A New Generation of Cold-shock Vector Derived from pcold I (pcold I-LZ) for Expression of Recombinant Peptides and Proteins

Transcript

1 pcold I-LZ Vector for Expression of Recombinant Peptides and Proteins A New Generation of Cold-shock Vector Derived from pcold I (pcold I-LZ) for Expression of Recombinant Peptides and Proteins Hamid Latifi Navid 1, Saeid Latifi-Navid 2, Saber Zahri 2 Original Article 1 Researcher, Division of Cellular and Molecular Biology, Department of Biology, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran 2 Division of Cellular and Molecular Biology, Department of Biology, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran ABSTRACT Background: Finding shows that there were several problems in the treatment of Helicobacter pylori infection such as the emergence of resistance to the antibiotics, the risk of recrudescence, and the high cost of treatment. The ineffectiveness of conventional treatment mechanisms against cancer cells reveals the importance of peptides as a novel therapeutic approach. However, the short length of peptides was a restriction factor to realise this approach. As a result, one or more amino acid residues were added during the cloning process that leads to the loss of the original peptide folding. The aim of study was to change the structure of the pcold I vector using site-directed mutagenesis in order to do the directional cloning of each target gene and express/purify the small peptides and native proteins without any additional N-terminus amino acids.. Materials and Methods: Site-directed mutagenesis was performed by plasmid amplification in two individual PCR reactions. Two PCR products were mixed and denatured to separate the nascent strands of plasmid DNA from the parental ones. Slow cooling conditions were used to allow reannealing of PCR products. The products were digested with DpnI that digests methylated parental strands, and then transformed into E.coli DH5α. The mutant plasmid was identified by digestion with NdeI and PceI and sequencing. Results: The mutant plasmids were not digested by NdeI. The presence of mutation was also confirmed by sequencing. In mutant vector the cut sites of both the first restriction enzyme at the multiple cloning site (at the nucleotide level) and factor Xa (at the amino acid level) became the same. Conclusion: The modified vector can be widely used for a fast and more convenient cloning and expression of the native proteins and short peptides, including anti-h.pylori peptides and anti-angiogenesis, gastric anti-cscs and anti-metastatic peptides. Keywords: Cold-shock vector; small peptides; recombinant expression; site-directed mutagenesis please cite this paper as: Latifi Navid H, Latifi-Navid S, Zahri S. A New Generation of Cold-shock Vector Derived from pcold I (pcold I-LZ) for Expression of Recombinant Peptides and Proteins. Govaresh 2015;20: Corresponding author: Saeid Latifi Navid, Ph.D Division of Cellular and Molecular Biology, Department of Biology, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran.Post code: Telefax: slatifin@yahoo.com Received: 06 May 2015 Edited: 06 Aug Accepted: 07 Aug

2 گوارش/ دوره 20 شماره 3/ پاییز / نسل جدید وکتور شوک سرمایی مشتق از )pcold I (pcold I-LZ برای بیان پپتیدها و پروتیین های نوترکیب 2 حمید لطیفی نوید 1 سعید لطیفی نوید 2 صابر زهری مقاله پژوهشی 1 پژوهشگر گروه بیولوژی سلولی و مولکولی بخش زیست شناسی دانشکده علوم دانشگاه محقق اردبیلی اردبیل ایران 2 گروه بیولوژی سلولی و مولکولی بخش زیست شناسی دانشکده علوم دانشگاه محقق اردبیلی اردبیل ایران زمینه و هدف: روش های درمانی متداول بر علیه میکروارگانیسم های بیماری زا دارای چندین مشکل از جمله تظاهر مقاومت به آنتیبیوتیک ها خطر بازگشت عفونت و هزینه باال می باشند. از طرف دیگر ناکارآمدی مکانیسم های درمانی مرسوم بر علیه سلول های سرطانی ضرورت به کارگیری پپتیدها را به عنوان راهکار نوین درمانی بیش از پیش آشکار می سازد. با این وجود طول کوتاه آن ها یک عامل محدودکننده در راستای بیان نوترکیب آن ها می باشد. دلیل این امر اضافه شدن یک یا چند آمینواسید به طول پپتید بیانی یا تغییر قالب خواندن باز می باشد. هدف از این مطالعه تغییر ساختمان وکتور pcold I با استفاده از روش جهش-زایی مختص جایگاه به منظور کلون سازی جهت دار هر ژن هدف و بیان و خالص سازی پپتیدهای کوچک و پروتیین های بکر-دست نخورده- میباشد. روش بررسی: جهشزایی مختص جایگاه با تکثیر پالسمید در دو واکنش PCR مجزا انجام شد. در واکنش 1 تنها پرایمر رفتی و در واکنش 2 تنها پرایمر برگشتی وجود داشت. دو محصول PCR مخلوط شدند. به منظور تفکیک زنجیره DNA تازه سنتز شده از DNA پالسمیدی الگو شرایط برای واسرشتگی آن ها فراهم شد. با کاهش تدریجی دما اتصال مجدد رشتههای مکمل امکان پذیر شد. با استفاده از آنزیم DpnI رشته های والدی متیله شده هضم شدند. سپس ترانسفورم پالسمیدها به باکتری Ecoli DH5aX انجام شد و پالسمیدهای جهش یافته با برش با آنزیمهای محدودگر NdeI و PceI و تعیین توالی تایید شدند. یافتهها: آنزیم NdeI قادر به برش پالسمید های جهش یافته نبود. تعیین توالی نیز وجود جهش در جایگاه خاص را تایید کرد. در وکتور جهش یافته جایگاه برشی جدید نخستین آنزیم محدودگر که در سطح نوکلئوتیدی برش صاف ایجاد می کرد با جایگاه عملکردی فاکتور Xa در سطح آمینواسیدی یکسان شد. نتیجه گیری: این وکتور می تواند برای کلون سازی سریع و بیان اختصاصی انواع پپتیدهای کوتاه دست نخورده از جمله پپتیدهای ضد باکتریایی پپتیدهای ضد سلول های بنیادی سرطانی و ضد متاستاز و نیز بیان پروتیینهای دست نخورده استفاده شود. کلید واژه: وکتور شوک سرمایی پپتید های کوچک بیان نوترکیب جهش زایی مختص جایگاه گوارش/ دوره 20 شماره 3/ پاییز / چکیده زمینه و هدف: یکی از عواملی که در سیس تم ایمنی غیراختصاصی مشارکت نموده و نويسنده مسئول: : سعید لطیفی نوید اردبیل دانشگاه محقق اردبیلی دانشکده علوم بخش زیست شناسی گروه بیولوژی سلولی و مولکولی کد پستی: صندوق پستی: 179 تلفن و نمابر: پست الکترونیک : slatifin@yahoo.com تاریخ دریافت: 94/2/16 تاریخ اصالح نهایی: 94/5/15 تاریخ پذیرش: 94/5/16 مکانیس م دفاعی اصلی برای اکثر ارگانیس م های زنده در طی مراحل اولیه ی عفونت محس وب می گردن د پپتیدهای ضدمیکروبی می باش د.) 1-3 ( این پپتیدها از انواع مختلفی از موجودات زنده جداس ازی ش ده اند و دامنه عملکردی آن ها طیف وس یعی از موجودات نظیر باکتری قارچ ویروس و حتی سلولهای سرطانی را شامل میشود.) 2, 5( 4, طول این پپتیدها معموال کمتر از 50 آمینواس ید بوده و به طور تقریبی نیمی از این آمینواس یدهای تشکیل دهنده از نوع هیدروفوب میباشند. پپتیدهای ضدمیکروبی به دلیل داشتن اسیدآمینه های بازی زیاد دارای بار مثبت میباشند. این پپتیدها اساسا غشاهای میکروبی را مورد هدف قرار می دهند که مانع از توانایی میکروب ها به منظور توسعه مقاوت نسبت به آن ها میگردد. در نتیجه این پپتیدها به نظر 169

3 همکاران و نوید لطیفی شوند.) 6 ( محسوب جدید های آنتیبیوتیک برای مناسبی کاندیدای رسد می نفوذپذیری روی بر تأثیرگذاری فرایند که است شده داده نشان وجود این با توانایی بر مبتنی مشاهداتی و نبوده میکروبی عوامل بردن بین از راه تنها غشا صورت در سلولی دیواره اجزای و پروتیین نوکلئیک اس یدهای سنتز مهار مهار به قادر پپتیدها این بعالوه دارد. وجود هدف سلول داخل به پپتید انتقال میباشند.) 7 ( نیز ضروری آنزیمی های فعالیت به قادر ضدمیکروبی پپتیدهای ها میکروارگانیسم علیه فعالیت بر عالوه تولید یا تغییر بیان القای طریق از اکتسابی و ذاتی ایمنی سیستم میانجیگری رونویسی و آپوپتوز کموتاکسی پیشالتهابی های کموکاین و ها سیتوکاین التهابی های پاسخ مهار نتیجه در است ممکن تأثیرات این میباش ند. ژنی لنفوسیت و ها ائوزینوفیل نوتروفیلها ماکروفاژها فراخوانی و تکثیر تحریک از بخش ی ضدمیکروبی پپتیدهای اگرچه 8( 6, گی رد.) 4, صورت T ه ای های جایگزین و ها ارگانیسم از بسیاری ذاتی ایمنی سیستم دفاعی مکانیسم آن از استفاده شوند می محسوب عفونی های بیماری با مقابله برای ای بالقوه در یا تنهایی )به سرطان درمان در س رطانی ضد های پپتید عنوان تحت ها شود می محسوب جدیدی درمانی استراتژی متداول( داروهای سایر با ترکیب توصیفشده های فعالیت این تمامی باشد. می بررسی و تحقیق نیازمند که و دارو کش ف راس تای در جالب ابزاری عنوان به را ضدمیکروبی پپتیدهای و 10 ( میسازد.) 9 مطرح آن توسعه و کارآیی عملکردی مکانیسمهای نظیر بنیادین رویکردهای از تعدادی گیرند. قرار بررسی مورد بالینی فازهای به ورود از قبل میبایست آنها ایمنی آن عملکردی و ساختاری گسترده های مطالعه نیازمند ها پرسش این به پاسخ دسترس در میزان به بستگی نسبی طور به مطالعهها این پیشرفت میباشد. ها پپتید بودن دس ترس در میزان این بر عالوه دارد. خالص پپتیدهای ب ودن گسترده صورت به ها آن از استفاده کننده تعیین و اصلی فاکتورهای از یکی و ای پایه تحقیقات مورد دو هر بنابراین میباش د. آنتیبیوتیک عنوان تحت طریق از شده تولید و باال کیفی درجه با پپتیدهایی نیازمند بالینی کاربردهای جداسازی فرایند کلی طور به باشد. می اقتصادی لحاظ به سودمند روش یک بنابراین و بوده طوالنی و فرسا طاقت سخت فرایند یک طبیعی منابع طریق از شود نمی محسوب وسیع مقیاس در پپتید آوردن دست به برای کارآمد روشی فراهم توالی در تغییر با را جدید های پپتید طراحی امکان روش این بع الوه کارآمدی رغم علی شیمیایی طریق از پپتید سنتز دیگر طرف از نمیس ازد. روش این بنابراین میباشد.) 11 ( پرهزینهای و پیچیده فرایند یک باال بسیار فناوری خوشبختانه باشد. نمی مناسب وسیع مقیاس در پپتید تولید برای نیز واقع در باشد می پروتیین تولید برای سودمند روش ی یک نوترکیب DNA برای را موقعیت نوترکیب DNA فناوری در گسترده و وسیع های پیشرفت فناوری این سازد. می فراهم وسیع مقادیر در ضدمیکروبی پپتیدهای تولید به اختصاصی وکتورهای در را خارجی)بیگان ه( ژنهای کلونس ازی فرایند می پذیر امکان یوکاریوتی یا و پروکاریوتی میزبانی های سلول در بیان منظور زمان مدت نظر از دیگر روش دو به نس بت نوترکیب DNA فناوری س ازد. باشد.) 12 و 13 ( می صرفه به مقرون اقتصادی لحاظ به و بوده تر کوتاه مصرفی میکنند استفاده مختلف بیانی وکتورهای از ژنتیک مهندسی مطالعات در یافته افزایش بسیار آن از استفاده اخیر های سال در که وکتورها این جمله از ایجاد منظور به تحقیق این در که وکتوری میباش د. pcold وکتور اس ت آمینه اسید هیچگونه بدون درمانی های پپتید تمام بیان برای اختصاصی سازه دارای که چرا میباشد pcold I وکتور میگیرد قرار اس تفاده مورد اضافی می نظر مورد پپتید س ازی خالص و کنترل مناس ب بیان برای الزم عناصر آمینواسید هرگونه ورود ضدمیکروبی پپتیدهای کوتاه طول دلیل به باش د. نتیجه در و مناسب فولدینگ رفتن دست از به منجر ها آن ساختار در اضافی در متداول سازی کلون های روش بنابراین میگردد. عملکرد میزان کاهش امر این دلیل نیست. برخوردار باالیی کارآیی از ضدمیکروبی پپتیدهای بیان اثر در که باشد می شده بیان پپتید طول به آمینواسید چند یا یک شدن اضافه های محدودیت علت به DNA قطعه سازی کلون فرایند از ناشی مشکالت تأثیر و کرده تغییر پپتید اصلی فولدینگ اینرو از شود. می ایجاد برشی جایگاه به نیاز که زمانی دیگر طرف از میگذارد. آن عملکرد میزان کاهش در بسزایی اصلی آمینواسیدی توالی با نخورده( )دست بکر نوترکیب های پروتیین تولید برخوردار پایین کارایی از متداول های وکتور اس ت اضافی آمینواسید بدون ایجاد منظور به جدید اس تراتژیهای طراحی نیازمند نتیجه در میباش ند. نماید. بیان را نظر مورد توالی تنها که باشیم می سازهای یکی نمودیم. استفاده جایگاه مختص زایی جهش روش از تحقیق این در DNA توالیهای تولید منظ ور به پروتیین مهندس ی در که روشهایی از رود می کار ب ه ش دگی حذف یا و دخول جهشیافته های ک دون دارای از فرایند این در جهش رخ داد میباش د. جایگاه مختص جهشزایی فرایند ناحیه در ناجور نوکلئوتیدهای محتوی پرایمرهای با PCR واکنش یک طریق است ممکن پرایمر-پرایمر اتصال روش این در گیرد. می صورت آنها میانی جلوگیری منظور به آورد. عمل به ممانعت جهشیافته cdna کلونسازی از هر آن در که نمودیم استفاده را جایگزینی روش تحقیق این در مشکل این از یکدیگر از مجزا صورت به و جداگانه PCR واکنش یک در پرایمر دو از کدام شدند. گرفته کار به از اس تفاده با pcold I وکتور س اختمان تغییر مطالعه این از ه دف ژن هر دار جهت س ازی کلون منظور به جایگاه مختص زایی جهش روش -دست بکر های پروتیین و کوچک پپتیدهای س ازی خالص و بیان و هدف اضافی آمینواسید گونه هیچ بدون اصلی آمینواسیدی توالی )دارای نخورده- میباشد. آمینی( انتهای در بررسی: روش pcold وکتور های ویژگی پایین حرارت درجه در pcold سرما ش وک تحت بیانی وکتورهای باشند. می محلول صورت به نوترکیب های پروتیین حداکثری بیان به قادر هک ش دهاند طراحی بهگونهای وکتورها این موثر و کارآمد بیان منظور ب ه پاییز 3/ شماره 20/ دوره گوارش/

4 وکتور pcold I-LZ برای بیان پپتیدها و پروتیین های نوترکیب از یک پروموتر مش تق ش ده از ژن CSPA )یکی از ژنهای تحت ش وک سرمایی( اس تفاده می نمایند. در پایین دست پروموتر cspa اپراتور lac قرار دارد که باعث میش ود بیان به طور دقیق و کنترل شده صورت گیرد. ع الوه بر آن ها ناحیه 5 غیر ترجمهش ونده یا UTR 5 عناصر افزاینده ترجمه) TEE ( توالیHis_tag جایگاه برشی فاکتور Xa و جایگاه کلون س ازی چندگانه وجود دارد که در پایین دست پروموتر cspa قرار گرفته اند. به دلیل اینکه این وکتور پروموتر مش تق شده از E.coli را به کار می گیرد بس یاری از ردههای E.coli میتوانند به عنوان میزبان بیانی به کار گرفته شوند. آرایش 4 نوع وکتور pcold بسیار متنوع میباشد و در حضور ی ا عدم حضور TEE توال ی His tag و جایگاه ب رش فاکتور Xa با هم تفاوت دارند. نوع یک pcold دارای هر 3 مورد می باشد)شکل 1(. طراحی اس تراتژی تغیی ر وکتور با تحلیل س اختاری و عملکردی وکتور pcold نوع 1 در س اختار وکتور 2 بخش به نام فاکتور Xa و His_tag وجود دارد. وجود His_tag که از 6 اسیدآمینه هیستیدین تشکیل شده است منجر به جداسازی پپتید مذکور از بقیه عوامل در یک ستون کروماتوگرافی می شود که دیواره آن آغشته به نیکل می باشد. بعد از اینکه پپتید متصل به His_ tag از بقیه جدا ش د نیازمند جداسازی پپتید ازHis_tag نیز میباشیم چرا که هدف تنها خالصس ازی پپتید می باش د. این فرایند توسط فاکتور Xa ص ورت می گیرد به عبارت دیگر این فاکت ور بعد از His_tag و قبل از MCS قرار گرفته اس ت. جایگاه برش ترجیحی فاکتور Xa توالی Ile Glu Gly Arg اس ت و این فاکتور درس ت بعد از Arg را مورد برش قرار میدهد. در س طح نوکلئوتیدی اگر بعد از برش جایگاه MCS )صرف نظر از صاف یا چسبنده بودن آن( یک یا دو نوکلئوتید به ابتدای توالی کدکننده پپتید اضافه ش ود احتمال آن وجود دارد که ترتیب خوانده شدن توالی به ه م بریزد. اگر هم جایگاه برش به گونه ای انتخاب ش ود که 3 نوکلئوتید یا مضربی از آن به ابتدای پپتید اضافه ش ود در نتیجه یک اس یدآمینه یا شکل 1: آرایش 4 نوع وکتور.pCold این وکتورها به لحاظ حضور یا عدم حضور TEE توالی His tag و جایگاه برش فاکتور Xa با هم تفاوت دارند. نوع یک pcold همه عناصر را دارد. 171

5 لطیفی نوید و همکاران شکل 2: نقشه وکتور.pCold I توالیHis_tag جایگاه برشی فاکتور Xa و جایگاه کلون سازی چندگانه که در پایین دست پروموتر cspa واقع شده اند در نقشه نشان داده شده است. بیشتر به ساختار پپتید اضافه می شود. این فرایند منجر به تغییر فولدینگ و عملکرد آن می شود. برای حل این مشکل جایگاه برشی آنزیم محدودگر به گونه ای طراحی شد که همانند فاکتور Xa منتها در سطح نوکلئوتیدی درس ت بعد از توالیAGG که متعلق به اس یدآمینه آرژینین میباشد را برش دهد)ش کل 2(. در وکتور تغییر یافته جایگاه برش ی جدید نخستین آنزیم محدودگر که در ناحیه MCS در سطح نوکلئوتیدی برش صاف ایجاد می کند با جایگاه عملکردی فاکتور Xa در سطح آمینواسیدی یکسان شد. با این راهکار مشکل اسیدآمینه اضافی در ابتدای پپتید برطرف شده و توالی پپتید مورد نظر درست بعد از جایگاه اثر فاکتور Xa قرار گرفت. از طرفی در زمان بیان پپتید باید یک کدون پایان درست بعد از توالی پپتید مورد نظر قرار گیرد تا بدین طریق مشکل انتها نیز برطرف گردد. جهش زایی مختص جایگاه استخراج پالسمید pcold I از باکتری اشریشیاکلی DH5α با استفاده از کیت استخراج پالسمید با درجهی خلوص باال Diagnostics,( Roche )Mannheim, Germany ص ورت گرفت )ش کل 3(. برای انجام فرایند جهشزایی مختص جایگاه جفت پرایمرهای SDM-F1 `5-CATATCGAAGGTAGGCCTATGGAGCTCGGTACC-3` و SDM-R1 `5-GGTACCGAGCTCCATAGGCCTACCTTCGATATG-3` با اس تفاده از نرم افزار الیگو )7.v )Oligo Primer Analysis Software طراحی ش دند. توالی ه ای پرایمرها مکمل یکدیگر بودن د. طول توالی تغییرنیافته در دو س مت ناحیه م ورد نظر )دارای جهش( 16 نوکلئوتید بود. ب از تغییریافته در بخش مرکزی هر دو پرایمر قرار گرفته بود. آغاز و خاتم ه پرایمر حداقل در یک G ی ا C بود. محتوای GC پرایمر طراحی ش ده %54/5 درصد بود. دو باز C وG مش خص ش ده در توالی پرایمر م وارد تغییریافته جه ت القای تغییرات مورد نظ ر در توالی اولیه وکتور بودن د. مرحله بع د انجام واکنش PCR با یک پرایم ر منفرد به منظور تحقق فرایند جهش زایی مختص جایگاه می باشد. تکثیر پالسمید اصلی در دو واکنش PCR مجزا انجام ش د. در واکن ش اول تنها پرایمر رفتی )forward( و در واکن ش دوم تنها پرایمر برگش تی )reverse( وجود داش ت. اجزای واکنش PCR ش امل 2/5 میکرولیتر باف ر 3 میکرولیتر DNA پالسمیدی الگو 5 میکرولیتر پرایمر 10 پیکوموالر 4 میکرولیتر MgCl2 4 میکرولیت ر dntps 5/0 میکرولیت ر Pfu پلیم راز و 6 میکرولیت ر آب دیونیزه بود )حجم نهای ی 25 میکرولیتر(. برنامه PCR تعریف ش ده برای دس تگاه ترموسایکلر ش امل 2 دقیقه در 94 C و 30 چرخه: 40 ثانیه در C ثانیه در 55 C و 5 دقیقه در 68 C و در آخر 1 ساعت در 68 C بود. در این مرحله دو محصول PCR ایجاد شده با تک-پرایمر رفتی یا برگشتی )شکل 4( با یکدیگر و در یک میکروتیوب مخلوط ش دند. به منظور تفکیک رش ته DNA تازه سنتزشده از رشته DNA پالس میدی الگو ش رایط برای واسرش تگی آن ها فراهم شد. با کاه ش تدریجی دما اتصال مجدد رش تههای مکمل امکان پذیر ش د. شیب دمایی استفاده شده در این تحقیق در جدول 1 آورده شده است. به منظور جداسازی پالس میدهای جهش یافته از پالسمید اولیه موجود در محیط از آنزیم DpnI استفاده شد. این آنزیم توانایی برش پالسمیدهای متیله غیرجهشیافته را داش ت. پالسمیدهای اس تخراج شده از باکتری 172

6 نوترکیب های پروتیین و پپتیدها بیان برای pcold I-LZ وکتور دمایی شیب 1: جدول مرحله گراد( سانتی )درجه دما زمان)دقیقه( / / / / Holding 37 8 %1 آگارز ژل در pcold I وکتور 3: شکل یافته جهش پالسمیدهای حاوی صحیح های کلنی شناسایی کشت یافته جهش وکتور حاوی صحیح های کلنی شناسایی منظور به و شد انجام آمپیس یلین آنتیبیوتیک حاوی مایع LB محیط در ها کلنی پالسمید در شده ایجاد تغییر تایید برای ش د. استخراج پالس مید سپس برای شد. انجام PceI و NdeI محدودگر های آنزیم با برش یافته جهش استفاده با برگشتی و رفتی پرایمر دو هر با توالی تعیین واکنش از نهایی تایید ABI3700XL DNA توالی تعیین دستگاه طریق از و BigDye فناوی از شد. استفاده Applied Biosystems پالس مید تکثیر از حاصل PCR محصوالت 4: ش کل به 2(. )واکنش برگش تی یا 1( )واکنش رفتی پرایمر ب ا می صورت پرایمر ی ک با PCR واکنش ک ه این دلیل الکتروفورز ژل روی ب ر آن بارگذاری هنگام به گی رد پالسمیدی DNA مختلف های کنفورماسیون خاطر به مختلف جایگاه های در متعدد های باند ای رشته تک شود. می ایجاد %1 آگارز ژل روی بر طراحی پرایمرهای ب ا PCR واکنش از که محصوالت ی اما بوده متیل ه منجر امر این نتیجه در باشند. می متیل گروه فاقد شوند می ایجاد شده ترانس فورم آخر مرحله در گردید. مذکور آنزی م اختصاصی عملکرد ب ه انجام DH5α نوع از E.coli باکتری مس تعد های سلول به پالس میدها SOB (Super جامد کشت محیط به آن انتقال از پس و 5( )شکل ش د به ها پلیت )Optimal Broth; Merck, Frankfurt, Germany رشد کلنیهای از شدند. گرمخانهگذاری 37 C دمای در ساعت 24 مدت هر گردید. انتخاب بیشتر های بررسی جهت و تصادفی طور به مورد 5 کرده Luria Bertani Broth;( برتانی لوریا مایع محیط یک در ها آن از کدام س یلین آمپی آنتیبیوتیک حاوی )Merck, Frankfurt, Germany گردید. استخراج ها آن پالسمید و شد داده کشت ها: یافته آنزیم pcold I وکتور MCS جایگاه در موجود محدودگر آنزیم نخستین شناسایی مورد توالی جایگاه مختص جهشزایی واکنش طی در بود. NdeI آنزیم این توسط دیگر که یافت تغییر ای گونه به )CATATG( آنزیم این یافت. تغییر CCTATG توالی به فوق توالی واقع در نشد. داده تش خیص وجود pcold I وکت ور در AGG توالی CCTATG توالی باالدس ت کرده شناس ایی را AGGCCT جدید توالی PceI آنزیم رو ای ن از دارد. Xa فاکتور عملکردی جایگاه کرد. ایجاد AGG توالی از بعد صاف ب رش و AGG توسط شده کد آرژنین از بعد درس ت آمینواسیدی س طح در نیز تغییر pcold I پالسمید برش از حاصل نتایج اس اس این بر باش د. می برش اثر در آمده دس ت به نتایج از متفاوت PceI و NdeI آنزیم با نیافته 6(. )ش کل بود جداگانه صورت به آنزیم دو این با یافت ه جهش پالس مید است( شده تغییر دچار )که یک ش ماره کلنی از شده استخراج پالس مید نداشت تاثیری آن روی بر NdeI آنزیم اما )M( ش د بریده PceI آنزیم با آنزیم با تغییرنیافته pcold I پالسمید برش که است حالی در این )K(. )H,I( نداشت تاثیری آن روی بر PceI آنزیم اما )G( گرفت صورت NdeI 6(. )شکل کلنیهای از شده اس تخراج پالس میدهای برای آنزیمی برش واکنش شده تغییر دچار نظر مورد جایگاه در وکتور 7(. )شکل شد انجام نیز مختلف 1394 پاییز 3/ شماره 20/ دوره گوارش/ 173

7 لطیفی نوید و همکاران ش کل 7: واکن ش برش آنزیم ی برای پالس میدهای اس تخراج ش ده از کلنی ه ای مختلف. 1.پالس مید ش اهد اصلی 2 و 3. برش ش اهد اصلی با NdeI 4. برش ش اهد اصلی با PceI 5. پالس مید استخراج شده از کلنی شماره 6. 2 برش پالسمید استخراج شده از کلنی شماره 2 با NdeI 7. برش پالس مید استخراج شده از کلنی شماره 2 با PceI 8. پالسمید استخراج شده از کلنی شماره 9. 3 برش پالسمید استخراج شده از کلنی شماره 3 با NdeI 10. برش پالسمید اس تخراج ش ده از کلنی ش ماره 3 با PceI 11. پالسمید استخراج ش ده از کلنی شماره برش پالسمید استخراج شده از کلنی 4 با NdeI 13. برش پالسمید استخراج شده از کلنی 4 با PceI 14. پالسمید استخراج شده از کلنی شماره برش پالسمید استخراج شده از کلنی شماره 2 با PceI 16. برش پالسمید استخراج شده از کلنی شماره 5 با NdeI بود به طوریکه آنزیم NdeI دیگر قادر به برش این وکتورهای تغییریافته نب ود. نتیج ه تعیی ن توال ی پالس مید ه ای ا شکل 5: مراحل انجام جهش زایی مختص جایگاه )16( شکل 8: کروماتوگرام حاصل از توالی یابی پالسمید های تغییر یافته با پرایمرهای عمومی وکتور. باز تغییر یافته با فلش نشان داده شده است. استخراج شده از کلنی های تغییر یافته نیز وجود جهش در جایگاه خاص را تایید کرد )ش کل 8(. در وکتور جهش یافته جایگاه برشی جدید نخستین آنزی م محدودگر که در س طح نوکلئوتیدی برش صاف ایج اد می کرد با جایگاه عملکردی فاکتور Xa در سطح آمینواسیدی یکسان شد. ش کل 6: بارگذاری پالس میدهای استخراج ش ده از 5 کلنی و انجام ب رش آنزیمی. A. پالس مید اس تخراج ش ده از کلنی ش ماره 2 B. پالس مید اس تخراج شده از کلنی ش ماره 3.C پالس مید استخراج ش ده از کلنی ش ماره 4 D. پالسمید استخراج ش ده از کلنی شماره G. پالسمید شاهد اصلی F.. شده پالسمید شاهد ترانس فورم E. 5 برش شاهد ترانس فورم ش ده با.NdeI H,I برش شاهد ترانسفورم با.PceI K برش پالس مید استخراج ش ده از کلنی شماره 1 با آنزیم.NdeI M برش پالس مید اس تخراج شده از کلنی ش ماره 1 با آنزیم.PceI. N پالس مید استخراج ش ده از کلنی شماره 1 به عنوان شاهد. پالسمیدهای بریده شده به شکل یک باند منفرد بین دو باند پالسمید اصلی دیده می شوند. بحث: در این مطالعه وکتور جهش یافته pcold I-LZ با اس تفاده از روش جه ش زایی مختص جایگاه بدس ت آمد که می تواند برای کلون س ازی سریع و جهت دار هر ژن هدف و بیان و خالص سازی پپتیدهای کوچک و پروتیین های بکر -دس ت نخورده- )دارای توالی آمینواسیدی اصلی بدون هیچ گونه آمینواس ید اضاف ی در انتهای آمین ی( از جمله پپتیدهای ضد 174

8 وکتور pcold I-LZ برای بیان پپتیدها و پروتیین های نوترکیب میکروبی و پپتیدهای ضد آنژیوژنز ضد س لول های بنیادی سرطانی و ضد سلول های متاستازی استفاده شود. طراحی مکانیس می در راستای تغییر وکتور pcold I به گونه ای که توانایی بیان مستقیم و بدون هیچ گونه اسیدآمینه ی اضافی را دارا باشد از اهداف این تحقیق بود. از آن جایی که هدف تغییر در جایگاه برش ی آنزیم NdeI بود روند طراحی پرایمر می بایست بهگونهای صورت می گرفت که باز تغییریافته در این ناحیه قرار گیرد. دو باز C وG نش ان داده ش ده در توالی پرایمر موارد تغییریافته جهت القای تغییرات مورد نظر در توالی اولیه وکتور می باشند. این تغییر در دومین باز از جایگاه شناسایی آنزیم NdeI صورت می گیرد. ب ه منظور ایجاد این تغییر از طریق جهش زایی مختص جایگاه ما با دو مش کل اصلی مواجه بودیم. مورد نخس ت از آن جایی که ه دف تغییر یک جفت باز مکمل واقع در هر دو رش ته وکتور pcold I بود بنابراین فرایند طراحی هر دو نوع پرایمر می بایس ت برای یک ناحیه مش خصی از وکتور صورت می گرفت. همین عام ل زمینه را برای مکمل بودن توالی های پرایمرهای طراحی ش ده و تش کیل دایمر پرایمر- پرایمر فراهم می نماید که این امر منجر به کاهش ش دید بازده در فرایند PCR و در ایجاد تغییر در وکتور میگردد. اس تراتژی طراحی شده برای رفع این مش کل انجام واکنش PCR با هرکدام از پرایمرهای رفتی و برگشتی و به ص ورت جداگانه بود. در واقع تکثیر پالس مید اصلی در دو واکنش PCR مجزا بهگونه ای انجام شد که یا پرایمر رفتی در سیستم واکنش وجود داشته باش د یا این که واکنش تنها از طریق یک پرایمر برگش تی صورت گیرد. مشکل دومی که در راستای ایجاد این تغییر در وکتور pcold I ایجاد شد بحث جداسازی وکتور تغییریافته به لحاظ نوکلئوتیدی از وکتور تغییرنیافته بود. از آن جایی که روند استراتژی طراحی شده به گونهای بود که منجر به تغییر در جایگاه کلون سازی چندگانه و نه در ژن مقاومت به آنتی بیوتیک می گردید بنابراین امکان استفاده از روش های متداول مبتنی بر حساسیت نس بت به آنتی بیوتیک به منظور تمایز و تفکیک بین وکتور تغییر یافته و فاقد تغییر وجود نداش ت. به عبارت دیگر هر دو نوع وکتور ایجاد شده بعد از انجام فرایند PCR قابلیت رش د در محیط حاوی آنتیبیوتیک را برای میزب ان خود فراهم می نمودند. در این مرحله برای غلبه بر این مش کل از آنزیم DpnI اس تفاده نمودیم. این آنزیم توانایی برش پالسمیدهای متیله غیرجهشیافته را دارا می باش د. از ط رف دیگر توجه به این نکته ضروری اس ت که پالسمیدهای استخراج شده از باکتری متیله بوده اما محصوالتی که از واکنش PCR با پرایمرهای طراحی شده ایجاد می شوند فاقد گروه متیل می باشند. در نتیجه این امر منجر به عملکرد اختصاصی آنزیم مذکور میگردد. تستی که برای تأیید اولیه ایجاد تغییر مورد نظر در وکتور بعد از ترانس فورم به باکتری و اس تخراج مجدد آن طراحی شد استفاده از هضم آنزیم ی با NdeI و PceI ب ود. در صورت ایجاد تغییر آنزیم PceI دارای توانایی برش پالسمید تغییر یافته بود در حالی که امکان هضم آنزیمی برای آنزیم NdeI در پالسمید تغییریافته وجود نداشت. پپتیده ای ض د باکتریایی و ضد س رطانی به عن وان عوامل درمانی بیولوژیک نس ل آینده م ورد توجه ب وده و دارای توانایی باال در میانکنش اختصاصی با اهداف بیولوژیک و اثرات جانبی نسبتا پایین می باشند. تجارت داروهای بر پایه پپتید-پروتیین در حدود 40 بیلیون دالر در سال می باشد ک ه حدود %10 تجارت قانونی دارو را دربرمی گیرد. تجارت این دس ته از داروها بس یار س ریعتر از موارد دیگر در حال گس ترش می باشد. در سال های اخیر توسعه پپتیدهای ضد میکروبی یا ضد آنژیوژنز )مانند آنژینکس( و متاستاز و س رطان معده و نیز نانوساختار های پپتیدی که قدرت ترمیم و بازس ازی بافت ها و اندام ها را دارند بس یار مورد توجه بوده و برخی در مراحل آزمایشگاهی بوده و برخی دیگر نیز در مرحله کارآزمایی های بالینی می باشند.) 14 ( از اینرو PEPTIDE NANOMEDICINE در سال های اخیر مطرح ش ده و آینده روشنی برای آن پیش بینی می شود. بیان نوترکیب این نانوساختارها می تواند امکان استفاده از آن ها را برای درمان بیماران فراهم کند. بس یاری از مولکول های آنتی آنژیوژنیک گزارش شده دارای ماهیت پپتیدی می باشند. تعدادی از این پپتیدها به گونه ای تکامل یافته اند که منجر به مهار عملکرد گیرنده های بیان ش ده بر روی س لول های اندوتلیال آنژیوژنیک میگردند. از جمله موارد بسیار موفق در این دسته می توان به پپتیدهای مهارکننده مولکول های چسبندگی به ویژه اینتگرین اش اره نمود. نمون ه ای از این پپتیدهای مهارکنن ده عملکرد تحت عنوان آنژینکس )Anginex( نام دارد که مانع از تکثیر اتصال و مهاجرت شده و منجر به القای آپوپتوز سلول های اندوتلیال عروقی در محیط in vitro و مهار آنژیوژنز در محیط in vivo می گردد. پپتید های ضد سرطانی به ویژه پپتیدهای ضد آنژیوژنز به نظر میرسد جزء استراتژی های درمانی جدید در س ال های آینده محسوب میشوند بطوریکه طراحی پپتیدهایی با پایداری زیاد و بیان تحت وکتوری آن ها چش م انداز روش نی در حیطه ی درمان بیماری سرطان فراهم می آورد.) 15 ( نتیجه گیری: در این مطالعه با اس تفاده از روش جهش زایی مختص جایگاه وکتور جهش یافته pcold I-LZ با قابلیت کلون سازی سریع و جهت دار هر ژن هدف و بیان و خالص سازی پپتیدهای کوچک و پروتیین های بکر -دست نخورده- به دس ت آمد. اس تفاده از هضم آنزیمی با دو آنزیم مختلف و در نهایت توالی یابی مراحلی بودند که در راس تای تأیید نتایج و شکل گیری تغییر در نوکلئوتید مورد نظر انجام ش دند. بیان تحت وکتوری پپتیدهایی با اثرات ضد میکروبی ضد آنژیوژنز ضد سلول های بنیادی سرطانی و ضد س لول های متاستازی تأیید شده از طریق وکتور جهش یافته )سنتز شده در این تحقیق( ش رایط را برای گس ترش کاربردهای بالینی آن ها فراهم می سازد. 175

9 لطیفی نوید و همکاران REFERENCES 1. Bowdish DM, Davidson DJ, Hancock RE. A re-evaluation of the role of host defence peptides in mammalian immunity. Curr Protein Pept Sci 2005;6: Hoskin DW, Ramamoorthy A. Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta 2008;1778: Shai Y. Mode of action of membrane active antimicrobial peptides. Biopolymers 2002;66: Silva ON, Mulder KC, Barbosa AE, Otero-Gonzalez AJ, Lopez- Abarrategui C, Rezende TM, et al. Exploring the pharmacological potential of promiscuous host-defense peptides: from natural screenings to biotechnological applications. Front Microbiol 2011;2: Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 2002;415: Hancock RE, Sahl HG. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nat Biotechnol 2006;24: Nguyen LT, Haney EF, Vogel HJ. The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action. Trends Biotechnol 2011;29: Nijnik A, Hancock R. Host defence peptides: antimicrobial and immunomodulatory activity and potential applications for tackling antibiotic-resistant infections. Emerg Health Threats J 2009;2:e1. 9. Suttmann H, Retz M, Paulsen F, Harder J, Zwergel U, Kamradt J, et al. Antimicrobial peptides of the Cecropin-family show potent antitumor activity against bladder cancer cells. BMC Urol 2008;8: Gaspar D, Veiga AS, Castanho MA. From antimicrobial to anticancer peptides. A review. Front Microbiol 2013;4: Andersson L, Blomberg L, Flegel M, Lepsa L, Nilsson B, Verlander M. Large-scale synthesis of peptides. Biopolymers 2000;55: Rao X, Hu J, Li S, Jin X, Zhang C, Cong Y, et al. Design and expression of peptide antibiotic hpab-beta as tandem multimers in Escherichia coli. Peptides 2005;26: Xu X, Jin F, Yu X, Ji S, Wang J, Cheng H, et al. Expression and purification of a recombinant antibacterial peptide, cecropin, from Escherichia coli. Protein Expr Purif 2007;53: Craik DJ, Fairlie DP, Liras S, Price D. The future of peptidebased drugs. Chem Biol Drug Des 2013;81: Wang JB, Wang MD, Li EX, Dong DF. Advances and prospects of anginex as a promising anti-angiogenesis and anti-tumor agent. Peptides 2012;38: Edelheit O, Hanukoglu A, Hanukoglu I. Simple and efficient sitedirected mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnol 2009;9: