ΙΩΑΝΝΑ ΠΑΠΑΝΤΩΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΩΝ ΥΨΗΛΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΣΤΗ ΦΑΡΜΑΚΟΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΕΞΑΤΟΜΙΚΕΥΜΕΝΗ ΙΑΤΡΙΚΗ

Transcript

1

2

3 ΙΩΑΝΝΑ ΠΑΠΑΝΤΩΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΩΝ ΥΨΗΛΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΣΤΗ ΦΑΡΜΑΚΟΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΕΞΑΤΟΜΙΚΕΥΜΕΝΗ ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΠΑΤΡΑ 2017

4

5 ΙΩΑΝΝΑ ΠΑΠΑΝΤΩΝΗ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΩΝ ΥΨΗΛΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΣΤΗ ΦΑΡΜΑΚΟΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΕΞΑΤΟΜΙΚΕΥΜΕΝΗ ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Ε Ξ Ε Τ Α Σ Τ Ι Κ Η Ε Π Ι Τ Ρ Ο Π Η ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΠΑΤΡΙΝΟΣ ΒΑΘΜΙΔΑ: ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ / ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΛΟΥΚΑΣ ΒΑΘΜΙΔΑ: ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΠΑΪΡΑΣ ΒΑΘΜΙΔΑ: ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ

6

7 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στις Φαρμακευτικές Επιστήμες και την Τεχνολογία του τμήματος Φαρμακευτικής, του Πανεπιστημίου Πατρών στην κατεύθυνση Μοριακή Φαρμακολογία, Βιοφαρμακευτική και Βιομοριακή Ανάλυση. Πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας κατά τα ακαδημαϊκά έτη , υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή Πατρινού Γεώργιου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω από καρδιάς τον Αναπληρωτή Καθηγητή Γεώργιο Πατρινό για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε όλα αυτά τα χρόνια, την συνεχή στήριξή του και την άριστη συνεργασία μας. Η καθοδήγησή του υπήρξε καθοριστικός παράγοντας για την ολοκλήρωση της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας. Αποτελεί για μένα πηγή έμπνευσης και παράδειγμα προς μίμηση. Ευχαριστώ θερμά και τα άλλα δύο μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, τον Αναπληρωτή Καθηγητή Γεώργιο Παϊρα και τον Αναπληρωτή Καθηγητή Ιωάννη Λουκά, για την αποδοχή τους να αποτελέσουν μέρος της εν λόγω εργασίας. Τους ευχαριστώ για το χρόνο και τη συνεργασία τους. Η παρουσία τους με τιμά ιδιαιτέρως. Θα ήθελα να αποδώσω ιδαίτερες ευχαριστίες στην Δρ. Θεοδώρα Κατσίλα για την αστείρευτη στήριξη της εντός και εκτός εργαστηρίου, τις αναρίθμητες συμβουλές της και την εμπιστοσύνη της. Ακόμη, ευχαριστώ ολόψυχα την Δρ. Μαρίνα Μπαρτσακούλια για την συνεχή βοήθειά της καθ όλη τη πορεία ολοκλήρωσης αυτής της εργασίας, για την ειλικρίνεια, το ήθος, την εμπιστοσύνη. Την ευχαριστώ που ήταν πάντα δίπλα μου, κάθε ώρα και μέρα από κάθε άκρη της γης. Ακόμη, δεν μπορώ να μην ευχαριστήσω τη Δρ. Ευαγγελία-Ειρήνη Τσερμπίνη και την υποψήφια διδάκτορα Ζωή Ζαγορίτη για την στήριξη και τη βοήθεια, τη προθυμία και τη φιλία τους. Ήταν δίπλα μου σε κάθε δυσκολία αλλά και χαρά και τις ευχαριστώ από καρδιάς για τον πολύτιμο χρόνο που μου αφιέρωσαν. Επιπλέον, ευχαριστώ πολύ όλα τα υπόλοιπα μέλη του Εργαστηρίου Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας για τη συνεργασία και το ζεστό χαμόγελό τους που με έκαναν να ανυπομονώ να βρεθώ στο εργαστήριο!

8 Τέλος, αποδίδω τη μέγιστη ευγνωμοσύνη στην οικογένεια μου, τους γονείς μου Κυριακή και Χρήστο, την αδερφή μου Θάλεια και στους φίλους μου για την ανιδιοτελή αγάπη, την στήριξη, την υπομονή Τους ευχαριστώ για όσα μου έχουν προσφέρει όλα αυτά τα χρόνια, για αυτό που είμαι σήμερα και για τα εφόδια που μου έχουν δώσει για να συνεχίσω στο αύριο Αισθάνομαι τυχερή που σε όλη την διάρκεια της παρούσας εργασίας, και όχι μόνο, είχα δίπλα μου τόσο σημαντικούς ανθρώπους. Χάρη σε αυτούς κατέστη δυνατή η ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας. Ειλικρινα, τους ευχαριστώ για όλα. Alone we can do so little; together we can do so much -Hellen Keller Παπαντώνη Ιωάννα Πάτρα, 2017

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Φαρμακογονιδιωματική: Μια επαναστατική επιστήμη Η φαρμακογονιδιωματική από το τότε μέχρι το σήμερα: μια ιστορική αναδρομή Βαρφαρίνη και φαρμακογονιδιωματική Τεχνολογίες Υψηλής Ανάλυσης Η Τεχνολογία των Μικροσυστοιχιών Οι μικροσυστοιχίες DNA στη φαρμακογονιδιωματική Στο Δρόμο Προς Την Εξατομικευμένη Ιατρική Η συμβολή της φαρμακογονιδιωματικής Η πλατφόρμα DMET Το περιεχόμενο της πλατφόρμας DMET Προδιαγραφές απόδοσης και ποιότητα δεδομένων Πλεονεκτήματα και Μειονεκτήματα της πλατφόρμας DMET Το λογισμικό ανάλυσης DMET Console ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ: ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Συλλογή Δειγμάτων Απομόνωση Ολικού Γονιδιωματικού DNA Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA Γονοτύπηση με τη πλατφόρμα DMET Στάδιο 1 ο mpcr Στάδιο 2 ο Anneal Στάδιο 3 ο Πλήρωση Κενού (Gap Fill) Mέσω Eνίσχυσης (Amplification) Στάδιο 4 ο Καθαρισμός Προϊόντων PCR και Πρώτο QC Gel Στάδιο 5 ο Fragmentation και Δεύτερο QC Gel Στάδιο 6 ο Labeling Στάδιο 7 ο Hybridization (Υβριδοποίηση) Στάδιο 8 ο Washing, Staining, Scanning (Πλύση, Βαφή και Σάρωση) Ανάλυση δεδομένων με το λογισμικό DMET Console Επιλογή σημαντικών βιοδεικτών και ορισμός σημαντικών γονοτύπων Υπολογισμός δόσης της βαρφαρίνης στον ελληνικό πληθυσμό ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ i

10 4.1. Ανάλυση δεδομένων με το λογισμικό DMET Console Ποιοτικός Ελεγχος Σύγκριση Πληθυσμών Ελλήνων και Ευρωπαίων Για Τους 36 Επιλεγμένους Βιοδείκτες με Φαρμακογενωμικό Ενδιαφέρον Πρόβλεψη Φαινοτύπου Για 20 Σημαντικά Φαρμακογονίδια Στον Ελληνικό Πληθυσμό Υπολογισμός δόσης βαρβαφρίνης στον ελληνικό πληθυσμό ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΤΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Α: Πίνακας βιοδεικτών εγκεκριμένων από τον FDA (προσαρμογή από: Pharmacogenetics/ucm htm) ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Β: Γραφήματα «Marker Summary» όπως αυτά δίνονται από το πρόγραμμα DMET Console για τους 36 επιλεγμένους βιοδείκτες ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Γ: Δημοσίευση που περιέχει τα αποτελέσματα της παρούσας διπλωματικής εργασίας ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ii

11 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1: Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα που περιγράφουν το μεγάλο εύρος των ορισμών της εξατομικευμένης ιατρικής (προσαρμογή από FDA, 2013) Πίνακας 2: Οι κατηγορίες και τα γονίδια που περιλαμβάνει η πλατφόρμα DMET (Από Sissung et al.,2010) Πίνακας 3: Επιλεγμένη λίστα γονιδίων της πλατφόρμας DMET και αντίστοιχα συσχετιζόμενα μονοπάτια φαρμάκων (Από Sissung et al., 2010) Πίνακας 4: Προδιαγραφές απόδοσης και ποιότητα δεδομένων της πλατφόρμας DMET (προσαρμογή από Afyymetrix) Πίνακας 6: Αντιδραστήρια σταδίου Πίνακας 7: mpcr Master Mix Πίνακας 8: Αντιδραστήρια σταδίου Πίνακας 9: Anneal Master Mix Πίνακας 10: Αντιδραστήρια σταδίου Πίνακας 11: Αντιδραστήρια σταδίου Πίνακας 12: Αντιδραστήρια σταδίου Πίνακας 13: Fragmentation Master Mix Πίνακας 14: Αντιδραστήρια σταδίου Πίνακας 15: Labeling Master Mix Πίνακας 16: Αντιδραστήρια σταδίου Πίνακας 17: Αντιδραστήρια σταδίου Πίνακας 18: Ρυθμιζόμενοι παράμετροι γονοτύπησης του λογισμικού DMET Console Πίνακας 19: Σύνολα γονιδίων για τα οποία δίνονται πληροφορίες στο επίπεδο δεικτών και στο επίπεδο φαινοτυπου Πίνακας 20: Σημαντικοί επιλεγμένοι βιοδείκτες με φαρμακογενωμικό ενδιαφέρον Πίνακας 21: Ο φαρμακογενετικός αλγόριθμος υπολογισμού δόσης βαρφαρίνης του IWPC. Το αποτέλεσμα του αλγορίθμου πρέπει να υψωθεί στο τετράγωνο προκειμένου να υπολογιστεί η εβδομαδιαία δόση της βαρφαρίνης (προσαρμογή από: International Warfarin Pharmacogenetics Consortium, 2009) Πίνακας 22: Σύνοψη του «CHP Summary Table» Πίνακας 23: Παράμετροι «Marker Call Rate» και «Probe Set ID» για τους φαρμακογενωμικούς δείκτες ενδιαφέροντος Πίνακας 24: Αποτελέσματα συχνοτήτων για 36 επιλεγμένους βιοδείκτες στον ελληνικό και τον καυκάσιο πληθυσμό Πίνακας 25: Αποτελέσματα στατιστικής ανάλυσης για τη σύγκριση του ελλληνικού και του καυκάσιου πληθυσμού για 36 επιλεγμένους βιοδείκτες iii

12 Πίνακας 26: Προβλέψεις φαινοτύπου για 20 σημαντικά φαρμακογονίδια στον ελληνικό πληθυσμό με τη βοήθεια του λογισμικού DMET Console Πίνακας 27: Αποτελέσματα στατιστικής ανάλυσης αναφορικά με τη δόση της βαρφαρίνης στον ελληνικό πληθυσμό και συγκριτικά με το μέσο όρο του ευρωπαϊκού πληθυσμού iv

13 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΧΗΜΑΤΩΝ-ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα 1: Η φαρμακευτική δείχνει τον δρόμο για την εξατομικευμένη θεραπεία. Στο αριστερό μέρος της εικόνας φαίνεται η προσέγγιση σύμφωνα με την οποία όλοι οι ασθενείς χορηγούνται την ίδια δόση ενός φαρμάκου ανεξάρτητα γονοτύπου. Αντίθετα, στο δεξί μέρος φαίνεται η εξατομικευμένη προσέγγιση της θεραπείας κατά την οποία κάθε ασθενής παίρνει διαφορετική δόση ενός φαρμάκου σύμφωνα με το γονότυπο και συνεπώς και με τον φαινοτυπικό μεταβολισμό του (Προσαρμογή από FDA, 2013) Εικόνα 2: Αριθμός δημοσιευμένων άρθρων στη βιβλιογραφική βάση MEDLINE (Pubmed) ανά έτος ( 4 Εικόνα 3: Η σχέση φαρμακογενετικής και φαρμακογονιδιωματικής (Roden et al., 2016)... 5 Εικόνα 4: Ένα ιστορικό χρονοδιάγραμμα για τη φαρμακογονιδιωματική (προσαρμογή από Meyer et al., 2014)... 9 Εικόνα 5: Η πορεία της σύγχρονης ιατρικής και η σύνδεση των διαφορετικών της προσεγγίσεων Εικόνα 6: Ποσοστό των ασθενών οι οποίοι δεν επωφελούνται από την θεραπεία τους για διάφορες σοβαρές ασθένειες (Από FDA, 2013) Εικόνα 7: Στο δρόμο για την εξατομικευμένη ιατρική: μια πορεία εφαρμογής. Ο όρος P5 Medicine προέρχεται από τις λέξεις Predictive, Preventive, Personalized και Participatory οι οποίες αναφέρονται στην νέα μορφή εξατομικευμένης ιατρικής (Anaya et al., 2016) Εικόνα 8: Ένα παράδειγμα αποδεκτής μέτρησης στο Nanodrop Εικόνα 9: Συνοπτική απεικόνιση της τεχνολογίας MIP Εικόνα 10: Συνοπτική διαγραμματική απεικόνιση της διαδικασίας που ακολουθείται κατά την δοκιμή DMET Εικόνα 11: Προετοιμασία της πλάκας GP Εικόνα 12: Προετοιμασία της πλάκας GP Εικόνα 13: Προετοιμασία της πλάκας mpcr Εικόνα 14: Πρόγραμμα DMET mpcr Εικόνα 15: Προετοιμασία της πλάκας ANN Εικόνα 16: Πρόγραμμα DMET Anneal Εικόνα 17: Προετοιμασία της πλάκας ASY Εικόνα 18: Πρόγραμμα DMET Assay Εικόνα 19: Πρόγραμμα DMET PCR Clean Up Εικόνα 20: Παράδειγμα καλής εικόνας του πρώτου QC Gel. Κάποιες φορές μια δεύτερη μπάντα μεγέθους ~75 bp χαμηλότερης έντασης μπορεί να είναι εμφανής. Διαφορετικές εντάσεις μπαντών είναι ένδειξη διαφορετικών ποσοτήτων προϊόντων PCR σε διαφορετικές θέσεις της πλάκας (ladder 25bp) v

14 Εικόνα 21: Πρόγραμμα DMET Frag Εικόνα 22: Παράδειγμα καλής εικόνας του δεύτερου QC Gel Εικόνα 23: Πρόγραμμα DMET Label Εικόνα 24: Προετοιμασία των μικροσυστοιχιών για τη διαδικασία της υβριδοποίησης: α) Πριν την μεταφορά δείγματος στη μικροσυστοιχία το ρύχγος τοποθετείται όπως φαίνεται στην εικόνα, β) μετά την μεταφορά του δείγματος στην μικροσυστοιχία τοποθετούνται μικρά αυτοκόλλητα προς αποφυγή απώλειας δείγματος κατά την υβριδοποίηση στον φούρνο Εικόνα 25: Πρόγραμμα DMET Denature Εικόνα 26: Αρχικό μενού προγράμματος AGCC (Launcher) Εικόνα 27: Αρχικό μενού του AGCC Portal. Επιλογή Batch Registration για τη δημιουργία κενού προτύπου καταγραφής δειγμάτων Εικόνα 28: Συμπλήρωση εγγράφου καταγραφής παρτίδας (batch registration file) Εικόνα 29: Απεικόνιση ενός workspace. Στο δεξί τμήμα φαίνονται οι πίνακες που εμφανίζονται με τη δημιουργία του data set Εικόνα 30: Βασική απεικόνιση των περιεχομένων των Comprehensive και Summary Translation Reports Εικόνα 31: Βασική απεικόνιση των περιεχομένων του Phenotype Translation Report Εικόνα 32: Βοηθητικό υπόμνημα για τον Πίνακα Εικόνα 33: Διαγραμματική απεικόνιση του ποσοστού των διαφόρων φαινοτύπων στον ελληνικό πληθυσμό για τα γονίδια CYP2C19, CYP2C9, CYP3A5, CYP2D6, TPMT και UGT1A Εικόνα 34: Διαγραμματική απεικόνιση του ποσοστού των διαφόρων φαινοτύπων στον ελληνικό πληθυσμό για το γονίδιο VKORC Εικόνα 35: Διαγραμματική απεικόνιση του ποσοστού των διαφόρων φαινοτύπων στον ελληνικό πληθυσμό για το γονίδιο SLCO1B Εικόνα 36: Διαγραμματική απεικόνιση του ποσοστού των διαφόρων φαινοτύπων στον ελληνικό πληθυσμό για τα γονίδια ΝΑΤ1 και ΝΑΤ Εικόνα 37: Διαγραμματική απεικόνιση του ποσοστού των διαφόρων φαινοτύπων στον ελληνικό πληθυσμό για τα γονίδια CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A7, GSTM1, GSTP1 και UGT2B Εικόνα 38: Διαγραμματική απεικόνισης της υπολογιζόμενης εβδομαδιαίας δόσης της βαρφαρίνης στον ελληνικό πληθυσμό vi

15 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΟΙ ΟΡΟΙ ADME (Absorption, Distriburtion, Metabolism, Excretion): Aπορρόφηση, κατανομή, μεταβολισμός και απέκκριση DMET (Drug Metabolizing Enzymes and Trasnporters): Πλατφόρμα γονοτύπησης ενζύμων μεταβολισμού φαρμάκων και μεταφορέων DNA (Deoxyribonucleic Acid): Δεοξυριβονουκλεϊκό Οξύ EMA (European Medicines Association): Ευρωπαϊκός Οργανισμός Φαρμάκων FDA (US Food and Drug Administration): Οργανισμός Τροφίμων και Φαρμάκων Ηνωμένων Πολιτειών Αμερικής G6PD (Glucose-6-phosphate dehydrogenase) : Αφυδρογονάση της 6- φωσφορικής γλυκόζης HER-2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2): Υποδοχέας του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα τύπου 2 HGP (Human Genome Project): Πρόγραμμα χαρτογράφησης του ανθρώπινου γονιδιώματος ICH (International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use): Διεθνές συνέδριο για την εναρμόνιση των Τεχνικών Απαιτήσεων για την Καταχώριση Φαρμακευτικών Προϊόντων για Ανθρώπινη Χρήση INR (International Normalized Ratio): Διεθνής χρόνος εξομάλυνσης IWPC (International Warfarin Pharmacogenetics Consortium): Διεθνής Κοινοπραξία Φαρμακογονιδωματικής της Βαρφαρίνης LC (Liquid Chromatography): Υγρή χρωματογραφία MIPs (Molecular Inversion Probes): Ανάστροφοι μοριακοί ανιχνευτές mpcr (Multiplex Polymerace Chain Reaction): Πολύπλοκη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης MS, MS/MS (Mass Spectrometry, Tandem Mass Spectrometry): Φασματομετρία μάζας, Δίδυμη φασματομετρία μάζας NGS (Next Generation Sequencing): Αλληλούχιση επόμενης γενιάς PTC (Phenylothiocarbamide): Φαινυλοθειοκαρβαμίδιο RNA (Ribonucleic Acid): Ριβονουκλεϊκό Οξύ SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms): Μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί U-PGx (Ubiquitous Pharmacogenomics Consortium): Κοινοπραξία U-PGx WES (Whole Exome Sequencing): Πλήρης αλληλούχηση εξωνίων WGS (Whole Genome Sequencing): Αλληλούχιση ολόκληρου γονιδιώματος vii

16

17 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1

18 2

19 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Φαρμακογονιδιωματική: Μια επαναστατική επιστήμη Ο όρος φαρμακογονιδιωματική αναφέρεται στην επιστήμη που έχει ως αντικείμενο τη μελέτη της επίδρασης της γενετικής ποικιλομορφίας στην ανταπόκριση ασθενών σε φάρμακα. Υπολογίζεται πως περίπου το 50% των ασθενών που λαμβάνουν κάποια θεραπευτική αγωγή ανταποκρίνεται θετικά σε αυτή με το ποσοστό αυτό να κυμαίνεται μεταξύ 20-60%. Το υπόλοιπο 50% των ασθενών είτε δεν ανταποκρίνονται καθόλου στην αγωγή είτε αντιμετωπίζουν ανεπιθύμητες ενέργειες, με αποτέλεσμα η θεραπεία τους να καθυστερεί σημαντικά μέχρι έως ότου κάποια εναλλακτική θεραπεία να επιφέρει τα κλινικά επιθυμητά οφέλη (Squassina et al., 2010). Σήμερα γνωρίζουμε πως αυτή η διαφορά μπορεί να οφείλεται στη σύνθετη αλληλεπίδραση διαφόρων παραγόντων όπως είναι η γενετική σύσταση, το περιβάλλον, η ύπαρξη παθολογικών καταστάσεων, η ηλικία, το φύλο, η εθνικότητα και η πολυφαρμακία. Από αυτούς, η γενετική σύσταση θεωρείται υπεύθυνη σε ένα μεγάλο βαθμο για την ετερογένεια ανταπόκρισης σε φάρμακα (Charlab & Zhang, 2013). Η φαρμακογονιδιωματική, ένα επιστημονικό πεδίο που συνδυάζει στοιχεία γενετικής, γονιδιωματικής και φαρμακολογίας, φαίνεται να δείχνει το δρόμο προς την εξατομικευμένη θεραπεία δίνοντας τη δυνατότητα πρόβλεψης της ασφάλειας και της αποτελεσματικότητας μιας φαρμακευτικής αγωγής (Εικόνα 1) (Schuck & Grillo, 2016). Η επιστημονική κοινότητα ανταποκρίθηκε με μεγάλο ενδιαφέρον απέναντι στο πεδίο της φαρμακογονιδιωματικής κάτι που φαίνεται αναμφισβήτητα από το μεγάλο αριθμό σχετικών δημοσιεύσεων, ιδιαίτερα τα τελευταία 10 χρόνια με τη ραγδαία πρόοδο των μοριακών και γενετικών τεχνολογιών (Meyer, 2004). Σύμφωνα με τα στοιχεία του Medline trend η αύξηση αυτή είναι εμφανής, με τον αριθμό των δημοσιευμένων άρθρων που περιέχουν τον όρο φαρμακογονιδιωματική να είναι περίπου μόλις το (Εικόνα 2). To Medline Trent είναι ένα διαδικτυακό εργαλείο το οποίο χρησιμοποιεί λέξεις κλειδιά ή φράσεις που ορίζει ο χρήστης για να υπολογίσει τον αριθμό των άρθρων που καταχωρούνται ανά έτος στη βιβλιογραφική βάση δεδομένων MEDLINE. 3

20 Εικόνα 1: Η φαρμακευτική δείχνει τον δρόμο για την εξατομικευμένη θεραπεία. Στο αριστερό μέρος της εικόνας φαίνεται η προσέγγιση σύμφωνα με την οποία όλοι οι ασθενείς χορηγούνται την ίδια δόση ενός φαρμάκου ανεξάρτητα γονοτύπου. Αντίθετα, στο δεξί μέρος φαίνεται η εξατομικευμένη προσέγγιση της θεραπείας κατά την οποία κάθε ασθενής παίρνει διαφορετική δόση ενός φαρμάκου σύμφωνα με το γονότυπο και συνεπώς και με τον φαινοτυπικό μεταβολισμό του (Προσαρμογή από FDA, 2013). Εικόνα 2: Αριθμός δημοσιευμένων άρθρων στη βιβλιογραφική βάση MEDLINE (Pubmed) ανά έτος ( 4

21 Σήμερα, ο όρος «φαρμακογονιδιωματική» χρησιμοποιείται εναλλακτικά του όρου «φαρμακογενετική» με τον πρώτο να προτιμάται πλέον περισσότερο. Παρα το γεγονός ότι και οι δύο όροι αφορούν την επίδραση της γενετικής ποικιλότητας στον μεταβολισμό και την ανταπόκριση των φαρμάκων, υπάρχουν διαφορές μεταξύ τους (Εικόνα 3). Πιο συγκεκριμένα, η φαρμακογενετική ασχολείται με τη μελέτη συγκεκριμένων γενετικών δεικτών, συνήθως γνωστής λειτουργίας, σε συγκεκριμένα και πολλές φορές μεμονωμένα γονίδια. Οι γενετικοί αυτοί δείκτες είναι συνήθως μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί ή αλλιώς SNPs, δηλαδή διαφορές ενός μόνο νουκλεοτιδίου που απαντώνται τουλάχιστον στο 1% του πληθυσμού. Με την πάροδο των ετών και την πρόοδο της έρευνας έγινε εμφανές πως η γενετική ποικιλότητα που επηρεάζει την ανταπόκριση στα φάρμακα μπορεί να είναι αποτέλεσμα πολύπλοκων σχέσεων μεταξύ πολλαπλών γονιδίων. Στα πλαίσια της ανάγκης για έρευνα αυτής της πολυπλοκότητας, η φαρμακογενετική ουσιαστικά εξελίχθηκε στη φαρμακογονιδιωματική η οποία είναι η ανάλυση γενετικών παραγόντων που σχετίζονται με την ανταπόκριση στα φάρμακα σε επίπεδο ολόκληρου του γονιδιώματος εντοπίζοντας SNPs αλλά και άλλου είδους γενετικές διαφορές που μπορεί να είναι γνωστής ή και άγνωστης λειτουργίας (Charlab & Zhang, 2013; Ventola, 2013). Εικόνα 3: Η σχέση φαρμακογενετικής και φαρμακογονιδιωματικής (Roden et al., 2006). Στη βιβλιογραφία υπάρχουν πολλοί ορισμοί για την φαρμακογενετική και τη φαρμακογονιδιωματική που κάποιες φορές δεν συνάδουν μεταξύ τους προκαλώντας σύγχυση. Επίσημοι ρυθμιστικοί φορείς, όπως ο Οργανισμός 5

22 Τροφίμων και Φαρμάκων των Ηνωμένων Πολιτειών Αμερικής (US Food and Drug Administration, FDA) και ο Ευρωπαϊκός Οργανισμός Φαρμάκων (European Medicine Association, EMA), ακολουθώντας τις κατευθυντήριες οδηγίες του Διεθνούς Συνεδρίου για την Εναρμόνιση των Τεχνικών Απαιτήσεων για την Καταχώριση Φαρμακευτικών Προϊόντων για Ανθρώπινη Χρήση (International Conference On Harmonisation Of Technical Requirements For Registration Of Pharmaceuticals For Human Use, ICH) ορίζουν τη φαρμακογονιδιωματική ως: «η μελέτη των παραλλαγών του DNA και των χαρακτηριστικών του RNA που σχετίζονται με την ανταπόκριση σε φάρμακα», ενώ τη φαρμακογενετική ως ένα υποσύνολο της φαρμακογονιδιωματικής που είναι: «η μελέτη των παραλλαγών της αλληλουχίας του DNA που σχετίζονται με την ανταπόκριση σε φάρμακα» (ICH Topic E15, 2007; FDA, 2008; EMA, 2007). Όπως θα συζητηθεί και στη συνέχεια, η φαρμακογονιδιωματική έχει μεγάλο αντίκτυπο στην εξέλιξη της φαρμακολογικής και γενετικής έρευνας. Το ενδιαφέρον και η ανταπόκριση τόσο της ευρύτερης επιστημονικής κοινότητας όσο και άλλων έμμεσα και άμεσα ενδιαφερόμενων φορέων, την καθιστούν μια επαναστατική και πολλά υποσχόμενη επιστήμη Η φαρμακογονιδιωματική από το τότε μέχρι το σήμερα: μια ιστορική αναδρομή Παρά το γεγονός πως η φαρμακογονιδιωματική έχει γνωρίσει ιδιαίτερη άνθιση τα τελευταία 50 χρόνια, έχει τις απαρχές της από πολύ παλιά, περίπου το 510 π.χ., όταν ο Πυθαγόρας παρατήρησε πως η κατανάλωση φασολιών φάβας είχε ως αποτέλεσμα μια δυνητικά θανατηφόρα επίδραση σε ενα συνολο ατόμων. Το γεγονός αυτό συνδέθηκε πολύ αργότερα με την ανεπάρκεια του ενζύμου αφυδρογονάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης (G6PD) (Nebert, 1999). Η φαρμακογονιδιωματική θα κάνει ξανά έντονα την εμφάνισή της πολλά χρόνια αργότερα, περίπου το 1908, όταν ο Archibald Garrod, ένας Άγγλος ιατρός, με το βιβλίο του «Inborn Errors of Metabolism» εισάγει τον όρο «chemical individuality» αναφερόμενος στις παρατηρήσεις του ότι η γενετική ποικιλότητα μπορεί να ευθύνεται για διαφορετικές ανταποκρίσεις σε φάρμακα. Ο Garrod, με εξαιρετική διορατικότητα, ανέφερε συγκεκριμένα πως: 6

23 «...Κάθε δραστικό φάρμακο είναι ένα δηλητήριο, όταν λαμβάνεται σε αρκετά μεγάλες δόσεις. Σε μερικά υποκείμενα μια δόση η οποία είναι αβλαβής στην πλειοψηφία των ανθρώπων, είναι τοξική σε αυτά ενώ άλλα εμφανίζουν εξαιρετική ανοχή για το ίδιο φάρμακο.» - A. Garrod, 1908 Παρά τις πολύ εύστοχες παρατηρήσεις του Garrod, η πρώτη μελέτη σχετικά με τη φαρμακογονιωματική δημοσιεύτηκε το 1932 από τον L.H. Snyder (Snyder, 1932). Η μελέτη αυτή είχε ως αντικείμενο την την αδυναμία κάποιων ατόμων να γευτούν το χημικό φαινυλοθειοκαρβαμίδιο (PTC), γεγονός που οφειλόταν στη διαφορετική γενετική σύσταση των ατόμων που το δοκίμαζαν. Μελετώντας 800 οικογένειες ο Snyder παρατήρησε πως το χαρακτηριστικό αυτό κληρονομούνταν με αυτοσωματικό υπολειπόμενο τρόπο και πως η συχνότητα του διέφερε σε πληθυσμούς διαφορετικής εθνικότητας (Snyder, 1932). Τη δεκαετία του 50, με την ανάπτυξη νέων τεχνικών που επέτρεπαν πιο ακριβείς μετρήσεις δραστηριότητας ενζύμων, φαρμακευτικών ουσιών και ανταποκρίσεων, η φαρμακογονιδιωματική αναπτύχθηκε ως ένας ξεχωριστός επιστημονικός κλάδος. Μια σειρά από παρατηρήσεις και δημοσιεύσεις οδήγησαν στην γρήγορη εξάπλωση του κλάδου και στην επινόηση του όρου «φαρμακογενετική» το 1959 από τον Γερμανό γενετιστή Friedrich Vogel. Μόλις τρία χρόνια μετά, το 1962, δημοσιεύεται το πρώτο βιβλίο με αποκλειστικό περιεχόμενο τη φαρμακογενετική από τον Werner Kalow ο οποίος κάνει μια ανασκόπηση όλων των δημοσιευμένων εργασιών που αναφέρουν περιπτώσεις όπου γενετικοί παράγοντες επηρεάζουν την ανταπόκριση σε χημικά και φάρμακα (Kalow, 1962). Λόγω της μεγάλης ανάπτυξης του πεδίου, δημιουργήθηκε μια κοινότητα ερευνητών με μεγάλο ενδιαφέρον για την φαρμακογενετική, και έτσι το πρώτο παγκόσμιο συνέδριο φαρμακογενετικής έλαβε χώρα στη Νέα Υόρκη μόλις το Στα επόμενα χρόνια ακολούθησαν πολλά ακόμη συνέδρια και συμπόσια ενώ ταυτόχρονα η δημοσίευση πλήθους ερευνών με αντικείμενο την φαρμακογενετική είχαν μεγάλο αντίκτυπο (Meyer, 2004). Ο όρος «φαρμακογονιδιωματική» εμφανίστηκε στην βιβλιογραφία στα τέλη της δεκαετίας του 1990, λίγο πριν την ολοκλήρωση του χάρτη της ποικιλότητας του ανθρώπινου γονιδιώματος (Single Nucleotide Polymorphisms Map, SNP Map) (The International SNP Map Working Group, 2001) και του 7

24 προγράμματος χαρτογράφησης του ανθρώπινου γονιδιώματος (Human Genome Project, HGP) (International Human Genome Sequencing Consortium, 2004; Venter et al., 2001) το 2000 και το 2003 αντίστοιχα. Τα δύο αυτά προγράμματα-σταθμοί στην ιστορία της φαρμακογονιδιωματικής ενίσχυσαν την άποψη ότι πολλά γονίδια είναι πολυμορφικά, γεγονός που σηματοδότησε τηναρχή μιας νέας εποχής για τη γενετική (Charlab & Zhang, 2013). Το 2005, ανακοινώνεται από τον FDA, η πρώτη έγκριση φαρμακογενετικού τεστ, συγκεκριμένα για τα διάφορα αλληλόμορφα των γονιδίων CYP2D6 και CYP2C19. Σήμερα, υπάρχουν, σύμφωνα με τον FDA, 135 ετικέτες φαρμάκων που αναφέρονται σε φαρμακογενετικούς δείκτες που σχετίζονται με την δραστικότητα και την ασφάλεια του φαρμάκου (Παράρτημα Α). Όμως, μόνο ένας πολύ μικρός αριθμός αυτών υποχρεώνουν τους ιατρούς να πραγματοποιούν φαρμακογενετικό έλεγχο πριν τη χορήγηση του φαρμάκου (Carr et al., 2014). Σήμερα, στην μεταγενωμική εποχή, ο όρος φαρμακογονιδιωματική χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο και είναι πλέον κατανοητή η ανάγκη για έλεγχο των γονιδίων και των δεικτών σε όλη την έκταση του γονιδιώματος. Στις μέρες μας, έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιούνται ευρέως τεχνολογίες γονοτύπησης γονιδιωματικής έκτασης (genome wide) για τον χαρακτηρισμό γενετικών μεταλλάξεων ή πολυμορφισμών και των λειτουργικών επιπτώσεων τους στις πρωτεϊνες (Charlab & Zhang, 2013). Οι τεχνολογίες αυτές που είναι γνωστές ως «μικροσυστοιχίες» (microarrays), δίνουν τη δυνατότητα ευρέων και πολύπλοκων γενετικών αναλύσεων με αποτέλεσμα την ανάκτηση ενός μεγάλου όγκου πληροφοριών. Λόγω της μεγάλης αναγνωρισιμότητας που έλαβε τα τελευταία 50 χρόνια, η φαρμακογονιδιωματική θεωρείται μια φαινομενικά νέα επιστήμη που όμως έχει θέσει τις βάσεις της από πολύ παλιά. Έχοντας μια εξαιρετική ιστορική πορεία (Εικόνα 4), πρόκειται πλέον για έναν αναμφισβήτητα κατοχυρωμένο και πολλά υποσχόμενο επιστημονικό κλάδο. Με την ανάπτυξη των νέων τεχνολογιών και το συνεχές ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας η φαρμακογονιδιωματική προσδοκά να συνεχίσει την πορεία της και να προσφέρει πιο ενεργά στην κλινική πράξη. 8

25 Εικόνα 4: Ένα ιστορικό χρονοδιάγραμμα για τη φαρμακογονιδιωματική (προσαρμογή από Meyer et al., 2014) 9

26 1.3. Βαρφαρίνη και φαρμακογονιδιωματική Η βαρφαρίνη (Coumadin κ.α.) είναι το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο αντιπηκτικό παγκοσμίως. Γενικά, χρησιμοποιείται για τη θεραπεία και την πρόληψη θρομβοεμβολικών διαταραχών. Αν και πρόκειται για ένα πολύ αποτελεσματικό φάρμακο, η χορήγηση της σωστής δοσολογίας είναι αρκετά δύσκολη λόγω του στενού θεραπευτικού της δείκτη. Ως θεραπευτικός δείκτης ορίζεται το πηλίκο της δόσης που προκαλεί τοξικότητα προς τη δόση που προκαλεί μια επιθυμητή ή αποτελεσματική απάντηση και αποτελεί ένα μέτρο ασφαλείας του φαρμάκου. Ένας στενός θεραπευτικός δείκτης, όπως συμβαίνει στην περίπτωση της βαρφαρίνης, σημαίνει πως υπάρχει μικρό περιθώριο μεταξύ αποτελεσματικών και τοξικών δόσεων (Howland & Mycek, 2007). Ακόμη, η βαρφαρίνη είναι γνωστό πως αλληλεπιδρά με πολλά φάρμακα αλλά και φαγητά και αυτό έχει μπορεί να έχει αντίκτυπο στη δράση της. Για την βελτιστοποίηση του θεραπευτικού αποτελέσματος αλλά και την αποφυγή επικίνδυνων παρενεργειών, η χορηγούμενη στον ασθενή δόση της βαρφαρίνης ελέγχεται μέσω του δείκτη INR (International Normalized Ratio) ο οποίος υπολογίζεται με βάση την εξέταση χρόνου προθρομβίνης του κάθε ασθενή (Holbrook et al., 2005). Έτσι, η χορήγηση της βαρφαρίνης γίνεται εμπειρικά με την αρχική χορήγηση μιας δόσης, τουλάχιστον εβδομαδιαία παρακολούθηση του δείκτη INR και προσαρμογή της δόσης μέχρι ο δείκτης να σταθεροποιηθεί στα επιθυμητά επίπεδα. Η διαδικασία αυτή μπορεί να διαρκέσει από εβδομάδες εως μήνες και είναι αρκετά επίφοβη για τους ασθενής καθώς διατρέχουν κίνδυνο υπερ- ή υπο- αντιπηκτικότητας και συνεπώς κίνδυνο αιμορραγίας ή θρομβοεμβολής (Johnson et al., 2017). Η βαρφαρίνη ανήκει, μαζί με τη δικουμαρόλη, στα κουμαρινικά αντιπηκτικά και δρα ως ανταγωνιστής της βιταμίνης Κ. Αποτελείται από ένα ρακεμικό μείγμα δυο δραστικών εναντιομερών, -R και S μορφές, κάθε μια από τις οποίες ακολουθεί διαφορετικές οδούς. Και τα δυο αυτά εναντιομερή υφίστανται μεταβολισμό από τα ένζυμα του κυτοχρώματος Ρ450 (CYPs) σχηματίζοντας πολλούς μεταβολίτες με τους κυριότερους να είναι η 7-υδρόξυβαρφαρίνη για το S εναντιομερές από το CYP2C9 και η 10-υδροξυ-βαρφαρινη για το R εναντιομερές από το CYP3A4. Η βαρφαρίνη αναστέλλει την εξαρτώμενη από την βιταμίνη Κ σύνθεση των βιολογικά ενεργών μορφών 10

27 ασβεστιο-εξαρτώμενων παραγόντων πήξης II, VII, IX και Χ, καθώς και των ρυθμιστικών πρωτεϊνών C και S (Ansell et al., 2008). Οι δυσκολίες κατά τη χορήγηση της βαρφαρίνης και η συχνή εμφάνιση ανεπιθύμητων ενεργειών την έχουν κατατάξει στα 10 φάρμακα με τις περισσότερες νοσηλείες σχετιζόμενες με παρενέργειες στις Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής (Limdi, 2012). Στη βιβλιογραφία υπάρχουν πολλές μελέτες που δείχνουν συσχέτιση πολυμορφισμών σε συγκεκριμένα γονίδια με την ανταπόκριση των ασθενών σε μια δόση βαρφαρίνης ενώ ακόμη έχουν αναπτυχθεί διάφορες κατευθυντήριες γραμμές και οδηγίες για την τροποποίηση της δόσης ανάλογα με το γονότυπο στα γονίδια αυτά. Τα γονίδια με τις περισσότερες αναφορές είναι τα CYP2C9, VKORC1 και CYP4F2 (Johnson et al., 2017) με μεγαλύτερη έμφαση στα δύο πρώτα γονίδια. Το γονίδιο CYP2C9 κωδικοποιεί το κύριο ένζυμο που εμπλέκεται στον μεταβολισμό της βαρφαρίνης και το γονίδιο VKORC1 κωδικοποιεί την αναγωγάση του εποξειδίου της βιταμίνης Κ που είναι το ένζυμο-στόχος της βαρφαρίνης (Limdi, 2012). Οι παραλλαγές CYP2C9*2 και CYP2C9*3 προκαλούν μείωση της ενζυματικής δραστηριότητας κατά 30% και 80% αντίστοιχα, με αποτέλεσμα την αύξηση του κινδύνου για αιμορραγία. Όσον αφορά το γονίδιο VKORC1, δέκα SNPs προσδιορίζουν την ευαισθησία ή την αντίσταση στην βαρφαρίνη και αντιστοιχούν στο 35% της πολυμορφικότητας στην δοσολογία. Οι γονότυποι των γονιδίων αυτών σε συνδυασμό με τα κλινικά χαρακτηρηστικά μπορούν να εξηγήγουν τις μισές περιπτώσεις ανάγκης μεταβλητότητας της δόσης. Συνεπώς, η γονοτύπηση για τα δύο αυτά γονίδια και εν συνεχεία η προσαρμογή της δόσης με βάση τα αποτελέσματα γονοτύπησης, θα μπορούσαν να δώσουν καλύτερες προβλέψεις για την δόση που πρέπει να χορηγηθεί σε έναν ασθενή επιτυγχάνοντας θεραπευτικά αποτελέσματα και μειώνοντας ταυτόχρονα τον κίνδυνο αιμορραγικών και θρομβοεμβολικών επιπλοκών (Stergiopoulos & Brown, 2014). Οι βιβλιογραφικές αναφορές είχαν ως αποτέλεσμα ο FDA το 2007 να εκδόσει νέα οδηγία σχετικά με τη βαρφαρίνη η οποία συμβούλευε τους ιατρούς να χρησιμοποιούν γενετικές εξετάσεις για την σωστή εκτίμηση της αρχικής δόσης του φαρμάκου. Μια δεύτερη έκδοση το 2010 ανέφερε πως αν οι σχετικοί γονότυποι ήταν διαθέσιμοι για έναν ασθενοί θα έπρεπε να ληφθούν υπόψιν στην επιλογή της δόσης αλλά και της παρακολούθησης της πορείας του ασθενούς. Η 11

28 τελευταία αναθεωρημένη έκδοση είναι της χρονολογίας 2016 και αναφέρει σαφώς πως οι γονότυποι των γονιδίων CYP2C9 και VKORC1 επηρεάζουν την αρχική δόση της βαρφαρίνης ενώ ακόμη έχει ενσωματωθεί πίνακας με την συνιστώμενη δόση βαρφαρίνης με βάση τους γονότυπους αυτούς (FDA Coumadin Tablets Label, 2016). Ακόμη, τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί αλγόριθμοι για τον υπολογισμό της δόσης της βαρφαρίνης οι οποίοι ενσωματώνουν για το σκοπό αυτό και τις γενετικές πληροφορίες σε συνδυασμό με τις κλινικές. Ένα παράδειγμα τέτοιου αλγορίθμου αναπτύχθηκε από τη Διεθνή Κοινοπραξία Φαρμακογονιδωματικής της Βαρφαρίνη και αναφέρεται αναλυτικά στο μέρος «Υλικά και Μέθοδοι» της παρούσας εργασίας. Ωστόσο, παρά τα πολλά διαθέσιμα δεδομένα η χρήση της φαρμακογενετικής πληροφορίας για την τροποποίηση της δόσης της βαρφαρίνης παραμένει αμφιλεγόμενη. Αποτελέσματα προηγούμενων σχετικών κλινικών δοκιμών είχαν πολύ μικρό αντίκτυπο και ήταν αρκετά ασυνεπή. Συνεπώς, η ερευνητική και κλινική κοινότητα παραμένει σε ένα μεγάλο μέρος διστακτική ως προς τη χρησιμότητα της ενσωμάτωσης των φαρμακογενετικών πληροφοριών στη συνταγογράφηση της βαρφαρίνης (Stergiopoulos & Brown, 2014) Τεχνολογίες Υψηλής Ανάλυσης Οι θεμελιώδεις ανακαλύψεις σχετικά με τη δομή και την πληροφορία που φέρουν το DNA και οι πρωτεΐνες, είχαν ως αποτέλεσμα την άνθιση της μοριακής βιολογίας και της γενετικής. Οι αυτοματοποιημένες τεχνολογίες αλληλούχισης εμφανίστηκαν περί τα μέσα της δεκατετίας του 90 και ήταν ικανές για αλληλουχίσεις σε επίπεδο γονιδιώματος (Westerhoff & Palsson, 2004). Το ανθρώπινο γονιδίωμα έχει μήκος 3.3 δισεκατομμύρια βάσεις και περιέχει περισσότερα από γονίδια, τα οποία είναι οργανωμένα σε 23 ζεύγη χρωμοσωμάτων. Το πρόγραμμα αλληλούχισης του ανρώπινου γονιδιώματος διήρκησε περίπου 13 χρόνια ( ) και κόστισε πάνω από 3 εκατομμύρια δολάρια. Σήμερα, το κόστος της αλληλούχισης του ανθρώπινου γονιδιώματος ανέρχεται περίπου στα 1000 δολάρια (Pavlopoulos et al., 2015). Μετά την ολοκλήρωση των προγραμμάτων HGP και SNP Map, ένας τεράστιος όγκος πληροφοριών για το ανθρώπινο γονιδίωμα και την ποικιλότητα του έγινε διαθέσιμος σημαίνοντας, μια καινούρια εποχή για τη μοριακή 12

29 βιολογία και τη γενετική αλλά και την επιστήμη της βιολογίας και της ιατρικής στο σύνολό τους. Έγινε πλέον κατανοητό πως εκατομμύρια περιοχές του ανθρώπινου γονιδιώματος είναι πολυμορφικές και μπορεί να διαφέρουν μεταξύ ατόμων. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα, την ανάγκη για μελέτη μεγαλύτερων συνόλων δεδομένων και όχι πια μεμονωμένων μορίων και γονιδίων. Σήμερα, στην εποχή των «μεγάλων δεδομένων» ή αλλιώς «big data», είναι εφικτή η συλλογή ενός πολύ μεγάλου μεγέθους δεδομένων με τη βοήθεια εξελιγμένων τεχνολογιών υψηλής ανάλυσης (High-Throughput). Οι τεχνολογίες αυτές στοχεύουν στην επέκταση της έρευνας από τη μελέτη μεμονωμένων γονιδίων ή πρωτεϊνών στη μελέτη πολλών ή και όλων των γονιδίων ή πρωτεϊνών ταυτόχρονα. Στον τομέα της γενωμικής, οι τεχνολογίες υψηλής ανάλυσης έχουν συμβάλλει σημαντικά στην απόκτηση ακόμα περισσότερων πληροφοριών σχετικά με τη γενετική ποικιλότητα μεταξύ ατόμων. Λόγω του μεγάλου όγκου πληροφοριών που αποκτώνται, είναι απαραίτητη η πραγματοποίηση στατιστικών και πληροφορικών αναλύσεων, κάνοντας τον συνεχώς αναπτυσσόμενο τομέα της βιοπληροφορικής αναπόσπαστο κομμάτι της γενετικής ανάλυσης. Γενικά, ως «τεχνολογία υψηλής ανάλυσης» μπορεί να χαρακτηριστεί κάθε μέθοδος που στοχεύει στη ταυτόχρονη μέτρηση πολλαπλών παραγόντων. Παραδείγματα τέτοιων τεχνολογιών είναι η αλληλουχιση επόμενης γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS), η υγρή χρωματογραφία με φασματομετρία μάζας (Liquid Chromatography Mass Spectrometry, LC-MS ή LC-MS/MS) και οι μικροσυστοιχίες (Microarrays) τεχνολογία που θα αναλυθεί στη συνέχεια. Στα πλαίσια της μελέτης της γενετικής ποικιλότητας οι τεχνολογίες υψηλής ανάλυσης μπορούν να αναφέρονται: α) στη μελέτη εκατοντάδων διαφορετικών δειγμάτων ταυτόχρονα (παράλληλη μέτρηση), β) στην ταυτόχρονη ανάλυση πολλαπλών γενετικών τόπων για ένα δείγμα (πολλαπλή μέτρηση) και/ή γ) στην λήψη πολύ γρήγορων αποτελεσμάτων με μεγάλη ακρίβεια. Με τις διαφορετικές αυτές προσεγγίσεις τους, οι τεχνολογίες υψηλής ανάλυσης χρησιμοποιούνται για την μελέτη της γενετικής ποικιλότητας έχοντας ως στόχο την ενσωμάτωση και χρήση της στη κλινική πράξη, κάτι που αποτελεί σημείο πρόκληση στον τομέα της υγείας (Wiita & Schrijver, 2011). 13

30 Η Τεχνολογία των Μικροσυστοιχιών Είναι γεγονός πως με τις παραδοσιακές, συμβατικές μοριακές μεθόδους η μελέτη ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων ή άλλων μορίων ταυτόχρονα δεν είναι δυνατή. Οι μικροσυστοιχίες είναι ουσιαστικά μικροσκοπικές συσκευές που μπορούν να ενσωματώνουν πολλές εργαστηριακές τεχνικές επιτυγχάνοντας με αυτόν τον τρόπο αυτοματοποίηση, υψηλή απόδοση, παράλληλη επεξεργασία και ανίχνευση. Σε γενικές γραμμές, η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών βασίζεται στη χρήση χιλιάδων ανιχνευτών (probes) γνωστής αλληλουχίας που βρίσκονται σταθεροποιημένοι σε ένα σταθερό υπόστρωμα (συνήθως γυαλί, πλαστικό ή σιλικόνη). Σε αυτούς δεσμεύονται με συμπληρωματικό τρόπο, σχηματίζοντας δεσμούς υδρογόνου, οι άγνωστες αλληλουχίες του προς εξέταση δείγματος επιτρέποντας έτσι παράλληλη ανάλυση γονιδίων, γονιδιακής έκφρασης και άλλων παραμέτρων ανάλογα με το είδος της μικροσυστοιχίας που χρησιμοποιείται. Μεγάλος βαθμός συμπληρωματικότητας μεταξύ της άγνωστης αλληλουχίας-στόχου και της γνωστής αλληλουχίας-ανιχνευτή σημαίνει πιο ισχυρή δέσμευση της πρώτης στη δεύτερη. Μετά από «πλύσιμο» (washing) των μην ειδικά προσδεδεμένων αλληλουχιών, μόνο τα ισχυρά προσδεδεμένα μόρια θα παραμείνουν υβριδοποιημένα. Έτσι, επισημασμένες αλληλουχίες που προσδένονται σε άλλες αλληλουχίες-ανιχνευτές παράγουν ένα σήμα το οποίο εξαρτάται από το πόσο ισχυρός είναι ο υβριδισμός που έχει πραγματοποιηθεί καθώς και από την ποσότητα των αλληλουχιών-στόχων που έχουν προσδεθεί στις αντίστοιχες αλληλουχίες-ανιχνευτές (Thakare et al., 2012). Ένας μεγάλος αριθμός διαφορετικών μικροσυστοιχιών υπάρχει διαθέσιμος στο εμπόριο, με πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες τις μικροσυστοιχίες DNA, ένα μέρος των οποίων αποτελούν και αντικείμενο μελέτης της παρούσας διπλωματικής εργασίας. Οι σύγχρονες μικροσυστοιχίες ουσιαστικά αναπτύχθηκαν τα τέλη της δεκαετίας του 90 και μετά. Σταδιακά οι μικροσυστοιχίες εξελίχθηκαν από την «εκτύπωση» (spotting) σχετικά μεγάλων τμημάτων DNA στην παραγωγή μικροσυστοιχιών με ολιγομερή bp. Η χρήση των δεύτερων έδωσαν την δυνατότητα πραγματοποίησης πειραμάτων με μεγαλύτερη ειδικότητα αναφορικά με τον στόχο πρόσδεσης του DNA. Μέσα σε αυτό το χρονικό διάστημα αναπτύχθηκαν τρία βασικά είδη μικροσυστοιχιών: α) οι μικροσυστοιχές «εκτύπωσης» σε γυαλί, β) οι in-situ συντιθέμενες 14

31 μικροσυστοιχίες και γ) οι «αυτοσυγκροτούμενες» (self-assembled) μικροσυστοιχίες. Πιο συγκεκριμένα, οι μικροσυστοιχίες εκτύπωσης έδωσαν τη δυνατότητα κατασκευής εξαιρετικά πυκνών DNA συστοιχιών πάνω σε υποστρώματα γυαλιού. Οι in-situ συντιθέμενες μικροσυστοιχίες χρησιμοποιούν τη μέθοδο της φωτολιθογραφίας προκειμένου να πραγματοποιήσουν χημική σύνθεση κατευθείαν σε ένα στερεό υπόστρωμα. Τέλος, μια εναλλακτική προσέγγιση στην κατασκευή των μικροσυστοιχιών αποτέλεσαν οι «αυτοσυγκροτούμενες» μικροσυστοιχές. Πρόκειται για μια μέθοδο κατά την οποία γινόταν σύνθεση DNA πάνω σε πολύ μικρές «χάντρες» (beads) πολυστυρενίου και στη συνέχεια εναπόθεση αυτών στην άκρη μιας συστοιχίας οπτικών ινών. Όλα αυτά τα διαφορετικά είδη κατασκευής και τεχνολογίας αναπτύχθηκαν, άλλα περισσότερο και άλλα λιγότερο, και χρησιμοποιούνται μέχρι και σήμερα από εταιρείες όπως η Affymetrix, η Agilent και η Illumina (Bumgarner, 2013) Οι μικροσυστοιχίες DNA στη φαρμακογονιδιωματική Οι μικροσυστοιχίες DNA διαθέτοντας ένα μεγάλο εύρος εφαρμογών έχουν αποκτήσει βασικό ρόλο στην φαρμακογονιδιωματική έρευνα. Καθοριστικός παράγοντας σε αυτό υπήρξε η δυνατότητα των μικροσυστοιχιών να παρέχουν μελέτες μεγάλης κλίμακας που μπορούν να βοηθήσουν στον εντοπισμό ομάδων γονιδίων ή γενετικής ποικιλότητας που συσχετίζονται με συγκεκριμένα βιολογικά προβλήματα. Με αυτόν τον τρόπο μπορούν ακόμη να αναδείξουν γενετικά μοτίβα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την πρόβλεψη φαινοτύπου, μια εφαρμογή πολύ χρήσιμη στην έρευνα «ταυτοτήτων» (signatures) προκειμένου να προβλεφθούν αποκρίσεις σε φάρμακα. Οι μελέτες γονιδιακής έκφρασης (gene expression) επικεντρώνονται στην εύρεση ταυτοτήτων που μπορούν να προβλέψουν την ανταπόκριση ενός ασθενή σε κάποιο φάρμακο. Τα προφίλ έκφρασης που λαμβάνονται με τις μικροσυστοιχίες DNA αποτελούν την μοριακή-φαινοτυπική ταυτότητα του οργανισμού υπό συγκεκριμένες συνθήκες (Waring, 2003). Με τον τρόπο αυτό, ερευνώνται οι αλλαγές στην γονιδιακή έκφραση -πριν και μετά την χορήγηση του φαρμάκου- οι οποίες προκαλούνται από τη χορηγούμενη φαρμακευτική αγωγή. Η ερευνητική αυτή προσέγγιση προσδοκεί να διαλευκάνει τους μηχανισμούς δράσης των φαρμάκων, να προτείνει νέους στόχους 15

32 φαρμακευτικού ενδιαφέροντος και να προβλέψει την αποτελεσματικότητα και την τοξικότητα νέων υποψήφιων φαρμάκων (Chicurel & Dalma-Weiszhausz, 2002; Nees & Woodworth, 2001). Οι μελέτες συσχέτισης γονοτύπουφαινοτύπου είναι μια άλλη πειραματική προσέγγιση στην οποία οι μικροσυστοιχές DNA χρησιμοποιούνται σε μεγάλο βαθμό. Οι δυνατότητες τους σε συνδυασμό με άλλες τεχνολογίες υψηλής ανάλυσης προσδοκούν να φέρουν θεμελιώδεις αλλαγές στις μελέτες γονοτύπου-φαινοτύπου. Πιο συγκεκριμένα, οι ερευνητές απομακρύνονται από την κλασσική προσέγγιση αναζήτησης γενετικών παραλλαγών με κλινική σημασία με βάση παρατηρήσεις του φαινοτύπου. Αντίθετα, πρώτα μελετάται το γενετικό υλικό και στη συνέχεια γίνονται προσπάθειες συσχέτισης των σαρωμένων αλληλουχιών με το φαινότυπο. Η προσέγγιση αυτή είναι γνωστή και ως «αντίστροφη γενετική». Πιστεύεται πως αυτή η ερευνητική κατεύθυνση θα φέρει πιο άμεσα αποτελέσματα στην ανακάλυψη κλινικά σημαντικών γενετικών παραλλαγών και επιπλέον θα βοηθήσει στην ανακάλυψη και άλλων πολυμορφισμών που ίσως να είχαν περάσει απαρατήρητοι με τις συμβατικές ερευνητικές προσεγγίσεις. Οι μικροσυστοιχιές DNA μπορούν να σχεδιαστούν ώστε να ανιχνεύουν μια πληθώρα γενετικών αλλαγών όπως μεταλλαγές σε θέσεις ματίσματος και σημειακές μεταλλάξεις ενώ επίσης μπορούν να κάνουν το διαχωρισμό μεταξύ ομόζυγων και ετερόζυγων γονοτύπων. Οι δυνατότητες τους αυτές τις καθιστούν εξαιρετικά χρήσιμες και στην αναζήτηση κλινικά σημαντικών SNPs οι οποίοι αποτελούν ένα μεγάλο κομμάτι των φαρμακογονιδιωματικών μελετών συσχέτισης (Chicurel & Dalma-Weiszhausz, 2002) Στο Δρόμο Προς Την Εξατομικευμένη Ιατρική Η έννοια της εξατομικευμένης ιατρικής, παρότι έχει αποκτήσει έδαφος στην επιστημονική κοινότητα κυρίως τα τελευταία χρόνια με τις ραγδαίες τεχνολογικές εξελίξεις, είναι μια έννοια που χρονολογείται εκατοντάδες ή και χιλιάδες χρόνια πριν. Συγκεκριμένα ο Ιπποκράτης, πατέρας της ιατρικής, αναφέρθηκε στην «ατομικότητα» της ασθένειας λέγοντας: «Είναι πολύ πιο σημαντικό να γνωρίζουμε το άτομο το οποίο πάσχει από μια ασθένεια, παρά την ασθένεια από την οποία πάσχει ένα άτομο». 16

33 Αν και στη βιβλιογραφία μια πληθώρα ορισμών είναι διαθέσιμη (Πίνακας 1), η εξατομικευμένη ιατρική έχει ως στόχο να βελτιώσει και να εκσυγχρονίσει την λήψη κλινικών αποφάσεων έχοντας την ικανότητα να ξεχωρίσει a priori τους ασθενείς που έχουν περισσότερες πιθανότητες να επωφεληθούν από μια θεραπεία από αυτούς που είτε δεν θα επωφεληθούν είτε θα εμφανίσουν σοβαρές παρενέργειες. Στα πλαίσια ενός ευρύτερου ορισμού όμως, ο κλάδος της εξατομικευμένης ιατρικής περιλαμβάνει την εφαρμογή του συνόλου της ιατρικής πράξης από την πρόληψη έως την θεραπεία έχοντας ως κέντρο τον κάθε ασθενή χωριστά (FDA, 2013). Πίνακας 1: Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα που περιγράφουν το μεγάλο εύρος των ορισμών της εξατομικευμένης ιατρικής (προσαρμογή από FDA, 2013) Περιγράφοντας την Εξατομικευμένη Ιατρική "Η χρήση νέων μεθόδων μοριακής ανάλυσης για την καλύτερη διαχείρηση της νόσου ενός ασθενή ή της προδιάθεση του σε μια νόσο" -Personalized Medicine Coalition "Η χορήγηση της σωστής θεραπείας στον σωστό ασθενή, στη σωστή δόση, τη σωστή στιγμή." -European Union "Υγειονομική περίθαλψη η οποία είναι ενημερωμένη για τις μοναδικές κλινικές, γενετικές και περιβαλλοντικές πληροφορίες κάθε ατόμου" -American Medical Association "Μια μορφή ιατρικής η οποία χρησιμοποιεί πληροφορίες σχετικά με τα γονίδια, τις πρωτεϊνες και το περιβάλλον ενός ατόμου για να αποτρέψει, να διαγνώσει και να θεραπεύσει μια ασθένεια." - National Cancer Institute, NIH Πολλοί διαφορετικοί όροι όπως «γενωμική ιατρική» (genomic medicine), «ιατρική ακριβείας» (precision medicine), «στοχευμένη ιατρική» (targeted medicine), συχνά χρησιμοποιούνται εναλλακτικά με τον όρο «εξατομικευμένη ιατρική» (personalized medicine). Από αυτούς, αν και συγγενέστερος του τελευταίου θεωρείται ο όρος «ιατρική ακριβείας» υπάρχει παρ όλα αυτά μια μικρή διαφοροποίηση μεταξύ των δυο. Πιο συγκεκριμένα, ο όρος «ιατρική ακριβείας» αφορά στην ακρίβεια μιας διάγνωσης αλλά και της διαδικασίας η οποία εφαρμόζεται για την ολοκλήρωση μιας διάγνωσης. Ουσιαστικά, επιδιώκει τον σαφή ορισμό του σταδίου και του είδους μιας ασθένειας καθώς και την πλήρη κατανόηση των παθολογικών μηχανισμών της. 17

34 Από την άλλη, όπως ήδη αναφέρθηκε, ο όρος «εξατομικευμένη ιατρική» αναφέρεται στην βελτιστοποίηση μιας συγκεκριμένης θεραπείας για ένα συγκεκριμένο άτομο σε αντίθεση με τη θεραπεία που αναφέρεται σε μια ομάδα ατόμων (Valdes & Yin, 2016). Όσον αφορά την έννοια της «γενωμικής ιατρικής», αυτή αναφέρεται στη χρήση πληροφοριών από γονιδιώματα καθώς και τα παράγωγά τους, όπως RNA, πρωτεϊνες και μεταβολίτες, για την καθοδήγηση της λήψης ιατρικών αποφάσεων (Ginsburg & Willard, 2009). Παρά τους διαφορετικούς τους ορισμούς δεν θα μπορούσε κανείς να πει πως οι έννοιες αυτές είναι αναξάρτητες αλλά αντίθετως, στην πράξη, φαίνεται να συμπληρώνουν η μια την άλλη έχοντας ως κοινό ενδιαφέρον τον ασθενή ως άτομο και την βελτίωση της ιατρικής του φροντίδας (Εικόνα 5). Γενωμική Ιατρική (Genomic Medicine) Εξατομικευμένη Ιατρική (Personalized Medicine) Ιατρική Ακριβείας (Precision Medicine) Εικόνα 5: Η πορεία της σύγχρονης ιατρικής και η σύνδεση των διαφορετικών της προσεγγίσεων Η συμβολή της φαρμακογονιδιωματικής Ο Spear και οι συνεργάτες του σε μια έρευνά τους η οποία βασίστηκε σε βιβλιογραφικά δεδομένα και δημοσιεύτηκε το 2001, έδειξαν ότι τα ποσοστά ανταπόκρισης των ασθενών σε διάφορα φάρμακα κινούνται από 25% εως 80% ενώ τα περισσότερα φάρμακα εμπίπτουν σε εύρος ανταπόκρισης 50-75% (Εικόνα 6). Συμπερασματικά ένα πολύ μεγάλο ποσοστό ασθενών που λαμβάνουν κάποια θεραπεία δεν επωφελούνται από αυτή ή ακόμη, όπως συμβαίνει σε πολλές περιπτώσεις, μπορεί να εμφανίσουν σοβαρές παρενέργειες οι οποίες μπορεί να οδηγήσουν ακόμη και σε θάνατο (Spear et al., 2001). Η φαρμακογονιδιωματική στοχεύει, όπως ήδη αναφέρθηκε, στην λύση αυτού του προβλήματος δίνοντας τη δυνατότητα χορήγησης θεραπειών με εξατομικευμένο χαρακτήρα, δηλαδή προσαρμοσμένη στον κάθε ασθενή χωριστά. 18

35 Εικόνα 6: Ποσοστό των ασθενών οι οποίοι δεν επωφελούνται από την θεραπεία τους για διάφορες σοβαρές ασθένειες (Από FDA, 2013). Στα πλαίσια της εξατομικευμένης ιατρικής, η φαρμακογονιδιωματική αποτελεί αναπόσπαστο κομμάτι της κλινικής πράξης. Ουσιαστικά, η εφαρμογή της φαρμακογονιδιωματικής δίνει τη δυνατότητα να καθοριστεί πιο ολοκληρωμένα η κατάλληλη θεραπεία καθώς επίσης και η βέλτιστη δόση αυτής για ένα άτομο βασιζόμενη στα γενετικά χαρακτηριστικά του. Η μέχρι πρόσφατα χρησιμοποιούμενη μέθοδος παρακολούθησης της θεραπείας ήταν η μέτρηση της συγκέντρωσης του φαρμάκου στο αίμα παίρνοντας πληροφορίες σχετικά με τη βιοδιαθεσιμότητα, το μεταβολισμό, τη μεταφορά και την απέκκριση του. Οι πληροφορίες αυτές, αν και χρήσιμες, επειδή ακριβώς λαμβάνονται μετά την χορήγηση της θεραπείας δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν στα πλαίσια της πρόβλεψης και της επιλογής μιας κατάλληλης για το κάθε άτομο θεραπείας. Σήμερα γνωρίζουμε πως το «προφίλ» ανταπόκρισης ενός ασθενή σε μια θεραπεία βασίζεται στη δράση τριών ειδών προτεϊνών: ένζυμα που μεταβολίζουν φάρμακα, πρωτεϊνες-αγωγοί που μεταφέρουν φάρμακα και πρωτεϊνες που λειτουργούν ως υποδοχείς φαρμακευτικών ουσιών (Valdes & 19

36 Yin, 2016). Σήμερα, με τη βοήθεια της φαρμακογονιδιωματικής, μας δίνεται η δυνατότητα γονοτύπησης των περισσότερων γονιδίων που κωδικοποιούν τις πρωτεϊνες αυτές, πρόβλεψης της δράστικότητας τους και επομένως και πρόβλεψη του μεταβολισμού του φαρμάκου που πρόκειται να λάβει ένας ασθενής. Στη βιβλιογραφία υπάρχουν διαθέσιμα πολλά παραδείγματα φαρμάκων στα οποία η φαρμακογονιδιωματική συνέβαλε στο να χρησιμοποιούνται σήμερα σε εξατομικευμένο πλαίσιο, ανάλογα με την ύπαρξη η μη συγκεκριμένων βιοδεικτών. Ως βιοδείκτης στη γονιδιωματική ορίζεται «ένα μετρήσιμο DNA ή/ και RNA χαρακτηριστικό που είναι δείκτης φυσιολογικών βιολογικών διαδικασίων, παθογόνων διεργασιών και/ ή ανταπόκρισης σε θεραπευτικές ή άλλες παρεμβάσεις» (ICH Topic E15, 2007). Μια από τις πιο χαρακτηριστικές περιπτώσεις είναι αυτή του καρκίνου του μαστού σε γυναίκες με υπερέκφραση του υποδοχέα του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα τύπου 2 ή αλλιώς HER-2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2), γεγονός το οποίο έχει συσχετιστεί με κλινικά πιο «επιθετικούς» όγκους και κακή πρόγνωση. Σε αυτές τις γυναίκες, η φαρμακευτική ουσία τραστουζουμαμπη (Herceptin ) μπορεί να μειώσει σημαντικά την επανεμφάνιση όγκου όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία, σε σύγκριση με τη χορήγηση μόνο της χημειοθεραπείας (Chen et al., 2016; Maximiano et al., 2016). Ένα άλλο παράδειγμα, είναι αυτό του καρκίνου του παχέος εντέρου. Συγκεκριμένα, ένα μεγάλο ποσοστό των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου δεν ανταποκρίνονται στην κετουξιμαμπη (Erbitux ) και στην πανιτουμουμάμπη (Vectibix ) επειδή οι όγκοι τους έχουν κάποια μετάλλαξη στο γονίδιο KRAS. Η χρήση των ουσιών αυτών συνίσταται σε ασθενείς με τη φυσιολογική (wild-type) μορφή του γονιδίου KRAS σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία (Tran et al., 2015; Grady & Pritchard, 2014). Σημαντικά παραδείγματα υπάρχουν φυσικά και εκτός του ογκολογικού τομέα. Η επίδραση της κλοπιδογρέλης (Plavix ), μια φαρμακευτικής ουσίας που χορηγείται για την πρόληψη της θρόμβωσης, εξαρτάται απο την γενετική ποικιλότητα του ασθενούς στο γονίδιο CYP2C19. Το γόνιδιο CYP2C19 κωδικοποιεί ένα ένζυμο που μετατρέπει το φάρμακο από την ανενεργή στην ενεργή μορφή του. Με βαση το γενετικό προφίλ του ασθενούς δίνεται η δυνατότητα για την χορήγηση της κατάλληλης δόσης του 20

37 φαρμάκου ή εύρεση εναλλακτικής θεραπείας στην περίπτωση μη απόκρισης του ασθενούς στην συγκεκριμένη δραστική ουσία. Το ίδιο συμβαίνει και με τη χορήγηση βαρφαρίνης, ενός φαρμάκου που χρησιμοποιείται επίσης για την πρόληψη σχηματισμού θρόμβων. Οι ασθενείς στην περίπτωση αυτή ελέγχονται ως προς το γονότυπό τους στα γονίδια CYP2C9 και VKORC1τα οποία κωδικοποιούν ένα ένζυμο-μεταβολιστή φαρμάκων και ένα ένζυμο που ενεργοποιεί την βιταμίνη Κ αντίστοιχα (Roden, 2016). Συνοψίζοντας, η επιτυχία της εξατομικευμένης ιατρικής εξαρτάται από την ανάπτυξη αξιόπιστων και μεγάλης ακριβείας διαγνωστικών τεστ αλλά και στην εύρεση βιοδεικτών με κλινική σημασία. Επιπλέον, η εφαρμογή της εξατομικευμένης ιατρικής απαιτεί πολύπλοκες διαδικασίες που έχουν ως κέντρο τον κάθε ένα ασθενή χωριστά αλλά και την συνεργασία πολλών διαφορετικά εξειδικευμένων επιστημόνων. Μια τέτοια πορεία απεικονίζεται συνοπτικά στην Εικόνα 7. Εικόνα 7: Στο δρόμο για την εξατομικευμένη ιατρική: μια πορεία εφαρμογής. Ο όρος P5 Medicine προέρχεται από τις λέξεις Predictive, Preventive, Personalized και Participatory οι οποίες αναφέρονται στην νέα μορφή εξατομικευμένης ιατρικής (Anaya et al., 2016). 21

38 1.6. Η πλατφόρμα DMET Παρόλο που η ιδέα της εξατομικευμένης ιατρικής, όπως ήδη αναφέρθηκε, δεν είναι καινούρια, εντούτοις η ενσωμάτωση της γενετικής πληροφορίας του κάθε ατόμου για τη λήψη κλινικών αποφάσεων είναι αρκετά πρόσφατη. Πολλά από τα ένζυμα τα οποία εμπλέκονται στον μεταβολισμό των φαρμάκων είναι γενετικά πολυμορφικά. Συνεπώς, η ενεργότητα τους μπορεί να διαφέρει αναλόγως το γονότυπο του κάθε ατόμου. Στα πλαίσια της ένταξης της φαρμακογονιδιωματικής στην κλινική εξατομικευμένη πράξη πιστεύεται πως μια ολοκληρωμένη και περιεκτική γονοτύπηση για αυτού του είδους την γενετική πληροφορία θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για την επιλογή του κατάλληλου φαρμάκου και της κατάλληλης δόσης αυτού για έναν συγκεκριμένο ασθενή Το περιεχόμενο της πλατφόρμας DMET Η πλατφόρμα γονοτύπησης Ενζύμων Μεταβολισμού Φαρμάκων και Μεταφορέων ή αλλιώς DMET (Drug Metabolizing Enzymes and Trasnporters, DMET) της εταιρείας Affymetrix δίνει τη δυνατότητα ολοκληρωμένης σκιαγράφησης της γενετικής ποικιλομορφίας για όλους τους γνωστούς δείκτες απορρόφησης, κατανομής, μεταβολισμού και απέκκρισης- ή αλλιώς ADME (Absorption, Distriburtion, Metabolism, Excretion)- των φαρμάκων. Η μικροσυστοιχία DMET περιλαμβάνει 1936 δείκτες σε 231 γονίδια που σχετίζονται με το μεταβολισμό των φαρμάκων, ρυθμιστικά μεταγραφικά μόρια, επιλεγμένους στόχους φαρμάκων καθώς και διάφορα είδη μεταφορέων φαρμάκων (Burmester et al., 2010). Τα γονίδια που περιλαμβάνει η πλατφόρμα DMET κατηγοριοποιούνται σε: (α) Ένζυμα φάσης Ι, (β) Ένζυμα φάσης ΙΙ, (γ) Μεταφορείς και (δ) Άλλα γονίδια που δεν εμπίπτουν σε κάποιες από τις παραπάνω κατηγορίες (Πίνακας 3). Τα ένζυμα φάσης Ι καταλύουν τις διαδικασίες υδρόλυσης, αναγωγής και οξείδωσης ενώ τα ένζυμα φάσης ΙΙ καταλύουν αντιδράσεις σύζευξης όπως η θείωση, η ακετυλίωση και η γλυκουρονιδίωση. Η πλειοψηφία των αντιδράσεων φάσης Ι καταλύονται από τα ένζυμα του κυτοχρώματος P450 (CYP). Υπάρχουν 18 CYP οικογένειες, όμως μόνο τρεις από αυτές (CYP1, CYP2 και CYP3) καταλύουν τις περισσότερες από τις αντιδράσεις φάσης Ι των φαρμάκων. Οι αντιδράσεις φάσης ΙΙ εχουν ως στόχο την απέκκριση των φαρμάκων μεσω της αύξησης της υδροφιλικότητας 22

39 του υποστρώματος ή μέσω της απενεργοποίησης των μορφών υψηλής δραστικότητας. Οι μεταφορείς πρέπει να εξετάζονται σε συνδυασμό με τα μεταβολικά ένζυμα. Παρόλο που κάποια φάρμακα διαχέονται παθητικά δια μήκος των μεμβρανών, τα περισσότερα μεταφέρονται ενεργητικά. Συνεπώς, οι μεταφορείς επηρεάζουν την απορρόφηση ενός φαρμάκου, την βιοδιαθεσιμότητα, τη στόχευση, την αποτελεσματικότητα, την τοξικότητα αλλά και την απέκκριση του. Πέρα από τις τρεις αυτές κατηγορίες γονιδίων, υπάρχουν πολυμορφισμοί σε γονίδια που δεν σχετίζονται άμεσα με το μεταβολισμό ή τη μεταφορά των φαρμάκων όπως για παράδειγμα στόχοιφαρμάκων και πυρηνικοί υποδοχείς που μπορεί να επηρεάζουν την ανταπόκριση ενός ασθενή στην θεραπεία του (Sissung et al., 2010). Πίνακας 2: Οι κατηγορίες και τα γονίδια που περιλαμβάνει η πλατφόρμα DMET (Από Sissung et al.,2010). 1. Ένζυμα Φάσης Ι CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2A7, CYP2A13, CYP2B6, CYP2B7, CYP2B7P1, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2F1, CYP2J2, CYP2S1, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43, CYP4A11, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4Z1, CYP7A1, CYP7B1, CYP8B1, CYP11A1, CYP11B1, CYP11B2, CYP17A1, CYP19A1, CYP20A1, CYP21A2, CYP24A1, CYP26A1, CYP27A1, CYP27B1, CYP39A1, CYP46A1, CYP51A1 2. Ένζυμα Φάσης ΙΙ ADH1A, ADH1B, ADH1C, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7, ALDH1A1, ALDH2, ALDH3A1, ALDH3A2, CHST1, CHST2, CHST3, CHST4, CHST5, CHST6, CHST7, CHST8, CHST9, CHST10, CHST11, CHST13, COMT, DPYD, FMO1, FMO2, FMO3, FMO4, FMO5, FMO6, GSTA1, GSTA2, GSTA3, GSTA4, GSTA5, GSTM1, GSTM2, GSTM3, GSTM4, GSTM5, GSTO1, GSTP1, GSTT1, GSTT2, GSTZ1, MAOA, MAOB, NAT1, NAT2, NNMT, NQO1, SULT1A1, SULT1A2, SULT1A3, SULT1B1, SULT1C1, SULT1C2, SULT1E1, SULT2A1, SULT2B1, SULT4A1, TPMT, UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A5, UGT1A6, UGT1A7, UGT1A8, UGT1A9, UGT1A10, UGT2A1, UGT2B4, UGT2B7, UGT2B11, UGT2B15, UGT2B17, UGT2B28, UGT8 3. Μεταφορείς ABCB1, ABCB4, ABCB7, ABCB11, ABCC1, ABCC2, ABCC3, ABCC4, ABCC5, ABCC6, ABCC8, ABCC9, ABCG1, ABCG2, ATP7A, ATP7B, SLCA13, SLC10A1, SLC10A2, SLC13A1, SLC15A1, SLC15A2, SLC16A1, SLC19A1, SLC22A1, SLC22A11, SLC22A12, SLC22A14, SLC22A2, SLC22A3, SLC22A4, SLC22A5, SLC22A6, SLC22A7, SLC22A8, SLC28A1, SLC28A2, SLC28A3, SLC29A1, SLC29A2, SLC5A6, SLC6A6, SLC7A5, SLC7A7, SLC7A8, SLCO1A2, SLCO1B1, SLCO1B3, SLCO2B1, SLCO3A1, SLCO4A1, SLCO5A1 4. Άλλα ABP1, AHR, AKAP9, ALB, AOX1, ARNT, ARSA, CBR1, CBR3, CDA, CES2, CROT, DCK, EPHX1, EPHX2, FAAH, G6PD, HMGCR, HNMT, MAT1A, METTL1, NR1I2, NR1I3, NR3C1, ORM1, ORM2, PNMT, PON1, PON2, PON3, POR, PPARD, PPARG, PTGIS, RALBP1, RPL13, RXRA, SEC15L1, SERPINA7, SETD4, SPG7, TBXAS1, TPSG1, TYMS, VKORC1, XDH 23

40 Η επιλογή των γονιδίων για την πλατφόρμα DMET έγινε με τη συμμετοχή επιστημόνων της Affymetrix στη κοινοπραξία PharmaADME. Πρόκειται για μια πρωτοβουλία και συνεργασία ακαδημαϊκών, της φαρμακευτικής βιομηχανίας και εκπροσώπων εταιρειών σχετικών με τη γενωμική τεχνολογία. Σκοπός της κοινοπραξίας PharmaADME ήταν η δημιουργία μιας λίστας όλων των γνωστών και πιθανώς κλινικά σημαντικών παραλλαγών σε γονίδια-κλειδιά τα οποία εμπλέκονται στις ADME ιδιότητες των πιο συχνά συνταγογραφούμενων φαρμάκων. Στη λίστα αυτή κατατάχθηκαν, με βάση την χρησιμότητά τους στην κλινική έρευνα, περισσότεροι από SNPs και άλλες σύνθετες μεταλλάξεις (π.χ. τριαλληλικοί δείκτες, μικρές ενθέσεις ή απαλοιφές κ.α.) (Affymetrix, 2012). Πιο αναλυτικά, τα γονίδια της λίστας PharmaADME αποτελούν το 95% (45/47) των ενζύμων φάσης Ι, το 93% (74/80) των ενζύμων φάσης ΙΙ, το 98% (51/52) των μεταφορέων και το 52% (24/56) «άλλων» γονιδίων της πλατφόρμας DMET. Ο πίνακας γονιδίων της πλατφόρμας DMET επεκτάθηκε περαιτέρω από τη λίστα ώστε να περιλαμβάνει 31 επιπλέον γονίδια, καταλήγοντας έτσι στο σύνολο των 225 γονιδίων (Sissung et al., 2010). Η επέκταση αυτή έγινε με κριτήριο την επιλογή δεικτών που θα είχαν πιο μεγάλη πιθανότητα να προσφέρουν ακόμα περισσότερη βιολογική χρησιμότητα στη πλατφόρμα DMET. Έτσι, στα επιπρόσθετα αυτά γονίδια περιλαμβάνονται νέοι μεταφορείς φαρμάκων, ρυθμιστές της μεταγραφής και γονίδια που φαίνεται να επάγουν άλλα ADME σχετιζόμενα γονίδια (Affymetrix, 2012). Μια λίστα επιλεγμένων γονιδίων και αντίστοιχα σχετιζόμενα μονοπάτια φαρμάκων παρουσιάζονται στον Πίνακα 4. Συμπερασματικά, πρόκειται για μια προσεκτικά σχεδιασμένη και εξαιρετικά περιεκτική πλατφόρμα που μπορεί να χρησιμοποιηθεί ερευνητικά σε φαρμακευτικές μελέτες, σε σχεδιασμό νέων φαρμακευτικών προϊόντων καθώς και σε κλινικές μελέτες. 24

41 Πίνακας 3: Επιλεγμένη λίστα γονιδίων της πλατφόρμας DMET και αντίστοιχα συσχετιζόμενα μονοπάτια φαρμάκων (Από Sissung et al., 2010) Γονίδια Συσχετιζόμενα Μονοπάτια Φαρμάκων 1. Ένζυμα Φάσης Ι CYP2A6 CYP2B6 CYP2C9 CYP2C19 Coumarin,Sm-12502,Tegafur 17-a-ethynylestradiol, Artemisinin, Bupropion, Clopidogrel, Cyclophosphamide, Diazepam, Efavirenz, Ifosfamide, Ketamine, Methadone, Meperidine, Mephenytoin, Midazolam, Nevirapine, Propofol, Selegiline, Tamoxifen, Thiotepa, Ticlopidine Celecoxib, Cyclophosphamide, Flurbiprofen, Fluvastatin, Glipizide, Ibuprofen, Ifosfamide, In-domethacin, Lornoxicam, Phenytoin, Raldecoxib, Tolbutamide, Warfarin Amitriptyline, Carbamazepine, Carisoprodol, Chloramphenicol, Cimetidine, Citalopram, Clomipramine, Clopidogrel, Cyclophosphamide, Felbamate, Fluoxetine, Fluvoxamine, Hexobarbital, Imipramine, Indomethacin, Ketoconazole, Lansoprazole, Mephenytoin, Mephobarbital, Moclobemide, Modafinil, Nelfinavir, Nilutamide, Omeprazole, Oxcarbazepine, Pantoprazole, Phenobarbitone, Phenytoin, Primidone, Probenecid, Progesterone, Proguanil, Propranolol, Rabeprazole, Rifampin, Teniposide, Ticlopidine, Topiramate, Warfarin CYP2D6 Amitriptyline, Atomoxetine, Carvedilol, Chlorpheniramine, Chlorpromazine, Citalopram, Clomipramine, Clozapine, Codeine, Debrisoquine, Desipramine, Dextromethorphan, Dihydrocodeine, Doxepin, Flecainide, Fluoxetine, Fluvoxamine, Gefitinib, Haloperidol, Imipramine, Maprotiline, Metoprolol, Mexiletine, Mianserin, Morphine, Nortriptyline, Paroxetine, Perhexiline, Perphenazine, Propafenone, Risperidone, Sparteine, Tamoxifen, Thioridazine, Timolol, Tolterodine, Tramadol, Yohimbine, Zuclopenthixol CYP3A4/5 2. Ένζυμα Φάσης ΙΙ ALDH1A1 COMT Alfentanil, Alprazolam, Amlodipine, Aripiprazole, Astemizole, Atorvastatin, Buspirone, Cafergot, Cerivastatin, Chlorpheniramine, Cilostazol, Cisapride, Clarithromycin, Codeine, Ciclosporin, Dapsone, Dextromethorphan, Diazepam, Diltiazem, Docetaxel, Domperidone, Eplerenone, Erythromycin, Estradiol, Felodipine, Fentanyl, Finasteride, Gleevec, Haloperidol, Hydrocortisone, Indinavir, Irinotecan, Laam, Lercanidipine, Lidocaine, Lovastatin, Methadone, Midazolam, Nateglinide, Nelfinavir, Nifedipine, Nisoldipine, Nitrendipine, Ondansetron, Pimozide, Progesterone, Quinine, Ritonavir, Salmeterol, Saquinavir, Sildenafil, Simvastatin, Sirolimus, Tacrolimus, Tamoxifen, Taxol, Telithromycin, Terfenadine, Terfenidine,Testosterone, Trazodone Triazolam, Verapamil, Vincristine, Zaleplon, Zolpidem Cyclophosphamide, Ifosfamide, Retinaldehyde Levodopa DPYD GSTP1 NQO1 TPMT UGT1A1 SULT1A1 5-fluorouracil Cisplatin, Cyclophosphamide, Doxorubicin, Etoposide, Oxaliplatin, Pyrimethamine Cisplatin, Dicumarol, Doxorubicin 6-mercaptopurine, 6-thioguanine Atazanavir, Etoposide, Irinotecan, Tranilast Acetaminophen, Minoxidil, Tamoxifen 25

42 Πίνακας 3 (συνέχεια) 3. Μεταφορείς ABCB1 SLC19A1 Amitriptyline, Atorvastatin, Clopidogrel, Ciclosporin, Daunorubicin, Digoxin, Doxorubicin, Etoposide, Exofenadine, Indinavir, Irinotecan, Loperamide, Paclitaxel, Rhodamine 123, Ritonavir, Saquinavir, Tacrolimus, Talinolol, Topotecan, Verapamil, Vinblastine 10-edam, 5,10-dideazatetrahydrofolate, Gw1843u89, Leucovorin, Methotrexate, Pemetrexed, Raltrexed SLCO1B1 4. Άλλα HMGCR PTGIS TYMS VKORC1 Atorvastatin, Atrasentan, Benzylpenicillin, Bosentan, Caspofungin, Cerivastatin, Clotrimazole, Ciclosporin A, Enalaprilat, Irinotecan, Lovastatin, Methotrexate, Mifepristone, Olmesartan, Paclitaxel, Pioglitazone, Pitavastatin, Pravastatin, Repaglinide, Repaglinide,, Rifampicin, Rifamycin SV, Rosiglitazone, Rosuvastatin, Temocapril, Troglitazone, Valsartan Pravastatin, Atorvastatin, Fluvastatin, Lovastatin, Simvastatin Celecoxib 5-fluoruracil, Gemcitabine, Methotrexate,Tomudex Acenocoumarol, Coumarin, Warfarin Προδιαγραφές απόδοσης και ποιότητα δεδομένων Κατά την διάρκεια του σχεδιασμού και της ανάπτυξης, η πλατφόρμα DMET αξιολογήθηκε σχετικά με την απόδοσή της σε περισσότερα από δείγματα. Κατά μέσο όρο παρατηρήθηκαν 99% εύρεση γονοτύπων (sample call rate), 99,5% συμφωνία δείγματος με το δείγμα αναφοράς, >99,8% αναπαραγωγιμότητα και > 95% επιτυχία δείγματος (pass rate) (Πίνακας 5). Ακόμη, οι δείκτες της πλατφόρμας αξιολογήθηκαν σε τουλάχιστον άτομα συμπεριλαμβανομένων 597 ατόμων από τα δεδομένα του HapMap (Affymetrix, n.d.). Πίνακας 4: Προδιαγραφές απόδοσης και ποιότητα δεδομένων της πλατφόρμας DMET (προσαρμογή από Affymetrix, n.d.) Προδιαγραφές Απόδοσης Μέσος όρος εύρεσης γονοτύπων 99% Μέση αντιστοίχηση δείγματος με δείγμα αναφοράς 99,5% Μέση αναπαραγωγιμότητα 99,8% Μέσος όρος επιτυχίας δείγματος 95% 26

43 Πλεονεκτήματα και Μειονεκτήματα της πλατφόρμας DMET Η πλατφόρμα DMET είναι η πρώτη πλατφόρμα του είδους της που δίνει τη δυνατότητα εξερεύνησης ενός τόσο μεγάλου αριθμού SNPs σχετικών με φαρμακολογικές ιδιότητες. Ακόμη, περιορίζει τη μελέτη όλων αυτών των πολυμορφισμών σε ένα πείραμα, μειώνοντας έτσι το σφάλμα τύπου Ι (ψευδώς θετικά αποτελέσματα) (Sissung et al., 2010). Όλα τα παραπάνω συνεπάγονται, όπως ήδη αναφέρθηκε, τη δυνατότητα χρήσης της πλατφόρμας σε πολλές εφαρμογές. Πιο αναλυτικά, η πλατφόρμα DMET βρίσκει εφαρμογή σε: Φαρμακολογική Έρευνα: ανακάλυψη και χρήση των νέων βιοδεικτών που προκύπτουν από φαρμακογενετικές συσχετίσεις αλλά και περεταίρω διερεύνηση αλληλομόρφων με ήδη γνωστές ADME ιδιότητες. Μεταφραστική Κλινική Έρευνα: μεγάλης διάρκειας μελέτες σχεδιασμένες για τη δημιουργία ολοκληρωμένων μεταβολικών προφίλ Προ-κλινική Έρευνα και Ανάπτυξη: ένας μεγάλος αριθμός νέων υποψήφιων φαρμάκων αποτυγχάνει κατά την διαδικασία ανάπτυξης τους λόγω της κακής φαρμακοκινητικής και τοξικότητας που εμφανίζουν, γεγονός που επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από τη γενετικά καθορισμένη ποικιλότητα σε γονίδια που σχετίζονται με το μεταβολισμό και τη μεταφορά των φαρμάκων Άλλες έρευνες: π.χ. μελέτες κινδύνου, εύρεσης διαφορετικότητας της κατανομής γονοτύπων σε διαφορετικούς πληθυσμούς κλπ. Οι μελέτες με προσέγγιση «υποψήφιου γονιδίου» είχαν ως αποτέλεσμα την ανακάλυψη ενός μεγάλου αριθμού SNPs που έχουν συσχετιστεί με πολλούς παράγοντες σε πολύ ετερογενείς πληθυσμούς. Το γεγονός αυτό δυσκολεύει αρκετά την καθαρή συσχέτιση SNP και απλότυπων με έναν φαινότυπο. Ακόμη, οι προσεγγίσεις αυτές δεν είναι κατάλληλες για την κατανόηση πιθανών άγνωστων μονοπατιών που μπορεί να επηρεάζουν τις φαρμακευτικές ιδιότητες ουσιών που βρίσκονται υπό έρευνα. Με την πλατφόρμα DMET είναι εύκολη η σύγκριση ης ίδιας ομάδας αλληλομόρφων σε πολλές ομάδες ασθενών ταυτόχρονα κάτι που διευκόλυνει την αναγνώριση των πιο σημαντικών πολυμορφισμών. Ακόμη, θα μπορούσε να επισημάνει πιθανούς πολυμορφισμούς που δίνουν εξήγηση στη «κλινική συμπεριφορά» ενός φαρμάκου το οποίο βρίσκεται σε φάση Ι κλινικών δοκιμών και οι πληροφορίες αυτές θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τις επόμενες φάσεις κλινικών 27

44 δοκιμών ώστε να γίνει προσαρμογή της δόσης για τον κάθε συμμετέχοντα ασθενή. Από την άλλη μεριά, η πλατφόρμα DMET εμφανίζει και κάποια μειονεκτήματα. Αρχικά, η τεχνολογία DMET δεν είναι εγκεκριμένη από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (Food and Drug Administration, FDA). Αυτό σημαίνει πως η πλατφόρμα μπορεί να χρησιμοποιεί σε πειραματικές εφαρμογές όχι όμως σε κλινικές εφαρμογές εξατομικευμένης ιατρικής και για τη λήψη κλινικών ιατρικών αποφάσεων. Έτσι είναι δύσκολο να ερευνηθούν περιπτώσεις που ο στόχος ενός φαρμάκου είναι πιο σημαντικός από τις γενετικά συσχετιζόμενες ADME ιδιότητες. Ένα άλλο μειονέκτημα που δυσκολεύει τη κλινική χρήση της πλατφόρμας DMET είναι η μη ύπαρξη επαρκών αποδείξεων στη βιβλιογραφία καθώς και η έλλειψη συγκεκριμένων κατευθυντήριων οδηγιών για τα περισσότερα από τα γονίδια που εμπεριέχονται στην πλατφόρμα. Για το σκοπό αυτό θα χρειαστούν ένας μεγάλος αριθμός προκλινικών μελετών και μελετών επαλήθευσης. Τέλος, η πλατφόρμα δεν είναι εύκολα προσαρμόσιμη και τροποποιήσιμη ενώ υπάρχουν αντίστοιχες πλατφόρμες που μπορούν να επιτύχουν το ίδιο αποτέλεσμα με πολυμορφισμούς επιλεγμένους συγκεκριμένα για τον σκοπό της εκάστοτε μελέτης (Sissung et al., 2010) Το λογισμικό ανάλυσης DMET Console Η ανάλυση των αποτελεσμάτων της δοκιμής DMET πραγματοποιείται με το λογισμικό ανάλυσης DMET Console το οποίο παρέχεται δωρεάν από την Affymetrix. Πρόκειται για ένα εύχρηστο, απλό και φιλικό προς το χρήστη λογισμικό. Η ανάλυση περιλαμβάνει αλγοριθμική γονοτύπηση των δειγμάτων, μετάφραση των γονοτύπων και απεικόνιση των αποτελεσμάτων με διαγράμματα και πίνακες. Πιο συγκεκριμένα το λογισμικό προσφέρει: Αλγοριθμική γονοτύπηση μεμονωμένων δειγμάτων: έχοντας προκαθορισμένες ρυθμίσεις ορίων για τους δείκτες επιτρέπει την επεξεργασία συνόλων κάθε μεγέθους χωρίς να επηρεάζεται η αναφορά των γονοτύπων. Ακόμη, περιλαμβάνει εξειδικευμένους αλγόριθμους ανάλυσης για την επεξεργασία δεικτών που δεν είναι SNPs και την απεικόνιση διαγραμμάτων τριαλληλικών δεικτών 28

45 Απλή απεικόνιση: ομαδοποιημένη απεικόνιση (clusters) για SNPs και δείκτες αριθμού αντιγράφων (copy number markers) Αναφορές δεδομένων προσαρμοσμένου περιεχομένου: δυνατότητα δημιουργίας λιστών δεικτών αρχικής γονοτύπησης αλλά και για την εξαγωγή των αναφορών Μετάφραση των γονοτύπων με τη χρήση της ονοματολογίας «star allele», υποδεικνύοντας το σχετικό επίπεδο μεταβολικής δραστηριότητας. Σε γενικές γραμμές, το λογισμικό ανάλυσης DMET Console κανονικοποιει τα ακατέργαστα δεδομένα (raw data) που προκύπτουν από τη δοκιμή DMET και διαθέτει ενσωματωμένα εργαλεία για την ανάλυση τους. Το λογισμικό έχει παρόλα αυτά έναν σημαντικό περιορισμό καθώς δεν διαθέτει εργαλεία για την στατιστική ανάλυση ενός πειράματος. Αυτής της μορφής η ανάλυση γίνεται είτε χειροκίνητα είτε με τη χρήση άλλων, εξωτερικών λογισμικών, όπως το λογισμικό DMET-Analyzer (Kumuthini et al., 2016; Guzzi et al., 2012). Συμπερασματικά, η πλατφόρμα DMET αποτελεί μια περιεκτική και στοχευμένη λύση για φαρμακογονιδιωματικές εφαρμογές. Πρόκεται για μια πλατφόρμα υψηλής ανάλυσης που αναπτύχθηκε με τη συμμετοχή και τη συνεργασία πλήθους επιστημόνων από ακαδημαϊκούς και ιδιωτικούς φορείς. Περιλαμβάνει έναν μεγάλο αριθμό δεικτών και γονιδίων ενώ ταυτόχρονα παρουσιάζει εξαιρετική απόδοση και υψηλή ποιότητα δεδομένων. Αν και η πλατφόρμα DMET χρησιμοποιείται προς το παρόν για ερευνητικούς σκοπούς, η ανάπτυξη της τεχνολογίας καθώς και η άνθιση της φαρμακογονιδιωματικής έρευνας ελπίζουν να εισάγουν τα φαρμακογονιδιωματικά τεστ πιο ενεργά στη κλινική πράξη. 29

46 30

47 2. ΣΚΟΠΟΣ 31

48 32

49 2. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η επιστήμη της φαρμακογονιδιωματικής εστιάζει στη μελέτη της γενετικής ποικιλότητας η οποία μπορεί να ευθύνεται για την διαφορετική ανταπόκριση των ασθενών στα φάρμακα. Οι τελευταίες τεχνολογικές εξελίξεις παρέχουν δυνατότητες ταυτόχρονης ανάλυσης πολύ μεγάλου αριθμού δειγμάτων και παραγόντων με αποτέλεσμα την απόκτηση μεγάλου όγκου πληροφοριών. Αν και οι εξελίξεις αυτές έχουν συμβάλει ιδιαίτερα στην πραγματοποίηση ενός μεγάλου αριθμού φαρμακογονιδιωματικών -και όχι μόνο- μελετών και στην στροφή της προσοχής της επιστημονικής κοινότητας στην εξατομικευμένη ιατρική, εντούτοις, η εφαρμογή στην κλινική πράξη παραμένει ακόμη σε πολύ πρώιμο στάδιο. Η διαχείριση του μεγάλου αυτού όγκου δεδομένων που προκύπτει από τις φαρμακογονιδιωματικές μελέτες αν και δύσκολη κρίνεται ολοένα και περισσότερο αναγκαία ώστε να μπορέσει να περάσει από την έρευνα στην κλινική ή αλλιώς αυτό που ονομάζουμε «from bench to bedside». Πολλές μελέτες επιλογής φαρμακογονιδιωματικών δεικτών που εξετάζουν διαφορετικούς πληθυσμούς έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθότι δείχνουν σημαντικά διαφορετικές συχνότητες αλληλομόρφων για έναν μεγάλο αριθμό φαρμακογονιδιωματικών βιοδεικτών. Ενώ ορισμένοι πληθυσμοί έχουν μελετηθεί εκτενώς κάποιοι άλλοι, συμπεριλαμβανομένου και του ελληνικού πληθυσμού, φαίνεται να χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης. Με αφορμή το γεγονός αυτό αλλά και λαμβάνοντας υπόψη τις σύγχρονες τεχνολογικές τάσεις στον τομέα της φαρμακογονιδιωματικής, σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση της συχνότητας φαρμακογονιδιωματικών δεικτών στον ελληνικό πληθυσμό με την χρήση της πλατφόρμας υψηλής ανάλυσης DMET καθώς και η αξιολόγηση της εφαρμογής μιας τέτοιας πλατφόρμας σε κλινικά πλαίσια. Αρχικά, η ανάλυση επικεντρώθηκε σε 36 επιλεγμένους βιοδείκτες με φαρμακογενωμικό ενδιαφέρον. Στη συνέχεια, έγινε σύγκριση των αποτελεσμάτων του ελληνικού πληθυσμού για τους δείκτες αυτούς με το μέσο όρο του καυκάσιου πληθυσμού. Επιπλέον, Η πλατφόρμα DMET χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη φαινοτύπου για 20 σημαντικά γονίδια στον ελληνικό πληθυσμό. Τέλος, έγινε υπολογισμός της δόσης της βαρφαρίνης στον ελληνικό πληθυσμό με τη χρήση συγκεκριμένων φαρμακογενωμικών στοιχείων για κάθε ασθενή. Η παρούσα εργασία επισημαίνει τη διαφορετικότητα μεταξύ των πληθυσμών και την σημαντικότητα του 33

50 εξορθολογισμού της χρήσης των φαρμάκων σε κάθε χώρα και ως εκ τούτου σε κάθε ασθενή. 34

51 3. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ: ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 35

52 36

53 3. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ: ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1. Συλλογή Δειγμάτων Τα δείγματα που μελετήθηκαν παρελήφθησαν από το Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Πατρών από άτομα με ελληνική ιθαγένεια. Πρόκειται για δείγματα 45 υγειών αιμοδοτών τα οποία λήφθησαν με τη συγκατάθεση των δοτών Απομόνωση Ολικού Γονιδιωματικού DNA Η απομόνωση του ολικού γονιδιωματικού DNA από ολικό αίμα έγινε με τη χρήση του προτυποποιημένου συστήματος Gentra Puregene Blood Kit (Qiagen). Απομονώθηκε γονιδιωματικό DNA από 3mL περιφερικού αίματος στο οποίο είχε προστεθεί EDTA ως αντιπηκτικός παράγοντας. Τα στάδια τα οποία ακολουθήθηκαν για την απομόνωση του DNA ήταν τα εξής: 1. Προσθήκη 9mL του αντιδραστηρίου RBC Lysis Solution σε σωλήνα φυγοκέντρου χωρητικότητας 15mL. 2. Προσθήκη 3mL αίματος και ήπια ανάδευση. 3. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά και ήπια ανάδευση σε τακτά χρονικά διαστήματα. 4. Φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στα 2000 x g. Το ίζημα που προκύπτει περιλαμβάνει τα λευκά κύτταρα του αίματος. 5. Απόρριψη του υπερκείμενου με τη βοήθεια πιπέτας ή με απόχυση αφήνοντας περίπου 200λ. 6. Επαναδιάλυση του ιζήματος στο εναπομείναν υπερκείμενο με τη χρήση vortex. 7. Προσθήκη 3mL του αντιδραστηρίου Cell Lysis Solution και ανάδευση με πιπέτα ή με vortex ώστε να γίνει η λύση των κυττάρων. 8. Προσθήκη 1mL αντιδραστηρίου Protein Precipitation Solution και ανάδευση με vortex για 20 δευτερόλεπτα στη μέγιστη ταχύτητα. 9. Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα 2000 x g. 10. Μεταφορά του υπερκειμένου σε νέο σωλήνα φυγοκέντρου, ο οποίος περιέχει 3mL ισοπροπανόλης. 11. Ήπια ανάδευση μέχρι το DNA να είναι εμφανές σαν ίνες. 37

54 12. Φυγοκέντρηση για 3 λεπτά στα 2000 x g. Το DNA εμφανίζεται ως λευκό ίζημα. 13. Απομάκρυνση του υπερκειμένου και αποστράγγιση του σωλήνα σε απορροφητικό χαρτί, προσέχοντας ώστε το ίζημα να παραμένει μέσα στο σωλήνα. 14. Προσθήκη 3mL αιθανόλης 70% και ήπια ανάδευση αρκετές φορές ώστε να πραγματοποιηθεί έκπλυση του ιζήματος. 15. Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα 2000 x g. 16. Απόρριψη του υπερκειμένου. Αποστράγγιση του σωλήνα σε απορροφητικό χαρτί σε θερμοκρασία δωματίου προσέχοντας ώστε το ίζημα να παραμένει στη θέση του. 17. Προσθήκη 300μL του αντιδραστηρίου DNA Hydration Solution και ανάδευση με vortex για 5 δευτερόλεπτα σε μέτρια ταχύτητα. 18. Επώαση στους 65 o C για 1 ώρα προκειμένου να διαλυθεί το DNA. 19. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου overnight (12-16 ώρες). Τα δείγματα φυγοκεντρούνται την επόμενη μέρα και αποθηκεύονται στους -20 ο C Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης των δειγμάτων DNA έγινε με τη χρήση της συσκευής NanoDrop ND Η συγκεκριμένη συσκευή είναι ένα φασματοφωτόμετρο που μετράει τη συγκέντρωση των νουκλεϊκών οξέων ή των πρωτεϊνών σε ένα διάλυμα. Η συσκευή αυτή έχει πολλά πλεονεκτήματα. Αρχικά, οι μετρήσείς πραγματοποιούνται με μεγάλη ταχύτητα (περίπου 5 δευτερόλεπτα ανά δείγμα). Δεύτερον, η ποσότητα του δείγματος που απαιτείται είναι πολύ μικρή και κυμαίνεται μεταξύ 0,5-2μL. Για τις δικές μας μετρήσεις χρησιμοποιήθηκε ποσότητα 1μL η οποία είναι η συνιστώμενη ποσότητα δείγματος για τη μέτρηση νουκλεϊκών οξέων. Ακόμη, με τη συσκευή αυτή δίνεται η δυνατότητα μέτρησης πυκνών διαλυμάτων χωρίς να είναι απαραίτητη η αραίωση αυτών. Επιπλέον, ο υπολογισμός των λόγων καθαρότητας 260/280nm και 260/230nm γίνεται αυτόματα και τέλος, η συσκευή είναι εξοπλισμένη με λογισμισκό φιλικό προς το χρήστη που δίνει τη δυνατότητα τροποποίησης και αυτόματης εξαγωγής αποτελεσμάτων σε αρχείο μορφής excel. 38

55 Το πρώτο βήμα είναι ο μηδενισμός της συσκευής με το διάλυμα έκλουσης του DNA. Ακολούθως, με τον βραχίονα ανοιχτό, 1μl του δείγματός μας τοποθετείται στην ειδική βάση. Κλείνουμε τον βραχίονα και με την επιλογή «Measure» γίνεται ο υπολογισμός της συγκέντρωσης του DNA με τη βοήθεια οπτικών ινών. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων, καταγράφονται αυτόματα στον υπολογιστή που βρίσκεται σε σύνδεση με τη συσκευή. Στο τέλος κάθε μέτρησης απομακρύνουμε τυχόν υπολείμματα με απορροφητικό χαρτί και προχωράμε στην επόμενη μέτρηση. Η φωτομέτρηση του δείγματος DNA πραγματοποιείται σε μήκος κύματος ίσο με 260nm και αυτόματα υπολογίζεται η συγκέντρωση του DNA. Ταυτόχρονα πραγματοποιείται και μέτρηση σε μήκος κύματος 280nm, ώστε να ελεγχθεί η περιεκτικότητα του δείγματος σε πρωτεΐνες. Ο λόγος της τιμής της οπτικής απορρόφησης (O.D.) στα 260nm προς την τιμή της οπτικής απορρόφησης στα 280nm εκφράζει την καθαρότητα του δείγματος DNA. Το καθαρό DNA δίνει λόγο 1,8-2,0. Στην περίπτωση που ο λόγος έχει τιμή μικρότερη του 1,8 τότε συμπεραίνουμε πως στο δείγμα μας υπάρχουν προσμίξεις πρωτεΐνης και ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA δεν θεωρείται ακριβής. Όσον αφορά το λόγο 260/230nm, χρησιμοποιείται σαν μια δεύτερη παράμετρος για τον έλεγχο της καθαρότητας του δείγματος DNA. Η τιμή του λόγου αυτού για ένα καθαρό δείγμα DNA είναι συνήθως υψηλότερη από την αντίστοιχη τιμή του λόγου 260/280nm. Οι αναμενόμενες τιμές του κυμαίνονται συνήθως μεταξύ 2,0-2,2. Ένα παράδειγμα αποδεκτής μέτρησης παρουσιάζεται στην Εικόνα 8. Στις περιπτώσεις που η τιμή είναι αισθητά χαμηλότερη, αυτό μπορεί να υποδεικνύει την παρουσία οργανικών προσμίξεων που απορροφούν στα 230nm. Εικόνα 8: Ένα παράδειγμα αποδεκτής μέτρησης στο Nanodrop. 39

56 3.4. Γονοτύπηση με τη πλατφόρμα DMET Για την διαδικασία γονοτύπησης των 1936 φαρμακογονιδιωματικών δεικτών με την πλατφόρμα DMET ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο σύμφωνα με της οδηγίες του κατασκευαστή το οποίο απεικονίζεται συνοπτικά στην Εικόνα 10. H πλατφόρμα DMET χρησιμοποιεί τη τεχνολογία των ανάστροφων μοριακών ανιχνευτών (Molecular Inversion Probes, MIPs) και ενός είδους πολύπλοκης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Multiplex Polymerase Chain Reaction, mpcr) προκειμένου να ενισχύσει την πληροφορία σε κάθε SNP γενετικό τόπο. Η χρήση των δύο αυτών τεχνολογιών επιτρέπει την επεξεργασία περιοχών γενετικών δεικτών οι οποίες είναι δύσκολο να επεξεργαστούν και να γονοτυπηθούν με συμβατικές μικροσυστοιχίες λόγω της παρουσίας ψευδογονιδίων και άλλων παρόμοιων αλληλουχιών. Έτσι, κάποιοι δείκτες προ-ενισχύονται αρχικά με τη χρήση της mpcr. Στη συνέχεια, οι αλληλουχίες που περιέχουν τους δείκτες ενδιαφέροντος ενισχύονται επιλεκτικά με την χρήση της τεχνολογίας MIP (Εικόνα 9) (Hardenbol et al., 2003). Συνοπτικά, η διαδικασία περιλαμβάνει, κατακερματισμό και σήμανση των PCR προϊόντων που παρήχθησαν με την τεχνολογία των MIPs, υβριδοποίηση αυτών σε μικροσυστοιχία που περιέχει ολιγονουκλεοτίδια ειδικά για κάθε αλληλόμορφο τα οποία χρησιμοποιούνται για τον διαχωρισμό των SNPs και τέλος γονοτύπηση. Εικόνα 9: Συνοπτική απεικόνιση της τεχνολογίας MIP. 40

57 Το πρωτόκολλο DMET αποτελείται από 8 διαφορετικά στάδια και πρέπει να πραγματοποιείται σε τρείς διαφορετικούς εργαστηριακούς χώρους προκειμένου να διαχωριστούν τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται πριν τις PCR αντιδράσεις από τα προϊόντα που προκύπτουν μετά τις PCR αντιδράσεις προστατεύοντας έτσι από πιθανή επιμόλυνση των δειγμάτων από διάφορα προϊόντα PCR. Οι χώροι αυτοί περιλαβάνουν: 1) χώρος/πάγκος mpcr ή απαγωγός στο χώρο προ-ενίσχυσης (pre-pcr), 2) χώρος/πάγκος pre-pcr και 3) χώρος/πάγκος όπου πραγματοποιούνται όλα τα στάδια μετά την PCR (post- PCR). Το πείραμα απαιτεί DNA συγκέντρωσης 60ng/μL αραιωμένο με τη χρήση 1X Tris-EDTA (ΤΕ) διαλύματος. Το διάλυμα ΤΕ διαλυτοποιεί το DNA και το προστατεύει από την αποδόμηση. Στη συνέχεια, παρατίθεται αναλυτικά το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε για την γονοτύπηση των δειγμάτων με την πλατφόρμα DMET. Εικόνα 10: Συνοπτική διαγραμματική απεικόνιση της διαδικασίας που ακολουθείται κατά την δοκιμή DMET. 41

58 Στάδιο 1 ο mpcr Το στάδιο αυτό πραγματοποιείται στο mpcr χώρο. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την ολοκλήρωση του αναγράφονται στον Πίνακα 6. Τα αντιδραστήρια αφήνονται να ξεπαγώσουν σε θερμοκρασία δωματίου, αναδεύονται ελαφρά με vortex, φυγοκεντρούνται σύντομα και έπειτα τοποθετούνται σε πάγο μέχρι τη χρήση τους (εξαιρείται το αντιδραστήριο PCR Dilution Buffer το οποίο παραμένει σε θερμοκρασία δωματίου). Πίνακας 5: Αντιδραστήρια σταδίου 1. Από το κιτ DMET Panel DMET Plus mpcr Primer Mix 1X TE Buffer DMET Plus gdna Control (1,2,3) PCR Dilution Buffer Από το κιτ QIAGEN Multiplex PCR 2X QIAGEN Multiplex PCR Master Mix Q-Solution, 5X Rnase-free water Προετοιμασία GP1 (Genomic Plate 1) 1. Σήμανση μιας πλάκας 96 θέσεων ως GP1. 2. Ανάδευση των δειγμάτων DNA προς ανάλυση με vortex και σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 3. Προσθήκη 17μL από κάθε δείγμα DNA προς ανάλυση στις θέσεις Β1- Ε12 και από κάθε δείγμα ελέγχου στις θέσεις C12, D12 και E12 (Εικόνα 11). Σημ.: Η χρήση των σειρών Α και Η συνιστάται να αποφεύγεται κατά την δοκιμή DMET λόγω πιθανής εξάτμισης από τις γωνιακές θέσεις της πλάκας. 4. Κλείσιμο της πλάκας με αυτοκόλλητη ταινία και σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 5. Τοποθέτηση της πλάκας στο πάγκο ή στους 4 o C μέχρι τη χρήση της. 42

59 Εικόνα 11: Προετοιμασία της πλάκας GP1 Προετοιμασία GP2 (Genomic Plate 2) 1. Σήμανση μιας πλάκας 96 θέσεων ως GP2 και τοποθέτηση της σε πάγο. 2. Προσθήκη 10μL αντιδραστηρίου 1Χ ΤΕ Buffer σε κάθε θέση από τις σειρές Β εως Ε. 3. Μεταφορά 2μL από κάθε δείγμα της πλάκας GP1 στις αντίστοιχες θέσεις της πλάκας GP2 (Εικόνα 12). 4. Ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές. Σημ: Ο τελικός όγκος σε κάθε θέση είναι 12μL ενώ η τελικη συγκέντρωση DNA σε κάθε θέση είναι 10ng/μL. 5. Κάλυψη της πλάκας με αυτοκόλλητη ταινία, ανάδευση με vortex και σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 6. Τοποθέτηση της πλάκας GP2 στον πάγο. 7. Φύλαξη της πλάκας GP1 καθώς χρησιμοποιείται ξανά στο επόμενο στάδιο. Εικόνα 12: Προετοιμασία της πλάκας GP2 43

60 Προετοιμασία του mpcr Master Mix Σημ: Για την προετοιμασία του 5Χ Q-Solution εναλλάσονται διαδικασίες ανάδευσης με vortex και σύντομης φυγοκέντρησης μέχρι το διάλυμα να γίνει διαυγές (χώρις εμφανές ίζημα) και έπειτα τοποθετείται σε πάγο. 1. Σήμανση ενός σωλήνα φυγοκέντρου χωρητικότητας 15mL ως mpcr. 2. Προσθήκη των αντιδραστηρίων με τη σειρά που αναγράφονται στον Πίνακα Ανάδευση 5 φορές με μL πιπέτα ρυθμισμένη στα 900μL και τοποθέτηση σε πάγο μέχρι τη χρήση του. Πίνακας 6: mpcr Master Mix Αντιδραστήριο QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 1 Αντίδραση 48 αντιδράσεις (>20% περίσσεια) 25 μl 1500 μl mpcr Primer Mix 5 μl 300 μl 5X Q-Solution 5 μl 300 μl Rnase-free Water 10 μl 600 μl Τελικός Όγκος 45 μl 2700 μl Προετοιμασία και Επώαση της πλάκας mpcr 1. Σήμανση πλάκας 96 θέσεων ως mpcr και τοποθέτηση της σε πάγο. 2. Προσθήκη 45μL mpcr Master Mix σε κάθε θέση από τις σειρές Β εως Ε. 3. Μεταφορά 5μL από κάθε δείγμα της πλάκας GP2 στις αντίστοιχες θέσεις της πλάκας mpcr (Εικόνα 13). 4. Ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές. 5. Κάλυψη της πλάκας με αυτοκόλλητη ταινία, ανάδευση με vortex και σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 6. Τοποθέτηση της πλάκας mpcr σε θερμικό κυκλοποιητή και πραγματοποίηση του προγράμματος DMET mpcr (Εικόνα 14). Φύλαξη της πλάκας GP2 σε πάγο μέχρι την ολοκλήρωση του σταδίου. 44

61 Εικόνα 13: Προετοιμασία της πλάκας mpcr Εικόνα 14: Πρόγραμμα DMET mpcr Αραίωση των προϊόντων mpcr Σημ: Τα προϊόντα mpcr αραιώνονται δύο φορές. Μια καινούρια πλάκα χρησιμοποιείται για κάθε αραίωση. 1. Μετά το τέλος του προγράμματος mpcr η πλάκα αφαιρείται από τον θερμικό κυκλοποιητή, τοποθετείται σε πάγο για 2 λεπτά, φυγοκεντρείται στα 2000rpm για δευτερόλεπτα και τοποθετείται στον πάγο 2. Σήμανση μιας πλάκας 96 θέσεων ως DP1 (Dilution Plate 1) και μιας άλλης ως DP2 (Dilution Plate 2) και τοποθέτησή τους σε πάγο. 3. Ανάδευση του αντιδραστηρίου PCR Dilution Buffer με αναστροφή του μπουκαλιού 10 φορές. 4. Προσθήκη 156μL από το PCR Dilution Buffer στις θέσεις Β1-Ε12 σε στις πλάκες DP1 και DP2. 45

62 5. Μεταφορά 5μL από κάθε θέση της πλάκας mpcr στις αντίστοιχες θέσης της πλάκας DP1 (συνολικός όγκος 158μL). 6. Ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές για καθαρισμό των ρύγχων της πιπετας και περαιτερω αργή ανάδευση με πιπέτα ρυθμισμένη στα 80μL. 7. Μεταφορά 5μL από κάθε θέση της πλάκας DP1 στις αντίστοιχες θέσεις της πλάκας DP2 (συνολικός όγκος 158μL). 8. Ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές για καθαρισμό των ρυγχων της πιπετας και περαιτέρω αργή ανάδευση με πιπέτα ρυθμισμένη στα 80μL. Σημ: Για αποφυγή δημιουργίας φυσαλίδων η πιπετα πατιέται μέχρι το πρώτο στοπ. 9. Κάλυψη της πλάκας DP2 με αυτοκόλλητη ταινία και τοποθέτηση της σε πάγο μέχρι τη χρήση της. Σημ: Τα προϊόντα mpcr είναι τώρα αραιωμένα 1000 φορές στην πλάκα DP Απόρριψη της πλάκας DP1 και συνέχεια στο στάδιο Στάδιο 2 ο Anneal Το στάδιο αυτό πραγματοποιείται στον mpcr/pre-pcr χώρο. Οι τελικές αλληλουχίες των MIP υβριδοποιούνται με τα συμπληρωματικά τους γονιδιωματικά πρότυπα δημιουργώντας με αυτό τον τρόπο κυκλικές δομές που εμπεριέχουν ένα μονο- ή πολύ- νουκλεοτιδικά κενά τα οποία εντοπίζονται μεταξύ των άκρων του MIP και ακριβώς απένταντι από το SNP που πρόκειται να αναλυθεί. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την ολοκλήρωση αυτού του σταδίου αναγράφονται στον Πίνακα 8. Τα αντιδραστήρια αφήνονται να ξεπαγώσουν σε θερμοκρασία δωματίου, αναδεύονται ελαφρά με vortex, φυγοκεντρούνται σύντομα και έπειτα τοποθετούνται σε πάγο μέχρι τη χρήση τους. Συγκεκριμένα, το αντιδραστήριο Enzyme A, αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου μόνο όσο χρόνο χρειάζεται προκειμένου να ξεπαγώσει. Μπορεί να φυγοκεντρηθεί σύντομα αλλά όχι να αναδευτεί με vortex. Μολις ξεπαγώσει,στη συνέχεια τοποθετείται σε πάγο. 46

63 Πίνακας 7: Αντιδραστήρια σταδίου 2. Από το κιτ DMET Pre-Amp Pre-Amp water Buffer A Enzyme A Από το κιτ DMET Panel DMET MIP Panel Προετοιμασία του Anneal Master Mix 1. Σήμανση ενός σωλήνα Eppendorf ως Ann και τοποθέτηση του σε πάγο. 2. Προσθήκη των αντιδραστηρίων με τη σειρά που αναγράφονται στον Πίνακα Ανάδευση 5 φορές με μl πιπέτα ρυθμισμένη στα 900μL και τοποθέτηση σε πάγο μέχρι τη χρήση του. Πίνακας 8: Anneal Master Mix Αντιδραστήριο 1 Αντίδραση 48 αντιδράσεις (>20% περίσσεια) Post-Amp Water 8,9 μl 536 μl Fragmentation Buffer 1 μl 60 μl Fragmentation Enzyme 0,0675 μl 4,1 μl Τελικός Όγκος 10 μl 600 μl Μεταφορά δειγμάτων από την πλάκα GP1 στην πλάκα ANN (Anneal) 1. Σήμανση πλάκας 96 θέσεων ως ΑΝΝ και τοποθέτηση της σε πάγο. 2. Φυγοκέντρηση της πλάκας GP1 στα 2000rpm για δευτερόλεπτα και τοποθέτηση της σε πάγο. 3. Προσθήκη 21,7μL από το Anneal Master Mix σε κάθε μια από τις θέσεις Β1-Ε12 της πλάκας ANN. 4. Μεταφορά 13,4μL από κάθε θέση της πλάκας GP1 στις αντίστοιχες θέσης της πλάκας ANN. 5. Ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές για καθαρισμό των ρυγχων της πιπετας και κλείσιμο της πλάκας με αυτοκόλλητη ταινία. 47

64 Προσθήκη αραιωμένων προϊόντων mpcr στη πλάκα ANN 1. Μεταφορά 5μL από τα αραιωμένα mpcr προϊόντα από την πλάκα DP2 στις αντίστοιχες θέσεις της πλάκας ANN (συνολικός όγκος 40,1 μl) (Εικόνα 15). 2. Κάλυψη της πλάκας ΑΝΝ με αυτοκόλλητη ταινία. Εικόνα 15: Προετοιμασία της πλάκας ANN. Anneal και προσθήκη του DMET MIP Panel 1. Ανάδευση με vortex στο κέντρο της πλάκας ANN σε υψηλή ταχύτητα για 3 δευτερόλεπτα και σύντομη φυγοκέντρηση της στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 2. Εκκίνηση του προγράμματος DMET Anneal (Εικόνα 16). 3. Φόρτωση της πλάκας όταν η θερμοκρασία φτάσει τους 20 ο C. 4. Παύση του προγράμματος στο τέλος του πρώτου hold στους 95 ο C. 5. Αφαίρεση της πλάκας ANN και τοποθέτηση της σε πάγο για 2 λεπτά. 6. Προσθήκη 5μL από το αντιδραστήριο DMET MIP Panel σε κάθε θέση της πλάκας ANN. 7. Ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές για καθαρισμό των ρυγχων της πιπετας (συνολικός όγκος 45,1μL). 8. Κάλυψη της πλάκας με αυτοκόλλητη ταινία, ανάδευση με vortex και σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 9. Τοποθέτηση της πλάκας πίσω στον θερμικό κυκλοποιητή και επαναφορά του προγράμματος. 10. Επώαση των δειγμάτων για ώρες. 48

65 Εικόνα 16: Πρόγραμμα DMET Anneal Στάδιο 3 ο Πλήρωση Κενού (Gap Fill) Mέσω Eνίσχυσης (Amplification) Το στάδιο αυτό πραγματοποιείται στον mpcr/pre-pcr χώρο. Το νουκλεοτίδιο που λείπει το οποίο είναι συμπληρωματικό με το SNP προς ανάλυση συμπληρώνεται από την DNA πολυμεράση και στη συνέχεια η DNA λιγάση κλείνει την κυκλική δομή (padlock). Εναπομείναντα, μη κυκλικά MIP, μαζί με τα μονόκλωνα μόρια γενωμικού DNA αποδομούνται από τις ενδονουκλεάσες. Στη συνέχεια, οι κυκλικές δομές τεμνονται από περιοριστικά ένζυμα και οι πλέον γραμμικοί, ανεστραμμένοι ανιχνευτές ενισχύονται με τη χρήση καθολικών εκκινητών. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την ολοκλήρωση του σταδίου αναγράφονται στον Πίνακα 10. Τα αντιδραστήρια dntp Mix και Universal Amp Mix αφήνονται να ξεπαγώσουν σε θερμοκρασία δωματίου, αναδεύονται ελαφρά με vortex, φυγοκεντρούνται σύντομα και έπειτα τοποθετούνται σε πάγο μέχρι τη χρήση τους. Τα υπόλοιπα αντιδραστήρια φυλλάσονται συνεχώς στους -20 ο C μέχρι τη χρήση τους. Πίνακας 9: Αντιδραστήρια σταδίου 3. Από το κιτ DMET Pre-Amp Gap Fill Mix 1 Gap Fill Mix 2 Exo Mix Cleavage Enzyme Universal Amp Mix dntp Mix Άλλα αντιδραστήρια TITANIUM Taq Polymerase 49

66 Προετοιμασία του Gap Fill Mix 1. Σήμανση ενός σωλήνα Eppendorf με το γράμμα G. 2. Αργή προσθήκη 190μL του αντιδραστήριο Gap Fill Mix Αργή προσθήκη 10μL του αντιδραστήριο Gap Fill Mix Ανάδευση 15 φορές με 200 μl πιπέτα ρυθμισμένη στα 150μL. 5. Σύντομη φυγοκέντρηση και τοποθέτηση σε πάγο μέχρι τη χρήση. Προσθήκη του Gap Fill Mix 1. Αφαίρεση της πλάκας ANN από τον θερμικό κυκλοποιητή και τοποθέτηση σε πάγο για 2 λεπτά. Έπειτα, σύντομη φυγοκέντρηση της πλάκας στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 2. Προσθήκη 2,5μL από το Gap Fill Mix σε κάθε θέση της πλάκας ANN και ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές για καθαρισμό των ρυγχων της πιπετας. 3. Κάλυψη της πλάκας ΑΝΝ με αυτοκόλλητη ταινία, ανάδευση με vortex και σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 4. Σήμανση μιας νέας πλάκας 96 θέσεων ως ASY (Assay Plate). 5. Μεταφορά 12μL κάθε αντίδρασης της πλάκας ANN στην πλάκα ASY (Εικόνα 17). 6. Κάλυψη της πλάκας ΑΝΝ με αυτοκόλλητη ταινία και σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 7. Εκκίνηση του προγράμματος DMET Assay (Εικόνα 18). 8. Τοποθέτηση της πλάκας στο θερμικό κυκλοποιητή όταν αυτός φτάσει τη θερμοκρασία των 58 o C. Σημ: Η πλάκα ANN μπορεί να φυλαχθεί για σύντομο χρονικό διάστημα στιυς -20 o C και μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε περιπτώσεις απώλειας δείγματος σε αργότερα σημεία του πειράματος. 50

67 Εικόνα 17: Προετοιμασία της πλάκας ASY. Εικόνα 18: Πρόγραμμα DMET Assay. Προετοιμασία και προσθήκη του dntp Mix 1. Έπειτα από επώαση 11 λεπτών στους 58 o C, πραγματοποιείται παύση του προγράμματος και αφαίρεση της πλάκας ASY από τον θερμικό κυκλοποιητή. 2. Τοποθέτηση σε πάγο για 2 λεπτά. 3. Σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 4. Προσθήκη 5μL από το αντιδραστήριο dntp Mix σε κάθε θέση αντίδρασης της πλάκας ASY και ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές για καθαρισμό των ρυγχων της πιπετας (συνολικός όγκος 17μL). 5. Κλείσιμο της πλάκας με αυτοκόλλητη ταινία, ανάδευση με vortex και σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 51

68 6. Τοποθέτηση της πλάκας πίσω στον θερμικό κυκλοποιητή και επαναφορά του προγράμματος. Προετοιμασία και προσθήκη του Exo Mix 1. Όταν η θερμοκρασία του θερμικού κυκλοποιητή φτάσει τους 37 o C, πραγματοποιείται παύση του προγράμματος και αφαίρεση της πλάκας ASY. 2. Τοποθέτηση σε πάγο για 2 λεπτά. 3. Σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 4. Προσθήκη 5μL από το αντιδραστήριο Exo Mix σε κάθε θέση αντίδρασης της πλάκας ASY και ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές για καθαρισμό των ρυγχων της πιπετας (συνολικός όγκος 22μL). 5. Κάλυψη της πλάκας με αυτοκόλλητη ταινία, ανάδευση με vortex και σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 6. Τοποθέτηση της πλάκας πίσω στον θερμικό κυκλοποιητή και επαναφορά του προγράμματος. Προετοιμασία και προσθήκη του Universal Amp Mix 1. Προσθήκη 25μL από το αντιδραστήριο Cleavage Enzyme και 70μL από το αντιδραστήριο TITANIUM Taq Polymerase στο σωλήνα του αντιδραστηρίου Universal Amp Mix. 2. Ανάδευση του διαλύματος 5 φορές με μl πιπέτα ρυθμισμένη στα 900μL και τοποθέτηση σε πάγο μέχρι τη χρήση του. 3. Όταν η θερμοκρασία του θερμικού κυκλοποιητή φτάσει τους 60 o C, παύση του προγράμματος και αφαίρεση της πλάκας ASY. 4. Τοποθέτηση σε πάγο για 2 λεπτά. 5. Σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 6. Προσθήκη 30μL από το αντιδραστήριο Universal Amp Mix σε κάθε θέση αντίδρασης της πλάκας ASY και ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές για καθαρισμό των ρυγχων της πιπετας (συνολικός όγκος 52μL). 7. Κάλυψη της πλάκας με αυτοκόλλητη ταινία, ανάδευση με vortex και σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 8. Τοποθέτηση της πλάκας πίσω στον θερμικό κυκλοποιητή και επαναφορά του προγράμματος. 52

69 9. Όταν το πρόγραμμα τελειώσει, η πλάκα μεταφέρεται στον post-pcr χώρο και τοποθετείται σε πάγο Στάδιο 4 ο Καθαρισμός Προϊόντων PCR και Πρώτο QC Gel Το στάδιο αυτό πραγματοποιείται στον post-pcr χώρο. Τα προϊόντα PCR καθαρίζονται ενζυμικά. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την ολοκλήρωση του αναγράφονται στον Πίνακα 11. Πίνακας 10: Αντιδραστήρια σταδίου 4 Από το κιτ DMET Labeling PCR Clean Up Mix Προετοιμασία και προσθήκη του PCR Clean-Up Mix 1. Σύντομη φυγοκέντρηση του αντιδραστηρίου PCR Clean Up Mix και τοποθέτηση του σε πάγο. 2. Προσθήκη 2,5μL από το αντιδραστήριο PCR Clean Up Mix σε κάθε θέση αντίδρασης της πλάκας ASY και ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές για καθαρισμό των ρυγχων της πιπετας (συνολικός όγκος 54,5μL). 3. Κάλυψη της πλάκας με αυτοκόλλητη ταινία, ανάδευση με vortex και σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 4. Τοποθέτηση της πλάκας πίσω στον θερμικό κυκλοποιητή και εκκίνηση του προγράμματος DMET Clean Up (Εικόνα 19). Εικόνα 19: Πρόγραμμα DMET PCR Clean Up 53

70 Προετοιμασία και τρέξιμο του πρώτου QC Gel 1. Αφαίρεση της πλάκας από τον θερμικό κυκλοποιητή και συντομη φυγοκεντρηση στα 2000rpm για δευτερολεπτα 2. Σήμανση μιας νέας πλάκας 96 θέσεων ως Gel1. 3. Προσθήκη 8μL αντιδραστηρίου 1Χ ΤΕ Buffer ή νερό βαθμού καθαρότητας για μοριακή βιολογία (molecular biology grade) στις θέσεις Β1-Ε Προσθήκη 2μL αντιδραστηρίου Loading Buffer στις ίδιες θέσεις με το βήμα Μεταφορά 2μL από κάθε θέση της πλάκας ASY (μετά τη διαδικασία καθαρισμού) στις αντίστοιχες θέσεις της πλάκας Gel1 και ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές για καθαρισμό των ρυγχων της πιπετας. 6. Κάλυψη της πλάκας ASY με αυτοκόλλητη ταινία και τοποθέτηση της σε πάγο (συνολικός όγκος 52,5μL). 7. Κάλυψη της πλάκας Gel1, ανάδευση με vortex και σύντομη φυγοκέντρηση. 8. Προετοιμασία Gel αγαρόζης 3% (ή χρήση ενός προκατασκευασμένου) και φόρτωση 10μL από κάθε αντίδραση. 9. Τρέξιμο του gel στα 120V για 20 λεπτά. 10. Εμφάνιση του gel και εξέταση ώστε να διαπιστωθεί εάν τα προϊόντα PCR βρίσκονται μεταξύ bp. Ο ladder που χρησιμοποιήθηκε ήταν 25bp. Η Εικόνα 20 απεικονίζει ένα παράδειγμα καλής εικόνας του πρώτου QC Gel. Εικόνα 20: Παράδειγμα καλής εικόνας του πρώτου QC Gel. Κάποιες φορές μια δεύτερη μπάντα μεγέθους ~75 bp χαμηλότερης έντασης μπορεί να είναι εμφανής. Διαφορετικές εντάσεις μπαντών είναι ένδειξη διαφορετικών ποσοτήτων προϊόντων PCR σε διαφορετικές θέσεις της πλάκας (ladder 25bp). 54

71 Στάδιο 5 ο Fragmentation και Δεύτερο QC Gel Το στάδιο αυτό πραγματοποιείται στον post-pcr χώρο. Τα προϊόντα PCR κατακερματίζονται για τη βελτίωση της υβριδοποίησης των δειγμάτων στις μικροσυστοιχίες. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την ολοκλήρωση του αναγράφονται στον Πίνακα 12. Τα αντιδραστήρια αφήνονται να ξεπαγώσουν σε θερμοκρασία δωματίου, αναδεύονται ελαφρά με vortex, φυγοκεντρούνται σύντομα και έπειτα τοποθετούνται σε πάγο μέχρι τη χρήση τους. Το αντιδραστήριο Fragmentation Reagent φυλλάσεται συνεχώς στους - 20 ο C μέχρι τη χρήση του και έπειτα φυγοκεντρείται σύντομα. Πίνακας 11: Αντιδραστήρια σταδίου 5 Από το κιτ DMET Labeling Post-Amp water Fragmentation Buffer Fragmentation Reagent Προετοιμασία και πραγματοποίηση του Fragmentation 1. Σήμανση μιας πλάκας 96 θέσεων ως Frag/Label 2. Μεταφορά 25μL από από κάθε θέση της πλάκας ASY (μετά τη διαδικασία καθαρισμού) στις αντίστοιχες θέσεις της πλάκας Frag/Label. 3. Σήμανση ενός σωλήνα Eppedorf ως Frag και τοποθέτηση του σε πάγο. 4. Προσθήκη των αντιδραστηρίων Fragmentation Buffer και Post-Amp Water όπως αναγράφονται στον Πίνακα Ψύξη του σωλήνα σε πάγο για 5 λεπτά. 6. Απομάκρυνση του αντιδραστηρίου Fragmentation Reagent από την κατάψυξη και προσθήκη της κατάλληλης ποσότητας στον σωλήνα Frag. 7. Ανάδευση του Frag Mix με vortex, σύντομη φυγοκέντρηση 3 δευτερολέπτων και τοποθέτηση σε πάγο. 8. Προσθήκη 10μL από το Frag Mix σε κάθε θέση αντίδρασης της πλάκας Frag/Label και ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές για καθαρισμό των ρυγχων της πιπετας (συνολικός όγκος 35μL). Σημ: το βήμα αυτό πρέπει να πραγματοποιείται σε σύντομο χρονικό διάστημα στον πάγο. 55

72 9. Κάλυψη της πλάκας με αυτοκόλλητη ταινία, ανάδευση με vortex και σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 10. Τοποθέτηση της πλάκας στον θερμικό κυκλοποιητή και εκκίνηση του προγράμματος DMET Frag (Εικόνα 21). Πίνακας 12: Fragmentation Master Mix Αντιδραστήριο 1 Αντίδραση 48 αντιδράσεις (>20% περίσσεια) Post-Amp Water 8,9 μl 536 μl Fragmentation Buffer 1 μl 60 μl Fragmentation Enzyme 0,0675 μl 4,1 μl Τελικός Όγκος 10 μl 600 μl Εικόνα 21: Πρόγραμμα DMET Frag Προετοιμασία και τρέξιμο του δεύτερου QC Gel 1. Με το πέρας του προγράμματος DMET Frag τελειώσει, η πλάκα αφαιρείται από τον θερμικό κυκλοποιητή και φυγοκεντρείται σύντομα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 2. Σήμανση μιας πλάκας 96 θέσεων ως Gel2. 3. Μεταφορά 10μL κάθε αντίδρασης από την πλάκα Frag/Label στις αντίστοιχες θέσεις της πλάκας Gel2. Κάλυψη της πλάκας Frag/Label. 4. Προσθήκη 2μL Loading Buffer σε κάθε αντίδραση και ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές για καθαρισμό των ρυγχων της πιπετας. 5. Κάλυψη της πλάκας με αυτοκόλλητη ταινία, ανάδευση με vortex και σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 6. Προετοιμασία Gel αγαρόζης 3% (ή χρήση ενός προκατασκευασμένου) και φόρτωση 10μL από κάθε αντίδραση. 56

73 7. Τρέξιμο του gel στα 120V για 24 λεπτά. 8. Εμφάνιση του gel και εξέταση ώστε να διαπιστωθεί εάν τα θραύσματα βρίσκονται κάτω από τα 120bp με το smear να επικεντρώνεται περίπου στα 50bp. Η εικόνα 22 απεικονίζει ένα παράδειγμα καλής εικόνας του δεύτερου GC Gel. Εικόνα 22: Παράδειγμα καλής εικόνας του δεύτερου QC Gel Στάδιο 6 ο Labeling Το στάδιο αυτό πραγματοποιείται στον post-pcr χώρο. Το κατακερματισμένο υλικό σημαίνεται με βιοτίνη για ανίχνευση (μετά την υβριδοποίηση) με στρεπταβιδίνη/ R-phycoerythrin.Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την ολοκλήρωση του αναγράφονται στον Πίνακα 14. Τα αντιδραστήρια αφήνονται να ξεπαγώσουν σε θερμοκρασία δωματίου, αναδεύονται ελαφρά με vortex, φυγοκεντρούνται σύντομα και έπειτα τοποθετούνται σε πάγο μέχρι τη χρήση τους. Το αντιδραστήριο TdT Enzyme φυλλάσεται συνεχώς στους -20 ο C μέχρι τη χρήση του και έπειτα φυγοκεντρείται σύντομα πριν τη χρήση του Πίνακας 13: Αντιδραστήρια σταδίου 6. Από το κιτ DMET Labeling Post-Amp Water DNA Labeling Reagent 5X TdT Buffer TdT Enzyme Προετοιμασία και πραγματοποίηση του Labeling 1. Σήμανση ενός σωλήνα Eppedorf ως Label και τοποθέτηση του σε πάγο. 2. Προσθήκη των αντιδραστηρίων με τη σειρά που αναγράφονται στον Πίνακα

74 3. Ανάδευση του Labeling Master Mix με vortex σε υψηλή ταχύτητα για 3 δευτερόλεπα, σύντομη φυγοκέντρηση 3 δευτερολέπτων και τοποθέτησή του σε πάγο. 4. Προσθήκη 10μL από το Labeling Master Mix σε κάθε θέση αντίδρασης της πλάκας Frag/Label και ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές για καθαρισμό των ρυγχων της πιπετας (συνολικός όγκος 35μL). 5. Κάλυψη της πλάκας με αυτοκόλλητη ταινία, ανάδευση με vortex και σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 6. Τοποθέτηση της πλάκας σε θερμικό κυκλοποιητή και εκκίνηση του προγράμματος DMET Label (Εικόνα 23). Πίνακας 14: Labeling Master Mix Αντιδραστήριο 1 Αντίδραση 48 αντιδράσεις (>20% περίσσεια) Post-Amp Water 0,4μL 24μL 5X TdT Buffer 7μL 420μL DNA Labelling Reagent 0,9μL 54μL TdT Enzyme 1,7μL 102μL Τελικός Όγκος 10μL 600μL Εικόνα 23: Πρόγραμμα DMET Label Στάδιο 7 ο Hybridization (Υβριδοποίηση) Το στάδιο αυτό πραγματοποιείται στον post-pcr χώρο. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την ολοκλήρωση του αναγράφονται στον Πίνακα 16. Τα αντιδραστήρια αφήνονται να ξεπαγώσουν σε θερμοκρασία δωματίου, αναδεύονται ελαφρά με vortex, φυγοκεντρούνται σύντομα και έπειτα τοποθετούνται σε πάγο μέχρι τη χρήση τους. 58

75 Πίνακας 15: Αντιδραστήρια σταδίου 7 Από το κιτ DMET Hyb-Stain Hybridization Solution Oligo Coltrol Reagent (OCR) Προετοιμασία του σταδίου 1. Ρύθμιση της θερμοκρασίας του φούρνου υβριδοποίησης στους 49 ο C και των στροφών στα 35rpm. Ενεργοποίηση της περιστροφής και προθέρμανση του φούρνου. 2. Ανοίγμα του περιτυλίγματος των μικροσυστοιχιών και τοποθέτησή τους στο πάγκο. Σημ: είναι σημαντικό οι μικροσυστοιχίες να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου κατά το φόρτωμά τους. 3. Σήμανση της κάθε μικροσυστοιχίας ώστε να είναι ευδιάκριτο ποιο δείγμα θα φορτωθεί σε ποια μικροσυστοιχία. 4. Τοποθέτηση των μικροσυστοιχιών ανάποδα και τοποθέτηση ενός ρύγχους πιπέτας 200μL στη πάνω δεξιά οπή (septum) της μικροσυστοιχίας όπως φαίνεται στην Εικόνα 24. Εικόνα 24: Προετοιμασία των μικροσυστοιχιών για τη διαδικασία της υβριδοποίησης: α) Πριν την μεταφορά δείγματος στη μικροσυστοιχία το ρύχγος τοποθετείται όπως φαίνεται στην εικόνα, β) μετά την μεταφορά του δείγματος στην μικροσυστοιχία τοποθετούνται μικρά αυτοκόλλητα προς αποφυγή απώλειας δείγματος κατά την υβριδοποίηση στον φούρνο. 59

76 Προετοιμασία του Hybridization Master Mix 1. Προσθήκη 50μL από το αντιδραστήριο OCR απευθείας στον σωλήνα του αντιδραστηρίου Hybridization Solution. 2. Καλή ανάδευση του διαλύματος με αναστροφή του σωλήνα 10 φορές και τοποθέτηση του σε πάγο. Προετοιμασία της πλάκας Hyb και αποδιάταξη των δειγμάτων 1. Σήμανση μιας πλάκας 96 θέσεων ως Hyb και τοποθέτηση της σε πάγο. 2. Σύντομη φυγοκέντρηση της πλάκας Frag/Label στα 2000rpm για δευτερόλεπτα και τοποθέτηση σε πάγο. 3. Ύγρανση του ρύγχους της πιπέτας αναρροφώντας και αφήνοντας ποσότητα από το Mix 3 φορές. 4. Προσθήκη 92μL από το Hybridization Master Mix στις κατάλληλες θέσεις της πλάκας Hyb. 5. Μεταφορά 8μL από την πλάκα Frag/Label στις αντίστοιχες θέσεις της πλάκας Hyb και και ανάδευση με την πιπέτα 3 φορές για καθαρισμό των ρυγχων της πιπετας (συνολικός όγκος 100μL). 6. Κάλυψη της πλάκας με αυτοκόλλητη ταινία, ανάδευση με vortex και σύντομη φυγοκέντρηση στα 2000rpm για 30 δευτερόλεπτα. 7. Εκκίνηση του προγράμματος DMET Denature (Εικόνα 25). Τοποθέτηση της πλάκας στον θερμικό κυκλοποιητής όταν η θερμοκρασία φτάσει τους 95 ο C. Σημ: η πλάκα Frag/Label μπορεί να φυλαχθεί στους -20 ο C εως και μια εβδομάδα για τυχόν επαναληπτικούς υβριδισμούς. Εικόνα 25: Πρόγραμμα DMET Denature 60

77 Δημιουργία και ανέβασμα του αρχείου εγγραφής παρτίδας (batch registration file) 1. Για τη δημιουργία του Batch Registration File χρησιμοποιείται το πρόγραμμα Affymetrix GeneChip Command Console (AGCC). Επιλογή του AGCC Portal (Εικόνα 26). Εικόνα 26: Αρχικό μενού προγράμματος AGCC (Launcher). 2. Στο παράθυρο που αναδύεται επιλογή Samples Batch Registration (Εικόνα 27). 61

78 Εικόνα 27: Αρχικό μενού του AGCC Portal. Επιλογή Batch Registration για τη δημιουργία κενού προτύπου καταγραφής δειγμάτων. 3. Δημιουργία ενός κενού αρχείου εγγραφής παρτίδας επιλέγοντας: i. Το πρότυπο της πλατφόρμας DMET ii. Έναν τύπο αρχείου (TSV ή Excel) iii. Τον αριθμό των δειγμάτων που θα καταχωρηθούν iv. Προαιρετικά: ένα όνομα της εργασίας v. Προαιρετικά: το είδος της μικροσυστοιχίας (DMET) 4. Επιλογή Download. Έμφανίζεται ένα κενό αρχείο καταγραφής το οποίο συμπληρώνεται από το χρήστη (Εικόνα 28). Απαραίτητα πεδία: Path ή Project Sample File Name (το όνομα που το πρόγραμμα θα δώσει το αρχείο.arr) Probe Array Type Sample Name Sample Type Consented Marker List 62

79 Εικόνα 28: Συμπλήρωση εγγράφου καταγραφής παρτίδας (batch registration file). 5. Επιλογή File Save As και στη συνέχεια ονομασία του αρχείου και επιλογή φακέλου αποθήκευσης. 6. Προσθήκη των barcodes των μικροσυστοιχιών στο αρχείο που δημιουργήθηκε. 7. Επιστροφή στο παράθυρο Batch Registration Browse Εύρεση του αρχείου που δημιουργήθηκε Upload Save. Η διαδικασία ολοκληρώνεται με εμφάνιση του μηνύματος «Batch Array Registration is complete». Φόρτωμα των δειγμάτων στις μικροσυστοιχίες 1. Μετά το πέρας της δεκάλεπτης επώασης, αφαίρεση της πλάκας Hyb από τον θερμικό κυκλοποιητή και τοποθέτηση της σε πάγο για 2 λεπτά. 2. Σύντομη φυγοκέντρηση της πλάκας στα 2000rpm για δευτερόλεπτα. 3. Δουλεύοντας 16 μικροσυστοιχίες τη φορά ακολουθείται η παρακάτων διαδικασία: i. Μεταφόρά 95μL από κάθε θέση (δείγμα) της πλάκας στην αντίστοιχη μικροσυστοιχία. ii. Αφαίρεση του ρύγχους που είχε τοποθετηθεί στη πάνω δεξιά οπή της μικροσυστοιχίας. 63

80 iii. Κάλυψη και των δύο οπών του πίσω μέρους της μικροσυστοιχίας με μικρές αυτοκόλλητες ταινίες. iv. Τοποθέτηση των μικροσυστοιχιών στις ειδικές θήκες και τοποθέτηση των θηκών στο φούρνο υβριδοποίησης. v. Επανάληψη των βημάτων μέχρι όλα τα δείγματα να έχουν φορτωθεί σε μικροσυστοιχίες και έχουν τοποθετηθεί στο φούρνο. 4. Επώαση των μικροσυστοιχιών στους 49 o C και 35rpm για ώρες. 5. Κλείσιμο της πλάκας Frag/Label με αυτοκόλλητη ταινία και φύλαξη στους -20 o C. 6. Φύλαξη του υπόλοιπου Hybridization Master Mix στους -20 o C μέχρι όλες οι μικροσυστοιχίες να έχουν σαρωθεί/ διαβαστεί με επιτυχία. 7. Μεταφορά των αντιδραστηρίων Stain Buffer και Hold Buffer από τους -20 o C στους 4 o C ως προετοιμασία της διαδικασίας πλύσης και βαφής Στάδιο 8 ο Washing, Staining, Scanning (Πλύση, Βαφή και Σάρωση) Το στάδιο αυτό πραγματοποιείται στον post-pcr χώρο. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την ολοκλήρωση του αναγράφονται στον Πίνακα 17. Τα αντιδραστήρια Stain Buffer και Hold Buffer ανακινούνται ελαφρά 5 φορές και τοποθετούνται σε πάγο μέχρι τη χρήση τους. Πίνακας 16: Αντιδραστήρια σταδίου 8. Από το κιτ DMET Hyb-Stain Stain Buffer Hold Buffer Από το κιτ DMET Wash A Wash B Άλλα αντιδραστήρια Streptavidin Phycoerythrin (SAPE) Προετοιμασία του Fluidics Station (Prime) Πρίν τη χρήση του Fluidics Station για την πλύση και βαφή των μικροσυστοιχιών είναι απαραίτητη η προετοιμασία του μηχανήματος με πραγματοποίηση του πρωτοκόλλου Prime. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: 64

81 1. Άνοιγμα του Fluidics Station. Στις οθόνες κάθε θέσης εμφανίζεται το μήνυμα «Power-On Done. NOT PRIMED 25 o C». 2. Τοποθέτηση των αντιδραστηρίων Wash A και Wash B στις κατάλληλες θέσης και γέμισμα του δοχείου νερού. Το δοχείο αποβλήτων (Waste) πρέπει να είναι άδειο. 3. Στον υπολογιστή, επιλογή του προγράμματος Launcher (Εικόνα 25) και στη συνέχεια επιλογή AGCC Fluidics Control. Εμφανίζεται το παράθυρο ελέγχου του Fluidics Station. 4. Στο πλαίσιο Step 2: Select Protocol, επιλογή του πρωτοκόλλου PRIME_ Επιλογή Check/Uncheck All Modules Copy to Selected Modules Run All. 6. Ακολούθηση των οδηγιών που δίνονται από το μηχάνημα τόσο στην οθόνη του υπολογιστή όσο και στις οθόνες των μονάδων (modules). Με την τοποθέτηση τριών κενών Eppendorf σε κάθε μια από τις θέσεις 1,2,3 κάθε μονάδας και κατέβασμα του αντίστοιχου μοχλού το πρωτόκολλο ξεκινάει. Προετοιμασία του διαλύματος βαφής SAPE 1. Προσθήκη 90μL από το αντιδραστήριο SAPE στο δοχείο του αντιδραστηρίου Stain Buffer. 2. Ανακίνηση με αναστροφή του δοχείου 5 φορές. Σημ: Το αντιδραστήριο SAPE είναι φωτοευαίσθητο γι αυτό θα πρέπει να προστατεύεται από το φως. Πλύση και βαφή των μικροσυστοιχιών 1. Όταν το πρωτόκολλο PRIME_450 ολοκληρωθεί ακολουθεί επιστροφή στο παράθυρο ελέγχου του Fluidics Station. 2. Στο πλαίσιο Step 1: Select Probe Array Type, επιλογή DMET_Plus.Universal. 3. Στο πλαίδιο Step 2: Select Protocol, επιλογή List Compatible Protocols Only και στη συνέχεια επιλογή του πρωτοκόλοου DME_Plus_169_v2. 4. Επιλογή Check/Uncheck All Modules Copy to Selected Modules Run All. 65

82 5. Απομάκρυνση από το φούρνο μόνο των μικροσυστοιχιών προς πλύση και βαφή. 6. Απομάκρυνση των αυτοκόλλητων ταινιών που είχαν τοποθετηθεί στις οπές στο πίσω μέρος των μικροσυστοιχιών. 7. Ακολουθώντας τις οδηγίες του Fluidics Staion, όταν εμφανιστεί το μήνυμα Load Cartidge ακολουθεί τοποθέτηση μιας μικροσυστοιχίας σε κάθε module και κλείσιμο της θέσης με τράβηγμα του κατάλληλου μοχλού. 8. Όταν εμφανιστεί το μήνυμα Load Vials 1 & 2, ακολουθεί τοποθέτηση eppendorf με 300μL SAPE στη θέση 1 και άλλου eppendorf με 300μL Hold Buffer στη θέση 2 κάθε module. 9. Τοποθέτηση ενός καθαρού eppendorf στη θέση 3 κάθε module και κατέβασμα των μοχλών προκειμένου να ξεκινήσει το πρωτόκολλο πλύσης. 10. Άνοιγμα του scanner και επιλογή του AGCC Scan Control από το αρχικό μενού του προγράμματος Launcher (Εικόνα 25). Σημ: Το scanner πρέπει να ζεσταθεί τουλάχιστον για 10 λεπτά πριν τη χρήση του. 11. Όταν εμφανιστεί το μήνυμα Eject and Inspect Cartidge, απομάκρυνση κάθε μικροσυστοιχίας από το Fluidics Station και έλεγχος για τυχόν παρουσία φυσσαλίδων. Εμφανίζεται το μήνυμα: Reload Cartridge to Debubble or Engage Washblock. Εάν: Α. Δεν υπάρχουν φυσσαλίδες τότε τράβηγμα του μοχλού και συνέχεια στο επόμενο βήμα Β. Υπάρχουν φυσσαλίδες τότε τοποθέτηση της μικροσυστοιχίας στη θέση της και τράβηγμα του μοχλού. Η μικροσυστοιχία στραγγίζεται και ξαναγεμίζει με Hold Buffer. Επανάληψη της διαδικασίας μέχρι να μην υπάρχουν φυσσαλίδες. 12. Όταν εμφανιστεί το μήνυμα Remove Vials 1 & 2, απομάκρυνση και απόρριψη των eppendorf από τις θέσεις 1 και Όταν εμφανιστεί το μήνυμα Load Clean Vials, τοποθέτηση καθαρών Eppendorf στις θέσεις 1 και 2, κατέβασμα των μοχλών και επαναφορά του πρωτοκόλλου. 66

83 14. Όταν εμφανιστεί το μήνυμα Remove Vials 1 & 2, απομάκρυνση των Eppendorf. Το πρωτόκολλο έχει ολοκληρωθεί και εμφανίζεται το μήνυμα Protocol Done. 15. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται μέχρι την πλύση και βαφή όλων των μικροσυστοιχιών. Σάρωση των μικροσυστοιχιών 1. Τοποθέτηση των μικροσυστοιχιών στον πάγκο ώστε να φαίνονται οι οπές τους και κάλυψη αυτών με μικρά αυτοκόλλητα προσέχοντας όμως να μην εξέχουν προς το κέντρο της μικροσυστοιχίας. 2. Έλεγχος για τυχόν σκόνη, κηλίδες ή άλλα σημαδάκια στα τζαμάκια των μικροσυστοιχιών. Εάν είναι απαραίτητο πραγματοποιείται καθαρισμός των επιφανειών είτε με πεπιεσμένο αέρα είτε με μαλακό χαρτομάντηλο (π.χ. Kimwipe) και λίγο απιονισμένο νερό. 3. Τοποθέτηση των μικροσυστοιχιών στο scanner ξεκινώντας από τη θέση 1. Σημ: το scanner έχει χωρητικότητα εως 48 μικροσυστοιχίες. 4. Στον υπολογιστή, επιλογή του προγράμματος Launcher (Εικόνα 25) και στη συνέχεια επιλογή AGCC Scan Control. Εμφανίζεται το παράθυρο ελέγχου του scanner. 5. Επιλογή Start. 6. Επιλογή Arrays in carousel positions 1-4 at room temperature OK. Σημ: Εάν οι μικροσυστοιχίες δεν βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου τότε δεν επιλέγεται. Το scanner θα περιμένει ~10 λεπτά πριν ξεκινήσει τη σάρωση προκειμένου να φέρει τις μικροσυστοιχίες σε θερμοκρασία δωματίου. 7. Η διαδικασία σάρωσης ξεκινά. Η κατάσταση σάρωσης εμφανίζεται στο παράθυρο Scan Status. Κλείσιμο και συντήρηση μηχανημάτων Όταν η διαδικασία πλύσης και βαφής των μικροσυστοιχιών έχει ολοκληρωθεί είναι σημαντικό να ακολουθηθεί το πρωτόκολλο Shutdown 67

84 για τον καθαρισμό του Fluidics Station πριν το σβήσιμο του μηχανήματος. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: 1. Απομάκρυνση των διαλυμάτων Wash A και Wash B. 2. Γέμισμα του δοχείου νερού και τοποθέτηση όλων των σωλήνων στο δοχείο αυτό. Εξαιρείται ο σωλήνας Waste ο οποίος παραμένει στο αντίστοιχο δοχείο. 3. Τοποθέτηση καθαρών eppendorf στις θέσεις 1-3 των modules. 4. Επιλογή του πρωτοκόλλου SHUTDOWN_450 All Modules Copy to Selected Modules Run All. 5. Όταν το πρωτόκολλο ολοκήρωθεί, σβήσιμο του Fluidics Station. Όταν η διαδικασία σάρωσης ολοκληρωθεί, οι μικροσυστοιχίες απομακρύνονται από το scanner και το μηχάνημα απενεργοποιείται από το κουμπί ενεργοποίησης-απενεργοποίησης Ανάλυση δεδομένων με το λογισμικό DMET Console Τα ακατέργαστα δεδομένα που προκύπτουν από τη διαδικασία σάρωσης των μικροσυστοιχιών αναλύονται με τη χρήση της πλατφόρμας DMET Console (version ). Για κάθε δείγμα που σαρώνεται δημιουργούνται τρία αρχεία. Αυτά είναι: Αρχεία Δείγματος (sample files,.arr): περιέχει χαρακτηριστικά του δείγματος και πληροφορίες της μικροσυστοιχίας Αρχεία Εικόνας (image files,.dat): περιέχει τιμές έντασης (intensity) των pixel που συλλέγονται από το scanner, μαζί με τις πληροφορίες πλέγματος (gridding information) που χρησιμοποιούνται κατά τη διάρκεια εξαγωγής χαρακτηριστικών. Αρχεία Έντασης Δεδομένων (intensity dara files,.cel): αποθηκεύει τα αποτελέσματα των υπολογισμών των τιμών έντασης των pixel του αρχείου.dat. Το πρόγραμμα για κάθε.cel αρχείο προς ανάλυση απαιτεί και την ύπαρξη του αντίστοιχου.arr αρχείου. Επομένως, για κάθε δείγμα που πρόκειται να γονοτυπηθεί χρειάζονται και τα δύο αυτά αρχεία. Από την επεξεργασία τους προκύπτει, για κάθε δείγμα, ένας τέταρτος τύπος αρχείου, το αρχείο ανάλυσης 68

85 ανιχνευτών (Probe Analysis Files,.CHP). Το αρχείο.chp περιέχει τα δεδομένα της ανάλυσης των ανιχνευτών της μικροσυστοιχία και περιέχει τα δεδομένα πραγματικού ενδιαφέροντος π.χ. SNP calls. Κατά την αρχική εκκίνηση και ρύθμιση του προγράμματος είναι απαραίτητη η δημιουργία ενός προφίλ χρήστη. Επιπλεόν, απαραίτητα βήματα που πρεπει να ακολουθηθούν είναι η επιλογή ενός έγκυρου μονοπατιού βιβλιοθήκης, η λήψη των αρχείων βιβλιοθήκης, τα οποία το πρόγραμμα χρησιμοποιεί για την ανάλυση των δεδομένων, και τέλος η ρύθμιση του λογισμικού σε συγκεκριμένες εκδόσεις των αρχείων βιβλιοθήκης. Σημ: Για την λήψη των αρχείων βιβλιοθήκης απαιτείται η συμπλήρωση στοιχείων λογαριασμού του χρήστη (NetAffx account) ο οποίος μπορεί να δημιουργηθεί στην ιστοσελίδα της Affymetrix ( ή επιλέγοντας Register Now στο εμφανιζόμενο παράθυρο. Δημιουργία χώρου εργασίας (workspace), εισαγωγή και διαχείρηση δεδομένων 1. Δημιουργία ενός νέου workspace είτε κατά την εκκίνηση του προγράμματος είτε από τη γραμμή εργαλείων επιλέγοντας File New Workspace. Προαιρετικά, δημιουργία περιγραφής για το συγκεκριμένο workspace. Σημ: κάθε workspace θα πρέπει να αποθηκεύεται στον ίδιο φάκελο όπου βρίσκονται αποθηκευμένα τα δεδομένα προς ανάλυση. 2. Δημιουργία ενός νέου συνόλου δεδομένων (data set) και ονομασία αυτού. Σημ: ένα workspace μπορεί να διαχειρίζεται περισσότερα του ενός data sets. 3. Επιλογή των τύπων αρχείων που πρόκειται να προστεθούν στο συγκεκριμένο data set. Δίνεται και η δυνατότητα επιλογής ολόκληρου φακέλου κυρίως σε περιπτώσεις μεγάλων data sets. 4. Μόλις δημιουργηθεί το data set εμφανίζονται δύο πίνακες: Sample Attributes Table και Instensity Table οι οποίοι περιέχουν πολλαπλές πληροφορίες για το data set που μόλις δημιουργήθηκες. 69

86 5. Στο αριστερό τμήμα του παραθύρου φαίνονται οι πληροφορίες τις οποίες διαχειρίζεται το workspace. Μέσω αυτού του τμήματος είναι δυνατή η εμφάνιση και απόκρυψη των παραπάνω ή και άλλων πινάκων. Σημ1: Κάτω από κάθε εμφανιζόμενο πίνακα δίνονται πληροφορίες για τον αριθμό των σειρών, των στηλών, των επιλεγμένων στηλών καθώς και του είδους των αρχείων από τα οποία ο εκάστοτε πίνακας αντλεί πληροφορίες. Σημ2: Οι πίνακες μπορούν να επεξεργαστούν αντιγράφοντας πληροφορίες, κάνοντας κάποιου είδους ταξινόμιση (sorting) ή αφαιρώντας σειρές. Η διαδικασία αυτή διαγράφει το αντίστοιχο.arr αρχείο από το workspace όμως δεν διαγράφει το πραγματικό αρχείο. Ακόμη, είναι δυνατή η προσθήκη δεδομένων. Εικόνα 29: Απεικόνιση ενός workspace. Στο δεξί τμήμα φαίνονται οι πίνακες που εμφανίζονται με τη δημιουργία του data set. 70

87 Διαδικασία Γονοτύπησης Για την γονοτύπηση των δειγμάτων απαιτούνται, όπως αναφέρθηκε, ένα.cel και ένα.arr αρχείο για κάθε δείγμα. Μετά τη διαδικασία γονοτύπησης προκύπτει το αρχείο.chp. Aρχεία τύπου.cel για τα οποία δεν διατίθενται τα αντίστοιχα.arr αρχεία δεν μπορούν να γονοτυπηθούν και να δώσουν.chp αρχεία. Ακόμη, είναι δυνατή η επιλογή κάποιων παραμέτρων όσον αφορά την διαδικασία γονοτύπησης που αφορούν τον αλγόριθμο που θα χρησιμοποιηθεί για τη γονοτύπηση, το μέγιστο όριο εμπιστοσύνης (Maximum Confidence Score Treshold) και τις ελάχιστες προηγούμενες παρατηρήσεις (Minimum Prior Observations). Στον Πίνακα 18 παρουσιάζονται αναλυτικά αυτές οι παράμετροι. Για την ρύθμιση των παραμέτρων γονοτύπησης ακολουθούνται τα παρακάτω βήματα: 1. Από τη γραμμή εργαλείων επιλογή Configuration Genotyping Configurations New Configuration. 2. Στο παράθυρο που ανοίγει, επιλογή DMET Plus Select και στη συνέχεια επιλογή του αλγόριθμου γονοτύπησης. 3. Στη συνέχεια, τροποποίηση των υπόλοιπων παραμέτρων. 4. Για την αποθήκευση των ρυθμίσεων επιλογή Save As Save. Για τη γονοτύπηση των δειγμάτων ακολουθούνται τα παρακάτω βήματα: 1. Από την γραμμή εργαλείων επιλογή Workspace Intensity Data Perform Genotyping. 2. Στο σημείο αυτό το λογισμικό δίνει ξανά τη δυνατότητα επιλογής κάποιων παραμέτρων γονοτύπησης, π.χ. επιλογή αλγορίθμου. 3. Επιλογή ΟΚ. 4. Μόλις η διαδικασία γονοτύπησης ολοκληρωθεί εμφανίζεται ο πίνακας «CHP Summary Table» ο οποίος περιέχει τις εξής πληροφορίες: Batch Name: μέθοδος γονοτύπησης. Σημ: Εάν για τη γονοτύπηση των δειγμάτων έχει χρησιμοποιηθεί ο αλγόριθμος «Fixed Boundaries» το πεδίο αυτό θα είναι κενό. Bounds: πληροφορία για εάν το δείγμα απέτυχε ή πέρασε τον ποιοτικό έλεγχο (Quality Control, QC). Σημ: Ο ποιοτικός έλεγχος γίνεται με την σύγκριση παραμέτρων του CHP Summary Table με προεπιλεγμένα όρια τα οποία όμως μπορούν 71

88 να τροποποιηθούν και από τον χρήστη. Η προεπιλεγμένη ρύθμιση της παραμέτρου «QC call rate» είναι 98%. Αυτό σημαίνει πως δείγματα με τέτοιο QC call rate χαρακτηρίζονται ως «In Bounds» (passed QC) ενώ δείγματα με χαμηλότερο QC call rate χαρακτηρίζονται ως «Out Bounds» (failed QC). qc_call_rate: η τιμή call rate για το κάθε αρχείο τύπου.chp εκφραζόμενη σε ποσοστό. pra_count: ο αριθμός των PRA γονοτύπων. Σημ: PRA γονότυποι δίνονται από το λογισμικό όταν στο δείγμα που χρησιμοποιήθηκε για την διαμόρφωση των ορίων των clusters το αλληλόμορφο στη χαμηλότερη συχνότητα (minor allele) ανιχνεύτηκε τόσο σπάνια που δεν υπήρχε υψηλό επίπεδο εμπιστοσύνης ως προς το που ακριβώς βρισκόταν η τοποθεσία του γονοτύπου στο cluster. probeset_count: ο αριθμός των δεικτών που χρησιμοποιήθηκαν για τη διαδικασία γονοτύπησης Τα αποτελέσματα της γονοτύπησης μπορούν να απεικονιστούν και με ένα γραμμικό γράφημα (Line Graph). Από προεπιλογή, το λογισμικό τοποθετεί όλα τα δείγματα στον άξονα Χ και στον άξονα Υ την πρώτη παράμετροπληροφορία που βρίσκει, π.χ. qc_call_rate. Μια άλλη μορφή απεικόνισης είναι η επιλογή «Show Marker Summary» η οποία γίνεται με δειξί κλικ σε οποιαδήποτε ομάδα (All, In ή Out Bounds) του πεδίου «Genotype Results». Η επιλογή αυτή περιλαμβάνει γραφήματα ανά δείκτη (marker) για τα επιλεγμένα αποτελέσματα γονοτύπησης καθώς και έναν πίνακα που περιέχει σταστιστικά στοιχεία και άλλες σημαντικές πληροφορίες. Τέλος, υπάρχει και η απεικόνιση «Copy Number Summary» η οποία παρουσιάζει την κατανομή της κατάστασης του αριθμού αντιγράφων (Copy Number, CN) σε μια ομάδα αποτελεσμάτων για συγκεκριμένες περιοχές του γονιδιώματος. Συγκεκριμένα η ανάλυση αυτή γίνεται για 5 γονίδια, τα CYP2A6, CYP2D6, GSTM1, GSTT1 και UGT2B17. 72

89 Πίνακας 17: Ρυθμιζόμενοι παράμετροι γονοτύπησης του λογισμικού DMET Console Παράμετρος Αλγόριθμος Maximum Confidence Score Treshold Minimum Prior Observation Περιγραφή Fixed Boundaries: οι γονότυποι ενός δείγματος δεν επηρεάζονται από άλλα δείγματα που τρέχουν στην ίδια παρτίδα (batch). Fixed Boundaries v.2: διαφέρει από την πρώτη έκδοση στο ότι μια μεγαλύτερη ομάδα δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε για τη διαμόρφωση των ορίων. Dynamic Boundaries: οι γονότυποι ενός δείγματος επηρεάζονται από άλλα δείγματα που τρέχουν στην ίδια παρτίδα (batch). Όσο περισσότερα δείγματα περιλαμβάνονται στην ανάλυση τόσο περισσότερο θα επηρεαστούν τα όρια. Dynamic Boundaries v.2: διαφέρει από την πρώτη έκδοση στο ότι μια μεγαλύτερη ομάδα δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε για τη διαμόρφωση των ορίων. Επηρεάζει το μέγεθος της περιοχής "NoCall" μεταξύ δυο πολύ κοντινών cluster γονοτύπων. Η τιμή του κυμαίνεται από 0-1. Μειώνοντας την τιμή αυτή μπορεί να ευξήσει την ακρίβεια σε βάρος όμως ενός χαμηλότερου call rate. Καθορίζει τον ελάχιστο αριθμό των προηγούμενων παρατηρήσεων για το αποτέλεσμα ενός ΜΗ πιθανώς σπάνιου αλληλομόρφου (Possible Rare Allele, PRA). Ένα PRA δίνεται από το λογισμικό εάν ο συγκεκριμένος γονότυπος παρατηρήθηκε σε λιγότερα δείγματα από τον αριθμό αυτόν. Προεπιλεγμένη Ρύθμιση Καμία (προτείνεται η χρήση των νεότερων εκδόσεων) 0,001 3 Μεταφραστική Ανάλυση Με την επιλογη της μεταφραστικής ανάλυσης το λογισμικό DMET Console μετατρέπει ή αλλιώς μεταφράζει τα αποτελέσματα γονοτύπων μιας υποομάδας σημαντικών βιοδεικτών σε φαινοτύπους χρησιμοποιώντας συγκεκριμένη ονοματολογία όπως η ονοματολογία «star allele». Το εν λόγω σύστημα ονοματολογίας συνοψίζει τα μοτίβα των γονοτύπων από μεμονωμένους δείκτες σε απλότυπους, δηλαδή σύνολα δεικτών που τείνουν να κληρονομούνται μαζί. Συνήθως το όνομα *1 αποδίδεται στο μοτίβο αναφοράς με βάση το οποίο συγκρίνονται τα πολυμορφικά μοτίβα. Το μοτίβο αναφοράς συνήθως είναι το πρώτο μοτίβο που περιγράφεται το οποίο κωδικοποιεί μια λειτουργική πρωτεϊνη χωρίς αυτό να σημαίνει πως είναι το πιο σύνηθες στον πληθυσμό ο οποίος μελετάται. Ακολούθως, ένα μοναδικό όνομα αποδίδεται με την ανακάλυψη μιας νέας παραλλαγής η οποία μπορεί να οδηγεί σε αντικατάσταση ενός αμινοξέος ή έχει δειχθεί να επηρεάζει την μεταγραφή, τη μετάφραση, το μάτισμα κλπ (Robarge et al., 2007; Kalman et al., 2016). 73

90 Για την πραγματοποίηση της μεταφραστικής ανάλυσης ακολουθούνται τα εξής βήματα: 1. Επιλογή οποιαδήποτε ομάδας από το πεδίο «Genotype Results» δεξί κλικ Perform Translations. 2. Επιλογή φακέλου αποθήκευσης των αποτελεσμάτων μεταφραστικής ανάλυσης. 3. Μόλις η μεταφραστική ανάλυση ολοκληρωθεί, ανοίγει ένα παράθυρο με τα αρχεία τα οποία δημιουργήθηκαν από την διαδικασία αυτή. Τα αρχεία αυτά είναι: Comprehensive Translation Report: εμφανίζει μια σειρά ανά μεταφρασμένο δείκτη για κάθε αρχείο.chp. Παρέχει πληροφορίες για κάθε δείκτη μαζί με τις πληροφορίες απλοτύπων (Εικόνα 30). Summary Translation Report: πρόκειται για μια σύντμηση του Comprehensive Translation Report. Εμφανίζει μια σειρά για κάθε μεταφρασμένο γονίδιο για κάθε αρχείο.chp. Ακόμη, εμφανίζει μια σειρά για κάθε γονότυπο για τον οποίο η μεταφραστική ανάλυση προσδιορίζει μια παραλλαγή. Μόνο στη συνοπτική αυτή έκθεση, εάν κανένας από τους δείκτες που ευθύνονται για λειτουργικές αλλαγές δεν δώσει ένα παραλλαγμένο αλληλόμορφο, τότε η πληροφορία για αυτούς τους δείκτες αντικαθίσταται από ένα σχόλιο. Συνοπτικά, το αρχείο αυτό παρέχει πληροφορίες για τους σχετικούς δείκτες μαζί με τις πληροφορίες απλοτύπων (Εικόνα 30). Phenotype Translation Report: περιέχει τις προβλέψεις φαινοτύπων για κάθε αρχείο.chp καθώς και τις πληροφορίες απλοτύπων που χρησιμοποιήθηκαν για αυτές (Εικόνα 31). Uncalled Report: περιέχει μια λίστα με NoCalls, PossibleRareAlleles και NotAvailableCalls από δείκτες οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για τη μετάφραση. MD5 Report: μια ηλεκτρονική υπογραφή που μπορεί να χρησιμοποιηθεί προκειμένου να επιβεβαιωθεί πως τα αρχεία αυτά δεν έχουν τροποποιηθεί. Log File: περιέχει μια λίστα μηνυμάτων τα οποία παρήχθησαν από το λογισμικό κατά την μεταφραστική επεξεργασία των δεδομένων. 74

91 Εικόνα 30: Βασική απεικόνιση των περιεχομένων των Comprehensive και Summary Translation Reports. Εικόνα 31: Βασική απεικόνιση των περιεχομένων του Phenotype Translation Report. Στα αρχεία Comprehensive και Summary Translation Report οι πληροφορίες σε επίπεδο δεικτών δίνονται για 79 γονίδια και από αυτά δίνονται πληροφορίες απλοτύπων σε επίπεδο γονιδίου για ένα υποσύνολο 49 γονιδίων. Τέλος, πληροφορίες φαινοτύπου δίνονται για ακόμη ένα μικρότερο υποσύνολο 20 γονιδίων για τα οποία υπάρχουν επαρκείς πληροφορίες στη βιβλιογραφία (Πίνακας 19). 75

92 Πίνακας 18: Σύνολα γονιδίων για τα οποία δίνονται πληροφορίες στο επίπεδο δεικτών και στο επίπεδο φαινοτυπου. Επίπεδο Δεικτών Σύνολο Γονιδίων Επίπεδο Φαινοτύπου ABCB1 CYP1B1 CYP19A1 SLCO2B1 CYP1A2 ABCB4 CYP2A6 DCK SULT1A1 CYP2A6 ABCB7 CYP2A13 DPYD SULT1A2 CYP2B6 ABCB11 CYP2B6 FAAH SULT1A3 CYP2C8 ABCC1 CYP2C8 FMO2 TBXAS1 CYP2C9 ABCC2 CYP2C9 FMO3 TPMT CYP2C19 ABCC3 CYP2C18 GSTM1 UGT1A1 CYP2D6 ABCC4 CYP2C19 GSTP1 UGT1A3 CYP2E1 ABCC5 CYP2D6 GSTT1 UGT1A4 CYP3A4 ABCC6 CYP2E1 NAT1 UGT1A5 CYP3A5 ABCC8 CYP2F1 NAT2 UGT1A6 CYP3A7 ABCC9 CYP2J2 PTGIS UGT1A7 GSTM1 ABCG1 CYP2S1 SLC15A1 UGT1A8 GSTP1 ABCG2 CYP3A4 SLC15A2 UGT1A9 NAT1 ATP7A CYP3A5 SLC22A1 UGT1A10 NAT2 CDA CYP3A7 SLC22A2 UGT2B7 SLCO1B1 CES2 CYP3A43 SLC22A6 UGT2B15 TPMT CHST7 CYP4B1 SLCO1A2 UGT2B17 UGT1A1 CYP1A1 CYP4F2 SLCO1B1 VKORC1 UGT2B7 CYP1A2 CYP17A1 SLCO1B3 VKORC Επιλογή σημαντικών βιοδεικτών και ορισμός σημαντικών γονοτύπων Η ανάλυση επικεντρώθηκε σε 36 σημαντικούς βιοδείκτες η επιλογή των οποίων έγινε με βάση την κλινική τους σημαντικότητα και τα διαθέσιμα στην βιβλιογραφία στοιχεία. Συγκεκριμένα, πρόκειται για βιοδείκτες οι οποίοι έχουν εγκριθεί από ρυθμιστικούς οργανισμούς (FDA και/ή EMA) για κλινική φαρμακογονιδιωματική χρήση. Οι βιοδείκτες αυτοί βρίσκονται σε 9 φαρμακογονίδια (CYP3D6, CYP2C19, CYP2C9, DPYD, TPMT, NAT2, SLCO1B1, VOKORC1 και UGT1A1) και παρουσιάζονται αναλυτικά στον Πίνακα

93 Πίνακας 19: Σημαντικοί επιλεγμένοι βιοδείκτες με φαρμακογενωμικό ενδιαφέρον. Γονίδιο Παραλλαγή (rs number) Αλληλόμορφο CYP2C19 rs CYP2C19*17 CYP2C19 rs CYP2C19*2 CYP2C9 rs CYP2C9*2 CYP2C9 rs CYP2C9*3 VKORC1 rs VKORC1*2 DPYD rs DPYD*2A DPYD rs DPYD*13 CYP2D6 rs CYP2D6*2/*2XN/*39 CYP2D6 rs CYP2D*42 CYP2D6 rs CYP2D6*41 CYP2D6 rs CYP2D6*7 CYP2D6 rs16947 CYP2D6*2/*2XN/*17 CYP2D6 rs CYP2D6*38 CYP2D6 rs CYP2D6*21 CYP2D6 rs CYP2D6*3A/*3B CYP2D6 rs CYP2D6*19 CYP2D6 rs CYP2D6*20 CYP2D6 rs CYP2D6*40 CYP2D6 rs CYP2D6*4/*4F/*4G/*4H CYP2D6 rs CYP2D6*6 CYP2D6 rs CYP2D6*17 CYP2D6 rs CYP2D6*11 CYP2D6 rs CYP2D6*15 CYP2D6 rs CYP2D6*12 CYP2D6 rs CYP2D6*10 UGT1A1 rs UGT1A1*28 TPMT rs TPMT*3C TPMT rs TPMT*4A TPMT rs TPMT*3A TPMT rs TPMT*2 NAT2 rs NAT2*4/*5G/*5J/*6A/*6C/*7B/*14B/*14D/*14G/*12B/*13 NAT2 rs NAT2*4/*5A/*5B/*5C/*5D/*5E/*5G/*5J/*14C/*14F NAT2 rs NAT2*4/*7A/*7B CYP2D6 rs CYP2C19 rs CYP2C19*3 SLCO1B1 rs SLCO1B1*5 Ως «actionable» ορίζονται οι γονότυποι που έχουν ως αποτέλεσμα την πιθανή τροποποίηση της δόσης του φαρμάκου ή ακόμη και την ακολούθηση μιας εναλλακτικής θεραπείας, ενώ ως «high risk», δηλαδή ως υψηλού κινδύνου, 77

94 χαρακτηρίζονται οι γονότυποι που μπορεί να οδηγήσουν σε πολύ σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες. Οι γονότυποι υψηλού κινδύνου είναι: i. CYP2C19*2 (rs424485) ομόζυγο: αντίσταση στη κλοπιδογρέλη ii. SLCO1B1*5 (rs ) ομόζυγο: μυοπάθεια προκαλούμενη από λήψη σιμβαστατίνης iii. CYP2C9*3 (rs ) ομόζυγο: ευαισθησία στη βαρφαρίνη iv. TPMT*2 (rs ) ή TPMT*3 (rs , rs ) ομόζυγο η σύνθετο ετερόζυγο: μυελοτοξικότητα προκαλούμενη από λήψη θειοπουρίνης Ο προσδιορισμός των γονοτύπων ως «actionable» και «high risk» έγινε με βάση το πρόγραμμα PREDICT του Πανεπιστημίου Vanderbilt (Van Driest et al., 2014) Υπολογισμός δόσης της βαρφαρίνης στον ελληνικό πληθυσμό Για τον υπολογισμό της δόσης της βαρφαρίνης χρησιμοποιήθηκε ο αλγόριθμος που ανέπτυξε η Διεθνής Κοινοπραξία Φαρμακογονιδωματικής της Βαρφαρίνης (International Warfarin Pharmacogenomics Consortium, IWPC). Πρόκειται για έναν αλγόριθμο ο οποίος ενσωματώνει και φαρμακογενετικές πληροφορίες για τον υπολογισμό της δόσης της βαρφαρίνης σε αντίθεση με άλλους αλγορίθμους που χρησιμοποιούν μόνο κλινικά χαρακτηριστικά ή αλγόριθμους που βασίζονται σε στρατηγική σταθερής δόσης (The International Warfarin Pharmacogenetics Consortium, 2009). Ο φαρμακογενετικός αυτός αλγόριθμος παρουσιάζεται αναλυτικά στον Πίνακα 21. Αξίζει να σημειωθεί πως το αποτέλεσμα του αλγόριθμου πρέπει να υψωθεί στο τετράγωνο προκειμένου να υπολογιστεί η εβδομαδιαία δόση της βαρφαρίνης. Στην ανάλυσή μας, επειδή πληροφορίες όπως το ύψος, το βάρος και η ηλικία δεν ήταν γνωστές, χρησιμοποιήθηκαν κατά προσέγγιση τιμές ίσες με το μέσο όρο των καυκάσιων (The International Hap Map Consortium, 2003). 78

95 Πίνακας 20: Ο φαρμακογενετικός αλγόριθμος υπολογισμού δόσης βαρφαρίνης του IWPC. Το αποτέλεσμα του αλγορίθμου πρέπει να υψωθεί στο τετράγωνο προκειμένου να υπολογιστεί η εβδομαδιαία δόση της βαρφαρίνης (προσαρμογή από: International Warfarin Pharmacogenetics Consortium, 2009). Φαρμακογενετικός Αλγόριθμος Υπολογισμού Δόσης Βαρφαρίνης 5,6044-0,2614 x Ηλικία (σε δεκαετίες) + 0,0087 x Ύψος (σε cm) + 0,0128 x Βάρος (σε kg) - 0,8677 x VKORC1 A/G - 1,6974 x VKORC1 A/A - 0,4854 x VKORC1 γονοτυπος άγνωστος - 0,5211 x CYP2C9 *1/*2-0,9357 x CYP2C9 *1/*3-1,0616 x CYP2C9 *2/*2-1,9206 x CYP2C9 *2/*3-2,3312 x CYP2C9 *3/*3-0,2188 x CYP2C9 γονοτυπος άγνωστος - 0,1092 x Ασιατική Φυλή - 0,2760 x Μαύρη ή Αφρικανοαμερικάνικη Φυλή - 0,1032 x Μικτή ή Άγνωστη Φυλή + 1,1816 x Κατάσταση επαγωγέων ενζύμων - 0,5503 x Κατάσταση αμιωδαρόνης = Τετραγωνική Ρίζα Εβδομαδιαίας Δόσης Βαρφαρίνης Το αποτέλεσμα του αλγορίθμου προκύπτει από το άθροισμα των γινομένων σταθερών επί των χαρακτηριστηκών του ασθενούς τα οποία «μεταφράζονται» σε αριθμούς ως εξής: Ηλικία σε δεκαετίες: 1 για 10-19, 2 για κ.λ.π. VKORC1 A/G: 1 εάν ετερόζυγο για τον rs , αλλιώς 0. VKORC1 A/A: 1 εάν ομόζυγο για το Α για τον rs , αλλιώς 0. VKORC1 γονοτυπος άγνωστος: 1 εάν ο γονότυπος για rs είναι άγνωστος, αλλιώς 0. CYP2C9 *1/*2: 1 εάν ο CYP2C9 γονότυπος είναι *1/*2, αλλιώς 0. CYP2C9 *1/*3: 1 εάν ο CYP2C9 γονότυπος είναι *1/*3, αλλιώς 0. CYP2C9 *2/*2: 1 εάν ο CYP2C9 γονότυπος είναι *2/*2, αλλιώς 0. CYP2C9 *2/*3: 1 εάν ο CYP2C9 γονότυπος είναι *2/*3, αλλιώς 0. CYP2C9 *3/*3: 1 εάν ο CYP2C9 γονότυπος είναι *3/*3, αλλιώς 0. CYP2C9 γονοτυπος άγνωστος: 1 εάν ο CYP2C9 γονότυπος είναι άγνωστος, αλλιώς 0. 79

96 Ασιατική Φυλή: 1 εάν η δηλωμένη φυλή είναι η ασιατική, αλλιώς 0. Μαύρη ή Αφρικανοαμερικάνικη Φυλή: 1 εάν η δηλωμένη φυλή είναι η μαύρη ή η αφρικανοαμερικανική, αλλιώς 0. Μικτή ή Άγνωστη Φυλή: 1 εάν η δηλωμένη φυλή είναι μικτή ή εάν δεν δηλώνεται φυλή, αλλιώς 0. Κατάσταση επαγωγέων ενζύμων: 1 εάν ο ασθενής ακολουθεί θεραπεία με καρβαμαζεπίνη, φαινυτοϊνη, ριφαμπικίνη, αλλιώς 0. Κατάσταση αμιοδαρόνης: 1 εάν ο ασθενής ακολουθεί θεραπεία με αμιοδαρόνη, αλλιώς 0. 80

97 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 81

98 82

99 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1. Ανάλυση δεδομένων με το λογισμικό DMET Console Ποιοτικός Ελεγχος Το πρώτο βήμα που ακολουθήθηκε ήταν η εισαγωγή των δεδομένων στο πρόγραμμα DMET Console και η αλγοριθμική γονοτύπησή τους που κατέληξε στη δημιουργία του πινακα «CHP Summary Table», μια σύνοψη του οποίου παρουσιάζεται στον Πίνακα 22. Η ανάλυση των δεδομένων γονοτύπησης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του αλγόριθμου «fixed boundaries» σύμφωνα με τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις. Τα δείγματα 23 και 27 τα οποία είχαν «qc_call_rate» μικρότερο του 98% χαρακτηρίστηκαν ως «Out Bounds» και αποκλείστηκαν από την περαιτέρω ανάλυση. Πίνακας 21: Σύνοψη του «CHP Summary Table». Sample No. Well Bounds qc_call_rate 1 A4 In B4 In C4 In D4 In E4 In F4 In G4 In H4 In A7 In A5 In B5 In C5 In D5 In E5 In B7 In C7 In F5 In D7 In E7 In F7 In G7 In H7 In A8 Out B8 In C8 In

100 Πίνακας 22 (συνέχεια) Sample No. Well Bounds qc_call_rate 26 D8 In E8 Out F8 In G8 In H8 In A9 In B9 In C9 In D9 In E9 In G5 In H5 In A6 In B6 In C6 In D6 In E6 In F6 In G6 In H6 In 99.9 Genomic Control 1 F9 In Genomic Control 2 G9 In Genomic Control 3 H9 In Μετα το πέρας της αλγοριθμικής γονοτύπησης έγινε εξαγωγή του πίνακα «Marker Summary Table» για τα δείγματα που χαρακτηρίστηκαν ως «In Bounds». Η παράμετρος «marker_call_rate» για κάθε φαρμακογενωμικό δείκτη ενδιαφέροντος στους οποίους εστιάστηκε η περαιτέρω ανάλυση για τους 36 επιλεγμένους βιοδείκτες (βλ. Πινακα 20) καθώς και το «Probe Set ID» κάθε δείκτη παρουσιάζονται στον Πίνακα 23. Παρατηρείται πως δύο από τους φαρμακογενωμικούς δείκτες, συγκεκριμένα οι CYP2D6*21 και UGT1A1*28 χαρακτηρίστηκαν με «marker_call_rate» 87% και 84,8%, τιμές οι οποίες θεωρούνται χαμηλές. Οι δείκτες αυτοί δεν αποκλέιστηκαν από τις επόμενες αναλύσεις θεωρείται όμως πως επαλήθευση των «no calls» με κάποια άλλη τεχνική θα έδινε πιο σαφή αποτελέσματα. 84

101 Πίνακας 22: Παράμετροι «Marker Call Rate» και «Probe Set ID» για τους φαρμακογενωμικούς δείκτες ενδιαφέροντος Γονίδιο Probe Set ID Αλληλόμορφο Marker Call Rate (%) CYP2C19 AM_10053 CYP2C19* CYP2C19 AM_10070 CYP2C19*2 100 CYP2C9 AM_10100 CYP2C9*2 97,8 CYP2C9 AM_10113 CYP2C9*3 100 VKORC1 AM_11054 VKORC1*2 100 DPYD AM_11647 DPYD*2A 100 DPYD AM_11651 DPYD* CYP2D6 AM_12247 CYP2D6*2/*2XN/* CYP2D6 AM_12252 CYP2D6* CYP2D6 AM_12257 CYP2D6* CYP2D6 AM_12259 CYP2D6*7 100 CYP2D6 AM_12261 CYP2D6*2/*2XN/* CYP2D6 AM_12265 CYP2D6* CYP2D6 AM_12266 CYP2D6*21 87 CYP2D6 AM_12267 CYP2D6*3A/*3B 100 CYP2D6 AM_12268 CYP2D6* CYP2D6 AM_12270 CYP2D6* CYP2D6 AM_12272 CYP2D6* CYP2D6 AM_12274 CYP2D6*4/*4F/*4G/*4H 100 CYP2D6 AM_12276 CYP2D6*6 100 CYP2D6 AM_12280 CYP2D6* CYP2D6 AM_12281 CYP2D6* CYP2D6 AM_12283 CYP2D6* CYP2D6 AM_12284 CYP2D6* CYP2D6 AM_12285 CYP2D6* UGT1A1 AM_13024 UGT1A1*28 84,8 TPMT AM_13973 TPMT*3C 100 TPMT AM_13977 TPMT*4A 100 TPMT AM_13980 TPMT*3A 100 TPMT AM_13986 TPMT*2 100 NAT2 AM_15000 NAT2*4/*5G/*5J/*6A/*6C/*7B/*14B/*14D/*14G/*12B/* NAT2 AM_15001 NAT2*4/*5A/*5B/*5C/*5D/*5E/*5G/*5J/*14C/*14F 97,8 NAT2 AM_15012 NAT2*4/*7A/*7B 100 G6PD AM_ CYP2C19 AM_10068 CYP2C19*3 100 SLCO1B1 AM_10500 SLCO1B1*

102 Σύγκριση Πληθυσμών Ελλήνων και Ευρωπαίων Για Τους 36 Επιλεγμένους Βιοδείκτες με Φαρμακογενωμικό Ενδιαφέρον Στη συνέχεια, η ανάλυση επικεντρώθηκε στους 36 επιπλεγμένους βιοδείκτες με φαρμακογενωμικό ενδιαφέρον. Τα αποτελέσματα για τους δείκτες αυτούς του ελληνικού πληθυσμού συγκριτικά με τον καυκάσιο πληθυσμό παρουσιάζονται στον Πίνακα 24. Για τη σύγκριση των δύο πληθυσμών ακολούθηθηκε στατιστική ανάλυση η οποία έγινε με τον υπολογισμό του z score και στη συνέχεια της τιμής p για κάθε βιοδείκτη. Ως επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε το 0.05 (95%). Για τον υπολογισμό αυτών των τιμών χρησιμοποιήθηκε υπολογιστικό εργαλείο το οποίο διατίθεται δωρεάν στο διαδίκτυο ( Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την στατιστική ανάλυση παρουσιάζονται στον Πίνακα 25. Παρατηρείται πως οι περισσότεροι δείκτες δεν εμφανίζουν στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο πληθυσμών. Εξαίρεση αποτελούν οι βιοδείκτες CYP2C19*17 (p=0,04136) και NAT2*4/*5A/*5B/*5C/ *5D/*5E/*5G/*5J/*14C/*14F (p=0,05118) οι οποίοι συμμετέχουν στον μεταβολισμό μιας πληθώρας φαρμάκων. Στην περίπτωση του βιοδείκτη NAT2*4/*5A/*5B/*5C/ *5D/*5E/*5G/*5J/*14C/*14F η τιμή p που προέκυψε είναι πολύ κοντινή του επιπέδου σημαντικότητας p=0,05. Η τιμή αυτή υποδεικνύει μια τάση στατιστικώς σημαντικής διαφοράς και πιθανόν να έφτανε το επίπεδο σημαντικότητας εάν το μέγεθος του δείγματος ήταν μεγαλύτερο. Τα ευρήματα αυτά μπορούν να αποτελέσουν το εναρκτήριο έναυσμα για τον εξορθολογισμό του τρόπου χορήγησης των φαρμάκων αυτών στον ελληνικό πληθυσμό και την ενσωμάτωσή τους στη κλινική πράξη. Για το σκοπό αυτό κρίνεται απαραίτητη περαιτέρω έρευνα σε μεγαλύτερο και πιο αντιπροσωπευτικό δείγμα του ελληνικού πληθυσμού. Ακόμη, χρήσιμη θα ήταν η σύγκριση και με άλλους πληθυσμούς ώστε να υπάρχουν περισσότερα στοιχεία σχετικά με τη συχνότητα εμφάνισης και τη σημαντικότητα των βιοδεικτών αυτών. 86

103 Πίνακας 23: Αποτελέσματα συχνοτήτων για 36 επιλεγμένους βιοδείκτες στον ελληνικό και τον καυκάσιο πληθυσμό. Γονίδιο Παραλλαγή (rs number) Αλληλόμορφο Ελληνες Minor Allele Frequencies Ευρωπαϊοι (Μέσος Όρος) CYP2C19 rs CYP2C19*17 0,09 0,22 CYP2C19 rs CYP2C19*2 0,21 0,14 CYP2C9 rs CYP2C9*2 0,11 0,12 CYP2C9 rs CYP2C9*3 0,08 0,08 VKORC1 rs VKORC1*2 0,48 0,42 DPYD rs DPYD*2A 0,00 0,00 DPYD rs DPYD*13 0,00 0,00 CYP2D6 rs CYP2D6*2/*2XN/*39 0,38 0,46 CYP2D6 rs CYP2D6*42 0,00 0,00 CYP2D6 rs CYP2D6*41 0,16 0,10 CYP2D6 rs CYP2D6*7 0,00 0,00 CYP2D6 rs16947 CYP2D6*2/*2XN/*17 0,39 0,35 CYP2D6 rs CYP2D6*38 0,00 0,00 CYP2D6 rs CYP2D6*21 0,00 0,00 CYP2D6 rs CYP2D6*3A/*3B 0,01 0,01 CYP2D6 rs CYP2D6*19 0,00 0,00 CYP2D6 rs CYP2D6*20 0,00 0,00 CYP2D6 rs CYP2D6*40 0,00 0,00 CYP2D6 rs CYP2D6*4/*4F/*4G/*4H 0,17 0,17 CYP2D6 rs CYP2D6*6 0,00 0,01 CYP2D6 rs CYP2D6*17 0,00 0,00 CYP2D6 rs CYP2D6*11 0,00 0,00 CYP2D6 rs CYP2D6*15 0,00 0,00 CYP2D6 rs CYP2D6*12 0,00 0,00 CYP2D6 rs CYP2D6*10 0,23 0,19 UGT1A1 rs UGT1A1*28 0,33 0,30 TPMT rs TPMT*3C 0,01 0,04 TPMT rs TPMT*4A 0,00 0,00 TPMT rs TPMT*3A 0,01 0,02 TPMT rs TPMT*2 0,00 0,00 NAT2 rs NAT2*4/*5G/*5J/*6A/*6C/*7B/*14B/*14D/*14G/*12B/*13 0,35 0,33 NAT2 rs NAT2*4/*5A/*5B/*5C/*5D/*5E/*5G/*5J/*14C/*14F 0,29 0,44 NAT2 rs NAT2*4/*7A/*7B 0,01 0,02 G6PD rs ,00 0,00 CYP2C19 rs CYP2C19*3 0,00 0,00 SLCO1B1 rs SLCO1B1*5 0,11 0,17 87

104 Πίνακας 24: Αποτελέσματα στατιστικής ανάλυσης για τη σύγκριση του ελλληνικού και του καυκάσιου πληθυσμού για 36 επιλεγμένους βιοδείκτες. Γονίδιο Παραλλαγή (rs number) Αλληλόμορφο z score p value CYP2C19 rs CYP2C19*17-2,0353 0,04136 CYP2C19 rs CYP2C19*2 1,2878 0,19706 CYP2C9 rs CYP2C9*2-0,1982 0,84148 CYP2C9 rs CYP2C9*3 0 1 VKORC1 rs VKORC1*2 0,7815 0,4354 DPYD rs DPYD*2A - - DPYD rs DPYD* CYP2D6 rs CYP2D6*2/*2XN/*39-1,0332 0,30302 CYP2D6 rs CYP2D6* CYP2D6 rs CYP2D6*41 1,2741 0,20408 CYP2D6 rs CYP2D6*7 - - CYP2D6 rs16947 CYP2D6*2/*2XN/*17 0,539 0,5892 CYP2D6 rs CYP2D6* CYP2D6 rs CYP2D6* CYP2D6 rs CYP2D6*3A/*3B 0 1 CYP2D6 rs CYP2D6* CYP2D6 rs CYP2D6* CYP2D6 rs CYP2D6* CYP2D6 rs CYP2D6*4/*4F/*4G/*4H 0 1 CYP2D6 rs CYP2D6*6-0,6589 0,50926 CYP2D6 rs CYP2D6* CYP2D6 rs CYP2D6* CYP2D6 rs CYP2D6* CYP2D6 rs CYP2D6* CYP2D6 rs CYP2D6*10 0,654 0,5157 UGT1A1 rs UGT1A1*28 0,4207 0,67448 TPMT rs TPMT*3C -0,9985 0,31732 TPMT rs TPMT*4A - - TPMT rs TPMT*3A -0,4638 0,64552 TPMT rs TPMT*2 - - NAT2 rs NAT2*4/*5G/*5J/*6A/*6C/*7B/*14B/*14D/*14G/*12B/*13 0,2735 0,78716 NAT2 rs NAT2*4/*5A/*5B/*5C/*5D/*5E/*5G/*5J/*14C/*14F -1,9469 0,05118 NAT2 rs NAT2*4/*7A/*7B -0,4638 0,64552 G6PD rs CYP2C19 rs CYP2C19*3 - - SLCO1B1 rs SLCO1B1*5-1,0331 0,

105 Πρόβλεψη Φαινοτύπου Για 20 Σημαντικά Φαρμακογονίδια Στον Ελληνικό Πληθυσμό Το λογισμικό DMET Console μέσω της εφαρμογής της μεταφραστικής ανάλυσης παρέχει τη δυνατότητα πρόβλεψης φαινοτύπου για 20 επιλεγμένα γονίδια με ιδιαίτερο φαρμακογονιδιωματικό ενδιαφέρον (Πίνακας 19). Για τη πρόβλεψη του φαινοτύπου χρησιμοποιήθηκε το αρχείο «Phenotype Translation Report» το οποίο για το σκοπό αυτό αντλεί πληροφορίες από τα αρχεία «Comprehensive Translation Report» και «Summary Tanslation Report». Τα αποτελέσματα της μεταφραστικής ανάλυσης παρουσιάζονται στον Πίνακα 26. Για την καλύτερη κατανόηση του Πίνακα 26 παρατίθεται σχετικό υπόμνημα (Εικόνα 32) ενώ τα αποτελέσματα παρουσιάζονται και διαγραμματικά στη συνέχεια (Εικόνες 33, 34, 35, 36). EM IM UM PM ET IT UT PT IA RA SA Off Normal Sensitive -- Sensitive - Resistant - Resistant -- Υπόμνημα Extensive Metabolizer (Normal) Φυσιολογικός Μεταβολιστής Intermediate Metabolizer Ενδιάμεσος Μεταβολιστής Ultrarapid Metablizer Υπερταχής Μεταβολιστής Poor Metabolizer Κακός Μεταβολιστής Extensive Transporter (Normal) Φυσιολογικός Μεταφορέας Intermediate Transporter Ενδιάμεσος Μεταφορέας Ultrarapid Transporter Υπερταχής Μεταφορέας Poor Transporter Κακός Μεταφορέας Intermediate Acetylator Ενδιάμεση Ακετυλίωση Rapid Acetylator Ταχύς Ακετυλίωση Slow Acetylator Αργή Ακετυλίωση Off Acetylator Καθόλου ακετυλίωση υψηλότερη εως χαμηλότερη αντίσταση σε αναστολή από ανταγωνιστές της Βιταμίνης Κ. Εικόνα 32: Βοηθητικό υπόμνημα για τον Πίνακα 26 89

106 Πίνακας 25: Προβλέψεις φαινοτύπου για 20 σημαντικά φαρμακογονίδια στον ελληνικό πληθυσμό με τη βοήθεια του λογισμικού DMET Console. Γονίδιο CYP1A2 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C19 CYP2C8 CYP2C9 CYP2D6 CYP2E1 Φαινότυπος Αριθμός Ατόμων ~ % Γονίδιο Φαινότυπος Αριθμός Ατόμων EM EM CYP3A7 EM or IM 3 7 UNK (UM or PM) 8 (6) 19 EM EM GSTM1 EM or IM 8 19 PM PM 1 2 EM GSTP1 EM or IM ~ % EM EM or IM IM 3 7 IM 4 9 IA 1 2 UNK 6 14 IA or SA 4 9 NAT1 EM RA IM SA 1 2 PM 2 5 IA UM 1 2 IA or SA UNK NAT2 RA 4 9 EM SA 9 21 EM or IM UNK 1 2 IM 2 5 ET EM SLCO1B1 IT 7 16 EM or IM UNK IM 3 7 EM TPMT UNK 2 5 IM 1 2 EM EM EM or IM IM UGT1A1 IM 8 19 PM PM 5 5 UNK 4 9 UNK (IM or PM) 7 (4) 16 (9) EM EM UGT2B7 EM or UM UNK UM 8 19 CYP3A4 EM CYP3A5 Normal 3 7 IM 7 16 Sensitive PM Sensitive VKORC1 Resistant Resistant UNK

107 Τα 20 φαρμακογονίδια για τα οποία πραγματοποιήθηκε η μεταφραστική ανάλυση ομαδοποιήθηκαν ανάλογα με την σημαντικότητά τους. Από αυτά, σημαντικότερα θεωρήθηκαν τα γονίδια CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5, CYP2D6, UGT1A1, VKORC1, SLCO1B1 και TPMT λόγων της παρουσίας σημαντικών πολυμορφισμών σε αυτά (actionable και high-risk, Πίνακας 20). Τα αποτελέσματα του Πίνακα 26 για τα 8 αυτά γονίδια παρουσιάζονται στα γραφήματα των Εικόνων 33, 34 και 35. Εικόνα 33: Διαγραμματική απεικόνιση του ποσοστού των διαφόρων φαινοτύπων στον ελληνικό πληθυσμό για τα γονίδια CYP2C19, CYP2C9, CYP3A5, CYP2D6, TPMT και UGT1A1. Από το διάγραμμα της Εικόνας 33, ο ελληνικός πληθυσμός φαίνεται να είναι αρκετά ετερογενής αναφορικά με τους φαινοτύπους μεταβολισμού των φαρμακογονιδίων CYP2C19, CYP2C9, CYP3A5, CYP2D6, TPMT και UGT1A1. Αν και στα περισσότερα γονίδια, με εξαίρεση το γονίδιο CYP3A5, το μεγαλύτερο ποσοστό ανήκει στους Extensive Metabolizers (EM), εντούτοις ένα σημαντικό ποσοστό παρουσιάζει ποικιλομορφία ως προς τον μεταβολικό φαινότυπο. Στο σημείο αυτό αξίζει να σημειωθεί πως οι EM φαινότυποι χαρακτηρίζονται από το πρόγραμμα DMET Console ως φυσιολογικοι μεταβολιστες. Ακόμη, για τα γονίδια CYP2C9 και CYP2D6 ένα ποσοστό 32% και 30% αντίστοιχα δίνεται από το πρόγραμμα ως «EM or IM» που σημαίνει 91

108 πως για το ποσοστό αυτό δόθηκαν περισσότεροι του ενός απλότυποι που έχουν ως αποτέλεσμα EM ή IM μεταβολισμό. Αυτό σημαίνει πως για τα δείγματα αυτά θα χρειαζόταν περαιτέρω εξέταση προκειμένου να διευκρινιστεί εάν πρόκειται για φυσιολογικό (EM) ή ενδιάμεσο (IM) μεταβολισμό. Στη δεύτερη περίπτωση πιθανόν να ήταν απαραίτητη η τροποποίηση της δόσης του φαρμάκου που επρόκειτω να χορηγηθεί. Ακόμη, για τα γονίδια CYP2C19, CYP2C9, CYP2D6 και UGT1A1 παρατηρείται πως ένα ποσοστό 30%, 5%, 16% και 9% αντίστοιχα δίνεται ως «UNK» που σημαίνει πως είτε ο προβλεπόμενος φαινότυπος δεν ήταν μοναδικός είτε λόγω «no calls» δεν μπορούσε να δωθεί πρόβλεψη φαινοτύπου από το πρόγραμμα DMET Console. Τα δείγματα τα οποία έδωσαν αποτέλεσμα φαινοτύπου «UNK» καλό θα ήταν να γονοτυπηθούν ξανά για τα γονίδια αυτά προκειμένου να προσδιοριστεί ο μεταβολικός τους φαινότυπος. Αξίζει να σημειωθεί πως συγκεκριμένα για το γονίδιο CYP2D6 το 9% των δειγμάτων «UNK» έδωσαν το αποτέλεσμα «IM or PM» που σημαίνει πως θα ήταν απαραίτητη η τροποποίηση της δόσης του φαρμάκου ή ακόμη και επιλογή εναλλακτικής θεραπείας στην περίπτωση πιθανότητας εμφάνισης σοβαρών παρενεργειών για τα «PM» δείγματα. Τη μεγαλύτερη ποικιλομορφία φαίνεται να παρουσιάζουν τα γονίδια CYP2C19 και CYP2D6 ενω τη μικρότερη το γονίδιο TPMT με το μεγαλύτερο ποσοστό των δειγμάτων να παρουσιάζουν φυσιολογικό μεταβολισμό και μόλις το 2% των δειγμάτων να δίνουν «IM» μεταβολικό φαινότυπο. Τέλος, εξαιρετικό ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα αποτελέσματα του γονιδίου CYP3A5 το οποίο δεν έδωσε κανένα δείγμα ως φυσιολογικό ενώ το μεγαλύτερο ποσοστό δειγμάτων (84%) έδωσε μεταβολισμό «PM» και το υπόλοιπο (16%) έδωσε μεταβολισμό «ΙM». Εξαιρετική ποικολομορφία ως προς το μεταβολισμό φαίνεται να παρουσιάζει και το γονίδιο VKORC1, όπως παρουσιάζεται στο διάγραμμα της Εικόνας 34. Οι «sensitive/resistant» φαινότυποι περιγράφουν τη σχετική ανθεκτικότητα (ή ευαισθησία) του ενζύμου VKORC1 στην αναστολή από κουμαρινικά φάρμακα. Πιο συγκεκριμένα, μόνο το 7% φαίνεται να είναι φυσιολογικό ενώ τα μεγαλύτερα ποσοστά 21% και 23% ανήκουν στον ευαίσθητο (Sensitive -) και πολύ ευαίσθητο (Sensitive --) μεταβολισμό αντίστοιχα. Ακόμη, υπάρχει και ένα μέρος των δειγμάτων το οποίο έδωσε αποτελέσματα φαινοτύπου ανθεκτικότητας (Resistant -) και μεγάλης ανθεκτικότητας (Resistant --) σε ποσοστά 9% και 7% αντίστοιχα. Βέβαια, τα 92

109 ποσοστά αυτά πιθανώς να διαφοροποιούνταν με την επανεξέταση των «UNK» δειγμάτων για το γονίδιο VKORC1 τα οποία υπήρχαν σε ποσοστό 33%. Αντίθετα με το γονίδιο VKORC1, το γονίδιο SLCO1B1 δεν φάνηκε να παρουσιάζει μεγάλη ποικιλομορφία στον ελληνικό πληθυσμό με το μεγαλύτερο ποσοστό να ανήκει σε φυσιολογικά άτομα (49%) ενώ ένα αρκετά μεγάλο ποσοστό της τάξης του 35% έδωσε «UNK» αποτέλεσμα (Εικόνα 35). Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα υπογραμμίζουν την αναγκαιότητα του φαρμακογονιδιωματικού ελέγχου και στον ελληνικό πληθυσμό ο οποίος φαίνεται να είναι εξαιρετικά ετερογενής όσον αφορά τον μεταβολισμό σημαντικών φαρμακογονιδίων. Εικόνα 34: Διαγραμματική απεικόνιση του ποσοστού των διαφόρων φαινοτύπων στον ελληνικό πληθυσμό για το γονίδιο VKORC1. Τα αποτελέσματα της μεταφραστικής ανάλυσης για τα υπόλοιπα 12 γονίδια (CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A7, GSTM1, GSTP1, UGT2B7, NAT1, NAT2) παρουσιάζονται στα διαγράμματα των Εικόνων 36 και 37. Από αυτά, τη μεγαλύτερη ποικιλομορφία παρουσιάζει το γονίδιο NAT2 ενώ ενδιαφέρον παρουσιάζει και το γονίδιο NAT1 δίνοντας ένα πολύ μεγάλο ποσοστό RA (Rapid Acetylator) μεταβολισμού (86%). Από τα υπόλοιπα γονίδια τα μεγαλύτερα ποσοστά φαίνεται να ανήκουν στο φυσιολογικό μεταβολισμό. Εξαίρεση αποτελεί το γονίδιο GSTM1 το οποίο έδωσε αποτελέσματα PM μεταβολισμού σε ποσοστό 51%. Τέλος, το γονίδιο 93

110 UGTB7 έδωσε αποτελέσματα UM μεταβολισμού σε ποσοστό 19%. Και για τα 12 αυτά γονίδια σημαντική κρίνεται η διερεύνηση των μεταβολικών φαινοτύπων «EM or IM» και «UNK» για την καλύτερη κατανόηση της κατανομής αυτών στον εξεταζόμενο πληθυσμό. Συμφωνα με αυτά τα αποτελέσματα ενισχύεται το συμπέρασμα ότι ελληνικός πληθυσμός χρήζει φαρμακονογιδιωματικού ελέγχου. Εικόνα 35: Διαγραμματική απεικόνιση του ποσοστού των διαφόρων φαινοτύπων στον ελληνικό πληθυσμό για το γονίδιο SLCO1B1. Εικόνα 36: Διαγραμματική απεικόνιση του ποσοστού των διαφόρων φαινοτύπων στον ελληνικό πληθυσμό για τα γονίδια ΝΑΤ1 και ΝΑΤ2. 94

111 Εικόνα 37: Διαγραμματική απεικόνιση του ποσοστού των διαφόρων φαινοτύπων στον ελληνικό πληθυσμό για τα γονίδια CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A7, GSTM1, GSTP1 και UGT2B Υπολογισμός δόσης βαρβαφρίνης στον ελληνικό πληθυσμό Ο υπολογισμός της δόσης της βαρφαρίνης έγινε, όπως αναφέρθηκε, με τη χρήση του αλγορίθμου του Πίνακα 21 ο οποίος αναπτύχθηκε από το IWPC. Για το σκοπό αυτό συλλέχθηκαν για κάθε δείγμα προς ανάλυση τα δεδομένα γονοτύπου για τον πολυμορφισμό rs του γονιδίου VKORC1 και οι απλότυποι του γονιδίου CYP2C9. Οι τιμές που χρησιμοποιήθηκαν για τα πεδία της ηλικίας, του ύψους και του βάρους ήταν 20y, 163cm και 68kg αντίστοιχα για όλα τα δείγματα. Ακόμη, επειδή πληροφορίες σχετικά με την πρόσληψη κάποιου επαγωγέα ενζύμου ή αμιοδαρόνης δεν ήταν γνωστές χρησιμοποιήθηκε η τιμή 0 στα αντίστοιχα πεδία του αλγόριθμου. Τέλος, δείγματα τα οποία δεν έδιναν σαφές αποτέλεσμα γονότυπου ή απλοτύπου για τα γονίδια VKORC1 και CYP2C9 εξαιρέθηκαν από τη διαδικασία υπολογισμού της δόσης βαρφαρίνης. Συγκεντρωτικά, τα αποτελέσματα αυτής της διαδικασίας παρουσιάζονται στο γράφημα της Εικόνας 38 για τον Ελληνικό πληθυσμό ενώ στον Πίνακα 27 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης συγκριτικά με τον μέσο όρο του Ευρωπαϊκού Πληθυσμού (Καυκάσιοι). 95

112 Εικόνα 38: Διαγραμματική απεικόνισης της υπολογιζόμενης εβδομαδιαίας δόσης της βαρφαρίνης στον ελληνικό πληθυσμό. Πίνακας 26: Αποτελέσματα στατιστικής ανάλυσης αναφορικά με τη δόση της βαρφαρίνης στον ελληνικό πληθυσμό και συγκριτικά με το μέσο όρο του ευρωπαϊκού πληθυσμού. Χώρα Μέσος Όρος Τυπική Απόκλιση Διάστημα Εμπιστοσύνης 95% Ανώτατο Όριο Κατώτατο Όριο Απόκλιση από τον Μ.Ο. (Ευρώπη) Ελλάδα 36,17 6,27 1,92 38,09 34,25-4,51 Ευρώπη (Μ.Ο.) 37,88 6,96 0,47 38,36 37,41 Σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα, η πλειοψηφία των δειγμάτων θα έπρεπε να λάβει εβδομαδιαία δόση φαρμάκου 35,1-40 mg. Αυτό σημαίνει πως τα περισσότερα δείγματα παρουσιάζουν καλό μεταβολικό φαινότυπο. Εντούτοις, υπάρχει ένα σημαντικό ποσοστό δειγμάτων το οποίο φαίνεται να χρειάζεται αρκετά χαμηλότερη δόση από το μέσο όρο κάτι που σημαίνει πως η εξατομίκευση της δόσης της βαρφαρίνης είναι πολύ σημαντική για την αποφυγή ανεπιθύμητων ενεργειών κατά τη λήψη της. 96

113 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 97

114 98

115 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η φαρμακογονιδιωματική, δηλαδή η επιστήμη που μελετά το πως η γενετική ποικιλότητα επηρεάζει την ανταπόκριση των ασθενών στα φάρμακα, έχει ως σκοπό την ανάδειξη των ασθενών αυτών που παρουσιάζουν υψηλή πιθανότητα μη ανταπόκρισης ή εμφάνισης ανεπιθύμητων ενεργειών σε μια θεραπεία. Με αυτό τον τρόπο η φαρμακογονιδιωματική δίνει τη δυνατότητα βελτιστοποίησης της θεραπείας αλλά και της γενικότερης κλινικής παρακολούθησης κάθε ασθενή ξεχωριστά, κάνοντας έτσι ένα βήμα πιο κοντά στην εξατομικευμένη ιατρική. Ιδιαίτερα τα τελευταία χρόνια και με τη βοήθεια των σύγχρονων τεχνολογιών οι ενδείξεις πως οι διάφορες παραλλαγές σε γονίδια που κωδικοποιούν ένζυμα και μεταφορείς σχετικά με τον μεταβολισμό τον φαρμάκων επηρεάζουν την λειτουργία αυτών, ολοένα και αυξάνονται. Με γνώμονα τις εξελίξεις αυτές καθώς και τα διαθέσιμα στη βιβλιογραφία δεδομένα, οι ρυθμιστικοί φορείς (FDA, EMA) έχουν εγκρίνει γενετικό έλεγχο για πάνω από 120 φάρμακα για τα οποία υπάρχουν επαρκείς αποδείξεις πως οι γενετικοί δείκτες επηρεάζουν την αποτελεσματικότητά τους (Mizzi et al., 2016). Παρόλη όμως την πρόοδο των τελευταίων ετών στο πεδίο της φαρμακογονιδιωματικής η εφαρμογή της στην κλινική ρουτίνα παραμένει ακόμη πολύ περιορισμένη. Τα κύρια εμπόδια φαίνεται να είναι i) η ελλειπής ενημέρωση και εκπαίδευση των ιατρών και φαρμακοποιών για τη φαρμακογονιδιωματική, ii) η απουσία κατάλληλων εργαλείων και ηλεκτρονικών ιατρικών αρχείων για να διευκολύνουν την ενσωμάτωση των αποτελεσμάτων των αποτελεσμάτων των φαρμακογονιδιωματικών εξετάσεων στην κλινική πράξη, iii) η έλλειψη συγκεκριμένων κατευθυντήριων γραμμών και οδηγιών σχετικά με την προσαρμογή της θεραπείας, iv) η μη πραγματοποίηση προληπτικών τεστ με αποτέλεσμα να μην υπάρχει διαθέσιμη η απαιτούμενη πληροφορία την ώρα που χρειάζεται να γίνει η χορήγηση ενός φαρμάκου και v) η μη καθορισμένη και θολή εικόνα σχετικά με την πολιτική αποζημίωσης και κάλυψης των εξετάσεων αυτών (Relling & Klein, 2011; van der Wouden et al., 2017). Στον Ευρωπαϊκό χώρο, μεγάλοι πληθυσμοί όπως ο Βρετανικός και ο Γαλλικός καθώς και οι πληθυσμοί των Σκανδιναβικών χωρών έχουν ήδη εφαρμόσει την φαρμακογονιδιωματική στην κλινική. Ωστόσο, σε πολλούς ευρωπαϊκούς πληθυσμούς και ιδιαίτερα σε χώρες χαμηλού εισοδήματος υπάρχει έλλειψη πληροφορίων σχετικά με φαρμακογενωμικούς δείκτες. Σε αυτό έχει συμβάλλει και το γεγονός πως, μέχρι πρόσφατα, οι φαρμακογονιδιωματικές 99

116 μελέτες επικεντρώνονταν κυρίως σε φυλές (π.χ. Λευκή Φυλή) και όχι σε επιμέρους πληθυσμούς παρά τις σημαντικές γεωγραφικές διαφορές όσον αφορά την εμφάνιση παρενεργειών και αποτελεσματικότητας των φαρμάκων (Mizzi et al., 2016). Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης σχετικά με τον ελληνικό πληθυσμό συγκριτικά με τον γενικότερο ευρωπαϊκό πληθυσμό ενισχύουν την άποψη πως η εθνικότητα διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανταπόκριση και την τοξικότητα των φαρμάκων. Συνεπώς και η εθνικότητα φαίνεται να είναι ένας παράγοντας που θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψιν προκειμένου να ληφθούν οι κατάλληλες κλινικά αποφάσεις για έναν ασθενή. Για την πραγματοποίηση της παρούσας μελέτης χρησιμοποιήθηκε η πλαταφόρμα DMET της εταιρειας Affymetrix, μια αρκετά περιεκτική μικροσυστοιχία σχεδιασμένη για την γονοτύπηση φαρμακογονιδιωματικών δεικτών. Συγκεκριμένα, η πλατφόρμα DMET δίνει τη δυνατότητα γονοτύπησης 1931 δεικτών σε 231 γονίδια που σχετίζονται με το μεταβολισμό των φαρμάκων σε ένα χρονικό διάστημα μόλις 2-3 ημερών. Πρόσφατες μελέτες έχουν αξιοποιήσει την πλατφόρμα αυτή για τον έλεγχο φαρμακογονιδιωματικών δεικτών σε ξεχωριστούς πληθυσμούς. Η Bonifaz-Peña V. και οι συνεργάτες της, εξέτασαν την κατανομή των φαρμακογονιδιωματικών δεικτών σε δυο εξαιρετικά πολύπλοκους πληθυσμούς της Νοτίου Αμερικής, του Μεξικού και της Βραζιλίας. Πρόκειται για δύο πληθυσμούς με εκτεταμένες προσμίξεις Ιθαγενών της Αμερικής, Ευρωπαίων και υποσακχάριων Αφρικανών αλλά η δομή τους είναι αρκετά διαφορετική. Η μελέτη έδειξε πως το γεγονός αυτό έχει άμεσες συνέπειες όσον αφορά τους φαρμακογονιδιωματικούς δείκτες αφού οι διαφορές μείξης των δύο πληθυσμών φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στην κατανομή των αλληλομόρφων και στις συχνότητες των γονοτύπων. Έτσι, οι πιθανότητες να έχει ένα άτομο μια παραλλαγή με φαρμακογονιδιωματικό ενδιαφέρον καθορίζεται από την συχνότητα της παραλλαγής αυτής στους επιμέρους προγονικούς πληθυσμούς (Bonifaz-Peña et al., 2014). Ομοίως, η μελέτη της Jittikoon και των συνεργατών της, εξέτασε τις συχνότητες αλληλομόρφων με φαρμακογονιδιωματικό ενδιαφέρον στον πληθυσμό της Ταϊλάνδης και σε σύγκριση με άλλους πληθυσμούς διαθέσιμους από το HapMap (Jittikoon et al., 2016). Τέλος, μια άλλη μελέτη έδειξε πως η πλατφόρμα DMET μπορεί να χρησιμοποιηθεί προκειμένου να προσιδοριστεί η πληθυσμιακή υποδομή ενός μείγματος πληθυσμών και στους πληθυσμούς τριών ηπείρων 100

117 εναλλακτικά των μεθόδων γονοτύπησης σε κλίμακα γονιδιώματος (Genome-wide) (Jackson et al., 2016). Η χρήση των μικροσυστοιχιών DNA κερδίζουν συνεχώς έδαφως στο πεδίο της φαρμακογονιδιωματικής. Αυτό συμβαίνει διότι οι μικροσυστοιχίες επιπέδου γονιδιώματος αποτελούν μια γρήγορη, προσιτή οικονομικά και άμεσα διαθέσιμη μέθοδο γονοτύπησης με υψηλή ακρίβεια, καθιερωμένες και επικυρωμένες διαδικασίες για την ανάλυση των δεδομένων (Shahandeh et al., 2016). Εντούτοις, οι μικροσυστοιχίες δεν δίνουν τη δυνατότητα εύρεσης νέων και πιθανώς επιβλαβών παραλλαγών, μια διαδικασία για την οποία θα ήταν απαραίτητη η εφαρμογή τεχνολογιών αλληλούχισης ολόκληρου του γονιδιώματος (Whole Genome Sequencing, WGS). Πρόσφατη μελέτη έδειξε πως ο αριθμός των ADME παραλλαγών που ανιχνεύθηκαν με τη χρήση WGS είναι σημαντικά υψηλότερος σε σύγκριση με αυτές που θα είχαν ανιχνευθεί με τη χρήση της πλατφόρμας DMET (Mizzi et al., 2014). Στα πλαίσια της προληπτικής γονοτύπησης όμως, το υψηλό κόστος, ο χρόνος και η πολυπλοκότητα ανάλυσης του WGS καθιστούν πολύ δύσκολη τη χρήση του. Το υψηλό κόστος του WGS πολλές φορές αποτελεί εμπόδιο ακόμη και σε ερευνητικό επίπεδο λόγω περιορισμένων ερευνητικών πόρων. Η χρήση της τεχνολογίας αλληλούχισης εξωνίων (Whole Exome Sequencing, WES) αποτελεί μεν μια πιο οικονομική λύση σε σύγκριση με το WGS όμως θα χάνονταν κάποιες πολύ σημαντικές παραλλαγές οι οποίες βρίσκονται σε μη κωδικές περιοχές του γονιδιώματος όπως π.χ. παραλλαγές στον υποκινητή του VKORC1 (Yang et al., 2016). Στην περίπτωση αυτή, όπου ο έλεγχος περιορίζεται σε ήδη γνωστές και συχνές παραλλαγές οι μικροσυστοιχίες αποτελούν μια καλή και εφικτή λύση. Μάλιστα, υπάρχουν τεστ τα οποία έχουν εγκριθεί από τον FDA και βασίζονται στη τεχνολογία των μικροσυστοιχιών όπως το AmpliChip CYP450 (Roche) και το MammaPrint (Agendia). Ενναλακτικά, η δημιουργία προσαρμοσμένων πάνελ γονοτύπησης, για παράδειγμα με βάση τα ευρήματα για διαφορετικούς πληθυσμούς, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως προληπτικά τεστ ειδικά σε αναπτυσσόμενες χώρες με περιορισμένες υγειονομικές δαπάνες (Mizzi et al., 2016) ή ως μια αρχική προσπάθεια ένταξης των φαρμακονογιδιωματικών τεστ σε χώρες που δεν τα έχουν ακόμη ενσωματώσει στην κλινική τους ρουτίνα. Τέλος, αξίζει να σημειωθεί πως η αγορά εμπλουτίζεται συνεχώς με όλο και πιο διευρυμένες μικροσυστοιχίες με τη δυνατότητα γονοτύπησης όλο και περισσότερων δεικτών. Ένα σημαντικό 101

118 παράδειγμα αποτελεί η πλατφόρμα PharmacoScan (Affymetrix). Η εν λόγω μικροσυστοιχία έχει σχεδιαστεί για την προληπτική γονοτύπηση όλων των γνωστών φαρμακογονιδιωματικών δεικτών και περιλαμβάνει 4,627 δείκτες σε 1,191 γονίδια με γνωστή φαρμακογονιδιωματική σημασία (Affymetrix, 2016). Η παρούσα εργασία επικεντρώθηκε ακόμη στην χρήση συγκεκριμένης φαρμακονογιδιωματικής πληροφορίας από την πλατφόρμα DMET για τον υπολογισμό της δόσης της βαρφαρίνης στον εληνικό πληθυσμό. Η θεραπεία με βαρφαρίνη παραμένει δύσκολη λόγω του στενού θεραπευτικού εύρους του φαρμάκου καθώς και των πολλαπλών παραγόντων που αλληλεπιδρούν με αυτή. Τα παραπάνω οδηγούν στην εμφάνιση πολλών ανεπιθύμητων ενεργειών με αποτέλεσμα η βαρφαρίνη βρίσκεται στα 10 φάρμακα τα οποία σχετίζονται με τις περισσότερες νοσηλείες λόγω παρενεργειών στις Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής (Limdi, 2012). Ως εκ τούτου, η δυνατότητα ενσωμάτωσης της γενετικής πληροφορίας για τον υπολογισμό της δόσης της βαρφαρίνης θα μπορούσε να επωφελήσει όχι μόνο τον ασθενή αλλά και το σύστημα υγείας οδηγώντας σε λιγότερα έξοδα νοσηλειών λόγω παρενεργειών. Η χρήση του αλγορίθμου από το IWPC έδειξε πως για τον ελληνικό πληθυσμό οι περισσότεροι ασθενείς μεταβολίζουν με φυσιολογικό τρόπο την βαρφαρίνη. Παρόλα αυτά υπάρχει και ένα σημαντικό ποσοστό που χρειάζεται αρκετά χαμηλότερη δόση από το μέσο όρο. Για την εκτίμηση της ορθότητας τον αποτελεσμάτων αυτών θα πρέπει να γίνει η χρήση του αλγορίθμου και σε κλινικό πλαίσιο προκειμένου να δειχθεί στην πράξη εάν οι ασθενείς επωφελούνται πραγματικά από την συνεκτίμηση της γενετικής πληροφορίας κατά τον υπολογισμό της δόσης. Όσον αφορά τον αλγόριθμο, φαίνεται να είχε λιγότερο ακριβείς προβλέψεις για άτομα που χρειάζονταν πολύ υψηλή δόση βαρφαρίνης. Αυτό ίσως οφείλεται στο γεγονός πως οι γενετικοί δείκτες που χρησιμοποιούνται στον φαρμακογενετικό αλγόριθμο σχετίζονται κυρίως με την ευαισθησία και όχι την ανθεκτικότητα στην βαρφαρίνη (The International Warfarin Pharmacogenetics Consortium, 2009). Επομένως πιθανών να χρειάζονται περαιτέρω τροποποιήσεις και βελτιώσεις του αλγορίθμου αυτού προκειμένου να επιτευχθούν ακόμη ακριβέστερες προβλέψεις. Παρά όλα τα πρόσφατα πολλά υποσχόμενα δεδομένα υπάρχουν, όπως ήδη αναφέρθηκε, κάποια εμπόδια που πρέπει να ξεπεραστούν προκειμένου να ενσωματωθεί η φαρμακογονιδιωματική πιο ενεργά στην κλινική ρουτίνα. Για το σκοπό αυτό, τόσο στις Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής όσο και στην Ευρώπη, 102

119 λαμβάνουν χώρα διάφορα προγράμματα υλοποίησης. Ένα σημαντικό παράδειγμα τέτοιου προγράμματος αποτελεί η κοινοπραξία U-PGx (Ubiquitous Pharmacogenomics Consortium). Χρηματοδοτούμενη από την Ευρωπαϊκή, η κοινοπραξία U-PGx έχει ως στόχο να κάνει όλα τα σημαντικά φαρμακογονιδιωματικά δεδομένα και την βελτιστοποίηση της θεραπείας κάθε ασθενή με βάση αυτά, διαθέσιμα σε κάθε Ευρωπαίο πολίτη. Αυτό θα γίνει εφικτό μέσω του προγράμματος μεσω μιας στρατηγικής προληπτικού φαρμακογονιδιωματικού ελέγχου. Άλλα παρόμοια παραδείγματα αποτελούν τα προγράμματα emerge-pgx, PREDICT, CLIPMERGE PGx και άλλα (van der Wouden et al., 2017). Όσον αφορά τον Ευρωπαϊκό χώρο αυτός έχει να αντιμετωπίσει κάποια ακόμη μοναδικά θέματα τα οποία επηρεάζουν την ενσωμάτωση της φαρμακογονιδιωματικής στα διάφορα συστήματα υγείας. Πρώτον, δεν είναι όλες οι χώρες της Ευρώπης μέλη της Ευρωπαϊκής Ένωση που σημαίνει πως δεν υπόκεινται στις ίδιες κατευθυντήριες γραμμές και οδηγίες. Επιπροσθέτως, ακόμη και μεταξύ των κρατών μελών της ΕΕ η υιοθετηση των κανόνων και των γραμμών σε κάθε χώρα εξαρτάται από τις εκάστοτε κυβερνήσεις και δεν είναι ομοιόμορφη. Τέλος, οι χώρες - μέλη της ΕΕ διαφέρουν από οικονομικής άποψης κάτι που επηρεάζει άμεσα τον χώρο της υγείας (Mitropoulos et al., 2011). Συγκεκριμένα για την Ελλάδα, έρευνα που πραγματοποιήθηκε σχετικά με τη στάση φορέων και άλλων ενδιαφερόμενων μερών έδειξε πως οι περισσότεροι από αυτούς τάσσονται θετικά απέναντι στην εφαρμογή της φαρμακογονιδιωματικής στη χώρα. Ενδιαφέρον όμως παρουσιάζει το γεγονός πως το υπουργείο υγείας καθώς και το ταμείο δημόσιας ασφάλισης δείχνουν να βρίσκονται απέναντι στο εγχείρημα αυτό κάτι που δυσκολεύει ακόμη περισσότερο την υλοποίησή του δεδομένου πως πρόκειται για φορείς με μεγάλη επιρροή στον τομέα της υγείας (Mitropoulou et al., 2014). Συμπερασματικά, στο μέλλον κρίνεται απαραίτητο να εστιάσουμε στο πως όλοι οι εμπλεκόμενοι φορείς θα ενημερωθούν σωστά, θα εκπαιδευτούν και θα ενδιαφερθούν να ενσωματώσουν όλη τη διαθέσιμη γνώση στην κλινική ρουτίνα. Όταν αυτό επιτευχθεί θα ανοιχτεί ο δρόμος ώστε να γίνουν όλες οι απαραίτητες ενέργειες προκειμένου να γίνει η φαρμακογονιδιωματική κι η εξατομικευμένη γενωμική ιατρική ένα αναπόσπαστο κομμάτι της κλινικής πράξης. 103

120 104

121 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 105

122 106

123 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Affymetrix, PharmacoScan Solution Data Sheet. Anaya, J.-M. et al., Personalized medicine. Closing the gap between knowledge and clinical practice. Autoimmunity reviews, 15(8), pp Anon, Affymetrix White Paper: DMET TM Plus allele translation. Available at: Anon, Translating pharmacogenetics Treat everyone as an individual DMET TM Plus Solution. Available at: hure.pdf. Ansell, J. et al., Pharmacology and management of the vitamin K antagonists: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines (8th Edition). Chest, 133(6 SUPPL. 6). Bonifaz-Pe??a, V. et al., Exploring the distribution of genetic markers of pharmacogenomics relevance in Brazilian and Mexican populations. PLoS ONE, 9(11), pp Bumgarner, R., DNA microarrays: Types, Applications and their future. Curr Protoc Mol Biol., 6137(206), pp Burmester, J.K. et al., DMET TM Microarray Technology for Pharmacogenomics- Based Personalized Medicine. In pp Carr, D.F., Alfirevic, A. & Pirmohamed, M., Pharmacogenomics: Current stateof-the-art. Genes, 5(2), pp Charlab, R. & Zhang, L., Pharmacogenomics: Historical Perspective and Current Status. In pp Available at: [Accessed May 18, 2017]. Chen, Y.-Y. et al., Efficacy, safety and administration timing of trastuzumab in human epidermal growth factor receptor 2 positive breast cancer patients: A metaanalysis. Experimental and therapeutic medicine, 11(5), pp Chicurel, M.E. & Dalma-Weiszhausz, D.D., Microarrays in pharmagenomics - advances and future promise. Pharmacogenomics, 3, pp Van Driest, S.L. et al., Clinically actionable genotypes among 10,000 patients with preemptive pharmacogenomic testing HHS Public Access. Clin Pharmacol Ther, 95(4), pp EMA, E15 Definitions for Genomic Biomarkers, Pharmacogenomics, 107

124 Pharmacogenetics, Genomic Data, and Sample Coding Categories. Guidance. Available at: 09/09/WC pdf. FDA, Coumadin (warfarin sodium) tablets Label. Available at: FDA, E15 Definitions for Genomic Biomarkers, Pharmacogenomics, Pharmacogenetics, Genomic Data, and Sample Coding Categories. Guidance. Available at: guidances/ucm pdf. FDA, Paving the Way for Personalized Medicine Paving the Way for Personalized Medicine. Personalized Medicine, pp Ginsburg, G.S. & Willard, H.F., Genomic and personalized medicine: foundations and applications. Translational Research, 154(6), pp Grady, W.M. & Pritchard, C.C., Molecular alterations and biomarkers in colorectal cancer. Toxicologic pathology, 42(1), pp Group, T.I.S.M.W., A map of human genome sequence variation containing million single nucleotide polymorphisms. Nature, 409(February), pp Guzzi, P.H. et al., DMET-Analyzer: automatic analysis of Affymetrix DMET Data. BMC Bioinformatics, 13. Hardenbol, P. et al., Multiplexed genotyping with sequence-tagged molecular inversion probes. Nature biotechnology, 21(6), pp Holbrook, A.M. et al., Systematic overview of warfarin and its drug and food interactions. Archives of internal medicine, 165(10), pp ICH, Definitions for Genomic Biomarkers, Pharmacogenomics, Pharmacogenetics, Genomic Data and Sample Coding Categories E15. International Human Genome Sequencing Consortium, Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature, 431(2), pp Jackson, J.N. et al., A comparison of DMET Plus microarray and genome-wide technologies by assessing population substructure. Pharmacogenetics and Genomics, 26(4), pp Jittikoon, J. et al., Comparison of genetic variation in drug ADME-related genes in Thais with Caucasian, African and Asian HapMap populations. Journal of 108

125 human genetics, 61(2), pp Johnson, J. et al., Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium (CPIC) Guideline for Pharmacogenetics-Guided Warfarin Dosing: 2017 Update. Clinical Pharmacology & Therapeutics. Kalman, L. V. et al., Pharmacogenetic Allele Nomenclature: International Workgroup Recommendations for Test Result Reporting. Clinical Pharmacology and Therapeutics, 99(2), pp Kumuthini, J. et al., Minimum information required for a DMET experiment reporting. Pharmacogenomics. Limdi, N.A., Warfarin pharmacogenetics: Challenges and opportunities for clinical translation. Frontiers in Pharmacology, 3 OCT(October), pp.1 5. Maximiano, S. et al., Trastuzumab in the Treatment of Breast Cancer. BioDrugs, 30(2), pp Meyer, U. a, Pharmacogenetics - five decades of therapeutic lessons from genetic diversity. Nature reviews. Genetics, 5(9), pp Mitropoulos, K. et al., Relevance of pharmacogenomics for developing countries in Europe. Drug Metabolism and Drug Interactions, 26(4), pp Mitropoulou, C. et al., Stakeholder analysis in pharmacogenomics and genomic medicine in Greece. Public Health Genomics, 17, pp Mizzi, C. et al., A European spectrum of pharmacogenomic biomarkers: Implications for clinical pharmacogenomics. PLoS ONE, 11(9), pp Mizzi, C. et al., Personalized pharmacogenomics profiling using whole-genome sequencing. Pharmacogenomics, 15(9), pp Nebert, D.W., Pharmacogenetics and pharmacogenomics: why is this relevant to the clinical geneticist? Clinical genetics, 56(4), pp Nees, M. & Woodworth, C.D., Microarrays: spotlight on gene function and pharmacogenomics. Current cancer drug targets, 1(2), pp Pavlopoulos, G.A. et al., Visualizing genome and systems biology: technologies, tools, implementation techniques and trends, past, present and future. GigaScience, 4(1), p.38. Relling, M. V & Klein, T.E., CPIC: Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium of the Pharmacogenomics Research Network. Clinical pharmacology and therapeutics, 89(3), pp Robarge, J.D. et al., The Star-Allele Nomenclature: Retooling for Translational 109

126 Genomics. Clinical Pharmacology & Therapeutics, 82(3), pp Roden, D.M. et al., Annals of Internal Medicine Review Pharmacogenomics : Challenges and Opportunities. Annals of Internal Medicine, 145, pp Roden, D.M., Cardiovascular pharmacogenomics: current status and future directions. Journal of Human Genetics, 61(1), pp Schuck, R.N. & Grillo, J.A., Pharmacogenomic Biomarkers: an FDA Perspective on Utilization in Biological Product Labeling. The AAPS Journal, 18(3), pp Shahandeh, A. et al., Advantages of Array-Based Technologies for Pre-Emptive Pharmacogenomics Testing. Microarrays, 5(2), p.12. Sissung, T.M. et al., Clinical pharmacology and pharmacogenetics in a genomics era: the DMET platform. Pharmacogenomics, 11(1), pp Snyder, L.H., Studies in human inheritance. IX. The inheritance of taste sensitivity in man. Ohio J. Sci,, 32(5), pp Spear, B.B., Heath-Chiozzi, M. & Huff, J., Clinical application of pharmacogenetics. Trends in Molecular Medicine, 7(5), pp Squassina, A. et al., Realities and expectations of pharmacogenomics and personalized medicine: impact of translating genetic knowledge into clinical practice. Pharmacogenomics, 11(8), pp Stergiopoulos, K. & Brown, D.L., Genotype-Guided vs Clinical Dosing of Warfarin and Its Analogues. JAMA Internal Medicine, 174(8), p Thakare, S. et al., DNA Microarray Technique. International Journal for Pharmaceutical Research Scholars, 1(4), pp The International Hap Map Consortium, The International HapMap Project. Nature, 426(6968), pp The International Warfarin Pharmacogenetics Consortium, Estimation of the Warfarin Dose with Clinical and Pharmacogenetic Data. The New England Journal of Medicine, 360(8), pp Tran, N.H. et al., Precision medicine in colorectal cancer: the molecular profile alters treatment strategies. Therapeutic advances in medical oncology, 7(5), pp Valdes, R. & Yin, D.L., Fundamentals of Pharmacogenetics in Personalized, Precision Medicine. Clinics in Laboratory Medicine, 36(3), pp Venter, J.C. et al., The sequence of the human genome. Science (Washington D 110

127 C), 291( SB IM), pp Ventola, C.L., Role of pharmacogenomic biomarkers in predicting and improving drug response: part 1: the clinical significance of pharmacogenetic variants. Pharmacy and therapeutics, 38(9), pp Waring, J.F., Overview of Microarrays in Drug Discovery and Development. In Current Protocols in Pharmacology. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., p Westerhoff, H. V & Palsson, B.O., The evolution of molecular biology into systems biology. Nat Biotechnol, 22(10), pp Wiita, A.A.P. & Schrijver, I., Clinical application of high throughput molecular screening techniques for pharmacogenomics. Pharmacogenomics and Personalized Medicine, 4(1), pp van der Wouden, C. et al., Implementing Pharmacogenomics in Europe: Design and Implementation Strategy of the Ubiquitous Pharmacogenomics Consortium. Clinical Pharmacology & Therapeutics, 101(3), pp Yang, W. et al., Comparison of genome sequencing and clinical genotyping for pharmacogenes. Clinical Pharmacology & Therapeutics, 100(4), pp

128 112

129 7. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΤΑ 113

130 114

131 7. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑΤΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Α: Πίνακας βιοδεικτών εγκεκριμένων από τον FDA (προσαρμογή από: Pharmacogenetics/ucm htm) Drug Therapeutic Area Biomarker Referenced Subgroup Abacavir Infectious Diseases HLA-B HLA-B*5701 allele carriers Pharmacogenomic Information on Ado- Trastuzumab Emtansine Oncology ERBB2 HER2 protein overexpression or gene amplification positive Pharmacogenomic Information on Afatinib Oncology EGFR EGFR exon 19 deletion or exon 21 substitution (L858R)positive Amitriptyline Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Anastrozole Oncology ESR1, PGR Hormone receptor-positive Arformoterol (1) Pulmonary UGT1A1 UGT1A1 poor metabolizers Arformoterol (2) Pulmonary CYP2D6 CYP2D6 intermediate or poor metabolizers Aripiprazole Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Pharmacogenomic Information on Arsenic Trioxide Oncology PML-RARA PML-RARα translocation positive Atomoxetine Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Azathioprine Rheumatology TPMT TPMT intermediate or poor metabolizers Boceprevir Infectious Diseases IFNL3 IL28B rs T allele carriers (C/T and T/T genotype) Bosutinib Oncology BCR/ABL1 Busulfan Oncology BCR-ABL1 Philadelphia chromosome positive Philadelphia chromosome negative Capecitabine Oncology DPYD DPD deficient Carbamazepine (1) Neurology HLA-B HLA-B*1502 allele carriers Carbamazepine (2) Neurology HLA-A HLA-A*3101 allele carriers 115

132 Pharmacogenomic Information on Carglumic Acid Inborn Errors of Metabolism NAGS N-acetylglutamate synthase deficient Carisoprodol Rheumatology CYP2C19 CYP2C19 poor metabolizers Carvedilol Cardiology CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Celecoxib Rheumatology CYP2C9 CYP2C9 poor metabolizers Pharmacogenomic Information on Ceritinib Oncology ALK ALK gene rearrangement positive Cetuximab (1) Oncology EGFR EGFR protein expression positive Cetuximab (2) Oncology KRAS KRAS codon 12 and 13 mutation negative Cevimeline Dental CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Chloroquine Infectious Diseases G6PD G6PD deficient Chlorpropamide Endocrinology G6PD G6PD deficient Cisplatin Oncology TPMT TPMT intermediate or poor metabolizers Citalopram (1) Psychiatry CYP2C19 CYP2C19 poor metabolizers Citalopram (2) Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Clobazam Neurology CYP2C19 CYP2C19 poor metabolizers Clomipramine Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Clopidogrel Cardiology CYP2C19 CYP2C19 intermediate or poor metabolizers Clozapine Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Codeine Anesthesiology CYP2D6 CYP2D6 ultra-rapid metabolizers Pharmacogenomic Information on Crizotinib Oncology ALK ALK gene rearrangement positive 116

133 Dabrafenib (1) Oncology BRAF BRAF V600E/K mutation positive Dabrafenib (2) Oncology G6PD G6PD deficient Dapsone (1) Dermatology G6PD G6PD deficient Dapsone (2) Infectious Diseases G6PD G6PD deficient Pharmacogenomic Information on Dasatinib Oncology BCR/ABL1 Philadelphia chromosome positive;, T315I mutationpositive Pharmacogenomic Information on Oncology IL2RA CD25 antigen positive Denileukin Diftitox Desipramine Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Dexlansoprazole Gastroenterology CYP2C19 CYP2C19 poor metabolizers Dextromethorphan and Quinidine Neurology CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Diazepam Psychiatry CYP2C19 CYP2C19 poor metabolizers Doxepin (1) Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Doxepin (2) Psychiatry CYP2C19 CYP2D6 poor metabolizers Drospirenone and Ethinyl Estradiol Gynecology, Dermatology CYP2C19 CYP2C19 intermediate metabolizers Eliglustat Inborn Errors of Metabolism CYP2D6 CYP2D6 ultrarapid, intermediate or poor metabolizers Eltrombopag (1) Hematology F5 Factor V Leiden carriers Eltrombopag (2) Hematology SERPINC1 Antithrombin III deficient Erlotinib (1) Oncology EGFR EGFR protein expression positive Erlotinib (2) Oncology EGFR EGFR exon 19 deletion or exon 21 substitution (L858R) positive Esomeprazole Gastroenterology CYP2C19 CYP2C19 poor metabolizers 117

134 Everolimus (1) Oncology ERBB2 HER2 protein overexpression negative Everolimus (2) Oncology ESR1 Estrogen receptor positive Exemestane (1) Oncology ESR1 Estrogen receptor positive Exemestane (2) Oncology PGR Progesterone receptor positive Fluorouracil (1) Dermatology DPYD DPD deficient Fluorouracil (2) Oncology DPYD DPD deficient Fluoxetine Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Flurbiprofen Rheumatology CYP2C9 CYP2C9 poor metabolizers Fluvoxamine Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Fulvestrant Oncology ESR1, PGR Hormone receptor positive Galantamine Neurology CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Glimepiride Endocrinology G6PD G6PD deficient Glipizide Endocrinology G6PD G6PD deficient Glyburide Endocrinology G6PD G6PD deficient Pharmacogenomic Information on Ibrutinib Oncology del (17p) Chromosome 17p deletion positive Iloperidone Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Imatinib (1) Oncology KIT KIT protein expression positive, c-kit D816V mutation negative Imatinib (2) Oncology BCR-ABL1 Philadelphia chromosome positive Imatinib (3) Oncology PDGFRB PDGFR gene rearrangement positive Imatinib (4) Oncology FIP1L1-PDGFRA FIP1L1-PDGFRα fusion kinase (or CHIC2 deletion) positive Imipramine Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers 118

135 Indacaterol Pulmonary UGT1A1 UGT1A1-*28 allele homozygotes Irinotecan Oncology UGT1A1 UGT1A1*28 allele carriers Isosorbide and Hydralazine Cardiology NAT1-2 Slow acetylators Ivacaftor Pulmonary CFTR CFTR G551D, G1244E, G1349D, G178R, G551S, S1251N, S1255P, S549N, or S549R mutation carriers, F508del mutation homozygotes Lansoprazole Gastroenterology CYP2C19 CYP2C19 intermediate or poor metabolizers Lapatinib (1) Oncology ERBB2 HER2 protein overexpression positive Lapatinib (2) Oncology HLA-DQA1, HLA-DRB1 HLA-DQA1*0201 or -DRB1*0701 allele carriers Pharmacogenomic Information on Lenalidomide Hematology del (5q) Chromosome 5q deletion positive Letrozole Oncology ESR1, PGR Hormone receptor positive Lomitapide Endocrinology LDLR LDLR mutation homozygotes (homozygous familial hypercholesterolemia) Mafenide Infectious Diseases G6PD G6PD deficient Pharmacogenomic Information on Mercaptopurine Oncology TPMT TPMT intermediate or poor metabolizers Methylene Blue Hematology G6PD G6PD deficient Metoclopramide Gastroentrology CYB5R1-4 NADH cytochrome b5 reductase deficient Metoprolol Cardiology CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Mipomersen Endocrinology LDLR LDLR mutation heterozygotes and homozygotes (heterozygous and homozygous familial hypercholesterolemia) Modafinil Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Mycophenolic Acid Transplantation HPRT1 HGPRT deficient Nalidixic Acid Infectious Diseases G6PD G6PD deficient Nefazodone Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers 119

136 Nilotinib (1) Oncology BCR-ABL Philadelphia chromosome positive Nilotinib (2) Oncology UGT1A1 UGT1A1*28 allele homozygotes Nitrofurantoin Infectious Diseases G6PD G6PD deficient Nortriptyline Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Obinutuzumab Oncology MS4A1 CD20 antigen positive Omacetaxine Oncology BCR-ABL1 Philadelphia chromosome positive Omeprazole Gastroenterology CYP2C19 CYP2C19 poor metabolizers Panitumumab (1) Oncology EGFR EGFR protein expression positive Panitumumab (2) Oncology KRAS KRAS codon 12 and 13 mutation negative Pantoprazole Gastroenterology CYP2C19 CYP2C19 poor metabolizers Paroxetine Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 extensive metabolizers Pharmacogenomic Information on Pazopanib Oncology UGT1A1 UGT1A1*28 allele homozygotes (TA)7/(TA)7 genotype PEG-3350, Sodium Sulfate, Sodium Chloride, Potassium Chloride, Sodium Ascorbate, and Ascorbic Acid Gastroenterology G6PD G6PD deficient Pegloticase Rheumatology G6PD G6PD deficient Perphenazine Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Pharmacogenomic Information onpertuzumab Oncology ERBB2 HER2 protein overexpression positive Phenytoin Neurology HLA-B HLA-B*1502 allele carriers Pimozide Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Pharmacogenomic Information on Ponatinib Oncology BCR-ABL1 Philadelphia chromosome positive; T315I mutation positive Prasugrel (1) Cardiology CYP2C19 CYP2C19 poor metabolizers Prasugrel (2) Cardiology CYP2C9 CYP2C9 variant carriers Prasugrel (3) Cardiology CYP3A5 CYP3A5 variant carriers 120

137 Prasugrel (4) Cardiology CYP2B6 CYP2B6 variant carriers Pravastatin Endocrinology LDLR LDLR mutation heterozygotes and homozygotes (heterozygous and homozygous familial hypercholesterolemia) Primaquine Infectious Diseases G6PD G6PD deficient Propafenone Cardiology CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Propranolol Cardiology CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Protriptyline Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Quinidine Cardiology CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Quinine Sulfate (1) Infectious Diseases G6PD G6PD deficient Quinine Sulfate (2) Infectious Diseases CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Rabeprazole Gastroenterology CYP2C19 CYP2C19 poor metabolizers Rasburicase (1) Oncology G6PD G6PD deficient Rasburicase (2) Oncology CYB5R1-4 NADH cytochrome b5 reductase deficient Rifampin, Isoniazid, and Pyrazinamide Infectious Diseases NAT1-2 Slow acetylators (inactivators) Risperidone Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Pharmacogenomic Information onrituximab Oncology MS4A1 CD20 antigen positive Simeprevir Infectious Diseases IFNL3 IL28B rs T allele carriers Sodium Nitrite Toxicology G6PD G6PD deficient Sodium phenylacetate and Sodium Benzoate Inborn Errors of Metabolism NAGS, CPS1, ASS1, OTC, ASL, ABL2 Urea cycle enzyme deficient Sofosbuvir Infectious Diseases IFNL3 IL28B rs T allele carriers (non-c/c genotype)il28b Succimer Hematology G6PD G6PD deficient Sulfamethoxazole and Trimethoprim Infectious Diseases G6PD G6PD deficient 121

138 Tamoxifen (1) Oncology ESR1, PGR Hormone receptor positive Tamoxifen (2) Oncology F5 Factor V Leiden carriers Tamoxifen (3) Oncology F2 Prothrombin 20210A allele positive Telaprevir Infectious Diseases IFNL3 IL28B rs T allele carriers (C/T and T/T genotype) Tetrabenazine Neurology CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Thioguanine Oncology TPMT TPMT intermediate or poor metabolizers (deficient) Thioridazine Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Ticagrelor Cardiology CYP2C19 CYP2C19 poor metabolizers Tolterodine Genitourinary CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Tositumomab Oncology MS4A1 CD20 antigen positive Tramadol Analgesic CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Pharmacogenomic Information ontrametinib Oncology BRAF BRAF V600E/K mutation positive Pharmacogenomic Information on Trastuzumab Oncology ERBB2 HER2 protein overexpression positive Tretinoin Oncology PML/RARA PML/RARα translocation positive Trimipramine Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Valproic Acid (1) Neurology POLG POLG mutation positive Valproic Acid (2) Neurology NAGS, CPS1, ASS1, OTC, ASL, ABL2 Urea cycle enzyme deficient Pharmacogenomic Information on Vemurafenib Oncology BRAF BRAF V600E mutation positive Venlafaxine Psychiatry CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers Voriconazole Infectious Diseases CYP2C19 CYP2C19 intermediate or poor metabolizers Vortioxetine Neurology CYP2D6 CYP2D6 poor metabolizers 122

139 Warfarin (1) Cardiology or Hematology CYP2C9 CYP2C9 intermediate or poor metabolizers Warfarin (2) Cardiology or Hematology VKORC1 VKORC1 A allele carriers Warfarin (3) Cardiology, Hematology PROS Protein S deficient Warfarin (4) Cardiology, Hematology PROC Protein C deficient 123

140 124

141 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Β: Γραφήματα «Marker Summary» όπως αυτά δίνονται από το πρόγραμμα DMET Console για τους 36 επιλεγμένους βιοδείκτες 125

142 126

143 127

144 128

145 129

146 130

147 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Γ: Δημοσίευση που περιέχει τα αποτελέσματα της παρούσας διπλωματικής εργασίας 131