ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ. ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Μελέτη της έκφρασης του brain-derived neurotrophic factor (BDNF) σε CD4 + CD25 + T-κύτταρα, CD4 + CD25 - T-κύτταρα και CD4 - peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), ασθενών με υποτροπιάζουσα μορφή πολλαπλής σκλήρυνσης, κατά τη διάρκεια των υποτροπών και στην ύφεση.» Μπούρα Ευαγγελία Επιβλέπων: κ. Ν. Γρηγοριάδης, Επίκουρος Καθηγητής Νευρολογίας, ΑΠΘ Θεσσαλονίκη Ιούνιος, 2007

2 Μελέτη της έκφρασης του brain-derived neurotrophic factor (BDNF) σε CD4 + CD25 + T-κύτταρα, CD4 + CD25 - T-κύτταρα και CD4 - peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), ασθενών με υποτροπιάζουσα μορφή πολλαπλής σκλήρυνσης, κατά τη διάρκεια των υποτροπών και στην ύφεση. Στόχος: Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η εκτίμηση της έκφρασης του BDNF στα CD4 + CD25 + ρυθμιστικά T-λεμφοκύτταρα, στα CD4 + CD25 - T-λεμφοκύτταρα και στα CD4 - PBMCs, ασθενών με υποτροπιάζουσα μορφή πολλαπλής σκλήρυνσης (RRMS), κατά τη διάρκεια των υποτροπών και στην ύφεση. Η μελέτη στοχεύει επίσης στην ανίχνευση πιθανών διακυμάνσεων της παραγωγής BDNF από τα παραπάνω κύτταρα, οφειλόμενων στην αγωγή με κορτικοστεροειδή. Μέθοδοι: 10 ml περιφερικού αίματος συλλέχθηκαν από 8 ασθενείς RRMS, κατά τα εξής χρονικά στιγμιότυπα: στην υποτροπή (πριν την έναρξη του σχήματος κορτικοστεροειδών), μετά 5 ημέρες, μετά 30 ημέρες (χρόνος απομάκρυνσης των κορτικοστεροειδών από το σώμα) και 6 μήνες μετά την υποτροπή, κατά την ύφεση. Όλοι οι ασθενείς ελάμβαναν αγωγή με ιντερφερόνη β ((IFN-β). Συλλογή αίματος έγινε και από 7 υγιείς μάρτυρες, με αντίστοιχο φύλο και ηλικία. Αρχικά, έγινε ο εμπλουτισμός των CD4 + T-κυττάρων από κάθε δείγμα και ακολούθησε η απομόνωση των CD4 + CD25 + T-κυττάρων και ο εμπλουτισμός των CD4 - PBMCs, από το ίζημα που προέκυψε με τον εμπλουτισμό των CD4 + κυττάρων. Η εκτίμηση των πρωτεϊνικών επιπέδων του BDNF έγινε με Western blotting. Αποτελέσματα: Ο BDNF δεν ανιχνεύθηκε στα CD4 + CD25 + και στα CD4 + CD25 - κύτταρα, με την τεχνική του Western blotting. Στα CD4 - PBMCs, η παραγωγή του BDNF δεν έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφόρων χρονικών στιγμιοτύπων. Ωστόσο, τα επίπεδα του BDNF στην ύφεση έτειναν να είναι χαμηλότερα, σε σύγκριση με αυτά των υγιών μαρτύρων. Συμπεράσματα: Τα CD4 + CD25 + αλλά και τα CD4 + CD25 - T-κύτταρα δε φαίνεται να εκφράζουν BDNF, τουλάχιστον σε επίπεδα ανιχνεύσιμα με Western blotting, κάτω από τις συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες. Τα κύτταρα CD4 - τείνουν να παράγουν BDNF σε χαμηλότερα επίπεδα από αυτά των υγιών μαρτύρων, κατά τη διάρκεια της ύφεσης. Λόγω της απουσίας στατιστικά σημαντικών αποτελεσμάτων, δεν μπορούν να εξαχθούν συγκεκριμένα συμπεράσματα ως προς την τυχόν επίδραση των κορτικοστεροειδών στην έκφραση του BDNF από τα προαναφερθέντα κύτταρα. 2

3 Study of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) expression in CD4 + CD25 + T- cells, CD4 + CD25 - T-cells and CD4 - peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), from relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS) patients, during relapses and in remission. Objectives: the aim of the present study is to assess the expression of BDNF in CD4 + CD25 + regulatory T-lymphocytes, CD4 + CD25 - T-lymphocytes and CD4 - PBMCs, from relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS) patients, during relapses and in remission. The study also aims to detect possible corticosteroid-induced variations in BDNF production by the above mentioned cells. Methods: 10 ml of peripheral blood were collected from 8 RRMS patients at the following time points: at relapse (before the beginning of the corticosteroid course), 5 days later, 30 days later (after corticosteroid clearance from the body) and 6 months after the relapse, in remission. All patients were treated with interferon-beta (IFN-β). Blood was also collected from 7 healthy age- and sex-matched controls. CD4 + T-cells enrichment from each sample was followed by CD4 + CD25 + T-cells isolation from CD4 + T-cells and CD4 - PBMCs enrichment, from the pellet that occurred from CD4 + T-cells enrichment. BDNF protein levels were estimated with Western blotting. Results: BDNF was not detectable in CD4 + CD25 + or CD4 + CD25 - T-cells, with Western blotting. In CD4 - PBMCs, BDNF production showed no statistically significant differences, among the various time points. However, BDNF levels in remission tended to be lower, compared to those of healthy controls. Conclusions: CD4 + CD25 +, as well as CD4 + CD25 - T-cells, do not seem to express BDNF, at least at levels detectable with Western blotting, under the specific experimental conditions. CD4 - cells tend to produce BDNF at lower levels than those of healthy controls, during remission. Due to the absence of statistically significant results, no definite conclusions can be conferred as to the influence of corticosteroids on BDNF levels. 3

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη Abstract 1. Πολλαπλή σκλήρυνση 1.1 Επιδημιολογία 1.2 Αιτιολογία 1.3 Παθογένεση 1.4 Κλινική εικόνα 1.5 Διάγνωση 1.6 Πρόγνωση 1.7 Θεραπεία 1.7.α Αντιμετώπιση των υποτροπών 1.7.β Ανοσοτροποποιητική αγωγή 1.7.γ Συμπτωματική θεραπεία 2. Ο ρόλος των CD4 + και CD4 + CD25 + T λεμφοκυττάρων στην πολλαπλή σκλήρυνση 2.1 Τα CD4 + Τ λεμφοκύτταρα 2.2 Τα CD4 + CD25 + ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα 3. Ο ρόλος του BDNF στην πολλαπλή σκλήρυνση 3.1 Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) 3.2 BDNF και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος 4. Σκοπός της εργασίας 5. Υλικό Μέθοδοι 5.1 Συλλογή δειγμάτων 5.2 Εμπλουτισμός του υποπληθυσμού των CD4 + Τ λεμφοκυττάρων 5.3 Απομόνωση CD4 + CD25 + Τ-λεμφοκυττάρων 5.4 Εμπλουτισμός CD4 - PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) 5.5 Απομόνωση ολικού RNA από τα CD4 + CD25 - και CD4 + CD Προετοιμασία πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων Σελίδα

5 5.7 Ανοσοανίχνευση πρωτεϊνών κατά Western Western blotting Ποσοτικός προσδιορισμός των πρωτεϊνικών ζωνών Αποτελέσματα Συμπεράσματα Παράρτημα Βιβλιογραφία 48 Ευχαριστίες 52 5

6 1. Πολλαπλή σκλήρυνση Η πολλαπλή σκλήρυνση ή σκλήρυνση κατά πλάκας είναι μια χρόνια αυτοάνοση απομυελινωτική νόσος του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ), με συνήθως υποτροπιάζουσα και ενίοτε προϊούσα πορεία. Έχουν περάσει πάνω από 100 χρόνια από την περιγραφή των κλινικών και παθολογοανατομικών χαρακτηριστικών της από τους Charcot, Carswell, Cruveilhier και άλλους επιστήμονες της εποχής. Ωστόσο, η νόσος εξακολουθεί να προκαλεί τους ερευνητές να κατανοήσουν την παθογένεση και να προλάβουν την εξέλιξή της. Η έναρξη της νόσου γίνεται τυπικά στη νεαρή ενήλικη ηλικία και η πρόγνωσή της ποικίλλει. Περίπου 50% των ασθενών θα χρειασθεί βοήθεια στη βάδιση μέσα σε 15 χρόνια από την έναρξη της νόσου (1). Οι βραχυπρόθεσμες κλινικές και απεικονιστικές (μέσω MRI) εκδηλώσεις της δραστηριότητας της νόσου έχουν περιοριστεί με τις νέες θεραπείες, αν και ο βαθμός της μακροπρόθεσμης ωφέλειας από τις θεραπείες αυτές θα πρέπει να διευκρινιστεί με περαιτέρω έρευνα. 1.1 Επιδημιολογία Ο επιπολασμός της πολλαπλής σκλήρυνσης στην Ευρώπη κυμαίνεται στους ασθενείς (2), ενώ καταγράφονται ασθενείς στις ΗΠΑ (3). Η συχνότητα της νόσου αυξάνεται με την αύξηση του γεωγραφικού πλάτους, τόσο προς το νότιο όσο και προς το βόρειο ημισφαίριο, με ζώνες μεγαλύτερης συχνότητας τη βόρεια Ευρώπη, τον Καναδά, τις βόρειες πολιτείες των ΗΠΑ και την Αυστραλία. Υπάρχουν όμως και επιδημιολογικές μελέτες που αμφισβητούν την παραπάνω πεποίθηση και υποστηρίζουν ότι η κατανομή της νόσου εμφανίζει διακυμάνσεις ακόμη και μέσα στην ίδια χώρα και φαίνεται να διαμορφώνεται από περιβαλλοντικούς και γενετικούς παράγοντες, καθώς οι περιοχές με συχνή επίπτωση τείνουν να σχηματίζουν εστίες (2,4). Ειδικά για το βορειοελλαδικό χώρο και το διάστημα , η μέση ετήσια επίπτωση ήταν 1,79 ανά κατοίκους, με τάση αύξησης για το διάστημα Ο επιπολασμός το 1984 ήταν 29,5 ανά κατοίκους, κατατάσσοντας τη Βόρεια Ελλάδα στη ζώνη μέσης συχνότητας κατά Kurtzke (5). 6

7 1.2 Αιτιολογία Όσον αφορά την αιτιολογία της πολλαπλής σκλήρυνσης, υπάρχει η γενική πεποίθηση ότι πρόκειται για μια διαταραχή του ανοσοποιητικού που συμβαίνει σε ανθρώπους με προδιάθεση να αναπτύξουν τη νόσο. Σύμφωνα με πρόσφατες επιδημιολογικές μελέτες, η προδιάθεση καθορίζεται από περιβαλλοντικούς και γενετικούς παράγοντες (6). Η επίδραση γενετικών παραγόντων υποστηρίζεται από παρατηρήσεις, σύμφωνα με τις οποίες η πολλαπλή σκλήρυνση εμφανίζεται φορές συχνότερα σε συγγενείς πρώτου βαθμού, σε σχέση με το γενικό πληθυσμό, με τη συχνότητα να μειώνεται παράλληλα με το βαθμό συγγένειας. Η αυξημένη επίπτωση σε οικογένειες δεν αφορά υιοθετημένα μέλη αυτών των οικογενειών. Μελέτες σε μονοζυγωτικούς διδύμους έδειξαν ότι η πιθανότητα εμφάνισης πολλαπλής σκλήρυνσης καθορίζεται γενετικά κατά 25-30%, ποσοστό το οποίο μειώνεται σε 3-5% για διζυγωτικούς διδύμους. Η περαιτέρω προσπάθεια διευκρίνισης του σύνθετου γενετικού υποβάθρου της νόσου χρησιμοποιεί μελέτες είτε ολόκληρου του γονιδιώματος είτε υποψηφίων γονιδίων, οι οποίες στοχεύουν στον εντοπισμό συγκεκριμένων προδιαθεσικών γονιδίων. Μέχρι στιγμής, σαφής συσχέτιση φαίνεται να υπάρχει για τον απλότυπο HLA-DRB1 του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MHC). Επίσης, πολυμορφισμοί της ιντερφερόνης γ (IFNγ) και οι αντίστοιχοι απλότυποι φαίνεται να προδιαθέτουν σε εμφάνιση πολλαπλής σκλήρυνσης με φυλο-εξαρτώμενο τρόπο, χωρίς όμως πλήρη επιβεβαίωση. Αντικρουόμενα αποτελέσματα υπάρχουν και για τη συσχέτιση του αλληλομόρφου ε4 της απολιποπρωτεΐνης Ε (ΑΡΟΕ) με προϊούσα πορεία της νόσου και βαρύτερη πρόγνωση, σε σχέση με το αλληλόμορφο ε2. Η περιβαλλοντική επίδραση στην εμφάνιση της πολλαπλής σκλήρυνσης υποστηρίζεται από τη γεωγραφική διακύμανση στην επίπτωση και τον επιπολασμό της νόσου και τη μεταβολή της πιθανότητας νόσησης μετά από μετανάστευση μεταξύ περιοχών διαφορετικής επίπτωσης. Επίσης, έχουν παρατηρηθεί τοπικές και χρονικές συγκεντρώσεις περιστατικών πολλαπλής σκλήρυνσης (π.χ. στις νήσους Faroe και την Ισλανδία) καθώς και το ότι η ταυτόχρονη εμφάνισή της σε μονοζυγωτικούς διδύμους είναι μεν συχνή, χωρίς όμως να αποτελεί κανόνα. Αν και η περιβαλλοντική επιδημιολογία της πολλαπλής σκλήρυνσης είναι ελάχιστα κατανοητή, πρόσφατες έρευνες ενοχοποιούν παράγοντες όπως έκθεση σε ιούς (π.χ. ο ιός Epstein-Barr και ο ερπητοϊός human herpes virus-6), λιπαρά οξέα της 7

8 διατροφής, έκθεση σε οργανικούς διαλύτες και κάπνισμα. Η έκθεση στην ηλιακή υπεριώδη ακτινοβολία και η προσθήκη βιταμίνης D στη διατροφή έχουν συσχετισθεί με μειωμένο κίνδυνο πολλαπλής σκλήρυνσης. Οι παρατηρήσεις αυτές αναδεικνύουν το ρόλο του μεταβολισμού της βιταμίνης D ως μια πιθανή εξήγηση για την αυξημένη συχνότητα πολλαπλής σκλήρυνσης σε συνάρτηση με την απόσταση από τον ισημερινό. 1.3 Παθογένεση Η αλληλουχία των γεγονότων που οδηγούν στην έναρξη της νόσου παραμένει σε αρκετά σημεία αδιευκρίνιστη. Με δεδομένη τη σημαντική κλινική, γενετική, απεικονιστική και παθολογοανατομική ετερογένεια της νόσου, είναι πιθανή η ύπαρξη περισσότερων του ενός παθογενετικών μηχανισμών. Το ενδεχόμενο αυτό επηρεάζει και την αντιμετώπιση της νόσου, καθώς μπορεί να απαιτούνται διαφορετικές θεραπευτικές προσεγγίσεις, ανά περίπτωση. Το παθολογοανατομικό χαρακτηριστικό της πολλαπλής σκλήρυνσης είναι η απομυελινωτική πλάκα, μια σαφώς καθορισμένη περιοχή, η οποία χαρακτηρίζεται από απώλεια της μυελίνης, σχετική διατήρηση των αξόνων και το σχηματισμό αστροκυτταρικών ουλών. Οι βλάβες εντοπίζονται συνήθως στα οπτικά νεύρα, την περικοιλιακή λευκή ουσία, το στέλεχος, την παρεγκεφαλίδα, τη λευκή ουσία του νωτιαίου μυελού και συχνά περιβάλλουν αγγεία μέσου μεγέθους. Τα φλεγμονώδη κύτταρα έχουν τυπικά περιαγγειακή κατανομή, όμως μπορεί να διηθούν διάχυτα το παρέγχυμα. Η σύνθεση του πληθυσμού των κυττάρων της φλεγμονής ποικίλλει ανάλογα με το στάδιο της απομυελινωτικής δραστηριότητας. Σε γενικές γραμμές, αποτελείται από λεμφοκύτταρα και μακροφάγα, με τα τελευταία να επικρατούν στις ενεργές βλάβες. Αν και η επαναμυελίνωση είναι ελάχιστη στις βλάβες της χρόνιας νόσου, οι πλάκες στην οξεία και πρώιμη πολλαπλή σκλήρυνση μπορεί να εμφανίζουν εκτεταμένη επαναμυελίνωση. Επιπλέον, αναφέρεται ότι στις βλάβες της χρόνιας πολλαπλής σκλήρυνσης υπάρχει σημαντικός αριθμός πρόδρομων μορφών ολιγοδενδροκυττάρων. Εφόσον, λοιπόν, η μυελίνη του κεντρικού νευρικού συστήματος μπορεί να επιδιορθωθεί, οι μηχανισμοί που προωθούν την ενδογενή επαναμυελίνωση ενδέχεται να αντιπροσωπεύουν μια εφικτή θεραπευτική στρατηγική. Γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες, οι οποίοι περιλαμβάνουν ιικές λοιμώξεις, βακτηριακούς λιποπολυσακχαρίτες, υπεραντιγόνα, δραστικούς μεταβολίτες και μεταβολικό στρες, μπορούν να διευκολύνουν τη μετακίνηση 8

9 αυτοαντιδρώντων Τ κυττάρων και απομυελινωτικών αντισωμάτων από τη συστηματική κυκλοφορία στο ΚΝΣ, μέσω της διάσπασης του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (Εικ. 1). Στο ΚΝΣ, τοπικοί παράγοντες (όπως ιικές λοιμώξεις και μεταβολικό στρες) μπορούν να αυξήσουν την έκφραση ενδοθηλιακών μορίων προσκόλλησης, όπως τα ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1), VCAM-1 (vascular-cell adhesion molecule 1) και η Ε-σελεκτίνη, διευκολύνοντας περαιτέρω την είσοδο των Τ κυττάρων στο ΚΝΣ. Πρωτεάσες, όπως οι μεταλλοπρωτεϊνάσες στρώματος, μπορούν να ενισχύσουν επιπλέον τη μετανάστευση των αυτοαντιδρώντων ανοσιακών κυττάρων, αποδομώντας μακρομόρια του εξωκυττάριου στρώματος (1). Προφλεγμονώδεις κυτοκίνες που εκκρίνονται από ενεργοποιημένα Τ κύτταρα, όπως η IFNγ και ο TNFβ (tumor necrosis factor β), μπορούν να αυξήσουν την έκφραση μορίων της κυτταρικής επιφάνειας σε γειτονικά λεμφοκύτταρα και αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APCs). Έχει προταθεί η ύπαρξη Τ κυττάρων που αντιδρούν με ορισμένα υποθετικά μυελινικά και μη αυτοαντιγόνα, τα οποία περιλαμβάνουν τη βασική πρωτεΐνη της μυελίνης (ΜΒΡ), τη σχετιζόμενη με τη μυελίνη γλυκοπρωτεΐνη (MAG), τη γλυκοπρωτεΐνη της μυελίνης των ολιγοδενδροκυττάρων (MOG), την πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη, την αβ-κρυσταλλίνη, φωσφοδιεστεράσες και την πρωτεΐνη S-100. Η αρχική ευαισθητοποίηση των Τ κυττάρων θεωρείται ότι προκύπτει ως επακόλουθο της έκθεσής τους σε εξωγενείς παράγοντες, πιθανώς ιικής προέλευσης. Η δομική ομολογία των εξωγενών παραγόντων με συστατικά της μυελίνης συνεπάγεται τη διασταυρούμενη αντίδραση των Τ κυττάρων με τα αυτοαντιγόνα του ΚΝΣ, στα πλαίσια του φαινομένου της μοριακής μιμητικότητας (7). Η δέσμευση των παραπάνω αυτοαντιγόνων στο τριμοριακό σύμπλεγμα (συναποτελούμενο από τον Τ-κυτταρικό υποδοχέα (TCR) και τα μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MHC) τάξης ΙΙ, στα APCs) αποτελεί το έναυσμα είτε μιας ενισχυμένης ανοσιακής απάντησης έναντι του δεσμευμένου αντιγόνου είτε «ανενεργησίας», ανάλογα με τον τύπο του σήματος που προκύπτει από την αλληλεπίδραση των επιφανειακών συνδιεγερτικών μορίων (π.χ. CD28 και CTLA-4) με τους συνδέτες τους (π.χ. Β7-1 και Β7-2). Η μειορρύθμιση της ανοσιακής απάντησης (ανενεργησία) προκαλεί την έκλυση αντιφλεγμονωδών κυτοκινών [ιντερλευκίνη 1 (IL-1), ιντερλευκίνη 4 (IL-4) και ιντερλευκίνη 10 (IL-10)] από τα CD4 + Τ λεμφοκύτταρα, με αποτέλεσμα τον πολλαπλασιασμό των CD4 + βοηθητικών Τ κυττάρων, τύπου 2 (Th2). Τα Th2 κύτταρα 9

10 στέλνουν κατασταλτικά της φλεγμονής σήματα στα ενεργοποιημένα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Εναλλακτικά, αν η δέσμευση του αντιγόνου οδηγήσει σε ενίσχυση της ανοσιακής απάντησης, οι προφλεγμονώδεις κυτοκίνες [ιντερλευκίνη 12 (IL-12) και IFNγ] προκαλούν την έναρξη ενός «καταρράκτη» γεγονότων, που καταλήγει στον πολλαπλασιασμό των CD4 + βοηθητικών Τ κυττάρων, τύπου 1 (Th1) και τελικά σε ανοσιακής αιτιολογίας βλάβη της μυελίνης και των ολιγοδενδροκυττάρων. Ως προς την προσβολή της μυελίνης και των ολιγοδενδροκυττάρων, υπάρχουν διάφοροι θεωρητικοί μηχανισμοί: βλάβη μέσω των κυτοκινών, πέψη των επιφανειακών μυελινικών αντιγόνων από μακροφάγα μέσω δέσμευσης με αντισώματα έναντι μυελίνης και ολιγοδενδροκυττάρων, βλάβη μέσω ενεργοποίησης του συμπληρώματος και άμεση προσβολή των ολιγοδενδροκυττάρων από CD4 + και CD8 + Τ λεμφοκύτταρα. Από τη βλάβη της μυελίνης, προκύπτουν απογυμνωμένοι νευράξονες, οι οποίοι δεν είναι πλέον ικανοί να μεταδώσουν αποτελεσματικά τα δυναμικά δράσης στο ΚΝΣ (απώλεια της αγωγής κατά άλματα). Αυτή η επιβράδυνση ή παρεμπόδιση της μετάδοσης των δυναμικών δράσης οδηγεί στην εμφάνιση των νευρολογικών συμπτωμάτων. Τα εκτεθειμένα τμήματα των αξόνων είναι ευάλωτα σε επιπλέον προσβολή από διαλυτούς φλεγμονώδεις παράγοντες (π.χ. κυτοκίνες, χημειοκίνες, συστατικά του συμπληρώματος και πρωτεάσες), με αποτέλεσμα τις μη αναστρέψιμες αξονικές βλάβες. Υπάρχουν, όμως, ορισμένοι πιθανοί μηχανισμοί επιδιόρθωσης του μυελινικού ελύτρου, οι οποίοι περιλαμβάνουν τη λύση της φλεγμονώδους αντίδρασης με επακόλουθη αυτόματη επαναμυελίνωση, τη μετακίνηση διαύλων νατρίου από τους κόμβους του Ranvier, ώστε να καλυφθούν τα γυμνά τμήματα των αξόνων και να αποκατασταθεί η αγωγή του ερεθίσματος και την επαναμυελίνωση που προκύπτει από τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση των πρόδρομων ολιγοδενδροκυττάρων της περιοχής. Επανειλημμένες υποτροπές της νόσου μπορεί να έχουν σαν αποτέλεσμα μη αναστρέψιμες βλάβες των νευραξόνων, γλοίωση και εξάντληση της δεξαμενής των ολιγοδενδροκυττάρων, οδηγώντας έτσι στην προοδευτική απώλεια νευρολογικής λειτουργικότητας. 1.4 Κλινική εικόνα Τα συμπτώματα με τα οποία παρουσιάζεται ο ασθενής και η χρονική εξέλιξη των κλινικών ευρημάτων μπορεί να υποδηλώνουν τη διάγνωση. Η υποτροπιάζουσα μορφή της νόσου (relapsing-remitting, RRMS), η οποία αφορά το 85% των ασθενών, 10

11 χαρακτηρίζεται από αυτοπεριοριζόμενες εξάρσεις νευρολογικής δυσλειτουργίας. Οι εξάρσεις εκδηλώνονται αιφνιδίως και εξελίσσονται σε διάστημα ημερών ή εβδομάδων. Ακολουθεί σταθεροποίηση και συνήθως βελτίωση, αυθόρμητα ή μετά από θεραπεία με κορτικοειδή, μέσα σε διάστημα μερικών εβδομάδων. Η υποτροπιάζουσα πολλαπλή σκλήρυνση τυπικά εμφανίζεται κατά τη δεύτερη ή τρίτη δεκαετία και είναι συχνότερη στις γυναίκες, με αναλογία περίπου 2:1. Η τάση των κορτικοστεροειδών να επιταχύνουν την ανάρρωση από τις υποτροπές συχνά αποδυναμώνεται με την πάροδο του χρόνου. Η δευτεροπαθώς προϊούσα μορφή πολλαπλής σκλήρυνσης (secondary progressive multiple sclerosis, SPMS) ξεκινά ως υποτροπιάζουσα, όμως μετά από 6-10 χρόνια ο ρυθμός των εξάρσεων μειώνεται και η κλινική εικόνα χαρακτηρίζεται από σταθερή επιδείνωση, ανεξάρτητη από υποτροπές. Ένα ποσοστό 15% των ασθενών εμφανίζουν την πρωτοπαθώς προϊούσα μορφή πολλαπλής σκλήρυνσης (primary progressive multiple sclerosis, PPMS), η οποία χαρακτηρίζεται από σταθερά εξελισσόμενη λειτουργική επιδείνωση, από την έναρξη της νόσου, χωρίς οξείες προσβολές. Η πρωτοπαθώς προϊούσα μορφή εμφανίζει παρόμοια επίπτωση μεταξύ ανδρών και γυναικών. Ο τέταρτος και σπανιότερος τύπος, η προϊούσα υποτροπιάζουσα μορφή (progressive-relapsing multiple sclerosis, PRMS), αρχίζει επίσης με μια προοδευτική πορεία, αν και οι ασθενείς εμφανίζουν επίσης περιστασιακές εξάρσεις. Η υποτροπιάζουσα πολλαπλή σκλήρυνση κατά κανόνα αρχίζει με αισθητικές διαταραχές, μονόπλευρη οπτική νευρίτιδα, διπλωπία (διαπυρηνική οφθαλμοπληγία), σημείο Lhermitte (παραισθησίες του κορμού και των άκρων που εκλύονται με κάμψη του αυχένα), αδυναμία των άκρων, αδεξιότητα, αταξία βάδισης και συμπτώματα νευρογενούς κύστεως και δυσλειτουργίας του εντέρου. Πολλοί ασθενείς περιγράφουν αίσθημα κόπωσης που επιδεινώνεται το απόγευμα και συνοδεύεται από αύξηση της θερμοκρασίας σώματος. Η έναρξη των συμπτωμάτων μετά τον τοκετό και η επιδείνωσή τους με την αύξηση της θερμοκρασίας σώματος (σύμπτωμα Uhthoff) καθώς και οι ψευδοεξάρσεις με τον πυρετό υποδηλώνουν τη διάγνωση. Ορισμένοι ασθενείς έχουν επαναλαμβανόμενα, σύντομα, στερεοτυπικά φαινόμενα (παροξυσμικό πόνο ή παραισθησίες, νευραλγία τριδύμου, επεισοδιακή αδεξιότητα ή δυσαρθρία και τονική θέση των άκρων), τα οποία είναι ιδιαίτερα ενδεικτικά της πολλαπλής σκλήρυνσης. Χαρακτηριστικά φλοιικά σημεία (αφασία, απραξία, επαναλαμβανόμενες επιληπτικές κρίσεις, απώλεια οπτικού πεδίου και πρώιμη άνοια) μόνο σπάνια 11

12 επικρατούν στην κλινική εικόνα. Κατά περίπτωση, μπορεί να προκαλούν προβλήματα η νοητική διαταραχή, η κατάθλιψη, η συναισθηματική αστάθεια, η δυσαρθρία, η δυσφαγία, ο ίλιγγος, η προοδευτική τετραπάρεση και απώλεια της αισθητικότητας, ο αταξικός τρόμος, ο πόνος, η σεξουαλική δυσλειτουργία, η σπαστικότητα και άλλες εκδηλώσεις δυσλειτουργίας του ΚΝΣ. Οι ασθενείς με πρωτοπαθή προϊούσα πολλαπλή σκλήρυνση συχνά παρουσιάζονται με ένα αργά εξελισσόμενο σύνδρομο άνω κινητικού νευρώνα των κάτω άκρων («χρόνια προοδευτική μυελοπάθεια»). Τυπικά, αυτή η παραλλαγή επιδεινώνεται βαθμιαία και μπορεί να αναπτυχθούν τετραπάρεση, νοητική έκπτωση, απώλεια όρασης, σύνδρομα εγκεφαλικού στελέχους και παρεγκεφαλιδική, εντερική, κυστική και σεξουαλική δυσλειτουργία. 1.5 Διάγνωση Η διάγνωση βασίζεται σε καθιερωμένα κλινικά και, όταν απαιτείται, εργαστηριακά κριτήρια, τα κριτήρια McDonald (8,9). Οι υποτροπιάζουσες μορφές θεωρούνται βέβαιες όταν η νευρολογική δυσλειτουργία εμφανίζει «διασπορά στο χώρο και στο χρόνο». Η πρωτοπαθής προϊούσα μορφή μπορεί να υποδηλώνεται κλινικά από μια προοδευτική πορεία που διαρκεί περισσότερο από 1 έτος, όμως συνιστώνται εργαστηριακές εξετάσεις για επιπλέον υποστηρικτικά στοιχεία και ο αποκλεισμός άλλων πιθανώς ιάσιμων παθήσεων, όπως η δομική ή μεταβολική μυελοπάθεια. Στη μαγνητική τομογραφία (MRI), ευρήματα πολυεστιακών βλαβών διαφόρων ηλικιών, ειδικά όσα αφορούν την περικοιλιακή λευκή ουσία, το στέλεχος, την παρεγκεφαλίδα και τη λευκή ουσία του νωτιαίου μυελού, υποστηρίζουν την κλινική εντύπωση. Η παρουσία εστιών στο MRI, που δίνουν ενισχυμένο σήμα με τη χορήγηση του σκιαστικού γαδολίνιο, υποδεικνύει θέσεις τρέχουσας φλεγμονώδους απομυελίνωσης (ενεργές εστίες). Επί διαγνωστικών αμφιβολιών, η επανάληψη του MRI μετά μερικούς μήνες ίσως δείξει ότι οι βλάβες «διασπείρονται στο χρόνο». Η ανάλυση του εγκεφαλονωτιαίου υγρού (ΕΝΥ) συχνά δείχνει αυξημένη ενδορραχιαία σύνθεση ανοσοσφαιρινών περιορισμένης ειδικότητας (μπορεί να υπάρχουν ολιγοκλωνικές ζώνες ή αυξημένη σύνθεση IgG), με μέτρια λεμφοκυττάρωση (σχεδόν πάντα υπάρχουν λιγότερα από 50 μονοπύρηνα κύτταρα). Οι ηλεκτροφυσιολογικές ενδείξεις υποκλινικής δυσλειτουργίας των οπτικών νεύρων και του νωτιαίου μυελού (μεταβολές στα οπτικά και σωματοαισθητικά 12

13 προκλητά δυναμικά) μπορούν να υποστηρίξουν το συμπέρασμα της «διασποράς στο χώρο». Επομένως, η μαγνητική τομογραφία και τα προκλητά δυναμικά επιβεβαιώνουν τη διάγνωση σε ασθενείς με ύποπτες μεμονωμένες κλινικές εκδηλώσεις. 1.6 Πρόγνωση Η πορεία της πολλαπλής σκλήρυνσης σε ένα συγκεκριμένο ασθενή είναι σε μεγάλο βαθμό απρόβλεπτη. Ωστόσο, οι προγνωστικές πληροφορίες που διαθέτουμε είναι σημαντικές για την καθοδήγηση των ασθενών και το σχεδιασμό κλινικών μελετών. Οι ασθενείς με κλινικά μεμονωμένο σύνδρομο (π.χ. οπτική νευρίτιδα, δυσλειτουργία του στελέχους ή ατελή εγκάρσια μυελίτιδα) διατρέχουν μεγαλύτερο κίνδυνο υποτροπής των συμβάντων και αναπηρίας μέσα σε μια δεκαετία, αν το MRI αναδείξει μεταβολές σε ασυμπτωματικές περιοχές του εγκεφάλου. Η παρουσία ολιγοκλωνικών ζωνών στο ΕΝΥ αυξάνει ελαφρά τον κίνδυνο υποτροπιάζουσας νόσου. Ένα ποσοστό 10% των ασθενών έχουν καλή πορεία για περισσότερο από 20 χρόνια και θεωρείται ότι έχουν καλοήθη πολλαπλή σκλήρυνση. Περίπου 70%, όμως, θα μεταπέσει στη δευτεροπαθή προϊούσα μορφή. Οι συχνές υποτροπές κατά τα δύο πρώτα χρόνια, μια προοδευτική πορεία από την αρχή, το ανδρικό φύλο και πρώιμα μόνιμα κινητικά ή παρεγκεφαλιδικά ευρήματα είναι ανεξάρτητα αν και όχι απόλυτα προγνωστικά σημεία μιας πιο σοβαρής κλινικής πορείας. Οι γυναίκες και οι ασθενείς με αισθητικά συμπτώματα και οπτική νευρίτιδα έχουν ευνοϊκότερη πρόγνωση. Το προσδόκιμο επιβίωσης ενδέχεται να μειωθεί ελαφρά. Σε σπάνιες περιπτώσεις, ασθενείς με την κεραυνοβόλο μορφή της νόσου πεθαίνουν μέσα σε μήνες από την έναρξή της, ενώ υπαρκτός είναι και ο κίνδυνος της αυτοκτονίας, ακόμη και σε νέους ασθενείς με ήπια συμπτώματα (1). 1.7 Θεραπεία Οι κύριοι στόχοι της θεραπευτικής αντιμετώπισης είναι η πρόληψη των υποτροπών και της συνεπαγόμενης συσσώρευσης αναπηρίας, η οποία επιδρά αρνητικά στις δραστηριότητες της καθημερινής ζωής και μπορεί τελικά να περιορίσει την ικανότητα του ασθενούς προς εργασία και να υποβαθμίσει την ποιότητα ζωής του. Για το σκοπό αυτό, είναι πλέον διαθέσιμη στους ασθενείς μια ομάδα ανοσοτροποποιητικών φαρμάκων, καθώς και τα πιο περιορισμένων ενδείξεων ανοσοκατασταλτικά φάρμακα. Ένας ακόμη βραχυπρόθεσμος θεραπευτικός στόχος 13

14 αφορά την αντιμετώπιση των υποτροπών και στοχεύει στην κατά το δυνατόν ταχύτερη και πληρέστερη ανάρρωση του ασθενούς. Παράλληλα, εφαρμόζονται η συμπτωματική θεραπεία, για την αντιμετώπιση των συμπτωμάτων της νόσου, και η υποστηρικτική θεραπεία, που περιλαμβάνει τη φυσική αποκατάσταση και την ψυχολογική στήριξη. Η υποτροπή ορίζεται ως ένα επεισόδιο νευρολογικής διαταραχής, με χαρακτηριστικά συμβατά με πολλαπλή σκλήρυνση, διάρκειας μεγαλύτερης των 24 ωρών, με απουσία πυρετού ή λοίμωξης και με παρουσία αντικειμενικών νευρολογικών σημείων. Μονήρη παροξυσμικά επεισόδια (π.χ. τονικός σπασμός) δε συνιστούν υποτροπή, όμως πολλαπλά επεισόδια, που συμβαίνουν σε ένα διάστημα όχι μικρότερο των 24 ωρών, θα μπορούσαν να αποτελούν υποτροπή. (9) 1.7.α Αντιμετώπιση των υποτροπών Η αντιμετώπιση των κλινικά σημαντικών υποτροπών της νόσου γίνεται κατά κανόνα με κορτικοστεροειδή, σε μια προσπάθεια να επιταχυνθεί η ανάρρωση. Συνήθως χορηγείται ένα πενθήμερο σχήμα ενδοφλέβιας μεθυλπρεδνιζολόνης (τουλάχιστον 500 mg - 1 g ημερησίως), το οποίο προαιρετικά ακολουθείται από βραχεία χορήγηση πρεδνιζόνης (1). Ο ακριβής τρόπος δράσης των κορτικοστεροειδών στην πολλαπλή σκλήρυνση δεν είναι σαφής. Ωστόσο, οι πιθανοί τρόποι δράσης περιλαμβάνουν τη μείωση του οιδήματος, τη σταθεροποίηση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, τη μείωση των προφλεγμονωδών κυτοκινών και την πρόκληση απόπτωσης των Τ-λεμφοκυττάρων, κυρίως των CD4 +, αλλά και των CD8 + (10). Σύμφωνα με κλινικές μελέτες τάξης Ι και ΙΙ, φαίνεται ότι από τη θεραπεία με κορτικοστεροειδή προκύπτει βραχυπρόθεσμο όφελος σε ότι αφορά τη λειτουργική ανάρρωση, σε ασθενείς με οξεία προσβολή πολλαπλής σκλήρυνσης. Υπάρχει επομένως σύσταση επιπέδου Α για τη θεραπεία των ώσεων με κορτικοστεροειδή (11,12). Ωστόσο, δε φαίνεται να υπάρχει μακροπρόθεσμο λειτουργικό όφελος από τη βραχεία χρήση των κορτικοστεροειδών, στη συγκεκριμένη συγκυρία (σύσταση επιπέδου Β) (12). Επίσης, επί του παρόντος, δεν υπάρχουν αδιαμφισβήτητα στοιχεία που να δείχνουν ότι το όποιο κλινικό όφελος επηρεάζεται από την οδό χορήγησης, τη δοσολογία και το συγκεκριμένο είδος κορτικοστεροειδούς (σύσταση επιπέδου C) (11). Η αντιμετώπιση της υποτροπής με μεθυλπρεδνιζολόνη θα ήταν καλό να ακολουθείται από εντατικά προγράμματα αποκατάστασης, διεπιστημονικής 14

15 προσέγγισης, καθώς υπάρχουν ενδείξεις ότι τέτοια προγράμματα βελτιώνουν την ανάρρωση (σύσταση επιπέδου Β) (11). Ασθενείς που δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία με μεθυλπρεδνιζολόνη μπορεί να ωφεληθούν από την πλασμαφαίρεση, αν και αναμένεται ανταπόκριση από το ένα τρίτο των ασθενών, στους οποίους εφαρμόζεται. Αυτή η θεραπευτική παρέμβαση θα έπρεπε πιθανώς να περιορίζεται στην υποομάδα ασθενών με πολύ σοβαρές υποτροπές (σύσταση επιπέδου Β) (11). Ως προς τη χρήση ενδοφλέβιας ανοσοσφαιρίνης (IVIG) ως μονοθεραπείας για τις υποτροπές της πολλαπλής σκλήρυνσης, δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα. Ωστόσο, η IVIG σαν συμπλήρωμα της θεραπείας με μεθυλπρεδνιζολόνη ή σαν μονοθεραπεία για την οξεία οπτική νευρίτιδα δε θεωρείται αποτελεσματική (σύσταση επιπέδου Α) (11). 1.7.β Ανοσοτροποποιητική αγωγή Για την προφύλαξη των ασθενών από τις υποτροπές, έχουν αναπτυχθεί αρκετά ανοσοτροποιητικά φάρμακα, μεταξύ των οποίων τρία σκευάσματα ιντερφερόνης β (IFNβ), ένα σκεύασμα IFNβ-1b και δύο σκευάσματα IFNβ-1a, καθώς και ο παράγοντας glatiramer acetate, γνωστός και ως copolymer 1. H IFNβ-1b (Betaferon ή Betaseron ) χορηγείται υποδορίως κάθε δύο ημέρες. Το ένα σκεύασμα IFNβ-1a (Avonex ) χορηγείται ενδομυικώς μία φορά την εβδομάδα, ενώ το άλλο (Rebif ) υποδορίως τρεις φορές την εβδομάδα. Το glatiramer acetate (Copaxone ) χορηγείται υποδορίως κάθε ημέρα. Μέχρι στιγμής, υπάρχουν ουσιαστικά δεδομένα για το ότι τα φάρμακα αυτά επηρεάζουν τη φυσική πορεία της νόσου. Ειδικότερα, η IFNβ έχει αποδειχθεί αποτελεσματική στη μείωση της συχνότητας (κατά 30% περίπου) αλλά και της βαρύτητας των υποτροπών, όπως επίσης και στη μείωση της συσσώρευσης βλαβών στον εγκέφαλο, σύμφωνα με απεικονιστικά δεδομένα (σύσταση τύπου Α) (12). Επίσης, υπάρχουν ενδείξεις για το ότι καθυστερεί την εξέλιξη της νευρολογικής δυσλειτουργίας, όπως αυτή αξιολογείται με την κλίμακα EDSS (σύσταση τύπου Β) (12). Ανάλογα συμπεράσματα έχουν προκύψει από κλινικές μελέτες για το glatiramer acetate, τόσο ως προς την εμφάνιση των υποτροπών όσο και ως προς την καθυστέρηση της εξέλιξης της αναπηρίας (12). Ο ακριβής τρόπος με τον οποίο οι παραπάνω παράγοντες παρεμβαίνουν και τροποποιούν την πορεία της πολλαπλής σκλήρυνσης δεν είναι πλήρως κατανοητός. Οι ιντερφερόνες καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων, μειώνουν την 15

16 παρουσίαση των αντιγόνων και μεταβάλλουν το προφίλ έκκρισης κυτοκινών, ευνοώντας εκείνες που αλληλεπιδρούν θετικά με τα Τh2 κύτταρα, με αποτέλεσμα την καταστολή της φλεγμονής (π.χ. μειώνουν την παραγωγή TNFα (tumor necrosis factor α) και αυξάνουν την έκκριση της IL-10). Επίσης, εμποδίζουν τη διέλευση των ανοσιακών κυττάρων μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, ασκώντας τις δράσεις τους στα μόρια προσκόλλησης, τις χημειοκίνες και τις πρωτεάσες (13). Ο παράγοντας glatiramer acetate είναι ένα μίγμα συνθετικών πολυπεπτιδίων, που περιέχουν τα L-αμινοξέα γλουταμικό οξύ, αλανίνη, λυσίνη και τυροσίνη. Το glatiramer acetate δρα ανταγωνιζόμενο τη βασική πρωτεΐνη της μυελίνης ως προς την παρουσίαση στα μόρια MHC τάξης ΙΙ, αναστέλλοντας επομένως την ενεργοποίηση ειδικών ως προς το αυτοαντιγόνο Τ κυττάρων (13). Επίσης, θεωρείται ότι ευνοεί τον πολλαπλασιασμό των Τh2 κυττάρων, σε σχέση με τα Τh1 κύτταρα και ότι προκαλεί την έκκριση νευροτροφικών παραγόντων από τα ανοσιακά κύτταρα (14). Η αξιολόγηση της απάντησης στη θεραπεία γίνεται λαμβάνοντας υπ όψη: α) τη συχνότητα των υποτροπών και το αν οι ασθενείς οδηγούνται σε πλήρη αποκατάσταση, β) την πρόοδο της νόσου σύμφωνα με την κλίμακα EDSS και γ) την εμφάνιση νέων ή την επέκταση υπαρχουσών εστιών, κατά την απεικόνιση του εγκεφάλου με MRI (15). Κριτήριο για ενδεχόμενη αλλαγή της θεραπείας αποτελεί και η εμφάνιση στον ορό του ασθενούς εξουδετερωτικών αντισωμάτων (Nabs), έναντι των σκευασμάτων IFNβ, αν και η κλινική τους σημασία δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί. Πρόσφατα, στο θεραπευτικό φάσμα της πολλαπλής σκλήρυνσης έχει προστεθεί το μονοκλωνικό αντίσωμα natalizumab (Tysabri ), αν και η εφαρμογή του γίνεται με επιφύλαξη, λόγω των περιστατικών προϊούσας πολυεστιακής λευκοεγκεφαλοπάθειας (PML), που είχαν σημειωθεί κατά τις κλινικές δοκιμές. Το natalizumab δεσμεύει την αλυσίδα a4 της ιντεγκρίνης a4b1, η οποία είναι μόριο προσκόλλησης που εκφράζεται στην επιφάνεια των CD4 + κυττάρων και των μακροφάγων. Έτσι, παρεμποδίζεται η είσοδος των ενεργοποιημένων ανοσιακών κυττάρων στο ΚΝΣ, μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Ο ιδιαίτερος αυτός μηχανισμός δράσης έχει αποδώσει, μέχρι στιγμής, ενθαρρυντικά θεραπευτικά αποτελέσματα (13). 1.7.γ Συμπτωματική θεραπεία Κατά την πορεία της πολλαπλής σκλήρυνσης, εμφανίζονται συμπτώματα, η αντιμετώπιση των οποίων είναι σημαντική για την ποιότητα ζωής του ασθενούς (16). 16

17 Για την αντιμετώπιση της σπαστικότητας, μπορούν να χορηγηθούν μπακλοφένη, από του στόματος ή με αντλία ενδορραχιαίας έγχυσης, τιζανιδίνη, διαζεπάμη, γκαμπαπεντίνη ή αλλαντοτοξίνη τύπου Α, σε συνδυασμό με φυσιοθεραπεία και ασκήσεις χαλάρωσης. Η κόπωση απαιτεί προσαρμογή του τρόπου ζωής του ασθενούς, έτσι ώστε να αποφεύγονται οι παράγοντες που την επιδεινώνουν. Από φαρμακευτικής πλευράς, το αίσθημα καταβολής μπορεί να αντιμετωπιστεί με μονταφινίλη, αμανταδίνη ή αναστολείς επαναπρόσληψης της σεροτονίνης, για βελτίωση της τυχόν συνυπάρχουσας κατάθλιψης. Σε ό,τι αφορά την κυστική δυσλειτουργία, η ακράτεια ούρων μπορεί να αντιμετωπιστεί με αντιχολινεργικούς παράγοντες και τοποθέτηση μόνιμου υπερηβικού καθετήρα, ενώ η επίσχεση ούρων και η ατελής κένωση της κύστης, μπορεί να απαιτήσουν αυτοκαθετηριασμούς. Στην ανακούφιση του νευροπαθητικού πόνου, συμβάλλουν η γκαμπαπεντίνη, η λαμοτριγίνη και η καρβαμαζεπίνη, η οποία επίσης χρησιμοποιείται στην αντιμετώπιση της παροξυσμικής δυστονίας. 2. Ο ρόλος των CD4 + και CD4 + CD25 + T λεμφοκυττάρων στην πολλαπλή σκλήρυνση 2.1 Τα CD4 + T λεμφοκύτταρα Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξής τους, τα Τ λεμφοκύτταρα εκφράζουν στην επιφάνειά τους διάφορα αντιγόνα επιφανείας, μεταξύ των οποίων τα CD4 και CD8. Έτσι, ανάλογα με το αντιγόνο επιφανείας (CD4 + ή CD8 + ), προκύπτουν δύο διαφορετικές σειρές Τ λεμφοκυττάρων, τα CD4 + και CD8 + Τ λεμφοκύτταρα, οι οποίες χαρακτηρίζονται από διαφορετικές ιδιότητες. Τα CD4 + Τ λεμφοκύτταρα έχουν την ιδιότητα να πολλαπλασιάζονται ως κλώνοι κυττάρων, όταν τους παρουσιάζεται ένα αντιγόνο από τα μακροφάγα ή άλλα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, που εκφράζουν μόρια MHC τάξης ΙΙ. Τότε, τα CD4 + κύτταρα διαφοροποιούνται σε δύο υποπληθυσμούς, τα Th1 και Th2 κύτταρα. Αυτοί οι υποπληθυσμοί διακρίνονται από το πρότυπο κυτοκινών που παράγουν. Τα Th1 κύτταρα παράγουν IL-2, IFNγ και TNFβ, ενώ τα Th2 κύτταρα παράγουν IL-4, IL-5, IL-10 και TGFβ. Οι διαφορές στις παραγόμενες κυτοκίνες αντανακλώνται και σε επίπεδο λειτουργίας, καθώς τα Th1 κύτταρα ενεργοποιούν τα μακροφάγα, μέσω της IFNγ και θεωρείται ότι προάγουν τη 17

18 φλεγμονώδη αντίδραση. Αντίθετα, τα Th2 κύτταρα ενεργοποιούν τα Β λεμφοκύτταρα, μέσω των IL-4 και IL-5 και αναστέλλουν την ανάπτυξη των Th1 κυττάρων, μέσω της IL-10. Όπως προκύπτει από πειραματικά μοντέλα της πολλαπλής σκλήρυνσης, π.χ. από την πειραματική αλλεργική εγκεφαλομυελίτιδα (ΕΑΕ), αυτοαντιδρώντα λεμφοκύτταρα, ειδικά έναντι της μυελίνης, και συγκεκριμένα CD4 + Τh1 κύτταρα, παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανοσοπαθογένεια της πολλαπλής σκλήρυνσης (17). Η ενεργοποίηση των CD4 + Τ κυττάρων της συστηματικής κυκλοφορίας από εξωγενείς παράγοντες προκαλεί την έκφραση μορίων προσκόλλησης στην επιφάνειά τους και διευκολύνει τη διέλευση στο ΚΝΣ, μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Εκεί, τα CD4 + Τ κύτταρα αναγνωρίζουν τα αντιγόνα στόχους πάνω στα APCs και ακολουθεί η διαφοροποίησή τους σε Τh1 κύτταρα και η έκκριση προφλεγμονωδών κυτοκινών και διαλυτών μεσολαβητών της φλεγμονής (IFNγ, TNFα και ΝΟ). Ακολουθεί η ενίσχυση της ανοσιακής απάντησης, η οποία οδηγεί στην καταστροφή της μυελίνης και των ολιγοδενδροκυττάρων. Η ύφεση της φλεγμονής επέρχεται με την επιστράτευση των Th2 κυττάρων, τα οποία εκκρίνουν τις αντιφλεγμονώδεις κυτοκίνες IL-4, IL-10 και TGFβ. 2.2 Τα CD4 + CD25 + ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα Η κλωνική διαγραφή των αυτοαντιδρώντων Τ κυττάρων, που συμβαίνει στο θύμο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των Τ κυττάρων, είναι ατελής, δεδομένου του ότι δυνητικά επιβλαβή αυτοαντιδρώντα κύτταρα υπάρχουν και στην κυκλοφορία υγιών ατόμων. Αυτό σημαίνει ότι στη διατήρηση της ανοσολογικής αυτοανοχής συμβάλλουν και άλλοι μηχανισμοί, μεταξύ των οποίων και η δράση των ρυθμιστικών Τ κυττάρων. Τα CD25 + ή ρυθμιστικά (regulatory) T κύτταρα αποτελούν υποπληθυσμό των CD4 + Τ κυττάρων. Η παρουσία τους αποτελεί αναγκαία προϋπόθεση για την ομαλή λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος, καθώς έχουν την ιδιότητα να καταστέλλουν τη δραστικότητα και τον πολλαπλασιασμό των αυτοαντιδρώντων Τ λεμφοκυττάρων. Ο δείκτης CD25 αναφέρεται στην α αλυσίδα του υποδοχέα υψηλής συγγένειας της IL-2, η παρουσία του οποίου χαρακτηρίζει την ομάδα των ρυθμιστικών κυττάρων. Η ανάπτυξη και διαφοροποίηση των φυσικά εμφανιζόμενων CD25 + κυττάρων γίνεται στο θύμο, απ όπου απελευθερώνονται στη συστηματική κυκλοφορία. Ο 18

19 χαρακτηρισμός «φυσικά εμφανιζόμενα» αντιδιαστέλλει τα ρυθμιστικά από άλλα Τ κύτταρα, τα οποία επίσης μπορούν να εκφράσουν το δείκτη CD25 μετά από διέγερση, χωρίς όμως να διαθέτουν κατασταλτικές ιδιότητες. Τα φυσικά εμφανιζόμενα ρυθμιστικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από την υπερέκφραση του μεταγραφικού παράγοντα FOXP3, ο οποίος είναι απαραίτητος για την ανάπτυξή τους. Άλλοι παράγοντες που επίσης εκφράζονται από τα ρυθμιστικά κύτταρα είναι οι CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4) και GITR (glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor). Σύμφωνα με μελέτες που έγιναν σε πειραματόζωα και αργότερα επιβεβαιώθηκαν και σε ανθρώπους, τα CD25 + κύτταρα χαρακτηρίζονται από τις εξής ιδιότητες (18) : κατ αρχήν, βρίσκονται σε ανενεργησία, καθώς δεν πολλαπλασιάζονται μετά από διέγερση με αντισώματα αντι- CD3. Ασκούν κατασταλτική δράση έναντι των συμβατικών CD4 + CD25 - Τ κυττάρων, in vitro. Η καταστολή γίνεται με μη ειδικό ως προς κάποιο αντιγόνο τρόπο και απαιτεί άμεση κυτταρική επαφή, καθώς δεν φαίνεται να μεσολαβείται από κάποιον διαλυτό παράγοντα, αν και υπάρχουν αντικρουόμενα δεδομένα ως προς τον πιθανό ρόλο των IL-10 και TGFβ, ιδιαίτερα για την καταστολή in vivo. Επίσης, η καταστολή δε θα μπορούσε να αποδοθεί σε κάποια απόκλιση της αναλογίας Th1/Th2 κυττάρων, καθώς δεν επηρεάζεται από αντισώματα έναντι των IL-4, IL-10 και TGFβ. Τέλος, παρά το ότι η IL-2 είναι απαραίτητη για τη διαφοροποίηση και ανάπτυξη των CD25 +, τα ίδια τα κύτταρα δεν μπορούν να τη συνθέσουν. Ο μηχανισμός της κατασταλτικής δράσης των ρυθμιστικών κυττάρων δεν είναι ακόμη σαφής. Πιθανολογείται, όμως, ότι η καταστολή επιτυγχάνεται μέσω της σύνδεσης του επιφανειακού μορίου CTLA-4 με τους συνδέτες CD80/CD86, με ή χωρίς τη μεσολάβηση αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων (19). Από πειράματα σε διαγονιδιακά ζώα, φάνηκε ότι η παρουσία των ρυθμιστικών κυττάρων ήταν σημαντική για την προστασία των οργανισμών από αυτοάνοσα νοσήματα. Επίσης, θεωρείται ότι παίζουν ρόλο στην πρόληψη της απόρριψης μοσχεύματος και στην ανοσιακή απάντηση σε όγκους και εξωγενή αντιγόνα. Στο πειραματικό πρότυπο της ΕΑΕ, αλλά και σε άλλα μοντέλα αυτοάνοσων διαταραχών, τα ρυθμιστικά κύτταρα έδειξαν τον προστατευτικό τους ρόλο έναντι της αυτοανοσίας. Σε ασθενείς με πολλαπλή σκλήρυνση, διαπιστώθηκε από σχετικές μελέτες (20,21), ότι ενώ ο πληθυσμός των ρυθμιστικών κυττάρων δεν υπολειπόταν του φυσιολογικού, η ικανότητά τους για καταστολή των CD25 - κυττάρων ήταν περιορισμένη. 19

20 3. Ο ρόλος του BDNF στην πολλαπλή σκλήρυνση 3.1 BDNF (brain-derived neurotrophic factor) Η πρωτεΐνη BDNF είναι νευροτροφικός παράγοντας και ανήκει στην οικογένεια των νευροτροφινών, τα μέλη της οποίας έχουν κοινά δομικά χαρακτηριστικά. Η οικογένεια αυτή περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες NGF (nerve growth factor), BDNF (brain-derived growth factor), NT-3 (neurotrophin-3) και NT-4/5 (neurotrophin-4/5). Επίσης, σε είδη ψαριών έχουν ανακαλυφθεί πρόσφατα οι νευροτροφίνες ΝΤ-6 και ΝΤ-7. Πρώτα ανακαλύφθηκε ο NGF και ακολούθησαν αρκετά χρόνια αργότερα οι άλλοι παράγοντες (22). Για να ασκήσει τις δράσεις του, ο BDNF δεσμεύεται με τον υψηλής συγγένειας υποδοχέα της κινάσης της τυροσίνης trkb και τον χαμηλής συγγένειας υποδοχέα p75, ο οποίος είναι κοινός για όλες τις νευροτροφίνες. Η δέσμευση αυτή διεγείρει το διμερισμό και την αυτοφωσφορυλίωση των υποδοχέων, αλλάζει ενδοκυτταρικά σήματα μέσω της ΜΑΡ κινάσης και μεταβάλλει χαρακτηριστικά των νευρώνων που περιλαμβάνουν ενίσχυση των μετασυναπτικών ρευμάτων, μέσω μηχανισμών που περιλαμβάνουν ενισχυμένη δραστηριότητα του υποδοχέα NMDA (23) (Εικόνα 2). Εκτός από το ρόλο του ως νευροπεπτίδιο νευροδιαβιβαστή, που ενισχύει τη συναπτική μετάδοση και συμβάλλει στην πλαστικότητα των συνάψεων, ο BDNF δείχνει ισχυρή τροφική δραστηριότητα. Στον αναπτυσσόμενο οργανισμό, παίζει ρόλο στην επιβίωση, ανάπτυξη και διαφοροποίηση διαφόρων νευρωνικών πληθυσμών, συμπεριλαμβανομένων των αισθητικών, παρεγκεφαλιδικών και νωτιαίων κινητικών νευρώνων (22). Ακόμη, όμως και στο ώριμο νευρικό σύστημα, ο BDNF προάγει την επιβίωση των νευρώνων, ρυθμίζοντας την ανταπόκρισή τους σε τραυματικές ή εκφυλιστικές διαδικασίες (24,25). Το γονίδιο του BDNF βρίσκεται στο χρωμόσωμα 11, στη θέση 11p13. Πρόκειται για ένα γονίδιο με αρκετά πολύπλοκη δομή, καθώς αποτελείται από 8 εξόνια, τα οποία σχηματίζουν 10 διαφορετικά κωδικοποιούντα μεταγραφήματα και άλλα 11 εξόνια, τα οποία σχηματίζουν 7 μη κωδικοποιούντα μεταγραφήματα (26) (Εικόνα 3). Τα πολυάριθμα εναλλακτικά πρότυπα splicing και μεταγραφής προσδίδουν μια αξιοσημείωτη ετερογένεια στα πρότυπα έκφρασης του BDNF, στους διάφορους ιστούς και στις διάφορες περιοχές του εγκεφάλου. Από την πολυπλοκότητα του γονιδίου, προκύπτουν 4 ισομορφές του BDNF, η συνηθέστερη εκ των οποίων είναι ο probdnf1. 20

21 Ο BDNF συντίθεται αρχικά σαν προ-προbdnf, ο οποίος είναι ένα πολυπεπτίδιο μήκους 247 αμινοξέων. Στο αμινοτελικό του άκρο φέρει ένα πεπτίδιο σήμανσης, το οποίο αποκόπτεται με την είσοδό του στο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο. Προκύπτει έτσι η πρόδρομη μορφή του BDNF, μήκους 229 αμινοξέων, η οποία έχει μοριακό βάρος περίπου 32 kda. Η πρόδρομη αυτή μορφή υφίσταται Ν- γλυκοσυλίωση και γλυκοθείωση σε αμινοξέα στην προ-περιοχή της. Έπειτα, στο δίκτυο trans-golgi, αποκόπτεται το αμινοτελικό της άκρο και προκύπτει η ώριμη μορφή του BDNF, με 119 αμινοξέα και μοριακό βάρος περίπου 14 kda. Από μια διαφορετική διαδικασία, προκύπτει σε μικρότερο βαθμό και μια μικρότερη της πρόδρομης μορφής, βάρους 28 kda (27). Σύμφωνα με πειραματικά δεδομένα, ακόμη και η πρόδρομη μορφή του BDNF είναι βιολογικά ενεργή, καθώς μπορεί να προωθήσει την αυτοφωσφορυλίωση του υποδοχέα trkb. Η τελική πρωτεϊνη έχει μορφή ομοδιμερούς, τα μονομερή του οποίου συνδέονται με μη ομοιοπολικούς δεσμούς. Πρόκειται για βασική πρωτεΐνη, με ισοηλεκτρικό σημείο πάνω από 9.0. Εξαιτίας της παρουσίας τριών δισουλφιδικών δεσμών με τέτοια διάταξη ώστε το μόριο να έχει μορφή διπλής αγκύλης, ο BDNF και οι νευροτροφίνες γενικότερα κατατάσσονται στην υπεροικογένεια του δεσμού κυστεΐνης (Cysteine Knot Superfamily) (27). Ο ώριμος πλέον BDNF συσκευάζεται σε κυστίδια, μεταφέρεται είτε σε προσυναπτικές απολήξεις νευραξόνων είτε σε μετασυναπτικούς δενδρίτες και ακολουθεί η τοπική έκκριση, η οποία ακολουθεί το ρυθμιζόμενο πρότυπο, δηλαδή προκύπτει ως απάντηση σε ερέθισμα (Εικόνα 4). 4.2 BDNF και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος Η κύρια πηγή προέλευσης του BDNF είναι τα κύτταρα του νευρικού ιστού. Ωστόσο, σε μικρότερο βαθμό έχει εντοπιστεί σε πολλούς ιστούς του ανθρώπινου σώματος, μεταξύ των οποίων και στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Η αναζήτηση της σχέσης του BDNF με τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος ξεκίνησε με βάση πειραματικά δεδομένα που υποδήλωναν ότι οι αυτοάνοσες αντιδράσεις στο ΚΝΣ μπορούν επίσης να επιφέρουν προστατευτικά αποτελέσματα στα τραυματισμένα νευρικά κύτταρα. Συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε ότι η μεταφορά αυτοαντιδρώντων ως προς τη μυελίνη Τ κυτταρικών σειρών αύξησε την επιβίωση των γαγγλιακών κυττάρων του αμφιβληστροειδούς, μετά από τραυματισμό του οπτικού νεύρου (24). Επίσης, η ενεργός ανοσοποίηση με εγκεφαλιτιδογόνο πεπτίδιο της 21

22 μυελίνης άσκησε παρόμοια δράση σε νωτιαίους κινητικούς νευρώνες, μετά από διακοπή της κοιλιακής ρίζας (25). Πάνω σ αυτό το φαινομενικά παράδοξο, διεξήχθησαν αρκετές μελέτες που υποστηρίζουν την ιδέα ότι η εξήγηση βρίσκεται στη μεταφορά νευροπροστατευτικών παραγόντων από λευκοκύτταρα. Κατ αρχήν, έχει βρεθεί ότι CD4 + Τ κυτταρικοί κλώνοι παράγουν και εκκρίνουν BDNF καθώς και τη νευροτροφίνη ΝΤ-3 (28). Επίσης, ενεργοποιημένα Τ κύτταρα, Β κύτταρα και μονοκύτταρα παράγουν BDNF in vitro, αλλά και in situ, σε φλεγμονώδεις βλάβες του εγκεφάλου (29). Ο BDNF βρέθηκε να είναι παρών και σε Τ κύτταρα, μακροφάγα/μικρογλοιακά κύτταρα και αντιδρώντα αστροκύτταρα, σε εγκεφαλικές βλάβες πολλαπλής σκλήρυνσης (30). Παράλληλα, μπορεί να αναφερθεί το πειραματικό εύρημα ότι μη διεγερμένα μονοκύτταρα παράγουν σταθερά BDNF, ενώ ο BDNF δεν ήταν ανιχνεύσιμος στα υπερκείμενα καλλιεργειών Τ και Β κυττάρων. Το παραπάνω αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε και με ανοσοκυτταροχημικές μεθόδους (31). Ειδικά σε ό,τι αφορά την πολλαπλή σκλήρυνση, οι παραπάνω ιδιότητες των νευροτροφινών παρουσιάζουν ενδιαφέρον, καθώς η εξέλιξη της μη αναστρέψιμης αναπηρίας οφείλεται κυρίως στην απώλεια νευραξόνων και όχι τόσο στην απομυελίνωση. Έτσι, η νευροπροστασία μπορεί να αποτελέσει έναν επιπρόσθετο θεραπευτικό στόχο, εκτός από την ανοσοτροποποίηση και την ανοσοκαταστολή. Ως προς την έκφραση του BDNF σε ασθενείς με πολλαπλή σκλήρυνση, μέχρι στιγμής, έχουν καταγραφεί τα εξής δεδομένα. Σύμφωνα με μια σύγκριση μεταξύ ασθενών ΠΣ και υγιών μαρτύρων, δε βρέθηκε διαφορά ως προς τα επίπεδα έκκρισης BDNF από διεγερμένα και μη διεγερμένα PBMCs. Ωστόσο, τα επίπεδα του BDNF ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με RRMS, μετά την έναρξη της υποτροπής και στη φάση ανάρρωσης, σε σχέση με τη σταθερή φάση (32). Ακολούθησε μια μελέτη, η οποία διαπίστωσε αυξημένη έκφραση BDNF σε PBMCs ασθενών με ΠΣ, σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες και ασθενείς άλλων νευρολογικών παθήσεων. Ειδικότερα, διαπιστώθηκε ότι ο BDNF εκφράζεται σε CD4+, CD8+, NK και B κύτταρα. Μάλιστα, τα CD4+ T κύτταρα εμφάνισαν διπλάσιο επίπεδο έκφρασης BDNF, σε σχέση με τους άλλους πληθυσμούς (33). Επιπλέον, σημειώνεται η διαπίστωση σημαντικής αύξησης του BDNF κατά την υποτροπή ασθενών που δεν έπαιρναν ανοσοτροποποιητική ή άλλη θεραπεία, σε σύγκριση με τη σταθερή φάση που ακολούθησε καθώς και ότι τα επίπεδα του BDNF σε ασθενείς με πλήρη ύφεση ήταν σημαντικά υψηλότερα σε σχέση με αυτά των ασθενών με μερική ύφεση. Μετά 22

23 την υποτροπή, τα υψηλά επίπεδα του BDNF διατηρήθηκαν στους ασθενείς με πλήρη ύφεση (34). Μια άλλη μελέτη διαπίστωσε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα BDNF στον ορό ασθενών, σε σχέση με τους μάρτυρες (35). Η εικόνα συμπληρώνεται με την εύρεση μιας τάσης αύξησης στην παραγωγή BDNF, μετά από 1 χρόνο θεραπείας με IFΝβ, σε σύγκριση με το αρχικό χρονικό σημείο (36). 4. Σκοπός της εργασίας Ανακεφαλαιώνοντας, συμπεραίνουμε ότι η πολλαπλή σκλήρυνση είναι μια νόσος, η αντιμετώπιση της οποίας είναι ιδιαίτερα σύνθετη. Μια από τις πτυχές της μελλοντικής αντιμετώπισης θα μπορούσε να εστιάσει στο νευροπροστατευτικό ρόλο των νευροτροφικών παραγόντων και ιδιαίτερα του BDNF, ο οποίος είναι και ο πληρέστερα μελετημένος ως προς αυτό το θέμα. Τα μέχρι στιγμής βιβλιογραφικά δεδομένα δείχνουν μια τάση αύξησης του BDNF στα διάφορα στάδια της υποτροπής, χωρίς όμως να είναι σε απόλυτη συμφωνία μεταξύ τους ή να διευκρινίζεται ποιοι υποπληθυσμοί των ανοσιακών κυττάρων συμμετέχουν στην πιθανή νευροπροστασία. Όπως είδαμε, υπάρχουν αναφορές, αν και αντικρουόμενες, ως προς την παραγωγή BDNF από τα CD4 + Τ κύτταρα. Αντίθετα, για τα ρυθμιστικά CD4 + CD25 + Τ κύτταρα, που επίσης θα μελετήσουμε, δεν υπάρχουν αντίστοιχα δεδομένα. Στην εργασία που ακολουθεί, μελετήθηκαν τα επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης του BDNF από τα CD4 + CD25 -, τα CD4 + CD25 + Τ κύτταρα και τα CD4 - PBMCs ασθενών με υποτροπιάζουσα μορφή πολλαπλής σκλήρυνσης, υπό αγωγή με ιντερφερόνη β. Η μελέτη αφορά τα εξής χρονικά σημεία: κατά την έναρξη της υποτροπής, 5 ημέρες αργότερα, με την ολοκλήρωση του σχήματος μεθυλπρεδνιζολόνης, 30 ημέρες αργότερα, όταν δηλαδή έχει απομακρυνθεί η μεθυλπρεδνιζολόνη από τον οργανισμό και τέλος, στη σταθερή φάση της νόσου, δηλαδή 6 μήνες μετά την υποτροπή. Η αναλυτική μελέτη των παραπάνω χρονικών σημείων στοχεύει, εκτός από την παρακολούθηση του BDNF στις διάφορες φάσεις της νόσου, και στην ανίχνευση της πιθανής επίδρασης των κορτικοστεροειδών στην έκφραση του BDNF από τα ανοσιακά κύτταρα. 23

24 5. Υλικά και Μέθοδοι 5.1 Συλλογή δειγμάτων ml ολικού περιφερικού αίματος συλλέχθηκαν από 9 ασθενείς με ιστορικό RRMS, υπό ανοσοτροποποιητική αγωγή με IFNβ. Με την παρουσίαση των ασθενών στο νοσοκομείο, έγινε η εξέτασή τους και η αξιολόγησή τους σύμφωνα με την κλίμακα EDSS (Expanded Disability Status Scale). Η δειγματοληψία του αίματος έγινε αφού επιβεβαιώθηκε σε αυτούς η κατάσταση της ώσης. Η μεταφορά του αίματος έγινε σε σωληνάρια συλλογής αίματος (Κ 3 -EDTA, BD Vacutainer). Τα νοσοκομεία που συνεργάστηκαν για το σκοπό αυτό ήταν τα πανεπιστημιακά νοσοκομεία ΑΧΕΠΑ (Β Νευρολογική Κλινική, υπεύθυνος κ. Ν. Γρηγοριάδης) και Ιπποκράτειο (Νευρολογική Κλινική, υπεύθυνη κ. Γ. Δερετζή) Θεσσαλονίκης. Στους ασθενείς χορηγήθηκε το τυπικό πενθήμερο σχήμα μεθυλπρεδνιζολόνης (Solumedrol, Pharmacia-Upjohn), με 1000 mg / ημέρα ενδοφλεβίως. Με την ολοκλήρωση του σχήματος, την έκτη ημέρα μετά από την εισαγωγή στο νοσοκομείο, πραγματοποιήθηκε νέα δειγματοληψία ολικού αίματος, όπως παραπάνω. Η συλλογή δειγμάτων επαναλήφθηκε δύο ακόμη φορές. Συγκεκριμένα, ελήφθησαν δείγματα τριάντα ημέρες μετά την διακοπή χορήγησης κορτικοστεροειδών, διάστημα κατά το οποίο η κορτιζόνη θεωρητικά δεν είναι πλέον ανιχνεύσιμη στο αίμα (REF) και περίπου έξι μήνες μετά την εισαγωγή, περίοδο κατά την οποία οι ασθενείς βρίσκονται σε ύφεση. Η τελευταία δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε εφόσον ο ασθενής δεν παρουσίασε στο διάστημα αυτό κάποια νέα ώση. Δείγματα αίματος ελήφθησαν επίσης από 8 υγιή άτομα και μάλιστα με τέτοιον τρόπο, ώστε να αντιστοιχούν στους ασθενείς ως προς την ηλικία και το φύλο. Συνοπτικά, το χρονικό πλαίσιο συλλογής των δειγμάτων δίνεται στον Πίνακα Εμπλουτισμός του υποπληθυσμού των CD4 + T-λεμφοκυττάρων Ο εμπλουτισμός των CD4 + T-λεμφοκυττάρων έγινε με τη χρήση του RosetteSep human CD4 + T cell enrichment cocktail, ακολουθώντας το προτεινόμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Stem Cell Τechnology, 15022). Η διαδικασία είναι σχετικά απλή. Βασίζεται στην παρουσία πολλών διαφορετικών αντισωμάτων, τα οποία προκαλούν σταυροσύνδεση (crosslinking) όλων των άλλων τύπων κυττάρων που είναι παρόντα στο αίμα (όπως CD8, CD16, CD19 και CD56) με τα ερυθρά αιμοσφαίρια, εκτός των επιθυμητών κυττάρων, 24

25 δηλαδή των CD4 +. Αποτέλεσμα της σταυροσύνδεσης είναι ο σχηματισμός ανοσοροζετών (Εικόνα 5), οι οποίες λόγω του μεγαλύτερου βάρους τους μπορούν να διαχωριστούν από τα CD4 + κύτταρα με φυγοκέντρηση. Η αναμενόμενη καθαρότητα των εμπλουτισμένων CD4 + κυττάρων με βάση στοιχεία του κατασκευαστή είναι 90 ± 5%. Ακολουθεί αναλυτικά το πειραματικό πρωτόκολλο εμπλουτισμού των CD4 + Τ-λεμφοκυττάρων. Εδώ θα πρέπει να σημειωθεί ότι όλες οι πειραματικές διεργασίες μετά την δειγματοληψία έως και την απομόνωση του RNA έγιναν όσο ήταν δυνατό πιο γρήγορα, έτσι ώστε να αποφευχθεί η αποικοδόμηση του RNA. 1. Σε 10ml ολικού αίματος προστέθηκαν 500μl του μείγματος RosetteSep human CD4 + T cell enrichment cocktail. Τόσο το αίμα όσο και το μείγμα αντισωμάτων είχαν προηγουμένως αφεθεί εκτός πάγου και ψυγείου αντίστοιχα, ώστε η θερμοκρασία τους να φτάσει τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος χώρου. Μετά από ανάδευση ακολούθησε επώαση για 20min σε θερμοκρασία δωματίου. 2. Το δείγμα αραιώθηκε και αναμείχθηκε με 10ml PBS + 2% FBS (Dulbecco's phosphate buffered saline + 2% fetal bovine serum, Stem Cell Τechnology, 07905), το οποίο είχε αφεθεί επίσης ώστε να φτάσει σε θερμοκρασία δωματίου. 3. Στη συνέχεια το δείγμα μεταφέρθηκε σε ένα νέο δοχείο τύπου falcon των 50ml, που περιείχε ήδη 15ml μέσου πυκνότητας (Ficoll-Paque, Stem Cell Τechnology, 07957). 4. Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 20min στα 1200 x g σε μία swing out κεφαλή της φυγοκέντρου Eppendorf 5810 και με το φρένο να είναι απενεργοποιημένο. 5. Τα εμπλουτισμένα CD4 + Τ-λεμφοκύτταρα βρίσκονταν πλέον στη μέση φάση μεταξύ του μέσου πυκνότητας και διαλύματος PBS, ενώ στο ίζημα βρίσκονταν όλοι οι άλλοι κυτταρικοί τύποι. Τα πρώτα μεταφέρθηκαν σε ένα νέο δοχείο falcon 50ml και φυγοκεντρήθηκαν όπως στο βήμα Αφού αφαιρέθηκε το υπερκείμενο, τα CD4 + Τ-λεμφοκύτταρα που βρίσκονταν πλέον στο ίζημα επαναιωρήθηκαν σε 1ml PBS + 2% FBS και ήταν έτοιμα για τη μετέπειτα απομόνωση του CD4 + CD25 + υποπληθυσμού, που θα περιγραφεί στη συνέχεια. 25

26 Η διαδικασία εμπλουτισμού του υποπληθυσμού των CD4 + T-λεμφοκυττάρων αποδίδεται σχηματικά στην Εικόνα Απομόνωση CD4 + CD25 + Τ-λεμφοκυττάρων Ο CD4 + CD25 + υποπληθυσμός Τ-λεμφοκυττάρων απομονώθηκε από τα CD4 + Τ-λεμφοκύτταρα, τα οποία είχαν εμπλουτιστεί από 10ml ολικού αίματος κατά τη διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω. Η απομόνωσή τους έγινε με τη χρήση των σφαιριδίων Dynabeads CD 25 (Dynal Biotech, ). Πρόκειται για παραμαγνητικά σφαιρίδια πολυστυρενίου, διαμέτρου 4,5 μm, τα οποία είναι επικαλυμμένα με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα, ειδικό για το CD25 αντιγόνο. Πιο συγκεκριμένα, το αντίσωμα αυτό συνδέεται ειδικά με την α-υπομονάδα του CD25 αντιγόνου. Έτσι, η απομόνωση των CD4 + CD25 + κυττάρων γίνεται μετά την σύνδεσή τους με το αντίσωμα και καθώς εκμεταλλευόμαστε τις μαγνητικές ιδιότητες των σφαιριδίων. Ακολουθεί αναλυτικά το πειραματικό πρωτόκολλο απομόνωσης των CD4 + CD25 + Τ-λεμφοκυττάρων ενώ οι εργαστηριακές διαδικασίες αποδίδονται σχηματικά στην Εικόνα 7. Πριν την επώαση των σφαιριδίων με τα CD4 + κύτταρα, 50μl των παραμαγνητικών σφαιριδίων τα οποία περιέχουν 2*10 7 σφαιρίδια τοποθετήθηκαν σε ένα σωληνάριο μικροφυγοκέντρου (eppendorf). Σε αυτά προστέθηκε 1ml PBS + 2% FBS και μετά από ανάδευση, το σωληνάριο μικροφυγοκέντρου τοποθετήθηκε για 1min σε μια μαγνητική βάση, η οποία μαγνητίζει τα σφαιρίδια και τα συγκρατεί στο κάτω μέρος του σωληναρίου. Με μία μικροπιπέττα αφαιρέθηκε το υπερκείμενο, ενώ τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 50μl PBS + 2% FBS και ήταν έτοιμα για να χρησιμοποιηθούν περαιτέρω. Το βήμα αυτό της πλύσης των σφαιριδίων είναι απαραίτητο, προκειμένου τα σφαιρίδια να εξισορροπηθούν στο διάλυμα, στο οποίο λαμβάνει χώρα η απομόνωση των κυττάρων. Η διαδικασία απομόνωσης συνεχίζεται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή των σφαιριδίων. 1. Στο σωληνάριο μικροφυγοκέντρου που περιέχει τα μαγνητικά σφαιρίδια προστίθεται το εναιώρημα των εμπλουτισμένων CD4 + λεμφοκυττάρων. Μετά από ανάδευση, ακολουθεί επώαση για 30min στους 4 C σε έναν περιστρεφόμενο δίσκο (test tube rotator Snijders, 34528). 2. Στη συνέχεια, το σωληνάριο μικροφυγοκέντρου τοποθετείται και πάλι στη μαγνητική βάση για 1min. Το υπερκείμενο που περιέχει τα υπόλοιπα CD4 + 26

27 κύτταρα, εκτός των CD4 + CD25 +, μεταφέρεται σε ένα νέο σωληνάριο μικροφυγοκέντρου. 3. Τα μαγνητικά σφαιρίδια που είναι συνδεδεμένα με τα CD4 + CD25 + πλένονται δύο φορές, με 1ml PBS + 2% FBS κάθε φορά, ώστε να απομακρυνθούν μη ειδικά συνδεδεμένες κυτταρικές προσμείξεις. Το υπερκείμενο μεταφέρεται κάθε φορά σε ένα νέο σωληνάριο μικροφυγοκέντρου. Το τελικό ίζημα που αποτελείται από σφαιρίδια και CD4 + CD25 + Τ- λεμφοκύτταρα μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως έχει για την απομόνωση ολικού RNA, που θα περιγραφεί στη συνέχεια. Τα τρία σωληνάρια μικροφυγοκέντρου που περιέχουν εναιώρημα των CD4 + κυττάρων που δεν συνδέθηκαν με τα σφαιρίδια φυγοκεντρούνται για 5min σε 1200 x g και σε θερμοκρασία δωματίου (Hettich, micro 22). Το υπερκείμενο απομακρύνεται και το ίζημα που αποτελείται από CD4 + κύτταρα είναι επίσης έτοιμο για τη διαδικασία απομόνωσης RNA. 5.4 Εμπλουτισμός CD4 - PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) Μετά τον εμπλουτισμό των CD4 + T-λεμφοκυττάρων και την απομόνωση των CD4 + CD25 + Τ-λεμφοκυττάρων, προέκυψε ένα ίζημα, το οποίο αποτελείτο από ερυθρά αιμοσφαίρια και τα υπόλοιπα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος, εκτός του υποπληθυσμού των CD4 + T-λεμφοκυττάρων (CD4 - PBMCs). Προκειμένου να γίνει δυνατή η περαιτέρω χρησιμοποίηση του πληθυσμού των CD4 - PBMCs, ήταν αναγκαία η απομάκρυνση της αιμοσφαιρίνης, η παρουσία της οποίας εμποδίζει την ανίχνευση πρωτεϊνών με western blotting. Η απομάκρυνση της αιμοσφαιρίνης έγινε με επεξεργασία του ιζήματος με ένα διάλυμα λύσης των ερυθρών αιμοσφαιρίων (EB buffer) και επανειλημμένες φυγοκεντρήσεις (Εικόνα 8). Αναλυτικά, η διαδικασία του εμπλουτισμού είχε ως εξής: Στο ίζημα που προέκυψε μετά τον εμπλουτισμό των CD4 + T-λεμφοκυττάρων, το οποίο προερχόταν από 10 ml ολικού αίματος, έγιναν οι παρακάτω διεργασίες: 1. 1,5 ml του ιζήματος μεταφέρθηκε σε δοχείο τύπου falcon, 15 ml. 2. προστέθηκαν 6 ml παγωμένου EB buffer (Θ=0 C) 3. έγινε ανάμειξη με ήπια αναστροφή του δοχείου, 6-8 φορές 4. το μείγμα επωάστηκε σε πάγο, για 10 min 5. ακολούθησε φυγοκέντρηση με επιτάχυνση 600 g, για 10 min, στους 4 C 27

28 6. μετά τη φυγοκέντρηση, απομακρύνθηκε το υπερκείμενο και έγινε επαναιώρηση του ιζήματος, με προσθήκη 6 ml παγωμένου EB buffer 7. η πλύση του ιζήματος επαναλήφθηκε άλλες δύο φορές, όπως από το βήμα 3 και μετά Η σύνθεση του διαλύματος λύσης των ερυθρών αιμοσφαιρίων είναι η ακόλουθη: EB buffer 72 mm NH4Cl 5 mm KCl 0.5 mm EDTA 10 mm Tris ph Απομόνωση ολικού RNA από τα CD4 + CD25 - και CD4 + CD25 + Η απομόνωση ολικού RNA έγινε με τη χρήση του kit NucleoSpin RNA II (Macherey Nagel, ), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το ολικό RNA απομονώθηκε προκειμένου να χρησιμοποιηθεί σε άλλο ερευνητικό πρωτόκολλο, όμως η διαδικασία περιγράφεται γιατί από τα πρώτα βήματά της προέκυψε το πρωτεϊνικό εκχύλισμα των κυττάρων, που χρησιμοποιήσαμε στη συνέχεια. Η διαδικασία απομόνωσης έχει γενικά ως εξής (Εικόνα 9). Αρχικά, γίνεται λύση των κυττάρων σε διάλυμα που περιέχει υψηλές συγκεντρώσεις χαοτροπικών ουσιών. Το προϊόν λύσης των κυττάρων φυγοκεντρείται και περνά μέσα από ένα φίλτρο ώστε να μειωθεί το ιξώδες του. Στη συνέχεια, αραιώνεται 1:1 με 70% αιθανόλη και μετά από ανάδευση φορτώνεται σε μία νέα στήλη όπου γίνεται η δέσμευση του RNA. Ακολουθεί επώαση με DΝάση Ι που δεν περιέχει ριβονουκλεάσες (RNase-free DNase I), ώστε το δείγμα να απαλλαχθεί από προσμείξεις γενωμικού DNA. Έτσι, αποφεύγονται ψευδή αποτελέσματα κατά την ποσοτικοποίηση μέσω της real time PCR που πρόκειται να ακολουθήσει. Μετά από πλυσίματα της στήλης που γίνονται με σκοπό να απομακρυνθούν τυχόν πρωτεϊνικές ή άλλες προσμείξεις, γίνεται η έκλουση του RNA. Ακολουθεί αναλυτικά το πειραματικό πρωτόκολλο απομόνωσης του ολικού RNA. Σημειώνεται πως όλα τα ακόλουθα βήματα λαμβάνουν χώρα σε θερμοκρασία δωματίου. 28

29 1. Στο κυτταρικό ίζημα προστέθηκαν 350μl του διαλύματος RA1 και 3,5μl >98% β-μερκαπτοαιθανόλη (Sigma, M7154). Μετά από ισχυρή ανάδευση, το διάλυμα φιλτράρεται μέσα από το NucleoSpin Filter unit, με φυγοκέντρηση για 1min στα x g. 2. Στο διάλυμα προστίθενται 350μl 70% αιθανόλης και ακολουθεί ανάμειξη 3. Το δείγμα μεταφέρεται σε μία στήλη NucleoSpin RNA II και φυγοκεντρείται για 30sec στα 8000 x g. 4. Στη στήλη προστίθενται 350μl διαλύματος αφαλάτωσης της μεμβράνης. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1min στα x g. 5. Στη στήλη προστίθενται 95μl διαλύματος DΝάσης Ι. Ακολουθεί επώαση για 30min. 6. Στη στήλη προστίθενται 200μl του διαλύματος RA2 που απενεργοποιεί την DΝάση Ι. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 30sec στα 8000 x g. 7. Η μεμβράνη πλένεται με 600μl του διαλύματος RA3 και φυγοκεντρείται για 30sec στα 8000 x g. 8. Ακολουθεί δεύτερο πλύσιμο με 250μl του διαλύματος RA3 και φυγοκέντρηση για 2min στα x g. 9. Το RNA που είναι συνδεδεμένο στη μεμβράνη εκλούεται σε 40μl νερού και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1min στα x g σε ένα καθαρό σωληνάριο μικροφυγοκέντρου. Η διαδικασία έκλουσης επαναλαμβάνεται ακόμη μία φορά καθώς τα 40μl νερού περνούν με τον ίδιο τρόπο μέσα από την μεμβράνη. Όλα τα δείγματα, πριν από την αποθήκευσή τους στους -80 C, επωάστηκαν για 5 min στους 65 C, έτσι ώστε να αποδιαταχθούν πιθανές δευτερογενείς δομές στα μόρια του RNA. 5.6 Προετοιμασία πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων Σε ό,τι αφορά τους υποπληθυσμούς CD4 + CD25 - και CD4 + CD25 +, το μίγμα πρωτεϊνών που χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοανίχνευση απομονώθηκε παράλληλα με την απομόνωση του ολικού RNA. Ουσιαστικά, πρόκειται για το προϊόν που προκύπτει μετά τη φυγοκέντρηση στο βήμα 3, κατά την απομόνωση του RNA, όπως αυτή περιγράφεται στο Κεφάλαιο 5.4. Tο πρωτεϊνικό εκχύλισμα που προέκυψε κατά τη διαδικασία αυτή αποθηκεύτηκε αρχικά ως είχε, στους -20 C. Πριν την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεϊνες συγκεντρώθηκαν με καθίζηση (methanoprecipitation), 29

30 παρουσία δεκαπλάσιου όγκου μεθανόλης (Fluka, 32212), -80 C, για >16h. Ακολούθησε φυγοκέντρηση του δείγματος στα 14000xg, για 10 min. Τα σωληνάρια μικροφυγοκέντρου αφέθηκαν για <5 min, με ανοιχτό καπάκι σε θερμοκρασία δωματίου, ώστε να εξατμιστούν τυχόν υπολείμματα μεθανόλης. Στη συνέχεια, το πρωτεϊνικό ίζημα διαλυτοποιήθηκε σε διάλυμα μετουσίωσης πρωτεϊνών O Farrel (loading buffer), τελικής συγκέντρωσης 2.5x [125mM Tris-Cl ph 6.8, 5% SDS, 25% γλυκερόλη, 250mM dithiothreitol (DTT) και λίγους κόκκους της χρωστικής Pyronin Y (Sigma)]. Ο όγκος του διαλύματος μετουσίωσης πρωτεϊνών ήταν 40 μl, στην περίπτωση των CD4 + CD25 - Τ λεμφοκυττάρων και 20 μl για τα CD4 + CD25 + Τ λεμφοκύτταρα. Για την προετοιμασία του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος των CD4 - PBMCs κυττάρων ακολουθήθηκε διαφορετική διαδικασία, λόγω του ότι έπρεπε να συμπεριληφθεί το στάδιο του ποσοτικού προσδιορισμού πρωτεϊνικού διαλύματος, κατά Bradford. Αναλυτικά, ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: 1. το ίζημα που προέκυψε από τον εμπλουτισμό των CD4 - PBMCs, διαλύθηκε σε 1 ml lysis buffer [10 ml PBS 1x, 0,05 gr DOC, 50 μl NP40 (Igepal)] 2. προστέθηκαν 5μl DNάσης Ι και 7μl αναστολέων πρωτεασών, σε κάθε δείγμα. 3. τα δείγματα επωάστηκαν για 30 min, στους 37 C 4. τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε σωληνάρια μικροφυγοκέντρου 5. ακολούθησε φυγοκέντρηση για 5 min, σε 14000xg 6. το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε νέα σωληνάρια μικροφυγοκέντρου Στα πρωτεϊνικά διαλύματα που προέκυψαν από την παραπάνω διαδικασία έγινε ποσοτικός προσδιορισμός του πρωτεϊνικού κλάσματος, κατά Bradford. Για τη διαδικασία αυτή ακολουθήθηκαν τα εξής βήματα: 1. 5 μl από κάθε δείγμα προστέθηκαν σε αντίστοιχα σωληνάρια μικροφυγοκέντρου, το κάθε ένα από τα οποία περιείχε 1 ml διαλύματος Roti- Quant 2. σε έξι σωληνάρια μικροφυγοκέντρου, προστέθηκαν 1 ml διαλύματος Roti- Quant, 5 μl lysis buffer και αντίστοιχα 0, 2, 4, 6, 8, 12 μl BSA standard (διάλυμα bovine serum albumin, συγκέντρωσης 1 μg/μl) 3. ακολούθησε επώαση των δειγμάτων για 10 min, σε θερμοκρασία δωματίου 4. με φασματοφωτόμετρο, μετρήθηκε η απορρόφηση των δειγμάτων και των προτύπων διαλυμάτων BSA, στα 260 nm. 30

31 Στα παραπάνω διαλύματα, η ποσότητα της πρωτεΐνης σε μg είναι συνάρτηση πρώτου βαθμού της απορρόφησης. Αυτό σημαίνει, ότι με βάση τις τιμές απορρόφησης των γνωστής συγκέντρωσης διαλυμάτων BSA, μπορούμε να σχηματίσουμε μια ευθεία, από την εξίσωση της οποίας προκύπτει η περιεκτικότητα κάθε δείγματος σε πρωτεΐνη. Στα πρωτεϊνικά διαλύματα των δειγμάτων CD4 - PBMCs, γνωστής πλέον συγκέντρωσης, έγινε συγκέντρωση πρωτεΐνης με καθίζηση σε δεκαπλάσιο όγκο μεθανόλης, όπως περιγράφηκε παραπάνω. Ακολούθησε διαλυτοποίηση του πρωτεϊνικού ιζήματος σε τόσο όγκο O Farrel buffer 2.5x, ώστε σε 20 μl κάθε δείγματος να περιέχονται 60 μg πρωτεΐνης. 5.7 Ανοσοανίχνευση πρωτεϊνών κατά Western Western blotting Με την τεχνική αυτή, γίνεται ποιοτική αλλά και ποσοτική ανάλυση ενός μείγματος πρωτεϊνών, ως προς μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Αρχικά, γίνεται διαχωρισμός των πρωτεϊνών του δείγματος, με την τεχνική της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE). Με την ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE, οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται ανάλογα με το μοριακό τους βάρος, κατά μήκος της πορώδους πηκτής, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Στη συνέχεια, η πηκτή τοποθετείται σε ειδική συσκευή, πάνω σε μια μεμβράνη από PVDF (polyvinylidene fluoride). Με την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου, οι πρωτεΐνες μεταφέρονται από την πηκτή στη μεμβράνη, η οποία έχει την ιδιότητα να τις δεσμεύει μη αναστρέψιμα (transfer). Μετά τη μεταφορά των πρωτεϊνών στη μεμβράνη, η μεμβράνη επωάζεται με το διάλυμα blocking (διάλυμα αλβουμίνης ή άπαχου αφυδατωμένου γάλακτος). Με το πλεόνασμα πρωτεΐνης του διαλύματος blocking, δεσμεύονται οι ελεύθερες θέσεις της μεμβράνης που θα μπορούσαν να δεσμευτούν με πρωτεΐνες και έτσι αποφεύγεται η μη ειδική σύνδεση του αντισώματος με τη μεμβράνη. Στη συνέχεια, γίνεται επώαση της μεμβράνης με το ειδικό αντίσωμα για την πρωτεΐνη που θέλουμε να ανιχνεύσουμε. Η αραίωση του αντισώματος προσδιορίζεται εμπειρικά. Ακολουθεί πλύσιμο της μεμβράνης με ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει απορρυπαντικό (π.χ. PBS ή TBS ph 7.5, με 0.1% Tween 20), ώστε να απομακρυνθεί η περίσσεια του αντισώματος που δεν έχει συνδεθεί ειδικά. Έπειτα, η μεμβράνη επωάζεται με ένα δεύτερο αντίσωμα, το οποίο αναγνωρίζει τις σταθερές περιοχές του πρώτου αντισώματος και είναι χημικά συνδεδεμένο με ένα ένζυμο. Το πλύσιμο της 31

32 μεμβράνης επαναλαμβάνεται και στο τέλος, αφού προσθέσουμε το κατάλληλο υπόστρωμα, ανιχνεύουμε την αντίδραση που καταλύεται από το ένζυμο. Στο πείραμά μας, χρησιμοποιήθηκε το ένζυμο HRP (horseradish peroxidase), σε συνδυασμό με υπόστρωμα χημειοφωταύγειας. Το αποτέλεσμα της αντίδρασης αποτυπώθηκε σε φωτογραφικό φιλμ αυτοραδιογραφίας. Καθώς η ένταση της ζώνης του μορίου στόχου είναι ανάλογη της ποσότητας της πρωτεΐνης που έχει φορτωθεί στην πηκτή, η ανοσοανίχνευση κατά Western μπορεί να χρησιμοποιηθεί όχι μόνο για ποιοτικό, αλλά και για ποσοτικό προσδιορισμό πρωτεϊνών. Ως πρωτεύον αντίσωμα για τον BDNF, χρησιμοποιήθηκε το πολυκλωνικό αντίσωμα anti-bdnf N-20 (sc-546) της Santa Cruz, το οποίο προέρχεται από ορό κουνελιού. Το πρωτεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:200. Ως δευτερεύον αντίσωμα, χρησιμοποιήθηκε πολυκλωνικό αντίσωμα από ορό αίγας, το οποίο αναγνωρίζει τα IgG μόρια του κουνελιού και είναι χημικά συνδεδεμένο με το ένζυμο HRP (Pierce 31460). Το δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1: Για τον έλεγχο του πρωτεϊνικού φορτίου κάθε δείγματος, επιλέχθηκε η ακτίνη, το επίπεδο έκφρασης της οποίας θεωρείται σταθερό. Η ακτίνη των δειγμάτων ανιχνεύθηκε με το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-actin C-2 (sc-8453) της Santa Cruz, το οποίο προέρχεται από ορό ποντικιού και είναι ήδη συνδεδεμένο με το ένζυμο HRP, με αποτέλεσμα να μην απαιτείται δευτερεύον αντίσωμα. Για το αντίσωμα έναντι της ακτίνης, επελέγη η αραίωση 1:1000. Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου SDS-PAGE έγινε με τη συσκευή mini protean cell III της εταιρείας Biorad. Η σύσταση της πηκτής διαχωρισμού, συγκέντρωσης 15% σε ακρυλαμίδιο και όγκου 5 ml, ήταν η εξής: Ακρυλαμίδιο 30% (ακρυλαμίδιο 29%, δισ-ακρυλαμίδιο 1%) 2.5 ml 1.5M Tris-Cl ph ml H 2 O 1.1 ml SDS 10% 50 μl APS 10% 50 μl TEMED 2 μl Η πηκτή διαχωρισμού αφέθηκε να πολυμεριστεί για >3h και έπειτα προστέθηκε το διάλυμα της πηκτής επιστοίβαξης. Η σύσταση της πηκτής επιστοίβαξης, όγκου 2 ml, ήταν η ακόλουθη: 32

33 Ακρυλαμίδιο 30% (ακρυλαμίδιο 29%, δισ-ακρυλαμίδιο 1%) 330 μl 1.5M Tris-Cl ph μl H 2 O 1.4 ml SDS 10% 20 μl APS 10% 20 μl TEMED 2 μl Η πηκτή επιστοίβαξης παρέμεινε περίπου 30 min σε θερμοκρασία δωματίου, για να πολυμεριστεί. Τα πρωτεϊνικά δείγματα, διαλυμένα σε διάλυμα μετουσίωσης πρωτεϊνών, θερμάνθηκαν για 5 min, στους 100 C. Μετά από φυγοκέντρηση για ~30 sec σε 2000g και σε θερμοκρασία δωματίου, 20 μl από κάθε δείγμα φορτώθηκαν σε ένα πηγάδι της πηκτής επιστοίβαξης. Το ρυθμιστικό διάλυμα της ηλεκτροφόρησης (running buffer) αποτελείτο από 25 mm Tris, 250 mm γλυκίνης (Applichem, A3707) και 0.1% SDS (Sigma, L4390). Ως πρωτεϊνικοί μάρτυρες γνωστού μοριακού βάρους, χρησιμοποιήθηκαν οι Prestained Protein Markers, Broad Range (NEB, P7708), με εύρος μοριακών βαρών kda. Η ανάλυση των δειγμάτων έγινε σε ηλεκτρικό πεδίο σταθερής έντασης 25 mα, για 70 min, σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF, με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου σταθερής τάσης 200 V, για 2h, στους 4 C. Κατά τη διάρκεια της ηλεκτρομεταφοράς, το σύστημα πηκτής μεμβράνης ήταν μέσα σε διάλυμα ηλεκτρομεταφοράς (transfer buffer), το οποίο είχε την εξής σύσταση: 48mM Tris, 39mM γλυκίνη, 0.01% SDS και 20% μεθανόλη. Όταν ολοκληρώθηκε η ηλεκτρομεταφορά, η μεμβράνη παρέμεινε για 30 min, τουλάχιστον, σε διάλυμα πλύσης (PBST). Το διάλυμα PBST αποτελείται από διάλυμα φωσφορικών PBS 1x και 0.1% Tween 20. Η σύνθεση του διαλύματος φωσφορικών PBS, όγκου 1 lt και ph 7.4, είναι η εξής: 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na 2 HPO 4 και 0.24g KH 2 PO 4. Ακολούθησε η διαδικασία ανοσοανίχνευσης κατά Western, η οποία περιλαμβάνει τα εξής βήματα: 1. επώαση της μεμβράνης σε διάλυμα blocking, για 1h, σε θερμοκρασία δωματίου. Το διάλυμα blocking αποτελείται από διάλυμα PBST 0.1%, με 5% άπαχο αφυδατωμένο γάλα Carnation, 2% BSA (bovine serum albumin) και 5% FBS (fetal bovine serum). 2. πλύση της μεμβράνης σε PBST, για 5min. 33

34 3. επώαση της μεμβράνης με το πρωτεύον αντίσωμα (anti-bdnf ή anti-actin), αραιωμένο σε διάλυμα blocking, για 1h, σε θερμοκρασία δωματίου. 4. πλύση της μεμβράνης σε PBST για 15 min και έπειτα 3 πλύσεις των 5min. 5. επώαση της μεμβράνης με το δευτερεύον αντίσωμα, αραιωμένο σε διάλυμα blocking, για 1h, σε θερμοκρασία δωματίου (στην περίπτωση της ακτίνης, αυτό το βήμα παραλείπεται). 6. πλύση της μεμβράνης, όπως στο βήμα επώαση της μεμβράνης με το υπόστρωμα SuperSignal West Femto (Pierce 34096), για 5min, σε θερμοκρασία δωματίου. 8. εμφάνιση του αποτελέσματος της αντίδρασης χημειοφωταύγειας, σε φιλμ αυτοραδιογραφίας (Fuji, medical X-ray film super RX), σε σκοτεινό θάλαμο, με χρήση του κατάλληλου εμφανιστικού υγρού (Sigma, P7167-5GA) και μονιμοποιητή (Sigma, P7042-5GA). 5.8 Ποσοτικός προσδιορισμός των πρωτεϊνικών ζωνών Ο ποσοτικός προσδιορισμός με βάση το εύρος των ζωνών της κάθε πρωτεΐνης έγινε με τη χρήση του προγράμματος Image J 1.34 (ελεύθερη χρήση από την ιστοσελίδα Αρχικά, έγινε σάρωση των φιλμ αυτοραδιογραφίας και ακολούθησε η επεξεργασία της ψηφιοποιημένης εικόνας, με το παραπάνω πρόγραμμα. Το εύρος κάθε πρωτεϊνικής ζώνης αντιστοιχεί στην επιφάνεια της κορυφής μιας καμπύλης, η οποία προκύπτει από την επεξεργασία των δεδομένων κάθε εικόνας. Έτσι, οι σχετικές ποσότητες των πρωτεϊνών υπολογίζονται με βάση την αναλογία των επιφανειών των αντίστοιχων προς αυτές κορυφών. 6. Αποτελέσματα Όπως φαίνεται στην Εικόνα 10, ο παράγοντας BDNF δεν ήταν ανιχνεύσιμος στα CD4 + CD25 + Τ κύτταρα, με τη μέθοδο της ανοσοανίχνευσης. Επίσης, όπως προκύπτει από την Εικόνα 11, ο παράγοντας BDNF δεν μπορεί να ανιχνευθεί ειδικά στα CD4 + CD25 - Τ κύτταρα, με τη μέθοδο της ανοσοανίχνευσης. Στα κύτταρα CD4 - PBMCs, ο παράγοντας BDNF είναι ανιχνεύσιμος, όπως φαίνεται ενδεικτικά από την Εικόνα 12. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων ποσοτικοποίησης των πρωτεϊνικών ζωνών έγινε με το πρόγραμμα 34

35 SPSS 10.0 (37). Αρχικά, έγινε έλεγχος της κανονικότητας των τιμών σχετικής έκφρασης του BDNF, με το τεστ Shapiro Wilk, καθώς το πλήθος των παρατηρήσεών μας είναι <50. Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 2, οι τιμές σχετικής έκφρασης του BDNF στους ασθενείς δεν παρουσιάζουν κανονική κατανομή (Sig.<0.01), σε αντίθεση με τις τιμές των υγιών μαρτύρων, που κατανέμονται κανονικά (Sig.=0.29>0.01). Αυτό σημαίνει ότι θα πρέπει να χρησιμοποιήσουμε μη παραμετρικές μεθόδους σύγκρισης και συγκεκριμένα, το τεστ Friedman, για τη σύγκριση μεταξύ χρονικών στιγμιοτύπων σε δείγματα που συνδέονται μεταξύ τους (Πίνακας 3). Από την επεξεργασία αυτή προέκυψε ότι τα επίπεδα του BDNF στους ασθενείς δεν εμφάνισαν στατιστικώς σημαντική διαφορά, μεταξύ των διαφόρων χρονικών στιγμιοτύπων (Sig.=0.896>0.01). Στο Σχήμα 1, φαίνεται η διακύμανση της σχετικής έκφρασης του BDNF στα διάφορα χρονικά στιγμιότυπα και σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες. Η σύγκριση των επιπέδων σχετικής έκφρασης του BDNF, μεταξύ ασθενών και μαρτύρων έγινε με τη δοκιμασία Kruskal Wallis, η οποία είναι μη παραμετρική μέθοδος για σύγκριση ανεξάρτητων δειγμάτων (Πίνακας 4). Από τη δοκιμασία αυτή δεν προέκυψε στατιστικώς σημαντική διαφορά, μεταξύ των μαρτύρων και των διαφόρων χρονικών στιγμιοτύπων των ασθενών (Sig.=0.613>0.01). Ωστόσο, από την κατάταξη ranks, παρατηρούμε ότι τα επίπεδα του BDNF κατά την ύφεση έτειναν να είναι αρκετά χαμηλότερα, σε σχέση με αυτά των υγιών μαρτύρων, αν και χωρίς να είναι στατιστικώς σημαντική αυτή η διαφορά. 7. Συμπεράσματα Τα CD25 + αλλά και τα CD4 + T-κύτταρα δε φαίνεται να εκφράζουν BDNF, τουλάχιστον σε επίπεδα ανιχνεύσιμα με Western blotting, κάτω από τις συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες. Ως προς τα αποτελέσματα των CD4 + T κυττάρων, παρατηρούμε μια απόκλιση σε σχέση με μέρος της προϋπάρχουσας βιβλιογραφίας, η οποία όμως θα μπορούσε να αποδοθεί στη διαφορετική μεθοδολογία ανίχνευσης του BDNF. Οι προηγούμενες μελέτες χρησιμοποιούν καλλιέργειες των σχετικών κυττάρων και ανιχνεύουν τον παράγοντα BDNF, με τη μέθοδο ELISA, στο υπερκείμενο υγρό της καλλιέργειας, μερικές φορές μετά από διέγερση των ανοσιακών κυττάρων με αντιγονικούς παράγοντες. Μέχρι στιγμής, δεν 35

36 εντοπίσαμε στη βιβλιογραφία προηγούμενο ανίχνευσης του BDNF σε κύτταρα περιφερικού αίματος με ανοσοανίχνευση. Η παραπάνω παρατήρηση ισχύει και για τη μελέτη των κυττάρων CD4 - PBMCs. Τα κύτταρα αυτά εκφράζουν σαφώς BDNF στις διάφορες φάσεις της νόσου, χωρίς όμως να παρατηρείται στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ τους. Ωστόσο, θα μπορούσαμε να παρατηρήσουμε ότι τα κύτταρα CD4 -, κατά τη διάρκεια της ύφεσης, τείνουν να παράγουν BDNF σε χαμηλότερα επίπεδα από αυτά των υγιών μαρτύρων. Το εύρημα ότι οι διαφορές στην έκφραση του BDNF είναι μεγαλύτερες στην ομάδα των ασθενών, σε σύγκριση με τους μάρτυρες, όπως φαίνεται από τις διαφορές στην κανονικότητα ή μη της κατανομής, πιθανώς αντανακλά την πολυμορφία της πορείας της νόσου. Λόγω της απουσίας στατιστικά σημαντικών αποτελεσμάτων, ως προς τη διακύμανση του BDNF στις διάφορες φάσεις της νόσου, δεν μπορούν να εξαχθούν συγκεκριμένα συμπεράσματα ως προς την τυχόν επίδραση των κορτικοστεροειδών στην έκφραση του BDNF από τα προαναφερθέντα κύτταρα. 36

37 8. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Εικ. 1. Παθογένεση της πολλαπλής σκλήρυνσης 37

38 Εικ. 2. Συναπτική έκκριση του BDNF Εικ. 3. Εξόνια και μεταγραφήματα του BDNF 38

39 Εικ. 4. Σύνθεση, τροποποίηση, αποθήκευση και έκκριση του BDNF. Εικ. 5. Σχηματισμός ανοσο-ροζέτας αποτελούμενης από ένα μη επιθύμητο κύτταρο και πολλά ερυθρά αιμοσφαίρια, μέσω σταυροσύνδεσης που πραγματοποιείται παρουσία τετραμερών συμπλόκων αντισωμάτων. Τα τελευταία αποτελούνται από μονοκλωνικά αντισώματα ποντικών και αρουραίων, τα οποία αναγνωρίζουν αντιγόνα των αιμοποιητικών κυττάρων (CD8, CD16, CD19 κλπ.), όπως και την γλυκοφορίνη Α των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Τα αντισώματα αυτά σχηματίζουν τετραμερή σύμπλοκα με άλλα αντισώματα που συνδέονται στις βαριές αλυσίδες τους (από το εγχειρίδιο της εταιρίας Stem Cell Τechnology). 39

40 Εικ. 6. Οι εργαστηριακές διαδικασίες εμπλουτισμού των CD4 + T-λεμφοκυττάρων σχηματικά (από το εγχειρίδιο της εταιρίας Stem Cell Τechnology). 40

41 Εικ. 7. Οι εργαστηριακές διαδικασίες απομόνωσης των CD25 + κυττάρων 41

42 Εικ. 8. Το αποτέλεσμα του σταδιακού καθαρισμού του ιζήματος από την αιμοσφαιρίνη, όπως φαίνεται στα διαδοχικά σωληνάρια και το αντίστοιχο αποτέλεσμα στο Western blot. 42

43 Εικ. 9. Σχηματική αναπαράσταση των εργαστηριακών διεργασιών για την απομόνωση του RNA (από το εγχειρίδιο του NucleoSpin RNA II της εταιρίας Macherey Nagel). 43

44 Α. BDNF Β. Actin Εικ. 10. Α. στα lanes 1-5, παρατηρούμε τη ζώνη του BDNF στα 14 kda περίπου σε δείγμα CD4 - ασθενούς με ΠΣ. Το lane 6 αντιστοιχεί στα CD25 + κύτταρα υγιούς, από όπου παρατηρούμε ότι απουσιάζει η ζώνη του BDNF. Β. Αντίθετα, η ζώνη της ακτίνης είναι παρούσα σε όλα τα lanes BDNF Εικ. 11 Στα lanes 1 και 2 έχουμε 10 και 20 μl αντίστοιχα δείγματος CD4 + υγιούς μάρτυρα. Παρατηρούμε την απουσία της ζώνης του BDNF, σε αντίθεση με το lane 3, όπου έχουμε δείγμα PBMCs υγιούς μάρτυρα. 44

45 Α. BDNF Β. Actin Εικ. 12. Στα lanes 1-4 φαίνονται τα δείγματα CD4 - PBMCs, που αντιστοιχούν στα στιγμιότυπα day 0, day 6, day 30 και remission ασθενούς με ΠΣ. Στο lane 5, έχει τρέξει το δείγμα του αντίστοιχου υγιούς μάρτυρα. Στην εικόνα Α παρατηρούμε τη ζώνη του BDNF στα 14 kda περίπου και στην εικόνα Β, τη ζώνη της ακτίνης, στα 46 kda περίπου. 45