Βούλγαρη Γεωργία Πτυχιούχος Βιολόγος του ΑΠΘ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ ΦΥΤΩΝ ΑΓΡΟΚΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΖΙΖΑΝΙΟΛΟΓΙΑΣ Δημιουργία διαγονιδιακών φυτών καπνού (N.tabacum L.) που υπερεκφράζουν γονίδια GST απο το είδος Phaseolus vulgaris και μελέτη της αντοχής τους σε συνθήκες καταπόνησης Μεταπτυχιακή διατριβή Βούλγαρη Γεωργία Πτυχιούχος Βιολόγος του ΑΠΘ Θεσσαλονίκη 2014

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ ΦΥΤΩΝ ΑΓΡΟΚΟΜΙΑΣ ΚΑΙ ΖΙΖΑΝΙΟΛΟΓΙΑΣ Δημιουργία διαγονιδιακών φυτών καπνού (N.tabacum L.) που υπερεκφράζουν γονίδια GST απο το είδος Phaseolus vulgaris και μελέτη της αντοχής τους σε συνθήκες καταπόνησης Μεταπτυχιακή διατριβή Βούλγαρη Γεωργία Πτυχιούχος Βιολόγος του ΑΠΘ Θεσσαλονίκη 2014 ii

3 Επιβλέπουσα Νιάνιου-Ομπεϊντάτ Ειρήνη Επίκουρος Καθηγήτρια Εξεταστική επιτροπή Νιάνιου-Ομπεϊντάτ Ειρήνη Επίκουρος Καθηγήτρια Πολύδωρος Αλέξιος Επίκουρος Καθηγητής Μαδέσης Παναγίωτης Ερευνητής Γ (ΙΝΕΒ-ΕΚΕΤΑ) H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος "Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση" του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Θαλής Μεταφοράσες γλουταθειόνης (GSTs): μοριακά εργαλεία για ανάπτυξη βασικής και εφαρμοσμένης έρευνας στα πεδία της πράσινης και κόκκινης βιοτεχνολογίας» iii

4 Πρόλογος-Ευχαριστίες Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή εκπονήθηκε κατά τα έτη στο Εργαστήριο Γενετικής και Βελτίωσης των Φυτών ενώ μέρος των πειραμάτων πραγματοποιήθηκε στο Ινστιτούτο Εφαρμοσμένων Βιοεπιστημών (ΙΝΕΒ-ΕΚΕΤΑ). Απο την παρούσα θέση θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά όλους τους ανθρώπους που συνέβαλλαν στην διεκπεραίωσή της. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την επιβλέπουσά μου Επίκουρο Καθηγήτρια κ. Νιάνιου καθώς και τα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, Επίκουρο Καθηγητή κ. Πολύδωρο Α. και τον κ. Μαδέση Π. Ερευνητή Γ (ΙΝΕΒ-ΕΚΕΤΑ) Οφείλω να ευχαριστήσω το προσωπικό του Ινστιτούτου Εφαρμοσμένων Βιοεπιστημών (ΙΝΕΒ-ΕΚΕΤΑ) και ιδιαίτερα στον κ. Μαδέση Π. καθώς και κ. Πασιέντση Κ. για την βοήθεια τις γνώσεις που μου προσέφεραν κατά την διεξαγωγή των μοριακών αναλύσεων. Επίσης, τον Καθηγητή κ. Ελευθεροχωρινό H. για την βοήθειά του κατά την διεξαγωγή μέρους των πειραμάτων. Τις θερμές μου ευχαριστίες προς όλους τους καθηγητές του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών για τις γνώσεις που μου προσέφεραν καθ όλη την διάρκεια των σπουδών μου. Πολλά ευχαριστώ σε όλους όσους συνέβαλλαν με τον τρόπο τους στην εκπόνηση της μεταπτυχιακής μου διατριβής. Στους φίλους μου καθώς και τους μεταπτυχιακούς και προπτυχιακούς φοιτητές που εκπόνησαν τις διατριβές τους στο Εργαστήριο Γενετικής και Βελτίωσης των Φυτών το χρονικό διάστημα που ήμουν και εγώ εκεί. Και τέλος, ένα μεγάλο θερμό ευχαριστώ στους γονείς μου Σπύρο και Ελένη και στην αδελφή μου Δέσποινα, για την αγάπη τους και όλα όσα έχουν κάνει για μένα... Θεσσαλονίκη, Ιούνιος 2014 Γ.Β iv

5 Περιεχόμενα Περίληψη... 1 Summary Εισαγωγή Ανασκόπηση Βιβλιογραφίας Ορισμός της καταπόνησης στους φυτικούς οργανισμούς Ενεργές μορφές οξυγόνου (Reactive Oxygene Species ROS) Αντιοξειδωτική άμυνα των φυτικών οργανισμών Καταπόνηση προκαλούμενη από υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων Μηχανισμοί αντοχής των φυτών σε υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων Βελτίωση της αντοχής των φυτών σε συνθήκες αλατότητας Τα ζιζανιοκτόνα φάρμακα: εκλεκτικότητα και φυτοτοξικότητα Μεταβολική αποτοξίνωση των ζιζανιόκτονων Το ζιζανιοκτόνα dimethenamid Βελτίωση τις αντοχής των φυτών σε ζιζανιοκτόνα φάρμακα Οι τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (Glutathione-S-transferase GSΤs) Tαξινόμηση και ονοματολογία Πρωτεϊνική δομή των GSTs Υποκυτταρική θέση των GSTs Έκφραση των GST γονιδίων Γενικά χαρακτηριστικά της έκφρασης Ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης Λειτουργικός ρόλος των GSTs Τα ισοένζυμα PvGSTU2-2 και PvGSTU Ο Καπνός (N.tabacum L) Η τεχνολογία της γενετικής τροποποίησης Βελτίωση της αντοχής των φυτών σε καταπονήσεις μέσω της γενετικής τροποποίησης Γενετικά τροποποιημένοι φυτικοί οργανισμοί με αντοχή στην αλατότητα Γενετικά τροποποιημένοι φυτικοί οργανισμοί με ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα Γενετικά τροποποιημένοι φυτικοί οργανισμοί που υπερεκφράζουν γονίδια GST Υλικά και Μέθοδοι Δημιουργία ανασυνδυασμένων πλασμιδίων Κλωνοποίηση των γονιδίων PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 στον πλασμιδιακό φορέα part Ανάπτυξη υγρών καλλιεργειών και καθαρισμός πλασμιδιακού DNA v

6 Αντιδράσεις με ένζυμα περιορισμού και καθαρισμός των προϊόντων πέψης Αντιδράσεις λιγάσης μεταξύ του φορέα part27 και των γονιδίων PvGSTU2-2 και PvGSTU Έλεγχος των αντιδράσεων λιγάσης με την τεχνική PCR Μετασχηματισμός δεκτικών κυτάρων E. coli με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια part27- PvGSTU2-2 και part27-pvgstu Tαυτοποίηση βακτηριακών αποικιών E. coli με την τεχνική PCR και την χρήση ενζύμων περιορισμού Μετασχηματισμός του A. tumefaciens με τους φορείς γενετικής τροποποίησης part27- PvGSTU2-2 και part27-pvgstu3-3 με την τεχνική της ηλεκτροδιήθησης Γενετική τροποποίηση και παραγωγή διαγονιδιακών φυτών καπνού Ν. tabacum (cv Χanthi) μέσω του Α. tumefacies Ανάπτυξη φυτών καπνού σε in vitro συνθήκες Μετασχηματισμός των φυλλικών δίσκων καπνού Αναγέννηση των φυλλικών δίσκων και επιλογή αναγεννημένων βλάστων Μοριακή ταυτοποίηση των πιθανά γενετικά τροποποιημένων φυτών καπνού με την τεχνική RT-PCR (Real Time PCR) Επιλογή Τ0 διαγονιδιακών σειρών με τα γονίδια PvGSTU2-2 και PvGSTU Μέτρηση της ποσοτικής έκφρασης σε γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού με την τεχνική q-rtpcr (Quantitative-Real Time PCR) Απομόνωση RNA Aντίδραση αντίστροφης μεταγραφής Μέτρηση της σχετικής ποσοτικής έκφρασης με την τεχνική q-rtpcr Μέτρηση της ενζυμικής δραστικότητας του ισοενζύμου PvGSTU3-3 και PvGSTU2-2 στα Τ0 διαγονιδιακα φυτά καπνού Φαινοτυπικός έλεγχος της έκφρασης των γονιδίων PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 στα Τ0 γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού Ιn vitro δοκιμή ανθεκτικότητας στην αλατότητα Ιn vitro και in vivo δοκιμή ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο dimethenamid Αποτελέσματα Δημιουργία ανασυνδυασμένων πλασμιδίων Μετασχηματισμός δεκτικών κυτάρων E. coli με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια part27- PvGSTU2-2 και part27-pvgstu Μετασχηματισμός του A. tumefaciens με τους φορείς γενετικής τροποποίησης part27- PvGSTU2-2 και part27-pvgstu3-3 με την τεχνική της ηλεκτροδιήθησης Γενετική τροποποίηση και παραγωγή διαγονιδιακών φυτών καπνού Ν. tabacum (cv Χanthi) μέσω του Α. tumefacies Μοριακή ταυτοποίηση των πιθανά γενετικά τροποποιημένων φυτών καπνού με την τεχνική RT-PCR (Real time PCR)...60 vi

7 4.6 Επιλογή των Τ0 διαγονιδιακών σειρών καπνού με τα γονίδια PvGSTU2-2 PvGSTU Μέτρηση της ποσοτικής έκφρασης με την τεχνική q-rtpcr (ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου) Μέτρησης της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας των ισοενζύμων PvGSTU2-2 και PvGSTU Φαινοτυπικός έλεγχος της έκφρασης των γονιδίων PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 στις Τ0 διαγονιδιακές σειρές καπνού In vitro δοκιμή της ανθεκτικότητας στην αλατότητα In vitro και in vivo δοκιμή ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο dimethenamid Συζήτηση και Συμπεράσματα Η σημασία του λειτουργικού χαρακτηρισμού των ισοενζύμων GSΤ Φαινοτυπικός έλεγχος της έκφρασης των γονιδίων PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 στις Τ0 διαγονιδιακές σειρές καπνού in vitro δοκιμή ανθεκτικότητας στην αλατότητα in vitro και in vivo δοκιμή ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο dimethenamid Συμπεράσματα...80 Βιβλιογραφία..81 vii

8 Περίληψη Οι τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (GSTs) είναι πολυλειτουργικές πρωτεΐνες και συνιστούν κύριο στοιχείο, του κυτταρικού συστήματος αποτοξίνωσης ξενοβιοτικών ουσιών καθώς και του αντοξειδωτικού μηχανισμού άμυνας των φυτών. Τα ισοένζυμα PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 απομονώθηκαν απο τα φύλλα και την ρίζα του είδους Phaseolus vulgaris αντίστοιχα. Εμφανίζουν αντιοξειδωτική δράση, ενώ επιπρόσθετα το PvGSTU2-2 καταλύει την συμπλοκοποίηση της GSH με τα ζιζανιοκτόνα alachlor και metalachlor (χλωροακεταμιδία). Στην παρούσα μελέτη, προκειμένου να χαρακτηριστούν λειτουργικά in planta τα δύο ισοένζυμα, δημιουργήθηκαν δύο ανασυνδυασμένα πλασμίδια, το part27- PvGSTU2-2 και part27-pvgstu3-3 και μέσω του A. Tumefaciencs, αναπτύχθηκαν Τ0 διαγονιδιακές σειρές καπνού (Nicotiana tabacum L. cv Xanthi). Η εισαγωγή των διαγονιδίων στις Τ0 σειρές επιβεβαιώθηκε με την τεχνική RTPCR και η έκφραση του PvGSTU2-2 με q- RTPCR ανάλυση. Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε πως οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούν τα διαγονίδια είναι ενεργές, μέσω του προσδιορισμού της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας των GSTs στο υπόστρωμα NBD-CI, στις Τ0 σειρές με το γονίδιο PvGSTU2-2 ή και στο CDNB στις Τ0 σειρές με το γονίδιο PvGSTU3-3. Τρεις Τ0 διαγονιδιακές σειρές που υπερεκφράζουν το γονίδιο PvGSTU2-2 αξιολογήθηκαν ως προς την αντοχή τους στο ζιζανιοκτόνο dimethenamid (χλωροακεταμιδία). Κάτω απο in vivo συνθήκες, οι Τ0 διαγονιδιακές σειρές ήταν πιο ανθεκτικές στις συγκεντρώσεις των 0,5 και 1 mg/l dimethenamide, καθώς είχαν στατιστικώς σημαντικά μεγαλύτερο μήκος ρίζας και βλαστού σε σχέση με τα μη γενετικά τροποποιημένα φυτά. Αντιθέτως, κάτω απο in vitro συνθήκες, παρά το γεγονός πως είχαν καλύτερη φαινοτυπική συμπεριφορά σε σχέση με τα μη γενετικά τροποποιημένα φυτά, δεν ήταν ανθεκτικές, πιθανόν λόγο της εξαιρετικά υψηλής συγκέντρωσης του ζιζανιοκτόνου (10 και 20 mg/l). Προκειμένου να χαρακτηριστεί ο βιολογικός ρόλος του PvGSTU3-3, τρεις Τ0 διαγονιδιακές σειρές που υπερεκφράζουν το συγκεκριμένο γονίδιο αξιολογήθηκαν για την αντοχή τους στην αλατότητα (200mM) σε in vitro συνθήκες. Oι σειρές ήταν πιο ανθεκτικές, καθώς το ριζικό τους σύστημα αναπτύχθηκε περισσότερο σε σχέση με τα φυτά άγριου τύπου. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν πως τα ισοένζυμα PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 συμμετέχουν σε φυσιολογικά μονοπάτια που σχετίζονται με την αύξηση της ανθεκτικότητας των φυτών σε συνθήκες καταπονήσεων. 1

9 Summary Glutathione S-transferases (GSTs) are multifunctional proteins and forms major part, of plant cellular detoxification system and antioxidant enzyme network. PvGSTU2-2 and PvGSTU3-3 has been previously isolated from leaves and roots of Phaseolus vulgaris plants respectively. Both enzymes, shows high antioxidant catalytic function but only PvGSTU2-2 catalyses the conjugation with chloroacetamide herbicides alachlor and metalachlor. In the present thesis two constitutive plant expression vectors part27-pvgstu2-2 and part27- PvGSTU3-3 was constructed and tobacco (Nicotiana tabacum L. cv Xanthi) plants overexpressing the two genes were raised via the method of A. tumefaciens, with the aim of studying in planta, the isoenzymes function. The introgression of the transgenes in the plant genome was confirmed by RTPCR and the expression of PvGSTU2-2 with q-rtpcr analysis. Furthermore, it was verified that transgenes codes functional proteins by measuring GST enzyme activity towards NBD-CI in PvGSTU2-2 T0 transgenics lines or CDNB and NBD-CI in PvGSTU3-3 lines. Three transgenic lines overexpressing PvGSTU2-2 were assayed for their tolerance towards the herbicide dimethenamid (chloroacetamide). Under in vivo conditions, all PvGSTU2-2 overexpressing lines exhibited increased tolerance at 0,5 and 1 mg/l dimethenamid, with significantly higher shoot and root elongation compared to wild type plants. In contrast, despite the better performance of transgenic lines, no increased tolerance was observed compared to wild type plants under in vitro conditions, possibly due to the extremely high concentration of the herbicide (10 and 20 mg/l). In order to characterize the biological function of PvGSTU3-3, three tobacco transgenic lines tested for their salt tolerance (200mM NaCl) under in vitro conditions. All lines were more tolerant compared to no transgenic plants, as demonstrated by the longer root length. These results suggest that PvGSTU2-2 and PvGSTU3-3 isoenzymes can mediate physiological pathways that enhance stress resistance in plants. 2

10 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή 3

11 Η συνεχής αύξηση του ανθρώπινου πληθυσμού ο οποίος προβλέπεται να αγγίξει τα εννέα δισεκατομμύρια το 2050, σε συνδυασμό με την κλιματική αλλαγή η οποία έχει επιτείνει την συχνότητα και την ένταση των βιοτικών και αβιοτικών καταπονήσεων, επιβάλλει όχι μόνο την αύξηση της παραγωγής αλλά και την διατήρησή της κάτω από ακραίες συνθήκες. Σήμερα οι αβιοτικές καταπονήσεις αποτελούν την κυριότερη αιτία μείωσης της μέσης απόδοσης των κυριότερων καλλιεργούμενων ειδών. Ωστόσο, οι βελτιωμένες ποικιλίες αυτών, ενώ είναι εξαιρετικά αποδοτικές σε βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης, κάτω από δυσμενείς συνθήκες παρουσιάζουν μειωμένη απόδοση. Ο ανταγωνισμός μεταξύ των καλλιεργούμενων φυτικών ειδών και των ζιζανίων συμβάλλει επίσης στην μείωση της παγκόσμιας παραγωγής έως 10%. Η χρήση ζιζανιοκτόνων φαρμάκων αποτελεί έναν αποτελεσματικό τρόπο για τον έλεγχο των ζιζανίων. Εντούτοις, τα περισσότερα ζιζανιοκτόνα φάρμακα στερούνται εκλεκτικότητας, η επαναλαμβανόμενη χρήση του ίδιου ζιζανιοκτόνου ή διαφορετικών ζιζανιοκτόνων με τον ίδιο τρόπο δράσης οδήγησε στην εμφάνιση ανθεκτικών βιοτύπων ζιζανίων ενώ επιπλέον, αποτελούν ακόμα μία πηγή μόλυνσης του περιβάλλοντος. Συνεπώς, είναι αναγκαία η δημιουργία ποικιλιών με πολλαπλή ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα, τα οποία θα έχουν μικρή τοξικότητα και υπολειμματική διάρκεια, με σκοπό την αντιμετώπιση των ανθεκτικών ζιζανίων αλλά παράλληλα και την ελαχιστοποίηση της μόλυνσης του περιβάλλοντος. Οι προσπάθειες για την δημιουργία ανθεκτικών ποικιλιών σε αβιοτικές καταπονήσεις με μεθόδους της κλασσικής βελτίωσης, δεν υπήρξαν ιδιαίτερα καρποφόρες, λόγω της πολυγονιδιακής φύσης τέτοιου είδους χαρακτηριστικών. Αντιθέτως, έχουν δημιουργηθεί αρκετές ποικιλίες με ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα κυρίως όμως με την εφαρμογή βιοτεχνολογικών μεθόδων. Η ανθεκτικότητα των φυτών στα ζιζανιοκτόνα φάρμακα, μπορεί να οφείλεται σε μετάλλαξη ενός γονιδίου, που κωδικοποιεί μία ανθεκτική μορφή του ενζύμου που αποτελεί στόχο ενός ζιζανιοκτόνου, ή σε κάποιο μηχανισμό μεταβολικής αποδόμησής του. Ο μηχανισμός αυτός, είναι ιδιαίτερα σημαντικός καθώς αποτελεί την βάση της πολλαπλής αντοχής σε ζιζανιοκτόνα με διαφορετικούς τρόπους δράσης. Οι τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (GSTs) αποτελούν μία πολυπληθή οικογένεια ισοενζύμων, κάθε μέλος της οποίας, μπορεί να συμμετέχει σε μη συσχετιζόμενες μεταξύ τους βιολογικές διεργασίες (moonlight proteins). Δύο από τους ρόλους τους με γεωργικό ενδιαφέρον, είναι της συμμετοχής τους στον μηχανισμό μεταβολικής αποδόμηση ξενοβιοτικών ουσιών και της προστασίας των κυττάρων από την οξειδωτική καταπόνηση 4

12 μέσω της δράσης τους ως υπεροξειδάσες, θειολοτρανσφεράσες και αφυδροασκορβικές ρεδουκτάσες. Τις τελευταίες δεκαετίες, η πρόοδος της μοριακής βιολογίας, άνοιξε τον δρόμο για την εφαρμογή σύγχρονων εργαλείων στην κλασσική βελτίωση των φυτών, με σκοπό την δημιουργία ποικιλιών με υψηλή μέση απόδοση και αντοχή σε αβιοτικές και βιοτικές καταπονήσεις. Η γενετική τροποποίηση αποτελεί ένα από τα πολλά διαθέσιμα εργαλεία των σύγχρονων προγραμμάτων βελτίωσης των φυτών. Τα γενετικά τροποποιημένα φυτά μπορεί να χρησιμοποιηθούν ως νέες ποικιλίες ή ως γενετικό υλικό για την δημιουργία χρήσιμης γενετικής παραλλακτικότητας ενώ παράλληλα είναι εξαιρετικά χρήσιμα για τον λειτουργικό χαρακτηρισμό διάφορων γονιδίων. Πρόσφατα απομονώθηκαν από το είδος Phaseolus vulgaris δύο γονίδια GST, το PvGSTU2-2 το οποίο επάγεται από το ζιζανιοκτόνο fluazifop-p-butyl και το το PvGSTU3-3 το οποίο επάγεται από τον μύκητα Uromyces appendiculatus. Από την ετερόλογη έκφραση των δύο γονίδιων σε κύτταρα E.coli προέκυψε πως και τα δύο έχουν δράση υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης ενώ επιπλέον το PvGSTU2-2 κατέχει και καταλυτική δράση έναντι δύο ζιζανιοκτόνων της ομάδας των χλωροακεταμιδίων (Chronopoulu et al., 2011 ; Chronopoulou et al., 2014). Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η δημιουργία γενετικά τροποποιημένων φυτών που υπερεκφράζουν τα γονίδια PvGSTU3-3 και PvGSTU2-2 μέσω του A. tumefaciencs και ο in planta χαρακτηρισμός τους κάτω από συνθήκες αλατότητας ή μετά από την εφαρμογή του ζιζανιοκτόνου dimethenamid (χλωκροακεταμίδια) αντίστοιχα. Μέσω της προσέγγισης αυτής επιδιώκεται η συσχέτιση της καταλυτικής δράσης των ισοενζύμων με τον βιολογικό τους ρόλο στους φυτικούς οργανισμούς. 5

13 Κεφάλαιο 2 Ανασκόπηση βιβλιογραφίας 6

14 2.1 Ορισμός της καταπόνησης στους φυτικούς οργανισμούς Κάθε φυτικός οργανισμός έχει προσαρμοστεί μέσω της εξέλιξης να αναπτύσσεται φυσιολογικά μέσα σε καθορισμένα όρια συνθηκών του περιβάλλοντος (βέλτιστες συνθήκες). Μικρές αποκλίσεις από το φυσιολογικό άριστο για την ανάπτυξή τους είναι ανεκτές λόγω των ομοιοστατικών μηχανισμών που διαθέτουν. Ωστόσο, συχνά τα φυτά εκτίθενται σε ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες οι οποίες μπορεί να επηρεάζουν δυσμενώς την ανάπτυξή τους ή ακόμη και την επιβίωσή τους. Ο όρος καταπόνηση αναφέρεται στην επίδραση δυσμενών παραγόντων του περιβάλλοντος οι οποίοι τείνουν να παρεμποδίσουν την εύρυθμη λειτουργία των φυσιολογικών μηχανισμών. Οι καταπονήσεις διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε επίπεδο παραγωγής καθώς έχει υπολογιστεί πως ευθύνονται για το 70% μείωσης της απόδοσης των καλλιεργούμενων ειδών σε παγκόσμιο επίπεδο (Acquaah, 2007). Συνεπώς γίνεται κατανοητό πως η ανθεκτικότητα των καλλιεργούμενων φυτών σε καταπονήσεις παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον για τον τομέα της γεωργικής παραγωγής. Οι παράγοντες που προκαλούν καταπόνηση είναι πολυάριθμοι. Αδρομερώς, διακρίνονται σε βιοτικούς παράγοντες δηλαδή σε ζωντανούς οργανισμούς οι οποίοι είτε παρασιτούν εις βάρος των φυτών είτε τα ανταγωνίζονται για φως, θρεπτικά στοιχεία κλπ. και σε αβιοτικούς παράγοντες οι οποίοι μπορεί να είναι περιβαλλοντικής φύσεως (ακραίες θερμοκρασίες, αλατότητα, ξηρασία κ.α) ή ανθρωπογενούς προέλευσης (ρύπανση, φυτοφάρμακα κ.α). Ένας από τους κυριότερους μηχανισμούς πρόκλησης βλάβης στα φυτά σε κυτταρικό επίπεδο, εξαιτίας ακραίων συνθηκών, είναι μέσω της ανεξέλεγκτης παραγωγής ενεργών μορφών οξυγόνου (Reactive Oxygene Species ROS) Ενεργές μορφές οξυγόνου (Reactive Oxygene Species ROS) Η εξέλιξη των εξαρτώμενων από το οξυγόνο μεταβολικών διεργασιών όπως η αναπνοή, η φωτοσύνθεση και η φωτοαναπνοή έχουν σαν αναπόφευκτη συνέπεια την παραγωγή ROS στα μιτοχόνδρια, στους χλωροπλάστες και στα υπεροξεισώματα (Foyer and Noctor, 2000). Επιπλέον, υπάρχουν δεδομένα που υποστηρίζουν πως οποιοδήποτε υποκυτταρικό διαμέρισμα αποτελεί μια εν δυνάμει θέση παραγωγής και συγκέντρωσης ROS. Έχει εκτιμηθεί πως το 1% του οξυγόνου που καταναλώνεται από τα φυτά αποκλίνει προς την παραγωγή ROS (Eltsner, 1987; Del Rio et al., 1992). 7

15 Οι κυριότερες κατηγορίες ROS είναι το υπεροξειδικό ανιόν (O2 ), το μονήρες οξυγόνο ( 1 O2), η ρίζα υπεροξειδίου (HO2 ), το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) και η ρίζα υδροξυλίου (OH ). Το O2 προκύπτει κυρίως από την μεταφορά ενός ηλεκτρονίου στο μοριακό οξυγόνο κατά την αντίδραση Mehler (Mehler 1951, Foyer 2002). Η αντίδραση αυτή πραγματοποιείται σε συνθήκες έλλειψης NADP στο φωτοσύστημα Ι με μεταφορά ενός ηλεκτρονίου από την ανηγμένη φερρεδοξίνη απευθείας στο Ο2. Το 1 Ο2 παράγεται συνεχώς κατά την διάρκεια την φωτοσύνθεσης στο φωτοσύστημα ΙΙ. Υψηλής έντασης ακτινοβολίας προκαλεί υπερδιέγερση στο P680 και μέσω της μεταφοράς της ενέργειας του στο Ο2 σχηματίζεται το 1 Ο2 (Hideg et al., 2002). Στα μιτοχόνδρια παράγεται κυρίως O2, στα σύμπλοκα I και III της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων. Τα μιτοχόνδρια αποτελούν την κυριότερη θέση παραγωγής ROS σε συνθήκες σκότους και στα μη φωτοσυνθετικά όργανα (Halliwell and Gutteridge, 1999). Τέλος στα υπεροξεισώματα ενεργές μορφές οξυγόνου παράγονται από τον μεταβολισμό του γλυκολικού και την β-οξείδωσης των λιπαρών οξέων (Foyer and Noctor, 2003). Κάτω από σταθερές συνθήκες ROS απομακρύνονται μέσω διαφόρων αντιοξειδωτικών μηχανισμών. Ωστόσο, κάτω από συνθήκες αβιοτικής και βιοτικής καταπόνησης η ισορροπία μεταξύ της παραγωγής και της απομάκρυνσης των ROS μπορεί να διαταραχθεί. Η ξαφνική αύξηση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα των ROS οδηγεί στον κυτταρικό θάνατο μέσω οξειδωτικών διαδικασιών όπως της υπεροξείδωσης των μεμβρανικών λιπιδίων, της οξείδωσης των πρωτεϊνών καθώς και μέσω της αναστολής ενζύμων ή της καταστροφής του DNA και RNA (Foyer and Noctor, 2005). Εντούτοις, θα πρέπει να τονιστεί πως, ο σχηματισμός των ROS δεν συνιστά έναν a priori παράγοντα καταπόνησης των κυττάρων. Οι ROS δρουν και σαν μόρια σηματοδότησης για την ενεργοποίηση μονοπατιών, που σχετίζονται με την απόκριση ή την άμυνα των φυτών κάτω από δυσμενής συνθήκες. Εξαιτίας του διττού τους ρόλου, τα φυτά απαιτούν τουλάχιστον δύο μηχανισμούς για να ρυθμίσουν την ενδοκυτταρική τους συγκέντρωση. Έναν που θα επιτρέπει την λεπτή ρύθμιση των επιπέδων τους σε χαμηλές συγκεντρώσεις, έτσι ώστε να δρουν σαν μόρια σηματοδότησης και έναν που θα επιτρέπει την απομάκρυνσή τους από τα κύτταρα κάτω από συνθήκες καταπόνησης (Μittler, 2002). 8

16 2.1.2 Αντιοξειδωτική άμυνα των φυτικών οργανισμών Η επαγόμενη από τις καταπονήσεις αύξηση των ROS, μπορεί να αντιμετωπιστεί μέσω αντιοξειδωτικών ενζυμικών μηχανισμών όπου συμμετέχουν τα ένζυμα υπεροξειδική δεσμουτάση (Superoxide Dismutase SOD), ασκορβική υπεροξειδάση (Ascorbate Peroxidase APX), υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (Glutathione Peroxidase GPX), τρανσφεραση της γλουταθειόνης (Glutathione-S-transferase GST) και καταλάση (Catalase CAT) αλλά και μέσω μη ενζυμικών μηχανισμών οι οποίοι εμπλέκουν αντιοξειδωτικά μόρια όπως το ασκορβικό οξύ (AsA), η ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH), η α-τοκοφερόλη, τα καροτενοειδή και τα φλαβονοειδή (Mittler et al., 2004 ; Mittler, 2002). Οι SOD αποτελούν την πρώτη γραμμή άμυνας έναντι των ενεργών μορφών οξυγόνο καθώς, καταλύουν την μετατροπή του O 2 σε H2O2. Πρόκειται για μία πολυγονιδιακή οικογένεια ενζύμων που κωδικοποιούνται από γονίδια του πυρήνα και εντοπίζονται σε όλα τα υποκυτταρικά διαμερίσματα (Alscher et al., 2002). Η ενδοκυτταρική ισορροπία μεταξύ των SOD και των υπολοίπων ενζύμων που είναι υπεύθυνα για την απομάκρυνση του H2O2 είναι καθοριστική για την διατήρηση σταθερών των επιπέδων του O 2 και του H2O2. Η ισορροπία αυτή, σε συνδυασμό με την απομάκρυνση των ιόντων μετάλλων από την φεριτίνη και άλλες μεταλλοπρωτεΐνες, αποτρέπει τον σχηματισμό της εξαιρετικά τοξικής ρίζας HO η οποία προκύπτει μέσω της αντίδρασης Haber-Weiss ή αντίδρασης Fenton (Halliwell and Gutteridge, 1999). Οι φυτικοί οργανισμοί δεν διαθέτουν ενζυμικά συστήματα για την απομάκρυνση της ρίζας HO συνεπώς, η αποτροπή του σχηματισμού της είναι ο μοναδικός μηχανισμός άμυνας που διαθέτουν. H απομάκρυνση του H2O2 πραγματοποιείται από μία ομάδα αντιοξειδωτικών ενζύμων τα οποία κωδικοποιούνται από πυρηνικά γονίδια όπως η CAT, APX και GPX. Η CAT διασπά το H2O2 χωρίς να χρειάζεται κάποιο αναγωγικό παράγοντα παρέχοντας έτσι στο φυτικό κύτταρο ένα ενεργειακά αποτελεσματικό μηχανισμό. Ο κύριος ρόλος της GPX είναι η αναγωγή των τοξικών υδροξυπεροξειδίων σε μη τοξικές αλκοόλες. Έτσι, προστατεύουν της κυτταρικές μεμβράνες διατηρώντας την ακεραιότητα των κυττάρων. Τα ένζυμα αυτά είναι παρόντα σε όλα τα υποκυτταρικά διαμερίσματα και εμπλέκονται στις αποκρίσεις των κυττάρων σε συνθήκες βιοτικής και αβιοτικής καταπόνησης, λειτουργώντας σαν ένζυμα που γενικά απομακρύνουν τα υπεροξείδια (Navrot et al., 2006). Η APX καταλύει την αναγωγή του H2O2 χρησιμοποιώντας ως αναγωγικό παράγοντα το ΑsA ή σε κάποιες περιπτώσεις την GSH. Η αναγέννηση του οξειδωμένου ασκορβικού πραγματοποιείται από τα ένζυμα 9

17 μονοαφυδροασκορβική αναγωγάση (MDAR) και αφυδροασκορβική αναγωγάση (DHAR) χρησιμοποιώντας το NAD(P)H ως δότη ηλεκτρονίων (Mittler et al., 2004). Το ασκορβικό οξύ και η γλουταθειόνη είναι οι κυριότεροι αντιοξειδωτικοί μεταβολίτες των φυτικών κυττάρων. Δρουν σαν δότες ηλεκτρονίων σε ενζυματικές αντιδράσεις, ενώ κάτω απο συγκεκριμένες συνθήκες οξειδώνονται άμεσα απο τις ενεργές μορφές οξυγόνου. O κύκλος του ασκορβικού-γλουταθειόνης εντοπίζεται σε όλα τα υποκυτταρικά διαμερίσματα που έχουν μελετηθεί μέχρι στιγμης ενώ επιπλέον η υψηλή συνάφεια της APX με το Η2Ο2 υποδεικνύει πως αυτός ο κύκλος παίζει κρίσιμο ρόλο στον έλεγχο των επιπέδων των ROS. 2.2 Καταπόνηση προκαλούμενη από υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων Η αλατότητα του εδάφους αποτελεί μία από τις πιο καταστροφικές περιβαλλοντικές καταπονήσεις καθώς, μειώνει την παραγωγή και υποβαθμίζει την ποιότητα του παραγόμενου προϊόντος (Wang et al., 2009). Το έδαφος χαρακτηρίζεται αλατούχο όταν η συγκέντρωση NaCl είναι μεγαλύτερη από 40mM. Η καταπόνηση των φυτών από υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων είναι ένα περίπλοκο φαινόμενο. Πρωτογενώς, η καταπόνηση προκύπτει από ωσμωτική και ιοντική ανισορροπία, η οποία τελικά οδηγεί σε οξειδωτική καταπόνηση των κυττάρων. Η συσσώρευση αλάτων δημιουργεί χαμηλό υδατικό δυναμικό νερού στο έδαφος. Στις συνθήκες αυτές, δυσχεραίνεται η πρόσληψη νερού και θρεπτικών συστατικών από το εδαφικό περιβάλλον και ως εκ τούτου η προκαλούμενη ωσμωτική καταπόνηση εμφανίζεται με την μορφή υδατικής καταπόνησης, η οποία οδηγεί στην μείωση της φωτοσύνθεσης και την αύξηση της διαπνοής με τελικό αποτέλεσμα την μείωση του ρυθμού αύξησης των φυτών (Khadri et al., 2006). Εκτός από την ωσμωτική καταπόνηση, η αλατότητα προκαλεί ιοντική ανισορροπία λόγω της υψηλής συγκέντρωσης Na +. Η είσοδος του Νa + στα κύτταρα πραγματοπoιείται είτε μέσω μη εκλεκτικών καναλιών που μεταφέρουν κατιόντα ή μέσω μεταφορέων χαμηλής ή υψηλής συγγένειας για Κ +. Το Na + δρα ανταγωνιστικά έναντι του K + για τα ενεργά κέντρα των ενζύμων (Blumwald et al., 2000) και των ριβοσωματίων (Tester and Davenport, 2003). Το Κ + είναι ενεργοποιητής περισσοτέρων από πενήντα ενζύμων τα οποία εμπλέκονται σε μεταβολικές διεργασίες και ο ρόλος του δεν μπορεί να αντικατασταθεί από το Na +. Συνεπώς, υψηλή συγκέντρωση Na + ή υψηλός λόγος Na + /K + μπορεί να επηρεάσει διάφορες μεταβολικές διεργασίες. Υψηλή συγκέντρωση συγκεκριμένων ιόντων και ειδικότερα του 10

18 Na + και του Cl - προκαλεί θρεπτική ανισορροπία στα φυτά η οποία συχνά εμπλέκει την έλλειψη ιόντων όπως το K +, Ca 2+, Mg 2+ και NO3 (Läunchli and Epstein, 1990). Δευτερογενής συνέπεια της αλατότητας είναι η πρόκληση οξειδωτικής καταπόνησης στα κύτταρα. Οι συνθήκες έλλειψης νερού που δημιουργούνται στο φυτό, προκαλούν αύξηση της συγκέντρωσης του ΑΒΑ το οποίο επάγει το κλείσιμο των στοματίων. Ο περιορισμός της διαθεσιμότητας του CO2 στα κύτταρα των φύλλων έχει ως αποτέλεσμα την καταστροφή του συντονισμού μεταξύ, της αφομοίωσης του άνθρακα και της λειτουργίας της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων στους χλωροπλάστες. Αυτή η δυσλειτουργία έχει ως αποτέλεσμα την δημιουργία ROS μέσω της μεταφοράς ηλεκτρονίων σε εναλλακτικούς αποδέκτες όπως το Ο2. (Foyer and Noctor, 2000). Επιπλέον οι υψηλές συγκεντρώσεις Na + /Cl - μπορεί να καταστρέψουν την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων στους χλωροπλάστες με αποτέλεσμα την διαρροή ηλεκτρονίων προς το O2. Η μείωση του διαθέσιμου άνθρακα επιβραδύνει τις αντιδράσεις του κύκλου τον Calvin και επάγει την φωτοαναπνοή με αποτέλεσμα τον σχηματισμό H2O2 στα υπεροξεισώματα. Η οξειδάση του NADPH και η οξειδάση της διαμήνης ενεργοποιούνται κατά την διάρκεια της καταπόνησης από την αλατότητα και συμβάλλουν στην δημιουργία ROS (Abogadallah, 2010). Διάφορες μελέτες έχουν δείξει πως η υπερπαραγωγή ROS στα φυτά καθώς και η προκαλούμενη καταστροφή των κυτταρικών μεμβρανών αποτελεί κύρια αιτία πρόκλησης κυτταρικής τοξικότητας κάτω από συνθήκες αλατότητας (Mittova et al., 2004 ; Hossain et al., 2011; Hasanuzzaman et al., 2011a,b ) Μηχανισμοί αντοχής των φυτών σε υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων Η ανθεκτικότητα των φυτών σε συνθήκες αλατότητας, εξαρτάται από προσαρμογές που θα επιτρέψουν την επανεγκατάσταση της ιοντικής και ωσμωτικής ομοιόστασης καθώς και την αποτροπή ή την αποκατάσταση των βλαβών που προκαλούνται από την οξειδωτική καταπόνηση. Ωστόσο, δεν υπάρχει ομοφωνία σχετικά με το ποια είναι η καθοριστική διαδικασία αλλά και οι επακόλουθες δευτερογενής διαδικασίες που σχετίζονται με την αντοχή των φυτών στην αλατότητα. Για την αποκατάσταση της ιοντικής ομοιόστασης και την διατήρηση των επίπεδων του Na + σε φυσιολογικά επίπεδα, κεντρικό ρόλο παίζει η ρύθμιση διαφόρων μεταφορέων ιόντων καθώς και το μονοπάτι SOS (SALT OVERLAY SENSITIVE). Το μονοπάτι διαμεταγώγησης SOS ανακαλύφθηκε στην αραβίδοψη και αποτελείται από τρία συστατικά στοιχεία: Τον 11

19 αισθητήρα Ca 2+ SOS3, την πρωτεϊνική κινάση SOS2, και τον αντιμεταφορέα Na + /H + SOS1 που εντοπίζεται στην πλασματική μεμβράνη (Türkan and Demiral, 2009). Η παρουσία του Na + στον αποπλάστη γίνεται αντιληπτή από ένα άγνωστο μέχρι στιγμής αισθητήρα ο οποίος μεταβάλλει τα επίπεδα του Ca 2+ στο κυτταρόπλασμα και ενεργοποιεί τον SOS3 ο οποίος σχηματίζει σύμπλοκο με την SOS2. Το σύμπλοκο αυτό ενεργοποιεί τον SOS1 ο οποίος απομακρύνει το Νa + απο το κυτόπλασμα. Μετάλλαξη στο γονίδιο SOS1 στην αραβίδοψη κατέστησε τα φυτά εξαιρετικά ευαίσθητα στις υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων, ενώ η υπερέκφρασή του είχε ως αποτέλεσμα την μείωση της συγκέντρωσης Na + στον βλαστό και την βελτίωση της ανθεκτικότητάς τους (Zhu, 2001). Το σύμπλοκο SOS2/SOS3 ενεργοποιεί επίσης τον αντιμεταφορέα Na + /H + NHX1, ο οποίος εντοπίζεται στον τονοπλάστη και είναι υπεύθυνος για την μεταφορά του Na + στο χυμοτόπιο. Η διαμερισματοποίηση του Na + στο χυμοτόπιο αποτελεί ένα ενεργειακά οικονομικό τρόπο για την επίτευξη ωσμωτικής ομοιόστασης στο κυτταρόπλασμα καθώς το Na + σε αυτή την περίπτωση παίζει τον ρόλο ωσμωλύτη. Το σύμπλοκο SOS2/SOS3 εμπλέκεται στην ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των προαναφερόμενων αντιμεταφορέων καθώς και της δράσης των H + -ATPασων και H + -Ppασων οι οποίες είναι υπεύθυνες για την δημιουργία ηλεκτροχημικής διαβάθμισης απαραίτητης για την δράση του NHX1 (Chinnusamy et al., 2005a). Ακόμη ένας συντηρημένος μηχανισμός που απαντάται στα μονοκοτυλήδονα και τα δικοτυλήδονα φυτά, αφορά την διατήρηση υψηλού λόγου K + /Na + στα φύλλα μέσω του μεταφορέα HKT. Υψηλός λόγος K + /Na + αποτελεί έναν καλό δείκτη της ανθεκτικότητας των φυτών στην αλατότητα (Hauser and Horie, 2010). Η αποκατάσταση της ωμωτικής ομοιόστασης επιτυγχάνεται μέσω της συσσώρευσης συμβατών ωσμωλυτών στο κυτόπλασμα. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται ωσμωτική προσαρμογή και είναι σημαντική για τον εγκλιματισμό των φυτών σε συνθήκες αλατότητας, καθώς μειώνει το ωσμωτικό δυναμικό του φυτού και οδηγεί το υδατικό δυναμικό της ρίζας σε τιμές αρνητικότερες από του εδάφους, επιτρέποντας τα φυτά να συνεχίσουν να προσλαμβάνουν νερό από το αλατούχο εδαφικό διάλυμα. Οι συμβατοί ωσμωλύτες δεν παρεμβαίνουν στις φυσιολογικές μεταβολικές διαδικασίες ενώ έχει δειχθεί πως κάποιοι εξ αυτών, προστατεύουν της δομές των κυττάρων και αποτοξινώνουν τις ROS (Diamant et al., 2001). Οι πιο συνήθεις είναι σάκχαρα (σουκρόζη, φρουκτόζη) και σύνθετα σάκχαρα (τρεχαλόζη, φρουκτάνες), πολυαμίνες, πολυόλες-πολυυδατωμένες αλκοόλες (πινιτόλη μαννιτόλη) ή μη φορτισμένους μεταβολίτες όπως η γλυκίνη μπεταϊνη μια τρετρασθενής αμίνη και η προλίνη. 12

20 Η δραστικότητα του αντιοξειδωτικού μηχανισμού των φυτών, εμφανίζει υψηλό βαθμό συσχέτισης με την αντιοξειδωτική άμυνα και την ανθεκτικότητα των φυτών σε συνθήκες αλατότητας. Η ενζυμική δραστικότητα είναι διαφορετική μεταξύ των καλλιεργούμενων ποικιλιών και εξαρτάται από την διάρκεια και την ένταση της καταπόνησης. Στους ανθεκτικούς γενότυπους αυξάνεται ως απόκριση σε υψηλή συγκέντρωση αλάτων κάτι το οποίο δεν παρατηρείται σε όσους εμφανίζουν ευαισθησία στην αυξημένη αλατότητα. Ο El-Bastawisy. (2010) μετά από μελέτη νεαρών φυτών σιταριού που υποβλήθηκαν σε καταπόνηση αλατότητας κατέληξε στο συμπέρασμα πως η αντοχή στην αλατότητα σχετίζεται με τα επίπεδα αντιοξειδωτικών ενζύμων και ουσιών. Μεταξύ των τριών υπό μελέτη ποικιλιών, η ενζυμική δραστικότητα των CAT, APX και GR όπως επίσης και τα επίπεδα του AsA και της GSH αυξήθηκαν στην ποικιλία με την μεγαλύτερη αντοχή στην αλατότητα και μειώθηκαν στις δύο ευαίσθητες. Oι Mittova και συν. (2002a,b) ανέφερε πως κατά την σύγκριση της καλλιεργούμενης τομάτας (L. esculentum) με το ανθεκτικό στην αλατότητα άγριο συγγενικό είδος (L. pennellii) τα πλαστίδια της ρίζας του ανθεκτικού γενότυπου δεν υπέστησαν βλάβη εξαιτίας της αυξημένης δραστικότητας των ενζύμων SOD, APX και GPX. Οι Vaidyanathan και συν. (2003) μελέτησαν την άμεση απόκριση δύο ποικιλιών ρυζιού (Oryza sativa L) με διαφορετική ευαισθησία στην αλατότητα στην επαγόμενη από την αλατότητα οξειδωτική καταπόνηση. H ανθεκτική ποικιλία παρουσίασε υψηλή δραστικότητα αντιοξειδωτικών ενζύμων όπως επίσης και αυξημένα επίπεδα ΑsA και GSH Οι προαναφερόμενοι μηχανισμοί αντοχής απαιτούν την παροχή ενέργειας με την μορφή ΑΤP, ανηγμένης ενέργειας, ή του καταβολισμού των υδατανθράκων, είτε για να υποστηρίξουν την δράση των ATPασών ή για την σύνθεση συμβατών ωσμωλυτών. Οι υψηλές απαιτήσεις σε ενέργεια υποδεικνύουν τον κεντρικό ρόλο της μιτοχονδριακής αναπνοής στους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα αλατότητας (Jacoby et al., 2011). Οι ανθεκτικοί γενότυποι φαίνεται πως έχουν πιο ενισχυμένο αντιοξειδωτικό σύστημα στα μιτοχόνδρια το οποίο πιθανόν είναι υπεύθυνο για τον συντονισμό της αντιοξειδωτικής απόκρισης των φυτών σε άλλα φυτικά μέρη Βελτίωση της αντοχής των φυτών σε συνθήκες αλατότητας Η βελτίωση της αντοχής των καλλιεργούμενων φυτών στην αλατότητα παρουσιάζει ορισμένες δυσκολίες εξαιτίας της πολυπλοκότητας σε γενετικό και φυσιολογικό επίπεδο του συγκεκριμένου χαρακτηριστικού. Φυσιολογικές μελέτες υποδεικνύουν πως ελέγχεται από έναν αριθμό χαρακτηριστικών, κάθε ένα από τα οποία μπορεί να καθορίζεται από ποικίλο 13

21 αριθμό γονιδίων (Flowers, 2004) με ετέρωση, κυριαρχία και αθροιστική δράση (Shannon, 1985). Για την αύξηση της αντοχής των φυτών στην αλατότητα σε γενετικό επίπεδο χρησιμοποιούνται δύο προσεγγίσεις 1) Εκμετάλλευση της φυσικής ποικιλότητας και άμεσης επιλογής των ανθεκτικών φυτών στην αλατότητα ή επιλογή υποβοηθούμενη από τους μοριακούς δείκτες (MAS Marker assisted selection) μέσω της χαρτογράφησης QTL και 2) Την δημιουργία γενετικά τροποποιημένων φυτών. Σύμφωνα με τους Chinnusamy και συν. (2005b) η βελτίωση της αντοχής των φυτών στην αλατότητα με συμβατικές μεθόδους είναι μια ιδιαίτερα χρονοβόρα διαδικασία, ενώ συχνή είναι η μεταφορά μη επιθυμητών αλληλομόρφων γονιδίων. Η γενετική ποικιλότητα για το εν λόγω χαρακτηριστικό εντός των καλλιεργούμενων ειδών είναι περιορισμένη, ενώ σύμφωνα με τους Ashraf και συν. (2008) η ενσωμάτωση της αντοχής από άγριους συγγενείς σε καλλιεργούμενα είδη, είναι δύσκολη εξαιτίας των αναπαραγωγικών εμποδίων που τίθενται. Επιπλέον, η αξιολόγηση και η επιλογή των ανθεκτικών γενότυπων είναι εξαιρετικά δύσκολη διαδικασία, εξαιτίας της διαφορετικής ευαισθησίας που εμφανίζουν κάποια φυτικά είδη ανάλογα με το στάδιο ανάπτυξής τους καθώς και της διακύμανσης της αλατότητας στον αγρό (Daniells et al., 2001) ή και της αλληλεπίδρασης άλλων παραγόντων του περιβάλλοντος που επηρεάζουν την απόκριση των φυτών. Γενικά, η χρήση των QTL, έχει βελτιώσει την αποτελεσματικότητα της επιλογής ειδικά για χαρακτηριστικά που ελέγχονται από πολλά γονίδια και επηρεάζονται από το περιβάλλον. Σύμφωνα με τους Yamaguchi και Blumwald (2005) η αντοχή στην αλατότητα ελέγχεται από πολλαπλά QTL, η αξιοποίηση των οποίων στην MAS θα βοηθήσει στην πυραμιδοποίηση των χαρακτηριστικών ενδιαφέροντος με σκοπό την βελτίωση της αντοχής των καλλιεργούμενων ειδών στην αλατότητα Η γενετική τροποποίηση αποτελεί ένα σύγχρονο εναλλακτικό εργαλείο για την βελτίωση των φυτών καθώς επιτρέπει την μεταφορά γονιδίων μεταξύ διαφορετικών ειδών και την δημιουργία χρήσιμης γενετική παραλλακτικότητας όταν αυτή είναι περιορισμένη ή απουσιάζει (Humphreys and Humphreys, 2005). Με βάση τις μέχρι τώρα μελέτες, φαίνεται πως η αντοχή στην αλατότητα μπορεί να μεταβληθεί μέσω της γενετικής τροποποίησης των φυτών με ένα ή δύο γονίδια, κάτι που είναι σημαντικό για την αναγνώριση και τον χαρακτηρισμό των μηχανισμών που επιτρέπουν στα φυτά να αντέχουν υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων καθώς και για την πρακτική εκμετάλλευση της συγκεκριμένης τεχνολογίας στη δημιουργία ανθεκτικών φυτών. Ωστόσο, εξαιτίας της ποσοτικής φύσης του 14

22 χαρακτηριστικού η αύξηση της αντοχής στην αλατότητα μέσω της αλλαγής στην έκφραση ενός η δύο γονιδίων τίθεται πολλές φορές υπό αμφισβήτηση. 2.3 Τα ζιζανιοκτόνα φάρμακα: εκλεκτικότητα και φυτοτοξικότητα Οι φυτικοί οργανισμοί συνεχώς εκτίθενται σε ποικίλα χημικά συστατικά όπως φυτοφάρμακα (εντομοκτόνα, ζιζανιοκτόνα), βαρέα μέταλλα κλπ, τα οποία μπορεί να προκαλέσουν έντονη τοξικότητα. Τα ζιζανιοκτόνα είναι ξενοβιοτικές ουσίες οι οποίες ανήκουν στην κατηγορία των ανθρωπογενών αβιοτικών παραγόντων καταπόνησης των φυτών. Πρόκειται για χημικά σκευάσματα τα οποία παρεμβαίνουν σε βασικές φυσιολογικές και μεταβολικές λειτουργίες των φυτών με αποτέλεσμα, είτε να αναστέλλουν την ανάπτυξή τους είτε να εμφανίζουν φυτοκτόνο δράση. Περισσότερα από 200 ενεργά συστατικά χρησιμοποιούνται ως ζιζανιοκτόνα. Μεταξύ των διαφόρων κριτηρίων ταξινόμησης, η κατηγοριοποίησή τους με βάση τον τρόπο δράσης τους περιγράφει καλύτερα τον τρόπο με τον οποίο το ζιζανιοκτόνο θέτει επιλεκτική πίεση στα ζιζάνια (Vencill et al., 2012). Με βάση αυτό το κριτήριο τα ζιζανιοκτόνα μπορεί να ταξινομηθούν σε τέσσερις γενικές ομάδες 1) Αναστολείς της φωτοσύνθεσης 2) Ζιζανιοκτόνα που μιμούνται την δράση της αυξίνης 3) Αναστολείς της βιοσύνθεσης αμινοξέων και 4) Αναστολείς της βιοσύνθεσης λιπιδίων και λιπαρών οξέων (Zornitsa and Μiteva, 2010). Στην ζιζανιολογία ο όρος αντοχή (resistance) αναφέρεται στην κληρονομήσιμη ιδιότητα ενός φυτού να επιβιώνει και να αναπαράγεται μετά από την έκθεση του σε μια δόση ζιζανιοκτόνου η οποία κανονικά είναι θανατηφόρα. Στα φυτά η αντοχή μπορεί να εμφανίζεται φυσικά ή να επάγεται από τεχνικές όπως η γενετική τροποποίηση, η επιλογή από κυτταρικές καλλιέργειες ή μέσω μεταλλάξεων (Vencill et al., 2012). Η αντοχή των φυτών στα ζιζανιοκτόνα μπορεί να οφείλεται σε τροποποίηση της θέσης δράσης του ζιζανιοκτόνου ή σε υπερπαραγωγή του στόχου του ζιζανιοκτόνου (Target site resistance) ή σε μηχανισμούς μεταβολικής αποδόμησης οι οποίοι δεν επιτρέπουν στο ζιζανιοκτόνο να φτάσει στην θέση δράση του (Νοn target site resistance) (Prather et al., 2000). Η θέση δράσης (Τarget site) είναι η θέση (συνήθως ένα ένζυμο) στο οποίο δεσμεύεται το ενεργό συστατικό του ζιζανιοκτόνου παρεμβαίνοντας έτσι, στις φυσιολογικές διεργασίες του φυτού (Nandula, 2010) Η πρόκληση τοξικότητας στα ζιζάνια και η αντοχή ενός καλλιεγούμενου είδους μετά από την εφαρμογή ενός ζιζανιοκτόνου προσδιορίζει την εκλεκτικότητα του. Παράγοντες 15

23 εκλεκτικότητας είναι οι διαφορές μεταξύ των φυτών στο ρυθμό πρόσληψης και μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων και στην ευαισθησία των ενζύμων που αποτελούν τον στόχο ενός ζιζανιοκτόνου. Ο κύριος παράγοντας εκλεκτικότητας είναι ο διαφορετικός μεταβολισμός μεταξύ των ζιζανίων και των καλλιεργούμενων φυτών κατά τον οποίο τα ευαίσθητα ζιζάνια έχουν μειωμένη ικανότητα να μεταβολίσουν ένα ζιζανιοκτόνο ενώ στα καλλιεργούμενα φυτά μεταβολίζεται και απενεργοποιείται πριν να ασκήσει την φυτοτοξική του δράση (Cole, 1994) Μεταβολική αποδόμηση των ζιζανιόκτονων Οι φυτικοί οργανισμοί μεταβολίζουν τις ξενοβιοτικές ουσίες μέσω τριών διαδοχικών βημάτων (Coleman et al., 1997). Kατά την φάση I γίνεται η μετατροπή ή η ενεργοποίηση της ξενοβιοτικής ουσίας μέσω οξείδωσης, αναγωγής και υδρόλυσης (Komives and Gullner, 2005). Στην φάση II πραγματοποιείται η συμπλοκοποίηση της ξενοβιοτικής ουσίας με ενδογενή υδρόφιλα μόρια όπως η GSH, τα σάκχαρα και τα αμινοξέα (Dietz and Schnoor, 2001) και τέλος, στην φάση III πραγματοποιείται η μεταφορά του τροποποιημένου μορίου στο χυμοτόπιο ή η ενσωμάτωσή του σε συστατικά του κυτταρικού τοιχώματος όπως η λιγνίνη και οι ημικυτταρίνες (Dietz and Schnoor, 2001). Αναλυτικότερα, στη φάση I, τα μόρια της ξενοβιοτικής ουσίας υφίστανται βιομετατροπή μέσω αντιδράσεων οξείδωσης αναγωγής και υδρόλυσης. Τα μεταβολικά μονοπάτια που λειτουργούν κατά την φάση αυτή, έχουν σαν αποτέλεσμα την έκθεση των λειτουργικών ομάδων των ξενοβιοτικών ουσιών, με αποτέλεσμα την δημιουργία περισσότερο πολικών, χημικά ενεργών και υδατοδιαλυτών συστατικών (Komives and Gullner, 2005). Ουσιαστικά, η φάση I αποτελεί την φάση της βιοενεργοποίησης του μεταβολισμού και προετοιμάζει την ουσία να εισέλθει στις αντιδράσεις της φάσης II. Διάφορες ομάδες ενζύμων παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την φάση αυτή, όπως η μονοoξυγενάση του κυτoχρώματος P450 (CytP450 momooxygenases) (Hatzios, 1997) η οποία είναι κρίσιμης σημασίας στην βιοενεργοποίηση των υδρόφοβων ουσιών σε ενεργά υδρόφιλα συστατικά, τα οποία στην συνέχεια σχηματίζουν σύμπλοκα κατά την φάση II. Στα φυτά το κυτόχρωμα P450 αποτελεί την μεγαλύτερη οικογένεια πρωτεϊνών και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην αντοχή των φυτών στις ξενοβιοτικές ουσίες (Morant et al., 2003). Οι περοξειδάσες, περοξυγενάσες, νιτροαναγωγάσες και λακάσσες συμμετέχουν επίσης στις βιομετατροπές που συμβαίνουν κατά την φάση I. Στην περίπτωση που η ξενοβιοτική ουσία 16

24 έχει ήδη μία λειτουργική ομάδα κατάλληλη για να προωθηθεί στην φάση II, η φάση της βιοενεργοποίησης παρακάμπτεται. Κατά την φάση II, η ενεργοποιημένη ξενοβιοτική ουσία δεσμεύεται σε σάκχαρα ή στην σουλφυδριλική ( SH) ομάδα της GSH, με αποτέλεσμα το προκύπτων μόριο να είναι περισσότερο υδρόφιλο. Γενικά, μέσω της συμπλοκοποίησης τα μόρια της ουσίας γίνονται λιγότερο τοξικά και περισσότερα πολικά με μεγαλύτερο μοριακό βάρος σε σχέση με το αρχικό μόριο (Edwards, 1998). Ένζυμα όπως οι τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (Glutathione-S-transferase, GST) (Edwards et al., 2000) και οι τρανσφεράσες της γλυκόζης (Glycosyl-transferase, GT) (Sandermann,1994) συμμετέχουν στην φάση II του μεταβολισμού. Οι GSTs καταλύουν την νουκλεόφιλη σύνδεση του ατόμου του θείου της GSH με τις ηλεκτρονιόφιλες ομάδες ενός μεγάλου εύρους ξενοβιοτικών ουσιών. Η συμπλοκοποίηση των ξενοβιοτικών ουσιών με την GSH λαμβάνει χώρα στο κυτόπλασμα. Η συσσώρευση αυτών των συμπλόκων στην περιοχή του κυτοπλάσματος είναι τοξική για τα κύτταρα. Κατά την φάση III, τα συμπλοκοποιημένα ξενοβιοτικά απομακρύνονται από τις ευαίσθητες περιοχές του κυτοπλάσματος στα χυμοτόπια μέσω μεταφορέων που εντοπίζονται στον τονοπλάστη ή στον αποπλάστη. Η διαμερισματοποίση στο χυμοτόπιο αποτελεί το κυριότερο βήμα στην αποτοξίνωση μια ξενοβιοτικής ουσίας (Coleman et al., 2002). Oι μεταφορείς εξαρτώμενοι από το ΑΤP (ΑΤP Binding Cassette Transporters, ABC) εντοπίζονται στον τονοπλάστη και αποτελούν την κυριότερη κατηγορία μεταφορέων που εμπλέκονται σε αυτή τη φάση (Martinois et al., 1993). Οι μεταβολίτες που παράγονται από την παραπάνω διαδικασία μπορεί να υποστούν περεταίρω υδρόλυση ή να εξαχθούν πάλι στο κυτόπλασμα όπου μεταβολίζονται. Σε κάποιες περιπτώσεις τα υπολείμματα μιας ανακυκλωμένης ξενοβιοτικής ουσίας μπορεί να εισέλθουν εκ νέου στον αποτοξινωτικό μηχανισμό (Brazier-Hicks και συν., 2008), να ενσωματωθούν σε βιολογικά μόρια ή να μεταβολιστούν πλήρως καταλήγοντας στην παραγωγή CO2 (Εrtunc και συν., 2004) Το ζιζανιοκτόνα dimethenamid Το ζιζανιοκτόνο dimethenamid (2-chloro-N-(2,4-dimethyl-3-thienyl)-N-(2-methoxy-1- methylethyl)acetamide ανήκει στην ομάδα των χλωροακεταμίδιων (chloroacetamides) και χρησιμοποιείται για τον έλεγχο των αγρωστωδών και κάποιων πλατύφυλλων ζιζανίων 17

25 προφυτρωτικά ή σε πρώιμο μεταφυτρωτικό στάδιο, σε έναν αριθμό οικονομικά σημαντικών καλλιεργούμενων ειδών όπως ο αραβόσιτος, η σόγια και το κοινό φασόλι. Γενικά, τα ζιζανιοκτόνα της ομάδας των χλωροακεταμίδιων δεν αναστέλλουν την φύτρωση. Προσλαμβάνονται από το κολεόπτιλο ή μέσω των ριζών και των εκπτυσσόμενων βλαστών και αναστέλλουν την αρχική ανάπτυξη των ευαίσθητων ζιζανίων. Τα πρώτα φύλλα που εξέρχονται από το κολεόπτιλο καθώς και οι κοτυληδόνες είναι παραμορφωμένες και με μικρότερο μέγεθος. Σε πειράματα που έχουν πραγματοποιηθεί στην βρώμη (Avena sativa) έχει δειχθεί πως η κυτταρική διαίρεση όπως και η επιμήκυνση των κυττάρων αναστέλλεται (Deal and Hess, 1980), το ίδιο έχει παρατηρηθεί και στα μικροφύκη Chlamydomonas reinhardtii (Fedtke, 1982) και Scenedesmus acutus (Weisshaar and BoÈger, 1987). Σε βιοχημικό και φυσιολογικό επίπεδο τα ζιζανιοκτόνα της ομάδας αυτής, παρεμποδίζουν την επιμήκυνση των αλυσίδων λιπαρών οξέων με άτομα άνθρακα μέσω της δέσμευσής τους στο ενζυμικό σύμπλοκο της ελονγκάσης (Böger και συν., 2000), επιδρούν στην σύνθεση του γιβεριλλικού οξέος (Wilkinson, 1982), αναστέλλουν την μετακίνηση του αμυλού (Ebert, 1980) και αυξάνουν το ωσμωτικό δυναμικό της ρίζας (Vavrina and Ashley, 1983) Βελτίωση τις αντοχής των φυτών σε ζιζανιοκτόνα φάρμακα O αποτελεσματικός έλεγχος των ζιζανίων συνεχίζει να αποτελεί ένα σημαντικό πρόβλημα της σύγχρονης γεωργίας. Τα περισσότερα ζιζανιοκτόνα φάρμακα στερούνται εκλεκτικότητας καθώς, παρεμβαίνουν σε σημαντικές φυσιολογικές διεργασίες οι οποίες είναι κοινές μεταξύ των καλλιεργούμενων φυτών και των ζιζανίων. Η ζητούμενη εκλεκτικότητα, επιτυγχάνεται μέσω της εμπειρικής σύνθεσης και ελέγχου ανάλογων των ενεργών μορίων ή με την χρήση προστατευτικών ουσιών (safeners) οι οποίες μπορούν εκλεκτικά να προστατεύουν συγκεκριμένες καλλιέργειες από την επίδραση συγκεκριμένων ζιζανιοκτόνων. Επιπλέον, η μόλυνση του περιβάλλοντος, η τοξικότητα στους ζωικούς οργανισμούς και η υπολειμματικότητα των ζιζανιοκτόνων στο έδαφος και στο νερό, οδήγησε στην έρευνα για την εύρεση νέων ζιζανιοκτόνων τα οποία είναι αποτελεσματικά ασφαλή και αποικοδομούνται εύκολα. Εντούτοις, τα περισσότερα από αυτά στερούνται εκλεκτικότητας. Η δημιουργία καλλιεργούμενων φυτών ανθεκτικών σε ζιζανιοκτόνα φάρμακα και ιδιαίτερα ευρέους φάσματος δράσης, αποτελεί ένα μέσω για την επίλυση των παραπάνω προβλημάτων. 18

26 Οι καλλιεργούμενες ποικιλίες με ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα φάρμακα είναι κατά κύριο λόγο προϊόν βιοτεχνολογικών μεθόδων, όπως της συγχώνευσης πρωτοπλαστών, της επιλογής από κυτταροκαλλιέργειες, της πρόκλησης μεταλλάξεων και της γενετικής τροποποίησης. Μέσω της κλασσικής βελτίωσης δημιουργήθηκαν πολύ λίγες ανθεκτικές ποικιλίες κυρίως διότι πρόκειται για μια χρονοβόρο διαδικασία (Snape et al., 1991). Παράδειγμα αποτελεί η δημιουργία ελαιοκάμβρης (Beversdorf and Hume, 1984) και μαρουλιού (Mallory et al., 1993) με ανθεκτικότκητα στην ατραζίνη. Η τεχνική της συγχώνευσης πρωτοπλαστών έχει χρησιμοποιηθεί για την ενσωμάτωση της αντοχής στο ζιζανιοκτόνο τριαζίνη σε είδη του γένους Solanum (Austin and Helgeson, 1987) όπως και σε ποικιλίες του γένους Brassica οι οποίες εμφανίζουν κυτοπλασμική ανδροστειρότητα (Barsby et al., 1987). Η σωμοκλωνική παραλλακτικότητα των κυτταροκαλλιεργειών αποτέλεσε μια από τις πιο σημαντικές μεθόδους επιλογής για την ανάπτυξη ποικιλιών ανθεκτικών σε ζιζανιοκτόνα (Chaleff, 1988) επίσης, ένας από τους πιο αποτελεσματικούς τρόπους δημιουργίας ανθεκτικών φυτών υπήρξε η πρόκληση μεταλλάξεων. Διάφορες προσεγγίσεις έχουν χρησιμοποιηθεί για την δημιουργία και την επιλογή μεταλλάξεων (Christianson, 1991). Για παράδειγμα, για την εύρεση αντοχής σε ζιζανιοκτόνα σε μεταλλάγματα σόγιας εφαρμόστηκε μαζική επιλογή (Sebastian et al., 1989). Παρόμοιες προσεγγίσεις έχουν χρησιμοποιηθεί και για άλλα καλλιεργούμενα είδη (Dyer et al., 1993) όπως η πρόκληση μεταλλάξεων σε μικροσπόρια ελαιοκράμβρης, σε συνδυαμό με μαζική επιλογή (Swanson et al., 1989). 2.4 Οι τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (Glutathione-S-transferase GSΤs) Tαξινόμηση και ονοματολογία Οι GSTs των φυτών ανακαλύφθηκαν το 1970 όταν αποδείχτηκε πως, η δραστικότητα τους στον αραβόσιτο ήταν υπεύθυνη για την δημιουργία συμπλόκου μεταξύ της τριαζίνης (Chloro-S-triazine) με την GSH, προστατεύοντας έτσι την καλλιέργεια από το συγκεκριμένο ζιζανιοκτόνο (Frear and Swanson, 1970). Αρχικά οι GSTs ταξινομούνταν σε τέσσερις τύπους I, II, III και IV (Dixon et al., 1998). Eνώ, σύμφωνα με τους Edwards και Dixon (2005) υποδιαιρούνται σε οχτώ κλάσεις, στις επτά εκ των οποίων (φ, τ, θ, ζ λ, DΗΑR και TCHQD) ανήκουν κυτταροπλασματικές ενώ σε μία κλάση μικροσωμικές GSTs. Για την ονοματολογία των φυτικών GSTs, Οι Dixon και συν. (2000) πρότειναν την υιοθέτηση του συστήματος που 19

27 χρησιμοποιείται για τις GSTs θηλαστικών. Επί παραδείγματι, το ΑtGSTU1 και ΑtGSTU2 υποδεικνύουν την ταυτοποίηση του πρώτου και δεύτερου GST γονιδίου στο φυτό Arabidopsis thaliana τα οποία ανήκουν στην κλάση τ. Ενώ, το ΑtGSTU1-2 δείχνει πως πρόκειται για μια ετεροδιμερή πρωτεΐνη που αποτελείται από τις υπομονάδες U1 και U2 του φυτού Arabidopsis thaliana. Οι κλάσεις φ και τ Είναι οι πολυπληθέστερες κλάσεις στις οποίες ανήκουν GSTs που απαντούν μόνο στους φυτικούς οργανισμούς. Σύμφωνα με το αρχικό σύστημα ταξινόμησης οι GSTs της κλάσης φ ανήκουν στον τύπο I και της τ στον τύπο III. Οι GSTs των δύο αυτών κλάσεων, συμπλοκοποιούνται με ένα μεγάλο εύρος ξενοβιοτικών ουσιών και επηρεάζουν την εκλεκτικότητα των ζιζανιοκτόνων σε καλλιεργούμενα φυτά και ζιζάνια. Από λειτουργικής απόψεως, είναι παρόμοιες με τις GSTs που καταβολίζουν φαρμακευτικές ουσίες στους ζωικούς οργανισμούς (Εdwards and Dixon, 2005). Επιπλέον, συμμετέχουν στον ενδογενή κυτταρικό μεταβολισμό δρώντας σαν υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης, παρέχοντας προστασία έναντι της οξειδωτικής καταπόνησης (Dixon et al., 2002a), συνδέονται με τα φλαβονοειδή (Μueller et al., 2000), λειτουργούν σαν πρωτεΐνες σηματοδότησης σε συνθήκες καταπόνησης (Loyal et al., 2000) και σαν ρυθμιστικές πρωτεΐνες της απόπτωσης (Kampranis et al., 2000) Οι κλάσεις θ και ζ Οι GSTs που ανήκουν σε αυτές τις δύο κλάσεις είναι συντηρημένες πρωτεΐνες και απαντούν σε φυτικούς και ζωικούς οργανισμούς. Έχουν περιορισμένη ενζυμική δραστικότητα έναντι των ξενοβιοτικών ουσιών. Οι GSTs της θ κλάσης (Τύπος IV) εμφανίζουν δράση υπεροξειδάσης και ανάγουν οργανικά υδροϋπεροξείδια τα οποία παράγονται κάτω από συνθήκες καταπόνησης. Οι GSTs της ζ κλάσης (Τύπος II) εκτός από τους φυτικούς οργανισμούς απαντούν και στον άνθρωπο. Στους φυτικούς οργανισμούς έχει δειχθεί πως εμπλέκονται στον καταβολισμό της τυροσίνης δρώντας σαν εξαρτώμενες από την γλουταθειόνη ισομεράσες. Γενικά, επάγονται κάτω από διαφορετικές συνθήκες. Φυλογενετικές μελέτες σε διαφορετικούς οργανισμούς έχουν δείξει ότι τα γονίδια της κλάσης αυτής είναι εξαιρετικά συντηρημένα. Η πρώτη GST αυτής της κλάσης αναγνωρίστηκε στο γαρύφαλλο (Βοard et al., 1997) και βρέθηκε ότι επάγεται κατά το 20

28 στάδιο της ωρίμανση κάτι που είναι σύμφωνο με τον ρόλο τους στον καταβολισμό αρωματικών αμινοξέων (Εdwards et al., 2000). Οι κλάσεις DHAR και λ Οι GSTs των κλάσεων DHAR και λ δρουν ως θειολοτρανσφεράσες. Οι DHAR μπορούν επιπλέον να ανάγουν το διυδροασκορβικό σε ασκορβικό οξύ. Αυτές οι δύο κλάσεις των GSTs είναι οξειδοαναγωγάσες παρά τρανσφεράσες της γλουταθειόνης. Ο Urano και συν. (2000) ανέφερε την ύπαρξη ενός πολυπεπτιδίου στο ρύζι (Oryza sativa) που έχει δράση DHAR. Τα επίπεδα του mrna και της DHAR πρωτεΐνης που κωδικοποιεί αυξάνονται μετά από έκθεση των φυτών σε υψηλές θερμοκρασίες, υποδεικνύοντας τον πιθανό προστατευτικό ρόλο των DHAR κάτω από συνθήκες θερμικής καταπόνησης. Τέλος, σύμφωνα με τον Sappl και συν., (2004) οι DHAR που εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα καθώς και GSTs που ανήκουν στην κλάση λ παίζουν ρόλο αντιοξειδωτικών ενζύμων καθώς επάγονται μετά από την έκθεση ριζών της αραβίδοψης σε χημικές ουσίες ή σε άλλο τύπου οξειδωτική καταπόνηση. TCHQD GST Μέχρι στιγμής μόνο ένα ένζυμο που ανήκει σε αυτή την κλάση έχει αναγνωριστεί στην αραβίδοψη. Η πρωτεΐνη δεν έχει χαρακτηριστεί λειτουργικά αλλά πιθανόν να ομοιάζει με ένζυμα προκαρυοτικών οργανισμών. Μικροσωμικές GSTs Οι μικροσωμικές GSTs αν και δεν σχετίζονται με την κύρια υπεροικογένεια των GSTs καταλύουν αντιδράσεις εξαρτώμενες από την GSH. Πρόκειται για μεμβρανικές πρωτεΐνες που ανήκουν στην υπεροικογένεια MAPEG (membrane associated proteins in eicosanoid and glutathione metabolism) δηλαδή πρωτεϊνών που συμμετέχουν στον μεταβολισμό των εικοσανοειδών και της GSH (Jakobsson et al., 2009). Στην αραβίδοψη έχει αναγνωριστεί ένα GST γονίδιο ενώ άλλα φυτικά είδη μπορεί να κατέχουν ένα ή και περισσότερα. Παρ όλα αυτά δεν υπάρχουν ερευνητικά δεδομένα για τον ακριβή ρόλο των ενζύμων αυτών στα φυτά. 21

29 2.4.2 Πρωτεϊνική δομή των GSTs Τυπικά, οι GSTs έχουν μοριακό βάρος περίπου 50kDa και είτε αποτελούνται από πανομοιότυπες (ομοδιμερή) ή από διαφορετικές (ετεροδιμερή) πολυπεπτιδικές υπομονάδες. Σύμφωνα με τους Edward και Dixon (2005) οι GSTs που ανήκουν στις κλάσεις φ,,τ θ και ζ είναι διμερής και χαρακτηρίζονται από την παρουσία του αμινοξέος σερίνη στο ενεργό τους κέντρο. Αντιθέτως, οι GSTs της κλάση λ και οι DHAR είναι μονομερής πρωτεΐνες και έχουν μία καταλυτική κυστεΐνη στο ενεργό τους κέντρο. Στην περίπτωση της φ και τ κλάσης μόνο οι υπομονάδες της ίδιας κλάσης μπορούν να σχηματίσουν διμερή (Dixon et al., 2002). Εντούτοις, υπομονάδες από την ίδια κλάση μπορούν να σχηματίσουν διμερή ακόμη και αν οι αμινοξικές τους αλληλουχίες είναι πολύ διαφορετικές. Η ύπαρξη των ετεροδιμερών μορφών αυξάνει τον αριθμό και την ποικιλότητα των GSTs σε όλα τα είδη (Εdwards et al., 2000). Πιθανόν οι ετεροδιμερής μορφές αναγνωρίζουν συγκεκριμένα φυτοχημικά ή παρουσιάζουν μοναδικές κινητικές ιδιότητες απαραίτητες για την διαχείριση των μεταβολιτών. Πληροφορίες για την τρισδιάστατη δομή των φυτικών GSTs είναι διαθέσιμες από την μελέτη GSTs που ανήκουν στην φ κλάση (Reinemer et al., 1996 ; Neuefeind et al., 1997a; 1997b) στην τ κλάση (Thom et al., 2002; Zeng and Wang 2005; Zeng et al., 2005) και στην ζ κλάση (Τhom et al., 2001). Παρά τις έντονες αποκλίσεις των αμινοξικών αλληλουχιών των παραπάνω ενζύμων, η γενική δομή των GST πρωτεϊνών είναι παρόμοια. Κάθε πρωτεϊνική υπομονάδα, κατέχει ένα ανεξάρτητο καταλυτικό ενεργό κέντρο το οποίο αποτελείται από δύο δομικές περιοχές (G -και H-θέση). Η G-θέση βρίσκεται στο αμινοτελικό άκρο και εξειδικεύεται στην δέσμευση της γλουταθειόνης ενώ η H-θέση βρίσκεται στο καρβοξυτελικό άκρο και αποτελείται από μια μεταβλητή αμινοξική αλληλουχία όπου δεσμεύονται υδρόφοβα υποστρώματα. Διαφορές στην καρβοξυτελική περιοχή μπορεί να είναι υπεύθυνες για διαφορές στην εξειδίκευση των υποστρωμάτων μεταξύ διαφορετικών κλάσεων GSTs (Sheehan et al., 2001). Το αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο ενώνονται μέσω μιας μικρής περιοχής η οποία αποτελείται από 5-10 αμινοξέα. Κατά την δέσμευση των υποστρωμάτων, οι υπομονάδες πιθανόν υφίστανται σημαντικές αλλαγές στην διαμόρφωσή τους καθώς, η G και H θέση εμφανίζουν μια σχετική κινητικότητα κατά τον προσδιορισμό της κρυσταλλικής τους δομής. Με δεδομένο ότι κάθε ενζυμική υπομονάδα είναι καταλυτικά ανεξάρτητη, ο λόγος ύπαρξης διμερών ενζύμων GST δεν έχει ακόμη αποσαφηνιστεί. 22

30 Η δέσμευση και ο σωστός προσανατολισμός της GSH φαίνεται να αποτελούν σημαντικούς παράγοντες κατά την διάρκεια της κατάλυσης και επηρεάζονται από την G- θέση (Dixon et al., 2002a) καθώς, η G-θέση προάγει τον ιονισμό της σουλφρυλομαδας της GSH, η οποία με την σειρά της οδηγεί στον σχηματισμό ενός ενεργού θειολικού ανιόντος, μέσω ενός υδρογονικού δεσμού με την παρακείμενη υδροξυλομάδα. Στις GSTs των φυτών την λειτουργία αυτή επιτελεί ένα αμινοξικό κατάλοιπο σερίνης. Η Η-θέση είναι υπεύθυνη για την δέσμευση ενός μεγάλου εύρους υδρόφοβων υποστρωμάτων διαφόρων χημικών δομών. Η κινητική μελέτη των ενζύμων όσον αφορά την δημιουργία συμπλόκων μεταξύ της GSH και πρότυπων υποστρωμάτων έδειξε πως ο μηχανισμός δέσμευσης των υποστρωμάτων είναι μηχανισμός τυχαίας διαδοχής δύο υποστρωμάτων δύο προϊόντων (Labrou et al., 2001). Επομένως, η συνολική ταχύτητα της αντίδρασης προσδιορίζεται από τον ρυθμό απελευθέρωσης του προϊόντος από το ενεργό κέντρο. Οι πληροφορίες σχετικά με την τρισδιάστατη δομή και την αρχιτεκτονική των ενεργών κέντρων των GSTs, υποβοήθησε την δημιουργία GSTs με αυξημένη δραστικότητα έναντι ξενοβιοτικών ουσιών, δίνοντας έτσι την δυνατότητα δημιουργίας γενετικά τροποποιημένων οργανισμών με αντοχή σε συγκεκριμένες ξενοβιοτικές ενώσεις. Τέλος, κάποια από τα δομικά χαρακτηριστικά των GSTs παρατηρούνται και σε άλλες εξαρτώμενες από την γλουταθειόνη πρωτεΐνες όπως για παράδειγμα η γλουταρεδοξίνη υποδεικνύοντας την ύπαρξη ισχυρής εξελικτικής πίεσης προς την κατεύθυνση της διατήρησης των δομικών μοτίβων τα οποία εμπλέκονται στην δέσμευσης της γλουταθειόνης στην ενεργή περιοχή (Dixon et al., 2003) Υποκυτταρική θέση των GSTs Βιοχημικές και ανοσολογικές μελέτες έχουν δείξει πως οι διαλυτές GSTs εντοπίζονται κατά κύριο λόγο στο κυτόπλασμα. Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών υποστηρίζονται περεταίρω και από την γενωμική ανάλυση στην αραβίδοψη η οποία έδειξε πως μόνο ένα γονίδιο GST της φ και ένα της λ κλάσης, έχουν ως υποκυτταρικό στόχο τα πλαστίδια και τα μιτοχόνδρια αντίστοιχα. Όλες οι υπόλοιπες GSTs που μελετήθηκαν δεν είχαν αλληλουχίες στόχους που να κατευθύνουν τις πρωτεΐνες σε συγκεκριμένη υποκυτταρική θέση. Ενώ, ελάχιστες είναι οι βιβλιογραφικές αναφορές για την έκφραση συγκεκριμένων GSTs στον πυρήνα ή εξωκυτταρικά (Edwards et al., 2000). 23

31 2.4.4 Έκφραση των GST γονιδίων Γενικά χαρακτηριστικά της έκφρασης Παρά το γεγονός πως οι GSTs στα κύρια καλλιεργούμενα δημητριακά εκφράζονται σε πολύ υψηλά επίπεδα και αποτελούν πάνω από το 2% της ολικής πρωτεΐνης των φύλλων, έχουν πραγματοποιηθεί λίγες μελέτες σχετικά με την ύπαρξη εξειδικευμένων προτύπων έκφρασης των GSTs σε διάφορους φυτικούς ιστούς. Σε μία τέτοια μελέτη, που πραγματοποιήθηκε σε καθαρές σειρές αραβόσιτου βρέθηκε πως διαφορετικά ισοένζυμα GST εκφράζονται σε διαφορετικούς ιστούς. Για παράδειγμα στη γύρη εκφράζεται ένα GST ισοένζυμο ενώ στο ασπίδιο πέντε (Sari-Gorla et al., 1993). Παρόμοιο εξειδικευμένο πρότυπο έκφρασης των GSTs έχει προταθεί από αναλύσεις EST cdna βιβλιοθηκών από διαφορετικά φυτικά μέρη στον αραβόσιτο (McGonigle et al., 2000). Εντούτοις, ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός πως, το εξειδικευμένο πρότυπο έκφρασης των GSTs, αίρεται μετά από την μεταχείριση των φυτών με διάφορες χημικές ουσίες. Για παράδειγμα στον αραβόσιτο κάτω από φυσιολογικές συνθήκες το γονίδιο ZmGSTF2, εκφράζεται μόνο στις ρίζα ενώ μετά από χημική μεταχείριση των φυτών με safeners εκφράζεται και στα φύλλα (Dixon και συν., 1997). Παρόμοιο πρότυπο έκφρασης έχει παρατηρηθεί σε γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού τα οποία εκφράζουν το γονίδιο αναφοράς της γλυκορουνιδάσης κάτω από τον έλεγχο του προαγωγέα ενός γονιδίου GST από την σόγια (Ulmasov et al., 1995) Ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης Η έκφραση των γονιδίων GST ελέγχεται κατά κύριο λόγο στο μεταγραφικό επίπεδο (Davies and Caseley, 1999). Η μεταγραφική ρύθμιση μεμονωμένων υπομονάδων επηρεάζει το εύρος του σχηματισμού ομοδιμερών και ετεροδιμερών μορφών καθώς, έχει βρεθεί πως κάτω από σταθερές συνθήκες τα κυρίαρχα ισοένζυμα GST στα φύλλα του αραβόσιτου και σιταριού είναι τα Zmgstf1-1 και TαGSTU1-1 αντίστοιχα ενώ, μετά από μεταχείριση τους με safeners παρατηρείται αυξημένη σύνθεση συγκεκριμένων υπομονάδων και σχηματισμός νέων ετεροδιμερών (Dixon et al., 1997). 24

32 Η σημασία της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο δεν έχει ακόμη αποσαφηνιστεί. Ωστόσο, υπάρχουν παραδείγματα, όπου κάτω από συνθήκες καταπόνησης προκύπτουν νέα GSTs μέσω του εναλλακτικού ματίσματος. Τα πρώιμα μεταγραφήματα του γονιδίου Bz2 από τον αραβόσιτο και GH2/4 από την σόγια υφίστανται εναλλακτικό μάτισμα ως απόκριση σε καταπόνηση από το βαρύ μέταλλο Cd (Czarnecka et al., 1988 ; Marrs and Walbot, 1997). Ο μηχανισμός όμως αυτός δεν έχει μελετηθεί λεπτομερώς (Wagner et al., 2002). Λεπτομέρειες για τους προαγωγείς των γονιδίων GST είναι περιορισμένες. Ένας καλά χαρακτηρισμένος προαγωγέας GST προέρχεται από το γαρύφαλλο και επάγεται από το αιθυλένιο. Αυτός ο προαγωγέας περιλαμβάνει ένα στοιχείο απόκρισης στο αιθυλένιο (ΕRE) (Itzhaki et al., 1994) ενώ έχει αναγνωριστεί και μία πρωτεΐνη δέσμευσης πάνω σε αυτόν (Maxon and Woodson, 1998). Πολλά GSTs επάγονται από ένα μεγάλο εύρος χημικών παραγόντων ή από άλλες συνθήκες καταπόνησης συνεπώς, οι προαγωγείς αυτοί είτε έχουν ένα σύνολο διαφορετικών μοτίβων (motifs) ή γενικές ρυθμιστικές αλληλουχίες οι οποίες ενεργοποιούνται από διαφορετικά μόρια. Προαγωγείς του πρώτου τύπου υπάρχουν στο γονίδια BZ2 από τον αραβόσιτο και στα γονίδια TtGSTU1 και TtGSTU2 από το T. Tauschiiτο τα οποία επάγονται μετά από μεταχείριση των φυτών με safeners. Ο προαγωγέας του BZ2 περιέχει πολλαπλές ρυθμιστικές ακολουθίες συμπεριλαμβανομένων των στοιχείων απόκρισης στα βαρέα μέταλλα (MRE) στο ΑΒΑ (ΑΒRE) και στο ψύχος (COR) τα οποία εμπλέκονται στην μεταγραφική τους ρύθμιση από αυτούς τους παράγοντες (Marrs and Walbot, 1997). Στους προαγωγείς των γονιδίων TtGSTU1 και TtGSTU2 έχουν αναγνωριστεί κάποια πιθανά στοιχεία απόκρισης στην αυξίνη, στο ΑΒΑ και στο αιθυλένιο (Xu et al., 2002). Σχετικά με τις γενικές ρυθμιστικές αλληλουχίες, οι προαγωγείς των φυτικών GSTs που έχουν αναλυθεί μέχρι στιγμής, δεν περιέχουν στοιχεία απόκρισης σε ξενοβιοτικές (XRE) και αντιοξειδωτικές (ARE) ουσίες όπως συμβαίνει με τους προαγωγείς των ζωικών GSTs, στους οποίους τα παραπάνω στοιχεία βρίσκονται σε πολλαπλά αντίγραφα. Μέχρι στιγμής το στοιχείο της συνθάσης των οκταπινών είναι το μόνο ρυθμιστικό μοτίβο (motif) που έχει βρεθεί σε ένα αριθμό προαγωγέων των GSTs οι οποίοι προέρχονται από την σόγια, το σιτάρι την αραβίδοψη και τον καπνό (Cheng et al., 1996; Marrs, 1996). Το στοιχείο αυτό βρέθηκε να διαμεσολαβεί στην επαγωγή των GSTs από την αυξίνη, το σαλυκιλικό οξύ, το Η2Ο2 το ιασμονικό οξύ το Cd, είτε μετά από τραυματισμό (Ulmasov et al., 1994; Cheng and Singh, 1999) 25

33 2.4.5 Λειτουργικός ρόλος των GSTs Ο πρώτος καλά χαρακτηρισμένος ρόλος των GSTs ήταν η ικανότητά τους να καταλύουν των σχηματισμό συμπλόκων μεταξύ ξένων για τον οργανισμό ουσιών (ξενοβιοτικών) και της GSH, ένα καθοριστικό βήμα στην μεταβολική αποτοξίνωση αυτών των ουσιών. Tο ευρύ και ποικίλο φάσμα των GSTs που κατέχει κάθε είδος, καθώς και ο πολυμορφισμός της Η- θέσης ακόμη και μέσα στην ίδια κλάση, θεωρητικά επιτρέπουν εκατοντάδες διαφορετικά τοξικά μόρια να συμπλοκοποιηθούν με την GSH. Τέτοια μόρια είναι ηλεκτρονιόφιλα ζιζανιοκτόνα όπως τριαζίνες (triazines), θειοκαρβαμιδικά (thiocarbammates), χλωροακεταμίδια (chloroacetamide), σουλφονυλουρίες (sulphonylureas), διφαινυλικοί αιθέρες (diphenylethers) (Cole et al., 1997) καθώς και φάρμακα ή άλλοι οργανικοί ρυπαντές. Υπό την προϋπόθεση πως οι GSTs και τα συσχετιζόμενα μονοπάτια αποτοξίνωσης δεν εξελίχθηκαν για να μεταβολίζουν συνθετικά συστατικά συνάγεται ότι, θα πρέπει να έχουν κάποιο ρόλο στον ενδογενή κυτταρικό μεταβολισμό. Στον αραβόσιτο και στην πετούνια η μεταφορά των ανθοκυανών στο χυμοτόπιο απαιτεί συγκεκριμένα GSTs. Μεταλλάξεις στα αντίστοιχα γονίδια Bz2 και An9 έχει ως αποτέλεσμα την συγκέντρωση αυτών των ουσιών στο κυτόπλασμα (Εdwards et al., 2000). Οι ανθοκυάνες δεν διαθέτουν ένα κατάλληλο ηλεκτρονιόφιλο κέντρο για την συμπλοκοποίηση τους με την GSH και τέτοια σύμπλοκα δεν έχουν βρεθεί in vivo ούτε και παράγονται in vitro (Dixon et al., 1998). To πρόσφατο εύρημα πως το γονίδιο AN9 κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη GST στην οποία δεσμεύονται τα φλαβονοειδή (Mueller et al., 2000), προτείνει πως αυτές οι GTS μπορεί να έχουν ρόλο μοριακών συνοδών οι οποίοι δεσμεύουν και σταθεροποιούν τα προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού, και όχι καταλυτικό ρόλο και δημιουργίας συμπλόκων με την γλουταθειόνη. Επιπλέον, η αναγνώριση GSTs τα οποία δεσμεύουν την αυξίνη (Marrs, 1996) και την κυτοκινήνη (Gonneau et al., 1998) υποδεικνύουν πως οι GSTs δρουν σαν πρωτεΐνες μεταφοράς ένας ρόλος που έχει αποδειχτεί και σε ζωικούς οργανισμούς. Ένας άλλος ρόλος που αποδίδεται στις GSTs είναι η προστασία των κυττάρων από την οξειδωτική καταπόνηση. Η παρατήρηση πως πολλά γονίδια GST επάγονται από πληθώρα φαινομενικά μη συσχετιζόμενων παραγόντων όπως η προσβολή από παθογόνα, το αιθυλένιο, ο τραυματισμός, το όζον, το H2O2, το σαλικυλικό οξύ και τα βαρέα μέταλλα, οδήγησε στην συσχέτιση των GSTs με την αντοχή στην οξειδωτική καταπόνηση. Το κοινό αποτέλεσμα όλων αυτών των παραγόντων είναι ο σχηματισμός ROS. Οι ROS επάγουν την 26

34 έκφραση των γονιδίων GST τα οποία με την σειρά τους μεταβολίζουν τοξικά προϊόντα που προέρχονται από την υπεροξείδωση των λιπιδίων και της βλάβης του DNA (Marrs, 1996). Διάφορα GSTs κατέχουν εξαρτώμενη από την GSH δράση υπεροξειδάσης (GPX). Τα ένζυμα αυτά χρησιμοποιούν την GSH ως δότη ηλεκτρονίων για να ανάγουν οργανικά υπεροξείδια των λιπαρών οξέων και των νουκλεϊκών οξέων σε μονοϋδροξυαλκοόλες. Μετά από την πρώτη αναφορά της παρουσίας GPX στην αραβίδοψη (Bartling et al., 1993), GSTs με δράση υπεροξειδάσης βρέθηκαν σε διάφορα φυτικά είδη μεταξύ των οποίων, στα κυριότερα καλλιεργούμενα είδη και στα ζιζάνια και δείχτηκε πως έχουν κύριο ρόλο στην αντιμετώπιση της οξειδωτικής καταπόνησης (Roxas et al., 1997; Cummins et al., 1999). Περαιτέρω σύνδεση των GSTs με την πρόληψη της οξειδωτικής βλάβης προέρχεται από μελέτη των Kampranis και συν. (2000) οι οποίοι έδειξαν πως η έκφραση ενός γονιδίου GST από την τομάτα σε κύτταρα ζύμης, καταστέλλει την απόπτωση η οποία επάγεται από την πρωτεΐνη BAX, αποτρέποντας πιθανόν την πρόκληση οξειδωτικής βλάβης. Οι GSTs μπορεί να μετέχουν στην αντοχή στις καταπονήσεις μέσου ενός ρόλου στην κυτταρική σηματοδότηση. Ο ρόλος τους αυτός αποδείχτηκε μέσω της παρατήρησης πως, μετά από την έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία, η επαγωγή γονιδίων τα οποία κωδικοποιούν ένζυμα της βιοσύνθεσης των φλαβονοειδών, απαιτεί την παρουσία της GSH και την έκφραση ενός συγκεκριμένου γονιδίου GST που ανήκει στην κλάση τ (Loyall et al., 2000). Ένας επιπλέον ρόλος των GSTs o οποίος δεν εμπλέκει τον σχηματισμό συμπλόκου με την GSH έχει αναγνωριστεί σε GST της κλάσης ζ στην αραβίδοψη (Thom et al., 2001). Οι GSTs αυτής της κλάσης δρουν σαν ισομεράσες εξαρτώμενες από την GSH καταλύοντας το τελευταίο στάδιο του καταβολισμό της τυροσίνης. GSTs που εντοπίζονται στον αποπλάστη και στον πυρήνα έχουν βρεθεί στον καπνό και την σόγια αντίστοιχα (Takahashi et al., 1995; Flury et al., 1996). Ο ακριβής τους ρόλος δεν έχει αποσαφηνιστεί. Η εξωκυτταρική GST επάγεται από σήματα προερχόμενα από οξειδωτική καταπόνηση. Πιθανόν το ένζυμο αυτό να εμπλέκεται σε αλληλεπιδράσεις μεταξύ φυτών και παθογόνων και να συμβάλλει στον χωρικό περιορισμό της αντίδρασης υπερευαισθησίας, η οποία επάγεται από την αύξηση των ROS μετά από μόλυνση με παθογόνα (Flury et al., 1996) Τα ισοένζυμα PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 Το ισοένζυμο PvGSTU2-2 (Eικόνα 2.1Β) αποτελείται από δύο όμοιες πρωτεϊνικές υπομονάδες μεγέθους 225 αμινοξέων και ανήκει στην κλάση τ. Το γονίδιο που τις 27

35 κωδικοποιεί έχει μέγεθος 678 bp και απομονώθηκε από τα φύλλα το είδος Phaseolus. vulgaris μετά από την μεταχείριση των φυτών με το ζιζανιοκτόνο fluazifop-p-butyl. Για τον προσδιορισμό της εξειδίκευσης του ισοενζύμου PvGSTU2-2 σε διάφορα υποστρώματα πραγματοποιήθηκε ετερόλογη έκφρασή του σε κύτταρα E. coli. To ένζυμο αυτό καταλύει ένα μεγάλο εύρος αντιδράσεων, εμφανίζει υψηλή εξειδίκευση στο υπόστρωμα NBD-CI καθώς και δράση υπεροξειδάσης (GPX). Για να διαπιστωθεί αν το PvGSTU2-2 συμβάλλει στην αντοχή σε ζιζανιοκτόνα εκτιμήθηκε η ικανότητά του να καταλύει τον σχηματισμό συμπλόκων μεταξύ της GSH και διαφόρων ζιζανιοκτόνων. Το ένζυμο φαίνεται να έχει αξιόλογη δράση έναντι των ζιζανιοκτόνων ατραζίνη, alachlor και metalachlor ενώ η δράση του στο ζιζανιοκτόνο fluorodifen είναι περιορισμένη. Τέλος, ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός πως εμφανίζει δράση θειολοτρανσφεράσης καθώς οι μόνες GSTs που εμφανίζουν την δράση αυτή ανήκουν στην κλάση λ και DHAR (Chronopoulou et al., 2011) Το ισοένζυμο PvGSTU3-3 (Εικόνα 2.1Β) αποτελείται από δύο όμοιες πρωτεϊνικές υπομονάδες, μεγέθους 221 αμινοξέων και μοριακού βάρους 25,071kDa. Ανήκει στην κλάση τ και επάγεται σε μεταγραφικό και πρωτεϊνικό επίπεδο μετά από μόλυνση του είδους Phaseolus vulgaris με τον μύκητα Uromyces appendiculatus. To γονίδιο που τις κωδικοποιεί έχει μέγεθος 663bp Το ισοένζυμο αυτό εμφανίζει υψηλή αντιοξειδωτική και καταλυτική δράση. Δρα σαν θειολοτρανσφεράση, GPX και DHAR ενώ έχει περιορισμένη ικανότητα να σχηματίζει σύμπλοκα με ξενοβιοτικές ουσίες. Η Km του ενζύμου για την GSH είναι πέντε φορές μικρότερη σε σχέση με άλλες φυτικές GSTs συνεπώς, καταλύει πολύ αποτελεσματικά αντιδράσεις σε χαμηλές συγκεντρώσεις GSH (π.χ σε συνθήκες καταπόνησης). Τέλος, η ικανότητά του να καταλύει την συμπλοκοποίηση της GSH με ισοθειοκυανικές ενώσεις, πιθανόν προσδίδει σε αυτό το ένζυμο έναν ακόμη ρόλο, σαν ρυθμιστή του σχηματισμού ισοθειοκυανικών ενώσεων από θειογλυκοζίτες ως απόκριση σε βιοτικές καταπονήσεις (Chronopoulou et al., 2014). 28

36 Εικόνα 2.1 Τριασδιάστατη απεικόνισητων των ισοένζυμων Α) PvGSTU2-2 και B) PvGSTU3-3 όπου φαίνονται τα καρβοξυτελικά (C-terminal) και αμινοτελικά άκρα (N-terminal), η ενδιάμεση περιοχή (Linker) καθώς και οι δομικές τους περιοχές (G-Site και H-site) 2.5 Ο Καπνός (N.tabacum L) Ο καπνός (Ν. tabacum L.) ανήκει στο γένος Nicotiana της οικογένειας Solanaceae της τάξεως Tubiflorae. Πρόκειται για ένα αυτογονιμοποιούμενο αλλοτετραπλοειδές είδος (2n=48) το οποίο πιθανόν κατάγεται από τις Άνδεις και έχει προέλθει από τον υβριδισμό δύο διπλοειδών προγόνων των ειδών N. Sylvestris και Ν. Tomentosiformis (Okamura and Goldber, 1985). Πέραν της οικονομικής του σημασίας ως καλλιεργούμενο είδος, λόγω του μεγάλου αριθμού και της ποικιλότητας των ειδών του γένους, της ευκολίας πραγματοποίησης διασταυρώσεων, καθώς και του μεγάλου αριθμού σπερμάτων που παράγει (σε κάποιες περιπτώσεις πάνω από 3000 σπέρματα/κάψα), o καπνός υπήρξε αντικείμενο εκτεταμένων κλασσικών γενετικών αναλύσεων. Η πλειονότητα των ανακαλύψεων στα πεδία της βιολογίας του φυτικού κυττάρου, της ιστοκαλλιέργειας και της μοριακής βιολογίας πραγματοποιήθηκαν μέσω μελετών στον καπνό (Ganapathi et al., 2004). Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε εκτεταμένα για την μελέτη των μεθόδων γενετικής τροποποίησης, της 29

37 έκφρασης και της σταθερότητας των διαγονιδίων καθώς και για τον λειτουργικό χαρακτηρισμό πλήθους γονιδίων. Δικαίως λοιπόν χαρακτηρίζεται ως φυτό-μοντέλο. Ο καπνός αποτέλεσε αντικείμενο εντατικής γενετικής βελτίωσης με πηγές παραλλακτικότητας, ποικιλίες του είδους Nicotiana tabacum, αλλά και είδη του γένους Nicotiana. Στόχοι των βελτιωτικών προγραμμάτων είναι η υψηλή απόδοση (αριθμός και μέγεθος φύλλων), η ποιότητα (μορφολογικά χαρακτηριστικά του φύλλου, καυσιμότητα, οργανοληπτικά και χημικά χαρακτηριστικά), η αντοχή σε ξηρασία και υψηλές θερμοκρασίες (αποφυγή εγκαυμάτων στα φύλλα) καθώς και η αντοχή σε εχθρούς και ασθένειες (κυρίως μέσω διειδικών διασταυρώσεων). Εντούτοις, οι προσπάθειες εισαγωγής γονιδίων στον καπνό από άγρια συγγενή είδη μέσω κλασσικών μεθόδων βελτίωσης φθίνουν. Πολλά επιθυμητά χαρακτηριστικά μπορούν πλεον να μεταφερθούν μέσω της κλωνοποίησης γονιδίων και της γενετικής τροποποίησης αποφεύγοντας με αυτό τον τρόπο την μεταφορά μη επιθυμητών χαρακτηριστικών απο άγρια συγγενή είδη που μπορεί να μειώνουν την απόδοση ή και την ποιότητα του παραγόμενου προϊόντος. Τέλος, ο καπνός χρησιμοποιείτε ως βιοαντιδραστήρας για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών όπως αντισωμάτων, ενζύμων κλπ. σε εμπορική κλίμακα. Η μεγάλη ποσότητα βιομάζας που παράγει και το υψηλό περιεχόμενο σε πρωτεΐνη τον καθιστά ένα ιδανικό φυτό-βιοαντιδραστήρα (Powledge, 2011). 2.6 Η τεχνολογία της γενετικής τροποποίησης Η γενετική τροποποίηση αποτελεί ένα από τα διαθέσιμα εργαλεία της βασικής έρευνας αλλά και των σύγχρονων προγραμμάτων βελτίωσης των φυτών. Για την γενετική τροποποίηση των φυτών χρησιμοποιούνται διάφορες τεχνικές όπως της μικροέκχγυσης, του βομβαρδισμού σωματιδίων, της πολυαιθελικής γλυκόλης ή διαμέσου του Agrobacterium tumefaciencs. Η μέθοδος του A.tumefaciens αποτελεί ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο σύστημα για την εισαγωγή γονιδίων σε δικοτυλήδονα φυτά ενώ ο βομβαρδισμός σωματιδίων χρησιμοποιείται κυρίως για την γενετική τροποποίηση μονοκοτυλήδονων φυτών. Η χρήση του A.tumefaciens είναι πλεονεκτική έναντι των άλλων μεθόδων, κυρίως λόγο της μεταφοράς στο γονιδίωμα των φυτών ενός ή λίγων γονιδιακών αντιγράφων καθώς και της δυνατότητας μεταφοράς πολύ μεγάλων τμημάτων DNA με ελάχιστες αναδιατάξεις (Shibata and Liu, 2000). 30

38 Σε κάθε τεχνική γενετικής τροποποίησης, υπάρχουν πολλαπλοί παράγοντες που επηρεάζουν την επιτυχία της. Στην περίπτωση του A. tumefaciencs οι κυριότεροι παράγοντες είναι οι εξής: 1) Το αναπτυξικό στάδιο στο οποίo βρίσκεται το φυτό 2) Ο τύπος του ιστού 3) Το στέλεχος του A. tumefaciencs 4) Η διάρκεια και οι συνθήκες επιμόλυνσης του ιστού και 4) Η φάση αύξησης στην οποία βρίσκεται η καλλιέργεια του A. tumefaciencs. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η γενετική τροποποίηση των φυτών βασίζεται στην ολοδυναμία των κυττάρων δηλαδή, στην ικανότητά τους να αναγεννήσουν ένα ολόκληρο φυτό. Τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για τον μετασχηματισμό και την αναγέννηση μπορεί να προέρχονται απο κυτταροκαλλιέργεις, κάλλους, από τμήματα ιστών (έκφυτα) ή πρωτοπλάστες. Παρά τις προσπάθειες βελτιστοποίησης των μεθόδων γενετικής τροποποίησης, είναι γεγονός πως ο αριθμός των κυττάρων που μετασχηματίζονται είναι μικρός. Τα γονίδια επιλογής τα οποία μεταφέρονται στο γονιδίωμα των φυτών μαζί με τα επιθυμητά γονίδια, επιτρέπουν την επιλεκτική αναγέννηση και αύξηση μόνο των γενετικά τροποποιημένων φυτών. Ο πιο συνηθισμένος τύπος γονιδίων επιλογής είναι αυτά που παρέχουν αντοχή σε αντιβιοτικά ή ζιζανιοκτόνα (Miki and Hugh, 2004). Εναλλακτικά χρησιμοποιούνται γονίδια αναφοράς μέσω των οποίων παράγεται κάποιο χρωμογόνο προϊόν ή φθορίζουσα χρωστική. Για την επιβεβαίωση της παρουσίας του διαγονιδίου στα πιθανά γενετικά τροποποιημένα φυτά, η απλούστερη μέθοδος που μπορεί να εφαρμοστεί είναι η PCR, ενώ ο έλεγχος της έκφρασής του μπορεί να γίνει στο επίπεδο του RNA, της πρωτεΐνης ή της μελέτης του φαινοτύπου. Δεν είναι απολύτως απαραίτητο να γίνει έλεγχος της έκφρασης σε όλα τα επίπεδα αλλά, η εφαρμογή του κατάλληλου κατά περίπτωση συνδυασμού ελέγχων κρίνεται απαραίτητη (Finer, 2010) 2.7 Βελτίωση της αντοχής των φυτών σε καταπονήσεις μέσω της γενετικής τροποποίησης Η απομόνωση νέων γονιδίων και τα προγράμματα λειτουργικής γονιδιωματικής (functional genomics) έχουν αποκαλύψει πλήθος μηχανισμών και οικογένειες γονιδίων που παρέχουν βελτιωμένη απόδοση και αντοχή σε αβιοτικές καταπονήσεις. Αυτές οι οικογένειες γονιδίων μπορεί να χρησιμοποιηθούν για την δημιουργία νέων γονιδιακών συνδυασμών, να εκφραστούν ετερόλογα ή να μεταφερθούν σε είδη από τα οποία απουσιάζουν. Η μεταφορά γονιδίων σε κύρια καλλιεργούμενα είδη από διάφορες βιολογικές πηγές (φυτικούς και 31

39 ζωικούς οργανισμούς, μικρόβια) αποτελεί ένα εξαιρετικά ισχυρό εργαλείο της μοριακής βελτίωσης των φυτών. Τα γενετικά τροποποιημένα φυτά μπορεί να χρησιμοποιηθούν σαν νέες ποικιλίες ή σαν πηγή παραλλακτικότητας σε προγράμματα βελτίωσης αλλά και σαν εργαλεία για τον χαρακτηρισμό και την μελέτη του τρόπου επικοινωνίας μεταξύ διαφορετικών γονιδιακών δικτύων (cross talk) σε συνθήκες καταπονήσεων (Jewell et al., 2010) Η μεταφορά μιας ιδιότητας που προσδίδει αντοχή σε καταπονήσεις σε μη ανθεκτικά καλλιεργούμεναε είδη, μπορεί να βασιστεί σε μία στρατηγική εντοπισμού οργανισμών που αναπτύσσονται κάτω από δυσμενείς συνθήκες και δημιουργίας ανθεκτικών καλλιεργούμενων φυτικών ειδών, μέσω τριών ή τεσσάρων διαδοχικών σταδίων (Εικόνα 2.2) (Holmberg and Bulow, 1998) Εικόνα 2.2 Στρατηγική για την δημιουργία φυτών ανθεκτικών σε καταπονήσεις 32

40 2.7.1 Γενετικά τροποποιημένοι φυτικοί οργανισμοί με αντοχή στην αλατότητα Η δημιουργία γενετικά τροποποιημένων φυτών με αντοχή στην αλατότητα βασίζεται στην μεταφορά γονιδίων τα οποία κωδικοποιούν 1) Συμβατούς ωσμωλύτες 2) Μεταφορείς ιόντων 3) Πρωτεΐνες HSP (Heat Sock Proteins) και LEA (Late Embryogenesis Proteins) 4) Αντιοξειδωτικά ένζυμα και ουσίες 5) Μεταγραφικούς παράγοντες (Ashraf et al., 2008). Οι συμβατοί ωσμωλύτες εκτός από τον ρόλο τους στην ωσμωτική ρύθμιση συμμετέχουν στην αντιοξειδωτική άμυνα των φυτών. Γενετικά τροποποιημένα φυτά τα οποία υπερεκφράζουν γονίδια που σχετίζονται με την σύνθεση συμβατών ωσμωλυτών έχουν αυξημένη αντοχή στην αλατότητα σε σχέση με τα μη γενετικά τροποποιημένα φυτά (Abebe et al., 2003 ; Garg et al., 2002; Kishitani et al., 2000 ; Sakamoto et al., 1998) Η ρύθμιση της μεταφοράς ιόντων θεωρείται ένας από τους σημαντικούς παράγοντες αντοχής στην αλατότητα. Η υπερέκφραση των αντιμεταφορέων Na + /H + (ΝΗΧ) που εντοπίζεται στο χυμοτόπιο, βελτίωσε την αντοχή στην αλατότητα στην αραβίδοψη, τον καπνό και την τομάτα (Aharon et al., 2003) καθώς και στο ρύζι (Ohta et al., 2002 ; Fukuda et al., 2004). Υπερέκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες με ρόλο μοριακών συνοδών όπως οι LEA και hsp αύξησε την αντοχή σε γενετικά τροποποιημένα φυτά ρυζιού σιταριού και αραβίδοψης (Siyamani et al., 2000 ; Sun et al., 2001). Ωστόσο, τα περισσότερα γενετικά τροποποιημένα φυτά με αντοχή στην αλατότητα έχουν δημιουργηθεί με υπερέκφραση γονιδίων που συμμετέχουν στην αντιοξειδωτική άμυνα των φυτών όπως η GPX SOD APX και GR (Roxas et al., 1997 ; Allen et al., 1997). Οι παραπάνω προσεγγίσεις βασίζονται στην μεταφορά ενός γονιδίου ωστόσο, η αντοχή στην αλατότητα είναι ένα πολυγονιδιακό χαρακτηριστικό ενώ επιπλέον, σε συνθήκες αγρού μπορεί να συνυπάρχουν περισσότεροι από ένας παράγοντες καταπόνησης οι οποίοι συμβάλλουν στην πολυπλοκότητα του φαινομένου. Μια εναλλακτική προσέγγιση είναι η δημιουργία γενετικά τροποποιημένων φυτών τα οποία εκφράζουν μεταγραφικούς παράγοντες. Μέσω αυτών των ρυθμιστικών πρωτεϊνών επάγονται ταυτόχρονα πολλά γονίδια που σχετίζονται με καταπονήσεις (Kasuga et al., 1999). Γενετικά τροποποιημένα φυτά που υπερεκφράζουν τους μεταγραφικούς παράγοντες CBF/DREB εμφανίζουν μεγαλύτερη αντοχή στην ξηρασία, την αλατότητα και τις χαμηλές θερμοκρασίες. Αυτοί οι μεταγραφικοί παράγοντες συνδέονται στο στοιχείο DRE/CRT το οποίο βρίσκεται στους προαγωγείς κάποιων γονιδίων που επάγονται από καταπονήσεις (Liu et al., 1998 ; Stockinger et al., 1997). 33

41 Μία άλλη σύγχρονη τάση, είναι μία πολυγονιδιακή προσέγγιση σύμφωνα με την οποία, διάφορα γονίδια τα οποία είναι υπεύθυνα για ολική αντοχή σε καταπονήσεις μεταφέρονται ταυτόχρονα στα φυτά (Cherian et al., 2006). Η τεχνολογία της ανάλυσης μικροσυστοιχιών, μέσω της οποίας δίνεται η δυνατότητα παρακολούθησης του συνόλου του μεταγραφήματος μετά από έκθεση των φυτών σε συνθήκες καταπόνησης, συμβάλλει προς την κατεύθυνση υλοποίησης των παραπάνω προσεγγίσεων. Ωστόσο, οι μελέτες σε μεμονωμένα γονίδια παραμένουν σημαντικές για την επιβεβαίωση και εκτίμηση του συνόλου των δεδομένων που προκύπτουν από αυτές τις αναλύσεις (Bartels and Ramanjulu, 2005) Γενετικά τροποποιημένοι φυτικοί οργανισμοί με ανθεκτικότητα σε ζιζανιοκτόνα Η δημιουργία γενετικά τροποποιημένων φυτών με αντοχή σε ζιζανιοκτόνα ή άλλες φυτοτοξικές ουσίες βασίζεται σε: 1) Τροποποίηση της θέσης δράσης του ζιζανιοκτόνου 2) Εισαγωγή ή αύξηση της έκφρασης ενζύμων, τα οποία απενεργοποιούν ή αποικοδομούν τα ζιζανιοκτόνα 3) Μηχανισμούς που αποτρέπουν στο ζιζανιοκτόνο να φτάσει στην θέση δράσης του, μέσω μειωμένης πρόσληψης και μετακίνησης ή αυξημένης μεταφοράς τους στο χυμοτόπιο. Η μεταβολική απενεργοποίηση ή αποδόμηση αποτελεί τον κυριότερο μηχανισμό της φυσικής αντοχής των καλλιεργούμενωn ειδών σε εκλεκτικά ζιζανιοκτόνα. Οι δύο πρώτες προσεγγίσεις έχουν χρησιμοποιηθεί για την εμπορική παραγωγή γενετικά τροποποιημένων φυτών με αντοχή σε ζιζανιοκτόνα. Το ζιζανιοκτόνο Glyphosate έχει ως στόχο το ένζυμο EPSPS, που συμμετέχει στο μονοπάτι βιοσύνθεσης αρωματικών αμινοξέων. Το ένζυμο αυτό είναι ευαίσθητο σε όλες τις καλλιεργούμενες ποικιλίες φυτών και γι αυτό το λόγο το συγκεκριμένο ζιζανιοκτόνο χαρακτηρίζεται ως μη εκλεκτικό. Ωστόσο, ανθεκτικές μορφές του ενζύμου ΕPSPS έχουν βρεθεί σε βακτήρια και μύκητες. Το γονίδιο CP4 του γένους Agrobacterium κωδικοποιεί την ανθεκτική μορφή του ενζύμου και έχει χρησιμοποιηθεί για την γενετική τροποποίηση σχεδόν όλων των καλλιεργούμενων φυτών με αντοχή σε αυτό το ζιζανιοκτόνο (Cerderia and Duke, 2007). Στο βακτήριο Ochrobactrum antropi βρέθηκε ένα ένζυμο αποικοδόμησης του ζιζανιοκτόνου Glyphosate το οποίο κωδικοποιείται από το γονίδιο GOX. Ταυτόχρονη έκφραση των γονιδίων CP4 και GOX στην κανόλα είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της αντοχής κατά 50 φορές (Nandula et al., 2007). Τα καλλιεργούμενα είδη με αντοχή στο ζιζανιοκτόνο Βromoxynil οφείλουν την αντοχή τους σε ένα γονίδιο μικροβιακής προέλευσης το οποίο μετατρέπει το ζιζανιοκτόνα σε μία μη φυτοξική μορφή (Stalker et al., 1996). 34

42 Το ζιζανιοκτόνο Glyfosinate αναστέλλει την δράση του ενζύμου συνθάση της γλουταμίνης και θεωρείται ζιζανιοκτόνο ευρέους φάσματος. Στo βακτήριο Streptomyces hygroscopicus εντοπίστηκε το ένζυμο PAT το οποίο απενεργοποιεί το εν λόγω ζιζανιοκτόνο. Το γονίδιο bar που το κωδικοποιεί έχει χρησιμοποιηθεί στην δημιουργία ανθεκτικών ποικιλιών (Vasil, 1996) Γενετικά τροποποιημένοι φυτικοί οργανισμοί που υπερεκφράζουν γονίδια GST Γενετικά τροποποιημένοι φυτικοί οργανισμοί που υπερεκφράζουν γονίδια GST είναι χρήσιμοι για τον λειτουργικό χαρακτηρισμό των GST γονιδίων in planta αλλά και για την μεταφορά νέων επιθυμητών χαρακτηριστικών σε καλλιεργούμενα είδη. Το πρώτο γενετικά τροποποιημένο με γονίδιο GST φυτικό είδος ήταν ο καπνός, ο οποίος υπερέκφραζε ένα ενδογενές γονίδιο GST της κλάσης τ (Νt 107) με δράση υπεροξειδάσης. Η υπερέκφραση του γονιδίου (Νt 107) αύξησε την αντοχή των φυτών σε υψηλή και χαμηλή θερμοκρασία στην αλατότητα και σε ζιζανιοκτόνα (Roxas et al., 1997, 2000). Παρόλ αυτά γενετικά τροποποιημένο βαμβάκι με το γονίδιο Nt 107 ενώ είχε αυξημένη δραστικότητα GST/GPX δεν παρουσίασε αυξημένη αντοχή σε παράγοντες οξειδωτικής καταπόνησης όπως η χαμηλή θερμοκρασία η αλατότητα και τα ζιζανιοκτόνα ατραζίνη και imazethapyr (Light et al., 2005). Σε αυτή την περίπτωση πιθανόν η εισαγωγή του διαγονιδίου διατάραξε το ενδογενές σύστημα προσαρμογής στις καταπονήσεις με αποτέλεσμα την αποτυχία παροχής προστασίας έναντι της οξειδωτικής βλαβης (Light et al., 2005). Ένα από τα πιο υποσχόμενα πεδία εφαρμογής των γενετικά τροποποιημένων φυτών με γονίδια GST σχετίζεται με την αυξημένη ικανότητάς τους να αποτοξινώνουν ζιζανιοκτόνα φάρμακα ή άλλες ρυπογόνες ενώσεις. Σε κάποια καλλιεργούμενα είδη όπως ο αραβόσιτος και η σόγια, τα γονίδια GST διαδραματίζουν ρόλο κλειδί, στον καθορισμό του μεταβολισμού και της εκλεκτικότητας των ζιζανιοκτόνων. Εντούτοις, σε πολλά άλλα καλλιεργούμενα είδη το σύνολο των GSTs τα οποία είναι απαραίτητα για την αποτοξίνωση κάποιων ζιζανιοκτόνων απουσιάζει. Για παράδειγμα ο καπνός και το σιτάρι είναι σχετικά ευαίσθητα στα χλωροακεταμίδια (chloroacetamide) και τα θειοκαρβαμιδικά (thiocarbammate), δύο ευρέως χρησιμοποιούμενες ομάδες ζιζανιοκτόνων. Ένα γονίδιο GST από τον αραβόσιτο το ZmGSTIV της κλάσης φ το οποίο είναι εξαιρετικά δραστικό έναντι του alachlor αύξησε την αντοχή γενετικά τροποποιημένων φυτών καπνού σε αυτές τις δύο ομάδες ζιζανιοκτόνων 35

43 (Jepson et al., 1997). Το ίδιο αποτέλεσμα προέκυψε μετά από υπερέκφραση του ίδιου γονιδίου στο σιτάρι (Milligan et al., 2001). Σε μία διαφορετική προσέγγιση με την εφαρμογή των τεχνικών της κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης και του in vitro ανασυνδυασμού (DNA shuffling) προέκυψε ένα γονίδιο GST το οποίο ήταν χίμαιρα δύο γονιδίων GST από τον αραβόσιτο, ενώ η μετάλλαξη αφορούσε την αντικατάσταση της γλουταμίνης από την λευκίνη. Γενετικά τροποποιημένα φυτά αραβίδοψης που υπερεκφράζουν το συγκεκριμένο γονίδιο εμφανίζουν αυξημένη αντοχή έναντι του ζιζανιοκτόνου fluarodifen της ομάδας των διφαινυλεθέρων (Dixon και συν., 2003). Η φυτοαποκατάσταση (phytoremediation) είναι μία ταχέως αναπτυσσόμενη τεχνολογία στην οποία χρησιμοποιούνται φυτά για την απομάκρυνση ή την αποικοδόμηση από το έδαφος ρυπογόνων χημικών ουσιών (υπολειμμάτων ζιζανιοκτόνων, ραδιενεργών στοιχείων και μετάλλων), μέσω του συστήματος αποτοξίνωσης GSH GST. Κάποια φυτικά είδη έχουν την ικανότητα να αποικοδομούν ξενοβιοτικές ουσίες (Newman and Reynolds, 2004). Ωστόσο, από τα περισσότερα απουσιάζει το πλήρες καταβολικό μονοπάτι για την αποικοδόμησή τους. Γενετικά τροποποιημένα φυτά που υπερεκφράζουν γονίδια GSTs μπορούν εν δυνάμει να χρησιμοποιηθούν στην φυτοαποκατάσταση ρυπασμένων εδαφών (Cherian and Oliveira, 2005). 36

44 Κεφάλαιο 3 Υλικά και μέθοδοι 37

45 3.1 Δημιουργία ανασυνδυασμένων πλασμιδίων Η γενετική τροποποίηση του καπνού πραγματοποιήθηκε με τα γονίδια PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 μέσω του A.tumefaciencs, που έφερε τo πλασμίδια part27-gstu2-2 ή part27- PvGSTU3-3. Το γονίδιο PvGSTU2-2 απομονώθηκαν από τα φύλλα (Chronopoulou et al., 2011) και τo PvGSTU3-3 απο την ρίζα του είδους Phaseolus vulgaris (Chronopoulou et al., 2014). Για την δημιουργία των ανασυνδυαμένων πλασμιδίων χρησιμοποιήθηκε o φορέας pαrt27-gstu4 (Benekos et al., 2010 ), o οποίος φέρει την κασέτα έκφρασης που αποτελείται από τον ισχυρό υποκινητή CaMV-35s από τον ιό της μωσαϊκής του κουνουπιδιού και την μη μεταφραζόμενη περιοχή του γονιδίου συνθάση των οκτοπινών (ocs 3 ) η οποία περιέχει σήματα πολυαδενιλίωσης για τον τερματισμό της μεταγραφής. Μεταξύ των δύο αυτών περιοχών υπάρχει η περιοχή του πολυσυνδέσμου στην οποία ήταν κλωνοποιημένo το γονίδιο GSTU4. Επίσης, ο φορέας part27, φέρει μια τεχνητή Τ-DNA περιοχή και τα γονίδια ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά σπεκτυνομυκίνης και στρεπτομυκίνης για επιλογή μεταξύ μεταμορφωμένων και μη κυττάρων E.coli ή Α. tumefaciens, ενώ μέσα στην T-DNA περιοχή το γονίδιο ανθεκτικότητας στο αντιβιοτικό καναμυκίνη για επιλογή μεταξύ μετασχηματισμένων και μη κυττάρων των παραπάνω βακτηρίων αλλά και φυτικών κυττάρων κατά την διαδικασία της γενετικής τροποποίησης (Εικόνα 4.1 Α και Β) H κλωνοποίησης των γονιδίων PvGSTU2-2 και PvGST3-3 στον φορέα part27 κατέστη δυνατή μετά από πέψη των ανασυνδυασμένου φορέα part27-gstu4, pet28a-pvgstu2-2 και του γονιδίου PvGSTU3-3 με τα κατάλληλα ένζυμα περιορισμού προκειμένου, να αφαιρεθεί το γονίδιο GSTU4 από τον φορέα part27 αφήνοντας όμως άθικτα τα υπόλοιπα στοιχεία της κασέτας έκφρασης αλλά και να δημιουργηθούν μονόκλωνα συμπληρωματικά άκρα μεταξύ του φορέα και των δύο γονιδίων. 38

46 A B Eικ.4.1 (Α) Γενετικός χάρτης του πλασμιδίου part27-gstu4 (Β) Νουκλεοτιδική αλληλουχία των μεταγραφικών στοιχείων του προαγωγέα CaMV 35S και της περιοχής του πολυσυνδέσμου Κλωνοποίηση των γονιδίων PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 στον πλασμιδιακό φορέα part Ανάπτυξη υγρών καλλιεργειών και καθαρισμός πλασμιδιακού DNA Για την συλλογή μεγάλης ποσότητας πλασμιδιακού DNA αναπτύχθηκαν υγρές καλλιέργειες E.coli που έφεραν τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια pet28a-pvgstu2-2 και part27-gstu4 σε 5ml LB(Luria Broth) (1%(v/w) τρυπτόνη, 0,5%(v/w) εκχύλισμα ζύμης, 1%(v/w) ΝaCl, PH=7) το οποίο περιείχε τα αντιβιοτικό καναμυκίνη (25mg/L) στην περίπτωση του πλασμιδιακού φορέα pet-28a-pvgstu2-2 ή καναμυκίνη (20mg/L) και σπεκτινομυκίνη (100mg/L) για τον πλασμιδιακό φορέα part27-gstu4. Οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν για 24 ώρες σε ανακινούμενο επωαστήρα. Ακολούθησε η συλλογή των βακτηριακών κυττάρων μετά από φυγοκέντρηση στις rcf για 10 και η απομόνωση του πλασμιδιακού DNΑ με το kit PureLink Quick Plasmid Miniprep (Ιnvitrogen) 39

47 Αντιδράσεις με ένζυμα περιορισμού και καθαρισμός των προϊόντων πέψης Μετά από την απομόνωση του πλασμιδιακού DNA, το επόμενο βήμα ήταν η απομόνωση του γονιδίου PvGSTU2-2 και του φορέα part27 και η δημιουργία μονόκλωνων συμπληρωματικών άκρων μεταξύ τους. Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε διπλή πέψη του pet28a-pvgstu2-2 και του part27-gstu4 με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI και HindIII (New England Biolabs). Από την πέψη του pet-28a-pvgstu2-2 αναμένονταν ένα τμήμα DNA 684bp που αντιστοιχεί στο γονίδιο PvGSTU2-2 και 5.350bp στον φορέα pet-28a ενώ, από την πέψη του part27-gstu4 ένα γραμμικό τμήμα DNA μαζί με την κασέτα έκφρασης bp και του γονιδίου GSTU4. Οι αντιδράσεις με τα ένζυμα περιορισμού πραγματοποιήθηκαν σε τελικό όγκο 50μl. Στο μείγμα της αντίδρασης προστέθηκαν 1x ρυθμιστικό διάλυμα ενζύμων περιορισμού, 150ng/μl πλασμιδιακό DNA pet-28a-pvgstu2-2 ή 75ng/μl πλασμιδιακό DNA part27-gstu4, 20U/μl EcoRI HF, 20U/μl HindIII HF και H2O έως τα 50μl. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν για 60 στους 37 ο C. Η διακοπή τους έγινε στους 65 ο C για 10 σε υδατόλουτρο. Τα προϊόντα των αντιδράσεων πέψης του part27-gstu4 και pet-28a-pvgstu2-2 ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1% (v/w) σε διάλυμα ΤΒΕ (40 mm Tris, 20 mm βορικού οξέος, 1 mm EDTA). Με την χρήση αποστειρωμένων λεπίδων, αφαιρέθηκαν οι περιοχές τoυ πηκτώματος, με τα τμήματα DNA που θα χρησιμοποιούνταν στην δημιουργία των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων. Ακολούθησε ο καθαρισμός των προϊόντων πέψης με το Kit Nucleospin Exctract ΙΙ (Macherey-Nagel) και ο έλεγχός τους μετά από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% (w/v) σε ΤΒΕ. Το γονίδιο PvGSTU3-3 όπως και ο φορέα part27 δόθηκαν μετά από την πέψη με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI και Xba και τον καθαρισμό τους Αντιδράσεις λιγάσης μεταξύ του φορέα part27 και των γονιδίων PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 Προκειμένου να ενωθούν τα μονόκλωνα συμπληρωματικά άκρα του φορέα part27 και των γονιδίων PvGSTU2-2 ή PvGSTU3-3, πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις της λιγάσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο της εταιρείας New England Biolabs. Οι αντιδράσεις προετοιμάστηκε πάνω σε πάγο. Σε τελικό όγκο 20 μl προστέθηκε 1x ρυθμιστικό διάλυμα λιγάσης, 0,025pmol πλασμιδιακού φορέα part27, 0,076 pmol γονίδιο PvGSTU2-2 ή PvGSTU3-3, Τ4 DNA λιγάση και H2O έως τα 20 μl. Η αντίδραση επωάστηκε 40

48 στους 16 ο C για 16 ώρες. Μάρτυρα αποτέλεσαν οι αντιδράσεις λιγάσης που περιείχαν μόνο ηηξτον φορέα part27 κομμένο με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI-HindIII ή EcoRI-XbaI. Ο μάρτυρας αυτός μπορεί να επιβεβαιώσει πως οι φορείς έχουν υποστεί πλήρη πέψη Έλεγχος των αντιδράσεων λιγάσης με την τεχνική PCR Η επιτυχία των αντιδράσεων λιγάσης ελέγχθηκε με την τεχνική PCR σε θερμοκυκλοποιητή PTC-200 DNA Engine Cycler (Bio-Rad). Οι αντιδράσεις έγιναν σε τελικό όγκο 20 μl. Το μείγμα της αντίδρασης περιείχε 1x ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης, 0,2mΜ dntps, 0,8μΜ εκκινητές F και R, 0,4U Taq πολυμεράση, 1μl εκμαγείο DNA (αντίδραση λιγάσης ή φορέας Part27 κομμένος με τα ένζυμα περιορισμού ΕcoRI-HindIII ή EcoRI-XbaΙ) και H2O έως τα 20 μl (Applied Biosystems). Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν οι εξής: Μετά από το αρχικό στάδιο αποδιάταξης στους 95 ο C για 3 ακολούθησαν 30 κύκλοι αποδιάταξης στους 95 ο C για 30, υβριδισμού στους 54 ο C για 20 και επιμήκυνσης στους 72 ο C για 50. Μετά από την ολοκλήρωση των 30 κύκλων πραγματοποιήθηκε ένα τελικό στάδιο επιμήκυνσης στους 72 ο C για 1. Oι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για το γονίδιο PvGSTU2-2 ήταν οι: F 5 -GAGCTACTGCAAAGCCCTTTGTTTG-3 R 5- CATTAGAATGAACCGAAACCGGCGG-3 και για το γονίδιο PvGSTU3-3 οι: F 5 -GAGAGCTCGAAAGTGAGGGTATTGGG-3 R 5 -CATTAGAATGAACCGAAACCGGCGG-3 Οι εμπρόσθιοι εκκινητές (Fοrward) υβριδίζονται με μια περιοχή εντός των γονιδίων ενώ ο ανάστροφος (Reverse) στην περιοχή ocs 3 η οποία περιέχει σήματα πολυαδενιλίωσης για τον τερματισμό της μεταγραφής του γονιδίου. Αρνητικούς μάρτυρες αποτέλεσαν οι αντιδράσεις λιγάσης που περιείχαν μόνο τον φορέα part27 ο οποίος κόπηκε με τα ένζυμα περιορισμού ΕcoRI-HindIII ή EcoRI-XbaΙ. Επιπλέον, για να επιβεβαιωθεί πως δεν υπήρχε επιμόλυνση σε μία αντίδραση δεν προστέθηκε DNA εκμαγείο. To αναμενόμενο προϊόν θα έπρεπε να έχει μεγέθους 795bp για το γονίδιο PvGSTU2-2 και 786 bp για το γονίδιο PvGSTU3-3. Ενώ στις αντιδράσεις που περιείχαν μόνο τους φορείς (αρνητικοί μάρτυρες) καθώς και στην αντίδραση χωρίς DNA εκμαγείο δεν θα έπρεπε να παρατηρηθεί κάποια ζώνη. Τα προϊόντα των αντιδράσεων PCR ηλεκτροφoρήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1% (w/v), σε διάλυμα TΒE. 41

49 3.2 Μετασχηματισμός δεκτικών κυτάρων E. coli με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια part27-pvgstu2-2 και part27-pvgstu3-3 Μετά από τον έλεγχο της επιτυχίας των αντιδράσεων της λιγάσης και προκειμένου να συλλεχθεί μεγάλη ποσότητα από τα εν λόγω πλασμίδια, ακολούθησε ο μετασχηματισμός κυττάρων Ε.coli. Η διαδικασία του μετασχηματισμού ήταν η εξής: Σε φιαλίδιο (eppedorf) που περιέχει 50 μl δεκτικών κυττάρων E.coli του στελέχους Mach1, προστέθηκαν 5-10 ng πλασμιδιακό DNA και μεταφέρθηκαν στον πάγο για 30. Ακολούθησε θερμικό σοκ στους 42 ο C για 30 και προσθήκη 250 μl θρεπτικού υποστρώματος SOC (4% (w/v) τρυπτόνη, 1% (w/v) εκχύλισμα ζύμης, 0,1% (w/v) ΝaCl και 250 mm KCl ). Εν συνεχεία, οι δοκιμαστικοί σωλήνες με τα κύτταρα επωάστηκαν οριζοντίως σε ανακινούμενο επωαστήρα για 1 ώρα στους 37 ο C. Ακολούθως, σε τρυβλία που περιέχουν στερεό αποστειρωμένο θρεπτικό υπόστρωμα LB και τα αντιβιοτικά στρεπτομυκίνη και καναμυκίνη σε συγκέντρωση 20 mg/l επιστρώθηκε υπό ασηπτικές συνθήκες καλλιέργεια όγκου 10, 20, 50 και 100 μl. H επώαση έγινε στους 37 ο C για μία ημέρα Tαυτοποίηση βακτηριακών αποικιών E. coli με την τεχνική PCR και την χρήση ενζύμων περιορισμού Για να επιβεβαιωθεί o μετασχηματισμός των κυττάρων E.coli με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια part27-pvgstu2-2 και part-pvgstu3-3, επιλέχθηκαν 5 αποικίες οι οποίες αρχικά ελέγχθηκαν για το αν φέρουν τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια με την τεχνική της PCR. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε τελικό όγκο 20μl. Το μείγμα της αντίδρασης περιείχε 1x ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης, 0,2mΜ dntps, 0,8μΜ εκκινητές F και R, 0,4U Taq πολυμεράση, H2O έως τα 20 μl και κύτταρα από τις τυχαία επιλεγμένες αποικίες, τα οποία προστέθηκαν με την βοήθεια αποστειρωμένου ακρορυγχίου. Tα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την εταιρεία Applied Biosystems. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή Veriti TM (Aplied biosystems). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν καθώς και οι συνθήκες της PCR ήταν ίδιες όπως κατά έλεγχο της αντίδρασης λιγάσης. Θετικοί μάρτυρες ήταν οι αντιδράσεις λιγάσης part27-pvgstu2-2 και part27-pvgstu3-3. Τα προϊόντα της PCR υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% (w/v) σε διάλυμα ΤΒΕ. Για κύτταρα που μετασχηματίστηκαν με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-pvgstu2-2 το προϊόν θα έπρεπε να έχει μέγεθος 795bp και για το πλασμίδιο 42

50 part27-pvgstu bp. Ζώνες ιδίων μεγεθών αναμένονταν και στις αντίστοιχες αντιδράσεις της λιγάσης. Στις αποικίες που βρέθηκαν θετικές διεξήχθη περαιτέρω έλεγχος με αντιδράσεις ενζύμων περιορισμού. Για τον σκοπό αυτό αναπτύχθηκαν υγρές καλλιέργειες των αποικιών που βρέθηκαν θετικές και ακολούθως έγινε απομόνωση του πλασμιδιακού DNA με το kit PureLink Quick Plasmid Miniprep (Ιnvitrogen). Για τον έλεγχο του πλασμιδίου part27- PvGSTU2-2 έγινε πέψη με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI και BamHI ενώ για τον έλεγχο του part27-pvgst3-3 πραγματοποιήθηκε πέψη με το ένζυμο περιορισμού HindIII. Οι ίδιες αντιδράσεις ενζύμων περιορισμού έγιναν και στον φορέα part27-gstu4, ο οποίος αποτέλεσε τον αρνητικό μάρτυρα. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε μείγμα τελικού όγκου 10 μl το οποίο περιείχε 1x ρυθμιστικό διάλυμα ενζύμων περιορισμού, 180ng/μl πλασμιδιακό DNA, 20U/μl EcoRI HF και ΒamHI ή HindIII HF (New England Biolabs) και H2O έως τα 10 μl. Η επώαση των αντιδράσεων έγινε στους 37 ο C για 60 και η διακοπή τους πραγματοποιήθηκε στους 65 ο C για 10 σε υδατόλουτρο. Τα προϊόντα των αντιδράσεων πέψης ηλεκτροφoρήθηκαν σε πηκτώματα 1% (w/v) αγαρόζης, σε διάλυμα TΒE. Τέλος, πραγματοποιήθηκε και αλληλούχιση των επιλεγέντων κλώνων και η ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα SeqMan pro. Οι αποικίες που βρέθηκαν θετικές πολλαπλασιάστηκαν σε υγρές καλλιέργειες και ακολούθησε απομόνωση του πλασμιδιακού DNA με το kit PureLink Quick Plasmid Miniprep (Invitrogen) 3.3 Μετασχηματισμός του A. tumefaciens με τους φορείς γενετικής τροποποίησης part27-pvgstu2-2 και part27-pvgstu3-3 με την τεχνική της ηλεκτροδιήθησης Oι πλασμιδιακοί φορείς γενετικής τροποποίησης part27-pvgstu2-2 και part27- PvGSTU3-3 κλωνοποιήθηκαν σε δεκτικά κύτταρα του A. tumefaciens (στέλεχος GV3101) με την μέθοδο της ηλεκτροδιήθησης. Σε φιαλίδιο (eppendorf) αναμείχθηκαν 1μl πλασμιδιακού DNA και 40μl δεκτικών κυττάρων. To διάλυμα μεταφέρθηκε σε κυψελίδα και ακολούθησε η ηλεκτροδιήθηση (6000Ω, 2μF και 2,5Κv). Έπειτα προστέθηκε 1 ml LB και τα διάλυμα επανατοποθετήθηκε στο δοκιμαστικό σωλήνα και επωάστηκε για δύο ώρες στους 30 ο C. Διάλυμα όγκου 50 και 100μl επιστρώθηκε σε θρεπτικό υπόστρωμα LB το οποίο περιείχε τα αντιβιοτικά στρεπτομυκίνη σε συγκέντρωση 25 mg/l (αντιβιοτικό επιλογής του 43

51 πλασμιδίου) και τζενταμυκίνη σε συγκέντρωση 50 mg/l (λόγω χρωμοσωμικής ανθεκτικότητας του στελέχους GV3101 στο εν λόγω αντιβιοτικό). Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 28 ο C σε συνθήκες σκότους για 4-5 ημέρες. 3.4 Γενετική τροποποίηση και παραγωγή διαγονιδιακών φυτών καπνού Ν. tabacum (cv Χanthi) μέσω του Α. tumefacies Ανάπτυξη φυτών καπνού σε in vitro συνθήκες Για την γενετική τροποποίηση φυτών καπνού μέσω του A. tumefaciens, ως έκφυτα χρησιμοποιήθηκαν φυλλικοί δίσκοι 1cm 2, δότες των οποίων ήταν in vitro φυτά καπνού της ποικιλίας Xanthi. Για την εγκατάσταση της in vitro καλλιέργειας χρησιμοποιήθηκαν σπόροι καπνού οι οποίοι απολυμάνθηκαν με την εξής διαδικασία: Τοποθετήθηκαν σε φιαλίδιο (eppendorf) που περιείχε 100% αιθανόλη για 1 και φυγοκεντρήθηκαν στις 16,000g για 15. Έπειτα αφαιρέθηκε η αιθανόλη και προστέθηκε 50% χλωρίνη εμπορίου (3 % NaClO) στην οποία παρέμειναν για 15. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις g για 30. Εν συνεχεία, τα σπέρματα ξεπλύθηκαν πέντε φορές με αποστειρωμένο και απεσταγμένο νερό και τοποθετήθηκαν σε τρυβλία που περιείχαν θρεπτικό υπόστρωμα MS (Murashige και Skoog, 1962) στερεοποιημένο με 0,6% w/v άγαρ. H αποστείρωση του θρεπτικού υποστρώματος έγινε σε αυτόκαστο κλίβανο στους 121 ο C για 20 και πίεση 1,2 bar. Για την φύτρωσή τους, τα σπέρματα τοποθετήθηκαν σε συνθήκες σκότους και θερμοκρασία 25±2 ο C. Έπειτα από 10 ημέρες τα σπορόφυτα μεταφέρθηκαν σε δοχεία Magenta TM GA-7 τα οποία επίσης περιείχαν ΜS. Οι συνθήκες ανάπτυξης και διατήρησης των φυτών ήταν: Ένταση φωτισμού LUX, 18 ώρες φώς/6 ώρες σκοτάδι και θερμοκρασία 25±2 ο C. Τα φυτά διατηρούνταν σε in vitro συνθήκες με μικροπολλαπλασιασμό ο οποίος επαναλαμβάνονταν ανά τρεις εβδομάδες περίπου, υπό ασηπτικές συνθήκες σε τράπεζα νηματικής ροής Μετασχηματισμός των φυλλικών δίσκων καπνού Η διαδικασία του μετασχηματισμού πραγματοποιήθηκε σε τέσσερις φάσεις. Στην πρώτη φάση έγινε η ανάπτυξη της καλλιέργειας του A. tumefaciencs. Κατά την φάση αυτή ενοφθαλμίστηκε μία αποικία μετασχηματισμένων βακτηρίων που έφεραν τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια part27-pvgstu2-2 ή part27-pvgst3-3 σε 5 ml υγρού 44

52 υποστρώματος LB που περιείχε τα αντιβιοτικά καναμυκίνη (20 mg/l), σπεκτυνομυκίνη (100 mg/l) και τζενταμυκίνη (50 mg/l). Η ανάπτυξη της καλλιέργειας έγινε στους 28 o C σε ανακινούμενο επωαστήρα για τρεις ημέρες. Η δεύτερη φάση περιελάμβανε την επιμόλυνση των εκφύτων. Στην φάση αυτή έγινε η συλλογή των βακτηριακών κυττάρων μετά από φυγοκέντρηση της καλλιέργειας στις rcf για 5. Έπειτα, δημιουργήθηκε το διάλυμα της επιμόλυνσης το οποίο περιείχε τα βακτηριακά κύτταρα και 10 ml υγρό MSR (MS με 0,1 mg/l ΝΑΑ και 1mg/l BAP). Σε αυτό το διάλυμα τοποθετήθηκαν οι φυλλικοί δίσκοι για 30 στους 28 ο C υπό ελαφρά ανάδευση (120 rpm) σε ανακινούμενο επωαστήρα. Ακολούθησε η τρίτη φάση της συγκαλλιέργειας κατά την οποία, οι φυλλικοί δίσκοι τοποθετήθηκαν σε τρυβλία με 25 ml υπόστρωμα αναγέννησης MSR στερεoποιημένο με 0,6% άγαρ σε συνθήκες ημισκότους στους 25 ο C για τρεις ημέρες. Κατά την τέταρτη φάση οι φυλλικοί δίσκοι δίσκοι τοποθετήθηκαν υπό ελαφρά ανακίνηση για 10, σε απεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό που περιείχε το αντιβιοτικό καρμπενικιλλίνη ή σεφοταξίμη σε συγκέντρωση 250mg/l, έπειτα ξεπλύθηκαν με απεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό τρεις φορές και στέγνωσαν πάνω σε αποστειρωμένο διηθητικό χαρτί Αναγέννηση των φυλλικών δίσκων και επιλογή αναγεννημένων βλάστων Για την επαγωγή κάλλων, οι πιθανά μετασχηματισμένοι φυλλικοί δίσκοι καπνού, μεταφέρθηκαν σε στερεό υπόστρωμα αναγέννησης και επιλογής ΜSR το οποίο περιείχε τα αντιβιοτικά σεφοταξίμη (250 mg/l) (βακτηριοστατικό) και καναμυκίνη (50 mg/l) (παράγοντας επιλογής των πιθανά γενετικά τροποποιημένων φυτών). Προκειμένου να αποφευχθεί η ανάπτυξη του Α. tumefaciens οι φυλλικοί δίσκοι ανά 10 μέρες μεταφέρονταν σε νέο υπόστρωμα ΜSR συμπληρωμένο με τα ίδια αντιβιοτικά. Η βλαστική αναγέννηση των φυλλικών δίσκων επάγεται μετά την πάροδο 4 εβδομάδων. Οι πιθανά γενετικά τροποποιημένοι βλαστοί μεταφέρονταν σε υπόστρωμα ΜS συμπληρωμένο με τα ίδια αντιβιοτικά για περαιτέρω ανάπτυξη και ριζοβολία. Τα πλήρως ανεπτυγμένα φυτά μικροπολλαπλασιάζονταν ανά τακτά χρονικά διαστήματα και τοποθετούνταν σε υπόστρωμα MS στο οποίο οι συγκεντρώσεις των αντιβιοτικών σταδιακά μειώνονταν. Αρνητικό μάρτυρα ως προς την γενετική τροποποίηση αποτέλεσαν δισκία φύλλων καπνού που δεν υποβλήθηκαν στην διαδικασία του μετασχηματισμού και τοποθετήθηκαν σε 45

53 υπόστρωμα MSR συμπληρωμένο με τα αντιβιοτικά καναμυκίνη (50mg/L) και σεφοταξίμη (250 mg/l). 3.5 Μοριακή ταυτοποίηση των πιθανά γενετικά τροποποιημένων φυτών καπνού με την τεχνική RT-PCR (Real Time PCR) Η ταυτοποίηση των πιθανά γενετικά τροποποιημένων φυτών N. tabacum ως προς την ένθεση των διαγονιδίων PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3, πραγματοποιήθηκε με την τεχνική PCR πραγματικού χρόνου (RT-PCR), λαμβάνοντας υπόψη την τιμή CT (κύκλος-κατώφλι) και την θερμοκρασία τήξης (Tm). Ο κύκλος κατώφλι CT είναι ο κύκλος της PCR στον οποίων παρατηρείται σημαντική αύξηση του φθορισμού καθώς στην φάση αυτή ο πολλαπλασιασμός του DNA εισέρχεται στην εκθετική φάση αύξησης. Στη συγκεκριμένη περίπτωση, χρησιμοποιώντας εκκινητές που υβριδίζονται στην περιοχή του Τ-DNA, αναμένονταν πως τα πιθανά γενετικά τροποποιημένα φυτά (εφόσον είχαν ενσωματώσει την περιοχή του Τ-DNA) θα είχαν παρόμοια CT με κάποιο ταυτοποιημένο γενετικά τροποποιημένο φυτό. Επιπλέον, για να αξιολογηθεί η εξειδίκευση των αντιδράσεων και να πιστοποιηθεί η ταυτότητα του προϊόντος που ενισχύεται στην PCR, πραγματοποιήθηκε ανάλυση των καμπυλών τήξης. Εν προκειμένω, η Tm των πιθανά γενετικά τροποποιημένων φυτών συγκρίθηκαν με τις Tm των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων στα οποία ήταν κλωνοποιημένα τα γονίδια PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3. Η ανάλυση αυτή επιτρέπει την αναγνώριση των εξειδικευμένων προϊόντων που πολλαπλασιάζονται στην PCR με βάση την θερμοκρασία που γίνεται η αποδιάταξη τους. Συνεπώς, είναι δυνατόν να διακριθούν από τα μη εξειδικευμένα προϊόντα που ενδεχομένως πολλαπλασιάζονται. Για την απομόνωση του DNA χρησιμοποιήθηκε το kit Nucleic acid and protein purification NucleoSpin Plant II (Macherey-Nagel). Οι αντιδράσεις τις RT-PCR πραγματοποιήθηκαν με το kit Kapa SYBR Fast qpcr (Kapa Biosystems). Σε μείγμα όγκο 20 μl προστέθηκαν 1x ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης, 1,5 mμ MgCl2, 0,2mΜ dntps, 0,5μΜ εκκινητές F και R, 0,5μM χρωστική cyto, 1U πολυμεράση, 50ng/μl εκμαγείο DNA και H2O έως τα 20 μl. Oι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή Rotor Gene (Qiagen). Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν οι εξής: Αρχική αποδιάταξη 95 ο C 2 και 30 κύκλοι αποδιάταξης στους 95 ο C για 20, υβριδισμού στους 54 ο C για 20 και επιμήκυνσης στους 72 ο C για 1. Μετά από την ολοκλήρωση των κύκλων ακολούθησε ένα τελικό στάδιο επιμήκυνσης στους 72 ο C για 46

54 1. Στο πρόγραμμα της PCR προστέθηκε και ένα στάδιο για την εκτίμηση της θερμοκρασίας Tm από τους 65 ο C-95 o C Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι F 35S 5 -GCTCCTACAAATGCCATCA-3 R nos-ter 5 -TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 Κατά τον έλεγχο των πιθανά γενετικά τροποποιημένων φυτών που φέρουν τα γονίδια PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3, θετικούς μάρτυρες για την επαλήθευση των CT αποτέλεσαν ταυτοποιημένα γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού με το γονίδιο GSTU4 και PvGSTU2-2 αντίστοιχα. Tα ανασυνδυασμένα πλασμίδια part27-pvgstu2-2και part27-pvgstu3-3 χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες για την επαλήθευση των Τm στα πιθανά γενετικά τροποποιημένα που έφεραν τα αντίστοιχα γονίδια. Αρνητικούς μάρτυρες και στις δύο περιπτώσεις αποτέλεσε ένα μη γενετικά τροποποιημένο φυτό καπνού. Για να εξασφαλισθεί πως δεν υπάρχει επιμόλυνση σε μία αντίδραση δεν προστέθηκε DNA εκμαγείο. Επιπλέον, τα προϊόντα της RT-PCR υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα 1% (w/v) αγαρόζης σε διάλυμα TBE και ο δείκτης μοριακού βάρους που χρησιμοποιήθηκε ήταν ο 100bp. Στα θετικά φυτά, με βάση την ανάλυση των Ct και Tm, αναμένονταν μία ζώνη 853bp για το γονίδιο PvGSTU2-2 και 822 για το γονίδιο PvGSTU3-3. Τα φυτά άγριου τύπου καθώς και τα αρνητικά ως προς την παρουσία των διαγονιδίων θα έπρεπε να χαρακτηρίζονται από απουσία ζωνών. 3.6 Επιλογή Τ0 διαγονιδιακών σειρών με τα γονίδια PvGSTU2-2 και PvGSTU Μέτρηση της ποσοτικής έκφρασης σε γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού με την τεχνική q-rtpcr (Quantitative-Real Time PCR) Η ανάλυση της έκφρασης πραγματοποιήθηκε σε 8 Τ0 γενετικά τροποποιημένα φυτά με το γονίδιο PvGSTU2-2. Για την μέτρηση των ειδικών αντιγράφων του mrna του γονιδίου χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου (q-rtpcr). Τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν ως σχετική ποσοτική έκφραση με βάση την μέθοδο 2 -ΔΔCT. (Livak et al., 2001). Όπου ΔΔCT=(CT γονιδίου στόχου - CT γονίδιο αναφοράς)x1 - (CT γονιδίου στόχου - CT γονίδιο αναφοράς)x2. Ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιήθηκε η β-ακτίνη. Το X1 αντιστοιχεί στο υπό μελέτη γενετικά τροποποιημένο φυτό και το X2 σε γενετικά τροποποιημένο φυτό το οποίο αποτελεί την βάση για τα συγκριτικά αποτελέσματα της έκφρασης (calibrator). 47

55 Επιπλέον, για να επιβεβαιωθεί η ταυτότητα των προϊόντων που ενισχύονται στην q- RTPCR, πραγματοποιήθηκε ανάλυση των καμπυλών τήξης για τον προσδιορισμό της Tm καθώς και ηλεκτροφόρηση για την επιβεβαίωση του μεγέθους τους Απομόνωση RNA Για την απομόνωση ολικού RNA, πραγματοποιήθηκε ομογενοποίηση 100 mg ιστού νεαρών φύλλων καπνού με την βοήθεια πλαστικής ράβδου, σε φιαλίδιο (eppendorf) που περιείχε 200μl TRIZOL (Ιnvitrogen). Έπειτα προστέθηκαν 800 μl επιπλέον από το συγκεκριμένο χημικό σκεύασμα και ακολούθησε φυγοκέντρηση στις rcf για 10 στους 4 ο C. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και επωάστηκε για 5 στους 30 ο C, προστέθηκαν 200μl χλωροφθόρμιο και έγινε επώαση για 3 στους 30 ο C. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε φυγοκέντρηση στις rcf για 15 στους 4 ο C και συλλέχθηκε το υπερκείμενο το οποίο περιείχε το RNA. Για την κατακρήμνισή του προστέθηκαν 500μl ισοπροπανόλης έπειτα έγινε επώαση στους 30 ο C για 10 και φυγοκέντρηση στις rcf για 10 στους 4 ο C. Mετά από την αφαίρεση της ισοπροπανόλης, προστέθηκε 1 ml 75% αιθανόλη και ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 7.500g για 5 στους 4 ο C. Τέλος αφού απομακρύνθηκε η αιθανόλη το RNA διαλύθηκε σε απεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό μετά από την τοποθέτησή του σε υδατόλουτρο στους 60 ο C για 10. Η ποσότητα καθώς και η καθαρότητα του RNA προσδιορίστηκε με φασματοφωτομέτρηση μετά από αραίωση 1/50. Για τον προσδιορισμό της ποσότητας του RNA μετρήθηκε η απορρόφηση στα 260nm ενώ η καθαρότητα εκτιμήθηκε από τον λόγο της απορρόφησης στα 260/280nm. Επιπλέον, η ακεραιότητά του προσδιορίστηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% σε διάλυμα ΤΑΕ (40 mm Tris, 20 mm οξικού οξέος, 1 mm EDTA). Η παρουσία δύο διακριτών ζωνών που αντιστοιχούν στο RNA των ριβοσομικών υπομονάδων μπορεί να επιβεβαιώσει πως τα RNA είναι ανέπαφο Aντίδραση αντίστροφης μεταγραφής Η αντίδραση αυτή εφαρμόστηκε προκειμένου να δημιουργηθεί συμπληρωματικό RNA (cdna) το οποίο επρόκειτο να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση της έκφρασης του διαγονιδίου PvGSTU2-2. Για την σύνθεση του cdna χρησιμοποιήθηκε το kit SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen). Σύμφωνα με το πρωτόκολλο της εταιρείας, η αντίδραση για την σύνθεση του cdna πραγματοποιείται σε τρία στάδια και σε τελικό όγκο 20μl. Στο πρώτο στάδιο 100ng RNA, 500μg/ml του εκκινητή ολιγο-δεοξυ-θυμιδίνης (oligo(dt)12-18), 10 48

56 mm dntps και Η2Ο επωάστηκαν στους 65 ο C για 5 έτσι ώστε να πραγματοποιηθεί η αποδιάταξη δευτεροταγών δομών RNA, καθώς και των εκκινητών. Στο δεύτερο στάδιο προστέθηκε 1x ρυθμιστικό διάλυμα αντίστροφης μεταγραφάσης και 0,01Μ DTT και έγινε επώαση στους 42 ο C για 2. Στο τρίτο στάδιο προστέθηκαν 10 U αντίστροφης μεταγραφάσης (SuperScript II RT) και έγινε επώαση στους 42 ο C για 50. Η διακοπή της αντίδρασης έγινε με αύξηση της θερμοκρασίας στους 70 o C για 15. Για να επιβεβαιωθεί πως το RNA που απομονώθηκε δεν περιείχε DNA πραγματοποιήθηκε και μια σειρά αντιδράσεων στις οποίες δεν προστέθηκε αντίστροφη μεταγραφάση Μέτρηση της σχετικής ποσοτικής έκφρασης με την τεχνική q-rtpcr Για την διεξαγωγή της q-rtpcr χρησιμοποιήθηκε το kit Kapa SYBR Fast qpcr (Kapa Biosystems). Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε μείγμα τελικού όγκου 20μl το οποίο περιείχε 1x ρυθμιστικό διάλυμα Τaq πολυμεράσης, 1,5 mμ MgCl2, 0,2mΜ dntps, 0,5μΜ εκκινητές F και R, 0,5μM χρωστική cyto, 1U πολυμεράση, 50ng/μl cdna και H2O έως τα 20 μl. Για κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκαν τρεις τεχνικές επαναλήψεις. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή Rοtor gene 6000 (Corbett reaserch). Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν οι εξής: Αρχική αποδιάταξη 95 ο C για 2 και 30 κύκλοι αποδιάταξης στους 95 ο C για 20, υβριδισμού στους 54 ο C για 20 και επιμήκυνσης στους 72 ο C για 1. Μετά απο την ολοκλήρωση των 30 κύκλων πραγματοποιήθηκε ένα τελικό στάδιο επιμήκυνσης στους 72 ο C για 1. Στο πρόγραμμα της PCR προστέθηκε και ένα στάδιο για την εκτίμηση της θερμοκρασίας Tm απο τους 65 ο C-95 o C. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: Γονίδιο 35S PvGSTU GGGCAACAAGAGTGAACAGC-3 5 -TCCACGTAGCACCCACAATC-3 Γονίδιο β-ακτίνης 5 -GGTGACGAACTCAGTCCAAAAGGGGT ACGGCCACTGGCGTATAGGGACAACA -3 Για την επαλήθευση των Tm θετικό μάρτυρα αποτέλεσε το DNA από ταυτοποιημένο γενετικά τροποποιημένο φυτό με τα γονίδια PvGSTU2-2 ενώ αρνητικός μάρτυρας ήταν ένα μη γενετικά τροποποιημένο φυτό. Για να εξασφαλισθεί πως δεν υπήρχε επιμόλυνση, σε μία 49

57 αντίδραση δεν προστέθηκε cdna. Τα προϊόντα της q-rtpcr ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1% σε TAE. Το προϊόν που ενισχύεται θα πρέπει να έχει μέγεθος 220bp για το γονίδιο PvGSTU2-2, και 345bp για το γονίδιο της β-ακτίνης Μέτρηση της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας του ισοενζύμου PvGSTU3-3 και PvGSTU2-2 στα Τ0 διαγονιδιακα φυτά καπνού Η μέτρηση της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας των ισοενζύμων PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 πραγματοποιήθηκε σε εκχύλισμα φύλλων από τα Τ0 γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού καθώς και φυτά άγριου τύπου (αρνητικοί μάρτυρες). Στις 9 Τ0 σειρές με το γονίδιο PvGSTU3-3, η μέτρηση πραγματοποιήθηκε στα υποστρώματα CDNB και ΝΒD-CI ενώ η ενζυμική δραστικότητα του ισοενζύμου PvGSTU2-2 μετρήθηκε σε 8 Τ0 σειρές (Τ0 σειρές στις οποίες μετρήθηκε η σχετική ποσοτική έκκφραση) μόνο στο υπόστρωμα ΝΒD-CI, στο οποίο το συγκεκριμένο ισοένζυμο εμφανίζει υψηλή ενζυμική δραστικότητα (Chronopoulou et al., 2011). Το υπόστρωμα CDNB χρησιμοποιείται ευρέως για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό της ενζυμικής δραστικότητας των GSTs. Ωστόσο, ορισμένα GSTs εμφανίζουν πολύ μικρή δραστικότητα σε αυτό το υπόστρωμα. Εναλλακτικά, χρησιμοποιείται το NBD-Cl το οποίο επίσης συμμετέχει σε αντιδράσεις συμπλοκοποίησης με την GSH. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ενζυμικής Τεχνολογίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών. 3.7 Φαινοτυπικός έλεγχος της έκφρασης των γονιδίων PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 στα Τ0 διαγονιδιακά φυτά καπνού Ο φαινοτυπικός έλεγχος της έκφρασης πραγματοποιήθηκε μέσω της επίδρασης υψηλής συγκέντρωσης αλάτων για τις Τ0 διαγονιδιακές σειρές με το γονίδιο PvGSTU3-3 ή με εφαρμογή του ζιζανιοκτόνου dimethenamid στις Τ0 σειρές που έφεραν το γονίδιο PvGSTU2-2. To είδος της καταπόνησης, επιλέχθηκε με βάση την καταλυτική δράση των ισοενζύμων μετά από την ετερόλογη έκφρασή τους σε κύτταρα E-coli. Το ισοένζυμο PvGSTU2-2 εμφανίζει καταλυτική δράση έναντι ζιζανιοκόνων της ομάδας των χλωροακεταμιδίων ενώ το PvGSTU3-3 έχει δράση υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GPX). 50

58 3.7.1 Ιn vitro δοκιμή ανθεκτικότητας στην αλατότητα Προκειμένου να αξιολογεί η ανθεκτικότητα στην αλατότητα, οι T0 σειρές NtGSTU3-3.1 NtGSTU3-3.4 και NtGSTU3-3.8 καθώς και φυτά μάρτυρες (μη γενετικά τροποποιημένα φυτά), μικροπολλασιαστήκαν και μεταφέρθηκαν σε υπόστρωμα MS. Στο στάδιο των τεσσάρων φύλλων και μετά από την αφαίρεση του ριζικού τους συστήματος, μεταφέρθηκαν υπό ασηπτικές συνθήκες σε θρεπτικό υπόστρωμα MS ή σε MS το οποίο περιείχε 200mM ΝaCl. Μετά από 30 ημέρες αξιολογήθηκε η ανθεκτικότητά τους με φαινοτυπικό έλεγχο της ανάπτυξης του ριζικού συστήματος. Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 3 γενετικά τροποποιημένα φυτά από κάθε Τ0 σειρά και αντίστοιχος αριθμός φυτών-μάρτυρες Ιn vitro και in vivo δοκιμή ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο dimethenamid Οι T0 σειρές ΝtGSTU2-2.9, NtGSTU NtGSTU καθώς και μη γενετικά τροποποιημένα φυτά μικροπολλαπλασιάστηκαν προκειμένου να αποκτηθεί ένας ικανοποιητικός αριθμός κλώνων για τα πειράματα ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο dimethenamid. Για την αξιολόγηση της επίδρασης του ζιζανιοκτόνου σε in vitro συνθήκες Τ0 κλώνοι νεαρών γενετικά τροποποιημένων φυτών και οι αντίστοιχοι μάρτυρες (μη γενετικά τροποποιημένα φυτά) με εκπτυγμένα 3-4 φύλλα τοποθετήθηκαν υπό ασηπτικές συνθήκες, μετά από την αφαίρεση του ριζικού συστήματος, σε γυάλινα δοχεία που περιείχαν θρεπτικό υπόστρωμα MS στο οποίο προστέθηκε το ζιζανιοκτόνο dimethenamid (εμπορικό σκεύασμα Frontier) σε συγκεντρώσεις 10 και 20 mg/l. Τα φυτά μεταφέρθηκαν στην συνέχεια σε θάλαμο ανάπτυξης με ένταση φωτισμού LUX, 18 ώρες φώς/6 ώρες σκοτάδι και θερμοκρασία 25±2 ο C. Με την πάροδο 30 ημερών αξιολογήθηκε η ανάπτυξη του ριζικού συστήματος και το μήκος του βλαστού. Συνολικά, για κάθε δόση του ζιζανιοκτόνου χρησιμοποιήθηκαν 3 γενετικά τροποποιημένα φυτά από κάθε Τ0 σειρά και αντίστοιχος αριθμός φυτών-μάρτυρες. Για την in vivo αξιολόγηση της αντοχής στο ζιζανιοκτόνο dimethenamid, πραγματοποιήθηκε σκληραγώγηση φυτών που προέρχονταν από in vitro μικροπολλασμασιασμό με την εξής διαδικασία: Αρχικά απομακρύνθηκε με προσοχή το άγαρ και οι ρίζες ξεπλύθηκαν με νερό. Έπειτα τα φυτάρια μεταφυτεύθηκαν σε γλάστρες που περιείχαν περλίτη και τύρφη σε αναλογία 3:1, καλύφθηκαν με διαφανές πλαστικό κάλυμμα προκειμένου να ελαττωθούν οι απώλειες των υδρατμών και τοποθετήθηκαν σε θάλαμο 51

59 ανάπτυξης με ένταση φωτισμού LUX, 18 ώρες φώς/6 ώρες σκοτάδι και θερμοκρασία 25±2 ο C. Μετά από δεκαπέντε ημέρες το διαφανές κάλυμμα αφαιρέθηκε και συνεχίστηκε μόνο το πότισμα. Το ζιζανιοκτόνο εφαρμόστηκε πέντε ημέρες μετά απο την σκληραγώγηση. Τα φυτά ποτίστηκαν με 5ml υδατικoύ διαλύματος του ζιζανιοκτόνου συγκέντρωσης 0,5 και 1 mg/l (συγκέντρωση που χρησιμοποιείται σε συνθήκες αγρού για τον έλεγχο των ζιζανίων) και ακολούθησε πότισμα με απεσταγμένο νερό προκειμένου το ζιζανιοκτόνο να προσληφθεί από τα φυτά. Μετά από την πάροδο 20 ημερών μετρήθηκε το μήκος των βλαστών και της ρίζας. Το πειραματικό σχέδιο ήταν το πλήρως τυχαιοποιημένο με τρεις επαναλήψεις. Η σύγκριση των μέσων όρων πραγματοποιήθηκε με το κριτήριο Dunkan για P<0,05 με το στατιστικό πακέτο ΙΒΜ SPSS Statistics

60 Κεφάλαιο 4 Αποτελέσματα 53

61 4.1 Δημιουργία ανασυνδυασμένων πλασμιδίων Προκειμένου να πραγματοποιηθεί η γενετική τροποποίηση του καπνού με τα γονίδια PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 μέσω του A. tumefaciencs δημιουργήθηκαν δύο ανασυνδυασμένα πλασμίδια το part27-pvgstu2-2 και το part27-pvgstu3-3. Από την διπλή πέψη του pet- 28a-PvGSTU2-2 με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI και HindIII προέκυψαν δύο τμήματα DNA 684bp που αντιστοιχεί στο γονίδιο PvGSTU2-2 και του πλασμίδιο pet-28a 5.350bp ενώ, από την πέψη του part27-gstu4 με τα ίδια ένζυμα περιορισμού προέκυψαν δύο τμήματα, του φορέα part27 μαζί με την κασέτα έκφρασης bp και του γονιδίου GSTU4 (Eικόνα 4.1 και 4.2). Για την δημιουργία του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου part27-pvgstu3-3 πραγματοποιήθηκε διπλή πέψη του φορέα part27-gstu4 και του γονιδίου PvGSTU3-3 με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI και Xba. Ο φορέας part27 είχε μέγεθος bp και το γονίδιο PvGST bp (Eικόνα 4.3) Eικόνα 4.1 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% των προϊόντων διπλής πέψης του part27- GST4 και pet-28a-pvgstu2-2 με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI και HindIII για την απομόνωση του γονιδίου PvGSTU2-2 και του φορέα part27 με τα απαραίτητα στοιχεία της κασέτας έκφρασης 1: Προϊόντα πέψης του πλασμιδιακού φορέα part27-gstu4 2: Προϊόντα πέψης του πλασμιδιακού φορέα pet-28a-pvgstu2-2 Εικόνα 4.2 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% των προϊόντων διπλής πέψης του part27- GSTU4 και του γονιδίου PvGSTU2-2 με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI και ΗindIII μετά από τον καθαρισμό τους 1: Ο πλασμιδιακός φορέας part27 2: Γονίδιο PvGSTU2-2 Μ: Δείκτης μοριακών βαρών 1Kb. 54

62 Εικόνα 4.3 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% των προϊόντων διπλής πέψης του part27- GSTU4 και του γονιδίου PvGSTU3-3 με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI και XbaI μετά από τη απομόνωση και τον καθαρισμό τους Μ: Δείκτης μοριακών βαρών 1Κb 1: Ο πλασμιδιακός φορέας pαrt27 2: Γονίδιο PvGSTU3-3. Mετά απο την απομόνωση και τον καθαρισμό των γονιδίων και του φορέα part27 εφαρμόστηκε η αντίδραση της λιγάσης για την ένωση των μονόκλωνων συμπληρωματικών άκρων των γονιδίων και του φορέα. Η επιτυχία της ένωσης τoυ γονιδίου PvGSTU3-3 ή PvGSTU2-2 με τον φορέα part27 ελέγχθηκε με την τεχνική PCR. Το τμήμα DNA που ενισχύθηκε είχε μέγεθος 795bp για το γονίδιο PvGSTU2-2 και 786bp για το γονίδιο PvGSTU3-3. Στον φορέα part27 ο οποίος κόπηκε με τα ένζυμα περιορισμού ΕcorI-HindIII ή EcoRI-XbaI (αρνητικός μάρτυρας) δεν ενισχύθηκε η περιοχή αυτή (Εικόνα 4.4). Η οργάνωση των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων part27-pvgstu2-2 και part27-pvgstu3-3 μετά από την κλωνοποίηση των γονιδίων φαίνεται στην Εικόνα 4.5A και B. Εικόνα 4.4 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% των προϊόντων PCR για τον έλεγχο των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων part27-pvgstu3-3 και part27-pvgstu2-2 μετά από τις αντιδράσεις της λιγάσης Μ: Δείκτης μοριακών βαρών 1Kb 1: Ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27- PvGST3-3 2: Πλασμιδιακός φορέας part27 κομμένος με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI και Xba (αρνητικός μάρτυρας) 3: Αντίδραση χωρίς DNA εκμαγείο 4: Ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27- PvGSTU2-2 5: Αρνητικός μάρτυρας (Πλασμιδιακός φορέας part27 κομμένος με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI και HindIII ) 6: Δείγμα χωρίς DNA εκμαγείο 55

63 Εικόνα 4.5 Γενετικοί χάρτες ανασυνδυασμένων πλασμιδίων (A) part27-pvgstu3-3 part27- PvGSTU2-2 και (B) 4.2 Μετασχηματισμός δεκτικών κυτάρων E. coli με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια part27-pvgstu2-2 και part27-pvgstu3-3 Για τον πολλαπλασιασμό των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων part27-pvgstu2-2 και part27-pvgstu3-3 έγινε μετασχηματισμός κυττάρων E.coli του στελέχους Μach 1. Εν συνεχεία, ελέγχθηκαν με την τεχνική PCR πέντε αποικίες για το κάθε ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. O έλεγχος για το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-pvgstu2-2, έδειξε πως δύο αποικίες έχουν μετασχηματιστεί με αυτόv καθώς έφεραν μία ζώνη 795bp ενώ για το πλασμίδιο part27-pvgstu3-3 και οι πέντε αποικίες ήταν θετικές με μία ζώνη 786bp (Eικόνα 4.6). Οι θετικές αποικίες, ελέγχθηκαν περαιτέρω μέσω της ανάλυσης με ένζυμα περιορισμού. Εφόσον οι αποικίες μετασχηματίστηκαν με το πλασμίδιο pαrt27-pvgstu2-2 η πέψη με τα ένζυμα περιορισμού EcoRI και BamHI θα έδινε 4 ζώνες bp, 1276bp, 502bp και 188bp. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4.6, μόνο σε ένα κλώνο παρατηρήθηκε αυτό το πρότυπο ζωνώσεων. Από την πέψη του part27-pvgstu3-3 με το ένζυμο περιορισμού HindIII θα έπρεπε να προκύψουν 2 ζώνες bp και 246 bp. Στην Εικόνα 4.7 φαίνεται πως δύο κλώνοι ήταν θετικοί και εμφανίζουν τις ζώνες αυτές. Η πέψη του part27-gstu4 με τα 56

64 ένζυμα περιορισμού EcoRI και BamHI έδωσε τρεις ζώνες bp, 1276bp, 693bp και πέψη με το ένζυμο περιορισμού HindIII ένα γραμμικό μόριο του part27-gstu4. Το διαφορετικό πρότυπο ζωνώσεων του part27-gstu4, μετά από την πέψη του με τα ένζυμα περιορισμού που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο των πλασμιδίων pαrt27-pvgstu2-2 ή part27-pvgstu3-3, επιβεβαίωσε πως οι αποικίες μετασχηματίστηκαν με αυτά τα πλασμίδια και όχι με τον φορέα part27-gstu4 (Eικόνα 4.7). Τέλος, από την αλληλούχιση των επιλεγμένων κλώνων προέκυψε πως ένας κλώνος για κάθε ανασυνδυασμένο πλασμίδιο ήταν θετικός Εικόνα 4.6 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% των προϊόντων PCR για τον έλεγχο του μετασχηματισμού των κυττάρων E-coli με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια part27-pvgstu2-2 και part27-pvgstu3-3 Μ: Δείκτης μοριακών βαρών 1Κb 1-5: Προϊόντα PCR από 5 αποικίες πιθανά μετασχηματισμένων κυττάρων E-coli με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-pvgstu2-2 6: ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-pvgstu2-2 (θετικός μάρτυρας) 7-11: Προϊόντα PCR από 5 αποικίες πιθανά μετασχηματισμένων κύτταρων E-coli με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27- PvGSTU : Ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-pvgst3-3 (θετικός μάρτυρας) 13: Δείγμα χωρίς DNA εκμαγείο Εικόνα 4.7 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5% των προϊόντων αντίδρασης με ένζυμα περιορισμού, για τον έλεγχο των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων part27-pvgstu2-2 και part27- PvGSTU3-3. M: Δείκτης μοριακού βάρους 1Κb 1 και 2: Κλώνοι part27-pvgstu2-2 3: Ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-gst4 4-6 Κλώνοι part27-pvgstu3-3 7: Ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-gst4 57

65 4.3 Μετασχηματισμός του A. tumefaciens με τους φορείς γενετικής τροποποίησης part27-pvgstu2-2 και part27-pvgstu3-3 με την τεχνική της ηλεκτροδιήθησης O μετασχηματισμός του στελέχους GV3101 του A. tumefaciens πραγματοποιήθηκε με την τεχνική της ηλεκτροδιήθησης χρησιμοποιώντας τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια part27- PvGSTU2-2 και part27-pvgstu3-3 των κλώνων που βρέθηκαν θετικοί στην αλληλούχιση. 4.4 Γενετική τροποποίηση και παραγωγή διαγονιδιακών φυτών καπνού Ν. tabacum (cv Χanthi) μέσω του Α. tumefacies Oι φυλλικοί δίσκοι μετά από την συγκαλλιέργειά τους με τα στελέχη A. tumefaciens που έφεραν τα πλασμίδια part27-pvgstu2-2 ή part27 PvGSTU3-3 αναγεννήθηκαν σε υπόστρωμα ΜSR επιλογής με την πάροδο περίπου 4 εβδομάδων. Οι αναγεννημένοι βλαστοί μεταφέρθηκαν σε θρεπτικό υπόστρωμα ΜS σε δοχεία Magenta για περεταίρω ανάπτυξη και ριζοβολία. (Eικόνα 4.7 Α,Β,Γ και Δ). Η πρώτη ένδειξη πως οι μικροβλαστοί προέρχονται απο κύτταρα που είχαν ενσωματώσει στο γονιδίωμά τους την περιοχή του Τ-DNA, αποτέλεσε η κανονική εξέλιξη της αναγέννησης στους φυλλικούς δίσκους που συγκαλλιεργήθηκαν με το A. tumefaciens σε υπόστρωμα αναγέννησης με το αντιβιοτικό επιλογής (Εικόνα 4.8 Α και Β). Aντίθετα, οι φυλλικοί δίσκοι που δεν συγκαλλιεργήθηκαν με το A.tumefaciencs (αρνητικοί μάρτυρες) στον ίδιο τύπο υποστρώματος ήταν χλωρωτικοί με σημάδια νεκρώσεων (Eικόνα 4.8Γ). Συνολικά, προέκυψαν 21 πιθανά γενετικά τροποποιημένες ανεξάρτητες Τ0 σειρές με ανθεκτικότητα στην καναμυκίνη για το γονίδιο PvGSTU2-2 και 10 που φέρουν το γονίδιο PvGSTU

66 Α Β Γ Δ Εικόνα 4.7 Στάδια αναγέννησης φυλλικών δίσκων N. tabacum μετά απο συγκαλλιέργεια με το Α. tumefaciencs (A) Σχηματισμός κάλλου (Β) Σχηματισμός μικροβλαστών (Γ) Απομονωμένοι μικροβλαστοί σε θρεπτικό υπόστρωμα ΜS (Δ) Νεαρό πιθανά γενετικά τροποποιημένο φυτό καπνού Εικόνα 4.8 Αναγέννηση φυλλικών δίσκων καπνού μετά από 30 ημέρες σε υπόστρωμα επιλογής (MSR). Αναγέννηση φυλλικών δίσκων μετά από την συγκαλλιέργεια με μετασχηματισμένα στελέχη Α. tumefaciencs (Α) Με το γονίδιο PvGSTU2-2 (Β) Με το γονίδιο PvGSTU3-3 και (Γ) Φυλλικοί δίσκοι που δεν συγκαλλιεργήθηκαν με το Α. tumefaciencs (Αρνητικός μάρτυρας ως προς την γενετική τροποποίηση) 59

67 Εικόνα 4.9 Πιθανά γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού με το γoνίδιο (Α) PvGSTU2-2 και (B) PvGSTU3-3 μετά την πάροδο 2-4 μηνών σε υπόστρωμα ΜS επιλογής 4.5 Μοριακή ταυτοποίηση των πιθανά γενετικά τροποποιημένων φυτών καπνού με την τεχνική RT-PCR (Real time PCR) Η ταυτοποίηση των Τ0 διαγονιδιακών σειρών ως προς την ένθεση των διαγονιδίων PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3, πραγματοποιήθηκε με ποιοτική ανάλυση του γενωμικού DNA με την τεχνική RT-PCR. Συνολικά, από τις 21 T0 διαγονιδιακές σειρές με το γονίδιο PvGSTU2-2, 19 έφεραν την αναμενόμενη ζώνη των 853 bp (Εικόνα. 4.10) Κατά τον έλεγχο για την παρουσία του γονιδίου PvGSTU3-3, 9 από τις 10 Τ0 σειρές βρέθηκαν θετικές καθώς έφεραν το αναμενόμενο τμήμα DNA μεγέθους 822bp (Εικόνα 4.11) Στα Τ0 φυτά που έφεραν το γονίδιο PvGSTU2-2, το CT (κύκλος- κατώφλι) κυμάνθηκε από και στο θετικό μάρτυρα (γενετικά τροποποιημένο φυτό με το γονίδιο GSTU4), είχε τιμή 21 (Eικόνα 4.12 και Πίνακας 4.1). Τα γενετικά τροποποιημένα φυτά με το γονίδιο PvGSTU3-3 είχαν CT από 24 εως 27 και στο θετικό μάρτυρα (ταυτοποιημένο γενετικά τροποποιημένο φυτό με το γονίδιο PvGSTU2-2) η τιμή του ήταν 24 (Εικόνα 4.14 και Πίνακας 4.2). Στους αρνητικούς μάρτυρες (μη γενετικά τροποποιημένα φυτά) δεν καταγράφηκε CT ενώ στα φυτά που δεν είχαν ενσωματώσει το διαγονίδιο είτε το CT είχε τιμή μεγαλύτερη από 30 είτε όπως και στην περίπτωση του αρνητικού μάρτυρα δεν καταγράφηκε CT. 60

68 Μέσω της ανάλυσης των καμπυλών τήξης τεκμηριώθηκε η ταυτότητα του προϊόντος που πολλαπλασιάστηκε στη PCR. H Tm (θερμοκρασία τήξης) για τα T0 φυτά που φέρουν το γονίδιο PvGSTU2-2 ήταν περίπου 85 ο C όπως και στον θετικό μάρτυρα part27-pvgstu2-2 (Εικόνα 4.13 και Πίνακας 4.1). Στα Τ0 φυτά με το γονίδιο PvGSTU3-3 οι Τm ήταν περίπου 83 και 86 ο C όπως και στον θετικό μάρτυρα part27-pvgstu3-3 (Εικόνα 4.15 και Πίνακας 4.2). Εικόνα 4.10 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% των προϊόντων RT- PCR για τον έλεγχο των Τ0 διαγονιδιακών σειρών Ν. tabacum με το γονίδιο PvGSTU2-2. Μ: Δείκτης μοριακών βαρών 100 bp 1-21: Πιθανά γενετικά τροποποιημένα φυτά με το γονίδιο PvGSTU2-2 22: Ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27-pvgstu2-2 (Θετικός μάρτυρας) 23: Ταυτοποιημένο γενετικά τροποποιημένο φυτό με το γονίδιο GSTU4 (Θετικός μάρτυρας) 24: Μη γενετικά τροποποιημένο φυτό Ν. tabacum (Αρνητικός μάρτυρας) 25: Δείγμα χωρίς DNA εκμαγείο Εικόνα 4.11 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% των προϊόντων RT-PCR για τον έλεγχο των T0 διαγονιδιακών σειρών N. tabacum PvGSTU3-3 Μ: Δείκτης μοριακών βαρών 100bp 1-10: Πιθανά γενετικά τροποποιημένα φυτά με το γονίδιο PvGSTU3-3 11: Ανασυνδυασμένο πλασμίδιο part27- PvGSTU3-3 (θετικός μάρτυρας) 12: Ταυτοποιημένο γενετικά τροποποιημένο φυτό με το γονίδιο PvGSTU2-2 (θετικό μάρτυρας) 13: Μη γενετικά τροποποιημένο φυτό καπνού (αρνητικός μάρτυρας) 14: Δείγμα χωρίς DNA εκμαγείο 61

69 Πίνακας 4.1 Μετρήσεις C T και Tm των Τ0 σειρών με με το γονίδιο PvGSTU2-2 Πίνακας 4.2 Μετρήσεις C T και Tm των T0 σειρών με το γονίδιο PvGSTU3-3 Τ0 C T Tm NtGSTU ,49 85,15 NtGSTU ,65 84,25 NtGSTU ,02 85,25 NtGSTU ,54 85,75 NtGSTU ,05 85,75 NtGSTU ,91 85,85 NtGSTU ,52 85,75 NtGSTU ,02 85,83 NtGSTU ,7 85,6 NtGSTU ,94 85,6 NtGSTU ,89 85,65 NtGSTU ,36 85,6 NtGSTU ,43 85,35 NtGSTU , NtGSTU ,87 85,65 NtGSTU ,61 85,4 NtGSTU ,39 85,65 NtGSTU ,16 85,35 NtGSTU ,27 85,35 NtGSTU ,08 85,35 NtGSTU N.tab GSTU4 23,01 part27 PvGSTU2-2 85,15 N.tab wt H2O Τ0 C T Τm 1 Tm 2 NtGSTU ,5 86 NtGSTU ,33 83,4 85,75 NtGSTU , NtGSTU ,48 83,6 86 NtGSTU ,69 83,4 85,85 Nt GSTU3-3.6 NtGSTU ,44 83,6 86 NtGSTU ,34 83,4 85,75 NtGSTU ,07 83,35 85,75 NtGSTU ,94 83,5 85,9 NtGSTU part27- PvGSTU3-3 83,35 85,75 N.tab wt H2O 62

70 Εικόνα 4.12 Kαμπύλες πολλαπλασιασμού RT-PCR για την ταυτοποίηση των 21 T0 διαγονιδιακών σειρών καπνού με το γονίδιο PvGSTU2-2 (NtGSTU2-2) Εικόνα 4.13 Kαμπύλες τήξης RT-PCR για την ταυτοποίηση των 21 T0 διαγονιδιακών σειρών καπνού με το γονίδιο PvGSTU2-2 (NtGSTU2-2) 63

71 Εικόνα 4.14 Kαμπύλες πολλαπλασιασμού RT-PCR για την ταυτοποίηση των 10 διαγονιδιακών σειρών καπνού με το γονίδιο PvGSTU3-3 (NtGSTU3-3) T0 Εικόνα 4.15 Kαμπύλες τήξης RT-PCR για την ταυτοποίηση των 10 T0 διαγονιδιακών σειρών καπνού με το γονίδιο PvGSTU3-3 (NtGSTU3-3) 64

72 4.6 Επιλογή των Τ0 διαγονιδιακών σειρών καπνού με τα γονίδια PvGSTU2-2 PvGSTU Μέτρηση της ποσοτικής έκφρασης με την τεχνική q-rtpcr (ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου) Μέσω της σχετικής ποσοτικοποίησης προσδιορίστηκαν τα επίπεδα mrna του γονιδίου PvGSTU2-2. Το γονίδιο PvGSTU2-2 εκφράζεται σε όλες τις Τ0 σειρές καπνού. Εντούτοις, υψηλότερα επίπεδα έκφρασης παρουσίασε η σειρά ΝtGSTU2-2.9, της οποίας η έκφραση ήταν περίπου 2 φορές μεγαλύτερη (1,99±0,33) και οι σειρές NtGSTU και NtGSTU των οποίων η έκφραση ήταν περίπου μία φορά μεγαλύτερη (0,93±0,55 και 0,99±0,25 αντίστοιχα) σε σχέση με την Τ0 σειρά NtGSTU (calibrator) (Πίνακας 4.3). Τα αποτελέσματα της q-rtpcr ήταν ακριβή και με επαναληψιμότητα καθώς, η διαφορές των CT μεταξύ των επαναλήψεων του ίδιου δείγματος ήταν μικρή. Στον πίνακα 4.3 παρατίθενται οι μέσοι όροι και οι τυπικές αποκλίσεις των CT, τριών επαναλήψεων από ένα δείγμα για κάθε Τ0 σειρά, για τα γονίδια PvGSTU2-2 και β-ακτίνης. Η τυπική απόκλιση για το γονίδιο PvGSTU2-2 κυμάνθηκε από 0,02-0,34 και για το γονίδιο της β-ακτίνης από 0,03-0,42. Η ανάλυση των καμπυλών τήξης έδειξε πως κατά την αντίδραση PCR πολλαπλασιάζεται μόνο ένα εξειδικευμένο προϊόν του οποίου η Tm ήταν περίπου 85 ο C όπως και στον θετικό μάρτυρα (DNA από ταυτοποιημένο γενετικά τροποποιημένο φυτό με το γονίδιο PvSTU2-2) (Εικόνα 4.16). Τέλος τα προϊόντα της q-rtpcr αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση. Στα γενετικά τροποποιημένα φυτά οι ζώνες αντιστοιχούσαν στα αναμενόμενα μεγέθη των 220bp για το γονίδιο PvGSTU2-2 και 345bp για το γονίδιο της β-ακτίνης ενώ, στον αρνητικό μάρτυρα (μη γενετικά τροποποιημένο φυτό) υπήρχε μόνο η ζώνη 345bp. Στο δείγμα που δεν προστέθηκε cdna δεν παρατηρήθηκε καμία ζώνη (Εικόνα 4.17). 65

73 Πίνακας 4.3 Μέσοι όροι (μ) και τυπικές αποκλίσεις (s) των C T (κύκλος κατώφλι) τριών επαναλήψεων από ένα δείγμα για τα γονίδια PvGSTU2-2 και της β-ακτίνης, και η προκύπτουσα ποσοτική έκφραση (2 -ΔΔCT ±s ) για κάθε μία από τις 8 Τ0 σειρές Ν. tabacum Τ0 μ±s C T PvGSTU2-2 μ±s C T β-ακτίνη 2 -ΔΔCT ±s Nt GSTU ,11± 0,07 14,75± 0,16 0,73±0.17 Νt GSTU ,7± 0,08 15,99± 0,21 0,57 ±0,22 Νt GSTU ,64± 0,34 15,64± 0,42 0,93±0,55 Νt GSTU ,18 ±0,06 15,27 ±0,25 0,99±0,25 Νt GSTU ,99± 0,08 15,87 ±0,23 0,86±0,24 Νt GSTU ,98± 0,08 16,07± 0,33 1,99±0,33 Νt GSTU (Calibrator) 12,92± 0,03 17,02± 0,03 1,00±0,04 Νt GSTU ,37 ±0,02 15,45 ±0,08 0,60±0,08 Εικόνα 4.16 Kαμπύλες τήξης q-rtpcr για την ταυτοποίηση του προϊόντος που ενισχύεται στις 8 Τ0 διαγονιδιακές σειρές με το γονίδιο PvGSTU2-2 (ΝtGSTU2-2) 66

74 Εικόνα 4.17 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% των προϊόντων q-rtpcr για τον έλεγχο των T0 διαγονιδιακών σειρών NtGSTU2-2 ως προς το γονίδιο (A) PvGSTU2-2 και (Β) β-ακτίνης. Μ: Δείκτης μοριακών βαρών 100bp 1-8: T0 σειρές NtGSTU2-2 9: Μη γενετικά τροποποιημένο φυτό (αρνητικός μάρτυρας) 10: DNA ταυτοποιημένου γενετικά τροποποιημένου φυτού N.tabacum με το γονίδιο PvGSTU2-2 (θετικός μάρτυρας ) 11: Δείγμα χωρίς cdna εκμαγείο Μέτρησης της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας των ισοενζύμων PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 Από τις 9 Τ0 σειρές με τo γονίδιο PvGSTU3-3, οι ΝtGSTU3-3.1, ΝtGSTU3-3.4 και ΝtGSTU3-3.8 παρουσίασαν την μεγαλύτερη ενζυμική δραστικότητα σε σχέση με τα μη γενετικά τροποποιημένα φυτά και στους δύο τύπους υποστρωμάτων (CDNB και NBD-CI). Απο τις 8 σειρές με το γονίδιο PvGSTU2-2, 7 παρουσίασαν παρουσίασαν παρόμοια ενζυμική δραστικότητα στο υπόστρωμα NBD-CI με εξαίρεση την σειρά NtGSTU της οποίας η ενζυμική δραστικότητα ήταν διπλάσια σε σύγκριση με τις υπόλοιπες. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαίωσαν πως τα διαγονίδια κωδικοποιούν ενεργές πρωτεΐνες GST στις παραπάνω Τ0 διαγονιδιακές σειρές. 4.7 Φαινοτυπικός έλεγχος της έκφρασης των γονιδίων PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 στις Τ0 διαγονιδιακές σειρές καπνού In vitro δοκιμή της ανθεκτικότητας στην αλατότητα Προκειμένου να χαρακτηριστεί ο ρόλος του PvGSTU3-3 στην αντοχή των φυτών σε συνθήκες αλατότητας, οι Τ0 σειρές NtGSTU3-3.1 NtGSTU3-3.4 NtGSTU3-3.8 καθώς και μη γενετικά τροποποιημένα φυτά (αρνητικοί μάρτυρες) τοποθετήθηκαν σε θρεπτικό υπόστρωμα MS ή σε ΜS στο οποίο προστέθηκαν 200mM ΝaCl. Μετά από 30 ημέρες, αξιολογήθηκε η ανάπτυξη του ριζικού συστήματος. Δεν παρατηρήθηκαν φαινοτυπικές διαφορές μεταξύ των Τ0 σειρών και των μη γενετικά τροποποιημένων φυτών κάτω από φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης. Ωστόσο, στην συγκέντρωση των 200mM NaCl στις τρεις 67

75 Τ0 σειρές το ριζικό σύστημα αναπτύχθηκε περισσότερο σε σχέση με τα μη γενετικά τροποποιημένα φυτά (Εικόνα 4.17). Εικόνα 4.17 Ανάπτυξη του ριζικού συστήματος των Τ0 διαγονιδιακών σειρών και μη γενετικά τροποποιημένων φυτών μετά απο 30 ημέρες σε υπόστρωμα ΜS με 200 mm NaCl. 1:Μη γενετικά τροποποιημένo φυτό σε υπόστρωμα ΜS 2: Μη γενετικά τροποποιημένο φυτό σε υπόστρωμα ΜS με 200mM NaCl 3-5: οι τρεις Τ0 σειρές NtGSTU3-3.1 NtGSTU3-3.4 NtGSTU3-3.8 αντίστοιχα σε υπόστρωμα ΜS με 200mM NaCl In vitro και in vivo δοκιμή ανθεκτικότητας στο ζιζανιοκτόνο dimethenamid Το ζιζανιοκτόνο dimethenamid αναστέλλει κατά κύριο λόγο την ανάπτυξη του ριζικού συστήματος και δευτερευόντως του υπέργειου τμήματος των φυτών. Από την in vitro αξιολόγηση της αντοχής των Τ0 σειρών ΝtGSTU2-2.9, NtGSTU και NtGSTU καθώς και των μη γενετικά τροποποιημένων φυτών προέκυψε πως η επίδραση του ζιζανιοκτόνου dimethenamid και στις δύο συγκεντρώσεις (10 και 20mg/L) ήταν έντονη στο ριζικό σύστημα καθώς και στο μήκος του βλαστού των φυτών. Συγκεκριμένα, στα μη γενετικά τροποποιημένα φυτά παρατηρήθηκε πλήρη αναστολή της ανάπτυξης του ριζικού συστήματος και της αύξησης του υπέργειο τμήματος των φυτών και στις δύο συγκεντρώσεις του ζιζανιοκτόνου (10 και 20mg/L) (Εικόνα 4.18 Α και Β Εικόνα 4.19 Α και Β). Ωστόσο στις Τ0 σειρές με το γονίδιο PvGSTU2-2 παρά το γεγονός πως τα συμπτώματα από την τοξικότητα του ζιζανιοκτόνου ήταν έντονα, τα φυτά παρουσίασαν καλύτερη φαινοτυπική συμπεριφορά καθώς ανέπτυξαν ένα υποτυπώδες ριζικό σύστημα και είχαν μεγαλύτερο μήκος βλαστού και στις δύο συγκεντρώσεις του ζιζανιοκτόνου (Εικόνα 4.18 Α και Β Εικόνα 4.19 Α και Β). 68

76 Περεταίρω μελετήθηκε η επίδραση του ζιζανιοκτόνου dimethenamid σε in vivo συνθήκες στις συγκεντρώσεις 0,5 και 1mg/L, οι οποίες εφαρμόζονται συνήθως σε συνθήκες αγρού για τον έλεγχο των ζιζανίων. Η επίδραση του ζιζανιοκτόνου dimethenamid ήταν έντονη καθώς προκάλεσε μεγάλη μείωση στο μήκος του βλαστού και της ρίζας στα μη γενετικά τροποποιημένα φυτά (Εικόνα 4.20). Στις τρεις Τ0 διαγονιδιακές σειρές καταγράφηκε στατιστικώς σημαντικά μεγαλύτερο μήκος ρίζας και στις δύο συγκεντρώσεις του ζιζανιοκτόνου. Συγκεκριμένα στην συγκέντρωση των 0,5mg/L στις τρεις Τ0 σειρές ΝtGSTU2-2.9, NtGSTU και NtGSTU οι μέσοι όροι του μήκους της ρίζας ήταν 15,23, 10,06 και 14,93 cm αντίστοιχα, ενώ στα μη γενετικά τροποποιημένα φυτά 6,9 cm. Στην συγκέντρωση του 1mg/L το μήκος της ρίζας στις Τ0 σειρές ήταν 14,6 9,33 και 14,7cm αντίστοιχα ενώ στα φυτά άγριου τύπου 5,1 cm. (Εικόνα 4.21 Α και Β και Σχήμα 4.1Α). Το μήκος του βλαστού και στις δύο συγκεντρώσεις του ζιζανιοκτόνου ήταν μεγαλύτερο στις Τ0 σειρές σε σχέση με τα μη γενετικά τροποποιημένα φυτά. Εντούτοις, στατιστικώς σημαντικές διαφορές καταγράφηκαν μόνο στην συγκέντρωση του 1mg/L, όπου οι μέσοι όροι του μήκος του βλαστού των τριών Τ0 σειρών ήταν 6,5 cm στις σειρές ΝtGSTU2-2.9 και NtGSTU και 6,66 cm στην σειρά NtGSTU ενώ στα μη γενετικά τροποποιημένα φυτά το μήκος του βλαστού ήταν 4,4 cm (Εικόνα 4.21 Α και Β και Σχήμα 4.1Β). 69

77 Α Β Εικ 4.18 Αξιολόγηση της αντοχής των Τ0 διαγονιδιακών σειρών καπνού (ΝtGSTU2-2) σε in vitro σύνθηκες μετά από 30 ημέρες παραμονής σε υπόστρωμα MS με το ζιανιοκτόνου dimethenamid σε συγκέντρωση 10mg/L (Α) και (Β) 1: Μη γενετικά τροποποιημένο φυτό σε υπόστρωμα MS 2: Μη γενετικά τροποποιημένο φυτό σε υπόστρωμα MS με ζιζανιοκτόνο 3-5: ΝtGSTU2-2.9, NtGSTU και NtGSTU αντίστοιχα σε υπόστρωμα MS με ζιζανιοκτόνο 70

78 Α Β Εικόνα 4.19 Αξιολόγηση της αντοχής των Τ0 διαγονιδιακών σειρών καπνού (ΝtGSTU2-2) σε in vitro συνθήκες μετά από 30 ημέρες παραμονής σε υπόστρωμα MS με το ζιανιοκτόνου dimethenamid σε συγκέντρωση 20mg/L (Α) και (Β) 1: Μη γενετικά τροποποιημένο φυτό σε υπόστρωμα MS 2: Μη γενετικά τροποποιημένο φυτό σε υπόστρωμα MS με ζιζανιοκτόνο 3-5: ΝtGSTU2-2.9, NtGSTU και NtGSTU αντίστοιχα σε υπόστρωμα MS με ζιζανιοκτόνο 71

79 Εικόνα 4.20 Επίδραση του ζιζανιοκτόνου dimethanemid σε μη γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού στην συγκέντρωση των 0,5 και 1 mg/l σε in vivo συνθήκες Εικόνα 4.21 Αξιολόγηση σε in vivo συνθήκες της αντοχής των Τ0 διαγονιδιακών σειρών καπνού (ΝtGSTU2-2) καθώς και μη γενετικά τροποποιημένων φυτών 20 ημέρες μετά απο την εφαρμογή του ζιζανιοκτόνιου dimethenamid (Α) 0,5 mg/l (Β) 1mg/L 1: Μη γενετικά τροποποιημένο φυτό 2-4: ΝtGSTU2-2.9, NtGSTU και NtGSTU αντίστοιχα 72

80 Σχήμα 4.1 Σύγκριση της ανθεκτικότητας μεταξύ των Τ0 διαγονιδιακών σειρών καπνού (ΝtGSTU2-2) καθώς και μη γενετικά τροποποιημένων φυτών 20 ημέρες μετά από την εφαρμογή του ζιζανιοκτόνιου dimethenamid (0,5 mg/l και 1mg/L) σε in vivo συνθήκες με την μέτρηση του μήκους (Α) της ρίζας και (Β) του βλαστού. 1: μη γενετικά τροποποιημένo φυτό 2-4: ΝtGSTU2-2.9, NtGSTU και NtGSTU αντίστοιχα. Τα δεδομένα αντιστοιχούν στον μέσο όρο (± τυπικό σφάλμα). Οι τιμές των διαγονιδιακών σειρών που επισημαίνονται με * διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά από των αντίστοιχων φυτών άγριου τύπου στις αντίστοιχες συγκεντρώσεις σε P 0,05 73