Elucigene CF Poly-T Οδηγίες χρήσης

Transcript

1 Elucigene CF Poly-T Οδηγίες χρήσης Κωδικός καταλόγου: PT003B2 50 εξετάσεις Για in vitro διαγνωστική χρήση Κατασκευάζεται από την: Για πωλήσεις, εξυπηρέτηση πελατών και τεχνική υποστήριξη: Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics (UK) Limited, a company registered in England and Wales, registration number PT003BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 1 από 14

2 Elucigene CF Poly-T Χρήση για την οποία προορίζεται Για την ταυτόχρονη ποιοτική ανίχνευση in vitro των αλληλόμορφων θέσης ματίσματος 5T, 7T και 9T της πολυθυμιδίνηςστο ιντρόνιο 8 του ανθρώπινου γονιδίου του ρυθμιστή διαμεμβρανικής αγωγιγόμητας της κυστικής ίνωσης (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, CFTR). Η εξέταση παρέχει γονοτυπική πληροφορία για τα αλληλόμορφα 5T, 7T και 9T σε DNA που εκχυλίζεται από δείγματα ανθρώπινου ολικού αίματος και στοματικού εκπλύματος. Σύνοψη και επεξήγηση Το τμήμα πολυθυμιδίνης (Poly-T) είναι μια αλληλουχία βάσεων θυμιδίνης που βρίσκονται στο ιντρόνιο 8 του γονιδίου της CFTR και σχετίζεται με ανωμαλίες που περιλαμβάνονται στην CFTR ανάλογα με το μέγεθός της. Τα τρία συνήθη παραλλάγματα του τμήματος poly T είναι τα 5T, 7T, και 9T. Τόσο το 7T όσο και το 9T θεωρούνται πολυμορφικά παραλλάγματα ενώ το 5T θεωρείται μετάλλαξη ποικίλης διεισδυτικότητας. Το παράλλαγμα 5T θεωρείται ότι μειώνει την αποτελεσματικότηταματίσματος του ιντρονίου 8. Η εξέταση της Poly-T είναι κατάλληλη ως αυτόματος έλεγχος (reflex test) στις περιπτώσεις που ανιχνεύεται μετάλλαξη R117H ή σε περιπτώσεις που άρρεν ενήλικας ελέγχεται για αμφοτερόπλευρη έλλειψη σπερματικού πόρου (Congenital Bilateral Absence of the Vas Deferens, CBAVD). Οι διάφοροι γονότυποι του γονιδίου CFTR (ρυθμιστή διαμεμβρανικής αγωγιγόμητας της κυστικής ίνωσης) είναι δυνατόν να οδηγήσουν στην ανάπτυξη κυστικής ίνωσης με διάφορους βαθμούς σοβαρότητας. Διακυμάνσεις που παρατηρήθηκαν στο μήκος του τμήματος πολυθυμιδίνης (Poly-T) στο ιντρόνιο 8 έχουν συνδεθεί με ποικίλη αποτελεσματικότητα ματίσματος του εξονίου και με τις επακόλουθες διαφορές στη φαινοτυπική έκφραση της νόσου (1). Ιδιαίτερης σημασίας θεωρείται ο ρόλος του τμήματος Poly-T στην ανδρική υπογονιμότητα λόγω αμφοτερόπλευρης έλλειψης σπερματικού πόρου (CBAVD). Συσχέτιση μεταξύ γονότυπων Poly- T και της CBAVD έχει καταδειχθεί σε φορείς CF αλλά ακόμη και επί απουσίας γνωστών μεταλλάξεων CF (2). Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός της κατάστασης της Poly-T είναι σημαντικός σε περιπτώσεις υπογονιμότητας όταν υπάρχει υποψία CBAVD. Αν ένα άτομο έχει τη μετάλλαξη R117H, συνιστάται αυτόματος έλεγχος (reflex testing) για ύπαρξη παραλλαγμάτων 5T/7T/9T. Αν το άτομο έχει το αλληλόμορφο 5T, συνιστάται η διεξαγωγή ελέγχου σε επίπεδο οικογένειας προκειμένου να προσδιοριστεί αν το αλληλόμορφο 5T είναι σε ομόπλευρη ή ετερόπλευρη διάταξη με το αλληλόμορφο R117H. Η σοβαρότητα της πνευμονικής νόσου σε άτομα με μία ή δύο μεταλλάξεις R117H εξαρτάται από την παρουσία παραλλαγής του τμήματος poly T στο ιντρόνιο 8 (3). Άτομα με μετάλλαξη που προκαλεί CFTR συν το παράλλαγμα 5T σε ομόπλευρη διάταξη με τη μετάλλαξη R117H συνήθως παρουσιάζουν την πνευμονική εκδήλωση της κυστικής ίνωσης, αλλά τα άτομα με R117H και το παράλλαγμα 7T ή το παράλλαγμα 9T παρουσιάζουν φαινότυπο που ποικίλει έντονα και μπορεί να κυμαίνεται από καθόλου συμπτώματα μέχρι ήπια πνευμονική νόσο (1)(4). PT003BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 2 από 14

3 Αρχές της διαδικασίας Η μέθοδος που χρησιμοποιείται από το κιτ δοκιμασίας Elucigene CF Poly-T βασίζεται στο σύστημα ανίχνευσης μεταλλάξεων ανθεκτικών στην ενίσχυση (AmplificationRefractory Mutation System, ARMS), μια τεχνολογία ενίσχυσης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) για συγκεκριμένα αλληλόμορφα, η οποία μπορεί να ανιχνεύει σημειακές μεταλλάξεις ή μικρές διαγραφές στο δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA)(5). Η αρχή του συστήματοςarms είναι ότι τα ολιγονουκλεοτίδιαμε παράταιρο κατάλοιπο 3 δεν θα λειτουργήσουν ως εκκινητές αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) υπό δεδομένες συνθήκες. Η προσεκτικήεπιλογή και σχεδιασμός κατάλληλων εκκινητών ολιγονουκλεοτιδίων επιτρέπει την ενίσχυση και ανίχνευση συγκεκριμένων μεταλλαγμένων ή φυσιολογικών αλληλουχιών DNA. Η εξέταση περιλαμβάνει ένα μίγμα αντίδρασης το οποίο περιλαμβάνει εκκινητές που ενισχύουν ειδικάαλληλουχίες DNA παραλλαγμάτων είτεπολυθυμιδίνης, είτε 5T είτε 7T ή9τ. Το μίγμα αντίδρασης περιλαμβάνει επίσης εκκινητές οι οποίοι ενισχύουν μη πολυθυμιδινικές αλληλουχίες DNA ως εσωτερικός έλεγχος ενίσχυσης για να επιβεβαιωθεί η επιτυχής ενίσχυση. Τα ενισχυμένα προϊόντα (amplicon) της PCR διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση σε γέληαγαρόζης και η παρουσία ή απουσία ζωνών στη γέλη υποδεικνύει αν η CF Poly-Tείναι 5T, 7T ή 9T. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις 1. Ο μάρτυρας DNA που παρέχεται σε αυτό το κιτ είναι ανθρώπινης προέλευσης και έχει εξεταστεί ξεχωριστά χρησιμοποιώντας μέθοδο που βασίζεται σε PCR και έχει διαπιστωθεί αρνητικός για τους ιούς της ηπατίτιδας Β (HBV), της ηπατίτιδας C (HBC) και για τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας 1 (HlV 1). 2. Θα πρέπει να προσέχετε κατά τον χειρισμό υλικού ανθρώπινης προέλευσης. Όλα τα δείγματα θα πρέπει να θεωρούνται δυνητικά μολυσματικά. Καμία μέθοδος εξέτασης δεν μπορεί να διασφαλίσει απόλυτα ότι απουσιάζουν οι ιοί HBV, HCV, HIV 1 ή άλλοι μολυσματικοί παράγοντες. 3. Ο χειρισμός των δειγμάτων και των συστατικών της εξέτασης, η χρήση τους, η φύλαξη και η απόρριψή τους θα πρέπει να γίνονται σύμφωνα με τις διαδικασίες που ορίζει η ανάλογη εθνική κατευθυντήρια οδηγία ή κανονισμός ασφαλείας για βιολογικούς κινδύνους. 4. Σύμφωνα με την τρέχουσα ορθή εργαστηριακή πρακτική, τα εργαστήρια θα πρέπει να αναλύουν τα δικά τους δείγματα εσωτερικού ποιοτικού ελέγχου γνωστού γονότυπου σε κάθε προσδιορισμό, ούτως ώστε να μπορεί αξιολογηθεί η εγκυρότητα της διαδικασίας. 5. Εάν το κουτί του κιτ έχει υποστεί ζημιά, ενδέχεται να έχει προκληθεί ζημιά στο περιεχόμενο. Μη χρησιμοποιήσετε το κιτ, επικοινωνήστε με το τμήμα εξυπηρέτησης πελατών. PT003BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 3 από 14

4 Σύμβολα που χρησιμοποιούνται στις ετικέτες Τα σύμβολα που χρησιμοποιούνται σε όλες τις ετικέτες και τις συσκευασίες συμμορφώνονται με το εναρμονισμένο πρότυπο ISO15223 Παρασκευαστής Αριθμός εξετάσεων Δείτε τις οδηγίες χρήσης X C Φυλάσσετε σε θερμοκρασία χαμηλότερη από τηναναγραφόμενη Χρησιμοποιείτε πριν από την αναγραφόμενη ημερομηνία Κωδικός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Ιατροτεχνολογικό προϊόν για in vitro διαγνωστική χρήση PT003BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 4 από 14

5 Υλικά που παρέχονται Τα αντιδραστήρια θα πρέπει να φυλάσσονται σε περιοχή που δεν περιέχει μολυσματικό DNA ή προϊόν PCR. Όλα τα αντιδραστήρια παρέχονται έτοιμα για χρήση. Φυλάσσετε τα μη ανοιγμένα και τα ανοιγμένα αντιδραστήρια σε θερμοκρασία -20 C. Τα ανοιγμένα αντιδραστήρια μπορούν να φυλαχθούν επί έως και 3 μήνες. Παρέχονται επαρκή υλικά για 50 εξετάσεις: 1. 2 φιαλίδια μίγματος εκκινητή A (TA) , που περιέχουν εκκινητές ειδικούς για ενίσχυση των αλληλόμορφων 5T, 7T και 9T στο ιντρόνιο 8 του γονιδίου CFTR, μάρτυρες εκκινητές και τριφοσφωρικό δεοξυνουκλεοτίδιο σε ρυθμιστικό διάλυμα (2 x 450 l) φιαλίδιο x 40 l AmpliTaq Gold (AG) φιαλίδιο x 200 l ρυθμιστικού διαλύματος (DB) φιαλίδιο x 600 l χρωστικής φόρτωσης (LD) φιαλίδιο x 50 l DNA μάρτυρα (DC) , που περιέχει ανθρώπινο DNA γονότυπου 7T/9T. Απαιτούμενα υλικά που δεν παρέχονται Εργαστηριακά αναλώσιμα - Γάντια, σωληνάρια μικροφυγοκέντρου με βιδωτό πώμα, ρύγχη πιπετών, φιαλίδια PCR 0,2 ml ή 0,5 ml με λεπτά τοιχώματα (η χρήση φιαλιδίων δύο διαφορετικών χρωμάτων θα διευκολύνει την ταυτοποίηση του μίγματος εκκινητή). Προετοιμασία του DNA - Αποστειρωμένο, απιονισμένο νερό καλής ποιότητας, χλωριούχο νάτριο (NaCl), δινάτριο άλας του αιθυλενοδιαμινοτετραοξικούοξέος (EDTA), κόκκοι υδροξειδίου του νατρίου (NaOH), 2-αμινο-2-(υδροξυμεθυλ)-1,3-προπανοδιόλη (Τρι-βασική) κρυσταλλική, υδροχλωρικό οξύ 36% ειδ. βάρους 1,18 (HCl), χλωριούχο αμμώνιο (NH 4Cl). Ενίσχυση PCR - Ελαφρύ, λευκό ορυκτέλαιο Sigma*, καλήςποιότητας αποστειρωμένο, αποσταγμένο νερό. Ηλεκτροφόρηση - Υλικά ηλεκτροφόρησης γέλης συμπεριλαμβανομένης αγαρόζης NuSieve 3:1 (Lonza), κλίμακα 50 ζευγών βάσεων, βρωμιούχο αιθίδιο. * Για ενίσχυση που πραγματοποιείται σε φιαλίδια PCR 0,5 ml ή θερμικούς κυκλοποιητές χωρίς θερμαινόμενα καπάκια Απαιτούμενος εξοπλισμός Εργαστηριακός εξοπλισμός - πιπέτες ακριβείας (2 σετ: 1 για τον χειρισμό πριν από την ενίσχυση και 1 για τον χειρισμό μετά την ενίσχυση:- κατά προτίμηση πιπέτες θερμικής μετατόπισης), γυαλιά, προστατευτικός ρουχισμός, αναμείκτης περιδίνησης (vortex), μικροφυγόκεντρος, ζυγαριά, φορέας σωληναρίων. Προετοιμασία του DNA - Φυγόκεντρος (για δείγματα στοματικού εκπλύματος), θερμαινόμενη πλάκα (θέρμανση στους 100 C). Ενίσχυση - Θερμικός κυκλοποιητής που δέχεται φιαλίδια 0,5 ml ή 0,2 ml (με ακρίβεια θερμοκρασίας +/-1 C μεταξύ 33 C και 100 C και ομοιομορφία στατικής θερμοκρασίας +/-1 C), θερμαινόμενο καπάκι προαιρετικό. PT003BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 5 από 14

6 Ηλεκτροφόρηση - Οριζόντιο εμβυθιζόμενο δοχείο γέλης, σύστημα τροφοδοσίας, φούρνος μικροκυμάτων, υδατόλουτρο για ψύξη της αγαρόζης, διαφανοσκόπιο UV, φωτογραφικό σύστημα. Συλλογή και φύλαξη δειγμάτων Θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν δείγματα ολικού αίματος (EDTA) ή στοματικού εκπλύματος. Συνιστάται το άτομο που θα εξεταστεί να μην έχει φάει ή πιει λίγο πριν δώσει το δείγμα στοματικού εκπλύματος. Έχει αναφερθεί ότι οι συσκευές συλλογής δειγμάτων, κατά περιπτώσεις, είναι επιβλαβείς για την ακεραιότητα ορισμένων αναλυόμενων ουσιών και μπορεί να παρεμβληθούν σε ορισμένες τεχνολογίες μεθόδων(6). Συνιστάται να επιβεβαιώνει κάθε χρήστης ότι η επιλεγμένη συσκευή χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και ότι τόσο οι συσκευές συλλογής δειγμάτων όσο και οι εναλλακτικές μέθοδοι προετοιμασίας του DNA είναι συμβατές με αυτή τη δοκιμασία. Τα δείγματα αίματος θα πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία -20 C πριν από την προετοιμασία του DNA. Να αποφεύγεται η επανειλημμένη κατάψυξη και απόψυξη. Τα δείγματα στοματικού εκπλύματος πρέπει να φυλάσσονται στους 4 C και το DNA να προετοιμάζεται εντός 7 ημερών. Προετοιμασία του DNA από δείγματα ολικού αίματος (EDTA) 1. Μεταφέρετε με πιπέτα 80 l από κάθε δείγμα αίματος μέσα σε ένα σωληνάριο μικροφυγοκέντρου με βιδωτό πώμα. 2. Μεταφέρετε με πιπέτα 320 l διαλύματος NH 4Cl 170 mm (9,09 g/l) σε κάθε σωληνάριο. 3. Αναμείξτε επί 20 λεπτά με ήπια περιδίνηση και αναστροφή. Αποφύγετε την έντονη ανατάραξη και τη δημιουργία αφρού. 4. Φυγοκεντρίστε κάθε σωληνάριο επί 2 λεπτά στα g έως ότου σχηματιστεί κυτταρικό ίζημα. 5. Χρησιμοποιώντας πιπέτα, αφαιρέστε και απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό. 6. Μεταφέρετε με πιπέτα 300 l NaCl 10 mm (0,58 g/l) / EDTA 10 mm (3,72 g/l) σε κάθε σωληνάριο και επαναιωρήστε τα κύτταρα σε αναμείκτη περιδίνησης. 7. Φυγοκεντρίστε κάθε σωληνάριο επί 1 λεπτό στα g έως ότου σχηματιστεί κυτταρικό ίζημα. 8. Επαναλάβετε τα βήματα 5 έως 7 τουλάχιστον δύο φορές ακόμη έως ότου απομακρυνθεί όλη η ορατή κόκκινη χρώση στο υπερκείμενο υγρό. 9. Χρησιμοποιώντας πιπέτα, αφαιρέστε και απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό. 10. Μεταφέρετε με πιπέτα 200 l διαλύματος NaOH 50 mm (2 g/l) σε κάθε σωληνάριο και επαναιωρήστε τα κύτταρα σε αναμείκτη περιδίνησης. 11. Επωάστε σε θερμαινόμενη πλάκα στους 100 C επί 10 λεπτά. 12. Μεταφέρετε με πιπέτα 40 l Τρι-βασικό 1M (121,1 g/l)/hcl (ph 7,5) σε κάθε σωληνάριο και αναμείξτε σε αναμείκτη περιδίνησης. 13. Προσθέστε 1 ml αποστειρωμένου απιονισμένου νερού σε κάθε σωληνάριομικροφυγοκέντρου ώστε να αποκτήσετε συνολικό όγκο δείγματος DNA 1,24 ml. 14. Φυγοκεντρίστε κάθε σωληνάριο επί 1 λεπτό στα g έως ότου σχηματιστεί ίζημα κυτταρικών υπολειμμάτων. Το DNA περιέχεται στο υπερκείμενο υγρό. PT003BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 6 από 14

7 Προετοιμασία του DNA από δείγματα στοματικού εκπλύματος 1. Αναταράξτε 10 ml φυσιολογικού ορού 0,9% στο στόμα επί 20 δευτερόλεπτα. Συλλέξτε το εναιώρημα σε στείρο πλαστικό σωληνάριο γενικής χρήσης. 2. Δημιουργήστε κυτταρικό ίζημα με φυγοκέντριση στα 800 g επί 10 λεπτά στους C. 3. Χρησιμοποιώντας πιπέτα, αφαιρέστε προσεκτικά και απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό. 4. Μεταφέρετε με πιπέτα 500 l NaCl 10 mm (0,58 g/l) / EDTA 10 mm (3,72 g/l) σε κάθε σωληνάριο και επαναιωρήστε τα κύτταρα σε αναμείκτη περιδίνησης. 5. Μεταφέρετε κάθε δείγμα σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρου με βιδωτό καπάκι. 6. Φυγοκεντρίστε κάθε σωληνάριο επί 1 λεπτό στα g έως ότου σχηματιστεί κυτταρικό ίζημα. 7. Χρησιμοποιώντας πιπέτα, αφαιρέστε και απορρίψτε το υπερκείμενο υγρό. 8. Μεταφέρετε με πιπέτα 500 l διαλύματος NaOH 50 mm (2 g/l) σε κάθε σωληνάριο και επαναιωρήστε τα κύτταρα σε αναμείκτη περιδίνησης. 9. Επωάστε σε θερμαινόμενη πλάκα στους 100 C επί 10 λεπτά. 10.Μεταφέρετε με πιπέτα 100 l Τρι-βασικό 1M (121,1 g/l) / HCl (ph 7,5) σε κάθε σωληνάριο και αναμείξτε σε αναμείκτη περιδίνησης. 11.Φυγοκεντρίστε κάθε σωληνάριο επί 1 λεπτό στα g έως ότου σχηματιστεί ίζημα κυτταρικών υπολειμμάτων. Το DNA περιέχεται στο υπερκείμενο υγρό. 12.Μεταφέρετε 100 l υπερκείμενου υγρού (δείγμα DNA) σε νέο σωληνάριο μικροφυγοκέντρου στο οποίο έχετε τοποθετήσει ετικέτα. 13.Προσθέστε 400 l αποστειρωμένου απιονισμένου νερού σε κάθε δείγμα DNA ώστε να έχετε συνολικό όγκο 500 l. Εναλλακτικές μέθοδοι προετοιμασίας του DNA Το κιτ DNA αίματος QIAamp (Qiagen) έχει χρησιμοποιηθεί επίσης για προετοιμασία του DNA από ολικό αίμα και έχει βρεθεί ότι δίνει αποτελέσματα που μπορούν να αναπαραχθούν και να ερμηνευτούν. Οι μέθοδοι προετοιμασίας του DNA που περιγράφονται παραπάνω συνιστώνται από την Elucigene Diagnostics και έχει αποδειχθεί ότι δίνουν επαναλήψιμα και αξιόπιστα αποτελέσματα. Το DNA που προετοιμάστηκε με χρήση άλλων μεθόδων ή από άλλους τύπους δειγμάτων ενδέχεται να μην είναι ιδανικό για την εξέταση Elucigene CF Poly-T και ενδέχεται να μη δώσει βέλτιστα αποτελέσματα. Τα σημαντικότερα κριτήρια για τη χρήση εναλλακτικών μεθόδων προετοιμασίας DNA είναι η συγκέντρωση DNA και η απουσία αναστολέων PCR. Συνιστάται η ενδελεχής αξιολόγηση της συμβατότητας εναλλακτικών μεθόδων και τύπων δειγμάτων με την εξέταση Elucigene CF Poly-T πριν από τη χρήση των αποτελεσμάτων για διαγνωστικούς σκοπούς. Η εξέταση δειγμάτων DNA σε συγκεντρώσεις <10 ng/5µl δεν συνιστάται. Υπό βέλτιστες συνθήκες PCR προκύπτει πάντα αποτέλεσμα σε συγκεντρώσεις DNA μεταξύ 10 και 100 ng/5 μl. PT003BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 7 από 14

8 Σημείωση: Εξαιτίας της κυμαινόμενης ποιότητας και ποσότητας του εκχυλιζόμενου DNA ενδέχεται κάποιες φορές να απαιτείται αραίωση του τελικού διαλύματος DNA ακόμη 5 φορές, ώστε να εξασφαλιστεί αποτελεσματική ενίσχυση. Πρωτόκολλο εξέτασης Διαδικασία ενίσχυσης Οι τιμές που αναγράφονται στους πίνακες 1 και 2 μπορούν να αυξηθούν αναλογικά για αριθμό εξετάσεων διαφορετικό από αυτούς που προσδιορίζονται. Ωστόσο, εξαιτίας των μικρών όγκων δειγμάτων, η Elucigene Diagnostics συνιστά να μην προετοιμάζονται λιγότερες από 5 εξετάσεις τη φορά. 1. Προγραμματίστε τον θερμικό κυκλοποιητή με αρχείο χρονορύθμισης ώστε να ενεργοποιείται το AmpliTaq Gold σε θερμοκρασία 94 C επί 20 λεπτά, σε συνδυασμό με ένα πρόγραμμα κύκλου ενίσχυσης 30 δευτερολέπτων σε θερμοκρασία 94 C (αποδιάταξη), 2 λεπτών σε θερμοκρασία 58 C (υβριδοποίηση) και 1 λεπτού σε θερμοκρασία 72 C (επιμήκυνση) για 35 κύκλους. Αυτό θα πρέπει να συνδυαστεί με αρχείο χρονορύθμισης διάρκειας 20 λεπτών σε θερμοκρασία 72 C (επιμήκυνση) στον τελικό κύκλο. Σημείωση: Επιλέξτε τη μέθοδο Block στο θερμικό κυκλοποιητή για PCR σε φιαλίδια 0,5 ml. 2. Αποψύξτε και φυγοκεντρίστε τα φιαλίδια μίγματος εκκινητή A (TA), AmpliTaq Gold (AG), χρωστικής φόρτωσης (LD) και ρυθμιστικού διαλύματος (DB) επί 10 δευτερόλεπτα στα g, αναμίξτε ήπια με αναμείκτη περιδίνησης και φυγοκεντρίστε ξανά τα φιαλίδια επί 10 δευτερόλεπτα. Σημείωση: Τα βήματα 3-5 πρέπει να εκτελεστούν σε χώρο που δεν υπάρχει καθόλου DNA 3. Με βάση τον πίνακα 1 προετοιμάστε επαρκή ποσότητα διαλύματος AmpliTaq Gold σε ρυθμιστικό διάλυμα και χρωστική φόρτωσης που παρέχονται και αποστειρωμένο απιονισμένο νερό για τον αριθμό των δειγμάτων και μαρτύρων που πρόκειται να εξεταστούν. Αναμείξτε σχολαστικά αναρροφώντας με πιπέτα πάνω-κάτω. Πίνακας 1. Διάλυμα AmpliTaq Gold Αριθμός απαιτούμενων εξετάσεων Όγκος αποστειρωμένου αποσταγμένου 10,2 20,4 40,8 102 νερού ( l) Όγκος χρωστικής φόρτωσης ( l) Όγκος ρυθμιστικού διαλύματος ( l) Όγκος AmpliTaq Gold ( l) 1,8 3,6 7,2 18 Συνολικός όγκος ( l) Βάσει των τιμών που αναγράφονται στον πίνακα 2, προετοιμάστε τα μίγματα αντίδρασης A. Μεταφέρετε το κατάλληλο κλάσμα του μίγματος εκκινητή Aσε σωληνάριο μικροφυγοκέντρου στο οποίο έχετε τοποθετήσει ετικέτα. Χρησιμοποιώντας ξεχωριστά ρύγχη πιπετών προσθέστε τον κατάλληλο όγκο διαλύματος AmpliTaq Gold (από το βήμα 3) σε κάθε σωληνάριο μικροφυγοκέντρου. Αναμείξτε ήπια με αναμείκτη περιδίνησης και φυγοκεντρίστε τα φιαλίδια επί 10 δευτερόλεπτα στα g. PT003BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 8 από 14

9 Πίνακας 2. Προετοιμασία μιγμάτων αντίδρασης A Αριθμός απαιτούμενων εξετάσεων A A A A Όγκος μίγματος εκκινητή A ( l) 82, Όγκος αραιωμένου ενζύμου ( l) 27, Συνολικός όγκος ( l) Μεταφέρετε με πιπέτα 20 l προετοιμασμένου μίγματος αντίδρασης A στον πυθμένα καθενός από τα προκαθορισμένου αριθμού φιαλίδια PCR. Τοποθετήστε ετικέτα σε ένα φιαλίδιο RCR για κάθε δείγμα και κάθε μάρτυρα. 6. Χρησιμοποιώντας ξεχωριστά ρύγχη πιπετών κάθε φορά, προσθέστε 5 l δείγματος του DNA προς εξέταση σε κάθε φιαλίδιο. Προσθέστε μία σταγόνα ελαφρύ λευκό ορυκτέλαιο Sigma για να καλύψετε την υδαρή φάση*. Επανατοποθετήστε τα πώματα καλά στη θέση τους. 7. Για τον αρνητικό μάρτυρα μην προσθέσετε DNA στο φιαλίδιο. Προσθέστε 1 σταγόνα ελαφρύ λευκό ορυκτέλαιο Sigma για να καλύψετε την υδαρή φάση*. Επανατοποθετήστε τα πώματα καλά στη θέση τους. 8. Φυγοκεντρίστε τα φιαλίδια επί 10 δευτερόλεπτα στα g. 9. Τοποθετήστε όλα τα φιαλίδια σταθερά στο θερμικό κυκλοποιητή. Ξεκινήστε το αρχείο χρονορύθμισης των 94 C, ακολουθούμενο από το πρόγραμμα κύκλου ενίσχυσης. 10. Απορρίψτε όλο το υπόλοιπο μη χρησιμοποιημένο διάλυμα AmpliTaq Gold και το προετοιμασμένο μίγμα αντίδρασης. 11. Μετά την ολοκλήρωση του προγράμματος κύκλου ενίσχυσης, τα δείγματα μπορούν να φυλάσσονται σε θερμοκρασία δωματίου όλη τη νύχτα ή σε θερμοκρασία 2-8 C για έως και 7 ημέρες πριν από την ανάλυση με ηλεκτροφόρηση γέλης. * Για ενίσχυση που διεξάγεται με φιαλίδια PCR 0,5 ml ή θερμικούς κυκλοποιητές χωρίς θερμαινόμενα καπάκια. Ηλεκτροφόρηση γέλης Συνιστάταινα επιβεβαιώνει κάθε χρήστης ότι ο επιλεγμένος εξοπλισμός χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και ότι είναι συμβατός με αυτή την εξέταση. Υπό αυτή την έννοια οι καθοριστικές παράμετροι είναι το υπόστρωμα (matrix) της γέλης και οι διαστάσεις της μήτρας κυψελίδων. Τα αποτελέσματα ελήφθησαν με τη χρήση των ακόλουθων συνθηκών ηλεκροφόρησης: 1. Το προϊόν PCR ηλεκτροφορήθηκε σε γέλη αγαρόζης 3% NuSieve 3:1 χρησιμοποιώντας τρι-βορικό με βρωμιούχο αιθίδιο (TBE/EtBr) ως ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης. Το TBE/EtBr προετοιμάστηκε ως Τρι-βασικό 134 mm (16,2 g/l), βορικό οξύ 74,9 mm (4,63 g/l), ρυθμιστικό διάλυμα EDTA 2,55 mm (0,95 g/l) μεβρωμιούχο αιθίδιο 0,1 g/ml g NuSieve 3:1 αραιώθηκαν σε 100 ml TBE/EtBr και μεταφέρθηκαν σε οριζόντιο δίσκο 15 x 12 cm με μήτρες κυψελίδων 1,5 mm x 5 mm αιωρούμενες 1 mm πάνω από τη βάση l του προϊόντος PCR από κάθε φιαλίδιο PCR πρέπει να τοποθετηθούν σε παρακείμενες θέσεις κυψελίδων πάνω στην προετοιμασμένη γέλη αγαρόζης. PT003BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 9 από 14

10 4. Μία κλίμακα 50 ζευγών βάσεων χρησιμοποιήθηκε δίπλα στα δείγματα ως δείκτης μοριακού βάρους. 5. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε στα 5 έως 6 V/cm μεταξύ των ηλεκτροδίων έως ότου το μέτωπο της χρωστικής μετακινήθηκε κατά 4 cm από τις κυψελίδες φόρτωσης προς την άνοδο (1 με 1,5 ώρα). 6. Μετά την ηλεκτροφόρηση οι γέλες τοποθετήθηκαν σε διαφανοσκόπιο UV στα 260 nm όπου οπτικοποιήθηκαν και φωτογραφήθηκαν. Ερμηνεία αποτελεσμάτων Τα προϊόντα PCR θα παρατηρηθούν ως ζώνες στις στήλες των φιαλιδίων της γέλης. 1. Οι διαγνωστικές ζώνες πρέπει να είναι ευκρινώς ορατές σε όλα τα δείγματα και να έχουν παρόμοια ένταση στη ζώνη 250 ζευγών βάσεων (bp) στην κλίμακα 50 bp (όταν 1,5 μg της κλίμακας έχει φορτωθεί στη γέλη). Ο μάρτυρας DNA θα λειτουργήσει επίσης ως οδηγός για την ένταση των ζωνών. 2. Τουλάχιστον μία διαγνωστική ζώνη πρέπει να είναι ορατή σε κάθε στήλη που αντιστοιχεί σε δείγματα προς εξέταση ή μάρτυρα DNA. 3. Σε καμία στήλη δεν πρέπει να παρατηρούνται σκιές και φθορισμός υπόβαθρου. 4. Η θέση των διαγνωστικών ζωνών πρέπει να δείχνει το σωστό μοριακό μέγεθος (βλ. Εικόνα 1). 5. Ο αρνητικός μάρτυρας δεν πρέπει να εμφανίζει καμία ζώνη. Αν δεν παρατηρηθεί κάποιο από τα παραπάνω κριτήρια, τα αποτελέσματα δεν πρέπει να ερμηνευτούν και θα πρέπει να επαναληφθεί η εξέταση. 6. Ένα άτομο έχει δύο αντίγραφα του γονιδίου CFTR. Όπου αυτά τα αντίγραφα έχουν την ίδια αλληλουχία για μία συγκεκριμένη θέση, το άτομο περιγράφεται ως ομόζυγο για αυτή τη θέση. Όπου τα αντίγραφα έχουν διαφορετική αλληλουχία για μία συγκεκριμένη θέση, το άτομο περιγράφεται ως ετερόζυγο για αυτή τη θέση. 7. Η παρουσία προϊόντος PCR που προέκυψε από τον εκκινητή αλληλόμορφου 5T θα παρατηρηθεί στη στήλη της γέλης στα 105 bp και ταυτοποιείται συγκρίνοντας τη θέση και την ένταση της ζώνης με την παρακείμενη στήλη δείκτη και το μάρτυρα DNA. Μόνο ζώνες προϊόντων σωστού μεγέθους θα πρέπει να ερμηνευτούν. 8. Η παρουσία προϊόντος PCR που προέκυψε από τον εκκινητή αλληλόμορφου 7T θα παρατηρηθεί στη στήλη της γέλης στα 132 bp και ταυτοποιείται συγκρίνοντας τη θέση και την ένταση της ζώνης με την παρακείμενη στήλη δείκτη και το μάρτυρα DNA. Μόνο ζώνες προϊόντων σωστού μεγέθους θα πρέπει να ερμηνευτούν. 9. Η παρουσία προϊόντος PCR που προέκυψε από τον εκκινητή αλληλόμορφου 9T θα παρατηρηθεί στη στήλη της γέλης στα 169 bp και ταυτοποιείται συγκρίνοντας τη θέση και την ένταση της ζώνης με την παρακείμενη στήλη δείκτη και το μάρτυρα DNA. Μόνο ζώνες προϊόντων σωστού μεγέθους θα πρέπει να ερμηνευτούν. 10.Ως αποτέλεσμα της επέκτασης των αλληλόμορφων μέσα στην μικροδορυφορική περιοχή (TG) 8-13 από το έως το (παρακείμενη στην ενισχυμένη περιοχή της πολυθυμιδίνης), το μήκος των διαγνωστικών προϊόντων PCR ενδέχεται να ποικίλει. Ως αποτέλεσμα, ενδέχεται να παρατηρηθεί πολύ μικρή μεταβολή του μεγέθους της ζώνης προϊόντος κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης. Αυτές οι μεταβολές δεν επηρεάζουν την ερμηνεία των αποτελεσμάτων της εξέτασης. 11.Λόγω της φύσης της αλληλουχίας γύρω από τη θέση poly-t, ενδέχεται να σχηματιστούν περιστασιακά ετερόδιπλα μόρια από τα προϊόντα PCR και συνεπώς ενδέχεται να είναι ορατά σε ορισμένες στήλες των προς εξέταση δειγμάτων. Η θέση αυτών των ετερόδιπλων PT003BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 10 από 14

11 μορίων, που δεν είναι τόσο έντονα όσο οι αντίστοιχες διαγνωστικές ζώνες, εικονίζεται σκιασμένη στην Εικόνα 1. Το αποτέλεσμα της εξέτασης δεν επηρεάζεται αρνητικά από την παρουσία ετερόδιπλων μορίων. 12.Κατά την επικύρωση της δοκιμασίας, μια σκιερή ή αμυδρή ζώνη ήταν ορατή περιστασιακά στα δείγματα 7T/7T κοντά στη θέση του αλληλόμορφου 9T. Το συγκεκριμένο τέχνημα ενίσχυσης PCR δεν είναι διαγνωστικό προϊόν PCR ή προϊόν σχηματισμούετερόδιπλων μορίων και δεν θα πρέπει να αξιολογηθεί ως διαγνωστική ζώνη. Εικόνα 1 Δείκτης μοριακού βάρους (Κλίμακα 50 ζευγών βάσεων) T/5T 5T/7T 5T/9T 7T/7T 7T/9T 9T/9T Δείκτης μοριακού βάρους (Κλίμακα 50 ζευγών βάσεων) T 169bp 9T 169bp 9T 169bp T 132bp 7T 132bp 7T 132bp 100 5T 105bp 5T 105bp 5T 105bp 100 Διαγνωστική ζώνη Παρατηρούμενα ετερόδιπλα μόρια Τα ετερόδιπλα μόρια που εικονίζονται στην Εικόνα 1 παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης της δοκιμασίας. Λόγω της ποικιλομορφίας της αλληλουχίας στην περιοχή των επαναλαμβανόμενων βάσεων Poly-T, ενδέχεται να παρατηρηθούν πρόσθετα (προηγουμένως ανύπαρκτα) ετερόδιπλα μόρια. PT003BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 11 από 14

12 Χαρακτηριστικά απόδοσης Εκατό δείγματα εξετάστηκαν με το κιτ Elucigene CF Poly-T σε ενδοεταιρική μελέτη. Όλα τα δείγματα ήταν ολικό αίμα (EDTA) και το DNA προετοιμάστηκε σύμφωνα με τη συνιστώμενη μέθοδο εκχύλισης DNA. Όλα τα αποτελέσματα που προέκυψαν επιβεβαιώθηκαν για τα αλληλόμορφα της θέσης ματίσματος της πολυθυμιδίνης στο ιντρόνιο 8 χρησιμοποιώντας εναλλακτική μέθοδο. Από τα 100 άτομα που εξετάστηκαν, 5 ήταν 5T/7T, 71 ήταν 7T/7T, 21 ήταν 7T/9T και 3 ήταν 9T/9T. Όλα τα δείγματα DNA ενισχύθηκανεπιτυχώς με τη χρήση του κιτ Elucigene CF Poly-T και κανένα δεν χρειάστηκε επανάληψη της εξέτασης. Δείγματα αίματος και στοματικού εκπλύματος ελήφθησαν από 100 άτομα και εξετάστηκαν με το κιτ Elucigene CF Poly-T. Το αποτέλεσμα που ελήφθη από κάθε δείγμα στοματικού εκπλύματος ήταν σύμφωνο με το αποτέλεσμα που ελήφθη με τη χρήση του δείγματος αίματος από το ίδιο άτομο. Παρεμβαλλόμενες παραλλαγές αλληλουχίας Έχουν ληφθεί μέτρα κατά την ανάπτυξη της δοκιμασίας για να αποφευχθεί η παρεμβολή στη λειτουργία της δοκιμασίας λόγω της παρουσίας άλλων αναφερόμενων πολυμορφισμών και μεταλλάξεων του γονιδίου CFTR (7). Υπάρχουν αρκετά παραλλάγματα αλληλουχίας στο γονίδιο CFTR άγνωστης συχνότητας τα οποία εντοπίζονται κοντά στα παραλλάγματα IVS8 5T, 7T και 9T. Η αξιολόγηση των αναφερόμενων παραλλαγμάτων αλληλουχίας ανέδειξε τις ακόλουθες επιδράσεις στα αποτελέσματα του κιτ Elucigene CF Poly-T: 1. Η μετάλλαξη TTT>G που οδηγεί σε άτομο (TG) 13(T) 3 με εμφανή κατάσταση νόσου 5T θα παράγει διαγνωστικό προϊόν PCR από τον εκκινητή 5T. 2. Ο πολυμορφισμός G/T που αλλοιώνει την τελευταία επανάληψη TG σε TT με υποκατάσταση της τελικής G, δεν επηρεάζει την απόδοση της εξέτασης, διότι αυτός ο πολυμορφισμός αλλάζει την κατάσταση των ατόμων όσον αφορά το μήκος του τμήματος της πολυθυμιδίνης. 3. Οι επιδράσεις των μεταλλάξεων G>C, A>C και delAG δεν εξετάστηκαν αλλά ενδέχεται να επηρεάζουν την εξέταση Elucigene CF Poly-T. Περιορισμοί της διαδικασίας 1. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τον παρόντα ή άλλους διαγνωστικούς προσδιορισμούς πρέπει να ερμηνευτούν σε συνδυασμό με άλλα εργαστηριακά και κλινικά δεδομένα που είναι διαθέσιμα στον ιατρό. 2. Η απουσία μεταλλάξεων που ανιχνεύονται με αυτό το κιτ δεν αποτελεί εγγύηση απουσίας άλλων μεταλλάξεων του γονιδίου CFTR. Είναι πιθανή η παρουσία άλλων μεταλλάξεων και αυτές δεν ανιχνεύονται από αυτό το κιτ. 3. Οι μεταλλάξεις διαφέρουν ως προς τη συχνότητά τους μεταξύ διαφορετικών πληθυσμών. Δεδομένα για τη συχνότητα μεταλλάξεων σε διαφόρους πληθυσμούς διατίθενται από την Κοινοπραξία Γενετικής Ανάλυσης της Κυστικής Ίνωσης (Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium) (7). 4. Όπως συμβαίνει σε όλες τις γενετικές εξετάσεις, ενδέχεται να εξαχθούν εσφαλμένα αποτελέσματα από δείγματα αίματος που έχουν ληφθεί αμέσως μετά από πρόσφατη μετάγγιση αίματος. PT003BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 12 από 14

13 Ο χρήστης αυτού του κιτ θα πρέπει να τονίσει αυτά τα σημεία κατά την αναφορά αποτελεσμάτων στον κλινικό γιατρό που θα θέσει τη διάγνωση ή τον γενετικό σύμβουλο. Βιβλιογραφία 1. Kiesewetter S, Macek M, Davis C, Curristin SM, Chu CS, Graham C, Shrimpton AE, Cashman SM, Tsui LC, Mickle J. et al. A mutation in CFTR produces different phenotypes depending on chromosomal background. Nat Genet. 1993; 5: Dork T, Dworniczak B, Aulehla-Scholz C, Wieczorek D, Bohm I, Mayerova A, Seydewitz HH, Nieschlag E, Meschede D, Horst J, Pander HJ, Sperling H, Ratjen F, Passarge E, Schmidtke J, Stuhrmann M. Distinct spectrum of CFTR gene mutations in congenital absence of vas deferens. Hum Genet. 1997; 100: Massie RJ, Poplawski N, Wilcken B, Goldblatt J, Byrnes C, Robertson C. Intron-8 polythymidine sequence in Australasian individuals with CF mutations R117H and R117C. Eur Respir J. 2001; 17: Chmiel JF, Drumm ML, Konstan MW, Ferkol TW, Kercsmar CM. Pitfall in the use of genotype analysis as the sole diagnostic criterion for cystic fibrosis. Pediatrics. 1999;103: Newton CR et al. Analysis of any point mutation in DNA. The Amplification Refractory Mutation System (ARMS). Nucleic Acid Res 17: (1989). 6. Satsangi J et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 343: (1994). 7. The Cystic Fibrosis Mutation Data base at Το ELUCIGENE είναι εμπορικό σήμα της Delta Diagnostics (UK) Ltd. Το ARMS είναι σήμα κατατεθέν της AstraZeneca UK Ltd. Το QIAAMP είναι σήμα κατατεθέν του ομίλου Qiagen. Το NUSIEVE είναι σήμα κατατεθέν της Lonza. Το AMPLITAQ GOLD είναι σήμα κατατεθέν της Roche Molecular Systems Inc. PT003BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 13 από 14

14 Copyright 2014 Delta Diagnostics (UK) Ltd PT003BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 14 από 14