Ο Μεταφραστικός ελεγχος και η διερευνηση των μοντελλων που θα μελετηθούν εστιαζεται σε τεσσερα σημεία

Transcript

1 Ο Μεταφραστικός ελεγχος και η διερευνηση των μοντελλων που θα μελετηθούν εστιαζεται σε τεσσερα σημεία Στην μελέτη του ριβοσώματος, των στοιχείων που το συγκροτούν αλλά και του τρόπου με τον οποίο αυτά αλληλεπιδρούν για να διαμορφωσουν λειτουργικές θέσεις Στην μελέτη του mrna του ρόλου των δευτεροταγών δομών καθώς επίσης και του Cap του Poly(A) του 3-UTR και 5-UTR Στην μελέτη της εναρξης και των παραγόντων εναρξης Στην μελέτη της επιμήκυσνης και των παραγόντων επιμήκυνσης

2 Η μεταφραστική ρύθμιση των προκαρυωτικών μηνυμάτων είναι μάλλον απλή υπόθεση και εστιάζεται στην παρουσία συγκεκριμένων αλληλουχιών στην πρωτοταγή δομή π.χ περιοχή Schine Dalgarino καθώς και στον τρόπο πού μεταβάλλεται η δευτεροταγής και τριτοταγής δομή Στα ευκαρυωτικά υπάρχουν πάρα πολλά στοιχεία που δρουν κατά τρόπο cis στις διάφορες περιοχές τού mrna στο κάλυμμα,στο Poly(A) στην 5 μη μεταφραζόμενη και στην 3 μη μεταφραζόμενη περιοχή στην αποδιάταξη της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής.ενώ υπάρχουν και στοιχεία τα οποία αντεπιδρούν κατά τρόπο trans σε διαμορφωμένες περιοχές τού mrna π.χ στο IRE στο mrna της φεριτίνης

3 Τα πλέον σημαντικά χαρακτηριστικά τα οποία επηρεάζουν το μήνυμα το οποίο μεταφράζεται φαίνεται να είναι τεσσερα Η παρουσία και η διαθεσιμότητα της δομής του καλύμματος διότι σχετίζεται άμεσα με την δυνατότητα αντεπίδρασης με τον παράγοντα έναρξης eif-4f αν υπάρχουν τέτοιες δομές που παρεμποδίζουν την πρόσβαση αυτό έχει συνέπεια στην απόδοση Η σταθερότητα της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής αλλά και η θέση πού βρίσκονται. Δομές που υπάρχουν στο 5 άκρο δημιουργούν πολύ μεγαλύτερο πρόβλημα από εκείνο πού δημιουργούν δομές στην κωδογόνο περιοχή Η κάλυψη ή οχι της τριπλέτας έναρξης Η παρουσία και το μήκος του Poly(A) στο 3 άκρο συνεισφέρει ουσιαστικά στην μεταφραστική απόδοση. Το μήκος του poly(a) μπορεί να μεταβάλλεται και βεβαίως και η μεταφραστική απόδοση

4 Έχουν μέχρι σήμερα υποστηριχθεί τρείς τουλάχιστον μηχανισμοί με τους οποίους είναι δυνατόν να ελεγχθεί η διαδικασία της εναρξης στα διάφορα μηνύματα Μέσω της τριτοταγούς δομής των mrna η τριτοταγής δομή μπορεί να παρεμποδίζει διάφορες αντεπιδράσεις π.χ τη πρόσδεση στην ριβοσωμική υπομονάδα. Αυτός ο τύπος ελέγχου για παράδειγμα έχει υποστηριχθεί για να εξηγήσει την ρύθμιση της μετάφρασης σε μια σειρά πολυσιστρονικά μηνύματα Μέσω της δέσμευσης συγκεκριμένων πρωτεινών στο mrna οι οποίες μπλοκάρουν την έναρξη. Το πιο κλασσικό παράδειγμα βρίσκεται στην σύνθεση των ριβοσωμικών πρωτεινών αυτών καθ αυτών Μέσω των antisense RNA.Τα κλάσματα των antisence αντιστοιχούν στην μη κωδικοποιούσα αλυσίδα του DNA

5

6 Ρύθμιση της μετάφρασης του μηνύματος του βακτηριοφάγου MS2 Το συγκεκριμένο πολυσιστρονικά μήνυμα κωδικοποιεί για τέσσερις πρωτεΐνες οι οποίες χρειάζονται στον ιό την Α πρωτεΐνη την πρωτεΐνη της κάψας την αντιγραφάση και την L- πρωτείνη Το μήνυμα για την πρωτεΐνη Α δεν μεταφράζεται σε πρώτη φάση διότι η τριτοταγής δομή παρεμποδίζει την ορθή δέσμευση του ριβοσώματος στην κατάλληλη θέση Το μήνυμα για την λυτική πρωτεΐνη επικαλύπτεται τα άλλα μηνύματα δεν μεταφράζεται παρά μόνο όταν μεταβληθεί το πλαίσιο ανάγνωσης Το ριβόσωμα αρχίζει την μετάφραση από την πρωτεΐνη της κάψας και συνεχίζει στην μετάφραση του μηνύματος της αντιγραφάσης Όταν η αντιγραφάση δημιουργηθεί αυτή καταλύει τον διπλασιασμό του μηνύματος RNA αυτού καθ αυτού τα αντίγραφα δεν πτυχώνονται άμεσα και έτσι μπορεί να αρχίσει η μετάφραση της πρωτεΐνης Α Το μήνυμα για την λυτική πρωτεΐνη μεταφράζεται μόνο από καιρό εις καιρό

7

8 Ρυθμιση της μετάφρασης του mrna των ριβοσωμικών πρωτεινών στα βακτήρια Για την συντριπτική πλεοψηφία των ριβοσωμικών πρωτεινών στα βακτηρια ο μηχανισμός ελέγχου της συνθεσης τους για επίτευξη συντονισμού βρίσκεται στην μετάφραση Στις περισσότερες περιπτώσεις το κάθε οπερώνειο που κωδικοποιεί για μια πρωτείνη κωδικοποιεί και για ενα καταστολέα της σύνθεσης της ριβοσωμικής πρωτείνης Ο καταστολέας δεσμευεται ειδικά στην 5 περιοχή του μηνύματος και σταματά την μετάφραση ολων των σιστρονίων πού βρίσκονται down stream.αυτό το φαινόμενο ονομαζεται μεταφραστική σύζευξη Ο μηχανισμός αυτός ρύθμισης ισχύει και για αλλα μηνύματα τα οποία είναι αλληλοεπικαλυπτόμενα ή περιέχουν μικρες ενδοσιστρονικές περιοχές

9 Ερωτήματα τα οποία δημιουργούνται από τον μηχανισμο δρασης του καταστολέα κατα την σύνθεση των ριβοσωμικών πρωτεινών Ποιά είναι η θέση δεσμευσης του καταστολέα επάνω στο mrna Πως η ριβοσωμική πρωτείνη της 30S υπομονάδος δεσμευεται επάνω σ αυτή την θέση στο mrna Υπάρχουν δομικές ομοιότητες μεταξύ των θέσεων δεσμευσης στο ριβοσωμικό και στο mrna και αν ναι πως σχετίζονται αυτές οι θέσεις και κατά πόσο λειτουργούν στην βάση της ανταγωνιστικότητος

10 Ενας άλλος τρόπος ρύθμισης της μετάφρασης o οποίος συναντάται στην ρύθμιση του ενζύμου τρανσποσάση είναι ή διακοπή της έναρξης μέσω της υβριδοποίησης με ένα συμπληρωματικό antisense RNA. Τα κλάσματα antisense RNA αντιστοιχούν στην μη κωδικοποιούσα αλυσίδα του DNA που είναι συμπληρωματική του 5 άκρου του mrna

11

12 Σε πολλές περιπτώσεις οι ταχύτητες μετάφρασης αλλάζουν μέσα σε μερικά λεπτά μετά την δράση των παραγόντων επαγωγής Πράγμα πού σημαίνει οτι κατά τους ρυθμιστικούς μηχανισμούς επισυμβαίνουν ταχείες αλλαγές στις ειδικές ενεργότητες των εξαρτημάτων της μηχανής της πρωτεινοσύνθεσης παρά αλλαγές στην συγκέντρωση του κάθε συστατικού

13 Για να δειχθεί ότι η φωσφορυλίωση συμμετέχει στον μεταφραστικό έλεγχο και για να χαρακτηρίσουμε τους ρυθμιστικούς δρόμους είναι απαραίτητο Να προσδιορίσουμε τις θέσεις και την στοιχειομετρία της φωσφορυλίωσης Ιn n vivo Να δειχθεί ότι η αλλαγή στην έκταση της φωσφορυλίωσης αλλάζει την ταχύτητα μετάφρασης In vivo και την ειδική ενεργότητα των πρωτεινών In vitro Να προσδιορισθούν οι κινάσες και οι φωσφατάσες των πρωτεινών που συμμετέχουν Να διερευνηθεί πως ελέγχεται η φωσφορυλίωση και η αποφωσφορυλίωση

14

15 Η μελέτη της ρύθμισης της πρωτεινοσύνθεσης στο επίπεδο του Ριβοσώματος εντοπίζεται σε τρία επίπεδα Στον ρόλο των διαφόρων ομάδων των ριβοσωμικών πρωτεινών. Κατά πόσο δηλαδή υπάρχει ετερογένεια στις πρωτείνες στα διάφορα ριβοσώματα που απομονώνονται από τους διάφορους οργανισμούς Κκατα πόσο συγκεκριμένες ομοιοπολικές τροποποιήσεις σε συγκεκριμένες πρωτείνες παίζουν ρυθμιστικό ρόλο Στους μηχανισμούς μεσω των οποίων επιτυγχάνεται η ρύθμιση της σύνθεσης των διαφόρων ριβοσωμικών πρωτεινών Στιον ρόλο τον οποίο μπορεί να εχουν οι δομές των διαφόρων RNA

16 Χαρακτηριστικά της Πρωτεϊνης S6 H H S6 είναι ιδιαίτερα σημαντική πρωτεΐνη στην 40S υπομονάδα μια και βρίσκεται στην περιοχή δέσμευσης του mrna Η πρωτεΐνη φωσφορυλιώνεται σε περισσότερα από πέντε παράγωγα σερίνης τα οποία μάλιστα συσσωρεύονται στην καρβοξυτελική περιοχή Τα μιτογόνα επάγουν την φωσφορυλίωση πράγμα που υποδηλώνει ότι το γεγονός της φωσφορυλίωσης αυτό καθ αυτό παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της κυτταρικής διαφοροποίησης Αυξημένη φωσφορυλίωση στην S6 σχετίζεται με ενεργοποίηση στην πρωτεινοσύνθεση που εντοπίζεται κύρια στο επίπεδο της έναρξης Αν και έχει υποστηριχθεί ότι η 40S υπομονάδες οι οποίες έχουν φωσφορυλιωμένη την S6 είναι μέχρι και τέσσερις φορές πιο ενεργείς στην σύνθεση της γλοβίνης κάτι τέτοιο δεν έχει παρατηρηθεί σε κλασματωμενο In vitro συστήματα

17 Φωσφορυλίωση της S6 εχει διαπιστωθεί στα ριβοσώματα που απομονώνονται Από δικτυοκύτταρα κουνελιού Από κύτταρα ασκίτου ποντικού Απο μια νησίδα καρκινικών κυττάρων από ποντικούς τύπου Hamster Από κύτταρα μυελώματος ποντικού Από λεμφοκύτταρα θύμου αδένα Από το πρωτόζωο Tetrahymena Από ζύμη Από Φυτά

18 Χαρακτηριστικά της Φωσφορυλίωσης της S6 Φωσφορυλιώνεται από μια υψηλής ειδικότητος κινάση ειδική για την S6 η οποία εντοπίζεται σε μια ποικιλία κυτταρικών τύπων η οποία όμως προς το παρόν όμως δεν έχει πλήρως προσδιορισθεί Η κινάση ενεργοποιείται με φωσφορυλίωση στην Σερίνη ή την θρεονίνη και αποφωσφορυλιώνεται με μια φωσφατάση τύπου 2Α Η φωσφορυλιωμένη S6 αποφωσφορυλιώνεται από μια πρωτεϊνική φωσφατάση τύπου Ι η οποία ρυθμίζεται από την Ινσουλίνη και τον αντίστοιχο παράγοντα ανάπτυξης Το γεγονός ότι η φωσφορυλίωση της S6 διεγείρεται με φορβολικούς εστέρες υποδηλώνει πιθανά ότι η πρωτεϊνική κινάση C είναι ένας από τους δρόμους που ρυθμίζουν την ενεργότητα της S6 Από την Κλωνοποίηση του cdna που κωδικοποιεί για την κιναση S6 στο Xenopus προκύπτουν δεδομένα για την παρουσία δύο δραστηριοτήτων κινασών μία πού είναι ομόλογη με την πρωτεϊνική κινάση C και μια πού είναι ομόλογη με την φωσφορυλάση b

19 Από την πρώτη ουσιαστική διερευνηση των ριβοσωμικών πρωτεινών στην E.coli διαπιστώθηκε η παρουσία μεταξύ των βασικών πρωτεινών μιας ομάδας ασυνηθιστα όξινων πρωτεινών Μεταξύ των πρωτεινων αυτών περιλαμβανόταν δυο διμερή των πρωτεινών L7/L12 καθώς και η L10 Ζεύγη των πρωτεινών αυτών διαπιστώθηκαν σε ολα τα ευκαρυωτικά ριβοσώματα

20 Χαρακτηριστικά των οξίνων Ριβοσωμικών Πρωτεινών Ολες οι οξινες πρωτείνες φαίνονται να είναι λειτουργικά ομόλογες ομως οι ευκαρυωτικές εχουν ωρισμένες ιδιότητες οι οποίες πιθανά υποδηλώνουν οτι τα πεπτίδια αυτά εμπλέκονται στην μεταφραση των διαφόρων ευκαρυωτικών μηνυμάτων Η οικογενεια των οξίνων ευκαρυωτικών πρωτεινών πού σχηματίζεται από δύο ή περισσότερα πολυπεπτίδια παρουσιάζει μια υψηλή συντηρητική αλληλουχία αμινοξέων

21 Η Οικογενεια των οξίνων Ριβοσωμικών Πρωτεινών διαιρούνται σε δυο υποομάδες με τα προτεινόμενα ονόματα Ρ1 και Ρ2 Ο αριθμός των πρωτεινών σε κάθε υποομάδα ποικίλει αναλογα με τον οργανισμό. Στον ανθρωπο στην Artemia salina και στην Drosophila melanogaster εχει βρεθει μόνο μια πρωτεινη απο κάθε ομάδα Στους ζυμομυκητες εχουν βρεθει δύο και ονομαζονται οι δυο Ρ1 πρωτεϊνες ΥΡ1α και ΥΡ1β και οι δύο Ρ2 ΥΡ2α και ΥΡ2β Στο τρυπανόσωμα μεγαλύτερος αριθμός

22 Οι Οξινες ριβοσωμικες πρωτεινες παρουσιάζουν μεγαλες ομοιότητες Η ομοιότητα είναι ιδιαιτερα υψηλή στην καρβοξυτελικη περιοχή η αλληλουχια DMGFGLFD εχει βρεθει πρακτικά σε ολους τους οργανισμός από τον ζυμομύκητα μεχρι τον ανθρωπο Συντηρητικες ειναι επίσης οι αμινοτελικές περιοχες των Ρ2 πρωτεινών αν και εχουν παρατηρηθεί μικροδιαφορες στις φυτικές πρωτείνες Οι πρωτείνες Ρ1 και Ρ2 εχουν ενα ενδιαφερον δομικό χαρακτηριστικό εχουν καλυμμένο ακρο κατι που τις διαφοροποιεί από τις αλλες πρωτείνες Ο υψηλά συντηρητικός χαρακτήρας αυτών των περιοχών που τις διαφοροποιεί από τις ριβοσωμικές εισηγείται οτι πιθανά οι περιοχές αυτές συμμετέχουν σε αγνωστη λειτουργία

23 Εχει σημερα βρεθεί οτι η αντιστοιχη της L10 των προκαρυωτικών ριβοσωμικών πρωτεινών είναι η Ρο των ευκαρυωτικών Η ταυτοποίηση εγινε στην αρχή με βαση τα αποτελεσματα που παρουσιαζόταν με τις αντεπιδρασεις με ωρισμένα ειδικά αντισώματα εναντι των οξίνων ριβοσωμικών πρωτεινών, Η επιβεβαίωση εχει γίνει σημερα με τον προσδιορισμό της αλληλουχίας των αμινοξέων στις υπο διερευνηση πρωτείνες

24 Στο ευκαρυωτικό κύτταρο το 85% του ολικού RNA αποτελείται από τα τεσσερα ριβοσωμικά RNA και το 15% των πρωτεινών από τις ριβοσωμικες πρωτεϊνες Το ερώτημα που διαμορφώνεται είναι πως ολα αυτά τα μακρομόρια πού συμμετέχουν στην συγκρότηση του ριβοσώματος κατορθώνουν να ρυθμίζουν την σύνθεση και την συσσώρευση τους ωστε την καθε χρονική στιγμή να καλύπτονται οι ανάγκες του κυτταρου για ριβοσώματα

25 Η ισσοροπη εκφραση των ριβοσωμικών συστατικών εξασφαλίζεται Με ρυθμιστικούς μηχανισμούς κατα την μεταγραφή που ρυθμίζουν την εκφραση των μηνυμάτων για τις διάφορες πρωτείνες Με ρυθμιστικούς μηχανισμούς πού αναπτυσσονται κατα την μεταφραση των μηνυματων που κωδικοποιούν για τις ριβοσωμικές πρωτεϊνες Με ρυθμιστικούς μηχανισμούς πού ελεγχουν την ημιζωή των RNA και την ημιζωή των πρωτεινών

26 Η ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν για τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες μελετάται σε συστήματα τα οποία κατατάσσονται σε δύο κατηγορίες Σε συστήματα που κατασκευάζονται από αρχικά σταδια ανάπτυξης συγκεκριμένων οργανισμών. Τα συστήματα αυτά παρέχουν το πλεονέκτημα οτι οι ταχύτητες σύνθεσης των ριβοσωμάτων πλησιάζουν τις ακραίες τιμές σε σχετικα μικρά χρονικά διαστήματα Σε συστήματα τα οποία δημιουργούνται από κυτταροκαλλιέργειες οι οποίες αναπτύσσονται υπό ελεγχόμενες συνθήκες

27 Οι ζυμομύκητες συνιστούν ένα πολύ ενδιαφέρον σύστημα για την διερευνηση της ρύθμισης της έκφρασης των γονιδίων των ριβοσωμικών πρωτεινών και τουτο διότι Μπορούν να αναπτυχθούν σε μια μεγάλη ποικιλία θερμικών και θρεπτικών συνθηκών Υφίστανται μια σειρά φυσιολογικές διεργασίες όπως η σποριογένεση Μπορούν ευκολα να εισαχθούν στο γενετικό υλικό αγρίων ή μεταλλαγμένων στελεχών γονιδίων σε ένα ή περισσότερα αντίγραφα Τα γονίδια μπορούν να εισαχθούν είτε σαν αυτόνομα στοιχεία ή σε επιλεγμένες περιοχές και έτσι να κατορθωθεί η διατάραξη της εξισορροπημένης παραγωγής ριβοσωμικών πρωτεινών και να εμφανισθούν κρυμμένοι ρυθμιστικοί μηχανισμοί

28 Εχει κατορθωθεί σήμερα να κλωνοποιηθούν τα γονίδια για μια σειρά ριβοσωμικές πρωτείνες Εχει διαπιστωθεί Αλλες ριβοσωμικές πρωτείνες κωδικοποιούνται από γονίδια πού βρίσκονται σε ενα αντίγραφο και αλλες ισως οι περισσότερες από γονίδια πού βρίσκονται σε περισσότερα αντιγραφα Σε ωρισμένες περιπτώσεις ισως στις περισσότερες και τα δύο αντίγραφα εκφράζονται Δεδομένου οτι οι ριβοσωμικές πρωτείνες ευρίσκονται σε ισομοριακη αναλογία το ερώτημα που προκύπτει είναι με ποιο τρόπο γίνεται η ρύθμιση στις περπτώσεις πού γίνεται κωδικοποίηση από δύο γονίδια Η πλέον γρήγορη βέβαια απάντηση είναι οτι στις πρωτείνες πού εχωμε κωδικοποίηση από δύο γονίδια εχωμε μικρότερη εκφραση

29 Η ριβοσωμική πρωτείνη S1 κωδικοποιείται από δύο γονίδια Δημιουργία ελλειψης σε ενα εκ των δύο αντιγράφων γονιδίων τα οποία κωδικοποιούν για την S1 εχει σαν συνέπεια μικρότερη παραγωγή m-rna για την συγκεκριμένη πρωτείνη πού οδηγεί σε ελλειψη ριβοσωμάτων και τελικά σε θάνατο Το συμπέρασμα πού βγαίνει είναι οτι καθε ενα από δύο αντίγραφα του γονιδίου συνεισφέρει μόνο εν μέρει στο σύνολο του m-rna που κωδικοποιεί για την συγκεκριμένη πρωτεϊνη

30 O Warner και οι συνεργάτες του εκαναν ενα πείραμα εισήγαγαν στο γονιδίωμα των ζυμομυκήτων πρόσθετα αντίγραφα γονιδίων που κωδικοποιούσαν για ριβοσωμικές πρωτείνες Διεπίστωσαν οτι Οταν εισήγαγαν αντίγραφα των γονιδίων που κωδικοποιούσαν για τις L3 και L29 που υπήρχαν σε ενα αντίγραφο τότε εμφανιζόταν μια αύξηση φορές στο mrna που κωδικοποιεί για τις συγκεκριμένες πρωτεϊνες Όταν έκαναν εισαγωγή 10 αντιγράφων γονιδίων για την S10 που βρίσκεται σε δύο αντίγραφα η μεταγραφή για την συγκεκριμένη πρωτεΐνη αυξανόταν μόνο κατά πέντε φορές Απο τα παραπάνω βγαίνει το συμπέρασμα οτι ο σακχαρομύκητας αντιδρά στην αύξηση του περιεχομένου σε γονίδια απλά χαμηλώνοντας την ταχύτητα μεταγραφής

31 Εκτός από τον έλεγχο στο μεταγραφικό επίπεδο για την ρύθμιση της σύνθεσης των ριβοσωμικών πρωτεινών φαίνεται να υπάρχει και ρύθμιση στο μεταφραστικό ο οποίος και συνεισφέρει ουσιαστικά στην εξισορρόπηση της σύνθεσης των ριβοσωμικών πρωτεινών Η συσσώρευση των μηνυμάτων για μια συγκεκριμένη ριβοσωμική πρωτεΐνη που προκύπτει κατά την μεταγραφή άλλες φορές επηρεάζει την σύνθεση της ίδια ή άλλης πρωτεΐνης άλλες όμως φορές οδηγεί σε μη ανιχνεύσιμη αύξηση. Οι λόγοι δεν είναι γνωστοί αλλά σχετίζονται με την σταθερότητα που έχει το μήνυμα που κωδικοποιεί για την κάθε ριβοσωμική πρωτεΐνη Από τις επιδράσεις που ασκούνται στην 3 και την 5 μη μεταφραζόμενη περιοχή Με την σταθερότητα αυτών καθ εαυτών των ριβοσωμικών πρωτεινών Στον τρόπο κατανομής του μηνύματος που κωδικοποιεί για μια ριβοσωμική πρωτεΐνη μεταξύ μικρών και μεγάλων πολυσωμάτων