής: 1. Αναγνώριση και απομάκρυνση της λανθασμένης ή τροποποιημένης βάσης. Το πρώτο βήμα κατά την επιδιόρθωση με εκτομή βάσεων πραγματοποιείται από τις DNA γλυκοζυλάσες, οι οποίες αναγνωρίζουν και απομακρύνουν τροποποιημένες βάσεις ή βάσεις που έχουν ενσωματωθεί κατά λάθος στο DNA (π.χ. ουρακίλη). Τα ένζυμα αυτά καταλύουν την υδρόλυση του Ν-γλυκοζιτικού δεσμού που συνδέει τη βάση με το σάκχαρο της δεσοξυριβόζης, δημιουργώντας έτσι μια απουρινική ή απυριμιδινική θέση (AP site). Υπάρχουν πολλές γλυκοζυλάσες, με διαφορετική εξειδίκευση όσον αφορά τη βάση που απομακρύνουν. Προκειμένου να εντοπίσουν το σημείο της βλάβης, τα ένζυμα αυτά διατρέχουν το DNA και προκαλούν αναστροφή στο σημείο της βλάβης. Με τον τρόπο αυτό η βάση που φέρει τη βλάβη εξέρχεται από τη διπλή έλικα του DNA και εισέρχεται στο κέντρο πρόσδεσης του ενζύμου. 2. Δημιουργία μονόκλωνου ρήγματος. Μετά την απομάκρυνση της βάσης, μια AP ενδονουκλεάση ή AP λυάση διασπά το φωσφοδιεστερικό δεσμό στην AP θέση, δημιουργώντας με αυτόν τον τρόπο ένα μονόκλωνο ρήγμα. Η κυριότερη AP ενδονουκλεάση των θηλαστικών είναι η APE1, της οποίας η δράση ενισχύεται από τα ιόντα Mg 2+. Η 45

46 διάσπαση του φωσφοδιεστερικού δεσμού σε κάποιες περιπτώσεις καταλύεται και από DNA γλυκοζυλάσες που έχουν ενεργότητα AP λυάσης. 3. Καθαρισμός αντισυμβατικών άκρων. Αντισυμβατικά 5 ή 3 άκρα στο DNA μπορεί να προκύψουν εκτός από τη δημιουργία μονόκλωνου ρήγματος που προκαλείται είτε από τη δράση AP ενδονουκλεασών είτε από τη δράση διλειτουργικών DNA γλυκοζυλασών, και από έκθεση σε δραστικές μορφές οξυγόνου ή ιονίζουσα ακτινοβολία. Τέτοια άκρα, όπως π.χ. 5 - drp, 5 -OH, 3 -PO4, 3 -PG, δεν επιτρέπουν στην DNA πολυμεράση να επιδιορθώσει το ρήγμα, και ως εκ τούτου πρέπει να «καθαριστούν». Στα θηλαστικά, υπάρχουν ειδικές πρωτεΐνες (PARP, PNK) που απομακρύνουν αυτά τα άκρα. 4. Εισαγωγή νουκλεοτιδίων. Οι DNA πολυμεράσες είναι τα ένζυμα που αναλαμβάνουν το ρόλο της συμπλήρωσης των κενών. Τα ένζυμα αυτά απαιτούν την ύπαρξη ενός πρωταρχικού τμήματος με μια 3'-OH ομάδα, στο οποίο θα αρχίσουν να προσθέτουν τα σωστά νουκλεοτίδια. Πολλές DNA πολυμεράσες διαθέτουν επίσης ενεργότητα εξωνουκλεάσης, απομακρύνοντας τροποποιημένα ή μη συμπληρωματικά νουκλεοτίδια αμέσως μετά το σχηματισμό του φωσφοδιεστερικού δεσμού και πριν την προσθήκη του επόμενου νουκλεοτιδίου. Ο μηχανισμός επιδιόρθωσης με εκτομή βάσεων αποτελείται από δύο μονοπάτια. Το βραχύβιο (Short-Patch BER, SP-BER) και το μακροχρόνιο (Long-Patch BER, LP-BER). Στο βραχύβιο μονοπάτι (SP-BER) τα κενά που επιδιορθώνονται περιλαμβάνουν 1-2 βάσεις, ενώ στο μακροχρόνιο (LP-BER) τα κενά που προκύπτουν έχουν μεγαλύτερο μήκος (2-12 βάσεις). Στα θηλαστικά κυριαρχεί το βραχύβιο μονοπάτι (SP-BER), κατά το οποίο η DNA πολυμεράση β (Polβ) απομακρύνει το 5 τελικό άκρο της δεσοξυριβόζης, με την ενεργότητα λυάσης που διαθέτει, και στη συνέχεια συμπληρώνει το κενό προσθέτοντας ένα μόνο νουκλεοτίδιο. Κατά το μακροχρόνιο μονοπάτι (LP-BER), η Polβ απομακρύνεται μετά την εισαγωγή του πρώτου νουκλεοτιδίου, και την πλήρωση του κενού αναλαμβάνουν οι πολυμεράσες δ (Polδ) και ε (Polε), σε συνεργασία με το πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA). Ακολούθως, η ενδονουκλεάση FEN1 (Flap Endonuclease 1) αναλαμβάνει την απομάκρυνση του 5 άκρου του νεοσυντιθέμενου τμήματος, που προεξέχει. Αξίζει να σημειωθεί ότι η επιλογή ανάμεσα στα δύο αυτά μονοπάτια καθορίζεται, εν μέρει, από τη σχετική συγκέντρωση του ATP. Έτσι, αν η συγκέντρωση του ATP είναι υψηλή, τότε ακολουθείται το βραχύβιο μονοπάτι (SP-BER), ενώ στην αντίθετη περίπτωση, 46

47 όταν δηλαδή η συγκέντρωση του ATP είναι χαμηλή, ακολουθείται το μακροχρόνιο μονοπάτι (LP-BER). Άλλοι παράγοντες που επηρεάζουν αυτή την επιλογή είναι επίσης το είδος της βλάβης του DNA, οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, το στάδιο του κυτταρικού κύκλου, καθώς και το αν το κύτταρο έχει διαφοροποιηθεί πλήρως ή όχι. Για παράδειγμα, κάποιες βλάβες στο DNA όπως π.χ. οξειδωμένες ή ανηγμένες AP θέσεις, δεν απομακρύνονται από την Polβ, με αποτέλεσμα να επιλέγεται το μακροχρόνιο μονοπάτι (LP-BER). 5. Ένωση του νεοσυντιθέμενου τμήματος με τον υπόλοιπο κλώνο. Το τελικό βήμα του μηχανισμού αυτού περιλαμβάνει τη δημιουργία ομοιοπολικού φωσφοδιεστερικού δεσμού ανάμεσα στο νεοσυντιθέμενο τμήμα του DNA και στον υπόλοιπο κλώνο. Τα ένζυμα που καταλύουν την αντίδραση αυτή, οι DNA λιγάσες, χρησιμοποιούν την ενέργεια της υδρόλυσης του ATP για τη δημιουργία του φωσφοδιεστερικού δεσμού. Η DNA λιγάση Ι (DNA ligase I, LIGI) συμμετέχει στο μακροχρόνιο μονοπάτι (LP-BER) αλληλεπιδρώντας με το σύμπλοκο PCNA, ενώ η DNA λιγάση ΙΙΙα (LIGIIIα) συμμετέχει αποκλειστικά στο βραχύβιο μονοπάτι (SP-BER) και η αλληλεπίδρασή της με την πρωτεΐνη XRCC1 αυξάνει τη δραστικότητα και τη σταθερότητά της. Εικόνα 4.2.: Μηχανισμός επιδιόρθωσης με εκτομή βάσεων. (Προσαρμογή από 47

48 4.3. Κυτοσίνη της αραβινοσίδης Η κυτοσίνη της αραβινοσίδης (Cytosine Arabinoside, ARA-C) χρησιμοποιείται ως αντικαρκινικό φάρμακο στη χημειοθεραπεία της οξείας μυελογενούς λευχαιμίας και του Non-Hodgkin λεμφώματος. Είναι χημικό ανάλογο της κυτιδίνης, και αποτελείται από την αζωτούχο βάση κυτοσίνη και από το σάκχαρο αραβινόζη. Εικόνα 4.3.α.: Χημική δομή της κυτοσίνης της αραβινοσίδης (ARA-C). (Kar, 2003) Η ARA-C εκδηλώνει την κυτταροτοξική της δράση παρεμβαίνοντας στη σύνθεση του DNA που λαμβάνει χώρα κατά την S φάση του κυτταρικού κύκλου και ως εκ τούτου τα κύτταρα που βρίσκονται στην S φάση είναι περισσότερο ευαίσθητα στη δράση της (S phasespecific drug) (Clementi & Fumagalli, 2015). Επιπλέον, επεμβαίνει στον μηχανισμό επιδιόρθωσης τροποποιημένων βάσεων με εκτομή. Συγκεκριμένα, μετά την εκτομή της τροποποιημένης βάσης, η ARA-C ενσωματώνεται στο DNA και εμποδίζει την DNA πολυμεράση να προσθέσει τα σωστά νουκλεοτίδια για την πλήρωση του κενού (gap-filling). Δημιουργείται έτσι ένα μονόκλωνο ρήγμα, το οποίο μετά από τη σύνθεση του DNA μετατρέπεται σε δίκλωνο. Το άκεντρο χρωμοσωματικό θραύσμα που προκύπτει μετατρέπεται στη συνέχεια σε μικροπυρήνα, μετά από έναν κύκλο αντιγραφής του DNA (Fenech, 2000). Η κυτοσίνη της αραβινοσίδης χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με τη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης (Cytokinesis Block Micronucleus Assay CBMN/ARA-C), για την ανίχνευση βλαβών οι οποίες επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής τροποποιημένων βάσεων. Η μέθοδος αυτή περιγράφεται σε επόμενη ενότητα. 48

49 Εικόνα 4.3.β.: Σχηματική απεικόνιση του μηχανισμού μετατροπής μιας τροποποιημένης βάσης που επιδιορθώνεται με εκτομή σε μικροπυρήνα, υπό την επίδραση της ARA-C, μέσα σε έναν κυτταρικό κύκλο. (Προσαρμογή από Fenech, 2007). 49

50 5. ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ 5.1. Γενικά Για κάθε κύτταρο υπάρχει η ζωή, αλλά και ο θάνατος. Ο κυτταρικός θάνατος είναι απαραίτητος για τη διατήρηση της ισορροπίας των κυτταρικών πληθυσμών στον ώριμο οργανισμό. Ο κυτταρικός θάνατος μπορεί να είναι αποτέλεσμα της φυσικής διαδικασίας κατά την οποία τα γερασμένα κύτταρα πεθαίνουν και αντικαθίστανται από νέα ή μπορεί να προκύπτει από παράγοντες όπως κάποια ασθένεια, τοπική βλάβη ή ο θάνατος του οργανισμού, του οποίου τα κύτταρα αποτελούν μέρος. Έχουν περιγραφεί τέσσερις κύριες κατηγορίες κυτταρικών διεργασιών που οδηγούν στον κυτταρικό θάνατο, στις οποίες περιλαμβάνονται: η απόπτωση, η νέκρωση, η αυτοφαγία και η μιτωτική καταστροφή. Οι τύποι αυτοί βασίζονται σε διακριτά βιοχημικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά που εμφανίζει ένα κύτταρο που οδηγείται στο θάνατο. Δύο από αυτούς τους τύπους, η απόπτωση και η αυτοφαγία, θεωρούνται ως προγραμματισμένες διεργασίες και υπόκεινται σε απόλυτο γενετικό έλεγχο. Η νέκρωση και η μιτωτική καταστροφή θεωρούνται παθητικές κυτταρικές αποκρίσεις σε εκτεταμένες βλάβες. Ωστόσο, νέα δεδομένα υποστηρίζουν ότι αυτοί οι τύποι κυτταρικού θανάτου πιθανότατα να ελέγχονται γενετικά. Η γήρανση, θεωρείται επίσης ένας τύπος κυτταρικού θανάτου που παρατηρείται στα πλαίσια της χημειοθεραπείας. Η γήρανση αποτελεί μία βασική διεργασία που σχετίζεται με την ηλικία και ακολουθεί μία διαδικασία κατευθυνόμενη από γονίδια, η οποία περιλαμβάνει την καταστροφή των τελομερών και την ενεργοποίηση μονοπατιών ογκοκαταστολής. Η απορρύθμιση των μονοπατιών μεταγωγής που ελέγχουν έναν από τους παραπάνω τύπους κυτταρικού θανάτου, εμπλέκεται με την καρκινογένεση (Ricci & Zong, 2006). Αξίζει να σημειωθεί ότι έχουν περιγραφεί κι άλλα μοντέλα κυτταρικού θανάτου. Σε αυτά περιλαμβάνονται: ο αποπτωτικός θάνατος που είναι ανεξάρτητος από τη δράση των κασπασών, η νεκρόπτωση (necroptosis), η παράπτωση (paraptosis), η πυρόπτωση (pyroptosis) και ο αργός κυτταρικός θάνατος (Ricci & Zong, 2006). Παρακάτω, θα επικεντρωθούμε στους δύο κυριότερους δρόμους μέσω των οποίων ένα κύτταρο οδηγείται στο θάνατο: τη νέκρωση και την απόπτωση. Η νέκρωση αποτελεί τον δρόμο του «βίαιου θανάτου», όπως π.χ. τραυματισμός, μόλυνση, έκθεση σε χημικές τοξικές ουσίες κλπ., ενώ η απόπτωση, γνωστή και ως προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, αναφέρεται στις οδούς επαγωγής των μηχανισμών αυτοκαταστροφής του κυττάρου 50

51 (Μαρμάρας, 2005). Ενώ η απόπτωση συχνά έχει ευεργετικά αποτελέσματα για τον οργανισμό, η νέκρωση σχεδόν πάντα έχει αρνητικά αποτελέσματα και μπορεί να είναι θανάσιμη (Kasper & Zaleznik, 2001) Απόπτωση Το 1972 οι Kerr, Wyllie και Currie πρότειναν ότι εκτός από τη νέκρωση είδος κυτταρικού θανάτου που αποτελεί παθητική συνέπεια επιβλαβών παραγόντων, όπως ισχαιμία, τοξίνες, τραυματισμοί υπάρχει και ένας δεύτερος τύπος κυτταρικού θανάτου, ο οποίος χαρακτηρίζεται από εκλεκτική και προγραμματισμένη απομάκρυνση των κυττάρων από τον οργανισμό, τονίζοντας ότι συμμετέχει στη ρύθμιση του κυτταρικού πληθυσμού, με ρόλο αντίθετο της μίτωσης. Η απόπτωση απαντάται σε όλους τους πολυκύτταρους οργανισμούς και είναι ιδιαίτερα σημαντική για πολλές διεργασίες του κυττάρου, όπως η ανανέωση των κυττάρων, η φυσιολογική λειτουργία και ανάπτυξη του ανοσοποιητικού συστήματος, η απομάκρυνση των πλεονάζοντων κυττάρων κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, η ορμονοεξαρτώμενη ατροφία διαφόρων ιστών και οργάνων, η εμβρυική ανάπτυξη και ο επαγόμενος από χημικούς παράγοντες κυτταρικός θάνατος. Επιπλέον, μαζί με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση, θεωρείται ένα από τα σημαντικότερα συστατικά λειτουργικά στοιχεία της ομοιόστασης των ιστών (Elmore, 2007). Λαμβάνει χώρα τόσο σε ενήλικα όσο και σε εμβρυικά κύτταρα. Στα έμβρυα, τα κύτταρα πεθαίνουν όταν η δομή που σχηματίζουν δεν είναι πλέον απαραίτητη, όπως στην ουρά του γυρίνου ή στα δάκτυλα των άκρων. Άλλοτε, ο κυτταρικός θάνατος είναι απαραίτητος για τη ρύθμιση του κυτταρικού αριθμού. Τα καρκινικά κύτταρα ανθίστανται στην απόπτωση με αποτέλεσμα ο αριθμός τους να μεγαλώνει. Όμως και η αυξημένη απόπτωση είναι επιβλαβής επειδή οδηγεί σε εκφυλιστικές ασθένειες. Η απόπτωση μπορεί να προκληθεί από πολλούς εξωκυτταρικούς και ενδοκυτταρικούς παράγοντες. Αποπτωτικοί παράγοντες είναι οι ιοί, η ακτινοβολία, η κόπωση και η αδυναμία επιδιόρθωσης του DNA. Επίσης, όταν τα κύτταρα του επιθηλιακού ιστού απομακρυνθούν από τον βασικό υμένα πεθαίνουν με απόπτωση. Η απόπτωση αποτελεί μέρος της ανοσοποιητικής απόκρισης. Ακόμη, τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται για τη χημειοθεραπεία του καρκίνου προκαλούν πολλές φορές βλάβες στο DNA ορισμένων κυττάρων, τα οποία μπορούν να οδηγήσουν σε αποπτωτικό θάνατο μέσω ενός μονοπατιού που ρυθμίζεται από την p53. Σε άλλα κύτταρα (π.χ. Τ-λεμφοκύτταρα) σε αποπτωτικό θάνατο 51

52 μπορεί να οδηγήσουν κάποιες ορμόνες, όπως τα κορτικοστεροειδή, χωρίς ωστόσο να επηρεάζονται τα υπόλοιπα κύτταρα που έχουν διεγερθεί από το ίδιο ερέθισμα (Elmore, 2007). Μερικά κύτταρα εκφράζουν τους υποδοχείς Fas ή TNF, και οδηγούνται έτσι σε απόπτωση μέσω πρόσδεσης σε αυτούς συγκεκριμένων πρωτεϊνών, είτε μέσω δημιουργίας χιαστί δεσμών με άλλες πρωτεΐνες. Άλλα κύτταρα έχουν μια προκαθορισμένη πορεία θανάτου, η οποία θα πρέπει να ανασταλεί από κάποιον παράγοντα επιβίωσης, όπως μια ορμόνη ή κάποιον αυξητικό παράγοντα (Elmore, 2007). Η υπερβολική ή η ανεπαρκής απόπτωση είναι παράγοντας που μπορεί να ευθύνεται για την πρόκληση παθολογικών καταστάσεων στον άνθρωπο, όπως νευροεκφυλιστικές ασθένειες, ισχαιμική βλάβη, αυτοάνοσες διαταραχές και κάποιοι τύποι καρκίνου. Οι νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις επικεντρώνονται στη διασαφήνιση των οδών σηματοδότησης που συμμετέχουν στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, λόγω της ικανότητάς της να ρυθμίζει την επιβίωση ή το θάνατο ενός κυττάρου. Τα κύτταρα που πεθαίνουν από απόπτωση υφίστανται τις ακόλουθες χαρακτηριστικές μορφολογικές αλλαγές: Προσβάλλονται μονήρη κύτταρα. Στα αρχικά στάδια παρατηρείται απώλεια μεσοκυττάριων συνδέσεων και εξειδικευμένων δομών κυτταρικής επιφάνειας και δημιουργία ακανόνιστων κυτταροπλασματικών προεκβολών (blebs). Στον πυρήνα παρατηρείται συμπύκνωση της χρωματίνης σε μάζες ομογενούς πυκνότητας (ημισεληνοειδείς δομές ή λείες, κοκκιώδεις μάζες). Η κυτταρική μεμβράνη παραμένει άθικτη. Η πυρηνική μεμβράνη αποδιοργανώνεται λόγω πρωτεόλυσης των λαμινών. Τα κύτταρα χάνουν την επαφή τους με τα γειτονικά κύτταρα και φαίνεται να συρρικνώνονται σε σχέση με τα υπόλοιπα κύτταρα του ιστού. Η χρωματίνη αποικοδομείται και συσπειρώνεται. Ο πυρήνας κομματιάζεται σε διακριτά σωμάτια (καρυόρηξη). Το DNA κομματιάζεται από ειδικές ενδονουκλεάσες. Η φωσφατιδυλοσερίνη που κανονικά βρίσκεται στην εσωτερική λιπιδική στοιβάδα της πλασματικής μεμβράνης του κυττάρου, μεταναστεύει στην εξωτερική λιπιδική στοιβάδα όπου και δεσμεύεται με υποδοχείς των μακροφάγων, με αποτέλεσμα την ενσωμάτωσή τους (κυτταροφαγία) από τα μακροφάγα. 52

53 Τα μιτοχόνδρια καταστρέφονται και ελευθερώνεται το κυτόχρωμα C. Τα φαγοκύτταρα εκκρίνουν κυτοκίνες που αναστέλλουν τη φλεγμονή. Το κύτταρο διασπάται σε κομμάτια που περιβάλλονται από μεμβράνη, τα αποπτωτικά σωμάτια. Τα αποπτωτικά σωμάτια περιλαμβάνουν τμήματα του πυρήνα και των οργανιδίων, προσλαμβάνονται με κυτταροφαγία από τα γειτονικά κύτταρα και τα μακροφάγα, και καταλήγουν στα λυοσώματά τους. Έτσι, δεν απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους ώστε να προκαλέσουν απόκριση φλεγμονής, όπως τα νεκρωτικά κύτταρα, και να βλάψουν πιθανόν τα παρακείμενα κύτταρα (Μαρμάρας, 2005). Τη φαγοκυττάρωση αναλαμβάνουν τα μακροφάγα ή τα γειτονικά επιθηλιακά κύτταρα, που αναλώνουν τα γειτονικά κατάλοιπα. Διακρίνονται τρεις τύποι κυτταρικού θανάτου: Ετεροφαγία ή κυτταρικός θάνατος τύπου Ι: τα αποπίπτοντα κύτταρα φαγοκυτταρώνονται από γειτονικά κύτταρα και διαλύονται από τα λυσοσώματα αυτών. Αυτοφαγία ή κυτταρικός θάνατος τύπου ΙΙ: η διάλυση των αποπτωτικών σωματίων γίνεται από λυσοσώματα που περιέχονται στα ίδια τα αποπτωτικά κύτταρα. Κυτταρικός θάνατος τύπου ΙΙΙ: στη φαγοκυττάρωση συμμετέχουν και τα μακροφάγα που εισβάλλουν στον εκφυλιζόμενο ιστό (Μαρμάρας, 2005). Εικόνα 5.2: Συνοπτική παρουσίαση των γεγονότων που συμβαίνουν κατά την απόπτωση. (Προσαρμογή από 53

54 Τα βιοχημικά μονοπάτια της απόπτωσης είναι εξαιρετικά σύνθετα και περίπλοκα, εφόσον περιλαμβάνουν καταρράκτες ενεργειακά εξαρτώμενων μοριακών αντιδράσεων. Μέχρι σήμερα, οι έρευνες έχουν δείξει ότι υπάρχουν δύο κύρια μονοπάτια που οδηγούν στην απόπτωση. Το εξωγενές ή μονοπάτι των υποδοχέων θανάτου (extrinsic pathway) και το ενδογενές ή μιτοχονδριακό μονοπάτι (intrinsic pathway). Ωστόσο, υπάρχουν πλέον ενδείξεις ότι οι δύο αυτές οδοί συνδέονται και ότι τα μόρια του ενός μονοπατιού μπορούν να επηρεάσουν το άλλο. Αξίζει να σημειωθεί ότι υπάρχει κι ένα επιπλέον μονοπάτι που οδηγεί στην καταστροφή των κυττάρων με μεσολάβηση των Τ-κυτταροτοξικών κυττάρων και πρωτεασών σερίνης (perforin/granzyme pathway). Και τα τρία αυτά μονοπάτια συγκλίνουν προς το ίδιο εκτελεστικό μονοπάτι. Το εκτελεστικό μονοπάτι ξεκινά με την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και έχει ως αποτέλεσμα τη θραύση του DNA, την αποικοδόμηση των πυρηνικών πρωτεϊνών και των πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού, τη δημιουργία χιαστί δεσμών ανάμεσα στις πρωτεΐνες, τη δημιουργία αποπτωτικών σωμάτων, την έκφραση των πρωτεϊνών που θα προσδεθούν στους υποδοχείς των φαγοκυττάρων και τελικά την ενδοκυττάρωση από τα γειτονικά φαγοκύτταρα. Το μονοπάτι που επάγει την απόπτωση μέσω του granzyme A ενεργοποιεί ένα παράλληλο μονοπάτι κυτταρικού θανάτου ανεξάρτητο από τις κασπάσες, μέσω δημιουργίας μονόκλωνου ρήγματος στο DNA (Elmore, 2007). Οι κασπάσες έχουν την ικανότητα να υδρολύουν όλα τα δομικά και λειτουργικά στοιχεία του κυττάρου. Είναι ειδικές πρωτεάσες που έχουν στο ενεργό τους κέντρο κυστεΐνη. Έχουν μεγάλη συγγένεια σύνδεσης με ασπαρτικό οξύ, που είναι το σημείο πρωτεόλυσης των πρωτεϊνών. Υπάρχουν ως ανενεργά προένζυμα, τις προκασπάσες, οι οποίες διακρίνονται σε εναρκτήριες και τελεστές. Οι εναρκτήριες ενεργοποιούν μέσω διαδοχικών πρωτεολύσεων διάφορες κασπάσες τελεστές, οι οποίες με τη σειρά τους αναγνωρίζουν και πρωτεολύουν επιλεκτικά πλήθος πυρηνικών και κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών. Άλλες από τις πρωτεΐνες αυτές είναι δομικές, όπως λαμίνες, άλλες συμμετέχουν σε μονοπάτια μεταγωγής μηνυμάτων, όπως οι κινάσες, άλλες συμμετέχουν στην επιδιόρθωση του DNA κλπ. Επίσης, άλλες σημαντικές πρωτεΐνες που συμμετέχουν στο μηχανισμό της απόπτωσης είναι οι πρωτεΐνες ικριώματα και συνδετήρες που περιλαμβάνουν υποδοχείς και κάποιες ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες, και οι πρωτεΐνες ρυθμιστές της απόπτωσης που περιλαμβάνουν την οικογένεια των Bcl-2 πρωτεϊνών και την οικογένεια των IAP αναστολέων (Μαρμάρας, 2005). 54

55 5.3. Νέκρωση Η νέκρωση είναι μια εναλλακτική μορφή κυτταρικού θανάτου. Πρόκειται για παθητική, ενεργειακά ανεξάρτητη και τοξική διεργασία. Ωστόσο, από κάποιους ο όρος νέκρωση θεωρείται ακατάλληλος για να περιγράψει έναν μηχανισμό κυτταρικού θανάτου, μιας και αναφέρεται στις διαδικασίες αποικοδόμησης που συμβαίνουν μετά το θάνατο του κυττάρου. Επιπλέον, η διαδικασία της νέκρωσης δεν υφίσταται καμιά ρύθμιση. Το ερέθισμα επαγωγής της νέκρωσης είναι πάντοτε κάποια βλαπτική επίδραση. Τα μορφολογικά χαρακτηριστικά της νέκρωσης συνοψίζονται στα εξής: Προσβάλλονται ομάδες κυττάρων. Στον πυρήνα η χρωματίνη συγκεντρώνεται σε μάζες ασαφούς περιγράμματος, παρατηρείται αποικοδόμηση του DNA με τυχαία κατανομή του, και διάρρηξη της πυρηνικής μεμβράνης (καρυόλυση του πυρήνα). Τα κύτταρα διογκώνονται, εφόσον τα ιόντα και το νερό περνούν ελεύθερα μέσα στο κύτταρο λόγω καταστροφής της πλασματικής μεμβράνης. Η είσοδος νερού έχει ως αποτέλεσμα μια γενικευμένη διεργασία πέψης και διάλυσης του κυττάρου. Η απώλεια της ακεραιότητας της μεμβράνης οδηγεί σε λύση του κυττάρου, απελευθέρωση των κυτταρικών συστατικών στον εξωκυττάριο χώρο και φλεγμονώδη αντίδραση στους περιβάλλοντες ιστούς (Μαρμάρας, 2005). Είναι φανερό πως η διαδικασία της νέκρωσης δεν υφίσταται καμία ρύθμιση. Τα κύτταρα τα οποία πεθαίνουν λόγω νέκρωσης δεν ακολουθούν το σηματοδοτικό μονοπάτι της απόπτωσης, αλλά οδηγούνται σε θάνατο μέσω ενεργοποίησης διάφορων υποδοχέων, είτε λόγω απώλειας της ακεραιότητας της κυτταρικής μεμβράνης, είτε λόγω ανεξέλεγκτης απελευθέρωσης προϊόντων του κυτταρικού θανάτου στον ενδοκυττάριο χώρο (Proskuryakov & Konoplyannikov, 2003). Η ενεργοποίηση αυτή των υποδοχέων προκαλεί στον περιβάλλοντα ιστό μια φλεγμονώδη αντίδραση η οποία εμποδίζει τα μακροφάγα να εντοπίσουν και να φαγοκυτταρώσουν τα νεκρά κύτταρα (Kasper & Zaleznik, 2001) Διάκριση της απόπτωσης από τη νέκρωση Η απόπτωση και η νέκρωση είναι δύο διαδικασίες που μπορεί να συμβαίνουν ανεξάρτητα, διαδοχικά ή ακόμα και ταυτόχρονα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, το είδος ή ο βαθμός του ερεθίσματος είναι αυτά που καθορίζουν τη διαδικασία με την οποία θα πεθάνει το κύτταρο. Σε χαμηλές δόσεις, μια ποικιλία βλαβερών παραγόντων, όπως η θερμότητα, η 55

56 ακτινοβολία, η υποξία και κυτταροτοξικά αντικαρκινικά φάρμακα μπορούν να προκαλέσουν απόπτωση, ενώ τα ίδια ερεθίσματα σε υψηλότερες δόσεις μπορεί να οδηγήσουν σε νέκρωση. Επίσης, η απόπτωση είναι μια συντονισμένη και συχνά ενεργειακά εξαρτώμενη διαδικασία που περιλαμβάνει την ενεργοποίηση μιας ομάδας πρωτεασών κυστεΐνης, τις κασπάσες, και μια σύνθετη αλληλουχία γεγονότων που συνδέουν το αρχικό ερέθισμα με την τελική καταστροφή του κυττάρου. Παρόλο που η νέκρωση και η απόπτωση διαφέρουν στη μορφολογία και τον μηχανισμό, υπάρχει επικάλυψη ανάμεσα σ αυτές τις δύο διαδικασίες. Τα βιβλιογραφικά στοιχεία δείχνουν ότι η νέκρωση και η απόπτωση αντιπροσωπεύουν μορφολογικές εκφράσεις ενός κοινού βιοχημικού δικτύου που περιγράφεται ως «το συνεχές απόπτωσηςνέκρωσης». Για παράδειγμα, είναι δυνατό να έχουμε μετατροπή από απόπτωση σε νέκρωση, μέσω μείωσης της διαθεσιμότητας των κασπασών ή του διακυτταρικού ATP. Το αν ένα κύτταρο θα πεθάνει με νέκρωση ή απόπτωση εξαρτάται εν μέρει από τη φύση του σήματος κυτταρικού θανάτου, από τον τύπο του ιστού, το αναπτυξιακό στάδιο του ιστού και το φυσιολογικό ενδιάμεσο κυτταρικό περιβάλλον (Elmore, 2007). Με τη χρησιμοποίηση της συμβατικής ιστολογίας δεν είναι πάντα εύκολο να διακρίνουμε τη νέκρωση από την απόπτωση, καθώς όπως είπαμε υπάρχει και η πιθανότητα να συμβούν ταυτόχρονα. Η νέκρωση είναι μια ανεξέλεγκτη και παθητική διαδικασία που προσβάλλει συνήθως μεγάλα πεδία κυττάρων, ενώ η απόπτωση είναι ελεγχόμενη και ενεργειακά εξαρτώμενη και μπορεί να επηρεάσει μεμονωμένα κύτταρα ή μικρές συναθροίσεις κυττάρων. Η νέκρωση προκαλείται από δύο κύριους μηχανισμούς: παρεμβολή με τα ενεργειακά αποθέματα του κυττάρου και απευθείας βλάβη στις κυτταρικές μεμβράνες. H απώλεια της ακεραιότητας της πλασματικής μεμβράνης που συμβαίνει κατά τη νέκρωση, έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση των κυτταροπλασματικών συστατικών στον περιβάλλοντα ιστό, στέλνοντας χημειοτακτικά σήματα με επακόλουθη επιστράτευση των κυττάρων της φλεγμονής. Επειδή τα αποπτωτικά κύτταρα δεν απελευθερώνουν τα κυτταρικά συστατικά τους στον περιβάλλοντα ενδιάμεσο ιστό και γρήγορα φαγοκυτταρώνονται από τα μακροφάγα ή γειτονικά φυσιολογικά κύτταρα, ουσιαστικά δεν υπάρχει φλεγμονώδης αντίδραση. Τέλος, να σημειωθεί ότι η συμπύκνωση της χρωματίνης και η καρυόρηξη δεν αποτελούν αποκλειστικά γεγονότα της διαδικασίας της απόπτωσης, καθώς μπορούν να αποτελούν και μέρος των μορφολογικών αλλαγών που συμβαίνουν κατά τη νέκρωση (Elmore, 2007). 56

57 Εικόνα 5.4.: Διάκριση των μορφολογικών χαρακτηριστικών της απόπτωσης και της νέκρωσης. (Προσαρμογή από 57

58 6. ΜΙΚΡΟΠΥΡΗΝΕΣ 6.1. Γενικά Οι μικροπυρήνες (micronuclei, MN), γνωστοί και ως σωμάτια Howell-Jolly ανακαλύφθηκαν πρώτη φορά σε πρόδρομα ερυθροκύτταρα, από τους William Howell και Justin Jolly στο τέλος του 19 ου αιώνα. Την περίοδο εκείνη τα σωμάτια αυτά θεωρούνταν υπολείμματα του πυρήνα των ερυθροκυττάρων διαφόρων οργάνων με παθολογικά χαρακτηριστικά (Sears & Udden, 2011). Στα μέσα του εικοστού αιώνα περιγράφηκε η παρουσία των μικροπυρήνων και σε άλλα κύτταρα, κυρίως στα λεμφοκύτταρα. Οι Fenech και Morley (1985) παρατήρησαν ότι η επίδραση με κυτταροτοξικούς παράγοντες (όπως η ακτινοβολία) σε λεμφοκύτταρα in vitro προκαλούσε τη δημιουργία μικροπυρήνων, καθιστώντας τους ένα πολύτιμο εργαλείο για κυτταρογενετικές και γονιδιοτοξικές μελέτες. Οι μικροπυρήνες αποτελούν πυρηνικό υλικό που διακρίνεται έξω από τον κύριο πυρήνα και μέσα στο κυτταρόπλασμα. Πρόκειται για εξωπυρηνικούς σχηματισμούς που δημιουργούνται σε διαιρούμενα κύτταρα και οφείλουν την προέλευσή τους σε χρωμοσωματικό υλικό, το οποίο αποτελείται είτε από άκεντρα χρωμοσωματικά τμήματα (χρωμοσωματικά ή χρωματιδικά θραύσματα), είτε από ολόκληρα χρωμοσώματα, τα οποία δεν συμπεριλήφθηκαν στους κύριους θυγατρικούς πυρήνες που σχηματίστηκαν κατά τη διάρκεια της πυρηνικής διαίρεσης (Fenech et al., 1999a). Εικόνα 6.1: Δημιουργία μικροπυρήνα σε διαιρούμενο κύτταρο (Προσαρμογή από Fenech, 2007). Η δημιουργία μικροπυρήνων στα κύτταρα σχετίζεται με πολλές παθολογικές καταστάσεις. Η αυξημένη παρουσία ΜΝ σε λεμφοκύτταρα συνδέεται με διάφορους τύπους καρκίνου, επιπλοκές στην εγκυμοσύνη ή ακόμα και αποβολές, ενώ η αύξηση των ΜΝ στα σπερματικά κύτταρα μπορεί να οδηγήσει σε στειρότητα (Fenech, 2011). 58

59 6.2. Μηχανισμοί δημιουργίας μικροπυρήνων Τα δύο βασικά φαινόμενα που οδηγούν στο σχηματισμό μικροπυρήνων στα διαιρούμενα κύτταρα είναι η χρωμοσωματική θραύση και η χρωμοσωματική καθυστέρηση. Συγκεκριμένα, στο στάδιο της ανάφασης κατά τη διάρκεια της πυρηνικής διαίρεσης, χρωμοσωματικό υλικό αδυνατεί να μετακινηθεί προς τους πόλους της μιτωτικής ατράκτου, με συνέπεια κατά την τελόφαση να σχηματίζεται ένας πυρηνικός φάκελος γύρω από το καθυστερούμενο χρωμοσωματικό τμήμα ή χρωμόσωμα, ο οποίος στη συνέχεια ξετυλίγεται και σταδιακά αποκτά τη μορφολογία ενός μεσοφασικού πυρήνα, με τη διαφορά ότι είναι μικρότερος από τον κυρίως πυρήνα. Αυτό δικαιολογεί και τον όρο «μικροπυρήνας», που χρησιμοποιείται για την περιγραφή της δομής αυτής (Fenech, 2000) Χρωμοσωματική θραύση (chromosome breakage) Η δημιουργία χρωμοσωματικών ρηγμάτων μπορεί να οφείλεται σε έκθεση των κυττάρων σε θραυσματογόνους παράγοντες (ενδογενείς ή εξωγενείς παράγοντες που προκαλούν δομικές χρωμοσωματικές αναδιατάξεις), οι οποίοι καλούνται θραυσματογόνα. Τέτοιες αναδιατάξεις μπορεί να είναι δικεντρικές χρωματίδες, αναμεμειγμένα δακτυλιοειδή χρωμοσώματα ή ένωση αδελφών χρωματίδων. Παραδείγματα εξωγενών παραγόντων πρόκλησης χρωμοσωματικής θραύσης είναι η ιονίζουσα ακτινοβολία και οι ενδονουκλεάσες περιορισμού, που προκαλούν τη δημιουργία δίκλωνων ρηγμάτων στους κλώνους του DNA είτε άμεσα, είτε έμμεσα λόγω βλαβών κατά τη διαδικασία επιδιόρθωσης του γενετικού υλικού (Pfeiffer et al., 2000). Όσον αφορά τους ενδογενείς παράγοντες, οι τοποϊσομεράσες (ένζυμα υπεύθυνα για την τροποποίηση της ελικοειδούς δομής του γενετικού υλικού, προκειμένου να πραγματοποιηθεί η αντιγραφή, ο ανασυνδυασμός, ο χρωμοσωματικός αποχωρισμός και η μεταγραφή), η διαδικασία της αντιγραφής του DNA, ο ομόλογος ανασυνδυασμός που λαμβάνει χώρα κατά τη μείωση, καθώς και οι εύθραυστες θέσεις του γενετικού υλικού, οι μικρο- και μινι-δορυφορικές αλληλουχίες συνιστούν πιθανές πηγές πρόκλησης δίκλωνων ρηγμάτων (Pfeiffer et al., 2000). Αξίζει ακόμη να σημειωθεί ότι στο σχηματισμό μικροπυρήνων που περικλείουν άκεντρα χρωμοσωματικά τμήματα, ενδεχομένως συμβάλλουν και οι επιγενετικές τροποποιήσεις στο DNA. Συγκεκριμένα, η υπομεθυλίωση σε ετεροχρωματινικές περιοχές του DNA προκαλεί αποσυμπύκνωση της χρωματίνης, κάτι που μπορεί να οδηγήσει σε χρωμοσωματική θραύση (Luzhna et al., 2013). 59

60 Χρωμοσωματική καθυστέρηση ή απώλεια (chromosome loss) Συμβαίνει κατά τον αποχωρισμό των χρωμοσωμάτων στο στάδιο της ανάφασης της μίτωσης ή της μείωσης. Πρόκειται για αποτυχία ενός ή περισσοτέρων χρωμοσωμάτων να ενσωματωθούν στη μιτωτική συσκευή που προκαλείται είτε λόγω καθυστέρησης των χρωμοσωμάτων κατά τη μετακίνησή τους στα ινίδια της ατράκτου, είτε λόγω λανθασμένης σύνδεσης των κινητοχώρων των χρωμοσωμάτων στους μικροσωληνίσκους της ατράκτου. Με τον έναν ή τον άλλον τρόπο τα χρωμοσώματα αυτά αποκλείονται από τον πυρήνα του θυγατρικού κυττάρου με τη δημιουργία πυρηνικής μεμβράνης κατά την τελόφαση, σχηματίζοντας έτσι έναν μικροπυρήνα στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου. Από τα δύο θυγατρικά κύτταρα που προκύπτουν τελικά από τη χρωμοσωματική καθυστέρηση, το ένα είναι φυσιολογικό και το άλλο μονοσωμικό, δηλ. με ένα χρωμόσωμα λιγότερο (Kirsch- Volders et al., 1998). Εναλλακτικά, είναι δυνατόν ο μικροπυρήνας τυχαία να ενσωματωθεί ξανά σε ένα από τα θυγατρικά κύτταρα, με συνέπεια το ένα θυγατρικό κύτταρο να είναι τρισωμικό και το άλλο μονοσωμικό ή επίσης μπορεί και τα δύο θυγατρικά κύτταρα να εμφανίζουν κανονικό αριθμό χρωμοσωμάτων (Parry et al., 2002). Οι μικροπυρήνες που περιέχουν ολόκληρα χρωμοσώματα σχηματίζονται κυρίως από βλάβες που σχετίζονται με το μηχανισμό του χρωμοσωματικού αποχωρισμού. Έτσι, στα θυγατρικά κύτταρα που διαθέτουν έναν τέτοιο μικροπυρήνα, που φέρει δηλαδή χρωμόσωμα με κεντρομέρος, μεταβάλλεται ο αριθμός των χρωμοσωμάτων στον κύριο πυρήνα, με αποτέλεσμα τη δημιουργία ανευπλοειδίας. Για το λόγο αυτό, οι παράγοντες που προκαλούν χρωμοσωματική καθυστέρηση και άρα δημιουργία μικροπυρήνων που περικλείουν ολόκληρα χρωμοσώματα, ονομάζονται ανευπλοειδογόνοι. Οι παράγοντες αυτοί προκαλούν βλάβες σε διάφορα κυτταρικά στοιχεία ή δομές της μιτωτικής συσκευής, κάτι που συνεπάγεται αδυναμία μετακίνησης των χρωμοσωμάτων προς τους πόλους της ατράκτου στο τέλος της μετάφασης (Cimini & Degrassi, 2002). Η χρωμοσωματική καθυστέρηση μπορεί να προκύψει από πολλούς μοριακούς μηχανισμούς που συμβαίνουν κατά την ανάφαση. Σ αυτούς περιλαμβάνεται η μεθυλίωση του DNA σε κεντρομερικές ή σε επαναλαμβανόμενες ετεροχρωματινικές περιοχές, όπως οι δορυφορικές αλληλουχίες. Η υπομεθυλίωση της κυτοσίνης σε περιοχές γύρω απ το κεντρομέρος των χρωμοσωμάτων, όπως και η μεθυλίωση των ιστονών προκαλούν αποσυμπύκνωση της χρωματίνης και επηρεάζουν την πρόσδεση του κινητοχώρου με τη μιτωτική συσκευή. Άλλοι παράγοντες που ευθύνονται για την καθυστέρηση των χρωμοσωμάτων είναι η αδυναμία συγκρότησης της μιτωτικής συσκευής, μεταλλάξεις σε 60

61 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, και ο μη φυσιολογικός πολλαπλασιασμός των κεντροσωμάτων (Fenech et al., 2011). Μια πρόσφατη μελέτη προτείνει ότι η δημιουργία ενός δικεντρικού χρωμοσώματος από την ένωση δύο τελομερικών άκρων, μπορεί επίσης να οδηγήσει σε ανώμαλο χρωμοσωματικό αποχωρισμό, λόγω του ότι τα κεντρομέρη του ωθούνται προς τους αντίθετους πόλους κατά την ανάφαση, με δυνάμεις που είναι ικανές να προκαλέσουν την αποδέσμευση του χρωμοσώματος από τη μιτωτική άτρακτο (Pampalona et al., 2010). Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι οι μη παραγωγικές προσδέσεις (συντελικές, μονοτελικές, μεροτελικές) μεταξύ των κινητοχώρων των χρωμοσωμάτων και των μικροσωληνίσκων της ατράκτου, εάν δεν επιδιορθωθούν, είναι δυνατόν να οδηγήσουν σε άνιση κατανομή του γενετικού υλικού στα θυγατρικά κύτταρα και σε ανευπλοειδικά φαινόμενα. Ειδικότερα οι μεροτελικές προσδέσεις δεν ανιχνεύονται από το σημείο ελέγχου της μίτωσης με συνέπεια εάν αυτό δεν είναι λειτουργικό, να παρατηρηθούν φαινόμενα χρωμοσωματικής καθυστέρησης (Cimini & Degrassi, 2002). Οι σταθερές αμφιτελικές προσδέσεις των κινητοχώρων των χρωμοσωμάτων στους μικροσωληνίσκους που εξέρχονται από τους αντίθετους πόλους της μιτωτικής ατράκτου εξασφαλίζουν τον σωστό προσανατολισμό των χρωμοσωμάτων, και άρα τον σωστό αποχωρισμό τους. Είναι δυνατόν όμως να παρατηρηθούν λανθασμένες προσδέσεις μεταξύ των κινητοχώρων των χρωμοσωμάτων και των μικροσωληνίσκων της ατράκτου, όπως συντελικές, μονοτελικές και μεροτελικές. Οι συντελικές προσδέσεις πραγματοποιούνται όταν μαζί οι δύο κινητοχώροι των αδελφών χρωματιδίων προσδένονται στους μικροσωληνίσκους που εξέρχονται από τον ίδιο πόλο της ατράκτου. Στις μονοτελικές προσδέσεις μόνο ο ένας κινητοχώρος των αδελφών χρωματιδίων προσδένεται στους μικροσωληνίσκους, ενώ στον άλλο συσσωρεύονται οι πρωτεΐνες του σημείου ελέγχου, με συνέπεια την καθυστέρηση της ανάφασης. Τέλος, στις μεροτελικές προσδέσεις ο κινητοχώρος ενός χρωμοσώματος προσδένεται στους μικροσωληνίσκους και των δύο πόλων της μιτωτικής ατράκτου (Luzhna et al., 2013). 61

62 Εικόνα: α.: Τύποι πρόσδεσης των κινητοχώρων των χρωμοσωμάτων στους μικροσωληνίσκους της μιτωτικής ατράκτου. (Προσαρμογή από Luzhna et al., 2013). Οι πυρηνοπλασματικές γέφυρες (Nucleoplasmic Bridges, NPBs) και οι πυρηνοπλασματικές προεκβολές (Nuclear buds, NBUDs) σχετίζονται με φαινόμενα χρωμοσωματικής αστάθειας, όπως και οι μικροπυρήνες (Fenech et al., 2011). Οι πυρηνοπλασματικές γέφυρες (NPBs) προκύπτουν από δικεντρικά χρωμοσώματα (χρωμοσώματα που έχουν δύο κεντρομέρη). Τα δικεντρικά χρωμοσώματα σχηματίζονται είτε από λανθασμένη επιδιόρθωση χρωμοσωματικών ρηγμάτων είτε από τη σύντηξη δύο τελομερικών άκρων (Fenech et al., 2011). Η λανθασμένη επιδιόρθωση των ρηγμάτων σε δύο χρωμοσώματα είναι δυνατόν να οδηγήσει σε ασύμμετρη χρωμοσωματική αναδιάταξη, με συνέπεια τη δημιουργία ενός δικεντρικού χρωμοσώματος και ενός άκεντρου χρωμοσωματικού τμήματος, το οποίο μετατρέπεται σε μικροπυρήνα. Τα κεντρομέρη των δικεντρικών χρωμοσωμάτων κινούνται προς τους αντίθετους πόλους της ατράκτου κατά την ανάφαση, με αποτέλεσμα η πυρηνική μεμβράνη να περιβάλλει και τους δύο θυγατρικούς πυρήνες, δημιουργώντας πυρηνοπλασματική γέφυρα ανάμεσά τους. Η πυρηνοπλασματική γέφυρα στη συνέχεια σπάει κατά τη διαίρεση του κυτταροπλάσματος, και το άκεντρο χρωμοσωματικό τμήμα που προκύπτει συνιστά έναν μικροπυρήνα (Luzhna et al., 2013). 62

63 Οι πυρηνοπλασματικές προεκβολές (NBUDs) έχουν την ίδια μορφολογία με τους μικροπυρήνες, με τη διαφορά ότι οι μικροπυρήνες στην περίπτωση αυτή συνδέονται με τον πυρήνα μέσω ενός πυρηνοπλασματικού υλικού. Ωστόσο, ο μηχανισμός δημιουργίας τους διαφέρει. Οι μικροπυρήνες περικλείουν κυρίως ολόκληρα χρωμοσώματα ή άκεντρα χρωμοσώματα που στερούνται τελομερικών περιοχών, ενώ οι πυρηνοπλασματικές προεκβολές περικλείουν άκεντρα χρωμοσωματικά τμήματα από τα οποία απουσιάζουν είτε ενδιάμεσες είτε τελομερικές περιοχές. Η δημιουργία πυρηνικών προεκβολών ενδεχομένως υποδηλώνει γονιδιακή ενίσχυση, κατά την οποία το ενισχυμένο τμήμα του DNA απομακρύνεται από τον πυρήνα και περικλείεται από πυρηνοπλασματική μεμβράνη (Fenech, 2011). Εικόνα: β.: Σχηματισμός πυρηνοπλασματικής γέφυρας (NPB) και πυρηνοπλασματική προεκβολή (NBUD) σε διαιρούμενο κύτταρο. (Προσαρμογή από Fenech, 2007). Μετά το σχηματισμό μικροπυρήνα μέσα στα κύτταρα μπορεί να συμβούν τα εξής γεγονότα: Διατήρηση του μικροπυρήνα στο κυτταρόπλασαμα ως εξωπυρηνική δομή, αφού ολοκληρώσει έναν ή περισσότερους κύκλους αντιγραφής του DNA. Εκ νέου ενσωμάτωση του μικροπυρήνα στον κυρίως πυρήνα, εφόσον το χρωμόσωμα που ενσωματώνεται δεν αναγνωρίζεται από τα χρωμοσώματα του κύριου πυρήνα και πιθανότατα εμφανίζει φυσιολογική λειτουργία. Εξάλειψη του κυττάρου που φέρει μικροπυρήνα μέσω της διαδικασίας της απόπτωσης. Απομάκρυνση του μικροπυρήνα από το κύτταρο, όταν το DNA που περιέχεται στον μικροπυρήνα δεν είναι λειτουργικό ή είναι ανίκανο να αντιγραφεί λόγω έλλειψης των απαραίτητων κυτταροπλασματικών συστατικών (Kirsch-Volders et al., 2011). 63

64 6.3. Μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης (Cytokinesis Block Micronucleus CBMN Assay) Η μελέτη της βλάβης του DNA σε χρωμοσωματικό επίπεδο, συνιστά βασικό μέρος της γενετικής τοξικολογίας, λόγω του ότι οι χρωμοσωματικές μεταλλάξεις αποτελούν άμεση συνέπεια βλαβών στο μόριο του DNA. Για παράδειγμα, τα χρωμοσωματικά ρήγματα μπορούν να προκύψουν από μη επιδιορθωμένα δίκλωνα ρήγματα στο DNA, και οι χρωμοσωματικές αναδιατάξεις από το λανθασμένο ζευγάρωμα μονόκλωνων ρηγμάτων στο DNA. Επιπλέον, έχει αναγνωριστεί ότι ο λανθασμένος αποχωρισμός των χρωμοσωμάτων, ένα από τα κυρίαρχα γεγονότα της γήρανσης και της καρκινογένεσης, μπορεί να προέλθει από βλάβες στη μιτωτική άτρακτο, το κεντρόσωμα ή λόγω υποσυμπύκνωσης των χρωμοσωμάτων πριν τη μετάφαση (Fenech, 2000). Οι κλασικές κυτταρογενετικές μέθοδοι περιλαμβάνουν την άμεση μελέτη των χρωμοσωμάτων, τα οποία παρατηρούνται στο στάδιο της μετάφασης, όπου και παρουσιάζουν το μέγιστο βαθμό συμπύκνωσης, και είναι έτσι δυνατή η ανίχνευση και η ανάλυση των χρωμοσωματικών ανωμαλιών. Μια τέτοια προσέγγιση απαιτεί πολύ λεπτομερειακή ανάλυση, χρόνο και μεγάλη εμπειρία από την πλευρά του ερευνητή. Επιπλέον, εμπεριέχει τον κίνδυνο της απώλειας κάποιων χρωμοσωμάτων κατά τη διαδικασία προετοιμασίας των μεταφασικών παρασκευασμάτων, γεγονός που δυσχεραίνει ακόμα περισσότερο τη χρήση της. Για το λόγο αυτό, προέκυψε η ανάγκη ανάπτυξης μιας πιο απλής μεθόδου, που θα επέτρεπε έναν γρηγορότερο και πιο ασφαλή τρόπο εκτίμησης της χρωμοσωματικής βλάβης (Fenech, 2000). Η τεχνική των μικροπυρήνων έχει αναδυθεί ως μια από τις πιο ευνοϊκές μεθόδους για την εκτίμηση χρωμοσωματικών βλαβών, καθώς οι μικροπυρήνες αποτελούν αξιόπιστο δείκτη τόσο της χρωμοσωματικής θραύσης, όσο και της χρωμοσωματικής καθυστέρησης ή απώλειας (Fenech, 2007). Όπως έχουμε ήδη αναφέρει, οι μικροπυρήνες περικλείουν άκεντρα χρωμοσωματικά θραύσματα ή ολόκληρα χρωμοσώματα, τα οποία δεν έχουν συμπεριληφθεί στους κύριους πυρήνες κατά την κυτταρική διαίρεση. Έτσι λοιπόν, η καταμέτρηση των μικροπυρήνων σε κύτταρα τα οποία έχουν διεγερθεί με μιτογόνες ουσίες, παρέχει έναν αξιόπιστο τρόπο εκτίμησης της χρωμοσωματικής βλάβης που έχουν υποστεί τα κύτταρα αυτά (Fenech & Morley, 1985). Είναι απαραίτητη προϋπόθεση η τεχνική αυτή να εφαρμόζεται σε διαιρούμενα κύτταρα, εφόσον τα δύο βασικά φαινόμενα που οδηγούν στο σχηματισμό μικροπυρήνων λαμβάνουν χώρα κατά τη μίτωση ή τη μείωση (Kirsch-Volders et al., 2011). 64

65 Η ανίχνευση των μικροπυρήνων in vivo μπορεί να γίνει σε διαιρούμενους κυτταρικούς πληθυσμούς, όπως είναι ο μυελός των οστών. Ωστόσο, η τάση μείωσης των in vivo πειραμάτων, και η χρησιμοποίηση πειραματοζώων δημιούργησε την ανάγκη τροποποίησης της τεχνικής αυτής, και την εφαρμογή της σε in vitro μελέτες για την εκτίμηση της γενετικής βλάβης (Fenech, 1997). Στη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης, τα κύτταρα που έχουν ολοκληρώσει έναν κύκλο πυρηνικής διαίρεσης εμποδίζονται από την κυτταροχαλασίνη-β (Cyt-B), να προχωρήσουν στο στάδιο της κυτταροκίνησης, και συνεπώς είναι εύκολα αναγνωρίσιμα από τη διπύρηνή τους εμφάνιση. Η κυτταροχαλασίνη-β είναι ένας αναστολέας του πολυμερισμού της ακτίνης που απαιτείται για το σχηματισμό του συσταλτού δακτυλίου (ο οποίος αποτελείται από μια δέσμη ινιδίων ακτίνης και μυοσίνης ΙΙ), που είναι υπεύθυνος για την περίσφιγξη του κυτταροπλάσματος μεταξύ των θυγατρικών πυρήνων κατά τη διάρκεια της κυτταροκίνησης. Η χρήση της Cyt-B επιτρέπει τη συσσώρευση πρακτικά όλων των κυττάρων του διαιρούμενου κυτταρικού πληθυσμού στο διπύρηνο στάδιο, ανεξάρτητα από το βαθμό συγχρονισμού τους και την αναλογία των διαιρούμενων κυττάρων. Οι μικροπυρήνες αναλύονται μόνο σε διπύρηνα κύτταρα, γεγονός που επιτρέπει την αξιόπιστη σύγκριση της χρωμοσωματικής βλάβης μεταξύ των κυτταρικών πληθυσμών, οι οποίοι μπορεί να διαφέρουν ως προς την κινητική της διαίρεσής τους. Η μέθοδος αρχικά εφαρμόστηκε σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων, αλλά πλέον έχει προσαρμοστεί και σε καλλιέργειες άλλων κυτταρικών τύπων, όπως συμπαγή καρκινικά κύτταρα και κύτταρα του μυελού των οστών (Fenech, 2000). Η ακόλουθη εικόνα δείχνει τον κρίσιμο ρόλο της Cyt-B στην αναστολή της κυτταροκίνησης και τη συσσώρευση των διαιρούμενων κυττάρων στο διπύρηνο στάδιο. Να σημειωθεί ότι το παράδειγμα της εικόνας αναφέρεται σε ένα υποθετικό κύτταρο με μόνο δύο ζεύγη χρωμοσωμάτων. Εικόνα 6.3.α.: Δημιουργία μικροπυρήνα (ΜΝ) και πυρηνοπλασματικής γέφυρας (NPB) σε διαιρούμενα κύτταρα λόγω δράσης της Cyt-B. (Προσαρμογή από Fenech et al., 2011). 65

66 Παρακάτω περιγράφονται συνοπτικά τα βασικά βήματα που ακολουθούνται κατά τη CBMN μέθοδο: Αρχικά τα κύτταρα διεγείρονται με κάποια μιτογόνο ουσία, όπως π.χ. η φυτοαιματογλουτινίνη (phytohaemagglutinin, PHA). Στη συνέχεια (σε καθορισμένο χρονικό διάστημα από την έναρξη της διαίρεσης) προστίθεται η Cyt-B, η οποία και σταματά τη διαίρεση των κυττάρων στο διπύρηνο στάδιο. Ακολούθως, τα κύτταρα απομονώνονται (εφόσον αυτό είναι απαραίτητο), επωάζονται για το κατάλληλο χρονικό διάστημα, μονιμοποιούνται, βάφονται και είναι έτοιμα για μικροσκοπική παρατήρηση. Σε περίπτωση που εξετάζεται κάποια χημική ένωση για την πρόκληση χρωμοσωματικής βλάβης σε μια καλλιέργεια κυττάρων, η προσθήκη Cyt-B στην καλλιέργεια γίνεται πριν από το πρώτο μιτωτικό κύμα και μετά την πρόκληση βλάβης στο DNA από τον εκάστοτε τοξικό παράγοντα (Fenech, 2000). Τα τελευταία χρόνια, η μέθοδος CBMN έχει εξελιχθεί σε μια αξιόπιστη μέθοδο που επιτρέπει τη μελέτη του συνόλου των κυτταρικών συστημάτων για την ύπαρξη χρωμοσωματικών βλαβών, χρησιμοποιώντας διάφορους γενετικούς δείκτες. Με τη μέθοδο αυτή είναι δυνατή η εκτίμηση γεγονότων χρωμοσωματικής αστάθειας, όπως η χρωμοσωματική θραύση, η χρωμοσωματική απώλεια, η λανθασμένη επιδιόρθωση των βλαβών του DNA, ο μη αποχωρισμός των χρωμοσωμάτων, χρησιμοποιώντας ως γενετικό δείκτη τους μικροπυρήνες. Παρέχεται επίσης η δυνατότητα μελέτης της απόπτωσης, της νέκρωσης, καθώς και του ρυθμού προόδου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Ακόμη, η μέθοδος CBMN εκτός από τους μικροπυρήνες, μελετά και την ύπαρξη πυρηνοπλασματικών γεφυρών (NPBs), ενός γενετικού δείκτη δικεντρικών χρωμοσωμάτων που προκύπτουν από τελικές συντήξεις τελομερών ή/και κακή επιδιόρθωση του DNA, καθώς και πυρηνοπλασματικών προεκβολών (NBUDs), που υποδεικνύουν την ενίσχυση κάποιου γονιδίου (Fenech, 2007). Επιπλέον, νέες εξελίξεις έχουν σημειωθεί, οι οποίες επιτρέπουν τη διάκριση μικροπυρήνων που περικλείουν χρωμοσωματικά θραύσματα από μικροπυρήνες που περικλείουν ολόκληρα χρωμοσώματα, καθώς και τον εντοπισμό γεγονότων μη αποχωρισμού των χρωμοσωμάτων σε διπύρηνα κύτταρα. Αυτό επιτυγχάνεται είτε με το συνδυασμό της CBMN μεθόδου με τη μέθοδο CREST, που περιλαμβάνει τη χρήση ειδικών αντισωμάτων για πρωτεΐνες του κινητοχώρου των χρωμοσωμάτων (CREST antibodies), είτε με το συνδυασμό της CBMN μεθόδου με την μέθοδο FISH (Fluorescence Ιn Situ Hybridization), όπου γίνεται η χρήση κατάλληλων πανκεντρομερικών ανιχνευτών (pan-centromeric DNA probes) (Benameur et al., 2011). 66

67 Τέλος, η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης σε συνδυασμό με την κυτοσίνη της αραβινοσίδης (ARA-C) επιτρέπει και την ανίχνευση βλαβών του DNA που επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής βάσεων, μέσω μετατροπής των περιοχών που επιδιορθώθηκαν σε μικροπυρήνες, κατά τη διάρκεια μίας πυρηνικής διαίρεσης (Fenech, 2000). Για όλους τους παραπάνω λόγους, η CBMN μέθοδος αναφέρεται και ως CBMN Cytome assay. Η ονομασία αυτή οφείλεται στο ότι κατά τη μέθοδο αυτή εξετάζεται η βιωσιμότητα των κυττάρων (μέτρηση αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων), ο ρυθμός του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (μέτρηση μονοπύρηνων, διπύρηνων, τριπύρηνων, τετραπύρηνων και πολυπύρηνων κυττάρων), η χρωμοσωματική βλάβη ή αστάθεια (παρουσία ΜΝ, NPBs, NBUDs, και η ύπαρξη σημάτων στους κύριους πυρήνες ή στους ΜΝ σε περίπτωση χρήσης κεντρομερικών ανιχνευτών) (Fenech, 2007). Εικόνα 6.3.β.: Οι γενετικές διεργασίες που υφίστανται τα κύτταρα έπειτα από την έκθεσή τους σε κυτταροτοξικούς παράγοντες και μπορούν να ανιχνευθούν με τη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης (CBMN Cytome assay). (Προσαρμογή από Fenech, 2007). 67

68 6.4. Κυτταροχαλασίνη-Β Έχουν απομονωθεί τέσσερις κυτταροχαλασίνες, που ονομάζονται κυτταροχαλασίνη A, B, C, και D, αντίστοιχα. Οι κυτταροχαλασίνες Α και Β απομονώθηκαν από καλλιέργειες του μύκητα Helminthosporium dematiodeum, ενώ οι C και D από το μύκητα Metarrhizium anisopliae. Αξίζει να σημειωθεί ότι και οι τέσσερις κυτταροχαλασίνες εμφανίζουν παρόμοια λειτουργία αλλά διαφέρουν ως προς την δραστικότητα, με τις C και D να παρουσιάζουν δέκα φορές πιο ισχυρή δράση από τις Α και Β (Carter, 1967). Συγκεκριμένα, η κυτταροχαλασίνη-β που χρησιμοποιείται στη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης, αποτελείται δομικά από ένα δακτύλιο λακτόνης που είναι συνδεδεμένος σε ένα δικυκλικό σύστημα λακτάμης (Carter, 1967). Εικόνα 6.4.: Χημική δομή της κυτταροχαλασίνης-β (Cyt-B). (Haidle & Myers, 2004) Πρόκειται για μία μυκοτοξίνη που διαπερνά τις μεμβράνες και αναστέλλει την κυτταροπλασματική διαίρεση μέσω αναστολής του σχηματισμού των συσταλτών μικροϊνιδίων. Αναστέλλει έτσι την κυτταροκίνηση και όχι την πυρηνοδιαίρεση. Πιο συγκεκριμένα, η Cyt-B μικραίνει τα νημάτια της ακτίνης παρεμποδίζοντας την προσθήκη μονομερούς στο ταχέως αναπτυσσόμενο άκρο των πολυμερών. Επιπλέον αναστέλλει τη μεταφορά της γλυκόζης, τη συσσωμάτωση των αιμοπεταλίων και το σχηματισμό αποπτωτικών σωμάτων που διεγείρονται από την αδενοσίνη, χωρίς να επηρεάζει την ενεργοποίηση της ενδογενούς ADP-ριβοζυλίωσης στα λευχαιμικά κύτταρα HL-60. Επίσης, χρησιμοποιείται στην κλωνοποίηση μετά από την πυρηνική μεταφορά. Στη CBMN μέθοδο, κύτταρα-δέκτες χωρίς πυρήνα επεξεργάζονται με τη χρωστική Hoechst που περιέχει Cyt-B. 68

69 6.5. Πλεονεκτήματα της μεθόδου αναστολής της κυτταροκίνησης Η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης παρουσιάζει πολλά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με άλλες μεθόδους που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη χρωμοσωματικών βλαβών. Το βασικότερο πλεονέκτημα της μεθόδου είναι η δυνατότητα για αξιόπιστη αναγνώριση των κυττάρων που έχουν ολοκληρώσει μία πυρηνική διαίρεση, κάτι που δεν ήταν εφικτό με άλλες κυτταρογενετικές μεθόδους που χρησιμοποιούνταν στο παρελθόν. Στο γεγονός αυτό συνέβαλε καθοριστικά η χρήση της Cyt-B (Fenech, 1997). Αρχικά, η μέθοδος των μικροπυρήνων περιλάμβανε την καταμέτρηση όλων των κυττάρων που φέρουν μικροπυρήνες, ανεξάρτητα από το πρότυπο της πυρηνικής τους διαίρεσης. Σε μια τέτοια περίπτωση όμως, η συχνότητα των μικροπυρήνων δεν αποτελεί πραγματικό δείκτη της χρωμοσωματικής βλάβης, εφόσον ακόμα και οι καλύτερες μέθοδοι συγχρονισμού των κυττάρων δεν καταφέρνουν να επιτύχουν την ταυτόχρονη διαίρεση όλων των κυττάρων. Αντιθέτως, η CBMN μέθοδος επιτρέπει την αναγνώριση των κυττάρων που έχουν ολοκληρώσει μία μόνο πυρηνική διαίρεση, και άρα μόνο αυτά τα κύτταρα καταμετρούνται για τον υπολογισμό της συχνότητας των μικροπυρήνων (Fenech, 1997). Επιπλέον, η συχνότητα των μικροπυρήνων στα διπύρηνα κύτταρα είναι διπλάσια από ότι απουσία κυτταροχαλασίνης Β. Αυτό σημαίνει ότι θα πρέπει να αναλύεται τουλάχιστον ο διπλάσιος αριθμός μονοπύρηνων κυττάρων για να παρατηρηθεί το ίδιο επίπεδο μικροπυρήνων που εμφανίζονται στα διπύρηνα. Το γεγονός αυτό δείχνει την ακρίβεια και την ευαισθησία της συγκεκριμένης μεθόδου (Fenech, 1997). Σημαντικό πλεονέκτημα μπορεί να θεωρηθεί και το γεγονός ότι η μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί σε πολλούς τύπους κυττάρων, με την προϋπόθεση ότι μπορούν να διαιρεθούν. Έτσι, εκτός από τα λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος, η μέθοδος εφαρμόζεται και σε κύτταρα του μυελού των οστών, ινοβλάστες του πνεύμονα, κερατινοκύτταρα της επιδερμίδας, επιθηλιακά κύτταρα της στοματικής κοιλότητας και καρκινικά κύτταρα πρωτογενών όγκων (Fenech, 2007). Ένα ακόμα πλεονέκτημα της CBMN μεθόδου είναι ότι επιτρέπει τη γρήγορη μέτρηση της έκτασης και της εξέλιξης της πυρηνικής διαίρεσης ενός διαιρούμενου κυτταρικού πληθυσμού. Αυτό επιτυγχάνεται με τη μέτρηση των μονοπύρηνων, διπύρηνων, τριπύρηνων, τετραπύρηνων και πολυπύρηνων κυττάρων μετά από ένα καθορισμένο σημείο μετά την προσθήκη της Cyt-B. Έτσι είναι δυνατόν να υπολογιστούν οι δείκτες CBPI (Δείκτης Πολλαπλασιασμού των κυττάρων, Cytokinesis Block Proliferation Index), NDI (Δείκτης Πυρηνικής Διαίρεσης, Nuclear Division Index) και ο δείκτης της κυτταροτοξικότητας. Η 69

70 μέτρηση των δεικτών αυτών μπορεί να μας δώσει σημαντικές πληροφορίες για τις κυτταροστατικές επιδράσεις κάποιου εξεταζόμενου φυσικού ή χημικού παράγοντα (Fenech, 1997). Όπως αναλύθηκε και στην προηγούμενη ενότητα, η μέθοδος αυτή καθιστά δυνατή τη μελέτη του συνόλου των γενετικών διεργασιών που υφίστανται τα κύτταρα έπειτα από την έκθεσή τους σε κυτταροτοξικούς παράγοντες. Έτσι, εκτός από τους ΜΝ, επιτρέπει την ανίχνευση πυρηνοπλασματικών γεφυρών, οι οποίες δεν θα μπορούσαν να παρατηρηθούν σε μονοπύρηνα κύτταρα, καθώς επίσης και πυρηνοπλασματικών προεκβολών. Ακόμη, η CBΜΝ μέθοδος παρουσιάζει και το πλεονέκτημα της ανάλυσης των αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων. Είναι δυνατόν κάποιος παράγοντας που προκαλεί βλάβη να μην οδηγεί στο σχηματισμό μικροπυρήνων, αλλά να οδηγεί το κύτταρο στην απόπτωση. Η χρήση της μεθόδου αυτής επιτρέπει την ευκολότερη ανάλυση των αποπτωτικών κυττάρων επειδή η παρουσία της Cyt-B παρεμποδίζει την αποσύνθεσή τους σε μικρότερα αποπτωτικά σωμάτια. Επιπλέον, η CBΜΝ μέθοδος επιτρέπει την ανάλυση των νεκρωτικών κυττάρων παρεμποδίζοντας με τη χρήση της Cyt-B το σχηματισμό των μικροϊνιδίων που είναι απαραίτητα για τον κατακερματισμό των νεκρωτικών κυττάρων (Fenech et al., 1999). Επιπλέον, με τη χρήση κατάλληλων κεντρομερικών DNA ανιχνευτών ή αντισωμάτων έναντι του κινητοχώρου είναι δυνατή η ταυτόχρονη ανίχνευση γεγονότων χρωμοσωματικών ρηγμάτων και χρωμοσωματικής απώλειας ή μη αποχωρισμού. Η ανίχνευση της χρωμοσωματικής απώλειας είναι ίσως το μοναδικό πλεονέκτημα της CBMN μεθόδου έναντι της ανάλυσης των μεταφασικών χρωμοσωμάτων, κι αυτό γιατί στη μέθοδο αυτή το χρωμόσωμα δεν απουσιάζει, αλλά περικλείεται στον μικροπυρήνα (Fenech, 1997). Στα πλεονεκτήματα της μεθόδου συγκαταλέγεται και η ανίχνευση βλαβών που επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής, όταν η μέθοδος εφαρμόζεται σε συνδυασμό με την κυτοσίνη της αραβινοσίδης (CBMN/ARA-C). Ένα τελευταίο πλεονέκτημα της μεθόδου αποτελεί η ανίχνευση πολυμορφισμών του HPRT γονιδίου, που παίζει σημαντικό ρόλο στην παραγωγή πουρινών. Με τη χρήση της Cyt- B είναι δυνατή η ανίχνευση των λεμφοκυττάρων που φέρουν μεταλλάξεις του HPRT γονιδίου, από την ανθεκτικότητά τους στην 6-θειογουανίνη. Τα κύτταρα που φέρουν τέτοιες μεταλλάξεις έχουν την ικανότητα να διαιρούνται τουλάχιστον μία φορά κατά την επώαση 72 ωρών, παρουσία 0,2mΜ 6-θειογουανίνης, και αναγνωρίζονται από τη διπύρηνη ή πολυπύρηνη μορφή τους που επιτυγχάνεται με τη χρησιμοποίηση Cyt-B 30 ώρες μετά από τη μιτογόνο διέγερσή τους (Fenech, 1997). 70

71 6.6. Μειονεκτήματα της μεθόδου αναστολής της κυτταροκίνησης Τα μειονεκτήματα της CBMN μεθόδου έχουν να κάνουν κυρίως με μειονεκτήματα που συνεπάγεται η δράση της Cyt-B. Ως γνωστόν, η ένωση αυτή αναστέλλει την κυτταροκίνηση, αφού προσδένεται σε σύμπλοκα μεγάλου μοριακού βάρους στην πλασματική μεμβράνη των κυττάρων που έχουν την ικανότητα να επάγουν τον πολυμερισμό της ακτίνης και επομένως την οργάνωση των μικροϊνιδίων που απαιτούνται για το σχηματισμό της περίσφιξης στον ισημερινό του κυττάρου. Η χρήση μίας τέτοιας ένωσης έχει ως αποτέλεσμα την αδυναμία ανίχνευσης άλλων χημικών ενώσεων που δρουν με ανάλογο τρόπο, αναστέλλοντας δηλαδή την κυτταροκίνηση ή τον πολυμερισμό των μικροϊνιδίων (Fenech, 1997). Επιπλέον, η αποτελεσματικότητα της χρήσης της κυτταροχαλασίνης Β εξαρτάται από τη συγκέντρωση της στην καλλιέργεια (Fenech, 1997), ενώ ποικίλλει και η κυτταροτοξικότητά της μεταξύ των κυτταρικών σειρών (Kirsch-Volders et al., 2003). Ως εκ τούτου θα πρέπει συνεχώς να προστίθεται η κατάλληλη συγκέντρωση Cyt-B στην καλλιέργεια, ούτως ώστε να εξασφαλίζεται ο μέγιστος βαθμός αναστολής της κυτταροκίνησης για κάθε κυτταρικό τύπο (Fenech, 1997). Αξίζει να αναφερθεί επίσης ότι η Cyt-B ενδέχεται να έχει κάποια ανεπιθύμητη επίδραση που θα έχει ως αποτέλεσμα περιορισμένα πειραματικά δεδομένα (Kirsch-Volders et al., 2003). Ένα ακόμη μειονέκτημα της μεθόδου είναι ότι μπορεί να εφαρμοστεί μόνο σε διαιρούμενους κυτταρικούς πληθυσμούς, με αποτέλεσμα να μην μπορούν να ανιχνευθούν χρωμοσωματικές βλάβες που συμβαίνουν σε μη διαιρούμενα κύτταρα, όπως είναι οι πρωτογενείς καλλιέργειες μυϊκού και νευρικού ιστού (Fenech, 1997). Τέλος, η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης δεν μπορεί να ανιχνεύσει ανωμαλίες του DNA όπως μετατοπίσεις ή αναστροφές και γενικότερα συμμετρικές αναδιατάξεις, μιας και αυτές οι ανωμαλίες δεν οδηγούν στο σχηματισμό μικροπυρήνων Εφαρμογές της μεθόδου αναστολής της κυτταροκίνησης Η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης χρησιμοποιείται ευρέως σε μελέτες για την in vitro αξιολόγηση της γονιδιοτοξικής δράσης νέων χημικών φαρμακευτικών ενώσεων που παράγονται από τις φαρμακοβιομηχανίες (Fenech & Kirsch-Volders, 2001). Ο υπολογισμός των δεικτών CBPI, NDI και της κυτταροτοξικότητας μπορεί να μας δώσει σημαντικές πληροφορίες για τις κυτταροστατικές επιδράσεις του εξεταζόμενου χημικού παράγοντα, και να βοηθήσει στην αναγνώριση μορίων που διεγείρουν ή αναστέλλουν την κυτταρική 71

72 διαίρεση. Οι δείκτες αυτοί επομένως θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την εκτίμηση της ανοσοαπόκρισης, με μέτρηση της μιτογόνου απόκρισης των λεμφοκυττάρων. Επιπλέον, οι δείκτες αυτοί είναι χρήσιμοι και σε μελέτες της δοσοεξαρτώμενης σχέσης των χημικών παραγόντων με την επαγωγή της διαίρεσης (Fenech, 1997). Ακόμη, ο συνδυασμός της CBMN μεθόδου με την FISH, συμβάλλει στον χαρακτηρισμό του γενετικού περιεχομένου των ΜΝ, επιτρέποντας έτσι τη μελέτη της θραυσματογόνου ή ανευπλοειδογόνου δράσης διαφόρων χημικών παραγόντων παρέχοντας πολλές φορές χρήσιμα αποτελέσματα για την κατανόηση πιθανών παρενεργειών της δράσης φαρμάκων, καθώς και στην εκτίμηση της ευαισθησίας διαφορετικών χρωμοσωμάτων σε γονιδιοτοξικούς παράγοντες (Hovhannisyan, 2010). Άλλες εφαρμογές της μεθόδου περιλαμβάνουν τον έλεγχο του πληθυσμού για γενετικές βλάβες και σύγκριση των βλαβών αυτών ανάμεσα σε πληθυσμούς που έχουν εκτεθεί σε διαφορετικούς περιβαλλοντικούς και άλλους παράγοντες, την πρόβλεψη της ραδιοευαισθησίας φυσιολογικών ιστών και όγκων, καθώς και την αξιολόγηση της διαφορετικής ραδιοευαισθησίας που εμφανίζουν οι όγκοι διαφόρων ασθενών, με σκοπό τη βελτίωση της ακτινοθεραπείας (Fenech & Kirsch-Volders, 2001). Η μέθοδος CBMN έχει επίσης αποδειχθεί ότι είναι ένα αποτελεσματικό εργαλείο για τη μελέτη των κυτταρικών και πυρηνικών δυσλειτουργιών που προκαλούνται από in vitro ή in vivo γήρανση, καθώς και της ανεπάρκειας σε μικροθρεπτικά συστατικά (micronutrient deficiency). Σύμφωνα με πρόσφατες έρευνες, η μέθοδος αυτή είναι πολλά υποσχόμενη στους αναδυόμενους τομείς των nutrigenomics και toxicogenomics, εφόσον είναι πλέον σαφές ότι τα επίπεδα των θρεπτικών συστατικών επηρεάζουν την ευαισθησία του οργανισμού σε εξωγενείς γονιδιοτοξικούς παράγοντες (Fenech, 2007). Τέλος, η ικανότητα της CBMN να εξετάζει ταυτόχρονα πολλές γενετικές διεργασίες (CBMN Cytome assay) συμβάλλει στην πρόβλεψη της πιθανότητας για εμφάνιση καρκίνου και στην ανίχνευση δυνητικά καρκινογόνων διατροφικών, γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων, με σκοπό την πρόληψη παθολογικών καταστάσεων (Fenech, 2007). 72

73 6.8. Μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης σε συνδυασμό με την κυτοσίνη της αραβινοσίδης (CBMN/ARA-C) Μετά την εφαρμογή της μεθόδου των μικροπυρήνων για τη μελέτη διάφορων γονιδιοτοξικών παραγόντων, έγινε εμφανές ότι ο βαθμός σχηματισμού μικροπυρήνων ήταν χαμηλός σε σχέση με την κυτταροτοξικότητα διάφορων χημικών ενώσεων ή της υπεριώδους ακτινοβολίας, παραγόντων δηλαδή που προκαλούν σε μεγαλύτερο βαθμό βλάβες στις βάσεις του DNA και τροποποιημένα νουκλεοτίδια, παρά χρωμοσωματικά ρήγματα και βλάβες στη μιτωτική συσκευή, όπως ισχύει π.χ. για την ιονίζουσα ακτινοβολία. Το γεγονός αυτό πιθανότατα οφείλεται στο ότι τα λεμφοκύτταρα βρίσκονται στη G0 φάση, ενώ οι παραπάνω παράγοντες ασκούν τη μέγιστη χρωμοσωματική τους δράση στη φάση S (Fenech & Neville, 1992). Έγινε λοιπόν η υπόθεση ότι οι βλάβες αυτές είτε επιδιορθώνονται, είτε εάν δεν επιδιορθωθούν, δεν μετατρέπονται σε δίκλωνα ρήγματα μετά από ένα κύκλο αντιγραφής τους DNA. Για το λόγο αυτό θεωρήθηκε ότι η αναστολή της επιδιόρθωσης αυτών των βλαβών, με τη χρησιμοποίηση της κυτοσίνης της αραβινοσίδης (ARA-C), θα μπορούσε να μετατρέψει τη βλάβη στη βάση του DNA σε ένα μονόκλωνο ρήγμα, το οποίο στη συνέχεια θα μετατραπεί σε δίκλωνο, μετά από έναν κύκλο αντιγραφής του DNA. Το δίκλωνο αυτό ρήγμα, αποτελεί άκεντρο χρωμοσωματικό τμήμα και εκφράζεται ως μικροπυρήνας μέσα σ έναν κύκλο διαίρεσης, όπως παρουσιάζεται και στην ακόλουθη εικόνα (Fenech & Neville, 1992). Με αυτό το σκεπτικό αποδείχθηκε από τους Fenech et al. (2007), ότι η προσθήκη της αραβινοσίδης για τις πρώτες 16 ώρες της καλλιέργειας των λεμφοκυττάρων (πριν την αντιγραφή του DNA), οδηγούσε πράγματι σε μια δραματική αύξηση (τουλάχιστον δεκαπλάσια) στη συχνότητα των μικροπυρήνων, μετά από επίδραση με ιονίζουσα ακτινοβολία ή με μεθυλονιτροζουρία (τοξική ένωση), όπως ήταν αναμενόμενο από την αναλογία των τροποποιημένων νουκλεοτιδίων/ λανθασμένων βάσεων που σχετίζονται με την επαγωγή χρωμοσωματικών ρηγμάτων (Fenech, 1997). Ακριβής μέτρηση των βλαβών που επιδιορθώνονται με εκτομή, με τη χρησιμοποίηση της κυτοσίνης της αραβινοσίδης, είναι δυνατή μόνο με την ταυτόχρονη εφαρμογή της μεθόδου αναστολής της κυτταροκίνησης, και αυτό γιατί: (α) η μετατροπή των βλαβών που επιδιορθώνονται με εκτομή σε μικροπυρήνες μπορεί να συμβεί μόνο σε κύτταρα που έχουν ολοκληρώσει μια διαίρεση, και (β) η προσθήκη της αραβινοσίδης μπορεί να οδηγήσει σε σημαντική τροποποίηση της κινητικής της πυρηνικής διαίρεσης. Για το λόγο αυτό, η 73

74 προσθήκη της αραβινοσίδης είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με την CBMN μέθοδο, σε περιπτώσεις όπου παρατηρούνται σημαντικά κυτταροτοξικά φαινόμενα, σε συνδυασμό με μικρή επαγωγή μικροπυρήνων (Fenech, 1997). Η αναστολή της DNA πολυμεράσης από την αραβινοσίδη, προκαλεί ρήγματα στο DNA μόνο σε κύτταρα τα οποία βρίσκονται στην S φάση (φάση αντιγραφής του DNA τους). Γι αυτό και η προσθήκη της ARA-C σε συνδυασμό με τη CBMN μέθοδο, χρησιμοποιείται μόνο σε λεμφοκύτταρα που βρίσκονται στη φάση G0 και έχουν διεγερθεί με κάποιον μιτογόνο παράγοντα, όπως η PHA. Η έκθεση στην ARA-C πρέπει να λαμβάνει χώρα κατά την G1 και πριν την S φάση, λόγω του ότι η επιδιόρθωση με εκτομή ενεργοποιείται κατά την G1 φάση. Πρακτικά, αυτό σημαίνει ότι τα λεμφοκύτταρα καλλιεργούνται παρουσία ARA-C κατά τη διάρκεια των πρώτων ωρών μετά τη διέγερση με την PHA. Ακολούθως τα λεμφοκύτταρα ξεπλένονται ώστε να απομακρυνθεί η αραβινοσίδη από την καλλιέργεια, και προστίθεται η δεοξυκυτιδίνη (DC), η οποία ανταγωνίζεται τη δράση της αραβινοσίδης. Το πειραματικό πρωτόκολλο που ακολουθείται κατά τη διαδικασία αυτή, προσαρμόζεται στη συνέχεια σε αυτό της CBMN μεθόδου (Fenech, 2007). Η μέθοδος αυτή έχει έκτοτε χρησιμοποιηθεί για διάκριση μεταξύ γονιδιοτοξικών παραγόντων που επάγουν ή όχι επιδιόρθωση με εκτομή (Surrallés, 1995). 74

75 7. ΜΕΘΟΔΟΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΜΟΝΑΔΙΑΙΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ (SINGLE CELL GEL ELECTROPHORESIS, SCGE/ COMET ASSAY) 7.1. Αρχή της μεθόδου Η μέθοδος ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (Single Cell Gel Electrophoresis/ SCGE, Comet assay) είναι μια γρήγορη, πολύ ευαίσθητη και αξιόπιστη μέθοδος που χρησιμοποιείται για την εκτίμηση της θραύσης του DNA σε επίπεδο μοναδιαίων κυττάρων. Σε γενικές γραμμές η μέθοδος επιτρέπει την ανίχνευση δίκλωνων ή μονόκλωνων ρηγμάτων στο DNA, θέσεων που είναι ασταθείς σε αλκαλικές συνθήκες (alkalilabile sites) και βλαβών που επιδιορθώνονται με κάποια καθυστέρηση. Για τους λόγους αυτούς τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιείται ευρέως σε διάφορους τομείς της έρευνας (Rojas et al., 1999). Τη δεκαετία του 1970, ο Cook και οι συνεργάτες του ανέπτυξαν μια προσέγγιση για τη διερεύνηση της δομής του πυρήνα, βασιζόμενοι στη λύση των κυττάρων με χρησιμοποίηση μη ιονικών απορρυπαντικών και NaCl υψηλής μοριακότητας. Μια τέτοια κατεργασία έχει ως αποτέλεσμα τη διάσπαση των μεμβρανών, του κυτταροπλάσματος και του πυρήνα, την αποδιοργάνωση των νουκλεοσωμάτων και τη διαλυτοποίηση σχεδόν όλων των ιστονών. Αυτό που απομένει είναι μια πυρηνική μήτρα που αποτελείται από RNA και πρωτεΐνες μαζί με DNA, η οποία ονομάζεται νουκλεοειδές (nucleoid). Το νουκλεοειδές είναι αρνητικά υπερελικωμένο, λόγω περιέλιξης της διπλής έλικας του DNA γύρω από τις ιστόνες του νουκλεοσώματος. Η ύπαρξη αυτής της υπερελίκωσης υποδηλώνει ότι δεν είναι δυνατή η ελεύθερη περιστροφή του DNA (Collins, 2004). Οι ίδιοι ερευνητές πρότειναν ένα μοντέλο σύμφωνα με το οποίο το DNA προσδένεται κατά διαστήματα στην πυρηνική μήτρα του νουκλεοειδούς, με συνέπεια να οργανώνεται ως ένα σύνολο από υπερελικωμένες θηλιές, και όχι ως γραμμικό μόριο. Παρατήρησαν επίσης ότι με την προσθήκη βρωμιούχου αιθίδιου, οι θηλιές ξεδιπλώνονται και εκτείνονται έξω από τον πυρήνα του νουκλεοειδούς, σχηματίζοντας μια «στεφάνη» (halo). Κάτι παρόμοιο συμβαίνει και με την επίδραση της ιονίζουσας ακτινοβολίας στο DNA, με την πρόκληση ενός μονόκλωνου ρήγματος να είναι αρκετή για το ξεδίπλωμα της θηλιάς (Collins, 2004). Η αρχή της μεθόδου στην πιο απλή της μορφή περιλαμβάνει την ανάμειξη κυττάρων με αγαρόζη πάνω σε αντικειμενοφόρους πλάκες, επακόλουθη λύση τους με χρήση διαλυμάτων 75

76 υψηλής συγκέντρωσης αλάτων και κατάλληλων απορρυπαντικών (π.χ. Triton X-100) και ηλεκτροφόρηση. Η ύπαρξη ρηγμάτων οδηγεί σε χαλάρωση της υπερελίκωσης του DNA, με αποτέλεσμα οι θηλιές να εξέρχονται από το νουκλεοειδές, σχηματίζοντας μια στεφάνη. Κατά την ηλεκτροφόρηση, οι θηλιές αυτές λόγω του αρνητικού φορτίου του DNA μετακινούνται προς την άνοδο υπό την επίδραση του ηλεκτρικού πεδίου. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται χρώση του DNA και μικροσκοπική ανάλυση των εικόνων που προκύπτουν. Οι εικόνες αυτές μοιάζουν με κομήτες που φέρουν διακριτή «κεφαλή» και «ουρά», για το λόγο αυτό και η μέθοδος ονομάστηκε Comet assay. Η κεφαλή αποτελείται από άθικτο DNA περιελιγμένο στο νουκλεοειδές, ενώ η ουρά αποτελείται από τις χαλαρές θηλιές που προκύπτουν από τα θραύσματα του DNA και που εκτείνονται έξω από τα όρια του νουκλεοειδούς, σχηματίζοντας μια στεφάνη (Shaposhnikov et al., 2008). Οι πρώτες εικόνες από «κομήτες» προήλθαν από τους Östling και Johanson το 1984, οι οποίοι εφάρμοσαν τη μέθοδο πραγματοποιώντας ηλεκτροφόρηση σε ουδέτερες συνθήκες (ph < 10) (Collins, 2004). Εικόνα 7.1.α.: Γενικές αρχές της μεθόδου ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (Comet assay). (Προσαρμογή από Shaposhnikov et al., 2008). Η βλάβη του DNA εκτιμάται μέσω οπτικής ή αυτοματοποιημένης ανάλυσης των εικόνων με ειδικά υπολογιστικά προγράμματα. Η έκταση της μετακίνησης του DNA στην ουρά του κομήτη σχετίζεται με τον τύπο της βλάβης του DNA. Η δημιουργία ρηγμάτων αυξάνει τη μετακίνηση του DNA στην ουρά του κομήτη, ενώ η ύπαρξη χιαστί δεσμών DNA- DNA ή DNA-πρωτεϊνών την επιβραδύνει (Kumaravel et al., 2009). Επιπλέον, η ποσότητα του DNA στην ουρά σε σχέση με την κεφαλή του κομήτη, είναι ανάλογη με τον αριθμό των ρηγμάτων (Hovhannisyan, 2010). 76

77 Εικόνα 7.1.β.: Εικόνες που προέρχονται από εφαρμογή της μεθόδου ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (Comet assay). Διακρίνονται οι χαρακτηριστικές δομές που μοιάζουν με κομήτες. ( Διαφορετικές μορφές της μεθόδου Όπως αναφέρθηκε στην προηγούμενη ενότητα, οι Östling and Johanson το 1984 εφάρμοσαν τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης, πραγματοποιώντας ηλεκτροφόρηση σε ουδέτερες συνθήκες (ph < 10). Λίγα χρόνια μετά, δύο ερευνητικές ομάδες δουλεύοντας ανεξάρτητα, εφάρμοσαν μια παραλλαγή της μεθόδου, η οποία περιλάμβανε την πραγματοποίηση της ηλεκτροφόρησης σε αλκαλικές συνθήκες. Ο Singh και οι συνεργάτες του το 1988 επώασαν αρχικά τα κύτταρα με διάλυμα λύσης που περιείχε 5M NaCl, Triton X-100, και Sarkosyl salt (ph 10) για 1 ώρα, και στη συνέχεια με αλκαλικό διάλυμα 0.3M NaOH (ph>13) στο οποίο και πραγματοποίησαν την ηλεκτροφόρηση. Οι Olive et al. (1990) διεξήγαγαν την ηλεκτροφόρηση σε μέτρια αλκαλικές συνθήκες, χρησιμοποιώντας ήπιο διάλυμα λύσης (0.03M NaOH) στο οποίο επώασαν τα κύτταρα για 1 ώρα πριν από την ηλεκτροφόρηση (Collins, 2004). Και οι δύο αυτές εκδοχές της μεθόδου (ηλεκτροφόρηση σε ουδέτερες ή αλκαλικές συνθήκες) επιτρέπουν την ταυτόχρονη ανίχνευση μονόκλωνων και δίκλωνων ρηγμάτων, χωρίς να είναι δυνατή η διάκρισή τους. Έτσι, το 1991 αναπτύχθηκε μια τελείως διαφορετική εκδοχή της μεθόδου από τους Olive et al., η οποία επέτρεπε την ανίχνευση των δίκλωνων ρηγμάτων του DNA, χωρίς την παρεμβολή των μονόκλωνων. Σε αυτή τη μέθοδο μετά τη λύση των κυττάρων, πραγματοποιείται παρατεταμένη επώασή τους στην αγαρόζη, στους 50 C. Σε αυτές τις συνθήκες ο πυρήνας του νουκλεοειδούς διαρρηγνύεται, με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η ανίχνευση μονόκλωνων ρηγμάτων, παρά μόνο των δίκλωνων τμημάτων 77

78 του DNA (Collins, 2004). Τα δίκλωνα ρήγματα έχουν μεγαλύτερη βιολογική σημασία σε σχέση με τα μονόκλωνα, καθώς οδηγούν άμεσα σε χρωμοσωματικές ανωμαλίες και απώλεια γενετικού υλικού (Olive et al., 1991). Η μέτρηση των ρηγμάτων του DNA μας δίνει περιορισμένες πληροφορίες, καθώς μπορεί να πρόκειται για ρήγματα που στη συνέχεια θα επιδιορθωθούν ή απουρινικές/ απυριμιδινικές θέσεις (AP sites), οι οποίες είναι ασθενείς σε αλκαλικές συνθήκες (alkalilabile sites) και ως εκ τούτου εμφανίζονται σαν ρήγματα. Ακόμη μπορεί να είναι τροποποιημένα νουκλεοτίδια ή βάσεις, που απομακρύνονται κατά την επιδιόρθωση με εκτομή, και στη συνέχεια αντικαθίστανται από τα σωστά νουκλεοτίδια. Για την ανίχνευση τέτοιων φαινομένων, αναπτύχθηκε μια εκδοχή της μεθόδου ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης κατά την οποία γίνεται ενζυμική πέψη του νουκλεοειδούς με ένζυμα που αναγνωρίζουν συγκεκριμένες βλάβες του DNA και δημιουργούν ρήγματα (Collins, 2004). Υπάρχουν επίσης και κάποιες λιγότερο χρησιμοποιούμενες εκδοχές της μεθόδου, όπως η ραδιοσήμανση των κυττάρων με BrdU για την ανίχνευση ρηγμάτων κατά την S φάση της μίτωσης, η χρησιμοποίηση αναστολέων του πολυμερισμού του DNA (όπως π.χ. ARA-C, υδροξυουρία) για την ανίχνευση βλαβών που επιδιορθώνονται με το μηχανισμό εκτομής, και ο συνδυασμός με τη μέθοδο FISH για τον εντοπισμό της βλάβης σε συγκεκριμένα χρωμοσώματα, χρωμοσωματικές περιοχές ή γονίδια μέσα από όλο το DNA του κομήτη. (Collins, 2004). Τέλος, σε περιπτώσεις όπου είναι γνωστή η ύπαρξη μονόκλωνων ρηγμάτων είναι δυνατό να ανιχνευθεί η ύπαρξη χιαστί δεσμών μεταξύ DNA-DNA ή DNA-πρωτεϊνών (crosslinkage), λόγω της μη αναμενόμενης μειωμένης μετανάστευσης του DNA στην ουρά του κομήτη, κατά την ηλεκτροφόρηση (Hovhannisyan, 2010) Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της μεθόδου Η μέθοδος ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης είναι μια τεχνική απλή, γρήγορη, ευαίσθητη και με χαμηλό κόστος, που επιτρέπει την ανίχνευση βλαβών του DNA σε μοναδιαία κύτταρα (Collins, 2004). Βασικό πλεονέκτημα της μεθόδου είναι ότι μπορεί να εφαρμοστεί σχεδόν σε όλα τα ευκαρυωτικά κυττάρα, ανεξάρτητα από την ικανότητά τους να διαιρεθούν. Οι πιο συχνοί τύποι κυττάρων που αναλύονται με τη μέθοδο αυτή είναι τα λεμφοκύτταρα, τα επιθηλιακά κύτταρα της στοματικής ή ρινικής κοιλότητας, τα κύτταρα του πλακούντα και τα σπερματικά 78

79 κύτταρα (Cortés-Gutiérrez, 2011). Έχει επίσης αναφερθεί και εφαρμογή της σε προκαρυωτικά κύτταρα (Hovhannisyan, 2010). Επιπλέον, η μέθοδος δεν απαιτεί μεγάλο αριθμό κυττάρων για την ανίχνευση βλαβών. Μπορεί να ανιχνεύει με αξιοπιστία ρήγματα ανά διπλοειδές κύτταρο θηλαστικών (Hovhannisyan, 2010). Ακόμη, πολύ σημαντική είναι και η ευελιξία της μεθόδου, εφόσον οι διάφορες παραλλαγές της χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση διαφορετικών τύπων βλαβών του DNA. Ωστόσο, η μέθοδος ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης παρουσιάζει και κάποια μειονεκτήματα, με κυριότερο το γεγονός ότι δεν είναι πάντα δυνατή η διάκριση του είδους της βλάβης του DNΑ, αν δηλαδή τα ρήγματα που ανιχνεύονται είναι μονόκλωνα, δίκλωνα, θέσεις ασθενείς σε αλκαλικές συνθήκες κλπ. Δεν είναι δυνατός επίσης ο προσδιορισμός του μεγέθους των θραυσμάτων, εφόσον τα θραύσματα δεν διαχωρίζονται με βάση το μέγεθός τους (Olive & Banath, 2006), ενώ τέλος δεν είναι δυνατή η ανίχνευση αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων (Collins, 2004) Εφαρμογές της μεθόδου Την τελευταία δεκαετία, η μέθοδος ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (comet assay) έχει εξελιχθεί σε μια ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδο για την αξιολόγηση της γονιδιοτοξικότητας μεγάλου αριθμού χημικών και φαρμακευτικών ενώσεων, σε μελέτες βιοπαρακολούθησης της έκθεσης σε τοξικούς περιβαλλοντικούς ή ενδογενείς παράγοντες στον άνθρωπο, καθώς και στη μοριακή επιδημιολογία. Επιπλέον, η μέθοδος βρίσκει εφαρμογή και στην οικοτοξικολογία, και συγκεκριμένα στην εκτίμηση της ρύπανσης του περιβάλλοντος με γονιδιοτοξικούς παράγοντες, με τη χρήση κατάλληλων οργανισμών, όπως π.χ. μύδια (Collins, 2004). Ακόμη, η τεχνική αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της ικανότητας επιδιόρθωσης σε κυτταρικό επίπεδο (Collins, 2004). Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της πρόκλησης βλάβης στα κύτταρα και παρακολούθησης της ταχύτητας με την οποία αυτές επιδιορθώνονται. Η επιδιόρθωση των μονόκλωνων ρηγμάτων είναι μια απλή διαδικασία που μπορεί να ολοκληρωθεί σε λιγότερο από μισή ώρα, ενώ η επιδιόρθωση των δίκλωνων ρηγμάτων ή των οξειδωμένων βάσεων απαιτεί περισσότερο χρόνο (Azqueta et al., 2014). Τέλος, σε ορισμένες περιπτώσεις χρησιμοποιείται και για διαγνωστικούς σκοπούς, όπως για τη διάγνωση συνδρόμων τα οποία σχετίζονται με ανικανότητα επιδιόρθωσης βλαβών στο DNA (π.χ. μελαγχρωματική ξηροδερμία, σύνδρομο Νijmegen) (Collins, 2004). 79

80 7.5. Διμέθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και εφαρμογές του Το διμεθυλοσουλφοξείδιο (dimethylsulfoxide, DMSO) είναι ένα άχρωμο, ελαιώδες, ελαφρά ιξώδες και εξαιρετικά υγροσκοπικό υγρό. Έχει σχετικά υψηλό σημείο πήξης (18.5 C), επομένως σε θερμοκρασία δωματίου είναι στερεό. Όσον αφορά τη χημική του δομή, είναι ένα μικρό οργανικό μόριο που περιέχει μια υδροφιλική σουλφονυλική ομάδα και δύο υδροφοβικές μεθυλομάδες. Χάρη στην «αμφιφιλική» συμπεριφορά του μπορεί να διαλύεται στο νερό, αλλά και να διαλυτοποιεί μεγάλο αριθμό λιπόφιλων ενώσεων. Τα χαρακτηριστικά αυτά εξηγούν την ευρεία χρήση του ως διαλύτη σε έρευνες για το σχεδιασμό φαρμακευτικών ενώσεων (Balakin et al., 2006). Εικόνα 7.5.: Χημική δομή του DMSO. (Gurtovenko & Anwar, 2007) Η τοξικότητα του DMSO είναι πρακτικά μηδενική, ωστόσο όταν χρησιμοποιείται στο εργαστήριο απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή, γιατί απορροφάται γρήγορα από το δέρμα και μεταφέρεται ταχύτατα στην κυκλοφορία του αίματος. Αυτή του η ιδιότητα, καθιστά εξαιρετικώς επικίνδυνα τα διαλύματα τοξικών ενώσεων σε αυτό, αφού αν αυτά έρθουν σε επαφή με το δέρμα, το DMSO θα τις μεταφέρει ταχύτατα στον οργανισμό, όπου θα εκδηλώσουν την τοξική τους δράση, η οποία μπορεί να είναι και μοιραία. Ο μηχανισμός δράσης του DMSO δεν έχει διευκρινισθεί πλήρως. Μελέτες έχουν δείξει ότι κατά πάσα πιθανότητα οι αναλγητικές ιδιότητές του οφείλονται στο μπλοκάρισμα των αμύελων ινών (C group fibers) των περιφερικών νεύρων. Έχει επίσης αντιφλεγμονώδη δράση, καθώς σταθεροποιεί τις μεμβράνες των φθαρμένων κυττάρων και επιβραδύνει ή διακόπτει τη διαρροή ουσιών μέσω αυτών. Οι αντιφλεγμονώδεις ιδιότητές του φαίνεται να σχετίζονται με την αντιοξειδωτική του δράση, καθώς εξουδετερώνει τις ελεύθερες ρίζες που συσσωρεύονται στα σημεία βλάβης των ιστών (Beilke et al., 1987). Ωστόσο, η δράση αυτή δεν επεκτείνεται σε περιπτώσεις κυτταρικών βλαβών, που οφείλονται σε μολύνσεις ή σε όγκους. Το DMSO σήμερα βρίσκει πολλές εφαρμογές σε διάφορους τομείς της βιολογίας και της ιατρικής. Η πρώτη χρήση του DMSO στην ιατρική έγινε τη δεκαετία του 1960, όταν ο Jacob και η ερευνητική του ομάδα ανακάλυψαν ότι μπορούσε να διαπερνά το δέρμα και τις υπόλοιπες μεμβράνες, χωρίς να προκαλεί βλάβες. Μπορούσε επίσης να μεταφέρει μαζί του 80

81 και άλλες χημικές ομάδες μέσα στο βιολογικό σύστημα. Πλέον, το DMSO χρησιμοποιείται ως τοπικό αναλγητικό και αντιφλεγμονώδες. Αποτελεί συστατικό σε διάφορες κρέμες ή αλοιφές που εφαρμόζονται στο δέρμα για την επούλωση πληγών και την αντιμετώπιση διάφορων παθολογικών καταστάσεων, όπως διάστρεμμα, τενοντίτιδα, οστεοαρθρίτιδα και διάμεση κυστίτιδα (interstitial cystitis), μια ασθένεια της ουροδόχου κύστης. Χάρη στη γρήγορη απορρόφησή του από τους ιστούς, χρησιμοποιείται στη μεταφορά φαρμακευτικών ενώσεων μέσω του δέρματος και η απορρόφησή του ενισχύεται από την προσθήκη EDTA. Συχνά χρησιμοποιείται και ως σύμπλοκο με αντιμυκητιασικά φάρμακα για τη μεταφορά τους στο δέρμα ή στα νύχια. Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες, το DMSO μπορεί να συμβάλλει στην αντιμετώπιση της αναιμίας με πολλούς τρόπους. Ενισχύει την ικανότητα της αιμοσφαιρίνης να μεταφέρει οξυγόνο στον οργανισμό, ενώ βοηθάει και στη μεταφορά του σιδήρου (ειδικά όταν λαμβάνεται ως συμπλήρωμα) από την κυκλοφορία του αίματος στο μυελό των οστών, ώστε να δεσμευτεί στο μόριο της αίμης και να παραχθεί η αιμοσφαιρίνη. Επίσης, η διάλυση των βιταμινών B-9 (φυλλικό οξύ) και B-12 στο DMSO έχει ως συνέπεια την άμεση απορρόφησή τους από το δέρμα, κάτι που επιτείνει την παραγωγή των ερυθροκυττάρων. Η λιποφιλικότητα του DMSO, έχει συμβάλλει καθοριστικά στο σχεδιασμό νέων φαρμάκων που δρουν στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ). Όταν χρησιμοποιείται ως σύμπλοκο με φάρμακα, τα καθιστά ικανά να διαπερνούν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό, αυξάνοντας έτσι τη συγκέντρωσή τους στο ΚΝΣ, ακόμα και όταν χρησιμοποιούνται σε χαμηλές δόσεις (Sanmartín-Suárez et al., 2011). Επιπρόσθετα, βρίσκει εφαρμογή και στην κτηνιατρική, χορηγούμενο συνήθως σε σύμπλοκα με άλλα φάρμακα για να διευκολύνει τη μεταφορά τους στο δέρμα. Στα άλογα το DMSO χορηγείται με ενδοφλέβια ένεση για τη θεραπεία της ενδοκρανιακής υπέρτασης και του εγκεφαλικού οιδήματος. Στο σημείο αυτό να σημειωθεί ότι η χρήση του DMSO ως μέσο μεταφοράς των φαρμάκων έχει κάποιους περιορισμούς. Λόγω της πλειοτροπικής του δράσης μπορεί να προκαλέσει κάποια παρενέργεια, η οποία μπορεί εσφαλμένα να αποδοθεί στο φάρμακο ή ακόμα και να εμποδίσει τη δράση του φαρμάκου. Επιπλέον, η χρήση του στη θεραπεία του καρκίνου δεν θεωρείται αποτελεσματική, καθώς σύμφωνα με έρευνες η διάλυση χημειοθεραπευτικών φαρμάκων, όπως τα σύμπλοκα του λευκόχρυσου (σισπλατίνη, καρβοπλατίνη, οξαλιπλατίνη) σε DMSO έχει ως αποτέλεσμα την αλληλεπίδραση του με τα μόρια αυτά, αλλάζοντας τη δομή τους και μειώνοντας έτσι την κυτταροτοξική τους δράση και την ικανότητά τους να επάγουν την απόπτωση (Hall et al., 2014). 81

82 Στη βιολογία, το DMSO χρησιμοποιείται στη μέθοδο PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) για την αποφυγή δημιουργίας παραπροϊόντων. Η προσθήκη DMSO πριν την έναρξη της PCR συμβάλλει στη χαλάρωση υπερελικωμένων μορίων DNA ή για τη μείωση της θερμοσταθερότητας περιοχών πλούσιων σε G-C, έτσι ώστε να είναι δυνατή η αποδιάταξη του DNA σε χαμηλότερη θερμοκρασία (Chakrabarti & Schutt, 2001). Το DMSO αποτελεί επίσης κρυοπροστατευτικό παράγοντα, συμβάλλει δηλαδή στην αποφυγή της καταστροφής των κυττάρων κατά την κατάψυξη των ιστών. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται για τη διατήρηση κυττάρων, ιστών και οργάνων μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται υαλοποίηση αντί κρυστάλλωση (vitrification), κατά την οποία αποφεύγεται η δημιουργία κρυστάλλων οι οποίοι θα κατέστρεφαν τα κύτταρα. Το DMSO εμφανίζει επίσης μικρότερη τοξικότητα σε σχέση με άλλες κρυοπροστατευτικές ουσίες (γλυκερίνη, αιθυλενογλυκόλη, προπυλενογλυκόλη) (Suzuki et al., 1995). Χρησιμοποιείται συνήθως σε αναλογία 10% για την κατάψυξη και διατήρηση εμβρυονικών και αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων. Τέλος, άλλες εφαρμογές του DMSO στη βιολογία περιλαμβάνουν τη χρήση του για την επαγωγή της διαφοροποίησης των μυελοειδών κυττάρων σε διάφορες κυτταρικές σειρές, καθώς και για την παύση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 σε κυτταρικές σειρές ανθρώπινων λεμφοειδών κυττάρων. Επιπλέον, το DMSO χρησιμοποιείται για την ενεργοποίηση διαφόρων ενζύμων και για τη ρύθμιση της οργάνωσης του κυτταροσκελετού (Sawai et al., 1990) Αντιοξειδωτική δράση του DMSO Είναι γνωστό από πολλές μελέτες ότι το DMSO δρα ως αντιοξειδωτικός παράγοντας, εξουδετερώνοντας τις δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS) που δημιουργούνται στα βιολογικά συστήματα. Γι αυτόν ακριβώς το λόγο βρίσκει ευρεία εφαρμογή στην αντιμετώπιση παθολογικών καταστάσεων, όπως νευροεκφυλιστικές ασθένειες ή καρδιαγγειακές παθήσεις. Το DMSO εμποδίζει την υπεροξείδωση των λιπιδίων και την οξείδωση των πρωτεϊνών λόγω της ικανότητάς του να «παγιδεύει» τις ρίζες υδροξυλίου ή υδροϋπεροξειδίου. Επιπλέον, έχει την ικανότητα να εξουδετερώνει το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2) με τον εξής τρόπο: το DMSO μπορεί εύκολα να οξειδωθεί σε DMSO2, το οποίο στη συνέχεια αντιδρά με το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2), αποσπώντας του ένα άτομο οξυγόνου και μετατρέποντάς το σε H2O. 82

83 Αυτή του η ιδιότητα αποδεικνύεται πολύ σημαντική για την αντιμετώπιση φλεγμονωδών εντερικών νόσων, όπως η νόσος του Crohn και η ελκώδης κολίτιδα. Οι τοπικές και οι συστηματικές φλεγμονές γενικότερα χαρακτηρίζονται από υπερβολική ενδοκυτταρική συσσώρευση σιδήρου, γεγονός που έχει ως συνέπεια τη συνεχή απελευθέρωση υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2) και ριζών υδροξυλίου (HO ) από τα κύτταρα της φλεγμονής, μέσω της αντίδρασης Haber-Weiss. Ως εκ τούτου, είναι απαραίτητη η ρύθμιση της ομοιόστασης του σιδήρου (Andriopoulos et al., 2007). Το DMSO συμβάλλει στην εξουδετέρωση του Η2Ο2 με τον τρόπο που περιγράφηκε, και ενεργοποιεί τους υποδοχείς της τρανσφερίνης, με αποτέλεσμα την απομάκρυνση του σιδήρου από τα κύτταρα της φλεγμονής και την είσοδό τους στην κυκλοφορία του αίματος. Έτσι, η αντίδραση Haber- Weiss δεν πραγματοποιείται, άρα δεν παράγονται ρίζες υδροξυλίου και σταματά ο φαύλος κύκλος. Εικονα 7.6.: Αντίδραση Haber-Weiss. (Kehrer, 2000) Λόγω της αντιοξειδωτικής του δράσης, το DMSO προστίθεται στο διάλυμα λύσης των κυττάρων κατά τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (comet assay) και γενικότερα σε πειράματα με καλλιέργειες κυττάρων του αίματος, γιατί εξουδετερώνει τις ελεύθερες ρίζες που δημιουργούνται από την απελευθέρωση του σιδήρου από την αιμοσφαιρίνη, αποτρέποντας έτσι την πρόκληση οξειδωτικής βλάβης στο DNA. 83

84 ΣΚΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ

85 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η γνώση της γενετικής δράσης των χημικών παραγόντων που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία του καρκίνου είναι απαραίτητη για το σχεδιασμό νέων δραστικότερων αντικαρκινικών φαρμακευτικών ενώσεων, με αυξημένη εξειδίκευση και λιγότερες ανεπιθύμητες παρενέργειες. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η γονιδιοτοξική μελέτη τεσσάρων νέων στεροειδών αναλόγων της μελφαλάνης (SN-A, SN-B, SN-C και SN-D). Η προσθήκη του στεροειδούς σκελετού συμβάλλει στην αποτελεσματικότερη μεταφορά της αλκυλιωτικής ομάδας της μελφαλάνης στις θέσεις στόχους του DNA, ενισχύοντας έτσι την αντικαρκινική της δράση. Αρχικά γίνεται μελέτη της κυτταρογενετικής δράσης των νέων αυτών χημικών παραγώγων, με τη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης (CBMN). Για το σκοπό αυτό αναπτύσσονται καλλιέργειες λεμφοκυττάρων in vitro, από δύο υγιείς, νεαρής ηλικίας και μη καπνιστές δότες, αρσενικού και θηλυκού φύλου, στις οποίες γίνεται επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις των τεσσάρων παραγώγων. Μελετάται ο ρυθμός προόδου του κυτταρικού κύκλου, καθώς και η ικανότητα των νέων αυτών χημικών παραγώγων να προκαλούν χρωμοσωματική αστάθεια, χρησιμοποιώντας ως γενετικό δείκτη τους μικροπυρήνες. Εξετάζεται επίσης η πρόκληση της απόπτωσης και της νέκρωσης των κυττάρων. Έπειτα, εξετάζεται η ικανότητα επαγωγής ρηγμάτων στο DNA, με τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (Single Cell Gel Electrophoresis assay, SCGE/ comet assay) κάτω από αλκαλικές συνθήκες. Με τον τρόπο αυτό είναι δυνατό να διαπιστωθεί εάν η χρωμοσωματική θραύση αποτελεί έναν από τους μηχανισμούς δημιουργίας των μικροπυρήνων στα μεσοφασικά κύτταρα. Τέλος, εφαρμόζεται η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης σε συνδυασμό με την κυτοσίνη της αραβινοσίδης (CBMN/ARA-C) για την ανίχνευση βλαβών στο DNA που επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής βάσεων. 85

86 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

87 8. ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΥΛΙΚΟ 8.1. Ανθρώπινα λεμφοκύτταρα Το αίμα αποτελείται από τα έμμορφα συστατικά (ερυθρά και λευκά αιμοσφαίρια) και τη ρευστή μεσοκυττάρια ουσία, το πλάσμα. Τα κύτταρα του αίματος αποτελούνται από ερυθροκύτταρα, λευκοκύτταρα και αιμοπετάλια, τα οποία δεν είναι πλήρη κύτταρα, αλλά θραύσματα του κυτταροπλάσματος των μεγακαρυοκυττάρων. Περισσότερο από το 99% των κυττάρων του αίματος είναι ερυθροκύτταρα, τα οποία μεταφέρουν οξυγόνο στους ιστούς. Τα λευκοκύτταρα προστατεύουν τον οργανισμό από τις μολύνσεις και τον καρκίνο, συνιστώντας το αμυντικό σύστημα του οργανισμού. Τα αιμοπετάλια συμβάλλουν στην πήξη του αίματος και βοηθούν στην επιδιόρθωση των ρηγμάτων του τοιχώματος των αιμοφόρων αγγείων. Το πλάσμα, δηλαδή το υγρό τμήμα του αίματος, αποτελείται από έναν μεγάλο αριθμό οργανικών και ανόργανων ουσιών, διαλυτών στο νερό, με τις πρωτεΐνες να αποτελούν το κύριο συστατικό του (Vander et al., 2011). Τα λευκοκύτταρα διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες με βάση την εμφάνισή τους στο φωτονικό μικροσκόπιο: στα κοκκιοκύτταρα, στα μονοκύτταρα και στα λεμφοκύτταρα. Τα κοκκιοκύτταρα υποδιαιρούνται με τη σειρά τους σε ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα και βασεόφιλα, ανάλογα με τη συγγένειά τους με τις διάφορες χρωστικές. Τα ουδετερόφιλα που ονομάζονται και πολυμορφοπύρηνα λευκά αιμοσφαίρια, είναι ο πιο κοινός τύπος κοκκιοκυττάρων. Συμμετέχουν στην άμυνα του οργανισμού κυρίως έναντι των βακτηρίων, τα οποία καταστρέφουν με κυτταροφαγία. Τα ηωσινόφιλα προστατεύουν τον οργανισμό από διάφορα παράσιτα (πρωτόζωα κλπ.) και συμμετέχουν στις αλλεργικές φλεγμονώδεις αντιδράσεις. Τα βασεόφιλα ελευθερώνουν ισταμίνη και σε μερικά είδη οργανισμών σεροτονίνη κατά τη διάρκεια ορισμένων ανοσοαντιδράσεων. Τα μονοκύτταρα, εγκαταλείποντας το αίμα, ωριμάζουν σε μακροφάγα και μαζί με τα ουδετερόφιλα αποτελούν τα κύρια φαγοκύτταρα του οργανισμού. Τα μακροφάγα πέπτουν τους μικροοργανισμούς που εισβάλλουν στον οργανισμό, τα ξένα σωματίδια, καθώς και τα κατεστραμμένα και γερασμένα κύτταρα του οργανισμού (Μαρμάρας, 2005). Τα λεμφοκύτταρα συμμετέχουν στις ανοσοαντιδράσεις του οργανισμού και γίνεται εκτενέστερη αναφορά σε αυτά παρακάτω. Το πρώτο στάδιο της ωρίμανσης των κυττάρων του αίματος είναι η διαίρεση των αρχέγονων πολυδύναμων κυττάρων σε δύο κύριες κυτταρικές σειρές: τη λεμφοειδή (lymphoid) και τη μυελοειδή (myeloid). Η λεμφοειδής σειρά αποτελείται από τα 87

88 λεμφοκύτταρα και η μυελοειδής σειρά από τα ερυθροκύτταρα και τα υπόλοιπα λευκά αιμοσφαίρια. Εικόνα 8.1.: Η ωρίμανση των κυττάρων του αίματος. (Προσαρμογή από Το βιολογικό σύστημα που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση χρωμοσωματικών ανωμαλιών είναι τα λεμφοκύτταρα του περιφερειακού αίματος. Τα λεμφοκύτταρα ποικίλλουν ως προς το μέγεθος, έχουν μεγάλους πυρήνες και τα περισσότερα δεν έχουν κυτταροπλασματικά κοκκία (Berne & Levy, 2011). Όπως όλοι οι τύποι κυττάρων του αίματος, έτσι και τα λεμφοκύτταρα παράγονται στο μυελό των οστών, πολλά λεμφοκύτταρα όμως είναι δυνατό να υφίστανται περαιτέρω ανάπτυξη και κυτταρική διαίρεση σε ιστούς έξω από το μυελό των οστών. Τα λεμφοκύτταρα κυκλοφορούν στο αίμα και στη λέμφο, ενώ υπάρχουν και σε εξειδικευμένους ιστούς. Η λέμφος είναι το άχρωμο υγρό των λεμφαγγείων που συνδέουν τους λεμφαδένες του σώματος. Τα λεμφαγγεία συλλέγουν τα λεμφοκύτταρα και τα αντισώματα από τους ιστούς και τους λεμφαδένες και τα επιστρέφουν στην κυκλοφορία του αίματος. Σε κάθε 100 κύτταρα του σώματός μας, το ένα είναι λεμφοκύτταρο. Όλα μαζί αποτελούν το λεμφικό σύστημα. Το λεμφικό σύστημα του ανθρώπου διακρίνεται σε κεντρικό και περιφερειακό. Στο κεντρικό σύστημα υπάγονται ο μυελός των οστών και ο θύμος αδένας. Στο περιφερειακό σύστημα περιλαμβάνονται ο σπλήνας, η σκωληκοειδής απόφυση, τα λεμφογάγγλια ή λεμφαδένες κλπ. Οι λεμφικοί ιστοί είναι διάσπαρτοι. Έτσι 88

89 εξυπηρετούν καλύτερα το αμυντικό σύστημα του οργανισμού, γιατί μπορούν και παγιδεύουν τα διάφορα αντιγόνα από όπου κι αν εισβάλλουν στον οργανισμό. Δύο διακριτές κατηγορίες λεμφοκυττάρων είναι υπεύθυνες για τις ανοσοαποκρίσεις: Τα Τ λεμφοκύτταρα και τα Β λεμφοκύτταρα. Τα Τ λεμφοκύτταρα είναι υπεύθυνα για την κυτταρική ανοσοαπόκριση, είναι δηλαδή αυτά που κατά κύριο λόγο αναγνωρίζουν τα κύτταρα-αντιγόνα σε όλες σχεδόν τις ανοσοαντιδράσεις, ενώ τα Β λεμφοκύτταρα είναι αυτά που παράγουν τα αντισώματα που απαιτούνται για τη συγκόλληση και την απομάκρυνση της ξένης ουσίας που έχει εισέλθει στον οργανισμό. Τα Τ και Β λεμφοκύτταρα έχουν την ίδια μορφολογία, όταν όμως ενεργοποιηθούν και διαφοροποιηθούν, η μορφολογία τους αλλάζει. Για να διαφοροποιηθούν τα αρχέγονα κύτταρα σε λεμφοκύτταρα, πρέπει να μεταναστεύσουν από τον αιμοποιητικό ιστό στον κεντρικό λεμφικό ιστό. Τα αρχέγονα κύτταρα που μεταναστεύουν στον θύμο διαφοροποιούνται σε Τ λεμφοκύτταρα, ενώ τα κύτταρα που μεταναστεύουν στον μυελό των οστών διαφοροποιούνται σε Β λεμφοκύτταρα. Τα Β και Τ λεμφοκύτταρα μετά τη διαφοροποίησή τους στο μυελό των οστών και το θύμο αδένα αντίστοιχα, μεταναστεύουν με την κυκλοφορία στους περιφερειακούς λεμφικούς ιστούς, όπου και συναντούν τα ξένα αντιγόνα, με αποτέλεσμα την τελική διαφοροποίησή τους και την ταυτόχρονη ενεργοποίησή τους. Στους ιστούς αυτούς τα Β και τα Τ λεμφοκύτταρα που έχουν διαφοροποιηθεί, αλλά δεν έχουν ακόμα λάβει μέρος σε ανοσοαποκρίσεις, βρίσκονται σε διαφορετικές περιοχές. Τα Τ και τα Β λεμφοκύτταρα εισέρχονται στους λεμφικούς ιστούς διαμέσου εξειδικευμένων αιμοφόρων αγγείων γνωστών ως HEV (High Endothelial Venule). Τα περισσότερα λεμφοκύτταρα δεν παραμένουν στα λεμφοειδή όργανα, περιμένοντας να ενεργοποιηθούν, αλλά κυκλοφορούν συνεχώς μεταξύ αυτών και του αίματος. Με τη συνεχή κυκλοφορία επιτυγχάνεται αφενός η γρήγορη δειγματοληψία από τα λεμφοειδή όργανα όλων των λεμφοκυττάρων που πιθανόν εκφράζουν υποδοχείς για τα ξένα αντιγόνα και αφετέρου εξασφαλίζεται η συνάντηση των κατάλληλων τύπων λεμφοκυττάρων, γεγονός απαραίτητο για την ανάπτυξη της ανοσοαπόκρισης. Τα Β λεμφοκύτταρα παρέχουν τη χυμική ανοσία, ενώ τα Τ λεμφοκύτταρα παρέχουν την κυτταρική ανοσία. Όταν διεγερθούν με ένα αντιγόνο τα Β λεμφοκύτταρα μετατρέπονται σε πλασματοκύτταρα, που συνθέτουν και εκκρίνουν αντισώματα (σφαιρίνη γ), τα οποία μεταφέρονται με τη ροή του αίματος στο σημείο δράσης τους (Berne & Levy, 2011). Τα αντισώματα είναι τετραμερή γλυκοπρωτεϊνικά μόρια και αποτελούν περίπου το 20% των πρωτεϊνών του αίματος. Συμβολίζονται ως Ig, και στον άνθρωπο διακρίνονται οι εξής πέντε κύριες κατηγορίες αντισωμάτων: IgM, IgD, IgG, IgE και IgA, οι οποίες καθορίζονται γενετικά από άτομο σε άτομο. 89

90 Σε γενικές γραμμές τα Τ λεμφοκύτταρα: Προστατεύουν τον οργανισμό έναντι διάφορων λοιμώξεων. Έχουν κεντρικό ρόλο στη διάκριση των ιστών του ίδιου οργανισμού από ξένους ιστούς και συνεπώς είναι σημαντική η σπουδαιότητά τους στη μεταμόσχευση οργάνων. Για να δράσουν πρέπει να έρθουν σε άμεση επαφή με τα αλλαγμένα κύτταρα του οργανισμού, τα οποία αποτελούν τους στόχους τους. Αντίθετα, τα Β λεμφοκύτταρα μπορούν να δράσουν από μεγάλες αποστάσεις μιας και εκκρίνουν τα αντισώματα. Αναγνωρίζουν πεπτιδικά τμήματα που προέρχονται από την πέψη του αντιγόνου μέσα στο κύτταρο-στόχο και τη μετέπειτα εμφάνισή τους στην επιφάνειά του. Τα κύτταρα αυτά καλούνται κύτταρα αντιγονοπαρουσίασης (APC: Antigen Presenting Cells) (Μαρμάρας, 2005). Τα κυριότερα Τ λεμφοκύτταρα είναι τα Τ κυτταροτοξικά, τα οποία είναι προορισμένα να καταστρέφουν τα γερασμένα, μολυσμένα και πιθανόν καρκινικά κύτταρα, με το μηχανισμό της απόπτωσης. Ευθύνονται επίσης, για την αποβολή μεταμοσχευμένων οργάνων. Άλλα Τ λεμφοκύτταρα είναι τα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα τα οποία ενεργοποιούν τα Β λεμφοκύτταρα, και τα κατασταλτικά Τ λεμφοκύτταρα τα οποία αναστέλλουν τη δραστηριότητα των Β λεμφοκυττάρων. Τέλος, υπάρχουν ειδικά κύτταρα μνήμης, Τ και Β, τα οποία «θυμούνται» συγκεκριμένα αντιγόνα. Αποτέλεσμα αυτής της μνήμης είναι να μπορούν να δημιουργήσουν μία ανοσοαπόκριση όταν εκτεθούν κατ εξακολούθηση στο ίδιο αντιγόνο (Berne & Levy, 2011) Κυτταρική καλλιέργεια ανθρώπινων λεμφοκυττάρων Η in vitro καλλιέργεια ανθρώπινων λεμφοκυττάρων αποτελεί ένα σημαντικό εργαλείο για τη μελέτη της γονιδιοτοξικής και κυτταροτοξικής δράσης διαφόρων παραγόντων. Σημαντικό βήμα προς την ανάπτυξη της τεχνικής της καλλιέργειας των λεμφοκυττάρων υπήρξε η ανακάλυψη ουσιών που έχουν τη δυνατότητα να διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των Τ-λεμφοκυττάρων. Τα Τ λεμφοκύτταρα, όπως και τα Β λεμφοκύτταρα όταν έρθουν σε επαφή με το ειδικό για αυτά αντιγόνο διεγείρονται για πολλαπλασιασμό (μίτωση). Η μιτογόνος αυτή απόκριση συνοδεύεται συνήθως από μορφολογική αλλαγή των μικρών λεμφοκυττάρων σε μεγάλα. Πολλές φυτικές ουσίες γνωστές ως λεκτίνες ή φυτομιτογόνα έχουν την ικανότητα να επάγουν μίτωση στα λεμφοκύτταρα με έναν τρόπο παρόμοιο με αυτόν που επάγει το 90

91 αντιγόνο. Το μιτογόνο συνδέεται με ειδικούς επιφανειακούς υποδοχείς των κυττάρων με αποτέλεσμα το λεμφοκύτταρο να εισέρχεται στον κυτταρικό κύκλο για διαίρεση. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα μιτογόνα, αντίθετα από τα αντιγόνα, διεγείρουν μεγάλο ποσοστό λεμφοκυττάρων μη ειδικά. Η φυτοαιμοσυγκολλητίνη ή φυτοαιματογλουτινίνη (PHA) και η κονκαναβαλίνη (CONA) έχουν μελετηθεί εκτενώς. Δεδομένα υποστηρίζουν ότι αυτά τα μιτογόνα διεγείρουν μόνο τα Τ λεμφοκύτταρα. Ωστόσο υπάρχουν μιτογόνα, όπως π.χ. το Pokeweed Mitogen (PWM) που διεγείρουν τα Β λεμφοκύτταρα να διαιρεθούν μόνο υπό την παρουσία Τ λεμφοκυττάρων (Gmelig-Meyling et al., 1977) καθώς και μιτογόνα που διεγείρουν μόνο τα Β λεμφοκύτταρα (βακτηριακοί λιποσακχαρίτες) (Lopatin et al., 1980) Πλεονεκτήματα της χρήσης των λεμφοκυττάρων ως βιολογικό υλικό Η καλλιέργεια των λεμφοκυττάρων σε γονιδιοτοξικές μελέτες παρουσιάζει ορισμένα πλεονεκτήματα αλλά και μειονεκτήματα που σύμφωνα με τους Evans και O Riordan (1975) συνοψίζονται στα παρακάτω: Αποτελούν εύκολη πηγή λήψης μεγάλου αριθμού κυττάρων και μπορούν να λαμβάνονται σε τακτά χρονικά διαστήματα. Μπορούν να θεωρηθούν ως ένας σχετικά συγχρονισμένος πληθυσμός κυττάρων, αφού τα περισσότερα κύτταρα βρίσκονται στην G0 φάση του κυτταρικού κύκλου. Είναι δυνατή η διέγερσή τους από μιτογόνες ουσίες και η παραγωγή μεγάλου αριθμού απογόνων. Η απόκριση των λεμφοκυττάρων in vitro σε μιτογόνες ουσίες είναι παρόμοια με αυτήν που συμβαίνει in vivo σε απόκριση σε αντιγόνα. Η φυτοαιματογλουτινίνη (PHA) διεγείρει κυρίως τα Τ λεμφοκύτταρα, παρέχοντας έτσι ένα σχετικά ομοιόμορφο πληθυσμό κυττάρων. Είναι δυνατόν η υπό εξέταση χημική ένωση να χρησιμοποιηθεί σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και να εξαχθούν έτσι, συμπεράσματα για τη δοσοεξαρτώμενη ή μη δράση αυτού. Η απόκριση των λεμφοκυττάρων στον υπό εξέταση παράγοντα in vitro δε διαφέρει σημαντικά από αυτήν που συμβαίνει in vivo. Χαρακτηρίζονται από μικρή συχνότητα τυχαίων χρωμοσωματικών ανωμαλιών. 91

92 Έχουν αναπτυχθεί πολύ καλές τεχνικές για την προετοιμασία παρασκευασμάτων από λεμφοκύτταρα για τη μελέτη χρωμοσωματικών ανωμαλιών και διαφόρων κυτταρογενετικών δεικτών Μειονεκτήματα της χρήσης των λεμφοκυττάρων ως βιολογικό υλικό Η in vitro καλλιέργεια των λεμφοκυττάρων δεν επιτρέπει τον έλεγχο της δράσης των μεταβολιτών της υπό εξέταση χημικής ένωσης, κάτι που είναι δυνατό να γίνει σε μια μελέτη in vivo. Τα Τ λεμφοκύτταρα που διεγείρονται από τη φυτοαιματογλουτινίνη, είναι στενά συνδεδεμένα με τις ανοσοαποκρίσεις. Έτσι όταν θέλουμε να μελετήσουμε τα αποτελέσματα που μπορεί να έχει η in vivo έκθεση σε έναν παράγοντα, κάθε προηγούμενη έκθεση σε οποιονδήποτε άλλο παράγοντα, μπορεί να τροποποιήσει το αποτέλεσμα της δράσης της υπό εξέταση ένωσης. Έτσι, είναι δυνατόν να μεταβληθεί προς τα πάνω ή προς τα κάτω ο αριθμός των κυττάρων με χρωμοσωματικές ανωμαλίες. Η ύπαρξη διαφορετικών υποπληθυσμών ακόμα και στο ίδιο το άτομο μπορεί να προκαλέσει διαφορετική αντίδραση στο μιτογόνο παράγοντα (Evans & O Riordan, 1975). 92

93 9. ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΗΣΗΣ 9.1. Πηγή λεμφοκυττάρων Ως πηγή λεμφοκυττάρων χρησιμοποιήθηκε φλεβικό αίμα από έναν αρσενικό και έναν θηλυκό δότη, νεαρής ηλικίας (20-30 ετών). Οι δότες κατά την διάρκεια των τελευταίων τριών μηνών πριν την αιμοληψία δεν είχαν υποστεί κάποια μορφή λοίμωξης και δεν είχαν υποβληθεί σε θεραπευτική αγωγή ή σε κάποια διαγνωστική ακτινογραφία. Συγκεκριμένα, στοιχεία των δοτών έχουν ως εξής: Δότης 1 (Μ. Α.): Θηλυκό άτομο ηλικίας 26 ετών (μη καπνιστής). Δότης 2 (Β. Α.): Αρσενικό άτομο ηλικίας 25 ετών (μη καπνιστής). Η αιμοληψία έγινε σε μικροβιολογικό εργαστήριο με αποστειρωμένη σύριγγα μιας χρήσης. Τα δείγματα διατηρήθηκαν σε ηπαρινισμένο και αποστειρωμένο σωληνάριο στους 4 C μέχρι να χρησιμοποιηθούν για τους πειραματικούς σκοπούς (για λιγότερο από 24 ώρες). Τέλος, να σημειωθεί ότι για κάθε δότη πραγματοποιήθηκαν δύο ξεχωριτές καλλιέργειες, ώστε να διασφαλιστεί η εγκυρότητα των αποτελεσμάτων Καλλιέργεια ανθρώπινων λεμφοκυττάρων Η έναρξη της καλλιέργειας ολικού αίματος πραγματοποιείται με την προσθήκη των απαραίτητων θρεπτικών συστατικών, σε ειδικά αποστειρωμένα δοχεία καλλιέργειας ( CellStar cell culture flasks Greiner bio-one). Το σημείο αυτό ορίζεται ως χρονική στιγμή t=0h, που καθορίζει την έναρξη της καλλιέργειας. Τα συστατικά που περιέχει το πλήρες θρεπτικό μέσο που τοποθετούμε στα δοχεία καλλιέργειας παρουσιάζονται στον ακόλουθο πίνακα: 93

94 Πίνακας 9.2.α.: Συστατικά του πλήρους θρεπτικού μέσου για τη μέθοδο CBMN. Συστατικά ml/καλλιέργεια Θρεπτικό υλικό Ham F-10 6,5 (Biochrom, F0715) Ορός εμβρύου βοός (FBS) 1,5 (Biochrom, S0113) Φυτοαιματογλουτινίνη (PHA, c=60μg/ml) 0,3 (Biochrom, M5030) Πενικιλίνη-Στρεπτομυκίνη (pen-strep) 0,088 (Biochrom, A2213) Γλουταμίνη (Glu) 0,065 (Serva, 22942) Φλεβικό αίμα 0,5 Η παρουσία των αντιβιοτικών ενώσεων, πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη σε ποσοστό 1% του πλήρους θρεπτικού μέσου καθώς και του αμινοξέος γλουταμίνης σε αναλογία 1% στο θρεπτικό υλικό Ham F-10, εξασφαλίζει την προστασία της καλλιέργειας από επιμολύνσεις και την ενίσχυση της σε θρεπτικά συστατικά, αντίστοιχα. Πιο συγκεκριμένα το Ham F-10 περιέχει αμινοξέα, βιταμίνες, γλυκόζη κλπ, καθώς και ένα χρωματικό δείκτη, το phenol red, ο οποίος αλλάζει χρώμα όταν έχουμε αλλαγή στο ph ως ένδειξη μόλυνσης. Ο ορός FBS περιέχει πρόσθετα ενισχυτικά θρεπτικά, όπως πρωτεΐνες και αυξητικούς παράγοντες, καθώς και κάποια αντισώματα για την προστασία της καλλιέργειας από μολύνσεις. Τέλος, η PHA προέρχεται από τα κόκκινα φασόλια του είδους Phaseolus vulgaris και διεγείρει κυρίως τα Τ λεμφοκύτταρα με την πρόσδεσή της στην επιφάνειά τους. Τα λεμφοκύτταρα βρίσκονται αρχικά σε κατάσταση ηρεμίας (φάση G0). Με την προσθήκη της φυτοαιματογλουτινίνης παρατηρείται έντονη αύξηση της σύνθεσης του RNA για τις πρώτες 24 ώρες. Στη διάρκεια των επόμενων 24 ωρών αυξάνεται το μέγεθος του πυρήνα των λεμφοκυττάρων και ακολουθεί η σύνθεση του γενετικού υλικού. Οι πρώτες μιτωτικές διαιρέσεις παρατηρούνται 48 ώρες μετά την έναρξη της καλλιέργειας και επαναλαμβάνονται περιοδικά κάθε 24 ώρες. Στο σημείο αυτό να σημειωθεί ότι προτού φτιάξουμε το πλήρες θρεπτικό μέσο, απαραίτητη προϋπόθεση είναι όλα τα συστατικά που αναφέρονται παραπάνω να βρίσκονται στην ίδια θερμοκρασία δωματίου. Για το λόγο αυτό, πριν την τοποθέτησή τους στα δοχεία 94

95 καλλιέργειας, φροντίζουμε να τα αποψύξουμε. Αφού τελειώσουμε την παρασκευή του καλλιεργητικού υλικού, προσθέτουμε στο τέλος το αίμα. Μετά την προσθήκη των απαραίτητων θρεπτικών συστατικών, τα δοχεία καλλιέργειας τοποθετούνται στον επωαστικό θάλαμο (Water-Jacketed Incubator 3250, Forma Scientific), σε θερμοκρασία 37 ºC, σταθερή παροχή 5% CO2 και 95% υγρασία. 41 ώρες μετά την έναρξη της καλλιέργειας προστίθενται οι υπό εξέταση χημικές ενώσεις, δηλ. τα χημικά παράγωγα της μελφαλάνης SN-A, SN-B, SN-C, SN-D. Oι τέσσερις αυτές χημικές ενώσεις διαλύονται σε DMSO (AppliChem, A7248) και ddh2o, φυλάσσονται στο σκοτάδι, στους 4 o C και χρησιμοποιούνται σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις (1 μμ, 2μΜ, 5μΜ). Το στάδιο αυτό παραλείπεται για τις καλλιέργειες του μάρτυρα (control). 44 ώρες μετά την έναρξη της καλλιέργειας προστίθενται 26,1 μl κυτταροχαλασίνης Β, για την αναστολή της κυτταροκίνησης. Η Cyt-B (AppliChem, A7657) διαλύεται στον οργανικό διαλύτη DMSO, φυλάσσεται στους -80 o C, επίσης στο σκοτάδι, και χρησιμοποιείται σε τελική συγκέντρωση 6 μg/ml. Ο λόγος που η κυτταροχαλασίνη προστίθεται σ αυτό το χρονικό διάστημα είναι γιατί τα λεμφοκύτταρα δεν έχουν εισέλθει ακόμα στη φάση της κυτταροκίνησης. Με την ολοκλήρωση των 72 ωρών, διακόπτεται η καλλιέργεια και ξεκινάει η διαδικασία απομόνωσης των λεμφοκυττάρων. Παρακάτω παρουσιάζεται διαγραμματικά το χρονοδιάγραμμα της πειραματικής αυτής πορείας: t=0 t=41 h t=44 h t=72 h Έναρξη Προσθήκη Προσθήκη Ολοκλήρωση καλλιέργειας καλλιέργειας χημικών Cyt-B και απομόνωση ενώσεων λεμφοκυττάρων Εικόνα 9.2.α.: Σχηματική αναπαράσταση του χρονοδιαγράμματος της καλλιέργειας των λεμφοκυττάρων στη μέθοδο CBMN. Όσον αφορά την ανίχνευση βλαβών που επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής βάσεων, ακολουθήθηκε η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης σε συνδυασμό με την κυτοσίνη της αραβινοσίδης (ARA-C). Για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκαν δύο σειρές καλλιεργειών από λεμφοκύτταρα του 1 ου δότη. Στη μία σειρά έγινε επίδραση με τον αναστολέα του πολυμερισμού του DNA, ARA-C, ενώ στην άλλη όχι. Εξετάστηκαν δύο συγκεντρώσεις της χημικής ένωσης SN-D (0,5μΜ, 1μΜ), ενώ πραγματοποιήθηκε και ένα επιπλέον πείραμα ελέγχου χρησιμοποιώντας ως θετικό 95

96 μάρτυρα την τοξική ένωση MNU (N-Nitroso-N-methylurea). Η MNU (Sigma, N4766) διαλύεται σε DMSO και χρησιμοποιείται σε συγκέντρωση 30μΜ. Και οι δύο καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν ταυτόχρονα, ακολουθώντας σε γενικές γραμμές την ίδια πειραματική πορεία, με τη διαφορά ότι τη χρονική στιγμή t=0h προστίθενται οι υπό μελέτη χημικές ενώσεις και η ARA-C στη μία σειρά καλλιεργειών. Επιπρόσθετα, τη χρονική στιγμή t=16h (αντιστοιχεί στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου των λεμφοκυττάρων) πραγματοποιείται έκπλυση των κυττάρων και στις δύο σειρές καλλιεργειών, για την απομάκρυνση τόσο των χημικών ενώσεων όσο και της ARA-C. Στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με ARA-C, στο στάδιο αυτό προστέθηκε επιπλέον 2 - δεοξυκυτιδίνη (DC), μια ουσία η οποία ανταγωνίζεται την ARA-C όσον αφορά τις θέσεις στις οποίες συνδέεται πάνω στο DNA. Η ARA-C (Sigma, C1768) και η DC (D3897) διαλύονται σε φυσιολογικό ορό και χρησιμοποιούνται σε συγκέντρωση 1μΜ και 10μΜ, αντίστοιχα. Πιο αναλυτικά, η διαδικασία που ακολουθείται περιλαμβάνει τα εξής στάδια: Μετά την πάροδο 16 ωρών από την έναρξη της καλλιέργειας, γίνεται μεταφορά του καλλιεργητικού υλικού σε πλαστικούς σωλήνες φυγοκέντρου ( CellStar tubes Greiner bio-one). Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 2 min στις 1200 rpm. Αφαίρεση του υπερκειμένου και προσθήκη PBS μέχρι να επιτευχθεί τελικός όγκος Vτελ = 8ml. Ακολουθεί και δεύτερη φυγοκέντρηση για 2 min στις 1200 rpm. Αφαίρεση του υπερκειμένου και προσθήκη 2 ml Ham F-10 για να επαναδιαλύσουμε το ίζημα των κυττάρων. Στη συνέχεια, μεταφέρουμε το εναιώρημα των κυττάρων σε δοχεία καλλιέργειας, στα οποία έχουμε ήδη προσθέσει τα εξής: Πίνακας 9.2.β.: Συστατικά του πλήρους θρεπτικού μέσου για τη μέθοδο CBMN/ARA-C, μετά την έκπλυση των κυττάρων. Συστατικά ml/καλλιέργεια Θρεπτικό υλικό Ham F-10 4,5 Ορός εμβρύου βοός (FBS) 1,5 Πενικιλίνη-Στρεπτομυκίνη (pen-strep) 0, δεοξυκυτιδίνη (DC) (μόνο στις καλλιέργειες με ARA-C) 0,088 96

97 Τέλος, τα δοχεία καλλιέργειας τοποθετούνται ξανά στον επωαστικό θάλαμο, σε θερμοκρασία 37 ºC, σταθερή παροχή 5% CO2 και 95% υγρασία. Το ακριβές χρονοδιάγραμμα της πειραματικής αυτής πορείας παρουσιάζεται στην ακόλουθη εικόνα: t=0 t=16 h t=44 h t=72 h Έναρξη Έκπλυση Προσθήκη Ολοκλήρωση καλλιέργειας καλλιέργειας/ κυττάρων Cyt-B και απομόνωση Προσθήκη χημικών λεμφοκυττάρων ενώσεων Εικόνα 9.2.β.: Σχηματική αναπαράσταση του χρονοδιαγράμματος της καλλιέργειας των λεμφοκυττάρων στη μέθοδο CBMN/ ARA-C. Είναι πολύ σημαντικό να αναφέρουμε ότι οι καλλιέργειες των λεμφοκυττάρων πραγματοποιήθηκαν κάτω από πλήρως αποστειρωμένες συνθήκες ώστε να αποφευχθεί μόλυνση των καλλιεργειών και πιθανή καταστροφή τους. Καταρχάς, όλα τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν, όπως φλάσκες, πιπέτες, θρεπτικό υλικό κλπ, παραλαμβάνονται από την εταιρεία πλήρως αποστειρωμένα. Τα γυάλινα και πλαστικά σκεύη που χρησιμοποιήθηκαν (δοχεία, σωλήνες φυγοκέντρου, tips, eppendorfs κλπ), αποστειρώθηκαν με υγρή αποστείρωση σε αυτόκαυστο κλίβανο. Με τον ίδιο τρόπο, αποστειρώθηκε και το νερό που χρειάζεται να είναι τοποθετημένο σε ειδικό δοχείο, για τη διατήρηση της κατάλληλης υγρασίας μέσα στον επωαστικό θάλαμο. Τέλος, να σημειωθεί ότι όλες οι εργασίες έγιναν μέσα σε θάλαμο νηματικής ροής (Hood, Telstar Bio II Advance, Biological Safety Cabinet), ο οποίος παρέχει συνεχώς αποστειρωμένο αέρα. Πριν την εκκίνησή του, απαραίτητη είναι η αποστείρωσή του για μία ώρα με υπεριώδες φως (UV), ενώ εξίσου σημαντική είναι και η απόλυμανσή του καθώς και οποιουδήποτε άλλου αντικειμένου εισάγεται σε αυτό, με 70% αιθανόλη Απομόνωση και μονιμοποίηση των λεμφοκυττάρων Η απομόνωση των λεμφοκυττάρων γίνεται μετά την πάροδο 72 ωρών από την έναρξη της καλλιέργειας. Μία ώρα πριν ξεκινήσουμε, είναι απαραίτητο να φτιάξουμε δύο διαλύματα: το υποτονικό και το μονιμοποιητικό διάλυμα. Το υποτονικό διάλυμα πρέπει να διατηρείται στους 37 ο C τουλάχιστον μία ώρα πριν από την απομόνωση, ενώ το 97

98 μονιμοποιητικό διάλυμα πρέπει να διατηρείται στους 4 ο C τουλάχιστον μία ώρα πριν από την απομόνωση. Τα δοχεία που περιέχουν τα διαλύματα, πριν τη φύλαξή τους, είναι απαραίτητο να καλύπτονται με parafilm. Στον πίνακα που ακολουθεί, παρουσιάζονται τα συστατικά των διαλυμάτων και η ποσότητα που χρειάζεται να προστεθεί σε κάθε καλλιέργεια. Πίνακας 9.3.: Συστατικά και ποσότητες που απαιτούνται για την παρασκευή υποτονικού και μονιμοποιητικού διαλύματος. ΥΠΟΤΟΝΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΜΟΝΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ Ham F-10 : ddh2o = 1 : 1 Μεθανόλη (Sds, ) : Οξικό οξύ (Sds, ) = 3 : 1 4 ml ανά καλλιέργεια περίπου 8 ml ανά καλλιέργεια Το υποτονικό διάλυμα χρησιμοποιείται για να προκαλέσει λύση των ερυθροκυττάρων του αίματος, συμβάλλοντας έτσι στην απομόνωση των λεμφοκυττάρων από τα υπόλοιπα κύτταρα. Επιπλέον, προκαλεί διόγκωση των λεμφοκυττάρων, με αποτέλεσμα να μπορούμε να διακρίνουμε καλύτερα τους πυρήνες και τους μικροπυρήνες των λεμφοκυττάρων. Το μονιμοποιητικό διάλυμα χρησιμοποιείται για να μονιμοποιήσει τα κύτταρα πάνω στην αντικειμενοφόρο πλάκα και να διατηρηθεί ακέραιη η μορφολογία τους. Κατά την απομόνωση των λεμφοκυττάρων ακολουθούμε τα εξής βήματα: Μεταφέρουμε τις καλλιέργειες από τις φλάσκες σε πλαστικούς σωλήνες φυγοκέντρου και στη συνέχεια φυγοκεντρούμε για 10 λεπτά στις 1500 στροφές. Μετά τη φυγοκέντρηση, αφαιρούμε το υπερκείμενο και προσθέτουμε σε κάθε σωλήνα με αργές κινήσεις 4 ml υποτονικού διαλύματος υπό ταυτόχρονη ανάδευση στο Vortex. Επωάζουμε για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Είναι απαραίτητο να κάνουμε προσεκτικές κινήσεις σ αυτό το στάδιο του πειράματος, προκειμένου να μη δημιουργηθούν συσσωματώματα κυττάρων, κάτι που θα δυσκολέψει τη μικροσκοπική παρατήρηση στη συνέχεια. Έπειτα, προσθέτουμε 4 ml μονιμοποιητικού διαλύματος (ώστε να έχουμε τελικό όγκο περίπου 8 ml) σε κάθε σωλήνα υπό ταυτόχρονη ανάδευση στο Vortex. (1 η μονιμοποίηση). Φυγοκεντρούμε για 7 λεπτά στις 1300 στροφές. 98

99 Αφαιρούμε το υπερκείμενο, αφήνοντας περίπου 0,5 ml καλλιέργειας και επαναδιαλύουμε προσθέτοντας περίπου 8 ml μονιμοποιητικού διαλύματος, υπό ταυτόχρονη ανάδευση στο Vortex. (2 η μονιμοποίηση). Φυγοκεντρούμε για 7 λεπτά στις 1300 στροφές. Αφαιρούμε ομοίως το υπερκείμενο, αφήνοντας περίπου 0,5 ml καλλιέργειας και επαναδιαλύουμε προσθέτοντας περίπου 8 ml μονιμοποιητικού διαλύματος, υπό ταυτόχρονη ανάδευση στο Vortex. (3 η μονιμοποίηση). Φυγοκεντρούμε για 7 λεπτά στις 1300 στροφές. Εφόσον διακρίνεται πλέον σαφώς το λευκό ίζημα, που αποτελεί τα λεμφοκύτταρα που απομονώσαμε, αφαιρούμε για τελευταία φορά το υπερκείμενο προσέχοντας ώστε να κρατήσουμε όλη την ποσότητα του ιζήματος. Σε περίπτωση που θέλουμε να αποθηκεύσουμε τα απομονωμένα λεμφοκύτταρα για μελλοντική χρήση, επαναδιαλύουμε το ίζημα σε μικρό όγκο μονιμοποιητικού διαλύματος (περίπου 5 ml) και στη συνέχεια τα διατηρούμε στους -20 ο C, έχοντας σφραγίσει το σωλήνα με parafilm. Με μια πιπέτα Pasteur στάζουμε 2-3 σταγόνες από το ίζημα (αφού πρώτα το αναδεύσουμε) σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα, στην οποία προηγουμένως έχουμε σημειώσει την κατάλληλη ένδειξη για κάθε καλλιέργεια, και την αφήνουμε να στεγνώσει. Προσέχουμε να στάζουμε από κοντινή απόσταση έτσι ώστε να μη σπάσουν τα κύτταρα και να διατηρηθεί η ακεραιότητα του κυτταροπλάσματος. Να σημειωθεί ότι η μεταφορά των καλλιεργειών από τις φλάσκες σε πλαστικούς σωλήνες φυγοκέντρου καθώς και η αφαίρεση του υπερκειμένου κάθε φορά γίνεται μέσα στο θάλαμο νηματικής ροής, και το υπερκείμενο απορρίπτεται σε ειδικό δοχείο που περιέχει νερό και χλωρίνη Χρώση και μονιμοποίηση των παρασκευασμάτων Τα παρασκευάσματα μπορούν να βαφτούν χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους έτσι ώστε να μπορούμε να ξεχωρίζουμε το κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των κυττάρων. Οι χρωστικές που χρησιμοποιούμε στη συγκεκριμένη μέθοδο είναι οι May-Grünwald (AppliChem, A0415) και Giemsa (AppliChem, A0885). Η πρώτη βάφει το κυτταρόπλασμα των λεμφοκυττάρων ειδικά και η δεύτερη βάφει το DNA του πυρήνα. Κατά προτίμηση την επόμενη μέρα μετά τη μονιμοποίηση πραγματοποιούμε τη χρώση των παρασκευασμάτων. Η διαδικασία της χρώσης είναι η εξής: 99

100 Αρχικά τοποθετούμε σε ειδικά δοχεία χρώσης όλα τα διαλύματα χρωστικών αλλά και ddh2o που θα χρειαστεί για το ξέπλυμα. Έπειτα τοποθετούμε τα πλακάκια πρώτα μέσα στο δοχείο που περιέχει τη χρωστική May-Grünwald για 5 λεπτά. Τα ξεπλένουμε τοποθετώντας τα στο δοχείο με το απιονισμένο νερό. Στη συνέχεια, τα τοποθετούμε στο δοχείο με το διάλυμα της χρωστικής Giemsa (περιέχει τη χρωστική Giemsa διαλυμένη σε απιονισμένο νερό σε αναλογία 10%) για 10 λεπτά. Τέλος, ξεπλένουμε 2 φορές με απιονισμένο νερό και αφήνουμε τα πλακάκια να στεγνώσουν για λίγη ώρα. Μετά τη χρώση, τα παρασκευάσματα τοποθετούνται σε δοχείο που περιέχει ξυλόλη για 1 λεπτό. Η ξυλόλη τα καθαρίζει και τα ενυδατώνει, έτσι ώστε να εφαρμόσει καλύτερα το στερεωτικό υλικό DPX. Προσθέτουμε 5-6 σταγόνες DPX (Serva, 18243), προσέχοντας ώστε να το ρίξουμε σε όλη την επιφάνεια της αντικειμενοφόρου πλάκας και να αποφύγουμε να συγκεντρωθεί σε ένα μόνο σημείο. Έπειτα, σκεπάζουμε με καλυπτρίδα, προσέχοντας να μην παραμείνουν φυσαλίδες κάτω από την καλυπτρίδα, και αφήνουμε τα παρασκευάσματα να στεγνώσουν για τουλάχιστον 24 ώρες πριν την μικροσκοπική παρατήρηση (Fenech, 2000). Να σημειωθεί ότι η διαδικασία αυτή της μονιμοποίησης των παρασκευασμάτων γίνεται στον απαγωγό, λόγω του ότι η ξυλόλη είναι πτητική ουσία και θα πρέπει να αποφεύγεται η εισπνοή της Μικροσκοπική παρατήρηση Η μικροσκοπική παρατήρηση όλων των μονιμοποιημένων παρασκευασμάτων που έχουν υποστεί χρώση Giemsa May Grünwald, πραγματοποιήθηκε σε μικροσκόπιο Zeiss Axioskop. Παράλληλα έγινε λήψη εικόνων με τη βοήθεια λογισμικού ανάλυσης εικόνας (ISIS Meta System), Ενδεικτικές φωτογραφίες παρατίθενται στο Παράρτημα Εικόνων. Προκειμένου οι μετρήσεις να είναι αξιόπιστες και αντιπροσωπευτικές τηρήθηκαν τα εξής: Αναλύθηκαν τουλάχιστον 2000 συνολικά κύτταρα για κάθε καλλιέργεια που πραγματοποιήθηκε για κάθε δότη. 100

101 Αναλύθηκαν τουλάχιστον 1000 διπύρηνα κύτταρα και προσδιορίστηκε ο αριθμός των μικροπυρήνων σε αυτά 1. Υπολογίστηκε η συχνότητα των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες, καθώς και η συχνότητα των μικροπυρήνων στα κύτταρα αυτά, και έγινε συσχετισμός τους με την ηλικία, το φύλο και την επίδραση χημικών ενώσεων. Προσδιορίστηκαν τα μονοπύρηνα, διπύρηνα, τριπύρηνα και τετραπύρηνα κύτταρα και υπολογίστηκε ο δείκτης πολλαπλασιασμού των κυττάρων (CBPI), ο δείκτης πυρηνικής διαίρεσης (NDI), το εκατοστιαίο ποσοστό των διπύρηνων κυττάρων, και το ποσοστό της κυτταροτοξικότητας. Προσδιορίστηκαν τα αποπτωτικά και νεκρωτικά κύτταρα, καθώς και διπύρηνα κύτταρα με πυρηνοπλασματικές γέφυρες (NPBs), και υπολογίστηκαν οι συχνότητές τους Κριτήρια αναγνώρισης διπύρηνων κυττάρων Τα διπύρηνα κύτταρα που έχουν προκύψει από τη μέθοδο CBMN, και λαμβάνουμε υπόψιν στις μετρήσεις μας για την πιθανή ύπαρξη μικροπυρήνων, πρέπει να έχουν τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: 1. Τα κύτταρα πρέπει να είναι διπύρηνα. 2. Οι δύο κύριοι πυρήνες πρέπει να έχουν άθικτες πυρηνικές μεμβράνες, που να μην εφάπτονται, και να είναι μέσα στα ίδια κυτταροπλασματικά όρια. 3. Οι δύο κύριοι πυρήνες πρέπει να έχουν το ίδιο περίπου μέγεθος, καθώς και το ίδιο πρότυπο και ένταση χρώσης. 4. Οι δύο κύριοι πυρήνες μέσα στο διπύρηνο κύτταρο είναι δυνατόν να συνδέονται με μια λεπτή πυρηνοπλασματική γέφυρα, η οποία δεν έχει μεγαλύτερο εύρος από το ¼ της μεγαλύτερης πυρηνικής διαμέτρου. 5. Οι δύο κύριοι πυρήνες είναι δυνατό να έρχονται σε επαφή, αλλά στην ιδανική περίπτωση δεν πρέπει να επικαλύπτει ο ένας τον άλλο. Ένα κύτταρο με δύο επικαλυπτόμενους πυρήνες μπορεί να συμπεριληφθεί στις μετρήσεις μόνο αν τα όρια του κάθε πυρήνα είναι διακριτά. 1 Σε περίπτωση που δεν είμαστε σίγουροι για το πώς πρέπει να ταξινομηθεί κάποιο κύτταρο, είναι καλύτερα να παραλείπεται η μέτρησή του. (Fenech et al., 2003). 101

102 6. Τα κυτταροπλασματικά όρια ή η μεμβράνη ενός διπύρηνου κυττάρου θα πρέπει να μην εφάπτεται και να μπορεί να διακριθεί από τα κυτταροπλασματικά όρια των παρακείμενων κυττάρων (Fenech et al., 2003). Εικόνα : Φωτογραφίες διπύρηνων κυττάρων, όπως αυτά φαίνονται στο μικροσκόπιο. (Fenech et al., 2003) Κριτήρια αναγνώρισης μικροπυρήνων Οι μικροπυρήνες είναι μορφολογικά όμοιοι, αλλά μικρότεροι από τους κύριους πυρήνες, και έχουν τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: 1. Η διάμετρος των μικροπυρήνων σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα συνήθως ποικίλλει μεταξύ του 1/16 και του 1/3 της διαμέτρου του κύριου πυρήνα, η οποία αντιστοιχεί στο 1/256 και στο 1/9 του χώρου που καταλαμβάνει ο ένας από τους δύο πυρήνες ενός διπύρηνου κυττάρου, αντίστοιχα. 2. Οι μικροπυρήνες έχουν στρογγυλό ή ελλειψοειδές σχήμα. 3. Οι μικροπυρήνες έχουν την ίδια διαθλαστικότητα με τους κύριους πυρήνες, και μπορούν να διακρίνονται εύκολα από κηλίδες χρωστικής ή άλλα υπολείμματα που μπορεί να υπάρχουν στο παρασκεύασμα. 4. Οι μικροπυρήνες δεν συνδέονται ή έρχονται σε επαφή με τους κύριους πυρήνες. 5. Οι μικροπυρήνες είναι δυνατόν να αγγίζουν, αλλά δεν πρέπει να επικαλύπτουν τους κύριους πυρήνες και τα όριά τους πρέπει να είναι διακριτά από αυτά των κύριων πυρήνων. 6. Οι μικροπυρήνες κατά κανόνα έχουν την ίδια ένταση στη χρώση με τους κύριους πυρήνες, αλλά σε κάποιες περιπτώσεις η χρώση τους ίσως είναι πιο έντονη (Fenech et al., 2003). 102

103 Εικόνα : Φωτογραφίες διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες, όπως αυτά φαίνονται στο μικροσκόπιο. (Fenech et al., 2003) Κριτήρια αναγνώρισης αποπτωτικών κυττάρων 1. Τα πρώιμα αποπτωτικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από την παρουσία συμπυκνωμένης χρωματίνης μέσα στον πυρήνα και άθικτα κυτταροπλασματικά και πυρηνικά όρια. 2. Τα αποπτωτικά κύτταρα που βρίσκονται σε προχωρημένο στάδιο χαρακτηρίζονται από κατακερματισμένο πυρήνα σε μικρότερα πυρηνικά σωμάτια εντός ενός άθικτου κυτταροπλάσματος ή μιας άθικτης κυτταροπλασματικής μεμβράνης. 3. Η ένταση της χρώσης στον πυρήνα, στα πυρηνικά θραύσματα και στο κυτταρόπλασμα είναι συνήθως μεγαλύτερη από αυτή των ζωντανών κυττάρων (Fenech et al., 2003). Εικόνα : Φωτογραφίες αποπτωτικών κυττάρων, όπως αυτά φαίνονται στο μικροσκόπιο. (a-c): Μονοπύρηνα κύτταρα που βρίσκονται σε πρώιμο αποπτωτικό στάδιο, (de): Διπύρηνο αποπτωτικό κύτταρο, (f): Κύτταρο που βρίσκεται σε προχωρημένο στάδιο απόπτωσης. (Fenech et al., 2003). 103

104 Κριτήρια αναγνώρισης νεκρωτικών κυττάρων 1. Τα πρώιμα νεκρωτικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από την παρουσία ωχρού κυτταροπλάσματος, με πολυάριθμα κενοτόπια (κυρίως στο κυτταρόπλασμα και κάποια στον πυρήνα) και κατεστραμμένη κυτταροπλασματική μεμβράνη με έναν σχεδόν άθικτο πυρήνα. 2. Τα νεκρωτικά κύτταρα που βρίσκονται σε προχωρημένο στάδιο χαρακτηρίζονται από απώλεια του κυτταροπλάσματος και κατεστραμμένη ή μη κανονική πυρηνική μεμβράνη με μόνο μια μερικώς άθικτη πυρηνική δομή και συχνά με πυρηνικό υλικό που διαφεύγει από τα πυρηνικά όρια. 3. Η ένταση της χρώσης του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος είναι συνήθως μικρότερη από αυτή που παρατηρείται στα ζωντανά κύτταρα (Fenech et al., 2003). Εικόνα : Φωτογραφίες νεκρωτικών κυττάρων, όπως αυτά φαίνονται στο μικροσκόπιο. (a-c): Κύτταρα που βρίσκονται σε πρώιμο νεκρωτικό στάδιο, (d-f): Κύτταρα που βρίσκονται σε προχωρημένο νεκρωτικό στάδιο. (Fenech et al., 2003) Δείκτης πολλαπλασιασμού των κυττάρων (CBPI) Ο Δείκτης Πολλαπλασιασμού των Κυττάρων (Cytokinesis Block Proliferation Index - CBPI) υπολογίζει το μέσο αριθμό των κυτταρικών κύκλων που έχει ολοκληρώσει ο κυτταρικός πληθυσμός και εκφράζει τον αριθμό των κυτταρικών διαιρέσεων που υφίσταται ένα κύτταρο. Όπως έχει προαναφερθεί, ο δείκτης αυτός υπολογίζεται από τη σχέση: CBPI = [M1+2M2+3(M3+M4)] / N όπου M1: τα μονοπύρηνα, M2: τα διπύρηνα, M3: τα τριπύρηνα, M4: τα τετραπύρηνα ή κύτταρα με περισσότερους πυρήνες και N: ο συνολικός αριθμός των κυττάρων. Ο λόγος που χρησιμοποιείται το άθροισμα των τριπύρηνων και των τετραπύρηνων κυττάρων είναι γιατί τα τριπύρηνα και τα τετραπύρηνα κύτταρα έχουν ολοκληρώσει δύο κυτταρικές διαιρέσεις. 104

105 Δείκτης πυρηνικής διαίρεσης (NDI) Ο Δείκτης Πυρηνικής Διαίρεσης (Nuclear Division Index NDI) αντιστοιχεί στη μέση τιμή των πυρήνων ανά κύτταρο και εκφράζει το ρυθμό με τον οποίο λαμβάνουν χώρα οι πυρηνικές διαιρέσεις. Περιγράφει δηλαδή το ρυθμό διαίρεσης των κυττάρων και υπολογίζεται με παρόμοιο τρόπο όπως ο δείκτης CBPI, σύμφωνα με τη σχέση: NDI = (M1+2M2+3M3+4M4) / N. Δεν έχουν μέχρι στιγμής αναφερθεί ποσοτικές διαφορές μεταξύ των τιμών που προκύπτουν από τους δύο δείκτες. Εντούτοις, ο δείκτης πολλαπλασιασμού των κυττάρων μπορεί να θεωρηθεί περισσότερο ακριβής και αξιόπιστος (Surrallés et al., 1995) Κυτταροτοξικότητα Ο υπολογισμός του δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων (CBPI) χρησιμοποιείται για την εκτίμηση της κυτταροτοξικότητας (cytotoxicity) που προκαλείται μετά από επίδραση με τις χημικές ενώσεις. Ο όρος κυτταροτοξικότητα αντιπροσωπεύει την αναστολή του ρυθμού κυτταρικής διαίρεσης και την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου (απόπτωσης και νέκρωσης). Ο υπολογισμός της γίνεται μέσω του τύπου: Cytotoxicity = 100 [100 (CBPIT-1 /CBPIC-1)] όπου Τ: η καλλιέργεια με την υπό εξέταση χημική ένωση (treatment) και C: η καλλιέργεια του μάρτυρα (control). Όταν η τιμή του δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων είναι ίση με τη μονάδα, τότε η κυτταροτοξικότητα αντιστοιχεί στο 100% και όλα τα κύτταρα είναι μονοπύρηνα, αφού αδυνατούν να ολοκληρώσουν την κυτταρική διαίρεση (Kirsch-Volders et al., 2003) Στατιστική ανάλυση Ο στατιστικός έλεγχος για τη μελέτη της επίδρασης των τεσσάρων χημικών παραγώγων της μελφαλάνης έγινε με τη δοκιμή x 2 του Yates (Yates x 2 correction test), με τη χρήση του λογισμικού της GraphPad ( Επιπλέον, για να διαπιστωθεί η ύπαρξη γραμμικής σχέσης ανάμεσα στην αύξηση της συγκέντρωσης των εξεταζόμενων χημικών ενώσεων και στην αύξηση της κυτταροτοξικότητας ή της συχνότητας των μικροπυρήνων, πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης (Regression Analysis) μέσω του προγράμματος SPSS (IBM SPSS Statistics 21). 105

106 10. ΜΕΘΟΔΟΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΜΟΝΑΔΙΑΙΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ (SCGE/ COMET ASSAY) Πειραματική πορεία Η μέθοδος ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης, όπως έχουμε ήδη αναφέρει, αποτελεί αξιόπιστη μέθοδο για την ανίχνευση της θραύσης του DNA σε επίπεδο μοναδιαίων κυττάρων. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της γονιδιοτοξικότητας μεγάλου αριθμού χημικών και φαρμακευτικών ενώσεων. Το πρωτόκολλο της πειραματικής πορείας περιλαμβάνει τη χρήση των ακόλουθων διαλυμάτων: - PBS ph: 7-7,2 Σε 500 ml απεσταγμένο ddh2o προστίθενται: 4 gr NaCl (Sds, ) 0,1 gr KCl (Merck, ) 0,1 gr KH2PO4 (Merck, ) 0,575 gr Na2HPO4 (Merck, ) Το διάλυμα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο. Φυλάσσεται σε θερμοκρασία 4 C για έναν μήνα. - 10N NaOH Σε αποστειρωμένο ddh2o προστίθενται 40 gr NaOH (Merck, ). Αφού διαλυθεί το NaOH προσθέτουμε ddh2o μέχρι ο τελικός όγκος του διαλύματος να είναι 100 ml. Το διάλυμα φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου και διατηρείται έως και δύο μήνες Μm EDTA ph: 10 Σε αποστειρωμένο ddh2o προστίθενται 7,44 gr Na2EDTA.2H2O (Applichem, A1104). Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με 10N NaOH και προστίθεται ddh2o μέχρι ο τελικός όγκος του να είναι 100 ml. Το διάλυμα φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου και διατηρείται έως και δύο μήνες. 106

107 - Διάλυμα λύσης ph: 10 Σε αποστειρωμένο ddh2o προστίθενται: 73,05 gr NaCl (Sds, ) 18,60 gr Na2EDTA.2H2O (Applichem, A1104) 0,6 gr Tris Ultrapure (Applichem, A1086) Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με 10N NaOH και προστίθεται ddh2o μέχρι ο τελικός όγκος του να είναι 465 ml. Το διάλυμα φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου. Την ημέρα του πειράματος προστίθενται 1% Triton X-100 (Sigma, T9284), 1% (N- Lauroylsarcosine sodium salt (Applichem, A7402) και 5% DMSO (Μerck, Art ) και τοποθετείται στους 4 C. Η προσθήκη των δύο απορρυπαντικών και του DMSO αυξάνει τον όγκο του διαλύματος σε 500 ml. Ο λόγος που προστίθεται το DMSO στο διάλυμα λύσης είναι για να μειωθεί η πιθανότητα επιπλέον πρόκλησης οξειδωτικής βλάβης στο DNA, λόγω απελευθέρωσης του σιδήρου από την αιμοσφαιρίνη ( Με τον τρόπο αυτό αποφεύγεται η δημιουργία οξειδωμένων βάσεων οι οποίες μετατρέπονται σε ρήγματα. Η απουσία του DMSO από το διάλυμα λύσης συνδέεται πολλές φορές με αυξημένη συγκέντρωση του DNA στην ουρά του κομήτη, κάτι που μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένα συμπεράσματα για τις υπό διερεύνηση τοξικές ενώσεις. - Αλκαλικό διάλυμα ph > 13 1,2 gr NaOH (Merck, ) 500 μl EDTA 200mM ph 10 99,50 ml αποστειρωμένο dh2o Το διάλυμα παρασκευάζεται την ημέρα του πειράματος. Όταν η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε αλκαλικές συνθήκες, τοποθετείται στους 4 C για τουλάχιστον μία ώρα πριν χρησιμοποιηθεί. 107

108 - 10 TBE ph: 7-8 Σε dh2o προστίθενται: 108 gr Tris Ultrapure (Applichem, A1086) 55 gr Boric acid (Applichem, A1097) 9,3 gr Na2EDTA.2H2O (Applichem, A1104) Συμπληρώνουμε με dh2o μέχρι να έχουμε τελικό όγκο 1l. Το διάλυμα αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο και φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου. Χρησιμοποιείται ως 1 TBE (σε 900 ml dh2o προστίθενται 100 ml 10 TBE). Ως πηγή λεμφοκυττάρων χρησιμοποιήθηκε φλεβικό αίμα μόνο από τον 1 ο δότη (θηλυκό άτομο ηλικίας 26 ετών, μη καπνιστής). Ακολουθήθηκε το ίδιο χρονοδιάγραμμα όσον αφορά την καλλιέργεια των λεμφοκυττάρων με αυτό της μεθόδου αναστολής της κυτταροκίνησης, με τη διαφορά ότι στην περίπτωση αυτή δεν προστίθεται Cyt-B, όπως φαίνεται και στην ακόλουθη εικόνα. t=0 t=41 h t=72 h Έναρξη καλλιέργειας Προσθήκη χημικής ένωσης Ολοκλήρωση καλλιέργειας και απομόνωση λεμφοκυττάρων Εικόνα 10.1.α.: Σχηματική αναπαράσταση του χρονοδιαγράμματος της καλλιέργειας των λεμφοκυττάρων κατά τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης. Η πειραματική πορεία αρχικά περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια: Τη χρονική στιγμή t=0 προστίθενται σε ειδικά αποστειρωμένα δοχεία καλλιέργειας τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά για την έναρξη της καλλιέργειας ολικού αίματος, όπως ακριβώς περιγράφονται στη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης. 41 ώρες μετά την έναρξη της καλλιέργειας προστίθεται η υπό εξέταση χημική ένωση, δηλ. στη συγκεκριμένη περίπτωση το χημικό παράγωγο της μελφαλάνης SN-D σε συγκέντρωση c=5μμ. Μετά την πάροδο 72 ωρών από την έναρξη της καλλιέργειας ξεκινάει η διαδικασία απομόνωσης των λεμφοκυττάρων. Μισή ώρα πριν την απομόνωση των λεμφοκυττάρων, eppendorfs τα οποία περιέχουν 325 μl αγαρόζης χαμηλού σημείου τήξεως (0,5% Low Melting Point Agarose, Promega) τοποθετούνται σε ποτήρι ζέσεως με βραστό νερό για 5 λεπτά και στη συνέχεια μεταφέρονται σε υδατόλουτρο στους 37 C, όπου παραμένουν για 108

109 τουλάχιστον 20 λεπτά προτού χρησιμοποιηθούν, προκειμένου να αποφευχθεί το θερμικό σοκ των κυττάρων. Επίσης, μία ώρα πριν ξεκινήσουμε την απομόνωση των λεμφοκυττάρων, είναι απαραίτητο να παρασκευάσουμε τα υποτονικά διαλύματα που θα χρειαστούμε, εφόσον πρέπει να διατηρούνται στους 37 C (στον επωαστικό θάλαμο) τουλάχιστον μία ώρα πριν από την απομόνωση. Στον ακόλουθο πίνακα, παρουσιάζονται τα συστατικά των τροποποιημένων υποτονικών διαλυμάτων. Το αραιωμένο υποτονικό διάλυμα (1:3) χρησιμοποιείται για την καλύτερη απομόνωση των λεμφοκυττάρων, καθώς η μεγαλύτερη περιεκτικότητά του σε ddh2o το καθιστά πιο δραστικό για τη λύση των ερυθροκυττάρων του αίματος. Η προσθήκη του DMSO γίνεται για λόγους προστασίας των κυττάρων από οξειδωτικά φαινόμενα. Πίνακας 10.1.β.: Συστατικά και αναλογίες που απαιτούνται για την παρασκευή των τροποποιημένων υποτονικών διαλυμάτων. ΥΠΟΤΟΝΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ 1:1 ΥΠΟΤΟΝΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ 1:3 Ham F-10 : ddh2o = 1 : 1 Ham F-10 : ddh2o = 1 : 3 DMSO 5% DMSO 5% Κατά την απομόνωση των λεμφοκυττάρων αρχικά μεταφέρουμε τις καλλιέργειες από τις φλάσκες σε πλαστικούς σωλήνες φυγοκέντρου και στη συνέχεια φυγοκεντρούμε για 5 λεπτά στις 1500 στροφές. Μετά τη φυγοκέντρηση, αφαιρούμε το υπερκείμενο και προσθέτουμε σε κάθε σωλήνα με αργές κινήσεις 4 ml τροποποιημένου υποτονικού διαλύματος (1:1), υπό ταυτόχρονη ανάδευση στο Vortex. Εν συνεχεία, αφήνουμε για επώαση τους σωλήνες σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Ακολουθεί ξανά φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις 1500 στροφές. Απόρριψη του υπερκειμένου και επαναδιάλυση του ιζήματος σε 8 ml τροποποιημένου υποτονικού διαλύματος (1:1) και επώαση για 10 λεπτά στους 37 C (δηλαδή σε επωαστικό θάλαμο). Ακολουθεί εκ νέου φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις 1500 στροφές, αφαίρεση υπερκειμένου και ανακίνηση του ιζήματος. 109

110 Προσθήκη σε κάθε σωλήνα 1 ml τροποποιημένου υποτονικού διαλύματος (1:1), και στη συνέχεια προσθήκη 7 ml αραιωμένου υποτονικού (1:3). Ακολουθεί επώαση για 10 λεπτά στους 37 C. Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις 1500 στροφές, αφαίρεση υπερκειμένου και ανακίνηση ιζήματος. Σε περίπτωση που στο ίζημα υπάρχουν πολλά ερυθροκύτταρα, προσθέτουμε 8 ml αραιωμένου υποτονικού (1:3) και επωάζουμε για 10 λεπτά στους 37 C. Επαναλαμβάνουμε τη φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις 1500 στροφές, αφαίρεση υπερκειμένου και ανακίνηση ιζήματος Έπειτα προσθέτουμε 4 ml PBS και αναδεύουμε πολύ καλά στο Vortex. Το PBS χρησιμοποιείται παγωμένο για να σταματήσουμε τη δράση των ενδονουκλεασών και να αποφύγουμε επιδιόρθωση του DNA. Ακολουθεί μια τελευταία φυγοκέντρηση, κι έπειτα γίνεται αφαίρεση του υπερκειμένου μέχρι να μείνει 1 ml εναιωρήματος, και ανακίνηση του ιζήματος. Σε αυτό το στάδιο γίνεται υπολογισμός της πυκνότητας των κυττάρων, καθώς και του ποσοστού της βιωσιμότητάς τους, με χρήση της χρωστικής trypan blue, η οποία βάφει μόνο τα νεκρά κύτταρα. Η χρωστική αυτή εισέρχεται στα νεκρά κύτταρα, διαπερνώντας την κατεστραμμένη κυτταρική τους μεμβράνη, δεν καταφέρνει όμως να εισέλθει στα ζωντανά κύτταρα, λόγω της άθικτης μεμβράνης τους. Επομένως, κύτταρα τα οποία έχουν αποκτήσει μπλε χρώμα καταμετρώνται ως νεκρά, ενώ κύτταρα που δεν έχουν χρωματιστεί καταμετρώνται ως ζωντανά. Η βιωσιμότητα του κυτταρικού πληθυσμού υπολογίζεται από τη σχέση: Ανάμειξη 10 λ από το εναιώρημα των κυττάρων με τη χρωστική trypan blue (10%) και τοποθέτηση σε αιμοκυτταρόμετρο. Μικροσκοπική παρατήρηση και καταμέτρηση του αριθμού των κυττάρων. Ακολουθεί αραίωση ή συμπύκνωση του εναιωρήματος των κυττάρων, προκειμένου να επιτύχουμε την απαιτούμενη για τη μέθοδο συγκέντρωση των κυττάρων (0, κύτταρα/ml). 110

111 Όλες οι ακόλουθες διαδικασίες πραγματοποιούνται στο σκοτάδι για την αποφυγή πρόκλησης βλαβών στο DNA λόγω ακτινοβολίας του φωτός. 25 μl διαλύματος κυττάρων αναμιγνύονται με 325 μl αγαρόζης χαμηλού σημείου τήξεως. Με μια πιπέτα αναμειγνύουμε καλά την αγαρόζη με αργές εκροφήσεις και αναρροφήσεις. 75 μl αυτού του μίγματος μεταφέρονται σε ειδική αντικειμενοφόρο πλάκα (Trevigen comet slide ) με κυκλικές κινήσεις από την περιφέρεια προς το κέντρο της αντικειμενοφόρου. Χρησιμοποιούμε tip με κομμένο το άκρο, γιατί η αγαρόζη είναι παχύρρευστη και προσέχουμε να μείνουμε μέσα στα όρια της περιοχής τοποθέτησης του δείγματος. Οι αντικειμενοφόροι στη συνέχεια τοποθετούνται σε τρυβλία (petri) 100 mm (Greiner, ). Τα τρυβλία με τις αντικειμενοφόρους μεταφέρονται σε πλακέτα, η οποία καλύπτεται με αλουμινόχαρτο και τοποθετείται στους 4 C έως ότου σχηματιστεί δακτύλιος 0,5 mm γύρω από την αγαρόζη (6-7 ώρες). Με την πάροδο του χρόνου σχηματίζεται ένας δακτύλιος διαμέτρου 0,5 mm γύρω από το σημείο όπου τοποθετήθηκε η αγαρόζη. Αν χρειαστεί περιμένουμε για παραπάνω χρονικό διάστημα, έως ότου είμαστε σίγουροι ότι η αγαρόζη έχει παγώσει και μπορούμε συνεπώς να προχωρήσουμε στο επόμενο βήμα. Ακολουθεί επώαση με παγωμένο διάλυμα λύσης ph: 10, για μία ώρα στους 4 C. Το διάλυμα λύσης πρέπει να είναι παγωμένο προκειμένου να αποφύγουμε την αποκόλληση της αγαρόζης από τις αντικειμενοφόρους. Αλκαλικές συνθήκες ηλεκτροφόρησης: Στιγμιαία έκπλυση με παγωμένο ddh2o. Οι αντικειμενοφόροι μεταφέρονται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης και καλύπτονται με ml αλκαλικό διάλυμα ph >13. Επωάζουμε για 30 λεπτά στους 4 C. Είναι σημαντικό, οι αντικειμενοφόροι κατά την τοποθέτησή τους στη συσκευή ηλεκτροφόρησης να είναι ευθυγραμμισμένες μεταξύ τους και να μην μετακινηθούν, έτσι ώστε να μην έχουμε αποκλίσεις στις εικόνες που θα πάρουμε μετά την ηλεκτροφόρηση. Έπειτα, ηλεκτροφορούμε για 30 λεπτά σε συνθήκες 300 ma, 300 Watt και 5 V/cm στους 4 C. 111

112 Ακολουθούν δύο στιγμιαίες εκπλύσεις με 1 TBE ph: 7-8. Έκπλυση διάρκειας 5 λεπτών με 70% αιθανόλη. Στη συνέχεια, γίνεται ξήρανση των αντικειμενοφόρων πλακών σε κουτί που περιέχει silica gel (Applichem, A4569) για ώρες. Αφού στεγνώσουν τελείως, πραγματοποιείται χρώση με 80 μl βρωμιούχο αιθίδιο συγκέντρωσης 2 μg/ml (Sigma, E8751) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, στο σκοτάδι. Ατελής ξήρανση της αγαρόζης μπορεί να εμποδίσει τη χρωστική να λειτουργήσει σωστά. Θα πρέπει να μη βλέπουμε καθόλου την αγαρόζη για να προχωρήσουμε στο στάδιο της χρώσης. Έκπλυση με dh2o για 5 λεπτά προκειμένου να απομακρυνθεί η περίσσεια της φθορίζουσας χρωστικής. Στέγνωμα των αντικειμενοφόρων, σε θερμοκρασία δωματίου, στο σκοτάδι. Μικροσκοπική παρατήρηση. Λήψη φωτογραφιών στο μικροσκόπιο φθορισμού με φακό 40. Εικόνα 10.1.: Σχηματική απεικόνιση των βασικών σταδίων της μεθόδου ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (Προσαρμογή από 112

113 10.2. Μικροσκοπική παρατήρηση και λήψη φωτογραφιών Η μικροσκοπική παρατήρηση των παρασκευασμάτων έγινε σε μικροσκόπιο φθορισμού Zeiss Axioskop Epi-Fluorescence. Όπως αναφέραμε, η χρώση του DNA έγινε με βρωμιούχο αιθίδιο. Πρόκειται για φθορίζουσα χρωστική που έχει την ικανότητα να παρεμβάλλεται ανάμεσα στις βάσεις του DNA γειτονικών νουκλεοτιδίων, με αποτέλεσμα να βάφει με αυτόν τον τρόπο το DNA. Παρουσιάζει μέγιστο βαθμό απορρόφησης στα 526 nm, δηλαδή στο υπεριώδες φάσμα και στη συνέχεια εκπέμπει φθορισμό στα 605 nm. Για το λόγο αυτό κατά τη μικροσκοπική παρατήρηση χρησιμοποιήθηκε το φίλτρο της ροδαμίνης (Zeiss ). Εικόνα 10.2.: Η χημική δομή του βρωμιούχου αιθίδιου. (Vardevanyan et al., 2003) Η λήψη των φωτογραφιών έγινε μέσω της κάμερας υψηλής ανάλυσης (Monochrome CCD-Camera) με την οποία είναι εφοδιασμένο το μικροσκόπιο και η επεξεργασία τους έγινε με χρήση του προγράμματος ανάλυσης εικόνων ISIS της METASYSTEM Υπολογισμός παραμέτρων και στατιστική ανάλυση Οι παράμετροι που μελετώνται κατά κανόνα σε πειράματα ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης είναι οι εξής: % DNA in head, % DNA in tail, tail length, tail intensity, tail moment και Olive moment. Ο υπολογισμός των παραμέτρων αυτών στην παρούσα εργασία έγινε μέσω του προγράμματος CometScore Version 1.5 της εταιρείας TriTek. Οι παράμετροι % DNA in head και % DNA in tail εκφράζουν το ποσοστό του DNA που υπάρχει στην κεφαλή του κομήτη και το ποσοστό του DNA που έχει μετακινηθεί στην ουρά του κομήτη, αντίστοιχα. Η παράμετρος % DNA in tail σχετίζεται με τη συχνότητα θραύσης του DNA και είναι ανάλογη της ποσότητας του DNA που έχει υποστεί ρήγματα. Η παράμετρος tail length εκφράζει το μήκος της ουράς του κομήτη, υπολογισμένο σε pixels. Λαμβάνοντας υπόψη την κάμερα του μικροσκοπίου, καθώς και τη μεγέθυνση του φακού με τον οποίο έγινε η μικροσκοπική παρατήρηση και η λήψη των εικόνων, το πρόγραμμα ISIS 113

114 της METASYSTEM παρέχει τη δυνατότητα μετατροπής των pixels σε μm, για τον υπολογισμό του μήκους της ουράς του κομήτη. Η παράμετρος tail intensity εκφράζει την ένταση του φθορισμού που παρατηρείται στην ουρά του κομήτη σε σύγκριση με τη συνολική ένταση του φθορισμού όλου του κομήτη ( Η παράμετρος tail moment προκύπτει από την εξίσωση tail moment = (% DNA in tail Tail length) / 100. Η παράμετρος αυτή είναι ενδεικτική της επαγόμενης βλάβης που υφίσταται το DNA, λαμβάνοντας υπόψη τόσο τη μετακίνηση των θραυσμάτων του γενετικού υλικού, όσο και τη σχετική ποσότητα DNA που υπάρχει στην ουρά του κομήτη (Hellman, et al., 1995). Τέλος, η παράμετρος Οlive tail moment δίνεται από τη σχέση Olive moment = (Tail mean Head mean) % DNA in tail / 100. Εκφράζει την απόσταση ανάμεσα στα κέντρα των περιοχών που ορίζουν την κεφαλή και την ουρά του κομήτη, καθώς και το ποσοστό του DNA στην ουρά του κομήτη σε σχέση με τη συνολική ποσότητα του DNA (Mozaffarieh et al., 2010). Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με χρήση του προγράμματος Oneway Anova (OriginPro, Version 8.0). Εικόνα 10.3.: Οι βασικές παράμετροι που εξετάζονται στη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (comet assay). ( Στο σημείο αυτό, αξίζει να σημειωθεί ότι οι Olive et al. (1990) υπολόγισαν την παράμετρο tail moment για να περιγράψουν τη μετακίνηση του DNA. Η παράμετρος αυτή είναι πλέον γνωστή ως Οlive tail moment και είναι πολύ χρήσιμη για την περιγραφή της ετερογένειας που παρατηρείται σε έναν κυτταρικό πληθυσμό, εφόσον μπορεί να διακρίνει αποκλίσεις στην κατανομή του DNA στην ουρά του κομήτη (Kumaravel et al., 2009). 114

115 Ωστόσο, η παράμετρος Οlive tail moment δεν αποτελεί πάντα αξιόπιστο δείκτη της βλάβης που έχει υποστεί το DNA, εφόσον η απόσταση ανάμεσα στα κέντρα των περιοχών που ορίζουν την κεφαλή και την ουρά του κομήτη εξαρτάται κάθε φορά από τις συνθήκες της ηλεκτροφόρησης, όπως π.χ. ο χρόνος ηλεκτροφόρησης (Sunjog et al., 2013). Επιπλέον, η παράμετρος αυτή υπολογίζεται σε αυθαίρετες μονάδες και ως εκ τούτου προκύπτουν διαφορετικές τιμές όταν χρησιμοποιούνται διαφορετικά συστήματα ανάλυσης εικόνων (Kumaravel & Jha, 2006). Επομένως, σε περιπτώσεις όπου γίνεται σύγκριση των παραμέτρων με τις αντίστοιχες παραμέτρους που προκύπτουν από πειράματα άλλων ερευνητών, είναι προτιμότερο να χρησιμοποιείται η παράμετρος tail intensity αντί της παραμέτρου Οlive tail moment (Sunjog et al., 2013), καθώς και η παράμετρος % DNA in tail (Kumaravel & Jha, 2006). Ακόμη, η παράμετρος tail intensity είναι προτιμότερη και έναντι της παραμέτρου tail length, καθώς όταν αυξάνεται η βλάβη στο DNA, η ουρά του κομήτη αυξάνεται σε ένταση αλλά όχι απαραίτητα σε μήκος. Επίσης, η παράμετρος tail length δεν υπολογίζεται πάντα σωστά από τα προγράμματα ανάλυσης εικόνων, καθώς στο τέλος της ουράς του κομήτη παρατηρείται συνήθως υπερβολικός διάχυτος φθορισμός (Sunjog et al., 2013). Τέλος, σύμφωνα με τους Lee et al. (2004) οι παράμετροι tail moment και % DNA in tail είναι αντιπροσωπευτικοί δείκτες της βλάβης του DNA και υπερτερούν της παραμέτρου tail length. Για το λόγο αυτό και οι δύο αυτές παράμετροι θα πρέπει να εξετάζονται πάντα σε τοξικολογικές μελέτες στον άνθρωπο (Lee et al., 2004). 115

116 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

117 11. ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΧΗΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΛΦΑΛΑΝΗΣ Μελέτη του ρυθμού του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταροτοξικότητας Η επίδραση των τεσσάρων χημικών παραγώγων της μελφαλάνης στον κυτταρικό κύκλο μελετήθηκε μέσω του προσδιορισμού των δεικτών CBPI (Cytokinesis Block Proliferation Index) και NDI (Nuclear Division Index). Επιπλέον, προκειμένου να εξάγουμε σαφέστερα συμπεράσματα για την κυτταροτοξική τους δράση, υπολογίστηκε και το ποσοστό των διπύρηνων κυττάρων, καθώς και ο δείκτης της κυτταροτοξικότητας. Στους πίνακες που ακολουθούν ( , , , ) παρουσιάζονται οι μεταβολές των δεικτών αυτών μετά από επίδραση με τρεις συγκεντρώσεις των χημικών παραγώγων της μελφαλάνης SN-A, SN-B, SN-C και SN-D σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro. Στην πρώτη στήλη αναφέρονται οι δότες που χρησιμοποιήθηκαν, στη δεύτερη στήλη η χημική ένωση και οι εξεταζόμενες συγκεντρώσεις, στην τρίτη στήλη ο αριθμός των κυττάρων που αναλύθηκαν σε κάθε καλλιέργεια, στην τέταρτη ο αριθμός των μονοπύρηνων κυττάρων, στην πέμπτη ο αριθμός και το ποσοστό των διπύρηνων κυττάρων, στην έκτη ο αριθμός των κυττάρων με τρεις ή περισσότερους πυρήνες. Στις τρεις τελευταίες στήλες παρουσιάζονται οι δείκτες CBPI, NDI και το ποσοστό της κυτταροτοξικότητας. 117

118 Δότης 1ος Πίνακας : Μεταβολή του δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων (CBPI), του δείκτη πυρηνικής διαίρεσης (NDI), του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων, και προσδιορισμός της κυτταροτοξικότητας σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-A. SN-A 1 SN-A 2 SN-A 5 Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) Κύτταρα που αναλύθηκαν Μ1 Μ2 (%) Μ3+ CBPI NDI Κυτταροτοξικότητα % Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (36,0 ± 2,32) 60 1,40 (1,40 ± 0,02) 1,41 (1,41 ± 0,02) - 1 η καλλιέργεια (35,0) 18 1,38 1, η καλλιέργεια (36,4) 14 1,38 1,39 5 Σύνολο ,38 1,39 5 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (35,7 ± 0,70) 32 (1,38 ± 0) (1,39 ± 0) (5 ± 0) 1 η καλλιέργεια (27,8) 37 1,32 1, η καλλιέργεια (34,2) 17 1,37 1,37 7,5 Σύνολο ,34 1,34 15 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (31,0 ± 3,20) * 54 (1,34 ± 0,02) (1,35 ± 0,02) (13,8 ± 6,25) * 1 η καλλιέργεια (17,7) 6 1,18 1, η καλλιέργεια (14,7) 9 1,15 1,15 62,5 Σύνολο ,16 1,17 60 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (16,2 ± 1,50) * 15 (1,17 ± 0,01) (1,17 ± 0,01) (58,8 ± 3,75) * * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) Όπου Μ 1: μονοπύρηνα κύτταρα, Μ 2: διπύρηνα κύτταρα, Μ 3+: κύτταρα με 3 ή περισσότερους πυρήνες. 118

119 Δότης 2ος Συνέχεια του Πίνακα : Μεταβολή του δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων (CBPI), του δείκτη πυρηνικής διαίρεσης (NDI), του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων, και προσδιορισμός της κυτταροτοξικότητας σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-A. SN-A 1 SN-A 2 SN-A 5 Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) Κύτταρα που αναλύθηκαν Μ1 Μ2 (%) Μ3+ CBPI NDI Κυτταροτοξικότητα % Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (31,9 ± 0,26) 44 1,35 (1,35 ± 0) 1,36 (1,35 ± 0,01) - 1 η καλλιέργεια (19,1) 34 1,22 1,22 37,1 2 η καλλιέργεια (19,6) 31 1,22 1,23 37,1 Σύνολο ,22 1,22 37,1 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (19,4 ± 0,25) * 65 (1,22 ± 0) (1,23 ± 0,01) (37,1 ± 0) * 1 η καλλιέργεια (18,4) 21 1,20 1,20 42,9 2 η καλλιέργεια (17,7) 21 1,19 1,20 45,7 Σύνολο ,19 1,20 45,7 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (18,1 ± 0,35) * 42 (1,20 ± 0,01) (1,20 ± 0) (44,3 ± 1,40) * 1 η καλλιέργεια (14,3) 8 1,15 1,15 57,1 2 η καλλιέργεια (15,4) 14 1,16 1,16 54,3 Σύνολο ,15 1,16 57,1 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (14,9 ± 0,55) * 22 (1,16 ± 0,01) (1,16 ± 0,01) (55,7 ± 1,40) * * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) Όπου Μ 1: μονοπύρηνα κύτταρα, Μ 2: διπύρηνα κύτταρα, Μ 3+: κύτταρα με 3 ή περισσότερους πυρήνες. 119

120 Όπως προκύπτει από τα αποτελέσματα του Πίνακα , η χημική ένωση SN-A εμφανίζει κυτταροτοξική δράση και στους δύο δότες. Και οι τρεις συγκεντρώσεις της SN-A που εξετάστηκαν προκαλούν μείωση των δεικτών CBPI, NDI και του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων (% BN), και αύξηση του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας. Επιπλέον, καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση της SN-Α παρατηρείται μείωση των δεικτών CBPI, NDI και % BN, και αύξηση της κυτταροτοξικότητας. Συγκεκριμένα, το ποσοστό των διπύρηνων κυττάρων στις καλλιέργειες του μάρτυρα υπολογίστηκε 36% στον 1 ο δότη και 31,9% στον 2 ο δότη, ενώ στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με τις συγκεντρώσεις 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ το ποσοστό μειώθηκε σε 35,7%, 31% και 16,2% αντίστοιχα στον 1 ο δότη, και σε 19,4%, 18,1% και 14,9% αντίστοιχα στον 2 ο δότη. Ομοίως, μειώθηκε και ο δείκτης CBPI από 1,40 και 1,35 στις καλλιέργειες-μάρτυρα του 1 ου και 2 ου δότη αντίστοιχα, σε 1,38, 1,34 και 1,17 (1 ος δότης) και 1,22, 1,20 και 1,16 (2 ος δότης) μετά την επίδραση με τις συγκεντρώσεις 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ, αντίστοιχα. Την ίδια μεταβολή παρουσίασε και ο δείκτης NDI. Όσον αφορά το ποσοστό της κυτταροτοξικότητας, η επίδραση με τις συγκεντρώσεις 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ προκάλεσε αύξησή του σε 5%, 13,8% και 58,8% στον 1 ο δότη αντίστοιχα, και σε 37,1%, 44,3% και 55,7% στον 2 ο δότη. Η στατιστική ανάλυση, χρησιμοποιώντας το Yates x 2 correction test, έδειξε ότι οι δύο μεγαλύτερες συγκεντρώσεις της SN-A (2μΜ και 5μΜ) προκαλούν στατιστικά σημαντική αύξηση της κυτταροτοξικότητας στον 1 ο δότη, ενώ στον 2 ο δότη στατιστικά σημαντική αύξηση προκαλείται και από τις τρεις συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν (1μΜ, 2μΜ και 5μΜ). Επιπλέον, παρατηρούμε πως υπάρχει ετερογένεια στα αποτελέσματα που αφορούν τους δύο δότες. Στον 1 ο δότη οι συγκεντρώσεις 1μΜ και 2μΜ προκαλούν σχετικά μικρή αύξηση της κυτταροτοξικότητας, ωστόσο η συγκέντρωση 5μΜ αποδεικνύεται ιδιαίτερα τοξική. Από την άλλη μεριά, στον 2 ο δότη η κυτταροτοξικότητα εμφανίζεται ιδιαίτερα αυξημένη μετά από την επίδραση και των τριών συγκεντρώσεων της SN-A. 120

121 Δότης 1ος Πίνακας : Μεταβολή του δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων (CBPI), του δείκτη πυρηνικής διαίρεσης (NDI), του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων, και προσδιορισμός της κυτταροτοξικότητας σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-B. SN-B 1 SN-B 2 SN-B 5 Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) Κύτταρα που αναλύθηκαν Μ1 Μ2 (%) Μ3+ CBPI NDI Κυτταροτοξικότητα % Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (36,0 ± 2,32) 60 1,40 (1,40 ± 0,02) 1,41 (1,41 ± 0,02) - 1 η καλλιέργεια (37,3) 14 1,40 1, η καλλιέργεια (38,7) 14 1,40 1,41 0 Σύνολο ,40 1,41 0 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (38,0 ± 0,70) 28 (1,40 ± 0) (1,40 ± 0) (0 ± 0) 1 η καλλιέργεια (33,9) 27 1,38 1, η καλλιέργεια (32,5) 31 1,36 1,37 10 Σύνολο ,37 1,38 7,50 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (33,2 ± 0,70) * 58 (1,37 ± 0,01) (1,38 ± 0,01) (7,50 ± 2,50) * 1 η καλλιέργεια (27,2) 23 1,30 1, η καλλιέργεια (28,1) 11 1,29 1,30 27,5 Σύνολο ,29 1,30 27,5 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (27,7 ± 0,45) * 34 (1,29 ± 0) (1,30 ± 0) (26,3 ± 1,25) * * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) Όπου Μ 1: μονοπύρηνα κύτταρα, Μ 2: διπύρηνα κύτταρα, Μ 3+: κύτταρα με 3 ή περισσότερους πυρήνες. 121

122 Δότης 2ος Συνέχεια του Πίνακα : Μεταβολή του δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων (CBPI), του δείκτη πυρηνικής διαίρεσης (NDI), του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων, και προσδιορισμός της κυτταροτοξικότητας σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-B. SN-B 1 SN-B 2 SN-B 5 Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) Κύτταρα που αναλύθηκαν Μ1 Μ2 (%) Μ3+ CBPI NDI Κυτταροτοξικότητα % Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (31,9 ± 0,26) 44 1,35 (1,35 ± 0) 1,36 (1,35 ± 0,01) - 1 η καλλιέργεια (32,8) 17 1,35 1, η καλλιέργεια (32,7) 13 1,35 1,35 0 Σύνολο ,35 1,35 0 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (32,8 ± 0,05) 30 (1,35 ± 0) (1,35 ± 0) (0 ± 0) 1 η καλλιέργεια (27,9) 18 1,31 1,32 11,4 2 η καλλιέργεια (28,6) 19 1,31 1,32 11,4 Σύνολο ,31 1,32 11,4 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (28,3 ± 0,35) * 37 (1,31 ± 0) (1,32 ± 0) (11,4 ± 0) * 1 η καλλιέργεια (21,1) 11 1,22 1,22 37,1 2 η καλλιέργεια (23,3) 13 1,25 1,25 28,6 Σύνολο ,23 1,23 34,3 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (22,2 ± 1,10) * 24 (1,24 ± 0,02) (1,24 ± 0,02) (32,8 ± 4,25) * * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) Όπου Μ 1: μονοπύρηνα κύτταρα, Μ 2: διπύρηνα κύτταρα, Μ 3+: κύτταρα με 3 ή περισσότερους πυρήνες. 122

123 Σύμφωνα με τον Πίνακα , η χημική ένωση SN-B εκδηλώνει την κυτταροτοξική της δράση και στους δύο δότες μόνο όταν χρησιμοποιείται στις δύο μεγαλύτερες συγκεντρώσεις (2μΜ και 5μΜ). Στις συγκεντρώσεις αυτές παρατηρείται μείωση των δεικτών CBPI, NDI και του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων, και αύξηση του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας. Επιπλέον, καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση της SN-Β παρατηρείται μείωση των δεικτών CBPI, NDI και % BN, και αύξηση της κυτταροτοξικότητας. Η SN-B σε συγκέντρωση 1μΜ δεν προκαλεί καθυστέρηση του κυτταρικού κύκλου, καθώς o δείκτης CBPI στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με αυτή τη συγκέντρωση παραμένει αμετάβλητος στο 1,40 (1 ος δότης) και στο 1,35 (2 ος δότης) σε σύγκριση με τις καλλιέργειες του μάρτυρα. Ως εκ τούτου, η κυτταροτοξικότητα είναι μηδενική ενώ αμετάβλητος παραμένει και ο δείκτης NDI. Όσον αφορά το ποσοστό των διπύρηνων κυττάρων, παρατηρείται μη αναμενόμενη αύξησή του από 36% (1 ος δότης) και 31,9% (2 ος δότης) στις καλλιέργειες του μάρτυρα, σε 38% (1 ος δότης) και 32,8% (2 ος δότης) στις καλλιέργειες που επιδράσαμε με τη συγκέντρωση 1μΜ της SN-B. Το γεγονός αυτό οφείλεται σύμφωνα με τους Surallés et al. (1995) στο ότι ο αριθμός των πολυπήρηνων κυττάρων έπειτα από τοξική επίδραση δεν μειώνεται αρκετά ώστε να μειωθεί και το ποσοστό των διπύρηνων. Για το λόγο αυτό είναι προτιμότερη η μελέτη των CBPI, NDI και της κυτταροτοξικότητας για την εξαγωγή συμπερασμάτων σχετικά με την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. To ποσοστό των διπύρηνων κυττάρων μετά από επίδραση με τις συγκεντρώσεις 2μΜ και 5μΜ μειώθηκε σε 33,2% και 27,7% αντίστοιχα στον 1 ο δότη, και σε 28,3% και 22,2% στον 2 ο δότη. Το ίδιο ισχύει και για τον δείκτη CBPI που μειώθηκε σε 1,37 και 1,29 (1 ος δότης), και 1,31 και 1,24 (2 ος δότης). Με τον ίδιο τρόπο μειώθηκε και ο δείκτης NDI. Επίσης, η επίδραση των συγκεντρώσεων 2μΜ και 5μΜ προκάλεσε αύξηση του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας σε 7,5% και 26,3% στον 1 ο δότη αντίστοιχα, και σε 11,4%, και 32,8% στον 2 ο δότη. Από τη στατιστική ανάλυση προκύπτει ότι οι δύο μεγαλύτερες συγκεντρώσεις της SN- Β (2μΜ και 5μΜ) προκαλούν στατιστικά σημαντική αύξηση της κυτταροτοξικότητας και στους δύο δότες. Επιπλέον, παρατηρούμε πως η κυτταροτοξική επίδραση της SN-B είναι μεγαλύτερη στον 2 ο δότη, αν και σε γενικές γραμμές κυμαίνεται στα ίδια επίπεδα και στους δύο δότες. 123

124 Δότης 1ος Πίνακας : Μεταβολή του δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων (CBPI), του δείκτη πυρηνικής διαίρεσης (NDI), του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων, και προσδιορισμός της κυτταροτοξικότητας σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-C. SN-C 1 SN-C 2 SN-C 5 Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) Κύτταρα που αναλύθηκαν Μ1 Μ2 (%) Μ3+ CBPI NDI Κυτταροτοξικότητα % Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (36,0 ± 2,32) 60 1,40 (1,40 ± 0,02) 1,41 (1,41 ± 0,02) - 1 η καλλιέργεια (36,2) 20 1,39 1,40 2,5 2 η καλλιέργεια (35,1) 15 1,37 1,38 7,5 Σύνολο , (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (35,7 ± 0,55) 35 (1,38 ± 0,01) (1,39 ± 0,01) (5 ± 2,50) 1 η καλλιέργεια (36,0) 21 1,39 1,39 2,5 2 η καλλιέργεια (33,1) 12 1,35 1,35 12,5 Σύνολο ,37 1,37 7,50 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (34,6 ± 1,45) 33 (1,37 ± 0,02) (1,37 ± 0,02) (7,50 ± 5,0) 1 η καλλιέργεια (33,2) 25 1,37 1,37 7,5 2 η καλλιέργεια (33,1) 21 1,36 1,36 10 Σύνολο ,36 1,37 10 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (33,2 ± 0,05) * 46 (1,36 ± 0) (1,36 ± 0,004) (8,75 ± 1,25) * * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) Όπου Μ 1: μονοπύρηνα κύτταρα, Μ 2: διπύρηνα κύτταρα, Μ 3+: κύτταρα με 3 ή περισσότερους πυρήνες. 124

125 Δότης 2ος Συνέχεια του Πίνακα : Μεταβολή του δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων (CBPI), του δείκτη πυρηνικής διαίρεσης (NDI), του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων, και προσδιορισμός της κυτταροτοξικότητας σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-C. SN-C 1 SN-C 2 SN-C 5 Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) Κύτταρα που αναλύθηκαν Μ1 Μ2 (%) Μ3+ CBPI NDI Κυτταροτοξικότητα % Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (31,9 ± 0,26) 44 1,35 (1,35 ± 0) 1,36 (1,35 ± 0,01) - 1 η καλλιέργεια (23,5) 14 1,25 1,25 28,6 2 η καλλιέργεια (23,1) 8 1,24 1,24 31,4 Σύνολο ,24 1,24 31,4 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (23,3 ± 0,20) * 22 (1,25 ± 0,01) (1,25 ± 0,01) (30 ± 1,40) * 1 η καλλιέργεια (22,5) 11 1,23 1,24 34,3 2 η καλλιέργεια (20,4) 9 1,21 1,21 40 Σύνολο ,22 1,23 37,1 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (21,5 ± 1,05) * 20 (1,22 ± 0,01) (1,23 ± 0,02) (37,2 ± 2,85) * 1 η καλλιέργεια (21,2) 7 1,22 1,22 37,1 2 η καλλιέργεια (18,6) 8 1,19 1,19 45,7 Σύνολο ,21 1,21 40 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (19,9 ± 1,30) * 15 (1,21 ± 0,02) (1,21 ± 0,02) (41,4 ± 4,30) * * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) Όπου Μ 1: μονοπύρηνα κύτταρα, Μ 2: διπύρηνα κύτταρα, Μ 3+: κύτταρα με 3 ή περισσότερους πυρήνες. 125

126 Όπως παρατηρούμε στον Πίνακα , η χημική ένωση SN-C προκαλεί κυτταροτοξικά φαινόμενα και στους δύο δότες. Η αύξηση της συγκέντρωσης της SN-C προκαλεί μείωση των δεικτών CBPI, NDI και του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων (% BN), και αύξηση του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας. Συγκεκριμένα, το ποσοστό των διπύρηνων κυττάρων παρουσιάζει μείωση από 36% και 31,9% στις καλλιέργειες-μάρτυρα του 1 ου και 2 ου δότη αντίστοιχα, σε 35,7%, 34,6% και 33,2% (1 ος δότης) και 23,3%, 21,5% και 19,9% (2 ος δότης) στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με τις συγκεντρώσεις 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. Η επίδραση των συγκεντρώσεων 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ στις καλλιέργειες προκάλεσε επίσης μείωση στην τιμή του CBPI σε 1,38, 1,37 και 1,36 (1 ος δότης) και σε 1,25, 1,22 και 1,21 (2 ος δότης) αντίστοιχα, από την τιμή 1,40 (1 ος δότης) και 1,35 (2 ος δότης) που υπολογίστηκε στις καλλιέργειες του μάρτυρα. Αντίστοιχη ήταν και η μείωση του δείκτη NDI. Όσον αφορά το ποσοστό της κυτταροτοξικότητας, οι συγκεντρώσεις 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ της SN-C προκάλεσαν αύξησή του σε 5%, 7,5% και 8,75% στον 1 ο δότη αντίστοιχα, και σε 30%, 37,2% και 41,4% στον 2 ο δότη. Σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, ο 2 ος δότης εμφανίζει σημαντικά αυξημένα ποσοστά κυτταροτοξικότητας έπειτα από τη δράση και των τριών εξεταζόμενων συγκεντρώσεων της SN-C. Αντίθετα, στον 1 ο δότη στατιστικά σημαντική αύξηση της κυτταροτοξικότητας επάγεται μόνο από τη συγκέντρωση 5μΜ της SN-C. Επομένως, όπως προκύπτει από τα παραπάνω αποτελέσματα, η SN-C προκαλεί σαφώς μεγαλύτερη αναστολή της προόδου του κυτταρικού κύκλου στον 2 ο δότη, σε σύγκριση με τον 1 ο δότη, όπου παρατηρείται ελάχιστη αύξηση του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας. 126

127 Δότης 1ος Πίνακας : Μεταβολή του δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων (CBPI), του δείκτη πυρηνικής διαίρεσης (NDI), του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων, και προσδιορισμός της κυτταροτοξικότητας σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-D. Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) SN-D 1 SN-D 2 SN-D 5 Κύτταρα που αναλύθηκαν Μ1 Μ2 (%) Μ3+ CBPI NDI Κυτταροτοξικότητα % Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (36,0 ± 2,32) 60 1,40 (1,40 ± 0,02) 1,41 (1,41 ± 0,02) - 1 η καλλιέργεια (35,2) 17 1,38 1, η καλλιέργεια (35,0) 27 1,39 1,39 2,5 Σύνολο ,38 1,39 5 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (35,1 ± 0,10) 44 (1,38 ± 0,01) (1,39 ± 0,01) (3,75 ± 1,25) 1 η καλλιέργεια (33,9) 21 1,36 1, η καλλιέργεια (34,4) 15 1,37 1,37 7,5 Σύνολο ,36 1,37 10 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (34,2 ± 0,25) 36 (1,37 ± 0) (1,37 ± 0) (8,75 ± 1,25) 1 η καλλιέργεια (29,1) 22 1,32 1, η καλλιέργεια (31,0) 16 1,33 1,33 17,5 Σύνολο ,32 1,32 20 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (30,1 ± 0,95) * 38 (1,32 ± 0) (1,32 ± 0) (18,8 ± 1,25) * * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) Όπου Μ 1: μονοπύρηνα κύτταρα, Μ 2: διπύρηνα κύτταρα, Μ 3+: κύτταρα με 3 ή περισσότερους πυρήνες. 127

128 Συνέχεια του Πίνακα : Μεταβολή του δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων (CBPI), του δείκτη πυρηνικής διαίρεσης (NDI), του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων, και προσδιορισμός της κυτταροτοξικότητας σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-D. Δότης 2ος Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) SN-D 1 SN-D 2 SN-D 5 Κύτταρα που αναλύθηκαν Μ1 Μ2 (%) Μ3+ CBPI NDI Κυτταροτοξικότητα % Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (31,9 ± 0,26) 44 1,35 (1,35 ± 0) 1,36 (1,35 ± 0,01) - 1 η καλλιέργεια (23,7) 15 1,25 1,25 28,6 2 η καλλιέργεια (23,3) 15 1,25 1,25 28,6 Σύνολο ,25 1,25 28,6 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (23,5 ± 0,20) * 30 (1,25 ± 0) (1,25 ± 0) (28,6 ± 0) * 1 η καλλιέργεια (18,6) 10 1,19 1,20 45,7 2 η καλλιέργεια (19,3) 16 1,21 1,21 40 Σύνολο ,21 1,20 40 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (19,0 ± 0,35) * 26 (1,20 ± 0,01) (1,21 ± 0,01) (42,9 ± 2,85) * 1 η καλλιέργεια (16,5) 8 1,17 1,17 51,4 2 η καλλιέργεια (19,2) 11 1,20 1,21 42,9 Σύνολο ,19 1,19 45,7 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (17,9 ± 1,35) * 19 (1,19 ± 0,02) (1,19 ± 0,02) (47,2 ± 4,25) * * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) Όπου Μ 1: μονοπύρηνα κύτταρα, Μ 2: διπύρηνα κύτταρα, Μ 3+: κύτταρα με 3 ή περισσότερους πυρήνες. 128

129 Η χημική ένωση SN-D, όπως και τα υπόλοιπα χημικά παράγωγα της μελφαλάνης που εξετάστηκαν, προκαλεί μείωση του ρυθμού του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Όπως φαίνεται και στον Πίνακα , και οι τρεις συγκεντρώσεις της SN-D που εξετάστηκαν προκαλούν μείωση των δεικτών CBPI, NDI και του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων (% BN), και αύξηση του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας. Επιπλέον, αυξανομένης της συγκέντρωσης της SN-D, παρατηρείται μείωση των δεικτών CBPI, NDI και % BN, και αύξηση της κυτταροτοξικότητας. Συγκεκριμένα, το ποσοστό των διπύρηνων κυττάρων στις καλλιέργειες του μάρτυρα υπολογίστηκε 36% στον 1 ο δότη και 31,9% στον 2 ο δότη, ενώ στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με τις συγκεντρώσεις 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ το ποσοστό αυτό μειώθηκε σε 35,1%, 34,2% και 30,1% αντίστοιχα στον 1 ο δότη, και σε 23,5%, 19% και 17,9% αντίστοιχα στον 2 ο δότη. Ο δείκτης CBPI μειώθηκε από 1,40 και 1,35 στις καλλιέργειες-μάρτυρα του 1 ου και 2 ου δότη αντίστοιχα, σε 1,38, 1,37 και 1,32 (1 ος δότης) και 1,25, 1,20 και 1,19 (2 ος δότης) μετά την επίδραση με τις συγκεντρώσεις 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ, αντίστοιχα. Παρόμοια μεταβλήθηκε και ο δείκτης NDI. Όσον αφορά το ποσοστό της κυτταροτοξικότητας, η επίδραση με τις συγκεντρώσεις 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ προκάλεσε αύξησή του σε 3,75%, 8,75% και 18,8% στον 1 ο δότη αντίστοιχα, και σε 28,6%, 42,9% και 47,2% στον 2 ο δότη. Από τη στατιστική ανάλυση προέκυψε ότι στον 1 ο δότη μόνο η μεγαλύτερη συγκέντρωση της SN-D (5μΜ) προκαλεί στατιστικά σημαντική αύξηση της κυτταροτοξικότητας, ενώ στον 2 ο δότη η αύξηση αυτή είναι στατιστικά σημαντική μετά από την επίδραση και των τριών συγκεντρώσεων που μελετήθηκαν. Παρατηρούμε λοιπόν, πως η SN-D προκαλεί ελάχιστη αύξηση του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας στον 1 ο δότη, ενώ αντιθέτως για τον 2 ο δότη αποδεικνύεται ιδιαίτερα κυτταροτοξική. Το γεγονός αυτό έρχεται σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μελέτη των υπολοίπων χημικών παραγώγων της μελφαλάνης (SN-A, SN-B, SN-C). 129

130 Επίσης, έγινε στατιστική ανάλυση για να διαπιστωθεί η ύπαρξη γραμμικής σχέσης ανάμεσα στην αύξηση της συγκέντρωσης της εκάστοτε ένωσης και στην αύξηση της κυτταροτοξικότητας. Τα αποτελέσματα αυτά παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας ). Πίνακας : Αποτελέσματα στατιστικής ανάλυσης γραμμικής παλινδρόμησης (Regression Analysis) στα ποσοστά της κυτταροτοξικότητας. Χημική ένωση Δότης R 2 P treg SN-A 1 ος 0,995 0,045 14,049 2 ος 0,702 0,162 2,171 SN-B 1 ος 0,999 0,016 40,992 2 ος 0,964 0,018 7,348 SN-C 1 ος 0,923 0,179 3,464 2 ος 0,55 0,258 1,564 SN-D 1 ος 0,992 0,058 10,97 2 ος 0,678 0,177 2,052 Όπως προκύπτει από τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης, γραμμική συσχέτιση (P < 0,05) ανάμεσα στην αύξηση της συγκέντρωσης και στην αύξηση της κυτταροτοξικότητας παρατηρείται στις ενώσεις SN-A και SN-Β στον 1ο δότη, και μόνο στην περίπτωση της SN-Β στον 2ο δότη. Αντίθετα, αυτό δεν ισχύει για τις ενώσεις SN-C και SN- D σε κανέναν από τους δύο δότες. 130

131 11.2. Επαγωγή μικροπυρήνων και πρόκληση απόπτωσης Για την περαιτέρω διερεύνηση της κυτταρογενετικής δράσης των παραγώγων της μελφαλάνης χρησιμοποιήθηκαν οι μικροπυρήνες ως γενετικός δείκτης της προκαλούμενης χρωμοσωματικής αστάθειας. Όπως ήδη έχει αναφερθεί, η δημιουργία μικροπυρήνων στα διπύρηνα κύτταρα οφείλεται σε γεγονότα χρωμοσωματικής θραύσης ή χρωμοσωματικής καθυστέρησης. Για το λόγο αυτό, υπολογίστηκαν οι συχνότητες των διπύρηνων κυττάρων που εμφανίζουν μικροπυρήνες (BN-ΜΝ), καθώς και οι συχνότητες των μικροπυρήνων (ΜΝ) εκφρασμένες ανά 1000 διπύρηνα κύτταρα. Μελετήθηκε επίσης η δημιουργία πυρηνοπλασματικών γεφυρών (NPBs), ως ένας επιπλέον δείκτης της γενετικής βλάβης, καθώς η παρουσία τους στα διπύρηνα κύτταρα υποδεικνύει την ύπαρξη δικεντρικών χρωμοσωμάτων. Τέλος, εξετάστηκε η ικανότητα των παραγώγων της μελφαλάνης να επάγουν τον κυτταρικό θάνατο. Υπολογίστηκαν, έτσι, οι συχνότητες των αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων στα συνολικά κύτταρα που αναλύθηκαν. Οι μετρήσεις που προέκυψαν μετά από επίδραση με τρεις συγκεντρώσεις των χημικών παραγώγων της μελφαλάνης SN-A, SN-B, SN-C και SN-D σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, παρουσιάζονται στους ακόλουθους πίνακες ( , , , ). Στην πρώτη στήλη αναφέρονται οι δότες και στη δεύτερη στήλη η χημική ένωση και οι εξεταζόμενες συγκεντρώσεις. Στην τρίτη και τέταρτη στήλη παρουσιάζεται ο αριθμός και οι συχνότητες των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες και των μικροπυρήνων, αντίστοιχα και στις δύο τελευταίες στήλες ο αριθμός και οι συχνότητες των αποπτωτικών και των νεκρωτικών κυττάρων. 131

132 Πίνακας : Μεταβολή της συχνότητας των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες, των μικροπυρήνων, των διπύρηνων κυττάρων με πυρηνοπλασματική γέφυρα, και κατανομή αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-A. Δότης 1ος Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) Διπύρηνα κύτταρα που αναλύθηκαν (%) Διπύρηνα με μικροπυρήνες ( ) Μικροπυρήνες ( ) Διπύρηνα με πυρηνοπλασματική γέφυρα Συνολικά κύτταρα που αναλύθηκαν Αποπτωτικά κύτταρα ( ) Νεκρωτικά κύτταρα ( ) Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (36,0 ± 2,32) (3,55 ± 0,20) (3,71 ± 0,28) (7,11 ± 1,29) 2926 (6,80 ± 0,96) (4,60 ± 0,80) SN-A 1 η καλλιέργεια 468 (35,0) 3 (6,41) 3 (6,41) 0 (0) (8,84) 9 (6,63) 1 2 η καλλιέργεια 538 (36,4) 6 (11,2) 6 (11,2) 3 (5,58) (9,99) 11 (7,32) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (35,7 ± 0,70) (8,81 ± 2,40) (8,81 ± 2,40) (2,79 ± 2,79) 2859 (9,42 ± 0,58) (6,98 ± 0,35) SN-A 1 η καλλιέργεια 538 (27,8) 6 (11,2) 6 (11,2) 4 (7,43) (8,66) 13 (6,62) 2 2 η καλλιέργεια 509 (34,2) 6 (11,8) 7 (13,7) 1 (1,96) (8,64) 6 (3,99) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (31,0 ± 3,20) * (11,5 ± 0,30) (12,5 ± 1,25) (4,70 ± 2,74) 3468 (8,65 ± 0,01) (5,31 ± 1,32) SN-A 1 η καλλιέργεια 509 (17,7) 8 (15,7) 8 (15,7) 6 (11,8) (5,86) 6 (2,07) 5 2 η καλλιέργεια 508 (14,7) 10 (19,7) 10 (19,7) 5 (9,84) (5,46) 9 (2,58) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (16,2 ± 1,50) * (17,7 ± 2,0) * (17,7 ± 2,0) * (10,8 ± 0,98) 6383 (5,66 ± 0,20) (2,33 ± 0,25) * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) 132

133 Συνέχεια του Πίνακα : Μεταβολή της συχνότητας των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες, των μικροπυρήνων, των διπύρηνων κυττάρων με πυρηνοπλασματική γέφυρα, και κατανομή αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-A. Δότης 2ος Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) Διπύρηνα κύτταρα που αναλύθηκαν (%) Διπύρηνα με μικροπυρήνες ( ) Μικροπυρήνες ( ) Διπύρηνα με πυρηνοπλασματική γέφυρα Συνολικά κύτταρα που αναλύθηκαν Αποπτωτικά κύτταρα ( ) Νεκρωτικά κύτταρα ( ) Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (31,9 ± 0,26) (3,18 ± 0,74) (3,18 ± 0,74) (8,80 ± 0,56) 3230 (4,02 ± 0,19) (3,25 ± 0,49) SN-A 1 η καλλιέργεια 504 (19,1) 3 (5,95) 3 (5,95) 4 (7,94) (3,77) 6 (2,26) 1 2 η καλλιέργεια 504 (19,6) 3 (5,95) 3 (5,95) 4 (7,94) (3,49) 5 (1,94) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (19,4 ± 0,25) * (5,95 ± 0) (5,95 ± 0) (7,94 ± 0) 5231 (3,63 ± 0,14) (2,10 ± 0,16) SN-A 1 η καλλιέργεια 511 (18,4) 4 (7,83) 4 (7,83) 4 (7,83) (4,29) 8 (2,86) 2 2 η καλλιέργεια 504 (17,7) 4 (7,94) 4 (7,94) 3 (5,95) (2,80) 7 (2,45) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (18,1 ± 0,35) * (7,89 ± 0,06) (7,89 ± 0,06) (6,89 ± 0,94) 5655 (3,55 ± 0,75) (2,66 ± 0,20) SN-A 1 η καλλιέργεια 508 (14,3) 10 (19,7) 10 (19,7) 6 (11,8) (3,07) 7 (1,96) 5 2 η καλλιέργεια 502 (15,4) 7 (13,9) 7 (13,9) 7 (13,9) (3,06) 8 (2,45) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (14,9 ± 0,55) * (16,8 ± 2,90) * (16,8 ± 2,90) * (12,9 ± 1,05) 6847 (3,07 ± 0,01) (2,21 ± 0,25) * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) 133

134 Από τη μελέτη του Πίνακα προκύπτει ότι η χημική ένωση SN-A, και στις τρεις συγκεντρώσεις που εξετάστηκαν, προκαλεί αύξηση στις συχνότητες των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες ( BN-MN) και των μικροπυρήνων ( MN), και στους δύο δότες. Καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση της SN-A παρατηρείται αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων από 3,71 και 3,18 στις καλλιέργειες-μάρτυρα του 1 ου και του 2 ου δότη αντίστοιχα, σε 8,81, 12,5 και 17,7 (1 ος δότης) και 5,95, 7,89 και 16,8 (2 ος δότης) μετά την έκθεση στις συγκεντρώσεις 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. Η στατιστική ανάλυση που έγινε με το Yates x 2 correction test, έδειξε ότι μόνο η επίδραση με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση της SN-A (5μΜ) προκαλεί στατιστικά σημαντική αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων και στους δύο δότες. Επιπλέον, παρατηρούμε πως στον 1 ο δότη η αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων από την επίδραση της SN-A είναι ελαφρώς μεγαλύτερη σε σύγκριση με τον 2 ο δότη. Όσον αφορά τα διπύρηνα κύτταρα με πυρηνοπλασματικές γέφυρες (NPBs), δεν παρατηρούνται στατιστικά σημαντικές μεταβολές στον αριθμό τους έπειτα από την επίδραση με την SN-A, σε σύγκριση με τις καλλιέργειες του μάρτυρα. Επιπλέον, η επίδραση των τριών συγκεντρώσεων της SN-A στις συχνότητες των αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων δεν δίνει σαφή αποτελέσματα, καθώς αυτές μεταβάλλονται με διαφορετικό τρόπο στους δύο δότες. Συγκεκριμένα, στον 1 ο δότη παρατηρείται αύξηση στις συχνότητες των αποπτωτικών κυττάρων μετά από επίδραση με τις συγκεντρώσεις 1μΜ και 2μΜ, όχι όμως με την 5μΜ. Οι συχνότητες των αποπτωτικών κυττάρων από 6,80 στις καλλιέργειες του μάρτυρα, αυξάνονται σε 9,42 και 8,65 στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με 1μΜ και 2μΜ αντίστοιχα, και μειώνονται σε 5,66 μετά από επίδραση με τη συγκέντρωση 5μΜ. Ομοίως και οι συχνότητες των νεκρωτικών κυττάρων από 4,60 στις καλλιέργειες του μάρτυρα, αυξάνονται σε 6,98 και 5,31 μετά από επίδραση με 1μΜ και 2μΜ αντίστοιχα, και μειώνονται σε 2,33 μετά από επίδραση με τη συγκέντρωση 5μΜ. Αντίθετα, στον 2 ο δότη παρατηρείται μείωση των συχνοτήτων των αποπτωτικών και των νεκρωτικών κυττάρων στις καλλιέργειες που εκτέθηκαν στις τρεις συγκεντρώσεις. Οι συχνότητες των αποπτωτικών κυττάρων από 4,02 στις καλλιέργειες-μάρτυρα, μειώθηκαν σε 3,63, 3,55 και 3,07 στις καλλιέργειες που επιδράσαμε με 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. Επίσης, οι συχνότητες των νεκρωτικών κυττάρων από 3,25 στις καλλιέργειες του μάρτυρα, μειώθηκαν σε 2,10, 2,66 και 2,21 μετά από την επίδραση με 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. 134

135 Από τη στατιστική ανάλυση προκύπτει ότι καμία από τις παραπάνω μεταβολές δεν είναι στατιστικά σημαντική. 135

136 Πίνακας : Μεταβολή της συχνότητας των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες, των μικροπυρήνων, των διπύρηνων κυττάρων με πυρηνοπλασματική γέφυρα, και κατανομή αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-B. Δότης 1ος Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) Διπύρηνα κύτταρα που αναλύθηκαν (%) Διπύρηνα με μικροπυρήνες ( ) Μικροπυρήνες ( ) Διπύρηνα με πυρηνοπλασματική γέφυρα Συνολικά κύτταρα που αναλύθηκαν Αποπτωτικά κύτταρα ( ) Νεκρωτικά κύτταρα ( ) Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (36,0 ± 2,32) (3,55 ± 0,20) (3,71 ± 0,28) (7,11 ± 1,29) 2926 (6,80 ± 0,96) (4,60 ± 0,80) 1 η καλλιέργεια 385 (37,3) 2 (5,19) 2 (5,19) 0 (0) (6,70) 5 (4,79) 2 η καλλιέργεια 629 (38,7) 4 (6,36) 4 (6,36) 4 (6,36) (9,71) 8 (4,86) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (38,0 ± 0,70) (5,78 ± 0,59) (5,78 ± 0,59) (3,18 ± 3,18) 2691 (8,21 ± 1,51) (4,83 ± 0,04) 1 η καλλιέργεια 448 (33,9) 5 (11,2) 5 (11,2) 1 (2,23) (17,0) 10 (7,39) 2 η καλλιέργεια 571 (32,5) 4 (7,01) 4 (7,01) 4 (7,0) (6,21) 5 (2,82) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (33,2 ± 0,70) * (9,11 ± 2,10) (9,11 ± 2,10) (4,62 ± 2,39) 3125 (11,6 ± 5,40) (5,11 ± 2,29) 1 η καλλιέργεια 502 (27,2) 12 (23,9) 12 (23,9) 5 (9,96) (9,08) 8 (4,27) 2 η καλλιέργεια 503 (28,1) 11 (21,9) 11 (21,9) 2 (3,98) (3,90) 3 (1,67) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (27,7 ± 0,45) * (22,9 ± 1,0) * (22,9 ± 1,0) * (6,97 ± 2,99) 3670 (6,49 ± 2,59) (2,97 ± 1,30) SN-B 1 SN-B 2 SN-B 5 * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) 136

137 Συνέχεια του Πίνακα : Μεταβολή της συχνότητας των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες, των μικροπυρήνων, των διπύρηνων κυττάρων με πυρηνοπλασματική γέφυρα, και κατανομή αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-B. Δότης 2ος Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) Διπύρηνα κύτταρα που αναλύθηκαν (%) Διπύρηνα με μικροπυρήνες ( ) Μικροπυρήνες ( ) Διπύρηνα με πυρηνοπλασματική γέφυρα Συνολικά κύτταρα που αναλύθηκαν Αποπτωτικά κύτταρα ( ) Νεκρωτικά κύτταρα ( ) Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (31,9 ± 0,26) (3,18 ± 0,74) (3,18 ± 0,74) (8,80 ± 0,12) 3230 (4,02 ± 0,19) (3,25 ± 0,49) 1 η καλλιέργεια 511 (32,8) 5 (9,78) 5 (9,78) 3 (5,87) (4,50) 7 (4,50) 2 η καλλιέργεια 503 (32,7) 4 (7,95) 5 (9,94) 5 (9,94) (5,85) 4 (2,60) SN-B 1 SN-B 2 SN-B 5 Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) 1014 (32,8 ± 0,05) 9 (8,87 ± 0,91) 10 (9,86 ± 0,08) 8 (7,91 ± 2,04) (5,18 ± 0,68) 11 (3,55 ± 0,95) 1 η καλλιέργεια 536 (27,9) 6 (11,2) 6 (11,2) 6 (11,2) (2,60) 5 (2,60) 2 η καλλιέργεια 469 (28,6) 4 (8,53) 4 (8,53) 5 (10,7) (4,87) 5 (3,05) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) 1005 (28,3 ± 0,35) * 10 (9,87 ± 1,34) 10 (9,87 ± 1,34) 11 (11,0 ± 0,25) (3,74 ± 1,14) 10 (2,83 ± 0,22) 1 η καλλιέργεια 501 (21,1) 10 (20,0) 10 (20,0) 8 (16,0) (4,64) 9 (3,80) 2 η καλλιέργεια 592 (23,3) 8 (13,5) 8 (13,5) 4 (6,76) (4,33) 6 (2,36) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (22,2 ± 1,10) * (16,8 ± 3,25) * (16,8 ± 3,25) * (11,4 ± 4,62) 4911 (4,49 ± 0,16) (3,08 ± 0,72) * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) 137

138 Όπως παρατηρούμε στον Πίνακα η χημική ένωση SN-B, και στις τρεις συγκεντρώσεις που εξετάστηκαν, προκαλεί αύξηση στις συχνότητες των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες ( BN-MN) και των μικροπυρήνων ( MN), και στους δύο δότες. Στον 1 ο δότη η συχνότητα των μικροπυρήνων αυξάνεται με την αύξηση της συγκέντρωσης της SN-B. Έτσι, από 3,71 στις καλλιέργειες του μάρτυρα, αυξάνεται σε 5,78, 9,11 και 22,9 στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. Στον 2 ο δότη παρατηρούμε ότι οι δύο μικρότερες συγκεντρώσεις της SN-B (1μΜ και 2μΜ) προκαλούν την ίδια αύξηση στη συχνότητα των μικροπυρήνων, ενώ μεγαλύτερη αύξηση προκαλείται από τη μεγαλύτερη συγκέντρωση (5μΜ). Συγκεκριμένα, η συχνότητα των μικροπυρήνων από 3,18 στις καλλιέργειες του μάρτυρα, αυξάνεται σε 9,86, 9,87 και 16,8 μετά την έκθεση σε 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. Από τη στατιστική ανάλυση προκύπτει ότι μόνο η μεγαλύτερη συγκέντρωση της SN-B (5μΜ) προκαλεί στατιστικά σημαντική αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων και στους δύο δότες. Ακόμη, παρατηρούμε πως στον 2 ο δότη σημειώνεται μεγαλύτερη αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων από την επίδραση των δύο μικρότερων συγκεντρώσεων της SN-B (1μΜ και 2Μμ), δεν ισχύει όμως το ίδιο για τη συγκέντρωση 5μΜ. Επιπλέον, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση, ο αριθμός των διπύρηνων κυττάρων με πυρηνοπλασματικές γέφυρες (NPBs) δεν μεταβάλλεται σημαντικά με την επίδραση της SN-B και στους δύο δότες. Όσον αφορά τις συχνότητες των αποπτωτικών και των νεκρωτικών κυττάρων μετά την έκθεση στις τρεις εξεταζόμενες συγκεντρώσεις της SN-B παρατηρούνται τα εξής: Στον 1 ο δότη παρατηρείται αύξηση στη συχνότητα των αποπτωτικών κυττάρων μετά από επίδραση με τις συγκεντρώσεις 1μΜ και 2μΜ, κάτι που δεν ισχύει για τη συγκέντρωση 5μΜ. Οι συχνότητες των αποπτωτικών κυττάρων από 6,80 στις καλλιέργειες του μάρτυρα, αυξάνονται σε 8,21 και 11,6 στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με 1μΜ και 2μΜ αντίστοιχα, και μειώνονται σε 6,49 μετά από επίδραση με τη συγκέντρωση 5μΜ. Ομοίως και οι συχνότητες των νεκρωτικών κυττάρων από 4,60 στις καλλιέργειες του μάρτυρα, αυξάνονται σε 4,83 και 5,11 μετά από επίδραση με 1μΜ και 2μΜ αντίστοιχα, και μειώνονται σε 2,97 μετά από επίδραση με τη συγκέντρωση 5μΜ. Στον 2 ο δότη οι συχνότητες των αποπτωτικών κυττάρων υπολογίστηκαν 4,02 στις καλλιέργειες του μάρτυρα και 5,18, 3,74 και 4,49 στις καλλιέργειες που επιδράσαμε με 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. Οι συχνότητες των νεκρωτικών κυττάρων υπολογίστηκαν 138

139 3,25 στις καλλιέργειες του μάρτυρα και 3,55, 2,83 και 3,08 μετά από την επίδραση με 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. Όπως προκύπτει από τη στατιστική ανάλυση, καμία από τις παραπάνω μεταβολές δεν είναι στατιστικά σημαντική. 139

140 Πίνακας : Μεταβολή της συχνότητας των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες, των μικροπυρήνων, των διπύρηνων κυττάρων με πυρηνοπλασματική γέφυρα, και κατανομή αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-C. Δότης 1ος Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) Διπύρηνα κύτταρα που αναλύθηκαν (%) Διπύρηνα με μικροπυρήνες ( ) Μικροπυρήνες ( ) Διπύρηνα με πυρηνοπλασματική γέφυρα Συνολικά κύτταρα που αναλύθηκαν Αποπτωτικά κύτταρα ( ) Νεκρωτικά κύτταρα ( ) Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (36,0 ± 2,32) (3,55 ± 0,20) (3,71 ± 0,28) (7,11 ± 1,29) 2926 (6,80 ± 0,96) (4,60 ± 0,80) SN-C 1 η καλλιέργεια 516 (36,2) 6 (11,6) 6 (11,6) 4 (7,75) (13,7) 15 (10,3) 1 2 η καλλιέργεια 507 (35,1) 3 (5,92) 3 (5,92) 3 (5,92) (10,9) 10 (6,79) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (35,7 ± 0,55) (8,76 ± 2,84) (8,76 ± 2,84) (6,84 ± 0,92) 2931 (12,3 ± 1,40) * (8,55 ± 1,76) SN-C 1 η καλλιέργεια 577 (36,0) 8 (13,9) 8 (13,9) 7 (12,1) (15,2) 21 (12,7) 2 2 η καλλιέργεια 448 (33,1) 5 (11,2) 5 (11,2) 4 (8,93) (8,73) 8 (5,82) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (34,6 ± 1,45) (12,6 ± 1,35) * (12,6 ± 1,35) * (10,5 ± 1,59) 3022 (12,0 ± 3,24) * (9,26 ± 3,44) * SN-C 1 η καλλιέργεια 505 (33,2) 10 (19,8) 11 (21,8) 8 (15,8) (7,16) 6 (3,91) 5 2 η καλλιέργεια 502 (33,1) 9 (17,9) 9 (17,9) 4 (7,97) (8,47) 4 (2,61) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (33,2 ± 0,05) * (18,9 ± 0,95) * (19,9 ± 1,95) * (11,9 ± 3,92) 3071 (7,82 ± 0,66) (3,26 ± 0,65) * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) 140

141 Συνέχεια του Πίνακα : Μεταβολή της συχνότητας των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες, των μικροπυρήνων, των διπύρηνων κυττάρων με πυρηνοπλασματική γέφυρα, και κατανομή αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-C. Δότης 2ος Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) Διπύρηνα κύτταρα που αναλύθηκαν (%) Διπύρηνα με μικροπυρήνες ( ) Μικροπυρήνες ( ) Διπύρηνα με πυρηνοπλασματική γέφυρα Συνολικά κύτταρα που αναλύθηκαν Αποπτωτικά κύτταρα ( ) Νεκρωτικά κύτταρα ( ) Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (31,9 ± 0,26) (3,18 ± 0,74) (3,18 ± 0,74) (8,80 ± 0,12) 3230 (4,02 ± 0,19) (3,25 ± 0,49) 1 η καλλιέργεια 537 (23,5) 3 (5,59) 3 (5,59) 4 (7,45) (4,38) 8 (3,50) 2 η καλλιέργεια 502 (23,1) 2 (3,98) 2 (3,98) 5 (9,96) (4,61) 7 (3,23) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (23,3 ± 0,20) * (4,79 ± 0,80) (4,79 ± 0,80) (8,71 ± 1,26) 4452 (4,50 ± 0,11) (3,37 ± 0,13) 1 η καλλιέργεια 567 (22,5) 8 (14,1) 10 (17,6) 5 (8,82) (4,36) 8 (3,17) 2 η καλλιέργεια 454 (20,4) 5 (11,0) 5 (11,0) 4 (8,81) (3,59) 8 (3,59) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (21,5 ± 1,05) * (12,6 ± 1,55) * (14,3 ± 3,30) * (8,82 ± 0,01) 4751 (3,98 ± 0,39) (3,38 ± 0,21) 1 η καλλιέργεια 513 (21,2) 13 (25,3) 13 (25,3) 6 (11,7) (8,27) 16 (6,62) 2 η καλλιέργεια 508 (18,6) 10 (19,7) 10 (19,7) 7 (13,8) (4,02) 6 (2,19) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (19,9 ± 1,30) * (22,5 ± 2,80) * (22,5 ± 2,80) * (12,8 ± 1,05) 5153 (6,15 ± 2,13) (4,41 ± 2,22) SN-C 1 SN-C 2 SN-C 5 * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) 141

142 Όπως προκύπτει από τα δεδομένα του Πίνακα , η χημική ένωση SN-C, και στις τρεις συγκεντρώσεις που εξετάστηκαν, προκαλεί αύξηση στις συχνότητες των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες ( BN-MN) και των μικροπυρήνων ( MN), και στους δύο δότες. Καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση της SN-C παρατηρείται αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων από 3,71 και 3,18 στις καλλιέργειες-μάρτυρα του 1 ου και του 2 ου δότη αντίστοιχα, σε 8,76, 12,6 και 19,9 (1 ος δότης) και 4,79, 14,3 και 22,5 (2 ος δότης) μετά την έκθεση στις συγκεντρώσεις 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. Σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση, η επίδραση με τις δύο μεγαλύτερες συγκεντρώσεις της SN-C (2μΜ και 5μΜ) προκαλεί στατιστικά σημαντική αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων και στους δύο δότες. Ακόμη, παρατηρούμε πως στον 2 ο δότη οι συχνότητες των μικροπυρήνων έπειτα από την επίδραση με τις δύο μεγαλύτερες συγκεντρώσεις της SN-C (2μΜ και 5μΜ) είναι υψηλότερες συγκριτικά με τις αντίστοιχες συχνότητες του 1 ου δότη, κάτι που δεν ισχύει για τη συγκέντρωση 1μΜ. Επιπλέον, ο αριθμός των διπύρηνων κυττάρων με πυρηνοπλασματικές γέφυρες (NPBs) δεν παρουσιάζει στατιστικά σημαντικές μεταβολές μετά από την επίδραση της SN-C και στους δύο δότες. Όσον αφορά τις συχνότητες των αποπτωτικών και των νεκρωτικών κυττάρων μετά την έκθεση στις τρεις εξεταζόμενες συγκεντρώσεις της SN-C παρατηρούμε ότι αυτές άλλοτε αυξάνονται και άλλοτε μειώνονται και στους δύο δότες. Στον 1 ο δότη παρατηρείται αύξηση της συχνότητας των αποπτωτικών κυττάρων μετά από την επίδραση και με τις τρεις συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν, η αύξηση αυτή ωστόσο δεν συμβαδίζει με την αύξηση της συγκέντρωσης. Έτσι, οι συχνότητες των αποπτωτικών κυττάρων από 6,80 στις καλλιέργειες του μάρτυρα αυξάνονται σε 12,3, 12 και 7,82 στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. Κάτι αντίστοιχο ισχύει και για τις συχνότητες των νεκρωτικών κυττάρων, με την εξαίρεση ότι η επίδραση με τη συγκέντρωση 5μΜ οδηγεί σε μείωση της συχνότητάς τους σε σύγκριση με το μάρτυρα. Συγκεκριμένα, οι συχνότητες των νεκρωτικών κυττάρων από 4,60 στις καλλιέργειες του μάρτυρα, αυξάνονται σε 8,55 και 9,26 μετά από επίδραση με 1μΜ και 2μΜ αντίστοιχα, και μειώνονται σε 3,26 μετά από επίδραση με τη συγκέντρωση 5μΜ. Στον 2 ο δότη παρατηρείται ελάχιστη μεταβολή των συχνοτήτων των αποπτωτικών και των νεκρωτικών κυττάρων στις καλλιέργειες που επιδράσαμε με τις τρεις συγκεντρώσεις της SN-C. Οι συχνότητες των αποπτωτικών κυττάρων υπολογίστηκαν 4,02 στις καλλιέργειες του μάρτυρα και 4,50, 3,98 και 6,15 στις καλλιέργειες που επιδράσαμε με 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. Επίσης, οι συχνότητες των νεκρωτικών κυττάρων υπολογίστηκαν 142

143 3,25 στις καλλιέργειες του μάρτυρα και 3,37, 3,38 και 4,41 μετά από την επίδραση με 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η επίδραση με τις συγκεντρώσεις 1μΜ και 2μΜ της SN-C προκαλεί στατιστικά σημαντική αύξηση των συχνοτήτων των αποπτωτικών κυττάρων στον 1 ο δότη. Επιπλέον, στατιστικά σημαντική αύξηση παρατηρείται και στη συχνότητα των νεκρωτικών κυττάρων έπειτα από έκθεση στη συγκέντρωση 2μΜ, στον ίδιο δότη. Με βάση τα αποτελέσματα αυτά, βλέπουμε πως η SN-C επάγει τον κυτταρικό θάνατο μόνο όταν χρησιμοποιείται στις δύο μικρές συγκεντρώσεις (1μΜ και 2μΜ) στον 1 ο δότη. 143

144 Πίνακας : Μεταβολή της συχνότητας των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες, των μικροπυρήνων, των διπύρηνων κυττάρων με πυρηνοπλασματική γέφυρα, και κατανομή αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-D. Δότης 1ος Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) Διπύρηνα κύτταρα που αναλύθηκαν (%) Διπύρηνα με μικροπυρήνες ( ) Μικροπυρήνες ( ) Διπύρηνα με πυρηνοπλασματική γέφυρα Συνολικά κύτταρα που αναλύθηκαν Αποπτωτικά κύτταρα ( ) Νεκρωτικά κύτταρα ( ) Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (36,0 ± 2,32) (3,55 ± 0,20) (3,71 ± 0,28) (7,11 ± 1,29) 2926 (6,80 ± 0,96) (4,60 ± 0,80) SN-D 1 η καλλιέργεια 515 (35,2) 7 (13,6) 7 (13,6) 5 (9,71) (11,5) 7 (4,71) 1 2 η καλλιέργεια 507 (35,0) 6 (11,8) 7 (13,8) 7 (13,8) (14,2) 13 (8,77) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (35,1 ± 0,10) (12,7 ± 0,90) * (13,7 ± 0,10) * (11,8 ± 2,05) 2968 (12,9 ± 1,35) * (6,74 ± 2,03) SN-D 1 η καλλιέργεια 553 (33,9) 8 (14,5) 8 (14,5) 6 (10,8) (13,2) 12 (7,20) 2 2 η καλλιέργεια 469 (34,4) 10 (21,3) 13 (27,7) 7 (14,9) (14,4) 10 (7,17) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (34,2 ± 0,25) (17,9 ± 3,40) * (21,1 ± 6,60) * (12,9 ± 2,05) 3061 (13,8 ± 0,60) * (7,19 ± 0,02) SN-D 1 η καλλιέργεια 512 (29,1) 10 (19,5) 11 (21,5) 7 (13,7) (8,97) 13 (7,28) 5 2 η καλλιέργεια 500 (31,0) 11 (22,0) 12 (24,0) 11 (22,0) (7,97) 5 (3,06) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (30,1 ± 0,95) * (20,8 ± 1,25) * (22,8 ± 1,25) * (17,9 ± 4,15) 3418 (8,47 ± 0,50) (5,17 ± 2,11) * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) 144

145 Συνέχεια του Πίνακα : Μεταβολή της συχνότητας των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες, των μικροπυρήνων, των διπύρηνων κυττάρων με πυρηνοπλασματική γέφυρα, και κατανομή αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης, SN-D. Δότης 2ος Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) Διπύρηνα κύτταρα που αναλύθηκαν (%) Διπύρηνα με μικροπυρήνες ( ) Μικροπυρήνες ( ) Διπύρηνα με πυρηνοπλασματική γέφυρα Συνολικά κύτταρα που αναλύθηκαν Αποπτωτικά κύτταρα ( ) Νεκρωτικά κύτταρα ( ) Μάρτυρας (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (31,9 ± 0,26) (3,18 ± 0,74) (3,18 ± 0,74) (8,80 ± 0,12) 3230 (4,02 ± 0,19) (3,25 ± 0,49) SN-D 1 η καλλιέργεια 583 (23,7) 4 (6,86) 4 (6,86) 2 (3,43) (3,25) 7 (2,85) 1 2 η καλλιέργεια 453 (23,3) 5 (11,0) 5 (11,0) 6 (13,2) (3,08) 5 (2,57) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (23,5 ± 0,20) * (8,93 ± 2,07) (8,93 ± 2,07) (8,32 ± 4,89) 4405 (3,17 ± 0,09) (2,71 ± 0,14) SN-D 1 η καλλιέργεια 503 (18,6) 6 (11,9) 7 (13,9) 5 (9,94) (2,59) 6 (2,22) 2 2 η καλλιέργεια 502 (19,3) 8 (15,9) 8 (15,9) 4 (7,97) (1,54) 4 (1,54) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (19,0 ± 0,35) * (13,9 ± 2,0) * (14,9 ± 1,0) * (8,96 ± 0,99) 5304 (2,07 ± 0,53) (1,88 ± 0,34) SN-D 1 η καλλιέργεια 460 (16,5) 7 (15,2) 7 (15,2) 4 (8,70) (2,52) 7 (2,52) 5 2 η καλλιέργεια 579 (19,2) 12 (20,7) 14 (24,2) 3 (5,18) (4,65) 8 (2,65) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (17,9 ± 1,35) * (18,0 ± 2,75) * (19,7 ± 4,50) * (6,94 ± 1,76) 5793 (3,59 ± 1,07) (2,59 ± 0,07) * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) 145

146 Σύμφωνα με τον Πίνακα , ότι η χημική ένωση SN-D, όπως και τα υπόλοιπα χημικά παράγωγα της μελφαλάνης που μελετήθηκαν, προκαλεί αύξηση στις συχνότητες των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες ( BN-MN) και των μικροπυρήνων ( MN), και στις τρεις συγκεντρώσεις που εξετάστηκαν, και στους δύο δότες. Καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση της SN-D παρατηρούμε ότι αυξάνεται και η συχνότητα των μικροπυρήνων από 3,71 και 3,18 στις καλλιέργειες-μάρτυρα του 1 ου και του 2 ου δότη αντίστοιχα, σε 13,7, 21,1 και 22,8 (1 ος δότης) και 8,93, 14,9 και 19,7 (2 ος δότης) μετά την έκθεση στις συγκεντρώσεις 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η επίδραση και με τις τρεις συγκεντρώσεις της SN-D προκαλεί στατιστικά σημαντική αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων στον 1 ο δότη, ενώ στον 2 ο δότη η αύξηση αυτή είναι στατιστικά σημαντική έπειτα από την επίδραση με τις συγκεντρώσεις 2μΜ και 5μΜ. Επίσης, βλέπουμε πως στον 1 ο δότη οι συχνότητες των μικροπυρήνων είναι μεγαλύτερες σε σύγκριση με τον 2 ο δότη. Όσον αφορά τα διπύρηνα κύτταρα με πυρηνοπλασματικές γέφυρες (NPBs), ούτε σε αυτήν την περίπτωση παρατηρούνται στατιστικά σημαντικές μεταβολές στον αριθμό τους έπειτα από την επίδραση με την SN-D, σε σύγκριση με τις καλλιέργειες του μάρτυρα. Επιπλέον, οι συχνότητες των αποπτωτικών και των νεκρωτικών κυττάρων μετά από την έκθεση στις τρεις συγκεντρώσεις της SN-D παρουσιάζουν διαφορετικές μεταβολές στους δύο δότες. Στον 1 ο δότη παρατηρείται αύξηση της συχνότητας των αποπτωτικών και των νεκρωτικών κυττάρων μετά από επίδραση και με τις τρεις εξεταζόμενες συγκεντρώσεις της SN-D, η οποία όμως δεν συμβαδίζει με την αύξηση της συγκέντρωσης. Έτσι, οι συχνότητες των αποπτωτικών κυττάρων από 6,80 στις καλλιέργειες του μάρτυρα, αυξάνονται σε 12,9, 13,8 και 8,47 στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ. Ομοίως και οι συχνότητες των νεκρωτικών κυττάρων από 4,60 στις καλλιέργειες του μάρτυρα, αυξάνονται σε 6,74, 7,19 και 5,17 μετά από επίδραση με 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. Αντίθετα, στον 2 ο δότη παρατηρείται μείωση των συχνοτήτων των αποπτωτικών και των νεκρωτικών κυττάρων στις καλλιέργειες που εκτέθηκαν στις τρεις συγκεντρώσεις, η οποία δεν ακολουθεί την αύξηση της συγκέντρωσης. Οι συχνότητες των αποπτωτικών κυττάρων από 4,02 στις καλλιέργειες-μάρτυρα, μειώθηκαν σε 3,17, 2,07 και 3,59 στις καλλιέργειες που επιδράσαμε με 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. Επίσης, οι συχνότητες των νεκρωτικών κυττάρων από 3,25 στις καλλιέργειες του μάρτυρα, μειώθηκαν σε 2,71, 1,88 και 2,59 μετά από την επίδραση με 1μΜ, 2μΜ και 5μΜ αντίστοιχα. 146

147 Σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση, η επίδραση με τις συγκεντρώσεις 1μΜ και 2μΜ της SN-D προκαλεί στατιστικά σημαντική αύξηση των συχνοτήτων των αποπτωτικών κυττάρων στον 1 ο δότη. Με βάση τα αποτελέσματα αυτά, βλέπουμε πως η SN-D επάγει την απόπτωση όταν χρησιμοποιείται στις δύο μικρές συγκεντρώσεις (1μΜ και 2μΜ) στον 1 ο δότη. Ωστόσο, όπως ισχύει και για τις SN-A, SN-B, SN-C, η ετερογένεια των αποτελεσμάτων δεν μας επιτρέπει να εξάγουμε σαφή συμπεράσματα για την ικανότητα της SN-D να επάγει τον κυτταρικό θάνατο. Και σε αυτήν την περίπτωση έγινε στατιστική ανάλυση για να διαπιστώσουμε αν η συχνότητα των μικροπυρήνων αυξάνεται γραμμικά με την αύξηση της συγκέντρωσης των εξεταζόμενων ενώσεων. Τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης παρουσιάζονται στον ακόλουθο πίνακα (Πίνακας ). Πίνακας : Αποτελέσματα στατιστικής ανάλυσης με το test Regression Analysis (SPSS) στις συχνότητες των μικροπυρήνων. Χημική ένωση Δότης R 2 P treg SN-A 1 ος 0,932 0,035 5,237 2 ος 0,996 0,002 23,574 SN-B 1 ος 0,977 0,012 9,183 2 ος 0,885 0,059 3,92 SN-C 1 ος 0,969 0,016 7,851 2 ος 0,926 0,038 4,998 SN-D 1 ος 0,723 0,149 2,287 2 ος 0,906 0,048 4,388 Όπως προκύπτει από τον Πίνακα 14.2., στις ενώσεις SN-A, SN-Β και SN-C παρατηρείται γραμμική συσχέτιση (P < 0,05) ανάμεσα στην αύξηση της συγκέντρωσης και στην αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων. Στην περίπτωση της SN-D, η γραμμική αυτή συσχέτιση ισχύει μόνο για τον 2 ο δότη. 147

148 12. ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΘΡΑΥΣΜΑΤΟΓΟΝΟΥ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΧΗΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΤΗΣ ΜΕΛΦΑΛΑΝΗΣ Έλεγχος της δημιουργίας ρηγμάτων στο DNA μέσω της μεθόδου ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (comet assay) Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης, οι αυξημένες συχνότητες των μικροπυρήνων επιβεβαιώνουν την ικανότητα των χημικών παραγώγων της μελφαλάνης να δημιουργούν χρωμοσωματική αστάθεια. Όπως είναι γνωστό, οι μικροπυρήνες προέρχονται είτε από χρωμοσωματική θραύση είτε από χρωμοσωματική απώλεια. Προκειμένου να διερευνήσουμε περαιτέρω την προέλευση των μικροπυρήνων, μελετήσαμε την ικανότητα των ενώσεων αυτών να προκαλούν ρήγματα στο DNA, εφαρμόζοντας τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (comet assay) κάτω από αλκαλικές συνθήκες. Η παρουσία ρηγμάτων υποδεικνύει ότι η χρωμοσωματική θραύση αποτελεί έναν από τους μηχανισμούς δημιουργίας των μικροπυρήνων. Για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκαν καλλιέργειες λεμφοκυττάρων in vitro από τον 1 ο δότη, στις οποίες επιδράσαμε με την ένωση SN-D σε συγκέντρωση 5μΜ. Ο λόγος που επιλέξαμε να εξετάσουμε την SN-D είναι γιατί όπως προκύπτει από τα αποτελέσματα που προηγήθηκαν, έχει την ικανότητα να προκαλεί επαγωγή μικροπυρήνων με τη μεγαλύτερη συχνότητα σε σύγκριση με τις υπόλοιπες ενώσεις που μελετήθηκαν. Οι παράμετροι που προέκυψαν από την ανάλυση των εικόνων των κυττάρων μετά την ηλεκτροφόρηση, χρησιμοποιούνται ως δείκτες της εκτίμησης της θραυσματογόνου δράσης της ένωσης SN-D, εφόσον μας παρέχουν πληροφορίες για την πρόκληση θραυσμάτων στο DNA, τα οποία κατά την ηλεκτροφόρηση μετακινούνται στην ουρά του κομήτη. Στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 12.1.) παρουσιάζονται οι μέσες τιμές των παραμέτρων που επιλέξαμε να εξετάσουμε, μετά από την επίδραση της SN-D σε τρεις διαφορετικές καλλιέργειες λεμφοκυττάρων του 1 ου δότη, και οι αντίστοιχες τιμές στις καλλιέργειες του μάρτυρα. Στην πρώτη στήλη αναφέρεται η χημική ένωση και η συγκέντρωση που εξετάστηκε, στη δεύτερη στήλη ο συνολικός αριθμός των κυττάρων που αναλύθηκαν, και στις επόμενες στήλες η μέση τιμή και το τυπικό σφάλμα των παραμέτρων % DNA in Head, % DNA in Tail, Tail intensity, Tail length, Tail moment και Olive moment. 148

149 Πίνακας 12.1.: Μέση τιμή και τυπικό σφάλμα των παραμέτρων % DNA in Head, % DNA in Tail, Tail Intensity, Tail length, Tail Moment και Olive Moment, μετά από έκθεση των λεμφοκυττάρων του 1 ου δότη στη χημική ένωση SN-D (5 μg/ml). Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) 1η καλλιέργεια 2η καλλιέργεια 3η καλλιέργεια Συνολικά Κύτταρα που αναλύθηκαν % DNA in Head (Μ.Τ. ± Τ.Σ.) % DNA in Tail (Μ.Τ. ± Τ.Σ.) Tail Intensity (Μ.Τ. ± Τ.Σ.) Tail length (px) (Μ.Τ. ± Τ.Σ.) Tail Moment (Μ.Τ. ± Τ.Σ.) Olive Moment (Μ.Τ. ± Τ.Σ.) Μάρτυρας ,05 ± 0,19 1,95 ± 0, ± ,25 ± 1,35 0,45 ± 0,11 1,05 ± 0,12 SN-D ,00 ± 0,35 * 7,00 ± 0,35 * ± * 81,63 ± 3,72 * 6,40 ± 0,50 * 6,63 ± 0,41 * Μάρτυρας ,50 ± 0,12 1,50 ± 0, ± ,41 ± 0,59 0,08 ± 0,01 0,68 ± 0,05 SN-D ,2 ± 0,37 * 6,75 ± 0,37 * ± * 83,5 ± 3,73 * 7,06 ± 1,03 * 6,43 ± 0,59 * Μάρτυρας ,6 ± 0,14 1,41 ± 0, ± ,78 ± 0,87 0,18 ± 0,03 0,65 ± 0,07 SN-D ,9 ± 0,33 * 7,10 ± 0,33 * ± * 83,7 ± 3,06 * 6,67 ± 0,54 * 6,90 ± 0,40 * Μάρτυρας ,4 ± 0,09 1,62 ± 0, ± ,15 ± 0,58 0,24 ± 0,04 0,79 ± 0,05 SN-D ,9 ± 0,33 * 7,10 ± 0,33 * ± 8261 * 83,7 ± 3,06 * 6,67 ± 0,54 * 6,90 ± 0,40 * * p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (One-way Anova) 149

150 Όπως προκύπτει από τη μελέτη του Πίνακα 12.1., οι μέσες τιμές των εξεταζόμενων παραμέτρων κυμαίνονται στις ίδιες τιμές και στις τρεις καλλιέργειες. Οι παράμετροι % DNA in Head και % DNA in Tail μεταβάλλονται αντιστρόφως ανάλογα, καθώς αντιπροσωπεύουν το ποσοστό του DNA που υπάρχει στην κεφαλή και στην ουρά του κομήτη αντίστοιχα. Έτσι, όπως παρατηρούμε από τα συνολικά αποτελέσματα του Πίνακα 12.1., η μέση τιμή της παραμέτρου % DNA in Head μειώνεται από 98,4 στις καλλιέργειες του μάρτυρα σε 92,9 στις καλλιέργειες που εκτέθηκαν στην SN-D, ενώ η μέση τιμή της παραμέτρου % DNA in Tail αυξάνεται από 1,62 στις καλλιέργειες του μάρτυρα σε 7,10 στις καλλιέργειες που εκτέθηκαν στην SN-D. Η στατιστική ανάλυση που έγινε με το One-way Anova test, έδειξε ότι η μεταβολή των δύο παραμέτρων μετά την επίδραση της SN-D είναι στατιστικά σημαντική, γεγονός που υποδεικνύει τη μετανάστευση του DNA στην ουρά του κομήτη. Η μετακίνηση του DNA στην ουρά του κομήτη από την επίδραση της SN-D επαληθεύεται και από την αύξηση των μέσων τιμών των υπολοίπων παραμέτρων που εξετάστηκαν. Συγκεκριμένα, οι μέσες τιμές των παραμέτρων Tail Intensity, Tail length, Tail Moment και Olive Moment αυξήθηκαν από , 9,15, 0,24 και 0,79 αντίστοιχα στις καλλιέργειες του μάρτυρα σε , 83,7, 6,67 και 6,90 στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με την SN-D. Η αύξηση αυτή σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση είναι στατιστικά σημαντική για όλες τις παραμέτρους. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα παραπάνω, προκύπτει ότι η SN-D δρα προκαλώντας ρήγματα στο DNA. 150

151 Ακολούθως (Διάγραμμα 12.1.) παρουσιάζονται τα ιστογράμματα της μέσης τιμής των παραμέτρων % DNA in Tail και Tail Intensity μετά από την επίδραση της SN-D σε τρεις διαφορετικές καλλιέργειες λεμφοκυττάρων του 1 ου δότη. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία οι παράμετροι αυτοί θεωρούνται οι πιο αξιόπιστες. Διάγραμμα 12.1.: Μεταβολή των παραμέτρων % DNA in Tail και Tail Intensity, μετά από in vitro έκθεση των λεμφοκυττάρων του 1 ου δότη στη χημική ένωση SN-D (5 μg/ml). 151

152 13. ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΒΛΑΒΩΝ ΣΤΟ DNA ΠΟΥ ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΝΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΟ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟ ΕΚΤΟΜΗΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΒΑΣΕΩΝ Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (Comet assay) έδειξαν πως το χημικό παράγωγο της μελφαλάνης, SN-D, δημιουργεί ρήγματα στο DNA. Όπως είναι γνωστό, οι αλκυλιωτικοί παράγοντες, στους οποίους ανήκει και η μελφαλάνη, προκαλούν αλκυλίωση στο DNA με αποτέλεσμα τη δημιουργία τροποποιημένων βάσεων. Κατά την επιδιόρθωση αυτών των τροποποιημένων βάσεων με το μηχανισμό εκτομής (Base Excision Repair BER) δημιουργούνται μονόκλωνα ρήγματα στο γενετικό υλικό, τα οποία εάν δεν επιδιορθωθούν πριν τη φάση της αντιγραφής του DNA, μετατρέπονται σε δίκλωνα ρήγματα και εκφράζονται ως χρωματιδικά θραύσματα, τα οποία με τη σειρά τους εκφράζονται ως ΜΝ μετά από έναν κύκλο αντιγραφής του DNA. Για να ελεγχθεί εάν η χημική ένωση SN-D δρα με αυτόν τον τρόπο, δημιουργώντας δηλαδή βλάβες στο DNA, οι οποίες επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής (excision repairable DNA lesions) εφαρμόστηκε η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης σε συνδυασμό με την κυτοσίνη της αραβινοσίδης (CBMN/ ARA-C). Όπως έχει ήδη περιγραφεί, η κυτοσίνη της αραβινοσίδης (ARA-C) αναστέλλει τον πολυμερισμό του DNA που λαμβάνει χώρα κατά την επιδιόρθωση με εκτομή τροποποιημένων βάσεων, με αποτέλεσμα οι βλάβες να μην επιδιορθώνονται και να προκύπτουν ρήγματα που τελικά εκφράζονται ως μικροπυρήνες. Αναπτύχθηκαν δύο σειρές καλλιεργειών από λεμφοκύτταρα του 1 ου δότη, παρουσία και απουσία του αναστολέα ARA-C αντίστοιχα. Εκτός από τη χημική ένωση SN-D, της οποίας η δράση εξετάζεται, έγινε επίδραση και με την τοξική ένωση MNU (N-Nitroso-N-methylurea) σε συγκέντρωση 30μΜ. Η MNU χρησιμεύει ως θετικός μάρτυρας, καθώς είναι γνωστή για την τοξική της δράση και την ικανότητα να προκαλεί τέτοιου είδους βλάβες στο DNA (Sanderson & Shield, 1996). Πρέπει να σημειωθεί ότι σε ένα αρχικό πείραμα η SN-D χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 2μΜ. Παρατηρήθηκαν όμως αυξημένα ποσοστά κυτταροτοξικότητας (αυξημένος αριθμός μονοπύρηνων κυττάρων), με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η ανάλυση των διπύρηνων κυττάρων για την ύπαρξη μικροπυρήνων. Η αυξημένη τοξικότητα οφείλεται στο γεγονός ότι σε αυτήν τη μέθοδο οι χημικές ενώσεις προστίθενται κατά την 152

153 έναρξη των καλλιεργειών, όπου τα κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη ευαισθησία. Για το λόγο αυτό επιλέχθηκαν τελικά να μελετηθούν δύο μικρότερες συγκεντρώσεις της χημικής ένωσης SN-D (0,5μΜ και 1μΜ) Μελέτη του ρυθμού του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταροτοξικότητας Όπως προαναφέρθηκε, η τροποποίηση της πειραματικής διαδικασίας κατά τη μέθοδο CBMN/ARA-C ενδεχομένως αυξάνει την τοξική δράση των εξεταζόμενων χημικών ενώσεων. Το γεγονός αυτό μπορεί να οφείλεται στην προσθήκη των χημικών ενώσεων στις καλλιέργειες κατά τη χρονική στιγμή t=0h, όταν δηλαδή τα κύτταρα βρίσκονται στη φάση G0 και είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στη δράση τοξικών παραγόντων. Επίσης, είναι πιθανό να εμφανίζει τοξική δράση και η ARA-C, ενισχύοντας έτσι την κυτταροτοξικότητα στις καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν παρουσία της. Για να διαπιστωθούν τα παραπάνω, μελετήθηκε ο ρυθμός προόδου του κυτταρικού κύκλου στις καλλιέργειες των λεμφοκυττάρων που αναπτύχθηκαν παρουσία ή απουσία του αναστολέα ARA-C, μέσω υπολογισμού των δεικτών CBPI, NDI, του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων και της κυτταροτοξικότητας, με τον τρόπο που περιγράφηκε στην ενότητα Στον ακόλουθο πίνακα (Πίνακας 13.1.) παρουσιάζονται οι μεταβολές των δεικτών που προέκυψαν σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro μετά από επίδραση με τη χημική ένωση MNU και με τις συγκεντρώσεις 0,5μΜ και 1μΜ της SN-D, παρουσία και απουσία του αναστολέα ARA-C. Στην αρχική στήλη του πίνακα αναφέρεται η χημική ένωση και οι εξεταζόμενες συγκεντρώσεις. Ο πίνακας στη συνέχεια χωρίζεται σε δύο μέρη. Στο πρώτο μέρος δίνονται οι τιμές των δεικτών για τις καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν απουσία ARA-C, και στο δεύτερο μέρος οι αντίστοιχες τιμές για τις καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν παρουσία ARA- C. Στην πρώτη στήλη κάθε μέρους δίνεται ο αριθμός των μονοπύρηνων κυττάρων, στη δεύτερη ο αριθμός και το ποσοστό των διπύρηνων κυττάρων, στην τρίτη ο αριθμός των κυττάρων με τρεις ή περισσότερους πυρήνες και στις τρεις τελευταίες στήλες παρουσιάζονται οι δείκτες CBPI, NDI και το ποσοστό της κυτταροτοξικότητας. 153

154 Πίνακας 13.1.: Μεταβολή του δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων (CBPI), του δείκτη πυρηνικής διαίρεσης (NDI), του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων, και προσδιορισμός της κυτταροτοξικότητας σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τη χημική ένωση MNU (30 μg/ml) και με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης SN-D, παρουσία και απουσία του αναστολέα ARA-C (1 μg/ml). 1 ος δότης Απουσία ARA-C (ARA-C -) Παρουσία ARA-C (ARA-C +) Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) M 1 M 2 (%) M 3+ CBPI NDI Κυτταροτοξικότητα % M 1 M 2 (%) M 3+ CBPI NDI Μάρτυρας MNU 30 SN-D 0,5 SN-D 1 Κυτταροτοξικότητα % 1 η καλλιέργεια (33,2) 25 1,36 1, (30,4) 13 1,32 1,32 11,1 2 η καλλιέργεια (31,8) 36 1,36 1, (32,1) 18 1,34 1,35 5,56 Σύνολο ,36 1, ,33 1,34 8,33 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) 2116 (32,5 ± 0,70) 61 (1,36 ± 0) (1,37 ± 0) 2245 (31,3 ± 0,85) 31 (1,33 ± 0,01) (1,34 ± 0,02) (8,33 ± 2,77) 1 η καλλιέργεια (27,1) 9 1,28 1,28 22, (20,6) 11 1,21 1,22 41,7 2 η καλλιέργεια (29,5) 7 1,30 1,30 16, (19,4) 9 1,20 1,20 44,4 Σύνολο ,29 1,29 19, ,20 1,20 44,4 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) 2626 (28,3 ± 1,20) b 16 (1,29 ± 0,01) (1,29 ± 0,01) (19,5 ± 2,75) b 6085 (20,0 ± 0,60) a, b 20 (1,21 ± 0,01) (1,21 ± 0,01) (43,1 ± 1,35) a, b 1 η καλλιέργεια (31,1) 14 1,32 1,33 11, (19,0) 12 1,20 1,20 44,4 2 η καλλιέργεια (31,0) 21 1,32 1,32 11, (19,1) 17 1,20 1,20 44,4 Σύνολο ,32 1,33 11, ,20 1,20 44,4 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) 3563 (31,1 ± 0,05) 35 (1,32 ± 0) (1,33 ± 0,01) (11,1 ± 0) 6387 (19,1 ± 0,05) a, b 29 (1,20 ± 0) (1,20 ± 0) (44,4 ± 0) a, b 1 η καλλιέργεια (19,2) 9 1,20 1,20 44, (10,6) 3 1,11 1,11 69,4 2 η καλλιέργεια (20,5) 14 1,21 1,21 41, (12,4) 2 1,12 1,12 66,7 Σύνολο ,21 1,21 44, ,12 1,12 66,7 (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) 6055 (19,9 ± 0,65) b 23 (1,21 ± 0,01) (1,21 ± 0,01) (43,1 ± 1,35) b 7867 (11,5 ± 0,90) a, b 5 (1,12 ± 0,01) (1,12 ± 0,01) (68,1 ± 1,35) a, b a: p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες ARA-C - (Yates x 2 correction test) b: p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) Όπου Μ 1: μονοπύρηνα κύτταρα, Μ 2: διπύρηνα κύτταρα, Μ 3+: κύτταρα με 3 ή περισσότερους πυρήνες. 154

155 Όπως προκύπτει από τα αποτελέσματα του Πίνακα 13.1., και στις δύο σειρές καλλιεργειών (απουσία και παρουσία ARA-C) οι χημικές ενώσεις MNU και SN-D προκαλούν μείωση των δεικτών CBPI, NDI, και του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων (% BN), και αύξηση του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας. Μάλιστα η αύξηση της συγκέντρωσης της SN-D και στις δύο σειρές καλλιεργειών ακολουθεί την αύξηση της κυτταροτοξικότητας. Συγκεκριμένα, απουσία ARA-C το ποσοστό των διπύρηνων κυττάρων μειώνεται από 32,5% στις καλλιέργειες του μάρτυρα σε 28,3%, 31,1% και 19,9% μετά από επίδραση με MNU 30μΜ, SN-D 0,5μΜ και SN-D 1μΜ αντίστοιχα. Παρόμοια μειώνεται το ποσοστό των διπύρηνων κυττάρων και παρουσία ARA-C από 31,3% στις καλλιέργειες του μάρτυρα σε 20%, 19,1% και 11,5% μετά από επίδραση με MNU 30μΜ, SN-D 0,5μΜ και SN-D 1μΜ αντίστοιχα. Όσον αφορά το δείκτη CBPI, απουσία ARA-C μειώνεται από 1,36 στην καλλιέργεια του μάρτυρα σε 1,29, 1,32 και 1,21 μετά από επίδραση με MNU 30μΜ, SN-D 0,5μΜ και SN-D 1μΜ αντίστοιχα. Αντίστοιχα μειώνονται και οι τιμές του CBPI παρουσία ARA-C από 1,33 στην καλλιέργεια του μάρτυρα σε 1,21, 1,20 και 1,12 μετά από επίδραση με MNU 30μΜ, SN-D 0,5μΜ και SN-D 1μΜ αντίστοιχα. Την ίδια μεταβολή παρουσιάζει και ο δείκτης NDI. Επιπλέον, το ποσοστό της κυτταροτοξικότητας στις καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν απουσία ARA-C αυξάνεται σε 19,5%, 11,1% και 43,1% μετά από επίδραση με MNU 30μΜ, SN-D 0,5μΜ και SN-D 1μΜ αντίστοιχα. Ομοίως και παρουσία ARA-C το ποσοστό της κυτταροτοξικότητας αυξάνεται από 8,33% στις καλλιέργειες του μάρτυρα, σε 43,1%, 44,4% και 68,1% μετά από επίδραση με MNU 30μΜ, SN-D 0,5μΜ και SN-D 1μΜ αντίστοιχα. Όπως παρατηρούμε, η παρουσία της ARA-C τόσο στις καλλιέργειες του μάρτυρα όσο και σε αυτές που εκτέθηκαν στις χημικές ενώσεις MNU και SN-D, προκαλεί επιπλέον μείωση των δεικτών CBPI, NDI, και του ποσοστού των διπύρηνων κυττάρων (% BN) και αύξηση του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας. Σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση, η αύξηση της κυτταροτοξικότητας είναι στατιστικά σημαντική και στις δύο σειρές καλλιεργειών μετά από την επίδραση της MNU και της SN-D, με εξαίρεση μόνο την καλλιέργεια που αναπτύχθηκε απουσία ARA-C και εκτέθηκε στη μικρή συγκέντρωση της SN-D (0,5μΜ). Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνει τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μέθοδο CBMN σχετικά με την κυτταροτοξική δράση της SN-D. Στο σημείο αυτό πρέπει να σημειωθεί ότι στις καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν απουσία ARA-C, τα ποσοστά της κυτταροτοξικότητας της SN-D είναι ιδιαίτερα αυξημένα σε 155

156 σχέση με αυτά που προέκυψαν από τη μέθοδο CBMN. Υπενθυμίζεται ότι με τη μέθοδο CBMN το ποσοστό της κυτταροτοξικότητας στον ίδιο δότη μετά από επίδραση με SN-D σε συγκέντρωση 1μΜ είχε υπολογιστεί 3,75%. Η αυξημένη κυτταροτοξικότητα πιθανότατα οφείλεται στο ότι στη μέθοδο CBMN/ARA-C οι χημικές ενώσεις προστίθενται κατά την έναρξη της καλλιέργειας, όταν δηλαδή τα κύτταρα βρίσκονται στη φάση G0 και είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στη δράση τοξικών παραγόντων. Η στατιστική ανάλυση έδειξε επίσης ότι η αύξηση της κυτταροτοξικότητας είναι στατιστικά σημαντική και έπειτα από την επίδραση με ARA-C στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με τις χημικές ενώσεις MNU και SN-D. Η μικρή αύξηση της κυτταροτοξικότητας που παρατηρείται παρουσία ARA-C στις καλλιέργειες του μάρτυρα, μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η ARA-C εμφανίζει τοξική δράση. Επιπλέον, η αύξηση της κυτταροτοξικότητας στις καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν παρουσία ARA-C και που εκτέθηκαν στις εξεταζόμενες χημικές ενώσεις, υποδηλώνει ότι η ARA-C ενισχύει την κυτταροτοξική δράση των χημικών ενώσεων. 156

157 13.2. Επαγωγή μικροπυρήνων Για να ελεγχθεί η ικανότητα της χημικής ένωσης SN-D να δημιουργεί τροποποιημένες βάσεις στο DNA, οι οποίες επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής, μελετήθηκε η επαγωγή της δημιουργίας μικροπυρήνων παρουσία του αναστολέα ARA-C. Όπως αναφέρθηκε στην αρχή αυτού του κεφαλαίου, η παρουσία της ARA-C στις καλλιέργειες αναστέλλει την επιδιόρθωση των τροποποιημένων βάσεων με το μηχανισμό της εκτομής, με αποτέλεσμα να προκύπτουν ρήγματα που εκφράζονται ως μικροπυρήνες στα διπύρηνα κύτταρα. Επομένως, η σύγκριση της συχνότητας των μικροπυρήνων ανάμεσα στις καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν απουσία και σε αυτές που αναπτύχθηκαν παρουσία ARA-C, παρέχει πληροφορίες για τη δημιουργία βλαβών που επιδιορθώνονται με τον προαναφερθέντα μηχανισμό. Για το λόγο αυτό, υπολογίστηκαν οι συχνότητες των διπύρηνων κυττάρων που εμφανίζουν μικροπυρήνες (BN-ΜΝ), καθώς και οι συχνότητες των μικροπυρήνων (ΜΝ) εκφρασμένες ανά 1000 διπύρηνα κύτταρα. Οι μετρήσεις που προέκυψαν μετά από επίδραση με τη χημική ένωση MNU και με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης SN-D, παρουσία και απουσία του αναστολέα ARA-C, σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, παρουσιάζονται στον ακόλουθο πίνακα (Πίνακας 13.2.). Στην αρχική στήλη του πίνακα αναφέρεται η χημική ένωση και οι εξεταζόμενες συγκεντρώσεις. Στη συνέχεια ο πίνακας χωρίζεται σε δύο μέρη. Στο πρώτο μέρος παρουσιάζονται οι μεταβολές των συχνοτήτων για τις καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν απουσία ARA-C, και στο δεύτερο μέρος οι αντίστοιχες μεταβολές για τις καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν παρουσία ARA-C. Στην πρώτη στήλη κάθε μέρους δίνεται ο αριθμός και οι συχνότητες των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες και στη δεύτερη ο αριθμός και οι συχνότητες των μικροπυρήνων. 157

158 Πίνακας 13.2.: Μεταβολή της συχνότητας των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες και των μικροπυρήνων σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τη χημική ένωση MNU (30 μg/ml) και με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης SN-D, παρουσία και απουσία του αναστολέα ARA-C (1 μg/ml). 1 ος δότης Απουσία ARA-C (ARA-C -) Παρουσία ARA-C (ARA-C +) Χημική ένωση Συγκέντρωση (μμ) Διπύρηνα κύτταρα που αναλύθηκαν (%) Διπύρηνα με μικροπυρήνες ( ) Μικροπυρήνες ( ) Διπύρηνα κύτταρα που αναλύθηκαν (%) Διπύρηνα με μικροπυρήνες ( ) Μάρτυρας MNU 30 SN-D 0,5 SN-D 1 a: p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες ARA-C - (Yates x 2 correction test) b: p < 0,05 σε σύγκριση με καλλιέργειες μάρτυρα (Yates x 2 correction test) Μικροπυρήνες ( ) 1 η καλλιέργεια 516 (33,2) 2 (3,88) 2 (3,88) 527 (30,4) 7 (13,3) 7 (13,3) 2 η καλλιέργεια 531 (31,8) 2 (3,77) 2 (3,77) 507 (32,1) 7 (13,8) 9 (17,7) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) 1047 (32,5 ± 0,70) 4 (3,83 ± 0,05) 4 (3,83 ± 0,05) 1034 (31,3 ± 0,85) 14 (13,6 ± 0,25) a 16 (15,5 ± 2,20) a 1 η καλλιέργεια 581 (27,1) 7 (12,0) 7 (12,0) 505 (20,6) 9 (17,8) 11 (21,8) 2 η καλλιέργεια 450 (29,5) 4 (8,89) 4 (8,89) 1002 (19,4) 24 (23,9) 24 (23,9) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (28,3 ± 1,20) b (10,4 ± 1,56) (10,4 ± 1,56) (20,0 ± 0,60) a, b (20,9 ± 3,05) a (22,9 ± 1,05) a 1 η καλλιέργεια 609 (31,1) 6 (9,85) 6 (9,85) 506 (19,0) 10 (19,8) 10 (19,8) 2 η καλλιέργεια 1009 (31,0) 8 (7,93) 8 (7,93) 1004 (19,1) 16 (15,9) 17 (16,9) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) (31,1 ± 0,05) (8,89 ± 0,96) (8,89 ± 0,96) (19,1 ± 0,05) a, b (17,9 ± 1,95) a (18,4 ± 1,45) a 1 η καλλιέργεια 514 (19,2) 13 (25,3) 14 (27,2) 448 (10,6) 14 (31,2) 16 (35,7) 2 η καλλιέργεια 1010 (20,5) 15 (14,8) 15 (14,8) 578 (12,4) 19 (32,9) 19 (32,9) Σύνολο (Μ.Τ. ± Τ. Σ.) 1524 (19,9 ± 0,65) b 28 (20,1 ± 5,25) b 29 (21,0 ± 6,20) b 1026 (11,5 ± 0,90) a, b 33 (32,1 ± 0,85) a, b 35 (34,3 ± 1,40) a, b 158

159 Σύμφωνα με τα αποτελέσματα του Πίνακα 13.2., η επίδραση με την ARA-C τόσο στις καλλιέργειες του μάρτυρα όσο και σε αυτές που εκτέθηκαν στις χημικές ενώσεις MNU και SN-D, προκαλεί αύξηση στη συχνότητα των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες ( BN- MN) και των μικροπυρήνων ( MN). Συγκεκριμένα, στις καλλιέργειες του μάρτυρα η συχνότητα των μικροπυρήνων αυξάνεται από 3,83 χωρίς την επίδραση με ARA-C σε 15,5 έπειτα από επίδραση με ARA-C. Στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με MNU 30μΜ η συχνότητα των μικροπυρήνων αυξήθηκε από 10,4 (απουσία ARA-C) σε 22,9 (παρουσία ARA-C), και στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με SN-D 0,5μΜ και SN-D 1μΜ η συχνότητα των μικροπυρήνων αυξήθηκε από 8,89 και 21 αντίστοιχα (απουσία ARA-C) σε 18,4 και 34,3 (παρουσία ARA-C). Από τη στατιστική ανάλυση προκύπτει ότι σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις η αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων είναι στατιστικά σημαντική. Έτσι οδηγούμαστε στο συμπέρασμα ότι η παρατηρούμενη αύξηση στη συχνότητα των μικροπυρήνων παρουσία της ARA-C είναι αποτέλεσμα της αναστολής της επιδιόρθωσης με εκτομή. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η αναστολή της επιδιόρθωσης με εκτομή έχει ως συνέπεια τα ρήγματα που δεν επιδιορθώνονται να μετατρέπονται σε μικροπυρήνες μετά την αντιγραφή του DNA. Επομένως, προκύπτει ότι η SN-D δρα προκαλώντας βλάβες στο DNA οι οποίες επιδιορθώνονται με το μηχανισμό εκτομής τροποποιημένων βάσεων (excision repairable DNA lesions), κάτι που έρχεται σε συμφωνία με το γεγονός ότι η SN-D, ως παράγωγο της μελφαλάνης, ανήκει στους αλκυλιωτικούς παράγοντες και ως εκ τούτου έχει την ικανότητα να τροποποιεί τις βάσεις του DNA. Επιπλέον, επαληθεύεται η γνωστή δράση της MNU όσον αφορά στην πρόκληση τέτοιου είδους βλαβών. Ακόμη, παρατηρούμε ότι και στις δύο σειρές καλλιεργειών (απουσία και παρουσία ARA-C) οι χημικές ενώσεις MNU και SN-D προκαλούν αύξηση στη συχνότητα των διπύρηνων κυττάρων με μικροπυρήνες ( BN-MN) και των μικροπυρήνων ( MN). Μάλιστα, καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση της SN-D παρατηρούμε ότι αυξάνεται και η συχνότητα των μικροπυρήνων. Η στατιστική ανάλυση στην περίπτωση αυτή, έδειξε ότι η αύξηση στη συχνότητα των μικροπυρήνων είναι στατιστικά σημαντική στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με τη συγκέντρωση 1μΜ της SN-D, είτε απουσία είτε παρουσία ARA-C. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνει τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μέθοδο CBMN σχετικά με την ικανότητα της SN-D να επάγει τη δημιουργία μικροπυρήνων. Πρέπει τέλος να τονίσουμε ότι, όπως και τα ποσοστά της κυτταροτοξικότητας, έτσι και οι συχνότητες των μικροπυρήνων στις καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν απουσία ARA-C, 159

160 είναι ιδιαίτερα αυξημένες σε σύγκριση με τις συχνότητες που προέκυψαν από τη μέθοδο CBMN. Συγκεκριμένα, η συχνότητα των μικροπυρήνων στον 1 ο δότη με τη μέθοδο CBMN είχε υπολογιστεί 12,7 μετά από επίδραση με SN-D 1μΜ, ενώ με τη μέθοδο CBMN/ARA- C αυξήθηκε σε 21. Η αύξηση αυτή, όπως εξηγήσαμε και στην προηγούμενη ενότητα πιθανότατα οφείλεται στο τροποποιημένο πρωτόκολλο που ακολουθείται κατά τη μέθοδο CBMN/ARA-C, σύμφωνα με το οποίο οι χημικές ενώσεις προστίθενται κατά την έναρξη της καλλιέργειας, όπου τα κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη ευαισθησία. 160

161 13.3. Βαθμός συνεργιστικότητας Τέλος, μελετήθηκε ο βαθμός συνεργιστικότητας (Degree of Synergism, DS) μεταξύ του αναστολέα ARA-C και των εξεταζόμενων χημικών ενώσεων, η ικανότητά τους δηλαδή να προκαλούν αυξημένη χρωμοσωματική αστάθεια όταν επιδρούν συνδυαστικά. Για να διαπιστωθεί λοιπόν εάν ο αναστολέας ARA-C δρα συνεργιστικά με τις εξεταζόμενες χημικές ενώσεις, ενισχύοντας την επαγωγή μικροπυρήνων, χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης ένας συντελεστής που υπολογίζεται από τον ακόλουθο τύπο: DS = (MNt+i MNC) / [(MNt MNC) + (MNi MNc)] όπου MNC : η συχνότητα των μικροπυρήνων στις καλλιέργειες του μάρτυρα που αναπτύχθηκαν απουσία ARA-C (control), MNi : η συχνότητα των μικροπυρήνων στις καλλιέργειες του μάρτυρα που αναπτύχθηκαν παρουσία ARA-C (inhibitor), MNt : η συχνότητα των μικροπυρήνων στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με την εξεταζόμενη χημική ένωση και αναπτύχθηκαν απουσία ARA-C (treatment), και MNt+i : η συχνότητα των μικροπυρήνων στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με την εξεταζόμενη χημική ένωση και αναπτύχθηκαν παρουσία ARA-C (treatment and inhibitor). Όταν ο δείκτης συνεργιστικότητας είναι ίσος με τη μονάδα σημαίνει πως δεν υπάρχει συνεργιστικότητα ανάμεσα στη δράση του εξεταζόμενου χημικού παράγοντα και του αναστολέα ARA-C (Surrallés et al., 1995). Με άλλα λόγια, η δράση του χημικού παράγοντα απουσία ARA-C δεν διαφέρει από τη δράση του παρουσία ARA-C. Επομένως, όταν ο δείκτης συνεργιστικότητας είναι μεγαλύτερος από τη μονάδα συμπεραίνουμε ότι η δράση του αναστολέα είναι συνεργιστική με τη δράση της εξεταζόμενης χημικής ένωσης, και άρα η χημική ένωση δημιουργεί βλάβες στο DNA, οι οποίες επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής τροποποιημένων βάσεων. Στον ακόλουθο πίνακα (Πίνακας 13.3.) παρουσιάζονται οι τιμές του δείκτη συνεργιστικότητας (DS) μεταξύ των χημικών ενώσεων MNU (30μΜ), SN-D (0,5μΜ και 1μΜ) και του αναστολέα ARA-C (1μΜ). 161

162 Πίνακας 13.3.: Δείκτης συνεργιστικότητας (Degree of Synergism, DS) μεταξύ των χημικών ενώσεων MNU (30 μg/ml), SN-D (0,5 μg/ml), SN-D (1 μg/ml) και του αναστολέα ARA-C (1 μg/ml). Χημική ένωση Δείκτης συνεργιστικότητας Συγκέντρωση (μμ) (DS) MNU 30 SN-D 0,5 SN-D 1 1 η καλλιέργεια 0,90 2 η καλλιέργεια 2,44 Συνολικά (Μ. Τ. ± Τ. Σ.) 1,63 (1,67 ± 0,77) 1 η καλλιέργεια 0,89 2 η καλλιέργεια 1,15 Συνολικά (Μ. Τ. ± Τ. Σ.) 1,10 (1,02 ± 0,13) 1 η καλλιέργεια 0,82 2 η καλλιέργεια 0,85 Συνολικά (Μ. Τ. ± Τ. Σ.) 0,84 (0,84 ± 0,02) Όπως προκύπτει από τον παραπάνω πίνακα (Πίνακας 13.3.) ο δείκτης συνεργιστικότητας (DS) είναι μεγαλύτερος από τη μονάδα στην περίπτωση της MNU (1,63) και της SN-D στη συγκέντρωση 0,5μΜ (1,10). Το γεγονός αυτό υποδηλώνει πως η δράση της ARA-C είναι συνεργιστική με τη δράση αυτών των ενώσεων, και επομένως οι ενώσεις αυτές προκαλούν βλάβες στο DNA, οι οποίες επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής τροποποιημένων βάσεων. Αντίθετα, ο δείκτης συνεργιστικότητας όσον αφορά την συγκέντρωση 1μΜ της SN-D είναι μικρότερος από τη μονάδα και συγκεκριμένα 0,84. Αυτό σημαίνει ότι δεν υπάρχει συνεργιστικότητα ανάμεσα στη δράση της SN-D και της ARA-C και άρα η δράση της SN-D όταν χρησιμοποιείται σε συχνότητα 1μΜ δεν επηρεάζεται από την επίδραση της ARA-C. Λόγω της παρατηρούμενης διαφοράς στην τιμή του δείκτη συνεργιστικότητας ανάμεσα στις δύο συγκεντρώσεις της SN-D δεν μπορούμε να εξάγουμε σαφές συμπέρασμα για την πρόκληση βλαβών που επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής. Επομένως, για να διευκρινιστεί η ύπαρξη συνεργιστικής δράσης ανάμεσα στην SN-D και τον αναστολέα ARA- C χρειάζεται μεγαλύτερη διερεύνηση. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μέθοδο CBMN/ARA-C φαίνεται με σαφήνεια η ικανότητα της SN-D να προκαλεί τροποποιημένες βλάβες στο DNA που επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής τροποποιημένων βάσεων. 162

163 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

164 14. Συζήτηση Ο καρκίνος αποτελεί πλέον μια από τις κυριότερες αιτίες θανάτου παγκοσμίως. Οι προσπάθειες που γίνονται για την αντιμετώπισή του περιλαμβάνουν μεταξύ άλλων και τη χημειοθεραπεία. Η θεραπεία αυτή στηρίζεται στη χρήση κυτταροτοξικών παραγόντων που στοχεύουν επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα και τα καταστρέφουν ή αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό τους. Σήμερα, λόγω της εξάπλωσης του καρκίνου, έχουν αναπτυχθεί πολλά αντικαρκινικά φάρμακα που ανάλογα με τη χημική δομή και τη δράση τους ταξινομούνται σε διάφορες κατηγορίες. Οι αλκυλιωτικοί παράγοντες αποτελούν μια από τις κυριότερες κατηγορίες των αντικαρκινικών φαρμάκων. Δρουν προκαλώντας αλκυλίωση στις βάσεις του DNA, εμποδίζουν την αντιγραφή και τη μεταγραφή του, ενώ είναι υπεύθυνοι και για την πρόκληση μεταλλάξεων. Είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικοί σε ταχέως διαιρούμενα κύτταρα καθώς επεμβαίνουν στη φάση S του κυτταρικού κύκλου, αναστέλλοντας τη συνεχή αντιγραφή του DNA. Οι υπερίτες του αζώτου θεωρούνται οι πιο ισχυροί αλκυλιωτικοί παράγοντες. Η χρήση τους στη χημειοθεραπεία του καρκίνου ξεκίνησε από τη δεκαετία του 1940 και συνεχίζεται μέχρι σήμερα. Εκτός από την τροποποίηση των βάσεων του DNA και τη δημιουργία ρηγμάτων, έχουν επίσης την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με το DNA οδηγώντας στη δημιουργία ομοιοπολικών ενδομοριακών ή διαμοριακών χιαστί δεσμών (cross-links). Ωστόσο, παρά την αντικαρκινική τους δράση, οι υπερίτες του αζώτου, όπως και άλλοι αντικαρκινικοί παράγοντες, εμφανίζουν κάποια μειονεκτήματα in vivo. Οι παράγοντες αυτοί εκτός από το DNA των καρκινικών κυττάρων αλκυλιώνουν και το DNA των υγιών κυττάρων. Η απουσία εκλεκτικότητας έχει ως αποτέλεσμα αυξημένη κυτταροτοξικότητα στα υγιή κύτταρα, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει και στην ανάπτυξη δευτερογενών όγκων (Mishra, 2013). Επιπλέον, εμφανίζουν μειωμένη δραστικότητα όσον αφορά τη δημιουργία χιαστί δεσμών, καθώς λόγω της ηλεκτρονιόφιλης δομής τους δεν συνδέονται αποκλειστικά με το DNA, αλλά μπορούν να συνδέονται και με πυρηνόφιλες θέσεις άλλων βιομορίων, ενώ υπάρχει και το ενδεχόμενο να υποστούν υδρόλυση προτού φτάσουν στο DNA (Brendel & Ruhland, 1984). Για το λόγο αυτό, γίνεται συνεχώς προσπάθεια από την επιστημονική κοινότητα για το σχεδιασμό νέων δραστικότερων αντικαρκινικών φαρμάκων που στοχεύουν αποκλειστικά τα καρκινικά κύτταρα, περιορίζοντας συγχρόνως τις κυτταροτοξικές τους παρενέργειες στα φυσιολογικά κύτταρα. Τα νέα αυτά φάρμακα προκύπτουν έπειτα από χημική σύζευξη 164

165 κατάλληλων μορίων στους υπερίτες του αζώτου, που χρησιμεύουν στη βελτιστοποίηση της αποτελεσματικότητάς τους. Στην παρούσα εργασία διερευνάται η γενετική δράση τεσσάρων νέων στεροειδών αναλόγων της μελφαλάνης (SN-A, SN-B, SN-C και SN-D). Η μελφαλάνη ανήκει στους υπερίτες του αζώτου και χρησιμοποιείται ευρέως στη θεραπεία διαφόρων μορφών καρκίνου, όπως το πολλαπλό μυέλωμα, ο καρκίνος των ωοθηκών, ο καρκίνος του μαστού, το λέμφωμα, καθώς και το νευροβλάστωμα. Τα νέα χημικά παράγωγα της μελφαλάνης συντέθηκαν στο εργαστήριο της Φαρμακευτικής Χημείας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, με σκοπό την ενίσχυση της αντινεοπλασματικής δράσης της μελφαλάνης. Η παρασκευή τους έγινε με προσθήκη ενός στεροειδούς σκελετού στο μόριο της μελφαλάνης, ο οποίος συμβάλλει στην αποτελεσματικότερη μεταφορά της αλκυλιωτικής ομάδας της μελφαλάνης στις θέσεις στόχους του DNA, ενισχύοντας έτσι την αντικαρκινική της δράση. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης (CBMN) και αναπτύχθηκαν καλλιέργειες λεμφοκυττάρων in vitro, από δύο υγιείς, νεαρής ηλικίας και μη καπνιστές δότες, αρσενικού και θηλυκού φύλου, στις οποίες επιδράσαμε με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις των τεσσάρων παραγώγων. Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση των χημικών παραγώγων της μελφαλάνης στον κυτταρικό κύκλο. Προσδιορίστηκαν έτσι οι βιολογικοί δείκτες CBPI και NDI οι οποίοι μας παρέχουν πληροφορίες για το ρυθμό προόδου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Επιπλέον, προκειμένου να εξάγουμε σαφέστερα συμπεράσματα για την κυτταροτοξική τους δράση, υπολογίστηκε και το ποσοστό των διπύρηνων κυττάρων, καθώς και το ποσοστό της κυτταροτοξικότητας. Σύμφωνα με τους Surallés et al. (1995), οι δείκτες CBPI και NDI είναι περισσότερο ακριβείς συγκριτικά με το ποσοστό των διπύρηνων κυττάρων, καθώς το ποσοστό αυτό δεν μειώνεται πάντοτε μετά από τοξική επίδραση. Ακόμη, αν και δεν έχουν βρεθεί ποσοτικές διαφορές στη μέτρηση της καθυστέρησης του κυτταρικού κύκλου μεταξύ των δεικτών CBPI και NDI, ο δείκτης CBPI θεωρείται βιολογικά περισσότερο ακριβής και αξιόπιστος για την εκτίμηση της προόδου του κυτταρικού κύκλου. Κρίνεται σκόπιμο να επικεντρωθούμε στη μελέτη του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας, καθώς αυτό υπολογίζεται μέσω του δείκτη CBPI και αντιπροσωπεύει την αναστολή του ρυθμού κυτταρικής διαίρεσης και την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου. Όταν η τιμή του CBPI είναι ίση με τη μονάδα, τότε η κυτταροτοξικότητα αντιστοιχεί στο 100% και όλα τα κύτταρα είναι μονοπύρηνα, αφού αδυνατούν να ολοκληρώσουν την κυτταρική διαίρεση (Kirsch-Volders et al., 2003). 165

166 Στο ακόλουθο ιστόγραμμα παρουσιάζεται η μεταβολή του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις (1μΜ, 2μΜ και 5μΜ) των τεσσάρων χημικών παραγώγων της μελφαλάνης SN-A, SN-B, SN-C, SN-D. Οι τιμές αυτές προέρχονται από τον υπολογισμό της μέσης τιμής των ποσοστών της κυτταροτοξικότητας και στους δύο δότες που εξετάσθηκαν. Διάγραμμα 14.1.: Μεταβολή της κυτταροτοξικότητας σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις των τεσσάρων χημικών παραγώγων της μελφαλάνης SN-A, SN-B, SN-C, SN-D, και στους δύο δότες. Όπως προκύπτει από το Διάγραμμα 14.1., και τα τέσσερα χημικά παράγωγα της μελφαλάνης προκαλούν αύξηση στο ποσοστό της κυτταροτοξικότητας. Η αύξηση αυτή είναι στατιστικά σημαντική και στις τρεις συγκεντρώσεις που εξετάστηκαν όσον αφορά τις ενώσεις SN-A, SN-C και SN-D. Στην περίπτωση της SN-B στατιστικά σημαντική αύξηση του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας παρατηρείται μόνο στις δύο μεγαλύτερες συγκεντρώσεις (2μΜ και 5μΜ), ενώ στην συγκέντρωση 1μΜ η κυτταροτοξικότητα είναι μηδενική. 166

167 Η μελέτη της κυτταρογενετικής δράσης των χημικών παραγώγων της μελφαλάνης περιλάμβανε επίσης και τη διερεύνηση της ικανότητάς τους να προκαλούν χρωμοσωματική αστάθεια, χρησιμοποιώντας ως γενετικό δείκτη τους μικροπυρήνες. Οι μικροπυρήνες όπως έχουμε ήδη αναφέρει αποτελούν έναν ευαίσθητο δείκτη της χρωμοσωματικής βλάβης, καθώς προκύπτουν από φαινόμενα χρωμοσωματικής θραύσης ή χρωμοσωματικής καθυστέρησης. Για το λόγο αυτό εξετάστηκε η συχνότητα των μικροπυρήνων στις καλλιέργειες μετά από επίδραση με τα χημικά παράγωγα της μελφαλάνης. Στο ακόλουθο ιστόγραμμα παρουσιάζεται η μεταβολή της συχνότητας των μικροπυρήνων μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις (1μΜ, 2μΜ και 5μΜ) των τεσσάρων χημικών παραγώγων της μελφαλάνης SN-A, SN-B, SN-C, SN-D. Οι τιμές αυτές προέρχονται από τον υπολογισμό της μέσης τιμής της συχνότητας των μικροπυρήνων και στους δύο δότες που εξετάσθηκαν. Διάγραμμα 14.2.: Μεταβολή της συχνότητας των μικροπυρήνων σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις των τεσσάρων χημικών παραγώγων της μελφαλάνης SN-A, SN-B, SN-C, SN-D, και στους δύο δότες. Όπως παρατηρούμε στο Διάγραμμα και τα τέσσερα χημικά παράγωγα της μελφαλάνης προκαλούν αύξηση στη συχνότητα των μικροπυρήνων. Η αύξηση αυτή είναι στατιστικά σημαντική μετά από επίδραση με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση (5μΜ) όλων των ενώσεων, ενώ στην περίπτωση των ενώσεων SN-C και SN-D στατιστικά σημαντική αύξηση παρατηρείται και στη συγκέντρωση 2μΜ. 167

168 Σύμφωνα με τους Millar και Bell (1987) η μελφαλάνη αποδείχθηκε ιδιαίτερα κυτταροτοξική για τα λεμφοκύτταρα της μυελοειδούς σειράς RPMI 8226, και σε μεγάλες συγκεντρώσεις παρατηρήθηκε ότι επάγει τη δημιουργία χιαστί δεσμών. Από in vivo πειράματα σε ποντικούς, προέκυψε ότι η μελφαλάνη προκαλεί επαγωγή μικροπυρήνων και χρωμοσωματικές ανωμαλίες σε κύτταρα μυελού των οστών (Shelby et al., 1989). Επιπλέον, οι Generoso et al. διαπίστωσαν ότι δημιουργεί υπερέχουσες θανατογόνες μεταλλάξεις καθώς και κληρονομήσιμες μετατοπίσεις σε σπερματικά κύτταρα αρσενικών ποντικών in vivo (Generoso et al., 1995). Αντίστοιχα είναι και τα ευρήματα από in vitro μελέτες σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα, σύμφωνα με τα οποία η μελφαλάνη είναι υπεύθυνη για επαγωγή μικροπυρήνων, ανταλλαγή γενετικού υλικού μεταξύ αδελφών χρωματίδων και άλλες χρωμοσωματικές ανωμαλίες (Sanderson & Shield, 1995). Σύμφωνα με παλαιότερη έρευνα του εργαστηρίου μας (Efthimiou et al., 2011) η μελφαλάνη και άλλα στεροειδικά ανάλογα υπεριτών του αζώτου προκαλούν φαινόμενα χρωμοσωματικής καθυστέρησης και μη αποχωρισμού, μέσω τροποποιήσεων της μιτωτικής συσκευής, με αποτέλεσμα την αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων σε καλλιέργειες κυττάρων ποντικού C2C12 in vitro. Επιπλέον, πρόσφατα οι Mishra και Mishra (2013) μελέτησαν τη γονιδιοτοξική δράση της μελφαλάνης σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro και από τα αποτελέσματά τους προέκυψε ότι η μελφαλάνη προκαλεί αύξηση στη συχνότητα των μικροπυρήνων με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Όλα τα παραπάνω επιβεβαιώνουν τα αποτελέσματά μας για την ικανότητα των παραγώγων της μελφαλάνης να επάγουν τη δημιουργία μικροπυρήνων. Στο σημείο αυτό να σημειωθεί ότι μελετήσαμε επίσης και την πρόκληση απόπτωσης και νέκρωσης των κυττάρων. Οι Efthimiou et al. (2011) έδειξαν ότι η επίδραση των στεροειδών αναλόγων των υπεριτών του αζώτου που μελέτησαν, οδηγούν τα κύτταρα της σειράς C2C12 σε απόπτωση, σε μικρό ποσοστό. Ακόμη, η επίδραση της μελφαλάνης σε κύτταρα με αυξημένη χρωμοσωματική βλάβη επάγει την καταστροφή τους μέσω απόπτωσης. Ωστόσο αυτό δεν προκύπτει από τα αποτελέσματά μας, καθώς η ετερογένεια που παρουσιάζουν δεν μας επιτρέπει να εξάγουμε σαφή συμπεράσματα για την ικανότητα των παραγώγων της μελφαλάνης να επάγουν τον κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, από τη μελέτη των διπύρηνων κυττάρων με πυρηνοπλασματική γέφυρα δεν ανιχνεύσαμε την ύπαρξη δικεντρικών χρωμοσωμάτων. 168

169 Στη συνέχεια, διερευνήσαμε περαιτέρω την ικανότητα της SN-D να προκαλεί ρήγματα στο DNA. Για το σκοπό αυτό εφαρμόστηκε η μέθοδος ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (comet assay) κάτω από αλκαλικές συνθήκες, με την οποία είναι δυνατή η ανίχνευση ρηγμάτων στο DNA. Αναπτύχθηκαν καλλιέργειες λεμφοκυττάρων in vitro από τον 1 ο δότη, στις οποίες επιδράσαμε με την ένωση SN-D σε συγκέντρωση 5μΜ. Οι παράμετροι που προέκυψαν από την ανάλυση των εικόνων των κυττάρων μετά την ηλεκτροφόρηση (% DNA in Head, % DNA in Tail, Tail Intensity, Tail length, Tail Moment και Olive Moment), χρησιμοποιήθηκαν ως δείκτες της εκτίμησης της θραυσματογόνου δράσης της ένωσης SN-D. Δίνεται έμφαση στις παραμέτρους % DNA in Tail και Tail Intensity καθώς, όπως έχει ήδη αναφερθεί, θεωρούνται οι πιο αξιόπιστες και μας παρέχουν τις πιο ακριβείς πληροφορίες για την πρόκληση θραυσμάτων στο DNA, τα οποία κατά την ηλεκτροφόρηση μετακινούνται στην ουρά του κομήτη. Ακολούθως (Διάγραμμα 14.3.) παρουσιάζονται τα ιστογράμματα της μέσης τιμής των παραμέτρων % DNA in Tail και Tail Intensity μετά από την επίδραση της SN-D σε τρεις διαφορετικές καλλιέργειες λεμφοκυττάρων του 1 ου δότη. 169

170 Διάγραμμα 14.3.: Μεταβολή των παραμέτρων % DNA in Tail και Tail Intensity, μετά από in vitro έκθεση των λεμφοκυττάρων του 1 ου δότη στη χημική ένωση SN-D (5 μg/ml). Όπως παρατηρούμε στα παραπάνω ιστογράμματα, οι μέσες τιμές των παραμέτρων % DNA in Tail και Tail Intensity παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική αύξηση και στις τρεις καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν. Η αύξηση αυτή υποδεικνύει τη μετανάστευση του DNA στην ουρά του κομήτη, και άρα την ισχυρή θραυσματογόνο δράση της SN-D. Επομένως, προκύπτει ότι η χρωμοσωματική θραύση αποτελεί έναν από τους μηχανισμούς δημιουργίας των μικροπυρήνων. Τα ευρήματά μας αυτά έρχονται σε συμφωνία με άλλες έρευνες που υποστηρίζουν την ικανότητα της μελφαλάνης να προκαλεί θραύση του DNA. Οι Tsuda et al. χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (comet assay) σε 170

171 αλκαλικές συνθήκες, παρατήρησαν αυξημένο ποσοστό μετακίνησης του DNA στην ουρά του κομήτη, έπειτα από in vivo επίδραση με μελφαλάνη σε 8 διαφορετικά όργανα ποντικών (Tsuda et al., 2000). Ακόμη, σε παλαιότερη έρευνα του εργαστηρίου μας (Kouloumenta et al., 2005) αποδείχτηκε η θραυσματογόνος δράση στεροειδών αναλόγων των υπεριτών του αζώτου με χρήση της μεθόδου CBMN σε συνδυασμό με in situ υβριδοποίηση με φθοροχρώματα (FISH) σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων. Σύμφωνα με την έρευνα αυτή η πλειονότητα των επαγόμενων μικροπυρήνων χαρακτηριζόταν από απουσία κεντρομερικού σήματος, κάτι που σημαίνει ότι οι μικροπυρήνες περιείχαν άκεντρα χρωμοσωματικά θραύσματα. Στο τελευταίο μέρος της εργασίας μας, αφού διαπιστώθηκε η θραυσματογόνος δράση της SN-D, ελέγξαμε την ικανότητά της να δημιουργεί βλάβες στο DNA, οι οποίες επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής βάσεων. Όπως έχει αναφερθεί, οι αλκυλιωτικοί παράγοντες δημιουργούν τροποποιημένες βάσεις στο DNA, οι οποίες επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής. Κατά την επιδιόρθωση των τροποποιημένων βάσεων με το μηχανισμό εκτομής (Base Excision Repair BER) δημιουργούνται μονόκλωνα ρήγματα στο γενετικό υλικό, τα οποία εάν δεν επιδιορθωθούν πριν τη φάση της αντιγραφής του DNA, μετατρέπονται σε δίκλωνα ρήγματα και εκφράζονται ως χρωματιδικά θραύσματα, τα οποία με τη σειρά τους εκφράζονται ως ΜΝ μετά από έναν κύκλο αντιγραφής του DNA. Για να ελεγχθεί εάν η χημική ένωση SN-D δρα με αυτόν τον τρόπο, δημιουργώντας δηλαδή τροποποιημένες βάσεις στο DNA, οι οποίες επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής (excision repairable DNA lesions) εφαρμόστηκε η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης σε συνδυασμό με την κυτοσίνη της αραβινοσίδης (CBMN/ARA-C). Όπως έχει ήδη περιγραφεί, η κυτοσίνη της αραβινοσίδης (ARA-C) αναστέλλει τον πολυμερισμό του DNA που λαμβάνει χώρα κατά την επιδιόρθωση με εκτομή τροποποιημένων βάσεων, με αποτέλεσμα οι βλάβες να μην επιδιορθώνονται και να προκύπτουν ρήγματα που τελικά εκφράζονται ως μικροπυρήνες. Στο ακόλουθο ιστόγραμμα (Διάγραμμα 14.4.) παρουσιάζεται η μεταβολή της κυτταροτοξικότητας μετά από επίδραση με τη χημική ένωση MNU (30 μμ) και με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης SN-D (0,5μΜ και 1μΜ), παρουσία και απουσία του αναστολέα ARA-C. 171

172 Διάγραμμα 14.4.: Μεταβολή της κυτταροτοξικότητας σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τη χημική ένωση MNU (30 μg/ml) και με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης SN-D, παρουσία και απουσία του αναστολέα ARA-C (1 μg/ml). Παρατηρούμε ότι και στις δύο σειρές καλλιεργειών (απουσία και παρουσία ARA-C) οι χημικές ενώσεις MNU και SN-D προκαλούν αύξηση του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας. Στις καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν απουσία ARA-C, τα ποσοστά της κυτταροτοξικότητας της SN-D είναι ιδιαίτερα αυξημένα σε σχέση με αυτά που προέκυψαν από τη μέθοδο CBMN. Η αυξημένη κυτταροτοξικότητα πιθανότατα οφείλεται στο γεγονός ότι στη μέθοδο CBMN/ARA-C οι χημικές ενώσεις προστίθενται κατά την έναρξη της καλλιέργειας, όταν δηλαδή τα κύτταρα βρίσκονται στη φάση G0 και είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στη δράση τοξικών παραγόντων. Προκύπτει ακόμη ότι η παρουσία της ARA-C προκαλεί επιπλέον αύξηση του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας, η οποία είναι στατιστικά σημαντική στις καλλιέργειες που έγινε επίδραση με τις χημικές ενώσεις MNU και SN-D. Το γεγονός αυτό μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι αφενός η ARA-C εμφανίζει τοξική δράση και αφετέρου ενισχύει την κυτταροτοξική δράση των χημικών ενώσεων. 172

173 Στο ιστόγραμμα που ακολουθεί (Διάγραμμα 14.5.) παρουσιάζεται η μεταβολή της συχνότητας των μικροπυρήνων μετά από επίδραση με τη χημική ένωση MNU (30 μμ) και με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης SN-D (0,5μΜ και 1μΜ), παρουσία και απουσία του αναστολέα ARA-C. Διάγραμμα 14.5.: Μεταβολή της συχνότητας των μικροπυρήνων σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, μετά από επίδραση με τη χημική ένωση MNU (30 μg/ml) και με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις του χημικού παραγώγου της μελφαλάνης SN- D, παρουσία και απουσία του αναστολέα ARA-C (1 μg/ml). Είναι φανερό πως η επίδραση με την ARA-C τόσο στις καλλιέργειες του μάρτυρα όσο και σε αυτές που εκτέθηκαν στις χημικές ενώσεις MNU και SN-D, προκαλεί στατιστικά σημαντική αύξηση στη συχνότητα των μικροπυρήνων. Συμπεραίνουμε, επομένως ότι η SN- D προκαλεί βλάβες στο DNA οι οποίες επιδιορθώνονται με το μηχανισμό εκτομής τροποποιημένων βάσεων (excision repairable DNA lesions). Επιπλέον, επαληθεύεται η γνωστή δράση της MNU όσον αφορά στην πρόκληση τέτοιου είδους βλαβών. Το εύρημά μας αυτό είναι σε συμφωνία με την έρευνα των Kouloumenta et al. (2005) κατά την οποία στεροειδή ανάλογα των υπεριτών του αζώτου είναι ικανά να δημιουργούν ρήγματα στο DNA που επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής βάσεων, σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα in vitro. 173

174 15. Συμπεράσματα Τα συμπεράσματα που προκύπτουν από τη μελέτη της γενετικής δράσης των χημικών παραγώγων της μελφαλάνης SN-A, SN-B, SN-C και SN-D σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro, συνοψίζονται παρακάτω: Όλες οι εξεταζόμενες χημικές ενώσεις παρουσιάζουν αυξημένη κυτταροτοξική δράση, όπως υποδεικνύει η μείωση του δείκτη CBPI και η αύξηση του ποσοστού της κυτταροτοξικότητας. Όλες οι εξεταζόμενες χημικές ενώσεις προκαλούν αυξημένη χρωμοσωματική αστάθεια, όπως φαίνεται από την αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων, η οποία σχετίζεται θετικά με την αύξηση της συγκέντρωσης των χημικών ενώσεων. Η χημική ένωση SN-D επάγει τη δημιουργία ρηγμάτων στο DNA, όπως προκύπτει από τη μετακίνηση του DNA στην ουρά του κομήτη κατά την ηλεκτροφόρηση σε αλκαλικές συνθήκες, υποδεικνύοντας ότι η θραύση του DNA αποτελεί τουλάχιστον έναν από τους μηχανισμούς που προκαλούν την εμφάνιση μικροπυρήνων στα μεσοφασικά κύτταρα. Η χημική ένωση SN-D δημιουργεί βλάβες στο DNA, οι οποίες επιδιορθώνονται με το μηχανισμό της εκτομής βάσεων, BER (Base Excision Repair). 174

175 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

176 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Adair F. E., Bagg H. J. (1931). Experimental and clinical studies on the treatment of cancer by dichlororethylsulfide (mustard gas). Ann. Surg. 93: Anand P., Kunnumakara A. B., Sundaram C., Harikumar K. B., Tharakan S. T., Lai O. S., Sung B., Aggarwall B. B. (2008). Cancer is a Preventable Disease that Requires Major Lifestyle Changes. Pharmaceutical Research. 25 (9): Andriopoulos B., Hegedūsch S., Mangin J., Riedel H. D., Hebling U., Wang J., Pantopoulos K., Mueller S. (2007). Sustained Hydrogen Peroxide Induces Iron Uptake by Transferrin Receptor-1 Independent of the Iron Regulatory Protein/Ironresponsive Element Network. The Journal of Biological Chemistry. 282 (28): Azqueta A., Slyskova J., Langie A. S. S., O Neill Gaivão I., Collins A., (2014). Comet assay to measure DNA repair: approach and applications. Frontiers in Genetics. 5 (288): 1-8. Balakin K. V., Sauchuk N. P., Tetko I.V. (2006). In Silico Approaches to Prediction of Aqueous and DMSO solubility of drug-like compounds: trends, problems and solutions. Curr. Med. Chem. 13 (2): Beilke M. A., Collins-Lech C., Sohnle P. G. (1987). Effects of dimethyl sulfoxide on the oxidative function of human neutrophils. J. Lab. Clin. Med. 110 (1): Benameur L., Orsière T., Rose J., Botta A. (2011). Detection of environmental clastogens and aneugens in human fibroblasts by cytokinesis-blocked micronucleus assay associated with immunofluorescent staining of CENP-A in micronuclei. Chemosphere. 84: Berne Robert M. & Levy Matthew N. (2011). Αρχές Φυσιολογίας. Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 5η έκδοση. Boiteux S., Guillet M. (2004). Abasic sites in DNA: repair and biological consequences in Saccharomyces cerevisiae. DNA Repair. 3:

177 Boveri T. (1914). Zur Frage der Enstehung maligner tumoren. Gustav Fischer Verlag, Jena, Germany. Brendel M., Ruhland A. (1984). Relationships between functionality and genetic toxicology of selected DNA-damaging agents. Mutation Research. 133: Carter S.B. (1967). Effects on cytochalasins on mammals cells. Nature. 213: Caldecott K. W. (2008). Single-strand break repair and genetic disease. Nature Reviews Genetics. 9: Chakrabarti R., Schutt C. E. (2001). The enhancement of PCR amplification by low molecular-weight sulfones. Gene. 274: Cimini D., Fioravanti D., Salmon E.D., Degrassi F. (2002). Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115: Clancy S. (2008). DNA Damage & Repair: Mechanisms for Maintaining DNA Integrity. Nature Education. 1 (1): 103. Clementi F., Fumagalli G. (2015). General and Molecular Pharmacology: Principles of Drug Action. John Wiley & Sons, Inc, Hoboken, New Jersey, 1 st ed. Collins A. R. (2004). The Comet Assay for DNA Damage and Repair: Principles, Applications, and Limitations. Molecular Biotechnology. 26: Cooke M. S., Evans M. D., Dizdaroglu M., Lunec J. (2003). Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. Faseb J. 17: Cortés-Gutiérrez E. I., Dávila-Rodríguez M. I., Fernández J. L., Carmen López- Fernández C., Gosálbez A., Gosálvez J. (2011). New Application of the Comet Assay: Chromosome Comet Assay. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (7): Duda D. G., Duyverman A. M. M. J., Kohno M., Snuderl M., Steller E. J. A., Fukumura D., Jain R. K. (2010). Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. PNAS. 107 (50):

178 Efthimiou M.,Stephanou G., Demopoulos N. A., Nikolaropoulos S. S. (2011). Aneugenic potential of the anticancer drugs melphalan and chlorambucil. The involvement of apoptosis and chromosome segregation regulating proteins. J. Appl. Toxicol. 33 (7): Elmore S. (2007). Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol Pathol. 35 (4): Espinosa E., Zamore P., Feliu J., Baron M. G. (2003). Classification of anticancer drugs a new system based on therapeutic targets. Cancer Treat. Rev. 29 (6): Evans H.J., O Riordan M.L. (1975). Human peripheral blood lymphocytes for the analysis of chromosome abberations in mutagen tests. Mutation Research. 31: Fenech M., Morley A. (1985). Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutation Research. 147: Fenech M., Neville S. (1992). Conversion of excision-repairable DNA lesions to micronuclei within one cell cycle in human lymphocytes. Env. Mol. Mutagen. 19: Fenech M. (1997). The advantages and disadvantages of the cytokinesis-block micronucleus method. Mutation Research. 392: Fenech M., Holland N., Chang P. W. Zeiger E., Bonassi S. (1999a). The Human MicroNucleus Project-An international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DANN damage in humans. Mutation Research. 428: Fenech M. (2000). The in vitro micronucleus technique. Mutation Research. 455: Fenech M., Kirsch-Volders M. (2001). Inclusion of micronuclei in non-divided mononuclear lymphocytes and necrosis/apoptosis may provide a more comprehensive cytokinesis block assay for biomonitoring purposes. Mutagenesis. 16 (1):

179 Fenech M., Chang W.P., Kirsch-Volders M., Holland N., Bonassi S., Zeige E. (2003). HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesisblock micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research. 534: Fenech M. (2007). Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5). Fenech M., Kirsch-Volders M., Natarajan A. T., Surrallés J., Crott J. W., Parry J., Norppa H., Eastmond D. A., Tucker J. D., Thomas P. (2011). Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26 (1): Frei E. III, Holden S. A., Gonin R., Waxman D. J., Teicher B. A. (1993). Antitumor alkylating agents: in vitro cross-resistance and collateral sensitivity studies. Cancer Chemother. Pharmacol. 33 (2): Fu D., Calvo J. A., Samson L. D. (2012). Balancing repair and tolerance of DNA damage caused by alkylating agents. Nature Reviews Cancer. 12: Generoso W. M., Witt K. L., Cain K. T., Hughes L., Cacheiro N. L. A., Lockhart A. M. C., Shelby M. D. (1995). Dominant lethal and heritable translocation tests with chlorambucil and melphalan in male mice. Mutation Research. 345: Giam Μ. and Rancati G. (2015). Aneuploidy and chromosomal instability in cancer: a jackpot to chaos. Cell Division. 10 (3): Gmelig-Meyling F., Uytde-Haag A. G. C. M., Ballieux R. E. (1977). Human B-Cell Activation in Vitro. T Cell-Dependent Pokeweed Mitogen-Induced Differentiation of Blood B Lymphocytes. Cell. Immunol. 33: Goodman L. S., Wintrobe M. M., Dameshek W., Goodman M. J., Gilman A., Mc Lennan M. T. (1984). Landmark article Sept. 21, 1946: Nitrogen mustard therapy. Use of methyl-bis(beta-chloroethyl)amine hydrochloride and tris(betachloroethyl)amine hydrochloride for Hodgkin's disease, lymphosarcoma, leukemia and certain allied and miscellaneous disorders. JAMA. 251 (17): Gottesman M.M. (2002). Mechanisms of cancer drug resistance. Annu. Rev. Med. 53:

180 Gurtovenko A. A., Anwar J. (2007). Modulating the Structure and Properties of Cell Membranes: The Molecular Mechanism of Action of Dimethyl Sulfoxide. J. Phys. Chem. 111: Hall M. D., Telma K. A., Chang K. E., Lee T. D., Madigan J. P., Lloyd J. R., Goldlust I. S., Hoeschele J. D., Gottesman M. M. (2014). Say No to DMSO: Dimethylsulfoxide Inactivates Cisplatin, Carboplatin and Other Platinum Complexes. Cancer Res. 74 (14): Hanahan D., Weinberg A.R. (2000). The Hallmarks of cancer. Cell. 100: Hanahan D., Weinberg A.R. (2011). Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144: Haidle A. M., Myers A. G. (2004). An enantioselective, modular, and general route to the cytochalasins: Synthesis of L-696,474 and cytochalasin B. PNAS. 101 (33): Hellman B., Vaghef H., Bostrom B. (1995). The concepts of tail moment and tail inertia in the single electrophoresis assay. Mut. Res. 336: Hill D. L., Kirk M. C., Struck R. F. (1975). Microsomal metabolism of nitrosoureas. Cancer Res. 35: Holland J. F., Frei E. Kufe D. W., Pollock R. E., Weichselbaum R. R., Bast R. C. Jr., Gansler T. S. (2003). Cancer Medicine. 6th edition. Hovhannisyan G. G. (2010). Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Molecular Cytogenetics. 3 (17): Jena N. R. (2012). DNA damage by reactive species: Mechanisms, mutation and repair. J. Biosci. 37: Jenkins G. J. S., Doak S. H., Johnson G. E., Quick E., Waters E. M., Parry J. M. (2005). Do dose response thresholds exist for genotoxic alkylating agents? Mutagenesis. 20 (6): Jones R. B. (2002). Clinical pharmacology of melphalan and its implications for clinical resistance to anticancer agents. Cancer Treat. Res. 112 (15):

181 Kar A. (2003). Pharmacognosy and Pharmacobiotechnology. New Age International (P) Ltd., New Delhi. ISBN: Kasper D.L., Zaleznik D.F. (2001). «Gas gangrene, antibiotic associated colitis, and other Clostridial infections». Stone RM. Harrison's principles of internal medicine self-assessment and board review (15η έκδοση). New York: McGraw-Hill, Medical Pub. Division ISBN Kehrer J. P. (2000). The Haber Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology. 149: Kerr J. F. R., Wyllie A. H., Currie A. R. (1972). Apoptosis: A basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer. 26: Kim Y. J., Wilson D. M. III (2012). Overview of Base Excision Repair Biochemistry. Curr. Mol. Pharmacol. 5 (1): King R.W. (2008). When 2+2=5: The origins and fates of aneuploidy and tetraploid cells. Biochim. Biophys. Acta. 1786: Kirsch-Volders M., Cundari E., Verdoodt B. (1998). Towards a unifying model for the metaphase/anaphase transition. Mutagenesis. 13 (4): Kirsch-Volders M., Vanhauwaert A., De Boeck M., Decordier I. (2002). Importance of detecting numerical versus structural chromosome aberrations. Mutation Research. 504 (1-2): Kirsch-Volders M., Sofuni T., Aardemac M., Albertini S., Eastmond D., Fenech M., Ishidate M. Jr., Kirchner S., Lorge E., Morita T., Norppa H., Surrallés J., Vanhauwaert A., Wakata A. (2003). Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research. 540: Knudson A. G. (1971). Statistical Study of Retinoblastoma. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 68 (4): Kouloumenta A., Stephanou G., Demopoulos N. A., Nikolaropoulos S. S. (2005). Anti-Cancer Drugs. 16:

182 Kryston T. B., Georgiev A. B., Pissis P., Georgakilas A. G. (2011). Role of oxidative stress and DNA damage in human carcinogenesis. Mutation Research. 711: Kumaravel T. S., Jha A. N. (2006). Reliable Comet assay measurements for detecting DNA damage induced by ionising radiation and chemicals. Mut. Res. 605: Kumaravel T. S., Vilhar B., Faux S. P., Jha A. N. (2009). Comet Assay measurements: a perspective. Cell. Biol. Toxicol. 25 (1): Langie S. A. S., Koppen G., Desaulniers D., Al-Mulla F., Al-Temaimi R., Amedei A., Azqueta A., Bisson W. H., Brown D. G., Brunborg G., Charles A. K., Chen T., Colacci A. M., Darroudi F., Forte S., Gonzalez L., Hamid R. A., Knudsen L. E., Leyns L., Lopez de Cerain Salsamendi A., Memeo L., Mondello C., Mothersill C., Olsen A. K., Pavanello S., Raju J., Rojas E., Roy R., Ryan E. P., Ostrosky-Wegman P., Salem H. K., Scovassi A. I., Singh N., Vaccari M., Van Schooten F. J., Valverde M., Woodrick J., Zhang L., Van Larebeke N., Kirsch- Volders M., R.Collins A. R. (2015). Causes of genome instability: the effect of low dose chemical exposures in modern society. Carcinogenesis. 36 (1): Lee J., Lee E. Oh E., Lee J., Sul D. (2004). Use of the Tail Moment of the Lymphocytes to Evaluate DNA Damage in Human Biomonitoring Studies. Toxicol. Sci. 81: Lopatin D. E., Mangan D. F., Horner I. S., Peebles F. L. (1980). Mitogen-Induced Amplification of Blastogenesis in Lipopolysaccharide-Precultured Lymphocytes. Infection and Immunity. 29 (2): Luzhna L., Kathiria P., Kovalchuk O. (2013). Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Frontiers in Genetics. 4 (131): Mehta A., Haber J. E. (2014). Sources of DNA Double-Strand Breaks and Models of Recombinational DNA Repair. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6 (9):

183 Millar B. C., Bell J. B. G. (1987). Comparison of melphalan toxicity in human lymphocytic cells and Chinese hamster cells in vitro: the relationship between DNA- DNA cross-link formation and clonogenic survival. Carcinogenesis. 8 (9): Milligan J. R., Ng J. Y. Y., Wu C. C. L., Aguilera J. A., Fahey R. C., Ward J. F. (1995). DNA repair by thiols in air shows two radicals make a double-strand break. Radiat. Res. 143 (3): Mishra S., Mishra R. P. (2013). A comparison of the in vitro Genotoxicity of Anticancer Drugs Melphalan and Mitoxantrone. Am. J. Biomed. Sci. 5 (3): Morita T., Asano N., Awogi T., Sasaki Y. F., Sato S., Shimada H., Sutou S., Suzuki T., Wakata A., Sofuni T., Hayashi M. (1997). Evaluation of the rodent micronucleus assay in the screening of IARC carcinogens (Groups 1, 2A and 2B) The summary report of the 6th collaborative study by CSGMT/JEMS MMS. Mutation Research. 389: Mozaffarieh M., Konieczka K., Hauenstein D., Schoetzau A., Flammer J. (2010). Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes. Tob. Induc. Dis. 8 (14): 1-4. Nakamura J., A. Swenberg J. A. (1999). Endogenous Apurinic/Apyrimidinic Sites in Genomic DNA of Mammalian Tissues. Cancer Research. 59: Noll D. M., McGregor Mason T., Miller P. S. (2006). Formation and Repair of Interstrand Cross-Links in DNA. Chem. Rev. 106 (2): Nussbaum R.L., Mc Innes R.R., Willard H.F. (2011). Thompson & Thompson Ιατρική Γενετική. Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης, 7η έκδοση. Olive P. L., Banath J. P., Durand R. E. (1990). Heterogeneity in radiation induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the Comet assay. Radiat. Res. 122: Olive P. L., Wlodek D., Banath J.P. (1991). DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel-electrophoresis. Cancer Res. 51: Olive P. L., Banath J. P. (2006). The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nature Protocols. 1 (1):

184 Pampalona J., Soler D., Genesca A., Tusell L. (2010). Whole chromosome loss is promoted by telomere dysfunction in primary cells. Genes Chromosomes Cancer. 49 (4): Parry E.M., Parry J.M., Corso C., Doherty A., Haddad F., Hermine T.F., Johnson G., Kayani M., Quick E., Warr T., Williamson J. (2002). Detection and characterization of mechanisms of action of aneugenic chemicals. Mutagenesis. 17 (6): Payne S., Miles D. (2008). Scott-Brown's Otorhinolaryngology: Head and Neck Surgery. CRC Press Ed. Chapter 4: Parnell C., Woll P. J. (2003). Principles of cancer treatment by chemotherapy. Surgery. 21 (11): Pfeiffer P., Goedecke W., Obe G. (2000). Mechanisms of DNA double-strand break repair and their potential to induce chromosomal aberrations. Mutagenesis. 15 (4): Polo S. E., Jackson S. P. (2011). Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & Development. 25: Proskuryakov S.Y., Konoplyannikov A.G., Gabai V.L. (2003). Necrosis: a specific form of programmed cell death? Exp. Cell Res. 283 (1): Rautio J., Kumpulainen H., Heimbach T., Oliyai R., Oh D., Järvinen T., Savolainen J. (2008). Prodrugs: design and clinical applications. Nature Reviews. 7: Ricci M. S., Zong W. X. (2006). Chemotherapeutic approaches for targeting cell death pathways. The Oncologist. 11: Rojas E., Lopez M. C., Valverde M. (1999). Single cell gel electrophoresis assay: methodology and applications. Journal of Chromatography B. 722: Sancar A., Lindsey-Boltz L. A., Unsal-Kacmaz K., Linn S. (2004). Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Annu. Rev. Biochem. 73:

185 Sanderson B. J. S., Shield A. J. (1996). Mutagenic damage to mammalian cells by therapeutic alkylating agents. Mutation Research. 355: Sanmartín-Suárez C., Soto-Otero R., Sánchez-Sellero I., Méndez-Álvarez E. (2011). Antioxidant properties of dimethyl sulfoxide and its viability as a solvent in the evaluation of neuroprotective antioxidants. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 63: Sawai M., Takase K., Teraoka H., Tsukada K. (1990). Reversible Gl Arrest in the Cell Cycle of Human Lymphoid Cell Lines by Dimethyl Sulfoxide. Experimental Cell Research. 187: Sears D. A., Udden M. M. (2011). Howell Jolly bodies: a brief historical review. Am. J. Med. Sci. 343 (5): Sergey A. Shaposhnikov S. A., Salenko V. B., Brunborg G., Nygren J., Collins A. R. (2008). Single-cell gel electrophoresis (the comet assay): Loops or fragments? Electrophoresis. 29: Shelby M. D., Gulati D. K., Tice R. R., Wojciechowski J. P. (1989). Results of Tests for Micronuclei and Chromosomal Aberrations in Mouse Bone Marrow Cells With the Human Carcinogens 4-Aminobiphenyl, Treosulphan, and Melphalan. Environmental and Molecular Mutagenesis. 13: Sinha R. P., Häder D. P. (2002). UV-induced DNA damage and repair: a review. Photochem. Photobiol. Sci. 1: Sonnenschein C., Soto A. (2013). The aging of the 2000 and 2011 Hallmarks of Cancer reviews: A critique. J. Biosci. 38 (3): Spanswick V. J., Craddock C., Sekhar M., Mahendra P., Shankaranarayana P., Hughes R. G., Hochhauser D., Hartley J. A. (2002). Repair of DNAinterstrand crosslinks as a mechanism of clinical resistance to melphalan in multiple myeloma. Blood. 100 (1): Spicka I. (2014). Advances in multiple myeloma therapy during two past decades. Comput. Struct. Biotechnol. J. 10 (16):

186 Stout S. A., Riley C. M. (1985). The hydrolysis of L-phenylalanine mustard (melphalan). International Journal of Pharmaceutics. 24: Stout S. A., Riley C. M. (1987). Hydrolysis of l-phenylalanine mustard (melphalan). II. Further observations on the effects of ph, chloride ions and buffers on the rate of reaction. 37 (3): Sunjog K., Kolarević S., Héberger K., Gačić Z., Knežević-Vukčević J., Vuković- Gačić B., Lenhardt M. (2013). Comparison of comet assay parameters for estimation of genotoxicity by sum of ranking differences. Anal. Bioanal. Chem. 405: Surrallés J., Xamena N., Creus A., Catalàn J. Norppa H., Marcos R. (1995). Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research. 341: Surrallés J., Xamena N., Creus A., Marcos R. (1995). The suitability of the micronucleus assay in human lymphocytes as a new biomarker of excision repair. Mutation Research. 342: Suzuki T., Komada H., Takai R., Arii K., Kozima T. T. (1995). Relation between Toxicity of Cryoprotectant DMSO and Its Concentration in Several Fish Embryos. Fisheries Science. 61 (2): Tsuda S., Matsusaka N., Madarame H., Miyamae Y., Ishida K., Satoh M., Sekihashi K., Sasaki Y. F. (2000). The alkaline single cell electrophoresis assay with eight mouse organs: results with 22 mono-functional alkylating agents (including 9 dialkyl N-nitrosoamines) and 10 DNA crosslinkers. Mutation Research. 467: Vander A., Sherman J., Luciano D., Τσακόπουλος Μ. (2011). Φυσιολογία του ανθρώπου Μηχανισμοί της λειτουργίας του οργανισμού. Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης, 8η έκδοση. Vardevanyan P. O., Antonyan A. P., Parsadanyan M. A., Davtyan H. G., Karapetyan A. T. (2003). The binding of ethidium bromide with DNA: interaction with single- and double-stranded structures. Experimental and Molecular Medicine. 35 (6): Μαρμάρας Βασίλης, Μαρμάρα-Λαμπροπούλου Μαρία. (2005). Βιολογία Κυττάρου - Μοριακή προσέγγιση. Εκδόσεις Typorama, 5η έκδοση. 186

187 ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΕΣ ΔΙΕΥΘΥΝΣΕΙΣ

188

189 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΕΙΚΟΝΩΝ

190

191 Εικόνα 1.: α,β: Μονοπύρηνα κύτταρα, γ,δ: Διπύρηνα κύτταρα, ε: Τριπύρηνο κύτταρο, στ: Τετραπύρηνο κύτταρο. 191

192

193 Εικόνα 2.: α,β: Διπύρηνα κύτταρα με μικροπυρήνα, γ: Διπύρηνο κύτταρο με δύο μικροπυρήνες, δ: Διπύρηνο κύτταρο με πυρηνοπλασματική γέφυρα, ε: Αποπτωτικό κύτταρο, στ: Νεκρωτικό κύτταρο. 193

194

195 Εικόνα 3.: α, β, γ: Κύτταρα σε διάφορα στάδια της μετάφασης, δ: Κύτταρο στο στάδιο της ανάφασης. 195

196

197 Εικόνα 4.: α,β: Κομήτες κυττάρων μάρτυρα, γ στ: Κομήτες κυττάρων μετά από έκθεση στη χημική ένωση SN-D (5 μg/ml). 197