Μελέτη του οστικού μεταβολισμού στην εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΑ ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗΣ ΜΥΕΛΟΥ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ Διευθυντής: Κωνσταντόπουλος Κωνσταντίνος Μελέτη του οστικού μεταβολισμού στην εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Μπούτσικας Γεώργιος Ιατρός-Αιματολόγος Αθήνα,

2 12

3 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΑ ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΗΣ ΜΥΕΛΟΥ ΤΩΝ ΟΣΤΩΝ Διευθυντής: Κωνσταντόπουλος Κωνσταντίνος Μελέτη του οστικού μεταβολισμού στην εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Μπούτσικας Γεώργιος Ιατρός-Αιματολόγος Αθήνα,

4 14

5 15

6 16

7 ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Ημερομηνία ορισμού τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής από τη Γ.Σ.Ε.Σ. της Ιατρικής Σχολής: 28/07/10 Ημερομηνία αντικατάστασης μέλους τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής: 31/07/15 ΜΕΛΗ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Παναγιωτίδης Παναγιώτης Καθηγητής Αιματολογίας Ιατρικής Σχολής Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, Μέλος Αγγελοπούλου Κ. Μαρία Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Αιματολογίας Ιατρικής Σχολής Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, Επιβλέπον Μέλος Κυρτσώνη Μαρία-Χριστίνα Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Αιματολογίας Ιατρικής Σχολής Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, Μέλος Ημερομηνία κατάθεσης θέματος και πρωτοκόλλου: 16/06/10 Ημερομηνία έγκρισης-ορισμού θέματος και πρωτοκόλλου: 24/11/10 Ημερομηνία κατάθεσης 1 ης προόδου: 31/07/15 Ημερομηνία κατάθεσης 2 ης προόδου: 29/09/15 Ημερομηνία κατάθεσης 3 ης προόδου: 02/02/16 Ημερομηνία κατάθεσης πρότασης ορισμού επταμελούς εξεταστικής επιτροπής: 30/08/17 Ημερομηνία ορισμού επταμελούς εξεταστικής επιτροπής: 27/09/17 Επταμελής εξεταστική επιτροπή: Κωνσταντόπουλος Κωνσταντίνος Παναγιωτίδης Παναγιώτης Θεοχάρης Σταμάτιος Αγγελοπούλου Μαρία Κυρτσώνη Μαρία-Χριστίνα Βασιλακόπουλος Θεόδωρος του Παναγιώτη Σιακαντάρη Μαρίνα

8 «Η έγκριση της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως.» (Άρθρο 202 παρ. 2 Ν. 5343/1932 και Άρθρο 50 παρ. 8 Ν. 1268/1982) 18

9 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Ολοκληρώνοντας κανείς τη διπλωματική του εργασία αισθάνεται υπερήφανος γεμάτος αυτοπεποίθηση για την επιτυχία του. Ωστόσο, με μια λιγότερο εγωκεντρική προσέγγιση συνειδητοποιεί ότι το αποτέλεσμα αυτό δε θα είχε επιτευχθεί χωρίς την αρωγή φίλων και συνεργατών. Στο πνεύμα αυτής της συλλογιστικής αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω εκ βάθους καρδιάς την Επίκουρη Καθηγήτρια Αιματολογίας κ. Αγγελοπούλου Μαρία, επιβλέπουσα της διδακτορικής μου διατριβής, για την τιμή να μου αναθέσει την εκπόνηση διδακτορικής διατριβής και την εμπιστοσύνη που επέδειξε στο πρόσωπό μου, την πολύτιμη συμβολή της στον σχεδιασμό και την υλοποίηση του πονήματος αυτού, αλλά και την έμπρακτη συμπαράστασή της σε ορισμένες προσωπικές δυσκολίες που ανέκυψαν κατά τη διάρκεια της ειδικότητας, τον Ομότιμο Καθηγητή Παθολογίας-Αιματολογίας κ. Μελέτη Ιωάννη για την αγάπη και το μεράκι που μεταδίδει για την Αιματολογία, καθώς και τον Αναπληρωτή Καθηγητή Αιματολογίας κ. Τέρπο Ευάγγελο που υπήρξε ο μυητής μου στον χώρο της ερευνητικής δραστηριότητας. Θα ήταν παράλειψη να μην ευχαριστήσω ειλικρινά τους φίλους και συνειδικευόμενούς μου στην Αιματολογική Κλινική του Γ.Ν.Α. «Λαϊκό» -Τελώνη Βασίλειο, Ζάννου Άννα, Πέτεβη Κυριακή, Κανελλόπουλο Αλέξανδρο, Μπιτσάνη Αικατερίνη, Ευθυμίου Άννα, Πέσσαχ Ηλία, Ζωγράφο Ελευθέριο, Νταλαγιώργο Θεμιστοκλή, Γκαϊνάρου Γκαμπριέλλα, Φλεβάρη Παγώνα, Παπαγεωργίου Λούλα, Κούτση Κατρίνα, Ασημακόπουλο Ιωάννη, Μπάρτζη Βασιλική, Κάραλη Βασιλική, Πέτσα Παναγιώτα, Πάνου Μάριο, Βαρδουνιώτη Ιωάννα, Τσοπρά Όλγα- για τη συνέπειά τους στη συλλογή των δειγμάτων και την ειλικρινή υπομονή προς το πρόσωπό μου και τις ιδιαιτερότητές μου όλα αυτά τα χρόνια. Ιδιαίτερη μνεία αξίζει στα στελέχη του Ερευνητικού Αιματολογικού Εργαστηρίου της Ά Προπαιδευτικής Παθολογικής Κλινικής του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών και ιδιαίτερα στις Στεφάνου Αγγελική, Παλαιολόγου Δανάη, Ρουμελιώτη Μαρία και Στάικου Ευσταθία για την ανιοδιοτελή βοήθειά τους στην αρχειοθέτηση και φύλαξη των συλλεχθέντων δειγμάτων. Παράλληλα, δε θα μπορούσα να μην αναφερθώ στον Βιολόγο του Τμήματος Βιοϊατρικής Έρευνας του 251 Γ.Ν.Α. κ. Παπαθεοδώρου Αθανάσιο χωρίς τη συμβολή του οποίου θα ήταν αδύνατη η μέτρηση με ELISA των υπό μελέτη μορίων στα συλλεχθέντα δείγματα. 19

10 Συγχρόνως, εκφράζω την εκτίμησή μου στο Ιατρικό και Νοσηλευτικό προσωπικό της Αιματολογικής Κλινικής του Γ.Ν.Α. «Λαϊκό», διότι με την προσήλωση στο λειτούργημά τους εξασφαλίζουν το απαραίτητο περιβάλλον για την υλοποίηση ερευνητικών εργασιών. Τέλος, την ευγνωμοσύνη μου εκφράζω στη σύζυγό μου Λαμπρινή που στέκει συνεχώς κοντά μου και υπομένει αγόγγυστα τις ώρες που απουσιάζω στα πλαίσια των υποχρεώσεων που ανακύπτουν από την ενασχόλησή μου με την ειδικότητα της Αιματολογίας. 20

11 Ιπποκράτης (γκραβούρα του Πέτερ Πάουλ Ρούμπενς, 1638) «Ἰητρικῇ δὲ πάλαι πάντα ὑπάρχει, καὶ ἀρχὴ καὶ ὁδὸς εὑρημένη, καθ ἣν τὰ εὑρημένα πολλά τε καὶ καλῶς ἔχοντα εὕρηται ἐν πολλῷ χρόνῳ, καὶ τὰ λοιπὰ εὑρεθήσεται, ἤν τις ἱκανός τε ἐὼν καὶ τὰ εὑρημένα εἰδὼς ἐκ τούτων ὁρμώμενος ζητῇ» Ιπποκράτους (460 π.χ π.χ.), Περὶ ἀρχαίας ἰητρικῆς 21

12 22

13 Στη σύζυγο και τα παιδιά μου 23

14 24

15 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η διαδικασία της αιμοποίησης Το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών Κύτταρα του στρώματος... 7 α) Ινοβλάστες... 8 β) Οστεοβλάστες... 8 γ) Λιποκύτταρα δ) Μακροφάγα και οστεοκλάστες ε) Ενδοθηλιακά κύτταρα Φυσικοί μεσολαβητές της αλληλεπίδρασης αιμοποιητικών κυττάρωνκυττάρων του στρώματος και κυττάρων-περιβάλλοντος α) Ιντεγκρίνες β1-ιντεγκρίνες β2-ιντεγκρίνες CD β) Μόρια προσκόλλησης τύπου βλεννίνης CD CD CD Συνδέτες σελεκτινών γ) Σελεκτίνες P-σελεκτίνη E-σελεκτίνη L-σελεκτίνη δ) Μόρια προσκόλλησης τύπου ανοσοσφαιρίνης ICAM VCAM PECAM Συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας α) Πρωτεογλυκάνες β) Υαλουρονικό οξύ γ) Λαμινίνη δ) Ινωδονεκτίνη ε) Κολλαγόνο Διαλυτοί παράγοντες που ρυθμίζουν την αλληλεπίδραση κυττάρων μεταξύ τους και την αλληλεπίδραση κυττάρων-εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας α) Αιμοποιητικοί αυξητικοί παράγοντες G-CSF... 25

16 SCF Θρομβοποιητίνη β) Αγγειογενετικοί αυξητικοί παράγοντες VEGF Αγγειοποιητίνη γ) Χημειοκίνες SDF IL MIP-1a δ) Πρωτεάσες της θεμέλιας ουσίας Μεταλλοπρωτεϊνάσες, μεταλλοπρωτεϊνάσες μεμβρανικού τύπου και μεταλλοπρωτείνάσες ιστικοί ανασταλτές Η κυκλοφορία των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων Η κινητοποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων Η εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων Προσκόλληση στο ενδοθήλιο, κύλισμα και μετανάστευση Άξονας SDF-1/CXCR Ενδοοστική φωλιά Αγγειακή φωλιά Ο οστίτης ιστός και η οστική ανακατασκευή Οι οστεοβλάστες Οι οστεοκλάστες Τα οστεοκύτταρα Το κολλαγόνο και οι μη-κολλαγονικές πρωτεΐνες Η οστική ανακατασκευή Δείκτες οστικού μεταβολισμού Δείκτες οστικού σχηματισμού α) OCN β) balp γ) PINP και PICP Δείκτες οστικής απορρόφησης α) Ασβέστιο/Κρεατινίνη ούρων β) Υδρόξυπρολίνη γ) PYD και DPD ούρων δ) NTx ε) CTx στ) TRAP5b Βιολογική μεταβλητότητα των δεικτών οστικού μεταβολισμού Αγγειογένεση και αγγειογενετικοί παράγοντες Επιστράτευση περιενδοθηλιακών κυττάρων Εξωκυττάρια θεμέλια ουσία Μόρια προσκόλλησης Μόρια καθοδήγησης

17 2.8.5 Αναδιαμόρφωση, υποστροφή και απόπτωση Αλληλεπίδραση προσδετών-υποδοχέων α) Επαγωγείς της αγγειογένεσης FGFs VEGFs Angs PDGFs Άλλοι παράγοντες β) Αναστολείς της αγγειογένεσης Σχέση αγγειακής ανάπτυξης και αιμοποίησης ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σκοπός της μελέτης Ασθενείς και μέθοδοι Ασθενείς Συλλογή δειγμάτων Προτυποποίηση της μεθόδου ELISA Μετρηθέντα μόρια α) Δείκτες οστικής απορρόφησης β) Δείκτες οστικού σχηματισμού γ) Αναστολείς οστεοβλαστών δ) Ρυθμιστές οστεοκλαστογένεσης ε) Αγγειογενετικοί αυξητικοί παράγοντες Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων Αποτελέσματα Ασθενείς Σύγκριση των τιμών μεταξύ της ημέρας προ έναρξης της μεγαθεραπείας και της ημέρας εγκατάστασης του μοσχεύματος α) Δείκτες οστικής απορρόφησης β) Δείκτες οστικού σχηματισμού γ) Αναστολείς οστεοβλαστών δ) Ρυθμιστές οστεοκλαστογένεσης ε) Αγγειογενετικοί αυξητικοί παράγοντες Μεταβολή των μορίων στις πέντε διαφορετικές χρονικές στιγμές α) Δείκτες οστικής απορρόφησης β) Δείκτες οστικού σχηματισμού γ) Αναστολείς οστεοβλαστών δ) Ρυθμιστές οστεοκλαστογένεσης ε) Αγγειογενετικοί αυξητικοί παράγοντες Συσχέτιση με τον χρόνο εγκατάστασης του μοσχεύματος α) Συσχέτιση με την άνοδο των ουδετεροφίλων β) Συσχέτιση με την άνοδο των αιμοπεταλίων Σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

18 α) Δείκτες οστικής απορρόφησης β) Δείκτες οστικού σχηματισμού γ) Αναστολείς οστεοβλαστών δ) Ρυθμιστές οστεοκλαστογένεσης ε) Αγγειογενετικοί αυξητικοί παράγοντες Συζήτηση-Συμπεράσματα ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΕΙΚΟΝΩΝ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΙΝΑΚΩΝ ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΗ ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΗ ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ

19 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΚΟΝΩΝ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εικόνα Γ1: Η ιεραρχία της αιμοποίησης... 3 Εικόνα Γ2: Θέσεις αιμοποίησης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης... 4 Εικόνα Γ3: Οι αιμοποιητικές φωλιές του μυελού των οστών... 5 Εικόνα Γ4: Το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών... 7 Εικόνα Γ5: Δομή ενός ινοβλάστη... 8 Εικόνα Γ6: Μεσεγχυματικά κύτταρα (Μ) συμπυκνώνονται και διαφοροποιούνται σε οστεοβλάστες (ΟΒ)... 9 Εικόνα Γ7: Δομή ενός λιποκυττάρου Εικόνα Γ8: Η αλληλουχία διαφοροποίησης του οστεοκλάστη Εικόνα Γ9: Το ενδοθηλιακό κύτταρο και οι πολλαπλές λειτουργίες του Εικόνα Γ10: Δομή και σχέση δομής-λειτουργίας των ιντεγκρινών Εικόνα Γ11: Δομή του CD Εικόνα Γ12: Δομή των σελεκτινών και αλληλεπιδράσεις με τους προσδέτες σελεκτινών Εικόνα Γ13: Δομή των Ig CAMs και σύνδεσή τους με τον κυτταροσκελετό Εικόνα Γ14: Μόρια προσκόλλησης Εικόνα Γ15: Σχηματική απεικόνιση των κυριότερων συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και των αλληλεπιδράσεών τους με τα κύτταρα Εικόνα Γ16: Κινητοποίηση προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων με G-CSF Εικόνα Γ17: Η έκφραση του c-kit στα αιμοποιητικά κύτταρα Εικόνα Γ18: Το μονοπάτι σηματοδότησης μέσω TPO/c-MPL Εικόνα Γ19: VEGF υποδοχείς και προσδέτες Εικόνα Γ20: SDF-1/CXCR4 σηματοδοτικά μονοπάτια Εικόνα Γ21: Ο SDF-1 και ο CXCR4 ρυθμίζουν την εγκατάσταση και την κινητοποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων Εικόνα Γ22: Τρόποι δράσης των μεταλλοπρωτεϊνασών Εικόνα Γ23: Κυκλοφορία αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων κατά την εμβρυική και την ενήλικη ζωή Εικόνα Γ24: Κινητοποίηση και εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων Εικόνα Γ25: Κινητοποίηση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων επαγόμενη από G- CSF Εικόνα Γ26: Ο ρόλος των οστεοκλαστών στην κινητοποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων Εικόνα Γ27: Η διαδικασία της εγκατάστασης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων Εικόνα Γ28: Εξειδικευμένες φωλιές για τα αρχέγονα και προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα... 52

20 Εικόνα Γ29: Μοντέλο υποστήριξης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων από τους οστεοβλάστες και μοντέλο παραγόντων που παράγονται από τους οστεοβλάστες και επηρεάζουν τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα Εικόνα Γ30: Μοντέλο ζευγών προσδετών ανάμεσα στους οστεοβλάστες και τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα Εικόνα Γ31: Βιολογικός κύκλος των οστεοβλαστών Εικόνα Γ32: Φαινοτυπικοί μάρτυρες που χαρακτηρίζουν τα στάδια της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών Εικόνα Γ33: Σχηματική αναπαράσταση της οστεοκλαστογένεσης Εικόνα Γ34: Το σύστημα RANKL/RANK/OPG Εικόνα Γ35: Οι κυτταροκίνες που παράγονται από τα Τ λεμφοκύτταρα και αναστέλλουν ή επάγουν την οστεοκλαστογένεση Εικόνα Γ36: Μοντέλο που αναπαριστά μηχανισμούς με τους οποίους τα οστεοκύτταρα μπορούν ανεξάρτητα να ελέγχουν την οστική απορρόφηση και την οστική κατασκευή Εικόνα Γ37: Ρύθμιση της οστεοκλαστογένεσης από τα οστεοκύτταρα μέσω του κυτταρικού θανάτου τους Εικόνα Γ38: Η βιοσύνθεση του κολλαγόνου Εικόνα Γ39: Η οστική ανακατασκευή Εικόνα Γ40: Δείκτες οστικού μεταβολισμού Εικόνα Γ41: Μοντέλο αγγειακής ανάπτυξης ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εικόνα Ε1: Μεταβολή των δεικτών οστικής απορρόφησης (CTx, TRAP5b) μεταξύ d- 8/-4 και d Εικόνα Ε2: Μεταβολή των δεικτών οστικού σχηματισμού (balp, OCN) μεταξύ d-8/- 4 και d Εικόνα Ε3: Μεταβολή του αναστολέα των οστεοβλαστών Dkk1 μεταξύ d-8/-4 και d Εικόνα Ε4: Μεταβολή των δεικτών οστεοκλαστογένεσης (RANKL, OPG, RANKL/OPG) μεταξύ d-8/-4 και d Εικόνα Ε5: Μεταβολή των αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων (Ang1, Ang2, Ang1/Ang2) μεταξύ d-8/-4 και d Εικόνα Ε6: Μεταβολή των δεικτών οστικής απορρόφησης (CTx, TRAP5b) στις πέντε διαφορετικές χρονικές στιγμές Εικόνα Ε7: Μεταβολή των δεικτών οστικού σχηματισμού (balp, OCN) στις πέντε διαφορετικές χρονικές στιγμές Εικόνα Ε8: Μεταβολή του αναστολέα των οστεοβλαστών Dkk1 στις πέντε διαφορετικές χρονικές στιγμές Εικόνα Ε9: Μεταβολή των δεικτών οστεοκλαστογένεσης (RANKL, OPG, RANKL/OPG) στις πέντε διαφορετικές χρονικές στιγμές Εικόνα Ε10: Μεταβολή των αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων (Ang1, Ang2, Ang1/Ang2) στις πέντε διαφορετικές χρονικές στιγμές

21 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΙΝΑΚΩΝ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Πίνακας Γ1: Οι κύριες μη-κολλαγονικές πρωτεΐνες της ομάδας 1 και οι βασικές ρυθμιστικές λειτουργίες τους Πίνακας Γ2: Οι κύριες μη-κολλαγονικές πρωτεΐνες της ομάδας 2 και οι βασικές λειτουργίες τους Πίνακας Γ3: Δείκτες οστικού σχηματισμού και απορρόφησης ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Πίνακας Ε1: Χαρακτηριστικά των ασθενών της μελέτης Πίνακας Ε2: Μεταβολή των δεικτών οστικού μεταβολισμού και αγγειογένεσης μεταξύ d-8/-4 και d+10 στο σύνολο των ασθενών, στους ασθενείς με HL, NHL, στους άρρενες και τις θήλεις ασθενείς Πίνακας Ε3: Διάμεση τιμή και εύρος των δεικτών οστικού μεταβολισμού και των αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων κατά την αυτόλογη μεταμόσχευση στις πέντε διαφορετικές χρονικές στιγμές Πίνακας Ε4: Συσχέτιση των μετρηθέντων μορίων με την άνοδο των ουδετεροφίλων Πίνακας Ε5: Συσχέτιση των μετρηθέντων μορίων με την άνοδο των αιμοπεταλίων Πίνακας Ε6: Σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των μετρηθέντων μορίων και του χρόνου εγκατάστασης του μοσχεύματος Πίνακας Ε7: Σύγκριση της μεταβολής των δεικτών οστικού μεταβολισμού και των αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων ανάμεσα στην αυτόλογη μεταμόσχευση και τη συμβατική χημειοθεραπεία

22 12

23 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ 5-FU: 5-fluorouracil ACE: angiotensin-converting enzyme ADAM: a disintegrin and metalloprotease domain ALP: alkaline phosphatase Ang: angiopoietin AP: activator protein balp: bone alkaline phosphatase BEAM: carmustine-bcnu, etoposide, cytarabine, melphalan bfgf: basic fibroblast growth factor BMP: bone morphogenetic protein BMU: basic multicellular/metabolic unit BSP: bone sialoprotein BSU: basic structural unit CaR: calcium-sensing receptor cc: correlation coefficient CC: cysteine-cysteine CCT: conventional chemotherapy ColI: collagen type I CTK: cathepsin K CTx: C-telopeptide of collagen type I CX: connexin CXC: cysteine-noncysteine-cysteine CXCL: cysteine-noncysteine-cysteine ligand CXCR: cysteine-noncysteine-cysteine receptor d: day Dkk1: Dickkopf-1 DPD: deoxypyridinoline EGF: epidermal growth factor ELISA: enzyme-linked immuno sorbent assay EP: prostaglandin E receptor ESHAP: etoposide, methylprednisolone, cytarabine, cisplatin FAK: focal adhesion kinase FGF: fibroblast growth factor GAG: glycosaminoglycan G-CSF: granulocyte colonystimulating factor GM-CSF: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor HCELL: hematopoietic cell E- and L- selectin ligand HDT: high dose therapy HGF: hepatocyte growth factor HIV: human immunodeficiency virus HL: Hodgkin Lymphoma HRP: horseradish peroxidase HSC: hematopoietic stem cell HSCT: hematopoietic stem cell transplantation ICAM: intercellular adhesion molecule Ig CAM: Ig cellular adhesion molecule IGEV: ifosfamide, gemcitabine, vinolerbine IGF: insulin-like growth factor IL: interleukin INF: interferon IV: intravenously JAK: Janus-activating kinase LFA: lymphocyte associated antigen LIF: leukocyte inhibitory factor LTC-IC: long-term culture-initiating cells Mac: macrophage antigen Mcl: myeloid cell leukemia sequence protein MCP: macrophage chemoattractant protein M-CSF: macrophage colonystimulating factor MIP: macrophage inflammatory protein MM: Multiple Myeloma MMP: matrix metalloproteinase

24 mscf: membrane stem cell factor MT-MMPs: membrane-type matrix metalloproteinases NCP: non-collagenous protein NF-κB: nuclear factor-κb NHL: Non-Hodgkin Lymphoma NK: natural killers NO: nitric oxide NTx: N-telopeptide of collagen type I OAF: osteoclast activation factor OCL: osteoclast OCN: osteocalcin OPG: osteoprotegerin OPN: osteopontin Osx: Osterix PDGF: platelet-derived growth factor PDGFR: platelet-derived growth factor receptor PECAM: platelet and endothelial cell adhesion molecule PG: prostaglandin PICP: procollagen type I C-terminal propeptide PINP: procollagen type I N-terminal propeptide PSGL: P-selectin glycoprotein ligand PTH: parathyroid hormone PTHrP: parathyroid hormone-related peptide PYD: pyridinoline RAFTK: related adhesion focal tyrosine kinase RANK: receptor activator of nuclear factor-κβ RANKL: receptor activator of nuclear factor-κb ligand RPM: reps per minute Runx: Runt-related transcription factor2 SCF: stem cell factor SDF: stromal cell-derived factor sscf: soluble stem cell factor TGF: transforming growth factor TIMPs: tissue inhibitor matrix proteases TNF: tumor necrosis factor TPO: thrombopoietin TRAF: TNF receptor-associated factor TRAP: tartrate-resistant acid phosphatase VCAM: vascular cell adhesion molecule VEGF: vascular endothelial growth factor VEGFR: vascular endothelial growth factor receptor VLA: very late antigen vwf: von Willebrand factor 12

25 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΕΙΚΟΝΩΝ AGM: aorta-gonad-mesonephros Alk PO4: alkaline phosphatase ALP: alkaline phosphatase Ang: angiopoietin balp: bone alkaline phosphatase BAX: bcl-2-associated X protein BFU-E: burst forming unit-erythrocyte BG: byglycan BM: bone marrow BMP: bone morphogenic protein BSP: bone sialoprotein CaR: calcium-sensing receptor CD: cluster of differentiation CFU-E: colony forming uniterythrocyte CFU-M: colony forming unitmonocyte CFU-S: colony forming unit-spleen CLCN7: chloride channel, voltagesensitive 7 CLP: common lymphocyte progenitor CMP: common myeloid progenitor Col1: collagen type I ColI: collagen type I CTK: cathepsin K CTx: C-telopeptide of collagen type I CXCL: cysteine-noncysteine-cysteine ligand CXCR: cysteine-noncysteine-cysteine receptor d: day DC: dendritic cell Dkk1: Dickkopf-1 EC: endothelial cell ECM: extracellular matrix EGF: epidermal growth factor EPC: endothelial progenitor cell ESL: E-selectin ligand FGF: fibroblast growth factor FL: fetal liver FL: Flt ligand FM: fibromodulin Fn: fibronectin FN: fibronectin GAG: glycosaminoglycan G-CFC: granulocyte-colony forming cells G-CSF: granulocyte colonystimulating factor GlyCAM: glycosylation-dependent cell adhesion molecule GM-CFC: granulocyte monocytecolony forming cells GM-CSF: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor GMP: granulocyte macrophage progenitor GPCR: G protein-coupled receptor Gro: growth-regulated oncogene HA: hyaluronic acid HGF: hepatocyte growth factor HS: heparin sulfate proteoglycan HSC: hematopoietic stem cell HSPC: hematopoietic stem and progenitor cell ICAM: intercellular adhesion molecule Ig CAM: Ig cellular adhesion molecule IGF: insulin-like growth factor IL: interleukin INF: interferon JAK: Janus-activating kinase LFA: lymphocyte associated antigen LIF: leukocyte inhibitory factor MAdCAM: mucosal vascular addressin cell adhesion molecule M-CFC: monocyte-colony forming cells MCP: monocyte chemotactic protein M-CSF: macrophage colonystimulating factor

26 Meg-CFC: megakaryocyte-colony forming cells MEP: megakaryocyte erythroid progenitor MGP: matrix Gla protein MIP: macrophage inflammatory protein MITF: micropthalmia-associated transcription factor MMP: matrix metalloproteinase MPP: multipotent progenitor cell MSC: mesenchymal stem cell NO: nitric oxide NTx: N-telopeptide of collagen type I OB: osteoblast OC: osteoblast cell OC: osteoclast OCIL: osteoclast inhibitory lectin OCL: osteoclast OCN: osteocalcin ON: osteonectin ONC: oncostatin OPG: osteoprotegerin OPN: osteopontin Osx: Osterix PAF: platelet activation factor PC: progenitor cell PDGF: platelet-derived growth factor PDGFR: platelet-derived growth factor receptor PEC: periendothelial cell PECAM: platelet and endothelial cell adhesion molecule PF: platelet factor PICP: procollagen type I C-terminal propeptide PINP: procollagen type I N-terminal propeptide pob: precursor osteoblast poc: precursor osteoclast PSGL: P-selectin glycoprotein ligand PTH: parathyroid hormone PTHrP: parathyroid hormone-related peptide RA: receptor antagonist RANK: receptor activator of nuclear factor-κβ RANKL: receptor activator of nuclear factor-κb ligand RBC: red blood cell RSTK: serine/threonine kinase receptor RTK: tyrosine kinase receptor Runx: Runt-related transcription factor SCF: stem cell factor SDF: stromal cell-derived factor sfrp: secreted Frizzled-related protein Spl: spleen StrC: stromal cell TCR: T cell receptor TF: tissue factor TGF: transforming growth factor TNF: tumor necrosis factor TP: thrombospondin TPO: thrombopoietin TRAP: tartrate-resistant acid phosphatase VCAM: vascular cell adhesion molecule VEGF: vascular endothelial growth factor VEGFR: vascular endothelial growth factor receptor VLA: very late antigen vwf: von Willebrand factor 12

27 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΠΙΝΑΚΩΝ ALP: alkaline phosphatase Ang: angiopoietin balp: bone alkaline phosphatase BMP: bone morphogenic protein BSP: bone sialoprotein cc: correlation coefficient CCT: conventional chemotherapy CTx: C-telopeptide of collagen type I d: day Dkk1: Dickkopf-1 DMP: dentin matrix protein DPD: deoxypyridinoline DSPP: dentin sialophosphoprotein FBN: fibrillins FN: fibronectin HDT: high dose therapy HL: Hodgkin Lymphoma HSCT: hematopoietic stem cell transplantation HYP: hydroxyproline IGF: insulin-like growth factor MEPE: matrix extracellular phosphoglycoprotein NHL: Non-Hodgkin Lymphoma NTx: N-telopeptide of collagen type I OCN: osteocalcin ONT: osteonectin OPG: osteoprotegerin OPN: osteopontin PICP: procollagen type I C-terminal propeptide PINP: procollagen type I N-terminal propeptide PYD: pyridinoline RANKL: receptor activator of nuclear factor-κb ligand SIBLING: small integrin-binding ligand N-linked glycoprotein SLRP: small leucine-rich proteoglycan TGF: transforming growth factor TRAP: tartrate-resistant acid phosphatase TSP: thrombospondin

28 2

29 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, με τις δυο μοναδικές τους ιδιότητες, δηλαδή την ικανότητα αυτοανανέωσης και τη δυνατότητα να δίνουν γένεση σε όλες τις αιμοποιητικές σειρές, αποτελούν τον ακρογωνιαίο λίθο του αιμοποιητικού συστήματος. Εδρεύουν στην κοιλότητα του μυελού των οστών σε συγκεκριμένες «φωλιές», οι οποίες υποστηρίζουν την επιβίωση, την ανανέωση και τη διαφοροποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Για ερευνητικούς σκοπούς έχουν αναγνωριστεί δυο τύποι φωλιάς: Η ενδοοστική (οστεοβλαστική) και η ενδοθηλιακή (αγγειακή) που εντοπίζονται στις δοκιδώδεις περιοχές των οστών και εξασφαλίζουν το απαραίτητο μικροπεριβάλλον για τη λειτουργία των αιμοποιητικών κυττάρων. Το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών απαρτίζεται από τα κύτταρα του στρώματος, την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία και τα αιμοποιητικά κύτταρα. Τα παραπάνω στοιχεία συνδέονται μηχανικά, επικοινωνούν και αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές μεσολαβούνται από μόρια προσκόλλησης, κυτταροκίνες και αυξητικούς αιμοποιητικούς παράγοντες και είναι απαραίτητες για την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων. Κλασσικό παράδειγμα της αλληλεπίδρασης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων με το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών αποτελεί η κυκλοφορία των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (κινητοποίηση-εγκατάσταση). Η μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, ως θεραπευτική πράξη, στηρίζεται στην εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, όπου τα εγχυόμενα αιμοποιητικά κύτταρα μεταναστεύουν από το περιφερικό αίμα στον μυελό των οστών. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει κυτταρικές συνδέσεις, κύλισμα και διάβαση μέσω των ενδοθηλιακών κυττάρων και αγκυροβόληση στις φωλιές του μυελού των οστών. Πλέον, θεωρείται δεδομένο ότι υπάρχει μια αμφίδρομη σχέση μεταξύ του μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών και, κατ επέκταση, της ενδοοστικής και της ενδοθηλιακής φωλιάς και των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Οι πιο σημαντικοί τύποι κυττάρων στις φωλιές αυτές είναι οι οστεοβλάστες και τα ενδοθηλιακά κύτταρα αντίστοιχα. Μέχρι πρόσφατα, ο ρόλος του οστίτη ιστού στην 1

30 αιμοποίηση και την κυκλοφορία των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων είχε υποεκτιμηθεί. Ωστόσο, φαίνεται, πλέον, ότι ο οστίτης ιστός δεν αποτελεί απλά έναν δομικό ιστό που στηρίζει τον μυελό των οστών, αλλά συμμετέχει στο μοναδικό κατάλληλο μικροπεριβάλλον στο οποίο τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα μπορούν να υποστηρίξουν την αιμοποίηση επί μακρόν. Οι περισσότερες γνώσεις που αφορούν το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών και τους μηχανισμούς που διέπουν την εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων προέρχονται είτε από πειραματικά μοντέλα σε ζώα είτε από in vitro μελέτες. Μελέτες του ρόλου του οστίτη ιστού και του ενδοθηλίου στην εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων σε ανθρώπους είναι εξαιρετικά σπάνιες. Σκοπός αυτής της εργασίας είναι η μελέτη των δεικτών του οστικού μεταβολισμού και των αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων σε ασθενείς που υποβάλλονται σε μεγαθεραπεία και αυτόλογη μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων για αιματολογικές κακοήθειες, προσπαθώντας να αποκτήσουμε μια πρώτη εικόνα σχετικά με τον ρόλο του μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών και, πιο ειδικά, του οστίτη ιστού και του ενδοθηλίου στην εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στους ανθρώπους. 2

31 2. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1 Η διαδικασία της αιμοποίησης Τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα αποτελούν τον θεμέλιο λίθο του αιμοποιητικού συστήματος και διατηρούν την παραγωγή όλων των αιμοποιητικών σειρών εφ όρου ζωής. Έχουν δύο μοναδικές ιδιότητες: α) Την ικανότητα αυτοανανέωσης, β) Τη δυνατότητα να δίνουν γένεση σε όλες τις αιμοποιητικές σειρές. Από τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα μέχρι τις πρόδρομες μορφές και τα πλήρως λειτουργικά κύτταρα του αίματος η πολυδυναμικότητα και η ικανότητα πολλαπλασιασμού μειώνονται, ενώ η συχνότητα και ο ρυθμός αντικατάστασης αυξάνονται (Εικόνα Γ1). Εικόνα Γ1: Η ιεραρχία της αιμοποίησης a. Τα πρώτα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα εμφανίζονται στην περιοχή Αορτή- Γονάδες-Μεσόνεφρος. Άλλα αιμοποιητικά κύτταρα και πρόδρομες μορφές 3

32 δημιουργούνται στον λεκιθικό ασκό και τον πλακούντα. Δεν έχει διασαφηνιστεί ακόμη εάν στον λεκιθικό ασκό και τον πλακούντα δημιουργούνται αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. Αιμοποιητικά κύτταρα από τους τρείς αυτούς ιστούς μεταναστεύουν και αποικίζουν το εμβρυικό ήπαρ. Εν συνεχεία, τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα μεταναστεύουν και αποικίζουν τον μυελό των οστών, όπου παραμένουν στα ενήλικα στάδια της ζωής (Εικόνα Γ2). Εικόνα Γ2: Θέσεις αιμοποίησης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης a. Προκειμένου να εξασφαλίσουν τη συνεχή παραγωγή των κυττάρων του αίματος για πολλές δεκαετίες τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα παραμένουν σε ένα εξειδικευμένο μικροπεριβάλλον, τις αιμοποιητικές φωλιές του μυελού των οστών, οι οποίες στηρίζουν τη διατήρηση, την αυτοανανέωση, την επέκταση, τη διαφοροποίηση και τη μετανάστευση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, μέσω παραγωγής τοπικών αυξητικών παραγόντων, κυτταρικών αλληλεπιδράσεων και πιο απομακρυσμένων σημάτων. Το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών είναι εξαιρετικά πολύπλοκο και περιλαμβάνει τις ενδοοστικές (οστεοβλαστικές) και ενδοθηλιακές (αγγειακές) φωλιές, που εντοπίζονται μέσα στις δοκιδώδεις περιοχές των μακρών οστών (Εικόνα Γ3) 1. 4

33 Εικόνα Γ3: Οι αιμοποιητικές φωλιές του μυελού των οστών a. 5

34 6

35 2.2 Το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών Το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών (Εικόνα Γ4) απαρτίζεται από τα κύτταρα του στρώματος, τους φυσικούς μεσολαβητές της αλληλεπίδρασης αιμοποιητικών κυττάρων-κυττάρων του στρώματος και κυττάρων-περιβάλλοντος, την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία και τους διαλυτούς παράγοντες που ρυθμίζουν την αλληλεπίδραση κυττάρων μεταξύ τους και την αλληλεπίδραση κυττάρων-εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας 2. Εικόνα Γ4: Το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών b Κύτταρα του στρώματος Τα κύτταρα του στρώματος αντιπροσωπεύουν την ομάδα των κυττάρων που προέρχονται από τον μυελό των οστών και έχουν την ικανότητα να στηρίζουν επί μακρόν την αιμοποίηση in vitro και in vivo. Διαιρούνται σε τρείς κατηγορίες: Μεσεγχυματικά στελεχιαία κύτταρα από τα οποία προέρχονται οι οστεοβλάστες, τα λιποκύτταρα και οι ινοβλάστες. Μονοκύτταρα-μακροφάγα και οστεοκλάστες. Ενδοθηλιακά κύτταρα. Από παρατηρήσεις στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο φαίνεται ότι υπάρχει στενή αλληλεπίδραση ανάμεσα στα στρωματικά κύτταρα και τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. Για παράδειγμα, οι οστεοβλάστες και οι οστεοκλάστες επιτείνουν τη λειτουργία τους στους αιμοποιητικούς χώρους, παίζοντας κάποιο ρόλο στη ρύθμιση της δυναμικής του μυελού των οστών για αιμοποίηση. 7

36 α) Ινοβλάστες Οι πρώτες καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων in vitro είχαν ως θρεπτικό υπόστρωμα τους ινοβλάστες. Διακρίνονται από τα αιμοποιητικά κύτταρα από την παρουσία της α-ακτίνης των λείων μυικών ινών και από την απουσία δεικτών αιμοποιητικών κυττάρων, όπως CD14, CD34, CD45. Οι ινοβλάστες εκφράζουν υποδοχείς για κυτταροκίνες, όπως ο bfgf (basic fibroblast growth factor), ο EGF (epidermal growth factor), ο PDGF (platelet-derived growth factor) και ο TGF-b (transforming growth factor-b). Εκκρίνουν συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, όπως πρωτεογλυκάνες, κολλαγόνο, ινωδονεκτίνη, λαμινίνη, ενώ εκφράζουν και μόρια προσκόλλησης, όπως το VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1). Με τον τρόπο αυτό αλληλεπιδρούν άμεσα με τα αιμοποιητικά κύτταρα. Εικόνα Γ5: Δομή ενός ινοβλάστη c. Φαίνεται ότι επηρεάζουν έμμεσα, μέσω έκκρισης GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), IL-6 (interleukin-6) και LIF (leukocyte inhibitory factor), τη διαφοροποίηση της μονοκυτταρικής και της λεμφικής σειράς 3, ενώ αναστέλλουν την κοκκιοκυτταροποίηση 4. β) Οστεοβλάστες Οι οστεοβλάστες είναι υπεύθυνοι για την οστική αναδόμηση. Οι πρόδρομες μορφές διαφοροποιούνται παράλληλα με τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα και υπάρχουν είτε ως επίπεδα αδρανή κύτταρα που καθορίζουν τα όρια του οστού είτε ως οστεοκύτταρα που εγκλείονται στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία. Οι ώριμοι 8

37 οστεοβλάστες είναι κύτταρα θετικά ως προς την αλκαλική φωσφατάση, την οστεοποντίνη και την οστεοκαλσίνη. Εικόνα Γ6: Μεσεγχυματικά κύτταρα (Μ) συμπυκνώνονται και διαφοροποιούνται σε οστεοβλάστες (ΟΒ) d. Τόσο οι εμβρυικοί όσο και οι ενήλικοι οστεοβλάστες εκκρίνουν κολλαγόνο τύπου Ι και ινωδονεκτίνη ως συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, έστω και για διαφορετικό σκοπό (στην εμβρυική ζωή η ινωδονεκτίνη στηρίζει τη διαφοροποίηση, ενώ στους ενήλικες την επιβίωση των οστεοβλαστών 5 ). Επιπλέον, οι οστεοβλάστες εκκρίνουν οστεονεκτίνη, που είναι μια γλυκοπρωτεϊνη σύνδεσης τόσο με κύτταρα όσο και με συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και παίζει ρόλο στην παρουσίαση αυξητικών παραγόντων 6. In vitro, μαζί με αιμοποιητικά κύτταρα, οι οστεοβλάστες στηρίζουν τον σχηματισμό αποικιών και LTC-IC (long-term cultureinitiating cells), μέσω της παραγωγής διαλυτών παραγόντων, όπως ο HGF (hepatocyte growth factor), ο M-CSF και ο GM-CSF, που ενισχύουν την επιβίωση, τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων 7. Ωστόσο, εκκρίνουν και ανασταλτικούς παράγοντες αιμοποίησης, όπως ο TGF-b και ο TNF-a (tumor necrosis factor-a) 8. Φαίνεται, λοιπόν, ότι, μέσω της αυστηρής ρύθμισης των εκκρινόμενων αυξητικών παραγόντων, οι οστεοβλάστες βοηθούν στη διατήρηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Τέλος, οι οστεοβλάστες είναι από τα πρωταρχικά κύτταρα του οστού που εκκρίνουν τον SDF-1 (stromal cell-derived factor-1), μία χημειοκίνη που μεσολαβεί στην κινητικότητα αιμοποιητικών και μη κυττάρων 9. 9

38 γ) Λιποκύτταρα Ο αριθμός και το μέγεθος των λιποκυττάρων αυξάνει όσο η αιμοποιητική δραστηριότητα στον μυελό των οστών ελαττώνεται με τη φυσιολογική διαδικασία της γήρανσης. Εικόνα Γ7: Δομή ενός λιποκυττάρου e. Τα λιποκύτταρα εκκρίνουν λεπτίνη, το προϊόν έκφρασης του γονιδίου της παχυσαρκίας 10, που αναστέλλει τη διαφοροποίηση των λιποκυττάρων, προάγωντας τη διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών στελεχιαίων κυττάρων σε οστεοβλάστες 11. Ο υποδοχέας της λεπτίνης έχει ανευρεθεί σε πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα (μακρά και βραχεία ισομορφή του υποδοχέα). Κατά τη μυελική διαφοροποίηση η έκφραση του υποδοχέα της λεπτίνης ελαττώνεται, αλλά σε περιπτώσεις οξείας μυελογενούς λευχαιμίας έχουν ανευρεθεί μονοπύρηνα κύτταρα με ισχυρή έκφραση και των δύο ισομορφών του υποδοχέα της λεπτίνης, υποδηλώνοντας έναν ρόλο της λεπτίνης στον πολλαπλασιασμό και την αναστολή της απόπτωσης στα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα 12. Η λεπτίνη έχει βρεθεί ότι ενισχύει την ανάπτυξη τόσο της κοκκιώδους όσο και της ερυθράς σειράς (συνεργική δράση με ερυθροποιητίνη) 13. Επιπλέον, τα λιποκύτταρα εκκρίνουν VEGF (vascular endothelial growth factor), έναν αγγειογενετικό αυξητικό παράγοντα που διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων 14. Συγκεντρωτικά, τα λιποκύτταρα συμμετέχουν στην ανάπτυξη του μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών (οστεοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα), αλλά και των αιμοποιητικών κυττάρων. δ) Μακροφάγα και οστεοκλάστες Αιμοποιητικής προέλευσης, τα μακροφάγα και οι οστεοκλάστες μοιράζονται κοινό πρόδρομο το CD34+ πρόδρομο μονοκύτταρο. Τα μακροφάγα ταυτοποιούνται από 10

39 τους δείκτες CD14, CD45 και έχουν ικανότητα φαγοκυττάρωσης. Εκκρίνουν κυτταροκίνες, όπως ο TNF-a, ο TGF-b, και χημειοκίνες, όπως η MIP-1 (macrophage inflammatory protein-1) και η MCP-1 (macrophage chemoattractant protein-1), που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων. Επιπλέον, τα μακροφάγα εκκρίνουν αγγειογενετικούς παράγοντες, όπως ο bfgf, ο PDGF, ο GM- CSF και το ACE (angiotensin-converting enzyme), οι οποίοι προάγουν τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης 15. In vitro, με άγνωστο μηχανισμό, Ph+ μακροφάγα σε Χρονία Μυελογενή Λευχαιμία συμβάλλουν στην ανεπάρκεια του στρώματος του μυελού των οστών να στηρίξει την αιμοποίηση 16. Το πρόδρομο μονοκύτταρο μπορεί να διαφοροποιηθεί, παρουσία του RANKL (receptor activator of nuclear factor-κb ligand), που παράγεται από τα στρωματικά κύτταρα και τους οστεοβλάστες, σε οστεοκλάστη 17 (Εικόνα Γ8). Εικόνα Γ8: Η αλληλουχία διαφοροποίησης του οστεοκλάστη f. Οι οστεοκλάστες είναι θετικά ως προς την TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) πολυπύρηνα κύτταρα που διαφοροποιούνται in vitro παρουσία M-CSF και βιταμίνης D3. Απορροφούν οστικές επιφάνειες εκκρίνοντας πρωτόνια, MMP-9 (matrix metalloproteinase-9) και όξινες υδρολάσες, όπως η καθεψίνη Κ, που αποδομούν αποτελεσματικά την τριπλή έλικα του κολλαγόνου. Ουσιαστικά, οι οστεοκλάστες επιδρούν στην αιμοποίηση διαταράσσοντας την οστική δομή 18. Τέλος, εκκρίνουν διαλυτούς παράγοντες, όπως IL-6 και TGF-b2, που λειτουργούν με αυτοκρινή και παρακρινή μηχανισμό, επηρεάζοντας τον σχηματισμό και/ή τη λειτουργία των οστεοκλαστών, αλλά και τον πολλαπλασιασμό των αιμοποιητικών κυττάρων

40 ε) Ενδοθηλιακά κύτταρα Λειτουργώντας, εν μέρει, ως φυσικός φραγμός ανάμεσα στην κοιλότητα του μυελού των οστών και την κυκλοφορία, τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν τους επιφανειακούς δείκτες CD34 και CD31, καθώς και vwf (von Willebrand factor), αλλά στερούνται CD45. Επιπλέον, εκφράζουν μόρια προσκόλλησης, όπως E- και P- σελεκτίνη, ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) και VCAM-1, που διαδραματίζουν κάποιον ρόλο στην κινητοποίηση και την εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, ενώ εκκρίνουν και χημειοκίνες, όπως ο SDF-1 και η IL-8, που ενεργοποιούν ιντεγκρίνες στην επιφάνεια αρχέγονων και πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων 20. Εικόνα Γ9: Το ενδοθηλιακό κύτταρο και οι πολλαπλές λειτουργίες του g. Συγχρόνως, εκκρίνουν διαλυτούς παράγοντες, όπως ο VEGF, ο PDGF και η αγγειοποιητίνη, οι οποίοι ευνοούν τον πολλαπλασιασμό των πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων που εκφράζουν FLK-1 και Tie υποδοχείς στην επιφάνειά τους 21. Ενδοθηλιακά κύτταρα που προέρχονται από τον σπλήνα επίμυος (περιοχή ερυθροποίησης στους επίμυες) υποστηρίζουν την ωρίμανση των ερυθροκυττάρων, μέσω ενός συστήματος επαφής που εξαρτάται από την αλληλεπίδραση κυττάρων μεταξύ τους 22. Μελέτες, λοιπόν, υποστηρίζουν τόσο την άμεση όσο και την έμμεση επίδραση των ενδοθηλιακών κυττάρων στην αιμοποίηση. 12

41 2.2.2 Φυσικοί μεσολαβητές της αλληλεπίδρασης αιμοποιητικών κυττάρωνκυττάρων του στρώματος και κυττάρων-περιβάλλοντος α) Ιντεγκρίνες Όπως υποδηλώνει το όνομα, οι ιντεγκρίνες ενσωματώνουν τον κυτταροσκελετό με την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία, μεσολαβώντας στον σχηματισμό εστιακών πλακών προσκόλλησης στα σημεία επαφής κυττάρων-θεμέλιας ουσίας και κυττάρων μεταξύ τους κατά τη διάρκεια προσκόλλησης και μετανάστευσης. Έχουν ταυτοποιηθεί τουλάχιστον 25 διαφορετικές ιντεγκρίνες, που ποικίλουν στον ετεροδιμερισμό ανάμεσα σε 19 διαφορετικές α- και 8 διαφορετικές β- υπομονάδες. Στερούνται δραστικότητας τυροσινικής κινάσης, το ενδοκυττάριο τμήμα είναι βραχύ και φέρει σταθμούς προσαρμογής σηματοδοτικών πρωτεϊνών. Το εξωκυττάριο τμήμα μεσολαβεί στην ειδικότητα σύνδεσης του προσδέτη. Η ενεργοποίηση των ιντεγκρινών απαιτεί δισθενή κατιόντα, όπως Mg 2+, Mn 2+, που εκτοπίζουν το Ca 2+ από τις ιντεγκρίνες, μετατρέποντας τον υποδοχέα από αδρανή σε ενεργή μορφή. Ενδοκυττάρια σήματα αυξάνουν τη συγγένεια σύνδεσης του προσδέτη, ενώ εξωκυττάρια σήματα από αυξητικούς παράγοντες επάγουν την αναδιάταξη του κυτταροσκελετού. Έτσι, η πλήρης ενεργοποίηση των ιντεγκρινών είναι αποτέλεσμα τόσο εξωκυττάριων όσο και ενδοκυττάριων σημάτων 23 (Εικόνα Γ10). Εικόνα Γ10: Δομή και σχέση δομής-λειτουργίας των ιντεγκρινών h. 13

42 β1-ιντεγκρίνες Στην κατηγορία αυτή περιλαμβάνονται τα VLA (very late antigens) -2, -4, -5, -6, που αποτελούνται από τη β1 υπομονάδα συνδυασμένη με την α -2, 4, 5, 6, αντίστοιχα υπομονάδα. Η α2β1 συνδέεται με τη λαμινίνη, ενώ η α6β1 συνδέεται με το κολλαγόνο, χωρίς κανένα να εκφράζεται στα φυσιολογικά προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα. Ωστόσο, η α2β1 έχει βρεθεί να εκφράζεται σε CD34+ κύτταρα Χρονίας Μυελογενούς και Οξείας Μυελογενούς Λευχαιμίας, υποδηλώνοντας έναν ρόλο στην προαγωγή της προσκόλλησης του λευχαιμικού κυττάρου στη βασική μεμβράνη πριν από την έξοδο από το αγγείο 24. Η α4β1 και η α5β1 εκφράζονται σε προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, η έκφραση μειώνεται με τη διαφοροποίηση και συνδέονται με την ινωδονεκτίνη. Επιπροσθέτως, η α4β1 συνδέεται με το VCAM-1, το οποίο εκφράζεται, για παράδειγμα, στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η ενεργοποίηση των α4β1 και α5β1 οδηγεί στην επιστράτευση προσαρμογέων του κυτταροσκελετού και στη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK (focal adhesion kinase) και της κινάσης RAFTK (related adhesion focal tyrosine kinase), που, τελικά, αναμεταδίδουν σήματα που εμπλέκονται στην κινητικότητα, την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα παραμένουν στον μυελό των οστών μετά από σύνδεση με τις ιντεγκρίνες α4β1 και/ή α5β1, κάτι που αντιστρέφεται in vivo με παράγοντες κινητοποίησης, όπως ο G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor) ή αντίσωμα έναντι της α4β1 25. Πιστεύεται ότι στη Χρονία Μυελογενή Λευχαιμία η ανεπαρκής ενεργοποίηση αυτών των ιντεγκρινών συμβάλλει στην κινητοποίηση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων που παρατηρείται. Αντίστροφα, αυξημένα επίπεδα του SDF-1 μετά από ακτινοβολία ενεργοποιούν τις ιντεγκρίνες και εξυπηρετούν την εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στον μυελό των οστών 9. In vitro έχει βρεθεί ότι η σύνδεση CD34+ προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων με την ινωδονεκτίνη μέσω της α4β1 και/ή της α5β1 έχει αρνητική επίδραση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό 26. Ανεπάρκεια της α4β1 και/ή της α5β1 στη Χρονία Μυελογενή Λευχαιμία οδηγεί σε ανεξέλεγκτο κυτταρικό πολλαπλασιασμό 27. Καθώς προχωρά η διαφοροποίηση, η εξάρτηση από τις παραπάνω ιντεγκρίνες ελαττώνεται. Επιπλέον, η α4β1 φαίνεται ότι διαδραματίζει εξαιρετικά σημαντικό ρόλο, πιθανώς μεγαλύτερο από τις σελεκτίνες, στην εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στον μυελό των οστών. Η σύνδεση της α4β1 και της α5β1 με την ινωδονεκτίνη και το 14

43 VCAM-1 εξαρτάται από την κατάσταση ενεργοποίησης της ιντεγκρίνης, κάτι που επηρεάζεται από διαλυτούς παράγοντες, όπως είναι οι αυξητικοί παράγοντες και οι χημειοκίνες. Τέλος, διασταυρούμενη αντίδραση ανάμεσα στην α4β1 και το CD44 φαίνεται να συμμετέχει στην ενεργοποίηση των β1 ιντεγκρινών, αντικατοπτρίζοντας περαιτέρω την πολυπλοκότητα της ρύθμισης της αιμοποίησης μέσω ιντεγκρινών 28. β2-ιντεγκρίνες Στην κατηγορία αυτή περιλαμβάνονται το LFA-1 (lymphocyte associated antigen- 1) και το Mac-1 (macrophage antigen-1). Σε in vitro καλλιέργειες με κυτταροκίνες που ευνοούν την ωρίμανση διαπιστώθηκε αύξηση στην έκφραση του LFA-1. Πιστεύεται ότι η απώλεια της επαφής με το στρώμα του μυελού των οστών οδηγεί σε αύξηση της έκφρασης του LFA-1, που με τη σειρά του διευκολύνει την απομάκρυνση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων από τον μυελό των οστών. Αγωγή με anti-lfa-1 αντίσωμα εμποδίζει την κινητοποίηση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων υπό IL-8. Ωστόσο, η εγκατάσταση αιμοποιητικών κυττάρων με ανεπάρκεια LFA-1 δε διαφοροποιείται από τα φυσιολογικά, υποδηλώνοντας ότι η λειτουργία του LFA-1 δεν είναι αναγκαία για την εγκατάσταση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων μετά από μεταμόσχευση 29. Επιπλέον, η συγκεκριμένη ιντεγκρίνη φαίνεται να συμμετέχει στις ανοσολογικές αντιδράσεις, καθώς εκφράζεται έντονα στα λευκοκύτταρα και μεσολαβεί στην προσκόλληση και μετανάστευση των λευκοκυττάρων στις εστίες λοίμωξης, ενώ η ανεπάρκειά της σχετίζεται με μεγαλύτερη ευαισθησία στις λοιμώξεις 30. Η ενεργοποίησή της ακολουθεί το γενικότερο μοτίβο των ιντεγκρινών. Φαίνεται, πάντως, ότι ο ρόλος της είναι σημαντικότερος στην κινητικότητα των λευκοκυττάρων παρά των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. CD44 Αποτελεί τον κυριότερο υποδοχέα για το υαλουρονικό οξύ, υπάρχει σε διάφορες ισομορφές, η έκφραση ποικίλει ανάμεσα σε πρόδρομα και διαφοροποιημένα κύτταρα, αλλά και ανάμεσα σε διαφορετικά όργανα από τα οποία απομονώνονται τα αιμοποιητικά κύτταρα. Για παράδειγμα, τα πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα στον μυελό των οστών εκφράζουν χαμηλότερα επίπεδα CD44 στην επιφάνειά τους σε σχέση με τα αντίστοιχα από τον ομφάλιο λώρο 31. Παρά το γεγονός ότι το 15

44 CD44 εκφράζεται ευρέως, τα περισσότερα φυσιολογικά αιμοποιητικά κύτταρα που εκφράζουν CD44 δε δεσμεύουν το υαλουρονικό οξύ, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση του CD44 υπερισχύει της έκφρασης. Το CD44 συνδέεται με το υαλουρονικό οξύ, την L-σελεκτίνη και ορισμένες ισομορφές αυτού συνδέονται με την οστεοποντίνη και τη σεργλυκερίνη. Ο υποδοχέας αυτός έχει τρεις καταστάσεις ενεργοποίησης: ιδιοσυστασιακή, επαγώγιμη, ανενεργή. Επαγώγιμη ενεργοποίηση του υποδοχέα μπορεί να γίνει με μονοκλωνικό αντίσωμα anti- CD44, αλλά ο διμερισμός του δεν αρκεί για τη σύνδεση με το υαλουρονικό οξύ, όταν χρησιμοποιείται κυτοχαλαζίνη D (φάρμακο που διασπά τον κυτταροσκελετό). Έτσι, η ιδανική σύδεση του CD44 με το υαλουρονικό οξύ απαιτεί αναδιάταξη των νηματίων ακτίνης του κυτταροσκελετού 32,33. Λειτουργικά, η σύνδεση υαλουρονικού οξέος-cd44 συμμετέχει στον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων. Σε επίμυες που στερούνται CD44 παρατηρείται φυσιολογική αιμοποίηση, αλλά αυξημένη απομάκρυνση των πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων από τον μυελό των οστών 34, ενώ η αγωγή με αντίσωμα που μπλοκάρει το CD44 προάγει την κινητοποίηση και εμποδίζει την εγκατάσταση προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων στον μυελό των οστών 35,36. Μια ισομορφή του υποδοχέα που εκφράζεται στα CD34+ προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα συνδέεται με την Ε- σελεκτίνη που εκφράζεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα, υποδηλώνοντας συμμετοχή του CD44 στην εγκατάσταση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Τέλος, η ενεργοποίηση CD44 με μονοκλωνικά αντισώματα ενισχύει την προσκόλληση αιμοποιητικών κυττάρων με χαμηλή συγγένεια σύνδεσης ανάμεσα στην α4β1 και την ινωδονεκτίνη 28. β) Μόρια προσκόλλησης τύπου βλεννίνης Βρίσκονται σε αφθονία στα πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα, σχηματίζοντας ένα αρνητικά φορτισμένο κελί γύρω από τα κύτταρα, μεσολαβώντας στην απώθηση ανάμεσα στα κύτταρα 37. CD43 Εκφράζεται σε όλα σχεδόν τα αιμοποιητικά κύτταρα, εκτός από τα ερυθροκύτταρα. Διαταραχή στη γλυκοζυλίωση αυτού του μορίου προσκόλλησης παρατηρείται στο σύνδρομο Wiscott-Aldrich και σχετίζεται με αδυναμία των λεμφοκυττάρων να πολλαπλασιασθούν σε απάντηση στην IL Ο αυξημένος αριθμός υπομονάδων σιαλικού οξέος αυξάνει το αρνητικό φορτίο του 16

45 πρωτεϊνικού μορίου, δημιουργώντας απώθηση ανάμεσα στα κύτταρα. Η ενεργοποίηση του CD43 δύναται να επάγει την απόπτωση στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, όχι και στα στελεχιαία κύτταρα 39, ενώ ενισχύει τη σύνδεση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων μέσω της α4β1 και της α5β1. Έτσι, το αποτέλεσμα της ενεργοποίησης του CD43 σε ένα κύτταρο εξαρτάται από το στάδιο διαφοροποίησής του 40,41. CD164 Εκφράζεται τόσο σε αιμοποιητικά όσο και σε μη αιμοποιητικά στοιχεία του μυελού των οστών. Στα αιμοποιητικά κύτταρα το CD164 είναι πιο άφθονο στις πιο πρόδρομες μορφές. Επιπροσθέτως, το CD164 εκφράζεται στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, στις πρόδρομες μορφές της ερυθράς και της μονοκυτταρικής σειράς 42. Ανευρίσκεται, κυρίως, στα ενδοσωμάτια και τα λυσοσωμάτια και, λιγότερο, στην κυτταρική επιφάνεια. Αντισώματα έναντι του CD164 μειώνουν την προσκόλληση των αιμοποιητικών κυττάρων μέσω CD164 στα κύτταρα του στρώματος του μυελού των οστών και αναστέλλουν την είσοδο σε κυτταρικό κύκλο CD κυττάρων, παρά την παρουσία κυτταροκινών. Σε αντίθεση με το CD43, το CD164 ρυθμίζει αρνητικά την αιμοποίηση σε επίπεδο πολλαπλασιασμού, όχι σε επίπεδο κυτταρικής επιβίωσης 43. CD34 Εκφράζεται στα πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα, αλλά η έκφραση ελαττώνεται με τη διαφοροποίηση. Το ενδοκυττάριο τμήμα, που εμπλέκεται στη μεταγωγή σημάτων, έχει δύο περιοχές φωσφορυλίωσης πρωτεϊνικής κινάσης C και μία περιοχή φωσφορυλίωσης τυροσινικής κινάσης 44 (Εικόνα Γ11). Εικόνα Γ11: Δομή του CD34 i. 17

46 Ανεπαρκής έκφραση του CD34 σχετίζεται με διαταραχή στη διαφοροποίηση της ερυθράς και της μυελικής σειράς, καθώς και με μειωμένη ικανότητα επέκτασης των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων 45. Φαίνεται ότι η ενισχυμένη έκφραση του CD34 εμποδίζει τη διαφοροποίηση, υποδηλώνοντας εμπλοκή του κυτταροπλασματικού τμήματος του CD34 σε σηματοδοτικές οδούς που ανταγωνίζονται την ωρίμανση των αιμοποιητικών κυττάρων 46. Επιπλέον, το CD34 εκφράζεται και σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Η δομή του υποδηλώνει κάποιο ρόλο στην κυτταρική σύνδεση. Η ενεργοποίησή του δεν επάγει απόπτωση, ωστόσο μειώνει την ικανότητα πολλαπλασιασμού των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Συμπερασματικά, εκτός του ότι αποτελεί κυτταρικό δείκτη των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, το CD34 διαδραματίζει σημαντικούς λειτουργικούς ρόλους στο να εμποδίζει τη διαφοροποίηση και να μεσολαβεί στην κυτταρική σύνδεση. Συνδέτες σελεκτινών Εκτός από σελεκτίνες, τα αιμοποιητικά κύτταρα εκφράζουν συνδέτες για τις διάφορες σελεκτίνες, γεγονός που τονίζει τον ρόλο των σελεκτινών στις συνδέσεις τόσο κυττάρων-εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας όσο και κυττάρων μεταξύ τους. Ο PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1) λειτουργεί ως συνδέτης για την P-, E-, L-σελεκτίνη και μεσολαβεί στο κύλισμα των λευκοκυττάρων στα φλεβίδια, μέσω L-σελεκτίνης 47. Στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα ο PSGL-1 συνδέεται με την P-σελεκτίνη, κάτι που οδηγεί σε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού 48 και σε απόπτωση σε έναν μικρό πληθυσμό προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Η έκφραση του PSGL-1 στα Β, τα Τ λεμφοκύτταρα και τα NK (natural killers) κύτταρα ελαττώνεται, καθώς αυτά μεταναστεύουν σε δευτερογενή λεμφικά όργανα. Ο HCELL (hematopoietic cell E- and L-selectin ligand) αποτελεί μια ειδική γλυκομορφή του CD44 49 που μπορεί να συνδέεται και με την E- και την L-σελεκτίνη (με την τελευταία έχει 5 φορές μεγαλύτερη συγγένεια σύνδεσης από τον PSGL-1), υποδηλώνοντας ότι αποτελεί τον προτιμούμενο συνδέτη για τα λευκοκύτταρα στον μυελό των οστών. Τέλος, το CD34 μπορεί να λειτουργήσει ως συνδέτης L-σελεκτίνης στα ενδοθηλιακά κύτταρα. γ) Σελεκτίνες Περιλαμβάνονται οι P-, E-, L-σελεκτίνες, που εκφράζονται τόσο στα ενδοθηλιακά όσο και στα αιμοποιητικά κύτταρα. Γενικά, οι σελεκτίνες ρυθμίζουν την 18

47 προσκόλληση και το κύλισμα των λευκοκυττάρων στο αγγειακό ενδοθήλιο ως απόκριση σε φλεγμονώδη ερεθίσματα. P-σελεκτίνη Αποτελεί μεμβρανική πρωτεΐνη, που αποθηκεύεται στα κοκκία των αιμοπεταλίων και στα σωμάτια Weibel-Palade των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και των ενδοθηλιακών κυττάρων, για παράδειγμα με ισταμίνη ή θρομβίνη, οδηγεί σε φωσφορυλίωση της P-σελεκτίνης και μεταφορά της στην κυτταροπλασματική μεμβράνη, όπου λειτουργεί ως προσωρινή γέφυρα ανάμεσα στα λευκοκύτταρα και τα αιμοπετάλια ή τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Μπορεί επιπλέον να διασπασθεί και να εκκριθεί 50. Η έκφρασή της στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα μεσολαβεί στην αλληλεπίδρασή τους με τα αιμοπετάλια. Ε-σελεκτίνη Η συγκεκριμένη σελεκτίνη συντίθεται, αλλά δεν αποθηκεύεται, στα ενδοθηλιακά κύτταρα μετά από χορήγηση φλεγμονωδών κυτταροκινών 51. Μπορεί να ανευρεθεί και σε διαλυτή μορφή, ιδιαίτερα κατά την κινητοποίηση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων με G-CSF. Είναι σημαντική για την εγκατάσταση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων στον μυελό των οστών 52. L-σελεκτίνη Αποτελεί μόριο προσκόλλησης των λευκοκυττάρων, εκφράζεται σε μεγάλο εύρος αιμοποιητικών κυττάρων, κυρίως σε κυκλοφορούντα λευκοκύτταρα. Σε μεταγραφικό επίπεδο η έκφραση της σελεκτίνης ελαττώνεται από τον Ίκαρο 7, μια ισομορφή των μεταγραφικών παραγόντων Ίκαρος 53. Σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο η έκφρασή της στην κυτταρική επιφάνεια ρυθμίζεται, εν μέρει, από διαδικασία απόρριψης εξαρτώμενη από μεταλλοπρωτεϊνάση 54. Τόσο η μεμβρανική όσο και η διαλυτή μορφή είναι έντονα γλυκοζυλιωμένες, χαρακτηριστικό σημαντικό για την προσκόλληση/κύλισμα των λευκοκυττάρων στο αγγειακό ενδοθήλιο και την προσκόλληση των ενεργοποιημένων μεγακαρυοκυττάρων στους ινοβλάστες του μυελού των οστών. Η έγχυση CD34+ που εκφράζουν L-σελεκτίνη σχετίζεται θετικά με γρήγορη άνοδο των αιμοπεταλίων, υποδηλώνοντας κάποιον ρόλο της σελεκτίνης στην ευόδωση της εγκατάστασης 55. Ωστόσο, in vitro μελέτες σε CD34+ κύτταρα που είχαν υποστεί επεξεργασία με anti-l-σελεκτίνη αντίσωμα δεν έδειξαν διαφορές όσον αφορά στην προσκόλληση, το κύλισμα και τη μετανάστευσή τους δια του ενδοθηλίου

48 Το κατά πόσο, λοιπόν, η L-σελεκτίνη ευοδώνει την εγκατάσταση των στελεχιαίων κυττάρων, μέσω αυξημένου πολλαπλασιασμού μετά από μεταμόσχευση με ή χωρίς αυξημένη δυναμική εγκατάστασης στον μυελό των οστών, παραμένει αδιευκρίνιστο. Εικόνα Γ12: Δομή των σελεκτινών και αλληλεπιδράσεις με τους προσδέτες σελεκτινών j. δ) Μόρια προσκόλλησης τύπου ανοσοσφαιρίνης Το εξωκυττάριο τμήμα των μορίων αυτών έχει δομή παρόμοια με την ανοσοσφαιρίνη. Μεσολαβούν στη σύνδεση κυττάρων του ίδιου, αλλά και διαφορετικού τύπου. Το κυτταροπλασματικό τμήμα στερείται δραστικότητας κινάσης, ενώ είναι σημείο σύνδεσης πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού (Εικόνα Γ13) που ανήκουν στην οικογένεια ERM και που συνδέουν Ιg CAMs (Ig cellular adhesion molecules) με τον κυτταροσκελετό. Εικόνα Γ13: Δομή των Ig CAMs και σύνδεσή τους με τον κυτταροσκελετό k. 20

49 ICAM Αποτελούν συνδέτες για τις ιντεγκρίνες LFA-1 και Mac Το ενδοκυττάριο τμήμα αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες κυτταροσκελετού, όπως η ακτίνη και η εζρίνη. Ο ρόλος των μορίων αυτών ρυθμίζεται τόσο σε επίπεδο έκφρασης όσο και από την κατάσταση ενεργοποίησης. Για παράδειγμα, η έκφραση του ICAM-1 στα λεμφοκύτταρα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα αυξάνει από φλεγμονώδεις κυτταροκίνες, όπως η INF-γ (interferon-γ) και ο TNF-a, ενώ το ICAM-2 εκφράζεται ιδιοσυστασιακά στα ενδοθηλιακά κύτταρα 58. Ο ρόλος του ICAM-1 είναι καλύτερα κατανοητός στην κυκλοφορία των λευκοκυττάρων. Τα ουδετερόφιλα προσκολλώνται στο ICAM-1 των ενδοθηλιακών κυττάρων πριν από τη μεταφορά διαμέσου του ενδοθηλίου από τα αγγεία στους ιστούς. Στα πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα η επαγωγή του ICAM-1 εξαρτάται από τη θερμοκρασία και τον χρόνο 59. Το μόριο αυτό μεσολαβεί σε αλληλεπιδράσεις αιμοποιητικών κυττάρων-κυττάρων του στρώματος και αιμοποιητικών κυττάρων μεταξύ τους. Η σύνδεση του ICAM με τον συνδέτη επάγει τη φωσφορυλίωση της MAP κινάσης, κάτι που οδηγεί σε ενεργοποίηση της πρωτεϊνης AP-1 (activator protein-1), που εμπλέκεται στη ρύθμιση της κυτταρικής διαφοροποίησης και της απόπτωσης. Τέλος, η μετάδοση σημάτων μέσω των ICAM ρυθμίζει την παραγωγή κυτταροκινών και παραγώγων οξυγόνου 60. VCAM-1 Πρόκειται για διαμεμβρανική πρωτεΐνη της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών. Η σύνδεση του VCAM-1 με την ιντεγκρίνη α4β1 των λευκοκυττάρων είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση των λευκοκυτταρικών ιντεγκρινών. Επιπλέον, παίζει σημαντικό ρόλο στην εμβρυική ανάπτυξη. Η έλλειψη του σχετίζεται με διαταραχές στην ανάπτυξη του πλακούντα, αλλά και διαταραχές στον σχηματισμό της καρδιάς 61,62. Ιδιοσυστασιακά, εκφράζεται στα κύτταρα του στρώματος του μυελού των οστών. Κινητοποίηση με G-CSF προκαλεί σημαντική ελάττωση του κυτταρικά συνδεδεμένου VCAM-1 και αύξηση του διαλυτού VCAM-1 στο πλάσμα 63. Ένας από τους ρόλους του VCAM-1 φαίνεται να είναι η σύνδεση με την ιντεγκρίνη α4β1 των προγονικών αιμοποητικών κυττάρων και η καθήλωσή τους στις φωλιές του μυελού των οστών. Το διαλυτό VCAM-1 που προέρχεται από διάσπαση στα όρια του 21

50 εξωκυττάριου τμήματος μπορεί να απελευθερώσει τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της κινητοποίησης 64. PECAM-1 Το PECAM-1 (platelet and endothelial cell adhesion molecule-1) ανευρίσκεται σε αιμοπετάλια, μονοκύτταρα, ουδετερόφιλα, προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα και ενδοθηλιακά κύτταρα 65. Η ενεργοποίησή του οδηγεί τελικά, μέσα από διαδοχικές σηματοδοτικές οδούς, σε ενεργοποίηση του AKT, κάτι που προστατεύει τα κύτταρα από την απόπτωση 66. Η λειτουργία του PECAM-1 συνδέεται με την κινητοποίηση και την εγκατάσταση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, σχετιζόμενη άμεσα με αυξημένη μετανάστευση διαμέσου του ενδοθηλίου 67. Εικόνα Γ14: Μόρια προσκόλλησης l Συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Εικόνα Γ15: Σχηματική απεικόνιση των κυριότερων συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και των αλληλεπιδράσεών τους με τα κύτταρα m. 22

51 α) Πρωτεογλυκάνες Οι πρωτεογλυκάνες παράγονται από τα στρωματικά και τα αιμοποιητικά κύτταρα. Είναι μεγάλα μόρια που μπορεί να συνδέονται είτε στην κυτταρική επιφάνεια είτε διαμεμβρανικά. Η κεντρική πρωτεΐνη αποτελείται από εναλλασσόμενες υποομάδες εξοσαμίνης και ουρονικού οξέος ως σημεία διασύνδεσης για την προσκόλληση της αρνητικά φορτισμένης GAG (glycosaminoglycan) αλυσίδας. Η λειτουργική ετερογένεια και ειδικότητα των πρωτεογλυκανών εξαρτάται από το είδος της εστεροποίησης μέσα στην GAG αλυσίδα: θειϊκή χονδροϊτίνη, θειϊκή δερματάνη, θειϊκή ηπαράνη 68,69. Η σεργλυκερίνη αποτελεί την καλύτερα μελετημένη πρωτεογλυκάνη με θειϊκή χονδροϊτίνη. Παράγεται από μυελικά και λεμφικά αιμοποιητικά κύτταρα και αποτελεί τον κύριο προσδέτη του CD44 στον μυελό των οστών. Επιπλέον, συνδέει τον αιμοπεταλιακό παράγοντα 4, την MIP-1a, τη λυσοζύμη, όπως και συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, όπως η ινωδονεκτίνη και το κολλαγόνο 70. Στα μαστοκύτταρα συνδέεται με πρωτεάσες 71. Πρόσφατα, η σύνθεση και η έκκρισή της έχουν ταυτοποιηθεί σε ενδοθηλιακά κύτταρα της ομφαλικής φλέβας 72. Πρωτεογλυκάνες με θειϊκή ηπαράνη ανευρίσκονται στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα και παρουσιάζουν ισχυρή συγγένεια σύνδεσης με την IL-3, τον αιμοπεταλιακό παράγοντα 4, την MIP-1a, την ινωδονεκτίνη και τη θρομβοσπονδίνη 73. Επιπλέον, δεσμεύουν την IL-7, αυξάνοντας τη διαθεσιμότητά της για τους υποδοχείς της IL-7 στα Β-λεμφοκύτταρα 74. Επιπροσθέτως, συνδέονται με το CD44 στα αιμοποιητικά κύτταρα και με τον διαλυτό SDF-1 στο μικροπεριβάλλον, αυξάνοντας την προσκόλληση και καθοδηγώντας το μεταναστευτικό μονοπάτι των αιμοποιητικών κυττάρων με την καλύτερη παρουσίαση της χημειοκίνης. Έτσι, οι συγκεκριμένες πρωτεογλυκάνες επιδρούν στην ανάπτυξη και την κινητικότητα των πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων. β) Υαλουρονικό οξύ Το υαλουρονικό οξύ και ο κύριος υποδοχέας του, το CD44, εκφράζονται σε αιμοποιητικά και μη αιμοποιητικά κύτταρα. Η προσκόλληση των αιμοποιητικών κυττάρων στα στρωματικά κύτταρα εξαρτάται από τη συγκέντρωση του CD44 στα αιμοποιητικά κύτταρα και την έκφραση του υαλουρονικού οξέος στα στρωματικά κύτταρα 75,76. Επώαση των αιμοποιητικών κυττάρων με αντισώματα έναντι CD44 ή αγωγή των στρωματικών κυττάρων με υαλουρονιδάση μειώνει σημαντικά την προσκόλληση των αιμοποιητικών κυττάρων 77. In vitro, η σύνδεση υαλουρονικού οξέος με το CD44 είναι σημαντική για τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση 23

52 των προγονικών κυττάρων της λεμφικής και της μυελικής σειράς 78. Η ενεργοποίηση του CD44 που εκφράζεται στα μακροφάγα μέσω του υαλουρονικού οξέος επάγει την έκφραση IL-1b, TNF-a και IGF-1 (insulin-like growth factor-1) 79. Τέλος, η ενεργοποίηση του CD44 από το υαλουρονικό οξύ, συνεργικά με τη θειϊκή χονδροϊτίνη, βοηθά στη διατήρηση της έκφρασης του CD34 από τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα και στη διατήρηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων 80,81. γ) Λαμινίνη Τα μόρια λαμινίνης αποτελούν ετεροτριμερή από τρεις υποομάδες: α1-α5, β1-β3, γ1- γ3 αλυσίδες. Οι λαμινίνες -8, -10 και -11 μεσολαβούν στην αλληλεπίδραση των CD προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων με τα στρωματικά κύτταρα. Η σύνδεση με τη λαμινίνη -10/11 είναι ιδιοσυστασιακή, ενώ η σύνδεση με τη λαμινίνη - 8 απαιτεί την ενεργοποίηση των ιντεγκρινών στα CD προγονικά κύτταρα. Πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα που εκφράζουν VLA-6 αλληλεπιδρούν με τη λαμινίνη -10/11 και τη λαμινίνη -8 κατά την SDF-1 κατευθυνόμενη μετανάστευση 82. Η λαμινίνη-1 μεσολαβεί στην αλληλεπίδραση ανάμεσα στα στρωματικά κύτταρα και τα μυελωματικά κύτταρα, διευκολύνοντας την εξαγγείωση των κυκλοφορούντων μυελωματικών κυττάρων 83. Υπάρχουν στοιχεία που συνηγορούν υπέρ της έκφρασης υποδοχέων λαμινίνης από τα λευχαιμικά κύτταρα στην Οξεία Μυελογενή Λευχαιμία 84, αλλά και στη Χρονία Μυελογενή Λευχαιμία τα λευχαιμικά CD34+ εκφράζουν α2β1 που συνδέεται με τη λαμινίνη στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία 24. Επιπλέον, τα επίπεδα της λαμινίνης στον ορό είναι αυξημένα σε ασθενείς με Χρονία Μυελογενή Λευχαιμία και η θεραπεία με ιντερφερόνη ελαττώνει τα συγκεκριμένα επίπεδα 85. Ουσιαστικά, πιθανολογείται ότι τα λευχαιμικά κύτταρα χρησιμοποιούν τη λαμινίνη ως υπόστρωμα για τις ανωμαλίες στην προσκόλληση τους στον μυελό των οστών. δ) Ινωδονεκτίνη Η αγωγή με ινωδονεκτίνη προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων παρουσία αυξητικών παραγόντων ευοδώνει την ανάπτυξη τόσο της ερυθράς όσο και της κοκκιώδους σειράς 86. Σε απουσία ή παρουσία χαμηλών συγκεντρώσεων κυτταροκινών η σύνδεση πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων με την ινωδονεκτίνη της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό τους. Ωστόσο, ο πολλαπλασιασμός δεν κατεστάλη παρουσία αυξητικών παραγόντων, υποδηλώνοντας ότι οι αυξητικοί παράγοντες υπερνικούν την κατασταλτική δράση της ινωδονεκτίνης 87. Τέλος, η 24

53 αλληλεπίδραση με την ινωδονεκτίνη προάγει την τελική διαφοροποίηση στα ώριμα μονοκύτταρα, αλλά και την απόπτωση σε μεγακαρυοβλαστικές κυτταρικές σειρές 88,89. ε) Κολλαγόνο Οι ινοβλάστες και οι οστεοβλάστες του μυελού των οστών παράγουν, κυρίως, κολλαγόνο τύπου Ι και ΙΙΙ, ενώ τα ενδοθηλιακά κύτταρα κυρίως κολλαγόνο τύπου ΙV και V. Η σύνθεση και η επεξεργασία του κολλαγόνου ρυθμίζονται από παράγοντες, όπως τα γλυκοκορτικοειδή, οι αυξητικοί παράγοντες και οι κολλαγενάσες. Η σημασία του κολλαγόνου στην αιμοποίηση κατεδείχθη σε μελέτες στις αρχές της δεκαετίας του 1980, όπου χρησιμοποιήθηκε γέλη κολλαγόνου για την κλωνοποίηση προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων 90. In vitro έχει δειχθεί ότι το κολλαγόνο βοηθά στη διατήρηση της «παντοδυναμίας» των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, όπως προσδιορίσθηκε από την ικανότητά τους να διαφοροποιούνται σε μυελική και λεμφική σειρά με τους κατάλληλους αυξητικούς παράγοντες 91, ενώ η αναστολή της σύνθεσης του κολλαγόνου οδηγεί σε σημαντική μείωση της παραγωγής των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων Διαλυτοί παράγοντες που ρυθμίζουν την αλληλεπίδραση κυττάρων μεταξύ τους και την αλληλεπίδραση κυττάρων-εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας α) Αιμοποιητικοί αυξητικοί παράγοντες Μυριάδες κυτταροκινών υπάρχουν στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών που επιδρούν στον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την προσκόλληση των αρχέγονων και πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων. Τα βασικά κύτταρα που εκκρίνουν αυξητικούς παράγοντες είναι τα μη αιμοποιητικά κύτταρα του μυελού των οστών, όπως τα ενδοθηλιακά κύτταρα, οι ινοβλάστες και οι οστεοβλάστες. Η παραγωγή των κυτταροκινών μπορεί να είναι ιδιοσυστασιακή και/ή επαγώγιμη. G-CSF Ο G-CSF προάγει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων που έχουν στρατευθεί στην κοκκιώδη σειρά και που εκφράζουν υποδοχείς για τον G-CSF. Σε αντίθεση, οι πρώτες μορφές των αιμοποιητικών κυττάρων δεν εκφράζουν υποδοχείς για τον G-CSF και δεν απαντούν στον G-CSF μόνο του 93. In vitro καλλιέργειες αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων με G-CSF και IL-3 επάγουν τον πολλαπλασιασμό των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Ωστόσο, είναι πιθανόν η IL-3 να επάγει την έκφραση του υποδοχέα του G-CSF στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, ο 25

54 οποίος, τότε, εμφανίζει συνεργική δράση με τη σηματοδότηση από την IL-3 για την επαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού 94. Ο G-CSF αποτελεί τον πλέον σύγχρονο παράγοντα κινητοποίησης του μυελού των οστών που χρησιμοποιείται πιο συχνά στις κλινικές μελέτες (Εικόνα Γ16). Ένας από τους μηχανισμούς με τους οποίους ο G-CSF επάγει την κινητοποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων είναι η ελάττωση της έκφρασης των ιντεγκρινών και η αύξηση της έκφρασης των σελεκτινών στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. Για παράδειγμα, ο G-CSF επάγει μείωση της έκφρασης του LFA-1, διευκολύνοντας την αποκόλληση των CD34+ αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων από τα ενδοθηλιακά κύτταρα του μυελού των οστών 95. Επιπλέον, ο G-CSF ελαττώνει την έκφραση στην επιφάνεια των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων των α4β1, α5β1, κάτι που οδηγεί σε ελαττωμένη προσκόλληση στο VCAM-1 και την ινωδονεκτίνη 25. Τα κινητοποιημένα με CD34+ αιμοποιητικά κύτταρα που εκφράζουν α4β1 δείχνουν ελαττωμένη συγγένεια σύνδεσης με τον προσδέτη, μια διαδικασία που θα μπορούσε να αντιστραφεί με επώαση των κυττάρων με Mg2+ που προκαλεί μια στροφή από την ανενεργή στην ενεργή διαμόρφωση της α4β1 ιντεγκρίνης 96. Από την άλλη, τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα που κινητοποιούνται με G-CSF εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα L-σελεκτίνης που είναι σημαντική για την πρόσδεση και το κύλισμα πριν/κατά τη διάρκεια της εξόδου από τα αγγεία 97. Ένας άλλος μηχανισμός δια του οποίου ο G-CSF επάγει την κινητοποίηση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων είναι δια της πρωτεολυτικής διάσπασης του VCAM-1, του συμπληρωματικού της α4β1 ιντεγκρίνης. Πιο συγκεκριμένα, η χορήγηση του G-CSF προκαλεί την αποκοκκίωση ουδετερόφιλων στον μυελό των οστών, οδηγώντας στην απελευθέρωση δύο πρωτεασών σερίνης, της ελαστάσης και της καθεψίνης G, οι οποίες, με τη σειρά τους, στοχεύουν στη διάσπαση του VCAM-1 που εκφράζεται στα στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών

55 Εικόνα Γ16: Κινητοποίηση προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων με G-CSF n. Συμπερασματικά, η κινητοποίηση με G-CSF πραγματοποιείται μέσω της ταυτόχρονης ρύθμισης της έκφρασης στην κυτταρική επιφάνεια ιντεγκρινών, σελεκτινών και μορίων προσκόλλησης τόσο στα αιμοποητικά όσο και στα στρωματικά κύτταρα. SCF Ο SCF (stem cell factor) αποτελεί τον προσδέτη για το c-kit, έναν υποδοχέα τυροσινικής κινάσης τύπου Ι που εκφράζεται στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα και η έκφρασή του ελαττώνεται με τη διαφοροποίηση (Εικόνα Γ17). Εικόνα Γ17: Η έκφραση του c-kit στα αιμοποιητικά κύτταρα o. 27

56 Η σύνδεση του SCF με το c-kit προκαλεί μια σειρά αλυσιδωτών ενδοκυττάριων αντιδράσεων φωσφορυλίωσης σημαντικών για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την επιβίωση. Διακοπή της σηματοδότησης υπάρχει σε δύο θέσεις: εσωτερικοποίηση του c-kit και αποφωσφορυλίωση του υποδοχέα από τη φωσφατάση Shp1, που προσδένεται στην περιοχή αποφωσφορυλίωσης του c- Kit 98. Υπάρχουν δύο ισομορφές του SCF: η μεμβρανική-mscf (membrane stem cell factor) και η διαλυτή-sscf (soluble stem cell factor) 99. Η μεμβρανική ισομορφή επάγει πιο ισχυρή απάντηση από το c-kit 100. Ο υποδοχέας από μόνος του περιέχει πολλές υποομάδες φωσφορυλίωσης της τυροσίνης, σημαντικές για τον επαγόμενο από τον προσδέτη ομοδιμερισμό, την αυτοφωσφορυλίωση και τη στρατολόγηση κυτταροπλασματικών σηματοδοτικών πρωτεϊνών, όπως οι JAKs (Janus-activating kinases). Η αλληλεπίδραση SCF/c-Kit ρυθμίζει τη σύνδεση των αιμοποιητικών κυττάρων με τα συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας 101 και έχει δειχθεί ότι η επαγόμενη από τον SCF σύνδεση οδηγεί στη φωσφορυλίωση τυροσίνης της FAK και της παξιλλίνης 102. Αρκετές μεταλλάξεις στον υποδοχέα c-kit έχουν ταυτοποιηθεί που ρυθμίζουν το επίπεδο ανταπόκρισης στον SCF και επηρεάζουν την κινητοποίηση και την εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Επίμυες που φέρουν μετάλλαξη σε μια περιοχή αυτοφωσφορυλίωσης του c-kit απαντούν στον SCF, αλλά το ενδοκυττάριο σήμα δεν ενισχύεται. Φαινοτυπικά, αυτοί οι επίμυες παρουσιάζουν ελαττωμένους αριθμούς αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, αλλά η μεταμόσχευση τέτοιων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων σε φυσιολογικούς επίμυες οδηγεί σε φυσιολογική εγκατάσταση στον μυελό των οστών και τον σπλήνα 103. Επίμυες που φέρουν μετάλλαξη στην περιοχή τυροσινικής κινάσης έχουν φυσιολογικά επίπεδα υποδοχέων c-kit στην επιφάνεια κυττάρων και φυσιολογικές δυνατότητες σύνδεσης του προσδέτη. Ωστόσο, σε αυτά παρατηρείται μειωμένη ανταπόκριση στον SCF και μειωμένη ικανότητα κινητοποίησης με G-CSF 104, ενώ η αγωγή με anti-α4β1 αντίσωμα δε βελτίωσε σημαντικά την κινητοποίηση, δίνοντας έμφαση στη σημασία ύπαρξης λειτουργικού c Kit υποδοχέα στην κινητοποίηση. Αντίθετα, επίμυες με ανεπάρκεια της φωσφατάσης Shp1, που συνδέεται στην περιοχή αυτοφωσφορυλίωσης του c-kit για τον τερματισμό της διαδικασίας σηματοδότησης, σχετίζονται με αυξημένη κινητοποίηση 105. Το κατά πόσο η ένταση και η διάρκεια της ανταπόκρισης στον SCF καθορίζει την τύχη των κυττάρων να συνδέονται ή να μεταναστεύουν δεν έχει ξεκαθαρίσει πλήρως, 28

57 ωστόσο, αυτή η παρατήρηση έχει γίνει με έναν άλλο αιμοποιητικό αυξητικό παράγοντα, την IL-3. Όταν CD34+ προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα διεγείρονται με IL-3 σε χαμηλή συγκέντρωση, η ικανότητα για προσκόλληση στο τμήμα της ινωδονεκτίνης το συγκεκριμένο για την α4β1 ιντεγκρίνη μειώθηκε 106. Γίνεται ξεκάθαρο ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ ιντεγκρινών και υποδοχέων αυξητικών παραγόντων καθορίζει τη μοίρα των αρχέγονων και προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Θρομβοποιητίνη Η θρομβοποιητίνη έχει βρεθεί ότι επάγει την επέκταση και τη σύνδεση των CD34+ κυττάρων. Αποτελεί τον προσδέτη για τον υποδοχέα c-mpi, που με τη σύνδεση της θρομβοποιητίνης ομοδιμερίζεται με αλληλεπακόλουθη ενεργοποίηση σηματοδοτικών γεγονότων, που συμπεριλαμβάνουν τα μονοπάτια Jak/Stat και Ras/MAPK (Εικόνα Γ18). Εικόνα Γ18: Το μονοπάτι σηματοδότησης μέσω TPO/c-MPL p. Η θρομβοποιητίνη εκφράζεται στα στρωματικά κύτταρα. Επίμυες με ανεπάρκεια TPO (thrombopoietin) ή c-mpi είναι χαρακτηριστικά θρομβοπενικοί, κάτι που υποδηλώνει τη σημασία της θρομβοποιητίνης στην παραγωγή των αιμοπεταλίων. Επίσης, αυτοί οι επίμυες παρουσιάζουν μειωμένο αριθμό προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων 107. Η TPO επιδρά μόνη της στην ανάπτυξη των 29

58 μεγακαρυοκυττάρων, επάγει την έκφραση P-σελεκτίνης στα αιμοπετάλια, διεγείροντας, έτσι, την αλληλεπίδραση αιμοπεταλίων-λευκοκυττάρων 108. Σε συνδυασμό με άλλους αιμοποιητικούς αυξητικούς παράγοντες προάγει τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων. Η σύνδεση της θρομβοποιητίνης στον υποδοχέα της προάγει τη σύνδεση των μεγακαρυοβλαστών στην ινωδονεκτίνη, ενεργοποιώντας τις ιντεγκρίνες α4β1 και α5β1. Η αναστολή των ιντεγκρινών με αντισώματα καταλήγει σε μειωμένη ικανότητα σύνδεσης, δείχνοντας τη μεγάλη σημασία της ενεργοποίησης των ιντεγκρινών στην επαγόμενη από τη θρομβοποιητίνη προσκόλληση 109. Στα πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα (CD34+38-) η θρομβοποιητίνη προάγει τη σύνδεση με την ινωδονεκτίνη, μέσω, κυρίως, της ενεργοποίησης της ιντεγκρίνης α5β1, ενώ στα πιο διαφοροποιημένα πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα (CD34+38+) συμμετέχει, κυρίως, η ιντεγκρίνη α4β β) Αγγειογενετικοί αυξητικοί παράγοντες Οι αγγειογετικοί αυξητικοί παράγοντες προάγουν τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά τον σχηματισμό των αγγείων από προϋπάρχοντες αγγειοβλάστες, ρυθμίζουν άμεσα και έμμεσα την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση αιμοποιητικών κυττάρων και επάγουν την κινητοποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων από τον μυελό των οστών. Τόσο μη αιμοποιητικά όσο και αιμοποιητικά κύτταρα εκκρίνουν αγγειογενετικούς αυξητικούς παράγοντες που επηρεάζουν τα κύτταρα με αυτοκρινή και παρακρινή τρόπο. Πρόσφατα έχει προταθεί ότι η έκκριση αγγειογενετικών παραγόντων από τα λευχαιμικά κύτταρα και τα γύρω ενδοθηλιακά κύτταρα θα μπορούσε να συμβάλλει, αν όχι να προδιαθέσει, στη λευχαιμιογένεση. VEGF Ο VEGF συνδέεται σε δύο υποδοχείς: τον Flt-1 που εκφράζεται στα μονοκύτταρα-μακροφάγα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τον Flk-1/KDR που εκφράζεται μόνο στα ενδοθηλιακά κύτταρα (Εικόνα Γ19). 30

59 Εικόνα Γ19: VEGF υποδοχείς και προσδέτες q. Και οι δύο υποδοχείς είναι υποδοχείς τυροσινικών κινασών 111. Ο Flt-1 συνδέει τον VEGF με μικρότερη συγγένεια από τον Flk-1, αλλά έχει μεγαλύτερη δραστηριότητα κινάσης από αυτόν 112,113. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα που υπερεκφράζουν Flt-1 δεν έδειξαν αυξημένο πολλαπλασιασμό με VEGF σε αντίθεση με αυτά που υπερεκφράζουν Flk-1. O VEGF επάγει την επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης της σηματοδοτικής οδού PIK3/AKT 114. Επίμυες με ανεπάρκεια Flt-1 εμφανίζουν ανεπαρκή ανάπτυξη αγγείων μαζί με διαταραχή της αιμοποίησης 115,116. Επίμυες με ανεπάρκεια Flk-1 δείχνουν ανώμαλη ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων και αποδιοργάνωση αγγείων 117. Ο ρόλος του Flk-1 στην αιμοποίηση είναι σημαντικός κατά την εμβρυκή ανάπτυξη, αλλά δεν παρατηρούνται λειτουργικές διαφορές ανάμεσα στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα από Flk-1 ανεπαρκείς και Flk-1 φυσιολογικούς επίμυες 118. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκκρίνουν VEGF που δρα τόσο στα ενδοθηλιακά όσο και στα αιμοποιητικά κύτταρα. In vivo έγχυση αδενοϊού που υπερεκφράζει VEGF προάγει την κινητοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων και των πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων 119. Επιπλέον, ο VEGF διεγείρει τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα να εκκρίνουν διάφορους αυξητικούς παράγοντες, όπως SCF, που με τη σειρά τους δρουν στα αιμοποιητικά και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Οι αιμοποιητικοί αυξητικοί παράγοντες, όπως οι SCF, IL-3 και G-CSF, αυξάνουν την έκφραση και έκκριση VEGF-A ισομορφής από τα αιμοποιητικά κύτταρα 120. Σε συνδυασμό με τη χημειοκίνη SDF-1, ο VEGF επάγει 31

60 τη μετανάστευση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Τόσο στην Οξεία Μυελογενή Λευχαιμία όσο και στη Χρονία Μυελογενή Λευχαιμία, τα επίπεδα VEGF είναι αυξημένα και μελέτες in vitro κατέδειξαν αυξημένη έκφραση VEGF μεταγράφων στα λευχαιμικά προγονικά κύτταρα. Σε πειραματικό μοντέλο, η in vivo χορήγηση νευροπιλλίνης-1 (ανταγωνιστής VEGF) παρέτεινε σημαντικά την επιβίωση, καταδεικνύοντας ότι ο VEGF ενέχεται στην επιβίωση ή τον πολλαπλασιασμό των αρχέγονων λευχαιμικών κυττάρων 121. Η σηματοδότηση μέσω του υποδοχέα VEGF-3 προάγει τον πολλαπλασιασμό και την αντίσταση στα χημειοθεραπευτικά των λευχαιμικών κυττάρων 122. Ένας από τους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους ο VEGF αναστέλλει την απόπτωση λευχαιμικών κυττάρων που εκτίθενται σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες είναι επάγοντας την έκφραση της Mcl-1 (myeloid cell leukemia sequence-1 protein), ενός αντιαποπτωτικού παράγοντα 123. Οι αναστολείς τυροσινικών κινασών αναστέλλουν την έκκριση VEGF από τα λευχαιμικά κύτταρα 124. Οι μελέτες αυτές καταδεικνύουν τον σημαντικό ρόλο του VEGF στη φυσιολογική, αλλά και στη λευχαιμική, αιμοποίηση σε επίπεδο επιβίωσης και πολλαπλασιασμού. Αγγειοποιητίνη Υπάρχουν τέσσερα μέλη στην οικογένεια της αγγειοποιητίνης: Οι αγγειοποιητίνες 1 έως 4 [Ang (angiopoietin) 1 έως Ang4], από τις οποίες η Ang1 και η Ang4 δρουν ως ενεργοποιητές του υποδοχέα Tie2, ενώ οι Ang2 και 3 δρουν ως ανταγωνιστές του υποδοχέα Tie2. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκκρίνουν Ang1 και 2 και εκφράζουν τον υποδοχέα Tie2 125,126. Τόσο ο Tie1 όσο και ο Tie2 εκφράζονται στα αιμοποιητικά κύτταρα, αλλά κανένας προσδέτης του Tie1 δεν έχει προσδιορισθεί επί του παρόντος 127. Σε έμβρυα χωρίς Tie1 η αιμοποίηση είναι φυσιολογική, υποδηλώνοντας ότι ο Tie1 δεν παίζει σημαντικό ρόλο στην αιμοποίηση 128. Από την άλλη, έμβρυα χωρίς Tie2 εμφανίζουν σοβαρά προβλήματα στην αιμοποίηση 129. Συγχρόνως, Tie2+ αιμοποιητικά κύτταρα προσκολλώνται σε Tie2+ ενδοθηλιακά κύτταρα μέσω της αγγειοποιητίνης1, όχι της αγγειοποιητίνης Οι προσδέτες του Tie2, κυρίως η Ang1 και η Ang2, έχουν μικρή επίδραση στην αιμοποίηση in vitro. Ωστόσο, παρουσία VEGF, η Ang1 προάγει τον πολλαπλασιασμό και την προσκόλληση των Tie2 κυττάρων του μυελού στην ινωδονεκτίνη 130. Επιπλέον, η αλληλεπίδραση Tie2-αγγειοποητίνης έχει λειτουργικό ρόλο στην κινητοποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, όπως o VEGF. Ωστόσο, σε αντίθεση με τον VEGF, οι αγγειοποιητίνες 32

61 επάγουν καθυστερημένη κινητοποίηση, ενώ, σε συνδυασμό με τον VEGF, λειτουργούν ως καλοί παράγοντες κινητοποίησης 131. Τόσο η Ang1 όσο και ο Tie2 έχουν απομονωθεί σε λευχαιμικά κύτταρα σε Οξεία Μυελογενή Λευχαιμία και σε Χρονία Μυελογενή Λευχαιμία, κάτι που υποδηλώνει αυτοκρινή μηχανισμό που προάγει τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των λευχαιμικών κυττάρων 132. Επιπλέον, υπάρχουν ενδείξεις ότι τα λευχαιμικά κύτταρα εκκρίνουν αγγειοποιητίνες για να δράσουν σε γειτονικά ενδοθηλιακά κύτταρα. Η υπόθεση αυτή στηρίζεται σε παρατηρήσεις ότι CD7+ κύτταρα Οξείας Μυελογενούς Λευχαιμίας εκφράζουν υψηλά επίπεδα αγγειοποιητίνης2, αλλά χαμηλά επίπεδα υποδοχέα, κάτι που υποδηλώνει ότι τα λευχαιμικά κύτταρα διεγείρουν τα γειτονικά ενδοθηλιακά κύτταρα, αποσταθεροποιώντας και προάγοντας τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων 133. Έτσι, η αλληλεπίδραση Tie2- αγγειοποιητίνης αποτελεί σημαντικό θεραπευτικό στόχο, ώστε να παρέμβουμε για να διακόψουμε την πρόοδο της λευχαιμίας. γ) Χημειοκίνες Αποτελούν οικογένεια προφλεγμονωδών μορίων. Δύο μεγάλες ομάδες αναγνωρίζονται με βάση τις ομάδες CC (cysteine-cysteine) έναντι CXC (cysteinenoncysteine-cysteine). Οι CΧC χημειοκίνες δρουν κυρίως στα ουδετερόφιλα, ενώ οι CC χημειοκίνες δρουν χημειοτακτικά για τα μονοκύτταρα, τα λεμφοκύτταρα, τα ηωσινίφιλα, τα βασεόφιλα, τα NK κύτταρα και τα δενδριτικά κύτταρα. SDF-1 Ο SDF-1 αναγνωρίστηκε λόγω ανταγωνισμού με τον HIV (Human Immunodeficiency Virus) για τη σύνδεση με τον CXCR4 (cysteine-noncysteinecysteine receptor 4) υποδοχέα. Ανήκει στην οικογένεια των α-χημειοκινών. Υπάρχει σε δυο ισομορφές α, β, που και οι δύο περιέχουν μια θέση σύνδεσης ηπαρίνης. Διακοπή της σύνδεσης του SDF-1 με την ηπαρίνη από θειϊκές γλυκάνες παρεμποδίζει την ικανότητα της χημειοκίνης να προσελκύει πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα προς και εντός του τμήματος του μυελού των οστών 134. Επίμυες με ανεπάρκεια του SDF-1 ή του CXCR4 πεθαίνουν ενδομητρίως, ως αποτέλεσμα διαταραχής της μετανάστευσης των εμβρυικών ηπατικών αρχέγονων κυττάρων στον μυελό των οστών για να να εγκαθιδρύσουν τη μετανεογνική αιμοποίηση 135. Η σύνδεση του SDF-1 με τον CXCR4 ενεργοποιεί τη φωσφορυλίωση πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην προσκόλληση, τη 33

62 μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την επιβίωση των αιμοποιητικών κυττάρων 136 (Εικόνα Γ20). Εικόνα Γ20: SDF-1/CXCR4 σηματοδοτικά μονοπάτια r. Ο CXCR4 εκφράζεται στα φυσιολογικά και τα λευχαιμικά αιμοποιητικά κύτταρα και φαίνεται να συμμετέχει στη μετανάστευση δια του ενδοθηλίου που επάγεται από τον SDF Ο SDF-1 εκκρίνεται από οστεοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα, οδηγώντας σε υψηλή συγκέντρωση SDF-1 στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών 9. Αυτή η διαβάθμιση του SDF-1 ελκύει ενδοφλεβίως εγχυθέντα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα στον μυελό των οστών. Έγχυση SDF-1 στον σπλήνα επίμυων πριν από τη μεταμόσχευση ελκύει τα αιμοποιητικά κύτταρα στις σπληνικές θέσεις 138. Διαταραχή της συγκέντρωσης του SDF-1 στον μυελό των οστών κινητοποιεί τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα στην περιφέρεια 139. Μειωμένη ευαισθησία στον SDF-1 στον μυελό των οστών μπορεί να συμβάλλει στην έξοδο των στελεχιαίων κυττάρων. Για παράδειγμα, στη Χρονία Μυελογενή Λευχαιμία παθολογικά προγονικά κύτταρα με παρόμοια έκφραση CXCR4 με τα φυσιολογικά ανευρίσκονται στο περιφερικό αίμα με σημαντική, όμως, ελάττωση στην ανταπόκριση στον SDF In vitro έκθεση προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων σε διαβαθμισμένη συγκέντρωση SDF-1 μειώνει την προσκόλληση και αυξάνει τη μετανάστευση. Οι διαλυτές μορφές του SDF-1 και/ή του CXCR4 που προέκυψαν από πρωτεολυτική διάσπαση συσχετίζονται άμεσα με κινητοποίηση προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων 141. Συλλήβδην, ο SDF-1 παρουσιάζει διαβάθμιση συγκέντρωσης-υψηλή στον μυελό 34

63 των οστών και χαμηλή στην περιφέρεια-που ελκύει τα μεταμοσχευθέντα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα στον μυελό των οστών (Εικόνα Γ21). Εικόνα Γ21: Ο SDF-1 και ο CXCR4 ρυθμίζουν την εγκατάσταση και την κινητοποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων s. Διαταραχή της διαβάθμισης της συγκέντρωσης του SDF-1 ή μειωμένη ευαισθησία στη συγκεκριμένη χημειοκίνη μπορεί να συμβάλει στην κινητοποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. IL-8 Η IL-8 παράγεται από διάφορα κύτταρα, όπως ουδετερόφιλα, μονοκύτταρα, μαστοκύτταρα και ινοβλάστες. Η παραγωγή της επάγεται από φλεγμονώδεις κυτταροκίνες, όπως TNF-a, IL-1, IL-3 και GM-CSF. Αποθηκεύεται στα σωμάτια Weibel-Palade των μικροαγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων 142. Ως χημειοτακτικό για τα ουδετερόφιλα η IL-8 αυξάνει την έκφραση του LFA-1 και μεσολαβεί στην απελευθέρωση από τα ουδετερόφιλα διαφόρων μεταλλοπρωτεϊνασών, όπως η ελαστάση, η γελατινάση-β και η β- γλυκουρονιδάση 143,144. Η επαγωγή ενός τόσο υψηλά πρωτεολυτικού περιβάλλοντος θεωρείται ότι προάγει τη μετανάστευση διαμέσου του ενδοθηλίου των ουδετερόφιλων. Η έκφραση του υποδοχέα της IL-8 αυξάνεται μετά την αγωγή με G-CSF 145. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η in vivo αγωγή με IL-8 κινητοποιεί ικανοποιητικά τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα σε επίπεδα συγκρίσιμα με τον G-CSF. Οι μηχανισμοί ποικίλουν ανάλογα με το είδος. Στους πιθήκους η επαγόμενη από IL-8 κινητοποίηση εξαρτάται από την επαγωγή και ενεργοποίηση της MMP-9. Αντισώματα έναντι της MMP-9 μειώνουν την ικανότητα κινητοποίησης 146. Αντιθέτως, στους επίμυες με ανεπάρκεια MMP-9 η 35

64 κινητοποίηση δεν επηρεάστηκε, υποδηλώνοντας ότι η MMP-9 είναι περιττή 147. Έτσι, η IL-8 ενεργοποιεί τα ουδετερόφιλα τόσο σε επίμυες όσο και σε πιθήκους, αλλά η απαίτηση και απελευθέρωση συγκεκριμένων πρωτεασών που παράγονται από τα ουδετερόφιλα ποικίλει μεταξύ των ειδών. Η επαγόμενη, τελικά, από την IL-8 κινητοποίηση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων εξαρτάται από τα ουδετερόφιλα και τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα που κινητοποιούνται έχουν τόσο την ικανότητα ραδιοπροστασίας όσο και την επί μακρόν ικανότητα ανασύστασης, όταν μεταμοσχεύονται σε ακτινοβοληθέντες δέκτες 148. MIP-1a Η MIP-1a παράγεται από κύτταρα της λεμφικής και της μυελικής σειράς και από στρωματικά κύτταρα. Εκκρίνεται in vivo από CD8+ T κύτταρα 149 και τα περισσότερα κύτταρα της μυελικής σειράς, συμπεριλαμβανομένων των ηωσινοφίλων, των ουδετεροφίλων και των μακροφάγων, παράγουν MIP-1a. Τα στρωματικά κύτταρα, ειδικά μετά από αγωγή με INF-α, εκκρίνουν MIP-1a. Ο λειτουργικός ρόλος της MIP-1a είναι τόσο ευρύς όσο και οι πηγές της. Λειτουργεί ως χημειοτακτικό για τα Τ κύτταρα, ενεργοποιώντας τη σηματοδοτική οδό Stat στα κύτταρα αυτά 150. Επάγει τη μετανάστευση των B κυττάρων, μέσω της ενεργοποίησης της PI3K 151. Επιπλέον, είναι σημαντική για τη χημειοταξία των ουδετερόφιλων. Έτσι, η MIP-1a παίζει σημαντικό ρόλο στις φλεγμονώδεις διεργασίες 152, ενώ καμία διαταραχή στην αιμοποίηση in vivo δεν έχει αναφερθεί σε MIP-1a ανεπαρκείς επίμυες 153. Η επίδραση της MIP-1a στα αρχέγονα και προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα είναι πιο σύνθετη. Η χημειοκίνη ασκεί ανασταλτική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, ενώ επάγει τη δραστηριότητα των ωριμότερων προγονικών κυττάρων 154. Σε καλλιέργειες μαζί με την IL-3 εμποδίζει τη διαφοροποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων που φυσιολογικά επάγεται από την IL-3 μόνη της. Επιπλέον, η προσθήκη της MIP-1a κατέληξε σε επέκταση των αωρότερων προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων 155. In vivo η MIP-1a μαζί με άλλους αυξητικούς παράγοντες ευνοεί την αιμοποιητική ανασύσταση μετά από μεταμόσχευση 156. Στα αρχέγονα λευχαιμικά κύτταρα η MIP-1a φαίνεται να είναι αναποτελεσματική 157. Ωστόσο, σε στρωματικές καλλιέργειες αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων από Χρονία Μυελογενή Λευχαιμία η INF-α επάγει την έκκριση MIP-1a και οδηγεί σε αυξημένη προσκόλληση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων 158. Το κατά πόσο η MIP-1a συμβάλλει στην 36

65 ενεργοποίηση των ιντεγκρινών σε προγονικά κύτταρα Χρονίας Μυελογενούς Λευχαιμίας δεν έχει διασαφηνιστεί. Συνεπώς, η MIP-1a είναι μια πλειοτροπική χημειοκίνη με διαφορετική επίδραση σε συγκεκριμένα αιμοποιητικά κύτταρα. δ) Πρωτεάσες της θεμέλιας ουσίας Τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα του μυελού των οστών κατοικούν σε συγκεκριμένες φωλιές. Κατά την κινητοποίηση τοπική αναδιαμόρφωση της περιβάλλουσας θεμέλιας ουσίας που μεσολαβείται από έναν συνδυασμό πρωτεασών του στρώματος θεωρείται ότι διευκολύνει την αποκόλληση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων πριν την έξοδο από τον μυελό των οστών. Αυτές οι πρωτεάσες μπορεί να εκφράζονται, εκκρίνονται και/ή ενεργοποιούνται από αιμοποιητικά και μη αιμοποιητικά κύτταρα σε απάντηση σε φλεγμονώδεις κυτταροκίνες, αυξητικούς παράγοντες, χημειοκίνες και ακτινοβολία. Η δραστηριότητα των πρωτεασών επηρεάζει όχι μόνο το μικροπεριβάλλον, αλλά και τα αιμοποιητικά κύτταρα αναφορικά με την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και την προσκόλληση/κινητικότητα. Μεταλλοπρωτεϊνάσες, μεταλλοπρωτεϊνάσες μεμβρανικού τύπου και μεταλλοπρωτεϊνάσες ιστικοί ανασταλτές Συντίθενται ως προένζυμα και απαιτούν πρωτεολυτική διάσπαση προκειμένου να ενεργοποιηθούν. Παράγονται τόσο από αιμοποιητικά (Τ κύτταρα, μακροφάγα, ουδετερόφιλα, προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα) όσο και από στρωματικά προγονικά κύτταρα. Διαιρούνται σε τέσσερις ομάδες ανάλογα με τα υποστρώματα πρωτεόλυσης: κολλαγενάσες, γελατινάσες, στρωμαλυσίνες, μεμβρανικού τύπου μεταλλοπρωτεϊνάσες. Οι γελατινάσες -MMP-2 και MMP-9- αποδομούν το κολλαγόνο, την ινωδονεκτίνη και την ελαστίνη

66 Εικόνα Γ22: Τρόποι δράσης των μεταλλοπρωτεϊνασών t. Η έκφραση και η έκκριση μεταλλοπρωτεϊνασών ρυθμίζεται σε μεταγραφικό και μετα-μεταφραστικό επίπεδο από τη σύνδεση ιντεγκρινών, αυξητικούς παράγοντες και χημειοκίνες. Για παράδειγμα, η σύνδεση της α4β1 με το VCAM-1 οδηγεί σε επαγωγή της έκφρασης μεταλλοπρωτεϊνάσης στα Τ κύτταρα. Η διέγερση με SDF- 1 επάγει την έκφραση MMP-2 και MMP-9 από τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα του μυελού των οστών 160. Τα ουδετερόφιλα αποτελούν τα κύρια αιμοποιητικά κύτταρα που παράγουν πρωτεάσες, όπως η MMP-9 (γελατινάση Β) και η MMP-8 (κολλαγενάση) 161. Η ενεργοποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών ρυθμίζεται θετικά από τις MT-MMPs (membrane-type matrix metalloproteinases) και αρνητικά από τις TIMPs (tissue inhibitor matrix proteases). Σε καλλιέργειες που περιέχουν ορό αύξηση στα επίπεδα των TIMPs σχετίζεται με ελάττωση ενεργών μορφών των MMP-2 και MMP-9. Η MMP-9 έχει συσχετισθεί στενά με την κινητοποίηση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, καθώς η MMP-9 αυξάνεται με την αγωγή με G-CSF 162. Το μπλοκάρισμα της MMP-9 αναστέλλει την επαγόμενη από την IL-8 κινητοποίηση σε επίμυες και πιθήκους 146. Επιπλέον, οι μεταλλοπρωτεϊνάσες αυξάνουν την απελευθέρωση κυτταροκινών, όπως ο SCF, συμβάλλοντας στην κινητικότητα και τον πολλαπλασιασμό αιμοποιητικών κυττάρων 163. Προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα Οξείας Μυελογενούς και Χρονίας Μυελογενούς Λευχαιμίας εκφράζουν και εκκρίνουν υψηλότερα επίπεδα μεταλλοπρωτεϊνασών από ότι τα φυσιολογικά αιμοποιητικά κύτταρα, κάτι που συμβαδίζει με την ιδέα ότι αυτά τα ένζυμα προάγουν την αποδόμηση συστατικών 38

67 της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, διευκολύνοντας την κινητοποίηση λευχαιμικών προγονικών κυττάρων 164,

68 40

69 2.3 Η κυκλοφορία των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων Από την περιγραφή στην προηγούμενη παράγραφο του μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών γίνεται κατανοητό ότι αυτό το πολύπλοκο, αλλά και εξαιρετικά οργανωμένο, σύστημα με τις δυναμικές σχέσεις μεταξύ των επιμέρους στοιχείων του ασκεί καταλυτική επίδραση στη διαδικασία της αιμοποίησης. Όπως έχει αναφερθεί, κλασσικό παράδειγμα της αλληλεπίδρασης του μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών με τα αιμοποιητικά κύτταρα αποτελεί η κυκλοφορία (trafficking) των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Η ικανότητα να μεταναστεύουν αποτελεί θεμελιώδη ιδιότητα των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Κατά τη διάρκεια της οντογένεσης η αιμοποίηση λαμβάνει χώρα σε διακριτές εξωεμβρυικές και εμβρυικές περιοχές που περιλαμβάνουν διαδοχικά τον λεκιθικό ασκό, την περιοχή Αορτή- Γονάδες-Μεσόνεφρος, τον πλακούντα, το εμβρυικό ήπαρ, πριν, τελικά, αναλάβει αποκλειστικά ο μυελός των οστών (Εικόνα Γ23). Εικόνα Γ23: Κυκλοφορία αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων κατά την εμβρυική και την ενήλικη ζωή u. Η μετανάστευση από μια περιοχή σε μια άλλη είναι απαραίτητη, όπως φαίνεται από το γεγονός ότι επίμυες με ανεπάρκεια του SDF-1, μιας χημειοκίνης υπεύθυνης για την εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στον μυελό των οστών, ή του 41

70 υποδοχέα του CXCR4 έχουν φυσιολογική παραγωγή αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στο εμβρυικό ήπαρ, αλλά η μεταφορά της αιμοποίησης στον μυελό των οστών αποτυγχάνει. Η μεταναστευτική ικανότητα των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων διατηρείται με την ενηλικίωση, κατά τη διάρκεια της οποίας ανευρίσκονται στο περιφερικό αίμα ακόμα και κάτω από συνθήκες ομοιόστασης (Εικόνα 23). Μετά τη χορήγηση κυτταροκινών, όπως είναι ο G-CSF, ο GM-CSF και η IL-8, ο αριθμός των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα αυξάνει δραματικά με κινητική που εξαρτάται από τον μηχανισμό που ενέχεται. Για παράδειγμα, ο G-CSF μπορεί να ελαττώσει την παραγωγή του SDF-1 από τους οστεοβλάστες, παρά την απουσία υποδοχέων του G-CSF σε αυτά τα κύτταρα. Μεγάλο ενδιαφέρον εμφανίζει η παρατήρηση ότι επίμυες με τροποποιημένη λειτουργία του συμπαθητικού νευρικού συστήματος στερούνται της ικανότητας να κινητοποιούν αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα από τον μυελό των οστών σε απάντηση στον G-CSF, υποδηλώνοντας ότι τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα μπορεί να έχουν την ικανότητα να «αισθάνονται» αλλαγές, όπως αυτές που συμβαίνουν μακριά στο σημείο ενός τραυματισμού. Περαιτέρω έρευνα στον χώρο της κινητοποίησης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων έχει πρόσφατα καταδείξει τη χρήση των ανταγωνιστών των χημειοκινών ως μια εναλλακτική και, πιθανώς, πιο αποτελεσματική στρατηγική σε σχέση με τον G-CSF. O AMD3100, ένας ειδικός ανταγωνιστής του υποδοχέα CXCR4, δοκιμάζεται για κλινική χρήση και κλινικές μελέτες έχουν αποδείξει την αποτελεσματικότητά του ακόμα και σε ασθενείς ή δότες ανθεκτικούς στον G-CSF 166. Συνοψίζοντας, τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να κυκλοφορούν στο ανθρώπινο σώμα και ανευρίσκονται στο περιφερικό αίμα σε μικρούς αριθμούς. Προκειμένου να εξέλθουν από τον μυελό των οστών θα πρέπει να διασχίσουν το αγγειακό ενδοθήλιο και αυτή η διαδικασία κινητοποίησης (mobilization) ενισχύεται από τη χορήγηση κυτταροκινών, όπως είναι ο G-CSF και ο GM-CSF. Η αντίστροφη διαδικασία της εγκατάστασης (homing) των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στον μυελό των οστών φαίνεται να εξαρτάται από τη διαβάθμιση μιας χημειοκίνης, του SDF-1 (CXCL12, cysteine-noncysteine-cysteine ligand 12) (Εικόνα Γ24). 42

71 Εικόνα Γ24: Κινητοποίηση και εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων u. 43

72 44

73 2.4 Η κινητοποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων Ενώ το μεγαλύτερο ποσοστό των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων παραμένει στις ενδοοστικές και ενδοθηλιακές φωλιές του μυελού των οστών, ένας μικρός πληθυσμός ανευρίσκεται στην κυκλοφορία του αίματος στα πλαίσια διαδικασιών ομοιόστασης, όπως είναι η άμυνα του ξενιστή. Καταστάσεις stress, όπως η φλεγμονή, το τραύμα, η χημειοθεραπεία ή άλλα κλινικά πρωτόκολλα, όπως η αγωγή με G-CSF, επάγουν μαζικό πολλαπλασιασμό των αρχέγονων και πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων στον μυελό των οστών που συνοδεύεται από μια σημαντική αύξηση στην απελευθέρωση προγονικών κυττάρων στην κυκλοφορία, μια διαδικασία που ονομάζεται κινητοποίηση. Η κινητοποίηση, λοιπόν, χαρακτηρίζεται από διαταραχή της ομοιόστασης, πολλαπλασιασμό των αρχέγονων και πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων, διαφοροποίηση και μαζική έξοδο στην κυκλοφορία. Αυτά τα γεγονότα εμπλέκουν αλληλεπιδράσεις μορίων προσκόλλησης μεταξύ τους (α4β1/vcam-1, CD44/υαλουρονικό οξύ) ή κυτταροκινών με τους υποδοχείς τους (SDF-1/CXCR4, SCF/c-Kit). Επιπλέον, η αύξηση κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων στο πλάσμα, όπως ο SCF και ο SDF-1, επάγουν την κινητοποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Συγχρόνως, μεταλλοπρωτεΐνάσες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας ρυθμίζουν την κινητοποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων διευκολύνοντας την κίνηση κατά μήκος του φυσικού φραγμού της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και αδρανοποιώντας αυξητικούς παράγοντες και χημειοκίνες που παράγονται στον μυελό των οστών και ευθύνονται για την προσκόλληση. Αρκετά ένζυμα, όπως το CD26, η ελαστάση των ουδετεροφίλων, η καθεψίνη G 141, η καθεψίνη Κ και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες MMP-2, MMP-9, αποδομούν τον SDF-1 με αποτέλεσμα τη χημειοτακτική αδρανοποίησή του. Επιπλέον, η μεμβρανική μορφή του SCF διασπάται από την MMP και την καθεψίνη Κ. Η απελευθέρωσή της μεμβρανικής μορφής του SCF από τον μυελό των οστών στο περιφερικό αίμα επάγει την κινητοποίηση 163. Συγχρόνως, έχει βρεθεί ότι CD34+ προγονικά κύτταρα του μυελού των οστών σε σταθερές καταστάσεις δεν εκκρίνουν MMP-2 ή MMP-9 που εμπλέκονται στην κινητικότητα των κυττάρων, ενώ κυκλοφορούντα CD34+ κύτταρα εκκρίνουν αυτά τα ένζυμα, όπως συμβαίνει και με τα προγονικά κύτταρα που κινητοποιούνται με G-CSF. Επιπροσθέτως, παρατηρήσεις καταδεικνύουν ότι κατά την επαγόμενη από stress κινητοποίηση αυξάνει και η δυναμική εγκατάστασης, επιβεβαιώνοντας ότι η κινητοποίηση και η εγκατάσταση είναι διαδοχικές, φυσιολογικές διαδικασίες. Υπάρχουν, ακόμη, αναφορές ότι το 45

74 συμπαθητικό νευρικό σύστημα εμπλέκεται σε ένα πρόσφατα αναγνωρισμένο μονοπάτι με το οποίο σήματα από περιφερικά όργανα μπορούν να φτάσουν στον μυελό των οστών. Πιο συγκεκριμένα, σήματα από το συμπαθητικό νευρικό σύστημα πυροδοτούν κινητοποίηση προγονικών κυττάρων επαγόμενη από G-CSF. Ιδιαίτερη αναφορά θα πρέπει να γίνει στην κινητοποίηση με επαναλαμβανόμενα ερεθίσματα με G-CSF, διότι βρίσκει συχνή εφαρμογή στην κλινική πράξη. Η συγκεκριμένη διαδικασία (Εικόνα Γ25) περιλαμβάνει μαζικό πολλαπλασιασμό και απελευθέρωση προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, πολλαπλασιασμό και ενεργοποίηση των οστεοκλαστών στην ενδοοστική φωλιά και τροποποίηση στον μυελό των οστών των επιπέδων κυτταροκινών, αυξητικών παραγόντων και πρωτεασών (παροδική αύξηση στην έκκριση του SDF-1, ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων, έκκριση της μεμβρανικής μορφής του SCF 163,167, αυξημένη έκκριση πρωτεολυτικών ενζύμων, συμπεριλαμβανομένων της καθεψίνης G, της ελαστάσης και της MMP-9, αποδόμηση του SDF-1 στον μυελό των οστών και αδρανοποίηση της χημειοτακτικής του δράσης, αυξημένη έκφραση του CXCR4 και, τελικά, κινητοποίηση των πρόδρομων και των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων 141,168 ). Εικόνα Γ25: Κινητοποίηση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων επαγόμενη από G- CSF v. 46

75 Αξίζει να σημειωθεί ότι στην επαγόμενη από τον G-CSF κινητοποίηση τα ώριμα ουδετερόφιλα έχουν έναν πολύ σημαντικό ρόλο με την έκκριση διαφόρων πρωτεασών, κάτι που, εν μέρει, διαφοροποιεί αυτόν τον μηχανισμό κινητοποίησης από τους υπολοίπους. Τα τελευταία χρόνια αναγνωρίζεται ολοένα και περισσότερο ο ρόλος των οστεοκλαστών στην κινητοποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων 169. Ένα προτεινόμενο μοντέλο για τον ρόλο των οστεοκλαστών στην κινητοποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων φαίνεται στην Εικόνα Γ26. Πιο συγκεκριμένα, καταστάσεις stress αυξάνουν τον HGF 170,171,172 και τον SDF-1 9,173 στην περιοχή του ενδόστεου. Ως απάντηση σε αυτά τα ερεθίσματα, όπως και στη διέγερση από τον RANKL 174,175, οι πρόδρομοι οστεοκλάστες του μυελού των οστών διαφοροποιούνται, πολλαπλασιάζονται και αναπτύσσονται σε TRAP+ ενεργούς OCLs (osteoclasts). Οι οστεοβλάστες που οριοθετούν το οστό απομακρύνονται από την περιοχή του ενδόστεου που καταλαμβάνεται, πλέον, από TRAP+ λειτουργικούς OCLs, οι οποίοι εκκρίνουν διάφορα ένζυμα, συμπεριλαμβανομένων της MMP-9 και της CTK (cathepsin K) 146,163,170. Η διάσπαση του SDF-1, της OPN (osteopontin) και του SCF 163,173,176,177 στην επιφάνεια των οστεοβλαστών και στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία εξασθενίζει τους δεσμούς άγκυρας των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων και μεταβάλλει τα σήματα που προέρχονται από τη φωλιά. Προκαταρκτικά in vitro αποτελέσματα υποστηρίζουν ότι η αυξημένη διαπερατότητα του ενδοθηλίου που επάγεται από τους ενεργούς OCLs με τρόπο που εξαρτάται από την MMP-9 βοηθά στη μετανάστευση και την κινητοποίηση των παρακείμενων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων προς την κυκλοφορία. Εικόνα Γ26: Ο ρόλος των οστεοκλαστών στην κινητοποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων w. 47

76 48

77 2.5 Η εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων Από την άλλη, η εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (Εικόνα Γ27) αποτελεί τη διαδικασία της προσκόλλησης, του κυλίσματος και της διέλευσης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων διαμέσου του ενδοθηλίου του μυελού των οστών 138,178,179,180, της εγκατάστασης τους σε μια από τις φωλιές του μυελού των οστών 181,182 και του πολλαπλασιασμού τους στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών 183. Εικόνα Γ27: Η διαδικασία της εγκατάστασης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων x. Η διαδικασία αυτή εξαρτάται από: Προσκόλληση στο ενδοθήλιο, κύλισμα και μετανάστευση Τα πρώτα βήματα για την κατάλληλη εγκατάσταση μεταμοσχευθέντων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στον μυελό των οστών περιλαμβάνουν την αλληλεπίδραση των κυττάρων αυτών με τα κολποειδή ενδοθηλιακά κύτταρα του μυελού των οστών και τη μετανάστευση διαμέσου του ενδοθηλίου 180,184,185. Αυτή η αρχική διαδικασία διέπεται από πολλαπλές αλληλεπιδράσεις ανάμεσα σε μόρια προσκόλλησης και προσδέτες. Τα αρχέγονα και τα πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα εκφράζουν αρκετά μόρια προσκόλλησης, συμπεριλαμβανομένων των ιντεγκρινών 186, μορίων προσκόλλησης τύπου βλεννίνης 187 και ισομορφών του CD Τα ενδοθηλιακά 49

78 κύτταρα στα κολποειδή του μυελού των οστών εκφράζουν Ε- και P-σελεκτίνη που συνδέονται με προσδέτες που εκφράζονται στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα 188. Ο PSGL-1 αποτελεί παράδειγμα τέτοιου προσδέτη στα λευκοκύτταρα για την P- σελεκτίνη 189. Εκτεταμένες μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι η συνεργική αλληλεπίδραση της E- και της P-σελεκτίνης με τους προσδέτες μεσολαβεί στην αρχική πρόσδεση και στο κύλισμα των λευκοκυττάρων στο ενδοθηλιακό τοίχωμα, όπως, επίσης, και στην επακόλουθη επιστράτευση στα σημεία της φλεγμονής 52,188. Από τη στιγμή που το λευκοκύτταρο έχει προσδεθεί στο ενδοθηλιακό τοίχωμα, χημειοτακτικοί παράγοντες, όπως ο SDF-1, επάγουν έναν καταρράκτη ενδοκυττάριας σηματοδότησης στο λευκοκύτταρο που οδηγεί στην ενεργοποίηση ιντεγκρινών 190. Οι ιντεγκρίνες, ιδιαίτερα η α4β1 ιντεγκρίνη, συνδέονται με τους αντίστοιχους υποδοχείς στα ενδοθηλιακά κύτταρα, ιδιαίτερα το VCAM-1, με αποτέλεσμα την ισχυρή σύνδεση 29,191. Η σύνδεση και το κύλισμα των αρχέγονων και πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα του μυελού των οστών έχει δειχθεί να ελέγχονται, εν μέρει τουλάχιστον, από τις μεσολαβούμενες από τον PSGL- 1 αλληλεπιδράσεις με την P-σελεκτίνη 29,191. Το κύλισμα των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στο ενδοθήλιο του μυελού των οστών λαμβάνει χώρα και ανεξάρτητα από μεσολαβούμενες από σελεκτίνες αλληλεπιδράσεις, μέσω αλληλεπιδράσεων στις οποίες συμμετέχουν ιντεγκρίνες 29,186,192. Πρόσφατα, η έκφραση του CD44 στα πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα έχει αναφερθεί να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εγκατάστασή τους στον μυελό των οστών 193,194. Ωστόσο, τα περισσότερα δεδομένα μέχρι σήμερα καταδεικνύουν έναν πρωταρχικό ρόλο της αλληλεπίδρασης της α4β1 με το VCAM-1 στην επιτυχή εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στον μυελό των οστών 192. Αγωγή των CD34+ αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων με SDF-1 αυξάνει την επιφανειακή έκφραση των ιντεγκρινών α4β1, α5β1 και LFA-1 και αυξάνει την προσκόλληση των CD34+ κυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα του μυελού των οστών 180. Επιπλέον, ο SDF-1, δυνητικά, επάγει τη σύνδεση του CD44 με το υαλουρονικό οξύ που, επίσης, εκφράζεται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων του μυελού των οστών 193. Αξίζει να σημειωθεί ότι σε ένα πειραματικό μοντέλο μεταμόσχευσης αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων σε επίμυες ο SDF-1 δεν ήταν απαραίτητος για την εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, λόγω αντιρρόπησης μέσω της αλληλεπίδρασης της α4β1 ιντεγκρίνης και του VCAM Τα παραπάνω στοιχεία καταδεικνύουν έναν ρυθμιστικό ρόλο του SDF-1 στην προσκόλληση των αρχέγονων 50

79 αιμοποιητικών κυττάρων στο ενδοθήλιο του μυελού των οστών, μέσω της επίδρασής του στη δραστικότητα των ιντεγκρινών και του CD44. Από την άλλη, ενώ εκτεταμένες πειραματικές μελέτες έχουν δείξει τη σημασία των ιντεγκρινών, των μορίων προσκόλλησης τύπου βλεννίνης και των σελεκτινών στην πρόσδεση και το κύλισμα των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στο ενδοθήλιο του μυελού των οστών, οι μηχανισμοί που διέπουν τη μετανάστευσή τους διαμέσου των αγγείων στην εξωαγγειακή φωλιά του μυελού των οστών δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως. Τρέχοντα δεδομένα, ωστόσο, προτείνουν έναν βασικό ρόλο του SDF-1 σε αυτή τη διαδικασία. Σε ένα in vitro μοντέλο 180 η διέγερση με SDF-1 επάγει τη μετανάστευση διαμέσου του ενδοθηλίου και αυξάνει την αλληλεπίδραση του CD44 που εκφράζεται στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα με το υαλουρονικό οξύ που ανευρίσκεται στην ενδοοστική φωλιά 193. Επιπροσθέτως, η φουκοσυλίωση νεογνικών CD34+ κυττάρων αυξάνει σημαντικά την προσκόλληση στα κολποειδή ενδοθηλιακά κύτταρα του μυελού των οστών, αλλά δεν έχει καμιά επίδραση στην εγκατάστασή τους στον μυελό των οστών, υποδηλώνοντας ότι ένα επιπλέον ερέθισμα (π.χ. SDF-1) απαιτείται για τη μετακίνηση διαμέσου του ενδοθηλίου 195. Όλα τα παραπάνω δεδομένα υποδηλώνουν ότι η διαβαθμισμένη συγκέντρωση του SDF-1 συμβάλλει σημαντικά στη διαδικασία της μετακίνησης διαμέσου του ενδοθηλίου προς τον εξωαγγειακό χώρο του μυελού των οστών Άξονας SDF-1/CXCR4 Ο SDF-1 είναι μέλος της οικογένειας των χημειοκινών και εκφράζεται τόσο από τα κύτταρα του στρώματος του μυελού των οστών, όπως οι οστεοβλάστες, όσο και από τα ενδοθηλιακά κύτταρα 184. Η αλληλεπίδραση του SDF-1 με τον υποδοχέα του CXCR4 που εκφράζεται σε αρχέγονα και πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα θεωρείται ως ο πρωταρχικός άξονας που κατευθύνει την εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στον μυελό των οστών μετά από μεταμόσχευση 167,184. Αρκετές μελέτες έχουν συσχετίσει την έκφραση του CXCR4 στα αρχέγονα/πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα με επιτυχή εγκατάστασή τους in vitro. Ωστόσο, και άλλες αλληλεπιδράσεις μορίων προσκόλλησης-προσδετών μπορεί να είναι ικανές να αντιρροπήσουν την έλλειψη CXCR Το CD26, μια πεπτιδάση, έχει βρεθεί να αποτελεί, δυνητικά, έναν αρνητικό ρυθμιστή στη διαδικασία εγκατάστασης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, ώστε η αναστολή του σχετίσθηκε με αυξημένη in vivo αναγεννητική ικανότητα των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων

80 Επιπλέον, η αλληλεπίδραση ανάμεσα στην α4β1 ιντεγκρίνη και το VCAM-1 έχει βρεθεί να διευκολύνει την εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων σε περίπτωση απουσίας της αλληλεπίδρασης CXCR4/SDF-1 192, καθώς το VCAM-1 εκφράζεται τόσο στα ενδοθηλιακά όσο και στα στρωματικά κύτταρα Ενδοοστική φωλιά Πριν από τρείς δεκαετίες, περίπου, εδείχθη ότι τα πιο άωρα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα εντοπίζονται στην περιοχή του ενδόστεου 197,198, ενώ τα προγονικά κύτταρα που έχουν διαφοροποιηθεί προς κάποια σειρά εντοπίζονται στον κεντρικό μυελό 181,199 (Εικόνα Γ28). Εικόνα Γ28: Εξειδικευμένες φωλιές για τα αρχέγονα και προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα y. Οι οστεοβλάστες που οριοθετούν την επιφάνεια του ενδόστεου στον μυελό των οστών εκκρίνουν αιμοποιητικούς αυξητικούς παράγοντες, όπως G-CSF 200, αλλά η συμβολή τους στην αιμοποίηση είχε παραμείνει αδιευκρίνιστη μέχρι πρόσφατα 181,201. Πρώιμες προσπάθειες για την κατανόηση της λειτουργικής σχέσης ανάμεσα στους οστεοβλάστες και την αιμοποίηση εστίασαν στον προστατευτικό ρόλο που μπορεί να έχει το οστό για τον αιμοποιητικό ιστό 202. Παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης ταχεία ανάπτυξη μυελού υπάρχει σε περιοχές οστικής απορρόφησης, γεγονός που υποδηλώνει ότι η οστεογένεση και η αιμοποίηση συνδέονται λειτουργικά 203. Ιστορικά, πολλοί ερευνητές έχουν προτείνει ότι οι οστεοβλάστες ρυθμίζουν την αιμοποίηση, διότι το οστό φιλοξενεί τον μυελό και οι οστεοβλάστες επάγουν την επέκταση και την ωρίμανση των οστεοκλαστών από τα πρόδρομα μονοκύτταρα και ενεργοποιούν την οστική απορρόφηση από τους 52

81 οστεοκλάστες 204,205. Οι οστεοβλάστες εκφράζουν χημειοτακτικά σήματα για να προσελκύσουν τους οστεοκλάστες σε μεταλλωμένες επιφάνειες και μπορούν να τροποποιήσουν την έκφραση μορίων προσκόλλησης, ώστε οι οστεοκλάστες να εντοπίζονται σε περιοχές οστικής απορρόφησης. Είναι εμφανές ότι τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα και οι οστεοβλάστες επικοινωνούν μεταξύ τους για την παραγωγή των οστεοκλαστών ή την ενεργοποίηση της οστικής απορρόφησης ή και τα δύο. Οι οστεοβλάστες εκφράζουν πολλά μόρια που ρυθμίζουν την αιμοποίηση [G- CSF, GM-CSF, IL-1, IL-6, IL-7, RANKL, OPG (osteoprotegerin), SDF-1, TNF-a, VEGF] 9,206,207,208. Έχει, επίσης, παρατηρηθεί ότι τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα ρυθμίζουν την έκφραση από τους οστεοβλάστες IL-6, MIP-1a και άλλων παραγόντων με σκοπό τη δημιουργία κατάλληλου μικροπεριβάλλοντος για την εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων 209. Πρόσφατες μελέτες καταδεικνύουν ότι οι οστεοβλάστες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη δημιουργία της ενδοοστικής φωλιάς και με τον τρόπο αυτό, πιθανώς, ρυθμίζουν τη διατήρηση, τον πολλαπλασιασμό και την ωρίμανση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Ρυθμιστικά συστατικά των οστεοβλαστών που επηρεάζουν τη λειτουργία των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων περιλαμβάνουν υποδοχείς, κυτταροκίνες και αυξητικούς παράγοντες. Αυτοί οι παράγοντες επηρεάζονται, πιθανώς, από μηχανικά, συστηματικά και τοπικά σήματα που ρυθμίζουν την οστεοβλαστική δραστηριότητα. Επιπροσθέτως, αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα και τους οστεοβλάστες και άλλα κύτταρα διαδραματίζουν, πιθανώς, κομβικό ρόλο στην εγκατάσταση και τη διατήρηση της φωλιάς στον μυελό των οστών, ενώ τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα λαμβάνουν ρυθμιστικές πληροφορίες από το οστό μέσω των παραγόντων που παράγονται από τους οστεοβλάστες που βοηθούν στην εντόπιση της αιμοποίησης στον μυελό των οστών (Εικόνα Γ29). 53

82 Εικόνα Γ29: Μοντέλο υποστήριξης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων από τους οστεοβλάστες και μοντέλο παραγόντων που παράγονται από τους οστεοβλάστες και επηρεάζουν τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα z. Ο SDF-1 και ο υποδοχέας του CXCR4 φαίνεται να αποτελούν σημαντικούς μοριακούς καθοριστές της εγκατάστασης του μυελού στο οστό 210,211. Οι οστεοβλάστες και τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν SDF-1 για να περιορίσουν τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα στον μυελό των οστών 212,213,214. Στον μυελό των οστών ο SDF-1 παράγεται από οστεοβλάστες, ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα. Ο SDF-1 που παράγεται από τους οστεοβλάστες μπορεί να αποτελεί έναν μηχανισμό για την εκλεκτική προσέλκυση των κυκλοφορούντων πρόδρομων οστεοκλαστών σε κατάλληλες περιαγγειακές περιοχές του στρώματος του μυελού των οστών, όπου με την επίδραση του RANKL διαφοροποιούνται σε ενεργούς οστεοκλάστες 215. Δεδομένου ότι η δημιουργία του μυελού των οστών είναι πιθανόν να απαιτεί τη συντονισμένη δράση των οστεοβλαστών και των πρόδρομων οστεοκλαστών, η απουσία των οστεοβλαστών που παράγουν SDF-1 ή αιμοποιητικών κυττάρων που εκφράζουν CXCR4 θα μπορούσε να περιορίσει την επιστράτευση των οστεοκλαστών και, διαδοχικά, των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στην κοιλότητα του μυελού των οστών. Η εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στην ενδοοστική φωλιά αποτελεί μια ταχεία και αναστρέψιμη διαδικασία, καθώς τα αιμοποιητικά κύτταρα μπορούν να απελευθερωθούν μέσω αλλαγών στην έκφραση/ενεργοποίηση υποδοχέων και μέσω ενζυματικής διάσπασης. Οι μηχανισμοί 54

83 που διέπουν αυτήν την κίνηση δύο κατευθύνσεων έχουν αρχίσει να ξεδιαλύνονται. Μόρια που εμπλέκονται σε αυτή τη ρύθμιση περιλαμβάνουν αυξητικούς παράγοντες και μόρια προσκόλλησης. Αυξητικοί παράγοντες επάγουν την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, καθώς και την εντόπισή τους στη φωλιά, ενώ τα μόρια προσκόλλησης μπορούν λειτουργικά να διακριθούν σε αυτά που κρατάνε τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα στις φωλιές και σε αυτά που ρυθμίζουν την επιβίωση των αιμοποιητικών κυττάρων (Εικόνα Γ30). Εικόνα Γ30: Μοντέλο ζευγών προσδετών ανάμεσα στους οστεοβλάστες και τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα z. Με διαφορά τα μόρια που καλύτερα μεσολαβούν στην αλληλεπίδραση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων με τα στρωματικά κύτταρα είναι η ιντεγκρίνη α4β1 που εκφράζεται στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα και το VCAM-1 που εκφράζεται στα στρωματικά κύτταρα 158,216,217,218,219. Έγχυση διαφορετικών υποπληθυσμών του μυελού των οστών κατέδειξε ότι η εγκατάσταση στον μυελό των οστών ποικίλει ανάλογα με τον φαινότυπο. Τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα εκλεκτικά εγκαθίστανται στην περιοχή του ενδόστεου, ενώ τα προγονικά κύτταρα που έχουν διαφοροποιηθεί προς κάποια συγκεκριμένη αιμοποιητική σειρά εγκαθίστανται στην περιοχή του κεντρικού μυελού 220,221. Αυτά τα αποτελέσματα 55

84 καταδεικνύουν ότι η κατανομή των μεταμοσχευθέντων αιμοποιητικών κυττάρων στον μυελό των οστών δεν είναι τυχαία. Οι οστεοβλάστες αντιπροσωπεύουν ένα ουσιαστικό τμήμα των κυττάρων του στρώματος που διευκολύνει την εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων σε ένα αλλογενές περιβάλλον 222. Μοσχεύματα ολικού μυελού μπορεί να περιέχουν αρκετούς αριθμούς κυττάρων με την ικανότητα να γίνονται οστεοβλάστες, οι οποίοι παράγουν θεμέλια ουσία οστού παρουσία ή απουσία μυελοαφανιστικής χημειοθεραπείας. Επιπροσθέτως, έχει καταδειχθεί ότι οι οστεοβλάστες υποστηρίζουν τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα in vitro και in vivo μέσω της παραγωγής της Jagged 1 πρωτεΐνης και της ενεργοποίησης της Notch σηματοδότησης στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα 181. Έχει αναφερθεί, επίσης, ότι τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα διατηρούνται in vivo στον μυελό των οστών μέσω αλληλεπιδράσεων με τους οστεοβλάστες που μεσολαβούνται από τη Ν- καντχερίνη 201. Πιο πρόσφατα, μια μελέτη έδειξε ότι η εγκατάσταση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στην ενδοοστική φωλιά καθοδηγείται από τον CaR (calcium-sensing receptor) που εκφράζεται σε αυτά τα κύτταρα 223 και ανταποκρίνεται στην υψηλή συγκέντρωση ασβεστίου στην ενδοοστική φωλιά 223. Τα παραπάνω επιβεβαιώνουν τη λειτουργική σημασία των οστεοβλαστών στην αιμοποίηση Αγγειακή φωλιά Τα ενδοθηλιακά κύτταρα λειτουργούν, εν μέρει, ως φυσικός φραγμός ανάμεσα στην κοιλότητα του μυελού των οστών και την κυκλοφορία. Εκφράζουν μόρια προσκόλλησης, όπως η Ε- και η P-σελεκτίνη, το ICAM-1 και το VCAM-1, που διαδραματίζουν έναν ρόλο στο κύλισμα και τη σταθερή σύνδεση των αιμοποιητικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της εγκατάστασης ή της κινητοποίησης. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα του μυελού των οστών παράγουν χημειοκίνες, όπως ο SDF-1 και η IL-8, που ενεργοποιούν ιντεγκρίνες που εκφράζονται στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, κάτι που οδηγεί σε σταθερή σύνδεση 20. Εκκρίνουν, επίσης, διαλυτούς παράγοντες (VEGF, αγγειοποιητίνη, PDGF) που ευνοούν τον πολλαπλασιασμό των πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων που εκφράζουν υποδοχείς FLK-1 και Tie στην επιφάνειά τους 21. Ο προτεινόμενος ρόλος της αγγειακής φωλιάς του μυελού των οστών στην αιμοποίηση προέρχεται από μελέτες που υπαινίσσονται έναν ρόλο των ενδοθηλιακών κυττάρων στην προαγωγή της διαφοροποίησης, του πολλαπλασιασμού και της κινητοποίησης των αρχέγονων και των πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων 182,224. Παρά το γεγονός ότι η συμβολή της αγγειακής φωλιάς στην εγκατάσταση των 56

85 αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων είναι αδιευκρίνιστη, οι διαδικασίες του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και της μετανάστευσης από τον μυελό των οστών φαίνεται να ρυθμίζονται, σε έναν βαθμό τουλάχιστον, από τα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα του μυελού των οστών 182,224. Για παράδειγμα, ως απάντηση στα αυξημένα επίπεδα χημειοκινών, του FGF (fibroblast growth factor) και του SDF- 1, τα πρόδρομα μεγακαρυοκύτταρα στον μυελό των οστών μεταναστεύουν και έρχονται σε στενή επαφή με τα κολποειδή ενδοθηλιακά κύτταρα 182. Ακολούθως, τα μεγακαρυοκύτταρα διαμέσου των ενδοθηλιακών κυττάρων απελευθερώνουν αιμοπετάλια στην κυκλοφορία, αυξάνοντας έτσι τη θρομβοποίηση 182. Η χορήγηση FGF ή SDF-1 μόνο δεν οδηγεί σε ταχύτερη αποκατάσταση των αιμοπεταλίων, υποδηλώνοντας ότι η αλληλεπίδραση των μεγακαρυοκυττάρων με τα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι απαραίτητη για την αυξημένη παραγωγή αιμοπεταλίων 182. Επιπλέον, η διάσπαση της αγγειακής φωλιάς μέσω της χορήγησης μονοκλωνικού αντισώματος έναντι της καντχερίνης μετά από μυελοκαταστολή με 5-FU (5-fluorouracil) είχε ως αποτέλεσμα την 5 φορές μεγαλύτερη μείωση στον αριθμό των μεγακαρυοκυττάρων τις ημέρες μετά τη χορήγηση 5-FU 182. Επιπρόσθετες μελέτες έχουν καταδείξει ότι η σηματοδότηση μέσω αγγειοποιητίνης/tie2 συμβάλλει στην επαναγγείωση του μυελού των οστών μετά από μυελοκαταστολή με 5-FU 224, ενώ η αναστολή της Tie2 σηματοδότησης διαταράσσει τόσο τη νεοαγγείωση όσο και την αιματολογική αποκατάσταση 224. Επίσης, οι συγκεκριμένες μελέτες κατέδειξαν ότι η χορήγηση με αδενοϊό αγγειοποιητίνης1 μετά τη μυελοκαταστολή επιτάχυνε την επαναγγείωση στον μυελό των οστών και την αποκατάσταση των ουδετεροφίλων in vivo 224. Μαζί αυτές οι μελέτες προτείνουν μια ευρεία συνεισφορά της αγγειακής φωλιάς στην υποστήριξη της αιμοποίησης. Η συνεισφορά των ενδοθηλιακών κυττάρων στην αιμοποίηση έχει καταδειχθεί σε in vitro μελέτες όπου τα ενδοθηλιακά κύτταρα φάνηκε να υποστηρίζουν τη μεγακαρυοποίηση και τη μυελοποίηση 225. Τρέχοντα δεδομένα υποστηρίζουν ότι τα μεταμοσχευθέντα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα εγκαθίστανται πρωταρχικά στην ενδοοστική φωλιά 223. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες ή συνθήκες stress μια σειρά γεγονότων διευκολύνουν τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό και την κινητοποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων από την ενδοοστική στην αγγειακή φωλιά και, τελικά, στην κυκλοφορία. Για παράδειγμα, μυελοαφανιστική χημειοθεραπεία επάγει την παραγωγή του SDF-1 ο οποίος αυξάνει τη δραστικότητα της MMP-9 με αποτέλεσμα την αύξηση του διαλυτού SCF στον μυελό των οστών 163. Ο τελευταίος επάγει τη μετακίνηση των αρχέγονων 57

86 αιμοποιητικών κυττάρων από την ενδοοστική στην αγγειακή φωλιά, όπου ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και η είσοδος στην κυκλοφορία μπορεί να λάβουν χώρα. 58

87 2.6 Ο οστίτης ιστός και η οστική ανακατασκευή Τα οστά είναι όργανα, αποτελούνται, δηλαδή, από περισσότερους ιστούς οι οποίοι βρίσκονται σε λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ τους 226. Ο οστίτης ιστός, με τη σειρά του, αποτελείται από τα κύτταρα (οστεοβλάστες, οστεοκλάστες, οστεοκύτταρα) και τη μεσοκυττάρια ουσία. Η τελευταία απαρτίζεται από τα ανόργανα στοιχεία (κρυστάλλους υδροξυαπατίτη) και τη θεμέλια ουσία, η οποία, επιμέρους, χωρίζεται σε κολλαγόνο και σε-μη κολλαγονικές πρωτεΐνες. Τα ανόργανα στοιχεία προσδίδουν στο οστό σκληρότητα και ανθεκτικότητα, ενώ το κολλαγόνο ελαστικότητα, ώστε να απορροφά τις εξωτερικές πιέσεις και να καθίσταται προσαρμοστικό στις διαρκώς μεταβαλλόμενες μηχανικές ανάγκες. Οι μη-κολλαγονικές πρωτεΐνες συμμετέχουν ενεργά στον οστικό μεταβολισμό διαδραματίζοντας, κυρίως, λειτουργικό ρόλο 227. Ο οστίτης ιστός είναι μεταβολικά ενεργός σε όλη τη διάρκεια της ζωής, ιδιαίτερα κατά την περίοδο της σκελετικής ανάπτυξης, στην ενήλικη ζωή κατά τις μεταβολές του όγκου του μυϊκού ιστού και της οστικής μάζας, κατά τη συνεχή επιδιόρθωση των μικροφθορών, στην αποκατάσταση εκτάκτων αναγκών (πόρωση καταγμάτων). Σε μακροσκοπικό επίπεδο τα οστά αποτελούνται από φλοιώδες και σπογγώδες τμήμα, δυο συστατικά δομικά και λειτουργικά διαφορετικά. Το φλοιώδες οστό αποτελεί το 80%, περίπου, του οστίτη ιστού, εντοπίζεται στο εξωτερικό περίβλημα των οστών, κυρίως στα άκρα, και η συμμετοχή του στον οστικό μεταβολισμό είναι, περίπου, 20%. Το σπογγώδες οστό αποτελεί το 20%, περίπου, του οστίτη ιστου, εντοπίζεται εντός των οστών, ιδίως στις μεταφύσεις των μακρών οστών και τους σπονδύλους, και η συμμετοχή του στον οστικό μεταβολισμό είναι, περίπου, 80%. Η λειτουργία του οστίτη ιστού εξαρτάται από τη λειτουργία των επιμέρους Βασικών Μικροκατασκευαστικών Μονάδων του οστού (BSU: basic structural unit), ενώ η Βασική Πολυκυτταρική/Μεταβολική Μονάδα (BMU: basic multicellular/metabolic unit) αποτελεί τη μετάπτωση της BSU στη φάση της ανακατασκευής Οι οστεοβλάστες Οι οστεοβλάστες είναι τα οστεοπαραγωγικά κύτταρα και είναι υπεύθυνοι για τη σύνθεση των κολλαγονικών, κυρίως του κολλαγόνου τύπου Ι, και μη-κολλαγονικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων της οστεοποντίνης, της οστεονεκτίνης, της οστικής σιαλοπρωτεΐνης και της οστεοκαλσίνης. Οι οστεοβλάστες είναι πλούσιοι σε αλκαλική φωσφατάση, καθώς, επίσης, συνθέτουν και εκκρίνουν πρωτεογλυκάνες, όπως η δεκορίνη και η διγλυκάνη. Οι ώριμοι οστεοβλάστες είναι απαραίτητοι για την επιμετάλλωση του οστεοειδούς, τη διαδικασία, δηλαδή, της εναπόθεσης 59

88 υδροξυαπατίτη στην αρχική μη επιμεταλλωμένη θεμέλια ουσία. Οι οστεοβλάστες ρυθμίζουν τις τοπικές συγκεντρώσεις του ασβεστίου και του φωσφόρου με τέτοιο τρόπο ώστε να επάγεται ο σχηματισμός του υδροξυαπατίτη. Οι οστεοβλάστες έχουν υποδοχείς για διάφορες ορμόνες και κυτταροκίνες, όπως της PTH (parathyroid hormone), του PTHrP (parathyroid hormone-related peptide), της 1,25(OH)2D, των οιστρογόνων και των γλυκοκορτικοστεροειδών, οι οποίοι συμμετέχουν στη διαφοροποίηση και στη δραστικότητα των οστεοβλαστών 228. Μια πληθώρα κυτταρικών υποδοχέων και διαμεμβρανικών πρωτεϊνών έχουν ανιχνευθεί στην κυτταρική μεμβράνη των οστεοβλαστών με σκοπό την επικοινωνία με τα υπόλοιπα κύτταρα του οστίτη ιστού και τη θεμέλια ουσία, καθώς και την απόκριση σε μεταβολικά και μηχανικά ερεθίσματα 229. Παρ όλο που η κύρια λειτουργία των οστεοβλαστών είναι να συνθέτουν, να οργανώνουν και να επιμεταλλώνουν τη θεμέλια ουσία του οστού, τα κύτταρα της οστεοβλαστικής σειράς κατέχουν κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της οστικής ανακατασκευής. Η οστεοβλαστική σειρά παίρνει μέρος στη διαφοροποίηση και ενεργοποίηση των οστεοκλαστών. Ο M-CSF και ο RANKL οι οποίοι είναι απαραίτητοι για την οστεοκλαστογένεση εκφράζονται από τους οστεοβλάστες. Η OPG η οποία προσδένεται με τον RANKL αποτρέποντας την αλληλεπίδραση RANK (receptor activator of nuclear factor-κβ)-rankl και, συνεπώς, τον σχηματισμό των οστεοκλαστών εκκρίνεται από τους οστεοβλάστες. Επίσης, οι οστεοβλάστες εκκρίνουν μεταλλοπρωτεϊνάσες, υποδηλώνοντας ότι συνδέονται με την αποδόμηση του κολλαγόνου. Τα κύτταρα αυτά φαίνεται να συμμετέχουν και στην οστική απορρόφηση μέσω της έκκρισης κολλαγενάσης 228. Χαρακτηρίζονται από μεγάλο πυρήνα, αναπτυγμένο δίκτυο Golgi και εκτεταμένο ενδοπλασματικό δίκτυο, στοιχεία που καταδεικνύουν κύτταρα με υψηλό ρυθμό σύνθεσης πρωτεϊνών. Επιπρόσθετα, στη συσκευή Golgi και σε κοντινές σε αυτή περιοχές παρατηρούνται κυστίδια τα οποία, πιθανόν, περιέχουν συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας 230. Οι οστεοβλάστες είναι εκκριτικά κύτταρα που διατηρούν την ικανότητά τους για πολλαπλασιασμό και συγγενεύουν με τους ινοβλάστες και τους χονδροβλάστες. Σημαντικός είναι, επίσης, ο ρόλος των οστεοβλαστών ως κύτταρα-ενορχηστρωτές στη φυσιολογία του οστού. Συγκεκριμένα, δεχόμενα ποικίλα ερεθίσματα εκκρίνουν με τη σειρά τους διαμεσολαβητές, ασκώντας αυτοκρινή και παρακρινή δράση 228. Ο απώτερος πρόγονος του οστεοβλάστη είναι το αρχέγονο, πολυδύναμο μεσεγχυματικό κύτταρο που, εκτός από τη μεγάλη αναγεννητική του ικανότητα, μπορεί να διαφοροποιηθεί προς την κατεύθυνση άλλων 60

89 κυτταρικών σειρών. Το πρώτο στάδιο στη διαφοροποίηση του αρχέγονου μεσεγχυματικού κυττάρου προς τη σειρά των οστεοπαραγωγικών κυττάρων είναι το επαγώγιμο οστεοπρογονικό κύτταρο, δηλαδή το κύτταρο που δεν έχει τελεσίδικα προκαθορισθεί ότι θα ακολουθήσει την κατεύθυνση διαφοροποίησης προς οστεοβλάστη, αλλά που σε κατάλληλο περιβάλλον, τελικά, την ακολουθεί. Το επόμενο στάδιο διαφοροποίησης είναι ο προ-οστεοβλάστης ο οποίος είναι προκαθορισμένος να εξελιχθεί σε οστεοβλάστη. Μικρό ποσοστό οστεοβλαστών εγκλωβίζεται σε τιτανωμένη θεμέλια ουσία και μετατρέπεται σε οστεοκύτταρα. Θεωρείται πως πολλοί οστεοβλάστες παραμένουν ανενεργοί στις οστικές επιφάνειες ως επενδυματικά κύτταρα 231 (Εικόνα Γ31). Εικόνα Γ31: Βιολογικός κύκλος των οστεοβλαστών aa. Σε γενετικό επίπεδο η διαφοροποίηση των οστεοβλαστών είναι μια διαδικασία που γίνεται βαθμιαία. Κατά τον κύκλο ζωής του ο οστεοβλάστης εκφράζει όλα τα γονίδια που είναι απαραίτητα για την παραγωγή οστίτη ιστού, αλλά όχι συγχρόνως. Η διαδικασία της οστεοβλαστικής διαφοροποίησης χωρίζεται σε τρία στάδια: (1) στον πολλαπλασιασμό, (2) στη σύνθεση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και ωρίμανση, (3) στην επιμετάλλωση. Αρχικά, εκφράζονται γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Ακολουθεί η έκφραση γονιδίων που αφορούν στη 61

90 σύνθεση πρωτεϊνών της θεμέλιας ουσίας (κολλαγόνο και μη-κολλαγονικές πρωτεΐνες), καθώς και εκείνων που σχετίζονται με την ωρίμανση του οστεοειδούς, και, τέλος, εκφράζονται γονίδια υπεύθυνα για την επιμετάλλωση (π.χ. οστεοκαλσίνη). Κάθε στάδιο χαρακτηρίζεται από την έκφραση συγκεκριμένων φαινοτυπικών μαρτύρων, όπως είναι η balp (bone alkaline phosphatase), το ColI (collagen type I), η OPN, η BSP (bone sialoprotein) και η OCN (osteocalcin). Αυτά τα μόρια χρησιμοποιούνται πειραματικά και ως δείκτες των οστεοβλαστών. Γενικά, η balp, το ColI και η BSP χαρακτηρίζουν τα πρώιμα στάδια του κύκλου ζωής του οστεοβλάστη, ενώ η OCN τα πιο όψιμα. Η έκφραση της OPN εμφανίζεται υψηλή τόσο κατά το στάδιο του πολλαπλασιασμού όσο και στα τελευταία στάδια της διαφοροποίησης 228 (Εικόνα Γ32). Εικόνα Γ32: Φαινοτυπικοί μάρτυρες που χαρακτηρίζουν τα στάδια της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών aa. Ο έλεγχος της οστεοβλαστικής λειτουργίας γίνεται σε τρία επίπεδα: ενδοκρινικά, παρακρινικά και αυτοκρινικά. Οι υπεύθυνοι παράγοντες χωρίζονται σε δύο κατηγορίες. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι παράγοντες που έχουν άμεση δράση στη λειτουργία των οστεοβλαστών, όπως είναι οι BMPs (bone morphogenetic proteins), ο IGF, ο TGF, ο FGF, ο PDGF, ο EGF και οι πρωτεΐνες Wnt. Η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνει τους παράγοντες που δρούν έμμεσα στους οστεοβλάστες. Τέτοιος παράγοντας είναι ο VEGF που τροποποιεί το μικροπεριβάλλον στο οστό. Όλοι αυτοί οι παράγοντες ρυθμίζουν τη δραστηριότητα των οστεοβλαστών μέσω ενεργοποίησης μονοπατιών που εμπλέκονται στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των κυττάρων αυτών 232,233. Οι οστεοβλάστες παράγουν 62

91 αυξητικούς παράγοντες οι οποίοι εναποτίθενται και παραμένουν δεσμευμένοι στη θεμέλια ουσία του οστίτη ιστού. Σε μεταγενέστερο χρόνο και αφού με τη δράση των οστεοκλαστών γίνει απορρόφηση του οστού οι δεσμευμένοι αυξητικοί παράγοντες απελευθερώνονται προάγοντας τον πολλαπλασιασμό οστεοπρογονικών κυττάρων και επάγοντας τη διαφοροποίηση σε οστεοβλάστες 228. Επιπροσθέτως, οι δύο κυριότεροι μεταγραφικοί παράγοντες που ρυθμίζουν την οστεοβλαστική διαφοροποίηση είναι ο Runx2 (Runt-related transcription factor 2) ο οποίος είναι υπεύθυνος σε δύο στάδια της διαφοροποίησης από τα οστεοπρογονικά κύτταρα στους προ-οστεοβλάστες και από τους προ-οστεοβλάστες σε οστεοβλάστες, ενώ δρά ως ανασταλτικός παράγοντας στα τελευταία στάδια 234, και ο Osx (Osterix) ο οποίος παίζει ρόλο αποκλειστικά στην οστεοβλαστική διαφοροποίηση, ενώ αναστέλλει τον οστεοβλαστικό πολλαπλασιασμό κατά τη διάρκεια της οστικής ανάπτυξης. Τέλος, ένα από τα σημαντικότερα σηματοδοτικά μονοπάτια που είναι υπεύθυνα για την οστεοβλαστική διαφοροποίηση είναι το μονοπάτι Wnt/β-κατενίνη που επάγει τη δέσμευση, τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό των οστεοβλαστών, ενώ, ταυτόχρονα, ενισχύει την επιβίωσή τους και μετέχει στην απόφαση για το αν το μεσεγχυματικό κύτταρο θα διαφοροποιηθεί σε λιποκύτταρο ή οστεοβλάστη 235. Το συγκεκριμένο μονοπάτι είναι αυτό που αναστέλλει ο ανταγωνιστής των Wnt πρωτεϊνών Dkk1 (Dickkopf-1) Οι οστεοκλάστες Πρόκειται για κύτταρα που είναι υπεύθυνα για την αποδόμηση-απορρόφηση του οστίτη ιστού. Τα κύτταρα αυτά παρουσιάζουν κυτταρική πόλωση, δηλαδή μπορούν και απορροφούν οστό μόνο από τη μια επιφάνειά τους, την πτυχωτή, που αποτελεί μια σύνθετη κατασκευή με πολλαπλές προσεκβολές του κυτταροπλάσματος και της μεμβράνης οι οποίες δημιουργούν μια κοιλότητα απορρόφησης (απορροφητικό βοθρίο) απομονωμένο από τον εξωκυττάριο χώρο. Μέσα από την πτυχωτή επιφάνεια διέρχονται οστεολυτικά οξέα (μεταφορά ιόντων H + μέσω αντλίας πρωτονίων), ένζυμα λυσοσωματικά (υδρολάσες και κυστεοπρωτεϊνάσες) και κολλαγενάση τα οποία αποδομούν το ανόργανο και οργανικό μέρος των οστών αντίστοιχα. Από τη διάλυση του υδροξυαπατίτη απελευθερώνονται ιόντα ασβεστίου που εισέρχονται στο εσωτερικό των οστεοκλαστών. Η ανταλλαγή των ιόντων ασβεστίου γίνεται μέσω ενός ειδικού υποδοχέα ασβεστίου, ενώ ο κορεσμός των οστεοκλαστών από τα ιόντα αυτά έχει ως αποτέλεσμα την αποκόλλησή τους και την απομάκρυνσή τους από το οστό, καθιστώντας τα κύτταρα αυτά εξαιρετικά ευκίνητα. Η δραστηριότητα των 63

92 οστεοκλαστών υπό φυσιολογικές συνθήκες φαίνεται ότι ελέγχεται από τοπικούς παράγοντες που προέρχονται από το οστό και το ενδοθήλιο. Τέτοιοι παράγοντες είναι π.χ. οι προσταγλανδίνες (PGs: prostaglandins), το μονοξείδιο του αζώτου (NO: nitric oxide) και η ενδοθηλίνη, συμπλέγματα κυτταροκινών της θεμέλιας ουσίας, συμπεριλαμβανομένων των ιντερλευκινών και των παραγόντων διέγερσης αποικιών. Όμως, η δραστηριότητά τους εξαρτάται και από συστηματικούς παράγοντες, όπως η PTH και η 1,25(OH)2D, που προάγουν άμεσα την οστεοκλαστική απορρόφηση 236. Οι οστεοκλάστες προέρχονται από τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα που διαφοροποιούνται σε ώριμους οστεοκλάστες μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται οστεοκλαστογένεση 237. Η διαδικασία αυτή ξεκινά με τη δέσμευση των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων στην κυτταρική σειρά των μονοκυττάρων/μακροφάγων. Ακολουθεί η διαφοροποίησή τους σε μονοπύρηνους προ-οστεοκλάστες, αρχικά αρνητικούς και στη συνέχεια θετικούς για την ανθεκτική στο άλας του τρυγικού οξέος όξινη φωσφατάση (TRAP). Οι προ-οστεοκλάστες αρχίζουν να εκφράζουν υποδοχείς καλσιτονίνης και γονίδια που κωδικοποιούν καθεψίνη Κ, β3 ιντεγκρίνη και ATP-εξαρτώμενες πρωτεϊνικές αντλίες πρωτονίων. Ακολουθεί η σύντηξη των μονοπύρηνων προ-οστεοκλαστών σε πολυπύρηνους οστεοκλάστες ή/και σύντηξη πολυπύρηνων οστεοκλαστών σε μεγαλύτερους. Οι ώριμοι οστεοκλάστες εκφράζουν TRAP(+) και έχουν μεγαλύτερο αριθμό υποδοχέων καλσιτονίνης στην κυτταρική τους μεμβράνη 237 (Εικόνα Γ33). Εικόνα Γ33: Σχηματική αναπαράσταση της οστεοκλαστογένεσης bb. Το επόμενο στάδιο της ωρίμανσης των οστεοκλαστών είναι η σωστή συγκρότηση του κυτταροσκελετού και η πόλωση του κυττάρου που, τελικά, οδηγεί στη στενή προσρόφηση πάνω στην επιφάνεια του οστού που πρόκειται να απορροφηθεί και τον σχηματισμό της ελεύθερης ζώνης που φαίνεται σαν δακτύλιος F-ακτίνης. Το σήμα κατατεθέν του ενεργοποιημένου οστεοκλάστη είναι ο σχηματισμός της έντονα 64

93 πτυχωτής επιφάνειάς του μέσα στην ελεύθερη ζώνη 238. Η διαφοροποίηση του κοινού μυελοειδούς προγονικού κυττάρου σε οστεοκλάστη ή μονοπύρηνο φαγοκύτταρο εξαρτάται από τα ερεθίσματα που αυτό λαμβάνει από το εξωτερικό περιβάλλον. Η δημιουργία αυτού του μυελοειδούς προγονικού κυττάρου εξαρτάται από την παρουσία του M-CSF και του μεταγραφικού παράγοντα PU Η διαπίστωση ότι ο M-CSF που παράγεται από τους οστεοβλάστες και τα στρωματικά κύτταρα επάγει τη διαφοροποίηση των προγονικών μυελικών κυττάρων σε προ-οστεοκλάστες βοήθησε στην in vitro παραγωγή προ-οστεοκλαστών, αλλά και στην παρατήρηση ότι από μόνος του αυτός ο παράγοντας δεν είναι αρκετός για να ολοκληρωθεί η διαδικασία αυτή. Έτσι, από το 1981 οι Rodan και Martin διατύπωσαν την υπόθεση ότι οι οστεοβλάστες και τα στρωματικά κύτταρα παίζουν κεντρικό ρόλο στην οστεοκλαστογένεση με αποτέλεσμα οι μελετητές να στρέψουν το ενδιαφέρον τους στην ανακάλυψη του παράγοντα ενεργοποίησης των οστεοκλαστών (OAF: osteoclast activation factor)-μετέπειτα ονομαζόμενος RANKL-με την επίδραση του οποίου ολοκληρώνεται η διαφοροποίηση των κυττάρων που έχουν, ήδη, εκτεθεί στον M- CSF. Η ανακάλυψη του σηματοδοτικού μονοπατιού RANKL/RANK/OPG έδωσε μεγάλη ώθηση στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν την οστεοκλαστογένεση 239,240. Οι Boyle και συν. ανακάλυψαν τυχαία στα μέσα της δεκαετίας του 90 την OPG σε μελέτες που σκοπό είχαν την αναγνώριση μορίων που συνδέονται με τους υποδοχείς του TNF παρατηρώντας ότι αυτή αποτελεί μόριο που προστατεύει τον σκελετό από την υπερβολική απορρόφηση μειώνοντας την οστεοκλαστική οστική απορρόφηση 241. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας την OPG ως μόριο κλειδί αναγνωρίσθηκε ο συνδέτης του μορίου, μια κυτταροκίνη της ίδιας οικογένειας του TNF που ονομάστηκε RANKL, ενώ, στη συνέχεια, ανακαλύφθηκε και ο φυσικός κυτταρικός υποδοχέας του RANKL, ο RANK, μέσω του οποίου ασκεί τη δράση του. Το σύστημα RANKL/RANK/OPG έχει αποδειχθεί ότι είναι ο σημαντικότερος ρυθμιστής της οστικής απορρόφησης τόσο in vitro όσο και in vivo. Η ρύθμιση της αναλογίας RANKL/OPG από τις άλλες κυτταροκίνες φαίνεται να αποτελεί το τελικό στάδιο ρύθμισης της οστεοκλαστογένεσης 242. Λίγο πιο αναλυτικά, ο M-CSF είναι μια ομοδιμερής γλυκοπρωτεΐνη που επάγει συνεργιστικά με τον RANKL την οστεοκλαστογένεση. In vitro ο M-CSF παράγεται από μεσεγχυματικά κύτταρα, οστεοβλάστες και ενεργοποιημένα μακροφάγα. Η παραγωγή του διεγείρεται από την PTH, την IL-1 και τον TNF-a. Στο στάδιο του προ-οστεοκλάστη η σύνδεση του M-CSF με τον υποδοχέα του c-fms ενεργοποιεί τον πολλαπλασιασμό και την 65

94 επιβίωσή του. Όμως, διαδραματίζει και σημαντικό ρόλο στην κινητοποίηση, την εξάπλωση και την επιβίωση και των ώριμων οστεοκλαστών 243. Η συνεργασία του M- CSF με ανασυνδυασμένο παράγοντα RANKL επάγει τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών από μονοκύτταρα του σπλήνα και του μυελού των οστών ακόμα και όταν απουσιάζουν οι οστεοβλάστες. Παρ όλα αυτά, ο M-CSF μόνος του δεν μπορεί να επάγει διαφοροποίηση οστεοκλαστών καταδεικνύοντας τον ρόλο του ως συμπαράγοντα στη δράση άλλων κυτταροκινών 244. Από την άλλη, ο RANKL είναι μια ομοτριμερής διαμεμβρανική πρωτεΐνη τύπου ΙΙ που εκφράζεται στους οστεοβλάστες. Λειτουργεί ως ένα δεσμευτικό πρωτεϊνικό μόριο το οποίο είτε είναι προσαρτημένο στην επιφάνεια του οστεοβλάστη είτε βρίσκεται σε διαλυτή μορφή. Οι δυο αυτές διαφορετικές μορφές είναι είτε αποτέλεσμα εναλλακτικού ματίσματος είτε αποτέλεσμα πρωτεολυτικής διάσπασης από MMPs. Τόσο η διαλυτή όσο και η μεμβρανική μορφή λειτουργούν ως αγωνιστές του RANK, παρ όλο που η μεμβρανική μορφή λειτουργεί πιο αποτελεσματικά από τη διαλυτή. Ο RANKL εκφράζεται σε πρώιμους, αλλά και ώριμους, οστεοβλάστες, στρωματικά, μεσεγχυματικά και συνοβιακά κύτταρα ως απάντηση στη δράση διαφόρων παραγόντων που είναι γνωστό ότι διεγείρουν τον σχηματισμό και την ενεργοποίηση των οστεοκλαστών, όπως PTH, TNF-a, IL-6, IL-11, 1,25(OH)2D 239,240. Ο RANK είναι μια τύπου Ι ομοτριμερής διαμεμβρανική πρωτεΐνη η οποία εκφράζεται ευρύτατα σε προγονικά κύτταρα οστεοκλαστών, ώριμους οστεοκλάστες, δενδριτικά κύτταρα, σιελογόνους αδένες και σε μερικά καρκινικά κύτταρα. Η σύνδεση του RANKL στον μεμβρανικό υποδοχέα RANK των οστεοκλαστών οδηγεί στη δέσμευση των πρόδρομων μονοκυττάρων προς την οστεοκλαστική σειρά και στην ενεργοποίηση των ώριμων οστεοκλαστών 245. Σε μοριακό επίπεδο η ενεργοποίηση του RANK από τον RANKL (η οποία εμποδίζεται από την παρέμβαση της OPG) οδηγεί στη στρατολόγηση ενδοκυττάριων μορίων που ονομάζονται TRAFs (TNF receptorassociated factors) και στην ενεργοποίηση περαιτέρω ενδοκυττάριων σηματοδοτικών μονοπατιών 246. Ας σημειωθεί ότι ο NF-κB (nuclear factor-κb) αποτελεί βασικό παράγοντα για τη διαφοροποίηση των πρόδρομων μονοκυττάρων σε οστεοκλάστες. Η OPG, με τη σειρά της, εκφράζεται σε πολλούς ιστούς, εκτός από τους οστεοβλάστες, όπως καρδιά, νεφροί, ήπαρ, σπλήν, μυελός των οστών. Η έκφρασή της ρυθμίζεται από τους ίδιους παράγοντες που επάγουν και την έκφραση του RANKL στους οστεοβλάστες. Γενικά, αύξηση της παραγωγής του RANKL σχετίζεται με αντίστοιχη μείωση της παραγωγής ή της δράσης της OPG ώστε η αναλογία RANKL/OPG να 66

95 ευνοεί την οστεοκλαστογένεση. Το σύστημα RANKL/RANK/OPG απεικονίζεται σχηματικά στην Εικόνα Γ34. Εικόνα Γ34: Το σύστημα RANKL/RANK/OPG cc. Εκτός από το σύστημα RANKL/RANK/OPG, υπάρχουν και άλλοι παράγοντες που διεγείρουν την οστεοκλαστογένεση προκαλώντας αύξηση της οστικής απορρόφησης, όπως ο TNF που περιλαμβάνει δυο πρωτεΐνες οξείας φάσης με σημαντική ομολογία, τον TNF-a και τον TNF-b. Ο TNF-a φαίνεται ότι προάγει την οστεοκλαστογένεση επάγοντας τον πολλαπλασιασμό των πρόδρομων οστεοκλαστών και διεγείροντας τους οστεοβλάστες να παράγουν κυτταροκίνες που προάγουν την ωρίμανση των οστεοκλαστών. Φαίνεται ότι ο ρόλος του TNF-a είναι σημαντικότερος σε φλεγμονώδεις καταστάσεις παρά κατά τη διάρκεια της οστικής εναλλαγής. Η σύγχρονη άποψη για τον ρόλο του TNF-a στην οστεόλυση που παρατηρείται σε φλεγμονώδεις καταστάσεις είναι ότι αυτή η κυτταροκίνη δρα στα στρωματικά κύτταρα όπου και προάγει την έκφραση οστεοκλαστογενετικών παραγόντων αυξάνοντας, έτσι, την οστεοκλαστογένεση in vivo ακόμη και σε χαμηλές συγκεντρώσεις του RANKL 247. Τέλος, τα Τ λεμφοκύτταρα παράγουν μια σειρά από κυτταροκίνες που προάγουν ή αναστέλλουν την οστεοκλαστογένεση (Εικόνα Γ35). Πιο συγκεκριμένα, η ανασταλτική δράση των Τ λεμφοκυττάρων στην οστεοκλαστογένεση έχει συσχετισθεί με την παραγωγή των OPG, INF-γ, IL-4, IL-10, IL-13, GM-CSF, TGF-b 248, ενώ η ευοδωτική δράση τους στην οστεοκλαστογένεση 67

96 φαίνεται να συνδέεται με παράγοντες που δρουν άμεσα ή έμμεσα, όπως οι RANKL, M-CSF, GM-CSF, TNF-a, IL-1, IL Εικόνα Γ35: Οι κυτταροκίνες που παράγονται από τα Τ λεμφοκύτταρα και αναστέλλουν ή επάγουν την οστεοκλαστογένεση dd Τα οστεοκύτταρα Τα οστεοκύτταρα είναι τα περισσότερα κύτταρα του οστίτη ιστού. Είναι σχεδόν 10 πλάσια από τους οστεοβλάστες και 1000 φορές περισσότερα από τους οστεοκλάστες. Σε αντίθεση με τους οστεοκλάστες (1-2% του συνόλου των οστικών κυττάρων) και τους οστεοβλάστες (4-6% του συνόλου των οστικών κυττάρων) που έχουν βραχείια διάρκεια ζωής και εντοπίζονται σε ένα μικρό τμήμα της οστικής επιφάνειας, τα οστεοκύτταρα έχουν μεγάλη διάρκεια ζωής και είναι διάσπαρτα σε όλη την έκταση του σκελετού. Είναι γνωστό από παλαιότερες μελέτες ότι η κύρια λειτουργία των οστεοκυττάρων είναι αυτή του οστικού μηχανοστάτη, δηλαδή η αντίληψη των εξωτερικών πιέσεων που ασκούνται στον σκελετό, η επεξεργασία και μετατροπή των μηχανικών ερεθισμάτων σε χημικά σήματα και η περαιτέρω μετάδοσή του στις υπόλοιπες κυτταρικές δομές του οστίτη ιστού. Η επικοινωνία με τα υπόλοιπα κυτταρικά στοιχεία του σκελετού γίνεται μέσω ενός εκετεταμένου και πολύπλοκου δικτύου με πολλαπλές συνδέσεις που, όχι άδικα, από πολλούς ερευνητές παρομοιάζεται με τα νευρικά κύτταρα του εγκεφάλου 250. Πρόσφατα δεδομένα αποκαλύπτουν ότι τα οστεοκύτταρα, εκτός από τη λειτουργία τους ως οστικού μηχανοστάτη, κατέχουν σημαντικό ρόλο τόσο σε επίπεδο οστίτη ιστού (οστική ανακατασκευή) όσο και σε απομακρυσμένους ιστούς (νεφρική ρύθμιση της ομοιοστασίας του φωσφόρου) 251. Οι κύριοι μεταγραφικοί παράγοντες που είναι 68

97 υπεύθυνοι για τη διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων προς οστεοβλάστες είναι ο Runx2, ο Osx και η β-κατενίνη. Η τελική διαφοροποίησή τους προς ώριμους οστεοβλάστες και η επακόλουθη μετατροπή τους σε οστεοκύτταρα αναστέλλεται από τον παράγοντα Runx2 που με τη δράση του σε αυτό το στάδιο της διαφοροποίησης εξασφαλίζει τη διατήρηση της παροχής άωρων προβαθμίδων των οστεοβλαστών. Ο Osx, επίσης, εκφράζεται στα οστεοκύτταρα, όπως και στους οστεοβλάστες όλων των αναπτυσσόμενων οστών, ενώ το σηματοδοτικό μονοπάτι του Wnt/β-κατενίνη συμμετέχει στη λειτουργία των οστεοκυττάρων και, κυρίως, στη μετάδοση του σήματος από τα μηχανικά ερεθίσματα που ασκούνται στα κύτταρα της οστικής επιφάνειας. Ο ακριβής, ωστόσο, μηχανισμός με τον οποίο οι οστεοβλάστες μετατρέπονται, τελικά, σε οστεοκύτταρα δεν είναι απόλυτα εξακριβωμένος. Μεταξύ των τελικώς διαφοροποιημένων οστεοβλαστών και των ώριμων οστεοκυττάρων έχει αναγνωρισθεί ένα μεταβατικό στάδιο διαφοροποίησης που είναι τα οστεοκύτταρα του οστεοειδούς τα οποία συμμετέχουν στην παραγωγή του οστεοειδούς, ενώ, παράλληλα, προάγουν την επιμετάλλωσή του 252. Τα ώριμα οστεοκύτταρα έχουν αστεροειδές ή δενδριτικό σχήμα και βρίσκονται θαμμένα μέσα στο βοθριοσωληνώδες οστικό δίκτυο που καλύπτει όλη την έκταση του οστίτη ιστού 253. Στα βοθρία περιέχονται τα κυτταρικά σώματα των οστεοκυττάρων από τα οποία εκφύονται μακρές και λεπτές κυτταροπλασματικές προσεκβολές που ακτινοβολούν προς όλες τις κατευθύνσεις και, κυρίως, προς την πλησιέστερη οστική επιιφάνεια. Οι προσεκβολές αυτές διέρχονται μέσω μικροσωληναρίων που σχηματίζουν ένα πολύπλοκο δίκτυο στην εσωτερική επιφάνεια του οστίτη ιστού. Μέσω αυτών των κυτταρικών αποφυάδων τα οστεοκύτταρα συνδέονται με άλλα γειτονικά οστεοκύτταρα, με τους οστεοβλάστες και τα επενδυματικά κύτταρα στην οστική επιφάνεια, αλλά και με τα κυτταρικά στοιχεία του μυελού των οστών, στέλνοντας, έτσι, σήματα σε όλες τις κυτταρικές παραμέτρους του σκελετού 254. Η αστεροειδής μορφολογία και η ικανότητα ανάπτυξης κυτταρικού δικτύου είναι ενδογενή χαρακτηριστικά των τελικώς διαφοροποιημένων οστεοκυττάρων Η σύνδεση των οστεοκυττάρων μεταξύ τους, αλλά και με την οστική επιφάνεια, είναι κριτικής σημασίας για την επιβίωσή τους, καθότι τους εξασφαλίζει την παροχή οξυγόνου και θρεπτικών συστατικών. Η πόλωση και ο προσανατολισμός των πρώιμων δενδριτικών προσεκβολών έχει κατεύθυνση προς την επιφάνεια της επιμετάλλωσης. Στη συνέχεια, καθώς προχωρεί η διαδικασία της επιμετάλλωσης και το επιμεταλλωμένο, πλέον, οστεοειδές περιβάλλει το οστεοκύτταρο, οι προσεκβολές κατευθύνονται και προς τα αγγεία. Τα 69

98 οστεοκύτταρα, όπως και οι οστεοβλάστες, διαθέτουν υποδοχείς PTH. Η χορήγηση παραθορμόνης σε ποντίκια αυξάνει την απαντητικότητα του οστού στο μηχανικό φορτίο in vivo, ενώ, αντίθετα, στην παραθυρεοειδεκτομή παρατηρείται απώλεια της οστικής ανταπόκρισης σε μηχανικά ερεθίσματα. Επίσης, η ενεργοποίηση του υποδοχέα της PTH στα οστεοκύτταρα αυξάνει τη στράτευση των οστεοπρογονικών κυττάρων και προάγει τη δημιουργία χασματοσυνδέσεων στα οστεοκύτταρα, όπως και στους οστεοβλάστες. Η ενεργοποίηση των υποδοχέων 1,25(OH)2D, που, επίσης, έχουν βρεθεί στα οστεοκύταρα με ανοσοϊστοχημικές μελέτες και με in situ υβριδισμό, φαίνεται να έχει παρόμοια δράση. Οι υποδοχείς οιστρογόνων, που, όπως είναι γνωστό, ρυθμίζουν τον ουδό απάντησης του οστού στο μηχανικό στρες, έχουν βρεθεί σε μεγαλύτερη αναλογία στα οστεοκύτταρα σε σχέση με τους πληθυσμούς των οστεοβλαστών ή των πρόδρομων οστεοπρογονικών κυττάρων. Παράλληλα, έχουν βρεθεί υποδοχείς ανδρογόνων, υποδοχείς γλυκοκορτικοειδών τύπου α και υποδοχείς προσταγλανδινών που, όπως φαίνεται, έχουν σημαντικό ρόλο στην αντίληψη και μετάδοση των μηχανικών ερεθισμάτων 250. Στα κύτταρα του οστίτη ιστού με δυνατότητα αντίληψης των μηχανικών ερεθισμάτων του εξωτερικού περιβάλλοντος, επεξεργασίας και μετατροπής τους σε βιοχημικά σήματα περιλαμβάνονται τα επενδυματικά κύτταρα, οι οστεοβλάστες και τα οστεοκύτταρα. Ωστόσο, λόγω της ευρείας κατανομής τους σε όλη την έκταση του σκελετού και του εκτεταμένου συνδετικού δικτύου που σχηματίζουν, τα οστεοκύτταρα θεωρούνται τα κύρια οστικά κύτταρα που λειτουργούν ως μηχανοστάτης και ρυθμίζουν τη μετάδοση σημάτων για την επαγωγή της οστικής κατασκευής και απορρόφησης ανάλογα με τις εκάστοτε ανάγκες. Η εφαρμογή μηχανικής πίεσης στον σκελετό έχει ως αποτέλεσμα τη διέγερση του οστεοκυτταρικού δικτύου και μελέτες σε κυτταρικές σειρές έχουν επιβεβαιώσει τη ροή του μεσοκυττάριου υγρού διαμέσου του βοθριοσωληνώδους οστικού δικτύου ως απάντηση στη μηχανική φόρτιση 255. Τα οστεοκύτταρα είναι πιο ευαίσθητα στην απελευθέρωση προσταγλανδινών ως απάντηση σε μεταβολές της υδροστατικής πίεσης ή της τάσεως διαχωρισμού σε σχέση με τους οστεοβλάστες. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η ένταση της τάσης διαχωρισμού είναι πιο αποτελεσματική από την υδροστατική συμπίεση στη διέγερση της απάντησης των οστεοκυττάρων. Η ροή του υγρού διαμέσου των σωληναρίων που περιβάλλουν τα οστεοκύτταρα προκαλεί παραμόρφωση της κυτταρικής μεμβράνης και των βλεφαρίδων και επαγωγή της τάσεως διαχωρισμού κατά μήκος των δενδριτικών προσεκβολών. Η τάση διαχωρισμού, στη συνέχεια, διεγείρει τη διακυττάρια 70

99 επικοινωνία μέσω των χασματοσυνδέσεων και αυξάνει την έκφραση της κονεξίνης CX43 (connexin 43) μέσω της απελευθέρωσης προσταγλανδινών 256. Εν συνεχεία, οι ημιδίαυλοι λειτουργούν ως δίοδοι εξόδου της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης των προσταγλανδινών. Οι προσταγλανδίνες, με τη σειρά τους, δρουν αυτοκρινικά μέσω των υποδοχέων τους EP2 (prostaglandin E2 receptor) στην επιφάνεια των οστεοκυττάρων και προκαλούν αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης του κυκλικού AMP (camp). Τα πιο πρόσφατα δεδομένα καθιστούν τα οστεοκύτταρα ως τα κύτταρα ενορχηστρωτές της οστικής εναλλαγής που ελέγχουν τόσο την οστική κατασκευή όσο και την οστική απορρόφηση ανάλογα με τις εκάστοτε ανάγκες της BMU (Εικόνα Γ36). Εικόνα Γ36: Μοντέλο που αναπαριστά μηχανισμούς με τους οποίους τα οστεοκύτταρα μπορούν ανεξάρτητα να ελέγχουν την οστική απορρόφηση και την οστική κατασκευή ee. Μελέτες από in vivo πειράματα με ιστο-ειδική έκφραση των κυτταροκινών RANKL και OPG έδειξαν ότι τα οστεοκύτταρα αποτελούν τις κύριες πηγές τους 257,258. Ένας ακόμη μηχανισμός ρύθμισης της οστεοκλαστογένεσης από τα οστεοκύτταρα είναι μέσω του κυτταρικού θανάτου τους. Τα οστεοκύτταρα αποπίπτουν στις περιοχές των μικροκακώσεων και προσελκύουν τους οστεοκλάστες με τελικό αποτέλεσμα την απομάκρυνσή τους (Εικόνα Γ37). 71

100 Εικόνα Γ37: Ρύθμιση της οστεοκλαστογένεσης από τα οστεοκύτταρα μέσω του κυτταρικού θανάτου τους ff. Η παρουσία ζωντανών οστεοκυττάρων αποτελεί την κύρια και αναγκαία συνθήκη για την καταστολή της ενεργοποίησης των οστεοκλαστών και τη διατήρηση της οστικής μάζας 259. Επίσης, μέσω της παραγωγής της σκληροστίνης ρυθμίζουν το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt στους οστεοβλάστες ελέγχοντας την οστεοβλαστογένεση και, κατ επέκταση, την ομοιοστατική προσαρμογή του οστού στη μηχανική φόρτιση Το κολλαγόνο και οι μη-κολλαγονικές πρωτεΐνες Όπως έχει προαναφερθεί 227, η μεσοκυττάρια ουσία του οστού αποτελείται από τα ανόργανα στοιχεία (κρυστάλλους υδροξυαπατίτη) και τη θεμέλια ουσία, η οποία, επιμέρους, χωρίζεται σε κολλαγόνο και σε μη-κολλαγονικές πρωτεΐνες. Το κολλαγόνο αποτελεί την πιο άφθονη πρωτεΐνη στα θηλαστικά (25-35% του συνόλου των πρωτεϊνών) 261. Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί 28 διαφορετικοί τύποι κολλαγόνου. Οι συχνότερα ευρισκόμενοι τύποι κολλαγόνου είναι οι I έως IV και ειδικά ο τύπος I, ο οποίος αποτελεί, περίπου, το 95% του συνολικού κολλαγόνου των οστών, το 80% των συνολικών πρωτεϊνών των οστών και το 90% της θεμέλιας ουσίας. Κολλαγόνο τύπου III και IV υπάρχει, επίσης, σε χαμηλά επίπεδα στα οστά 262. Οι τύποι του κολλαγόνου και η κατανομή τους στα διάφορα όργανα, συμπεριλαμβανομένων των οστών, ποικίλει ανάλογα με το στάδιο αύξησης και ανάπτυξης. Το κολλαγόνο των οστών παράγεται από τους οστεοβλάστες. Κάθε μόριο 72

101 κολλαγόνου αποτελείται από τρεις πολυπεπτιδικές αλυσίδες (α-αλυσίδες) οι οποίες σχηματίζουν μια τριπλή έλικα. Χαρακτηριστικό της δομής κάθε αλυσίδας είναι η αλληλοδιαδοχή της δομής αμινοξέων Gly-X-Y, όπου Gly είναι πάντα γλυκίνη, ενώ X και Y μπορεί να είναι οποιαδήποτε άλλα αμινοξέα, αλλά συνηθέστερα όπου X είναι προλίνη και όπου Y είναι υδροξυπρολίνη. Τα στάδια της βιοσύνθεσης του κολλαγόνου φαίνονται στην Εικόνα Γ38. Εικόνα Γ38: Η βιοσύνθεση του κολλαγόνου gg. Στη μεσοκυττάρια ουσία το κολλαγόνο ενδέχεται να υποστεί μη-ενζυματικές τροποποιήσεις που είναι, κυρίως, η μη-ενζυματική γλυκοζυλίωση, ο ισομερισμός και η ρακεμοποίηση και που έχουν ως αποτέλεσμα λειτουργικές αλλαγές που σχετίζονται με τη βιολογική του δραστικότητα 227. Η δομική και λειτουργική ακεραιότητα του κολλαγόνου τύπου Ι αποτελεί θεμελιώδες προαπαιτούμενο για την καλή ποιότητα του οστού. Η σταθερότητα, η διαλυτότητα και η μηχανική αντοχή του κολλαγόνου καθορίζονται από το είδος και τον αριθμό των δεσμών εντός και μεταξύ των α- αλυσίδων, καθώς και μεταξύ των κολλαγονικών μικροϊνιδίων και ινιδίων. Δομικές και λειτουργικές αλλαγές του κολλαγόνου επηρεάζουν τις μηχανικές ιδιότητες του 73

102 οστού 227. Οι μη-κολλαγονικές πρωτεΐνες (NCPs: non-collagenous proteins) αποτελούν, περίπου, το 10% της θεμέλιας ουσίας των οστών και ποικίλλουν με την ηλικία, την πιθανή ύπαρξη μεταβολικού νοσήματος και τη φαρμακευτική αγωγή. Μέχρι σήμερα έχουν περιγραφεί, περίπου, μη-κολλαγονικές πρωτεΐνες στη θεμέλια ουσία των οστών. Σε απλουστευμένη θεώρηση θα μπορούσαν να ταξινομηθούν σε 2 ομάδες: α) ομάδα 1 που περιλαμβάνει πρωτεΐνες που έχουν, πρωτίστως, δομικό και μηχανιστικό και, δευτερευόντως, ρυθμιστικό ρόλο και β) ομάδα 2 που περιλαμβάνει πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης, πρωτεάσες και ορμόνες και έχουν, πρωτίστως, ρυθμιστικό ρόλο στη λειτουργία των οστεοκυττάρων, οστεοβλαστών και οστεοκλαστών 263. Οι μη-κολλαγονικές πρωτεΐνες της ομάδας 1 και 2 ταξινομούνται στους Πίνακες Γ1 και Γ2 αντίστοιχα. Η ταξινόμηση αυτή είναι αδρή, αφού δομικές και ρυθμιστικές λειτουργίες, συχνά, συνυπάρχουν σε μέλη των δυο ομάδων, όπως για παράδειγμα στην οστεοκαλσίνη και την οστεοποντίνη. Οι μη-κολλαγονικές πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και με το κολλαγόνο με σκοπό τον εύρυθμο μεταβολισμό των οστών. Δομικές ή λειτουργικές ανωμαλίες των πρωτεϊνών αυτών ή ελαττωματική αλληλεπίδραση μεταξύ τους ευθύνονται για άλλοτε άλλου βαθμού ποιοτικές διαταραχές του οστού 227. Μη-κολλαγονική πρωτεΐνη OCN ONT Βασικές ρυθμιστικές λειτουργίες Σχηματισμός οστεοειδούς μαζί με το κολλαγόνο τύπου Ι/Ρύθμιση οστικής επιμετάλλωσης/ρύθμιση οστικής ανακατασκευής Έναρξη και ρύθμιση οστικής επιμετάλλωσης/ρύθμιση διαμέτρου κολλαγονικών ινών/ρύθμιση άωρων μεσεγχυματικών κυττάρων TSP2 FN Ρύθμιση άωρων μεσεγχυματικών κυττάρων/ρύθμιση σχηματισμού κολλαγονικών ινιδίων Ρύθμιση κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης οστεοβλαστών/έμμεση ρύθμιση οστικής επιμετάλλωσης μέσω τροποποίησης λειτουργίας άλλων μηκολλαγονικών πρωτεϊνών FBN Διαμεσολάβηση της επαγόμενης από τους οστεοβλάστες οστεοκλαστικής δραστηριότητας/αλληλεπίδραση με TGF-b και BMPs Πρωτεΐνες SIBLING OPN BSP MEPE DSPP DMP1 Σχηματισμός οστεοειδούς μαζί με το κολλαγόνο τύπου Ι/Ρύθμιση οστικής επιμετάλλωσης/ρύθμιση οστικής ανακατασκευής Ρύθμιση οστικής επιμετάλλωσης Ρύθμιση οστικής επιμετάλλωσης Ρύθμιση επιμετάλλωσης οστού και οδοντίνης Ρύθμιση επιμετάλλωσης οστού και οδοντίνης Πίνακας Γ1: Οι κύριες μη-κολλαγονικές πρωτεΐνες της ομάδας 1 και οι βασικές ρυθμιστικές λειτουργίες τους A. 74

103 Μη-κολλαγονική πρωτεΐνη Βασικές λειτουργίες Αυξητικοί παράγοντες TGF-b Οστική ανάπτυξη και διατήρηση/ρύθμιση οστικής επιμετάλλωσης IGF-1 Οστική ανάπτυξη και διατήρηση BMP-2 Ρύθμιση οστικής επισκευής και αναγέννησης BMP-3 Αρνητική ρύθμιση οστικής μορφογένεσης BMP-5 Ρύθμιση μορφογένεσης οστού και χόνδρου BMP-6 Ρύθμιση οστικής μορφογένεσης BMP-7 Ρύθμιση οστικής επισκευής και αναγέννησης BMP-9 Ρύθμιση οστικής μορφογένεσης BMP-14 Ρύθμιση οστικής επισκευής και αναγέννησης BMP-16 Ρύθμιση οστικής επισκευής και αναγέννησης SLRPs Διγλυκάνη Ρύθμιση διαμέτρου κολλαγονικών ινιδίων/ρύθμιση κορυφαίας οστικής μάζας Δεκορίνη Ρύθμιση διαμέτρου κολλαγονικών ινιδίων/προστασία κολλαγονικών ινιδίων από πρωτεάσες Πίνακας Γ2: Οι κύριες μη-κολλαγονικές πρωτεΐνες της ομάδας 2 και οι βασικές λειτουργίες τους A Η οστική ανακατασκευή Οι διαδικασίες της οστικής ανακατασκευής αποτελούν κεφαλαιώδη γνώση για την κατανόηση της φυσιολογίας του οστίτη ιστού και της παθογένειας των μεταβολικών νοσημάτων των οστών 264. Οστική ανακατασκευή είναι η διαδικασία ανανέωσης των μικρομονάδων των οστών με διαδοχική ενεργοποίηση και λειτουργία των οστεοκλαστών και των οστεοβλαστών με σκοπό την ανανέωση του σκελετού, την επιδιόρθωση των μικροφθορών των μικρομονάδων αυτού, την ομοιοστασία των τιμών του ιονισμένου ασβεστίου του εξωκυττάριου χώρου και την προσαρμογή της ποσότητας του οστού στις εκάστοτε απαιτούμενες μηχανικές ανάγκες του σκελετού. Οι βιολογικές λειτουργίες του οστίτη ιστού εξαρτώνται από τη λειτουργία των επιμέρους στοιχειωδών μικρομονάδων του, των BSUs. Η οστική ανακατασκευή γίνεται με την τροποποίηση της BSU σε BMU. Πιο αναλυτικά, οι φάσεις της οστικής ανακατασκευής είναι οι εξής 265 (Εικόνα Γ39): α) Φάση ενεργοποίησης. Η φάση της ενεργοποίησης διαρκεί 5-7 ημέρες και στους δύο τύπους οστών. Στη φάση αυτή ένας διεγέρτης των οστεοκλαστών κινητοποιεί τους προ-οστεοκλάστες οι οποίοι συντηκόμενοι σε πολυπύρηνα γιγαντοκύτταρα σχηματίζουν τους οστεοκλάστες. Πιο συγκεκριμένα, κατά την ενεργοποίηση η PTH συνδέεται στον υποδοχέα της PTH στους προοστεοβλάστες. Η καταστροφή της επιμεταλλωμένης θεμέλιας ουσίας οδηγεί στην απόπτωση των οστεοκυττάρων της περιοχής με αποτέλεσμα την ελάττωση της τοπικής συγκέντρωσης του TGF-b και της αναστολής που αυτός ασκεί στην οστεοκλαστογένεση. Σε απάντηση στην PTH οι οστεοβλάστες απελευθερώνουν 75

104 MCP-1, csf-1 και RANKL, ενώ ελαττώνεται η έκφραση της OPG, με αποτέλεσμα την επιστράτευση των προ-οστεοκλαστών στην οστική επιφάνεια, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίησή τους σε ώριμους οστεοκλάστες. Εικόνα Γ39: Η οστική ανακατασκευή hh. β) Φάση οστικής απορρόφησης. Διαρκεί 3-4 εβδομάδες στο σπογγώδες οστό και 6-10 εβδομάδες στο φλοιώδες οστό. Κατά τη διάρκεια της φάσης αυτής οι οστεοκλάστες που βρίσκονται στην επιφάνεια του οστού απορροφούν προοδευτικά την αποτιτανωμένη θεμέλια ουσία αδειάζοντας το περιεχόμενο της μεταβολικής μονάδας. γ) Φάση κυτταρικής αναστροφής. Η κυτταρική αναστροφή διαρκεί λίγες μόνο ημέρες. Στη φάση αυτή απομακρύνονται οι οστεοκλάστες και επιστρατεύονται οι οστεοβλάστες στον πυθμένα του βοθρίου. Πιο αναλυτικά, εξειδικευμένα κύτταρα (κύτταρα αναστροφής) απομακρύνουν από την οστική επιφάνεια το απομεταλλωμένο κολλαγόνο που δεν έχει φαγοκυτταρωθεί και σηματοδοτείται η αναστολή της οστικής απορρόφησης και η έναρξη της διαδικασίας του οστικού σχηματισμού. δ) Φάση οστικής παραγωγής. Στη φάση αυτή, που διαρκεί 2-3 μήνες στο σπογγώδες οστό και 5 μήνες στο φλοιώδες οστό, οι οστεοβλάστες παράγουν προοδευτικά οστό, γεμίζουν το 76

105 βοθρίο με νεοσχηματιζόμενο οστό (οστεοειδές) και ακολουθεί η φάση της επιμετάλλωσης. Πιο συγκεκριμένα, σηματοδοτικά μόρια παράγονται από την αποδομημένη θεμέλια ουσία, τους ώριμους οστεοκλάστες και, πιθανώς, από τα κύτταρα αναστροφής που ευοδώνουν την αναστολή της οστικής απορρόφησης και την προαγωγή της οστικής παραγωγής. Η PTH και η μηχανική ενεργοποίηση των οστεοκυττάρων μειώνουν την έκφραση της σκληροστίνης επιτρέποντας την Wnt καθοδηγούμενη οστική παραγωγή να λάβει χώρα. Τελικά, η έκφραση της σκληροστίνης επιστρέφει και η οστική παραγωγή ολοκληρώνεται. Το νεοσχηματισμένο οστεοειδές επιμεταλλώνεται και, έτσι, ο κύκλος της οστικής ανακατασκευής συμπληρώνεται και η μεταβολική μονάδα επανέρχεται στην αρχική φάση ηρεμίας. ε) Φάση ηρεμίας. Στη φάση αυτή η μεταβολική μονάδα του οστού ταυτίζεται με τη μικροκατασκευαστική μονάδα. Η ελεύθερη επιφάνειά της επιστρώνεται από άφθονα αποπλατυσμένα επενδυματικά κύτταρα και προοστεοβλάστες ανάμεσα στα οποία παρεμβάλλονται οστεομακροφάγα. Β κύτταρα είναι παρόντα στον μυελό των οστών και εκκρίνουν OPG η οποία αναστέλλει την οστεοκλαστογένεση. Η οστική ανακατασκευή, όπως φαίνεται, ρυθμίζεται από την απόλυτη συνεργασία του οστεοβλάστη και του οστεοκλάστη. Αν και οι λειτουργίες που έχουν οι οστεοβλάστες και οι οστεοκλάστες είναι εκ διαμέτρου αντίθετες, οι κυτταρικοί αυτοί πληθυσμοί βρίσκονται σε μια διαρκή συνεργασία και ισορροπία. Η ισόρροπη αυτή συνεργασία των δυο αυτών κυτταρικών τύπων ονομάζεται σύζευξη και αποτελεί τον ακρογωνιαίο λίθο της σωστής οστικής ανακατασκευής με την οποία ο σκελετός διατηρεί τη μάζα και την αρχιτεκτονική του. Η διατάραξη της ισορροπίας υπέρ του ενός ή του άλλου κυττάρου ονομάζεται αποσύζευξη και είναι η κύρια αιτία πρόκλησης μεταβολικού νοσήματος των οστών

106 78

107 2.7 Δείκτες οστικού μεταβολισμού Όπως είδαμε στο προηγούμενο κεφάλαιο, η οστική ανακατασκευή επιτυγχάνεται με την αρμονική συνεργασία οστεοβλαστών, οστεοκυττάρων και οστεοκλαστών. Τα κύτταρα αυτά μέσω του φαινομένου της σύζευξης λειτουργούν ως μια ομάδα αφαιρώντας βαθμιαία το φθαρμένο οστό και αντικαθιστώντας το με ίση ποσότητα νέου, μηχανικά ισχυρότερου οστού. Στο παρελθόν η εκτίμηση του ρυθμού οστικής ανακατασκευής μπορούσε να επιτευχθεί μόνο με βιοψία οστού μετά από διπλή σήμανση με τετρακυκλίνη. Ωστόσο, η μέθοδος αυτή δεν είναι βολική στην καθ ημέρα κλινική πράξη, γιατί είναι παρεμβατική, ακριβή και πολύπλοκη. Έτσι, σήμερα ο ρυθμός οστικής ανακατασκευής εκτιμάται με προσδιορισμό στον ορό ή τα ούρα των δεικτών οστικού μεταβολισμού (Εικόνα Γ40). Ως τέτοιοι δείκτες χρησιμοποιούνται προϊόντα αποδόμησης του κολλαγόνου και μη-κολλαγονικών πρωτεϊνών της θεμέλιας ουσίας, ένζυμα ή άλλα μόρια που απελευθερώνονται από τους οστεοβλάστες και τους οστεοκλάστες κατά τη διαδικασία οστικής ανακατασκευής. Ανάλογα με τη φάση της ανακατασκευής στην οποία απελευθερώνονται οι δείκτες διακρίνονται σε δείκτες οστικού σχηματισμού και δείκτες οστικής απορρόφησης 266. Εικόνα Γ40: Δείκτες οστικού μεταβολισμού ii. Κατά τον οστικό σχηματισμό οι οστεοβλάστες συνθέτουν κυρίως κολλαγόνο τύπου Ι, αλλά και άλλες μη κολλαγονικές πρωτεΐνες, όπως οστεοκαλσίνη, οστεοποντίνη, οστεονεκτίνη, που συμπλέκονται εξωκυττάρια για να σχηματίσουν οστεοειδές, το οργανικό υπόστρωμα πάνω στο οποίο, στη συνέχεια, πραγματοποιείται η 79

108 επιμετάλλωση 267. Το πρώτο βήμα στη σύνθεση του κολλαγόνου τύπου Ι είναι η παραγωγή των πολυπεπτιδικών αλύσων α-1 και α-2. Αφού πολλές προλίνες και λυσίνες στις αλύσους του κολλαγόνου υδροξυλιωθούν σε υδροξυπρολίνη και υδροξυλυσίνη, μια α-2 και δυο α-1 άλυσοι περιελίσσονται μεταξύ τους ώστε να σχηματίσουν ελικοειδή μορφή γνωστή ως προκολλαγόνο. Στη συνέχεια, τα αμινο- και καρβοξυ-τελικά προπεπτίδια του προκολλαγόνου τύπου Ι αποκόπτωνται από το μόριο του προκολλαγόνου οδηγώντας στον σχηματισμό του τροποκολλαγόνου. Αυτά τα τμήματα του προκολλαγόνου που απελευθερώνονται στον ορό κατά τη μετατροπή του σε τροποκολλαγόνο είναι το αμινοτελικό προπεπτίδιο του προκολλαγόνου τύπου I (PINP: procollagen type I N-terminal propeptide) και το καρβοξυτελικό προπεπτίδιο του προκολλαγόνου τύπου Ι (PICP: procollagen type I C-terminal propeptide). Τα μόρια τροποκολλαγόνου ευθυγραμμίζονται το ένα δίπλα στο άλλο για να σχηματίσουν ένα ινίδιο κολλαγόνου. Τότε, οι πλευρικές αλυσίδες τριών υπολειμμάτων υδροξυλυσίνης από διαφορετικά μόρια τροποκολλαγόνου συμπλέκονται σε έναν δακτύλιο πυριδινίου σχηματίζοντας με αυτόν τον τρόπο τους διασταυρούμενους δεσμούς (crosslinks) πυριδινολίνης (PYD: pyridinoline) που συνδέουν τρία διαφορετικά μόρια τροποκολλαγόνου. Υπάρχουν τρεις τύποι δεσμών πυριδινολίνης που είναι χαρακτηριστικοί του οστικού κολλαγόνου. Ένας είναι η δεοξυπυριδινολίνη (DPD: deoxypyridinoline), μια παραλλαγή του δεσμού πυριδινολίνης, που σχηματίζεται όταν δυο πλευρικές άλυσοι υδροξυλυσίνης συμπλέκονται με μια πλευρική άλυσο λυσίνης. Στα οστά του ανθρώπου η αναλογία PYD/DPD είναι 2:3. Ο δεύτερος είναι ο δεσμός πυριδινολίνης στην περιοχή του αμινοτελικού τελοπεπτιδίου (NTx: N-telopeptide of collagen type I) που συνδέει τις α-1 με τις α-2 αλύσους. Ο τρίτος είναι ένα τμήμα του α-1 πεπτιδίου με έναν ισομερισμένο δεσμό μεταξύ του ασπαρτικού και της γλυκίνης. Η μέθοδος προσδιορισμού για αυτόν τον δεσμό ονομάζεται crosslaps ή CTx (C-telopeptide of collagen type I). Στην κυτταρική μεμβράνη των οστεοβλαστών είναι προσδεδεμένη αλκαλική φωσφατάση η οποία απελευθερώνεται όψιμα κατά τη διαδικασία του οστικού σχηματισμού και συγκεκριμένα στη φάση της επιμετάλλωσης. Αυτή η οστική αλκαλική φωσφατάση είναι λειτουργικά παραπλήσια, αλλά αντιγονικά διακριτή από την ηπατική, την εντερική, τη νεφρική και την πλακουντιακή αλκαλική φωσφατάση. Κατ αντιστοιχία με τους οστεοβλάστες, στην κυτταρική μεμβράνη των οστεοκλαστών είναι προσδεδεμένη όξινη φωσφατάση η οποία απελευθερώνεται κατά την οστική απορρόφηση και διακρίνεται από την όξινη φωσφατάση άλλων ιστών, 80

109 διότι είναι ανθεκτική στο τρυγικό οξύ (TRAP5b). Κατά την οστική απορρόφηση οι οστεοκλάστες προσκολλώνται στην οστική επιφάνεια και εκκρίνουν υδροχλωρικό οξύ και υδρολυτικά ένζυμα (κυρίως καθεψίνη-κ και λυσιλ-υδροξυλάση) που απορροφούν οστό απελευθερώνοντας μέταλλα και κλάσματα του κολλαγόνου. Ένα μέρος του κολλαγόνου αποδομείται πλήρως στις μικρότερες χημικές μονάδες του με αποτέλεσμα την απελευθέρωση ελεύθερης πυριδινολίνης (PYD) και δεοξυπυριδινολίνης (DPD) που απεκκρίνονται στα ούρα. Ένα άλλο μέρος του, ωστόσο, αποδομείται ατελώς με αποτέλεσμα την απελευθέρωση αμινοτελικών τμημάτων των α-1 και α-2 αλύσων που είναι συνδεδεμένα με δεσμούς πυριδινολίνης (NTx). Και αυτοί οι δεσμοί απεκκρίνονται στα ούρα. Με βάση τους μηχανισμούς που περιγράφηκαν όσον αφορά στον οστικό σχηματισμό η συγκέντρωση του PINP και του PICP στον ορό αντανακλά τον ρυθμό σύνθεσης νέου κολλαγόνου, η συγκέντρωση οστεοκαλσίνης στον ορό αντανακλά τον ρυθμό σύνθεσής της από τους οστεοβλάστες, η οστική αλκαλική φωσφατάση στον ορό αντανακλά την κυτταρική δραστηριότητα των οστεοβλαστών, ενώ όσον αφορά στην οστική απορρόφηση η απέκκριση ασβεστίου στα ούρα παρέχει μια αδρή εκτίμηση αποδόμησης του οστού, η απέκκριση υδροξυπρολίνης στα ούρα αντανακλά την αποδόμηση του κολλαγόνου στο οστό, αλλά επηρεάζεται από την αποδόμηση κολλαγόνου και σε άλλες θέσεις (χόνδρο, δέρμα) και από τη διαιτητική πρόσληψη κολλαγόνου, η συγκέντρωση της οστικής όξινης φωσφατάσης στον ορό αντανακλά τη δραστηριότητα των οστεοκλαστών, η συγκέντρωση δεσμών κολλαγόνου στον ορό (NTx, CTx) ή η απέκκρισή τους στα ούρα (DPD, NTx, CTx) αντανακλά ειδικά τον ρυθμό αποδόμησης του οστικού κολλαγόνου Δείκτες οστικού σχηματισμού α) OCN Είναι η κυριότερη μη κολλαγονική πρωτεΐνη του σκελετού. Το μόριό της περιέχει 49 αμινοξέα και έχει μοριακό βάρος περίπου 6 kda. Η οστεοκαλσίνη αυξάνεται με την ηλικία κυρίως στα αναπτυσσόμενα παιδιά και σε γυναίκες που βρίσκονται κοντά στην εμμηνόπαυση. Τα επίπεδά της είναι υψηλά κατά τη γέννηση, αυξάνονται περισσότερο στη διάρκεια της ήβης για να σταθεροποιηθούν σε ηλικία 18 ετών σε χαμηλότερα επίπεδα που είναι αυτά των ενηλίκων. Κατά τη διάρκεια της κύησης τα επίπεδά της είναι χαμηλά στο δεύτερο και αυξημένα στο τρίτο τρίμηνο. Η οστεοκαλσίνη έχει κιρκάδιο ρυθμό φτάνοντας τη μέγιστη τιμή κατά τις 4 π.μ. και στο ναδίρ στις 5 μ.μ. Αποδομείται ταχέως στον ορό in vitro. Έτσι, το δείγμα αίματος πρέπει να συλλεχθεί 81

110 σε πάγο και ο ορός άμεσα να διαχωρισθεί και να καταψυχθεί. Προσδιορίζεται με χρήση πολυκλωνικών ή μονοκλωνικών αντισωμάτων, καθώς και με ραδιοϊσοτοπικές μεθόδους 266. β) balp Έχει μοριακό βάρος 140 kda, το γονίδιό της εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 1p και αποτελεί το 46% της ολικής αλκαλικής φωσφατάσης, ενώ μαζί με την ηπατική ισομορφή αποτελούν, περίπου, το 95% της ολικής ALP (alkaline phosphatase) έχοντας αναλογία 1:1 σε φυσιολογικές συνθήκες. Μεταβολίζεται στους νεφρούς και, επομένως, δεν επηρεάζεται από την ηπατική λειτουργία. Αδρανοποιείται εύκολα στους 55 ο C σε αντίθεση με το ηπατικό ισοένζυμο που είναι ανθεκτικό σε αυτή τη θερμοκρασία. Τα επίπεδα της balp αυξάνονται σε φυσιολογικές καταστάσεις, όπως η παιδική ηλικία, η εφηβεία και η εγκυμοσύνη, αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις που χαρακτηρίζονται από αυξημένο οστικό μεταβολισμό, όπως η οστεοπόρωση, η οστεομαλακία, η νόσος Paget, ο υπερθυρεοειδισμός, ο πρωτοπαθής υπερπαραθυρεοειδισμός, η νεφρική οστεοδυστροφία, οι κακοήθειες, τα κατάγματα, η οικογενής υπερφωσφοραιμία και η ινώδης δυσπλασία. Χαμηλές τιμές υπάρχουν στον υποπαραθυρεοειδισμό και στην υποφωσφοραιμία. Η balp προσδιορίζεται με ανοσολογικές μεθόδους με χρήση ειδικού μονοκλωνικού αντισώματος. Είναι ο μόνος δείκτης που δεν έχει κιρκάδια διακύμανση. Ωστόσο, οι σημερινές μέθοδοι εμφανίζουν ενός βαθμού διασταυρούμενη αντίδραση με το ηπατικό κλάσμα και, έτσι, επηρεάζονται κάπως από πιθανή ηπατική νόσο. Τέλος, υπάρχουν δεδομένα που υποστηρίζουν ότι στην καθημέρα κλινική πράξη επί απουσίας ηπατικής νόσου και η πολύ φθηνότερη και ευρύτερα διαδεδομένη ολική ALP μπορεί να παρέχει μια αδρή εκτίμηση του ρυθμού οστικής ανακατασκευής 268. γ) PINP και PICP Η συγκέντρωσή τους στον ορό αντανακλά τον ρυθμό σύνθεσης νέου κολλαγόνου τόσο από τους οστεοβλάστες όσο και από τους ινοβλάστες σε άλλους συνδετικούς ιστούς. Ωστόσο, η συμμετοχή του δέρματος και των άλλων συνδετικών ιστών στα επίπεδα τους στον ορό φαίνεται να είναι μηδαμινή. Η μέτρηση του PINP φαίνεται να είναι πιο ειδική από του PICP για τη σύνθεση του οστικού κολλαγόνου 269. Επιπλέον, τα επίπεδα του PICP ορού μεταβάλλονται λιγότερο σε σύγκριση με άλλους δείκτες οστικού σχηματισμού, μεταξύ των οποίων και το PINP, σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις και μετά από κάποια παρέμβαση 270. Έτσι, το PINP προτιμάται ως δείκτης οστικού μεταβολισμού. Τα επίπεδα του PINP στον ορό αυξάνονται με την 82

111 ηλικία και στα δυο φύλα και σχετίζονται με τον βαθμό κινητικότητας στους ηλικιωμένους. Αν και υπάρχει κάποιου βαθμού κιρκάδια διακύμανση, ούτε αυτή ούτε η σίτιση επηρεάζουν ιδιαίτερα τη μέτρηση του PINP στον ορό στην πράξη Δείκτες οστικής απορρόφησης α) Ασβέστιο/Κρεατινίνη ούρων Η διατροφική πρόσληψη ασβεστίου επηρεάζει την απέκκρισή του στα ούρα. Τυπικά προσδιορίζεται το ασβέστιο διορθωμένο προς κρεατινίνη σε δείγμα ούρων δυο ωρών μετά την πρωινή ούρηση και κατόπιν 12ωρης νηστείας. Μπορεί, επίσης, να προσδιορισθεί και ο λόγος ασβεστίου προς κρεατινίνη ούρων 24ώρου. Είναι ο φθηνότερος βιοχημικός δείκτης οστικού μεταβολισμού, έχει, όμως, χαμηλή ευαισθησία και ειδικότητα. β) Υδροξυπρολίνη Προσδιορίζεται σε συλλογή ούρων διώρου μετά την πρωινή ούρηση και 12ωρη νηστεία. Σημαντικό ποσοστό της υδροξυπρολίνης ούρων προέρχεται από την αποδόμηση κολλαγόνου εξωσκελετικής προέλευσης, καθώς και από την υδροξυπρολίνη που προσλαμβάνεται με την τροφή. Για τη μέτρησή της πρέπει να προηγηθεί δίαιτα τουλάχιστον τριών ημερών με αποφυγή ουσιών που περιέχουν κολλαγόνο. Η απέκκριση υδροξυπρολίνης μπορεί να αυξηθεί 5-10 φορές σε ασθενείς με σοβαρή μεταβολική νόσο των οστών, αλλά μπορεί να είναι εντός φυσιολογικών ορίων σε ασθενείς με ήπια νόσο. Συμπερασματικά, η υδροξυπρολίνη είναι ευαίσθητος δείκτης οστικού μεταβολισμού, η ειδικότητά της, όμως, είναι χαμηλή και η χρήση της, πλέον, είναι περιορισμένη. γ) PYD και DPD ούρων Περίπου 40-50% των δεσμών πυριδινίου στα ούρα είναι ελεύθερη PYD και DPD. Οι δεσμοί αυτοί δε μεταβολίζονται περαιτέρω και δεν επηρεάζονται από το διαιτολόγιο του ατόμου. Επειδή οι δεσμοί πυριδινίου σχηματίζονται μόνο κατά τα τελικά στάδια του σχηματισμού ινιδίων κολλαγόνου, ο προσδιορισμός τους αντανακλά την αποδόμηση μόνο του ώριμου λειτουργικού ιστού και δεν επηρεάζεται από την αποδόμηση νεοσχηματισμένου άωρου κολλαγόνου. Οι ελεύθεροι δεσμοί πυριδινίου έχουν υψηλό βαθμό ειδικότητας για τον οστίτη ιστό, καθώς πρακτικά απουσιάζουν από το δέρμα και άλλες θέσεις εξωσκελετικού κολλαγόνου. Η σχετική αναλογία PYD και DPD ελέγχεται από το υδρολυτικό ένζυμο λυσυλ-υδροξυλάση και φαίνεται ότι η PYD έχει πολύ ευρύτερη κατανομή στους ιστούς από την DPD. Η PYD και η DPD 83

112 προσδιορίζονται στα ούρα με ανοσολογικές μεθόδους. Η ολική DPD ούρων παρέχει ακριβή εκτίμηση του ρυθμού οστικού μεταβολισμού, ωστόσο η μέτρησή της στα ούρα απαιτεί διαδικασίες χημικής υδρόλυσης που την καθιστούν τεχνικά δύσκολη και χρονοβόρα. Ο προσδιορισμός της ελεύθερης DPD, πιθανώς, αποτελεί μια καλή εναλλακτική λύση, καθώς είναι τεχνικά ευχερής και η αναλογία ελεύθερης προς ολική DPD δε φαίνεται να μεταβάλλεται σε ασθενείς με οστεοπόρωση ή άλλα μεταβολικά νοσήματα των οστών 272. Σημαντικός περιορισμός στη χρήση της DPD ως δείκτη οστικού μεταβολισμού είναι η έλλειψη μεθόδου προσδιορισμού της στον ορό όπου η βιολογική διακύμανση είναι χαμηλότερη και δεν υπάρχει ανάγκη διόρθωσης προς κρεατινίνη. Οι συγκεντρώσεις της ελεύθερης DPD στον ορό είναι πολύ χαμηλές για ακριβή ποσοτικό προσδιορισμό. Έχει περιγραφεί μια τροποποιημένη ανοσολογική μέθοδος για μέτρηση της ολικής DPD στον ορό. δ) NTx Μπορεί να προσδιορισθεί στον ορό και τα ούρα με ανοσολογικές μεθόδους. Ο επίτοπος ΝΤx απελευθερώνεται, κυρίως, από το οστικό κολλαγόνο τύπου Ι. Η απέκκρισή του εμφανίζει κιρκάδια διακύμανση 273. Αποδομείται περαιτέρω στο ήπαρ και τους νεφρούς δημιουργώντας ελεύθερη DPD. Η συγκέντρωση NTx στον ορό αυξάνεται στη χρόνια νεφρική ανεπάρκεια. Η απέκκριση NTx στα ούρα δεν επηρεάζεται από τη διαιτητική πρόσληψη κολλαγόνου. Η προσδοκώμενη μείωση του NTx ούρων μετά από θεραπεία είναι 20-30% με την καλσιτονίνη, 35-50% με τα οιστρογόνα και πάνω από 50% με την αλενδρονάτη. Το NTx ορού μειώνεται, επίσης, σημαντικά, αν και λιγότερο από των ούρων, μετά από αγωγή με αντιοστεοκλαστικά. Έτσι, η διαγνωστική αξία του NTx ορού φαίνεται να είναι ανάλογη του προσδιορισμού του στα ούρα, ενώ η βιολογική διακύμανση είναι, περίπου, διπλάσια στο NTx ούρων (15% έναντι 7%) ε) CTx Μπορεί να προσδιορισθεί τόσο στον ορό όσο και στα ούρα με ανοσολογικές μεθόδους. Υπάρχουν διάφορες ισομερείς μορφές του δεσμού ασπαρτικού-γλυκίνης που εντοπίζεται στο α-1 τελοπεπτίδιο (CTx). Η αl μορφή είναι η φυσική και αντιπροσωπεύει το νεοσχηματισθέν οστό, ενώ τρεις άλλες ισομορφές, οι βl, βd και αd, αυξάνονται αναλογικά καθώς το οστό παλαιώνει. Δηλαδή ο β-ισομερισμός του δεσμού αυτού είναι μια ηλικοεξαρτώμενη διαδικασία. Η αύξηση του λόγου της φυσικής προς τις ηλικιοεξαρτώμενες ισομορφές του CTx στα ούρα έχει σχετισθεί με αυξημένο κίνδυνο κατάγματος ανεξάρτητα από την οστική πυκνότητα 274. Η μέθοδος 84

113 Crosslaps στον ορό μετρά μόνο τη β-ισομορφή, ενώ η μέθοδος στα ούρα προσδιορίζει την α- και β-ισομερή μορφή. Έτσι, η μέθοδος προσδιορισμού του CTx στον ορό είναι πιο ειδική για το ώριμο οστό. Επιπλέον, ο προσδιορισμός του στα ούρα υπόκειται σε περιορισμούς, όπως η μεγάλη νυχθημερινή διακύμανση, η ανάγκη διόρθωσης του όγκου των ούρων από την απέκκριση κρεατινίνης, η δυσκολία της ακριβούς συλλογής των ούρων και η αδυναμία ποσοτικού προσδιορισμού του CTx σε πολύ αραιά ούρα. Το CTx ορού εμφανίζει μεγάλη νυχθημερινή διακύμανση με κορύφωση τις πρώτες πρωινές ώρες (2-6 π.μ.) και τις χαμηλότερες τιμές μεταξύ 12 π.μ.-3 μ.μ Η μέγιστη και η ελάχιστη τιμή μπορεί να απέχουν ±60% από τον μέσο όρο του 24ώρου. Τα επίπεδα του CTx ορού είναι πολύ χαμηλότερα μετά από σίτιση από ότι μετά από ολονύκτια νηστεία. Έτσι, συνιστάται το δείγμα να προέρχεται από πρωινή αιμοληψία μετά από ολονύκτια νηστεία για προσδιορισμό του CTx ορού και από τη δεύτερη πρωινή ούρηση μετά από ολονύκτια νηστεία για το CTx ούρων. Τα επίπεδα του CTx αυξάνονται με την ηλικία και στα δυο φύλα. Η κάθαρσή του γίνεται από τους νεφρούς, επομένως τα επίπεδά του είναι αυξημένα σε νεφρική ανεπάρκεια. Ωστόσο, αυτό δε φαίνεται να περιορίζει την κλινική τους χρησιμότητα σε νεφροπαθείς ασθενείς. στ) TRAP5b Είναι ένα από τα έξι ισοένζυμα της όξινης φωσφατάσης και εντοπίζεται αποκλειστικά στους οστεοκλάστες. Είναι γλυκοπρωτεΐνη με μοριακό βάρος 33kDa και το γονίδιό της εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 19. Οι τιμές της είναι αυξημένες στα παιδιά και μετά την εμμηνόπαυση, καθώς και σε παθήσεις με αυξημένο οστικό μεταβολισμό, όπως η οστεοπόρωση, η νόσος Paget και ο υπερπαραθυρεοειδισμός. Προσδιορίζεται στον ορό με ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) με χρήση μονοκλωνικού αντισώματος και δεν επηρεάζεται από νεφρική ή ηπατική δυσλειτουργία Βιολογική μεταβλητότητα των δεικτών οστικού μεταβολισμού Με τον όρο αυτό περιγράφονται οι φυσιολογικές καταστάσεις που μεταβάλλουν τον ρυθμό οστικού μεταβολισμού και, κατ επέκταση, των δεικτών. Αυτές πρέπει να λαμβάνονται υπ όψιν στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων: α) Κιρκάδια διακύμανση. Συναντάται στους περισσότερους δείκτες με κορύφωση των επιπέδων τους στον ορό ή την απέκκρισή τους στα ούρα περί τις 6 π.μ. και ναδίρ περί τις 6 μ.μ Μοναδική εξαίρεση αποτελεί η balp. β) Σίτιση. Η πρόσφατη πρόσληψη τροφής καταστέλλει τους δείκτες που είναι σημαντικά χαμηλότεροι μετά από σίτιση σε σύγκριση με τον 85

114 προσδιορισμό τους μετά ολονύκτια νηστεία 271. Εξαίρεση αποτελεί και πάλι η balp. Η κλινική σημασία της διαφοράς αυτής μεταξύ σίτισης-νηστείας είναι μικρή για τους περισσότερους δείκτες με εξαίρεση το CTx ορού. γ) Ηλικία. Τα επίπεδα των δεικτών είναι αυξημένα στην παιδική και εφηβική ηλικία, λόγω της επίδρασης της αύξησης. Στην ενήλικη ζωή διακρίνεται μια διφασική μεταβολή των δεικτών που μειώνονται με την ηλικία φτάνοντας στο ναδίρ μεταξύ 30 και 50 ετών και αυξάνουν βαθμιαία στη συνέχεια. Η αρχική μείωση των δεικτών, πιθανώς, αντανακλά την ολοκλήρωση της οστικής μάζας και τη σύγκλειση των αυξητικών πλακών. Η αύξηση μετά τα 50 έτη αντικατοπτρίζει την επίδραση της εμμηνόπαυσης στον οστικό μεταβολισμό. Οι δείκτες είναι ιδιαίτερα αυξημένοι τα πρώτα έτη μετά την εμμηνόπαυση. Επιπλέον, η αύξηση είναι πολύ μεγαλύτερη για τους δείκτες οστικής απορρόφησης σε σύγκριση με αυτούς του οστικού σχηματισμού. Αν και αυτή η σημαντική αύξηση των δεικτών αρχίζει σταδιακά να μειώνεται, ένας υψηλότερος ρυθμός οστικού μεταβολισμού παραμένει για πολλά έτη μετά την εμμηνόπαυση. Στους άνδρες οι περισσότερες μελέτες, επίσης, αναφέρουν μια ηλικιοεξαρτώμενη αύξηση των δεικτών. δ) Δείκτης μάζας σώματος. Τα αδύνατα άτομα έχουν υψηλότερο ρυθμό οστικού μεταβολισμού, άρα υψηλότερα επίπεδα δεικτών. ε) Κάπνισμα. Οι καπνιστές, επίσης, έχουν υψηλότερο ρυθμό οστικού μεταβολισμού, άρα υψηλότερα επίπεδα δεικτών. στ) Άσκηση-φυσική δραστηριότητα. Σχετίζονται με μειωμένο οστικό μεταβολισμό. Αντιθέτως, η παρατεταμένη ακινητοποίηση συνοδεύεται από αύξηση των δεικτών, ιδίως της οστικής απορρόφησης. ζ) Εποχιακή διακύμανση. Έχει παρατηρηθεί μια μικρή, αλλά στατιστικά σημαντική, καλοκαιρινή αύξηση των δεικτών οστικού σχηματισμού. η) Ωοθυλακιορρηξία. Οι δείκτες αυξάνονται κατά την ωοθυλακιορρηξία, ενώ μειώνονται κατά τη λήψη αντισυλληπτικών. θ) Πρόσφατο κάταγμα. Λόγω της διαδικασίας πόρωσης, οι δείκτες παραμένουν αυξημένοι έως και 4 μήνες μετά το κάταγμα. Στον πίνακα Γ3 φαίνονται συγκεντρωτικά οι κυριότεροι δείκτες οστικού σχηματισμού και απορρόφησης. 86

115 Δείγμα Κιρκάδιος ρυθμός Επίδραση σίτισης Δείκτες οστικού σχηματισμού OCN *ορός ναι ναι με μικρή κλινική σημασία Ελάχιστη σημαντική μεταβολή Ιδιαιτερότητεςμειονεκτήματα 21% ταχεία διάσπασηανάγκη άμεσης φυγοκέντρησης ALP *ορός όχι όχι - balp *ορός όχι όχι 28% 15-20% διασταυρούμενη αντίδραση με το ηπατικό κλάσμα PINP *ορός ναι ναι με μικρή 21% κλινική σημασία PICP *ορός ναι ναι με μικρή 24% κλινική σημασία Δείκτες οστικής απορρόφησης Ασβέστιο/κρεατινίνη ούρα ναι ναι - HYP ούρα ναι ναι - μεγάλη εξάρτηση από το είδος τροφής PYD ούρα * ναι - 36% DPD ούρα ναι ναι με μικρή κλινική σημασία 26% NTx CTx ορός, ούρα* ορός*, ούρα ναι ναι ναι με μικρή κλινική σημασία Ορός: ναι σημαντικά Ούρα: ναι με μικρή κλινική σημασία ορός: 35% ούρα: 70% ορός: 30% ούρα: 80% TRAP5b ορός ναι - 17% *υπάρχει αυτοματοποιημένη μέθοδος προσδιορισμού +ορός: πρωινό δείγμα αίματος μετά ολονύκτια νηστεία-ούρα: 2 η πρωινή ούρηση μετά ολονύκτια νηστεία Πίνακας Γ3: Δείκτες οστικού σχηματισμού και οστικής απορρόφησης Β. 87

116 88

117 2.8 Αγγειογένεση και αγγειογενετικοί παράγοντες Η νεοαγγειογένεση αποτελεί τη διαδικασία de novo σχηματισμού νέων αγγείων από τη διαφοροποίηση των πρόδρομων μορφών του μεσοδέρματος. Η αγγειογένεση αναφέρεται στην ανάπτυξη νέων τριχοειδών από προϋπάρχοντα αγγεία και θεωρείται ότι αποτελεί τον κύριο τρόπο ανάπτυξης νέων αγγείων στον ενήλικα. Στον φυσιολογικό ενήλικα η αγγειογένεση λαμβάνει χώρα πρωτίστως στο γυναικείο αναπαραγωγικό σύστημα. Ωστόσο, αποτελεί διαδικασία που έχει σημαντική επίδραση σε σοβαρές παθολογικές καταστάσεις. Το καλύτερα μελετημένο παράδειγμα παθολογικής αγγειογένεσης είναι η αγγειογένεση στα πλαίσια κακοήθειας. Ωστόσο, η αγγειογένεση είναι σημαντική, επίσης, στη χρόνια φλεγμονή, την ισχαιμία και την επούλωση πληγών 275. Τριχοειδικές εκβλαστήσεις από την υπάρχουσα μικροκυκλοφορία σχηματίζονται δευτερογενώς σε ένα ερέθισμα που έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη αγγειακή διαπερατότητα, τη συγκέντρωση εξωαγγειακής ινικής και την τοπική πρωτεολυτική αποδόμηση της βασικής μεμβράνης 276,277,278. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα που καλύπτουν τη διαταραγμένη περιοχή ενεργοποιούνται, αλλάζουν σχήμα και μέγεθος και προεκτείνουν επιμηκυμένες προσεκβολές στον περιβάλλοντα ιστό. Φιλοπόδια που εκτείνονται από τα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα στην άκρη της αγγειακής εκβλάστησης καθοδηγούν τη μετανάστευση του εκκολαπτόμενου αγγείου 279. Η κατευθυνόμενη μετανάστευση προς το αγγειογενετικό ερέθισμα έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό μιας στήλης ενδοθηλιακών κυττάρων. Ακριβώς κοντά στη μεταναστευτική άκρη της στήλης βρίσκεται μια περιοχή πολλαπλασιαζόμενων ενδοθηλιακών κυττάρων. Αυτά τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα αυξάνουν το μήκος της αγγειακής εκβλάστησης. Στην περιοχή του πολλαπλασιασμού μέχρι και 20% των ενδοθηλιακών κυττάρων μπορεί να εισέρχονται στον κυτταρικό κύκλο. Αυτό το γεγονός αποτελεί αξιοσημείωτη διαφορά σε σχέση με το ενδοθήλιο που βρίσκεται σε ηρεμία και στο οποίο λιγότερο από 0.01% των ενδοθηλιακών κυττάρων βρίσκονται σε κυτταρικό κύκλο. Εγγύς στη ζώνη πολλαπλασιασμού τα ενδοθηλιακά κύτταρα υφίστανται περαιτέρω αλλαγή του σχήματος, προσκολλώνται ισχυρά το ένα στο άλλο και σχηματίζουν έναν αυλό. Δευτερογενείς εκβλαστήσεις από τη μεταναστευτική άκρη οδηγούν στον σχηματισμό ενός πλέγματος τριχοειδών, ενώ η σύντηξη των εκβλαστήσεων στις άκρες τους κλείνει το κύκλωμα και αίμα κυκλοφορεί στην αγγειοθείσα περιοχή. Ενεργοποιημένα μακροφάγα και αιμοπετάλια εκκρίνοντας αυξητικούς παράγοντες, κυτταροκίνες, 89

118 πρωτεάσες και αναστολείς των πρωτεασών μπορούν να επηρεάσουν όλες τις φάσεις της αγγειογένεσης Επιστράτευση περιενδοθηλιακών κυττάρων Η ωρίμανση των νέων αγγείων απαιτεί την επιστράτευση λείων μυικών κυττάρων ή περικυττάρων προκειμένου να επανεγκατασταθεί η αγγειακή ακεραιότητα. Περιενδοθηλιακά κύτταρα παρέχουν δομική υποστήριξη, βοηθούν στην παραγωγή εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, παρέχουν λειτουργίες συσταλτικότητας με σκοπό τη ρύθμιση της αγγειακής διαμέτρου και διατηρούν τα κύτταρα σε κατάσταση ηρεμίας. Η τοπική παραγωγή των περιενδοθηλιακών κυττάρων συμβάλλει στην ανάπτυξη ιστοειδικού φαινοτύπου του αγγειακού συστήματος 281. Παρά το γεγονός ότι ορισμένες μελέτες έχουν καταδείξει ότι τα περικύτταρα μπορεί να αποτελέσουν πιθανούς στόχους για αντινεοπλασματική θεραπεία 282,283, άλλες εργασίες έχουν προτείνει ότι τα περικύτταρα δρουν ώστε να περιορίσουν τη διαδικασία της μετάστασης Εξωκυττάρια θεμέλια ουσία Το κολλαγόνο και η ινωδονεκτίνη της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας θεωρείται ότι διεγείρουν μορφογενετικά γεγονότα των ενδοθηλιακών κυττάρων, ενώ η λαμινίνη οδηγεί σε διαφοροποίηση και σταθεροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων 280. Επιπλέον, πρωτεΐνες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και/ή προϊόντα πρωτεολυτικής τους διάσπασης φαίνεται να αναστέλλουν την αγγειογένεση. Η αποδόμηση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας από μεταλλοπρωτεϊνάσες και ηπαρανάσες επιτρέπει στα ενδοθηλιακά κύτταρα να μεταναστεύουν στην αρχή της αγγειογένεσης 285,286. Αυξητικοί παράγοντες, επίσης, ελευθερώνονται ως αποτέλεσμα της αποδόμησης της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Η ισορροπία ανάμεσα στους θετικούς και αρνητικούς ρυθμιστές αποτελεί τη βάση του αυστηρού ελέγχου στη συγκεκριμένη διαδικασία. Η δράση των μεταλλοπρωτεϊνασών της θεμέλιας ουσίας είναι απαραίτητη για την αγγειογένεση και οι ιστικοί ανασταλτές των μεταλλοπρωτεϊνασών ρυθμίζουν τη λειτουργία τους Μόρια προσκόλλησης Από τις διάφορες τάξεις των μορίων προσκόλλησης που ενέχονται στην αγγειογένεση οι ιντεγκρίνες είναι τα πιο καλά μελετημένα 288,289,290. Παρά το γεγονός ότι οι ιντεγκρίνες και οι προσδέτες τους λειτουργούν στην αγγειογένεση, ο ακριβής τους 90

119 ρόλος παραμένει ακαθόριστος. Πιο συγκεκριμένα, αντιφατικές απόψεις αφορούν στον ρόλο της ανβ3 ιντεγκρίνης 288,289,291. Ανοσοϊστοχημικες μελέτες τοποθετούν τη συγκεκριμένη ιντεγκρίνη στην άκρη των αγγειακών εκβλαστήσεων. Αντισώματα που αδρανοποιούν τη συγκεκριμένη ιντεγκρίνη αναστέλλουν την αγγειογένεση και επάγουν την απόπτωση αγγειακών κυττάρων in vivo. Ωστόσο, επίμυες που στερούνται την αν ιντεγκρίνη δείχνουν εκτεταμένη αγγειογένεση και επίμυες και άνθρωποι που στερούνται τη β3 ιντεγκρίνη δείχνουν, επίσης, φυσιολογική αγγειογένεση. Προκλινικές μελέτες έχουν αξιολογήσει την ανβ3 και, πιθανώς, άλλες ιντεγκρίνες ως θεραπευτικούς αντιαγγειογενετικούς στόχους και κλινικές μελέτες είναι τρεχόντως σε εξέλιξη Μόρια καθοδήγησης Παρόμοια με το νευρικό σύστημα το αγγειακό σύστημα σχηματίζει ένα καλά οργανωμένο δίκτυο με διακλαδώσεις. Η οργάνωση αυτού του πρότυπου δικτύου εξαρτάται από πολλά θετικά και αρνητικά ερεθίσματα, πολλά από τα οποία είναι κοινά και για το νευρικό και για το αγγειακό σύστημα 293,294. Για παράδειγμα, ο VEGF165 δρα ως ευοδωτικό ερέθισμα στο κύτταρο στην άκρη της ενδοθηλιακής εκβλάστησης, ενώ σήματα της Netrin1 στο UNC5b στο αγγειακό σύστημα δρουν ως ανασταλτικό ερέθισμα. Το κοινό, λοιπόν, πρότυπο του νευρικού και του αγγειακού συστήματος οφείλεται πιθανώς στη χρήση κοινών οδών σηματοδότησης και μπορεί να απαιτεί συνεργασία μεταξύ των δυο συστημάτων Αναδιαμόρφωση, υποστροφή και απόπτωση Τα αγγεία που δε χρησιμοποιούνται υποστρέφουν. Μια χρόνια ελάττωση στην αιματική ροή οδηγεί σε ελάττωση της διαμέτρου του αγγειακού αυλού. Αυτή η αλλαγή εξαρτάται από την ύπαρξη ενός άθικτου και λειτουργικού ενδοθηλίου 295. Η αναδιαμόρφωση που περιλαμβάνει την απώλεια ορισμένων αγγείων, αλλαγές στη διάμετρο και το πάχος του τοιχώματος απαιτεί κυτταρικό θάνατο, κυτταρικό πολλαπλασιασμό και αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Εκτός από σήματα που μεταφέρονται μέσω των ιντεγκρινών, το stress διάτμησης είναι σημαντικό για την επιβίωση του ενδοθηλίου και την αγγειακή επούλωση μετά τον τραυματισμό 296,297,298. Η τάση του οξυγόνου είναι απαραίτητη για τη διατήρηση των αγγείων. Η υποξία αυξάνει τα επίπεδα του VEGF ο οποίος σηματοδοτεί τη διατήρηση των αγγείων και τη νεοαγγειογένεση 299. Η υπεροξία, από την άλλη, αναστέλλει την 91

120 έκφραση του VEGF που οδηγεί σε υποστροφή και θάνατο των αγγείων του αμφιβληστροειδούς 300. Σε ορισμένα πειραματικά μοντέλα η υποστροφή των αγγείων λαμβάνει χώρα μετά την απόπτωση των αγγειακών κυττάρων 301,302. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν αρκετά αντιαποπτωτικά μόρια με σκοπό τη διατήρηση της βιωσιμότητας 303,304. Πιθανώς, μια ισορροπία μεταξύ κυτταρικού θανάτου και πολλαπλασιασμού διατηρείται μέσω ενεργοποιητών και ανασταλτών των δυο διαδικασιών Αλληλεπίδραση προσδετών-υποδοχέων Αρκετοί παράγοντες ρυθμίζουν την αγγειακή ανάπτυξη και διαφοροποίηση με θετικό ή αρνητικό τρόπο. Στην εικόνα Γ41 παρουσιάζεται ένα μοντέλο αγγειακής ανάπτυξης. Εικόνα Γ41: Μοντέλο αγγειακής ανάπτυξης jj. α) Επαγωγείς της αγγειογένεσης FGFs Ο ρόλος των FGFs στην αγγειακή ανάπτυξη παραμένει σκοτεινός 305,306,307 και η απόδοση συγκεκριμένων ρόλων στα διάφορα μέλη της οικογένειας των FGF έχει υπάρξει δύσκολη. Στοιχεία καταδεικνύουν ότι οι FGF υποδοχείς σηματοδοτούν 92