ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: ΥΔΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΥΔΑΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Συγκριτική μελέτη της επίδρασης της μερικής υποκατάστασης των ιχθυάλευρων με άλευρα από έντομα σε παραμέτρους φυσιολογίας καταπόνησης σε τρία είδη εκτρεφόμενων τελεόστεων ιχθύων Θωμάς Μπούσδρας Επιβλέπων: Ευθυμία Αντωνοπούλου, Επίκουρη Καθηγήτρια Θεσσαλονίκη 215

2 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCES SCHOOL OF BIOLOGY POSTGRADUATE PROGRAM HYDROBIOLOGY AND AQUACULTRURE Comparative study of effect of partial fishmeal substitution with insect meal on parameters of stress physiology in three farmed teleost species Thomas Bousdras Supervisor: Euthimia Antonopoulou, Assistant Professor Thessaloniki 215

3 Πρόλογος Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών «Υδροβιολογία και Υδατοκαλλιέργειες» του Τμήματος Βιολογίας του Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης το διάστημα Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω πολύ την Επίκουρη Καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας, κ. Ευθυμία Αντωνοπούλου που μου εμπιστεύτηκε το συγκεκριμένο θέμα και μου έδωσε την δυνατότητα να εργαστώ στο εργαστήριό της. Επίσης, για την καθοδήγηση και την βοήθεια που μου παρείχε καθ όλη την διάρκεια της εργασίας. Ακόμη, οφείλω να ευχαριστήσω τους Δρ Σταύρο Χατζηφώτη, ερευνητή στο Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας, Βιοτεχνολογίας και Υδατοκαλλιεργειών, ΕΛΚΕΘΕ, στο Ηράκλειο Κρήτης, Dr Giovanni Piccolo, ερευνητή στο Τμήμα Κτηνιατρικής και Ζωικής Παραγωγής του Πανεπιστημίου Federico II της Νάπολης, στην Ιταλία, και την Dr Laura Gasco, ερευνήτρια στο Τμήμα Γεωργικών, Δασικών και Διατροφικών Επιστημών του Πανεπιστημίου του Τορίνο, στην Ιταλία, για την παροχή των δειγμάτων για την πραγματοποίηση των αναλύσεων, καθώς και για την άψογη συνεργασία που είχαμε. Δεν θα μπορούσα να ξεχάσω τον μεταδιδάκτορα Κωνσταντίνο Φειδάντση, στον οποίο οφείλω ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ τόσο για την βοήθειά του στις αναλύσεις και σε διάφορα στάδια της πειραματικής διαδικασίας, όσο και για την ψυχολογική υποστήριξη που μου παρείχε. Τέλος, ευχαριστώ τον Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας κ. Βασίλη Μιχαηλίδη και τον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας κ. Αθανάσιο Παπαδόπουλο που δέχτηκαν να είναι μέλη της εξεταστικής μου επιτροπής καθώς και για τις εύστοχες παρατηρήσεις τους πάνω στο κείμενο. 1

4 Περιεχόμενα Εισαγωγή Η υδατοκαλλιέργεια σήμερα Οι ιχθυοτροφές στις υδατοκαλλιέργειες Επίδραση εναλλακτικών σιτηρεσίων Παράμετροι αύξησης Βιολογία καταπόνησης Αντιοξειδωτικά ένζυμα Απόπτωση-αυτοφαγία Σκοπός Υλικά και μέθοδοι Γενικά στοιχεία της βιολογίας των ειδών Τσιπούρα Λαβράκι Ιριδίζουσα πέστροφα Πειραματικός σχεδιασμός Πειράματα Σιτηρέσια Προσδιορισμός ενζυμικών δραστικοτήτων Αντιοξειδωτικά ένζυμα Ρεδουκτάση της γλουταθειόνης (GR) Υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) Καταλάση (CAT) Μεταβολικά ένζυμα Αφυδρογονάση του γαλακτικού οξέος (L-LDH) Συνθετάση του κιτρικού οξέος (CS) Αφυδρογονάση του μαλικού οξέος (MDH) Προσδιορισμός πρωτεϊνών Απομόνωση πρωτεϊνών και προσδιορισμός ολικής πρωτεΐνης Western blot ανάλυση

5 4.3 Dot blot ανάλυση Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα Επίδραση στη δραστικότητα των ενζύμων Αντιοξειδωτικά ένζυμα Ρεδουκτάση της γλουταθειόνης (GR) Υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) Καταλάση (CAT) Μεταβολικά ένζυμα Αφυδρογονάση του γαλακτικού οξέος (L-LDH) Συνθετάση του κιτρικού οξέος (CS) Αφυδρογονάση του μαλικού οξέος (MDH) Επίδραση στην έκφραση των πρωτεϊνών θερμικού πλήγματος Hsp Hsp Επίδραση στην φωσφορυλίωση των MAPKs p38mapk ERKs JNKs Επίδραση στην απόπτωση και την αυτοφαγία Bcl Bax Kασπάση Oυβικουιτίνη LC3BII/LC3BI SQSTM1/p

6 Συζήτηση... 8 Συμπεράσματα Βιβλιογραφία

7 Περίληψη Η παγκόσμια παραγωγή από υδατοκαλλιέργειες έχει σημειώσει μια σταθερή αύξηση από την δεκαετία του 195 μέχρι σήμερα, ξεπερνώντας τους 66,5 εκατομμύρια τόνους το 212. Η συνεχής αύξηση του ανθρώπινου πληθυσμού δημιουργεί μεγαλύτερες απαιτήσεις για παραγωγή τροφής, με αποτέλεσμα να ασκείται ολοένα και μεγαλύτερη πίεση στις υδατοκαλλιέργειες για μεγιστοποίηση της παραγωγής τους. Κατά συνέπεια, καθίσταται απαραίτητη η παραγωγή μεγαλύτερων ποσοτήτων σιτηρεσίων για χρησιμοποίηση τους ως τροφή για τα εκάστοτε εκτρεφόμενα είδη. Ωστόσο, η παραγωγή ιχθυάλευρου και ιχθυελαίου, που αποτελούν παγκοσμίως τα κύρια συστατικά των ιχθυοτροφών, έχει μειωθεί κυρίως εξαιτίας της συρρίκνωσης των ιχθυοαποθεμάτων λόγω υπεραλίευσης. Η μείωση αυτή, σε συνδυασμό με την αυξημένη ζήτηση που υπάρχει, έχει οδηγήσει σε σημαντική άνοδο της τιμής των δύο αυτών συστατικών τα τελευταία χρόνια. Έτσι, η έρευνα έχει στραφεί στην αναζήτηση εναλλακτικών πηγών πρωτεϊνών που είναι ικανές να αντικαταστήσουν αυτές που χρησιμοποιούνται σήμερα. Μια από αυτές αποτελούν οι φυτικές πρωτεΐνες, με σημαντικότερη εξ αυτών τη σόγια, η οποία χρησιμοποιείται για την σίτιση αρκετών ειδών εκτρεφόμενων ψαριών. Μια νέα, ελπιδοφόρα και υψηλής ποιότητας πηγή πρωτεϊνών συνιστούν τα έντομα, παρόλο που η προοπτική χρήσης τους ως τροφή στις ιχθυοκαλλιέργειες διάφορων ειδών δεν έχει λάβει την απαραίτητη προσοχή σε πολλά μέρη του κόσμου. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της επίδρασης που έχει η μερική αντικατάσταση ιχθυάλευρων με άλευρα από το έντομο Tenebrio molitor σε παραμέτρους της φυσιολογίας καταπόνησης σε τρία είδη εκτρεφόμενων τελεόστεων μεγάλης οικονομικής αξίας: την τσιπούρα (Sparus aurata), το λαβράκι (Dicentrarchus labrax) και την ιριδίζουσα πέστροφα (Oncorhynchus mykiss). Πραγματοποιήθηκε φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός της δραστικότητας αντιοξειδωτικών και μεταβολικών ενζύμων και ανάλυση κατά Western και Dot Blot πρωτεϊνών-δεικτών καταπόνησης, καθώς και πρωτεϊνών σχετιζόμενων με την απόπτωση και την αυτοφαγία στην καρδιά, το ήπαρ, τον μυ και τον πεπτικό σωλήνα. Όσον αφορά τα αποτελέσματα, στα ένζυμα του βασικού μεταβολισμού (αερόβιου και αναερόβιου) όπως είναι η L-LDH, η CS και η MDH, ανάλογα με τον εξεταζόμενο ιστό, παρατηρούνται μεταβολές σε σχέση με την % αντικατάσταση 5

8 κυρίως στην τσιπούρα και στο λαβράκι. Οι λιγότερο σημαντικές μεταβολές παρατηρήθηκαν στην ιριδίζουσα πέστροφα. Παράλληλα με τα παραπάνω αποτελέσματα, αυξημένη δραστικότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων που υποδεικνύει αυξημένο οξειδωτικό στρες παρατηρήθηκε κυρίως στους ιστούς της τσιπούρας και του λαβρακιού, και συγκεκριμένα στο ήπαρ. Αν και οι δείκτες οξειδωτικού στρες παρουσιάστηκαν αυξημένοι, δεν παρατηρήθηκε μια ανάλογη μεταβολή στις πρωτεΐνες που συμμετέχουν στο μονοπάτι της απόπτωσης. Συγκεκριμένα, η χορήγηση του εντομοάλευρου προκάλεσε αύξηση των επιπέδων της αντιαποπτωτικής Bcl-2 και μείωση της αποπτωτικής Bax και των πρωτεϊνών που είναι συζευγμένες με τις κασπάσες και την ουβικουϊτίνη, μαρτυρώντας μια θετική επίδραση του εντομοαλεύρου στο μονοπάτι αυτό. Πιθανότατα, το οξειδωτικό στρες επηρέασε περισσότερο το μονοπάτι της αυτοφαγίας όπως φαίνεται από την αύξηση του λόγου LC3B II/LC3B I και την παράλληλη μείωση των επιπέδων της SQSTM1/p62. Αντίστοιχα, όσον αφορά τις πρωτεΐνες θερμικού πλήγματος, ενώ η έκφραση της Hsp9 παρουσιάστηκε κατά βάση μειωμένη και στα τρία υπό μελέτη είδη, τα επίπεδα της Hsp7 ήταν κατά βάση αυξημένα στους ιστούς της τσιπούρας και του λαβρακιού. Η φωσφορυλίωση των MAPKs παρουσίασε μεταβολές ανάλογα με τον εξεταζόμενο ιστό και το ποσοστό αντικατάστασης με εντομοάλευρα, με τις λιγότερο σημαντικές μεταβολές να εμφανίζονται στην ιριδίζουσα πέστροφα. Οι ποικίλες μεταβολές των συγκεκριμένων κινασών μαρτυρούν την πληθώρα των στόχων και των κυτταρικών λειτουργιών στις οποίες εμπλέκονται και τελικά ρυθμίζουν. Εν κατακλείδι, από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας προέκυψε ιστοειδική και ειδοειδική απόκριση των εξεταζόμενων ειδών στα σιτηρέσια με εντομοάλευρα, με την ιριδίζουσα πέστροφα να είναι το είδος που επηρεάστηκε λιγότερο σε σχέση με την τσιπούρα και το λαβράκι. Για μια πιο εμπεριστατωμένη άποψη στην επίδραση της αντικατάστασης ιχθυαλεύρων με εντομοάλευρα στην υγεία και στη βελτίωση φυσιολογικών παραμέτρων σε εκτρεφόμενα είδη, κρίνεται απαραίτητη η περαιτέρω μελέτη φυσιολογικών δεικτών. 6

9 Abstract Global aquaculture production has raised steadily since 195 to date, surpassing 66.5 million tonnes in 212. The continuing increase of human population demands greater food production, thereby increasing pressure to aquaculture to maximize its production. Consequently, production of larger quantities of aquafeeds used as meal for farmed species becomes a necessity. However, the production of fishmeal and fish oil, which are the main ingredients of aquafeeds worldwide, has decreased mainly due to shrinking of fish stocks attributed to overfishing. This decline, in correlation to the existing increased demand, has lately led to a significant rise in the price of these two components. Thus, research has been directed to the search of alternative protein sources capable of replacing those presently used. Among the plant proteins widely used in aquaculture, soya is the most important and is used as feed in diets of various farmed fish. Insects are a new, high quality protein source, although their potential as aquafeed for many farmed species is underestimated in many parts of the world. The aim of this study was to investigate the effect of partial fishmeal substitution with Tenebrio molitor meal in three different teleost species of great economic importance: gilthead seabream (Sparus aurata), European seabass (Dicentrarchus labrax) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). We measured the activities of antioxidant and metabolic enzymes phasmatophotometrically, as well the levels of stress-related proteins and proteins related to apoptosis and autophagy using Western and Dot Blot analysis the heart, the liver, the muscles and the digestive tract. Regarding our results, the aerobic and anaerobic enzymes of basic metabolism such as L-LDH, CS and MDH, depending on the examined tissue, exhibit variations compared to the % substitution mainly in the gilthead sea bream and the European sea bass. The less significant variations were observed in the rainbow trout. Additionally to the above results, increased activity of antioxidant enzymes exhibiting increased oxidative stress, was observed mainly in the tissues of sea bream and sea bass and specifically in the liver. Even though oxidative stress indicators increased their values, a respective increase in the levels of proteins participating in the apoptosis cascade was not observed. Specifically, insect meal substitution resulted in the increase of the antiapoptotic Bcl-2 and decrease of apoptotic Bax and protein 7

10 conjugated with caspases and ubiquitin, indicating a positive effect of insect meal on the specific cascade. Probably, oxidative stress mostly affected the autophagy cascade as it is observed from the increase of LC3B II/LC3B I ratio and the parallel decrease of SQSTM1/p62 levels. Concerning heat shock proteins, even though Hsp9 levels decreased in all 3 examined species, induction of Hsp7 was obvious mainly in the tissues of sea bream and sea bass. MAPK phosphorylation exhibited variations depending on the examined tissue and the % insect meal substitution, with the less significant variations observed in the rainbow trout. These kinases variations exhibit the variety of targets and cell functions in which these molecules are involved and finally regulate. Thus, the above results indicate a species and tissue specific response of the examined species with rainbow trout being the species less affected compared to the other two. A further investigation of molecular and physiological indicators is needed for an in depth analysis of the effect of insect meal substitution on the health and improvement of physiological parameters of farmed species. 8

11 Εισαγωγή 9

12 1. Η υδατοκαλλιέργεια σήμερα Σύμφωνα με τον ορισμό του Παγκόσμιου Οργανισμού Τροφίμων και Γεωργίας (Food and Agriculture Organization, FAO), η υδατοκαλλιέργεια ορίζεται ως η καλλιέργεια υδρόβιων οργανισμών σε ηπειρωτικές ή παράκτιες περιοχές η οποία περιλαμβάνει παρεμβάσεις στις διαδικασίες της αύξησης και της εκκόλαψης, προκειμένου να βελτιωθεί η παραγωγή και η ατομική ή συνεταιριστική ιδιοκτησία του καλλιεργούμενου αποθέματος. Σήμερα, αποτελεί τον ταχύτερα αναπτυσσόμενο κλάδο της γεωργίας και εκτιμάται ότι η ιχθυοκαλλιέργεια, ο πιο δυναμικός της τομέας, είναι υπεύθυνη για την παραγωγή του 5% της συνολικής καταναλισκόμενης για τροφή ποσότητας ψαριών παγκοσμίως. Η παγκόσμια παραγωγή από υδατοκαλλιέργειες παρουσιάζει μια σταθερή αύξηση τις τελευταίες δεκαετίες (δεκαετία 195 σήμερα) (Εικ. 1). Συγκεκριμένα, το έτος 199 η παραγωγή ανέρχονταν κοντά στους 13 εκατομμύρια τόνους, ενώ το έτος 212 ξεπέρασε τους 66,5 εκατομμύρια τόνους. Σημαντικότερη παραγωγός χώρα είναι η Κίνα με παραγωγή πάνω από 41 εκατομμύρια τόνους το 212, που αντιστοιχεί στο 61,7% της παγκόσμιας παραγωγής για το εν λόγω έτος. Τα κυριότερα είδη εκτρεφόμενων ιχθύων παγκοσμίως είναι ο κυπρίνος (Cyprinus carpio), ο σολομός του Ατλαντικού (Salmo salar), η ιριδίζουσα πέστροφα (Oncorhynchus mykiss) και η τιλάπια (Oreochromis niloticus) (FAO 214). Εικόνα 1: Εξέλιξη της παγκόσμιας παραγωγής προϊόντων αλιείας και υδατοκαλλιεργειών ( Figure 1: Global fish and aquaculture production ( 1

13 Η παραγωγή της ευρωπαϊκής υδατοκαλλιέργειας παρουσιάζει μια σταθερά αυξητική πορεία από την δεκαετία του 195 μέχρι τις μέρες μας (Εικ. 2). Συγκεκριμένα, το έτος 195 η συνολική παραγωγή κυμαίνονταν μόλις στους 2. τόνους περίπου, ενώ το έτος 212 ύστερα από μακροχρόνια σταδιακή αύξηση έφτασε τόνους. Ωστόσο, το μερίδιο της ευρωπαϊκής υδατοκαλλιέργειας στην παγκόσμια παραγωγή παρουσιάζει μια σταδιακή μείωση όλα αυτά τα χρόνια, κυρίως ως αποτέλεσμα της επέκτασης του κλάδου και σε άλλες ηπείρους, και ειδικότερα στην Ασία. Οι σημαντικότερες παραγωγές χώρες είναι η Νορβηγία, η Γαλλία, η Ισπανία και το Ηνωμένο Βασίλειο, ενώ τα κυριότερα εκτρεφόμενα είδη είναι ο σολομός του Ατλαντικού και η ιριδίζουσα πέστροφα (FAO 214). Εικόνα 2: Εξέλιξη ευρωπαϊκής παραγωγής υδατοκαλλιέργειας και αναλογία αυτής στην παγκόσμια παραγωγή ( Figure 2: European aquaculture production and its proportion in global production ( H παραγωγή της ελληνικής υδατοκαλλιέργειας όπως φαίνεται στην Εικ. 3, σημείωσε εντυπωσιακή αύξηση τα τελευταία χρόνια, κυρίως από την δεκαετία του 198 και μετά λόγω της εμφάνισης των πρώτων θαλασσοκαλλιεργειών. Έτσι, το έτος 29 η παραγωγή της ελληνικής υδατοκαλλιέργειας ξεπέρασε τους 12. τόνους, με την Ελλάδα να κατέχει σήμερα την πρώτη θέση στην Ευρώπη στην παραγωγή τσιπούρας (Sparus aurata) και λαβρακιού (Dicentrarchus labrax). Ο κλάδος της 11

14 ιχθυοκαλλιέργειας καλύπτει μόλις το,2% του εγχώριου προϊόντος, αλλά οι εξαγωγές του καλύπτουν το 3% των εξαγωγών της χώρας και το 12% των εξαγωγών του πρωτογενούς τομέα. Σύμφωνα με τα στοιχεία του Ελληνικού Οργανισμού Εξωτερικού Εμπορίου, το έτος 212 οι εξαγωγές ψαριών κατέλαβαν τη δεύτερη θέση στις εξαγωγές ελληνικών αγροτικών προϊόντων και ήταν μεγαλύτερες από τις εξαγωγές βαμβακιού, ελαιολάδου και λαχανικών (FAO 213). Εικόνα 3: Διαχρονική εξέλιξη της παραγωγής ελληνικής υδατοκαλλιέργειας ( Figure 3: Greek aquaculture production ( Σε παγκόσμιο επίπεδο τόσο η παραγωγή της ιχθυοκαλλιέργειας εσωτερικών υδάτων όσο και αυτή της θαλασσοκαλλιέργειας παρουσιάζουν σταθερή αύξηση, με την πρώτη ωστόσο να χαρακτηρίζεται από υψηλότερες τιμές και να είναι σταθερά μεγαλύτερη από την παραγωγή της θαλασσοκαλλιέργειας (Εικ.4). Αυτό οφείλεται Εσωτ.υδάτων Θαλασσοκαλλιέργεια Εικόνα 4: Εξέλιξη της παραγωγής ιχθυοκαλλιέργειας σε θαλάσσια και εσωτερικά ύδατα παγκοσμίως (με στοιχεία από FAO 214) Figure 4: World production of food fish from mariculture and inland aquaculture (data from FAO 214) 12

15 κυρίως στην ραγδαία ανάπτυξη που σημείωσε η ιχθυοκαλλιέργεια εσωτερικών υδάτων στην Κίνα και συγκεκριμένα η εκτροφή κυπρίνου. Όσον αφορά στην Ευρώπη, παρατηρείται μια συνεχόμενη αύξηση της παραγωγής της θαλάσσιας ιχθυοκαλλιέργειας που οφείλεται κατά κύριο λόγο στην ανάπτυξη που σημείωσε η εκτροφή τσιπούρας και λαβρακιού στην περιοχή της Μεσογείου κατά την τελευταία 2ετία. Αντίθετα, η παραγωγή της ιχθυοκαλλιέργειας εσωτερικών υδάτων από την αρχή της δεκαετίας του 199 και έπειτα έχει σημειώσει σημαντική πτώση, κυρίως λόγω του γεγονότος ότι η παραγωγή του κυπρίνου, που αποτελούσε το σημαντικότερο είδος στην ευρωπαϊκή ιχθυοκαλλιέργεια εσωτερικών υδάτων, παρουσίασε σημαντική μείωση εξαιτίας της μειωμένης ζήτησης, αλλά και λόγω περιβαλλοντικών περιορισμών (Εικ. 5) (FAO 214). Εσωτ.υδάτων Θαλασσοκαλλιέργεια Εικόνα 5: Εξέλιξη της παραγωγής ιχθυοκαλλιέργειας σε θαλάσσια και εσωτερικά ύδατα στην Ευρώπη (με στοιχεία από FAO 214) Figure 5: European production of food fish from mariculture and inland aquaculture (data from FAO 214) Στην Ελλάδα, παρόλο που η εμφάνιση των πρώτων θαλάσσιων ιχθυοκαλλιεργειών έγινε μόλις της αρχές της δεκαετίας του 198, αυτές σημείωσαν ραγδαία ανάπτυξη χάρη της φυσικές συνθήκες που προσφέρει το κλίμα της χώρας, στην εκτεταμένη ακτογραμμή, καθώς της και εξαιτίας της αυξανόμενης ζήτησης της αγοράς για τα μεσογειακά είδη (τσιπούρα και λαβράκι). Έτσι, σήμερα σύμφωνα με στοιχεία της Εθνικής Στατιστικής Υπηρεσίας Ελλάδος (ΕΣΥΕ, 29) το 96% της παραγωγής της ελληνικής ιχθυοκαλλιέργειας προέρχεται από την θαλάσσια ιχθυοκαλλιέργεια και το υπόλοιπο 4% από την ιχθυοκαλλιέργεια εσωτερικών υδάτων, 13

16 με την σημαντικότερη μορφή της να αποτελεί η καλλιέργεια της ιριδίζουσας πέστροφας, με παραγωγή σχεδόν σταθερή πάνω από της 2. τόνους/έτος από την δεκαετία του 198 και έπειτα (FAO 214). 2. Οι ιχθυοτροφές στις υδατοκαλλιέργειες Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, οι υδατοκαλλιέργειες βρίσκονται σε μια σταθερά ανοδική πορεία τις τελευταίες δεκαετίες σε παγκόσμιο επίπεδο, με ολοένα αυξανόμενη παραγωγή. Επιπρόσθετα, η συνεχής αύξηση του ανθρώπινου πληθυσμού σε παγκόσμιο επίπεδο (έχει ξεπεράσει ήδη τα 7 δισεκατομμύρια ενώ εκτιμάται ότι θα ανέρχεται στα 9 το 25) και η επακόλουθη αυξημένη ανάγκη για παραγωγή τροφής έχουν δημιουργήσει μια τεράστια πίεση στις υδατοκαλλιέργειες για μεγιστοποίηση της παραγωγής. Έτσι, είναι απαραίτητη η παραγωγή μεγαλύτερων ποσοτήτων σιτηρεσίων που θα χρησιμοποιηθούν ως τροφή για τα διάφορα καλλιεργούμενα είδη (FAO 213). Το ιχθυάλευρο και το ιχθυέλαιο αποτελούν τα σημαντικότερα συστατικά των ιχθυοτροφών παγκοσμίως τις τελευταίες δεκαετίες. Το ιχθυάλευρο περιέχει ιδανική σύνθεση σε αμινοξέα, παρέχοντας αρκετά καλή ποιότητα πρωτεϊνών για τα περισσότερα καλλιεργούμενα είδη ψαριών, είναι γευστικό και ενισχύει την απορρόφηση, ενώ το ιχθυέλαιο αποτελεί επίσης πηγή λιπαρών οξέων (Jackson 26). Ωστόσο, η υποβάθμιση του θαλάσσιου περιβάλλοντος και η συρρίκνωση των ιχθυοαποθεμάτων λόγω υπεραλίευσης έχουν οδηγήσει στη μείωση της παγκόσμιας παραγωγής ιχθυάλευρου, η οποία σε συνδυασμό με την αυξημένη του ζήτηση, είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της τιμής του (Εικ. 6) τα τελευταία χρόνια (Sanchez-Muros et al. 214). Έτσι, λαμβάνοντας υπόψη και την ολοένα και εντονότερη πίεση που ασκείται στις υδατοκαλλιέργειες για παραγωγή τροφής, η έρευνα έχει πλέον στραφεί στην αναζήτηση εναλλακτικών πηγών πρωτεϊνών, ικανών να αντικαταστήσουν τα άλευρα και τα έλαια που χρησιμοποιούνται σήμερα (Jackson 26, FAO 213). 14

17 Εικόνα 6: Εξέλιξη της εμπορικής τιμής ιχθυάλευρου και ιχθυελαίου (από Tacon & Metian 28) Figure 6: Market price of fishmeal and fish oil (Tacon & Metian 28) Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί ορισμένες εναλλακτικές πηγές που μπορούν να αντικαταστήσουν τα ιχθυάλευρα και τα ιχθυέλαια σε διαφορετικά ποσοστά, όπως είναι οι ζωικές πηγές πρωτεϊνών, οι φυτικές πρωτεΐνες και τα έντομα (Anastasiou & Nengas 25, FAO 213). Οι ζωικές πηγές πρωτεϊνών αποτελούν μια καλή και χαμηλού κόστους πηγή πρωτεϊνών που θα μπορούσε να αντικαταστήσει μερικώς το ιχθυάλευρο. Ωστόσο η οδηγία περί απαγόρευσης χρήσης τροφών που παράγονται από χερσαία ζώα, ως σιτηρέσιο στις υδατοκαλλιέργειες (αριθ. 999/21) αποτέλεσε τροχοπέδη σε αυτή την προοπτική (Anastasiou & Nengas 25). Οι φυτικές πηγές πρωτεϊνών συνιστούν επίσης μια σημαντική εναλλακτική πηγή καθώς εκτός του χαμηλού τους κόστους είναι και ευρέως διαθέσιμες στη φύση. Τα μειονεκτήματά τους έγκεινται στην χαμηλή τους περιεκτικότητα σε ορισμένα απαραίτητα αμινοξέα, ενέργεια και ιχνοστοιχεία, όπως ο φώσφορος (Alexis & Nengas 21), στη σχετικά χαμηλή τους γευστικότητα και στην υψηλή τους περιεκτικότητα σε μη-αμυλούχους πολυσακχαρίτες, τα οποία καθιστούν απαραίτητο τον συνδυασμό τους και με άλλες πηγές πρωτεϊνών (Sanchez-Muros et al. 214). Η σημαντικότερη και περισσότερο αποδεκτή φυτική πηγή πρωτεϊνών για την αντικατάσταση του ιχθυάλευρου είναι η σόγια που έχει χρησιμοποιηθεί για τη διατροφή διαφόρων ειδών εκτρεφόμενων ψαριών, παρόλο που η διατροφική της αξία για τα καλλιεργούμενα είδη είναι αμφιλεγόμενη (Anastasiou & Nengas 25). Μια νέα και ελπιδοφόρα εναλλακτική πηγή πρωτεϊνών αποτελούν τα έντομα, παρόλο που η δυνατότητά τους να αποτελέσουν τροφή για αρκετά είδη εκτρεφόμενων ψαριών παραμένει ακόμη υποεκτιμημένη στα περισσότερη μέρη του κόσμου (FAO 15

18 213, Sanchez-Muros et al. 214). Τα έντομα μπορούν να παρέχουν μεγάλη ποσότητα πρωτεϊνών υψηλής ποιότητας. Διαθέτουν πολύ καλή αμινοξική σύσταση και είναι πλούσια σε ορισμένα βασικά αμινοξέα όπως η μεθειονίνη, η λυσίνη και η λευκίνη, ενώ είναι ιδιαίτερα εύπεπτα (Sanchez-Muros et al. 214). Πέραν της σημαντικής διατροφικής τους αξίας όμως, ο μικρός χώρος που απαιτεί η καλλιέργεια και η ανάπτυξή τους, καθώς και το γεγονός ότι αρκετά είδη εντόμων αποτελούν φυσική τροφή για ορισμένα είδη εκτρεφόμενων ψαριών μπορούν να διευρύνουν τις προοπτικές χρήσης τους ως τροφή στις υδατοκαλλιέργειες (FAO 213). Επίσης, η χιτίνη, ο πολυσακχαρίτης που αποτελεί το κύριο συστατικό του εξωσκελετού των εντόμων συνιστά μια ουσιώδη πηγή ενέργειας για το είδος Rachycentron canadum (Gutowska et al. 24). Επίσης, προκαλεί αύξηση στην δραστηριότητα του ανοσοποιητικού συστήματος της τσιπούρας (Esteban et al. 21) και τέλος, διεγείρει τη μακροφαγική ικανότητα της ιριδίζουσας πέστροφας (Sakai et al. 1992). Ωστόσο, η έλλειψη πολυακόρεστων ω-3 λιπαρών οξέων όπως το εικοσαπεντανοϊκό (EPA) και το δοκοσαεξανοϊκό οξύ (DHA) στη σύσταση λιπαρών οξέων των εντόμων αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα για τη χρήση τους (Rumpold & Schluter 213), καθιστώντας απαραίτητη την περαιτέρω διερεύνηση για το ποσοστό στο οποίο είναι δυνατό να υποκατασταθεί το ιχθυάλευρο και το ιχθυέλαιο με άλευρα από έντομα στα σιτηρέσια των ψαριών. Εντούτοις, πρόσφατες έρευνες δείχνουν ότι είναι δυνατή η ενσωμάτωση ω-3 λιπαρών οξέων σε προνύμφες εντόμων, πριν αυτές χορηγηθούν ως τροφή σε εκτρεφόμενα είδη (St-Hilaire et al. 27). Μέχρι σήμερα, αρκετά είδη εντόμων έχουν χορηγηθεί ως τροφή σε εκτρεφόμενα ψάρια με ενθαρρυντικά μάλιστα αποτελέσματα. Συγκεκριμένα, μεταξύ άλλων έχουν χρησιμοποιηθεί άλευρα από την ακρίδα Zonocerus variegatus (Alegbeleye et al. 212) και το σκαθάρι Tenebrio molitor (Ng et al. 21) ως σιτηρέσιο για το αφρικανικό γατόψαρο Clarias gariepinus. Επίσης, άλευρα από την μύγα-μαύρο στρατιώτη Hermetia illucens (St-Hilaire et al. 27, Sealey et al. 211) και την κοινή μύγα Musca domestica (St-Hilaire et al. 27) για τη σίτιση της ιριδίζουσας πέστροφας, από το σκαθάρι Zophobas morio για τη σίτιση της τιλάπιας Oreochromis niloticus (Jabir et al. 212) και τέλος, άλευρα βασισμένα στον τερμίτη Macrotermes subhyalinus ως σιτηρέσιο για το είδος Heterobranchus longifilis (Sogbesan & Ugwumba 28). 16

19 3. Επίδραση εναλλακτικών σιτηρεσίων 3.1 Παράμετροι αύξησης Βασική παράμετρο των σιτηρεσίων αποτελεί η επίδραση που έχουν στην αύξηση των εκτρεφόμενων ψαριών. Στην περίπτωση των εναλλακτικών σιτηρεσίων, η απόδοση αυτών όσον αφορά την αύξηση των ψαριών ποικίλλει, ανάλογα με το ποσοστό αντικατάστασης του ιχθυάλευρου, αλλά και με το εκάστοτε εκτρεφόμενο είδος. Στην τσιπούρα, οι Nengas et al. (1996) παρατήρησαν ότι η αντικατάσταση ιχθυάλευρου με σογιάλευρο σε ποσοστό 1 και 2% δεν έχει σημαντική επίδραση στην αύξηση και στο τελικό σωματικό βάρος των ψαριών, σε σχέση με τα άτομα τα οποία σιτίζονταν με σιτηρέσιο αποτελούμενο αποκλειστικά από ιχθυάλευρο. Ωστόσο, στην ίδια εργασία, μεγαλύτερο ποσοστό αντικατάστασης (3 ή 4%) οδηγεί σε μείωση του σωματικού βάρους των ψαριών. Αργότερα, οι Kissil et al. (2) προχώρησαν σε μεγαλύτερη υποκατάσταση ιχθυάλευρου με σόγια στη σίτιση της τσιπούρας, συγκεκριμένα σε σιτηρέσια 3, 6 και 1%. Τα αποτελέσματά τους έδειξαν ότι το τελικό σωματικό βάρος των ψαριών μειώνεται με την αύξηση του ποσοστού αντικατάστασης ιχθυάλευρου με σόγια. Στο λαβράκι, η χορήγηση σιτηρεσίων με υψηλά ποσοστά αντικατάστασης ιχθυάλευρου με φυτικές πηγές πρωτεϊνών (>5%) δεν παρουσιάζει σημαντικό αντίκτυπο στα ποσοστά αύξησης των ψαριών, με το τελικό σωματικό βάρος και μήκος αυτών να μην διαφέρει σημαντικά μεταξύ των διαφορετικών καταστάσεων σίτισης (Kaushik et al. 24). Τέλος στην ιριδίζουσα πέστροφα, οι Gomes et al. (1995) υποκατέστησαν το ιχθυάλευρο με φυτικές πηγές πρωτεϊνών σε ποσοστά 33, 66 και 1% παρατηρώντας μη σημαντικές διαφορές, όσον αφορά το τελικό βάρος των ψαριών και το ρυθμό αύξησης στις καταστάσεις 33 και 66% αντικατάστασης σε σχέση με την κατάσταση ελέγχου. Οι τιμές, ωστόσο, των δύο παραπάνω παραμέτρων είναι σημαντικά χαμηλότερες στην κατάσταση με την ολική αντικατάσταση (1%) στην προαναφερόμενη εργασία. Όπως προαναφέρθηκε, τα τελευταία χρόνια έχει αρχίσει η μερική υποκατάσταση των ιχθυαλεύρων με άλευρα από έντομα. Οι St-Hilaire et al. (27) χρησιμοποίησαν άλευρα βασισμένα σε προνύμφες και νύμφες της μύγας-μαύρου στρατιώτη και της κοινής μύγας για τη σίτιση της ιριδίζουσας πέστροφας. Ειδικότερα, στη συγκεκριμένη εργασία δύο σιτηρέσια αποτελούνταν από άλευρα προερχόμενα από προνύμφες του πρώτου εντόμου σε ποσοστό 25 και 5% αντίστοιχα, ενώ το τρίτο 17

20 σιτηρέσιο περιείχε άλευρα από νύμφες του δεύτερου εντόμου σε ποσοστό 25%. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, κανένα από τα προαναφερθέντα σιτηρέσια δεν προκαλεί σημαντικές διαφορές στο τελικό βάρος των ψαριών. Όπως προαναφέρθηκε, ο εμπλουτισμός προνυμφών με ω-3 λιπαρά οξέα πριν αυτές χορηγηθούν ως τροφή σε εκτρεφόμενα είδη ψαριών αποτελεί μια προοπτική που μπορεί να περιορίσει αρκετά το μειονέκτημα της έλλειψης πολυακόρεστων λιπαρών οξέων στα έντομα. Ωστόσο, θα πρέπει να διερευνηθεί τόσο η αποδοτικότητα των τροποποιημένων αυτών σιτηρεσίων, όσο και η επίδρασή τους στο ρυθμό αύξησης των ψαριών. Έτσι, οι Sealey et al. (211) πραγματοποίησαν πείραμα σίτισης στην ιριδίζουσα πέστροφα χρησιμοποιώντας ως σιτηρέσια άλευρα από προνύμφες της μύγας-μαύρου στρατιώτη σε ποσοστό 25 και 5%, καθώς και από προνύμφες του ίδιου εντόμου εμπλουτισμένες σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα στα ίδια ποσοστά αντικατάστασης του ιχθυάλευρου. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι η αύξηση των ψαριών που σιτίστηκαν με τις εμπλουτισμένες προνύμφες δεν διαφέρει σημαντικά σε σχέση με αυτά που σιτίζονταν μόνο με ιχθυάλευρο, ενώ η αύξηση των ατόμων που σιτίστηκαν με τις κανονικές προνύμφες είναι σημαντικά μειωμένη συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. 3.2 Βιολογία καταπόνησης Η κατανόηση της επίδρασης που έχουν οι διαφοροποιήσεις του διατροφικού καθεστώτος των εκτρεφόμενων οργανισμών, όπως π.χ. η ασιτία και η επανασίτιση, καθώς και τα εναλλακτικά σιτηρέσια, στη φυσιολογία θρέψης είναι αναγκαία. Ωστόσο, η πιθανή επίδραση τόσο των μεταβολικών, όσο και διατροφικών προκλήσεων στην ευζωία των ψαριών, αλλά και στην πιθανή πρόκληση καταπόνησης (stress) παραμένει αδιευκρίνιστη. Επιπλέον, παρά τις οδηγίες και τους κανονισμούς του Ευρωπαϊκού συμβουλίου και κοινοβουλίου για την καλή διαβίωση και ορθή μεταχείρηση των ζώων, καθώς και τη μείωση της καταπόνησης, εντούτοις ακόμη και σήμερα τίθενται ερωτήματα σχετικά με την αξιολόγηση της ευζωίας αλλά και της καταπόνησης των ζώων και συγκεκριμένα των ψαριών. Σε αυτό το πλαίσιο, η έκφραση των πρωτεϊνών θερμικού πλήγματος (Hsps) ως δείκτες κυτταρικής καταπόνησης (στρες), αλλά και δείκτες επαγόμενοι από 18

21 διαφορετικές διατροφικές προκλήσεις αποτελεί μια αρκετά υποσχόμενη προοπτική (Antonopoulou et al. 213, 214, Feidantsis et al. 214). Επίσης, κοινό δείκτη για την εκτίμηση της κυτταρικής αντίδρασης σε ποικίλες περιβαλλοντικές διαταραχές, όπως π.χ. η θερμοκρασία (Feidantsis et al. 212, 214) συνιστά και η φωσφορυλίωση των ενεργοποιούμενων από μιτογόνα πρωτεϊνικών κινασών (MAPKs). Μέλη της οικογένειας των MAPKs φαίνεται να επηρεάζονται και από διαφορετικές διατροφικές προκλήσεις, όπως π.χ. την ασιτία και επανασίτιση (Antonopoulou et al. 213), τα διαφορετικά λιπιδικής περιεκτικότητας σιτηρέσια (Antonopoulou et al. 214), τα σιτηρέσια μερικής υποκατάστασης με άλευρα σόγιας και παράλληλη χορήγηση ταυρίνης (Feidantsis et al. 214). Μεταξύ των πρωτεϊνικών οικογενειών των Hsps, οι Hsp7 και Hsp9 είναι από τις επικρατέστερες ομάδες με παρουσία σε όλους τους κυτταρικούς τύπους και εξαιρετικά συντηρημένες μεταξύ των φύλων. Η επαγωγή της έκφρασης των Hsps μπορεί να προκληθεί από μια ποικιλία στρεσσογόνων παραγόντων όπως η υπερθερμία, το ωσμωτικό στρες, η έκθεση σε βαρέα μέταλλα, τα χημικά σοκ και το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από υποξία ή ανοξία (Gornati et al. 24). Στις κυτταρικές λειτουργίες αυτών των πρωτεϊνών περιλαμβάνονται η αναδίπλωση, η επισκευή και η μετατόπιση ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών καθώς και η επανενεργοποίηση μετουσιωμένων πρωτεϊνών (Werner et al. 26), ενώ συγκεκριμένα για μέλη της οικογένειας Hsp7 έχει βρεθεί ότι συμβάλουν στην αποκατάσταση της κυτταρικής λειτουργίας κατά την ανάρρωση από το στρες, απομακρύνοντας μετουσιωμένες πρωτεΐνες εντός του κυττάρου (Joyeux-Faure et al. 23). Οι Hsps είναι κομβικής σημασίας για την ενεργοποίηση πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων, ενώ ακόμα αλληλεπιδρούν με σηματοδοτικά μόρια του κυτταρικού κύκλου και των μονοπατιών του κυτταρικού θανάτου. Επίσης, τα μεταβαλλόμενα επίπεδα των Hsps στα κύτταρα (ως αντίδραση στο στρες) μπορούν να αλλάξουν τη συνολική αντίδραση σε φυσιολογικά σήματα, ενώ ακόμα έχουν συσχετιστεί και με μειωμένες συγκεντρώσεις των μεταβολικών ενεργειακών αποθεμάτων (Werner et al. 26). Όσον αφορά την υπεροικογένεια των MAPKs, αυτή παίζει ένα σημαντικό ρόλο στα κύτταρα των θηλαστικών στη μεταγωγή ποικίλων εξωκυτταρικών σημάτων στο εσωτερικό του κυττάρου και τον πυρήνα και επομένως στην επαγωγή της γονιδιακής έκφρασης, τον πολλαπλασιασμό του κυττάρου και την απόπτωση. Τρεις 19

22 υποοικογένειες των MAPKs έχουν περιγραφεί λεπτομερώς: οι ERKs (p44/42 MAPK), oi JNKs και η p38mapk. Το μονοπάτι των ERKs ενεργοποιείται είτε από πολλαπλασιαστικά σήματα, ή από αυξητικούς παράγοντες, ενώ αυτά των JNKs και p38mapk από προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες και μια ποικιλία στρεσογόνων περιβαλλοντικών παραγόντων (Urushibara et al. 29). Πέραν των θηλαστικών τα παραπάνω γεγονότα που αφορούν τις MAPKs έχουν αναφερθεί και σε θαλάσσιους οργανισμούς συμπεριλαμβανομένων των ψαριών, ενώ υπάρχουν επίσης αναφορές για ενεργοποίηση των MAPKs από επαγωγή των Hsps σε ιστούς θηλαστικών (Sheikh- Hamad et al. 1998, Uehara et al. 1999, Rafiee et al. 23) και ερυθροκύτταρα τσιπούρας υπό την επίδραση θερμικού σοκ (Feidantsis et al. 212). Οι Antonopoulou et al. (213) μελέτησαν την επίδραση της μακροχρόνιας στέρησης τροφής (1 μήνας σίτιση-3 μήνες ασιτία) και της ασιτίας/επανασίτησης (2 μήνες ασιτία-2 μήνες σίτιση) στο κυτταρικό στρες και την αντιοξειδωτική άμυνα σε τέσσερις ιστούς στο λαβράκι. Συγκεκριμένα, παρατήρησαν αυξημένη φωσφορυλίωση των ERKs στις δύο αυτές καταστάσεις σε σχέση με τα λαβράκια της ομάδας ελέγχου (4 μήνες κανονικής σίτισης) στο έντερο. Στο ήπαρ και τον ερυθρό μυ της ασιτίας/επανασίτισης παρατηρήθηκαν μειωμένα επίπεδα της Hsp7 και της φωσφορυλιωμένης p38mapk, ενώ αντίθετα αυξημένα επίπεδα της Hsp9. Στους ίδιους ιστούς στην κατάσταση ασιτίας, τα επίπεδα της Hsp7 αυξήθηκαν, ενώ η φωσφορυλιωμένη p38mapk ελαττώθηκε μόνο στο ήπαρ. Τέλος, στον λευκό μυ τα επίπεδα της Hsp9 μειώθηκαν, ενώ αυξήθηκαν της φωσφορυλιωμένης p38mapk τόσο στην ασιτία, όσο και στην ασιτία/επανασίτιση σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Οι Feidantsis et al. (214) μελέτησαν την επίδραση εμπλουτισμένων με ταυρίνη σιτηρεσίων στην ενεργοποίηση των Hsps και MAPKs στο λαβράκι. Συγκεκριμένα, τα σιτηρέσια που χρησιμοποιήθηκαν περιείχαν ταυρίνη σε διαφορετικές συγκεντρώσεις [.2% (Τ.2),.5% (Τ.5) και 1.% (Τ 1.) w/w], ενώ στην ομάδα ελέγχου χορηγήθηκε σιτηρέσιο χωρίς ταυρίνη. Παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα Hsp7 και φωσφορυλιωμένης p38mapk στο ήπαρ και στις 3 καταστάσεις σίτισης με ταυρίνη, ενώ αύξηση στην φωσφορυλίωση των ERKs σημειώθηκε στο πρόσθιο τμήμα του εντέρου στις καταστάσεις σίτισης με τα σιτηρέσια Τ.2 και Τ.5. 2

23 3.3 Αντιοξειδωτικά ένζυμα Οι ελεύθερες οξειδωτικές ρίζες (ROS Reactive Oxygen Species) όπως η ρίζα του υπεροξειδίου (Ο2 - ), η ρίζα του υδροξυλίου (ΟΗ - ) και το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2) αποτελούν προϊόντα του μεταβολισμού του οξυγόνου και παράγονται συνεχώς σε όλους τους αερόβιους οργανισμούς. Όταν το ισοζύγιο μεταξύ της παραγωγής των ελεύθερων οξειδωτικών ριζών και της ικανότητας του οργανισμού να αδρανοποιεί τα τοξικά αυτά μόρια και να επισκευάζει τις βλάβες που προκαλούν διαταράσσεται, το αποτέλεσμα είναι η πρόκληση οξειδωτικού στρες το οποίο στη συνέχεια προκαλεί άλλες βλάβες όπως οξείδωση πρωτεϊνών και βάσεων στο DNA και υπεροξείδωση των λιπιδίων. Πρόσφατα το οξειδωτικό στρες έχει συσχετιστεί και με μια σειρά διεργασιών και ασθενειών, στις οποίες περιλαμβάνονται η μεταλλαξιγένεση, ο καρκίνος, η αρτηριοσκληρίωση, καρδιακές παθήσεις, διαταραχές του κεντρικού νευρικού συστήματος, χρόνιες φλεγμονώδεις ασθένειες, ενώ έχει αναφερθεί και ο πιθανός ρόλος του στην διαδικασία της γήρανσης (Martinez-Alvarez et al. 25). Τα ψάρια όπως όλοι οι αερόβιοι οργανισμοί είναι ευάλωτα στις ελεύθερες οξειδωτικές ρίζες και έτσι έχουν αναπτύξει μηχανισμούς αντιμετώπισης του οξειδωτικού στρες. Συγκεκριμένα, στα περισσότερα ψάρια που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα, η πρώτη γραμμή άμυνας φαίνεται να αποτελείται από αντιοξειδωτικά μόρια όπως η γλουταθειόνη (GSH), τις βιταμίνες C, E και Κ και τα καροτενοειδή, ενώ ο δεύτερος αμυντικός μηχανισμός συνίσταται από τα αντιοξειδωτικά ένζυμα καταλάση (CAT), υπεροξειδική δισμουτάση (SOD), υπεροξειδάση και ρεδουκτάση της γλουταθειόνης (GPx και GR) (Martinez-Alvarez et al. 25, Jin et al. 21). Οι αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί των ψαριών μπορούν να ενεργοποιηθούν κάτω από την επίδραση διάφορων βιοτικών και αβιοτικών παραγόντων, όπως οι περιβαλλοντικές μεταβολές, οι αλλαγές διατροφικών παραγόντων και συμπεριφορών, η παρουσία ξενοβιοτικών και οι παρασιτικές μολύνσεις (Martinez-Alvarez et al. 25). 21

24 3.4 Απόπτωση Αυτοφαγία Ο θάνατος των ευκαρυωτικών κυττάρων μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε με νέκρωση, είτε με απόπτωση. Η νέκρωση, που θεωρείται διαχρονικά ως ο παθητικός και μη ελεγχόμενος τύπος κυτταρικού θανάτου, είναι το τελικό αποτέλεσμα μιας βιοενεργητικής καταστροφής που οφείλεται στην εξάντληση των αποθεμάτων ATP σε τέτοιο επίπεδο που δεν συμβαδίζει με την επιβίωση του κυττάρου. Αιτίες της νέκρωσης αποτελούν διάφορες διαταραχές του κυτταρικού περιβάλλοντος όπως αυξημένες συγκεντρώσεις τοξινών και φυσικές βλάβες. Μορφολογικά, η νέκρωση χαρακτηρίζεται από το σχηματισμό κενοτοπίων στο κυτταρόπλασμα, διάσπαση της πλασματικής μεμβράνης και εμφάνιση φλεγμονής γύρω από το νεκρό κύτταρο η οποία οφείλεται στην απελευθέρωση από το κύτταρο του κυτταρικού περιεχομένου και διάφορων προφλεγμονοδών μορίων. Τέλος, συχνά παρατηρούνται αλλαγές και στη μορφολογία του πυρήνα του κυττάρου, χωρίς ωστόσο να παρατηρείται συμπύκνωση της χρωματίνης και κατακερματισμός του DNA (Edinger & Thompson 24, Lockshin & Zakeri 24). Από την άλλη μεριά, η απόπτωση θεωρείται ως ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος καθώς αποτελεί έναν ενδογενή μηχανισμό του κυττάρου, ο οποίος ρυθμίζεται από μια ποικιλία κυτταρικών σηματοδοτικών μονοπατιών. Κατά τον αποπτωτικό θάνατο παρατηρούνται συμπύκνωση της χρωματίνης και κατακερματισμός του DNA σε κομμάτια 2 bp, πακετάρισμα των νεκρών κυττάρων σε αποπτωτικά σωμάτια, δεν συμβαίνει διάσπαση της πλασματικής μεμβράνης, ενώ δεν παρατηρείται και σχηματισμός φλεγμονής γύρω από το νεκρό κύτταρο, όπως στην νέκρωση. Λόγω της ρύθμισης στην οποία υπόκειται, η απόπτωση είναι μια διεργασία που απαιτεί ενέργεια υπό μορφή ATP για την πραγματοποίησή της (Edinger & Thompson 24). Ο αποπτωτικός μηχανισμός του κυτταρικού θανάτου χαρακτηρίζεται από δύο διακριτά μονοπάτια, το εξωγενές και το ενδογενές. Το εξωγενές μονοπάτι ενεργοποιείται από ένα σύμπλοκο, στο σχηματισμό του οποίου συμμετέχουν εξωτερικοί υποδοχείς, διάφορες πρωτεΐνες καθώς και οι κασπάσες 8 και 1, ενώ το ενδογενές ενεργοποιείται από πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2 και είναι εξαρτώμενο από τα μιτοχόνδρια. Παράγοντες που προκαλούν βλάβες στο DNA ή αναστέλλουν την επιδιόρθωσή του, επάγουν την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c (πρωτεΐνη μεταφορέας ηλεκτρονίων),, από τα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα. Εκεί, το κυτόχρωμα c αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη Apaf-1 και την κασπάση-9 22

25 ενεργοποιώντας αμφότερες αυτές. Οι ενεργοποιημένες πλέον κασπάσες ρυθμίζουν καθοδικά με τη σειρά τους άλλες κασπάσες και πρωτεΐνες-στόχους ώστε να επαχθεί η διαδικασία της απόπτωσης και να επέλθει τελικά η λύση των κυττάρων, υπεύθυνα για την οποία είναι και πάλι τα εν λόγω ένζυμα. Μία άλλη πρωτεΐνη, η AIF, που απελευθερώνεται επίσης από τα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα κατά την απόπτωση, είναι πιθανό να προκαλεί και η ίδια απόπτωση, η οποία όμως είναι ανεξάρτητη από κασπάσες, επάγοντας βλάβες του DNA στον πυρήνα του κυττάρου (Chen & Wang 22, Lalier et al. 27). Όπως αναφέρθηκε, οι πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2 είναι υπεύθυνες για τον έλεγχο του ενδογενούς μονοπατιού του αποπτωτικού μηχανισμού. Ειδικότερα, η εν λόγω οικογένεια αποτελείται τόσο από προ-αποπτωτικές πρωτεΐνες (Bax, Bad), όσο και από αντι-αποπτωτικές (Bcl-2, Bclxl), με την ίδια την Bcl-2 να έχει αναφερθεί ότι παρεμποδίζει την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα, αναστέλλοντας εν μέρει την απόπτωση (Yang et al. 1997, Lalier at al. 27). Ο μηχανισμός της απόπτωσης έχει μελετηθεί εκτεταμένα στο νηματώδη Caenorhabitis elegans και στο έντομο Drosophila melanogaster, αλλά και στα θηλαστικά συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπου, λόγω κυρίως της διασύνδεσης της απόπτωσης με την ανάπτυξη του καρκίνου και διάφορων εκφυλιστικών νόσων. Μέχρι πρόσφατα δεν υπήρχαν αναφορές για μελέτη του αποπτωτικού μηχανισμού σε κάποιο μη-θηλαστικό σπονδυλωτό, ωστόσο τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει αρκετές έρευνες πάνω στο εν λόγω θέμα σε μια μεγάλη ομάδα σπονδυλωτών, αυτή των ψαριών. Μάλιστα, τα ψάρια φαίνεται να μοιράζονται τα ίδια βασικά χαρακτηριστικά του αποπτωτικού μηχανισμού με τα θηλαστικά, ενώ είναι πολύ πιθανό και τα κεντρικά μονοπάτια του κυτταρικού θανάτου να είναι υψηλά διατηρημένα μεταξύ των σπονδυλωτών. Λαμβάνοντας υπόψη και το γεγονός ότι το zebrafish (Danio rerio) αποτελεί έναν οργανισμό-μοντέλο στην έρευνα της βιολογίας των σπονδυλωτών, τα ψάρια φαίνεται να έχουν όλα τα χαρακτηριστικά για να αποτελέσουν σημείο αναφοράς στην μελέτη της απόπτωσης στα σπονδυλωτά (Krumschnabel & Podrabsky 29). Η αυτοφαγία είναι μια καλά μελετημένη φυσιολογική διεργασία των ευκαρυωτικών κυττάρων που σχετίζεται με την αντικατάσταση κυτταρικών συστατικών, όπως διάφορα οργανίδια και πρωτεΐνες και αποσκοπεί στην παραγωγή ενέργειας σε στρεσογόνες για το κύτταρο καταστάσεις. Θεωρείται λοιπόν, ένας 23

26 μηχανισμός επιβίωσης για τα κύτταρα, ικανός να επιμηκύνει την βιωσιμότητά τους σε δυσμενείς για αυτά καταστάσεις (Edinger & Thompson 24, Debnath et al. 25). Σε φυσιολογικές συνθήκες, η αυτοφαγία εμφανίζεται σε σχετικά χαμηλά επίπεδα σε όλους τους κυτταρικούς τύπους, επάγεται όμως σε μεγάλο βαθμό σε καταστάσεις στρες όπως η ασιτία, το οξειδωτικό στρες και διάφορες μολυσματικές ασθένειες. Δύο κύρια μονοπάτια αποδόμησης πρωτεϊνών έχουν περιγραφεί: το μονοπάτι ουβικουιτίνης-πρωτεασώματος που εμπλέκεται στην αποδόμηση των πρωτεϊνών βραχείας ζωής και των μη φυσιολογικών ή λάθος αναδιπλωμένων πρωτεϊνών και το αυτοφαγικό-λυοσωμικό μονοπάτι που είναι υπεύθυνο για την αποδόμηση κυτοπλασματικών συστατικών και πρωτεϊνών μακράς ζωής (Debnath et al. 25, Belghit et al. 213). Όσον αφορά το πρώτο μονοπάτι, κύριο συστατικό του αποτελεί η ουβικουιτίνη, μια εξελικτικά συντηρημένη πρωτεΐνη των ευκαρυωτικών κυττάρων που αποτελείται από 76 αμινοξέα. Η αποδόμηση των πρωτεϊνών μέσω του μονοπατιού αυτού περιλαμβάνει δύο διακριτά και ανεξάρτητα στάδια: τη δημιουργία αλυσίδας ουβικουιτίνης που συνδέεται ομοιοπολικά με το πρωτεϊνικό υπόστρωμα και την αποδόμηση της στοχευμένης πρωτεΐνης από το 26S πρωτεάσομα. Αρχικά, η ουβικουιτίνη ενεργοποιείται από το ένζυμο ενεργοποίησης Ε1 και ακολουθεί η μεταφορά της, από ένα από τα πολλά ένζυμα σύζευξης ουβικουιτίνης Ε2, σε ένα άλλο ένζυμο το Ε3, που αποτελεί μέλος της οικογένειας των πρωτεϊνικών λιγασών ουβικουιτίνης. Το ένζυμο αυτό καταλύει την ομοιοπολική σύνδεση της ουβικουιτίνης με το υπόστρωμα της πρωτεΐνης που πρόκειται να αποδομηθεί. Η σύνδεση αυτή αποτελεί σήμα για την μεταφορά της πρωτεΐνης αυτής στο 26S πρωτεάσομα όπου θα γίνει τελικά η αποδόμησή της. Η τροποποίηση πολλών κυτταρικών πρωτεϊνών με τη βοήθεια της ουβικουιτίνης παίζει σημαντικό ρόλο σε μια πληθώρα βασικών κυτταρικών διεργασιών όπως η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, η ρύθμιση των αποκρίσεων του κυττάρου στο στρες και σε εξωκυτταρικούς παράγοντες και η βιογένεση οργανιδίων. Εκατοντάδες κυτταρικές πρωτεΐνες είναι γνωστό ότι αποτελούν στόχο αυτού του συστήματος με τον αριθμό τους να αυξάνεται διαρκώς (Ciechanover et al. 2). Το αυτοφαγικό-λυοσωμικό μονοπάτι χαρακτηρίζεται από τον σχηματισμό των αυτοφαγοσωμάτων στο κυτταρόπλασμα. Τα αυτοφαγοσώματα είναι κυστίδια που σχηματίζονται από τον διαχωρισμό τμήματος του κυτταροπλάσματος και περικλείονται συνήθως από μια διπλή μεμβράνη. Μετά τον σχηματισμό τους, 24

27 εσωκλείουν τα συστατικά που πρόκειται να αποδομηθούν και ακολουθεί η σύζευξή τους με τα λυοσώματα από τα οποία αποκτούν τα κατάλληλα υδρολυτικά ένζυμα για την γρήγορη αποδόμηση του περιεχομένου τους. Μια από τις πιο ευρέως γνωστές για την εμπλοκή τους στην αυτοφαγία πρωτεΐνες είναι η LC3. Στα κύτταρα των θηλαστικών η LC3 συντίθεται ως μια πρόδρομος ένωση (Pro-LC3-I). Αμέσως μετά την σύνθεση αυτής της πρόδρομης πρωτεΐνης ακολουθεί η μετατροπή της σε LC3-I, η οποία εν συνεχεία μετατρέπεται σε LC3-IΙ στην μεμβράνη του αυτοφαγοσώματος, όπου είναι τοποθετημένη τόσο στην κυτοπλασματική πλευρά αυτής, όσο και στην εσωτερική. Μετά την σύζευξη του αυτοφαγοσώματος με το λυόσωμα, η LC3-IΙ της εσωτερικής πλευράς της μεμβράνης αποδομείται από καθεψίνες του λυοσώματος, ενώ η LC3-IΙ της κυτοπλασματικής πλευράς του αυτοφαγοσώματος ανακυκλώνεται ξανά σε LC3-I Η παρουσία της LC3 στα αυτοφαγοσώματα και η μετατροπή της σε LC3-II έχουν χρησιμοποιηθεί ως δείκτες αυτοφαγίας (Ichimura et al. 2, Wu et al. 25). Παρόλο που ο ρυθμιστικός μηχανισμός της αυτοφαγίας έχει μελετηθεί αρκετά, υπάρχουν ακόμα πολλά σημεία προς διαλεύκανση (Belghit et al. 213). Μια άλλη πρωτεΐνη που πιθανώς εμπλέκεται στην διεργασία της απόπτωσης είναι η SQSTM1/p62. Η εν λόγω πρωτεΐνη εντοπίζεται ως κύριο συστατικό σε πρωτεϊνικά συσσωματώματα τα οποία είναι υπεύθυνα για διάφορες νευροεκφυλιστικές ασθένειες του ήπατος και του εγκεφάλου. Ο πιθανός ρόλος της SQSTM1/p62 στο αυτοφαγικό-λυοσωμικό μονοπάτι έγκειται στην στενή σχέση που έχει με την LC3 σε πολλά σημεία του μονοπατιού. Συγκεκριμένα, η σύνδεση των δύο αυτών πρωτεϊνών είναι απαραίτητη για την αποδόμηση πολυουβικουιτινομένων πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων μέσω του μονοπατιού αυτού. Η λυσοσωμική αποικοδόμηση των αυτοφαγοσωμάτων οδηγεί σε μείωση των επιπέδων της SQSTM1/p62 κατά τη διάρκεια της αυτοφαγίας (Pankiv et al. 27). Μειωμένα επίπεδα της συγκεκριμένης πρωτεΐνης έχουν παρατηρηθεί σε περιπτώσεις καταπόνησης κυττάρων από οξειδωτικό στρες, ενώ σε συνθήκες ασιτίας η μείωση της ανέστειλε την εγκατάσταση της LC3 στα αυτοφαγοσώματα (Bjorkoy et al. 25, Pankiv et al. 27). 25

28 Σκοπός Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να διερευνηθεί η επίδραση της μερικής αντικατάστασης ιχθυάλευρων με άλευρα από το έντομο Tenebrio molitor στη φυσιολογία σε τρία είδη εκτρεφόμενων τελεόστεων: την τσιπούρα (Sparus aurata), το λαβράκι (Dicentrarchus labrax) και την ιριδίζουσα πέστροφα (Oncorhynchus mykiss). Οι επιμέρους στόχοι της εργασίας που τέθηκαν ήταν: Να μελετηθεί πως επηρεάζεται ο μεταβολισμός και η γενική φυσιολογία των ψαριών (μεταβολικά-αντιοξειδωτικά ένζυμα) από τα εναλλακτικά αυτά σιτηρέσια Να διερευνηθεί η καταπόνηση που υφίστανται τα ψάρια ως αποτέλεσμα σίτισης με τα σιτηρέσια αυτά, μέσω της μελέτης της έκφρασης των Hsps και της φωσφορυλίωσης των MAPKs Να διερευνηθεί η επίδραση των σιτηρεσίων αυτών στις διεργασίες απόπτωσης και αυτοφαγίας μέσω της μελέτης της έκφρασης των σχετιζόμενων πρωτεϊνών Να εκτιμηθεί αν υπάρχει ιστοειδική ή ειδοειδική επίδραση των σιτηρεσίων στα τρία είδη ψαριών Να προσδιοριστεί το ποσοστό στο οποίο είναι εφικτή η υποκατάσταση του ιχθυάλευρου με άλευρο από T.molitor στα σιτηρέσια των ψαριών αυτών 26

29 Υλικά & Μέθοδοι 27

30 1. Γενικά στοιχεία βιολογίας των ειδών Τα πειράματα της παρούσας εργασίας εκτελέστηκαν σε τρία διαφορετικά είδη τελεόστεων ιχθύων: την τσιπούρα (Sparus aurata), το λαβράκι (Dicentrarchus labrax) και την ιριδίζουσα πέστροφα (Oncorhyncus mykiss). Στοιχεία της συστηματικής κατάταξης, της μορφολογίας, της εξάπλωσης καθώς και της βιολογίας διατροφής κι αναπαραγωγής των ειδών παρατίθενται παρακάτω. 1.1 Τσιπούρα Συστηματική κατάταξη Φύλο: Chordata Υποφύλο: Vertebrata Κλάση: Actinopterygii Τάξη: Perciformes Οικογένεια: Sparidae Γένος: Sparus Είδος: Sparus aurata Linnaeus, 1758 Εικόνα 7: Η τσιπούρα (Sparus aurata) ( Figure 7: Gilthead seabream (Sparus aurata) ( 28

31 Μορφολογία Το είδος χαρακτηρίζεται από την παρουσία 11 ραχιαίων ακάνθων, μαλακών ραχιαίων ακτίνων, 3 εδρικών ακάνθων, εδρικών και μαλακών ακτίνων. Το σώμα είναι υψηλό και φέρει μια μαύρη κηλίδα πάνω στο βραγχιακό επικάλυμμα. Το ρύγχος έχει μήκος διπλάσιο της διαμέτρου του ματιού. Το μέσο μήκος του ψαριού είναι 35 cm, ενώ το μέγιστο μήκος αγγίζει τα 7 cm. Το μέγιστο δημοσιευμένο βάρος είναι 17,2 kg ( Εξάπλωση Η τσιπούρα κατανέμεται στον Ανατολικό Ατλαντικό ωκεανό από τα Βρετανικά νησιά μέχρι τις Κανάριες Νήσους. Επίσης το είδος απαντάται στη Μεσόγειο και στη Μαύρη Θάλασσα ( Εικόνα 8: Γεωγραφική εξάπλωση της τσιπούρας (Sparus aurata) ( Figure 8: Distribution of gilthead seabream (Sparus aurata) ( Στοιχεία βιολογίας, διατροφής και αναπαραγωγής Τα άτομα του είδους είναι βενθοπελαγικά και απαντώνται σε θαλάσσια οικοσυστήματα. Κατανέμονται σε βάθη κυμαινόμενα μεταξύ 1 και 15 m, συχνότερα όμως σε βάθη 1-3 m. Διαβιούν σε ζώνες υποτροπικού κλίματος και συγκεκριμένα σε θαλάσσια λιβάδια, αλλά και αμμώδεις πυθμένες. Δεν είναι ιδιαίτερα δραστήριο είδος. Επίσης είναι μονήρες ή σχηματίζει μικρές συναθροίσεις. 29

32 Είναι κατά κύριο λόγο σαρκοφάγο, ενώ περιστασιακά στρέφεται στη φυτοφαγία. Η δίαιτά του περιλαμβάνει οστρακοειδή (μύδια και στρείδια). Το είδος χαρακτηρίζεται από τροφικό επίπεδο περί το 3,4. Κύριοι θηρευτές του είδους στη Γαλλία είναι πουλιά και θαλασσοπούλια της οικογένειας Phalacrocoracidae. Όσον αφορά την αναπαραγωγή τους, οι τσιπούρες παρουσιάζουν το φαινόμενο της πρωτανδρίας. Στο τρίτο έτος της ηλικίας τους, τα αρσενικά γίνονται θηλυκά. Η γονιμοποίηση είναι εξωτερική και οι γονείς δεν φροντίζουν τα γονιμοποιημένα ωάρια. Η αναπαραγωγική περίοδος για το είδος αυτό παρατηρείται τους μήνες Νοέμβριο και Δεκέμβριο ( 1.2 Λαβράκι Συστηματική κατάταξη Φύλο: Chordata Υποφύλο: Vertebrata Κλάση: Actinopterygii Τάξη: Perciformes Οικογένεια: Moronidae Γένος: Dicentrarchus Είδος: Dicentrarchus labrax (Linnaeus, 1758) Εικόνα 9: Το λαβράκι (Dicentrarchus labrax) ( Figure 9: European seabass (Dicentrarchus labrax) ( 3

33 Μορφολογία Το είδος χαρακτηρίζεται από την παρουσία 8-1 ραχιαίων ακάνθων, ραχιαίων, μαλακών ακτίνων, 3 εδρικών ακάνθων και 1-12 εδρικών, μαλακών ακτίνων (Εικ. 77). Το μέσο μήκος του είναι 5 cm, ενώ το μέγιστο μήκος αγγίζει τα 13 cm. Το μέσο βάρος είναι 5-7 kg, ενώ το μέγιστο δημοσιευμένο βάρος είναι 12 kg. Το σώμα είναι επίμηκες. Έχει ασημί χρώμα, ενώ τα μικρά ιχθύδια φέρουν μαύρα στίγματα στην πλάτη και τα πλευρά. Ο ασημένιος χρωματισμός είναι πιο σκούρος στη ράχη και λιγότερο στην κοιλιακή χώρα (φαινόμενο αντισκίασης). Χαρακτηρίζεται από την παρουσία καλά αναπτυγμένων δοντιών που χρησιμεύουν για την αρπαγή και τη συγκράτηση της τροφής ( Εξάπλωση Το είδος κατανέμεται στον Ανατολικό Ατλαντικό από τη Νορβηγία ως το Μαρόκο, τις Κανάριες Νήσους και τη Σενεγάλη. Επίσης πληθυσμοί εντοπίζονται στη Μεσόγειο και τη Μαύρη Θάλασσα ( Εικόνα 1: Γεωγραφική εξάπλωση του λαβρακιού (Dicentrarchus labrax) ( Figure 1: Distribution of European seabass (Dicentrarchus labrax) ( Στοιχεία βιολογίας, διατροφής και αναπαραγωγής Τα άτομα του είδους είναι βενθοπελαγικά. Διαβιούν σε ζώνες υποτροπικού κλίματος. Γενικά είναι ένα είδος με μεγάλο εύρος επιβίωσης σε θερμοκρασίες 8 3 C, ευρύαλο (με δυνατότητα προσαρμογής των μεγάλων ατόμων και σε γλυκά νερά), ενώ προτιμά να κινείται σε νερά με ph 7,8-8,3 και πάντα σε κορεσμένο 31

34 διαλυμένο οξυγόνο. Ως θερμοκρασία βέλτιστης ανάπτυξης θεωρείται αυτή των 22 C. Η μέγιστη ηλικία θεωρείται τα 15 χρόνια. Τα ενήλικα άτομα διαβιούν σε παράκτια ύδατα σε μικρά βάθη αλλά και μέχρι τα 1 m. Εντοπίζονται σε εκβολές ποταμών, λιμνοθάλασσες και περιστασιακά σε ποτάμια. Το τροφικό επίπεδο είναι 3,8. Θεωρείται ιδιαίτερα αδηφάγο είδος. Τα ανώριμα άτομα τρέφονται με ασπόνδυλα. Τα ενήλικα άτομα τρέφονται κυρίως με γαρίδες, μαλάκια και οι διατροφικές τους συνήθειες περιλαμβάνουν και την ιχθυοφαγία. Στους θηρευτές του είδους στη Μεσόγειο περιλαμβάνονται πουλιά και θαλασσοπούλια της οικογένειας Phalacrocoracidae με βάση δεδομένα από τη Γαλλία. Η θήρευση ασκείται τόσο επί ανώριμων, όσο και επί ενήλικων ατόμων. Όσον αφορά την αναπαραγωγή τους, η γονιμοποίηση είναι εξωτερική και οι γονείς δεν φροντίζουν τα γονιμοποιημένα ωάρια. Η αναπαραγωγική περίοδος για το είδος αυτό λαμβάνει χώρα κατά τους μήνες Ιανουάριο-Ιούνιο ( 1.3 Ιριδίζουσα πέστροφα Συστηματική κατάταξη Φύλο: Chordata Υποφύλο: Vertebrata Κλάση: Actinopterygii Τάξη: Salmoniformes Οικογένεια: Salmonidae Γένος: Oncorhynchus Είδος: Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792) Εικόνα 11: Η ιριδίζουσα πέστροφα (Oncorhynchus mykiss) ( Figure 11: Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) ( 32

35 Μορφολογία Το είδος χαρακτηρίζεται από ουραίο πτερύγιο με 19 ακτίνες. Ο χρωματισμός ποικίλλει με το ενδιαίτημα, το μέγεθος και την σεξουαλική κατάσταση του είδους. Άτομα που ζούνε σε ρεύματα έχουν σκουρότερα χρώματα, ενώ αυτά που ζούνε σε λίμνες είναι πιο λαμπερά και φωτεινότερα. Εδρικό πτερύγιο με 6-9 διακλαδισμένες ακτίνες. Μεγάλη ροζ-κόκκινη λωρίδα από το κεφάλι έως την εδρική βάση. Το μέσο μήκος του είναι 6 cm, ενώ το μέγιστο μήκος αγγίζει τα 12 cm. Το μέγιστο δημοσιευμένο βάρος είναι 25,4 kg ( Εξάπλωση Το είδος κατανέμεται στον Ειρηνικό από την Αλάσκα έως το Μεξικό, στον Καναδά, στο νότιο Όρεγκον των ΗΠΑ, ενώ έχει εισαχθεί ευρέως σε άλλες περιοχές της βόρειας Αμερικής, αλλά και παγκοσμίως ( Εικόνα 12: Γεωγραφική εξάπλωση της ιριδίζουσας πέστροφας (Oncorhynchus mykiss) ( Figure 12: Distribution of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) ( Στοιχεία βιολογίας, διατροφής και αναπαραγωγής Τα άτομα του είδους είναι βενθοπελαγικά. Διαβιούν σε ζώνες υποτροπικού κλίματος και σε ρυάκια, ποτάμια και λίμνες. Το εύρος θερμοκρασίας του είδους κυμαίνεται από 1oC-24oC. Ανήκει στα ανάδρομα είδη. 33

36 Το τροφικό επίπεδο του είδους 4,4. Τα νεαρά άτομα τρέφονται κυρίως με ζωοπλαγκτό, ενώ τα ενήλικα άτομα κυρίως με δίπτερα έντομα (προνύμφες, νύμφες και ενήλικα άτομα) και άλλα ζώα. Είναι θηρευτής μακροπανίδας, ενώ θηρευτές του είδους είναι τα Micropterus salmoides, Phoca vitulina, Ptychocheilus sp. Όσον αφορά την αναπαραγωγή του, η γονιμοποίηση είναι εξωτερική και οι γονείς δεν φροντίζουν τα γονιμοποιημένα ωάρια. Η αναπαραγωγική περίοδος του είδους λαμβάνει χώρα κατά τους μήνες Οκτώβριο-Μάιο στο βόρειο ημισφαίριο και τους μήνες Αύγουστο-Νοέμβριο στο νότιο ( 2. Πειραματικός σχεδιασμός 2.1 Πειράματα Ο πειραματικός σχεδιασμός της παρούσας εργασίας αφορούσε τρία ανεξάρτητα πειράματα σε τρία είδη τελεόστεων ιχθύων, που σιτίστηκαν με διαφορετικά σιτηρέσια μερικής υποκατάστασης των ιχθυαλεύρων της τροφής με εντομοάλευρα και εκτελέστηκαν σε διαφορετικές χρονικές στιγμές, σε διαφορετικούς τόπους. Το πείραμα σίτισης της τσιπούρας πραγματοποιήθηκε στις εγκαταστάσεις του Τμήματος Κτηνιατρικής και Ζωικής Παραγωγής του Πανεπιστημίου Federico II της Νάπολης, στην Ιταλία. Χρησιμοποιήθηκαν τρία διαφορετικά σιτηρέσια (Πίνακας 1). Συγκεκριμένα, οι τσιπούρες σιτίστηκαν με σιτηρέσια των οποίων η πρωτεΐνη προέρχονταν αποκλειστικά από ιχθυάλευρα (%) ή είχε μερικώς υποκατασταθεί (25 και 5%) με άλευρα από T.molitor. Ο αριθμός των χρησιμοποιούμενων δεξαμενών ήταν όπως και προηγουμένως, 3 ανά κατάσταση σίτισης. Το πείραμα έλαβε χώρα κατά το χρονικό διάστημα από 24/5/213 4/1/214 και διήρκησε 3 εβδομάδες. Το πείραμα σίτισης του λαβρακιού πραγματοποιήθηκε στις εγκαταστάσεις του Ινστιτούτου Θαλάσσιας Βιολογίας, Βιοτεχνολογίας και Υδατοκαλλιεργειών (Ι.ΘΑ.Β.Β.ΥΚ.) του Ελληνικού Κέντρου Θαλασσίων Ερευνών (ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε.) στο Ηράκλειο Κρήτης. Χρησιμοποιήθηκαν τρία διαφορετικά σιτηρέσια (Πίνακας 1). Συγκεκριμένα, τα λαβράκια σιτίστηκαν με σιτηρέσια είτε εξ ολοκλήρου ιχθυαλεύρων (%) ή με μερικής υποκατάστασης των ιχθυαλεύρων με άλευρα από T.molitor (25 και 5%). Χρησιμοποιήθηκαν τρεις δεξαμενές ανά κατάσταση σίτισης, ενώ σε κάθε 34

37 δεξαμενή ο αρχικός αριθμός των ψαριών ήταν 5. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε το χρονικό διάστημα από 15/5/213-24/7/213 και η διάρκειά του ήταν 9 εβδομάδες. Τέλος, το πείραμα σίτισης της ιριδίζουσας πέστροφας πραγματοποιήθηκε στις εγκαταστάσεις του Τμήματος Γεωργικών, Δασικών και Διατροφικών Επιστημών του Πανεπιστημίου του Τορίνο, στην Ιταλία. Χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά σιτηρέσια (Πίνακας 1). Οι πέστροφες σιτίστηκαν με σιτηρέσια των οποίων η πρωτεΐνη προέρχονταν αποκλειστικά από ιχθυάλευρα (%) ή είχε υποκατασταθεί σε ποσοστό 6% με άλευρα από T.molitor. Χρησιμοποιήθηκαν 4 δεξαμενές ανά κατάσταση σίτισης. Ωστόσο, λόγω της καθολικής θνησιμότητας (1%) που παρατηρήθηκε σε μια από τις δεξαμενές της 6% αντικατάστασης, η συγκεκριμένη ομάδα εξαιρέθηκε από το πείραμα μειώνοντας τον αριθμό των δεξαμενών σε αυτή την κατάσταση σε 3. Ο αρχικός αριθμός των ψαριών ανά δεξαμενή ήταν 3. Η χρονική διάρκεια του πειράματος ήταν 75 μέρες. Εικόνα 43: Δεξαμενές στις οποίες πραγματοποιήθηκε η πειραματική διαδικασία σίτισης της ιριδίζουσας πέστροφας (αριστερά) και του λαβρακιού (δεξιά) Figure 13: Tanks used for the experimental feeding procedure of rainbow trout (left) and European seabass (right) 2.2 Σιτηρέσια Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε η κατάρτιση και παραγωγή 8 πειραματικών σιτηρεσίων με διαφορετική σύσταση το καθένα. Η ακριβής σύσταση των χορηγούμενων σιτηρεσίων για κάθε είδος φαίνεται στον πίνακα 1. Τα σιτηρέσια που χρησιμοποιήθηκαν για τη σίτιση των προαναφερόμενων ψαριών ήταν το σιτηρέσιο της ομάδας ελέγχου (FM) στο οποίο η πρωτεΐνη και συνεπώς τα αμινοξέα 35