Ένας σημαντικός αριθμός εργασιών που αφορούν τη μορφή αυτή του καρκίνου αναφέρεται στους μηχανισμούς της λεμφαγγειογένεσης, μιας διαδικασίας κρίσιμης

Transcript

1 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι ο καρκίνος του μαστού είναι ο συχνότερος καρκίνος του γυναικείου πληθυσμού στις αναπτυγμένες χώρες του δυτικού κόσμου [1]. Αποτελεί την πρώτη αιτία θανάτου, από κακόηθες νεόπλασμα, γυναικών ηλικίας ετών. Στην Ελλάδα αντιμετωπίζονται περίπου 4000 νέες περιπτώσεις καρκίνου του μαστού κάθε χρόνο. Η αιτιολογία του παραμένει άγνωστη,αλλά έχουν εντοπισθεί αρκετοί προδιαθεσικοί παράγοντες της νόσου όπως η πρώιμη εμμηναρχή, η καθυστερημένη εμμηνόπαυση, η ατεκνία, το θετικό οικογενειακό ιστορικό και όσον αφορά τον κληρονομικό καρκίνο του μαστού, η εντόπιση γονιδιακών μεταλλάξεων BRCA 1 και BRCA 2. Η μετάσταση ενός κακοήθους όγκου στους γειτονικούς λεμφαδένες μέσω των λεμφαγγείων είναι ένα κοινό και συχνό βήμα κατά την εξέλιξη του όγκου και σπουδαίος προγνωστικός παράγοντας για πολλούς τύπους καρκίνου. Ο καρκίνος του μαστού εξαπλώνεται κυρίως δια της λεμφικής οδού. Η ιστολογική εξέταση των λεμφαδένων της μασχάλης είναι ο πλέον αξιόπιστος, ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης της συμπεριφοράς και της τελικής έκβασης της νόσου και έχει αποδειχθεί ότι η κατάλληλη συστηματική θεραπεία (χημειοθεραπεία) που χορηγείται βασισμένη στη γνώση της διήθησης των μασχαλιαίων λεμφαδένων ελαττώνει την πιθανότητα θανάτου από την νόσο κατά 30% [2,3], (Πίνακας 1). Η πιθανότητα ανεύρεσης διηθημένων λεμφαδένων σχετίζεται ευθέως ανάλογα με το μέγεθος του πρωτοπαθούς όγκου [4,5]. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ακόμη και σε μικρούς σε μέγεθος όγκους ( <2 εκ.) υπάρχει ένα σημαντικό ποσοστό ασθενών με διηθημένους λεμφαδένες (Πίνακας 2).

2 Ένας σημαντικός αριθμός εργασιών που αφορούν τη μορφή αυτή του καρκίνου αναφέρεται στους μηχανισμούς της λεμφαγγειογένεσης, μιας διαδικασίας κρίσιμης για την πρόοδο της νόσου και την δημιουργία μεταστάσεων. Ένας πρωτοπαθής όγκος μπορεί να δώσει μετάσταση σε λεμφαδένες μέσω διάφορων μηχανισμών. Σε αυτούς συμπεριλαμβάνονται η καρκινική διήθηση λεμφαγγείων που βρίσκονται μέσα στο παρέγχυμα ενός καρκίνου, η καρκινική διήθηση προϋπαρχόντων λεμφαγγείων που βρίσκονται στην περιφέρεια του όγκου ή καρκινική διήθηση νεοσχηματιζόμενων λεμφαγγείων η δημιουργία των οποίων επάγεται από τον όγκο [6,7]. Όμως η σημασία αυτών των μηχανισμών δεν είναι γνωστή και μπορεί να ποικίλει μεταξύ διαφορετικών τύπων καρκίνου [6]. Πρόσφατες μελέτες δηλώνουν ότι η λεμφαγγειογένεση (ανάπτυξη νέων λεμφαγγείων που σχετίζονται με τον καρκίνο) η οποία επάγεται απο την δράση αυξητικών παραγόντων που παράγονται από τον όγκο, προάγει την λεμφαδενική μετάσταση [ 7,8,9,10 ]. Η λειτουργικότητα όμως αυτών των ενδοογκικών λεμφαγγείων αλλά και η παρουσία τους, από πολλούς αμφισβητείται και έχει οδηγήσει στην άποψη ότι τα λεμφαγγεία που βρίσκονται στην περιφέρεια του όγκου είναι μεγαλύτερης σημασίας για την δημιουργία λεμφαδενικών μεταστάσεων [11,12,13]. Μέχρι πρόσφατα η απουσία ειδικών δεικτών που θα επέτρεπαν την ταυτοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων των λεμφαγγείων σε σχέση με το ενδοθήλιο των αιμοφόρων αγγείων, αποτελούσε ένα ουσιαστικό ανασταλτικό παράγοντα για την μελέτη της λεμφαγγειογένεσης. Ο LYVE-1 είναι ένα ανάλογο του CD44,που λειτουργεί σαν υποδοχέας για το υαλουρονικό, εκφράζεται πρώιμα κατά την ανάπτυξη του λεμφαγγειακού ενδοθηλίου, θεωρείται από τους πλέον ειδικούς δείκτες για την ταυτοποίηση λεμφαγγείων και αντισώματα έναντι αυτού πολύ πρόσφατα έχουν δημιουργηθεί.

3 Ο σκοπός της παρούσας μελέτης περιλαμβάνει : Ανίχνευση και πιστοποίηση της παρουσίας του LYVE 1 στο πορογενές και λοβιακό ( διηθητικό, in situ ) καρκίνωμα, με εφαρμογή της ανοσοϊστοχημικής μεθόδου σε ιστούς μονιμοποιημένους και εγκλεισμένους σε παραφίνη. Ανίχνευση της παρουσίας του CD 31 / PECAM 1, το οποίο δεσμεύεται στα αιμοφόρα αγγεία σε περιπτώσεις αγγειογένεσης και μας βοηθά να διαφοροποιήσουμε την λεμφαγγειογένεση από την αγγειογένεση. Διερεύνηση της πιθανής συσχέτισης της έκφρασης του LYVE1 με τον βαθμό διαφοροποίησης των νεοπλασμάτων. Εξαγωγή συμπερασμάτων σχετικών με τη κλινική σημασία του LYVE1 στον καρκίνο του μαστού, 1) για την σημασία της έκφρασης του LYVE-1 σε σχέση με τις λεμφαδενικές μεταστάσεις του καρκίνου του μαστού και 2) για το ενδεχόμενο αυτός ο υποδοχέας να αποτελέσει μελλοντικό στόχο θεραπείας.

4 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

5 ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ Μοριακή Ανατομική - Ιστολογία Οι μαστοί είναι δυο ημισφαιρικά και κωνικά μορφώματα που βρίσκονται στο πρόσθιο θωρακικό τοίχωμα. Βρίσκονται μεταξύ 3 ης και 7 ης πλευράς επί της περιτονίας του μείζονος θωρακικού μυ. Είναι πιο πολύ ανεπτυγμένοι στις ένηβες γυναίκες και παρουσιάζουν αύξηση του όγκου τους στη διάρκεια της κύησης και της γαλουχίας. Είναι τροποποιημένοι αποκρινείς ιδρωτοποιοί αδένες που αναπτύσσονται κάτω από την επίδραση των ορμονών του φύλου. Σχηματίζονται από καταδύσεις της επιδερμίδας στο χόριο οι οποίες στα θηλαστικά αναπτύσσονται κατά μήκος μιας λοξής γραμμής (της γαλακτικής γραμμής ή ακρολοφίας ) που επεκτείνεται από την μασχαλιαία ως την βουβωνική περιοχή, σχηματίζοντας προς την μασχάλη μια πυραμοειδή προσεκβολή την ουρά του Spence. H αιμάτωση του μαστού προέρχεται από την μασχαλιαία αρτηρία μέσω της ακρωμιοθωρακικής, πλαγίας θωρακικής και υποπλάτιας αρτηρίας και από την υποκλείδιο αρτηρία μέσω της έσω θωρακικής (μαστικής). Επίσης δέχεται διατιτρόντες κλάδους από τις άνω μεσοπλεύριες αρτηρίες. Το φλεβικό δίκτυο είναι ιδιαίτερα πλούσιο κάτω από την θηλή και καταλήγει στις μεσοπλεύριες, μασχαλιαίες και έσω θωρακικές φλέβες. Η λεμφική παροχέτευση του μαστού,που παίζει σημαντικό ρόλο στην μετάσταση του καρκίνου,αρχίζει με μικρά λεμφικά πλέγματα μέσα από το μαζικό παρέγχυμα και την υποθηλαία περιοχή και κατευθύνεται στους λεμφαδένες κυρίως της σύστοιχης μασχάλης οι οποίοι διακρίνονται σε τρία χειρουργικά επίπεδα. Τα επίπεδα αυτά είναι το Ι, ΙΙ και ΙΙΙ ανάλογα με την εντόπιση τους επί τα εκτός,πίσω και επί τα εντός του ελάσσονος θωρακικού μυός. Μια μικρή οδός λεμφικής παροχέτευσης υπάρχει προς τον αντίθετο μαστό και προς την θήκη του ορθού κοιλιακού μυός. Επίσης μέσω του έσω τμήματος του αδένα παροχετεύεται η λέμφος μέσω διατιτραινόντων λεμφικών αγγείων προς τους έσω θωρακικούς και μεσοθωράκιους λεμφαδένες. Η νεύρωση του μαστού είναι ιδιαίτερα πλούσια στο σύμπλεγμα θηλής άλω από σωματικές αισθητικές απολήξεις ενώ το παρέγχυμα καλύπτεται κυρίως από το αυτόνομο συμπαθητικό σύστημα.

6 Εικόνα 1. Λεμφική παροχέτευση του μαστού. Εικόνα 2. Νεύρωση του μαστού.

7 Κάθε μαστός αποτελείται : α) από το δέρμα, β) από το μαζικό αδένα και γ) από το περιμαστικό λίπος. Το δέρμα του μαστού, όντας λεπτό και λείο, φέρει στην κεντρική μοίρα χαρακτηριστική προβολή, τη θηλή, που περιβάλλεται από περιοχή βαθύτερης χροιάς, την άλω. Επίσης, φέρει σμηγματογόνους και ιδρωτοποιούς αδένες, εκτός από το δέρμα των θηλών που δεν έχει ιδρωτοποιούς αδένες. Το δέρμα της άλω και των θηλών φέρει αφθονία ελαστικών και λείων μυϊκών ινών, που φερόμενες κυκλοτερώς και ακτινοειδώς, προκαλούν την σκλήρυνση των θηλών ( στύση ) κατά το θηλασμό και την προστριβή τους. Το περιμαστικό λίπος περιβάλλει το μαζικό αδένα, γεμίζει τα μεταξύ των ακρολοφιών του κοιλώματα και διαιρείται με ινώδεις δεσμίδες σε λοβία. Ο μαζικός αδένας αποτελείται από λοβούς του σύνθετου σωληνοκυψελοειδούς τύπου, των οποίων η λειτουργία έγκειται στην έκκριση του γάλακτος για την διατροφή του νεογνού. Κάθε λοβός, χωρίζεται από τους υπόλοιπους από πυκνό συνδετικό ιστό και πλούσιο λιπώδη ιστό, ώστε στην πραγματικότητα κάθε λοβός να αποτελεί έναν αδένα με το δικό του απεκκριτικό γαλακτοφόρο πόρο, και εκβάλλει με ιδιαίτερο τμήμα στη θηλή, η οποία έχει στόμια, με διάμετρο το καθένα περίπου 0,5 mm. Η ιστολογική δομή των μαζικών αδένων ποικίλλει ανάλογα με το φύλο, την ηλικία και την φυσιολογική κατάσταση (Εικόνα 3) [14]. Εικόνα 3. Σχηματική παράσταση του μαστού.

8 Ανάπτυξη του μαστού Πριν από την ήβη, οι μαζικοί αδένες αποτελούνται από γαλακτοφόρους κόλπους ( ή λήκυθο ) και αρκετούς κλάδους αυτών των κόλπων, τους γαλακτοφόρους πόρους. Στις γυναίκες κατά τη διάρκεια της εφηβείας οι μαζικοί αδένες αυξάνονται σε μέγεθος και αναπτύσσουν την θηλή. Στους άντρες, οι μαζικοί αδένες παραμένουν επίπεδοι. Η διόγκωση των μαστών κατά τη διάρκεια της εφηβείας είναι αποτέλεσμα της συσσώρευσης λιπώδους και συνδετικού ιστού, καθώς και της αυξημένης ανάπτυξης και διακλάδωσης των γαλακτοφόρων πόρων. Οι παραπάνω διεργασίες οφείλονται στην αύξηση του ποσού των οιστρογόνων της ωοθήκης κατά την εφηβεία. Η χαρακτηριστική δομή του αδένα το λοβίο - στην ενήλικη γυναίκα αναπτύσσεται στα άκρα των μικρότερων πόρων ( τελικοί εξωλόβιοι πόροι ). Ένα μαζικό λοβίο αποτελείται από αρκετούς ενδολοβιακούς πόρους ( τελικά σωληνάρια ) που καταλήγουν μέσα σε ένα τελικό πόρο. Κάθε λοβίο είναι σκηνωμένο σε χαλαρό συνδετικό ιστό. Τα λοβία χωρίζονται μεταξύ τους από πυκνότερο και λιγότερο κυτταροβριθή συνδετικό ιστό. Κάθε λοβός του μαστού αποτελεί ένα εκτεταμένο σύστημα διακλαδιζόμενων μεγάλων πόρων οι οποίοι εισχωρούν βαθειά μέσα στον ινολιπώδη ιστό.κάθε πόρος επενδύεται από μια συνεχή εσωτερική στιβάδα κυβοειδών ή κυλινδρικών επιθηλιακών κυττάρων με ωοειδείς πυρήνες και από μια ασυνεχή εξωτερική στιβάδα μυοεπιθηλιακών κυττάρων με διαυγές κυτταρόπλασμα.το σύστημα των μεγάλων αυτών πόρων καταλήγει σε ένα τελικό πόρο ο οποίος διακλαδίζεται σαν σταφύλι σε ένα δίκτυο μικρών τυφλών τελικών σωληναρίων (αδενοκυψέλες) τα οποία επενδύονται από μονόστιβο κυβοειδές επιθήλιο που περιβάλλεται από πυκνά διατεταγμένα μυοεπιθηλιακά κύτταρα. Το κάθε μεμονωμένο δίκτυο τελικών σωληναρίων (αδενοκυψελών) μαζί με τον τελικό πόρο που τα χορηγεί αποτελούν το λόβιο του μαζικού αδένα ή πορολοβιακή μονάδα των τελικών πόρων (TDLU). Οι τελικοί πόροι μπορεί να έχουν ένα ενδολοβιακό και ένα εξωλοβιακό τμήμα. Οι γαλακτοφόροι κόλποι επενδύονται από πολύστιβο πλακώδες επιθήλιο στα εξωτερικά τους στόμια. Αυτό το επιθήλιο μεταπίπτει ταχέως σε πολύστιβο κυλινδρικό ή κυβοειδές επιθήλιο. Η επένδυση των γαλακτοφόρων πόρων και των τελικών πόρων αποτελείται από μονόστιβο κυβοειδές επιθήλιο που περιβάλλεται από πυκνά διατεταγμένα μυοεπιθηλιακά κύτταρα ( Εικόνα 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ).

9 Εικόνα 4. Ιστολογική εικόνα του μαζικού αδένα. Στα δεξιά φαίνεται ένας μεγάλος πόρος, ενώ στα αριστερά τα λοβία. Μεταξύ αυτών των δομών φαίνεται ένα κολλαγονώδες στρώμα. Εικόνα 5. Λόβια αδρανούς μαζικού αδένα.

10 Εικόνα 6. Λόβια αδρανούς μαζικού αδένα τα οποία διαχωρίζονται από άφθονο ινώδη συνδετικό ιστό (βέλη). Εικόνα 7. Λόβιο αδρανούς μαζικού αδένα με τις αδενοκυψέλες ή τελικά σωληνάρια (TDLU), το εξειδικευμένο στρώμα και τον ενδολοβιακό αθροιστικό πόρο (βέλος).

11 Εικόνα 8. Λόβιο ενεργού μαζικού αδένα ή τελική πορολοβιακή μονάδα (TDLU). Εικόνα 9. Λόβιο ενεργού μαζικού αδένα ή τελική πορολοβιακή μονάδα (TDLU).

12 Εικόνα 10. Επιθηλιακά κύτταρα κυβοειδή σε ένα στοίχο επενδύουν το τοίχωμα των αδενοκυψελών ενός λοβίου του μαζικού αδένα (βέλη). Εικόνα 11. Ένας στοίχος μυοεπιθηλιακών κυττάρων βρίσκεται κάτω από το επιθήλιο των πόρων του μαζικού αδένα (βέλος).

13 Εικόνα 12. Μυοεπιθηλιακά κύτταρα κάτω από το επιθήλιο ενός εξωλοβιακού πόρου του μαζικού αδένα (βέλος). Εικόνα 13. Ανοσοϊστοχημική χρώση για ακτίνη η οποία εκφράζεται από τα μυοεπιθηλιακά κύτταρα που εντοπίζονται υποεπιθηλιακά στους πόρους του μαζικού αδένα.

14 Όπως συμβαίνει με όλα τα επιθήλια, το επιθήλιο του μαστού επικάθεται σε μια συνεχή στιβάδα εξειδικευμένης ουσίας τη βασική μεμβράνη, η οποία διαχωρίζει τα επιθηλιακά κύτταρα από το διάμεσο συνδετικό ιστό ή στρώμα. Η βασική μεμβράνη αποτελείται από κολλαγόνο τύπου IV, λαμινίνη και πρωτεογλυκάνες, που είναι ειδικά της βασικής μεμβράνης μακρομόρια αλλά και συστατικά που απαντώνται και στο στρώμα όπως η τενασίνη C και η ινονεκτίνη. Είναι πλέον αποδεκτό ότι η σύσταση της εξωκυττάριας ουσίας καθορίζει σε μεγάλο βαθμό το μικροπεριβάλλον των επιθηλιακών κυττάρων που εμπλέκεται σε σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες, τόσο κατά την διάρκεια της εμβρυικής ανάπτυξης όσο και μετά, όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η μετανάστευση και η απόπτωση ( Εικόνα 14 ) [14,15]. Ο συνδετικός ιστός που περιβάλλει τις αδενοκυψέλες περιέχει πολλά λεμφοκύτταρα και πλασματοκύτταρα. Ο πληθυσμός των πλασματοκυττάρων αυξάνεται σημαντικά προς το τέλος της κύησης και είναι υπεύθυνος για την έκκριση ανοσοσφαιρινών ( εκκριτικής IgA ) που παρέχει παθητική ανοσία στο νεογνό. Η ιστολογική δομή αυτών των αδένων υπόκειται σε μικρές μεταβολές κατά την διάρκεια του εμμηνορρυσιακού κύκλου, δηλαδή γύρω στο χρόνο της ωορρηξίας φαίνεται πολλαπλασιασμός στα κύτταρα, που έχουν οι πόροι και τα εκκριτικά τμήματα. Αυτές οι μεταβολές συμπίπτουν με τον χρόνο κατά τον οποίο παρουσιάζεται εκριτική αιχμή στα επίπεδα των οιστρογόνων στην κυκλοφορία. Η εντονότερη ενυδάτωση του συνδετικού ιστού κατά των προεμμηνορρυσιακή φάση προκαλεί διόγκωση των μαστών. Εικόνα 14. Η σύσταση της εξωκυττάριας ουσίας.

15 Η θηλή έχει κωνικό σχήμα και εξωτερικά καλύπτεται από πολύστιβο πλακώδες κερατινοποιημένο επιθήλιο που συνέχεται με αυτό της επιδερμίδας του παρακείμενου δέρματος. Το επιθήλιο της εδράζεται σε στιβάδα συνδετικού ιστού που είναι πλούσιος σε λείες μυικές ίνες ( όπως αναφέρθηκε παραπάνω ), ( Εικόνα 15 ). Πολύστοιβο πλακώδες επιθήλιο Γαλακτοφόροι πόροι Εικόνα 15. Ιστολογική εικόνα της θηλής. Διακρίνεται το πολύστιβο κερατινοποιημένο επιθήλιο.

16 Εμβρυϊκή ανάπτυξη Η εμβρυϊκή ανάπτυξη του μαστού χαρακτηρίζεται από τέσσερα στάδια : 1) στην 4 η εμβρυϊκή εβδομάδα παρατηρείται ταινιοειδής πάχυνση του εκτοδέρματος ( επιδερμίδα ) η λεγόμενη μαζική γραμμή ή ακρολοφία, 2) στην 7 η εμβρυϊκή εβδομάδα η γραμμή εκτείνεται και στις δυο πλευρές του σώματος από τη ρίζα του άνω άκρου μέχρι την περιοχή του κάτω άκρου, 3) στην 10 η - 12 η εμβρυϊκή εβδομάδα, το μέγιστο τμήμα εξαφανίζεται λίγο μετά τον σχηματισμό του, ενώ το μικρό τμήμα διατηρείται και εισχωρεί στο υποκείμενο παρέγχυμα, ενώ σχηματίζονται προσεκβολές, οι οποίες παράγουν μικρές, συμπαγείς εκβλαστήσεις, 4) στα τέλη της προγεννητικής ζωής οι προσεκβολές, αποκτούν αυλό, σχηματίζοντας τους γαλακτοφόρους πόρους, οι οποίοι καταλήγουν σε ένα βοθρίο ( μετατρέπεται σε θηλή, με πολλαπλασιασμό του μεσεγχύματος ), ( Εικόνα 16, 17 ). Εικόνα 16. (α) και (β). Τομές αναπτυσσόμενου μαζικού αδένα τον 3ο και τον 8ο μήνα της κύησης, αντίστοιχα. (γ) Σχηματική απεικόνιση των θέσεων των υπεράριθμων θηλών ( η μπλε γραμμή δηλώνει τη θέση των μαζικών γραμμών ).

17 Εικόνα 17. Εμβρυϊκή ανάπτυξη του μαζικού αδένα. Οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στα διάφορα αναπτυξιακά γεγονότα είναι πολύπλοκοι και περιλαμβάνουν μεταξύ των άλλων τη δράση μεταγραφικών παραγόντων όπως ο FGF, ομοιοτικών ( Hox ) γονιδίων και παρα ομοιοτικών ( para Hox ) γονιδίων που παίζουν ρόλο στα διάφορα στάδια της μορφοποίησης των οργάνων π.χ. Νκχ πνεύμονες κ.α. [17]. Πολύ σημαντικό ρόλο στην μορφοποίηση και διαφοροποίηση κατά την εμβρυογένεση παίζει το μονοπάτι Wnt β-catenin ( Εικόνα 18 ).

18 Εικόνα 18. Το μονοπάτι Wnt-catenin. Οι πρωτεϊνες αλληλεπιδρούν με τους υποδοχείς Frizzled και μέσω της ενδοκυττάριας πρωωτεϊνης Dishevelled αναστέλλουν την GSK-3. Αύτο έχει ως συνέπεια την αναστολή της αποδόμησης και την αύξηση των ενδοκυττάριων επιπέδων της και ενεργοποιεί τον μεταγραφικό παράγοντα TGF. Επίσης, σπουδαίο ρόλο στην προαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ανάπτυξης και μορφοποίησης παίζει ο μεταγραφικός παράγοντας TGF beta1 ( TFG-b1 ).

19 ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΑ ΤΟΥ ΜΑΖΙΚΟΥ ΑΔΕΝΑ Οι όγκοι είναι οι πλέον σημαντικές βλάβες του μαστού. Αν και μπορεί να προέλθουν από το συνδετικό ιστό ή το επιθήλιο, είναι οι τελευταίοι που προκαλούν τα συνήθη νεοπλάσματα του μαστού. Οι συχνότεροι όγκοι είναι το ινοαδένωμα, το πορογενές και λοβιακό καρκίνωμα ( διηθητικό, in situ ) και λιγότερο μυελοειδές, βλεννώδες κ.α.. ΚΑΛΟΗΘΕΙΣ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΕΣ ΠΑΘΗΣΕΙΣ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ Μεγάλη ποικιλία αλλοιώσεων στο επίπεδο των πόρων και των λοβίων παρατηρείται συχνά στον μαζικό αδένα. Οι αλλοιώσεις αυτές έχουν διαιρεθεί σε τρεις ομάδες σύμφωνα με τον βαθμό κινδύνου που ενέχουν για την ανάπτυξη καρκινώματος του μαστού : Μη υπερπλαστικές αλλοιώσεις του μαστού, υπερπλαστικές αλλοιώσεις και άτυπη υπερπλασία. ΜΗ ΥΠΕΡΠΛΑΣΤΙΚΕΣ ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΜΑΖΙΚΟΥ ΑΔΕΝΑ (ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ ΙΝΟΚΥΣΤΙΚΗΣ ΝΟΣΟΥ) Πρόκειται για τρεις κύριες μορφολογικές αλλοιώσεις : 1. Κύστεις ( δημιουργούνται από διάταση των λοβίων ) 2. Ίνωση ( οι κύστεις συχνά σπάνε, απελευθερώνεται το περιεχόμενο τους στο γύρω στρώμα με αποτέλεσμα φλεγμονή και ανάπτυξη ουλώδους συνδετικού ιστού ). 3. Αδένωση (είναι η αύξηση του αριθμού των αδενοκυψελών ανά λόβιο) Ινοαδενώματα Το ινοαδένωμα είναι κατά πολύ ο συνηθέστερος καλοήθης όγκος του μαστού. Μια απόλυτη ή σχετική αύξηση της οιστρογονικής δραστηριότητας θεωρείται ότι παίζει έναν ρόλο στην ανάπτυξή του. Τα ινοαδενώματα συνήθως εμφανίζονται σε νεαρές γυναίκες, με αιχμή συχνότητας την τρίτη δεκαετία της ζωής. Βάσει των μακροσκοπικών τους χαρακτηριστικών, τα ινοαδενώματα εμφανίζονται ως μονήρης, ελεύθερα κινούμενος όζος διαμέτρου 1 έως 10 cm. Σπάνια, απαντώνται πολλαπλοί όγκοι και εξίσου σπάνια, υπερβαίνουν τη διάμετρο των 10 cm ( γιγαντιαίο ινοαδένωμα ). Αδρομερώς, είναι συμπαγή, με ένα ομοιόμορφο καστανόλευκο χρώμα.

20 Ιστολογικά, υπάρχει μια χαλαρή ινοβλαστική βασική στιβάδα, η οποία περιέχει ποροειδή ή αδενικά διαστήματα είναι ανοιχτά, στρογγυλά ή ωοειδή και αρκετά κανονικά ( περισωληναριακό ινοαδένωμα ), άλλα συμπιέζονται από εκτεταμένη αναπαραγωγή της βασικής στιβάδας, έτσι ώστε να φαίνονται σαν εντομές ή αστεροειδείς σχηματισμοί ( ενδοσωληναριακό ινοαδένωμα ), (Εικόνα 19) [18]. Εικόνα 19. Μικρής ισχύος μικροσκοπική εικόνα ενός ινοαδενώματος του μαστού. Εικόνα 20. Αλλοιώσεις ινοκυστικής νόσου,κυστικά διατεταμένοι πόροι.

21 Εικόνα 21. Αλλοιώσεις ινοκυστικής νόσου, κύστεις, ίνωση και εστίες αποτιτάνωσης (βέλος). ΥΠΕΡΠΛΑΣΤΙΚΕΣ ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ ΧΩΡΙΣ ΑΤΥΠΙΑ Στον φυσιολογικό μαστό μόνο μυοεπιθηλιακά κύτταρα και ένας στοίχος επιθηλιακών κυττάρων βρίσκονται πάνω από τον βασικό υμένα των πόρων και των αδενοκυψελών των λοβίων. Οι υπερπλαστικές αλλοιώσεις είναι ομάδα αλλοιώσεων που χαρακτηρίζονται από υπερπλασία του επιθηλίου των πόρων (πάνω από δύο στοίχοι κυττάρων) και/η του στρώματος χωρίς κυτταρολογικές αλλοιώσεις ενδεικτικές κακοήθειας. Σε αυτήν την κατηγορία υπάγονται οι ακόλουθες οντότητες: Η μέτρια ή σοβαρή επιθηλιακή υπερπλασία, η σκληρυντική αδένωση, η ακτινωτή ουλή, τα θηλώματα ( Εικόνα 22, 23, 24 )

22 ΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΤΟΥ ΜΑΖΙΚΟΥ ΑΔΕΝΑ Εικόνα 22. Σοβαρού βαθμού επιθηλιακή υπερπλασία των πόρων. Εικόνα 23. Αλλοιώσεις ήπιας επιθηλιακής υπερπλασίας των πόρων.

23 Εικόνα 24. Κυστική διάταση των πόρων και ίνωση στα πλαίσια ινοκυστικής νόσου. ΥΠΕΡΠΛΑΣΤΙΚΕΣ ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΜΑΖΙΚΟΥ ΑΔΕΝΑ ΜΕ ΑΤΥΠΙΑ Πρόκειται για αλλοιώσεις που χαρακτηρίζονται από έντονο πολλαπλασιασμό και ατυπία των επιθηλιακών κυττάρων των πόρων και των λοβίων που δεν πληρούν όμως όλα τα ποσοτικά και ποιοτικά χαρακτηριστικά του in situ καρκινώματος ( Εικόνα 25 ). Σε αυτή την κατηγορία συμπεριλαμβάνονται : 1.Η άτυπη επιθηλιακή υπερπλασία των πόρων. 2.Η άτυπη επιθηλιακή υπερπλασία των λοβίων. ΚΛΙΝΙΚΗ ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΚΑΛΟΗΘΩΝ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΩΝ ΑΛΛΟΙΩΣΕΩΝ Οι μη υπερπλαστικές αλλοιώσεις δεν αυξάνουν τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκινώματος του μαστού. Οι υπερπλαστικές αλλοιώσεις αυξάνουν ελαφρά τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου. Οι υπερπλαστικές αλλοιώσεις με ατυπία αυξάνουν αρκετά τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου.

24 Εικόνα 25. Άτυπη επιθηλιακή υπερπλασία των πόρων. ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΕΣ ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ ΚΑΙ ΚΙΝΔΥΝΟΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΜΑΣΤΟΥ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΟΜΑΔΑ ΜΗ ΥΠΕΡΠΛΑΣΤΙΚΕΣ ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ ΥΠΕΡΠΛΑΣΤΙΚΕΣ ΧΩΡΙΣ ΑΤΥΠΙΑ ΑΤΥΠΗ ΥΠΕΡΠΛΑΣΙΑ ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ ΣΧΕΤΙΚΟΣ ΚΙΝΔΥΝΟΣ 0,9 ΜΗ ΑΥΞΗΜΕΝΟΣ 1,6 ΕΛΑΦΡΑ ΑΥΞΗΜΕΝΟΣ 4,4 ΣΗΜΑΝΤΙΚΑ ΑΥΞΗΜΕΝΟΣ

25 ΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΤΟΥ ΜΑΖΙΚΟΥ ΑΔΕΝΑ Εισαγωγή επιδημιολογία Στον αιώνα που πέρασε έγιναν εντατικές ερευνητικές προσπάθειες με στόχο τη διαλεύκανση της αιτιολογίας, την πρόληψη και την αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού. Κατά τη διάρκεια της τελευταίας μόνο δεκαετίας δημοσιεύτηκαν περισσότερες από ερευνητικές μελέτες, καθώς και αρκετά βιβλία σχετικά με το θέμα [19-20]. Αντίστοιχα, η επιδημιολογία του καρκίνου του μαστού έχει μελετηθεί τα τελευταία 20 χρόνια περισσότερο από εκείνη οποιουδήποτε άλλου νοσήματος. Αρκετοί παράγοντες κινδύνου έχουν επαρκώς τεκμηριωθεί, αλλά οι μεγάλες διακρατικές και διαχρονικές διαφοροποιήσεις του νοσήματος δεν φαίνεται ότι μπορούν να ερμηνευτούν ικανοποιητικά με βάση τους παράγοντες αυτού. Κατά συνέπεια, η πρωτογενής πρόληψη του νοσήματος παρουσιάζει ακόμη τόσες δυσκολίες όσες και η κατανόηση της αιτιολογίας του. Κάθε χρόνο υπολογίζεται ότι σε όλον τον κόσμο γίνεται πρωτοδιάγνωση καρκίνου του μαστού περίπου σε 1 εκατ. γυναίκες, εκ των οποίων το 60% αφορά κατοίκους αναπτυγμένων χωρών. Ειδικότερα, στην Β. Ευρώπη και στη Β. Αμερική, η επίπτωση του καρκίνου κυμαίνεται περίπου σε 100 περιπτώσεις ανά γυναίκες ανά έτος και η δια βίου πιθανότητα νόσησης 1 : 9. Στο 1% των περιπτώσεων παρατηρείται σύγχρονη ανάπτυξη καρκίνου και στους δυο μαστούς, ποσοστό που αυξάνεται μέχρι και 10% αν γίνει βιοψία ρουτίνας στον άλλο μαστό κατά τη διάρκεια της μαστεκτομής. Σε περίπτωση ετερόπλευρης νόσου, συχνότερα προσβάλλεται ο αριστερός μαστός, γεγονός που αποδίδεται στο μεγαλύτερο σχετικά μέγεθος του αριστερού μαζικού αδένα και συνεπώς στην αυξημένη πιθανότητα εξαλλαγής των κυττάρων του αντίστοιχου μαστού.

26 Αιτιολογία παθογένεια Η αιτιολογία του καρκίνου του μαζικού αδένα είναι πολυπαραγοντική. I. Βιολογικοί παράγοντες Aναπαραγωγικοί παράγοντες Η ατεκνία, η πρώιμη εμμηναρχή, η όψιμη εμμηνόπαυση και προχωρημένη ηλικία της πρώτης τελειόμηνης εγκυμοσύνης αποτελούν γνωστούς και γενικά αποδεκτούς παράγοντες κινδύνου για τον καρκίνο του μαστού. Νεότερα δεδομένα συνηγορούν ότι η μεγάλη γονιμότητα, η ηλικία των επόμενων - πλην της πρώτης - κυήσεως και ο θηλασμός αποτελούν επιπρόσθετους, ανεξάρτητους παράγοντες κινδύνου μικρής σημασίας. Ηλικία εμμηναρχής Από μελέτες υπολογίζεται ότι η μείωση του κινδύνου για κάθε χρόνο καθυστέρησης της εμμηναρχής ανέρχεται σε 10 20%, πιθανόν επειδή η πρώιμη εμμηναρχή σχετίζεται με πιο παρατεταμένη έκθεση του μαστού σε υψηλότερα επίπεδα κυκλοφορούντων οιστρογόνων. Ηλικία εμμηνόπαυσης Η ηλικία εμμηνόπαυσης συνδέεται σταθερά με αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του μαστού [20]. Υπολογίζεται ότι ο κίνδυνος αυξάνεται κατά 3% για κάθε χρόνο καθυστέρησης της εμμηνόπαυσης. Η μείωση του κινδύνου φαίνεται ότι οφείλεται στην πρωϊμότερη διακοπή της ωοθηκικής λειτουργίας και επομένως, του χρόνου έκθεσης του μαστού σε υψηλά επίπεδα των στεροειδών ορμονών. Ηλικία πρώτης τελειόμηνης κύησης και τεκνοποίηση Σε γενικές γραμμές, η ηλικία της μητέρας κατά την πρώτη τελειόμηνη κύηση αποτελεί σημαντικό παράγοντα κινδύνου : όσο μικρότερη είναι η ηλικία της πρώτης εγκυμοσύνης τόσο μικρότερος είναι ο κίνδυνος μεταγενέστερης ανάπτυξης της νόσου [20]. Υπολογίζεται ότι γυναίκες με πρώτη εγκυμοσύνη πριν από την ηλικία των 20 χρόνων έχουν 30% μικρότερο κίνδυνο σε σχέση με γυναίκες που απέκτησαν παιδί μετά την ηλικία των 35 χρόνων.

27 Θηλασμός Ο παρατεταμένος χρόνος θηλασμού φαίνεται να προσφέρει κάποια προστασία, αλλά η δράση είναι ασθενής και περιορίζεται στον προεμμηνοπαυσιακό καρκίνο. Τα ευρήματα όμως με τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου δεν είναι σταθερά πιθανόν λόγω αδυναμίας των διαφόρων μελετών να εκτιμήσουν με ακρίβεια την έκθεση στον παράγοντα αυτό. Αποβολές και εκτρώσεις Η διερεύνηση αυτών στον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του μαστού βασίστηκε στην υπόθεση ότι η ατελής διαφοροποίηση των μαστικών κυττάρων, μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία του ιστού για κακοήθη εξαλλαγή. Τα πρόσφατα αποτελέσματα μελετών δείχνουν ότι μάλλον δεν υπάρχει συσχέτιση ιστορικού αποβολών και εκτρώσεων με τον καρκίνο του μαστού [20]. Ενδογενείς ορμόνες Πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι τα οιστρογόνα και η προγεστερόνη προάγουν την καρκινογένεση, ενώ η ταμοξιφαίνη με την αντι οιστρογονική της δράση στον μαστό φαίνεται ότι μειώνει τον κίνδυνο. Άλλες ορμόνες που επηρεάζουν την καρκινογένεση είναι τα ανδρογόνα, η προλακτίνη και η σωματομεδίνη ( IGF ) [20, 22]. II. Περιβαλλοντικοί παράγοντες Διατροφή Τα ερευνητικά αποτελέσματα είναι αντικρουόμενα και οι γνώμες διίστανται ως προς την ύπαρξη κρίσιμων περιόδων, στη διάρκεια των οποίων οι διατροφικοί παράγοντες μπορεί να έχουν καθοριστική σημασία για την ανάπτυξη καρκινογενετικών διεργασιών. Οινόπνευμα Κάπνισμα Σωματική άσκηση Ακτινοβολία

28 III. Γενετικοί παράγοντες Οικογενειακό ιστορικό Ο καρκίνος του μαστού εμφανίζει οικογενή συρροή πρώτου βαθμού ( μητέρα ή αδερφή ) που πάσχει από καρκίνο του μαστού έχουν δυο με τρεις φορές υψηλότερο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του μαστού [20]. Γυναίκες με ιστορικό καρκίνου του μαστού σε δυο συγγενείς πρώτου βαθμού έχουν σαφώς υψηλότερο κίνδυνο (Πίνακας 3). Πίνακας 3. Εκτίμηση της πιθανότητας μετάλλαξης σε γυναίκες φορείς BRCA1 με βάση το οικογενειακό ιστορικό και την ηλικία διάγνωσης της νόσου. Οικογενειακό ιστορικό και ηλικία Πιθανότητα μετάλλαξης διάγνωσης της νόσου (χρόνια) BRCA1 (%) Ένα προσβεβλημένο μέλος Καρκίνος μαστού, < Καρκίνος μαστού, Καρκίνος μαστού, Καρκίνος μαστού, < 50 7 Αδελφές Δυο με καρκίνου μαστού, < Δυο με καρκίνο μαστού, Καρκίνος μαστού < 50, καρκίνος ωοθήκης < Δυο με καρκίνο ωοθήκης, < Οικογένειες 3 μέλη με καρκίνο μαστού, < μέλη με καρκίνο μαστού, 1 μέλος με καρκίνο ωοθήκης 82 2 μέλη με καρκίνο του μαστού, 2 μέλη με καρκίνο ωοθήκης 92 Shattuck Eidens και συνεργ. (1995), τροποποιημένο Γενετικοί παράγοντες Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί μια από τις εκδηλώσεις των συνδρόμων Li Fraumeni, Muir Torre, Peutz Jeghers, καθώς επίσης και της νόσου Cowden, της αταξίας τηλαγγειεκτασίας, του οικογενούς καρκίνου του μαστού και του οικογενούς συνδρόμου καρκίνου μαστού ωοθήκης.

29 Σύνδρομο οικογενούς καρκίνου Li- Fraumeni Το σύνδρομο LFS είναι σπάνιο, αλλά σημαντικό οικογενές σύνδρομο πολλαπλών καρκίνων. Η αρχική περιγραφή του συνδρόμου έγινε πριν από 20 χρόνια από τους Frederick Li και Joseph Fraumeni. Το σύνδρομο κληρονομείται με αυτοσωμικό επικρατούν χαρακτήρα, ενώ ως υπεύθυνο γονίδιο ταυτοποιήθηκε στις αρχές του Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53, που έχει μεγάλη διεισδυτικότητα. Οι φορείς του μεταλλαγμένου p53, έχουν περισσότερες από 90% πιθανότητες να παρουσιάσουν καρκίνο μέχρι την ηλικία των 60 χρόνων και 50% μέχρι την ηλικία των 30 χρόνων, ενώ ο κίνδυνος που διατρέχει ο γενικός πληθυσμός στην τελευταία αυτή ηλικιακή κατηγορία είναι 1%. Νόσος του Cowden Είναι σπάνιο κληρονομικό νόσημα, που χαρακτηρίζεται από θηλώματα στα χείλη και το στοματοφάρυγγα, οσχεοειδή γλώσσα, υψηλή υπερώα, υποπλασία της κάτω γνάθου, δυσπλασίες του ΚΝΣ, καρκίνο του μαστού και καρκίνο του θυρεοειδούς αδένα. Μεταβιβάζεται με αυτοσωμική επικρατούσα μορφή κληρονομικότητας ενώ το 30% των γυναικών με αυτό το νόσημα εμφανίζουν αμφοτερόπλευρο και σε νεαρή ηλικία. Με γονιδιακή μελέτη εντοπίστηκε το υπεύθυνο γονίδιο PTEN που βρίσκεται στο μακρύ σκέλος του χρωμοσώματος 10 (10q23). Αταξία τηλαγγειεκτασία Η ΑΤ είναι σπάνιο νόσημα που κληρονομείται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο χαρακτήρα. Το γονίδιο της ΑΤ εντοπίζεται στο μακρύ σκέλος του χρωμοσώματος 11 (11q22-23). Αναφέρεται ότι το 10% των ασθενών αναπτύσσουν κακοήθεια του λεμφοενδοθηλιακού συστήματος. Ενώ, επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι οι φορείς του γονιδίου έχουν 3,9 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο από εκείνον του γενικού πληθυσμού να αναπτύξουν καρκίνο του μαστού.

30 Γενετικές μεταλλαγές και πολυμορφισμοί Υπάρχουν τουλάχιστον 4 γόνοι που συνδέονται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του μαστού και αντανακλούν υψηλής διαπεραστικότητας γονιδιακές μεταλλαγές : BRCA1, BRCA2, p53 και ο γόνος PTEN ( phosphate and tensin homologue deleted on chromosome ten ). Αρκετά άλλα πολυμορφικά συστήματα γόνων χαμηλής διαπερατότητας, ιδίως όσα εμπλέκονται στον μεταβολισμό των καρκινογόνων ουσιών ( π.χ. του κυτοχρώματος P450 1A1 CYP1A1, των - NAT1 και - ΝΑΤ2 ) και των γενετήσιων ορμονών ( π.χ. του ενζύμου του κυτοχρώματος Ρ450 CYP17, CYP19, το πρωτο ογκογονίδιο HRAS 1 και το γονίδιο της ΑΤ ) ( Πίνακας 4 ). Πίνακας 4. Γονίδια και κληρονομικός καρκίνος του μαστού*. Γονίδιο Χρωμοσωμική Συχνότητα Διεισδυτικότητα Κίνδυνος (%) θέση γονιδίου γονιδίου BRCA1 17q2.1 Πολύ χαμηλή Υψηλή 5 BRCA2 13q Πολύ χαμηλή Υψηλή 3 ;BRCA3 ;8p ; ; ; p53 17p1.13 Πολύ χαμηλή Υψηλή < 1 Cowden 10q Πολύ χαμηλή Υψηλή << 1 Υποδοχέας X q Πολύ χαμηλή ; ; ανδρογόνων ΑΤΜ 11q Υψηλή Χαμηλή 7 HRAS1 11p 1.55 Υψηλή Χαμηλή 9 VNTR ΑΤΜ : γονίδιο της αταξίας τηλεαγγειετασίας, HRAS1 VNTR : πολυμορφική θέση για το γονίδιο HRAS1. * M. Greene (1997), τροποποιημένο

31 ΜΗ ΔΙΗΘΗΤΙΚΟΣ ( IN SITU ) ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΜΑΖΙΚΟΥ ΑΔΕΝΑ Ως μη διηθητικός ( in situ ) καρκίνος του μαστού χαρακτηρίζεται η αντικατάσταση του φυσιολογικού επιθηλίου των πόρων ή των λοβιακών μονάδων με καρκινικά κύτταρα, που όμως δεν ξεπερνούν το όριο της βασικής μεμβράνης των επιθηλιακών κυττάρων και κατ επέκταση δεν υπάρχει διήθηση του γύρω υποστρώματος. Με βάση τα χαρακτηριστικά των νεοπλασματικών κυττάρων, τις ιστολογικές δομές, τα in situ νεοπλάσματα του μαστού ταξινομούνται σε πορογενή και λοβιακά [23]. Λοβιακός μη διηθητικός καρκίνος ( LCIS ) Αποτελεί τη σπανιότερη μορφή καρκινώματος in situ του οργάνου. Η νόσος εμφανίζεται σε γυναίκες της προ εμμηνοπαυσιακής ηλικίας και σχεδόν πάντα είναι πολυεστιακή. Κλινικά, η αλλοίωση είναι μη ψηλαφητή, με αποτέλεσμα η αναγνώρισή της να αποτελεί τυχαίο μικροσκοπικό εύρημα. Συγκεκριμένα, παρατηρείται απόφραξη της πορολοβιακής μονάδας από συμπαγές μάζες νεοπλασματικών κυττάρων, χαλαρής σύνδεσης και χαμηλού βαθμού κακοήθειας, που προκαλούν μικρή, αλλά εμφανή, διεύρυνση των αυλών. Η αρχιτεκτονική της πορο λοβιακής μονάδας δεν διαταράσσεται αισθητά. Τα νεοπλασματικά κύτταρα είναι εντυπωσιακά ομοιόμορφα : μικρά, σφαιρικά, με ασαφή όρια, μικρούς πυκνοχρωματιστούς πυρήνες και μη ευδιάκριτους πυρηνίσκους συχνά, περιέχουν κυτταροπλασματικά σφαιρίδια βλεννώδους ουσίας. Οι μιτώσεις είναι σπάνιες. Το λοβιακό καρκίνωμα in situ είναι βραδείας εξέλιξης και η μετάπτωσή του σε διηθητικό καρκίνο του μαστού διατρέχει μια περίοδο χρόνων [23], ( Εικόνα 26, 27 ).

32 Εικόνα 26. Λοβιακό καρκίνωμα. Οι τελικοί πόροι κ' οι μικροί πόροι του μαστού διατείνονται απο τα κύτταρα του όγκου (LCIS). Εικόνα 27. Λοβιακό in situ καρκίνωμα μαστού: παρατηρείται διάταση και ενδοαυλική απόφραξη των αδενοκυψελών του λοβίου από ένα ομοιόμορφο κακοήθη κυτταρικό πληθυσμό.

33 Πορογενές μη διηθητικό καρκίνωμα ( DCIS ) Το μη διηθητικό πορογενές καρκίνωμα του μαστού είναι πολύ πιο συχνό από το λοβιακό καρκίνωμα in situ. Ο όγκος, με βάση την αρχιτεκτονική του δομή, διακρίνεται σε διάφορους ιστολογικούς τύπους : comedo ( φαγεσωρικό ), ηθμοειδή, μικροθηλώδη, θηλώδη, συμπαγή και μεικτά. Από αυτούς ξεχωρίζει ο τύπος comedo για τα μεγάλα νεοπλασματικά κύτταρα, τη συχνή παρουσία κεντρικής νέκρωσης και την επιθετική βιολογική συμπεριφορά. Οι υπόλοιποι τύποι αποτελούνται από μικρά νεοπλασματικά, χωρίς κεντρική νέκρωση και λιγότερο επιθετική συμπεριφορά. Υπάρχει η τάση απλοποίησης της ταξινόμησής του μη διηθητικού πορογενούς καρκινώματος του μαστού σε δυο βασικούς τύπους, comedo ( μεγαλοκυτταρικός τύπος ) και μη comedo ( μικροκυτταρικός τύπος ) [18,23], (Εικόνα 28). Εικόνα 28. Ιστολογική εικόνα του DCIS. Comedo καρκίνωμα in situ Εκδηλώνεται ως μικρή ψηλαφητή σκληρία ή / και αιμορραγική έκκριση από τη θηλή. Η μικροσκοπική εξέταση του όγκου είναι χαρακτηριστική : άναρχες μάζες από μεγάλα νεοπλασματικά κύτταρα αποφράσσουν τους αυλούς της πορο λοβιακής μονάδας, διευρύνοντας τη φυσιολογική τους διάμετρο έως και 10 φορές. Τα νεοπλασματικά αυτά κύτταρα, εκτός από μεγάλα, είναι ακανόνιστου σχήματος και διαθέτουν άφθονο κυτταρόπλασμα.

34 Οι πυρήνες είναι και αυτοί μεγάλοι, πολύμορφοι, βαθυχρωματικοί ή κενοτοπιώδεις και εμφανίζουν απώλεια του προσανατολισμού. Οι πυρηνίσκοι είναι ευδιάκριτοι, ενώ οι μιτώσεις είναι πολλές και συχνά άτυπες. Οι κακοήθεις ενδοαυλικές μάζες του καρκινώματος in situ τύπου comedo σπάνια μόνον παρουσιάζουν συμπαγή τύπο ανάπτυξης ( συμπαγές μεγαλοκυτταρικός καρκίνος in situ ) και σχεδόν πάντα εμφανίζουν κεντρική νέκρωση ( γνήσιο comedο μεγαλοκυτταρικός καρκίνος in situ ). Χαρακτηριστικό της πάθησης είναι η έξοδος νεκρωμένου υλικού, μετά από άσκηση ελαφράς πίεσης. Ο τύπος comedo είναι ιδιαίτερα επιθετικός όγκος και, όταν δεν αντιμετωπισθεί θεραπευτικά, εξελίσσεται σε διηθητικό καρκίνωμα στις μισές τουλάχιστον περιπτώσεις ( 50% ) και σε διάστημα τριών μόλις χρόνων [18,23], ( Εικόνα 29 ). Εικόνα 29. Ιστολογική εικόνα φαγεσωρικού τύπου (comedo) DCIS. Η παρουσία κεντρικής νέκρωσης σημειώνεται με βέλος. Μη comedo καρκίνωμα in situ Τα περισσότερα καρκινώματα του τύπου αυτού είναι μη ψηλαφητά και ανιχνεύονται από τις μικρές επασβεστώσεις στη μαστογραφία. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα νεοπλασματικά κύτταρα είναι μικρά, ομοιόμορφα, σφαιροειδή και εμφανίζουν ελάχιστο κυτταρόπλασμα. Οι πυρήνες είναι και αυτοί μικροί, σφαιρικοί ή ωοειδείς συνήθως υπερχρωματικοί και περιέχουν μικρούς πυρηνίσκους. Οι μιτώσεις είναι σπάνιες [18,23], ( Εικόνα 30 ). Γενικά, ο τύπος μη comedo είναι λιγότερο επιθετικός από τον τύπο comedo αφού, χωρίς θεραπεία, 30% των περιπτώσεων μεταπίπτουν σε διηθητικό καρκίνωμα του μαστού μετά από χρόνια ( Πίνακας 5).

35 Εικόνα 30. Ιστολογική εικόνα μη φαγεσωρικού τύπου (non - comedo) DCIS. Πίνακας 5. Σύγκριση χαρακτηριστικών φαγεσωρικού και μη φαγεσωρικού DCIS. Μη Φαγεσωρικός φαγεσωρικοί Βαθμός κακοήθειας Υψηλός Χαμηλός Ανευπλοειδία Συχνά Όχι συχνά Βαθμός υπερπλασίας Υψηλός Χαμηλός c-erb-b2 / neu (+) Συχνά Όχι συχνά p53 (+) Συχνά Όχι συχνά Μικροδιήθηση Πολύ συχνή Λιγότερο συχνή Ασβεστοποιήσεις Casting Λεπτά κοκκία ανώμαλα κοκκία Οι διάφοροι τύποι πορογενούς μη comedo καρκινώματος in situ, σκιαγραφούνται παρακάτω : Ηθμοειδής τύπος : Αποτελείται από μικρά, ομοιόμορφα νεοπλασματικά κύτταρα που διαμορφώνουν αδενοειδείς σχηματισμούς και επιθηλιοειδείς γέφυρες, χωρίς αγγειοσυνδετικούς άξονες. Τα παραπάνω εμφανίζονται ομοιόμορφα διατεταγμένα σε διευρυμένους αυλούς πορο λοβιακών μονάδων. Ο τύπος αυτός έχει την τάση να αναπτύσσεται σε περισσότερα του ενός τεταρτημόρια του μαστού ( Εικόνα 31 ).

36 Εικόνα 31. Ιστολογική εικόνα ηθμοειδούς τύπου DCIS. Μικροθηλώδης τύπος : Χαρακτηρίζεται από μικρές θηλώδεις προσεκβολές των νεοπλασματικών κυττάρων, χωρίς αγγειοσυνδετικούς άξονες. Συχνά, ο τύπος αυτός συνυπάρχει με τον ηθμοειδή (Εικόνα 32). Εικόνα 32. Ιστολογική εικόνα μικροθηλώδους τύπου DCIS.

37 Θηλώδης τύπος : Υπάρχει άναρχος ενδοαυλικός πολλαπλασιασμός των κυττάρων, που προσλαμβάνει τη μορφή θηλωδών προσεκβολών, με τυπικούς αγγειοσυνδετικούς άξονες. Ο θηλώδης τύπος, που είναι από τους πιο σπάνιους, έχει την τάση να αναπτύσσεται σε γυναίκες μεγάλης ηλικίας και να εκδηλώνεται με αιματηρή έκκριση από τη θηλή ( Εικόνα 33 ). Εικόνα 33. Ιστολογική εικόνα θηλώδους τύπου DCIS. Συμπαγής τύπος : Άναρχες μάζες από μικρά ομοιόμορφα νεοπλασματικά κύτταρα αποφράσσουν και διευρύνουν τους αυλούς της πορο λοβιακής μονάδας, χωρίς να συνοδεύονται από κεντρική νέκρωση ( Εικόνα 34 ). Εικόνα 34. Ιστολογική εικόνα συμπαγούς τύπου DCIS.

38 ΔΙΗΘΗΤΙΚΟ ΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΤΟΥ ΜΑΖΙΚΟΥ ΑΔΕΝΑ Διηθητικό πορογενές καρκίνωμα, μη ειδικού τύπου Ο μη ειδικός τύπος διηθητικού καρκινώματος του μαστού είναι ο επικρατέστερος του οργάνου ( αποτελεί το 75% όλων των καρκινωμάτων ) και χαρακτηρίζεται από την έλλειψη ειδικών και σταθερών ιστολογικών γνωρισμάτων ( not otherwise specified NOS, no special type NST ). Ο όγκος αναπτύσσεται ως ψηλαφητή μάζα, μεγέθους 1 3 cm με πετρώδη σκληρία και ανώμαλο περίγραμμα. Η μάζα είναι κινητή, αν και παραμελημένες μορφές της νόσου παρουσιάζουν συμφύσεις στο δέρμα και στο δέρμα και στο μείζονα θωρακικό μυ, προκαλώντας συρρίκνωση και ρυτίδωση του μαστού με εισολκή της θηλής. Εντυπωσιακή είναι η διατομή της μάζας με νυστέρι, καθώς αυτή δίνει την ίδια αίσθηση κριγμού που δίνει η διατομή άγουρου απιδιού ( παλιά ονομασία σκίρρο καρκίνωμα ). Μακροσκοπικά, ο όγκος εμφανίζεται λευκόφαιος και λεπτοκοκκιώδης, συχνά με διάσπαρτα κίτρινα στίγματα ή μικρές κίτρινες γραμμώσεις που αντιπροσωπεύουν ελαστικές ίνες. Τα όρια του όγκου είναι εμφανώς ανώμαλα και φέρουν λεπτές ακτινοειδείς προσεκβολές ( αστεροειδές περίγραμμα ). Μικροσκοπικά, αναγνωρίζονται διάφορες ιστολογικές εικόνες, ως απόρροια μιας ποικιλότροπης διαπλοκής των επιθηλιακών με τα μεσεγχυματικά στοιχεία του όγκου ( Εικόνα 35 ). Έτσι, ενώ μερικοί όγκοι χαρακτηρίζονται από αφθονία καρκινικών κυττάρων και ελάχιστα μεσεγχυματικά στοιχεία, άλλοι όγκοι αποτελούνται από ελάχιστα καρκινικά κύτταρα και άφθονο μεσεγχυματικό υπόστρωμα ινώδους συνδετικού ιστού και άλλοι όγκοι παρουσιάζουν τάση διαμόρφωσης άτυπων αδενικών και σωληνωδών σχηματισμών σε υπόστρωμα, που η ποσότητα του διαφέρει από περίπτωση σε περίπτωση. Συχνή είναι η υαλοειδής εκφύλιση του υποστρώματος, η παρουσία λεμφοκυτταρικής αντίδρασης και η ελάττωση γύρω από εκφορητικούς πόρους και αγγεία. Τα νεοπλασματικά κύτταρα του μη ειδικού τύπου διαφέρουν ως προς το μέγεθος, το σχήμα, την ποσότητα του κυτταροπλάσματος και τα χαρακτηριστικά του πυρήνα. Υπάρχει η τάση διήθησης, των αιμο λεμφοφόρων αγγείων, του περιμαστικού λίπους και σπανιότερα του μείζονα θωρακικού μυ. Ο όγκος είναι πολύ επιθετικός και η 5ετής επιβίωση για ασθενείς όλων των σταδίων είναι μόνο 60% [18,23].

39 Εικόνα 35. Διηθητικό πορογενές καρκίνωμα μη ειδικού τύπου. Ομάδες καρκινικών κυττάρων συμπαγείς ή σωληνοειδείς αναπτύσσονται μέσα σε σε στρώμα με έντονη ινοπλασία. ΚΥΡΙΟΙ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΟΙ ΤΥΠΟΙ: 1. Μη ειδικού τύπου 2. Μυελοειδές 3. Βλεννώδες 4. Σωληνώδες 5. Μεταπλαστικό 6. Νόσος Paget της θηλής.

40 Εικόνα 36. Μυελοειδούς τύπου αδενοκαρκίνωμα μαστού. Αθροίσεις καρκινικών κυττάρων περιβάλλονται από έντονο λεμφοκυτταρικό διήθημα. Εικόνα 37. Βλεννώδους τύπου καρκίνωμα μαστού. Καρκινικά αδένια ή συμπαγείς καρκινικές ομάδες επιπλέουν σε βλεννώδες υπόστρωμα (βέλη).

41 Διηθητικό λοβιακό καρκίνωμα Η συχνότητα του διηθητικού λοβιακού καρκινώματος κυμαίνεται σε διάφορες αναφορές από 1 έως 20%, αλλά οι διαφορές αυτές οφείλονται σε προβλήματα ταξινόμησης κυρίως και όχι σε γεωγραφικούς ή περιβαλλοντικούς παράγοντες. Πάντως, μια συχνότητα γύρω στα 10% φαίνεται να ανταποκρίνεται περισσότερο στην πραγματικότητα. Ο όγκος είναι πολυεστιακός και συχνά αμφοτερόπλευρος. Σε μακροσκοπική εξέταση εμφανίζει σκιρρώδη σύσταση και ασαφές περίγραμμα. Εκδηλώνεται ως μια ψηλαφητή σκληρία ή ως διάχυτη αλλοίωση μη ανιχνεύσιμη ψηλαφητά ή μαστογραφικά. Αναγνωρίζονται διάφοροι τύποι διηθητικού λοβιακού καρκίνου του μαστού : κλασικός, βοτρυοειδής, συμπαγής, σωληνολοβιακός, πολύμορφος και μεικτός τύπος. Οι τύποι αυτοί, αν και διαφέρουν ως προς την αρχιτεκτονική τους δομή, αποτελούνται από όμοιου τύπου κύτταρα : μικρά, ομοιόμορφα, μάλλον σφαιρικά, χαλαρής σύνδεσης, με ομαλούς πυρήνες ( Εικόνα 38 ). Κλασικός τύπος : Ο τύπος αυτός είναι ο πιο συχνός. Τα νεοπλασματικά κύτταρα έχουν την τάση να διατάσσονται σε σειρές του ενός κυττάρου ( γραμμική διάταξη, ινδιάνικη φάλαγγα ) ή στροβιλοειδώς γύρω από τα αγγεία και υπολείμματα πόρων ή λοβίων ( Εικόνα 39 ). Εικόνα 38. Διηθητικό λοβιακό καρκίνωμα.

42 Βοτρυοειδής τύπος : Διάταξη σε πυκνές σφαιροειδείς αθροίσεις των είκοσι ή περισσότερων νεοπλασματικών κυττάρων. Σωληνολοβιακός τύπος : Μικροσωληνώδεις σχηματισμοί σε γραμμική ή στοχοτική διάταξη κλασικού τύπου. Συμπαγής τύπος : Διάταξη νεοπλασματικών κυττάρων σε συνεχείς επιφάνειες με παρεμβολή ελάχιστου υποστρώματος. Πολύμορφος τύπος : Διάχυτος τύπος ανάπτυξης με σοβαρού βαθμού ατυπίες των κυττάρων. Μεικτός τύπος : Συνδυασμός δυο ή περισσοτέρων μορφών [18,23]. Εικόνα 39. Διηθητικό λοβιακό καρκίνωμα μαστού με διάταξη των καρκινικών κυττάρων δίκην ινδιάνικης φάλαγγος.

43 Ιστολογική διαβάθμιση - Grading Η κατάταξη των όγκων του μαστού αποσκοπεί στον ακριβέστερο προσδιορισμό της επιβίωσης, δεδομένης της μεγάλης ποικιλομορφίας ιστολογικών εικόνων και της διαφορετικής βιολογικής συμπεριφοράς. Διακρίνονται σε καλώς, μετρίως και κακώς διαφοροποιημένα ή σε χαμηλού βαθμού κακοήθειας (καλώς και μετρίως διαφοροποιημένα) και υψηλού βαθμού κακοήθειας (κακώς διαφοροποιημένα και αδιαφοροποίητα καρκινώματα). Από τα διάφορα σχήματα που έχουν κατά καιρούς προταθεί, αποτελεσματικότερο φαίνεται να είναι το σύστημα διαβάθμισης των Bloom and Richardson, όπως αυτό τροποποιήθηκε από τους Elston and Ellis. Το σχήμα αυτό, γνωστό και ως τροποποιημένο Nottingham, αξιολογεί τρία κύρια ιστολογικά γνωρίσματα : το ποσοστό διαμόρφωσης των σωληνωδών σχηματισμών, το βαθμό πολυμορφισμού των πυρήνων και τον αριθμό των μιτώσεων ανά 10 οπτικά πεδία μεγάλης μεγέθυνσης. Ο ιστολογικός βαθμός I αντιστοιχεί στους βαθμούς (score) 3 5, ο ιστολογικός βαθμός II στους 6 7 και ο ιστολογικός βαθμός III στους 8 9. Χρησιμοποιώντας το σύστημα αυτό διαβάθμισης σε μια προοπτική μελέτη με διηθητικό καρκίνωμα, η δεκαετής επιβίωση ήταν 90%, 60% και 40% για τους ιστολογικούς βαθμούς I, II και III αντίστοιχα [18]. Σταδιοποίηση προγνωστικοί παράγοντες Αναμφισβήτητα, ο σημαντικότερος προγνωστικός παράγοντας στον καρκίνο του μαστού είναι η ανατομική έκταση της νόσου. Τα συστήματα σταδιοποίησης που χρησιμοποιούνται ευρέως σήμερα είναι το σύστημα της Αμερικανικής Μικτής Επιτροπής για τον Καρκίνο (AJCC), που δημοσιεύτηκε το 1992 και το σύστημα ΤΝΜ, όπου Τ αναφέρεται στον όγκο, το Ν στους λεμφαδένες και το Μ στη μετάσταση ( Πίνακας 5 ). Επιπλέον, στην προσπάθεια εξατομίκευσης της πρόγνωσης και σχεδιασμού της καταλληλότερης επικουρικής θεραπείας έχει ανακαλυφθεί ένας μεγάλος αριθμός μοριακών δεικτών με προγνωστική σημασία. Οι προγνωστικοί παράγοντες επιβίωσης (prognostic factors) διακρίνονται σε τέσσερις βασικές κατηγορίες : i) παράμετροι που εκφράζουν τις αντιρροπούμενες δυνάμεις μεταξύ ρυθμού πολλαπλασιασμού και ρυθμού απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων, ii) παράμετροι που εκφράζουν την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να διασπούν την κυτταρική συνοχή ή την συνοχή μεταξύ καρκινικών κυττάρων υποστρώματος, iii) παράμετροι που εκφράζουν την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να δημιουργούν νέο αγγειακό και λεμφαγγειακό δίκτυο και iv) παράμετροι που εκφράζουν την ανοσολογική αντίδραση του οργανισμού στον όγκο και την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να διαφεύγουν από την ανοσολογική επιτήρηση.

44 Οι προγνωστικοί παράγοντες ανταπόκρισης στη θεραπεία (predictive factors) αναγνωρίζονται οι εξής κύριες κατηγορίες : i) παράγοντες που αφορούν την επιδιόρθωση των βλαβών του DNA, μετά από έκθεση των καρκινικών κυττάρων σε κυτταροτοξικούς παράγοντες, ii) παράγοντες που καθορίζουν την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να σχηματίζουν νέα αγγεία και λεμφαγγεία, iii) παράγοντες που αναστέλλουν ή επάγουν τη διαδικασία της απόπτωσης και iv) παράγοντες που αφορούν το μεταβολισμό του όγκου και του ενδο νεοπλασματικού περιβάλλοντος ( οξυγόνωση, ph ). Πίνακας 5. Σταδιοποίηση καρκίνου του μαστού (AJCC, 1992) Ορισμός του συστήματος ΤΝΜ Πρωτοπαθής όγκος Τχ** Τ0 Τis Τ 1 Τ 2 Τ 3 Τ 4 Δεν είναι δυνατή η εκτίμηση του πρωτοπαθούς όγκου Μη εμφανής πρωτοπαθής όγκος Ενδοθηλιακό (in situ) καρκίνωμα : ενδοπορικό καρκίνωμα, λοβιακό καρκίνωμα in situ, νόσος Paget της θηλής με απουσία όγκου Διάμετρος όγκου ίση ή μικρότερη των 2 εκ. Τ 1a διάμετρος όγκου 0,5 εκ. Τ 1b διάμετρος όγκου > 0,5 και < 1 εκ. Τ 1c διάμετρος όγκου > 1 και < 2 εκ. Διάμετρος όγκου > 2 εκ. και < 5 εκ. Διάμετρος όγκου > 5 εκ. Όγκος οποιαδήποτε διαμέτρου με επέκταση στο θωρακικό τοίχωμα ή το δέρμα Τ 4a επέκταση του όγκου στο θωρακικό τοίχωμα Τ 4b οίδημα (συμπεριλαμβανομένης της όψης εν είδει φλοιού πορτοκαλιού), εξέλκωση του δέρματος του μαστού, ή δορυφόρα δερματικά οζίδια Τ 4c συνύπαρξη σταδίων Τ4a και Τ4b φλεγμονώδες καρκίνωμα Τ 4d Περιοχικοί λεμφαδένες Κλινικά Νχ** Νο Ν 1 Ν 2 Ν 3 Δεν είναι δυνατή η εκτίμηση της μεταστατικής διήθησης Απουσία μεταστατικής διήθησης Μεταστατική διήθηση, κινητοί λεμφαδένες Μεταστατική διήθηση και σύμφυση των μασχαλιαίων λεμφαδένων μεταξύ τους ή με άλλους ιστούς Μεταστατική διήθηση λεμφαδένων μασχάλης και έσω μαστικής Ιστολογικά ΡΝχ** ΡΝ 0 ΡΝ 1 ΡΝ 2 ΡΝ 3 Δεν είναι δυνατή η αξιολόγηση Απουσία μεταστατικής διήθησης Μετάσταση σε κινητούς μασχαλιαίους λεμφαδένες ΡΝ 1a Παρουσία μικρομεταστάσεων ΡΝ 1b Μεταστάσεις διαμέτρου > 0,2 εκ. Μεταστάσεις στους σύστοιχους μασχαλιαίους λεμφαδένες που εμφανίζουν σύμφυση μεταξύ τους ή με άλλους ιστούς Μεταστάσεις στους λεμφαδένες της έσω μαστικής

45 Πίνακας 5. Σταδιοποίηση καρκίνου του μαστού (Συνέχεια) Απομακρυσμένες μεταστάσεις Μχ** Μ 0 Μ 1 Δεν είναι δυνατή η εκτίμηση Απουσία απομακρυσμένων μεταστάσεων Παρουσία απομακρυσμένων μεταστάσεων ( συμπεριλαμβανομένων των μεταστάσεων στους σύστοιχους υπερκλείδιους λεμφαδένες ) ΣΤΑΔΙΟΠΟΙΗΣΗ Στάδιο Ο Στάδιο I Στάδιο ΙΙ Α Στάδιο ΙΙ Β Στάδιο ΙΙΙ Α Στάδιο ΙΙΙ Β Στάδιο IV Τis, Ν Ο, Μ Ο T1, N O, M O Τ Ο, Ν1, Μ Ο Τ1, Ν1*, Μ Ο Τ2, Ν Ο, Μ Ο Τ2, Ν1, Μ Ο Τ3, Ν Ο, Μ Ο Τ Ο, Ν2, Μ Ο Τ1, Ν2, Μ Ο Τ2, Ν2, Μ Ο Τ3, Ν1, Μ Ο Τ3, Ν2, Μ Ο Τ4, οποιοδήποτε Ν, Μ Ο Οποιοδήποτε Τα, Ν3, Μ Ο οποιοδήποτε Τ, οποιοδήποτε Ν, Μ1 * Η πρόγνωση των ασθενών με Ν1α είναι ίδια με αυτή των ασθενών με ρνο. ** Αδυναμία εκτίμησης λόγω προηγούμενης εξαίρεσης ή αντιμετώπισης σε άλλο θεραπευτικό κέντρο.

46 ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ Αγγειογένεση είναι ο σχηματισμός νέων τριχοειδών από προϋπάρχοντα τριχοειδή αγγεία, που σχηματίζονται από τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, αποτελούν αναπόσπαστο στοιχείο του φυσιολογικού φαινομένου της αναγέννησης και επούλωσης των ιστών [24], ενώ εμφανίζουν άρρηκτη σύνδεση και με το παθολογικό φαινόμενο της νεοπλασίας. Στην περίπτωση αυτή, η αγγειογένεση αποδεικνύεται απαραίτητη για τη συνεχή ανάπτυξη και εξέλιξη της ενδο νεοπλασματικής αγγειακής πυκνότητας και αποτελεί ένα νέο, ανεξάρτητο παράγοντα πρόγνωσης, χρήσιμο για την αξιολόγηση του μεταστατικού δυναμικού. Πράγματι, οι αγγειοβριθέστεροι όγκοι εμφανίζουν με μεγαλύτερη συχνότητα μεταστάσεις από ότι οι λιγότερο αγγειοβριθείς, προφανώς λόγω της ευκολότερης πρόσβασης των κακοηθών κυττάρων στην κυκλοφορία του αίματος. Η αγγειογένεση συντελεί και σε παθολογικές καταστάσεις, όπως στην εξέλιξη των όγκων και στη δημιουργία μεταστάσεων, καθώς ο νεοσχηματισμένος όγκος χρειάζεται την ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων για να καλύψει τις ανάγκες του σε οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά, ενώ ταυτόχρονα τα νεοσχηματισμένα αγγεία δίνουν την δυνατότητα στα καρκινικά κύτταρα να εισέλθουν στην κυκλοφορία και να προκαλέσουν μεταστάσεις σε άλλα όργανα [25]. Σήμερα, είναι αποδεκτό πως υπάρχει ένας αγγειογενετικός διακόπτης, ο οποίος παραμένει κλειστός, όσο τα προαγγειογενετικά μόρια βρίσκονται σε ισορροπία με τα αντι αγγειογενετικά μόρια, ενώ ανοίγει όταν η ισορροπία διαταράσσεται. Πολλά σήματα που ανοίγουν τον αγγεογενετικό διακόπτη έχουν επισημανθεί, όπως για παράδειγμα το μεταβολικό stress (μείωση PO 2 και ph), μηχανικό stress, ανοσο / φλεγμονώδη απόκριση και γενετικές μεταλλάξεις [26].

47 Μηχανισμός αγγειογένεσης Η διαδικασία της αγγειογένεσης σε καρκινικές καταστάσεις διακρίνεται σε 3 φάσεις : 1. στην έναρξη ( initiation ) 2. στον πολλαπλασιασμό / διήθηση ( proliferation / invasion ) 3. στην ωρίμανση ( maturation ) Καθώς ο όγκος αρχίζει να μεγαλώνει, τα κύτταρα απομακρύνονται από τα υπάρχοντα αγγεία και έτσι δυσκολεύονται να εφοδιαστούν με οξυγόνο και απαραίτητα θρεπτικά συστατικά. Μοριακοί αισθητήρες μέσα σ αυτά τα πεινασμένα κύτταρα αναγνωρίζουν τη μείωση του οξυγόνου και αρχίζουν τις διαδικασίες για την παραγωγή αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων ( Εικόνα 40 ). Έτσι απελευθερώνονται από τον όγκο αγγειογενετικές κυτοκίνες ή αυξητικοί παράγοντες όπως ο Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), o basic Fibroblast Growth Factor (FGF), o Transforming Growth Factor alpha (TGFa) και ο Platelet - derived - Endothelial Cell Growth Factor (PD ECGF). Σε σχέση με τον καρκίνο του μαστού είναι ενδιαφέρον ότι ο όγκος αποτέλεσε το πρώτο κλινικο παθολογοανατομικό μοντέλο στη διερεύνηση του προγνωστικού ρόλου της αγγειογένεσης.

48 ΛΕΜΦΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ Λεμφαγγεία : Μορφολογικές, Λειτουργικές και Μοριακές Ιδιότητες Τα λεμφικά αγγεία περιγράφτηκαν για πρώτη φορά τον 17 ο αιώνα από τον Gasparo Aselli σαν lactae venae ή milky veins, ενώ η εμβρυϊκή ανάπτυξη μελετήθηκε στις αρχές του περασμένου αιώνα. Μέχρι τότε, το θέμα αυτό προόδευε πολύ αργά λόγω της έλλειψης βασικών λεμφικών παραγόντων ενώ η ιστογενετική προέλευση των λεμφικών αγγείων υπήρξε αμφιλεγόμενο και αντικρουόμενο θέμα [27,28]. Το πιο ευρέως αποδεκτό μοντέλο ανάπτυξης των λεμφαγγείων έχει προταθεί από τον Sabin στις αρχές του 20 ου αιώνα. Ο Sabin προτείνει ότι οι πρωτογενείς λεμφικοί σάκοι ( οι σφαγιτιδικοί, οι οπίσθιοι, ο οπισθοπεριτοναϊκός και η χυλοφόρος δεξαμενή ) προέρχονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα που βλασταίνουν από τις φλέβες κατά την πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη. Οι δυο σφαγιτιδικοί λεμφικοί σάκοι αναπτύσσονται από τη συμβολή της υποκλειδίου ( subclavian ) και κεφαλικής ( cardinal ) φλέβας κατά τη βλάστησή τους από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Ο οπισθοπεριτοναϊκός λεμφικός σάκος δημιουργείται κοντά στην αρχέγονη κάτω κοίλη φλέβα, η χυλοφόρος δεξαμενή κοντά στα σωμάτια Wolffian και οι οπίσθιοι λεμφικοί σάκοι εμφανίζονται κοντά στην συμβολή της αρχέγονης λαγόνιας φλέβας και στην οπίσθια κεφαλική φλέβα ( Εικόνα 41 ). Από αυτούς τους σάκους βλαστάνουν κύτταρα φυγόκεντρα προς την περιφέρεια σχηματίζοντας τριχοειδή που περιβάλλουν όργανα και ιστούς. Έτσι, τα ενδοθηλιακά κύτταρα των λεμφαγγείων προέρχονται αποκλειστικά από το ενδοθήλιο των φλεβών. Τα περιφερικά λεμφικά αγγεία προέρχονται από αυτούς τους σάκους μέσω ενδοθηλιακών βλαστήσεων στους γύρω ιστούς και όργανα όπου και σχηματίζονται τα λεμφικά τριχοειδή. Άλλη θεωρία, υποστηρίζει ότι τα αρχέγονα λεμφαγγεία προέρχονται από το μεσέγχυμα από δυνητικούς λεμφαγγειοβλάστες, ανεξάρτητα από τις φλέβες [28].

49 Εικόνα 41. Schematic representation of the primitive lymphatic system showing the primary lymph sacs in a 42 - day - old human embryo, after Sabin (reprinted from Human Embryology, by W. J. Larse, 1993, Harcourt, with permission from Harcourt Interation). Μορφολογία Τα λεμφικά τριχοειδή είναι τυφλά απολήγοντα αγγεία, τα οποία αποτελούνται από μια μονήρη μη θυριδωτή ενδοθηλιακή κυτταρική στιβάδα, ιδιαίτερη λεπτή εκτός από τις περιπυρηνικές περιοχές. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα εμφανίζουν εκκολπώσεις της βασικής μεμβράνης και κυτταροπλασματικά κυστίδια. Συνήθως, τα ενδοθηλιακά κύτταρα αλληλοεπικαλύπτονται και στερούνται βασικής μεμβράνης. Τα τριχοειδή λεμφαγγεία συνενώνονται σε μεγαλύτερα αγγεία που λέγονται προαθροιστικά και αναπαριστούν την αρχική μεταφορική οδό της λέμφου. Τα προαθροιστικά αγγεία εμφανίζουν δομικά ίδιες περιοχές με τα λεμφικά τριχοειδή που εναλλάσσονται με περιοχές όπου υπάρχει ένας καλά ανεπτυγμένος μυϊκός χιτώνας. Η παλινδρόμηση του ιστικού υγρού παρεμποδίζεται από λεπτές καλοσχηματισμένες βαλβίδες οι οποίες και αποτελούν το μόνο σημείο όπου το ενδοθήλιο στηρίζεται σε συνεχή βασική μεμβράνη ( Εικόνα 42 ).

50 Τα προαθροιστικά λεμφικά αγγεία ενώνονται και σχηματίζουν τα αθροιστικά αγγεία τα οποία έχουν μια συνεχή στιβάδα λείων μυϊκών κυττάρων και μονόδρομες βαλβίδες. Τα αθροιστικά αγγεία διακόπτονται από τους λεμφαδένες όπου η λέμφος φιλτράρεται και με βάση την παρουσία λεμφαδένων χωρίζονται σε προ- και μεταλεμφαδενικά αθροιστικά λεμφαγγεία [28,29,30,31]. Εικόνα 42. Human lymphatic system. Diagram of the network of superficial lymphatic capillaries present in human skin. (a). Differences in capillary density occur among the body regions. A representation of the capillaries and vessels of the dermis is shown in b and c.

51 Πρόσφατο προτεινόμενο μοντέλο λεμφαγγειακής ανάπτυξης Πρώτο στάδιο Lymphatic endothelial cell competence Το στάδιο αυτό, χαρακτηρίζεται από την απόκτηση της ικανότητας των ενδοθηλιακών κυττάρων να απαντούν σε ένα αρχικό επαγωγικό σήμα ( competence ). Το στάδιο αυτό, φαίνεται να είναι αυτόνομο και ελεγχόμενο από τον χρόνο ανάπτυξης (development timer). Για να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς που συμμετέχουν στην ανάπτυξη των λεμφαγγείων, πρέπει να ορίσουμε τον εντοπισμό και την ρύθμιση της ενεργοποίησης του μηχανισμού. Σύμφωνα με το μοντέλο του Sabin, η πρώτη ένδειξη ότι η εμβρυϊκή λεμφαγγειακή ανάπτυξη ξεκινάει, είναι η απόκτηση της ικανότητας των φλεβικών ενδοθηλιακών κυττάρων να ανταποκρίνονται στο επαγωγικό σήμα των λεμφικών αγγείων. Η ενεργοποίηση του μηχανισμού, που καθοδηγεί την ανάπτυξη των λεμφικών αγγείων, επιβραδύνεται από την δημιουργία των φλεβικών αγγείων. Επίσης, πρέπει να επισημάνουμε ότι τα φλεβικά αγγεία δεν είναι δυνατόν να βρίσκονται μόνα τους, λόγω της αδυναμίας να ενεργοποιηθεί η ανάπτυξη των λεμφικών αγγείων, κάποια συμπληρωματικά γονίδια που εκφράζονται για τα φλεβικά ενδοθηλιακά κύτταρα γίνονται ικανά για να ανταποκριθούν στο επαγωγικό σήμα. Οι μοριακοί παράγοντες που ρυθμίζουν αυτό το στάδιο είναι άγνωστοι [27]. Η έκφραση του υαλουρονικού υποδοχέα LYVE 1 ομοιόμορφα σε όλα τα ενδοθηλιακά κύτταρα που επενδύουν την πρόσθια κύρια φλέβα θα μπορούσε να θεωρηθεί ως η πρώτη μορφολογική ένδειξη ότι τα φλεβικά ενδοθηλιακά κύτταρα είναι ικανά να απαντήσουν σε επαγωγικά σήματα για την ανάπτυξή τους (Εικόνες 43, 44). Αυτό το στάδιο, είναι ανεξάρτητο από τις αλληλεπιδράσεις των ιστών, και η έκφραση των επαγωγικών παραγόντων πρέπει να είναι τέτοια ώστε να δημιουργούνται εμβρυϊκά αγγεία ικανά να παράγουν λεμφικά αγγεία ( LEC ) μετά την έκθεση στο επαγωγικό σήμα ( lymphatic inducing signal ), [32].

52 Δεύτερο στάδιο Lymphatic endothelial cell bias Χαρακτηρίζεται από την απόκτηση της ικανότητας να δώσουν γένεση σε ένα ιδιαίτερο κυτταρικό τύπο ή δομή (lymphatic bias). Κατά την εμβρυϊκή ημέρα Ε9.5, λίγες ώρες μετά την έκφραση του LYVE 1, εκφράζεται στον ίδιο ιστό, ο μεταγραφικός παράγοντας Prox 1 ( prospero related homeobox 1 ), [33]. Η έκφραση του Prox 1 περιορίζεται σε ένα μικρό υποπληθυσμό κυττάρων στο ένα πλευρό της φλέβας. Η δράση του είναι απαραίτητη και επαρκής για να δημιουργηθεί ο φαινότυπος των λεμφαγγείων ενδοθηλίων, τα οποία διαφορετικά θα παρέμεναν αιμοφόρα αγγεία. Ο παράγοντας Prox 1 εκφράζεται στα εμβρυϊκά και ενήλικα LECs και δεν εκφράζεται στα αιμοφόρα αγγεία [33,34]. Αυτό που είναι άγνωστο είναι εάν η περιορισμένη έκφραση του Prox 1 στην μια πλευρά της φλέβας προκύπτει από ένα εντοπισμένο επαγωγικό σηματοδοτικό μηχανισμό ή από ετερογένεια των φλεβικών ενδοθηλιακών κυττάρων. Η απουσία της ανάπτυξης των λεμφαγγείων σε Prox 1 -/- έμβρυα δεν είναι απαραίτητα αποτέλεσμα της διακοπής της εκβλάστησης των LEC αλλά αποτυχία του προσδιορισμού ( ειδικότητα ) των λεμφικών αγγείων. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα που προέρχονται από τον Prox 1 στην πρόσθια κύρια φλέβα κατά την Ε δεν εκφράζουν λεμφαγγειογενετικούς παράγοντες, αντί αυτού εκφράζουν παράγοντες αιμοποιητικούς [34]. Μετά την εμφάνιση της έκφρασης του Prox 1 από τα φλεβώδη ενδοθηλιακά κύτταρα, θα πρέπει να εκδηλώνεται η έκφραση κάποιου συστήματος υποδοχέα προσδέτη, ώστε να κατευθύνει την πολικότητα των εκβλαστήσεων των ενδοθηλιακών κυττάρων προς την πηγή του υποδοχέα προσδέτη για να εξασφαλισθεί η ακριβής θέση των πρωτογενών λεμφικών σάκων (Εικόνες 43, 44). Τρίτο στάδιο Specification of lymphatic endothelial cells Στο στάδιο αυτό, τα ενδοθηλιακά λεμφικά κύτταρα εξειδικεύονται. Η εξειδίκευση αυτή, είναι το πρώτο βήμα προς την τελική αγγειακή λεμφική διαμόρφωση. Κατά την διάρκεια αυτού του σταδίου αρχίζουν να εκφράζονται περισσότεροι λεμφικοί δείκτες, ενώ οι δείκτες των αιμοφόρων αγγείων, όπως το CD44 και η λαμινίνη ( laminin ) προοδευτικά μειώνονται [34]. Η σαφής μορφολογική ένδειξη της διαφοροποίησης των λεμφαγγείων είναι η εκβλάστηση των LECs την Ε10.5. Οι εκβλαστήσεις ενδοθηλιακών κυττάρων από τις φλέβες που εκφράζουν και τον Prox 1 και τον LYVE 1 [28,34]. Γύρω στην Ε η έκφραση της λαμινίνης και του κολλαγόνου IV αρχίζει να ελαττώνεται στα LECs [34], ( Εικόνες 43,44 ).

53 Η Νευροπιλίνη ( Nrp2 ) μεσολαβεί στην καθοδήγηση των αξόνων κατά την νευρική διαφοροποίηση. Οι Nrp πρωτεΐνες δεσμεύουν διάφορους αγγειακούς αυξητικούς παράγοντες (VEGFs) και παίζουν επίσης σπουδαίο ρόλο στην σηματοδότηση των VEGF VEGFR. Η Nrp2 εκφράζεται ομοιόμορφα γύρω στην Ε10.0, στην πρόσθια κύρια φλέβα, στα βλαστάνοντα ενδοθηλιακά κύτταρα και στο γύρω μεσόδερμα. Σε περίπτωση απουσίας της παρατηρείται απουσία ή σοβαρή μείωση του αριθμού των μικρών λεμφαγγείων και των λεμφικών τριχοειδών [35, 36]. Ο VEGFR3 ( fms like tyrosine kinase 4, flt4 ) δεσμεύει τις πρωτεΐνες VEGF C και VEGF D που διεγείρουν την αγγειογένεση και λεμφαγγειογένεση ανάλογα με το αν δεσμεύτουν με τον VEGFR2 ή τον VEGFR3 αντίστοιχα. Πρώιμα στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, ο VEGFR3 εκφράζεται και από τα αιμοφόρα και από τα λεμφικά ενδοθήλια, συμπεριλαμβανομένης και της κύριας φλέβας, όμως κατά την όψιμη εμβρυϊκή περίοδο και στην ενήλικο ζωή η έκφρασή του περιορίζεται στο λεμφαγγειακό ενδοθήλιο [37]. Η ποδοπλανίνη ( T1a / podoplanin ), ( βλεννώδους τύπου γλυκοπρωτεϊνη της κυτταρικής επιφάνειας ) αρχίζει να εκφράζεται, περίπου την 11 η εβδομάδα (Ε10.5 Ε12.5), στα βλαστάνοντα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η απουσία της μπορεί να προκαλέσει λεμφοίδημα και διάταση των λεμφαγγείων [38]. Κατά την Ε12.5, ο αριθμός των εκβλαστήσεων που εκφράζουν podoplanin, Prox 1 LYVE 1, Nrp2 και VEGFR3 έχει αυξηθεί σημαντικά. Κατά το ίδιο χρονικό διάστημα αρχίζει να εκφράζεται στα κύτταρα αυτών των εκβλαστήσεων και η δευτερογενής λεμφοειδής κυτοκίνη ( SLC ). Η διατήρηση υψηλών επιπέδων VEGFR3 και η έκφραση της ποδοπλανίνης και του SLC από τα λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα που εκφράζουν ήδη τον Prox 1 και τον LYVE 1, καθώς και η Nrp2 δείχνει ότι την 12.5 εμβρυϊκή εβδομάδα τα βλαστάνοντα φλεβικά ενδοθηλιακά κύτταρα έχουν εξειδικευθεί να ακολουθήσουν το πρόγραμμα της λεμφαγγειογένεσης, ενώ οι πρωτογενείς λεμφικοί σάκοι εμφανίζονται αυτήν την περίοδο.

54 Τέταρτο στάδιο Differentation and maturation of lymplatic vessels and lymphangiogenesis Πρόκειται για το στάδιο της διαφοροποίησης και της ωρίμανσης των λεμφαγγείων, καθώς και της λεμφαγγειογένεσης. Η διαφοροποίηση των λεμφαγγείων είναι μια διεργασία που διαρκεί μερικές μέρες. Έτσι, το επίπεδο έκφρασης ορισμένων δεικτών στα διαφοροποιημένα λεμφαγγεία εξαρτάται από το αναπτυξιακό στάδιο του εμβρύου και το είδος του ιστού που μελετάται ή και τα δυο. Μόνο κοντά στην γέννηση, τα λεμφαγγεία εκφράζουν το πλήρες προφίλ των δεικτών, οι οποίοι εμφανίζονται και στα ενήλικα λεμφαγγεία. Η ποδοπλανίνη και η SLC αρχίζουν να εμφανίζονται την περίοδο που αρχίζει η εκβλάστηση από την πρόσθια κύρια φλέβα. Η έκφραση της δεσμοπλακίνης ( desmoplakin ) και του β υποδοχέα κυτοκινών D6 ( β chemokine receptor D6 ) είναι πιθανόν ένδειξη τελικών σταδίων διαφοροποίησης και ωρίμανσης λεμφαγγείων. Πρόσφατες μελέτες, δείχνουν ότι η αγγειοποιητίνη 2 ( Ang 2 ) είναι απαραίτητη για την ωρίμανση των λεμφαγγείων και είναι αυτή που ενεργοποιεί τον ειδικό υποδοχέα των ενδοθηλιακών κυττάρων Tie2 σε μερικά κύτταρα και τον μπλοκάρει σε κάποια άλλα. Η φυσιολογική λεμφαγγειακή ανάπτυξη απαιτεί τοπική έκφραση της Ang2 και την δράση της πάνω στους Tie2 υποδοχείς στα λεμφαγγεία [39]. Επίσης, έχει προταθεί ότι ο VEGF C και ο VEGF D χρειάζονται την Ang2 για να σχηματισθούν λειτουργικά λεφαγγεία. Η αντικατάσταση της Ang2 από την Ang1 είναι αρκετή για να ξεφύγουν από τον λεμφαγγειακό φαινότυπο. Τελικά, μπορούμε να υποθέσουμε ότι τα σηματοδοτικά μονοπάτια των αυξητικών παραγόντων - υποδοχέων Ang1 / Ang2 μέσω Tie2 και VEGFRs και Nrp συνυποδοχέων μπορούν να ρυθμίσουν την ανάπτυξη των αιμοφόρων και λεμφοφόρων αγγείων.

55 Εικόνα 43. Model for differentation of the lymphatic vasculature. The proposed four - step model for lymphatic vasculature formation is summarized in this scheme. Εικόνα 44. Summary of the proposed model for the embryonic development of the mammalian lymphatic vasculature.

56 Διαχωρισμός αιμοφόρων και λεμφικών αγγείων Καθώς τα λεμφικά αγγεία και τα λεμφικά τριχοειδή διασπείρονται κατά μήκος του εμβρύου θα πρέπει να διαχωριστούν από τα προϋπάρχοντα αιμοφόρα αγγεία. Η προσαρμοστική πρωτεΐνη SLP76 ( SRC homology 2 domain containing leukocyte protein of 76 kda ) και η τυροσινική κινάση SYK, δυο μόρια που εκφράζονται κυρίως από τα αιμοποιητικά κύτταρα ενέχονται στον διαχωρισμό της αιματικής και λεμφικής αγγείωσης αλλά ο τρόπος που γίνεται αυτό είναι άγνωστος. Κατά την φλεβική αναγέννηση, σηματοδότηση της SYK καταστέλλει την συνένωση μεταξύ λεμφαγγείων και φλεβικών αγγείων. Την ίδια στιγμή, άλλοι άγνωστοι μηχανισμοί διατηρούν την εγγύτητα μεταξύ της ανάπτυξης λεμφικών αγγείων και προϋπάρχοντα φλεβικά αγγεία [27, 40], ( Εικόνα 45 ). Εικόνα 45. Η δράση της προσαρμοστικής πρωτεΐνης SLP76 και της τυροσινικής κινάσης SYK.

57 Δομικές διαφορές αιμοφόρων αγγείων και λεμφαγγείων Αν και έχουν πολλά κοινά δομικά χαρακτηριστικά με τα αιμοφόρα αγγεία έχουν και σαφείς διαφορές : 1) Τα λεμφικά τριχοειδή έχουν πιο ακανόνιστο και ευρύτερο αυλό και το ενδοθήλιό τους είναι υπερβολικά λεπτό. 2) Σε αντίθεση με τα αιμοφόρα αγγεία έχουν ασυνεχή βασική μεμβράνη και δεν περιβάλλονται από περικύτταρα. 3) Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό που εμφανίζουν είναι η αλληλοεπικάλυψη των διακυτταρικών συνδέσεων που σχηματίζονται από την εναπόθεση του ενός ενδοθηλιακού κυττάρου πάνω στο άλλο. Η αύξηση του διάμεσου υγρού προκαλεί το άνοιγμα αυτών των συνδέσεων και έτσι διευκολύνεται η παροχέτευση του διάμεσου υγρού. 4) Δεν εμφανίζουν συχνά στεγανές συνδέσεις και συνδέσεις προσκόλλησης. Αντίθετα εμφανίζουν εστιακά σημεία προσκόλλησης. 5) Έχουν στενότατη σχέση με τη μεσοκυττάρια ουσία με την οποία συνδέονται μέσω λεπτών αγκυροβολούντων νηματίων, τα οποία αποτελούνται από φιμβριλίνη, μια μεγάλη γλυκοπρωτεϊνη που έχει την ικανότητα σύνδεσης με τις β ιντεγκρίνες ( Εικόνα 45 ). Οι ιντεγκρίνες μεταδίδουν εξωκυττάρια ερεθίσματα, μέσω του κυτταροπλασματικού τους άκρου, μέσα στο κύτταρο και μπορεί να ενεργοποιήσουν διάφορες σηματοδοτικές πρωτεΐνες όπως την FAK. Η ενεργοποίηση της FAK προκαλεί επαναδιάταξη του κυταροσκελετού μέσω της ακτίνης και έτσι πιθανόν να επηρεάζεται η διαπερατότητα των λεμφαγγείων [30,31,32].

58 Εικόνα 45. Characteristic structure and function of the lymphatic microvasculature. (BM) : basal membrane, (P) : pericytes, (AF) : anchoring filaments, (T) : T - cell, (D) : dendritic cell, (APC) : antigen presenting cell. Λειτουργία λεμφικών αγγείων Τα λεμφαγγεία έχουν ως κύριο ρόλο την παροχέτευση της πλούσιας σε πρωτεΐνες λέμφου από τον εξωκυττάριο χώρο. Αποτελούν επίσης, ένα σημαντικό σημείο εισόδου για λευκοκύτταρα και τα κύτταρα των όγκων. Τα μακρομόρια και το υγρό, που εξέρχονται από τα αιμοφόρα τριχοειδή, συγκεντρώνονται από τον μεσοκυττάριο χώρο μέσω των λεμφικών τριχοειδών και επιστρέφουν πίσω στην κυκλοφορία μέσω δικτύου μεγαλύτερων λεμφαγγείων. Η απορρόφηση του λίπους από το λεπτό έντερο είναι άλλη μια από τις πολλές λειτουργίες που διενεργούν τα λεμφαγγεία.

59 Ουσιαστικός, επίσης, ο ρόλος τους στην έναρξη της ανοσοαπόκρισης, κατευθύνοντας λευκοκύτταρα και αντιγόνα από τους ιστούς στους λεμφαδένες. Οι συνδέσεις των λεμφαγγείων παίζουν σπουδαίο ρόλο στην παρεμπόδιση της παλινδρόμησης του υγρού προς τον διάμεσο χώρο. Καθώς το υγρό εισέρχεται μέσα στον αυλό, η διαφορά πίεσης κατά μήκος του αγγειακού τοιχώματος ελαττώνεται με αποτέλεσμα οι συνδέσεις, που προαναφέρθηκαν, να κλείνουν έτσι ώστε να μην υπάρξει παλινδρόμηση του υγρού. Το λεμφικό ενδοθήλιο χαρακτηρίζεται από αφθονία μεμβρανικών εγκολπώσεων και κυτταροπλασματικών κυστιδίων των οποίων η λειτουργική σημασία δεν είναι ακόμη πλήρως διευκρινισμένη. Οι μεσοκυττάριες σχισμές θεωρούνται ένα κύριο σημείο για την κίνηση υγρών και πρωτεϊνών δια μέσου των λεμφαγγείων. Υπάρχουν, επίσης, ενδείξεις ότι με την διακυττάρια μεταφορά, τα διαενδοθηλιακά μονοπάτια μπορεί να χρησιμοποιούνται ως μηχανισμοί εισόδου ορίων μέσα στα λεμφαγγεία. Αυτό εγείρει την πιθανότητα ότι τα λεμφαγγεία μπορεί να έχουν την ικανότητα να αφαιρούν εκλεκτικά μόρια από τον διάμεσο χώρο με αποτέλεσμα να έχουν ένα ενεργό ρόλο στην σύσταση της λέμφου και του διάμεσου υγρού. Ρόλος των λεμφαγγείων στην διασπορά των όγκων Οι μεταστάσεις των περισσότερων καρκίνων αρχικά γίνονται μέσω των λεμφαγγείων και η έκταση της λεμφαδενικής προσβολής είναι ένας από τους σπουδαιότερους προγνωστικούς δείκτες για την πορεία του ασθενούς. Παραδοσιακά, το λεμφικό σύστημα δεν είχε ποτέ θεωρηθεί ότι εμπλέκεται ενεργά στην διαδικασία της μετάστασης. Τα κύτταρα του όγκου πίστευαν ότι μεταφέρονται παθητικά μέσα στα λεμφαγγεία με το διάμεσο υγρό και τις πρωτεΐνες και ότι η λεμφαγγειογένεση δεν αποτελεί μέρος της ογκογένεσης. Όμως, πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι ο αριθμός των λεμφαγγείων του όγκου σχετίζεται με τις λεμφαδενικές μεταστάσεις και αν υπάρχουν και προϋπάρχοντα λεμφαγγεία γύρω από τον όγκο είναι πιθανόν αρκετά για την διασπορά των καρκινικών κυττάρων. Ο σχηματισμός νέων αγγείων εγγύτατα του όγκου μπορεί να αυξάνει την πιθανότητα της μετάστασης (Εικόνα 46).

60 Έτσι, αυξημένος αριθμός λεμφαγγείων και / ή παρουσία ενδοογκικών λεμφαγγείων θα πρέπει να θεωρείται σαν ένας επιπλέον δρόμος για μετάσταση παρά μια αναγκαία προϋπόθεση. Πολλές μελέτες δείχνουν άμεση συσχέτιση του VEGF C με την λεμφαγγειογένεση του όγκου και την παρουσία λεμφογενών μεταστάσεων ( Εικόνα 47 ). Αύξηση της λεμφαγγειακής πυκνότητας ( lymphatic vessel density, LVD ) μπορεί να προωθήσει την μετάσταση των όγκων, με την δημιουργία κατάλληλων περιστάσεων ώστε τα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα να αφήσουν την αρχική θέση του καρκίνου, τα λεμφαγγεία πρέπει να παίζουν δραστικό ρόλο στην μετάσταση. Η ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών λεμφικών κυττάρων από τον VEGF C ή άλλων παραγόντων, μπορούν να επάγουν την απελευθέρωση κυτοκινών οι οποίες μπορεί να έλκουν τα κύτταρα του όγκου μέσα στα λεμφαγγεία. Καθώς η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων μέσα στους λεμφαδένες μοιάζει πολύ με την φυσιολογική μετανάστευση των λευκοκυττάρων είναι λογικό ο φυσιολογικός μηχανισμός μετανάστευσης μέσω των κυτοκινών να ισχύει και για τα καρκινικά κύτταρα. Η σημασία δυο υποδοχέων κυτοκινών ( CCRs ) στις λεμφαδενικές μεταστάσεις έχει πιστοποιηθεί. Είναι ο CXCR4 και ο CCR7. Ο CXCR4 έχει βρεθεί ότι υπερεκφράζεται στο κακοήθες μελάνωμα και στον καρκίνο του μαστού, ενώ ο προσδέτης του CXCL12 υπερεκφράζεται σε λεμφαδένες και σε άλλα κύτταρα στόχους του καρκίνου του μαστού. Ο CCR7 και οι προσδέτες του CCL19 και CCL21 και είναι απαραίτητη για την μετανάστευση των λεμφοκυττάρων και τα κύτταρα των δενδρίτων στους λεμφαδένες. Ο CCR7 είσης υπερεκφράζεται στο κακοήθες μελάνωμα και τον καρκίνο του μαστού, ενώ η έκφρασή του συνδέεται με την μετάσταση του καρκίνου του γαστρεντερικού συστήματος και του καρκίνου του πνεύμονος. Ο CCL21 και διάφορες άλλες κυτοκίνες εκφράζεται από τα LECs, διευθετώντας την κυτταρική μετανάστευση στην φυσιολογική λειτουργία και στον καρκίνο. Οι μηχανισμοί μέσω των οποίων τα κύτταρα του όγκου διαπερνούν το λεμφαγγειακό ενδοθήλιο και εισέρχονται μέσα στα λεμφαγγεία δεν είναι ξεκάθαροι [30]. Μια νέα υπόθεση είναι ότι τα κύτταρα του όγκου χρειάζονται διαντιδράσεις προσκόλλησης με τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Μέχρι τώρα, ελάχιστα μόρια προσκόλλησης, που να εκφράζονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, έχουν βρεθεί όπως η δεσμοπλακίνη (desmoplakin), η πλακογλοβίνη (plakoglobin), η πλακοφιλλίνη 2 (plakophilin 2), η Η καντχερίνη (H cadherin) που έχουν αναγνωρισθεί στα ενδοθηλιακά κύτταρα με γονιδιακό προφίλ. Ένα ακόμα μόριο προσκόλλησης που ανήκει στην υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών, το JAM 2 έχει βρεθεί ότι εκφράζεται στις συνδέσεις των λεμφαγγείων και έχει δειχθεί ότι διευκολύνει την λεμφοκυτταρική μετανάστευση.

61 Ο υποδοχές μαννόζης των μακροφάγων ( MR ) I που εκφράζεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα των λεμφαγγείων έχει δειχθεί ότι μεσολαβεί στην προσκόλληση των λεμφοκυττάρων στα λεμφαγγεία, των λεμφαδένων, με τρόπο εξαρτώμενο από σελεκτίνη ( L selectin ) και αυτή η αλληλεπίδραση καθορίζει την ρύθμιση της εξόδου των λεμφοκυττάρων από τους λεμφαδένες. Ακόμα, ο CLEVER 1 ( common lympahtic endothelial and vascular endothelial receptor 1 ) είναι ένα μόριο προσκόλλησης που πρόσφατα έχει βρεθεί ότι ενέχεται στην δέσμευση των λεμφοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα των λεμφαγγείων στους λεμφαδένες. Ο CLEVER 1 σαν μόριο προσκόλλησης, ρυθμίζει την μετανάστευση των λευκοκυττάρων στην περιοχή της φλεγμονής. Ο ( MR ) I και ο CLEVER 1 φαίνεται να εκφράζονται στα περι - και ενδοογκικά λεμφαγγεία σε καρκίνο κεφαλής τραχήλου και μαστού. Επίσης, η έκφραση του ( MR ) I στα λεμφαγγεία μέσα στον όγκο σχετίσθηκε με αύξηση των λεμφαδενικών μεταστάσεων σε καρκίνο μαστού [30]. Εικόνα 46. The differential effects of tumor secreted VEGF C on blood vascular angiogenesis versus lymphangiogenesis are dependent on proteolytic processing after secretion.

62 Εικόνα 47. Lymphatic vessel structure and potential modes of tumor cell dissemination. Μοριακή ρύθμιση του σχηματισμού και της διαφοροποίησης των λεμφαγγείων Κατά την ανάπτυξη και την επούλωση των ιστών, η αγγειογένεση προηγείται της λεμφαγγειογένεσης, πράγμα που δείχνει την ύπαρξη διαφορετικών ρυθμιστικών μηχανισμών και στον τόπο και στον χρόνο. Δυο μέλη της οικογένειας του VEGF, ο VEGF C και ο VEGF D έχει αποδειχθεί ότι έχουν κριτικής σημασίας ρόλο στην λεμφαγγειογένεση μέσω ενεργοποίησης του VEGFR3, ο οποίος εκφράζεται κυρίως από τα λεμφαγγεία σε φυσιολογικούς ενήλικες ιστούς. Η σηματοδότηση του VEGFR3 είναι σημαντική για την ανάπτυξη του εμβρυϊκού λεμφικού συστήματος, της λεμφαγγειακής αναγέννησης στον ενήλικα και στην λεμφαγγειογένεση των όγκων. Ο VEGF C δεσμεύεται, επίσης, με ένα υποδοχέα που δεν ανήκει στις κινάσες την νευροπιλίνη ( Nrp 2 ) που είναι κλασικός υποδοχέας για τις σεμαφορίνες της τάξης III, ο οποίος ρυθμίζει την χημειοτακτική καθοδήγηση των αναπτυσσόμενων νευρώνων. Πρόσφατες μελέτες, σε ποντίκια που στερούνται αυτού του υποδοχέα δείχνουν διαταραχή στην ανάπτυξη των λεμφικών τριχοειδών στους περισσότερους ιστούς, είναι ένδειξη ότι η Nrp2 έχει κάποιο ρόλο στην λεμφαγγειογένεση και ίσως και στην καθοδήγηση.

63 Η Ang2 εκφράζεται από τα λεμφαγγεία και είναι απαραίτητη για την σωστή ανάπτυξη του λεμφικού συστήματος. Ποντίκια χωρίς αυτήν εμφανίζουν αποδιοργάνωση και υποπλασία των λεμφικών τριχοειδών και οι αθροιστικοί λεμφικοί πόροι δεν περιβάλλονται σωστά από λείο μυϊκό ιστό και εμφανίζουν σοβαρό λεμφοίδημα. Ο μεταγραφικός παράγοντας Prox 1 φαίνεται να είναι απαραίτητος για την εντολή να ενταχθούν τα ενδοθηλιακά κύτταρα στο πρόγραμμα της λεμφικής διαφοροποίησης. Η εντόπισή του στο έμβρυο εκφράζεται σε ένα υποπληθυσμό ενδοθηλιακών κυττάρων στις εμβρυϊκές φλέβες, τα οποία είναι προορισμένα στο λεμφικό μονοπάτι. Λειτουργική αδρανοποίηση αυτού προκαλεί διακοπή της ανάπτυξης των λεμφαγγείων.

64 Lymphatic Vessel Endothelial Receptor 1 ( LYVE 1 ) Πρόκειται για τον υποδοχέα του υαλουρονικού του λεμφαγγειακού ενδοθηλίου. Ο LYVE 1 αποτελείται από 322 υπολείμματα ( 322 residues ) τύπου I, είναι μια ειδική διαμεμβρανική πρωτεΐνη ( πολυπεπτίδιο ), ομόλογη κατά 43% του υποδοχέα του υαλουρονικού CD44. Ο LYVE 1 εκφράζεται στην επιφάνεια των κυττάρων σαν 60 kda πρωτεΐνη [41, 42], ( Εικόνα 48 ). Όπως το CD44, έτσι και το μόριο του LYVE 1, έχει μια περιοχή σύνδεσης με το ΗΑ ( υαλουρονικό οξύ ), τη λεγόμενη HA binding domain, στο Ν άκρο το οποίο ακολουθείται από μια γλυκοζυλιωμένη μεμβρανική περιοχή ( glycosylated juxtamembrane region ), [40]. Η περιοχή σύνδεσης αποτελείται από δυο β πτυχές ( sheets ) και δυο α έλικες ( helices ) που βρίσκονται πλευρικά των πτυχών, περικλείει έναν υδρόφοβο πυρήνα και σταθεροποιείται από δυο δισουλφιδικές ενώσεις [42,43]. Οι τέσσερις κεντρικές κυστεϊνες ( C 2 C 5 ), οι οποίες διαμορφώνουν τα δισουλφίδια, και το πλάγιο ζεύγος κυστεϊνης ( C 1 και C 6 ) βρίσκονται όμοια στο LYVE 1 και στο CD44, ( C 1 X 24 C 2 X 23 C 3 X 20 C 4 X 20 C 5 - X 10 C 6 ), ( Εικόνα 49 ). Ο LYVE 1, ενώνεται με τη διαλυτή και τη σταθερή μορφή του ΗΑ, η ειδικότητα αυτή ενισχύεται με τον συναγωνισμό των ελεύθερων γλυκοζαμινογλυκανών και των προσκοληθέντων αντισωμάτων κατά του LYVE 1 ( adhesion blocking antibodies ), [44,45]. O LYVE 1 εκφράζεται, εκτός από τα ενδοθηλιακά κύτταρα των κολποειδών του σπληνός και την συγκιτιοτροφοβλάστη, στα ενδοθηλιακά λεμφαγγειακά τριχοειδή, ενώ είναι αρνητικός, όπως φαίνεται, στα ενδοθήλια των αθροιστικών λεμφαγγείων. Εικόνα 48. The hyaluronan (HA) receptor LYVE-1 is expressed on the surface of lymphatic endothelial cells. Putative roles include the transport of HA to the lumen of lymphatic vessels, or in the localization of HA to lymphatics providing a substrate for transmigrating CD44 + cells.

65 Εικόνα 49. The basic features of lymphatic vessel endothelial hyaluronan (HA) receptor (LYVE 1) and its closest homolog CD44. Υαλουρονικό οξύ Το ΗΑ ( copolymer of N acetyl d glucosamine and d glucuronic acid ) είναι μεγάλος μουκοπολυσακχαρίτης ( kda ) και αναγνωρίζεται σαν συστατικό δομής των επικοινωνούντων ιστών και συστατικό του αρθρικού υγρού και του υαλώδους σώματος [46]. Το ΗΑ είναι ο διαμεσολαβητής για την κυτταρική μετανάστευση, κατά την ενηλικίωση, όπως την επούλωση τραυμάτων και της καρκινικής μετάστασης [47]. Στο ανοσοποιητικό σύστημα, το ΗΑ δρα σαν υπόστρωμα για την λεμφοκυτταρική μετανάστευση. Για παράδειγμα, κατά την φλεγμονή, η αλληλεπίδραση της μεσοκυττάριας ουσίας φλεγμένοντων αγγείων ( αγγειακό επιθήλιο ) διευκολύνεται από την εξαγγείωση και την ακόλουθη μετανάστευση δραστικών λευκοκυττάρων στο θεμελιώδες παρέγχυμα.

66 Το ΗΑ οργανωμένο σε δικτυωτές ίνες ( reticular fibres ), πιστεύεται, ότι ρυθμίζει την μεταφορά των κυττάρων στους λεμφαδένες, προωθώντας τον σωλήνα για την λεμφοκυτταρική μετανάστευση μεταξύ του φλοιώδους και μυελικού κόλπου [36]. Πάνω από το 80% του ΗΑ εισέρχεται στο λεμφικό σύστημα και αποσυνθέτεται στους λεμφαδένες. Προς το παρόν, κανένας υποδοχέας, υπεύθυνος για την μεταφορά του ΗΑ από τους ιστούς προς την λέμφο ή για την απομόνωση ή την αποσύνθεση στους λεμφαδένες, δεν έχει αναγνωρισθεί. Η πλειοψηφία των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με το ΗΑ ανήκουν σε μια υπεροικογένεια, τα μέλη της οποίας έχουν μόριο σύνδεσης με το ΗΑ, το λεγόμενο Link domain [42]. Τα περισσότερα μέλη της οικογένειας αυτής είναι δομικά συστατικά των ιστών που επικοινωνούν και μόνο ένας υποδοχέας αναγνωρίστηκε, ο υποδοχέας CD44 ( όπως προαναφέρθηκε ).

67 Ρόλος του LYVE 1 στην λεμφική μεταφορά του ΗΑ Ο LYVE 1 μεσολαβεί στην απορρόφηση του ΗΑ in vitro, αυτό γίνεται αντιληπτό με την εμφάνιση της ενσωμάτωσης του φθοριομένου ΗΑ από τον LYVE 1 ( LYVE 1 tranfected fibroblasts ), [50]. Επίσης, πιθανολογείται, ότι ο LYVE 1 παλινδρομεί κατά μήκος του λεμφικού ενδοθηλίου και μεταφέρει το ΗΑ από τους ιστούς στην λέμφο με ενδοκύττωση ( Εικόνα 50 ). Επίσης, η ενσωμάτωση από τον LYVE 1 είναι μέρος ( μονοπάτι ) της αποσύνθεσης του ΗΑ στο λεμφικό ενδοθήλιο. Η εντόπιση του LYVE 1 μαζί με το ΗΑ στην πρασαύλια επιφάνεια των λεμφαγγείων δηλώνει ότι μπορεί να καλύπτει τον αυλό των λεμφαγγείων δεσμευμένο με τον LYVE 1 και αυτή η επικάλυψη μπορεί να είναι σημαντική για τα κύτταρα που δεσμεύονται με το ΗΑ και μεταναστεύουν, για παράδειγμα τα λεμφοκύτταρα και τα δενδριτικά κύτταρα. Η έλξη των λευκοκυττάρων προς τα λεμφαγγεία γνωρίζουμε ότι ρυθμίζονται από κυτταροκίνες, όπως η SLC, που απελευθερώνονται από το λεμφικό επιθήλιο. Εδώ τίθονται τα ερωτήματα, πως επιτυγχάνεται η είσοδος και η επακόλουθη δίοδος των λευκοκυττάρων μέσα από τον αυλό των αγγείων, και αν μπορούν τα μεταναστευτικά λευκοκύτταρα να παρακάμπτουν την συμβολή των ενδοθηλιακών κυττάρων των λεμφικών τριχοειδών και πως χειρίζονται το άνοιγμα και το κλείσιμό τους ; Μια περίπτωση είναι το ΗΑ να απομονώνεται από τον LYVE 1 στην πλευρική επιφάνεια του λεμφικού ενδοθηλίου με την προώθηση της προσκόλλησης και της παρα κυτταρικής μετανάστευσης των CD44 λευκοκυττάρων και των καρκινικών κυττάρων κατά μήκος του αγγειακού τοιχώματος. Η αλληλεπίδραση του συμπλόκου LYVE 1 ΗΑ, στην επιφάνεια του αυλού, πιθανόν να διευκολύνει την μετανάστευση στους λεμφαδένες. Εικόνα 50. Possible roles of LYVE 1 in the lymphatic system.

68 LYVE 1 and tumor lymphangiogenesis Αφήνοντας, κατά μέρος τους ρόλους των λεμφαγγείων στην ανοσία και την ομοιόσταση, τα λεμφαγγεία είναι σημαντική δίοδος για την μετάσταση του καρκίνου. Υπάρχουν δυο αντιφατικές απόψεις, όσον αφορά την μετάσταση αυτή. Η πρώτη άποψη, στηρίζεται στο γεγονός ότι ο καρκίνος προκαλεί μεταστάσεις με την εισβολή σε ήδη υπάρχοντες ιστούς των λεμφαγγείων. Η δεύτερη άποψη είναι ότι ο καρκίνος προκαλεί μεν μεταστάσεις αλλά προωθεί και την διαμόρφωση νέων λεμφαγγείων μέσα στο ίδιο του το σώμα [10]. Παρ όλα αυτά, καμία τελική απόδειξη για την λεμφαγγειογένεση στους καρκίνους δεν έχει δημοσιευτεί, ενώ και οι ογκολόγοι συμφωνούν ότι ασκείται υψηλή πίεση εντός των καρκίνων, με αποτέλεσμα να καταστρέφονται τα αγγεία, τα οποία είναι απαραίτητα για την διατήρηση της ακεραιότητας των καρκινικών κυττάρων. Μέχρι τώρα, η πρώτη άποψη είναι αυτή που επικρατεί, ενώ η λεμφαγγειογένεση στους καρκίνους παραμένει μια υπόθεση. Διάφορες μελέτες, επιβεβαιώνουν την λεμφαγγειογένεση σαν μηχανισμό για την μετάσταση σε διαφόρων ειδών καρκίνου. Για παράδειγμα, σε διηθητικό καρκίνο του μαστού, τα λεμφικά τριχοειδή δεν δεσμεύουν τον LYVE 1 ( anti LYVE 1 antibodies ) εντός του καρκινικού σώματος ( intratumoral ), αλλά στην περιφέρεια του καρκίνου ( peritumoral ) [51].

69 ΔΕΙΚΤΕΣ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΛΕΜΦΑΓΓΕΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ SLC : κυτταροκίνη που απελευθερώνεται από το λεμφικό ενδοθήλιο και αντιδρά με τον CCR7, έλκοντας λευκοκύτταρα μέσα στα λεμφικά αγγεία. Η SLC εκφράζεται ομοιόμορφα στο λεμφικό ενδοθήλιο του ενήλικος. Podoplanin : είναι μια γλυκοπρωτεϊνη ( 43 kda ) της κυτταρικής επιφάνειας και ανιχνεύεται μαζί με τον VEGFR3 στο ενδοθήλιο των λεμφαγγείων. Πιθανολογείται ότι παίζει ρόλο στην ρύθμιση της διαπερατότητας των λεμφαγγείων, στη διατήρηση του σχήματος τους ή ακόμη και της δομής των βαλβίδων. Η ποδοπλανίνη είναι ένας πολλά υποσχόμενος δείκτης για την διαφοροποίηση μεταξύ λεμφικών και αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων. Prox 1 : είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που αποτελεί δείκτη για έναν υποπληθυσμό ενδοθηλιακών κυττάρων, τα οποία μετά την έκφρασή του προγραμματίζονται α ακολουθήσουν τον δρόμο της λεμφαγγειακής διαφοροποίησης. Φαίνεται απαραίτητος στο να εντάξει αυτόν τον υποπληθυσμό στο πρόγραμμα διαφοροποίησης, έτσι ώστε τα ενδοθηλιακά κύτταρα των φλεβών να θεωρούνται η πηγή προέλευσης των προγονικών κυττάρων των λεμφαγγείων. VEGFR3 : αυτός ο υποδοχέας εκφράζεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα των λεμφικών αγγείων του ενήλικος και αν και είναι ο καλύτερα χαρακτηρισμένος δείκτης για τα λεμφαγγεία και αρκετά ειδικός, πρέπει να διευκρινισθεί καλύτερα κάτω από ποιες συνθήκες εκφράζεται και στα αιμοφόρα αγγεία. Η σηματοδότηση από αυτόν τον υποδοχέα είναι απολύτως απαραίτητη για την ανάπτυξη των λεμφαγγείων. Βάφει τα PAL 3 αρνητικά τριχοειδή, όμως εντοπίζεται στα νέα αιμοφόρα αγγεία των όγκων και σε κοκκιώδη φλεγμονώδη ιστό.

70 PECAM 1 / CD31 Ο δείκτης PECAM 1 είναι το λεγόμενο μόριο προσκόλλησης αιμοπεταλίων / ενδοθηλιακών κυττάρων. Η χρήση του δείκτη αυτού είναι πολύτιμη τόσο για την επισήμανση αγγείων κατά τον προσδιορισμό της αγγειογένεσης, όσο και για την διαφοροποίηση της λεμφαγγειογένεσης από την αγγειογένεση. Το CD31 είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη μονής αλυσίδας τύπου I, με μοριακή περίπου 135 kda, η οποία ανήκει στην υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών. Σε ανθρώπινο ορό, έχουν ανιχνευτεί εναλλακτικά συρραμμένες εκδόσεις του CD31, συμπεριλαμβανομένης μιας μορφής που στερείται φαινομενικά μια διαμεμβρανική περιοχή, αλλά η οποία περιλαμβάνει την κυτταροπλασματική ουρά. Το CD31 δεσμεύεται τόσο με ομόφιλο όσο και με ετερόφιλο τρόπο. Οι ετερόφιλοι συνδέτες περιλαμβάνουν γλυκοζαμινογλυκάνες θειικής ηπαράνης, ηπαρίνη και α ν β 3 ιντεγκρίνη. Το CD31 διαδραματίζει ένα ρόλο σε αλληλεπιδράσεις προσκόλλησης μεταξύ παρακείμενων ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς και μεταξύ λευκοκυττάρων και ενδοθηλιακών κυττάρων. Η σύνδεση του CD31 στις επιφάνειες των λευκοκυττάρων έχει ως αποτέλεσμα την αυξορρύθμιση των λειτουργικών ιντεγκρινών των λευκοκυττάρων και η διαπίδυση των λευκοκυττάρων διαμέσου του ενδοθηλίου ενέχει ομόφιλες αλληλεπιδράσεις του CD31. Επιπλέον, η ετερόφιλη αλληλεπίδραση του CD31 διαδραματίζει ξεχωριστό ρόλο στην μετανάστευση των μονοκύτταρων διαμέσου του υποενδοθηλιακού βασικού υμένα. Το CD31 εκφράζεται σε όλα τα συνεχή ενδοθήλια, συμπεριλαμβανομένων εκείνων των αρτηριών, αρτηριδίων, φλεβιδίων, φλεβών και μη κολποειδών τριχοειδών, αλλά δεν εκφράζεται σε ασυνεχές ενδοθήλιο όπως π.χ. ερυθρό πολφό του σπληνός [52].

71 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

72 Υ Λ Ι Κ Ο Τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη προέρχονται από το Παθολογοανατομικό Εργαστήριο του Γενικού Νοσοκομείου Πατρών Άγιος Ανδρέας. Συνολικά η μελέτη συμπεριέλαβε 99 περιστατικά πορογενούς και λοβιακού καρκινώματος, τα οποία υποβλήθηκαν σε χειρουργείο ( ριζική μαστεκτομή (Halsted), εκτεταμένη ριζική μαστεκτομή, τροποποιημένη, τμηματική ), κατά το χρονικό διάστημα , στο 409 Στρατιωτικό Νοσοκομείο και το Γ. Ν. Πατρών Άγιος Ανδρέας. Τα περιστατικά προήλθαν από γυναίκες ηλικίας 30 έως 94 ετών (μέσος όρος ηλικίας τα 60 έτη). Τα περιστατικά ταξινομήθηκαν σύμφωνα με τον βαθμό κακοήθειας τους κατά Nottingham και τον ιστολογικό τύπο. Σε 41 περιπτώσεις συνυπήρχαν μεταστάσεις στους σύστοιχους μασχαλιαίους λεμφαδένες κατά την διάγνωση. Μετά από επιβεβαίωση της αρχικής διάγνωσης και ταξινόμησης, οι περιπτώσεις αυτές χωρίστηκαν σε έξι ομάδες όγκων : 1. Πορογενή διηθητικά καρκινώματα Grade I καλής διαφοροποίησης (n=6 ) 2. Πορογενή διηθητικά καρκινώματα Grade II μέσης διαφοροποίησης (n=34) 3.Πορογενή διηθητικά καρκινώματα Grade ΙΙΙ χαμηλής διαφοροποίησης (n= 47) 4. Λοβιακά διηθητικά καρκινώματα Grade II ( n = 7) 5. In situ πορογενή καρκινώματα υψηλής κακοήθειας ( n = 5 ).

73 Μ Ε Θ Ο Δ Ο Σ Επιλογή της μεθόδου Η μελέτη πρωτεϊνικής έκφρασης μπορεί να γίνει με πληθώρα ερευνητικών μεθόδων, βιοχημικών, ανοσολογικών ή μορφολογικών. Η πραγματοποίηση της παρούσας μελέτης έγινε με τη χρήση της ανοσοϊστοχημείας, μιας μεθόδου με ευρεία και επιτυχή εφαρμογή στον τομέα της διαγνωστικής ερευνητικής παθολογικής ανατομικής και μοριακής ογκολογίας. Η επιλογή της ανοσοϊστοχημικής μεθόδου έγινε λόγω των εξής πλεονεκτημάτων της : Επιτρέπει την μελέτη της έκφρασης των πρωτεϊνών in situ στον υπό εξέταση ιστό. Το γεγονός αυτό, δίνοντας την δυνατότητα εντόπισης των πρωτεϊνών ( π.χ. σε ποια κύτταρα, μεμβρανική, πυρηνική ή κυτταροπλασματική ανοσοχρώση κ.τ.λ. ) και άμεσης συσχέτισης της πρωτεϊνικής έκφρασης με ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά ( ιστολογικά, κυτταρικά και πυρηνικά χαρακτηριστικά του όγκου, βαθμός διαφοροποίησης, διήθηση, χαρακτηριστικά με προγνωστική σημασία ), συμβάλλει στην εξαγωγή συμπερασμάτων για τον μηχανισμό δράσης των πρωτεϊνών και τον ρόλο τους στην παθογένεια του ιστού. Είναι ευαίσθητη και ειδική μέθοδος, καθώς βασίζεται στην ειδική δέσμευση αντιγόνου αντισώματος. Πρόκειται για σχετικά γρήγορη, απλή, και οικονομική μέθοδο. Δίνει μόνιμα αποτελέσματα, επιτρέποντας την επανεκτίμησή τους. Η εφαρμογή της σε μονιμοποιημένους ιστούς δίνει τη δυνατότητα αξιοποίησης μεγάλου αριθμού περιστατικών σε σύντομο χρονικό διάστημα καθώς και την διεξαγωγή αναδρομικών μελετών.

74 Βασικές αρχές ανοσοϊστοχημείας Η ανοσοϊστοχημεία βασίζεται στην ειδική δέσμευση αντισωμάτων ( μονοκλωνικών ή πολυκλωνικών ) με ενδοκυττάρια ή εξωκυττάρια αντιγόνα που βρίσκονται in situ στον υπό μελέτη ιστό. Η ανίχνευση των θέσεων δέσμευσης γίνεται με την χρήση είτε φθορίζοντων μορίων ( ανοσοφθορίζουσες τεχνικές ), είτε, πιο διαδεδομένα, με την χρήση ενζυμικής χρωμογόνου αντίδρασης ( ανοσοενζυμικές τεχνικές ). Η ανοσοϊστοχημεία περιλαμβάνει τη χρήση πολυκλωνικών αντισωμάτων, τα οποία παράγονται από την ανοσοποίηση ζώου ξενιστή με έγχυση σε αυτό καθαρμένου ειδικού μορίου (ανοσογόνο) που φέρει το ζητούμενο αντιγόνο. Το ζώο απαντά χυμικά στο ανοσογόνο και τα αντισώματα που παράγονται συγκεντρώνονται στον ορό που είναι πλούσιος σε ανοσοσφαιρίνες. Το ζώο συνθέτει ποικίλους κλώνους πλασματοκυττάρων, όπου ο καθένας από αυτούς παράγει ένα αντίσωμα με ασθενή ειδικότητα, δηλαδή με ποικιλία επιτόπων για το συγκεκριμένο αντιγόνο. Μερικά από αυτά τα αντισώματα μπορούν να αντιδράσουν διασταυρούμενα με άλλα μόρια, γι αυτό χρειάζεται να απομακρύνονται με προσρόφηση με το κατάλληλο αντιγόνο. Μπορεί, επίσης, να διαθέτει και άλλα αντισώματα και πρωτεΐνες στον ορό που είναι δυνατόν να οδηγήσουν σε προβλήματα διασταυρούμενης αντίδρασης ή μη εδικής χρώσης. Εάν το ζητούμενο αντίσωμα παρουσιασθεί σε υψηλή συγκέντρωση, πολλές από τις ανεπιθύμητες αντιδράσεις μπορούν να αποκλεισθούν με διάλυσή του [53]. Η επίτευξη της παραγωγής μονοκλωνικών αντισωμάτων προσέφερε το πλεονέκτημα της απόλυτης ειδικότητας για μια απλή αλληλουχία ή επίτοπο του προς ανίχνευση αντιγονικού μορίου. Η ανάπτυξη της τεχνικής του υβριδιώματος από τους Kohler και Milstein το 1975, έδωσε ώθηση στην ανοσοϊστοχημεία με την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων. Λεπτομερής περιγραφή της τεχνικής ανακοινώθηκε από τους Gatter et al και Ritter το H μέθοδος συνδυάζει την ικανότητα των διαφοροποιημένων Β λεμφοκυττάρων να παράγουν ειδικό αντίσωμα με την ιδιότητα της in vitro αθανασίας της κυτταρικής σειράς του πολλαπλού μυελώματος. Με την σύντηξη των δυο αυτών κυττάρων παράγεται ένα υβρίδιο που διατηρεί και τις δυο ιδιότητες. Με την τεχνική της κλωνοποίησης το κύτταρο αυτό μπορεί να αναπτυχθεί και να πολλαπλασιασθεί σε κυτταρική σειρά ή σε ασκιτικό υγρό, θεωρητικά σε απεριόριστο βαθμό. Επιλέγονται για κλωνοποίηση τα υβρίδια εκείνα που παράγουν αντισώματα χωρίς διασταυρούμενη αντίδραση με άλλα μόρια. Τα μονοκλωνικά αντισώματα γενικά υπερτερούν των πολυκλωνικών, γιατί εκτός της σύνδεσής τους με την αμινοξική αλληλουχία του επιτόπου, εμφανίζουν σε πολύ μικρότερο βαθμό φαινόμενα ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων και θορύβου (background staining). Ωστόσο, η πιθανή αλλοίωση της μοναδικής θέσης δέσμευσης του αντιγόνου κατά την επεξεργασία του ιστού μπορεί να οδηγήσει σε αδυναμία ανίχνευσης του αντιγόνου και η δέσμευση μικρότερου αριθμού μορίων αντισώματος / μόριο

75 αντιγόνου έχει ως αποτέλεσμα ασθενέστερη ανοσοχρώση ( μειωμένη ευαισθησία ). Στις ανοσοενζυμικές τεχνικές το ένζυμο που κυρίως χρησιμοποιείται για την σήμανση των αντισωμάτων είναι η υπεροξειδάση. Άλλα ένζυμα ( αλκαλική φωσφατάση, οξειδάση γλυκόζης ) χρησιμοποιούνται συνήθως μόνο σε ειδικές περιπτώσεις ιστών ή όταν επιθυμείτε η ταυτόχρονη ανίχνευση δυο διαφορετικών αντιγόνων ( double immunostaining ). Η υπεροξειδάση καταλύει, παρουσία ενός δότη ηλεκτρονίων, τη διάσπαση του υπεροξειδίου του υδρογόνου σε νερό και οξυγόνο. Ως δότες ηλεκτρονίων στην αντίδραση χρησιμοποιούνται ουσίες οι οποίες καθώς οξειδώνονται παράγουν χρώμα (χρωμογόνο). Το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο χρωμογόνο στην ανοσοϊστοχημεία είναι η 3,3 τετραυδροχλωρική διάμινο βενζιδίνη ( DAB ), που αποφέρει ζωηρή, σταθερή, σκούρα καφέ αντίδραση. Οι τεχνικές ανοσο υπεροξειδάσης διακρίνονται σε άμεσες (σημασμένο πρωτογενές αντίσωμα), έμμεσες δυο βημάτων (πρωτογενές και σημασμένο δευτερογενές αντίσωμα) και έμμεσες τριών βημάτων. Στην τελευταία κατηγορία ανήκουν η μέθοδος υπεροξειδάσης - αντιυπεροξειδάσης ( PAP ), η μέθοδος αβιδίνης βιοτίνης ( ABC ) και η μέθοδος βιοτίνης στρεπταβιδίνης ( B SA ) [54]. Η έμμεση μέθοδος τριών βημάτων βιοτίνης - στρεπταβιδίνης (B SA) είναι η ανοσοϊστοχημική τεχνική που έχει σήμερα την ευρύτερη εφαρμογή, καθώς σε σύγκριση με τις άμεσες και δύο βημάτων έμμεσες μεθόδους προκαλεί ενίσχυση της έντασης του σήματος, πλεονεκτεί δε των υπολοίπων έμμεσων μεθόδων τριών βημάτων γιατί εμφανίζει μεγαλύτερη ευαισθησία και μικρότερου βαθμού μη ειδική χρώση. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην ιδιότητα της βιοτίνης να συνδέεται ειδικά, ισχυρά και μη ανοσολογικά με την στρεπταβιδίνη, μια πρωτεΐνη μοριακού βάρους 60 kd που προέρχεται από το βακτήριο Streptomyces avidinii. Όπως και στις άλλες μεθόδους τριών βημάτων χρησιμοποιούνται τρία αντιδραστήρια : α) το πρώτο αντίσωμα (primary antibody), το οποίο είναι ειδικό για το υπό ανίχνευση αντιγόνο, β) το δεύτερο βιοτινυλιωμένο αντίσωμα ( link ), το οποίο αναγνωρίζει το πρώτο και συνδέεται σε αυτό, και γ) το σύμπλοκο στρεπταβιδίνης υπεροξειδάσης ( label : streptavidin peroxidase reagent ), που συνδέεται με το δεύτερο αντίσωμα. Οι θέσεις δέσμευσης γίνονται ορατές με την προσθήκη στην συνέχεια του χρωμογόνου ( DAB ). Βασικά βήματα της τεχνικής που συνολικά αποσκοπούν στη βέλτιστης έντασης χρώση με το μικρότερο δυνατό βαθμό μη ειδικής χρώσης ( background ) είναι η κατανάλωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης των ιστών, η πρωτεϊνική δέσμευση (protein blocking) πριν την προσθήκη του πρώτου αντισώματος για την μείωση της μη ειδικής δέσμευσης και η επιλογή της κατάλληλης αραίωσης και των συνθηκών επώασης του ειδικού αντισώματος. Επίσης, επειδή πολλές φορές η διαδικασία μονιμοποίησης του ιστού προκαλεί συγκάλυψη των αντιγονικών θέσεων δέσμευσης (antigen masking ) με αποτέλεσμα την αδυναμία ανίχνευσής τους, σημαντική είναι η εφαρμογή κάποιας μεθόδου ανάδειξης των

76 αντιγονικών επιτόπων ( antigen epitope retrieval ). Οι ευρύτεροι χρησιμοποιούμενες μέθοδοι ανάδειξης των επιτόπων είναι, ανάλογα με το αντίσωμα, η πέψη του ιστού σε φούρνο μικροκυμάτων [55,56]. Μεγάλη σημασία έχει η σύσταση και το ph του διαλύματος εμβάπτισης, ενώ δεν ενδύκνειται θέρμανση σε απεσταγμένο νερό. Είναι βέβαια σημαντικό να γνωρίζουμε ότι η αναδίπλωση των πρωτεϊνικών αλυσίδων, με επακόλουθο την ανάδειξη των αντιγονικών θέσεων, συμβαίνει όταν η θερμοκρασία του διαλύματος επανέλθει σε θερμοκρασία δωματίου [56,57]. Κύριο, τέλος, μειονέκτημα είναι ο μεγάλος βαθμός υποκειμενικότητας στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων που μπορεί όμως να αντιμετωπιστεί είτε με τη αξιολόγηση των αποτελεσμάτων από περισσότερους του ενός ανεξάρτητους εκτιμητές, είτε με την χρήση συστημάτων ψηφιακής ανάλυσης και ποσοτικοποίησης της ιστοπαθολογικής εικόνας.

77 Αναλυτική μεθοδολογία της παρούσας μελέτης Προετοιμασία του ιστού Όλα τα παρασκευάσματα μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα φορμαλίνης 10% και στην συνέχεια εγκλείστηκαν σε κύβους παραφίνης. Από κάθε περιστατικό που μελετήθηκε, επιλέχθηκε ένας αντιπροσωπευτικός κύβος παραφίνης από τον οποίο ελήφθησαν τομές πάχους 5 μm. Ακολούθησε μεταφορά των τομών σε έτοιμες προς χρήση αντικειμενοφόρους πλάκες ( SuperFrost Plus και Poly L Lysine, Menzel Glaser, Germany ). Ανοσοϊστοχημική χρώση Η ανοσοϊστοχημική μέθοδος που εφαρμόστηκε ήταν η μέθοδος βιοτίνης - στρεπταβιδίνης υπεροξειδάσης σε τομές παραφίνης. Τα ειδικά αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα εξής : anti human LYVE 1 AG ( RELIATech GmbH, 50 μg ) σε αραίωση 1 : 400 και anti human CD 31, monoclonal mouse, Endothelial Cell Clone JC70A ( DakoCytomation ) σε αραίωση 1 : 20. Η αραίωση, η οποία έγινε με το Antibody Diluent Chemmate TM S2022 ( DakoCytomation ), και οι συνθήκες επώασης ( overnight στους 4 0 C και 1 ½ h σε θερμοκρασία δωματίου αντίστοιχα ) των αντισωμάτων, που χρησιμοποιήθηκαν τελικά μετά από πολλές δοκιμές, ήταν αυτές που συνδύαζαν το βέλτιστης έντασης σήμα με το μικρότερο δυνατό βαθμό μη ειδικής χρώσης ( background staining ). Η δέσμευση των ειδικών αντισωμάτων ανιχνεύθηκε με το σύστημα Chemmate TM Dako Envision TM / HRP, Rabbit / Mouse (100 ml) ( DakoCytomation ) και χρωμογόνο το DAB ( DAB Peroxidase Substrate Kit, Vector Laboratories Inc., SK 4100 ). Για τον έλεγχο της μεθόδου χρησιμοποιήθηκαν : 1) ως αρνητικοί μάρτυρες ( negative control ), τομές ιστού που επεξεργάστηκαν με την μέθοδο χωρίς όμως την προσθήκη πρωτογενούς αντισώματος και 2) ως θετικοί μάρτυρες ( positive control ), τομές παραφίνης αγγειοσαρκωμάτων και λεμφαγγειωμάτων. Τα αναλυτικά πρωτόκολλα ανοσοϊστοχημικής χρώσης για το LYVE 1 και το CD 31 παρουσιάζονται παρακάτω στους Πίνακες 6,7.

78 Πίνακας 6. Ανοσοϊστοχημική μέθοδος για την ανίχνευση του LYVE Αποπαραφίνωση των τομών παραφίνης στους 56 0 C overnight. 2. Εμβάπτιση των τομών σε ξυλόλη στους 56 0 C επί 20 min και στην συνέχεια σε ξυλόλη σε θερμοκρασία δωματίου για 3 min ( 2 αλλαγές ). 3. Ενυδάτωση του ιστού σε κατιούσα σειρά αλκοολών (100 0, 100 0, 96 0, 80 0, 70 0 ) και έκπλυση στη συνέχεια με απιονισμένο Η 2 Ο για 5 min. 4. Κατανάλωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης του ιστού με εμβάπτιση των τομών σε διάλυμα 0.3 % Η 2 Ο 2 σε απιονισμένο Η 2 Ο επί 20 min (σε σκοτεινό μέρος ). 5. Έκπλυση των τομών σε απιονισμένο Η 2 Ο ( 2 φορές χ 5 min ). 6. Ανάδειξη αντιγονικών επιτόπων : επικάλυψη των τομών με κιτρικό νάτριο σε ph 6.0 και τοποθέτηση των τομών στον φούρνο μικροκυμάτων 5 min στα 700 watt, 5 min στα 500 watt και 5 min στα 300 watt. 7. Παραμονή σε θερμοκρασία δωματίου για 20 min, προκειμένου να γίνει επαναδίπλωση των πρωτεϊνικών αλυσίδων. 8. Έκπλυση των τομών σε απιονισμένο Η 2 Ο ( 2 φορές χ 5 min ) 9. Έκπλυση των τομών σε TBS ph 7.6 ( 3 φορές χ 5 min ). 10. Επώαση με το ειδικό anti LYVE 1 αντίσωμα overnight στους 4 0 C. 11. Έκπλυση των τομών σε TBS ( 3 φορές χ 5 min ). 12. Κατανάλωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης του ιστού με εμβάπτιση των τομών σε διάλυμα 0.3 % Η 2 Ο 2 σε απιονισμένο Η 2 Ο επί 3 min ( σε σκοτεινό μέρος ). 13. Έκπλυση των τομών σε TBS ( 3 φορές χ 5 min ). 14. Επώαση με το διάλυμα En vision της DakoCytomation για 45 min. 15. Έκπλυση των τομών σε TBS ( 3 φορές χ 5 min ). 16. Ανίχνευση θέσεων δέσμευσης υπεροξειδάσης με την εφαρμογή του διαλύματος τετραϋδροχλωρικής διαμινοβενζιδίνης ( DAB ) επί 10 min. 17. Έκπλυση με απιονισμένο Η 2 Ο. 18. Έκπλυση με νερό βρύσης. 19. Χρώση αντίθεσης των πυρηνών ( counterstaining ) με αιματοξυλίνη Harris, έκπλυση με τρεχούμενο νερό βρύσης. 20. Αφυδάτωση των τομών σε ανιούσα σειρά αλκοολών ( 70 0, 80 0, 96 0, 100 0, ). 21. Εμβάπτιση σε ξυλόλη ( 2 φορές χ 2 min ). 22. Επικόλληση καλυπτρίδων με χρήση διαλυτού στην ξυλόλη μέσου (Entellan, Merch, Germany).

79 Πίνακας 7. Ανοσοϊστοχημική μέθοδος για την ανίχνευση του CD Αποπαραφίνωση των τομών παραφίνης στους 56 0 C overnight. 2. Εμβάπτιση των τομών σε ξυλόλη στους 56 0 C επί 20 min και στην συνέχεια σε ξυλόλη σε θερμοκρασία δωματίου για 3 min ( 2 αλλαγές ). 3. Ενυδάτωση του ιστού σε κατιούσα σειρά αλκοολών (100 0, 100 0, 96 0, 80 0, 70 0 ) και έκπλυση στη συνέχεια με απιονισμένο Η 2 Ο για 5 min. 4. Κατανάλωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης του ιστού με εμβάπτιση των τομών σε διάλυμα 0.3 % Η 2 Ο 2 σε απιονισμένο Η 2 Ο επί 20 min (σε σκοτεινό μέρος ). 5. Έκπλυση των τομών σε απιονισμένο Η 2 Ο ( 2 φορές χ 5 min ). 6. Ανάδειξη αντιγονικών επιτόπων : τοποθέτηση του δ/τος TRILOGY στους C για 4 min. Τοποθετούμε τις τομές στο ζεστό διάλυμα για 5 min. Συγχρόνως βάζουμε και το δεύτερο μπανάκι για 5 min στον φούρνο. Μόλις τελειώσουν τα 5 min βάζουμε τις τομές στο δεύτερο μπανάκι για 10 min. 7. Έκπλυση των τομών σε απιονισμένο Η 2 Ο ( 2 φορές χ 5 min ) 8. Έκπλυση των τομών σε TBS ph 7.6 ( 3 φορές χ 5 min ). 9. Επώαση με το ειδικό anti CD 31 αντίσωμα 1 ½ h σε θερμοκρασία δωματίου. 10. Έκπλυση των τομών σε TBS ( 3 φορές χ 5 min ). 11. Κατανάλωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης του ιστού με εμβάπτιση των τομών σε διάλυμα 0.3 % Η 2 Ο 2 σε απιονισμένο Η 2 Ο επί 3 min ( σε σκοτεινό μέρος ). 12. Έκπλυση των τομών σε TBS ( 3 φορές χ 5 min ). 13. Επώαση με το διάλυμα En vision της DakoCytomation για 45 min. 14. Έκπλυση των τομών σε TBS ( 3 φορές χ 5 min ). 15. Ανίχνευση θέσεων δέσμευσης υπεροξειδάσης με την εφαρμογή του διαλύματος τετραϋδροχλωρικής διαμινοβενζιδίνης ( DAB ) επί 10 min. 16. Έκπλυση με απιονισμένο Η 2 Ο. 17. Έκπλυση με νερό βρύσης. 18. Χρώση αντίθεσης των πυρηνών ( counterstaining ) με αιματοξυλίνη Harris, έκπλυση με τρεχούμενο νερό βρύσης. 19. Αφυδάτωση των τομών σε ανιούσα σειρά αλκοολών ( 70 0, 80 0, 96 0, 100 0, ). 20. Εμβάπτιση σε ξυλόλη ( 2 φορές χ 2 min ). 21. Επικόλληση καλυπτρίδων με χρήση διαλυτού στην ξυλόλη μέσου (Entellan, Merch, Germany).

80 Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα ακόλουθα : Tris buffer 0.05 M ( ph 7.6 ) : 6,1 gr Tris σε 1000 ml απιονισμένο Η 2 Ο. ρύθμιση του ph με 1 Ν HCl. 1 Ν HCl : 8,5 ml HCl σε 1000 ml απιονισμένο H 2 O. Διάλυμα NaCl : 8,1 gr NaCl σε 900 ml απιονισμένο Η 2 Ο. Tris buffer saline ( TBS ) ( ph 7.6 ) : 100 ml Tris και 900 ml διαλύματος NaCl. 1 N NaOH : 40 gr NaOH σε 1000 ml απιονισμένο Η 2 Ο. Κιτρικό νάτριο 0,1 Μ (ph 6.0) : 2,1 gr κιτρικό νάτριο σε 1000 ml απιονισμένο H 2 O. Διάλυμα Η 2 Ο 2 0,3 % : 194 ml απιονισμένο Η 2 Ο και 6 ml Hydrogen Peroxidase 30 %.

81 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ ΣΥΝΟΠΤΙΚΑ Χρησιμοποιήσαμε τομές πάχους 4 μ. αρχειακού υλικού αποτελούμενου από 99 ιστικά δείγματα καρκίνου του μαστού, πορογενή διηθητικά καρκινώματα grade III ( n=47), grade II (n=34 ), grade I (n=6 ), λοβιακά διηθητικά grade II (n=7) και in situ πορογενή υψηλής κακοηθείας( n=5 ), 99 θήλεων ασθενών, μονιμοποιημένα σε φορμόλη και εγκλεισμένα σε παραφίνη. Με 41 /99 όγκους συνυπήρχαν λεμφαδενικές μεταστάσεις κατά την διάγνωση. Με ανοσοϊστοχημική μέθοδο (Envision-HRP) διερευνήσαμε στά ανωτέρω καρκινώματα: 1. Την έκφραση του υποδοχέα υαλουρονικού LYVE-1 (PA, Relia Tech Gmbh) που θεωρείται κύριος υποδοχέας για το υαλουρονικό (μια γλυκοζαμινογλυκάνη της εξωκυττάριας ουσίας) και ο οποίος πιθανόν συμμετέχει στον μεταβολισμό του υαλουρονικού στο λεμφικό σύστημα. Η έκφραση του LYVE-1 περιορίζεται ευρέως στα ενδοθηλιακά κύτταρα που επενδύουν τα λεμφαγγεία καθώς και στα ενδοθηλιακά κύτταρα των κολποειδών του σπληνός. Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν ιστολογικές τομές φυσιολογικού λεπτού εντέρου επειδή η μεγαλύτερη ένταση της έκφρασης του LYVE-1 έχει παρατηρηθεί στα χυλοφόρα τριχοειδή των λαχνών καθώς και στα υποβλεννογόνια αγγεία του παχέος εντέρου. 2. Την έκφραση του ενδοθηλιακού δείκτη CD31 (JC70 MoAB DAKO ) ο οποίος δεν έχει ιδιαίτερη συγγένεια με τα λεμφαγγεία και μέσω αυτού μπορούμε να αναδείξουμε την μικροαγγειακή πυκνότητα και άμεσα την αγγειογενετική δραστηριότητα ενός όγκου. Η μέτρηση της μικροαγγειακής και λεμφαγγειακής πυκνότητας έγινε επί και εγγύς (απόσταση 2mm ) της παρυφής των όγκων, μέσα στο παρέγχυμα του νεοπλασματικού ιστού και στο φυσιολογικό ινολιπώδες στρώμα του μαζικού αδένα. Οι περιοχές με την μεγαλύτερη αγγειοβρίθεια (hot spots) επιλέχθηκαν με μικρή μεγέθυνση ( 100) και η μέτρηση των όλων των αγγείων με θετική έκφραση του LYVE-1 και του CD31 έγινε σε τρία οπτικά πεδία αυτών των αγγειοβριθών περιοχών με μεγέθυνση ( 200), ανεξάρτητα, από δύο παθολογοανατόμους. Ως μικροαγγειακή πυκνότητα ελήφθη ο μέσος όρος του αριθμού των αγγείων που αναγνωρίσθηκαν σε αυτά τα τρία οπτικά πεδία με την μεγαλύτερη αγγειοβρίθεια. Όταν ο μέσος αριθμός αυτός των αγγείων είναι μεγαλύτερος του 7 ο καρκίνος θεωρείται ότι έχει μεγάλη λεμφαγγειακή ( n = 5 in situ ductal carcinoma ) ή αγγειακή πυκνότητα ( n = 99, invasive ductal and lobular carcinoma ) ενώ όταν ο μέσος αριθμός των αγγείων είναι μικρότερος του 7 τότε ο όγκος θεωρείται ότι έχει μικρή λεμφαγγειακή ( n=94 invasive ductal and lobular carcinoma ) ή αγγειακή πυκνότητα( n=0 ), (Petri Bono,Veli Matti Wasenius,et al. Clinical Cancer Research Vol.10, ,Nov 1,2004.

82 Α Π Ο Τ Ε Λ Ε Σ Μ Α Τ Α Η έκφραση του LYVE 1 μελετήθηκε με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας σε τομές παραφίνης σε 99 συνολικά νεοπλάσματα μαστού και έγινε συσχέτιση των ευρημάτων με διάφορες κλινικές και παθολογοανατομικές παραμέτρους. Λεμφαγγεία μέσα στον όγκο δεν παρατηρήθηκαν σε κανένα καρκίνωμα ( 0 / 99 ). Παρουσία λεμφαγγείων παρατηρήθηκε στο φυσιολογικό παρέγχυμα του μαστού ( 68 / 99 ), εγγύτερα προς την περιφέρεια των in situ καρκινωμάτων (5/99) και σε αρκετά πιο απομακρυσμένες θέσεις σε σχέση με την περιφέρεια των διηθητικών όγκων (στο φυσιολογικό ινολιπώδες στρώμα του μαζικού αδένα,μεταξύ των λοβίων,γύρω από πόρους και εγγύς αιμοφόρων αγγείων) Στατιστικά σημαντική σχέση δεν παρατηρήθηκε μεταξύ της λεμφαγγειακής πυκνότητος στο παρακείμενο (1mm) και στο πιο απομακρυσμένο (3mm) του όγκου φυσιολογικό παρέγχυμα του μαζικού αδένα, ούτε με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων και του ιστολογικού βαθμού κακοηθείας, ούτε μεταξύ της απουσίας ενδοογκικών λεμφαγγείων και του βαθμού κακοηθείας των διηθητικών όγκων. Σε αντίθεση με τον LYVE 1, ο ενδοθηλιακός δείκτης CD31 ανέδειξε αυξημένη πυκνότητα μικρών αιμοφόρων αγγείων μέσα στο νεοπλασματικό παρέγχυμα καθώς και στην περιφέρεια του διηθητικού καρκινώματος, σε όλα τα διηθητικά καρκινώματα που μελετήσαμε ανεξαρτήτως τύπου και ιστολογικού βαθμού κακοηθείας (94 / 99). Τα in situ πορογενή καρκινώματα παρουσίασαν μικρή αγγειακή πυκνότητα με βάσει την έκφραση του δείκτη CD31 τόσο μέσα όσο και κατά μήκος της περιφέρειας του όγκου. ΠΙΝΑΚΑΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Πορογενή διηθητικά GRADE I ( n = 5 ) Πορογενή διηθητικά GRADE II ( n = 34 ) Πορογενή διηθητικά GRADE III (n = 47) Λοβιακά διηθητικά GRADE II ( n = 8 ) Πορογενή IN SITU HIGH GRADE (n=5) LYVE-1 5/5(--) CD31 5/5 (+) high density LYVE-1 34/34 (-- CD31 34/34 (+) ) high density LYVE-1 47/47 (-- ) CD31 47/47 (+) high density LYVE-1 8/8 (--) CD31 8/8 (+) high density LYVE-1 peritumoral 5/5 (+) high density Μετάσταση σε λεμφαδένες 1/5 Μετάσταση σε λεμφαδένες 16/34 Μετάσταση σε λεμφαδένες 22/47 Μετάσταση σε λεμφαδένες 2/8 CD31 5/5 (+) Low density) -----

83 ΕΙΚΟΝΕΣ ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗΣ ΧΡΩΣΗΣ

84 Εικόνα 1. Διηθητικό πορογενές καρκίνωμα μαστού στο οποίο δεν αναδεικνύεται παρουσία λεμφαγγείων εντός του νεοπλασματικού παρεγχύματος με την ανοσοϊστοχημική μέθοδο για το αντίσωμα LYVE-I (χ200). Εικόνα 2. Παρουσία λεμφαγγείων στο φυσιολογικό στρώμα του μαζικού αδένα σε παρακείμενες θέσεις του όγκου (βέλη 200 ).

85 Εικόνα 3. Παρουσία θετικών λεμφαγγείων στο LYVE-1 εγγύς της περιφερείας in situ λοβιακού καρκινώματος μαστού (βέλη 200 ). Εικόνα 4. Παρουσία θετικών λεμφαγγείων στο LYVE-1 εγγύς της περιφερείας in situ πορογενούς καρκινώματος μαστού (βέλη 200 ).

86 Εικόνα 5. Παρουσία λεμφαγγείων με θετική έκφραση LYVE-1 εγγύς της περιφέρειας πορογενούς in situ καρκινώματος μαστού φαγεσωρικού τύπου (βέλος 200 ). Θετική χρώση παρατηρείται και σε μικρό αριθμό μακροφάγων κυττάρων (μικρά βέλη). Εικόνα 6. Παρουσία λεμφαγγείων δεν παρατηρήθηκε κατά μήκος της περιφερείας του πορογενούς διηθητικού καρκινώματος του μαζικού αδένα (βέλη 200 ).

87 Εικόνα 7. Παρουσία λεμφαγγείων δεν παρατηρήθηκε κατά μήκος της περιφερείας του πορογενούς διηθητικού καρκινώματος του μαζικού αδένα (βέλη 200 ). Εικόνα 8. Λεμφαγγεία θετικά στο LYVE-1 παρατηρούνται στο φυσιολογικό στρώμα του μαζικού αδένα μεταξύ των λοβίων ενώ τα αιμοφόρα αγγεία δεν παρουσιάζουν θετική χρώση (βέλη 200 ).

88 Εικόνα 9. Ανάδειξη μεγάλου αριθμού αριθμού αιμοφόρων αγγείων (high microvessel density) στο νεοπλασματικό παρέγχυμα διηθητικού πορογενούς καρκινώματος με την ανοσοϊστοχημική μέθοδο για το αντίσωμα CD31 (200 ). Εικόνα 10. Θετική έκφραση του δείκτη CD31 μέσα στο παρέγχυμα διηθητικού πορογενούς καρκινώματος μαστού (βέλη 200 ).

89 Εικόνα 11. Θετική έκφραση του δείκτη CD31 μέσα στο παρέγχυμα διηθητικού πορογενούς καρκινώματος μαστού (200 ). Εικόνα 12. Καρκινικό έμβολο μέσα σε λεμφαγγείο θετικό στο LYVE-1 σε αρκετή απόσταση από τον κυρίως όγκο (200 ).