«Φυσική διασύνδεση της ERK με τον Elk-1 μέσω της FAK στα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου.»

Transcript

1 ΝΑΚΓΝΖΟΠΕΙΖΜ ΝΑΠΞΩΚ ΟΜΘΕ ΘΓΠΖΗΩΚ ΓΝΖΟΠΕΙΩΚ ΠΙΕΙΑ ΒΖΜΘΜΓΖΑΟ ΠΜΙΓΑΟ ΓΓΚΓΠΖΗΕΟ, ΒΖΜΘΜΓΖΑΟ ΗΡΠΠΑΞΜΡ ΗΑΖ ΑΚΑΝΠΡΛΕΟ «Φυσική διασύνδεση της ERK με τον Elk-1 μέσω της FAK στα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου.» Δηαηνηβή Ιεηαπηοπηαθμφ Δηπιχμαημξ Γηδίθεοζεξ ηθαηεξίλε.μ. 3 82Καπνδίζηξηα Αηθαηεξίλε Βηνιόγνο πνδίζηξηα Α Πάτρα 2008

2 ΠΡΟΘΟΓΟ Η πανμφζα δζαηνζαή εηπμκήεδηε ζημ πθαίζζμ ημο Μεηαπηοπζαημφ Γζπθχιαημξ Δζδίηεοζδξ, ζημ ενβαζηήνζμ Βζμθμβίαξ ημο Σιήιαημξ Βζμθμβίαξ ημο Πακεπζζηήιζμο Παηνχκ, ηαηά ηδ πνμκζηή πενίμδμ Η ακάεεζδ ημο εέιαημξ ηαεχξ ηαζ δ επίαθερδ ηδξ ενβαζίαξ έβζκε απυ ηδκ ακαπθδνχηνζα ηαεδβήηνζα Μανία Λαιπνμπμφθμο-Μανιάνα, ηδκ μπμία εοπανζζηχ εενιά βζα ημ ζοκεπέξ, αιείςημ ηαζ εζθζηνζκέξ εκδζαθένμκ, αθθά ηαζ βζα ηδκ ειπζζημζφκδ πμο ιμο έδεζλε ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ ζοκενβαζία ιαξ. Αηυια, ηδκ εοπανζζηχ βζα ηζξ οπμδείλεζξ ηαζ ηζξ παναηδνήζεζξ ηδξ ηαηά ηδ ζοββναθή ημο ηεζιέκμο. Δπίζδξ, εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ημκ μιυηζιμ ηαεδβδηή Βαζίθδ Μανιάνα βζα ηδκ ηαεμδήβδζδ ηαζ ηζξ ζοιαμοθέξ ημο ηαηά ηδ δζάνηεζα ηςκ πεζναιάηςκ. Δοπανζζηχ εενιά, ημοξ ακαπθδνςηέξ ηαεδβδηέξ Πακαβζχηδ Καηζχνδ ηαζ Κςκζηακηίκμ Φθοηγάκδ βζα ηζξ πμθφηζιεξ ζοιαμοθέξ ημοξ ηαζ βζα ηδ ζοιιεημπή ημοξ ζηδκ ηνζιεθή ιμο ελεηαζηζηή επζηνμπή. Έκα ιεβάθμ εοπανζζηχ μθείθς ηαζ ζημ ςηήνδ Σζάηα, μ μπμίμξ ήηακ πάκημηε δίπθα ιμο υζεξ θμνέξ ημκ πνεζάζηδηα πνμζθένμκηάξ ιμο απθυπενα ηζξ βκχζεζξ ημο, αθθά ηαζ βζα ηδ αμήεεζά ημο ζημ πεζνζζιυ ημο ζοκεζηζαημφ ιζηνμζημπίμο. Γε εα ιπμνμφζα, αέααζα, κα λεπάζς ημοξ θίθμοξ ηαζ ζοκαδέθθμοξ ιμο Φχηδ Καναβζάκκδ ηαζ Μανίκα Ανιπή βζα ηδκ άρμβδ ζοκενβαζία αοηά ηα δφμ πνυκζα, ηζξ παθαζυηενεξ δζπθςιαηζημφξ Δθέκδ ηαζ Μανζθέκα, ηζξ κευηενεξ Βάζς ηαζ Γήιδηνα, ηαεχξ επίζδξ ηαζ ηα ιέθδ ηςκ οπμθμίπςκ ενβαζηδνίςκ, ηαζ κα πς ζε υθμοξ έκα ιεβάθμ εοπανζζηχ βζα ηδ αμήεεζά ημοξ, ια πάκς απ υθα βζα ημ εοπάνζζημ ηθίια ηαζ ηζξ οπένμπεξ ζηζβιέξ πμο γήζαιε ιαγί ζημ ενβαζηήνζμ. Δοπανζζηχ εενιά επίζδξ, ημοξ ζοκαδέθθμοξ ιμο ζημ ενβαζηήνζμ Παζνβηνινγίαο θπηηάξσλ θαη εμσθπηηάξηνπ ηζηνύ ημο Ικζηζημφημο Βζμθμβίαξ ημο ΔΚΔΦΔ «Γδιυηνζημξ» βζα ηδκ ηαηακυδζδ ηαζ ηδκ οπμζηήνζλή ημοξ ηαηά ηδ ζοββναθή ημο ηεζιέκμο. Σέθμξ, εοπανζζηχ ηδκ μζημβέκεζά ιμο βζα ηδ αμήεεζα, ηδκ εκεάννοκζδ, ηαζ ηδκ αιένζζηδ ζοιπανάζηαζή ημοξ (εζηθή θαη πιηθή) ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ηςκ ζπμοδχκ ιμο Σας ευχαριστώ!

3 ΠΓΡΖΓΥΟΙΓΚΑ Δζζαβςβή 1 Ακμζμθμβζηέξ απμηνίζεζξ 2 Σμ ακμζμπμζδηζηυ ζφζηδια ηςκ ζπμκδοθςηχκ 2 Σμ ακμζμπμζδηζηυ ζφζηδια ηςκ εκηυιςκ 4 Σφπμζ αζιμηοηηάνςκ ηαζ αζιμπμίδζδ 6 Ακμζμαπμηνίζεζξ αζιμηοηηάνςκ 8 Κοηηανμθαβία 9 Κοηηανζηή επζημζκςκία 12 Μεηαβςβή ζδιάηςκ 13 Μεηαβςβή ελςηοηηανζηχκ ζδιάηςκ απυ ηζξ ζκηεβηνίκεξ πνμξ ηδκ FAK 15 Κζκάζδ εζηζχκ πνμζηυθθδζδξ (Focal Adhesion Kinase, FAK) 18 FAK ηαζ MAP ηζκάζεξ 20 FAK ηαζ DFak56 21 Κζκάζεξ εκενβμπμζμφιεκεξ απυ ιζημβυκα (Mitogen Activated Protein Kinases, MAPKs) 23 Σμ ζφζηδια ηςκ MAPKs 23 Η ιεηααίααζδ ηδξ πθδνμθμνίαξ ζε ιζα ηοπζηή μδυ MAPKs 24 Δκενβμπμίδζδ ηςκ MAPKs 24 Ονβάκςζδ ηαζ νφειζζδ ηςκ μδχκ ηςκ MAPKs 25 Οζ μδμί ιεηαβςβήξ ζδιάηςκ MAPKs ζηα εδθαζηζηά 28 Η μδυξ MAPK ERK 28 Η μδυξ MAPK JNK 34 Η μδυξ MAPK p38 36 Elk-1: Κμζκυ οπυζηνςια ηαζ βζα ηζξ 3 MAPKs 38 Οζ μδμί ιεηαβςβήξ ζδιάηςκ MAPKs ζηα έκημια 41 ημπυξ ηδξ δζαηνζαήξ 44 Τθζηά & Μέεμδμζ 45 οκμπηζηυξ πίκαηαξ ακηζδναζηδνίςκ 46 Καθθζένβεζα ημο εκηυιμο Ceratitis capitata 49 Απμιυκςζδ αζιμηοηηάνςκ 52 Μέηνδζδ αζιμηοηηάνςκ ζε αζιμηοηηανυιεηνμ improved Neubauer 53 Καθθζένβεζα αζιμηοηηάνςκ 54 Καθθζένβεζα ημο ααηηδνίμο Escherichia coli 54 Πμζμηζηυξ πνμζδζμνζζιυξ πνςηεσκχκ ιε ηδ ιέεμδμ Bradford 55 Ηθεηηνμθυνδζδ πμθοαηνοθαιζδίμο (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, PAGE) 56 SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE) 58 Ακμζμαπμηφπςια (Western blotting) 61 Ακμζμηαηαηνήικζζδ (Immunoprecipitation) 65

4 Ακμζμεκημπζζιυξ πνςηεσκχκ ιε ιζηνμζημπία θεμνζζιμφ 67 Ακίπκεοζδ ηοηηανμπθαζιαηζημφ ακηζβυκμο 68 οκεζηζαηή ιζηνμζημπία (Confocal microscopy) 69 Απμηεθέζιαηα 71 Καηακμιή ηςκ FAK, p Tyr397 FAK, ERK, p Thr202/Tyr204 ERK, Elk-1 ηαζ p Ser383 Elk-1 ζηα αζιμηφηηανα ηδξ ιφβαξ ηδξ Μεζμβείμο 72 Γζενεφκδζδ ζοκεκημπζζιμφ ηαζ ζοιπθμημπμίδζδξ ηςκ FAK ηαζ ERK 76 Γζενεφκδζδ ζοκεκημπζζιμφ ηαζ ζοιπθμημπμίδζδξ ηςκ FAK ηαζ Elk-1 84 Γζενεφκδζδ ζοκεκημπζζιμφ ηαζ ζοιπθμημπμίδζδξ ηςκ ERK ηαζ Elk-1 88 ογήηδζδ οιπενάζιαηα 92 ογήηδζδ 93 οιπενάζιαηα 95 Βζαθζμβναθία 96 Πενίθδρδ δζαηνζαήξ 108 Abstract 109

5

6 ΑΚΟΟΘΟΓΖΗΓ ΑΠΟΗΡΖΓΖ Όθμζ μζ γςκηακμί μνβακζζιμί ημο πθακήηδ αβςκίγμκηαζ ηαεδιενζκχξ κα επζαζχζμοκ ζηζξ εηάζημηε ακηίλμεξ ζοκεήηεξ ημο πενζαάθθμκημξ. Οζ ιζηνμμνβακζζιμί απμηεθμφκ ζοκεπή απεζθή υπζ ιυκμ βζα ημοξ γςζημφξ μνβακζζιμφξ (αζπόλδπια θαη ζπνλδπισηά) αθθά ηαζ βζα ημοξ θοηζημφξ. Πνμηεζιέκμο θμζπυκ, μζ μνβακζζιμί κα ημοξ ακηζιεηςπίζμοκ απμηεθεζιαηζηά, ιέζα απυ ηδκ πάνμδμ δζζεηαημιιονίςκ πνυκςκ, έπμοκ ακαπηφλεζ ηαηάθθδθμοξ ιδπακζζιμφξ, μζ μπμίμζ πενζθαιαάκμοκ ηδκ ακαβκχνζζδ ημο εζζαμθέα, δδθαδή ηδ δζάηνζζδ ηςκ «λέκςκ» ζοζηαηζηχκ πμο δεκ ακήημοκ ζημκ λεκζζηή ηαεχξ ηαζ ηδκ απυηνζζδ ζηα δζάθμνα παεμβυκα (Hoffmann and Reichhart 2002). Το ανοσοποιητικό σύστημα των σπονδυλωτών ηα ζπμκδοθςηά, δ άιοκα έκακηζ ηςκ παεμβυκςκ ααζίγεηαζ ζηζξ απμηνίζεζξ ηδξ εββεκμφξ (κε εηδηθήο) ηαζ ηδξ επίηηδηδξ (εηδηθήο) ακμζίαξ. Η εββεκήξ ακμζία πενζθαιαάκεζ αζμπδιζημφξ ηαζ ηοηηανζημφξ αιοκηζημφξ ιδπακζζιμφξ πμο πνμτπάνπμοκ ηδξ ιυθοκζδξ ηαζ ανίζημκηαζ ζε εημζιυηδηα βζα άιεζδ απυηνζζδ, εκχ δε παναηηδνίγεηαζ απυ ελεζδίηεοζδ. Γδθαδή, δ ίδζα απυηνζζδ επζηεθείηαζ βζα υθμοξ ημοξ παεμβυκμοξ πανάβμκηεξ, αθμφ ακαβκςνίγμκηαζ ιυκμ δμιέξ πμο είκαζ ημζκέξ ζε ιεβάθεξ μιάδεξ ηαζ απμοζζάγμοκ απυ ημοξ πμθοηφηηανμοξ λεκζζηέξ ημοξ πςνίξ κα οπάνπεζ δ δοκαηυηδηα δζάηνζζδξ θεπηχκ δζαθμνχκ ιεηαλφ ηςκ λέκςκ ζοζηαηζηχκ (Delves and Roitt 2000). ηδ ιδ εζδζηή άιοκα ηςκ ζπμκδοθςηχκ ζοιαάθθμοκ: 1) μζ θοζζημί ηαζ μνμθμβζημί θναβιμί, υπςξ ηα επζεήθζα ηαζ δ αθέκκα πμο ηα ηαθφπηεζ, δ μπμία πενζέπεζ ηαζ ακηζααηηδνζαηέξ μοζίεξ (ληεθελζίλεο), 2) ηα θαβμηφηηανα (νπδεηεξόθηια, κνλνθύηηαξα θαη καθξνθάγα) ηαζ ηα ηφηηανα-θοζζημί δμθμθυκμζ (natural killer cells, NK), 3) μζ πνςηεΐκεξ ημο αίιαημξ, ζηζξ μπμίεξ πενζθαιαά-κμκηαζ μζ πνςηεΐκεξ ημο ζοιπθδνχιαημξ ηαζ άθθμζ ιεζμθααδηέξ ηςκ ακμζμακηζδνάζεςκ (Nappi et al. 2004) ηαεχξ επίζδξ ηαζ 4) μζ δζάθμνεξ ηοηηανμηίκεξ πμο ζοκημκίγμοκ πμθθέξ απυ ηζξ δναζηδνζυηδηεξ ηςκ ηοηηάνςκ πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδκ εββεκή ακμζία (Bodian et al. 2004, Ottavianni et al. 2004). Σα ηφηηανα ηςκ ζπμκδοθςηχκ, ηαηά ηδκ ελέθζλδ, ακέπηολακ οπμδμπείξ ακαβκχνζζδξ (pattern-recognition receptors, PRRs), μζ μπμίμζ δεζιεφμοκ ζοκηδνδιέκεξ µμνζαηέξ δμιέξ παεμβυκςκ ιζηνμμνβακζζιχκ (pathogenassociated molecular patterns, PAMPs)(Fearon 1997). Οζ πζμ βκςζηέξ PAMPs είκαζ ζοζηαηζηά ημο ηοηηανζημφ ημζπχιαημξ ααηηδνίςκ ή ιοηήηςκ υπςξ μ θζπμπμθοζαηπανίηδξ (LPS), δ πεπηζδμβθοηάκδ ηαζ μζ α-1,3- βθοηάκεξ, πμο ακαβκςνίγμκηαζ είηε απυ μνμθμβζημφξ (δηαιπηνύο) είηε απυ

7 ηοηηανζημφξ οπμδμπείξ PRRs. Οζ μνμθμβζημί PRRs, υπςξ δ πνςηεΐκδ δέζιεοζδξ ηδξ ιακκυγδξ, πνμζδέκμκηαζ ζηα PAMPs µε ζοκέπεζα ηδκ μρςκζκμπμίδζδ ημο εζζαμθέα, εκχ ζηδ ζοκέπεζα ημ ζφιπθμημ ακαβκςνίγεηαζ απυ πνςηεΐκεξ-οπμδμπείξ ηδξ επζθάκεζαξ ηςκ ακμζμηοηηάνςκ. Ακηζεέηςξ, μζ ηοηηανζημί PRRs, υπςξ μζ ζκηεβηνίκεξ, εηθνάγμκηαζ ζηδκ επζθάκεζα ηςκ ακμζμηοηηάνςκ ηαζ δεζιεφμοκ ηα ΡΑΜΡs άιεζα (Aderem and Underhill 1999). Η ιδ εζδζηή άιοκα, υιςξ, δεκ επανηεί βζα ηδκ πθήνδ ακηζιεηχπζζδ ηςκ παεμβυκςκ παναβυκηςκ. Γζ αοηυ ηα ζπμκδοθςηά έπμοκ ακαπηφλεζ ημ ακμζμπμζδηζηυ ζφζηδια, ημ μπμίμ απμηεθείηαζ απυ έκα ζφκμθμ μνβάκςκ ηαζ ανηεημφξ δζαθμνεηζημφξ ηφπμοξ ηοηηάνςκ, ηα μπμία ελεθίπεδηακ βζα κα ακαβκςνίγμοκ μνεά ηαζ εζδζηά ημοξ ιμθοζιαηζημφξ πανάβμκηεξ, ηα ημλζηά ημοξ πνμσυκηα ηαζ ηα λέκα οθζηά (εηδηθή αλνζία). Έπεζηα απυ ηδκ ακαβκχνζζδ αημθμοεεί ιε ηδ αμήεεζα αοηχκ ηςκ ηοηηάνςκ δ ηαηαζηνμθή ηςκ παεμβυκςκ ιε ιζα δζενβαζία βκςζηή ςξ αλνζναπόθξηζε. Όθα ηα ηφηηανα ημο ακμζμπμζδηζημφ ζοζηήιαημξ πνμένπμκηαζ απυ πμθοδφκαια πνυδνμια ηφηηανα (stem cells) πμο δίκμοκ βέκεζδ ζε δφμ ηφνζεξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ, ηδ θειθμεζδή ηαζ ηδ ιοεθμεζδή (ή κπειηθή) (Πίνακας 1). Νίκαθαξ 1 : Οπεμαηηθή απεηθυκηζε ηεξ αημμπμίεζεξ ( Η θειθμεζδήξ ζεζνά ζοκίζηαηαζ απυ ηα θειθμηφηηανα πμο δζαθμνμπμζμφκηαζ ζε Σ ή Β ηφηηανα ακάθμβα ιε ημ ιζηνμπενζαάθθμκ ζημ

8 μπμίμ εα ανεεμφκ. Αοηυ είκαζ μ εφιμξ αδέκαξ βζα ηα Σ ηφηηανα ηαζ ημ ειανοσηυ ήπαν ή μ ιοεθυξ ηςκ μζηχκ βζα ηα Β ηφηηανα. Σα ηφηηανα πμο πνμένπμκηαζ απυ ηδ ιοεθμεζδή ζεζνά δζαθμνμπμζμφκηαζ ζε θαβμηφηηανα ηαζ άθθεξ πμζηίθεξ ηάλεζξ ηοηηάνςκ υπςξ πανμοζζάγμκηαζ ζηoκ Πίνακα 1. Η εζδζηυηδηα είκαζ έκα απυ ηα δφμ παναηηδνζζηζηά πμο δζαηνίκεζ ηδκ επίηηδηδ ακμζία απυ ηδκ εββεκή. Σμ άθθμ είκαζ δ ακμζμθμβζηή ικήιδ, δδθαδή δ ζηακυηδηα ημο ακμζμπμζδηζημφ ζοζηήιαημξ κα απμηνίκεηαζ ιε ιζα πζμ ζζπονή ηαζ απμηεθεζιαηζηή ακμζμαπυηνζζδ έκακηζ ηςκ παεμβυκςκ έπεζηα απυ ηδκ πνχηδ επαθή ημο ιε αοηά, πανέπμκηαξ ζημκ μνβακζζιυ ηαθφηενδ ακμπή ζημ ιέθθμκ (Louis Du Pasquier 2000). Το ανοσοποιητικό σύστημα των εντόμων Πμθθέξ ένεοκεξ έπμοκ δείλεζ υηζ ηυζμ ηα ζπμκδοθςηά υζμ ηαζ ηα αζπυκδοθα πνδζζιμπμζμφκ μιυθμβα ιυνζα βζα κα νοειίζμοκ ηζξ ακμζμαπμηνίζεζξ ημοξ (Engstrom 1993). Βέααζα, μζ ηαηχηενμζ ελεθζηηζηά μνβακζζιμί πνδζζιμπμζμφκ πζμ πνςηυβμκμοξ ιδπακζζιμφξ βζα ηδκ άιοκά ημοξ. Σα έκημια δε δζαεέημοκ επίηηδημ ζφζηδια ακμζίαξ, αθθά υπςξ πνμακαθένεδηε, ιε ηδκ πάνμδμ ηςκ πνυκςκ απέηηδζακ απμηεθεζιαηζημφξ ιδπακζζιμφξ βζα ηδκ ακηζιεηχπζζδ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ, ημ ζφζηδια ηδξ εββεκμφξ ακμζίαξ, πμο πενζθαιαάκεζ ηυζμ ηδκ μνμθμβζηή υζμ ηαζ ηδκ ηοηηανζηή απυηνζζδ. Η μνμθμβζηή απυηνζζδ ζοκίζηαηαζ ζηδκ παναβςβή ακηζµζηνμαζαηχκ πεπηζδίςκ απυ ημ θζπανυ ζχια (Hoffmann 2003, Meister et al. 2000, Lowenberger 2001), εκενβχκ παναβχβςκ μλοβυκμο ηαζ αγχημο (Bogdan et al. 2000, Vass and Nappi 2001) ηαεχξ επίζδξ ηαζ εκγφιςκ πμο νοειίγμοκ ηδκ πήλδ ηδξ αζιμθέιθμο ηαζ ηδ ιεθακμβέκεζδ (Gillespie et al. 1997, Mavrouli et al. 2005). Ακηζεέηςξ, δ ηοηηανζηή άιοκα ζοκίζηαηαζ ζε απμηνίζεζξ ηςκ αζιμηοηηάνςκ υπςξ δ ηοηηανμθαβία, μ ζπδιαηζζιυξ μγζδίςκ ηαζ δ εβηφζηςζδ (Schmidt et al. 2001, Metheniti et al. 2001, Lamprou et al. 2005)(Εικόνα 1). Η πνχηδ βναιιή άιοκαξ πενζθαιαάκεζ υνβακα πμο απμηεθμφκηαζ απυ δζαθμνεηζηά είδδ ηοηηάνςκ ηαεχξ ηαζ απυ ιζα πμζηζθία ηοηηάνςκ πμο ηοηθμθμνμφκ εθεφεενα ζηδκ αζιμθέιθμ (Marmaras et al. 1996). Μέπνζ ζήιενα είκαζ βκςζηυ υηζ υθα ηα ζοζηαηζηά ημο ακμζμπμζδηζημφ ζοζηήιαημξ, ημ θζπανυ ζχια, μζ θειθζημί αδέκεξ ηαζ ηα αζιμηφηηανα πνμένπμκηαζ απυ ημ ιεζυδενια. Σμ θζπανυ ζχια απμηεθείηαζ απυ θζπχδδ ζζηυ, εθάπηεηαζ ζηδκ εζςηενζηή επζθάκεζα ημο επζδενιζδίμο ηαζ δζακέιεηαζ ζε υθα ηα ηιήιαηα ημο εκηυιμο. Δίκαζ έκα ιεβάθμ αζμζοκεε-ηζηυ υνβακμ πμο θεζημονβεί ζε ακαθμβία ιε ημ ήπαν ηςκ εδθαζηζηχκ ηζ είκαζ οπεφεοκμ βζα ηδ ζφκεεζδ ηςκ πενζζζμηένςκ ακηζιζηνμαζαηχκ πεπηζδίςκ. Ο θειθζηυξ

9 αδέκαξ απμηεθείηαζ απυ ζοβηεηνζιέκμοξ πενζ-ηανδζαημφξ θμαμφξ πμο ανίζημκηαζ ζημ ιπνμζηζκυ ηαζ ναπζαίμ αββείμ ηαζ εεςνείηαζ υηζ δδιζμονβεί ηα αζιμηφηηανα ηδξ πνμκφιθδξ ηαζ ημο εκήθζημο αηυιμο. Σα αζιμηφηηανα είκαζ ηφηηανα πμο ηοηθμθμνμφκ ζοκεπχξ ηαζ ζπεηίγμκηαζ ιε υθμοξ ζπεδυκ ημοξ αιοκηζημφξ ιδπακζζιμφξ (Meister et al. 1997). Γηθυκα 1 : Ε ακηημηθνμβηαθή άμοκα ηεξ Drosophila (ηζπφεη γηα υια ηα μιμμεηάβμια έκημμα)(τροποποιημένη από Hoffmann and Reichhart 2002). Σα ηεθεοηαία πνυκζα έπμοκ βίκεζ ιεβάθα αήιαηα ζηδκ ηαοημπμίδζδ ηςκ ακηζιζηνμαζαηχκ πεπηζδίςκ ηαζ ηςκ μδχκ πμο νοειίγμοκ ηδ ζφκεεζή ημοξ. Όιςξ, μζ δοζημθίεξ πμο ειθακίγμκηαζ ζε ηέημζεξ ιεθέηεξ είκαζ πμθθέξ. Γζα πανάδεζβια, ημ ιζηνυ ιέβεεμξ πμθθχκ εκηυιςκ δοζημθεφεζ ανηεηά ηδ ζοθθμβή ηςκ αζιμηοηηάνςκ ηαζ ηαη επέηηαζδ ηδκ ηαοημ-πμίδζδ µμνίςκ πμο πανάβμκηαζ απυ αοηά. Δπζπθέμκ, είκαζ δφζημθδ δ δζελαβςβή πενίπθμηςκ in vivo πεζναιάηςκ βζα ηδ ιεθέηδ ηςκ ηοηηανζηχκ ακμζμαπμηνίζεςκ ηαεχξ ηαζ δ απμιυκςζδ ζοβηεηνζιέκςκ ηοηηανζηχκ πθδεοζιχκ πνμηεζιέκμο κα πνδζζιμπμζδεμφκ ζε in vitro πεζνάιαηα θυβς ηδξ πενζμνζζιέκδξ πμζυηδηαξ αζιμθέιθμο, αθθά ηαζ ηδξ αζηαεμφξ θφζδξ ηςκ ηοηηάνςκ ημο αίιαημξ ηςκ εκηυιςκ.

10 Τύποι αιμοκυττάρων και αιμοποίηση Σα αζιμηφηηανα ηςκ εκηυιςκ πενζβνάθδηακ πνχηδ θμνά ημ 1758 απυ ημκ Schwammerdam. Πνυηεζηαζ βζα πμθφιμνθα, ειπφνδκα ηφηηανα ιεζμδενιζηήξ πνμέθεοζδξ, ηα μπμία εεςνμφκηαζ μιυθμβα ηςκ ιαηνμθάβςκ ηςκ εδθαζηζηχκ, ηοηθμθμνμφκ ζηδκ αζιμθέιθμ ηαζ απμηεθμφκ ηα ιυκα έιιμνθα ζημζπεία αοηήξ. Σα αζιμηφηηανα έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα πνμζημθθχκηαζ ζηδκ επζθάκεζα ζζηχκ ζπδιαηίγμκηαξ ζοζζςιαηχιαηα πμο μκμιάγμκηαζ αηκνθπηηαξηθέο απνζήθεο ιε απυννμζα ηδκ εηθεηηζηή ηοηθμθμνία ημοξ πςνίξ κα απαζηείηαζ δ ηαηαζηνμθή ηαζ δ δδιζμονβία κέςκ αζιμηοηηάνςκ, ακαθυβςξ ηςκ πενζζηάζεςκ. Η ηαλζκυιδζή ημοξ ιέπνζ πνυζθαηα βζκυηακ ζφιθςκα ιε ηα ιμνθμθμβζηά, ζζημπδιζηά ηαζ θεζημονβζηά ημοξ παναηηδνζζηζηά, υιςξ ηα ηεθεοηαία πνυκζα πνδζζιμπμζμφκηαζ ςξ δείηηεξ ιυνζα ηδξ ηοηηανζηήξ ημοξ επζθάκεζαξ. Η πνήζδ ιμκμηθςκζηχκ ακηζζςιάηςκ χζηε κα δζαπςνζζημφκ μζ πθδεοζιμί ηςκ θεοημηοηηάνςκ απμηέθεζε ημ έκαοζια βζα ηδκ εθανιμβή ημοξ ηαζ ζηα αζιμηφηηανα ηςκ εκηυιςκ (Chain et al. 1992, Mullet et al. 1993, Willott et al. 1994, Strand and Johnsson 1996, Gardiner and Strand 1999, Lebestky et al. 2000). Οζ πζμ ημζκμί ηφπμζ αζµμηοηηάνςκ πμο ακαθένμκηαζ ζηδ αζαθζμ-βναθία είκαζ ηα πνμαζιμηφηηανα (prohaemocytes), ηα ημηηζμηφηηανα (granulocytes), ηα πθαζιαημηφηηανα (plasmatocytes), ηα ζθαζνμηφηηανα (spherulocytes) ηαζ ηα μζκμηοηηανμεζδή (oenocytoids)(εικόνα 2). Αοημί μζ ηφπμζ αζµμηοηηάνςκ έπμοκ ανεεεί ζε είδδ δζαθμνεηζηχκ ηάλεςκ ηςκ εκηυιςκ υπςξ ζε Λεπζδυπηενα, ίπηενα, Ονευπηενα, Κμθευπηενα, Τιεκυπηενα, Ηιίπηενα ηαζ άθθα (Ahmad 1988, Azambuja et al. 1991, Ahmad 1992, Luckhart et al. 1992, Fenoglio et al. 1993, Sonawane and More 1993, Butt and Shields 1996, Joshi and Lambdin 1996, Hernandez et al. 1999, de Silva et al. 2000a, Ling et al. 2003, Ling et al. 2005). Γηθυκα 2 : Μη πημ θμηκμί ηφπμη αημμθοηηάνςκ πμο ζοκακηχκηαη ζηα Θεπηδυπηενα. (Α) Ημθθημθφηηανμ, (Β) Οθαηνμθφηηανμ, (Γ) Ννμαημμθφηηανμ, (Δ) Νιαζμαημθφηηανμ θαη (Γ) Μηκμθοηηανμεηδή (τροποποιημένη από Ling et al. 2003).

11 ημ πνμκοιθζηυ ζηάδζμ ηςκ Λεπζδυπηενςκ, μζ ιμκαδζημί ηφπμζ αζµμηοηηάνςκ πμο έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα πνμζηυθθδζδξ ζε λέκεξ επζθά-κεζεξ είκαζ ηα ημηηζμηφηηανα ηαζ ηα πθαζµαημηφηηανα. Σα ηεθεοηαία απμηεθμφκ πενζζζυηενμ απυ ημ 50% ηςκ ηοηθμθμνμφκηςκ αζµμηοηηάνςκ (Strand and Pech 1995, Lackie 1988). Οζ άθθμζ ηφπμζ αζµμηοηηάνςκ πμο ακαθένμκηαζ ζηδκ ηάλδ αοηή είκαζ ηα ζθαζνμηφηηανα, ηα μζκμηοηηανμεζδή ηαζ ηα πνμαζµμηφηηανα. Σα ζθαζνμηφηηανα ιεηαθένμοκ ζοζηαηζηά ημο επζδενιζδίμο, εκχ ηα μζκμηοηηανμεζδή πενζέπμοκ πνυδνμια ηοηηανμπθαζιαηζηά µυνζα θαζκμθμλεζδάζδξ πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδκ παναβςβή ιεθακίκδξ ηαζ ζηδ ιεθακμηζηή εβηφζηςζδ (Ashida and Dohke 1980, Iwama and Ashida 1986, Jiang et al. 1997). Σα πνμαζµμηφηηανα πανα-ηηδνίγμκηαζ ςξ ανπέβμκα ηφηηανα, ηα μπμία δζαθμνμπμζμφκηαζ ζε έκακ ή πενζζζυηενμοξ απυ ημοξ πνμακαθενεέκηεξ ηοηηανζημφξ ηφπμοξ. ηδ Drosophila, ηα αζµμηφηηανα έπμοκ δζαθμνεηζηή μκμιαζία απυ εηείκα ηςκ οπμθμίπςκ εκηυιςκ (Lanot et al. 2001). ημ έκημιμ αοηυ, δ αζιμπμίδζδ πναβιαημπμζείηαζ ζε δφμ θάζεζξ ηαηά ηδκ ακάπηολδ, ηαζ πνμηφπημοκ ηνεζξ ζεζνέξ αζιμηοηηάνςκ πμο πανμοζζάγμοκ ημζκά παναηηδνζζηζηά µε ηζξ ιοεθμεζδείξ ζεζνέξ ηςκ εδθαζηζηχκ. Η πνχηδ θάζδ θαιαάκεζ πχνα ζημ δεφηενμ ιζζυ ηδξ ειανομβέκεζδξ, υηακ έκαξ πθδεοζιυξ αζιμηοηηάνςκ λεηζκά απυ ημ πνμηεθαθζηυ ιεζυδενια ηαζ ιεηακαζηεφεζ βζα κα απμζηίζεζ υθμ ημ έιανομ (Tepass et al. 1994). Αοηά ηα ηφηηανα θέβμκηαζ πθαζιαημηφηηανα ηαζ δνμοκ ςξ ιαηνμθάβα ελαθείθμκηαξ ηα απμπηςηζηά ηφηηανα. Έκαξ δεφηενμξ πθδεοζιυξ δζαθμ-νμπμζείηαζ ηαοηυπνμκα ημκηά ζηδκ πνυζεζα πενζμπή ημο εκηένμο υπμο ηαζ παναιέκεζ (Lebestky et al. 2000). Οκμιάγμκηαζ ηνοζηαθθμηφηηανα (crystal cells), πενζέπμοκ πνυδνμια ιυνζα θαζκμθμλεζδάζδξ, ιμνθμθμβζηά ιμζάγμοκ µε ηα μζκμηοηηανμεζδή ηςκ άθθςκ εκηυιςκ ηαζ μ νυθμξ ημοξ ζημ έιανομ είκαζ άβκςζημξ. Οζ θειθζημί αδέκεξ είκαζ μζ ηφνζεξ πενζμπέξ αζιμπμίδζδξ ηαηά ηα πνμκοιθζηά ζηάδζα (Lanot et al. 2001). Απμηεθμφκηαζ απυ πμζηίθμ ανζειυ γεοβανζχκ θμαχκ πμο είκαζ ημπμεεηδιέκα ηαηά ιήημξ ημο ναπζαίμο αββείμο. ημοξ μπίζεζμοξ θμαμφξ οπάνπμοκ ηονίςξ µδ δζαθμνμπμζδιέκα πνυδνμια ηφηηανα, ηα πνμαζιμηφηηανα. Πζμ ιπνμζηά παναηδνμφκηαζ δζαθμνμπμζδιέκα ηφηηανα, πμο απεθεοεενχκμκηαζ ζηδκ ηοηθμθμνία ηαζ ηα μπμία ζηδκ πθεζμρδθία ημοξ είκαζ πθαζµαημηφηηανα ή θαβμηφηηανα, εκχ έκα ιζηνυ πμζμζηυ, πενίπμο 5%, ακηζζημζπεί ζε ηνοζηαθθμηφηηανα. ημοξ πνυζεζμοξ θμαμφξ ηςκ θειθαδέκςκ οπάνπεζ έκαξ επζπθέμκ ηφπμξ ηοηηάνςκ πμο πανμοζζάγεζ παναηηδνζζηζηά έκημκδξ πνςηεσκμζφκεεζδξ. Αοηά ηα εηηνζηζηά ηφηηανα δεκ απακηχκηαζ ζηδκ ηοηθμθμνία. Σέθμξ, ζηζξ πνμκφιθεξ οπάνπεζ ιζα ηνίηδ ακελάνηδηδ ζεζνά αζιμηοηηάνςκ, βκςζηά ςξ εθαζιαημηφηηανα (lamellocytes), ηα μπμία δζαθμνμπμζμφκηαζ ιαγζηά ζημοξ θειθαδέκεξ ιεηά απυ πενζπηχζεζξ παναζζηζζιμφ. Πνυηεζηαζ βζα ιεβάθα ηαζ επίπεδα ηφηηανα

12 πμο ζοιιεηέπμοκ ζηδκ εβηφζηςζδ εζζαμθέςκ, μζ μπμίμζ είκαζ ανηεηά ιεβάθμζ ζε ιέβεεμξ χζηε κα οπμζημφκ ηοηηανμθαβία. Σα έκημια ζοκεπίγμοκ ηδκ παναβςβή αζιμηοηηάνςκ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηςκ ζηαδίςκ ηδξ πνμκφιθδξ ηαζ ηδξ κφιθδξ είηε µε ηδ δζαίνεζδ ηςκ ανπέβμκςκ ηοηηάνςκ πμο εκημπίγμκηαζ ζηα ιεζμδενιζηήξ πνμέθεοζδξ αζιμπμζδηζηά υνβακα είηε µε ηδ δζαίνεζδ ηςκ αζµμηοηηάνςκ πμο ανίζημκηαζ ήδδ ζηδκ ηοηθμθμνία. Καηά ηδκ έκανλδ ηδξ ιεηαιυνθςζδξ, απεθεοεενχκεηαζ απυ ημοξ θειθαδέκεξ ιεβάθμξ ανζειυξ εκενβχκ θαβμηοηηάνςκ πμο παίγμοκ πμθφ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδκ ακαηαηαζηεοή ηςκ ζζηχκ, ηαεχξ θαβμηοηηα-νχκμοκ ηφηηανα ηςκ ηαηεζηναιιέκςκ πνμκοιθζηχκ δμιχκ. Καηά ηδ δζαδζηαζία αοηή, απμιαηνφκμοκ ηα οπμθείιιαηα ηςκ θειθαδέκςκ, µε απμηέθεζια ζηα ηεθεοηαία ζηάδζα κα µδκ οπάνπεζ ηακέκα αζιμπμζδηζηυ υνβακμ (Lanot et al. 2001). Όθεξ μζ ηνμπμπμζήζεζξ ηςκ ζζηχκ πμο ζπεηίγμκηαζ µε ηδ ιεηαιυνθςζδ ανίζημκηαζ οπυ ημκ έθεβπμ ηδξ ζηενμ-εζδμφξ μνιυκδξ εθδπζόλεο (Sorrentino et al. 2002, Lanot et al. 2001). ηα εκήθζηα άημια ηδξ Drosophila, μ ηονίανπμξ ηφπμξ ηςκ αζιμηοηηάνςκ πμο ηοηθμθμνμφκ είκαζ ηα πθαζιαημηφηηηανα. Ανοσοαποκρίσεις αιμοκυττάρων Η ηφνζα θεζημονβία ηςκ αζιμηοηηάνςκ είκαζ δ ακμζμθμβζηή απυηνζζδ (νξνινγηθή ή θπηηαξηθή) έκακηζ πνμζαμθχκ ημο αζιμημίθμο απυ παεμβυκμοξ ή ιδ ιζηνμμνβακζζιμφξ, εκχ επίζδξ ζοιιεηέπμοκ ζηδ δζαδζηαζία επμφθςζδξ ηςκ πθδβχκ ιε ημ ζπδιαηζζιυ ενυιαμο πνμξ απμθοβή απχθεζαξ ηδξ αζιμθέιθμο. Η νξνινγηθή αλνζία, υπςξ πνμακαθένεδηε, πενζθαιαάκεζ ηδ ζφκεεζδ ακηζααηηδνζαηχκ πεπηζδίςκ ηαζ πνςηεσκχκ πμο εηηνίκμκηαζ ζηδκ αζιμθέιθμ. Σμ θζπανυ ζχια απμηεθεί ημκ ζζηυ πμο είκαζ ηονίςξ οπεφεοκμξ βζα ηδ ζφκεεζδ ηςκ πνςηεσκχκ αοηχκ. ε ιζηνυηενμ ααειυ ζοκεζζθένμοκ ηα αζιμηφηηανα ηαζ άθθμζ ζζημί υπςξ ηα πενζηανδζαηά ηφηηανα, ηα ιαθπζββζακά ζςθδκάνζα ηαζ ημ ιεζέκηενμ. Σα ιυνζα αοηά ηαλζκμιμφκηαζ ζε δζάθμνεξ ηαηδβμνίεξ ιε αάζδ ηδκ μιμζυηδηα ηδξ αθθδθμοπίαξ ημοξ. Σα ηονζυηενα απυ αοηά είκαζ: νη ιπζνδύκεο, νη θεθξνπίλεο, νη δηπηεξηζίλεο, νη ληεθελζίλεο θαη ε νηθνγέλεηα αηηαθηίλεο/ ζαξθνηνμίλεο ΙΙ. Η ηαοημπμίδζδ ηαζ μ παναηηδνζζιυξ ηςκ ακηζααηηδ-νζαηχκ πεπηζδίςκ ηαζ πνςηεσκχκ, απμηεθμφκ πεδίμ έκημκδξ ένεοκαξ, θυβς ηδξ πζεακήξ αλζμπμίδζήξ ημοξ ςξ ακηζαζμηζηχκ (Hoffmann and Reichhart 2002). Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, μζ ακμζμθμβζηέξ απμηνίζεζξ ηςκ αζιμηοηηάνςκ πμο οπάβμκηαζ ζηδκ θπηηαξηθή αλνζία είκαζ μζ παναηάης (Hoffmann 1995): οζζςιάηςζδ ηςκ αζιμηοηηάνςκ (haemocyte aggregation)

13 Κοηηανζηή εβηφζηςζδ (encapsulation): Η εβηφζηςζδ είκαζ ιία δζαδζηαζία, δ μπμία θαιαάκεζ πχνα υηακ μ εζζαμθέαξ είκαζ εοιεβέεδξ, μπυηε ηα αζµμηφηηανα πενζηοηθχκμοκ ημ ζηυπμ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα πνμζημθθχκηαζ ζηδκ επζθάκεζά ημο. Πναβιαημπμζείηαζ ζε δφμ θάζεζξ. Ανπζηά ηα αζµμηφηηανα ζοζζςιαηχκμκηαζ βφνς απυ ημκ εζζαμθέα ηαζ ζηδ ζοκέπεζα θφκμκηαζ ηαζ απεθεοεενχκμοκ ζημκ μνυ μοζίεξ πμο πνμζεθηφμοκ άθθα αζµμηφηηανα ηαζ ζοιπθδνχκμοκ ημ ζπδιαηζζιυ ηδξ ηφζηδξ. πδιαηζζιυξ μγζδίςκ (nodulation): Όηακ μ ανζειυξ ηςκ ιζηνμμνβακζζιχκ πμο εζζαάθθμοκ ζημ αζιυημζθμ είκαζ πμθφ ιεβάθμξ ζπδιαηίγμκηαζ μγίδζα χζηε κα απμιαηνοκεμφκ µε ηδ δζαδζηαζία ηδξ ηοηηανμθαβίαξ. Πμθθέξ θμνέξ δ δζάηνζζδ ακάιεζα ζηα μγίδζα ηαζ ηζξ ηφζηεζξ είκαζ δφζημθδ, εκχ είκαζ δοκαηυκ μζ δφμ δζαδζηαζίεξ κα πναβιαημπμζμφκηαζ ηαοημπνυκςξ. Γζα ημ ζπδιαηζζιυ ηςκ μγζδίςκ έπεζ πνμηαεεί υηζ ηα αζιμηφηηανα απμημηηζχκμκηαζ ηαζ απεθεοεενχκμοκ πανάβμκηεξ πμο πνμηαθμφκ ηδ ζοζζςιάηςζδ ηςκ ααηηδνίςκ. Κοηηανμθαβία (phagocytosis): Η ηοηηανμθαβία είκαζ ιία δζαδζηαζία ηαηά ηδκ μπμία πναβιαημπμζείηαζ δ ακαβκχνζζδ ηαζ δ εβηυθπςζδ ιζηνμμνβακζζιχκ ή ηαηαθμίπςκ ζζηχκ πμο ζοζζςνεφμκηαζ ηαηά ηδ ιυθοκζδ, ηδ θθεβιμκή ή ηδκ επμφθςζδ πθδβχκ (Brown 1994). Η δζαδζηαζία αοηή εα ακαθοεεί αιέζςξ παναηάης. Κυτταροφαγία Η ηοηηανμθαβία παναηδνείηαζ ζε υθμοξ ημοξ μνβακζζιμφξ, είηε είκαζ ιμκμηφηηανμζ είηε πμθοηφηηανμζ, ιε δζαθμνεηζηυ υιςξ ζημπυ. Έηζζ, βζα ημοξ ιμκμηφηηανμοξ μνβακζζιμφξ δ δζαδζηαζία αοηή απμηεθεί ημκ ηαη ελμπήκ ηνυπμ πνυζθδρδξ ηδξ ηνμθήξ, εκχ βζα ημοξ ακχηενμοξ μνβα-κζζιμφξ είκαζ ααζζηυ ζημζπείμ ημο αιοκηζημφ ζοζηήιαημξ, αθμφ είκαζ απαναίηδηδ ηυζμ βζα ηδκ εζδζηή υζμ ηαζ βζα ηδ ιδ εζδζηή άιοκα, βζα ηδκ ηαηαζηνμθή ηςκ παεμβυκςκ εζζαμθέςκ, ηαεχξ επίζδξ ηαζ ηδ δζαηήνδζδ ηδξ μιμζυζηαζδξ ζηα ζδιεία πνμζαμθήξ ηαζ θθεβιμκήξ (επνύισζε πιεγώλ). Δπζπθέμκ, ααζζηυξ είκαζ μ νυθμξ ηδξ ζηδκ πανμοζίαζδ ημο ακηζβυκμο ηαηά ηδκ επαβςβή ηαζ ηδκ εκενβμπμίδζδ ηςκ θειθμηοηηάνςκ. ημοξ ακχηενμοξ ελεθζηηζηά μνβακζζιμφξ, δ ηοηηανμθαβία επζηε-θείηαζ απυ ελεζδζηεοιέκα ηφηηανα πνμενπυιεκα απυ ημ ιοεθυ ηςκ μζηχκ, ηα μοδεηενυθζθα, ηα ιμκμηφηηανα ηαζ ηα ιαηνμθάβα. Σα ηεθεοηαία απακηχκηαζ ζε ηάεε ζζηυ ηαζ θαίκεηαζ κα παίγμοκ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδκ άιοκα έκακηζ ηςκ ιμθφκζεςκ, ζηδκ επμφθςζδ πθδβχκ ηαζ ηδκ ακακέςζδ ηςκ ζζηχκ, εκχ ηα μοδεηενυθζθα ηαζ ηα ιμκμηφηηανα ανίζημκηαζ ζηδκ ηοηθμθμνία ηαζ απακηχκηαζ ζε μθυηθδνμ ημ ζχια.

14 ηα έκημια, μζ ηονζυηενεξ ηαηδβμνίεξ αζιμηοηηάνςκ πμο πναβιαημπμζμφκ ηοηηανμθαβία είκαζ ηα πιαζκαηνθύηηαξα ηαζ ηα θνθθηνθύηηαξα (Gupta 1991). Σα έκημια είκαζ βκςζηυ υηζ δε δζαεέημοκ ακμζμζθαζνίκεξ, υιςξ έπμοκ βίκεζ πμθθέξ ακαθμνέξ βζα ηδκ πανμοζία ποιζηχκ θεηηζκχκ, μζ μπμίεξ θεζημονβμφκ ςξ νςσλίλεο (Pendland and Boucias 1996). Δπίζδξ, ημ ζφζηδια ηδξ πνμθαζκμθμλεζδάζδξ πμο οπάνπεζ ζηα ανενυπμδα, ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ηαζ ηςκ εκηυιςκ, επάβεζ ημ ζπδιαηζζιυ ημθθςδχκ ζοζηαηζηχκ ηα μπμία δνμοκ ςξ μρςκίκεξ ηαζ θεζημονβζηά ιμζάγμοκ ιε πανάβμκηεξ ημο ζοιπθδνχιαημξ ηςκ ζπμκδοθςηχκ. Σα αζιμηφηηανα θαβμηοηηανχκμοκ αζμηζημφξ πανάβμκηεξ υπςξ ααηηήνζα, γοιμιφηδηεξ ή/ηαζ απμπηςηζηά ζςιάηζα, ηαεχξ επίζδξ ηαζ ιζηνμφξ ααζμηζημφξ πανάβμκηεξ υπςξ ηα ζοκεεηζηά εθαζηζηά ζθαζνίδζα (Lavine and Strand 2002, Hernandez et al. 1999)(Εικόνες 3 & 4). ηα Λεπζδυπηενα, ηα ημηηζμηφηηανα ηαζ ηα πθαζµαημηφηηανα, εκχ ζηα Γίπηενα ιυκμ ηα πθαζµαημηφηηανα είκαζ μζ ηφνζεξ ηαηδβμνίεξ θαβμ-ηοηηάνςκ (Elrod-Erickson et al. 2000, Lamprou et al. 2005). Η ηοηηανμ-θαβία ηαζ μζ ιδπακζζιμί ηδξ ζηα έκημια δεκ έπμοκ αηυια δζεοηνζκζζηεί πθήνςξ. Η πθεζμκυηδηα ηςκ ιεθεηχκ έπεζ πναβιαημπμζδεεί ζηδ ιφβα ηδξ Μεζμβείμο ηαζ έπεζ μδδβήζεζ ζημ ζοιπέναζια υηζ μζ ιδπακζζιμί ιεηαβςβήξ ιδκοιάηςκ ηαηά ηδκ ηοηηανμθαβία είκαζ ςξ έκα ααειυ ζοκηδνδιέκμζ ιεηαλφ εκηυιςκ ηαζ εδθαζηζηχκ (Foukas et al. 1998, Metheniti et al. 2001). Η δζαπίζηςζδ αοηή δίκεζ ιεβάθδ αανφηδηα ζηδ ιεθέηδ ηςκ ιδπακζζιχκ αοηχκ. Γηθυκα 3 : Ηοηηανμθαγία ζοκζεηηθχκ ειαζηηθχκ ζθαηνηδίςκ απυ έκα θαγμθφηηανμ (A τροποποιημένη από και Β από Γηθυκα 4 : Ηοηηανμθαγία εκυξ βαθηενίμο απυ έκα θαγμθφηηανμ (τροποποιημένη από «Molecular Biology of the Cell», Alberts et al. 2002).

15 ΜΗΦΑΝΙΜΟ ΚΤΣΣΑΡΟΥΑΓΙΑ Η ηοηηανμθαβία λεηζκά µε ηδκ πνυζδεζδ ημο ιζηνμμνβακζζιμφ ζημκ οπμδμπέα ημο. ηδ ζοκέπεζα ημ θαβμηφηηανμ, µε ηδ ιεζμθάαδζδ ημο ηοηηανμζηεθεημφ ηδξ αηηίκδξ, επεηηείκεζ πνμεηαμθέξ ηδξ ηοηηανμπθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ ημο, πμο μκμιάγμκηαζ ςεπδνπόδηα, βφνς απυ ημ ιζηνμμνβακζζιυ πμο έπεζ ακαβκςνίζεζ, δ ιειανάκδ ζοκηήηεηαζ ηαζ ζπδιαηίγεηαζ έκα ηοζηίδζμ, ημ θαγόζσκα, ημ μπμίμ εβηθείεζ ημ ιζηνμμνβακζζιυ. Σμ θαβυζςια απμηυπηεηαζ ηαζ ιεηαηζκείηαζ πνμξ ημ εζςηενζηυ ημο ηοηηάνμο υπμο ζοκηήηεηαζ ιε θομζχιαηα ηαζ ζπδιαηίγεζ ημ θαγνιπόζσκα. Σαοημπνυκςξ, ηαεχξ μ ιζηνμμνβακζζιυξ ζοκδέεηαζ ιε ημοξ οπμδμπείξ ημο θαβμηοηηάνμο ηαζ θαβμηοηηανχκεηαζ, μζ οπμδμπείξ απμζηέθθμοκ ζήιαηα πμο εκενβμπμζμφκ δζάθμνα έκγοια ιέζα ζημ θαβμθουζςια ζηακά βζα ηδκ ηαηαζηνμθή ημο ιζηνμμνβακζζιμφ. Έηζζ, μ ζηυπμξ εακαηχκεηαζ ή δζαζπάηαζ µε ηζξ εθεφεενεξ νίγεξ μλοβυκμο πμο πανάβμκηαζ ζηα θαβμζχιαηα ή µε ηδ αμήεεζα θομζςιαηζηχκ εκγφιςκ («Βιολογία Κυττάρου Μοριακή προσέγγιση», Μαρμάρας και Λαμπροπούλου- Μαρμάρα 2000). ηδκ Εικόνα 5 πανμοζζάγεηαζ δ βεκζηή πμνεία ηδξ ηοηηανμθαβίαξ. Γηθυκα 5 : Μ μεπακηζμυξ ηεξ θοηηανμθαγίαξ. Μ εηζβμιέαξ, αθμφ πνμζδεζεί ζηεκ επηθάκεηα ημο θοηηάνμο, εζςηενηθεφεηαη ζπεμαηίδμκηαξ έκα θαγυζςμα, ημ μπμίμ φζηενα απυ ζφκηελε με έκα ιουζςμα, μδεγεί ζε θαηαζηνμθή ημο εηζβμιέα, εκχ ηα οπμιείμμαηα πμο δε δφκακηαη κα πνεζημμπμηεζμφκ απυ ημ θφηηανμ απειεοζενχκμκηαη απυ αοηυ με ηε δηαδηθαζία ηεξ ελςθοηηάνςζεξ (τροποποιημένη από «Micro-biology: An introduction», Tortora et al. 2004).

16 Οζ ιδπακζζιμί ακαβκχνζζδξ πμο μδδβμφκ ζηδκ ηοηηανμθαβία είκαζ ηοηηανζημί ή μνμθμβζημί (ρπκηθνί). Γεκζηά, θαίκεηαζ υηζ δζαθμνεηζημί οπμδμπείξ ιεηααζαάγμοκ δζαθμνεηζηά ζήιαηα ζημκ ηοηηανμζηεθεηυ ηδξ αηηίκδξ πνμςεχκηαξ δζαθμνεηζημφξ ιδπακζζιμφξ εκδμηοηηάνςζδξ. Αοηυ θαίκεηαζ απυ ιεθέηεξ ηςκ ζπδιαηζγυιεκςκ ζε ηάεε πενίπηςζδ ηοηηανμζηεθεηζηχκ δμιχκ, υπμο εκημπίγμκηαζ δζαθμνεηζηέξ ζδιαημδμηζηέξ πνςηεΐκεξ ακαθυβςξ ημο οπμδμπέα πμο είκαζ οπεφεοκμξ βζα ηδκ ηοηηανμθαβία (Allen et al. 1996). ΗΤΣΣΑΡΖΗΕ ΓΠΖΗΟΖΚΩΚΖΑ Σα ηφηηανα έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα αθθδθεπζδνμφκ ιεηαλφ ημοξ ηαζ αοηή δ αθθδθεπίδναζδ είκαζ βκςζηή ςξ ηοηηανζηή επζημζκςκία (cell signaling). Η ελέθζλδ ηςκ πμθοηφηηανςκ μνβακζζιχκ ηαεχξ ηαζ ημ ζφκμθμ ηςκ ηοηηανζηχκ θεζημονβζχκ ααζίγμκηαζ ζηδκ ζηακυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ κα επζημζκςκμφκ ιεηαλφ ημοξ. Η ηοηηανζηή επζημζκςκία επζηοβπάκεηαζ είηε ιε ηδκ άιεζδ επαθή εκυξ ηοηηάνμο ιε ηα βεζημκζηά ημο είηε ειιέζςξ ιε ηδ αμήεεζα δζαθυνςκ εηηνζκυιεκςκ ζδιαημδμηζηχκ ιμνίςκ, απυ ηφηηανα πμο ανίζημκηαζ ημκηά ή ιαηνζά απυ ημ ηφηηανμ-ζηυπμ. Η ιεηαβςβή ζδιάηςκ απυ ηδκ άιεζδ επαθή ηςκ ηοηηάνςκ ιε ηα βεζημκζηά ημοξ ή απυ ηδκ αθθδθεπί-δναζή ημοξ ιε ηδκ ελςηοηηάνζα φθδ πναβιαημπμζείηαζ ιέζς οπμδμπέςκ, ζοκδεηζηχκ ιμνίςκ ηαεχξ ηαζ ιμνίςκ ιεηααίααζδξ ιδκοιάηςκ, εκχ ηα ιδκοιαημθυνα ιυνζα πμζηίθμοκ ςξ πνμξ ηδκ πνμέθεοζδ, ηδ δμιή ηαζ ηδ θεζημονβία. Πμθθά απυ ηα ζήιαηα πμο δέπεηαζ ηάεε ηφηηανμ, αημθμοεμφκ ιζα ζοβηεηνζιέκδ μδυ ιεηααίααζδξ, απυ ηδκ ηοηηανζηή ιειανάκδ ιέπνζ ημκ πονήκα ημο ηοηηάνμο. Γζα ημ ζημπυ αοηυ, ηα ηφηηανα έπμοκ ακαπηφλεζ ιμνζαημφξ ιδπακζζιμφξ βζα ηδκ ακαβκχνζζδ ηςκ ζδιαημδμηζηχκ ιμνίςκ ηαζ ηδ ιεηαθμνά ημο ζήιαημξ ζημ εζςηενζηυ ημοξ. Καηά ηδ ιεηαβςβή ηδξ πθδνμθμνίαξ ζοκηεθείηαζ ιζα αθθδθμοπία ακηζδνάζεςκ, δ μπμία πενζθαιαάκεζ ηονίςξ δζαδμπζηέξ θςζθμνοθζχζεζξ ηαζ απμθςζθμνοθζχ-ζεζξ πνςηεσκχκ πμο πναβιαημπμζμφκηαζ ιε ηδ ιεζμθάαδζδ ηζκαζχκ ηαζ θςζθαηαζχκ ακηζζημίπςξ. Με ημκ ηνυπμ αοηυ, μζ πνςηεΐκεξ εκενβμπμζμφκηαζ ηαζ απεκενβμπμζμφκηαζ ακαθυβςξ ηςκ απαζηήζεςκ ημο ηοηηάνμο. Έκα ηφηηανμ ζε έκακ πμθοηφηηανμ μνβακζζιυ είκαζ εηηεεεζιέκμ ζε εηαημκηάδεξ δζαθμνεηζηά ιυνζα-ζήιαηα. Αοηά ηα ζήιαηα ιπμνεί κα είκαζ δζαθοηά, πνμζδειέκα ζηδκ ελςηοηηάνζα φθδ (ECM), ή αηυιδ δεζιεοιέκα ζηδκ επζθάκεζα βεζημκζηχκ ηοηηάνςκ, ιε απμηέθεζια κα ιπμνμφκ κα ζοκδοαζημφκ µε πάνα πμθθμφξ δζαθμνεηζημφξ ηνυπμοξ. Ωζηυζμ, ημ ηφηηανμ, ακηαπμηνίκεηαζ ζηδκ πθδεχνα ηςκ ζδιάηςκ επζθεηηζηά, ζφιθςκα µε ημκ εζδζηυ παναηηήνα πμο έπεζ απμηηήζεζ µε πνμμδεοηζηή ηοηηανζηή ελεζδίηεοζδ ηαηά ηδκ ακάπηολδ. Έηζζ, έκα ηφηηανμ ιπμνεί κα είκαζ

17 πνμβναιιαηζζιέκμ κα απμηνίκεηαζ ζε έκα ζοκδοαζιυ ζδιάηςκ µε δζαθμνμπμίδζδ, εκχ ζε άθθμ ζοκδοαζιυ κα ακηζδνά µε πμθθαπθαζζαζιυ, ή αηυια εηηεθχκηαξ εζδζηέξ θεζημονβίεξ υπςξ είκαζ δ ζφζπαζδ ηαζ δ έηηνζζδ (Εικόνα 6). Η πνήζδ αοηχκ ηςκ πμθοάνζειςκ ζοκδοαζιχκ ζδιάηςκ βζα ημκ έθεβπμ ηδξ ηοηηανζηήξ ζοιπενζθμνάξ επζηνέπεζ ζημοξ μνβακζζιμφξ κα εθέβπμοκ ηα ηφηηανά ημοξ µε πμθφ εζδζηυ ηαζ ηαοημπνυκςξ «μζημκμιζηυ» ηνυπμ πνδζζιμπμζχκηαξ ιζα πενζμνζζιέκδ πμζηζθία ζδιαημδμηζηχκ µμνίςκ. Γηθυκα 6: Ηάζε θοηηανηθυξ ηφπμξ εμθακίδεη δηαθμνεηηθμφξ ζοκδοαζμμφξ οπμδμπέςκ πμο ημο επηηνέπμοκ κα απμθνίκεηαη ζε ίδηα ή δηαθμνεηηθά ενεζίζμαηα με δηαθμνεηηθυ ηνυπμ. Πα ζεμαημδμηηθά μυνηα δνμοκ ζε ζοκδοαζμμφξ νοζμίδμκηαξ ηε ζομπενηθμνά ηςκ θοηηάνςκ. Έηζη, ημ θφηηανμ απαηηεί πμιιαπιά ζήμαηα γηα κα επηβηχκεη, εκχ πνυζζεηα μεκφμαηα μπμνεί κα μδεγήζμοκ ημ θφηηανμ ζε δηαίνεζε ή ζε δηαθμνμπμίεζε. Όηακ ημ θφηηανμ ζηενεζεί ηα ζήμαηα επηβίςζεξ, ηυηε εθηειεί έκακ ηφπμ θοηηανηθήξ αοημθημκίαξ, ηεκ απυπηςζε (τροποποιημένη από «Molecular Biology of the Cell», Alberts et al. 2002). Μεταγωγή σημάτων ε ηάεε ηφηηανμ οπάνπεζ έκα πμθφπθμημ δίηηομ επζημζκςκίαξ βζα ηδκ οπμδμπή, ηδκ επελενβαζία ηαζ ηδ ιεηααίααζδ ηδξ ελςηενζηήξ πθδνμ-θμνίαξ ζημ εζςηενζηυ ημο ηοηηάνμο ηαζ ζοβηεηνζιέκα ζημκ πονήκα ημο (Εικόνα 7). ε αοηυ ημ ηοηηανζηυ δίηηομ ειπενζέπμκηαζ : Ιεμβρακηθοί θαη εκδοθσηηαρηθοί σποδοτείς: Τποδοτείς ηωκ οποίωκ ηο θσηηαροπιαζμαηηθό ημήμα ζσκδέεηαη με G πρωηεΐκες Τποδοτείς με εκδσμηθή εκεργόηεηα ή σποδοτείς ποσ ζσκδέοκηαη με έκδσμα Τποδοτείς-ηοκηηθά θακάιηα ποσ ακοίγοσκ ή θιείκοσκ με ηε δέζμεσζε ηοσ ζεμαηοδοηηθού μορίοσ Πρωηεΐκες δηαβηβαζηές Ιεκσμαηοθόρες πρωηεΐκες Ακαγκςνίδμοκ θαη δεζμεφμοκ ηα ζεμαημδμηηθά μυνηα Δηαβηβάδμοκ ημ ζήμα ζημ επυμεκμ ζεμαημδμηηθυ μυνημ-ζηυπμ ηεξ μδμφ μεηαγςγήξ ζεμάηςκ Ιεηαθένμοκ ημ μήκομα απυ ημ έκα μένμξ ζε άιιμ

18 Πρωηεΐκες-ζσκδεηήρες Πρωηεΐκες εκηζτσηές Πρωηεΐκες μεηαηροπείς Πρωηεΐκες δηαθιάδωζες Πρωηεΐκες εκοποίεζες Πρωηεΐκες γοκηδηαθής ρύζμηζες ποσ βρίζθοκηαη ζε προζωρηκή αδράκεηα Οοκδέμοκ ζεμαημδμηηθέξ πνςηεΐκεξ μεηαλφ ημοξ δίπςξ κα μεηαβηβάδμοκ ημ ζήμα Έκδομα ή ημκηηθμί δίαοιμη πμο εκηζπφμοκ ημ ζήμα πμο ιαμβάκμοκ Ιεηαηνέπμοκ ημ ζήμα ζε δηαθμνεηηθή μμνθή Δηακέμμοκ ημ ζήμα απυ ημ έκα μεηαγςγηθυ μμκμπάηη ζημ άιιμ Οογθεκηνχκμοκ ζήμαηα απυ δφμ ή πενηζζυηενα μεηαγςγηθά μμκμπάηηα θαη ηα ζοκεκχκμοκ πνηκ πνμςζήζμοκ ηεκ πιενμθμνία πνμξ ηεκ επυμεκε πνςηεΐκε Γκενγμπμημφκηαη θμκηά ζηεκ θοηηανηθή επηθάκεηα απυ εκενγμπμηεμέκμοξ θοηηανηθμφξ οπμδμπείξ θαη μεηακαζηεφμοκ πνμξ ημκ πονήκα γηα κα ηνμπμπμηήζμοκ ηε γμκηδηαθή έθθναζε Γηθυκα 7 : Πμ πμιφπιμθμ δίθηομ μεηαγςγήξ ζήμαημξ (τροποποιημένη από «Molecular Biology of the Cell», Alberts et al. 2002).

19 Μεταγωγή εξωκυτταρικών σημάτων από τις ιντεγκρίνες προς την FAK Οζ πζμ ηαθά ιεθεηδιέκμζ οπμδμπείξ ζδιάηςκ απυ ζδιεία επαθήξ ημο ηοηηάνμο ιε ηδκ ελςηοηηάνζα φθδ είκαζ μζ ζκηεβηνίκεξ. Η μκμιαζία ημοξ πνμένπεηαζ απυ ημ νήια integrate πμο ζδιαίκεζ θένς ζε ζοκάθεζα, αθμφ θένμοκ ζε ζοκάθεζα ημκ ηοηηανμζηεθεηυ ιε ηδκ ελςηοηηάνζα φθδ. Οζ οπμδμπείξ αοημί είκαζ δζαιειανακζηέξ πνςηεΐκεξ, εηενμδζιενείξ απυ α ηαζ α πεπηζδζηέξ αθοζίδεξ πμο ζοκδέμκηαζ ιεηαλφ ημοξ µε αζεεκείξ δεζιμφξ (Εικόνα 8). Γηθυκα 8: Οπεμαηηθή απεηθυκηζε ηεξ δμμήξ ηςκ ηκηεγθνηκχκ (τροποποιημένη από «Molecular Biology of the Cell», Alberts et al. 2002). ηδκ α αθοζίδα ( kda), ημ αιζκμηεθζηυ άηνμ πμο επεηηεί-κεηαζ ζημκ ελςηοηηάνζμ πχνμ παναηηδνίγεηαζ απυ πμθθαπθέξ εκενβέξ πενζμπέξ (domains) ζηζξ μπμίεξ δεζιεφμκηαζ δζζεεκή ηαηζυκηα πμο ζοιαάθθμοκ ζηδ θεζημονβία ηδξ ζκηεβηνίκδξ. Η δζαιειανακζηή πενζμπή ηδξ α αθοζίδαξ ζοκήεςξ ηυπηεηαζ ζηδ ιέζδ (κεηα-κεηαθξαζηηθή ηξνπνπνίεζε) ηαζ επακαζοκδέεηαζ ιε δζζμοθθζδζηυ δεζιυ. Σμ ιζηνυηενμ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ ηδξ α αθοζίδαξ ηαηαθήβεζ ζημ ηοηηανυπθαζια. ηδ α αθοζίδα ( kda), ημ αιζκμηεθζηυ άηνμ ζημκ ελςηοηηάνζμ πχνμ παναηηδνίγεηαζ απυ 56 ηοζηεΐκεξ, ηςκ μπμίςκ δ εέζδ είκαζ αοζηδνά ζοκηδνδιέκδ ιεηαλφ υθςκ ηςκ α αθοζίδςκ ηαζ απμηεθμφκ πζεακά ζδιεία ζπδιαηζζιμφ δζζμοθθζδζηχκ δεζιχκ πμο παίγμοκ ζδιακηζηυ νυθμ ζηδ δζαηήνδζδ ηδξ δμιήξ ηδξ ζκηεβηνίκδξ. Η δζαιειανακζηή πενζμπή ηδξ α οπμιμκάδαξ ηαηαθήβεζ ζημ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ ιέζα ζημ ηοηηανυπθαζια ηαζ είκαζ αοηή δ πενζμπή πμο

20 αθθδθεπζδνά ιε ημκ ηοηηανμζηεθεηυ ηδξ αηηίκδξ ιέζς ηοηηανμπθαζιαηζηχκ πνςηεσκχκ υπςξ δ ηαθίκδ, δ αζκημοθίκδ ηαζ δ α- αηηζκίκδ. Σα ζήιαηα πμο πενκμφκ µέζς ζκηεβηνζκχκ απυ ηα ζδιεία επαθήξ ζπεηίγμκηαζ µε ηδκ ηοηηανζηή αφλδζδ, ηδκ ηοηηανζηή ηίκδζδ, ηδκ άιοκα ηαζ ηδκ επζαίςζδ (Brakebusch et al. 2002). οκεπχξ, μζ ζκηεβηνίκεξ νοειίγμοκ πμθοάνζεια ηοηηανζηά ιμκμπάηζα ιεηαβςβήξ ζδιάηςκ (Hynes 2002). Η φπανλδ ηςκ ζκηεβηνζκχκ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηα ηφηηανα, βεβμκυξ πμο επζαεααζχκεηαζ ηυζμ απυ ηδκ εηηεηαιέκδ έηθναζδ ημοξ ηαηά ηδκ ακάπηολδ υζμ ηαζ απυ ημ πθήεμξ ηςκ αζεεκεζχκ πμο ζπεηίγμκηαζ µε ακςιαθίεξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ. Οζ ζκηεβηνίκεξ ζοκζζημφκ ημοθάπζζημκ ηνεζξ ηαηδβμνίεξ μζημβεκεζχκ βμκζδίςκ ηαζ απακημφκ ζε υθα ζπεδυκ ηα ηφηηανα. Γζα ηδ νφειζζδ ηδξ ηοηηανζηήξ αφλδζδξ ηαζ δζαθμνμπμίδζδξ, μζ ζκηεβηνίκεξ ζοκενβάγμκηαζ µε άθθμοξ οπμδμπείξ ηδξ ηοηηανζηήξ επζθάκεζαξ, υπςξ βζα πανάδεζβια ιε ημοξ οπμδμπείξ ηςκ αολδηζηχκ παναβυκηςκ. Γεκ επανηεί υιςξ αοηυ, αθμφ μζ ζκηεβηνίκεξ εα πνέπεζ κα εκενβμπμζδ-εμφκ βζα κα ζοκδεεμφκ µε ηδκ ελςηοηηάνζα φθδ. Φαίκεηαζ υηζ ελςηοηηα-νζηά ζήιαηα εκενβμπμζμφκ εκδμηοηηανζημφξ πανάβμκηεξ, μζ μπμίμζ µε ηδ ζεζνά ημοξ αθθάγμοκ ηδ δζαιυνθςζδ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ηαζ ηαηά ζοκέπεζα ηδκ ζηακυηδηα πνμζηυθθδζήξ ημοξ ζηδκ ελςηοηηάνζα φθδ (Εικόνα 9). Γηθυκα 9 : Όηακ μη ηκηεγθνίκεξ βνίζθμκηαη ζε ακεκενγή θαηάζηαζε έπμοκ ηέημηα δηαμυνθςζε χζηε κα μεκ αιιειεπηδνμφκ με ελςθοηηανη-θμφξ πνμζδέηεξ. Ε εκενγμπμίεζή ημοξ μπμνεί κα γίκεη είηε απυ ελςθοηηανηθυ πνμζδέηε είηε απυ θάπμηα εκδμθοηηανηθή πνςηεΐκε (π.π. ηαιίκε). Ε ζοκάζνμηζε ηςκ ηκηεγθνηκχκ ζηαζενμ-νμπμηείηαη απυ μμμμιηγμμενή ηςκ δηαμεμβνακηθχκ ημεμάηςκ ηςκ α θαη β οπμμμκάδςκ. Αοηέξ μη αιιειεπηδνάζεηξ θένμοκ ζε γεηηκίαζε ηηξ ηκηεγθνίκεξ, ηα πνμζδέμαηά ημοξ, θοηηανμζθειεηη-θέξ πνςηεΐκεξ αιιά θαη ζεμαημδμηηθέξ πνςηεΐκεξ υπςξ ε FAK (τροποποιημένη από Li et al. 2002). Η αθθδθεπίδναζδ ηδξ ελςηοηηανζηήξ πενζμπήξ ιζαξ ζκηεβηνίκδξ µε ιζα πνςηεΐκδ ή πνςηεμβθοηάκδ ηδξ ελςηοηηάνζαξ φθδξ πνμηαθεί ηδ ζοκάενμζζδ ηςκ ζκηεβηνζκχκ ηαζ ιπμνεί κα επάβεζ ηδ δδιζμονβία δεφηενςκ

21 ιδκοιάηςκ ηαεχξ ηαζ ηδ θςζθμνοθίςζδ δζαθυνςκ ηοηηανζηχκ πνςηεσκχκ δζαιέζμο ηδξ εκενβμπμίδζδξ ηζκαζχκ (Hynes 2002). Όθα αοηά πνμθακχξ επδνεάγμοκ ααζζηέξ ηοηηανζηέξ θεζημονβίεξ υπςξ ημκ πμθθαπθαζζαζιυ, ηδκ ηίκδζδ, ηδ δζαθμνμπμίδζδ, ηαζ ηδκ επζαίςζδ (Brakebusch et al. 2002). Αοηυξ είκαζ ηαζ μ θυβμξ πμο ηα θοζζμθμβζηά ηφηηανα δεκ ιπμνμφκ κα πμθθαπθαζζαζημφκ ηαζ κα επζαζχζμοκ ζε ηοηηανμηαθθζένβεζεξ εάκ δεκ πνμζημθθδεμφκ ζημ δμπείμ ηαθθζένβεζαξ. Οζ ζκηεβηνίκεξ ακαβκςνίγμοκ ηαζ δεζιεφμοκ πνςηεΐκεξ πμο θένμοκ ιζα ζοβηεηνζιέκδ αθθδθμοπία αιζκμλέςκ. Μενζηέξ ιάθζζηα, ακαβκςνί-γμοκ ηδκ ίδζα εζδζηή αθθδθμοπία ζε πενζζζυηενεξ απυ ιία δζαθμνεηζηέξ πνςηεΐκεξ. Η πζμ δζαδεδμιέκδ αθθδθμοπία είκαζ δ RGD (Arg-Gly-Asp). Απακηά ιεηαλφ άθθςκ, ζηδ αζηνμκεηηίκδ, ημ θζµπνζκμβυκμ, ηδκ εκηαηηίκδ, ημ ημθθαβυκμ ηαζ ηδ θζµπνμκεηηίκδ. Δηηυξ ηςκ παναπάκς, μζ ζκηεβηνίκεξ είκαζ βκςζηυ υηζ ζοιιεηέπμοκ ζηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ηοηηάνςκ ιεηαλφ ημοξ µε εηενμθζθζηή ζφκδεζδ. ηζξ εζηίεξ πνμζηυθθδζδξ πμο είκαζ ηα πζμ ηαθά ιεθεηδιέκα ζδιεία ηοηηανζηχκ επαθχκ, μζ ζκηεβηνίκεξ ζοκδέμκηαζ µε ηδκ ηοηηανμπθαζια-ηζηή ημοξ πενζμπή µε δζάθμνεξ ηοηηανμζηεθεηζηέξ πνςηεΐκεξ, αθθά ηαζ µε πνςηεΐκεξ ιεηαβςβήξ ζδιάηςκ υπςξ ιε ηδκ ηζκάζδ ηονμζζκχκ βκςζηήξ ςξ ηζκάζδ εζηζχκ πνμζηυθθδζδξ (FAK). Οζ θςζθμηονμζίκεξ πμο πνμηφπημοκ απμηεθμφκ εέζεζξ πνυζδεζδξ ημο ζοµπθυημο Grb2-SOS πμο μδδβεί ζηδκ μδυ Ras-MAPK, ηαεχξ ηαζ ζηδκ μδυ ηδξ PI3K (δηακέζνπ ηεο πεξηνρήο SH 2 πνπ δηαζέηεη). Δπίζδξ, μζ ζκηεβηνίκεξ ιπμνμφκ µέζς ηδξ FAK ηαζ ηςκ ηζκαζχκ ηδξ μζημβέκεζαξ Src κα εκενβμπμζήζμοκ ηζξ Rho-GTPάζεξ, μζ μπμίεξ εηηυξ απυ ηδκ ηοηηανζηή ηίκδζδ ηαζ ιεηακάζηεοζδ ζπεηίγμκηαζ µε ημκ ηοηηανζηυ πμθθαπθαζζαζιυ, ηδκ ηοηηανζηή επζαίςζδ αηυια ηαζ ηδ ιεηαθμνά ηςκ ηοζηζδίςκ ζημ εζςηενζηυ ημο ηοηηάνμο. Δπμιέκςξ, µε ηδ ζφκδεζδ ζκηεβηνζκχκ-ελςηοηηάνζαξ φθδξ ιεηααζαάγμκηαζ δζαιέζμο ηδξ FAK ζήιαηα πμθθαπθαζζαζιμφ, δζαθμνμπμίδζδξ ηαζ επζαίςζδξ (Εικόνα 10). Γηθυκα 10 : Ιε ηε ζφκδεζε ηςκ ηκηεγθνηκχκ ζηεκ ελςθοηηάνηα φιε μεηαβηβάδμκηαη δηαμέζμο ηεξ FAK ζήμαηα πνμξ δηαθμνεηηθά ζεμαημδμηηθά μμκμπάηηα (τροποποιημένη από Juliano 2002).

22 ΗΖΚΑΕ ΓΣΖΩΚ ΠΡΟΗΟΘΘΕΕ (Focal Adhesion Kinase, FAK) Η ηζκάζδ ηςκ εζηζχκ πνμζηυθθδζδξ (FAK) είκαζ ιζα ηοηηανμπθαζιαηζηή ηζκάζδ ηονμζίκδξ, δ μπμία, υπςξ θαίκεηαζ ηαζ απυ ημ υκμιά ηδξ, εκημπίγεηαζ ηονίςξ ζηζξ εζηίεξ πνμζηυθθδζδξ ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ απμηεθεί ζδιακηζηυ ζημζπείμ ηςκ ελανηχιεκςκ απυ ηζξ ζκηεβηνίκεξ ηοηηανζηχκ ιμκμπαηζχκ ιεηαβςβήξ ζδιάηςκ ιεηαθένμκηαξ ζήιαηα απυ ηδκ ελςηοηηάνζα φθδ ζημ ηοηηανυπθαζια (Schlaepfer et al. 1999, Guan 1997, Parsons et al. 2000, Cornillon et al. 2003)(Εικόνα 11). Γηθυκα 11 : Ε FAK απμηειεί θμμβηθυ ζεμείμ γηα δηαθμνεηηθά ζεμαημδμηηθά μμκμπάηηα πμο μδεγμφκ ζε δηαθμνεηηθέξ θοηηανηθέξ απμθνίζεηξ (τροποποιημένη από ).

23 Πμθθά είδδ δζεβένζεςκ ιπμνμφκ κα επάβμοκ θςζθμνοθίςζδ ηδξ ηονμζίκδξ ηαζ εκενβμπμίδζδ ηδξ ηαηαθοηζηήξ δνάζδξ ηδξ FAK, υπςξ αολδηζημί πανάβμκηεξ, κεονμπεπηίδζα, πδιζηέξ μοζίεξ πμο δζεβείνμοκ οπμδμπείξ ζοκδεδειέκμοξ ιε G πνςηεΐκεξ ηαζ ιδπακζηή δζέβενζδ. Παν υθα αοηά, μ ηφνζμξ ηνυπμξ νφειζζδξ βίκεηαζ ιε ηδκ πνυζδεζδ ζηδκ ελςηοηηάνζα φθδ ιέζς ζκηεβηνζκχκ ηαζ δ FAK, υπςξ πνμακαθένεδηε, είκαζ ακαπυζπαζημ ζοζηαηζηυ ηδξ μδμφ ιεηαβςβήξ ζδιάηςκ ιέζς ζκηεβηνζκχκ (Schlaepfer et al. 1999, Schaller 2001). Η ηαηαθοηζηή πενζμπή ηζκάζδξ ηδξ FAK πμο ανίζηεηαζ ηεκηνζηά, πενζαάθθεηαζ απυ ιεβάθεξ αιζκμηεθζηέξ ηαζ ηαναμλοηεθζηέξ ιδ ηαηαθοηζηέξ πενζμπέξ. Οζ πενζμπέξ αοηέξ παίγμοκ ηαεμνζζηζηυ νυθμ ζηζξ αθθδθεπζδνάζεζξ ημο ιμνίμο ιε άθθα ηοηηανζηά ζημζπεία. ημ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ ηδξ ανίζηεηαζ δ πενζμπή FAT (Focal Adhesion Targeting) πμο ζοιαάθθεζ ζημκ εκημπζζιυ ηδξ FAK ζηα ζδιεία ηςκ εζηζχκ πνμζηυθθδ-ζδξ (Schlaepfer et al.1999, Schaller 2001), εκχ ακαζημθή ηδξ FAK ιέζς ηδξ πενζμπήξ FAT επάβεζ ηδκ απυπηςζδ. Δπίζδξ, δ πενζμπή αοηή απμηεθεί εέζδ πνυζδεζδξ πνςηεσκχκ, υπςξ δ παλζθθίκδ ηαζ δ ηαθίκδ (Chen et al. 1995, Hildebrand et al. 1995). Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, ημ αιζκμηεθζηυ ηδξ άηνμ πανμοζζάγεζ μιμζυηδηα ιε ηζξ πνςηεΐκεξ πμο θένμοκ μιμθμβία πενζμπήξ FERM (erythrocyte band four.1 ezrin radixin moesin) ηαζ παίγμοκ νυθμ ζηδκ μνβάκςζδ ημο ηοηηανμζηεθεημφ. Δπζπθέμκ, ακαβκςνίγεζ ημ ηοηηανμπθαζιαηζηυ ηιήια ηδξ α 1 οπμιμκάδαξ ηςκ ζκηεβηνζκχκ (Girault et al. 1999, Schaller et al. 1995). Η ηαναμλο-ηεθζηή ιδ ηαηαθοηζηή πενζμπή ηδξ FAK μκμιάγεηαζ ηαζ FRNK (FAK related-non kinase)(εικόνα 12). Γηθυκα 12 : Πμ μυνημ ηεξ FAK (τροποποιημένη από www2.ub.edu) Όηακ ημ ηφηηανμ δεπεεί ζήια βζα απυπηςζδ, δ FAK απμιαηνφκεηαζ απυ ηδ ιειανάκδ, πνςηεμθφεηαζ απυ ηδκ ηαζπάζδ-3, χζηε κα παναπεεί ημ ηαναμλοηεθζηυ FRNK ηιήια, εκχ ημ αιζκμηεθζηυ ηιήια ηαηεοεφκεηαζ ζημκ πονήκα υπμο επάβεζ ηδκ απυπηςζδ (Gervais et al. 1996). Πνυζθαηα ακζπκεφεδηε ζοζζχνεοζδ ηδξ FAK ζημκ πονήκα εκδμεδθζαηχκ ηοηηάνςκ οπυ θοζζμθμβζηέξ ζοκεήηεξ, ηαηά ηδ δζάνηεζα υιςξ ηδξ απυπηςζδξ ηα

24 επίπεδα ηδξ πονδκζηήξ FAK αολήεδηακ (Lobo and Zachary 2000, Damsky and Ilić 2002) Δπζπνμζεέηςξ, ζημκ πονήκα ηανδζαηχκ ιομηοηηάνςκ απυ αζεεκείξ ιε οπενηαζζηή οπενηνμθία, εηηυξ απυ ηδκ FAK έπεζ ακζπκεοηεί ηαζ ημ ηαναμλοηεθζηυ FRNK ηιήια θςζθμνοθζςιέκμ ζε δζαθμνεηζηά ηαηάθμζπα ζενίκδξ (Yi et al. 2005). FAK και MAP κινάσες Η θςζθμνοθίςζδ ηδξ FAK ζηδκ ηονμζίκδ 925 (Tyr 925 ) ζημ ηαναμλοηεθζηυ άηνμ, ζοιαάθθεζ ζηδ δδιζμονβία εέζδξ πνυζδεζδξ βζα ηδκ Grb2 ηαζ ζημ ζπδιαηζζιυ ημο ζοιπθυημο Grb2/SOS, ιε απμηέθεζια ηδκ εκενβμπμίδζδ ηδξ μδμφ ιεηαβςβήξ ζδιάηςκ Ras/MAPK (Schlaepfer et al. 1994). Δπίζδξ, δ FAK πενζέπεζ ιζα εέζδ πνυζδεζδξ βζα ηδκ πνςηεΐκδ p130cas. Η θςζθμνοθίςζδ ηονμζίκδξ ηδξ p130cas μδδβεί ζε αθθδθεπίδναζδ ιε ηζξ πνςηεΐκεξ Crk ηαζ Nck. Οζ πνςηεΐκεξ αοηέξ ζπδιαηίγμοκ ζφιπθμηα ιε ηζξ πνςηεΐκεξ SOS ηαζ C3G, ακηίζημζπα. Οζ πανάβμκηεξ ακηαθθαβήξ GTP (GEF), SOS ηαζ C3G, ιπμνμφκ κα εκενβμπμζήζμοκ πνςηεΐκεξ πμο δεζιεφμοκ GTP, ιε ζοκέπεζα ηδκ εκενβμπμίδζδ ηςκ ΜΑΡ ηζκαζχκ, δ μπμία πνμάβεζ ηδ θςζθμνοθίςζδ ηδξ ηονμζίκδξ ηδξ Shc, πμο ιε ηδ ζεζνά ηδξ ζοιαάθθεζ ζηδ ζοβηνυηδζδ ημο ζοιπθυημο Grb2/SOS (Schlaepfer et al. 1997). Δίκαζ πζεακυ, ηαηά ηδκ πνυζδεζδ ζηδκ ελςηοηηάνζα φθδ ζκηεβηνζ-κχκ πμο ζοκδέμκηαζ ιε Shc, ηυζμ δ FAK υζμ ηαζ δ Shc κα ζοιαάθθμοκ ζηδκ εκενβμπμίδζδ ηδξ μδμφ Ras/MAPKs. Η ζπεηζηή ζοιαμθή ηδξ ηάεε μδμφ ίζςξ κα ελανηάηαζ απυ ημκ ηφπμ ημο ηοηηάνμο ή ημ ζδιείμ πμο έπεζ πνμπςνήζεζ δ ηοηηανζηή πνμζηυθθδζδ. Η Shc είκαζ ιάθθμκ οπεφεοκδ βζα ηα ορδθά ανπζηά επίπεδα εκενβμπμίδζδξ ηδξ ERK ηαηά ηδκ πνμζηυθθδζδ, εκχ δ FAK πμο εκενβμπμζείηαζ πζμ ανβά ίζςξ εοεφκεηαζ βζα ηδ δζαηήνδζδ ηδξ εκενβυηδηαξ ηδξ ERK (Schlaepfer et al. 1998, Lin et al. 1997, Giancotti and Ruoslahti 1999)(Εικόνες 13 & 14). Γηθυκα 13 : Ε θςζθμνοιίςζε ηεξ FAK ζε ζογθεθνημέκεξ ζέζεηξ μδεγεί ζηεκ αιιειεπίδναζή ηεξ με ζογθεθνημέκα μυνηα (τροποποιημένη από Schlaepfer and Mitra 2004).

25 Γηθυκα 14 : Ε θςζθμνοιίςζε ηεξ FAK ζηεκ ηονμζίκε 925 (Tyr 925 ) ζημ θανβμλοηειηθυ άθνμ, ζομβάιιεη ζηε δεμημονγία ζέζεξ πνυζδεζεξ γηα ηεκ Grb2 θαη ζημ ζπεμαηηζμυ ημο ζομπιυθμο Grb2/SOS, με απμηέιεζμα ηεκ εκενγμπμίεζε ηεξ μδμφ μεηαγςγήξ ζεμάηςκ Ras/MAPKs (τροποποιημένη από www2.ub.edu). FAK και DFak56 Δίκαζ πθέμκ βκςζηυ υηζ ηυζμ δ αθθδθμοπία ηδξ πνςηεΐκδξ FAK υζμ ηαζ μζ θεζημονβίεξ ηδξ είκαζ ζοκηδνδιέκεξ ελεθζηηζηά. Η μιυθμβδ πνςηεΐκδ ηδξ FAK ζημ έκημιμ Drosophila, δ μπμία μκμιάγεηαζ DFak56, απμιμκχεδηε ζπεηζηά πνυζθαηα ηαζ έδεζλε πενίπμο 33% αιζκμλζηή μιμθμβία µε ηδκ FAK ημο ακενχπμο. Η DFak56 πανμοζζάγεζ ηδκ ίδζα δμιζηή μνβάκςζδ µε ηδκ FAK, έπμκηαξ ιία ηεκηνζηή ηαηαθοηζηή πενζμπή πμο μνζμεεηείηαζ απυ ηδκ αµζκμηεθζηή ηαζ ηδκ ηαναμλοηεθζηή πενζμπή (κε θαηαιπηηθέο)(εικόνα 15). Όιςξ, δ DFak56 πενζέπεζ επζπθέμκ ιία ιεβάθδ ηαναμλοηεθζηή πενζμπή πένα απυ ηδκ ηαναμλοηεθζηή FAT αθθδθμοπία ηδξ FAK. Η DFak56 ειθακίγεζ ηζξ ίδζεξ αζμθμβζηέξ ζδζυηδηεξ µε ηδκ ακενχπζκδ FAK, δδθαδή οπμηοηηανζηυ εκημπζζιυ ζηζξ εζηίεξ πνμζηυθ-θδζδξ ηαζ ελανηχιεκδ απυ ηδκ πνμζηυθθδζδ νφειζζδ ηδξ θςζθμνοθίς-ζδξ ηονμζζκχκ (Fox et al. 1999, Palmer et al. 1999, Fujimoto et al. 1999). Η ιεβαθφηενδ μιμζυηδηα ακάιεζα ζηζξ πενζμπέξ ηδξ DFak56 ηαζ ηδξ FAK ειθακίγεηαζ ζηδκ ηαηαθοηζηή πενζμπή ηδξ ηζκάζδξ ηονμζίκδξ, δ μπμία είκαζ ηαηά 63% ζοκηδνδιέκδ ζηα δφμ αοηά δζαθμνεηζηά είδδ. Δπίζδξ, δ αημθμοεία ηδξ FAT είκαζ ελίζμο ανηεηά ζοκηδνδιέκδ, ζε πμζμζηυ 47%, εκχ δ αµζκμηεθζηή πενζμπή ηαζ δ πενζμπή πμο ανίζηεηαζ ιεηά ηδκ ηζκάζδ ηαζ πνζκ ηδκ FAT ειθακίγμοκ πμζμζηυ μιμθμβίαξ µυκμ 32% ηαζ 31%

26 ακηζζημίπςξ, ακάιεζα ζηδ ιφβα ηαζ ημκ άκενςπμ. Η εέζδ ηδξ ηφνζαξ αοημθςζθμνοθίςζδξ είκαζ ζοκηδνδιέκδ ζηδκ DFak56, υπςξ ηαζ μζ άθθεξ δφμ ηονμζίκεξ ζηδκ ηαηαθοηζηή πενζμπή. Ακηίεεηα, ακ ηαζ οπάνπεζ ιζα ηονμζίκδ ζηδκ DFak56 πμο ακηζζημζπεί ζε εηείκδ ηδξ εέζδξ Tyr 925 ηδξ FAK, θαίκεηαζ υηζ αοηυ ημ αιζκμλφ δεκ ελοπδνεηεί ςξ εέζδ πνυζδεζδξ βζα ηδκ πνςηεΐκδ Grb2, ηαεχξ οπάνπμοκ ζδιακηζηέξ δζαθμνέξ ζηα βεζημκζηά αιζκμλέα. Οιμίςξ, δ πνχηδ Ρ πενζμπή (όπνπ Ρ πεξηνρή πινύζηα ζε πξνιίλε) ζηδκ ηαναμλοηεθζηή πενζμπή ηδξ FAK, δ μπμία πνδζζιεφεζ ςξ εέζδ πνυζδεζδξ βζα ηδκ p130cas, είκαζ ζοκηδνδ-ιέκδ ζηδκ DFak56, ηάηζ πμο δεκ ζζπφεζ βζα ηδ δεφηενδ Ρ αθθδθμοπία ζηδκ ηαναμλοηεθζηή πενζμπή, δ μπμία δεζιεφεζ ηδ GRAF ζηδκ FAK. Σεθζηά, υιςξ, μζ μιμζυηδηεξ ηαζ υπζ μζ δζαθμνέξ, έπμοκ πείζεζ ημοξ ενεοκδηέξ κα πνδζζιμπμζμφκ ηδ DFak56, ηαζ ηαη επέηηαζδ ηδ ιφβα, ςξ ενβαθείμ βζα ηδκ ακίπκεοζδ κέςκ βμκζδίςκ ηαζ πνςηεσκχκ πμο αθθδθε-πζδνμφκ µε ηδκ FAK ή ζοιιεηέπμοκ ζηδ ιεηαβςβή ηςκ ζδιάηςκ δζαιέζμο ζκηεβηνζκχκ, υπμο δ FAK ηαηέπεζ ηονίανπμ νυθμ. Γηθυκα 15 : Ε αμηκμληθή μμμιμγία ακάμεζα ζηηξ αιιειμοπίεξ ηεξ DFak56 θαη ηεξ ακζνχπηκεξ FAK. Μη μαφνεξ μπάνεξ οπμδειχκμοκ ηεκ πενημπή FERM, εκχ ζημ ζπήμα θαίκμκηαη ε θαηαιοηηθή πενημπή ηεξ θηκάζεξ ηονμζίκεξ, μη θφνηεξ ζέζεηξ θςζθμνοιίςζεξ, ε αιιειμοπία FAT θαζχξ θαη μη πενημπέξ πμο είκαη πιμφζηεξ ζε πνμιίκεξ. Μη ανηζμμί ακηηπνμζςπεφμοκ ηεκ επί % μμμιμγία ηςκ δηαθμνεηηθχκ πενημπχκ ηεξ FAK θαη ηεξ DFak56. Πμ πμζμζηυ ηεξ μμμιμγίαξ ηςκ αμηκμλέςκ μεηαλφ ηςκ πενημπχκ FERM ηςκ δφμ πνςηεσκχκ είκαη 49% (Schaller 2001).

27 ΗΖΚΑΓ ΓΚΓΡΓΟΠΟΖΟΤΙΓΚΓ ΑΠΟ ΙΖΣΟΓΟΚΑ (Mitogen-Activated Protein Kinases, MAPKs) Το σύστημα των MAP κινασών Σμ ζφζηδια ηςκ ΜΑΡ ηζκαζχκ είκαζ έκα ηοηηανμπθαζιαηζηυ ζφκμθμ απυ ηζκάζεξ πνςηεσκχκ, μζ μπμίεξ ζοιαάθθμοκ χζηε κα θεάζεζ ημ ιήκοια απυ ημοξ ηεθεζηέξ ηδξ ιειανάκδξ ζημκ πονήκα ημο ηοηηάνμο. Όθα ηα εοηανοςηζηά ηφηηανα ηαηέπμοκ πμθθαπθά ιμκμπάηζα ΜΑΡΚs, ηαεέκα απυ ηα μπμία εκενβμπμζείηαζ απυ δζαθμνεηζηά ενεείζιαηα (Εικόνα 16). ηα εδθαζηζηά ηα ιμκμπάηζα ηςκ ΜΑΡΚs ιπμνμφκ κα εκενβμπμζμφκηαζ απυ πμθθαπθά ενεείζιαηα, ιέζς δζαθμνεηζηχκ μζημβεκεζχκ οπμδμπέςκ. Γηθυκα 16 : Δηαθμνεηηθά ενεζίζμαηα μδεγμφκ ζηεκ εκενγμπμίεζε δηαθμνεηηθχκ μμκμπαηηχκ MAPKs (τροποποιημένη από Γζα πανάδεζβια : Οζ μνιυκεξ [ηλζνπιίλε] ηαζ αολδηζημί πανάβμκηεξ [epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF)], εκενβμπμζμφκ ηζξ ΜΑΡΚs ιέζς οπμδμπέςκ ηζκαζχκ ηονμζίκδξ. Οζ αολδηζηέξ μνιυκεξ δνμοκ ιέζς οπμδμπέςκ ηςκ ηοηηανμηζκχκ.

28 Πμθοπεπηίδζα πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ημκ TGF-α δνμοκ ιέζς οπμδμπέςκ ηζκαζχκ ζενίκδξ/ενεμκίκδξ. Κοηηανμηίκεξ ηδξ μζημβέκεζαξ TNF ηαζ πενζααθθμκηζηά ζηνεξ υπςξ, ημ ςζιςηζηυ ζμη, μζ ζμκίγμοζεξ αηηζκμαμθίεξ αθθά ηαζ μζ ζζπαζιζηέξ αθάαεξ εκενβμπμζμφκ ηζξ μδμφξ MAPKs ιέζς οπμδμπέςκ ηδξ μζημβέκεζαξ ηςκ TNF οπμδμπέςκ. Αββεζμδναζηζηά πεπηίδζα υπςξ δ ANG11 ηαζ δ εκδμεδθίκδ, εκενβμπμζμφκ μδμφξ MAPKs, ιέζς δζαιειανακζηχκ οπμδμπέςκ μζ μπμίμζ ζοκδέμκηαζ ιε G πνςηεΐκεξ ζημ ηοηηανμπθαζιαηζηυ ημοξ ηιήια (Herskowitz 1995, Kyriakis and Avruch 1996). Η μεταβίβαση της πληροφορίας σε μια τυπική οδό MAPΚs Μζα ηοπζηή μδυξ ιεηαβςβήξ ζήιαημξ ιέζς ΜΑΡΚs αημθμοεεί ιζα αθθδθμοπία βεβμκυηςκ, δ μπμία λεηζκά απυ ηδ δέζιεοζδ ημο ζδιαημδμηζημφ ιμνίμο ζημκ οπμδμπέα ημο, ηδκ εκενβμπμίδζδ ημο οπμδμπέα, ηδ ζηναημθυβδζδ ηςκ πνςηεσκχκ-ζοκδεηήνςκ (adaptor proteins) ηαζ ηδκ εκενβμπμίδζδ ηςκ Ras πνςηεσκχκ. ηδ ζοκέπεζα, αημθμοεεί ιζα ζεζνά απυ ηνεζξ ή ηέζζενζξ ηζκάζεξ. Δζδζηυηενα, μζ ΜΑΡΚΚΚΚs ή ΜΔΚΚΚs (Mitogen and ERK kinase kinase kinases) θςζθμνοθζχκμοκ ηαζ εκενβμπμζμφκ ηζξ ΜΑΡΚΚΚs ή ΜΔΚΚs, μζ μπμίεξ θςζθμνοθζχκμοκ ηαζ εκενβμπμζμφκ ηζξ ΜΑΡΚΚs ή ΜΔΚs. Έπεζηα, αοηέξ μζ δζπθήξ ελεζδίηεοζδξ ηζκάζεξ ζενίκδξ/ενεμκίκδξ/ηονμζίκδξ θςζθμνοθζχκμοκ ηαζ εκενβμπμζ-μφκ ηζξ ΜΑΡΚs. Οζ ΜΑΡΚs ζηδ ζοκέπεζα, θςζθμνοθζχκμοκ ηαζ εκενβμπμζμφκ ηα οπμζηνχιαηά ημοξ ζε ηαηάθμζπα ζενίκδξ/ενεμκίκδξ. Σα οπμζηνχιαηα ηςκ ΜΑΡΚs είκαζ ηονίςξ ιεηαβναθζημί πανάβμκηεξ, μζ μπμίμζ δναζηδνζμπμζμφκηαζ ηαζ νοειίγμοκ ηδ βμκζδζαηή έηθναζδ, ηαεχξ επίζδξ ηαζ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ πνςηεΐκεξ, υπςξ ηζκάζεξ ηαζ θςζθμ-θζπάζεξ πμο ζπεηίγμκηαζ ιε ημκ ηοηηανμζηεθεηυ (Cobb and Goldsmith 1995, Hagemann and Blank 2001, Windmann et al. 1999). Ενεργοποίηση των MAPΚs Οζ ΜΑΡ ηζκάζεξ θςζθμνοθζχκμοκ ιυκμ οπμζηνχιαηα, ηα μπμία πενζέπμοκ πνμθίκδ ζηδ εέζδ Ρ-1. Γζα ηζξ ERK1/2 ημ βεκζηυ ιμηίαμ είκαζ Pro-X-Ser/Thr-Pro (Alvarez et al. 1991). Η εκενβυηδηα ηςκ ΜΑΡΚs εθέβπεηαζ απυ ηδ δζπθή θςζθμνοθίςζδ ιζαξ αιζκμλζηήξ αθθδθμοπίαξ πμο είκαζ βκςζηή ςξ βξόρνο ελεξγνπνίεζεο. Η αθθδθμοπία Thr-X-Tyr ζημ ανυπμ εκενβμπμίδζδξ (όπνπ Χ είλαη ζπγθεθξηκέλν ακηλνμύ αλαιόγσο ηνπ ηύπνπ ηεο MAPK) είκαζ δ εέζδ δζπθήξ θςζθμνοθίςζδξ πμο ηαηαθφεηαζ απυ ηδκ εζδζηή ΜΑΡΚΚ. Γζα ηζξ ERK1/2 μζ εέζεζξ θςζθμνοθίςζδξ είκαζ μζ Thr 183 ηαζ

29 Tyr 185. Γζπθή θςζθμνοθίςζδ ζηζξ εέζεζξ αοηέξ έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ ακαδίπθςζδ ημο ανυπμο ηαζ ηδκ αθθδθεπίδναζδ ιε επζθακεζαηέξ εέζεζξ δέζιεοζδξ ανβζκίκδξ αολάκμκηαξ έηζζ, ηδκ εζδζηή εκενβυηδηα ηςκ ΜΑΡΚs ημοθάπζζημκ 1000 θμνέξ (Canagarajah et al. 1997, Windmann et al. 1999). Θα πνέπεζ κα ζδιεζςεεί υηζ ακηζηαηάζηαζδ ηςκ δφμ παναπάκς εέζεςκ θςζθμνοθίςζδξ απυ ηάπμζμ υλζκμ αιζκμλφ, υπςξ ημ Glu δεκ μδδβεί ζε εκενβμπμίδζδ, αθμφ ηα παναηηδνζζηζηά ημο ανυπμο εκενβμ-πμίδζδξ ηαζ δ δζπθή θςζθμνοθίςζδ ζε Thr ηαζ Tyr επάβμοκ ανηεηέξ αθθαβέξ ζηδ δζαιυνθςζδ ημο πνςηεσκζημφ ιμνίμο, μζ μπμίεξ δεκ ιπμνμφκ κα επαπεμφκ απυ ημ βθμοηαιζκζηυ μλφ. Γζ αοηυ ημ θυβμ, μζ ζδιεζαηέξ ιεηαθθάλεζξ ζηζξ MAPKs δεκ επάβμοκ ηδκ εκενβμπμίδζή ημοξ. Φαίκεηαζ επμιέκςξ, υηζ ημ ιμηίαμ pthr-x-ptyr είκαζ απαναίηδημ βζα ηδ νφειζζδ ηδξ εκενβμπμίδζδξ ηςκ MAP ηζκαζχκ, βεβμκυξ πμο ελδβεί ημ θυβμ πμο μζ MAPKs δεκ έπμοκ ηαοημπμζδεεί πμηέ ςξ μβημβμκίδζα υπςξ εα ήηακ ακαιεκυιεκμ βζα πνςηεΐκεξ μζ μπμίεξ νοειίγμοκ ηδκ ηοηηανζηή αφλδζδ (Canagarajah et al. 1997, Oldenhoff et al. 2002). Οργάνωση και ρύθμιση των οδών των MAPΚs Οζ ΜΑΡ ηζκάζεξ παίνκμοκ ιένμξ ζηδ νφειζζδ ζφκεεηςκ ηοηηανζηχκ δζενβαζζχκ υπςξ είκαζ δ ιίηςζδ, δ δζαθμνμπμίδζδ, δ επζαίςζδ, δ απυπηςζδ ηαζ δ ιεηακάζηεοζδ. Η ελεζδίηεοζδ ζηδκ απυηνζζδ ιέζς ηςκ ΜΑΡΚs επζηοβπάκεηαζ ιε ηδκ εκενβμπμίδζδ δζαθμνεηζηχκ ζοζηδιάηςκ ΜΔΚΚ- ΜΔΚ-ΜΑΡΚ ζε απυηνζζδ δζαθμνεηζηχκ ενεεζζιάηςκ. Έηζζ, δζαθμνεηζηά ζοζηήιαηα ΜΑΡΚs εκενβμπμζμφκηαζ απυ ηοηηανμηίκεξ, αολδηζημφξ πανάβμκηεξ ηαζ μνιυκεξ, ηαεχξ επίζδξ ηαζ απυ ηοηηανζηυ ζηνεξ (αθηηλνβνιία, ζεξκηθό ζνθ, νζκσηηθέο δηαηαξαρέο, θαηαζηξνθή ηνπ DNA θαη βαθηεξηαθνύο παξάγνληεο). Η εκενβμπμίδζδ ηςκ ΜΑΡΚs πνμξ απυηνζζδ ζηα παναπάκς ενεείζιαηα ζοκίζηαηαζ βζα ηδ νφειζζδ ηδξ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ, ημο ιεηααμθζζιμφ, ηδξ δζάηαλδξ ημο ηοηηανμ-ζηεθεημφ ηαζ άθθςκ νοειζγυιεκςκ ηοηηανζηχκ βεβμκυηςκ (Garrington and Johnson 1999). Μέπνζ ζήιενα έπμοκ ηαοημπμζδεεί ζηα εδθαζηζηά 14 ΜΑΡΚΚΚs, 7 ΜΑΡΚΚs ηαζ 15 ΜΑΡΚs (Εικόνα 17). Κάεε ηφπμξ ηζκάζδξ οπμδζαζνείηαζ ζε οπμμζημβέκεζεξ ιε ηνζηήνζα ηδ θεζημονβία ηαζ ηδκ μιμθμβία ηδξ αθθδθμοπίαξ (Πίνακας 2). Όπςξ θαίκεηαζ ζημκ παναηάης πίκαηα, μζ ΜΑΡΚs δζαηνίκμκηαζ ζε 6 οπμμζημβέκεζεξ, ηδ ΜΑΡΚ ERK1/2, ηδ ΜΑΡΚ ERK3/4, ΜΑΡΚ ERK5/6, ΜΑΡΚ ERK7/8, ηδ ΜΑΡΚ p38 ηαζ ηδ ΜΑΡΚ JNK, μζ μπμίεξ δίκμοκ ηαζ ημ υκμια ζηδκ μδυ ηδξ ΜΑΡΚ ζηδκ μπμία ιεηέπμοκ (π.ρ. ε νδόο ησλ MAPKs πνπ ρξεζηκνπνηεί ηε ΜΑΡΚ p38 νλνκάδεηαη νδόο ηεο p38 ΜΑΡΚ).

30 Γηθυκα 17 : Πμ ζεμαημδμηηθυ μμκμπάηη ηςκ ΙΑΞ θηκαζχκ (τροποποιημένη από Πφπμξ θηκάζεξ MAPKKKs Ρπμμηθμγέκεηα Raf MEKK Ιέιε MAPKKK A-RAF, MAPKKK B-RAF, MAPKKK RAF1 MEKK MEKK1, MEKK MEKK2, MEKK MEKK3, MEKK MEKK4 MAPKKK ASK1, MAPKKK TPL2 MAPKKK MST, MAPKKK SPRK, MAPKKK MUK, MAPKKK TAK1, MAPKKK MOS

31 MAPKKs MAPKs MEK MAPK ERK1/2 MAPK ERK3/4 MAPK ERK5/6 MAPK ERK7/8 MAPK p38 MAPK JNK MAPKK MKK1, MAPKK MKK2 MAPKK MKK3, MAPKK MKK6 MAPKK MKK4 MAPKK MKK5 MAPKK MKK7 ERK1, ERK2 ERK3, ERK4 ERK5, ERK6 ERK7, ERK8 p38α, p38β, p38γ, p38δ JNK1, JNK2, JNK3 Νίκαθαξ 2 : Πα μέιε ηεξ μηθμγέκεηαξ ηςκ ΙΑΞΗs πμο έπμοκ ηαοημπμηεζεί μέπνη ζήμενα ζηα ζειαζηηθά. Οζ MAPKKs ακηζπνμζςπεφμκηαζ ιε ηα θζβυηενα ιέθδ ζημ ζφζηδια ηςκ ΜΑΡΚs ηαζ ειθακίγμοκ ορδθυ ααειυ ελεζδίηεοζδξ βζα ηα οπμζηνχιαηά ημοξ επζηνέπμκηαξ έηζζ, εθάπζζημοξ ζοκδοαζιμφξ ημο ηιήιαημξ ΜΔΚ-ΜΑΡΚ ημο ζοζηήιαημξ ηςκ ΜΑΡΚs. Ακηζεέηςξ, μζ 14 ηαοημπμζδιέκεξ ΜΑΡΚΚΚs πμζηίθθμοκ δμιζηά ηαζ έπμοκ δζαθμνεηζηέξ νοειζζηζηέξ πενζμπέξ πμο δεκ απακηχκηαζ ζηζξ ΜΑΡΚΚs ή ηζξ ΜΑΡΚs. ηζξ πενζμπέξ αοηέξ ακήημοκ αθθδθμοπίεξ πθμφζζεξ ζε πνμθίκδ βζα ηδ δέζιεοζδ SH 3 πενζμπχκ, εέζεζξ δέζιεοζδξ βζα πνςηεΐκεξ πμο δεζιεφμοκ GTP, αθθδθμοπίεξ δζιενζζιμφ ημο ηφπμο θενιμοάν θεοηίκδξ ηαεχξ επίζδξ ηαζ εέζεζξ θςζθμνοθίςζδξ βζα ηζκάζεξ ηονμζίκδξ ή ζενίκδξ/ ενεμκίκδξ. Μ αοηυκ ημκ ηνυπμ, μζ ΜΑΡΚΚΚs νοειίγμκηαζ δζαθμνζηά απυ έκα εονφ ζφκμθμ ζδιάηςκ πμο πνμδβμφκηαζ (upstream), εκχ νοειίγμοκ εηθεηηζηά ηζξ ΜΑΡΚΚs (Garrington and Johnson 1999). ε αοηή ηδκ πμζηζθμιμνθία ηςκ νοειζζηζηχκ πενζμπχκ μθείθεηαζ δ εοεθζλία ηςκ ζοζηδιάηςκ ηςκ MAPKs κα απμηνίκμκηαζ ζε ιζα εονεία ηθίιαηα ηοηηανζηχκ ενεεζζιάηςκ υιςξ, δεκ έπεζ δζεοηνζκζζηεί αηυια ηζ είκαζ αοηυ πμο πνμζδίδεζ ηδκ ζηακυηδηα ζε ιζα ΜΑΡΚΚΚ κα δνα εηθεηηζηά ζε ιζα μδυ ΜΑΡΚ θςζθμνοθζχκμκηαξ, ηαζ ηαη επέηηαζδ εκενβμπμζχκηαξ, δζαθμνεηζηέξ ΜΑΡΚΚs. φιθςκα ιε πνυζθαηεξ εκδείλεζξ, δ ελεζδίηεοζδ αοηή επζηοβπάκεηαζ εκ ιένεζ ιέζς πνςηεσκχκ αβηονμαυθδζδξ ηαζ ζηαθςζζάξ, μζ μπμίεξ ζοκημκίγμοκ ηδ δέζιεοζδ ηςκ MAPKKKs είηε ζε εζδζηέξ πνςηεΐκεξ βζα ζήιαηα πμο πνμδβμφκηαζ (upstream) είηε ζε εζδζηά ζοιπθέβιαηα ΜΑΡΚΚs-ΜΑΡΚs πμο έπμκηαζ (downstream)(pawson and Scott 1997). Η κέα εεςνία βζα ηδ ιεηαβςβή ζήιαημξ οπμζηδνίγεζ υηζ μζ ηοηηανζηέξ μδμί νοειίγμκηαζ απυ ηδκ μνβάκςζή ημοξ ζε ιαηνμιμνζαηά ζοιπθέβιαηα. Μέπνζ πνυζθαηα δ ηοηηανζηή μνβάκςζδ ήηακ άννδηηα ζοκδεδειέκδ ιε ηα

32 ηοηηανζηά μνβακίδζα, υιςξ ηχνα βίκεηαζ απμδεηηυ υηζ δ ιαηνμιμνζαηή μνβάκςζδ είκαζ ελίζμο ζδιακηζηή βζα ηζξ ηοηηανμ-πθαζιαηζηέξ πνςηεΐκεξ. Σα ζοζηήιαηα ιεηαβςβήξ ζήιαημξ ζοιπενζθαι-αάκμοκ πνςηεΐκεξ πςνίξ ηαηαθοηζηή εκενβυηδηα ηαζ έκγοια πμο είκαζ θοζζηά ακαπυζπαζηα ιέθδ ημο ζοζηήιαημξ. Οι οδοί μεταγωγής σημάτων MAPΚs στα θηλαστικά H ΟΔΟ MAPK ERK Η μδυξ ηδξ ΜΑΡK ERK είκαζ δ ηαθφηενα παναηηδνζζιέκδ αθθδθμοπία ακηζδνάζεςκ ηςκ ΜΑΡΚs ηαζ εκενβμπμζείηαζ απυ δζάθμνεξ ηοηηανμηίκεξ ηαζ αολδηζημφξ πανάβμκηεξ (Platanias 2003). Δίκαζ έκα ελεθζηηζηά δζαηδνδιέκμ ιεηαβςβζηυ ιμκμπάηζ πμο ειπθέηεηαζ ζημκ έθεβπμ πμθθχκ εειεθζςδχκ ηοηηανζηχκ δζενβαζζχκ ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ημο ηοηηανζημφ πμθθαπθαζζαζιμφ, ηδξ επζαίςζδξ, ηδξ απυπηςζδξ, ηδξ δζαθμνμπμίδζδξ, ηδξ ηοηηανζηήξ ηίκδζδξ ηαζ ημο ιεηααμθζζιμφ (Kolch 2005). Απυ ημ ζφκμθμ ηςκ πνςηεσκχκ πμο ακαθένμκηαζ ςξ ERKs, μζ ERK1 ηαζ ERK2 είκαζ μζ πζμ ηαθά ιεθεηδιέκεξ ηαζ απμηεθμφκ ηδκ οπμμζημ-βέκεζα MAPK ERK1/2 (Εικόνα 18). Πνυηεζηαζ βζα πνςηεΐκεξ µμνζαημφ αάνμοξ 44 kda ηαζ 42 kda ακηζζημίπςξ ηαζ ειθακίγμοκ μιμθμβία 85% ζημ ζφκμθμ ημο µμνίμο, πμζμζηυ ημ μπμίμ αολάκεηαζ βζα ηζξ πενζμπέξ πνυζδεζδξ οπμζηνςιάηςκ (Boulton et al. 1991). Οζ δφμ εέζεζξ θςζθμ-νοθίςζδξ, ζηδκ Thr 183 ηαζ ηδκ Tyr 185, πςνίγμκηαζ απυ έκα αιζκμλφ βθμοηαιζκζημφ μλέμξ ηυζμ ζηδκ ERK1 υζμ ηαζ ζηδκ ERK2 δδιζμον-βχκηαξ ημ ιμηίαμ Thr-Glu- Tyr ζημ ανυβπμ εκενβμπμίδζδξ. Καζ μζ δφμ εηθνάγμκηαζ εονέςξ µε ημ πμζμζηυ έηθναζδξ κα πμζηίθθεζ ζημοξ δζαθμνεηζημφξ ζζημφξ. Γηθυκα 18 : Οπεμαηηθή απεηθυκηζε ηεξ δμμήξ ηεξ ERK2 (

33 Οζ ERK 1 ηαζ 2 εκενβμπμζμφκηαζ απυ έκα γεφβμξ ΜΔΚs, ηζξ ΜΔΚ 1 ηαζ 2. Καζ μζ δφμ αοηέξ ΜΔΚs ιπμνμφκ κα εκενβμπμζήζμοκ πθήνςξ ηζξ ERK1/2 in vitro. Η νφειζζδ ηδξ εκενβμπμίδζδξ ηδξ ERK είκαζ ζφκεεηδ ηαζ ελανηάηαζ απυ ηζξ δφμ θςζθμνοθζχζεζξ ζηζξ εέζεζξ πμο πνμακαθέν-εδηακ ηαζ μζ μπμίεξ βίκμκηαζ ζε δφμ θάζεζξ. Η πνχηδ θςζθμνοθίςζδ βίκεηαζ ζηδκ Tyr 185 ηαζ πνμηαθεί ηδ ιεηααμθή ηδξ ηαναμλοηεθζηήξ πενζμπήξ, εκχ ιυθζξ αοηή μθμηθδνςεεί πναβιαημπμζείηαζ ιζα δεφηενδ θςζθμνοθίςζδ ζηδ Thr 183, δ μπμία μδδβεί ζε ακαδζαιυνθςζδ ηδξ αιζκμηεθζηήξ πενζμπήξ. Η ERK ηαείζηαηαζ εκενβή ιυκμ ιεηά ηδκ μθμηθήνςζδ ηαζ ηςκ δφμ θςζθμνοθζχζεςκ (Galetic et al. 2003). Οζ ΜΔΚ1/2 θςζθμνοθζχκμκηαζ απυ µέθδ ηςκ ΜΔΚΚs ηαζ ζοβηεηνζιέκα απυ ζζμιμνθέξ Raf ηαζ Mos. Μάθζζηα, μζ πνςηεΐκεξ αοηέξ θςζθμνοθζχκμοκ απμηθεζζηζηά ηζξ ΜΔΚ1/2 βεβμκυξ πμο ηζξ εκηάζζεζ ζηδκ μδυ ERK1/2 (Kyriakis et al. 1992). Η μζημβέκεζα ηςκ Raf ηζκαζχκ απμηεθείηαζ απυ ηδκ Α-Raf, ηδ Β-Raf ηαζ ηδ Raf-1. Οζ πενζζζυηενεξ ιεθέηεξ έπμοκ εζηζαζηεί ζηδ Raf-1. Η νφειζζδ ηδξ ηζκάζδξ αοηήξ είκαζ ζφκεεηδ ηαεχξ αθμνά πνςηεσκζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ, θςζθμνοθίςζδ ζε ηονμζίκδ, ζενίκδ ηαζ ενεμκίκδ ηαζ ηαηάθθδθδ εκδμηοηηανζηή ημπμεέηδζδ (Morrison and Cutler 1997). Αοημί μζ πμθθαπθμί ηνυπμζ νφειζζδξ επζηνέπμοκ ζηδ Raf-1 κα ηοιαίκεηαζ ιεηαλφ δζαθυνςκ επζπέδςκ εκενβμπμίδζδξ. Ίζςξ δ ηαθφηενα παναηηδνζζιέκδ μδυξ ERK1/2 είκαζ αοηή πμο δζένπεηαζ µέζς οπμδμπέςκ µε εκενβυηδηα ηζκάζδξ ηονμζίκδξ. Η δέζιεοζδ ημο ηαηάθθδθμο πνμζδέιαημξ ζημοξ οπμδμπείξ αοημφξ έπεζ απμηέθεζια ηδκ αφλδζδ ηδξ ηαηαθοηζηήξ ημοξ εκενβυηδηαξ ηαζ αημθμφ-θμφεςξ ηδκ αοημθςζθμνοθίςζδ ζε ηονμζίκεξ. Η θςζθμνοθίςζδ ηςκ οπμδμπέςκ αοηχκ μδδβεί ζημ ζπδιαηζζιυ πμθοπνςηεσκζηχκ ζοιπθεβιά-ηςκ, δ μνβάκςζδ ηςκ μπμίςκ ηαεμνίγεζ ηα ιεηέπεζηα ζήιαηα. Πμθφ ζοπκά ημ απμηέθεζια είκαζ δ εκενβμπμίδζδ ιζαξ ιμκμιενμφξ G πνςηεΐκδξ, ηδξ Ras. Αοηυ επζηοβπάκεηαζ µε ζοκάενμζζδ ζημκ οπμδμπέα δζαθυνςκ πνςηεσκχκ-ζοκδεηήνςκ, υπςξ δ Shc ηαζ δ Grb2, θυβς ηςκ αθθδθεπζδνάζεςκ ηςκ SH 2 πενζμπχκ ημοξ µε θςζθμηονμζίκεξ. Συηε μ πανάβμκηαξ ακηαθθαβήξ κμοηθεμηζδίςκ βμοακίκδξ (GEF), SOS (Son of Sevenless), εζζένπεηαζ ζημ ζφιπθεβια, ηαεχξ ανίζηεηαζ δζανηχξ δεζιεοιέκμξ µε ηδκ SH 3 πενζμπή ηδξ Grb2, επάβμκηαξ ηδκ ακηαθθαβή ημο GDP ηδξ Ras µε GTP ζηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή ιειανάκδ. Η Ras δεζιεοιέκδ πθέμκ µε GTP αθθδθεπζδνά άιεζα µε δζάθμνμοξ ηεθεζηέξ υπςξ ζζμιμνθέξ ηδξ Raf. Η δέζιεοζδ ηδξ Ras ζηδ Raf μδδβεί είηε ζε αθθαβέξ ηδξ ζηενεμδζαµυνθςζδξ ηδξ Raf μζ μπμίεξ αολάκμοκ ηδκ εκενβυηδηά ηδξ ςξ ηζκάζδ, είηε απθχξ δδιζμονβεί ημ ηαηάθθδθμ πενζαάθθμκ βζα ηδ ιεηαβςβή ζδιάηςκ απυ ηδ Raf-1 (Moodie et al. 1993, Jelinek et al. 1996). Η ημπμεέηδζδ ηδξ Raf ζηδκ ηοηηανμπθαζιαηζηή ιειανάκδ επζηνέπεζ επίζδξ ζε ηζκάζεξ, υπςξ δ Src ηαζ δ PKC, κα ηνμπμ-πμζμφκ πεναζηένς ηδ Raf χζηε κα αολδεεί δ εκενβυηδηά ηδξ (Dent et al. 1995, Diaz et al. 1997).

34 H αφλδζδ αοηή ιεηααζαάγεηαζ ζηδ ζοκέπεζα µέζς ηςκ MEK-ERK (Εικόνα 19). Γηθυκα 19 : Ε μδυξ μεηαγςγήξ ζεμάηςκ ΙΑΞΗ ERK1/2 (τροποποιημένη από ). Οζ εκενβμπμζδιέκεξ ERK1 ηαζ ERK2 θςζθμνοθζχκμοκ πμθοάνζεια οπμζηνχιαηα ζε υθα ηα ηοηηανζηά δζαιενίζιαηα ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ιειανακζηχκ πνςηεσκχκ (CD120a, Syk θαη Calnexin), πονδκζηχκ οπμζηνςιάηςκ (SRC-1, Rax6, NF-AT, Elk-1, MEF2, c-fos, c-myc θαη STAT3), πνςηεσκχκ ημο ηοηηανμζηεθεημφ (paxillin) ηαζ ανηεηέξ ηζκάζεξ

35 πμο εκενβμπμζμφκηαζ απυ ηζξ ΜΑΡΚs (Roux and Blenis 2004). Δπεζδή ηα οπμζηνχιαηα ηςκ ERK1/2 ανίζημκηαζ ζε δζαθμνεηζηά οπμηοηηανζηά δζαιενίζιαηα (Εικόνα 20), δ αζμθμβζηή έηααζδ ηδξ εκενβμπμίδζήξ ημοξ εα ελανηδεεί εκ ιένεζ απυ ημκ εκημπζζιυ ηςκ ERK1/2 ηαζ ηδκ πνμζααζζιυηδηα ζε εκδεπυιεκα οπμζηνχιαηα ιέζα ζημ δζαιένζζια. Δίκαζ, επίζδξ, πζεακυ υηζ ιμνζαηά ζηνζχιαηα, ηα μπμία ηαηεοεφκμοκ ηδ δνάζδ ηςκ ΜΑΡΚs ζε εζδζηά οπμζηνχιαηα, έπμοκ ιμκαδζηή ζφκεεζδ ιέζα ζε δζαηνζηά δζαιενίζιαηα ηαζ ηοηηανζημφξ ηφπμοξ, μζ μπμίμζ πνμζηίεεκηαζ ζηδκ εοεθζλία ηδξ ιεηαβςβήξ ζήιαημξ πμο μθείθεηαζ ζηδ δνάζδ ηςκ ERK1/2. Ένεοκεξ ζε ηφηηανα γφιδξ ηαζ ηφηηανα εδθαζηζηχκ έπμοκ δείλεζ νοειζζηέξ ηδξ δζαιενζζιαημπμίδζδξ ηςκ ERK1/2 ζημοξ μπμίμοξ ζοιπενζθαιαάκμκηαζ ηαζ μζ πνςηεΐκεξ αβηονμαμθίαξ πμο ηζξ πενζμνίγμοκ ζημ ηοηηανμπθαζιαηζηυ ή ημ πονδκζηυ δζαιένζζια (Chu et al. 2004). Γηθυκα 20 : Ηοηηανμπιαζμαηηθά θαη πονεκηθά οπμζηνχμαηα ηςκ ERK1/2 (τροποποιημένη από Η ιεηαβςβή ζδιάηςκ ζηζξ ERKs µέζς GPCRs (ππνδνρείο ζπλδεδε-κέλνη µε G πξσηεΐλεο) είκαζ επίζδξ άννδηηα ζοκδεδειέκδ µε ηνμπμ-πμίδζδ ηδξ εκενβμπμίδζδξ ηδξ Raf. Παν υθα αοηά, μζ ιδπακζζιμί πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ απυ ημοξ ζοβηεηνζιέκμοξ οπμδμπείξ πμζηίθθμοκ. Η πμθοπθμηυηδηα ηςκ GPCRs, δ δζαθμνεηζηή αθθδθεπίδναζή ημοξ µε εηενμηνζιενείξ ζζμιμνθέξ G πνςηεσκχκ, δ ζηακυηδηα μνζζιέκςκ οπμδμπέςκ κα εκενβμπμζμφκ πενζζζυηενεξ απυ µία ηάλεζξ G πνςηεσκχκ ηαζ μζ

36 ηοηηανμεζδζημί ιδπακζζιμί ζοιαάθθμοκ ζε αοηή ηδκ εηπθδηηζηή πμζηζθυηδηα (Belcheva and Coscia 2002). Οζ ιεβάθμο µμνζαημφ αάνμοξ G πνςηεΐκεξ, υπςξ είκαζ βκςζηυ, απμηεθμφκηαζ απυ 3 οπμιμκάδεξ α, α ηαζ β. φιθςκα µε έκα πνμηεζκυ-ιεκμ ιμκηέθμ, μζ α ηαζ β εκενβμπμζμφκ µέθδ ηδξ μζημβέκεζαξ Src µέζς ηδξ ηζκάζδξ ΡΙ3Κ (Lopez-Ilasaca et al. 1997). Η Src ιπμνεί ηυηε κα θςζθμνοθζχζεζ ηδκ Pyk2 ή ηδκ FAK δδιζμονβχκηαξ SH 2 εέζεζξ πνυζδεζδξ (Della Rocca et al. 1999). ηδ ζοκέπεζα, ακάθμβα µε ημ ιδπακζζιυ πμο πνδζζιμπμζείηαζ απυ ημοξ οπμδμπείξ µε εκενβυηδηα ηζκάζδξ ηονμζίκδξ, ζπδιαηίγεηαζ ζηδ ιειανάκδ έκα ζφιπθμημ πμο πενζθαιαάκεζ ηζξ Shc, Grb2 ηαζ SOS ηαζ ημ μπμίμ εκενβμπμζεί ηδ Ras ηαζ αημθμφεςξ ηδ Raf-1. ε ηοηηανζημφξ ηφπμοξ, υπμο δ έηθναζδ ηδξ ΡΙ3Κ είκαζ ιζηνή, δ εκενβμπμίδζδ ηδξ ERK ελανηάηαζ απυ εκαθθαηηζηέξ μδμφξ εκενβμπμίδζδξ ημο ζοιπθέβιαημξ FAK/Src (Dikic et al. 1996). φιθςκα ιε ηδ αζαθζμβναθία μζ ERK1/2 ηαηακέιμκηαζ πακημφ ζε ηφηηανα πμο ανίζημκηαζ ζε δνειία, εκχ φζηενα απυ ηάπμζμ ενέεζζια έκαξ ζδιακηζηυξ πθδεοζιυξ ERK1/2 ζοζζςνεφεηαζ ζημκ πονήκα. Δκχ μζ ιδπακζζιμί πμο ειπθέημκηαζ ζηδ ζοζζχνεοζδ δεκ είκαζ εκηεθχξ βκςζημί, μ δζιενζζιυξ, δ θςζθμνοθίςζδ ηαζ δ απεθεοεένςζδ απυ ηοηηανμπθαζιαηζηέξ άβηονεξ θαίκεηαζ κα παίγμοκ ηάπμζμ νυθμ (Roux and Blenis 2004). Έηζζ, ιεηαθθαβιέκα ιυνζα ERK πμο δεκ ιπμνμφκ κα δζιενζζημφκ, δε ιεηαημπίγμκηαζ ζημκ πονήκα. Δπίζδξ, δ πονδκζηή ιεηαηυπζζδ ηςκ ERKs δζεοημθφκεηαζ απυ ηδ θςζθμνοθίςζή ημοξ ζημ ανυπμ εκενβμ-πμίδζδξ, αθθά δεκ απαζηεί απυ αοηέξ ηδκ απυηηδζδ ηδξ εκενβυηδηαξ ηζκάζδξ (Schaeffer and Weber 1999). Ωζηυζμ, απυ ηδ αζαθζμβναθία είκαζ βκςζηυ υηζ ζε κεονζηά ηφηηανα δ θςζθμνοθζςιέκδ ERK (perk) ακζπκεφεηαζ ζημκ πονήκα, ημ ηοηηανυπθαζια ηαζ ημοξ δεκδνίηεξ. (Sgambato et al 1998). Σέθμξ, δ ιεηαηυπζζδ ηδξ ERK ζημκ πονήκα είκαζ εειεθζχδδξ βζα ηδκ είζμδμ ζηδκ S θάζδ. Έηζζ, ζε ηαηάζηαζδ ηοηηανζηήξ ακαιμκήξ, δ ERK παναιέκεζ ζημ ηοηηανυπθαζια ζε ζφκδεζδ ιε ηδ ΜΔΚ, ημ δίηηομ ηςκ ιζηνμζςθδκίζηςκ ηαεχξ ηαζ θςζθαηάζεξ υπςξ ηδκ MKP-3. ε πνμζημθθδιέκα ηφηηανα δ ERK απακηάηαζ ηονίςξ ζημκ πονήκα ηαζ δ MEK ζημ ηοηηανυπθαζια, εκχ ζε ιδ πνμζημθθδιέκα ηφηηανα μζ ERK ηαζ MEK ζοκεκημπίγμκηαζ ζημ ηοηηανυπθαζια. Η ERK δδθαδή, πνεζάγεηαζ ιία ηαηάζηαζδ ηοηηανζηήξ πνμζηυθθδζδξ βζα ηδκ μοζζχδδ ιεηαηυπζζή ηδξ ζημκ πονήκα ηαζ μζ ζοκδέζεζξ ζκηεβηνίκδξ-ηοηηανμζηεθεημφ είκαζ ζδιακηζηέξ βζα ηδ δζαδζηαζία αοηή (Aplin et al. 2001). Έκα άθθμ ιέθμξ ηςκ ERKs, δ ERK3, αιθζζαδηήεδηε ηαζ δεκ ηδξ δυεδηε δ απαζημφιεκδ ζδιαζία ανπζηά, παν υθμ πμο δ αθθδθμοπία ηδξ έβζκε βκςζηή ηαοηυπνμκα ιε εηείκεξ ηςκ ERK1 ηαζ 2. Πνυηεζηαζ βζα ιία ηζκάζδ ιμνζαημφ αάνμοξ 63 kda, δ μπμία απακηάηαζ ηαζ ζημκ πονήκα ηαζ

37 ζημ ηοηηανυπθαζια, θαίκεηαζ κα πανμοζζάγεζ ζηδκ ηαηαθοηζηή πενζμπή 50% μιμθμβία ιε ηδκ ERK1, εκχ δ θεζημονβία ηδξ ηαναμλοηεθζηήξ ηδξ πενζμπήξ δεκ έπεζ αηυια δζεοηνζκζζηεί. Δπίζδξ, ζηδ εδθζά εκενβμπμίδζδξ ημ ιμηίαμ πμο απακηάηαζ είκαζ Ser-Glu-Gly ακηί Thr-Glu-Tyr. Δπεζδή ιάθζζηα δ θςζθμνοθίςζδ ηδξ ηονμζίκδξ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηδκ εκενβμπμίδζδ ηαζ ηδκ αθθδθεπίδναζδ ιε ηα οπμζηνχιαηα, ακηζηαηάζηα-ζή ηδξ ιε ηδ βθοηίκδ βεκκά ενςηήιαηα βζα ημ πχξ ιπμνεί δ ERK3 κα εκενβμπμζείηαζ ηαζ κα δεζιεφεηαζ ζηα οπμζηνχιαηά ηδξ. Η ERK3 θμζπυκ, πανμοζζάγεζ ηάπμζεξ μιμζυηδηεξ ιε ηζξ ERK1/2 ςξ πνμξ ηδκ αθθδθμοπία, επεζδή υιςξ, μζ θεζημονβίεξ ηαζ δ νφειζζδ είκαζ δζαθμνεηζηή έπεζ ημπμεεηδεεί ιαγί ιε ηδκ ERK4 ζε δζαθμνεηζηή οπμμζημβέκεζα, ηδ MAPK ERK3/4 (Bogoyevitch and Court 2004, Cheng et al. 1996, Pearson et al. 2001). Η ERK4 έπεζ ιμνζαηυ αάνμξ 45 kda ηαζ δ αιζκμλζηή ηδξ αθθδθμοπία δεκ είκαζ αηυια βκςζηή (Bogoyevitch and Court 2004). Η ERK5, θυβς ημο ιεβάθμο ιεβέεμοξ ηδξ (98 kda), μκμιάγεηαζ ηαζ ιεβάθδ MAPK (Big MAPK, BΜΚ). Η πνςημηαβήξ δμµή ηδξ ηαηαθοηζηήξ πενζμπήξ ηδξ ERK5 ειθακίγεζ ιεβαθφηενδ μιμθμβία µε ηδκ ακηίζημζπδ ηδξ ERK2. Η έηθναζή ηδξ ζηα εδθαζηζηά είκαζ εονφηαηδ ηαζ υπςξ μζ άθθεξ ΜΑΡΚs, δ νφειζζή ηδξ οπυηεζηαζ ζε ιζα πμζηζθία παναβυκηςκ πμθθαπθαζζαζιμφ (απμεηηθνί παξάγνληεο, θνξβνιηθνί εζηέξεο) ηαεχξ ηαζ ηοηηανζημφ ζηνεξ (ζνξβηηόιε, Η 2 Ο 2, UV αθηηλνβνιία, θ.ά.). Η ERK5 εκενβμπμζείηαζ απυ ηδ ΜΔΚ5 ηαζ ιάθζζηα απμηεθεί ημ µυκμ βκςζηυ οπυζηνςιά ηδξ. Βάζεζ πνςημηαβμφξ δμιήξ, δ ΜΔΚ5 ζπεηίγεηαζ πενζζζυηενμ µε ηζξ ΜΔΚ1/2. Ωξ ζοκέπεζα αοηήξ ηδξ ζφκδεζδξ, δ ERK5 ακαζηέθθεηαζ απυ ημοξ PD98059 ηαζ U0126, δφμ πμθφ ελεζδζηεοιέκμοξ ακαζημθείξ ηςκ ΜΔΚ1/2 (Bogoyevitch and Court 2004, Kamakura et al. 1999). Πάκηςξ δ ΜΔΚ5 δε θςζθμνοθζχκεηαζ ηαζ δεκ εκενβμπμζείηαζ απυ ηδ Raf-1 υπςξ μζ ΜΔΚ1/2. Η ERK6 έπεζ ιμνζαηυ αάνμξ 40.3 kda ηαζ πανμοζζάγεζ 41% μιμθμβία ιε ηδκ ERK1, 39% ιε ηδκ ERK2 ηαζ 33% ιε ηδκ ERK3, υιςξ ηδ ιεβαθφηενδ μιμθμβία (60%) πανμοζζάγεζ ιε ηδκ p38 ΜΑΡΚ, βζ αοηυ ηαζ ηδξ δυεδηακ επίζδξ, ηα μκυιαηα SAPK-3 ηαζ p38β. Όπςξ ηαζ μζ ηζκάζεξ p38, δ ERK6 ζηδ εδθζά εκενβμπμίδζδξ θένεζ ημ ιμηίαμ Thr-Gly-Tyr ηαζ εκενβμπμζείηαζ ηαηά ημ ηοηηανζηυ ζηνεξ ηαζ οπυ ηδκ επίδναζδ ηοηηανμηζκχκ. Παν υθα αοηά, δ ERK6 πανμοζζάγεζ ηαζ δζαθμνέξ ςξ πνμξ ηζξ p38 ηζκάζεξ, αθμφ δεκ επδνεάγεηαζ απυ ημκ SB203580, έκακ ακαζημθέα ηςκ p38α/α (Bogoyevitch and Court 2004). Σμ 1999 ηθςκμπμζήεδηε ιε PCR δ ΔRΚ7 (61 kda) πνδζζιμπμζ-χκηαξ εκανηηήνζεξ αθθδθμοπίεξ (primers) ααζζγυιεκεξ ζηζξ ορδθά ζοκηδνδιέκεξ αθθδθμοπίεξ ηςκ ΜΑΡΚs, εκχ πνυζθαηα απμιμκχεδηε άθθμ έκα ιέθμξ ηςκ ERKs, δ ERK8 (60 kda) ιε πνήζδ ηδξ ERK7 ςξ ακζπκεοηή (probe). Η εδθζά εκενβμπμίδζδξ ηαζ ηςκ δφμ πενζέπμοκ ημ ιμηίαμ Thr-Glu-Tyr, υπςξ

38 ηαζ μζ ERK1, ERK2 ηαζ ERK5, εκχ δ ERK7 πανμοζζάγεζ 40% μιμθμβία ιε ηζξ δφμ πνχηεξ. Η ERK7 θαίκεηαζ κα θςζθμνοθζχκεζ ηα οπμζηνχιαηα c-fos ηαζ c-myc, υπζ υιςξ ηαζ ηα οπμζηνχιαηα Elk-1, c-jun ή ATF2 ηαζ PHAS-I, εκχ δ ERK8 δε θαίκεηαζ κα θςζθμνοθζχκεζ ηα οπμζηνχιαηα c-jun, c-myc, c-max, Elk-1, Ets-1, ζζηυκδ Η1 ηαζ παλζθθίκδ. Δπίζδξ, δ ERK8 πανμοζζάγεζ 69% μιμθμβία ιε ηδκ ERK7, πμζμζηυ πμο αολάκεηαζ ζε 80% ζηδκ ηαηαθοηζηή πενζμπή (Bogoyevitch and Court 2004). H ΟΔΟ MAPK JNK Η JNK/SAPK απμιμκχεδηε ανπζηά ςξ ιζα MAP ηζκάζδ ιμνζαημφ αάνμοξ 54 kda (Εικόνα 21). ηδ ζοκέπεζα, ακαηαθφθεδηακ άθθεξ δφμ ζζμιμνθέξ ιμνζαημφ αάνμοξ 46 ηαζ 54 kda ακηζζημίπςξ (Hibi et al. 1993). Απμιυκςζδ ηςκ cdnas ηςκ πνςηεσκχκ αοηχκ ηαεχξ ηαζ ακάθοζδ ηδξ έηθναζήξ ημοξ απμηάθορε ηνία βμκίδζα απυ ηα μπμία µε εκαθθαηηζηυ ιάηζζια πνμηφπημοκ 10 ημοθάπζζημκ ζζμιμνθέξ (Tibbles and Woodgett 1999). Δκηυξ ηδξ ηαηαθοηζηήξ πενζμπήξ δ μιμθμβία ηςκ JNK1/SAPK β, JNK2/SAPK α ηαζ JNK3/SAPK α αββίγεζ ημ 85%. Οζ ηζκάζεξ αοηέξ ζηδ εδθζά εκενβμπμίδζδξ θένμοκ ημ ιμηίαμ Thr-Pro-Tyr ηαζ εκενβμπμζμφκηαζ απυ ηοηηανμηίκεξ, πνμζδέιαηα GPCRs, πανάβμκηεξ πμο ειπθέημκηαζ ζηδ ζφκεεζδ DNA ηαζ πνςηεσκχκ, πανάβμκηεξ ζηνεξ η.ά. Γηθυκα 21 : Οπεμαηηθή απεηθυκηζε ηεξ δμμήξ ηεξ JNK/SAPK (

39 Γηθυκα 22 : Ε μδυξ μεηαγςγήξ ζεμάηςκ ΙΑΞΗ JNK (τροποποιημένη από www. superarray.com). Οζ JNK/SAPKs εκενβμπμζμφκηαζ απυ ηζξ ΜΔΚ4 ηαζ 7, μζ μπμίεξ έπμοκ ηδκ ζηακυηδηα κα θςζθμνοθζχκμοκ ηαζ µέθδ ηδξ μζημβέκεζαξ ηςκ p38, υιςξ μζ JNK/SAPKs θαίκεηαζ κα είκαζ ηα επζηναηέζηενα οπμ-ζηνχιαηά ημοξ (Pearson et al. 2001). Απυ in vitro ιεθέηεξ πνμηφπηεζ υηζ δ ΜΔΚ4 πνμηζιά ηδ θςζθμνοθίςζδ ηδξ ηονμζίκδξ, εκχ δ ΜΔΚ7 ηδξ ενεμκίκδξ ζημ ιμηίαμ ηδξ εδθζάξ εκενβμπμίδζδξ. Με αάζδ αοηυ ημ δεδμιέκμ, έπεζ πνμηαεεί υηζ μζ ηζκάζεξ αοηέξ ζοκενβάγμκηαζ βζα ηδκ εκενβμπμίδζδ ηςκ JNK/SAPKs (Lawler et al. 1998, Lisnock et al. 2000). Μάθζζηα βζα ηδ JNK3, ηα απμηεθέζιαηα δείπκμοκ υηζ δ θςζθμνοθίςζδ ζηδ ενεμκίκδ ίζςξ είκαζ δ πζμ

40 ζδιακηζηή βζα ηδκ εκενβμπμίδζή ηδξ (Lisnock et al. 2000). Ακαθφζεζξ βζα ηδκ εκενβμπμίδζδ ηδξ JNK ζηα εδθαζηζηά, απoηάθορακ υηζ, ζε ακηίεεζδ µε ηζξ ERK1/2, ζηα πενζζζυηε-να ηφηηανα πμο ελεηάζεδηακ, δ JNK δεκ εκενβμπμζείηαζ απυ ιζημβυκμοξ πανάβμκηεξ υπςξ μζ EGF, PDGF ηαζ FGF. Ακηίεεηα, δ JNK εκενβμ-πμζείηαζ ζζπονά απυ ιζα ιεβάθδ πμζηζθία αθαπηζηχκ βζα ηα ηφηηανα παναβυκηςκ. Σέημζμζ πανάβμκηεξ είκαζ μζ ηοηηανμηίκεξ ηδξ μζημβέκεζαξ TNF (Tumor Necrosis Factor)[ηληεξιεπθίλε-1 (IL-1), CD40-ligand, CD27-ligand, Fas ligand θ.ά.], ημ ηοηηανζηυ ζηνεξ [ζεξκνθξαζηαθό ή ππεξσζκσηηθό ζνθ, ε UV αθηηλνβνιία θαη ην ηζραηκηθό ζνθ], ηα αββεζμδναζηζηά πεπηίδζα [ε ελδνζειίλε θαη ε αγγεηνηελζίλε II (ANGII)] ηαζ ημ νζαμημλζηυ ζηνεξ πμο πνμηαθείηαζ απυ ηδκ ακζζμµοηίκδ ηαζ ηδκ παθζημλίκδ (Iordanov et al. 1998, Kallunki et al. 1998, Matsuda et al. 1995, Silapiro et al. 1996, Minden et al. 1995). Σέθμξ, δ εκενβμπμίδζδ ηδξ JNK έπεζ δεζπεεί υηζ ζπεηίγεηαζ µε ημκ πνμβναιιαηζζιέκμ ηοηηανζηυ εάκαημ ή ηδκ απυπηςζδ (Johnson et al. 2002, Tournier et al. 2000)(Εικόνα 22). H ΟΔΟ MAPK p38 Η p38 ακαβκςνίζηδηε πνχηδ θμνά ημ 1994 ςξ MAPK-ζηυπμξ ηδξ εκδμημλίκδξ ηαζ ηδξ οπενςζιςηζηυηδηαξ ζηα ηφηηανα ηςκ εδθαζηζηχκ (Han et al. 1994). Λίβμ ανβυηενα, ακαθένεδηε υηζ ημ απμηέθεζια ηδξ ηθςκμπμίδζδξ ημο ζηυπμο εκυξ ακηζθθεβιμκχδμοξ θανιάημο (αλαζηνιέαο SB203580), ήηακ ηαοηυζδιμ µε ηδκ p38 ηαζ μκμιάζηδηε CSBP (Lee et al. 1994). Η ηζκάζδ αοηή πανμοζζάγεζ ιεβάθδ μιμθμβία µε ηδκ ηζκάζδ HOG1 ημο Saccharomyces cerevisiae πμο ζοιιεηέπεζ ζηδκ πνμζηαζία ημο ηοηηάνμο απυ ημ οπενςζιςηζηυ ζηνεξ (Brewster et al. 1993), εκχ ιία αηυια μιυθμβδ πνςηεΐκδ έπεζ απμιμκςεεί απυ ημ Xenopus, δ XMpk2. Πμθθαπθμί ηφπμζ ηοηηανζημφ ζηνεξ ανέεδηε κα εκενβμπμζμφκ ηζξ p38 ηςκ εδθαζηζηχκ (όπσο ε ππεξηώδεο αθηηλνβνιία, ην σζµσηηθό θαη ην ζεξκηθό ζνθ, ν ιηπνπνιπζαθραξίηεο ή αλαζηνιείο ηεο πξσηετλνζύλζεζεο). Δπίζδξ, ζηδκ εκενβμπμίδζδ ηςκ p38 MAP ηζκαζχκ ζοιιεηέπμοκ μνζζιέκεξ ηοηηανμηίκεξ (IL-1, TNF-α), μνιυκεξ ηαζ οπμδμπείξ ζοκδευιεκμζ µε G πνςηεΐκεξ (Windmann et al. 1999). Μεηαβεκέζηενεξ ιεθέηεξ έπμοκ πνμηείκεζ ηδ ζοιιεημπή ηςκ p38 υπζ µυκμ ζηζξ ακηζδνάζεζξ θθεβιμκήξ, αθθά επίζδξ ζηδκ επαβυιεκδ απυ ημ ζηνεξ ιεηαβςβή ιδκοιάηςκ, ζημκ ηοηηανζηυ πμθθαπθαζζαζιυ ηαεχξ επίζδξ ηαζ ζηδκ απυπηςζδ (Johnson and Lapadat 2002). Η μδυξ ΜΑΡΚ p38 (Εικόνα 23) απμηεθείηαζ απυ ημοθάπζζημκ ηέζζενζξ δζαθμνεηζηέξ μιυθμβεξ πνςηεΐκεξ, ηδκ p38α, ηδκ p38α, ηδκ p38β ηαζ ηδκ p38δ (Wang et al. 1999, Zerbos et al. 1995). Καζ μζ ηέζζενζξ ηζκάζεξ πενζέπμοκ ημ ιμηίαμ Thr-Gly-Tyr ζηδ εδθζά εκενβμπμίδζδξ. Οζ p38 ΜΑΡ

41 ηζκάζεξ εκενβμπμζμφκηαζ απυ δφμ ΜΔΚs, ηζξ ΜΔΚ3 ηαζ ΜΔΚ6, εζζένπμκηαζ ζημκ πονήκα ηαζ εηεί θςζθμνοθζχκμοκ πονδκζηά οπμζηνχιαηα υπςξ μ Elk-1. Η ΜΔΚ3 θςζθμνοθζχκεζ ηαηά πνμηίιδζδ ηζξ ζζμιμνθέξ p38α ηαζ p38α εκχ δ ΜΔΚ6 υθα ηα µέθδ ηδξ μζημβέκεζαξ p38. Καζ μζ δφμ επίζδξ, ιπμνμφκ κα θςζθμνοθζχζμοκ ζζμιμνθέξ JNK/SAPKs (Enslen et al. 2000). ε υθεξ ζπεδυκ ηζξ πενζπηχζεζξ μζ δζεβένζεζξ πμο εκενβμπμζμφκ ηζξ JNK/SAPKs, αζημφκ ηδκ ίδζα δνάζδ ηαζ ζηζξ p38 (Johnson and Lapadat 2002, Kyriakis and Avruch 1996). Γηθυκα 23 : Ε μδυξ μεηαγςγήξ ζεμάηςκ MAPK p38 (τροποποιημένη από

42 Αλζμζδιείςημ είκαζ υηζ έπμοκ ακαθενεεί ζηδ αζαθζμβναθία ηάπμζα ιυνζα πμο εκενβμπμζμφκ ιζα μδυ ΜΑΡΚ ακαζηέθθμκηαξ ηαοημπνυκςξ ιία άθθδ. Γζα πανάδεζβια, μ πανάβμκηαξ ςνίιακζδξ ηδξ κεονμβθμίαξ (glia maturation factor) εκενβμπμζεί ηδκ μδυ ηδξ ΜΑΡΚ p38, εκχ πανάθθδθα ακαζηέθθεζ ηδκ μδυ ηδξ ΜΑΡΚ ERK. Ο πανάβμκηαξ αοηυξ είκαζ ιζα πνςηεΐκδ ημο εβηεθάθμο, 17 kda, δ μπμία υηακ θςζθμνοθζχκεηαζ απυ ηδκ campελανηχιεκδ PKA αολάκεζ ηδκ εκενβυηδηα ηδξ ΜΑΡΚ p38, εκχ δνα ηαζ ςξ ζζπονυξ ακαζημθέαξ ηςκ ERK1 ηαζ ERK2 (Windmann et al. 1999). ΕLK-1 : ΚΟΙΝΟ ΤΠΟΣΡΩΜΑ ΚΑΙ ΓΙΑ ΣΙ 3 ΜΑΡΚS O Elk-1 (Ε-26 like protein-1) είκαζ έκαξ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ ιμνζαημφ αάνμοξ 62 kda πμο είκαζ ιέθμξ ηδξ μζημβέκεζαξ ηςκ ETS μβημβμκζδίςκ ηαζ ηδξ οπμμζημβέκεζαξ ηςκ TCFs (Ternary Complex Factors), εκχ πζζηεφεηαζ υηζ επζδνά ζηδ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ κεονχκςκ, ζημκ ηοηηανζηυ πμθθαπθαζζαζιυ, ηδκ ηανηζκμβέκεζδ ηαζ ηδκ απυπηςζδ (Barrett et al. 2006). ημκ πονήκα ζπδιαηίγεζ ηνζιενέξ ζφιπθμημ (Εικόνα 24 Α) ιε δφμ πανάβμκηεξ SRF (Serum Response Factor) ηαζ πνμζδέκεηαζ ζηδκ πενζμπή SRE (Serum Response Element) ημο οπμηζκδηή μνζζιέκςκ βμκζδίςκ νοειίγμκηαξ ηδκ έηθναζή ημοξ. ημ αιζκμηεθζηυ ημο άηνμ, θένεζ ηδκ πενζμπή ETS, ιε ηδ μπμία ακαβκςνίγεζ ηδκ επακαθαιαακυιεκδ αθθδθμοπία 5 - GGA(A/T)-3 ηαζ πνμζδέκεηαζ ζημ DNA (Graves and Petersen 1998, Sharrocks 2001). Δπζπθέμκ, θένεζ ημ θνπηί Β ( B box ), ιία ζοκηδνδιέκδ αθθδθμοπία 21 αιζκμλέςκ, ιέζς ηδξ μπμίαξ αθθδθε-πζδνά ιε ημκ SRF, ιζα C πεξηνρή πμο δνα ςξ πενζμπή εκενβμπμίδζδξ ηδξ ιεηαβναθήξ, δφμ πενζμπέξ ηαηαζημθήξ (R motif) ηαζ δφμ πενζμπέξ δζαζφκδεζδξ ιε ηζξ ΜΑΡΚs ERK ηαζ JNK, εκχ επίζδξ, θαίκεηαζ κα αθθδθεπζδνά ηαζ ιε ηδκ p38 (Barrett et al. 2006, Ling and Lakey 1997)(Εικόνα 24 Β). Απυ ηδ αζαθζμβναθία είκαζ βκςζηυ υηζ μ Elk-1 απμηεθεί οπυζηνςια ηδξ ERK2, δ μπμία ημκ θςζθμνοθζχκεζ ζηδκ ηαναμλοηεθζηή ημο πενζμπή (Ser 383 ) ηαεζζηχκηαξ ημκ ζηακυ κα εκενβμπμζεί ηδ ιεηαβναθή ζοβηεηνζιέκςκ βμκζδίςκ (Hjoberg et al. 2004, Bar Sagi and Hall 2000). Πζμ ζοβηεηνζιέκα θαίκεηαζ υηζ δ πενζμπή πμο είκαζ οπεφεοκδ βζα ηδκ αθθδθεπίδναζή ημο ιε ηδκ ERK είκαζ δ πενζμπή PNT (Pointed) πμο απμηεθείηαζ απυ 5 α έθζηεξ (Slupsky et al. 1998). Δπίζδξ, ιε ακαζημθή ηδξ ιεηαηυπζζδξ ηδξ ERK ζημκ πονήκα ακαζηέθθεηαζ ζζπονά δ ιεηα-βναθή βμκζδίςκ πμο ελανηχκηαζ απυ ημκ Elk-1 ηαεχξ ηαζ δ ζηακυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ κα εζζένπμκηαζ ζηδκ S θάζδ ημο ηοηηανζημφ ηφηθμο πνμξ απυηνζζδ ζε αολδηζημφξ πανάβμκηεξ (Brunet et al. 1999). φιθςκα ιε ημ Mao ηαζ ηδκ μιάδα ημο δ θςζθμνοθζςιέκδ ιμνθή ημο Elk-1 πενζμνίγεηαζ ζημκ πονήκα ηςκ κεονζηχκ ηοηηάνςκ, εκχ δεκ ακζπκεφεηαζ ζηζξ κεονζηέξ απμθφζεζξ ηαζ ημ ηοηηανυπθαζια (Barrett et al.

43 2006, Mao and Wang 2003). Ακηίεεηα, δ ιδ εκενβμπμζδιέκδ ιμνθή ημο Elk- 1 δεκ ακζπκεφεηαζ ζημκ πονήκα αθθά ιυκμ ζημ ζχια, ημοξ δεκδνίηεξ ηαζ ηζξ απμθήλεζξ ηςκ κεοναλυκςκ (Sgambato et al. 1998). Η παναιμκή ημο Elk-1 ζημκ πονήκα θαίκεηαζ κα νοειίγεηαζ ιε ηδ ζμοιμτθίςζδ ημο πανάβμκηα, δδθαδή ηδκ πνμζεήηδ εκυξ πεπηζδίμο SUMO (γλσζηνύ θαη σο Sentrin) ζηζξ θοζίκεξ 230, 249 ηαζ 254 (Εικόνα 24). Η ζμοιμτθίςζδ (sumoylation) ιπμνεί κα ακαζηναθεί απυ πνςηεάζεξ πμο απμιαηνφκμοκ ημ ζογεοβιέκμ πεπηίδζμ απυ ηδκ πνςηεΐκδ-ζηυπμ επζηνέπμκηαξ ζδζαίηενα πενίπθμημοξ ηνυπμοξ νφειζζδξ (Salinas et al. 2004, Wilson and Rangasami 2001, Hill and Treisman 1995, Sukhatme 1990, Trenczek and Bennich 1990). Γηθυκα 24 : Οπεμαηηθή απεηθυκηζε ηεξ δμμήξ ημο Elk-1 (Α τροποποιημένη από και Β τροποποιημένη από Salinas et al. 2004). Δηηυξ ηδξ ERK αιθυηενεξ μζ JNK ηαζ p38 θςζθμνοθζχκμοκ ημκ Elk-1 (Galetic et al. 2003, Aplin et al. 2002, Yang et al. 1998)(Εικόνα 25). Δπίζδξ, θαίκεηαζ υηζ δ PKB/Akt νοειίγεζ ανκδηζηά ημ ιμκμπάηζ Ras-Raf-MEK-ERK ιεζχκμκηαξ ηδκ εκενβμπμίδζδ ηδξ ERK, βεβμκυξ πμο μδδβεί ζε ακεκενβμπμίδζδ ημο Elk-1 ηαζ άνα ζε ηαηαζημθή ηδξ ιεηαβναθήξ πμο ελανηάηαζ απυ ημ SRE, δδθαδή ζε ιείςζδ ηδξ ιεηαβναθήξ βμκζδίςκ πμο πενζέπμοκ ημ SRE (όπσο ηα ακέζσο πξώηκα γνλίδηα θαη ην c-fos). Ωξ βκςζηυκ, δ έηθναζδ ημο c-fos αολάκεηαζ πνζκ ηδκ απυπηςζδ, επμιέκςξ ηα απμηεθέζιαηα αοηά ζοιθςκμφκ ιε ημκ εζδζηυ νυθμ ηδξ PKB/Akt ζηδκ πνμαβςβή ηδξ ηοηηανζηήξ

44 επζαίςζδξ. Πεζνάιαηα in vitro ζοιπεναίκμοκ υηζ πζεακχξ δ PKB/Akt κα εκενβμπμζεί ιία θςζθαηάζδ, δ μπμία απμ-θςζθμνοθζχκεζ ηαζ ακεκενβμπμζεί ημκ Elk-1. (Galetic et al. 2003). Γηθυκα 25 : Ξφζμηζε ηεξ γμκηδηαθήξ μεηαγναθήξ μέζς ημο ηνηαδηθμφ ζομπιυθμο ηςκ Elk-1 θαη SRF (Yordy and Muise-Helmericks 2000). Δπζπθέμκ, πνμζθάηςξ δδιμζζεφεδηε υηζ έκα άθθμ ιέθμξ ηςκ ETS μβημβμκζδίςκ, μ Tel, πνμζδέκεηαζ ζηζξ πενζμπέξ ηαηαζημθήξ ημο Elk-1 ηαζ ημκ ακεκενβμπμζεί, εκχ δ θεζημονβζηυηδηά ημο νοειίγεηαζ απυ ηζξ ERK ηαζ p38, υπζ υιςξ ηαζ απυ ηδ JNK, μζ μπμίεξ ημκ θςζθμνοθζχκμοκ ηαζ ηαηαζηέθθμοκ ηδ δνάζδ ημο (Arai et al. 2002). Σέθμξ, μ Elk-1 θαίκεηαζ κα απεκενβμπμζείηαζ ηαζ απυ ημ ζφιπθμημ απμαηεηοθαζχκ ηςκ ζζημκχκ (HDAC)(Yordy and Muise-Helmericks 2000) (Εικόνες 26 & 27). msin3 A Γηθυκα 26 : Ννμηεηκυμεκμ μμκηέιμ γηα ηε νφζμηζε ηεξ γμκηδηαθήξ έθθναζεξ απυ ημκ Elk-1 (τροποποιημένη από Tootle and Rebay 2005). A) Απμοζία ζεμαημδυηεζεξ, ημ ζφμπιμθμ Elk-1/SRF δεζμεφεηαη ζημ DNA ζε ζφμπιμθμ με ηεκ p300/cbp δηαηενχκηαξ ζε βαζηθά επίπεδα ηε μεηαγναθηθή δναζηενηυηεηα, Β) ζμομμτιίςζε ημο Elk-1 μδεγεί ζηεκ

45 πιήνε θαηαζημιή ηεξ μεηαγναθήξ θαη ηε ζοκανμμιυγεζε ηςκ HDACs, Γ) ζεμαημδυηεζε μέζς MAPKs μδεγεί ζηε θςζθμνοιίςζε ημο Elk-1 πμο δηαθμνμπμηεί ηεκ αιιειεπίδναζή ημο με ηεκ p300/cbp θαη αολάκεη ηε μεηαγνα-θηθή δναζηενηυηεηα θαη Δ) μέζς ανκεηηθήξ ακάδναζεξ, ε θςζθμ-νοιίςζε ημο Elk-1 απυ ηηξ MAPKs μδεγεί ζηεκ αιιειεπίδναζε με ημ ζφμπιμθμ msin3a/hdac1 με απυννμηα ηεκ θαηαζημιή ηεξ μεηαγναθήξ θαη ηεκ ελαζζέκηζε ηεξ απυθνηζεξ. Γηθυκα 27 : Ννμηεηκυμεκμ μμκηέιμ γηα ηε νφζμηζε ηεξ γμκηδηαθήξ έθθναζεξ απυ ημκ Tel (τροποποιημένη από Tootle and Rebay 2005). A) Μιηγμμενή ημο Tel θαηαζηέιιμοκ ηε μεηαγναθή θαηά ηεκ απμοζία ζεμαημδυηεζεξ, Β) έπεηηα απυ ηεκ εκενγμπμίεζε ημο ζεμαημδμηηθμφ μμκμπαηημφ, ε θςζθμνοιίςζε απυ ηηξ MAPKs θαη ε ζμομμτιίςζε ημο Tel ημκ απμμαθνφκμοκ απυ ημ DNA (δεκ είκαη γκςζηυ πμηα ηνμπμπμίεζε ζομβαίκεη πνχηε) θαη Γ) μ Tel ζηε ζοκέπεηα, αιιειεπηδνά με ημκ CRM1 θαη ελάγεηαη ζημ θοηηανυπιαζμα, αιιά δεκ απμδμμείηαη. Οι οδοί μεταγωγής σημάτων MAPΚs στα έντομα Σμ πνμσυκ ημο βμκζδίμο rolled ηδξ Drosophila είκαζ μιυθμβμ ηςκ ERKs ηςκ εδθαζηζηχκ. Η ηζκάζδ DMAPK rolled απαζηείηαζ ηαηά ηδκ ακάπηολδ ημο ζφκεεημο μθεαθιμφ απυ ημ ζφζηδια sevenless, ημ μπμίμ θεζημονβεί βζα ηδκ ηεθζηή δζαθμνμπμίδζδ ηςκ πνυδνμιςκ ηοηηάνςκ ηςκ R7 θςημτπμδμπέςκ

46 (Biggs et al. 1994). Η μιυθμβδ ηδξ RAF1 ζηδ Drosophila, DMAPKKK RAF1, απαζηείηαζ ηαηά ηδκ ακάπηολδ ηςκ πνχζιςκ πνμκοιθζηχκ ζηαδίςκ. Γεκζηά, θαίκεηαζ υηζ δ μδυξ ηδξ MAPK ERK ειπθέ-ηεηαζ ζε ανηεηά ακαπηολζαηά ζηάδζα ηδξ ιφβαξ. Οζ πνςηεΐκεξ DΜAPΚΚ HEP (γνληδηαθό πξντόλ ηνπ hemipterus) ηαζ DMAPK BSK (γνληδηαθό πξντόλ ηνπ basket) είκαζ μιυθμβεξ ηςκ ΜAPΚΚ MKK7 ηαζ ΜΑΡΚ JNK1 ακηζζημίπςξ ηαζ νοειίγμοκ ιμνθμβεκεηζηέξ ηζκήζεζξ ηαηά ηδκ ειανομβέκεζδ. Δπζπθέμκ, δ DMAPK BSK ζοιιεηέπεζ ζηζξ ακμζμαπμηνίζεζξ έκακηζ ααηηδνίςκ ζηδ Drosophila, ηαεχξ εκενβμ-πμζείηαζ απυ ημ θζπμπμθοζαηπανίηδ (Sluss et al. 1996). Δπίζδξ, έπμοκ ηθςκμπμζδεεί ζηδ Drosophila μζ DMAPK p38α ηαζ DMAPK p38α, μιυθμβεξ ηςκ ΜΑΡΚ p38 (Han et al. 1998), μζ μπμίεξ εκενβμπμζμφκηαζ απυ ημ ζηνεξ (σζκσηηθό, ζεξκηθό, νμεηδσηηθό) ζηα ηφηηανα ηδξ Drosophila. Όιςξ, ακηίεεηα µε ηζξ μιυθμβεξ πνςηεΐκεξ ηςκ εδθαζηζηχκ, μζ DMAPK p38 δε νοειίγμοκ εεηζηά ζήιαηα άιοκαξ. Φαίκεηαζ ιάθζζηα υηζ ζοιιεηέπμοκ ζηδκ ηαηαζημθή ηδξ βμκζδζαηήξ έηθναζδξ ηαηά ηδκ ακμζμαπυηνζζδ (θαηαζηνιή ηεο κεηαγξαθήο ησλ αληηκηθξνβηαθώλ πεπηηδίσλ, αηηαθίλε θαη αθξνπίλε)(han et al. 1998). Η ιείςζδ αοηή πάκηςξ, πναβιαημπμζείηαζ ζηα ηεθεοηαία ζηάδζα ηδξ ιυθοκζδξ ηαζ πζεακχξ ακηζπνμζςπεφεζ έκα ιδπακζζιυ εθέβπμο πμο απμηνέπεζ ηδκ οπενδζέβενζδ ημο ακμζμπμζδηζημφ ζοζηήιαημξ µε ηζξ επαηυθμοεεξ αθααενέξ ζοκέπεζεξ. Σέθμξ, δ πνςηεΐκδ Pointed (Pnt) ηδξ Drosophila ηςδζημπμζείηαζ απυ έκα βμκίδζμ πμο θαίκεηαζ κα είκαζ μιυθμβμ ηςκ βμκζδίςκ πμο ηςδζημπμζ-μφκ ηζξ πνςηεΐκεξ Ets-1 ηαζ Ets-2 ηςκ εδθαζηζηχκ (Brunner et al. 1994, O Neill et al. 1994, Zettevall et al. 2004). Τπάνπεζ ζε δφμ ζζμιμνθέξ, ηζξ PntP1 ηαζ PntP2, μζ μπμίεξ πνμηφπημοκ ιε εκαθθαηηζηή πνήζδ δφμ οπμηζκδηχκ πμο απέπμοκ ιεηαλφ ημοξ πενίπμο 50 kb. Οζ PntP1 ηαζ PntP2 πενζέπμοκ ιμκαδζηέξ πενζμπέξ ζημ αιζκμηεθζηυ ημοξ άηνμ, αθθά ιμζνάγμκηαζ ιία αθθδθμοπία 394 αιζκμλέςκ ζημ ηαναμλοηεθζηυ ημοξ άηνμ ιέζα ζηδκ μπμία πενζέπεηαζ ηαζ δ ETS πενζμπή ιε ηδκ μπμία πνμζδέκμκηαζ ζημ DNA. Η ζηακυηδηά ημοξ κα δεζιεφμκηαζ ζημ DNA θαίκεηαζ ίδζα, παν υθα αοηά, μζ δφμ πνςηεΐκεξ δζαθένμοκ ζηζξ θεζημονβζηέξ ημοξ ζδζυηδηεξ ηαζ ζηδ νφειζζδ ηδξ ιεηαβναθήξ ημοξ. Η PntP1 είκαζ έκαξ μοζζχδδξ (constitutive) ιεηαβναθζηυξ εκενβμπμζδηήξ ηαζ δ εκενβμπμίδζδ ηδξ μδμφ Ras/MAPKs επάβεζ ηδ ιεηαβναθή ηδξ ζε ακηίεεζδ ιε ηδκ PntP2 (Gabay et al. 1996). Απυ ηδ αζαθζμβναθία θαίκεηαζ υηζ ηαζ μζ δφμ ζζμιμνθέξ πανμοζζάγμοκ 63% μιμθμβία ιε ημκ Elk-1 ηαζ νοειίγμοκ ηδκ ακάπηολδ πμθθχκ δζαθμνεηζηχκ ηοηηανζηχκ ηφπςκ ηαζ ζζηχκ ζηδ Drosophila. Ακαζημθέαξ ηςκ δφμ ζζμιμνθχκ ηδξ Pointed είκαζ μ D-YAN, μ μπμίμξ είκαζ μιυθμβμξ ημο Tel ηςκ εδθαζηζηχκ (Brunner et al. 1994, O Neill et al. 1994)(Εικόνα 28).

47 Γηθυκα 28 : Ννμηεηκυμεκμ μμκηέιμ γηα ηε νφζμηζε ηεξ γμκηδηαθήξ έθθναζεξ απυ ηεκ Pointed θαη ημκ Yan (τροποποιημένη από Tootle and Rebay 2005). A) Όηακ μη MAPKs δεκ είκαη εκενγμπμηεμέκεξ, με θςζθμνοιηςμέκα μιηγμμενή ημο YAN ακηαγςκίδμκηαη ηεκ PNT (Pointed ) γηα πνυζβαζε ζηηξ ETS πενημπέξ γηα κα θαηαζηείιμοκ ηε μεηαγναθή, Β) ε δη-θςζθμ-erk μπαίκεη ζημκ πονήκα θαη θςζθμνοιηχκεη ημ YAN θαη ηεκ PNT με μηα δηαδηθαζία υπμο ζομμεηέπεη μ MAE θαη θαηά ηεκ μπμία ηα πμιομενή ημο YAN απμζοκανμμιμγμφκηαη θαη απμμαθνφκμκηαη απυ ημ DNA, Γ) ε ελπμνηίκε CRM1 ελάγεη ημκ YAN υπμο αοηυξ απμδμμείηαη, εκχ ε PNT δεζμεφεηαη ζηεκ ETS πενημπή θαη επάγεη ηε μεηαγναθή ημο γμκηδίμο, θαη Δ) μέζς ανκεηηθήξ ακάδναζεξ, μ ΙΑΓ δεζμεφ-εηαη ζηεκ PNT θαη ελαζζεκεί ηε μεηαγναθηθή δναζηενηυηεηα με άγκςζημ αθυμα μεπακηζμυ.

48 ΗΟΠΟ ΣΕ ΔΖΑΣΡΖΒΕ Πμθθέξ ιεθέηεξ έπμοκ θακενχζεζ ανηεηέξ μιμζυηδηεξ ιεηαλφ ημο ακμζμπμζδηζημφ ζοζηήιαημξ ηςκ εδθαζηζηχκ ηαζ ηςκ εκηυιςκ, ζδζαζηένςξ δε ζε υ,ηζ ζπεηίγεηαζ ιε ηα ζδιαημδμηζηά ιμκμπάηζα, αθμφ μζ μνβακζζιμί αοημί πνδζζιμπμζμφκ μιυθμβα ιυνζα βζα κα νοειίζμοκ ηζξ ακμζμθμβζηέξ ημοξ απμηνίζεζξ (Engstrom 1993, Hoffman and Reichhart 2002). ηυπμξ ημο ενβαζηδνίμο ιαξ ηα ηεθεοηαία πνυκζα είκαζ δ ιεθέηδ ηςκ ζδιαημδμηζηχκ ιμκμπαηζχκ πμο νοειίγμοκ ηζξ δζάθμνεξ ακμζμαπμηνίζεζξ ηςκ εκηυιςκ. Έπεζ ανεεεί υηζ ηα αζιμηφηηανα ηςκ εκηυιςκ πνδζζιμπμζμφκ ημ ζδιαημδμηζηυ ιμκμπάηζ ηληεγθξίλεο FAK Src MAPKs Elk-1 βζα ηδκ ηοηηανμθαβία ηδξ E. coli (Foukas et al.1998, Metheniti et al. 2001, Lamprou et al. 2005, Lamprou et al. 2007, Mamali et al. 2007). Ακηζηείιεκμ ηδξ πανμφζαξ ενβαζίαξ απμηεθεί δ δζενεφκδζδ ημο ηνυπμο αθθδθεπίδναζδξ ηςκ ζδιαημδμηζηχκ ιμνίςκ ηα μπμία ζοιιεηέπμοκ ζημ ιμκμπάηζ πμο μδδβεί ζηδκ ηοηηανμθαβία ηδξ E. coli. Πζμ ζοβηεηνζιέκα ιεθεηήεδηε δ ηαηακμιή ηςκ FAK, ERK ηαζ Elk-1 ηαεχξ ηαζ ηςκ θςζθμνοθζςιέκςκ ημοξ ιμνθχκ ζηα αζιμηφηηανα ηδξ ιφβαξ ηδξ Μεζμβείμο, εκχ δζενεοκήεδηε ακ ζοκεκημπίγμκηαζ ηαζ ζοιπθμημπμζμφκηαζ πνμηεζιέκμο κα αθθδθεπζδνάζμοκ ιεηαλφ ημοξ.

49

50 ΤΚΟΠΣΖΗΟ ΠΖΚΑΗΑ ΑΚΣΖΔΡΑΣΕΡΖΩΚ Ριηθυ Ζδηυηεηα Γηαηνεία θςδηθυξ παναγγειίαξ Πειηθή ζογθέκηνςζε Rabbit anti-fak αληίζσκα Santa cruz sc-932 WB 1:1000 IP 0.2 κg/100 κg πξση. Mouse anti-fak αληίζσκα Santa cruz sc-1688 IF 1:100 Rabbit antip Y397 FAK αληίζσκα Santa cruz sc r WB 1:1000 IP 0.2 κg/100 κg πξση. Mouse antip Y397 FAK αληίζσκα Santa cruz sc IF 1:100 Cell Signaling WB 1:1000 Elk-1 Antibody αληίζσκα Technology IF 1:100 #9182 IP 0.5 κg/100 κg πξση. Phospho-Elk-1 (Ser383) αληίζσκα Cell Signaling Technology #9181 WB 1:1000 IP 0.5 κg/100 κg πξση. Phospho-Elk-1 (Ser383) (2B1) Monoclonal Antibody αληίζσκα Cell Signaling Technology #9186 WB 1:1000 IF 1:100 p44/42 MAP Kinase Antibody αληίζσκα Cell Signaling Technology #9102 WB 1:1000 IF 1:100 IP 0.5 κg/100 κg πξση. phospho-p44/42 (Thr202/Tyr204) Antibody αληίζσκα Cell Signaling Technology WB 1:1000 IF 1:100 IP 0.5 κg/100 κg πξση. anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody αληίζσκα Cell Signaling Technology #7074 WB 1:3000

51 Prestained Protein Marker Cell Signaling Technology # mg/ml γηα θάζε πξσηεΐλε anti-mouse FITC conjugate αληίζσκα Sigma F2012 IF 1:100 anti-rabbit Cy3 conjugate αληίζσκα Jackson ImmunoResearch laboratories, Inc IF 1:100 Toto-3 iodide ( ) Χξώζε ππξήλσλ γηα αλνζνθζνξηζκό Invitrogen Molecular Probes T3604 IF 1:2000 Protein A Sepharose 4B, Fast Flow Staphylococcus aureus θαηξίδηα γηα αλνζνθαηαθξήκληζε Sigma P κl/ αλνζνθαηαθξήκληζε Ε.coli (DH10B) Εξγαζηεξηαθό ζηέιερνο E.coli 6 βαθηήξηα E.coli/ αηκνθύηηαξν PVDF membrane Pierce Grace s insect medium Θξεπηηθό κέζν Sigma G9771 Ammonium Persulfate (AP) Καηαιύηεο γηα ηνλ πνιπκεξηζκό ηνπ αθξπιακηδίνπ Sigma A3678 TEMED θαηαιύηεο Sigma T9281 DTT αλαγσγέαο δηζνπιθηδηθώλ δεζκώλ Sigma D9163

52 ECL detection system Enchanced Chemiluminescent HRP substrate Amersham Biosciences RPN2106V1/2 Millipore 100 κl/cm 2 επηθάλεηαο WBKLS0500 Mowiol 4-88 έγθιεηζε παξαζθεπαζκάησλ Calbiochem κl/θύθιν SuperBlock blocking buffer in TBS Pierce κl/θύθιν Albumin bovine Fraction V BSA Serva Medical X-ray film blue CP-BU new film Agfa 100 NIF Developer Replenisher Agfa G ml ζε 250 ml dh 2 O Manual Fixing Bath Agfa G ml ζε 200 ml dh 2 O Protease inhibitor cocktail αλαζηνιείο πξσηεαζώλ Sigma P2714 Phosphatase inhibitor cocktail 2 αλαζηνιείο θσζθαηαζώλ Sigma P5726 PMSF αλαζηνιέαο πξσηεαζώλ Sigma P7626 Sodium (ortho)vanadate αλαζηνιέαο ATPαζώλ, πξσηεαζώλ Tyr, θσζθαηαζώλ θαη ελδύκσλ πνπ κεηαθέξνπλ θσζθνξηθά Sigma S6508

53 ΗΑΘΘΖΓΡΓΓΖΑ ΣΟΤ ΓΚΣΟΙΟΤ ε υθα ηα πεζνάιαηα πμο δζελήπεδζακ βζα ηδκ μθμηθήνςζδ ηδξ πανμφζαξ δζαηνζαήξ ημ πεζναιαηζηυ οθζηυ πμο πνδζζιμπμζήεδηε ήηακ έκαξ ενβαζηδνζαηυξ πθδεοζιυξ ημο μθμιεηααυθμο εκηυιμο Ceratitis capitata, ημ μπμίμ ακήηεζ ζηδκ μζημβέκεζα Tephritidae ηδξ ηάλδξ Diptera. Ο πθδεοζιυξ αοηυξ δζαηδνείηαζ ζημ ενβαζηήνζμ Βζμθμβίαξ απυ ημ 1973 ηαζ πνμένπεηαζ απυ ημ Μπεκάηεζμ Φοημπαεμθμβζηυ Ικζηζημφημ (Εικόνα 29). Γηθυκα 29 : Ε μφγα ηεξ Ιεζμγείμο Ceratitis capitata ( Σμ έκημιμ αοηυ είκαζ βκςζηυ ςξ κύγα ηεο Μεζνγείνπ ή θξνπηόκπγα ηαζ ζηδ θφζδ παναζζηεί ζε πενζζζυηενα απυ 260 είδδ θνμφηςκ, θαπα-κζηχκ ηαζ ηανπχκ ιε πνμηίιδζδ ζηα χνζια ηαζ ζανηχδδ θνμφηα. Ο αζμθμβζηυξ ηφηθμξ ημο (Εικόνα 30) ελανηάηαζ απυ ηζξ ζοκεήηεξ εενιμ-ηναζίαξ, οβναζίαξ ηαζ θςημπενζμδζζιμφ. ημ ενβαζηήνζυ ιαξ δζαηδνείηαζ ζε εάθαιμ ζηαεενήξ εενιμηναζίαξ 25 o C, µε ζπεηζηή οβναζία 75% ηαζ µε αοηυιαημ ζφζηδια 12ςνμο θςημπενζμδζζιμφ. ηζξ ζοκεήηεξ αοηέξ δ ειανομβέκεζδ δζανηεί 52 χνεξ, ημ πνμκοιθζηυ ζηάδζμ πενίπμο 6 διένεξ, ημ κοιθζηυ ζηάδζμ 9 διένεξ, εκχ ημ ζηάδζμ ημο εκήθζημο αηυιμο δζανηεί πενίπμο 15 διένεξ (Πίνακας 3). Ακαπηοληαθά ζηάδηα Φοζηθυξ πιεζοζμυξ Γνγαζηενηαθυξ πιεζοζμυξ Αογά 2 20 εκέξεο 1 2 εκέξεο Ννμκφμθε (3 ζηάδηα) εκέξεο 5 6 εκέξεο Κφμθε εκέξεο 9 10 εκέξεο Νίκαθαξ 3 : Ε δηάνθεηα ηςκ ζηαδίςκ ημο βημιμγηθμφ θφθιμο ηεξ C. capitata

54 Γηθυκα 30 : Μ βημιμγηθυξ θφθιμξ ηεξ μφγαξ ηεξ Ιεζμγείμο ( 1. Πμ ζειοθυ άημμμ εκαπμζέηεη ηα αογά ημο ζημ εζςηενηθυ χνημςκ θνμφηςκ, 2. Απυ ηα αογά εθθμιάπημκηαη μη πνμκφμθεξ (larvae), μη μπμίεξ ηνέθμκηαη θαηαζηνέθμκηαξ ημ θνμφημ, 3. Γκηειχξ ακαπηογμέκεξ πνμκφμθεξ ακαδφμκηαη ζηεκ επηθάκεηα ημο θνμφημο θαη πέθημοκ ζημ έδαθμξ υπμο βμμβοθηχκμκηαη, 4. Πα εκήιηθα άημμα, αθμφ εθθμιαθζμφκ, ακαδεημφκ ηνμθή θαη κενυ πνμθεη-μέκμο κα επηβηχζμοκ. Γπίζεξ, έπεη παναηενεζεί υηη ημ θαιμθαίνη, πμο ε ζενμμθναζία είκαη ορειυηενε, μ θφθιμξ δςήξ ηεξ C. capitata επηηαπφκεηαη εκ ακηηζέζεη με ημ πεημχκα. Σα εκήθζηα άημια δζαηδνμφκηαζ ζε πμθοεζηενζηά ηθμοαζά δζαζηά-ζεςκ 42 x 24 x 30 cm (Εικόνα 31). Η μνμθή ημο ηάεε ηθμοαζμφ θένεζ ζονιάηζκδ ζήηα υπμο ηαζ ημπμεεηείηαζ wettex ειπμηζζιέκμ µε κενυ πνμζθένμκηαξ έηζζ ηδ δοκαηυηδηα ζηζξ ιφβεξ κα πνμζθαιαάκμοκ κενυ. Η ιία πθεονά ημο επίζδξ, αοηή πμο είκαζ ζηναιιέκδ πνμξ ημ θςξ, θένεζ θεπηυ ζοκεεηζηυ φθαζια µε μπέξ ιζηνήξ δζαιέηνμο, χζηε ηα εδθοηά άημια κα δζαπενκμφκ µε ημκ ςαπμεέηδ ημοξ ημ φθαζια ηαζ κα αθήκμοκ ηα αοβά ημοξ έλς απυ ημ ηθμοαί. Σα αοβά πμο βεκκζμφκηαζ ιέζα ζε δζάζηδια θεπηχκ, ζοθθέβμκηαζ ηαζ ημπμεεημφκηαζ βζα µία διένα ζε ηνοαθίμ petri µε ζπεηζηά ιεβάθδ οβναζία, εκχ ηδκ επυιεκδ διένα ιεηαθένμκηαζ ζε εζδζηά, αενζγυιεκα, απμζηεζνςιέκα, πθαζηζηά ημοηζά µε ηνμθή βζα κα εηημθαθεμφκ. Σα εκήθζηα άημια βίκμκηαζ ζελμοα-θζηχξ εκενβά ηδκ ηνίηδ διένα ηδξ εκήθζηδξ γςήξ ημοξ. Γηθυκα 31 : Πα εκήιηθα άημμα δηαηενμφκηαη μέζα ζε πμιοεζηενηθά θιμοβηά

55 Η ακάπηολδ ηςκ πνμκοιθχκ βίκεηαζ ιέζα ζηα αενζγυιεκα πθαζηζηά ημοηζά, ηα μπμία πενζέπμοκ 100 gr ηνμθήξ. ηδκ επζθάκεζα αοηήξ ημπμεεημφκηαζ 40 mg αοβά. Η ζφζηαζδ ηδξ ηνμθήξ βζα ηεθζηυ υβημ 2 L δίκεηαζ ζημκ Πίνακα 4. Οοζηαηηθά Κενυ δηθηφμο Δάπανε εμπμνίμο Ιαγηά ανηί ηφπμο Softex Δηάιομα HCl 1.5 N μιεζηενυιε 5% ζε οδαηηθυ δηάιομα αηζακυιεξ 85% Βεκδμσθυ κάηνημ 10% ζε οδαηηθυ δηάιομα αηζακυιεξ 25% Νμζυηεηεξ 2000 ml 120 gr 120 gr 120 gr 40 ml 40 ml 40 ml Νίκαθαξ 4 : Οφζηαζε ηνμθήξ πνμκομθχκ Ceratitis capitata. Η ακάπηολδ ηςκ πνμκοιθχκ ιέζα ζηδκ ηνμθή δζανηεί 6 διένεξ πενίπμο. ημ ηέθμξ ημο πνμκοιθζημφ ζηαδίμο ηαηά ηδκ έηηδ διένα, μζ πνμκφιθεξ έπμοκ ακαπηφλεζ ημ ιοσηυ ημοξ ζφζηδια ηαζ εηηζκάζζμκηαζ (ζηάδην πεξηπιάλεζεο wandering stage, WS)(Εικόνα 32) εβηαηαθεί-πμκηαξ ηδκ ηνμθή ηαζ πέθημκηαξ ζε έκα ημοηί µε άιιμ υπμο ηαζ αμιαο-ηζχκμκηαζ έπεζηα απυ 7-8 χνεξ. Ανπζηά ζπδιαηίγεηαζ δ θεοηή κφιθδ (white pupa, WP) ηδξ μπμίαξ δ επζδενιίδα ζηαδζαηά ζημοναίκεζ ηαζ ζηθδναίκεζ ζπδιαηίγμκηαξ ηδκ ηαθέ κφιθδ (brown pupa, BP). Σμ ζηάδζμ ηδξ κφιθδξ δζανηεί 8-9 διένεξ. Μία διένα πνζκ εηημθαθεμφκ ηα εκήθζηα άημια ημπμεεημφκηαζ ζηα ηθμοαζά υπμο βίκεηαζ ηαζ δ ιεηαιυνθςζή ημοξ. Γηθυκα 32 : Ννμκομθηθυ ζηάδημ πενηπιάκεζεξ (Wandering stage).

56 ΑΠΟΙΟΚΩΕ ΑΖΙΟΗΤΣΣΑΡΩΚ Πνμκφιθεξ ημο ζηαδίμο πενζπθάκδζδξ ανπζηά λεπθέκμκηαζ µε κενυ ανφζδξ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα µε απζμκζζιέκμ κενυ. Η αζµμθέιθμξ ζοθθέβεηαζ ηνοπχκηαξ ημ επζδενιίδζμ ηδξ ηάεε πνμκφιθδξ ζημ πίζς ιένμξ ημο ζχιαημξ µε ηδ αμήεεζα ιίαξ θααίδαξ ιε θεπηά άηνα ηαζ ημπμεεηχκηαξ ηζξ πνμκφιθεξ ζε έκα ζςθδκάηζ ηφπμο eppendorf, ημ μπμίμ θένεζ μνβακηίκα πμο πνδζζιμπμζείηαζ ςξ δειυξ ηαζ 450 µl ακηζπδηηζημφ δζαθφιαημξ. ε ηάεε ζςθδκάηζ ημπμεεημφκηαζ πενίπμο 100 πνμκφιθεξ. Αθμφ ζηδ ζοκέπεζα, ηνοπδεεί μ ποειέκαξ ημο eppendorf ιε ιία απμζηεζνςιέκδ αεθυκα ακαημιίαξ, ημπμεεηείηαζ ιέζα ζε δεφηενμ ζςθδκάηζ eppendorf. Έπεζηα αημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ βζα 10 θεπηά ζηζξ 1000 ζηνμθέξ ακά θεπηυ (rpm) ηαζ ημ ίγδια επακαζςνείηαζ ζε 500 ιl νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ Ringer. ηδ ζοκέπεζα, ημ εκαζχνδια ηςκ αζιμηοηηάνςκ θοβμηεκηνείηαζ βζα 5 θεπηά ζηζξ 1000 rpm ηαζ επακαζςνείηαζ ζε ίδζμ υβημ Ringer, εκχ δ δζαδζηαζία αοηή επακαθαιαάκεηαζ αηυια ιία θμνά πνμηεζιέκμο κα λεπθοεμφκ ηαθά ηα αζιμηφηηανα. Ύζηενα απυ ηδκ μθμηθήνςζδ ηςκ εηπθφζεςκ ηα αζµμηφηηανα είηε επακαζςνμφκηαζ ζε ενεπηζηυ µέζμ Grace (Grace 1962), ημ μπμίμ πενζέπεζ υθα ηα απαναίηδηα βζα ηδκ επζαίςζδ ηςκ ηοηηάνςκ ενεπηζηά ζοζηαηζηά, χζηε κα βίκεζ ηαθθζένβεζά ημοξ ηαζ επίδναζδ µε δζάθμνεξ μοζίεξ, είηε θφκμκηαζ ζε δζάθοια θφζδξ (lysis buffer) ή/ηαζ έπεζηα απυ επίδναζδ µε οπενήπμοξ (sonication). ΔΙΑΛΤΜΑΣΑ Ακηηπεθηηθυ δηάιομα Ξοζμηζηηθυ δηάιομα Ringer 62 mm NaCl 100 mm γιπθόδε 10 mm EDTA 30 mm tri-sodium citrate 26 mm θηηξηθό νμύ ph mm NaCl 18.0 mm CaCl mm KCl 2.3 mm NaHCO 3 ph 7.0 Γηα ηελ παξαζθεπή ησλ δηαιπκάησλ πνπ απαηηνύληαη γηα ηελ απνκόλσζε θαη θαιιηέξγεηα θπηηάξσλ ρξεζηκνπνηήζεθαλ αληηδξαζηήξηα θαη λεξό πνπ πξννξίδνληαη γηα θπηηαξνθαιιηέξγεηα θαη είλαη απαιιαγκέλα από ελδνηνμίλεο (LPS free).

57 ΙΓΣΡΕΕ ΑΖΙΟΗΤΣΣΑΡΩΚ Γ ΑΖΙΟΗΤΣΣΑΡΟΙΓΣΡΟ improved Neubauer Σμ αζµμηοηηανυµεηνμ improved Neubauer είκαζ ιζα ηνμπμπμζδιέκδ ακηζηεζιεκμθυνμξ πθάηα πμο έπεζ δφμ ηαηάθθδθα επελενβαζιέκεξ, θείεξ επζθάκεζεξ (Εικόνα 33). Καεειία απυ αοηέξ θένεζ έκα πθέβια παναβχκ, ημ μπμίμ απμηεθείηαζ απυ 9 ηφνζα ηεηνάβςκα µε ιήημξ πθεονάξ 1 mm (εκβαδόλ 1 mm 2 ). Κάεε ηεηνάβςκμ μνίγεηαζ απυ πανάθθδθεξ βναιιέξ ηςκ μπμίςκ δ ιεηαλφ ημοξ απυζηαζδ είκαζ 2.5 µm, πμο πνδζζιεφμοκ βζα ημκ ηαεμνζζιυ ημο ακ ηα ηφηηανα ανίζημκηαζ ιέζα ή έλς απυ ημ πθέβια. Δπίζδξ, ηαεέκα απυ ηα ανπζηά ηεηνάβςκα, έπεζ επζπθέμκ δζαααειίζεζξ (ρσξίδεηαη ζε κηθξόηεξα ηεηξάγσλα) πνμηεζιέκμο κα δζεοημθφκεηαζ δ ιέηνδζδ ηςκ ηοηηάνςκ. Σμ επίπεδμ ημο πθέβιαημξ ανίζηεηαζ 0.1 mm παιδθυηενα απυ δφμ πνμελμπέξ ζηζξ μπμίεξ ζηδνίγεηαζ δ ηαθοπηνίδα. Τπάνπεζ ιζα ημίθδ επζθάκεζα ιεηαλφ ηδξ ελςηενζηήξ πθεονάξ ηάεε ηεηναβςκζζιέκδξ βοαθζζιέκδξ επζθάκεζαξ ηαζ ηςκ ζδιείςκ υπμο ζηδνίγεηαζ δ ηαθοπηνίδα. ηδκ ημίθδ αοηή επζθάκεζα ημπμεεηείηαζ ημ ηοηηανζηυ εκαζχνδια ηαζ µε ηνζπμεζδζηά θαζκυιεκα απθχκεηαζ ζηδκ ηεηναβςκζζιέκδ επζθάκεζα. Ο υβημξ ημο ηοηηανζημφ εκαζςνήιαημξ πμο εα ηαθφπηεζ ημ έκα απυ ηα εκκέα ηεηνάβςκα είκαζ 0.1 mm 3 (1.0 mm 2 x 0.1 mm) ή 1 x 10-4 ml. Δπμιέκςξ, δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ ηοηηάνςκ ζημ ανπζηυ εκαζχνδια (ζε θύηηαξα / ml) οπμθμβίγεηαζ ςξ ελήξ: Ανηζμυξ θοηηάνςκ ζημ 1 απυ ηα 9 θφνηα ηεηνάγςκα x 10 4 Γηθυκα 33 : A. Αημμθοηηανυμεηνμ improved Neubauer. Β. Οπεμαηηθή απεηθυκηζε ημο ηνυπμο οπμιμγηζμμφ ημο ανηζμμφ ηςκ αημμθοηηάνςκ.

58 ΗΑΘΘΖΓΡΓΓΖΑ ΑΖΙΟΗΤΣΣΑΡΩΚ Σα αζιμηφηηανα ιπμνμφκ κα ηαθθζενβδεμφκ είηε ζε εκαζχνδια είηε ζε ιμκυζημζαα, ακάθμβα µε ημ ζημπυ ημο πεζνάιαημξ. Γζα ηδκ ηαθθζένβεζα ηςκ αζιμηοηηάνςκ ζε εναιώρημα, αθμφ μθμηθδνςεμφκ μζ εηπθφζεζξ ιε ημ νοειζζηζηυ δζάθοια Ringer, ηα αζιμηφηηανα επακαζςνμφκηαζ ζε ενεπηζηυ µέζμ Grace ηαζ επςάγμκηαζ βζα μνζζιέκμ πνμκζηυ δζάζηδια (ζπλήζσο 20 ιεπηά) πνζκ ηδκ εθανιμβή ηδξ πεζναιαηζηήξ δζαδζηαζίαξ (ζηάδην εξεκίαο). Η επχαζδ δζελάβεηαζ οπυ ζοκεπή ακαηίκδζδ ζημοξ 25 μ C χζηε κα απμθεοπεεί δ πνμζηυθθδζδ ηςκ ηοηηάνςκ. Σμ ζηάδζμ ηδξ δνειίαξ είκαζ απαναίηδημ, ηαεχξ δ δζαδζηαζία απμιυκςζδξ ηςκ αζιμηοηηάνςκ ζηνεζάνεζ ηα αζιμηφηηανα. Γζα ηδκ ηαθθζένβεζα ηςκ αζιμηοηηάνςκ ζε μονόστοιβα, αθμφ μθμηθδνςεμφκ μζ εηπθφζεζξ ιε ημ νοειζζηζηυ δζάθοια Ringer, ηα αζιμηφηηανα επακαζςνμφκηαζ ζε ενεπηζηυ δζάθοια Grace ζε ακαθμβία αζιμηφηηανα 30 πνμκοιθχκ / 100 µl Grace ( 10 5 θύηηαξα / δείγκα). Σμ εκαζχνδια ημπμεεηείηαζ ζε ακηζηεζιεκμθυνμοξ, ζηζξ μπμίεξ ζηδ ιζα πθεονά έπμοιε ζπδιαηίζεζ 2 ηφηθμοξ µε οαθμβνάθμ (50 µl ελαησξήκαηνο / θύθιν) ηαζ αθήκεηαζ βζα 20 θεπηά, χζηε κα πνμζημθθδεμφκ ηα ηφηηανα ηαζ κα δνειήζμοκ, εκχ αημθμοεεί έηπθοζδ µε νοειζζηζηυ δζάθοια TBS βζα κα απμιαηνοκεμφκ ηα ηφηηανα πμο δεκ πνμζημθθήεδηακ. Καζ ζηζξ δφμ πενζπηχζεζξ ηαθθζένβεζαξ, έπεζηα απυ ημ ζηάδζμ ηδξ δνειίαξ, αημθμοεεί δ επίδναζδ µε ακαζημθείξ ή εκενβμπμζδηέξ ηςκ δζαδζηαζζχκ πμο ιεθεημφιε. ΗΑΘΘΖΓΡΓΓΖΑ ΣΟΤ ΒΑΗΣΕΡΖΟΤ Βαηηήνζα Escherichia coli δζαηδνμφκηαζ ζε ζηενεή ηαθθζένβεζα (1.5% άγαξ, 0.5% βαθηνπεπηόλε θαη 0.5% εθρύιηζκα καγηάο), εκχ ακά ηαηηά πνμκζηά δζαζηήιαηα βίκμκηαζ ακαηαθθζένβεζεξ. ηα πεζνάιαηα πμο δζελήπεδζακ πνδζζιμπμζήεδηακ ααηηήνζα ημο ζηεθέπμοξ DH10B πμο είπακ πνμδβμοιέκςξ απεκενβμπμζδεεί µε αναζιυ ζημοξ 100 μ C βζα 20 θεπηά ηαζ επακαζςνδεεί ζε ενεπηζηυ ιέζμ Grace.

59 ΠΟΟΣΖΗΟ ΠΡΟΔΖΟΡΖΙΟ ΠΡΩΣΓΧΚΩΚ ΙΓ ΣΕ ΙΓΘΟΔΟ BRADFORD Γζα ημκ πμζμηζηυ πνμζδζμνζζιυ ηςκ πνςηεσκχκ οπάνπμοκ δζάθμνεξ ιέεμδμζ, απυ ηζξ μπμίεξ μζ ιέεμδμζ Bradford ηαζ Lowry πνδζζιμπμζμφκηαζ πζμ ζοπκά. Σα ηεθεοηαία πνυκζα πνδζζιμπμζείηαζ δ Bradford, θυβς ηδξ ζηαεενυηδηαξ ηδξ ιεευδμο, ηδξ εοημθίαξ ηαζ ηδξ ηαπφηδηαξ µε ηδκ μπμία ιπμνεί κα πναβιαημπμζδεεί. Η ιέεμδμξ αοηή ζηδνίγεηαζ ζημ βεβμκυξ υηζ δ πνςζηζηή Coomassie brilliant blue R-250 δεζιεφεηαζ ηονίςξ ζηα ααζζηά αιζκμλέα ηςκ πνςηεσκχκ, αθθάγμκηαξ ηαοηυπνμκα ημ ιήημξ ηφιαημξ ηδξ ιέβζζηδξ απμννυθδζήξ ημοξ. Γζα ηδκ αηνίαεζα δ πνςζηζηή δεζιεφεηαζ ζηζξ αιζκμιάδεξ ιε δθεηηνμζηαηζημφξ δεζιμφξ ηαζ ζηζξ ιδ πμθζηέξ μιάδεξ ηςκ πνςηεσκχκ ιε αζεεκείξ δεζιμφξ. Όηακ δ πνςζηζηή είκαζ εθεφεενδ έπεζ ηυηηζκμ πνχια, εκχ υηακ είκαζ δεζιεοιέκδ ιε πνςηεΐκεξ έπεζ πνχια ιπθε (Bradford 1976). Όζμ αολάκεηαζ δ έκηαζδ ημο ιπθε πνχιαημξ ζημ δείβια ηυζμ πενζζζυηενδ πνςηεΐκδ είκαζ δζαθοιέκδ ζε αοηυ. Με ηδ ιέεμδμ Bradford ιπμνμφκ κα ιεηνδεμφκ απυ 1 έςξ 100 µg πνςηεΐκδξ. Γζα ημκ οπμθμβζζιυ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ αβκχζημο δείβιαημξ πνδζζιμπμζείηαζ πνυηοπδ ηαιπφθδ, δ μπμία ηαηαζηεοάγεηαζ µε ηδ αμήεεζα βκςζηχκ ζοβηεκηνχζεςκ αθαμοιίκδξ μνμφ αμυξ (BSA). Θα πνέπεζ κα ζδιεζςεεί υηζ δ πνυηοπδ πνςηεΐκδ δζαθφεηαζ ζε νοειζζηζηυ δζάθοια ίδζαξ ζφζηαζδξ µε εηείκδ ημο δζαθφιαημξ άβκςζηδξ ζοβηέκηνς-ζδξ. Παναηάης (Εικόνα 34) θαίκμκηαζ ηα ηφνζα ζημζπεία απυ ηα μπμία απμηεθείηαζ έκα θαζιαημθςηυιεηνμ. Γηθυκα 34 : Πα θφνηα ημήμαηα εκυξ θαζμαημθςημμέηνμο (τροποποιημένη από «Lehninger principles of Biochemistry», Nelson and Cox, 2004) ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΙΑ ε ζςθδκάηζα ηφπμο eppendorf ημπμεεημφκηαζ 250 µl αναζςιέκμο ακηζδναζηδνίμο Bradford ιε απζμκζζιέκμ κενυ (d-h 2 O) ζε ακαθμβία 1:4. ηδ ζοκέπεζα πνμζηίεεηαζ πμζυηδηα αβκχζημο δείβιαημξ (κέρξη όγθνπ 10 µl) ή πνυηοπμο δζαθφιαημξ BSA. Αημθμοεεί ακάδεοζδ ζε vortex ηαζ έπεζηα

60 απυ 2-5 θεπηά θαιαάκεηαζ δ ιέηνδζδ ηδξ μπηζηήξ απμννυθδζδξ ηςκ δεζβιάηςκ ζε πθαζηζηή ηοαέηηα. Οζ ιεηνήζεζξ έβζκακ ζε θαζιαημθςηυιεηνμ (U-1800, HITACHI), ζε ιήημξ ηφιαημξ 595 nm, ιδδεκίγμκηαξ ηδκ μπηζηή απμννυθδζδ πμο έπεζ μ ιάνηοναξ, δδθαδή ημ ακηζδναζηήνζμ Bradford ιε ηδκ πνμζεήηδ ημο νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ. Ακηηδναζηήνημ Bradford Ννυηοπμ δηάιομα BSA ΔΙΑΛΤΜΑΣΑ 85% v/v d-h 2 O 10% v/v Φσζθνξηθό νμύ 5% v/v Αηζαλόιε 95 ν 0.01% w/v Coomassie brilliant blue R mg/ml Σν αληηδξαζηήξην Bradford πξηλ ρξεζηκνπνηεζεί θηιηξάξεηαη γηα ηελ απνκάθξπλζε ηεο ρξσζηηθήο πνπ δελ έρεη δηαιπηνπνηεζεί. ΕΘΓΗΣΡΟΦΟΡΕΕ ΠΟΘΤΑΗΡΤΘΑΙΖΔΖΟΤ (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, PAGE) Η δθεηηνμθυνδζδ είκαζ ιζα ηεπκζηή δζαπςνζζιμφ, παναηηδνζζιμφ ηαζ ακάθοζδξ αζμιμνίςκ ηαζ ααζίγεηαζ ζημ βεβμκυξ υηζ ιαηνμιυνζα υπςξ ημ DNA, ημ RNA ηαζ μζ πνςηεΐκεξ θένμοκ δθεηηνζηά θμνηία, πμο ημοξ πνμζδίδμοκ ηδκ ζδζυηδηα ηδξ ηίκδζδξ ιέζα ζε δθεηηνζηυ πεδίμ. Οζ πνςηεΐκεξ μθείθμοκ ημ δθεηηνζηυ ημοξ θμνηίμ ζηα υλζκα αιζκμλέα (π.ρ. Glu, Asp) ηαζ ζηα ααζζηά (π.ρ. Lys, Arg). Όιςξ ημ θμνηίμ πμο αλζμπμζεί δ δθεηηνμθυνδζδ είκαζ ημ ζοκμθζηυ ηαεανυ θμνηίμ ηςκ αζμιμνίςκ. Γζα κα οπάνλεζ ιεηαηίκδζδ θμνηζζιέκςκ µμνίςκ εα πνέπεζ ημ δθεηηνζηυ πεδίμ κα έπεζ ζηαεενή πμθζηυηδηα ηαζ αοηυξ είκαζ μ θυβμξ πμο πνδζζιμπμζείηαζ µυκμ ημ ζοκεπέξ νεφια. Σμ αηνοθαιίδζμ δδιζμονβεί ηνζζδζάζηαηα πμθοιενή δίηηοα ζε ιζα εονεία ηθίιαηα ζοβηεκηνχζεςκ απυ 3% έςξ 30%. Σα πδηηχιαηα αηνοθαιζδίμο είκαζ μοδέηενα, οδνυθζθα ηαζ πανμοζζάγμοκ ηνζζδζάζηαηεξ δζαηάλεζξ µαηνζχκ οδαηακεναηζηχκ αθοζίδςκ πμο ζοκδέμκηαζ µε ιεεοθεκμιάδεξ. Σμ πήηηςια ζπδιαηίγεηαζ µε πμθοιενζζµυ ηςκ ιμκμιενχκ αηνοθαµζδίμο, μδδβχκηαξ ζηδ δδιζμονβία αθοζίδςκ πμθοαηνοθαιζδίμο. Μεηαλφ ηςκ αθοζίδςκ αοηχκ εκζςιαηχκμκηαζ ηαηά δζαζηήιαηα µυνζα ΝΝ- µεεοθεκ-bis-αηνοθαιζδίμο (bis), ηα μπμία θυβς ηδξ δμιήξ ημοξ ιπμνμφκ κα εκζςιαηςεμφκ ζε δφμ δζαθμνεηζηέξ αθοζίδεξ ζπδιαηίγμκηαξ πθέβια. Ο πμθοιενζζµυξ ημο αηνοθαιζδίμο ηαηαθφεηαζ απυ µία αάζδ, ηδκ ΝΝΝ Ν - ηεηναµεεοθαζεοθεκμδζαµίκδ (TEMED), αθθά µυκμ οπυ ηδκ πανμοζία

61 εθεοεένςκ νζγχκ πμο ιπμνμφκ κα δδιζμονβδ-εμφκ πδιζηχξ µε οπενεεζσηά ζυκηα (S 2 O 8 2- ). Η ζοβηέκηνςζδ ημο πνδζζιμπμζμφιεκμο αηνοθαιζδίμο ηαεμνίγεζ ημ µέζμ ιήημξ ηδξ αθοζίδαξ ημο πμθοιενμφξ, εκχ ημ ΝΝ-µεεοθεκ-bisαηνοθαιίδζμ ηαεμνίγεζ ηδκ έηηαζδ ημο ζπδιαηζζιμφ βεθονχκ (cross-links). Η ιέζδ απυζηαζδ ιεηαλφ ηςκ πμθοιενχκ ημο πδηηχιαημξ είκαζ βκςζηή ςξ κέγεζνο πόξνπ ηνπ πεθηώκαηνο. Σμ ιέβεεμξ πμο επζθέβεηαζ ελανηάηαζ απυ ημ ιέβεεμξ ηςκ πνςηεσκζηχκ µμνίςκ πμο πνυηεζηαζ κα δζαπςνζζημφκ, εκχ ηαεμνίγεηαζ απυ ηζξ ζοβηεκηνχζεζξ αηνοθαιζδίμο ηαζ bis-αηνοθαιζδίμο. Γεκζηά, ηα πδηηχιαηα παιδθήξ ζοβηέκηνςζδξ αηνοθαιζδίμο είκαζ ιαθαηά ηαζ επεζδή έπμοκ ιεβάθμοξ πυνμοξ πνδζζιμ-πμζμφκηαζ βζα ημ δζαπςνζζιυ ιαηνμιμνίςκ ιεβάθμο µμνζαημφ αάνμοξ. Ακηζεέηςξ, πδηηχιαηα µε ιεβάθεξ ζοβηεκηνχζεζξ είκαζ ζηθδνυηενα, πενζζζυηενμ εφεναοζηα, έπμοκ ιζηνυηενμοξ πυνμοξ ηαζ πνδζζιμπμζ-μφκηαζ βζα ημ δζαπςνζζιυ μοζζχκ ιζηνμφ ζπεηζηά µμνζαημφ αάνμοξ. Η δθεηηνμθυνδζδ βίκεηαζ ζε πδηηχιαηα επζθακείαξ πμο πμθοιενίγμκηαζ ιεηαλφ δφμ βοάθζκςκ πθαηχκ ηαζ δφμ πθαζηζηχκ πθεονζηχκ εθαζιάηςκ. Σα δείβιαηα ηςκ πνςηεσκχκ ημπμεεημφκηαζ ζε εζδζηά θνεάηζα οπμδμπήξ πμο πνμηφπημοκ µε ηδκ ημπμεέηδζδ ιίαξ εζδζηήξ πθαζηζηήξ μδμκηςηήξ ιήηναξ ζημ πήηηςια παηεηανίζιαημξ ηαηά ηδ δζάνηεζα ημο πμθοιενζζµμφ ημο. Σμ πήηηςια, ζηδ ζοκέπεζα, ημπμεεηείηαζ ζηδ ζοζηεοή ζε ηαηαηυνοθδ εέζδ χζηε ημ άκς ηαζ ημ ηάης άηνμ ημο κα είκαζ ειααπηζζιέκα ζε νοειζζηζηά δζαθφιαηα ηςκ δμπείςκ ηδξ ηαευδμο ( ) ηαζ ηδξ ακυδμο (+), ακηζζημίπςξ (Εικόνα 35). Δείγκα Καηεύζσλζε δωλώλ Γηθυκα 35 : Δηαθμνεηηθά δείγμαηα θμνηχκμκηαη ζηα εηδηθά θνεάηηα οπμδμπήξ ζημ επάκς μένμξ ημο πεθηχμαημξ. Μη πνςηεΐκεξ μεηαθηκμφκηαη πνμξ ημ ζεηηθυ πυιμ (άκμδμ) υηακ βνεζμφκ ζε ειεθηνηθυ πεδίμ (τροποποιημένη από «Lehninger principles of Biochemistry», Nelson and Cox, 2004).

62 SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE Η ακάθοζδ ηςκ πνςηεσκχκ έβζκε µε δθεηηνμθυνδζδ ζε πήηηςια πμθοαηνοθαµζδίμο, πανμοζία απμδζαηαηηζηχκ παναβυκηςκ (SDS, DTT). Σμ SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) είκαζ έκα ακζμκηζηυ απμννοπακηζηυ πμο ηαηαζηνέθεζ ζπεδυκ υθεξ ηζξ ιδ μιμζμπμθζηέξ αθθδθεπζδνάζεζξ ηςκ πνςηεσκχκ. Δπίζδξ, ημ SDS δεζιεφεηαζ ζηζξ οδνυθμαεξ πενζμπέξ ηςκ πνςηεσκζηχκ µμνίςκ µε ζηαεενή ακαθμβία αάνμοξ (1.4 gr SDS αλά gr πξσηεΐλεο), ακελάνηδηα απυ ηδκ πνςηεσκζηή αθθδθμοπία, ηζξ πνμζδίδεζ ηαεανυ ανκδηζηυ θμνηίμ ηαζ ηζξ ακαβηάγεζ κα λεδζπθςεμφκ. Η επζπθέμκ πνήζδ ακαβςβζηχκ παναβυκηςκ, υπςξ είκαζ ημ DTT (Dithiothreitol) ηαζ δ α-ιενηαπημαζεακυθδ, έπεζ απμηέθεζια ηδ δζάζπαζδ ηςκ δζζμοθθζδζηχκ δεζιχκ ηαζ ζοκεπχξ ηδκ ηαηαζηνμθή ηδξ ηεηανημηαβμφξ δμιήξ ηςκ πνςηεσκχκ ηαζ ημ δζαπςνζζιυ ηςκ ακελάνηδηςκ πμθοπεπηζδζηχκ οπμµμκάδςκ. Η πθήνδξ απμδζάηαλδ ηςκ πνςηεσκχκ μθμηθδνχκεηαζ µε αναζιυ ηςκ δεζβιάηςκ βζα 3 θεπηά ζημοξ 100 μ C, πανμοζία ηςκ παναπάκς απμδζαηαηηζηχκ παναβυκηςκ. Γηθυκα 36 : Οηεκ SDS-PAGE μη πμιοπεπηηδηθέξ αιοζίδεξ δηαπςνίδμκηαη βάζεη ημο μμνηαθμφ ημοξ μεγέζμοξ (τροποποιημένη από «Lehninger principles of Biochemistry», Nelson and Cox, 2004) Δθυζμκ υθεξ μζ πμθοπεπηζδζηέξ αθοζίδεξ εζζαπεμφκ ηδκ ίδζα πνμκζηή ζηζβιή ζημ πήηηςια, θυβς δζαθμνάξ δοκαιζημφ ηαζ ημο ανκδηζημφ θμνηίμο ηςκ πνςηεσκχκ εα ανπίζεζ ηαοηυπνμκα δ ιεηαηίκδζδ ημοξ πνμξ ημ εεηζηυ

63 πυθμ ηδξ ζοζηεοήξ. Όπςξ πνμακαθένεδηε μ δζαπςνζζιυξ ημοξ εα βίκεζ αάζεζ ημο ιμνζαημφ ημοξ ιεβέεμοξ (Εικόνα 36), ιε ηζξ πνςηεΐκεξ ιζηνυηενμο ιμνζαημφ αάνμοξ κα ιεηαηζκμφκηαζ ηαπφηενα, ηαευηζ ιπμνμφκ ηαζ εθίζζμκηαζ πζμ βνήβμνα ακάιεζα ζηα ηακάθζα ημο πδηηχιαημξ. ε υθα ηα πεζνάιαηα πμο πενζβνάθμκηαζ παναηάης πνδζζιμπμζήεδηε ημ αζοκεπέξ ζφζηδια νοειζζηζηχκ δζαθοιάηςκ (discontinuous PAGE) ζφιθςκα ιε ηδ ιέεμδμ ημο Laemli (Laemli 1970). ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΙΑ Σα πνςηεσκζηά δείβιαηα ακαιζβκφμκηαζ µε ημ νοειζζηζηυ δζάθοια δεζβιάηςκ (sample buffer) ζε ακαθμβία 5:2. Αιέζςξ ιεηά αημθμοεεί αναζιυξ ηςκ δεζβιάηςκ βζα 3 θεπηά ζε οδαηυθμοηνμ 100 μ C ηαζ θοβμηέκηνδζδ βζα 5 θεπηά ζηζξ rpm. ηδ ζοκέπεζα, ημ οπενηείιεκμ ημπμεεηείηαζ ζηα εζδζηά θνεάηζα οπμδμπήξ ηςκ δεζβιάηςκ. Η δθεηηνμθυνδζδ βίκεηαζ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο µε ηδκ εθανιμβή δθεηηνζημφ πεδίμο ζηαεενήξ έκηαζδξ 40 ma, ιέπνζ δ πνςζηζηή ιπθε ηδξ ανςιμθαζκυθδξ κα θεάζεζ ζημ υνζμ ημο πδηηχιαημξ. Αοηυ δζανηεί πενίπμο 1 χνα ηαζ 30 θεπηά ζε πήηηςια 12%. Σμ πήηηςια ιπμνεί ζηδ ζοκέπεζα κα πνςιαηζζηεί ζε δζάθοια πνχζδξ Coomassie brilliant blue βζα 1 χνα ηαζ έπεζηα κα ημπμεεηδεεί ζε δζάθοια απμπνςιαηζζιμφ. Με ηδκ πνςζηζηή αοηή αάθμκηαζ υθεξ μζ πμθοπεπηζδζηέξ αθοζίδεξ πμο οπάνπμοκ ζημ πήηηςια ηαζ ηδ ιειανάκδ. ηδκ πενίπηςζδ πμο πνέπεζ κα βίκεζ ακμζμαπμηφπςια (immunoblot) εα πνέπεζ κα πνμδβδεεί ηδξ πνχζδξ, δζυηζ είκαζ ιία δζαδζηαζία ιδ ακηζζηνεπηή. Δκαθθαηηζηά, ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ δζαθμνεηζηέξ ηεπκζηέξ πνχζδξ, υπςξ μζ πνχζεζξ ρεοδανβφνμο (zinc stain) ηαζ παθημφ (copper stain) ή δ πνχζδ ιε Ponceau S, μζ μπμίεξ είκαζ ακηζζηνεπηέξ ηαζ δφκακηαζ κα πναβιαημ-πμζδεμφκ πνζκ ημ ακμζμαπμηφπςια. Ο οπμθμβζζιυξ ηςκ µμνζαηχκ αανχκ ηςκ πμθοπεπηζδίςκ βίκεηαζ ιε ηδ αμήεεζα πνυηοπδξ ηαιπφθδξ, δ μπμία ηαηαζηεοάγεηαζ ζε διζθμβανζε-ιζηά ααειμθμβδιέκμ πανηί µε ηδ αμήεεζα πνςηεσκχκ-δεζηηχκ µμνζαημφ αάνμοξ (markers). Οζ πνςηεΐκεξ-δείηηεξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ήηακ μζ παναηάης: Πρωηεΐκες δείθηες μορηαθού βάροσς Πρωτεΐνη Πηγή Μοριακό βάρος (kda)

64 Οζ Weber ηαζ Osborn (Weber and Osborn 1969) έδεζλακ υηζ εάκ ζε ιζα ζηήθδ πδηηχιαημξ αηνοθαιζδίμο, πανμοζία SDS, δθεηηνμθμνδεεί έκα ιείβια απυ πνςηεΐκεξ δζαθμνεηζηχκ µμνζαηχκ αανχκ, ηυηε μζ πνςηεΐκεξ αοηέξ εα δζαπςνζζημφκ ζε ιζα ζεζνά απυ γχκεξ. Η γξαθηθή παξάζηαζε ηεο απόζηαζεο ησλ δσλώλ από ην ζεκείν έλαξμήο ηνπο (Rf) έλαληη ηνπ logm (όπνπ Μ = κνξηαθό βάξνο) δίλεη κηα επζεία γξακκή, πμο ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί ανβυηενα βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ ημο µμνζαημφ αάνμοξ ιζαξ άβκςζηδξ πνςηεΐκδξ (Εικόνα 37). Έηζζ, ακ ιζα πνςηεΐκδ, αβκχζημο µμνζαημφ αάνμοξ, δθεηηνμθμνδεεί ιαγί µε δφμ ή πενζζζυηενεξ πνςηεΐκεξ βκςζηχκ µμνζαηχκ αανχκ, ηυηε ιπμνεί κα οπμθμβζζηεί ημ ιμνζαηυ αάνμξ ηδξ απυ ιζα ηέημζα βναθζηή πανάζηαζδ µε ζθάθια 5 10%. Γηθυκα 37 : Γναθηθή πανάζηαζε απυ ηεκ μπμία μπμνεί κα οπμιμγηζηεί ημ μμνηαθυ βάνμξ (ΙΒ) άγκςζηεξ πνςηεΐκεξ (τροποποιημένη από «Lehninger principles of Biochemistry», Nelson and Cox, 2004). ΔΙΑΛΤΜΑΣΑ ΗΛΕΚΣΡΟΥΟΡΗΗ Ξοζμηζηηθυ δηάιομα πεθηχμαημξ δηαπςνηζμμφ Ξοζμηζηηθυ δηάιομα πεθηχμαημξ ζομπφθκςζεξ Ξοζμηζηηθυ δηάιομα δεηγμάηςκ (5x) (Sample buffer) Σν DTT, επεηδή έρεη ηελ ηάζε λα εμαηκίδεηαη εύθνια, πξνζηίζεηαη ιίγν πξηλ ηε ρξήζε ηνπ ξπζκηζηηθνύ δηαιύκαηνο δεηγκάησλ, από ππθλό δηάιπκα DTT 1Μ πνπ δηαηεξείηαη ζηνπο -20 ν C. Ξοζμηζηηθυ δηάιομα ειεθηνμδίςκ ph 8.3 (Running buffer) Δηάιομα αθνοιαμηδίμο/bis 30% (100:1) Δηάιομα SDS 10% w/v Δηάιομα οπενζεησθμφ αμμςκίμο (Ammonium Persulphate) 20% w/v TEMED 100% v/v 1.5 Μ Tris HCl, ph Μ Tris HCl, ph Μ Tris HCl, ph 6.8 4% w/v SDS 40% w/v γιπθεξόιε 0.2 Μ DTT 0.05% w/v κπιε ηεο βξσκνθαηλόιεο 50 mm Tris γιπθίλε 0.1% w/v SDS

65 Δηάιομα πνχζεξ πεθηχμαημξ Δηάιομα απμπνςμαηηζμμφ πεθηχμαημξ 53% v/v d-h 2 O 40% v/v κεζαλόιε 7% v/v νμηθό νμύ 0.3% w/v Coomassie brilliant blue R % v/v d-h 2 O 40% v/v κεζαλόιε 7% v/v νμηθό νμύ Νήθηςμα δηαπςνηζμμφ 12% νοζμηζηηθυ δηάιομα (ph 8.8) Μ d-h 2 O 33.3% v/v δηάιομα αθνοιαμηδίμο / bis 12% / 0.12% SDS 0.1% w/v AP (οπενζεησθυ αμμχκημ) 0.133% w/v ΠΓΙΓD 0.1% v/v Νήθηςμα ζομπφθκςζεξ νοζμηζηηθυ δηάιομα (ph 6.8) Μ d-h 2 O 55% v/v δηάιομα αθνοιαμηδίμο / bis 6% / 0.06% SDS 0.1% w/v AP (οπενζεησθυ αμμχκημ) 0.16% w/v ΠΓΙΓD 0.1% v/v ΑΚΟΟΑΠΟΣΤΠΩΙΑ (Western blotting) Σμ ακμζμαπμηφπςια (ή αλάιπζε θαηά Western) είκαζ ιία ηεπκζηή πμο εθανιυγεηαζ πνμηεζιέκμο κα ακζπκεοεεί εηθεηηζηά ιία πνςηεΐκδ-ακηζβυκμ πμο έπεζ αηζκδημπμζδεεί ζε ιειανάκδ, ιε ηδ πνήζδ εζδζηχκ ακηζζςιάηςκ (Antibody, Ab) ηα μπμία έπμοκ παναζηεοαζηεί βζα ημ ζοβηεηνζιέκμ ακηζβυκμ (Gershoni and Palade 1983, Beisiegel 1986). Η ιεεμδμθμβία αοηή εθανιυγεηαζ βζα ηδκ ακίπκεοζδ ηαζ ηδκ πμζμηζηή ιέηνδζδ ακηζβυκςκ εκυξ ιίβιαημξ πνςηεσκχκ, βζα ηδ ιεθέηδ ηδξ αθθδθεπίδναζδξ ηςκ πνςηεσκχκ ηαεχξ επίζδξ ηαζ ηςκ ηνμπμπμζήζεχκ ημοξ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ ζφκεεζήξ ημοξ. Πενζθαιαάκεζ ηδκ δθεηηνμ-θμνδηζηή ακάθοζδ ημο ακηζβμκζημφ δζαθφιαημξ µε δθεηηνμθυνδζδ ζε πήηηςια πμθοαηνοθαιζδίμο πανμοζία SDS (SDS-PAGE), ηδ ιεηαθμνά ηςκ πνςηεσκχκ ζε ιειανάκδ PVDF

66 (ειεθηξνκεηαθνξά) ηαζ ηέθμξ ηδ δέζιεοζδ ηςκ εζδζηχκ ακηζζςιάηςκ ζημ ακηζβυκμ (Towbin et al. 1979). Αθμφ μθμηθδνςεεί δ δθεηηνμθυνδζδ, ημ πήηηςια ημπμεεηείηαζ ζε εζδζηή ζοζηεοή δθεηηνμιεηαθμνάξ µε ηέημζμκ ηνυπμ χζηε, οπυ ηδκ επίδναζδ ημο δθεηηνζημφ νεφιαημξ, μζ ανκδηζηά θμνηζζιέκεξ πνςηεΐκεξ κα ιεηαθενεμφκ ζηδ ιειανάκδ PVDF (Polyvinylidene Difluoride), πμο είκαζ ημπμεεηδιέκδ ιεηαλφ ημο εεηζημφ πυθμο ηαζ ημο πδηηχιαημξ (Εικόνα 38) ηαζ ζηδκ μπμία δδιζμονβείηαζ έκα απμηφπςια ηςκ πνςηεσκχκ πμο ανίζημκηαζ ζημ πήηηςια. Οζ πνςηεΐκεξ δεζιεφμκηαζ ζζπονά ηονίςξ µε οδνυθμαεξ αθθδθεπζδνάζεζξ, εκχ δζαηδνμφκ ηζξ ακηζβμκζηέξ ημοξ ζδζυηδηεξ δζεοημθφκμκηαξ ηδκ ακαβκχνζζή ημοξ απυ ηα ακηζζχιαηα. Η ειθάκζζδ ημο ζοιπθυημο ακηζβυκμο-ακηζζχιαημξ βίκεηαζ µε ηδ πνήζδ εκγοιζηχκ ή ναδζεκενβχκ ζπκδεεηχκ. Γηθυκα 38 : Οοζθεοή μεηαθμνάξ πνςηεσκχκ ζε μεμβνάκε PVDF (τροποποιημένη από «Molecular Biology in Cellular Pathology», Crocker and Murray, 2003). Η ηεπκζηή αοηή έπεζ ιεβάθδ δζαηνζηζηή ζηακυηδηα ηαζ εζδζηυηδηα, εκχ δ ηνμπμπμζδιέκδ ηεπκζηή ειθάκζζδξ µε εκζζποιέκδ πδιεζμθςηαφ-βεζα (ECL) πμο πενζβνάθεηαζ παναηάης πνμζδίδεζ αηυια ιεβαθφηενδ εοαζζεδζία (Εικόνα 39). Μεηαθορά ηωλ πρωηεϊλώλ ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΙΑ Μεηά ηδκ SDS-PAGE ηα πμθοπεπηίδζα πμο έπμοκ ακαθοεεί ζημ πήηηςια δζαπςνζζιμφ ιεηαθένμκηαζ ζε ιειανάκδ ιεηαθμνάξ, µε ηδκ εθανιμβή δθεηηνζημφ πεδίμο ζηαεενήξ έκηαζδξ 400 ma βζα 2 χνεξ. Πνζκ ηδκ δθεηηνμιεηαθμνά, επεζδή δ ιειανάκδ PVDF είκαζ οδνυθμαδ,

67 πνμεημζιάγεηαζ ηαηάθθδθα (1 ιεπηό ζε κεζαλόιε) ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ελζζμννμπείηαζ ζε δζάθοια ιεηαθμνάξ (ζπλήζσο γηα 90 ιεπηά). Γηθυκα 39 : Ε δηαδηθαζία ηεξ ακάιοζεξ θαηά Western. α) Ειεθηνμμεηαθμνά, β) Ακίπκεοζε ημο ακηηγυκμο με εηδηθυ ακηίζςμα, γ) Γμθάκηζε ηεξ επηζομεηήξ δχκεξ με ECL (τροποποιημένη από «Lehninger principles of Biochemistry», Nelson and Cox, 2004). Κορεζκός ηωλ ειεσζέρωλ ζέζεωλ δέζκεσζες ηες κεκβράλες (blocking) Η ιειανάκδ, αθμφ λεπθοεεί ιε νοειζζηζηυ δζάθοια TBS βζα 1 θεπηυ, επςάγεηαζ υθδ ηδ κφπηα ζε εενιμηναζία 4 μ C, οπυ ζοκεπή ακάδεοζδ, ζε 20 ml δζαθφιαημξ TBS-Tween ημ μπμίμ πενζέπεζ 5% w/v απμαμοηονς-ιέκμ βάθα ζε ζηυκδ (skim milk). Να ζδιεζςεεί υηζ ημ δζάθοια TBS-Tween είκαζ νοειζζηζηυ δζάθοια TBS ημ μπμίμ πενζέπεζ απμννοπακηζηυ Tween-20 ζε ζοβηέκηνςζδ 0.1% v/v. Πρόζδεζε ηοσ πρώηοσ αληηζώµαηος Αθμφ ημνεζημφκ μζ εθεφεενεξ εέζεζξ δέζιεοζδξ, απμιαηνφκεηαζ ημ δζάθοια ηαζ δ ιειανάκδ επςάγεηαζ µε ημ πνχημ ακηίζςια βζα 1 χνα ζε εενιμηναζία δςιαηίμο, οπυ ζοκεπή ακάδεοζδ. Σμ ζηάδζμ αοηυ είκαζ πμθφ ζδιακηζηυ ηαεχξ πενζθαιαάκεζ ηδκ ακαβκχνζζδ ηαζ δέζιεοζδ ηςκ ακηζζςιάηςκ ζημ ακηζβυκμ πμο µαξ εκδζαθένεζ κα εκημπίζμοιε. Γζα ημ θυβμ αοηυ, απαζηείηαζ δ ζςζηή ηζηθμδυηδζδ ηςκ ακηζζςιάηςκ, χζηε κα απμθεοπεεί δ δέζιεοζή ημοξ ζε µδ εζδζηέξ εέζεζξ δέζιεοζδξ. To ακηίζςια δζαθφεηαζ ζε νοειζζηζηυ δζάθοια TBS.

68 Εθπιύζεης Αημθμοεμφκ 3 δζαδμπζηέξ εηπθφζεζξ ηςκ 5 θεπηχκ µε TBS-Tween. Πρόζδεζε ηοσ δεύηεροσ αληηζώκαηος Σμ δεφηενμ ακηίζςια ακαβκςνίγεζ ηαζ δεζιεφεηαζ ζηδκ Fc πενζμπή ηςκ IgGs ηαζ είκαζ ζογεοβιέκμ µε ημ έκγοιμ οπενμλεζδάζδ. Η ιειανάκδ επςάγεηαζ 1 χνα ζε εενιμηναζία δςιαηίμο (25 o C), ζε δζάθοια TBS, οπυ ζοκεπή ακάδεοζδ. Εθπιύζεης ηάιομα 1 μο ακηηζχμαημξ 10 ml TBS 10 µl ακηζζχιαημξ (1:1000) ηάιομα 2 μο ακηηζχμαημξ 9 ml TBS 3 µl ακηζζχιαημξ (1:3000) 5% w/v blocking skim milk Αημθμοεμφκ 3 δζαδμπζηέξ εηπθφζεζξ µε TBS-Tween ηςκ 5 θεπηχκ ηαζ 2 εηπθφζεζξ µε TBS ηςκ 5 θεπηχκ. Εκθάληζε ηοσ ζσκπιόθοσ αληηγόλοσ-αληηζώκαηος µε ηελ ηετληθή ηες εληζτσκέλες τεκεηοθωηαύγεηας (ECL). Γζα ηδκ ακίπκεοζδ ημο ζοιπθυημο ακηζβυκμο-ακηζζχιαημξ πνδζζιμπμζήεδηε δ πνχζδ ηαηά ECL (Enhanced Chemiluminescence substrate, ECL), δ μπμία ααζίγεηαζ ζηδκ ανπή ηδξ πδιεζμθςηαφβεζαξ ηαζ έπεζ ιεβάθδ εοαζζεδζία. Σμ δεφηενμ ακηίζςια πμο πνδζζιμπμζήεδηε έθενε ζοκδεδειέκμ μιμζμπμθζηά ημ έκγοιμ ππεξνμεηδάζε (HRP), ημ μπμίμ ηαηαθφεζ ηδκ μλείδςζδ ηδξ ινπκηλόιεο. Καηά ηδ πδιζηή αοηή ακηίδναζδ πανάβμκηαζ θςηυκζα, ηα μπμία θακενχκμοκ ηδ εέζδ ημο ζοιπθυημο ακηζβυκμοακηζζχιαημξ υηακ δ ιειανάκδ εηηεεεί βζα ζφκημιμ πνμκζηυ δζάζηδια, ακάθμβα µε ηδκ έκηαζδ ημο ζήιαημξ, ζε X-ray film. διακηζηυ πθεμκέηηδια αοηήξ ηδξ ιεευδμο είκαζ υηζ ιπμνμφιε κα απμιαηνφκμοιε ηα ακηζζχιαηα απυ ηδ ιειανάκδ ηαζ κα ηδκ επςάζμοιε ζηδ ζοκέπεζα µε άθθα (stripping). Η εκζζποιέκδ πδιεζμθςηαφβεζα ααζίγεηαζ ζηδκ ακηίδναζδ ηδξ θμοµζκυθδξ (3-amino-phthalhydrazide) µε έκακ μλεζδςηζηυ πανάβμκηα, υπςξ ημ οπενμλείδζμ ημο οδνμβυκμο (Η 2 Ο 2 )(Εικόνα 40). Η ακηίδναζδ αοηή ηαηαθφεηαζ απυ ιεηαθθζηά ζυκηα ζε ορδθυ ph, μδδβχκηαξ ζε εηπμιπή ιπθε θςηυξ (κέγηζηε εθπνκπή πεξίπνπ 425 nm). Καεχξ δ εηπμιπή ημο θςηυξ είκαζ αζεεκήξ µε πνυκμ διζγςήξ ιενζηχκ δεοηενμ-θέπηςκ, δ πανμοζία ιζαξ

69 ζεζνάξ µμνίςκ εκζζποηχκ αολάκεζ ηδ δζάνηεζα ηαζ ηδκ έκηαζδ ηδξ εηπμιπήξ ημο θςηυξ απυ ηδκ οπενμλεζδάζδ πενίπμο 100 θμνέξ αθθάγμκηαξ ηδκ ηζκδηζηή, έηζζ χζηε κα πανάβεηαζ ιζα ζηαεενή θάιρδ πμο δζανηεί ανηεηέξ χνεξ. Υνδζζιμπμζμφκηαζ δφμ δζαθφιαηα, ημ ακηζδναζηήνζμ ηδξ θμοιζκυθδξ (luminol) ηαζ ημ δζάθοια οπενμλεζδίμο ημο οδνμβυκμο, ηα μπμία ακαιζβκφμκηαζ ζε ακαθμβία 1:1, ζε πμζυηδηα 100 ιl / cm 2 επζθάκεζαξ ιειανάκδξ. Γηθυκα 40 : Ε ηεπκηθή ηεξ εκηζπομέκεξ πεμεημθςηαφγεηαξ (ECL) (τροποποιημένη από ΑΚΟΟΗΑΣΑΗΡΕΙΚΖΕ (Immunoprecipitation) Αλνζνθαηαθξήκληζε μκμιάγεηαζ δ δζαδζηαζία ηαηά ηδκ μπμία έκα ακηίζςια εζδζηυ βζα έκα ακηζβυκμ πμο πενζέπεηαζ ζε έκα ιίβια πνςηεσκχκ, πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ απμιυκςζδ ηαζ απμιάηνοκζδ ημο ζοβηεηνζιέκμο ακηζβυκμο απυ ημ ιίβια, µε ζημπυ ηδκ πμζμηζηή ηαζ πμζμηζηή ιεθέηδ μνζζιέκςκ παναηηδνζζηζηχκ ημο υπςξ ημ µμνζαηυ αάνμξ ή ημ ζζμδθεηηνζηυ ζδιείμ. Σμ ακηίζςια έπεζ πνμζδεεεί ζε ζςιάηζα ζηενεήξ θάζδξ (π.ρ. καγλεηηθά ζθαηξίδηα ή ζθαηξίδηα αγαξόδεο) είηε άιεζα µε πδιζηυ δεζιυ είηε έιιεζα. Η άιεζδ πνυζδεζδ ιπμνεί κα επζηεοπεεί µε ηδ πνήζδ εκυξ ακηζ-ακηζζχιαημξ (δεύηεξνπ αληηζώκαηνο) είηε µε ηδ πνήζδ ηάπμζαξ άθθδξ πνςηεΐκδξ µε εζδζηή ζοββέκεζα βζα ημ Fc ηιήια ηςκ IgG µμνίςκ, υπςξ μζ πνςηεΐκεξ Α ή G πμο έπμοκ απμιμκςεεί απυ ζηαθοθυημηημοξ. Η επζθμβή ηδξ πνςηεΐκδξ ελανηάηαζ απυ ημ είδμξ ημο μνβακζζιμφ πμο έβζκε δ παναβςβή ημο ακηζζχιαημξ. Γζα πανάδεζβια, δ πνςηεΐκδ Α δεζιεφεηαζ ζζπονά ζε IgGs πμο πνμένπμκηαζ απυ ημοκέθζ, βάηα, άκενςπμ ή πμζνίδζα αθθά ηαζ IgG 2a ηαζ

70 IgG 2b πμκηζημφ. Η πνςηεΐκδ G δεζιεφεηαζ ζζπονά ζε IgGs αμυξ, αθυβμο, ημοκεθζμφ, πμζνζδίμο, αζβυξ αθθά ηαζ IgG 1 ηαζ IgG 2 πμκηζημφ. Αθμφ ηα επζηαθοιιέκα µε ακηίζςια ζθαζνίδζα επςαζημφκ µε ημ δζάθοια ημο ακηζβυκμο, ηα µυνζα πμο δεκ έπμοκ πνμζδεεεί απμιαηνφκμκηαζ µε λεπθφιαηα απυ ημ ζφιπθμημ ζθαζνίδζμ-ακηίζςια-ακηζβυκμ. Σμ ακηζβυκμ πμο επζεοιμφιε απεθεοεενχκεηαζ απυ ημ ακηίζςια µε αθθαβή ημο ph ή µε άθθεξ ζοκεήηεξ πμο εθαηηχκμοκ ηδ ζοββέκεζα ηδξ πνυζδεζδξ ακηζζχιαημξακηζβυκμο (Εικόνα 41) ηαζ ιπμνεί κα ακαθοεεί µε SDS-PAGE ηαζ άθθεξ ζοκδεζζιέκεξ αζμπδιζηέξ ηεπκζηέξ. Γηθυκα 41 : Πα βαζηθά ζηάδηα μηαξ ακμζμθαηαθνήμκηζεξ (τροποποιημένη από ΔΙΑΛΤΜΑΣΑ Ξοζμηζηηθυ δηάιομα ιφζεξ 50 mm Tris-Cl ph mm NaCl 5 mm EDTA 1% Triton-X mm Na 3 VO 4 1 mm PMSF Protease inhibitor cocktail (AEBSF, EDTA, Bestatin, E-64, Leupeptin, Aprotinin, PMSF) ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΙΑ Ανπζηά ζοθθέβμκηαζ αζιμηφηηανα απυ άημια ημο ζηαδίμο πενζπθάκδζδξ (πεξίπνπ 100 κg πξσηεΐλεο γηα θάζε αλνζνθαηαθξήκληζε). Σα αζιμηφηηανα πμο απμιμκχκμκηαζ ιπμνμφκ κα θοθαπημφκ ςξ ίγδια ανπζηά ζε οβνυ άγςημ βζα θεπηά ηαζ έπεζηα ιπμνμφκ κα απμεδηεοημφκ ζημοξ -80 μ C. Η θφζδ ηςκ αζιμηοηηάνςκ βίκεηαζ µε νοειζζηζηυ δζάθοια θφζδξ [lysis buffer (300 µl/δείγµα)], εκχ αημθμοεεί επελενβαζία µε οπενήπμοξ (3 x 15 sec ζηα 10 microns) ζε πάβμ. Σμ πνςηεσκζηυ εηπφθζζια επςάγεηαζ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο (25 ν C) βζα 30 θεπηά µε 25 ιl ζθαζνζδίςκ αβανυγδξ βζα ηάεε ακμζμηαηα-

71 ηνήικζζδ πνμηεζιέκμο κα απμιαηνοκεμφκ μζ πνςηεΐκεξ πμο δεζιεφμκηαζ ζε αοηά ιε ιδ εζδζηυ ηνυπμ. Να ζδιεζςεεί υηζ πνζκ πνδζζιμπμζδεμφκ ηα ζθαζνίδζα λεπθέκμκηαζ απυ ημ ανπζηυ δζάθοια ζημ μπμίμ ειπενζέπμκηαζ ιε νοειζζηζηυ δζάθοια TBS. Αθμφ ζηδ ζοκέπεζα, απμιαηνοκεμφκ ηα ζθαζνίδζα ηδξ αβανυγδξ ιε θοβμηέκηνδζδ ζηζξ rpm βζα 5 θεπηά, ζοθθέβεηαζ ημ πνςηεσκζηυ εηπφθζζια ηαζ ημπμεεηείηαζ ζε κέμ ζςθδκάηζ eppendorf. Πανάθθδθα ζε άθθμ eppendorf ημπμεεημφκηαζ 100 ιl TBS, 0.5 µg πνχημο ακηζζχιαημξ ηαζ 25 ιl ζθαζνζδίςκ αβανυγδξ ηαζ αημθμοεεί επχαζδ βζα 90 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο οπυ ζοκεπή ακάδεοζδ. Με θοβμηέκηνδζδ ζηζξ rpm βζα 5 θεπηά ηαηαηνδικίγμκηαζ ηα ζθαζνίδζα αβανυγδξ ηαζ, αθμφ απμιαηνοκεεί ημ οπενηείιεκμ, πνμζηίεεηαζ 1 ml TBS. Αημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ ζηζξ rpm βζα 5 θεπηά, εκχ δ δζαδζηαζία αοηή επακαθαιαάκεηαζ αηυια ιία θμνά χζηε κα λεπθοεμφκ ηα ζθαζνίδζα ηαζ κα απμιαηνοκεεί δ πμζυηδηα ημο ιδ δεζιεοιέκμο ακηζζχιαημξ. Έπεζηα, ηα ζθαζνίδζα επακαζςνμφκηαζ ζε 25 ιl TBS ηαζ επςάγμκηαζ ιε ημ πνςηεσκζηυ εηπφθζζια βζα 90 θεπηά (ζηνπο 25 o C ππό ζπλερή αλάδεπζε). ηδ ζοκέπεζα, αθμφ πνμδβδεεί θοβμηέκηνδζδ ζηζξ rpm βζα 5 θεπηά, ημ οπενηείιεκμ ζοθθέβεηαζ ζε ηαεανυ eppendorf, εκχ ημ ζφιπθμημ εηπθέκεηαζ 2 θμνέξ µε 1 ml δζαθφιαημξ TBS ηαζ πνμζηίεεηαζ νοειζζηζηυ δζάθοια δεζβιάηςκ (sample buffer) βζα δθεηηνμθυνδζδ (50 µl/ δείγµα), εκχ ιαγί ιε αοηά εα δθεηηνμθμνδεμφκ ηαζ ιg μθζηήξ πνςηεΐκδξ απυ ημ οπενηείιεκμ ημο ακμζμσγήιαημξ. ΑΚΟΟΓΚΣΟΠΖΙΟ ΠΡΩΣΓΧΚΩΚ ΙΓ ΙΖΗΡΟΗΟΠΖΑ ΦΘΟΡΖΙΟΤ Όηακ έκα ζοζηαηζηυ απμννμθά θςξ, ηα δθεηηνυκζα ιεηαθένμκηαζ απυ ιζα ηαηάζηαζδ εθάπζζηδξ εκένβεζαξ ζε ιζα δζεβενιέκδ ηαηάζηαζδ, εκχ ζηδ ζοκέπεζα επζζηνέθμοκ ζηδκ ηαηάζηαζδ εθάπζζηδξ εκένβεζαξ ιέζς πμζηίθςκ μδχκ. Κάπμζεξ δζαδζηαζίεξ υπςξ δ απχθεζα εκένβεζαξ ιε ηδ ιμνθή εενιυηδηαξ δεκ μδδβμφκ ζε θεμνζζιυ, αθθά ζοβηεηνζιέκα ιυνζα (θζνξίδνπζεο νπζίεο) πάκμοκ επίζδξ εκένβεζα ιέζς θεμνζζιμφ. Γζα ημκ in situ εκημπζζιυ εκυξ ζοβηεηνζιέκμο ακηζβυκμο ζηδκ επζθάκεζα ή ζημ εζςηενζηυ ηςκ ηοηηάνςκ πνδζζιμπμζμφκηαζ ακηζζχιαηα ζογεοβιέκα µε ηάπμζα θεμνίγμοζα μοζία (π.ρ. θινπνξνζεΐλε [FITC], ξνδακίλε [TRITC]) ηαζ ημ παναζηεφαζια παναηδνείηαζ ζε ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ. Σμ ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ είκαζ πανυιμζμ ιε ημ ηθαζζηυ θςημκζηυ ιζηνμζηυπζμ ιε ηδ δζαθμνά υηζ ημ πνμζπίπημκ θςξ πενκά απυ δφμ μιάδεξ θίθηνςκ. Η πνχηδ μιάδα θίθηνςκ αθήκεζ κα πενάζμοκ ιυκμ ηα ιήηδ ηφιαημξ πμο δζεβείνμοκ ηδ θεμνίγμοζα μοζία, εκχ δ άθθδ μιάδα

72 αθήκεζ κα πενάζεζ ιυκμ μ εζδζηυξ θεμνζζιυξ πμο εηπέιπεηαζ απυ ηδ θεμνίγμοζα μοζία. Με ηδκ ηεπκζηή αοηή είκαζ δοκαηή δ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηαζ δ ακίπκεοζδ πενζζζυηενςκ δζαθμνεηζηχκ ακηζβυκςκ θυβς ηδξ δοκαηυηδηαξ πνήζδξ ζοβπνυκςξ πμθθχκ δζαθμνεηζηχκ θεμνζγμοζχκ πνςζηζηχκ. Ανίχνευση κυτταροπλασματικού αντιγόνου Ανπζηά απμιμκχκμκηαζ αζιμηφηηανα εκηυιςκ απυ ημ ζηάδζμ πενζπθάκδζδξ ηαζ, αθμφ επακαζςνδεμφκ ζε ενεπηζηυ ιέζμ Grace, επςάγμκηαζ µε ηαηάθθδθμοξ επαβςβείξ ή ακαζημθείξ βζα ημκ απαζημφιεκμ βζα ηδκ μοζία πνυκμ (ζπλήζσο 30 ιεπηά). Έπεζηα, ηα ηφηηανα ηαθθζενβμφκηαζ ζε ιμκυζημζαα, πενίπμο 20 θεπηά, βζα κα πνμζημθθδεμφκ. Αθμφ βίκεζ έηπθοζδ µε δζάθοια TBS, χζηε κα απμιαηνοκεεί ημ µδ πνμζημθθδιέκμ οθζηυ, ηα ηφηηανα ιμκζµμπμζμφκηαζ µε θμνιαθδεΰδδ (HCHO 3.7%) βζα 10 θεπηά. Έπεζηα απυ έηπθοζδ ιε TBS, απμιαηνφκεηαζ δ θμνιαθδεΰδδ ηαζ πνμζηίεεκηαζ 50 ιl απμννοπακηζημφ Triton X-100 (0.1%) βζα δεοηενυθεπηα, χζηε κα ακμίλμοκ πυνμζ ζηδκ ηοηηανμ-πθαζιαηζηή ιειανάκδ ηαζ κα ιπμνέζμοκ ζηδ ζοκέπεζα κα εζζέθεμοκ ηα ακηζζχιαηα ζημ ηοηηανυπθαζια. Αημθμοεεί έηπθοζδ ιε TBS ηαζ πνμζηίεεηαζ δζάθοια 5% BSA ζε TBS ή δζάθοια SuperBlock βζα 10 θεπηά πνμηεζιέκμο κα ημνεζημφκ μζ εέζεζξ µδ εζδζηήξ δέζιεοζδξ ηςκ ακηζζςιάηςκ. Σμ πνχημ ακηίζςια επςάγεηαζ βζα 1 χνα (αξαίσζε 1:100 ζε TBS) ζημοξ 37 μ C, ζε επςαζηζηυ ηθίαακμ ηαζ φζηενα απυ έηπθοζδ µε TBS, αημθμοεεί επχαζδ ηςκ ηοηηάνςκ βζα µία χνα ζημοξ 37 μ C µε ημ δεφηενμ ακηίζςια (αξαίσζε 1:100 ζε TBS), ζημ μπμίμ είκαζ δεζιεοιέκδ θθμομνμζεΐκδ (FITC) ή άθθμ θεμνυπνςια (Cy3). Απυ ημ ζδιείμ αοηυ ηαζ ελήξ, δ δζαδζηαζία θαιαάκεζ πχνα ζημ ζημηάδζ θυβς ηδξ θςημεοαζζεδζίαξ ημο εηάζημηε θεμνμπνχιαημξ. Αημθμοεμφκ εηπθφζεζξ µε TBS ηαζ d-h 2 O, εκχ ιυθζξ ζηεβκχζεζ δ ακηζηεζιεκμθυνμξ ημπμεεηείηαζ ιία ζηαβυκα ιέζμο επζηάθορδξ ηαηάθθδθμο βζα ηδ δζαηήνδζδ ημο θεμνζζιμφ (anti-fade) ηαζ βίκεηαζ έβηθεζζδ µε ηαθοπηνίδα. Σα παναζηεοάζιαηα θοθάζζμκηαζ, ζηδ ζοκέπεζα, ζημοξ 4 o C ηαζ ιπμνμφκ κα παναηδνδεμφκ ζημ ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ εκηυξ θίβςκ διενχκ. Οη παξαπάλσ πεηξακαηηθέο δηαδηθαζίεο κπνξνύλ λα ηξνπνπνηεζνύλ θαηαιιήισο γηα ηαπηόρξνλν αλνζνεληνπηζκό δπν αληηγόλσλ. Γηα ηελ επηηέιεζε κηαο ηέηνηαο εξγαζίαο αξθεί ηα αληηζώκαηα πνπ ρξεζηκνπνηνύληαη γηα ηελ αλίρλεπζε λα έρνπλ δηαθνξεηηθή δσηθή πξνέιεπζε θαη θπζηθά λα είλαη δηαζέζηκα θζνξνρξώκαηα µε ίδην θάζκα δηέγεξζεο αιιά δηαθνξεηηθό θάζκα εθπνκπήο (π.ρ. FITC θαη Cy3).

73 Συνεστιακή μικροσκοπία (Confocal microscopy) Πνςημπυνμξ ηδξ ζοκεζηζαηήξ ιζηνμζημπίαξ οπήνλε ημ 1955 μ οπυηνμθμξ ημο Πακεπζζηδιίμο ημο Harvard, Μarvin Minsky, μ μπμίμξ ηαημπφνςζε ηδκ παηέκηα ημ ηδκ πναβιαηζηυηδηα, ημ ζοκεζηζαηυ ιζηνμζηυπζμ (Εικόνα 42 Α & Γ) είκαζ έκα ιζηνμζηυπζμ θεμνζζιμφ, υιςξ ακηί κα θςηίγεζ μθυηθδνμ ημ παναζηεφαζια, ημ μπηζηυ ημο ζφζηδια ζε ηάεε ζηζβιή εζηζάγεζ ηζξ αηηίκεξ laser ζε έκα ζδιείμ ηαζ έκα επίπεδμ (νπηηθή ηνκή). Μάθζζηα, πνμημφ μζ εηπειπυιεκεξ αηηίκεξ θεάζμοκ ζημκ ακζπκεοηή πενκμφκ απυ έκα ζφζηδια πμο επζηνέπεζ κα δζέθεμοκ ιυκμ αοηέξ πμο πνμένπμκηαζ απυ ιία μπηζηή ημιή. Μ αοηυκ ημκ ηνυπμ, δ εζηυκα είκαζ ηαεανυηενδ (Εικόνα 42 Β). οκεπχξ, πανέπεηαζ υπζ ιυκμ δ δοκαηυηδηα παναηήνδζδξ ηςκ θεπημιενεζχκ, αθθά ηαζ δ ζοβηνυηδζδ ηδξ ηνζζδζάζηαηδξ δμιήξ μνβακζδίςκ, ηοηηάνςκ ηηθ. ζοκανιμθμβχκηαξ ιζα ζεζνά δζαδμπζηχκ θεπηχκ μπηζηχκ ημιχκ πμο θαιαάκμκηαζ ηαηά ιήημξ ημο ηαηαηυνοθμο άλμκα ημο παναζηεοάζιαημξ (Minsky 1988, Semwo-gerere and Weeks 2005, Stelzer 1995). Γηθυκα 42 : Α. Πμ ζοκεζηηαθυ μηθνμζθυπημ, Β. Δηαθμνά ζηεκ πμηυηεηα ηεξ εηθυκαξ μεηαλφ ημο ζοκεζηηαθμφ θαη ημο ζομβαηηθμφ μηθνμζθμπίμο θζμνηζμμφ [Ιε Cy2 (πνάζηκμ) έπεη ζεμακζεί ε βαζηθή μεμβνάκε, εκχ

74 με Cy3 (θυθθηκμ) μη κεονχκεξ.], Γ. Ε βαζηθή μνγάκςζε εκυξ ζοκεζηηαθμφ μηθνμζθμπίμο [Πμ laser ζανχκεη ημ παναζθεφαζμα με ηε βμήζεηα θαζνεθηχκ. Μη μπηηθέξ ημμέξ ιαμβάκμκηαη θαζχξ ημ θςξ πενκά πνμξ ημκ ακηπκεοηή μέζς εκυξ δηαθνάγμαημξ.]. Η πεζναιαηζηή δζαδζηαζία πμο αημθμοεήεδηε βζα ηδ δδιζμονβία ηςκ παναζηεοαζιάηςκ πμο πνμμνίγμκηακ βζα ημ ζοκεζηζαηυ ιζηνμζηυπζμ είκαζ ζπεδυκ δ ίδζα ιε εηείκδ πμο πενζβνάθδηε παναπάκς. Η ιυκδ δζαθμνά έβηεζηαζ ζημ οθζηυ πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ έβηθεζζδ ηςκ παναζηεοαζιάηςκ, ημ μπμίμ είκαζ έκα δζάθοια Mowiol 4-88 πμο έπεζ δείηηδ δζάεθαζδξ 1,463. Απυ ηδ ζηζβιή πμο εα βίκεζ δ έβηθεζζδ, ημ παναζηεφαζια εα πνέπεζ κα παναιείκεζ 40 θεπηά ζημ ζημηάδζ (ζηνπο 25 o C) πνμηεζιέκμο κα ζηενεμπμζδεεί ημ οθζηυ έβηθεζζδξ πνζκ παναηδνδ-εεί ζημ ιζηνμζηυπζμ.

75

76 ΑΠΟΣΓΘΓΙΑΣΑ Kατανομή των FAK, p Tyr397 FAK, ERK, p Thr202/Tyr204 ERK, Elk-1 και p Ser383 Elk-1 στα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου παρουσία και απουσία E. coli. Όπςξ πενζβνάθεηαζ ηαζ ζηδκ εζζαβςβή, ηα αζιμηφηηανα ηδξ C. capitata παίγμοκ ηονίανπμ νυθμ ζημ αιοκηζηυ ζφζηδια ημο εκηυιμο ηαζ έκα ιεβάθμ πμζμζηυ αοηχκ είκαζ θαβμηφηηανα. Απυ πνμδβμφιεκεξ ενβαζίεξ ημο ενβαζηδνίμο ιαξ είκαζ βκςζηυ υηζ δ ηοηηανμθαβία ηςκ ααηηδνίςκ απυ ηα αζιμηφηηανα ημο εκηυιμο αημθμοεεί ημ ζδιαημδμηζηυ ιμκμπάηζ ηληεγθξίλεο FAK Src MAPKs Elk-1 (Foukas et al. 1998, Metheniti et al. 2001, Lamprou et al. 2005, Lamprou et al. 2007, Mamali et al. 2007). Γεδμιέκμο υηζ δ οπμηοηηανζηή δζαιενζζιαημπμίδζδ ηςκ ζδιαημδμηζηχκ ιμνίςκ είκαζ ηνίζζιδ βζα ηδ ζςζηή απυηνζζδ ημο ηοηηάνμο ζηα δζάθμνα ενεείζιαηα, εεθήζαιε κα δζαθεοηάκμοιε πενζζζυηενμ ημ ζδιαημδμηζηυ ιμκμπάηζ πμο μδδβεί ζηδκ ηοηηανμθαβία ηςκ ααηηδνίςκ. Ανπζηά, ιε ηδ ιέεμδμ ημο ακμζμθεμνζζιμφ, ιεθεηήζαιε ηδκ ηαηακμιή ηςκ FAK, p Tyr397 FAK, ERK, p Thr202/Tyr204 ERK, Elk-1 ηαζ p Ser383 Elk-1 πανμοζία E. coli. Γζ αοηυ ημ ζημπυ, αζιμηφηηανα απυ πνμκφιθεξ ημο ζηαδίμο πενζπθάκδζδξ απμιμκχεδηακ ηαζ επςάζηδηακ βζα 20 θεπηά ζε ενεπηζηυ ιέζμ Grace πανμοζία E. coli ηαζ ζηδ ζοκέπεζα, πνμζημθθήεδηακ ζε ακηζηεζιεκμθυνμοξ πθάηεξ. Σα ακηζβυκα πμο ιεθεηήεδηακ ήηακ ηοηηανμπθαζιαηζηά ηαζ βζα ημ θυβμ αοηυ, ιεηά ηδκ παναζηεοή ηςκ ιμκυζημζαςκ ηαζ ηδ ιμκζιμπμίδζή ημοξ, ηα ηφηηανα έβζκακ δζαπεναηά έπεζηα απυ επχαζδ ιε Triton-X-100. Η ακίπκεοζδ ηςκ πνςηεσκχκ έβζκε ιε ζοκεζηζαηή ιζηνμζημπία. Όζμκ αθμνά ζηδκ FAK, πνδζζιμπμζήεδηακ ιμκμηθςκζηά ακηζζχιαηα πμκηζηζμφ έκακηζ ηδξ μθζηήξ FAK ηςκ εδθαζηζηχκ ηαεχξ ηαζ ημο θςζθμνοθζςιέκμο ηθάζιαηυξ ηδξ ζηδκ ηονμζίκδ 397, εκχ ημ δεφηενμ ακηίζςια ήηακ ζογεοβιέκμ ιε ημ θεμνυπνςια FITC, ημ μπμίμ δζεβεζνυιεκμ εηπέιπεζ πνάζζκμ θεμνζζιυ. Η θςζθμνοθίςζδ ζηδκ ηονμζίκδ 397 εεςνείηαζ πςξ είκαζ ημ ηνίζζιμ αήια βζα ηδκ εκενβμπμίδζδ ημο ιμνίμο ηαζ ηαηά ζοκέπεζα δ πνήζδ ημο ακηζζχιαημξ αοημφ έπεζ ζημπυ ηδκ ακάδεζλδ ηδξ θςζθμνοθζςιέκδξ ηαζ άνα εκενβμπμζδιέκδξ ιμνθήξ ηδξ FAK. Παναηδνμφιε υηζ δ μθζηή FAK (Εικόνα 43 Α & Β) ηαηακέιεηαζ μιμζυιμνθα ζε υθμ ημ ηφηηανμ πανμοζζάγμκηαξ έκα δζάζηζηημ ιμηίαμ. Πανμοζία E. coli δζαηδνείηαζ δ δζάζηζηηδ ηαηακμιή ηδξ FAK ιε ημκζζιέκδ πενζζζυηενμ ηδκ πενζθένεζα ημο ηοηηάνμο.

77 A B Γηθυκα 43 : Ηαηακμμή ηεξ μιηθήξ FAK ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata. Αημμθφηηανα απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ θαη θαιιηενγήζεθακ απμοζία (Α) ή πανμοζία (Β) E. coli, πνμζθμιιήζεθακ ζε ακηηθεημεκμθυνμοξ πιάθεξ θαη ζεμάκζεθακ με ακηίζςμα έκακηη ηεξ μιηθήξ FAK. Μη θςημγναθίεξ πνμένπμκηαη απυ ζοκεζηηαθυ μηθνμζθυπημ ζάνςζεξ θαη είκαη μπηηθέξ ημμέξ δηαμέζμο ημο πονήκα. A Γηθυκα 44 : Ηαηακμμή ηεξ p Tyr397 FAK ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata Αημμθφηηανα απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ θαη θαιιηενγήζεθακ απμοζία (Α) ή πανμοζία (Β) E. coli, πνμζθμιιήζεθακ ζε ακηηθεημεκμθυνμοξ πιάθεξ θαη ζεμάκζεθακ με ακηίζςμα έκακηη ηεξ p Tyr397 FAK. Μη θςημγναθίεξ πνμένπμκηαη απυ ζοκεζηηαθυ μηθνμζθυπημ ζάνςζεξ θαη είκαη μπηηθέξ ημμέξ δηαμέζμο ημο πονήκα. Β Απυ ηδκ άθθδ ιενζά, δ p Tyr397 FAK (Εικόνα 44 Α & Β) εκημπίγεηαζ ηονίςξ ζημ ηοηηανυπθαζια, υιςξ ακζπκεφεηαζ ηαζ ζημκ πονήκα, εκχ δ εζηυκα αοηή βίκεηαζ εκημκυηενδ πανμοζία E. coli. Πνμθακχξ δ πανμοζία ηδξ E. coli μδδβεί ζηδ θςζθμνοθίςζδ ηαζ ηαη επέηηαζδ ζηδκ εκενβμπμίδζδ ηδξ FAK ηαζ ηδ ζηαδζαηή ιεηαηυπζζή ηδξ ζημκ πονήκα. Αοηυ εκζζπφεηαζ

78 απυ ημ βεβμκυξ υηζ ζε άθθα ηφηηανα, πανμοζία ααηηδνίςκ, ακζπκεφεηαζ πενζζζυηενδ εκενβή FAK ζημκ πονήκα ηαζ ζε άθθα θζβυηενδ, πνμθακχξ θυβς δζαθμνεηζηήξ πνμκζηήξ εκενβμπμίδζδξ. Βέααζα, δ πανμοζία θςζθμνοθζςιέκδξ FAK ζηα ηφηηανα-ιάνηονεξ πνμθακχξ μθείθεηαζ ζηδκ ηοπαία εκενβμπμίδζδ ηςκ ηοηηάνςκ. Η ίδζα δζαδζηαζία αημθμοεήεδηε ηαζ βζα ηδ MAPK ERK. Υνδζζιμπμζήεδηακ πμθοηθςκζηά ακηζζχιαηα ημοκεθζμφ έκακηζ ηδξ μθζηήξ ERK ηςκ εδθαζηζηχκ ηαεχξ ηαζ ηδξ δζπθά θςζθμνοθζςιέκδξ ιμνθήξ ηδξ ζηδ ενεμκίκδ 202 ηαζ ηδκ ηονμζίκδ 204, πμο απμηεθεί ηαζ ηδκ εκενβή ιμνθή ηδξ. Σμ δεφηενμ ακηίζςια πμο πνδζζιμπμζήεδηε ήηακ ζογεοβιέκμ ιε ημ θεμνυπνςια Cy3, ημ μπμίμ δζεβεζνυιεκμ εηπέιπεζ ηυηηζκμ θεμνζζιυ. Παναηδνμφιε υηζ δ μθζηή ERK (Εικόνα 45 Α & Β) ηαηακέιεηαζ μιμζυιμνθα ζε υθμ ημ ηφηηανμ πανμοζζάγμκηαξ ημ ίδζμ δζάζηζηημ ιμηίαμ πμο πανμοζζάγεζ ηαζ δ FAK, εκχ πανμοζία E. coli θαίκεηαζ υηζ δζαηδνείηαζ δ δζάζηζηηδ ηαηακμιή ιε ιεβαθφηενδ έκηαζδ ζηδκ πενζμπή ημο πονήκα. Φαίκεηαζ δδθαδή, υηζ πανμοζία E. coli δίκεηαζ ημ ζήια ζηδκ ERK κα εζζέθεεζ ζημκ πονήκα, δε βκςνίγμοιε υιςξ ζίβμονα ακ δ ERK πμο ιπαίκεζ ζημκ πονήκα είκαζ δ θςζθμνοθζςιέκδ ηαζ ζοκεπχξ δ εκενβή ή υπζ. Γζ αοηυ δ παναπάκς δζαδζηαζία επακαθήθεδηε βζα ηδκ p Thr202/Tyr204 ERK (Εικόνα 46 Α, Β & Γ), δ μπμία υπςξ θαίκεηαζ, εκημπίγεηαζ ηονίςξ ζημ ηοηηανυπθαζια, υιςξ ακζπκεφεηαζ ηαζ ζημκ πονήκα, εκχ πανμοζία E. coli ζηαδζαηά εζζένπεηαζ ζημκ πονήκα. Πνμθακχξ δ πανμοζία ηδξ E. coli μδδβεί ζηδ θςζθμνοθίςζδ ηαζ ηαη επέηηαζδ ζηδκ εκενβμπμίδζδ ηδξ ERK ηαζ ηδ ζηαδζαηή ιεηαηυπζζή ηδξ ζημκ πονήκα. A Β Γηθυκα 45 : Ηαηακμμή ηεξ μιηθήξ ERK ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata. Αημμθφηηανα απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ θαη θαιιηενγήζεθακ απμοζία (Α) ή πανμοζία (Β) E. coli, πνμζθμιιήζεθακ ζε ακηηθεημεκμθυνμοξ πιάθεξ θαη ζεμάκζεθακ με ακηίζςμα έκακηη ηεξ μιηθήξ ERK. Μη θςημγναθίεξ πνμένπμκηαη απυ ζοκεζηηαθυ μηθνμζθυπημ ζάνςζεξ θαη είκαη μπηηθέξ ημμέξ δηαμέζμο ημο πονήκα.

79 A Β Γ Γηθυκα 46 : Ηαηακμμή ηεξ p Thr202/Tyr204 ERK ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata. Αημμθφηηανα απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ θαη θαιιηενγήζεθακ απμοζία (Α) ή πανμοζία (Β & Γ) E. coli, πνμζθμιιήζεθακ ζε ακηηθεημεκμθυνμοξ πιάθεξ θαη ζεμάκζεθακ με ακηίζςμα έκακηη ηεξ p Thr202/ Tyr204 ERK. (Ε θςημγναθία Β πνμεγείηαη πνμκηθά ηεξ θςημγναθίαξ Γ ). Μη θςημγναθίεξ πνμένπμκηαη απυ ζοκεζηηαθυ μηθνμζθυπημ ζάνςζεξ θαη είκαη μπηηθέξ ημμέξ δηαμέζμο ημο πονήκα. Σέθμξ, υζμκ αθμνά ζημ ιεηαβναθζηυ πανάβμκηα Elk-1, πνδζζιμπμζήεδηε πμθοηθςκζηυ ακηίζςια ημοκεθζμφ έκακηζ ημο Elk-1 ηαζ ιμκμηθςκζηυ ακηίζςια πμκηζηζμφ έκακηζ ηδξ θςζθμνοθζςιέκδξ ζηδ ζενίκδ 383 ιμνθήξ ημο, εκχ ημ δεφηενμ ακηίζςια ήηακ ζογεοβιέκμ ιε FITC. Παναηδνμφιε υηζ μ Elk-1 ηαηακέιεηαζ ζε μθυηθδνμ ημ ηφηηανμ ιε πενζζζυηενμ ημκζζιέκμ ημκ πονήκα, εκχ μ p Ser383 Elk-1 (Εικόνα 47 Α & Β) ηαηακέιεηαζ μιμζυιμνθα ζε υθμ ημ ηφηηανμ πανμοζζάγμκηαξ έκα δζάζηζηημ ιμηίαμ, εκχ δ εζηυκα αοηή βίκεηαζ πζμ έκημκδ πανμοζία E. coli. Πνμθακχξ δ πανμοζία E. coli μδδβεί ζηδ θςζθμνοθίςζδ ηαζ ηαη επέηηαζδ ζηδκ εκενβμπμίδζδ ημο Elk-1, μ μπμίμξ ζηδ ζοκέπεζα εζζένπεηαζ ζημκ πονήκα ηαζ νοειίγεζ ηδ βμκζδζαηή έηθναζδ.

80 Α Β Γ Γηθυκα 47 : Ηαηακμμή ημο Elk-1 θαη ημο p Ser383 Elk-1 ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata. Αημμθφηηανα απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ θαη θαιιηενγήζεθακ πανμοζία (Α & Γ) ή απμοζία (Β) E. coli, πνμζθμιιήζεθακ ζε ακηηθεημεκμθυνμοξ πιάθεξ θαη ζεμάκζεθακ με ακηίζςμα έκακηη ημο Elk-1 (Α) θαη ημο p Ser383 Elk-1 (Β & Γ). Μη θςημγναθίεξ πνμένπμκηαη απυ ζοκεζηηαθυ μηθνμζθυπημ ζάνςζεξ θαη είκαη μπηηθέξ ημμέξ δηαμέζμο ημο πονήκα. Διερεύνηση συνεντοπισμού και συμπλοκοποίησης των FAK και ERK. Σα ζδιαημδμηζηά ιυνζα πμο ζοιιεηέπμοκ ζε έκα ιμκμπάηζ είκαζ πμθφ πζεακυκ κα ανίζημκηαζ ζε άιεζδ επαθή. Η θεζημονβζηή ζοζπέηζζδ ηδξ FAK ιε ηζξ MAPKs (Chen et al. 1992, Yang et al. 2000, Yordy and Muise- Helmericks 2000) ιάξ εκεάννοκε, ζηδ ζοκέπεζα, κα δζενεοκήζμοιε ηδ θοζζηή δζαζφκδεζδ ηδξ FAK ιε ηδκ ERK. Ανπζηά, ιε ζοκεζηζαηή ιζηνμζημπία εθέβπεδηε ακ μζ δφμ πνςηεΐκεξ ζοκεκημπίγμκηαζ. Γζ αοηυ ημ ζημπυ, αζιμηφηηανα απυ πνμκφιθεξ ημο ζηαδίμο πενζπθάκδζδξ απμιμκχεδηακ ηαζ επςάζηδηακ βζα 20 θεπηά ζε ενεπηζηυ ιέζμ Grace πανμοζία E. coli ηαζ ζηδ ζοκέπεζα, πνμζημθθήεδηακ ζε ακηζηεζιεκμθυνμοξ πθάηεξ. Σα ακηζζχιαηα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ημκ ακμζμεκημπζζιυ ήηακ ιμκμηθςκζηά ακηζζχιαηα πμκηζηζμφ έκακηζ ηδξ μθζηήξ FAK ηςκ εδθαζηζηχκ ηαεχξ ηαζ ημο θςζθμνοθζςιέκμο ηθάζιαηυξ ηδξ ζηδκ ηονμζίκδ 397, εκχ ημ δεφηενμ ακηίζςια ήηακ ζογεοβιέκμ ιε ημ θεμνυπνςια FITC ηαζ πμθοηθςκζηά ακηζζχιαηα ημοκεθζμφ έκακηζ ηδξ μθζηήξ ERK ηςκ εδθαζηζηχκ ηαεχξ ηαζ ηδξ δζπθά θςζθμνοθζςιέκδξ ιμνθήξ ηδξ ζηδ ενεμκίκδ 202 ηαζ ηδκ ηονμζίκδ 204, εκχ ημ δεφηενμ ακηίζςια είπε πνμζδειέκμ ημ θεμνυπνςια Cy3.

81 A Β Γ Γηθυκα 48 : Δηενεφκεζε ζοκεκημπηζμμφ ηεξ FAK θαη ηεξ ERK ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata. Αημμθφηηανα απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ θαη θαιιηενγήζεθακ απμοζία (Α & Γ) ή πανμοζία (Β & Δ) E. coli, πνμζθμιιήζεθακ ζε ακηηθεημεκμθυνμοξ πιάθεξ θαη ζεμάκζεθακ με ακηηζχμαηα έκακηη ηεξ FAK θαη ηεξ ERK. Μη θςημγναθίεξ Α θαη Β πνμένπμκηαη απυ ηεκ πιήνε πνμβμιή (full projection) ηςκ μπηηθχκ ημμχκ, εκχ μη θςημγναθίεξ Γ θαη Δ πνμένπμκηαη απυ μπηηθέξ ημμέξ πμο δηένπμκηαη απυ ημκ πονήκα ηςκ αημμθοηηάνςκ. Γ

82 Όζμκ αθμνά ζηζξ μθζηέξ FAK ηαζ ERK (Εικόνα 48 Α, Β, Γ & Δ), απμοζία E. coli, δεκ παναηδνείηαζ ζοκεκημπζζιυξ. Ακηζεέηςξ, πανμοζία E. coli θαίκεηαζ υηζ μζ δφμ πνςηεΐκεξ ζοκεκημπίγμκηαζ, ζε ιζηνυ υιςξ ααειυ, ηονίςξ ζηδκ πενζθένεζα ημο ηοηηάνμο. Πνμηεζιέκμο υιςξ, κα δζαθεοηακεεί ακ μ ζοκεκημπζζιυξ μθείθεηαζ ζηδκ εκενβή ιμνθή ηςκ πνςηεσκχκ αοηχκ επακαθήθεδηε δ παναπάκς δζαδζηαζία βζα ηζξ θςζθμνοθζςιέκεξ ιμνθέξ ημοξ. Έηζζ, ζηδκ Εικόνα 49 Α, Β, Γ & Δ, παναηδνμφιε υηζ απμοζία E. coli, μ ζοκεκημπζζιυξ ηδξ p Tyr397 FAK ιε ηδκ μθζηή ERK είκαζ ζε πμθφ ιζηνυ ααειυ, εκχ αολάκεηαζ ζηδκ πενζθένεζα ημο ηοηηάνμο πανμοζία E. coli. ημ ζδιείμ αοηυ εα πνέπεζ κα ζδιεζςεεί υηζ δ ακίπκεοζδ ηδξ εκενβήξ ιμνθήξ ηδξ FAK απμοζία E. coli οπμδδθχκεζ υηζ ημ ζφζηδιά ιαξ είπε εκενβμπμζδεεί ηοπαία ζε ιζηνυ ααειυ απυ δζάθμνμοξ ελςβεκείξ πανάβμκηεξ. Αοηυ υιςξ δεκ αθθμζχκεζ ημ απμηέθεζιά ιαξ, αθμφ πανμοζία E. coli δ εκενβμπμίδζδ ηδξ FAK αολάκεηαζ πμθφ πενζζζυηενμ. Δπίζδξ, ζηδκ Εικόνα 50 Α, Β, Γ & Δ, παναηδνμφιε υηζ απμοζία E. coli, δ μθζηή FAK ζοκεκημπίγεηαζ ιε ηδ p Thr202/Tyr204 ERK ζε πμθφ ιζηνυ ααειυ, εκχ μ ζοκεκημπζζιυξ ημοξ αολάκεηαζ ανηεηά ζδίςξ ζηδκ πενζθένεζα ημο ηοηηάνμο πανμοζία E. coli. Πνμθακχξ, μ ιζηνμφ ααειμφ ζοκεκημπζζιυξ πμο παναηδνείηαζ απμοζία E. coli πνμένπεηαζ απυ ηδκ πανμοζία ηδξ p Thr202/Tyr204 ERK, δ μπμία υιςξ, έπεζ εκενβμπμζδεεί απυ άθθδ αζηία. Σέθμξ, υζμκ αθμνά ζηζξ θςζθμνοθζςιέκεξ ιμνθέξ ηςκ FAK ηαζ ERK (Εικόνα 51 Α, Β, Γ & Δ), παναηδνμφιε υηζ μζ δφμ πνςηεΐκεξ ζοκεκημπίγμκηαζ ζηδκ πενζθένεζα ημο ηοηηάνμο απμοζία E. coli, εκχ δ εζηυκα αοηή βίκεηαζ πζμ έκημκδ πανμοζία E. coli. Απυ ηα παναπάκς απμηεθέζιαηα, θαίκεηαζ υηζ μζ πνςηεΐκεξ FAK ηαζ ERK ζοκεκημπίγμκηαζ ιυκμ υηακ ανίζημκηαζ ζηδ θςζθμνοθζςιέκδ ηαζ ηαη επέηηαζδ εκενβμπμζδιέκδ ημοξ ιμνθή, πςνίξ υιςξ κα βίκεηαζ βκςζηυ πμζα απυ ηζξ δφμ θςζθμνοθζχζεζξ είκαζ δ πνμαπαζημφιεκδ. Αημθμφεςξ, δζενεοκήεδηε ιε ακμζμηαηαηνήικζζδ ηαζ ακάθοζδ ηαηά Western ακ μζ δφμ παναπάκς πνςηεΐκεξ ζοιπθμημπμζμφκηαζ. Έπεζηα απυ ακμζμηαηαηνήικζζδ ηδξ μθζηήξ FAK ηαζ ηδξ p Tyr397 FAK απυ πνςηεσκζηυ εηπφθζζια αζιμηοηηάνςκ ηα μπμία είπακ πνμδβμοιέκςξ επςαζηεί απμοζία ή πανμοζία E. coli (Εικόνα 52 Α & Β), θάκδηε υηζ πνάβιαηζ δ μθζηή ERK ζοβηαηαηνδικίγεηαζ ιε ηδκ μθζηή FAK πανμοζία E. coli ηαεχξ ηαζ ιε ηδ p Tyr397 FAK απμοζία ή πανμοζία E. coli. Γε θαίκεηαζ δδθαδή, κα δδιζμονβείηαζ ζφιπθμημ ιεηαλφ ηςκ μθζηχκ FAK ηαζ ERK απμοζία E. coli, ημ μπμίμ

83 Α Β Γ Γηθυκα 49 : Δηενεφκεζε ζοκεκημπηζμμφ ηεξ p Tyr397 FAK θαη ηεξ ERK ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata. Αημμθφηηανα απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ θαη θαιιηενγήζεθακ απμοζία (Α & Γ) ή πανμοζία (Β & Δ) E. coli, πνμζθμιιήζεθακ ζε ακηηθεημεκμθυνμοξ πιάθεξ θαη ζεμάκζεθακ με ακηηζχμαηα έκακηη ηεξ p Tyr397 FAK θαη ηεξ ERK. Μη θςημγναθίεξ Α θαη Β πνμένπμκηαη απυ ηεκ πιήνε πνμβμιή (full projection) ηςκ μπηηθχκ ημμχκ, εκχ μη θςημγναθίεξ Γ θαη Δ πνμένπμκηαη απυ μπηηθέξ ημμέξ πμο δηένπμκηαη απυ ημκ πονήκα ηςκ αημμθοηηάνςκ. Γ

84 Α Β Γ Γηθυκα 50 : Δηενεφκεζε ζοκεκημπηζμμφ ηεξ FAK θαη ηεξ p Thr202/Tyr204 ERK ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata. Αημμθφηηανα απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ θαη θαιιηενγήζεθακ απμοζία (Α & Γ) ή πανμοζία (Β & Δ) E. coli, πνμζθμιιήζεθακ ζε ακηηθεημεκμθυνμοξ πιάθεξ θαη ζεμάκζεθακ με ακηηζχμαηα έκακηη ηεξ FAK θαη ηεξ p Thr202/Tyr204 ERK. Μη θςημγναθίεξ Α θαη Β πνμένπμκηαη απυ ηεκ πιήνε πνμβμιή (full projection) ηςκ μπηηθχκ ημμχκ, εκχ μη Γ θαη Δ πνμένπμκηαη απυ μπηηθέξ ημμέξ πμο δηένπμκηαη απυ ημκ πονήκα ηςκ αημμθοηηάνςκ. Γ

85 Α Β Γ Γηθυκα 51 : Δηενεφκεζε ζοκεκημπηζμμφ ηεξ p Tyr397 FAK θαη ηεξ p Thr202/Tyr204 ERK ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata. Αημμθφηηανα απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ θαη θαιιηενγήζεθακ απμοζία (Α & Γ) ή πανμοζία (Β & Δ) E. coli, πνμζθμιιήζεθακ ζε ακηηθεημεκμθυνμοξ πιάθεξ θαη ζεμάκζεθακ με ακηηζχμαηα έκακηη ηεξ p Tyr397 FAK θαη ηεξ p Thr202/Tyr204 ERK. Μη θςημγναθίεξ Α θαη Β πνμένπμκηαη απυ ηεκ πιήνε πνμβμιή (full projection) ηςκ μπηηθχκ ημμχκ, εκχ μη θςημγναθίεξ Γ θαη Δ πνμένπμκηαη απυ μπηηθέξ ημμέξ πμο δηένπμκηαη απυ ημκ πονήκα ηςκ αημμθοηηάνςκ. Γ

86 A Β Γηθυκα 52 : Δηενεφκεζε ζομπιμθμπμίεζεξ ηεξ FAK θαη ηεξ ERK ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata. Γκαηχνεμα αημμθοηηάνςκ απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ, θαιιηενγήζεθακ απμοζία ή πανμοζία E. coli, ιφζεθακ θαη αθμιμφζεζε ακμζμθαηαθνήμκηζε με πμιοθιςκηθά ακηηζχμαηα έκακηη ηςκ FAK θαη p Tyr397 FAK. Πα ακμζμσδήμαηα ακαιφζεθακ ζε 10% SDS-PAGE θαη ζηε ζοκέπεηα, έγηκε ακμζμαπμηφπςζε γηα ηεκ μιηθή ERK (Α) θαη ηε p Thr202/ Tyr204 ERK (Β).

87 ζοιθςκεί ηαζ ιε ηα απμηεθέζιαηα ημο ακμζμθεμνζζιμφ. Σμ ίδζμ απμηέθεζια πνμέηορε ηαζ ιε ηδ p Thr202/Tyr204 ERK. Η αθθδθεπίδναζδ ηδξ FAK ιε ηδκ ERK επζαεααζχεδηε ιε ακηίζηνμθδ ακμζμζοβηαηαηνήικζζδ, δδθαδή ιε ακμζμηαηαηνήικζζδ ηδξ μθζηήξ ERK ηαζ ηδξ p Thr202/Tyr204 ERK ηαζ ακάθοζδ ηαηά Western βζα ηδκ μθζηή FAK ηαζ ηδ p Tyr397 FAK (Εικόνα 53 Α & Β). Αοηά ηα πεζνάιαηα ηδξ ακηίζηνμθδξ ακμζμζοβηαηαηνήικζζδξ ιαξ έδςζακ ηάπμζα εκδζαθένμκηα απμηεθέζιαηα. Όηακ ακμζμσγήιαηα ακαθφεδηακ ηαζ αημθμφεδζε ακμζμαπμηφπςζδ βζα ηδκ μθζηή FAK ιε πμθοηθςκζηυ ακηίζςια, ακζπκεφεδηακ πμθθέξ πεπηζδζηέξ γχκεξ παιδθμφ ιμνζαημφ αάνμοξ (27, 32, 62, 66, 72, 76 kda). Αοηυ πζεακχξ κα μθείθεηαζ ζηα ορδθά επίπεδα ηδξ εκδμβεκμφξ πνςηεμθοηζηήξ δναζηδνζυηδηαξ ηςκ ηοηηάνςκ αοηχκ (Kanost et al. 2004), υπςξ ζοιααίκεζ ηαζ ζε ηοηηανζηέξ ζεζνέξ εδθαζηζηχκ (Jones and Stewart 2004). Παναηδνμφιε θμζπυκ, υηζ μνζζιέκα εναφζιαηα ηδξ FAK ζοβηαηαηνδικίγμκηαζ ιε ηδκ ERK ή ηδ p Thr202/Tyr204 ERK, εκχ άθθα υπζ. Σμ ίδζμ απμηέθεζια πνμέηορε ηαζ ιε ηδ p Tyr397 FAK. A

88 B Γηθυκα 53 : Δηενεφκεζε ζομπιμθμπμίεζεξ ηεξ FAK θαη ηεξ ERK ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata. Γκαηχνεμα αημμθοηηάνςκ απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ, θαιιηενγήζεθακ απμοζία ή πανμοζία E. coli, ιφζεθακ θαη αθμιμφζεζε ακμζμθαηαθνήμκηζε με πμιοθιςκηθά ακηηζχμαηα έκακηη ηςκ ERK θαη p Thr202/Tyr204 ERK. Πα ακμζμσδήμαηα ακαιφζεθακ ζε 10% SDS-PAGE θαη ζηε ζοκέπεηα, έγηκε ακμζμαπμηφπςζε γηα ηεκ μιηθή FAK (Α) θαη ηε p Tyr397 FAK (Β). οκμρίγμκηαξ θμζπυκ ηα παναπάκς απμηεθέζιαηα, πανμοζία E. coli, δ FAK ηαζ δ ERK θςζθμνοθζχκμκηαζ, ζοκεκημπίγμκηαζ ηαζ ζοιπθμημπμζμφκηαζ. Διερεύνηση συνεντοπισμού και συμπλοκοποίησης των FAK και Elk-1. Απυ πνμδβμφιεκα πεζνάιαηα ημο ενβαζηδνίμο ιαξ είπε βίκεζ βκςζηυ υηζ μ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Elk-1 είκαζ έκαξ ηαεμνζζηζηυξ πανάβμκηαξ βζα ηδκ ηοηηανμθαβία ηδξ E. coli απυ ηα αζιμηφηηανα ηδξ ιφβαξ ηδξ Μεζμβείμο, εκχ είπε δζαπζζηςεεί ηαζ δ θεζημονβζηή ζπέζδ ημο ιε ηδκ FAK (Mamali et al. 2007). Γζ αοηυ εεθήζαιε αημθμφεςξ, κα δζενεοκήζμοιε ακ οπάνπεζ ηαζ θοζζηή δζαζφκδεζδ ηςκ δφμ πνςηεσκχκ.

89 Ανπζηά, ιε ζοκεζηζαηή ιζηνμζημπία εθέβπεδηε ακ μζ δφμ πνςηεΐκεξ ζοκεκημπίγμκηαζ. Γζ αοηυ ημ ζημπυ, αζιμηφηηανα απυ πνμκφιθεξ ημο ζηαδίμο πενζπθάκδζδξ απμιμκχεδηακ ηαζ επςάζηδηακ βζα 20 θεπηά ζε ενεπηζηυ ιέζμ Grace πανμοζία E. coli ηαζ ζηδ ζοκέπεζα, πνμζημθθήεδηακ ζε ακηζηεζιεκμθυνμοξ πθάηεξ. Σα ακηζζχιαηα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ημκ ακμζμεκημπζζιυ ήηακ πμθοηθςκζηά ακηζζχιαηα ημοκεθζμφ έκακηζ ηδξ μθζηήξ FAK ηςκ εδθαζηζηχκ ηαεχξ ηαζ ημο θςζθμνοθζςιέκμο ηθάζιαηυξ ηδξ ζηδκ ηονμζίκδ 397, εκχ ημ δεφηενμ ακηίζςια ήηακ ζογεοβιέκμ ιε ημ θεμνυπνςια Cy3 ηαζ ιμκμηθςκζηυ ακηίζςια πμκηζηζμφ έκακηζ ηδξ θςζθμνοθζςιέκδξ ιμνθήξ ημο Elk-1 ζηδ ζενίκδ 383, εκχ ημ δεφηενμ ακηίζςια είπε πνμζδειέκμ ημ θεμνυπνςια FITC (Εικόνα 54 Α, Β, Γ & Δ). Σμ παναπάκς πείναια απμηάθορε υηζ ιυκμ δ μθζηή FAK ηαζ μ p Ser383 Elk-1 ζοκεκημπίγμκηαζ ζημκ πονήκα, εκχ παναιέκεζ αηυια αδζεοηνίκζζημ ακ δ θςζθμνοθίςζδ ημο Elk-1 ζοιααίκεζ ζημ ηοηηανυπθαζια ή ζημκ πονήκα. Γζα ηεπκζημφξ θυβμοξ δεκ ιπμνμφζε κα εθεβπεεί μ ζοκεκημπζζιυξ ημο μθζημφ Elk-1 ιε ηδκ μθζηή FAK ή ηδ p Tyr397 FAK, αθμφ ηα ακηζζχιαηα πμο δζαεέηαιε βζα ηζξ παναπάκς πνςηεΐκεξ ήηακ υθα ακαπηοβιέκα ζε ημοκέθζ. ηδ ζοκέπεζα, δζενεοκήεδηε ιε ακμζμηαηαηνήικζζδ ηαζ ακάθοζδ ηαηά Western ακ μζ δφμ παναπάκς πνςηεΐκεξ ζοιπθμημπμζμφκηαζ. Έπεζηα απυ ακμζμηαηαηνήικζζδ ηδξ μθζηήξ FAK ηαζ ηδξ p Tyr397 FAK απυ πνςηεσκζηυ εηπφθζζια αζιμηοηηάνςκ ηα μπμία είπακ πνμδβμοιέκςξ επςαζηεί απμοζία ή πανμοζία E. coli (Εικόνα 55 Α, Β & Γ), θάκδηε υηζ πνάβιαηζ μ Elk-1 ζοβηαηαηνδικίγεηαζ ιε ηδκ μθζηή FAK πανμοζία E. coli υπζ υιςξ ηαζ ιε ηδ p Tyr397 FAK. Δπίζδξ, μ p Ser383 Elk-1 ζοβηαηαηνδικίγεηαζ ιε ηδκ μθζηή FAK υπζ υιςξ ηαζ ιε ηδ p Tyr397 FAK. Η αθθδθεπίδναζδ ηδξ FAK ιε ημκ Elk-1 επζαεααζχεδηε ιε ακηίζηνμθδ ακμζμζοβηαηαηνήικζζδ, δδθαδή ιε ακμζμηαηαηνήικζζδ ημο Elk-1 ηαζ ημο p Ser383 Elk-1 ηαζ ακάθοζδ ηαηά Western βζα ηδκ μθζηή FAK (Εικόνα 55 Δ). Καζ ζε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ ακζπκεφεδηακ πμθθέξ πεπηζδζηέξ γχκεξ παιδθμφ ιμνζαημφ αάνμοξ (23, 30, 33, 35, 58, 63, 68, 71, 80 kda), εκχ δεκ ακζπκεφεδηε FAK πθήνμοξ ιμνζαημφ αάνμοξ. οκεπχξ, ηα παναπάκς απμηεθέζιαηα οπμζηδνίγμοκ ζεεκανά υηζ μ Elk-1 ζοιπθμημπμζείηαζ ιε ηδκ FAK πανμοζία E. coli, υηακ υιςξ θςζθμνοθζχκεηαζ δ FAK ζηδκ ηονμζίκδ 397 παφεζ ημ ζφιπθμημ αοηυ κα οθίζηαηαζ. Σμ εφνδια αοηυ είκαζ πμθφ ζδιακηζηυ αθμφ δζεονφκεζ ημ πεδίμ δνάζδξ ηδξ FAK.

90 Α Β Γ Γ Γηθυκα 54 : Δηενεφκεζε ζοκεκημπηζμμφ ηεξ FAK ή ηεξ p Tyr397 FAK με ημκ p Ser383 Elk-1 ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata. Αημμθφηηανα απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ θαη θαιιηενγήζεθακ απμοζία (Α & Γ) ή πανμοζία (Β & Δ) E. coli, πνμζθμιιήζεθακ ζε ακηηθεημεκμθυνμοξ πιάθεξ θαη ζεμάκζεθακ με ακηηζχμαηα έκακηη ηεξ FAK (Α & Β) ή ηεξ p Tyr397 FAK (Γ & Δ) με ημκ p Ser383 Elk-1. Μη θςημγναθίεξ πνμένπμκηαη απυ ηεκ πιήνε πνμβμιή (full projection) ηςκ μπηηθχκ ημμχκ.

91 A B Γ Γ Γηθυκα 55 : Δηενεφκεζε ζομπιμθμπμίεζεξ ηεξ FAK θαη ημο Elk-1 ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata. Γκαηχνεμα αημμθοηηάνςκ απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ, θαιιηενγήζεθακ απμοζία ή πανμοζία E. coli, ιφζεθακ θαη αθμιμφζεζε ακμζμθαηαθνήμκηζε με πμιοθιςκηθά ακηηζχμαηα έκακηη ηςκ FAK θαη p Tyr397 FAK (Α, Β & Γ) ή Elk-1 θαη p Ser383 Elk-1 (Δ). Πα ακμζμσδήμαηα ακαιφζεθακ ζε 10% SDS-PAGE θαη ζηε ζοκέπεηα, έγηκε ακμζμαπμηφπςζε γηα ημκ Elk-1 (Α), ημκ p Ser383 Elk-1 (Β & Γ) θαη ηεκ FAK (Δ).

92 Διερεύνηση συνεντοπισμού και συμπλοκοποίησης των ERK και Elk-1. Όπςξ ακαθένεδηε ηαζ ζηδκ εζζαβςβή, μ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Elk-1 απμηεθεί οπυζηνςια ηαζ βζα ηζξ ηνεζξ MAPKs, αθμφ ακαζηέθθμκηαξ ηζξ ηεθεοηαίεξ ιε εζδζημφξ ακαζημθείξ (PD ή U0126 γηα ηελ ERK, SB γηα ηελ p38 θαη SP γηα ηελ JNK) ιεζχκεηαζ ηαζ δ θςζθμνοθίςζδ ημο Elk-1 (Mamali et al. 2007). Γζ αοηυ απμθαζίζαιε, ζηδ ζοκέπεζα, κα ιεθεηήζμοιε ακ μ Elk-1 ζοιπθμημπμζείηαζ ιε ηζξ MAPKs ηαζ ζοβηεηνζιέκα ιε ηδκ ERK. Ανπζηά, ιε ζοκεζηζαηή ιζηνμζημπία εθέβπεδηε ακ μζ δφμ πνςηεΐκεξ ζοκεκημπίγμκηαζ. Γζ αοηυ ημ ζημπυ, αζιμηφηηανα απυ πνμκφιθεξ ημο ζηαδίμο πενζπθάκδζδξ απμιμκχεδηακ ηαζ επςάζηδηακ βζα 20 θεπηά ζε ενεπηζηυ ιέζμ Grace πανμοζία E. coli ηαζ ζηδ ζοκέπεζα, πνμζημθθήεδηακ ζε ακηζηεζιεκμθυνμοξ πθάηεξ. Σα ακηζζχιαηα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ημκ ακμζμεκημπζζιυ ήηακ πμθοηθςκζηά ακηζζχιαηα ημοκεθζμφ έκακηζ ηδξ μθζηήξ ERK ηςκ εδθαζηζηχκ ηαεχξ ηαζ ηδξ δζπθά θςζθμνοθζςιέκδξ ιμνθήξ ηδξ ζηδ ενεμκίκδ 202 ηαζ ηδκ ηονμζίκδ 204, εκχ ημ δεφηενμ ακηίζςια ήηακ ζογεοβιέκμ ιε ημ θεμνυπνςια Cy3 ηαζ ιμκμηθςκζηυ ακηίζςια πμκηζηζμφ έκακηζ ηδξ θςζθμνοθζςιέκδξ ιμνθήξ ημο Elk-1 ζηδ ζενίκδ 383, εκχ ημ δεφηενμ ακηίζςια είπε πνμζδειέκμ ημ θεμνυπνςια FITC. Όζμκ αθμνά ζηδκ μθζηή ERK ηαζ ημκ p Ser383 Elk-1 (Εικόνα 56 Α, Β, Γ & Δ), παναηδνμφιε υηζ οπάνπεζ έκαξ ιζηνμφ ααειμφ ζοκεκημπζζιυξ ηςκ δφμ πνςηεσκχκ ζηδκ πενζθένεζα ημο ηοηηάνμο, εκχ δ p Thr202/Tyr204 ERK ζοκεκημπίγεηαζ ιε ημκ p Ser383 Elk-1 ζημκ πονήκα (Εικόνα 57 Α, Β, Γ & Δ). Γζα ηεπκζημφξ θυβμοξ δεκ ιπμνμφζε κα εθεβπεεί μ ζοκεκημπζζιυξ ημο μθζημφ Elk-1 ιε ηδκ μθζηή ERK ή ηδ p Thr202/Tyr204 ERK, αθμφ ηα ακηζζχιαηα πμο δζαεέηαιε βζα ηζξ παναπάκς πνςηεΐκεξ ήηακ υθα ακαπηοβιέκα ζε ημοκέθζ. Σέθμξ, δζενεοκήεδηε ιε ακμζμηαηαηνήικζζδ ηαζ ακάθοζδ ηαηά Western ακ μζ δφμ παναπάκς πνςηεΐκεξ ζοιπθμημπμζμφκηαζ. Έπεζηα απυ ακμζμηαηαηνήικζζδ ηδξ μθζηήξ ERK ηαζ ηδξ p Thr202/Tyr204 ERK απυ πνςηεσκζηυ εηπφθζζια αζιμηοηηάνςκ πμο είπακ πνμδβμοιέκςξ επςαζηεί απμοζία ή πανμοζία E. coli (Εικόνα 58 Α & Β), θάκδηε υηζ μ Elk-1 δε ζοβηαηαηνδικίγεηαζ. Γεδμιέκμο υηζ ημ ακηίζςια έκακηζ ημο Elk-1 ακαβκςνίγεζ ηαζ ηδ θςζθμνοθζςιέκδ ημο ιμνθή ιπμνμφιε κα ζοιπενάκμοιε υηζ μφηε μ p Ser383 Elk-1 ζοβηαηαηνδικίγεηαζ ιε ηδκ ERK ή ηδ p Thr202/Tyr204 ERK.

93 A Β Γ Γ Γηθυκα 56 : Δηενεφκεζε ζοκεκημπηζμμφ ηεξ ERK θαη ηoο p Ser383 Elk-1 ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata. Αημμθφηηανα απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ θαη θαιιηενγήζεθακ απμοζία (Α & Γ) ή πανμοζία (Β & Δ) E. coli, πνμζθμιιήζεθακ ζε ακηηθεημεκμθυνμοξ πιάθεξ θαη ζεμάκζεθακ με ακηηζχμαηα έκακηη ηεξ ERK θαη ημο p Ser383 Elk-1. Μη θςημγναθίεξ Α θαη Β πνμένπμκηαη απυ ηεκ πιήνε πνμβμιή (full projection) ηςκ μπηηθχκ ημμχκ, εκχ μη θςημγναθίεξ Γ θαη Δ πνμένπμκηαη απυ μπηηθέξ ημμέξ πμο δηένπμκηαη απυ ημκ πονήκα ηςκ αημμθοηηάνςκ.

94 A Β Γ Γηθυκα 57 : Δηενεφκεζε ζοκεκημπηζμμφ ηεξ p Thr202/Tyr204 ERK θαη ηoο p Ser383 Elk-1 ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata. Αημμθφηηανα απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ θαη θαιιηενγήζεθακ απμοζία (Α & Γ) ή πανμοζία (Β & Δ) E. coli, πνμζθμιιήζεθακ ζε ακηηθεημεκμθυνμοξ πιάθεξ θαη ζεμάκζεθακ με ακηηζχμαηα έκακηη ηεξ p Thr202/Tyr204 ERK θαη ημο p Ser383 Elk-1. Μη θςημγναθίεξ Α θαη Β πνμένπμκηαη απυ ηεκ πιήνε πνμβμιή (full projection) ηςκ μπηηθχκ ημμχκ, εκχ μη θςημγναθίεξ Γ θαη Δ πνμένπμκηαη απυ μπηηθέξ ημμέξ πμο δηένπμκηαη απυ ημκ πονήκα ηςκ αημμθοηηάνςκ. Γ

95 Α Β Γηθυκα 58 : Δηενεφκεζε ζομπιμθμπμίεζεξ ηεξ ERK θαη ημο Elk-1 ζηα αημμθφηηανα ηεξ C. capitata. Γκαηχνεμα αημμθοηηάνςκ απυ πνμκφμθεξ ημο ζηαδίμο πενηπιάκεζεξ απμμμκχζεθακ, θαιιηενγήζεθακ απμοζία ή πανμοζία E. coli, ιφζεθακ θαη αθμιμφζεζε ακμζμθαηαθνήμκηζε με πμιοθιςκηθά ακηηζχμαηα έκακηη ηςκ ERK θαη p Thr202/Tyr204 ERK. Πα ακμζμσδήμαηα ακαιφζεθακ ζε 10% SDS-PAGE θαη ζηε ζοκέπεηα, έγηκε ακμζμαπμηφπςζε γηα ημκ Elk-1 (Α & B). οκεπχξ, ηα παναπάκς απμηεθέζιαηα οπμζηδνίγμοκ υηζ μ Elk-1, παν υθμ πμο ζοκεκημπίγεηαζ ιε ηδκ ERK ηαζ ηδ p Thr202/Tyr204 ERK πανμοζία E. coli, δε θαίκεηαζ κα ζοιπθμημπμζείηαζ ιε αοηέξ ή ημοθάπζζημκ δεκ ιπμνμφιε ειείξ κα ημ δζαηνίκμοιε υπςξ εα ζογδηδεεί παναηάης.

96

97 ΤΔΕΣΕΕ Γεδμιέκμο υηζ ζηα έκημια ηαζ ζηα εδθαζηζηά μζ ιδπακζζιμί άιοκαξ είκαζ ανηεηά ζοκηδνδιέκμζ, εα πνέπεζ κα δεπεμφιε υηζ ηα εκδμηοηηανζηά ζδιαημδμηζηά ιμκμπάηζα πμο πνδζζιμπμζμφκ ηαηά ηδκ ηοηηανμθαβία είκαζ επίζδξ ζοκηδνδιέκα. διαημδμηζηά βεβμκυηα πμο έπμοκ ιεθεηδεεί ανηεηά ζηα θεοημηφηηανα ηςκ εδθαζηζηχκ, αθθά ηαζ ζηα αζιμηφηηανα ηςκ εκηυιςκ ζοζπεηίγμοκ ηδκ FAK ιε ηζξ MAPKs. Η FAK, υπςξ πνμακαθένεδηε, δέπεηαζ ζήιαηα απυ αολδηζημφξ πανάβμκηεξ ηαζ ζκηεβηνίκεξ πμο ανίζημκηαζ ζηδκ ηοηηανζηή ιειανάκδ (Sieg et al. 2000), ηαζ ηα ιεηααζαάγεζ ζε άθθα εκδμηοηηανζηά ζδιαημδμηζηά ιυνζα (Schlaepfer et al. 1994). Δπίζδξ, είκαζ βκςζηυ υηζ ιεηάβεζ ζήιαηα ηαηά ηδκ ηοηηανμθαβία ζηα αζιμηφηηανα ηδξ C. capitata ηαζ ηδκ απυπηςζδ ζηδκ ακενχπζκδ ηοηηανζηή ζεζνά ΗΚ-2 (Lamprou et al. 2007, Mamali et al. 2007, Mamali et al. 2008). Δπζπνμζεέηςξ, δ εκενβμπμίδζδ ηςκ μδχκ ηςκ MAPKs ηαηά ηδκ ηοηηανμθαβία είκαζ ανηεηά ζοκηδνδιέκδ ηυζμ ζε ζοζηήιαηα εδθαζηζηχκ (Yamamori et al. 2000, Leverrier and Ridley 2001) υζμ ηαζ ζηα αζιμηφηηανα ηςκ εκηυιςκ (Lamprou et al. 2007). Σα απμηεθέζιαηα πμο πανμοζζάζηδηακ παναπάκς πνμέηορακ απυ ιία ιεθέηδ, δ μπμία είπε ηφνζμ ζηυπμ ηδ δζενεφκδζδ ημο ηνυπμο αθθδθεπίδναζδξ ηςκ ζδιαημδμηζηχκ ιμνίςκ ηα μπμία ζοιιεηέπμοκ ζημ ιμκμπάηζ πμο μδδβεί ζηδκ ηοηηανμθαβία ηδξ E. coli απυ ηα αζιμηφηηανα ηδξ C. capitata. Ανπζηά, πεζνάιαηα ακμζμεκημπζζιμφ πνςηεσκχκ ιε ζοκεζηζαηή ιζηνμζημπία θεμνζζιμφ έδεζλακ ηδκ ηαηακμιή ηςκ FAK, ERK ηαζ Elk-1, ηαεχξ ηαζ ηςκ θςζθμνοθζςιέκςκ ηαζ ζοκάια εκενβμπμζδιέκςκ ιμνθχκ ημοξ απμοζία ή/ηαζ πανμοζία E. coli. Παναηδνήεδηε θμζπυκ, υηζ δ FAK ηαηακέιεηαζ μιμζυιμνθα ζε υθμ ημ ηφηηανμ, εκχ δ πανμοζία ηδξ E. coli μδδβεί ζηδ θςζθμνοθίςζδ ηαζ ηαη επέηηαζδ ζηδκ εκενβμπμίδζδ ηδξ FAK ηαζ ηδ ζηαδζαηή ιεηαηυπζζή ηδξ ζημκ πονήκα. Σμ ίδζμ θάκδηε κα ζζπφεζ ηαζ βζα ηδκ ERK, δ μπμία πνεζάγεηαζ κα θςζθμνοθζςεεί δζπθά (ζηε ζξενλίλε 202 θαη ηελ ηπξνζίλε 204) πνμηεζιέκμο κα εκενβμπμζδεεί, μπυηε αημθμφεςξ είηε θςζθμνοθζχκεζ ηοηηανμπθαζιαηζηά οπμζηνχιαηα είηε εζζένπεηαζ ζημκ πονήκα βζα κα θςζθμνοθζχζεζ πονδκζηά οπμζηνχιαηά ηδξ. Έκα ηοηηανμπθαζιαηζηυ οπυζηνςιά ηδξ, ηαζ υπζ πονδκζηυ υπςξ εεςνείημ ηα ηεθεοηαία πνυκζα, είκαζ ηαζ μ ιεηαβναθζηυξ πανάβμκηαξ Elk-1, μ μπμίμξ θαίκεηαζ κα απμηεθεί έκα ζδιακηζηυ ζοκδεηζηυ ζημζπείμ ημο ιμκμπαηζμφ ηςκ MAPKs βζα ηδ ιεηαβςβή ιδκοιάηςκ απυ ηδκ επζθάκεζα ημο ηοηηάνμο ζημκ πονήκα, αθμφ υηακ θςζθμνοθζχκεηαζ, εκενβμπμζείηαζ ηαζ εζζένπεηαζ ζημκ πονήκα πνμηεζιέκμο κα ζπδιαηίζεζ ηνζιενέξ ζφιπθμημ ιε ημκ SRF ηαζ κα νοειίζεζ

98 ηδκ έηθναζδ ηςκ απαναίηδηςκ ηάεε θμνά βμκζδίςκ πμο μδδβμφκ ζε ζοβηεηνζιέκεξ απμηνίζεζξ (Graves and Petersen 1998, Sharrocks 2001). Αημθμφεςξ, ιε ζοκεζηζαηή ιζηνμζημπία θάκδηε υηζ μζ πνςηεΐκεξ FAK ηαζ ERK, αθμφ θςζθμνοθζςεμφκ πανμοζία E. coli, ζοκεκημπίγμκηαζ ζηδκ πενζθένεζα ημο ηοηηάνμο. Βζμπδιζηά απμηεθέζιαηα έδεζλακ υηζ δ FAK πνςηεμθφεηαζ εκδμηοηηανζηά ηαζ μνζζιέκα εναφζιαηά ηδξ ζοιπθμημπμζμφκηαζ ιε ηδκ ERK ηαζ ηδ p Thr202/Tyr204 ERK, εκχ άθθα υπζ. Σμ ίδζμ απμηέθεζια πνμέηορε ηαζ βζα ηδ p Tyr397 FAK. Δπεζδή υιςξ ηα ακηζζχιαηα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ έκακηζ ηςκ FAK ηαζ ERK ακαβκςνίγμοκ ηαζ ηζξ θςζθμνοθζςιέκεξ ημοξ ιμνθέξ, δ ζοιπθμημπμίδζδ πμο θαίκεηαζ ζηα ζοβηεηνζιέκα ακμζμσγήιαηα πζεακχξ κα είκαζ ρεοδήξ ηαζ κα μθείθεηαζ ζηδκ εκενβμπμίδζδ ηςκ πνςηεσκχκ απυ άθθδ αζηία. Δπυιεκα πεζνάιαηα ιε ακηζζχιαηα έκακηζ ηςκ ιδ θςζθμνοθζςιέκςκ ιμνθχκ ηςκ παναπάκς πνςηεσκχκ ίζςξ κα δζεοηνζκίζμοκ πενζζζυηενμ ηδκ ηαηάζηαζδ. Πνμζθάηςξ, ιε ηδ πνήζδ dsrna βζα ηδκ FAK είπαιε δείλεζ υηζ δ ηαηαζημθή ηδξ έηθναζδξ ηδξ FAK μδδβεί ζηδ ιείςζδ ηδξ θςζθμνοθίςζδξ ημο Elk-1, εκχ ιε πεζνάιαηα ςζιςηζηήξ πνυζθδρδξ ηαζ πνδζζιμπμζχκηαξ ακηίζςια έκακηζ ημο Elk-1 είπε απμδεζπεεί υηζ δ ηοηηανμθαβία ηδξ E. coli ελανηάηαζ απυ ημκ Elk-1 (Mamali et al. 2007). Γζ αοηυ εεθήζαιε κα δείλμοιε εηηυξ ηδξ θεζημονβζηήξ ζπέζδξ ηςκ δφμ ιμνίςκ ηαζ ηδ θοζζηή ημοξ ζφκδεζδ. Έηζζ, ιε ζοκεζηζαηή ιζηνμζημπία απμηαθφθεδηε υηζ ιυκμ δ μθζηή FAK ζοκεκημπίγεηαζ ιε ημκ Elk-1 ηαζ ημκ p Ser383 Elk-1 πανμοζία E. coli ηαζ ιυκμ ζημκ πονήκα, εκχ ημ απμηέθεζια αοηυ επζαεααζχεδηε ηαζ αζμπδιζηά ιε ακμζμηαηαηνήικζζδ. Γεδμιέκςκ ηςκ παναπάκς απμηεθεζιάηςκ ηαεχξ ηαζ ημο υηζ ιυκμ αιζκμηεθζηά εναφζιαηα ηδξ FAK εζζένπμκηαζ ζημκ πονήκα ζε ανηεηέξ δζαθμνεηζηέξ ηοηηανζηέξ ζεζνέξ εδθαζηζηχκ (Lobo and Zachary 2000, Jones et al. 2001, Jones and Stewart 2004), εα ιπμνμφζαιε κα ζοιπενάκμοιε υηζ μ Elk-1 ζοιπθμημπμζείηαζ ιε ηδκ FAK πανμοζία E. coli, υηακ υιςξ θςζθμνοθζχκεηαζ δ FAK ζηδκ ηονμζίκδ 397 παφεζ ημ ζφιπθμημ αοηυ κα οθίζηαηαζ. Μία άθθδ υιςξ οπυεεζδ, πζμ θμβζηή, είκαζ εηείκδ πμο οπμζηδνίγεζ υηζ, θυβς ηδξ πνςηευθοζδξ ηδξ FAK πμο ζοιααίκεζ ιέζα ζημ ηφηηανμ, ίζςξ κα απμιαηνφκεηαζ δ πενζμπή πμο θένεζ ηδ θςζθμνοθζςιέκδ ηονμζίκδ 397, εκχ μ Elk-1 κα παναιέκεζ πνμζδειέκμξ ζε άθθμ εναφζια ηδξ FAK. Ίζςξ δδθαδή, κα ζοκεπίγεζ κα οθίζηαηαζ ημ ζφιπθμημ αθθά κα ιδκ είκαζ εθζηηυ κα δζαηνζεεί. Βέααζα, ίζςξ κα οπάνπμοκ ηαζ εθεφεενα εναφζιαηα ηδξ FAK, ηα μπμία κα εζζένπμκηαζ ζημκ πονήκα ηαζ κα έπμοκ δζαθμνεηζηή θεζημονβία. Δπυιεκα πεζνάιαηα ιε ακηζζχιαηα έκακηζ ιμνθχκ ηδξ FAK θςζθμνοθζςιέκςκ ζε δζαθμνεηζηέξ εέζεζξ ίζςξ κα δχζμοκ πενζζζυηενεξ απακηήζεζξ ζηα ενςηήιαηα πμο βεκκχκηαζ. Σέθμξ, εθυζμκ δ FAK ζοιπθμημπμζείηαζ ιε ηδκ ERK ηαζ ιε ημκ Elk-1 ηαζ βκςνίγμκηαξ υηζ μ Elk-1 απμηεθεί οπυζηνςια ηδξ ERK (Mamali et al.

99 2007), εεθήζαιε κα δζενεοκήζμοιε ακ δ ERK ζοκδέεηαζ θοζζηά ιε ημκ Elk-1. Έηζζ, ιε ζοκεζηζαηή ιζηνμζημπία θάκδηε υηζ μ p Ser383 Elk-1 ζοκεκημπίγεηαζ ιε ηδκ μθζηή ERK ζηδκ πενζθένεζα ημο ηοηηάνμο ηαζ ιε ηδ p Thr202/ Tyr204 ERK ζημκ πονήκα. Ωζηυζμ, ηα αζμπδιζηά απμηεθέζιαηα δε θαίκεηαζ κα ζοιθςκμφκ, αθμφ δε θαίκεηαζ κα ζοιπθμημπμζμφκηαζ μζ δφμ πνςηεΐκεξ. Μία οπυεεζδ, δ μπμία ιέκεζ κα επζαεααζςεεί, είκαζ υηζ δ FAK απμηεθεί έκα ζηνίςια (scaffold) ζημ μπμίμ πνμζδέκμκηαζ δζάθμνεξ πνςηεΐκεξ, μζ μπμίεξ έηζζ, ένπμκηαζ ζε επαθή ηαζ αθθδθεπζδνμφκ. Ίζςξ θυβς ηδξ πνςηευθοζδξ ηδξ FAK, μζ ERK ηαζ Elk-1 κα ανίζημκηαζ δεζιεοιέκεξ ζε δζαθμνεηζηά εναφζιαηά ηδξ ηαζ βζ αοηυ κα ιδκ ιπμνμφκ κα ζοβηαηαηνδικζζημφκ. Δπυιεκα πεζνάιαηα ιε ακηζζχιαηα έκακηζ ιμνθχκ ηδξ FAK θςζθμνοθζςιέκςκ ζε δζαθμνεηζηέξ εέζεζξ ίζςξ κα δζαθεοηάκμοκ ηδκ οπυεεζδ ηαζ κα δχζμοκ πενζζζυηενα ζημζπεία πμο εα αμδεήζμοκ ζηδκ πεναζηένς ηαηακυδζδ ηςκ ιδπακζζιχκ αοηχκ ΤΙΠΓΡΑΙΑΣΑ Οζ πνςηεΐκεξ FAK, ERK ηαζ Elk-1 ηαηακέιμκηαζ μιμζυιμνθα ζε μθυηθδνμ ημ ηφηηανμ, εκχ πανμοζία E. coli θςζθμνοθζχκμκηαζ ηαζ ζηαδζαηά μδδβμφκηαζ ζημ εζςηενζηυ ημο πονήκα. Πανμοζία E. coli μζ FAK ηαζ ERK θςζθμνοθζχκμκηαζ, ζοκεκημπίγμκηαζ ζηδκ πενζθένεζα ημο ηοηηάνμο ηαζ ζοιπθμημπμζμφκηαζ. Πανμοζία E. coli ιυκμ δ μθζηή FAK ζοκεκημπίγεηαζ ζημκ πονήκα ηαζ ζοιπθμημπμζείηαζ ιε ημκ Elk-1 ηαζ ημκ p Ser383 Elk-1. Παν υθμ πμο μ Elk-1 ζοκεκημπίγεηαζ ιε ηδκ μθζηή ERK ηαζ ηδ p Thr202/ Tyr204 ERK πανμοζία E. coli, δε θαίκεηαζ κα ζοιπθμημπμζείηαζ ιε αοηέξ. Δίκαζ πζεακυκ υηζ δ ERK ηαζ μ Elk-1 δζαζοκδέμκηαζ θοζζηά δζαιέζμο ηδξ FAK, δ μπμία υιςξ πνςηεμθφεηαζ ιε απμηέθεζια μζ ERK ηαζ Elk-1 κα ανίζημκηαζ δεζιεοιέκεξ ζε δζαθμνεηζηά εναφζιαηα ηδξ FAK ηαζ βζ αοηυ κα ιδ ζοβηαηαηνδικίγμκηαζ.

100