ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΚΑΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΣΕ ΓΥΝΑΙΚΕΣ ΜΕ ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΠΟΛΥΚΥΣΤΙΚΩΝ ΩΟΘΗΚΩΝ (PCOS)

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΚΑΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΣΕ ΓΥΝΑΙΚΕΣ ΜΕ ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΠΟΛΥΚΥΣΤΙΚΩΝ ΩΟΘΗΚΩΝ (PCOS) ΖΕΡΒΑ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ ΑΘΗΝΑ 2017

2 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΚΑΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΣΕ ΓΥΝΑΙΚΕΣ ΜΕ ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΠΟΛΥΚΥΣΤΙΚΩΝ ΩΟΘΗΚΩΝ (PCOS) ΖΕΡΒΑ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ Βιοχημικός ΑΘΗΝΑ 2017 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

3 ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΚΑΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΣΕ ΓΥΝΑΙΚΕΣ ΜΕ ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΠΟΛΥΚΥΣΤΙΚΩΝ ΩΟΘΗΚΩΝ (PCOS) ΖΕΡΒΑ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ Επιβλέπουσα Καθηγήτρια: Κλεάνθη Δήμα, Αν. Καθηγήτρια Κλινικής Βιοχημείας, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ Τριμελής συμβουλευτική επιτροπή: Παπαβασιλείου Αθανάσιος, Καθηγητής Βιολογικής Χημείας, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ Κλεάνθη Δήμα, Αν. Καθηγήτρια Κλινικής Βιοχημείας, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ Δημήτριος Κασσάνος, Καθηγητής Γυναικολογίας, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ Επταμελής συμβουλευτική επιτροπή: Κλεάνθη Δήμα, Αν. Καθηγήτρια Κλινικής Βιοχημείας, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ Παπαβασιλείου Αθανάσιος, Καθηγητής Βιολογικής Χημείας, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ Δημήτριος Κασσάνος,, Καθηγητής Γυναικολογίας, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ Χρήστος Κρούπης, Αν. Καθηγητής Κλινικής Βιοχημείας-Μοριακής Διαγνωστικής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ Παρασκευή Μουτσάτσου, Καθηγήτρια Ιατρικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ Χαράλαμπος Χρέλιας Αν. Καθηγητής Γυναικολογίας, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ Δημήτριος Βλαχάκος, Καθηγητής Νεφρολογίας, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ

4

5 AKT2 gene polymorphisms, srankl/opg and hormone measurements in Polycystic Ovarian Syndrome (PCOS) women ABSTRACT OBJECTIVE: Polycystic Ovarian Syndrome (PCOS) is a common endocrinologic disorder diagnosed in 6-10% of female population at reproductive age. Altered expression of AKT2 gene has been correlated to increased insulin tolerance and reduced glucose disposal, both of which are PCOS features. The goal of this study was to investigate the association between AKT2 gene polymorphisms, serum biomarkers OPG and srankl as cardiovascular biomarkers, hormones (DHEAS, SHBG, testosterone, E2, LH, FSH, prolactin, insulin, 17-OH progesterone) and clinical characteristics as well (amenorrhea, oligomenorrhea, dysmenorrhea, acne, hirsutism, oily skin). STUDY DESIGN: A total of 60 Greek Caucasian PCOS patients and another 30 healthy women that were age- and BMI-matched, were recruited in the study and their blood specimens and clinical characteristics collected. Serum OPG and srankl were measured with ELISA kits and hormones with Roche Cobas e411 immunochemical analyzer. Four AKT2 gene DNA SNPs (Single Nucleotide polymorphisms) were selected; rs , rs , rs and rs and novel real-time qpcr methods were developed using either the dual probe or the single probe format for their genotyping in the LightCycler platform. All findings were confirmed with DNA Sequencing and statistical analysis was performed using SNPstats and SPSS software.

6 RESULTS: PCOS women had higher serum levels of srankl, DHEAS, testosterone and 17-OH progesterone and lower levels of E2, SHBG and prolactin than controls. There was a statistically important difference for SNP rs between patients and controls regarding Minor Allele Frequency (MAF%): it was found to be more frequent in PCOS patients compared to controls [OR 4.04 (C.I )], whereas concerning the entire population, studied individuals bearing the rs SNP have higher values of DHEAS and 17-OH progesterone, both biomarkers of PCOS. Furthermore, an association between hirsutism and SNP rs was found in PCOS patients (p=0.044). Eight participants had SNP rs in their DNA in combination with either rs or rs ; all were PCOS women. CONCLUSIONS: Our results adjudicate further study on AKT2 gene SNPs in relation with PCOS.

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το σύνδρομο των πολυκυστικών ωοθηκών είναι μια συχνή ενδοκρινολογική διαταραχή στον γυναικείο πληθυσμό αναπαραγωγικής ηλικίας. Αποτελεί τη συχνότερη αιτία υπερανδρογοναιμίας και χαρακτηρίζεται από διαταραχές περιόδου, υπογονιμότητα, δασυτριχισμό και δερματολογικά προβλήματα, ενώ μπορεί να έχει και σοβαρότερες συνέπειες, όπως την ανάπτυξη σακχαρώδους διαβήτη και τον κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακής νόσου. Παρά το γεγονός ότι πολλές μελέτες έχουν ερευνήσει το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών, υπάρχουν ακόμη ερωτήματα σχετικά με τους μηχανισμούς που συμμετέχουν στη δημιουργία του. Φαίνεται πως οφείλεται σε ένα συνδυασμό γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων. Το γονίδιο AKT2 έχει συσχετιστεί με την αυξημένη ανοχή στην ινσουλίνη και τη μειωμένη διάθεση γλυκόζης, δύο από τα χαρακτηριστικά που απαντώνται σε γυναίκες με PCOS. Οι παράγοντες OPG και srankl αποτελούν έναν σημαντικό προγνωστικό δείκτη για την εμφάνιση της καρδιαγγειακής νόσου και σχετίζονται με το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών, αφού όπως αναφέρθηκε οι PCOS ασθενείς εμφανίζουν αυξημένο κίνδυνο για καρδιαγγειακά νοσήματα. Ο σκοπός ευτής της μελέτης είναι να διερευνηθούν: α) οι τέσσερις πολυμορφισμοί του γονιδίου AKT2, β) οι παράγοντες OPG και srankl και γ) το ορμονικό προφίλ αλλά και τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών στον ελληνικό γυναικείο πληθυσμό.

8 Υλικά και μέθοδοι Υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 60 γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών και 30 μάρτυρες αντιστοίχου ηλικίας (18-35 ετών) και ΒΜΙ. Σε όλες τις γυναίκες έγινε πλήρης μελέτη και καταγραφή όλων των κλινικών και σωματομετρικών ευρημάτων καθώς και και υπερηχογράφημα ωοθηκών. Οι OPG και srankl μετρήθηκαν στον ορό με τη χρήση ELISA κιτ, ενώ οι μετρήσεις των ορμονών έγιναν στον ανοσοχημικό αναλυτή Cobas -E411 της Roche. Επελέγησαν τέσσερις πολυμορφισμοί (SNPs) του γονιδίου ΑΚΤ2 οι: rs , rs , rs και rs και αναπτύχθηκαν νέες μέθοδοι real-time qpcr για τη γονοτύπωσή τους στο LightCycler. Όλα τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν με DNA Sequencing και στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση SNPstats και λογισμικού SPSS. Αποτελέσματα Οι ασθενείς με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών έχουν υψηλότερα επίπεδα ορού για τις: srankl, DHEAS, Τεστοστερόνη και 17-ΟΗ προγεστερόνη και χαμηλότερα επίπεδα για τις: Ε2, SHBG και Προλακτίνη, συγκριτικά με τους μάρτυρες. Υπήρξε μια στατιστικά σημαντική διαφορά για τον πολυμορφισμό rs μεταξύ ασθενών και μαρτύρων, όσον αφορά τη συχνότητα του ελάσσονος αλληλόμορφου (MAF%) όπου βρέθηκε να είναι πιο συχνό στους PCOS ασθενείς σε σύγκριση με τους μάρτυρες [OR 4,04 (CI 1,12-14,54)]. Όσον αφορά το σύνολο του πληθυσμού, οι συμμετέχοντες που φέρουν τον πολυμορφισμό rs έχουν υψηλότερα επίπεδα ορού για τη DHEAS και τη 17-ΟΗ προγεστερόνη που αποτελούν βιοδείκτες του συνδρόμου πολυκυστικών ωοθηκών. Επιπλέον, βρέθηκε μια συσχέτιση μεταξύ της εμφάνισης δασυτριχισμού και του πολυμορφισμού rs στους PCOS ασθενείς (p = 0,044).

9 Τέλος, οκτώ PCOS ασθενείς είχαν στο DNA τους τον πολυμορφισμό rs σε συνδυασμό είτε με τον rs ή με τον rs Συμπεράσματα Τα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν πως ο πολυμορφισμός rs παρουσιάζει στατιστικά σημαντική συσχέτιση με το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών και με κάποια από τα χαρακτηριστικά του. Φαίνεται λοιπόν πως οι πολυμορφισμοί του γονιδίου ΑΚΤ2 αξίζει να μελετηθούν περαιτέρω και σε μεγαλύτερους πληθυσμούς προκειμένου να επιβεβαιώσουν τα παρόντα αποτελέσματα και να παγιώσουν αυτή τη γενετική συσχέτιση.

10 Περιεχόμενα 1.Εισαγωγή Σύνδρομο Πολυκυστικών Ωοθηκών (Polycystic Ovarian Syndrome: PCOS) Παθογένεση του Συνδρόμου Πολυκυστικών Ωοθηκών Αντίσταση στην ινσουλίνη Νευροενδοκρινολογική διαταραχή Διαταραχή στη σύνθεση των ανδρογόνων στις ωοθήκες Η θεωρία της FSH Γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες Διάγνωση του συνδρόμου πολυκυστικών ωοθηκών Κλινικά συμπτώματα του Συνδρόμου Πολυκυστικών Ωοθηκών Διαταραχές στην έμμηνο ρύση Δασυτριχισμός Κοινή Ακμή Μελανίζουσα Ακάνθωση (Acanthosis nigricans) Ανδρογενετική αλωπεκία Καρδιαγγειακά νοσήματα και σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών Οστεοπροτεγερίνη (OPG) και srankl AKT2 (AKT serine/threonine kinase 2) Σκοπός Υλικά και μέθοδοι Υλικά Μετρήσεις ορμονών και βιοχημικών δεικτών (OPG/sRANKL) Απομόνωση DNA Μέθοδοι Οστεοπροτεγερίνη (OPG) αmpli-srankl AKT Μεταλλάξεις-Μοριακές μέθοδοι ανίχνευσης πολυμορφισμών 58

11 4.3.2 Τεχνικές ανάλυσης μεταλλάξεων Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου και ανάλυση καμπυλών τήξης Προσδιορισμός της αλληλουχίας των βάσεων DNA (DNAsequencing) Απομόνωση DNA Ποσοτικός προσδιορισμός του DNA Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης..` Real time PCR και ανάλυση καμπυλών τήξης Αποτελέσματα Συζήτηση Βιβλιογραφία 185

12 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Σύνδρομο Πολυκυστικών Ωοθηκών (Polycystic Ovarian Syndrome: PCOS) Με τον όρο πολυκυστικές ωοθήκες περιγράφουμε εκείνες τις ωοθήκες που περιέχουν πολλές μικρές κύστες (περισσότερες από 12) οι οποίες δεν ξεπερνούν συνήθως τα 8 χιλιοστά σε μέγεθος και εντοπίζονται κάτω από την επιφάνεια της ωοθήκης. Οι μικρές αυτές κύστες είναι ωοθηλάκια που περιέχουν ωάρια, λόγω όμως ορμονικών διαταραχών δεν έχουν αναπτυχθεί πλήρως και παρουσιάζουν στασιμότητα στην πορεία εξέλιξής τους. Το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών είναι η συχνότερη αιτία υπερανδρογοναιμίας και η πιο συχνή ενδοκρινοπάθεια σε γυναίκες της αναπαραγωγικής ηλικίας 1,2 ( 6-10% του γυνακείου πληθυσμού 3 ). Το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών περιλαμβάνει ένα σύνολο ετερογενών χαρακτηριστικών τα οποία καλύπτουν ένα μεγάλο φάσμα κλινικών εκδηλώσεων, από τις πιο ήπιες όπως οι διαταραχές περιόδου στις πιο σοβαρές όπως ο κίνδυνος ανάπτυξης σακχαρώδους διαβήτη. Τα πρώτα συμπτώματα εμφανίζονται συνήθως στην εφηβεία, αν και σε πολλές γυναίκες μπορεί να εμφανιστούν αργότερα. Τα συμπτώματα που είναι πιθανόν να εκδηλωθούν στο πλαίσιο του συνδρόμου των πολυκυστικών ωοθηκών είναι: 1

13 Διαταραχές περιόδου Ρήξη των ωοθυλακίων και προβλήματα γονιμότητας Αυξημένη τριχοφυΐα και προβλήματα ακμής Πρόσληψη βάρους και δυσκολία στην απώλεια βάρους Κατάθλιψη και εναλλαγές διάθεσης 1.2 Παθογένεση του Συνδρόμου Πολυκυστικών Ωοθηκών Παρά το γεγονός ότι το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών αποτελεί μια από τις πιο συχνές ενδοκρινολογικές διαταραχές, η παθογένειά του παραμένει ασαφής. Είναι ένα ετερογενές σύνδρομο που δημιουργείται από πολλαπλούς παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς χωρίς όμως να έχει διευκρινιστεί ο βαθμός συμμετοχής κάθε μηχανισμού. Έχουν διατυπωθεί διάφορες θεωρίες που έχουν σκοπό την ερμηνεία της παθογένειας του συνδρόμου: Αντίσταση στην ινσουλίνη Η αντίσταση στην ινσουλίνη είναι μια παθολογική κατάσταση όπου ένα κύτταρο, ένας ιστός ή ένας οργανισμός χρειάζεται μεγαλύτερες από τις φυσιολογικές ποσότητες ινσουλίνης για να λειτουργήσει φυσιολογικά, με αποτέλεσμα να υπάρχει αυξημένη έκκριση ινσουλίνης από τα β παγκρεατικά κύτταρα, ενώ τα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα παραμένουν 2

14 φυσιολογικά. Όταν η ανταπόκριση των παγκρεατικών κυττάρων μειώνεται, ο ασθενής αναπτύσσει δυσανεξία στη γλυκόζη ή σακχαρώδη διαβήτη τύπου II 4. Η μειωμένη ανταπόκριση της γλυκόζης σε συγκεκριμένη ποσότητα ινσουλίνης μπορεί να οφείλεται σε α) αυξημένη αντίσταση του περιφερικού ιστού, β) χαμηλή κάθαρση από το ήπαρ, γ) αυξημένη ευαισθησία του παγκρέατος. Ο συσχετισμός της αντίστασης στην ινσουλίνη και του συνδρόμου των πολυκυστικών ωοθηκών είναι πλέον τεκμηριωμένος από έναν μεγάλο αριθμό μελετών και είναι ανεξάρτητος από το βάρος των ασθενών 5,6,10,11. Είναι ευρέως γνωστό επίσης πως η αντίσταση στην ινσουλίνη συμβάλλει στην αυξημένη παραγωγή ανδρογονικών ορμονών και ειδικότερα της τεστοστερόνης (εικόνα 1). Αυτό γίνεται με: Ενίσχυση της δράσης της LH μέσω της διέγερσης των υποδοχέων της ινσουλίνης και του IGF στις ωοθήκες Αύξηση του εύρους έκκρισης της LH Ενίσχυση της δράσης του P450c17 Παρεμπόδιση της σύνθεσης της SHBG Παρεμπόδιση της σύνθεσης του IGFBP-1 στο ήπαρ 3

15 Εικόνα 1. Η ινσουλίνη διεγείρει τo ένζυμo Ρ450 είτε άμεσα στην ωοθήκη είτε έμμεσα μέσω της δράσης της LH ή IGF-1 Ωστόσο, είναι αξιοσημείωτο ότι δεν εμφανίζουν υπερανδρογοναιμία όλες οι γυναίκες με υπερινσουλιναιμία. Έχει αποδειχθεί ότι οι γυναίκες με υπερανδρογοναιμία και κανονική ωοθηλακιορρηξία δεν εμφανίζουν ινσουλινοαντίσταση 12. 4

16 Νευροενδοκρινολογική διαταραχή Σύμφωνα με τη θεωρία αυτή η αυξημένη ποσότητα των ανδρογόνων οφείλεται σε υπερ-έκκριση της LH από την υπόφυση και αυτό οφείλεται σε αυξημένη ευαισθησία της υπόφυσης στην GnRH 13 επηρεάζοντας τη συχνότητα και το εύρος της έκκρισής της. Έτσι, ενώ κάτω από φυσιολογικές συνθήκες η αυξημένη συχνότητα ώσεων της GnRH κατά τη θυλακική φάση του κύκλου ευνοεί τη σύνθεση της LH, μετά την ωορρηξία τα στεροειδή που παράγονται από το ωχρό σωμάτιο μειώνουν τη συχνότητα ώσεων της GnRH και με τον τρόπο αυτό ευνοείται η σύνθεση της FSH 13,14. Σε γυναίκες με PCOS η συχνότητα ώσεων της GnRH είναι σταθερά αυξημένη και αυτό οδηγεί σε υπερέκκριση της LH,σε υπερανδογοναιμία και σε απουσία ωορρηξίας. Στην εικόνα 2 είναι σαφής ο τρόπος με τον οποίο η υπερ-έκκριση της LH επάγει την πρώιμη ωχρινοποίηση των κοκκιωδών κυττάρων και συμβάλλει στην πρόωρη διακοπή της ανάπτυξης των ωοθηλακίων. 5

17 Εικόνα 2. Στον φυσιολογικό κύκλο εμμήνου ρύσης μόνο το ώριμο ωοθηλάκιο (διαμέτρου 10mm) ανταποκρίνεται στην LH ενώ στους PCOS ασθενείς ανταποκρίνονται και τα ωοθηλάκια μικρότερης διαμέτρου με αποτέλεσμα την πρώιμη διαφοροποίηση. 6

18 Διαταραχή στη σύνθεση των ανδρογόνων στις ωοθήκες Η θεωρία αυτή υποστηρίζει πως η υπερανδρογοναιμία μπορεί να οφείλεται σε κάποιο έλλειμμα στη διαδικασία σύνθεσης ή μεταβολισμού των στεροειδών του φύλου στην ωοθήκη. Η βιοχημική εκτίμηση της υπερανδρογοναιμίας πραγματοποιείται με τη μέτρηση της ολικής τεστοστερόνης (TT), της ελεύθερης τεστοστερόνης (ft), της φυλοδεσμευτικής σφαιρίνης (SHBG), της ανδροστενεδιόνης (A), της 17- υδροξυπρογεστερόνης (17-OH P) και της θειικής διυδροεπιανδροστερόνης (DHEAS) στον ορό. Αν και η υπερανδρογοναιμία έχει πολυπαραγοντική προέλευση, αποδίδεται κατά κύριο λόγο στις ωοθήκες, με σημαντική συμβολή από τα επινεφρίδια και μια μικρή συνεισφορά από το λιπώδη ιστό (Εικόνα 3) 7

19 . Εικόνα 3. Η δημιουργία στεροειδών στα επινεφρίδια και στην ωοθήκη Οι γυναίκες με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών έχουν συχνά υψηλότερες του φυσιολογικού συγκεντρώσεις στον ορό ανδρογόνων λόγω διαταραχής της ενζυμικής ρύθμισης της στεροειδογένεσης. Η διαταραχή αυτής της ενζυμικής ρύθμισης οφείλεται στην δράση του κυτοχρωματικού ενζύμου P450c Το ένζυμο αυτό έχει συνδυασμό δράσεων της 17α-υδροξυλάσης και 17,20-λυάσης στις ωοθήκες και στα επινεφρίδια με την μετατροπή της προγεστερόνης σε 17- υδρόξυπρογεστερόνη ή σε Δ4-ανδροστενεδιόνη αντίστοιχα. Παρατηρείται μερική αναστολή της δραστικότητας της λυάσης σε σχέση με την 17-υδροξυλάση με αποτέλεσμα αυξημένο λόγο 17OHP / A. 8

20 Επιπλέον, όταν στις γυναίκες με PCOS χορηγηθεί κάποιο ανάλογο της LH (GnRH ή hcg) συμβαίνει υπερ-έκκριση της 17-OH προγεστερόνης και της ανδροστενεδιόνης στοιχείο που αποδεικνύει ότι λαμβάνει χώρα διαταραχή της ενζυμικής ρύθμισης και ότι δεν είναι αρκετή η υπερέκκριση της LH για να δικαιολογήσει την υπερανδρογοναιμία στο σύνδρομο των πολυκυστικών ωοθηκών. 16 Έχει επίσης καταδειχθεί σε γυναίκες με PCOS χαμηλή δραστικότητα της αρωματάσης. Η αρωματάση είναι ένα ένζυμο των κοκκιωδών κυττάρων που μετατρέπει τα ανδρογόνα σε οιστρογόνα και είναι εν μέρει υπεύθυνη για υπερανδρογοναιμία σε αυτό το σύνδρομο 17,18 (Εικόνα 4). 9

21 Εικόνα 4. Μερική αναστολή της δραστικότητας της λυάσης σε σχέση με την 17-υδροξυλάση σε γυναίκες με PCOS. Αύξηση της αναλογίας 17OHP / A και μείωση της δράσης της αρωματάσης. Η υπερανδρογοναιμία μπορεί να έχει αρνητικά αποτελέσματα στην ανάπτυξη των ωοθυλακίων (ατρησία) όπως επίσης και στην ανάπτυξη των ωοθηκών (αναστολή της μειωτικής ωρίμανσης μέσω της μείωσης των ταλαντώσεων στα ενδοκυτταροπλασματικά επιπέδα του ασβεστίου)

22 Η θεωρία της FSH Εικάζεται, χωρίς όμως να υπάρχει μεγάλος αριθμός πειραματικών ή κλινικών μελετών στη βιβλιογραφία, ότι η FSH παίζει ρόλο στην παθογένεια του συνδρόμου των πολυκυστικών ωοθηκών διότι είναι η ορμόνη που καθοδηγεί την επιλογή του επικρατούντος ωοθηλακίου (ωοθηλάκια με διάμετρο 2-5mm είναι ευαίσθητα στην FSH). Αν λοιπόν η συγκέντρωση της ορμόνης που απαιτείται για την επιλογή του επικρατούντος ωοθηλακίου δεν είναι η αναγκαία τότε η διαδικασία αποτυγχάνει και προκαλείται μια αλυσίδα γεγονότων που οδηγεί στην υπερανδρογοναιμία 20. Μια άλλη ορμόνη που συνδέεται με την υπερανδρογοναιμία και την καθήλωση της εξέλιξης των ωοθηλακίων είναι η αντιμυλλεριανή ορμόνη (AMH). Η ΑΜΗ είναι μια γλυκοπρωτεΐνη που αναστέλλει την ανάπτυξη των Mullerιan αγωγών στα αρσενικά έμβρυα 19. Δημιουργείται στα κοκκιώδη κύτταρα των ωοθηκών των γυναικών αναπαραγωγικής ηλικίας, και ελέγχει τον σχηματισμό των πρωτογενών ωοθυλακίων και τη διαδικασία επιλογής του επικρατούντος ωοθυλακίου από την FSH, διαδραματίζοντας σημαντικό ρόλο στην ωοθηλακιογένεση 21,22,23. Στις γυναίκες με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών τα επίπεδα της AMH στον ορό είναι αυξημένα. Τα επίπεδα της ορμόνης αυτής σχετίζονται με τον αριθμό των ωοθηλακίων που απεικονίζονται υπερηχογραφικά στην πρώιμη παραγωγική φάση του κύκλου. Η AMH μειώνει την ευαισθησία 11

23 των κοκκιωδών κυττάρων στην FSH και αναστέλλει τη δράση της αρωματάσης με αποτέλεσμα την καταστολή της διαδικασίας επιλογής του κυρίαρχου ωοθηλακίου και την αναστολή της μεταβολής των ανδρογόνων σε οιστρογόνα 20,24. 12

24 1.3 Γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες Το σύνδρομο των πολυκυστικών ωοθηκών είναι αποτέλεσμα της γενετικής προδιάθεσης σε συνδυασμό με την επίδραση των περιβαλλοντικών παραγόντων. Παρατηρείται μια οικογενής κατανομή του PCOS γεγονός που δείχνει μια γενετική προδιάθεση 25,26. Ο τρόπος κληρονομικότητας παραμένει ωστόσο ασαφής διότι εμπλέκονται περισσότερα από ένα γονίδια τα οποία αλληλεπιδρούν μεταξύ τους καθώς και με περιβαλλοντικούς και διατροφικούς παράγοντες. Τα γονίδια που έχουν μελετηθεί ως τώρα είναι τα εξής 27,28,29 : Γονίδια που συμμετέχουν στην έκκριση και δράση των γοναδοτροπινών, Γονίδια που συμμετέχουν στη σύνθεση και δράση των ανδρογόνων, Γονίδια που συμμετέχουν στην έκκριση και δράση της ινσουλίνης, Γονίδια που συμμετέχουν στην ωοθηλακιογένεση, Γονίδια που σχετίζονται με την παχυσαρκία και την ενεργειακή ομοιόσταση. Δεν υπάρχουν γονίδια όμως που να είναι παγκοσμίως αποδεκτά για το θεμελιώδη ρόλο τους στην αιτιολογία του συνδρόμου πολυκυστικών ωοθηκών

25 Αν και το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών είναι εξίσου διαδεδομένο σε όλες τις χώρες, ο φαινότυπος του ποικίλλει ανάμεσα στα έθνη 30,31. Αυτό υποδηλώνει πως οι διαφορετικοί περιβαλλοντικοί παράγοντες όπως η διατροφή, η σωματική δραστηριότητα και γενικότερα ο τρόπος ζωής παίζουν καθοριστικό ρόλο. Έχει αναφερθεί πως η απώλεια βάρους, η άσκηση και η αλλαγή στον τρόπο ζωής μπορούν να βελτιώσουν σημαντικά τα συμπτώματα του συνδρόμου 32,33,34,35. 14

26 1.4 Διάγνωση του συνδρόμου πολυκυστικών ωοθηκών Η πρώτη προσπάθεια για τον καθορισμό των κριτηρίων διάγνωσης του συνδρόμου πολυκυστικών ωοθηκών έγινε το 1990 από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NHI) των Ηνωμένων Πολιτειών Αμερικής 36. Για την διάγνωση του συνδρόμου σύμφωνα με τον NHI θα πρέπει να πληρούνται οι ακόλουθες προϋποθέσεις: 1. υπερανδρογοναιμία η οποία θα διαπιστώνεται μετά από βιοχημικό έλεγχο και κλινική εξέταση, 2. ολιγο- ή ανωοθηλακιοωρρηξία (ολιγομηνόρροια ή αμηνόρροια). Ο υπερηχογραφικός έλεγχος όπου φαίνεται η πολυκυστική εικόνα των ωοθηκών θεωρείται ενδεικτικός αλλά όχι καθοριστικός για τον προσδιορισμό της παθογένειας του συνδρόμου. Αυτή ήταν και η βασική διαφορά των κριτηρίων του NHI με αυτά που καθορίστηκαν στο συνέδριο που έγινε στο Ρότερνταμ το 2003 υπό την αιγίδα της Ευρωπαϊκής Εταιρίας Ανθρώπινης Αναπαραγωγής (European society for Human Reproduction) και της Αμερικανικής Εταιρίας Αναπαραγωγικής Ιατρικής (American Society for Reproductive Medicine) (ESHRE/ASRM). Στο συνέδριο του Ρότερνταμ προστέθηκε και ένα ακόμα κριτήριο. Προκειμένου λοιπόν να γίνει η διάγνωση του συνδρόμου πολυκυστικών ωοθηκών θα πρέπει να πληρούνται τα εξής κριτήρια: 1. υπερανδρογοναιμία διαπιστωμένη είτε κλινικά είτε 15

27 βιοχημικά, 2. ολιγομηνόρροια ή αμηνόρροια και 3. εικόνα πολυκυστικών ωοθηκών στον υπέρηχο 37. Η τελευταία προσπάθεια καθορισμού διαγνωστικών κριτηρίων για το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών έγινε το 2006 από την Εταιρία Υπερανδρογοναιμίας (Androgen Excess Society) 38. Η πρόταση αυτή της AES ουσιαστικά αποτελεί μια προσπάθεια να ενώσει τις προηγούμενες και προτείνει προκειμένου να γίνει η διάγνωση του συνδρόμου πολυκυστικών ωοθηκών, να πληρούνται τα εξής δύο κριτήρια: 1. υπερανδρογοναιμία διαπιστωμένη είτε κλινικά είτε βιοχημικά και 2. διαταραχή της λειτουργίας των ωοθηκών (ολιγο- ή ανωοθηλακιοωρρηξία) ή/και την πολυκυστική εικόνα των ωοθηκών στον υπέρηχο. Στον πίνακα 1 φαίνονται τα διαγνωστικά κριτήρια για το σύνδρομο των πολυκυστικών ωοθηκών. 16

28 1990 NIH 1.υπερανδρογοναιμια (κλινική ή βιοχημική) 2.ολιγομηνόρροια ή αμηνόρροια 2003 ESHRE/ASRM δύο από τα: 1. υπερανδρογοναιμια (κλινική ή βιοχημική) 2. ολιγομηνόρροια ή αμηνόρροια 3. πολυκυστική μορφολογία ωοθηκών 2006 AES 1. υπερανδρογοναιμια (κλινική ή βιοχημική) 2. ολιγομηνόρροια ή αμηνόρροια ή/και πολυκυστική μορφολογία ωοθηκών Πίνακας 1. Διαγνωστικά κριτήρια για το Σύνδρομο Πολυκυστικών Ωοθηκών Βασική προϋπόθεση για τη διάγνωση του συνδρόμου πολυκυστικών ωοθηκών, ανεξάρτητα από τα κριτήρια που θα χρησιμοποιηθούν, είναι ο αποκλεισμός άλλων διαταραχών που μπορεί να προκαλέσουν υπερανδρογοναιμία. Οι πιο σημαντικές διαταραχές είναι η μη κλασσική συγγενής υπερπλασία των επινεφριδίων, η υπερπρολακτιναιμία, το σύνδρομο Cushing και οι διαταραχές του θυρεοειδούς αδένα 37. Μέχρι σήμερα ωστόσο δεν υπάρχει ομοφωνία σχετικά με τα κριτήρια διάγνωσης δεδομένου ότι δεν υπάρχει ένας κοινώς αποδεκτός μηχανισμός παθογένεσης του συνδρόμου και επιπλέον δεν υπάρχει ομοιογένεια στους φαινοτύπους των ασθενών. 17

29 1.5 Κλινικά συμπτώματα του Συνδρόμου Πολυκυστικών Ωοθηκών Διαταραχές στην έμμηνο ρύση Η βασικότερη αιτία των διαταραχών της εμμήνου ρύσης στις γυναίκες με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών είναι οι διαταραχές στην εξέλιξη και στην ωρίμανση των ωοθηλακίων με αποτέλεσμα ανωορρηκτικούς κύκλους και εμφάνιση ολιγομηνόρροιας ή αμηνόρροιας 39,40. Με τον όρο ολιγομηνόρροια περιγράφεται ο μηνιαίος κύκλος >35 ημερών ενώ ως αμηνόρροια ορίζεται η κατάσταση εκείνη στην οποία υπάρχει απουσία της εμμήνου ρύσης για διάστημα μεγαλύτερο από τρεις συνεχόμενους μήνες, αφού φυσικά αποκλειστεί το ενδεχόμενο κύησης. Αυτές οι διαταραχές στην έμμηνο ρύση εμφανίζονται συνήθως στην αρχή της εφηβείας 40,41. Πολλές γυναίκες λόγω των διαταραχών αυτών καταφεύγουν στη χρήση αντισυλληπτικών χαπιών με αποτέλεσμα την εξαφάνιση των συμπτωμάτων, καθίσταται δύσκολη η διάγνωση του συνδρόμου. Η διάγνωση της ανωοθυλακιοωορρηξίας απαιτεί συχνά την εκτίμηση των επιπέδων της προγεστερόνης κατά τη δεύτερη φάση του κύκλου. Απαιτείται επίσης η μέτρηση των επιπέδων της προλακτίνης (PRL) για να αποκλεισθεί η υπερπρολακτιναιμία και η μέτρηση των γοναδοτροπινών, της ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH) και της ωχρινοποιητικής ορμόνης (LH) για να αποκλεισθεί η αμηνόρροια λόγω υπογοναδοτροπικού υπογοναδισμού 42. Τα κριτήρια του Rotterdam και της AES δεν θεωρούν βασική προϋπόθεση για τη διάγνωση του 18

30 συνδρόμου πολυκυστικών ωοθηκών 43 την διαταραχή της περιόδου ή της ωοθηλακιορηξίας Δασυτριχισμός Η υπερανδρογοναιμία στις γυναίκες οφείλεται σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις μία εκ των οποίων είναι το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών. Ανεξαρτήτως αιτίων τα αυξημένα επίπεδα της τεστοστερόνης και των προδρόμων της στοχεύουν σε διάφορους ιστούς και κυρίως στο δέρμα 44. Αποτέλεσμα μιας τέτοιας δερματολογικής επίδρασης είναι ο δασυτριχισμός 45. Ως δασυτριχισμός ορίζεται η ανάπτυξη τελικών τριχών σε συγκεκριμένες περιοχές του σώματος των γυναικών και διαφέρει από την υπερτρίχωση που παρατηρείται σε ολόκληρο το σώμα. Ο δασυτριχισμός αποτελεί μια παθολογική κατάσταση για τις γυναίκες και επηρεάζεται από τα ανδρογόνα 46.Η παρουσία ή απουσία δηλαδή του δασυτριχισμού εξαρτάται από το αν ο αυξημένος αριθμός ανδρογόνων που παράγονται τόσο από την ωοθήκη όσο και από τα επινεφρίδια, μετατρέπεται εντός του θύλακα της τρίχας με τη βοήθεια του ενζύμου 5-άλφα αναγωγάση (5-alpha reductase) στα πιο ισχυρά ανδρογόνα: την διυδροτεστοστερόνη (DHT) και την 3-άλφα γλυκουρονική διόλη (3-alpha diol-glucuronide) 47. Η δράση της 5-alpha reductase επηρεάζεται από τα επίπεδα ινσουλίνης καθώς επίσης και 19

31 του IGF 47,48. Η δράση του ενζύμου αυτού είναι αυξημένη σε γυναίκες με δασυτριχισμό. Ωστόσο τα υψηλά επίπεδα ανδρογόνων ενδέχεται να προκαλέσουν αυξημένη τριχοφυία ακόμα και σε περιοχές που δεν εξαρτώνται από τα ανδρογόνα 49. Ο δασυτριχισμός ταξινομείται με βάση την έκταση και το βαθμό τριχοφυίας σε ήπιο, μέτριο και σοβαρό. Η πρώτη μέθοδος για την εκτίμηση του δασυτριχισμού δημιουργήθηκε από τους Ferriman- Gallway το Γίνεται εκτίμηση της κατανομής των τριχών σε 11 διαφορετικές περιοχές του σώματος και ο δασυτριχισμός βαθμολογείται με τη χρήση μιας κλίμακας με αφετηρία το 0 (απουσία τριχών) και τέλος το 4 (πυκνή τριχοφυία) 50. Όταν το σύνολο των βαθμών των επί μέρους περιοχών είναι μεγαλύτερο του 8 δίνεται ο χαρακτηρισμός του δασυτριχισμού. Στην εικόνα 5 φαίνεται η κλίμακα βαθμολόγησης δασυτριχισμού κατά Ferriman- Gallway. 20

32 Εικόνα 5. Κλίμακα βαθμολόγησης δασυτριχισμού κατά Ferriman- Gallway (11 σημείων). 21

33 Στη συνέχεια δημιουργήθηκε η τροποποιημένη κλίμακα Ferriman- Gallway (modified FG score) η οποία συμπεριελάμβανε 9 περιοχές του σώματος προς εκτίμηση αντί για 11 50,51,52,53. Στην εικόνα 6 φαίνεται η τροποποιημένη Ferriman- Gallway κλίμακα βαθμολόγησης δασυτριχισμού. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται μέχρι και σήμερα λόγω της απλότητάς της και της αξιοπιστίας της 50,51. Εικόνα 6. Τροποποιημένη κλίμακα κατά Ferriman- Gallway (9 σημείων). βαθμολόγησης δασυτριχισμού 22

34 Το 1970 οι Mocanda- Lorenzo χρησιμοποίησαν ένα σύστημα για τη βαθμολόγηση του δασυτριχισμού όπου αξιολογήθηκαν μόνο 5 περιοχές του γυναικείου σώματος όσον αφορά στην κατανομή των τριχών: το άνω χείλος, το πηγούνι, το στήθος, η κοιλιά και οι μηροί 54. Η βαθμολόγηση έγινε με χρήση κλίμακας από το 0 έως το 4, ενώ όλα τα φυσιολογικά άτομα είχαν συνολικό σκορ =<5. Η μελέτη αυτή απέδειξε επίσης ότι τα σκορ που καταγράφησαν για την τριχοφυία του προσώπου, έδιναν μια ικανοποιητική δυνατότητα πρόβλεψης όσον αφορά τα σκορ του στήθους, της κοιλιάς και των μηρών 52,54, Κοινή Ακμή Η ακμή είναι μια κλινική εκδήλωση του δέρματος αποτέλεσμα της αυξημένης συγκέντρωσης των ανδρογόνων στο αίμα. Τα ανδρογόνα επιδρούν στους σμηγματογόνους αδένες και προκαλούν την παραγωγή σμήγματος 56. Ο ακριβής μηχανισμός της επίδρασης των ανδρογόνων στους σμηγματογόνους αδένες δεν είναι γνωστός ο ρόλος τους όμως στη διέγερση των σμηγματογόνων αδένων επιβεβαιώνεται από το γεγονός ότι άτομα που έχουν χαμηλό αριθμό υποδοχέων τεστοστερόνης δεν παρουσιάζουν ακμή 57 και από το γεγονός ότι η σοβαρότητα της ακμής επηρεάζεται από τα επίπεδα των ανδρογόνων στο αίμα. Όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση των κυκλοφορούντων ανδρογόνων, τόσο αυξάνεται η σοβαρότητα της ακμής 58,59. 23

35 Τα ανδρογόνα που εκκρίνονται τοπικά έχουν τον κύριο ρόλο στη δημιουργία της ακμής 58. Όπως αναφέρθηκε, το ένζυμο 5-άλφα αναγωγάση (5-alpha reductase) καταλύει τη μετατροπή της τεστοστερόνης στο πιο ισχυρό ανδρογόνο διυδροτεστοστερόνη (DHT) μέσα στους σμηγματογόνους αδένες 47. Η 5-άλφα αναγωγάση έχει δύο ισοένζυμα (τύπου 1 και τύπου 2). Η δραστικότητα του ενζύμου διαφέρει ανάλογα με την εντόπιση των σμηγματογόνων αδένων. Στο πρόσωπο όπου κυρίως εμφανίζεται η ακμή, η δραστικότητα του τύπου 1 της 5- άλφα αναγωγάσης είναι συγκριτικά αυξημένη με άλλα μέρη του σώματος που δεν είναι επιρρεπή στην εμφάνιση της ακμής 57. Εκτός της 5-άλφα αναγωγάσης υπάρχουν και άλλα ένζυμα που καταλύουν το μεταβολισμό των ανδρογόνων στο αίμα: η 17βυδροξυστεροειδο-δεϋδρογονάση (17β-HSD) και η 3β- υδροξυστεροειδοδεϋδρογονάση (3β- HSD). Η 17β-HSD όπως και η 5-άλφα αναγωγάση έχει διαφορετική δραστικότητα ανάλογα με την περιοχή εντόπισης των σμηγματογόνων αδένων, με πιο έντονη δράση στους αδένες του προσώπου. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα να παράγονται περισσότερα ανδρογόνα (τεστοστερόνη και δεϋδροεπιανδροστερόνη) στην περιοχή του προσώπου. Μολονότι η ακμή είναι ένας δείκτης υπερανδρογοναιμίας, δεν αποτελεί ταυτόχρονα και δείκτη συνδρόμου πολυκυστικών ωοθηκών ή κάποιας άλλης ενδοκρινολογικής διαταραχής και δεν υπάρχει κλίμακα 24

36 αξιολόγησής και βαθμολόγησής της. Μπορεί να διακριθεί σε ήπια, μέτρια και έντονη ανάλογα με την έκτασή της κυρίως στην περιοχή του προσώπου Μελανίζουσα Ακάνθωση (Acanthosis nigricans) Η μελανίζουσα ακάνθωση είναι μια δερματοπάθεια χαρακτηριζόμενη από υπερκεράτωση (αύξηση σε πάχος) και υπερμελάγχρωση του δέρματος, με την εμφάνιση σκούρων δερματικών περιοχών, ιδίως στην περιοχή των πτυχώσεων του σώματος. Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι περιοχές που πλήττονται είναι οι μασχάλες, η μηροβουβωνική περιοχή, οι πτυχές κάτω από το στήθος και ο λαιμός 61,62. Η πιο κοινή αιτία της μελανίζουσας ακάνθωσης είναι η αντίσταση στην ινσουλίνη. Η υψηλή συγκέντρωση της ινσουλίνης στο αίμα προκαλεί ανώμαλη ανάπτυξη των κυττάρων του δέρματος (υπερπλασία), ενώ ο έλεγχος των επιπέδων γλυκόζης στο αίμα μέσω της άσκησης και της διατροφής βελτιώνει συχνά συμπτώματα. Η μελανίζουσα ακάνθωση σχετίζεται επίσης και με την παχυσαρκία. Τόσο η αντίσταση στην ινσουλίνη, όσο και η παχυσαρκία είναι χαρακτηριστικά που απαντώνται σε γυναίκες με το σύνδρομο των πολυκυστικών ωοθηκών 61,62,63,64. 25

37 Ο μηχανισμός με τον οποίο η αντίσταση στην ινσουλίνη οδηγεί σε μελανίζουσα ακάνθωση στις γυναίκες με PCOS δεν είναι γνωστός, ενδέχεται να συμμετέχουν και άλλοι παράγοντες στην παθογένεια αυτής της δερματολογικής αυτής πάθησης Ανδρογενετική αλωπεκία Η ανδρογενετική αλωπεκία στις γυναίκες εμφανίζεται με μείωση του όγκου και της πυκνότητας του τριχωτού της κεφαλής. Η πιο πιθανή εξήγηση για την εμφάνιση της ανδρογενετικής αλωπεκίας στις γυναίκες με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών είναι τα ανδρογόνα που παράγονται στους θυλάκους των τριχών. Όπως αναφέρθηκε και στις περιπτώσεις του δασυτριχισμού και της ακμής, η δραστικότητα των ενζύμων 5-άλφα αναγωγάση και 17β-HSD μετατρέπει την τεστοστερόνη σε δεϋδροεπιανδροστερόνη η οποία είναι πιο δραστική, ενώ υπάρχει αυξημένη έκφραση υποδοχέων ανδρογόνων στις γυναίκες με ανδρογενετική αλωπεκία. Πολλές φορές υπάρχει ανδρογενετική αλωπεκία που οφείλεται σε υπερανδρογοναιμία, χωρίς να υπάρχει παράλληλα δασυτριχισμός ή διαταραχές στην έμμηνο ρύση και αυτό ενισχύει την απόδοση της αλωπεκίας στο σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών

38 1.6 Καρδιαγγειακά νοσήματα και σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών Ο αυξημένος κίνδυνος για την εμφάνιση καρδιαγγειακής νόσου είναι ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου, ενώ έχει διατυπωθεί η άποψη ότι και στο σύνδρομο των πολυκυστικών ωοθηκών ο κίνδυνος για νοσήματα της καρδιάς και των μεγάλων αγγείων είναι επίσης αυξημένος. Με κριτήρια έκβασης την αυξημένη ή πρόωρη θνησιμότητα από καρδιαγγειακή νόσο και την αυξημένη νοσηρότητα από έμφραγμα του μυοκαρδίου ή/και αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο στις ασθενείς με PCOS, υπάρχουν λίγα δεδομένα που μπορούν να υποστηρίξουν ότι τα παραπάνω εμφανίζονται πιο συχνά στους ασθενείς αυτούς 66,67. Παρά το γεγονός ότι δεν έχει αποδειχθεί άμεσα ότι ο αυξημένος κίνδυνος για καρδιαγγειακά νοσήματα αποτελεί μία από τις κύριες επιπτώσεις του PCOS, υπάρχουν αρκετές ενδείξεις και κλινικοεργαστηριακά χαρακτηριστικά που έμμεσα υποστηρίζουν την υπόθεση αυτή. Η παρουσία σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2, ή παχυσαρκίας, αποτελούν παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη καρδιαγγειακής νόσου και η επίπτωσή τους είναι σαφώς αυξημένη στις ασθενείς με PCOS, σε σύγκριση με το γενικό πληθυσμό 69. Απεικονιστικές μελέτες έχουν δείξει ότι ασθενείς με PCOS έχουν σημαντικά αυξημένο δείκτη αθηρωμάτωσης στις καρωτίδες 71,74, 27

39 σημαντικά αυξημένο πάχος του μέσου χιτώνα των καρωτίδων 72, αυξημένη παρουσία επασβεστώσεων στις στεφανιαίες αρτηρίες 73, σε σύγκριση με φυσιολογικές μάρτυρες. Τα παραπάνω χαρακτηριστικά είναι δείκτες αθηρωμάτωσης και υποδηλώνουν την παρουσία αυξημένου κινδύνου για αθηρωματική νόσο, ενώ η επίπτωσή τους αυξάνει στις ασθενείς με την πάροδο της ηλικίας και αποκτά, ενδεχομένως, κλινική σημασία μετά την ηλικία των 50 ετών 67. Πολλές μελέτες έχουν διαπιστώσει ότι οι ασθενείς με PCOS παρουσιάζουν διαταραχές των λιπιδίων του ορού, που είναι ανάλογες με εκείνες που παρατηρούνται στο μεταβολικό σύνδρομο και αποτελούν προγνωστικό δείκτη για την εκδήλωση καρδιαγγειακής νόσου 75,. Οι διαταραχές αυτές περιλαμβάνουν την αύξηση των επιπέδων των τριγλυκεριδίων και των χαμηλών επιπέδων της HDL χοληστερόλης του ορού, σε σύγκριση με τις φυσιολογικές γυναίκες 76,77. Κάποιες διαταραχές μπορεί να είναι χαρακτηριστικές του συνδρόμου, όπως είναι η παρουσία μικρότερων και πυκνότερων μορίων των LDL λιποπρωτεϊνών, ενώ ενδέχεται τα υψηλότερα επίπεδα της LDL χοληστερόλης να συνδέονται με την παρουσία υπερανδρογοναιμίας 77,78,79. Η δυσλιπιδαιμία είναι η πιο κοινή μεταβολική διαταραχή στο PCOS, αλλά η έκτασή της και η βαρύτητά της παρουσιάζουν σημαντική διακύμανση. Άλλα χαρακτηριστικά ενδεικτικά της παρουσίας υψηλού 28

40 κινδύνου για την εκδήλωση καρδιαγγειακής νόσου έχουν συσχετισθεί με το PCOS κατ αναλογία με παρόμοια ευρήματα που περιγράφονται στο πλαίσιο του μεταβολικού συνδρόμου. Αναφέρονται τα παρακάτω: Δυσλειτουργία του αγγειακού ενδοθηλίου με υψηλά επίπεδα ενδοθηλίνης στο πλάσμα και μείωση της ικανότητας αγγειοδιαστολής που αποδίδεται σε διαταραχή της ισορροπίας ενδοθηλίνης υποξειδίου του αζώτου (ΝΟ 80,81,82 ). Υψηλά επίπεδα δεικτών χρόνιας φλεγμονής, όπως της C- αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP) 83,84, του παράγοντα νέκρωσης των όγκων α (TNFα), της ιντερλευκίνης -6 (IL-6) 85 και της ιντερλευκίνης 18 (IL-18) 86. Διαταραχές του μηχανισμού πήξης ινωδόλυσης με αυξημένα επίπεδα του αναστολέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου -1 (PAI-1)314 και μειωμένη ινωδολυτική δραστηριότητα

41 1.7 Οστεοπροτεγερίνη (Osteoprotegerin, OPG) και srankl (soluble receptor activator of nuclear factor κβ ligand) Η OPG είναι μια διμερής γλυκοπρωτεΐνη της οικογένειας των υποδοχέων TNF (Tumor Necrosis Factor) (παράγοντας της νέκρωσης του όγκου) με μοριακό βάρος των δύο μορφών 60kDa και 120 kda, 88 η οποία παράγεται σε διαφορετικά είδη ιστών και κυττάρων. Η srankl (soluble receptor activator of nuclear factor κβ ligand) (ενεργοποιημένος υποδοχέας του πυρηνικού παράγοντα κβ) είναι επίσης ένα μέλος της οικογένειας του παράγοντα της νέκρωσης του όγκου (TNF),παράγεται στους οστεοβλάστες και ενεργοποιείται από τα Τ-λεμφοκύτταρα. Αποτελεί τον κύριο διεγερτικό παράγοντα για το σχηματισμό των ώριμων οστεοκλαστών και παίζει σημαντικό ρόλο στην επιβίωσή τους 89. Η srankl ενεργοποιεί το συγκεκριμένο υποδοχέα της RANK, ο οποίος βρίσκεται στους οστεοκλάστες και τα δενδριτικά κύτταρα 89. Η OPG δρα ως διαλυτός εκκρινόμενος υποδοχέας για την srankl, και με την σύνδεσή της εμποδίζει την δέσμευση της RANKL στο RANK 90,91. Με τον τρόπο αυτό αναστέλλεται η ενεργοποίηση του RANK στην επιφάνεια των οστεοκλαστών και παύει η οστεοκλαστική επαναρρόφηση. 30

42 Τα υψηλα επίπεδα της srankl στον ορό αποτελούν έναν σημαντικό προγνωστικό δείκτη για την εμφάνιση της καρδιαγγειακής νόσου 92,93. Η OPG έχει έναν αριθμό βιολογικών λειτουργιών, αλλά και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες και επίσης φαίνεται να έχει και ένα προστατευτικό ρόλο στο καρδιαγγειακό σύστημα. Όλες αυτές οι λειτουργίες της OPG σχετίζονται με το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών αφού όπως αναφέρθηκε οι PCOS ασθενείς εμφανίζουν αυξημένο κίνδυνο για καρδιαγγειακά νοσήματα. 31

43 1.8 AKT2 (AKT serine/threonine kinase 2) Όπως προαναφέρθηκε, η αντίσταση στην ινσουλίνη παρατηρείται στο μεγαλύτερο ποσοστό των γυναικών με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών. Η μοριακή βάση αυτού του εγγενούς μηχανισμού της ινσουλινοαντίστασης παραμένει άγνωστη, ωστόσο κάποιες βλάβες στον υποδοχέα της ινσουλίνης φαίνεται να συνεισφέρουν στην παθοφυσιολογία τόσο της αντίστασης στην ινσουλίνη όσο και της υπερανδρογοναιμίας 7. Η οδός σηματοδότησης της ινσουλίνης περιλαμβάνει δύο κύρια σκέλη: το ένα σκέλος έχει σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της φωσφατιδυλινοσιτόλης 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) ενώ το άλλο σκέλος την ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης (protein kinase) 94. Η έκφραση και η δραστικότητα της ΡΙ3Κ έχουν διερευνηθεί σε διάφορους ιστούς ασθενών με PCOS και βρέθηκαν διακριτές μοριακές βλάβες στον υποδοχέα της ινσουλίνης στους ινοβλάστες και στους λιπώδεις ιστούς των ασθενών 8. Το γονίδιο AKT συμβάλλει στην ενεργοποίηση της 3-φωσφοϊνοσιτιδίου εξαρτώμενης κινάσης (PIDK) η οποία ενεργοποιείται από το προϊόν της ΡΙ3Κ, την 3,4,5-τριφωσφορική φωσφατιδυλινοσιτόλη και συμμετέχει στη σηματοδότηση της ινσουλίνης. 32

44 Τρία γονίδια κωδικοποιούν τις μορφές του AKT. Αυτά είναι τα AKT1, AKT2 και AKT3 95,38. Το γονίδιο AKT2 (κινάση σερίνης / θρεονίνης 2) βρίσκεται στη θέση 19q13.2 (22 εξώνια) και είναι ένα ευρέως εκφραζόμενο γονίδιο που συμμετέχει στον μεταβολισμό της ινσουλίνης, στη μιτογονική σηματοδότηση και στην απόπτωση 95. Στις περιπτώσεις διαβήτη τύπου 2 υπάρχει μειωμένη ενεργοποίηση του γονιδίου AKT2 από την ινσουλίνη στα λιποκύτταρα. Η φωσφορυλίωση του AKT είναι μειωμένη κατά 40-60% στο σκελετικό μυ των ασθενών με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών συγκριτικά με τα φυσιολογικά άτομα

45 2. ΣΚΟΠΟΣ Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί: α) η σχέση των τεσσάρων πολυμορφισμών (SNPs- Single Nucleotide Polymorphisms) του γονιδίου AKT2, β) οι παράγοντες OPG και srankl ως καρδιαγγειακοί βιοδείκτες και γ) το ορμονικό προφίλ αλλά και τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών στον ελληνικό γυναικείο πληθυσμό. 34

46 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1. ΥΛΙΚΑ Υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 60 γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας με Σύνδρομο Πολυκυστικών Ωοθηκών (PCOS) που προσήλθαν στα Γυναικολογικά Εξωτερικά Ιατρεία του ΠΓΝ «ΑΤΤΙΚΟΝ» και 30 μάρτυρες αντιστοίχου ηλικίας (18-35 ετών) και ΒΜΙ. Σε όλες τις γυναίκες έγινε πλήρης μελέτη και καταγραφή όλων των κλινικών και σωματομετρικών ευρημάτων καθώς και και υπερηχογράφημα ωοθηκών. Για το σκοπό της μελέτης, ζητήθηκε η έγγραφη συγκατάθεση τόσο των ασθενών όσο και των μαρτύρων. Συμμετοχή στο ερευνητικό πρωτόκολλο προσφέρθηκε στους ασθενείς που πληρούν τα διαγνωστικά κριτήρια για PCOS (Rotterdam criteria) και των ακόλουθων κριτηρίων ένταξης: να είναι προ-εμμηνοπαυσιακές, να μην είναι έγκυες και να μην έχουν υποβληθεί σε ορμονική θεραπεία (συμπεριλαμβανομένης της από του στόματος θεραπείας με αντισυλληπτικά) για τουλάχιστον 3 μήνες πριν από τη μελέτη. Τα άτομα της ομάδας ελέγχου ήταν υγιείς γυναίκες με τακτική έμμηνο ρύση και χωρίς οικογενειακό ιστορικό PCOS ενώ δεν είχαν καμία ένδειξη υπερτρίχωσης, ακμής, αλωπεκίας, ενδοκρινολογικής δυσλειτουργίας και δεν είχαν υποβληθεί σε ορμονική θεραπεία (συμπεριλαμβανομένης της 35

47 από του στόματος θεραπείας με αντισυλληπτικά) για τουλάχιστον 3 μήνες πριν από την μελέτη. 3.2 Μετρήσεις ορμονών και βιοχημικών δεικτών (OPG/sRANKL) Ελήφθη ολικό αίμα κατά την 2η ή 3η ημέρα του έμμηνου κύκλου ή σε τυχαία ημέρα στις περιπτώσεις αμηνόρροιας. Το αίμα φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στις 3500 στροφές /λεπτό και ο ορός συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80 C μέχρι την περαιτέρω ανάλυση. 3.3 Απομόνωση DNA Ελήφθη ολικό αίμα σε σωληνάκια που περιείχαν EDTA και έγινε απομόνωση του DNA με το QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η καθαρότητα και η ποσότητα του DNA προσδιορίστηκαν με μετρήσεις φθορισμού με τη χρήση του kit Quant-iTdsDNA-BR στο qubit 1.0 φθορόμετρο (Invitrogen Life Technologies, USA). Το DNA αποθηκεύτηκε στους -20 C μέχρι μέχρι την περαιτέρω ανάλυση. 36

48 4. ΜΕΘΟΔΟΙ Οι παράμετροι που μετρήθηκαν ήταν οι εξής: TSH, T4, T3, FT3, FT4, 17-OH Progesterone, E2, LH, FSH, Prolactin, Insulin, Testosterone, DHEAS, SHBG, Osteoprotegerin(OPG) και srankl(receptor activator of nuclear factor (NF)-Kb ligand) και οι πολυμορφισμοί rs , rs , rs και rs του γονιδίου AKT2. Οι ορμονικοί προσδιορισμοί έγιναν στον αυτόματο ανοσολογικό αναλυτή COBAS e411(roche Diagnostics, Manheim, Germany). Ο αναλυτής αυτός διαθέτει έγχρωμη οθόνη αφής (touch screen) και κατάλληλα διαμορφωμένο πληκτρολόγιο και λογισμικό, με τη βοήθεια του οποίου προγραμματίζονται οι επιθυμητές λειτουργίες (ανάλυση δειγμάτων, επείγουσα ανάλυση δείγματος, βαθμονόμηση του μηχανήματος για κάθε εξέταση, ποιοτικός έλεγχος QC, διαδικασίες συντήρησης και αυτοκαθαρισμού του αναλυτή κλπ). Το πάνελ των εξετάσεων που περιλαμβάνει είναι ευρύ (ορμόνες αναπαραγωγής, θυρεοειδικές ορμόνες, καρκινικοί και καρδιακοί δείκτες, δείκτες αναιμίας και οστεοπόρωσης), ενώ η μέθοδος που χρησιμοποιεί 37

49 είναι αυτή της ηλεκτροχημειοφωταύγειας (ElectroChemiLuminescence- ECL). Εικόνα 1. COBAS e- 411 Η μέθοδος της ηλεκτροχημειοφωταύγειας (ECL), αντίθετα με τη συμβατική χημειοφωταύγεια, είναι αντίδραση χημειοφωταύγειας μορίων που παράγονται ηλεκτροχημικά πάνω στην επιφάνεια ενός ηλεκτροδίου. Η μέθοδος αυτή είναι ένας τρόπος μετατροπής της 38

50 ηλεκτρικής ενέργειας σε φως και σε αντιδράσεις μεταφοράς ενέργειας ηλεκτρονίων ηλεκτροχημικά παραγόμενων μορίων. Γενικά, η ηλεκτροχημειοφωταύγεια παράγεται μέσω μιας αντίδρασης μεταφοράςηλεκτρονίων ανάμεσα σε ένα οξειδωμένο και ένα ανηγμένο μόριο, τα οποία παράγονται πάνω σε ένα ηλεκτρόδιο: A e A D e D * A D A D * A A hv (αναγωγή) (οξείδωση) (διεγερμένη κατάσταση) (εκπομπή φωτός) Για τον αναλυτή Cobas E411, που χρησιμοποιεί το σύμπλοκο Ru(bpy)3 2+ οι παραπάνω αντιδράσεις διαμορφώνονται ως εξής: Ru( bpy) e Ru( bpy) C H N e [ C H N] H C H N Ru( bpy) Ru( bpy) προϊόντα 3 * Ru( bpy) Ru( bpy) hv( 2.0 ev, 610 nm) (εκπομπή φωτός) * Η ηλεκτροχημειοφωταύγεια εμφανίζει πολλά πλεονεκτήματα έναντι των άλλων συστημάτων ανίχνευσης που χρησιμοποιούνταν στο παρελθόν, διότι: 39

51 Δε χρησιμοποιούνται ραδιοϊσότοπα. Τα όρια ανίχνευσης των ισοτόπων που παράγονται είναι ιδιαίτερα χαμηλά. Το πεδίο τιμών για τον ισοτοπικό προσδιορισμό ξεπερνά τις 6 τάξεις μεγέθους. Τα ισότοπα που δημιουργούνται είναι εξαιρετικά σταθερά. Η εκλεκτικότητα δεσμευμένων και μη κλασμάτων μπορεί να βασιστεί στην ικανότητα των επισημασμένων μορίων να πλησιάσουν την επιφάνεια του ηλεκτροδίου. Απλή και γρήγορη μέθοδος. Συνοπτικά, η μέθοδος έχει ως εξής: 1. Ικανή ποσότητα δείγματος μαζί με ένα ειδικό βιοτινυλιωμένο μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της προσδιοριζόμενης ουσίας και ένα ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα επισημασμένο με σύμπλοκο ρουθηνίου (σύμπλοκο τρις(2,2-διπυριδυλο)ρουθηνίου(ιι), Ru(bpy)3 2+ ) σχηματίζουν το λεγόμενο sandwich. 2. Μετά την προσθήκη μικροσφαιριδίων επικαλυμμένων με στρεπταβιδίνη, το σύμπλοκο του πρώτου βήματος δεσμεύεται στη στερεά φάση μέσω της αλληλεπίδρασης της βιοτίνης με τη στρεπταβιδίνη, σχηματίζοντας τη «γέφυρα». 40

52 3. Το μίγμα της αντίδρασης εισάγεται με αναρρόφηση στο θάλαμο μέτρησης, όπου γίνεται μαγνητική δέσμευση των μικροσφαιριδίων στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου. Απομακρύνονται οι μη δεσμευμένες ουσίες και η εφαρμογή τάσης στο ηλεκτρόδιο προκαλεί την εκπομπή χημειοφωταύγειας, η οποία μετράται με φωτοπολλαπλασιαστή. 4. Τα αποτελέσματα προσδιορίζονται βάσει καμπύλης βαθμονόμησης 2 σημείων, η οποία παράγεται ειδικά για κάθε ουσία-αναλυτή και μιας πρότυπης καμπύλης 5 σημείων που λαμβάνεται ηλεκτρονικά μέσω του γραμμωτού κώδικα των αντιδραστηρίων. Ο προσδιορισμός των παραγόντων Οsteoprotegerin και srankl έγινε με την μέθοδο ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) με το kit της εταιρίας BIOMEDICA (Biomedica Gruppe, Vienna, Austria). Τα όρια ανίχνευσης για τα OPG και srankl ήταν 0.14pmol/L και 0.02pmol/L αντίστοιχα. Αμφότερα τα kit δίνουν διευκρινίσεις διαδοκιμασίας μικρότερες από 8% στα χαρακτηριστικά της απόδοσης τους. 41

53 Η ELISA είναι μια ταχεία ενζυμική ανοσοχημική μέθοδος για τον καθορισμό της παρουσίας ενός αντιγόνου ή ενός αντισώματος στο δείγμα. Οι τεχνικές της ELISA μπορούν να χρησιμοποιηθούν τόσο για ποιοτική όσο και για ποσοτική ανάλυση. Η ποιοτική ανάλυση παρέχει απλά ενδείξεις για την ύπαρξη θετικού ή αρνητικού αποτελέσματος σε ένα δείγμα. Η ποσοτική ανάλυση στηρίζεται στη μέτρηση της απορρόφησης ή οπτικής πυκνότητας (OD) του δείγματος και στη σύγκριση αυτής με μια πρότυπη καμπύλη, προκειμένου να προσδιοριστεί η συγκέντρωση του αντιγόνου ή του αντισώματος στο δείγμα. Για την ποσοτική μέτρηση της αλληλεπίδρασης αντιγόνου-αντισώματος έχουν χρησιμοποιηθεί διάφοροι τρόποι επισήμανσης που επιτρέπουν την ανίχνευση του μορίου που μας ενδιαφέρει: 1) Επισήμανση με ραδιενέργεια (ραδιοανοσολογικός προσδιορισμός- RIA) 2) Επισήμανση με ένζυμα (ανοσοενζυμικός προσδιορισμός-eia).στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιούνται οι αντιδράσεις ενζύμουυποστρώματος για τον ποσοτικό προσδιορισμό του μορίου που μας ενδιαφέρει. 42

54 3) Χρήση φθοριζόντων συστατικών ως ιχνηθετών μαζί με υποστρώματα που προκαλούν φθορισμό (φθορισμομετρικός προσδιορισμός-fia). Η ELISA βασίζεται στην ειδική δέσμευση αντιγόνου (Ag) και αντισώματος (Ab). Αρχή της μεθόδου στηρίζεται στην ειδική και αμφίδρομη σύνδεση αντιγόνου-αντισώματος και τον σχηματισμό συμπλόκου το οποίο μπορεί να διαχωριστεί από τα υπόλοιπα ελεύθερα μόρια εντός του δείγματος. Ag + Ab Ag-Ab Μια ανάλογη ισορροπία αποκαθίσταται μεταξύ ενός επισημασμένου αντιγόνου Ag και ενός αντισώματος Ab. Ag - + Ab Ag - -Ab + Ag Ag-Ab 43

55 Οι μέθοδοι ELISA διακρίνονται σε: 1. Ανταγωνιστικές 2. Μη ανταγωνιστικές Στην ανταγωνιστική μέθοδο, ο επισημασμένος ιχνηθέτης είναι το ίδιο το αντιγόνο. Το προς μέτρηση αντιγόνο και το επισημασμένο αντιγόνο ανταγωνίζονται για τη σύνδεση με την περιορισμένη ποσότητα του ίδιου αντισώματος και για αυτό το αποτέλεσμα της αντίδρασης είναι αντιστρόφως ανάλογο της συγκέντρωσης του μετρούμενου αντιγόνου στο δείγμα. Στη μη ανταγωνιστική μέθοδο, ο επισημασμένος ιχνηθέτης είναι το αντίσωμα. Το αντιγόνο προσροφάται καταρχήν σε ένα μη επισημασμένο αντίσωμα, που είναι καθηλωμένο συνήθως σε μια στερεή επιφάνεια και μετά προστίθεται το ίδιο επισημασμένο αντίσωμα (τεχνική sandwich). Το αποτέλεσμα της αντίδρασης είναι ευθέως ανάλογο προς τη συγκέντρωση της ουσίας που μετράμε στο δείγμα. Στην ELISA η επισήμανση πραγματοποιείται με τη σύνδεση ενός ενζύμου στο προς ιχνηθέτηση αντιγόνο ή αντίσωμα. Ο προσδιορισμός του συνδεδεμένου ενζύμου απαιτεί την προσθήκη του υποστρώματος και τη μέτρηση του προιόντος μιας καταλυτικής αντίδρασης ενζύμου- 44

56 υποστρώματος. Μια μικρή σχετικά ποσότητα ενζύμου μπορεί να προκαλέσει τη μετατροπή -σε σύντομο χρόνο- μεγάλης ποσότητας υποστρώματος σε έγχρωμο προϊόν. Η παραγωγή του προϊόντος σταματάει με την προσθήκη συγκεκριμένου αντιδραστηρίου (συνήθως οξύ) και μετράται η απορρόφησή του με τη βοήθεια ειδικού φασματοφωτόμετρου τύπου ELISA (Εικόνα 2).. Εικόνα 2. Φασματοφωτόμετρο τύπου ELISA. 45

57 Τα στάδια ανταγωνιστικής μεθόδου είναι τα εξής: 1. Το αντίσωμα βρίσκεται καθηλωμένο στο πλακίδιο εργασίας 2. Ακολουθεί η προσθήκη αντιγόνου (δείγμα). 3. Επώαση και πλύση 3-5 φορές για να απομακρυνθεί ότι δε δεσμεύτηκε από το αντίσωμα. 4. Στη συνέχεια γίνεται προσθήκη αντιγόνου συνδεδεμένου με το ένζυμο. Το ιχνηθετημένο αντιγόνο ανταγωνίζεται με το αντιγόνο που θέλουμε να μετρήσουμε για τη σύνδεση στα ίδια ακινητοποιημένα αντισώματα. 5. Κατόπιν γίνεται επώαση και πλύση 3-5 φορές για να απομακρυνθεί ότι δε δεσμεύτηκε. 6. Προσθήκη υποστρώματος, επώαση και παραγωγή έγχρωμου προϊόντος και προσθήκη διαλύματος τερματισμού. 7. Τέλος γίνεται η μέτρηση της απορρόφησης του προϊόντος. Τα στάδια μη-ανταγωνιστικής μεθόδου είναι: 1. Το αντίσωμα υπάρχει καθηλωμένο στο πλακίδιο εργασίας. 2. Προσθήκη αντιγόνου (δείγμα). 3. Επώαση. 46

58 4. Πλύση 3-5 φορές για να απομακρυνθεί ότι δε δεσμεύτηκε από το αντίσωμα. 5. Προσθήκη αντισώματος συνδεδεμένου με το ένζυμο. 6. Επώαση και πλύση 3-5 φορές για να απομακρυνθεί ότι δε δεσμεύτηκε. 7. Προσθήκη υποστρώματος. Επώαση, παραγωγή έγχρωμου προϊόντος και προσθήκη διαλύματος τερματισμού. 8. Μέτρηση της απορρόφησης. Στα πρώτα στάδια της μεθόδου, πριν την προσθήκη του δείγματος στα πηγαδάκια της πλάκας μικροτιτλοδότησης, τοποθετείται διάλυμα BSA (λευκωματίνη ορού βόειας προέλευσης ) ή καζεΐνης. Οι πρωτεΐνες αυτές έχουν την ικανότητα να δεσμεύουν τις μη ειδικές πρωτείνες στην πλάκα μικροτιτλοδότησης, οι οποίες θα μπορούσαν να δώσουν ψευδώς θετικό αποτέλεσμα. Το στάδιο αυτό είναι γνωστό και ως στάδιο μπλοκαρίσματος (blocking step). 47

59 4.1.ΟΣΤΕΟΠΡΟΤΕΓΕΡΙΝΗ (OPG) Η Οστεοπροτεγερίνη (Osteoprotegerin OPG) ή Ανασταλτικός Παράγοντας Οστεοκλαστών (Osteoclast Inhibitory Factor OCIF) είναι μια διμερής πρωτεΐνη της οικογένειας των TNF(Tumor Necrosis Factor) υποδοχέων με μοριακό βάρος 60kD και 120 kd αντίστοιχα. Η Οστεοπροτεγερίνη δρά ως ένας διαλυτός εκκρινόμενος υποδοχέας για το RANKL, εμποδίζοντας τη δέσμευση του RANKL στο RANK και αναστέλλοντας έτσι την ενεργοποίηση του RANK (διαφοροποίηση οστεοκλαστών και ενεργοποίηση του υποδοχέα, ODAR), στην επιφάνεια των οστεοκλαστών. Έτσι η OPG αναστέλλει την ανάπτυξη των οστεοκλαστών. ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ 1. Οστεοπόρωση 2. Ασθένειες με τοπικά αυξημένη δραστηριότητα απορρόφησης 3. Αρθρίτιδα 4. Ογκολογία 5. Καρδιαγγειακά νοσήματα. 48

60 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΤΟΥ ΠΑΚΕΤΟΥ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ (kit) 1. Πλάκα μικροτιτλοδότησης (PLATE) 2. -Μονοκλωνικά anti OPG αντισώματα ποντικού, προεπικαλυμμένες λωρίδες μικροτιτλοδότησης 3. Πλυστικό Διάλυμα (WASH BUFFER) 4. - Διάλυμα συμπυκνωμένο 20Χ 5. AB -Πολυκλωνικό anti OPG αντίσωμα κατσίκας (επισημασμένο με βιοτίνη). 6. Πρότυπο Διάλυμα (STANDARD) 7. -Standards 1-6, (0; 0,37; 1,1; 3,3; 10; 30 pmol/lt) 8. Διάλυμα ελέγχου (CONTROL) 9. Ρυθμιστικό διάλυμα δοκιμασίας (ASSAY BUFFER) 10.Διάλυμα σύζευξης (CONJUGATE) (streptavidin-hrpo) 11.Υπόστρωμα (SUBSTRATE) (Διάλυμα TMB) 12.Διάλυμα Τερματισμού (STOP SOLUTION) 13.Διάλυμα OPG-STOCK (OPG-STOCK SOLUTION) (500pmol/l 49

61 ΠΡΟΤΟΚΟΛΟ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ 1. Εισαγωγή 100μl Assay Buffer σε κάθε πηγαδάκι της πλάκας μικροτιτλοδότησης. Εισαγωγή επιπλέον 100μl στο πηγαδάκι που έχει μαρκαριστεί ως blank. 2. Προσθήκη 50μl Standard/Sample/Control εις διπλούν στα αντίστοιχα πηγαδάκια με εξαίρεση το blank. 3. Προσθήκη 50μl AB σε όλα τα πηγαδάκια εκτός του blank και ελαφριά ανακίνηση. 4. Καλύπτουμε σφιχτά την πλάκα μικροτιτλοδότησης και επωάζουμε για 18-24h στους 4 C. 5. Στη συνέχεια γίνεται αναρρόφηση και πλύσιμο στα πηγαδάκια (5 φορές) με 300μl αραιωμένου Wash Buffer. Μετά την τελευταία πλύση γίνεται αφαίρεση του επιπλέον wash Buffer από την πλάκα, χτυπώντας την σθεναρά σε μια χάρτινη πετσέτα. 6. Ακολουθεί προσθήκη 200μl Conjugate σε όλα τα πηγαδάκια. 7. Καλύπτουμε σφιχτά την πλάκα μικροτιτλοδότησης και επωάζουμε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (18-26 C). 8. Στη συνέχεια γίνεται αναρρόφηση και πλύσιμο στα πηγαδάκια (5 φορές) με 300μl αραιωμένου Wash Buffer. Μετά την τελευταία πλύση γίνεται αφαίρεση του επιπλέον wash Buffer από την πλάκα, χτυπώντας την σθεναρά σε μια χάρτινη πετσέτα. 9. Προσθήκη 200μl Substrate σε όλα τα πηγαδάκια. 50

62 10. Επωάζουμε για 20min σε θερμοκρασία δωματίου (18-26 C) σε σκοτεινό μέρος. 11. Τέλος γίνεται προσθήκη 50μl Stop solution σε όλα τα πηγαδάκια. 12. Ακολουθεί άμεση μέτρηση της απορρόφησης στα 450nm. Οι αρχές της μεθόδου φαίνονται στην Εικόνα 3: Εικόνα 3. Αρχή της μεθόδου για τo OPG. 51

63 ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Γίνεται μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (OD) σε όλα τα πηγαδάκια της πλάκας χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο για ELISA, ρυθμισμένο στα 450nm (διόρθωση μήκους κύματος στα 630nm). Στη συνέχεια γίνεται αφαίρεση της τιμής της οπτικής πυκνότητας του blank από τις τιμές οπτικής πυκνότητας του standard, του control και των δειγμάτων. Έτσι φτιάχνεται η πρότυπος καμπύλη χρησιμοποιώντας τις τιμές της οπτικής πυκνότητας του standard. Η καμπύλη αυτή χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης των δειγμάτων (Εικόνα 4).. Εικόνα 4. Πρότυπος καμπύλη για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης των δειγμάτων για το OPG. 52

64 4.2. αmpli-srankl To srankl(soluble receptor activator of nuclear factor (NF)-Kb ligand) (επίσης Osteoprotegerin ligand, OPGL), είναι μέλος της οικογένειας TNF (Tumor Necrosis Factor), αποτελεί τον κύριο διεγερτικό παράγοντα για το σχηματισμό των ώριμων οστεοκλαστών ενώ είναι απαραίτητο για την επιβίωσή τους. Το srankl παράγεται από κύτταρα οστεοβλαστών και ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα και ενεργοποιεί τον ειδικό υποδοχέα του RANK, ο οποίος βρίσκεται στους οστεοκλάστες και στα δενδριτικά κύτταρα. Οι επιδράσεις του RANKL εξουδετερώνονται από την OPG η οποία εκκρίνεται από διάφορους ιστούς και δρα ανταγωνιστικά ως ένας ενδογενής διαλυτός υποδοχέας,. Καθώς η συγκέντρωση του srankl στον ορό είναι συνήθως πολύ χαμηλή στα φυσιολογικά δείγματα, στη συγκεκριμένη ELISA χρησιμοποιείται ένα πρόσθετο σύστημα ενίσχυσης. ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ 1. Μετα-εμμηνοπαυσιακή και γεροντική Οστεοπόρωση 2. Επαγόμενη από γλυκοκορτικοειδή Οστεοπόρωση 3. Αρθρίτιδα 4. Ογκολογία 53

65 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΤΟΥ ΠΑΚΕΤΟΥ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ (kit) 1. Πλάκα μικροτιτλοδότησης (PLATE) -Ανθρώπινο ανασυνδυασμένο OPG, προ-επικαλυμμένες λωρίδες μικροτιτλοδότησης 2. Πλυστικό Διάλυμα (WASH BUFFER) - Διάλυμα συμπυκνωμένο 20X 3. AB -Πολυκλωνικό βιοτινυλιωμένο anti srankl αντίσωμα κατσίκας 4. Πρότυπο Διάλυμα (STANDARD) -Standards 1-6, (0; 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2 pmol/lt) 5. Διάλυμα ελέγχου (CONTROL) 6. Διάλυμα σύζευξης (CONJUGATE) (streptavidin-alkaline phosphatase 54

66 7. AMPLIFIER A (Ανόργανα άλατα και ρυθμιστικό διάλυμα ενζύμου με βιολετί τετραζολίου) 8. AMPLIFIER B (Σταθεροποιημένο διάλυμα NADPH) 9. Διάλυμα Τερματισμού (STOP SOLUTION) ΠΡΟΤΟΚΟΛΟ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ 1. Εισαγωγή 100μl Standard/Sample/Control εις διπλούν στα αντίστοιχα πηγαδάκια με εξαίρεση το blank. 2. Προσθήκη 100μl σε όλα τα πηγαδάκια εκτός του blank και ελαφριά ανακίνηση. 3. Καλύπτουμε σφιχτά την πλάκα μικροτιτλοδότησης και επωάζουμε για 18-24h σε θερμοκρασία δωματίου (18-26 C) ενώ παράλληλα ανακινούμε. 4. Στη συνέχεια γίνεται αναρρόφηση και πλύσιμο στα πηγαδάκια (5 φορές) με 300μl αραιωμένου Wash Buffer. Μετά την τελευταία πλύση γίνεται αφαίρεση του επιπλέον wash Buffer από την πλάκα, χτυπώντας την σθεναρά σε μια χάρτινη πετσέτα. 5. Ακολουθεί προσθήκη 200μl Conjugate σε όλα τα πηγαδάκια εκτός του blank. 55

67 6. Καλύπτουμε σφιχτά την πλάκα μικροτιτλοδότησης και επωάζουμε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (18-26 C). 7. Στη συνέχεια γίνεται αναρρόφηση και πλύσιμο στα πηγαδάκια (5 φορές) με 300μl αραιωμένου Wash Buffer. Μετά την τελευταία πλύση γίνεται αφαίρεση του επιπλέον wash Buffer από την πλάκα, χτυπώντας την σθεναρά σε μια χάρτινη πετσέτα. 8. Προσθήκη 100μl Amplifier A σε κάθε πηγαδάκι. 9. Προσθήκη 100μl Amplifier B σε κάθε πηγαδάκι. 10.Επωάζουμε για 45min +/- 10min σε θερμοκρασία δωματίου (18-26 C). 11.Τέλος γίνεται προσθήκη 50μl Stop solution σε όλα τα πηγαδάκια. 12.Ακολουθεί άμεση μέτρηση της απορρόφησης στα 490nm με αναφορά τα 630 nm, εφόσον αυτό είναι απαραίτητο. Οι αρχές της μεθόδου φαίνονται στην Εικόνα 5: 56

68 Εικόνα 5. Αρχή της μεθόδου για το srankl ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Γίνεται μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (OD) σε όλα τα πηγαδάκια της πλάκας χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο για ELISA, ρυθμισμένο στα 490nm (διόρθωση μήκους κύματος στα 630nm). Στη συνέχεια γίνεται αφαίρεση της τιμής της οπτικής πυκνότητας του blankτυφλού από τις τιμές οπτικής πυκνότητας του standard-βαθμονομητή, του control ορού ελέγχου και των δειγμάτων. Έτσι φτιάχνεται η πρότυπος καμπύλη χρησιμοποιώντας τις τιμές της οπτικής πυκνότητας του standard. Η καμπύλη αυτή χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης των δειγμάτων (Εικόνα 6) 57

69 Εικόνα 6. Πρότυπος καμπύλη για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης των δειγμάτων για το srankl AKT ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ-ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΩΝ Ως μετάλλαξη (mutation) ορίζεται μία μόνιμη αλλαγή ή αλλοίωση στο γενετικό υλικό ενός κυττάρου, η οποία επηρεάζει την νουκλεοτιδική αλληλουχία ενός ή περισσοτέρων γονιδίων. Οι μεταλλάξεις αποτελούν καθημερινότητα για τη ζωή ενός κυττάρου. Αν και οι πιο πολλές είναι επιβλαβείς εφόσον δεν επιδιορθωθούν, χωρίς αυτές η εξέλιξη θα ήταν αδύνατη. Μία νέα μετάλλαξη, για ένα δεδομένο γονίδιο, εμφανίζεται με 58

70 συχνότητα περίπου μία στο εκατομμύριο κατά τη μετάβαση της γενετικής πληροφορίας από το μητρικό στο θυγατρικό κύτταρο. Συνεπώς αν θεωρηθεί σωστή η εκτίμηση πως το ανθρώπινο γονιδίωμα περιέχει περίπου γονίδια, τότε το 2,5% όλων των νεογέννητων φέρει μια νέα μετάλλαξη. Οι περισσότερες όμως από τις προαναφερθείσες μεταλλάξεις δεν εκδηλώνονται, αφού το αντισταθμιστικό γονίδιο του αλληλόμορφου χρωμοσώματος είναι φυσιολογικό, ενώ για να εκδηλωθεί κάποια γενετική ασθένεια είναι απαραίτητο να υπάρχει μετάλλαξη και στα δύο αλληλόμορφα χρωμοσώματα, στο συγκεκριμένο γονίδιο από το οποίο εξαρτάται η ασθένεια (υπολλειπόμενη κληρονόμηση). Η κατάταξη των μεταλλάξεων γίνεται με διάφορους τρόπους. Κατάταξη βάσει του είδους της βάσης που αντικαθίσταται κάθε φορά: 1) Μεταλλάξεις μετάπτωση (transition) 2)Μεταλλάξεις μεταστροφής (transversion). Στις μεταλλάξεις μετάπτωσης μία πουρίνη (αδενίνη ή γουανίνη) αντικαθίσταται από μία άλλη πουρίνη ή μία πυριμιδίνη (θυμίνη ή κυτοσίνη) αντικαθίσταται από μία άλλη πυριμιδίνη. Στις μεταλλάξεις μεταστροφής μία πουρίνη αντικαθίσταται από μία πυριμιδίνη ή το αντίστροφο. Κατάταξη βάσει του μεγέθους του γενετικού υλικού που υφίσταται μετάλλαξη: 59

71 1) Μεταλλάξεις που προκαλούν μεγάλες αναδιατάξεις στο μόριο του DNA, όπως ελλείμματα ή προσθήκες μεγάλων τμημάτων DNA και 2) Σημειακές μεταλλάξεις(point mutations) στις οποίες μόνο μία βάση υφίσταται την αλλοίωση. Οι σημειακές μεταλλάξεις κατηγοριοποιούνται ως εξής: α) Μεταλλάξεις με λάθος νόημα ή παρερμηνεύσιμες (missense), στις οποίες η αλλαγή της βάσης οδηγεί κατά την μετάφραση σε αντικατάσταση ενός αμινοξέος από άλλο β) Μεταλλάξεις χωρίς νόημα ή μη νοηματικές (nonsense), στις οποίες η αλλαγή της βάσης οδηγεί κατά την μετάφραση στη δημιουργία ενός εκ των τριών κωδικονίων λήξης της πρωτεϊνοσύνθεσης (UAA, UAG, UGA). Έτσι, δημιουργούνται πρωτεΐνες με μικρότερο μέγεθος και μειωμένη λειτουργικότητα γ) Μεταλλάξεις αλλαγής πλαισίου ανάγνωσης (frameshift), όπου υπάρχει προσθήκη ή έλλειμμα ενός ή περισσοτέρων νουκλεοτιδίων, χωρίς ο αριθμός των προστιθέμενων ή αφαιρούμενων νουκλεοτιδίων να είναι πολλαπλάσιο του τρία, με αποτέλεσμα να αλλάζει το πλαίσιο ανάγνωσης και να δημιουργείται μία εντελώς διαφορετική πρωτεΐνη δ) Σιωπηρές μεταλλάξεις (silent), δηλαδή μεταλλάξεις στις οποίες έχει αντικατασταθεί το τρίτο νουκλεοτίδιο κάποιου κωδικονίου και λόγω του εκφυλισμού του γενετικού κώδικα, η μετάλλαξη αυτή δε συνεπάγεται την αλλαγή κάποιου αμινοξέος κατά τη μετάφραση 60

72 ε) Μεταλλάξεις στις συντηρητικές αλληλουχίες ματίσματος (splicing) ιντρονίων, δηλαδή μεταλλάξεις που επηρεάζουν την ωρίμανση του mrna παρεμποδίζοντας τη σωστή αποκοπή των αλληλουχιών που αντιστοιχούν στα ιντρόνια και την ανασυγκόλληση των αλληλουχιών που αντιστοιχούν στα εξόνια στ) Μεταλλάξεις στους υποκινητές (promoter) των γονιδίωνόπου συνήθως εντοπίζονται σε θέσεις δέσμευσης μεταγραφικών παραγόντων, με αποτέλεσμα τη μείωση της ικανότητας μεταγραφής αυτού του γονιδίου ζ) Μεταλλάξεις στις μη μεταφραζόμενες αλληλουχίες (ιντρόνια) των γονιδίων, με φυσική απόρροια την αποικοδόμηση mrna και τελικά την μειωμένη ικανότητα πρωτεϊνοσύνθεσης. Ως σημειακοί νουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (Single Nucleotide Polymorphisms SNPs), ορίζονται οι διαλληλικές διαφοροποιήσεις σε ποσοστό>1%του πληθυσμού κάθε 1:250 έως 1:300 βάσεις στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Μπορεί να βρίσκονται είτε σε κωδικοποιούσες περιοχές είτε όχι και μπορεί να συνδέονται με νόσημα ή όχι. Οι μεταλλάξεις, θα μπορούσαν επιπροσθέτως να χωρισθούν στις κληρονομούμενες (hereditary) και στις επίκτητες ή αυθόρμητες (acquired or spontaneous). Οι κληρονομούμενες μεταλλάξεις είναι αυτές που μεταβιβάζονται από γενιά σε γενιά, γιατί βρίσκονται στο γενετικό υλικό των γαμετικών κυττάρων (germline mutations), ενώ οι 61

73 επίκτητες ή αυθόρμητες είναι το αποτέλεσμα τυχαίων λαθών στην αντιγραφή του DNA, συναντώνται στα σωματικά κύτταρα και δε μεταβιβάζονται από γενιά σε γενιά. Οι σωματικές μεταλλάξεις (somatic mutations) συνήθως υπάρχουν σε πολύ χαμηλά επίπεδα παρουσία υψηλών επιπέδων φυσιολογικών αλληλουχιών «φυσικού τύπου» (wild-type) που λειτουργούν σαν υπόβαθρο. Για το λόγο αυτό, είναι απαραίτητη η ανάπτυξη μεθόδων με μεγαλύτερη ευαισθησία συγκριτικά με αυτές που χρησιμοποιούνται για ανάλυση μεταλλάξεων στη γαμετική σειρά Τεχνικές ανάλυσης μεταλλάξεων Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται σήμερα για την ανάλυση και τον προσδιορισμό μεταλλάξεων είναι ποικίλες και βασίζονται σε πολλές και διαφορετικές αρχές με πιο σύνηθες κοινό χαρακτηριστικό τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό. Οι τεχνικές ανάλυσης μεταλλάξεων χωρίζονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες σύμφωνα με το αν μπορούν να προσδιορίσουν γνωστές ή άγνωστες μεταλλάξεις. Εάν είναι γνωστό το φάσμα των μεταλλάξεων ενός συγκεκριμένου πληθυσμού θα χρησιμοποιηθούν τεχνικές ανίχνευσης που στοχεύουν σε συγκεκριμένες μεταλλάξεις όπως: 62

74 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLPs, Aνίχνευση μεταλλάξεων με χρήση περιοριστικών ενζύμων): Η τεχνική RFLPs ήταν από τις πρώτες που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση DNA τόσο στη Μοριακή Διαγνωστική, όσο και στη Γενετική. Σήμερα, η χρήση της δεν είναι τόσο ευρεία όσο στο παρελθόν, λόγω της ανακάλυψης νέων τεχνικών, πιο απλών, γρήγορων και ευαίσθητων. Η χρήση περιοριστικών ενζύμων και η εμφάνιση του αποτελέσματος με ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό και την τεχνική της αποτύπωσης ήταν από τις πρώτες προσεγγίσεις για την ανίχνευση μεταλλάξεων. Προσδιορισμός της αλληλουχίας των βάσεων του DNA Maxam&Gilbert Sequencing, Sanger Sequencing: τεχνική προσδιορισμού της αλληλουχίας των βάσεων δεοξυριβονουκλεϊκών οξέων (DNA) και γενικότερα των νουκλεϊκών οξέων (δηλαδή και RNA) 97, 98. Pyrosequencing (Αλληλούχηση DNA σε πραγματικό χρόνο): μέθοδος αλληλούχησης DNA πραγματικού χρόνου (RealtimeDNA-sequencing) σε μικρό τμήμα του DNA που βασίζεται στην ανίχνευση πυροφωσφορικού (PPi) που απελευθερώνεται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης πολυμερισμού του DNA

75 Next Generation Sequencing Sequencing νέας γενιάς: Νεώτερης τεχνολογίας ανάλυση αλληλουχίας DNA η οποία καθιστά δυνατή τη λήψη πληροφοριών για όλο το γονιδίωμα 100. Quantitative PCR (QPCR, Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου με χρήση ανιχνευτών υβριδισμού ή TaqMan): Βασίζεται στην ιχνηθέτηση των προϊόντων της PCR με φθορίζοντα μόρια και την καταγραφή του φθορισμού που εκπέμπεται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR 101. Τα PNAs (Peptide NucleicAcids- Πεπτιδικά Νουκλεϊκά Οξέα) και τα LNAs (Locked Nucleic Acids-«Κλειδωμένα» Νουκλεϊκά Οξέα) είναι ένα είδος ανιχνευτών που χρησιμοποιούνται στην αντίδραση της PCR. Πρόκειται για μία τεχνική που χρησιμοποιεί φυσικές μοριακές ρυθμίσεις για επίτευξη ειδικότητας 102.H ασύμμετρη PCR με χρήση ανιχνευτών υβριδισμού (Asymmetric PCR with probes) είναι μία παραλλαγή της PCR. Η κύρια διαφορά της από τη συνήθη PCR είναι ότι χρησιμοποιούνται άνισες συγκεντρώσεις των δύο εκκινητών 101. Αλληλοειδική ενίσχυση PCR (Αllele Specific Amplification, ASA ή ARMS): Μία άλλη κατηγορία μεθοδολογιών που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση γνωστών μεταλλάξεων είναι αυτές που βασίζονται στην αλληλοειδική ενίσχυση κατά την αντίδραση της PCR (Allele- 64

76 Specific Amplification, ASA). Η αντίδραση της PCR πραγματοποιείται σε δύο παράλληλες αντιδράσεις. ASO (Υβριδισμός με συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια): Τεχνική ανάλυσης γνωστών σημειακών μεταλλάξεων που βασίζεται στο γεγονός ότι τα ολιγονουκλεοτίδια (probes) υβριδίζονται μόνο με αλληλουχίες που παρουσιάζουν απόλυτη συμπληρωματικότητα 101. Μικροσυστοιχίες Ολιγονουκλεοτιδίων DNA (DNA Microarrays): Βασίζεται στον υβριδισμό ιχνηθετημένου RNA ή DNA του προς εξέταση δείγματος με συμπληρωματικά μόρια DNA ακινητοποιημένα σε συγκεκριμένα σημεία επάνω σε μία σταθερή επιφάνεια 101 Σε αντίθετη περίπτωση, θα χρησιμοποιηθούν τεχνικές που μπορούν να προσδιορίσουν οποιαδήποτε μετάλλαξη σαρώνοντας τη γενωμική περιοχή όπως: SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism): Τεχνική απλή και σχετικά γρήγορη για την ανίχνευση άγνωστων μεταλλάξεων, βασίζεται στην ιδιότητα που έχει το μονόκλωνο DNA να σχηματίζει δευτεροταγείς δομές

77 DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή με κλίση αποδιατακτικού): Μέθοδος ανίχνευσης σημειακών μεταλλάξεων που βασίζεται στη διαφορά κινητικότητας που έχει μία νουκλεοτιδική αλληλουχία σε σχέση με μία άλλη όταν κινείται σε πηκτή που περιέχει βαθμίδωση σε αποδιατακτικό (οι δύο συμπληρωματικές αλυσίδες αποδιατάσσονται είτε λόγω αύξησης της θερμοκρασίας είτε λόγω παρουσίας συγκεκριμένων χημικών αποδιατακτικών ουσιών) 101, 103. TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis, Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή με βαθμίδωση θερμοκρασίας): Η μέθοδος TGGE αποτελεί μια παραλλαγή της μεθόδου DGGE, καθώς αντί της χρήσης βαθμίδωσης συγκέντρωσης χημικών αποδιατακτικών, χρησιμοποιείται βαθμίδωση θερμοκρασίας 104. COLD-PCR (Co-amplificationat Lower Temperature, Συνενίσχυση σε χαμηλότερη θερμοκρασία αποδιάταξηςαλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης): Νέα παραλλαγή της κλασικής τεχνικής της PCR που ενισχύει ειδικά και επιλεκτικά μία μετάλλαξη ή γενικότερα ένα μεταλλαγμένο αλλήλιο που βρίσκεται σε χαμηλή συγκέντρωση μέσα σε ένα μείγμα με περίσσεια φυσιολογικών αλληλίων (π.χ σωματική μετάλλαξη), ανεξάρτητα από το είδος της μετάλλαξης ή τη θέση της μέσα στην αλληλουχία

78 PTT (Protein Truncation Test, Δοκιμασία πρόωρου τερματισμού της πρωτεϊνοσύνθεσης): Ανιχνεύει γρήγορα και με αξιοπιστία μη νοηματικές μεταλλάξεις καθώς και μεταλλάξεις που αλλάζουν το πλαίσιο ανάγνωσης 101. D-HPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography, Αποδιατακτική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης): Παραλλαγή της ήδη καταξιωμένης τεχνικής HPLC σε δείγματα PCR. Φασματομετρία Μάζας με Ιοντισμό Εκρόφησης: Χρησιμοποιείται υλικό μήτρας σε συνδυασμό με ανιχνευτή χρόνου πτήσης (Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOFMS): επιτρέπει την αλληλούχηση εκατοντάδων βάσεων σε μερικά μόνο δευτερόλεπτα 106. Τέλος μία τεχνική που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση γνωστών μεταλλάξεων, αλλά και τον έλεγχο ύπαρξης νέων, άγνωστων μεταλλάξεων σε δείγματα είναι η Υψηλής διακριτικότητας ανάλυση καμπυλών τήξεως(high Resolution Melting Curve Analysis). Είναι μια γρήγορη μέθοδος που βασίζεται στην ανάλυση των καμπυλών τήξης των προϊόντων PCR παρουσία ειδικών φθοριζουσών ουσιών, με ειδικά όργανα υψηλής διακριτικής ικανότητας

79 4.3.3 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου και ανάλυση καμπυλών τήξης Η τεχνολογία της PCR σε πραγματικό χρόνο (Real Time PCR) είναι διαθέσιμη εδώ και περισσότερο από δέκα χρόνια, αλλά σημειώνεται μεγάλη αύξηση στην εφαρμογή της τα τελευταία χρόνια 108. Μία μέθοδος ανάλυσης SNPS που προσφέρει ταχύτητα και ακρίβεια στη γονοτύπωση είναι η ανάλυση καμπύλων τήξης (melting curve analysis) κατόπιν ενίσχυσης με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-time PCR). Η τεχνική επιτρέπει γονοτύπωση σε ένα κλειστό τριχοειδές χωρίς να παρεμβάλλονται άλλοι χειρισμοί μετά την PCR, ελαχιστοποιώντας με τον τρόπο αυτό τον κίνδυνο επιμόλυνσης και μειώνοντας τον απαιτούμενο για την ανάλυση χρόνο 109. Η PCR πραγματοποιείται με στόχο τον πολλαπλασιασμό ορισμένης αλληλουχίας ενός υποστρώματος γενωμικού DNA (σχήμα 4.1). Για την πραγματοποίηση της αντίδρασης είναι απαραίτητοι δύο ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές που οριοθετούν την προς ενίσχυση περιοχή, τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dntps-deoxy nucleotide triphosphates), μια θερμοανθεκτική πολυμεράση και ιόντα μαγνησίου. Η PCR πραγματοποιείται με διαδοχικές αλλαγές της θερμοκρασίας (θερμικούς κύκλους). Αρχικά εφαρμόζεται υψηλή θερμοκρασία για το 68

80 διαχωρισμό των δίκλωνων μορίων (denaturation-melting), στη συνέχεια η θερμοκρασία ελαττώνεται ώστε να υβριδοποιηθούν οι εκκινητές στις συμπληρωματικές τους αλληλουχίες (annealing) και τελικά η θερμοκρασία ρυθμίζεται στους 72 C, την ιδανική θερμοκρασία για την αντιγραφή από τη χρησιμοποιούμενη πολυμεράση (extensionelongation). Η θερμοκρασία και η διάρκεια της αποδιάταξης (denaturation) εξαρτάται από το μήκος και την αλληλουχία του υποστρώματος, καθώς και από το όργανο και τα σωληνάρια ή τριχοειδή που χρησιμοποιούνται. Η θερμοκρασία του υβριδισμού (annealing) πρέπει να είναι λίγους βαθμούς χαμηλότερη από τη θερμοκρασία τήξης (Τm) των δύο εκκινητών (οι οποίοι σχεδιάζονται κατά τέτοιο τρόπο ώστε να έχουν παρόμοιες θερμοκρασίες τήξης), έτσι ώστε να σχηματίζονται σταθερά σύμπλοκα εκκινητών- αλληλουχιών στόχων αλλά όχι άλλα μηειδικά σύμπλοκα 101, 109,

81 Εικόνα 7: Αρχή της μεθόδου PCR. A) Τα τρία στάδια ενός κύκλου PCRB) Πολλαπλασιασμός της επιλεγμένης αλληλουχίας σε διαδοχικούς κύκλους PCR 110. Στην PCR πραγματικού χρόνου, τα δεδομένα συλλέγονται κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης του DNA και όχι σε ένα μόνο τελικό σημείο, όπως με τη συμβατική PCR. Η τεχνική χρησιμοποιεί φθορίζοντα μόρια που ιχνηθετούν τα προϊόντα της PCR και οργανολογία που καταγράφει το φθορισμό κατά την πρόοδο της αντίδρασης. Τα δεδομένα που συλλέγονται δίνουν πληροφορίες για την ταυτότητα, ποσότητα και αλληλουχία των ενισχυόμενων τμημάτων DNA 101, 109. Ο μειωμένος κίνδυνος επιμολύνσεων, η ευκολία στη διαχείριση των δειγμάτων, ο περιορισμός των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων, η ελάττωση του συνολικού όγκου αντίδρασης και η μεγάλη ευαισθησία, ακρίβεια και 70

82 επαναληψιμότητα της μεθόδου έχουν συντελέσει στην αύξηση της χρήσης της τόσο στην έρευνα όσο και σε κλινικά εργαστήρια 101, 111. Από κινητικής άποψης, μια αντίδραση PCR μπορεί να θεωρηθεί ότι αποτελείται από τρεις φάσεις: την πρώιμη φάση «υποβάθρου» ή φάση «θορύβου» (background phase), την εκθετική φάση (exponential growth phase) ή λογαριθμική φάση (log phase) και τη φάση κορεσμού (plateau) (σχήμα 4.2). Η φάση του θορύβου διαρκεί έως ότου το σήμα του προϊόντος της PCR γίνει μεγαλύτερο από το σήμα του υποβάθρου του συστήματος. Η φάση της εκθετικής ανάπτυξης ξεκινά μόλις συσσωρευτεί επαρκής ποσότητα προϊόντος, έτσι ώστε να είναι ανιχνεύσιμο πάνω από το θόρυβο και ολοκληρώνεται όταν η απόδοση της αντίδρασης μειωθεί, καθώς η αντίδραση εισέρχεται στη φάση κορεσμού 101, 110 (Εικόνα 8).Ο κορεσμός οφείλεται στην εξάντληση κάποιου κρίσιμου παράγοντα που μπορεί να είναι οι εκκινητές, οι φθορίζοντες ιχνηθέτες (όταν είναι ιχνηθέτες υδρόλυσης) ή τα dntps 112. Πρέπει να σημειωθεί ότι σε ένα τυπικό πείραμα real-time PCR οι καμπύλες όλων των δειγμάτων φθάνουν στο ίδιο επίπεδο κορεσμού και έτσι οι μετρήσεις τελικού σημείου δε δίνουν καμία πληροφορία για την αρχική ποσότητα των μορίων στόχων στο δείγμα. Η διάκριση μπορεί να γίνει ωστόσο στη λογαριθμική φάση, κατά την οποία η πρώτη σημαντική αύξηση του μετρούμενου φθορισμού σχετίζεται με την αρχική ποσότητα του εκμαγείου-στόχου. Με άλλα λόγια ο κύκλος όπου κάθε αντίδραση 71

83 δίνει πρώτη φορά σήμα μεγαλύτερο του σήματος υποβάθρου (κύκλος ουδός-ct:cycle Threshold ή κύκλος ποσοτικοποίησης-cq: CycleQuantification) εξαρτάται από την ποσότητα του DNA-στόχου που υπήρχε στο δείγμα στην αρχή της αντίδρασης. Όσο λιγότερα μόρια περιέχει αρχικά το δείγμα, τόσο περισσότεροι κύκλοι απαιτούνται για την ανίχνευση του σήματος, δηλαδή τόσο μεγαλύτερη είναι η τιμή Cq 101, 110, 111 (Εικόνα 9). 72

84 Εικόνα 8: Η κινητική της αντίδρασης PCR. A) Γραφική παράσταση του αριθμού των DNA αντιγράφων ως προς τον αριθμό των PCR κύκλων, όπου διακρίνονται η φάση θορύβου, η λογαριθμική φάση και η φάση plateau. B) Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων PCR που προκύπτουν μετά από διαφορετικό αριθμό κύκλων PCR

85 Εικόνα 9: Γραφική παράσταση του αριθμού των DNA αντιγράφων ως προς τον αριθμό των PCR κύκλων για δύο δείγματα Α και Β με διαφορετική αρχική ποσότητα μορίων DNA. Η αρχική ποσότητα μορίων DNA του δείγματος Α (qao) είναι μεγαλύτερη από την αυτή του δείγματος Β (qβo) και η υπέρβαση του θορύβου επιτυγχάνεται συντομότερα για το δείγμα Α από ότι για το δείγμα B. Με άλλα λόγια, το Cq του δείγματος Α είναι μικρότερο από το Cq του δείγματος Β

86 Αυτή η εξάρτηση μεταξύ του Cq και του αριθμού των μορίων που αρχικά υπήρχαν στο δείγμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον ποσοτικό προσδιορισμό άγνωστων δειγμάτων. Για δύο δείγματα Α και Β ο λόγος μεταξύ του αριθμού των μορίων του υποστρώματος στα αρχικά δείγματα [Νο]Α και [Νο]Β δίνεται από τη σχέση: Ct όπου Ε η απόδοση της αντίδρασης. Ιδανικά η απόδοση ισούται με 1 και σε κάθε κύκλο τα μόρια της αλληλουχίας στόχου διπλασιάζονται, κάτι που ωστόσο δεν επιτυγχάνεται στα συνήθη πειράματα. Με τη χρήση σειριακών αραιώσεων δειγμάτων πλασμιδιακού ή άλλου DNA που περιέχει την αλληλουχία στόχο είναι δυνατόν να υπολογιστεί η απόδοση και να κατασκευαστεί διάγραμμα βαθμονόμησης με γραμμική παλινδρόμηση μεταξύ των τιμών της αρχικής συγκέντρωσης και των τιμών για κάθε δείγμα με τύπο: όπου k η κλίση της ευθείας και Cq(1) η τιμή Cq για αραιωμένο δείγμα που περιέχει 1 αντίγραφο της αλληλουχίας στόχου 112 (Εικόνα 10). 75

87 Εικόνα 10: Παράδειγμα σχεδιασμού της καμπύλης βαθμονόμησης (standardcurve) με χρήση προτύπων δειγμάτων γνωστής αρχικής συγκέντρωσης. Τα δείγματα ενισχύονται και κατασκευάζεται γραφική παράταση των Cq ως προς τον αρχικό αριθμό μορίων DNA

88 Από την κλίση της καμπύλης υπολογίζεται η απόδοση με τη σχέση: Με βάση το διάγραμμα βαθμονόμησης μπορεί να υπολογισθεί η αρχική συγκέντρωση κάθε άγνωστου δείγματος. Ωστόσο πρέπει να αναφερθεί ότι η απόδοση της αντίδρασης στα βιολογικά δείγματα μπορεί να επηρεαστεί σημαντικά από την παρουσία ποικίλων ουσιών-αναστολέων της PCR, κάτι που δεν λαμβάνεται υπ όψιν στη σχεδίαση της καμπύλης αναφοράς με πρότυπα διαλύματα που δεν περιέχουν αναστολείς. Έτσι, η προετοιμασία των δειγμάτων πρέπει να είναι όσο το δυνατόν καλύτερα βελτιστοποιημένη και προτυποποιημένη 101, 112. Το μεγαλύτερο μέρος της επεξεργασίας των αποτελεσμάτων γίνεται με υπολογιστή που είναι συνδεδεμένος με το εκάστοτε όργανο της PCR σε πραγματικό χρόνο, με τη βοήθεια ειδικών λογισμικών, που επιτρέπουν τη γρήγορη και αξιόπιστη παρουσίαση τους 101. Μια σημαντική παράμετρος της real-time PCR που δεν εξετάσθηκε μέχρι στιγμής είναι η φύση και οι ιδιότητες των φθοριζόντων μορίων ιχνηθετών. Μέχρι σήμερα έχουν χρησιμοποιηθεί αρκετά τέτοια μόρια που εμπίπτουν σε μια από τις ακόλουθες κατηγορίες: χρωστικές που προσδένονται στη διπλή έλικα του DNA (όπως η SYBR Green), ανιχνευτές υβριδισμού DNA (hybridization probes), ανιχνευτές υδρόλυσης διπλής χρωστικής 77

89 (τύπου TaqMan), «μοριακοί φάροι» (molecular beacons) και μόρια «σκορπιοί» 101, 110 (Εικόνα 11). Όλα τα προαναφερθέντα συστήματα ανίχνευσης εκτός των χρωστικών που προσδένονται στη διπλή έλικα, βασίζονται στο φαινόμενο μεταφοράς ενέργειας με φθορισμό (FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer). Το φαινόμενο αυτό βασίζεται στη μεταφορά ενέργειας από ένα ηλεκτρονιακά διεγερμένο μόριο, το φθορισμοφόρο δότη, σε ένα γειτονικό μόριο αποδέκτη, με αποτέλεσμα το μόριο δότης να επιστρέφει στη βασική μη διεγερμένη του κατάσταση. Το φαινόμενο FRET μπορεί να συμβεί μόνο όταν τα δύο μόρια (δότης και δέκτης) βρεθούν σε μια συγκεκριμένη απόσταση, που ονομάζεται ακτίνα Förster, στην οποία η απόδοση της μεταφοράς ενέργειας είναι 50% και εξαρτάται από τις φασματοσκοπικές ιδιότητες των μορίων. Όταν το κατάλληλο ζεύγος δότη-δέκτη βρεθεί στην απαιτούμενη απόσταση, λόγω του φαινομένου FRET το μόριο δότης δεν εκπέμπει πλέον φθορισμό. Εάν το μόριο δέκτης είναι επίσης φθορίζον, εκπέμπει φθορισμό στο χαρακτηριστικό για αυτό μήκος κύματος, οπότε και μπορεί να ανιχνευθεί. Η κύρια προϋπόθεση για να συμβεί κάτι τέτοιο είναι ενέργεια που χάνει το μόριο δότης επιστρέφοντας στη βασική κατάσταση να ταυτίζεται με την ενέργεια που απαιτείται για τη διέγερση του μορίου δέκτη. Με άλλα λόγια το φάσμα απορρόφησης του μορίου δέκτη πρέπει να επικαλύπτει το φάσμα εκπομπής του μορίου δότη

90 Στην παρούσα ερευνητική εργασία έγινε χρήση ανιχνευτών υβριδισμού. Πρόκειται για ανιχνευτές σχεδιασμένους να υβριδοποιούνται ο ένας δίπλα στον άλλον στην υπό ενίσχυση αλληλουχία. Το 3 άκρο του ενός ανιχνευτή είναι επισημασμένο με μια χρωστική, η οποία δρα ως δότης στο φαινόμενο FRET, ενώ το 5 άκρο του δεύτερου ανιχνευτή είναι επισημασμένο με μια χρωστική δέκτη. Στη real-time PCR, η πρώτη χρωστική διεγείρεται από πηγή ακτινοβολίας που υπάρχει στο χρησιμοποιούμενο όργανο και στη συνέχεια εκπέμπει ακτινοβολία σε λίγο μεγαλύτερο μήκος κύματος. Όταν οι δύο χρωστικές βρεθούν κοντά, η εκπεμπόμενη ακτινοβολία διεγείρει τη δεύτερη χρωστική που με τη σειρά της εκπέμπει ακτινοβολία σε ακόμα μεγαλύτερο μήκος κύματος, η οποία και καταγράφεται από το όργανο. Η απόδοση μεταφοράς της ενέργειας μεταξύ των δύο χρωστικών εξαρτάται όπως αναφέρθηκε από την απόσταση μεταξύ τους, η οποία πρακτικά είναι 1-5 νουκλεοτίδια όταν οι ανιχνευτές υβριδοποιούνται στην αλληλουχία-στόχο και σε διάταξη «κεφαλή-ουρά». Η μέτρηση της έντασης του φθορισμού πραγματοποιείται σε κάθε κύκλο μετά το στάδιο του υβριδισμού και η αύξησή της κατά την πρόοδο της αντίδρασης είναι ανάλογη με την αύξηση της ποσότητας της ενισχυόμενης αλληλουχίας. Ενίοτε, είναι χρησιμότερο να λαμβάνονται οι λόγοι των σημάτων της χρωστικής που λειτουργεί ως δέκτης (τα οποία συνεχώς αυξάνουν) προς τα σήματα της χρωστικής που λειτουργεί ως δότης (τα οποία συνεχώς φθίνουν). 79

91 Οι ανιχνευτές υβριδισμού παρέχουν μεγάλη ευαισθησία και εξειδίκευση στην ταυτοποίηση των προϊόντων της PCR, ακόμα και στις περιπτώσεις που τα προς προσδιορισμό δείγματα περιέχουν μικρό αριθμό προσδιοριζόμενων μορίων 109, 110. Οι ανιχνευτές υβριδισμού παίζουν σημαντικό ρόλο και στη γονοτύπωση που επιτυγχάνεται εν συνεχεία με την ανάλυση των καμπύλων τήξης. H ανάλυση αυτή βασίζεται στο γεγονός ότι κάθε μόριο δίκλωνου DNA έχει τη δική του ειδική θερμοκρασία τήξης (Tm), η οποία ορίζεται ως η θερμοκρασία στην οποία το 50% των μορίων DNA παραμένει δίκλωνο και το 50% γίνεται μονόκλωνο (Εικόνα 12). Η τιμή της Tm εξαρτάται από το μήκος μιας αλληλουχίας, την περιεκτικότητά της σε ζεύγη γουανίνης-κυτοσίνης και την παρουσία λάθος ζευγαρώματος βάσεων (mismatch)

92 Εικόνα 11: Διαφορετικοί τύποι φθοριζόντων μορίων ιχνηθετών που χρησιμοποιούνται σε αντιδράσεις PCR πραγματικού χρόνου. Α) SybrGreen, B) ανιχνευτές υδρόλησης, C) ανιχνευτές υβριδισμού, D) μοριακοί φάροι

93 Εικόνα 12: Γραφική παράσταση της έντασης φθορισμού ως προς τη θερμοκρασία σε πειράματα ανάλυσης καμπύλης τήξης. Με την αύξηση της θερμοκρασίας τα δίκλωνα μόρια αποδιατάσσονται με αποτέλεσμα τη μείωση της καταγραφόμενης έντασης φθορισμού. Χαρακτηριστική για κάθε αλληλουχία είναι η θερμοκρασία τήξης Tm, στην οποία το 50% των μορίων DNA παραμένει δίκλωνο και το 50% γίνεται μονόκλωνο. 82

94 H ανάλυση καμπύλων τήξης ακολουθεί την ενίσχυση με real-time PCR. Aρχικά εφαρμόζεται υψηλή θερμοκρασία για την αποδιάταξη των δίκλωνων μορίων, στη συνέχεια η θερμοκρασία ελαττώνεται ώστε να επιτευχθεί υβριδισμός των ανιχνευτών στις συμπληρωματικές τους αλληλουχίες και τελικά η θερμοκρασία αυξάνεται σταδιακά ώστε να προσδιορισθούν τα Tm των δίκλωνων μορίων με ταυτόχρονη συνεχή μέτρηση της έντασης του φθορισμού. Είναι σημαντικό για τη λήψη αξιόπιστων αποτελεσμάτων να σχηματισθούν κατά το δυνατόν περισσότερα διμερή αλληλουχίας στόχου-ανιχνευτών και λιγότερα δίκλωνα PCR προϊόντα. Σε αυτό μπορεί να βοηθήσει η εφαρμογή μεθοδολογίας ασύμμετρης PCR 113 και η χρήση πολυμερασών που δε διαθέτουν ικανότητα 5 εξωνουκλεάσης 109. Στην περίπτωση που εξετάζεται ένας SNP στην ενισχυμένη αλληλουχία, σχεδιάζονται κατάλληλοι ανιχνευτές, ένας εκ των οποίων υβριδίζεται σε περιοχή που περιλαμβάνει την πολυμορφική θέση. Γενικά ο ανιχνευτής μπορεί να είναι συμπληρωματικός είτε για το φυσιολογικό είτε για το μεταλλαγμένο αλλήλιο. Σε χαμηλή θερμοκρασία ο ανιχνευτής αυτός υβριδοποιείται και στα δύο αλλήλια. Με τη βραδεία αύξηση της θερμοκρασίας, ο ανιχνευτής αποδιατάσσεται αρχικά από το αλλήλιο με το οποίο δεν είναι απόλυτα συμπληρωματικός και σε υψηλότερη θερμοκρασία και από το έτερο αλλήλιο. Καλά σχεδιασμένοι ανιχνευτές 83

95 μπορούν να επιτύχουν διαφορά στην Tm της τάξης των 8-10 C για μία μόνο αλλαγή βάσης στην περιοχή υβριδοποίησης του ανιχνευτή. Η μείωση του μετρούμενου σήματος φθορισμού που προκύπτει από την ελάττωση του αριθμού των υβριδισμένων ανιχνευτών, παράγει τις χαρακτηριστικές καμπύλες τήξης καμπύλες τήξης για τους ομοζυγώτες φυσιολογικούς, τους ετεροζυγώτες και τους ομοζυγώτες μεταλλαγμένους. Η αρνητική πρώτη παράγωγος παρέχει καλύτερη οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων 109, 114 (Εικόνα 13). 84

96 Εικόνα 13:Σχηματική αναπαράσταση γονοτύπωσης με ανάλυση καμπύλων τήξης με χρήση ανιχνευτών υβριδισμού. Στο παράδειγμα ο ανιχνευτής είναι συμπληρωματικός του φυσιολογικού αλληλίου. Κατά την αύξηση της θερμοκρασίας ο ανιχνευτής αυτός αποδιατάσσεται ταχύτερα από το μεταλλαγμένο αλλήλιο, αφού η παρουσία του λάθος ζευγαρώματος στην πολυμορφική θέση μειώνει την Τm του δίκλωνου μορίου. Η αποδιάταξη έχει ως αποτέλεσμα την απομάκρυνση των δύο ανιχνευτών, μεταξύ των οποίων δεν εκδηλώνεται πλέον το φαινόμενο FRET. Έτσι η μετρούμενη ένταση φθορισμού μειώνεται. Η αποδιάταξη και η συνεπακόλουθη μείωση της έντασης φθορισμού για το φυσιολογικό αλλήλιο επέρχεται σε υψηλότερη θερμοκρασία

97 Προσδιορισμός της αλληλουχίας των βάσεων DNA (DNAsequencing) Πρόκειται για μία τεχνική προσδιορισμού της αλληλουχίας των βάσεων δεοξυριβονουκλεϊκών οξέων (DNA) και γενικότερα των νουκλεϊκών οξέων (δηλαδή και RNA). Ένας σημαντικός σταθμός στην ανάλυση των νουκλεϊκών οξέων έγινε το 1977 όταν περιγράφηκε για πρώτη φορά από τους Maxam & Gilbert 97 μια μέθοδος ανάλυσης της αλληλουχίας του DNA με χημική αποικοδόμηση των βάσεων. Αργότερα το ίδιο έτος, προτάθηκε από τον Sanger 98 και τους συνεργάτες του μια ενζυμική μέθοδος για την ανάγνωση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας βασιζόμενη στον πρόωρο τερματισμό της νουκλεϊκής σύνθεσης. Σήμερα, οι δύο αυτές μέθοδοι έχουν υποστεί αρκετές τροποποιήσεις (δημιουργία διάφορων πρωτοκόλλων), οι βασικές τους αρχές όμως εξακολουθούν να παραμένουν αναλλοίωτες. Όλα τα σύγχρονα αυτοματοποιημένα μηχανήματα ανάλυσης του DNA (DNA sequencers) στηρίζονται κυρίως στην εφαρμογή της μεθόδου του Sanger. H μέθοδος των Maxam&Gilbert βασίζεται στην ιδιότητα ορισμένων χημικών ενώσεων, όπως η υδραζίνη, το διμεθυλοθειϊκό (DMS) ή το φορμικό οξύ, να μπορούν να τροποποιήσουν τις βάσεις του DNA εντός του μορίου αυτού 97. Το DNA που προορίζεται για ανάλυση/ανάγνωση, επισημαίνεται με κάποιο ραδιοϊσότοπο σε ένα από τα 3, 5 άκρα του, και ακολούθως με τη βοήθεια των προαναφερθέντων χημικών 86

98 ενώσεων, τροποποιείται σε τέσσερις διαφορετικές αντιδράσεις -σε κάθε μία εκ των οποίων χρησιμοποιείται ένα από τα παραπάνω αντιδραστήρια- σε συγκεκριμένη βάση για κάθε αντίδραση. Ακολούθως προστίθεται το αντιδραστήριο πιπεριδίνη, το οποίο καταλύει το σπάσιμο του φωσφοδιεστερικού δεσμού στο σημείο της τροποποιημένης βάσης. Ακολουθεί ο διαχωρισμός των παραγόμενων προϊόντων με ηλεκτροφόρηση σε ειδική πηκτή πολυακρυλαμιδίου μεγάλης διαχωριστικής ικανότητας και κατόπιν αυτοραδιογραφία σε φιλμ. Με αυτό τον τρόπο, εμφανίζονται ολιγονουκλεοτιδικά προϊόντα τα οποία έχουν ως αρχή το επισημασμένο άκρο και τερματίζουν σε όλες τις δυνατές ανά είδος βάσεις σε κάθε μία από τις τέσσερεις διαφορετικές αντιδράσεις (Εικόνα 14). Η μέθοδος των Maxam&Gilbert παρουσιάζει αρκετές δυσκολίες από πλευράς εκτέλεσης, ενώ τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται είναι τοξικά και ασταθή. Παρ όλα αυτά όμως, παρουσιάζει κάποια πλεονεκτήματα συγκριτικά με τη μέθοδο του Sanger: α) δε χρειάζεται να προηγηθεί αντίδραση PCR έτσι ώστε να ενισχυθεί η αλληλουχία που πρόκειται να αναλυθεί β) αναλύει απευθείας τμήματα γενωμικού DNA, χωρίς να απαιτείται ενζυμική ενίσχυση κατά την οποία ενδέχεται να συμβούν λάθη γ) η πιθανότητα να συμβούν λάθη λόγω δευτεροταγών δομών της αλληλουχίας που αναλύεται είναι πολύ περιορισμένη

99 Εικόνα 14: Αρχή της χημικής μεθόδου DNA sequencing κατά Maxam & Gilbert 101. Η μέθοδος των Maxim και Gilbert έχει χρησιμοποιηθεί σε διάφορες περιπτώσεις όπως: α) αλληλούχηση γενωμικού DNA με παράλληλη εξαγωγή πληροφοριών σχετικά με τη μεθυλίωση του DNA καθώς και τη δομή της χρωματίνης 116 β) ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων 117 γ) επιβεβαίωση της αλληλουχίας συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων ή περιοχών DNA με δομές φουρκέτας ή θηλιάς 118. Η τεχνική του Sequencing κατά Sanger είναι μία διαδικασία με την οποία επιτυγχάνεται η αλληλούχηση τμημάτων DNA που συνήθως είναι προϊόντα μιας αντίδρασης PCR που έχει προηγηθεί. Βασίζεται στην παρουσία στο μείγμα της αντίδρασης δι-δεοξυνουκλεοτιδίων (dideoxynucleotide, ddntps) και των τεσσάρων αζωτούχων βάσεων (Α, Τ, G, C), τα οποία όταν τοποθετηθούν στη νεοσυντιθέμενη αλυσίδα από τη DNA-πολυμεράση, τότε η σύνθεση της νέας αλυσίδας διακόπτεται και 88

100 το συγκεκριμένο δι-δεοξυνουκλεοτίδιο σηματοδοτεί τον τερματισμό της αλυσίδας. Αυτό συμβαίνει διότι, τα δι-δεοξυνουκλεοτίδια στερούνται της υδροξυλομάδας στην 3 θέση του δακτυλίου της δεοξυριβόζης. Λόγω της έλλειψης αυτής της υδροξυλομάδας, αφού η πολυμεράση τοποθετήσει αυτό το δι-δεοξυνουκλεοτίδιο στην αλυσίδα που συντίθεται, δεν μπορεί πια να τοποθετήσει άλλο νουκλεοτίδιο στη συνέχεια γιατί δεν είναι εφικτό να σχηματιστεί ο φωσφοδιεστερικός δεσμός μεταξύ των νουκλεοτιδίων. Ο σχηματισμός του φωσφοδιεστερικού δεσμού απαιτεί την παρουσία μιας 3 -υδροξυλομάδας από το ήδη υπάρχον τελευταίονουκλεοτίδιο και μιας 5 -φωσφορικής ομάδας από το «επόμενο» νουκλεοτίδιο που θα τοποθετηθεί στην αλυσίδα. Πραγματοποιούνται τέσσερις σειρές τέτοιων αντιδράσεων όπου στην καθεμία χρησιμοποιείται ένα από τα τέσσερα δι-δεοξυνουκλεοτίδια. Μετά το τέλος όλης της διαδικασίας προκύπτουν τμήματα DNA των οποίων το μέγεθος εξαρτάται από το σημείο όπου τοποθετήθηκε το διδεοξυνουκλεοτίδιο. Τα τμήματα αυτά αναλύονται με ηλεκτροφόρηση κατά την οποία επιβεβαιώνεται το μήκος τους 98 (Εικόνα 15). Οι πληροφορίες αυτές συνδυάζονται και προκύπτει η πλήρης αλληλουχία των αζωτούχων βάσεων στο τμήμα του DNA που μας ενδιαφέρει. Έτσι μπορούμε να ανιχνεύσουμε αν σε κάποια θέση υπάρχει μετάλλαξη ή αν πρόκειται για φυσιολογικό DNA. 89

101 Εικόνα 15: Αρχή ενζυμικής μεθόδου DNA sequencing κατά Sanger 101. Παρά το γεγονός ότι, η μέθοδος του Sanger για DNA sequencing είναι ο πιο αξιόπιστος τρόπος για τον ακριβή προσδιορισμό της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων ενός τμήματος DNA και έχει χαρακτηριστεί ως το «χρυσό πρότυπο» (gold standard) μεταξύ όλων των μεθόδων ανίχνευσης μεταλλάξεων, δυστυχώς χαρακτηρίζεται από σχετικά χαμηλή ευαισθησία που κυμαίνεται περίπου στο 5-20%. Αυτό σημαίνει ότι η μέθοδος αυτή δε μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ανίχνευση π.χ σωματικών μεταλλάξεων σε αλλήλια που βρίσκονται σε πολύ χαμηλή συγκέντρωση μέσα στο δείγμα και παρουσία περίσσειας φυσιολογικών αλληλίων. Υπάρχει δηλαδή κίνδυνος πολλά δείγματα που φέρουν τη μετάλλαξη να χαρακτηριστούν ως φυσιολογικά (ψευδώς αρνητικά). Κατά την ανάλυση μεταλλάξεων με τη χρήση αυτόματου DNA sequencer, οι σημειακές μεταλλάξεις φαίνονται σαν δύο αλληλοεπικαλυπτόμενες κορυφές εξαιτίας της ύπαρξης και του 90

102 φυσιολογικού νουκλεοτιδίου στο αλληλόμορφο γονίδιο. Για μεταλλάξεις που προκαλούν αλλαγή στο πλαίσιο ανάγνωσης (προσθήκες ή απαλοιφές), υπάρχει εμφάνιση διπλών κορυφών από το σημείο της αλλαγής και μέχρι το τέλος του γραφήματος. Οι διπλές κορυφές είναι ισοϋψείς μόνο σε περίπτωση ετεροζυγωτίας, δηλαδή σε περίπτωση που η μετάλλαξη υπάρχει στο ένα από τα δύο αλληλόμορφα γονίδια (και συνεπώς στο 50% όλων των μορίων DNA). Με αυτόν το τρόπο, παρουσιάζονται οι κληρονομούμενες μεταλλάξεις 119. Η τροποποίηση της μεθόδου Sanger με την αντικατάσταση της ραδιενεργούς σήμανσης από φθορίζουσες χρωστικές κατέστησε δυνατή την αυτοματοποίηση του DNA sequencing και τον ταχύ και αξιόπιστο προσδιορισμό της αλληλουχίας των βάσεων του DNA με τη χρήση ειδικών αυτοματοποιημένων οργάνων (DNA Sequencers). Το προς ανάλυση δείγμα υπόκειται αρχικά σε ενίσχυση με συμβατική PCR με κατάλληλους εκκινητές, η οποία ακολουθείται από τη μέθοδο των θερμικών κύκλων (cycle sequencing). Σε αυτή το προϊόν PCR, αφού προηγουμένως καθαρισθεί με στήλες ή με ενζυμική κατεργασία με Exo SAP-IT (Affymetrix, ΗΠΑ), αντιγράφεται με χρήση της Taq πολυμεράσης παρουσία ενός εκκινητή, dntps και επισημασμένων με φθορίζουσες χρωστικές ddntps. Τα διαφορετικού μεγέθους τμήματα που παράγονται, εισάγονται στη συνέχεια στο DNA sequencer, όπου πραγματοποιείται η ηλεκτροφόρηση σε ειδικά τριχοειδή στα οποία διοχετεύεται ειδικό πολυμερές που αναγεννάται μετά το πέρας της 91

103 αντίδρασης. Εφ όσον τα φάσματα της εκπομπής των τεσσάρων χρωστικών δεν αλληλεπικαλύπτονται τότε με μια οπή στο τέλος του τριχοειδούς και το κατάλληλο laser και ανιχνευτή είναι δυνατόν να ανιχνεύονται τα σήματα φθορισμού που προκύπτουν από τις τέσσερις χρωστικές σε ένα μόνο πέρασμα στο ίδιο τριχοειδές. Τα σήματα αντιστοιχίζονται σε καμπύλες με διαφορετικά χρώματα και στη συνέχεια «μεταφράζονται» σε βάσεις DNA με κατάλληλο λογισμικό 101, 120. Τέλος, με τον όρο Next Generation Sequencing (NGS) περιγράφονται οι νεότερες και ταχύτερες τεχνολογίες ανάλυσης αλληλουχίας DNA οι οποίες καθιστούν δυνατή τη λήψη πληροφοριών για τη γενωμική αλληλουχία σε ένα επίπεδο που ήταν παλιότερα αδιανόητο. Οι νέες τεχνολογίες γενετικής ανάλυσης δεν είναι μόνο ευέλικτες, αλλά χαρακτηρίζονται και από ικανοποιητικές αποδόσεις και αρκετά χαμηλό κόστος ώστε να επεξεργάζονται το μεγάλο αριθμό των δειγμάτων που απαιτούνται για να ληφθούν στατιστικώς σημαντικές πληροφορίες. Η πληροφορία που προκύπτει από το NGS τροφοδοτεί ένα παγκόσμιο υπολογιστικό σύστημα που λειτουργεί χάρη σε μεγάλους παρόχους βιοπληροφορικών υπηρεσιών. Η πληροφορία αυτή αποτελεί τη βάση για εκτενέστερες σειρές ερμηνείας, όπως η ομαδοποίηση σε πλήρη γονιδιώματα, ο σχολιασμός της δομής γονιδίων καθώς και η χαρτογράφηση ως προς ήδη γνωστά πρότυπα γονιδιώματα και μεταγραφήματα προκειμένου για ποσοτική ανάλυση έκφρασης. Οι εναλλακτικές στρατηγικές του Next Generation DNA sequencing 92

104 μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε 4 επιμέρους κατηγορίες: α) μικροηλεκτροφορητικές μεθόδους, β) sequencing με υβριδισμό, γ) με παρατήρηση μορίων σε πραγματικό χρόνο και δ) με sequencing κυκλικών συστοιχιών 121. H πλέον διαδεδομένη μέθοδος NGS είναι αυτή των κυκλικών συστοιχιών η οποία συγκεντρώνει τα εξής πλεονεκτήματα: 1) η in vitro κατασκευή της βιβλιοθήκης, ακολουθούμενη από in vitro ενίσχυση των κλώνων, ώστε να παραχθούν οι αποικίες παρακάμπτει αρκετές δυσχέρειες που δεν επιτρέπουν την παράλληλη ανάλυση με τη συμβατική μέθοδο. 2) το sequencing που βασίζεται στις συστοιχίες επιτρέπει σε μεγαλύτερο βαθμό την παράλληλη ανάλυση σε σχέση με το συμβατικό sequencing των τριχοειδών. Καθώς το μέγεθος των αποικιών μπορεί να είναι της τάξης του ενός μικρομέτρου, εκατοντάδες εκατομμυρίων αποικιών μπορούν να χρησιμοποιηθούν παράλληλα για το διάβασμα της αλληλουχίας σε μία μικρή επιφάνεια. 3) επειδή οι αποικίες είναι ακινητοποιημένες σε μια επίπεδη επιφάνεια, μπορούν να προσεγγιστούν από τα ένζυμα από μικρό όγκο αντιδραστηρίων. Συλλογικά, όλα αυτά μεταφράζονται σε δραματικά μικρότερο κόστος για την προετοιμασία του DNA sequencing 121. Όμως από την άλλη πλευρά δεν παύουν να υπάρχουν και ορισμένα μειονεκτήματα. Τα πλέον σημαντικά από αυτά συνιστούν το μέγεθος του 93

105 πλαισίου ανάγνωσης (για όλες τις νέες πλατφόρμες, τα μεγέθη αυτά παραμένουν πολύ μικρότερα σε σχέση με τα αντίστοιχα του συμβατικού sequencing), καθώς και η ακρίβεια (κατά μέσο όρο, οι νέες πλατφόρμες είναι τουλάχιστον δέκα φορές λιγότερο ακριβείς σε σχέση με τις πλατφόρμες τύπου Sanger)

106 4.3.5 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ DNA Ιδανικά η αιμοληψία γίνεται σε δύο EDTA σωληνάρια των 3 ml για κάθε ασθενή έτσι ώστε εάν βρεθεί μετάλλαξη να επιβεβαιωθεί και στο δεύτερο σωληνάριο. Εάν δεν υπάρχουν σωληνάρια EDTA χρησιμοποιούνται και σωληνάρια με κιτρικό νάτριο με ή χωρίς δεξτρόζη χωρίς διαφορά στην ποιότητα του απομονωθέντος DNA, ενώ καλύτερα να αποφεύγονται τα σωληνάρια με ηπαρίνη. Από το αίμα απομονώνεται γενωμικό DNA, το οποίο φυλάσσεται στους -20 ο C. Αν δεν είναι δυνατή η άμεση απομόνωση του DNA, τότε είτε απομονώνεται τουλάχιστον η στιβάδα των μονοπύρηνων λευκοκυττάρων (buffycoat) και φυλάσσεται στους -20 ο C, είτε το ίδιο το αίμα φυλάσσεται στους -20 ο C και όταν αποψυχθεί φυγοκεντρείται δύο φορές για 10 min στα rpm με 6 ml φυσιολογικού ορού ή PBS και γίνεται η απομόνωση γενωμικού DNA στο κυτταρικό ίζημα. Για την απομόνωση γενωμικού DNA έγινε χρήση ειδικών στηλών με ρητίνη. Συγκεκριμένα στην εργασία η απομόνωση και ο καθαρισμός του γενωμικού DNA έγινε με τις στήλες QIAamp των προπαρασκευασμένων αντιδραστηρίων (kit) QIAamp DNA Blood Mini Kits (QIAGEN, Hilden, Germany). Με τις στήλες αυτές το ολικό DNA (γενωμικό, μιτοχονδριακό, ιϊκό) μπορεί να απομονωθεί και να καθαρισθεί από το ολικό αίμα, πλάσμα, ορό, buffy coat, μυελό των οστών, λεμφοκύτταρα, 95

107 καλλιεργημένα κύτταρα και άλλα βιολογικά υγρά και δείγματα. Μπορεί να γίνει ταυτόχρονη επεξεργασία πολλών δειγμάτων και να απομονωθεί καθαρό και με μεγάλη απόδοση DNA (έτοιμο για αντιδράσεις PCR) εντός 20 min. Η αρχή μεθόδου απομόνωσης στηρίζεται στην ειδική σύσταση των μεμβρανών στης στήλης QIAamp από οξείδιο του πυριτίου (silica gel). Οι στήλες αυτές με την χρήση ειδικών ρυθμιστικών διαλυμάτων για έκπλυση και ρύθμιση του ph, κατάλληλων συγκεντρώσεων αλάτων και διαδοχικών φυγοκεντρήσεων, κατακρατούν από το κυτταρικό εκχύλισμα μόνο το DNA, το οποίο προσροφάται μέσω ενός έντονου σταδίου φυγοκέντρησης πάνω στην πυριτική μεμβράνη, ενώ οι πρωτεΐνες και άλλες προσμίξεις διαπερνούν τη στήλη. Το DNA που απομονώνεται με αυτόν τον τρόπο εκλούεται σε απεσταγμένο νερό και είναι έτοιμο για αντιδράσεις PCR ή άλλες ενζυματικές διαδικασίες ή αποτύπωση κατά Southern καθώς είναι καθαρό και ελεύθερο πρωτεϊνών, νουκλεασών, παρεμποδιστών της PCR καθώς και καταλοίπων φαινόλης ή αλκοόλης. Το μήκος του DNA που απομονώνεται με τα QIAamp Kits κυμαίνεται έως 50kb με ως επι το πλείστον τμήματα των kb. Είναι σημαντικό ότι το DNA αυτού του μήκους αναδιατάσσεται πλήρως στην αντίδραση PCR. Μακροπρόθεσμα το DNA φυλάσσεται καλύτερα στους -20 ο C. 96

108 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ-ΥΛΙΚΑ-ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ Ένζυμο πρωτεάση (QIAGEN, Γερμανία) Λυτικό διάλυμα ATL (QIAGEN, Γερμανία) Λυτικό διάλυμα AL με χαοτροπικό άλας (QIAGEN, Γερμανία) Ρυθμιστικό διάλυμα AW1 (QIAGEN, Γερμανία, προστίθεται EtOH) Ρυθμιστικό διάλυμα AW2 (QIAGEN, Γερμανία,προστίθεται EtOH) Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών PBS (PhosphateBufferedSaline) Φικόλη (Seromed, d = 1,077g/L) Φυσιολογικός ορός (0,9 % NaCl) Απόλυτος αιθανόλη EtOH ( Merck, Γερμανία) Απεσταγμένο και αποστειρωμένο Η2Ο, ελεύθερο νουκλεασών και πυρετογόνων Φυγόκεντρος (Labofuge 400, Heraeus,Thermo Fisher, ΗΠΑ) Επωαστήρας σωληναρίων (Grant, Αγγλία) Συσκευή Vortex (Fisher, ΗΠΑ) Πιπέτες ακριβείας 0,1 20 μl και μl (Gilson, ΗΠΑ) Μικροφυγόκεντρος (Minispinplus, Eppendorf, Γερμανία) 97

109 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ 1. Αν η πειραματική διαδικασία αφορά κυτταρικό ίζημα από αποψυχθέν αίμα τότε επωάζεται με 180 μl λυτικού διαλύματος ATL και 20 μl πρωτεϊνάσης K ολονύκτια στους 56 ο C στον κλίβανο. 2. Η πειραματική διαδικασία μπορεί να ξεκινήσει από 200 μl ολικού αίματος ωστόσο καλύτερα για μεγαλύτερες αποδόσεις απομονώνεται η στιβάδα των μονοπύρηνων λευκοκυττάρων μετά από φυγοκέντρηση του σωληναρίου για 10 min στα 3500rpm και ακολουθεί συλλογή της λευκής στιβάδας των λευκοκυττάρων μαζί με ερυθροκύτταρα σε πλαστικό σωληνάριο Eppendorf του 1,5 ml. Επίσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν απομονωθέντα λεμφοκύτταρα (5 x 10 6 ) μετά από επιστίβαση ολικού αίματος (αραιωμένου 1:1 με PBS) σε φικόλη και ήπια φυγοκέντρηση στα rpm για 20 min. Αποχύνεται το πλάσμα με προσοχή ώστε να μην συλλέχθούν ερυθροκύτταρα και στη συνέχεια επακολουθεί έκπλυση δύο φορές με PBS. Χρησιμοποιούνται 200 μl από το buffycoat ή τα απομονωθέντα λεμφοκύτταρα ενώ σε δείγματα μικρότερου όγκου προστίθεται ποσότητα PBS έως τα 200 μl. 3. Προσθήκη 20 μl πρωτεάσης ( εάν ξεκινάμε από το στάδιο 2). 4. Προσθήκη 200 μl λυτικού διαλύματος AL στο δείγμα. Άμεση ανάδευση σε vortex για 15 sec (να μην προπαρασκευάζεται διάλυμα ενζύμου / AL καθώς αυτοαποικοδομείται το ένζυμο εάν παραμείνει για μεγάλο διάστημα χωρίς προσθήκη δείγματος). 98

110 5. Επώαση στους 70 ο C για 10 min στον επωαστήρα σωληναρίων. 6. Προσθήκη 210 μl απόλυτης αιθανόλης στο δείγμα και ανάμιξη με vortex. 7. Τοποθέτηση μιας QIAampspin στήλης σε ένα σωληνάριο συλλογής. Προσεκτική ένεση του μίγματος του σταδίου 4 στην QIAampspin στήλη χωρίς να υγρανθεί το χείλος της, κλείσιμο του πώματος και φυγοκέντρηση στα xg (8.000 xrpm) για 1 min σε θερμοκρασία δωματίου. Τοποθέτηση της QIAampspin στήλης σε ένα καθαρό πλαστικό σωληνάριο συλλογής των 2 ml και απόρριψη του σωληναρίου που περιέχει το διήθημα. 8. Προσεκτικό άνοιγμα της QIAampspin στήλης και προσθήκη 500 μl του ρυθμιστικού διαλύματος AW1. Φυγοκέντρηση στα xg (8.000 xrpm) για 1 min. Τοποθέτηση της QIAampspin στήλης σε ένα καθαρό πλαστικό σωληνάριο συλλογής των 2 ml και απόρριψη του σωληναρίου που περιέχει το διήθημα. 9. Προσεκτικό άνοιγμα της QIAamp spin στήλης και προσθήκη 500 μl του ρυθμιστικού διαλύματος AW2. Φυγοκέντρηση στη μέγιστη ταχύτητα xg ( rpm) για 3 min ώστε να μην μείνουν υπολείμματα αιθανόλης στη στήλη. 10. Τοποθέτηση της QIAamp spin στήλης σε ένα καθαρό πλαστικό σωληνάριο συλλογής των 1,5 ml και απόρριψη του σωληναρίου που περιέχει το διήθημα. 99

111 11. Προσεκτικό άνοιγμα της QIAamp spin στήλης. Έκλουση του DNA με 200 μl απεσταγμένου ύδατος προθερμασμένο στους 70 ο C. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 min και φυγοκέντρηση στα xg (8.000 xrpm) για 1 min. 12. Επαναφορά του εκχυλίσματος στη στήλη και επώαση της στήλης για 5 min στους 70 ο C σε επωαστήρα σωληναρίων (ή σε κλίβανο) και φυγοκέντρηση στα xg (8.000 xrpm) για 1 min. 13. Το DNA που απομονώνεται με αυτόν τον τρόπο περιέχει και RNA το οποίο εάν δεν είναι επιθυμητό μπορούμε να το κατεργαστούμε με RNaseA στο στάδιο ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ DNA Ο ποσοτικός προσδιορισμός του DNA έγινε φθορισμομετρικά από τον αναλυτή Qubit Fluorimeter της εταιρείας Invitrogen (ΗΠΑ), χρησιμοποιώντας το Quant-iT dsdnahsassaykit (Εικόνα 16). Το Kit αυτό μπορεί να μετρήσει ποσοτικά γενωμικό DNA, ϊικό dsdna καθώς και PCR προϊόντα. Η ποσότητα του δείγματος που μπορεί να χρησιμοποιηθεί είναι από 1 έως 20μl, ενώ τα όριο ανίχνευσης είναι 10pg/μl. Η πειραματική διαδικασία μπορεί να γίνει σε θερμοκρασία δωματίου (22-28 ο C) ενώ η φωτοσταθερότητα των αντιδραστηρίων είναι υψηλή. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 1μl δείγματος σε 100

112 σωληνάρια PCR των 0.5ml, με καινούρια βαθμονόμηση για κάθε χρήση του. Εικόνα 16: Φωτογραφία Qubit φθορισμομέτρου. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA γίνεται με βάση την καμπύλη αλγορίθμου χρησιμοποιώντας πρότυπα διαλύματα συγκέντρωσης 0 ng/ml και 100 ng/ml. Τέλος το Qubit fluorometer δίνει τις τιμές των συγκεντρώσεων είτε σε μg/ml είτε σε ng/ml. Για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης χρησιμοποιείται η σχέση : C = QFvaluex (200) / n Όπου QF value= η τιμή που δίνεται στον αναλυτή n = ο αριθμός των μl του δείγματος που χρησιμοποιήθηκαν. 101

113 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ-ΥΛΙΚΑ-ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ Πιπέτες (Thermo, Fisher, ΗΠΑ) των 10μl και 200μl Ρύγχη των 10μl και 200μl Σωληνάρια των 500μl Αντιδραστήρια dsdnabr βαθμονομητής 1 (0 ng/μl), dsdnabr βαθμονομητής 2 (100ng/ μl), ds ρυθμιστικό διάλυμα DNABR και dsdnabr αντιδραστήριο (παρέχονται από το QuantiTdsDNABRAssayKit, Q32850) Συσκευή Vortex (Fisher, ΗΠΑ) ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ Αρχικά αφήνουμε όλα τα διαλύματα να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου. 1. Προστίθενται 190 xn ( n= αριθμός δειγμάτων) μl αντιδραστηρίου dsdnabr και 10 μl αντιδραστηρίου dsdnabr αντιδραστηρίου σε σωληνάριο eppendorf. 2. Από το παραπάνω διάλυμα λαμβάνονται 199μl για κάθε δείγμα, τοποθετούνται σε νέο σωληνάριο eppendorfs και προστίθεται 1μl δείγματος DNA. 102

114 3. Ακολουθεί ανάδευση του διαλύματος και τοποθέτηση στο φθορισμόμετρο ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΗ ΑΓΑΡΟΖΗΣ Η ηλεκτροφόρηση είναι η πιο κοινή τεχνική ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων. Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό, την ταυτοποίηση και την απομόνωση τμημάτων DNA που συντίθενται κατά την PCR. Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στο γεγονός ότι τόσο το DNA όσο και το RNA είναι αρνητικά φορτισμένα σε ουδέτερο ph λόγω των φωσφορικών ομάδων τους και κατά συνέπεια θα μετακινηθούν προς την άνοδο (το θετικά φορτισμένο ηλεκτρόδιο) όταν εφαρμοσθεί ηλεκτρικό πεδίο. Ο διαχωρισμός των νουκλεϊκών οξέων επιτυγχάνεται ανάλογα με το μοριακό τους βάρος όταν αυτά ηλεκτροφορηθούν σε γέλη πολυμερούς. Η ταχύτητα μετακίνησης των μορίων DNA είναι αντιστρόφως ανάλογη του δεκαδικού λογαρίθμου του αριθμού των βάσεων τους. Έτσι, τα μικρότερα μόρια DNA μετακινούνται στην πηκτή πιο γρήγορα από τα μεγαλύτερα. Επειδή η πηκτή εμποδίζει την τυχαία διάχυση των μορίων, τα μόρια διαφορετικού μεγέθους διαχωρίζονται σε «ζώνες». Η συγκέντρωση της αγαρόζης που χρησιμοποιείται σε κάθε εφαρμογή εκφράζεται σε %w/v και εξαρτάται από την ικανότητα διάκρισης (resolution) που επιδιώκεται. Η πηκτή αγαρόζης είναι διαπερατή για χρωστικές, όπως το βρωμιούχο αιθίδιο, το οποίο έχει τη δυνατότητα να 103

115 παρεμβάλλεται στη διπλή έλικα και να σχηματίζει φθορίζον σύμπλοκο με το DNA, καθιστώντας ορατές τις ζώνες των διαχωρισμένων μορίων. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ ΚΑΙ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ Ρυθμιστικό διάλυμα 5ΧTBE (τρις-βορικό-edta) [54g Τrizma Base (Sigma # ), 27,5 g βορικό οξύ (Sigma #036K0210) και 20ml ΕDTA 0,5Μ ph 8.0 σε 1L] Βρωμιούχο αιθίδιο (500μg/ml), [Sigma,012K8934] Aγαρόζη (HT Biotechnology, UK), 100g Δείκτης μοριακών βαρών bp, (ΝΕΒ, ΗΠΑ, N3234G) Χρωστική 6Χ (loading dye) με κυανό της βρωμοφαινόλης (BPB) και φικόλη Πιπέτες (Thermo, Γερμανία) των 20μL και των 100μL Ρύγχη των 20μL χωρίς φίλτρο Ηλεκτροφορητική συσκευή Peqlab (Γερμανία) Τροφοδοτικό ηλεκτροφόρησης EPS5301 (Amersham, Αγγλία) Τράπεζα ακτινοβολίας UV (Vilbert Loumart, Γαλλία) και κάμερα (Vilbert Loumart, Γαλλία) 104

116 ΠΗΚΤΗ ΑΓΑΡΟΖΗΣ 1% w/v Για το διαχωρισμό των προϊόντων της συμβατικής και real-time PCR έγινε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Η πηκτή παρασκευάζεται με 0,4g αγαρόζης σε 40 ml ρυθμιστικού διαλύματος TBE 0.5X. Κατόπιν θερμάνσεως σε φούρνο μικροκυμάτων και διαλυτοποίησης της αγαρόζης, προστίθενται 40 μl βρωμιούχο αιθίδιο. Κατάλληλος όγκος δείγματος (5-10 μl) αναμιγνύεται με χρωστική πλήρωσης (gel-loading dye) σε αναλογία 6:1. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται παρουσία ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρηρησης ΤΒΕ 0,5Χ, υπό σταθερή τάση 100V για 30 min. Παράλληλα με τα δείγματα γίνεται ηλεκτροφόρηση του δείκτη μοριακών βαρών DNA (molecular weight marker) για τον προσδιορισμό του μεγέθους των PCR προϊόντων. Οι ζώνες του DNA γίνονται ορατές με την επίδραση υπεpιώδους ακτινοβολίας μήκους κύματος 312 nm λόγω της εκπομπής ακτινοβολίας φθορισμού από το προσδεδεμένο στο DNA βρωμιούχο αιθίδιο. 105

117 REAL TIME PCR ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΚΑΜΠΥΛΩΝ ΤΗΞΗΣ Όπως αναφέρθηκε, η ανάλυση καμπύλων τήξης μετά από ενίσχυση με PCR πραγματικού χρόνου αποτελεί μια αξιόπιστη μέθοδο γονοτύπωσης πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου που εκμεταλλεύεται τη μεταβολή στη θερμοκρασία τήξης ενός δίκλωνου μορίου DNA, όταν στην αλληλουχία υπάρχει κάποιο λάθος ζευγάρωμα βάσεων (mismatch). Στην παρούσα εργασία αυτή η μέθοδος επιλέχθηκε και αναπτύχθηκε για την ανάλυση δυο σημειακών πολυμορφισμών στo γονίδιο ΑΚΤ2. ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Οι αντιδράσεις PCR πραγματικού χρόνου και η ανάλυση καμπύλων τήξης πραγματοποιήθηκαν με το θερμικό κυκλοποιητή Light Cycler 1.5 (εικόνα 5.2) της εταιρείας Roche Applied Science. Η αντίδραση λαμβάνει χώρα σε υάλινα τριχοειδή (capillaries) τα οποία τοποθετούνται σε ένα περιστρεφόμενο δίσκο χωρητικότητας 32 δειγμάτων (εικόνα 17). 106

118 α) β) Εικόνα 17: α. Το όργανο Light Cycler 1.5 β. Ο περιστρεφόμενος δίσκος με χωρητικότητα 32 τριχοειδών. Σε αντίθεση με τους συμβατικούς θερμικούς κυκλοποιητές που επιτυγχάνουν τη θέρμανση και ψύξη των δειγμάτων με θερμικά block ή με αξιοποίηση του θερμοηλεκτρικού φαινομένου Peltier, στο Light Cycler οι θερμοκρασιακές αλλαγές επέρχονται με μεγάλη ταχύτητα μέσω ροής αέρα διαμέσου των εξαιρετικά λεπτών γυάλινων τριχοειδών (Εικόνα 20). Ο αέρας θερμαίνεται από ένα θερμικό σπείραμα με ±0,3 C ακρίβεια στην επιτυγχανόμενη θερμοκρασία, ενώ ένας ανεμιστήρας ανακατανέμει τη ροή του αέρα εντός του θερμικού θαλάμου, ώστε να εξασφαλίζονται ταυτόσημες συνθήκες για όλα τα τριχοειδή του περιστρεφόμενου δίσκου (εικόνα 20). Τα τριχοειδή, με χωρητικότητα 20 μl, διαθέτουν υψηλό λόγο επιφάνειας προς όγκο, επιτρέποντας γρήγορη εξισορρόπηση της θερμοκρασίας μεταξύ αέρα και δείγματος. Έτσι επιτυγχάνονται γρήγοροι ρυθμοί μεταβολής της θερμοκρασίας που φτάνουν μέχρι και τους 20 C ανά δευτερόλεπτο και επιτρέπουν την 107

119 τέλεση μιας PCR αντίδρασης κύκλων σε χρονικό διάστημα λεπτών (Light cycler manual). Εικόνα 20: Σχηματική παράσταση της οργανολογίας του Light Cycler. Η οπτική μονάδα του LightCycler ανιχνεύει το φθορισμό ανά προγραμματισμένα χρονικά διαστήματα κατά τη διάρκεια της ανίδρασης PCR και κατά συνεχή τρόπο κατά την ανάλυση καμπύλων τήξης. Οι οπτικές ιδιότητες των τριχοειδών τα καθιστούν κατάλληλα για χρήση 108

120 σαν κυψελίδες για τις φθορισμομετρικές μετρήσεις. Η οπτική μονάδα διαθέτει τρία κανάλια ανίχνευσης που μετρούν το εκπεμπόμενο φως σε τρία διαφορετικά μήκη κύματος (530 nm, 640 nm και 710 nm) καθώς και μία δίοδο εκπομπής φωτός (LED: Light Emiting Diode) που δρα ως πηγή διέγερσης. Έτσι οι κυριότερες φθορίζουσες χρωστικές που χρησιμοποιούνται για την επισήμανση των ανιχνευτών DNA στο όργανο Light Cycler είναι η φλουορεσκεΐνη, η Light Cycler-Red 640 (LC-Red 640) και η Light Cycler-Red 705 (LC-Red 705) με μέγιστα απορρόφησης και εκπομπής που σημειώνονται στον Πίνακα 1. Κατά τη μέτρηση του σήματος φθορισμού, ιώδες φως μήκους κύματος 470 nm εκπέμπεται από την πηγή διέγερσης και εστιάζεται στην άκρη του τριχοειδούς, διεγείροντας τα φθορισμοφόρα της αντίδρασης. Κατόπιν ο παραγόμενος φθορισμός κατευθύνεται εκ νέου προς την οπτική μονάδα, όπου μια σειρά φίλτρων και κατόπτρων διαχωρίζει τη φωτεινή ακτινοβολία σε διαφορετικά μήκη κύματος που μετρώνται από τα τρία κανάλια. Κατά τη διάρκεια των μετρήσεων ένας κατάλληλος κινητήρας περιστρέφει κυκλικά το δίσκο με τα δείγματα, έτσι ώστε το άκρο κάθε τριχοειδούς να τοποθετείται ακριβώς στο εστιακό σημείο της φθορισμομετρικής οπτικής. Η βέλτιστη θέση για τη μέτρηση καθορίζεται για κάθε τριχοειδές σε μια «διαδικασία αναζήτησης» ( seekprocess ) που προηγείται κάθε PCR αντίδρασης (Light cycler manual) 109

121 Φλουορεσκεΐνη LC-Red 640 LC-Red 705 Μέγιστο απορρόφησης 493 nm 625 nm 685 nm Μέγιστο εκπομπής 525 nm 640 nm 705 nm Πίνακας 1: Μέγιστο απορρόφησης και εκπομπής των χρωστικών που χρησιμοποιούνται στο όργανο LightCycler Για την παρακολούθηση της αντίδρασης ενώ αυτή εξελίσσεται, οι διάφορες πληροφορίες μεταφέρονται από και προς έναν ηλεκτρονικό υπολογιστή, μέσω κατάλληλης σύνδεσης. Ο χρήστης εισάγει τα δεδομένα στον υπολογιστή στο συγκεκριμένο πειραματικό πρωτόκολλο και ο υπολογιστής μεταφέρει τις πληροφορίεςστην συσκευή. Επίσης, ο υπολογιστής καταγράφει τις θερμοκρασίες και τα σήματα φθορισμού κατά τη διάρκεια της αντίδρασης και επεξεργάζεται τέλος τα αποτελέσματα μέσω κατάλληλου αναλυτικού λογισμικού (Light cycler manual) Για το γονίδιο ΑΚΤ2 (v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 2) εξετάστηκαν τέσσερις ιντρονικοί πολυμορφισμοί (SNPs): rs ,rs , rs και rs Το γονίδιο ΑΚΤ2 (ΑΚΤ σερίνη / θρεονίνη κινάση 2) βρίσκεται στη θέση 19q13.2 (22 εξώνια). 110

122 Οι εκκινητές και οι αλληλουχίες των ανιχνευτών που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση γονιδίου ΑΚΤ2 φαίνονται στον πίνακα 2. Η θέση SNP υπογραμμίζεται με κόκκινο χρώμα. Οι ανιχνευτές σημάνθηκαν είτε με φθορεσκεΐνη (FL) ή με LC 640 ή 705 χρωστικές SNP Location PCR primers Probes Tanneal b/pairs rs Intron 10 GTGGGGGTAGGAACGTG CCCCAGACCTGTGTGT X I TTCCA GAGGCTGGCATCACAGTC rs Intron 1 CCTGCATTAGCCTGTGATGAA GGGTCCTTGCTTGCCCAC-FL CCCTATGACTTCATCTCAGGAAGTAC LC 640-TTCTAGACTCCCAAGCCTCCGTTTCCT rs Intron 4 GAAAAAAGCCTGTCATGGA AAAAAA XI AGCAGGGGCCGGGGAC AACTTGCTTTAACCCATGC rs Intron 8 TTGTGATGGAGTATGCCAACG ACGAAGCCGCCTGCCTCAAGGG-FL TGGGCAAGCCACTTAACCT LC705-GAGGGGCACCAGATGACACTGA Πίνακας 2. Εκκινητές και ανιχνευτές που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των τεσσάρων πολυμορφισμών του γονιδίου ΑΚΤ2 Στην εικόνα 21(α,β,γ,δ) φαίνεται η θέση των εκκινητών (primers) και των ανιχνευτών (probes) υβριδισμού για τη γονοτύπωση των τεσσάρων πολυμορφισμών (rs , rs , rs και rs ) του γονιδίου AKT2. 111

123 α. rs SNP β. rs SNP γ. rs SNP δ. rs SNP Εικόνα 21. Θέσεις των primers (εκκινητών) και των probes (ανιχνευτών) για τους τέσσερις πολυμορφισμούς του γονιδίου AKT2. Τα πορτοκαλί βέλη δείχνουν τους 3 -FL labeled probes ενώ τα μπλε βέλη δείχνουν τους 5 -LC labeled probes. Οι σκιασμένες με γκρι χρώμα περιοχές δείχνουν τους primers. 112

124 Στην αντίδραση της Real-time PCR για τον πολυμορφισμό rs χρησιμοποιήθηκαν ένα ζευγάρι εκκινητών και ένας ανιχνευτής (Simple Probe) λόγω της θέσης της μετάλλαξης. Το πρωτόκολλο σε τελικό όγκο 10μL καθώς και το πρόγραμμα θερμοκρασιών φαίνονται στους πίνακες 3 και 4. Αντιδραστήρια Προστιθέμενος όγκος (μl) Η2O 2,8 MgCl2 0,8 F primer 2 A primer 2 rs probe 0,4 DNA 1 Red cup (Roche) 1 TOTAL 10 Πίνακας 3. Πρωτόκολλο Real-time PCR για τον πολυμορφισμό rs

125 Στάδιο PCR Θερμοκρασία Διάρκεια Ρυθμός μεταβολής της θερμοκρασίας Επαναλήψεις Αρχικός διαχωρισμός των κλώνων DNA 95 C 10 min Διαχωρισμός των κλώνων του 95 C 10 sec 20 C/sec DNA Yβριδισμός των εκκινητών στο 56 C 15 sec 20 C/sec 45 κύκλοι DNA Επέκταση των εκκινητών 72 C 15 sec 20 C/sec Πίνακας 4. Θερμοκρασιακό πρόγραμμα Real-time PCR για τον πολυμορφισμό rs Μετά την ενίσχυση ακολουθεί πρόγραμμα τήξης κατά το οποίο η θερμοκρασία μετά από αρχική αποδιάταξη στους 95 C, μειώνεται στους 40 C και κατόπιν σταδιακά αυξάνεται με παράλληλη συνεχή καταγραφή 114

126 της έντασης του φθορισμού. Η καμπύλη τήξης, η οποία και σχεδιάζεται αυτόματα από το όργανο, προκύπτει από τη αρνητική πρώτη παράγωγο της συνάρτησης μεταβολής της έντασης του φθορισμού ως προς τη θερμοκρασία. Ο Πίνακας 5 συνοψίζει το θερμοκρασιακό πρόγραμμα της δοκιμασίας τήξης: Στάδιο Ρυθμός ανάλυσης Θερμοκρασία Διάρκεια μεταβολής της τήξης θερμοκρασίας 1 ο 95 C 0 sec 20 C/sec 2 ο 40 C 30 sec 20 C/sec 3 ο 95 C 0 0,10 C/sec Πίνακας 5. Θερμοκρασιακό πρόγραμμα ανάλυσης καμπυλών τήξης για τον πολυμορφισμό rs Για τον πολυμορφισμό rs χρησιμοποιήθηκαν ένα ζευγάρι εκκινητών και ένα ζευγάρι ανιχνευτών (Dual Probe). Το πρωτόκολλο σε τελικό όγκο 10μL καθώς και το θερμοκρασιακό πρόγραμμα της ενίσχυσης φαίνονται στους Πίνακες 6 και

127 Αντιδραστήρια Προστιθέμενος όγκος (μl) Η2O 4,2 MgCl2 0,8 S primer 1 R primer 1 Probe FL 0,5 Probe LC 0,5 DNA 1 Red cup (Roche) 1 TOTAL 10 Πίνακας 6. Πρωτόκολλο Real-time PCR για τον πολυμορφισμό rs

128 Στάδιο PCR Θερμοκρασία Διάρκεια Ρυθμός μεταβολής της θερμοκρασίας Επαναλήψεις Αρχικός διαχωρισμός των κλώνων DNA 95 C 10 min Διαχωρισμός των κλώνων του 95 C 10 sec 20 C/sec DNA Yβριδισμός των εκκινητών στο 59 C 20 sec 20 C/sec 35 κύκλοι DNA Επέκταση των εκκινητών 72 C 10 sec 20 C/sec Πίνακας 7. Θερμοκρασιακό πρόγραμμα Real-time PCR για τον πολυμορφισμό rs Ο Πίνακας 8 συνοψίζει το θερμοκρασιακό πρόγραμμα της δοκιμασίας τήξης: 117

129 Στάδιο Ρυθμός ανάλυσης Θερμοκρασία Διάρκεια μεταβολής της τήξης θερμοκρασίας 1 ο 95 C 0 sec 20 C/sec 2 ο 40 C 30 sec 20 C/sec 3 ο 85 C 0 0,10 C/sec Πίνακας 8. Θερμοκρασιακό πρόγραμμα ανάλυσης καμπυλών τήξης για τον πολυμορφισμό rs Για τον πολυμορφισμό rs χρησιμοποιήθηκαν ένα ζευγάρι εκκινητών και ένας ανιχνευτής (SimpleProbe) εξαιτίας του ότι ο συγκεκριμένος πολυμορφισμός βρίσκεται σε μια προβληματική αλληλουχία. Το πρωτόκολλο σε τελικό όγκο 10μL καθώς και το θερμοκρασιακό πρόγραμμα της ενίσχυσης φαίνονται στους Πίνακες 9 και

130 Αντιδραστήρια Προστιθέμενος όγκος (μl) Η2O 4,8 MgCl2 0,8 S primer 1 A primer 1 rs probe 0,4 DNA 1 Red cup (Roche) 1 TOTAL 10 Πίνακας 9. Πρωτόκολλο Real-time PCR για τον πολυμορφισμό rs

131 Στάδιο PCR Θερμοκρασία Διάρκεια Ρυθμός μεταβολής της θερμοκρασίας Επαναλήψεις Αρχικός διαχωρισμός των κλώνων DNA 95 C 10 min Διαχωρισμός των κλώνων του 95 C 10 sec 20 C/sec DNA Yβριδισμός των εκκινητών στο 53 C 15 sec 20 C/sec 35 κύκλοι DNA Επέκταση των εκκινητών 72 C 15 sec 20 C/sec Πίνακας 10. Θερμοκρασιακό πρόγραμμα Real-time PCR για τον πολυμορφισμό rs Ο Πίνακας 11 συνοψίζει το θερμοκρασιακό πρόγραμμα της δοκιμασίας τήξης: 120

132 Στάδιο Ρυθμός ανάλυσης Θερμοκρασία Διάρκεια μεταβολής της τήξης θερμοκρασίας 1 ο 95 C 10 sec 20 C/sec 2 ο 40 C 2 min 20 C/sec 3 ο 85 C 0 0,10 C/sec Πίνακας 11. Θερμοκρασιακό πρόγραμμα ανάλυσης καμπυλών τήξης για τον πολυμορφισμό rs Για τον πολυμορφισμό rs χρησιμοποιήθηκαν ένα ζευγάρι εκκινητών και ένα ζευγάρι ανιχνευτών (Dual Probe). Το πρωτόκολλο σε τελικό όγκο 10μL καθώς και το θερμοκρασιακό πρόγραμμα της ενίσχυσης φαίνονται στους Πίνακες 12 και

133 Αντιδραστήρια Προστιθέμενος όγκος (μl) Η2O 4,2 MgCl2 0,8 F primer 1 A primer 1 Probe FL 0,5 Probe LC 0,5 DNA 1 Red cup (Roche) 1 TOTAL 10 Πίνακας 12. Πρωτόκολλο Real-time PCR για τον πολυμορφισμό rs

134 Στάδιο PCR Θερμοκρασία Διάρκεια Ρυθμός μεταβολής της θερμοκρασίας Επαναλήψεις Αρχικός διαχωρισμός των κλώνων DNA 95 C 10 min Διαχωρισμός των κλώνων του 95 C 10 sec 20 C/sec DNA Yβριδισμός των εκκινητών στο 59 C 20 sec 20 C/sec 35 κύκλοι DNA Επέκταση των εκκινητών 72 C 15 sec 20 C/sec Πίνακας 13. Θερμοκρασιακό πρόγραμμα Real-time PCR για τον πολυμορφισμό rs Ο Πίνακας 14 συνοψίζει το θερμοκρασιακό πρόγραμμα της δοκιμασίας τήξης 123

135 Στάδιο Ρυθμός ανάλυσης Θερμοκρασία Διάρκεια μεταβολής της τήξης θερμοκρασίας 1 ο 95 C 10 sec 20 C/sec 2 ο 40 C 2 min 20 C/sec 3 ο 85 C 0 0,30 C/sec Πίνακας 14. Θερμοκρασιακό πρόγραμμα ανάλυσης καμπυλών τήξης για τον πολυμορφισμό rs Όλα τα τέστ πραγματοποιήθηκαν με το kit LightCycler Faststart DNA MasterHybProbe της Roche Applied Science. 124

136 5. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στους παρακάτω πίνακες φαίνονται τα αποτελέσματα για όλους τους παράγοντες που μετρήθηκαν τόσο για τους ασθενείς όσο και για τους μάρτυρες. 125

137 srankl OPG amplisrankl Α/Α PATIENTS Α/Α 0PG (pmol/lt) (pmol/lt) Controls 1 P1 0, C1 0,00 4,10 2 P2 0, C2 0,00 4,2 3 P3 0, C3 0,00 2,50 4 P4 0,17 3,80 4 C4 0,00 4,30 5 P5 0,13 4,00 5 C5 0,00 3,10 6 P6 0, C6 0,00 2,6 7 P7 0, C7 0,00 2,50 8 P8 0, C8 0,00 2,4 9 P9 0,12 3,98 9 C9 0,00 2,40 10 P10 0, C10 0,00 2,4 11 P11 0,34 2,80 11 C11 0,00 2,6 12 P12 0,31 2,41 12 C12 0,00 2,60 13 P13 0,22 4,00 13 C13 0,00 3,00 14 P C14 0,00 4,20 15 P ,65 15 C15 0,00 2,60 16 P C16 0,00 2,50 17 P17 0, C17 0,00 4,30 18 P18 0,17 4,30 18 C18 0,00 2,60 19 P19 0,14 2,60 19 C19 0,00 2,50 20 P20 1,00 1,55 20 C20 0,00 3,20 21 P21 0, C21 0,00 4,10 22 P22 1,09 1,82 22 C22 0,00 2,10 23 P23 0,25 1,64 23 C23 0,00 2,40 24 P24 3,50 4,60 24 C24 0,00 4,00 25 P25 0, C25 0,00 2,20 26 P26 3,47 4,60 26 C26 0,00 2,50 27 P27 0,11 3,44 27 C27 0,00 3,00 28 P28 0,21 4,33 28 C28 0,00 4,40 29 P29 0,15 4,15 29 C29 0,00 2,50 30 P30 0,12 4,35 30 C30 0,00 2,60 31 P31 2,64 0,32 31 C31 0,00 2,61 32 P32 0, C32 0,00 2,60 33 P33 1,34 0,29 34 P34 1,22 2,12 35 P35 0, P36 1,33 0,22 37 P37 0, P38 1, P39 0,53 5,00 40 P40 0, P41 0,15 4,61 42 P42 0,11 2,80 43 P43 0,47 0,28 44 P44 0,12 0,44 45 P45 0,17 3,44 46 P46 0, P47 0,10 6,40 48 P48 0,20 3,10 49 P49 0,28 0,31 50 P50 1,18 2,28 51 P51 0,20 4,20 52 P52 0,17 4,70 53 P53 0, P54 0,14 3,70 55 P55 0,11 4,80 56 P56 0, P57 0,17 6,40 58 P58 0,09 3,20 59 P59 0,76 2,80 60 P60 0,

138 Α/Α PATIENTS DHEAS SHBG TESTO Α/Α Controls DHEAS SHBG TESTO 1 P1 269,6 36,54 0,193 1 C1 213,7 44,05 0,105 2 P2 522, C2 175,4 57,12 0,112 3 P3 386,0 58,62 0,323 3 C3 265,8 48,17 0,110 4 P4 204, C4 275,9 74,12 0,094 5 P5 202, C5 120,8 88,22 0,076 6 P6 373,6 19,23 0,707 6 C6 212,4 71,04 0,088 7 P7 290,8 155,70 0,493 7 C7 189,6 58,12 0,085 8 P8 321,6 74,34 0,358 8 C8 186,7 64,72 0,115 9 P9 441, C9 202,4 37,15 0, P10 305,1 66,74 0, C10 185,6 108,00 0, P11 283, C11 204,2 95,46 0, P12 447,0 44,09 0, C12 195,4 65,82 0, P13 337,7 22,50 0, C13 221,3 67,44 0, P14 330,2 35, C14 301,5 74,78 0, P15 374,0 87,77 0, C15 192,4 63,12 0, P16 544, C16 285,9 68,28 0, P17 438,7 14,44 0, C17 216,8 85,22 0, P18 467,4 21,38 0, C18 199,2 64,08 0, P19 262, C19 204,9 72,04 0, P20 272,3 46,16 0, C20 193,2 75,35 0, P21 303,2 20,65 0, C21 245,8 59,06 0, P22 367, C22 285,4 64,12 0, P23 554,0 21,63 0, C23 145,7 68,57 0, P24 363,8 38,25 0, C24 176,5 73,20 0, P25 371,5 22,37 0, C25 208,7 80,45 0, P26 383, C26 245,2 68,25 0, P27 220,8 150,90 0, C27 174,8 54,78 0, P28 186,3 82,36 0, C28 224,0 62,55 0, P29 514,2 34,49 0, C29 292,5 71,64 0, P30 311, C30 188,6 48,06 0, P31 264,5 54,78 0, C31 189,6 49,06 1, P32 230,2 202,00 0, C32 190,6 50,08 0, P33 247,8 25,67 0, P34 280,5 84,12 0, P35 153,6 81,89 0, P36 195,4 66,87 o, P37 241,7 31,80 0, P38 192, P39 170, P40 294,3 45,38 0, P41 308,9 65,65 0, P42 194,1 40,22 0, P43 409,6 79,17 0, P44 382,4 77,12 o, P45 227,7 48,55 0, P46 45,9 84,85 0, P47 154,9 37,96 0, P48 214,4 36,45 0, P49 223,9 94,71 0, P50 243,9 25,18 0, P51 376,1 89,26 0, P52 382,7 44,18 o, P53 388, P54 390,2 54,34 0, P55 306,5 92,28 0, P56 881,5 26,87 1, P57 412,6 62,12 0, P58 179,9 57,81 0, P59 285,4 38,55 0, P60 582,5 28,62 0,

139 Α/Α PATIENTS E2 LH FSH Α/Α Controls E2 LH FSH 1 P1 34,70 3,45 4,85 1 C1 58,86 5,77 5,77 2 P C2 78,12 5,12 4,78 3 P3 55,40 3,90 5,71 3 C3 53,12 5,82 5,68 4 P C4 44,08 7,12 5,19 5 P C5 68,85 4,95 5,72 6 P6 50,27 6,98 8,55 6 C6 83,60 5,88 4,18 7 P7 37,68 8,42 8,01 7 C7 67,45 6,44 4,68 8 P8 45,60 10,27 7,59 8 C8 56,33 6,02 5,45 9 P C9 40,15 5,55 6,01 10 P10 64,77 5,37 3,99 10 C10 74,20 6,40 5,56 11 P C11 65,23 6,22 4,94 12 P12 38,46 6,54 5,07 12 C12 60,18 6,79 5,40 13 P13 44,79 5,72 4,20 13 C13 58,85 4,55 5,55 14 P14 34,12 4,12 4,12 14 C14 55,45 4,92 5,78 15 P15 50,27 8,17 5,01 15 C15 62,78 7,08 4,97 16 P16 42,78 5,85 3,90 16 C16 67,45 5,74 4,78 17 P17 47,09 4,11 5,15 17 C17 69,12 7,46 4,94 18 P18 40,10 4,48 5,84 18 C18 55,45 6,74 5,51 19 P19 49,15 4,12 6,28 19 C19 57,12 6,85 5,64 20 P20 54,18 9,04 7,65 20 C20 54,65 6,42 5,72 21 P21 30,93 14,64 3,95 21 C21 48,23 4,87 5,60 22 P22 38,12 5,88 4,20 22 C22 51,12 7,12 5,67 23 P23 35,15 3,36 2,54 23 C23 60,12 6,87 4,86 24 P24 42,03 4,44 5,67 24 C24 49,28 6,74 4,94 25 P25 44,68 3,91 4,50 25 C25 47,13 6,89 5,42 26 P C26 54,12 7,09 5,34 27 P27 92,97 9,14 6,94 27 C27 57,36 7,12 5,12 28 P28 100,60 4,66 4,08 28 C28 63,14 6,98 4,75 29 P29 52,79 9,10 5,21 29 C29 49,25 4,36 4,77 30 P30 36, C30 55,85 5,84 5,54 31 P31 34,28 3,52 5,84 31 C31 56,85 6,84 5,58 32 P32 77,66 6,35 8,21 32 C32 57,85 7,14 4,55 33 P33 40,59 7,61 6,31 34 P34 35,85 5,85 7,12 35 P35 21,01 7,02 7,14 36 P36 48,86 6,12 5,88 37 P37 34,54 1,71 7,04 38 P38 25,19 4,33 6,67 39 P39 42,56 5,75 5,67 40 P40 56,06 30,45 7,37 41 P41 44,95 17,94 5,72 42 P42 67,10 12,56 5,17 43 P43 35,60 6,64 7,14 44 P44 47,82 4,44 6,12 45 P45 44,27 6,07 3,95 46 P46 43,68 8,48 5,21 47 P47 73,46 12,15 4,93 48 P48 53,08 6,14 5,68 49 P49 32,75 8,78 7,53 50 P50 24,77 12,26 6,77 51 P51 74,19 8,09 4,94 52 P52 43,12 4,77 6,12 53 P53 47,21 5,77 4,80 54 P54 28,00 8,32 6,36 55 P55 56,07 3,51 5,18 56 P56 48,56 6,76 5,10 57 P57 53,07 4,32 5,76 58 P58 44,96 6,64 4,79 59 P59 38,12 7,04 4,68 60 P60 71,63 6,69 6,40 128

140 Α/Α PATIENTS 17-OH PROG Α/Α PRL INSULIN (ng / ml) Controls PRL INSULIN 17-OH PROG 1 P1 4,29 18,09 0,678 1 C1 15,12 9,78 0,255 2 P ,44 0,890 2 C2 12,94 9,98 0,348 3 P3 10,64 5,57 1,200 3 C3 14,78 9,64 0,348 4 P ,48 0,693 4 C4 13,77 8,12 0,410 5 P ,820 5 C5 15,02 8,45 0,228 6 P6 17,69 36,89 2,200 6 C6 14,54 7,12 0,345 7 P7 17,69 7,44 0,920 7 C7 15,14 10,04 0,270 8 P8 17,69 7,49 1,300 8 C8 13,13 12,45 0,264 9 P9 17,69 34,51 2,900 9 C9 14,22 13,24 0, P10 17,69 5,00 0, C10 14,33 10,80 0, P11 17,69 4,18 0, C11 14,78 7,14 0, P12 17,69 34,29 0, C12 14,67 12,05 0, P13 17,69 13,21 0, C13 14,55 9,46 0, P14 17,69 32,12 0, C14 13,87 8,32 0, P15 17,69 4,58 0, C15 13,94 4,18 0, P16 17,69 10,88 0, C16 15,11 5,35 0, P17 17,69 17,20 1, C17 13,65 7,18 0, P18 17,69 7, C18 13,74 6,12 0, P19 17,69 9,08 0, C19 14,45 9,56 0, P20 17,69 3,18 1, C20 13,93 8,24 0, P21 17,69 8,10 0, C21 15,58 7,36 0, P22 17,69 10,44 2, C22 14,33 6,79 0, P23 17,69 4,41 1, C23 14,54 9,46 0, P24 17,69 18,94 0, C24 13,65 10,64 0, P25 17,69 27,31 1, C25 15,34 8,64 0, P26 17,69 5,70 1, C26 15,42 8,67 0, P27 17,69 3,59 0, C27 14,12 9,12 0, P28 17,69 5,82 0, C28 14,44 10,01 0, P29 17,69 12,10 1, C29 14,21 7,34 0, P30 17, , C30 13,67 5,85 0, P31 17,69 9,28 0, C31 14,67 6,85 0, P32 17,69 4,05 1, C32 15,68 7,82 0, P33 17,69 9,39 0, P34 17,69 7,31 0, P35 17,69 6,19 1, P36 17,69 12,46 0, P37 17,69 6,03 0, P38 17,69 6,84 0, P39 17,69 8,64 0, P40 17,69 3,26 0, P41 17,69 6,18 1, P42 17,69 5,12 1, P43 17,69 10,75 1, P44 17,69 6,78 0, P45 17,69 7,72 1, P46 17,69 10, P47 17,69 11,66 1, P48 17,69 10,85 0, P49 17,69 7,06 0, P50 17,69 13,13 0, P51 17,69 7,60 1, P52 17,69 8,12 0, P53 17,69 5,92 0, P54 17,69 7,81 0, P55 17,69 8,48 1, P56 17,69 19,64 0, P57 17,69 19,53 1, P58 17,69 8,27 0, P59 17,69 8,67 0, P60 17,69 10,94 0,

141 Α/Α PATIENTS TSH T4 T3 Α/Α Controls TSH T4 T3 1 P1 1,35 10,10 1,07 1 C1 2,25 7,45 0,87 2 P2 2,82 7,90 122,00 2 C2 2,20 10,37 0,99 3 P3 2,70 8,02 1,88 3 C3 2,18 12,09 1,04 4 P4 2,13 7,60 2,00 4 C4 4,35 9,25 0,96 5 P5 0,61 6,22 1,18 5 C5 4,15 8,30 1,15 6 P6 2,80 10,11 1,44 6 C6 3,36 11,32 1,38 7 P7 2,91 11,32 1,17 7 C7 0,99 9,23 0,96 8 P8 6,02 6,12 1,82 8 C8 1,54 9,85 0,86 9 P9 2,91 73,11 1,43 9 C9 3,35 10,18 1,65 10 P10 1,29 11,15 1,18 10 C10 1,15 10,12 1,04 11 P11 1,45 10,04 1,89 11 C11 1,09 12,23 1,18 12 P12 1,39 8,04 1,19 12 C12 4,17 7,56 1,09 13 P13 1,86 12,22 1,15 13 C13 3,55 10,18 1,17 14 P14 2,23 8,96 8,12 14 C14 2,16 10,09 1,25 15 P15 1,70 10,34 1,17 15 C15 1,19 9,95 1,87 16 P16 2,23 13,12 9,10 16 C16 4,22 7,42 1,06 17 P17 1,10 7,00 1,28 17 C17 3,85 10,04 0,87 18 P18 1,21 10,76 1,87 18 C18 0,75 13,15 0,94 19 P19 2,69 13,12 1,72 19 C19 4,31 10,32 1,44 20 P20 2,53 6,10 112,00 20 C20 0,33 9,86 1,35 21 P21 1,10 10,28 1,85 21 C21 1,18 11,47 1,12 22 P22 0,24 10,21 133,00 22 C22 2,24 8,94 0,88 23 P23 1,58 7,22 129,00 23 C23 2,87 7,57 1,46 24 P24 3,48 9,26 1,72 24 C24 4,31 9,12 0,74 25 P25 1,08 10,23 1,14 25 C25 0,20 8,35 1,87 26 P26 1,00 9,87 117,00 26 C26 1,08 10,28 1,05 27 P27 1,79 7,80 1,29 27 C27 2,31 10,15 1,85 28 P28 1,56 11,01 1,44 28 C28 3,01 8,94 1,11 29 P29 0,70 10,85 1,86 29 C29 2,12 9,35 1,55 30 P30 1,54 6,32 1,30 30 C30 4,17 13,12 1,85 31 P31 1,11 10,31 1,55 31 C31 2,17 11,12 1,87 32 P32 0,74 9,95 0,97 32 C32 2,32 7,92 1,17 33 P33 2,05 6,42 0,90 34 P34 1,85 6,70 1,23 35 P35 2,10 5,10 0,95 36 P36 0,77 10,15 1,79 37 P37 1,42 9,83 0,97 38 P38 1,40 11,33 0,96 39 P39 2,88 10,85 1,32 40 P40 1,81 6,60 107,00 41 P41 1,90 7,20 1,54 42 P42 1,19 9,85 1,12 43 P43 2,15 10,15 1,62 44 P44 2,31 6,00 0,88 45 P45 3,98 12,15 1,98 46 P46 1,70 10,25 1,88 47 P47 2,30 9,87 1,64 48 P48 3,66 11,55 1,04 49 P49 2,04 8,97 1,24 50 P50 1,89 7,10 110,00 51 P51 1,33 9,96 1,15 52 P52 0,92 1,08 2,63 53 P53 1,67 10,07 1,55 54 P54 2,25 9,87 1,34 55 P55 2,88 10,22 1,16 56 P56 1,19 10,45 1,86 57 P57 2,26 6,90 0,94 58 P58 1,81 10,88 1,05 59 P59 1,78 8,88 1,12 60 P60 1,16 9,79 1,44 130

142 Α/Α PATIENTS FT4 FT3 Α/Α Controls FT4 FT3 1 P1 0,85 3,99 1 C1 0,78 2,77 2 P2 1,46 2,89 2 C2 1,63 2,99 3 P3 14,70 2,82 3 C3 0,97 3,15 4 P4 0,95 2,56 4 C4 1,57 2,97 5 P5 5,40 2,85 5 C5 0,88 2,11 6 P6 1,40 3,50 6 C6 0,94 2,01 7 P7 1,62 3,00 7 C7 1,25 3,07 8 P8 1,21 2,14 8 C8 1,48 3,10 9 P9 1,65 3,12 9 C9 1,84 3,34 10 P10 0,89 2,04 10 C10 1,12 2,85 11 P11 1,85 3,92 11 C11 1,77 2,56 12 P12 1,14 3,30 12 C12 1,46 2,79 13 P13 1,10 3,57 13 C13 1,64 3,34 14 P14 1,64 3,15 14 C14 1,18 3,46 15 P15 0,95 3,20 15 C15 1,59 3,09 16 P16 1,62 3,21 16 C16 1,75 3,12 17 P17 1,62 2,68 17 C17 1,48 2,97 18 P18 1,01 3,03 18 C18 1,35 2,64 19 P19 1,14 3,50 19 C19 0,95 2,89 20 P20 1,71 2,85 20 C20 1,58 3,05 21 P21 1,60 3,00 21 C21 1,32 2,93 22 P22 1,40 2,32 22 C22 1,25 3,17 23 P23 1,74 3,20 23 C23 0,89 3,22 24 P24 1,26 2,97 24 C24 1,56 2,74 25 P25 1,65 2,81 25 C25 1,75 2,93 26 P26 1,20 2,89 26 C26 1,64 3,17 27 P27 1,65 3,10 27 C27 1,57 3,08 28 P28 1,08 2,46 28 C28 1,69 2,79 29 P29 1,00 3,00 29 C29 1,55 3,55 30 P30 1,71 3,22 30 C30 0,97 3,00 31 P31 1,43 2,80 31 C31 1,24 3,11 32 P32 13,92 2,99 32 C32 1,12 2,87 33 P33 2,00 3,22 34 P34 1,65 3,42 35 P35 1,64 3,11 36 P36 1,62 3,42 37 P37 1,30 2,89 38 P38 13,30 5,20 39 P39 0,99 2,92 40 P40 1,63 2,85 41 P41 1,64 3,20 42 P42 1,77 3,44 43 P43 1,68 2,99 44 P44 0,96 2,84 45 P45 18,00 6,67 46 P46 0,97 2,76 47 P47 1,12 3,43 48 P48 1,38 3,41 49 P49 1,65 3,21 50 P50 1,66 2,22 51 P51 1,22 3,30 52 P52 1,78 3,34 53 P53 1,55 3,21 54 P54 1,20 2,90 55 P55 1,30 2,56 56 P56 1,87 2,32 57 P57 1,13 3,42 58 P58 1,14 3,10 59 P59 0,88 1,91 60 P60 1,68 3,64 131

143 Α/Α PATIENTS ΗΛΙΚΙΑ BMI Α/Α Controls ΗΛΙΚΙΑ ΒΜΙ 1 P C P C P C P C P C P C P C P C P C P C P11 11 C P C P C P C P C P C P ,4 17 C P C P C P C P C P C P C P24 38 >35 24 C P C P C P C P C P C P30 30 C P C P ,4 32 C P P P P36 37 P P P39 23 <18 40 P P ,96 42 P P ,3 44 P P P P P P P P P P53 54 P P P P P P P60 132

144 Α/Α PATIENTS ΑΜΗΝΟΡΡΟΙΑ ΟΛΙΓΟΜΗΝΟΡΡΟΙΑ ΔΥΣΜΗΝΟΡΡΟΙΑ Α/Α Controls ΑΜΗΝΟΡΡΟΙΑ ΟΛΙΓΟΜΗΝΟΡΡΟΙΑ ΔΥΣΜΗΝΟΡΡΟΙΑ 1 P1 ΟΧΙ ΝΑΙ ΟΧΙ 1 C1 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 2 P2 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 2 C2 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 3 P3 ΟΧΙ ΟΧΙ ΝΑΙ 3 C3 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 4 P4 OXI OXI OXI 4 C4 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 5 P5 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 5 C5 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 6 P6 ΝΑΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 6 C6 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 7 P7 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 7 C7 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 8 P8 ΟΧΙ ΝΑΙ ΝΑΙ 8 C8 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 9 P9 ΟΧΙ ΟΧΙ ΝΑΙ 9 C9 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 10 P10 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 10 C10 ΝΑΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 11 P11 11 C11 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 12 P12 ΝΑΙ ΝΑΙ ΟΧΙ 12 C12 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 13 P13 ΝΑΙ ΝΑΙ ΝΑΙ 13 C13 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 14 P14 OXI OXI NAI 14 C14 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 15 P15 OΧΙ OΧΙ ΝΑΙ 15 C15 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 16 P16 OXI OXI OXI 16 C16 ΟΧΙ ΝΑΙ ΟΧΙ 17 P17 ΟΧΙ ΟΧΙ ΝΑΙ 17 C17 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 18 P18 ΟΧΙ ΟΧΙ ΝΑΙ 18 C18 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 19 P19 ΟΧΙ 19 C19 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 20 P20 ΟΧΙ ΝΑΙ ΝΑΙ 20 C20 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 21 P21 21 C21 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 22 P22 ΝΑΙ ΝΑΙ ΟΧΙ 22 C22 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 23 P23 ΟΧΙ ΝΑΙ ΝΑΙ 23 C23 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 24 P24 ΟΧΙ ΝΑΙ ΝΑΙ 24 C24 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 25 P25 ΟΧΙ ΝΑΙ ΟΧΙ 25 C25 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 26 P26 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 26 C26 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 27 P27 ΟΧΙ ΟΧΙ ΝΑΙ 27 C27 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 28 P28 ΟΧΙ ΟΧΙ ΝΑΙ 28 C28 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 29 P29 ΝΑΙ ΝΑΙ ΟΧΙ 29 C29 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 30 P30 30 C30 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 31 P31 ΝΑΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 31 C31 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 32 P32 ΟΧΙ ΝΑΙ ΝΑΙ 32 C32 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 33 P33 ΟΧΙ ΝΑΙ ΝΑΙ 34 P34 ΟΧΙ ΟΧΙ ΝΑΙ 35 P35 ΟΧΙ 36 P36 37 P37 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 38 P38 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 39 P39 40 P40 ΟΧΙ ΝΑΙ ΝΑΙ 41 P41 ΝΑΙ ΝΑΙ ΟΧΙ 42 P42 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 43 P43 ΟΧΙ ΝΑΙ ΝΑΙ 44 P44 ΟΧΙ ΟΧΙ ΝΑΙ 45 P45 ΝΑΙ ΝΑΙ ΝΑΙ 46 P46 ΟΧΙ ΝΑΙ ΟΧΙ 47 P47 ΝΑΙ ΝΑΙ ΟΧΙ 48 P48 ΟΧΙ ΝΑΙ ΟΧΙ 49 P49 ΟΧΙ ΝΑΙ ΟΧΙ 50 P50 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 51 P51 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 52 P52 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 53 P53 54 P54 ΟΧΙ ΝΑΙ ΟΧΙ 55 P55 ΟΧΙ ΟΧΙ ΟΧΙ 56 P56 ΟΧΙ ΝΑΙ ΟΧΙ 57 P57 ΟΧΙ ΝΑΙ ΝΑΙ 58 P58 ΟΧΙ ΟΧΙ ΝΑΙ 59 P59 ΟΧΙ ΝΑΙ ΟΧΙ 60 P60 133

145 Α/Α PATIENTS ΔΥΣΠΑΡΕΥΝΙΑ ΑΚΜΗ ΑΚΑΝΘΩΣΗ Α/Α Controls ΔΥΣΠΑΡΕΥΝΙΑ ΑΚΜΗ ΑΚΑΝΘΩΣΗ 1 P1 ΟΧΙ (+) ΟΧΙ 1 C1 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 2 P2 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 2 C2 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 3 P3 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 3 C3 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 4 P4 OXI (+) OXI 4 C4 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 5 P5 ΟΧΙ (+) ΟΧΙ 5 C5 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 6 P6 ΟΧΙ (+) ΟΧΙ 6 C6 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 7 P7 ΟΧΙ (+) ΟΧΙ 7 C7 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 8 P8 ΟΧΙ (+) ΟΧΙ 8 C8 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 9 P9 ΝΑΙ (+) 9 C9 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 10 P10 ΟΧΙ 10 C10 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 11 P11 11 C11 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 12 P12 ΟΧΙ (+) 12 C12 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 13 P13 ΟΧΙ (+) 13 C13 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 14 P14 (+) OXI 14 C14 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 15 P15 ΝΑΙ (+) OΧΙ 15 C15 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 16 P16 OXI (+) OXI 16 C16 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 17 P17 (+) ΟΧΙ 17 C17 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 18 P18 (-) 18 C18 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 19 P19 OΧΙ (+) 19 C19 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 20 P20 ΟΧΙ (+) 20 C20 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 21 P21 (+) ΟΧΙ 21 C21 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 22 P22 (+) ΟΧΙ 22 C22 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 23 P23 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 23 C23 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 24 P24 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 24 C24 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 25 P25 ΟΧΙ (+) ΟΧΙ 25 C25 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 26 P26 (+) 26 C26 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 27 P27 (+) 27 C27 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 28 P28 ΝΑΙ (+) 28 C28 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 29 P29 ΟΧΙ (-) 29 C29 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 30 P30 30 C30 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 31 P31 ΟΧΙ (+++) 31 C31 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 32 P32 ΟΧΙ (+) ΟΧΙ 32 C32 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 33 P33 ΟΧΙ (-) 34 P34 (+) 35 P35 (++++) 36 P36 37 P37 ΟΧΙ ΝΑΙ 38 P38 ΟΧΙ (+) 39 P39 (+) 40 P40 ΝΑΙ ΟΧΙ 41 P41 ΟΧΙ (+) 42 P42 ΟΧΙ 43 P43 ΝΑΙ ΟΧΙ 44 P44 ΝΑΙ 45 P45 ΝΑΙ (+) 46 P46 ΟΧΙ (+) ΟΧΙ 47 P47 ΟΧΙ (-) 48 P48 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 49 P49 ΟΧΙ (+) 50 P50 ΟΧΙ (-) ΟΧΙ 51 P51 ΟΧΙ (+) 52 P52 ΟΧΙ (-) 53 P53 54 P54 ΟΧΙ (+) 55 P55 (+) ΟΧΙ 56 P56 (+) ΟΧΙ 57 P57 (+) ΟΧΙ 58 P58 ΟΧΙ (-) 59 P59 (-) ΟΧΙ 60 P60 134

146 Α/Α PATIENTS ΔΑΣΥΤΡΙΧΙΣΜΟΣ Α/Α Controls ΔΑΣΥΤΡΙΧΙΣΜΟΣ 1 P1 LORENZO C1 ΟΧΙ 2 P2 ΟΧΙ 2 C2 ΟΧΙ 3 P3 LORENZO C3 ΟΧΙ 4 P4 ΜΕΤΡΙΑ 4 C4 ΟΧΙ 5 P5 LORENZO C5 ΟΧΙ 6 P6 LORENZO 20 6 C6 ΟΧΙ 7 P7 ΟΧΙ 7 C7 ΟΧΙ 8 P8 LORENZO>10 8 C8 ΟΧΙ 9 P9 9 C9 ΟΧΙ 10 P10 ΝΑΙ 10 C10 ΟΧΙ 11 P11 11 C11 ΟΧΙ 12 P12 LORENZO C12 ΟΧΙ 13 P13 LORENZO C13 ΟΧΙ 14 P14 LORENZO C14 ΟΧΙ 15 P15 OΧΙ 15 C15 ΟΧΙ 16 P16 OXI 16 C16 ΟΧΙ 17 P17 LORENZO C17 ΟΧΙ 18 P18 LORENZO >12 18 C18 ΟΧΙ 19 P19 OΧΙ 19 C19 ΟΧΙ 20 P20 LORENZO C20 ΟΧΙ 21 P21 ΝΑΙ 21 C21 ΟΧΙ 22 P22 LORENZO >20 22 C22 ΟΧΙ 23 P23 ΟΧΙ 23 C23 ΟΧΙ 24 P24 LORENZO C24 ΟΧΙ 25 P25 ΟΧΙ 25 C25 ΟΧΙ 26 P26 ΟΧΙ 26 C26 ΟΧΙ 27 P27 LORENZO C27 ΟΧΙ 28 P28 ΟΧΙ 28 C28 ΟΧΙ 29 P29 LORENZO C29 ΟΧΙ 30 P30 30 C30 ΟΧΙ 31 P31 LORENZO C31 ΟΧΙ 32 P32 LORENZO C32 ΟΧΙ 33 P33 LORENZO P34 ΝΑΙ ΟΡΙΑΚΑ 35 P35 LORENZO P36 37 P37 LORENZO >10 38 P38 LORENZO P39 LORENZO P40 ΟΧΙ 41 P41 ΟΧΙ 42 P42 LORENZO P43 LORENZO 6 44 P44 ΝΑΙ 45 P45 ΟΧΙ 46 P46 LORENZO P47 ΟΧΙ 48 P48 LORENZO P49 ΟΧΙ 50 P50 ΝΑΙ ΟΡΙΑΚΑ 51 P51 ΝΑΙ ΟΡΙΑΚΑ 52 P52 LORENZO P53 54 P54 LORENZO P55 LORENZO P56 ΟΧΙ 57 P57 ΟΧΙ 58 P58 LORENZO P59 LORENZO P60 135

147 Α/Α PATIENTS ΛΙΠΑΡΟΤΗΤΑ ΔΕΡΜΑΤΟΣ ΗΧΟΓΡΑΜΜΑ Α/Α Controls ΛΙΠΑΡΟΤΗΤΑ ΔΕΡΜΑΤΟΣ ΗΧΟΓΡΑΜΜΑ 1 P1 OΧΙ NAI 1 C1 OXI ΝΑΙ 2 P2 ΝΑΙ ΝΑΙ 2 C2 OXI ΝΑΙ 3 P3 ΝΑΙ ΝΑΙ 3 C3 OXI ΝΑΙ 4 P4 ΝΑΙ ΝΑΙ 4 C4 OXI ΝΑΙ 5 P5 OXI ΝΑΙ 5 C5 OXI ΝΑΙ 6 P6 ΝΑΙ 6 C6 OXI ΝΑΙ 7 P7 ΝΑΙ ΝΑΙ 7 C7 OXI ΝΑΙ 8 P8 ΝΑΙ 8 C8 OXI ΝΑΙ 9 P9 ΝΑΙ ΝΑΙ 9 C9 OXI ΝΑΙ 10 P10 OΧΙ ΝΑΙ 10 C10 OXI ΝΑΙ 11 P11 11 C11 OXI ΝΑΙ 12 P12 ΝΑΙ 12 C12 OXI ΝΑΙ 13 P13 ΝΑΙ ΝΑΙ 13 C13 OXI ΝΑΙ 14 P14 NAI ΝΑΙ 14 C14 OXI ΝΑΙ 15 P15 ΝΑΙ ΝΑΙ 15 C15 OXI ΝΑΙ 16 P16 NAI ΝΑΙ 16 C16 OXI ΝΑΙ 17 P17 ΝΑΙ ΝΑΙ 17 C17 OXI ΝΑΙ 18 P18 ΝΑΙ ΝΑΙ 18 C18 OXI ΝΑΙ 19 P19 OΧΙ ΝΑΙ 19 C19 OXI ΝΑΙ 20 P20 ΝΑΙ ΝΑΙ 20 C20 OXI ΝΑΙ 21 P21 ΝΑΙ 21 C21 OXI ΝΑΙ 22 P22 ΝΑΙ 22 C22 OXI ΝΑΙ 23 P23 ΟΧΙ ΝΑΙ 23 C23 OXI ΝΑΙ 24 P24 ΟΧΙ ΝΑΙ 24 C24 OXI ΝΑΙ 25 P25 ΝΑΙ ΝΑΙ 25 C25 OXI ΝΑΙ 26 P26 ΝΑΙ ΝΑΙ 26 C26 OXI ΝΑΙ 27 P27 ΝΑΙ 27 C27 OXI ΝΑΙ 28 P28 ΝΑΙ ΝΑΙ 28 C28 OXI ΝΑΙ 29 P29 ΟΧΙ ΝΑΙ 29 C29 OXI ΝΑΙ 30 P30 30 C30 OXI ΝΑΙ 31 P31 ΝΑΙ ΝΑΙ 31 C31 OXI ΝΑΙ 32 P32 ΟΧΙ ΝΑΙ 32 C32 OXI ΝΑΙ 33 P33 ΝΑΙ ΝΑΙ 34 P34 ΝΑΙ 35 P35 ΝΑΙ ΝΑΙ 36 P36 37 P37 ΝΑΙ ΝΑΙ 38 P38 OXI ΝΑΙ 39 P39 ΝΑΙ ΝΑΙ 40 P40 ΟΧΙ ΝΑΙ 41 P41 ΟΧΙ ΝΑΙ 42 P42 ΟΧΙ ΝΑΙ 43 P43 ΝΑΙ 44 P44 ΟΧΙ ΝΑΙ 45 P45 ΝΑΙ 46 P46 ΝΑΙ 47 P47 ΟΧΙ ΝΑΙ 48 P48 ΝΑΙ ΝΑΙ 49 P49 ΝΑΙ ΝΑΙ 50 P50 ΟΧΙ ΝΑΙ 51 P51 ΝΑΙ 52 P52 ΝΑΙ ΝΑΙ 53 P53 54 P54 ΝΑΙ 55 P55 ΝΑΙ 56 P56 ΝΑΙ 57 P57 ΝΑΙ ΝΑΙ 58 P58 ΝΑΙ 59 P59 OXI ΝΑΙ 60 P60 136

148 Α/Α PATIENTS rs rs rs rs Α/Α PATIENTS rs rs rs rs P1 wild type wild type wild type wild type 61 P61 Heterozygote wild type wild type wild type 2 P2 wild type wild type wild type wild type 62 P62 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 3 P3 Heterozygote Heterozygote wild type Heterozygote 63 P63 wild type Heterozygote Heterozygote Heterozygote 4 P4 wild type wild type Heterozygote wild type 64 P64 Heterozygote wild type wild type wild type 5 P5 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 65 P65 Heterozygote wild type wild type wild type 6 P6 Heterozygote wild type wild type wild type 66 P66 wild type wild type Homozygote wild type 7 P7 wild type wild type wild type wild type 67 P67 Heterozygote wild type wild type wild type 8 P8 wild type wild type Heterozygote wild type 68 P68 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 9 P9 Heterozygote wild type Heterozygote wild type 69 P69 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 10 P10 wild type wild type Heterozygote wild type 70 P70 wild type wild type wild type wild type 11 P11 Heterozygote wild type wild type wild type 71 P71 wild type wild type wild type wild type 12 P12 Heterozygote wild type Heterozygote wild type 72 P72 Heterozygote wild type wild type wild type 13 P13 wild type wild type wild type wild type 73 P73 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 15 P15 wild type wild type wild type wild type 74 P74 wild type wild type wild type wild type 16 P16 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 75 P75 Heterozygote wild type wild type wild type 17 P17 Heterozygote wild type wild type wild type 76 P76 Heterozygote wild type wild type wild type 18 P18 wild type wild type Homozygote wild type 77 P77 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 19 P19 wild type wild type Heterozygote wild type 78 P78 wild type wild type wild type wild type 20 P20 wild type Heterozygote wild type Homozygote 79 P79 Heterozygote Heterozygote wild type Heterozygote 21 P21 wild type Heterozygote Heterozygote wild type 80 P80 wild type wild type Homozygote wild type 22 P22 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 81 P81 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 23 P23 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 82 P82 Homozygote wild type wild type wild type 24 P24 Heterozygote Heterozygote wild type Heterozygote 83 P83 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 26 P26 wild type Heterozygote Heterozygote Heterozygote 27 P27 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 28 P28 wild type wild type wild type wild type 29 P29 Heterozygote Heterozygote wild type Heterozygote 30 P30 wild type wild type wild type wild type 31 P31 wild type wild type Heterozygote wild type 32 P32 Heterozygote wild type wild type wild type 33 P33 wild type wild type wild type wild type 34 P34 wild type Heterozygote Heterozygote Heterozygote 35 P35 wild type Heterozygote Heterozygote Heterozygote 36 P36 wild type wild type wild type wild type 37 P37 Heterozygote wild type wild type wild type 38 P38 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 39 P39 wild type wild type Homozygote wild type 40 P40 Heterozygote wild type wild type wild type 41 P41 wild type Heterozygote wild type Homozygote 42 P42 Heterozygote wild type wild type wild type 43 P43 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 44 P44 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 45 P45 wild type wild type Heterozygote wild type 46 P46 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 47 P47 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 48 P48 Heterozygote wild type wild type wild type 49 P49 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 50 P50 wild type Heterozygote Heterozygote Heterozygote 51 P51 wild type wild type wild type wild type 52 P52 wild type wild type wild type wild type 53 P53 Heterozygote wild type wild type wild type 54 P54 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 55 P55 Heterozygote wild type wild type wild type 56 P56 wild type wild type Heterozygote wild type 57 P57 wild type wild type wild type wild type 58 P58 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 59 P59 Heterozygote wild type wild type wild type 60 P60 wild type Heterozygote wild type Heterozygote 137

149 Α/Α Controls rs rs rs rs C1 wild type wildtype heterozygote wildtype 2 C2 wild type heterozygote wildtype heterozygote 3 C3 wild type heterozygote wildtype heterozygote 4 C4 wild type wildtype wildtype wildtype 5 C5 wild type heterozygote wildtype homozygote 6 C6 heterozygote wildtype wildtype wildtype 7 C7 wild type wildtype heterozygote wildtype 8 C8 wild type wildtype wildtype wildtype 9 C9 wild type wildtype wildtype wildtype 10 C10 wild type heterozygote wildtype heterozygote 11 C11 wild type wildtype wildtype wildtype 12 C12 wild type heterozygote wildtype heterozygote 13 C13 wild type heterozygote wildtype heterozygote 14 C14 wild type wildtype wildtype wildtype 15 C15 wild type wildtype wildtype wildtype 16 C16 wild type heterozygote wildtype homozygote 17 C17 wild type heterozygote wildtype homozygote 18 C18 heterozygote wildtype wildtype wildtype 19 C19 heterozygote wildtype wildtype wildtype 20 C20 wild type heterozygote wildtype heterozygote 21 C21 wild type heterozygote wildtype heterozygote 22 C22 wild type wildtype wildtype wildtype 23 C23 wild type wildtype wildtype wildtype 24 C24 wild type wildtype wildtype wildtype 25 C25 wild type wildtype wildtype wildtype 26 C26 wild type heterozygote wildtype heterozygote 27 C27 wild type heterozygote wildtype heterozygote 28 C28 wild type wildtype heterozygote wildtype 29 C29 wild type wildtype heterozygote wildtype 30 C30 wild type wildtype heterozygote wildtype 31 C31 wild type wildtype heterozygote wildtype 32 C32 wild type wildtype wildtype wildtype 138

150 5.1. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ Ακολουθούν τα αποτελέσματα για τους τέσσερις πολυμορφισμούς του γονιδίου AKT2 όπως υπολογίστηκαν από το πρόγραμμα SNPstats. Index Descriptivestatistics Single-SNP analysis rs rs rs rs Multiple-SNP analysis Linkagedisequilibriumanalysis SNPStatsresults Haplotypeanalysis Descriptive statisticsresponse variable: GROUP Type: categorical n missing unique Allsubjects GROUP=0 33 (29.2%) GROUP=1 80 (70.8%) Single-SNP analysissnp: rs percentage of typed samples: 113/113 (100%) rs allelefrequencies (n=113) Allsubjects GROUP=0 GROUP=1 Allele Count Proportion Count Proportion Count Proportion T C rs genotypefrequencies (n=113) Allsubjects GROUP=0 GROUP=1 Genotype Count Proportion Count Proportion Count Proportion C/C C/T rs exact test for Hardy-Weinberg equilibrium (n=113) N11 N12 N22 N1 N2 P-value 139

151 Allsubjects GROUP= GROUP= rs association with response GROUP (n=113, crude analysis) Model Genotype GROUP=0 GROUP=1 --- C/C 30 (90.9%) C/T 3 (9.1%) 57 (71.2%) 23 (28.8%) OR (95% CI) ( ) P- value AIC BIC SNP: rs percentage of typed samples: 113/113 (100%) rs allelefrequencies (n=113) Allsubjects GROUP=0 GROUP=1 Allele Count Proportion Count Proportion Count Proportion C G rs genotypefrequencies (n=113) Allsubjects GROUP=0 GROUP=1 Genotype Count Proportion Count Proportion Count Proportion C/C C/G rs exact test for Hardy-Weinberg equilibrium (n=113) N11 N12 N22 N1 N2 P-value Allsubjects GROUP= GROUP= rs association with response GROUP (n=113, crude analysis) Model Genotype GROUP=0 GROUP=1 OR (95% CI) P-value AIC BIC --- C/C 21 (63.6%) 46 (57.5%) 1.00 C/G 12 (36.4%) 34 (42.5%) 1.29 ( ) SNP: rs percentage of typed samples: 113/113 (100%) rs allelefrequencies (n=113) Allsubjects GROUP=0 GROUP=1 Allele Count Proportion Count Proportion Count Proportion C T rs genotypefrequencies (n=113) Allsubjects GROUP=0 GROUP=1 Genotype Count Proportion Count Proportion Count Proportion C/C C/T T/T rs exact test for Hardy-Weinberg equilibrium (n=113) 140

152 N11 N12 N22 N1 N2 P-value Allsubjects GROUP= GROUP= rs association with response GROUP (n=113, crude analysis) Model Genotype GROUP=0 GROUP=1 Codominant Dominant Recessive C/C 27 (81.8%) C/T 6 (18.2%) 63 (78.8%) 14 (17.5%) T/T 0 (0%) 3 (3.8%) C/C 27 (81.8%) C/T-T/T 6 (18.2%) C/C-C/T 33 (100%) 63 (78.8%) 17 (21.2%) 77 (96.2%) T/T 0 (0%) 3 (3.8%) 27 C/C-T/T (81.8%) Overdominant C/T 6 (18.2%) 66 (82.5%) 14 (17.5%) Log-additive OR (95% CI) ( ) NA (0.00- NA) ( ) 1.00 NA (0.00- NA) ( ) 1.37 ( ) P- value AIC BIC SNP: rs percentage of typed samples: 113/113 (100%) rs allelefrequencies (n=113) Allsubjects GROUP=0 GROUP=1 Allele Count Proportion Count Proportion Count Proportion A G rs genotypefrequencies (n=113) Allsubjects GROUP=0 GROUP=1 Genotype Count Proportion Count Proportion Count Proportion A/A A/G G/G rs exact test for Hardy-Weinberg equilibrium (n=113) N11 N12 N22 N1 N2 P-value Allsubjects GROUP= GROUP= rs association with response GROUP (n=113, crude analysis) 141

153 Model Genotype GROUP=0 GROUP=1 Codominant Dominant Recessive A/A 21 (63.6%) A/G 9 (27.3%) 47 (58.8%) 30 (37.5%) G/G 3 (9.1%) 3 (3.8%) A/A A/G-G/G A/A-A/G 21 (63.6%) 12 (36.4%) 30 (90.9%) 47 (58.8%) 33 (41.2%) 77 (96.2%) G/G 3 (9.1%) 3 (3.8%) 24 A/A-G/G (72.7%) Overdominant A/G 9 (27.3%) 50 (62.5%) 30 (37.5%) Log-additive OR (95% CI) ( ) 0.45 ( ) ( ) ( ) ( ) 0.99 ( ) P- value AIC BIC Multiple-SNP analysis Linkagedisequilibriumanalysis D statistic rs rs rs rs rs rs rs rs D' statistic rs rs rs rs rs rs rs rs r statistic rs rs rs rs rs rs rs rs P-values rs rs rs rs rs rs

154 rs rs Haplotypeanalysis rs Haplotypefrequenciesestimation (n=113) rs rs rs C C C A 143 Total group group. 1 Cumulati ve frequenc y C G C G T C C A C C T A 5 C C C G 6 C G T A NA C G T G 0 NA T G C G 0 NA NA 1 Haplotype association with response (n=113, crude analysis)

155 rs rs rs rs C C C A Freq C G C G T C C A C C T A 5 C C C G rar e * * * * Global haplotype association p-value: OR (95% CI) P- value ( ) 6.01 ( ) 1.97 ( ) 0.36 ( ) ( ) <

156 Κλινικές παράμετροι Τόσο οι PCOS ασθενείς, όσο και οι μάρτυρες ήταν αντιστοιχισμένοι όσον αφορά την ηλικία και τον Δείκτη Μάζας Σώματος (BMI: Body Mass Index) όπως φαίνεται στον Πίνακα 1 ( p> 0,05, Mann Whitney). Ασθενείς Μάρτυρες p Ηλικία BMI Αμηνόρροια Ολιγομηνόρροια Δυσμηνόρροια Κοινή ακμή Δασυτριχισμός Λιπαρότητα δέρματος Πίνακας 1. Διαφορές μεταξύ ασθενών και μαρτύρων Σχεδόν όλα τα κλινικά χαρακτηριστικά του συνδρόμου πολυκυστικών ωοθηκών εκτός της αμηνόρροιας, ήταν σημαντικά πιο συχνά στους ασθενείς από ότι στους μάρτυρες όπως υπολογίζεται με το ακριβές τεστ του Fisher (Fisher s exact test) (Πίνακας 1). 145

157 Έλεγχος κανονικότητας της κατανομής των συνεχών μεταβλητών Έγινε έλεγχος της κανονικότητας της κατανομής των συνεχών μεταβλητών, για τις οποίες λήφθηκαν μετρήσεις από όλο το δείγμα, με το κριτήριο Kolmogorov-Smirnov. Τα αποτελέσματα του ελέγχου παρουσιάζονται στον Πίνακα

158 Kolmogorov-Smirnov a Statistic df Sig. srankl OPG Θειικη DHEA Φυλοσυνδετική πρωτεΐνη Τεστοστερόνη Οιστραδιόλη * Ωχρινοτρόπος Ωοθυλακιοτρόπος Προλακτίνη Ινσουλίνη Υδρόξυ-προγεστερόνη Θυροειδοτρόπος ορμόνη Θυροξίνη Τριιωδοθυροξίνη Ελεύθερη θυροξίνη Ελεύθερη τριιωδοθυροξίνη *Υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα Πίνακας 2. Αποτελέσματα ελέγχου κανονικότητας της κατανομής των συνεχών μεταβλητών σε όλο το δείγμα της μελέτης. 147

159 Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, κανονική ήταν η κατανομή μόνο της Οιστραδιόλης. Δεδομένου αυτού, γενικές μετρήσεις που αφορούν σε όλο το δείγμα για τις μεταβλητές αυτές έγιναν με μη παραμετρικά στατιστικά κριτήρια. Ο έλεγχος κανονικότητας της κατανομής των μεταβλητών αυτών επαναλήφθηκε ανά ομάδα PCOS (ασθενείς, μάρτυρες). Ο Πίνακας 3 παρουσιάζει τα αποτελέσματα του δεύτερου ελέγχου. 148

160 Kolmogorov-Smirnov a PCOS Statistic df Sig. ampli-srankl Μάρτυρες Ασθενείς OPG Μάρτυρες Ασθενείς * Θειική DHEA Μάρτυρες Ασθενείς Φυλοσυνδετική πρωτεΐνη Μάρτυρες * Ασθενείς Τεστοστερόνη Μάρτυρες Ασθενείς Οιστραδιόλη Μάρτυρες Ασθενείς Ωχρινοτρόπος Μάρτυρες Ασθενείς Ωοθυλακιοτρόπος Μάρτυρες Ασθενείς Προλακτίνη Μάρτυρες * Ασθενείς * Ινσουλίνη Μάρτυρες * Ασθενείς Υδρόξυ-προγεστερόνη Μάρτυρες Ασθενείς Θυροειδοτρόπος ορμόνη Μάρτυρες Ασθενείς Θυροξίνη Μάρτυρες Ασθενείς Τριιωδοθυροξίνη Μάρτυρες Ασθενείς Ελεύθερη θυροξίνη Μάρτυρες Ασθενείς Ελεύθερη τριιωδοθυροξίνη Μάρτυρες * Ασθενείς *Υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα Πίνακας 3 Αποτελέσματα ελέγχου κανονικότητας της κατανομής των συνεχών μεταβλητών χωριστά για ασθενείς και μάρτυρες. 149

161 Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, μόνο η θειική DHEA και η Προλακτίνη κατανέμονται κανονικά για τις δύο ομάδες. Για λόγους ομοιογένειας των αναλύσεων χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις μεταβλητές μη παραμετρικά στατιστικά κριτήρια για τη σύγκριση μεταξύ των δύο ομάδων. Στον Πίνακα 4 έχουν επίσης υπολογιστεί οι διαφορές μεταξύ των PCOS ασθενών και των μαρτύρων με το μη παραμετρικό στατιστικό κριτήριο Mann-Whitney και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στην τελευταία στήλη ως U (τιμή του τεστ), p (σημαντικότητα του τεστ). 150

162 Control Group Mean (SD) Patient Group Mean (SD) U, p RANKL 0.01 (0.01) 0.47 (0.72) U=.00, p=.000 OPG 2.99 (0.75) 2.76 (1.47) U=805.5, p=.205 DHEAS (42.59) (132.66) U=370, p=000 SHBG (14.95) (34.43) U=592.5, p=.003 TESTO 0.65 (1.23) 3.07 (4.31) U=618.5, p=.021 E (9.56) (15.38) U=348, p=.000 LH 6.24 (0.87) 6.97 (4.25) U=893, p=.583 FSH 5.26 (0.45) 5.71 (1.31) U=774, p=.127 PRL (0.68) (7.11) U=653, p=.012 Insulin 8.62 (2.04) (7.91) U=917.5, p= OH Progesterone 0.30 (0.05) 0.96 (0.50) U=76, p=.000 TSH 2.47 (1.30) 1.91 (0.94) U=704, p=.036 T (1.54) (8.54) U=849.5, p=.365 T (0.34) 1.62 (1.36) U=680, p=.022 FT (0.31) 2.37 (3.48) U=803, p=.198 FT (0.32) 3.12 (0.69) U=823, p=.261 Πίνακας 4. Διαφορές στις βιοχημικές παραμέτρους του ορού μεταξύ των PCOS ασθενών και των μαρτύρων κατά Mann- Whitney. 151

163 Όπως φαίνεται στον Πίνακα 4, βρέθηκαν οι παρακάτω στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ ομάδας ασθενών και ομάδας ελέγχου: Η μέση τιμή του RANKL ήταν σημαντικά υψηλότερη για την ομάδα των ασθενών,u=.00, p<.000 Η μέση τιμή της θειικής DHEA ήταν σημαντικά υψηλότερη για την ομάδα των ασθενών,u=370, p<.000 Η μέση τιμή της φιλοσυνδετικής πρωτεΐνης ήταν σημαντικά υψηλότερη για την ομάδα ελέγχου,u=592.5, p=.003 Η μέση τιμή της τεστοστερόνης ήταν σημαντικά χαμηλότερη για την ομάδα ελέγχου,u=618.5, p=.021 Η μέση τιμή της οιστραδιόλης ήταν σημαντικά υψηλότερη για την ομάδα ελέγχου,u=348, p<.000 Η μέση τιμή της προλακτίνης ήταν σημαντικά υψηλότερη για την ομάδα των ασθενών,u=653, p=.012 Η μέση τιμή της 17- υδρόξυ-προγεστερόνης ήταν σημαντικά υψηλότερη για την ομάδα των ασθενών,u=76, p<.000 Η μέση τιμή της θυροειδοτρόπου ορμόνης ήταν σημαντικά υψηλότερη για την ομάδα ελέγχου,u=704, p=.036 Η μέση τιμή της τριιωδοθυροξίνης ήταν σημαντικά υψηλότερη για την ομάδα των ασθενών,u=680, p=

164 Τα παρακάτω ομαδοποιημένα ραβδογράμματα παρουσιάζουν οπτικά τις διαφορές που βρέθηκαν μεταξύ των ομάδων. Η επιλογή των μεταβλητών σε κάθε διάγραμμα έγινε βάσει του εύρους τιμών των μεταβλητών. Κάθε μεταβλητή παρουσιάζεται με τη ράβδο σφάλματος που την αφορά στο διάστημα εμπιστοσύνης 95%. Εικόνα 1. Σημαντικές διαφορές για τις παραμέτρους srankl, Τεστοστερόνη και 17-υδρόξυ- προγεστερόνη μεταξύ PCOS ασθενών και μαρτύρων. 153

165 Εικόνα 2. Διαφορές στη μέση τιμή της Φυλοσυνδετικής πρωτεΐνης και της Οιστραδιόλης μεταξύ PCOS ασθενών και μαρτύρων. 154

166 Εικόνα 3. Διαφορές στη μέση τιμή της DHEAS και της Προλακτίνης μεταξύ PCOS ασθενών και μαρτύρων. 155

167 Διαφορές στα SNP μεταξύ ασθενών και μαρτύρων Όλες οι νέες μέθοδοι προσδιορισμού του γονότυπου του γονιδίου ΑΚΤ2 έχουν βελτιστοποιηθεί και αναπτυχθεί ικανοποιητικά, ενώ έχουν επικυρωθεί για την ακρίβεια τους με τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA Gold Standard (100% συμφωνία). Κάθε αντίδραση real-time PCR περιελάμβανε ένα blank (τυφλό) και ένα θετικό ορό ελέγχου (positive control) είτε ομοζυγώτη ή ετεροζυγώτη. Χαρακτηριστικές εικόνες που δείχνουν τις καμπύλες ενίσχυσης (amplification plots), καμπύλες τήξης (melting curves), με Tm (σημείο τήξης) καθορισμού του αλληλόμορφου καθώς και κάποια ενδεικτικά ηλεκτροφορήματα της Αλληλούχησης του DNA (DNA Sequencing) για τους τέσσερις πολμορφισμούς είναι οι εικόνες

168 Εικόνα 4. Καμπύλη Ενίσχυσης (Amplification plot) (F3 έναντι του χρόνου) για τον πολυμορφισμό rs του γονιδίου AKT2. 157

169 Εικόνα 5. Καμπύλη Τήξης (Melting curve) με Tm= C για τη μετάλλαξη και Tm=62.75 C για το wild-type για τον πολυμορφισμό rs του γονιδίου AKT2. 158

170 Εικόνα 6. Ηλεκτροφορήματα της Αλληλούχησης του DNA (DNA Sequencing) για τον πολυμορφισμό rs του γονιδίου AKT2 όπου στο επάνω μέρος φαίνεται ο ετεροζυγότης (A/G) και στο κάτω μέρος φαίνεται ο ομοζυγότης (G/G). 159

171 Εικόνα 7. Καμπύλη Ενίσχυσης (Amplification plot) (F2 έναντι του χρόνου) για τον πολυμορφισμό rs του γονιδίου AKT2. 160

172 Εικόνα 8. Καμπύλη Τήξης (Melting curve) με Tm= C για τη μετάλλαξη και Tm=56.34 C για το wild-type για τον πολυμορφισμό rs του γονιδίου AKT2. 161

173 Εικόνα 9. Ηλεκτροφορήματα της Αλληλούχησης του DNA (DNA Sequencing) για τον πολυμορφισμό rs του γονιδίου AKT2 όπου στο επάνω μέρος φαίνεται ο ετεροζυγότης (C/T) και στο κάτω μέρος φαίνεται ο ομοζυγότης (T/T). 162

174 Εικόνα 10. Καμπύλη Ενίσχυσης (Amplification plot) (F1 έναντι του χρόνου) για τον πολυμορφισμό rs του γονιδίου AKT2. 163

175 Εικόνα 11. Καμπύλη Τήξης (Melting curve) με Tm= C για τη μετάλλαξη και Tm=52.47 C για το wild-type για τον πολυμορφισμό γονιδίου AKT2 rs του 164

176 Εικόνα 12. Καμπύλη Ενίσχυσης (Amplification plot) (F1 έναντι του χρόνου) για τον πολυμορφισμό rs του γονιδίου AKT2. 165

177 Εικόνα 13. Καμπύλη Τήξης (Melting curve) με Tm= C για τη μετάλλαξη και Tm=53.67 C για το wild-type για τον πολυμορφισμό rs γονιδίου AKT2 του 166

178 Τα αποτελέσματα για καθέναν από τους τέσσερις πολυμορφισμούς ( SNPs) του γονιδίου AKT2 ήταν σε Hardy Weinberg Equilibrium (HWE) (p>0.05). Τα MAF% (Minor Allele Frequencies-συχνότητες ελάσσονος αλληλόμορφου) υπολογίστηκαν ξεχωριστά για τους PCOS ασθενείς και για τους μάρτυρες. Παράλληλα έγινε σύγκριση με τα %MAF που δίνονται από το Genome Variation Server (GVS) τα δεδομένα του οποίου συλλέγονται από την ανάλυση τουλάχιστον 450 γονιδιωμάτων ανά πολυμορφισμό. Από τους τέσσερις πολυμορφισμούς που εξετάστηκαν μόνο σε έναν βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ PCOS ασθενών και μαρτύρων και αυτός ήταν ο πολυμορφισμός rs , όπου υπήρχε μια αύξηση του T ελάσσονος αλληλόμορφου από 9% στους μάρτυρες σε 29% στους PCOS ασθενείς. Αυτό έδωσε μια αναλογία πιθανοτήτων (Odds Ratio- OR) : 4.04 (C.I ) για εκδήλωση κινδύνου της νόσου στους φορείς του T αλληλόμορφου συγκριτικά με τους φορείς του wild-type (Εικόνα 4 και Πίνακας 5). Οι διαφορές στην MAF% μεταξύ του GVS και της τρέχουσας μελέτης ήταν σημαντικές για τον πολυμορφισμό rs όσον αφορά τους μάρτυρες και για τον πολυμορφισμό rs τόσο για τους μάρτυρες όσο και για τους PCOS ασθενείς. 167

179 Εικόνα 4. Οι διαφορές στην MAF% μεταξύ των PCOS ασθενών και των μαρτύρων για τους τέσσερις πολυμορφισμούς του AKT2 γονιδίου 168

180 SNP Alleles GVS Control Case p* p** p*** OR (C.I.) MAF% MAF% MAF% rs C/T ( ) rs C/G ( ) rs C/T ( ) rs A/G ( ) *Fisher s exact test μεταξύ της MAF% των μαρτύρων της μελέτης και της MAF% του GVS **Fisher s exact test μεταξύ της MAF% των ασθενών της μελέτης και της MAF% του GVS ***Fisher s exact test μεταξύ της MAF% των ασθενών της μελέτης και της MAF% των μαρτύρων της μελέτης Πίνακας 5. Περιγραφικά στατιστικά στοιχεία για τους τέσσερις πολυμορφισμούς του γονιδίου AKT2 για τους PCOS ασθενείς και τους μάρτυρες της μελέτης συγκριτικά με τα δεδομένα του GVS. 169

181 ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΣΤΑ SNP ΜΕ ΤΙΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΤΙΜΕΣ ΓΙΑ ΟΛΟ ΤΟ ΔΕΙΓΜΑ Για τον πολυμορφισμό rs βρέθηκε σημαντική διαφορά για την θεiϊκή DHEA, όπου οι συμμετέχουσες που φέραν το wild-type (ΜΟ=278,13, ΤΑ=126,67) είχαν σημαντικά χαμηλότερη τιμή από τις συμμετέχουσες που φέραν τον πολυμορφισμό (ΜΟ=316,80, ΤΑ=100,10), U=491.5, p=.051. Για τον πολυμορφισμό rs βρέθηκε σημαντική διαφορά για την 17- υδρόξυ-προγεστερόνη, όπου οι συμμετέχουσες που φέραν το wildtype (ΜΟ=,64, ΤΑ=,43) είχαν σημαντικά χαμηλότερη τιμή από τις συμμετέχουσες που φέραν τον πολυμορφισμό (ΜΟ=1,02, ΤΑ=,68), U=422.5, p=.009 (Εικόνα 16, Πίνακας 6). 170

182 Εικόνα 16. Διαφορές στις τιμές των DHEAS και 17-OH προγεστερόνης μεταξύ των ατόμων που φέρουν το SNP rs και αυτών που φέρουν το wild-type. 171