ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕΪΝΑΣΩΝ ΣΤΟ ΥΠΑΜΦΙΒΛΗΣΤΡΟΕΙΔΙΚΟ ΥΓΡΟ ΚΑΙ ΤΟ ΥΑΛΟΕΙΔΕΣ ΚΑΙ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΤΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΠΡΟΟΔΟ ΤΗΣ ΑΠΟΚΟΛΛΗΣΗΣ ΤΟΥ ΑΜΦΙΒΛΗΣΤΡΟΕΙΔΟΥΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΑΙΣΘΗΤΗΡΙΩΝ ΟΡΓΑΝΩΝ Β ΟΦΘΑΛΜΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: Ο ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΣΤΑΥΡΟΣ Α. ΔΗΜΗΤΡΑΚΟΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ Αριθμός 2073 ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕΪΝΑΣΩΝ ΣΤΟ ΥΠΑΜΦΙΒΛΗΣΤΡΟΕΙΔΙΚΟ ΥΓΡΟ ΚΑΙ ΤΟ ΥΑΛΟΕΙΔΕΣ ΚΑΙ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΤΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΠΡΟΟΔΟ ΤΗΣ ΑΠΟΚΟΛΛΗΣΗΣ ΤΟΥ ΑΜΦΙΒΛΗΣΤΡΟΕΙΔΟΥΣ ΧΡΥΣΑΝΘΟΥ Γ. ΣΥΜΕΩΝΙΔΗ ΙΑΤΡΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 Η εκπόνηση της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής χρηματοδοτήθηκε από το Υπουργείο Εθνικής Παιδείας και Θρησκευμάτων μέσω της υποτροφίας υπ αριθμόν 22 του Προγράμματος «Ηράκλειτος: Υποτροφίες Έρευνας στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης» του Επιχειρησιακού Προγράμματος Εκπαίδευση και Αρχική Επαγγελματική Κατάρτιση (Ε.Π.Ε.Α.Ε.Κ.)-ΙΙ του Γ Κοινοτικού Πλαισίου Στήριξης της Ευρωπαϊκής Ένωσης.

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ Ν. ΜΠΟΝΤΗΣ 3

4 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΣΤΑΥΡΟΣ Α. ΔΗΜΗΤΡΑΚΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ-ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΥΔΟΞΙΑ ΔΙΖΑ-ΜΑΤΑΥΤΣΗ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΣΤΑΥΡΟΣ Α. ΔΗΜΗΤΡΑΚΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ-ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΥΔΟΞΙΑ ΔΙΖΑ-ΜΑΤΑΥΤΣΗ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΓΕΩΡΓΙΑΔΗΣ-ΣΤΕΦΑΝΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΜΑΝΘΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΠΑΠΠΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΑΚΙΟΥΛΑΚΗΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η έγκριση της Διπλωματικής αυτής Εργασίας από την Ιατρική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα (Νόμος 5343/32, άρθρ και 1268/82, άρθρ. 50 8) 4

5 Στους πολυαγαπημένους μου γονείς, στην οικογένειά μου Στη γλυκιά μου Δάφνη 5

6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Κυριότερες συντμήσεις Πρόλογος.. 15 Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΑΠΟΚΟΛΛΗΣΗ ΤΟΥ ΑΜΦΙΒΛΗΣΤΡΟΕΙΔΟΥΣ. 21 Α.1. Ο αμφιβληστροειδής χιτώνας 21 Α.1.1. Ανατομία-Φυσιολογία του αμφιβληστροειδούς (Μελάγχρουν επιθήλιο-μεσοκυττάρια ουσία).. 21 Α Ανατομικά στοιχεία.. 21 Α Λειτουργίες. 21 Α Η μεσοκυττάρια ουσία μεταξύ των φωτοϋποδοχέων.. 23 Α.1.2. Η αμφιβληστροειδική πρόσφυση 23 Α Συντελεστές αμφιβληστροειδικής πρόσφυσης 23 Α.2. Η ρηγματογενής αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς. 25 Α.2.1. Η ρηγματογενής αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς.. 25 Α.2.2. Τα χαρακτηριστικά της αποκόλλησης. 26 Α.2.3. Ο υπαμφιβληστροειδικός χώρος - Το υπαμφιβληστροειδικό υγρό. 27 Α Η μετακίνηση υγρού διαμέσου ενός αμφιβληστροειδικού ρήγματος 27 Α Δυνάμεις δρώσες κατά τη μετακίνηση υγρού από τον υπαμφιβληστροειδικό χώρο προς το χοριοειδή 28 Α Η σύσταση του υπαμφιβληστροειδικού υγρού. 29 Α α. Ο αυξητικός παράγοντας των ηπατοκυττάρων (HGF/SF).. 29 Α β. Ιντερλευκίνες και σύσταση του υπαμφιβληστροειδικού υγρού. 30 Α γ. Ινωδόλυση στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό 31 - Eνεργοποιητής πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (u-pa) 31 - Ενεργοποιητής πλασμινογόνου ιστικού τύπου (t-pa) 32 7

8 Α δ. Πλασμίνη. 33 Α ε. Πρωτεϊνάσες και μεταλλοπρωτεϊνάσες.. 33 Α στ. Λευκωματίνη. 33 Α ζ. Πρωτεΐνες 34 Α η. Λιπίδια. 35 Α θ. Υποδοχέας της τρανσφερρίνης. 35 Α ι. Πρωτεΐνη της μεσοκυττάριας ουσίας που συνδέεται με τα ρετινοειδή (IRBP) 36 Α ια. Aνοσοσφαιρίνες. 37 Α ιβ. Κύτταρα.. 37 Α.2.4. Επιπτώσεις της αποκόλλησης στη μορφολογία του αμφιβληστροειδούς. 38 Α Επιπτώσεις στη μορφολογία του μελάγχρου επιθηλίου. 38 Α Επιπτώσεις στη μορφολογία του ιδίως αμφιβληστροειδούς.. 39 Α Η αποδιαφοροποίηση των κυττάρων του μελάγχρου επιθηλίου 40 Α.3. Παραγωγική υαλοειδοαμφιβληστροειδοπάθεια (Proliferative Vitreoretinopathy-PVR). 41 Α.3.1. Ορισμός 41 Α.3.2. Παθογένεια 41 Α.3.3. Συμπτωματολογία και ταξινόμηση 44 Α.4. Η χειρουργική αντιμετώπιση της ρηγματογενούς αποκόλλησης 45 A.5. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜΡs) A.5.1. Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία στον αμφιβληστροειδή A.5.2. Κριτήρια υπαγωγής στην οικογένεια των μεταλλοπρωτεϊνασών.. 48 A.5.3. Μοριακή δομή. 49 A.5.4. Παραγωγή 50 A.5.5. Κατηγοριοποίηση. 50 A.5.6. Ρύθμιση της έκφρασης των μεταλλοπρωτεϊνασών.. 52 A.5.7. Ενεργοποίηση. 55 8

9 A.5.8. Λειτουργία 56 A.6. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες στην αποκόλληση. 58 A.6.1. ΜΜΡ A.6.2. ΜΜΡ-2 59 A.6.3. ΜΜΡ A.6.4. ΜΜΡ A.6.5. ΜΜΡ A.7. Οι αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών (ΤΙΜΡs) A.7.1. Δομή 61 A.7.2. Παραγωγή 62 A.7.3. Λειτουργία 62 A.8. Οι αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών στην αποκόλληση. 63 A.8.1. ΤΙΜΡ A.9. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες σε παθήσεις του οφθαλμού. 64 A.9.1. Ο ρόλος των ΜΜΡs στην επούλωση 64 A.9.2. Ο ρόλος των ΜΜΡ σε παθήσεις του οφθαλμού.. 65 A.9.3. Ο ρόλος των ΜΜΡs στον αμφιβληστροειδή.. 67 A.9.4. Ο ρόλος των ΜΜΡs κατά την αποκόλληση και την PVR 67 A.9.5. Ο επιμέρους ρόλος των ΜΜΡs κατά την αποκόλληση και την PVR 69 A ΜΜΡ A ΜΜΡ A ΜΜΡ-3 69 A ΜΜΡ-8 69 A ΜΜΡ-9 70 A ΤΙΜΡ

10 Β. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕΪΝΑΣΩΝ ΣΤΟ ΥΠΑΜΦΙΒΛΗ- ΣΤΡΟΕΙΔΙΚΟ ΥΓΡΟ ΚΑΙ ΤΟ ΥΑΛΟΕΙΔΕΣ ΚΑΙ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΤΟΥΣ ΜΕ ΤΗΝ ΠΡΟΟΔΟ ΤΗΣ ΡΗΓΜΑΤΟΓΕΝΟΥΣ ΑΠΟΚΟΛ- ΛΗΣΗΣ ΤΟΥ ΑΜΦΙΒΛΗΣΤΡΟΕΙΔΟΥΣ 73 Β.1. Σκοπός-Κλινικά ερωτήματα.. 73 Β.2. Ασθενείς-Υλικό και μέθοδοι. 73 Β.2.1. Πληθυσμός μελέτης. 73 Β.2.2. Ομάδα μαρτύρων. 74 Β.2.3. Παράμετροι μελέτης 74 Β.2.4. Λήψη δειγμάτων.. 75 Β Λήψη δειγμάτων υπαμφιβληστροειδικού υγρού 75 Β Λήψη δειγμάτων υαλοειδούς 75 Β.2.5. Ποσοτικός προσδιορισμός μεταλλοπρωτεϊνασών 76 Β Ποσοτικός προσδιορισμός μεταλλοπρωτεϊνασών με την ανοσοενζυμική δοκιμασία ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 76 Β Ποσοτικός προσδιορισμός μεταλλοπρωτεϊνασών με τη χρήση της ζυμογραφίας. 78 Β α. Ζυμογραφία ζελατίνης. 78 Β β. Ενεργοποίηση των ζελατινασών 79 Β γ. Πυκνομετρία σάρωσης. 79 Β δ. Προσδιορισμός πρωτεϊνών Β.2.6. Στατιστική ανάλυση. 80 B.3. Αποτελέσματα.. 81 B.3.Α. Υπαμφιβληστροειδικό υγρό. 81 B.3.A.1. Επίπεδα ΜΜΡs και ΤΙΜΡ-1 με ELISA και ζυμογραφία. 81 B.3.A.1.1. Ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης της ζυμογραφίας με πυκνομετρία σάρωσης. 81 B.3.A.1.2.Ενεργοποίηση των MMPs με 4 αμινοφαινυλουδραργυρικό οξικό οξύ (4-aminophenylmercuric acetate, APMA)

11 B.3.A.2. Σύγκριση επιπέδων ΜΜΡs και ΤΙΜΡ-1 μεταξύ ασθενών και μαρτύρων.. 88 B.3.A.3. Συγκρίσεις με κλινικές παραμέτρους της αποκόλλησης. 89 B.3.A.3.1. Συσχέτιση με την έκταση της αποκόλλησης. 90 B.3.A.3.2. Συσχέτιση με την παλαιότητα της αποκόλλησης. 91 B.3.A.3.3. Συσχέτιση με την πρόοδο της PVR 92 B.3.A.3.4. Συσχέτιση με την κατάσταση της ωχράς. 93 B.3.A.3.5. Συσχέτιση με την εντόπιση της ρωγμής.. 94 B.3.A.3.6. Συσχέτιση με την υποτροπή της αποκόλλησης.. 95 B.3.A.3.7. Συσχέτιση με την κατάσταση του φακού. 95 B.3.A.4. Συσχέτιση με συστηματικές νόσους (σακχαρώδης διαβήτης, υπέρταση).. 96 B.3.Β. Υαλοειδές. 106 B.3.Β.1. Επίπεδα ΜΜΡs και ΤΙΜΡ-1 με ELISA και ζυμογραφία B.3.B.2. Σύγκριση με τα επίπεδα της ομάδας των μαρτύρων. 106 B.3.B.3. Συσχέτιση με κλινικές παραμέτρους της αποκόλλησης 107 B.3.B.3.1. Συσχέτιση με την έκταση της αποκόλλησης 107 B.3.B.3.2. Συσχέτιση με την παλαιότητα της αποκόλλησης 109 B.3.B.3.3. Συσχέτιση με την πρόοδο της PVR. 111 B.3.B.3.4. Συσχέτιση με την κατάσταση της ωχράς 112 B.3.B.3.5. Συσχέτιση με την εντόπιση της ρωγμής. 113 B.3.B.3.6. Συσχέτιση με την υποτροπή της αποκόλλησης. 114 B.3.Β.3.7. Συσχέτιση με την κατάσταση του φακού B.3.B.4. Συσχέτιση με συστηματικές νόσους (σακχαρώδης διαβήτης, υπέρταση) 115 B.4. Συζήτηση. 125 B.4.Α. Υπαμφιβληστροειδικό υγρό 125 B.4.Α.1. Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός 125 B.4.Α.2. Έκταση. 128 B.4.Α.3. Παλαιότητα B.4.Α.4. Παραγωγική αμφιβληστροειδοπάθεια (PVR). 132 B.4.Α.5. Ωχρά

12 B.4.Α.6. Εντόπιση της ρωγμής 135 B.4.Α.7. Υποτροπή. 136 B.4.Α.8. Φακός. 137 B.4.Α.9. Συστηματικές κλινικές παράμετροι (σακχαρώδης διαβήτης, υπέρταση) 137 B.4.Β. Υαλοειδές B.4.Β.1. Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός B.4.Β.2. Έκταση. 140 B.4.Β.3. Παλαιότητα. 143 B.4.Β.4. Παραγωγική αμφιβληστροειδοπάθεια (PVR) 147 B.4.Β.5. Ωχρά. 149 B.4.Β.6. Εντόπιση της ρωγμής 151 B.4.Β.7. Υποτροπή. 151 B.4.Β.8. Φακός B.4.Β.9. Συστηματικές κλινικές παράμετροι (σακχαρώδης διαβήτης, υπέρταση). 153 B.5. Συμπεράσματα 155 B.5.Α. Υπαμφιβληστροειδικό υγρό. 155 B.5.Β. Υαλοειδές 156 Β.6. Περίληψη 159 Β.6.Α. Ελληνική περίληψη. 159 Β.6.Β. Αγγλική περίληψη Β.7. Βιβλιογραφία

13 ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΑΡΜΑ: CAMs: CV: CK: ECM: EGF: ERM: FGF: GFAP: HGF/SF: IGF: IPM: IRBP: ΜΜΡs: ΡΑΙ: PDGF: PDR: PPV: PVD: PVR: RPE: RRD: TGF-β: TIMPs: TNF-α: t-pa: u-pa: ΥΥ: 4-aminophenylmercuric acetate Cell Adhesion Molecules Coefficient of variation Cytokeratins Extracellular matrix Epidermal Growth Factor Epiretinal Membranes Fibroblast Growth Factor Glial Fibrillary Protein Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor Insulin-like Growth Factor-IGF Interphotoreceptor matrix Interphotoreceptor Retinol Binding Protein Matrix metalloproteinases Plasminogen Activator Inhibitor Platelet-Derived Growth Factor Proliferative Diabetic Retinopathy Pars plana vitrectomy Posterior Vitreal Detachment Proliferative Vitreo Retinopathy Retinal Pigment Epithelium Rhegmatogenous retinal detachment Transforming Growth Factor-beta Tissue Inhibitors of Metalloproteinases Tumor Necrosis Factor-alpha Tissue type Plasminogen Activator Urokinase type-plasminogen Activator Υπαμφιβληστροειδικό υγρό 13

14

15 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες της θεμέλιας ουσίας (matrix metalloproteinases-mmps) αποτελούν πεδίο μελέτης τα τελευταία χρόνια λόγω της εμπλοκής τους στην αναδιαμόρφωση (remodelling) της βασικής μεμβράνης και του συνδετικού ιστού, στη σύσπαση των ιστών εξαιτίας της βλάβης, στην νεοαγγείωση αλλά και την αγγειογένεση γενικότερα, στην αύξηση του όγκου των νεοπλασιών και σε πιθανή μετάστασή τους. Η δράση των μεταλλοπρωτεϊνασών αποτελεί έναν σημαντικό παράγοντα στην παθογένεση πολλών ασθενειών όπως αθηροσκλήρυνση, αρθρίτιδα, καρδιακή ανεπάρκεια, οζώδης σκλήρυνση. Σε κυτταρικό επίπεδο, η δράση των μεταλλοπρωτεϊνασών συνίσταται στην αποδόμηση συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και των βασικών μεμβρανών καθώς και την αναδιαμόρφωσή τους. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες χαρακτηρίζονται από αλληλοεπικαλυπτόμενα υποστρώματα δράσης και θεωρείται πιθανό η δράση πολλών μεταλλοπρωτεϊνασών να αντισταθμίζει την απώλεια ή τη μη παραγωγή ενός μέλους της οικογένειας. Συγχρόνως αποτρέπουν την εναπόθεση περίσσειας θεμέλιας ουσίας η οποία είναι αποτέλεσμα αυτής της αναδιαμόρφωσης. Η αυξημένη παραγωγή MMPs μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη αποδόμησή της θεμέλιας ουσίας σε πρώτο στάδιο αλλά και αυξημένη παραγωγή και εναπόθεσή της μεταγενέστερα. Οι παραπάνω δράσεις σε συνδυασμό με αυτή των αναστολέων τους (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases-ΤΙΜΡs) είναι ενδεικτικές του σημαντικού ρόλου που παίζουν οι μεταλλοπρωτεϊνάσες στη διατήρηση της ομοιόστασης της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Γενικότερα οι ΜΜΡs είναι σημαντικές για τη διατήρηση ενός φυσιολογικού ισοζυγίου παραγωγής και αποδόμησης της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Το γεγονός αυτό επιτυγχάνεται με την ύπαρξη μίας ισορροπίας παραγωγής, ενεργοποίησης και αναστολής μεταξύ των ΜΜΡs και των αναστολέων τους. Αυτή η ισορροπία καθορίζει την τελική μορφολογία και ποσότητα συστατικών της θεμέλιας ουσίας. Από τα παραπάνω είναι προφανές ότι η διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ ΜΜΡs και ΤΙΜΡs είναι καθοριστική για την ομοιόσταση του κυττάρου και της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και ότι πιθανή περίσσεια μεταλλοπρωτεϊνασών έναντι των αναστολέων τους είναι δυνατό να οδηγήσει σε εκτεταμένη καταστροφή ιστών. Αυτή η απώλεια ισορροπίας έχει συνδεθεί με παθολογικές καταστάσεις όπως φλεγμονώδεις αντιδράσεις, διαδικασία επούλωσης, δημιουργία ιστικών βλαβών, μετάσταση νεοπλασμάτων, αγγειογένεση. Η ρηγματογενής αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς αποτελεί κλινική οντότητα που μπορεί να οδηγήσει σε ορισμένες περιπτώσεις και σε απώλεια 15

16 της όρασης. Η πλέον σοβαρή επιπλοκή της είναι η παραγωγική υαλοειδοαμφιβληστροειδοπάθεια, η οποία χαρακτηρίζεται από την εναπόθεση νεοσχηματισθέντος ινώδους ιστού στην έσω και την έξω επιφάνεια του αμφιβληστροειδούς και αποτελεί την πλέον συχνή αιτία αποτυχίας της χειρουργικής αποκατάστασης της αποκόλλησης. Με βάση την παραγωγή τους από κύτταρα που έχουν απομονωθεί στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό και το υαλοειδές κατά την αποκόλληση αλλά και το γενικότερο ρόλο τους στην αναδιαμόρφωση των ιστών και την επούλωση, οι μεταλλοπρωτεϊνάσες αποτελούν τα τελευταία χρόνια αντικείμενο μελέτης, όσον αφορά τον πιθανό ρόλο τους στη ρηγματογενή αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς. Η καταγραφή των επιπέδων των μεταλλοπρωτεϊνασών τόσο στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό όσο και το υαλοειδές κατά τη διάρκεια της ρηγματογενούς αποκόλλησης του αμφιβληστροειδούς αλλά και η διερεύνηση της ύπαρξης σημαντικών συσχετίσεων των επιπέδων των ΜΜΡs με κλινικές παραμέτρους της αποκόλλησης, ευρήματα ενδεικτικά ενός παθογενετικού ρόλου των μεταλλοπρωτεϊνασών στη αποκόλληση, αποτελούν το σκοπό της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποτελεί φυσική συνέχεια της διπλωματικής εργασίας του υποψηφίου διδάκτορα με τίτλο: «Σύσταση και μορφολογία του υπαμφιβληστροειδικού υγρού κατά τη ρηγματογενή αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς» που εκπονήθηκε στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών Ιατρικής (ΠΡΟ.ΜΕ.Σ.Ι.) για τη μερική εκπλήρωση των απαιτήσεων για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Εξειδίκευσης (Μ.Δ.Ε.) στην Ιατρική Ερευνητική Τεχνολογία από την Ιατρική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης το Η εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής ξεκίνησε στην Οφθαλμολογική Κλινική του Α.Π.Θ. και συνεχίσθηκε και ολοκληρώθηκε στη νεοσυσταθείσα Β Οφθαλμολογική Κλινική του Α.Π.Θ. Παράλληλα οι απαιτούμενες εργαστηριακές δοκιμασίες διενεργήθηκαν στο Α Εργαστήριο Μικροβιολογίας και το Εργαστήριο Φαρμακολογίας του Α.Π.Θ. Για τη συμβολή τους στην εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής, θα ήθελα να εκφράσω τις ειλικρινείς και θερμές μου ευχαριστίες: Στον Καθηγητή Οφθαλμολογίας Σταύρο Α. Δημητράκο, Διευθυντή της Β Οφθαλμολογικής Κλινικής του Α.Π.Θ., ο οποίος μου εμπιστεύθηκε το συγκεκριμένο θέμα για την εκπόνηση της διδακτορικής μου διατριβής. Παράλληλα, συνέβαλε τα μέγιστα στην ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής με τη διαμόρφωση του ερευνητικού ερωτήματος, την παροχή της πλειοψηφίας των απαιτούμενων δειγμάτων υπαμφιβληστροειδικού υγρού και υαλοειδούς αλλά και με τη συνεχή εκπαίδευσή μου στην κατανόηση αλλά και τη 16

17 χειρουργική αντιμετώπιση της ρηγματογενούς αποκόλλησης του αμφιβληστροειδούς. Η καθοδήγηση και ενθάρρυνσή του κατέστησαν την τακτική συμμετοχή μου στο τμήμα χειρουργικής υαλοειδούς-αμφιβληστροειδούς αλλά και στη συνολική λειτουργία της Β Οφθαλμολογικής Κλινικής του Α.Π.Θ., κατά τα τελευταία τρία έτη, ένα προνόμιο για το οποίο είμαι βαθύτατα ευγνώμων. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή Οφθαλμολογίας Σταύρο Α. Δημητράκο, ως Επιστημονικώς Υπεύθυνο του αντιστοίχου Υποέργου του Προγράμματος «Ηράκλειτος», το οποίο χρηματοδότησε κατά την τελευταία τετραετία το ερευνητικό και διδακτικό μου έργο στα πλαίσια της Β Οφθαλμολογικής Κλινικής του Α.Π.Θ., καθώς και τις αναγκαίες δαπάνες για αναλώσιμα υλικά που απαιτήθηκαν για τη διεξαγωγή της πειραματικής αυτής εργασίας. Στην Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Μικροβιολογίας-Εργαστηριακής Ανοσολογίας Ευδοξία Δίζα-Ματαυτσή, για τη συμμετοχή της στην τριμελή συμβουλευτική επιτροπή και τη συνολική συμβολή της σε όλες τις πτυχές της εκπόνησης της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Η διάθεση από μέρους της απεριορίστου χρόνου για τη διαμόρφωση του ερευνητικού πρωτοκόλλου, τη διενέργεια μέρους των απαιτούμενων εργαστηριακών δοκιμασιών, την ερμηνεία των αποτελεσμάτων και τη διαμόρφωση του τελικού κειμένου ήταν καθοριστική για την επιτυχή περάτωση της παρούσας έρευνας. Η αμέριστη συμπαράστασή της, οι εύστοχες συμβουλές της αλλά και η οξυδερκής κριτική ματιά της ήταν πολύτιμος οδηγός καθόλη τη διάρκεια εκπόνησης αυτής της διδακτορικής διατριβής. Στον Καθηγητή Οφθαλμολογίας Αλέξανδρο-Κωνσταντίνο Αλεξανδρίδη, για τη συμμετοχή του στην τριμελή συμβουλευτική επιτροπή και την παρακολούθηση του προόδου της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Στον Καθηγητή Οφθαλμολογίας Νικόλαο Γεωργιάδη-Στεφανίδη, Διευθυντή της Α Οφθαλμολογικής Κλινικής Α.Π.Θ., για τη συμβολή του στην απρόσκοπτη εκπόνηση της παρούσας διατριβής στα πλαίσια της Α Οφθαλμολογικής Κλινικής Α.Π.Θ. αλλά και τη συμμετοχή του στην επταμελή εξεταστική επιτροπή. Στον Καθηγητή Ιστολογίας-Εμβρυολογίας Αναστάσιο Μάνθο, Πρύτανη του Α.Π.Θ. και τον Καθηγητή Ιατρικής Πληροφορικής Κωνσταντίνο Παππά, για τη συμμετοχή τους στην επταμελή εξεταστική επιτροπή. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα Καθηγητή Κωνσταντίνο Παππά για την ίδρυση και διεύθυνση του ΠΡΟ.ΜΕ.Σ.Ι., στο οποίο είχα την ευκαιρία να φοιτήσω κατά τα έτη Στον Αναπληρωτή Καθηγητή Φαρμακολογίας Γεώργιο Καρακιουλάκη, για την καθοριστική συμβολή του στη διαμόρφωση του ερευνητικού πρωτοκόλλου, τη διενέργεια μέρους του πειραματικού μέρους της διατριβής και 17

18 την άρτια παρουσίαση των αποτελεσμάτων της παρούσας έρευνας. Η μακροχρόνια ενασχόλησή του στο αντικείμενο της δράσης των μεταλλοπρωτεϊνασών, σε συνδυασμό με τη διάθεση από μέρους του απαραίτητου χρόνου για την αποσαφήνιση των ανακυπτουσών αποριών μου αποτέλεσαν πολύτιμη βοήθεια για την επιτυχή ολοκλήρωση της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Στη Λέκτορα του Εργαστηρίου Φαρμακολογίας Α.Π.Θ. Ελένη Παπακωνσταντίνου, για την πολύτιμη βοήθειά της κατά τη διάρκεια του πειραματικού μέρους της παρούσας διατριβής αλλά και τις εύστοχες συμβουλές της κατά την προκαταρκτική παρουσίαση των αποτελεσμάτων της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Στον Καθηγητή Οφθαλμολογίας Συμεών Λάκε και το Χειρουργό Οφθαλμίατρο Αθανάσιο Βακάλη, Επιστημονικό Συνεργάτη της Α Οφθαλμολογικής Κλινικής Α.Π.Θ. για τη διάθεση αριθμού δειγμάτων υαλοειδούς στα πλαίσια της λειτουργίας της Α Οφθαλμολογικής Κλινικής Α.Π.Θ. Στον ειδικευόμενο Οφθαλμίατρο Κωνσταντίνο Κάλτσιο, για τη συμβολή του στη λήψη των δειγμάτων μαρτύρων στα πλαίσια της Τράπεζας Οφθαλμών της Α Οφθαλμολογικής Κλινικής Α.Π.Θ. Στους γονείς μου, Γεώργιο Συμεωνίδη και Ευφημία Σούλιου-Συμεωνίδου, για τις αρχές που μου μετέδωσαν, τους στόχους που με ενθάρρυναν πάντοτε να θέτω, το ήθος που προσπάθησαν να μου εμφησήσουν, ώστε να πορεύομαι με σεμνότητα, σοβαρότητα και εργατικότητα. Στη Δάφνη, που με χαμόγελο και κατανόηση με ενθάρρυνε κατά τις ατελείωτες ώρες ενασχόλησής μου με την εκπόνηση και τη συγγραφή της διδακτορικής μου διατριβής. 18

19 Α. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 19

20

21 ΑΠΟΚΟΛΛΗΣΗ ΤΟΥ ΑΜΦΙΒΛΗΣΤΡΟΕΙΔΟΥΣ Α.1. Ο αμφιβληστροειδής χιτώνας Α.1.1. Ανατομία-Φυσιολογία του αμφιβληστροειδούς (Μελάγχρουν επιθήλιο-μεσοκυττάρια ουσία) Α Ανατομικά στοιχεία Ο αμφιβληστροειδής είναι ο εσωτερικός χιτώνας του οφθαλμού και αποτελείται από δύο πέταλα: το μελάγχρουν επιθήλιο προς τα έξω και τον αισθητηριακό ή ιδίως αμφιβληστροειδή προς τα έσω. To μελάγχρουν επιθήλιο συνίσταται από μία σειρά κυβοειδών επιθηλιακών κυττάρων πλούσιων σε χρωστικές. Επικάθεται στη μεμβράνη του Bruch, με την οποία συνδέεται στερεά. Το μελάγχρουν επιθήλιο αποτελείται από κύτταρα που χαρακτηρίζονται από τις μεταξύ τους στερεές συνδέσεις (tight junctions), κορυφαίες μικρολάχνες και αναδιπλώσεις της βασικής μεμβράνης 1,2. Επιπρόσθετα, στα κύτταρα αυτά υπάρχουν κοκκία μελανίνης που πιστεύεται ότι αυξάνουν την απόδοση των φωτοϋποδοχέων με την απορρόφηση φωτός, φαγοσωμάτια και φαγολυσοσωμάτια, τα οποία αποδομούν υλικό των έξω κυρίων τμημάτων των φωτοϋποδοχέων που έχει φαγοκυτταρωθεί. Στον ιδίως αμφιβληστροειδή απαντώνται τρεις ομάδες εν σειρά κυττάρων: τα οπτικά κύτταρα, έξω τμήματα των οποίων είναι οι φωτοϋποδοχείς, τα δίπολα και τα γαγγλιακά κύτταρα, τα οποία μεταφέρουν μέσω της οπτικής οδού το ερέθισμα μέχρι τα έξω γονατώδη σώματα 3,4. Απαντώνται, επίσης, κύτταρα που συνδέουν τα ανωτέρω κύτταρα «εν παραλλήλω» (οριζόντια, αμακρόϊνα). Είναι φανερό ότι η κύρια λειτουργία του αμφιβληστροειδούς, δηλαδή η υποδοχή του φωτεινού ερεθίσματος, η μετατροπή του σε νευρικό και η διαβίβασή του στο κέντρο της όρασης, γίνεται κατά ένα μεγάλο μέρος στον ιδίως αμφιβληστροειδή. Παρόλα αυτά, σημαντικός είναι και ο ρόλος του μελάγχρου επιθηλίου καθώς και της μεσοκυττάριας ουσίας των φωτοϋποδοχέων (interphotoreceptor matrix-ipm). Α Λειτουργίες Οι πιο σημαντικές λειτουργίες του μελάγχρου επιθηλίου είναι οι εξής: α. Το μελάγχρουν επιθήλιο σχηματίζει τον έξω αιματοαμφιβληστροειδικό φραγμό και συμβάλλει στη μεταφορά ουσιών κυρίως της ρετινόλης. 21

22 Εδώ σημαντικό ρόλο παίζει η ύπαρξη στερεών συνδέσεων μεταξύ των κυττάρων του μελάγχρου επιθηλίου. Ακόμη και μικρά μόρια δεν μπορούν να περάσουν παθητικά ανάμεσα από τα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου και κατά συνέπεια πρέπει να μεταφερθούν διαμέσου της μεμβράνης των κυττάρων αυτών. Η ενεργητική ανταλλαγή ουσιών υποβοηθείται από την ύπαρξη των κορυφαίων μικρολαχνών και των αναδιπλώσεων της βασικής μεμβράνης που αυξάνουν τη διαθέσιμη επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης για ανταλλαγή ουσιών 5. Επίσης η μεταφορική λειτουργία του μελάγχρου επιθηλίου μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στην ισομερίωση της trans-ρετινάλης σε 11-cis ρετινάλη, γεγονός σημαντικό για την προσαρμογή στο φως και το σκότος 5-9. β. Άλλη λειτουργία είναι η φαγοκυττάρωση των δίσκων των φωτοϋποδοχέων που αποπίπτουν συνεχώς 5,6,10. Έτσι παρατηρείται μία αρχική φάση αναγνώρισης, όπου τα υπολείμματα των φωτοϋποδοχέων συνδέονται με τις κορυφαίες μικρολάχνες. Στη συνέχεια ακολουθεί εγκόλπωση των υπολειμμάτων από την κυτταροπλασματική μεμβράνη και σχηματισμός ενός φαγοσώματος 11. Αυτό μεταφέρεται με τη βοήθεια ενός συστήματος μικροσωληνίσκων κοντά σε ένα λυσόσωμα που περιέχει τις κατάλληλες πρωτεάσες και ακολουθεί η ένωσή τους με στόχο την πλήρη αποδόμηση των υπολειμμάτων των έξω κυρίων τμημάτων 12. Η διαδικασία αυτή εξαρτάται από τη διαθέσιμη ενέργεια με τη μορφή των απαραίτητων κυκλικών νουκλεοτιδίων 5. γ. Μια σημαντική λειτουργία του μελάγχρου επιθηλίου είναι η παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας. Τα παραγόμενα μόρια διακρίνονται σε αυτά που τοποθετούνται στη μεμβράνη του Bruch και σε αυτά που τοποθετούνται στην εξωκυττάρια ουσία μεταξύ των φωτοϋποδοχέων. Οι διαφορές μεταξύ των δύο ειδών μορίων εντοπίζονται στην έλλειψη κολλαγόνου και λαμινίνης αλλά και στην ανίχνευση διαφορετικών πρωτεογλυκανών μεταξύ των μορίων που προορίζονται για την ΙΡΜ 13. Οι πρωτεογλυκάνες της μεμβράνης του Bruch μπορεί να παίζουν κάποιο ρόλο στον αιματοεγκεφαλικό φραγμό δρώντας ως ένα φίλτρο για μακρομόρια που φθάνουν στην περιοχή με την αιματική ροή του χοριοειδή 14. δ. Κορυφαία στη μεμβράνη των κυττάρων του μελάγχρου επιθηλίου εντοπίζεται και μία ΑΤΡάση η οποία δρα ως αντλία 15,16 και ελέγχει την είσοδο ιόντων νατρίου στα κύτταρα, ενώ παράλληλα διατηρεί τα ηλεκτρικά δυναμικά μεμβράνης τα οποία μπορεί να επηρεάζουν την είσοδο άλλων μορίων, όπως π.χ. της ταυρίνης 5,16. Πάντως στοιχεία δείχνουν ότι αυτή η αντλία δεν παίζει ρόλο στην απορρόφηση ύδατος από την αμφιβληστροειδοεπιθηλιακή ενδοεπιφάνεια

23 ε. Το μελάγχρουν επιθήλιο συμβάλλει στη διατήρηση της πρόσφυσης του αμφιβληστροειδούς, με τη φυγόκεντρη μεταφορά ύδατος και ιόντων, στη ρύθμιση της ανοσιακής απάντησης και στον περιορισμό της δράσης ελευθέρων ριζών 18. Α Η μεσοκυττάρια ουσία μεταξύ των φωτοϋποδοχέων Η μεσοκυττάρια ουσία του αμφιβληστροειδή (InterPhotoreceptor Matrix-ΙΡΜ) βρίσκεται μεταξύ του μελάγχρου επιθηλίου και των φωτοϋποδοχέων. Περιέχει σημαντικό αριθμό μορίων, τα οποία παίζουν διαμεσολαβητικό ή υποστηρικτικό ρόλο στην αλληλεπίδραση φωτοϋποδοχέων και μελάγχρου επιθηλίου. Η κύρια γλυκοπρωτεΐνη της μεσοκυττάριας ουσίας μεταξύ των φωτοϋποδοχέων είναι η IRBP (Interphotoreceptor Retinol Binding Protein-πρωτεΐνη σύνδεσης ρετινόλης φωτοϋποδοχέων) και ο ρόλος της συνίσταται στη σύνδεση με τη ρετινόλη, στη μεταφορά αυτής σε νευρογλοιακά κύτταρα, όπου μπορεί να γίνει η ισομερίωση των ρετινοειδών, και στη μεταφορά της 11-cis ρετινάλης για την επανασύσταση των φωτοχρωστικών 19,20. Παράλληλα, πρωτεογλυκάνες και άλλες ουσίες μπορεί να λειτουργούν ως συνδετική ουσία μεταξύ του μελάγχρου επιθηλίου και του ιδίως αμφιβληστροειδούς, γεγονός για το οποίο υπάρχουν ενδείξεις χωρίς να έχει αποδειχθεί επαρκώς 12,21,22. Τέλος, η μεσοκυττάρια ουσία μεταξύ των φωτοϋποδοχέων μπορεί να υποστηρίζει τροφικά τον αμφιβληστροειδή, όπως αναφέρεται σε σχετικές μελέτες. Πράγματι υπάρχει απώλεια της λειτουργικότητας του αμφιβληστροειδούς και ως επακόλουθο ο θάνατος των φωτοϋποδοχέων σε περιοχές όπου υπάρχει αποκόλληση από το μελάγχρουν επιθήλιο 23,24. Α.1.2. Η αμφιβληστροειδική πρόσφυση Το μελάγχρουν επιθήλιο είναι μία πολωμένη μονοστοιβάδα νευροεπιθηλιακών κυττάρων που συνδέονται μεταξύ τους με χασματοσυνδέσεις (gap junctions), στέρεες συνδέσεις και συνδέσεις συνοχής Δεν υπάρχουν όμως κυτταρικές συνδέσεις μεταξύ του μελάγχρου επιθηλίου και του ιδίως αμφιβληστροειδούς. Τα έξω κύρια τμήματα των φωτοϋποδοχέων περιβάλλονται από μικρολάχνες και μικροπτυχές οι οποίες είναι οργανωμένες διαφορετικά για τα ραβδία και τα κωνία 27. Η σημαντικότερη διαφορά έγκειται στο γεγονός ότι παρατηρείται ένας ευμεγέθης χώρος πάνω από τα έξω κύρια τμήματα των κωνίων ( supracone space ). Η περιοχή της εξωκυττάριας ουσίας που περιβάλλει τα έξω κύρια τμήματα των κωνίων είναι γνωστή ως «θήκη κωνίων» ( cone sheath ) 28. Υπάρχει λοιπόν ένα δυσδιάκριτο «ενδιάμεσο/διεπιφάνεια» ( interface ) που παρεμβάλλεται μεταξύ του ιδίως αμφιβληστροειδούς και του μελάγ- 23

24 χρου επιθηλίου. Παρόλο όμως το γεγονός ότι δεν υπάρχουν πραγματικές κυτταρικές συνδέσεις μεταξύ αυτών των δύο ανατομικών στοιχείων του αμφιβληστροειδούς παρατηρείται ένας σημαντικός αριθμός συντελεστών αμφιβληστροειδικής πρόσφυσης. Θα μπορούσε να λεχθεί ότι η ύπαρξη της διεπιφάνειας είναι το άθροισμα της παρουσίας αυτών των συντελεστών ή καλύτερα το αποτέλεσμα της δράσης τους σε συνδυασμό και με την ύπαρξη της εξωκυτταρίου ουσίας που περιβάλλει τα έξω τμήματα των φωτοϋποδοχέων. Α Συντελεστές αμφιβληστροειδικής πρόσφυσης Η πρόσφυση του αμφιβληστροειδούς στο μελάχρουν επιθήλιο οφείλεται σε ιστοχημικούς και μεταβολικούς δεσμούς καθώς και μηχανικές δυνάμεις συνοχής 29. α. Ιστοχημικοί δεσμοί: Όπως αναφέρθηκε παραπάνω τα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου περιβάλλουν τις άπω περιοχές των έξω κυρίων τμημάτων των φωτοϋποδοχέων και ασκούν δυνάμεις πάκτωσης ή τριβής σε αυτά. Η μορφολογία των μικρολαχνών αυξάνει σημαντικά την επιφάνεια πρόσφυσης του μελάγχρου επιθηλίου με τον αισθητηριακό αμφιβληστροειδή. Συγχρόνως πρωτεΐνες και γλυκοζαμινογλυκάνες μεσολαβούν μεταξύ των σημείων κυτταρικής πρόσφυσης και δρουν ενισχυτικά σε αυτήν. Τελευταία υπάρχουν αποσπασματικά στοιχεία που υποστηρίζουν τη θεωρία της σύνδεσης κυττάρου-υποστρώματος-κυττάρου. Σύμφωνα με αυτή τη θεωρία, μόρια προσκολλημένα στην κυτταρική μεμβράνη όπως ινονεκτίνη, λαμινίνη, κολλαγόνα και πρωτεογλυκάνες αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες όπως η βινκουλίνη και η α-ακτινίνη σε σημεία προσκόλλησης κυττάρου-υποστρώματος. Μόρια της εξωκυττάριας ουσίας στο χώρο μεταξύ των φωτοϋποδοχέων μπορεί να συνδέονται με συγκεκριμένα μόρια σύνδεσης στις άπω περιοχές των έξω κυρίων τμημάτων. Παράλληλα η «θήκη» της εξωκυττάριας ουσίας που περιβάλλει τα έσω και έξω τμήματα σε πολλά ζωικά είδη μπορεί να παίζει ρόλο στην αμφιβληστροειδική προσκόλληση 30,31. Ταυτόγχρονα έχουν διατυπωθεί και θεωρίες προσκόλλησης κυττάρου με κύτταρο που επικεντρώνονται στη δράση μορίων κυτταρικής προσκόλλησης (Cell Adhesion Molecules-CAMs) 32. Αυτά βρίσκονται σε μία ποικιλία ιστών, είναι ενδογενείς γλυκοπρωτεΐνες και μεσολαβούν στην προσκόλληση κυττάρου με κύτταρο. Η παραπάνω διαδικασία επιτυγχάνεται μέσω απευθείας μοριακής σύνδεσης μεταξύ των CAMs που υπάρχουν σε κάθε κύτταρο. Τα μόρια αυτά, παρόλο που βρίσκονται στον ιδίως αμφιβληστροειδή, δεν έχουν ακόμη αναγνωρισθεί ως συ- 24

25 στατικό της διεπιφάνειας μεταξύ των φωτοϋποδοχέων και του μελάγχρου επιθηλίου. β. Μεταβολικοί δεσμοί: Τα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου μεταφέρουν ενεργητικά νερό από τον οπισθοϋαλοειδικό χώρο προς το χοριοειδή με τη βοήθεια αντλιών που διαθέτουν. Αυτός είναι και ο μοναδικός τρόπος μεταφοράς μορίων μέσω του μελάγχρου επιθηλίου, αφού τα κύτταρά του συνδέονται μεταξύ τους με τις αποφράσσουσες ζώνες, γεγονός που καθιστά τη δίοδο μακρομορίων ανάμεσά τους αδύνατη 29,33. γ. Μηχανικές δυνάμεις συνοχής: Η ενδοφθάλμια πίεση, το ενεργό σύστημα αντλίας του μελάγχρου επιθηλίου καθώς και η οσμωτική πίεση του εξωκυτταρίου υγρού του χοριειδούς προκαλούν τη μετακίνηση ύδατος από τον υαλοειδικό χώρο προς το χοριοειδή. Πιστεύεται ότι η ροή του υγρού που μετακινείται μέσω του αμφιβληστροειδούς από το υαλοειδές προς το χοριοειδή αποτελεί μία από τις δυνάμεις που διατηρεί τον ιδίως αμφιβληστροειδή στη φυσιολογική του θέση. Ο αμφιβληστροειδής προσφέρει αντίσταση σε αυτή τη μετακίνηση υγρού και «αναρροφάται» προς την κορυφαία επιφάνεια του μελάγχρου επιθηλίου 34. Πάντως είναι αδύνατο η μεταφορά υγρών από μόνη της να εξηγήσει πλήρως όλες τις πλευρές της αμφιβληστροειδικής πρόσφυσης 35. Α.2. Η ρηγματογενής αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς Α.2.1. Η ρηγματογενής αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς Η ρηγματογενής αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς ορίζεται ως ο διαχωρισμός του ιδίως αμφιβληστροειδούς από το μελάγχρουν επιθήλιο. Μεταξύ αυτών σχηματίζεται ο υπαμφιβληστροειδικός χώρος που πληρούται από υπαμφιβληστροειδικό υγρό, το οποίο προέρχεται από ρευστοποιημένο υαλοειδές και φθάνει στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο διαμέσου ρωγμής του αμφιβληστροειδούς 36. Από τα παραπάνω συνάγεται το συμπέρασμα ότι προϋπόθεση της ρηγματογενούς αποκόλλησης είναι η ύπαρξη ρωγμής ή γενικότερα λύσης της συνεχείας του αμφιβληστροειδούς. Κατά τον τρόπο αυτόν ρευστοποιημένο υαλοειδές μετά από ρήξη του φλοιώδους υαλοειδούς εισέρχεται μεταξύ του μελάγχρου επιθηλίου και του ιδίως αμφιβληστροειδούς και δημιουργεί το λεγόμενο υπαμφιβληστροειδικό χώρο. Η αποκόλληση προκαλείται και συντηρείται από ένα άθροισμα παραγόντων. Έτσι κατά πρώτο λόγο υπάρχουν οι ελκτικές δυνάμεις του υαλοειδούς που δρουν επάνω στα χείλη του ρήγματος 37. Αυτές οφείλονται στο 25

26 διαφορετικό ειδικό βάρος μεταξύ ρευστοποιημένου και σχηματισμένου υαλοειδούς καθώς και στην αδράνεια της πυκνότερης φάσης του υαλοειδούς κατά τις κινήσεις του βολβού. Επίσης σημαντικό ρόλο παίζει και η κατά κύματα ροή ρευστοποιημένου υαλοειδούς διαμέσου της ρωγμής προς και από τον υπαμφιβληστροειδικό χώρο. Αξιοσημείωτο είναι και το γεγονός ότι ο αμφιβληστροειδής είναι βαρύτερος από το ρευστοποιημένο υαλοειδές μέσα στο οποίο προπίπτει και κατακρημνίζεται κατά την αποκόλληση, κάτι που αποτελεί επιπρόσθετο παθογενετικό παράγοντα. Η χοριοειδική εξίδρωση που χαρακτηρίζεται ως φλεγμονώδης εξιδρωματική αποκόλληση χοριοειδούς καθώς και η λειτουργική ανεπάρκεια του μελάγχρου επιθηλίου διατηρούν και επιβαρύνουν την αποκόλληση 35,36. Α.2.2. Τα χαρακτηριστικά της αποκόλλησης Η ρηγματογενής αποκόλληση μπορεί να περιγραφεί με τη χρήση ορισμένων κλινικών παραμέτρων, όπως η έκταση και η παλαιότητά της. Κατά την κλινική εξέταση, ο βυθός σχεδιάζεται από τον εξεταστή, ώστε να υπάρχει ένα σημείο αναφοράς και σύγκρισης με τα μεταγενέστερα στάδια της αποκόλλησης. Το σχήμα που χρησιμοποιείται για το σχεδιασμό του βυθού είναι το κατά Amsler και Dubois και περιέχει τρεις ομόκεντρους κύκλους. Ο έσω αναπαριστά τον ισημερινό και ο μέσος την οδοντωτή περιφέρεια. Οι ομόκεντροι αυτοί κύκλοι τέμνονται από δώδεκα μεσημβρινούς οι οποίοι ονομάζονται κατά τις ώρες του ρολογιού. Η θηλή σχεδιάζεται στο κέντρο και η ωχρά δεξιά ή αριστερά της ανάλογα με τον οφθαλμό. Η έκταση της αποκόλλησης εκφράζεται σύμφωνα με τη φορά των δεικτών του ρολογιού. Διακρίνεται σε ανώτερη (από την 9 η μέχρι την 3 η ώρα), κατώτερη (από την 3 η μέχρι την 9 η ώρα), ενώ είναι δυνατό μία αποκόλληση να είναι και ανώτερη και κατώτερη αλλά και κροταφική ή ρινική, ανάλογα με την εντόπισή της. Παράλληλα, σχεδιάζονται, με βάση ένα κοινά συμφωνηθέντα χρωματικό κώδικα, τα ευρήματα (αποκολληθείς αμφιβληστροειδής, πτυχές και ρωγμές αμφιβληστροειδούς, αγγεία, θολώσεις και έλξεις υαλοειδούς, ενδοϋαλοειδική αιμορραγία, εκφυλιστικές βλάβες, αποκολλήσεις χοριοειδούς, οίδημα της ωχράς, υπαμφιβληστροειδικά εξιδρώματα) 29. Όσον αφορά την παλαιότητα της αποκόλλησης, αυτή περιγράφει το χρόνο από την εγκατάσταση της αποκόλλησης έως την ημερομηνία εξέτασης ή επέμβασης και εκφράζεται σε ημέρες ή σπανιότερα και σε μήνες. Η παλαιότητα της αποκόλλησης είναι δύσκολο να υπολογισθεί ακριβώς αφού τα συμπτώματα διαφέρουν από ασθενή σε ασθενή, ενώ πολλές φορές είναι δυνατό να μη γίνουν αντιληπτά. Ως έναρξη της αποκόλλησης θεωρείται η απώλεια τμήματος ή ολοκλήρου του οπτικού πεδίου. Η ακριβής εξακρίβωση της παλαιότητας μίας αποκόλλησης μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στην αντιμετώπιση αλλά και την πρόγνωσή της. 26

27 Η περιγραφή αυτή των αποκολλήσεων και η ταξινόμησή τους με βάση τα παραπάνω χαρακτηριστικά μπορεί να βοηθήσει για την εξαγωγή κλινικών συμπερασμάτων. Α.2.3. Ο υπαμφιβληστροειδικός χώρος - Το υπαμφιβληστροειδικό υγρό Ο εξωκυττάριος χώρος μεταξύ του κορυφαίου ορίου του μελάγχρου επιθηλίου από τη μία πλευρά και των κυττάρων των φωτοϋποδοχέων και των βασικών μικρολαχνών των κυττάρων της γλοίας του Μüller από την άλλη ορίζεται ως ο υπαμφιβληστροειδικός χώρος 34. Ο όρος αυτός χρησιμοποιείται μόνον όταν υπάρχει αποκόλληση του ιδίως αμφιβληστροειδούς από το μελάγχρουν επιθήλιο. Η δημιουργία του υπαμφιβληστροειδικού χώρου, συνεπεία της αποκόλλησης, έχει ως γενεσιουργό αίτιο ρήγματα στον αμφιβληστροειδή. Πάντως η ύπαρξη ρηγμάτων ή λύσεων της συνεχείας του αμφιβληστροειδούς αφ εαυτής δεν έχει πάντα ως άμεσο επακόλουθο την εμφάνιση αποκόλλησης. Η ύπαρξη ρηγμάτων είναι νεκροτομικό εύρημα στο 5-10% των οφθαλμών χωρίς ποτέ να έχει εκδηλωθεί αποκόλληση 38. Δεύτερη προϋπόθεση για την αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς είναι η ύπαρξη ελκτικών δυνάμεων που ασκούνται από το υαλοειδές στα όρια ή πλησίον των ρηγμάτων. Παρόλα αυτά δεν έχει εξηγηθεί επαρκώς το γιατί σε κάποιες περιπτώσεις ο αμφιβληστροειδής αποκολλάται πολύ εύκολα και σε άλλες περιπτώσεις δεν αποκολλάται καθόλου. Έχει αποδειχθεί ότι κατά τη ρηγματογενή αποκόλληση υπάρχει ροή υγρού από το υαλοειδές προς τον υπαμφιβληστροειδικό χώρο. Το υγρό που εντοπίζεται σε αυτόν το χώρο ονομάζεται υπαμφιβληστροειδικό (Υ.Υ.). Πιθανώς η αρχική πηγή αυτής της ροής να είναι το κροσσωτό επιθήλιο του ακτινωτού, ενώ μια εναλλακτική πηγή μπορεί να είναι η διαρροή από περιφερικά αγγεία του αισθητηριακού αμφιβληστροειδούς. Η ρευστοποίηση του υαλοειδούς με την πρόοδο της ηλικίας μπορεί να δημιουργήσει διαύλους υγρού, οι οποίοι διευκολύνουν την κίνησή του 39. Υπό φυσιολογικές συνθήκες ο αισθητηριακός αμφιβληστροειδής αποτελεί το πιο σημαντικό εμπόδιο στην κίνηση υγρού και η λύση της συνεχείας επιτρέπει τη μετακίνηση υγρού από το υαλοειδές στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο. Α Η μετακίνηση υγρού διαμέσου ενός αμφιβληστροειδικού ρήγματος Η μετακίνηση υγρού μεταξύ του υαλοειδούς και του υπαμφιβληστροειδικού χώρου εξαρτάται πρωτίστως από το μέγεθος του ρήγματος. Έχει αποδειχθεί πειραματικά ότι με ένα μικρότερο ρήγμα υπάρχει πολύ λιγότερη 27

28 ανταλλαγή από ότι σε μία μεγάλο ρήγμα, γεγονός που οδηγεί και στην ύπαρξη υπαμφιβληστροειδικού υγρού με υψηλά επίπεδα πρωτεΐνης 40,41. Άλλος σημαντικός παράγοντας είναι η εντόπιση της αποκόλλησης (ανώτερη-κατώτερη) Συγχρόνως καθοριστικό ρόλο παίζει και η κατάσταση του υαλοειδούς που βρίσκεται επί του ρήγματος. Έχει υποτεθεί ότι πυκνότερο υαλοειδές πάνω από το ρήγμα μπορεί να οδηγήσει ακόμη και σε πωματισμό του 44,45. Η συνεχής ροή υγρού από το υαλοειδές στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο οφείλεται κυρίως στη μεταφορά υγρού από το συγκεκριμένο χώρο στο χοριοειδή διαμέσου του μελάγχρου επιθηλίου. Αυτή η ροή προς τα έξω θα αντλήσει υγρό από το υαλοειδές στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό, ενώ το υαλοειδές αντικαθίσταται ισόποσα από υδατοειδές υγρό που προέρχεται από τον οπίσθιο θάλαμο. Ταυτόγχρονα τα ρεύματα του υαλοειδούς που προκαλούνται από κινήσεις των οφθαλμών παίζουν ρόλο στην ροή υγρού μεταξύ του υαλοειδούς και του υπαμφιβληστροειδικού υγρού. Φαίνεται λοιπόν ότι τόσο η ελαττωμένη παραγωγή υδατοειδούς υγρού όσο και η ανεμπόδιστη χοριοειδική αποχέτευσή του υδατοειδούς υγρού συμβάλλουν στην υποτονία που παρατηρείται στη ρηγματογενή αποκόλληση 46. Α Δυνάμεις δρώσες κατά τη μετακίνηση υγρού από τον υπαμφιβληστροειδικό χώρο προς το χοριοειδή Από τη στιγμή που υγρό εισέρχεται στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο, τίθενται σε λειτουργία δυνάμεις που δρουν με στόχο την αφαίρεση ύδατος κατά πρώτο λόγο καθώς και άλλων ουσιών από αυτό το χώρο. Πρωτεύοντα ρόλο παίζουν οι οσμωτικές δυνάμεις που ασκούνται στις μεμβράνες της συγκεκριμένης περιοχής. Ειδικότερα, η διαφορά οσμωτικής πίεσης μεταξύ του υπαμφιβληστροειδικού χώρου και του χοριοειδή προκαλεί τη μεταφορά κυρίως ύδατος από το ένα ανατομικό διαμέρισμα στο άλλο. Ρυθμιστικό ρόλο στην κίνηση υγρού παίζει η καλή λειτουργία του μελάγχρου επιθηλίου που παρεμβάλλεται μεταξύ τους 47. Παράλληλα υπάρχουν και οι υδροστατικές δυνάμεις. Πιθανή διαφορά υδροστατικής πίεσης μεταξύ του υαλοειδούς και του υπαμφιβληστροειδικού υγρού μπορεί να επηρεάσει τη μετακίνηση υγρού διαμέσου του μελάγχρου επιθηλίου. Όμως έχει αποδειχθεί πειραματικά ότι οι υδροστατικές δυνάμεις παίζουν ελάσσονα ρόλο στη μεταφορά υγρών διαμέσου του μελάγχρου επιθηλίου 48. Ταυτόγχρονα με τις παραπάνω δυνάμεις διαπιστώθηκε η ύπαρξη ενός συστήματος ενεργού μεταφοράς ύδατος διαμέσου του μελάγχρου επιθηλίου 41,49. Σύμφωνα με τα πειραματικά δεδομένα, η απορρόφηση ύδατος και άλ- 28

29 λων ουσιών από τον υπαμφιβληστροειδικό χώρο οφείλεται σε ποσοστό έως και 70% σε αυτή την ενεργό μεταφορά ενώσεων με τη μορφή ιόντων 50. Α Η σύσταση του υπαμφιβληστροειδικού υγρού Τις τελευταίες δεκαετίες έχει ανιχνευθεί ένας μεγάλος αριθμός συστατικών του υπαμφιβληστροειδικού υγρού που συμπεριλαμβάνει τον αυξητικό παράγοντα των ηπατοκυττάρων, ιντερλευκίνες, ενεργοποιητή πλασμινογόνου ιστικού τύπου και τύπου ουροκινάσης, πλασμίνη, πρωτεΐνες, λευκωματίνη, λιπίδια, πρωτεϊνάσες, μεταλλοπρωτεϊνάσες, υποδοχέα της τρανσφερρίνης, ανοσοσφαιρίνες και πρωτεΐνη της μεσοκυττάριας ουσίας που συνδέεται με τα ρετινοειδή 51. Ο ρόλος των παραπάνω συστατικών περιγράφεται παρακάτω. Α α. Ο αυξητικός παράγοντας των ηπατοκυττάρων (HGF/SF) Ένα από τα συστατικά του υπαμφιβληστροειδικού υγρού είναι ο αυξητικός παράγοντας των ηπατοκυττάρων (Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor-HGF/SF). O εν λόγω αυξητικός παράγοντας έχει ιδιότητες που σχετίζονται με τη μίτωση, τη μορφογένεση και την κίνηση σε κυτταρικό επίπεδο 52. Σε φυσιολογικές συνθήκες υπάρχει στο υδατοειδές υγρό και παράγεται από τα κερατοκύτταρα του στρώματος του κερατοειδή κατά την επούλωση των τραυμάτων 53,54. Στην παραγωγική υαλοειδοαμφιβληστροειδοπάθεια (Proliferative Vitreo Retinopathy-PVR), τα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου (Retinal Pigment Epithelial cells-rpe cells) ενεργοποιούνται και μεταναστεύουν σε αντίθεση με ότι συμβαίνει σε φυσιολογικές συνθήκες 55,56. Παράλληλα συντελείται και μία φαινοτυπική αλλαγή ώστε μετά το πέρας της να μοιάζουν με ινοβλάστες Η παραπάνω διαδικασία αποδιαφοροποίησης αποκλήθηκε μετάβαση από επιθήλιο σε μεσέγχυμα (epithelial-to-mesenchymal transition) 57,60. Ο HGF/SF μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στην αποδιαφοροποίηση των κυττάρων του μελάγχρου επιθηλίου, η οποία συμβάλλει στη δημιουργία μεμβρανών κατά την PVR. Ειδικότερα ο συγκεκριμένος αυξητικός παράγων μπορεί να έχει έναν καθοριστικό ρόλο στην ενεργοποίηση των κυττάρων του μελάγχρου επιθηλίου και τη μετατροπή τους από ακίνητα σε κινούμενα και πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα 61,62. Tα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου πιθανώς να εκφράζουν τον υποδοχέα c-met που είναι ειδικός για τον HGF/SF, γεγονός που τα καθιστά κύτταρα στόχους του

30 Μία ένδειξη που μπορεί να στηρίζει τα παραπάνω είναι και η παρατήρηση ότι στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό ατόμων με ρηγματογενή αποκόλληση και διαβητική παραγωγική αμφιβληστροειδοπάθεια (Proliferative Diabetic Retinopathy-PDR), η συγκέντρωση του HGF/SF ήταν τριπλάσια από ότι σε φυσιολογικές συνθήκες. Από τα παραπάνω συμπεραίνεται ότι ο HGF/SF μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της ρηγματογενούς αποκόλλησης, της PVR αλλά και της PDR. Α β. Ιντερλευκίνες και σύσταση του υπαμφιβληστροειδικού υγρού Ενδιαφέρον παρουσιάζει η μελέτη της κυτταρικής σύνθεσης του υπαμφιβληστροειδικού υγρού σε συνδυασμό με χαρακτηριστικά της αποκόλλησης και την ύπαρξη συγκεκριμένων ενώσεων σε αυτό 64. Η διαφοροποίηση στην ιστολογική εικόνα του υπαμφιβληστροειδικού υγρού εξαρτάται από τη διάρκεια της αποκόλλησης. Στο εν λόγω υγρό υπάρχει πληθώρα κυττάρων που προέρχονται από το μελάγχρουν επιθήλιο, τον ιδίως αμφιβληστροειδή και το αίμα 65. Ο μεγάλος αριθμός των κυττάρων που εισέρχονται στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο μπορεί να δώσει το έναυσμα για ένα πλήθος ανοσολογικών μηχανισμών που βασίζονται στη φλεγμονή και οδηγούν στην εμφάνιση της PVR. Τα κύτταρα αυτά διαχωρίζονται σε φλεγμονώδη (μακροφάγα, λεμφοκύτταρα, κοκκιώδη κύτταρα) και σε αυτά που προέρχονται από τον αμφιβληστροειδή λόγω της αποκόλλησης 66. Σε υπαμφιβληστροειδικό υγρό παλαιότητας μικρότερης των 3 εβδομάδων, το κυρίαρχο στοιχείο είναι τα μακροφάγα ενώ παρατηρούνται σποραδικά σιτευτικά κύτταρα (mast cells) και σπάνια λεμφοκύτταρα 64. Τα ενεργοποιημένα μακροφάγα παράγουν σημαντικές ποσότητες βιολογικά ενεργών ουσιών (κυτταροκίνες, στοιχεία του συμπληρώματος, λυσοσωμικά ένζυμα κ.ά.) 67. Σε αποκόλληση ηλικίας 5-8 εβδομάδων τα μακροφάγα συνεχίζουν να είναι κυρίαρχα αλλά έχουν επέλθει σημαντικές μορφολογικές αλλαγές όπως και σε όλα τα υπόλοιπα είδη κυττάρων. Παράλληλα υπάρχουν και ινοβλάστες. Σε αποκόλληση ηλικίας 6 μηνών υπάρχει πλήρης απουσία φυσιολογικών κυττάρων στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό. Όσον αφορά τις ιντερλευκίνες, η συγκέντρωση των IL-1β, IL-2, IL-4 φαίνεται ότι παραμένει αμετάβλητη στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό, ενώ παρατηρείται αύξηση στη συγκέντρωση της IL-6, γεγονός που δείχνει ενεργοποίηση μακροφάγων και λεμφοκυττάρων. Τα κύτταρα μικρογλοίας του αμφιβληστροειδούς καθώς και το μελάγχρουν επιθήλιο παράγουν IL-6. Η IL-6 ανήκει στις κυτταροκίνες που συνδέονται με τη φλεγμονή: ρυθμίζει την αύξηση και τη διαφοροποίηση των κυττάρων του θύμου και των ώριμων Τ-λεμφοκυττάρων, προκαλεί την τελική διαφοροποίηση των Β-λεμφοκυττάρων και είναι ο κύριος παράγοντας που επηρεάζει την έκκριση των πρωτεϊνών της οξείας φάσης 68,69. Επίσης ανιχνεύθηκε και IL-10 που ανα- 30

31 στέλλει την παραγωγή της IL-6 από τα λεμφοκύτταρα και είναι σημαντικός παράγοντας στη ρύθμιση της δραστηριότητας των προφλεγμονωδών κυττάρων σε παθολογικές καταστάσεις 70,71. Η παραγωγή IL-6 που προκαλείται από τους TNF-α, IL-β, LPS από ενεργοποιημένα κύτταρα του ενδοθηλίου, αναστέλλεται από τον TGF-P1 72,73. Φαίνεται λοιπόν ότι η συσσώρευση κυττάρων σε μία αποκόλληση παλαιότητας λίγων ημερών ενεργοποιεί μία πληθώρα ανοσολογικών διαδικασιών που βασίζονται στη φλεγμονή, προωθεί την εξέλιξη παραγωγικών υαλοειδοαμφιβληστροειδικών αλλαγών και καθορίζει την κατεύθυνση περαιτέρω μορφολογικών αλλαγών 74. Α γ. Ινωδόλυση στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό Eνεργοποιητής πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (u-pa) Η διαδικασία της ινωδόλυσης στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό καθώς και των παραγόντων που εμπλέκονται σε αυτή (πλασμινογόνο, πλασμίνη, ενεργοποιητές της πλασμίνης και αναστολείς τους) έγινε επίσης αντικείμενο μελέτης. Όπως είναι γνωστό, ο πιο σημαντικός μηχανισμός στην εξωκυττάρια πρωτεόλυση είναι η ενεργοποίηση του πλασμινογόνου και σε αυτόν λαμβάνουν μέρος δύο τύποι ενεργοποιητών: ο ενεργοποιητής πλασμινογόνου ιστικού τύπου (tissue type Plasminogen Activator-t-PA) και ο ενεργοποιητής πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (urokinase type-plasminogen Activator-u-PA) 75. Η αύξησή των ενεργοποιητών αυτών αποτελεί σημαντικό βήμα στον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την αναπαραγωγή πολλών τύπων κυττάρων και σε πολλές διαδικασίες καταστροφής ιστών 76. Το υπαμφιβληστροειδικό υγρό περιέχει και στοιχεία που μπορούν να προκαλέσουν την ενεργοποίηση του πλασμινογόνου όπως η ενεργοποιημένη πλασμίνη και το t-pa που πιθανώς εμπλέκεται στην καταστροφή του αιματοαμφιβληστροειδικού φραγμού 77,78. Σε καλλιέργειες κυττάρων από υπαμφιβληστροειδικό υγρό ασθενών με ρηγματογενή αποκόλληση παρατηρήθηκε αυξημένη πρωτεολυτική δραστηριότητα και παραγωγή ενεργοποιητή πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης 79. Στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό, φαίνεται ότι τα κύτταρα εκτίθενται σε ερεθίσματα όπως ινονεκτίνη, στοιχεία του υαλοειδούς, πιθανή κρυοθεραπεία, που επηρεάζουν τη μεταφορά, τον πολλαπλασιασμό και τη μορφολογία των κυττάρων 64,78, 80,81. Εν κατακλείδι, η ενεργοποίηση της πρωτεόλυσης που προωθείται από το σύστημα πλασμίνης-πλασμινογόνου πιθανώς συνεισφέρει στην απελευθέρωση κυττάρων του μελάγχρου επιθηλίου στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό, τα οποία μεταναστεύουν και εκκρίνουν ενεργοποιητές του πλασμινογόνου. 31

32 Ενεργοποιητής πλασμινογόνου ιστικού τύπου (t-pa) O t-pa είναι πρωτεϊνάση υπεύθυνη για την κυτταρική μετανάστευση και την αναδιαμόρφωση (remodelling) ιστών, μπορεί να καταλύει την εντοπισμένη περικυτταρική πρωτεόλυση μετατρέποντας το πλασμινογόνο σε πλασμίνη και να προάγει με τον τρόπο αυτό την ινωδόλυση 82,83. Είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί για τη διάλυση θρόμβων αίματος (σε περίπτωση απόφραξης κεντρικής αρτηρίας και φλέβας). Πιθανή πηγή του αποτελούν τα ενδοθηλιακά κύτταρα αγγείων ενώ δεν αποκλείεται να είναι φυσιολογικό συστατικό ιστών της ίριδας, του χοριοειδή, του αμφιβληστροειδούς και του ακτινωτού σώματος 84. Η δράση του t-pa αλλά και του συνόλου των ενεργοποιητών του πλασμινογόνου υπόκειται σε ρύθμιση από τους ειδικούς αναστολείς τους (αναστολέας ενεργοποιητή πλασμινογόνου-ραι: Plasminogen Activator Inhibitor) καθώς και από την ισορροπία μεταξύ ΡΑ/ΡΑΙ. Πάντως η ακριβής αλληλεπίδρασή τους στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό μένει να περιγραφεί εκτενώς αφού προγενέστερες μελέτες δεν κατέληξαν σε οριστικά συμπεράσματα 47. Σε μία εφαρμογή των παραπάνω παρατηρήσεων, ο t-pa χρησιμοποιήθηκε κατά την υαλοειδεκτομή ασθενών με παραγωγική διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια 85. Η χρήση του t-pa βασίζεται στην παρατήρηση ότι στην PDR δημιουργούνται νέα αγγεία στο φλοιό του υαλοειδούς δημιουργώντας με αυτό τον τρόπο ένα «πλέγμα» για δημιουργία μεμβρανών 86. Σε παλαιότερες μελέτες συνδέθηκε η μερική οπίσθια αποκόλληση του υαλοειδούς (Posterior Vitreal Detachment-PVD) με την πρόοδο της παραγωγικής διαδικασίας κατά την PDR, γεγονός που μπορεί να εξηγηθεί από το ότι η παρατηρούμενη καταστροφή του φραγμού της διάχυσης των ουσιών φαίνεται ότι ενισχύει τις μεταβολικές λειτουργίες του υποκειμένου αμφιβληστροειδούς 87. Αυτό επιτυγχάνεται με την υδρόλυση των γλυκοπρωτεϊνών που αποτελούν το μέσο προσκόλλησης του υαλοειδούς στον αμφιβληστροειδή 88. Πιθανολογείται ότι αυτό είναι αποτέλεσμα της δράσης του t-pa, της πλασμίνης ή των πρωτεϊνασών του ορού που ενεργοποιήθηκαν από την πλασμίνη. Παράλληλα, φαίνεται ότι η αγγειακή προσκόλληση του υαλοειδούς φαίνεται ότι χαλαρώνει με τη χρήση t-pa. Η απελευθέρωση του t-pa που σχετίζεται με τη φαγοκυτταρική ιδιότητα του μελάγχρου επιθηλίου μπορεί να εμπλέκεται στη διαδικασία εκφύλισης των φωτοϋποδοχέων 89. Η συμβολή του t-pa στην παθοφυσιολογία του υπαμφιβληστροειδικού υγρού παραμένει ακαθόριστη. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι σε φυσιολογικές συνθήκες ο t-pa συνδέεται απευθείας με την ινική και συμβάλλει στην εμφάνιση της πλασμίνης που εντοπίζεται στο θρόμβο 90,91. 32

33 Α δ. Πλασμίνη Ένα ακόμη αντικείμενο μελέτης στα πλαίσια του μηχανισμού της ινωδόλυσης αλλά και των συστατικών του υπαμφιβληστροειδικού υγρού είναι και η πλασμίνη. Φαίνεται ότι η πλασμίνη συναντάται συχνότερα στις μεγαλύτερες αποκολλήσεις και σπανιότερα στις μικρότερες 92. Παρόλα αυτά δεν κατέστει δυνατό να αποδειχθεί άμεση συσχέτιση με τη χρονική διάρκεια της αποκόλλησης ή τα χαρακτηριστικά των ρηγμάτων του αμφιβληστροειδούς. Η πηγή της πλασμίνης είναι άγνωστη. Είναι πιθανό η καταστροφή του αιματοαμφιβληστροειδικού φραγμού μετά από μία αποκόλληση να δίνει την ευκαιρία σε στοχεία του συστήματος της ενεργοποήσης του πλασμινογόνου να εισέλθουν στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο και το υαλοειδές 93. Επίσης μακροφάγα, που είναι πάντα παρόντα στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό, μπορεί να ενεργοποιούν το πλασμινογόνο, εύρημα που εξηγεί και τη ενεργοποίηση της πλασμίνης. Η πλασμίνη μπορεί να αυξάνει την κατανομή του κυττάρων του μελάγχρου επιθηλίου στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο και το υαλοειδές ενώ παράλληλα μπορεί να προκαλέσει την απελευθέρωση των εν λόγω κυττάρων με την αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας. Με αυτό τον τρόπο μπορεί να συμβάλλει στην εξέλιξη της PVR 77,78. Α ε. Πρωτεϊνάσες και μεταλλοπρωτεϊνάσες Η δράση των μεταλλοπρωτεϊνασών κατά τη ρηγματογενή αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς είναι το αντικείμενο της παρούσας μελέτης και θα αναπτυχθεί εκτενώς σε επόμενο κεφάλαιο. Α στ. Λευκωματίνη Μία από τις ενώσεις που ανιχνεύονται στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό και έγινε αντικείμενο μελέτης είναι και η αλβουμίνη. Παθολογική αύξηση της πρωτεΐνης του υπαμφιβληστροειδικού υγρού μπορεί να παίζει ρόλο στη συσσώρευση και την παραμονή του υγρού, μέσω της αύξησης της οσμωτικής πίεσης στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο. Αυτό συμβαίνει μέχρι του σημείου της εκμηδένισης ή ακόμη και της αντιστροφής της απορρόφησης από το χοριοειδή. Η συγκέντρωση πρωτεϊνών υπαμφιβληστροειδικά αυξάνει καθώς νερό απορροφάται από το μελάγχρουν επιθήλιο 48,94,95. Σε μοντέλο πρόκλησης πειραματικής μη ρηγματογενούς αποκόλλησης παρατηρήθηκε ότι γίνεται ανταλλαγή νερού, ιόντων και πρωτεϊνών ενώ απαραίτητη προϋπόθεση απο- 33

34 τελεί η βλάβη του μελάγχρου επιθηλίου 40. Η συγκέντρωση της λευκωματίνης στο υπαφιβληστροειδικό υγρό αυξήθηκε από 224,1 μg/ml σε 333,3 μg/ml, ενώ ο όγκος του υγρού μειώθηκε κατά 35%. Αυτή η παρατήρηση καταδεικνύει τον κυρίαρχο ρόλο που παίζει η απορρόφηση υγρών κατά μήκος του μελάγχρου επιθηλίου στην αύξηση της συγκέντρωσης της λευκωματίνης στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο. Πριν από τη διενέργεια του πειράματος η συγκέντρωση της λευκωματίνης στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό και το υαλοειδές ήταν στα ίδια επίπεδα, ενώ στη συνέχεια πρωτεΐνη περνά από το υαλοειδές στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο και η λευκωματίνη μετακινείται προς την αντίθετη κατεύθυνση. Ο φραγμός που συνιστά το μελάγχρουν επιθήλιο διασπάται στην αρχή της ρηγματογενούς αποκόλλησης αλλά φαίνεται ότι επανέρχεται 1-2 εβδομάδες μετά, γεγονός που υποδεικνύει την κύρια αιτία αύξησης της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών 49. Το υπαμφιβληστροειδικό υγρό απορροφάται πολύ πιο γρήγορα μετά από βλάβη του μελάγχρου επιθηλίου πιθανώς λόγω της ωσμωτικής πιέσεως που ασκείται από το χοριοειδή 96. Παρατηρήθηκε ότι όταν δεν υπάρχει βλάβη στο μελάγχρουν επιθήλιο η υπαμφιβληστροειδική συγκέντρωση της λευκωματίνης παραμένει χαμηλή σε σχέση με αυτή του ορού, αφού η λευκωματίνη δεν μπορεί να μετακινηθεί άμεσα αλλά διηθείται αργά διαμέσου του ιδίως αμφιβληστροειδούς. Πάντως σε περίπτωση ρωγμής, η διάχυση θα εξισώσει τις συγκεντρώσεις μεταξύ υαλοειδούς και υπαμφιβληστροειδικού χώρου 97. Από τα παραπάνω προκύπτει το γενικό συμπέρασμα ότι η είσοδος, η παραμονή αλλά και η κάθαρση του υπαμφιβληστροειδικού υγρού κατά τη ρηγματογενή αποκόλληση είναι μία δυναμική διαδικασία και καθορίζεται από μία ισορροπία δυνάμεων παρά από μία συγκεκριμένη παράγοντα. Α ζ. Πρωτεΐνες Παράλληλα με τη λευκωματίνη ερευνήθηκε η συγκέντρωση, η κινητική και ο ρόλος των πρωτεϊνών γενικότερα. Η συγκέντρωση πρωτεϊνών στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό βρέθηκε 3-5 φορές αυξημένη σε σχέση με τις αντίστοιχες του ορού. Τα κλάσματα της πρωτεΐνης ήταν ίδια με αυτά του ορού 98. Πολλές μελέτες δείχνουν θετική συσχέτιση με τη διάρκεια της αποκόλλησης και συγκέντρωσης πρωτεϊνών στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό 94,95,99,100. Η συγκέντρωση πρωτεϊνών στο υαλοειδές είναι μικρότερη από ότι στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό 94,95,99,100. Σε μεγάλα αμφιβληστροειδικά ρήγματα, ο λόγος συγκέντρωσης πρωτεϊνών μεταξύ των δύο είναι περίπου ίσος με 1, κάτι που δείχνει την ελεύθερη διάχυση μεταξύ τους. Σε μικρά ρήγματα, ο συγκεκριμένος λόγος βρέθηκε αυξημένος, γεγονός που υποδεικνύει ότι η ελεύθερη διάχυση εξαρτάται από το μέγεθος του ρήγματος. 34

35 Ο αιματοαμφιβληστροειδικός φραγμός παραμένει ακέραιος σε περίπτωση ρηγματογενούς αποκόλλησης 101,102. Άρα, πιθανώς, το υαλοειδές να διέρχεται μέσω της δημιουργηθέντος ρήγματος ενώ νερό και μικρά μόρια απορροφώνται μέσω του μελάγχρου επιθηλίου, εύρημα που μπορεί να αποδοθεί στην αυξημένη διαπερατότητα του μελάγχρου επιθηλίου και των αμφιβληστροειδικών αγγείων 17,101. Α η. Λιπίδια Μία ακόμη ομάδα συστατικών του υπαμφιβληστροειδικού υγρού είναι αυτή των λιπιδίων (λιποπρωτεϊνών-απολιποπρωτεϊνών). Η απολιποπρωτεΐνη Ε παίζει σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό και τη μεταφορά των λιποπρωτεϊνών και γενικότερα στη διαδικασία επούλωσης τραυμάτων στο νευρικό ιστό 103. Σύμφωνα με σχετικές μελέτες, φαίνεται ότι υπάρχει θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων της απολιποπρωτεΐνης Ε και της διάρκειας της αποκόλλησης 104. Η αύξηση της συγκέντρωσης της συγκεκριμένης απολιποπρωτεΐνης είναι δυνατό να προέρχεται από διαρροή των τριχοειδών ή από τοπική παραγωγή από κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου και τον ιδίως αμφιβληστροειδή (το οποίο φαίνεται και πιο πιθανό) 105. Τα πειραματικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι η λειτουργία της απολιποπρωτεΐνης Ε στον αμφιβληστροειδή πιθανότατα περιλαμβάνει και μεταφορά λιπιδίων παρόμοια με αυτή που πιστεύεται ότι έχει και στο ΚΝΣ, ενώ παράλληλα μπορεί να παίζει ρόλο στη διαδικασία επούλωσης των οπών (σχετιζόμενη με λιπίδια) στον επανασυγκολλημένο αμφιβληστροειδή 106. Πάντως όσον αφορά τις λιποπρωτεΐνες γενικότερα, σε ρηγματογενή αποκόλληση τα επίπεδα χοληστερίνης και τριγλυκεριδίων στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό αυξάνουν ενώ σε εξιδρωματική αποκόλληση τα επίπεδα της χοληστερίνης αυξάνουν και των τριγλυκεριδίων παραμένουν σταθερά. Λιπίδια βρέθηκαν να συσσωρεύονται στο εξεταζόμενο υγρό σε ρηγματογενή αποκόλληση σε συγκεντρώσεις μεταξύ 0,1-2,4 mg/ml 107. Από τις μετρήσεις που έγιναν εξάχθηκε το συμπέρασμα ότι η αδυναμία συσχέτισης της συγκέντρωσης των λιπιδίων με αυτή των πρωτεϊνών μπορεί να δείχνει ότι η μεγαλύτερη ποσότητα λιπιδίων στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό δεν προέρχεται από διαρροή αγγείων. Παράλληλα, η απουσία μακρομορίων του αίματος αποκλείει τη διαρροή αίματος κατά τη λήψη των δειγμάτων. Α θ. Υποδοχέας της τρανσφερρίνης Ο σίδηρος είναι απαραίτητος για πολλές μεταβολικές διαδικασίες, όπως η σύνθεση DNA και πρωτεϊνών, και μεταφέρεται από την τρανσφερρίνη. Αυτή ανιχνεύεται και στο υαλοειδές και στις μεμβράνες που σχηματί- 35

36 ζονται κατά την PVR 108. Η τρανσφερρίνη είναι απαραίτητη για την κυτταρική αύξηση και μίτωση ενώ η ποσότητα του υποδοχέα της δείχνει να αυξάνεται στα κύτταρα που παράγονται κατά την PVR σε σχέση με τα ανενεργά κύτταρα 58. Παρατηρήθηκε ότι στην PVR τα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου σε υπαμφιβληστροειδικό υγρό και υαλοειδές εκφράζουν υποδοχείς της τρανσφερρίνης 109. Όμως ενώ η πλειοψηφία τους εκφράζει τους υποδοχείς, μόνο λίγα κύτταρα αντέδρασαν σε κύτταρα ειδικά για αυτούς. Δεν παρατηρήθηκε αντίδραση στον αμφιβληστροειδή παρά μόνο σε μερικά κύτταρα σε ίριδα, επιπεφυκότα, pars plana, επιθήλιο κερατοειδή και φακού 110. Τέτοιες διαφορές οφείλονται πιθανότατα στην ετερογένεια του κυτταρικού μεταβολισμού και δραστηριότητας. Επίσης σε ορισμένα κύτταρα, αυξητικοί παράγοντες όπως ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (Epidermal Growth Factor-EGF), ο αιμοπεταλιακός αυξητικός παράγοντας (Platelet Derived Growth Factor-PDGF), ο αυξητικός παράγοντας που ομοιάζει στην ινσουλίνη τύπου Ι (Insulin-like Growth Factor-IGF-Ι) προκαλούν μία παροδική αύξηση στην έκφραση του υποδοχέα της τρανσφερρίνης 59,110,111. Α ι. Πρωτεΐνη της μεσοκυττάριας ουσίας που συνδέεται με τα ρετινοειδή (IRBP) Πιθανώς σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της αποκόλλησης να παίζει η πρωτεΐνη της μεσοκυττάριας ουσίας που συνδέεται με τα ρετινοειδή (Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein-IRBP). Η IRBP χρησιμεύει στη μεταφορά ρετινοειδών μεταξύ του μελάγχρου επιθηλίου και των κωνίων και ραβδίων 8. Η είσοδος IRBP μεταξύ του μελάγχρου επιθηλίου και του ιδίως αμφιβληστροειδή κατά την αποκόλληση αύξησε σημαντικά το ρυθμό της επαναδημιουργίας της ροδοψίνης και φαίνεται πως υπερδιπλασίασε το ποσό της στο σκότος. Αποδείχθηκε ότι η είσοδος υγρού στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο προκάλεσε σημαντικά προβλήματα, γεγονός που φάνηκε από το ρυθμό και το ποσό της ροδοψίνης που επαναδημιουργήθηκε μετά την πειραματική αποκόλληση 112. Αναφέρονται και άλλες μελέτες που εμπλέκουν την IRBP και σε άλλες δυσλειτουργίες των μηχανισμών κίνησης των χρωστικών μετά από αποκολλήσεις. Πάντως είναι σίγουρο ότι η αποκόλληση μεταβάλλει σημαντικά την ιστολογική εικόνα του αμφιβληστροειδούς, προκαλεί βλάβες στα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου και τις απολήξεις τους και αφήνει πολλά έξω τμήματα κωνίων και ραβδίων αποκομμένα από τα πλούσια σε μιτοχόνδρια έσω τμήματα

37 Α ια. Aνοσοσφαιρίνες Το υπαμφιβληστροειδικό υγρό περιέχει μεγάλη ποσότητα πρωτεϊνών και υπάρχουν στοιχεία που συνιστούν ότι αυτές έχουν προέλθει από το πλάσμα 94,116 ενώ παράλληλα περιέχει και λιποπρωτεΐνες που προέρχονται από την αποδόμηση αμφιβληστροειδικών στοιχείων αλλά και α 1 -λιποπρωτεΐνης από φωσφολιπάση Α 91,117. Αν και τα περισσότερα στοιχεία συνηγορούν για μετακίνηση υγρού από το υαλοειδές στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο, δεν έχει καθοριστεί ακόμη ο ρυθμός ανάμειξης του υαλοειδούς με το υπαμφιβληστροειδικό υγρό. Αν έφθαναν σε χημική ισορροπία, θα έπρεπε να υπάρχει βιοχημική ομοιότητα. Στην προσπάθεια κατανόησης του τρόπου με τον οποίο αναμιγνύεται το υπαμφιβληστροειδικό υγρό με το υαλοειδές, επελέγησαν οι ανοσοσφαιρίνες γιατί είναι φυσιολογικά παρούσες στα βιολογικά υγρά, έχουν κατά κύριο λόγο υψηλά μοριακά βάρη και πιθανολογείται ότι αντιμετωπίζουν δυσκολία στη δίοδό τους διαμέσω του αθίκτου αμφιβληστροειδούς 118. Βρέθηκε σημαντικά μεγαλύτερη συγκέντρωση ανοσοσφαιρινών στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό από ότι στο υαλοειδές. Οι υψηλές τιμές IgG/IgM που καταγράφησαν τόσο στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό όσο στο υαλοειδές οφείλονται στο γεγονός ότι και τα δύο ενδοφθάλμια υγρά δέχονται σημαντική ποσότητα IgG από επιλεκτική διήθηση ορού ή από επιλεκτική έκκριση ή τοπική παραγωγή ανοσοσφαιρινών στον οφθαλμό ή από επιλεκτική κάθαρση IgM από τον οφθαλμό. Τα κλάσματα IgG/IgM και IgA/IgM στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό είχαν μία θετική συσχέτιση με τη χρονική διάρκεια της αποκόλλησης ενώ κάτι ανάλογο δεν παρατηρήθηκε στο υαλοειδές. Από τη σύγκριση των συγκεντρώσεων φαίνεται ότι είναι πιθανή η κοινή καταγωγή υαλοειδούς και υπαμφιβληστροειδικού υγρού. Όμως δεν μπορεί να γίνει άμεση συσχέτιση λόγω της ύπαρξης ενός οργανικού φραγμού που δεν επιτρέπει σημαντική διάχυση μέσω του αμφιβληστροειδικού ρήγματος. Επιπρόσθετα, κατέστει σαφές ότι δεν υφίσταται ελεύθερη ανάμειξη των υγρών υαλοειδικής κοιλότητας και του υπαμφιβληστροειδικού χώρου διαμέσω του ρήγματος σε ρηγματογενή αποκόλληση παρόλο που είναι αποδεκτό ότι η κατεύθυνση της κίνησης του υγρού είναι από το υαλοειδές προς τον υπαμφιβληστροειδικό χώρο 118. Α ιβ. Κύτταρα Η σύσταση του υπαμφιβληστροειδικού υγρού μεταβάλλεται σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές μετά την αποκόλληση 119. Το υπαμφιβληστροειδικό υγρό δημιουργείται συνεπεία της τήξης του υαλοειδούς σε συνδυασμό με την αύξηση στη διαπερατότητα των χοριοειδικών αγγείων 120,121. Κατά τη 37

38 διάρκεια της PVR παράγονται ποσότητες προ- και υπαμφιβληστροειδικών ιστών ενώ ταυτόγχρονα παρατηρείται μία μαζική υαλοειδική αντίδραση 122. Η σύσπαση αυτών των ιστών εμποδίζει την επανασυγκόλληση. Στους ιστούς αυτούς απαντώνται ινοβλάστες, κύτταρα γλοίας και μελάγχρου επιθηλίου. Σε υπαμφιβληστροειδικό υγρό 7-8 ημερών παρατηρείται μικρός αριθμός κυττάρων Σε ΥΥ 2 εβδομάδων τα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου είναι οργανωμένα σε ομάδες των 4-10 κυττάρων, ενώ σε ΥΥ ημερών παρατηρούνται μακροφάγα. Η παρατηρηθείσα φαινοτυπική αλλαγή στη μορφολογία τους θα πρέπει να οφείλεται στην παραμονή τους στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό. Παράλληλα, σε πειραματικά μοντέλα πρόκλησης αποκόλλησης καταγράφηκε ο καθοριστικός ρόλος της μεμβράνης του Bruch στη παθοφυσιολογία της αποκόλλησης 128,129. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων του μελάγχρου επιθηλίου, που αποδείχθηκε σε περιοχές του αμφιβληστροειδούς παρακείμενα της βλάβης, είναι πιθανό να σημαίνει ότι η ακεραιότητα του υποκειμένου στρώματος είναι σημαντική για την ίαση και τον καθορισμό των μορφολογικών χαρακτηριστικών της μονοστοιβάδας των κυττάρων του μελάγχρου επιθηλίου 130,131, αφού φαίνεται ότι το μελάγχρουν επιθήλιο μπορεί να μην ιαθεί σε μία πάσχουσα μεμβράνη του Bruch, μετά από χειρουργική επέμβαση για την αποκατάσταση αποκολληθέντος αμφιβληστροειδούς. Α.2.4. Επιπτώσεις της αποκόλλησης στη μορφολογία του αμφιβληστροειδούς Η ρηγματογενής αποκόλληση έχει μελετηθεί εκτενώς σε πειραματικά μοντέλα πρόκλησής της σε πειραματόζωα. Πάντως οι ακριβείς συνθήκες που επικρατούν κατά τη διάρκειά της είναι δύσκολο να προσομοιωθούν. Παρακάτω αναφέρονται οι επιπτώσεις της αποκόλλησης σε κυτταρικό επίπεδο στο μελάγχρουν επιθήλιο και στον ιδίως αμφιβληστροειδή. Α Επιπτώσεις στη μορφολογία του μελάγχρου επιθηλίου Μία από τις πρώτες επιπτώσεις της αποκόλλησης συμβαίνει στην κορυφαία επιφάνεια του μελάγχρου επιθηλίου. Στην περιοχή αυτή οι λαχνωτές απολήξεις που φυσιολογικά περιβάλλουν τα έξω κύρια τμήματα χάνονται κατά τη διάρκεια των πρώτων ωρών και αντικαθίστανται από μικρολάχνες 113. Παράλληλα παρατηρείται μια συνολική αλλαγή στη μορφολογία των κυττάρων ώστε να εμφανίζονται με ένα πιο στρογγυλό σχήμα, ενώ ο πυρήνας τοποθετείται σε μία πιο κορυφαία θέση ( mounding ) 113. Ταυτόγχρονα, αμέσως μετά την αποκόλληση, φαίνεται ότι τα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου που φυσιολογικά είναι αδρανή εισέρχονται σε ένα 38

39 στάδιο σύνθεσης DNA 132. Από τα πειραματικά δεδομένα εξάγεται το συμπέρασμα ότι η προσκόλληση του μελάγχρου επιθηλίου με τον ιδίως αμφιβληστροειδή έχει ως αποτέλεσμα το μελάγχρουν επιθήλιο να παραμένει μιτοτικά ανενεργό και η κορυφαία επιφάνειά του υψηλά διαφοροποιημένη 133. Άλλη επίπτωση της αποκόλλησης στο μελάγχρουν επιθήλιο είναι η μετανάστευση κυττάρων στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο. Είναι δυνατό να εντοπισθούν λοιπόν πολυμορφοπύρηνα ουδετερόφιλα και μονοκύτταρα σε διάστημα 24 ωρών καθώς και κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου σε 72 ώρες 113. Ιδιαίτερα δύσκολος αποδεικνύεται ο καθορισμός του ιστού προέλευσης των παραπάνω κυττάρων αφού αυτός μπορεί να μην είναι ένας και μοναδικός. Σημαντική μορφολογική επίπτωση είναι η εκφύλιση των έξω κυρίων τμημάτων. Έτσι παρατηρείται κενοτοπίωση του άπω τέλους ενός έξω τμήματος στις πρώτες 12 ώρες, ενώ μεταξύ των 24 και των 72 ωρών τα έξω τμήματα τόσο των ραβδίων όσο και των κωνίων δείχνουν σημεία βλάβης 133. Τέλος η ανανέωση των έξω κυρίων τμημάτων των φωτοϋποδοχέων μέσω μιας συνεχούς διαδικασίας προσθήκης δίσκων στη βάση και η φαγοκυττάρωση στις άκρες των κωνίων και των ραβδίων 134,135, καθώς και η βιοσύνθεση οψίνης ελαττώνεται σημαντικά σε περίπτωση αποκόλλησης, χωρίς να σταματά τελείως ακόμη και μετά παρατεταμένα ανάλογα επεισόδια 34. Α Επιπτώσεις στη μορφολογία του ιδίως αμφιβληστροειδούς Συγχρόνως με το μελάγχρουν επιθήλιο, ο ιδίως αμφιβληστροειδής υφίσταται και αυτός τις συνέπειες της αποκόλλησης. Τα έσω κύρια τμήματα των φωτοϋποδοχέων εμφανίζουν σημεία εκφύλισης κατά την πρώτη ως τρίτη ημέρα μετά την αποκόλληση. Παράλληλα στην έξω πυρηνική και την έξω πλεγματοειδή στοιβάδα παρατηρούνται μορφολογικές αλλαγές που εξαρτώνται από τη χρονική διάρκεια της αποκόλλησης 136. Σε μεγάλης χρονικής διάρκειας αποκολλήσεις (50 ημερών και άνω) οι συνάψεις μεταξύ των φωτοϋποδοχέων και των δευτέρων αισθητηριακών νευρώνων αναγνωρίζονται δύσκολα και σπάνια. Φαίνεται όμως ότι τα κυτταρικά σώματα των ραβδίων αντιδρούν πιο γρήγορα στην αποκόλληση από ότι των κωνίων. Ο αμφιβληστροειδής σε απάντηση προς τις επερχόμενες αλλαγές προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του π.χ. των κυττάρων του Müller. Σε περίπτωση που η αποκόλληση διαρκέσει περισσότερο από δύο ημέρες είναι διακριτή και μία αξιοσημείωτη υπερτροφία των απολήξεων των κυττάρων του Müller στην έξω κοκκώδη και την έξω δικτυωτή στοιβάδα, γεγονός που δημιουργεί μία «ουλή γλοίας» στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο 137. Φαίνεται ότι αυτή η εξέλιξη η παραγωγή κυττάρων γλοίας μετά από τραυματισμό αναστέλλει την αναγέννηση και επαναδημιουργία συναπτικών συν- 39

40 δέσεων μεταξύ αυτών και των δευτέρων αισθητηριακών νευρώνων. Τέλος ένα θεαματικό συμβάν είναι η απώλεια κυττάρων των φωτοϋποδοχέων λόγω νεκρώσεως και προσεκβολής των κυτταρικών σωμάτων τους στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο 114,138. Α Η αποδιαφοροποίηση των κυττάρων του μελάγχρου επιθηλίου Οι μεμβράνες που αναπτύσσονται επί του αμφιβληστροειδούς (EpiRetinal Membranes-ERM) κατά τη διάρκεια της παραγωγικής υαλοειδοαμφιβληστροειδοπάθειας (Proliferative VitreoRetinopathy-PVR) είναι προϊόν κυτταρικού πολλαπλασιασμού και δημιουργίας συνδετικού ιστού 123,139. Προϋπάρχουσες μελέτες έδειξαν ότι περιέχουν κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου, γλοίας, ινοβλάστες και κύτταρα που έχουν υποστεί μυοϊνοβλαστική μεταμόρφωση 122,124,139. Επιπρόσθετα έχει βρεθεί ότι πεπτίδια και πρωτεΐνες του ορού μπορεί να προάγουν τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό και την προσκόλλησή των κυττάρων καθώς και ιστική σύσπαση 81,140. Τα κύτταρα που πολλαπλασιάζονται σε αυτές τις μεμβράνες (ERM) γενικά χαρακτηρίζονται ως κύτταρα που μοιάζουν με ινοβλάστες ή είναι ακαθόριστου τύπου, κάτι που σημαίνει ότι τα χαρακτηριστικά τους χάθηκαν ή τροποποιήθηκαν κατά του πολλαπλασιασμό 122,124,139. Η διαδικασία της μετατροπής επιθηλιακού κυττάρου σε μεσεγχυματικό αποκλήθηκε epithelial-to-mesenchymal transition (μετάβαση από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό κύτταρο) 141,142. Η μελέτη της συμπεριφοράς των κυττάρων του μελάγχρου επιθηλίου μετά την αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς έδειξε ότι κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου ενηλίκων και in vitro και στην PVR υφίστανται κυτταρική διαφοροποίηση και φαινοτυπικές αλλαγές που χαρακτηρίζονται από απώλεια των κυτταρικών τους συνδέσεων (απαραίτητες για τη σύνδεση των κυττάρων) 143,144. Αυτό μπορεί να συμβαίνει λόγω της απώλειας επαφής με τη βασική μεμβράνη τους αλλά και της απώλειας συνδέσεων απαραιτήτων για την επικοινωνία τους με τα υπόλοιπα κύτταρα. Παρατηρούνται επίσης και αποδιαφοροποιημένα κύτταρα μελάγχρου επιθηλίου που υπέστησαν epithelial-to-mesenchymal transition κατά τη διάρκεια της PVR. Η αποδιαφοροποίηση συμβαίνει κατά τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό 141,142, Κατά την PVR κύτταρα με επιθηλιοειδή χαρακτηριστικά αλλά και κύτταρα με ινοβλαστικά χαρακτηριστικά, με ή χωρίς χρωστική, που ομοιάζουν με κύτταρα μελάγχρου επιθηλίου μορφολογικά εκφράζουν τα γονίδια CK- Vim-GFAP και παράγουν τα προϊόντα τους που είναι πρωτεΐνες των ενδιαμέσων ινιδίων 143. Κύτταρα με χαρακτηριστικά γλοίας εκφράζουν τα γονίδια GFAP-Vim αλλά όχι το CK. (CK:Cytokeratins, Vim:Vimentin και GFAP:Glial Fibrillary Protein). Άρα η έκφραση των CK-Vim-GFAP συμ- 40

41 βαίνει κυρίως σε αποδιαφοροποιημένα κύτταρα μελάγχρου επιθηλίου. Επίσης παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα παράγουν μία κολλαγονώδη ουσία που οδηγεί σε μία μεμβρανογενετική διαδικασία και αποκτούν συσταλτικές ιδιότητες 140,148,149. Συμπερασματικά η μελέτη πρωτεϊνών των συγκεκριμένων κυττάρων υποδεικνύει ότι αυτές ομοιάζουν με πρωτεΐνες των ενδιαμέσων ινιδίων: τα κύτταρα αποδιαφοροποιούνται και προσαρμόζονται στη νέα-παθολογικήκατάσταση που αντιπροσωπεύει η αποκόλληση με την αλλαγή του φαινοτύπου τους προς μία μεσεγχυματική μορφολογία. Η epithelial-to-mesenchymal transition χαρακτηρίζει τις πολύπλοκες λειτουργικές και μεταβολικές αλλαγές των πολλαπλασιαζομένων κυττάρων κατά την PVR. Α.3. Παραγωγική υαλοειδοαμφιβληστροειδοπάθεια (Proliferative Vitreoretinopathy-PVR) Α.3.1. Ορισμός Η παραγωγική υαλοειδοαμφιβληστροειδοπάθεια (Proliferative Vitreoretinopathy-PVR) είναι μία διαδικασία παραγωγής ινοαγγειακών μεμβρανών κατά τη διάρκεια της ρηγματογενούς αποκολλήσεως επί- και υπο- τον αμφιβληστροειδή καθώς και επί της οπισθίας επιφανείας του αποκολλημένου υαλειδούς 29. Συμβαίνει ακόμη και μετά από τη χειρουργική αποκατάσταση της αποκόλλησης ενώ είναι δυνατό να συμβεί και σε υποκλινικές αποκολλήσεις, ιδίως σε περιπτώσεις μεγάλων αμφιβληστροειδικών ρωγμών χωρίς αποκόλληση. Παρατηρείται στο 5-10% των χειρουργηθέντων αποκολλήσεων αμφιβληστροειδούς και αποτελεί το βασικό παθογενετικό μηχανισμό αποτυχίας της χειρουργικής προσπάθειας αποκατάστασής τους 150. Α.3.2. Παθογένεια Η παθογένεση της PVR φαίνεται ότι είναι πολυπαραγοντική αλλά η πρωταρχική προϋπόθεση για την εμφάνισή της είναι η ύπαρξη αμφιβληστροειδικού ρήγματος. Στους παράγοντες κινδύνου συμπεριλαμβάνονται η ύπαρξη γιγαντιαίων ρωγμών, ο αριθμός και το μέγεθος των αμφιβληστροειδικών ρωγμών, η αφακία, η ενδοφθάλμια αιμορραγία, τα υψηλά επίπεδα πρωτεϊνών του υαλοειδούς, η χρήση της κρυοθεραπείας, η βαρύτητα της προεγχειρητικής PVR και ο αριθμός προηγουμένων επεμβάσεων 151. Κατά δεύτερο σκοπό, πιστεύεται ότι κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου μεταναστεύουν μέσω της ρωγμής στο χώρο που σχηματίζεται προ του αμφιβληστροειδούς και επί της αμφιβληστροειδικής επιφάνειας. Στη συνέχεια επέρχεται η δημιουργία ινώδους ιστού, ο οποίος εντοπίζεται συχνότερα στον κα- 41

42 τώτερο αμφιβληστροειδή και επί του οποίου κατακρημνίζονται τα κύτταρα. Ακολουθεί η εμφάνιση κυττάρων γλοίας και μεσοκυττάριας ουσίας. Μία πληθώρα κυττάρων είναι συστατικό των μεμβρανών κατά την PVR εκ των οποίων τα πιο σημαντικά είναι τα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου, κύτταρα ομοιάζοντα με μακροφάγα, κύτταρα γλοίας και κύτταρα ομοιάζοντα με ινοβλάστες 109. Άλλα κύτταρα που εμπλέκονται αλλά θεωρείται ότι έχουν δευτερεύοντα ρόλο είναι ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα, Β- και Τ-λεμφοκύτταρα, αιμοπετάλια και ερυθρά 152. Τα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου φαίνεται ότι είναι από τους βασικούς παράγοντες εμφάνισης της PVR, πλην όμως η συγκεκριμένη επιπλοκή της ρηγματογενούς αποκόλλησης θα πρέπει να θεωρείται το αποτέλεσμα αλληλεπιδράσεων μεταξύ όλων των τύπων κυττάρων που εισέρχονται στην υαλοειδική κοιλότητα μετά τη ρήξη των αιματοαμφιβληστροειδικών φραγμών 153. Όσον αφορά τα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου, θεωρείται ότι είναι σημαντικά για την παθογένεια της PVR και κυρίως για την έναρξή της 149. Έχει διατυπωθεί η άποψη ότι οι μορφολογικές αλλαγές που παρατηρούνται σε αυτά τα κύτταρα μετά την απώλεια επαφής τους με τους φωτοϋποδοχείς 113 μπορεί να είναι το έναυσμα για την εμφάνιση της PVR. Τα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου είναι παρόντα σχεδόν στο 100% των επαμφιβληστροειδικών μεμβρανών 109,143,153 και μπορεί να έχουν διαφορετικά μορφολογικά χαρακτηριστικά (ομοιάζοντα με μακροφάγα, ομοιάζοντα με ινοβλάστες) 143. Κατά την PVR, τα μακροφάγα είναι τα πιο σημαντικά φλεγμονώδη κύτταρα 154. Προέρχονται πιθανότατα από το μελάγχρουν επιθήλιο ή από τη συστηματική κυκλοφορία 153. Η διαφορά στην προέλευση είναι δυνατό να δικαιολογεί τις παρατηρηθείσες διαφορές στη μορφολογία αλλά και τη δράση τους κατά την PVR 155. Παράλληλα, μελέτες έδειξαν ότι τα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου μπορούν να προάγουν και να ρυθμίζουν τη διαφοροποίηση των μονοκυττάρων σε μακροφάγα, τονίζοντας με τον τρόπο αυτό τον καθοριστικό ρόλο των αλληλεπιδράσεων μεταξύ του μελάγχρου επιθηλίου και των μονοκυττάρων στην εξέλιξη της PVR 156. Τα κύτταρα της γλοίας συμπεριλαμβάνουν τα αστροκύτταρα, τα κύτταρα του Μüller και την περιαγγειακή γλοία, και έχουν ανιχνευθεί σε επαμφιβληστροειδικές μεμβράνες κατά την PVR 153. Παράλληλα, φαίνεται ότι μπορούν να δημιουργήσουν μία μεμβράνη στην επιφάνεια του υαλοειδούς και να προκαλέσουν σύσπαση ινιδίων κολλαγόνου 157. Έχει δειχθεί ότι ο αμφιβληστροειδής σε περιπτώσεις τραυματισμού συχνά απαντά με τη δημιουργία ουλώδους ιστού που περιέχει κύτταρα γλοίας (αστροκύτταρα) 18. Ο ρόλος των κυττάρων γλοίας στη διαδικασία επούλωσης στον αμφιβληστροειδή δεν έχει καθοριστεί επακριβώς αλλά με δεδομένο το σημαντικό ρόλο που παίζουν τα κύτταρα αυτά σε διαδικασίες επούλωσης στον εγκέ- 42

43 φαλο, τα κύτταρα του Μüller και τα αστροκύτταρα είναι δυνατό να παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεση της PVR 158. Οι ινοβλάστες αποτελούν συστατικό σχεδόν όλων των μεμβρανών που χαρακτηρίζουν την PVR 149. Τα κύτταρα αυτά δεν είναι είδικά για την PVR αλλά ανιχνεύονται και σε μεμβράνες κατά τη διαβητική παραγωγική αμφιβληστροειδοπάθεια. Η προέλευση των ινοβλαστών παραμένει ακαθόριστη αφού κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου, κύτταρα του υαλοειδούς, επιθηλιακά κύτταρα των αγγείων και αστροκύτταρα έχουν αναγνωρισθεί ως πιθανές πηγές τους 153,159. Οι ινοβλάστες παράγουν κολλαγόνο και άλλα συστατικά της θεμέλιας ουσίας και φαίνεται ότι έχουν το σημαντικό ρόλο στη σύσπαση των μεμβρανών κατά την PVR, στην ανάπτυξη ελκτικών δυνάμεων και κατά συνέπεια στην εμφάνιση μίας ελκτικής αποκόλλησης 153. Η θεμέλια ουσία των μεμβρανών που χαρακτηρίζουν την PVR θεωρείται πλέον ότι έχει ενεργό ρόλο αφού τα συστατικά της παίρνουν μέρος στη διαδικασία της επούλωσης 160. Όπως έχει δειχθεί, η συγκεκριμένη θεμέλια ουσία εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση των κυττάρων καθώς και την αναδιαμόρφωση και τη σύσπαση των ιστών 160. Από τα συστατικά της θεμέλιας ουσίας των μεμβρανών βασικό δομικό ρόλο φαίνεται ότι παίζουν τα κολλαγόνα I, II, III, IV, V 160. Παράλληλα θα πρέπει να αναφερθεί ότι έχει περιγραφεί η ύπαρξη λαμινίνης, ινονεκτίνης, βιτρονεκτίνης καθώς και ινών ελαστίνης 160. Εξ αυτών, η ινονεκτίνη φαίνεται ότι δρα ως προσωρινό υπόστρωμα για τη μετανάστευση κυττάρων αλλά και για την επούλωση. Η παρατήρηση όμως ότι έχει βρεθεί και σε άλλες παθολογικές οντότητες, όπως διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια, τραύματα και φλεγμονές, την καθιστά παράγοντα μη ειδικό για την PVR 152. Η βιτρονεκτίνη είναι ένα μόριο το οποίο θεωρείται ότι παίζει ρόλο στην προσκόλληση των κυττάρων στις μεμβράνες 108 ενώ ο ρόλος της λαμινίνης και των ινών ελαστίνης κατά την PVR παραμένει ακαθόριστος 149. Τέλος, στις μεμβράνες της PVR ανευρέθησαν και μη δομικές πρωτεΐνες όπως η θρομβοσπονδίνη-1 (thrombospondin-1), η οστεονεκτίνη (osteonectin) και η τενασίνη (tenascin) οι οποίες γενικά εκφράζονται κατά τη διάρκεια διαδικασιών παραγωγής νέου ιστού 160. Οι πρωτεΐνες αυτής της ομάδας μπορεί να παίζουν ρυθμιστικό ρόλο σε πολλά στάδια της διαδικασίας επούλωσης αλλά και κατά τη διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την προσκόλληση των κυττάρων 161. Συμπερασματικά, η θεμέλια ουσία των μεμβρανών υπόκειται σε συνεχή αναδιαμόρφωση καθόλη τη διάρκεια της νόσου. Οι παρατηρούμενες αλλαγές προάγονται κυρίως από τα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου, τα οποία μπορούν να συνθέσουν πρωτεΐνες κάτω από την επίδραση αυξητικών παραγόντων αλλά και ενζύμων υπευθύνων για την αποδόμηση συστατικών της θεμέλιας ουσίας 162. Οι δύο τύποι ενζύμων που φαίνεται ότι εμπλέκονται στην αποδόμηση συστατικών της θεμέλιας ουσίας είναι οι πρωτεϊνάσες της 43

44 σερίνης και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες της θεμέλιας ουσίας (Matrix Μetalloproteinases-MMPs). Η πληθώρα των αλληλεπιδράσεων μεταξύ της θεμέλιας ουσίας των μεμβρανών και των κυττάρων έχει περιγραφεί εκτενώς, όπως αναφέρθηκε παραπάνω αν και όχι στην πλήρη έκτασή της 149. Όπως μπορεί να συναχθεί από τα παραπάνω, παρόλο που η καταγωγή των κυττάρων των μεμβρανών παίζει πολύ σημαντικό ρόλο, το εξωκυττάριο περιβάλλον παίζει και αυτό ένα καθοριστικό ρόλο. Παράλληλα, η τοπική φλεγμονή σε συνδυασμό με τη ρήξη του αιματοαμφιβληστροειδικού φραγμού φαίνεται ότι συμβάλλουν στην ενίσχυση του κυτταρικού στοιχείου των μεμβρανών. Τέλος, θα πρέπει να αναφερθεί ότι η όλη παθοφυσιολογική πορεία της PVR που συμπεριλαμβάνει τη μετανάστευση των κυττάρων, την τοπική φλεγμονή, τη δημιουργία των μεμβρανών και τη σύσπασή τους με πιθανό αποτέλεσμα την υποτροπή έχει ένα χρονικό πλαίσιο που κύμαινεται από 4 έως 6 εβδομάδες από την χειρουργική αντιμετώπιση της αποκόλλησης. Α.3.3. Συμπτωματολογία και ταξινόμηση Η συμπτωματολογία της PVR ποικίλλει ανάλογα με τη εντόπιση και τη έκταση των μεμβρανών καθώς και την ύπαρξη και την τοποθεσία αμφιβληστροειδικών ρωγμών 29. Στην πλέον σοβαρή μορφή της, η σύσπαση των μεμβρανών της PVR μπορεί να προκαλέσει μία ολική αποκόλληση η οποία μπορεί να οδηγήσει σε υποτονία και ακόμη και σε φθίση βολβού. Τα πρώιμα σημεία της PVR συμπεριλαμβάνουν θολώσεις του υαλοειδούς και κοκκία μελανίνης στο υαλοειδές (βαθμός Α). Σε πιο προχωρημένες περιπτώσεις, παρατηρείται συστροφή των χειλέων της ρωγμής και ελίκωση των αγγείων της περιοχής που εμπλέκεται. Ο αμφιβληστροειδής φαίνεται άκαμπτος ενώ παράλληλα λόγω της σύσπασης των μεμβρανών παρατηρείται και ρυτίδωσή του (βαθμός Β). Σε ακόμη πιο προχωρημένο στάδιο (βαθμός C), παρατηρούνται εκσεσημασμένες ολικού πάχους και αστεροειδείς πτυχές του αποκολληθέντος αμφιβληστροειδούς σε 1-3 τεταρτημόρια. Στο πλέον προχωρημένο στάδιο (βαθμός D), εντοπίζονται μαζικές και ακίνητες πτυχές και στα τέσσερα τεταρτημόρια του αμφιβληστροειδούς και δημιουργείται μία «χοάνη» του αμφιβληστροειδούς εξαιτίας της ρίκνωσής του αλλά και της σύσπασης των μεμβρανών 163. Η αποκτηθείσα εμπειρία και οι ανάγκες σταδιοποίησης των εγχειρητικών ενδείξεων από την εφαρμογή της παραπάνω ταξινόμησης οδήγησαν στην αναθεώρησή της σύμφωνα με την οποία υπάρχουν τρεις βαθμοί της PVR. Ο τρίτος βαθμός (βαθμός C), που συμπεριλαμβάνει τους βαθμούς C και D της παλαιότερης ταξινόμησης, περιλαμβάνει άκαμπτες ολικού πάχους πτυχές και διακρίνει την PVR σε πρόσθια (C A ) και οπίσθια (C P ) ενώ παράλληλα λαμβάνει υπόψη τις ώρες στις οποίες εκτείνονται οι πτυχές (C 1-12 )

45 Α.4. Η χειρουργική αντιμετώπιση της ρηγματογενούς απόκόλλησης Ο άμεσος στόχος της χειρουργικής της ρηγματογενούς αποκόλλησης είναι η ίασή της μέσω της αναστροφής των παραγόντων που την προκάλεσαν 29. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με τον πωματισμό της ρωγμής που είναι υπεύθυνη για την αποκόλληση αλλά και την κατάργηση των υαλοειδικών έλξεων που ευθύνονται για την αδυναμία επαφής των χειλέων της ρωγμής με τους υποκείμενους ιστούς, μία προϋπόθεση απαραίτητη για την επιτυχή αντιμετώπιση της ρηγματογενούς αποκολλήσεως. Ο παραπάνω αναφερθείς πωματισμός επιτυγχάνεται με την καθήλωση επισκληρικού μοσχεύματος σιλικόνης (scleral buckling) στο βολβό η οποία ελαττώνει τον όγκο του βολβού και αυξάνει την ενδοφθάλμια πίεση. Σαν αποτέλεσμα της προκληθείσας υπερτονίας, τα ενδοβολβικά υγρά αποχετεύονται ταχύτερα και από το υαλοειδές μέσω της γωνίας του προσθίου θαλάμου ενώ το μόσχευμα εκτοπίζει το υπαμφιβληστροειδικό υγρό προς τα πλάγια και ταυτόγχρονα το τοίχωμα προωθείται προς τη ρωγμή. Σε συνδυασμό με τα παραπάνω χρησιμοποιείται η κρυοπηξία για τη δημιουργία στερεών ουλών που θα οδηγήσουν σε στερεή χορειοαμφιβληστροειδική σύμφυση. Παράλληλα είναι δυνατή η παροχέτευση του υπαμφιβληστροειδικού υγρού με την παρακέντηση του βολβού με χρήση βελόνας ινσουλίνης σε ασφαλές σημείο αντίστοιχο του υπαμφιβληστροειδικού χώρου. Η παραπάνω τεχνική συνοδεύεται από υψηλά ποσοστά επιτυχίας (91%) αλλά και από χαμηλό ποσοστό περαιτέρω επεμβάσεων (10,7%) 164. Παράλληλα με τη χρήση των σκληρικών μοσχευμάτων για την αντιμετώπιση της ρηγματογενούς αποκολλήσεως, έχει εφαρμοστεί και ένας αριθμός άλλων τεχνικών για την αντιμετώπιση της ρηγματογενούς αποκολλήσεως. Η ρετινοπηξία με αέριο (pneumatic retinopexy) συνίσταται στη διεπιπεφυκοτική κρυοπηξία της ρωγμής και ενδοϋαλοειδική εμφύσηση αερίου από την pars plana 165. Ο εσωτερικός πωματισμός της ρωγμής από την ενδοϋαλοειδική φυσαλίδα οδηγεί στην απορρόφηση του υπαμφιβληστροειδικού υγρού με τη διάχυσή του στους υποκείμενους ιστούς και την επανασυγκόλληση του αμφιβληστροειδούς. Η τεχνική αυτή προτείνεται για την αντιμετώπιση επιπεπλεγμένων αποκολλήσεων ή σε αποκολλήσεις με οπίσθιες ή γιγαντιαίες ρωγμές. Στα λεγόμενα «διαστελλόμενα αέρια» τα οποία χρησιμοποιούνται στην παραπάνω τεχνική συμπεριλαμβάνονται ο αέρας, το εξαφθοριούχο θείο (SF 6 ), οι υπερφθοράνθρακες (C x F y ) και το ξένο (Xe) Η ποικιλία στην επιλογή των διαθεσίμων αερίων οφείλεται στις διαφορές που παρουσιάζουν στη διαστολή και το χρόνο παραμονής μέσα στην υαλοειδική κοιλότητα. Τέλος, σε περιστατικά περισσότερο επιπεπλεγμένων αποκολλήσεων χρησιμοποιούνται μείγματα των παραπάνω αερίων με αέρα για την αποτροπή της μετεγχειρητικής αύξησης της ενδοφθάλμιας πίεσης αλλά 45

46 και για την ύπαρξη εσωτερικού πωματισμού για ικανό χρόνο ώστε να αναπτυχθούν οι χοριοαμφιβληστροειδικές ουλές 170. Στα πλεονεκτήματα της μεθόδου συμπεριλαμβάνονται η μικρή συχνότητα μετεγχειρητικών επιπλοκών (κυστικό οίδημα ωχράς, οπή ωχράς, επαμφιβληστροειδική μεμβράνη και παραγωγική υαλοειδοαμφιβληστροειδοπάθεια). Στους λόγους μειωμένων ποσοστών επιτυχίας της συγκεκριμένης μεθόδου συμπεριλαμβάνονται η ύπαρξη ρωγμών που δεν αναγνωρίσθηκαν καθώς και το εκ νέου άνοιγμα των ρωγμών, ενώ φαίνεται ότι τα μετεχειρητικά αποτελέσματά της όσον αφορά την οπτική οξύτητα είναι κατώτερα της χρήσης επισκληρικών μοσχευμάτων 164,171. Μία άλλη τεχνική αντιμετώπισης της ρηγματογενούς αποκολλήσεως αποτελεί το παραβολβικό μπαλόνι των Lincoff-Kreissig 172. Η συγκεκριμένη τεχνική χρησιμοποιείται σε περιπτώσεις χαμηλών αποκολλήσεων μικρής έκτασης, με μία μικρή ρωγμή και με PVR μικρότερη του βαθμού C. Παράλληλα, είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί και σε περιπτώσεις ανεπαρκούς πωματισμού ή γενικότερα ανεπιτυχούς επέμβασης με μόνιμο μόσχευμα, σε περιπτώσεις ρωγμών κάτω από τις καταφύσεις μυών, διαγνωστικά για των αποκλεισμό ή την επιβεβαίωση ύποπτης αμφιβληστροειδικής ρωγμής, ενώ δεν αποκλείεται η εφαρμογή της από έμπειρους χειρουργούς σε ολικές και αφακικές αποκολλήσεις 173. Η επέμβαση με τη χρήση του παραβολβικού μπαλονιού των Lincoff-Kreissig είναι ατραυματική και γρήγορη. Η ακριβής όμως προώθησή του κατά το μεσημβρινό της ρωγμής αλλά και η ακριβής τοποθέτησή του κάτω από τον επιπεφυκότα στο σημείο της ρωγμής αποτελούν καθοριστικές προϋποθέσεις για την επιτυχία της επέμβασης. Γενικά, η επιτυχής έκβαση της επέμβασης εξαρτάται από την καλή προεγχειρητική κατάσταση του ασθενούς με στόχο τον αποκλεισμό της ύπαρξης δευτερευουσών ρωγμών ή έλξεων του υαλοειδούς γύρω από τη ρωγμή και τη σωστή τοποθέτηση του προσωρινού μοσχεύματος στην επιλεχθείσα θέση κάτω από τον επιπεφυκότα 29. Στην προσπάθεια αντιμετώπισης της ρηγματογενούς αποκολλήσεως μπορεί να χρησιμοποιηθεί η έγχυση υαλουρονικού νατρίου (Healon) στον υπερχοριοειδικό χώρο, αντίστοιχα με τη ρωγμή. Με την προσωρινή αυτή υπερχοριοειδική πρόωση δημιουργείται μία παροδική αποκόλληση του χοριοειδούς που πωματίζει τη ρωγμή και συμβάλλει στην απορρόφηση του υπαμφιβληστροειδικού υγρού. Στα πλεονεκτήματα αυτής της επέμβασης συμπεριλαμβάνεται η αποφυγή των περισσοτέρων επιπλοκών των επισκληρικών μοσχευμάτων αλλά θα πρέπει να σημειωθεί ότι η επέμβαση αυτή είναι λεπτή και εγκυμονεί σοβαρούς κινδύνους αιμορραγίας από το χοριοειδή, γεγονότα που δικαιολογούν την περιριοσμένη διάδοσή της 29. Παράλληλα, χρησιμοποιήθηκαν παλαιότερα απορροφήσιμα εμφυτεύματα ζελατίνης τα οποία τοποθετούνταν ενδοσκληρικά και στη συνέχεια επισκληρικά με θετικά αποτελέσματα

47 Μία ακόμη τεχνική αντιμετώπισης της ρηγματογενούς αποκολλήσεως είναι η υαλοειδεκτομή σε συνδυασμό με τον εσωτερικό πωματισμό της ρωγμής με αέριο. Η συγκεκριμένη τεχνική εκτελείται με την από την pars plana παροχέτευση του υπαμφιβληστροειδικού υγρού κατά πρώτο χρόνο και το υαλοειδούς κατά δεύτερο (pars plana vitrectomy). Στη συνέχεια η υαλοειδική κοιλότητα πληρώνεται με μείγμα αερίου. Η απόλυτη ένδειξη της συγκεκριμένης τεχνικής είναι αποκολλήσεις που έχουν ως αιτία μεγάλες, πολλαπλές, οπίσθιες ρωγμές που λόγω της εντόπισής τους είναι δύσκολο να αντιμετωπισθούν με επισκληρικά μοσχεύματα 175. Στα πλεονεκτήματα της υαλοειδεκτομής όσον αφορά την τεχνική συμπεριλαμβάνονται η δυνατότητα χρήσης ενδοφωτισμού, μεγαλύτερης μεγέθυνσης μικροσκοπίου, συστημάτων ευρείας γωνίας αλλά και σκληρικής πρόωσης 164. Λόγω των παραπάνω διαθεσίμων δυνατοτήτων καθίσταται δυνατή η καλύτερη κατόπτευση του αποκολλημένου αμφιβληστροειδούς και η εντόπιση ακραία περιφερικών ρωγμών. Παράλληλα, η συγκεκριμένη τεχνική επιτρέπει την αφαίρεση θολεροτήτων του υαλοειδούς αλλά και μεμβρανών ενώ παρέχει τη δυνατότητα ενδοπωματισμού με τη χρήση βαρέων υγρών 164. Με την εφαρμογή των παραπάνω θεωρείται ότι μπορεί να αποφευχθούν επιπλοκές της τοποθέτησης επισκληρικών μοσχευμάτων όπως χοριοειδική αιμορραγία, τρώση και διάτρηση του αμφιβληστροειδούς και του σκληρού αλλά και διπλωπία (λόγω της παρέμβασης στη λειτουργία των εξωφθαλμίων μυών). Στα μειονεκτήματα της υαλοειδεκτομής συμπεριλαμβάνονται η αυξημένη συχνότητα ιατρογενών ρωγμών, αλλά και οι διεγχειρητικές βλάβες που μπορεί να προκληθούν στο φακό. Το παραπάνω γεγονός έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη συχνότητα πυρηνικών καταρρακτών μετεγχειρητικά που συνεπάγεται μυωπική εκτροπή, πτώση της οπτικής οξύτητας και απώλεια μεγάλου μέρους της δυνατότητας προσαρμογής. Τελικά, η πλειψηφία αυτών των ασθενών θα οδηγηθεί εκ νέου στο χειρουργείο για την αφαίρεση του καταρράκτη 164. Συμπερασματικά η υαλοειδεκτομή μπορεί να θεωρηθεί ιδανική σε περιστατικά με ρηγματογενείς αποκολλήσεις με οπίσθιες ρωγμές αλλά και σε σπάνιες περιπτώσεις αποκολλήσεων που οφείλονται σε οπή ωχράς 176. A.5. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜΡs) Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (Matrix Metalloproteinases-MMPs) αποτελούν μια πολυμελή οικογένεια ενδοπεπτιδασών με κοινή δράση την αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας. Τα ένζυμα αυτά φαίνεται ότι παίζουν καταλυτικό ρόλο σε μια ποικιλία φυσιολογικών καταστάσεων, όπως αναδιαμόρφωση ιστών, απόπτωση, εμβρυογένεση, ίαση τραυμάτων. Σε φυσιολογικές συνθήκες η δράση των μεταλλοπρωτεϊνασών 47

48 ελέγχεται από τους λεγόμενους ιστικούς αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases-ΤΙΜPs). Απώλεια ρύθμισης των μεταλλοπρωτεϊνασών από τους φυσιολογικά παραγόμενους αναστολείς τους έχει συνδεθεί με μία σειρά παθολογικών καταστάσεων όπως αθηροσκλήρυνση, αρθρίτιδα, νεοαγγειογένεση, καρκινογένεση και μετάσταση νεοπλασματικών κυττάρων. A.5.1. Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία στον αμφιβληστροειδή Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία (extracellular matrix-ecm) του αμφιβληστροειδούς διακρίνεται στις βασικές μεμβράνες (basement membranes) και τις μη-βασικές μεμβράνες (non-basement membranes). Όσον αφορά τις πρώτες, υπάρχουν τρεις βασικές μεμβράνες στον αμφιβληστροειδή: η μεμβράνη του Bruch, η έσω αφοριστική μεμβράνη και η βασική μεμβράνη που σχετίζεται με τα αγγεία του αμφιβληστροειδούς. Η θεμέλια ουσία της έσω αφοριστικής μεμβράνης αποτελείται κυρίως από λαμινίνες (laminins), ενώ κολλαγόνα τύπου IV και XVIII, περλεκάνη και αγρίνη συμμετέχουν σε μικρότερο ποσοστό 162,177. Οι λειτουργίες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας συνίστανται στην υποβοήθηση της αύξησης και ωρίμανσης των νευραξόνων 178,179, στη διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 180,181, καθώς και τον κυτταρικό θάνατο 182. Σε γενικές γραμμές, τα μακρομόρια της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ECM) είναι σημαντικά για τη δημιουργία και τη διατήρηση ενός κυτταρικού περιβάλλοντος που προωθεί την ανάπτυξη. Ένας αριθμός αλληλεπιδράσεων μεταξύ της εξωκυττάριας ουσίας και των κυττάρων αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την ομοιόσταση του αμφιβληστροειδούς 183. A.5.2. Κριτήρια υπαγωγής στην οικογένεια των μεταλλοπρωτεϊνασών Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας αποτελούν μία οικογένεια πρωτεϊνασών με σημαντικό ρόλο στην αναδιαμόρφωση της θεμέλιας ουσίας. Καθώς ο αριθμός των ανακαλυπτόμενων μεταλλοπρωτεϊνασών έχει αυξηθεί σημαντικά τα τελευταία χρόνια, έχουν θεσπιστεί ορισμένα κριτήρια για την ένταξη ενός συγκεκριμένου ενζύμου στη συγκεκριμένη οικογένεια 162, : 1. Ύπαρξη μορίου ψευδαργύρου στην καταλυτική περιοχή του ενζύμου. 2. Αναστολή από τους TIMPs. 48

49 3. Aποδόμηση τουλάχιστον ενός συστατικού της μεσοκυττάριας ουσίας. 4. Έκκριση σε πρόδρομη-ανενεργό-μορφή. 5. Αλληλουχία cdna ομόλογη με αυτή της κολλαγονάσης. A.5.3. Μοριακή δομή (Εικόνες 1, 2) Η δομή κάθε κατηγορίας των MMPs αποτελείται από ορισμένα από τα ακόλουθα μορφολογικά τμήματα, τα οποία είναι κοινά για όλα τα μέλη της. Ένας αριθμός των παρακάτω δομών απαντάται σε κάθε μία κατηγορία ΜΜΡs, π.χ. οι ματριλυσίνες έχουν μόνο τις 2, 3 και «Προ-πεδίο» (Pre-domain): ανάρρους περιοχή προ της κυρίως πρωτεΐνης (upstream) που σηματοδοτεί την έκκριση της πρωτεϊνάσης από το κύτταρο Πρόδρομο πεδίο (Pro-domain): περιοχή στο Ν-άκρο της πρωτεϊνάσης, μήκους περίπου 80 με 90 αμινοξέων. Η περιοχή αυτή παίζει αυτο-ανασταλτικό ρόλο αφού συνδέεται με το άτομο ψευδαργύρου (Zn) της καταλυτικής περιοχής που είναι υπεύθυνο για τη δράση του ενζύμου 188,189. Όταν το συγκεκριμένο πεπτίδιο αποκοπεί τότε το ένζυμο ενεργοποιείται 162, Καταλυτικό πεδίο (Catalytic domain): καταλυτική περιοχή η οποία περιέχει ένα άτομο Zn απαραίτητο για την καταλυτική δράση και ένα άτομο Zn για τη διατήρηση μιας σταθερής και λειτουργικής διαμόρφωσης 162. Η θέση της καταλυτικής περιοχής διαφέρει μεταξύ των διαφόρων μελών της οικογενείας, γεγονός που εξηγεί και τις διαφορές στα υποστρώματα. 4. Πεδίο ομοιάζον με την αιμοπηξίνη (Haemopexin-like domain): περιοχή στο C-άκρο της πρωτεϊνάσης που παίζει σημαντικό ρόλο στη σύνδεση με το υπόστρωμα και την αλληλεπίδραση με τους TIMPs 162,189, Διαμεμβρανικό πεδίο (Transmembrane domain): περιοχή χαρακτηριστική των μεμβρανικού τύπου μεταλλοπρωτεϊνασών απαραίτητη για την εγκατάσταση ενός συγκεκριμένου τμήματος της ΜΜΡ στην κυτταρική μεμβράνη «Διακόπτης κυστεΐνης» (Cysteine switch): στο πρόδρομο πεδίο βρίσκεται ένα υπόλειμμα κυστεΐνης που έχει τη δυνατότητα να συνδέεται με τον καταλυτικό Zn και να καθιστά το ένζυμο ανενεργό Kυτταροπλασματική «ουρά» (Cytoplasmic tail): περιοχή μήκους 25 υπολειμμάτων αμινοξέων που χρησιμοποιείται για τη σύνδεση του ενζύμου στην αντίστοιχη περιοχή της κυτταρικής μεμβράνης (για τις μεμβρανικές μεταλλοπρωτεϊνάσες)

50 Εικόνα 1. Σχηματική δομή μεταλλοπρωτεϊνασών Pro-domain: Πρόδρομο πεδίο Catalytic domain: Καταλυτικό πεδίο Haemopexin-like domain: Πεδίο ομοιάζον με την αιμοπηξίνη Transmembrane domain: Διαμεμβρανικό πεδίο Gelatin binding domain: Πεδίο σύνδεσης με τη ζελατίνη A.5.4. Παραγωγή Οι MMPs παράγονται από μία ποικιλία κυττάρων όπως λευκά (κυρίως πολυμορφοπύρηνα) αλλά και μακροφάγα ιστών 162,177, ινοβλάστες 177,193, επιθηλιακά κύτταρα 162,177, ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων 177 και αστροκύτταρα 194. Στον οφθαλμό παράγονται από τα κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου , μακροφάγα 162,177 και πολυμορφοπύρηνα 162. A.5.5. Κατηγοριοποίηση Η οικογένεια των μεταλλοπρωτεϊνασών αποτελείται, μέχρι στιγμής, από τουλάχιστον 28 μέλη όσον αφορά τον άνθρωπο 183. Με βάση το υπόστρωμα πάνω στο οποίο δρουν κατά κύριο λόγο, οι μεταλλοπρωτεϊνάσες διαχωρίσθηκαν σε κολλαγονάσες, ζελατινάσες, στρωμαλυσίνες, ματριλυσίνες, μεμβρανικού τύπου, ενώ υπάρχουν και κάποιες οι οποίες δεν έχουν ενταχθεί σε κάποια συγκεκριμένη κατηγορία 162,

51 Εικόνα 2. Τριασδιάστατη δομή μεταλλοπρωτεϊνασών 205. Α. Σύμπλεγμα prommp-2-timp-2. Πορτοκαλί: πρόδρομο πεδίο, πράσινο: καταλυτικό πεδίο, ροζ: πεδίο ινονεκτίνης, κόκκινο: πεδίο ομοιάζον με την αιμοπηξίνη, μπλε: ΤΙΜΡ-2. Άτομα ψευδαργύρου φαίνονται ροζ, άτομα ασβεστίου: γκρι. Β. Στο πρόδρομο πεδίο της ΜΜΡ-2 διακρίνεται ο «διακόπτης κυστεΐνης». Βέλος: η περιοχή της αρχικής αποκοπής που οδηγεί σε μερική ενεργοποίηση. C. Το καταλυτικό πεδίο της ΜΜΡ-1. D. Τα τρία πεδία ινονεκτίνης της ΜΜΡ-2. Ε. Το πεδίο ομοιάζον με την αιμοπηξίνη της ΜΜΡ-1. 51

52 1. Οι κολλαγονάσες (ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-8, ΜΜΡ-13, ΜΜΡ-18) αποδομούν κυρίως ινικά κολλαγόνα, που είναι περισσότερο ανθεκτικά στην πρωτεόλυση, σε μετουσιωμένα κολλαγόνα 177,184,190. Αυτή η δράση των κολλαγονασών καθιστά αυτά τα δομικά κολλαγόνα της θεμέλιας ουσίας περισσότερα δεκτικά σε αποδόμηση από τις υπόλοιπες μεταλλοπρωτεϊνάσες 199. Θεωρείται ότι έχουν δυνητικά την ισχυρότερη δράση. 2. Οι ζελατινάσες (ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9) ονομάζονται και κολλαγονάσες τύπου IV και σε αντίθεση με τις κολλαγονάσες αποδομούν μετουσιωμένα κολλαγόνα (ζελατίνες) και άλλα μη ινικά κολλαγόνα καθώς και τη βασική μεμβράνη 177,184, Οι στρωμαλυσίνες (MMP-3, ΜΜΡ-10, ΜΜΡ-11) έχουν ως κύριο υπόστρωμα πρωτεογλυκάνες, κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ, IV, V και IX καθώς και λαμινίνη 162,200,201, Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μεμβρανικού τύπου (membrane type MMPs ή MT-MMPs, ΜΜΡ-14 έως ΜΜΡ-17, ΜΜΡ-24, ΜΜΡ-25) αποδομούν κυρίως κολλαγόνα (I, II, III) και ζελατίνες, αλλά και έναν αριθμό μεταλλοπρωτεϊνασών. Κοινό χαρακτηριστικό τους η σύνδεσή τους με την κυτταρική μεμβράνη αφού, σε αντίθεση με τις υπόλοιπες μεταλλοπρωτεϊνάσες δεν είναι διαλυτές 185,186,187, Οι ματριλυσίνες (ΜΜΡ-7 ή ματριλυσίνη-1, ΜΜΡ-26 ή ματριλυσίνη-2 ή ενδομετάση) χαρακτηρίζονται από την έλλειψη στο μόριό τους του πεδίου του ομοιάζοντος με την αιμοπηξίνη. Αποδομούν ένα μεγάλο αριθμό συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας 203, Οι υπόλοιπες μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜΡ-12 ή μεταλλοελαστάση, ΜΜΡ-19, ΜΜΡ-20 ή εναμελυσίνη, ΜΜΡ-22, ΜΜΡ-23 ή cysteine array MMP, ΜΜΡ-26, ΜΜΡ-27, ΜΜΡ-28 ή επιλυσίνη) δεν είναι ενταγμένες σε κάποια ομάδα και αποδομούν ποικίλα συστατικά της θεμέλιας ουσίας 184,188,205,206,207. Το γεγονός ότι μία μεταλλοπρωτεϊνάση έχει ενταχθεί σε μία κατηγορία δε σημαίνει ότι αποδομεί αποκλειστικά ένα και μόνο υπόστρωμα. Αντίθετα, κάθε ένα μέλος της συγκεκριμένης οικογένειας χαρακτηρίζεται από πολλαπλά υποστρώματα. A.5.6. Ρύθμιση της έκφρασης των μεταλλοπρωτεϊνασών Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (με την εξαίρεση της ΜΜΡ-1 και του ΤΙΜΡ-2) δεν εκφράζονται συνεχώς σε φυσιολογικές συνθήκες στο κύτταρο 162. Η παραγωγή των ΜΜΡs προάγεται ως απάντηση σε εξωγενή ερεθίσματα, όπως 52

53 κυτταροκίνες, εστέρες φορβόλης αλλά και αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρων καθώς και μεταξύ κυττάρου και εξωκυττάριας ουσίας 162. Η ρύθμιση της έκφρασης των μεταλλοπρωτεϊνασών είναι μία πολύπλοκη διαδικασία, η οποία γίνεται σε 3 επίπεδα: κατά τη διάρκεια της μεταγραφής, μετά τη μεταγραφή καθώς και μετά την έκκρισή τους από τους φυσικούς αναστολείς τους 69. Σε πρώτο επίπεδο η ρύθμιση της έκφρασης των ΜΜΡs γίνεται κατά τη μεταγραφή των υπευθύνων γονιδίων 177. Για παράδειγμα, συγκεκριμένοι μεταγραφικοί παράγοντες (c-fos, c-jun) συνδέονται σε καθορισμένα σημεία των γονιδίων που κωδικοποιούν τις κολλαγονάσες και τις στρωμαλυσίνες επάγοντας με τον τρόπο αυτό την έκφρασή τους 208,209,210. Σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της μεταγραφής των MMPs παίζει ο μεταγραφικός παράγοντας ΑΡ-1. Ο συγκεκριμένος παράγοντας έχει μία ειδική περιοχή σύνδεσης πριν από τον προαγωγέα (promoter) στο 5 -άκρο του γονιδίου των ΜΜPs. Τα μέχρι τώρα στοιχεία καταλήγουν στο ότι είναι απαραίτητος για την έναρξη της μεταγραφής. Είναι δυνατό να ενεργοποιηθεί από μία ομάδα αυξητικών παραγόντων που περιλαμβάνει τον αυξητικό παράγοντα των αιμοπεταλίων (Platelet-Derived Growth Factor-PDGF), των ινοβλαστών (Fibroblast Growth Factor-FGF) και τoν επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (Epidermal Growth Factor-EGF) 184,211,212. Η θέση του βρίσκεται συνήθως στο εγγύς τμήμα του προ-πεδίου των γονιδίων των ΜΜΡs με εξαίρεση τα γονίδια υπεύθυνα για την ΜΜΡ-2 και την ΜΜΡ-11, των οποίων τα προ-πεδία δε βρίσκονται σε συνέχεια με τη θέση του ΑΡ-1 213,214. Παράλληλα με τα παραπάνω, ένας αριθμός παθογενετικών μηχανισμών σηματοδότησης οδηγούν στην έκφραση των γονιδίων ΜΜΡs. Η ενεργοποίηση του πυρηνικού μεταγραφικού παράγοντα ΝF-kB συμβάλλει στην προαγωγή της κυτταροκίνης IL-1, η οποία με τη σειρά της προάγει την έκφραση της ΜΜΡ-1. Η υπεριώδης ακτινοβολία φαίνεται ότι μπορεί να επηρεάσει την έκφραση των ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-3 και ΜΜΡ-9 μέσω της ενεργοποίησης ειδικών πρωτεϊνικών κινασών (JNK-2) 215. Επιπρόσθετα, η μεταγραφή προάγεται από παράγοντες στους οποίους συμπεριλαμβάνονται οι προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες (IL-1β, TNF-α). Οι μεταβολές των επιπέδων των ΜΜΡs μετά από την ενεργοποίησή τους από τις προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες έχουν ως αποτέλεσμα μία μεταβολή στην αναλογία ΜΜΡs και ΤΙΜΡs. Παράλληλα, οι συγκεκριμένες μεταβολές προωθούν την πρωτεόλυση των βασικών μεμβρανών και της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας στη στοιβάδα των φωτοϋποδοχέων 216. Οι παρατηρήσεις αυτές αναδεικνύουν το σημαντικό ρόλο της ρυθμιστικής δράσης των κυτταροκινών στην έκφραση των μεταλοπρωτεϊνασών. Γενικά η έκφραση των ΜΜΡs περιορίζεται από τη δράση των IL-4, IL-10, IL-13, TGF-β 162, ενώ αναστέλλεται από τους TNF-α, IL-1, TGF-β

54 Ειδικότερα, έχει δειχθεί ότι οι αυξητικοί παράγοντες έχουν ρυθμιστική δραστηριότητα όσον αφορά την έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών με παραδείγματα τον EGF, τον PDGF και τον αυξητικό παράγοντα μεταμόρφωσης-βήτα (Transforming Growth Factor-beta TGF-β). Θα πρέπει να αναφερθεί ότι η γονιδιακή έκφραση των ΜΜΡs μπορεί να κατασταλεί από ποικίλους παράγοντες όπως ο TGF-β, τα ανάλογα της βιταμίνης Α (ρετινοειδή) και τα γλυκοκορτικοειδή. Από τους αναφερθέντες αυξητικούς παράγοντες, τα τελευταία χρόνια ο TGF-β έχει γίνει αντικείμενο ευρύτατης μελέτης 162. Φαίνεται ότι έχει διττό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης των MMPs: αφ ενός αναστέλλει τη δράση τους και πιο συγκεκριμένα των κολλαγονασών και των στρωμαλυσινών (αναστέλλοντας με αυτό τον τρόπο την καταστροφή της μεσοκυττάριας ουσίας) και αφ ετέρου προάγει την έκφραση του ΤΙΜΡ Παράλληλα, έχει βρεθεί και συγκεκριμένη αλληλουχία στο 5 -άκρο του γονιδίου των μεταλλοπρωτεϊνασών για τη σύνδεση του TGF-β 162. Τα διαθέσιμα βιβλιογραφικά στοιχεία δείχνουν ότι κάποιες πρωτεΐνες της μεσοκυττάριας ουσίας (π.χ. ντεκορίνη) με τη μεσολάβηση των μεταλλοπρωτεϊνασών μετατρέπουν την πρόδρομη μορφή του TGF-β σε ενεργό και συμβάλλουν στην απελευθέρωσή του από «αποθήκες» στο συνδετικό ιστό 162. Συγκεκριμένα, ο TGF-β αναστέλλει την έκφραση της ΜΜΡ-3 μέσω του λεγόμενου ανασταλτικού στοιχείου του TGF-β, μιας ειδικής αλληλουχίας που βρίσκεται στο προ-πεδίο. Η αλληλουχία αυτή συνδέεται με ένα πυρηνικό πρωτεϊνικό σύμπλεγμα που περιέχει Fos. Η προαγωγή της έκφρασης του Fos απαιτείται για τη συγκεκριμένη αναστολή. Ανεξάρτητα από τα παραπάνω, φαίνεται ότι η παρουσία του ΑΡ-1 στο προαγωγό τμήμα των γονιδίων των ΜΜΡs είναι καθοριστική για αυτή τη δράση, παρά το γεγονός ότι ο καθένας από τους παραπάνω παράγοντες έχει τη σημασία του στην αναστολή της έκφρασης 213. Με δεδομένο το ρόλο του συγκεκριμένου αυξητικού παράγοντα καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι από ένα σημείο και μετά οι MMPs δρομολογούν την αναστολή τους. Σε δεύτερο χρόνο η ρύθμιση των ΜΜΡs γίνεται σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Η παραγωγή και η έκκριση των ΜΜΡ με τη μορφή των προενζύμων προάγεται με τη δράση ενός αριθμού φυσιολογικών ενεργοποιητών. Η δράση των ενεργοποιηθεισών ΜΜΡs από την άλλη πλευρά μπορεί να ρυθμιστεί από αναστολείς οι οποίοι συνδέονται στις ενεργές θέσεις τους και αναστέλλουν την καταλυτική τους δραστηριότητα. Παράλληλα, φαίνεται ότι πολλές ΜΜΡs μπορούν ενεργοποιήσουν άλλες ΜΜΡs. Τέλος, η ρύθμιση της δράσης των ΜΜΡs γίνεται και από τους φυσικούς αναστολείς τους (ΤΙΜΡs) όπως θα αναπτυχθεί και παρακάτω

55 A.5.7. Ενεργοποίηση Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μπορούν να ενεργοποιηθούν in vivo από πρωτεϊνάσες και in vitro από χημικές ουσίες όπως το ΑΡΜΑ (4-aminophenylmercuric acetate), ο διχλωριούχος υδράργυρος (HgCl 2 ), το SDS (sodium dodecylsulfate) 205. Το χαμηλό ph και η θέρμανση μπορούν επίσης να οδηγήσουν σε ενεργοποίηση 218. Η ενεργοποίηση των ΜΜΡs μπορεί να πραγματοποιηθεί με τη βήμα προς βήμα εξωκυττάρια ενεργοποίηση, την ενδοκυττάρια ενεργοποίηση και την ενεργοποίηση στην κυτταρική επιφάνεια 205. Η ενεργοποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών επέρχεται με τη διάσπαση της ανενεργού πρόδρομης μορφής τους 69. Η διαδικασία αυτή λαμβάνει χώρα στον εξωκυττάριο χώρο (με την εξαίρεση της ΜΜΡ-11 και των μεταλλοπρωτεϊνασών μεμβρανικού τύπου οι οποίες ενεργοποιούνται πριν από την έκκρισή τους) 162. Οι ενεργές μορφές είναι περισσότερο ασταθείς από τις πρόδρομες μορφές 69. Όπως έχει αποδειχθεί, οι μεταλλοπρωτεϊνάσες και κυριότερα οι μεμβρανικού τύπου παίζουν σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση άλλων μελών της οικογενείας τους. Οι τελευταίες δέχονται ερεθίσματα από διαφόρους υποδοχείς στην επιφάνεια του κυττάρου, ειδικότερα από αυτούς της ιντεγκρίνης 162. Από τις επί μέρους διαδικασίες ενεργοποίησης, η εξωκυττάρια ενεργοποίηση αφορά στις περισσότερες ΜΜΡs. Παράλληλα με την εξωκυττάρια ενεργοποίηση, παρατηρείται ενεργοποίηση και στην κυτταρική επιφάνεια. Έτσι για παράδειγμα, η ΜΜΡ-14 σε συνδυασμό με τον ΤΙΜΡ-2 ενεργοποιούν την prommp-2 219, η ΜΜΡ-3 ενεργοποιεί την prommp και το σύμπλεγμα prommp-9/τιμρ-1 σε συνδυασμό με την ΜΜΡ-3 ενεργοποιεί την MMP Η ενδοκυττάρια ενεργοποίηση των ΜΜΡs αφορά κυρίως τις ΜΤ- ΜΜΡs και την ΜΜΡ ,218. Οι παραπάνω ΜΜΡs διαθέτουν μία αλληλουχία αμινοξέων ανάμεσα στο προπεπτίδιο και το Ν-άκρο του καταλυτικού πεδίου, η οποία αναγνωρίζεται από την οικογένεια των σερινοπρωτεϊνασών και επιτρέπει την ενεργοποίησή τους στη συσκευή Golgi 222. Μετά τη συγκεκριμένη διαδικασία και με την ενεργό μορφή τους τα ένζυμα αυτά ανέρχονται στην κυτταρική επιφάνεια επιτρέποντας την ενεργοποίηση άλλων ΜΜΡs. Η ενεργοποίηση των MMPs στην επιφάνεια του κυττάρου, σε συνδυασμό με την εξωκυττάρια ενεργοποίηση τους, έχει το πλεονέκτημα ότι μεγιστοποιεί την πρωτεολυτική δράση του κυττάρου στο άμεσο περιβάλλον του 162. Όσον αφορά στην ιδιότητα πολλών ΜΜΡs να ενεργοποιούν άλλες ανενεργές ΜΜΡs πρέπει να επισημανθεί ότι αυτή αποτελεί ιδιότητα κυρίως των κολλαγονασών και των ζελατινασών 218. Για παράδειγμα η ΜΤ1-ΜΜΡ ενεργοποιεί την ΜΜΡ-13 και η ΜΜΡ-2 ενισχύει την παραπάνω ενεργοποίηση. Η ΜΤ1-ΜΜΡ, επίσης ενεργοποιεί την ΜΜΡ-2, η ΜΜΡ-10 την proμμρ-8, ενώ η ΜΜΡ-3 φαίνεται ότι διασπά τις πρόδρομες μορφές των 55

56 ΜΜΡ-1, -7, -9 και Η ενεργοποιημένη ΜΜΡ-7 μπορεί να ενεργοποιήσει τόσο την ΜΜΡ-1 όσο και την ΜΜΡ Από τα προαναφερθέντα παραδείγματα καταδεικνύεται η πολυπλοκότητα των αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στις ΜΜΡs η οποία υφίσταται ανάμεσα στη σύνθεση και την ενεργοποίηση των ΜΜΡs. Η διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ των ΜΜΡs και των ΤΙΜΡs έχει ως άμεσο αποτέλεσμα την ομοιόσταση των ιστών. A.5.8. Λειτουργία Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες εμπλέκονται σε μία πληθώρα καταστάσεων. Γενικά παίζουν ρόλο στην αναδιαμόρφωση (remodeling) της βασικής μεμβράνης και του συνδετικού ιστού, στη σύσπαση των ιστών εξαιτίας της βλάβης 223, στην νεοαγγείωση 177,224 αλλά και την αγγειογένεση γενικότερα 190,225, στην αύξηση του μεγέθους των νεοπλασιών και σε πιθανή μετάστασή τους 185,226,227. Η δράση των μεταλλοπρωτεϊνασών αποτελεί έναν σημαντικό παράγοντα στην παθογένεση πληθώρας ασθενειών όπως αθηροσκλήρυνση 228, αρθρίτιδα 229, καρδιακή ανεπάρκεια 230, οζώδης σκλήρυνση 231. Έχουν ενοχοποιηθεί ότι εμπλέκονται στην παθογένεια οφθαλμολογικών παθήσεων. Τέλος, σε μία λειτουργία τους ειδική για τον οφθαλμό, φαίνεται ότι εμπλέκονται στη διαδικασία γήρανσης του υαλοειδούς Σε κυτταρικό επίπεδο, η δράση των μεταλλοπρωτεϊνασών συνίσταται στην αποδόμηση συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και των βασικών μεμβρανών καθώς και την αναδιαμόρφωσή τους (remodelling) 69,235,236. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες χαρακτηρίζονται από αλληλοεπικαλυπτόμενα υποστρώματα δράσης, ενώ θεωρείται πιθανό η δράση πολλών μεταλλοπρωτεϊνασών να αντισταθμίζει την απώλεια ή τη μη παραγωγή ενός μέλους της οικογένειας 162,177,190. Συγχρόνως αποτρέπουν την εναπόθεση περίσσειας θεμέλιας ουσίας που είναι αποτέλεσμα αυτής της αναδιαμόρφωσης 200. Η αυξημένη παραγωγή μεταλλοπρωτεϊνασών μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη αποδόμησή της σε πρώτο στάδιο αλλά και αυξημένη παραγωγή και εναπόθεση της θεμέλιας ουσίας μεταγενέστερα 237. Οι παραπάνω δράσεις σε συνδυασμό με αυτή των αναστολέων τους είναι ενδεικτικές του σημαντικού ρόλου που παίζουν οι μεταλλοπρωτεϊνάσες στη διατήρηση της ομοιόστασης της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας 198,238. Επιπλέον, ως ένζυμα με πρωτεολυτικές ιδιότητες συμμετέχουν στην αποδόμηση άλλων πρωτεϊνασών, κυτταροκινών και πρωτεϊνών της κυτταρικής επιφάνειας 177. Μία ακόμη λειτουργία των μεταλλοπρωτεϊνασών αποτελεί και η πρωτεολυτική ενεργοποίηση παραγόντων όπως η ενεργοποίηση του TGF-β από την ΜΜΡ-9 ή του παράγοντα νεκρώσεως των όγκων-α (Tumor Necrosis Factor-α/TNF-α) 162,177. Η πρωτεολυτική αυτή δραστηριότητα εξαρτάται από τις διαθέσιμες 56

57 συγκεντρώσεις των μεταλλοπρωτεϊνασών αλλά και από τη σχέση αυτών με τις αντίστοιχες των ΤΙΜΡ Οι πρωτεολυτικοί μηχανισμοί ενεργοποίησης διευκολύνουν κρίσιμες αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρων, καθώς και μεταξύ κυττάρων και μεσοκυττάριας ουσίας. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις αποκαλύπτουν περιοχές των συγκεκριμένων μορίων οι οποίες δεν ήταν προηγουμένως προσβάσιμες 162. Τα προϊόντα αυτής της δράσης των μεταλλοπρωτεϊνασών είναι ενεργοποιημένα μόρια και έχουν ιδιότητες που το αρχικό μόριο δε διαθέτει 177. Οι μεταλοπρωτεϊνάσες συμμετέχουν στη μετάδοση μηνυμάτων με διττό τρόπο: αφενός με τη συμμετοχή στην απελευθέρωση ανενεργών μορίων μετάδοσης του σήματος και πρωτεϊνασών, αφετέρου με την ενεργοποίηση ενδοκυτταρίων καταρρακτών μετάδοσης σημάτων (intracellular transduction cascades) 162,177. Τέλος λαμβάνουν μέρος στη σύσπαση των κολλαγόνων, ιδιότητα που εξηγεί την εμπλοκή τους στη διαδικασία επούλωσης 224. Γενικότερα οι ΜΜΡs είναι σημαντικές για τη διατήρηση ενός φυσιολογικού ισοζυγίου παραγωγής και αποδόμησης της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας 69. Το γεγονός αυτό επιτυγχάνεται με την ύπαρξη μίας ισορροπίας παραγωγής, ενεργοποίησης και αναστολής μεταξύ των ΜΜΡs και των αναστολέων τους 162,239. Αυτή η ισορροπία καθορίζει την τελική μορφολογία και ποσότητα συστατικών της θεμέλιας ουσίας, όπως το κολλαγόνο και η ελαστίνη 234,240. Από τα παραπάνω είναι προφανές ότι η διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ ΜΜΡs και ΤΙΜΡs είναι καθοριστική για την ομοιόσταση του κυττάρου και της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και ότι πιθανή περίσσεια μεταλλοπρωτεϊνασών έναντι των αναστολέων τους είναι δυνατό να οδηγήσει σε εκτεταμένη καταστροφή ιστών 69. Ο ακριβής χρόνος της δράσης των μεταλλοπρωτεϊνασών δεν είναι επακριβώς καθορισμένος. Φαίνεται όμως ότι η δράση τους εκδηλώνεται στα πρώιμα στάδια μίας νόσου αλλά οι ΜΜΡs είναι πιθανό να λαμβάνουν μέρος και σε μεταγενέστερο στάδιο στη διαδικασία της επούλωσης 162. Συνεπώς η ενδογενής αναστολή τους γίνεται κατά τη διάρκεια αυτών ακριβώς των πρωίμων σταδίων 162. Αυτή η απώλεια ισορροπίας έχει συνδεθεί με παθολογικές καταστάσεις όπως σε φλεγμονώδεις αντιδράσεις 241,242, στη διαδικασία επούλωσης 243, στη δημιουργία ιστικών βλαβών 240, στη μετάσταση νεοπλασμάτων 226, στη αγγειογένεση 244. Όπως περιγράφηκε παραπάνω, μία βασική λειτουργία των ΜΜΡs είναι η αποδόμηση των συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και η απομάκρυνση των προϊόντων αυτής της αποδόμησης. Η θεμέλια ουσία, όμως, δεν είναι απλά ένας εξωκυττάριος σκελετός αφού αποτελεί και μία δεξαμενή βιολογικά ενεργών μορίων, όπως αυξητικών παραγόντων 245. Κάποια συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας μπορεί να εκφράσουν σε πρώτο στάδιο μη εκδηλωθείσες βιολογικές λειτουργίες κατά τη διάρκεια της πρωτεόλυσης. Κατά συνέπεια, η αποδόμηση των συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, μπορεί να μεταβάλει κυτταρικές συμπεριφορές, 57

58 αλλά και κλινικές εκδηλώσεις 205. H πληθώρα βιολογικών λειτουργιών των μεταλλοπρωτεϊνασών οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η δράση τους είναι πολύ πιο πολύπλοκη και έμμεση από απλή αποδόμηση. Τα παραπάνω σε συνδυασμό με το συνεχώς αυξανόμενο αριθμό πρωτεϊνών που δεν είναι συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας αλλά αποτελούν υπόστρωμα των ΜΜΡs καθιστούν φανερή την πολυπλοκότητα του ρόλου των ΜΜΡs σε φυσιολογικές αλλά και παθολογικές καταστάσεις 246. A.6. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες στην αποκόλληση Στη μελέτη μας συμπεριελήφθησαν οι ΜΜΡ-1, -2, -3, -8, -9 καθώς και ο ΤΙΜΡ-1. Ειδικότερα: A.6.1. ΜΜΡ-1 Η ΜΜΡ-1 ανήκει στην ομάδα των κολλαγονασών. Εναλλακτικά της ονόματα: κολλαγονάση-1 (collagenase-1), κολλαγονάση ινοβλαστών (fibroblast collagenase) και κολλαγονάση του ενδιαμέσου χώρου (interstitial collagenase). Παράγεται από ινοβλάστες, μακροφάγα, κερατοκύτταρα, χονδροκύτταρα και κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου 200. Τα υποστρώματά της περιλαμβάνουν κυρίως τα κολλαγόνα (τύπου I, II, III, VII, VIII, X) 247,248 αλλά και τη ζελατίνη (gelatin), την εντακτίνη (entactin), την αγκρεκάνη (aggrecan), τη βερσικάνη (versican), την L-σελεκτίνη (L-selectin), την τενασίνη-c (tenascin-c), την πρωτεΐνη σύνδεσης της πρωτεογλυκάνης, την α 1 -αντιθρυψίνη, την α 1 -αντιχυμοθρυψίνη, την ιντερλευκίνη 1β (IL-1β). Η ΜΜΡ-1 είναι δυνατό να έχει ως υποστρώματα και τις ΜΜΡ-2 και -9. Έχει ανιχνευθεί στο φυσιολογικό αμφιβληστροειδή, όπου είναι πιθανό να έχει ένα φυσιολογικό ρόλο στην αποδόμηση των αποπίπτωντων άκρων (tips) των φωτουποδοχέων 237. Όπως έχει αποδειχθεί, αυξημένη παραγωγή της ΜΜΡ-1 οδηγεί σε αυξημένη αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας (ECM) 199. Oι κολλαγονάσες φαίνεται ότι έχουν ένα κοινό και ειδικό ρόλο: αποδομούν ινικά κολλαγόνα του εξωκυττάριου χώρου, ώστε αυτά να είναι πιο εύκολα αποδομήσιμα από άλλες μεταλλοπρωτεΐνάσες 199. Ο ρόλος της ΜΜΡ-1 φαίνεται ότι είναι ευρύς και συμπεριλαβάνει τη ρύθμιση κυτταροκινών και συμμετοχή σε καταρράκτες ενζύμων. Η ρύθμιση της παραγωγής της γίνεται από τον TGF-β, τον ΕGF, τον TNF-α, την ιντερλευκίνη-1β (Il-1β) καθώς και από γεγονότα τα οποία συμβαίνουν στην επιφάνεια του κυττάρου, όπως φαγοκυττάρωση

59 A.6.2. ΜΜΡ-2 Η ΜΜΡ-2 ανήκει στην ομάδα των ζελατινασών. Εναλλακτικά ονόματά της: ζελατινάση Α, (gelatinase A), ζελατινάση 72 kda (72 kda gelatinase) και ουδετερόφιλη ζελατινάση (neutrophil gelatinase). Εκκρίνεται με την πρόδρομη, μη ενεργό μορφή της (72 kda) ενώ μετά την ενεργοποίησή της είναι ελαφρώς μικρότερη (65 kda) 195. Στα κύρια υποστρώματά της συμπεριλαμβάνονται η ζελατινάση και τα κολλαγόνα τύπου I, ΙΙ, ΙΙΙ, IV, V, VII, X, XI, XIV 235,236,239,253,254. Άλλα υποστρώματα της ΜΜΡ-2 αποτελούν η ελαστίνη, η ινονεκτίνη (fibronectin), η αγκρεκάνη, η λαμινίνη (laminin), η ντεκορίνη, η βερσικάνη, η γκαλεκτίνη (galectin), η πρωτεΐνη σύνδεσης της πρωτεογλυκάνης, η α 1 -αντιθρυψίνη, η ιντερλευκίνη-1β και ο FGF. Γενικότερα, η ΜΜΡ-2 είναι δυνατό να εμπλέκεται σε παθολογικές διεργασίες όπως το οίδημα, η αιμορραγία και η αγγειογένεση 255. Ο TGF-β φαίνεται ότι προάγει αποτελεσματικά την ΜΜΡ-2, ενώ μοιράζεται τον παραπάνω ρόλο με τον TNF-α και την IL-1β 216,249,250,251. Η διαδικασία έχει διάρκεια μεγαλύτερη των πέντε ωρών 247. Αντίθετα, η παραγωγή της ΜΜΡ-2 φαίνεται ότι αναστέλλεται από την ιντερφερόνη-γ 216. A.6.3. ΜΜΡ-3 Η ΜΜΡ-3 ανήκει στην ομάδα των στρωμαλυσινών. Εναλλακτικά ονόματά της: στρωμαλυσίνη-1 (stromelysin-1), τρανσίνη (transin). Παράγεται από κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου, ινοβλάστες, κερατινοκύτταρα, χονδροκύτταρα, οστεοκύτταρα, λείες μυϊκές ίνες αγγείων και μακροφάγα 216. Εκκρίνεται από τα παραπάνω κύτταρα ως προένζυμο και με αυτή τη μορφή φαίνεται ότι μπορεί να συμβάλλει στην ενεργοποίηση του πλασμινογόνου 256. Υποστρώματα της ΜΜΡ-3 αποτελούν τα κολλαγόνα (τύπου ΙΙΙ, IV, V, IX), η ζελατίνη, η ελαστίνη, η ινονεκτίνη, λαμινίνη, η αγκρεκάνη, η βερσικάνη, η πρωτεΐνη σύνδεσης της πρωτεογλυκάνης, η περλεκάνη (perlecan), η καζεΐνη (casein), η ντεκορίνη, η εντακτίνη, η τενασίνη-c, η IL-1β, η αντιθρομβίνη ΙΙΙ, η α 1 -αντιθρυψίνη, η α 1 -αντιχυμοθρυψίνη, το πλασμινογόνο, το ινωδογόνο, η ινική και η οστεονεκτίνη (osteonectin). Από τις υπόλοιπες μεταλλοπρωτεϊνάσες, μπορεί να έχει ως υπόστρωμά της τις prommp-1, ΜΜΡ- 7, -8, -9, -13 καθώς και το σύμπλεγμα ΜΜΡ-2/ΤΙΜΡ-2 247,236. Φαίνεται ότι παίζει ρόλο στην ενεργοποίηση του TNF-α 200,223,237 αλλά και στη φυσιολογική ομοιόσταση της θεμέλιας ουσίας καθώς και στην παθολογική καταστροφή ιστών. Η ρύθμιση της παραγωγής της γίνεται από τους TGF-β, TNF-α και την IL-1β 216,249,250,

60 A.6.4. ΜΜΡ-8 Η ΜΜΡ-8 ανήκει στην ομάδα των κολλαγονασών. Εναλλακτικά της ονόματα είναι κολλαγονάση-2 (collagenase-2) και ουδετερόφιλη κολλαγονάση (neutrophil collagenase). Παράγεται από πολυμορφοπύρηνα και ενδοθηλιακά κύτταρα 199. Τα πολυμορφοπύρηνα έχουν σημαντικό ρόλο στη φαγοκυττάρωση. Όσον αφορά στα υποστρώματά της μοιράζεται κάποια με τις υπόλοιπες κολλαγονάσες αφού, όπως έχει προαναφερθεί, υπάρχει σημαντικός βαθμός αλληλοεπικάλυψης μεταξύ τόσο των μελών μίας ομάδας μεταλλοπρωτεϊνασών όσο και με άλλα μέλη της ευρύτερης οικογένειας. Έτσι, στα υποστρώματα της ΜΜΡ-8 συμπεριλαμβάνονται τα κολλαγόνα τύπου I, II, III, V, VII, VIII, X, η ζελατίνη, η ινονεκτίνη, η α 2 -αντιπλασμίνη, η αγκρεκάνη, η α 1 -αντιθρυψίνη και η α 1 -αντιχυμοθρυψίνη. Είναι αξιοσημείωτο ότι δεν εκκρίνεται άμεσα, αλλά αποθηκεύεται σε κοκκία μακροφάγων και ουδετερόφιλων κοκκίων, μία ιδιότητα που μοιράζεται με την ΜΜΡ Η απελευθέρωση της ΜΜΡ-8 από τα κοκκία μπορεί να επιτευχθεί υπό τη επίδραση των IL-1 και -8, TNF-α και GM-CSF. Aυξημένη παραγωγή ΜΜΡ-8 συνεπάγεται αυξημένη αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας. Αποδομεί κολλαγόνα στον εξωκυττάριο χώρο ώστε να τα καταστήσει περισσότερο δεκτικά στη δράση άλλων μεταλλοπρωτεϊνασών 199. Γενικά, η ΜΜΡ-8 αποτελεί ένζυμο κλειδί, με σημαντικό ρόλο κατά την έναρξη της αποδόμησης της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας σε παθολογικές καταστάσεις, όπως η φλεγμονή, οστεοαρθρίτιδα και ρευματοειδής αρθρίτιδα 258. A.6.5. ΜΜΡ-9 Η ΜΜΡ-9 ανήκει στην ομάδα των ζελατινασών. Η ΜΜΡ-9 (ή ζελατινάση B gelatinase B) εκκρίνεται σε μία πρόδρομη μορφή (92 kda) και αφού εκταμεί τμήμα της προκύπτει η ενεργός μορφή (79 kda) 195. Όσον αφορά στη δομή της αναφέρεται ότι υπάρχουν συγκεκριμένες περιοχές της οι οποίες πιθανώς να χρησιμεύουν για την περαιτέρω προαγωγή της δράσης της από κυτταροκίνες 247. Παράγεται από κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου, μακροφάγα, αστροκύτταρα και Τ-λεμφοκύτταρα 259. Μετά την παραγωγή της, όπως και η ΜΜΡ-8, δεν εκκρίνεται άμεσα αλλά αποθηκεύεται σε κοκκία μακροφάγων και ουδετερόφιλων κοκκίων 257. Τα κύρια υπόστρωματά της είναι η ζελατίνη και τα κολλαγόνα τύπου IV, V, VII, X, XIV. Παράλληλα, η ΜΜΡ-9 μπορεί να αποδομήσει ελαστίνη, ινονεκτίνη, αγκρεκάνη, εντακτίνη, βερσικάνη, γκαλεκτίνη, πρωτεΐνη σύνδεσης της πρωτεογλυκάνης, α 1 -αντιθρυψίνη, ιντερλευκίνη-1β και πλασμινογόνο. Τέλος, παίζει ρόλο σε μία πληθώρα ασθενειών (ρευματοειδής αρθρίτις, οστεοαρθρίτις, φλεγμονώδεις νευρολογικές ασθένειες, μετάσταση καρκινικών κυττάρων, αθηροσκλήρωση) 259. Σε σύγκριση με το άλλο μέλος της ομάδας των ζελατινασών, την ΜΜΡ-2, μπορεί να εμπλέκεται σε περισσότερο οξείες κατα- 60

61 στάσεις 260, γεγονός που επιβεβαιώνεται από την παρατήρηση ότι απελευθερώνεται σε διάστημα λίγων ωρών σε αντίθεση με την ΜΜΡ-2, η οποία ελευθερώνεται σε διάστημα 3-4 ημερών 200. Η επαγωγή της ρύθμισής της γίνεται από τους TGF-β, TNF-α και την IL-1β A.7. Οι αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών (ΤΙΜΡs) Όπως έχει αναφερθεί, κεφαλαιώδη ρόλο στη δράση των μεταλλοπρωτεϊνασών παίζει η ισορροπία μεταξύ αυτών και των ενδογενών αναστολέων τους, των ΤΙΜΡs. Η απώλεια αυτής της ισορροπίας προς όφελος των MMPs έχει ως αποτέλεσμα την αλόγιστη δράση τους σε έναν αριθμό παθολογικών καταστάσεων. Η έκφραση των ειδικών για τους ΤΙΜΡs γονιδίων εξαρτάται από τη φύση του ερεθίσματος που θα δεχθούν 162. Οι ενδογενείς αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών είναι μικρά μόρια (22-30 kda) 277 τα οποία ανιχνεύονται στους περισσότερους ιστούς και βιολογικά υγρά. Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωρισθεί τέσσερις ισομορφές στον άνθρωπο: TIMP-1, -2, -3, , Αναστέλλουν όλες τις ΜΜΡs με την εξαίρεση του ΤΙΜΡ-1 που δεν μπορεί να αναστείλει την ΜΜΡ A.7.1. Δομή Η δομή των τεσσάρων αναστολέων των μεταλλοπρωτεϊνασών έχει ορισμένα κοινά χαρακτηριστικά. Και οι τέσσερις ισομορφές των ΤΙΜΡs προέρχονται από διαφορετικά γονίδια. Όσον αφορά λοιπόν στην πρωτοταγή τους δομή, οι ΤΙΜΡs παρουσιάζουν πολλές ομοιότητες μεταξύ τους, ενώ αντίθετα περισσότερες διαφορές υπάρχουν μεταξύ των ΤΙΜΡs στην τριτοταγή τους δομή 268. Όλες οι ΜΜΡs έχουν 12 διατηρημένα κυστεϊνικά υπολείμματα και ένα αμινοτελικό άκρο, απαραίτητα για την ανασταλτική δραστηριότητα των ΤΙΜΡs 269. Η ανάλυση των κρυσταλλικών δομών των ΤΙΜΡ-1 και -2 δείχνει ότι τα μόρια αυτά μοιράζονται ένα κοινό σχέδιο τοπολογίας. Για παράδειγμα οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες διπλώνονται σε δύο διαφορετικά αντίθετα ίσα τμήματα, τα οποία περιέχουν Ν- και C-τομείς. Σε γενικές γραμμές, διαθέτουν κατά 30-40% ομόλογες αλληλουχίες σε επίπεδο αμινοξέων και δύο περιοχές σύνδεσης (binding sites). Αυτές διατηρούν τη διαμόρφωση των ΤΙΜΡs στο χώρο με τη βοήθεια 6 δισουλφιδικών δεσμών και είναι υπεύθυνες η πρώτη για την αναστολή των ΜΜΡs και η δεύτερη για τη σύνδεση με τις πρόδρομες μορφές των ΜΜΡs καθώς και τον έλεγχο της ενεργοποίησής τους 162,270,271. Ο ΤΙΜΡ-3 φαίνεται ότι παρουσιάζει διαφορετικές αλληλουχίες από τους ΤΙΜΡ-1 και -2 αλλά διατηρεί τους δισουλφιδικούς δεσμούς και αποτελεί έναν αποτελεσματικό αναστολέα των ΜΜΡs. Ο ΤΙΜΡ-4 πα- 61

62 ρουσιάζει ταύτιση αλληλουχίας με τους ΤΙΜΡ-2 και -3 σε ποσοστό 50% και με τον ΤΙΜΡ-1 σε ποσοστό 30% 270. Αυτές οι δομικές διαφορές αλλά και η δυνατότητά τους να αναστέλλουν περισσότερες της μίας ΜΜΡ υποδεικνύει ότι μοιράζονται συγκεκριμένες ιδιότητες 268. To N-άκρο του μορίου των ΤΙΜΡs είναι και αυτό απαραίτητο για την αναστολή των μεταλλοπρωτεϊνασών 268. Οι ΤΙΜΡ-1 και -2 είναι διαλυτοί και ανιχνεύονται ευρέως στον οργανισμό. Ο ΤΙΜΡ-3 ανιχνεύεται κυρίως στη εξωκυττάρια θεμέλια ουσία και ο ΤΙΜΡ-4 φαίνεται ότι περιορίζεται στον καρδιακό ιστό 272. Οι παραπάνω παρατηρήσεις μπορεί να υπαινίσσονται την ύπαρξη μοναδικών λειτουργιών για κάθε έναν ΤΙΜΡ, γεγονός που μένει να αποδειχθεί 268. A.7.2. Παραγωγή Παράγονται από μία ποικιλία κυττάρων με κυριότερα τα κύτταρα του μελάχρου επιθηλίου, ινοβλάστες και κύτταρα του αγγειακού ενδοθηλίου 236, 235,273. A.7.3. Λειτουργία Η βασική λειτουργία των αναστολέων των μεταλλοπρωτεϊνασών συνίσταται κυρίως στον περιορισμό της δράσης των μεταλλοπρωτεϊνασών καθώς και στην αναστολή τους 200, Κάθε ΜΜΡ μπορεί να ανασταλεί από τους ΤΙΜΡ-1, -2 και ,271,277. Γενικά, οι ΤΙΜΡs είναι εκλεκτικοί για τις ΜΜΡs γενικά, αλλά δεν υπάρχει συγκεκριμένη εκλεκτικότητα ενός ΤΙΜΡs για τις ΜΜΡs. Κάθε αναστολέας επιδεικνύει διαφορετική εκλεκτικότητα για τις επι μέρους ΜΜΡs 278, πρακτικά όμως υπάρχουν μόνο μικρές διαφορές μεταξύ των ΤΙΜΡs όσον αφορά στην ειδικότητα του υποστρώματος 162. Παρά το γεγονός ότι οι όλοι οι ΤΙΜΡs συνδέονται με τις περισσότερες ΜΜΡs, έχουν αναφερθεί ορισμένες διαφορές στις ανασταλτικές τους ιδιότητες. Έτσι, οι ΤΙΜΡ-2 και -3 είναι αποτελεσματικοί αναστολείς των ΜΤ- ΜΜΡs, ιδιότητα που δε διαθέτει ο ΤΙΜΡ Η ανασταλτική τους δραστηριότητα οφείλεται στη δυνατότητά τους για σύνδεση με την ενεργή μορφή των ΜΜΡ. Η αναστολή των ΜΜΡs επιτυγχάνεται με τη δημιουργία ενός μη-ομοιοπολικού δεσμού μεταξύ ενός μορίου ΜΜΡ με ένα μόριο ΤΙΜΡ (στοιχειομετρική αναλογία 1:1) 162. Τα παραπάνω συμπλέγματα μπορούν να παραμείνουν ενεργά, αλλά δεν έχουν την ίδια δραστηριότητα με τις μη σύμπλοκες ΜΜΡs. Επιπρόσθετα, πρέπει να αναφερθεί ότι οι ΤΙΜΡs διαθέτουν πρόσθετες λειτουργίες, ανεξάρτητες της αναστολής των ΜΜΡs, όπως η διαφοροποίηση των κυττάρων, η απόπτωση 270 και η επαγωγή της αύξησης σε μία ποικιλία κυττάρων 255,280. Aξιοσημείωτο είναι ότι μπορεί να έχουν προαποπτω- 62

63 τική (ΤΙΜΡ-3) αλλά και αντιαποπτωτική δραστηριότητα (ΤΙΜΡ-1 και 2) 268,281,282. Άλλες λειτουργίες τους συμπεριλαμβάνουν την εμπλοκή τους στην αναστολή της αγγειογένεσης 283, την ωρίμανση των όρχεων 284, την ωορρηξία 285 και την παραγωγή των στεροειδών 284. Σημαντική παρατήρηση είναι και ότι ελαττώνουν την αύξηση των όγκων 272. Σε μία ενδιαφέρουσα παρατήρηση, ο ΤΙΜΡ-4 ανιχνεύθηκε μόνο σε καρκινικά κύτταρα και φαίνεται ότι είναι υπεύθυνος για την τροποποίηση ενεργοποίησης της κυτταρικής επιφάνειας από την ΜΜΡ-2, γεγονός που υποδηλώνει το ρόλο του ως ειδικού ιστικού ρυθμιστή στην αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας 278. Παρόλο που μία πληθώρα κυττάρων συνθέτουν ΤΙΜΡs, λίγα είναι γνωστά για τη φυσιολογική ρύθμισή τους in vivo. In vitro, η δραστηριότητά τους μπορεί να επιταθεί μετά από χορήγηση κορτικοστεροειδών, αυξητικών παραγόντων (TGF-β, FGF), IL-1β και ρετινοειδών. Όπως έχει προαναφερθεί, σε φυσιολογικές συνθήκες υφίσταται μία δυναμική ισορροπία μεταξύ της ενεργού μορφής των μεταλλοπρωτεϊνασών και των αναστολέων τους 162. Ο παραπάνω ανασταλτικός ρόλος των ΤΙΜΡs έχει ως αποτέλεσμα τον περιορισμό της έκτασης της αποδόμησης της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας κατά τη διάρκεια των διαδικασιών αναδιαμόρφωσης (remodelling) των ιστών σε φυσιολογικές συνθήκες 200, Η ισορροπία αυτή είναι κεφαλαιώδης για την ομοιόσταση, καθώς η απώλειά της, δηλαδή η περίσσεια της πρωτεάσης έναντι του αναστολέα, μπορεί να οδηγήσει σε εκτεταμένη καταστροφή ιστών 69. Ομοίως αυξημένη παραγωγή ΤΙΜΡs είναι δυνατό να οδηγήσει σε αυξημένη εναπόθεση εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, με αποτέλεσμα τη διαταραχή της ομοιόστασης 237. H απώλεια αυτής της δυναμικής ισορροπίας μεταξύ των ΜΜΡs και των αναστολεών τους αποτελεί έναν παράγοντα στην παθογένεση μίας πλειάδας νοσολογικών οντοτήτων, όπως αθηροσκλήρυνση 228, αρθρίτις 229, νεοαγγειογένεση 230, καρδιακή ανεπάρκεια 231, οζώδης σκλήρυνση 287, καρκινογένεση 286 και μεταστάσεις νεοπλασματικών κυττάρων 288. A.8. Οι αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών στην αποκόλληση A.8.1. ΤΙΜΡ-1 Ο ΤΙΜΡ-1 είναι ένας φυσικός ιστικός αναστολέας των μεταλλοπρωτεϊνασών. Αποτελεί μία πολυλειτουργική πρωτεΐνη με επιπλέον δραστηριότητες εκτός από αυτές της αναστολής των ΜΜΡs. Ο ΤΙΜΡ-1 περιγράφηκε αρχικά ως ένας δυνητικός παράγοντας ερυθροποίησης, ενώ άλλοι ερευνητές έδειξαν ότι ενεργοποιεί τη στεροειδογένεση και προάγει την κυτταρική διαφοροποίηση. Είναι ένα μόριο μικρού μοριακού βάρους (29 kda) 289 με 63

64 δράση ομοιάζουσα αυτή των αυξητικών παραγόντων 237. Στον οφθαλμό, παράγεται από κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου 216. Η κύρια δράση του συνίσταται στην αναστολή της δράσης των ΜΜΡ-1 και 3, η οποία γίνεται σε αναλογία ένα προς ένα μόριο, ενώ ένα επιπρόσθετο μόριο είναι απαραίτητο για τη πλήρη καταστολή της πρωτεόλυσης της εξωκυττάριας ουσίας 69,290. Επίσης, αναστέλλει τη δράση της ΜΜΡ-2 και 9 με τη σύνδεσή του στην ενεργό περιοχή, ενώ ο ΤΙΜΡ-2 σταθεροποιεί το μόριο 69,290. Επιπρόσθετα, έχει ρόλο σε παθολογικές καταστάσεις, όπως αρθρίτις και μετάσταση, αλλά και σε φυσιολογικές καταστάσεις όπως η ερυθροποίηση, μία ιδιότητα ανεξάρτητη από την ανασταλτική του δράση στις ΜΜΡs 291. Αναστέλλει την αγγειογένεση 237 και καταστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων, διαδικασία που αποτελεί προϋπόθεση για την αναδιαμόρφωση των ιστών κατά την PVR. Η επαγωγή της παραγωγής του γίνεται από τον TGF-β 212. A.9. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες σε παθήσεις του οφθαλμού A.9.1. Ο ρόλος των ΜΜΡs στην επούλωση H διαδικασία της επούλωσης χαρακτηρίζεται από αιμόσταση, επανεπιθηλιοποίηση, δημιουργία κοκκιώδους ιστού και αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας 162. Το τραύμα έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία μίας προσωρινής εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, η οποία αποτελεί το πλαίσιο για τη μετανάστευση κυττάρων με τη χρήση πρωτεολυτικών και ινωδολυτικών ενζυμικών συστημάτων 292. Η βιβλιογραφία που αφορά στο ρόλο των ΜΜΡs στην επούλωση στον οφθαλμό είναι εξαιρετικά περιορισμένη 195,293. Πιο συγκεκριμένα, ανευρέθησαν ζελατινάσες σε δάκρυα ασθενών με έγκαυμα και έλκος κερατοειδούς 294. Επιπρόσθετα, φαίνεται ότι έχουν ρόλο κατά τη διαδικασία επούλωσης του κερατοειδούς 295. Tα διαθέσιμα στοιχεία προέρχονται κυρίως από μελέτες σε κύτταρα του δέρματος. Η προαναφερθείσα μετανάστευση των κυττάρων από τις βασικές μεμβράνες προς την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία προκαλεί τη μεταγραφή των ΜΜΡ-1, -9 και -10, ενώ παρακείμενοι προς την πληγή ιστοί εκφράζουν την ΜΜΡ Η ΜΜΡ-1 κυρίως έχει το ρόλο της μετουσίωσης των κολλαγόνων, γεγονός που αποκαλύπτει περιοχές της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, οι οποίες προωθούν τη μετανάστευση. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας της επούλωσης, η έκφραση της ΜΜΡ-1 καταστέλλεται, ενώ παράλληλα οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ της βασικής μεμβράνης και των κυττάρων που μετανάστευσαν παγιοπούνται. Αυτό επιτυγχάνεται με την ανάπυξη ημιδεσμοσωματίων μεταξύ των κυττάρων σε ένα πλαίσιο που προσφέρει η αναδιαμορφωμένη εξωκυττάρια θεμέλια ουσία 297. Έτσι, φαίνεται ότι η φυσιολογική διαδικασία της επούλωσης συνοδεύεται 64

65 από μία προσωρινή αύξηση της δράσης των ΜΜΡs. Υπάρχουν όμως ειδικά σήματα που ελαττώνουν την παραγωγή των ΜΜΡs με το πέρας της προκαθορισμένης διαδικασίας. Τα αυξημένα επίπεδα ΜΜΡs που έχουν καταγραφεί σε χρόνια έλκη μπορούν να αποδωθούν και στην έλλειψη αυτών των ειδικών σημάτων. Τα αυξημένα επίπεδα των ΜΜΡs είναι, κατά συνέπεια, μία πρώτη ένδειξη ανεπαρκούς επούλωσης ενώ η μη ελεγχόμενη δραστηριότητα των ΜΜΡs μπορεί να προκαλέσει περαιτέρω βλάβες 298. Πρόσφατες μελέτες σε κερατινοκύτταρα έδειξαν ότι οι ΤΙΜΡ-1 και -3 βρέθηκαν σε βλάβες που χαρακτηρίζονταν από φυσιολογική διαδικασία επούλωσης ενώ αντίθετα δεν ανιχνεύθηκαν σε χρόνιες βλάβες 299. Το γεγονός αυτό μπορεί να συμβάλλει στην περίσσεια πρωτεολυτική δραστηριότητα και στην αδυναμία επούλωσης. A.9.2. Ο ρόλος των ΜΜΡ σε παθήσεις του οφθαλμού Οι ΜΜΡs έχουν ανιχνευθεί σε όλους τους οφθαλμικούς ιστούς σε παθολογικές καταστάσεις ενώ ένας αριθμός τους έχει ανιχνευθεί και σε φυσιολογικές καταστάσεις, όπως η επούλωση 300. Πιο συγκεκριμένα, οι ΜΜΡs έχουν ανιχνευθεί στον κερατοειδή σε περιπτώσεις ελκώδους κερατίτιδας 301, κερατόκωνου 302, πτερυγίου 303 και οιδήματος κερατοειδούς 304. Ειδικότερα, φαίνεται ότι οι ΜΜΡs παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια του πτερυγίου αφού κύτταρα του σκληροκερατοειδούς ορίου (limbus) που συμμετείχαν στη δημιουργία πτερυγίου, είχαν αυξημένη έκφραση των ΜΜΡs 305. Σε μία άλλη πτυχή της δράσης των ΜΜΡs, φαίνεται ότι η αναστολή τους συμβάλλει στην επιβίωση αλλομοσχευμάτων κερατοειδούς 306. Όσον αφορά το φακό και το περιφάκιο, ανιχνεύθηκαν στο περιφάκιο ασθενών που υπεβλήθησαν σε αφαίρεση του καταρρακτικού φακού 307, ενώ υπάρχουν ενδείξεις για την εμπλοκή τους στην παθογένεια του καταρράκτη γενικότερα 308. Φαίνεται ότι συμβάλλουν στην μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων του φακού και στη σύσπαση του περιφακίου, αφού η αναστολή τους δεν αποτρέπει τις παραπάνω διεργασίες 184. Αυξημένα επίπεδα ΜΜΡs έχουν ανιχνευθεί και σε περιπτώσεις λοιμώξεων του οφθαλμού. Έτσι, οι ΜΜΡs ανιχνεύθηκαν στα δάκρυα ασθενών με κερατοεπιπεφυκίτιδα 309. Εξ άλλου, αυξημένα επίπεδα ΜΜΡs αλλά και ΤΙΜΡs ανιχνεύθηκαν σε πειραματική ερπητική κερατίτιδα 310, ενώ ερευνήθηκε και ο ρόλος τους στην παθογόνο δράση μυκήτων στον κερατοειδή 311. Παράλληλα, έχουν ανιχνευθεί στο σκληρό σε περιπτώσεις σκληρίτιδας 312, στους ιστούς υπό τον επιπεφυκότα 313 αλλά και στα λεία μυϊκά κύτταρα του ακτινωτού σώματος 314. Οι ΜΜΡs ανιχνεύθηκαν και σε κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού (trabeculum) 315 και ερευνήθηκε ο ρόλος τους στην παθογένεια του γλαυκώμα- 65

66 τος 316. Μεταγενέστερα ανιχνεύθηκαν σε ασθενείς με πρωτοπαθές γλαύκωμα ανοικτής γωνίας, με αποφολιδωτικό σύνδρομο και αποφολιδωτικό γλαύκωμα 317, αλλά και στο υδατοειδές ασθενών με ψευδοαποφολιδωτικό σύνδομο 318. Παράλληλα, η δράση των ΜΜΡs συνδέθηκε με την αποτυχία τραμπεκουλεκτομών 319. Οι ΜΜΡs φαίνεται ότι παίζουν ρόλο και στην παθογένεια φλεγμονωδών νόσων του οφθαλμού και συγκεκριμένα της ραγοειδίτιδας 241. Η παρατήρηση αυτή υποστηρίχθηκε και από το εύρημα ότι συνθετικός αναστολέας των ΜΜΡs απέτρεψε την εκδήλωση αυτοανόσου ραγοειδίτιδας πειραματικά 320. Όσον αφορά τα οπίσθια μόρια, οι ΜΜΡs λαμβάνουν ενεργό ρόλο στη νεοαγγείωση αφού ανιχνεύθηκαν σε χορειοειδικές νεοαγγειακές μεμβράνες 321 in vivo αλλά και πειραματικά 322 ενώ σε πιο πρόσφατες μελέτες δείχθηκε ότι πράγματι προωθούν τη νεοαγγείωση 323. Επίσης, οι ΜΜΡs συμβάλλουν στην αγγειογένεση στον οφθαλμό, όπως δείχθηκε πειραματικά σε πτερύγια 324. Σε μία επιβεβαίωση των παραπάνω παρατηρήσεων, η αδυναμία έκφρασης ΜΜΡs πειραματικά οδήγησε σε ελαττωμένη αγγειογένεση στον αμφιβληστροειδή 325. Παράλληλα, η αυξημένη δράση τους στον κερατοειδή ασθενών πασχόντων από διαβήτη έγινε αντικείμενο μελέτης σε μία προσπάθεια κατανόησης του τρόπου δράσης τους στα πλαίσια μίας συστηματικής νόσου 326. Όσον αφορά το υαλοειδές και τον αμφιβληστροειδή, οι ΜΜΡs ανιχνεύθηκαν στις μεμβράνες κατά την PVR 195,200 αλλά και την ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς 198. Σε μία άλλη ευρέως διαδεδομένη νόσο, μεταλλοπρωτεϊνάσες ανιχνεύθηκαν στο υαλοειδές ασθενών με παραγωγική διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια (PDR) 237,327,328 αλλά και σε επαμφιβληστροειδικές μεμβράνες κατά την PDR και την PVR 329. Οι ΜΜΡs παίζουν ρόλο και στη δυστροφία του Sorsby, όπου η έκφραση των μεταλλάξεων των υπεύθυνων για την εκδήλωση της νόσου ελαττώνει την αναστολή των μεταλλοπρωτεϊνασών και προωθεί την αγγειογένεση 303. Η εμπλοκή των ΜΜΡs διαπιστώθηκε ακόμη και σε επίπεδο των εξωφθαλμίων μυών. Διαφορετικά επίπεδα ΜΜΡs ανιχνεύθηκαν σε μυϊκές ίνες προερχόμενες από διαφορετικούς μύες σε ασθενείς με στραβισμό 330. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ο οφθαλμός αποτελεί πεδίο μελέτης της ρύθμισης της έκφρασης των ΜΜΡs από διάφορα μόρια σε παθολογικές και φυσιολογικές συνθήκες. Ενδεικτικά αναφέρονται η ρύθμιση της έκφρασης των ΜΜΡs στα κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού από τον TNF-α, στα κύτταρα του μελάγχρου από τον PDGF και τον TGF-β 2 αλλά και στα κερατινοκύτταρα από την IL-1β και τον TGF-β 1 331,332,

67 Α.9.3. Ο ρόλος των ΜΜΡs στον αμφιβληστροειδή Η έκφραση ενός σημαντικού αριθμού ΜΜΡs σε φυσιολογικές συνθήκες έχει επιβεβαιωθεί στον αμφιβληστροειδή. Πιο συγκεκριμένα, οι ΜΜΡs έχουν ανιχνευθεί στον αισθητηριακό αμφιβληστροειδή (στοιβάδα των γαγγλιακών κυττάρων) 334, στο φυσιολογικό υαλοειδές, στη μεσοκυττάρια ουσία μεταξύ των φωτοϋποδοχέων 234,335, στο μελάγχρουν επιθήλιο 336 και στο χοριοειδή 337. Η έκφραση των ΜΜΡs σε μία πληθώρα παθολογικών καταστάσεων στα οπίσθια μόρια έχει επιβεβαιωθεί στη διεθνή βιβλιογραφία 177. Τα οπίσθια μόρια προσφέρονται για τη μελέτη της φλεγμονής, της επούλωσης, της αγγειογένεσης και εκφυλιστικών ασθενειών 162. Όσον αφορά στις πλέον σοβαρές νοσολογικές οντότητες, αυξημένα επίπεδα ΜΜΡs έχουν ανιχνευθεί στην ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς 162,198,335, στην παραγωγική διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια 234,338, σε γλαυκωματικές βλάβες της κεφαλής του οπτικού νεύρου 316, στη διαδικασία τήξης του υαλοειδούς 232 και στην παραγωγική υαλοειδοαμφιβληστροειδοπάθεια 195,200. Η προέλευση των ΜΜΡs στις παραπάνω ασθένειες είναι πιθανότατα ένας συνδυασμός τοπικής παραγωγής από κύτταρα της περιοχής, καθώς και φλεγμονωδών κυττάρων 334. Σε κάθε περίπτωση, η έκφραση των ΜΜΡs σε αυτή την πληθώρα των νοσολογικών οντοτήτων κατέστησε τις συγκεκριμένες πρωτεάσες ένα ελκυστικό θεραπευτικό στόχο και ήδη ένας αριθμός κλινικών μελετών με αντικείμενο συνθετικούς αναστολείς των ΜΜΡs είναι σε εξέλιξη 162. A.9.4. Ο ρόλος των ΜΜΡs κατά την αποκόλληση και την PVR Η παραγωγική υαλοειδοαμφιβληστροειδοπάθεια (Proliferative Vitreoretinopathy-PVR) αποτελεί τη σοβαρότερη επιπλοκή της ρηγματογενούς αποκολλήσεως και τη συχνότερη αιτία αποτυχίας χειρουργικής αποκατάστασης του αποκολληθέντος αμφιβληστροειδούς 153. Η PVR συμβαίνει σε ένα ποσοστό 5-10% του συνόλου των αποκολλήσεων αμφιβληστροειδούς και θεωρείται μία περίπτωση παθολογικής διαδιακασίας επούλωσης, κατά την οποία παρατηρείται παραγωγή και μετανάστευση κυττάρων επί και υπό τον αποκολληθέντα αμφιβληστροειδή, με αποτέλεσμα τη δημιουργία επικαι υπαμφιβληστροειδικών μεμβρανών 153. Χαρακτηριστική ιδιότητα των μεμβρανών αυτών είναι η δυνατότητα σύσπασής τους, μία ιδιότητα που αποτελεί πιθανότατα σημαντικό μηχανισμό αποτροπής επούλωσης του αμφιβληστροειδικού ρήγματος 153,223. Πολλές από τις προαναφερθείσες διαδικασίες (παραγωγή και μετανάστευση κυττάρων, σύσπαση, εναπόθεση θεμέλιας ουσίας) ρυθμίζονται από τις ΜΜΡs, γεγονός που τις καθιστά ένα ελκυστικό θεραπευτικό στόχο. Όπως έχει αναφερθεί, μία ελεγχόμενη αύξηση της δραστηριότητας των ΜΜΡs αποτελεί χαρακτηριστικό της φυσιολογικής διαδικασίας επούλωσης, ενώ η απώλεια της ρύθμισης αυτής της διαδικασίας έχει αρνητικές επιπτώσεις στην επούλωση. 67

68 Ένας αριθμός ΜΜΡs έχει ανιχνευθεί τόσο στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό όσο στο υαλοειδές κατά την αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς, σε αυξημένα επίπεδα σε σχέση με τους μάρτυρες 339,340. Είναι αξιοσημείωτο ότι κύτταρα που απομονώθηκαν στις μεμβράνες που χαρακτηρίζουν την PVR, όπως κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου, κύτταρα γλοίας, ινοβλάστες και λευκά κύτταρα, έχει αποδειχθεί ότι είναι σε θέση να παράγουν ΜΜΡs και ΤΙΜΡs in vitro, η έκφρασή της κάθε μίας, όμως, διαφέρει ανάλογα με την ενεργοποίησή τους από μία κυτταροκίνη ή ένα αυξητικό παράγοντα 196,250,341. Η έκφραση των πρόδρομων και ενεργών μορφών των ΜΜΡ-1 και -2 στις επι- και υπαμφιβληστροειδικές μεμβράνες που χαρακτηρίζουν την PVR επιβεβαιώθηκε με τη χρήση ανοσοϊστοχημείας 200. Τα επίπεδα των ΜΜΡs που έχουν ανιχνευθεί στο υαλοειδές πιθανότατα αντιπροσωπεύουν πρωτεΐνες που παρήχθησαν στον αμφιβληστροειδή και τους παρακείμενους ιστούς, αλλά και πιθανότατα και από λευκά και άλλα κύτταρα που εισήλθαν στην υαλοειδική κοιλότητα μετά την απώλεια του αιματοαμφιβληστροειδικού φραγμού 162. Όσον αφορά τον ΤΙΜΡ-1, αυξημένα επίπεδά του καταγράφονται στη βιβλιογραφία, με καμία συσχέτιση, όμως με την ακεραιότητα του αιματοαμφιβληστροειδικού φραγμού 342. Παρόλα αυτά φαίνεται ότι η ολική δραστηριότητα των ΜΜΡs σχετίζεται με την αντίστοιχη του ΤΙΜΡ-1 σε μία μη επιπεπλεγμένη αποκόλληση, ενώ αυτή η συσχέτιση χάνεται σε μία επιπεπλεγμένη από την PVR αποκόλληση, όπου η δραστηριότητα των ΜΜΡs είναι σημαντικά αυξημένη 343. Αυτή η παρατήρηση μπορεί να είναι ακόμη μία ένδειξη ότι η έλλειψη ισορροπίας έκφρασης μεταξύ των ΜΜΡs και των ΤΙΜΡs συνδέεται με παθολογική διαδικασία επούλωσης κατά την PVR 162. Τα επίπεδα των ΜΜΡs στο υαλοειδές και το υπαμφιβληστροειδικό υγρό μπορεί να μην αντιπροσωπεύουν άμεσα τα συμβάντα στο επίπεδο του ιστού, αλλά μπορεί να θεωρηθεί ότι είναι ενδεικτικά της παθολογικής διαδικασίας επούλωσης που αντιπροσωπεύεται από την PVR 162. Παράλληλα είναι πιθανό οι ενεργές ΜΜΡs στο υαλοειδές να προωθούν την παθολογική αναδιαμόρφωση μέσω του ρόλου τους στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στην προ- και υπαμφιβληστροειδική επιφάνεια 162. Έχει αποδειχθεί ότι υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων της ΜΜΡ-9 στο υαλοειδές και την εμφάνιση μετεγχειρητικής PVR 195, παρατήρηση που επιβεβαιώνει τα παραπάνω και πιθανότατα υποδεικνύει και ένα μηχανισμό για την αποκόλληση κυττάρων του μελάγχρου επιθηλίου από τη βασική τους μεμβράνη και τη μετανάστευσή τους διαμέσου του αμφιβληστροειδούς 162. Το εάν τα αυξημένα επίπεδα της ΜΜΡ-9 κατά την PVR είναι απόδειξη της εμπλοκής της στην παθοφυσιολογία της συγκεκριμένης οντότητας ή απλά ένδειξη της κυτταρικής δραστηριότητας στους εμπλεκόμενους ιστούς μπορεί να αποδειχθεί μόνο με την αναστολή της συγκεκριμένης ΜΜΡ (αλλά και άλλων με αντίστοιχη δραστηριότητα) σε ένα αντίστιχο μοντέλο. Συνθε- 68

69 τικοί αναστολείς των ΜΜΡs είναι ήδη σε στάδιο κλινικών μελετών για την επίτευξη αυτού του στόχου 190,344. Είναι πιθανό ότι η αναστολή των μεταλλοπρωτεϊνασών, εάν ξεκινήσει κατά τα πρώτα στάδια της PVR, να αποτελέσει μέρος μίας θεραπευτικής στρατηγικής αποτροπής εμφάνισης της PVR, ώστε να μειωθεί η πιθανότητα μετεγχειρητικής υποτροπής της αποκόλλησης 162. A.9.5. Ο επιμέρους ρόλος των ΜΜΡs κατά την αποκόλληση και την PVR A ΜΜΡ-1 Έχει ανιχνευθεί στο φυσιολογικό αμφιβληστροειδή όπου είναι πιθανό να έχει ένα φυσιολογικό ρόλο στην αποδόμηση των αποπιπτόντων άκρων (tips) των φωτοϋποδοχέων 237. Παράλληλα έχει ανιχνευθεί σε παθολογικές καταστάσεις και συγκεκριμένα σε επι- και υπαμφιβληστροειδικές μεμβράνες κατά την πρόοδο της PVR 200,223,237. A ΜΜΡ-2 Μπορεί παράλληλα να διασπά τις ΜΜΡ-1, -9, -13. Έχει ανιχνευθεί στο φυσιολογικό 335 αλλά και στο παθολογικό υαλοειδές 237,259. Πιο συγκεκριμένα, έχει ανιχνευθεί στις επι- και υπαμφιβληστροειδικές μεμβράνες που χαρακτηρίζουν την PVR και σε αυξημένη συχνότητα στις πρώτες σε σύγκριση με τις δεύτερες 200,223,237. Παράλληλα, έχει παρατηρηθεί ότι τα επίπεδά της μπορεί να αυξάνουν με την ηλικία 345. Ο κύριος φυσιολογικός ρόλος της ΜΜΡ-2 συνίσταται στην αποδόμηση του ενδοθηλιακού βασικού πετάλου και, κατ επέκταση, στη διατήρηση της ακεραιότητας του αιματοαμφιβληστροειδικού φραγμού 346. A ΜΜΡ-3 Aνιχνεύθηκε σε επι- και υπαμφιβληστροειδικές μεμβράνες κατά την PVR 200,223,237. A ΜΜΡ-8 Δεν έχει αναφερθεί ο ρόλος της μέχρι σήμερα κατά την αποκόλληση και την PVR. 69

70 A ΜΜΡ-9 Έχει ανιχνευθεί σε φυσιολογικές συνθήκες στη στοιβάδα των γαγγλιακών κυττάρων του αμφιβληστροειδούς 177. Σε παθολογικές συνθήκες έχει ανιχνευθεί στις επι- και υπαμφιβληστροειδικές μεμβράνες που χαρακτηρίζουν την PVR, σε μικρότερη συχνότητα πάντως σε σύγκριση με την ΜΜΡ ,223. Ταυτόγχρονα, έχει ανιχνευθεί σε αυξημένες ποσότητες στο υαλοειδές οφθαλμών πασχόντων από PVR και παραγωγική διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια (PDR) 237. Εμπλέκεται στην αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας (matrix remodelling) με την προαγωγή της αποκόλλησης κυττάρων του μελάγχρου επιθηλίου από τη βασική μεμβράνη και της μετανάστευσής τους, καθώς και με την παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας για το σχηματισμό επαμφιβληστροειδικών μεμβρανών κατά την PVR 259. Υπάρχουν ενδείξεις εμπλοκής της στη νεοαγγείωση του αμφιβληστροειδούς κατά τη διάρκεια της PVR 237,346. Τοπική παραγωγή της ΜΜΡ-9 σε οφθαλμικούς ιστούς συνδέεται με τραύμα, φλεγμονή και επούλωση 195. A ΤΙΜΡ-1 Δεν ανιχνεύεται στο φυσιολογικό αμφιβληστροειδή 345, αντίθετα όμως ανιχνεύεται στην πλειοψηφία των επαμφιβληστροειδικών μεμβρανών που χαρακτηρίζουν την PVR 200,

71 Β. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 71

72

73 ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕΪΝΑΣΩΝ ΣΤΟ ΥΠΑΜΦΙΒΛΗΣΤΡΟΕΙΔΙΚΟ ΥΓΡΟ ΚΑΙ ΤΟ ΥΑΛΟΕΙΔΕΣ ΚΑΙ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΤΟΥΣ ΜΕ ΤΗΝ ΠΡΟΟΔΟ ΤΗΣ ΡΗΓΜΑΤΟΓΕΝΟΥΣ ΑΠΟΚΟΛΛΗΣΗΣ ΤΟΥ ΑΜΦΙΒΛΗΣΤΡΟΕΙΔΟΥΣ Β.1. Σκοπός-Κλινικά ερωτήματα Σκοπός της μελέτης ήταν ο προσδιορισμός των επιπέδων των μεταλλοπρωτεϊνασών ΜΜΡ-1, prommp-2, MMP-2, MMP-3, MMP-8, prommp-9, ΜΜΡ-9 και του αναστολέα τους TIMP-1 σε ασθενείς πάσχοντες από ρηγματογενή αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς και η συσχέτισή τους με κλινικές παραμέτρους της ρηγματογενούς αποκόλλησης. Στην παρούσα μελέτη, τα επίπεδα των ΜΜΡs προσδιορίσθηκαν στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό και στο υαλοειδές των ασθενών και στη συνέχεια αξιολογήθηκαν σε σχέση με την έκταση και την παλαιότητα της αποκόλλησης, καθώς και με το βαθμό της παραγωγικής υαλοειδοαμφιβληστροειδοπάθειας, με σκοπό τη διερεύνηση της εμπλοκής τους στην παθογένεια της ρηγματογενούς αποκόλλησης. Διερευνήθηκε, επίσης, η ύπαρξη στατιστικά σημαντικών συσχετίσεων των επιπέδων των μεταλλοπρωτεϊνασών με την κατάσταση της ωχράς, την τοπογραφία της ρωγμής, την ύπαρξη υποτροπής και με συνυπάρχοντα συστηματικά νοσήματα όπως σακχαρώδης διαβήτης και υπέρταση. Β.2. Ασθενείς-Υλικό και μέθοδοι Β.2.1. Πληθυσμός μελέτης Ο πληθυσμός της μελέτης αποτελείτο από 69 ασθενείς με ρηγματογενή αποκόλληση αμφιβληστροειδούς οι οποίοι προσήλθαν στην Α Οφθαλμολογική Κλινική του Α.Π.Θ., Π.Γ.Ν.Θ. «ΑΧΕΠΑ», στο χρονικό διάστημα από τον Ιούλιο του 2002 έως το Φεβρουάριο του 2004 και στη Β Οφθαλμολογική Κλινική του Α.Π.Θ., Γ.Ν.Θ. «Παπαγεωργίου», στο χρονικό διάστημα από το Μάρτιο του 2004 έως το Νοέμβριο του Με βάση την κλινική εικόνα, αποφασίζονταν το είδος της χειρουργικής αντιμετώπισης (σε κάθε περιστατικό της κάθε αποκόλλησης), είτε με παρακέντηση και χρήση επισκληρικού μοσχεύματος (εξωβολβική αντιμετώπιση), είτε με υαλοειδεκτομή (ενδοβολβική αντιμετώπιση). Με τον τρόπο αυτό, προέκυψαν δύο ομάδες ασθενών και, κατά συνέπεια, δειγμάτων: τα προερχόμενα από την εξωβολβική αντιμετώπιση 37 δείγματα υπαμφιβληστροειδι- 73

74 κού υγρού και τα προερχόμενα από την ενδοβολβική αντιμετώπιση 35 δείγματα υαλοειδούς. Οι ασθενείς, των οποίων η αποκόλληση αντιμετωπίσθηκε εξωβολβικά ήταν συνολικά 37, εκ των οποίων 26 (70,27%) ήταν άνδρες και 11 (29,73%) ήταν γυναίκες με μέση ηλικία 62,83±2,32 έτη και διακύμανση μεταξύ 19 και 80 ετών. Οι ασθενείς, των οποίων η αποκόλληση αντιμετωπίσθηκε ενδοβολβικά ήταν συνολικά 32, εκ των οποίων 27 (74,28%) ήταν άνδρες και 9 (25,71%) ήταν γυναίκες με μέση ηλικία 62,51 έτη και διακύμανση μεταξύ 30 και 91 ετών. Β.2.2. Ομάδα μαρτύρων Το υπαμφιβληστροειδικό υγρό δεν υφίσταται υπό φυσιολογικές συνθήκες στον οφθαλμό και για το λόγο αυτό τόσο στην ομάδα δειγμάτων υπαμφιβληστροειδικού υγρού όσο και στην ομάδα δειγμάτων υαλοειδούς ως υγιείς μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν 9 δείγματα υαλοειδούς από δότες οργάνων σώματος, όπως αναφέρεται στη βιβλιογραφία 335. Ειδικότερα στην περίπτωση των δειγμάτων του υπαμφιβληστροειδικού υγρού, μία ακόμη επιλογή θα ήταν να χρησιμοποιηθεί ως μάρτυρας δείγμα υαλοειδούς από τον ίδιο τον ασθενή. Μία τέτοια επιλογή όμως θα απαιτούσε και επιπρόσθετη υαλοειδεκτομή στον ίδιο ασθενή, γεγονός που θα υπέβαλε τον ασθενή στους κινδύνους μίας επιπλέον χειρουργικής επέμβασης χωρίς ορατά οφέλη, όσον αφορά στην αντιμετώπιση της αποκόλλησης. Τα δείγματα του υαλοειδούς ελήφθησαν από τους οφθαλμούς των παραπάνω δοτών σε χρονικό διάστημα 3-5 ωρών από την ώρα του θανάτου, ώστε να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα βιοχημικών αλλοιώσεων του υαλοειδούς μετά θάνατον 335. Οι δότες (6 άνδρες, 3 γυναίκες με μέση ηλικία 55,11±5,20 έτη και διακύμανση μεταξύ ετών) δεν παρουσίαζαν κάποια οφθαλμολογική ή συστηματική παθολογία που θα ήταν σε θέση να μεταβάλει τη σύσταση του υαλοειδούς. Β.2.3. Παράμετροι μελέτης Σε κάθε ασθενή καταγράφησαν οι παρακάτω κλινικές παράμετροι: 1. Ονοματεπώνυμο. 2. Ηλικία. 3. Φύλο. 4. Πάσχων οφθαλμός. 5. Οπτική οξύτητα του πάσχοντος και του έτερου οφθαλμού. 74

75 6. Έκταση της αποκόλλησης: καταγραφή της έκτασης της αποκόλλησης σε ώρες ωρολογιού και σε τεταρτημόρια του αμφιβληστροειδούς Παλαιότητα της αποκόλλησης: καταγραφή της παλαιότητας της αποκόλλησης σε ημέρες από την έναρξη της αποκόλλησης. Στη συνέχεια η παλαιότητα κατηγοριοποιούνταν ως εξής: α. ομάδα A: <3 ημέρες β. ομάδα B: 4-7 ημέρες γ. ομάδα Γ: 8-14 ημέρες δ. ομάδα Δ: ημέρες ε. ομάδα E: ημέρες 8. Παραγωγική υαλοειδοαμφιβληστροειδοπάθεια (PVR): η καταγραφή της ύπαρξης PVR και σε περίπτωση ύπαρξης ο βαθμός της (0-C) Κατάσταση της ωχράς: κολλημένη ή αποκολλημένη. 10. Εντόπιση της ρωγμής: ανώτερη, μεσαία, κατώτερη. 11. Ύπαρξη υποτροπής: καταγραφή της ύπαρξης πρωτοπαθούς αποκόλλησης ή υποτροπής. 12. Ύπαρξη συνυπαρχουσών συστηματικών νοσημάτων, όπως σακχαρώδης διαβήτης, υπέρταση καθώς και η ύπαρξη φαρμακευτικής αγωγής για την αντιμετώπισή τους. Β.2.4. Λήψη δειγμάτων Β Λήψη δειγμάτων υπαμφιβληστροειδικού υγρού Τα δείγματα υπαμφιβληστροειδικού υγρού ελήφθησαν αυτούσια με αναρρόφηση σε αποστειρωμένη σύριγγα 27 G στο σημείο της παρακέντησης του βολβού, σημείο που αντιστοιχούσε σε τμήμα του αποκολλημένου αμφιβληστροειδούς. Τα δείγματα που περιείχαν αίμα κατά τη συλλογή δεν συμπεριελήφθησαν στην παρούσα μελέτη. Στη συνέχεια φυγοκεντρούνταν σε 5000 g για 15 λεπτά, στους 15 o C. Τα υπερκείμενα διαμοιράζονταν σε ποσότητες των 200 μl, όταν αυτές ήταν διαθέσιμες, σε αποστειρωμένα σωληνάρια τύπου Eppendorf του 1 ml (Eppendorf, Freemont, California, U.S.A.) και αποθηκεύονταν στους -70 o C μέχρι τη χρησιμοποίησή τους για τον ποσοτικό προσδιορισμό των ΜΜΡ και του ΤΙΜΡ-1. Β Λήψη δειγμάτων υαλοειδούς Τα δείγματα υαλοειδούς ελήφθησαν αυτούσια με αναρρόφηση σε αποστειρωμένη σύριγγα 27 G κατά το αρχικό στάδιο της υαλοειδεκτομής. Πιο 75

76 συγκεκριμένα, η αναρρόφηση του κεντρικού υαλοειδούς γινόταν με τον αυλό του υαλοειδοτόμου καθαρό από τα ειδικά διαλύματα που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο της ομαλής λειτουργίας του. Με τον τρόπο αυτό, εξασφαλίζονταν η διατήρηση της συγκέντρωσης των ΜΜΡs και του ΤΙΜΡ- 1 στα επίπεδα στα οποία βρίσκονταν και στην υαλοειδική κοιλότητα. Στη συνέχεια, όπως και στην περίπτωση του υπαμφιβληστροειδικού υγρού, τα δείγματα φυγοκεντρούνταν σε 5000 g για 15 λεπτά, στους 15 o C και τα προκύπτοντα υπερκείμενα διαμοιράζονταν σε ποσότητες των 200 μl, όταν αυτές ήταν διαθέσιμες, σε αποστειρωμένα σωληνάρια τύπου Eppendorf του 1 ml (Eppendorf, Freemont, California, U.S.A.). Ακολουθούσε η αποθήκευσή τους σε θερμοκρασία -70 o C μέχρι τη χρησιμοποίησή τους για τον ποσοτικό προσδιορισμό των ΜΜΡ και του ΤΙΜΡ-1. Β.2.5. Ποσοτικός προσδιορισμός μεταλλοπρωτεϊνασών Β Ποσοτικός προσδιορισμός μεταλλοπρωτεϊνασών με την ανοσοενζυμική δοκιμασία ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Ο ποσοτικός προσδιορισμός των ΜΜΡ-1, -3, -8 και ΤΙΜΡ-1 έγινε με την ανοσοενζυμική δοκιμασία ELISA διπλού αντισώματος (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν της εταιρείας R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Σύμφωνα με τη δοκιμασία αυτή, ειδικά μονοκλωνικά ή πολυκλωνικά αντισώματα, προσροφημένα σε πλάκες μικροτιτλοποίησης 96 βοθρίων από πολυστυρένιο χρησιμοποιούνται για τη δέσμευση των ΜΜΡs και του ΤΙΜΡ-1 στα υπό εξέταση δείγματα. Σε δεύτερο στάδιο, προστίθεται ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα σημασμένο με ένζυμο και στη συνέχεια το ανοσοσύμπλεγμα ανιχνεύεται μέσω της διάσπασης καταλλήλων υποστρωμάτων και την εμφάνιση συγκεκριμένου χρώματος. Το εν λόγω χρώμα προσδιορίζεται ποσοτικά σε φασματοφωτόμετρο (μέτρηση οπτικής πυκνότητας απορρόφησης OD). Παράλληλα προσδιορίζεται η οπτική πυκνότητα γνωστών συγκεντρώσεων ΜΜΡs ή ΤΙΜΡ και με βάση αυτές τις οπτικές πυκνότητες διαμορφώνεται η πρότυπος καμπύλη. Ο ποσοτικός προσδιορισμός της ΜΜΡ ή του ΤΙΜΡ γίνεται με τη βοήθεια της πρότυπης καμπύλης, μετατρέποντας τις οπτικές πυκνότητες του κάθε δείγματος σε ng/ml. Για τη δημιουργία της πρότυπης καμπύλης για κάθε ΜΜΡ και τον ΤΙΜΡ-1 χρησιμοποιήθηκαν ανασυνδυασμένη ανθρώπινη MMP-1, ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-8 και ανθρώπινος ΤΙΜΡ-1 (R&D Systems) σε συγκεντρώσεις: 0, 0,78, 0,156, 3,12, 6,25, 12,5, 25, 50 και 100 ng/ml. ΜΜΡ-1. Η MMP-1 προσδιορίσθηκε με τη χρήση της ELISA (Quantikine ). Η δοκιμασία ELISA πραγματοποιήθηκε σε όλα τα συλλεχθέντα δείγματα υπαμφιβληστροειδικού υγρού και υαλοειδούς σύμφωνα με τις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρείας. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό 76

77 χρησιμοποιήθηκαν μικροπλάκες πολυστυρενίου 96 βοθρίων (με 12 γραμμές των 8 βοθρίων). Κάθε βοθρίο ήταν επικαλυμμένο με προσροφημένο μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της ΜΜΡ-1. Σε πρώτη φάση μετά από επανειλλημμένες προκαταρκτικές δοκιμές καθορίσθηκε η κατάλληλη αραίωση για τα δείγματα (υπαμφιβληστροειδικό υγρό και υαλοειδές). Στην περίπτωση της ΜΜΡ-1 λόγω των χαμηλών συγκεντρώσεων αυτής τα δείγματα εξετάσθηκαν αρχικά αυτούσια, χωρίς αραίωση, και σε όσα η ποσότητα του υπαμφιβληστροειδικού υγρού ή του υαλοειδούς ήταν επαρκής εξετάσθηκε και η αραίωση 1:2. Κατά τη διαδικασία, τοποθετούνταν μία ποσότητα 100 μl από το συλλεχθέν δείγμα αναραίωτο ή και σε αραίωση 1:2, η μικροπλάκα καλύπτονταν με ειδικό διάφανο κάλυμμα και στη συνέχεια ακολουθούσε επώαση για χρονικό διάστημα 2 ωρών σε θερμοκρασία δωματίου. Η επώαση γινόταν με ανακίνηση σε 500±50 στροφές ανά λεπτό (rpm). Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας γινόταν η δέσμευση της ΜΜΡ-1 από το μονοκλωνικό αντίσωμα με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός συμπλόκου, που καθηλωνόταν στο κάθε βοθρίο. Ακολούθησε απομάκρυνση των μη δεσμευθέντων συστατικών του δείγματος με απόπλυση: γινόταν τέσσερεις πλύσεις με ρυθμιστικό διάλυμα PBS-T, που περιείχε 0.1% BSA σε ποσότητες των 400 μl για κάθε βοθρίο για 3 λεπτά, χρησιμοποιώντας ειδικό εξοπλισμό αυτόματης απόπλυσης, και αφαίρεση των σταγονιδίων χτυπώντας την πλάκα 4-5 φορές πάνω σε απορροφητικό χαρτί. Στο επόμενο βήμα, προσθέτονταν 200 μl ειδικού πολυκλωνικού αντισώματος έναντι της ΜΜΡ-1, συνδεδεμένου με horseradish υπεροξειδάση, το οποίο επίσης δεσμεύει το ήδη δεσμευμένο με το πρώτο αντίσωμα αντιγόνο, και η πλάκα καλύπτονταν με ειδικό διάφανο κάλυμμα. Ακολουθούσε περαιτέρω επώαση υπό ήπια οριζόντια ανάδευση 500±50 στροφών ανά λεπτό επί δίωρο σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από μία ακόμη σειρά 4 πλύσεων, με τη διαδικασία που αναφέρθηκε παραπάνω, τοποθετούνταν σε κάθε βοθρίο 200 μl διαλύματος υποστρώματος που περιείχε υπεροξείδιο του υδρογόνου και τετραμεθυλοβεζιδίνη. Ακολουθούσε επώαση για διάστημα 30 λεπτών σε συνθήκες σκότους και θερμοκρασία δωματίου. Στο επόμενο στάδιο, προσθέτονταν 2Ν θειικού οξέος σε κάθε βοθρίο και ακολούθως μετριόταν η ένταση του εμφανισθέντος χρώματος ως οπτική απορρόφηση σε φωτόμετρο ειδικό για πλάκες των 96 βοθρίων σε μήκος κύματος 450 nm (διόρθωση λ στα 540 nm). Τα στοιχεία της κατασκευάστριας εταιρείας αναφέρουν ότι με τη μέθοδο αυτή ανιχνεύονταν η φυσική και η ανασυνδυασμένη ΜΜΡ-1 σε βιολογικά δείγματα. Η μέση ευαισθησία της μεθόδου ήταν 0,021 ng/ml (διακύμανση μεταξύ 0,006 και 0,095 ng/ml). Παράλληλα, η εταιρεία αναφέρει ότι ο συντελεστής μεταβλητότητας (coefficient of variation-cv), όσον αφορά την επαναληψιμότητα της μεθόδου κυμαινόταν από 6,1% έως 10,4%. Τα επίπεδα της ΜΜΡ-1 εκφράσθηκαν σε ng/ml. ΜΜΡ-3. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ΜΜΡ-3 ακολουθήθηκε η ίδια μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για την ΜΜΡ-1 (ELISA Quantikine ). Στα σημεία της διαδικασίας όπου χρησιμοποιήθηκε αντίσωμα, στην πρώτη 77

78 περίπτωση στην επικάλυψη κάθε βοθρίου με αντίσωμα και στη δεύτερη στην προσθήκη ειδικού σημασμένου αντισώματος και τα δύο ήταν ειδικά πολυκλωνικά αντισώματα ειδικά για την ΜΜΡ-3. Η αραίωση που χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ΜΜΡ-3 στα δείγματα της μελέτης (υπαμφιβληστροειδικό υγρό και υαλοειδές), καθορίστηκε σε επανειλημμένες προκαταρκτικές δοκιμασίες και ήταν 1:5. Η μέση ευαισθησία της μεθόδου ήταν 0,009 ng/ml (διακύμανση μεταξύ 0,002 και 0,045 ng/ml) και ο συντελεστής μεταβλητότητας κυμαινόταν από 6,4% έως 8,6%. Τα επίπεδα της ΜΜΡ-3 εκφράσθηκαν σε ng/ml. ΜΜΡ-8. Η MMP-8 προσδιορίσθηκε με τη χρήση ELISA σταθερής φάσης διπλού αντισώματος (Quantikine ). Ο ποσοτικός προσδιορισμός της ΜΜΡ-8 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση όπου απαιτούνταν μονοκλωνικών αντισωμάτων, ειδικά για την ΜΜΡ-8. Μετά από αρχικές δοκιμασίες, τα δείγματα δεν αραιώνονταν αλλά χρησιμοποιήθηκαν αυτούσια για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ΜΜΡ-8 στα δείγματα υπαμφιβληστροειδικού υγρού και υαλοειδούς. Η μέση ευαισθησία της μεθόδου ήταν 0,02 ng/ml (διακύμανση μεταξύ 0,01 και 0,06 ng/ml) και ο συντελεστής μεταβλητότητας κυμαινόταν μεταξύ 5,0% και 6,0%. Τα επίπεδα της ΜΜΡ-8 εκφράσθηκαν σε ng/ml. ΤΙΜΡ-1. Ο ΤΙΜΡ-1 προσδιορίσθηκε με τη χρήση ELISA σταθερής φάσης διπλού αντισώματος (Quantikine ). Ο ποσοτικός προσδιορισμός του ΤΙΜΡ-1 έγινε με τη μέθοδο που περιγράφηκε παραπάνω με τη χρήση δύο σειρών των 3 πλύσεων αντί των 4. Χρησιμοποιήθηκαν ειδικά για τον ΤΙΜΡ- 1 μονοκλωνικά και πολυκλωνικά αντισώματα. Η αραίωση που χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ΜΜΡ-3 στα υπό μελέτη δείγματα υπαμφιβληστροειδικού υγρού και υαλοειδούς, καθορίστηκε σε αρχικό στάδιο και ήταν 1:20. Η ευαισθησία της μεθόδου ήταν 0,08 ng/ml, ενώ ο συντελεστής μεταβλητότητας για την επαναληψιμότητα της μεθόδου κυμάνθηκε μεταξύ 3,9% και 4,9%. Τα επίπεδα του ΤΙΜΡ-1 εκφράσθηκαν σε ng/ml. Β Ποσοτικός προσδιορισμός μεταλλοπρωτεϊνασών με τη χρήση της ζυμογραφίας Β α. Ζυμογραφία ζελατίνης Με τη μέθοδο αυτή διαπιστώνεται η ύπαρξη των ζελατινασών τόσο σε μορφή προενζύμου, όσο και σε ενεργοποιημένη μορφή 348,349. Τα δείγματα προεπωάσθηκαν για 15 στους 37 o C σε ρυθμιστικό διάλυμα επεξεργασίας δειγμάτων Laemmli, απουσία β-μερκαπτοαιθανόλης, και στη συνέχεια υποβλήθηκαν (10 μg πρωτεΐνης σε τελικό όγκο 10 μl) σε ηλεκτροφόρηση σε πήγματα πολυακρυλαμιδίου που περιείχε SDS (SDS-PAGE) (25 mamp, 2 h, θερμοκρασία δωματίου) και 1 mg/ml ζελατίνη κολλαγόνου τύπου Ι. 78

79 Μετά την ηλεκτροφόρηση, για την απομάκρυνση του SDS, τα πήγματα πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα 50 mm Tris-HCl, ph 7.5, 5 mm CaCl 2, 1 μm ZnCl 2, 0.02% NaN 3, το οποίο περιέχει 2.5% Τriton X-100, και στη συνέχεια επωάσθηκαν για 20 h στους 37 ο C στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0.1% Triton X-100. Μετά την επώαση τα πήγματα χρωματίσθηκαν σε διάλυμα Coomassie Brilliant blue R-250 και ακολούθησε αποχρωματισμός με 45 % μεθανόλη, 5 % οξικό οξύ 350. Στις θέσεις που έχουν ηλεκτροφορηθεί τα ένζυμα, λόγω τοπικής αποδόμησης του υποστρώματος, εμφανίζονται διαφανείς ζώνες λύσεως. Η ως άνω διαδικασία επαναλήφθηκε παρουσία των χηλικών ενώσεων Na 2 EDTA (20 mm), 1,10-φαινανθρολίνης (4 mm), ή υδροχλωρικής βενζαμιδίνης (benzamidine hydrochloride) (5 mm), (Sigma Chemical Co), οι οποίες αναστέλλουν μόνο τις ζώνες λύσης που αντιστοιχούν στις ζελατινάσες, καθώς επίσης και παρουσία των αναστολέων πρωτεασών σερίνης, θειόλης και κυστεϊνης, όπως ο φθοριούχος μεθανοσουλφονικός φαινυλεστέρας (phenylmethanesulphonyl fluoride, PMSF) (1 mm) ή N-αιθυλομηλεϊμίδιο (N-ethylmaleimide, NEM) (5 mm), (Sigma Chemical Co). Το μοριακό βάρος που αντιστοιχεί στις διαφανείς ζώνες λύσης λόγω ενζυμικής δραστηριότητας υπολογίσθηκε συγκριτικά με ηλεκτροφόρηση καθαρής μορφής prommp-2 (72.0 kda), ενεργού MMP-2 (64.0 kda), prommp-9 (92.0 kda) και ενεργού MMP-9 (78.0 kda) του εμπορίου (Anawa Trading, Wangen), καθώς και με ηλεκτροφόρηση δειγμάτων πρωτεϊνών αναφοράς γνωστού μοριακού βάρους: β-γαλακτοσιδάση (116 kda), φωσφορυλάση β (97.4 kda), λευκωματίνη βόειου ορού (66.2 kda), αφυδρογονάση του L-γλουταμινικού οξέος (55.0 kda), οβαλβουμίνη (42.7 kda), αλδολάση (40.0 kda) και καρβονική ανυδράση (29 kda) (Promega, Madison, WI). Β β. Ενεργοποίηση των ζελατινασών Η ενεργοποίηση των ζελατινασών επιτεύχθηκε με επώαση των δειγμάτων παρουσία 1 mm 4-aminophenylmercuric acetate (APMA, Sigma Chemical Co) διαλυμένου σε DMSO, σε 50 mm Tris-HCI, ph 7.3, που περιείχε 200 mm NaCI και 5 mm CaCl 2, για 24 h στους 37 o C. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση (25 mamp, 2 h, θερμοκρασία δωματίου) των δειγμάτων σε πήγματα πολυακρυλαμιδίου που περιείχε SDS (SDS-PAGE) και 1 mg/ml ζελατίνη κολλαγόνου τύπου Ι 231. Β γ. Πυκνομετρία σάρωσης Οι ζώνες λύσης λύσης που εμφανίσθηκαν μετά τη ζυμογραφία με αρνητική χρώση, ύστερα από το χρωματισμό των πρωτεϊνών με Coomasie Brilliant Blue R 250, ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία σάρωσης χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα υπολογιστή 1D Image Analysis Software, 79

80 version 3.0 (Kodak Digital Science, Eastman Kodak, Rochester, NY) 351. Ακολούθησε σύγκριση μεταξύ των ζωνών λύσης που αντιστοιχούσαν σε φυσιολογικά και παθολογικά δείγματα. Ο υπολογισμός της δραστηριότητας των ζελατινασών των δειγμάτων έγινε αρχικά σε αυθαίρετες μονάδες (arbitrary units) και ακολούθως εκφράσθηκε ως % των επιπέδων του μάρτυρα. Β δ. Προσδιορισμός πρωτεϊνών Σε κάθε δείγμα υπαμφιβληστροειδικού υγρού και υαλοειδούς έγινε προσδιορισμός του ολικού ποσού των πρωτεϊνών με τη μέθοδο Bradford (Bio-Rad, Glattbrugg, Switzerland), χρησιμοποιώντας λευκωματίνη από βόειο ορό (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Germany) για τον καθορισμό της πρότυπης καμπύλης. Σε όλες τις μετρήσεις χρησιμοποιήθηκαν δείγματα με ίση ποσότητα πρωτεϊνών, μετά από ανάλογη αραίωση αυτών. Όλα τα αποτελέσματα εκφράσθηκαν ως προς το περιεχόμενο πρωτεΐνης. Β.2.6. Στατιστική ανάλυση Τα επίπεδα των μεταλλοπρωτεϊνασών και του αναστολέα τους που συμπεριελήφθησαν στην παρούσα μελέτη περιεγράφησαν με τη χρήση του μέσου όρου και του τυπικού σφάλματος του μέσου όρου. Η δοκιμασία t-test του student (Student s t-test) και η ανάλυση της διακύμανσης (analysis of variance) χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση δεδομένων μεταξύ της ομάδας των ασθενών και της ομάδας των μαρτύρων καθώς και μεταξύ υπο-ομάδων των ασθενών. Η ύπαρξη συσχετίσεων μεταξύ των επιπέδων των ΜΜΡs και του ΤΙΜΡ-1 και των καταγεγραμμένων κλινικών παραμέτρων που συμπεριελήφθησαν στη μελέτη ελέγχθηκε με τη χρήση του συντελεστή συσχέτισης και της δοκιμασίας συσχέτισης κατά Spearman (συντελεστής συσχέτισης-correlation coefficient: r, Spearman rank correlation test). Η ανάλυση παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση ύπαρξης ενός στατιστικά σημαντικού μοντέλου των επιπέδων των ΜΜΡs και του ΤΙΜΡ-1 που θα μπορούσε να συσχετισθεί με την έκταση και την παλαιότητα της αποκόλλησης καθώς και το βαθμό της PVR. Ως επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίσθηκε το p<0,05. Για την παραπάνω στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). 80

81 B.3. Αποτελέσματα B.3.Α. Υπαμφιβληστροειδικό υγρό B.3.A.1. Επίπεδα ΜΜΡs και ΤΙΜΡ-1 με ELISA και ζυμογραφία Τα επίπεδα των ΜΜΡ-1, -3, -8 και του ΤΙΜΡ-1 στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό που προσδιορίσθηκαν με τη χρήση της ELISA, και των prommp- 2, MMP-2, prommp-9 και ΜΜΡ-9 που προσδιορίσθηκαν με τη μέθοδο της ζυμογραφίας παρουσιάζονται στον πίνακα [πίνακας 1 και διάγραμμα 1]. Πίνακας 1: Έκφραση των MMP και του TIMP-1 στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό ασθενών με ρηγματογενή αποκόλληση αμφιβληστροειδούς και το υαλοειδές δοτών οργάνων (ομάδα μαρτύρων) ομάδα ασθενών α υπαμφιβληστροειδικό υγρό ομάδα μαρτύρων β υαλοειδές (Μ.Ο.±SE) (Μ.Ο.±SE) p κολλαγονάσες MMP-1 γ 0,4±0,1 0,04±0,01 0,001 ε MMP-8 γ 1,9±0,6 0,09±0,01 0,006 ε στρωμαλυσίνη MMP-3 γ 11,9±3,2 0,35±0,2 0,001 ε ζελατινάσες prommp-2 δ 47800± ±6300 0,047 ε MMP-2 δ 2800± ±1100 0,929 prommp-9 δ 23400± ±1700 0,001 ε MMP-9 δ 5500± ±500 0,001 ε αναστολέας ΜΜΡs TIMP-1 γ 286±18,9 75±17 0,001 ε α ν = 37 β ν = 9 γ τιμές σε ng/ml δ τιμές σε αυθαίρετες μονάδες ε στατιστικά σημαντικό Πιο συγκεκριμένα για τις ζελατινάσες, ανάλυση με ζυμογραφία σε πήγμα ζελατίνης (Σχήμα 1) του υπαμφιβληστροειδικού και του υαλοειδούς υγρού (2 μg πρωτεΐνης) έδειξε δραστηριότητα ζελατινάσης με ποικίλα μοριακά βάρη. Οι ζώνες λύσης με τα δύο μικρότερα μοριακά βάρη ήταν κοινές 81

82 σε όλα τα δείγματα. Επιπρόσθετα των μικρού μοριακού βάρος ζωνών λύσης, σε ορισμένα δείγματα παρατηρήθηκαν ζώνες λύσης με μεγαλύτερα μοριακά βάρη. Οι δύο χαμηλού μοριακού βάρους ζώνες λύσης μετανάστευσαν κατά τη ζυμογραφία στο πήγμα πολυακρυλαμιδίου ζελατίνης κατά ακριβώς παρόμοιο τρόπο όπως οι καθαρές μορφές prommp-2 (72.0 kda) και MMP-2 (64.0 kda) του εμπορίου, αντίστοιχα (Σχήμα 1). Με την ταυτόχρονη ηλεκτροφόρηση δειγμάτων πρωτεϊνών αναφοράς γνωστού μοριακού βάρους, υπολογίστηκε ότι το μοριακό βάρος των δύο κατώτερων ζωνών λύσης είναι 66 και 62 kda, αντίστοιχα. Για την εξακρίβωση της ταυτότητας των υπευθύνων ενζύμων για τις εν λόγω ζώνες λύσεις, η ζυμογραφική ανάλυση έγινε παρουσία εκλεκτικών και μη εκλεκτικών αναστολέων των μεταλλοπρωτεϊνασών, όπως χαρακτηριστικά απεικονίζεται στο Σχήμα 2 για ένα δείγμα υπαμφιβληστροειδικού υγρού. Παρατηρήθηκε ότι οι 66 και 62 kda ζώνες λύσης εξαφανίζονται όταν η ζυμογραφία γίνεται παρουσία των χηλικών ενώσεων Na 2 EDTA (20 mm) (Σχήμα 2, διάδρομος 4), 1,10-φαινανθρολίνης (4 mm) (Σχήμα 2, διάδρομος 5), ή υδροχλωρικής βενζαμιδίνης (5 mm) (Σχήμα 2, διάδρομος 6), αλλά δεν επηρεάζονται παρουσία φθοριούχου μεθανοσουλφονικού φαινυλεστέρα (phenylmethanesulphonyl fluoride, PMSF) (1 mm) (Σχήμα 2, διάδρομος 7), ή N-αιθυλομηλεϊμιδίου (N-ethylmaleimide, NEM) (5 mm) (Σχήμα 2, διάδρομος 8). Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι οι 66 και 62 kda ζώνες λύσης οφείλονται σε δραστηριότητα μεταλλοπρωτεϊνασών και όχι σε πρωτεϊνάσες σερίνης, θειόλης ή κυστεΐνης. Δεδομένου του μοριακού βάρους των υπευθύνων ενζύμων και του γεγονότος ότι αποδομούν τη ζελατίνη συμπεραίνεται ότι η εν λόγω δραστηριότητα οφείλεται σε prommp-2 και MMP-2, αντίστοιχα. Σε ορισμένα δείγματα, παρατηρήθηκαν ζώνες λύσης οι οποίες μετανάστευσαν κατά τη ζυμογραφία στο πήγμα πολυακρυλαμιδίου ζελατίνης κατά ακριβώς παρόμοιο τρόπο όπως η καθαρή μορφή prommp-9 (92.0 kda) και η MMP-9 (78.0 kda) του εμπορίου (Σχήμα α). Με την ταυτόχρονη ηλεκτροφόρηση δειγμάτων πρωτεϊνών αναφοράς γνωστού μοριακού βάρους, υπολογίστηκε ότι το μοριακό βάρος των δύο ανώτερω ζωνών λύσης είναι 88 και 80 kda αντίστοιχα. Για την εξακρίβωση της ταυτότητας των υπευθύνων ενζύμων για τις εν λόγω ζώνες λύσης, η ζυμογραφική ανάλυση έγινε, επίσης, παρουσία εκλεκτικών και μη εκλεκτικών αναστολέων των μεταλλοπρωτεϊνασών, όπως χαρακτηριστικά απεικονίζεται στο Σχήμα 2 για ένα δείγμα υπαμφιβληστροειδικού υγρού. Παρατηρήθηκε ότι οι 88 και 80 kda ζώνες λύσης εξαφανίζονται όταν η ζυμογραφία γίνεται παρουσία των χηλικών ενώσεων Na 2 EDTA (20 mm) (Σχήμα 2, διάδρομος 4), ή 1,10-φαινανθρολίνης (4 mm) (Σχήμα 2, διάδρομος 5), ή υδροχλωρικής βενζαμιδίνης (5 mm) (Σχήμα 2, διάδρομος 6), αλλά δεν επηρεάζονται παρουσία PMSF (1 mm) (Σχήμα 2, διάδρομος 82

83 7), ή NEM (5 mm) (Σχήμα 2, διάδρομος 8). Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι οι 88 και 80 kda ζώνες λύσης οφείλονται σε δραστηριότητα μεταλλοπρωτεϊνασών και όχι σε πρωτεϊνάσες σερίνης, θειόλης ή κυστεΐνης. Δεδομένου του μοριακού βάρους των υπευθύνων ενζύμων και του γεγονότος ότι αποδομούν τη ζελατίνη συμπεραίνεται ότι η εν λόγω δραστηριότητα οφείλεται σε prommp-9 και MMP-9, αντίστοιχα. A kda prommp-9 (94.0 kda) MMP-9 (68 kda) prommp-2 (65.0 kda) MMP-2 (52.0 kda) B kda prommp-9 (94.0 kda) MMP-9 (68 kda) prommp-2 (65.0 kda) MMP-2 (52.0 kda) Γ kda prommp-9 (94.0 kda) MMP-9 (68 kda) prommp-2 (65.0 kda) MMP-2 (52.0 kda) Σχήμα 1. Χαρακτηριστικές ζυμογραφίες ζελατίνης δειγμάτων (2 μg πρωτεΐνης) υπαμφιβληστροειδικού υγρού μετά από αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς (Α), υαλοειδούς υγρού μετά από αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς (Β), και υαλοειδούς υγρού από μάρτυρες (Γ). Το μοριακό βάρος που αντιστοιχεί στις διαφανείς ζώνες λύσης λόγω ενζυμικής δραστηριότητας στα δείγματα υπολογίσθηκε με ηλεκτροφόρηση και σύγκριση με καθαρή μορφή prommp-2 (72.0 kda), MMP-2 (64.0 kda), prommp-9 (92.0 kda) και MMP-9 (78.0 kda) του εμπορίου (βέλη δεξιά), καθώς και με ηλεκτροφόρηση δειγμάτων πρωτεϊνών αναφοράς γνωστού μοριακού βάρους: φωσφορυλάση β (97.4 kda), λευκωματίνη βόειου ορού (66.2 kda), αφυδρογονάση του L-γλουταμινικού (55.0 kda) και οβαλβουμίνη (42.7 kda) (βέλη αριστερά). Α: Διάδρομος 1: καθαρή μορφή prommp-2 (72.0 kda) και MMP-2 (64.0 kda). Διάδρομος 2: καθαρή μορφή prommp-9 (94.0 kda) και MMP-9 (

84 kda). Διάδρομος 3, 7, 8, 9: δείγματα υπαμφιβληστροειδικού υγρού μετά από αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς. Διάδρομος 4, 5, 6: δείγματα υπαμφιβληστροειδικού υγρού μετά από αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς και υποτροπή. Β: Διάδρομος 1: πρωτεΐνες αναφοράς γνωστού μοριακού βάρους. Διάδρομος 2: καθαρή μορφή prommp-2 (72.0 kda) και MMP-2 (64.0 kda). Διάδρομος 3, 7, 8, 9, 10, 11: δείγματα υαλοειδούς υγρού μετά από αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς. Διάδρομος 4, 5, 6: δείγματα υαλοειδούς υγρού μετά από αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς και υποτροπή. Γ: Διάδρομος 1: πρωτεΐνες αναφοράς γνωστού μοριακού βάρους. Διάδρομος 2-10: δείγματα υαλοειδούς υγρού από μάρτυρες prommp-9 (94.0 kda) MMP-9 (68 kda) prommp-2 (65.0 kda) MMP-2 (52.0 kda) Σχήμα 2: Τυπική ζυμογραφία ζελατίνης απουσία και παρουσία αναστολέων πρωτεασών. Διάδρομος 1: καθαρή μορφή prommp-2 (72.0 kda) και MMP-2 (64.0 kda). Διάδρομος 3 Δείγμα υπαμφιβληστροειδικού υγρού. Διάδρομος 4-8: υπαμφιβληστροειδικό υγρό παρουσία: Na 2 EDTA (20 mm) (διάδρομος 4), 1,10-φαινανθρολίνη (4 mm) (διάδρομος 5), υδροχλωρική βενζαμιδίνη (5 mm) (διάδρομος 6), PMSF (1 mm) (διάδρομος 7), NEM (5 mm) (διάδρομος 8). Βέλη δεξιά: σημεία έκλουσης καθαρής μορφής prommp-2 (72.0 kda), ενεργού MMP-2 (64.0 kda), prommp-9 (92.0 kda) και ενεργού MMP-9 (78.0 kda) του εμπορίου. Τέλος, ειδικά στα δείγματα υπαμφιβληστροειδικού υγρού μετά από αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς παρατηρήθηκε μια ενδιάμεση ζώνη λύσης, μεταξύ ΜΜΡ-9 και prommp-2, η οποία μετανάστευσε κατά τη ζυμογραφία στο πήγμα πολυακρυλαμιδίου ζελατίνης με μοριακό βάρος που αντιστοιχούσε στα 74 kda (Σχήμα 1,Α). Η εν λόγω ενζυμική δραστηριότητα ήταν αυξημένη κατά 3 περίπου φορές στο υπαμφιβληστροειδικό υγρό μετά από υποτροπή της αποκόλλησης του αμφιβληστροειδούς (Σχήμα 1,Α, Πίνακας 2, Α). B.3.A.1.1. Ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης της ζυμογραφίας με πυκνομετρία σάρωσης Η ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης έγινε με πυκνομετρία σάρωσης, με τη βοήθεια ειδικού προγράμματος στον ηλεκτρονικό υπολογιστή. Χαρακτηριστικά παραδείγματα ποσοτικοποίησης των ζωνών λύσης της ζυμογραφίας απεικονίζονται στον Πίνακα α. Η ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης με πυκνομετρία σάρωσης για το σύνολο των δειγμάτων απεικονίζεται στον Πίνακα 2. 84

85 Πίνακας 2: Χαρακτηριστικά παραδείγματα ποσοτικοποίησης των ζωνών λύσης της ζυμογραφίας, με πυκνομετρία σάρωσης σε ηλεκτρονικό υπολογιστή. Α. Υπαμφιβληστροειδικό υγρό μετά από αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς (ΥΥ) ή μετά από αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς και υποτροπή (ΥΥΥ) prommp-9 (94.0 kda) MMP-9 (68 kda) prommp-2 (65.0 kda) MMP-2 (52.0 kda) Διάδρομος Υπαμφιβληστροειδικό υγρό ΥΥ ΥΥΥ ΥΥΥ ΥΥΥ ΥΥ ΥΥ ΥΥ Ζώνη λύσης Ένταση πυκνότητας ζώνης (τυχαίες μονάδες) prommp MMP kda-mmp prommp MMP B. Υαλοειδές μετά από αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς (ΑΑ) ή μετά από αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς και υποτροπή (ΥΑΑ) prommp-9 (94.0 kda) MMP-9 (68 kda) prommp-2 (65.0 kda) MMP-2 (52.0 kda) Διάδρομος Υαλοειδές ΑΑ YΑΑ YΑΑ YΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ ΑΑ Ζώνη λύσης Ένταση πυκνότητας ζώνης (τυχαίες μονάδες) prommp MMP prommp MMP

86 prommp-9 (94.0 kda) MMP-9 (68 kda) prommp-2 (65.0 kda) MMP-2 (52.0 kda) Γ. Υαλοειδές από μάρτυρες. Διάδρομος Υαλοειδές Μάρτυρας Ζώνη λύσης Ένταση πυκνότητας ζώνης (τυχαίες μονάδες) prommp MMP prommp MMP

87 B.3.A.1.2. Ενεργοποίηση των MMP με 4 αμινοφαινυλο-υδραργυρικό οξικό οξύ (4-aminophenyl-mercuric acetate, APMA) Δείγματα υαλοειδούς και υπαμφιβληστροειδικού υγρού, (2 μg πρωτεΐνης), επωάσθηκαν με APMA (1 mm, σε 1% διμεθυλοσουλφοξίδιο, DMSO) για 24 h, και ακολούθως υποβλήθηκαν σε ζυμογραφία ζελατίνης. Ανεξαρτήτως της προέλευσης του δείγματος, οι ζώνες λύσης που αντιστοιχούσαν στην prommp-2 μετατράπηκαν μερικώς σε ζώνες λύσης που αντιστοιχούν σε MMP-2. Χαρακτηριστικό παράδειγμα απεικονίζεται στο Σχήμα 3 για ένα δείγμα φυσιολογικού υαλοειδούς, ένα δείγμα υπαμφιβληστροειδικού υγρού μετά από αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς και ένα δείγμα υπαμφιβληστροειδικού υγρού μετά από υποτροπή της αποκόλλησης του αμφιβληστροειδούς. Ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης με πυκνομετρία σάρωσης, έδειξε ότι το σύνολο της έντασης της πυκνότητας των 2 ζωνών λύσης μετά την επεξεργασία με ΑΡΜΑ δεν ελαττώθηκε σε σχέση με το σύνολο της αρχικής έντασης της πυκνότητας των ζωνών λύσης 66 και 62 kda πριν την επεξεργασία με ΑΡΜΑ. Η μερική μετατροπή της ζώνης λύσης 66 kda σε ζώνη λύσης 62 kda που προκάλεσε το APMA και η τελική σταθερότητα της ζώνης λύσης 62 kda, ακόμη και μετά από παρατεταμένη επεξεργασία με APMA, υποδεικνύουν ότι η prommp-2 (66 kda) και η ΜΜΡ-2 (62 kda) των δειγμάτων υαλοειδούς και υπαμφιβληστροειδικού υγρού βρίσκεται σε μορφή συμπλόκου με TIMP-1 ή TIMP-2. Εάν υπήρχε ελεύθερη-τιμρprommp-2 ή ελεύθερη-τιμρ-mmp-2 στα δείγματα, θα αναμένονταν σημαντική μείωση της συνολικής έντασης της πυκνότητας των 2 ζωνών λύσης μετά την επεξεργασία με ΑΡΜΑ, δεδομένου ότι όταν η ελεύθερη-timpprommp-2 εκτεθεί σε APMA, αρχικά μετατρέπεται σε MMP-2 (65-60 kda), η οποία είναι ασταθής, και ακολούθως αυτο-πέπτεται μέσα σε λίγες ώρες. Κατά παρόμοιο τρόπο, και ανεξαρτήτως της προέλευσης του δείγματος, οι ζώνες λύσης που αντιστοιχούσαν στην prommp-9 μετατράπηκαν σχεδόν ολοσχερώς σε ζώνες λύσης που αντιστοιχούν σε MMP-9 (Σχήμα 3). Ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης με πυκνομετρία σάρωσης, έδειξε ότι το σύνολο της έντασης της πυκνότητας των 2 ζωνών λύσης μετά την επεξεργασία με ΑΡΜΑ δεν ελαττώθηκε σε σχέση με το σύνολο της αρχικής έντασης της πυκνότητας των ζωνών λύσης 88 και 80 kda πριν την επεξεργασία με ΑΡΜΑ. Η μετατροπή της ζώνης λύσης 88 kda σε ζώνη λύσης 80 kda που προκάλεσε το APMA και η τελική σταθερότητα της ζώνης λύσης 80 kda, ακόμη και μετά από παρατεταμένη επεξεργασία με APMA, υποδεικνύουν ότι η prommp-9 (88 kda) και η ΜΜΡ-9 (80 kda) των δειγμάτων υαλοειδούς και υπαμφιβληστροειδικού υγρού βρίσκεται σε μορφή συμπλόκου με TIMP-1. Εάν υπήρχε ελεύθερη-τιμρ-prommp-9 ή ελεύθερη-τιμρ- MMP-9 στα δείγματα, θα αναμέναμε σημαντική μείωση της συνολικής έντασης της πυκνότητας των 2 ζωνών λύσης μετά την επεξεργασία με 87

88 ΑΡΜΑ, δεδομένου ότι όταν η ελεύθερη-timp-prommp-9 εκτεθεί σε APMA, αρχικά μετατρέπεται σε MMP-9 (82-78 kda), η οποία είναι ασταθής, και ακολούθως αυτο-πέπτεται μέσα σε λίγες ώρες. Τέλος, η 74 kda-mmp η οποία παρατηρήθηκε αποκλειστικά σε δείγματα υπαμφιβληστροειδικού υγρού μετά από αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς δεν ανιχνεύθηκε μετά από κατεργασία με APMA, γεγονός που υποδεικνύει ότι η 74 kda-mmp δεν βρίσκεται με τη μορφή συμπλόκου με TIMP. Υπαμφιβληστροειδές αποκόλληση, υποτροπή Υπαμφιβληστροειδές αποκόλληση Υαλοειδές μάρτυρας Τα καταγραφέντα επίπεδα των μεταλλοπρωτεϊνασών και του αναστολέα τους στα συλλεχθέντα δείγματα υπαμφιβληστροειδικού υγρού από ασθενείς συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα επίπεδα στα δείγματα μαρτύρων. Από την παραπάνω σύγκριση προέκυψε ότι τα μέσα επίπεδα των ΜΜΡ-1, prommp-2, MMP-3, MMP-8, prommp-9, ΜΜΡ-9 και TIMP-1 στα δείγματα υπαμφιβληστροειδικού υγρού ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα σε σχέση με τα μέσα επίπεδα των συγκεκριμένων ΜΜΡ και του ΤΙΜΡ στα δείγματα μαρτύρων (ΜΜΡ-1: p=0,001, prommp-2: p=0,047, ΜΜΡ-3: p=0,001, ΜΜΡ-8: p=0,006, proμμρ-9: p=0,001, ΜΜΡ-9: p=0,001, ΤΙΜΡ- 1: p=0,001). Οι μέσες συγκεντρώσεις της MMP-2 στα δείγματα υπαμφιβληστροειδικού υγρού των ασθενών ήταν ελαφρώς χαμηλότερα πλην όμως όχι σημα- prommp-9 (94.0 kda) MMP-9 (68 kda) prommp-2 (65.0 kda) MMP-2 (52.0 kda) APMA Σχήμα 3. Επίδραση του APMA στις MMP. Δείγματα υαλοειδούς και υπαμφιβληστροειδικού υγρού (2 μg πρωτεΐνης) επωάσθηκαν απουσία (-) ή παρουσία (+) APMA στους 37 C για 24 h, και υποβλήθηκαν σε ζυμογραφία ζελατίνης. B.3.A.2. Σύγκριση επιπέδων ΜΜΡs και ΤΙΜΡ-1 μεταξύ ασθενών και μαρτύρων 88