Mehanizam djelovanja kolinesteraza

Transcript

1 KOLINESTERAZE

2

3 Mehanizam djelovanja kolinesteraza

4 Inhibitor kolinesteraze veže se za serinsku hidroksilnu grupu

5 Prijelazno stanje u kojem se raspadaju stare, a formiraju nove veze

6 Inhibitor kolinesteraze sprječava vezanje acetil-kolina

7 Sudbina inhibirane kolinesteraze- starenje, hidroliza ili...

8 Starenje kolinesteraze

9 Mehanizam djelovanja PAM-a (antidota)

10 Mehanizam djelovanja PAM-a

11 Regenerirana kolinesteraza

12 PRIMARNI I SEKUNDARNI MEHANIZMI TOKSIČNOG DJELOVANJA OFS O S δ+ R 1 O P L R 1 O P L R 2 R 2 LD 50 = mg/kg LD 50 = 30 g/kg NEKI ORGANO-FOSFORNI SPOJEVI: - SARIN - PARATION - SOMAN - MALATION - TABUN - DDVP

13 ANTIKOLINESTERAZNO DJELOVANJE KARBAMATI OFS reverzibilna inhibicija ireverzibilna inhibicija

14 LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA OTROVANJA ORGANOFOSFORNIM SPOJEVIMA (I KARBAMATIMA)

15 1. MJERENJE AKTIVNOSTI ACIL- KOLINESTERAZA 2. MJERENJE KONCENTRACIJE METABOLITA

16 SPECIFIČNA AChE ACETILKOLINESTERAZA = SUPSTRAT ACETILKOLIN (ACh) (živčani sustav, pluća, slezena eritrociti)

17 NESPECIFIČNA AChE SUKCINILKOLINESTERAZA, BUTIRILKOLINESTERAZA (BCh) SUPSTRAT: ACETILKOLIN + SUKCINILKOLIN + BUTIRILKOLIN (serum, a nastaje u jetri)

18 ACETIL KOLIN AChE OCTENA KISELINA CH 3 COOCH 2 CH 2 N(CH 3 ) 3 CH 3 COOH + KOLIN (CH 3 ) 3 -N-CH 2 -CH 2 OH

19 U TESTU PRATIMO NASTANAK JEDNOG OD PRODUKATA REAKCIJE: a) pomoću prisutnog indikatora ( pad ph radi produkta octene kiseline) b) prateći tvorbuobojenog kompleksa s produktima reakcije: octenom kiselinom ili kolinom

20 KVALITATIVNI TEST REAGENSI supstrat acetiltiokolin ATCh fosfatni pufer, 0,1 M, ph 7,4 kromogen DTBNB PRIBOR 6 epruveta pipete od 3 ml, 0.02 ml, 0,1 ml kapaljke

21 IZ HEPARINIZIRANE VENSKE KRVI SE CENTRIFUGIRANJEM RAZDVOJE PLAZMA I ERITROCITI. ERITROCITI SE ZATIM SUSPENDIRAJU U VODI, RAZRIJEDE S PUFEROM I SMRZNU RADI HEMOLIZE

22 POSTUPAK ZA PLAZMU (aktivnost butiril kolinesteraze) EPRUVETA 1 EPRUVETA 2 EPRUVETA 3 kontrola proba 1 proba ML KROMOGENA ,02 ml PLAZME + 0,02 ml PLAZME+ 0,02 ml PLAZME zdrave živ.(z) zdrave živ. (Z) bolesne živ. (O) ,1 ml pufera + 0,1 ml supstrata ATCh

23 1. 2. KROMOGEN PLAZMA ZDRAVE ŽIVOTINJE + pufer KROMOGEN + + PLAZMA ZDRAVE ŽIVOTINJE + supstrat ATCh 3. KROMOGEN + PLAZMA BOLESNE ŽIVOTINJE + supstrat ATCh

24 ZAČEPITI, PROTRESTI I PRATITI PROMJENU BOJE U EPRUVETAMA 2 i 3 USPOREDITI S EPRUVETOM 1 REZULTAT: ZDRAVA ŽIVOTINJA - JAČE OBOJENJE BOLESNA ŽIVOTINJA - SLABIJE OBOJENJE - snižena aktivnost enzima, reakcija usporena, smanjena konc. produkata, slabije obojenje

25 POSTUPAK ZA ERITROCITE ( aktivnost acetilkolinesteraze) EPRUVETA 1 EPRUVETA 2 EPRUVETA 3 kontrola proba 1 proba ML KROMOGENA 2.+ 0,02 ml E + 0,02 ml E + 0,02 ml E zdrave živ.(z) zdrave živ. (Z) bolesne živ. (O) ,1 ml pufera + 0,1 ml supstrata ATCh

26 1. 2. KROMOGEN ERITROCITI ZDRAVE ŽIVOTINJE + pufer KROMOGEN + + ERITROCITI ZDRAVE ŽIVOTINJE + supstrat ATCh 3. KROMOGEN + ERITROCITI BOLESNE ŽIVOTINJE + supstrat ATCh

27 ZAČEPITI, PROTRESTI I PRATITI PROMJENU BOJE U EPRUVETAMA 2 i 3 USPOREDITI S EPRUVETOM 1 REZULTAT ZDRAVA ŽIVOTINJA - JAČE OBOJENJE BOLESNA ŽIVOTINJA - SLABIJE OBOJENJE snižena aktivnost enzima, reakcija usporena, nema reakcije kromogena s produktima razgradnje Ach

28 PARAQUAT

29 MEHANIZAM TOKSIČNOG DJELOVANJA + + FOTOSINTEZA (okoliš) CH 3 ---N N---CH 3 bezbojni NADPH (organizam) * * O CH 3 ---N N---CH 2 3 plavi + + CH 3 N N CH 3 + H 2 O 2 ili: +O 2 PQ E PQ ** PQ ++ + O 2 * O 2 * + H 2 O > OH* + OH + O 2

30 Hidroksilni radikali započinju tvorbu i umnažanje masnih peroksida. Masna peroksidacija izaziva inaktivaciju membranskih enzima i receptora, depolimerizaciju polisaharida, kao i međupovezivanje i cijepanje proteina. Kako su membranski lipidi ključni za održavanje i integritet stanične funkcije, razgradnja membranskih fosfolipida i masna peroksidacija, uzrokovana nastankom slobodnih radikala mijenja strukturu stanične membrane, njenu protočnost, transport i antigena svojstva, te izaziva patogenezu organskih poremećaja.

31 4 mg/kg - smetnje u disanju -disfunkcijabubrega -žutica > 30 mg/kg - edem pluća -krvarenja u plućima - nekroza bubrežnih tubula - nekroza adrenalnih žlijezda -nekroza miokarda - centrolobularna nekroza -nekroza epitela žučovoda - nekroza kože do masnog sloja NEKROZA PLUĆA

32 TEST ZA PARAQUAT u vodi i urinu

33 KEMIKALIJE PRIBOR NaHCO 3 indikator papir : ph > 8 Na - ditionit (Na 2 S 2 O 4 ) kemijska epruveta NaOH, 10% POSTUPAK Provjera ph direktno u epruveti br. 2 s uzorkom; ako je ph ispod 8 dodati par kapi NaOH, začepiti epruvetu, promućkati U prvu kemijsku epruvetu s reducensom uliti vodu (KONTROLA), u drugu uzorak 2. REZULTAT: plavo obojenje = redukcija iona u radikal (> 0,001 mg paraquata)

34 FOSFOR I FOSFIDI UPOTREBA: fosfor - rodenticid, raticid (1-3%) - mamci fosforesciraju Zn 3 P 2 - rodenticid, raticid AlP + Ca 3 P 2 - rodenticid, raticid (Fostoksin), fumigant AlP + NH 4 -karbamat - dezinficijens

35 MEHANIZAM TOKSIČNOG DJELOVANJA Zn P Zn P Zn Zn 3 P H 2 O 2 PH Zn OH - FOSFIN (fosforovodik) FOSFIN = protoplazmatski otrov - INHIBICIJA OKSIDATIVNIH PROCESA - MASNA DEGENERACIJA TKIVA

36 TEST ZA FOSFOR I FOSFIDE u želučanom sadržaju, krvi i homogenatu jetre KEMIKALIJE PRIBOR Pb - acetat - staklena vuna za uklanjanje sulfida H 2 SO 4, 20% - tikvice AgNO 3, 10% - indikator - papir - traka filter-papira obrađena s AgNO3

37 POSTUPAK UKLONITI SULFIDE, ako je potrebno, propuštanjem uzorka preko staklene vune natopljene Pb - acetatom KONTROLA UZORAK 20 ml vode 20 ml tekućeg uzorka 1 kapaljka H 2 SO 4 UČVRSTITI TRAKU NA GRLU TIKVICE DOBRO ZATVORITI GRIJATI 1 h NA 50 o C ili suspenzije 2 : 1 REZULTAT: pozitivni fosfidi ili fosfor - žuta do crna mrlja na filter - papiru (> 5 μg/ uzorku)

38 KONTROLA 20 ml vode 1 kapaljka H2SO4 UZORAK 20 ml tekućeg uzorka UČVRSTITI TRAKU NA GRLU TIKVICE DOBRO ZATVORITI POZITIVNI FOSFIDI ILI FOSFOR +