ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΚΑΙ ΑΡΧΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ ΣΤΙΣ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΕΙΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΑ ΛΟΥΚΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΚΑΙ ΑΡΧΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ ΣΤΙΣ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΕΙΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΑ ΛΟΥΚΑ Επιβλέπων Τιμολέων-Αχιλλέας Βυζαντιάδης Μέλη Τριμελούς Επιτροπής Αικατερίνη Πατσατσή Ευαγγελία Σπάνδου ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ Ιούνιος 2015

2 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στον κύριο Τιμολέοντα-Αχιλλέα Βυζαντιάδη, επίκουρο καθηγητή της Ιατρικής Βιοπαθολογίας-Μικροβιολογίας και επιβλέποντα της διπλωματικής εργασίας, για την επιλογή του θέματος και τη συνεχή καθοδήγησή του. Τον ευχαριστώ για τις γνώσεις που μου προσέφερε σε όλη τη διάρκεια της συνεργασίας μας, τη στήριξη και την ενθάρρυνσή του. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω θερμά τα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, κυρία Αικατερίνη Πατσατσή, επίκουρη καθηγήτρια Δερματολογίας-Αφροδισολογίας, και κυρία Ευαγγελία Σπάνδου, αναπληρώτρια καθηγήτρια Φυσιολογίας, για την πολύτιμη βοήθειά τους. Ένα τεράστιο ευχαριστώ στην οικογένειά μου και στους δύο ήρωες της καθημερινότητάς μου, του γονείς μου Κωνσταντίνο και Καλλιόπη, για την ανεκτίμητη ηθική βοήθεια που μου προσέφεραν, για την υπομονή που υπέδειξαν και για την στήριξή τους όλα αυτά τα χρόνια. Για το τέλος άφησα το μεγαλύτερό μου σύμμαχο στην εργασία αυτή, τον άνθρωπο που δεν έπαψε στιγμή να πιστεύει σε εμένα και να με στηρίζει με κάθε δυνατό τρόπο, το σύζυγό μου Θεόδωρο Γιαμουρίδη. Θεσσαλονίκη, Ιούνιος

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΤΟΥ ΟΝΥΧΑ.7 ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΟΝΥΧΑ..9 ΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΠΠΤΩΣΗ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΗΣ...9 ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΗ.10 ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ..14 ΜΟΡΦΕΣ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΗΣ Άπω και πλάγια Επιφανειακή Ενδονύχια Εγγύς υπωνύχια Μικτό μοντέλο Ολική δυστροφική Δευτεροπαθής..17 ΑΙΤΙΑ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΗΣ Ζυμομύκητες Δερματόφυτα Μη-δερματοφυτικοί νηματοειδείς μύκητες.23 ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΗΣ Συλλογή δείγματος νυχιών Άμεση μικροσκόπηση Ιστολογική εξέταση Καλλιέργεια Κυτταρομετρία ροής Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Φασματοσκοπία μάζας.33 2

4 ΘΕΡΑΠΕΙΑ..34 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ...38 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Δείγμα Επεξεργασία κλινικών δειγμάτων Καλλιέργεια Εκχύλιση δειγμάτων Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης...45 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Εφαρμογή της 1 ης PCR για την ανίχνευση των ζυμομυκήτων Εφαρμογή της 2 ης PCR για την ανίχνευση των δερματοφυτικών μυκήτων Εφαρμογή της πολυπλεκτικής (multiplex) PCR..52 ΣΥΖΗΤΗΣΗ.58 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ..64 3

5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Η ονυχομυκητίαση είναι η πιο συχνή πάθηση των νυχιών με συχνότητα που αγγίζει το 10% στο γενικό πληθυσμό και φτάνει ως το 40% στους ηλικιωμένους. Τα υπεύθυνα αίτια περιλαμβάνουν τους δερματοφυτικούς μύκητες και ακολουθούν τα είδη Candida και οι μη-δερματοφυτικοί νηματοειδείς μύκητες. Οι κλασσικές μέθοδοι ταυτοποίησης περιλαμβάνουν την άμεση μικροσκόπηση και καλλιέργεια του νυχιού, αλλά είναι χρονοβόρες και απαιτούν καλά εκπαιδευμένο προσωπικό με ειδικές γνώσεις μυκητολογίας. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι ένα χρήσιμο εναλλακτικό διαγνωστικό εργαλείο που μπορεί να ταυτοποιεί ταχύτατα και έγκυρα τους υπεύθυνους μύκητες. ΣΚΟΠΟΣ: Σκοπός αυτής της μελέτης είναι ο σχεδιασμός μιας πολυπλεκτικής PCR που θα ανιχνεύει την ύπαρξη στα νύχια των δύο συχνότερων αιτιών των ονυχομυκητιάσεων, των δερματοφύτων και της Candida, σε μία μόνο αντίδραση. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν όνυχες και οι καλλιέργειές τους από ασθενείς με εικόνα συμβατή ονυχομυκητίασης καθώς και στελέχη που κρατήθηκαν στα πλαίσια εξωτερικού ποιοτικού ελέγχου. Η εκχύλιση έγινε με την κατοχυρωμένη μεθοδολογία (διεθνής πατέντα) της Μονάδας Μυκητολογίας και Παρασιτολογίας του Ινστιτούτου Statens Κοπεγχάγης. Εφαρμόσθηκαν τρία πρωτόκολλα PCR, ένα για την ανίχνευση των ζυμομυκήτων, ένα για την ανίχνευση των δερματοφύτων και ένα τρίτο πολυπλεκτικό των δύο προηγούμενων. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Όλα τα εκχυλίσματα των καλλιεργειών και των ονύχων με Candida έδωσαν προϊόν στις μεμονωμένες και στην πολυπλεκτική PCR. Δυσκολίες υπήρξαν μόνο στα εκχυλίσματα των ονύχων που έπασχαν από δερματόφυτα καθώς σε μερικά από αυτά εμφανίσθηκαν αχνά προϊόντα ή/και μη ειδικές ανεπιθύμητες ζώνες. Η ευαισθησία της μεθόδου έφτασε ως 0,025 ng/μl/ανά αντίδραση για την Candida albicans και 2,5 ng/μl για το T. rubrum. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Αναπτύχθηκε μία νέα αντίδραση πολυμεράσης που μπορεί ταχύτατα να ανιχνεύσει την ύπαρξη δερματόφυτου ή/και Candida στους όνυχες, καθιστώντας την πολύτιμο εργαλείο στην διάγνωση του ασθενούς και στην άμεση έναρξη τεκμηριωμένης θεραπευτικής αγωγής. 4

6 Λέξεις κλειδιά: ονυχομυκητίαση, πολυπλεκτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, Candida, δερματόφυτα. 5

7 ABSTRACT INTRODUCTION: Onychomycosis is the most common nail disorder and its prevalence varies from 10% in the general population reaching up to 40% among the elderly. The dermatophytes are the most common causative agents followed by Candida sp. and non-dermatophyte moulds. The diagnosis of onychomycosis is conventially made by direct microscopy and fungal culture but these techniques are time-consuming and require experienced investigators with good knowledge of mycology. Polymerase chain reaction is a useful alternative diagnostic tool that identifies accurately and rapidly the pathogenic fungi. OBJECTIVE: The purpose of this study is to design a new single multiplex PCR which will detect the presence of the two most common causative agents, dermatophytes or/and Candida sp., in clinically diseased nails. MATERIALS AND METHODS: The materials of this study include nail samples and their cultures from patients with clinically suspected onychomycosis and some clinical isolates from the external quality control scheme. DNA extraction was performed using the methodology, proposed by the Statens Serum Institute of Copenhagen (Denmark patent-wo/2006/133701). Three PCR protocols were tested, one for the detection of dermatophytes, one for Candida sp., and one for the multiplex format. RESULTS: PCR products were visible from all DNA extractions originated from fungal cultures and nails with Candida, in both separate PCRs and multiplex format. Some difficulties were only faced with dermatophyte nail extractions as some of them gave faint PCR amplification products and non-specific bands. The analytical sensitivity of the method was found to be ng/μl/per reaction for the detection of Candida albicans and 2.5 ng/μl/per reaction for T. rubrum. CONCLUSION: A new single multiplex PCR for the detection of dermatophyte and Candida nail infections was developed. The technique facilitates the rapid and accurate diagnosis of onychomycosis and allows the early and pre-emptive antifungal treatment. Key-words: onychomycosis, multiplex PCR, Candida, dermatophytes. 6

8 ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΤΟΥ ΟΝΥΧΑ ΟΡΙΣΜΟΣ: Τα νύχια αποτελούν λεπτές κεράτινες ημιδιαφανείς πλάκες που καλύπτουν τη ραχιαία επιφάνεια της άπω φάλαγγας των δαχτύλων χεριών και ποδιών. (83) Αποτελούνται από τα εξής μέρη: Εικόνα 1: Ανατομία του νυχιού (1) 1.Ονυχαία πλάκα: Είναι μια τροποποιημένη μορφή της κεράτινης στοιβάδας του δέρματος που επικαλύπτει και προστατεύει την κοίτη και τη μήτρα του όνυχα. Έχει σχήμα ορθογωνίου παραλληλογράμμου με αποστρογγυλεμένες άκρες, ημιδιαφανή όψη και ελαφρά καμπυλότητα τόσο κατά τον εγκάρσιο όσο και κατά τον επιμήκη άξονα. Η κυρτότητα αυτή, που είναι πιο έντονη εγκαρσίως, εξυπηρετεί την ενσωμάτωση της πλάκας στις ονυχαίες πτυχές παρέχοντας ισχυρή προσκόλληση και στερεότητα. Η ανώτερη επιφάνειά της είναι σχετικά ομαλή με ποικίλο αριθμό επαρμάτων που μεταβάλλονται με τα χρόνια. (1) Στην παιδική ηλικία υπάρχουν συχνά μικρές, τμηματικές πλάγιες ακρολοφίες (2) που εξαφανίζονται δίνοντας τη θέση τους σε επιμήκεις. Τα επάρματα αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην διάκριση πανομοιότυπων διδύμων (3) καθώς και για ιατροδικαστικούς σκοπούς. (4) 7

9 2.Ονυχαίες πτυχές: Διακρίνονται στις πλάγιες και την κεντρική και μαζί αποτελούν το περιωνύχιο. Οι πλάγιες είναι πιο έντονες στα δάχτυλα των ποδιών και απώλειά τους προδιαθέτει σε ονυχόλυση. Το περιωνύχιο δημιουργεί ένα προστατευτικό στρώμα πάνω από τη μήτρα του νυχιού και το προστατεύει έναντι της υπεριώδους ακτινοβολίας (5) ενώ βλάβη του οδηγεί σε μόνιμες αλλοιώσεις. 3.Επωνύχιο: Αποτελεί προέκταση της κεντρικής ονυχαίας πτυχής πάνω στην ονυχαία πλάκα. Η απομάκρυνσή του με το μανικιούρ καθώς και η καταστροφή του από φλεγμονές ή λοιμώξεις επιτρέπει την είσοδο μικροβίων. Η απώλειά του αποτελεί το πρώτο σημάδι εκδήλωσης χρόνιας παρωνυχίας (6) ενώ η επανεμφάνισή του είναι ευνοϊκό σημάδι υποχώρησης της φλεγμονής. 4.Μηνίσκος: Είναι η λευκωπή ημισελινοειδής περιοχή που εντοπίζεται σε όλα τα δάκτυλα με εξαίρεση το μικρό. Το χρώμα του πιθανόν οφείλεται στο παχύτερο στρώμα επιθηλιακών κυττάρων και τη λεπτότερη ονυχαία πλάκα που τον καλύπτει. (83) 5.Μήτρα όνυχα: Οι ιστοί κάτω από το νύχι χωρίζονται στη μήτρα (15-25%) και στην κοίτη (75-85%). (1) Από τη μήτρα παράγεται όλο ή το μεγαλύτερο μέρος της ονυχαίας πλάκας. Για λειτουργικούς λόγους, μπορεί να γίνει διάκριση ανάμεσα στο κεντρικό μέρος της μήτρας που παράγει το ραχιαίο τμήμα της ονυχαίας πλάκας (7) και στο περιφερικό μέρος, που ονομάζεται μηνίσκος, και παράγει το κοιλιακό τμήμα του νυχιού. Τραυματισμοί και επεμβάσεις στο περιφερικό τμήμα έχουν λιγότερες πιθανότητες πρόκλησης μόνιμων ουλών συγκριτικά με αντίστοιχες βλάβες στο κεντρικό τμήμα. 6.Κοίτη του όνυχα: Εκτείνεται από το περιφερικό όριο του μηνίσκου ως το υπωνύχιο. Βρίσκεται σε πλήρη επαφή με την ονυχαία πλάκα με εξαίρεση το ελεύθερο χείλος της. Διασχίζεται από επιμήκεις ακρολοφίες πλούσιες σε τριχοειδή αγγεία και έχει χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού και χαμηλή έκφραση κερατινών τελικής διαφοροποίησης (Κ1 και Κ10) που εκφράζονται στο υγιές δέρμα. Αυτό οφείλεται στο ότι η ονυχαία πλάκα λειτουργεί ως ένα κερατινοποιημένο επιθήλιο που επικαλύπτει την κοίτη. (1) Σε περίπτωση τραυματισμού και αποκόλλησης του νυχιού η κατάσταση αυτή διαφοροποιείται. Παρατηρείται έκφραση κερατινών τελικής διαφοροποίησης σε μεγάλο βαθμό, σχηματισμός κοκκώδες στρώματος και απώλεια των ραβδώσεων 8

10 στην κάτω επιφάνεια του νυχιού που οδηγούν σε ελάττωση της σύνδεσης και προσκολλήσεως της ονυχαίας πλάκας στην κοίτη. σταθερότητας 7.Υπωνύχιο: Αποτελεί το τμήμα κάτω από το ελεύθερο άκρο της ονυχαίας πλάκας. Εκτείνεται από την ονυχοδερματική ταινία ως το δερματικό άκρο της ραχιαίας επιφάνειας της τελικής φάλαγγας. 8.Ονυχοδερματική ταινία: Το περιφερικό άκρο της κοίτης του όνυχα διαφέρει χρωματικά σε σύγκριση με το υπόλοιπο τμήμα. Ουσιαστικά, πρόκειται για μια εγκάρσια γραμμή πάχους 1-1,5 mm με απόχρωση βαθύ ροζ (Καυκάσιοι) ή καφέ (Αφροαμερικανοί). Το χρώμα του επηρεάζεται από ποικίλες παθήσεις και καταστάσεις των αγγείων της περιοχής. Αποτελεί τον πρώτο φραγμό προστασίας έναντι στην είσοδο μικροβίων στην κάτω επιφάνεια του όνυχα. (1) ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΟΝΥΧΑ Ο ρυθμός ανάπτυξης της ονυχαίας πλάκας στα χέρια είναι 0,1 mm /ημέρα ενώ στα πόδια είναι μειωμένος στο μισό ή στο ένα τρίτο του ρυθμού των χεριών. Αυτό συνεπάγεται πως η πλήρης ανανέωση των νυχιών στα χέρια απαιτεί 5-6 μήνες ενώ στα πόδια μήνες. Οι παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη του νυχιού είναι πολυάριθμοι. Ευνοϊκά δρουν η μικρή ηλικία, η εγκυμοσύνη, η ονυχοφαγία, η χειρουργική αφαίρεση του νυχιού, η καλοκαιρινή περίοδος και η ψωρίαση ενώ ο υποσιτισμός, οι νευρολογικές και αγγειακές διαταραχές καθώς και οι ιογενείς λοιμώξεις καθυστερούν το ρυθμό ανάπτυξης. (83) ΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΠΙΠΤΩΣΗ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΗΣ Σύμφωνα με την Παγκόσμια Εταιρεία Μυκητολογίας (ISHAM), η ονυχομυκητίαση είναι μία διεισδυτική λοίμωξη των νυχιών ανεξαρτήτως αιτιολογικού παράγοντα. Ο όρος δερματοφυτία ονύχων (Τinea Unguium) αναφέρεται στις λοιμώξεις των νυχιών που οφείλονται αποκλειστικά σε δερματόφυτα οι οποίες είναι οι συχνότερες. Για το λόγο αυτό συχνά, οι δύο ορισμοί θεωρούνται λανθασμένα συνώνυμοι. Επομένως, ο όρος ονυχομυκητίαση αναφέρεται στο σύνολο των λοιμώξεων των νυχιών με αίτια που περιλαμβάνουν τόσο τα δερματόφυτα, όσο και τους ζυμομύκητες και τους μη-δερματοφυτικούς νηματοειδείς μύκητες (NDM-non dermatophyte moulds). (8) 9

11 Η ονυχομυκητίαση αντιπροσωπεύει το 30% των επιφανειακών μυκητιάσεων και το 50% του συνόλου των παθήσεων των νυχιών. Η εκτιμώμενη συχνότητα της νόσου αγγίζει το 10% στο γενικό πληθυσμό και φτάνει ως το 40% στα ηλικιωμένα άτομα με αίτια που περιλαμβάνουν τη μειωμένη ικανότητα του ανοσιακού συστήματος και τα συνοδά προβλήματα υγείας στην ομάδα αυτή καθώς και την αδυναμία εφαρμογής σωστής υγιεινής ειδικά στα νύχια των ποδιών. (9) Η πάθηση συχνά θεωρείται ως ένα αμιγώς αισθητικό πρόβλημα ήσσονος σημασίας που δεν αξίζει την προσπάθεια επίλυσής του. Η πεποίθηση αυτή ενισχύεται από τη μεγάλης διάρκειας θεραπεία που απαιτείται και τις παρενέργειες που συχνά εμφανίζονται. Στην πραγματικότητα, η νόσος συνοδεύεται από σημαντικά αρνητικά αποτελέσματα τόσο για τον ίδιο τον ασθενή (οικονομικά, ψυχολογικά, λειτουργικά) όσο και για την πολιτεία (οικονομική επιβάρυνση). Οι προσβεβλημένοι βιώνουν ντροπή και κοινωνικό αποκλεισμό τόσο στο εργασιακό περιβάλλον τους, ειδικά σε θέσεις που απαιτείται επαφή με άλλους ανθρώπους, όσο και στις διαπροσωπικές τους σχέσεις. (10) Σε περίπτωση που η νόσος αφεθεί χωρίς θεραπεία, υπάρχει κίνδυνος επιπλοκών ειδικά στους ασθενείς που βρίσκονται υπό ανοσοκατασταλτική αγωγή. Επομένως, αγνοώντας ή υποθεραπεύοντας μια ονυχομυκητίαση υπάρχει κίνδυνος πλήρους καταστροφής των νυχιών ακόμη και εξάπλωση της λοίμωξης στους περιβάλλοντες ιστούς, σε άλλα νύχια καθώς και σε άλλα μέρη του σώματος με αυτόενοφθαλμισμό. (11) ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΗ ΗΛΙΚΙΑ Η συχνότητα εμφάνισης ονυχομυκητίασης αυξάνεται με την ηλικία (1,1 % στην ηλικιακή ομάδα ετών, 2,9% στην ομάδα ετών και ξεπερνάει το 28% στις ηλικίες άνω των 60). (12) Παράγοντες που ενοχοποιούνται γι αυτό αποτελούν: η φτωχή περιφερική κυκλοφορία, ο σακχαρώδης διαβήτης, οι συνεχείς τραυματισμοί, το μεγαλύτερο διάστημα έκθεσης σε παθογόνους μύκητες, η αδυναμία εφαρμογής σωστής υγιεινής στα νύχια ειδικά των κάτω άκρων, η ελαττωμένη ανοσιακή απάντηση και ο χαμηλός ρυθμός ανάπτυξης των νυχιών στις μεγάλες ηλικίες. (13) 10

12 ΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Η συμμετοχή της γενετικής προδιάθεσης στην εκδήλωση της νόσου παραμένει ένα θέμα αμφιλεγόμενο. Υπάρχουν μελέτες που υποστηρίζουν πως η άπω-πλάγια υπωνύχια ονυχομυκητίαση που οφείλεται στο Trichophyton rubrum εμφανίζει έναν αυτοσωματικό κυρίαρχο τύπο κληρονομικότητας. (14) ΦΥΛΟ Οι άντρες εμφανίζουν ονυχομυκητίαση τρεις φορές συχνότερα σε σχέση με τις γυναίκες αν και οι λόγοι αυτής της επικράτησης δεν έχουν γίνει ακόμη πλήρως κατανοητοί. (15) ΣΑΚΧΑΡΩΔΗΣ ΔΙΑΒΗΤΗΣ Ο διαβήτης αυξάνει τη πιθανότητα εκδήλωσης νόσου κυρίως λόγω της επίδρασης που ασκεί στην μικροκυκλοφορία. Έτσι, οι σακχαροδιαβητικοί ασθενείς έχουν 2,77 φορές μεγαλύτερη πιθανότητα εκδήλωσης ονυχομυκητίασης συγκριτικά με το γενικό πληθυσμό. (16) Βρέθηκε πως οι ζυμομύκητες επικρατούν στον πληθυσμό αυτό (48,1%) ακολουθούμενοι από τα δερματόφυτα (37%) και τους μη-δερματοφυτικούς μύκητες (14,9%). (13) ΚΑΠΝΙΣΜΑ Έχει παρατηρηθεί πως υπάρχει συσχέτιση ανάμεσα στην εκδήλωση ονυχομυκητίασης και καπνίσματος (17) αν και η σχέση αυτή έχει αμφισβητηθεί αρκετά. ΑΝΟΣΟΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ Η συχνότητα εμφάνισης ονυχομυκητιάσεων στους ανοσοκατεσταλμένους συγκριτικά με το γενικό πληθυσμό είναι αυξημένη (30,3% έναντι 12,6%). (18) Επιβαρυντικοί παράγοντες νόσου στην ομάδα αυτή είναι ο χαμηλός αριθμός CD4 Τ- λεμφοκυττάρων, η ύπαρξη οικογενειακού ιστορικού μυκητίασης και το ατομικό ιστορικό μυκητίασης άκρου ποδός. Ο τύπος που επικρατεί είναι η εγγύς υπωνύχια ονυχομυκητίαση (4,3% σε σχέση με το 0,3% που παρατηρείται στους ανοσοϊκανούς). (13) 11

13 ΨΩΡΙΑΣΗ Η ονυχομυκητίαση συναντάται συχνότερα στα άτομα που πάσχουν από ψωρίαση σε σχέση με το γενικό πληθυσμό και μάλιστα ο επιπολασμός της νόσου σχεδόν διπλασιάζεται. (19, 20) ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΗ ΑΡΤΗΡΙΑΚΗ ΝΟΣΟΣ AΘΛΗΤΙΣΜΟΣ Η ενασχόληση με τα σπορ και ειδικότερα τα θαλάσσια, ευνοεί την εκδήλωση ονυχομυκητίασης κυρίως των κάτω άκρων. (21) ΤΡΑΥΜΑ Προηγούμενοι τραυματισμοί στα νύχια αυξάνουν τις πιθανότητες εμφάνισης ονυχομυκητίασης ειδικά στους ηλικιωμένους. (22) ΕΠΑΦΗ ΜΕ ΤΗΝ ΠΗΓΗ ΤΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ Αποτελεί παράγοντα κινδύνου κυρίως για τους ζωόφιλους και γεώφιλους μύκητες (Trichophyton erinacei, Trichophyton equinum, Microsporum gypseum). ΣΥΓΧΡΟΝΟΣ ΤΡΟΠΟΣ ΖΩΗΣ Πολλές είναι οι συνήθειες της καθημερινότητας που αυξάνουν τον κίνδυνο νόσησης. Περιλαμβάνουν τη χρησιμοποίηση στενών και ψηλοτάκουνων παπουτσιών για πολλές συνεχόμενες ώρες, τη χρήση γυμναστηρίων και το περπάτημα με γυμνά πόδια στα λουτρά και τις πισίνες. (10) ΑΛΛΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Εκδηλώσεις ατοπίας όπως το βρογχικό άσθμα, η κνίδωση και το αγγειοοίδημα, ο καρκίνος, οι διαταραχές του γαστρεντερικού και τα ρευματικά νοσήματα αποτελούν πιθανούς παράγοντες κινδύνου για εκδήλωση ονυχομυκητιάσεων. (19) 12

14 Πίνακας 1: Πιθανοί παράγοντες κινδύνου για την ονυχομυκητίασης. (19) εκδήλωση Με αστεράκι σημειώνονται αυτοί που έχουν σημαντική συσχέτιση με τη νόσο Odds ratio 95% CI ΑΤΟΠΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ Ατοπικό έκζεμα 0,69 0,44-1,10 Αγγειοοίδημα 1,65 1,12-2,42 * Άσθμα 1,52 1,07-2,17* Κνίδωση 1,36 1,06-1,73 * ΧΡΟΝΙΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ Κακοήθεια 3,44 1,15-10,35 * Παθήσεις καρδιαγγειακού 1,63 0,91-2,92 Παθήσεις αναπνευστικού 1,34 0,69-2,59 Νευρολογικές παθήσεις 0,62 0,08-4,86 Ρευματικά νοσήματα 1,88 1,25-2,83 * Παθήσεις των ενδοκρινών αδένων 1,48 0,73-2,97 Παθήσεις του γαστρεντερικού 1,86 1,03-3,36 * ΠΑΘΗΣΕΙΣ ΔΕΡΜΑΤΟΣ Ψωρίαση 2,44 1,61-3,72* Έκζεμα 0,91 0,58-1,44 Λοιπές παθήσεις 1,28 0,88-1,87 ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΙΣ ΔΕΡΜΑΤΟΣ Δερματοφυτία άκρου ποδός (μεσοδακτύλιος τύπος) Δερματοφυτία άκρου ποδός (υπερκερατωσικός τύπος) 3,93 3,11-4,95* 4,26 3,34-5,45* ΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Γονέας με ονυχομυκητίαση 2,59 1,89-3,53 * Παιδί με ονυχομυκητίαση 3,48 2,05-5,88 * Σύντροφος με ονυχομυκητίαση 2,53 1,72-3,72 * Συγκάτοικος με ονυχομυκητίαση 0,98 0,51-1,87 ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΔΙΑΒΙΩΣΗΣ Κάπνισμα 1,13 0,90-1,42 Ηλικία >50 ετών 2,74 2,19-3,42 * Κολύμβηση 2,57 2,00-3,30 * Ανώτατη εκπαίδευση 0,99 0,73-1,34 Οίκοι ευγηρίας 1,62 0,73-3,60 13

15 ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ Πολλές είναι οι παθήσεις που μιμούνται κλινικά την ονυχομυκητίαση και θα πρέπει να διαφοροδιαγνωστούν από αυτήν. Η ψωρίαση, ο ομαλός λειχήνας, η χρόνια δερματίτιδα, η ονυχογρύπωση, το έκζεμα, η νόσο Darier, η λευκονυχία, το σύνδρομο κίτρινων ονύχων, οι τραυματισμοί, οι κακοήθειες, οι συστηματικές και μεταβολικές παθήσεις (αμυλοείδωση, διαβήτης, πορφύρα), οι κολλαγονοπάθειες (ρευματοειδής αρθρίτιδα, ΣΕΛ, σκληρόδερμα), η λήψη φαρμακευτικών ουσιών (τετρακυκλίνες, κυτταροστατικά, ρετινοειδή, αντϊικά) και οι βακτηριακές λοιμώξεις (από ψευδομονάδα, σταφυλόκοκκο) είναι μερικές από αυτές. (23) ΜΟΡΦΕΣ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΗΣ Η πρώτη ταξινόμηση των ονυχομυκητιάσεων έγινε από τον Zaias το (24) Έκτοτε ακολούθησαν πολυάριθμες τροποποιήσεις που ενσωμάτωναν τα νέα δεδομένα. Η πλέον καθιερωμένη και πληρέστερη κατάταξη είναι η ακόλουθη: Πίνακας 2: Αναθεωρημένη ταξινόμηση των ονυχομυκητιάσεων (25) 1.Άπω και πλάγια υπωνύχια ονυχομυκητίαση 2.Επιφανειακή ονυχομυκητίαση 3.Ενδονύχια ονυχομυκητίαση 4.Εγγύς υπωνύχια ονυχομυκητίαση 5.Μικτό μοντέλο ονυχομυκητίασης 6.Ολική δυστροφική ονυχομυκητίαση 7.Δευτεροπαθής ονυχομυκητίαση 1.ΑΠΩ ΚΑΙ ΠΛΑΓΙΑ ΥΠΩΝΥΧΙΑ ΜΥΚΗΤΙΑΣΗ Αποτελεί τον πιο συχνό τύπο της ονυχομυκητίασης. Το υπεύθυνο αίτιο εισβάλλει από την άπω ή/και τις πλάγιες επιφάνειες της κάτω πλευράς της ονυχαίας πλάκας και σταδιακά επεκτείνεται προς την κοίτη και τη μήτρα. Κλινικά εκδηλώνεται με υπωνύχια υπερκεράτωση, βαθμιαία υπέγερση της ονυχαίας πλάκας με ονυχόλυση και 14

16 μεταβολή της φυσιολογικής χροιάς του νυχιού. Προσβάλλονται κυρίως τα νύχια των ποδιών ενώ συχνά συνυπάρχει με δερματοφυτία. (84) Εικόνα 2: Άπω-πλάγια μορφή με αίτιο το T. mentagrophytes (25) 2.ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΗ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΗ Ο παλαιότερος όρος, «λευκή επιφανειακή μυκητίαση», που χρησιμοποιούταν έχει εγκαταλειφθεί καθότι διαπιστώθηκε πως η αλλοίωση συνδυάζεται με ποικιλία δυσχρωμικών μεταβολών. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί το T. rubrum όσο και το Scytalidium dimidiatum που προκαλούν μαύρες αλλοιώσεις στο νύχι. (26) Ο τύπος αυτός είναι σχετικά σπάνιος (10% των περιπτώσεων ονυχομυκητίασης). (27) Ο μύκητας προσβάλλει μόνο την επιφανειακή στιβάδα της ονυχαίας πλάκας και μπορεί να εκδηλώνεται είτε με μικρές εγκάρσιες ραβδώσεις είτε με τη μορφή νησίδων που σταδιακά εξαπλώνονται και μπορεί να καταλάβουν όλη την επιφάνεια του νυχιού. Σπανιότερα, μπορεί να υπάρξει εισχώρηση του μύκητα στις βαθύτερες στιβάδες της (28, 29) ονυχαίας πλάκας και κυρίως ενοχοποιούνται μη-δερματοφυτικοί μύκητες. Εντοπίζεται κυρίως στα νύχια των ποδιών, συνοδεύεται συχνά με μυκητίαση των μεσοδακτύλιων πτυχών και πελμάτων και ως υπεύθυνοι αιτιολογικοί παράγοντες έχουν αναφερθεί το T. mentagrophytes var. interdigitale, τα είδη Acremonium, ο Aspergillus και η Onychocola canadensis. Διάφορα είδη Candida έχουν επίσης ενοχοποιηθεί με ταυτόχρονη προσβολή πολλών νυχιών στα χέρια και στα πόδια πρόωρων νεογνών προερχόμενα από μητέρες με καντιντιασική κολπίτιδα. (30, 31) Εικόνα 3: Επιφανειακή μορφή προερχόμενη από Fusarium sp. (25) 15

17 3.ΕΝΔΟΝΥΧΙΑ ONYXOMYKHTIAΣΗ Η μορφή αυτή έχει προστεθεί τα τελευταία χρόνια. Τα χαρακτηριστικά της είναι η απευθείας προσβολή της ονυχαίας πλάκας με απουσία φλεγμονής και αποικισμού της κοίτης, η έλλειψη υπωνύχιας υπερκεράτωσης, η πεταλοειδής διάσπαση του νυχιού και ο αποχρωματισμός της επιφάνειάς του (γαλακτώδεις νησίδες). Αρχικά, ως υπεύθυνο αίτιο ενοχοποιήθηκε το T. soudanense (32, 33) που κυρίως προκαλεί ενδοτριχική προσβολή του τριχωτού της κεφαλής χωρίς όμως να μπορεί να διασαφηνιστεί για ποιο λόγο ο συγκεκριμένος μύκητας ευθύνεται για τον τύπο αυτό ονυχομυκητίασης. Τελευταίως, έχουν αναφερθεί περιπτώσεις ενδονύχιας μυκητίασης οφειλόμενη σε T. rubrum και T. violaceum. Εικόνα 4: Ενδονύχια μορφή από T. soudanense (25) 4.ΕΓΓΥΣ ΥΠΩΝΥΧΙΑ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΗ Η συνήθης οδός προσβολής του νυχιού είναι μέσω της κεντρικής ονυχαίας πτυχής όπου ο μύκητας διατρυπά το νεοσχηματιζόμενο νύχι και επεκτείνεται περιφερικά. Η κλινική εικόνα περιλαμβάνει υπωνύχια υπερκεράτωση, κεντρική ονυχόλυση κι εμφάνιση λευκωπής κηλίδας κάτω από το μηνίσκο με τάση επέκτασης περιφερικά. Αποτελεί τον πιο σπάνιο τύπο στο γενικό πληθυσμό ενώ είναι αρκετά συχνός στους ασθενείς με AIDS αποτελώντας μάλιστα συχνά την πρώτη κλινική εκδήλωση της νόσου με ταυτόχρονη προσβολή πολλών νυχιών. (34) Προσβάλλονται τόσο τα πόδια όσο και τα χέρια με υπεροχή των πρώτων. Το T. rubrum αποτελεί το πιο συχνό αίτιο και ακολουθούν άλλα δερματόφυτα (T. megninii, T. tonsurans, T. schoenleinii) όπως και C. albicans, (35) Fusarium sp., Aspergillus sp. (36) Η μορφή αυτή είναι δύσκολη στην αντιμετώπιση, χρήζει συστηματικής αγωγής ενώ υποτροπιάζει συχνά. 16

18 Εικόνα 5: Εγγύς υπωνύχια μορφή οφειλόμενη σε T. rubrum (25) 5.ΜΙΚΤΟ ΜΟΝΤΕΛΟ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΗΣ Η μορφή αυτή είναι σχετικά σπάνια, παρατηρείται στον ίδιο ασθενή ακόμη και στο ίδιο προσβεβλημένο νύχι. Έχουν περιγραφεί πολλοί διαφορετικοί συνδυασμοί τύπων με πιο συχνό τη συνύπαρξη επιφανειακού με εγγύς υπωνύχιου και επιφανειακού με άπω-πλάγιου υπωνύχιου. (29, 37) Σχεδόν πάντα δεν επαρκεί η τοπική αγωγή και απαιτείται θεραπεία per os για την επιτυχή εκρίζωση της νόσου. 6.ΟΛΙΚΗ ΔΥΣΤΡΟΦΙΚΗ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΗ Αποτελεί το τελικό στάδιο όλων των άνωθεν τύπων κυρίως όμως της άπω-πλάγιας και της εγγύς υπωνύχιας μορφής. Χαρακτηρίζεται από τον πλήρη θρυμματισμό της ονυχαίας πλάκας, την πάχυνση της κοίτης και την κάλυψή της με υπολείμματα νυχιού. Συνήθως προσβάλλει μεμονωμένα νύχια ενώ συχνά συνυπάρχει με λευκά υπωνύχια δερματοφυτώματα που ανθίστανται στη συνήθη θεραπευτική αγωγή. (84) Εικόνα 6: Ολική δυστροφική μορφή από Candida albicans (25) 7.ΔΕΥΤΕΡΟΠΑΘΗΣ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΗ Οι μύκητες μπορεί να προσβάλλουν και δευτεροπαθώς την ονυχαία πλάκα και τους γύρω ιστούς, όπως για παράδειγμα στη ψωρίαση και την τραυματική ονυχία. Στις περιπτώσεις αυτές η εικόνα του νυχιού είναι συνήθως τυπική της παθήσεως. 17

19 Εικόνα 7: Οδοί προσβολής του νυχιού α=άπω και πλάγια υπωνύχιος μορφή β=ενδονύχιος τύπος γ=επιφανειακή μορφή δ=εγγύς υπωνύχια μορφή ε=ολική δυστροφία. (38) Πίνακας 3: Τύποι ονυχομυκητίασης και συχνότεροι υπεύθυνοι μύκητες (25) Άπω και πλάγια υπωνύχια Δερματόφυτα (T. rubrum, T. mentagrophytes, E. floccosum) ονυχομυκητίαση C. albicans Fusarium sp. Scytalidium sp. Scopulariopsis brevicaulis Επιφανειακή ονυχομυκητίαση Ενδονύχια ονυχομυκητίαση Εγγύς υπωνύχια ονυχομυκητίαση Μικτό μοντέλο ονυχομυκητίασης Επιφανειακή-Άπω-πλάγια υπωνύχια Επιφανειακή-Εγγύς υπωνύχια Εγγύς Άπω-πλάγια υπωνύχια Ολική δυστροφική ονυχομυκητίαση Παρωνυχία με ονυχομυκητίαση χωρίς ονυχομυκητίαση T. mentagrophytes, T. rubrum Fusarium sp., Acremonium sp. Scytalidium sp. T. soudanense T. violaceum T. rubrum, Fusarium sp. T. rubrum, Fusarium sp. T. rubrum, Fusarium sp. T. rubrum Δερματόφυτα C. albicans Scytalidium sp. Candida sp. Scytalidium sp. Candida sp. Fusarium sp. 18

20 ΑΙΤΙΑ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΗΣ 1. ΖΥΜΟΜΥΚΗΤΕΣ Ενώ αρχικά είχαν θεωρηθεί ως επιμολυντές, οι ζυμομύκητες αναγνωρίζονται πλέον ως βασική αιτία ονυχομυκητιάσεων. Θεωρούνται τα επικρατέστερα ανευρισκόμενα αίτια στις μυκητιάσεις των χεριών και συναντώνται συχνότερα σε άτομα με ελαττωμένη ανοσιακή απάντηση (μεταμοσχευμένοι, HIV(+), καρκινοπαθείς, ασθενείς με σύνδρομο DiGeorge, αγαμμασφαιριναιμία, κ.λ.π.). Οι γυναίκες πλήττονται τρεις φορές συχνότερα συγκριτικά με τους άντρες και ως πιθανές αιτίες έχουν ενοχοποιηθεί η συχνότερη διαβροχή των χεριών τους, η χρήση χημικών ουσιών για τις οικιακές εργασίες (31) καθώς και ο αυτοενοφθαλμισμός από την κολπική χλωρίδα. (10) ΑΙΤΙΑ: Η Candida albicans ενοχοποιείται για το 70% των περιπτώσεων (39) και ακολουθούν οι C. parapsilosis, C. guilliermondii και C. tropicalis. Πίνακας 4: Ζυμομύκητες που προκαλούν ονυχομυκητιάσεις (84) ΣΥΧΝΟΤΕΡΟΙ ΣΠΑΝΙΟΤΕΡΟΙ C. albicans C. krusei C. parapsilosis C. glabrata C. guilliermondii Geotrichum candidum C. tropicalis Trichosporon beigelii Εικόνα 8: Candida albicans ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ: Τα διάφορα είδη Candida έχουν αναπτύξει πολυάριθμους μηχανισμούς άμυνας έναντι του ξενιστή. Παράγουν εξωκυττάριες υδρολάσες (πρωτεϊνάσες, φωσφολιπάσες, λιπάσες) που διευκολύνουν τη διείσδυσή της στους ιστούς ενώ έχουν τη δυνατότητα τροποποίησης της έκφρασης αντιμικροβιακών πεπτιδίων που παράγονται από τα νύχια (β-ντεφενσίνες). Ειδικά η Candida albicans παράγει σωματίδια μελανίνης τόσο in vitro όσο και κατά την εισβολή της στους ιστούς που σκοπό έχουν την προστασία του μύκητα έναντι αντιμυκητιασικών φαρμάκων, αντιμικροβιακών πεπτιδίων και υπεριώδους ακτινοβολίας. 19

21 ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ-ΤΥΠΟΙ: Εκδηλώνεται με δυστροφία των ονυχαίων πτυχών, έντονη πάχυνση με παραμόρφωση και αλλαγή της χροιάς της ονυχαίας πλάκας ενώ συχνά εμφανίζεται και ως παρωνυχία με αποχρωματισμό του νυχιού. Διακρίνονται τρεις επιμέρους τύποι: η καντιντιακή παρωνυχία η ονυχόλυση του περιφερικού άκρου η ονυχία στα πλαίσια του συνδρόμου χρόνιας δερματοβλεννογόνιας καντιντίασης. (10) Καντιντιακή παρωνυχία: Είναι ο συνηθέστερος τύπος με κυριότερο αιτιολογικό παράγοντα την Candida albicans. (40) Χαρακτηρίζεται από αρχική προσβολή των μαλακών ιστών που εμφανίζονται φλεγμονώδεις και εξέρυθροι και ακολουθεί επέκταση στην ονυχαία πλάκα. Σε περίπτωση συμμετοχής και της ονυχαίας μήτρας κάνουν την εμφάνισή τους εγκάρσιες αύλακες (Beau s lines). Εικόνα 9: καντιντιακή παρωνυχία (31) Ονυχόλυση του περιφερικού άκρου: Στο αρχικό στάδιο παρατηρείται περιφερική υπωνύχια υπερκεράτωση που μετέπειτα οδηγεί σε υπέγερση και αποκόλληση της ονυχαίας πλάκας που αποκτά λευκο-κίτρινη χροιά. Ονυχία στα πλαίσια του συνδρόμου χρόνιας δερματοβλεννογόνιας καντιντίασης: Είναι σχετικά σπάνιος τύπος και εμφανίζεται συνήθως στα παιδιά. Ο μύκητας προσβάλλει την ονυχαία πλάκα σε όλο το πάχος της με συνέπεια να καθίσταται εύθρυπτη. Σε πιο προχωρημένες μορφές της νόσου συνυπάρχει οίδημα των πτυχών και τα δάχτυλα αποκτούν μορφή πλήκτρο τυμπάνου. (10) 20

22 2. ΔΕΡΜΑΤΟΦΥΤΑ Ο όρος δερματοφυτίαση χρησιμοποιείται για να περιγράψει τη λοίμωξη που προκαλείται από τα τρία γένη των δερματοφύτων: Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton. Ενοχοποιούνται για πάνω από 90% των περιπτώσεων ονυχομυκητίασης στα πόδια και για τουλάχιστον 50% των λοιμώξεων στα χέρια. Τα δερματόφυτα αποτελούν μια ομάδα κερατινόφιλων και κερατινολυτικών μυκήτων που εμφανίστηκαν αρχικά ως σαπρόφυτα του εδάφους, σταδιακά απέκτησαν την ικανότητα αποδόμησης κερατινοειδών υπολειμμάτων ζωϊκών οργανισμών και κατόπιν της κεράτινης στιβάδας ζώων και ανθρώπων. Ανάλογα με το φυσικό τους περιβάλλον και την προτίμηση που εμφανίζουν ως προς τον ξενιστή, διακρίνονται σε γεώφιλα, ζωόφιλα και ανθρωπόφιλα. Τα γεώφιλα είδη αποτελούν κατά κύριο λόγο σαπρόφυτα του εδάφους. Στη μεγάλη τους πλειοψηφία δεν είναι παθογόνα. Μικρός αριθμός τους μπορεί να προκαλέσει εκδηλώσεις στον άνθρωπο μέσω επαφής με το έδαφος που βρίθει σπορίων του μύκητα. Τα ζωόφιλα είδη παρασιτούν κυρίως στα ζώα, δείχνουν ιδιαίτερη προτίμηση σε συγκεκριμένα είδη και η νόσος στον άνθρωπο προκαλείται συνήθως μέσω επαφής με το μολυσμένο ζώο. Το M. canis είναι το πιο συχνό αίτιο με πηγή κυρίως τις γάτες και τους σκύλους. Ακολουθούν το T. verrucosum, T. mentagrophytes var. mentagrophytes και T. erinacei που εντοπίζονται στα αιγοπρόβατα, χοίρους, κουνέλια και σκαντζόχοιρους αντίστοιχα. Τέλος, τα ανθρωπόφιλα είδη παρασιτούν κυρίως στον άνθρωπο και σπανίως στα ζώα. Κύρια πηγή μόλυνσης είναι οι πάσχοντες και οι φορείς του μύκητα ενώ η μετάδοση γίνεται κυρίως έμμεσα μέσω τριχών, λεπιών και μολυσμένων αντικειμένων και σπανιότερα από άμεση επαφή με το νοσούντα. Το κύριο μέσον μετάδοσης της νόσου είναι τα αρθροκονίδια του μύκητα που επιβιώνουν στο περιβάλλον για μεγάλο διάστημα καθιστώντας δύσκολη την εντόπιση της πηγής της μόλυνσης. Συχνά, η μετάδοση γίνεται στο οικογενειακό περιβάλλον και σε χώρους συνωστισμού. Έχουν αναφερθεί επιδημίες σε σχολεία, στρατώνες και παιδικούς σταθμούς. 21

23 ΛΟΙΜΩΞΗ: Η λοίμωξη γίνεται συνήθως έμμεσα μετά από επαφή του πέλματος με μολυσμένες επιφάνειες, διευκολύνεται δε με την παρουσία υγρασίας και στενών παπουτσιών. Συνήθως προηγείται δερματοφυτία των πελμάτων ή των μεσοδακτύλιων πτυχών και ακολουθεί επέκταση στα νύχια. Αρχικά προσβάλλονται τα νύχια των ποδιών, ιδίως το 1 ο και 5 ο δάχτυλο, και μετά δευτεροπαθώς τα νύχια των χεριών. ΠΡΟΔΙΑΘΕΣΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ: Σημαντικοί παράγοντες κινδύνου για εκδήλωση νόσου από δερματόφυτα είναι οι γενικοί παράγοντες που ισχύουν για τις ονυχομυκητιάσεις, αλλά ειδικά για το T. rubrum αποδείχθηκε και η ύπαρξη ενός μηχανισμού προδιαθεσικής κληρονομικότητας με αυτοσωματικό επικρατούντα χαρακτήρα. (14) ΠΑΘΟΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ: Για την εκδήλωση της νόσου δεν αρκεί μόνο η παρουσία προδιαθεσικών παραγόντων από μέρους του ξενιστή αλλά απαιτείται και η ύπαρξη παραγόντων μολυσματικότητας από μέρους των μυκήτων. Το αρχικό στάδιο της λοίμωξης περιλαμβάνει την προσκόλληση του δερματόφυτου στην επιφάνεια των κερατινοκυττάρων (41) μέσω γλυκοπρωτεϊνών που υπάρχουν στο κυτταρικό του τοίχωμα. Τα αρθροκονίδια του μύκητα παράγουν υφές ικανές να διεισδύσουν στα βαθύτερα στρώματα του ιστού. Ο μύκητας με τη βοήθεια ενζύμων που εκκρίνει (κερατινάση, διοξυγενάση κυστεΐνης και νουκλεάση) αποδομεί την κεράτινη στοιβάδα και χρησιμοποιεί τις αποδομούμενες ουσίες για την περαιτέρω ανάπτυξή του. ΑΙΤΙΑ: Όλα τα είδη των δερματοφύτων μπορεί να προσβάλλουν τα νύχια με επικρατέστερο το T. rubrum και ακολούθως τα T. mentagrophytes var. intedigitale και E. floccosum. Πίνακας 5: Αιτιολογικοί παράγοντες των δερματοφυτιών των ονύχων (84) ΣΥΧΝΟΤΕΡΟΙ ΣΠΑΝΙΟΤΕΡΟΙ T. rubrum E. floccosum T. mentagrophytes var. interdigitale T. violaceum T. tonsurans T. megninii T. mentagrophytes var. mentagrophytes M. gypseum T. soudanense T. equinum M. canis T. schoenleinii 22

24 To T. rubrum θεωρείται πως έχει μεγάλη προσαρμοστικότητα και λοιμογόνο δύναμη και επεκτείνεται βαθμιαία και σε άλλα σημεία του σώματος, στις παλάμες και στα νύχια των χεριών. Το T. mentagrophytes var. intedigitale συνήθως περιορίζεται στα νύχια των ποδιών και τα πέλματα ενώ σπάνια επεκτείνεται στα νύχια των χεριών. Τέλος, το E. floccosum εμφανίζει μικρή ικανότητα διείσδυσης στην κεράτινη στοιβάδα των νυχιών και σπανίως απομονώνεται. Ονυχομυκητιάσεις από γεώφιλα και ζωόφιλα είδη όπως το T. erinacei, T. equinum, M. gypseum, M. canis είναι σχετικά πιο σπάνιες και συνδυάζονται με μυκητιάσεις των άκρων και του κορμού. Ανθρωπόφιλα είδη όπως το T. tonsurans, T. violaceum, T. soudanense που προκαλούν ενδοτριχική προσβολή του τριχωτού της κεφαλής, ευθύνονται για ονυχομυκητιάσεις των χεριών δια αυτοενοφθαλμισμού. 3. ΜΗ-ΔΕΡΜΑΤΟΦΥΤΙΚΟΙ ΝΗΜΑΤΟΕΙΔΕΙΣ ΜΥΚΗΤΕΣ (NDM-nondermatophyte moulds) Πρόκειται για μια μεγάλη ετερογενή ομάδα νηματοειδών ευκαιριακά παθογόνων μυκήτων που ανευρίσκονται συνήθως ως σαπρόφυτα του εδάφους και παθογόνα των φυτών. Ενοχοποιούνται για το 2-12 % των περιπτώσεων ονυχομυκητίασης. Είναι μηκερατινόφιλοι και πρέπει να προηγηθεί καταστροφή της κεράτινης στοιβάδας του νυχιού από κάποιο δερματοφυτικό μύκητα ή τοπικό τραυματισμό και άλλη πάθηση του όνυχα για να μπορέσουν να εισβάλλουν και να προκαλέσουν βλάβη. Για το λόγο αυτό θεωρούνται δευτερεύοντες εισβολείς. (42) ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ: Τα συχνότερα αίτια NDM που προκαλούν ονυχομυκητιάσεις παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα: Πίνακας 6: Μη-δερματοφυτικοί μύκητες που προκαλούν ονυχομυκητιάσεις (84) ΣΥΧΝΟΤΕΡΟΙ ΣΠΑΝΙΟΤΕΡΟΙ Scopulariopsis brevicaulis Aspergillus sp. Acremonium sp. Fusarium sp. Scytalidium sp. Onychocola canadensis Alternaria sp. Paecilomyces sp. Cladosporium sp. Chaetomium sp. Curvularia sp. 23

25 ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ: Τα είδη Fusarium και Aspergillus προσβάλλουν τα νύχια με τη μορφή της υπωνύχιας μυκητίασης (εγγύς και άπω-πλάγιας μορφής) και συνήθως συνοδεύονται με φλεγμονή της εγγύς ονυχαίας πτυχής. Τα είδη Aspergillus terreus, Aspergillus candidus και Acremonium προσβάλλουν το νύχι με τη μορφή της επιφανειακής μυκητίασης και είτε σχηματίζουν νησίδια στην επιφάνειά του είτε διαχέονται σε όλο το πάχος της ονυχαίας πλάκας δίνοντάς του διάχυτη γαλακτόχροα-κιτρινωπή απόχρωση. Εικόνα 10: Λευκή επιφανειακή μυκητίαση από Aspergillus sp. (43) Τα είδη Scytalidium, Alternaria και Cladosporium προκαλούν υπέρχρωση κατά τόπους της ονυχαίας πλάκας (μελανωνυχία) ως αποτέλεσμα της παραγωγής μέλαινας χρωστικής από τον μύκητα. Εικόνα 11: Μελανωνυχία από Aspergillus sp. (43) Τέλος, ο μύκητας Scopulariopsis brevicaulis προσβάλλει κυρίως το νύχι του μεγάλου δαχτύλου του ποδός με τη μορφή της άπω πλάγιας υπωνύχιας μυκητίασης, εμφανίζει μικρή υπερκεράτωση και απόχρωση κίτρινο-καφέ. (84) Εικόνα 12: Άπω-πλάγια ονυχομυκητίαση από Scopulariopsis brevicaulis (43) 24

26 Πίνακας 7: Χαρακτηριστικά των NDM που προκαλούν ονυχομυκητιάσεις (84) ΕΙΔΗ ΜΥΚΗΤΩΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ Scopulariopsis brevicaulis ΑΚΠΥΟ-κίτρινο καφέ απόχρωση Acremonium sp. ΕΟ με επιφανειακά γαλακτόχροα νησίδια Fusarium sp. Όλες οι κλινικές μορφές με συνοδό παρωνυχία Aspergillus niger Όλες οι κλινικές μορφές με γαλακτόχροες και μαύρες περιοχές Aspergillus fumigatus, A. terreus, A. glaucus Όλες οι κλινικές μορφές με κίτρινο-καφέ απόχρωση Aspergillus candidus ΕΟ με παρωνυχία, ταχεία εξέλιξη Scytalidium dimidiatum ΑΚΠΥΟ με παρωνυχία και μαύρη απόχρωση Scytalidium hyalinum ΑΚΠΥΟ με παρωνυχία και λευκή απόχρωση Onychocola canadensis ΑΚΠΥΟ ή ΕΟ ΕΟ= Επιφανειακή ονυχομυκητίαση ΑΚΠΥΟ= Άπω και περιφερική υπωνύχια ονυχομυκητίαση ΔΙΑΓΝΩΣΗ: Τα κριτήρια γενικά για τη διάγνωση και το χαρακτηρισμό ενός μηδερματοφυτικού νηματοειδούς μύκητα ως υπεύθυνου αιτιολογικού παράγοντα για την ονυχομυκητίαση και τη διάκρισή του από σαπρόφυτο- επιμολυντή είναι τα παρακάτω: Όταν απομονώνεται δερματόφυτο, θεωρείται πάντα ως το παθογόνο αίτιο της ονυχομυκητίασης. Η διάγνωση των ζυμομυκήτων και των μη-δερματοφυτικών νηματοειδών μυκήτων ως αίτια, γίνεται όταν βρεθούν στην άμεση μικροσκόπηση του κλινικού δείγματος στοιχεία μυκήτων (αρθροσπόρια, υφές, κονίδια). Για τη διάγνωση μη-δερματοφυτικού νηματοειδούς μύκητα απαιτείται να απομονωθεί ο ίδιος μύκητας σε τουλάχιστον 5 από τις 20 αποικίες. (42) Επειδή οι συγκεκριμένοι μύκητες είναι πολύ συχνά επιμολυντές των εργαστηρίων, για τη διάγνωσή τους ως υπεύθυνα αίτια για την ονυχομυκητίαση χρησιμοποιούνται 7 κριτήρια στη διεθνή βιβλιογραφία. Από αυτά απαιτείται να συνυπάρχουν τουλάχιστον 3 ( τα 3 πρώτα) για να αυξηθεί η πιθανότητα σωστής διάγνωσης. (44) 1) Η ύπαρξη θετικής άμεσης μικροσκόπησης. 2) Η ύπαρξη θετικής καλλιέργειας. Απαιτείται προσοχή στην επιλογή των υλικών καθότι κάποια από τα αντιβιοτικά που περιέχονται στα θρεπτικά υλικά μπορεί να αναστείλουν την ανάπτυξη των NDM. 3) Ο αποκλεισμός δερματοφύτου ως αίτιο της ονυχομυκητίασης. Σύμφωνα με τα κριτήρια των Walshe και English, προκειμένου να θεωρηθεί ένα NDM ως αίτιο 25

27 μυκητίασης, απαιτείται η απουσία δερματόφυτου από τις καλλιέργειες των ονύχων. (45) 4) Επαναλαμβανόμενη δειγματοληψία και απομόνωση του ίδιου μύκητα. Απαιτείται απομόνωση του ίδιου μη-δερματοφυτικού μύκητα σε τουλάχιστον 2 καλλιέργειες του όνυχα. 5) Καταμέτρηση αποικιών. Απαιτείται απομόνωση του ίδιου μύκητα σε πάνω από 5 αποικίες. 6) Ιστοπαθολογικές τεχνικές. 7) Μοριακές μέθοδοι. ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΟΝΥΧΟΜΥΚΗΤΙΑΣΗΣ Τα κριτήρια για τη διάγνωση της ονυχομυκητίασης περιλαμβάνουν τόσο εργαστηριακά όσο και κλινικά χαρακτηριστικά. Η απομόνωση ενός μύκητα από την καλλιέργεια του δείγματος δεν επαρκεί για να επιβεβαιώσει τη νόσο όπως και το αντίθετο. Ένα παθολογικό νύχι χωρίς την απομόνωση μύκητα δεν μας επιτρέπει τη διάγνωση της ονυχομυκητίασης. Η έγκυρη διάγνωση απαιτεί συνδυασμό θετικής εργαστηριακής μεθόδου και κλινικής εικόνας συμβατής με τη νόσο. (46) 1. ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΝΥΧΙΩΝ Στις ονυχομυκητιάσεις απαιτούνται τεχνικές λήψης δείγματος του όνυχα που διαφοροποιούνται ανάλογα με τη μορφή της νόσου. Σε γενικές γραμμές, χρειάζεται να πραγματοποιείται από έμπειρο λήπτη με προσοχή, ώστε να διασφαλιστεί ότι θα ληφθεί επαρκής ποσότητα δείγματος και θα περιέχει όσο το δυνατόν μεγαλύτερη ποσότητα του υπεύθυνου μύκητα. Στην επιφανειακή μορφή, συλλέγονται ξύσματα από την επιφάνεια της ονυχαίας πλάκας με τη βοήθεια ξέστρου ή κοχλία από τις δυσχρωμικές αλλοιώσεις. Στην ενδονύχια μορφή, όπου στοιχεία του υπεύθυνου μύκητα υπάρχουν σε όλο το πάχος της ονυχαίας πλάκας, αποκόπτεται ένα τμήμα του προσβεβλημένου νυχιού. Στην εγγύς υπωνύχια συλλέγονται ξύσματα από την κατώτερη και ενδιάμεση στιβάδα της ονυχαίας πλάκας στην περιοχή της βλάβης που εδράζεται πλησίον του μηνίσκου. Η 26

28 λήψη απαιτεί τοπική αναισθησία και ειδική τεχνογνωσία για αποφυγή διάτρησης και αιμορραγίας του νυχιού και γίνεται με οδοντιατρική φρέζα ή με ειδικό μαχαιρίδιο βιοψίας. Στην ολική δυστροφική παίρνουμε τρίμματα από διάφορα σημεία της ονυχαίας κοίτης καθώς η ονυχαία πλάκα είναι πλήρως κατεστραμμένη. Τέλος, στην άπω και πλάγια υπωνύχια μορφή λαμβάνουμε τμήματα ή τρίμματα της κοίτης με ξέστρο από τα όρια μεταξύ υγιούς και κατεστραμμένου νυχιού καθώς εκεί αναμένουμε μεγαλύτερη συγκέντρωση των πιο ενεργών μορφών του μύκητα. Αποφεύγουμε τη λήψη από την επιφάνεια της ονυχαίας πλάκας καθώς και από τα πλάγια και το ελεύθερο άκρο του νυχιού γιατί λόγω μικρής αγγείωσης της περιοχής, εκεί ανευρίσκονται μη ενεργά στοιχεία του μύκητα αλλά και άφθονοι επιμολυντές. (84) Όσον αφορά τις τεχνικές λήψης νυχιών, έχουν περιγραφεί αρκετές με επικρατέστερες την απόξεση με εφαρμογή ξέστρου υπωνύχια και την διάτρηση με τρυπανισμό, είτε οριζόντια υπωνύχια είτε διανύχια. Και με τις τρεις τεχνικές η ευαισθησία των καλλιεργειών βελτιώνεται όσο πιο κοντά στην περιοχή της βλάβης γίνεται η λήψη, με τις τεχνικές διάτρησης να δίνουν καλύτερα αποτελέσματα επιτρέποντας τη λήψη περισσότερου υλικού πιο γρήγορα και ανώδυνα. Η διανύχιος διάτρηση οδηγεί σε ακόμα καλύτερα αποτελέσματα καθώς λαμβάνουμε το δείγμα σε μορφή σκόνης που είναι πιο εύκολη στον χειρισμό και την καλλιέργεια. (47) (α) (β) (γ) Εικόνα 13: Τεχνικές λήψης νυχιού: α=υπωνύχια διάτρηση, β=διανύχια διάτρηση (47) γ=απόξεση με ειδικό ξέστρο (48) 27

29 2. ΑΜΕΣΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Η άμεση μικροσκοπική εξέταση των κλινικών δειγμάτων αποτελεί την πιο εύκολη και γρήγορη μέθοδο επιβεβαίωσης της ύπαρξης στοιχείων μυκήτων στα νύχια. Η ευαισθησία και ειδικότητά της εξαρτάται από την ποιότητα του δείγματος (αριθμός μυκήτων και συγκέντρωσή τους στο δείγμα), την εμπειρία του εξεταστή και το είδος του μύκητα. Η ανεύρεση στοιχείων μυκήτων αποτελεί ένδειξη ύπαρξης ονυχομυκητίασης και επιτρέπει στον κλινικό ιατρό την άμεση έναρξη θεραπευτικής αγωγής ενώ το αρνητικό αποτέλεσμα δεν αποκλείει τη νόσο. Διαγνωστικά σφάλματα (ψευδώς αρνητικά και θετικά) παρατηρούνται συχνά σε 5-15 % των περιπτώσεων και εξαρτώνται τόσο από την αντιπροσωπευτικότητα του δείγματος όσο και από τον εξεταστή. (49) Βασική παράμετρος για την μικροσκόπηση του δείγματος είναι η κατάλληλη προετοιμασία του με διαυγαστικά διαλύματα. Συνήθως χρησιμοποιείται διάλυμα KOH ή NaOH πυκνότητας 10-30% που πέπτει την κερατίνη. Το παρασκεύασμα αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου μέχρις ότου διαυγάσει και η όλη διαδικασία επιταχύνεται με ήπια θέρμανση. Σε συνδυασμό με το KOH μπορεί να χρησιμοποιηθεί και το DMSO (διμεθυλοσουλφοξείδιο) που ενισχύει την κερατινολυτική του δράση και αυξάνει την ευαισθησία της μεθόδου. (27) Για την αύξηση της αντιθέσεως μεταξύ των στοιχείων του μύκητα και των επιθηλιακών κυττάρων χρησιμοποιούνται σειρά χρωστικών ενώσεων: Calcofluor White: Αποτελεί μια φθορίζουσα χρωστική που προσκολλάται στην κυτταρίνη και τη χιτίνη του κυτταρικού τοιχώματος. Τα στοιχεία του μύκητα απεικονίζονται πράσινα ή λευκά ανάλογα με τα φίλτρα του μικροσκοπίου. Η μέθοδος υπερτερεί έναντι της απλής μικροσκόπησης με KOH καθότι αυξάνει την ευαισθησία από 72% σε 88% αλλά μειονεκτεί στο ότι απαιτείται μικροσκόπιο φθορισμού και από το γεγονός πως η χρωστική απορροφάται και από άλλα στοιχεία του παρασκευάσματος (ίνες βαμβακιού). Chlorazol black E (CBE): Χρωματίζει μόνο τις δομές του μύκητα οι οποίες εμφανίζονται κυανόμαυρες και έτσι αποκλείονται πολλά ψευδώς προσομοιάζοντα στοιχεία (artifacts). Είναι πιο χρήσιμο για τους νηματοειδείς μύκητες σε σχέση με τους ζυμομύκητες. (50) 28

30 Congo red: Δεσμεύεται στους πολυσακχαρίτες του κυτταρικού τοιχώματος και συγκεκριμένα στην β-d-γλυκάνη και επιτρέπει την ανίχνευση στοιχείων του μύκητα. Quink Parker: Χρησιμεύει κυρίως για την διάκριση στοιχείων των μυκήτων Malassezia, Scopulariopsis brevicaulis και Trichosporon τα οποία προσλαμβάνουν άμεσα τη χρωστική και βάφονται με βαθύ μπλε χρώμα ενώ αντίθετα δεν ενδείκνυται γενικά για τα δερματόφυτα και την Candida που απαιτούν μεγάλο χρόνο για να χρωστούν και βάφονται αμυδρά. Μειονέκτημα της μεθόδου είναι η πρόσληψη της χρωστικής και από άλλα στοιχεία του παρασκευάσματος. (84) Κυανό γαλακτοφαινόλης: Η χρώση διευκολύνεται με ήπια θέρμανση του παρασκευάσματος και αυξάνει την ευαισθησία της μικροσκόπησης αν και είναι μη ειδική καθώς προσλαμβάνεται και από άλλα στοιχεία (artifacts) που μπορεί να προσομοιάζουν με στοιχεία μυκήτων. Χρώση Gram: Οι μύκητες εμφανίζονται συνήθως ως Gram θετικοί με σημαντικές όμως διαφοροποιήσεις. Για το λόγο αυτό θα πρέπει να χρησιμοποιούνται άλλες πιο ειδικές χρώσεις. 3. ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Αποτελεί συμπληρωματική εξέταση στη διάγνωση των ονυχομυκητιάσεων σε περιπτώσεις ισχυρής κλινικής υποψίας που δεν μπορούν όμως να επιβεβαιωθούν με τις συνήθεις μυκητολογικές εξετάσεις. Οι ευρύτερα χρησιμοποιούμενες χρώσεις είναι το περιοδικό οξύ-schiff (PAS) και το αργυρό της μεθεναμίνης κατά Grocott s (GMS). (51) Η χρώση ΡΑS χρωματίζει τα στοιχεία των μυκήτων ερυθρά ενώ η GMS, που αποδεικνύεται ανώτερη της πρώτης λόγω της ισχυρότερης χρωματικής αντίθεσης, τα χρωματίζει μαύρα. Η ιστολογική εξέταση είναι χρήσιμη στη διάκριση των ζυμομυκήτων από τα δερματόφυτα και τους μη-δερματοφυτικούς μύκητες και επιτρέπει την παρατήρηση των υφών και των σπορίων με μεγάλη λεπτομέρεια. Παράλληλα δίνει πληροφορίες για την εισχώρηση του μύκητα στην ονυχαία πλάκα ενώ μειονεκτεί στην αξιολόγηση της βιωσιμότητας των μυκήτων και είναι χρονοβόρα διαδικασία. 29

31 4. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ Αποτελεί την κύρια μέθοδο για τη διάγνωση των ονυχομυκητιάσεων και θεωρείται η πρότυπη μέθοδος με την οποία συγκρίνονται όλες οι άλλες εργαστηριακές τεχνικές. ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ: Τα κλινικά δείγματα καλλιεργούνται συνήθως σε δύο διαφορετικές κατηγορίες θρεπτικών υλικών: 1) μη εκλεκτικά, όπως το Sabouraud dextrose agar (SDA) το οποίο επιτρέπει την ανάπτυξη όλων των μυκήτων 2) εκλεκτικά τα οποία είναι εμπλουτισμένα είτε με προσθήκη αντιβιοτικών (χλωραμφενικόλη συνήθως 0,05 gr/l, γενταμυκίνη, στρεπτομυκίνη) που αποτρέπουν την ανάπτυξη βακτηρίων είτε με κυκλοεξαμίδη-ακτιδιόνη (0,4 gr/l) που εμποδίζει την ανάπτυξη και σαπροφυτικών μυκήτων. Επιπρόσθετα, μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλα θρεπτικά υλικά όπως το PDA (potato dextrose agar) που περιέχει άγαρ πατάτας, το ΜΕΑ (malt extract agar) άγαρ με εκχύλισμα βύνης και το CZA (czapek dox agar) τα οποία ευνοούν τη σπορογονία των νηματοειδών μυκήτων. Χρήσιμο για την ταυτοποίηση των ζυμομυκήτων είναι και το CHROMagar στο οποίο τα διάφορα είδη Candida μετά από επώαση 48 ωρών εμφανίζονται με διαφορετικό χρώμα (έντονο πράσινο για τη C. albicans, μεταλλικό κυανό για τη C. tropicalis και ανοιχτό ρόδινο για τη C. krusei). Τέλος, υπάρχει το DTM (Dermatophyte test medium agar) που περιέχει δείκτη ερυθρού της φαινόλης. Τα δερματόφυτα χρησιμοποιούν αζωτούχες ενώσεις για το μεταβολισμό τους και παράγουν αλκαλικά προϊόντα που αυξάνουν το ph και αλλάζουν το χρώμα του υλικού από κίτρινο σε ερυθρό. Εντούτοις, πολλοί μη-παθογόνοι μύκητες δίνουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα εάν η επώαση παραταθεί για μεγάλο διάστημα ενώ και πολλά είδη δερματοφύτων (Microsporum sp.) μπορεί να δώσουν ψευδώς αρνητικά. (50) ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΕΠΩΑΣΗΣ: Τα δείγματα συνήθως επωάζονται σε θερμοκρασίες βαθμούς Κελσίου για διάστημα 2-3 εβδομάδων. Οι ζυμομύκητες και τα NDM αναπτύσσονται ταχύτερα, ενώ τα δερματόφυτα χρειάζονται έως και 25 ημέρες για την πλήρη ανάπτυξη των μορφολογικών χαρακτηριστικών τους. Η ανάγνωση των καλλιεργειών θα πρέπει να πραγματοποιείται τακτικά ανά 2-3 ημέρες για παρακολούθηση της πορείας και την έγκυρη ανίχνευση ανάπτυξης βακτηρίων και σαπροφύτων. 30

32 Πίνακας 8: Απαιτούμενος χρόνος για διάγνωση ονυχομυκητιάσεων (84) ΜΥΚΗΤΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ Δερματόφυτα 5-25 ημέρες 1-20 ημέρες Ζυμομύκητες 2-10 ημέρες 2-8 ημέρες Μη-δερματόφυτα 5-15 ημέρες 1-20 ημέρες ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ : Η τελική ταυτοποίηση του υπεύθυνου για τη λοίμωξη μύκητα πραγματοποιείται από τη μακροσκοπική και μικροσκοπική μορφολογία των αποικιών και με τη χρήση ειδικών αλγόριθμων για κάθε είδος. Χρήσιμες είναι και ορισμένες βιοχημικές δοκιμασίες όπως εκείνη της παραγωγής ουρεάσης για τη διάκριση ειδών δερματοφύτων, η δοκιμασία ανάπτυξης σε αποστειρωμένους κόκκους ρυζιού, η δοκιμασία διάτρησης της τρίχας, η ανάπτυξη σε θρεπτικά υλικά εμπλουτισμένα με βιταμίνες και αμινοξέα, η δοκιμασία θερμοευαισθησίας και η δοκιμασία βλαστικού σωλήνα για τους ζυμομύκητες (95% θετική δοκιμασία για C.albicans μετά επώαση 2-3 ωρών στους 37 βαθμούς Κελσίου). Ενώ η σημαντικότητα των καλλιεργητικών μεθόδων στη διάγνωση της ονυχομυκητίασης παραμένει αδιαμφισβήτητη, παρουσιάζει εντούτοις αρκετά μειονεκτήματα: χαμηλή ευαισθησία σχετιζόμενη με τον υψηλό αριθμό ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων, μεγάλη χρονοκαθυστέρηση ως την τελική ταυτοποποίηση, απαίτηση εξειδικευμένου προσωπικού με μεγάλη εμπειρία και μεγάλο αριθμό ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων λόγω πιθανών σαπρόφυτων των νυχιών και των καλλιεργειών. Όλα αυτά οδηγούν συχνά τους κλινικούς ιατρούς σε άμεση έναρξη θεραπείας χωρίς την αναμονή των αποτελεσμάτων των καλλιεργειών και κατ επέκτασην τους ασθενείς σε μακροχρόνιες θεραπείες που πιθανόν δεν χρειαζόταν σε πολλές περιπτώσεις. (52) Πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε πως εξαιτίας των παραπάνω μόνο το 3,4 % των γενικών ιατρών και το 39,6 % των δερματολόγων ζητούν εξέταση για μύκητες σε ασθενείς με κλινική υποψία ονυχομυκητίασης. (53) 5. ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ Η κυτταρομετρία ροής στηρίζεται στην κοκκίωση και το μέγεθος των κυττάρων καθώς και σε δείκτες πρωτεϊνών και DNA για την διάκριση των μυκήτων. (54) 31

33 Επιβεβαιώνει τη διείσδυση του μύκητα στην ονυχαία πλάκα και διαγιγνώσκει το είδος αλλά απαιτεί μεγάλη ποσότητα γενετικού υλικού, είναι πολύ δαπανηρή εξέταση και πολύ εξειδικευμένη. (55) 6. PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) Η PCR είναι μια διαδικασία in vitro ενίσχυσης του γενετικού υλικού που μας ενδιαφέρει. Πρόκειται για μια γρήγορη, ευαίσθητη και ειδική μέθοδο στη διάγνωση των ονυχομυκητιάσεων που όμως κοστίζει αρκετά και στερείται της ικανότητας διάκρισης ανάμεσα στο παθογόνο μύκητα που ευθύνεται για τη λοίμωξη και ενός σαπρόφυτου που απλά αποικίζει την ονυχαία πλάκα. Μπορεί να συνδυαστεί με RFLP (restriction fragment length polymorphism), με αλληλούχιση των προϊόντων της (sequencing) και με ανοσοενζυμική μέθοδο (ELISA) αυξάνοντας ακόμα περισσότερο την ακρίβεια της μεθόδου. Παραδοσιακά, το ριβοσωμιακό DNA και ιδίως οι υποομάδες του, 18S, 5,8S και 28S αποτελούν διαδεδομένους γονιδιακούς στόχους ενίσχυσης. Ο μεγάλος αριθμός των αντιγράφων rdna στο γονιδίωμα των μυκήτων παρέχει μεγάλη ευαισθησία στην εφαρμογή μεθόδων που στοχεύουν στις συγκεκριμένες θέσεις. Αποτελούν επομένως ιδανικό στόχο για σχεδίαση ειδικών εκκινητών, τόσο για το γένος ή ακόμη και το είδος του μύκητα. Υπάρχουν επίσης πολυάριθμα δεδομένα για τους συγκεκριμένους στόχους που διευκολύνουν τη σωστή αξιολόγηση των ευρημάτων. Εικόνα 14: Η μυκητιακή rdna περιοχή (56) Αρκετά συχνά χρησιμοποιούνται και οι ITS1 και ITS2 (internal transcribed spacer) περιοχές που παρεμβάλλονται ανάμεσα στις 18S και 5,8S η πρώτη και 5,8S και 28S η δεύτερη. Λόγω της μεγάλης μεταβλητότητας και ποικιλομορφίας που παρουσιάζουν χρησιμοποιούνται ευρέως για τη διάκριση σε επίπεδο είδους και 32

34 στελέχους. (52) Άλλοι γονιδιακοί τόποι στόχοι αποτελούν τα γονίδια για την τοποϊσομεράση που είναι όμως λιγότερο ευαίσθητα από το ριβοσωμιακό DNA και τα γονίδια για τη σύνθεση της χιτίνης, ενός ενζύμου που εμπλέκεται στην κατασκευή της χιτίνης του κυτταρικού τοιχώματος των μυκήτων. 7. ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΜΑΖΑΣ (MALDI-TOF MS) Η τεχνική αυτή στηρίζεται στην ανάλυση του μοριακού βάρους των πρωτεϊνικών κλασμάτων ενός μικροοργανισμού για την αναγνώρισή του. Οι πρωτεΐνες τοποθετούνται στη μήτρα (κρύσταλλοι UV ακτινοβολίας), ακτίνες laser ιονίζουν τα μόρια της μήτρας και σχηματίζονται κατιόντα που εντοπίζονται από τον ανιχνευτή. Τα μικρότερα σε μέγεθος κατιόντα ανιχνεύονται ταχύτερα συγκριτικά με τα μεγαλύτερα. Από το χρόνο ανίχνευσης σχηματίζεται ένα ξεχωριστό φάσμα για κάθε μικροοργανισμό που συγκρίνεται με τις υπάρχουσες βάσεις δεδομένων κι έτσι πραγματοποιείται η ταυτοποίηση. (11) Η τεχνολογία MALDI-TOF μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν επιβοηθητική μέθοδος για να επιβεβαιώσει το αποτέλεσμα των καλλιεργειών, ειδικά όταν απαιτείται ακριβής καθορισμός της ταυτοποίησης. Πλεονεκτήματα αποτελούν η ταχύτητα (αποτελέσματα εντός 24ώρου), η μη απαίτηση ιδιαίτερης εμπειρίας και εξειδίκευσης, η απλότητα στη διαδικασία προετοιμασίας του όνυχα (38) και η δυνατότητα διάκρισης μεταξύ ονυχομυκητίασης και άλλων παθήσεων των ονύχων. (57) Πίνακας 9: Σύγκριση διαγνωστικών τεχνικών (55) ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΔΙΕΙΣΔΥΣΗΣ ΣΤΗΝ ΟΝΥΧΑΙΑ ΠΛΑΚΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΒΙΩΣΙΜΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ ΜΕ ΚΟΗ - - +/- ΙΣΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑ + - +/- PCR ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΕΙΔΟΥΣ 33

35 Σχήμα 1: Αλγόριθμος γενικής προσέγγισης της εργαστηριακής διάγνωσης ονυχομυκητιάσεων (84) ΘΕΡΑΠΕΙΑ Πριν την έναρξη της θεραπείας για την ονυχομυκητίαση πρέπει να ληφθούν σοβαρά υπόψιν οι εξής παράμετροι: το υπεύθυνο αίτιο, η ευαισθησία του στα αντιμυκητιασικά φάρμακα, οι παρενέργειες της αγωγής, τα συνοδά νοσήματα, η ηλικία του ασθενούς, η θέληση για συμμόρφωση και ολοκλήρωση της θεραπείας και το κόστος. (58) Η εκτίμηση της σοβαρότητας και έκτασης της πάθησης είναι επίσης σημαντική. (59) 34