Physiology and Pharmacology

Transcript

1 تا سیس ١٣۴٧ جلد 12 شمارة 1 بهار 1387 Physiology and Pharmacology, 14(3), Autumn 2010 [Article in Persian] Physiology and Pharmacology Caspase inhibition in neuroinflammation induced by soluble β amyloid monomer, protects cells from abnormal survival and proliferation, via attenuation of NFқB activity Azadeh Abdi 1, Fatemeh Mohagheghi 1, S. Homayoon Sadraie 2, Leila Dargahi 1, Leila Khalaj 1, Abolhassan Ahmadiani 1* 1. Dept. Pharmacology, Neuroscience Research Center, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran 2. Dept. Anatomy, School of Medicine, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran Abstract Received: 18 May 2010 Accepted: 24 July 2010 مرفین و بیان ژن برخی آنزیمهاي دخیل در بیوسنتز و تجزیه کتکولامینها ستاریان و همکاران Introduction: Evidence suggests that neuronal apoptosis in neurodegenerative diseases is correlated with inflammatory reactions. The beneficial or detrimental role of apoptosis in neuroinflammation is unclear. Elucidating this question may be helpful in management of neurodegenerative diseases. Since TNF-α is able to induce apoptosis as well as increased viability of the cells by activation of caspases or NF-қB, respectively, the question is what will happen if the balance between the two pathways is disturbed by inhibition of apoptosis. Methods: In this study, we used β amyloid peptide (soluble Aβ monomer) injection into the Wistar male rat prefrontal cortex for induction of neuroinflammation in the hippocampus. Levels of TNF-α and caspase-3 were determined via western blot analysis. Using chronic intracerebroventricular administration of caspase inhibitors, z-vad fmk and z-devd-fmk, we inhibited apoptosis. Exploring consequences of apoptosis inhibition, activity of NF-қB was evaluated via western blotting. Results: After β amyloid peptide injection we observed an increase in TNF-α and caspase3 as an inflammatory cytokine and apoptotic marker, respectively (P<0.001 and P<0.0001, respectively). As a consequences of apoptosis inhibition, nuclear NF-κB was decreased and cytosolic NF-κB was increased and these changes were significant compared to Aβ-injected group (P<0.001 and P<0.05, respectively). Conclusion: Caspase inhibition as an initiator of apoptosis, probably by attenuation of NF-қB activity, protect cells from abnormal survival and proliferation. Key words: neuroinflammation, apoptosis, NF-κB, caspase-3, cell proliferation * Corresponding author aahmadiani@yahoo.com Available online at:

2 (3) پاییز 1389 تا سیس ١٣۴٧ جلد 12 شمارة 1 بهار 1387 مهار کاسپاز طی التهاب عصبی القا شده توسط محلول مونومر آمیلوي ید بتا (AΒ) از طریق کاهش فعالیت NFҚB سلولها را در قبال افزایش غیر طبیعی توان زیستی و تکثیرشان حفاظت می کند * آزاده عبدي فاطمه محققی سید همایون صدرایی لیلا درگاهی لیلا خلج ابوالحسن احمدیانی 1. مرکز تحقیقات علوم اعصاب گروه فارماکولوژي دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی تهران 2. گروه آناتومی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی تهران دریافت: 28 اردیبهشت 89 پذیرش: 2 مرداد 89 چکیده مرفین و بیان ژن برخی آنزیمهاي دخیل در بیوسنتز و تجزیه کتکولامینها ستاریان و همکاران مقدمه: شواهد حاکی از آن است که در بیماریهاي نورودژنراتیو آپپتوز با واکنشهاي التهابی مقارن است. نقش بهبودبخشی و یا تخریبی آپپتوز در التهاب عصبی نامعلوم است. بنابراین روشن شدن این مطلب می تواند در مدیریت بیماریهاي نورودژنراتیو موثر باشد. از آنجا که TNFα می تواند هم آپپتوز و هم توان زیستی سلولها را به ترتیب توسط کاسپاز و فعال شدن NFқB را القا کند این سوال که اگر تعادل بین این دو مسیر توسط مهار آپپتوز به هم بخورد چه رخ می دهد مطرح می شود. روشها: در این مطالعه به منظور القاي التهاب عصبی در هیپوکمپ از تزریق محلول مونومر آمیلوي ید بتا (Aβ) به کورتکس پري فرونتال رتهاي نر از نژاد ویستار استفاده شد. پس از تزریق میزان TNFα و کاسپاز 3 توسط وسترن بلات تعیین شد. در گروهی دیگر پس از تزریق Aβ تجویز مزمن داخل بطنی مهار کننده هاي کاسپاز شامل -z NFқB به مغز به منظور مهار کاسپاز 3 صورت گرفت. براي بررسی عواقب مهار آپپتوز فعالیت z-devd-fmk و VAD- fmk یافتهها: پس از تزریق Aβ به کورتکس پري فرونتال افزایش TNFα توسط وسترن بلات ارزیابی شد. و کاسپاز 3 به ترتیب به عنوان سیتوکین التهابی و مارکر آپپتوز دیده شد (به ترتیب 0/001>P و 0/0001>P). پس از مهار کاسپاز 3 سطح NFқB هسته اي کاهش و سطح NFқB سیتوزولی افزایش یافت که این تغییرات از لحاظ آماري در مقابل گروهی که تنها تزریق و 0/05>P). داشتند معنی دار بود ) به ترتیب 0/001>P Aβ می کند. نتیجهگیري: احتمالا مهار کاسپاز به عنوان عامل آغازگر آپپتوز از طریق کاهش فعالیت NFқB سلولها را در قبال افزایش غیر طبیعی توان زیستی و تکثیرشان حفاظت * واژههاي کلیدي: التهاب عصبی آپپتوز NFқB کاسپاز 3 تکثیر سلولی مقدمه* التهاب پاسخ فیزیولوژیکی به انواع مختلف آسیبهاي بافتی نویسندة مسي ول مکاتبات: وبگاه مجله: آبشاري از واکنشهاي سلولی و شیمیایی هماهنگ است. در پدیده التهاب سایتوکاینهاي مختلفی تولید می شوند که با القاء بیان ژنهاي ویژه اي می توانند روي سرنوشت سلول نقش داشته باشند. التهاب نورونی حاد که به دنبال سکته یا تروما ایجاد می شود با افزایش میزان مرگ نورونی می تواند aahmadiani@yahoo.com

3 جلد 14 شماره 3 پاییز آسیبهاي نورونی را توسعه دهد. از طرفی توانایی پلاستی سیتی نورونها را نیز افزایش داده و می تواند تا حدي عملکرد نورونها را بهبود بخشد. در حالیکه التهاب نورونی مزمن به دلیل مرگ سلولی بیشترو وسیعتر منجر به بروز شرایط پاتولوژیک از قبیل بیماریهاي خودایمنی (از جمله اسکلروزیز متعدد) و بیماریهاي نورودژنراتیو (مثل آلزایمر) می شوند [5]. التهاب مغزي وابسته به سنتز و ترشح ملکولهاي نورواکتیو خصوصا از سلولهاي گلیال فعال شده شامل سیتوکینها TNFα) IL-1β و...) رادیکالهاي آزاد واکنشی اکسیژن و نیتروژن پروتي ینهاي کمپلمان آمینواسیدهاي تحریکی پروتي ازها و... می باشد [8]. به طور کلی التهاب از نظرایجاد محدودیت زندگی و تکثیر پاتوژن حمله کننده شروع توان زیستی بافت ترمیم بهبود و حفظ انرژي به نفع موجود زنده می باشد. هرچند که التهاب وسیع و کنترل نشده می تواند بسیار مخرب باشد [4]. پپتید آمیلوي ید بتا (Aβ) به خصوص Aβ(1-42) براي نورونها سمی است و بنابراین شدیدا با فقدان عملکرد مغزي طی بیماري آلزایمر همراه است. این امر سبب فعال شدن و مهاجرت آستروسیتها و میکروگلیاها می شود که خود مسیرهاي سیتوتوکسیک نورونی را واسطه گري می کنند. در سالهاي اخیر بیشتر مطالعات بر فعال شدن میکروگلیاها توسط Aβ با توجه به ترشح سیتوکینهاي التهابی مانند TNFα و IL-β فعال شدن فاکتورهاي کمپلمان و رها شدن رادیکالهاي آزاد متمرکز شده اند 8].[21 TNFα می تواند هم سبب القاي تومورهایی چون سرطان پروستات و هم سبب القاي مرگ سلولی از نوع آپپتوز شود [24]. یکی از دلایل این امر آن است که TNFα از طریق دو رسپتور اعمال بیولوژیکی خود را بروز می دهد (TNFRI) P55.P57 TNF Receptor (TNFRII) و TNF Receptor TNFRI حاوي بخش درون سلولی به نام "دومین مرگ" است و در مرگ سلولی دخالت دارد در حالیکه TNFRII نقشی تروفیک و حفاظتی در توان زیستی نورونها دارد[ 2 6]. TNFα تولید شده در اطراف سلولهاي توموري و یا دچار التهاب می تواند توان زیستی سلولهاي توموري را توسط کد کردن ژنهاي ضد آپپتوز وابسته به NFқB مانند Bcl-xl 1 CIAP و 2 افزایش دهد [15 18]. در حقیقت التهاب مزمن 213 می تواند القاي تومور را افزایش دهد [1 12] وNFқB التهاب و سرطان را به هم مربوط می سازد. با توجه به ژنهاي هدف NFқB می توان پیش بینی کرد که رابطه تنگاتنگی بین این فاکتور رونویسی و سرطان وجود دارد به طوریکه در مدلهاي موشی مختلفی وابستگی فعالیت NFқB و پیشرفت تومور و متاستاز به خوبی نشان داده شده است [1 17]. 12 در مطالعه اي دیگر مشخص شد که TNFRI می تواند هم آپپتوز و هم توان زیستی سلول را القا کند. به طوریکه سیگنال فعال شده با TNFα دو گروه پروتي ین آداپتور و فاکتورهاي رونویسی را درگیر می کند TRAF-2 TNF receptor ) receptor interactive ) RIP و (associated factor-2 (protein که این دو مسیرهایی را القا می کنند که به ترتیب منجر به فعال شدن MAPkinase و NFқB می شوند. مطالعات در موشها و انسانها نشان داده که NFқB یک متوقف کننده براي آپپتوز است هر چند که MAPK ممکن است آپپتوز را مهار و یا القا کند [9]. برخی از مطالعات نیز به این موضوع پرداخته اند که فعال شدنNFқB ممکن است به عنوان فاکتور پیش برنده آپپتوز عمل کند [13 25]. در واقع سیتوکینهاي متعدد پیش برنده التهاب و کموکینهایی مثل IL-6 IL-1 TNFα و IL-8 وابسته به مسیر فعال شدن NFқB و پیشرفت تومور هستند [1 12]. بنابراین به طور کلی TNFα دو مسیر را فعال می کند یکی آپپتوز و دیگري NFқB و در نهایت تکثیر و القاي توان زیستی سلول. سوالی که اینجا مطرح می شود این است که چه رابطه اي بین این دو مسیر وجود دارد و آیا مسدود کردن یک مسیر می تواند مسیر دیگر را تشدید کند براي مشخص کردن این موضوع در این مطالعه از طریق مهار کننده هاي کاسپاز روند آپپتوز مهار شد و فعالیت NFқB اندازه گرفته شد. مواد و روشها رتهاي بالغ نر از نژاد ویستار ( گرم) از مرکز تحقیقات علوم اعصاب دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی تهیه و در دوره دوازده ساعته روشنایی-تاریکی (روشنایی بین ساعات 8-20) به تعداد سه رت در یک قفس با دسترسی آزاد آب و غذا نگهداري شدند. پس از یک هفته عادت حیوانها به

4 تاثیر مهار کاسپاز بر میزان فعالیت NFқB عبدي و همکاران 214 محیط رتها در گروه هاي آزمایشی قرار گرفتند. تمام پروتکل هاي آزمایشی مطابق با دستور العمل هاي شوراي جامعه اروپایی 86/609/EEC صورت گرفت و تلاش بر آن بود که آزار و تعداد حیوانات به کار برده شده به حداقل برسد. در هر گروه چهار رت براي وسترن بلات و سه رت براي تست تانل استفاده گردید. محلول مونومر آمیلوي ید بتاي (1-42) ) Sigma, Aβ, A9810) با غلظت 0/1 mg/ml در حلال سالین استریل به میزان 10 برابر تهیه و سپس در ویالهاي 10µl درC 20o- نگهداري شدند. و در دماي 20- سلسیوس تا زمان مصرف نگهداري می شد. 3 μl از این محلول μl) 10) ng/ براي هر تزریق استفاده می شد ng) Aβ 30 در هر طرف). رتهاي گروه کنترل سالین استریل دریافت می کردند. رتها با کتامین ) (150mg/kg و زایلزین mg/kg) 8) بیهوش می شدند. سپس با کمک دستگاه استریوتاکس Aβ و یا حامل آن به کورتکس فرونتال عمقی AP) 2 mm DV 3/2 mm با توجه به برگما و 3 mm عمق) طبق مطالعه قبلی تزریق می شد [26]. تزریق به صورت دو طرفه انجام می شد. هر تزریق μl) 3) سه دقیقه توسط یک سرنگ 10 μl هامیلتون طول می کشید. پس از اتمام تزریق و پیش از بیرون کشیدن سوزن به مدت یک دقیقه در محل خود نگه داشته می شد. Sigma) z-vad fmk,116-v) یک مهار کننده غیر اختصاصی کاسپاز و Sigma) z-devd fmk (CO605, مهار کننده اختصاصی کاسپاز 3 به ترتیب با دوزهاي 2000 و 400 نانوگرم تزریق می شدند. z-vad fmk در DMSO یک درصد و z-devd fmk در 0/5 DMSO درصد حل می شد سپس در یک سرنگ هامیلتون 25 میکرولیتري 6 μl از- z z-devd ازfmk 3/7 μl و (333/3 ng/μl) VAD fmk (icv) مخلوط و به صورت داخل بطنی 107/14) ng/μl) تزریق می شد AP) 1/6 با mmdv -0/4mm توجه به برگما و 4 mm عمق). گروه کنترل DMSO یک درصد را به صورت icv دریاف ت م ی کردن د. تزریق از طریق کانول گذاري (سوزن 23 که G در بطن جاگذاري و توسط سیمان آکریلیک محکم شده بود) در روزهاي و 7 پس از جراحی تکرار شد. در روز 13 رتها قربانی و هیپوکمپ آنها جدا و در 20- نگهداري شد. 214 جهت بررسی تغییرات بیان پروتي ین ها آنالیز وسترن بلات بر بخش هیپوکمپ مغزهاي حیوانات تحت مطالعه صورت گرفت. به منظور تحصیل عصاره سیتوزولی هیپوکمپ رتها در یک بافر لیز کننده ) 50 میلی مولارTris-Hcl 150 میلی مولار 0/1 Triton x-100 Nacl درصد sodium deoxy 0/25 cholate درصد 0/1 SDS درصد 1 میلی مولار EDTA و کوکتیل مهار کننده هاي پروتي از 1 درصد ( هموژن شده سپس بافت هاي هموژنه در 4 c و 13000rpm به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شدند. غلظتهاي پروتي ینی هر نمونه مطابق روش برادفورد تعیین شدند. و میزانی معادل 80 میکروگرم از پروتي ین کل هرنمونه جهت الکتروفورز SDS-PAGE در نظر گرفته شد. پروتي ینها بر روي غشاهاي PVDF بر طبق راهنماییهاي شرکت Bio-Rad منتقل شدند. غشاها توسط انکوباسیون در شیر خشک بدون چربی 2 درصد ) Amersham, (Ecl Advance TM blocking agent, cpk1075 در TBST به مدت 1 ساعت و 15 دقیقه اشباع شدند. سپس توسط آنتی بادي هاي زیر در دماي 4 درجه سلسیوس به صورت overnight انکوبه شدند: NFқB (cell signaling, 1/1000 v/v), anti- TNFα (cell signaling, 1/1000 v/v) تمام آنتی بادیهاي اولیه و ثانویه در محلول TBST در شیر خشک بدون چربی 2 درصد حل شدند. غشاها 3 بار با TBST Anti-caspase3 (cell signaling, 1/1000 v/v), anti- antirabbit شستشو داده شده و سپس با آنتی بادي هاي ثانویه مجاور شدند v/v).(cell signaling, 1/3000 سپس غشاها مجددا با TBST شسته شده و در نهایت باندهاي پروتي ینی برروي فیلم هاي عکاسی و با کمک کیت ECL Amersham, Ecl Advance TM western blotting ) (detection kit, RPN21354 ظاهر گشتند. فیلم ها اسکن شده و توسط نرم افزار Image J کمی شدند. پس از جداسازي عصاره سیتوزولی به روش بالا سوپرناتانت حاوي پروتي ینهاي سیتوزولی است که جدا شده و در دماي 70- نگهداري می شود. اما پلت حاوي پروتي ینهاي هسته مجددا لیز شده 7.9]) 20 Hepes/KOH[pH میلی مولار 1/5 Mgcl2 میلی مولار 0/2 EDTA میلی مولار 650 Nacl میلی مولار گلیسرول 25 درصد 1 DTT v/v میلی مولار 0/5 PMSF

5 جلد 14 شماره 3 پاییز 1389 عنوان یک سیتوکین التهابی در هیپوکمپ در مقایسه با گروه کنترل شد (0/001>P). شکل 1. تزریق تک دوزAβ (1-42) با غلظت 60ng/μl به کورتکس پري فرونتال به صورت دو طرفه سبب افزایش پروتي ین کاسپاز 3 در هیپوکمپ رتهایی که در روز 13 قربانی شده بودند در مقابل گروه کنترل شد (0/0001>P). اما در گروههایی که در روز 25 پس از تزریقAβ قربانی شده بودند کاسپاز 3 به سطح اولیه خود بازگشته بود بنابراین این رتها در این مطالعه پیگیري نشدند (داده ها نشان داده نشده است). اما تزریق z-vad fmk و z-devd fmk در روزهاي 5) 0 دقیقه قبل از تزریق (Aβ 1 5 و 7 پس از جراحی سبب کاهش معنی دار کاسپاز 3 در مقایسه با گروهی که تنها تزریق Aβ در آنها صورت گرفته بود گردید (0/0001>P). شکل 2. TNF-α β- actin Control Aβ *** Control Aβ Aβ+zVAD+zDEVD caspase-3 17KD β- actin caspase-3 (17K D ) relative intensity ### *** control Aβ Aβ+zVAD+zDEVD شکل (B 1,A)- تزریق تک دوز Aβ در داخل کورتکس پرفرونتال بعد از 13 روز TNF-α را در هیپوکمپ رت افزایش داد. A: تغییرات بیان TNF-α (15KD) در پروتي ینهاي سیتوپلاسمی هیپوکمپ و توسط روش وسترن بلاتینگ بررسی شد. B: باندهاي ظاهر شده بر روي فیلم هاي x-ray ابتدا scan شده سپس توسط نرم افزار Image J دانسیتومتري شدند. از بررسی پروتي ین بتا اکتین( 43KD ) به عنوان استاندارد داخلی استفاده شد. داده ها به صورت TNF-α/β-actin نشان داده شده اند که بیان گر نسبت relative intensity می باشد. SE),Independent samples T- Test,mean ±.( ***P<0.001 میلی مولار و مهار کننده پروتي از) و بافتهاي هموژنه در 4 c و 13000rpm به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ شدند. سوپرناتانت حاوي پروتي ینهاي هسته اي است که جدا شده و در 70- ذخیره گردید. کاسپاز 3 NFқB در میان سه گروه توسط آزمون آماري ANOVA یکطرفه hoc) (Tukey post با هم مقایسه شدند. TNFα بین دو گروه با استفاده از آزمون T-test مقایسه شد. داده ها به صورت Mean±SEM نمایش داده شده اند و 0/05>P از نظر آماري معنی دار در نظر گرفته شده است. یافته ها 215 تزریق (1-42) Aβ به میزان 30 نانو گرم در کورتکس پري فرونتال در هر نیمکره موجب افزایش معنی دار TNFα به شکل (B 2,A)- تزریق تک دوزAβ در داخل کورتکس پرفرونتال بعد از 13 روز تغییرات بیان caspase-3 A: را در هیپوکمپ رت افزایش داد. caspase-3 (17KD) در پروتي ینهاي سیتوپلاسمی هیپوکمپ و توسط روش وسترن بلاتینگ بررسی شد. B : باندهاي ظاهر شده بر روي فیلم هاي x-ray ابتدا scan شده سپس توسط نرم افزارJ Image دانسیتومتري شدند. از بررسی پروتي ین بتا اکتین( 43KD ) به عنوان استاندارد داخلی استفاده شد. داده ها به صورت relative caspase-3/β-actin نشان داده شده اند که بیان گر نس بت intensity می باشد.( SE, one-way ANOVA, post hoc Tukey, mean ± 0.001>P*** (در مقایسه با گروهی که تنها Aβ دریافت کرده), 0.001>P### (در مقایسه با گروه کنترل).

6 تاثیر مهار کاسپاز بر میزان فعالیت NFқB عبدي و همکاران Control Aβ Aβ+zVAD+zDEVD Control Aβ Aβ+zVAD+zDEVD NF-κB Cytosol NF-κB nuclear β- actin β- actin NF-kBcytosol(65kD)relative density * control AB AB+zVAD+Zdevd NF-kB nuclear(65kd)relative intensity *** control AB AB+zVAD+zDEVD پس از تزریق NFқB Aβ هسته اي افزایش یافت اما این افزایش در برابر گروه کنترل از لحاظ آماري فاقد معنی بود. پس از تزریق مهار کننده هاي کاسپاز fmk) z-vad و z-devd (fmk با پنج تکرار NFқB هسته اي در مقابل گروهی که تنها تزریق Aβ داشتند به طور معنی دار کاهش پیدا کرد NFқB شکل 3. براي تایید این نتیجه میزان (0/001>P). سیتوزولی نیز اندازه گیري شد و نتایج نشان داد که تزریق Aβ نتوانست تغییر معنی داري در سطح NFқB سیتوزولی به وجود بیاورد. اما به دنبال مهار کاسپاز میزان NFқB در مقایسه با گروهی که تنها تزریق Aβ داشتند به طور معنی داري افزایش را نشان داد (0/05>P). شکل 4. بحث به نظر می رسد تمام سیتوکینها و کموکینهایی که در شکل (B 4,A)- مهار آپوپتوز سطح NF-κB سیتوپلاسمی را در هیپوکمپ رت افزایش داد. A : تغییرات بیان (65KD) NF-κB در پروتي ینهاي سیتوپلاسمی هیپوکمپ و توسط روش وسترن بلاتینگ بررسی شد. B : باندهاي ظاهر شده بر روي فیلم هاي x-ray ابتدا scan شده سپس توسط نرم افزارJ Image دانسیتومتري شدند. از بررسی پروتي ین بتا اکتین( 43KD ) به عنوان استاندارد داخلی استفاده شد. داده ها به صورت relative intensity نشان داده شده اند که بیان گر نسبت NF-κB(cytosolic) /β-actin می باشد., one-way.(* P<0.05 ANOVA, post hoc Tukey, mean ± SE) آلزایمر مطالعه شده اند شامل IL-8 TNFα IL-6 IL-1β MIP-1α و (Transforming growth factor-β) TGF-β protein1α) (macrophage inflammatory در بیماري آلزایمر افزایش می یابند [2 23]. 10 واکنش التهابی القا شده توسط آمیلوي ید بتا در سیستم عصبی مرکزي موجب رها شدن فاکتورهاي تخریبی مثل سیتوکینها (TNFα) نیتریک اکسید (NO) و گونه هاي واکنشی اکسیژن (ROS) می شود. TNFα یکی از اولین مدیاتورهاي فرایندهاي نورودژنراتیو القا شده با Aβ می باشد.[20 6 4] شکل (B 3,A)- مهار آپوپتوز سطح NF-κB هسته اي را در هیپوکمپ رت کاهش داد. A : تغییرات بیان (65KD) NF-κB در پروتي ینهاي هسته اي هیپوکمپ و توسط روش وسترن بلاتینگ بررسی شد. B : باندهاي ظاهر شده بر روي فیلم هاي x-ray ابتدا scan شده سپس توسط نرم افزارJ Image دانسیتومتري شدند. از بررسی پروتي ین بتا اکتین( 43KD ) به عنوان استاندارد داخلی استفاده شد. داده ها به صورت relative intensity نشان داده شده اند که بیان گر نسبت NF-κB(nuclear) /β-actin می باشد., one-way داده هاي این مطالعه تایید می کند که Aβ التهاب را القا می کند. در این مطالعه TNFα به عنوان یک سیتوکین التهابی به طور معنی داري در گروهی که Aβ به آنها تزریق شده بود افزایش یافت. شکل 1. التهاب فاکتوري اساسی در تومورهاي مختلف انسانی از.( ***P<0.001,ANOVA, post hoc Tukey, mean ± SE)

7 جلد 14 شماره 3 پاییز 1389 جمله سرطان پروستات در نظر گرفته شده است. در فرایندهاي التهابی نقش فاکتورهاي متعددي از جمله سیتوکینها خصوصا TNFα در سرطان پروستات شناخته شده است. تعادل بین آپپتوز و تکثیر سلولها در پروستات طبیعی انسان در سرطان پروستات از بین رفته است. داده ها نشان داده که عواملی که نسبت تکثیر به آ پپتوز را کنترل می کنند در شرایط پاتولوژیک تغییر می یابند [24]. TNFα تولید شده در اطراف سلولهاي توموري و یا دچار التهاب می تواند توان زیستی سلولهاي توموري را توسط کد کردن ژنهاي ضد آپپتوز وابسته به NFқB مانند Bcl-xl 1 CIAP و 2 افزایش دهد [15 18]. در حقیقت التهاب مزمن می تواند القاي تومور را افزایش دهد [1 12] و NFқB التهاب و سرطان را به هم مربوط می سازد. با توجه به ژنهاي هدف NFқB می توان پیش بینی کرد که رابطه تنگاتنگی بین این فاکتور رونویسی و سرطان وجود دارد به طوریکه در مدلهاي موشی مختلفی وابستگی فعالیت NFқB و پیشرفت تومور و متاستاز به خوبی نشان داده شده است [1 17]. 12 TNFα می تواند آپپتوز را در اولیگودندروسیتها و رده سلولی نورونی در محیط in vitro القا کند. آپپتوز اولیگودندروسیتها در محیط in vivo توسط بیان بیش از اندازه TNFRI القا می شود [14] و مشخص شده است که کاسپازها در نوتروفیلها فاکتورهاي اساسی در آپپتوز القا شده توسط TNFα هستند [7]. مطالعات مختلف نشان داده اند که TNFα دو مسیر آپپتوز و تکثیر سلولی به واسطه NFқB را می تواند به راه بیندازد. نشان داده شده است که مهار NFқB قابلیت آپپتوتیک بودن TNFα را افزایش می دهد [7]. نورونهایی که در محیط کشت با Aβ تیمار شده اند افزایش فعالیت (c Jun N terminal Kinase) JNK کاسپاز 2 و 3 را نشان داده اند. مسیري که در اکثر مواقع معرف مرگ نورون است [29]. نورونهایی که در معرض Aβ قرار گرفته اند آپپتوزي تیپیک شامل متراکم شدن اجسام سلولی و قطعه قطعه شدن DNA را نشان داده اند [30] و در نهایت افزایش P53 Bax نفوذپذیري گذراي غشاي میتوکن دري رها شدن سیتوکروم C و فعال شدن آپپتوزوم سبب فعال شدن کاسپاز می گردد [19]. همچنین Aβ سبب ظهور تعدادي سلول تانل مثبت و فعالیت کاسپاز 3 در شکنج دندانه اي هیپوکمپ شده 217 است 22].[27 در مطالعه حاضر 13 روز پس از تزریق (1-42) Aβ کاسپاز 3 فعال شده در مقایسه با گروه کنترل به طور معناداري افزایش یافت (حدود 4 برابر) که می توان آن را احتمالا معادل آپپتوز در نظر گرفت. شکل 2. از آنجا که هدف این مطالعه احتمال وجود رابطه بین آپپتوز و فعالیت NFқB و همچنین نقش آپپتوز در التهاب عصبی بود روند آپپتوز توسط مهار کاسپاز متوقف و سپس فعالیت NFқB سنجیده شد. براي دستیابی به این هدف براي مهار آپپتوز از تزریق z-vad fmk (مهار کننده غیر اختصاصی کاسپازها) و z-devd fmk (مهار کننده اختصاصی کاسپاز 3) استفاده شد. نتیجه آن که تجویز Aβ هرچند سبب افزایش NFқB شد اما این افزایش در قیاس با گروه کنترل معنی دار نبود. اما پس از مهار کاسپاز 3 سطح NFқB هسته اي به طور معنی دار و تا حدود 2 تا 2/5 برابر کاهش را نشان داد. شکل 3. در اینجا نقش دوگانه فعالیت NFқB قابل بررسی است. هر چند شواهد متعددي بر آثار حفاظتی NFқB در سیستم عصبی وجود دارد [3 13] مشخص شده که فعال شدنNFқB ممکن است به عنوان فاکتور پیش برنده آپپتوز عمل کند [13 25] و همچنین فعال شدن مسیرNFқB MAPK- نقشی مهم در فعال کردن میکروگلیاها طی التهاب دارد که خود نشانگر پاتولوژیکی بیماري آلزایمر است [11 16]. در مطالعه اي توسط Youn sook song و همکارانش در سال 2004 مشخص شد که طی القاي مرگ سلولی توسط Aβ در سلولهاي تمایز یافته NFқB PC12 فعال می شود ودر سلولهایی که بیش از حد Bcl2 بیان می کنند فعالیت NFқB و مرگ سلولی ناشی ازAβ کاهش می یابد. در واقع یکی از دلایل یافت این نتیجه می تواند این باشد که بیان بیش از حد Bcl2 می تواند با کاهش کاسپاز 3 (که می تواند IқB را تجزیه کند) فعال شدن NFқB را مهار کند [25]. بر طبق این مطالعه کاسپاز 3 عنصري اساسی در فعال کردن NFқB است به طوریکه مهار این آنزیم تجزیه IқB را کاهش می دهد. IқB مهار کننده NFқB است و توسط استقرار آن در سیتوپلاسم مانع فعالیت آن می شود. کاسپاز 3 می تواند با قطع این ارتباط NFқB را به صورت فعال در بیاورد. در مطالعه حاضر به نظر می رسد مهار کننده هاي کاسپاز 217

8 تاثیر مهار کاسپاز بر میزان فعالیت NFқB عبدي و همکاران fmk) z-vad و (z-devd fmk از طریق چنین مکانیسمی NFқB را به صورت غیر فعال در سیتوزول نگه داشته اند و سبب کاهش میزان آن در هسته شده اند. در صورت فقدان محرك NFқB توسط مهار کننده اش یعنی IқB (که به P65 متصل است) در سیتوپلاسم به صورت غیر فعال وجود دارد. فقدان IқB سیگنالهاي هسته اي را در معرض P65 قرار داده که انتقال دایمرNFқB به هسته را تسهیل می کند. در واقع اندازه گیري NFқB هسته اي معیاري براي سنجشNFқB فعال است [28]. با این اوصاف انتظار بر این بود که با کاهش NFқB در هسته (کاهش فعالیت آن) سطح آن در سیتوزول افزایش یابد. داده هاي این مطالعه نیز نشان داد که مهار کاسپاز 3 سبب افزایش سطح NFқB سیتوزول می شود. شکل 4. این نتایج نشان می دهد که مهار کاسپاز فعالیت NFқB را کاهش می دهد. در این مطالعه التهاب عصبی توسط تزریق (1-42) Aβ در هیپوکمپ القا شد. TNFα و کاسپاز 3 به ترتیب به عنوان مارکرهاي التهاب و آپپتوز افزایش پیدا کردند. داده هاي این مطالعه نشان داد که احتمالا فقدان کاسپاز 3 عاملی مهاري بر فعال شدن NFқB است زیرا اگر رابطه اي بین این دو وجود نداشت با انسداد مسیر آپپتوز فعالیت TNFα می بایست از آپپتوز به فعال کردن NFқB تغییر پیدا می کرد و تعادل بین آپپتوز و توان زیستی سلول به هم می خورد. بنابراین احتمالا مهار کاسپاز به عنوان عامل آغازگر آپپتوز از طریق کاهش فعالیت NFқB سلولها را در قبال افزایش غیر طبیعی توان زیستی و تکثیرشان حفاظت می کند. References [1] Aggarwal BB, Nuclear factor-κb: the enemy within. Cancer Cell 6 (2004) [2] Akiyama H, Barger S, Barnum S, Bardt B, et al., Inflammation and Alzheimer,s disease. Neurobiology of Aging 21 (2000) [3] Alexanian AR, Bamburg JR, Neuronal survival activity of S100ββ is enhanced by calcineurin inhibitors and requires activation of NF-κB. FASEB 13 (1999) [4] Allan SM, Rothwell NJ, Inflammation in central nervous system injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 358 (2003) [5] Chauveau F, Boutin H, Van Camp N, Dolle F, Tavitian B, Nuclear imaging of neuroinflammation: a comprehensive review of [11C] PK11195 challengers. Eur J Nucl Med Mol Imaging 35 (2008) [6] Combs CK, Karlo JC, Kao SC, Landreth GE, β-amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNFα-dependent expression of inducible nitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J Neurosci 21 (2001) [7] Cowburn AS, White JF, Deighton J, Walmsley SR, Chilvers ER, z-vad-fmk augmentation of TNF-αstimulated neutrophil apoptosis is compound specific 218 and does not involve the generation of reactive oxygen species. Blood 105 (2005) [8] Gahtan E, Overmier BC, Inflammatory pathogenesis in Alzheimer, s disease: biological mechanisms and cognitive sequel. Neurosci Biohav Rev 23 (1999) [9] Gupta S, A decision between life and death during TNFα-induced signaling. J Clin Immun 22 (2002) [10] Halliday G, Robinson SR, Shepherd C, Kril J, Alzheimer,s disease and inflammation: a review of cellular and therapeutic mechanisms. Clin Exp Pharmacol Physiol 27 (2000)v 1-8. [11] Jang JH, Surh YJ, β-amyloid-induced apoptosis is associated with cyclooxygenase-2 up-regulation via the mitogen-activated protein kinase-nf-κb signaling pathway. Free Radical Biol Med 38 (2005) [12] Karin M, Greten FR, NF-κB: linking inflammation and immunity to cancer development and progression. Nature 5 (2005) [13] Kinsky TK, Papaconstantinou J, Perez-Polo JR, Ageassociated alterations in hippocampal and basal forebrain nuclear factor kappa B activity. J Neurosci Res 48 (1997) [14] Lee YB, Yune TY, Baik SY, Shin YH, et al., Role of tumor necrosis factor-α in neuronal and glial apoptosis after spinal cord injury. Exp Neur 166 (2000)

9 جلد 14 شماره 3 پاییز 1389 [15] Lin WW, Karin M, A cytokine-mediated link between innate immunity, inflammation, and cancer. J Clin Invest 117 (2007) [16] Liu Q, Zhang J, Zhu H, Qin C, Chen Q, Zhao B, Dissecting the signaling pathway of nicotine-mediated neuroprotection in a mouse Alzheimer,s disease model. FASEB 21 (2007) [17] Luo JL, Kamata H, Karin M, IKK/NF-κB signaling: balancing life and death- a new approach to cancer therapy. J Clin Invest 115 (2005) [18] Luo JL, Maeda S, Hsu LC, Yagita H, Karin Mcancer, Inhibition of NF-κB in cancer cells converts inflammation-induced tumor growth mediated by TNF-α to TRAIL-mediated tumor regression. Cell 6 (2004) [19] Mattson MP, Pathways towards and away from Alzheimer, s disease. Nature 430 (2004) [20] Medeiros R, Prediger RDS, Passos GF, Pandolfo P, et al., Connecting TNF-α signaling pathways to inos expression in a mouse model of Alzheimer's disease: relevance for the behavioral and synaptic deficits induced by amyloid β protein. J Neurosci 27 (2007) [21] Monsonego A, Imitola J, Zota V, Oida T, Weiner HL, Microglia-mediated nitric oxide cytotoxicity of Tcells following amyloid β-peptide presentation to Th1 cells. J Immun 171 (2003) [22] Muller T, Meyer HE, Egensperger R, Marcus K, The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) as modulator of gene expression, apoptosis, and cytoskeletal dynamics-relevance for Alzheimer, s disease.progress in Neurobiol 85 (2008) [23] Padmanabhan J, Levy M, Dickson DW, Potter H, Alpha 1-antichymotrypsin, an inflammatory protein overexpressed in Alzheimer's disease brain, induces tau phosphorylation in neurons. Brain 129 (2006) [24] Royuela M, Rodriguete-Berriguete G, Fraile B, Paniagua R, TNF-α/IL-1/NF-κB transduction pathway in human cancer prostate. Histopathol 23 (2008) [25] Song YS, Park HJ, Kim SY, Lee SH, et al., Protective role of Bcl-2 on β-amyloid-induced cell death of differentiated PC12 cells: reduction of NF-κB and p38 MAP Kinase activation. Neurosci Res 49 (2004) [26] Stelt MV, Mazzola C, Esposito G, Matias I, et al., Endocannabinoids and β-amyloid-induced neurotoxicity in vivo: effect of pharmacological elevation of endocannabinoid levels. Cell Mol Life Sci 63 (2006) [27] Stepanichev MY, Zdobnova IM, Yakovlev AA, Onufriev MV, et al., Effects of tumor necrosis factoralpha central administration on hippocampal damage in rat induced by amyloid beta-peptide (25-35). J Neurosci Res 71 (2003) [28] Tripathy D, Grammas P, Acetaminophen inhibits neuronal inflammation and protects neurons from oxidative stress. J Neuroinflamm 6 (2009) 1-9. [29] Troy CM, Rabacchi SA, Xu Z, Maroney AC, et al., β- Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-jun N- terminal kinase activation. J Neur Chem 77 (2001) [30] Xiao XQ, Zhang HY, Tang XC, Huperzine A attenuates amyloid β-peptide fragment induced apoptosis in rat cortical neurons via inhibiting reactive oxygen species formation and caspase-3 activation. J Neurosci Res 67 (2002)