مجله دیابت و لیپید ایران. بهار 1389 دوره 9 (شماره 3)

Transcript

1 ه ب مجله دیابت و لیپید ایران. بهار 1389 دوره 9 (شماره 3) بررسی اثر محافظتی ) آنتی اکسیدانی) سیلیمارین برمیزان مرگ سلولی و تولید پراکسیداسیون چربی ناشی از گلوکز بالا در کشت سلول هاي عصبی PC12 *3 2 ١ یاسین اسدي ناهید ابوطالب علی محمد شریفی چکیده مقدمه: نوروپاتی یکی از عمدهترین عوارض در افراد دیابتی بوده که علت احتمالی آن مواجهه طولانی مدت سلولها با میزان بالاي گلوکز خون میباشد. این مواجهه موجب افزایش استرس اکسیداتیو و از جمله یکی از مهمترین عواقب آن یعنی پراکسیداسیون مواد به ویژه چربیها گردیده و با مرگ سلولی همراه است. سیلیمارین از خانواده فلاونوییدها بوده که به جهت خاصیت آنتی اکسیدانی نقش مهمی در بهبود بسیاري از بیماريهاي مزمن ایفا میکند. هدف این پژوهش بررسی اثر محافظتی (آنتی اکسیدانی) سیلیمارین بر میزان مرگ سلولی و تولید پراکسیداسیون چربیها ناشی از گلوکز بالا در سلولهاي عصبی PC12 عنوان یک مدل نوروپاتی دیابتی است. روشها: از سلولهاي PC12 به عنوان مدلی شناخته شده از سلولهاي عصبی استفاده شده و در 6 گروه مورد بررسی قرار گرفتند و پس از زمانهاي و 72 ساعت میزان حیات سلولی از طریق روش (Methyl-thiazol-tetrazolium) MTT و تولید پراکسیداسیون لیپیدي به روش سنجش (Malon di aldehyde) MDA بررسی شد. یافتهها: نتایج نشان داد که میزان حیات سلولی در گروه دوز بالاي گلوکز نسبت به گروه کنترل کاهش معناداري داشته و سیلیمارین با دوز 100 µm/ml به طور معناداري منجر به کاهش میزان مرگ سلولی گردید. همچنین سیلیمارین با دوز 100 µm/ml منجر به کاهش معنی دار رهایش میزان MDA در حضورگلوکز گردید. نتیجهگیري: براساس یافتههاي موجود گلوکز با غلظت 20 mg/ml موجب مرگ سلولهاي PC12 گردیده که سیلیمارین احتمالا از طریق کاهش پراکسیداسیون لیپیدي موجب کاهش مرگ ناشی از گلوکز بالا در سلولهاي عصبی میگردد. واژگان کلیدي: سلولهاي عصبیPC12 سیلیمارین رادیکالهاي آزاد اکسیژن دوز بالاي گلوکز پراکسیداسیون لیپیدي 1- کارشناس ارشد فیزیولوژي دانشگاه علوم پزشکی ایران 2- مرکز تحقیقات فیزیولوژي دانشگاه علوم پزشکی ایران 3- گروه فارماکولوژي مرکز تحقیقات علوم دارویی رازي دپارتمان فارماکولوژي و مرکز تحقیقات سلولی مولکولی دانشگاه علوم پزشکی ایران نشانی: دپارتمان فارماکولوژي مرکز تحقیقات علوم دارویی رازي دانشگاه علوم پزشکی ایران پست الکترونیک: iums.ac.ir تاریخ دریافت: 88/06/18 تاریخ درخواست اصلاح: 88/10/20 تاریخ پذیرش: 88/11/25

2 ] ه ب شریفی و همکاران: بررسی اثر محافظتی ) آنتی اکسیدانی) سیلیمارین برمیزان مرگ سلولی و مقدمه دیابت از جمله بیماريهاي مزمن و شایع در جهان است که به میزان متفاوتی تمام نژادهاي انسانی را گرفتار مینماید [1]. شیوع جهانی دیابت در سال 2000 طبق آمار 1 سازمان جهانی بهداشت 17 میلیون نفر بوده است. این رقم با آمریکا در سال تنها در 9/ (19/3 درصد میلیون نفر) برآورد شد که در افراد بالاي 65 سال این میزان به %21/6 افزایش یافت. بیماري دیابت در زمره شایعترین بیماريهاي غدد درونریز بشمار میآید [2]. این بیماري اختلال در متابولیسم چربیها پروتي ینها کربوهیدراتها و [3]. میباشد هیپرگلیسمی و اصلیترین مشخصه بیماران دیابتی است و از مهمترین عوامل شروع نوروپاتی محسوب میگردد [4 بنابراین مصرف انسولین داروهاي حساس کننده بافتها نسبت به انسولین با کاهش هیپرگلیسمی میتواند از نوروپاتی دیابتی پیشگیري نماید [5 6]. در حال حاضر کنترل قند خون بالا در بیماران 2 و 1 دیابتی نوع با روشهاي معمول بطور کامل امکانپذیر نمیباشد لذا احتمال بروز و ایجاد نوروپاتی در این بیماران سازوکارهاي وجود دارد. قابل ذکر است که نوروپاتی پس از شروع بسیاري از وارد مرحلهاي میگردند که در اکثر موارد برگشت ناپذیر میباشند. کاهش جریان خون اعصاب از سازوکارهایی است که به صورت غیر مستقیم از طریق ایسکمی به ایجاد نوروپاتی کمک مینماید متابولیک.[7] نیز دیابت بیماري در همچنین اختلالات منجر به استرس اکسیداتیو و اختلال در عملکرد میتوکندري گردیده که از علل مهم ضایعات ایجاد شده در نوروپاتی دیابتی میباشد [8 9]. با اندازهگیري غیر مستقیم استرس اکسیداتیو در نورونهاي حسی نمونههاي دیابتی این موضوع نشان داده شده است استرس اکسیداتیو هیدروژن آزادسازي.[10 11] ٢ ROS (H2O2) یون سوپراکسید شامل که و ( O2) در پراکسید نیتریک اکسید (NO ) میباشند موجب تغییرات در اجزاي سلول و از جمله پراکسیداسیون لیپیدي و متعاقبا مرگ سلولی میگردد. آنتیاکسیدانها از جمله موادي هستند که بنظر میرسد پیشگیري با کاهش میزان نمایند ROS.[12] آنتیاکسیدانی میباشند میگردند میگردند که بتوانند فلاونوییدها از از مرگ نورونی جمله که باعث کاهش آزادسازي مواد ROS.[12] دارا میباشند. فلاونوییدها ترکیبات متعددي را شامل این ترکیبات اثرات زیستی متنوعی در بدن سیلیمارین فلاونوییدي اثرات که است متعددي از جمله اثر ضد سرطانی و خواص آنتیاکسیدانی را موجب میشود [13]. سیلیمارین از میوه رسیده وخشک گیاه Silybum marianum بدست میآید [14]. سیلیمارین عصارهاي است که از چندین ایزومر تشکیل شده مهمترین ماده موجود در این عصاره سیلیبینین است که و حدود 80 درصد از این عصاره را شامل میشود [15]. با توجه به موارد ذکر شده فوق مطالعه حاضر در نظر دارد اثر محافظتی (آنتیاکسیدانی) سیلیمارین را بر میزان مرگ ناشی از رهایش رادیکالهاي آزاد در اثر میزان بالاي گلوکز در سلولهاي عصبی PC12 دیابتی مورد بررسی قرار دهد. روشها عنوان یک مدل نوروپاتی پژوهش حاضر از نوع مداخلهاي بوده و به صورت مقطعی انجام گردیده است. تعداد نمونههاي مورد آزمایش 8 عدد بود و کلیه آزمایشها براي تمامی گروهها 2 بار تکرار گردید.گروه هاي مورد مطالعه در این تحقیق عبارتند بودند از: 1- گروه کنترل( CO ) 2- گروه با گلوکز بالا( HG ) 3- گروه با گلوکز بالا به علاوه سیلیمارین با دوز 20 μm/ml (HGS20l) 4- گروه با گلوکز بالا به علاوه سیلیمارین با دوز (HGS60) 60 μm/ml 5- گروه با گلوکز بالا به علاوه سیلیمارین با دوز (HGS100) و 6- گروه با گلوکز بالا به علاوه سیلیمارین با دوز.(HGS200) 200 μm/ml سلولهاي PC12 از انستیتو پاستور ایران خریداري شد. 3 این سلولها در محیط کشت DMEM با %5 سرم جنین گاوي (FBS) %5 سرم اسبی( HS ) و %1 آنتی بیوتیک (پنیسیلسن + استرپتومایسین )که تماما از شرکت سیگما خریداري شدند تحت شرایط کشت (دماي 37 درجه سانتیگراد %95 O2 و ( %5 CO2 نگهداري شدند.[15] 3- Dulbeccoos Modfied Eagles Medium 1- World Health Organization 2- Reactive Oxygen Patios'

3 229 مجله دیابت و لیپید ایران. بهار 1389 دوره 9 (شماره 3) سلولهاي مورد نظر 24 ساعت پس از انتقال به درون فلاسک حاوي محیط کشت به کف فلاسک چسبیده و به تدریج حالت رشتهاي به خود میگیرند. این در حالی است که سلولهاي مرده کروي شده و در سطح محیط کشت شناور میگردند [15]. محیط کشت حاوي سلولهاي مرده حذف گردیدند و سلولهاي چسبیده به کف فلاسک با استفاده از تریپسین (TE) پاساژ داده شدند. سلولها پس از شمارش به تعداد 5000 سلول در هر چاهک به پلیت 24 خانهاي منتقل شدند. این سلولها پس از 24 ساعت رشد در معرض مواد قرار گرفتند. سیلیمارین(خریداري شده از شرکت سیگما) حل شده در الکل به محیط کشت حاوي سلولها اضافه گردید. یک ساعت پس از افزودن سیلیمارین گلوکز با غلظت mg/dl 20 جهت ایجاد مرگ به محیط کشت اضافه گردید و در زمانهاي و 72 ساعت بعد سلولها از نظر توان حیاتی و میزان تو لید رادیکالهاي آزاد اکسیژن مورد بررسی قرار گرفتند. نحوه اندازهگیري توان حیاتی سلولها به روش MTT MTT روشی براي تعیین سلولهاي زنده در بسیاري از نمونههاي بیولوژیک میباشد. در این روش معرف MTT یا تترازولیوم که مادهاي زرد رنگ است به نمونهها افزوده میشود تترازولیوم توسط آنزیم میتوکندریایی سوکسینیت دهیدروژناز شکسته شده و فورمازون نامحلول ایجاد میکند میزان فورمازون به روش اسپکتروفوتومتري اندازهگیري میشود [16]. در اجراي این روش به ترتیب زیر عمل شده است: 10 میکرو لیتر از محلولMTT (5 درصد)را به پلیت 96 چاهی اضافه شد و به مدت دو ساعت در دماي 37 درجه انکوبه گردید. در گام بعدي سلولها و کریستالهاي رنگی با اضافه کردن میکرو لیتر ازDMSO بصورت محلول درآمدند و میزان جذب نوري آنها در طول موج 570 نانومتر (رفرانس 620 نانومتر) در Readerخوانده شد. سلولی دارد ] 17]. دستگاه Elisa میزان جذب ارتباط مستقیم با حیات نحوه اندازهگیري میزان پراکسیداسیون لیپیدي به روش MDA یکی از موادي که در اثر پراکسیداسیون اسیدهاي چرب در سلولها تولید میشود مالون دي آلدهید( MDA ) است. این ماده وقتی که در معرض تیوباربیتوریک اسید (TBA) قرار میگیرد تشکیل پیوند میدهد. کمپلکس این دو ماده در نمونهها قابل تشخیص است و به شکل TBA-MDA-) (TBA تشکیل میگردد [17]. تمامی معرفهایی که قرار بود استفاده شود یک ساعت قبل از انجام پروتکل آماده شد تا تازه باشند و به خوبی مخلوط شد. نمونههایی که MDA در آنها مورد سنجش قرار گرفت سلولهایی بودند که در پلیتهاي 24 خانهاي کشت داده شدند. محلول دودسیل سولفات به نمونههاي سلولی اضافه گردید پس از هم زدن وارد لولههاي میکروسانتریفیوز شده و 5 دقیقه در دماي اتاق قرار داده شد. به هر میکروتیوب 250 میکرو لیتر از معرف TBA (خریداري از شرکت فراز گستر) اضافه شد و پس از این مرحله 100 میکرولیتر از محلول استیک اسید %20 (شرکت کیا آزما) به هر میکروتیوپ اضافه شد. درب میکروتیوبها بسته و در دماي 95 درجه سانتیگراد به مدت 45 تا 60 دقیقه انکوبه گردید تیوبها برداشته شد و با استفاده از ظرف یخ به دماي اتاق رسید نمونهها در دستگاه سانتریفیوژ با دور 3000 rpm و به مدت 15 دقیقه قرار داده شد. مایع رویی یا سوپرناتانت از میکروتیوبها جمعآوري شده در داخل کوبت اسپکتروفوتومتر ریخته و میزان جذب در طول موج نوري 532 نانومتر سنجیده شد.[17] آنالیز آماري تمامی اطلاعات بدست آمده به صورت mean± SEM گزارش شدهاند. براي مقایسه یک به یک متغیرها با هم از آزمون آماري Student t-test استفاده شد. اطلاعات مربوط به متغیرهاي متعدد توسط روش آماري one way ANOVA و با استفاده از برنامه JMP70 تجزیه وتحلیل گردید. < 0/05 P معنیدار در نظر گرفته شد. 1- Di Methyl Soulfat

4 شریفی و همکاران: بررسی اثر محافظتی ) آنتی اکسیدانی) سیلیمارین برمیزان مرگ سلولی و یافتهها بررسی توان حیاتی سلولها پس از سنجش توان حیاتی سلولها با روش MTT مشاهده شد که گلوکز با غلظت بالا به طور معنیداري پس از 48 ساعت باعث القاي مرگ سلولی شده و میزان جذب نوري که توسط سلولهاي زنده صورت میگیرد را کاهش داده است. سیلیمارین با دوزهاي 20 و µm/ml µm/ml 60 میزان سلولهاي زنده را نسبت به گروه با گلوکز بالا افزایش داد اما این اثر معنادار نبود. در حالی که سیلیمارین با دوز 100 µ M/ml توانست اثرات کشندگی گلوکز بالا را به طور معناداري کنترل کند. اما همان طور که در نمودار شماره 1 مشاهده میشود سیلیمارین با دوز 200µM/ml خود ایجاد مرگ سلولی کرد. نمودار 1- مقایسه توان حیاتی سلولها در گروههاي مختلف 48 ساعت پس از درمان با سیلیمارین نتایج حاصل از مقایسه توان حیاتی سلولها در گروههاي مختلف 48 ساعت پس از درمان با تجویز دوزهاي متفاوت داروي سیلیمارین بر حسب µ M/ML گلوکز بالا /ML) 20) µm و آنالیز یافتهها با استفاده از آزمون آماري n 8=.T-Student و 5000 سلول در هر چاهک انجام شده است. تفاوت معنیدار بین گروه 100+ گلوکز بالا ** کنترل در مقایسه با گروه گلوکز بالا (HG) >P 0/001 و گروه گلوکز بالا (HG) در مقایسه با گروه سیلیمارین µm/ml >P 0/005 مشاهده شد. بررسی میزان تولید رادیکالهاي آزاد اکسیژن با اندازهگیري MDA مشاهده گردید که سیلیمارین با غلظت 100µ M/ml و در زمان 48 ساعت پس از درمان به طور معنیداري منجر به کاهش رادیکالهاي آزاد اکسیژن میگردد که در نمودار شماره 2 نشان داده شده است.

5 231 مجله دیابت و لیپید ایران. بهار 1389 دوره 9 (شماره 3) نمودار 2- مقایسه میزان آزادسازي MDA در گروههاي مختلف در زمان 48 ساعت پس از درمان با سیلیمارین نتایج حاصل از متقایسه میزان آزادسازي MDA از سلولها در گروههاي مختلف 48 ساعت پس از درمان با تجویز دوزهاي متفاوت داروي سیلیمارین بر حسب µ M/ML گلوکز بالا /ML) 20) µm و آنالیز یافته ها با استفاده از آزمون آماري.T-Student 8= وn 5000 سلول در هر چاهک) انجام شده است. ** تفاوت معنیدار بین گروه کنترل در مقایسه با گروه گلوکز بالا (HG) >P 0/001 گروه سیلیمارین گلوکز (SIL100HG) در مقایسه با گروه گلوکز بالا (HG) >P 0/005 و گروه سیلیمارین 60 + گلوکز (SIL60HG) در مقایسه با گروه گلوکز بالا (HG) >P 0/005 مشاهده میگردد. بحث وقوع دیابت و عوارض متعاقب آن بطور چشمگیري در حال افزایش است. کاهش کیفیت زندگی و افزایش مرگ و میر از مشکلات جدي مبتلایان به دیابت میباشد. این مشکلات در دراز مدت و ناشی از عواقب مزمن بیماري ایجاد میگردند. نوروپاتی دیابتی که یکی از عواقب مزمن بیماري دیابت میباشد میتواند منجر به نارساییهاي متعدد در اعصاب محیطی حسی و حرکتی و همچنین در اعصاب خودکار گردد. وقتی نورونهاي محیطی در معرض غلظتهاي بالاي گلوکز قرار میگیرند تغییرات از درون سلول آغاز میشود که در ادامه و نهایتا به کمک عوامل عروقی و تغییرات بین بافتی منجر به تخریب سلولهاي عصبی میگردند. از جمله تغییراتی که در اثر مواجهه با گلوکز بالا ایجاد میشود تولید رادیکالهاي آزاد اکسیژن نیتروژن و پراکسیداسیون اسیدهاي چرب در سلول میباشد که منجر به تحت تاثیر قرار دادن میزان حیات سلولی میگردند [18]. در این مطالعه اثرات محافظتی سیلیمارین بر مرگ سلولی و رهایش رادیکالهاي آزاد بر اثرگلوکز بالا بر روي سلول PC12 به عنوان مدلی از نورون محیطی مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه بطور معنیداري سیلیمارین موجب کاهش مرگ سلولهاي PC12 در اثر میزان بالاي گلوکز گردید و از طرف دیگر از پراکسیداسیون سلولی حاصل گلوکز بالا نیز بطور معنیداري جلوگیري نمود. شواهد متعددي مبنی بر تاثیر مطلوب مواد آنتیاکسیدان در کنترل نوروپاتی دیابتی موجود است. در مطالعاتی که بر روي موش صحرایی دیابتی صورت گرفت مشاهده شد که میزان مالون دي آلدهید (MDA) در نورونها افزایش و فعالیت آنزیم SOD (سوپراکسید دیسموتاز)کاهش یافت [19]. عوامل آنتیاکسیدانی از جمله ویت امین C U83836E E وآلفا لیپوییک اسید در کنترل نوروپاتی موثر بودهاند [20]. همچنین ملاتونین نیز به طور موثر بیان آنزیمهاي آنتیاکسیدانی را افزایش میدهد [21].

6 شریفی و همکاران: بررسی اثر محافظتی ) آنتی اکسیدانی) سیلیمارین برمیزان مرگ سلولی و مطالعات بسیاري پیرامون اثرات سیلیمارین در محیط کشت و بر انواع سلولها صورت گرفته است که با نتایج مشابه بدست آمده از این مطالعات بر اثرات آنتیاکسیدانی و ضد سرطانی این عصاره گیاهی دلالت دارد [22]. در مطالعهاي که اخیرا انجام شده آنتیاکسیدانهایی مانند سیلیمارین و کوارستین با ثبات بخشیدن به گانگلیوزیدهاي غشایی باعث تداوم غشاهاي زیستی و افزایش توان حیاتی سلولها شدهاند. ازطرفی عوامل کارسینوژن مانند آرسنیک باعث ایجاد بدخیمی در سلولهاي پوست و القاي استرس اکسیداتیو شده که سلیمارین تا حدودي با هر دو پدیده مقابله میکند [23]. سیلیمارین همچنین در سلولهاي عصبی PC12 باعث افزایش فاکتور رشد عصبی (NGF) شده و افزایش حیات سلولی در محیط کشت گردیده است. سیلیمارین در سلولهاي کشت شده هیپوکامپ موش صحرایی باعث کاهش آپوپتوز ناشی از مواد میشود[ 24 ]. همچنین سیلیمارین در محیط کشت باعث تمایز این سلولها میگردد. از طرفی مشاهده شده است که سیلیمارین با مهار گیرندههاي تیروزین کیناز که بوسیله فاکتور رشد فعال میشوند از رشد و تمایز بی رویه سلولی و بعبارت دیگر از سرطانی شدن آنها پیشگیري مینماید [24]. با توجه به موارد ذکر شده اثر سیلیمارین بر سازوکارهاي داخل سلولی و همچنین اثر مهار کنندگی و یا محرك رشد آن وابسته به دوز و مدت زمان تماس سلولها در معرض دارو میباشد. نتایج حاصل از پژوهشی که انجام شد نشان میدهد که اثرات توکسیک گلوکز با غلظت 20mg/dl بر سلولها در کمتر از 24 ساعت شروع میشود و میزان حیات سلولی را کاهش میدهد. با گذشت زمان اثرات توکسیک گلوکز بر سلولها بیشتر میشود تا اینکه پس از 48 ساعت میزان سمیت ناشی از گلوکز به بیش از دو برابر میرسد اما بین زمانهاي 48 و 72 ساعت پس از افزودن گلوکز تفاوت معنیداري مشاهده نمیشود. این یافته نشان میدهد که زمان مطلوب براي ایجاد اثرات توکسیک همان زمان 48 ساعت پس از افزودن گلوکز است. از طرفی وقتی در کنترل این اثرات توکسیک با سیلیمارین دارو به صورت وابسته به دوز عمل مینماید در زمان 24 ساعت با افزایش دوز سیلیمارین از توان حیاتی سلولها کاسته میشود که ممکن است به علت اثرات آنتی کارسینوژنیک سیلیمارین با دوزهاي پایین باشد. اما با گذشت زمان مشاهده میگردد که با افزایش دوز سیلیمارین توان حیاتی سلولها افزایش مییابد. با توجه به این یافتهها بنظر میرسد که اثرات آنتیاکسیدانی سیلیمارین در دوزهاي بالاتر و نه دوزهاي بسیار بالا قابل مشاهده خواهد بود. زمان مطلوب براي مشاهده اثرات آنتیاکسیدانی 48 ساعت پس از افزودن سیلیمارین به محیط کشت بود. طی زمان مذکور بیشترین افزایش در توان حیاتی سلولها مشاهده شد. بیشترین اثر کاهش آزادسازي MDA از سلولها توسط سیلیمارین در 48 ساعت پس از درمان و با دوز 100 µm/ml ایجاد شده است. از نتایج بدست آمده این گونه استنباط میشود که احتمالا سیلمارین در هر دو دوز 60 و 100 µm/ml باعث ک اهش می زان MDA میگردد اما سیلیمارین در دوز 100µM/ml ممکن است از طریق سازوکارهاي دیگر موجب افزایش هرچه بیشتر حیات سلولی شده باشد لذا توصیه میگردد در مطالعات آینده اثر دوزهاي مختلف داروي مورد نظر بر سایر سازوکارهاي مرتبط با حیات سلولی بررسی شود. همچنین مشاهده گردید که سیلیمارین در دوزهاي بالاتر µm/ml) 200) اثرات توکسیک بر سلولها اعمال مینماید و باعث کاهش توان حیاتی سلولها و افزایش آزادسازي MDA میشود. احتمالا سیلیمارین نیز مانند برخی آنتیاکسیدانها در دوزهاي بالاتر به عنوان یک پرواکسیدان عمل مینماید.[25] در مشاهده و تفسیر نتایج سیلیمارین در دوز 60 و 20 میلی مولار /میلی لیتر در میزان حیات سلولی و نتیج دوزهاي مشابه در میزان MDA شاید بتوان توضیح داد که میزان افزایش میزان MDA در قیاس با میزان ایجاد مرگ سلولی همخوانی دقیق وجود ندارد اگرچه جهت تغییر آنها تا حدي در یک راستا میباشد. توضیح اینکه در اثر غلظت بالاي گلوکز حدود 4 برابر میزان کنترل میزان MDA افزایش مییابد و این در حالیست که مرگ سلولها به میزان حدود ثلث میزان کنترل در اثر همان میزان گلوکز میباشد. لذا اگرچه میزان MDA در اثر سیلیمارین غلظت

7 233 مجله دیابت و لیپید ایران. بهار 1389 دوره 9 (شماره 3) 60 میلی مولار/میلی لیتر حدود 30 درصد کاهش یافته ولی مرگ سلولی به همان میزان نتوانسته است کاهش یابد. بعبارت دیگر میزان بیشتر کاهش MDA لازم است تا بتواند بطور معنیداري مرگ سلولی را کاهش دهد. پس در مجموع مشاهده میکنیم که سیلیمارین با دوز 100 µm/ml و در زمان 48 ساعت پس از ورود به محیط کشت حاوي سلولها به طور معنیداري داراي اثرات محافظتی بر سلولهاي PC12 بوده و باعث کاهش در رهایش رادیکالهاي آزاد ناشی از گلوکز بالا شده است. شاید با یک بررسی دقیقتر بتوان از داروهاي گیاهی ماخذ آنتیاکسیدانی مشابه سیلیمارین در جلوگیري از عوارض دیابت استفاده نمود. سپاسگزاري نویسندگان این مقاله مراتب تشکر و قدردانی خود را از گروه فیزیولوژي وگروه فارماکولوژي دانشگاه علوم پزشکی ایران به سبب فزاهم آوردن امکانات پژوهشی و همچنین معاونت پژوهشی دانشگاه ایران به موجب تا مین مالی پروژه اعلام می دارند. 1. Wild S, RoglicG, GreenA, SicreeR, KingH.Global prevalence of diabetes: estimates for the year2000 and projections for Diabetes care 2004; 27: Anderoli T E, CaroenterCCJ, GariggsRC, Loscaizo J. Cecil essential of medicine 5 th edition, 2001; chapter68, P ٣. همایونفر,ه."علم اندوکرینولوژي در پزشکی"انتشارات دانشگاه علوم پزشکی ایران ; 1382 (5): Vinik AI, Porte D Jr, Sherwin RS, Baron A. Diabetic autonomic neuropathy. In Ellenberg and Rifkin s diabetes mellitus. New York: McGraw Hill 2002; Skyler JS, Effect of glycemic control on diabetic complications and on the prevention of diabetes. Clinical Diabetes 2004; 22: Chronic Complications in Diabetes. Animal Models and Chronic Complications. 2000; P Sheetz MJ King GL.molecular understanding of hyperglycemias adverse effects for diabetic complications. AMA 2002; 288: Pacher P, Obrosova I G, Mabley J G, Szado C. Role of introsative stress and proxynitrite in the pathogenesis of diabetic complications. Emerging new therapeutical strategies. Curr Med Chem 2005; 12: Vinik AI, Diabetic neuropathy: Pathogenesis and therapy. Diabetes 2002; Russell JW, Golovoy D,Vincent AM, Mahendru P, Olzmann JMentzer EL. High glucose Stress and mitochondrial dysfunction in neurons. FASEB J 2002; 16: Geolotto G, Gallo A, Rosiglitazon reduces glucose-induced oxidative stress mediated by NADPH oxidase via MAPK- dependent mechanism. Diabetes 1997; 13: Fraschini F, Demartini G, Exposit D. Pharmacology of Silymarin. Cline drug invest 2002; 22(1): Firenzuoli F, Gori L. Crupi A, Neri D. Flavenoeids: risks or opportunities? Recenti Prog Med 2004; 95(7-8) Fraschini F, Gori L, Esposti D, Pharmacology of Silymarin. Clin drug invest 2002; 22: Li Y, Decherchi P, and Raisman G, Transplanation of olfactory ensheathing cells into spinal cord lesions restores breathing and climbing. J Neurosci 2003; 23: Wang TTY, Phang JM, Effects of estrogen on apoptotic pathways in human breast cancer cell line MCF-7. Cancer Res 1995; 55: Kwon, T and watts. Malonaldehyde in aqueous solution and iys role as a measure of lipid oxidation in foods. Journal of Food Science 1998; 29: Sharifi AM, Darabi R, Akbarloo N, Larijani B, Khoshbaten A. Study of high glucose-induced apoptosis in PC 12 cells: role of bax protein. Elsevier toxicology Baluchnegad T,Homayunfar H,Roghani M,khastkhodaei Z. Survey of the effect of Silymarin on diabetic neuropathy in male rat. J iran un 2008; Sayyed, SG, Kumar A, Sharma SS. Effects of U8383 on nerve functions. hyperalgesia and oxidative stress in experimental diabetic neuropathy. Life Sci 2006; 79(8): Esparza JL, Gomez M, Rosa NM, Paternian JL, Malool, Domigo JL. Melatonin induces oxidative stress and increases gene expression in the cerebral cortex and cerebellum of aluminum-exposed rats. Journal of pineal Research 2005; 39: Elio A.Soria, AldoR, Eynard, Patricia L. Quiroga, Guillermina A. Bongiovanni Differential effects of quercetin and Silymarin on arsenate-induced cytotoxicity in two human breast adenocarcinoma cell lines. Cell Cul 2007; 18:54.

8 شریفی و همکاران: بررسی اثر محافظتی ) آنتی اکسیدانی) سیلیمارین برمیزان مرگ سلولی و KitturS, Wilasrusmee S, Pedersen WA, Mattson MP, Straube-West K, Wilasrusmee C, Jubelt B, KitturD.S. Neurotrophic and Neuroprotective Effects of Milk Thistle (Silybum marianum) on Neurons in Culture. J ubelt 2002; Shiqin Xiong, Qiuhui Zhao, Zhili Rong, Guanrong Huang, Yiling Huang, Peila Chen, Shuping Zhang, Li Liu, and Zhijie Chang. hsef Inhibits PC-12 Cell Differentiation by Interfering with Ras-Mitogen-activated Protein Kinase MAPK Signaling. J cell 2003; Silvano Nocentini, Miche` le Guggiari, Danielle Rouillardand Sophie Surgis. Exacerbating Effect of Vitamin E Supplementation on DNA Damage Induced in Cultured Human Normal Fibroblasts by UVA Radiation. MS 2001; 33:71-73.