ΑΙΤΗΣΗ ΓΙΑ ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΗ ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟΥ ΕΡΓΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΒΑΣΙΚΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ «Κ. ΚΑΡΑΘΕΟΔΩΡΗ»

Transcript

1 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΡΕΥΝΩΝ Προς την ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΡΕΥΝΩΝ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΑΙΤΗΣΗ ΓΙΑ ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΗ ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟΥ ΕΡΓΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΒΑΣΙΚΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ «Κ. ΚΑΡΑΘΕΟΔΩΡΗ» Τμήμα: ΙΑΤΡΙΚΗΣ (Πανεπιστημιακή Παθολογική Κλινική). Ονοματεπώνυμο Υπεύθ. Έργου: Έλενα Σολωμού-Λιόση. Ιδιότητα: Λέκτορας. Ονοματεπώνυμο και ιδιότητα συνεργατών : Βασίλης Φερτάκης (Μεταπτυχιακός Φοιτητής) Τίτλος του έργου: Παθογενετικός ρόλος των νεότερων υποπληθυσμών των Τ- λεμφοκυττάρων σε ασθενείς με μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο και απλαστική αναιμία: Μελέτη του φαινοτύπου καθώς και των μοριακών μηχανισμών που ελέγχουν την έκφραση και τη λειτουργία των Th17, TFH και των ρυθμιστικών Τ- λεμφοκυττάρων. Νέο Έργο Προτεινόμενη Ημερομηνία Έναρξης: Μάιος 2010 Συνολική Δαπάνη του Έργου: Ενίσχυση από άλλες πηγές: Οχι Αιτούμενη Συνολική Χρηματοδότηση Ημερομηνία: 14 Απριλίου 2010 Ο Επιστημονικός Υπεύθυνος Έλενα Σολωμού- Λιόση 1

2 Π Ρ Ο T Ε Ι Ν Ο Μ Ε Ν Ο Ε Ρ Γ Ο Α. ΤΙΤΛΟΣ: «Παθογενετικός ρόλος των νεότερων υποπληθυσμών των Τ- λεμφοκυττάρων σε ασθενείς με μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο και απλαστική αναιμία: Μελέτη του φαινοτύπου καθώς και των μοριακών μηχανισμών που ελέγχουν την έκφραση και τη λειτουργία των Th17, TFH και των ρυθμιστικών Τ- λεμφοκυττάρων». Β. ΣΤΟΧΟΣ: Στόχος του προτεινόμενου έργου είναι η μελέτη της έκφρασης και των μηχανισμών εκείνων μέσω των οποίων οι νεότεροι υποπληθυσμοί των Τ- λεμφοκυττάρων συμμετέχουν στην παθογένεια των μυελοδυσπλαστικών συνδρόμων και της απλαστικής αναιμίας. Επικεντρώνουμε στην ανάλυση της λειτουργίας και του φαινότυπου των Th17, TFH και των ρυθμιστικών Τ- λεμφοκυττάρων (Tregs). Γ. ΠΕΡΙΛΗΨΗ: Η απλαστική αναιμία και τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα αποτελούν τους κυριότερους εκπροσώπους των συνδρόμων απλασίας του μυελού. Στους ασθενείς που πάσχουν από απλασία του μυελού χορηγούνται ανοσοκατασταλτικά φάρμακα και η ανταπόκριση πολλών εξ αυτών στην ανοσοκαταστολή υπογραμμίζει το ρόλο αυτοάνοσων παραγόντων στην παθογένεια των νοσημάτων αυτών. Σε πολύ πρόσφατες μελέτες φαίνεται ότι τα Τ- λεμφοκύτταρα παίζουν πρωταρχικό ρόλο στη παθογένεια των νοσημάτων αυτών. Η υπέρμετρη παραγωγή IFN-γ από τα Τ λεμφοκύτταρα των ασθενών, έχει σαν αποτέλεσμα την καταστροφή των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στο μυελό. Επιπλέον, τα εναπομείναντα CD34+ κύτταρα χαρακτηρίζονται από αυξημένη απόπτωση. Σήμερα πιστεύουμε ότι τα Τh1 κύτταρα συμβάλλουν καθοριστικά στην υπερπαραγωγή της IFN-γ αλλά ο ρόλος των νεότερων υποπληθυσμών των Τ- λεμφοκυττάρων δεν είναι καλά κατανοητός. Επίκεντρο των προτεινόμενων πειραμάτων είναι το T-λεμφοκύτταρο. Συγκεκριμένα προτείνουμε τη μελέτη της έκφρασης των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών (Th17, Tregs, και ΤFH) σε ασθενείς με μυελοδυσπλαστικό σύνδρομo και απλαστική αναιμία στο περιφερικό αίμα και στο μυελό, αναλύοντας την έκφραση των επιφανειακών υποδοχέων και των ενδοκυττάριων μεταγραφικών παραγόντων που χαρακτηρίζουν κάθε υποπληθυσμό. Θα αναλύσουμε την έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων που φέρει κάθε πληθυσμός καθώς και τα ενδοκυττάρια μονοπάτια που οδηγούν στην ενεργοποίησή τους. Τέλος θα αναλύσουμε τις κυττοκίνες που εκφράζει χαρακτηριστικά κάθε υποπληθυσμός και μέσω φαρμακολογικών αναστολέων θα προσπαθήσουμε να επηρεάσουμε/επιδράσουμε στην έκφραση τους σε ελεγχόμενες in vitro πειραματικές συνθήκες. Λέξεις-κλειδιά: Τ-λεμφοκύτταρο (ρυθμιστικά Τ-, Th17, TFH), απλασία μυελού, ανθρώπινη αυτοανοσία, μετάδοση ενδοκυττάριου μηνύματος, μεταγραφικοί παράγοντες, αναστολείς κινασών. Key words: T-cells (regulatory T cells, Th17, TFH), bone marrow failure, autoimmunity, signal transduction, transcription factors, kinase inhibitors. 2

3 Δ. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ 1. Σημερινή γνώση στο θέμα Τα Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα (ΜΔΣ) αποτελούν μια ετερογενή ομάδα κλωνικών νοσημάτων αγνώστου αιτιολογίας, με αυξημένο ποσοστό (περίπου 30%) εξέλιξης προς Οξεία Μυελογενή Λευχαιμία (ΟΜΛ), ενώ συγχρόνως αποτελούν τη συχνότερη αιματολογική κακοήθεια που αφορά κυρίως τους ηλικιωμένους, με μέση ηλικία εμφάνισης τα έτη 1. Η ακριβής συχνότητα της νόσου δεν είναι απόλυτα γνωστή. Στις ΗΠΑ υπολογίζεται ότι διαγιγνώσκονται 15,000-20,000 νέες περιπτώσεις το χρόνο, ενώ με την αύξηση του μέσου όρου ηλικίας επιβίωσης φαίνεται ότι ο αριθμός αυτός θα αυξηθεί στα επόμενα χρόνια. Η εμφάνιση και εξέλιξη στο ΜΔΣ αποτελεί μια πολυπαραγοντική διαδικασία κατά την οποία μια αλληλουχία μεταλλάξεων σε ένα αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο οδηγεί στην δημιουργία του παθολογικού κλώνου 2. Ο κλώνος αυτός αποκτά πλεονέκτημα επιβίωσης σε σχέση με τα φυσιολογικά αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, και συνοδεύεται από δυσπλασία, υπέρμετρη έκκριση ανασταλτικών κυτταροκινών, διαταραγμένη διαφοροποίηση και μη αποτελεσματική αιμοποίηση, καθώς και γονιδιακή αστάθεια. Έχουν περιγραφεί διάφορες διαταραχές σε μόρια που σχετίζονται με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, καθώς και με υποδοχείς αυξητικών παραγόντων που πιθανά να σχετίζονται με την εμφάνιση του ΜΔΣ. Συγκεκριμένοι μεταγραφικοί παράγοντες που δίνουν πλεονέκτημα επιβίωσης στα παθολογικά κύτταρα έναντι των φυσιολογικών φαίνεται επίσης να επηρεάζονται. Η υπέρμετρη έκκριση ανασταλτικών κυτταροκινών (IFN-γ, TNF-α) έχει σαν αποτέλεσμα την αυξημένη απόπτωση των προγονικών κυττάρων, διαταραχές στο στρώμα και σε μονοπάτια μετάδοσης ενδοκυττάριου μηνύματος, καθώς και επιγενετικές διαταραχές όπως μεθυλίωση, ενεργοποίηση του Ras μέσω μεταλλάξεων και καταστολή του πρωτο-ογκογονιδίου p15. Φαίνεται ότι σε αρκετές περιπτώσεις ΜΔΣ υπάρχει μια ισχυρή συσχέτιση με διαταραχές όπου κεντρικό ρόλο έχουν τα Τ-λεμφοκύτταρα 3. Ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα, προάγουν την απόπτωση σε μια προσπάθεια τους να καταστρέψουν τον παθολογικό κλώνο, με υπέρμετρη έκκριση IFN-γ, TNF-α, και αλληλεπίδραση του ζεύγους Fas/FasL με αποτέλεσμα τη καταστροφή των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Υπάρχει επίσης ολογοκλωνική έκπτυξη Τ-λεμοκυττάρων στα ΜΔΣ σύμφωνα με διάφορες μελέτες. Αυτοί οι κλώνοι Τ-λεμφοκυττάρων καταστέλλουν την αιμοποίηση όταν καλλιεργηθούν in vitro με κύτταρα μυελού από ασθενείς με ΜΔΣ. Η εξέλιξη της νόσου σχετίζεται με μειωμένη ανοσολογική απόκριση και απώλεια ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Πολύ πρόσφατα έχει δειχθεί ότι οι ασθενείς με ΜΔΣ έχουν επίσης χαμηλό λόγο CD4:CD8 κυττάρων, και ότι αυτό οφείλεται στη μείωση των CD4 4. H ανοσοκατασταλτική θεραπεία με κυκλοσπορίνη ή με αντιθυμοκυτταρικό ορό βοηθά σε ορισμένες περιπτώσεις. Η Απλαστική Αναιμία (ΑΑ) θεωρείται ότι στις περισσότερες περιπτώσεις αποτελεί αυτοάνοσο νόσημα στο οποίο τα αυτοαντιδραστικά Τ-λεμφοκύτταρα σε συνδυασμό με γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες καταστρέφουν τα CD34+ κύτταρα στο μυελό. Η απάντηση πολλών ασθενών στην ανοσοκατασταλτική θεραπεία δείχνει τον αυτοάνοσο χαρακτήρα του νοσήματος 5. Η αυξημένη έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα T-bet 6 στην πλειονότητα των ασθενών με απλαστική αναιμία έχει σαν αποτέλεσμα την υπέρμετρη παραγωγή IFN-γ, που είναι υπεύθυνη για την καταστροφή των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Τα εναπομείναντα 3

4 CD34+ κύτταρα χαρακτηρίζονται από αυξημένη απόπτωση και συγχρόνως υπερέκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση και τον κυτταρικό θάνατο. Ο σημαντικός ρόλος της IFN-γ στη καταστροφή των CD34+ κυττάρων φαίνεται και σε πειράματα in vitro: φυσιολογικά CD34+ κύτταρα με εξωγενή επίδραση IFN-γ, αποκτούν χαρακτηριστικά CD34+ κυττάρων από ασθενείς με απλαστική αναιμία με υπερέκφραση γονιδίων που οδηγούν σε κυτταρικό θάνατο και σε απόπτωση. Τα λευκά αιμοσφαίρια στο 30% περίπου των ασθενών με απλαστική αναιμία χαρακτηρίζονται από μειωμένο μήκος τελομερών 7. Επίσης ένα μικρό ποσοστό των ασθενών με αιμοφαγοκυττάρωση στο μυελό, χαρακτηρίζονται από μεταλλάξεις στην περφορίνη 8. Τα Τ-ρυθμιστικά κύτταρα, τα οποία φυσιολογικά ελέγχουν την αυτοανοσία καταστέλλοντας τα αυτοαντιδραστικά Τ κύτταρα, είναι μειωμένα στην απλαστική αναιμία 9. Με τις πιο πάνω παρατηρήσεις φαίνεται ο καθοριστικός ρόλος των Τ-λεμφοκυττάρων στην παθογένεια της απλαστικής αναιμίας. Ενας νεότερος διακριτός Τ λεμφοκυτταρικός υποπληθυσμός που έχει περιγραφεί είναι τα Th17 κύτταρα 10. Πρόκειται για κύτταρα με εκτελεστικό ρόλο που συμβάλλουν στην πρόκληση ιστικής βλάβης και τα οποία ενέχονται παθογενετικά σε ορισμένα αυτοάνοσα νοσήματα 11. Νεότερο υποπληθυσμό αποτελούν και τα Th1/Th17 κύτταρα τα οποία εκτός από IL-17, παράγουν και IFN-γ. Καμμιά επιβεβαιωμένη πληροφορία δεν υπάρχει σε ότι αφορά στα Th17 όσο και τα Th1/Th17 κύτταρα τόσο στην ΑΑ όσο και στο ΜΔΣ. Μέχρι σήμερα γνωρίζαμε ότι τα Th1 κύτταρα συμμετέχουν στην καταστροφή των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στην απλαστική αναιμία και στο ΜΔΣ. Είναι όμως πιθανό εκτός από τα Th1 κύτταρα, και τα Th17 να συμμετέχουν, πιθανά διαιωνίζοντας τη βλάβη που αρχίζουν τα Th1 κύτταρα. Κάθε Τ-κυτταρικός πληθυσμός χαρακτηρίζεται από ένα μεταγραφικό παράγοντα που προσδίδει και συγκεκριμένες ιδιότητες όπου ανήκει. Ο μεταγραφικός παράγοντας T-bet αποτελεί χαρακτηριστικό (hallmark) μεταγραφικό παράγοντα των Th1 κυττάρων 12 και ανήκει στην οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων T-box. Οι παράγοντες της οικογένειας αυτής φέρουν το τμήμα T-box, το οποίο είναι καλά διατηρημένο (highly conserved), και με αυτό το τμήμα προσδένονται στον υποκινητή (promoter) διαφόρων γονιδίων-στόχων. Ο Τ- bet βρίσκεται στα Th1 αλλά όχι στα Th2 κύτταρα, και αποτελεί κύριο ρυθμιστή της δημιουργίας και της λειτουργίας των Th1 κυττάρων. Είναι ικανός να επάγει τη δημιουργία των Th1 καταστέλλοντας τα Th2 κύτταρα. Η έκφραση του T-bet επάγεται μετά από διέγερση των Τ-λεμφοκυττάρων 6. Ο RORγt αποτελεί χαρακτηριστικό μεταγραφικό παράγοντα των Th17 κυττάρων 13, ανήκει στην οικογένεια των retinoic-acid-receptor-related orphan nuclear hormone receptors και βρίσκεται αποκλειστικά στα ανοσοκύτταρα, ενώ η έκφραση του επάγεται από τον TGF-β και την IL Μεθοδολογία του προγράμματος Α. Ασθενείς: Αρχικά προτείνουμε την ανάλυση 60 ασθενών με ΜΔΣ, και 20 ασθενών με ΑΑ, που βρίσκονται εκτός ανοσοκατασταλτικής ή ανοσοτροποποιητικής θεραπείας. Οι ασθενείς θα κατηγοριοποιηθούν σύμφωνα με την κατάταξη του WHO σε ανθεκτική αναιμία (refractory anemia,ra), ανθεκτική αναιμία με δυσπλασία σε περισσότερες από μια σειρές (refractory anemia with multilineage dysplasia, RCMD), ανθεκτική αναιμία με περίσσεια βλαστών (refractory anemia with 4

5 excess of blasts, RAEB I and II), και σε σύνδρομο με έλλειψη 5q (5q- syndrome). Οι ασθενείς με απλαστική αναιμία βάσει κριτηρίων θα κατηγοριοποιηθούν σε βαριά, πολύ βαριά και ήπια (severe, very severe, and moderate, αντίστοιχα) απλαστική αναιμία. Παράλληλα θα περιλάβουμε στη μελέτη μας και μια ομάδα από 8-10 ασθενείς που δεν πάσχουν από ΜΔΣ ή ΑΑ, αλλά μεταγγίζονται ώστε να αποκλείσουμε ότι τα αποτελέσματα μας επηρεάζονται από τις μεταγγίσεις (ασθενείς-μάρτυρες), καθώς και 30 περίπου εθελοντές (υγιείς-μάρτυρες). Β. Χρονικά σημεία: Προτείνουμε την ανάλυση των ασθενών αυτών στα χρονικά σημεία: χρόνος 0 (ημέρα κατά την οποία οι ασθενείς εντάσσονται στη μελέτη), 3 μήνες, 6 μήνες και 12 μήνες, μετά την ημερομηνία ένταξής τους. Επίσης ενδιάμεσα αν κάποιος/οι ασθενείς παρουσιάσουν εξέλιξη της νόσου εκτός των προκαθορισμένων χρονικών σημείων, θα γίνεται και πάλι ανάλυση στο σημείο εκείνο. Θα προτιμηθούν ασθενείς στους οποίους έχει τεθεί πρόσφατα η διάγνωση και δεν έχουν λάβει κάποια αγωγή. Για ασθενείς στους οποίους η διάγνωση έχει τεθεί από καιρό και λαμβάνουν μεταγγίσεις, η ανάλυση τους θα γίνει πριν από την έναρξη της μετάγγισης για να αποκλείσουμε το ενδεχόμενο αλλοίωσης των αποτελεσμάτων μας από τις μεταγγίσεις. Απαραίτητη προϋπόθεση για ένταξη των ασθενών στη μελέτη αποτελεί η έγγραφη συγκατάθεση για τη συμμετοχή τους. Ασθενείς που βρίσκονται υπό ανοσοκατασταλτική ή ανοσοτροποποιητική αγωγή θα αποκλείονται από τη μελέτη. Στα παραπάνω χρονικά σημεία θα γίνεται αιμοληψία 30 ml φλεβικού αίματος. Πέντε ml από αυτά θα χρησιμοποιούνται για συλλογή ορού και τα υπόλοιπα 25 ml θα χρησιμοποιούνται για την απομόνωση Μονοπύρηνων Κυττάρων του Περιφερικού Αίματος (ΜΚΠΑ) με κλασική μεθοδολογία (επίστρωση σε Ficoll-Hypaque). Από το δείγμα αυτό αναμένουμε να συλλέξουμε τουλάχιστον Χ 10 6 ΜΚΠΑ και τα οποία θα φυλάσσονται κατάλληλα μοιρασμένα σε υγρό άζωτο. Παράλληλα, από τους ασθενείς θα γίνει απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων από το μυελό (όπου αυτό είναι εφικτό). Γ. Μελέτη των Th17 λεμφοκυττάρων σε ασθενείς με ΜΔΣ, ΑΑ και υγιείς μάρτυρες: Για να μελετήσουμε το ρόλο των Th17 και των Th1/Th17 κυττάρων προτείνουμε σε κάθε περίπτωση τον προσδιορισμό των ποσοστών (και των απόλυτων αριθμών) των περιφερικών Τh17 και των Th1/Th17 κυττάρων στους ασθενείς και μάρτυρες του προγράμματος. Μέρος του δείγματος των κατεψυγμένων ΜΚΠΑ θα αποψύχονται και ένας αριθμός θα χρησιμοποιείται για καλλιέργειες βραχείας διάρκειας με φυτοαιμοσυγκολητίνη (PHA) και IL-2, για 6 μέρες. Στη συνέχεια ένας μικρός αριθμός από τα κύτταρα της καλλιέργειας θα επωάζεται σε κατάλληλες συνθήκες με αντισώματα συνδεδεμένα με φθοριοχρώματα για τους επιφανειακούς δείκτες CD4 και IL23R και ενδοκυτταρίως για IL-17 και IFN-γ. Στη συνέχεια θα αναλύεται με κυτταρομετρία ροής για προσδιορισμό των Th17, τα οποία είναι CD4 + IL23R + IL17 + κύτταρα και τα Th1/Th17 που θα προσδιοριστούν ως CD4+CD23R+IL17+IFNγ+. Τα υπόλοιπα κύτταρα από τις καλλιέργειες θα καταψύχονται και θα φυλάσσονται σε υγρά άζωτο μέχρι να χρησιμοποιηθούν ή θα χρησιμοποιούνται αμέσως για τα πειράματα που περιγράφονται πιο κάτω. Επίσης τα υπερκείμενα από τις καλλιέργειες θα φυλάσσονται στους C για άλλα πειράματα. Ο προσδιορισμός των υποπληθυσμών αυτών θα γίνεται σε όλα τα χρονικά σημεία που αναφέρθηκαν πιο πάνω. Από όποιους ασθενείς είναι δυνατόν θα γίνει ανάλυση των Th17 και Th1/Th17 και στο μυελό εκτός από το περιφερικό αίμα. Επίσης από όσο το δυνατό μεγαλύτερο αριθμό ασθενών και μαρτύρων, θα γίνουν χρώσεις σε 5

6 παρασκευάσματα από την οστεομυελική βιοψία με ανοσοϊστοχημεία για CD4 και IL- 17. Από προκαταρκτικά αποτελέσματα με κυτταρομετρία ροής σε δείγματα περιφερικού αίματος έχουμε παρατηρήσει ότι οι ασθενείς με ΜΔΣ έχουν πολύ μεγαλύτερο και σαφώς διακριτό πληθυσμό Th17 και Th1/Th17 σε σχέση με τους υγιείς-μάρτυρες (Εικόνα 1). Γ1. Μελέτη των μεταγραφικών παραγόντων των Th17 και Th1/Th17 κυττάρων σε ασθενείς με ΜΔΣ, ΑΑ και υγιείς μάρτυρες: Αφού προσδιορίσουμε τους Th17 και Th1/Th17 κυτταρικούς πληθυσμούς σε ασθενείς και υγιείς μάρτυρες, θα εξετάσουμε κατά πόσο υπάρχουν διαφορές έκφρασης στους χαρακτηριστικούς μεταγραφικούς παράγοντες κάθε πληθυσμού. Γ1α. Μελέτη των επιπέδων των T-bet και RORγt σε απομονωμένα CD4+ κύτταρα καλλιεργειών σε ασθενείς και σε υγιείς-μάρτυρες μέσω ανοσοαποτυπώματος κατά Western. Για να εξετάσουμε αν οι διαφορές στους Th17 και Th1/Th17 πληθυσμούς σχετίζονται μηχανιστικά με τυχόν διαφορές στους μεταγραφικούς παράγοντες-κλειδιά κάθε πληθυσμού, θα μελετήσουμε την έκφραση των Τ-bet και RORγt στα CD4+ κύτταρα των ασθενών και των υγιών μαρτύρων. Από το σύνολο των κυττάρων των καλλιεργειών βραχείας διάρκειας (όπως περιγράφηκαν πιο πάνω) από όπου θα έχουμε προσδιορίσει τα Th17 και Th1/Th17 κύτταρα, θα απομονώσουμε τα CD4+ κύτταρα με μαγνητικό διαχωρισμό (magnetic beads) με kit που διατίθεται στο εμπόριο (MACS, Miltenyi Biotech). Η μέθοδος αυτή μας δίνει τη δυνατότητα σε ελάχιστο χρόνο να λαμβάνουμε δείγμα που είναι εμπλουτισμένο με CD4+ λεμφοκύτταρα, και μάλιστα σε ποσοστό >95% (το οποίο, σε κάθε περίπτωση θα ελέγχουμε με κυτταρομετρία ροής). Από αυτά τα CD4+ κύτταρα θα γίνεται απομόνωση κυτταροπλασματικών και πυρηνικών πρωτεινών μέσω ειδικών διαλυμάτων (lysis buffers) 6. Η συγκέντρωση της πρωτείνης ανά μl δείγματος θα προσδιορίζεται με τη οπτική πυκνότητα του δείγματος με τη μέθοδο Bradford. Ίση ποσότητα πυρηνικής πρωτείνης από κάθε δείγμα ασθενούς και μάρτυρα θα αναλύεται σε ανοσοαποτύπωμα κατά Western (Western Blot) για προσδιορισμό της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων T- bet και RΟRγt. Ο προσδιορισμός αυτός θα γίνεται για το χρονικό σημείο 0 (κατά την ένταξη των ασθενών στη μελέτη). Αν υπάρχουν αλλαγές στο προσδιορισμό των Th1/Th17 και Th17 κυττάρων στα άλλα χρονικά σημεία, τότε θα γίνεται προσδιορισμός της συγκέντρωσης των πρωτεινών αυτών και στα χρονικά σημεία εκείνα στα οποία θα έχουμε καταγράψει τυχόν μεταβολές των παραπάνω κυτταρικών υποπληθυσμών. Θα γίνει ποσοτικοποίηση της έκφρασης των πρωτεινών στα films μεταξύ ασθενών και μαρτύρων με πρόγραμμα ηλεκτρονικού υπολογιστή (ImageQuant, Amersham) για ακριβή προσδιορισμό τυχόν διαφορών. Αν από τα αποτελέσματα μας βρούμε αυξημένη έκφραση στα επίπεδα του Τ-bet και RORγt πιθανόν να μας οδηγήσει σε συμπέρασμα ότι οι μεταγραφικοί παράγοντες συμμετέχουν στο μηχανισμό της αυξημένης έκφρασης των Th17 κυττάρων στους ασθενείς με ΜΔΣ. Γ1β. Μελέτη των επιπέδων T-bet και RORγt σε ασθενείς και σε υγιείςμάρτυρες με συνεστιακό μικροσκόπιο (confocal microscopy). Για να επιβεβαιώσουμε τα ευρήματα μας από τα western blots για τους μεταγραφικούς παράγοντες T-bet και RΟRγt, θα γίνει επιπλέον προσδιορισμός τους με συνεστιακό μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας μέρος από τα CD4+ κύτταρα που θα απομονώνονται από τις καλλιέργειες όπως περιγράφηκε πιο πάνω. Η μελέτη αυτή απαιτεί πολύ 6

7 μικρούς αριθμούς CD4+ κυττάρων. Τα κύτταρα θα μονιμοποιούνται σε ειδικά γυάλινα πλακίδια που προηγουμένως έχουν επιστρωθεί με poly-l-lysine (Sigma) και θα επωάζονται με αντισώματα 8 έναντι των T-bet και RΟRγt. Στη συνέχεια θα επωάζονται με ένα δεύτερο αντίσωμα το οποίο είναι συνδεδεμένο με φθοριόχρωμα Texas-Red- ή FITC- έτσι ώστε θα σημανθούν με κόκκινο χρώμα τα κύτταρα που είναι θετικά για το RΟRγt και με πράσινο χρώμα εκείνα που είναι θετικά για το T-bet. Θα γίνεται ποσοτικοποίηση της έκφρασης 9 κάθε παράγοντα ανά κύτταρο για τουλάχιστον 100 κύτταρα από κάθε δείγμα που θα αναλυθεί. Η ποσοτικοποίηση αυτή γίνεται μέσω ειδικού προγράμματος ηλεκτρονικού υπολογιστή και έτσι θα προσδιορίζεται ο μέσος όρος έκφρασης του κάθε μεταγραφικού παράγοντα ανά κύτταρο ανά δείγμα. Έτσι θα είναι δυνατή η σύγκριση των αποτελεσμάτων σε ασθενείς και υγιείς μάρτυρες. Για να ελαχιστοποιηθούν τα πιθανά σφάλματα από τη μέθοδο, η χρώση καθώς και η εξέταση των δειγμάτων στο μικροσκόπιο θα γίνεται για όσο το δυνατό περισσότερους ασθενείς και μάρτυρες κάθε φορά παράλληλα. Σε προκαταρκτικά πειράματα έχουμε δείξει ότι οι ασθενείς με ΜΔΣ έχουν αυξημένη έκφραση RORγt και T-bet σε απομονωμένα CD4+ κύτταρα σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων σε προκαταρκτικά πειράματα-πιλότους από 3 ασθενείς και 3 υγιείς-μάρτυρες έδειξε ότι η διαφορές αυτές είναι στατιστικά σημαντικές. Γ1γ. Μελέτη των επιπέδων T-bet και RORγt σε ασθενείς και σε υγιείς μάρτυρες με Real-Time PCR. Για να επιβεβαιώσουμε τα αποτελέσματα μας από τα πειράματα που περιγράφονται στις παραγράφους Γ1α και Γ1β για τους μεταγραφικούς παράγοντες T-bet και RΟRγt, θα γίνει επιπλέον προσδιορισμός τους με Real-Time PCR. Από το σύνολο των κυττάρων των καλλιεργειών βραχείας διάρκειας (όπως περιγράφηκαν πιο πάνω) από όπου θα έχουμε προσδιορίσει τα Th17 και Th1/Th17 κύτταρα, θα απομονώσουμε τα CD4+ κύτταρα με μαγνητικό διαχωρισμό και θα προσδιορίσουμε τα επίπεδα των T-bet και RΟRγt. Δ. Μελέτη των επιπέδων της IL-17 και IFN-γ, και των κυτταροκινών εκείνων που προάγουν τη δημιουργία των Th17 κυττάρων. Κάθε ένας από τους πληθυσμούς που μελετούμε παράγει κυτταροκίνες που συμμετέχουν στη λειτουργία τους. Η IL- 17 προάγει την έκφραση προφλεγμονωδών μορίων μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB και του μονοπατιού των ΜΑΡΚ κινασών. Η IFN-γ αποτελεί κυτοκίνη με κατασταλτική δράση για τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. Τα υπερκείμενα από τις καλλιέργειες των ασθενών και των υγιών-μαρτύρων καθώς και ορός από την αρχική αιμοληψία, θα χρησιμοποιηθούν για προσδιορισμό των επιπέδων της IL-17, της IFN-γ, καθώς και των IL-6, IL-23, και TGF-β που φαίνεται ότι συμμετέχουν/προάγουν τη δημιουργία των Th17 κυττάρων 14. Ο προσδιορισμός τους θα γίνει με ELISA με εμπορικά διαθέσιμα kits (R&D Systems). Κάθε kit έχει 96 θέσεις για προσδιορισμό, και έτσι τα υπερκείμενα από τις καλλιέργειες θα φυλάσσονται στους C μέχρι την ανάλυσή τους, ώστε να γίνεται ο προσδιορισμός σε όλα τα δείγματα ταυτόχρονα. Από πρόδρομα αποτελέσματα φαίνεται ότι οι ασθενείς έχουν αυξημένη συγκέντρωση IL-17 στα υπερκείμενα των καλλιεργειών σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Τα πιο πάνω αποτελέσματα θα μας βοηθήσουν να εξετάσουμε και να αναλύσουμε α) αν οι αριθμητικές διαφορές των Th1/Th17 και Th17 κυττάρων σχετίζονται με διαφορές στην έκφραση των κυτοκινών που παράγουν και β) αν οι διαφορές στις κυτοκίνες αυτές σχετίζονται με διαφορές στην έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων T-bet και RΟRγt. 7

8 Δ1. Μελέτη των επιπέδων του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB. Αφού η IL-17 ενεργοποιεί και ρυθμίζει την έκφραση του NF-κB, θα προσδιορίσουμε αν τα επίπεδα της IL-17 επηρεάζουν και την έκφραση του NF-κB. Σε πυρηνικές πρωτείνες από ολικά T-λεμφοκύτταρα τα οποία θα απομονώσουμε από τις καλλιέργειες όπως περιγράφηκαν πιο πάνω, θα προσδιορίσουμε τυχόν διαφορές μεταξύ ασθενών και μαρτύρων. Από τα αποτελέσματα μας θα μπορέσουμε πιθανόν να εξηγήσουμε το πιθανό μηχανισμό της ιστικής βλάβης που γίνεται μέσω της IL-17, αφού η ενεργοποίηση προφλεγμονωδών μορίων από την IL-17 γίνεται μέσω του NF-κB. Ε. Επίδραση αναστολέων κινασών στην έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων T-bet και RORγt και στους Th17 και Th1/Th17 κυτταρικούς πληθυσμούς. Μετά τη διέγερση των Τ-λεμφοκυττάρων μέσω του επιφανειακού τους υποδοχέα (TCR) ακολουθεί ένας καταρράκτης ενεργοποίησης διαφόρων κινασών που έχει σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων, που και αυτοί με τη σειρά τους ενεργοποιούν γονίδια-στόχους. Η πρωτεινική κινάση PKC-θ παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων, και αποτελεί την επικρατέστερη ισομορφή από την οικογένεια των πρωτεινικών κινασών στα Τ- λεμφοκύτταρα 15. Σε προηγούμενη μελέτη μας 6 δείξαμε ότι η PKC-θ είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα T-bet και την επακόλουθη σύνδεση του στον υποκινητή του γονιδίου της IFN- γ. Επίσης είναι γνωστό ότι η IL- 17 ενεργοποιεί τον μεταγραφικό παράγοντα NF-κB και το μονοπάτι των MAPK κινασών. Μέχρι σήμερα δεν είναι γνωστό ποιά κινάση ελέγχει και επάγει την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα RORγt στα Th17 κύτταρα. Θα χρησιμοποιήσουμε φαρμακευτικούς αναστολείς για να επηρεάσουμε την έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων T-bet και RΟRγt και κατά συνέπεια την έκφραση των κυτταρικών πληθυσμών Th1/Th17 και Th17. Θα επωάσουμε κύτταρα από τις καλλιέργειες από ασθενείς και υγιείς-μάρτυρες με φαρμακευτικούς αναστολείς και στη συνέχεια θα τα διεγείρουμε με PMA και ιονομυκίνη. Θα χρησιμοποιήσουμε τους πιο κάτω αναστολείς (στη παρένθεση φαίνεται η συγκέντρωση που θα χρησιμοποιήσουμε, η οποία είναι απαραίτητη για τη σωστή λειτουργία κάθε αναστολέα): Calphostin C (0.05 μm) και rottlerin (30 μm) για αναστολή των PKC και PKC-θ αντίστοιχα, SB (10 μm) και PD98059 (50 μm) για αναστολή του p38 και του ΜEK/Erk (mitogen-activated protein/extracellular signal regulated kinase kinase) μονοπατιού. Μέρος από τα κύτταρα που θα επωασθούν με τους αναστολείς θα τα αναλύσουμε με κυτταρομετρία ροής για να δούμε την επίδραση των αναστολέων στους Th17 και Th1/Th17 κυτταρικούς πληθυσμούς. Ένα άλλο μέρος από τα κύτταρα αυτά θα χρησιμοποιηθούν για απομόνωση CD4+ κυττάρων και στη συνέχεια συλλογή πυρηνικών πρωτεινών που θα χρησιμοποιηθούν σε ανοσοτύπωμα κατά Western για τον έλεγχο της επίδρασης των αναστολέων στους μεταγραφικούς παράγοντες T-bet και RORγt. Τα αποτελέσματα με τους φαρμακευτικούς αναστολείς α) θα μας δώσουν πληροφορίες για το μηχανισμό του ελέγχου της έκφρασης των T-bet και RORγt, και β) ενδεχομένως να αποδώσουν αποτελέσματα που μπορεί μελλοντικά να έχουν εφαρμογή σε θεραπευτικές επιλογές σε ασθενείς με ΜΔΣ. Σε προκαταρκτικά πειράματα φαίνεται ότι η PKC-θ συμμετέχει στην έκφραση τόσο του T-bet αλλά και του RORγt, αφού η έκφραση του RORγt μειώνεται κατά περίπου 20% μετά την επίδραση του αναστολέα rottlerin σε western blot. Επίσης υπό την επίδραση του αναστολέα rottlerin μειώνονται τόσο ο Th17 αλλά και ο Th1/Th17 πληθυσμός κατά 40% και 65%, αντίστοιχα σε 8

9 κυτταρομετρία ροής, γεγονός που έμμεσα υπογραμμίζει τη λειτουργική σημασία της φαρμακευτικής αναστολής των αντίστοιχων μεταγραφικών παραγόντων. ΣΤ. Συσχέτιση των αποτελεσμάτων με το στάδιο της νόσου των ασθενών με ΜΔΣ και ΑΑ: Τα αποτελέσματα τόσο από την κυτταρομετρία ροής αλλά και από τη μελέτη των μεταγραφικών παραγόντων από το σύνολο των ασθενών θα συγκριθούν φυσικά με αυτά από τους υγιείς μάρτυρες. Θα γίνει όμως παράλληλα και ανάλυση των αποτελεσμάτων μας ανά κατηγορία ασθενών με ΜΔΣ (RA, RCMD, RAEB, και 5q-) και ΑΑ. Οι ασθενείς με ΜΔΣ θα χωριστούν βάσει του συστήματος IPSS σε high και low risk, και θα γίνει σύγκριση των ομάδων αυτών με τους υγιείς-μάρτυρες. Από τα μέχρι τώρα προκαταρκτικά πειράματα που έχουμε φαίνεται ότι οι low risk ασθενείς έχουν πολύ μεγαλύτερα ποσοστά Th17 και Th1/Th17 κυττάρων σε σχέση τόσο με τους high risk ασθενείς, όσο και με τους υγιείς μάρτυρες. Από τις συγκρίσεις αυτές θα μπορέσουμε να προσδιορίσουμε σε ποιους ασθενείς τα Th17 και Th1/Th17 κύτταρα έχουν σημαντικότερο ρόλο κατά την εμφάνιση της νόσου. ΣΤ1. Μελέτη των Th17 και Th1/Th17 κυτταρικών πληθυσμών σε σχέση με την πορεία/εξέλιξη της νόσου. Θα μελετήσουμε τους Th17 και Th1/Th17 πληθυσμούς στα διάφορα χρονικά σημεία όπως αναφέρθηκε πιο πάνω αλλά και ενδιάμεσα αν παρατηρηθεί αλλαγή στη πορεία της νόσου των ασθενών. Αφού τα Th17 κύτταρα συμβάλλουν στην αυτοανοσία, θα γίνει ανάλυση και σύγκριση των αποτελεσμάτων και θα εξαχθούν συμπεράσματα κατά πόσο οι κυτταρικοί πληθυσμοί επηρεάζονται από τη πορεία/εξέλιξη της νόσου. Ζ. Μελέτη των ρυθμιστικών Τ-κυττάρων και συσχέτιση τους με τους Th17 και Th1/Th17 υποπληθυσμούς. Τα ρυθμιστικά Τ-κύτταρα χαρακτηρίζονται από την επιφανειακή έκφραση των CD4, CD25, και CTLA4, ενώ στον πυρήνα τους φέρουν το μεταγραφικό παράγοντα FOXP3 16. Τα κύτταρα αυτά ρυθμίζουν-ελέγχουν την εμφάνιση και εξέλιξη της αυτοανοσίας καταστέλλοντας τα αυτοαντιδραστικά Τ λεμφοκύτταρα, αποτελώντας έτσι ένα μηχανισμό περιφερικής ανοχής. Αναγνωρίζουν τα διάφορα αντιγόνα (self, non-self) ώστε να διατηρείται η ομοιόσταση του ανοσοποιητικού συστήματος 17. Πολύ πρόσφατα έχει περιγραφεί ότι οι ασθενείς με ΜΔΣ και ΑΑ έχουν μειωμένα ποσοστά ρυθμιστικών Τ- λεμφοκυττάρων σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες 9,22 και πιθανόν συμμετέχουν στην παθογένεια τους. Επίσης περιγράφηκε ότι τα ρυθμιστικά Τ-λεμφοκύτταρα είναι δυνατό να μετατραπούν σε Th Θα εξετάσουμε για διαφορές στον αριθμό των ρυθμιστικών Τ-κυττάρων στους ασθενείς σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες και θα συγκρίνουμε τα ποσοστά τους σε σχέση με τα Th17 και Th1/Th17 κύτταρα (στους ασθενείς και στους υγιείς-μάρτυρες). Βάσει προηγούμενης εμπειρίας μας 9 θα αναλύσουμε τους σχετικούς και απόλυτους αριθμούς των ρυθμιστικών Τ- λεμφοκυττάρων με κυτταρομετρία ροής: ως θετικά θα θεωρούνται τα CD4+CD25high+CTLA4+FOXP3+ κύτταρα. Δεν υπάρχουν δημοσιευμένα στοιχεία για την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα FOXP3 σε ασθενείς με ΜΔΣ. Γι αυτό θα αναλύσουμε με ανοσοτύπωμα κατά Western (Western Blot) και με Real-Time PCR την έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων FOXP3 αλλά και του NFAT1 που αποτελεί τον μεταγραφικό εκείνο παράγοντα που ρυθμίζει με τη σειρά του την έκφραση του FOXP3 9. Όλα τα αποτελέσματα μας θα τα συγκρίνουμε τόσο μεταξύ ασθενών και υγιών-μαρτύρων, αλλά θα γίνει και σύγκριση ανάμεσα και στις διάφορες υποκατηγορίες-ομάδες ασθενών ανάλογα με το στάδιο της νόσου, όπως περιγράφηκε πιο πάνω για τυχόν διαφορές. Τα αποτελέσματα θα μας δώσουν 9

10 πληροφορίες για την πιθανή σχέση μεταξύ ρυθμιστικών Τ- και Th17 κυττάρων, καθώς και το ρόλο του κάθε πληθυσμού στη παθογένεια της νόσου ανάλογα με το στάδιο της νόσου. Η. Μελέτη των T Follicular Helper Cells (TFH): Τα TFH αποτελούν μια νέα υποομάδα κυττάρων τα οποία βρίσκονται στα βλαστικά κέντρα των λεμφοζιδίων και χαρακτηρίζονται από τον υποδοχέα CXCR5 19. Είναι CD4+ κύτταρα και εκτός από τον επιφανειακό δείκτη CXCR5, στην επιφάνειά τους εκφράζουν επίσης τα μόρια ICOS και IL-21R, ενώ χαρακτηριστικός μεταγραφικός παράγοντάς τους είναι ο BCL-6. Αποτελούν τον κύριο πληθυσμό που βοηθά τα Β κύτταρα να μετατραπούν σε πλασματοκύτταρα. Ανευρίσκονται στα δευτερογενή λεμφικά όργανα αλλά και στο αίμα 20. Στο αίμα βρίσκονται σε ποσοστό περίπου 10% σε κατάσταση ηρεμίας. Το ICOS (inducible costimulator) αποτελεί συνδιεγερτικό μόριο, που είναι απαραίτητο για τη δημιουργία και τη διατήρηση των TFH. Χωρίς ICOS δεν είναι δυνατή η δημιουργία TFH in vivo. Η IL-21 παράγεται από τα TFH, αλλά και από τα Th17. Στα TFH η IL-21 δρά αυτοκρινώς (μέσω του IL-21R) και επάγει την έκφραση του CXCR5. Τα Th17 αν και εκφράζουν IL-21 εντούτοις δεν αλληλεπιδρούν με τα Β κύτταρα γιατί δεν εκφράζουν CXCR5 21. Η IL-21 αποτελεί απαραίτητο παράγοντα για την αύξηση και τη διαφοροποίηση των TFH. Θα προσδιορίσουμε τον αριθμό των TFH τόσο στους ασθενείς αλλά και στους υγιείς μάρτυρες στην περιφέρεια και θα ελέγξουμε αν υπάρχουν και στο μυελό. Θα συγκρίνουμε τον αριθμό των TFH με τον αριθμό των Th17 και θα προσδιορίσουμε τυχόν διαφορές μεταξύ ασθενών και μαρτύρων. Θα προσδιορίσουμε επίσης τα επίπεδα του χαρακτηριστικού μεταγραφικού παράγοντα των TFH, του BCL-6, ενώ με ELISA θα προσδιορίσουμε τα επίπεδα της IL- 21. Αν υπάρχουν διαφορές στα επίπεδα της IL-21, θα προχωρήσουμε ένα βήμα ακόμα και θα μελετήσουμε την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Blimp-1 ο οποίος επάγεται από την IL-21. Θ. Έλεγχος της απόπτωσης των CD34+ κυττάρων από τα Th17 κύτταρα in vitro. Με κυταρομετρία (sorting) θα προσπαθήσουμε να απομονώσουμε Th17 κύτταρα κυρίως από ασθενείς οι οποίοι στα αρχικά πειράματα έδειξαν αυξημένο πληθυσμό. Βάση των δεικτών CD4, IL-23R, και IL-17, θα γίνει απομόνωση των Th17 κυττάρων από το περιφερικό αίμα, ενώ παράλληλα από τους ίδιους ασθενείς θα γίνει απομόνωση CD34+ κυττάρων από το μυελό. Τους δύο πληθυσμούς θα τους χρησιμοποιήσουμε σε μεικτές καλλιέργειες, για να ελέγξουμε την απόπτωση των CD34+ κυττάρων. Ο μικρός αριθμός των κυττάρων θα αποτελέσει περιοριστικό παράγοντα, αλλά από όπου είναι εφικτό ανάλογα πειράματα θα γίνουν και από υγιείς μάρτυρες. Τα CD34+ κύτταρα θα τα απομονώσουμε με μαγνητικό διαχωρισμό από το μυελό ασθενών αλλά και από δείγματα ομφαλίου λώρου. Με τα αποτελέσματα αυτά θα εξάγουμε συμπεράσματα για τη λειτουργικότητα/ρόλο των Th17 κυττάρων, πως επηρεάζουν τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, και αν πραγματικά ευθύνονται για τη καταστροφή των CD34+ κυττάρων στο ΜΔΣ και την ΑΑ. 3. Σκοπιμότητα, σημασία, και συμβολή του προγράμματος Τα τελευταία χρόνια δίνεται όλο και πιο μεγάλη σημασία στο ρόλο των Τ- λεμφοκυττάρων στην παθογένεια των ΜΔΣ και της απλαστικής αναιμίας. Μέχρι πρόσφατα γνωρίζαμε ότι τα αυτοαντιδραστικά Τ-λεμφοκύτταρα μέσω IFN-γ και TNF-α καταστρέφουν τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα στο μυελό, και ότι υπάρχει μια «πόλωση» των νοσημάτων αυτών προς την Th1 κατεύθυνση. Με τη 10

11 περιγραφή των νεοτέρων υποπληθυσμών όμως των Τ-κυττάρων όπως τα Th17, πολλά δεδομένα για «Th1 νοσήματα» αναθεωρούνται και πιστεύεται ότι τα Th17 κύτταρα είναι εκείνα που κυρίως συμβάλλουν παθογενετικά. Τα Th1 κύτταρα φαίνεται οτι είναι υπεύθυνα για την έναρξη της φλεγμονώδους ιστικής βλάβης, ενώ τα Th17 για τη συνέχιση και διαιώνιση της. Με βάση τα παραπάνω δεδομένα θεωρούμε ότι είναι απαραίτητος ο έλεγχος των Th17 κυττάρων στους ασθενείς με σύνδρομα απλασίας μυελού. Στο πρόγραμμα προτείνουμε πειράματα που εστιάζουν στον προσδιορισμό των νεότερων Τ- λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών κυρίως στο περιφερικό αίμα αλλά και στο μυελό. Στα προτεινόμενα πειράματα θα προσδιορίσουμε α) τον πληθυσμό των Th17 και Th1/Th17 κυττάρων στα ΜΔΣ και την απλαστική αναιμία, β) συσχέτιση των Th17 και Th1/Th17 με το στάδιο και την εξέλιξη της νόσου, και γ) επίδραση των Th17 κυττάρων στην απόπτωση των CD34+ κυττάρων. Τα αποτελέσματα θα δώσουν πληροφορίες ως προς τον παθογενετικό ρόλο των Th17. Με τον παράλληλο προσδιορισμό των ρυθμιστικών Τ-λεμφοκυττάρων και των TFH θα γίνει σύγκριση των διαφόρων υποπληθυσμών μεταξύ τους και θα εξαχθούν συμπεράσματα για το ρόλο τους στη παθογένεια του ΜΔΣ και της ΑΑ. Πέραν όμως από τα πιο πάνω πειράματα, θα μελετήσουμε και σε in vitro συνθήκες «μηχανιστικά» πειράματα στα οποία θα προσδιορίσουμε τους μεταγραφικούς παράγοντες-κλειδιά που χαρακτηρίζουν κάθε υποπληθυσμό και προάγουν το πολλαπλασιασμό και την διατήρηση τους. Επιπλέον, η ταυτοποίηση των κινασών που ελέγχουν τους μεταγραφικούς παράγοντες, πιθανά να αποτελέσει έναυσμα για νεότερες στοχευμένες θεραπείες στους ασθενείς με ΜΔΣ και ΑΑ. Τα πρόδρομα αποτελέσματα μας, έγιναν δεκτά και παρουσιάστηκαν για πρώτη φορά διεθνώς στο Αμερικανικό Συνέδριο Αιματολογίας (American Society of Hematology Annual Meeting, San Francisco December 6-9, 2008) αλλά και στο Πανελλήνιο Αιματολογικό Συνέδριο (Αθήνα Νοεμβρίου, 2008). Η απήχηση που είχαν και τα θετικά σχόλια που εισπράξαμε μέχρι στιγμής μας προτρέπει στο να συνεχίσουμε και να ολοκληρώσουμε το προτεινόμενο πρόγραμμα, με σκοπό να κατανοήσουμε καλύτερα την παθογένεια των συνδρόμων απλασίας του μυελού και μέσω των αποτελεσμάτων μας να γίνει προσπάθεια για ανεύρεση νέων θεραπευτικών επιλογών. 4. Βιβλιογραφία 1. Mufti GJ. Pathobiology, classification, and diagnosis of myelodysplastic syndrome. Best Practice Research Clinical Haematology. 2004; 17: Sloand EM and Rezvani K. The Role of the Immune System in Myelodysplasia: Implications for Therapy. Semin Hematol. 2008; 45: Kitagawa M, Saito I, Kuwata T et al. Overexpression of tumor necrosis factor (TNF)-a and interferon (IFN)-g by bone marrow cells from patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 1997; 11: Zou JX, Rollison DE, Boulware D et al. Altered naive and memory CD4+ T-cell homeostasis and immunosenescence characterize younger patients with myelodysplastic syndrome. Leukemia Mar 12. Epub ahead of print 5. Young NS, Scheinberg P, Calado RT. Aplastic Anemia. Curr Opin Hematol. 2008;15: Solomou EE, Keyvanfar K, Young NS. T-bet, a Th1 transcription factor, is up-regulated in T cells from patients with aplastic anemia. Blood. 2006;107: Yamaguchi H, Calado RT, Ly H et al. Mutations in TERT, the gene for telomerase reverse transcriptase, in aplastic anemia. N Engl J Med. 2005;352:

12 8. Solomou EE, Gibellini F, Stewart B et al. Perforin gene mutations in patients with acquired aplastic anemia. Blood. 2007;109: Solomou EE, Rezvani K, Mielke S et al. Deficient CD4+ CD25+ FOXP3+ T regulatory cells in acquired aplastic anemia.blood. 2007;110: McGeachy MJ and Cua DJ. Th17 Cell Differentiation: The Long and Winding Road. Immunity 2008; 28: Steinman L. A brief history of TH17, the first major revision in the TH1/TH2 hypothesis of T cell mediated tissue damage. Nat Med. 2007;13: Bowen H, Kelly A, Lee T, Lavender P. Control of cytokine gene transcription in Th1 and Th2 cells.clin Exp Allergy Sep;38(9): Dong C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 2008;8: Korn T, Bettelli E, Oukka M, Kuchroo VK. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 2009;27: Solomou EE, Juang YT, Tsokos GC. Protein kinase C-theta participates in the activation of cyclic AMP-responsive element-binding protein and its subsequent binding to the -180 site of the IL-2 promoter in normal human T lymphocytes. J Immunol. 200;166: Vignal DAA, Collison LW and Workman CJ. How regulatory T cells work. Nat Rev Immunol. 2008; 8: Daniel J. Campbell DJ and Ziegler SF. FOXP3 modifies the phenotypic and functional properties of regulatory T cells. Nat Rev Immunol.2007;7: Human CD25highFoxp3pos regulatory T cells differentiate into IL-17 producing cells. Koenen HJPM, Smeets RL, Vink PM et al. Blood 2008;112: T Follicular Helper Cells Express a Distinctive Transcriptional Profile, Reflecting Their Role as Non-Th1/Th2 Effector Cells That Provide Help for B Cells. Chtanova T, Tangye SG, Newton R et al. J Immunol, 2004, 173: Fazilleau N, Mark L, McHeyzer-Williams LJ, McHeyzer-Williams MG. Follicular Helper T Cells:Lineage and Location. Immunity 2009; 30: King C, Tangye SG, Mackay CR. T Follicular Helper (TFH) Cells in Normal and Dysregulated Immune Responses. Annu. Rev. Immunol : Kordasti SY, Ingram W, Hayden J et al. CD4+CD25high Foxp3+ regulatory T cells in myelodysplastic syndrome (MDS). Blood Aug 1;110(3): CD4+IL23R+IL17+ CD4+IL17+IFNg+ Υγιής Μάρτυρας IL-17+ CD4+IL23R+IL17+ IFNg+ CD4+IL17+IFNg+ ΜΔΣ IL-23R+ IL-17+ CD4+IL23R+IL-17+IFNg+ Εικόνα 1. Αντιπροσωπευτικό προκαταρτικό πείραμα για τον προσδιορισμό των Th17 και Th1/Th17 κυττάρων σε ασθενή με ΜΔΣ και υγιή μάρτυρα (κυτταρομετρία ροής). 12

13 Ε. ΧΡΟΝΟΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗΣ ΕΡΓΟΥ Στο Αιματολογικό Τμήμα του Πανεπιστημίου Πατρών παρακολουθείται ένας πολύ μεγάλος αριθμός ασθενών που πάσχουν από Μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο, ενώ υπάρχει και μια συνεχής ροή νέων περιστατικών. Από την εμπειρία μας θα χρειαστούν περίπου 18 μήνες για την στρατολόγηση του προτεινόμενου αριθμού ασθενών με ΜΔΣ, ενώ ήδη έχει αρχίσει η συλλογή των δειγμάτων από τους ασθενείς και τους υγιείς μάρτυρες που χρησιμοποιήθηκαν στα προκαταρτικά πειράματα. Για τους ασθενείς με απλαστική αναιμία θα χρειαστούν τουλάχιστον 2 χρόνια, καθώς αποτελεί πολύ πιο σπάνιο νόσημα. Η συλλογή των κυττάρων από το περιφερικό αίμα και το μυελό προβλέπεται να γίνει στα προκαθορισμένα χρονικά σημεία όπως περιγράψαμε πιο πάνω. Επομένως απαιτείται ακόμα ένας χρόνος για τη συλλογή όλων των δειγμάτων για όλα τα χρονικά σημεία. Στο διάστημα του τρίτου χρόνου, δεν προβλέπεται στρατολόγηση νέων ασθενών, αλλά θα γίνει η συλλογή των τελευταίων δειγμάτων-χρονικών σημείων των ασθενών που έχουν ήδη ενταχθεί στο πρόγραμμα. Το καθαρά πειραματικό μέρος που έχει ήδη αρχίσει, θα συνεχιστεί και υπολογίζεται ότι στο τέλος του πρώτου χρόνου θα έχει αναλυθεί ένας μεγάλος αριθμός ασθενών και μαρτύρων. Όλα τα πειράματα θα γίνονται με παράλληλη ανάλυση δειγμάτων από τουλάχιστον 3 άτομα από κάθε ομάδα (ασθενείς και υγιείς μάρτυρες). Υπολογίζουμε ότι σε 2 χρόνια από την έναρξη των πειραμάτων θα έχουμε ολοκληρώσει την ανάλυση όλων των ασθενών με καλλιέργειες βραχείας διάρκειας, κυτταρομετρία ροής, western blots, συνεστιακό μικροσκόπιο, ανοσοιστοχημεία, και ELISA. Επίσης, θα έχουμε συλλέξει όλα τα στοιχεία των ασθενών ώστε να μπορέσει να γίνει η ανάλυση τους κατά ομάδες ανάλογα σε ποια κατηγορία ΜΔΣ ανήκουν, επιμέρους αλλά και συνολικά σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Τους τελευταίους 6-8 μήνες του προγράμματος υπολογίζουμε να γίνει η ολοκλήρωση όλων των πειραμάτων με παράλληλη ανάλυση όλων των τελευταίων δειγμάτων-χρονικών σημείων. Συνοπτικά το χρονοδιάγραμμα πουο προτείνουμε είναι: Μάιος 2010-Μάρτιος 2011: Συλλογή δειγμάτων από ασθενείς και υγιείς μάρτυρες, στα χρονικά σημεία 0, 3, και 6 μήνες, και έναρξη των πειραμάτων με παράλληλη στρατολόγηση και νέων ασθενών. Μάρτιος Δεκέμβριος 2012: Συλλογή όλων των δειγμάτων από το σύνολο των ασθενών και μαρτύρων. Ανάλυση του συνόλου των ασθενών, ασθενών μαρτύρων και υγιών μαρτύρων και ολοκλήρωση των πειραμάτων με όλη τη προτεινόμενη μεθοδολογία (κυτταρομετρία ροής, WB, ELISA, confocal microscopy, κλπ). Δεκέμβριος 2012-Μάιος 2013: Ολοκλήρωση του συνόλου των πειραμάτων, και ανάλυση των αποτελεσμάτων. ΣΤ. Π Ρ Ο Υ Π Ο Λ Ο Γ Ι Σ Μ Ο Σ Δ Α Π Α Ν Ω Ν 1. ΥΠΟΤΡΟΦΙΕΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΙ ΦΟΙΤΗΤΕΣ (82 %) ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΜΗΝΕΣ ΜΕΣΗ ΜΗΝΙΑΙΑ ΣΥΝΟΛΙΚΗ ΑΠΑΣΧΟΛΗΣΗΣ ΑΜΟΙΒΗ ΔΑΠΑΝΗ Φερτάκης Βασίλειος ,180 13

14 2. ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΠΟΣΟ Υγρά καλλιεργειών (RPMI-1640), Φικόλη,FBS, PBS, 1250 κλπ Πλαστικά (πιπέτες 1-50ml), σωληνάρια Falcon 1100 Αντισώματα για κυτταρομετρία, western blot, 3000 confocal microscopy Υλικά για προσδιορισμό πρωτεινών με western blot 330 Σύστημα χημειοφωταύγειας (Amersham) 280 Σύστημα μαγνητικού διαχωρισμού Τ- 500 λεμφοκυττάρων (MACS-Miltenyi Biotech) Ανόργανα υλικά για western confocal microscopy ΜΕΤΑΚΙΝΗΣΕΙΣ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ Δεν προβλέπονται δαπάνες για μετακινήσεις ΠΟΣΟ ΣΥΝΟΛΙΚΗ ΔΑΠΑΝΗ ΕΡΓΟΥ 33,840 14

15 Προσωπικά στοιχεία Βιογραφικό Επιστημονικού Υπευθύνου Επώνυμο Όνομα Θέση στο Ίδρυμα Τμήμα Σολωμού-Λιόση Έλενα Λέκτορας Παθολογίας Ιατρικής Τηλέφωνο επικοινωνίας , Έτος Ίδρυμα Τίτλος (πτυχίο, διδακτορικό) 1997 Πανεπιστήμιο Αθηνών Πτυχίο Ιατρικής 2000 Πανεπιστήμιο Αθηνών ΜεταπτυχιακόΠρόγραμμα Ιατρικής 2002 Πανεπιστήμιο Αθηνών Διδακτορικό (Ιατρική) Κύρια ερευνητική δραστηριότητα Φυσιολογία και παθοφυσιολογία του ανθρώπινου Τ λεμφοκυττάρου Παθοφυσιολογία της αυτοανοσίας στον άνθρωπο με μοντέλο την απλαστική αναιμία και το συστηματικό ερυθηματώδη λύκο. Μετάδοση ενδοκυττάριου μηνύματος σε Τ λεμφοκύτταρα από ασθενείς με απλαστική αναιμία και συστηματικό ερυθηματώδη λύκο. Επιστημονικές εργασίες τα τελευταία 7 χρόνια (σε διεθνή περιοδικά με κριτές) 1. Solomou EE, Sfikakis PP, Kotsi P, Papaioannou M, Karali V, Vervessou E, Hoffbrand AV, Panayiotidis P. Identification of a new gene that maps on the 13q14.3 chromosomal region and acts as a guanine nucleotide factor. Leukemia Lymphoma, 2003; 44: Juang YT, Wang Y, EE Solomou, Li Y, Marwin C, Tenbrock K, Kyttaris V, Tsokos GC. Systemic lupus erythematosus serum IgG increases CREM binding to the IL-2 promoter and suppresses IL-2 productin through CaMKIV. J Clin Invest, 2005; 115 (4):

16 3. Monastirli A, Matsouka P, Pasmatzi E, Melachrinou M, Georgiou S, Solomou EE, Zoumbos N, Tsambaos D. Complete remission of recalcitrant viral warts under oral isotretinoin in a patient with low-grade B-cell lymphoma. Acta Dermato- Venereologica, 2005; 85(4): Solomou EE, Keyvanfar K and Young NS. T-bet, a Th1 transcription factor, is upregulated in T cells from patients with aplastic anemia. Blood, 2006; 107: Symeonidis A, Kouraklis-Symeonidis A, Constandinidou I, Solomou EE, Kougelou S, Vassilakos P, Zoumbos N. Increased CA-15.3 levels in the serum of patients with homozygous β-thalassaemia and sickle-cell/ β-thalassaemia. Br J Haematol, 2006; 133 (6): Liossis SN, Solomou EE, Sfikakis PP. Lyn deficiency in B cells from patients with systemic lupus erythematosus: comment on the article by FloresBorja et al. Arthritis Rheumat 2006; 54: Sloand EM, Yong ASM, Ramkissoon S, Solomou EE, Bruno TC, Kim S, Fuhrer M, Kajigaya S, Barrett AJ, Young NS. Granulocyte colony-stimulating factor preferentially stimulates proliferation of monosomy 7 cells bearing the soform IV receptor. Proc Nat Acad Sciences (PNAS) 2006; 103: Sloand EM, Chen G, Pfannes L, Shah S, Solomou EE, Barrett JA, Young NS. CD34 cells from trisomy 8 myelodysplastic syndrome (MDS) patients express early apoptotic markers but avoid programmed cell death by upregulation of antiapoptotic proteins. Blood, 2007; 109: Solomou EE, Gibellini F, Stewart B, Malide D, Berg M, Visconte V, Green S, Childs R, Chanock SJ, Young NS. Perforin gene mutations in patients with acquired aplastic anemia. Blood 2007; 109: Solomou EE, Visconte V, Wong Suzan, Gibellini F, Young NS. Decreased TCR ζ- chain expression in T cells from patients with aplastic anemia. Br J Haematol 2007; 138: Solomou EE, Rezvani K, Mielke S, Malide D, Keyvanfar K, Visconte V, Barrett AJ, Young NS. FOXP3-positive regulatory T cells in patients with acquired aplastic anemia. Blood 2007; 110: Feng X, Kajigaya S, Solomou EE, Keyvanfar K, Xu X, Raghavachari N, Munson PJ, Herndon TM, Chen J, Young NS. Rabbit ATG but not horse ATG promotes expansion of functional CD4+CD25highFOXP3+ regulatory T cells in vitro. Blood. 2008;111: Daoussis D, Liossis SN, Solomou EE, Tsanaktsi A, Bounia K, Karampetsou M, Yiannopoulos G, Andonopoulos AP Evidence that Dkk-1 is dysfunctional in ankylosing spondylitis. Arthritis Rheum. 2010;62:

17 Επιστημονικές εργασίες στο αντικείμενο της πρότασης τα τελευταία 10 χρόνια (σε διεθνή περιοδικά με κριτές, συμπεριλαμβανομένων σχετικών επίσης διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας, βιβλίων, βραβείων, κ.ά.) 1.Solomou EE, YT Juang, GC Tsokos. PKC-θ participates in the activation of CREB and its subsequent binding on the -180 site of the IL-2 promoter in normal human T lymphocytes. J Immunol 2001; 166: Juang YT, EE Solomou, B Rellahan, MF Gourley, GC Tsokos. Phosphorylation and O-linked glycosylation of Elf-1 leads to its translocation to the nucleus and binding to the promoter of the TCR-zeta chain. J Immunol 2002; 168: Solomou EE, Keyvanfar K and Young NS. T-bet, a Th1 transcription factor, is up-regulated in T cells from patients with aplastic anemia. Blood, 2006; 107: Sloand EM, Yong ASM, Ramkissoon S, Solomou EE, Bruno TC, Kim S, Fuhrer M, Kajigaya S, Barrett AJ, Young NS. Granulocyte colony-stimulating factor preferentially stimulates proliferation of monosomy 7 cells bearing the soform IV receptor. Proc Nat Acad Sciences 2006; 103: Sloand EM, Chen G, Pfannes L, Shah S, Solomou EE, Barrett JA, Young NS. CD34 cells from trisomy 8 myelodysplastic syndrome (MDS) patients express early apoptotic markers but avoid programmed cell death by upregulation of anti-apoptotic proteins. Blood, 2007; 109: Solomou EE, Gibellini F, Stewart B, Malide D, Berg M, Visconte V, Green S, Childs R, Chanock SJ, Young NS. Perforin gene mutations in patients with acquired aplastic anemia.blood 2007; 109: Solomou EE, Visconte V, Wong Suzan, Gibellini F, Young NS. Decreased TCR ζ-chain expression in T cells from patients with aplastic anemia. Br J Haematol 2007; 138: Solomou EE, Rezvani K, Mielke S, Malide D, Keyvanfar K, Visconte V, Barrett AJ, Young NS. FOXP3-positive regulatory T cells in patients with acquired aplastic anemia. Blood 2007; 110: Feng X, Kajigaya S, Solomou EE, Keyvanfar K, Xu X, Raghavachari N, Munson PJ, Herndon TM, Chen J, Young NS. Rabbit ATG but not horse ATG promotes expansion of functional CD4+CD25highFOXP3+ regulatory T cells in vitro. Blood. 2008;111: Daoussis D, Liossis SN, Solomou EE, Tsanaktsi A, Bounia K, Karampetsou M, Yiannopoulos G, Andonopoulos AP.Evidence that Dkk-1 is dysfunctional in ankylosing spondylitis. Arthritis Rheum. 2010;62:

18 Αριθμός ετεροαναφορών και σημαντικές διεθνείς συνεργασίες: 363 ετεροαναφορές Συνολικός αριθμός δημοσιεύσεων σε περιοδικά: 18 δημοσιεύσεις σε ξενόγλωσσα περιοδικά που λειτουργούν με κριτές. Ζ. ΣΥΝΘΕΣΗ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗΣ ΟΜΑΔΑΣ ΚΑΙ ΑΠΑΣΧΟΛΗΣΗ ΚΑΘΕ MΕΛΟΥΣ (Ακολουθούν τα επισυναπτόμενα 2 πλήρη βιογραφικά σημειώματα) 1. Σολωμού-Λιόση Έλενα (Επιστημονικός Υπεύθυνος) Ο επιστημονικός υπεύθυνος του προτεινόμενου προγράμματος επιλέγει τους υπό μελέτη ασθενείς καθώς και τους μάρτυρες. Κατ εξοχήν όμως, ως γνώστης όλων των τεχνικών των προτεινόμενων πειραμάτων, διδάσκει αρχικά, και στη συνέχεια καθοδηγεί, επιβλέπει, και συμμετέχει σε όλα τα προτεινόμενα πειράματα (κυτταρομετρία ροής, κυτταροκαλλιέργειες, ELISA, Western blots, συνεστιακό μικροσκόπιο). Στη συνέχεια επιβλέπει / συμμετέχει στην ανάλυση των αποτελεσμάτων και στην συγγραφή των αποτελεσμάτων της μελέτης. 2. Φερτάκης Βασίλειος (Μεταπτυχιακός φοιτητής) Ο Κος Φερτάκης συμμετέχει στη καταγραφή των κλινικών παραμέτρων των ασθενών και μαρτύρων. Στη συνέχεια απομονώνει τα ΜΚΠΑ, φυλάσσει τα δείγματα στο υγρό άζωτο, και εκτελεί το σύνολο των πειραμάτων όπως προτείνονται στο πρόγραμμα. Συμμετέχει στην καταγραφή και ανάλυση των αποτελεσμάτων και στην συγγραφή των αποτελεσμάτων της μελέτης. 18

19 ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ (Σολωμού-Λιόση Έλενα) 1. ΠΡΟΣΩΠΙΚΗ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ 1.1. Όνομα: Έλενα Σολωμού-Λιόση 1.2. Ημερομηνία Γεννήσεως: 25/09/ Τόπος Γεννήσεως: Λευκωσία, Κύπρος 1.4. Οικογενειακή κατάσταση: Έγγαμος. Μητέρα ενός παιδιού 1.5. Διεύθυνση: Τέρμα Λάδωνος, Πάτρα, Τηλ: Κινητό: FAX: Προπτυχιακές Σπουδές ΣΠΟΥΔΕΣ Πτυχιούχος της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών. Γράφτηκα μετά από εισαγωγικές εξετάσεις το Aποφοίτησα: Σεπτέμβριος 1997, με βαθμό πτυχίου «Λίαν Καλώς» Υποτροφίες (προπτυχιακά). Στα 6 συνολικά έτη φοίτησής μου στην Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Αθηνών έλαβα ισάριθμες (6) φορές υποτροφία από την Αρχή Τηλεπικοινωνιών Κύπρου Μεταπτυχιακές Σπουδές Μεταπτυχιακό πρόγραμμα σπουδών της Ιατρικής Σχολής του Παν/μίου Αθηνών: (Masters Degree) «Κλινική και Εργαστηριακή Ιατρική», με εξειδίκευση στην Αιματολογία. Τίτλος διπλωματικής εργασίας: «Ανίχνευση ενος νέου γονιδίου στη χρωμοσωμική περιοχή 13q14». Βαθμός: Άριστα Υποτροφίες (μεταπτυχιακά). Υποτροφία (διαρκείας δύο ετών) από το Μεταπτυχιακό πρόγραμμα σπουδών του Πανεπιστημίου Αθηνών «Κλινική και Εργαστηριακή Ιατρική» ( ) Translational Research in Clinical Oncology (TRACO Course, ) National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, ΗΠΑ. Μετεκπαιδευτικά μαθήματα ογκολογίας για ιατρούς με ιδιαίτερο ενδιαφέρον στην ογκολογία το οποίο οδηγεί σε απόκτηση πτυχίου μετά από συμπλήρωση μαθημάτων και γραπτές εξετάσεις. 19

20 Postdoctoral Fellow, από 3/2005 έως 3/2008 στο Αιματολογικό Τμήμα του Αιματολογικού Τμήματος των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (National Institutes of Health, ΝΙΗ), Bethesda, Maryland, H.Π.A. (Δ/ντής: Neal S. Young) Διδακτορικό Δίπλωμα Τίτλος: «Ανίχνευση και χαρακτηρισμός ενος νέου γονιδίου στη χρωμοσωμική περιοχή 13q14 που δρα ως παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης και λείπει σε ασθενείς με Χρονία Λεμφογενή Λευχαιμία». Ιατρικό Τμήμα Πανεπιστημίου Αθηνών, Βαθμός: «Άριστα» Ημερομηνία: 24/9/ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ 3.1. Λαϊκό Περ. Γεν. Νοσ/μείο Αθηνών, Α Προπαιδευτική Παθολογική Κλινική (Δ/ντής ο Καθ. Ν. Κατσιλάμπρος), εσωτερικός βοηθός ειδικευόμενος στην Παθολογία, από 10/1997-2/ Τομέας Παθολογίας του Uniformed Services University of the Health Sciences (USUHS), εργαζόμενη στο Τμήμα Παθολογίας του Ινστιτούτου Walter Reed (Walter Reed Army Hospital and Institute of Research), Washington, DC, ΗΠΑ ως εσωτερικός βοηθός ειδικευόμενος στην Παθολογία, από 2/2000 3/ , Λαϊκό Περ. Γεν. Νοσ/μείο Αθηνών, Α Προπαιδευτική Παθολογική Κλινική (Δ/ντής ο Καθ. Ν. Κατσιλάμπρος), εσωτερικός βοηθός ειδικευόμενος στην Παθολογία, από 3/2001-9/ Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσ/μείο Πατρών, Παθολογική Κλινική (Δ/ντής ο Καθ. Ν. Ζούμπος), εσωτερικός βοηθός ειδικευόμενος στην Αιματολογία, από 9/2002 9/ Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (National Institutes of Health), Bethesda, Maryland, H.Π.A. (Δ/ντής: Neal S. Young), εσωτερικός βοηθός ειδικευόμενος στην Αιματολογία, από 9/2005 9/ Ιούλιος 2007, Τίτλος Ειδικότητος Αιματολογίας, μετά από τις σχετικές εξετάσεις που διενεργήθηκαν τον ίδιο μήνα. 20