DNA2-An Important Player in DNA Damage Response or Just Another DNA Maintenance Protein?

Transcript

1 DNA2-An Important Player in DNA Damage Response or Just Another DNA Maintenance Protein? Elzbieta Pawłowska (1), Joanna Szczepanska (2) and Janusz Blasiak (3), (1)Department of Orthodontics, Medical University of Lodz, Lodz, Poland; (2)Department of Pediatric Dentistry, Medical University of Lodz, Lodz, Poland; (3)Department of Molecular Genetics, Faculty of Biology and Environmental Protection, University of Lodz, Lodz, Poland The human DNA2 (DNA replication helicase/nuclease 2) protein is expressed in both the nucleus and mitochondria, where it displays ATPase-dependent nuclease and helicase activities. DNA2 plays an important role in the removing of long flaps in DNA replication and long-patch base excision repair (LP-BER), interacting with the replication protein A (RPA) and the flap endonuclease 1 (FEN1). DNA2 can promote the restart of arrested replication fork along with Werner syndrome ATP-dependent helicase (WRN) and Bloom syndrome protein (BLM). In mitochondria, DNA2 can facilitate primer removal during strand-displacement replication. DNA2 is involved in DNA double strand (DSB) repair, in which it is complexed with BLM, RPA and MRN for DNA strand resection required for homologous recombination repair. DNA2 can be a major protein involved in the repair of complex DNA damage containing a DSB and a 50 adduct resulting from a chemical group bound to DNA 50 ends, created by ionizing radiation and several anticancer drugs, including etoposide, mitoxantrone and some anthracyclines. The role of DNA2 in telomere end maintenance and cell cycle regulation suggests its more general role in keeping genomic stability, which is impaired in cancer. Therefore DNA2 can be an attractive target in cancer therapy. This is supported by enhanced expression of DNA2 in many cancer cell lines with oncogene activation and premalignant cells. Therefore, DNA2 can be considered as a potential marker, useful in cancer therapy. DNA2, along with PARP1 inhibition, may be considered as a potential target for inducing synthetic lethality, a concept of killing tumor cells by targeting two essential genes. Εισαγωγή Η ανασκόπηση των Pawłowska, Szczepanska και Blasiak αφορά το ρόλο που επιτελεί η ανθρώπινη πρωτεΐνη DNA2 στην επιδιόρθωση του DNA και γενικότερα στη διατήρηση της σταθερότητας του γονιδιώματος και τις πιθανές εφαρμογές αυτού στη θεραπεία του καρκίνου. Η DNA2 είναι μια πρωτεΐνη με ATP-εξαρτώμενες δραστικότητες ελικάσης και νουκλεάσης, η οποία εντοπίζεται τόσο στα νουκλεοειδή των μιτοχονδρίων, όσο και στον πυρήνα των κυττάρων και συμμετέχει στις διαδικασίες αντιγραφής και επιδιόρθωσης του DNA. Αντιγραφή 1.Μιτοχόνδρια Στα μιτοχόνδρια η DNA2 παίζει σημαντικό ρόλο στην πορεία της αντιγραφής. Ο ρόλος αυτός φαίνεται ξεκάθαρα σε κύτταρα με μεταλλαγές στην πρωτεΐνη TWINKLE, μια ελικάση απαραίτητη για την αντιγραφή και την ακεραιότητα του mtdna. Στα κύτταρα αυτά, η DNA2 εντοπίζεται σχεδόν αποκλειστικά στο εσωτερικό των νουκλεοειδών, σε αντίθεση με τα φυσιολογικά κύτταρα, στα οποία ένα μόνο ποσοστό της εντοπίζεται εκεί. Στα μεταλλαγμένα κύτταρα, δηλαδή, αλλάζει η τοπολογία της πρωτεΐνης. Άλλες έρευνες έχουν δείξει ότι η DNA2 ως ελικάση αλληλεπιδρά με την

2 μιτοχονδριακή DNA πολυμεράση γ, αυξάνοντας τη δραστικότητα της, κάτι που καθιστά την DNA2 εξίσου σημαντική ελικάση για την αντιγραφή του mtdna με την TWINKLE. Τέλος, η DNA2 συμμετέχει και στην απομάκρυνση των RNA εκκινητών, αυξάνοντας τη δραστικότητα της FEN1(flap endonouclease 1), ενός ενζύμου με δράση 5-3 εξωνουκλεάσης, το οποίο είναι υπεύθυνο για την απομάκρυνση μονόκλωνων προεξέχοντων τμημάτων ( flaps ) DNA ή/και RNA. 2.Πυρήνας Στον πυρήνα, η DNA2 δρα συνεργιστικά με άλλες πρωτεΐνες κατά την επεξεργασία των τεμαχίων Okazaki. Συγκεκριμένα, η απομάκρυνση του RNA/DNA εκκινητή ξεκινά από την DNA πολυμεράση δ και συνεχίζεται από την 5-3 ελικάση PIF1, οπότε και μένει ένα flap στο 5 άκρο. Τέτοια τμήματα συνήθως απομακρύνονται από την FEN1, όπως αναφέρθηκε πιο πάνω. Ωστόσο, σε μεγαλύτερα flaps προσδένεται η RPA (replication protein A) και παρεμποδίζει την πρόσδεση της FEN1. Η RPA προσελκύει στο σημείο την DNA2, η οποία χρησιμοποιεί τη νουκλεολυτική της δράση για να φέρει το flap σε τέτοιο μήκος, ώστε να μπορεί να το επεξεργαστεί η FEN1. Η RPA απομακρύνεται από το σημείο με τη βοήθεια της DNA2, οπότε και μπορεί να προσδεθεί η FEN1, η οποία απομακρύνει πλήρως το flap, αφήνοντας ένα θραύσμα στον κλώνο, το οποίο διορθώνει η DNA λιγάση Ι. Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα ευρήματα των Duxin et al., οι οποίοι έδειξαν ότι μειωμένη έκφραση (knockdown) της DNA2 έχει ως αποτέλεσμα βλάβη του DNA κατά την S φάση, αλλά δεν επηρεάζει την επεξεργασία των τεμαχίων Okazaki ούτε τη γενικότερη πορεία της διχάλας της αντιγραφής. Επιπλέον, το knockdown της DNA2 προκαλούσε αστάθεια στο γονιδιώμα, η οποία δεν επιδιορθωνόταν από εκτοπική έκφραση της FEN1. Από αυτά, συμπεραίνουμε ότι η DNA2 έχει διευρυμένο ρόλο στη ρύθμιση της αντιγραφής και στη σταθερότητα του DNA και δε δρα απλώς επικουρικά της FEN1. Η DNA2 διαδραματίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην περίπτωση που η πορεία της αντιγραφής είχε σταματήσει λόγω βλάβης που δεν υφίσταται πλέον και άρα πρέπει να ξεκινήσει πάλι. Συγκεκριμένα, σε κάποιες περιπτώσεις οι επιπλοκές κατά την αντιγραφή του DNA αντιμετωπίζονται με ένα μηχανισμό επανενεργοποίησης της θηλιάς της αντιγραφής, ο οποίος όμως δεν είναι ακόμα πλήρως κατανοητός. Είναι γνωστό, πάντως, ότι ξεκινά με υβριδοποίηση των νεοσυντιθέμενων αλυσίδων προς δημιουργία ενός κόμβου Holliday. Ακολουθεί η επιδιόρθωση της βλάβης (πχ μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού), οπότε και μπορεί να συνεχιστεί η αντιγραφή. Για να γίνει, όμως, αυτό, είναι απαραίτητο να αποδομηθεί ο κόμβος Holliday, διαδικασία η οποία επιτελείται από την ελικάση RECQ1 (ATP-dependent DNA helicase Q1). Ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα ευρήματα των Thangavel et al., οι οποίοι έδειξαν ότι στην αποδόμηση του κόμβου Holliday συμμετέχει ενεργά η DNA2, ακόμα και σε κύτταρα με έλλειψη της RECQ1. Συγκεκριμένα, η DNA2 συνεργάζεται με την WRN (Werner syndrome ATP-dependent helicase) και την BLM (Bloom syndrome protein) και επιτελούν την 5-3 εκτομή των άκρων που είναι απαραίτητη για την επιδιόρθωση την θραύσεων διπλής έλικας (DSBs: DNA double-strand breaks) μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού. Ο ακριβής μηχανισμός αυτής της διαδικασίας δεν είναι ακόμα γνωστός, ωστόσο πιθανολογείται ότι η DNA2, με τη βοήθεια των WRN/BLM, δημιουργεί θραύσματα μονόκλωνου DNA στα άκρα του κόμβου, τα οποία εισβάλουν στο δίκλωνο DNA που προηγείται της θηλιάς, δημιουργώντας μια διακλάδωση που μεταναστεύει, επαναφέροντας εν μέρει την αντιγραφική ικανότητα της θηλιάς. Σε αυτό συμβάλλουν και εξειδικευμένες πρωτεΐνες, οι οποίες αναγνωρίζουν τη μετανάστευση διακλάδωσης.

3 3.Τελομερή Η DNA2 φαίνεται να συμβάλλει και στη διατήρηση των τελομερών. Γενικότερα, τα τελομερή περιέχουν περιοχές μονόκλωνου DNA πλούσιου σε γουανίνη, οι οποίες αναδιπλώνονται και σχηματίζουν ενδομοριακά τετραμερή γουανίνης (G4). Η δομή αυτή είναι ανθεκτική στις περισσότερες ελικάσες και νουκλεάσες, με αποτέλεσμα να παρεμποδίζεται η αντιγραφή του DNA. Παρόλα αυτά, η DNA2 μπορεί και προσδένεται στα G4 και μάλιστα με μεγαλύτερη συγγένεια απ ότι στο μονόκλωνο τελομερικό DNA. Εκεί, με τη βοήθεια της RPA, η οποία ενισχύει επιλεκτικά τη δράση 5-3 νουκλεάσης της DNA2, ενώ ταυτόχρονα καταστέλλει τη δράση 3-5 νουκλεάσης, η DNA2 ξετυλίγει ή απομακρύνει τα G4. Αξίζει να αναφέρουμε ότι knockdown της DNA2 στις καρκινικές κυτταρικές σειρές U2OS και HeLa είχε ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση κυττάρων στο σημείο ελέγχου G2/M, πιθανότατα ως αποτέλεσμα χρωμοσωμικών ανωμαλιών, το οποίο αποτελεί ένδειξη γενικευμένης γονιδιωματικής αστάθειας. Επιδιόρθωση Τα DSBs και η δημιουργία δεσμών ανάμεσα στις δύο αλυσίδες του DNA (ICLs: interstrand crosslinks) είναι οι πιο σοβαρές βλάβες που μπορεί να πάθει το DNA και μπορούν να οδηγήσουν σε χρωμοσωμική θραύση και μετατόπιση. Όσον αφορά τα DSBs, μπορούν να επιδιορθωθούν μέσω δύο μηχανισμών, της μη-ομόλογης σύνδεσης άκρων (NHEJ: non-homologous end joining) και του ομόλογου ανασυνδυασμού. Στο πλαίσιο της συγκεκριμένης επισκόπησης μας ενδιαφέρει ο ομόλογος ανασυνδυασμός. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός, λοιπόν, χρειάζεται μονόκλωνα 3 προεξέχοντα τμήματα DNA, τα οποία δρουν ως υπόστρωμα για πρωτεΐνες που συμμετέχουν στον ομόλογο ανασυνδυασμό. Τα 3 προεξέχοντα άκρα δημιουργούνται από τη συνδυαστική δράση μιας DNA ελικάσης και μίας 5-3 νουκλεάσης μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται «εκτομή των άκρων» (end resection). Στον άνθρωπο, το DSB αναγνωρίζεται από το σύμπλοκο MRN. H RPA προσδένεται στο 3 προεξέχον άκρο και στρατολογεί την RAD51, την κύρια πρωτεΐνη του ομόλογου ανασυνδυασμού, με τη βοήθεια της BRCA2. Στη συνέχεια πραγματοποιείται ξετύλιγμα και αποδόμηση του μονόκλωνου DNA, διαδικασίες που μπορούν να γίνουν από δύο σύμπλοκα: είτε του συμπλόκου BLM-EXO1 είτε του συμπλόκου BLM-DNA2. Και στις δύο περιπτώσεις, η BLM δρα ως ελικάση, ενώ η EXO1 και DNA2 έχουν 5-3 νουκλεολυτική δράση. Οι Tkac et al. βρήκαν ότι η HELB (DNA helicase B) παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία εκτομής των άκρων, καθώς παρεμποδίζει τη δράση των συμπλόκων BLM-EXO1/BLM-DNA2. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι στην περίπτωση της DNA2, η δράση της παρεμποδίζεται μόνο όταν είναι σε σύμπλοκο με τη BLM και όχι όταν είναι μόνη της. Η DNA2 συμμετέχει επίσης και σε έναν άλλο μηχανισμό ομόλογου ανασυνδυασμού, τον ανασυνδυασμό μονής αλυσίδας (SSA: single-strand annealing). Οι Karanja et al. έδειξαν ότι σε κύτταρα με knockdown της DNA2 μειώθηκε αντίστοιχα και το SSA. Ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα μετέπειτα πειράματα τους, στα οποία αρχικά εξετάστηκε η επίπτωση της μειωμένης έκφρασης της DNA2. Βρήκαν, λοιπόν, ότι κύτταρα με αυτή τη μεταλλαγή ήταν τόσο ευαίσθητα σε παράγοντες που προκαλούν ICLs όσο κύτταρα με διπλό knockout στο γονίδιο που κωδικοποιεί την FANCD2 πρωτεΐνη, η οποία είναι απαραίτητη για την επιδιόρθωση των ICLs. Ωστόσο, όταν το knockdown της DNA2 έγινε σε κύτταρα knockout για την FANCD2, αυτά έγιναν πιο ανθεκτικά σε παράγοντες που προκαλούν δεσμούς DNA-DNA και DNA-πρωτεϊνών. Μια πιθανή ερμηνεία για αυτό είναι

4 ανταγωνιστική δράση μεταξύ των DNA2 και FANCD2. Αυτό είναι και το πρώτο σημείο που υποδεικνύει ένα διττό ρόλο για τη DNA2 στη σταθερότητα του γονιδιώματος. Η DNA2 φαίνεται πως μπορεί να επιδιορθώσει και πολύ σοβαρές βλάβες του DNA, όπως τα DSBs με 5 πρόσθετο μόριο. Αυτό μπορεί να προκληθεί από μη φυσιολογική δράση ενζύμων επεξεργασίας του DNA, όπως για παράδειγμα η TOP2 (DNA topoisomerase 2). Σε αυτή την περίπτωση, δύο υπομονάδες του ενζύμου προσδένονται ομοιοπολικά στα 5 άκρα του DNA. Τέτοια σύμπλοκα παγιδεύονται από αντικαρκινικά φάρμακα και δημιουργούνται τελικά τα DSBs με 5 πρόσθετο μόριο. Η DNA2 επιτελεί σημαντικό, αν και περιορισμένο, ρόλο και στην επιδιόρθωση των ICLs. Ουσιαστικά, η DNA2 είναι υπεύθυνη για την επιδιόρθωση των DSBs, τα οποία μπορεί να προκύψουν είτε ως απόρροια των ICLs είτε ως ενδιάμεσο προϊόν της επιδιόρθωσης τους. Καρκίνος Πολλές μορφές καρκίνου σχετίζονται με ενεργοποίηση ογκογονιδίων, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε αντιγραφικό stress, το οποίο καταπολεμά η DNA2. Έτσι, παρεμπόδιση ή knockdown της DNA2 μπορεί να επιφέρει χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης καρκινικών κυττάρων. Πολλές έρευνες έχουν δείξει ότι η DNA2 υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου. Οι Strauss et al. έδειξαν ότι το γονίδιο που κωδικοποιεί την DNA2 φαίνεται να είναι μεταλλαγμένο σε οιστρογονοεξαρτώμενες μορφές καρκίνου μαστού και ωοθηκών. Στον άνθρωπο, συσχέτισαν την υπερέκφραση της DNA2 με χαμηλή επιβίωση ασθενών οιστρογονο-εξαρτώμενων μορφών καρκίνου. Οι Liu et al. έδειξαν ότι ομόζυγη απαλοιφή του γονιδίου της DNA2 αυξάνει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε ακτινοβολία και τον αναστολέα της DNA τοποϊσομεράσης 1 καμπτοθεκίνη. Τέλος, απαλοιφή της DNA2 σε καρκινικά κύτταρα με gain-of-function μεταλλαγή της p53 τα έκανε πιο ευαίσθητα σε αντικαρκινικά φάρμακα. Μια άλλη ενδιαφέρουσα προσέγγιση είναι αυτή της συνθετικής θνησιμότητας (synthetic lethality), κατά την οποία ταυτόχρονες μεταλλαγές σε δύο γονίδια είναι θανατηφόρες για το κύτταρο, ενώ μεταλλαγή σε ένα μόνο από τα δύο δεν επιφέρει κυτταρικό θάνατο. Ένα τέτοιο παράδειγμα είναι παρεμπόδιση της PARP1 (poly(adp-ribose) polymerase 1) σε κύτταρα με μεταλλαγές στα γονίδια BRCA1 και BRCA2. Οι μεταλλαγές σε αυτά τα γονίδια προκαλούν προβλήματα στην επιδιόρθωση των DSBs με ομόλογο ανασυνδυασμό και σε συνδυασμό με αναστολή της δράσης της PARP1 απαραίτητη για την επιδιόρθωση των θραύσεων μονής έλικας (SSBs: single-strand breaks)- το κύτταρο οδηγείται σε απόπτωση. Δεδομένου ότι η DNA2 είναι καθοριστική για την επιδιόρθωση των DSBs και ότι μπορεί να συνεργαστεί με την PARP1 κατά την επιδιόρθωση, θα μπορούσε η αναστολή της δράσης της PARP1 να εφαρμοστεί σε κύτταρα με μεταλλαγές στην DNA2. Συμπεράσματα-επόμενα βήματα Η ανασκόπηση καταλήγει στο συμπέρασμα ότι η DNA2 δεν είναι απλώς άλλη μία πρωτεΐνη συντήρησης του DNA. Παρόλα αυτά, υπάρχουν ακόμα πολλά αναπάντητα ερωτήματα. Ένα από αυτά αφορά τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις της. Η DNA2 είναι στόχος μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, οι οποίες είναι πολύ σημαντικές για τη λειτουργία της. Ενδεικτικά θα αναφέρουμε την ακετυλίωση της από την p300 και τη φωσφορυλίωση της από την Cdk1, που φαίνεται να είναι καθοριστικές για το ρόλο της πρωτεΐνης στην αντιγραφή και την επιδιόρθωση του DNA. Ωστόσο, οι

5 περισσότερες σχετικές μελέτες έχουν γίνει στη ζύμη, οπότε είναι απαραίτητο να γίνουν αντίστοιχες μελέτες και για την ανθρώπινη DNA2. Επιπλέον, καθώς η ακετυλίωση και η φωσφορυλίωση δεν είναι οι μοναδικές μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που μπορεί να δεχτεί μια πρωτεΐνη, είναι πολύ σημαντικό να διερευνηθεί η πιθανότητα η DNA2 να υπόκειται και σε άλλες τροποποιήσεις. Πολύ σημαντική είναι επίσης η διερεύνηση του ρόλου της στην επιλογή μεταξύ NHEJ και ομόλογου ανασυνδυασμού. Λίγα είναι γνωστά για τον τρόπο επιλογής ανάμεσα στους δύο αυτούς μηχανισμούς επιδιόρθωσης, αλλά θεωρείται ότι η δομή του DNA παίζει κάποιο ρόλο. Επομένως, δεδομένο ότι η DNA2 είναι απαραίτητη για τη διαδικασία εκτομής των άκρων, είναι πιθανό να επηρεάζει έμμεσα αυτή την επιλογή. Ο ρόλος της DNA2 στην αντιγραφή και την επιδιόρθωση του DNA, καθώς και στη διατήρηση των τελομερών μαρτυρούν τη σημασία της για τη γενωμική σταθερότητα. Καθώς η γενωμική αστάθεια είναι χαρακτηριστικό των περισσότερων καρκινικών κυττάρων, είναι πιθανό η DNA2 να παίζει ρόλο στη διαδικασία μετατροπής ενός φυσιολογικού κυττάρου σε καρκινικό, κάτι που θα την καθιστούσε πολύ ελκυστικό στόχο για αντικαρκινική θεραπεία. Αυτό ενισχύεται και από το ρόλο της στην επιδιόρθωση των βλαβών του DNA που προκαλούνται από αντικαρκινικά φάρμακα. Επομένως, χρειάζεται περισσότερη έρευνα και αυτά τα δύο σημεία. Ελένη Τσουκαλά, ΑΜ: