ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΝΕΥΜΟΝΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΛΑΖΑΡΟΣ ΣΙΧΛΕΤΙΔΗΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΝΕΥΜΟΝΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΛΑΖΑΡΟΣ ΣΙΧΛΕΤΙΔΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜ.2744 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΩΝ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΒΡΟΓΧΟΚΥΨΕΛΙΔΙΚΟΥ ΕΚΠΛΥΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΣΤΗΝ ΠΝΕΥΜΟΝΙΚΗ ΣΑΡΚΟΕΙΔΩΣΗ ΕΥΔΟΞΙΑ Φ. ΓΟΥΝΑΡΗ ΙΑΤΡΟΣ ΒΙΟΠΑΘΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010

2

3 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΥΡΙΑΖΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΔΕΣΠΟΙΝΑ ΠΑΠΑΚΩΣΤΑ ΚΟΝΤΑΚΙΩΤΗ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΥΔΟΞΙΑ ΔΙΖΑ ΜΑΤΑΥΤΣΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΥΡΙΑΖΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΔΕΣΠΟΙΝΑ ΠΑΠΑΚΩΣΤΑ ΚΟΝΤΑΚΙΩΤΗ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΥΔΟΞΙΑ ΔΙΖΑ ΜΑΤΑΥΤΣΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΜΙΧΑΗΛ ΔΑΝΙΗΛΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΕΣΤΩΡ ΑΓΚΟΜΑΧΑΛΕΛΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΜΑΛΙΣΙΟΒΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΣΤΑΝΟΠΟΥΛΟΣ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκρισις της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως» (Νόμος 5343/32, άρθρ και ν. 1268/82, άρθρ. 50 8)

4

5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΤΟΥ ΤΟΜΕΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΥΛΟΣ ΝΙΚΟΛΑΪΔΗΣ

6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΑΡΚΟΕΙΔΩΣΗ Εισαγωγή Επιδημιολογία Αιτιολογία της σαρκοείδωσης Γενετικοί παράγοντες Περιβαλλοντικοί παράγοντες Αυτοανοσία Υποδοχέας των Τ λεμφοκυττάρων (TCR) Ανοσοπαθογένεια Ιστοπαθολογία Κλινικά συμπτώματα και ευρήματα Διάγνωση Περαιτέρω διερεύνηση Φυσική ιστορία της νόσου Θεραπεία Αναπάντητα ερωτήματα ΠΝΕΥΜΟΝΙΤΙΔΑ ΑΠΟ ΥΠΕΡΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ Εισαγωγή Επιδημιολογία Κλινική εικόνα Ανοσοπαθογένεια Διάγνωση Πρόγνωση Θεραπεία Αναπάντητα ερωτήματα ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΔΙΑΜΕΣΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ ΤΩΝ ΠΝΕΥΜΟΝΩΝ Εισαγωγή Ταξινόμηση Επιδημιολογία Διάγνωση

8 ΤΟ ΒΡΟΓΧΟΚΥΨΕΛΙΔΙΚΟ ΕΚΠΛΥΜΑ ΩΣ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΟ ΚΑΙ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΛΕΙΟ Εισαγωγή Οδηγίες και συστάσεις για τη λήψη και τη μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος Το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα στους υγιείς, καπνιστές και μη Το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ως διαγνωστικό εργαλείο στα διάμεσα νοσήματα του πνεύμονα Το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα στη σαρκοείδωση Το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ως εργαλείο έρευνας Νέες εφαρμογές του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ Γενικά περί της μεθόδου Εφαρμογές Κατευθυντήριες οδηγίες, προτυποποίηση και ποιοτικός έλεγχος Μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος με κυτταρομετρία ροής Μελέτη των κλασικών ΝΚΤ (inkt) λεμφοκυττάρων στον άνθρωπο με κυτταρομετρία ροής Προσδιορισμός ενδοκυττάριων κυτταροκινών με κυτταρομετρία ροής ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Ασθενείς Μεθοδολογία ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Χαρακτηριστικά ομάδων που μελετήθηκαν Ευρήματα στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα από ασθενείς με σαρκοείδωση και από ασθενείς με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία Ευρήματα στο περιφερικό αίμα από ασθενείς με σαρκοείδωση, ασθενείς με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία και φυσιολογικούς μάρτυρες Ευρήματα στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα σχετικά με τους υποπληθυσμούς των CD16/56 + T και inkt λεμφοκυττάρων

9 5. Ευρήματα από τη μελέτη της ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στα CD4 + και CD8 + T λεμφοκύτταρα, στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα Εκατοστιαία αναλογία CD4 + και CD8 + T λεμφοκυττάρων στο νωπό δείγμα και στα διεγερμένα, ολικά και «CD45 bright», λεμφοκύτταρα ΠΙΝΑΚΕΣ ΓΡΑΦΗΜΑΤΑ ΕΙΚΟΝΕΣ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

10 10

11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η σαρκοείδωση αποτελεί ένα χρόνιο συστηματικό νόσημα αγνώστου αιτιολογίας, που κατατάσσεται στις διάμεσες πνευμονοπάθειες λόγω της συχνής προσβολής των πνευμόνων. Χαρακτηρίζεται από μη τυροειδοποιημένα επιθηλιοειδή κοκκιώματα στα προσβεβλημένα όργανα και επικράτηση των CD4 + T λεμφοκυττάρων στους περισσότερους ασθενείς. Αν και η αιτιολογία της σαρκοείδωσης παραμένει άγνωστη, στην παθογένεια της κοκκιωματώδους φλεγμονής φαίνεται ότι εμπλέκονται CD4 + T λεμφοκύτταρα που παράγουν κυτταροκίνες τύπου 1 και μακροφάγα, όπως προκύπτει και από μελέτες του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος. Υπεροχή του Τ Η 1 φαινοτύπου έχει περιγραφεί και στα CD8 + T λεμφοκύτταρα στη σαρκοείδωση, ενώ λιγότερες μελέτες υποδεικνύουν την πιθανή συμμετοχή των inkt και NKT like λεμφοκυττάρων στην παθογένεια της νόσου. Δύο διαφορετικοί λειτουργικά υποπληθυσμοί CD4 + T λεμφοκυττάρων έχουν περιγραφεί στον άνθρωπο, οι οποίοι διαφέρουν ως προς τις κυτταροκίνες που εκκρίνουν. Η ιντερφερόνη (IFN) γ, και η ιντερλευκίνη (IL) 4 με την IL 5, αποτελούν τις χαρακτηριστικές κυτταροκίνες των δραστικών Τ Η 1 και Τ Η 2 λεμφοκυττάρων, αντίστοιχα, και παράγονται μετά από ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των παρθένων Τ λεμφοκυττάρων. Οι κυτταροκίνες τύπου 1 συμμετέχουν κυρίως στην κυτταρική ανοσιακή απάντηση, ενώ οι κυτταροκίνες τύπου 2 στη λειτουργία των Β λεμφοκυττάρων. Η διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ κυτταροκινών τύπου 1 και 2, σε ένα ορισμένο διαμέρισμα ή στο σύνολο του οργανισμού, θεωρείται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια πολλών νοσημάτων, συμμετέχοντας καθοριστικά στον προστατευτικό ρόλο και τις παθολογικές συνέπειες της ανοσιακής απάντησης. Αν και η ετερογενής παραγωγή κυτταροκινών τύπου 1 και 2 ανιχνεύτηκε αρχικά στα CD4 + T λεμφοκύτταρα, αργότερα φάνηκε ότι αφορά και άλλους λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς, όπως τα CD8 +, τα γδ και τα ΝΚΤ λεμφοκύτταρα. Τα ΝΚΤ λεμφοκύτταρα αποτελούν έναν ετερογενή και εξελικτικά διατηρημένο υποπληθυσμό Τ λεμφοκυττάρων, ο οποίος παρουσιάζει CD1d περιορισμό και ικανότητα αθρόας και ταχείας παραγωγής κυτταροκινών. Τα inkt λεμφοκύτταρα αποτελούν τον καλύτερα μελετημένο υποπληθυσμό των ΝΚΤ λεμφοκυττάρων, με βασικά χαρακτηριστικά τον μη πολυμορφικό (invariant) Τ λεμφοκυτταρικό υποδοχέα (TCR) και την ικανότητά τους να αναγνωρίζουν το θαλάσσιο γλυκοσφιγγολιπίδιο α galactosylceramide. Η 11

12 ικανότητα αναγνώρισης εξωγενών και ενδογενών γλυκολιπιδικών αντιγόνων και η προφλεγμονώδης ή ανοσοκατασταλτική δράση των inkt λεμφοκυττάρων οδήγησαν σε έντονη μελέτη του ρόλου τους σε πειραματικά μοντέλα, ενώ λιγότερες μελέτες αφορούν τη συμμετοχή τους στην παθοφυσιολογία νοσημάτων του ανθρώπου, όπως την αυτοανοσία, την αλλεργία, τον καρκίνο και τη λοίμωξη. Τα NKT like λεμφοκύτταρα διαφέρουν από τα ΝΚΤ λεμφοκύτταρα, καθώς συνιστούν υποπληθυσμό κλασικών α/β Τ λεμφοκυττάρων, ο οποίος εκφράζει επίσης δείκτες ΝΚ λεμφοκυττάρων (CD16, CD56, CD57, CD161, KIRs, CD94/NKG2A), αλλά αναγνωρίζει πεπτιδικά αντιγόνα παρουσιαζόμενα από κλασικά MHC μόρια. Η πλειονότητα των CD56 + T λεμφοκυττάρων εκφράζουν τον δείκτη CD8, και φαίνεται ότι υπερέχουν ως προς την παραγωγή IFN γ, σε σύγκριση με τα CD56 CD8 + T λεμφοκύτταρα. Αύξηση των NKT like λεμφοκυττάρων έχει παρατηρηθεί σε κλινικές καταστάσεις που συνδέονται με χρόνια ενεργοποίηση του ανοσιακού συστήματος, ενώ περιορισμένη είναι η βιβλιογραφία σχετικά με τον ρόλο τους στη σαρκοείδωση. Παρά τη μεγάλη έρευνα, η ανοσοπαθογένεια της σαρκοείδωσης δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί. Διαφορετικές τεχνικές έχουν εφαρμοσθεί για τη μελέτη των κυτταροκινών, που συμμετέχουν στην παθογένεια ή την εξέλιξη της σαρκοείδωσης, χωρίς ομόφωνα πάντα αποτελέσματα. Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί μία πολυπαραμετρική μέθοδο, η οποία διαθέτει το πλεονέκτημα του συνδυασμού της συνήθους φαινοτυπικής ανάλυσης των κυττάρων με την ενδοκυττάρια ανίχνευση κυτταροκινών και της δυνατότητας ανίχνευσης μικρών λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών, όπως των inkt λεμφοκυττάρων. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση των T H 1/T H 2 και T C 1/T C 2 φαινοτύπων των Τ λεμφοκυττάρων και ο προσδιορισμός της συχνότητας των inkt και των CD16/56 + T λεμφοκυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα ασθενών με πνευμονική σαρκοείδωση, με χρησιμοποίηση της κυτταρομετρίας ροής. Η μελέτη αποτελείται από Γενικό και Ειδικό Μέρος. Στο Γενικό Μέρος γίνεται αναφορά στη σαρκοείδωση, με έμφαση στην ανοσοπαθογένειά της, και την πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία. Ακολουθεί η περιγραφή της διαγνωστικής προσέγγισης των διαμέσων νοσημάτων των πνευμόνων και της αξίας του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος στη διάγνωση και την έρευνα των νοσημάτων αυτών. Τέλος, περιγράφονται οι βασικές αρχές της κυτταρομετρίας ροής και οι εφαρμογές της στη μελέτη του 12

13 βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, την ανίχνευση των iνκτ λεμφοκυττάρων και τον προσδιορισμό των ενδοκυττάριων κυτταροκινών. Στο Ειδικό Μέρος καταγράφονται ο σκοπός της παρούσας διατριβής, τα χαρακτηριστικά της ομάδας των ασθενών και των δύο ομάδων ελέγχου, οι εργαστηριακές μέθοδοι που εφαρμόσθηκαν και ο τρόπος στατιστικής ανάλυσης των δεδομένων. Ακολουθεί η ενότητα με τα αποτελέσματα της διατριβής και παρατίθενται οι σχετικοί πίνακες, τα γραφήματα και αντιπροσωπευτικές εικόνες από την ανάλυση της ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών. Στη συνέχεια παρατίθεται η συζήτηση, όπου σχολιάζονται η μεθοδολογία και τα αποτελέσματα, με αναφορά στοιχείων από τη διεθνή βιβλιογραφία, και γίνεται προσπάθεια ερμηνείας τους. Έπεται η έκθεση των κύριων συμπερασμάτων. Τέλος, στην περίληψη γίνεται συνοπτική αναφορά στη μεθοδολογία και στα αποτελέσματα της διατριβής και ακολουθεί η βιβλιογραφία. Θερμές ευχαριστίες και βαθιά ευγνωμοσύνη θα ήθελα να εκφράσω στον Καθηγητή, κύριο Γεώργιο Κυριαζή, υπεύθυνο του Εργαστηρίου Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας, της Πνευμονολογικής Κλινικής του ΑΠΘ, για την ανάθεση του θέματος, καθώς και τη συνεχή συμπαράσταση και καθοδήγηση καθόλη τη διάρκεια εκπόνησης της παρούσας διατριβής. Ευχαριστώ επίσης ολόψυχα την Καθηγήτρια, κυρία Ευδοξία Δίζα Ματαυτσή, για τη συνεχή υποστήριξη και τις εποικοδομητικές συμβουλές της κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στην Επίκουρη Καθηγήτρια, κυρία Δέσποινα Παπακώστα Κοντακιώτη, για τη σημαντική προσφορά της στην εκπόνηση αυτής της μελέτης. Ευχαριστώ επίσης θερμά και τα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, τον Καθηγητή κ. Μιχαήλ Δανιηλίδη, τον Καθηγητή κ. Νέστωρ Αγκομαχαλελή, τον Καθηγητή κ. Νικόλαο Μαλισιόβα και τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Ιωάννη Στανόπουλο, για τις εποικοδομητικές συμβουλές και παρατηρήσεις τους. Ευχαριστώ ολόψυχα τη Διευθύντρια του ΕΣΥ στο Εργαστήριο Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας, της Πνευμονολογικής Κλινικής του ΑΠΘ, κυρία Όλγα Χατζηζήση, για τη συνεχή συμπαράσταση και την ουσιαστική συμβολή της στην εκπόνηση της παρούσας μελέτης. Θερμές ευχαριστίες οφείλω στον Επίκουρο Καθηγητή, κύριο Θεόδωρο Κοντακιώτη για τη συμμετοχή του στην ολοκλήρωση της μελέτης. Επίσης, 13

14 ευχαριστώ θερμά τους Ιατρούς Πνευμονολόγους του Βρογχοσκοπικού Τμήματος του Νοσοκομείου «Γ. Παπανικολάου», κύριο Δημήτρη Ιακωβίδη και κύριο Φώτη Ζογλοπίτη, για την εξαιρετική συνεργασία και συμπαράσταση, χωρίς την οποία δε θα ήταν δυνατή η εκπόνηση της μελέτης. Ευχαριστώ ιδιαιτέρως τον βιολόγο, κύριο Δημήτρη Μπουγιουκλή, για την ουσιαστική και έμπρακτή του βοήθεια στην εφαρμογή των μεθόδων της κυτταρομετρίας ροής. Ακόμη ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στους Ιατρούς Πνευμονολόγους της Α Πνευμονολογικής Κλινικής, κυρία Αικατερίνη Μαρκοπούλου, κύριο Σταύρο Τρύφων, και της Β Πνευμονολογικής Κλινικής, κυρία Ευαγγελία Σέρασλη, του Νοσοκομείου «Γ. Παπανικολάου», στο Διευθυντή της Πνευμονολογικής Κλινικής του Γενικού Νοσοκομείου Σερρών, κύριο Αντώνη Αντωνιάδη και στους υπόλοιπους συναδέλφους της κλινικής, και στους ιδιώτες Ιατρούς Πνευμονολόγους, που μου παρείχαν τις κλινικές πληροφορίες και την οριστική διάγνωση για τους ασθενείς που συμμετείχαν στη μελέτη. Επίσης, ευχαριστώ θερμά το σύνολο των ειδικών και ειδικευόμενων Ιατρών Πνευμονολόγων του Νοσοκομείου «Γ. Παπανικολάου» για τη βοήθειά τους στην εκπόνηση της μελέτης. Επιπλέον, θα ήθελα να εκφράσω ολόψυχες ευχαριστίες στις τεχνολόγους του Εργαστηρίου Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας, της Πνευμονολογικής Κλινικής του ΑΠΘ, κυρία Σοφία Ποζίδου και κυρία Βιολέτα Κικιδάκη, για την ουσιαστική συμβολή και την άριστη συνεργασία καθόλη τη διάρκεια της παρούσας μελέτης. Ευχαριστώ θερμά τους νοσηλευτές του Βρογχοκοσκοπικού Τμήματος, για τη σημαντική συμμετοχή τους στην υλοποίηση της παρούσας μελέτης, καθώς και το προσωπικό, ιατρικό, νοσηλευτικό και τεχνολογικό, που αποτέλεσε την ομάδα των υγιών μαρτύρων της παρούσας μελέτης. Θα ήθελα ακόμη να ευχαριστήσω όλους τους συναδέλφους μου και τους τεχνολόγους των εργαστηρίων του Νοσοκομείου «Γ. Παπανικολάου», για τη συμπαράσταση και ενθάρρυνσή τους. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τη Διευθύντρια, κυρία Αικατερίνη Παυλίτου, τη συνάδελφο Ιατρό Βιοπαθολόγο, κυρία Αναστασία Γιαννακού, τις βιολόγους και όλες τις τεχνολόγους του Εργαστηρίου Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας του Νοσοκομείου Παπαγεωργίου για την έμπρακτη συμπαράστασή τους. 14

15 Τέλος, ευχαριστώ την οικογένειά μου για τη διαρκή στήριξη και την αγάπη που μου παρείχε σε όλη τη διάρκεια της παρούσας προσπάθειας. 15

16 16

17 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 17

18 18

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η σαρκοείδωση αποτελεί μία χρόνια, συστηματική διαταραχή αγνώστου αιτιολογίας, η οποία χαρακτηρίζεται από την άθροιση Τ λεμφοκυττάρων και μονοκυττάρων, δημιουργία κοκκιωμάτων και διαταραχή της φυσιολογικής αρχιτεκτονικής στα προσβεβλημένα όργανα [1]. Συχνότερα προσβάλλει τους πνεύμονες και τους ενδοθωρακικούς λεμφαδένες, αν και οποιοδήποτε όργανο μπορεί να εμφανίσει κοκιωματώδη φλεγμονή. Η διάγνωση της σαρκοείδωσης τίθεται από τα συμβατά με τη νόσο κλινικοεργαστηριακά ευρήματα, σε συνδυασμό με την ιστολογική επιβεβαίωση των μη τυροειδοποιημένων επιθηλιοειδών κοκκιωμάτων στα προσβεβλημένα όργανα, αφού αποκλεισθούν γνωστά αίτια εμφάνισης όμοιων βλαβών. Η πορεία της νόσου ποικίλει έντονα και σχετίζεται με την έναρξη και την έκταση της νόσου [2]. Η πνευμονική σαρκοείδωση κατατάσσεται στα διάμεσα νοσήματα των πνευμόνων, μία ετερογενή ομάδα νοσημάτων, που προσβάλλουν κυρίως τον διάμεσο χώρο των πνευμόνων και διαφέρουν ως προς την αιτιολογία, την κλινική και ακτινολογική εικόνα, τα ιστοπαθολογικά ευρήματα και την εξέλιξη [3]. Στα διάμεσα νοσήματα των πνευμόνων ανήκει και η πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία, η οποία οφείλεται σε λεμφοκυτταρική φλεγμονώδη αντίδραση του πνευμονικού παρεγχύματος μετά από επαναλαμβανόμενη εισπνοή ποικίλων περιβαλλοντικών παραγόντων [4]. Στα πλαίσια της διαγνωστικής προσέγγισης των διαμέσων νοσημάτων των πνευμόνων, η λήψη και μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (BAL) αποτέλεσε αρχικά ένα εργαλείο έρευνας και στη συνέχεια καθιερώθηκε ως κλασική διαγνωστική διαδικασία για τη διερεύνηση των ασθενών με ασαφείς διάχυτες αλλοιώσεις των πνευμόνων. Η τεχνική λήψης του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος επιτρέπει την ανάκτηση κυττάρων και διαλυτών ουσιών από το κατώτερο αναπνευστικό, παρέχοντας έτσι τη δυνατότητα καλύτερης διερεύνησης των διαταραχών του πνευμονικού ιστού [5 7]. Η μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος στη σαρκοείδωση συμβάλλει τόσο στη διάγνωση της νόσου, στα πλαίσια συμβατών κλινικοεργαστηριακών ευρημάτων, όσο και στη διερεύνηση της ανοσοπαθογένειας της νόσου. Πoλλές ερευνητικές μελέτες των κυττάρων και των διαλυτών ουσιών του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος έχουν δείξει υπεροχή της Τ Η 1 ανοσιακής απάντησης στη σαρκοείδωση. Ωστόσο, η αξία του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος για την εκτίμηση της ενεργότητας ή της 19

20 εξέλιξης της σαρκοείδωσης και την παρακολούθηση των ασθενών δεν είναι ακόμη τεκμηριωμένη [5, 8]. Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί μία πολυπαραμετρική μέθοδο, που έχει παίξει σημαντικό ρόλο στη μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του περιφερικού αίματος στη σαρκοείδωση, για διαγνωστικούς και ερευνητικούς σκοπούς. Εξέχουσα θέση στη διεθνή βιβλιογραφία καταλαμβάνει ο προσδιορισμός του ανοσοφαινοτύπου των Τ λεμφοκυττάρων, με στόχο τη διερεύνηση της συμμετοχής διαφορετικών υποπληθυσμών στην ανοσοπαθογένεια και την πρόγνωση της νόσου. Επιπλέον, η κυτταρομετρία ροής έχει χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη λειτουργικών χαρακτηριστικών των κυττάρων, όπως τη δυνατότητα παραγωγής ενδοκυττάριων κυτταροκινών. Δεδομένου ότι στη φλεγμονώδη απάντηση μπορούν να συμμετέχουν διαφορετικοί κυτταρικοί πληθυσμοί, με την έκκριση κυτταροκινών με πλειοτροπική δράση, η δυνατότητα ανάλυσης των κυτταροκινών στο επίπεδο του ενός κυττάρου με κυτταρομετρία ροής μπορεί να συμβάλλει στην καλύτερη κατανόηση της σαρκοείδωσης και πιθανώς στην αντιμετώπιση της νόσου. 20

21 ΣΑΡΚΟΕΙΔΩΣΗ 1. Εισαγωγή Η σαρκοείδωση αποτελεί πολυσυστηματικό νόσημα, αγνώστου αιτιολογίας, που χαρακτηρίζεται από συγκέντρωση λεμφοκυττάρων στα προσβαλλόμενα όργανα, ανάπτυξη μη τυροειδοποιημένων κοκκιωμάτων σε αυτά και αλλοίωση της αρχιτεκτονικής τους [2, 9, 10]. Εκδηλώνεται συχνότερα σε ενήλικες μικρής και μέσης ηλικίας. Η σαρκοείδωση προσβάλλει συχνότερα τους πνεύμονες, σε ποσοστό έως 95%, και τους λεμφαδένες. Η νόσος προσβάλλει και άλλα όργανα. Συμπτώματα εμφανίζονται συχνότερα από τους οφθαλμούς, το δέρμα και το ήπαρ. Η διάγνωση τίθεται από τα συμβατά με τη νόσο κλινικοεργαστηριακά ευρήματα, και επιβεβαιώνεται από την ιστολογική εξέταση των μη τυροειδοποιημένων επιθηλιοειδών κοκκιωμάτων, αφού αποκλεισθούν άλλα γνωστά αίτια εμφάνισης παρόμοιων βλαβών, όπως φυματίωση και μυκητιασική νόσος. Σε κλινικές, επιδημιολογικές και ενδοοικογενειακές μελέτες υποστηρίζεται η υπόθεση ότι η σαρκοείδωση οφείλεται στην έκθεση ατόμων, με γενετική προδιάθεση, σε περιβαλλοντικό, πιθανώς λοιμογόνο, αίτιο. Η αιτιολογία της σαρκοείδωσης παραμένει άγνωστη. Στην παθογένεια της κοκκιωματώδους φλεγμονής εμπλέκονται κυρίως CD4 + T λεμφοκύτταρα, που παράγουν κυτταροκίνες τύπου 1, και μακροφάγα. Η πορεία και η πρόγνωση της σαρκοείδωσης συσχετίζονται, σε μεγάλο βαθμό, με την έναρξη και την έκταση της νόσου. Σε οξεία έναρξη, με οζώδες ερύθημα ή ασυμπτωματική πυλαία λεμφαδενοπάθεια, προοιωνίζεται αυτοπεριοριζόμενη και καλής έκβασης πορεία, ενώ αντίθετα η λιγότερο εμφανής έναρξη, με πολλές εξωπνευμονικές βλάβες, εξελίσσεται συνήθως ύπουλα και οδηγεί σε σταδιακή ίνωση των πνευμόνων και άλλων οργάνων. Η θνητότητα της νόσου είναι 1 5%. Στις περιπτώσεις που η θεραπεία κρίνεται απαραίτητη, λόγω σοβαρής βλάβης των οργάνων ή χρόνιας προοδευτικής νόσου, τα κορτικοστεροειδή αποτελούν την κύρια θεραπευτική αγωγή. 21

22 2. Επιδημιολογία Η σαρκοείδωση προσβάλλει αμφότερα τα φύλα, όλες τις φυλές και όλες τις ηλικίες. Συχνότερα εκδηλώνεται σε ενήλικες της 3ης 4ης δεκαετίας, με μικρή υπεροχή στο γυναικείο φύλο. Αν και η καταγραφή των κρουσμάτων της νόσου παγκοσμίως δεν είναι πλήρης, έντονες διαφορές φαίνεται να υπάρχουν, στον επιπολασμό και στην κλινική εικόνα της νόσου, στις διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές και στις φυλετικές ομάδες [2, 10 12]. Ο επιπολασμός της σαρκοείδωσης κυμαίνεται μεταξύ λιγότερο από 1 και 40 κρούσματα ανά 100,000 ανθρώπους. Υψηλότερες τιμές αναφέρονται στις Σκανδιναβικές χώρες και στον πληθυσμό των Αφροαμερικανών στις ΗΠΑ. Η σαρκοείδωση είναι συχνή στην Κεντρική Ευρώπη, στις ΗΠΑ και στην Ιαπωνία. Η νόσος εκδηλώνεται με σοβαρότερη μορφή στους Αφροαμερικανούς, σε αντίθεση με την Καυκάσια φυλή, στην οποία είναι συχνότερη η ασυμπτωματική μορφή. Η συνολική θνητότητα από τη νόσο είναι 1 5%. Το οζώδες ερύθημα, το οποίο συνδέεται με οξεία νόσο και καλή πρόγνωση, αποτελεί το πρώτο σύμπτωμα της σαρκοείδωσης στο 18% των Φινλανδών και στο 30% των Βρετανών ασθενών, ενώ είναι σπάνιο στους Αφροαμερικανούς και στους Ιάπωνες. Αντίθετα, ο χειμετλοειδής λύκος και άλλες δερματικές εκδηλώσεις συνδέονται με χρόνια πορεία της νόσου και εκδηλώνονται συχνότερα στους Αφροαμερικανούς, συγκριτικά με την Καυκάσια φυλή. Αυξημένη συχνότητα της νόσου έχει επίσης αναφερθεί σε συγκεκριμένους χώρους ή ενδοοικογενειακά. 3. Αιτιολογία της σαρκοείδωσης Η αιτιολογία της σαρκοείδωσης είναι άγνωστη. Πιθανολογείται ότι η νόσος εμφανίζεται, όταν άτομα, με γενετική προδιάθεση, εκτεθούν σε «ίδια» (εαυτά) ή εξωγενή αντιγόνα, τα οποία πυροδοτούν μία εκσεσημασμένη κυτταρική ανοσιακή απάντηση που οδηγεί στη δημιουργία του κοκκιώματος [11 17]. Η υπόθεση αυτή στηρίζεται: 1) σε επιδημιολογικές μελέτες, 2) στην παθογένεια της κοκκιωματώδους φλεγμονής, στην οποία συμμετέχουν κυρίως τα ενεργοποιημένα CD4 + βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα, με έκφραση κυρίως Τ Η 1 ανοσιακής απάντησης στους πνεύμονες, και τα μακροφάγα, 3) σε μελέτες του υποδοχέα των Τ λεμφοκυττάρων (TCR), σε ασθενείς με σαρκοείδωση. 3.1 Γενετικοί παράγοντες Οι αναφορές σχετικά με την αυξημένη επίπτωση της νόσου, ενδοοικογενειακά ή και εθνικά, καθώς και οι φυλετικές και εθνικές διαφορές 22

23 στην εκδήλωση και στη σοβαρότητα της νόσου οδήγησαν στη διερεύνηση του γενετικού υπόβαθρου της σαρκοείδωσης. Ο ρόλος των γενετικών παραγόντων στην παθογένεια της σαρκοείδωσης έγκειται πιθανώς σε γονιδιακούς πολυμορφισμούς παραγόντων που εμπλέκονται στη λειτουργία των Τ λεμφοκυττάρων, στην αναγνώριση και επεξεργασία των αντιγόνων ή στη ρύθμιση της εναπόθεσης της μεσοκυττάριας ουσίας. Επίσης, ενδέχεται οι γενετικοί παράγοντες να καθορίζουν τον τρόπο παρουσίασης και εξέλιξης της νόσου. Διαφορετικά γονίδια συνδέονται πιθανώς με την ευαισθησία στη νόσο και με τους ποικίλους κλινικούς φαινοτύπους [17, 18]. Το μείζον σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας (MHC) παίζει κεντρικό ρόλο στην παρουσίαση αντιγόνων στα Τ λεμφοκύτταρα. Η μελέτη του MHC έχει αποκαλύψει διαφορετικές συσχετίσεις μεταξύ της εκδήλωσης ή της μορφής της νόσου με ορισμένα αλλήλια, στους μελετούμενους πληθυσμούς [2, 11, 14 18]. Τα γονίδια του MHC, τάξης Ι και ΙΙ, δρουν πιθανώς συνδυασμένα στην παθοφυσιολογία της σαρκοείδωσης, ενώ αλλήλια του HLA DRB1 γονιδίου φαίνεται να συνδέονται με την ευαισθησία στη σαρκοείδωση και με την πρόγνωση της νόσου [14, 19]. Στα πλαίσια έρευνας του πιθανού πολυγονιδιακού υπόβαθρου της σαρκοείδωσης έχουν μελετηθεί επίσης τα γονίδια του υποδοχέα της βιταμίνης D, του παράγοντα νέκρωσης των όγκων (TNF), της ιντερλευκίνης (IL) 1, της IL 6, της ιντερφερόνης (IFN) γ, του αυξητικού παράγοντα της βλαστικής μεταμόρφωσης (TGF) β, της IL 10, των υποδοχέων χημειοκινών CCR2 και CCR5, του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης (ACE) και το γονίδιο butyrophilin like 2 (BTNL2), χωρίς οριστικά ή σημαντικά συμπεράσματα [16, 17, 19 23]. Κατά τη μελέτη του γενετικού υπόβαθρου της σαρκοείδωσης, προέκυψε η αναγκαιότητα ανάλυσης του φαινοτύπου, καθώς και των παθοφυσιολογικών επιπτώσεων ενός συγκεκριμένου γονοτύπου. Συγκεκριμένα, από μελέτες των πολυμορφισμών της προαγωγικής περιοχής του γονιδίου του TNF α, φάνηκε ότι η αυξημένη συχνότητα εμφάνισης του TNFA2 αλληλίου δεν ήταν εφικτό να συσχετιστεί με αυξημένη παραγωγή TNF α στο σύνδρομο Löfgren, σε αντίθεση με άλλα νοσήματα [24]. 3.2 Περιβαλλοντικοί παράγοντες Ο κατάλογος των περιβαλλοντικών παραγόντων, που έχουν ενοχοποιηθεί ως αίτια της σαρκοείδωσης, είναι μεγάλος. Διάφοροι λοιμογόνοι παράγοντες έχουν προταθεί ως αίτια της νόσου, όπως ιοί, η Borrelia 23

24 burgdorferi, το προπιονοβακτηρίδιο της ακμής, το μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης και το μυκόπλασμα, χωρίς όμως να τεκμηριωθεί η αιτιολογική σχέση τους με τη σαρκοείδωση. Μη λοιμογόνοι παράγοντες, οργανικοί και ανόργανοι, που έχουν συσχετισθεί με τη σαρκοείδωση, είναι η γύρη των πεύκων, η άργιλος, το αλουμίνιο, το ζιρκόνιο και ο τάλκης [11]. Παρά την απουσία ενός τεκμηριωμένου αιτιολογικού παράγοντα, οι επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι οι περιβαλλοντικοί παράγοντες παίζουν ρόλο στην παθογένεια της σαρκοείδωσης [2, 18]. 3.3 Αυτοανοσία Ορισμένοι ερευνητές προτείνουν τη θεωρία ότι η σαρκοείδωση είναι αυτοάνοσο νόσημα, μέσω μηχανισμών μοριακής μίμησης (αντιγόνα λοιμογόνων παραγόντων μιμούνται «ίδια» αντιγόνα). Στοιχεία που ενισχύουν αυτή την υπόθεση είναι η παρουσία αντιπυρηνικών αντισωμάτων, ρευματοειδών παραγόντων και ανοσοσυμπλεγμάτων στη θέση της φλεγμονής, καθώς και η παρατηρούμενη υπεργαμμασφαιριναιμία [2]. Πρόσφατα, σε ομάδα DRB1*0301 θετικών ασθενών με σαρκοείδωση αναγνωρίστηκαν πεπτίδια γνωστών αυτοαντιγόνων να παρουσιάζονται από HLA DR μόρια [25]. 3.4 Υποδοχέας των Τ λεμφοκυττάρων (TCR) Η ανάλυση του TCR, σε υποομάδες ασθενών με σαρκοείδωση, έχει αποκαλύψει την αύξηση ολιγοκλωνικών Τ λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών στους πνεύμονες, το δέρμα και το αίμα, οι οποίοι χρησιμοποιούν ορισμένες γονιδιακές θέσεις των μεταβλητών περιοχών των αλύσων β, α, γ και δ του TCR [11, 17, 26]. Επιπλέον, η παρουσία του HLA DR3 απλοτύπου έχει συσχετισθεί με την αυξημένη έκφραση του TCR Vα2.3 στα CD4 + T λεμφοκύτταρα των πνευμόνων [27]. Τα ευρήματα αυτά ενισχύουν εμμέσως την υπόθεση της ύπαρξης ενός (ή περισσοτέρων) «ίδιου» αντιγόνου ή αλλοαντιγόνου που αποτελεί τον αιτιολογικό παράγοντα της σαρκοείδωσης. Μειονέκτημα των μελετών αυτών αποτελεί η πιθανή επίδραση της διάρκειας της νόσου στον TCR, καθώς η μακρά διάρκεια της νόσου ίσως να συμβάλλει σε περισσότερο ετερογενή Τ κυτταρική απάντηση. Η σταδιακή έναρξη της νόσου δυσχεραίνει ακόμη περισσότερο την αποσαφήνιση του πιθανού ρόλου της χρονικής διάρκειας της σαρκοείδωσης στην ετερογένεια του TCR. Επιπλέον, η ποικιλότητα των αναφορών ως προς τα σχετιζόμενα με τη σαρκοείδωση γονίδια της μεταβλητής περιοχής του TCR, ίσως να οφείλεται και στις διαφορές εθνικότητας των μελετηθέντων πληθυσμών [11, 17]. 24

25 3.5 Ανοσοπαθογένεια Η ανοσοπαθογένεια της σαρκοείδωσης δύναται να αναλυθεί σε ιδιαίτερες φάσεις, που αναφέρονται στην αναγνώριση ενός ή περισσοτέρων, άγνωστων μέχρι στιγμής, αντιγόνων, στην αντιγονοπαρουσίαση από τα μακροφάγα στα Τ λεμφοκύτταρα, στην άθροιση και ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων, στην άθροιση των μονοκυττάρων και στην ενεργοποίηση των μακροφάγων στη θέση της φλεγμονής, στη δημιουργία του κοκκιώματος και στη διαδικασία επούλωσης. Κεντρικό ρόλο στην κυψελιδίτιδα, στην κοκκιωματώδη αντίδραση και στην ευνοϊκή ή μη εξέλιξη της νόσου παίζουν οι κυτταροκίνες, που παράγονται από τα Τ λεμφοκύτταρα και τα μακροφάγα στις θέσεις της φλεγμονής. Οι κυτταροκίνες δρουν κυρίως τοπικά, συνδεόμενες με τους αντίστοιχους υποδοχείς στα κύτταρα στόχους. Επίσης, ρυθμίζουν την παραγωγή άλλων κυτταροκινών από τα κύτταρα, με αποτέλεσμα η δράση της καθεμίας να θεωρείται μέρος ενός δικτύου κυτταροκινών [11, 17, 24, 28]. Όπως προκύπτει από τη μελέτη δειγμάτων βιοψίας και βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, η σαρκοείδωση χαρακτηρίζεται από συσσώρευση δραστικών Τ λεμφοκυττάρων στη θέση έναρξης της φλεγμονής, όπου σχηματίζονται τα κοκκιώματα [29, 30]. Αντίθετα με την αύξηση των λεμφοκυττάρων στους πνεύμονες, στο περιφερικό αίμα παρατηρείται λεμφοπενία [30]. Διαμερισματοποίηση παρατηρείται και μεταξύ των ανατομικών στοιχείων των πνευμόνων, καθώς διαφορετικοί υποπληθυσμοί λεμφοκυττάρων ανευρίσκονται στα πνευμονικά αγγεία, το επιθήλιο, τον διάμεσο χώρο και τον λεμφικό ιστό των βρόγχων [31]. Ο λόγος CD4/CD8 των λεμφοκυττάρων είναι πολύ αυξημένος στους πνεύμονες ασθενών με έντονη κυψελιδίτιδα, με ενεργό νόσο και κατά την έναρξη οξείας νόσου [30, 32, 33], ενώ σε σπάνιες περιπτώσεις παρατηρείται υπεροχή των CD8 + T λεμφοκυττάρων [34]. Ελάττωση του λόγου CD4/CD8 έχει παρατηρηθεί σε νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς προχωρημένου σταδίου (σταδίου ΙΙ, ΙΙΙ) [35]. Ο αυξημένος αριθμός των κυττάρων στους προσβεβλημένους ιστούς, οφείλεται στη μετανάστευση κυτταρικών πληθυσμών από το περιφερικό αίμα στον πνεύμονα, αλλά και στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων in situ. Χημειοκίνες και κυτταροκίνες, όπως οι IL 8, ΙL 15, IL 16 και RANTES, συνεργάζονται για τη χημειοταξία των CD4 + T λεμφοκυττάρων στις θέσεις της φλεγμονής. Επιπλέον, η παραγωγή IL 2 in situ δρα ως τοπικός αυξητικός παράγοντας για τα Τ λεμφοκύτταρα που διηθούν το πνευμονικό παρέγχυμα και τους άλλους προσβεβλημένους ιστούς [11]. 25

26 Κεντρικό κύτταρο στη διαδικασία δημιουργίας του κοκκιώματος αποτελεί το ενεργοποιημένο CD45RO + T H 1 λεμφοκύτταρο [11]. Τα μνημονικά CD45RO + Τ λεμφοκύτταρα υπερέχουν σημαντικά σε σύγκριση με τα παρθένα Τ λεμφοκύτταρα, όπως φαίνεται από μελέτες στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και σε δείγματα βιοψίας από τους πνεύμονες και τους λεμφαδένες [36, 37]. Ο λόγος μάλιστα των μνημονικών προς τα παρθένα λεμφοκύτταρα (CD45RO + /CD45RA + ) είναι σημαντικά υψηλότερος στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, σε σύγκριση με το περιφερικό αίμα [37]. Τα Τ λεμφοκύτταρα στη σαρκοείδωση εκφράζουν ποικίλους δείκτες ενεργοποίησης, όπως τους IL 2R, HLA DR, CD69 και VLA 1 [38 45]. Οι δείκτες αυτοί έχουν ανιχνευτεί σε αυξημένη συχνότητα στα λεμφοκύτταρα από τις θέσεις της φλεγμονής και στα λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, συγκριτικά με τα αντίστοιχα του περιφερικού αίματος των ασθενών ή των φυσιολογικών μαρτύρων. Επιπλέον, έχει βρεθεί αυξημένη ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, που εκφράζουν ορισμένη περιοχή της α αλύσου του TCR, ενισχύοντας έτσι την υπόθεση της ενεργοποίησης των συγκεκριμένων Τ λεμφοκυττάρων από ένα αντιγόνο [46]. Η ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων ελέγχεται έμμεσα με προσδιορισμό των διαλυτών υποδοχέων της IL 2 (sil 2R), που απελευθερώνονται από τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα και αυξάνονται στην ενεργό σαρκοείδωση [47]. Η αύξηση μάλιστα των διαλυτών υποδοχέων της IL 2 στον ορό έχει συσχετισθεί με προοδευτική νόσο ή ανάγκη για θεραπεία [48, 49]. Επιπλέον, τα Τ λεμφοκύτταρα των ασθενών παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση των υποδοχέων του TNF (CD120a και CD120b) και του Fas αντιγόνου (CD95) σε σύγκριση με τα αντίστοιχα των υγιών μαρτύρων, η οποία μάλιστα κυμαίνεται με την πορεία της νόσου [50 52]. Δύο διαφορετικοί λειτουργικά υποπληθυσμοί CD4 + και CD8 + T λεμφοκυττάρων έχουν περιγραφεί στον άνθρωπο, οι οποίοι διαφέρουν ως προς τις κυτταροκίνες που εκκρίνουν. Η IFN γ αφενός και η IL 4 με την IL 5 αφετέρου αποτελούν αντίστοιχα τις χαρακτηριστικές κυτταροκίνες των δραστικών Τ Η 1 και Τ Η 2 λεμφοκυττάρων και παράγονται μετά από ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των παρθένων Τ λεμφοκυττάρων [53 55]. Επιπλέον, έχει αναγνωρισθεί και ένας τρίτος υποπληθυσμός Τ δραστικών λεμφοκυττάρων, τα Τ Η 17 κύτταρα, τα οποία έχουν συσχετισθεί με διάφορα μοντέλα αυτοάνοσων νοσημάτων του ανθρώπου, όπως αρθρίτιδα, ραγοειδίτιδα και σκλήρυνση κατά πλάκας. Ο ρόλος των Τ Η 17 λεμφοκυττάρων 26

27 στην άμυνα έναντι λοιμογόνων παραγόντων δεν είναι πλήρως αποσαφηνισμένος [56]. Μελέτες σε πειραματικά μοντέλα έχουν δείξει ότι οι ανοσιακές κοκκιωματώδεις αντιδράσεις μπορεί να χαρακτηρίζονται από την επικράτηση Τ Η 1 ή Τ Η 2 κυτταροκινών. Το προφίλ των κυτταροκινών δεν είναι σταθερό, αλλά εξαρτάται κυρίως από το αντιγόνο. Στις μυκοβακτηριδιακές λοιμώξεις η αρχική Τ Η 1 ανοσιακή απάντηση ελαττώνεται και αυξάνεται η παραγωγή Τ Η 2 κυτταροκινών, καθώς καταστάλλεται η ανοσιακή απάντηση. Αντίθετα, στην κοκκιωματώδη πνευμονική νόσο του πειραματικού μοντέλου σχιστοσωμίασης, παρατηρείται επίμονη επικράτηση της Τ Η 2 ανοσιακής απάντησης [57]. Στη σαρκοείδωση οι υποδοχείς χημειοκινών και κυτταροκινών, που συνδέονται με την Τ Η 1 ανοσιακή απάντηση (CXCR3, CCR5, IL 12R, IL 18R), εκφράζονται σε μεγαλύτερο ποσοστό στα CD4 + και CD8 + Τ λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, συγκριτικά με τα αντίστοιχα του περιφερικού αίματος, σε αντίθεση με τους υποδοχείς χημειοκινών που συνδέονται με την Τ Η 2 ανοσιακή απάντηση (CXCR4 και CCR4) [58]. Μόνο τα κυψελιδικά Τ λεμφοκύτταρα εμφανίζουν ενεργοποίηση του γονιδίου της IL 2 [59]. Επιπρόσθετα στη σαρκοείδωση, τα CD4 + T λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος εκφράζουν ενδοκυττάρια κυτταροκίνες τύπου 1 (IL 2, IFN γ, TNF α) σε μεγαλύτερη συχνότητα, συγκριτικά με τα αντίστοιχα του περιφερικού αίματος των ασθενών ή των φυσιολογικών μαρτύρων, σε αντίθεση με κυτταροκίνες τύπου 2 (IL 4, IL 5, IL 10, IL 13) [37, 60 63]. Αντίστοιχα ευρήματα αναφέρονται σε ορισμένες μελέτες και για τα CD8 + T λεμφοκύτταρα [37, 62, 63]. Τα κυψελιδικά Τ λεμφοκύτταρα, και ιδιαίτερα τα CD4 + /HLA DR +, παράγουν αυτόματα ή μετά από διέγερση IL 2 και IFN γ [32, 64 67]. Διαφορές στην παραγωγή των κυτταροκινών αναφέρονται και σε σχέση με την ενεργότητα της νόσου [65, 66]. Η IL 2 φαίνεται ότι συμμετέχει στον τοπικό πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων και στην υπεργαμμασφαιριναιμία της σαρκείδωσης [64, 65]. Η IL 2 ανήκει στους μεσολαβητές της ειδικής ανοσίας. Συντίθεται και παράγεται από Τ λεμφοκύτταρα και έχει αυτοκρινή δράση διεγείροντας την έκπτυξη των Τ λεμφοκυτταρικών κλώνων, αλλά και τον πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση των ΝΚ και Β λεμφοκυττάρων [55]. Αυξημένη έκκριση IL 2, σε συνδυασμό με αυξημένο αριθμό Τ λεμφοκυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, έχει ανευρεθεί σε ασθενείς με προοδευτική νόσο [68]. Το γεγονός αυτό ίσως να σχετίζεται με τον σημαντικό ρόλο της IL 2 στην ανάπτυξη των Τ 27

28 ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων (Tregs). Επιπλέον, αυξημένη έκφραση IL 2 έχει παρατηρηθεί στην ενεργό σαρκοείδωση, συγκριτικά με την ανενεργό νόσο και τους φυσιολογικούς μάρτυρες [69]. Η παραγωγή της IFN γ εμφανίζεται αυξημένη στη σαρκοείδωση και οφείλεται στη δράση της IL 12 και της IL 18 επί των αντιγονοειδικών Τ λεμφοκυττάρων [70]. Η IFN γ αποτελεί τον κύριο διεγέρτη των μακροφάγων και της ειδικής κυτταρικής ανοσίας και συντίθεται από τα ΝΚ, τα ΝΚΤ, τα CD4 + T Η 1 και τα CD8 + T C 1 λεμφοκύτταρα. Η IFN γ αυξάνει την μικροβιοκτόνο ικανότητα των μακροφάγων έναντι των φαγοκυτταροθέντων μικροβίων, επάγοντας τη σύνθεση των ενεργών μορίων του οξυγόνου και του νιτρικού οξειδίου. Συμβάλλει επίσης στην αύξηση της έκφρασης των μορίων MHC τάξης Ι και ΙΙ, των συνδιεγερτικών μορίων, καθώς και πολλών πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην επεξεργασία του αντιγόνου στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Με τον τρόπο αυτό ενισχύει την αντιγονοπαρουσίαση στα Τ λεμφοκύτταρα [55]. Επιπλέον, υπό την επίδραση της IFN γ και στις κατάλληλες συνθήκες, τα κυψελιδικά μακροφάγα σχηματίζουν γιγαντοκύτταρα [71]. Ο ρόλος της IFN γ και της IL 12 στη δημιουργία του κοκκιώματος αποκαλύπτεται από τις διαταραχές στις κοκκιωματώδεις αντιδράσεις που εμφανίζουν οι ασθενείς με συγγενή ελλείμματα στην παραγωγή ή στους υποδοχείς των κυτταροκινών αυτών [72]. Η IFN γ ανταγωνίζεται τη δράση του TGF β στους ινοβλάστες, και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και τη σύνθεση κολλαγόνου από τους ινοβλάστες, ασκώντας έτσι αντιινωτική δράση [73, 74]. Ελαττωμένη έκφραση IFN γ έχει διαπιστωθεί σε ασθενείς με ανενεργό νόσο και με ευνοϊκή πρόγνωση [69, 75]. Τα Β λεμφοκύτταρα φαίνεται ότι είναι επίσης ενεργοποιημένα στην πνευμονική σαρκοείδωση. Τα επίπεδα των ανοσοσφαιρινών στο αίμα και τους πνεύμονες είναι συχνά αυξημένα, ενώ σε ορισμένους ασθενείς ανευρίσκονται ανοσοσυμπλέγματα, τόσο στο αίμα όσο και στο υγρό που επαλείφει το επιθήλιο. Αυξημένος αριθμός Β λεμφοκυττάρων έχει βρεθεί ακόμη μεταξύ των κοκκιωμάτων σε δείγματα βιοψίας πνεύμονα και λεμφαδένων [17]. Ο ρόλος άλλων λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών στη σαρκοείδωση δεν είναι πλήρως αποσαφηνισμένος. Αν και τα ΝΚ και CD56 + T λεμφοκύτταρα είναι ελαττωμένα στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα σε σύγκριση με το περιφερικό αίμα στους ασθενείς με σαρκοείδωση, εντούτοις τα λεμφοκύτταρα αυτά παρουσιάζουν διαφορετικούς δείκτες και λειτουργία, συμμετέχοντας πιθανώς στην προφλεγμονώδη δράση των Τ Η 1 κυτταροκινών [76]. Διαφορές στον 28

29 αριθμό των ΝΚ και CD16/56 + T λεμφοκυττάρων έχουν ανευρεθεί και μεταξύ των διαφορετικών σταδίων της σαρκοείδωσης [77]. Επίσης, έχει παρατηρηθεί μείωση των iνκτ λεμφοκυττάρων στο αίμα και στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα σε ασθενείς με σαρκοείδωση [78, 79]. Αντικρουόμενα αποτελέσματα υπάρχουν σχετικά με τον υποπληθυσμό των γδ Τ λεμφοκυττάρων. Ορισμένες μελέτες αναφέρουν αύξησή τους στον πνεύμονα και στο αίμα [80, 81], ενώ άλλες δε διαπιστώνουν διαφορές στον συγκεκριμένο υποπληθυσμό μεταξύ ασθενών και υγιών μαρτύρων [82, 83]. Στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα ασθενών με ενεργό σαρκοείδωση έχει παρατηρηθεί αύξηση του αριθμού των CD4 + CD25 bright T ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων (Τregs), με ισχυρή ανασταλτική δράση στον πολλαπλασιασμό των λεμφοκυττάρων [45, 84]. Αντίθετα, σε άλλη μελέτη ασθενών με σαρκοείδωση αναφέρεται ελάττωση της συχνότητας των FoxP3 + κυττάρων και του FoxP3 mrna στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, συγκριτικά με τους φυσιολογικούς μάρτυρες [85]. Τα μακροφάγα των πνευμόνων φαίνεται ότι παίζουν επίσης σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της σαρκοείδωσης. Τα πολυπύρηνα γιγαντοκύτταρα, που προέρχονται από τα μακροφάγα, απαντώνται στο κέντρο του σαρκοειδωσικού κοκκιώματος. Μελέτες του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, σε ασθενείς με σαρκοείδωση, δείχνουν αύξηση του αριθμού των κυψελιδικών μακροφάγων, σε σύγκριση με φυσιολογικούς μάρτυρες. Η αύξηση αυτή οφείλεται πιθανώς στη μετανάστευση των μονοκυττάρων του περιφερικού αίματος στους πνεύμονες και στον τοπικό πολλαπλασιασμό, υπό την επίδραση τοπικά παραγόμενων κυτταροκινών. Τα μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος, σε ασθενείς με ενεργό πνευμονική σαρκοείδωση, παρουσιάζουν φαινότυπο ενεργοποιημένων κυττάρων, καθώς εκφράζουν σε υψηλότερα ποσοστά τα μόρια CD16, CD69 και VLA 1 [86]. Τα κυψελιδικά μακροφάγα, στους ασθενείς με ενεργό κυρίως σαρκοείδωση, παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση των MHC τάξης ΙΙ μορίων, καθώς και των συνδιεγερτικών μορίων CD154, CD153, CD80, CD86 και CD72, ίσως λόγω της συμμετοχής τους στην αποτελεσματική αντιγονοπαρουσίαση και στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων. Μόρια προσκόλλησης, όπως τα CD54, CD11a,b,c, τα οποία συμμετέχουν στην αντιγονοπαρουσίαση, είναι αυξημένα στη σαρκοείδωση. Οι μεμβρανικοί υποδοχείς των μακροφάγων υποδηλώνουν επομένως την ενεργοποίηση των τελευταίων στις θέσεις εντόπισης της σαρκοείδωσης, και τις λειτουργικές δραστηριότητές τους όσον αφορά την προσκόλληση και τη σύνδεση με τους αντίστοιχους συνδέτες [17, 24, 28]. 29

30 Οι πληροφορίες σχετικά με το ρόλο των δενδριτικών κυττάρων, ως αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, στη σαρκοείδωση είναι λιγότερες και δείχνουν ότι τα δενδριτικά κύτταρα δεν είναι σημαντικά στη δημιουργία των κοκκιωμάτων στους πνεύμονες. Αντίθετα, σε εξωπνευμονικές θέσεις, όπως το δέρμα, τα δενδριτικά κύτταρα ίσως να συμμετέχουν στην κοκκιωματώδη αντίδραση [28]. Τα κυψελιδικά μακροφάγα στη σαρκοείδωση, παράγουν αυτόματα ή μετά από διέγερση, αυξημένες ποσότητες IL 1, TNF α, IL 6, IL 15 και GM CSF [87 95]. Επίσης έχει αναφερθεί αυξημένη έκφραση σε αυτά του mrna του TNFα, της IL 6 και της IL 15 [96, 97]. Ακόμη σε ασθενείς με σαρκοείδωση έχει παρατηρηθεί παραγωγή διαλυτών υποδοχέων του TNF (TNFRs) από τα κυψελιδικά μακροφάγα, σε μεγαλύτερα ποσά συγκριτικά με φυσιολογικούς μάρτυρες. Οι υποδοχείς αυτοί πιθανώς ρυθμίζουν τη δράση του TNF α [95]. Μεταβολίτες του αραχιδονικού οξέος, υπεροξειδικό ανιόν και 1,25 διυδροξυβιταμίνη D3 παράγονται επίσης από τα κυψελιδικά μακροφάγα, στην ενεργό κυρίως σαρκοείδωση [98 100]. Η IL 12 και η IL 18 ανευρίσκονται αυξημένες στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με σαρκοείδωση [69, 70, 101]. Ποικίλες χημειοκίνες, όπως οι CCL4 (MIP 1β), CCL2 (MCP 1), CCL5 (RANTES), CXCL9 (Mig), CXCL10 (IP 10), ανευρίσκονται επίσης αυξημένες [ ]. Κύρια πηγή προέλευσης των παραπάνω κυτταροκινών και χημειοκινών θεωρούνται τα κυψελιδικά μακροφάγα. Επιπλέον, τα κυψελιδικά μακροφάγα στη σαρκοείδωση φαίνεται να συμμετέχουν στην παραγωγή και αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών, όπως IL 10 και IL 13 [94, 105, 106]. Όσον αφορά τον TGF β, τα κυψελιδικά μακροφάγα έχουν πιθανώς μικρότερη συμμετοχή στην παραγωγή του, σε σύγκριση με άλλα κύτταρα, όπως τα επιθηλιοειδή ιστιοκύτταρα [107]. Οι προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες IL 1 και TNF α φαίνεται ότι συμμετέχουν στην παθογένεια της σαρκοείδωσης, αν και δεν υπάρχει πλήρης ομοφωνία μεταξύ των μελετών [17, 28]. Μελέτη σε πειραματικά μοντέλα με λοίμωξη από μυκοβακτηρίδια έχει δείξει ότι ο TNF α συνεργάζεται με την IFN γ στον σχηματισμό του κοκκιώματος [108]. Αντικρουόμενα αποτελέσματα υπάρχουν σχετικά με τον προγνωστικό ρόλο της αυξημένης παραγωγής TNF α από τα κυψελιδικά μακροφάγα σε νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς, καθώς έχει συσχετισθεί με προοδευτική νόσο ή ευνοϊκή εξέλιξη [109, 110]. Αυξημένη παραγωγή TNF α στους πνεύμονες έχει παρατηρηθεί σε ασθενείς με χρόνια σαρκοείδωση, οι οποίοι είχαν προοδευτική νόσο ή νόσο ανθεκτική στα 30

31 κορτικοστεροειδή, σε αντίθεση με όσους είχαν σταθερή νόσο, καθώς και σε ασθενείς με ενεργό σαρκοείδωση συγκριτικά με ασθενείς με ανενεργό νόσο [91, 111, 112]. Η συμμετοχή της IL 12 και της IL 18 στην Τ Η 1 ανοσιακή απάντηση της σαρκοείδωσης υποστηρίζεται από τα αυξημένα επίπεδα των παραπάνω κυτταροκινών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, τα οποία συσχετίζονται με τον αριθμό των λεμφοκυττάρων [69, 70, 101, 113]. Αυξημένα επίπεδα και έκφραση IL 12 έχουν ανευρεθεί σε ασθενείς με ενεργό νόσο, και έχουν συνδεθεί με δυσμενέστερη πρόγνωση [69, 113]. Η IL 12 συνιστά κύριο μεσολαβητή της ανοσιακής απάντησης σε ενδοκυττάρια μικρόβια, καθώς επάγει την παραγωγή IFN γ από τα Τ και ΝΚ λεμφοκύτταρα και προωθεί τη διαφοροποίηση των CD4 + T λεμφοκυττάρων σε Τ Η 1 λεμφοκύτταρα. Αποτελείται από δύο υπομονάδες, τις p40 και p35, και παράγεται κατά κύριο λόγο από τα ενεργοποιημένα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα και τα δενδριτικά κύτταρα. Τα διεγερμένα CD4 + T λεμφοκύτταρα και τα ΝΚ λεμφοκύτταρα προάγουν την παραγωγή IL 12 από τα μακροφάγα, με τη σύνδεση ειδικών υποδοχέων (CD40L CD40) και με την παραγωγή IFN γ. Η IL 23, η IL 27 και η IL 18 παράγονται επίσης από ενεργοποιημένα μακροφάγα και δενδριτικά κύτταρα, και διεγείρουν την παραγωγή IFN γ από τα Τ και ΝΚ λεμφοκύτταρα, συμμετέχοντας έτσι στην Τ Η 1 ανοσιακή απάντηση [55]. Επιπλέον, η IL 23 συμβάλλει πιθανώς, μαζί με άλλες κυτταροκίνες, στη διαφοροποίηση των T H 17 λεμφοκυττάρων στον άνθρωπο, και σε παθολογικές Τ Η 1 φλεγμονώδεις απαντήσεις [56]. Οι δύο υπομονάδες της IL 27 (EB13 και p28) έχουν ανιχνευτεί στα επιθηλιοειδή και στα πολυπύρηνα γιγαντοκύτταρα των κοκκιωμάτων, σε δείγματα βιοψίας λεμφαδένων ασθενών με σαρκοείδωση, υποδεικνύοντας πιθανή συμμετοχή της στην παθογένεια της σαρκοείδωσης [114]. Ασθενείς με γενετικά ελλείμματα στο σύστημα IL12/IL 12R παρουσιάζουν διαταραχές ποικίλου βαθμού στη δημιουργία των κοκκιωμάτων, αναδεικνύοντας έτσι τη σημασία της IL 12 στην κοκκιωματώδη απάντηση [72]. Μελέτες σχετικά με τη συμμετοχή της IL 23 στη σαρκοείδωση δεν υπάρχουν μέχρι σήμερα. Στην ενεργό σαρκοείδωση έχει ανευρεθεί αυξημένη παραγωγή IL 15 από τα κυψελιδικά μακροφάγα και τα περιφερικά μονοπύρηνα, σε σύγκριση με φυσιολογικούς μάρτυρες, αλλά σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις [92]. Η IL 15 μοιάζει με την IL 2, ως προς τη δομή και τη δράση. Σε αντίθεση με την IL 2, δεν παράγεται από Τ λεμφοκύτταρα, αλλά από μονοπύρηνα φαγοκύτταρα, και άλλους τύπους κυττάρων. Η IL 15 διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των ΝΚ και 31

32 των Τ λεμφοκυττάρων, δρώντας όπως η IL 2 κατά την πρώιμη φυσική ανοσιακή απάντηση [55]. Σε δείγματα βιοψίας βρογχικού ιστού από ασθενείς με σαρκοείδωση έχει παρατηρηθεί αυξημένος αριθμός κυττάρων (ουδετερόφιλων πολυμορφοπυρήνων και μακροφάγων) θετικών στην IL 15 [115]. Τα CD4 + T λεμφοκύτταρα των πνευμόνων ασθενών με σαρκοείδωση διαθέτουν υποδοχείς για την IL 15 και πολλαπλασιάζονται μετά από προσθήκη IL 15 [97]. Η σχετικά υψηλή συχνότητα αυτόματης υποχώρησης της σαρκοείδωσης οδήγησε στη διερεύνηση του ρόλου των αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών, όπως της IL 10, της IL 13 και του TGF β. Η IL 10 παράγεται κυρίως από ενεργοποιημένα μακροφάγα, αλλά και από Τ Η 2 λεμφοκύτταρα. Δρα ανασταλτικά σε πολλές λειτουργίες των ενεργοποιημένων μακροφάγων, όπως στην παραγωγή IL 12 και στην έκφραση συνδιεγερτικών μορίων και μορίων MHC τάξης ΙΙ, συμμετέχοντας έτσι στον τερματισμό της κυτταρικής ανοσιακής απάντησης [55]. Επιπλέον, η IL 10, όπως και η IL 4, φαίνεται ότι προάγει την απόπτωση των μονοκυττάρων και των Τ λεμφοκυττάρων [116, 117]. Αντιφατικά είναι τα ευρήματα σχετικά με το ρόλο της IL 10 στη σαρκοείδωση. Ορισμένες μελέτες δείχνουν αυξημένη έκφραση και παραγωγή IL 10 σε ασθενείς με ενεργό νόσο [69, 94]. Το εύρημα αυτό δεν επιβεβαιώνεται σε άλλες μελέτες [101, 118]. Η IL 13 και ο TGF β, σε αντίθεση με την IL 10, κατατάσσονται στις κυτταροκίνες μεσολαβητές της ειδικής ανοσίας. Η IL 13 μοιάζει δομικά και λειτουργικά με την IL 4, καθώς αναστέλλει την ενεργοποίηση των μακροφάγων και ανταγωνίζεται τη δράση της IFN γ. Συντίθεται από τα Τ Η 2 λεμφοκύτταρα και από ορισμένα επιθηλιακά κύτταρα [55]. Η IL 13, μαζί με την IL 4, συμμετέχει στην κοκκιωματώδη απάντηση και κυρίως στην ίνωση σε ζωϊκό μοντέλο σχιστοσωμίασης [119]. Στη σαρκοείδωση έχει ανευρεθεί αυξημένη έκφραση IL 13 στα κύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του περιφερικού αίματος, και η δράση της θα μπορούσε να σχετίζεται με την ελάττωση της παραγωγής TNF α [106]. Στην ίδια μελέτη φάνηκε ότι η κύρια κυτταρική πηγή της IL 13 ήταν τα κυψελιδικά μακροφάγα, και όχι τα Τ λεμφοκύτταρα. Το εύρημα ενισχύεται από την παρόμοια έκφραση IL 13 στα λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του περιφερικού αίματος, μεταξύ ασθενών και υγιών μαρτύρων σε άλλη μελέτη [63]. O TGF β συντίθεται στα Τ λεμφοκύτταρα, στα μακροφάγα και σε άλλους κυτταρικούς τύπους. Ασκεί αντιφλεγμονώδη και ανοσορρυθμιστική δράση, αναστέλλοντας τον πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων και την 32

33 ενεργοποίηση των μακροφάγων. Επιπλέον, προωθεί τη σύνθεση πρωτεϊνών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας [55]. O TGF β διεγείρει τη σύνθεση κολλαγόνου σε ινοβλάστες από δείγματα φυσιολογικού, αλλά και ινωτικού πνεύμονα [120]. Μελέτες σχετικά με το ρόλο του TGF β στη σαρκοείδωση έχουν καταλήξει σε αντιφατικά αποτελέσματα. Η αυξημένη παραγωγή του TGFβ έχει συνδεθεί με υποχώρηση της ενεργού νόσου, αλλά και με διαταραχή της πνευμονικής λειτουργίας [107, 118]. Σχετικά αυξημένη έκφραση TGF β έχει παρατηρηθεί σε νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς με ευνοϊκή πρόγνωση, ενώ σε άλλη μελέτη δεν ανευρέθηκαν διαφορές στην έκκριση του TGF β μεταξύ ασθενών και φυσιολογικών μαρτύρων [75, 105]. Ο αυξητικός παράγοντας των κοκκιοκυττάρων μακροφάγων (GM CSF) συντίθεται στα μακροφάγα, στα ενδοθηλιακά κύτταρα, στα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα και στους ινοβλάστες, και δρα επί των προγονικών κυττάρων του μυελού των οστών, προωθώντας την παραγωγή δενδριτικών κυττάρων και μονοκυττάρων [55]. Επίσης διεγείρει τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και το σχηματισμό πολυπύρηνων γιγαντοκυττάρων από τα κυψελιδικά μακροφάγα [121]. Η κυτταροκίνη αυτή ανευρίσκεται αυξημένη στη σαρκοείδωση [94, 122]. O GM CSF προκαλεί εντονότερη παραγωγή TNF α και IL 1 από τα κυψελιδικά μακροφάγα ασθενών με σαρκοείδωση, σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς μάρτυρες [123]. Οι χημειοκίνες συνιστούν μία μεγάλη οικογένεια ομόλογων δομικά κυτταροκινών, οι οποίες διεγείρουν την κίνηση των λευκοκυττάρων και ρυθμίζουν τη μετανάστευσή τους από το αίμα στους ιστούς, δρώντας στους αντίστοιχους υποδοχείς. Οι χημειοκίνες των CC και CXC οικογενειών παράγονται από λευκοκύτταρα, όπως διεγερμένα Τ λεμφοκύτταρα, καθώς και από διάφορους τύπους κυττάρων, όπως ενδοθηλιακά, επιθηλιακά και ινοβλάστες, υπό την επίδραση συχνά μικροβίων και των προφλεγμονωδών κυτταροκινών TNF και IL 1 [55]. Στη σαρκοείδωση αυξάνονται ποικίλες χημειοκίνες που είναι υπεύθυνες για τη χημειοταξία των μονοκυττάρων και των λεμφοκυττάρων, κυρίως των CD4 + T λεμφοκυττάρων, όπως η CCL2 (MCP 1), η CCL4 (MIP 1β), η CCL5 (RANTES), η CXCL9 (MIG), η CXCL10 (IP 10) [ , ]. Τα κυψελιδικά μακροφάγα φαίνεται ότι αποτελούν την κυτταρική πηγή των χημειοκινών CCL5, CXCL9, CXCL10 στη σαρκοείδωση [104, 127]. Επιπλέον στη σαρκοείδωση παρατηρείται άθροιση των κυττάρων που εκφράζουν τον υποδοχέα CXCR3 στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, η οποία συσχετίζεται με την αυξημένη έκκριση του αντίστοιχου συνδέτη CXCL10 [128, 33

34 129]. Οι χημειοκίνες συμμετέχουν πιθανώς σε ένα θετικό παλίνδρομο κύκλωμα ρύθμισης, όπου η ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων και των μακροφάγων οδηγεί σε αυξημένη έκφραση IFN γ, η οποία με τη σειρά της αυξάνει την παραγωγή χημειοκινών, που προσελκύουν περισσότερα Τ λεμφοκύτταρα [28]. Στη σαρκοείδωση έχει ανευρεθεί αύξηση χημειοκινών, που προκαλούν τη συσσώρευση ουδετερόφιλων πολυμορφοπυρήνων, όπως της CXCL1 (GROα), της CCL3 (MIP 1α) και της CXCL8 (IL 8) [126, 130, 131]. Μεγαλύτερη έκκριση CXCL8 και CCL3 έχει παρατηρηθεί στους ασθενείς με προοδευτική νόσο [130]. Ο λόγος μετάπτωσης της νόσου στη χρονιότητα σε ορισμένους μόνο από τους ασθενείς, καθώς και οι μηχανισμοί με τους οποίους η εμμένουσα νόσος οδηγεί σε ίνωση και καταστροφή του πνεύμονα, παραμένουν άγνωστα. Τα ανοσιακά χαρακτηριστικά ωστόσο των κυττάρων, στο κοκκίωμα της σαρκοείδωσης, δείχνουν ότι αφενός τα σαρκοειδωσικά κοκκιώματα δημιουργούνται εξαιτίας του επίμονου αντιγονικού και ανοσογονικού ερεθίσματος που απομακρύνεται δύσκολα, και οδηγεί σε μια πληθωρική τοπική T Η 1 ολιγοκλωνική κυτταρική απάντηση, και αφετέρου, λόγω της χρόνιας αντιγονικής διέγερσης, τα μακροφάγα απελευθερώνουν τοπικά μεσολαβητές της φλεγμονής που επιτείνουν τη συνάθροιση T Η 1 κυττάρων στη θέση της συνεχιζόμενης φλεγμονής, με αποτέλεσμα τη δημιουργία της δομής του κοκκιώματος [10]. Ο λόγος T H 1/T H 2 πιθανώς να εξηγεί τις διαφορές στην κλινική έκβαση της νόσου. Ο μηχανισμός με τον οποίο η επίμονη νόσος οδηγεί στην ίνωση έγκειται πιθανώς σε μία μεταστροφή του T H 1 φαινότυπου σε T H 2 με παραγωγή IL 4, IL 5, IL 9 και IL 10, που οφείλεται ίσως σε μία προσπάθεια καταστολής της φλεγμονώδους απάντησης. Ίσως όμως η Τ Η 2 ανοσιακή απάντηση να επικρατεί από τα αρχικά στάδια της νόσου στους ασθενείς με ίνωση [57, 132, 133]. Εναλλακτικά, η παρατεταμένη Τ Η 1 φλεγμονώδης απάντηση, σε συνδυασμό με την ιστική βλάβη από την τοπική παραγωγή ελευθέρων ριζών οξυγόνου, πρωτεασών και λυσοσωμικών προϊόντων, παρουσία προϊνωτικών κυτταροκινών, όπως IGF 1 και TGF β, είναι πιθανό να οδηγούν στην ίνωση [2, 11]. Η μελέτη των Τ Η 1/Τ Η 2 κυτταροκινών, στις διαφορετικές φάσεις της πνευμονικής σαρκοείδωσης, θεωρείται αναγκαία για την αποσαφήνιση του ρυθμιστικού τους ρόλου στην ίνωση [11, 57]. 4. Ιστοπαθολογία Η χαρακτηριστική βλάβη της σαρκοείδωσης είναι το διακριτό, συμπαγές, μη τυροειδοποιημένο επιθηλιοειδές κοκκίωμα [134]. Το επιθηλιοειδές 34

35 κοκκίωμα απαρτίζεται από έντονα διαφοροποιημένα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα (επιθηλιοειδή κύτταρα και γιγαντοκύτταρα) και λεμφοκύτταρα. Στο κεντρικό τμήμα του κοκκιώματος ανευρίσκονται CD4 + λεμφοκύτταρα, ενώ CD4 + και CD8 + λεμφοκύτταρα βρίσκονται στην περιφερική ζώνη του κοκκιώματος. Αν και το σαρκοειδωσικό κοκκίωμα δε χαρακτηρίζεται τυπικά από νέκρωση, μικρού ή μέτριου βαθμού κεντρική νέκρωση μπορεί να υπάρχει. Η συρροή των κοκκιωμάτων μπορεί να οδηγήσει στη δημιουργία μονήρων ή πολλαπλών, ακτινολογικά εμφανών όζων [11, 135]. Πριν την εμφάνιση των κοκκιωμάτων, στις θέσεις ενεργότητας της σαρκοείδωσης παρατηρούνται κυτταρικές διηθήσεις, που αποτελούνται κυρίως από Τ Η 1 λεμφοκύτταρα. Οι πρόδρομες αυτές βλάβες, που συνιστούν την κυψελιδίτιδα της σαρκοείδωσης, έχουν ανευρεθεί σε δείγματα ανοικτής βιοψίας και διαβρογχικής βιοψίας πνεύμονα, και αντικατοπτρίζονται στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα [135]. Τα σαρκοειδωσικά κοκκιώματα, ιδιαίτερα στα αρχικά στάδια, δε διαφέρουν από τα κοκκιώματα που παρατηρούνται σε άλλες κοκκιωματώδεις νόσους άγνωστης ή ακόμη και γνωστής αιτιολογίας, όπως στη βηρυλλίωση, στη φυματίωση και στην πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία. Στον πνεύμονα τα κοκκιώματα συνήθως σχηματίζονται στον υποβλεννογόνιο χιτώνα των βρόγχων, υποϋπεζωκοτικά και στα διαφράγματα ανάμεσα στα λοβία, δηλαδή στις θέσεις όπου υπάρχουν άφθονα λεμφαγγεία. Μέσω των λεμφαγγείων, το υπεύθυνο αντιγόνο ή αντιγόνα θεωρείται ότι μεταφέρονται από την περιφέρεια των πνευμόνων στους πυλαίους και μεσοθωρακικούς λεμφαδένες. Η λεμφαγγειακή κατανομή των κοκκιωμάτων είναι χαρακτηριστική στη σαρκοείδωση [135]. Τα κοκκιώματα προκύπτουν λόγω ανοσιακής απάντησης σε ολιγοπεπτίδια, τα οποία είναι άγνωστα στην περίπτωση της σαρκοείδωσης. Τα ολιγοπεπτίδια φαγοκυτταρώνονται από τα μακροφάγα και παραμένουν εντός αυτών λόγω αντοχής στην ενζυμική διάσπαση. Στη συνέχεια παρουσιάζονται στα Τ λεμφοκύτταρα μέσω των MHC τάξης II μορίων, προκαλώντας ενεργοποίηση των CD4 + T λεμφοκυττάρων μέσω του TCR. Η κυτταρική ανάλυση των κοκκιωμάτων σε διαφορετικές χρονικές στιγμές δείχνει ότι τα κυτταρικά συστατικά βρίσκονται σε δυναμική ισορροπία, που οφείλεται στην κυτταρική ανανέωση και τον κυτταρικό θάνατο. Τα διαφορετικά συστατικά του κοκκιώματος βρίσκονται υπό τον έλεγχο ποικίλων κυτταροκινών, οι οποίες 35

36 παράγονται από μακροφάγα και Τ λεμφοκύτταρα, ως συνέπεια στενών κυτταρικών αλληλεπιδράσεων, και έχουν αυτοκρινή και παρακρινή δράση [17]. Τα κοκκιώματα λύονται ή μεταπίπτουν σε ίνωση. Η ίνωση αρχίζει συνήθως από την περιφέρεια του κοκκιώματος και μπορεί να επεκταθεί κεντρικά, μέχρι και πλήρους αντικατάστασης του κοκκιώματος από ινώδη ιστό [135]. Η ισορροπία μεταξύ ανάπτυξης ή λύσης των κοκκιωμάτων αντικατοπτρίζει την ισορροπία μεταξύ προφλεγμονωδών κυτταροκινών και παραγόντων που επηρεάζουν τον ρυθμό κυτταρικής απόπτωσης. Στη σαρκοείδωση η απόπτωση ελέγχεται από ποικιλία διαφορετικών παραγόντων, που εμπλέκονται στη διαταραχή ρύθμισης της υπεροικογένειας του TNF, την έκφραση ογκογονιδίων και τον λόγο T H 1/T H 2 [17, 136, 137]. Στη σαρκοείδωση τελικού σταδίου παρατηρείται ίνωση του παρεγχύματος και εικόνα μελισσοκηρύθρας στην απλή ακτινογραφία θώρακα. Οι παράγοντες που οδηγούν στην ίνωση δεν είναι πλήρως διευκρινισμένοι [11]. 5. Κλινικά συμπτώματα και ευρήματα Η σαρκοείδωση είναι μία πολυσυστηματική νόσος. Η κλινική της εικόνα ποικίλει έντονα και εξαρτάται από την εθνικότητα, τη διάρκεια της νόσου, τη θέση και την έκταση της προσβολής των διαφόρων οργάνων, καθώς και τη δραστηριότητα της κοκκιωματώδους φλεγμονής [2, 11, 138]. Περισσότεροι από τα δύο τρίτα των ασθενών είναι ασυμπτωματικοί και η διάγνωση της σαρκοείδωσης τίθεται μετά την ανεύρεση παθολογικών ευρημάτων στην απλή ακτινογραφία θώρακος ή σπανιότερα στη βιοχημική εξέταση της ηπατικής λειτουργίας. Το ένα τρίτο των ασθενών με σαρκοείδωση εμφανίζουν μη ειδικά συμπτώματα, όπως πυρετό, εύκολη κόπωση, κακουχία και απώλεια βάρους. Ο πυρετός και η απώλεια βάρους δεν είναι συνήθως έντονα. Σύμφωνα με την αρχική κλινική εκδήλωση της σαρκοείδωσης, οι ασθενείς μπορούν να χωριστούν σε δύο υποομάδες, αυτούς με οξεία ή χρόνια μορφή. Η οξεία μορφή μπορεί να εκδηλωθεί με το σύνδρομο Löfgren, που χαρακτηρίζεται από πυρετό, αμφοτερόπλευρη πυλαία λεμφαδενοπάθεια, πολυαρθρίτιδα και οζώδες ερύθημα. Το σύνδρομο Löfgren παρατηρείται συχνότερα στην Καυκάσια φυλή. Η έναρξη των συμπτωμάτων είναι συνήθως αιφνίδια, ενώ αυτόματη υποχώρηση του συνδρόμου παρατηρείται τις περισσότερες φορές μετά από λίγες εβδομάδες ή μήνες. Η χρόνια μορφή της σαρκοείδωσης χαρακτηρίζεται από σταδιακή, ύπουλη εισβολή. 36

37 Οι πνεύμονες προσβάλλονται σε περισσότερους από το 90% των ασθενών με σαρκοείδωση, με κυριότερα συμπτώματα τον ξηρό βήχα, τη δύσπνοια και το θωρακικό άλγος. Η νόσος ταξινομείται σε πέντε στάδια με βάση την ακτινολογική εικόνα. Στο στάδιο 0 δεν αναφέρονται ορατές βλάβες στον θώρακα. Στο στάδιο I παρατηρείται πυλαία λεμφαδενοπάθεια, που ενίοτε συνοδεύεται από παρατραχειακή λεμφαδενοπάθεια. Αν και δεν υπάρχουν ορατές πνευμονικές διηθήσεις, βιοψίες του πνεύμονα σε αυτό το στάδιο δείχνουν συχνά την ύπαρξη κοκκιωμάτων. Στο στάδιο ΙΙ παρατηρούνται πυλαία λεμφαδενοπάθεια και παρεγχυματικές διηθήσεις. Στο στάδιο III υπάρχουν στην ακτινογραφία πνευμονικές διηθήσεις χωρίς πυλαία λεμφαδενοπάθεια. Στο στάδιο IV διαπιστώνεται η εγκατάσταση προχωρημένης ίνωσης, με στοιχεία εικόνας μελισσοκηρήθρας, κύστεων και εμφυσήματος. Από τους ασθενείς, στους οποίους τίθεται για πρώτη φορά η διάγνωση της σαρκοείδωσης, 40 50% βρίσκονται στο στάδιο I, 20 30% στο στάδιο II και 10 20% στο στάδιο III. Αν και η προσβολή του πνευμονικού παρεγχύματος είναι η πιο συχνή, αναφέρονται και περιπτώσεις προσβολής των αεροφόρων οδών (λάρυγγας, τραχεία, βρόγχοι), με αποτέλεσμα απόφραξη και βρογχεκτασίες. Επίσης αναφέρεται ότι οι ασθενείς με σαρκοείδωση, σε ποσοστό μεγαλύτερο του 20%, παρουσιάζουν βρογχική υπεραντιδραστικότητα [139]. Η οφθαλμική σαρκοείδωση εκδηλώνεται συχνότερα με πρόσθια ραγοειδίτιδα, σε συνδυασμό συνήθως με αμφοτερόπλευρη πυλαία λεμφαδενοπάθεια. Η νόσος μπορεί να προσβάλλει οποιοδήποτε τμήμα του οφθαλμού. Συμμετοχή του δέρματος παρουσιάζεται στο 25% όλων των ασθενών. Δύο κλινικά σημαντικές δερματικές βλάβες είναι το οζώδες ερύθημα και ο χειμετλοειδής λύκος (lupus pernio). Το οζώδες ερύθημα συνήθως υποχωρεί εντός 6 8 βδομάδων, σε αντίθεση με τον χειμετλοειδή λύκο που ακολουθεί χρόνια πορεία. Όσον αφορά τον λεμφικό ιστό, περίπου το ένα τρίτο των ασθενών με σαρκοείδωση παρουσιάζουν ψηλαφητούς περιφερικούς λεμφαδένες. Η διόγκωση του σπληνός είναι συνήθως ελάχιστη και ασυμπτωματική, αλλά μπορεί να προκαλέσει συμπτώματα από πίεση, αναιμία, λευκοπενία και θρομβοπενία. Συμμετοχή του μυοκαρδίου εκδηλώνεται κλινικά μόνο στο 5% των πασχόντων από σαρκοείδωση. H καρδιακή νόσος ποικίλει, από την εκδήλωση ήπιων αρρυθμιών μέχρι τον καρδιακό αποκλεισμό και τον αιφνίδιο θάνατο. 37

38 Με βάση ιστολογικά κριτήρια το ήπαρ προσβάλλεται στο 50 80% των ασθενών, ενώ τα συμπτώματα και η κλινική εξέταση δείχνουν ηπατική προσβολή σε μικρότερο ποσοστό. Άλλα όργανα που μπορούν να προσβληθούν από τη σαρκοείδωση είναι το νευρικό σύστημα, το μυοσκελετικό σύστημα, ο πεπτικός σωλήνας, το αιμοποιητικό σύστημα, οι σιελογόνοι αδένες, ο δακρυϊκός αδένας και το αναπαραγωγικό σύστημα. Οι νεφροί προσβάλλονται κυρίως λόγω χρόνιας υπερασβεστιουρίας, που προκαλείται από τη μεγάλη παραγωγή 1,25 διυδροξυβιταμίνης D 3 στα μακροφάγα και στα επιθηλιοειδή κύτταρα των κοκκιωμάτων. 6. Διάγνωση Δεν υπάρχουν παθογνωμονικά χαρακτηριστικά της σαρκοείδωσης ούτε ειδική διαγνωστική μέθοδος αναφοράς. Η διάγνωση της σαρκοείδωσης τίθεται από τη συμβατή κλινική εικόνα, από την ιστολογική επιβεβαίωση των μη τυροειδοποιημένων κοκκιωμάτων και από τον αποκλεισμό άλλων νοσημάτων με παρόμοια κλινική ή ιστολογική εικόνα [2, 10]. Η παρουσία μη τυροειδοποιημένων κοκκιωμάτων σε ένα όργανο, όπως το δέρμα, δε θέτει τη διάγνωση της σαρκοείδωσης. Η διαγνωστική προσέγγιση των πασχόντων με σαρκοείδωση πρέπει να ολοκληρώνεται με την ιστολογική επιβεβαίωση της νόσου, την αποτίμηση της έκτασης και της σοβαρότητας προσβολής των πνευμόνων και άλλων οργάνων, την πρόγνωση για την πορεία της νόσου, και την εκτίμηση της αναγκαιότητας ή μη για χορήγηση θεραπείας. Εφόσον η συμπτωματολογία του ασθενούς συνηγορεί υπέρ της διάγνωσης της σαρκοείδωσης, το επόμενο βήμα είναι η επιλογή της σωστής θέσης για βιοψία. Η διαβρογχική βιοψία πνεύμονα συστήνεται στις περισσότερες περιπτώσεις. Η διαγνωστική ακρίβεια της μεθόδου αναφέρεται ότι είναι περίπου 70%. Η διαγνωστική αξία της βελτιώνεται, εφόσον αυξάνεται ο αριθμός των βιοψιών και όταν η βιοψία εκτελείται από έμπειρο γιατρό [140]. Η πρόσφατη ανάπτυξη των γραμμικών ηχοενδοσκοπίων έχει προσφέρει νέες δυνατότητες στη διάγνωση της πνευμονικής σαρκοείδωσης. Τόσο η αναρρόφηση με λεπτή βελόνη με την καθοδήγηση διοισοφαγικού υπερήχου (transesophageal ultrasound guided fine needle aspiration, EUS FNA), όσο και η διαβρογχική αναρρόφηση με βελόνη με την καθοδήγηση ενδοβρογχικού υπερήχου (endobronchial ultrasonography guided transbronchial needle aspiration, EBUS TBNA) αποτελούν ασφαλείς και ελάχιστα επεμβατικές μεθόδους. Η διαγνωστική αξία, η ευαισθησία και η ειδικότητα των μεθόδων 38

39 αυτών φαίνεται ότι είναι υψηλή και για τις δύο μεθόδους, οι οποίες διαφέρουν ως προς τη δυνατότητα πρόσβασης των πυλαίων λεμφαδένων. Επιπλέον, η EBUS TBNA πλεονεκτεί, καθώς μπορεί να διενεργηθεί ταυτόχρονα με άλλες διαγνωστικές μεθόδους, όπως τη λήψη βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος [138]. Η προσεκτική εξέταση του ασθενή μπορεί να αποκαλύψει άλλες πιθανές θέσεις για βιοψία, όπως το δέρμα ή επιφανειακούς λεμφαδένες. Δεν είναι ωστόσο χρήσιμη η βιοψία βλαβών οζώδους ερυθήματος, καθώς δεν παρουσιάζουν κοκκιώματα. Σπάνια ενδείκνυται η βιοψία ήπατος, ακόμη και σε περίπτωση ενδείξεων συμμετοχής του ήπατος στη νόσο, ενώ η βιοψία σκαληνού μυός δε συστήνεται. Το ολοσωματικό σπινθηρογράφημα με 67 Ga μπορεί να υποδείξει την κατάλληλη θέση για βιοψία [11]. Όταν η βρογχική ή διαβρογχική βιοψία είναι μη διαγνωστική και δεν ανευρίσκονται άλλες προσβάσιμες θέσεις για βιοψία, τότε η χειρουργική βιοψία πνεύμονα μπορεί να ενδείκνυται, εφόσον υπάρχουν βλάβες στην απλή ακτινογραφία ή αξονική τομογραφία θώρακος. Η διαπίστωση λεμφαδενοπάθειας μεσοθωρακίου στην αξονική τομογραφία θώρακος, αποτελεί κατά σειρά ένδειξη για βιοψία με μεσοθωρακοσκόπηση, θωρασκοπική βιοψία πνεύμονα με βοήθεια video (videoassisted thoracoscopic lung biopsy, VTLB) ή ανοικτή βιοψία πνεύμονα. Η διαγνωστική αξία αυτών των διαδικασιών υπερβαίνει το 90% [11]. Τα κυριότερα νοσήματα που πρέπει συνήθως να αποκλεισθούν είναι η φυματίωση, ορισμένες λοιμώξεις από μύκητες και το λέμφωμα. Επίσης, πρέπει να γίνει διαφορική διάγνωση από τη χρόνια βηρυλλίωση, την πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία και τις φαρμακευτικές αντιδράσεις, στις περιπτώσεις που τίθεται υποψία από το ιστορικό του ασθενούς. Όταν απουσιάζει η πολυσυστηματική νόσος, η διάγνωση της σαρκοείδωσης εικάζεται, δεδομένου ότι τοπικές αντιδράσεις, παρόμοιες με τα σαρκοειδωσικά κοκκιώματα, εμφανίζονται ενίοτε σαν απάντηση σε λοίμωξη, κακοήθεια ή ξένο σώμα [2]. Στην περίπτωση που η βιοψία δεν είναι εφικτή ή επιθυμητή, τα κλινικά και ακτινολογικά στοιχεία μπορεί να είναι διαγνωστικά για ασθενείς με σαρκοείδωση σταδίου I (αξιοπιστία 98%) και σταδίου II (αξιοπιστία 89%), αλλά είναι λιγότερο επαρκή για ασθενείς σταδίου III (αξιοπιστία 52%) ή σταδίου 0 (23%) [10]. Στην περίπτωση που ο ασθενής εμφανίζει την κλασική κλινική εικόνα του συνδρόμου Löfgren, δηλαδή πυρετό, οζώδες ερύθημα, αρθραλγίες και αμφοτερόπλευρη πυλαία λεμφαδενοπάθεια, η βιοψία μπορεί να μην είναι απαραίτητη, εφόσον η νόσος λύεται ταχέως και αυτόματα. 39

40 Το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα μπορεί να παρέχει χρήσιμες πληροφορίες για τη διάγνωση της σαρκοείδωσης. Τα χαρακτηριστικά ευρήματα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος στη σαρκοείδωση είναι ο φυσιολογικός ή ήπια αυξημένος αριθμός κυττάρων με επικράτηση των λεμφοκυττάρων, το φυσιολογικό συνήθως ποσοστό ουδετερόφιλων και εωσινόφιλων πολυμορφοπυρήνων, και η απουσία πλασματοκυττάρων και αφρωδών κυψελιδικών μακροφάγων. Αύξηση των λεμφοκυττάρων ανευρίσκεται στο 90% των ασθενών με σαρκοείδωση κατά την έναρξη της νόσου [138]. Σε πολλές περιπτώσεις η μελέτη των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα είναι βοηθητική. Ο προσδιορισμός τιμής λόγου CD4/CD8 μεγαλύτερης του 3.5 στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα έχει ευαισθησία 53%, ειδικότητα 94%, θετική προγνωστική αξία 76% και αρνητική προγνωστική αξία 85% για τη σαρκοείδωση [11,141]. Επομένως, λόγος CD4/CD8 μεγαλύτερος από 3.5 είναι διαγνωστικός για τη σαρκοείδωση, ακόμη και σε περίπτωση μη διαγνωστικής διαβρογχικής βιοψίας. Η έκφραση της ιντεγκρίνης CD103, στα CD4 + Τ λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, έχει προσφάτως αξιολογηθεί χρήσιμη στη διαφορική διάγνωση της σαρκοείδωσης από τις άλλες διάμεσες πνευμονοπάθειες [142]. Σύμφωνα με τη μελέτη αυτή, η συνδυασμένη χρήση του λόγου CD103 + CD4 + /CD4 + (<0.2) με τον απόλυτο ή σχετικό λόγο (σε σχέση με το περιφερικό αίμα) CD4 + /CD8 + (>3 ή >2, αντίστοιχα) διαχωρίζει την πνευμονική σαρκοείδωση από άλλες διάμεσες πνευμονοπάθειες με ευαισθησία 66% και ειδικότητα 89%. Επιπλέον, βιοψία βρογχικού βλεννογόνου κατά τη διάρκεια βρογχοσκόπησης δείχνει μη τυροειδοποιημένα κοκκιώματα στο 41 57% των ασθενών με σαρκοείδωση [11]. Η παρουσία των σημείων «lamda» «panda» στο ολοσωματικό σπινθηρογράφημα με 67 Ga στηρίζει τη διάγνωση της σαρκοείδωσης, σε λίγους όμως ασθενείς, και αποφεύγεται η εφαρμογή μιας επεμβατικής διαγνωστικής μεθόδου [ ]. Ορισμένοι ορολογικοί δείκτες έχουν επίσης εκτιμηθεί ως προς τη διαγνωστική τους αξία. Το μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτενσίνης (ACE), το οποίο προέρχεται από τα κοκκιώματα, ανευρίσκεται αυξημένο στο 40 80% των ασθενών με σαρκοείδωση, αλλά με χαμηλή ειδικότητα. Μεγαλύτερη ειδικότητα έχει η υπερδιπλάσια αύξηση του ACE, αν και μπορεί να ανευρεθεί και στη φυματίωση, στη νόσο Gaucher και στον υπερθυρεοειδισμό. Η λυσοζύμη, που εκκρίνεται από τα μακροφάγα, βρίσκεται αυξημένη στα 2/3 περίπου των ασθενών. Στους νεότερους υποψήφιους ορολογικούς 40

41 διαγνωστικούς δείκτες της σαρκοείδωσης περιλαμβάνονται ο διαλυτός υποδοχέας II του TNF (stnfrii) και η IL 12 p40, χωρίς όμως να είναι τεκμηριωμένη η αξία τους [11, 138]. 7. Περαιτέρω διερεύνηση Αφού τεκμηριωθεί η διάγνωση της σαρκοείδωσης με το ιστορικό, την κλινική εξέταση και την απλή ακτινογραφία θώρακος, συνιστάται η εφαρμογή επιπλέον εξετάσεων σε όλους τους ασθενείς [10, 11, 138]. Οι εξετάσεις αυτές περιλαμβάνουν: 1. δοκιμασίες ελέγχου της αναπνευστικής λειτουργίας, 2. γενική αίματος, 3. βιοχημικές ορολογικές εξετάσεις (ασβέστιο, ηπατικά ένζυμα, κρεατινίνη, BUN), 4. γενική ούρων, 5. ηλεκτροκαρδιογράφημα, 6. οφθαλμολογική εξέταση, 7. δερματική δοκιμασία με φυματίνη (Mantoux). Οι δοκιμασίες ελέγχου της αναπνευστικής λειτουργίας περιλαμβάνουν συνήθως την ικανότητα διάχυσης του μονοξειδίου του άνθρακα (DL CO ), τη σπιρομέτρηση και τον υπολογισμό των πνευμονικών όγκων. Η ικανότητα διάχυσης του του μονοξειδίου του άνθρακα και η ζωτική χωρητικότητα (vital capacity) αποτελούν τις πιο ευαίσθητες εξετάσεις. Η μέτρηση των αερίων του αρτηριακού αίματος, σε ηρεμία και κατά την άσκηση, συνιστούν επίσης ευαίσθητους δείκτες πνευμονικής λειτουργίας. Τυπικά η πνευμονική σαρκοείδωση χαρακτηρίζεται από λειτουργικές διαταραχές περιοριστικού τύπου, ενώ μέχρι 30% των ασθενών εμφανίζουν διαταραχές αποφρακτικού τύπου. Οι δοκιμασίες ελέγχου της αναπνευστικής λειτουργίας παρουσιάζουν μέτρια συσχέτιση με την έκταση της πνευμονικής προσβολής, όπως αποτυπώνεται στην απλή ακτινογραφία θώρακος. Διαταραχές της πνευμονικής λειτουργίας παρατηρούνται στο 20% των ασθενών σταδίου I και στο 40 70% των ασθενών σταδίου II, III ή IV. Η δοκιμασία βάδισης έξι λεπτών (6 min walk test) αποτελεί χρήσιμη μέθοδο για την εκτίμηση της πνευμονικής δυσλειτουργίας και της πρόγνωσης σε ποικίλα πευμονικά νοσήματα. Σε πρόσφατη μελέτη, η πλειονότητα των ασθενών με σαρκοείδωση παρουσίασαν παθολογική τη δοκιμασία [146]. Η αξονική τομογραφία υψηλής ευκρίνειας (HRCT) ενδείκνυται σε ασθενείς με άτυπα κλινικά ή ακτινολογικά ευρήματα, για την ανίχνευση 41

42 επιπλοκών της πνευμονικής νόσου, καθώς και σε περιπτώσεις που οι ισχυρές κλινικές ενδείξεις σαρκοείδωσης δεν επιβεβαιώνονται από την απλή ακτινογραφία θώρακος [10]. Η σαρκοείδωση χαρακτηρίζεται από οζώδεις βλάβες, με κατανομή κυρίως γύρω από τα λεμφαγγεία και εντόπιση συνήθως στα άνω και μεσαία πνευμονικά πεδία [11, 147]. Η εξωπνευμονική σαρκοείδωση διερευνάται επίσης με τις κατάλληλες μεθόδους, όπως την ηχοκαρδιογραφία (καρδιακή σαρκοείδωση) και τη μαγνητική τομογραφία (σαρκοείδωση του ΚΝΣ). Η καρδιακή συμμετοχή στη σαρκοείδωση διαγινώσκεται με ακρίβεια πριν το θάνατο στο 29% μόνο των ασθενών. Η καρδιακή μαγνητική τομογραφία χαρακτηρίζεται από σχετικά υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, όσον αφορά τη διάγνωση της καρδιακής σαρκοείδωσης. Επιπλέον, η ηχοκαρδιογραφία doppler αποτελεί χρήσιμο εργαλείο για τη διάγνωση της πνευμονικής υπέρτασης. Σημαντική είναι επίσης η εκτίμηση της ενεργότητας της νόσου, για λόγους κλινικούς και ερευνητικούς. Ο όρος «ενεργότητα» διαφέρει από την έννοια της σοβαρότητας της νόσου ή της δυσμενούς πρόγνωσης, καθώς αναφέρεται στην ενεργό νόσο, η οποία εξελίσσεται με φλεγμονή και δημιουργία κοκκιωμάτων [138]. Οι δείκτες ενεργότητας διακρίνονται σε κλινικούς, στους οποίους ανήκουν και οι απεικονιστικοί, σε ορολογικούς, καθώς και σε παραμέτρους του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος. Από τους παραπάνω δείκτες, τα κλινικά ευρήματα, η ακτινογραφία θώρακος και οι δοκιμασίες ελέγχου της αναπνευστικής λειτουργίας μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην καθημερινή πράξη για την εκτίμηση της ενεργότητας της σαρκοείδωσης, ενώ χρήσιμα είναι σε ορισμένες περιπτώσεις τα επίπεδα του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης, το σπινθηρογράφημα με 67 Ga, η αξονική τομογραφία υψηλής ευκρίνειας, οι λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί και ο λόγος CD4/CD8 του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος [148]. 8. Φυσική ιστορία της νόσου Η κλινική εκδήλωση, η φυσική εξέλιξη και η πρόγνωση της σαρκοείδωσης παρουσιάζουν μεγάλη διακύμανση, δεδομένου ότι η νόσος τείνει να επιδεινώνεται ή να υποχωρεί, αυτόματα ή μετά από θεραπεία [2, 11]. Αυτόματη λύση της νόσου παρατηρείται στα δύο τρίτα περίπου των ασθενών, ενώ στο 10 30% η πορεία της νόσου είναι χρόνια ή προδευτική. Η αναγνώριση της φυσικής πορείας της σαρκοείδωσης δυσχεραίνεται λόγω της χορήγησης κορτικοστεροειδών συνήθως στους ασθενείς που παρουσιάζουν έντονα συμπτώματα από το αναπνευστικό, εξωπνευμονικές βλάβες ή επιδείνωση της 42

43 αναπνευστικής λειτουργίας. Οι περισσότεροι ασθενείς σταθεροποιούνται ή βελτιώνονται με τη θεραπεία, αλλά κατά την ελάττωση ή διακοπή της φαρμακευτικής αγωγής μπορεί να εμφανισθούν υποτροπές [149, 150]. Φυλετικά, εθνικά, γενετικά και κλινικά χαρακτηριστικά έχουν αξιολογηθεί ως προγνωστικοί δείκτες για την εξέλιξη της νόσου [11, 150]. Στους αρνητικούς προγνωστικούς δείκτες συμπεριλαμβάνονται ο χειμετλοειδής λύκος, η χρόνια ραγοειδίτιδα, η έναρξη της νόσου μετά τα σαράντα έτη, η χρόνια υπερασβεστιαιμία, η προοδευτική πνευμονική σαρκοείδωση, η σαρκοείδωση του νευρικού συστήματος και η προσβολή του μυοκαρδίου. Πολλές μελέτες έχουν επιβεβαιώσει τη χρησιμότητα της ακτινολογικής σταδιοποίησης της νόσου στην πρόγνωση της πορείας του ασθενούς. Αυτόματη λύση της νόσου παρουσιάζεται στο 55 90% των ασθενών στο στάδιο I, στο 40 70% των ασθενών στο στάδιο II, στο 10 20% των ασθενών στο στάδιο III, ενώ δεν παρατηρείται στο στάδιο IV [10]. Αρκετοί εργαστηριακοί δείκτες έχουν επίσης εξετασθεί, για να εκτιμηθεί η εξέλιξη της σαρκοείδωσης [2, 151]. Όσον αφορά το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, η ενεργοποίηση των κυττάρων του BAL (έκφραση HLA DR και IL 2R), ο λόγος CD4/CD8, το ποσοστό των λεμφοκυττάρων με αυτόματη έκφραση IL 2 in vitro, και τα επίπεδα έκκρισης TNF α από τα κυψελιδικά μακροφάγα (μετά από καλλιέργεια) έχουν συσχετισθεί με την πορεία της νόσου και την απάντηση στη θεραπευτική αγωγή. Τα αποτελέσματα των παραπάνω μελετών δεν καθόρισαν σαφώς την προγνωστική αξία των προαναφερθέντων δεικτών, ενώ υπήρχαν και αντικρουόμενα αποτελέσματα. Δεδομένου όμως ότι το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα αποτελεί ένα κλινικό δείγμα από ένα χώρο, που γειτνιάζει με τον διάμεσο χώρο του πνεύμονα, η μελέτη του αντικατοπτρίζει τους ανοσολογικούς μηχανισμούς κριτικής σημασίας για την έκβαση της νόσου. Από τους ορολογικούς δείκτες που έχουν εξετασθεί, η προγνωστική αξία του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης και της νεοπτερίνης είναι ακόμη υπό αμφισβήτηση, ενώ πιο αξιόπιστος δείκτης φαίνεται να είναι ο διαλυτός υποδοχέας της IL 2 (sil 2R) στον ορό. Για κανέναν από τους παραπάνω ορολογικούς δείκτες δεν έχει τεκμηριωθεί η χρησιμότητά του για την εκτίμηση της αναγκαιότητας θεραπευτικής αντιμετώπισης της σαρκοείδωσης. Ο χρόνος παρακολούθησης των ασθενών για την εμφάνιση υποτροπών αποτελεί ένα σημαντικό ερώτημα. Το 85% των αυτόματων υφέσεων εκδηλώνεται στα πρώτα δύο έτη από την εμφάνιση της σαρκοείδωσης. Αδυναμία αυτόματης υποχώρησης της νόσου εντός δύο ετών από την 43

44 εκδήλωση της σαρκοείδωσης δείχνει χρόνια ή προοδευτική πορεία. Η παρακολούθηση των ασθενών με σαρκοείδωση πρέπει να είναι πιο έντονη τα πρώτα δύο έτη μετά την έναρξη της νόσου, έτσι ώστε να εκτιμάται η πρόγνωση και η ανάγκη για θεραπεία. Σε σαρκοείδωση σταδίου I η αρχική παρακολούθηση κάθε έξι μήνες είναι συνήθως ικανοποιητική, ενώ πιο τακτική εξέταση των ασθενών (κάθε τρεις με έξι μήνες) συνιστάται για τα υπόλοιπα στάδια. Όλοι οι ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία, παρακολουθούνται τουλάχιστον για τα επόμενα τρία χρόνια μετά τη διακοπή της θεραπείας. Εμμένουσα σαρκοείδωση, ανεξαρτήτως σταδίου, παρακολουθείται ετησίως επ αόριστον. Τακτικός έλεγχος για μεγάλο χρονικό διάστημα απαιτείται και σε εξωπνευμονική σαρκοείδωση, ανεξάρτητα από το ακτινολογικό στάδιο της νόσου [10]. Η παρακολούθηση των ασθενών με σαρκοείδωση περιλαμβάνει την καταγραφή των συμπτωμάτων, την κλινική εξέταση, τον ακτινολογικό και τον σπιρομετρικό έλεγχο. Επιπλέον εξετάσεις διενεργούνται ανάλογα με την εντόπιση της νόσου, καθώς και σε περιπτώσεις εμφάνισης νέων συμπτωμάτων και κλινικών ευρημάτων [11]. 9. Θεραπεία Οι κλινικές ενδείξεις και η διάρκεια χορήγησης της θεραπευτικής αγωγής παραμένουν ασαφείς και σε ορισμένες περιπτώσεις αντιφατικές, δεδομένου ότι η σαρκοείδωση παρουσιάζει ποικίλη πορεία και συχνά αυτόματες υφέσεις. Σε ασθενείς με ήπια νόσο, όπως με δερματικές βλάβες ή πρόσθια ραγοειδίτιδα, η εφαρμογή τοπικά κορτικοστεροειδών μπορεί να είναι αρκετή. Σε ασθενείς με συμπτωματική συστηματική νόσο χορηγούνται συχνά κορτικοστεροειδή per os. Συστηματική θεραπεία με κορτικοστεροειδή ενδείκνυται σαφώς σε προσβολή του μυοκαρδίου, σε νευρολογική νόσο, σε εμμένουσα οφθαλμική νόσο και σε υπερασβεστιαιμία. Συστηματική θεραπεία συνήθως χορηγείται σε πνευμονική σαρκοείδωση, όταν είναι προοδευτική, συμπτωματική και μη. Αν και τα κορτικοστεροειδή αποτελούν μία αποτελεσματική βραχυπρόθεσμη θεραπεία, ο ρόλος τους στη φυσική ιστορία της νόσου δεν είναι ακόμη γνωστός [2, 11]. Παρόλο που τα κορτικοστεροειδή παραμένουν ο ακρογωνιαίος λίθος στη θεραπεία της σαρκοείδωσης, η χρήση άλλων φαρμάκων έχει ερευνηθεί τα τελευταία είκοσι χρόνια για την αντιμετώπιση ασθενών, στους οποίους η αγωγή με κορτικοστεροειδή είναι ανεπιτυχής ή προκαλεί ανεπιθύμητες ενέργειες. Τα φάρμακα αυτά κατατάσσονται σε τρεις μεγάλες κατηγορίες: τα κυτταροτοξικά, τα αντιμικροβιακά και τους τροποποιητές (modulators) των 44

45 κυτταροκινών. Η μεθοτρεξάτη, η αζαθειοπρίνη, η κυκλοφωσφαμίδη και η λεφλουνομίδη ανήκουν στα κυτταροτοξικά φάρμακα, που έχουν χρησιμοποιηθεί στη σαρκοείδωση. Αν και η χρήση της μεθοτρεξάτης προτιμάται από τα υπόλοιπα κυτταροτοξικά φάρμακα, είναι αναγκαία η παρακολούθηση των ασθενών ως προς τη μυελοτοξική και την ηπατοτοξική της δράση. Το μέλλον της κυτταροτοξικής θεραπείας στη σαρκοείδωση φαίνεται ότι έγκειται στο συνδυασμό φαρμάκων (π.χ. λεφλουνομίδη με μεθοτρεξάτη), καθώς επιτρέπει την ταυτόχρονη αύξηση της ανοσοκαταστολής και μείωση της τοξικότητας. Στην κατηγορία των αντιμικροβιακών, τα ανθελονοσιακά φάρμακα είναι χρήσιμα στην αντιμετώπιση ορισμένων μορφών σαρκοείδωσης, όπως της δερματικής νόσου, δρώντας μάλλον ως αντιφλεγμονώδη φάρμακα. Μία μελέτη έδειξε ακόμη τη χρησιμότητα της μινοκυκλίνης και της δοξυκυκλίνης στη θεραπεία της δερματικής σαρκοείδωσης. Η καταστολή της έκκρισης του TNF α αποτελεί το στόχο των τροποποιητών των κυτταροκινών. Στα φάρμακα αυτά ανήκουν η θαλιδομίδη, η οποία έχει φανεί αποτελεσματική στη θεραπεία της χρόνιας δερματικής σαρκοείδωσης, και οι βιολογικοί παράγοντες με αντι TNF δράση, οι οποίοι διαφέρουν μεταξύ τους ως προς την αποτελεσματικότητα στη θεραπεία της σαρκοείδωσης. Σε ορισμένες περιπτώσεις σαρκοείδωσης τελικού σταδίου έχει πραγματοποιηθεί επιτυχώς και μεταμόσχευση πνευμόνων ή άλλων οργάνων [11, 152]. 10. Αναπάντητα ερωτήματα Αναπάντητα ερωτήματα σχετικά με τη σαρκοείδωση υπάρχουν τόσο σε κλινικό όσο και σε εργαστηριακό επίπεδο, όσον αφορά την αποτελεσματική και λιγότερο βλαπτική θεραπεία, τα γενετικά χαρακτηριστικά, τους προγνωστικούς δείκτες της εξέλιξης, τους μηχανισμούς που οδηγούν σε χρόνια νόσο και σε ίνωση του πνεύμονα και το αίτιο της σαρκοείδωσης [10]. 45

46 ΠΝΕΥΜΟΝΙΤΙΔΑ ΑΠΟ ΥΠΕΡΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ 1. Εισαγωγή Η πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία περιλαμβάνει μία ομάδα χρονίων διαμέσων νοσημάτων του πνεύμονα με ποικίλη βαρύτητα, κλινική εικόνα και εξέλιξη, που οφείλεται σε λεμφοκυτταρική φλεγμονώδη αντίδραση του πνευμονικού παρεγχύματος μετά από επαναλαμβανόμενη εισπνοή διαφόρων περιβαλλοντικών οργανικών και ανόργανων ουσιών [4, 153, 154]. Η φλεγμονή των πνευμόνων χαρακτηρίζεται από την παρουσία διάχυτων, πολλαπλών, μη νεκρωτικών κοκκιωμάτων στο πνευμονικό παρέγχυμα, τα οποία ενδεχομένως οδηγούν σε μη αναστρέψιμη ίνωση των πνευμόνων. Αντιγόνα που εμπλέκονται στην παθογένεια της νόσου είναι πρωτεΐνες βακτηρίων, μυκήτων, ζώων και άλλες χημικές ουσίες. Η έγκαιρη απομάκρυνση από το υπεύθυνο αντιγόνο αποτελεί και την αποτελεσματική θεραπεία της νόσου. 2. Επιδημιολογία Ο επιπολασμός και η επίπτωση της νόσου ποικίλλει στις διάφορες μελέτες, γεγονός που οφείλεται τόσο σε μεθοδολογικές διαφορές όσο και στους διαφορετικούς περιβαλλοντικούς και γενετικούς παράγοντες. Η εμφάνιση κλινικά σημαντικής νόσου εξαρτάται από τον τύπο, την ένταση και τη διάρκεια της έκθεσης στο υπεύθυνο αντιγόνο, την ευαισθησία του εκτεθειμένου ατόμου, τη θέση αλληλεπίδρασης του αντιγόνου με το αναπνευστικό σύστημα και το βαθμό της προκαλούμενης απορρύθμισης της κυτταρικής και της χυμικής ανοσίας. Παρά το ότι μεγάλος αριθμός ατόμων εκτίθενται σε αντιγόνα που ενοχοποιούνται για την παθογένεια της νόσου, ένα μικρό ποσοστό των εκτεθειμένων ατόμων εμφανίζει τη νόσο. Τις τελευταίες δεκαετίες έχουν παρατηρηθεί διακυμάνσεις στον επιπολασμό της νόσου λόγω της μείωσης αφενός της επαγγελματικής έκθεσης σε αντιγόνα, γνωστά για την πρόκληση πνευμονίτιδας από υπερευαισθησία, και αφετέρου λόγω της ταυτόχρονης αύξησης της έκθεσης σε οικιακά αντιγόνα, που συνδέονται κυρίως με οικιακά πτηνά, επιμολυσμένους υγραντές και αυξημένες συγκεντρώσεις μυκήτων [4, 154]. 3. Κλινική εικόνα Η πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία μπορεί να εκδηλωθεί με τρεις μορφές: την οξεία, την υποξεία και τη χρόνια [4, 153, 154]. 46

47 Η οξεία πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία εκδηλώνεται με πυρετό, ρίγος, κακουχία, δύσπνοια και βήχα, δύο με εννιά ώρες μετά την έκθεση του ατόμου στον γενεσιουργό παράγοντα, και υποχωρεί σε δώδεκα ώρες έως και λίγες ημέρες μετά τη διακοπή της έκθεσης. Η ευαισθητοποίηση του ατόμου προηγείται πάντα του οξέος επεισοδίου και η βαρύτητα των συμπτωμάτων συσχετίζεται με το ποσό του αντιγόνου και τη διάρκεια έκθεσης. Λειτουργικά προκαλεί περιοριστικές διαταραχές στον πνεύμονα, καθώς και διαταραχές της διάχυσης. Η υποξεία πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία χαρακτηρίζεται από ύπουλη έναρξη, λίγες ημέρες ή εβδομάδες μετά την έκθεση στον αιτιολογικό παράγοντα. Εκδηλώνεται με δύσπνοια κατά την κόπωση, παραγωγικό βήχα, ανορεξία και απώλεια βάρους. Οι ασθενείς αναφέρουν επαναλαμβανόμενα οξέα επεισόδια, ενώ τα συμπτώματά τους βελτιώνονται θεαματικά μετά την απομάκρυνση του εκλυτικού παράγοντα. Η χρόνια πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία αναπτύσσεται στο 5% περίπου των ασθενών και χαρακτηρίζεται από παραγωγικό βήχα, δύσπνοια, κακουχία και απώλεια βάρους. Οι ασθενείς ενδέχεται να μην αναφέρουν οξέα επεισόδια στο ιστορικό τους. Οφείλεται σε παρατεταμένη έκθεση σε χαμηλές συγκεντρώσεις του αντιγόνου. Η διακοπή της έκθεσης στο αντιγόνο οδηγεί σε μερική μόνο βελτίωση των συμπτωμάτων. 4. Ανοσοπαθογένεια Πληροφορίες για την ανοσοπαθογένεια της νόσου προέρχονται από μελέτες ζωϊκών μοντέλων και έχουν επιβεβαιωθεί, όπου ήταν εφικτό, σε ασθενείς από μελέτες του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, των προκλητών πτυέλων και των δειγμάτων βιοψίας [4, 153]. Τόσο η χυμική όσο και η κυτταρική ανοσία φαίνεται ότι συμβάλλουν στην εκδήλωση της πνευμονίτιδας από υπερευαισθησία, καθώς ενεργοποιούνται διαδοχικά, μετά την εισπνοή του υπεύθυνου αντιγόνου [154]. Τα περισσότερα άτομα, που εκτίθενται σε ενοχοποιηθέντα αντιγόνα, παράγουν IgG αντισώματα, χωρίς όμως να εκδηλώνουν τη νόσο. Η παραγωγή αντισωμάτων δεν οδηγεί στην εκδήλωση συμπτωμάτων, καθώς η πνευμονίτιδα των νοσημάτων αυτών είναι το αποτέλεσμα εγκατάστασης αντίδρασης επιβραδυνόμενης υπερευαισθησίας, με επικράτηση των κυτταροτοξικών CD8 + λεμφοκυττάρων. Διάφορες μελέτες έχουν γίνει στα πλαίσια της προσπάθειας ανεύρεσης της αιτιολογίας της νόσου, χωρίς όμως να ανευρεθεί ένα σαφές παθογενετικό αίτιο. Οι μελέτες αυτές αφορούσαν τις μεταβλητές περιοχές του 47

48 TCR, τα MHC μόρια και αλλήλια, και τους γενετικούς πολυμορφισμούς της κυτταροκίνης TNF α [ ]. Επιπλέον, η διαταραχή της Τ Η 1/Τ Η 2 ισορροπίας έχει προταθεί ως πιθανό αίτιο εμφάνισης της νόσου σε ορισμένους μόνο από τους εκτεθειμένους ασθενείς [153]. Η ανοσοπαθογένεια των τριών μορφών της πνευμονίτιδας από υπερευαισθησία παρουσιάζει ομοιότητες, αλλά και διαφορές: Οξεία μορφή: απάντηση μακροφάγων και λεμφοκυττάρων Στην οξεία αντίδραση της πνευμονίτιδας από υπερευαισθησία, όπως προκύπτει από τη μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, των δειγμάτων βιοψίας και των προκλητών πτυέλων, φαίνεται ότι συμμετέχουν ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα, σιτευτικά κύτταρα, λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα και μακροφάγα [153, 161, 162]. Αμέσως μετά την εισπνοή του αντιγόνου, δημιουργούνται ανοσοσυμπλέγματα που ενεργοποιούν το συμπλήρωμα. Το ενεργοποιημένο συμπλήρωμα και η φαγοκυττάρωση του αντιγόνου οδηγεί στην ενεργοποίηση μακροφάγων, που εκκρίνουν χημειοκίνες και κυτταροκίνες, προκαλώντας αρχικά χημειοταξία των ουδετερόφιλων πολυμορφοπυρήνων και στη συνέχεια χημειοταξία και ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων και των μονοκυττάρων. Σε αντίθεση με τις αλλεργικές αντιδράσεις, σπάνια παρατηρείται εωσινοφιλία [4]. Στη φλεγμονώδη αντίδραση συμμετέχουν χημειοκίνες, όπως η CXCL8 (IL 8), η CCL3 (MIP 1α), η CCL2 (MCP 1) και η CCL5 (RANTES), και κυτταροκίνες, όπως ο TNF α και η IL 1 [ ]. Η CXCL8 είναι χημειοτακτικός παράγοντας για τα T λεμφοκύτταρα και τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα. Η πρωτεΐνη CCL3 αποτελεί χημειοτακτικό παράγοντα για τα μονοκύτταρα και τα T λεμφοκύτταρα και συγχρόνως συμμετέχει στη διαφοροποίηση των CD4 + T H 0 σε T H 1 λεμφοκύτταρα. Ο TNF α και η IL 1, που παράγονται από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα, ευθύνονται για τον πυρετό και τις οξείες αντιδράσεις της νόσου. Η λεμφοκυττάρωση, που ακολουθεί την ουδετεροφιλική φλεγμονώδη αντίδραση, χαρακτηρίζεται από αύξηση των CD4 + T H 1 λεμφοκυττάρων, και, στη συνέχεια, από την εισροή και τον τοπικό πολλαπλασιασμό CD8 + T λεμφοκυττάρων, ειδικών έναντι σαφώς καθορισμένων αντιγόνων, όπως για παράδειγμα στην πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία θερινού τύπου [4, 170]. Τα CD8 + λεμφοκύτταρα συνήθως υπερτερούν σε αριθμό των CD4 + λεμφοκυττάρων [171]. Μελέτες σε ανθρώπους και ζωϊκά μοντέλα υποδεικνύουν τον ρόλο της IFN γ στη δημιουργία των κοκκιωμάτων και τη 48

49 συμμετοχή της IL 12 στη διαφοροποίηση των T H 0 λεμφοκυττάρων σε T H 1 λεμφοκύτταρα [165, 172, 173]. Επιπλέον, τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα αποτελούν πιθανώς σημαντική πηγή IFN γ κατά την ανάπτυξη της νόσου, όπως φαίνεται από τη μελέτη ζωϊκού μοντέλου της νόσου [174]. Αντίθετα με την IFNγ, η απουσία IL 10 σε πειραματικό μοντέλο της νόσου οδηγεί σε σοβαρότερη κοκκιωματώδη, φλεγμονώδη απάντηση [175]. Υποξεία μορφή: δημιουργία κοκκιώματος Στην υποξεία πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία τα μακροφάγα, που ενεργοποιήθηκαν στους πνεύμονες, εξελίσσονται σε επιθηλιοειδή κύτταρα και πολυπύρηνα γιγαντοκύτταρα και δημιουργούν τα κοκκιώματα [176]. Η μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος δείχνει λεμφοκυτταρική κυψελιδίτιδα, με αύξηση του ποσοστού και του απόλυτου αριθμού των CD8 + T λεμφοκυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα. Τα κύτταρα αυτά παρουσιάζουν κατασταλτική/κυτταροτοξική δράση και ολιγοκλωνικότητα [177, 178]. Η παρουσία όμοιων κλώνων Τ λεμφοκυττάρων στους πνεύμονες και στο περιφερικό αίμα του ίδιου ασθενούς δείχνει ότι η ανοσιακή απάντηση στους πνεύμονες οδηγεί σε συστηματική αντίδραση [179]. Τα CD8 + λεμφοκύτταρα των πνευμόνων εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του υποδοχέα 2 του TNF (CD120b), του Fas αντιγόνου (CD95) και του CD70 [50, 180]. Ταυτόχρονα, τα κυψελιδικά λεμφοκύτταρα παρουσιάζουν ελαττωμένη απόπτωση συγκριτικά με φυσιολογικούς μάρτυρες, γεγονός που μπορεί να σχετίζεται με την κυψελιδική λεμφοκυττάρωση που παρατηρείται στην πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία [180]. Τα κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα στους πνεύμονες παράγουν IFN γ και παρουσιάζουν λειτουργικές ιδιότητες, που συμβαδίζουν με Tc1 ανοσοφαινότυπο [173]. Τα μακροφάγα αποτελούν τον δεύτερο μεγαλύτερο πληθυσμό στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία. Εκφράζουν δείκτες ενεργοποίησης, σελεκτίνες, καθώς και τα συνδιεγερτικά μόρια CD80 και CD86 [158, 181, 182]. Τα μακροφάγα εκκρίνουν χημειοκίνες, που οδηγούν στην κινητοποίηση των λεμφοκυττάρων στους πνεύμονες [183]. Χρόνια μορφή: ίνωση Στη χρόνια πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία παρατηρείται συνήθως χρόνια ουδετεροφιλία, όπως συμβαίνει και σε άλλα διάμεσα νοσήματα του 49

50 πνεύμονα που εξελίσσονται σε ίνωση των πνευμόνων [184]. Τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα στην πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία αθροίζονται μέσα στα αγγεία, στις κυψελίδες και στον διάμεσο χώρο και συμμετέχουν πιθανώς στη βλάβη του πνευμονικού ιστού, με αποτέλεσμα την εξέλιξη σε ίνωση. Τα ενεργοποιημένα μακροφάγα και τα επιθηλιακά κύτταρα εκφράζουν τον TGFβ1, μία κυτταροκίνη που διεγείρει την ίνωση και την αγγειογένεση [185]. Αύξηση παρατηρείται, όπως και στην οξεία νόσο, στον αριθμό των σιτευτικών κυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, που φαίνεται να σχετίζεται με δείκτες ενεργοποίησης των ινοβλαστών [161, 186]. Η αυξημένη παραγωγή TNFα από τα κυψελιδικά μακροφάγα, ως συνέπεια της μακρόχρονης αντιγονικής έκθεσης, συμμετέχει πιθανώς στην ίνωση, διεγείροντας τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών στον διάμεσο χώρο, με τη μεσολάβηση του TGF β [187]. Ο αριθμός των λεμφοκυττάρων και οι υποπληθυσμοί τους διαφοροποιούνται σε σύγκριση με τις προηγούμενες δύο μορφές. Ο αριθμός των λεμφοκυττάρων ελαττώνεται, ενώ ο λόγος CD4/CD8 αυξάνεται στους ασθενείς με ίνωση [188, 189]. Επίσης, παρατηρείται ελάττωση των γδ Τ λεμφοκυττάρων και αύξηση των μνημονικών CD4 + και CD8 + λεμφοκυττάρων. Λειτουργικά τα λεμφοκύτταρα φαίνεται να παρουσιάζουν Τ Η 2 φαινότυπο, με αυξημένη έκφραση του CXCR4 και αυξημένα επίπεδα IL 4 στο υπερκείμενο των καλλιεργειών μετά από ειδική αντιγονική διέγερση των κυττάρων [189]. Ο διαφορετικός αυτός φαινότυπος των λεμφοκυττάρων στη χρόνια μορφή, σε σύγκριση με την υποξεία, σχετίζεται πιθανώς με τη διαδικασία της ίνωσης. Ανοσολογικές διαταραχές έχουν παρατηρηθεί και σε ασυμπτωματικούς ανθρώπους, που έχουν εκτεθεί στα αντιγόνα που προκαλούν τη νόσο [190]. Τα άτομα αυτά παρουσιάζουν κυψελιδίτιδα με λεμφοκυττάρωση, δεν εμφανίζουν ακτινολογικά ευρήματα και θεωρείται ότι πάσχουν από ασυμπτωματική πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία. 5. Διάγνωση Ο χαμηλός επιπολασμός, η ποικίλη κλινική εικόνα της πνευμονίτιδας από υπερευαισθησία και η απουσία ειδικής διαγνωστικής μεθόδου αναφοράς ευθύνονται για την αδυναμία διάγνωσης ή τη λανθασμένη διάγνωση της νόσου. Παρά το ότι έχουν προταθεί από αρκετές μελέτες ειδικά διαγνωστικά κριτήρια, η χρήση τους για την οριστική διάγνωση της πνευμονίτιδας από υπερευαισθησία δεν έχει τεκμηριωθεί ικανοποιητικά [4, 154]. Σχετικά πρόσφατα, τεκμηριώθηκε η χρήση έξι κλινικών και βασικών εργαστηριακών 50

51 δεικτών για τη διάγνωση της νόσου, με σημαντικότερο προγνωστικό δείκτη το ιστορικό έκθεσης στο υπεύθυνο αντιγόνο [191]. Τα κλινικά και εργαστηριακά σημεία στα οποία βασίζεται η διάγνωση της πνευμονίτιδας από υπερευαισθησία είναι τα παρακάτω [4, 154]: 1. Ατομικό ιστορικό: το ιστορικό επαγγελματικής ή περιβαλλοντικής έκθεσης σε αντιγόνα που έχουν ενοχοποιηθεί για την παθογένεια της νόσου, η διαλείπουσα συμπτωματολογία και η χρονική συσχέτιση έκθεσης στο αντιγόνο και εκδήλωσης συστηματικών ή αναπνευστικών συμπτωμάτων, συμβάλλουν στη διάγνωση. Τα υπεύθυνα αντιγόνα για τη νόσο όμως παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλία και δεν είναι όλα γνωστά, ενώ τα προαναφερθέντα συμπτώματα δεν είναι ειδικά. 2. Φυσική εξέταση: η παρουσία τριζόντων ρόγχων και ενίοτε συριγμού κατά την ακρόαση αποτελούν αναμενόμενο, αλλά μη ειδικό εύρημα. 3. Ανίχνευση ιζηματινών στον ορό με τεχνικές ανοσοδιάχυσης: ειδικές ιζηματίνες ανιχνεύονται στον ορό πολλών ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία. Το θετικό αποτέλεσμα δείχνει προηγούμενη επαφή με το αντιγόνο και όχι απαραίτητα νόσο. Ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα οφείλονται συνήθως στην έλλειψη τυποποιημένων αντιγόνων και στη χρήση περιορισμένου αριθμού αντιγόνων. 4. Ανίχνευση ειδικών IgG αντισωμάτων στον ορό (π.χ. έναντι μυκήτων) με ανοσοενζυμική μέθοδο: είναι πιο ευαίσθητη δοκιμασία, αλλά ανιχνεύει την παρουσία αντισωμάτων και όχι τη νόσο. 5. Ακτινολογικές εξετάσεις (απλή ακτινογραφία θώρακος, αξονική τομογραφία υψηλής ευκρίνειας): τα ευρήματα της αξονικής τομογραφίας υψηλής ευκρίνειας (HRCT) στην πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία συνίστανται σε διάχυτες κεντρολοβιδιακές οζώδεις ή μικροοζώδεις βλάβες και εικόνα θολής υάλου στην οξεία μορφή της νόσου, διάχυτες δικτυοοζώδεις βλάβες στην υποξεία μορφή, και διάμεση ίνωση ή εικόνα μελισσοκυρήθρας στα ανώτερα και μεσαία κυρίως πνευμονικά πεδία στη χρόνια μορφή της νόσου. Οι ακτινολογικές εξετάσεις συνιστούν ευαίσθητες μεθόδους που απεικονίζουν συνολικά τις βλάβες του πνευμονικού παρεγχύματος, αλλά τα ευρήματά τους είναι μη ειδικά για τη νόσο ή ενδέχεται σε ορισμένους ασθενείς να είναι φυσιολογικά. 6. Σπιρομέτρηση και έλεγχος ανταλλαγής αερίων (ικανότητα διάχυσης μονοξειδίου του άνθρακα, DL CO ): αποτελούν απλές μεθόδους ελέγχου 51

52 της αναπνευστικής λειτουργίας, οι οποίες αποκαλύπτουν διαταραχές περιοριστικού τύπου και ελαττωμένη ικανότητα διάχυσης στην πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία. Τα ευρήματα όμως αυτά δεν είναι ειδικά για τη νόσο, ενώ ο έλεγχος της αναπνευστικής λειτουργίας είναι φυσιολογικός σε ορισμένους ασθενείς. 7. Δοκιμασία διέγερσης λεμφοκυττάρων με ειδικά αντιγόνα: διαφοροδιαγιγνώσκει τη νόσο από την απλή έκθεση, αλλά αποτελεί εξειδικευμένη, μη τυποποιημένη και χρονοβόρο δοκιμασία. 8. Ανοσολογική μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος: αποτελεί επικουρικό διαγνωστικό εργαλείο και αποκλείει ενεργό νόσο σε περίπτωση φυσιολογικού αριθμού λεμφοκυττάρων. Συχνά ευρήματα αποτελούν η λεμφοκυττάρωση (συνήθως 30 70%), με υπεροχή των CD8 + λεμφοκυττάρων, αν και τα ευρήματα αυτά διαφοροποιούνται ανάλογα με το στάδιο της νόσου και το χρόνο έκθεσης στο αντιγόνο. Ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα ανευρίσκονται, όταν το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα λαμβάνεται εντός 48 ωρών από την οξεία έκθεση. Ο λεμφοκυτταρικός τύπος στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα δεν αποτελεί επίσης παθογνωμονικό εύρημα για τη νόσο. 9. Βιοψία πνευμόνων (συνήθως διαβρογχική): η τυπική ιστολογική εικόνα της πνευμονίτιδας από υπερευαισθησία χαρακτηρίζεται από διάχυτη διήθηση του διαμέσου ιστού, μη νεκρωτικά κοκκιώματα και φλεγμονή των βρογχιολίων, ενώ στη χρόνια μορφή παρατηρείται ίνωση και εικόνα μελισσοκηρύθρας. Η ιστολογική εξέταση έχει μεγάλη διαγνωστική αξία, αλλά δεν είναι παθογνωμονική για τη νόσο και τα αποτελέσματά της διαφέρουν ανάλογα με το ληφθέν δείγμα και το στάδιο της νόσου. 10. Δοκιμασία πρόκλησης με εισπνοή ειδικών αντιγόνων στο εργαστήριο: επιβεβαιώνει τη διάγνωση σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος, αλλά δεν έχει υψηλή αρνητική διαγνωστική αξία και δεν είναι ακόμη τυποποιημένη. Απαιτεί την ύπαρξη εξειδικευμένου εργαστηρίου. 11. Δοκιμασία «φυσικής πρόκλησης» με έκθεση στο επαγγελματικό ή οικιακό περιβάλλον και ταυτόχρονο κλινικό και λειτουργικό έλεγχο του ασθενούς: έχει μεγάλη αρνητική και θετική προγνωστική αξία, αλλά δε διαφοροδιαγιγνώσκει εύκολα την πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία από το σύνδρομο οργανικής σκόνης. 52

53 6. Πρόγνωση Θεραπεία Η έγκαιρη διάγνωση της πνευμονίτιδας από υπερευαισθησία και η απομάκρυνση του αιτιολογικού παράγοντα σχετίζονται με καλή πρόγνωση της νόσου. Αν και η πρόγνωση είναι ευνοϊκότερη στην οξεία και υποξεία μορφή της νόσου, ασθενείς με πνεύμονα του αγρότη (farmer s lung disease) παρουσιάζουν συχνά επιδείνωση, παρόλη την απομάκρυνση από το υπεύθυνο αντιγόνο [4, 192]. Η αποφυγή του αιτιολογικού παράγοντα μπορεί επίσης να βελτιώσει μερικώς τους περισσότερους ασθενείς με ήπια μορφή χρόνιας πνευμονίτιδας από υπερευαισθησία. Τα κορτικοστεροειδή βελτιώνουν θεαματικά την κλινική και ακτινολογική εικόνα των ασθενών με σοβαρή οξεία ή υποξεία νόσο. Επίσης, ενδείκνυνται σε περιπτώσεις σοβαρής ή προοδευτικής χρόνιας νόσου, στις οποίες όμως, εφόσον δεν υπάρχει αντικειμενική βελτίωση, δε θα πρέπει να χορηγούνται για διάστημα μεγαλύτερο των έξι μηνών [154]. 7. Αναπάντητα ερωτήματα Η μελέτη της πνευμονίτιδας από υπερευαισθησία παρουσιάζει προκλήσεις τόσο στην κλινική πράξη όσο και στην έρευνα. Αδιευκρίνιστα παραμένουν ακόμη ο επιπολασμός της νόσου, η συχνότητα χρόνιας πνευμονικής ίνωσης που οφείλεται στην πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία και η μακροχρόνια εξέλιξη της νόσου. Η ταυτοποίηση, σε μοριακό επίπεδο, των υπεύθυνων για τη νόσο αντιγόνων, ο ρόλος της φυσικής, χυμικής και κυτταρικής ανοσίας, οι γενετικοί παράγοντες που καθιστούν ορισμένα άτομα ευαίσθητα στη νόσο και οι περιβαλλοντικοί παράγοντες που ευνοούν την εξέλιξη της νόσου αποτελούν επιπρόσθετα θέματα που πρέπει να αποσαφηνισθούν. Απομένει επίσης να διευκρινισθεί, αν η διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ τύπου 1 και τύπου 2 ανοσιακής απάντησης, αποτελεί επιφαινόμενο ή γενεσιουργό αίτιο της νόσου, και να διερευνηθεί ο ρόλος των μικρών λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών, όπως των Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων [4]. 53

54 ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΔΙΑΜΕΣΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ ΤΩΝ ΠΝΕΥΜΟΝΩΝ 1. Εισαγωγή Τα διάμεσα νοσήματα των πνευμόνων (interstitial lung diseases, ILDs) αποτελούν μία ετερογενή ομάδα νοσημάτων, που προσβάλλουν κυρίως το πνευμονικό παρέγχυμα και διαφέρουν ως προς την αιτιολογία, την κλινική και ακτινολογική εικόνα, τα ιστοπαθολογικά ευρήματα και την εξέλιξη [3, 147, 193, 194]. Χαρακτηρίζονται από διήθηση του πνευμονικού παρεγχύματος από κυτταρικά και μη στοιχεία. Προσβάλλουν κυρίως τον διάμεσο χώρο των πνευμόνων, αλλά και τις κυψελίδες, τα αιμοφόρα αγγεία και τους περιφερικούς αεραγωγούς. Η βλάβη των πνευμόνων έχει ως βασική συνέπεια τη διαταραχή της ανταλλαγής των αερίων στους πνεύμονες. Σε περίπτωση προϊούσας εξέλιξης του νοσήματος, η αναπνευστική λειτουργία του ασθενούς επιδεινώνεται προοδευτικά, με τελική συνέπεια τον θάνατο από αναπνευστική ανεπάρκεια. Κλινικά εκδηλώνονται με μη ειδικά συμπτώματα, όπως βήχα και δύσπνοια, ενώ ακτινολογικά χαρακτηρίζονται, στους περισσότερους ασθενείς, από διάχυτες πνευμονικές διηθήσεις. 2. Ταξινόμηση Η μελέτη των διαμέσων νοσημάτων των πνευμόνων παρουσιάζει δυσκολίες, τόσο σε επίπεδο διαφορικής διάγνωσης από άλλα νοσήματα που μπορεί προκαλούν διάχυτη βλάβη των πνευμόνων, όσο και σε επίπεδο διαφορικής διάγνωσης μεταξύ τους, δεδομένου ότι δεν υπάρχει διεθνώς αποδεκτό σύστημα ταξινόμησης των νοσημάτων αυτών. Διάφορα σχήματα ταξινόμησης έχουν προταθεί για το σύνολο των διαμέσων νοσημάτων, τα οποία βασίζονται σε διαφορετικές παραμέτρους [ ]. Η πιο πρακτική προσέγγιση των διαμέσων νοσημάτων, που επιτρέπει την επιδημιολογική τους μελέτη, είναι μάλλον η αιτιολογική ταξινόμηση (πίνακας 1) [3]. Η ταξινόμηση αυτή μπορεί να βελτιωθεί με τον διαχωρισμό των διαμέσων νοσημάτων αγνώστου αιτιολογίας, τα οποία συνιστούν το 65% του συνόλου, σε νοσήματα που προσβάλλουν αποκλειστικά τους πνεύμονες, και σε συστηματικά νοσήματα. Εναλλακτικά, η διαγνωστική προσέγγιση των διαμέσων νοσημάτων μπορεί να γίνει βάσει της ιστολογικής ταξινόμησης, της ανταπόκρισης στη θεραπεία ή των κλινικών χαρακτηριστικών, σε συνδυασμό με την αιτιολογία [3, 197]. 54

55 Πίνακας 1. Αιτιολογική ταξινόμηση των διαμέσων νοσημάτων των πνευμόνων Διάμεσα νοσήματα γνωστής αιτιολογίας Διάμεσα νοσήματα που συνδέονται με νόσημα του συνδετικού ιστού (π.χ. σκληρόδερμα, ρευματοειδής αρθρίτιδα) Πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία (π.χ. πνεύμονας του αγρότη) Πνευμονοκονιώσεις (π.χ. αμιάντωση, πυριτίαση) Διάμεσα νοσήματα φαρμακευτικής αιτιολογίας (π.χ. χημειοθεραπευτικά φάρμακα, αμιωδαρόνη, νιτροφουραντοΐνη) Διάμεσα νοσήματα που συνδέονται με το κάπνισμα Πνευμονική ιστιοκύττωση από κύτταρα Langerhans Διάμεσο νόσημα που συνδέεται με αναπνευστική βρογχιολίτιδα Οξεία εωσινοφιλική πνευμονία Αποφολιδωτική διάμεση πνευμονία Διάμεσα νοσήματα οφειλόμενα σε ακτινοβολία Διάμεσα νοσήματα οφειλόμενα σε εισπνοή τοξικών ουσιών (π.χ. κοκαΐνη, αμμωνία) Διάμεσα νοσήματα άγνωστης αιτιολογίας Ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση Σαρκοείδωση Άλλες ιδιοπαθείς διάμεσες πνευμονίες Κρυπτογενής οργανούμενη πνευμονία Μη ειδική διάμεση πνευμονία Λεμφοκυτταρική διάμεση πνευμονία Οξεία διάμεση πνευμονία Εωσινοφιλικές πνευμονίες Πνευμονικές αγγειίτιδες Πνευμονική λεμφαγγειολειομυομάτωση Πνευμονική κυψελιδική πρωτεΐνωση Άλλες σπάνιες διαταραχές 3. Επιδημιολογία Οι επιδημιολογικές μελέτες των διαμέσων νοσημάτων καταγράφουν τους αιτιολογικούς παράγοντες, τον επιπολασμό, την επίπτωση, τα κλινικά 55

56 στοιχεία και τη θνητότητα του κάθε νοσήματος στην κοινότητα και το νοσοκομειακό περιβάλλον. Οι διαφορές, που εμφανίζουν τα επιδημιολογικά στοιχεία των διαμέσων νοσημάτων στη διεθνή βιβλιογραφία, οφείλονται αφενός σε πραγματικές διαφορές στην επίπτωση των νοσημάτων σε διαφορετικούς πληθυσμούς, και αφετέρου σε τροποποιήσεις στην ονομασία και στην ταξινόμηση των νοσημάτων, καθώς και στη μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε. Ενώ η καταγραφή των νοσημάτων αυτών στον γενικό πληθυσμό φαίνεται να είναι επισφαλής, η μελέτη της σχετικής συχνότητάς τους φαίνεται να είναι πιο έγκυρη. Βάσει αυτών των μελετών, τα συχνότερα διάμεσα νοσήματα των πνευμόνων είναι μάλλον η σαρκοείδωση και η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση, ενώ ακολουθούν η πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία, τα διάμεσα νοσήματα που οφείλονται σε νοσήματα του συνδετικού ιστού που προσβάλλουν τα αγγεία, οι κλασικές πνευμονοκονιώσεις και τα διάμεσα νοσήματα φαρμακευτικής αιτιολογίας. Μία μεγάλη ομάδα συνιστούν επίσης τα νοσήματα, στα οποία παρατηρείται μη ειδική ίνωση [3, ]. 4. Διάγνωση Η διάγνωση των διαμέσων νοσημάτων του πνεύμονα έχει γίνει πιο σύνθετη τα τελευταία χρόνια, εν μέρει εξαιτίας των αναθεωρήσεων της ονομασίας και των διαγνωστικών κριτηρίων για τα ιδιοπαθή, κυρίως, διάμεσα νοσήματα [200, 201]. Οι τροποποιήσεις αυτές προήλθαν από νεότερα δεδομένα σε σχέση με την αιτιολογία, την παθογένεια και τις κλινικοακτινολογικές συσχετίσεις των νοσημάτων αυτών. Η διαγνωστική προσέγγιση του ασθενούς με πιθανό διάμεσο νόσημα των πνευμόνων περιλαμβάνει λήψη ενός λεπτομερούς ατομικού και οικογενειακού ιστορικού, κλινική εξέταση και σειρά εργαστηριακών εξετάσεων, με μη επεμβατικές ή επεμβατικές μεθόδους, οι οποίες διενεργούνται διαδοχικά [3, 6, 147, 194]. Σε ορισμένες περιπτώσεις η διάγνωση δεν μπορεί να τεκμηριωθεί, κυρίως όταν ο κίνδυνος από την εφαρμογή των επεμβατικών μεθόδων είναι μεγαλύτερος από το όφελος. Στις περιπτώσεις αυτές ακολουθείται θεραπεία για τον ασθενή, με βάση την πιθανή διάγνωση Ατομικό ιστορικό Οι πληροφορίες που πρέπει να καταγραφούν στα πλαίσια του ατομικού ιστορικού του ασθενούς, προκύπτουν από τα παρακάτω: Δημογραφικά στοιχεία (φύλο, ηλικία) 56

57 Ορισμένα διάμεσα νοσήματα προσβάλλουν συγκεκριμένες πληθυσμιακές ομάδες, όπως για παράδειγμα η πνευμονική λεμφαγγειολειομυομάτωση που προσβάλλει σχεδόν αποκλειστικά τις γυναίκες. Συμπτώματα από το αναπνευστικό και τα άλλα συστήματα Ορισμένα διάμεσα νοσήματα, όπως η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση, προσβάλλουν μόνο τους πνεύμονες, ενώ άλλα προσβάλλουν περισσότερα όργανα. Χρονική εξέλιξη των συμπτωμάτων Τα περισσότερα διάμεσα νοσήματα χαρακτηρίζονται από σταδιακή εισβολή των αναπνευστικών συμπτωμάτων, με σταδιακή ή μη επιδείνωση, ενώ άλλα μπορεί να εμφανίσουν οξεία έναρξη (<4 6 εβδομάδες), όπως η πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία και η κρυπτογενής οργανούμενη πνευμονία. Παροξύνσεις είναι δυνατόν να εκδηλωθούν σε ασθενείς με ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση. Ιστορικό καπνίσματος Έκθεση σε επαγγελματικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες Λήψη φαρμάκων Το κάπνισμα, η έκθεση σε παράγοντες του περιβάλλοντος, καθώς και η λήψη ορισμένων φαρμάκων παρουσιάζουν αιτιολογική συσχέτιση με ορισμένα διάμεσα νόσηματα. Συνυπάρχοντα νοσήματα Τα συμπτώματα από το αναπνευστικό σύστημα μπορεί να είναι δευτεροπαθείς εκδηλώσεις άλλων νοσημάτων. Οικογενειακό ιστορικό Είναι σημαντικό για τη διάγνωση κληρονομικών διαμέσων νοσημάτων, όπως είναι η οικογενής πνευμονική ίνωση, το σύνδρομο Hermansky Pudlak και η νόσος Gaucher Κλινική εξέταση Στην κλινική εξέταση περιλαμβάνονται: Ακρόαση των πνευμόνων Η ανεύρεση τριζόντων ρόγχων είναι σταθερό χαρακτηριστικό της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης, αλλά είναι ασυνήθης στη σαρκοείδωση. Έλεγχος για ύπαρξη πληκτροδακτυλίας 57

58 Εμφανίζεται στα 2/3 των ασθενών με ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση, αλλά είναι σπάνια στη σαρκοείδωση. Εξέταση άλλων συστημάτων, εκτός του αναπνευστικού Η ανεύρεση εξωπνευμονικών κλινικών σημείων μπορεί να είναι επιβοηθητικό στοιχείο, όπως για παράδειγμα η εμφάνιση οζώδους ερυθήματος στη σαρκοείδωση Εργαστηριακές εξετάσεις Γενική αίματος Είναι σημαντική σε περιπτώσεις εμφάνισης αναιμίας λόγω πνευμονικής αιμορραγίας, ή περιφερικής εωσινοφιλίας στις εωσινοφιλικές πνευμονίες, το σύνδρομο Churg Strauss και σε ορισμένες φαρμακευτικές αντιδράσεις. Βιοχημικές εξετάσεις Είναι αναγκαίες για τον έλεγχο της ηπατικής ή νεφρικής λειτουργίας σε περίπτωση ύπαρξης συστηματικού νοσήματος, και για τον έλεγχο άλλων στοιχείων που επηρεάζονται από το υποκείμενο νόσημα, όπως το ασβέστιο και το μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτενσίνης του ορού στη σαρκοείδωση ή το νατριουρητικό πεπτίδιο (BNP), σε περίπτωση ανάπτυξης πνευμονικής υπέρτασης. Γενική ούρων Παθολογικά ευρήματα μπορούν να βρεθούν στο ίζημα των ούρων σε συστηματική αγγειίτιδα ή νόσο του συνδετικού ιστού. Ορολογικές εξετάσεις για νόσο του συνδετικού ιστού Ο έλεγχος για αυτοαντισώματα (π.χ. ANA, ANCA) είναι αναγκαίος για την επιβεβαίωση ή τον αποκλεισμό νοσήματος του συνδετικού ιστού. Ορολογικές εξετάσεις για την πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία Η ανεύρεση ιζηματίνης στον ορό, ειδικής για ορισμένο αντιγόνο, είναι χρήσιμη στη διάγνωση της πνευμονίτιδας από υπερευαισθησία Ακτινολογικές εξετάσεις Απλή ακτινογραφία θώρακος Η απλή ακτινογραφία θώρακος παρέχει τις πρώτες πληροφορίες σχετικά με το νόσημα. Ωστόσο, 10% των ασθενών εμφανίζουν φυσιολογική ακτινογραφία θώρακος, ιδιαίτερα στα πρώτα στάδια του νοσήματος. Αξονική τομογραφία υψηλής ευκρίνειας 58

59 Η αξονική τομογραφία υψηλής ευκρίνειας αποτελεί απαραίτητο εργαλείο στη διαγνωστική προσέγγιση των διαμέσων νοσημάτων, καθώς χαρακτηρίζεται από υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία. Η αξονική τομογραφία υψηλής ευκρίνειας πρέπει να διενεργείται νωρίς κατά τη διαγνωστική προσέγγιση των περισσότερων ασθενών, διότι συνήθως καθορίζει το είδος των εξετάσεων που θα ακολουθήσουν. Τα ευρήματα της αξονικής τομογραφίας υψηλής ευκρίνειας, που βοηθούν στη διάγνωση, αφορούν τον τύπο της βλάβης του πνευμονικού παρεγχύματος (π.χ. δικτυωτή κατανομή, σύμπτωση), την ανατομική περιοχή των πνευμόνων που εντοπίζεται η διαταραχή (π.χ. άνω ή κάτω λοβοί, κεντρικά ή περιφερικά) και τα συνοδά ευρήματα (π.χ. λεμφαδένες μεσοθωρακίου). Ηχοκαρδιογραφία Είναι χρήσιμη σε ασθενείς με δύσπνοια ή αίσθημα κόπωσης, που είναι δυσανάλογα προς την πνευμονική βλάβη που προκύπτει από την ακτινολογική εξέταση Δοκιμασίες ελέγχου της αναπνευστικής λειτουργίας Ο έλεγχος της αναπνευστικής λειτουργίας είναι αναγκαίος στους ασθενείς με υποψία διάμεσης πνευμονοπάθειας και περιλαμβάνει τη σπιρομέτρηση, την ικανότητα διάχυσης του μονοξειδίου του άνθρακα, τον υπολογισμό των πνευμονικών όγκων και την οξυμετρία. Οι δοκιμασίες αυτές στους ασθενείς με διάμεση πνευμονοπάθεια συνήθως αποκαλύπτουν διαταραχή περιοριστικού τύπου, με ελαττωμένη ικανότητα διάχυσης, αν και στα πρώτα στάδια του νοσήματος μπορεί να ανευρίσκεται μόνο ήπια ελάττωση της ικανότητας διάχυσης. Ο προσδιορισμός των αερίων του αρτηριακού αίματος εφαρμόζεται σε ασθενείς με μέτρια ή σοβαρή διαταραχή της πνευμονικής λειτουργίας Βρογχοσκόπηση Λήψη βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος Διαβρογχική βιοψία Η βρογχοσκόπηση, με σύγχρονη λήψη βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και διαβρογχική βιοψία, επιβεβαιώνει σε υψηλό ποσοστό τη διάγνωση της σαρκοείδωσης, της πνευμονίτιδας από υπερευαισθησία, των εωσινοφιλικών πνευμονιών, της κρυπτογενούς οργανούμενης πνευμονίας, της πνευμονικής ιστιοκύττωσης από κύτταρα Langerhans, της αποφολιδωτικής διάμεσης πνευμονίας, τη λεμφοκυτταρικής διάμεσης πνευμονίας, της πνευμονικής 59

60 λεμφαγγειολειομυομάτωσης και της πνευμονικής κυψελιδικής πρωτεΐνωσης. Οι περισσότερες από αυτές τις διαταραχές συνδέονται με χαρακτηριστικά ιστοπαθολογικά ευρήματα, που μπορούν να αναγνωρισθούν ακόμη και σε μικρά δείγματα βιοψίας πνεύμονα. Μπορεί επίσης να αποκαλύψει την ύπαρξη λοιμώδους ή νεοπλασματικού νοσήματος, που εκδηλώνεται με διηθήσεις του διαμέσου δικτύου των πνευμόνων Χειρουργική βιοψία πνεύμονα/εξωπνευμονικού ιστού Σκοπός της βιοψίας πνεύμονα είναι η ειδική διάγνωση, που θα βοηθήσει στην πρόγνωση και στην επιλογή της κατάλληλης θεραπείας για τον ασθενή. Στην περίπτωση όμως που η ειδική διάγνωση προκύπτει από τα κλινικά και λοιπά εργαστηριακά στοιχεία, η βιοψία πνεύμονα δεν είναι απαραίτητη. Ο αριθμός των ιστολογικών τύπων στις διάμεσες πνευμονοπάθειες είναι περιορισμένος σε σχέση με το συνολικό αριθμό των διαμέσων νοσημάτων, ενώ διαφέρει η ειδικότητα του κάθε ιστολογικού τύπου για τη διάγνωση των διαμέσων νοσημάτων. Οι περισσότερες βιοψίες σήμερα γίνονται με θωρακοσκοπική χειρουργική μέθοδο με τη βοήθεια video (video assisted thoracoscopic surgery, VATS). Σε περίπτωση αντενδείξεων, η βιοψία λαμβάνεται με θωρακοτομή. Η δυνατότητα τεκμηρίωσης της διάγνωσης με την ιστολογική εξέταση των δειγμάτων βιοψίας πλησιάζει το 90%. Οι θέσεις της βιοψίας καθορίζονται από την αξονική τομογραφία υψηλής ευκρίνειας. Η θνητότητα από τη χειρουργική βιοψία πνεύμονα είναι μικρότερη από 2%, αλλά αυξάνεται στην περίπτωση επιβαρημένων ασθενών. Το πόρισμα της ιστολογικής εξέτασης ερμηνεύεται σε συνδυασμό με τα υπόλοιπα κλινικοεργαστηριακά ευρήματα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η βιοψία εξωπνευμονικού ιστού (π.χ. δερματικής βλάβης) παρέχει ειδική διάγνωση. 60

61 ΤΟ ΒΡΟΓΧΟΚΥΨΕΛΙΔΙΚΟ ΕΚΠΛΥΜΑ ΩΣ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΟ ΚΑΙ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΛΕΙΟ 1. Εισαγωγή Βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (bronchoalveolar lavage, BAL) είναι το υγρό που ανακτάται μετά την έκπλυση με φυσιολογικό ορό μιας περιοχής των πνευμόνων, με χρήση εύκαμπτου βρογχοσκοπίου. Η μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος αποτέλεσε αρχικά ένα εργαλείο έρευνας, αλλά στη συνέχεια καθιερώθηκε ως κλασική διαγνωστική διαδικασία για τη διερεύνηση όλων των ασθενών με ασαφείς διάχυτες αλλοιώσεις των πνευμόνων. Τα ευρήματα από την ανάλυση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος είναι ιδιαίτερα χρήσιμα στη διάγνωση νοσημάτων κυρίως του διάμεσου χώρου του πνεύμονα, αλλά και άλλων, όπως πνευμονικών λοιμώξεων και νεοπλασιών. Η τεχνική λήψης του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος επιτρέπει την ανάκτηση κυττάρων και διαλυτών ουσιών από το κατώτερο αναπνευστικό, παρέχοντας έτσι τη δυνατότητα καλύτερης διερεύνησης των διαταραχών του πνευμονικού ιστού. Αν και τα ευρήματα από την ανάλυση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος θεωρούνται συμπληρωματικά των αντίστοιχων της ιστοπαθολογικής εξέτασης των δειγμάτων βιοψίας, η βρογχοκυψελιδική έκπλυση παρουσιάζει ορισμένα πλεονεκτήματα συγκριτικά με τη βιοψία. Η διαδικασία λήψης του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος θεωρείται ελάχιστα επεμβατική, με μηδενική σχεδόν νοσηρότητα. Επιπλέον, η εξέτασή του παρέχει πληροφορίες για ευρύτερη περιοχή των πνευμόνων συγκριτικά με αυτές που προκύπτουν από τη μελέτη των μικρών ιστοτεμαχίων της διαβρογχικής ή της ανοικτής βιοψίας των πνευμόνων. Κατ αυτόν τον τρόπο η εικόνα που προκύπτει από το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα είναι πιο αντιπροσωπευτική των φλεγμονωδών και ανοσιακών διαταραχών των πνευμόνων [5]. Πολλοί παράγοντες ωστόσο, που αφορούν την τεχνική λήψης, επεξεργασίας και μελέτης του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, μπορούν να επηρεάσουν τη δυνατότητά του να αντικατοπτρίζει τις μεταβολές στα κύτταρα και στα μη κυτταρικά στοιχεία του υγρού που επαλείφει το βρογχοκυψελιδικό επιθήλιο σε φλεγμονώδεις καταστάσεις των πνευμόνων. Επίσης οι συνυπάρχουσες λοιμώξεις και το κάπνισμα επηρεάζουν τα αποτελέσματα της ανάλυσης του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος. Η αξία του βρογχοκυψελιδικού 61

62 εκπλύματος αυξάνεται, όταν λαμβάνεται με προτυποποιημένο τρόπο, εξετάζεται εξειδικευμένα και ερμηνεύεται σε συνδυασμό με τα κλινικά στοιχεία και τα ακτινολογικά ευρήματα [6]. 2. Οδηγίες και συστάσεις για τη λήψη και τη μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος Λεπτομερείς οδηγίες, συστάσεις, ανασκόπηση της βιβλιογραφίας και αναφορές σε πιθανά σφάλματα σχετικά με την τεχνική λήψης, επεξεργασίας και μελέτης του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, τις κλινικές ενδείξεις λήψης του και τη χρησιμότητά του σε ποικίλα νοσήματα των πνευμόνων, έχουν εκδοθεί από τις επιστημονικές εταιρείες από το 1989 [ ]. Μεταξύ άλλων, γίνεται αναφορά σε θέματα σχετικά με την ασφάλεια της μεθόδου, τον δίαυλο αναρρόφησης του ινοπτικού βρογχοσκοπίου, τη χορηγούμενη αναισθησία στον ασθενή, τη θέση λήψης του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, το υγρό έκπλυσης, τον τρόπο και τη διάρκεια έκπλυσης, την αρχική επεξεργασία, τη συντήρηση και τον τρόπο μελέτης του δείγματος. Παράλληλα, αναφέρεται η επίδραση των χρησιμοποιούμενων μεθόδων στα ευρήματα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος. Ιδιαίτερη αναφορά γίνεται ακόμη σε συγκεκριμένες κλινικές καταστάσεις, όπου εφαρμόζεται βρογχοσκόπηση με λήψη βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, όπως η μεταμόσχευση πνευμόνων [202]. Για τη λήψη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος στις διάμεσες πνευμονοπάθειες με διάχυτη βλάβη των πνευμόνων επιλέγεται συνήθως ο δεξιός μέσος λοβός ή η γλωσσίδα, λόγω της ευκολίας εισόδου του βρογχοσκοπίου και του ικανοποιητικού όγκου επιστροφής. Ολικός όγκος του υγρού έγχυσης ml, σε δόσεις των ml, παρέχει παρόμοια αποτελέσματα ως προς τον τύπο των κυττάρων σε υγιείς και σε ασθενείς με διάμεση πνευμονοπάθεια. Η αφαίρεση της βλέννης με διήθηση μέσω αποστειρωμένης γάζας ενδέχεται να προκαλέσει απώλεια κυττάρων και άλλων στοιχείων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος. Η απώλεια ελαχιστοποιείται, όταν η διήθηση εκτελείται από προσωπικό που διαθέτει τη σχετική εμπειρία. Η επεξεργασία και μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος πρέπει να γίνεται ταχέως, αν και η παραμονή του στους 4 ο C επηρεάζει σε μικρό βαθμό τον αριθμό κυρίως των κυττάρων. Η αποθήκευση και κατάψυξη των κυττάρων επηρεάζει τον αριθμό των κυττάρων και πιθανώς και τον κυτταρικό τύπο. Ο ολικός αριθμός των κυττάρων είναι προτιμότερο να προσδιορίζεται άμεσα, από το νωπό δείγμα, σε πλάκα Neubauer ή σε αυτόματο αιματολογικό αναλυτή, 62

63 ενώ η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίζεται με χρωστική Trypan blue (Trypan blue exclusion test). Το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα φυγοκεντρείται, προκειμένου να βελτιωθεί η ευαισθησία της καλλιέργειας για την απομόνωση ποικίλων λοιμογόνων παραγόντων, όπως των μυκοβακτηριδίων. Η κυτταροφυγοκέντρηση και η χρώση με May Grünwald Giemsa χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό του κυτταρικού τύπου. Ποικίλοι παράγοντες, όπως η ταχύτητα φυγοκέντρησης και ο αριθμός των μετρούμενων κυττάρων, επηρεάζουν σημαντικά τα αποτελέσματα στον κυτταρικό τύπο. Η μέτρηση 300 τουλάχιστον κυττάρων από ένα επίχρισμα βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και ο υπολογισμός του μέσου όρου των αποτελεσμάτων από δύο διαφορετικά παρασκευάσματα είναι αναγκαία για τη βελτίωση της ακρίβειας των αποτελεσμάτων. Τα κύτταρα, που ανευρίσκονται κατά τη μικροσκοπική παρατήρηση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, περιλαμβάνουν κυψελιδικά μακροφάγα, λεμφοκύτταρα, ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα, εωσινόφιλα πολυμορφοπύρηνα, σιτευτικά κύτταρα και πλασματοκύτταρα. Ταυτόχρονα, καταγράφεται ο αριθμός των επιθηλιακών κυττάρων και η παρουσία ερυθρών αιμοσφαιρίων, άτυπων κακοήθων κυττάρων και μικροοργανισμών. Ανάλογα με την κλινική εικόνα του ασθενούς, καθώς και τη μακροσκοπική και μικροσκοπική εικόνα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, χρησιμοποιούνται πρόσθετες χρώσεις. Ειδικές μέθοδοι ανοσοκυτταροχημείας, ανοσοφθορισμού και κυτταρομετρίας ροής εφαρμόζονται για τον λεπτομερέστερο προσδιορισμό των πληθυσμών και των υποπληθυσμών των κυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, και ιδιαίτερα των λεμφοκυττάρων, με χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι αντιγόνων επιφανείας των λεμφοκυττάρων και των μονοκυττάρων/μακροφάγων (clusters of designation, CDs) [6, 202]. Ποικίλες μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό των διαλυτών ουσιών του υγρού που επαλείφει το επιθήλιο (epithelial lining fluid, ELF) στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, για ερευνητικούς κυρίως λόγους. Τα διαλυτά συστατικά του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος μπορεί να προέρχονται από παθητική διάχυση, ενεργητική μεταφορά και τοπική παραγωγή. Σε περίπτωση προσδιορισμού ουσιών που παράγονται από τα κύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, είναι απαραίτητος ο άμεσος διαχωρισμός του υπερκείμενου υγρού από τα κύτταρα. Δυσκολίες στον προσδιορισμό των διαλυτών ουσιών προέρχονται από την αδυναμία ακριβούς 63

64 ποσοτικού προσδιορισμού του υγρού που επαλείφει το επιθήλιο, με κάποια πρότυπη ουσία αναφοράς, και τη χαμηλή συγκέντρωση ορισμένων ουσιών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, λόγω της προηγηθείσας αραίωσης [202]. Για το λόγο αυτό, η European Respiratory Society (ERS) Task Force επανεξέτασε και δημοσίευσε συστάσεις για την προτυποποίηση των μεθόδων προσδιορισμού των μη κυτταρικών στοιχείων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, όπως των ανοσοσφαιρινών, των πρωτεασών και αντιπρωτεασών, του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης, των κυτταροκινών και των δεικτών ίνωσης, κακοήθειας ή κυτταρικού θανάτου [5, 205, 206]. Οι παραπάνω οδηγίες συνιστούν ένα πλαίσιο που αφορά την τεχνική λήψης του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, όπως είναι ο όγκος έγχυσης και επιστροφής, και τις εργαστηριακές μεθόδους επεξεργασίας και ανάλυσης των συστατικών του. Στόχος των οδηγιών είναι να δοθεί λύση στους παράγοντες που επηρεάζουν τον έγκυρο ποσοτικό προσδιορισμό των στοιχείων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και την επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων, όπως την ανάμιξη του υγρού που επαλείφει το επιθήλιο, με στοιχεία από τους βρόγχους, την ποικίλη διαβατότητα των πνευμόνων στο υγρό έγχυσης, και κυρίως τον διαφορετικό συντελεστή αραίωσης του εκπλύματος σε κάθε ασθενή που βρογχοσκοπείται. Μεγαλύτερη ανακρίβεια παρατηρείται κατά τον προσδιορισμό των μη κυτταρικών στοιχείων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, γιατί εκφράζονται μόνο ποσοτικά ανά μονάδα όγκου. Αντίθετα, οι κυτταρικοί πληθυσμοί μπορούν να εκφρασθούν τόσο σε απόλυτους αριθμούς όσο και σε ποσοστά, που δεν επηρεάζονται από τον συντελεστή αραίωσης. Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος συνιστάται να είναι σταθερός ο όγκος, ο τρόπος και η θέση έγχυσης του φυσιολογικού ορού, δηλαδή τουλάχιστον 100 ml στους ενήλικες, σε τέσσερις ισόποσες δόσεις, στον μέσο λοβό του δεξιού πνεύμονα. Η προτυποποίηση όμως της έκπλυσης δεν εξασφαλίζει ίδιο όγκο ανάκτησης, άρα και συντελεστή αραίωσης. Επιπλέον, οι υπάρχουσες πρότυπες ουσίες αναφοράς, όπως η λευκωματίνη, το ολικό λεύκωμα, οι ανοσοσφαιρίνες και η ουρία, παρουσιάζουν μειονεκτήματα ως προς την ικανότητα προσδιορισμού του όγκου του υγρού που επαλείφει το επιθήλιο και του συντελεστή αραίωσης. Για το λόγο αυτό συστήνεται οι προσδιορισμοί δύο ή περισσότερων μη κυτταρικών στοιχείων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος να εκφράζονται ποσοτικά, αλλά και αναλογικά μεταξύ τους, όπως γίνεται και στην περίπτωση των κυτταρικών 64

65 στοιχείων, μέχρι να βρεθεί κάποια πρότυπη ουσία αναφοράς για τον ακριβή προσδιορισμό του συντελεστή αραίωσης. Οπωσδήποτε, ιδιαίτερα σημαντικός παράγοντας στην ορθή βρογχοκυψελιδική έκπλυση είναι και η εμπειρία του εκτελούντος και κυρίως η ικανότητά του να επιτυγχάνει τη βέλτιστη ενσφήνωση του βρογχοσκοπίου, ώστε να ελαχιστοποιείται η διαφυγή του εκπλύματος στον βρογχικό χώρο. Μετά το πέρας της λήψης καταγράφονται οι όγκοι έκπλυσης και ανάκτησης, καθώς και το ποσοστό ανάκτησης, έτσι ώστε τα αποτελέσματα να είναι συγκρίσιμα. Όσον αφορά την αντιπροσωπευτικότητα του συλλεγόμενου δείγματος, συνιστάται να προσδιορίζεται το ποσοστό των κροσσωτών βρογχικών και πλακωδών επιθηλιακών κυττάρων του εκπλύματος. Το αποτέλεσμα θεωρείται ικανοποιητικό, όταν δεν υπερβαίνει το 5%. Σε περίπτωση δειγμάτων που παρατηρείται υπέρβαση του ποσοστού αυτού, αυτή εκλαμβάνεται ως μεγάλη συμμετοχή των στοιχείων του βρογχικού χώρου στο έπλυμα, σε βάρος των στοιχείων του κυψελιδικού χώρου, που αλλοιώνουν την εικόνα των συμβαινόντων στον διάμεσο χώρο. Η ανάλυση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος αποτελεί ευαίσθητη μέθοδο για την ανίχνευση ανόργανων σωματιδίων στους πνεύμονες, έτσι ώστε να είναι δυνατή η ανεύρεση ατόμων με επαγγελματική, ή και περιβαλλοντική έκθεση στα σωματίδια αυτά. Η αναγνώριση ορισμένων σωματιδίων γίνεται κατά τη συνήθη κυτταρολογική εξέταση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και οδηγεί στην αναζήτηση πιθανής επαγγελματικής νόσου και στην περαιτέρω ανάλυση της χημικής σύστασης των σωματιδίων. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των σωματιδίων είναι χρήσιμος για την ανεύρεση πιθανής συσχέτισης των επιπέδων των σωματιδίων με την ανάπτυξη νόσου, με στόχο την εύρεση των ορίων ανάπτυξης της νόσου [202]. Ξεχωριστές συστάσεις, σχετικά με την τεχνική λήψης και επεξεργασίας του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, έχουν εκδοθεί και για την παιδική ηλικία [207]. Ταυτόχρονα με τα μεθοδολογικά ζητήματα, γίνεται αναφορά στις φυσιολογικές τιμές των κυτταρικών και μη παραμέτρων, τις ενδείξεις και την ερμηνεία των ευρημάτων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος στα παιδιά. Κλινικές ενδείξεις λήψης βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος αποτελούν νοσήματα με διηθήσεις του διαμέσου χώρου των πνευμόνων, διηθήσεις των κυψελίδων, πνευμονικές διηθήσεις σε ασθενείς με ανοσοανεπάρκειες και επαγγελματικά νοσήματα με ιστορικό έκθεσης σε σκόνη. Σε ορισμένα από τα νοσήματα αυτά, το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα συνιστά διαγνωστική μέθοδο 65

66 εκλογής (π.χ. πνευμονική κυψελιδική πρωτεΐνωση, ευκαριακές λοιμώξεις του κατώτερου αναπνευστικού σε ασθενείς με ανοσοανεπάρκεια) [203]. 3. Το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα στους υγιείς, καπνιστές και μη Στους φυσιολογικούς, μη καπνιστές τα κύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος αποτελούνται κατά 80 85% από μακροφάγα, 5 20% από λεμφοκύτταρα, λιγότερο από 2 3% από ουδετερόφιλα και λιγότερο από 1% από εωσινόφιλα πολυμορφοπύρηνα [208]. Οι τιμές των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών, όπως αυτοί έχουν προσδιοριστεί σε υγιείς μάρτυρες με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων, φαίνονται στον πίνακα 2 [202]. Το κάπνισμα αυξάνει τον αριθμό των μακροφάγων και των ουδετερόφιλων πολυμορφοπυρήνων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και μειώνει το ποσοστό των λεμφοκυττάρων [209]. Στους καπνιστές παρατηρούνται ακόμη διαφορές στην κυτταρική σύσταση του πρώτου δείγματος έκπλυσης από τα επόμενα [210]. Οι βαρείς καπνιστές παρουσιάζουν επιπλέον αύξηση των CD8 + Τ λεμφοκυττάρων και κατά συνέπεια μείωση του λόγου CD4/CD8 [211]. Η ηλικία επηρεάζει επίσης τον αριθμό και τον τύπο των κυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, έτσι ώστε να παρατηρείται αύξηση του αριθμού των λεμφοκυττάρων και των ουδετερόφιλων πολυμορφοπυρήνων, και του λόγου CD4/CD8 στα ηλικιωμένα άτομα [212, 213]. 66

67 Πίνακας 2. Τιμές λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα υγιών μαρτύρων. Cluster of differentiation CD1 Ειδικότητα θυμοκύτταρα κύτταρα Langerhans/Ιστιοκυττάρωση Χ Τιμές δέκα υγιών (μη καπνιστών) μαρτύρων 0 3% CD2 υποδοχέας ερυθροκυττάρων 82% (70 90) προβάτου CD3 Τ λεμφοκύτταρα 75% (63 88) CD4 βοηθητικά λεμφοκύτταρα με τάξης ΙΙ MHC περιορισμό 53% (36 70) CD8 κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα με 28% (15 40) τάξης Ι MHC περιορισμό CD19 Β λεμφοκύτταρα 5% (0 12) CD25 υποδοχέας της IL 2 2% (0 5) HNK 1 κοκκιώδη λεμφοκύτταρα 7% (1 14) 4. Το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ως διαγνωστικό εργαλείο στα διάμεσα νοσήματα του πνεύμονα Το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικό εργαλείο στα διάμεσα νοσήματα του πνεύμονα, καθώς φαίνεται ότι αντικατοπτρίζει τον διάμεσο χώρο των πνευμόνων, ως προς την κατανομή των κυττάρων [214, 215]. Η μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, ως διαγνωστικού εργαλείου στα διάμεσα νοσήματα, περιλαμβάνει: 1. τη μακροσκοπική εκτίμηση, 2. τον προσδιορισμό του κυτταρικού τύπου, της μορφολογίας και του ανοσοφαινοτύπου των κυττάρων του, και 3. την εξέταση για λοιμογόνους παράγοντες. Ορισμένα ευρήματα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος είναι διαγνωστικά για πνευμονικά νοσήματα, όπως η ιστιοκύττωση από κύτταρα Langerhans και η κυψελιδική πρωτεΐνωση, καθιστώντας έτσι τη βιοψία πνεύμονα μη αναγκαία (πίνακας 3) [5, 6]. 67

68 Πίνακας 3. Διαγνωστικά ευρήματα βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος Εύρημα από το βρογχοκυψελιδικό Διάγνωση έκπλυμα 1. Pneumocystis carinii, μύκητες, κύτταρα τροποποιημένα από CMV 1. Ευκαιριακές λοιμώξεις 2. Γαλακτώδες υγρό, PAS θετικά μη κυτταρικά σωματίδια, άμορφα συγκρίμματα, αφρώδη μακροφάγα 2. Κυψελιδική πρωτεΐνωση 3. Μακροφάγα θετικά σε αιμοσιδηρίνη, ενδοκυττάρια θραύσματα ερυθρών αιμοσφαιρίων στα μακροφάγα, ελεύθερα ερυθρά αιμοσφαίρια 3. Σύνδρομο κυψελιδικής αιμορραγίας 4. Καρκινικά κύτταρα συμπαγών όγκων, λεμφώματος, λευχαιμίας 4. Διηθήσεις από καρκινικά κύτταρα 5. Σωματίδια σκόνης στα μακροφάγα, μετρήσιμα σωμάτια αμιάντου 5. Έκθεση σε σκόνη 6. Εωσινόφιλα >25% 6. Εωσινοφιλική πνευμονοπάθεια 7.Θετική δοκιμασία μεταμόρφωσης των λεμφοκυττάρων στο βηρύλλιο 7. Χρόνια βηρυλλίωση 8. Αυξημένα CD1 θετικά κύτταρα Langerhans CMV, κυτταρομεγαλοϊός; PAS, periodic acid Schiff 8. Ιστιοκύττωση από κύτταρα Langerhans Σε άλλα νοσήματα, τα ευρήματα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος δεν είναι ειδικά, αλλά μπορούν να χρησιμοποιηθούν επικουρικά στη διάγνωση. Έτσι, λεμφοκυτταρικός, ουδετεροφιλικός ή μικτός κυτταρικός τύπος παρατηρείται σε περισσότερα του ενός νοσήματα (πίνακας 4) [5]. Στα 68

69 νοσήματα αυτά, ο κυτταρικός τύπος του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος δεν μπορεί να τεκμηριώσει τη διάγνωση, αλλά πρέπει πάντα να συνεκτιμάται με το ατομικό ιστορικό, την κλινική εξέταση, τα ακτινολογικά και τα λοιπά εργαστηριακά ευρήματα του ασθενούς. Ο συνδυασμός του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος με την αξονική τομογραφία υψηλής ευκρίνειας έχει ενισχύσει τη διαγνωστική αξία και των δύο μεθόδων [5]. 69

70 Πίνακας 4. Ο κυτταρικός τύπος του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος ως επικουρικό διαγνωστικό εργαλείο Λεμφοκυτταρικός Σαρκοείδωση Πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία Χρόνια βηρυλλίωση Φυματίωση Νοσήματα του συνδετικού ιστού Φαρμακευτική πνευμονίτιδα Διηθήσεις από κακοήθειες Πυριτίαση Νόσος Crohn Πρωτοπαθής χολική κίρρωση Λοίμωξη από HIV Ιογενής πνευμονία Ουδετεροφιλικός (+/ εωσινοφιλικός) Ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση Αποφολιδωτική διάμεση πνευμονία Οξεία διάμεση πνευμονία Σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας Βακτηριακή πνευμονία Νοσήματα του συνδετικού ιστού Αμιάντωση Κοκκιωμάτωση Wegener Διάχυτη πανβρογχιολίτιδα Αποφρακτική βρογχιολίτιδα μετά από μεταμόσχευση Ιδιοπαθής αποφρακτική βρογχιολίτιδα Εωσινοφιλικός Εωσινοφιλική πνευμονία Σύνδρομο Churg Strauss Υπερεωσινοφιλικό σύνδρομο Αλλεργική βρογχοπνευμονική ασπεργίλλωση Ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση Φαρμακευτική αντίδραση Μικτός Κρυπτογενής οργανούμενη πνευμονία Νοσήματα του συνδετικού ιστού Μη ειδική διάμεση πνευμονία 70

71 Κατά τη μικροσκοπική παρατήρηση των παρασκευασμάτων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, μετά από κυτταροφυγοκέντρηση, καταγράφεται επιπλέον η πιθανή παρουσία σιτευτικών κυττάρων και πλασματοκυττάρων. Τα σιτευτικά κύτταρα υπάρχουν συνήθως σε χαμηλό αριθμό στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα υγιών ανθρώπων, ενώ αυξάνονται στην πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία, στην ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση, στη σαρκοείδωση, στο άσθμα, στο λέμφωμα και στη φυματίωση [216, 217]. Τα πλασματοκύτταρα δεν ανευρίσκονται συνήθως στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα. Αυξημένα ποσοστά έχουν παρατηρηθεί σε πνευμονίτιδες από υπερευαισθησία, σε χρόνιες εωσινοφιλικές πνευμονίες, σε λοιμώξεις και σε λεμφώματα [ ]. Το φυσιολογικό βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα έχει αρνητική διαγνωστική αξία για ορισμένα νοσήματα, όπως την πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία, την εωσινοφιλική πνευμονία και την κυψελιδική αιμορραγία, κατευθύνοντας, σε αυτές τις περιπτώσεις, τη διαγνωστική σκέψη σε άλλες παθήσεις [5]. Ο περαιτέρω προσδιορισμός του ανοσοφαινότυπου των κυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, και ιδιαίτερα ο λόγος του αριθμού των βοηθητικών προς τον αριθμό των κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων, έχει διαγνωστική αξία για τη σαρκοείδωση. Αν και έχει αναφερθεί ότι ο λόγος CD4/CD8 παρουσιάζει έντονη μεταβλητότητα στους ασθενείς με σαρκοείδωση, καθώς και μεταξύ των σταδίων της νόσου [35, 220], τα αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων μελετών παρουσιάζουν σχεδόν όμοια ευαισθησία και ειδικότητα του αυξημένου λόγου CD4/CD8 για τη διάγνωση της σαρκοείδωσης [5]. Σύμφωνα με τις μελέτες αυτές, λόγος CD4/CD8 στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα μεγαλύτερος από 3.5 ή 4.0 έχει 55% ευαισθησία λόγω της έντονης μεταβλητότητας, αλλά 95% ειδικότητα, υπερβαίνοντας ακόμη και την ειδικότητα της διαβρογχικής βιοψίας σε μία από αυτές [5, 221]. Αντίθετα, ο φυσιολογικός ή ελαττωμένος λόγος (CD4/CD8<1.0), δεν αποκλείει τη διάγνωση της σαρκοείδωσης [222]. Αύξηση του λόγου CD4/CD8 παρατηρείται με την αύξηση της ηλικίας, γεγονός που πρέπει να λαμβάνεται υπόψη σε ηλικιωμένους ασθενείς [213]. Ελάττωση του λόγου CD4/CD8 έχει παρατηρηθεί σε πνευμονίτιδες από υπερευαισθησία, σε φαρμακευτικές πνευμονοπάθειες, στην εωσινοφιλική πνευμονία και στην κρυπτογενή οργανούμενη πνευμονία [6, 223]. Όσον αφορά την πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία, ο λόγος CD4/CD8 στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα διαφέρει ανάλογα με τη μορφή της νόσου (οξεία, 71

72 υποξεία ή χρόνια) και το υπεύθυνο αντιγόνο. Αναστροφή του λόγου (CD4/CD8<1.0) παρατηρείται στην πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία θερινού τύπου και φυσιολογικός ή αυξημένος λόγος στον πνεύμονα του αγρότη [224]. Yψηλότερο λόγο CD4/CD8 παρουσιάζουν οι ασθενείς με χρόνια μορφή της νόσου και ίνωση [188, 189]. Ο προσδιορισμός των διαλυτών, μη κυτταρικών, στοιχείων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος δεν έχει ακόμη αποδεδειγμένη διαγνωστική αξία. Επιπλέον, η μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος δεν έχει κλινικά τεκμηριωμένη αξία στην εκτίμηση της ενεργότητας των πνευμονοπαθειών, της ανάγκης για θεραπεία και της εξέλιξης των νοσημάτων. Για τον λόγο αυτό δεν συνιστάται ακόμη στην καθημερινή πρακτική η επανειλημμένη λήψη του για την παρακολούθηση της πορείας μίας διάμεσης πνευμονοπάθειας [5]. Ωστόσο, το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ενδέχεται να φανεί χρήσιμο για την εκτίμηση επιπλοκών των διαμέσων νοσημάτων των πνευμόνων [6]. 5. Το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα στη σαρκοείδωση Τα ευρήματα από την ανάλυση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος μεμονωμένα δεν τεκμηριώνουν τη διάγνωση της σαρκοείδωσης. Η ανεύρεση λεμφοκυττάρωσης και αυξημένου λόγου CD4/CD8>3.5 μπορούν να υποστηρίξουν τη διάγνωση της νόσου, σε συνδυασμό με τα λοιπά κλινικοεργαστηριακά ευρήματα [203]. Πληθώρα ερευνητικών μελετών του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος έχουν διελευκάνει ως ένα βαθμό την ανοσοπαθογένεια της σαρκοείδωσης. Σε πολλές από αυτές υποστηρίζεται η υπεροχή της Τ Η 1 ανοσιακής απάντησης. Στις εργασίες αυτές χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές τεχνικές για τη μελέτη των κυττάρων, των κυτταροκινών και άλλων μεσολαβητών που ανευρίσκονται στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (ELISA, RT PCR, bioassays, κυτταρομετρία ροής, in situ υβριδισμός, ανοσοκυτταροχημεία, ανοσοφθορισμός). Ποικίλες κυτταροκίνες, όπως IL 1, IL 2, IL 6, IL 10, IL 12, IL 18, TNF, TGF β, έχουν προσδιοριστεί στο υπερκείμενο κυτταρικών καλλιεργειών ή καλλιεργειών κυτταρικών κλώνων, κυψελιδικών μακροφάγων και Τ λεμφοκυττάρων, που έχουν απομονωθεί από το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και έχουν υποστεί ή όχι διέγερση [70, 112, 118, ]. Η έκφραση κυτταροκινών και χημειοκινών, όπως IL 4, IL 6, IL 10, IL 13, IL 12, IL 18, TNF α, IFN γ, PDGF, GM CSF, CCL5 (RANTES), CCL3 (MIP 1α), έχει επίσης προσδιοριστεί με μοριακές μεθόδους σε επίπεδο mrna σε κύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος [70, 106, 166, ]. Επιπλέον, η πρωτεϊνική έκφραση κυτταροκινών (IL 2, IL 4, IL 5, IL 10, 72

73 IL 13, IL 18, TNF α, IFN γ) έχει προσδιοριστεί στα κύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος με χρήση συνήθως μεθόδων κυτταρομετρίας ροής [37, 43, 60, 62, 63, 106, 233, 234]. Προσδιορισμοί κυτταροκινών και χημειοκινών, όπως IL 2, IL 8, IL 18, IFN γ, TGF β, CCL2 (MCP 1), CCL5 (RANTES), CXCL10 (IP 10), έχουν γίνει και στο υπερκείμενο του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος [39, 41, 107, 126, 128, 235, 236]. Η έκκριση άλλων μεσολαβητών, όπως του υπεροξειδικού ανιόντος, από τα κύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, έχει επίσης ερευνηθεί στη σαρκοείδωση [237, 238]. Ποικίλοι δείκτες επιφανείας έχουν προσδιορισθεί στα λεμφοκύτταρα και στα μακροφάγα του βρογχοκυψελιδικού εκλύματος, διασαφηνίζοντας το ρόλο τους στη σαρκοείδωση [39, 41, 44, 58, 239, 240]. Ορισμένες μελέτες στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα έχουν ερευνήσει την απόπτωση στη σαρκοείδωση [52, 136, 137, 241], και άλλες αφορούν τα γδ και iνκτ λεμφοκύτταρα, καθώς και το ρόλο τους στη νόσο [78, 79, 81, 82]. Σημαντικά ευρήματα έχουν προκύψει επιπλέον από τη μελέτη του TCR και των συνδεδεμένων πεπτιδίων με HLA DR μόρια στα κύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος [25, 46, ]. Τα ευρήματα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος ενδεικτικά χρησιμοποιούνται στην εκτίμηση της ενεργότητας και της εξέλιξης της σαρκοείδωσης. Διαφορές έχουν ανευρεθεί στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα στα επίπεδα της IL 12, καθώς και στην παραγωγή TNF α από τα κυψελιδικά μακροφάγα, ανάλογα με την ενεργότητα της νόσου [113, 229]. Στα πλαίσια ανεύρεσης προγνωστικών δεικτών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, ο λόγος CD4/CD8, το ποσοστό των ουδετερόφιλων πολυμορφοπυρήνων, ο αριθμός των σιτευτικών κυττάρων, η παραγωγή TNF α, CXCL8 (IL 8) και CCL3 (MIP 1α) από τα κύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, ο λόγος IL 1ra/IL 1β στο υπερκείμενο καλλιέργειας μακροφάγων και τα επίπεδα της πρωτεΐνης clara cell 10 kda (CC10) έχουν συσχετισθεί με την ευνοϊκή ή την προϊούσα εξέλιξη της νόσου, χωρίς όμως να έχει γίνει εφικτή η τεκμηριωμένη η χρήση τους στην κλινική πράξη [5, 8, 109, 130, 203, 245, 246]. 6. Το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ως εργαλείο έρευνας Για αρκετές δεκαετίες η ανάλυση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος έχει χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο έρευνας στη μελέτη των νοσημάτων του πνεύμονα, και έχει συμβάλει στην έγκαιρη διάγνωση και στην καλύτερη παρακολούθηση των ασθενών. Από τα κυτταρικά στοιχεία του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, έχουν μελετηθεί ιδιαίτερα τα κυψελιδικά 73

74 μακροφάγα και τα λεμφοκύτταρα ως προς τη συμμετοχή τους στους τοπικούς ανοσιακούς μηχανισμούς των πνευμόνων. Λιγότερες ερευνητικές μελέτες αφορούν τους μικρότερους και περισσότερο ευαίσθητους, φυσιολογικά, πληθυσμούς των ουδετερόφιλων και εωσινόφιλων πολυμορφοπυρήνων, καθώς και άλλους μικρούς, λεμφοκυτταρικούς ή μη, πληθυσμούς, όπως των ΝΚ και των ΝΚΤ λεμφοκυττάρων, των δενδριτικών κυττάρων και των σιτευτικών κυττάρων. Στα μη κυτταρικά στοιχεία του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, που έχουν μελετηθεί, συμπεριλαμβάνονται πρωτεΐνες, ένζυμα, λιπίδια και άλλοι διαλυτοί παράγοντες. Τα μη κυτταρικά διαλυτά στοιχεία προέρχονται από το αίμα και από τους πνεύμονες, και προσδιορίζονται ταυτόχρονα στο περιφερικό αίμα και στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα [247]. Νέες τεχνολογίες, όπως η πρωτεωμική, έχουν ήδη αρχίσει να χρησιμοποιούνται για τη μελέτη των πρωτεϊνών του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος [234, 248]. 7. Νέες εφαρμογές του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος Η διαγνωστική αξία του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, προβλέπεται να βελτιωθεί στο μέλλον με τη χρήση σύγχρονων εργαλείων, όπως οι DNA μικροσυστοιχίες, που θα επιτρέψουν τη γενωμική και την πρωτεωμική ανάλυσή του. Καθώς εξελίσσεται η γνώση σχετικά με τη συμμετοχή νέων κυτταρικών και μη στοιχείων στην παθογένεια των διαμέσων νοσημάτων, και καθώς εμφανίζονται νέες θεραπείες που τροποποιούν τα στοιχεία αυτά, η μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος ενδέχεται να λάβει σημαντικότερη θέση στη διάγνωση και στην παρακολούθηση των διαμέσων πνευμονοπαθειών [7]. 74

75 ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ 1. Γενικά περί της μεθόδου Η κυτταρομετρία ροής είναι μέθοδος μέτρησης, ταυτοποίησης και διαχωρισμού κυττάρων, κυτταρικών συστατικών, ή και μικρών σωματιδίων που βρίσκονται σε εναιώρημα, με βάση τα σήματα σκέδασης και φθορισμού που εκπέμπονται από αυτά. Αποτελεί ταχεία, ποσοτική και πολυπαραμετρική τεχνική που βασίζεται στην ανάλυση και καταγραφή των σημάτων του κάθε κυττάρου (ή σωματιδίου) ξεχωριστά. Στην αρχική της μορφή αναπτύχθηκε με κύριο σκοπό τον κυτταροδιαχωρισμό, στον οποίο οφείλεται το όνομα «FACS» (Fluorescence Αctivated Cell Sorter). Η μέθοδος στηρίζεται στη δίοδο των κυττάρων ή σωματιδίων του εναιωρήματος μέσα από μια κυψελίδα ροής σε μονήρη διάταξη. Κάθετα στη ροή του δείγματος προσπίπτει εστιασμένη η φωτεινή ακτινοβολία (LASER). Στη συνέχεια οπτικά σήματα (σκέδαση, φθορισμός) παράγονται διαδοχικά από κάθε κύτταρο ή σωματίδιο. Τα σήματα ανιχνεύονται, μετατρέπονται σε ηλεκτρονικά σήματα, ενισχύονται και χρησιμοποιούνται για την ανάλυση και την ταυτοποίηση του καθενός κυττάρου ή σωματιδίου. Τα κύτταρα είναι δυνατό επίσης να διαχωριστούν, βάσει των αναλυθέντων χαρακτηριστικών τους (cell sorting). Το πρώτο στάδιο για την ανάλυση ενός δείγματος με κυτταρομετρία ροής είναι η προετοιμασία του, με σκοπό την παρασκευή εναιωρήματος κυττάρων που έχουν κατάλληλα σημανθεί. Στις περισσότερες περιπτώσεις το δείγμα είναι ολικό αίμα που λαμβάνεται με αντιπηκτικό ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ή sodium heparin, αλλά είναι δυνατό να αναλυθούν ακόμη και συμπαγή δείγματα μετά από επεξεργασία. Η επεξεργασία των νωπών δειγμάτων, όπως του αίματος, γίνεται ιδανικά αμέσως μετά τη συλλογή. Το παρασκευασθέν εναιώρημα, ανάλογα με τον προσδιοριζόμενο ανοσοφαινότυπο, επωάζεται με ένα ή περισσότερα μονοκλωνικά συνήθως αντισώματα, που είναι συζευγμένα με φθορίζουσες χρωστικές (άμεση σήμανση), ή συνδέονται σε δεύτερο στάδιο με φθορίζουσες χρωστικές, μέσω αντισώματος ή του συστήματος βιοτίνης αβιδίνης ή στρεπταβιδίνης (έμμεση σήμανση). Φθορίζουσες χρωστικές που συχνά χρησιμοποιούνται συζευγμένες με αντισώματα στην κυτταρομετρία ροής είναι η φλουορεσκεΐνη (FITC), η φυκοερυθρίνη (PE), η peridinin chlorophyll protein (PerCP), η allophycocyanin 75

76 (APC) κ.ά.. Οι τρεις πρώτες χρωστικές διεγείρονται από LASER αργού (488 nm), ενώ η τέταρτη από LASER ήλιου νέου ή diode LASER (633 nm). Άλλες φθορίζουσες ουσίες (π.χ. propidium iodide, Hoechst 33342, DAPI, 7 amino actinomycin D, pyronin Y, κ.ά.) χρησιμοποιούνται για τη σήμανση των νουκλεϊκών οξέων, για τον προσδιορισμό του ενδοκυττάριου ιονισμένου ασβεστίου, του ενδοκυττάριου ph, του δυναμικού της μεμβράνης και της ενδοκυττάριας ενζυμικής δραστικότητας. Η επιλογή των κλώνων των μονοκλωνικών αντισωμάτων, καθώς και των φθοριοχρωμάτων, αποτελούν κρίσιμα σημεία για την επιτυχία της ανάλυσης. Αρνητικοί παράγοντες που σχετίζονται με τα φθοριοχρώματα, είναι η ελάττωση της έντασης φθορισμού, η επικάλυψη των φασμάτων εκπομπής και η μεταφορά ενέργειας μεταξύ των συνδεδεμένων φθοριοχρωμάτων. Το δεύτερο στάδιο αφορά τη μέτρηση του δείγματος. Απαραίτητη προϋπόθεση είναι η μονήρης διάταξη των κυττάρων ή σωματιδίων του εναιωρήματος σε σταθερή ροή, η οποία επιτυγχάνεται με κατάλληλο υδροδυναμικό σύστημα. Το εναιώρημα των σημασμένων κυττάρων κινείται με άσκηση πίεσης. Η νηματική ροή (laminar flow) του δείγματος επιτυγχάνεται με ένεση εντός περιβάλλοντος υγρού που ρέει (carrier fluid, sheath fluid). Με το σύστημα αυτό αποφεύγονται οι στροβιλισμοί του εναιωρήματος του δείγματος. Η ταχύτητα της ροής ελέγχεται με άσκηση διαφορετικών πιέσεων στα υγρά. Η φωτεινή ακτινοβολία προσπίπτει κάθετα στη διεύθυνση ροής, οπότε από το κάθε διερχόμενο κύτταρο ή σωματίδιο παράγονται σήματα σκέδασης και φθορισμού. Η προσπίπτουσα ακτινοβολία προέρχεται συνήθως από μία ή περισσότερες πηγές LASER (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation). Σε αντίθεση με άλλες μορφές ακτινοβολίας, η ακτινοβολία LASER είναι μονοχρωματική. Οι πηγές LASER Argon ion, Krypton και Helium Neon είναι οι συνηθέστερες που εφαρμόζονται στους αναλυτές κυτταρομετρίας. Κατάλληλα οπτικά συστήματα χρησιμοποιούνται για την εξασφάλιση ομοιόμορφης, κατά το δυνατό, έντασης σε όλη τη διάμετρο της ακτίνας LASER. Η χρήση περισσότερων της μίας πηγών LASER, που εκπέμπουν σε διαφορετικά μήκη κύματος, επιτρέπει την εφαρμογή περισσότερων φθοριοχρωμάτων για τη σήμανση και αναγνώριση των μελετούμενων κυττάρων ή σωματιδίων. Μετά την πρόσπτωση της ακτινοβολίας στο διερχόμενο, από το σημείο ανάλυσης, κύτταρο ή σωματίδιο, το φως σκεδάζεται προς διαφορετικές κατευθύνσεις ανάλογα με τον δείκτη διάθλασης, το μέγεθος και το σχήμα κάθε 76

77 σωματιδίου. Η σκεδαζόμενη ακτινοβολία έχει ίδιο μήκος κύματος με την προσπίπτουσα. Το φως που σκεδάζεται σε μικρές γωνίες από την προσπίπτουσα LASER (πρόσθια σκέδαση, FS) καταγράφεται από τον ανιχνευτή πρόσθιας σκέδασης και εξαρτάται από το μέγεθος του σωματιδίου. Το φως που σκεδάζεται σε πλάγια ή και κάθετη κατεύθυνση από την προσπίπτουσα ακτίνα ονομάζεται πλάγια σκέδαση (SS) και εξαρτάται από τις εσωτερικές δομές του κυττάρου (π.χ. την κοκκίωση όσον αφορά τα λευκά αιμοσφαίρια). Συνεπώς, από τα σήματα σκέδασης προκύπτουν στοιχεία σχετικά με το μέγεθος και τη σύσταση του καθενός κυττάρου. Ταυτόχρονα, από τις διεγερθείσες φθορίζουσες ουσίες παράγονται σήματα φθορισμού. Οι συνδεδεμένες φθορίζουσες χρωστικές διεγείρονται από την ορισμένου μήκους κύματος φωτεινή ακτινοβολία και εκπέμπουν σε διαφορετικά μήκη κύματος (φάσματα εκπομπής), μεγαλύτερα της διέγερσης. Η ένταση εκπομπής είναι ανάλογη με τον αριθμό των συνδεδεμένων φθοριοχρωμάτων ανά κύτταρο ή σωματίδιο, γεγονός που επιτρέπει την ποιοτική, αλλά και την ποσοτική ανάλυση των δεδομένων. Τα εκπεμπόμενα φωτεινά σήματα, που παράγονται κατά τη διέλευση κάθε κυττάρου ή σωματιδίου, μέσα από κατάλληλα οπτικά συστήματα, διαχωρίζονται και οδηγούνται στους ανιχνευτές, όπου ανιχνεύονται, ενισχύονται, μετατρέπονται σε ψηφιακά και διοχετεύονται στον ηλεκτρονικό υπολογιστή. Ως ανιχνευτές χρησιμοποιούνται κυρίως φωτοπολλαπλασιαστές (photomultiplier tubes, PMT). Κατά την πρόσπτωση του φωτεινού σήματος στον φωτοπολλαπλασιαστή παράγεται ηλεκτρικό ρεύμα και δημιουργείται ηλεκτρικό παλμικό κύμα. Τα ηλεκτρικά παλμικά κύματα ενισχύονται είτε γραμμικά είτε λογαριθμικά σε ενισχυτή (amplifier). Η επιλογή της γραμμικής ή της λογαριθμικής ενίσχυσης εξαρτάται από τον τύπο της παραμέτρου που αναλύεται. Τέλος τα αναλογικά παλμικά σήματα μετατρέπονται σε ψηφιακές ενδείξεις δυαδικών αριθμών, αναγνώσιμων από τον ηλεκτρονικό υπολογιστή. Το επόμενο στάδιο στην ανάλυση δειγμάτων με κυτταρομετρία ροής αφορά την παρουσίαση και την ανάλυση των αποτελεσμάτων των μετρήσεων. Μέσω του ηλεκτρονικού υπολογιστή, τα δεδομένα πολλών κυττάρων ή σωματιδίων υφίστανται πολύπλοκες αναλύσεις, συσχετίσεις και στατιστική επεξεργασία, σε μικρό χρονικό διάστημα. Οι συνηθέστεροι τρόποι παρουσίασης των δεδομένων είναι τα ιστογράμματα και τα διαγράμματα δύο παραμέτρων ή σημειακά διαγράμματα ή κυτταρογράμματα (scatter plots ή dot plots). Στα ιστογράμματα, ο άξονας χ αντιπροσωπεύει ένταση φθορισμού ή 77

78 σκέδασης και ο άξονας ψ τον αριθμό των σωματιδίων με την αντίστοιχη ένταση. Τα σημειακά διαγράμματα παρουσιάζουν δύο παραμέτρους ταυτόχρονα (στον χ και ψ άξονα, αντίστοιχα), σκέδασης ή φθορισμού ή αμφότερα, εκατοντάδων έως χιλιάδων κυττάρων ταυτόχρονα, δείχνοντας οπτικά διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς. Το λογισμικό των ηλεκτρονικών υπολογιστών, που υποστηρίζουν τους κυτταρομετρητές ροής, επιτρέπει στο χρήστη την οριοθέτηση (gating) και τον προσδιορισμό του ποσοστού των κυττάρων που παρουσιάζουν ένα ή περισσότερα χαρακτηριστικά. Επιπλέον, με την οριοθέτηση δίνεται η δυνατότητα στον χρήστη να περιορίσει την περαιτέρω ανάλυση μόνο στα κύτταρα που εμπίπτουν στην περίφραξη (gate), εξαιρώντας όλα τα άλλα. Τα σήματα, τα οποία μπορούν να συνυπάρξουν σε ένα διάγραμμα δεν είναι αποκλειστικά φθορισμού ή σκέδασης, αλλά χρήσιμες πληροφορίες προκύπτουν και από τον συνδυασμό των σημάτων πλάγιας σκέδασης και φθορισμού. Πολλές φορές είναι απαραίτητη η χρήση περισσοτέρων της μίας περίφραξης κατά την ανάλυση των αποτελεσμάτων [ ]. Το τελευταίο στάδιο στην κυτταρομετρία ροής περιλαμβάνει τη διαλογή και απομόνωση κυττάρων (cell sorting) ή χρωμοσωμάτων με βάση επιλεγμένες παραμέτρους, με στόχο την παραλαβή εναιωρημάτων κυττάρων με υψηλό ποσοστό ανάκτησης ή τη δημιουργία ειδικών βιβλιοθηκών χρωμοσωμάτων. Το στάδιο αυτό είναι εφικτό μόνο στους ειδικά εξοπλισμένους κυτταροδιαχωριστές, σε αντίθεση με τους απλούς αναλυτές κυτταρομετρίας ροής. Καθώς το κυτταρικό εναιώρημα εξέρχεται από το θάλαμο ροής υπό πίεση και σε νηματική ροή, εξαναγκάζεται σε ήπια παλμική δόνηση, που έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ομοιόμορφων σταγονιδίων (droplets). Τα κύτταρα αμέσως μετά την αναγνώριση και την ταυτοποίησή τους, εγκλωβίζονται ανά ένα σε σταγονίδια και φορτίζονται ηλεκτρικά, ανάλογα με την κυτταρική τους ταυτότητα (ανοσοφαινότυπος). Στη συνέχεια τα σταγονίδια εισάγονται σε ηλεκτρικό πεδίο και, όσα επιλέχθηκαν, εκτρέπονται από την πορεία τους, διαχωρίζονται από τα υπόλοιπα και συλλέγονται. Πολλοί πληθυσμοί κυττάρων μπορούν να διαχωριστούν ταυτόχρονα, με την εφαρμογή φορτίων διαφορετικής έντασης και πολικότητας [251, 254, 255]. Με τη μελέτη του ανοσοφαινοτύπου προσδιορίζεται η εκατοστιαία αναλογία των παθολογικών και των φυσιολογικών κυτταρικών πληθυσμών. Επειδή στους πλέον διαδεδομένους κυτταρομετρητές ροής δεν υπάρχει δυνατότητα μέτρησης του όγκου του δείγματος, εφαρμόζονται έμμεσοι τρόποι 78

79 για τον υπολογισμό του απόλυτου αριθμού των κυττάρων. Συνήθως χρησιμοποιούνται οι τεχνικές «dual platform» και «PanLeucogating», όπου ο απόλυτος αριθμός των λευκών προσδιορίζεται σε αιματολογικό αναλυτή. Μέθοδος εκλογής ωστόσο θεωρείται η «single platform» τεχνική, η οποία στηρίζεται στην προσθήκη ειδικών φθοριζόντων μικροσφαιριδίων (beads) γνωστής συγκέντρωσης σε συγκεκριμένο όγκο δείγματος [ ]. Η εξέλιξη στην κυτταρομετρία ροής είναι συνεχής και αφορά όλα τα προηγούμενα στάδια μέτρησης και ανάλυσης ενός δείγματος. Είναι εφικτή η προετοιμασία των δειγμάτων με αυτοματοποιημένο σύστημα και η δειγματοληψία από μικροπλάκα. Επίσης έχει αυξηθεί ιδιαίτερα ο αριθμός των χρησιμοποιούμενων φθιοριοχρωστικών, που διεγείρονται από μία ή περισσότερες πηγές LASER. Σημαντικές βελτιώσεις έχουν γίνει στο υδροδυναμικό σύστημα, στο σύστημα συλλογής ακτινοβολίας και στο υπολογιστικό ηλεκτρονικό σύστημα του κυτταρομετρητή, καθιστώντας την πολυχρωματική ανάλυση εφικτή και αξιόπιστη [260]. Παράλληλα με τους κυτταρομετρητές ροής και τους κυτταροδιαχωριστές υψηλής ταχύτητας και αυξημένης πολυπλοκότητας, έχουν αρχίσει να κατασκευάζονται φθηνότεροι και απλούστεροι αναλυτές, κατάλληλοι για την καθημερινή κλινική πράξη [254]. 2. Εφαρμογές Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιείται για τη μελέτη των κυττάρων και των διαλυτών ουσιών, στο αίμα και σε άλλα βιολογικά υλικά, όπως το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, το εγκεφαλονωτιαίο υγρό, ο μυελός των οστών, οι κυτταρικές καλλιέργειες, κ.ά. Η μελέτη της κυτταρικής βιολογίας περιλαμβάνει συνηθέστερα την ανάλυση αντιγόνων της κυτταρικής μεμβράνης (ανοσοφαινότυπος), η οποία αποτελεί την ευρύτερα διαδεδομένη κλινική εφαρμογή της κυτταρομετρίας ροής. Με τη μελέτη του ανοσοφαινοτύπου επιτυγχάνεται η ανίχνευση των παθολογικών κυττάρων και των διαταραχών σύστασης των φυσιολογικών κυτταρικών πληθυσμών. Στην κλινική πράξη, η ανοσοφαινοτυπική ανάλυση έχει φανεί ιδιαίτερα χρήσιμη στη διάγνωση, στην παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της χημειοθεραπείας και στην πρώιμη αναγνώριση της υποτροπής των αιματολογικών κακοηθειών. Επίσης, ο προσδιορισμός του ανοσοφαινοτύπου έχει χρησιμεύσει στη διάγνωση και παρακολούθηση κληρονομικών και επίκτητων ανοσοανεπαρκειών, στη διάγνωση και 79

80 παρακολούθηση αυτοάνοσων νοσημάτων και στη διαγνωστική προσέγγιση των διαμέσων πνευμονοπαθειών. Άλλες εφαρμογές της κυτταρομετρίας ροής στη μελέτη της κυτταρικής βιολογίας περιλαμβάνουν την ανάλυση των νουκλεϊκών οξέων, την HLA τυποποίηση, τη χρωμοσωμική ανάλυση, τη διασταύρωση ιστοσυμβατότητας, τον προσδιορισμό ενδοκυττάριων ουσιών, τη μελέτη της φαγοκυτταρικής λειτουργίας και τη μελέτη της απόπτωσης. Ειδικότερα, η ανάλυση της περιεκτικότητας των κυττάρων σε DNA έχει εφαρμοσθεί στον έλεγχο της ανευπλοειδικότητας των καρκινικών κυττάρων, καθώς συσχετίζεται με την πρόγνωση της νόσου. Ο προσδιορισμός διαλυτών ουσιών με κυτταρομετρία ροής στα βιολογικά υγρά χρησιμοποιείται κυρίως για τον προσδιορισμό αντισωμάτων και διαλυτών κυτταροκινών, με τη χρήση ειδικών σφαιριδίων συζευγμένων με τα αντίστοιχα αντιγόνα ή αντισώματα [250, 254, ]. 3. Κατευθυντήριες οδηγίες, προτυποποίηση και ποιοτικός έλεγχος Η ευρεία χρήση της κυτταρομετρίας ροής στο κλινικό εργαστήριο για τον προσδιορισμό κυτταρικών πληθυσμών οδήγησε στην ανάγκη θέσπισης κριτηρίων, με στόχο την εξασφάλιση ακρίβειας και επαναληψιμότητας των αποτελεσμάτων. Κατευθυντήριες οδηγίες έχουν κατά καιρούς εκδοθεί σχετικά με τις διαφορετικές εφαρμογές της κυτταρομετρίας ροής, όπως τον προσδιορισμό των CD4 + T λεμφοκυττάρων, των CD34 + αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων και του DNA [258, 270, 271]. Κατευθυντήριες οδηγίες έχουν εκδοθεί από το CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), που αφορούν το χαρακτηρισμό και τη μέτρηση των λεμφοκυττάρων και των λευχαιμικών κυττάρων, τον προσδιορισμό των δικτυοερυθροκυττάρων και την ανίχνευση των εμβρυϊκών ερυθροκυττάρων. Πρόσφατες οδηγίες του CLSI αφορούν τη μέτρηση με κυτταρομετρία ροής ανοσολογικά καθοριζόμενων κυτταρικών πληθυσμών, όπου θίγονται θέματα μεθοδολογίας και εξασφάλισης ποιότητας στις κλινικές εφαρμογές της κυτταρομετρίας ροής. Στα ειδικά θέματα που αναλύονται, περιλαμβάνονται η συλλογή, η μεταφορά και η προετοιμασία των δειγμάτων, ο ποιοτικός έλεγχος και η σήμανση του δείγματος, η βαθμονόμηση του οργάνου, η ανάλυση του δείγματος και η ανάλυση και παρουσίαση των δεδομένων. Πρόσθετες οδηγίες του CLSI αφορούν την κλινική ανάλυση των νεοπλασματικών κυττάρων του αιμοποιητικού και του λεμφικού συστήματος με κυτταρομετρία ροής, με σκοπό την εφαρμογή του κατάλληλου ανοσοφαινοτυπικού ελέγχου για τη σωστή 80

81 διάγνωση και αντιμετώπιση των ασθενών με λευχαιμία ή λέμφωμα [259, 272, 273]. Απαραίτητη προϋπόθεση για την εξαγωγή αξιόπιστων αποτελεσμάτων με την κυτταρομετρία ροής είναι η σωστή βαθμονόμηση του κυτταρομετρητή ροής, η οποία γίνεται με τη χρήση κατάλληλων πρότυπων σφαιριδίων από latex με γνωστά και σταθερά χαρακτηριστικά σκέδασης και φθορισμού. Τα σφαιρίδια ταξινομούνται σε τρεις βασικές κατηγορίες: α) σφαιρίδια οπτικής ευθυγράμμισης, τύπος Ι, για τον έλεγχο της ευθυγράμμισης του οπτικού συστήματος του οργάνου και τον έλεγχο των υδραυλικών συστημάτων και της καθαρότητας της κυψελίδας ροής, β) σφαιρίδια αναφοράς, τύπος ΙΙ, με γνωστή ένταση φθορισμού, για τη ρύθμιση (set up) του οργάνου, και γ) σφαιρίδια βαθμονόμησης με πολλαπλούς πληθυσμούς, τύπος ΙΙΙ, για τη βαθμονόμηση των τάσεων των φωτοπολλαπλασιαστών και τη διόρθωση της φασματικής επικάλυψης των φθοριοχρωμάτων (compensation). Αναγκαίος για την εξασφάλιση ποιότητας στην κυτταρομετρία ροής είναι επίσης ο εσωτερικός και εξωτερικός ποιοτικός έλεγχος. Ο εσωτερικός ποιοτικός έλεγχος γίνεται με τα υλικά ελέγχου, τα οποία είναι συνήθως σταθεροποιημένα δείγματα αίματος με γνωστή μέση τιμή και τυπική απόκλιση για τις προσδιοριζόμενες παραμέτρους. Τα υλικά ελέγχου συμπεριλαμβάνονται στην επεξεργασία των δειγμάτων σε κάθε αναλυτική σειρά, έτσι ώστε να ελέγχεται αποτελεσματικά η μέθοδος προετοιμασίας, μέτρησης και ανάλυσης των εξεταζόμενων δειγμάτων [272, 274, 275]. 4. Μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος με κυτταρομετρία ροής 4.1 Εισαγωγή Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιείται στη μελέτη των κυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, παρέχοντας αντίστοιχα αποτελέσματα και πλεονεκτώντας ορισμένες φορές, σε σύγκριση με τις κλασικές μικροσκοπικές μεθόδους [ ]. Η εφαρμογή της κυτταρομετρίας ροής, για διαγνωστικούς ή ερευνητικούς σκοπούς, παρουσιάζει ιδιαιτερότητες ως προς την προετοιμασία και την ανάλυση των δειγμάτων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος. 4.2 Προετοιμασία των δειγμάτων Η προετοιμασία των κυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος περιλαμβάνει τη διήθηση του πρόσφατου δείγματος με αποστειρωμένη γάζα, τη φυγοκέντρηση σε χαμηλή ταχύτητα, το πλύσιμο των κυττάρων και την 81

82 επανεναιώρηση στην κατάλληλη κυτταρική συγκέντρωση (π.χ. 1x10 7 /ml). Η σήμανση γίνεται με μονοκλωνικά αντισώματα σημασμένα με φθοριοχρώματα και τα ερυθρά αιμοσφαίρια λύονται με ειδικό λυτικό αντιδραστήριο. Συνήθη μονοκλωνικά αντισώματα, που έχουν χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, συνδέονται με τα αντιγόνα CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD25 και HNK 1. Πριν τη μέτρηση του σημασμένου δείγματος στον κυτταρομετρητή, είναι αναγκαίο να απομακρύνονται οι σωροί των κυττάρων [202]. 4.3 Ανάλυση των αποτελεσμάτων Η μελέτη των αποτελεσμάτων από τις μετρήσεις του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος γίνεται μετά από οριοθέτηση του κάθε υποπληθυσμού, δεδομένου ότι ο κάθε υποπληθυσμός παρουσιάζει διαφορετική ένταση αυτοφθορισμού. Εντονότερο και ποικίλο αυτοφθορισμό παρουσιάζουν τα κυψελιδικά μακροφάγα, ενώ μικρότερο και σταθερό αυτοφθορισμό εμφανίζουν τα λεμφοκύτταρα [202]. Η καθαρότητα της περιοχής οριοθέτησης των λεμφοκυττάρων αποτελεί πρόβλημα κατά τη φαινοτυπική ανάλυση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος με κυτταρομετρία ροής. Στόχος της ανάλυσης είναι ο προσδιορισμός του συνόλου των λεμφοκυττάρων και ο αποκλεισμός από την περιοχή οριοθέτησής τους των μακροφάγων, των νεκρών κυττάρων, των επιθηλιακών κυττάρων και των σωματιδίων σκόνης, που ανευρίσκονται στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα. Η χρήση του CD45, μόνου του ή σε συνδυασμό με άλλα μονοκλωνικά αντισώματα και χρωστικές του DNΑ, έχει προταθεί για τον καλύτερο διαχωρισμό των λευκοκυτταρικών υποπληθυσμών και τη βελτίωση της ειδικότητας της μεθόδου [278, 279, 281]. Επιπλέον, η οριοθέτηση των λεμφοκυττάρων βάσει της έκφρασης του CD45 και των σκεδαστικών χαρακτηριστικών τους φαίνεται ότι επαρκεί για τον ακριβή προσδιορισμό του λόγου CD4/CD8 στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα [282]. 4.4 Εφαρμογές της κυτταρομετρίας ροής στη μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος Η κύρια κλινική εφαρμογή της κυτταρομετρίας ροής στη μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος είναι ο προσδιορισμός των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών και των δεικτών ενεργοποίησης που βοηθούν στη διάγνωση της σαρκοείδωσης και της πνευμονίτιδας από υπερευαισθησία, καθώς και ο 82

83 προσδιορισμός των κυττάρων Langerhans για τη διάγνωση της ιστιοκύττωσης, με τη χρήση του CD1a μονοκλωνικού αντισώματος [6, 202]. Επιπλέον, η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των λευκοκυτταρικών πληθυσμών σε νοσήματα των πνευμόνων που παρουσιάζουν λεμφοκυττάρωση, ουδετεροφιλία ή εωσινοφιλία, με τη χρήση των CD45, CD15 και CD23 μονοκλωνικών αντισωμάτων, προσφέροντας συγκρίσιμα αποτελέσματα με τα αντίστοιχα της κλασικής μικροσκοπικής μεθόδου [278]. Σε ερευνητικό επίπεδο, η κυτταρομετρία ροής έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τον προσδιορισμό του ανοσοφαινοτύπου και της λειτουργίας των λεμφοκυτταρικών, κυρίως, υποπληθυσμών του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, στα διάμεσα νοσήματα των πνευμόνων και ιδιαίτερα στη σαρκοείδωση [43, 58, 76, 77, 79, 283]. 5. Μελέτη των κλασικών ΝΚΤ (inkt) λεμφοκυττάρων στον άνθρωπο με κυτταρομετρία ροής Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί βασικό μέσο για τη μελέτη των ΝΚΤ λεμφοκυττάρων. Η ανάλυση αυτών των κυττάρων είναι ιδιαίτερα δυσχερής, δεδομένου ότι δεν είναι δυνατή η ειδική ανίχνευσή τους, με χρήση των δεικτών των ΝΚ λεμφοκυττάρων (CD56, CD161), οι οποίοι εκφράζονται σε ποικίλο βαθμό και στα συμβατικά Τ λεμφοκύτταρα, ενώ δεν εκφράζονται σε όλα τα ΝΚΤ λεμφοκύτταρα [ ]. Η μελέτη των ΝΚΤ λεμφοκυττάρων απαιτεί υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, δεδομένου ότι πρόκειται για έναν πολύ μικρό υποπληθυσμό των λεμφοκυττάρων, που παρουσιάζει αξιοσημείωτη διακύμανση μεταξύ των υγιών ανθρώπων (100 φορές στην περίπτωση των inkt λεμφοκυττάρων). Σήμερα, είναι εφικτός ο προσδιορισμός των κλασικών ή μη πολυμορφικών NKT (invariant NKT, inkt) λεμφοκυττάρων με ειδικά αντιδραστήρια, ενώ δυσκολίες παρουσιάζονται στη μελέτη των μη κλασικών ΝΚΤ λεμφοκυττάρων. Η πολυπαραμετρική ανάλυση με κυτταρομετρία ροής συνεχίζει να αποτελεί το κύριο εργαλείο μελέτης των inkt λεμφοκυττάρων στον άνθρωπο και στα ποντίκια. Η μελέτη των inkt λεμφοκυττάρων με κυτταρομετρία ροής στηρίζεται στα ειδικά χαρακτηριστικά τους, δηλαδή την αντιδραστικότητα στο γλυκοσφιγγολιπίδιο αgalcer, παρουσιαζόμενο από το μόριο CD1d, και τον μη πολυμορφικό TCR [288, 289]. Τρία είδη αντιδραστηρίων έχουν σχεδιαστεί και χρησιμοποιούνται, μεμονωμένα ή σε συνδυασμό, για την ταυτοποίηση και 83

84 αρίθμησή τους, παρουσιάζοντας διαφορές ως προς την ευαισθησία και την ειδικότητα: anti Vα24 και anti Vβ11 μονοκλωνικά αντισώματα Συνδέονται με τον μη πολυμορφικό TCR των inkt λεμφοκυττάρων. Χαρακτηριστικά της μεθόδου είναι η αυξημένη ευαισθησία, με αποτέλεσμα τη δυνατότητα ανίχνευσής τους ακόμη και σε συχνότητα μικρότερη από 0.01%. Η μέθοδος όμως παρουσιάζει χαμηλή ειδικότητα, καθώς ο συνδυασμός Vα24/Vβ11 απαντάται και σε κλασικά Τ λεμφοκύτταρα, χωρίς CD1d περιορισμό, με συνέπεια την πιθανή υπερεκτίμηση του αριθμού τους. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με τα CD1d τετραμερή ή το αντίσωμα 6Β11. CD1d τετραμερή (ή διμερή) Κατ αντιστοιχία με τα MHC τετραμερή, τα CD1d τετραμερή αποτελούνται από τέσσερα μόρια CD1d, που συνδέονται με ένα επιλεγμένο αντιγόνο. Σε αντίθεση με τα MHC τετραμερή, τα μόρια CD1d δεν είναι πολυμορφικά, γεγονός που καθιστά δυνατή την εφαρμογή τους σε όλα τα άτομα του ίδιου είδους. Αντίστοιχα, τα διμερή αποτελούνται από ανασυνδυασμένο CD1d:Ig και ανθρώπινη β2 μικροσφαιρίνη. Το αντιγόνο που χρησιμοποιείται συνήθως για τη φόρτωση των CD1d τετραμερών (ή διμερών) είναι το αgalcer, που συνδέεται ισχυρά με όλα τα inkt λεμφοκύτταρα και χρησιμοποιείται στην ταυτοποίησή τους. Η «φόρτωση» των CD1d τετραμερών με άλλα ενδογενή, μικροβιακά ή συνθετικά γλυκολιπιδικά μόρια, εφαρμόζεται στην έρευνα για τον προσδιορισμό των φυσικών αντιγόνων των inkt λεμφοκυττάρων, στη μελέτη των αντιγονοειδικών υποπληθυσμών των inkt και στην παρασκευή συνθετικών αντιγόνων για θεραπευτικές χρήσεις. Ο συνδυασμός των CD1d τετραμερών/αgalcer αποτελεί τον πιο ειδικό τρόπο ταυτοποίησης των inkt λεμφοκυττάρων. Μειονεκτήματα της μεθόδου αποτελούν η μη ειδική σύνδεση των τετραμερών κυρίως σε μονοκύτταρα, η μικρότερη ευαισθησία τους, η σήμανση και ενός μικρού ποσοστού μη κλασικών ΝΚΤ λεμφοκυττάρων και η πιθανή διέγερση των inkt κυττάρων από το αgalcer κατά το διαχωρισμό τους (FACS sorting), γεγονός που επηρεάζει τις λειτουργικές δοκιμασίες τους. Η μη ειδική σύνδεση (background staining) μειώνεται με τη χρήση ειδικών αντιδραστηρίων (blocking solutions) και την απομάκρυνση των μονοκυττάρων. Η χρήση ενός μη ειδικού αντιδραστηρίου (π.χ. μη συνδεδεμένα unloaded CD1d τετραμερή) βοηθά στον αποκλεισμό των αυτοφθοριζόντων και μη ειδικά σημασμένων κυττάρων. Τα τετραμερή, όταν 84

85 χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με anti CD3, anti Vα24 ή anti Vβ11 μονοκλωνικά αντισώματα, εμφανίζουν αυξημένη αναλυτική ικανότητα. Κατά τη συνδυασμένη χρήση τετραμερών με anti Vα24 C15 αντισώματα, πρέπει να προηγείται η σήμανση με τα πρώτα, λόγω εκτόπισής τους από τα δεύτερα. 6B11 μονοκλωνικό αντίσωμα (anti Vα24 Jα18 CDR3) Το αντίσωμα αυτό αναφέρεται συνήθως με το όνομα του κλώνου που χρησιμοποιείται. Αναγνωρίζει μία μοναδική περιοχή που καθορίζει τη συμπληρωματικότητα (complementarity determining region, CDR), την CDR3, η οποία προκύπτει από τον Vα24/Jα18 ανασυνδυασμό και αποτελεί αποκλειστικό χαρακτηριστικό του TCR των inkt λεμφοκυττάρων. Η χρήση του PE 6B11 αντισώματος, μόνου του ή σε συνδυασμό με anti CD3 ή FITC anti Vβ11, αποτελεί άριστο εργαλείο για την ανάλυση των inkt λεμφοκυττάρων στον άνθρωπο. Το 6Β11 αντίσωμα έχει χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με το anti Vα24, με σκοπό την εξασφάλιση ειδικότητας στην ανίχνευση των inkt λεμφοκυττάρων. Στην περίπτωση αυτή, μόνο ο συνδυσμός FITC 6B11 και PEanti Vα24 C15 είναι επιτρεπτός, καθώς το FITC anti Vα24 C15 εκτοπίζει το PE 6Β11 από τη θέση σύνδεσής τους και ο συνδυασμός τους θα πρέπει επομένως να αποφεύγεται. Λόγω της μεγαλύτερης έντασης φθορισμού, προτιμάται το PE 6B11 αντίσωμα. Επιπλέον, και στη μέθοδο αυτή, συνιστάται η προηγούμενη επεξεργασία του εξεταζόμενου δείγματος με αντιδραστήρια δέσμευσης των υποδοχέων Fcγ. Κατά τη συνδυασμένη χρήση αντιδραστηρίων, για τη μελέτη των inkt λεμφοκυττάρων, χρειάζεται προσοχή στη μεταφορά ενέργειας μεταξύ των φθοριοχρωμάτων (fluorescence resonance emission transfer, FRET), η οποία συμβαίνει, όταν διαφορετικά αντισώματα βρίσκονται σε κοντινή θέση. Έτσι, όταν το φάσμα εκπομπής του ενός φθοριοχρώματος συμπίπτει με το φάσμα απορρόφησης του άλλου, μπορεί να προκύψει μη ειδική εκπομπή φθορισμού, με επιπτώσεις στη διόρθωση της φασματικής επικάλυψης των φθοριοχρωμάτων και στην ανάλυση των αποτελεσμάτων. Επιπλέον, επειδή η ανίχνευση των inkt λεμφοκυττάρων στηρίζεται σε αντιδραστήρια που συνδέονται με τον TCR, η παρεμβολή μεταξύ των αντιδραστηρίων (steric interference) μπορεί να οδηγήσει σε ελάττωση του εκπεμπόμενου φθορισμού, με κίνδυνο την ανεύρεση ψευδώς ελαττωμένου αριθμού inkt λεμφοκυττάρων [289]. Ο προσδιορισμός του φαινοτύπου των inkt λεμφοκυττάρων, βάσει των παραγόμενων κυτταροκινών, συμβάλλει σημαντικά στην κατανόηση της 85

86 λειτουργίας των iνκτ λεμφοκυττάρων, δεδομένου του σημαντικού ανοσορρυθμιστικού τους ρόλου, που οφείλεται στην ικανότητα αθρόας παραγωγής κυτταροκινών. Διαφορετικές μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της λειτουργίας των inkt λεμφοκυττάρων, σε επίπεδο κυτταρικών σειρών, κλώνων, ή μεμονωμένων κυττάρων από πρόσφατα δείγματα [287, ]. Ο διαχωρισμός των inkt λεμφοκυττάρων με κυτταρομετρία ροής, προκειμένου να εμπλουτισθούν πριν τη λειτουργική μελέτη τους, αποτελεί καλύτερη μέθοδο σε σύγκριση με τα μαγνητικά σφαιρίδια, λόγω της συνδυασμένης χρήσης δεικτών των inkt λεμφοκυττάρων [289]. Η κυτταρομετρία ροής με χρήση ειδικών σφαιριδίων (cytometric bead array) έχει χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των κυτταροκινών στο υπερκείμενο κυτταροκαλλιέργειας. Σε κυτταρικό επίπεδο, η κυτταρομετρία ροής έχει εφαρμοσθεί, τόσο για την ενδοκυττάρια σήμανση κυτταροκινών, όσο και σε συνδυασμό με την τεχνολογία cell surface affinity matrix (cell surface affinity matrix technology, CSAMT), που επιτρέπει την ανίχνευση και τον μαγνητικό διαχωρισμό ζωντανών κυττάρων, ανάλογα με τις κυτταροκίνες που παράγουν. Διαφορετικοί διεγέρτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ενεργοποίηση της σύνθεσης κυτταροκινών από τα iνκτ λεμφοκύτταρα (π.χ. anti Vα24+/ anti CD28, Con A, anti CD3+/ anti CD28, phorbol myristate acetate+ionomycin και CD1d μόρια που φέρουν γλυκολιπιδικό αντιγόνο). Κατά την ενδοκυττάρια σήμανση κυτταροκινών, θεωρείται σημαντική η συνδυασμένη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων anti IFNγ και anti IL 4 (ή anti IL 13), με την οποία προσδιορίζεται η λειτουργική διαφοροποίηση των iνκτ κυττάρων και ο διαχωρισμός τους σε Τ Η 1, T Η 2, ή T Η 0 υποπληθυσμούς [288]. Στις λειτουργικές δοκιμασίες των iνκτ λεμφοκυττάρων περιλαμβάνονται και οι δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας. Η κυτταρομετρία ροής έχει χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο της κυτταροτοξικότητας των inkt λεμφοκυττάρων έναντι καρκινικών κυττάρων, με τη χρήση παραλλαγών της μεθόδου [295, 296]. Συγκριτικά με τη συνήθη μέθοδο ελέγχου της κυτταροτοξικότητας με ραδιενεργό χρώμιο (Cr 51 release assay), η κυτταρομετρία ροής πλεονεκτεί τόσο σε πρακτικό όσο και σε ερευνητικό επίπεδο, καθώς δε δημιουργεί ραδιενεργά απόβλητα και επιτρέπει τη μελέτη των μηχανισμών της κυτταροτοξικότητας [288]. Η ύπαρξη επιμέρους υποπληθυσμών inkt λεμφοκυττάρων, με διαφορετικές λειτουργικές ιδιότητες, καθιστά αναγκαία τη λεπτομερέστερη ανοσοφαινοτυπική μελέτη τους. Ένας επαρκής ανοσοφαινοτυπικός έλεγχος των 86

87 iνκτ κυττάρων περιλαμβάνει και τη μελέτη της έκφρασης των CD4, CD8 και CD161 μορίων. Η μελέτη περισσότερων φαινοτυπικών δεικτών προϋποθέτει τη χρήση κυτταρομετρίας πολλαπλού φθορισμού, με την οποία ελέγχεται η έκφραση και άλλων δεικτών των ΝΚ λεμφοκυττάρων (CD16, CD56), δεικτών διέγερσης (CD25, CD69, CD38, HLADR), δεικτών παρθένων ή μνημονικών λεμφοκυττάρων (CD45RA, CD45RO, CD62L), και υποδοχέων χημειοκινών (CCR5, CXCR3, CCR6, CCR9, CXCR6) [287, 297]. Εκτός από τον προσδιορισμό της έκφρασης υποδοχέων χημειοκινών, η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιείται και για τη μελέτη της χημειοταξίας των inkt λεμφοκυττάρων, ελέγχοντας έτσι και τη λειτουργία των αντίστοιχων υποδοχέων [288, 298]. Με την πολυχρωματική ανάλυση ολοκληρώνεται η μελέτη των ιδιοτήτων και της επανακυκλοφορίας των inkt λεμφοκυττάρων. Η μελέτη των inkt λεμφοκυττάρων στο αίμα δεν είναι σίγουρο ότι αντικατοπτρίζει τη λειτουργία και τη σύστασή τους σε άλλους ιστούς. Το φαινόμενο αυτό έχει παρατηρηθεί σε πειραματόζωα, αλλά δεν είναι σαφές αν ισχύει και στον άνθρωπο. Τα ευρήματα πάντως από το περιφερικό αίμα πρέπει να μην εκλαμβάνονται ως ισχύοντα και στους ιστούς [289]. 6. Προσδιορισμός ενδοκυττάριων κυτταροκινών με κυτταρομετρία ροής Αν και ορισμένοι επιφανειακοί κυτταρικοί δείκτες συσχετίζονται με την κυτταρική λειτουργία, ο προσδιορισμός της κυτταρικής λειτουργίας, βάσει των επιφανειακών δεικτών, δεν είναι απόλυτα ακριβής. Φαινοτυπικά όμοια κύτταρα, ως προς τους δείκτες επιφανείας, είναι δυνατό να συνθέτουν διαφορετικά προϊόντα και να έχουν διαφορετικά λειτουργικά χαρακτηριστικά [299, 300]. Η ταυτοποίηση διαφορετικών λειτουργικά υποπληθυσμών CD4 + T λεμφοκυττάρων, με πολωμένη παραγωγή κυτταροκινών, στηρίχθηκε αρχικά στον προσδιορισμό των κυτταροκινών με ELISA στο υπερκείμενο κυτταρικών καλλιεργειών κλώνων Τ λεμφοκυττάρων [301]. Αν και η μέθοδος αυτή εφαρμόσθηκε και από άλλους ερευνητές, παρουσιάζει μειονεκτήματα ως προς τη δυνατότητα εφαρμογής της σε μεγάλο αριθμό ασθενών και ως προς την ακρίβεια των αποτελεσμάτων της, καθώς είναι κοπιώδης και προϋποθέτει παρατεταμένη in vitro επεξεργασία των κυττάρων [299, 300, 302]. Γενικά, διάφορες μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί για τον προσδιορισμό της παραγωγής κυτταροκινών από τα κύτταρα, όπως η enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), η reverse trancription polymerase chain reaction (RT PCR), η Taqman real time PCR, ο υβριδισμός in situ (in situ hybridization, ISH), η ανοσοϊστοχημεία, η limiting dilution analysis (LDA), η enzyme linked 87

88 immunospot assay (ELISPOT), και η σήμανση των ενδοκυττάριων κυτταροκινών (intracellular cytokine staining, ICCS) [299]. Όλες οι μέθοδοι παρουσιάζουν πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Οι μέθοδοι LDA, ELISPOT και ICCS είναι οι πιο κατάλληλες για την εκτίμηση της συχνότητας των κυττάρων που παράγουν μία ή περισσότερες κυτταροκίνες. Η μέθοδος ELISA προσδιορίζει το συνολικό ποσό της παραχθείσας πρωτεΐνης, η RT PCR προσδιορίζει ημιποσοτικά τα επίπεδα του mrna ενός γονιδίου, ενώ ο υβριδισμός in situ και η ανοσοϊστοχημεία είναι χρήσιμες στην εντόπιση εντός ιστών των κυττάρων που παράγουν μια κυτταροκίνη. Χρώση ενδοκυττάριων κυτταροκινών έγινε για πρώτη φορά σε τομές ιστών [303]. Μετά την ανάπτυξη μεθόδων για τη μονιμοποίηση και την αύξηση της διαπερατότητας των λεμφοκυττάρων, ακολούθησε η χρήση αναστολέων, με σκοπό την άθροιση των κυτταροκινών ενδοκυττάρια, επιτρέποντας τη βελτίωση του λόγου του σήματος προς τον θόρυβο [304, 305]. Τελικά η έρευνα πολλών μονοκλωνικών αντισωμάτων οδήγησε στην επιλογή ειδικών αντισωμάτων που συνδέουν τις ενδοκυττάριες κυτταροκίνες, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη πρακτικών και ευαίσθητων μεθόδων [ ]. Σχετικά πρόσφατα, η απόδοση της μεθόδου βελτιώθηκε περαιτέρω με τη χρήση πλακών με 24 ή 96 βαθύσματα και αλγορίθμου αυτόματης ανάλυσης των αποτελεσμάτων [309]. Η εφαρμογή της κυτταρομετρίας ροής σε κύτταρα σημασμένα για ενδοκυττάριες κυτταροκίνες επιτρέπει τον χαρακτηρισμό της λειτουργίας μεγάλου αριθμού κυττάρων στο επίπεδο του ενός κυττάρου, μετά από βραχύχρονη in vitro διέγερση των κυττάρων. H χρήση πολλών φθοριοχρωμάτων στην κυτταρομετρία ροής δίνει τη δυνατότητα ταυτόχρονου προσδιορισμού περισσότερων της μίας κυτταροκινών ανά κύτταρο, καθιστώντας δυνατή την ταυτοποίηση της λειτουργίας των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών, βάσει των παραγόμενων κυτταροκινών και των μεμβρανικών δεικτών τους. Η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα, για τον χαρακτηρισμό της ανοσιακής απάντησης ή τη διαγνωστική προσέγγιση πολλών νοσημάτων, όπως αυτοάνοσων, πρωτοπαθών ανοσοανεπαρκειών, άσθματος, ιογενών και βακτηριακών λοιμώξεων [ ], καθώς και για τον έλεγχο της ανταπόκρισης σε εμβόλια [315]. Προσδιορισμός ενδοκυττάριων κυτταροκινών έχει γίνει και στη σαρκοείδωση, σε ασθενείς διαφορετικών σταδίων, με χρήση παραλλαγών της μεθόδου [37, 43, 60 63]. Η σήμανση των ενδοκυττάριων κυτταροκινών με κυτταρομετρία ροής αποτελεί μέθοδο εκλογής για τον 88

89 προσδιορισμό της Τ Η 1/Τ Η 2 ισορροπίας, με τον προσδιορισμό των IFN γ και IL 4, ως κυτταροκινών δεικτών, για την Τ Η 1 και Τ Η 2 ανοσιακή απάντηση, αντίστοιχα. Αν και οι περισσότερες μελέτες στους ανθρώπους έχουν γίνει στα μονοπύρηνα του περιφερικού αίματος (PBMCs), έχουν επίσης μελετηθεί κύτταρα και σε άλλα βιολογικά υγρά, όπως το αρθρικό υγρό και το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, ως προς την ενδοκυττάρια παραγωγή κυτταροκινών, διότι τα κύτταρα του περιφερικού αίματος δεν αποκαλύπτουν την τοπική ανοσιακή απάντηση. Επιπλέον, η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί, με ορισμένες τροποποιήσεις, για τη μελέτη και άλλων κυττάρων, εκτός των Τ λεμφοκυττάρων, όπως των σιτευτικών κυττάρων, των μονοκυττάρων, των ΝΚ λεμφοκυττάρων, των ουδετερόφιλων και των βασεόφιλων πολυμορφοπυρήνων [299, 302, 316]. Κατά την ερμηνεία των αποτελεσμάτων της μεθόδου χρειάζεται προσοχή, καθώς με την κυτταρομετρία ροής ανιχνεύεται η συχνότητα των κυττάρων που εκφράζουν ενδοκυττάρια μία ή περισσότερες κυτταροκίνες σε ορισμένη χρονική στιγμή, και όχι η έκκριση των κυτταροκινών ή το συνολικό ποσό τους. Επιπλέον, το ποσοστό των κυττάρων ενός πληθυσμού, που εκφράζουν μία κυτταροκίνη, ή η ένταση έκφρασης μίας κυτταροκίνης δεν ισοδυναμεί με τον ρόλο της κυτταροκίνης ή του κυτταρικού πληθυσμού σε ένα νόσημα. Οι Τ Η 1 κυτταροκίνες, για παράδειγμα, εκφράζονται φυσιολογικά από μεγαλύτερο ποσοστό λεμφοκυττάρων και σε εντονότερο βαθμό, σε σύγκριση με τις Τ Η 2 κυτταροκίνες [299, 316, 317]. Διακυμάνσεις στα αποτελέσματα προκύπτουν και από τις διαφορές μεταξύ των πρωτοκόλλων όσον αφορά την εφαρμογή της μεθόδου, όπως τον χρόνο και τον τρόπο διέγερσης, καθώς και από την υποκειμενικότητα κατά την ανάλυση [316, 318]. Η αυτοματοποίηση, σε όλα τα στάδια της εφαρμογής της μεθόδου και της ανάλυσης των αποτελεσμάτων, αυξάνει την ταχύτητα και συμβάλλει στην προτυποποίηση της μεθόδου, έτσι ώστε να είναι κατάλληλη για κλινικές μελέτες ευρείας κλίμακας, που αφορούν την ανοσιακή απάντηση σε ιικά αντιγόνα [319]. Εναλλακτικές μέθοδοι (π.χ. magnetic assisted cell sorting, MACS, ή gel microdrop, GMD, secretion assay), που προσδιορίζουν κυτταροκίνες σε ζωντανά κύτταρα, αντί για μονιμοποιημένα, επεκτείνουν τις εφαρμογές της κυτταρομετρίας στη μελέτη της λειτουργίας των κυττάρων [299, 316, 320]. Συνοπτικά, ο προσδιορισμός των ενδοκυττάριων κυτταροκινών με κυτταρομετρία ροής παρουσιάζει τα εξής στάδια: 1) διέγερση των κυττάρων, με σύγχρονη προσθήκη ενός αναστολέα έκκρισης κυτταροκινών, 2) επώαση των κυττάρων με τα ειδικά για τα επιφανειακά αντιγόνα σημασμένα μονοκλωνικά 89

90 αντισώματα, 3) μονιμοποίηση των κυττάρων, 4) αύξηση της διαπερατότητας (permeabilization) των κυττάρων, 5) επώαση των κυττάρων με τα ειδικά για τις κυτταροκίνες σημασμένα μονοκλωνικά αντισώματα, 6) ανάλυση στον κυτταρομετρητή ροής με τη βοήθεια των κατάλληλων προτύπων ελέγχου (controls) [299, 316, 321]. Αναλυτικά, τα στάδια για τον προσδιορισμό των ενδοκυττάριων κυτταροκινών περιλαμβάνουν: Επιλογή των προς ανάλυση κυττάρων Οι κυτταροκίνες παράγονται από διάφορα κύτταρα, όπως λεμφοκύτταρα, βασεόφιλα πολυμορφοπύρηνα, εωσινόφιλα πολυμορφοπύρηνα, αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (όπως μονοκύτταρα και δενδριτικά κύτταρα), ινοβλάστες. Οι περισσότερες μελέτες προσδιορισμού ενδοκυττάριων κυτταροκινών αφορούν τα λεμφοκύτταρα. Τα περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος διαχωρίζονται μετά από φυγοκέντρηση σε διάλυμα βαθμιδωτής συγκέντρωσης (Ficoll Hypaque). Νεότερες μέθοδοι χρησιμοποιούν ολικό αίμα [317, ]. Ο προσδιορισμός των ενδοκυττάριων κυτταροκινών σε ολικό αίμα αποτελεί μια ευκολότερη και λιγότερο χρονοβόρα διαδικασία, που διατηρεί τα λεμφοκύτταρα, μέχρι την επεξεργασία τους, σε περιβάλλον σχεδόν όμοιο με το in vivo. Η κυτταρομετρία ροής δίνει τη δυνατότητα ανάλυσης των λεμφοκυττάρων μικτών κυτταρικών πληθυσμών, όπως στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, χωρίς να απαιτείται προηγούμενος διαχωρισμός ή καλλιέργεια in vitro των κυττάρων [299]. Διέγερση των κυττάρων Η σύνθεση και η παραγωγή των κυτταροκινών δεν είναι γενικά σταθερή και μόνο ένα μικρό μέρος των κυττάρων, που λαμβάνονται ex vivo, σημαίνονται για ενδοκυττάριες κυτταροκίνες. Αυτό παρατηρείται και όταν τα κύτταρα προέρχονται από θέση ενεργού φλεγμονής. Πιθανά αίτια αυτού του φαινομένου είναι η κινητική της διέγερσης των κυττάρων και η μη ταυτόχρονη παραγωγή κυτταροκινών από αυτά. Για τον λόγο αυτό είναι αναγκαία η διέγερση των Τ λεμφοκυττάρων, με πολυκλωνικό διεγέρτη (π.χ. phorbol myristate acetate και ionomycin, phytohemagglutinin, anti CD3 και anti CD28, σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Β) ή, αν είναι γνωστή η ειδικότητα των κυττάρων, με το ειδικό αντιγόνο που παρουσιάζεται από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Ο συνδυασμός των διεγερτών phorbol myristate acetate (PMA) και ionomycin προκαλεί ισχυρή διέγερση των κυττάρων, μέσω ενεργοποίησης της πρωτεϊνικής κινάσης C και αύξησης του 90

91 ενδοκυττάριου ασβεστίου, αντίστοιχα. Η phytohemagglutinin (PHA) αποτελεί πολυκλωνικό διεγέρτη του TCR, ενώ τα υπεραντιγόνα, όπως η σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Β (SEB), ενεργοποιούν όλα τα Τ λεμφοκύτταρα, που διαθέτουν TCR με συγκεκριμένους τύπους β αλύσου. Σε μερικές περιπτώσεις, προηγείται πολλαπλασιασμός των κυττάρων παρουσία IL 2 και IL 4, για τρεις ημέρες, και στη συνέχεια γίνεται διέγερση με PMA και ionomycin. Η χρονική στιγμή της διέγερσης, όταν έχουν προηγηθεί άλλοι διεγέρτες, έχει μεγάλη σημασία, καθώς τα Τ λεμφοκύτταρα δεν απαντούν σε νέα ερεθίσματα, όταν είναι ήδη διεγερμένα (refractory phase) [55, 299, 316]. Η επιλογή του διεγέρτη εξαρτάται από τον σκοπό της μελέτης. Ένα πολυκλωνικό ερέθισμα, σε αντίθεση με ένα ειδικό αντιγόνο, μπορεί να προκαλέσει τη σύνθεση ευρύτερου φάσματος κυτταροκινών. Το είδος του ερεθίσματος επηρεάζει τους επιφανειακούς κυτταρικούς δείκτες και την κινητική της σύνθεσης των κυτταροκινών [324]. Σημαντική είναι η σχέση των ευρημάτων με τα in vivo χαρακτηριστικά των κυττάρων. Οι φαινότυποι των Τ λεμφοκυττάρων μετά από διέγερση με PMA και ionomycin φαίνεται ότι αντιπροσωπεύουν καλύτερα τη φυσιολογική προγραμματισμένη δυνατότητα παραγωγής κυτταροκινών [302, 308]. Προετοιμασία και επώαση των κυττάρων Το κυτταρικό εναιώρημα (περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος, ολικό αίμα, βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, κ.ά.) ετοιμάζεται σε μέσο RPMI 1640 με 10% ορό και συνήθη συμπληρώματα, για να επιτευχθεί κυτταρική συγκέντρωση 1 10x10 6 κύτταρα/ml. Για τον προσδιορισμό των περισσότερων κυτταροκινών, τα κύτταρα επωάζονται με τον διεγέρτη και τον αναστολέα έκκρισης των κυτταροκινών για 4 6 ώρες στους 37 ο C, σε ατμόσφαιρα 5% CO 2. Ο χρόνος επώασης εξαρτάται από τον διεγέρτη και την προσδιοριζόμενη κυτταροκίνη. Η κινητική ενδοκυττάριας σύνθεσης κυτταροκινών κυμαίνεται σημαντικά, ως προς τον χρόνο εμφάνισης της μέγιστης τιμής και ως προς τον ρυθμό ελάττωσής της. Η διέγερση με PMA και ionomycin, σε συγκεντρώσεις από 10 50ng/mL και ng/ml αντίστοιχα, προκαλεί κυτταρικό θάνατο, που αυξάνεται σε παρατεταμένη διέγερση των κυττάρων, πέραν των 24 ωρών. Σημαντική απώλεια των περισσότερο ενεργοποιημένων κυττάρων επηρεάζει την ακρίβεια των αποτελεσμάτων και δημιουργεί δυσχέρειες στην ανάλυση, λόγω απελευθέρωσης του DNA και εγκλωβισμού των κυττάρων σε σωρούς. Ειδικό αντιδραστήριο (DNase I) χρησιμοποιείται για τη διάσπαση του DNA και την ελάττωση των κυτταρικών σωρών. 91

92 Σε περίπτωση διέγερσης των κυττάρων με άλλους διεγέρτες, πολυκλωνικούς ή μη, τροποποιείται ο χρόνος διέγερσης. Στην περίπτωση χρήσης υπεραντιγόνων (π.χ.seb) ή ειδικών αντιγόνων, είναι αναγκαία η παρουσία αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων [299, 307, 316]. Αναστολή έκκρισης των κυτταροκινών Η αναστολή της έκκρισης των κυτταροκινών εξωκυττάρια και η άθροισή τους ενδοκυττάρια επιτυγχάνεται με προσθήκη brefeldin A (10 μg/ml) ή monensin, ταυτόχρονα με τον διεγέρτη ή τις τελευταίες 4 6 ώρες της καλλιέργειας των κυττάρων, στις περιπτώσεις πρωτοκόλλων με μεγαλύτερη περίοδο επώασης. Κατά τον προσδιορισμό ενδοκυττάριων κυτταροκινών σε αντιγονοειδικά Τ λεμφοκύτταρα, η brefeldin A προστίθεται μετά την πρώτη ώρα διέγερσης, έτσι ώστε να είναι δυνατή η επεξεργασία του αντιγόνου από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα [299, 316, 325]. Οι δύο αυτοί αναστολείς δρουν στην περιοχή πριν τη συσκευή Golgi (brefeldin A) ή στη συσκευή Golgi (monensin). Και οι δύο αναστολείς είναι τοξικοί για τα κύτταρα, όταν παρατείνεται η παραμονή τους στην καλλιέργεια πάνω από ώρες. Το είδος του αναστολέα έκκρισης επηρεάζει την ανάλυση, καθώς η brefeldin A φαίνεται να πλεονεκτεί ως προς τη μικρότερη τοξικότητα, την αποτελεσματική ενδοκυττάρια δέσμευση των κυτταροκινών και την ανάλυση του CD4 + υποπληθυσμού των λεμφοκυττάρων [326, 327]. Προσδιορισμός των επιφανειακών δεικτών Οι κλασικοί επιφανειακοί δείκτες, όπως CD3, CD4, CD8, αλλά και άλλοι, συσχετίζονται με διαφορετικά επίπεδα παραγωγής κυτταροκινών. Η σήμανση των επιφανειακών δεικτών είναι προτιμότερο να γίνεται πριν τη μονιμοποίηση των κυττάρων, διότι ενδέχεται να καταστραφούν οι αντιγονικοί τους επίτοποι με τη μονιμοποίηση και την αύξηση της διαπερατότητας των κυττάρων. Ο προσδιορισμός του φαινοτύπου επιφανείας των διεγερμένων Τ λεμφοκυττάρων δεν είναι πάντα εφικτός, δεδομένου ότι ορισμένοι επιφανειακοί δείκτες ελαττώνονται λόγω της διέγερσης. Το φαινόμενο αυτό παρατηρείται έντονα κατά τη διέγερση των κυττάρων με PMA και ionomycin, οπότε προκαλείται ενδοκυττάρωση και ελάττωση της έκφρασης κυρίως του δείκτη CD4, αλλά και άλλων δεικτών, όπως CD3 και CD8. Η σήμανση του CD4 υποδοχέα, μετά τη διέγερση, εξαρτάται έντονα από τον κλώνο που θα χρησιμοποιηθεί. Ο προσδιορισμός των CD4 + λεμφοκυττάρων γίνεται εναλλακτικά, με απομόνωση των CD3 + T λεμφοκυττάρων και μελέτη των CD8 92

93 λεμφοκυττάρων, ή με διαχωρισμό των CD4 + T λεμφοκυττάρων, πριν την ενεργοποίηση [299, 316]. Μονιμοποίηση και αύξηση της διαπερατότητας Με τη μονιμοποίηση επιτυγχάνεται ακινητοποίηση των κυτταροκινών ενδοκυττάρια. Η μονιμοποίηση με φορμαλδεΰδη διατηρεί την αντιγονικότητα των κυτταροκινών και τα χαρακτηριστικά σκέδασης των κυττάρων, με αποτέλεσμα να μην αυξάνει έντονα τον αυτοφθορισμό. Μετά τη μονιμοποίηση τα κύτταρα μπορούν να διατηρηθούν και να υποστούν την υπόλοιπη επεξεργασία σε δεύτερο χρόνο. Η αύξηση της διαπερατότητας των κυττάρων γίνεται με σαπωνίνη, που δεν τροποποιεί έντονα τα κυτταρικά χαρακτηριστικά, για να δημιουργηθεί αυτοφθορισμός. Η μονιμοποίηση και η αύξηση της διαπερατότητας μπορούν να γίνουν συγχρόνως με έτοιμα εμπορικά διαλύματα [299, 302]. Σήμανση των ενδοκυττάριων κυτταροκινών Η άμεση σήμανση των ενδοκυττάριων κυτταροκινών, με μονοκλωνικά αντισώματα συζευγμένα με φθοριοχρώματα, δημιουργεί ασθενέστερο μη ειδικό φθορισμό (background) και είναι πιο εύκολη από την έμμεση. Τα μονοκλωνικά αντισώματα, που χρησιμοποιούνται για την ενδοκυττάρια σήμανση των κυτταροκινών, είναι συνήθως συζευγμένα με τα φθοριοχρώματα PE και FITC, και λιγότερο συχνά με APC και βιοτίνη. Τα PE συζευγμένα μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιούνται για κυτταροκίνες με ασθενές σήμα, όπως η IL 4, γιατί παρουσιάζουν τον υψηλότερο λόγο σήματος προς θόρυβο [299, 316]. Ποιοτικός έλεγχος Για την αξιολόγηση της μεθόδου σημαντική είναι η χρήση θετικών και αρνητικών προτύπων ελέγχου (controls). Το θετικό πρότυπο ελέγχου μπορεί να προέρχεται από μονιμοποιημένα διεγερμένα κύτταρα που διατίθενται στο εμπόριο, ή από κυτταρικές σειρές που παράγουν γνωστή κυτταροκίνη. Το αρνητικό πρότυπο έχει ως στόχο τον έλεγχο της ειδικότητας της μεθόδου, καθώς τόσο η μονιμοποίηση όσο και η αύξηση της διαπερατότητας αυξάνουν τον αυτοφθορισμό των κυττάρων και τη μη ειδική σύνδεση των αντισωμάτων. Η μη ειδική σύνδεση ελαττώνεται με την προσεκτική τιτλοποίηση της συγκέντρωσης των μονοκλωνικών αντισωμάτων, με τον αποκλεισμό των Fc υποδοχέων και με τη χρήση BSA ή άλλων πρωτεϊνών. Ο έλεγχος της ειδικότητας της σύνδεσης των μονοκλωνικών αντισωμάτων δεν είναι τόσο αποτελεσματικός με τη χρήση ισοτυπικών προτύπων, διότι 93

94 παρουσιάζουν συχνά διαφορές μεταξύ τους, ως προς τον βαθμό μη ειδικής σύνδεσης. Διάφοροι τρόποι αρνητικού ποιοτικού ελέγχου έχουν αναπτυχθεί (π.χ. επώαση των μονοκλωνικών αντισωμάτων με περίσσεια της αντίστοιχης κυτταροκίνης, επώαση των κυττάρων με περίσσεια μη συζευγμένου μονοκλωνικού αντισώματος έναντι της κυτταροκίνης). Η ειδικότητα των αντισωμάτων επιβεβαιώνεται με την ανεύρεση παρόμοιων ποσοστών θετικών κυττάρων για την ίδια κυτταροκίνη, μετά από σήμανση με διαφορετικά αντισώματα [299, 302, 316]. Ανάλυση Η εφαρμογή κυτταρομετρίας ροής τριπλού ή τετραπλού φθορισμού, για τον ενδοκυττάριο προσδιορισμό κυτταροκινών, δε διαφέρει, ως προς τον τρόπο ανάλυσης, από τη συμβατική μέθοδο για τον προσδιορισμό επιφανειακών δεικτών. Πριν την ανάλυση, είναι αναγκαία η διόρθωση της φασματικής επικάλυψης των φθοριοχρωμάτων (compensation). Δεδομένου ότι η μονιμοποίηση και η αύξηση της διαπερατότητας τροποποιούν τα σκεδαστικά χαρακτηριστικά των κυττάρων, τα χαρακτηριστικά αυτά πρέπει να ελέγχονται μετά την οριοθέτηση των κυττάρων βάσει του φθορισμού (backgating). Η μέτρηση και ανάλυση πολλών γεγονότων (>20,000 40,000) ενδείκνυται για τον προσδιορισμό μικρών κυτταρικών πληθυσμών (π.χ. IL 4 + κυττάρων). Ιδανικές συνθήκες διέγερσης εξασφαλίζουν καλό διαχωρισμό των θετικών από τα αρνητικά κύτταρα, ως προς την έκφραση μίας κυτταροκίνης, τα οποία κατανέμονται σε διακριτούς πληθυσμούς στα ιστογράμματα και στα κυτταρογράμματα [299]. 94

95 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 95

96 96

97 ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της διατριβής είναι: 1. Η προσαρμογή, η προετοιμασία και η εφαρμογή της μεθόδου προσδιορισμού των ενδοκυττάριων κυτταροκινών με χρήση κυτταρομετρίας ροής σε κύτταρα των κυτταρικών πληθυσμών και υποπληθυσμών του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος 2. Η εφαρμογή της παραπάνω μεθόδου της κυτταρομετρίας ροής, καθώς και της αντίστοιχης με σήμανση της κυτταρικής επιφάνειας, για τον προσδιορισμό των ανοσοφαινοτύπων των λεμφοκυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του περιφερικού αίματος σε ασθενείς με πνευμονική σαρκοείδωση 3. Η μελέτη της συχνότητας των λεμφοκυτταρικών πληθυσμών και υποπληθυσμών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα, σε ασθενείς με πνευμονική σαρκοείδωση, σε διαφορετικά στάδια της νόσου 4. Η συγκριτική μελέτη των αναλογιών των υποπληθυσμών των Τ λεμφοκυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα, στους παραπάνω ασθενείς, για τον έλεγχο της διαμερισματοποίησης της λεμφοκυτταρικής απάντησης 5. Η συγκριτική μελέτη των Τ Η 1/Τ Η 2 και T C 1/T C 2 φαινοτύπων των Τ λεμφοκυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα, στους παραπάνω ασθενείς 6. H ανάδειξη διαφορών μεταξύ ασθενών με σαρκοείδωση διαφορετικής πρόγνωσης 7. Η σύγκριση των ευρημάτων της ομάδας της σαρκοείδωσης με τα αντίστοιχα ομάδας φυσιολογικών μαρτύρων και ομάδας ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία (κοκκιωματώδης νόσος, γνωστής στις περισσότερες περιπτώσεις αιτιολογίας) Για το σκοπό αυτό: 1. Προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα ασθενών με πνευμονική σαρκοείδωση η εκατοστιαία αναλογία και ο απόλυτος αριθμός των CD4 +, CD8 +, CD16/56 + Τ και inkt λεμφοκυττάρων 97

98 τα ποσοστά των CD4 + και CD8 + Τ λεμφοκυττάρων που εκφράζουν ενδοκυττάρια τις κυτταροκίνες IL 2, TNF α, IFN γ, IL 4 και IL 13, 2. Προσδιορίστηκαν οι παραπάνω παράμετροι στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία στο περιφερικό αίμα φυσιολογικών μαρτύρων 3. Αναζητήθηκαν πιθανές διαφορές στους λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς και στην ενδοκυττάρια έκφραση κυτταροκινών μεταξύ του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του περιφερικού αίματος στους ασθενείς με πνευμονική σαρκοείδωση 4. Συγκρίθηκαν και συσχετίστηκαν τα ποσοστά ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στους CD4 + και CD8 + λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του περιφερικού αίματος στους ασθενείς με πνευμονική σαρκοείδωση 5. Αναζητήθηκαν πιθανές διαφορές στα ποσοστά ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών και στους λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς, μεταξύ των ασθενών με πνευμονική σαρκοείδωση σταδίου I και σταδίων II IV 6. Συγκρίθηκαν τα ευρήματα των ασθενών με σαρκοείδωση, με τα ευρήματα των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία και των φυσιολογικών μαρτύρων 98

99 ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1. Ασθενείς Μελετήθηκαν είκοσι (20) ασθενείς με πνευμονική σαρκοείδωση, έξι (6) ασθενείς με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία (HSP) και δέκα (10) φυσιολογικοί μάρτυρες. Από τους ασθενείς λήφθηκε βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και περιφερικό αίμα για διαγνωστικούς λόγους, ενώ από τους φυσιολογικούς μάρτυρες μόνο περιφερικό αίμα. Οι μάρτυρες δεν ανέφεραν στο ιστορικό τους διαταραχή της αναπνευστικής λειτουργίας, αυτοάνοσο νόσημα ή ατοπία, και δε λάμβαναν φαρμακευτική αγωγή. Η διάγνωση στους ασθενείς τέθηκε βάσει του ατομικού ιστορικού και των συμβατών κλινικοεργαστηριακών ευρημάτων [11]. Ειδικότερα, από τους είκοσι ασθενείς με πνευμονική σαρκοείδωση, στους δεκαεννιά (19) τέθηκε για πρώτη φορά η διάγνωση της νόσου και δε λάμβαναν θεραπεία, ενώ ο ένας ασθενής έπασχε από διετίας και βρισκόταν υπό αγωγή με κορτικοστεροειδή. Σε επτά (7) ασθενείς η διάγνωση της νόσου ήταν επιβεβαιωμένη, στους τρεις (3) ιστολογικά και στους τέσσερις (4) με σπινθηρογράφημα με 67 Ga. Από τους υπόλοιπους δεκατρείς (13) ασθενείς, στους δέκα (10) ο λόγος CD4/CD8 στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ήταν υψηλότερος από 4, γεγονός που ενίσχυε τη διάγνωση [222]. Βάσει της ακτινολογικής εικόνας, δέκα (10) ασθενείς βρίσκονταν στο στάδιο Ι της νόσου (αμφοτερόπλευρη πυλαία λεμφαδενοπάθεια), εννιά (9) στο στάδιο ΙΙ (αμφοτερόπλευρη πυλαία λεμφαδενοπάθεια και δικτυοζώδεις πνευμονικές διηθήσεις) ή ΙΙΙ (μόνο πνευμονικές διηθήσεις), και ένας (1) ασθενής στο στάδιο ΙV (πνευμονική ίνωση). Τα χαρακτηριστικά των ασθενών και των φυσιολογικών μαρτύρων που μελετήθηκαν παρουσιάζονται στους πίνακες 1 και Μεθοδολογία 2.1. Λήψη βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος Η λήψη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος γινόταν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Πνευμονολογίας [202]. Μετά την εισαγωγή εύκαμπτου ινοβρογχοσκοπίου (τύπου Pentax 5.6 mm, Japan) και την ενσφήνωσή του σε βρόγχο της προς έλεγχο περιοχής του πνευμονικού παρεγχύματος, γινόταν έγχυση 200 ml συνολικά φυσιολογικού 99

100 ορού (4x50 ml). Μετά από κάθε έγχυση, γινόταν αναρρόφηση του εκπλύματος και συλλογή του σε αποστειρωμένα, πλαστικά δοχεία μίας χρήσης. Τα δείγματα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος φυλάσσονταν στους 5 8 ο C μέχρι την επεξεργασία τους Λήψη αίματος Η συλλογή του φλεβικού αίματος γινόταν σε σωληνάρια με EDTA, για τον προσδιορισμό των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών, και σε σωληνάρια με νατριούχο ηπαρίνη, για τον προσδιορισμό των ενδοκυττάριων κυτταροκινών και των inkt λεμφοκυττάρων. Τα δείγματα αίματος φυλάσσονταν σε θερμοκρασία δωματίου, στο σκοτάδι, μέχρι την επεξεργασία τους Προετοιμασία των δειγμάτων Η προετοιμασία των δειγμάτων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του αίματος γινόταν εντός 24 ωρών από τη λήψη τους. Μετά τη διήθηση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος από αποστειρωμένη γάζα, γινόταν μέτρηση του όγκου του και στη συνέχεια φυγοκέντρηση σε 500g για 10 λεπτά (φυγόκεντρος Beckman Model TJ 6 Centrifuge). Το ίζημα μετά από δύο πλύσεις με RPMI 1640 medium, επανεναιωρούνταν σε RPMI 1640 medium. Ο αριθμός των κυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του αίματος, καθώς και ο λευκοκυτταρικός τύπος του αίματος προσδιοριζόταν σε αιματολογικό αναλυτή (Sysmex K 4500, Roche, Kobe, Japan) Προετοιμασία των κυτταρικών παρασκευασμάτων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος για τον προσδιορισμό του κυτταρικού τύπου Τα κυτταρικά παρασκευάσματα παρασκευάζονταν με κυτταροφυγοκέντρηση του κυτταρικού εναιωρήματος σε κυτταροφυγόκεντρο (Cytospin 2, Shandon, Astmoor, Runcorn, Cheshire, UK) και χρώση των κυττάρων με May Grünwald Giemsa Σήμανση των δεικτών επιφανείας των κυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος Το κυτταρικό εναιώρημα εργασίας του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος διαμοιραζόταν σε κλάσματα των 100μL και τοποθετούνταν σε σωληνάρια πολυστυρενίου των 5 ml (Falcon tubes, Becton Dickinson (BD) Biosciences, San Jose, CA, USA). Η επώαση με τα μονοκλωνικά αντισώματα (MoAbs) γινόταν επί 100

101 20 στο σκοτάδι. Για τη σήμανση των δεικτών επιφανείας CD45, CD23, CD3, CD19, CD16/56, CD4, CD8 και Vα24 JαQ χρησιμοποιούνταν αντίστοιχα τα εξής μονοκλωνικά αντισώματα: CD45 PerCP, CD23 PE, CD3 FITC ή CD3 PE, CD19 PE, CD16+56 PE, CD4 PE, CD8 PE, 6B11 FITC (BD Biosciences). Σε κάθε μέτρηση χρησιμοποιούνταν ισοτυπικό πρότυπο ελέγχου (isotype control) συνδεμένο με FITC/PE (BD Biosciences), ως αρνητικός μάρτυρας. Μετά την επώαση με τα μονοκλωνικά αντισώματα γινόταν λύση των ερυθρών με πρόσθεση 2 ml FACS Lysing Solution (BD Biosciences) και παραμονή σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Ακολουθούσε φυγοκέντρηση σε 500g για 5 λεπτά, πλύσιμο του ιζήματος με 2 ml FACSFlow ανά σωληνάριο (BD Biosciences) και επανεναιώρηση των κυττάρων σε τελικό όγκο 500μL Σήμανση των δεικτών επιφανείας των μειζόνων λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών και των inkt λεμφοκυττάρων του αίματος Το ολικό αίμα, που συλλεγόταν με EDTA ή νατριούχο ηπαρίνη, διαμοιραζόταν σε κλάσματα των 100μL και τοποθετούνταν σε σωληνάρια πολυστυρενίου των 5 ml (Falcon tubes, BD Biosciences). Ακολούθως γινόταν επώαση με μονοκλωνικά αντισώματα επί 20 λεπτά στο σκοτάδι. Για τη σήμανση των δεικτών επιφανείας CD45, CD14, CD3, CD19, CD16/56, CD4, CD8 και Vα24 JαQ χρησιμοποιούνταν αντίστοιχα τα παρακάτω μονοκλωνικά αντισώματα: CD45 FITC ή CD45 PerCP, CD14 PE, CD3 FITC ή CD3 PE, CD19 PE, CD16+56 PE, CD4 PE, CD8 PE, 6B11 FITC (BD Biosciences). Σε κάθε μέτρηση χρησιμοποιούνταν ισοτυπικό πρότυπο ελέγχου (isotype control) συνδεμένου με FITC/PE (BD Biosciences), ως αρνητικός μάρτυρας. Μετά την επώαση με τα μονοκλωνικά αντισώματα γινόταν λύση των ερυθρών με πρόσθεση 2 ml FACS Lysing Solution (BD Biosciences) και παραμονή σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Ακολουθούσε φυγοκέντρηση σε 500g για 5 λεπτά, πλύσιμο του ιζήματος με 2 ml FACSFlow ανά σωληνάριο (BD Biosciences) και επανεναιώρηση των κυττάρων σε τελικό όγκο 1 ml In vitro διέγερση του ολικού αίματος και του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος Αρχικά γινόταν αραίωση με RPMI 1640 του ολικού αίματος και του κυτταρικού εναιωρήματος του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος σε τελική συγκέντρωση των κυττάρων 2x10 6 /ml, με εξαίρεση τα δείγματα 101

102 βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος με χαμηλή κυτταροβρίθεια (<2x10 6 /ml). Στη συνέχεια τα αραιωμένα δείγματα διαμοιράζονταν σε δύο ή και τρία μέρη (εφόσον χρησιμοποιούνταν και πρότυπο ελέγχου ενεργοποίησης), και τοποθετούνταν σε σωληνάρια πολυστυρενίου. Στο πρώτο σωληνάριο γινόταν προσθήκη 25 ng/ml phorbol myristate acetate (PMA, Sigma Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA), 1 μg/ml ionomycin (Sigma) και 10 μg/ml brefeldin A (Sigma). Στο δεύτερο σωληνάριο γινόταν προσθήκη 10 μg/ml brefeldin A και το δείγμα αυτό αποτελούσε το μη διεγερμένο πρότυπο ελέγχου της πιθανής in vivo ενεργοποίησης των λεμφοκυττάρων. Στο τρίτο σωληνάριο γινόταν προσθήκη 25 ng/ml PMA και 1 μg/ml ionomycin και το δείγμα αυτό αποτελούσε το πρότυπο ελέγχου ενεργοποίησης. Όλα τα κυτταρικά δείγματα επωάζονταν στους 37 ο C σε κλίβανο με 5% CO 2 για τέσσερις ώρες. Μετά την επώαση γινόταν λύση των ερυθρών και μονιμοποίηση των κυττάρων με πρόσθεση 2 ml FACS Lysing Solution και παραμονή σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Ακολουθούσε φυγοκέντρηση σε 500g για 5 λεπτά, πλύσιμο του ιζήματος μία φορά με κρύο phosphate buffered saline (PBS) και επανεναιώρηση των κυττάρων σε 2mL PBS με 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) και 1% bovine serum albumin (BSA, Sigma). Στη συνέχεια τα δείγματα αποθηκεύονταν στους 70 ο C μέχρι την ανάλυση Αύξηση της διαπερατότητας των κυττάρων και σήμανση Μετά την απόψυξη των διεγερμένων δειγμάτων, των μη διεγερμένων προτύπων ελέγχου (unstimulated controls) και των προτύπων ελέγχου ενεργοποίησης σε θερμοκρασία δωματίου, γινόταν φυγοκέντρηση και πλύσιμο των δειγμάτων μία φορά με FACSFlow. Ακολουθούσε επανεναιώρηση των κυττάρων σε FACSFlow και προσθήκη των κυτταρικών εναιωρημάτων ανά 100μL σε σωληνάρια πολυστυρενίου (Falcon tubes). Στη συνέχεια γινόταν επώαση με μονοκλωνικά αντισώματα για 15 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Για τη σήμανση των δεικτών επιφανείας των λεμφοκυττάρων που διεγέρθηκαν, των μη διεγερμένων προτύπων ελέγχου και του προτύπου ελέγχου ενδοκυττάριας σήμανσης χρησιμοποιούνταν αντίστοιχα τα παρακάτω μονοκλωνικά αντισώματα: CD45 APC, CD3 PerCP, CD4 FITC multiclone, CD8 FITC (BD Biosciences). Για τη σήμανση των δεικτών επιφανείας των κυττάρων του προτύπου ελέγχου 102

103 ενεργοποίησης χρησιμοποιούνταν τα μονοκλωνικά αντισώματα CD45 APC, CD3 PerCP και CD69 PE (BD Biosciences). Μετά την επώαση, ακολουθούσε πλύσιμο των κυττάρων του προτύπου ελέγχου ενεργοποίησης με FACSFlow και επανεναιώρηση του ιζήματος σε 500μL FACSFlow. Στα υπόλοιπα δείγματα γινόταν προσθήκη 500μL permeabilizing solution ανά σωληνάριο (permeabilizing solution 2, BD Biosciences) και επώαση για 10 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου, προκειμένου να αυξηθεί η διαπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης. Ακολουθούσε πλύσιμο με FACSFlow και φυγοκέντρηση (500g για 5 λεπτά). Στη συνέχεια γινόταν επώαση των κυττάρων για 30 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου, με τα παρακάτω μονοκλωνικά αντισώματα ενδοκυττάριων κυτταροκινών: αντι IL 2 PE, αντι TNF α PE, αντι IFN γ PE, αντι IL 4 PE και αντι IL 13 PE (BD Biosciences). Όσον αφορά το πρότυπο ελέγχου ενδοκυττάριας σήμανσης η επώαση γινόταν με μονοκλωνικό αντίσωμα CD69 PE (BD Biosciences). Μετά την επώαση γινόταν πλύσιμο των κυττάρων με FACSFlow και επανεναιώρηση του ιζήματος σε 500μL FACSFlow Πρότυπα ελέγχου της μεθόδου προσδιορισμού των ενδοκυττάριων κυτταροκινών Για κάθε δείγμα αίματος και βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος ενός ασθενούς ή υγιούς μάρτυρα χρησιμοποιούνταν μη διεγερμένα και ισοτυπικά πρότυπα ελέγχου (controls). Για ορισμένα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον πρότυπα ελέγχου ενεργοποίησης, ενώ για κάθε δείγμα αίματος χρησιμοποιούνταν και πρότυπο ελέγχου ενδοκυττάριας σήμανσης: Μη διεγερμένα πρότυπα ελέγχου (unstimulated controls) Χρησιμοποιούνταν για την εκτίμηση πιθανής in vivo ενεργοποίησης των κυττάρων. Η προετοιμασία τους έγινε, όπως ακριβώς και του διεγερμένου δείγματος, με τη διαφορά ότι στη φάση της τετράωρης διέγερσης των κυττάρων τα δείγματα αυτά επωάζονταν μόνο με 10 μg/ml brefeldin A. Ισοτυπικά πρότυπα ελέγχου (isotype controls) Χρησιμοποιούνταν για τον έλεγχο της μη ειδικής σύνδεσης των μονοκλωνικών αντισωμάτων ενδοκυττάριων κυτταροκινών στα κύτταρα. Συγκεκριμένα τα κύτταρα επωάζονταν με μονοκλωνικά αντισώματα του ίδιου ισοτύπου με τα μονοκλωνικά αντισώματα των ενδοκυττάριων κυτταροκινών (BD Biosciences), μετά την αύξηση της διαπερατότητας της κυτταρικής τους μεμβράνης. Πρότυπα ελέγχου ενεργοποίησης (activation controls) 103

104 Με τα συγκεκριμένα πρότυπα προσδιοριζόταν η επιφανειακή έκφραση του μορίου CD69, που αποτελεί δείκτη της πρόσφατης ενεργοποίησης των κυττάρων. Η επιτυχής διέγερση των κυττάρων προϋποθέτει την ανεύρεση περισσότερων από 90% CD69 + /CD3 + T λεμφοκυττάρων. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνταν το μονοκλωνικό αντίσωμα CD69 PE, πριν την αύξηση της διαπερατότητας (permeabilization) των κυττάρων. Πρότυπα ελέγχου ενδοκυττάριας σήμανσης (intracellular staining controls) Με τα παραπάνω πρότυπα προσδιοριζόταν η ενδοκυττάρια έκφραση του CD69, έτσι ώστε να αξιολογηθεί η επιτυχία της αύξησης της διαπερατότητας της κυτταρικής μεμβράνης και η ενδοκυττάρια σήμανση. Η επιτυχία των σταδίων αυτών βεβαιώνεται από τo αυξημένο ποσοστό CD3 + λεμφοκυττάρων (>90%) με ενδοκυττάρια σήμανση του CD69. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνταν επίσης το μονοκλωνικό αντίσωμα CD69 PE, μετά την αύξηση της διαπερατότητας (permeabilization) των κυττάρων Ανάκτηση και ανάλυση των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής Η ανάκτηση και ανάλυση των δεδομένων για τους μείζονες λεμφοκυτταρικούς πληθυσμούς του αίματος, στον κυτταρομετρητή FACSCalibur (BD Biosciences), γινόταν με χρήση του λογισμικού Simulset, ενώ για όλα τα υπόλοιπα δεδομένα με το λογισμικό CellQuest. Ανάλογα με τους επιθυμητούς προσδιορισμούς υπήρχαν διαφοροποιήσεις στα πρωτόκολλα Προσδιορισμός κύριων λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών Η οριοθέτηση (gating) των λεμφοκυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος γινόταν έναντι της πλάγιας σκέδασης και του CD45. Στο αίμα η οριοθέτηση των λεμφοκυττάρων γινόταν έναντι της πρόσθιας και της πλάγιας σκέδασης. Ο έλεγχος της καθαρότητας της οριοθετημένης περιοχής γινόταν με τα μονοκλωνικά αντισώματα CD45 και CD14. Κάθε προσδιορισμός γινόταν με βάση τουλάχιστον 10,000 γεγονότα. Οι άξονες ορίου θετικότητας ορίζονταν με τη βοήθεια των ισοτυπικών προτύπων. Η ρύθμιση της ευαισθησίας του οργάνου, ο έλεγχος των λυχνιών LASERs, η ένταση των φθοριοχρωμάτων και η διόρθωση της επικάλυψης του φάσματος εκπομπής των φθοριοχρωμάτων (compensation) γινόταν με τη χρήση ειδικών σφαιριδίων (CaliBRITE beads, BD Biosciences) και του αντίστοιχου λογισμικού (FACSComp) Προσδιορισμός inkt λεμφοκυττάρων Η οριοθέτηση (gating) των λεμφοκυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του αίματος γινόταν έναντι της πλάγιας σκέδασης και του CD45 104

105 και με βάση 10,000 γεγονότα. Οι άξονες ορίζονταν με τη βοήθεια των ισοτυπικών προτύπων Προσδιορισμός ενδοκυττάριων κυτταροκινών Η οριοθέτηση (gating) των λεμφοκυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του αίματος γινόταν έναντι της πλάγιας σκέδασης και του CD45, αφού προηγούνταν αδρός διαχωρισμός των λεμφοκυττάρων βάσει των σκεδαστικών τους χαρακτηριστικών (πρόσθια και πλάγια σκέδαση). Στη συνέχεια οριοθετούνταν τα CD3 + CD4 + ή CD3 + CD8 + λεμφοκύτταρα και σε αυτά γινόταν προσδιορισμός των θετικών λεμφοκυττάρων για κάθε κυτταροκίνη. Ανάλογα με την κυτταροβρίθεια και τον όγκο του αρχικού δείγματος, γινόταν ανάκτηση διαφορετικού αριθμού γεγονότων (συνήθως 5,000 10,000 στο αίμα και 2,000 10,000 στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα). Οι χαμηλοί αριθμοί ανακτηθέντων κυττάρων οφείλονταν στην απόπτωση, κυρίως λόγω της προηγηθείσας διέγερσης. Οι άξονες ορίζονταν με τη βοήθεια των ισοτυπικών προτύπων. Η θετική απάντηση στη διέγερση υπολογιζόταν με αφαίρεση του ποσοστού των θετικών κυττάρων του ισοτυπικού προτύπου από το ποσοστό των θετικών κυττάρων του διεγερμένου δείγματος. Ανάλυση της ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών γινόταν και μετά από οριοθέτηση υποσυνόλου των διεγερμένων λεμφοκυττάρων με εντονότερη έκφραση του CD45 μορίου. Το όριο που χρησιμοποιούνταν ήταν σταθερό σε όλες τις αναλύσεις, έτσι ώστε τα αποτελέσματα να είναι συγκρίσιμα. Για λόγους πρακτικούς, τα περιφραγμένα λεμφοκύτταρα με εντονότερη έκφραση του CD45 μορίου χαρακτηρίστηκαν ως «CD45 bright». Λόγω του μικρού αριθμού ανακτηθέντων κυττάρων ή ακατάλληλου δείγματος, στην ανάλυση των αποτελεσμάτων δε συμπεριλήφθησαν το σύνολο των ασθενών με σαρκοείδωση και πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία, όπως καταγράφεται στους αντίστοιχους πίνακες με τα αποτελέσματα. 105

106 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ Για τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το πακέτο ανάλυσης στατιστικών δεδομένων SPSS 12.0 for Windows. Τα δεδομένα εκφράζονται με τη διάμεσο, την ελάχιστη και τη μέγιστη τιμή. Για το σύνολο των στατιστικών αναλύσεων χρησιμοποιήθηκαν μη παραμετρικές δοκιμασίες, διότι ορισμένες από τις μετρήσεις δεν ακολουθούσαν κανονική κατανομή. Για τη σύγκριση των δεδομένων μεταξύ των ασθενών με σαρκοείδωση και των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία ή των φυσιολογικών μαρτύρων, χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία Mann Whitney. Η δοκιμασία Wilcoxon matched pairs εφαρμόστηκε στις συγκρίσεις μεταξύ παραμέτρων του ιδίου ασθενούς. Ο έλεγχος των συσχετίσεων πραγματοποιήθηκε με τη δοκιμασία Spearman. Στατιστικά σημαντικό θεωρήθηκε επίπεδο σημαντικότητας (p) μικρότερο του 0.05, σε όλες τις συγκρίσεις, με εξαίρεση της συγκρίσεις στο περιφερικό αίμα μεταξύ των ομάδων των ασθενών και των φυσιολογικών μαρτύρων. Στην περίπτωση αυτή έγινε διόρθωση κατά Bonferroni και στατιστικά σημαντικό θεωρήθηκε επίπεδο σημαντικότητας (p) μικρότερο του

107 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Χαρακτηριστικά ομάδων που μελετήθηκαν Η ηλικία των ασθενών με σαρκοείδωση δε διέφερε σημαντικά από την ηλικία των φυσιολογικών μαρτύρων (διάμεσος τιμή 47.5 στους ασθενείς με σαρκοείδωση και 48 στους φυσιολογικούς μάρτυρες, p=0.86). Διαφορά δεν υπήρχε ως προς την ηλικία και μεταξύ των ασθενών με σαρκοείδωση σταδίου Ι και σταδίων ΙΙ IV (p=0.059). Τα χαρακτηριστικά των ομάδων που μελετήθηκαν παρουσιάζονται στους πίνακες 1 και Ευρήματα στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα από ασθενείς με σαρκοείδωση και από ασθενείς με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία Το ποσοστό των λεμφοκυττάρων που ανευρέθηκε στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με σαρκοείδωση και με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία ήταν υψηλό. Ο λόγος CD4/CD8 του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος ήταν σημαντικά υψηλότερος στη σαρκοείδωση σε σύγκριση με την πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία (p<0.001), ενώ δε διέφερε σημαντικά μεταξύ των ασθενών με σαρκοείδωση σταδίου Ι και σταδίων II IV (p=0.65). Η κυτταροβρίθεια, ο τύπος των κυττάρων και ο λόγος CD4/CD8 στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με πνευμονική σαρκοείδωση, σταδίου Ι και σταδίων II IV, και των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία παρουσιάζονται στους πίνακες 3 και Ευρήματα στο περιφερικό αίμα από ασθενείς με σαρκοείδωση, ασθενείς με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία και φυσιολογικούς μάρτυρες Η συγκέντρωση των λευκών αιμοσφαιρίων στο περιφερικό αίμα, η συγκέντρωση των λεμφοκυττάρων, η εκατοστιαία αναλογία των CD4 + και CD8 + T λεμφοκυττάρων και ο λόγος CD4/CD8 στο περιφερικό αίμα, στους ασθενείς και στους φυσιολογικούς μάρτυρες, παρουσιάζονται στον πίνακα 5. Το ποσοστό των CD4 + T λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των ασθενών με σαρκοείδωση ήταν σημαντικά χαμηλότερο συγκριτικά με το αντίστοιχο του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, σε αντίθεση με το ποσοστό των CD8 + T λεμφοκυττάρων (CD4 + % λεμφοκυττάρων: 82.45% στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα vs 38% στo περιφερικό αίμα p<0.001, CD8 + % λεμφοκυττάρων: 10.89% στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα vs 22% στο περιφερικό αίμα p<0.001). Αντίστοιχα, ο λόγος CD4/CD8 ήταν σημαντικά υψηλότερος στο 107

108 βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με σαρκοείδωση, συγκριτικά με το περιφερικό αίμα (CD4/CD8: 7.73 στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα vs 1.79 στο περιφερικό αίμα p<0.001). 4. Ευρήματα στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα σχετικά με τους υποπληθυσμούς των CD16/56 + T και inkt λεμφοκυττάρων Η εκατοστιαία αναλογία των CD16/56 + T και inkt επί των λεμφοκυττάρων και η συγκέντρωσή τους, στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα, των ασθενών με σαρκοείδωση, των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία και των φυσιολογικών μαρτύρων, παρουσιάζονται στους πίνακες 6 και Ασθενείς με σαρκοείδωση: βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα vs περιφερικό αίμα Σημαντικά χαμηλότερη ήταν η εκατοστιαία αναλογία των CD16/56 + T λεμφοκυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα σε σύγκριση με το περιφερικό αίμα, στους ασθενείς με σαρκοείδωση (2.91% στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα vs 8% στο περιφερικό αίμα p<0.001). Αντίθετα, σημαντικά υψηλότερη ήταν η εκατοστιαία αναλογία των inkt λεμφοκυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα συγκριτικά με το περιφερικό αίμα των ασθενών με σαρκοείδωση (0.59% vs 0% p<0.001). 4.2 Ασθενείς με σαρκοείδωση σταδίου Ι vs σταδίων II IV Στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στο ποσοστό και τη συγκέντρωση των CD16/56 + T και inkt λεμφοκυττάρων, μεταξύ των ασθενών με σαρκοείδωση σταδίου Ι και σταδίων II IV. Στο περιφερικό αίμα ανευρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στο ποσοστό και τη συγκέντρωση των inkt λεμφοκυττάρων μεταξύ των ασθενών σταδίου Ι και σταδίων II IV (0.06% στο στάδιο Ι vs 0% στα στάδια II IV p=0.041, 0.99/μL στο στάδιο Ι vs 0/μL στα στάδια II IV p=0.041). Διαφορές δεν παρατηρήθηκαν ως προς τα CD16/56 + T λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος. 4.3 Ασθενείς με σαρκοείδωση vs ασθενείς με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία Δεν ανευρέθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές, τόσο στα ποσοστά όσο και στις συγκεντρώσεις, των CD16/56 + T και inkt λεμφοκυττάρων, στο 108

109 βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα, μεταξύ των ασθενών με σαρκοείδωση και των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία. 4.4 Ασθενείς με σαρκοείδωση vs φυσιολογικοί μάρτυρες Η εκατοστιαία αναλογία και η συγκέντρωση των CD16/56 + T λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα δε διέφερε σημαντικά στους ασθενείς με σαρκοείδωση σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς μάρτυρες. Σημαντικά χαμηλότερη ήταν μόνο η συγκέντρωση των inkt λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των ασθενών με σαρκοείδωση συγκριτικά με τους φυσιολογικούς μάρτυρες (0/μL vs 2.25/μL p=0.011), ενώ οριακά σημαντική ήταν η διαφορά στην εκατοστιαία αναλογία των inkt λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα μεταξύ των δύο ομάδων (p=0.025). 5. Ευρήματα από τη μελέτη της ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στα CD4 + και CD8 + T λεμφοκύτταρα, στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα Τα ποσοστά ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στα CD4 + και CD8 + T λεμφοκύτταρα, μετά από διέγερση και χωρίς διέγερση, στις ομάδες που μελετήθηκαν, παρουσιάζονται στους πίνακες Στους πίνακες παρατίθενται τα ποσοστά ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στα διεγερμένα CD4 + και CD8 + T λεμφοκύτταρα, μετά από οριοθέτηση των «CD45 bright» λεμφοκυττάρων. Μετά την ενότητα των γραφημάτων παρατίθενται αντιπροσωπευτικές εικόνες από τον προσδιορισμό ενδοκυττάριων κυτταροκινών σε δείγματα βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και περιφερικού αίματος ενός ασθενούς. 5.1 Ασθενείς με σαρκοείδωση: λεμφοκύτταρα βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος vs περιφερικού αίματος Τα μη διεγερμένα CD4 + και CD8 + T λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του περιφερικού αίματος δεν παρουσίαζαν σημαντικές διαφορές ως προς την έκφραση ενδοκυττάριων κυτταροκινών, με εξαίρεση την IL 13, που ήταν σημαντικά αυξημένη στα μη διεγερμένα CD8 + T λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (p=0.043). Σημαντικά αυξημένα ποσοστά έκφρασης IFN γ παρατηρήθηκαν στα διεγερμένα CD4 + T λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος σε σύγκριση με το περιφερικό αίμα (58.45% στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα vs 24.37% στο περιφερικό αίμα p=0.002), σε αντίθεση με την IL 2, η οποία 109

110 εκφραζόταν σε υψηλότερα ποσοστά στο περιφερικό αίμα (34.17% στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα vs 48.67% στο περιφερικό αίμα p=0.033). Αντίθετα, υψηλότερα ποσοστά διεγερμένων CD8 + T λεμφοκυττάρων, θετικών στον TNF α και την IFN γ, παρατηρήθηκαν στο περιφερικό αίμα σε σύγκριση με το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (TNF α: 48.04% στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα vs 69.84% στο περιφερικό αίμα p=0.007, IFN γ: 27.77% στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα vs 73.24% στο περιφερικό αίμα p=0.003). 5.2 Ασθενείς με σαρκοείδωση και φυσιολογικοί μάρτυρες: CD4 + vs CD8 + T λεμφοκύτταρα Ασθενείς με σαρκοείδωση Βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα Σημαντικά υψηλότερα ποσοστά ενδοκυττάριας έκφρασης IL 2, TNF α και IFN γ ανευρέθηκαν στα διεγερμένα CD4 + T λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος σε σύγκριση με τα CD8 + (IL 2: 40.85% στα CD4 + vs 10.73% στα CD8 + p=0.001, TNF α: 52.84% στα CD4 + vs 48.04% στα CD8 + p=0.001, IFN γ: 60.88% στα CD4 + vs 27.77% στα CD8 + p<0.001). Περιφερικό αίμα Αυξημένο ποσοστό έκφρασης IL 2, αλλά ελαττωμένα ποσοστά έκφρασης TNF α και IFN γ παρατηρήθηκαν στα διεγερμένα CD4 + T λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος σε σύγκριση με τα CD8 + (IL 2: 48.67% στα CD4 + vs 8.13% στα CD8 + p<0.001, TNF α: 52.67% στα CD4 + vs 69.58% στα CD8 + p=0.002, IFN γ: 24.37% στα CD4 + vs 71.52% στα CD8 + p<0.001) Φυσιολογικοί μάρτυρες Περιφερικό αίμα Τα διεγερμένα CD4 + T λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος των φυσιολογικών μαρτύρων εξέφραζαν σε σημαντικά υψηλότερο ποσοστό IL 2 και σε ελαττωμένο ποσοστό IFN γ, σε σύγκριση με τα CD8 + T λεμφοκύτταρα (IL 2: 52.51% στα CD4 + vs 14.04% στα CD8 + p=0.005, IFN γ: 31.45% στα CD4 + vs 56.73% στα CD8 + p=0.005). 110

111 5.3 Ασθενείς με σαρκοείδωση: συσχέτιση Τ Η 1 και T C 1, Τ Η 2 και T C 2 απάντησης Βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα Ισχυρή θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ των ποσοστών των διεγερμένων Τ Η 1 CD4 + και T C 1 CD8 + T λεμφοκυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, για το σύνολο των κυτταροκινών τύπου 1 που μελετήθηκαν: CD4 + IL 2 + /CD4 + TNF α + r=0.913 p<0.001, CD4 + IL 2 + /CD4 + IFN γ + r=0.926 p<0.001, CD4 + IL 2 + /CD8 + IL 2 + r=0.851 p<0.001, CD4 + IL 2 + /CD8 + TNF α + r=0.795 p<0.001, CD4 + IL 2 + /CD8 + IFN γ + r=0.853 p<0.001, CD4 + TNF α + /CD4 + IFN γ + r=0.944 p<0.001, CD4 + TNF α + /CD8 + IL 2 + r=0.871 p<0.001, CD4 + TNF α + /CD8 + TNF α + r=0.868 p<0.001, CD4 + TNF α + /CD8 + IFN γ + r=0.912 p<0.001, CD4 + IFN γ + /CD8 + IL 2 + r=0.933 p<0.001, CD4 + IFN γ + /CD8 + TNF α + r=0.9 p<0.001, CD4 + IFN γ + / CD8 + IFN γ + r=0.961 p<0.001, CD8 + IL 2 + /CD8 + TNF α + r=0.847 p<0.001, CD8 + IL 2 + /CD8 + IFN γ + r=0.938 p<0.001, CD8 + TNF α + /CD8 + IFN γ + r=0.914 p< Οριακά σημαντική θετική συσχέτιση ανευρέθηκε μεταξύ των ποσοστών των διεγερμένων T H 2 CD4 + Τ λεμφοκυττάρων, ενώ σημαντική ήταν η συσχέτιση μεταξύ των διεγερμένων T C 2 CD8 + T λεμφοκυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα: CD4 + IL 4 + /CD4 + IL 13 + r=0.442 p=0.051, CD8 + IL 4 + /CD8 + IL 13 + r=0.647 p= Περιφερικό αίμα Σημαντικές θετικές συσχετίσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ των ποσοστών των διεγερμένων Τ Η 1 CD4 + και T C 1 CD8 + T λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος, για ορισμένες από τις μελετούμενες κυτταροκίνες τύπου 1: CD4 + IL 2 + /CD4 + TNF α + r=0.577 p=0.008, CD4 + IL 2 + /CD8 + IL 2 + r=0.576 p=0.008, CD4 + IL 2 + /CD8 + TNF α + r=0.571 p=0.008, CD4 + IL 2 + /CD8 + IFN γ + r=0.573 p=0.008, CD4 + TNF α + /CD4 + IFN γ + r=0.671 p=0.001, 111

112 CD4 + TNF α + /CD8 + IL 2 + r=0.522 p=0.018, CD4 + TNF α + /CD8 + TNF α + r=0.705 p=0.001, CD4 + TNF α + /CD8 + IFN γ + r=0.618 p=0.004, CD8 + TNF α + /CD8 + IFN γ + r=0.944 p< Σημαντικές συσχετίσεις, θετικές ή αρνητικές, παρατηρήθηκαν επίσης μεταξύ των διεγερμένων T H 2 CD4 + και T C 2 CD8 + T λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος: CD4 + IL 4 + /CD4 + IL 13 + r=0.650 p=0.002, CD8 + IL 4 + /CD8 + IL 13 + r=0.485 p=0.03, CD4 + IL 4 + / CD8 + IL 4 + r= p= Βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα Περιφερικό αίμα Δεν ανευρέθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ των ποσοστών των T H 1 και T C 1 διεγερμένων Τ λεμφοκυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του περιφερικού αίματος. 5.4 Ασθενείς με σαρκοείδωση: συσχέτιση λόγου CD4/CD8 με Τ Η 1 και T C 1 απάντηση στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ του λόγου CD4/CD8 και των ποσοστών ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών τύπου 1 από τα διεγερμένα CD4 + και CD8 + Τ λεμφοκύτταρα στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα. 5.5 Ασθενείς με σαρκοείδωση σταδίου Ι vs σταδίων II IV Βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα Οι ασθενείς με σαρκοείδωση σταδίου Ι παρουσίαζαν σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό ενδοκυττάριας έκφρασης IFN γ στα διεγερμένα CD4 + T λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (26.46% στο στάδιο Ι vs 71.66% στα στάδια II IV p=0.028). Ομοίως, εμφάνιζαν σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά ενδοκυττάριας έκφρασης TNF α και IFN γ στα διεγερμένα CD8 + T λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (TNF α: 11.32% στο στάδιο Ι vs 57.14% στα στάδια II IV p=0.04, IFN γ: 13.39% στο στάδιο Ι vs 54.21% στα στάδια II IV p=0.04). Δεν ανευρέθηκαν σημαντικές διαφορές ως προς τα ποσοστά ενδοκυττάριας έκφρασης των υπολοίπων κυτταροκινών από τα διεγερμένα CD4 + και CD8 + T λεμφοκύτταρα. 112

113 5.5.2 Περιφερικό αίμα Τα διεγερμένα CD4 + και CD8 + T λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος δεν παρουσίαζαν σημαντικές διαφορές ως προς τα ποσοστά έκφρασης των μελετούμενων κυτταροκινών μεταξύ του σταδίου Ι της σαρκοείδωσης και των σταδίων II IV. 5.6 Ασθενείς με σαρκοείδωση vs ασθενείς με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία Βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα Στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στα ποσοστά ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών των μη διεγερμένων CD4 + και CD8 + Τ λεμφοκυττάρων μεταξύ των ασθενών με σαρκοείδωση και των ασθενών πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία. Τα διεγερμένα CD4 + Τ λεμφοκύτταρα στη σαρκοείδωση εξέφραζαν σε σημαντικά υψηλότερο ποσοστό IL 2, TNF α και IFN γ, και σε σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό IL 4, σε σύγκριση με την πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία (IL 2: 34.17% vs 1.01% p=0.008, TNF α: 54.84% vs 24.9% p=0.042, IFN γ: 58.45% vs 17.89% p=0.021, IL 4: 0% vs 0.04% p=0.011, αντίστοιχα). Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στα ποσοστά ενδοκυττάριας έκφρασης των μελετούμενων κυτταροκινών στα διεγερμένα CD8 + T λεμφοκύτταρα Περιφερικό αίμα Στο περιφερικό αίμα δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στα ποσοστά ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στα, διεγερμένα ή μη, CD4 + και CD8 + Τ λεμφοκύτταρα μεταξύ των ασθενών με σαρκοείδωση και των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία, με εξαίρεση το σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των θετικών στην IL 2 διεγερμένων CD8 + T λεμφοκυττάρων στην πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία (8.13% στη σαρκοείδωση vs 19.1 % στην πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία p=0.01). 5.7 Ασθενείς με σαρκοείδωση vs φυσιολογικοί μάρτυρες Τα μη διεγερμένα CD4 + και CD8 + T λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος δεν παρουσίαζαν στατιστικά σημαντικές διαφορές, ως προς την έκφραση ενδοκυττάριων κυτταροκινών, μεταξύ ασθενών με σαρκοείδωση και φυσιολογικών μαρτύρων. 113

114 Αυξημένα ποσοστά θετικών στην IL 4 και IL 13 διεγερμένων CD4 + T λεμφοκυττάρων ανευρέθηκαν στο περιφερικό αίμα των υγιών μαρτύρων (IL 4: 0% στη σαρκοείδωση vs 0.49% στους φυσιολογικούς μάρτυρες p=0.015, IL 13: 0% στη σαρκοείδωση vs 0.29% στους φυσιολογικούς μάρτυρες p=0.014). Αντίθετα, δεν ανευρέθηκαν σημαντικές διαφορές ως προς τα ποσοστά έκφρασης των υπολοίπων κυτταροκινών από τα διεγερμένα CD4 + και CD8 + T λεμφοκύτταρα. 5.8 Διεγερμένα CD4 + και CD8 + Τ λεμφοκύτταρα με εντονότερη έκφραση του CD45 vs ολικά CD4 + και CD8 + Τ λεμφοκύτταρα Ασθενείς με σαρκοείδωση Στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα τα διεγερμένα CD4 + T λεμφοκύτταρα με εντονότερη έκφραση του CD45 παρουσίαζαν σημαντικά υψηλότερα ποσοστά έκφρασης IL 2, TNF α και IFN γ σε σύγκριση με τα διεγερμένα ολικά CD4 + T λεμφοκύτταρα (IL 2: 58.54% στα «CD45 bright» vs 40.85% στα ολικά p<0.001, TNF α: 87% στα «CD45 bright» vs 56.83% στα ολικά p<0.001, IFN γ: 79.6% στα «CD45 bright» vs 60.88% στα ολικά p<0.001). Στο περιφερικό αίμα τα διεγερμένα CD4 + T λεμφοκύτταρα με εντονότερη έκφραση του CD45 παρουσίαζαν επίσης σημαντικά υψηλότερα ποσοστά έκφρασης IL 2, TNF α και IFN γ σε σύκριση με τα ολικά CD4 + T λεμφοκύτταρα (IL 2: 53.68% στα «CD45 bright» vs 48.67% στα ολικά p=0.001, TNF α: 61.47% στα «CD45 bright» vs 52.67% στα ολικά p<0.001, IFN γ: 29.4% στα «CD45 bright» vs 24.37% στα ολικά p<0.001). Ανάλογα αποτελέσματα υπήρχαν και για τα διεγερμένα CD8 + T λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος με εντονότερη έκφραση του CD45 σε σύγκριση με τα ολικά (IL 2: 8.6% στα «CD45 bright» vs 8.13% στα ολικά p=0.014, TNF α: 75.16% στα «CD45 bright» vs 69.58% στα ολικά p<0.001, IFN γ: 76.47% στα «CD45 bright» vs 71.52% στα ολικά p<0.001) Ασθενείς με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία και φυσιολογικοί μάρτυρες Αντίστοιχα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στο περιφερικό αίμα των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία για τις κυτταροκίνες TNF α και IFN γ, στα διεγερμένα CD4 + T «CD45 bright» λεμφοκύτταρα (TNF α: 50.06% στα «CD45 bright» vs 44.17% στα ολικά p=0.043, IFN γ: 17.51% στα «CD45 bright» vs 17.31% στα ολικά p=0.043) και στα διεγερμένα CD8 + T «CD45 bright» 114

115 λεμφοκύτταρα (TNF α: 67.93% στα «CD45 bright» vs 66.95% στα ολικά p=0.043, IFN γ: 74.55% στα «CD45 bright» vs 73.65% στα ολικά p=0.043). Στο περιφερικό αίμα των φυσιολογικών μαρτύρων ανευρέθηκαν σημαντικά υψηλότερα ποσοστά ενδοκυττάριας έκφρασης όλων των κυτταροκινών από τα διεγερμένα CD4 + T «CD45 bright» λεμφοκύτταρα (IL 2: 57.2% στα «CD45 bright» vs 52.51% στα ολικά p=0.005, TNF α: 62.56% στα «CD45 bright» vs 58.57% στα ολικά p=0.005, IFN γ: 34.87% στα «CD45 bright» vs 31.45% στα ολικά p=0.005, IL 4: 0.65% στα «CD45 bright» vs 0.49% στα ολικά p=0.038, IL 13: 0.39% στα «CD45 bright» vs 0.29% στα ολικά p=0.012). Τα διεγερμένα CD8 + T «CD45 bright» λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος των υγιών μαρτύρων εξέφραζαν σε υψηλότερα ποσοστά τις κυτταροκίνες IL 2, TNFα και IFN γ σε σύγκριση με τα ολικά CD8 + T (IL 2: 15.31% στα «CD45 bright» vs 14.04% στα ολικά p=0.005, TNF α: 64.33% στα «CD45 bright» vs 60.63% στα ολικά p=0.005, IFN γ: 61.2% στα «CD45 bright» vs 56.73% στα ολικά p=0.005). 5.9 Ασθενείς με σαρκοείδωση: διεγερμένα CD4 + Τ λεμφοκύτταρα με εντονότερη έκφραση του CD45 βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος vs περιφερικού αίματος Τα διεγερμένα CD4 + T «CD45 bright» λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελδικού εκπλύματος εξέφραζαν σε σημαντικά υψηλότερο ποσοστό TNF α και IFN γ, σε σύγκριση με το περιφερικό αίμα, ενώ σημαντικές διαφορές δεν υπήρχαν για τις υπόλοιπες κυτταροκίνες (TNF α: 87% στα CD4 + T «CD45 bright» του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος vs 61.35% στα CD4 + T «CD45 bright» του περιφερικού αίματος p=0.001, IFN γ: 79.6% στα CD4 + T «CD45 bright» του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος vs 28.49% στα CD4 + T «CD45 bright» του περιφερικού αίματος p<0.001). 6. Εκατοστιαία αναλογία CD4 + και CD8 + T λεμφοκυττάρων στο νωπό δείγμα και στα διεγερμένα, ολικά και «CD45 bright», λεμφοκύτταρα 6.1 Νωπό δείγμα vs διεγερμένο Το ποσοστό των CD4 + T λεμφοκυττάρων επί του συνόλου των λεμφοκυττάρων δε διέφερε σημαντικά στο νωπό και το διεγερμένο δείγμα βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (79.7% στο νωπό vs 76.63% στο διεγερμένο p=0.128), σε αντίθεση με το ποσοστό τους στο περιφερικό αίμα (41% στο νωπό vs 41.47% στο διεγερμένο p=0.002). Η εκατοστιαία αναλογία των CD8 + T λεμφοκυττάρων επί του συνόλου των λεμφοκυττάρων διέφερε τόσο στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, όσο και στο περιφερικό αίμα, πριν και μετά τη 115

116 διέγερση (βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα: 15.52% πριν τη διέγερση vs 11.88% μετά τη διέγερση p<0.001, περιφερικό αίμα: 23% πριν τη διέγερση vs 22.14% μετά τη διέγερση p=0.02). 6.2 Ολικά vs «CD45 bright» διεγερμένα λεμφοκύτταρα Σημαντικά υψηλότερο ποσοστό CD4 + T και CD8 + T λεμφοκυττάρων ανευρέθηκε, μετά από οριοθέτηση των «CD45 bright» διεγερμένων λεμφοκυττάρων σε σύγκριση με τα ολικά, τόσο στo βροχοκυψελιδικό έκπλυμα (CD4 + Τ: 85.14% των «CD45 bright» vs 79.83% των ολικών λεμφοκυττάρων p=0.006), όσο και στο περιφερικό αίμα (CD4 + Τ: 42.25% των «CD45 bright» vs 41.47% των ολικών λεμφοκυττάρων p<0.001, CD8 + Τ: 24.66% των «CD45 bright» vs 22.64% των ολικών λεμφοκυττάρων p<0.001). 116

117 ΠΙΝΑΚΕΣ Πίνακας 1. Χαρακτηριστικά των υπό μελέτη ομάδων Παράμετροι Ομάδες μελέτης Ασθενείς με σαρκοείδωση Ασθενείς με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία Φυσιολογικοί μάρτυρες Φύλο, άντρες/ γυναίκες Ηλικία (έτη), διάμεσος τιμή (ελάχιστημέγιστη) Κάπνισμα, καπνιστής/ πρώην καπνιστής/ άκαπνος 9/11 4/2 3/ (24 67) (46 70) (33 60) 5/5/10 2/1/3 2/1/7 117

118 Πίνακας 2. Χαρακτηριστικά ασθενών με σαρκοείδωση σταδίου Ι και σταδίων II IV Παράμετροι Ομάδες μελέτης Σαρκοείδωση σταδίου Ι Σαρκοείδωση σταδίων II IV Φύλο, άντρες/γυναίκες 3/7 6/4 Ηλικία (έτη), διάμεσος τιμή (ελάχιστη μέγιστη) Κάπνισμα, καπνιστής/ πρώην καπνιστής/ άκαπνος 40.5 (24 60) 51.5 (36 67) 3/2/5 2/3/5 118

119 Πίνακας 3. Κυτταρικοί πληθυσμοί και υποπληθυσμοί στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ασθενών με σαρκοείδωση (ΠΣ) και ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία (ΠΥ) Παράμετροι Ομάδες μελέτης Αριθμός κυττάρων (x10 3 /ml) Επιθηλιακά κύτταρα (ανά 100 κύτταρα BAL) Κυψελιδικά μακροφάγα (%) Ουδετερόφιλα πολ/να (%) Σαρκοείδωση n=20 Πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία n=6 214 (34 440) 230 (91 605) 9.5 (5 18) 8 (4 18) 49 (11 80) 41.5 (12 72) 3.5 (1 17) 5 (1 6) Εωσινόφιλα 2 (0 9) 4 (0 14) πολ/να (%) Λεμφοκύτταρα (%) 41.5 (15 75) 52 (18 70) CD4 + (% λεμφοκυττάρων) CD8 + (% λεμφοκυττάρων) 81.6 ( ) ( ) Λόγος CD4/CD ( ) ( ) ( ) 0.38 ( ) ΠΣ vs ΠΥ Επίπεδο σημαντικότητας (p) <0.001 Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των αντίστοιχων παραμέτρων. 119

120 Πίνακας 4. Κυτταρικοί πληθυσμοί και υποπληθυσμοί στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ασθενών με σαρκοείδωση σταδίου Ι και σταδίων II IV Παράμετροι Ομάδες μελέτης Αριθμός κυττάρων (x10 3 /ml) Επιθηλιακά κύτταρα (ανά 100 κύτταρα BAL) Κυψελιδικά μακροφάγα (%) Ουδετερόφιλα πολ/να (%) Στάδιο Ι n=10 Στάδια ΙΙ IV n= (34 385) (46 440) 11.5 (7 16) 9 (5 18) 50.5 (24 75) 49 (11 80) 3 (2 6) 6 (1 17) Εωσινόφιλα 1 (0 3) 2.5 (0 9) πολ/να (%) Λεμφοκύτταρα (%) 45 (15 70) 37 (15 75) CD4 + (% λεμφοκυττάρων) CD8 + (% λεμφοκυττάρων) ( ) 12 ( ) 78.1 ( ) ( ) Στάδιο Ι vs στάδια ΙI IV Επίπεδο σημαντικότητας (p) Λόγος CD4/CD ( ) 6.51 ( ) NS NS=μη σημαντική Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των αντίστοιχων παραμέτρων. 120

121 Πίνακας 5. Ευρήματα στο περιφερικό αίμα από ασθενείς με σαρκοείδωση, ασθενείς με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία και φυσιολογικούς μάρτυρες Παράμετροι Ομάδες μελέτης Αριθμός λευκών (x10 3 /ml) Λεμφοκύτταρα (x10 3 /ml) CD4 + (% λεμφοκυττάρων) CD8 + (% λεμφοκυττάρων) Ασθενείς με σαρκοείδωση n= ( ) 1425 ( ) 38 (17 58) 22 (12 70) Λόγος CD4/CD ( ) Ασθενείς με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία n= ( ) 2297 ( ) 29.5 (26 43) (11 50) 0.82 ( ) Φυσιολογικοί μάρτυρες n= ( ) 2420 ( ) 47.5 (36 65) 25.5 (13 34) 1.83 ( ) Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των αντίστοιχων παραμέτρων. 121

122 Πίνακας 6. CD16/56 + T και inkt λεμφοκύτταρα στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με σαρκοείδωση (ΠΣ) και των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία (ΠΥ) Παράμετροι Ομάδες μελέτης Σαρκοείδωση Πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία ΠΣ vs ΠΥ Επίπεδο σημαντικότητας (p) CD16/56 + T (% λεμφοκυττάρων) CD16/56 + T ( /μl) inkt (% λεμφοκυττάρων) inkt ( /μl) 2.35 (0 6.72) n= (0 7.47) n= ( ) n= ( ) n= ( ) n= ( ) n= ( ) n= ( ) n=6 NS=μη σημαντική Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των αντίστοιχων παραμέτρων. NS NS NS NS 122

123 Πίνακας 7. CD16/56 + T και inkt λεμφοκύτταρα στο περιφερικό αίμα των ασθενών με σαρκοείδωση (ΠΣ), των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία (ΠΥ) και των φυσιολογικών μαρτύρων (ΦΜ) Παράμετροι Ομάδες μελέτης ΠΣ ΠΥ ΦΜ ΠΣ vs ΠΥ ΠΣ vs ΦΜ CD16/56 + T (% λεμφοκυττάρων) CD16/56 + T ( /μl) inkt (% λεμφοκυττάρων) inkt ( /μl) 8 (2 30) n= ( ) n=19 0 (0 0.31) n=20 0 (0 4.48) n=20 7 (1 24) n= ( ) n= (0 0.09) n= (0 2.28) n=5 5.5 (0 11) n= (0 297) n= (0 0.54) n= ( ) n=10 Επίπεδο σημαντικό τητας (p) NS NS NS Επίπεδο σημαντικό τητας (p) NS NS NS NS <0.025 NS=μη σημαντική Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των αντίστοιχων παραμέτρων. 123

124 Πίνακας 8. Εκατοστιαία αναλογία ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με σαρκοείδωση IL 2 TNF α IFN γ IL 4 IL 13 Διεγερμένα CD4 + n=20 Διεγερμένα CD8 + n=17 Μη διεγερμένα CD4 + n=20 Μη διεγερμένα CD8 + n= ( ) ( ) 0 (0 0.14) 0 (0 3.64) ( ) ( ) 0 (0 0.9) 0 (0 4.1) ( ) ( ) 0.43 (0 2.82) 0.79 (0 7.14) 0 (0 0.45) 0 (0 5) 0 (0 0.81) 0 (0 5.52) 0 (0 0.52) 0 (0 1.69) 0 (0 0.01) 0 (0 3.39) Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των % θετικών CD4 + ή CD8 + Τ λεμφοκυττάρων για καθεμία από τις κυτταροκίνες. 124

125 Πίνακας 9. Εκατοστιαία αναλογία ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στο περιφερικό αίμα των ασθενών με σαρκοείδωση IL 2 TNF α IFN γ IL 4 IL 13 Διεγερμένα CD4 + n=20 Διεγερμένα CD8 + n=20 Μη διεγερμένα CD4 + n=20 Μη διεγερμένα CD8 + n= ( ) 8.13 ( ) 0 (0 0.12) 0 (0 0.26) ( ) ( ) 0 (0 0) 0 (0 0.69) ( ) ( ) 0.02 (0 1.87) 0.04 (0 1.69) 0 (0 1.26) 0 (0 0.54) 0 (0 0.32) 0 (0 0.64) 0 (0 0.64) 0 (0 0.06) 0 (0 0.41) 0 (0 0.12) Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των % θετικών CD4 + ή CD8 + Τ λεμφοκυττάρων για καθεμία από τις κυτταροκίνες. 125

126 Πίνακας 10. Εκατοστιαία αναλογία ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία IL 2 TNF α IFN γ IL 4 IL 13 Διεγερμένα CD4 + n=5 Διεγερμένα CD8 + n=6 Μη διεγερμένα CD4 + n=6 Μη διεγερμένα CD8 + n= ( ) 2.16 (0 18) 0 (0 1.3) 0 (0 1.47) 24.9 ( ) 9.72 ( ) 0 (0 0.04) 0 (0 1.19) ( ) ( ) 0.14 (0 3.62) 0.92 (0 3.03) 0.04 (0 1.95) 0 (0 0) 0.05 (0 1.54) 0 (0 1.59) 0 (0 0.97) 0 (0 0) 0 (0 1.4) 0 (0 0) Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των % θετικών CD4 + ή CD8 + Τ λεμφοκυττάρων για καθεμία από τις κυτταροκίνες. 126

127 Πίνακας 11. Εκατοστιαία αναλογία ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στο περιφερικό αίμα των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία IL 2 TNF α IFN γ IL 4 IL 13 Διεγερμένα CD4 + n=5 Διεγερμένα CD8 + n=5 Μη διεγερμένα CD4 + n=5 Μη διεγερμένα CD8 + n= ( ) 19.1 ( ) 0 (0 0.22) 0 (0 1.27) ( ) ( ) 0 (0 0) 0 (0 0) ( ) ( ) 0.16 (0 0.54) 0 (0 0.33) 0.21 (0 4.35) 0.04 (0 0.66) 0 (0 0.09) 0 (0 0.81) 0 (0 1.03) 0 (0 0.27) 0 (0 0) 0 (0 0) Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των % θετικών CD4 + ή CD8 + Τ λεμφοκυττάρων για καθεμία από τις κυτταροκίνες. 127

128 Πίνακας 12. Εκατοστιαία αναλογία ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στο περιφερικό αίμα των φυσιολογικών μαρτύρων IL 2 TNF α IFN γ IL 4 IL 13 Διεγερμένα CD4 + n=10 Διεγερμένα CD8 + n=10 Μη διεγερμένα CD4 + n=10 Μη διεγερμένα CD8 + n= ( ) ( ) 0 (0 0.24) 0 (0 0.52) ( ) ( ) 0 (0 0) 0 (0 0.31) ( ) ( ) 0.09 (0 0.36) 0.27 (0 0.98) 0.49 (0 1.54) 0.28 (0 1.28) 0 (0 0.19) 0 (0 0.86) 0.29 (0 1.21) 0 (0 2.06) 0 (0 0.17) 0 (0 0) Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των % θετικών CD4 + ή CD8 + Τ λεμφοκυττάρων για καθεμία από τις κυτταροκίνες. 128

129 Πίνακας 13. Εκατοστιαία αναλογία ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με σαρκοείδωση σταδίου Ι IL 2 TNF α IFN γ IL 4 IL 13 Διεγερμένα CD4 + n=10 Διεγερμένα CD8 + n=10 Μη διεγερμένα CD4 + n=10 Μη διεγερμένα CD8 + n= ( ) 1.23 ( ) 0 (0 0.14) 0 (0 3.64) ( ) ( ) 0 (0 0.9) 0 (0 4.1) ( ) ( ) 0.4 (0 1.02) 0.4 (0 7.14) 0 (0 0) 0 (0 5) 0 (0 0.81) 0 (0 4.92) 0 (0 0.26) 0 (0 0) 0 (0 0.01) 0 (0 1.45) Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των % θετικών CD4 + ή CD8 + Τ λεμφοκυττάρων για καθεμία από τις κυτταροκίνες. 129

130 Πίνακας 14. Εκατοστιαία αναλογία ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στο περιφερικό αίμα των ασθενών με σαρκοείδωση σταδίου Ι IL 2 TNF α IFN γ IL 4 IL 13 Διεγερμένα CD4 + n=10 Διεγερμένα CD8 + n=10 Μη διεγερμένα CD4 + n=10 Μη διεγερμένα CD8 + n= ( ) 9 ( ) 0 (0 0.12) 0 (0 0.26) ( ) ( ) 0 (0 0) 0 (0 0.69) ( ) ( ) 0 (0 0.6) 0 (0 1.69) 0 (0 0.59) 0.12 (0 0.54) 0 (0 0.25) 0 (0 0.64) 0 (0 0.53) 0 (0 0.06) 0 (0 0) 0 (0 0) Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των % θετικών CD4 + ή CD8 + Τ λεμφοκυττάρων για καθεμία από τις κυτταροκίνες. 130

131 Πίνακας 15. Εκατοστιαία αναλογία ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με σαρκοείδωση σταδίων II IV IL 2 TNF α IFN γ IL 4 IL 13 Διεγερμένα CD4 + n=10 Διεγερμένα CD8 + n=7 Μη διεγερμένα CD4 + n=10 Μη διεγερμένα CD8 + n= ( ) ( ) 0 (0 0) 0 (0 1.8) ( ) ( ) 0 (0 0.35) 0 (0 0.96) ( ) ( ) 0.55 (0 2.82) 1.13 (0 3.94) 0 (0 0.45) 0 (0 4.29) 0 (0 0.66) 0 (0 5.52) 0 (0 0.52) 0 (0 1.69) 0 (0 0.01) 0 (0 3.39) Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των % θετικών CD4 + ή CD8 + Τ λεμφοκυττάρων για καθεμία από τις κυτταροκίνες. 131

132 Πίνακας 16. Εκατοστιαία αναλογία ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στο περιφερικό αίμα των ασθενών με σαρκοείδωση σταδίων II IV IL 2 TNF α IFN γ IL 4 IL 13 Διεγερμένα CD4 + n=10 Διεγερμένα CD8 + n=10 Μη διεγερμένα CD4 + n=10 Μη διεγερμένα CD8 + n= ( ) 4.88 ( ) 0 (0 0) 0 (0 0) ( ) ( ) 0 (0 0) 0 (0 0.06) ( ) ( ) 0.39 (0 1.87) 0.13 (0 0.68) 0 (0 1.26) 0 (0 0.37) 0 (0 0.32) 0 (0 0) 0 (0 0.64) 0 (0 0) 0 (0 0.41) 0 (0 0.12) Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των % θετικών CD4 + ή CD8 + Τ λεμφοκυττάρων για καθεμία από τις κυτταροκίνες. 132

133 Πίνακας 17. Εκατοστιαία αναλογία ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στα «CD45 bright» διεγερμένα λεμφοκύτταρα στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα των ασθενών με σαρκοείδωση IL 2 TNF α IFN γ IL 4 IL 13 ΒΡΟΓΧΟΚΥΨΕΛΙΔΙΚΟ ΕΚΠΛΥΜΑ CD4 + n=19 ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΑΙΜΑ CD4 + n=20 ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΑΙΜΑ CD8 + n= ( ) ( ) 8.6 ( ) 87 ( ) ( ) ( ) 79.6 ( ) 29.4 ( ) ( ) 0 (0 1.85) 0 (0 1.25) 0 (0 0.62) 0 (0 0.05) 0 (0 0.87) 0 (0 0.47) Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των % θετικών CD4 + ή CD8 + Τ λεμφοκυττάρων για καθεμία από τις κυτταροκίνες. 133

134 Πίνακας 18. Εκατοστιαία αναλογία ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στα «CD45 bright» διεγερμένα λεμφοκύτταρα στο περιφερικό αίμα των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία IL 2 TNF α IFN γ IL 4 IL 13 ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΑΙΜΑ CD4 + n=5 ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΑΙΜΑ CD8 + n= ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) 0.26 (0 4.21) 0.72 (0 0.98) 0 (0 1.13) 0 (0 0.61) Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των % θετικών CD4 + ή CD8 + Τ λεμφοκυττάρων για καθεμία από τις κυτταροκίνες. Πίνακας 19. Εκατοστιαία αναλογία ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών στα «CD45 bright» διεγερμένα λεμφοκύτταρα στο περιφερικό αίμα των φυσιολογικών μαρτύρων IL 2 TNF α IFN γ IL 4 IL 13 ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΑΙΜΑ CD4 + n=10 ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟ ΑΙΜΑ CD8 + n= ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) 61.2 ( ) 0.65 (0 2.09) 0.29 (0 0.71) 0.39 (0 1.4) 0 (0 1.7) Οι τιμές στα κελιά αντιπροσωπεύουν τις διάμεσες τιμές και στις παρενθέσεις τις ακραίες τιμές των % θετικών CD4 + ή CD8 + Τ λεμφοκυττάρων για καθεμία από τις κυτταροκίνες. 134

135 ΓΡΑΦΗΜΑΤΑ 30,00 CD16/56 + Τ λεμφοκύτταρα (%) CD16/56+ T κύτταρα % λεμφοκυττάρων 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 p< ,00 BAL BALF PBL Αίμα 4,00 inkt λεμφοκύτταρα (%) inkt κύτταρα % λεμφοκυττάρων 3,00 2,00 1,00 p< ,00 BAL BALF PBL Αίμα Γραφήματα 1 και 2. Σύγκριση των ποσοστών των CD16/56 + Τ και inkt λεμφοκυττάρων (% των λεμφοκυττάρων) μεταξύ του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του περιφερικού αίματος, στους ασθενείς με σαρκοείδωση. 135

136 4,00 Στάδιο Ι Στάδια II-IV inkt λεμφοκύτταρα (%) inkt κύτταρα % λεμφοκυττάρων 3,00 2,00 1,00 p= ,00 BALF Αίμα PBL Γράφημα 3. Σύγκριση των ποσοστών των inkt λεμφοκυττάρων (% των λεμφοκυττάρων) του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του περιφερικού αίματος, μεταξύ των ασθενών με σαρκοείδωση σταδίου Ι και και σταδίων II IV. 136

137 800,00 Σαρκοείδωση Πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία Φυσιολογικοί μάρτυρες CD16/56 + Τ λεμφοκύτταρα (/μl δείγματος) CD16/56+ T λεμφοκύτταρα/μl 600,00 400,00 200,00 0,00 BALF Αίμα PBL Γράφημα 4. Σύγκριση των συγκεντρώσεων (ανά μl) των CD16/56 + T λεμφοκυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα μεταξύ των ασθενών με σαρκοείδωση, των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία, και των φυσιολογικών μαρτύρων. 137

138 inkt λεμφοκύτταρα (/μl δείγματος) inkt κύτταρα/μl 20,00 15,00 10,00 p=0.011 Σαρκοείδωση Πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία Φυσιολογικοί μάρτυρες 5,00 0,00 BALF Αίμα PBL Γράφημα 5. Σύγκριση των συγκεντρώσεων (ανά μl) των inkt λεμφοκυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο περιφερικό αίμα μεταξύ των ασθενών με σαρκοείδωση, των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία, και των φυσιολογικών μαρτύρων. 138

139 100,00 80,00 p=0.033 p=0.002 BALF CD4+ T λεμφοκύτταρα θετικά CD4 + Τ στην αντίστοιχη λεμφοκύτταρα κυτταροκίνη στο BAL PBL CD4+ T λεμφοκύτταρα CD4 + Τ θετικά λεμφοκύτταρα στην αντίστοιχη κυτταροκίνη στο αίμα 60,00 40,00 20,00 0,00 IL-2 TNF-α IFN-γ IL-4 IL-13 Γράφημα 6. Σύγκριση των ποσοστών έκφρασης κυτταροκινών από τα διεγερμένα CD4 + T λεμφοκύτταρα μεταξύ του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του περιφερικού αίματος στους ασθενείς με σαρκοείδωση. 139

140 100,00 80,00 p=0.007 p=0.003 BALF CD8+ T λεμφοκύτταρα CD8 + Τ θετικά λεμφοκύτταρα στην αντίστοιχη BAL κυτταροκίνη PBL CD8+ T λεμφοκύτταρα CD8 + Τ θετικά στην αντίστοιχη λεμφοκύτταρα κυτταροκίνη στο αίμα 60,00 40,00 20,00 0,00 IL-2 TNF-α IFN-γ IL-4 IL-13 Γράφημα 7. Σύγκριση των ποσοστών έκφρασης κυτταροκινών από τα διεγερμένα CD8 + T λεμφοκύτταρα μεταξύ του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του περιφερικού αίματος στους ασθενείς με σαρκοείδωση. 140

141 100,00 80,00 p=0.001 p=0.001 p<0.001 BALF CD4 + CD4+ Τ T λεμφοκύτταρα λεμφοκύτταρα θετικά στην αντίστοιχη BAL κυτταροκίνη BALF CD8+ T λεμφοκύτταρα CD8 + Τ θετικά λεμφοκύτταρα στην αντίστοιχη κυτταροκίνη στο BAL 60,00 40,00 20,00 0,00 IL-2 TNF-α IFN-γ IL-4 IL-13 Γράφημα 8. Σύγκριση των ποσοστών έκφρασης κυτταροκινών μεταξύ των διεγερμένων CD4 + και CD8 + T λεμφοκυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με σαρκοείδωση. 141

142 100,00 80,00 p<0.001 p=0.002 p<0.001 PBL CD4+ T λεμφοκύτταρα CD4 + Τ θετικά στην λεμφοκύτταρα αντίστοιχη κυτταροκίνη στο αίμα PBL CD8+ T λεμφοκύτταρα θετικά CD8 + Τ στην αντίστοιχη λεμφοκύτταρα κυτταροκίνη στο αίμα 60,00 40,00 20,00 0,00 IL-2 TNF-α IFN-γ IL-4 IL-13 Γράφημα 9. Σύγκριση των ποσοστών έκφρασης κυτταροκινών μεταξύ των διεγερμένων CD4 + και CD8 + T λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των ασθενών με σαρκοείδωση. 142

143 80,00 80,00 60,00 60,00 40,00 40,00 20,00 0,00 r=0.913 p< ,00 0,00 r=0.926 p< ,00 40,00 60,00 80,00 100,00 CD4 + TNF α + (%) 20,00 40,00 60,00 80,00 CD4 + IFN γ + (%) 80,00 80,00 CD4 + IL 2 + (%) στο BAL 60,00 40,00 20,00 0,00 r=0.795 p< ,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 CD8 + TNF α + (%) 60,00 40,00 20,00 0,00 r=0.853 p< ,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 CD8 + IFN γ + (%) 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 r=0.851 p< ,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 CD8 + IL 2 + (%) στο BAL 143

144 100,00 100,00 80,00 80,00 60,00 60,00 40,00 40,00 CD4 + TNF α + (%) στο BAL 20,00 100,00 80,00 r=0.944 p< ,00 40,00 60,00 80,00 CD4 + IFN γ + (%) 20,00 100,00 80,00 r=0.871 p< ,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 CD8 + IL 2 + (%) 60,00 60,00 40,00 20,00 r=0.868 p< ,00 20,00 r=0.912 p< ,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 CD8 + TNF α + (%) CD8 + IFN γ + (%) στο BAL 144

145 CD4 + IFN γ + (%) στο BAL 80,00 60,00 40,00 20,00 r=0.933 p< ,00 60,00 40,00 20,00 r=0.9 p< ,00 60,00 40,00 20,00 r=0.961 p< ,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 CD8 + IL 2 + (%) CD8 + TNF α + (%) CD8 + IFN γ + (%) 60,00 60,00 CD8 + IL 2 + (%) στο BAL 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 r=0.847 p< ,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 r=0.938 p< ,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 CD8 + TNF α + (%) CD8 + IFN γ + (%) 100,00 CD8 + TNF α + (%) στο BAL 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 r=0.914 p< ,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 CD8 + IFN γ + (%) στο BAL Γραφήματα Συσχετίσεις μεταξύ των ποσοστών (%) των διεγερμένων CD4 + και CD8 + Τ λεμφοκυττάρων, με ενδοκυττάρια έκφραση IL 2, TNF α και IFNγ, στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με σαρκοείδωση. 145

146 80,00 80,00 70,00 70,00 60,00 60,00 50,00 50,00 CD4 + IL 2 + (%) στο αίμα 40,00 30,00 20,00 r=0.577 p= ,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 CD4 + TNF α + (%) 40,00 30,00 20,00 r=0.576 p= ,00 10,00 20,00 30,00 CD8 + IL 2 + (%) 80,00 80,00 70,00 70,00 60,00 60,00 50,00 50,00 40,00 40,00 30,00 20,00 r=0.571 p= ,00 20,00 r=0.573 p= ,00 40,00 60,00 80,00 100,00 CD8 + TNF α + (%) 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 CD8 + IFN γ + (%) στο αίμα 146

147 80,00 80,00 70,00 70,00 60,00 60,00 50,00 50,00 CD4 + TNF α + (%) στο αίμα 40,00 30,00 20,00 80,00 70,00 r=0.671 p= ,00 20,00 30,00 40,00 50,00 CD4 + IFN γ + (%) 40,00 30,00 20,00 80,00 70,00 r=0.522 p= ,00 10,00 20,00 30,00 CD8 + IL 2 + (%) 60,00 60,00 50,00 50,00 40,00 30,00 r=0.705 p= ,00 30,00 r=0.618 p= ,00 20,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 CD8 + TNF α + (%) CD8 + IFN γ + (%) CD8 + TNF α + (%) στο αίμα 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 r=0.944 p< ,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 CD8 + IFN γ + (%) στο αίμα Γραφήματα Συσχετίσεις μεταξύ των ποσοστών των διεγερμένων CD4 + και CD8 + Τ λεμφοκυττάρων, με ενδοκυττάρια έκφραση IL 2, TNF α και IFN γ, στο περιφερικό αίμα των ασθενών με σαρκοείδωση. 147

148 BALFCD4+ T CD4 + T λεμφοκύτταρα θετικά στο BAL στην αντίστοιχη κυτταροκίνη 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 p=0.028 Στάδιο Ι Ι Στάδια II-IV ΙΙ IV 0,00 IL-2 TNF-α IFN-γ IL-4 IL-13 Γράφημα 34. Σύγκριση των ποσοστών έκφρασης κυτταροκινών από τα διεγερμένα CD4 + T λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος μεταξύ των ασθενών με σαρκοείδωση σταδίου Ι και σταδίων II IV. 148

149 BALF CD8+ T λεμφοκύτταρα CD8 + T λεμφοκύτταρα θετικά στο BAL στην αντίστοιχη κυτταροκίνη 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 p=0.04 p=0.04 Στάδιο Ι Ι Στάδια II-IV ΙΙ IV 0,00 IL-2 TNF-α IFN-γ IL-4 IL-13 Γράφημα 35. Σύγκριση των ποσοστών έκφρασης κυτταροκινών από τα διεγερμένα CD8 + T λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος μεταξύ των ασθενών με σαρκοείδωση σταδίου Ι και σταδίων II IV. 149

150 BALF CD4+ T λεμφοκύτταρα CD4 + T λεμφοκύτταρα θετικά στο BAL στην αντίστοιχη κυτταροκίνη 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 p=0.008 p=0.042 p=0.021 p=0.011 Σαρκοείδωση Πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία από υπερευαισθησία 0,00 IL-2 TNF-α IFN-γ IL-4 IL-13 Γράφημα 36. Σύγκριση των ποσοστών έκφρασης κυτταροκινών από τα διεγερμένα CD4 + T λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος μεταξύ των ασθενών με σαρκοείδωση και των ασθενών με πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία. 150

151 CD4 PBL CD4+ T λεμφοκύτταρα + T λεμφοκύτταρα στο αίμα θετικά στην αντίστοιχη κυτταροκίνη 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 p=0.015 p=0.014 Σαρκοείδωση Φυσιολογικοί μάρτυρες IL-2 TNF-α IFN-γ IL-4 IL-13 Γράφημα 37. Σύγκριση των ποσοστών έκφρασης κυτταροκινών από τα διεγερμένα CD4 + T λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος μεταξύ των ασθενών με σαρκοείδωση και των φυσιολογικών μαρτύρων. 151

152 100,00 80,00 p<0.001 p<0.001 p<0.001 BALF CD4 + CD4+ Τ T λεμφοκύτταρα λεμφοκύτταρα θετικά στην αντίστοιχη στο BAL κυτταροκίνη BALF CD4+ "CD45 + bright" Τ T λεμφοκύτταρα θετικά στην στο BAL αντίστοιχη κυτταροκίνη με εντονότερη έκφραση του CD45 60,00 40,00 20,00 0,00 IL-2 TNF-α IFN-γ Γράφημα 38. Σύγκριση των ποσοστών έκφρασης κυτταροκινών από τα διεγερμένα CD4 + T λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος στους ασθενείς με σαρκοείδωση, μετά από οριοθέτηση (gating) του συνόλου των λεμφοκυττάρων και των λεμφοκυττάρων με εντονότερη έκφραση του CD45 («CD45 bright»), αντίστοιχα. 152

153 100,00 80,00 p=0.001 p<0.001 p<0.001 PBL CD4+ T λεμοκύτταρα CD4 + Τ θετικά λεμφοκύτταρα στην αντίστοιχη στο αίμα κυτταροκίνη PBL CD4+ "CD45 bright" CD4 + Τ T λεμφοκύτταρα θετικά στο αίμα στην αντίστοιχη με εντονότερη κυτταροκίνη έκφραση του CD45 60,00 40,00 20,00 0,00 IL-2 TNF-α IFN-γ Γράφημα 39. Σύγκριση των ποσοστών έκφρασης κυτταροκινών από τα διεγερμένα CD4 + T λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος των ασθενών με σαρκοείδωση, μετά από οριοθέτηση του συνόλου των λεμφοκυττάρων και των λεμφοκυττάρων με εντονότερη έκφραση του CD45, αντίστοιχα. 153

154 100,00 80,00 60,00 p=0.001 p<0.001 CD4 + Τ BALF CD4+ "CD45 λεμφοκύτταρα bright" T λεμφοκύτταρα στο BAL θετικά με εντονότερη στην αντίστοιχη έκφραση του κυτταροκίνη CD45 PBL CD4+ "CD45 bright" T CD4 + Τ λεμφοκύτταρα θετικά λεμφοκύτταρα στην αντίστοιχη αίμα κυτταροκίνη με εντονότερη έκφραση του CD45 40,00 20,00 0,00 IL-2 TNF-α IFN-γ Γράφημα 40. Σύγκριση των ποσοστών έκφρασης κυτταροκινών από τα διεγερμένα CD4 + T λεμφοκύτταρα μεταξύ του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και του περιφερικού αίματος, στους ασθενείς με σαρκοείδωση, μετά από οριοθέτηση των λεμφοκυττάρων με εντονότερη έκφραση του CD

155 ΕΙΚΟΝΕΣ Εικόνα 1. Ανάλυση της ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών σε διεγερμένα με PMA/ionomycin CD4 + T λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, με τη χρήση τριών διαδοχικών ηλεκτρονικών περιφράξεων (gates). 155

156 156

157 Εικόνα 2. Ανάλυση της ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών σε διεγερμένα με PMA/ionomycin CD4 + T λεμφοκύτταρα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, μετά από οριοθέτηση των λεμφοκυττάρων, ανάλογα με την επιφανειακή έκφραση του CD

158 Εικόνα 3. Ανάλυση της ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών σε διεγερμένα με PMA/ionomycin CD4 + T λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος, με τη χρήση τριών διαδοχικών ηλεκτρονικών περιφράξεων (gates). 158