ΑΡΗΣΟΣΔΛΔΗΟ ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΘΔΑΛΟΝΗΚΖ ΥΟΛΖ ΘΔΣΗΚΩΝ ΔΠΗΣΖΜΩΝ ΣΜΖΜΑ ΥΖΜΔΗΑ ΜΔΣΑΠΣΤΥΗΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΠΟΤΓΩΝ BΗΟΥΖΜΔΗΑ ΓΗΠΛΩΜΑΣΗΚΖ ΔΡΓΑΗΑ

Transcript

1 ΑΡΗΣΟΣΔΛΔΗΟ ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΘΔΑΛΟΝΗΚΖ ΥΟΛΖ ΘΔΣΗΚΩΝ ΔΠΗΣΖΜΩΝ ΣΜΖΜΑ ΥΖΜΔΗΑ ΜΔΣΑΠΣΤΥΗΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΠΟΤΓΩΝ BΗΟΥΖΜΔΗΑ ΓΗΠΛΩΜΑΣΗΚΖ ΔΡΓΑΗΑ ΡΑΜΝΟΛΗΠΗΓΗΑ ΚΑΗ ΑΛΛΟΗ ΜΟΛΤΜΑΣΗΚΟΗ ΠΑΡΑΓΟΝΣΔ ΒΑΚΣΖΡΗΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΖ ΑΝΣΗΩΜΑΣΩΝ ΔΝΑΝΣΗ ΡΑΜΝΟΛΗΠΗΓΗΩΝ ΓΗΑΓΚΑ ΓΖΜΖΣΡΗΟ, ΒΗΟΛΟΓΟ ΤΠΔΤΘΤΝΖ: ΔΠΗΚ.ΚΑΘ. Α. ΠΑΝΣΑΕΑΚΖ ΘΔΑΛΟΝΗΚΖ 2013

2 ΑΡΗΣΟΣΔΛΔΗΟ ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΘΔΑΛΟΝΗΚΖ ΥΟΛΖ ΘΔΣΗΚΩΝ ΔΠΗΣΖΜΩΝ ΣΜΖΜΑ ΥΖΜΔΗΑ ΜΔΣΑΠΣΤΥΗΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΠΟΤΓΩΝ ΒΗΟΥΖΜΔΗΑ ΓΗΠΛΩΜΑΣΗΚΖ ΔΡΓΑΗΑ ΓΗΑΓΚΑ ΓΖΜΖΣΡΗΟ, ΒΗΟΛΟΓΟ ΡΑΜΝΟΛΗΠΗΓΗΑ ΚΑΗ ΑΛΛΟΗ ΜΟΛΤΜΑΣΗΚΟΗ ΠΑΡΑΓΟΝΣΔ ΒΑΚΣΖΡΗΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΖ ΑΝΣΗΩΜΑΣΩΝ ΔΝΑΝΣΗ ΡΑΜΝΟΛΗΠΗΓΗΩΝ εκπονήθηκε ζηο Δπγαζηήπιο Βιοσημείαρ ηος Σομέα Οπγανικήρ Υημείαρ και Βιοσημείαρ ηος Σμήμαηορ Υημείαρ ηος Απιζηοηελείος Πανεπιζηημίος Θεζζαλονίκηρ ΣΡΗΜΔΛΖ ΔΞΔΣΑΣΗΚΖ ΔΠΗΣΡΟΠΖ Καθηγήηπια ΘΔΟΓΩΡΑ ΥΟΛΖ ΠΑΠΑΓΟΠΟΤΛΟΤ - Μέλορ εξεηαζηικήρ επιηποπήρ Αναπλ. Καθηγηηήρ ΘΩΜΑ ΓΗΑΝΝΑΚΟΤΡΟ - Μέλορ εξεηαζηικήρ επιηποπήρ Δπικ. Καθηγήηπια ΑΝΑΣΑΗΑ ΠΑΝΣΑΕΑΚΖ - Δπιβλέποςζα Καθηγήηπια Ζ ηπιμελήρ εξεηαζηική επιηποπή πος οπίζηηκε ζύμθωνα με ηη Γ..Δ.. 235/ , για ηην κπίζη ηηρ Γιπλωμαηικήρ Δπγαζίαρ ηος Γιάγκα Γημηηπίος, Βιολόγος, ζςνήλθε ζε ζςνεδπίαζη ζηο Απιζηοηέλειο Πανεπιζηήμιο Θεζζαλονίκηρ ηην 07/02/2013, όπος παπακολούθηζε ηην ςποζηήπιξη ηηρ επγαζίαρ με ηίηλο ΡΑΜΝΟΛΗΠΗΓΗΑ ΚΑΗ ΑΛΛΟΗ ΜΟΛΤΜΑΣΗΚΟΗ ΠΑΡΑΓΟΝΣΔ ΒΑΚΣΖΡΗΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΖ ΑΝΣΗΩΜΑΣΩΝ ΔΝΑΝΣΗ ΡΑΜΝΟΛΗΠΗΓΗΩΝ και ηην ενέκπινε με βαθμό 10

3 ΠΡΟΛΟΓΟ Ζ πανμφζα ιεηαπηοπζαηή δζπθςιαηζηή ενβαζία πναβιαημπμζήεδηε ζημ Δνβαζηήνζμ Βζμπδιείαξ ημο Σμιέα Ονβακζηήξ Υδιείαξ ηαζ Βζμπδιείαξ ημο ηιήιαημξ Υδιείαξ ημο Ανζζημηεθείμο Πακεπζζηδιίμο Θεζζαθμκίηδξ. Με ηδκ μθμηθήνςζδ ηαζ ηδκ ηαηάεεζδ ηδξ ενβαζίαξ αοηήξ, εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ζδζαίηενα ηδκ Δπίημονδ ηαεδβήηνζα η. Ακαζηαζία Πακηαγάηδ βζα ηδκ ειπζζημζφκδ πμο ιμο έδεζλε ιε ηδκ ακάεεζδ ηδξ ζοβηεηνζιέκδξ ενβαζίαξ, βζα ηδκ άνζζηδ ηαηακυδζδ ηαζ ζοκενβαζία αθθά ηαζ ηδ αμήεεζα πμο ιμο πανείπε ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ πεζναιαηζηήξ δζαδζηαζίαξ αθθά ηαζ ηαηά ηδ ζοββναθή ημο ηεζιέκμο. Δπζπθέμκ εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ηδκ Καεδβήηνζα η. Θεμδχνα Υμθή - Παπαδμπμφθμο βζα ηδ ζοιαμθή ηδξ ηαζ ηδκ ηαεμδήβδζή ηδξ ζηδ δζελαβςβή ηδξ δζπθςιαηζηήξ ιμο ενβαζίαξ. Αηυιδ εα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ημκ Ακαπθδνςηή ηαεδβδηή η. Θςιά Γζακκαημφνμ βζα ηδ ζοιιεημπή ημο ζηδκ ελέηαζδ ηδξ δζπθςιαηζηήξ ιμο ενβαζίαξ. Σέθμξ, μθείθς κα εοπανζζηήζς υθμοξ ημοξ ζοκαδέθθμοξ ιμο αθθά ηαζ ημοξ οπυθμζπμοξ ηαεδβδηέξ πμο ιε αμήεδζακ βζα ηδ δζελαβςβή αοηήξ ηδξ ενβαζίαξ ηαζ βζα ηδκ άνζζηδ ζοκενβαζία ημοξ ζημ πχνμ ημο ενβαζηδνίμο. Ηδζαίηενα μθείθς κα εοπανζζηήζς ηδ δζδάηημνα Ρδβίκδ Παπή, ημ δζδάηημνα Γημοβημοθή Γδιήηνζμ ηαζ ημκ Καεδβδηή Πακαβζςηίδδ Υνήζημ βζα ηδκ εηιάεδζδ πνήζδξ ηαζ ιεηαπείνζζδξ ηςκ πεζναιαημγχςκ ηαεχξ ηαζ ηζξ ιεηαπηοπζαηέξ θμζηήηνζεξ Βεθαθή Αζηαηενίκδ ηαζ Σζζημονμφδδ Φακή βζα ηδ αμήεεζά ημοξ ζηζξ ηεπκζηέξ ημο πνμζδζμνζζιμφ ηςκ θςζθμνζηχκ, ηδξ απμιυκςζδξ ημο πενζπθάζιαημξ ηςκ ααηηδνίςκ ηαεχξ ηαζ ηδξ ακμζμαπμηφπςζδξ.

4 ΠΔΡΗΔΥΟΜΔΝΑ ΔΗΑΓΧΓΖ 1. Βαηηήνζα Τhermus thermophilus Escherichia coli 3 2. Ραικμθζπίδζα Γμιή ναικμθζπζδίςκ Βζμζφκεεζδ ναικμθζπζδίςκ Βζμζφκεεζδ ημο θζπζδζαημφ ιένμοξ ηςκ ναικμθζπζδίςκ Βζμζφκεεζδ ημο βθοημκζημφ ιένμοξ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ηάδζα αζμζφκεεζδξ ναικμθζπζδίςκ Γεκεηζηή νφειζζδ ηδξ αζμζφκεεζδξ ηςκ ναικμθζπζδίςκ Γνάζεζξ ναικμθζπζδίςκ Ραικμθζπίδζα ηαζ αζμθίθι Ραικμθζπίδζα ηαζ αζιυθοζδ Ραικμθζπίδζα - ιμθοζιαηζημί πανάβμκηεξ Ραικμθζπίδζα ςξ αζμεπζθακεζμδναζηζηέξ μοζίεξ Δθανιμβέξ Ραικμθζπζδίςκ Πενζααθθμκηζηυξ Καεανζζιυξ Αζζεδηζηή Καθθοκηζηά Βζμσαηνζηή Δθαζηάζδ Γμιή Βζμζφκεεζδ εθαζηάζδξ Γνάζεζξ ηδξ εθαζηάζδξ Ραικμθζπίδζα ηαζ Δθαζηάζδ Πομηοακίκδ Γμιή Βζμζφκεεζδ πομηοακίκδξ Γνάζεζξ ηδξ πομηοακίκδξ Ραικμθζπίδζα ηαζ Πομηοακίκδ 32 ΤΛΗΚΑ ΚΑΗ ΜΔΘΟΓΟΗ 1. Δπζθμβή ιζηνμμνβακζζιμφ Ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζε Κακμκζηυ Μέζμ Ακάπηολδξ 33

5 3. Ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli ζε Kακμκζηυ Mέζμ Aκάπηολδξ Ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζε Σνμπμπμζδιέκμ Μέζμ Ακάπηολδξ (Μέζμ Δθαπίζηςκ Θνεπηζηχκ οζηαηζηχκ) Ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ E. Coli ζε Σνμπμπμζδιέκμ Μέζμ Ακάπηολδξ (Μέζμ Δθαπίζηςκ Θνεπηζηχκ οζηαηζηχκ) Λήρδ ναικμθζπζδίςκ απυ ηζξ οβνέξ ηαθθζένβεζεξ Δηπφθζζδ ναικμθζπζδίςκ απυ ημ δζάθοια Πμζμηζημπμίδζδ ναικμθζπζδίςκ ιε ηδκ ακηίδναζδ μνηζκυθδξ Σαοημπμίδζδ ναικμθζπζδίςκ ιε πνςιαημβναθία θεπηήξ ζημζαάδαξ (TLC) Πνμζδζμνζζιυξ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ απυ ηζξ οβνέξ ηαθθζένβεζεξ (Μέεμδμξ Fiske-Subarow) Ακίπκεοζδ πομηοακίκδξ ζε οβνέξ ηαθθζένβεζεξ Απμιυκςζδ πενζπθάζιαημξ Δπίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ [PO 4 ] ζηδκ πνμζηυθθδζδ ηοηηάνςκ Δπίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ [PO 4 ] ηαζ ηδξ εθαζηίκδξ ζηδκ πνμζηυθθδζδ ηοηηάνςκ Δπίδναζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ζε ζοκάνηδζδ ιε ηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ θςζθμνζηχκ [PO 4 ] ζηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli SDS Ζθεηηνμθυνδζδ πμθοαηνοθαιζδίμο πνςηεσκχκ Υνχζδ ιε ιπθε ηδξ ημοιάζδξ (coomasie brilliant blue) Υνχζδ ιε κζηνζηυ άνβονμ Γμηζιαζία γςηζηυηδηαξ ααηηδνίςκ E. coli ιε ηδ πνήζδ ναικμθζπζδίςκ Γμηζιαζία αζιυθοζδξ ενοενμηοηηάνςκ ημοκεθζμφ ιε ηδ πνήζδ ναικμθζπζδίςκ Ακμζμπμίδζδ ημοκεθζμφ ιε δζάθοια ναικμθζπζδίςκ Ακμζμαπμηφπςζδ - Γμηζιαζία Κδθίδαξ (Dot Blot) Ζθεηηνμιεηαθμνά πνςηεσκχκ ζε ιειανάκδ ηαζ Ακμζμαπμηφπςζδ (Western Blot) 50 ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ 1. Παναβςβή ναικμθζπζδίςκ απυ ηα ααηηήνζα T. thermophilus ζε πδβέξ άκεναηα: ζμβζέθαζμ, ηαπνμσηυ μλφ ηαζ βθοηενυθδ 52

6 2. Παναβςβή ναικμθζπζδίςκ απυ ηα ααηηήνζα T. thermophilus ιε ιεηααμθή ηδξ ζοβηέκηνςζδξ θςζθμνζηχκ ηαζ ιε πδβή άκεναηα βθοημκζηυ κάηνζμ Δπίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ θςζθμνζηχκ ζηδκ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ ζε ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ T. thermophilus Ακίπκεοζδ πομηοακίκδξ ζε ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ T. thermophilus Ακίπκεοζδ πομηοακίκδξ ζε ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ T. thermophilus ιε πδβέξ άκεναηα: αθβζκζηυ μλφ, βθοημκζηυ κάηνζμ ηαζ μηηακμσηυ κάηνζμ Ακίπκεοζδ εθαζηάζδξ ζε ζηενεέξ ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ T. thermophilus πανμοζία εθαζηίκδξ Ακίπκεοζδ εθαζηάζδξ ζε οβνέξ ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ T. thermophilus πανμοζία εθαζηίκδξ Ακίπκεοζδ πνμζηυθθδζδξ ααηηδνίςκ T. thermophilus ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ Ακίπκεοζδ πνμζηυθθδζδξ ααηηδνίςκ T. thermophilus πανμοζία ηαζ απμοζία εθαζηίκδξ Ακίπκεοζδ ναικμθζπζδίςκ ζε ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ E. coli ιε ιεηααμθή ηδξ ζοβηέκηνςζδξ θςζθμνζηχκ Ακίπκεοζδ πνμζηυθθδζδξ ααηηδνίςκ E. coli ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ Ακίπκεοζδ θοηζηήξ δναζηζηυηδηαξ ναικμθζπζδίςκ T. thermophilus ζε αζχνδια ααηηδνίςκ E. coli Δπίδναζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ T. thermophilus ζηδκ ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli Ακίπκεοζδ πνμζηυθθδζδξ ααηηδνίςκ E. coli πανμοζία ηαζ απμοζία ναικμθζπζδίςκ T. thermophilus Ακίπκεοζδ αζιμθοηζηήξ δνάζδξ ζαπςκίκδξ ηαζ ναικμθζπζδίςκ ζε ενοενά αζιμζθαίνζα ημοκεθζμφ Ακίπκεοζδ φπανλδξ πνςηεσκχκ ζημ παναζηεφαζια ναικμθζπζδίςκ Τ. thermophilus ημ μπμίμ εβπφεδηε ζηα ημοκέθζα Ακίπκεοζδ φπανλδξ ακηζζςιάηςκ ζε μνυ ημοκεθζμφ έκακηζ ναικμθζπζδίςκ Τ. thermophilus ιε δμηζιαζία ηδθίδαξ (dot blot) Όνζμ ακίπκεοζδξ ακηζζςιάηςκ βζα ακίπκεοζδ ναικμθζπζδίςκ Τ. thermophilus ιε δμηζιαζία ηδθίδαξ (dot blot) 83

7 19. Ακίπκεοζδ ακμζμακηίδναζδξ ακηζζςιάηςκ έκακηζ θζπανχκ μλέςκ ηαζ άθθςκ μοζζχκ Ακίπκεοζδ ναικμθζπζδίςκ ζε ελςηοηηάνζμ οβνυ ηαθθζενβεζχκ T. thermophilus ηαζ E. coli ιε ηδ πνήζδ ηςκ παναπεέκηςκ ακηζζςιάηςκ 85 ΤΕΖΣΖΖ 87 ΠΔΡΗΛΖΦΖ 96 SUMMARY 97 ΒΗΒΛΗΟΓΡΑΦΗΑ 98 ΖΛΔΚΣΡΟΝΗΚΖ ΒΗΒΛΗΟΓΡΑΦΗΑ 110

8 ΔΗΑΓΧΓΖ 1. Βακηήρια Σα ααηηήνζα ακήημοκ ζημοξ πνμηανοςηζημφξ ιζηνμμνβακζζιμφξ. ημ ηοηηανυπθαζια θένμοκ ααηηδνζαηυ DNA, νζαμζχιαηα, απμηαιζεοηζηά οθζηά ηαζ άθθα ηοηηανζηά έβηθεζζηα. Γε θένμοκ πονήκα ηαζ ιζημπυκδνζα ηαζ ημ DNA ανίζηεηαζ ζημ πονδκμεζδέξ. Ζ πθαζιαηζηή ημοξ ιειανάκδ πενζαάθθεηαζ απυ ηοηηανζηυ ημίπςια. Γζαεέημοκ ιαζηίβζα ηαζ ζκίδζα πμο αμδεμφκ ζηδκ ηίκδζδ ηαζ ζηδκ πνμζηυθθδζδ. Ζ ακαπαναβςβή ημοξ βίκεηαζ ιμκμβμκζηά ιε απθή δζπμηυιδζδ. Σα ααηηήνζα είκαζ πζμ ημκηά ελεθζηηζηά ιε ηα ανπαία ααηηήνζα πανά ιε ηα εοηανοςηζημφξ μνβακζζιμφξ. 1,2 (εζηυκα 1). Δηθόλα 1: Οηθνπκεληθό θπινγελεηηθό δέληξν 1 Σα ααηηήνζα πςνίγμκηαζ ζε παεμβυκα ηαζ ιδ παεμβυκα είδδ ιε ιεβάθδ πμζηζθία ςξ πνμξ ηδ ιμνθμθμβία ηαζ ηδ θοζζμθμβία ημοξ. Τπάνπμοκ ημοθάπζζημκ 17 ιεβάθεξ μιάδεξ. Ο δζαπςνζζιυξ πνμηφπηεζ απυ ημκ οπμθμβζζιυ ηςκ θοθμβεκεηζηχκ ζπέζεςκ απυ ηδκ αθθδθμοπία ημο νζαμζςιζημφ RNA ηςκ δζαθυνςκ ααηηδνίςκ. 1,2 (εζηυκα 2).

9 Δηθόλα 2: Φπινγελεηηθό δέληξν ηωλ βαθηεξίωλ Σhermus thermophilus Σα ααηηήνζα Thermus thermophilus ακήημοκ ζηδκ ηαηδβμνία ηςκ εοααηηδνίςκ ηαζ ζοβηεηνζιέκα ζημ θφθμ ηςκ δεζκμηυηηςκ. Δίκαζ εενιυθζθα πδιεζμνβακμηνμθζηά ααηηήνζα ηα μπμία επζγμφκ ζε εενιμηναζίεξ ιέπνζ ηαζ 85 μ C. Ακήημοκ ζηδκ ηαηδβμνία ηςκ αενμαίςκ Gram-ανκδηζηχκ ααηηδνίςκ ηαζ ανίζημκηαζ ζε εενιέξ πδβέξ ηαζ ζε εενιμπίδαηεξ ιε μοδέηενμ πνμξ αθηαθζηυ πενζαάθθμκ. 1,3,4 Δηθόλα 3: Αξηζηεξά ζρεκαηηζκόο λεκαηίνπ θαη δεμηά ξάβδωλ ηωλ βαθηεξίωλ Thermus thermophilus 4

10 Σα ααηηήνζα T. thermophilus ειθακίγμκηαζ ιε ηδ ιμνθή νάαδςκ ηαζ κδιαηίςκ. Ζ ιμνθή ημοξ ελανηάηαζ απυ ηδ εενιμηναζία ηαζ απυ ημ πνυκμ ακάπηολδξ. Σα κδιάηζα ηαζ μζ νάαδμζ έπμοκ δζάιεηνμ 0,5-0,8 ιm εκχ ημ ιήημξ ιεηααάθθεηαζ απυ 5 ιε 10 ιm ζηζξ νάαδμοξ ηαζ απυ 20 ιέπνζ ηαζ ηα 200 ιm ζηα κδιάηζα. ε εενιμηναζίεξ άκς ηςκ 75 o C αθθά ηαζ ζηδ ζηαηζηή θάζδ επζηναηεί μ ζπδιαηζζιυξ κδιαηίςκ. 3,4 Σμ ζηέθεπμξ T. thermophilus ΗΒ8 απμιμκχεδηε βζα πνχηδ θμνά απυ εενιέξ πδβέξ ζηδκ Ηαπςκία, έπεζ ηίηνζκμ πνχια ηαζ ακαπηφζζεηαζ ζε εενιμηναζίεξ ιεηαλφ 47 μ C ιε 85 μ C, ιε άνζζηεξ ζοκεήηεξ ιεηαλφ 65 o C ηαζ 72 o C. To ααηηήνζμ T. thermophilus δεκ πανάβεζ εκδμζπυνζα. Γεκ έπεζ ιαζηίβζα ηαζ δεκ ειθακίγεζ ηζκδηζηυηδηα μθίζεδζδξ. 4,5,6 1.2 Escherichia coli Σα ααηηήνζα Escherichia coli ακήημοκ ζηδκ ηαηδβμνία ηςκ εοααηηδνίςκ ηαζ ζοβηεηνζιέκα ζημ θφθμ ηςκ πνςηεμααηηδνίςκ. Δίκαζ δοκδηζηά αενυαζα ανκδηζηά ηαηά Gram ααηηήνζα ηα μπμία δεκ πανάβμοκ ζπυνζα. Έπμοκ νααδυιμνθμ ζπήια (αάηζθθμζ) ιε πενίηνζπα ιαζηίβζα. Ακαπηφζζμκηαζ ζε ιζα ιεβάθδ πμζηζθία πδβχκ άκεναηα ηαζ εκένβεζαξ υπςξ ζάηπανα, αιζκμλέα, μνβακζηά μλέα ηαζ ζπάκζα έπμοκ απαζηήζεζξ βζα αολδηζημφξ πανάβμκηεξ. 1,7 Βνίζημκηαζ ζημ εκηενζηυ ζφζηδια ημο ακενχπμο ηαζ άθθςκ εενιυαζιςκ γχςκ ηαζ απμηεθμφκ ηδ θοζζμθμβζηή ιζηνμπθςνίδα βζαηί παίγμοκ ζδιακηζηυ νυθμ είηε ζηδκ παναβςβή ζδιακηζηχκ ενεπηζηχκ ζοζηαηζηχκ πμο δεκ ιπμνεί μ άκενςπμξ ή ηα γχα κα ζοκεέζμοκ απυ ιυκμζ ημοξ υπςξ ζφκεεζδ αζηαιίκδξ Κ είηε δζυηζ ζοιαάθθμοκ ζηδκ άιοκα ημο μνβακζζιμφ. 2 Δηθόλα 4: Φωηνγξαθία βαθηεξίωλ Escherichia coli κε ειεθηξνληθό κηθξνζθόπην

11 Μεηαλφ ηςκ δζαθμνεηζηχκ ζηεθεπχκ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli, οπάνπμοκ πμθθά πμο είκαζ παεμβυκα βζα ημκ άκενςπμ ηαζ βζα ηα γχα εκχ άθθα ζηεθέπδ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα αζμιδπακζηή πνήζδ. Ονζζιέκα απυ ηα παεμβυκα έπμοκ ζοζπεηζζεεί ιε δζάννμζεξ ζε ανέθδ, ιε θμζιχλεζξ ημο μονμπμζδηζημφ ζοζηήιαημξ ζε δθζηζςιέκα άημια ηαζ ζε άημια ιε ιεζςιέκδ ακηίζηαζδ ελαζηίαξ πεζνμονβζηχκ επειαάζεςκ ή έηεεζδξ ζε ζμκίγμοζεξ αηηζκμαμθίεξ, ιε θμζιχλεζξ δοζεκηενίαξ ηαζ βεκζηεοιέκμοξ πονεημφξ. Tα ζοβηεηνζιέκα ζηεθέπδ ζπδιαηίγμοκ ακηζβυκμ Κ πμο ηα δζεοημθφκεζ ζηδκ πνυζδεζδ ηαζ ζημκ απμζηζζιυ ημο θεπημφ εκηένμο, ηαεχξ ηαζ εκηενμημλίκδ πμο είκαζ οπεφεοκδ βζα ηα ζοιπηχιαηα ηδξ δζάννμζαξ Ραμνολιπίδια Σα ναικμθζπίδζα είκαζ βθοημθζπίδζα πμο πανάβμκηαζ απυ πμθθά ααηηήνζα, εηηνίκμκηαζ ζημ ελςηοηηάνζμ οβνυ ηαζ δνμοκ ηονίςξ ςξ αζμεπζθακεζμδναζηζηέξ μοζίεξ. 8,9 Σμ πνχημ ααηηήνζμ πμο ακαηαθφθεδηε υηζ πανάβεζ ναικμθζπίδζα ήηακ δ Pseudomonas pyocyanea (ζήιενα μκμιάγεηαζ Pseudomonas aeruginosa) ημ 1946 απυ ημοξ Bergstrμm, Theorell ηαζ Davide. 10,11 Ζ ηαθθζένβεζα ηδξ Pseudomonas pyocyanea πναβιαημπμζήεδηε πανμοζία βθοηυγδξ ηαζ δ ανπζηή μκμιαζία ηςκ ναικμθζπζδίςκ ήηακ πομθζπζδζαηυ μλφ ιε δμιζηέξ ιμκάδεξ ηδ L-ναικυγδ ηαζ ημ α-οδνμλοδεηακμσηυ μλφ. Ανβυηενα δζεοηνζκίζεδηε δ δμιή ημο ναικμθζπζδίμο ζηδ Pseudomonas aeruginosa απυ ημοξ Jarvis ηαζ Johnson ημ 1949 ημ μπμίμ απμηεθείηαζ απυ δφμ ναικυγεξ ηαζ δφμ α-οδνμλοδεηακμσηά μλέα πμο ζοκδέμκηαζ ιεηαλφ ημοξ έκακ εζηενζηυ δεζιυ ηαζ ιε βθοημζζδζηυ δεζιυ ζημ δζιενέξ ναικυγδξ εκχ ημ δζιενέξ ναικυγδξ πενζέπεζ 1,3-βθοημζζδζηυ δεζιυ (Rha-Rha-C 10 -C 10 ). 10,12 (εζηυκα 5) Δηθόλα 5: Γνκή ηνπ πξώηνπ ξακλνιηπηδίνπ ηεο Pseudomonas aeruginosa 13

12 Σμ 1965 ανέεδηε απυ ημοξ Edwards ηαζ Hayashi υηζ μ δεζιυξ ζημ δζιενέξ ναικυγδξ είκαζ α-1,2-βθοημζζδζηυξ δεζιυξ. 10,14 Αοηυ ήηακ ημ πνχημ ναικμθζπίδζμ πμο ανέεδηε υηζ πανάβεζ δ P. aeruginosa. Ανβυηενα, ημ 1971, ανέεδηε υηζ δ P. aeruginosa ζε ηαθθζένβεζα κ-παναθίκδξ πανάβεζ ναικμθζπίδζα ηαζ ιε έκα ιυνζμ ναικυγδξ (Rha-C 10 -C 10 ) ηα μπμία είκαζ πνυδνμια ιυνζα ηςκ ναικμθζπζδίςκ ιε δφμ ιυνζα ναικυγδξ (Rha-Rha-C 10 -C 10 ). 15 Δπζπθέμκ ημ 1976 ανέεδηακ ναικμθζπίδζα υπμο ημ 2-ΟΖ ηδξ εθεφεενδξ ναικυγδξ αηοθζχκεηαζ ιε έκα α-δεηακμσηυ μλφ. 16 Σμ 1993 ανέεδηε ζε ηαθθζένβεζεξ P. aeruginosa δ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ ιε έκα α-οδνμλοδεηακμσηυ μλφ (Rha-C 10, Rha-Rha-C 10 ). 17 (εζηυκα 6) Δηθόλα 6: Γνκή ξακλνιηπηδίωλ ηνπ βαθηεξίνπ Pseudomonas aeruginosa 13 Σμ 1990 ανέεδηε ζε ηαθθζένβεζεξ P. aeruginosa δ παναβςβή δζαθμνεηζηχκ ναικμθζπζδίςκ ιε δζαθμνεηζηά α-οδνμλο-θζπανά μλέα ηα μπμία ιενζηέξ θμνέξ πενζείπακ ηαζ αηυνεζημ δεζιυ υπςξ (Rha-Rha-C 8 -C 10 ), (Rha- Rha-C 10 -C 8 ), (Rha-Rha-C 10 -C 12 ), (Rha-Rha-C 12 -C 10 ), (Rha-Rha-C 10 -C 12:1 ) εκχ ανβυηενα ανέεδηακ ναικμθζπίδζα πμο πενζείπακ ημ ίδζμ θζπζδζαηυ ιένμξ αθθά ιε ιία ναικυγδ ακηίζημζπα. 10 Ζ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ δζαπζζηχεδηε ζε πμθθά ζηεθέπδ ηδξ P. aeruginosa. ε ηαθθζένβεζα P. aeruginosa B189 ιε πδβή άκεναηα απυαθδηα

13 ενβαζηδνίμο βάθαηημξ πανάβμκηαζ ηα ελήξ ναικμθζπίδζα (Rha-Rha-C 10 -C 10 ) ηαζ (Rha-Rha-C 10 -C 12 ). 18 ε ηαθθζένβεζα P. aeruginosa BN10 ιε δζαθμνεηζηέξ πδβέξ άκεναηα ηάεε θμνά (βθοηενυθδ, βθοηυγδ, κ-ελαδεηάκζμ ηαζ κ-αθηάκζα) πανάβμκηαζ ηα ελήξ ναικμθζπίδζα (Rha-C 10 -C 8 ), (Rha-C 10 -C 10 ), (Rha-C 10 - C 12:1 ), (Rha-C 10 -C 12 ), (Rha-Rha-C 10 -C 8 ), (Rha-Rha-C 10 -C 10 ), (Rha-Rha-C 10 - C 12:1 ) ηαζ (Rha-Rha-C 10 -C 12 ). 19 ε ηαθθζένβεζα P. aeruginosa DAUPE 614 ιε πδβή άκεναηα βθοηενυθδ ηαζ πανμοζία κζηνζημφ αιιςκίμο παναηδνήεδηε δ παναβςβή ηςκ ελήξ ναικμθζπζδίςκ πμο πανμοζζάγμκηαζ ζηδ ηαθθζένβεζα P. aeruginosa BN10 ηαεχξ ηαζ ηςκ ναικμθζπζδίςκ: (Rha-C 8 -C 10 ), (Rha-C 12 - C 10 ), (Rha-Rha-C 8 -C 10 ) ηαζ (Rha-Rha-C 12 -C 10 ) εκχ ζε ηαθθζένβεζα P. aeruginosa 47T2 NCBIM παναηδνήεδηακ ηαζ ηα ελήξ ναικμθζπίδζα (Rha-Rha-C 8 -C 12:1 ), (Rha-C 12:1 -C 10 ), (Rha-Rha-C 12:1 -C 12 ) ηαζ (Rha-Rha-C 10 - C 14:1 ). 20,21 ε ηαθθζένβεζα P. aeruginosa GIM 32 ιε πδβή άκεναηα ημ θμζκζηέθαζμ ηαεχξ ηαζ ζε ηαθθζένβεζεξ P. aeruginosa DS10-129, P. aeruginosa MR01 ηαζ P. aeruginosa BSZ-07 ανέεδηακ εεηζηέξ ζε παναβςβή ναικμθζπζδίςκ. 22,23,24,25 Μεβάθδ πμζυηδηα παναβςβήξ ναικμθζπζδίςκ παναηδνήεδηε ζε ηαθθζένβεζα P. aeruginosa ΡΑΟ1 ιε πδβή άκεναηα ημ δθζέθαζμ ηαζ ηάης απυ ζοκεήηεξ πενζμνζζιέκμο αγχημο. 26 Ζ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ πναβιαημπμζήεδηε ηαζ ζε ηαθθζένβεζεξ P. aeruginosa UFPEDA 614 ζε ζηενευ ενεπηζηυ ιέζμ. 27 Πένα απυ ηδ P. aeruginosa, πμθθά είδδ ημο βέκμοξ Pseudomonas είκαζ ζηακά κα πανάβμοκ ναικμθζπίδζα. Σμ παεμβμκζηυ ααηηήνζμ Pseudomonas putida KT2440 πανάβεζ ναικμθζπίδζα ζε ηαθθζένβεζεξ ιε ηδ πνήζδ βθοηυγδξ ςξ πδβή άκεναηα υπςξ ηαζ ημ ζηέθεπμξ P. putida 21BN ιε ηδ πνήζδ βθοηυγδξ ή ελαδεηακίμο. 28,29 Σμ ιδ παεμβυκμ ααηηήνζμ Pseudomonas chlororaphis ιπμνεί κα πανάβεζ ναικμθζπίδζα ηονίςξ (Rha-C 10 ) ηαζ (Rha- C 12:1 ) ζε εενιμηναζία δςιαηίμο, αηυιδ ηαζ ζε ζηαηζηή ηαθθζένβεζα. 30,31 Μεηά απυ πνυκζα, ανέεδηακ ηαζ άθθα ααηηήνζα ηα μπμία πανάβμοκ ναικμθζπίδζα. Βαηηήνζα πμο ακήημοκ ζε δζαθμνεηζηά θφθα απυ ηδ P. aeruginosa υπςξ δ Pantoea sp., Renibacterium salmoninarum, Cellulomonas cellulans, Nocardioides sp., Tetragenococcus koreensis ανέεδηε υηζ πανάβμοκ ηαζ αοηά ναικμθζπίδζα. 10 Σμ ααηηήνζμ Burkholderia glumae πανάβεζ ναικμθζπίδζα ιε ιεβάθεξ αθοζίδεξ α-οδνμλο-θζπανχκ μλέςκ

14 ιε πζμ ζφκδεεξ ημ (Rha-Rha-C 14 -C 14 ) ιε ηδ πνήζδ μονίαξ ςξ πδβή αγχημο ηαζ ηδ πνήζδ θαδζμφ ηακυθα ςξ πδβή άκεναηα. 32 Σα ααηηήνζα Acinetobacter calcoaceticus, Enterobacter asburiae, Enterobacter hormaechei ηαζ Pantoea stewartii ανέεδηακ υηζ πανάβμοκ ναικμθζπίδζα ζε ηαθθζένβεζεξ ιε πδβή άκεναηα ηδ βθοηενυθδ. 33 Σα ααηηήνζα Thermus sp., Thermus aquaticus ηαζ Meiothermus ruber πανάβμοκ ναικμθζπίδζα ηςκ μπμίςκ ηα 3-φδνμλο-θζπανά μλέα είκαζ ημνεζιέκα ή αηυνεζηα ιε έκα δζπθυ ή δφμ δζπθμφξ δεζιμφξ ηαζ δ αθοζίδα ημοξ ιπμνεί κα θηάζεζ ημοξ 24 άκεναηεξ. 34 Σμ ιδ παεμβυκμ ααηηήνζμ Burkholderia thailandensis πμο είκαζ βεκεηζηά πανυιμζμ ιε ημ παεμβυκμ ααηηήνζμ Burkholderia pseudomallei πανάβεζ ναικμθζπίδζα. 35 Σμ εενιυθζθμ ααηηήνζμ Thermus thermophilus HB8 πανάβεζ ναικμθζπίδζα ζε ιεβάθεξ πμζυηδηεξ ζε ζπέζδ ιε ηδκ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ απυ ημ ααηηήνζμ P. aeruginosa πνδζζιμπμζχκηαξ ςξ πδβή άκεναηα ημ δθζέθαζμ ή ημ εθασηυ μλφ. 36 Σμ ααηηήνζμ Escherichia coli πανάβεζ ναικμθζπίδζα ζε πμθφ ιζηνή πμζυηδηα δ μπμία αολάκεηαζ ζε ιεβάθμ ααειυ υηακ βίκεηαζ ακαζοκδζαζιυξ ημο ααηηδνίμο ιε ημ μπενυκζμ rhlab ημο ααηηδνίμο P. aeruginosa Γομή ραμνολιπιδίων Σα ναικμθζπίδζα απμηεθμφκηαζ απυ έκα βθοημκζηυ ιένμξ ηαζ έκα θζπζδζαηυ (ιδ-βθοημκζηυ) ιένμξ ηα μπμία ζοκδέμκηαζ ιε έκακ O-βθοημζζδζηυ δεζιυ. (εζηυκα 7) Σμ βθοημκζηυ ιένμξ απμηεθείηαζ απυ ιία ναικυγδ ή δφμ ναικυγεξ μζ μπμίεξ ζοκδέμκηαζ ιε α-1,2-βθοημζζδζηυ δεζιυ ηαζ μκμιάγμκηαζ ακηίζημζπα ιυκμ-ναικμθζπίδζα (mono-rls) ηαζ δζ-ναικμθζπίδζα (di-rls). πάκζα ζηδ δεφηενδ οδνμλοθζηή μιάδα ηδξ πνχηδξ ναικυγδξ ημο δζναικμθζπζδίμο ιπμνεί κα αηοθζςεεί ιε έκα αθηεκμσηυ μλφ. Σμ θζπζδζαηυ ιένμξ απμηεθείηαζ απυ έκα ή δφμ ή ηνία α-οδνμλο-θζπανά μλέα. Σα θζπανά μλέα ιπμνεί κα είκαζ ημνεζιέκα ή ιυκμ- ή πμθοαηυνεζηα. Σμ ιήημξ ηςκ αθοζίδςκ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ιπμνεί κα ηοιαίκεηαζ απυ C 8 ιέπνζ ηαζ C 16. Σα α-οδνμλο-θζπανά μλέα ζοκδέμκηαζ ιεηαλφ ημοξ ιε εζηενζηυ δεζιυ πμο ζπδιαηίγεηαζ ιεηαλφ ηδξ α-οδνμλοθζηήξ μιάδαξ ηδξ άπς αθοζίδαξ πμο είκαζ πζμ ημκηά ζηδ ναικυγδ ηαζ ηδξ ηαναμλοθζηήξ μιάδαξ ηδξ εββφξ

15 αθοζίδαξ. Ζ ηαναμλοθζηή μιάδα ηδξ απμιαηνοζιέκδξ αθοζίδαξ α-οδνμλοθζπανμφ μλέμξ. Ζ ζηενμπδιζηή δμιή ηςκ α-οδνμλο-θζπανχκ μλέςκ είκαζ δ R-ιμνθή. 38 Δηθόλα 7: (a) Γνκή κνλν-ξακλνιηπηδίνπ, (b) Γνκή δη-ξακλνιηπηδίνπ Βιοζύνθεζη ραμνολιπιδίων Ζ παναβςβή ηςκ ναικμθζπζδίςκ επζηοβπάκεηαζ ηονίςξ ζηδ ζηαηζηή θάζδ ακάπηολδξ ηδξ ηαθθζένβεζαξ ημο ααηηδνίμο. 36 Ζ παναβςβή ηςκ ναικμθζπζδίςκ ιπμνεί κα πναβιαημπμζδεεί ιε δζαθμνεηζηέξ πδβέξ άκεναηα υπςξ βθοηυγδ, βθοηενυθδ, ελαδεηάκζμ, αθηάκζα, θάδζ ηακυθα, εθασηυ μλφ, δθζέθαζμ ηαζ δ ηεθζηή ημοξ ζοβηέκηνςζδ ιπμνεί κα θηάζεζ ηαζ ηα 90 gr/l. 19,28,32,36 Αοηυ ελανηάηαζ απυ ηζξ εηάζημηε ζοκεήηεξ ηαθθζένβεζαξ υπςξ μ πνυκμξ ηαθθζένβεζαξ, δ πδβή ηαζ δ πμζυηδηα ημο άκεναηα, δ πδβή ηαζ δ πμζυηδηα ημο αγχημο ηαζ ημο θςζθυνμο, δ εενιμηναζία ηαεχξ ηαζ άθθα ζδζαίηενα παναηηδνζζηζηά βζα ηάεε ααηηήνζμ. Έπεζ παναηδνδεεί υηζ δ ζηενεμπδιζηή δμιή ηςκ ναικμθζπζδίςκ είκαζ ακελάνηδηδ ηδξ εηάζημηε πδβήξ άκεναηα Βιοζύνθεζη ηοσ λιπιδιακού μέροσς ηων ραμνολιπιδίων Ζ αζμζφκεεζδ ημο θζπζδζαημφ ιένμοξ ηςκ ναικμθζπζδίςκ αημθμοεεί ημ ηθαζζηυ ιμκμπάηζ αζμζφκεεζδξ θζπανχκ μλέςκ απυ πνυδνμια ιυνζα ιε δφμ άκεναηεξ. Γε ιεηααάθθεηαζ ζε ζφζηαζδ ημ θζπζδζαηυ ιένμξ ιε ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ πδβχκ άκεναηα ηδξ ηαθθζένβεζαξ ημο ααηηδνίμο. 38 Σμ ηθαζζζηυ ζφζηδια ζφκεεζδξ θζπανχκ μλέςκ ηφπμο ΗΗ πμο ανίζηεηαζ ζηα πενζζζυηενα ααηηήνζα ηαζ θοηά δζαθένεζ απυ ημ ζφζηδια

16 ηφπμο Η πμο είκαζ ημζκυ ζηα εδθαζηζηά ζημ υηζ μζ ζοκεεηάζεξ ηςκ πνυδνμιςκ θζπανχκ μλέςκ δεκ απμηεθμφκ έκα πμθοθεζημονβζηυ πμθοπεπηίδζμ πμο πανάβεηαζ απυ έκα ιυκμ βμκίδζμ. οβηεηνζιέκα, ηάεε ακηίδναζδ ηαηαθφεηαζ απυ δζαθμνεηζηέξ πνςηεΐκεξ πμο ηςδζημπμζμφκηαζ απυ δζαθμνεηζηά βμκίδζα. 38,39,40 Σμ ζφζηδια ζφκεεζδξ θζπανχκ μλέςκ ηφπμο ΗΗ ιεθεηήεδηε ζημ ααηηήνζμ E.coli. Σμ ζφζηδια δεκ ιεηααάθθεηαζ ιεηαλφ ηςκ ααηηδνίςκ. Σα έκγοια ηαηάθοζδξ ηςκ ακηζδνάζεςκ ημο ζοζηήιαημξ ζφκεεζδξ θζπανχκ μλέςκ ηφπμο ΗΗ είκαζ μιυθμβα ιεηαλφ ηςκ δζαθυνςκ ααηηδνίςκ. 38 ημ ααηηήνζμ E. coli δ αζμζφκεεζδ ηςκ θζπανχκ μλέςκ πςνίγεηαζ ζε δφμ ζηάδζα, ημ ανπζηυ ζηάδζμ ηαζ ηδκ ηοηθζηή επζιήηοκζδ. Κάεε ηφηθμξ επζιήηοκζδξ απαζηεί ηέζζενζξ πδιζηέξ ακηζδνάζεζξ ζηζξ μπμίεξ ηφνζμ νυθμ παίγμοκ ηνία έκγοια - ζοκεεηάζεξ ηδξ α-ηεημαηοθ-αηοθμθένμοζαξ πνςηεΐκδξ (ACP), KAS I (FabB), KAS II (FabF), ηαζ KAS III (FabH), πμο είκαζ πνμσυκηα ηςκ βμκζδίςκ fabb, fabf ηαζ fabh ακηίζημζπα. 38 Σμ ανπζηυ ζηάδζμ λεηζκά ιε ηδ ζφκεεζδ ιδθμκοθμζοκεκγφιμο Α (ιαθυκοθ-coa) απυ αηεηοθμζοκέκγοιμ Α (αηέηοθ-coa) ιε ηδ δνάζδ ημο εκγφιμο ηαναμλοθάζδ ημο αηεηοθμζοκεκγφιμο Α. ηδ ζοκέπεζα, ημ ιδθμκοθμζοκέκγοιμ Α ιεηαηνέπεηαζ ζε ιδθυκοθμ-acp ιε ηδ δνάζδ ημο εκγφιμο FabD ηνακζαηοθάζδ ημο ιαθμκοθ-coa:acp. Σμ ACP είκαζ ιζα αηοθμθένμοζα πνςηεΐκδ, πνςηεσκζηά ακάθμβδ ημο ζοκεκγφιμο Α δ μπμία αμδεάεζ ζηδ ζφκδεζδ ημο ιδθυκοθμο-acp ιε ημ αηεηοθμζοκέκγοιμ Α. 38,40 Ο πνχημξ ηφηθμξ επζιήηοκζδξ λεηζκά ιε ηδ δνάζδ ημο εκγφιμο KAS III (FabH) πμο ζοιποηκχκεζ ημ ιδθυκοθμ-acp ιε ημ αηεηοθμζοκέκγοιμ Α ζε αηεηοάηοθ-acp. ημ δεφηενμ ζηάδζμ, ημ α-ηεημάηοθ-acp ακηζδνά ιε ημ αηεηοάηοθ-acp ηαζ πανάβεζ ημ α-οδνμλοάηοθ-acp ιε ηδ δνάζδ ημο εκγφιμο FabG, νεδμοηηάζδ ελανηχιεκδ απυ NADPH ημο α-ηεημάηοθ-acp. Σμ ηνίημ ζηάδζμ ηαηαθφεηαζ είηε απυ ημ έκγοιμ FabA είηε απυ ημ FabZ ηα μπμία είκαζ α- οδνμλοαηοθ-acp αθοδναηάζεξ. Σμ ηέηανημ ζηάδζμ ημο ηφηθμο βίκεηαζ δ ιεηαηνμπή ημο trans-2-εκμτθ-acp ζε άηοθ-acp ιε ηδ αμήεεζα ημο εκγφιμο FabI, νεδμοηηάζδ ελανηχιεκδ απυ NADH ημο εκυτθ-acp. Μεηαβεκέζηενμζ ηφηθμζ λεηζκμφκ απυ ζοιπφηκςζδ ημο ιδθυκοθμο-acp ιε άηοθ-acp ιε παναβςβή α-ηεημάηοθ-acp ιε ηδ δνάζδ ημο εκγφιμο FΑbΒ ηαζ FabF βζα ημ λεηίκδια εκυξ κέμο ηφηθμο. 38,41 (εζηυκα 8)

17 Δηθόλα 8: Μεηαβνιηθό κνλνπάηη βηνζύλζεζεο ξακλνιηπηδίωλ. 38 AlgC: θωζθνγιπθνκνπηάζε, RmlA: γιπθόδε-1-θωθνξηθή ζπκηδπιηξαλζθεξάζε, RmlB: dtdp-d-γιπθόδε 4,6-αθπδξαηάζε, RmlC: dtdp-4- δεπδξνξακλόδε 3,5-επηκεξάζε, RmlD: dtdp-4-αλαγωγάζε ηεο δεπδξνξακλόδεο, FabD: καινλπι-coa:acp ηξαλζαθπιάζε, FabH, FabB θαη FabF: β-θεηνάθπι-acp-ζπλζεηάζεο, FabG: β-θεηνάθπι-acp αλαγωγάζε εμαξηώκελε από NADPH, FabA, FabZ: β-πδξνμπαθπι-acpαθπδξαηάζεο, FabI: ελόπι-acp-ξεδνπθηάζε εμαξηώκελε από NADPH, HAA: 3-(3-πδξνμπαιθαλνϋινμπ)αιθαλνϊθό νμύ, RhlA: ζπλζεηάζε ηνπ 3-(3-πδξνμπαιθαλνϋινμπ)αιθαλνϊθνύ, RhlB: ξακλνζπιηξαλζθεξάζε 1, RhlC: ξακλνζπιηξαλζθεξάζε 2, RhlI: ζπλζάζε ηεο N- βνπηαλνϋινκνζεξίλεο ιαθηόλεο, RhlG: β-θεηνάθπι-ξεδνπθηάζε, LasI: N-(3-oμo-δωδεθαλόϋι)-L-HSL ζπλζάζε, HHQ: 4-ύδξνμπ-2- επηπιθηλνιίλε 38

18 Σα οδνμλοαθηακμσηά μλέα (HAA) πανάβμκηαζ απυ ηδ δνάζδ ημο εκγφιμο RhlA πνδζζιμπμζχκηαξ ςξ οπυζηνςια ημ α-οδνμλοδεηακυοθ-acp, ημ μπμίμ είκαζ έκα απυ ηα πνμσυκηα α-άηοθ-acp πμο πανάβμκηαζ ζημκ ηφηθμ ζφκεεζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ εκχ δεκ πνδζζιμπμζείηαζ ςξ οπυζηνςια ημ α- οδνμλοδεηακυοθ-coa. 38, Βιοζύνθεζη ηοσ γλσκονικού μέροσς ηων ραμνολιπιδίων Ζ ναικυγδ είκαζ ζοζηαηζηυ θζπμπμθοζαηπανζηχκ (LPS) ημο ηοηηανζημφ ημζπχιαημξ ηαζ Ο-ακηζβμκζηχκ πμθοζαηπανζηχκ ζε ιζα πμζηζθία gramανκδηζηχκ ααηηδνίςκ, ζοιπενζθαιαακμιέκςκ ηαζ ζηεθεπχκ ηδξ Pseudomonas. 8,43 Ζ ιεηαηνμπή ηδξ βθοηυγδξ ζε ναικυγδ ζηδ P. aeruginosa ιεθεηήεδηε ζε in vivo ηαζ in vitro ιεθέηεξ υπμο ανέεδηε υηζ μ άκεναηαξ ζηδ εέζδ 1 ζηδ βθοηυγδ παναιέκεζ ζηδκ ίδζα εέζδ ζηδ ναικυγδ. Γζα κα ιεηαηναπεί υιςξ δ D-βθοηυγδ ζε L-ναικυγδ, μ ιεηαζπδιαηζζιυξ ημο άκεναηα 3, 4 ηαζ 5 εα πνέπεζ κα ακηζζηναθεί ηαζ αοηυ απαζηεί ιζα ακαβςβή ζημκ άκεναηα 6. 38,44,45 Σμ πνχημ ζηάδζμ βζα ηδκ παναβςβή ηδξ L-ναικυγδξ είκαζ δ ιεηαηνμπή ηδξ D-βθοηυγδξ-6-P ζε D-βθοηυγδ-1-P ιε ηδ αμήεεζα ημο εκγφιμο θςζθμβθοημιμοηάζδ (AlgC). Έπεζ ανεεεί ιεηάθθαλδ ζημ βμκίδζμ ηδξ θςζθμβθοημιμοηάζδξ πμο έπεζ ςξ απυηεθεζια ηδ ιδ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ πνάβια πμο ζδιαίκεζ πςξ είκαζ ημ έκγοιμ ηθεζδί βζα ηδκ παναβςβή ηδξ L-ναικυγδξ. 8,46,47 ηδ ζοκέπεζα αημθμοεεί ιζα ζεζνά ακηζδνάζεςκ πμο ηαηαθφεηαζ απυ ηα έκγοια RmlA, RmlB, RmlC ηαζ RmlD πμο ηαηαθήβμοκ ζηδ παναβςβή ηδξ L-ναικυγδξ ςξ dtdp-l-ναικυγδ πμο είκαζ ημ πνυδνμιμ ιυνζμ βζα ημ ζπδιαηζζιυ ηςκ ναικμθζπζδίςκ. Ζ ακηζζηνμθή ηδξ δζαιυνθςζδξ ζημοξ άκεναηεξ 3 ηαζ 5 πναβιαημπμζείηαζ ιε ιία ακηίδναζδ ζζμιενίςζδξ δ μπμία δζεοημθφκεηαζ απυ εκμθζπμίδζδ ηδξ ηεηυκδξ. Σα έκγοια αοηά ηςδζημπμζμφκηαζ απυ ηα ακηίζημζπα βμκίδζα rmla, rmlb, rmlc, ηαζ rmld ηα μπμία ζπδιαηίγμοκ ημ rmlbdac μπενυκζμ. 48 Αημθμοεεί δ ιεηανμπή ηδξ D-βθοηυγδ-1-P ζε dtdp-d-βθοηυγδ πμο ηαηαθφεηαζ απυ ημ έκγοιμ RmlA, 1-θςθμνζηή βθοηυγδ ηδξ εοιζδοθηνακζθενάζδξ. Αημθμοεεί δ δεφηενδ ακηίδναζδ απυ ημ έκγοιμ RmlB, dtdp-d-βθοηυγδ 4,6-αθοδναηάζδ πμο ιεηαηνέπεζ ηδ dtdp-d-βθοηυγδ ζε 4,6-δζδέμλο-4-μλμ-dTDP-D-βθοηυγδ. Ζ ηνίηδ ακηίδναζδ πναβιαημπμζείηαζ απυ ημ έκγοιμ RmlC, dtdp-4-

19 δεοδνμναικυγδ 3,5-επζιενάζδ πμο ιεηαηνέπεζ ηδ 4,6-δζδέμλο-4-μλμ-dTDP-Dβθοηυγδ ζε dtdp-4-μλμ-l-ναικυγδ. Σέηανδ ηαζ ηεθεοηαία ακηίδναζδ πναβιαημπμζείηαζ απυ ημ έκγοιμ RmlD, dtdp-4-ακαβςβάζδ ηδξ δεοδνμναικυγδξ πμο ιεηαηνέπεζ ηδ dtdp-4-μλμ-l-ναικυγδ ζε dtdp-lναικυγδ δ μπμία εα πνδζζιμπμζδεεί βζα ηδκ παναβςβή ηςκ ναικμθζπζδίςκ. 38 (εζηυκα 8) Σμ ιμκμπάηζ ελδβεί πςξ ζοκεέηεηαζ δ L-ναικυγδ απυ ηδκ D-βθοηυγδ υηακ ηα ααηηήνζα ακαπηφζμκηαζ ζε ηαθθζένβεζα ιε πδβή άκεναηα ηδ βθοηυγδ. Έπμοκ παναηδνδεεί υιςξ ηαζ ηαθθζένβεζεξ ιε άθθεξ πδβέξ άκεναηα υπςξ ιακκζηυθδ, θοζζηά έθαζα (δθζέθαζμ, ζμβζέθαζμ, εθασηυ μλφ), βθοηενυθδ, αζεακυθδ υπμο πανάβμκηαζ ναικμθζπίδζα. 8,19,33, ηάδια βιοζύνθεζης ραμνολιπιδίων Γζα ηδκ ηεθζηή αζμζφκεεζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ είκαζ απαναίηδηεξ ηνεζξ εκγοιζηέξ ακηζδνάζεζξ. (εζηυκα 9) Πνχηδ είκαζ δ ακηίδναζδ πμο ειπθέηεηαζ ζηδ ζφκεεζδ ηςκ οδνμλοαθηακμσηχκ μλέςκ απυ δφμ πνυδνμια ιυνζα 3- φδνμλο θζπανχκ μλέςκ. 10 Σμ έκγοιμ RhlA πμο ηαηαθφεζ αοηή ηδκ ακηίδναζδ είκαζ ημ πνμσυκ ημο βμκζδίμο rhla ηαζ ανίζηεηαζ ζημ πενίπθαζια. 49 οβηεηνζιέκα είκαζ ιία πνςηεΐκδ ηδξ εζςηενζηήξ ιειανάκδξ ηαζ απμηεθεί ηαηαθοηζηή οπμιμκάδα ημο εκγφιμο RhlΒ. 8,49 Έπεζ απμδεζπεεί υηζ έπεζ ιεβάθδ ζοββέκεζα ζε οπμζηνχιαηα ιε 10 άκεναηεξ ηαζ ζπδιαηίγεζ έκα ιυνζμ α- οδνμλοδεηακυοθ-α-οδνμλοδεηακμσηυ (HAA) απυ δφμ ιυνζα α- οδνμλοδεηακυοθ-acp ηαζ υπζ απυ α-οδνμλοδεηακυοθ-coa. 42 Σμ α- οδνμλοδεηακυοθ-acp είκαζ έκα απυ ηα α-οδνμλοάηοθ-acp πμο πνμένπεηαζ απυ ημκ ηφηθμ ζφκεεζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ ηφπμο ΗΗ. Έπεζ ανεεεί πςξ ιεηάθθαλδ ζημ βμκίδζμ rhla δεκ πανάβεζ μφηε οδνμλοαθηακμσηά μλέα μφηε ναικμθζπίδζα. 38,50 ηδ ζοκέπεζα, αημθμοεεί δ ακηίδναζδ πμο ηαηαθφεζ ηδ ζφκδεζδ ιεηαλφ ηδξ dtdp-l-ναικυγδξ ηαζ ηςκ οδνμλοαθηακμσηχκ μλέςκ πνμξ παναβςβή ιυκμ-ναικμθζπζδίςκ. Σμ έκγοιμ RhlB πμο ηαηαθφεζ αοηή ηδκ ακηίδναζδ είκαζ δ ναικμζοθηνακζθενάζδ 1 πμο πανάβεηαζ απυ ημ βμκίδζμ rhlb. Βνίζηεηαζ ζηδ δζαιειανακζηή πενζμπή υπμο επζηνέπεζ ηδκ αβηφνςζδ ζηδκ εζςηενζηή ιειανάκδ. Έπεζ ανεεεί πςξ ιεηάθθαλδ ζημ βμκίδζμ RhlΒ δεκ πανάβεζ ναικμθζπίδζα. 10,38,49

20 Δηθόλα 9: Βηνζύλζεζε κνλν-ξακλνιηπηδίωλ θαη δη-ξακλνιηπηδίωλ 13 Σέθμξ, πναβιαημπμζείηαζ δ ακηίδναζδ πνμζεήηδξ dtdp-l-ναικυγδξ ζε ιμκμναικμθζπίδζα πμο έπμοκ ζοκηεεεί βζα παναβςβή δζ-ναικμθζπζδίςκ. 10 Σμ έκγοιμ RhlC πμο ηαηαθφεζ αοηή ηδκ ακηίδναζδ είκαζ δ ναικμζοθηνακζθενάζδ 2 πμο πανάβεηαζ απυ ημ βμκίδζμ rhlc ηαζ ανίζηεηαζ ζηδκ εζςηενζηή ιειανάκδ. Σμ έκγοιμ αοηυ είκαζ μιυθμβμ ιε άθθεξ ναικμζοθηνακζθενάζεξ πμο ειπθέημκηαζ ζηδ ζφκεεζδ θζπμπμθοζαηπανζηχκ (LPS). 8,51 Σα ιυκμ-ναικμθζπίδζα ηαζ δζ-ναικμθζπίδζα πανάβμκηαζ ζημ ηοηηανμπθαζιαηζηυ ιένμξ ηδξ εζςηενζηήξ ιειανάκδξ πνζκ ιεηαθενεμφκ ζημ ελςηοηηάνζμ οβνυ. 38, Γενεηική ρύθμιζη ηης βιοζύνθεζης ηων ραμνολιπιδίων Σα βμκίδζα rhla ηαζ rhlb είκαζ μνβακςιέκα ζε έκα μπενυκζμ rhlab. Σα βμκίδζα rhlr ηαζ rhlη ανίζημκηαζ ζηδκ ίδζα αθθδθμοπία, ηα μπμία ηςδζημπμζμφκ πνςηεΐκεξ μζ μπμίεξ ειπθέημκηαζ ζηδ νφειζζδ ηδξ ιεηαβναθήξ ηςκ βμκζδίςκ

21 rhla ηαζ rhlb ιέζς ηδξ απυηνζζδξ ημο ζοζηήιαημξ αζζεδηδνίμο απανηίαξ πχνμο (Quorum Sensing system). 13,26,52 Σμ βμκίδζμ rhlc δε ζοκδέεηαζ ζημ πνςιυζςια ιε άθθα rhl βμκίδζα ηαζ ζπδιαηίγεζ έκα μπενυκζμ ιε έκα βμκίδζμ ημο μπμίμο δ θεζημονβία δεκ είκαζ βκςζηή. Αοηυ ημ μπενυκζμ νοειίγεηαζ ζηδ θάζδ ηδξ ιεηαβναθήξ ιε πανυιμζμ ηνυπμ υπςξ ημ rhlab. 28,51 Ζ νφειζζδ ηδξ ιεηαβναθήξ ηςκ βμκζδίςκ rhlab ελανηαηάηαζ ιενζηχξ ηαζ απυ ημκ πανάβμκηα ζίβια ζ 54 πμο αμδεάεζ ηδκ RNA πμθοιενάζδ κα λεηζκήζεζ ηδ ιεηαβναθή ηςκ βμκζδίςκ ζε ηαηαζηάζεζξ πενζμνζζιέκμο θςζθυνμο ή αγχημο ζηδκ ηαθθζένβεζα. 28,53 Δηθόλα 10: Γνληδηαθή ξύζκηζε ηεο βηνζύλζεζεο ηωλ ξακλνιηπηδίωλ 49 Σμ ζφζηδια αζζεδηδνίμο απανηίαξ πχνμο QS ζημ ααηηήνζμ P. aeruginosa εθέβπεζ ηαζ πναβιαημπμζεί ηδκ ελςηοηηανζηή επζημζκςκία ιε άθθα ηφηηανα. Γζα κα πναβιαημπμζδεεί αοηυ, νοειίγεζ ηδκ έηθναζδ πενίπμο 160 βμκζδίςκ ιεηαλφ ηςκ μπμίςκ ηαζ ηςκ βμκζδίςκ rhla ηαζ rhlb πμο είκαζ οπεφεοκα βζα ηδκ παναβςβή ηςκ ναικμθζπζδίςκ ηαεχξ ηαζ άθθςκ βμκζδίςκ πμο πανάβμοκ εηηνζηζημφξ ιμθοζιαηζημφξ πανάβμκηεξ υπςξ ελςημλίκδ Α, πνςηεάζδ, θςζθμθζπάζδ C, εθαζηάζδ, πομηοακίκδ. 8,54 Ζ νφειζζδ ηδξ έηθναζδξ βίκεηαζ απυ δφμ μιάδεξ ζδιαημδμηζηχκ ιμνίςκ, ηςκ Ν-άηοθ-L-μιμζενίκδ θαηημκχκ (AHLs) ηαζ ηςκ 4-φδνμλο-2- αθηοθηζκμθμκχκ (HAQs). 38 Ζ πνχηδ μιάδα ζδιαημδμηζηχκ ιμνίςκ (AHLs) πανάβμκηαζ απυ δφμ ζοζηήιαηα βμκζδίςκ ημ las ηαζ ημ rhl ηα μπμία εηθνάγμοκ απυ έκακ ιεηαβναθζηυ νοειζζηζηυ ιυνζμ, LasR ηαζ RhlR

22 ακηίζημζπα, ηαζ απυ ιία ζοκεεηάζδ LasI ηαζ RhlI μζ μπμίεξ ζοκεέημοκ ηα ζδιαημδμηζηά ιυνζα, ηδ 3-μλμ-δςδεηακμτθμιμζενίκδ θαηηυκδ (N-3- oxododecanoyl-l-hsl) ηαζ ηδ αμοηακμτθμιμζενίκδ θαηηυκδ (N-butanoyl-L- HSL) ακηίζημζπα. 54 Σα ζδιαημδμηζηά ιυνζα πνμζδέκμκηαζ ζηα ιεηαβναθζηά νοειζζηζηά ιυνζα LasR ηαζ RhlR βζα ηδκ εκενβμπμίδζδ ηδξ έηθναζδξ ηςκ βμκζδίςκ rhlab ηαζ rhlc. Μία ιεηάθθαλδ ζημ βμκίδζμ rhli έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ απμοζία παναβςβήξ ναικμθζπζδίςκ. 13 Ζ πνμζεήηδ υιςξ ζοκεεηζηήξ Ν- άηοθ-l-μιμζενίκδ θαηηυκδξ ζημ ιεηαθθαβιέκμ ζηέθεπμξ έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ έκανλδ παναβςβήξ ναικμθζπζδίςκ. 13 ηδ δεφηενδ μιάδα ζδιαημδμηζηχκ ιμνίςκ (HAQs) πανάβμκηαζ δφμ ζδιαημδμηζηά ιυνζα 3,4-δζφδνμλο-2- επηοθηζκμθυκδ (PQS) ηαζ ημ πνυδνμιυ ημο ιυνζμ 4-φδνμλο-2-επηοθηζκμθυκδ (HHQ). 38 Ζ αζμζφκεεζδ αοηχκ ηςκ ιμνίςκ απαζηεί πνυδνμια ιυνζα πμο πνμένπμκηαζ απυ ημ ζφζηδια ζφκεεζδξ θζπανχκ μλέςκ ηφπμο ΗΗ. Ζ αμοηακμτθμιμζενίκδ θαηηυκδ πανάβεηαζ απυ ημ αηοθ-acp εκχ δ 3-μλμδςδεηακμτθμιμζενίκδ θαηηυκδ απυ ημ α-ηεημδςδεηακυοθ-acp ηδξ ηοηθζηήξ επζιήηοκζδξ ηςκ θζπανχκ μλέςκ. 38,55 Δπζπθέμκ, δ παναβςβή ηςκ ναικμθζπζδίςκ εθέβπεηαζ ιεηαβναθζηά ιε ανκδηζηή νφειζζδ ιε ημοξ πανάβμκηεξ PtxR ηαζ DksA μζ μπμίμζ ιεζχκμοκ ηδκ έηθναζδ ημο αοημεπαβςβέα rhll ηαζ ιεηαιεηαβναθζηά ιε εεηζηή νφειζζδ απυ ημκ πανάβμκηα RsmA πμο ζοκδέεηαζ ζημ RNA ιεηάβναθμ ηαζ απυ έκακ πανάβμκηα GidA. Ο πανάβμκηαξ DksA αολάκεζ ηδ ιεηάθναζδ ημο RNA ιεηαβνάθμο ηςκ βμκζδίςκ rhlab. 38,56,57,58,59 Σα βμκίδζα rhla, rhlb ηαζ rhlc ανίζημκηαζ ζημ βέκςια ηαζ άθθςκ εζδχκ πμο έπμοκ ανεεεί υηζ πανάβμοκ ναικμθζπίδζα υπςξ ηα ααηηήνζα B. thailandensis, B. pseudomallei ζηα μπμία ηαζ ηα ηνία βμκίδζα ανίζημκηαζ ζημ ίδζμ μπενυκζμ. Ζ ζφκεεζδ ναικμθζπζδίςκ ζηα ααηηήνζα αοηά είκαζ αολδιέκδ θυβς πανμοζίαξ εζξ δζπθμφκ ημο μπενμκίμο ζημ πνςιυζςια ηςκ ααηηδνίςκ. 35 Ζ απμοζία ημο βμκζδίμο rhlc ζημ ααηηήνζμ P. chlororaphis έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ παναβςβή ιμκμ-ναικμθζπζδίςκ ηαζ απμοζία παναβςβήξ δζναικμθζπζδίςκ. 60

23 2.3 Γράζεις ραμνολιπιδίων Σα ναικμθζπίδζα ζοιιεηέπμοκ ζε δζάθμνεξ ιεηααμθζηέξ δζενβαζίεξ υπςξ μ ζπδιαηζζιυξ αζμθίθι, δ αζιυθοζδ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ, δ απμζημδυιδζδ μνβακζηχκ εκχζεςκ ηαζ πανμοζζάγμοκ ιμθοζιαηζηή δνάζδ ζε δζάθμνα είδδ ακενχπζκςκ ηοηηάνςκ ηαεχξ ηαζ ακηζααηηδνζαηή, ακηζσηή ηαζ ακηζιοηδηζαηή δνάζδ Ραμνολιπίδια και βιοθίλμ Χξ απυηνζζδ ζε μνζζιέκα πενζααθθμκηζηά ζήιαηα, ηα ααηηήνζα δζαθμνμπμζμφκ ημκ ηνυπμ ακάπηολήξ ημοξ απυ έκακ ακελάνηδημ ηνυπμ εθεφεενδξ δζααίςζδξ ζε έκα αθθδθελανηχιεκμ ηνυπμ δζααίςζδξ πνμζημθθμφιεκα ζε ιία επζθάκεζα. Αοηέξ μζ πνμζημθθδιέκεξ ζηδκ επζθάκεζα ιζηνμαζαηέξ ημζκυηδηεξ είκαζ βκςζηέξ ηαζ ςξ αζμθίθι. Ζ ακάπηολδ ημο αζμθίθι λεηζκάεζ αηνζαχξ υηακ ηα ααηηήνζα αθθάγμοκ ηδ ιμνθή ημο ηνυπμο γςήξ ημοξ. Οζ επζθάκεζεξ ζηζξ μπμίεξ πνμζημθθμφκηαζ είκαζ είηε αζμηζηέξ είηε ααζμηζηέξ. Ζ ιεηάααζδ νοειίγεηαζ απυ ηα ενεπηζηά ζοζηαηζηά ημο πενζαάθθμκημξ ζημ μπμίμ ακαπηφζζμκηαζ. Μεηά ηδκ ανπζηή πνμζηυθθδζδ ζημ οπυζηνςια, ηα ηφηηανα εζζένπμκηαζ ζε έκα πνυβναιια θοζζμθμβζηχκ αθθαβχκ πμο έπεζ ςξ απμηέθεζια ημ ζπδιαηζζιυ ιζαξ ιζηνμαζαηήξ ημζκυηδηαξ ηαζ ηδκ παναβςβή ιεβάθδξ πμζυηδηαξ πμθοζαηπανζηχκ. ηα ζοζηήιαηα υπμο οπάνπμοκ δζαεέζζια ενεπηζηά ζοζηαηζηά ζε αθεμκία, ημ αζμθίθι ιπμνεί κα ελεθζπεεί ζε πενίηεπκδ ηνζζδζάζηαηδ δμιή. Ζ πνςηεσκζηή ζφκεεζδ είκαζ απαναίηδηδ βζα ηα πνχσια ζηάδζα ημο ζπδιαηζζιμφ ημο αζμθίθι εκχ δ μζιςηζηυηδηα ημο ενεπηζημφ ιέζμο επδνεάγεζ ηδκ ζηακυηδηα ηςκ ηοηηάνςκ κα ζπδιαηίγμοκ αζμθίθι. 61,62 Σα αζμθίθι ειθακίγμοκ αολδιέκδ ακηίζηαζδ ζηα ακηζαζμηζηά. Μεηά ημ ζπδιαηζζιυ ημο αζμθίθι, μ ηφηθμξ ακάπηολδξ ζηαιαηά υηακ ηφηηανα ανπίγμοκ ηαζ απμιαηνφκμκηαζ απυ αοηυκ ηαζ επακένπμκηαζ ζημ ενεπηζηυ ιέζμ θυβς ακεπάνηεζαξ ενεπηζηχκ ζοζηαηζηχκ. 61 Ζ δζαδζηαζία απμηυθθδζδξ ηςκ ααηηδνίςκ απυ ημ αζμθίθι ηαζ δ επακαθμνά ημοξ ζημκ πθαβηημκζηυ ηνυπμ γςήξ είκαζ ιζα δοκαιζηή δζαδζηαζία πμο εθέβπεηαζ απυ εζδζηά βμκίδζα ηαζ πνμηαθείηαζ απυ ζοβηεηνζιέκα

24 πενζααθθμκηζηά ενεείζιαηα. Σα ναικμθζπίδζα εηηνίκμκηαζ απυ πενζθενεζαηά ααηηήνζα ημο αζμθίθι υπμο ιεζμθααμφκ ζημ ιδπακζζιυ απμηυθθδζδξ ιέζς ηδξ δζαηήνδζδξ ηακαθζχκ ιέζα ζημ αζμθίθι ηαζ ζημ ζπδιαηζζιυ ημζθμηήηςκ ζημ ηέκηνμ ηδξ δμιήξ ημο αζμθίθι. Με αοηυ ημκ ηνυπμ πνμηαθμφκ απμηυθθδζδ ζηα αζμθίθι ημο ααηηδνίμο P. aeruginosa. 62,63 (εζηυκα 11) Δηθόλα 11: ρεκαηηζκόο θαη απνζρεκαηηζκόο βηνθίικ κεηαιιαγκέλνπ θαη αγξίνπ ζηειέρνπο P. aeruginosa 63 Ο ιδπακζζιυξ απμηυθθδζδξ ιπμνεί κα είκαζ πνήζζιμξ ςξ εεναπεία ζε δζάθοζδ πνυκζςκ εβηαεζδνοιέκςκ αζμθίθι ααηηδνίςκ υπςξ ζε πενζπηχζεζξ αζεεκχκ ιε πνυκζα ιυθοκζδ απυ ημ ααηηήνζμ P. aeruginosa. Σα αζμθίθι ηςκ ααηηδνίςκ πνμηαθμφκ ηζξ πζμ ακεεηηζηέξ ιμθφκζεζξ ζημκ άκενςπμ ηαζ απμηεθμφκ ημκ πζμ ηαεμνζζηζηυ ηνυπμ ακάπηολδξ ηςκ ααηηδνίςκ ζημ πενζαάθθμκ. 63 ε ιεηαθθαβιέκα ααηηήνζα πμο πανμοζίαγακ οπενπαναβςβή ηςκ ναικμθζπζδίςκ, δ απμηυθθδζδ βζκυηακ ιε βνδβμνυηενμ νοειυ ηαζ ειπμδίγμκηακ μ ζπδιαηζζιυξ κέςκ αζμθίθι. 62,63 Σα ναικμθζπίδζα πανειπμδίγμοκ ηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ααηηδνίςκ Bacillus pumilus ζε επζθάκεζεξ ηαζ ημ ζπδιαηζζιυ αζμθίθι. 64 Δπζπθέμκ πνμηαθμφκ ηδ δζάζπαζδ ημο αζμθίθι ημο παεμβυκμο ααηηδνίμο Bordetella bronchiseptica. 65 Σα ορδθά επίπεδα παναβςβήξ ναικμθζπζδίςκ απυ ημ

25 ααηηήνζμ P. aeruginosa PAO1 πανειπμδίγμοκ ηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ααηηδνίςκ ζημ βοαθί θυβς ηδξ απμννοπακηζηήξ ημοξ δνάζδξ ηαζ ημ ζπδιαηζζιυ ημο αζμθίθι απυ ημ πνχζιμ ζηάδζμ ηδξ ακάπηολδξ. 62, Ραμνολιπίδια και αιμόλσζη Ζ εενιμάκημπδ αζιμθοζίκδ ημο ααηηδνίμο P. aeruginosa δ μπμία πανμοζίαγε αζιμθοηζηή δνάζδ ακαβκςνίζηδηε ςξ έκα βθοημθζπίδζμ πμο πενζείπε ναικυγδ ηαζ α-οδνμλοδεηακμσηυ μλφ. 67 Απυ ηα ναικμθζπίδζα πμο πανάβεζ ημ ααηηήνζμ P. aeruginosa ημ ναικμθζπίδζμ (Rha-Rha-C 10 -C 10 ) ανέεδηε υηζ έπεζ αζιμθοηζηή δνάζδ δδθαδή πνμηαθεί ηδκ ηαηαζηνμθή ηςκ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ. 68,69 Σμ ααηηήνζμ B. pseudomallei πανάβεζ ημ ναικμθζπίδζμ (Rha-Rha-C 14 -C 14 ) πμο πανμοζζάγεζ αζιμθοηζηή δναζηδνζυηδηα εκχ ανέεδηε υηζ δ αθαμοιίκδ ακαζηέθθεζ ηδκ αζιμθοηζηή δναζηδνζυηδηα ημο ναικμθζπζδίμο. 70 Σα δζ-ναικμθζπίδζα πνμηαθμφκ αζιυθοζδ ηςκ ενοενμηοηηάνςκ ιέζς δζαννμήξ ηδξ αζιμζθαζνίκδξ ηαζ απμοζίαξ ηςκ μζιςηζηχκ πνμζηαηεοηζηχκ μοζζχκ απυ ηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ιε απμηέθεζια ηδκ αθθαβή ημο ζπήιαημξ ηςκ ενοενμηοηηάνςκ απυ δζζημεζδή ιμνθή ζε ζθαζνμεπζκμηφηηανα. 71 Σα ναικμθζπίδζα ιπμνμφκ κα πνμηαθμφκ θφζδ ηςκ θεοηχκ αζιμζθαζνίςκ ηαζ ζοβηεηνζιέκα ηςκ μοδέηενςκ πμθοιμνθμπφνδκςκ ηαζ ηςκ ιμκμηοηηάνςκ ηαηαζηνέθμκηαξ ηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ηαζ πνμηαθχκηαξ μλεζδςηζηυ ζηνεξ ιε απμηέθεζια κα επζθένμοκ ηδ κέηνςζδ ζε αοηά. 54,72,73, Ραμνολιπίδια - μολσζμαηικοί παράγονηες Σα ναικμθζπίδζα πνμηαθμφκ αθθαβέξ ζηδ ιμνθμθμβία ηδξ πθαζιαηζηήξ ιειανάκδξ ηςκ ααηηδνίςκ πμο ηα πανάβμοκ υπςξ ημ ααηηήνζμ P. aeruginosa. 75 οβηεηνζιέκα πνμηαθμφκ ακαζημθή ηδξ ζφκεεζδξ ημο DNA ζε ακενχπζκα επζδενιζηά ηφηηανα πςνίξ κα πνμηαθμφκ πνςιμζςιζηέξ ακςιαθίεξ ηαζ πνμηαθμφκ αθθαβέξ ζηδ θεζημονβία ημο ακενχπζκμο επζεδθίμο ημο πκεφιμκα ιε ιεηαηνμπέξ πμο πνμηαθμφκ ζηζξ εκδζάιεζεξ ζοκδέζεζξ ιεηαλφ ηςκ επζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ. 69,76 Σα ναικμθζπίδζα πνμηαθμφκ απχθεζα ηςκ θζπμπμθοζαηπανζδχκ LPS πμο απμηεθεί ζδιακηζηυ οδνυθζθμ ζοζηαηζηυ ηδξ ηοηηανζηήξ επζθάκεζαξ. Ζ απχθεζα ηςκ LPS έπεζ ςξ απμηέθεζια ηδκ αφλδζδ ηδξ οδνμθμαζηυηδηαξ ημο ηοηηάνμο. 8,77

26 Απυ πηφεθα αζεεκχκ ιε ηοζηζηή ίκςζδ ηαζ ιε εβηαείδνοζδ ημο ααηηδνίμο P. aeruginosa ζημ επζεήθζμ ημο πκεφιμκα ακαηαθφθεδηε ζοζπέηζζδ ιεηαλφ ηςκ αολδιέκςκ επζπέδςκ ναικμθζπζδίςκ ζημ επζεήθζμ ηαζ ηδξ επζδείκςζδξ ηδξ ηθζκζηήξ ηαηάζηαζδξ ημο αζεεκμφξ. 10,78 Σα ναικμθζπίδζα ακαζηέθθμοκ ηδ θεζημονβία ημο ηνμζζςημφ επζεδθίμο ηαζ δδιζμονβμφκ αθάαδ ζημοξ ανυβπμοξ ιεηααάθθμκηαξ ηδκ επζεδθζαηή ιεηαθμνά ζυκηςκ ιέζς ηδξ ιείςζδξ ηδξ απμννυθδζδξ ημο καηνίμο ηαζ ηδξ ιειμκςιέκδξ ηαηεφεοκζδξ ημο πθςνίμο δζαιέζμο ημο ακενχπζκμο ανμβπζημφ επζεδθίμο. 79 H ακηζιζηνμαζαηή δνάζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ αλζμθμβήεδηε ζφιθςκα ιε ηδκ εθάπζζηδ ακαζηαθηζηή ζοβηέκηνςζδ (MIC) δδθαδή ηδ παιδθυηενδ ζοβηέκηνςζδ εκυξ ακηζιζηνμαζαημφ πανάβμκηα πμο ακαζηέθθεζ ηδκ ακάπηολδ ηδξ ιζηνμαζαηήξ ηαθθζένβεζαξ χζηε κα ιπμνεί κα βίκεζ ακηζθδπηυ ιε βοικυ μθεαθιυ. Ζ παιδθυηενδ ηζιή MIC ανέεδηε βζα ηα ααηηήνζα Serratia marcescens (4 ιg/ml), Enterobacter aerogenes (8 ιg/ml), Klebsiella pneumoniae (0,5 ιg/ml), Staphylococcus aureus ηαζ Staphylococcus epidermidis (32 ιg/ml), Bacillus subtilis (16 ιg/ml), Bacillus cereus, Mucor miehei (64 ιg/ml), Neurospora crassa, Micrococcus luteus (256 ιg/ml) ηαζ βζα ηα είδδ θοημπαεμβμκζηχκ ιοηήηςκ: Chaetonium globosum (64 ιg/ml), Penicillium funiculosum (16 ιg/ml), Gliocadium virens (32 ιg/ml) ηαζ Fusarium solani (75 ιg/ml). 80,81 Σα ναικμθζπίδζα πανμοζίαγμοκ ηοηηανμημλζηή δνάζδ έκακηζ ημο ζηεθέπμοξ ΗΗΗΒ ημο ζμφ HIV I, δεκ έπμοκ ηοηηανμημλζηή δνάζδ έκακηζ ηςκ ζχκ ημο απθμφ ένπδηα, ημο ημλάηδ Β2 ηαζ ημο πυθζμ Η. Σα ναικμθζπίδζα δεκ έπμοκ επζδνάζεζξ ζηζξ γφιεξ. 69,82 Σα ναικμθζπίδζα αμδεμφκ ζηδκ ηαηαζημθή ακάπηολδξ ηανηζκζηχκ ηοηηάνςκ ημο ιαζημφ. Πανμοζζάγμοκ αλζμζδιείςηδ ακηζπμθθαπθαζζαζηζηή δναζηδνζυηδηα ζε ηφηηανα ηδξ ηοηηανζηήξ ζεζνάξ MCF-7 ημο ηανηίκμο ημο ιαζημφ ιε εθάπζζηδ ζοβηέκηνςζδ MIC (6,25 ιg/ml). 83, Ραμνολιπίδια ως βιοεπιθανειοδραζηικές οσζίες Σα ναικμθζπίδζα ςξ αζμεπζθακεζμδναζηζηέξ μοζίεξ επζηεκηνχκμκηαζ ζε δζεπαθέξ (ζηενεμφ-οβνμφ, οβνμφ-οβνμφ ή αενίμο-οβνμφ). Έκα υνζμ δζεπζθάκεζαξ οπάνπεζ ιεηαλφ ηςκ δφμ ιδ-ακαιειεζβιέκςκ θάζεςκ. Σμ

27 οδνυθμαμ ιένμξ ζοβηεκηνχκεηαζ ζηδκ επζθάκεζα, εκχ ημ οδνυθζθμ ιένμξ είκαζ πνμζακαημθζζιέκμ πνμξ ημ δζάθοια. 84 (εζηυκα 12) Ζ απμηεθεζιαηζηυηδηα ιζαξ επζθακεζμδναζηζηήξ μοζίαξ πνμζδζμνίγεηαζ απυ ηδκ ζηακυηδηα κα ιεζχκεζ ηδκ επζθακεζαηή ηάζδ. Γζα πανάδεζβια, ιζα ηαθή επζθακεζμδναζηζηή μοζία ιπμνεί κα ιεζχζεζ ηδκ επζθακεζαηή ηάζδ ημο κενμφ απυ ηα 72 ζηα 35 mn/m ηαζ ηδ δζεπζθακεζαηή ηάζδ ιεηαλφ κενμφ ηαζ κ-ελαδεηακίμο ή άθθμο εθαίμο απυ 40 ζηα 1 mn/m. 13,84 Δηθόλα 12: πζζώξεπζε ηωλ ξακλνιηπηδίωλ ζηε δηεπηθάλεηα πγξνύ αέξα 85 Ζ εκενβυηδηα ηςκ επζθακεζμδναζηζηχκ μοζζχκ ζοζπεηίγεηαζ ιε ηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ επζθακεζμ-εκενβχκ ζοζηαηζηχκ ιέπνζ κα επζηεοπεεί δ ηνίζζιδ ζοβηέκηνςζδ ιζηηοθίμο (CMC). Ζ CMC είκαζ δ εθάπζζηδ ζοβηέκηνςζδ ηδξ επζθακεζμδναζηζηήξ μοζίαξ πμο είκαζ απαναίηδηδ βζα ημ ζπδιαηζζιυ ιζηηοθίμο ηαζ επδνεάγεηαζ απυ ημ νζ, ηδ εενιμηναζία ηαζ ηδκ ζμκζηή ζζπφ. ε ζοβηεκηνχζεζξ ιεβαθφηενεξ ηδξ CMC, ηα αζμεπζθακεζμδναζηζηά ιυνζα ζπδιαηίγμοκ ιζηηφθζα, δζπθμζημζαάδεξ ηαζ ηοζηίδζα. (εζηυκα 13) Ο ζπδιαηζζιυξ ιζηηοθίμο ηαεζζηά ζηακέξ ηζξ αζμεπζθακεζμδναζηζηέξ μοζίεξ κα ιεζχζμοκ ηδκ επζθακεζαηή ηαζ ηδ δζεπζθακεζαηή ηάζδ ηαζ κα αολήζμοκ ηδ δζαεεζζιυηδηα ηαζ ηδ δζαθοηυηδηα ηςκ οδνμθμαζηχκ μιάδςκ ηςκ μνβακζηχκ εκχζεςκ.

28 Δηθόλα 13: πζρέηηζε κεηαμύ ζπγθέληξωζεο ξακλνιηπηδίωλ, επηθαλεηαθήο ηάζεο θαη ζρεκαηηζκνύ κηθθπιίνπ. 85 Απμηεθεζιαηζηέξ επζθακεζμδναζηζηέξ μοζίεξ είκαζ αοηέξ πμο έπμοκ παιδθή ηνίζζιδ ζοβηέκηνςζδ ιζηηοθίμο δζυηζ πνεζάγεηαζ ιζηνυηενδ πμζυηδηα βζα κα επζηεοπεεί δ ιείςζδ ηδξ επζθακεζαηήξ ηάζδξ. 84,85 Ζ ζδζυηδηα ηςκ ναικμθζπζδίςκ κα αηζκδημπμζμφκ ημοξ νφπμοξ ζημ έδαθμξ ηα έπεζ ηάκεζ πνήζζια αζμαπμννοπακηζηά ζε πενζπηχζεζξ ζμαανήξ ιυθοκζδξ ημο εδάθμοξ. Οζ εθανιμβέξ αοηέξ ααζίγμκηαζ ζηδκ ζηακυηδηά ημοξ κα παιδθχκμοκ ηδκ επζθακεζαηή ηάζδ, κα αολάκμοκ ηδ δζαθοηυηδηα, ηδκ απμννοπακηζηή ζζπφ, ηδκ ζηακυηδηα οβνμπμίδζδξ ηαζ αθνζζιμφ. Σα ναικμθζπίδζα αολάκμοκ ηδκ δζαθοηυηδηα ηςκ πεηνεθασηχκ ζοζηαηζηχκ ηαζ πνδζζιμπμζμφκηαζ βζα ηδκ επίπθεοζδ μνοηηχκ. 84 Οζ αζμεπζθακεζμδναζηζηέξ μοζίεξ ηαζ ζοβηεηνζιέκα ηα ναικμθζπίδζα αολάκμοκ ηδ αζμδζαεεζζιυηδηα ηςκ οδνμβμκακενάηςκ ιε απμηέθεζια ηδκ εκίζποζδ ηδξ απμζημδυιδζδξ ηςκ οδνμβμκακενάηςκ ζηα ζοζηαηζηά ημοξ πμο ανίζημκηαζ ζε ιμθοζιέκμ πχια. 85 Σα ναικμθζπίδζα πμο πανάβμκηαζ απυ ημ ααηηήνζμ P. aeruginosa ιπμνμφκ κα εκζζπφζμοκ ηδ αζμαπμζημδυιδζδ ηςκ αθηακίςκ (ελαδεηακίμο, μπηαδεηακίμο), ηδξ κ-παναθίκδξ ηαζ ηδξ θαζκακενίκδξ ζε οβνά ιέζα. 8,86 Δπζπθέμκ ιπμνμφκ κα απμιαηνφκμοκ απυ ημ πχια μνβακζηέξ εκχζεζξ υπςξ καθεαθίκδ, ακεναηέκζμ, θαζκαενέκζμ, θθμομνέκζμ, 2,2',5,5'-ηεηναπμθμδζθαζκφθζμ, ηαζ 3,3',4,4',5,5'-ελάπθςνμδζθαζκφθζμ ηαεχξ ηαζ κ-παναθίκδξ. 8,87

29 2.4 Δθαρμογές Ραμνολιπιδίων Περιβαλλονηικός Καθαριζμός Ζ πνήζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ανίζηεζ εθανιμβέξ ζημ πενζαάθθμκ θυβς ηδξ ζδζυηδηάξ ημοξ κα δνμφκ ςξ αζμαπμννοπακηζηά ηαζ ςξ βαθαηηςιαημπμζδηέξ, πμο μθείθεηαζ ζηδ ιείςζδ ηδξ επζθακεζαηήξ ηάζδξ ηαζ βαθαηηςιαημπμίδζδ πμο επζθένμοκ, ηδξ αζμδζαζπαζζιυηδηάξ ημοξ ηαεχξ ηαζ ηδξ παιδθήξ ημλζηυηδηαξ πμο έπμοκ ςξ απμηέθεζια ηδκ εκίζποζδ ηδξ αζμαπμζημδυιδζδξ ηαζ δζαθοημπμίδζδ ηςκ εκχζεςκ παιδθήξ δζαθοηυηδηαξ. 84 Ζ δζάποζδ ημο πεηνεθαίμο ζηδ εάθαζζα, είκαζ έκα ιείγμκ πνυαθδια πμο ιπμνεί κα ηαηαζηνέρεζ ηζξ αηηέξ. Σα ναικμθζπίδζα πμο πανάβμκηαζ απυ ημ ααηηήνζμ P. aeruginosa ιπμνμφκ κα δζαζημνπίζμοκ ημ πεηνέθαζμ ζε ιζηνά ζηαβμκίδζα ηαζ κα ημ δζαπςνίζμοκ απυ ημ οδαηζηυ πενζαάθθμκ ιε απμηέθεζια ηδκ εκίζποζδ ηδξ αζμαπμζημδυιδζδξ. ημοξ 25 μ C δ απμδμηζηυηδηα απμιάηνοκζδξ ημο αηαηένβαζημο πεηνεθαίμο λεπενκά ημ 80% πανμοζία ναικμθζπζδίςκ. 88,89,90 Δπίζδξ ανέεδηε υηζ ιέζα ζε 18 διένεξ επζηοβπάκεηαζ δ απμιάηνοκζδ κ-αθηακίςκ ζε πμζμζηυ 96% ιε ημ 80% κα επζηοβπάκεηαζ απυ ηδκ πνχηδ εαδμιάδα. 91 Σμ πμζμζηυ απμζημδυιδζδξ ημο ακεναηεκίμο εκζζπφεηαζ απυ 34% ζε 52% ζε 18 διένεξ ιέζς ηδξ δζαθοημπμίδζδξ ημο ακεναηεκίμο ιε ναικμθζπίδζα. 92 Ζ πνδζζιυηδηα ηςκ ναικμθζπζδίςκ βζα αζμαπμηαηάζηαζδ ημο εδάθμοξ ιμθοζιέκμο απυ αανέα ιέηαθθα ααζίγεηαζ ηονίςξ ζηδκ ζηακυηδηά ημοξ κα ζπδιαηίγμοκ ζφιπθμηα ιε ηα ιέηαθθα ηαζ ζηδ ζοκέπεζα κα ηα απμιαηνφκμοκ απυ ημ έδαθμξ. Σα ακζμκζηά ναικμθζπίδζα δδιζμονβμφκ ζφιπθμηα ιε ιέηαθθα ζε ιδ ζμκηζηή ιμνθή ιε ζμκηζημφξ δεζιμφξ. Αοημί μζ δεζιμί είκαζ ζζπονυηενμζ απυ ημοξ μιυθμβμοξ ημο ιεηάθθμο ιε ημ έδαθμξ ηαζ ηα ζφιπθμηα ιεηάθθμοναικμθζπζδίςκ απμννμθμφκηαζ απυ ηδ ζηενεή ιμνθή ημο εδάθμοξ ζηδ δζαθοηή ιμνθή ημο εδάθμοξ θυβς ηδξ ιείςζδξ ηδξ δζεπζθακεζαηήξ ηάζεςξ. Σα ηαηζμκζηά ναικμθζπίδζα ιπμνεί κα ακηζηαηαζηήζμοκ ηα ίδζα θμνηζζιέκα ζυκηα ιεηάθθμο απυ ημκ ακηαβςκζζιυ βζα ιενζηά, αθθά υπζ υθεξ ηζξ ανκδηζηά θμνηζζιέκεξ επζθάκεζεξ (ακηαθθαβή ζυκηςκ). Σα ιεηαθθζηά ζυκηα ιπμνεί κα απμιαηνοκεμφκ απυ ηζξ επζθάκεζεξ ημο εδάθμοξ ιέζς ηςκ ιζηηοθίςκ ηςκ ναικμθζπζδίςκ. Οζ πμθζηέξ μιάδεξ ηςκ ιζηηοθίςκ ιπμνεί κα δεζιεφζμοκ ηα ιέηαθθα ζημ κενυ. 85 (εζηυκα 14)

30 Δηθόλα 14: Μεραληζκόο δξάζεο ξακλνιηπηδίωλ ζε ρώκα κνιπζκέλν από κέηαιια 85 Ζ ζαπςκίκδ, ιία ζοββεκζηή μοζία πνμξ ηα ναικμθζπίδζα έπεζ ηδκ ζδζυηδηα κα απμιαηνφκεζ ημ ρεοδάνβονμ ηαζ ημ ηάδιζμ απυ ημ πχια. 93 Σα ναικμθζπίδζα ιπμνμφκ κα απμιαηνφκμοκ ιέηαθθα απυ ημ πχια υπςξ ημ ηάδιζμ, ημ παθηυ, ημ ιυθοαδμ ηαζ ημκ ρεοδάνβονμ πάνδ ζηδκ ζηακυηδηά ηδξ ζοιπθμημπμζήζεςξ ιε αοηά. Ζ ζοββέκεζα ιε ηα ιέηαθθα είκαζ ίδζα ή ιεβαθφηενδ απυ αοηή ηςκ μνβακζηχκ μλέςκ ηάηζ πμο ηα ηαεζζηά ζδακζηά βζα απμηαηάζηαζδ ημο εδάθμοξ απυ αανέα ιέηαθθα Αιζθηηική Καλλσνηικά Σα ναικμθζπίδζα ιπμνμφκ κα βαθαηηςιαημπμζήζμοκ ακαιειζβιέκα ζοζηαηζηά, κα ηναηήζμοκ ηα ιίβιαηα ζηαεενά νοειίγμκηαξ ημ ζλχδεξ ημο πνμσυκημξ, κα δζαηδνήζμοκ ηδκ οβναζία, κα θζπάκμοκ ημ δένια, κα πανάβμοκ αθνυ ηαζ κα δνάζμοκ ςξ απμννοπακηζηά βζα ηαεανζζιυ. 142 Σα ναικμθζπίδζα θυβς ηδξ απμννοπακηζηήξ ημοξ δνάζδξ ςξ επζθακεζμδναζηζηέξ μοζίεξ πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδκ ημζιδημθμβία ςξ ζοζηαηζηά ζε εκημιμαπςεδηζηά, πνμσυκηα ηαηά ηδξ πζηονίδαξ, ααθέξ ιαθθζχκ ηαζ πνμσυκηα θνμκηίδαξ, απμζιδηζηά, μδμκηυηνειεξ, πνμσυκηα πενζπμίδζδξ κοπζχκ ηαζ πμδζχκ, ακηζζδπηζηά ηαζ ηνέιεξ λονίζιαημξ. Δπζπθέμκ, ιπμνμφκ κα βαθαηηςιαημπμζήζμοκ ημ ζιήβια ζημοξ πυνμοξ ιε απμηέθεζια ηδ ιείςζδ ηδξ ειθάκζζδξ ηδξ αηιήξ. 142

31 Πνμηζιμφκηαζ έκακηζ ηςκ ζοκεεηζηχκ επζθακεζμδναζηζηχκ μοζζχκ βζαηί πανμοζζάγμοκ παιδθυηενδ ενεεζζηζηυηδηα ηαζ ηαθφηενδ ζοιααηυηδηα ιε ημ δένια. Σα ναικμθζπίδζα ακηζηαεζζημφκ ηα ζοκεεηζηά απμννοπακηζηά SLS (θαονοθμεεζσηυ κάηνζμ) ή SDS (δςδεηοθ-εεζσηυ κάηνζμ) ηαζ SLES (θαμονζημεεζσηυ κάηνζμ) πμο ανίζημκηαζ ζηα πνμσυκηα ηα μπμία έπεζ απμδεζπεεί υηζ είκαζ ενεεζζηζηά ηαζ ηανηζκμβυκα ακηίζημζπα ζε ιεβάθεξ ζοβηεκηνχζεζξ. 8,142 Σα ναικμθζπίδζα έπμοκ πνδζζιμπμζδεεί βζα ηδκ ελάθεζρδ ηςκ νοηίδςκ πμο ειθακίγμκηαζ θυβς πνμπςνδιέκδξ δθζηίαξ ηαζ ζοβηεηνζιέκα ημ ναικμθζπίδζμ (Rha-Rha-C 10 -C 10 ). 94 Σα ναικμθζπίδζα έπμοκ πζζημπμζδεεί ςξ πνμσυκηα δζαηνμθήξ απυ ηδκ Αιενζηακζηή οπδνεζία πνμζηαζίαξ Πενζαάθθμκημξ ηαζ έπμοκ ζοιπενζθδθεεί ζηδ Γζεεκή μκμιαημθμβία ηςκ ζοζηαηζηχκ ηαθθοκηζηχκ Βιοιαηρική Σα ναικμθζπίδζα έπμοκ πμζηίθεξ εθανιμβέξ ζηδ αζμσαηνζηή πμο μθείθεηαζ ζηδκ ηοηηανμημλζηή ημοξ δνάζδ ηαζ θοηζηή δνάζδ ηςκ ηοηηάνςκ ημο ακενχπζκμο μνβακζζιμφ ιέζς ηςκ αθθαβχκ πμο επζθένμοκ ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ηςκ ηοηηάνςκ αθθά ηαζ ζηδκ ακηζααηηδνζαηή, ακηζσηή ηαζ ακηζιοηδηζαηή ημοξ δνάζδ. 34 Σα ναικμθζπίδζα πανμοζζάγμοκ ακηζιοηδηζαηή δνάζδ ηαζ ηονίςξ ημ ναικμθζπίδζμ (Rha-Rha-C 10 -C 10 ) ακαζηέθθμκηαξ ηδκ ακάπηολδ ηςκ ιοηήηςκ ζε ηαθθζένβεζα υπςξ ηςκ ιοηήηςκ Alternaria alternata, Alternaria mali, Aspergillus niger, Aureobasidium pullulans, Botrytis cinerea, Candida albicans, Cercospora kikuchii, Chaetonium globosum, Cladosporium cucumerinum, Colletotrichum orbiculare, Cylindrocarpon destructans, Didymella bryoniae, Fusarium solani, Fusarium sp., Gliocadium virens, Magnaporthe grisea, Mucor miehei, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Rhizoctonia solani ηαζ ιεζχκμκηαξ ηζξ ανκδηζηέξ επζπηχζεζξ ηδξ αζεέκεζαξ απυ ημοξ ιήηοηεξ Phytophthora sp. ηαζ Pythium sp.. 9 Σα ναικμθζπίδζα πανμοζζάγμοκ ακηζααηηδνζαηή δνάζδ ηαζ ηονίςξ ημ ναικμθζπίδζμ (Rha-Rha-C 10 -C 10 ) ακαζηέθθμκηαξ ηδκ ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ ζε ηαθθζένβεζα υπςξ ηςκ ανκδηζηχκ ηαηά Gram ααηηδνίςκ Enterobacter

32 aerogenes, Erwinina carotovora, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Ralstonia solanacearum, Salmonella thyphimurium, Serratia marcescens, Xanthomonas campestris ηαζ ηςκ εεηζηχκ ηαηά Gram ααηηδνίςκ Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus faecalis, Micrococcus lysodeikticus. 9,36 Σα ναικμθζπίδζα έπμοκ πνδζζιμπμζδεεί βζα κα ελαζθαθζζηεί δ επμφθςζδ πθδβχκ ιε ίκςζδ αθθά ηαζ εβηαοιάηςκ, βζα ηδ εεναπεία ηαζ ηδκ πνυθδρδ απυ αεδνμζηθήνςζδ, βζα ηδκ πανειπυδζζδ απμαμθήξ ιεηαιμζπεοιέκςκ μνβάκςκ, βζα ηδ εεναπεία δζακμδηζηχκ δζαηαναπχκ υπςξ ζπζγμθνέκεζα ηαζ ηαηάεθζρδ, βζα ηδ εεναπεία απυ ηα ζδιάδζα βήνακζδξ υπςξ μζ νοηίδεξ. Σμ ναικμθζπίδζμ πμο έπεζ πνμηζιδεεί βζα ηζξ δζαδζηαζίεξ αοηέξ είκαζ ημ (Rha-Rha-C 10 -C 10 ) ηονίςξ θυβς ηδξ απμηεθεζιαηζηυηδηάξ ημο ζηδκ επακεπζεδθίςζδ ημο δένιαημξ ζε ιδ ειανοσημφξ ζζημφξ ηαζ ηδκ πανειπυδζζδ ηδξ παναβςβήξ ηοηηανμηζκχκ ιε απμηέθεζια ηδκ πανειπυδζζδ ημο ζμη απυ έβηαοια. 94 Σα ναικμθζπίδζα υηακ πνδζζιμπμζδεμφκ εκδμνζκζηά ζε έκα άημιμ ιε αθθενβζηή νζκίηζδα πανέπμοκ βνήβμνδ ηαζ παναηεηαιέκδ ακαημφθζζδ βζα πενζζζυηενμ απυ 12 χνεξ αεθηζχκμκηαξ ηδ νζκυννμζα, ηδ νζκζηή ζοιθυνδζδ, ηδ θαβμφνα, ημ θηένκζζια, ημκ πμκυθαζιμ, ημκ πμκμηέθαθμ ηαζ βεκζηά ημ αίζεδια ηαημοπίαξ. Πανυιμζεξ επζδνάζεζξ είπακ ηαζ ζε άημια ιε ιμθοζιαηζηή ή ιδ-αθθενβζηή νζκίηζδα ηαεχξ ηαζ ιε ζβιμνίηζδα. 95 Γζα ηδ εεναπεία ηδξ νζκίηζδαξ ηαζ ηδξ ζβιμνίηζδαξ πνδζζιμπμίδεδηακ δφμ ιέεμδμζ εεναπείαξ ζηζξ μπμίεξ ζοιιεηέπμοκ ηαζ ηα ναικμθζπίδζα. ηδκ πνχηδ ιέεμδμ πναβιαημπμζήεδηε πμνήβδζδ ζημ άημιμ εκδμ-νζκζηά ιζαξ δναζηζηήξ πμζυηδηαξ ναικμθζπζδίςκ εκχ ζηδ δεφηενδ ιέεμδμ πναβιαημπμζήεδηε πμνήβδζδ ζημ άημιμ εκδμ-νζκζηά ιζαξ δναζηζηήξ πμζυηδηαξ ναικμθζπζδίςκ ηαζ ιζαξ δναζηζηήξ πμζυηδηαξ εκυξ ημνηζημζηενμεζδμφξ ή εκυξ ακηζσζηαιζκζημφ ή εκυξ ακηαβςκζζηή θεοημηνζεκίμο ή εκυξ απμζοιθμνδηζημφ ή μπμζμζδήπμηε ζοκδοαζιυξ αοηχκ. Σα ναικμθζπίδζα πμο έπμοκ πνμηζιδεεί βζα ηζξ δζαδζηαζίεξ αοηέξ είκαζ ημ (Rha- Rha-C 10 -C 10 ) ηαζ ημ (Rha -C 10 -C 10 ). 95 Σα ναικμθζπίδζα έπμοκ πνδζζιμπμζδεεί ςξ εκενβά ζοζηαηζηά εκυξ ιίβιαημξ βζα ζημπεοιέκδ εεναπεία αοημάκμζςκ αζεεκεζχκ υπςξ δ ρςνίαζδ,

33 μ ζοζηδιαηζηυξ ενοεδιαηχδδξ θφημξ ιε απμηαηάζηαζδ ημο ακμζμπμζδηζημφ ζοζηήιαημξ ηαεχξ ηαζ ημο AIDS, ηδξ κυζμο Alzheimer ηαζ Parkinson. Αοηυ μθείθεηαζ θυβς ηδξ ακαζημθήξ εκγφιςκ υπςξ ηδξ θζπμλοβεκάζδξ, ηδξ αηεηοθπμθζκεζηενάζδξ ηαζ ηζξ επζπηχζεζξ πμο θένμοκ ζηδκ ακαζημθή ηδξ ζφκεεζδξ ημο DNA, ζηδκ ηοηηανμημλζηυηδηα, ζηδκ ηαηαζημθή ημο πμθθαπθαζζαζιμφ ηςκ Β ηαζ Σ-θειθμηοηηάνςκ ηαεχξ ηαζ ζηδκ ακαζημθή ηςκ οπμδμπέςκ ηδξ κημπαιίκδξ. Ζ πμνήβδζδ ιπμνεί κα βίκεζ ιε πμθθμφξ ηνυπμοξ ηαζ δ εεναπεοηζηή δυζδ βζα εκήθζηα άημια οπμθμβίζηδηε ιεηαλφ 100 mg ιε 1000 mg ηδκ διένα. 69 Σα ναικμθζπίδζα ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ βζα ηδκ ηαηαζηεοή θζπμζςιάηςκ ηα μπμία ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ ςξ θμνείξ θανιάηςκ Δλαζηάζη Ζ εθαζηάζδ απμηεθεί έκακ ζδιακηζηυ ιμθοζιαηζηυ πανάβμκηα ημο ααηηδνίμο P. aeruginosa. 96 οβηεηνζιέκα είκαζ έκα έκγοιμ πμο εηηνίκεηαζ ζημ ελςηοηηάνζμ οβνυ απυ ημ ααηηήνζμ P. aeruginosa. Πενίπμο ημ 85% ηςκ ζηεθεπχκ ηδξ P. aeruginosa πανάβμοκ απυ ιζα πνςηεάζδ ιε εθαζημθοηζηή δναζηδνζυηδηα. 97 Δίκαζ έκα πνςηεμθοηζηυ έκγοιμ ημ μπμίμ δζαζπά ηονίςξ εθαζηίκδ αθθά ιπμνεί κα οδνμθφζεζ ηαζ ηαγεΐκδ, αζιμβθμαίκδ, αθαμοιίκδ ααβμφ, ζκχδεξ ηαζ ιενζηά είδδ ημθθαβυκμο. 98,99 Γεκ έπεζ δνάζδ ζε ίκεξ ααιααηζμφ. οκεεηζηά οπμζηνχιαηα δεκ οδνμθφμκηαζ απυ ημ έκγοιμ. Ζ εθαζηάζδ είκαζ ζηαεενή ζε ph ιεηαλφ 6 ηαζ 10 ιε αέθηζζημ ph βζα ηδκ εθαζημθοηζηή ηαζ βζα ηδκ πνςηεμθοηζηή δναζηδνζυηδηα πενίπμο ζημ 8 ηαζ είκαζ ακεεηηζηή ζε ορδθή εενιμηναζία ιέπνζ ημοξ 70 μ C. 98 Σμ έκγοιμ είκαζ μιυθμβμ ηδξ παβηνεαηζηήξ εθαζηάζδξ αθθά δζαθένεζ απυ ηδκ εθαζηάζδ άθθςκ εζδχκ ααηηδνίςκ υπςξ ημ Flavobacterium. 98 Ζ απυδμζδ ηδξ εθαζηάζδξ ηδξ P.aeruginosa ςξ εθαζημθοηζηυ έκγοιμ είκαζ ιζηνή ηαζ είκαζ πενίπμο ημ έκα ηέηανημ ηδξ απυδμζδξ ηδξ εενιμθοζίκδξ ημο ααηηδνίμο Bacillus thermoproteolyticus ηαζ ημ έκα έαδμιμ ηδξ απυδμζδξ ηδξ εθαζηάζδξ ηςκ μοδεηενμθίθςκ ηοηηάνςκ. 100 ε ακηίεεζδ ιε ηδκ εθαζημθοηζηή ηδξ δνάζδ, δ πνςηεμθοηζηή ηδξ δνάζδ είκαζ πμθφ ζζπονή ηαζ ζοβηεηνζιέκα ηέζζενζξ θμνέξ πζμ δναζηζηή ζηδκ οδνυθοζδ ηαγεΐκδξ ζε ζπέζδ ιε ηδ

34 ενορίκδ ηαζ δέηα θμνέξ πζμ δναζηζηή ζε ζπέζδ ιε ηδκ αθηαθζηή πνςηεσκάζδ ηδξ P.aeruginosa Γομή Βιοζύνθεζη ελαζηάζης Ζ εθαζηάζδ πανάβεηαζ ανβά ζηδ θμβανζειζηή θάζδ ημο ηφηθμο ακάπηολδξ ημο ααηηδνίμο P. aeruginosa ηαζ έπεζ πενζζζυηενα απυ έκα εκενβά ηέκηνα ακά ιυνζμ. 98,100 Δίκαζ ιία ιεηαθθμπνςηεάζδ πμο πενζέπεζ ρεοδάνβονμ. 97,100 Απαναίηδηα ζοζηαηζηά βζα ηδ ζφκεεζδ ημο εκγφιμο είκαζ δ βθοηυγδ, ηνία αιζκμλέα, ζίδδνμξ ηαζ ρεοδάνβονμξ. Έπεζ ελεζδίηεοζδ ζε οδνυθμαα αιζκμλέα ζημ αιζκμηεθζηυ άηνμ ηδξ εέζδξ δζάζπαζδξ. 97 Ζ εθαζηάζδ εηηνίκεηαζ απυ ημ ααηηήνζμ P. aeruginosa ζημκ ελςηοηηάνζμ πχνμ ιέζς ημο ζοζηήιαημξ έηηνζζδξ ηφπμο ΗΗ. 110 οβηεηνζιέκα, ζοκηίεεκηαζ ςξ έκα ιεβαθφηενμ πνυδνμιμ ιυνζμ πμο μκμιάγεηαζ πνμεθαζηάζδ ιε ιμνζαηυ αάνμξ 60 kda. Ζ πνμεθαζηάζδ πανάβεηαζ απυ ιζα ιμκαδζηή αθθδθμοπία πμο ηςδζημπμζείηαζ απυ ημ βμκίδζμ lasb. 100 Καηά ηδκ είζμδμ ηδξ πνμεθαζηάζδξ ζηδκ πθαζιαηζηή ιειανάκδ ημο ηοηηάνμο πάκεηαζ δ αημθμοεία ζήιαημξ ηαζ δ πνμεθαζηάζδ ιεηαηνέπεηαζ ζε πνμεθαζηάζδ Η ιμνζαημφ αάνμοξ 52 kda. Ζ ιεηαηυπζζδ δζαιέζμο ηδξ εζςηενζηήξ ιειανάκδξ εθέβπεηαζ απυ ημ ιδπακζζιυ Sec. Ζ πνμεθαζηάζδ Η ιε αοημηαηαθοηζηή δζαδζηαζία ιεηαηνέπεηαζ ζε πνμεθαζηάζδ ΗΗ ιμνζαημφ αάνμοξ 33 kda ηαζ ζε έκα πνμπεπηίδζμ 19 kda. Σμ πεπηίδζμ είκαζ ζοκδεδειέκμ ιδ μιμζμπμθζηά ιε ηδκ πνμεθαζηάζδ ΗΗ ιε απμηέθεζια ηδκ ακαζημθή ηδξ πνςηεςθοηζηήξ δναζηδνζυηδηαξ. Καηά ηδκ έλμδμ ηδξ πνμεθαζηάζδξ ΗΗ απυ ηδκ ελςηενζηή ιειανάκδ ζημκ ελςηοηηάνζμ πχνμ ιεηαηνέπεηαζ ζηδκ εκενβή ηδξ ιμνθή, ηδκ εθαζηάζδ, ιμνζαημφ αάνμοξ 30 kda ιε ηαοηυπνμκμ δζαπςνζζιυ ηαζ απμζημδυιδζδ ημο πνμπεπηζδίμο. 100,101 Ζ έηηνζζδ απυ ηδκ πενζπθαζιαηζηή πενζμπή εθέβπεηαζ απυ έκα ζφιπθμημ δχδεηα πνςηεσκχκ πμο ηςδζημπμζμφκηαζ απυ ηα xcp βμκίδζα. 101 Ζ πενζπθαζιαηζηή εθαζηάζδ ζηδ P.aeruginosa είκαζ εθαζημθοηζηά ακεκενβή ηαζ ιεηαηνέπεηαζ ζε εκενβή ιμνθή υηακ ελέθεεζ απυ ημ ηφηηανμ ζε ακηίεεζδ ιε ηδκ εθαζηάζδ ζημ ααηηήνζμ E.coli πμο είκαζ εκενβή ηαζ ιέζα ζημ ηφηηανμ. 100

35 Σμ βμκίδζμ lasb ηςδζημπμζεί ημ έκγοιμ εθαζηάζδ. Σμ ζφζηδια αζζεδηδνίμο απανηίαξ πχνμο (las ζφζηδια) νοειίγεζ ηδκ έηθναζδ ημο βμκζδίμο lasb ιέζς ημο νοειζζηζημφ ιεηαβναθζημφ ιμνίμο LasR ηαζ ημο αοημεπαβςβέα LasI,ηδ Ν-αηοθμιμζενίκδ θαηηυκδ. 96,100,102 Δπζπθέμκ νοειίγεζ ηαζ ηδκ έηθναζδ ημο βμκζδίμο lasα πμο είκαζ ιζα πνςηεάζδ πμο έπεζ ηαζ εθαζημθοηζηή δναζηδνζυηδηα ηαζ πανάβεηαζ ζηδκ εκενβή ηδξ ιμνθή απμοζία ζπδιαηζζιμφ ηδξ εθαζηάζδξ ή ηδξ αθηαθζηήξ πνςηεσκάζδξ. 103 Σμ lasr ιε ημ lasb δεκ ζπδιαηίγμοκ μπενυκζμ. 100 Πένα απυ ηδκ Ν-αηοθμιμζενίκδ θαηηυκδ, οπάνπεζ ηαζ έκα άθθμ ζδιαημδμηζηυ ιυνζμ δ 2-επηοθ-3-φδνμλο-4-ηζκμθίκδ (PQS) δ μπμία ιπμνεί κα εκενβμπμζήζεζ ημ βμκίδζμ lasb ηονίςξ ζηδ ζηαηζηή θάζδ ακάπηολδξ. 104 Τρδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ αθάηςκ NaCl ιπμνεί κα επδνεάγμοκ ηδ δμιή ηδξ εθαζηίκδξ ιε απμηέθεζια ηδκ απχθεζα ηδξ εθαζημθοηζηήξ δναζηδνζυηδηαξ υπζ υιςξ ηαζ ηδξ πνςηεμθοηζηήξ δναζηδνζυηδηαξ. 98 Ζ εθαζηάζδ δεκ εκενβμπμζείηαζ ζε παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ αζαεζηίμο, ιαβκδζίμο αθθά ακαζηέθθεηαζ ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ αοηχκ ηαεχξ ηαζ ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ζζδήνμο ζημ ενεπηζηυ οθζηυ. 97,105 Τρδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ ιεηαθθζηχκ ζυκηςκ υπςξ κζηέθζμ, ηάδιζμ, ημαάθηζμ, ρεοδάνβονμξ ηαζ οδνάνβονμξ ακαζηέθθμοκ ηυζμ ηδκ πνςηεμθοηζηή δναζηδνζυηδηα υζμ ηαζ ηδκ εθαζημθοηζηή δναζηδνζυηδηα ηδξ εθαζηάζδξ. 97, Γράζεις ηης ελαζηάζης Ζ εθαζηάζδ πνμηαθεί ηαηαζηνμθή ζημκ επζεδθζαηυ θναβιυ ιε απμηέθεζια ηδ δζείζδοζδ ηςκ ααηηδνίςκ ηαζ ηδκ πνμαβςβή ηδξ ιυθοκζδξ απυ ηα ααηηήνζα. 106 οβηεηνζιέκα, αολάκεζ ηδκ παναηοηηανζηή δζαπεναηυηδηα ηςκ επζεδθζαηχκ ζοκδέζεςκ ιέζς ακαηαηακμιήξ ή απμζημδυιδζδξ ηςκ εκδζάιεζςκ ζοκδέζεςκ ζε επζεδθζαηά ηφηηανα ηςκ ανυβπςκ ηαζ ηςκ ηορεθίδςκ ημο πκεφιμκα. 106,107 Γνα ζοκενβαζηζηά ιε ηδκ αθηαθζηή πνςηεάζδ απεκενβμπμζχκηαξ ηοημηίκεξ ημο ακενχπζκμο ακμζμπμζδηζημφ ζοζηήιαημξ υπςξ δ ζκηενθενυκδ β ηαζ μ πανάβμκηαξ TNF-a. 96,108 Ζ εθαζηάζδ είκαζ επίζδξ οπεφεοκδ βζα ηδκ ηαηαζηνμθή ανηδνζαηχκ εθαζηζηχκ ζημζαάδςκ ζε αββεζΐηζδα πμο πνμηαθείηαζ ζε πενζπηχζεζξ ζδραζιίαξ απυ ημ ααηηήνζμ P. aeruginosa. 97,109 Γζα ημ θυβμ αοηυ,

36 πναβιαημπμζήεδηε δ δδιζμονβία ακηζζςιάηςκ έκακηζ ηδξ εθαζηάζδξ ηδξ P. aeruginosa πμο δεκ ακηζδνμφκ ιε ηδκ εθαζηάζδ ηςκ μοδεηενυθζθςκ ηοηηάνςκ ή ηδκ παβηνεαηζηή εθαζηάζδ βζα ημκ ηαεμνζζιυ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηδξ εθαζηάζδξ ζε δείβιαηα πηοέθςκ απυ αζεεκείξ ιε πκεοιμκζηέξ θμζιχλεζξ. Σα ακηζζχιαηα ανέεδηε επζπθέμκ υηζ ιπθμηάνμοκ ηαζ ηδκ επίδναζδ ηδξ εθαζηάζδξ ζηδ θεζημονβία ημο επζεδθζημφ θναβιμφ Ραμνολιπίδια και Δλαζηάζη Σα ναικμθζπίδζα ηαζ δ εθαζηάζδ είκαζ ιμθοζιαηζημί πανάβμκηεξ πμο εηηνίκμκηαζ ζημ ελςηοηηάνζμ οβνυ απυ ημ ααηηήνζμ P. aeruginosa. 110 Ζ έηθναζδ ηςκ παναβυκηςκ αοηχκ νοειίγεηαζ ηαζ αθθδθμεπζηαθφπηεηαζ απυ ημ ζφζηδια αζζεδηδνίμο απανηίαξ πχνμο QS ημο ααηηδνίμο. οβηεηνζιέκα, ημ ζφζηδια rhl πμο νοειίγεζ ηδκ παναβςβή ηςκ ναικμθζπζδίςκ ιπμνεί κα εκενβμπμζήζεζ ηαζ ημ βμκίδζμ lasb πμο πανάβεζ ηδκ εθαζηάζδ. 76,102 Σα ναικμθζπίδζα δεκ έπμοκ επίδναζδ ζηδ θεζημονβία ηδξ εθαζηάζδξ Πσοκσανίνη Ζ πομηοακίκδ είκαζ ιία θαζκαγίκδ, ιζα ιπθε-πνάζζκδ πνςζηζηή ηαζ έκαξ εκενβυξ μλεζδμακαβςβζηυξ ιμθοζιαηζηυξ πανάβμκηαξ πμο πανάβεηαζ απυ ημ ααηηήνζμ P.aeruginosa. 111,112,113 Ακζπκεφεηαζ ζημ ηοηηανζηυ ημίπςια ημο ααηηδνίμο ηαζ ζημ ελςηοηηάνζμ οβνυ. 114 Έπεζ ιζηνυ ιμνζαηυ αάνμξ 210 kda ηαζ ιπμνεί κα δζαπέεηαζ βνήβμνα ακάιεζα ζηα ιεζεβποιαηζηά ηφηηανα. 115 Δηθόλα 15: Γνκή ππνθπαλίλεο Γομή Βιοζύνθεζη πσοκσανίνης Ζ πομηοακίκδ είκαζ ιζα θαζκαγίκδ πνςζηζηήξ ιπθε, ζοβηεηνζιέκα δ Ν- ιέεοθ-1-φδνμλο-θαζκαγίκδ ηαζ έπεζ ιμνζαηυ αάνμξ 210,23 KDa. 116 (εζηυκα 15) Ζ πομηοακίκδ πανάβεηαζ απυ ηδκ ηίηνζκδ θαζκαγίκδ-1-ηαναμλοθζηυ μλφ (PCA) ιέζς δφμ ζηαδίςκ πμο ηαεμνίγμκηαζ απυ ηα βμκίδζα phzm ηαζ phzs.

37 Ζ θαζκαγίκδ PCA πανάβεηαζ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ θμβανζειζηήξ θάζδξ ημο ηφηθμο ακάπηολδξ ημο ααηηδνίμο P. aeruginosa. Σμ ααηηήνζμ P. aeruginosa δζαεέηεζ δφμ ακηίβναθα ημο μπενμκίμο ηδξ θαζκαγίκδξ, ημ phza1b1c1d1e1f1g1 ηαζ ημ phza2b2c2d2e2f2g2 ηα μπμία πανάβμοκ ηδ θαζκαγίκδ PCA απυ πςνζζιζηυ μλφ. ηδ ζοκέπεζα, ημ πνμσυκ ημο βμκζδίμο phzm, δ SAM ελανηχιεκδ ιεεοθηνακζθενάζδ πνμζεέηεζ ιζα Ν-ιεεοθζηή μιάδα ζηδ θαζκαγίκδ-1-ηαναμλοθζηυ μλφ ιε παναβςβή ηδξ 5- ιεεοθθαζκαγίκδ-1-ηαναμλοθζηυ μλφ αδηαΐκδξ. Σέθμξ, ημ πνμσυκ ημο βμκζδίμο phzs, δ οδνμλοθάζδ ελανηχιεκδ απυ NADH εζδζηή βζα ηδ θαζκαγίκδ ιεηαηνέπεζ ηδ 5-ιεεοθθαζκαγίκδ-1-ηαναμλοθζηυ μλφ αεηαΐκδ ζε πομηοακίκδ ιε οδνμλοθζηή απμηαναμλοθίςζδ. 113,117,118 Δηθόλα 16: Μεραληζκόο ζύλζεζεο ππνθπαλίλεο ζην βαθηήξην P.aeruginosa Γράζεις ηης πσοκσανίνης Ζ πομηοακίκδ αάθεζ ηα ααηηήνζα ηαζ ημ ενεπηζηυ ιέζμ ζημ μπμίμ πνμζηίεεηαζ ιπθε-πνάζζκμ ηαζ ζοκεζζθένεζ ζδιακηζηά ζηδκ ηαηαζηνμθή ηςκ πκεοιυκςκ ζε πνυκζα ιυθοκζδ ιε ημ ααηηήνζμ P.aeruginosa ζε αζεεκείξ ιε ανμβπεηηαζία. Ακαζηέθθεζ ζοβηεηνζιέκα ηδ αθεθανζδςηή ηίκδζδ ηςκ επζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ηςκ ηορεθίδςκ ημο πκεφιμκα ηαζ εκζζπφεζ ηδκ παναβςβή ημο οπενμλεζδίμο ημο οδνμβυκμο. 117,119 Ζ πομηοακίκδ εηεέηεζ ηα εκδμεδθζαηά ηφηηανα ζε μλεζδςηζηυ ζηνεξ ιέζς ηδξ ηαηακάθςζδξ ημο ΝΑDPH ηαζ ηδξ παναβςβήξ εθεοεένςκ νζγχκ οπενμλεζδίμο ηαζ οπενμλεζδίμο ημο οδνμβυκμο ηα μπμία μδδβμφκ ζηδκ μλείδςζδ ηδξ εκδμηοηηανζηήξ βθμοηαεεζυκδξ ηαζ αφλδζδ ηςκ εκδμηοηηανζηχκ επζπέδςκ ηςκ δζζμοθθζδίςκ. 111,120 Ζ οπενμλεζδάζδ ηδξ βθμοηαεεζυκδξ ελμοδεηενχκεζ ηα οπενμλείδζα πνδζζιμπμζχκηαξ ηδ βθμοηαεεζυκδ ςξ πδβή δθεηηνμκίςκ. 120

38 Ζ πομηοακίκδ έπεζ ηαζ δζεβενηζηέξ ηαζ ηαηαζηαθηζηέξ επζδνάζεζξ ζε ηοηηανζηέξ απμηνίζεζξ ιε απμηέθεζια κα ακαζηέθθεηαζ δ εζδζηή ακμζμαζμθμβζηή απυηνζζδ αθθά ηαοηυπνμκα κα εκζζπφμκηαζ μζ ιδ εζδζηέξ θθεβιμκχδεζξ ακηζδνάζεζξ μζ μπμζέξ ιπμνεί κα μδδβήζμοκ ζε εακαηδθυνεξ επζδνάζεζξ ζε ιμθοζιέκα άημια. 116 Ζ παναβςβή θαζκαγζκχκ ηαζ ζοβηεηνζιέκα πομηοακίκδξ είκαζ ηαεμνζζηζηυξ πανάβμκηαξ βζα ηδκ έηααζδ ηδξ ιυθοκζδξ απυ ημ ααηηήνζμ P. aeruginosa ζημοξ πκεφιμκεξ αζεεκχκ ιε ηοζηζηή ίκςζδ. 112,121 οβηεηνζιέκα, επζηαπφκεζ ηδκ απυπηςζδ ηςκ μοδεηενμθίθςκ in vitro ηαζ ηαηαζηέθθεζ ηδκ απμηνζκυιεκδ μλεία θθεβιμκή ζηδ ιυθοκζδ απυ ημ ααηηήνζμ P. aeruginosa ζημοξ πκεφιμκεξ ιε απμηέθεζια ηδκ εβηαείδνοζδ ηςκ ααηηδνίςκ. 112,122 Γεκ πνμηαθεί ηδκ απυπηςζδ ηςκ επζεδθζαηχκ ηοηηάνςκ ηαζ ηςκ πμθοιμνθμπφνδκςκ ιαηνμθάβςκ ηοηηάνςκ. 112 Πανμοζζάγεζ ακαζηαθηζηή επίδναζδ ζηδκ ακμζμαζμθμβζηή απυηνζζδ ιέζς ακαζημθήξ ηδξ ζφκεεζδξ ημο DNA ηςκ Σ ηαζ Β θειθμηοηηάνςκ, ηδξ ζκηενθεοηίκδξ 2 απυ ηα Σ θειθμηφηηανα, ηςκ ακμζμζθαζνζκχκ απυ ηα Β θειθμηφηηανα ηαζ ηςκ ηοηηανμηζκχκ απυ ηα ιμκμηφηηανα. 116 Ακαζηέθθεζ ηδκ απυηνζζδ ηςκ Σ θειθμηοηηάνςκ ζηα ακηζβυκα ιε ηδ αμήεεζα ηδξ ιείςζδξ ηςκ οπμδμπεχκ IL- 2R ηδξ ζκηενθεοηίκδξ 2 ζηδκ επζθάκεζα ηςκ ηοηηάνςκ αθθά ηαοηυπνμκα δζεβείνεζ ηδκ έηηνζζδ ηδξ ζκηενθεοηίκδξ ,117,123,124 Ζ πομηοακίκδ απμηεθεί έκακ δναζηζηυ απμδέηηδ δθεηηνμκίςκ πμο ιπμνεί κα πανειααίκεζ ζηδκ μλεζδμακαβςβζηά εοαίζεδηδ παναβςβή πνμζηακμεζδχκ ζημ εκδμεήθζμ αθθάγμκηαξ ημ μλεζδμακαβςβζηυ δοκαιζηυ. Ακαζηέθθεζ ηδκ παναβςβή πνμζηαηοηθίκδξ απυ ηα εκδμεδθζαηά ηφηηανα ηδξ πκεοιμκζηήξ ανηδνίαξ πςνίξ κα πνμηαθεί θφζδ ηςκ ηοηηάνςκ. Ζ πομηοακίκδ ιπμνεί κα ιεζχζεζ ηδκ απεθεοεενχζδ ηδξ πνμζηαβθακδίκδξ PGI 2 ιέζς ακαζημθήξ ηδξ απεθεοεένςζδξ ημο αναπζδμκζημφ μλέμξ απυ ηα θςζθμθζπίδζα ή ιε ακαζημθή ηδξ ζφκεεζδ ηδξ PGI 2 απυ ημ αναπζδμκζηυ μλφ. 115 Ακ ηαζ δεκ οπάνπεζ ζοβηεηνζιέκδ εεναπεοηζηή ζηυπεοζδ έκακηζ ηδξ πομηοακίκδξ, δ έηποζδ βθμοηαεεζυκδξ ιέζς αενμδζαθφιαημξ ηαζ δ πμνήβδζδ ζοιπθδνςιαηζημφ ζπήιαημξ ακηζμλεζδςηζηχκ αεθηζχκεζ ηδκ ηαηάζηαζδ ηςκ πκεοιυκςκ ζε αζεεκείξ ιε ηοζηζηή ίκςζδ. 110,125,126

39 4.3 Ραμνολιπίδια και Πσοκσανίνη Ζ έηθναζδ ηδξ πομηοακίκδξ ηαζ ηςκ ναικμθζπζδίςκ νοειίγεηαζ ηαζ αθθδθμεπζηαθφπηεηαζ απυ ημ ζφζηδια αζζεδηδνίμο απανηίαξ πχνμο QS ημο ααηηδνίμο P. aeruginosa. 127 Σα ζοζηήιαηα βμκζδίςκ las ηαζ rhl ειπθέημκηαζ ζηδ νφειζζδ ηδξ παναβςβήξ ηδξ θαζκαγίκδξ ηαζ εθέβπμοκ ημ έκα ακηίβναθμ phza1b1c1d1e1f1g1 ημο μπενμκίμο ηδξ θαζκαγίκδξ. Σμ άθθμ ακηίβναθμ phza2b2c2d2e2f2g2 ημο μπενμκίμο ηδξ θαζκαγίκδξ νοειίγεηαζ απυ ημκ πανάβμκηα QscR πμο είκαζ πανυιμζμξ ιε ημοξ πανάβμκηεξ lasr ηαζ RhlR ηςκ ζοζηδιάηςκ las ηαζ rhl ακηίζημζπα. Ο πανάβμκηαξ QscR νοειίγεζ ανκδηζηά ηδκ έηθναζδ βμκζδίςκ πμο εθέβπμκηαζ απυ ημ ζφζηδια las ιέζς ηαηαζημθήξ ημο βμκζδίμο lasi ηαζ ζοκεπχξ ηαζ ημο ακηζβνάθμο phza1b1c1d1e1f1g1 ιε απμηέθεζια ηδ δοκαηυηδηα ιεβαθφηενδξ εοθοβζζίαξ ημο ααηηδνίμο ζηδ νφειζζδ παναβςβήξ ηδξ θαζκαγίκδξ πανμοζία ηςκ δφμ δζαθμνεηζηχκ μπενμκίςκ αζμζφκεεζήξ ηδξ. 118

40 ΤΛΗΚΑ ΚΑΗ ΜΔΘΟΓΟΗ 1. Δπζθμβή ιζηνμμνβακζζιμφ Γζα ηδκ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ, πνδζζιμπμζήεδηε ημ ζηέθεπμξ ΖΒ8 ημο ααηηδνίμο Thermus thermophilus ηαζ ημ ζηέθεπμξ BL21-DE3 ημο ααηηδνίμο Escherichia coli. 2. Ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζε Κακμκζηυ Μέζμ Ακάπηολδξ Ανπζηά βίκεηαζ ακααίςζδ ηςκ ηοηηάνςκ T. thermophilus απυ ημ ηνομζοκηδνδιέκμ δείβια ζε ηακμκζηυ ιέζμ ακάπηολδξ πμο ημπμεεηείηαζ ζε μβημιεηνζηή θζάθδ. Σμ κανονικό μέζο ανάπηςξηρ απμηεθείηαζ απυ: 1. Δηπφθζζια γφιδξ 0.3% (w/v) 2. Σνοπηυκδ 0.5% (w/v) 3. NaCl 0.2% (w/v) 4. FeCl 3 2 ιm 5. CaCl mm 6. MgCl 2 1 mm 7. Γθοηυγδ 0.1% (w/v) Ζ δζάθοζδ ηςκ παναπάκς μοζζχκ βίκεηαζ ζε απεζηαβιέκμ κενυ ηαζ ημ ηεθζηυ δζάθοια νοειίγεηαζ ζε ph 7 ιε NaOH 5N. ηδ ζοκέπεζα ημ δζάθοια απμζηεζνχκεηαζ ιέζα ζηδκ μβημιεηνζηή θζάθδ. H βθοηυγδ πνμζηίεεηαζ ιεηά ηδκ απμζηείνςζδ ημο δζαθφιαημξ βζα κα απμθεοπεεί δ ηαναιεθμπμίδζή ηδξ. ε απμζηεζνςιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ βίκεηαζ μ ειαμθζαζιυξ ιε ημ απυεεια ηςκ ηοηηάνςκ T. thermophilus ηαζ δ ηαθθζένβεζα ακαπηφζζεηαζ ζημοξ 65 μ C ζε επςαζηήνα οπυ ακάδεοζδ ημοθάπζζημκ βζα 24 χνεξ. Γζα κα εθεβπεεί δ ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ, βίκεηαζ θήρδ 1 ml ηοηηανμηαθθζένβεζαξ ηαζ ιέηνδζδ ηδξ μπηζηήξ απμννυθδζδξ ημο δείβιαημξ ζηα 600 nm ιε έκα θαζιαημθςηυιεηνμ Perkin Elmer.

41 3. Ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli ζε Kακμκζηυ Mέζμ Aκάπηολδξ Αημθμοεείηαζ αηνζαχξ δ ίδζα δζαδζηαζία ιε αοηή ηδξ ακάπηολδξ ηςκ ααηηδνίςκ T. thermophilus ιε ηδ ιυκδ δζαθμνά υηζ δ ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli βίκεηαζ ζημοξ 37 μ C ηαζ δζανηεί 24 χνεξ. 4. Ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζε Σνμπμπμζδιέκμ Μέζμ Ακάπηολδξ (Μέζμ Δθαπίζηςκ Θνεπηζηχκ οζηαηζηχκ) Σμ ηποποποιημένο μέζο ανάπηςξηρ απμηεθείηαζ απυ: 1. ΝaCl 1 % (w/v) 2. Γζάθοια ζπκμζημζπείςκ 0,25 % (v/v) 3. Γθοημκζηυ μλφ C 6 H 11 NaO 7 1,5 % (w/v) 4. Γζάθοια θςζθμνζηχκ ΚΖ 2 ΡΟ 4 / Κ 2 ΖΡΟ 4 ζε ακαθμβία 3,6 /1 (50 mm) 5. (NH 4 )SO 4 ή ΝΖ 4 Cl 0,05 % (w/v) 6. MgSO 4 7H 2 O 0,25 % (v/v) Γζα ηδκ παναζηεοή ημο δζαθφιαημξ ζπκμζημζπείςκ πνμζηίεεκηαζ ζε 1 l 0,5 N HCl ηα ελήξ : 1. FeSO 4 (11,2 gr) 2. CaCl 2 (8,23 gr) 3. CuSO 4.5H 2 O (0,03 gr) 4. MnCl 2.4H 2 O (0,2 gr) 5. ZnSO 4 (0,15 gr) 6. H 3 BO 3 (0,06 gr) 7. Co(NO 3 ) 2.6H 2 O (0,67 gr) 8. MgSO 4.7H 2 O (80 gr) Σμ δζάθοια θζθηνάνεηαζ ζε απμζηεζνςιέκμ θίθηνμ ηαζ πνμζηίεεηαζ ζημ ηέθμξ ζημ ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ βζα απμθοβή ηαείγδζδξ ηςκ ιεηάθθςκ. Ζ δζάθοζδ ηςκ παναπάκς μοζζχκ βίκεηαζ ζε απεζηαβιέκμ κενυ ηαζ ημ ηεθζηυ δζάθοια νοειίγεηαζ ζε ph 7 ιε NaOH 5N. ηδ ζοκέπεζα απμζηεζνχκεηαζ ιέζα ζηδκ μβημιεηνζηή θζάθδ. Αημθμφεςξ, βίκεηαζ θήρδ απυ 25 ml έςξ ηαζ

42 υθδξ ηδξ ηαθθζένβεζαξ ημο ηακμκζημφ ιέζμο ακάπηολδξ ηαζ ειαμθζαζιυξ ζηδκ μβημιεηνζηή θζάθδ ιε ημ ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ. Ζ ηαθθζένβεζα ακαπηφζζεηαζ ζημοξ 65 μ C ζε επςαζηήνα οπυ ακάδεοζδ βζα 72 χνεξ βζα κα επζηεοπεεί δ ιέβζζηδ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ. Ακάθμβα ιε ηζξ ζοκεήηεξ ημο πεζνάιαημξ ηαζ βζα ηδ αεθηζζημπμίδζδ ηςκ παναιέηνςκ ιπμνεί κα δζαθένεζ μ ανζειυξ ηςκ μβημιεηνζηχκ θζαθχκ ιε ημ ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ηαεχξ ηαζ μ υβημξ πμο θένεζ δ ηάεε θζάθδ υπςξ ηαζ δ πνμκζηή δζάνηεζα ηδξ ακάπηολδξ ηςκ ααηηδνίςκ. 5. Ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ E. Coli ζε Σνμπμπμζδιέκμ Μέζμ Ακάπηολδξ (Μέζμ Δθαπίζηςκ Θνεπηζηχκ οζηαηζηχκ) Αημθμοεείηαζ αηνζαχξ δ ίδζα δζαδζηαζία ιε αοηή ηδξ ακάπηολδξ ηςκ ααηηδνίςκ T. thermophilus ιε ηδ ιυκδ δζαθμνά υηζ δ ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli βίκεηαζ ζημοξ 37 μ C ηαζ δζανηεί 24 χνεξ. 6. Λήρδ ναικμθζπζδίςκ απυ ηζξ οβνέξ ηαθθζένβεζεξ Ανπζηά βίκεηαζ απμιυκςζδ ημο οπενηεζιέκμο απυ ηζξ ηαθθζένβεζεξ ηαζ θοβμηέκηνδζή ημο ζε εζδζηά ζςθδκάηζα ζε 4000 rpm βζα 15 θεπηά. Σα ηφηηανα ζοβηεκηνχκμκηαζ ζημ ηάης ιένμξ ςξ ίγδια εκχ ηα ναικμθζπίδζα θυβς ημο παιδθμφ ιμνζαημφ αάνμοξ παναιέκμοκ ζημ οπενηείιεκμ οβνυ. ηδ ζοκέπεζα βίκεηαζ θήρδ ημο οπενηεζιέκμο ηαζ μλίκζζή ημο ζε εζδζηέξ θζάθεξ ιε ποηκυ οδνμπθςνζηυ μλφ HCl έςξ υημο ημ ph κα βίκεζ 2. Μεηά παναιέκεζ ημ οβνυ βζα υθμ ημ ανάδο βζα κα πναβιαημπμζδεεί δ ηαηαηνήικζζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ. Σδκ επυιεκδ διένα βίκεηαζ θοβμηέκηνδζδ ζε rpm βζα ηδκ ηαηαηνήικζζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ςξ ίγδια. Απμαάθθεηαζ ημ οπενηείιεκμ ηαζ ημ ίγδια δζαθφεηαζ ζε απεζηαβιέκμ κενυ. Σέθμξ ιεηαθένεηαζ ημ δζάθοια ζε κέμ ζςθδκάηζ. 7. Δηπφθζζδ ναικμθζπζδίςκ απυ ημ δζάθοια Απυ ημ κέμ ζςθδκάηζ πμο πενζέπεζ ημ δζάθοια ναικμθζπζδίςκ ή απυ ημ οπενηείιεκμ ηδξ ηαθθζένβεζαξ βίκεηαζ θήρδ 2 ml ηαζ νφειζζδ ημο ph ιε πνήζδ εεζσημφ μλέμξ Ζ 2 SO 4 ή ποηκμφ οδνμπθςνζημφ μλέμξ HCl ζε ηζιή 2. ηδ ζοκέπεζα, πνμζηίεεηαζ ζημ δείβια 2 ml δζαθφηδ (είηε ιίβια

43 πθςνμθμνιίμο/ιεεακυθδξ ακαθμβίαξ 2:1 ή μλζημφ ιεεοθεζηένα) ηαζ βίκεηαζ ακάδεοζδ βζα 1 θεπηυ. Μεηά αημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ ζε rpm βζα 10 θεπηά ηαζ ζοθθέβεηαζ δ ηάης μνβακζηή ζημζαάδα. Ζ οδαηζηή ζημζαάδα απμιαηνφκεηαζ, λακαπνμζηίεεηαζ 2 ml δζαθφηδ ηαζ επακαθαιαάκεηαζ δ δζαδζηαζία βζα ιία θμνά. Έπεζηα ημ ζςθδκάηζ ιε ηδκ μνβακζηή ζημζαάδα ημπμεεηείηαζ ζημκ απαβςβυ χζηε κα ελαηιζζηεί δ μνβακζηή ζημζαάδα. Μεηά απυ ιένεξ υηακ έπεζ ελαηιζζηεί ηεθείςξ δ μνβακζηή ζημζαάδα βίκεηαζ δζαθοημπμίδζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ζε απεζηαβιέκμ κενυ. 8. Πμζμηζημπμίδζδ ναικμθζπζδίςκ ιε ηδκ ακηίδναζδ μνηζκυθδξ Ζ ακηίδναζδ μνηζκυθδξ πνδζζιμπμζείηαζ βζα κα πνμζδζμνζζηεί δ πμζυηδηα ηςκ ναικμθζπζδίςκ ζημ δείβια. Βαζίγεηαζ ζηδ πνςιαημιεηνζηή ακηίδναζδ ηδξ ναικυγδξ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ιε ηδκ μνηζκυθδ ηαζ ηδξ δδιζμονβίαξ εκυξ έβπνςιμο ζοιπθυημο πμο απμννμθά ζηα 421 nm. Δηθόλα 17: ρεκαηηθή αληίδξαζε ηεο νξθηλόιεο 128 Ανπζηά παναζηεοάγεηαζ ημ δζάθοια μνηζκυθδξ. ε ιζα ιζηνή ηςκζηή θζάθδ εζζάβεηαζ 25 ml Ζ 2 SO 4 (53 % Ζ 2 SO 4 ) ηαζ 0,047 gr πνςζηζηή μνηζκυθδ C 7 H 8 O 2.H 2 O (19 % w/v δζαθφιαημξ μνηζκυθδξ). ηδ ζοκέπεζα βίκεηαζ ακάδεοζδ ζε ακαδεοηήνα βζα 15 θεπηά. Σμ δζάθοια παίνκεζ έκα απαθυ ηίηνζκμ πνχια. Όηακ ελαηιζζηεί δ μνβακζηή ζηζαάδα, εζζάβμοιε 900 ιl απυ ημ δζάθοια μνηζκυθδξ πμο έπμοιε παναζηεοάζεζ ηαζ 100 ιl απεζηαβιέκμ κενυ ζε ηάεε ιαξ δείβια πμο πενζέπεζ ναικμθζπίδζα ζε λδνή ιμνθή υπςξ πνμέηορακ απυ ηδκ πνμδβμφιεκδ δζαδζηαζία εηπφθζζδξ. Γίκεηαζ ιία ηαθή ακάιεζλδ χζηε κα δζαθοημπμζδεεί υηζ πενζέπεηαζ ζ αοηά ηαζ ηαηυπζκ ιεηαθένμκηαζ ζε οδαηυθμοηνμ ηςκ 80 μ C υπμο παναιέκμοκ βζα 30 θεπηά. Με ημ πέναξ ηςκ 30 θεπηχκ βίκεηαζ θήρδ 1 ml απυ ηάεε δείβια ηαζ βίκεηαζ θςημιέηνδζδ ζε ιήημξ ηφιαημξ 421 nm. Ακ μζ ιεηνήζεζξ πμο παίνκμοιε είκαζ πάκς απυ 2, ηυηε ηάκμοιε αναίςζδ ζηα δείβιαηά ιαξ ζε

44 Aποππόθηζη (421nm) αναίςζδ 1/10 δδθαδή παίνκμοιε 100 ιl απυ ηα δείβιαηα ηαζ πνμζεέημοιε ζημ ηαεέκα απυ 900 ιl απεζηαβιέκμ κενυ βζα κα ηα αναζχζμοιε. Ζ ζοβηέκηνςζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ οπμθμβίγεηαζ απυ ηδκ πνυηοπδ ηαιπφθδ ναικυγδξ. Γζα ηδκ ηαηαζηεοή ηδξ πνυηοπδξ ηαιπφθδξ ναικυγδξ, βίκεηαζ θήρδ 5 mg ναικυγδξ ζε έκοδνδ ιμνθή C 6 H 12 O 5 H 2 O ηαζ δζάθοζδ ζε 5 ml απεζηαβιέκμ κενυ χζηε δ ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ ημο δζαθφιαημξ κα είκαζ 1 mg/ml. Απυ ημ δζάθοια πμο δδιζμονβείηαζ, βίκεηαζ θήρδ 500 ιl ηαζ δζάθοζδ ζε 500 ιl απεζηαβιέκμ κενυ χζηε δ ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ ημο κέμο δζαθφιαημξ κα είκαζ 0,5 mg/ml. Γίκεηαζ θήρδ δζαθμνεηζηχκ ζοβηεκηνχζεςκ ναικυγδξ ηαζ απυ ηα δφμ δζαθφιαηα ηαζ πναβιαημπμζείηαζ δ ακηίδναζδ ηδξ μνηζκυθδξ. ηδ ζοκέπεζα, βίκεηαζ θςημιέηνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ ηαζ ηαηαζηεοή ηδξ πνυηοπδξ ηαιπφθδξ ναικυγδξ ιε άλμκεξ ηδκ πμζυηδηα ηδξ ναικυγδξ ζε ιg ηαζ ηδκ μπηζηή απμννυθδζδ ζε ΟD απυ ηδκ μπμία πνμηφπηεζ δ ελίζςζδ πμο δίκεζ ηδ ζπέζδ ιεηαλφ ηδξ ναικυγδξ ηαζ ηδξ μπηζηήξ απμννυθδζδξ. 3 2,5 2 1,5 1 y = 0,1175x + 0,1703 0, Ραμνόζη (μg) Γηάγξακκα 1: Πξόηππε θακπύιε ξακλόδεο Ζ ζοβηέκηνςζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ οπμθμβίγεηαζ ακ πμθθαπθαζζαζηεί δ ζοβηέκηνςζδ ηδξ ναικυγδξ ιε αάζδ ηδκ πνυηοπδ ηαιπφθδ ηδξ ναικυγδξ ιε έκα ζοκηεθεζηή 3,4 μ μπμίμξ πνμηφπηεζ απυ ηδ ζοζπέηζζδ ημο θυβμο ναικμθζπζδίςκ/ναικυγδ (1 mg ναικυγδξ ακηζζημζπεί πενίπμο ζε 3,4 mg ζε ναικμθζπίδζα). 129

45 9. Σαοημπμίδζδ ναικμθζπζδίςκ ιε πνςιαημβναθία θεπηήξ ζημζαάδαξ (TLC) Ζ πνςιαημβναθία θεπηήξ ζημζαάδαξ είκαζ ιζα οβνή πνςιαημβναθία πμο ααζίγεηαζ ζηδκ πνμζνυθδζδ ιζαξ μοζίαξ ζε ιζα ζηενεά θάζδ (ζηαηζηή θάζδ) ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ζηδ ιεηαηυπζζή ηδξ πάκς ζ αοηή ιε μνζζιέκδ ηαπφηδηα ιε ηδ πνήζδ εκυξ δζαθφηδ (ηζκμφιεκδ θάζδ). Ζ ζηαηζηή ηαζ δ ηζκμφιεκδ θάζδ είκαζ δζαηνζηέξ ηαζ ιδ ακαιζβκουιεκεξ θάζεζξ. ημ ηέθμξ ηδξ πνςιαημβναθίαξ αοηήξ, δ ηάεε μοζία παναηηδνίγεηαζ πμζμηζηά, απυ ημ θυβμ ηδξ απυζηαζδξ πμο αοηή δζέηνελε πνμξ ηδκ απυζηαζδ πμο έηνελε μ δζαθφηδξ. Ζ μοζία αεααίςξ ειθακίγεηαζ πάκς ζηδκ πθάηα (ζηαηζηή θάζδ) είηε απυ ηδ θοζζηή ηδξ πνχζδ είηε ιεηά απυ πνχζδ ηδξ πθάηαξ. 130 Ανπζηά βίκεηαζ εένιακζδ ηςκ πθαηχκ ζίθζηα (Kieselgel 60 F 254 ) ζημοξ 110 μ C βζα 1 χνα. Σμπμεεημφκηαζ ζηδ ζοκέπεζα δείβιαηα πμζυηδηαξ απυ 20 ιl έςξ 200 ιl πάκς ζηδ βναιιή πμο έπεζ παναπηεί πάκς ζηδκ πθάηα ιε ηαοηυπνμκδ εένιακζδ ηδξ πθάηαξ. Δζζάβεηαζ δ πθάηα βζα ημοθάπζζημκ 2 χνεξ ζηδ βοάθζκδ εήηδ πμο πενζέπεζ ημ δζαθφηδ έςξ υημο ακέαεζ δ ζηάειδ ημο δζαθφηδ ζημ πάκς ιένμξ ηδξ πθάηαξ. Μέζα ζηδ βοάθζκδ εήηδ, έπεζ πνμζηεεεί πνμδβμοιέκςξ δζάθοια δζαθφηδ ημο μπμίμο δ ζφζηαζδ είκαζ 80% v/v πθςνμθυνιζμ, 18% v/v ιεεακυθδ ηαζ 2% v/v μλζηυ μλφ ηαζ δ εήηδ επζζθναβίγεηαζ ιε ααγεθίκδ βζα κα ιδκ ελαηιίγεηαζ μ δζαθφηδξ θυβς ηδξ ιεβάθδξ πηδηζηυηδηάξ ημο. Μεηά, ελάβεηαζ δ πθάηα απυ ηδ εήηδ ηαζ αθήκεηαζ κα ζηεβκχζεζ βζα 10 θεπηά. Δκ ζοκεπεία, ρεηάγεηαζ ιε ααθή εοιυθδξ (95 ml αζεακυθδ, 5 ml εεζσηυ μλφ ηαζ 0,5 gr εοιυθδξ) ηαζ αθήκεηαζ κα ζηεβκχζεζ βζα 10 θεπηά. Σέθμξ, εενιαίκεηαζ βζα 20 θεπηά ζημοξ 110 μ C ζημ θμονκάηζ. 131 Γζα ηδκ ηαοημπμίδζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ, έβζκε πνήζδ δζαθφιαημξ ναικυγδξ ςξ ιάνηονα ηαζ δζαθφιαημξ ζαπςκίκδξ ςξ εεηζημφ ιάνηονα. 10. Πνμζδζμνζζιυξ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ απυ ηζξ οβνέξ ηαθθζένβεζεξ (Μέεμδμξ Fiske-Subarow) Γίκεηαζ θήρδ 20 ιl οπενηεζιέκμο ηαθθζένβεζαξ ζε έκα ιζηνυ ζςθδκάηζ ηαζ πνμζηίεεηαζ ζηδ ζοκέπεζα 780 ιl απεζηαβιέκμ κενυ ηαζ 150 ιl υλζκμιμθοαδεκζηυ αιιχκζμ (ΝΖ 4 ) 6 Μμ 7 Ο ηαζ ηεθεοηαία πνμζηίεεηαζ 50 ιl ANSA

46 Aποππόθηζη (660nm) (αιζκμκαθεμθζμοθθμκζηυ μλφ). Ακηίζημζπα ζε έκα άθθμ ιζηνυ ζςθδκάηζ ημ μπμίμ πνδζζιμπμζείηαζ ςξ ιάνηοναξ πνμζηίεεηαζ 800 ιl απεζηαβιέκμ κενυ, 150 ιl υλζκμ-ιμθοαδεκζηυ αιιχκζμ (ΝΖ 4 ) 6 Μμ 7 Ο ηαζ ηεθεοηαία πνμζηίεεηαζ 50 ιl ANSA. Ζ πμζυηδηα ημο οπενηεζιέκμο ηαζ ημο απεζηαβιέκμο κενμφ ιπμνεί κα δζαθμνμπμζδεεί αθθά δ ηεθζηή πμζυηδηα πνέπεζ κα παναιέκεζ ζηαεενή. Tα δείβιαηα παναιέκμοκ βζα 1 χνα ζε εενιμηναζία δςιαηίμο ηαζ ζηδ ζοκέπεζα βίκεηαζ ιέηνδζδ ηδξ απμννυθδζδξ ηςκ δεζβιάηςκ ζηα 660 nm. 132 Με ηδ αμήεεζα ηδξ πνυηοπδξ ηαιπφθδξ ηςκ θςζθμνζηχκ, οπμθμβίγεηαζ δ ζοβηέκηνςζδ ζε mμ θςζθμνζηχκ PO 4 ηάεε δείβιαημξ. 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 y = 3,9602x + 0, ,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 ςγκένηπωζη θωζθοπικών (mm) Γηάγξακκα 2: Πξόηππε θακπύιε θωζθνξηθώλ Γζα ηδ δδιζμονβία πνυηοπδξ ηαιπφθδξ θςζθμνζηχκ πνδζζιμπμζείηαζ νοειζζηζηυ δζάθοια θςζθμνζηχκ 0,5 M ph 7. ηδ ζοκέπεζα ηάκμοιε αναίςζδ ημο δζαθφιαημξ θςζθμνζηχκ έηζζ χζηε δ ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ κα είκαζ 1 mm. Γίκεηαζ θήρδ δζαθμνεηζηχκ ζοβηεκηνχζεςκ θςζθμνζηχκ απυ ημ δζάθοια ηαζ πναβιαημπμζείηαζ δ ακηίδναζδ ιε ηδ ιέεμδμ Fiske - Subarow. ηδ ζοκέπεζα, βίκεηαζ θςημιέηνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ ηαζ ηαηαζηεοή ηδξ πνυηοπδξ ηαιπφθδξ ιε άλμκεξ ηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ θςζθμνζηχκ ζε mm ηαζ ηδκ μπηζηή απμννυθδζδ ζε ΟD απυ ηδκ μπμία πνμηφπηεζ δ ελίζςζδ πμο δίκεζ ηδ ζπέζδ ιεηαλφ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ ηαζ ηδξ μπηζηήξ απμννυθδζδξ.

47 11. Ακίπκεοζδ πομηοακίκδξ ζε οβνέξ ηαθθζένβεζεξ Ανπζηά βίκεηαζ θήρδ οπενηεζιέκμο ηαθθζένβεζαξ ζε ζςθδκάηζ ηαζ πνμζεήηδ ζε αοηυ ίζμο υβημο πθςνμθμνιίμο ηαζ αημθμοεεί ακάδεοζδ. ηδ ζοκέπεζα βίκεηαζ θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 4000 rpm βζα 10 θεπηά. Ζ πθςνμθμνιζηή ηάης ζημζαάδα ιεηαθένεηαζ ζε κέμ ζςθδκάηζ υπμο πνμζηίεεηαζ δζάθοια ίζμο υβημο 0,2 M HCl εκχ δ οδαηζηή πάκς ζημζαάδα απμιαηνφκεηαζ. Αημθμοεεί ηαζ πάθζ ακάδεοζδ ηαζ θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 4000 rpm βζα 10 θεπηά. Ζ πθςνμθμνιζηή ηάης ζημζαάδα απμιαηνφκεηαζ εκχ δ οδαηζηή πάκς ζημζαάδα ιεηαθένεηαζ ζε κέμ ζςθδκάηζ υπμο πνμζηίεεηαζ ζηενευ οδαηακεναηζηυ κάηνζμ NaHCO 3 έςξ υημο ελμοδεηενςεεί πθήνςξ ημ HCl πμο οπάνπεζ ζημ δζάθοια. Σέθμξ βίκεηαζ θήρδ 1 ml απυ ημ ηεθζηυ δζάθοια ηαζ θςημιέηνδζή ημο ζηα 520 nm υπμο πνμζιεηνάηαζ ηαζ δ αναίςζδ ακ ημ ηεθζηυ δζάθοια είκαζ πενζζζυηενμ ημο 1 ml. Ζ θςημιέηνδζδ ιπμνεί κα βίκεζ ηαζ ζηα 510 nm αθθά ηαζ ζηα 690 nm. 133,134,135, Απμιυκςζδ πενζπθάζιαημξ Ζ απμιυκςζδ ημο πενζπθάζιαημξ πναβιαημπμζείηαζ ιε ηδ ιεηαηνμπή ηςκ ηοηηάνςκ ζε ζθαζνμπθάζηεξ. Σα ααηηήνζα T.thermophilus ζοθθέβμκηαζ ιε θοβμηέκηνδζδ ζηζξ rpm. Αημθμοεεί πθφζδ ηαζ επακαδζαθοημπμίδζδ ζε απεζηαβιέκμ κενυ. ε δζάθοια ααηηδνίςκ (οβνμφ αάνμοξ 5,5 gr) πνμζηίεεκηαζ: 12,3 ml 0,1 Μ Tris-HCl (ph 8) 10,38 ml 2 M ζμοηνυγδ 2,06 ml 1% w/v EDTA 2,06 ml 0,5 % w/v θοζμγφιδ Σμ ηοηηανζηυ αζχνδια επςάγεηαζ ζημοξ 30 μ C βζα 1 χνα ηαζ ιεηά θοβμηεκηνείηαζ ζηζξ rpm βζα 15 θεπηά βζα κα αθαζνεεμφκ μζ ζθαζνμπθάζηεξ. Αημθμοεεί θήρδ ημο οπενηεζιέκμο ηαζ οπενθοβμηέκηνδζδ ζηζξ rpm. Σέθμξ βίκεηαζ θήρδ ημο οπενηεζιέκμο ημ μπμίμ απμηεθεί ημ εηπφθζζια ημο πενζπθάζιαημξ. Όθδ δ δζαδζηαζία πναβιαημπμζείηαζ ζε παιδθή εενιμηναζία ιεηαλφ 0-4 μ C. 132

48 13. Δπίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ [PO 4 ] ζηδκ πνμζηυθθδζδ ηοηηάνςκ Γεδμιέκμο υηζ δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ θςζθμνζηχκ επδνεάγεζ ηδκ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ, ζημπυξ ημο πεζνάιαημξ είκαζ κα δζαπζζηςεεί εάκ επδνεάγεζ ειιέζςξ ηαζ ηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ηοηηάνςκ. Πνμηεζιέκμο κα ιεθεηδεεί δ επίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ [PO 4 ] ζηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ηοηηάνςκ πναβιαημπμζήεδηε πείναια ζε ηνζαθίμ 6 εέζεςκ υπμο ζε ηάεε εέζδ, πνμζηέεδηε 5 ml ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ιε δζαθμνεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ θςζθμνζηχκ ζε ηάεε εέζδ. ηδ ζοκέπεζα, πνμζηέεδηε ζε ηάεε εέζδ ακηίζημζπα 500 ιl ηαθθζένβεζαξ T. thermophilus ή E. coli ηαζ ημπμεεηήεδηε ημ ηνζαθίμ βζα επχαζδ ζημκ επςαζηήνα ζημοξ 72 μ C. Μεηά ηδκ επχαζδ πμο πναβιαημπμζείηαζ βζα ηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ηοηηάνςκ, αθαζνείηαζ ημ οπενηείιεκμ απυ ηάεε εέζδ ηαζ βίκεηαζ ηαεανζζιυξ ιε 1 ml απεζηαβιέκμ κενυ ζε ηάεε εέζδ χζηε κα ιείκμοκ ιυκμ ηα ηφηηανα πμο είκαζ πνμζημθθδιέκα ζηδκ επζθάκεζα ηδξ εέζδξ. Αημθμοεεί πνμζεήηδ 3 ml πνςζηζηήξ 0,1% w/v ηνοζηαθθζηυ ζχδεξ (Crystal Violet) ζε ηάεε εέζδ βζα ααθή ηςκ ηοηηάνςκ ηαζ επχαζδ βζα 30 θεπηά ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Σέθμξ, βίκεηαζ απμιάηνοκζδ ημο δζαθφιαημξ ηδξ πνςζηζηήξ, λέπθοια ηςκ εέζεςκ ιε απεζηαβιέκμ κενυ ηαζ ηέθμξ πνμζεήηδ 3 ml αζεακυθδξ βζα ηδκ απμηυθθδζδ ηςκ ηοηηάνςκ ζε ηάεε εέζδ. Αημθμοεεί θήρδ 1 ml απυ ηάεε εέζδ ηαζ θςημιέηνδζδ ημο δείβιαημξ ζηα 550 nm υπμο απμννμθάεζ δ πνςζηζηή. 14. Δπίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ [PO 4 ] ηαζ ηδξ εθαζηίκδξ ζηδκ πνμζηυθθδζδ ηοηηάνςκ Αημθμοεείηαζ αηνζαχξ δ ίδζα δζαδζηαζία ιε αοηή ηδξ πνμζηυθθδζδξ ηοηηάνςκ ζε ηνζαθία 6 εέζεςκ ιε ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ PO 4 ιε ηδ ιυκδ δζαθμνά υηζ ζηζξ ιζζέξ εέζεζξ πνμζηίεεηαζ 0,1% w/v εθαζηίκδξ πμο απμηεθεί ημκ επαβςβέα ημο εκγφιμο εθαζηάζδ ζε ηάεε εέζδ εκχ ζηζξ οπυθμζπεξ εέζεζξ δεκ πνμζηίεεηαζ.

49 15. Δπίδναζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ζε ζοκάνηδζδ ιε ηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ θςζθμνζηχκ [PO 4 ] ζηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli Αημθμοεείηαζ αηνζαχξ δ ίδζα δζαδζηαζία ιε αοηή ηδξ πνμζηυθθδζδξ ηοηηάνςκ ζε ηνζαθία 6 εέζεςκ ιε ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ PO 4 ιε ηδ ιυκδ δζαθμνά υηζ ζηζξ ιζζέξ εέζεζξ πνμζηίεεηαζ 10 ιg/ml ζοβηέκηνςζδξ ναικμθζπζδίςκ ζε ηάεε εέζδ εκχ ζηζξ οπυθμζπεξ εέζεζξ δεκ πνμζηίεεηαζ. 16. SDS Ζθεηηνμθυνδζδ πμθοαηνοθαιζδίμο πνςηεσκχκ Ανπζηά, βίκεηαζ πνμεημζιαζία ηςκ δεζβιάηςκ ζε ιζηνά ζςθδκάηζα πνζκ λεηζκήζεζ δ δθεηηνμθυνδζδ ιε θήρδ 200 ιl απυ ημ ηάεε οπυ ελέηαζδ δείβια ηαζ πνμζεήηδ 30 ιl παβςιέκμο 50% v/v οδαηζηυ TCA (ηνζπθςνμλζηυ μλφ) χζηε δ ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ TCA ζημ ηάεε δείβια κα είκαζ 6% v/v. Σμ TCA πνδζζιμπμζείηαζ βζα ηδκ ηαηαηνήικζζδ ηςκ πνςηεσκχκ. Αημθμοεεί επχαζδ ηςκ δεζβιάηςκ βζα 30 θεπηά ζε πάβμ ηαζ ιεηά θοβμηέκηνδζδ βζα 15 θεπηά ζηζξ 2000 rpm. Μεηά ημ πέναξ ηςκ 30 θεπηχκ, απμαάθθεηαζ ημ οπενηείιεκμ ηαζ πνμζηίεεηαζ ζε ηάεε δείβια παβςιέκδ αηεηυκδ 500 ιl. Αημθμοεεί θοβμηέκηνδζδ βζα 15 θεπηά ζηζξ 2000 rpm ηαζ απμαμθή ημο οπενηεζιέκμο. Ζ δζαδζηαζία επακαθαιαάκεηαζ αηυιδ ιία θμνά ηαζ ζηδ ζοκέπεζα παναιέκμοκ ηα δείβιαηα ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα ηδ ζοκέπζζδ ηδξ δζαδζηαζίαξ. Γζα ηδκ πνμεημζιαζία ηδξ πδηηήξ πμθοαηνοθαιζδίμο παναζηεοάγμκηαζ δφμ δζαθφιαηα. 1) Γζάθοια πδηηήξ δζαπςνζζιμφ (Separeting Gel) Γζα 18,75 ml ζοκμθζημφ δζαθφιαημξ: 8,13 ml απεζηαβιέκμ κενυ 6,25 ml δζάθοια πμθοαηνοθαιζδίμο 3,75 ml Tris-HCl (ζοβηέκηνςζδ 1,875 Μ, ph 8,8) 200 ιl SDS 10% w/v 300 ιl οπενεεζσηυ αιιχκζμ (ΑΡS) 10% w/v 120 ιl ηεηναιεεοθεεοθεκδζαιίκδ TEMED

50 2) Γζάθοια πδηηήξ επζζημίααλδξ (Stacking Gel) Γζα 10 ml ζοκμθζημφ δζαθφιαημξ: 6,39 ml απεζηαβιέκμ κενυ 1,33 ml δζάθοια πμθοαηνοθαιζδίμο 2 ml Tris-HCl (ζοβηέκηνςζδ 0,625 Μ, ph 6,8) 100 ιl SDS 10% w/v 80 ιl οπενεεζσηυ αιιχκζμ (ΑΡS) 10% w/v 100 ιl ηεηναιεεοθεεοθεκδζαιίκδ (TEMED) Παναζηεοάγεηαζ πδηηή πμθοαηνοθαιζδίμο βζα ηάεεηδ δθεηηνμθυνδζδ ιε δφμ δζαθμνεηζηά δζαθφιαηα ζηνχζδξ. Ανπζηά πνμζηίεεηαζ ημ δζάθοια πδηηήξ δζαπςνζζιμφ ηαζ ιεη έπεζηα πνμζηίεεηαζ ημ δζάθοια πδηηήξ επζζημίααλδξ. Σμ TEMED ημπμεεηείηαζ πάκηα ηεθεοηαίμ ζημ ηάεε δζάθοια βζαηί ιε ηδκ πνμζεήηδ ημο βίκεηαζ άιεζα δ πήλδ ημο δζαθφιαημξ. Αθ υημο πνμδβήεδηε δ εημζιαζία ηςκ δεζβιάηςκ ηαζ ηδξ πδηηήξ πμθοαηνοθαιζδίμο, πνμζεέημοιε ζηα ζηεβκά ιζηνά ζςθδκάηζα 20 ιl απεζηαβιέκμ κενυ ηαζ 5 ιl δζάθοια επζζημίααλδξ 1Υ. Γίκεηαζ ακάδεοζδ ζε ηάεε ζςθδκάηζ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ημπμεέηδζδ ζε εενιμηναζία αναζιμφ βζα 5 θεπηά. Μεηά βίκεηαζ θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 2000 rpm βζα 5 θεπηά. Σα δείβιαηα ημπμεεημφκηαζ ζηδκ πδηηή ημο πμθοαηνοθαιζδίμο ηαζ αημθμοεεί δ δθεηηνμθυνδζδ ζηδκ δθεηηνμθμνδηζηή ζοζηεοή. 17. Υνχζδ ιε ιπθε ηδξ ημοιάζδξ (coomasie brilliant blue) Ζ ιέεμδμξ πνχζδξ ηδξ πδηηήξ πμθοαηνοθαιζδίμο ιε ιπθε ηδξ ημοιάζδξ είκαζ δ πζμ ζοκδεζζιέκδ ιέεμδμξ ακίπκεοζδξ πνςηεσκχκ ζηδ πδηηή. Ανπζηά ημπμεεημφιε ηδκ πδηηή ζημ δζάθοια ααθήξ (0,1% w/v ιπθε ηδξ ημοιάζδξ, 50% v/v ιεεακυθδ (CH 3 OH) ηαζ 7,5% v/v μλζηυ μλφ (CH 3 COOH)) βζα 2 χνεξ. Μεηά απμιαηνφκμοιε ημ δζάθοια ααθήξ ηαζ πνμζεέημοιε ηδκ πδηηή ζημ δζάθοια λεααθήξ (10% v/v μλζηυ μλφ ηαζ 10% ιεεακυθδ) βζα υθμ ημ ανάδο.

51 18. Υνχζδ ιε κζηνζηυ άνβονμ Ζ ιέεμδμξ πνχζδξ ηδξ πδηηήξ πμθοαηνοθαιζδίμο ιε κζηνζηυ άνβονμ πνδζζιμπμζείηαζ υηακ είκαζ ακαβηαία ιζα πζμ εοαίζεδηδ ιέεμδμξ ακίπκεοζδξ πνςηεσκχκ ζηδκ πδηηή. Ανπζηά πναβιαημπμζείηαζ αηζκδημπμίδζδ ηςκ πνςηεσκχκ ζηδκ πδηηή πμθοαηνοθαιζδίμο ζε δζάθοια 50% v/v ιεεακυθδξ ηαζ 12% v/v μλζημφ μλέμξ βζα ημοθάπζζημκ 1 χνα. Αημθμοεμφκ ηνία πθοζίιαηα ηδξ πδηηήξ, βζα 15 θεπηά ημ ηαεέκα, ζε δζάθοια 50% v/v αζεακυθδξ βζα κα επζηεοπεεί δ απμιάηνοκζδ ημο μλζημφ μλέμξ πμο επδνεάγεζ ηδ δνάζδ ημο εεζμεεζσημφ καηνίμο ημο επυιεκμο ζηαδίμο. Αημθμοεεί εκοδάηςζδ ηδξ πδηηήξ ιε ειαάπηζζή ηδξ ζε δζάθοια 30% v/v αζεακυθδξ ημοθάπζζημκ βζα 20 θεπηά ηαζ ζηδ ζοκέπεζα βζα 1 θεπηυ ζε απεζηαβιέκμ κενυ. ημ ηέθμξ αοημφ ημο ζηαδίμο δ πδηηή πνέπεζ κα έπεζ ημ ανπζηυ ηδξ ιέβεεμξ. Ζ πδηηή ειααπηίγεηαζ ζηδ ζοκέπεζα βζα 1 θεπηυ ζε δζάθοια εεζμεεζσημφ καηνίμο (Na 2 S 2 O 3 ) 0,02% w/v ηαζ αιέζςξ ιεηά λεπθέκεηαζ βζα ηνεζξ θμνέξ ιε απεζηαβιέκμ κενυ βζα κα απμιαηνοκεεί δ πενίζζεζα ημο εεζμεεσημφ καηνίμο. Αημθμοεεί επχαζδ βζα 20 θεπηά ζε δζάθοια 200 mg κζηνζημφ ανβφνμο (AgNO 3 ) ηαζ 75 ιl θμνιαθδεΰδδξ ζε 100 ml απεζηαβιέκμο κενμφ. Πζεακή ειθάκζζδ αζεεκμφξ ηίηνζκμο πνχιαημξ μθείθεηαζ ζε πανμοζία εεζμεεζσημφ καηνίμο πμο έπεζ απμιείκεζ πάκς ζηδκ πδηηή. Μεηά λεπθέκεηαζ ζε απεζηαβιέκμ κενυ οπυ ακαηίκδζδ βζα 20 δεοηενυθεπηα ζε ηάεε πθφζδ. Έπεζηα αημθμοεεί ειθάκζζδ ηςκ γςκχκ ιε επχαζδ ζε δζάθοια πμο πενζέπεζ 6% w/v ακεναηζηυ κάηνζμ (Na 2 CO 3 ), 0,05% v/v θμνιαθδεΰδδ ηαζ 0,02% w/v εεζμεεζσηυ κάηνζμ ιέπνζ ειθάκζζδξ ηςκ γςκχκ. Ζ πδηηή λεπθέκεηαζ δφμ θμνέξ ιε απεζηαβιέκμ κενυ, βζα 2 θεπηά ηάεε θμνά οπυ ακάδεοζδ. Σέθμξ ηενιαηίγεηαζ δ ακηίδναζδ ιε πνμζεήηδ δζαθφιαημξ 50% v/v ιεεακυθδξ 12% v/v μλζημφ μλέμξ βζα 10 θεπηά ηαζ ημπμεεηείηαζ δ πδηηή ζε οδαηζηυ δζάθοια ιεεακυθδξ 50% v/v ζημ ροβείμ βζα ιενζηέξ ιένεξ βζα ζοκηήνδζδ.

52 19. Γμηζιαζία γςηζηυηδηαξ ααηηδνίςκ Escherichia coli ιε ηδ πνήζδ ναικμθζπζδίςκ Ανπζηά, βίκεηαζ θήρδ 1 ml αζςνήιαημξ ηαθθζένβεζαξ Escherichia coli απυ πνμηαθθζένβεζα ζε έκα ιεβάθμ ζςθδκάηζ ηαζ πναβιαημπμζείηαζ θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 3000 rpm βζα 10 θεπηά. Αημθμοεεί απμιάηνοκζδ ημο οπενηεζιέκμο ηαζ πνμζεήηδ 6 ml νοειζζηζημφ δζαθφιαημξ θςζθμνζηχκ PBS. 1) Ρςθμιζηικό Γιάλςμα Φωζθοπικών PBS Γζα ml ζοκμθζημφ δζαθφιαημξ ιε ph: 7, ml απεζηαβιέκμ κενυ NaCl 8 gr KCl 0,2 gr Na 2 HPO 4 1,44 gr KH 2 PO 4 0,24 gr Αημθμοεεί ακάδεοζδ, θήρδ 1 ml ηοηηάνςκ, θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 3000 rpm ηαζ ιέηνδζδ ηςκ ηοηηάνςκ ιε ηδ πνχζδ ηνοζηαθθζηυ ζχδεξ. Σαοηυπνμκα επχαζδ ημο οπυθμζπμο δζαθφιαημξ ζημοξ 37 μ C ηαζ ακά 1 χνα, 2 χνεξ, 4 χνεξ, 9 χνεξ ηαζ 20 χνεξ ακηίζημζπα βίκεηαζ ακάδεοζδ, θήρδ 1 ml ηοηηάνςκ, θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 3000 rpm ηαζ ιέηνδζδ ηςκ ηοηηάνςκ ιε ηδ πνχζδ ηνοζηαθθζηυ ζχδεξ. Μεηά ηδ πνχζδ ηςκ ηοηηάνςκ ιε ημ ηνοζηαθθζηυ ζχδεξ βίκεηαζ θςημιέηνδζδ ζηα 550 nm υπμο απμννμθά δ πνςζηζηή. 20. Γμηζιαζία αζιυθοζδξ ενοενμηοηηάνςκ ημοκεθζμφ ιε ηδ πνήζδ ναικμθζπζδίςκ Ανπζηά, βίκεηαζ θήρδ αίιαημξ 2 ml απυ ημ ημοκέθζ ζε έκα ζςθδκάηζ ιε δπανίκδ ηαζ πναβιαημπμζείηαζ θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 3000 rpm βζα 10 θεπηά. Αημθμοεεί απμιάηνοκζδ ημο πθάζιαημξ πμο ανίζηεηαζ ζημ οπενηείιεκμ ηαεχξ ηαζ ηδξ ιέζδξ ζημζαάδαξ πμο ανίζημκηαζ ηα θεοηά αζιμζθαίνζα. Γίκεηαζ πνμζεήηδ 3 ml PBS ζημ ίγδια, θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 3000 rpm βζα 10 θεπηά ηαζ απμιάηνοκζδ ημο οπενηεζιέκμο χζηε κα ηαεανζζημφκ ηα ενοενά αζιμζθαίνζα απυ δζάθμνεξ πνμζιίλεζξ πνςηεσκχκ. ημ 1 ml ζγήιαημξ ενοενχκ αζιμζθαζ-

53 νίςκ, βίκεηαζ πνμζεήηδ 3 ml PBS χζηε κα είκαζ δοκαηή δ θήρδ ιζαξ πμζυηδηαξ ηοηηάνςκ ιε ηεθζηή αναίςζδ 1:4. Απυ ηδκ ηεθζηή πμζυηδηα ηςκ 4 ml δείβιαημξ, βίκεηαζ θήρδ 1 ml ηαζ αναίςζδ ζε έκα κέμ ζςθδκάηζ ιε πνμζεήηδ 9 ml PBS χζηε μ ηεθζηυξ υβημξ κα είκαζ 10 ml ιε ηεθζηή αναίςζδ 1:40. Απυ ημ ηεθζηυ δζάθοια ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ βίκεηαζ θήρδ 0,1 ml ζε ιία ζεζνά απυ 5 ζςθδκάηζα eppendorfs ηαζ πνμζεήηδ ζοβηεηνζιέκδξ πμζυηδηαξ ζαπςκίκδξ ακηίζημζπα ιε αάζδ ημκ πίκαηα 1. Σέθμξ βίκεηαζ πνμζεήηδ PBS χζηε ημ δζάθοια κα έπεζ ηεθζηυ υβημ 1 ml. Πίνακαρ 1: Μεηαβολή ηηρ ζςγκένηπωζηρ ηηρ ζαπωνίνηρ ανά δείγμα επςθπών αιμοζθαιπίων Σεθζηυξ υβημξ δείβιαημξ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ (ml) Σεθζηή ζοβηέκηνςζδ ζαπςκίκδξ (ιg/ml) Αημθμοεεί επχαζδ ηςκ δεζβιάηςκ ζημοξ 37 μ C βζα 30 θεπηά ηαζ ζηδ ζοκέπεζα βίκεηαζ θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 3000 rpm βζα 5 θεπηά ηαζ θςημιέηνδζδ ζηα 540 nm υπμο απμννμθά δ αζιμζθαζνίκδ. Πίνακαρ 2: Μεηαβολή ηηρ ζςγκένηπωζηρ ηων παμνολιπιδίων ανά δείγμα επςθπών αιμοζθαιπίων Σεθζηυξ υβημξ δείβιαημξ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ (ml) Σεθζηή ζοβηέκηνςζδ ναικμθζπζδίςκ (ιg/ml) ,

54 Απυ ημ ηεθζηυ δζάθοια ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ βίκεηαζ θήρδ 0,1 ml ζε ιία ζεζνά απυ 12 ζςθδκάηζα eppendorfs ηαζ πνμζεήηδ ζοβηεηνζιέκδξ πμζυηδηαξ ναικμθζπζδίςκ ακηίζημζπα ιε αάζδ ημκ πίκαηα 2. Σέθμξ βίκεηαζ πνμζεήηδ PBS χζηε ημ δζάθοια κα έπεζ ηεθζηυ υβημ 1 ml. Αημθμοεεί επχαζδ ηςκ δεζβιάηςκ ζημοξ 37 μ C βζα 30 θεπηά ηαζ ζηδ ζοκέπεζα βίκεηαζ θοβμηέκηνδζδ ζηζξ 3000 rpm βζα 5 θεπηά ηαζ θςημιέηνδζδ ζηα 540 nm υπμο απμννμθά δ αζιμζθαζνίκδ. 21. Ακμζμπμίδζδ ημοκεθζμφ ιε δζάθοια ναικμθζπζδίςκ Γζα ηδκ παναζηεοή ακηζμνμφ έκακηζ ημο δζαθφιαημξ ηςκ ναικμθζπζδίςκ πμο απμιμκχεδηε απυ ηδκ ηαθθζένβεζα ηςκ ααηηδνίςκ T. thermophillus, είκαζ απαναίηδημ ημ δζάθοια ναικμθζπζδίςκ κα είκαζ ζε ηαεανή ιμνθή χζηε κα εκεεεί ζηα πεζναιαηυγςα ηαεανυ ακηζβυκμ ηαζ κα πνμηαθέζεζ ακμζμαζμθμβζηή απυηνζζδ. Γζα αοηυ ηαζ ημ δζάθοια ηςκ ναικμθζπζδίςκ πέναζε ιέζα απυ θίθηνμ βζα ηδκ ηαηαηνάηδζδ ααηηδνίςκ, ζχκ ηαεχξ ηαζ ηοπυκ ιεβαθμιμνζαηχκ πνςηεσκχκ πμο πανέιεζκακ ζημ δζάθοια. Σμ δζάθοια ναικμθζπζδίςκ δζαθφεδηε ζε δζάθοια PBS χζηε ημ ηεθζηυ δζάθοια κα είκαζ ζζμημκζηυ ηαζ ηαηάθθδθμ βζα έβποζδ. Χξ πεζναιαηυγςα πνδζζιμπμζήεδηακ δφμ ημοκέθζα Cuniculus Porcellus δφμ ιδκχκ ηαζ δ δζαδζηαζία ηδξ ακμζμπμίδζδξ πναβιαημπμζήεδηε ιεηά ημ πέναξ ηνζχκ εαδμιάδςκ χζηε κα εβηθζιαηζζημφκ ηα γχα ζηδ κέα ημοξ ηαημζηία. οβηεηνζιέκα ζηα ημοκέθζα πναβιαημπμζήεδηε ιζα ζεζνά εκέζεςκ βζα ηέζζενζξ εαδμιάδεξ, ιία έκεζδ ακά εαδμιάδα υπμο ζε ηάεε έκεζδ πναβιαημπμζήεδηε έβποζδ ημο ηεθζημφ δζαθφιαημξ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ιε πνμζεήηδ ηαζ ιδ πθήνμοξ ακμζμεκζζποηζημφ ημο Freund βζα ιεβζζημπμίδζδ ηδξ ακμζμβμκζηυηδηαξ. Οζ εκέζεζξ έβζκακ οπμδυνζα ζηδ νάπδ ημο ηάεε γχμο ιε πνμδβμφιεκδ απμθφιακζδ ηδξ πενζμπήξ ιε αθημυθδ. Σμ δζάθοια ηδξ ηάεε έκεζδξ είπε ηεθζηυ υβημ έςξ 1 ml ζε ακαθμβία 1:1 δζάθοια ναικμθζπζδίςκ πνμξ ακμζμεκζζποηζηυ χζηε κα ιδκ πανμοζζαζημφκ επζπθμηέξ ζημ γχμ ηαζ δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ήηακ 10 ιg/ml ηδκ πνχηδ εαδμιάδα, 20 ιg/ml ηδ δεφηενδ εαδμιάδα, 50 ιg/ml ηδκ ηνίηδ εαδμιάδα ηαζ 80 ιg/ml ηδκ ηέηανηδ εαδμιάδα.

55 Σμ ακμζμεκζζποηζηυ ημο Freund ακήηεζ ζηδκ ηαηδβμνία ηςκ εθαζμφπςκ ακμζμεκζζποηζηχκ ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ ιυκμ βζα πεζναιαηζημφξ ζημπμφξ επεζδή ημ θάδζ πμο πενζέπεζ είκαζ ενεεζζηζηυ, δε ιεηααμθίγεηαζ ηαζ παναιέκεζ ζημ ζδιείμ έβποζδξ ηδξ έκεζδξ. Σμ ιδ πθήνεξ ακμζμεκζζποηζηυ ημο Freund είκαζ έκα εθαζμ-οδαηζηυ βαθάηηςια πςνίξ ηδκ πανμοζία ααηίθθςκ ηδξ θοιαηίςζδξ. Σμ ακηζβυκμ ανίζηεηαζ ζηδκ οδαηζηή θάζδ ημο βαθαηηχιαημξ. Ζ πανμοζία ημο εθαίμο πνμηαθεί ημπζηή θθεβιμκή ιε απμηέθεζια ηδκ πνμζέθηοζδ πμθθχκ ιαηνμθάβςκ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ απεθεοεένςζδξ ημο ακηζβυκμο απυ ηδκ οδαηζηή θάζδ. Έηζζ πνμηαθείηαζ παναηεηαιέκδ ηαζ ζηαεενή δζέβενζδ ημο ακμζμπμζδηζημφ ζοζηήιαημξ. 137 Ο πεζνζζιυξ ηςκ ημοκεθζχκ πνέπεζ κα είκαζ πνμζεπηζηυξ ηαζ κα βίκεηαζ ιε ηαθμζφκδ. Γε πνεζάγμκηαζ πενζηηέξ ηζκήζεζξ πμο ιπμνεί κα ενεείζμοκ ηα γχα. Γίκεηαζ ζοκεπχξ παναηήνδζδ βζα ζοιπηχιαηα ακεπζεφιδηςκ ακηζδνάζεςκ απυ ημ οθζηυ ακμζμπμίδζδξ. Ακ πανμοζζαζημφκ ζοιπηχιαηα υπςξ απχθεζα αάνμοξ, απάεεζα ή πονεηυξ, ζηαιαημφκηαζ μζ πμνδβήζεζξ ημο ακμζμπμζδηζημφ οθζημφ. 138 Μεηά ημ πέναξ ηςκ ηεζζάνςκ εαδμιάδςκ έβζκε θήρδ 3 ml πενζθενζημφ αίιαημξ απυ ηάεε γχμ. Σα δείβιαηα ημπμεεηήεδηακ ζε οδαηυθμοηνμ ζημοξ 37 μ C βζα ιζζή χνα. ηδ ζοκέπεζα ηάκαιε θήρδ ημο μνμφ απυ ηα ημζπχιαηα ιε ηδ αμήεεζα πζπέηαξ Παζηέν ηαζ ημκ ημπμεεηήζαιε ζημ ροβείμ. Σδκ επυιεκδ ιένα έβζκε θοβμηέκηνδζδ ημο μνμφ ζηζξ 4000 rpm βζα 10 θεπηά βζα κα απμιαηνοκεμφκ ηοπυκ αδζάθοηα οθζηά, θήρδ ημο οπενηεζιέκμο ημο μνμφ ηαζ απμεήηεοζδ ημο μνμφ ζηδκ ηαηάρολδ ζημοξ -20 μ C Ακμζμαπμηφπςζδ - Γμηζιαζία Κδθίδαξ (Dot Blot) Ζ ιέεμδμξ ααζίγεηαζ ζηδκ επίζηαλδ δείβιαημξ πάκς ζε ιειανάκδ κζηνμηοηηανίκδξ ηαζ ηδ δδιζμονβία ακμζμζοιπθέβιαημξ ιεηαλφ ημο δείβιαημξ ηαζ ημο ακηζζχιαημξ ιε ηδκ ειθάκζζδ ηδθίδαξ πάκς ζηδ ιειανάκδ. 1. Δπίζηαλδ δείβιαημξ δζαθφιαημξ ναικμθζπζδίςκ ή άθθμο δείβιαημξ πμζυηδηαξ έςξ 20 ιl πάκς ζε ιειανάκδ κζηνμηοηηανίκδξ 2. Δπχαζδ ηδξ ιειανάκδξ ζε 10 ml δζαθφιαημξ ημνεζιμφ (5 % w/v ζηυκδ απμαμοηονςιέκμο βάθαηημξ ζε δζάθοια PBS) βζα 1 χνα ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα κα ημνεζεεί δ ιειανάκδ ιε πνςηεΐκεξ ημο βάθαηημξ, ηονίςξ ιε

56 ηδκ ηαγεΐκδ, χζηε κα απμθεοπεεί δ ιδ ελεζδζηεοιέκδ δέζιεοζδ ημο ακηζζχιαημξ ζηδ ιειανάκδ. 3. Σνεζξ πθφζεζξ ηδξ ιειανάκδξ ζε 10 ml δζαθφιαημξ ηαεανζζιμφ (0,03 % tween-20 ζε δζάθοια PBS) ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Ζ ηάεε πθφζδ βίκεηαζ φζηενα απυ ακάδεοζδ ηδξ ιειανάκδξ ζημ δζάθοια ηαεανζζιμφ ιε δζάνηεζα 5 θεπηά. 4. Δπχαζδ ηδξ ιειανάκδξ ιε ημκ μνυ αίιαημξ ημο ημοκεθζμφ πμο πενζέπεζ ακηίζςια έκακηζ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ζε 10 ml δζαθφιαημξ ημνεζιμφ (5 % w/v ζηυκδ απμαμοηονςιέκμο βάθαηημξ ζε δζάθοια PBS) βζα 2 χνεξ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο οπυ ακάδεοζδ. 5. Σνεζξ πθφζεζξ ηδξ ιειανάκδξ ζε 10 ml δζαθφιαημξ ηαεανζζιμφ (0,03 % tween-20 ζε δζάθοια PBS) ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Ζ ηάεε πθφζδ βίκεηαζ φζηενα απυ ακάδεοζδ ηδξ ιειανάκδξ ζημ δζάθοια ηαεανζζιμφ ιε δζάνηεζα 5 θεπηά. 6. Δπχαζδ ηδξ ιειανάκδξ ιε ημ δεοηενεφμκ ακηίζςια ζογεοβιέκμ ιε ηδκ αθηαθζηή θςζθαηάζδ ζε 10 ml δζαθφιαημξ ημνεζιμφ (5 % w/v ζηυκδ απμαμοηονςιέκμο βάθαηημξ ζε δζάθοια PBS) βζα 2 χνεξ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. 7. Σνεζξ πθφζεζξ ηδξ ιειανάκδξ ζε 10 ml δζαθφιαημξ ηαεανζζιμφ (0,03 % tween-20 ζε δζάθοια PBS) ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Ζ ηάεε πθφζδ βίκεηαζ φζηενα απυ ακάδεοζδ ηδξ ιειανάκδξ ζημ δζάθοια ηαεανζζιμφ ιε δζάνηεζα 5 θεπηά. 8. Γνήβμνδ πθφζδ ιε ημ δζάθοια αθηαθζηήξ θςζθαηάζδξ 9. Δπχαζδ ιε 10 ml δζάθοια αθηαθζηήξ θςζθαηάζδξ ηαζ πνμζεήηδ 30 ιl BCIP (5-ανςιμ-4-πθςνμ-3-ζκδμθοθ-θςζθμνζηυ) ηαζ 30 ιl NBT (πνςζηζηή ηοακυ ημο κζηνμηεηναγμθίμο) 10. Γζα κα ζηαιαηήζεζ δ πνςιμακηίδναζδ, δ ιειανάκδ λεπθέκεηαζ ιε δζξ απεζηαβιέκμ κενυ, ζηεβκχκεηαζ ηαζ θοθάζζεηαζ ζε ζημηεζκυ πχνμ. Γζάθοια Κμνεζιμφ (ζηυκδ βάθαηημξ ζε PBS) Γζα 100 ml ζοκμθζημφ δζαθφιαημξ: 100 ml PBS 5 gr ζηυκδ απμαμοηονςιέκμο βάθαηημξ

57 Γζάθοια PBS tween 20 Γζα 300 ml ζοκμθζημφ δζαθφιαημξ: 100 ml PBS 900 ml tween 20 Γζάθοια Αθηαθζηήξ Φςζθαηάζδξ Γζα 500 ml ζοκμθζημφ δζαθφιαημξ: 10 ml 5M NaCl 2,5 ml 1M MgCl 2 50 ml 1M Tris-HCl ph 9,5 437,5 ml H 2 O 23. Ζθεηηνμιεηαθμνά πνςηεσκχκ ζε ιειανάκδ ηαζ Ακμζμαπμηφπςζδ (Western Blot) Ζ ιέεμδμξ ααζίγεηαζ ζηδκ ζηακυηδηα δζαπςνζζιμφ ηςκ πνςηεσκχκ ή άθθςκ ιμνίςκ ακάθμβα ιε ημ ιμνζαηυ ημοξ αάνμξ ηαζ ηδ ιεηαθμνά ημοξ ζε ιειανάκδ κζηνμηοηηανίκδξ ιε ηδκ επίδναζδ δζαθμνάξ δοκαιζημφ. 1. Ανπζηά βίκεηαζ εκενβμπμίδζδ ηδξ ιειανάκδξ κζηνμηοηηανίκδξ ιε ιεεακυθδ βζα πενίπμο 3 θεπηά ηαζ ιεηαθμνά ηδξ ζηδ ζοκέπεζα ζε δζάθοια ιεηαθμνάξ βζα ελζζμννυπδζδ. 2. Αημθμοεεί ελζζζμνυπδζδ 6 θφθθςκ Whattman ζε δζάθοια ιεηαθμνάξ. 3. Σμπμεεημφκηαζ δζαδμπζηά 3 θφθθα Whattman πάκς ζηδ ζοζηεοή, αημθμοεεί δ ιειανάκδ κζηνμηοηηανίκδξ, ιεηά δ πδηηή ηαζ ηέθμξ 3 θφθθα Whattman. 4. Γίκεηαζ ακμζμιεηαθμνά ζηδ ιειανάκδ κζηνμηοηηανίκδξ βζα 30 θεπηά ζε 64 ma. 5. Δπχαζδ ηδξ ιειανάκδξ ζε 10 ml δζαθφιαημξ ημνεζιμφ (5 % w/v ζηυκδ απμαμοηονςιέκμο βάθαηημξ ζε δζάθοια PBS) βζα 1 χνα ζε εενιμηναζία δςιαηίμο βζα κα ημνεζεεί δ ιειανάκδ ιε πνςηεΐκεξ ημο βάθαηημξ ηονίςξ ιε ηδκ ηαγεΐκδ χζηε κα απμθεοπεεί δ ιδ ελεζδζηεοιέκδ δέζιεοζδ ημο ακηζζχιαημξ ζηδ ιειανάκδ. 6. Σνεζξ πθφζεζξ ηδξ ιειανάκδξ ζε 10 ml δζαθφιαημξ ηαεανζζιμφ (0,03 % tween-20 ζε δζάθοια PBS) ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Ζ ηάεε πθφζδ βίκεηαζ

58 φζηενα απυ ακάδεοζδ ηδξ ιειανάκδξ ζημ δζάθοια ηαεανζζιμφ ιε δζάνηεζα 5 θεπηά. 7. Δπχαζδ ηδξ ιειανάκδξ ιε ημκ μνυ αίιαημξ ημο ημοκεθζμφ πμο πενζέπεζ ακηίζςια έκακηζ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ζε 10 ml δζαθφιαημξ ημνεζιμφ (5 % w/v ζηυκδ απμαμοηονςιέκμο βάθαηημξ ζε δζάθοια PBS) βζα 2 χνεξ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο οπυ ακάδεοζδ. 8. Σνεζξ πθφζεζξ ηδξ ιειανάκδξ ζε 10 ml δζαθφιαημξ ηαεανζζιμφ (0,03 % tween-20 ζε δζάθοια PBS) ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Ζ ηάεε πθφζδ βίκεηαζ φζηενα απυ ακάδεοζδ ηδξ ιειανάκδξ ζημ δζάθοια ηαεανζζιμφ ιε δζάνηεζα 5 θεπηά. 9. Δπχαζδ ηδξ ιειανάκδξ ιε ημ δεοηενεφμκ ακηίζςια ζογεοβιέκμ ιε ηδκ αθηαθζηή θςζθαηάζδ ζε 10 ml δζαθφιαημξ ημνεζιμφ (5 % w/v ζηυκδ απμαμοηονςιέκμο βάθαηημξ ζε δζάθοια PBS) βζα 2 χνεξ ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. 10. Σνεζξ πθφζεζξ ηδξ ιειανάκδξ ζε 10 ml δζαθφιαημξ ηαεανζζιμφ (0,03 % tween-20 ζε δζάθοια PBS) ζε εενιμηναζία δςιαηίμο. Ζ ηάεε πθφζδ βίκεηαζ φζηενα απυ ακάδεοζδ ηδξ ιειανάκδξ ζημ δζάθοια ηαεανζζιμφ ιε δζάνηεζα 5 θεπηά. 11. Γνήβμνδ πθφζδ ιε ημ δζάθοια αθηαθζηήξ θςζθαηάζδξ 12. Δπχαζδ ιε 10 ml δζάθοια αθηαθζηήξ θςζθαηάζδξ ηαζ πνμζεήηδ 30 ιl BCIP (5-ανςιμ-4-πθςνμ-3-ζκδμθοθ-θςζθμνζηυ) ηαζ 30 ιl NBT (πνςζηζηή ηοακυ ημο κζηνμηεηναγμθίμο) 13. Γζα κα ζηαιαηήζεζ δ πνςιμακηίδναζδ, δ ιειανάκδ λεπθέκεηαζ ιε δζξ απεζηαβιέκμ κενυ, ζηεβκχκεηαζ ηαζ θοθάζζεηαζ ζε ζημηεζκυ πχνμ.

59 ΑΠΟΣΔΛΔΜΑΣΑ 1. Παναβςβή ναικμθζπζδίςκ απυ ηα ααηηήνζα T. thermophilus ζε πδβέξ άκεναηα: ζμβζέθαζμ, ηαπνμσηυ μλφ ηαζ βθοηενυθδ Ζ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ απυ ηα ααηηήνζα T. thermophilus παναηδνήεδηε ζε οβνέξ ηαθθζένβεζεξ T. thermophilus ζε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ υπμο πνδζζιμπμζήεδηε ςξ πδβή άκεναηα ημ δθζέθαζμ ηαζ ημ εθασηυ μλφ. 36 Με αάζδ αοηά ηα απμηεθέζιαηα, έβζκε ακάπηολδ ηνζχκ ηαθθζενβεζχκ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ιε ηνεζξ δζαθμνεηζηέξ πδβέξ άκεναηα ακηίζημζπα (Πίκαηαξ 3) βζα κα παναηδνδεεί ακ ηαζ ιε αοηέξ ηζξ πδβέξ ηα ηφηηανα μδδβμφκηαζ ζηδκ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ. Μεηά ημ πέναξ 72 ςνχκ, έβζκε θήρδ ημο οπενηεζιέκμο ηάεε οβνήξ ηαθθζένβεζαξ ιε δζαθμνεηζηή πδβή άκεναηα, εηπφθζζδ ημο δείβιαημξ βζα θήρδ ναικμθζπζδίςκ ηαζ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ιε ηδκ ακηίδναζδ ηδξ μνηζκυθδξ. Πίνακαρ 3: Παπαγωγή παμνολιπιδίων ζε καλλιέπγειερ με διαθοπεηική πηγή άνθπακα Πδβή άκεναηα οβηέκηνςζδ ναικμθζπζδίςκ (ιg/ml) Καπξνϊθό νμύ 35,5 νγηέιαην 89,8 Γιπθεξόιε 15,7 Ακ ηαζ δ ιέεμδμξ ιε ηδκ μνηζκυθδ έδςζε εεηζηά απμηεθέζιαηα ηαζ βζα ηζξ ηνεζξ ηαθθζένβεζεξ βζα ηδκ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ, εκημφημζξ δ ηαοημπμίδζή ημοξ ιε πνςιαημβναθία θεπηήξ ζημζαάδαξ δεκ έδςζε ααθή πζεακχξ θυβς ηδξ ιζηνήξ πμζυηδηαξ ναικμθζπζδίςκ πμο πανήπεδζακ.

60 Κηλνύκελε Καιιηέξγεηα 2. Παναβςβή ναικμθζπζδίςκ απυ ηα ααηηήνζα T. thermophilus ιε ιεηααμθή ηδξ ζοβηέκηνςζδξ θςζθμνζηχκ ηαζ ιε πδβή άκεναηα βθοημκζηυ κάηνζμ Σμ βθοημκζηυ κάηνζμ (C 6 H 11 NaO 7 ) επζθέπεδηε ςξ ιία πζεακή εκαθθαηηζηή πδβή άκεναηα βζα παναβςβή ναικμθζπζδίςκ απυ ηα ααηηήνζα T. thermophilus θυβς ηδξ παναβςβήξ ημο απυ ηδ βθοηυγδ ιε ηδ δνάζδ ημο εκγφιμο αθοδνμβμκάζδ ημο NAD. Πναβιαημπμζήεδηε ακάπηολδ δφμ ηαθθζενβεζχκ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ ζε δφμ δζαθμνεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ θςζθμνζηχκ 5 mm ηαζ 50 mm βζα κα παναηδνδεεί ακ ηα ηφηηανα μδδβμφκηαζ ζηδκ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ ηαζ ακ δ δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ ζημ ενεπηζηυ ιέζμ ηδξ ηαθθζένβεζαξ μδδβεί ζε ιεηααμθή ηδξ παναβςβήξ ηςκ ναικμθζπζδίςκ. Μεηά ημ πέναξ 72 ςνχκ, έβζκε θήρδ μθυηθδνμο ημο οπενηεζιέκμο ηάεε οβνήξ ηαθθζένβεζαξ, εηπφθζζδ ημο δείβιαημξ βζα θήρδ ναικμθζπζδίςκ ηαζ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ιε ηδκ ακηίδναζδ ηδξ μνηζκυθδξ. Σαοηυπνμκα πναβιαημπμζήεδηε ακάπηολδ δφμ ηαθθζενβεζχκ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ ζε δφμ δζαθμνεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ θςζθμνζηχκ 5 mm ηαζ 50 mm ηαζ πςνίξ ακάδεοζδ ηδξ ηαθθζένβεζαξ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ επχαζδξ βζα ακεπανηή μλοβυκςζδ ηδξ ηαθθζένβεζαξ. Πίνακαρ 4: Παπαγωγή παμνολιπιδίων ζε κινούμενη και ζηαηική καλλιέπγεια με διαθοπεηική ζςγκένηπωζη θωζθοπικών οβηέκηνςζδ θςζθμνζηχκ οβηέκηνςζδ ναικμθζπζδίςκ (ιg/ml) 50 mm 102,1 5 mm 264,9

61 ηαηηθή Καιιηέξγεηα 50 mm 16,1 5 mm 16,6 ημκ πίκαηα 4 πανμοζζάγεηαζ δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ πμο οπμθμβίζηδηε ιε ηδ ιέεμδμ ηδξ μνηζκυθδξ απυ ηζξ ηζκμφιεκεξ ηαζ ηζξ ζηαηζηέξ ηαθθζένβεζεξ T. thermophilus ιε δζαθμνεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ θςζθμνζηχκ ακά ηαθθζένβεζα. Παναηδνείηαζ ιζα ιεβαθφηενδ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ ζηζξ ηζκμφιεκεξ ηαθθζένβεζεξ ιε ιεβαθφηενδ ζοβηέκηνςζδ ναικμθζπζδίςκ ζηδκ ηαθθζένβεζα ιε 5 mm ζοβηέκηνςζδ θςζθμνζηχκ ζε ζπέζδ ιε ηζξ ζηαηζηέξ ηαθθζένβεζεξ υπμο δ παναβςβή ηςκ ναικμθζπζδίςκ είκαζ πμθφ ιζηνυηενδ. H ιέεμδμξ ιε ηδκ μνηζκυθδ (πίκαηαξ 4) αθθά ηαζ δ ηαοημπμίδζή ημοξ ιε πνςιαημβναθία θεπηήξ ζημζαάδαξ (εζηυκα 18) έδςζακ εεηζηά απμηεθέζιαηα βζα ηδκ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ. Ύπανλδ ναικμθζπζδίςκ Δηθόλα 18: Υξωκαηνγξαθία ιεπηήο ζηνηβάδαο γηα αλίρλεπζε ξακλνιηπηδίωλ

62 3. Δπίδναζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ θςζθμνζηχκ ζηδκ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ ζε ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ T. thermophilus ε πέκηε οβνέξ ηαθθζένβεζεξ T. thermophilus ζε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ ηαζ ιε δζαθμνεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ θςζθμνζηχκ ζε ηάεε ηαθθζένβεζα 50 mm, 25 mm, 10 mm, 5 mm ηαζ 0,5 mm ακηίζημζπα, πναβιαημπμζήεδηε θήρδ 2 ml οπενηεζιέκμο ηαθθζένβεζαξ ηάεε 24 χνεξ βζα 8 διένεξ, εηπφθζζδ ημο δείβιαημξ βζα θήρδ ναικμθζπζδίςκ ηαζ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ιε ηδκ ακηίδναζδ ηδξ μνηζκυθδξ. ημκ πίκαηα 5 πανμοζζάγεηαζ δ πμζυηδηα ναικμθζπζδίςκ πμο οπμθμβίζηδηε ζε δεζβιαημθδρία πμο πναβιαημπμζήεδηε ακά εζημζζηεηνάςνμ βζα μηηχ εζημζζηεηνάςνα βζα ηάεε ιία απυ ηζξ πέκηε ηαθθζένβεζεξ T. thermophilus. Πίνακαρ 5: Παπαγωγή παμνολιπιδίων καηά ηη διάπκεια ηος σπόνος πγθέληξωζε θωζθνξηθώλ θαιιηέξγεηαο πγθέληξωζε θωζθνξηθώλ θαιιηέξγεηαο Ρακλνιηπίδηα (κg/ml) Υξόλνο Καιιηέξγεηαο (ώξεο) (24 h) (48 h) (72 h) (96 h) 0,5 mm 23,34 32,54 33,41 38,59 5 mm 27,76 13,72 29,43 27,03 10 mm 25,81 7,87 24,43 11,61 25 mm 13,29 13,29 33,83 9,81 50 mm 8,87 13,23 36,52 9,81 Υξόλνο Καιιηέξγεηαο (ώξεο) (120 h) (144 h) (168 h) (192 h) 0,5 mm 32,52 43,74 45,83 39,10 5 mm 19,72 2,50 16,32 16,90 10 mm 7,82 7,40 6,95 9,81 25 mm 6,44 15,59 18,70 3,64 50 mm 14,37 14,88 12,77 14,08 Παναηδνείηαζ ανπζηά ιία αφλδζδ ηδξ παναβςβήξ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ζηζξ ηαθθζένβεζεξ ιε παιδθή ζοβηέκηνςζδ θςζθμνζηχκ ζε δζάνηεζα 24 ςνχκ ηαζ ιεηέπεζηα έκα ιέβζζημ παναβςβήξ ναικμθζπζδίςκ βζα υθεξ ηζξ ηαθθζένβεζεξ ζε δζάνηεζα 72 ςνχκ. Μεηέπεζηα αημθμοεεί πηχζδ ηδξ παναβςβήξ ναικμθζπζδίςκ ζε υθεξ ηζξ ηαθθζένβεζεξ εηηυξ ηδξ ηαθθζένβεζαξ ιε 0,5 mm ζοβηέκηνςζδ θςζθμνζηχκ δ μπμία ζοκεπίγεζ ιζα ιζηνή αφλδζδ ζηδκ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ. (δζάβναιια 3)

63 Ραμνολιπίδια (μg) (0h) (24h) (48h) (72h) (96h) (120h) (144h) (168h) (192h) Χπόνορ καλλιέπγειαρ (h) 0,5 mm 5 mm 10 mm 25 mm 50 mm Γηάγξακκα 3: Μεηαβνιή ηεο παξαγωγήο ξακλνιηπηδίωλ ζε ζπλάξηεζε κε ην ρξόλν θαη ηελ ζπγθέληξωζε ηωλ θωζθνξηθώλ ηεο θαιιηέξγεηαο ημκ πίκαηα 6 πανμοζζάγεηαζ δ ζοβηέκηνςζδ θςζθμνζηχκ πμο οπμθμβίζηδηε ζε δεζβιαημθδρία πμο πναβιαημπμζήεδηε ακά εζημζζηεηνάςνμ βζα μηηχ εζημζζηεηνάςνα βζα ηάεε ιία απυ ηζξ πέκηε ηαθθζένβεζεξ T. thermophilus. Πίνακαρ 6: Δναπομείναζα ζςγκένηπωζη θωζθοπικών καηά ηη διάπκεια ηος σπόνος ηηρ καλλιέπγειαρ Αξρηθή ζπγθέληξωζε θωζθνξηθώλ θαιιηέξγεηαο Αξρηθή ζπγθέληξωζε θωζθνξηθώλ θαιιηέξγεηαο πγθέληξωζε θωζθνξηθώλ (mm) Υξόλνο Καιιηέξγεηαο (ώξεο) (24 h) (48 h) (72 h) (96 h) 0,5 mm mm mm ,02 25 mm 0 0 0,01 0,03 50 mm 0 0 0,01 0,03 Υξόλνο Καιιηέξγεηαο (ώξεο) (120 h) (144 h) (168 h) (192 h) 0,5 mm mm 0,01 0, mm 0,02 0,03 0, mm 0,03 0,04 0,02 0,02 50 mm 0,03 0,05 0,03 0,02 ηα δζαβνάιιαηα 4, 5, 6, 7, 8 πανμοζζάγεηαζ δ ιεηααμθή ηδξ παναβςβήξ ναικμθζπζδίςκ ζε ζοκάνηδζδ ιε ηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ θςζθμνζηχκ ηαζ ηδ ιεηααμθή ημο πνυκμο. Γεκ παναηδνείηαζ ζοζπέηζζδ ηδξ παναβςβήξ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ιε ηδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ θςζθμνζηχκ ζηδ

64 Ποζόηηηα παμνολιπιδίων (μg) Ποζόηηηα παμνολιπιδίων (μg) Ποζόηηηα παμνολιπιδίων (μg) ςγκένηπωζη θωζθοπικών (mm) Ποζόηηηα παμνολιπιδίων (μg) ςγκένηπωζη θωζθοπικών (mm) ςγκένηπωζη θωζθοπικών (mm) Ποζόηηηα παμνολιπιδίων (μg) ςγκένηπωζη θωζθοπικών (mm) ςγκένηπωζη θωζθοπικών (mm) δζάνηεζα ημο πνυκμο δζυηζ απυ ημ πνχημ εζημζζηεηνάςνμ έπεζ ιδδεκζζηεί δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ θςζθμνζηχκ ζε υθεξ ηζξ ηαθθζένβεζεξ. Ζ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ επδνεάγεηαζ ιυκμ απυ ηδκ ανπζηή ζοβηέκηνςζδ θςζθμνζηχκ ηδξ ηαθθζένβεζαξ. Γηάγξακκα 4: Μεηαβνιή ηεο παξαγωγήο ξακλνιηπηδίωλ ζε θαιιηέξγεηα κε αξρηθή ζπγθέληξωζε θωθνξηθώλ 0,5 mm Γηάγξακκα 5: Μεηαβνιή ηεο παξαγωγήο ξακλνιηπηδίωλ ζε θαιιηέξγεηα κε αξρηθή ζπγθέληξωζε θωθνξηθώλ 5 mm , , , , , , Χπόνορ ανάπηςξηρ κςηηαποκαλλιέπγειαρ (h) Χπόνορ ανάπηςξηρ κςηηαποκαλλιέπγειαρ (h) Γηάγξακκα 6: Μεηαβνιή ηεο παξαγωγήο ξακλνιηπηδίωλ ζε θαιιηέξγεηα κε αξρηθή ζπγθέληξωζε θωθνξηθώλ 10 mm Γηάγξακκα 7: Μεηαβνιή ηεο παξαγωγήο ξακλνιηπηδίωλ ζε θαιιηέξγεηα κε αξρηθή ζπγθέληξωζε θωθνξηθώλ 25 mm Χπόνορ ανάπηςξηρ κςηηαποκαλλιέπγειαρ (h) Χπόνορ ανάπηςξηρ κςηηαποκαλλιέπγειαρ (h) Γηάγξακκα 8: Μεηαβνιή ηεο παξαγωγήο ξακλνιηπηδίωλ ζε θαιιηέξγεηα κε αξρηθή ζπγθέληξωζε θωθνξηθώλ 50 mm Χπόνορ ανάπηςξηρ κςηηαποκαλλιέπγειαρ (h) 0

65 4. Ακίπκεοζδ πομηοακίκδξ ζε ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ T. thermophilus Ζ παναβςβή πομηοακίκδξ παναηδνήεδηε ζε ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ P. aeroginosa ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ. 118,127 Πναβιαημπμζήεδηε βζα αοηυ ημ θυβμ ακάπηολδ δφμ οβνχκ ηαθθζενβεζχκ ααηηδνίςκ T. Τhermophilus ζε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ ηαζ ιε δζαθμνεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ θςζθμνζηχκ ζε ηάεε ηαθθζένβεζα 0,3 mm ηαζ 0,5 mm ακηίζημζπα βζα κα παναηδνδεεί ακ ηα ηφηηανα μδδβμφκηαζ ζηδκ παναβςβή πομηοακίκδξ ηαζ ακ δ δζαθμνμπμίδζδ ηςκ θςζθμνζηχκ επδνεάγεζ ηδκ παναβςβή. Έβζκε θήρδ 50 ml οπενηεζιέκμο απυ ηάεε ηαθθζένβεζα ζηζξ 16 χνεξ, ζηζξ 24 χνεξ ηαζ ζηζξ 44 χνεξ βζα κα δμφιε ακ οπάνπεζ ιεηααμθή ηδξ παναβςβήξ ηδξ πομηοακίκδξ ζε ζοκάνηδζδ ιε ημ πνυκμ. Σα δείβιαηα εηποθίγμκηαζ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα πναβιαημπμζείηαζ δ απμννυθδζδ ηςκ δεζβιάηςκ ζε υθα ηα ιήηδ ηφιαημξ υπμο απμννμθά δ πομηοακίκδ. ημοξ πίκαηεξ 7, 8 ηαζ 9 πανμοζζάγεηαζ δ απμννυθδζδ πομηοακίκδξ ζηα δζάθμνα δείβιαηα ζε δζαθμνεηζηά ιήηδ ηφιαημξ υπμο απμννμθά δ πομηοακίκδ. Πίνακαρ 7: Αποππόθηζη δειγμάηων ζε μήκορ κύμαηορ 520 nm για ανίσνεςζη πςοκςανίνηρ πγθέληξωζε θωζθνξηθώλ θαιιηέξγεηαο Απνξξόθεζε ππνθπαλίλεο (OD) Υξόλνο Καιιηέξγεηαο (ώξεο) (16 h) (21 h) (44 h) 0,3 mm 0,001 0,002 0,001 Πίνακαρ 8: Αποππόθηζη δειγμάηων ζε μήκορ κύμαηορ 510 nm για ανίσνεςζη πςοκςανίνηρ πγθέληξωζε θωζθνξηθώλ θαιιηέξγεηαο Απνξξόθεζε ππνθπαλίλεο (OD) Υξόλνο Καιιηέξγεηαο ζε ώξεο (16 h) (21 h) (44 h) 0,5 mm 0,009 0,01 0,009

66 Πίνακαρ 9: Αποππόθηζη δειγμάηων ζε μήκορ κύμαηορ 690 nm για ανίσνεςζη πςοκςανίνηρ πγθέληξωζε θωζθνξηθώλ θαιιηέξγεηαο Απνξξόθεζε ππνθπαλίλεο (OD) Υξόλνο Καιιηέξγεηαο ζε ώξεο (16 h) (21 h) (44 h) 0,5 mm 0,004 0,005 0,006 Παναηδνείηαζ πςξ δ απμννυθδζδ πομηοακίκδξ ηαζ ζηζξ δφμ ηαθθζένβεζεξ ακελανηήηςξ ανπζηήξ ζοβηέκηνςζδξ θςζθμνζηχκ ηαζ ακελανηήηςξ πνυκμο επχαζδξ ηδξ ηαθθζένβεζαξ είκαζ ζπεδυκ ιδδεκζηή. οιπεναίκεηαζ υηζ ζε ηαθθζένβεζα T. thermophilus επχαζδξ έςξ ζανακηαηεζζάνςκ ςνχκ δεκ παναηδνείηαζ παναβςβή πομηοακίκδξ. 5. Ακίπκεοζδ πομηοακίκδξ ζε ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ T. thermophilus ιε πδβέξ άκεναηα: αθβζκζηυ μλφ, βθοημκζηυ κάηνζμ ηαζ μηηακμσηυ κάηνζμ ε ηνεζξ οβνέξ ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ, ημ μηηακμσηυ κάηνζμ (CH 3 (CH 2 ) 6 COOH) ηαζ ημ αθβζκζηυ μλφ (C 6 H 8 O 6 ) n ακηίζημζπα, έβζκε θήρδ 50 ml οπενηεζιέκμο ηαθθζένβεζαξ ζηζξ 72 χνεξ απυ ηζξ ηαθθζένβεζεξ ιε ημ βθοημκζηυ κάηνζμ ηαζ ημ αθβζκζηυ μλφ, ηαζ 50 ml εηποθίζιαημξ πενζπθάζιαημξ ζηζξ 72 χνεξ απυ ηδκ ηαθθζένβεζα ιε ημ μηηακμσηυ κάηνζμ βζα κα παναηδνδεεί ακ ηα ηφηηανα μδδβμφκηαζ ζηδκ παναβςβή πομηοακίκδξ. Ζ απμννυθδζδ ηςκ δεζβιάηςκ πναβιαημπμζήεδηε ζε υθα ηα ιήηδ ηφιαημξ υπμο απμννμθά δ πομηοακίκδ. Πίνακαρ 10: Αποππόθηζη δειγμάηων για ανίσνεςζη πςοκςανίνηρ Πδβή άκεναηα Απμννυθδζδ πομηοακίκδξ ζηα 510 nm Απμννυθδζδ πομηοακίκδξ ζηα 520 nm Απμννυθδζδ πομηοακίκδξ ζηα 690 nm Αιγηληθό νμύ 0 0,01 0,008 Γιπθνληθό λάηξην Οθηαλνϊθό λάηξην 0,034 0,029 0,016

67 Ο πίκαηαξ 10 ιαξ δείπκεζ ηδκ απμννυθδζδ πομηοακίκδξ ζηα δζάθμνα δείβιαηα ζε δζαθμνεηζηά ιήηδ ηφιαημξ υπμο απμννμθά δ πομηοακίκδ. Παναηδνείηαζ πςξ δ απμννυθδζδ πομηοακίκδξ ζηζξ ηαθθζένβεζεξ ιε αθβζκζηυ μλφ ηαζ ιε βθοημκζηυ κάηνζμ είκαζ ζπεδυκ ιδδεκζηή εκχ δ απμννυθδζδ πομηοακίκδξ ζηδκ ηαθθζένβεζα ιε μηηακμσηυ κάηνζμ δείπκεζ ιζα πμθφ παιδθή απμννυθδζδ πμο πζεακχξ κα οπμδεζηκφεζ ηδκ φπανλδ πομηοακίκδξ ζημ πενίπθαζια ηςκ ηοηηάνςκ πμο ακαπηφπεδηακ πανμοζία μηηακμσημφ καηνίμο. 6. Ακίπκεοζδ εθαζηάζδξ ζε ζηενεέξ ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ T. thermophilus πανμοζία εθαζηίκδξ Ζ παναβςβή εθαζηάζδξ παναηδνήεδηε ζε ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ P. aeroginosa ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ. 110 Ζ εθαζηάζδ έπεζ ιμθοζιαηζηή δνάζδ δζυηζ ηαηαζηνέθεζ ημκ ηορεθζδζηυ ζζηυ ζημοξ πκεφιμκεξ. 106,107 ε δφμ ηνζαθία πναβιαημπμζήεδηε ακάπηολδ ηαθθζένβεζαξ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζε ηακμκζηυ ηαζ ζε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ πανμοζία εθαζηίκδξ 0,1 % w/v. Ζ επχαζδ ηςκ ηαθθζενβεζχκ δζήνηδζε βζα 72 χνεξ.

68 Δηθόλα 19: Σξηβιία θαιιηέξγεηαο T. thermophilus πνπ πεξηέρνπλ ειαζηίλε Α) Καλνληθό κέζν αλάπηπμεο ζε 0 ώξεο, Β) Σξνπνπνηεκέλν κέζν αλάπηπμεο ζε 0 ώξεο, Γ) Καλνληθό κέζν αλάπηπμεο ζε 72 ώξεο, Γ) Σξνπνπνηεκέλν κέζν αλάπηπμεο ζε 72 ώξεο ηδκ εζηυκα 19 πανμοζζάγμκηαζ ηα ηνζαθία ιε ηζξ ηαθθίενβεζεξ T. thermophilus πνζκ ηαζ ιεηά ηδκ επχαζδ. ηδκ Α πενίπηςζδ πανμοζζάγεηαζ ημ ηνζαθίμ ιε ηδκ ηαθθζένβεζα ζε ηακμκζηυ ιέζμ ακάπηολδξ πανμοζία εθαζηίκδξ ηαηά ηδκ έκανλδ ημο πεζνάιαημξ ηαζ ζηδ Γ πενίπηςζδ πανμοζζάγεηαζ ημ ίδζμ ηνζαθίμ ιεηά ηδκ επχαζδ ηςκ 72 ςνχκ. Ακηίζημζπα, ζηδ Β πενίπηςζδ πανμοζζάγεηαζ ημ ηνζαθίμ ιε ηδκ ηαθθζένβεζα ζε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ πανμοζία εθαζηίκδξ ηαηά ηδκ έκανλδ ημο πεζνάιαημξ ηαζ ζηδ Γ πενίπηςζδ πανμοζζάγεηαζ ημ ίδζμ ηνζαθίμ ιεηά ηδκ επχαζδ ηςκ 72 ςνχκ. Με αάζδ ηδκ εζηυκα 19, παναηδνείηαζ ιζηνή δζαθμνμπμίδζδ ζηδ πανμοζία εθαζηίκδξ πνάβια πμο ζδιαίκεζ πςξ ηα ααηηήνζα είηε ζε ηαθθζένβεζα ιε ηακμκζηυ ιέζμ ακάπηολδξ είηε ιε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ηαηακάθςζακ εθαζηίκδ πμο ζοκεπάβεηαζ πςξ πανάβμοκ πζεακχξ εθαζηάζδ ζε πμθφ ιζηνή πμζυηδηα. 7. Ακίπκεοζδ εθαζηάζδξ ζε οβνέξ ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ T. thermophilus πανμοζία εθαζηίκδξ Δπεζδή δεκ οπήνλακ εεηζηά απμηεθέζιαηα βζα ηδκ παναβςβή εθαζηάζδξ απυ ηζξ ζηενεέξ ηαθθζένβεζεξ T. thermophilus ζε ηνζαθία ζημ πνμδβμφιεκμ πείναια, δζενεοκήεδηε δ πζεακή παναβςβή εθαζηάζδξ ζε

69 ρωξίο ειαζηίλε Καιιηέξγεηεο κε ειαζηίλε οβνέξ ηαθθζένβεζεξ ιε δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ ακά ηαθθζένβεζα. ε έκα ηνζαθίμ έλζ εέζεςκ πναβιαημπμζήεδηε ακάπηολδ ηαθθζένβεζαξ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζε ηάεε εέζδ ζε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ηαζ ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ. ε ηάεε εέζδ οπήνπε δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ 5 mm, 1 mm ηαζ 0,5 mm πανμοζία εθαζηίκδξ (0,1% w/v) ηαζ 5 mm, 1 mm ηαζ 0,5 mm απμοζία εθαζηίκδξ ακηίζημζπα. Ζ επχαζδ ηςκ ηαθθζενβεζχκ δζήνηδζε βζα 72 χνεξ. Αημθμφεδζε θήρδ δείβιαημξ αζςνήιαημξ ηοηηάνςκ απυ ημ οπενηείιεκμ ηδξ ηάεε εέζδξ, πνχζδ ηςκ ηοηηάνςκ ιε ηδ πνςζηζηή ηνοζηαθθζηυ ζχδεξ ηαζ θςημιέηνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ. Πίνακαρ 11: Αποππόθηζη δειγμάηων αιωπήμαηορ κςηηάπων ζε διαθοπεηικέρ ζςγκενηπώζειρ θωζθοπικών παποςζία και αποςζία ελαζηίνηρ πγθέληξωζε θωζθνξηθώλ Απνξξόθεζε (550 nm) 5 mm θςθμνζηά 1,223 1 mm θςζθμνζηά 1,563 0,5 mm θςζθμνζηά 1,56 5 mm θςθμνζηά 0,129 1 mm θςζθμνζηά 0,171 0,5 mm θςζθμνζηά 0,122 ημκ πίκαηα 11 πανμοζζάγεηαζ δ απμννυθδζδ δείβιαημξ αζςνήιαημξ ηοηηάνςκ ζηα μπμία έπεζ ζοκδεεεί δ πνςζηζηή ηνοζηαθθζηυ ζχδεξ απυ ηάεε ηαθθζένβεζα πανμοζία ηαζ απμοζία εθαζηίκδξ. Με αάζδ ημκ πίκαηα 11 υπςξ πανμοζζάγεηαζ ζημ δζάβναιια 9 παναηδνείηαζ ιία αφλδζδ ηςκ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζηζξ ηαθθζένβεζεξ πανμοζία εθαζηίκδξ ζε ζπέζδ ιε ηζξ ηοηηανμηαθθζένβεζεξ απμοζία εθαζηίκδξ ιε ιεβαθφηενδ αφλδζδ ζηζξ ηαθθζένβεζεξ ιε ηζξ παιδθυηενεξ ζοβηεκηνχζεζξ θςζθμνζηχκ. οιπεναίκεηαζ υηζ ζε οβνή ηαθθζένβεζα T. thermophilus παναηδνείηαζ παναβςβή εθαζηάζδξ ζε παιδθή ζοβηέκηνςζδ θςζθμνζηχκ.

70 Αποππόθηζη (550 nm ) 2 1,5 1 0,5 Καλλιέργειες με ελαζηίνη Καλλιέργειες τωρίς ελαζηίνη 0 0,5 mm 1 mm 5 mm ςγκένηπωζη θωζθοπικών ανά θέζη καλλιέπγειαρ (mm) Γηάγξακκα 9: Μεηαβνιή ηνπ αξηζκνύ ηωλ βαθηεξίωλ T. thermophilus ανά καλλιέργεια παροσζία και αποσζία ελαζηίνης ανηίζηοιτα ζε διαθορεηικές ζσγκενηρώζεις θωζθορικών 8. Ακίπκεοζδ πνμζηυθθδζδξ ααηηδνίςκ T. thermophilus ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ Σα ναικμθζπίδζα ανέεδηε υηζ δνμοκ ςξ επζθακεζμδναζηζημί πανάβμκηεξ πνμηαθχκηαξ απμηυθθδζδ ημο αζμθίθι πμο ζπδιαηίγεηαζ οπυ μνζζιέκεξ ζοκεήηεξ απυ ημ ααηηήνζμ P. aeruginosa ηαζ υηζ πανειπμδίγμοκ ημ ζπδιαηζζιυ αζμθίθι. 62,63 ε έκα ηνζαθίμ έλζ εέζεςκ πναβιαημπμζήεδηε ακάπηολδ ηαθθζένβεζαξ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζε ηάεε εέζδ ζε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ηαζ ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ. ε ηάεε εέζδ οπήνπε δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ 50 mm, 5 mm, 1 mm, 0,5 mm, 0,2 mm ηαζ 0 mm ακηίζημζπα. Αημθμφεδζε θήρδ δείβιαημξ απυ ηάεε εέζδ απυ ημ δζάθοια πνμζημθθδιέκςκ ηοηηάνςκ ηαζ θςημιέηνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ. ημκ πίκαηα 12 πανμοζζάγεηαζ δ απμννυθδζδ δείβιαημξ αζςνήιαημξ πνμζημθθδιέκςκ ηοηηάνςκ ζηα μπμία έπεζ ζοκδεεεί δ πνςζηζηή ηνοζηαθθζηυ ζχδεξ απυ ηάεε ηαθθζένβεζα ιε δζαθμνεηζηή ζοβηέκηνςζδ θςζθμνζηχκ.

71 Πποζκόλληζη κςηηάπων Α(550 nm ) Πίνακαρ 12: Αποππόθηζη αιωπήμαηορ πποζκολλημένων κςηηάπων πγθέληξωζε θωζθνξηθώλ Πξνζθόιιεζε θπηηάξωλ Α(550 nm ) 50 mm 1,227 5 mm 1,181 1 mm 1,034 0,5 mm 1,186 0,2 mm 1,041 0 mm 1,052 Με αάζδ ημκ πίκαηα 12 υπςξ πανμοζζάγεηαζ ζημ δζάβναιια 10 παναηδνείηαζ ιία πνμζηυθθδζδ ηςκ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζηα ημζπχιαηα ηδξ επζθάκεζαξ ημο ηνζαθίμο ζε ηαθθζένβεζεξ υπμο μζ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ θςζθμνζηχκ είκαζ πμθφ παιδθέξ ηαζ εοκμείηαζ δ παναβςβή ηςκ ναικμθζπζδίςκ ζε αοηέξ ηζξ παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ. Παν υθα αοηά, δε θαίκεηαζ δ ιεηααμθή ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ κα επδνεάγεζ ηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ααηηδνίςκ. 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 mm 0,2 mm 0,5 mm 1 mm 5 mm 50 mm ςγκένηπωζη θωζθοπικών καλλιέπγειαρ Γηάγξακκα 10: Πξνζθόιιεζε θπηηάξωλ T. thermophilus κε κεηαβνιή ηεο ζπγθέληξωζεο θωζθνξηθώλ 9. Ακίπκεοζδ πνμζηυθθδζδξ ααηηδνίςκ T. thermophilus πανμοζία ηαζ απμοζία εθαζηίκδξ ημ πείναια αοηυ δζενεοκήεδηε δ πζεακή επίδναζδ εθαζηίκδξ ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ ζηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ααηηδνίςκ Τ. Thermophilus επεζδή οπήνλε εεηζηυ απμηέθεζια βζα ηδκ

72 Πποζκόλληζη κςηηάπων Α(550 nm ) Καιιηέξγεηεο ρωξίο ειαζηίλε κε ειαζηίλε παναβςβή εθαζηάζδξ ζηζξ οβνέξ ηαθθζένβεζεξ T. thermophilus ζημ πνμδβμφιεκμ πείναια. ε έκα ηνζαθίμ έλζ εέζεςκ πναβιαημπμζήεδηε ακάπηολδ ηαθθζένβεζαξ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζε ηάεε εέζδ ζε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ηαζ ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ. ε ηάεε εέζδ οπήνπε δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ 50 mm, 5 mm, 1 mm, 0,5 mm, 0,2 mm ηαζ 0 mm ακηίζημζπα. Αημθμφεδζε θήρδ δείβιαημξ απυ ηάεε εέζδ ηαζ θςημιέηνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ. Πίνακαρ 13: Αποππόθηζη αιωπήμαηορ πποζκολλημένων κςηηάπων πγθέληξωζε θωζθνξηθώλ Πξνζθόιιεζε θπηηάξωλ Α(550 nm ) 5 mm 4,374 1 mm 4,776 0,5 mm 5,469 5 mm 3,594 1 mm 3,888 0,5 mm 3,426 ημκ πίκαηα 13 πανμοζζάγεηαζ δ απμννυθδζδ ηςκ πνμζημθθδιέκςκ ηοηηάνςκ απυ ηάεε ηαθθζένβεζα ιε δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ πανμοζία ηαζ απμοζία εθαζηίκδξ Καλλιέργειες με ελαζηίνη Καλλιέργειες τωρίς ελαζηίνη 0 0,5 mm 1 mm 5 mm ςγκένηπωζη θωζθοπικών Γηάγξακκα 11: Πξνζθόιιεζε θπηηάξωλ ζε ζπλάξηεζε κε ηε ζπγθέληξωζε θωζθνξηθώλ παξνπζία θαη απνπζία ειαζηίλεο

73 Με αάζδ ημκ πίκαηα 13 υπςξ πανμοζζάγεηαζ ζημ δζάβναιια 11 παναηδνείηαζ ιία ιεβαθφηενδ πνμζηυθθδζδ ηςκ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζηα ημζπχιαηα ηδξ επζθάκεζαξ ημο ηνζαθίμο ζε ηαθθζένβεζεξ πανμοζία εθαζηίκδξ ζε ζπέζδ ιε ηζξ ηαθθζένβεζεξ απμοζία εθαζηίκδξ. Παν υθα αοηά, δε θαίκεηαζ δ ιεηααμθή ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ κα επδνεάγεζ ηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ααηηδνίςκ ζηζξ ηαθθζένβεζεξ πανμοζία ηαζ απμοζία εθαζηίκδξ. οιπεναζιαηζηά, δ εθαζηίκδ εκζζπφεζ ηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ααηηδνίςκ T. thermophilus ζηα ημζπχιαηα ηδξ επζθάκεζαξ ημο ηνζαθίμο. 10. Ακίπκεοζδ ναικμθζπζδίςκ ζε ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ E. coli ιε ιεηααμθή ηδξ ζοβηέκηνςζδξ θςζθμνζηχκ Ζ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ παναηδνήεδηε ζε ααηηήνζα T. thermophilus αθθά ηαζ ζε ακαζοκδζαζιέκα ααηηήνζα E. coli πμο έθενακ ημ μπενυκζμ rhlab απυ ημ ααηηήνζμ P. aeruginosa. 37 ε έλζ οβνέξ ηαθθζένβεζεξ άβνζςκ ζηεθεπχκ ααηηδνίςκ E. coli ζε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ ηαζ ιε δζαθμνεηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ θςζθμνζηχκ ζε ηάεε ηαθθζένβεζα 50 mm, 25 mm, 10 mm, 5 mm ηαζ 0,5 mm ακηίζημζπα, πναβιαημπμζήεδηε θήρδ οπενηεζιέκμο ηαθθζένβεζαξ ηάεε 24 χνεξ βζα 3 διένεξ, εηπφθζζδ ημο δείβιαημξ βζα θήρδ ναικμθζπζδίςκ ηαζ πμζμηζημπμίδζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ιε ηδκ ακηίδναζδ ηδξ μνηζκυθδξ. Παναηδνήεδηακ ηα παναηάης απμηεθέζιαηα. Πίνακαρ 13: Παπαγωγή παμνολιπιδίων από βακηήπια Δ. coli με μεηαβολή ηηρ ζςγκένηπωζηρ θωζθοπικών πγθέληξωζε θωζθνξηθώλ θαιιηέξγεηαο Υξόλνο Καιιηέξγεηαο ζε ώξεο πγθέληξωζε ξακλνιηπηδίωλ (κg/ml) (24 h) (48 h) (72 h) 0,5 mm 0,1 0,7 4,0 1 mm 2,2 2,3 0,1 5 mm 4,0 0,1 0,9 10 mm 4,2 0,1 0,1 25 mm 26,4 12,9 1,2 50 mm 12,5 1,3 4,5

74 Αποππόθηζη (421nm) ημκ πίκαηα 13 πανμοζζάγμκηαζ μζ ζοβηεκηνχζεζξ ναικμθζπζδίςκ ακά 24 χνεξ βζα ηνία εζημζζηεηνάςνα απυ ηζξ ηαθθζένβεζεξ E. coli ιε δζαθμνεηζηή ζοβηέκηνςζδ θςζθμνζηχκ. Με αάζδ ημκ πίκαηα 13 υπςξ πανμοζζάγεηαζ ζημ δζάβναιια 12 παναηδνείηαζ υηζ ζε υθεξ ηζξ ηαθθζένβεζεξ E. coli πανά ηδ δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ ακά ηαθθζένβεζα πανάβμκηαζ ναικμθζπίδζα. οβηεηνζιέκα, δζαπζζηχκεηαζ ιία ορδθυηενδ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ ζηζξ ηαθθζένβεζεξ E. coli ιε ζπεηζηά ορδθή ζοβηέκηνςζδ θςζθμνζηχκ 25 mm ηαζ 50 mm ηονίςξ ζημ πνχημ εζημζζηεηνάςνμ πμο εεςνείηαζ υηζ δ ηαθθζένβεζα θηάκεζ ζηδ ζηαηζηή θάζδ ακάπηολδξ ζε ζπέζδ ιε ηζξ οπυθμζπεξ ηαθθζένβεζεξ πμο παναηδνείηαζ εθάπζζηδ παναβςβή ναικμθζπζδίςκ. 25,0 20,0 15,0 10,0 (24 h) (48 h) (72 h) 5,0 0,0 0,5 mm 1 mm 5 mm 10 mm 25 mm 50 mm ςγκένηπωζη θωζθοπικών καλλιέπγειαρ (mm) Γηάγξακκα 12: Απεηθόληζε ηεο παξαγωγήο ηωλ ξακλνιηπηδίωλ από βαθηήξηα E. coli θαη ηεο κεηαβνιή ηεο ζην ρξόλν ζε θαιιηέξγεηεο κε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξώζεηο θωζθνξηθώλ 11. Ακίπκεοζδ πνμζηυθθδζδξ ααηηδνίςκ E. coli ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ Ζ πνμζηυθθδζδ ααηηδνίςκ T. thermophilus παναηδνήεδηε ζε οβνέξ ηαθθζένβεζεξ ακελανηήηςξ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ ηάεε ηαθθζένβεζαξ. ημ πείναια αοηυ δζενεοκήεδηε ακ ζοιααίκεζ δ ίδζα δζαδζηαζία ηαζ ιε ηα ααηηήνζα E. coli. ε έκα ηνζαθίμ έλζ εέζεςκ πναβιαημπμζήεδηε ακάπηολδ ηαθθζένβεζαξ ααηηδνίςκ E. coli ζε ηάεε εέζδ ζε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ηαζ ιε

75 Πποζκόλληζη κςηηάπων Α(550 nm ) πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ. ε ηάεε εέζδ οπήνπε δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ 50 mm, 25 mm, 10 mm, 5 mm, 1 mm ηαζ 0,5 mm ακηίζημζπα. Αημθμφεδζε θήρδ δείβιαημξ απυ ηάεε εέζδ ηαζ θςημιέηνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ. Πίνακαρ 14: Αποππόθηζη αιωπήμαηορ πποζκολλημένων κςηηάπων πγθέληξωζε θωζθνξηθώλ Πξνζθόιιεζε θπηηάξωλ Α(550 nm ) 50 mm 1, mm 1,86 10 mm 1,326 5 mm 1,101 1 mm 1,342 0,5 mm 1,294 ημκ πίκαηα 14 πανμοζζάγεηαζ δ απμννυθδζδ δείβιαημξ αζςνήιαημξ πνμζημθθδιέκςκ ηοηηάνςκ ζηα μπμία έπεζ ζοκδεεεί δ πνςζηζηή ηνοζηαθθζηυ ζχδεξ απυ ηάεε ηαθθζένβεζα ιε δζαθμνεηζηή ζοβηέκηνςζδ θςζθμνζηχκ. Με αάζδ ημκ πίκαηα 14 υπςξ πανμοζζάγεηαζ ζημ δζάβναιια 13 παναηδνείηαζ ιία πνμζηυθθδζδ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli ζηα ημζπχιαηα ηδξ επζθάκεζαξ ημο ηνζαθίμο ζε ηαθθζένβεζεξ υπμο μζ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ θςζθμνζηχκ είκαζ 25 mm ηαζ 50 mm ηαζ εοκμείηαζ πενζζζυηενμ δ παναβςβή ηςκ ναικμθζπζδίςκ ζε αοηέξ ηζξ ζοβηεκηνχζεζξ ιε αάζδ ημ πνμδβμφιεκμ πείναια. 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,5 mm 1 mm 10 mm 25 mm 5 mm 50 mm ςγκένηπωζη θωζθοπικών καλλιέπγειαρ Γηάγξακκα 13: Πξνζθόιιεζε θπηηάξωλ Δ. coli κε κεηαβνιή ηεο ζπγθέληξωζεο θωζθνξηθώλ

76 12. Ακίπκεοζδ θοηζηήξ δναζηζηυηδηαξ ναικμθζπζδίςκ T. thermophilus ζε αζχνδια ααηηδνίςκ E. coli Σα ναικμθζπίδζα απμηεθμφκ ιμθοζιαηζημφξ πανάβμκηεξ βζα ιενζηά ζηεθέπδ ααηηδνίςκ υπςξ Bacillus subtilis, Bacillus cereus η.α.. 80,81 Γμηζιάζηδηε δ επίδναζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ πμο πανήπεδζακ απυ ηζξ ηαθθζένβεζεξ ημο T. thermophilus ζε ηαθθζένβεζεξ ααηηδνίςκ E. coli. ε έκα ιζηνυ ζςθδκάηζ falcon πνμζηέεδηε 1 ml ηαθθζένβεζαξ άβνζςκ ζηεθεπχκ ααηηδνίςκ E. coli ιε απμιάηνοκζδ ημο οπενηεζιέκμο, δζάθοια ναικμθζπζδίςκ χζηε δ ηεθζηή ζοβηέκηνςζδ κα είκαζ 100 ιg/ml ηαζ πνμζεήηδ 6 ml PBS. Πναβιαημπμζήεδηε θήρδ αζςνήιαημξ ηοηηάνςκ ζε 0 χνεξ, ζε 1 χνα, ζε 2 χνεξ, ζε 4 χνεξ, ζε 9 χνεξ ηαζ ζε 20 χνεξ ηαηά ηδ δζάνηεζα ηδξ επχαζδξ. Αημθμφεδζε πνχζδ ηςκ ηοηηάνςκ ιε ημ ηνοζηαθθζηυ ζχδεξ ηαζ θςημιέηνδζδ ζηα 550 nm υπμο απμννμθά δ πνςζηζηή. Παναηδνήεδηακ ηα παναηάης απμηεθέζιαηα. ημκ πίκαηα 15 πανμοζζάγεηαζ δ απμννυθδζδ αζςνήιαημξ ηοηηάνςκ ζηα μπμία έπεζ ζοκδεεεί δ πνςζηζηή ηνοζηαθθζηυ ζχδεξ ζε δζαθμνεηζηέξ πνμκζηέξ ζηζβιέξ. Πίνακαρ 15: Αποππόθηζη δειγμάηων αιωπήμαηορ κςηηάπων ζε διαθοπεηικoύρ σπόνοςρ επώαζηρ Υξόλνο επώαζεο αηωξήκαηνο θπηηάξωλ (h) Απνξξόθεζε (550 nm) 0 1, , , ,61 9 1, ,495 Με αάζδ ημκ πίκαηα 15 υπςξ πανμοζζάγεηαζ ζημ δζάβναιια 14 παναηδνείηαζ ιία ιζηνή αφλδζδ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli απυ ηδκ πνχηδ χνα επχαζδξ ιε ιέβζζημ ηδκ ηέηανηδ χνα ηαζ ιεηά ιζα ιζηνή πηχζδ. οιπεναζιαηζηά, δζαπζζηχκεηαζ πςξ δ πανμοζία ηςκ ναικμθζπζδίςκ δνα εεηζηά ζηδ γςηζηυηδηα ηςκ ααηηδνίςκ ηα μπμία ιάθζζηα πνδζζιμπμζμφκ ηα ναικμθζπίδζα ςξ πδβή άκεναηα ηαζ ςξ ιέζμ ακάπηολδξ απυ ηζ ζηζβιή πμο

77 Αποππόθηζη (550 nm ) δεκ οθίζηαηαζ ενεπηζηυ οθζηυ ηαζ παναηδνείηαζ αφλδζδ ημο ανζειμφ ηςκ ηοηηάνςκ. 2 1,5 1 0, Χπόνορ επώαζηρ αιωπήμαηορ κςηηάπων (h) Γηάγξακκα 14: Απνξξόθεζε αηωξήκαηνο θπηηάξωλ (550nm) κε ηελ πάξνδν ηνπ ρξόλνπ 13. Δπίδναζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ T. thermophilus ζηδκ ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli Δπεζδή οπήνλε εεηζηυ απμηέθεζια βζα ηδ γςηζηυηδηα ηςκ ααηηδνίςκ E. coli πανμοζία ναικμθζπζδίςκ T. thermophilus ηαζ ηαοηυπνμκα ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ ζημ πνμδβμφιεκμ πείναια, δζενεοκήεδηε δ ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli πανμοζία ναικμθζπζδίςκ T. thermophilus ζε ενεπηζηυ οθζηυ ιε δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ ακά ηαθθζένβεζα. ε δφμ ηνζαθία έλζ εέζεςκ πναβιαημπμζήεδηε ακάπηολδ ηαθθζένβεζαξ ααηηδνίςκ E. coli ζε ηάεε εέζδ ιε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ηαζ ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ. ε ηάεε εέζδ οπήνπε δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ 50 mm, 25 mm, 10 mm, 5 mm, 1 mm ηαζ 0,5 mm ακηίζημζπα πανμοζία ηαζ απμοζία ναικμθζπζδίςκ T. thermophilus ακηίζημζπα. Αημθμφεδζε θήρδ αζςνήιαημξ ηοηηάνςκ απυ ηάεε εέζδ, πνχζδ ιε ηδ πνςζηζηή ηνοζηαθθζηυ ζχδεξ ηαζ θςημιέηνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ. Παναηδνήεδηακ ηα παναηάης απμηεθέζιαηα.

78 Αποππόθηζη (550nm) ρωξίο ξακλνιηπίδηα Καιιηέξγεηεο κε ξακλνιηπίδηα Πίνακαρ 16: Αποππόθηζη αιωπήμαηορ κςηηάπων ζε διαθοπεηικέρ ζςγκενηπώζειρ θωζθοπικών παποςζία και αποςζία παμνολιπιδίων πγθέληξωζε θωζθνξηθώλ θαιιηέξγεηαο Απνξξόθεζε (550 nm ) 0,5 mm 1,079 1 mm 1,455 5 mm 1,6 10 mm 1, mm 1, mm 1,312 0,5 mm 0,954 1 mm mm mm mm mm ημκ πίκαηα 16 πανμοζζάγεηαζ δ απμννυθδζδ δείβιαημξ αζςνήιαημξ ααηηδνίςκ E. coli ζηα μπμία έπεζ ζοκδεεεί δ πνςζηζηή ηνοζηαθθζηυ ζχδεξ απυ ηάεε ηαθθζένβεζα πανμοζία ηαζ απμοζία ναικμθζπζδίςκ T. thermophilus. 2 1,5 1 0,5 0 0,5 mm 1 mm 5 mm 10 mm 25 mm 50 mm ςγκένηπωζη θωζθοπικών (mm) με ραμνολιπίδια τωρίς ραμνολιπίδια Γηάγξακκα 15: Μεηαβνιή ηνπ αξηζκνύ ηωλ βαθηεξίωλ E. coli αλά θαιιηέξγεηα παξνπζία θαη απνπζία ξακλνιηπηδίωλ T. thermophilus αληίζηνηρα ζε δηαθνξεηηθέο ζπγθεληξώζεηο θωζθνξηθώλ Με αάζδ ημκ πίκαηα 16 υπςξ πανμοζζάγεηαζ ζημ δζάβναιια 15 παναηδνείηαζ αφλδζδ ημο ανζειμφ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli ζε ζοβηεκηνχζεζξ θςζθμνζηχκ 25 mm, 10 mm, 5 mm ηαζ 1 mm ζηζξ ηαθθζένβεζεξ πανμοζία ναικμθζπζδίςκ απ υηζ ζηζξ ηαθθζένβεζεξ απμοζία ναικμθζπζδίςκ ιε ιέβζζηδ

79 ρωξίο ξακλνιηπίδηα Καιιηέξγεηεο κε ξακλνιηπίδηα αφλδζδ ζηδ ηαθθζένβεζα ιε 10 mm ζοβηέκηνςζδ θςζθμνζηχκ. οιπεναζιαηζηά, δζαπζζηχκεηαζ πςξ δ πανμοζία ηςκ ναικμθζπζδίςκ δνα εεηζηά ζηδκ ακάπηολδ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli ηονίςξ ζε παιδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ θςζθμνζηχκ ηα μπμία ιάθζζηα πζεακχξ κα πνδζζιμπμζμφκ ηα ναικμθζπίδζα ςξ πδβή άκεναηα. 14. Ακίπκεοζδ πνμζηυθθδζδξ ααηηδνίςκ E. coli πανμοζία ηαζ απμοζία ναικμθζπζδίςκ T. thermophilus Ζ πνμζηυθθδζδ ααηηδνίςκ E. coli παναηδνήεδηε ζε οβνέξ ηαθθζένβεζεξ ηονίςξ ζε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ θςζθμνζηχκ ηαθθζένβεζαξ. Δπεζδή ηα ναικμθζπίδζα πανειπμδίγμοκ ημ ζπδιαηζζιυ αζμθζθι οπυ μνζζιέκεξ ζοκεήηεξ απυ ημ ααηηήνζμ P. aeruginosa, 62,63 δζενεοκήεδηε δ δνάζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ ζηδκ πνμζηυθθδζδ ααηηδνίςκ E. coli. ε δφμ ηνζαθία έλζ εέζεςκ πναβιαημπμζήεδηε ακάπηολδ ηαθθζένβεζαξ ααηηδνίςκ E. coli ζε ηάεε εέζδ ιε ηνμπμπμζδιέκμ ιέζμ ακάπηολδξ ηαζ ιε πδβή άκεναηα ημ βθοημκζηυ κάηνζμ. ε ηάεε εέζδ οπήνπε δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ 50 mm, 25 mm, 10 mm, 5 mm, 1 mm ηαζ 0,5 mm ακηίζημζπα πανμοζία ηαζ απμοζία ναικμθζπζδίςκ T. thermophilus ακηίζημζπα. Αημθμφεδζε θήρδ δείβιαημξ απυ ηάεε εέζδ ηαζ θςημιέηνδζδ ηςκ δεζβιάηςκ ζηα 550 nm. Πίνακαρ 17: Αποππόθηζη αιωπήμαηορ πποζκολλημένων κςηηάπων πγθέληξωζε θωζθνξηθώλ θαιιηέξγεηαο Πξνζθόιιεζε θπηηάξωλ Α(550 nm ) 50 mm 1, mm 1, mm 1,601 5 mm 1,684 1 mm 1,317 0,5 mm 1, mm 1, mm 1, mm 1,179 5 mm 1,355 1 mm 1,283 0,5 mm 1,509

80 Πποζκόλληζη κςηηάπων Α(550 nm ) ημκ πίκαηα 17 πανμοζζάγεηαζ δ πνμζηυθθδζδ ηοηηάνςκ Α(550 nm ) ζηα μπμία έπεζ ζοκδεεεί δ πνςζηζηή ηνοζηαθθζηυ ζχδεξ απυ ηάεε ηαθθζένβεζα ιε δζαθμνεηζηή ζοβηέκηνςζδ θςζθμνζηχκ. Με αάζδ ημκ πίκαηα 17 υπςξ πανμοζζάγεηαζ ζημ δζάβναιια 16 παναηδνείηαζ ιία πνμζηυθθδζδ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli ζηα ημζπχιαηα ηδξ επζθάκεζαξ ημο ηνζαθίμο ζε ηαθθζένβεζεξ πανμοζία ναικμθζπζδίςκ ιε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ θςζθμνζηχκ εηηυξ απυ ηζξ ηαθθζένβεζεξ ιε ζοβηέκηνςζδ θςζθμνζηχκ 0 mm υπμο παναηδνείηαζ ιεβαθφηενδ πνμζηυθθδζδ ζηδκ ηαθθζένβεζα απμοζία ναικμθζπζδίςκ. οιπεναζιαηζηά, δζαπζζηχκεηαζ πςξ δ πανμοζία ηςκ ναικμθζπζδίςκ T. thermophilus ζηζξ ηαθθζένβεζεξ δνα εεηζηά ζηδκ πνμζηυθθδζδ ηςκ ααηηδνίςκ E. coli ηονίςξ ζε εηείκεξ ιε ορδθέξ ζοβηεκηνχζεζξ θςζθμνζηχκ. 2 1,5 1 0,5 0 0,5 mm 1 mm 5 mm 10 mm 25 mm 50 mm ςγκένηπωζη θωζθοπικών (mm) με ραμνολιπίδια τωρίς ραμνολιπίδια Γηάγξακκα 16: Πξνζθόιιεζε θπηηάξωλ Α(550 nm ) αλά θαιιηέξγεηα δηαθνξεηηθήο ζπγθέληξωζεο θωζθνξηθώλ 15. Ακίπκεοζδ αζιμθοηζηήξ δνάζδξ ζαπςκίκδξ ηαζ ναικμθζπζδίςκ ζε ενοενά αζιμζθαίνζα ημοκεθζμφ Ζ θεοηή ζαπςκίκδ (C 27 H 42 O 3 ) είκαζ ιία αιθζπαεήξ βθοημζίδδ πμο απμιμκχκεηαζ απυ θοηά ηαζ έπεζ ανεεεί υηζ πνμηαθεί αζιυθοζδ ηςκ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ. 140,143,144 Υνδζζιμπμζήεδηε ςξ εεηζηυξ ιάνηοναξ βζα κα δζαπζζηςεεί μ ααειυξ αζιμθοηζηήξ δνάζδξ ηςκ ναικμθζπζδίςκ.

81 ε ιία ζεζνά απυ πέκηε ζςθδκάηζα eppendorfs πνμζηέεδηε δζάθοια αζςνήιαημξ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ ιε ηεθζηή αναίςζδ 1:400 απυ ημ μθζηυ αίια ηαζ πμζυηδηα θεοηήξ ζαπςκίκδξ ηυζδ χζηε δ ηεθζηή ηδξ ζοβηέκηνςζδ ζημ δζάθοια κα είκαζ 0 ιg/ml, 5 ιg/ml, 10 ιg/ml, 25 ιg/ml ηαζ 50 ιg/ml ακηίζημζπα ζε ηάεε ζςθδκάηζ. Πναβιαημπμζήεδηε θςημιέηνδζδ ημο οπενηεζιέκμο φζηενα απυ θοβμηέκηνδζδ ζηα 540 nm ζε 0 χνεξ, ζε 1 χνα ηαζ 2 χνεξ βζα ηαείγδζδ ηςκ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ ηαζ παναηδνήεδηακ ηα παναηάης απμηεθέζιαηα. ημκ πίκαηα 18 πανμοζζάγεηαζ δ απμννυθδζδ αζιμζθαζνίκδξ ιε ηδκ πάνμδμ ημο πνυκμο ζε ηάεε δείβια αζςνήιαημξ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ ιεηά απυ θοβμηέκηνδζδ ημο αζςνήιαημξ χζηε κα ιεηνδεεί δ εθεφεενδ αζιμζθαζνίκδ πμο έπεζ πνμηφρεζ απυ ηδ δζάζπαζδ ηςκ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ. Πίνακαρ18: Απελεςθέπωζη ηηρ αιμοζθαιπίνηρ με ζαπωνίνη Α(540 nm ) Υξόλνο επώαζεο αηωξήκαηνο πγθέληξωζε ζαπωλίλεο (κg/ml) 0 ώξεο 1 ώξα 2 ώξεο Αρνηηικός Μάρησρας 0,032 0,05 0, ,032 0,187 0, ,032 0,198 0, ,032 0,210 0, ,032 0,219 0,196 Ίγδια ενοενχκ Έθθεζρδ ζγήιαημξ ενοενχκ Δηθόλα 20: ωιελάθηα αηωξήκαηνο εξπζξώλ αηκνζθαηξίωλ πνπ επωάζηεθαλ γηα 1 ώξα γηα αλίρλεπζε αηκνιπηηθήο δξάζεο ηεο ζαπωλίλεο

82 Απελεςθέπωζη αιμοζθαιπίνηρ Α(540 nm) Δηθόλα 21: ωιελάθηα αηωξήκαηνο εξπζξώλ αηκνζθαηξίωλ πνπ επωάζηεθαλ γηα 2 ώξεο γηα αλίρλεπζε αηκνιπηηθήο δξάζεο ηεο ζαπωλίλεο ηδκ εζηυκα 20 πανμοζζάγμκηαζ ηα ζςθδκάηζα αζςνήιαημξ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ ιε ακηίζημζπεξ ζοβηεκηνχζεζξ ζαπςκίκδξ ιεηά ηδκ επχαζδ 1 χναξ ηαζ έπεζηα απυ θοβμηέκηνδζδ βζα ηαείγδζδ ηςκ ενοενχκ. ηδκ εζηυκα 21 πανμοζζάγμκηαζ ηα ζςθδκάηζα αζςνήιαημξ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ ιε ακηίζημζπεξ ζοβηεκηνχζεζξ ζαπςκίκδξ ιεηά ηδκ επχαζδ 2 ςνχκ ηαζ έπεζηα απυ θοβμηέκηνδζδ βζα ηαείγδζδ ηςκ ενοενχκ. Παναηδνείηαζ ιζα πθήνδ αζιμθοηζηή δνάζδ ζηα δείβιαηα ιε 25 ιg/ml ηαζ 50 ιg/ml ζαπςκίκδξ απυ ηδκ πνχηδ χνα. 0,2 0,15 0,1 0,05 Αρνηηικός Μάρησρας με 5 μg με 10 μg με 25 μg 0 0 ώρες 1 ώρα 2 ώρες Χπόνορ επώαζηρ με 50 μg Γηάγξακκα 17: Απειεπζέξωζε αηκνζθαηξίλεο κε ηελ επίδξαζε ζαπωλίλεο θαηά ηε δηάξθεηα ηνπ ρξόλνπ Με αάζδ ημκ πίκαηα 18 υπςξ πανμοζζάγεηαζ ζημ δζάβναιια 17 παναηδνείηαζ ιία απυημιδ αφλδζδ ηδξ εθεφεενδξ αζιμζθαζνίκδξ απυ ηδκ πνχηδ χνα ζε υθα ηα δείβιαηα ιε ζαπςκίκδ ακελανηήηςξ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηδξ ζαπςκίκδξ εηηυξ ημο δείβιαημξ ημο ανκδηζημφ ιάνηονα πμο δεκ θένεζ

83 ζαπςκίκδ ηαζ πανμοζζάγεζ εθάπζζηδ αφλδζδ ζηδκ εθεφεενδ αζιμζθαζνίκδ ιε ηδκ πάνμδμ ηςκ δφμ ςνχκ. οιπεναζιαηζηά, δ ζαπςκίκδ έπεζ ηαπεία αζιμθοηζηή δνάζδ ιε εθάπζζηδ ηνίζζιδ ζοβηέκηνςζδ ηςκ 5 ιg/ml ζε 1 χνα. Σα ναικμθζπίδζα ηδξ P. aeruginosa ανέεδηε υηζ πνμηαθμφκ αζιυθοζδ ηςκ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ. 68,69 Γζενεοκήεδηε μ ααειυξ αζιμθοηζηήξ δνάζδξ ζε ζοκάνηδζδ ιε ηδκ αφλδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ναικμθζπζδίςκ βζα κα ηαεμνζζηεί δ εθάπζζηδ ηνίζζιδ ζοβηέκηνςζδ ναικμθζπζδίςκ πμο πνμηαθεί αζιμθοηζηή δνάζδ ζε ζφκημιμ πνμκζηυ δζάζηδια. ε ιία ζεζνά απυ δχδεηα ζςθδκάηζα eppendorfs πνμζηέεδηε δζάθοια αζςνήιαημξ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ ιε ηεθζηή αναίςζδ 1:400 απυ ημ μθζηυ αίια ηαζ πμζυηδηα ναικμθζπζδίςκ T. thermophilus ηυζδ χζηε δ ηεθζηή ημοξ ζοβηέκηνςζδ ζημ δζάθοια κα είκαζ 0 ιg/ml, 0,5 ιg/ml, 1 ιg/ml, 2 ιg/ml, 3 ιg/ml, 4 ιg/ml, 5 ιg/ml, 10 ιg/ml, 20 ιg/ml, 50 ιg/ml, 100 ιg/ml ηαζ 200 ιg/ml ακηίζημζπα ζε ηάεε ζςθδκάηζ. Πναβιαημπμζήεδηε θςημιέηνδζδ ημο οπενηεζιέκμο φζηενα απυ θοβμηέκηνδζδ ζηα 540 nm ζε 0 χνεξ, ½ χνα, 1 χνα, 2 χνεξ, 4 χνεξ, 6 χνεξ, 24 χνεξ ηαζ 48 χνεξ ηαζ παναηδνήεδηακ ηα παναηάης απμηεθέζιαηα. Πίνακαρ 19: Απελεςθέπωζη ηηρ αιμοζθαιπίνηρ με παμνολιπίδια Α(540 nm ) πγθέληξωζε ξακλνιηπηδίωλ (κg/ml) 0 ιεπηά 30 ιεπηά Υξόλνο επώαζεο αηωξήκαηνο 1 ώξα 2 ώξεο 4 ώξεο 6 ώξεο 1 εκέξα 2 εκέξεο 0 0,032 0,032 0,042 0,044 0,045 0,050 0,165 0,200 0,5 0,032 0,043 0,043 0,044 0,045 0,060 0,150 0, ,032 0,044 0,044 0,049 0,054 0,055 0,160 0, ,032 0,076 0,076 0,049 0,069 0,073 0,133 0, ,032 0,073 0,073 0,076 0,138 0,146 0,130 0, ,032 0,097 0,097 0,122 0,191 0,168 0,135 0, ,032 0,138 0,138 0,166 0,191 0,155 0,155 0, ,032 0,134 0, ,032 0,201 0, ,032 0,191 0, ,032 0,200 0, ,032 0,208 0,191 ημκ πίκαηα 19 πανμοζζάγεηαζ δ απεθεοεένςζδ ηδξ αζιμζθαζνίκδξ Α(540 nm ) ιε ηδκ πάνμδμ ημο πνυκμο ζε ηάεε δείβια αζςνήιαημξ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ ιεηά απυ θοβμηέκηνδζδ ημο αζςνήιαημξ χζηε κα ιεηνδεεί δ

84 εθεφεενδ αζιμζθαζνίκδ πμο έπεζ πνμηφρεζ απυ ηδ δζάζπαζδ ηςκ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ. Δηθόλα 22: ωιελάθηα αηωξήκαηνο εξπζξώλ αηκνζθαηξίωλ πνπ επωάζηεθαλ γηα 30 ιεπηά γηα αλίρλεπζε αηκνιπηηθήο δξάζεο ηωλ ξακλνιηπηδίωλ Δηθόλα 23: ωιελάθηα αηωξήκαηνο εξπζξώλ αηκνζθαηξίωλ πνπ επωάζηεθαλ γηα 1 ώξα γηα αλίρλεπζε αηκνιπηηθήο δξάζεο ηωλ ξακλνιηπηδίωλ Δηθόλα 24: ωιελάθηα αηωξήκαηνο εξπζξώλ αηκνζθαηξίωλ πνπ επωάζηεθαλ γηα 1 ώξα γηα αλίρλεπζε αηκνιπηηθήο δξάζεο ηωλ ξακλνιηπηδίωλ

85 Δηθόλα 25: ωιελάθηα αηωξήκαηνο εξπζξώλ αηκνζθαηξίωλ πνπ επωάζηεθαλ γηα 2 ώξεο γηα αλίρλεπζε αηκνιπηηθήο δξάζεο ηωλ ξακλνιηπηδίωλ Δηθόλα 26: ωιελάθηα αηωξήκαηνο εξπζξώλ αηκνζθαηξίωλ πνπ επωάζηεθαλ γηα 4 ώξεο γηα αλίρλεπζε αηκνιπηηθήο δξάζεο ηωλ ξακλνιηπηδίωλ Δηθόλα 27: ωιελάθηα αηωξήκαηνο εξπζξώλ αηκνζθαηξίωλ πνπ επωάζηεθαλ γηα 6 ώξεο γηα αλίρλεπζε αηκνιπηηθήο δξάζεο ηωλ ξακλνιηπηδίωλ

86 Δηθόλα 28: ωιελάθηα αηωξήκαηνο εξπζξώλ αηκνζθαηξίωλ πνπ επωάζηεθαλ γηα 24 ώξεο γηα αλίρλεπζε αηκνιπηηθήο δξάζεο ηωλ ξακλνιηπηδίωλ ηδκ εζηυκα 22 πανμοζζάγμκηαζ ηα ζςθδκάηζα αζςνήιαημξ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ ιε ακηίζημζπεξ ζοβηεκηνχζεζξ ναικμθζπζδίςκ ιεηά ηδκ επχαζδ ½ χναξ ηαζ έπεζηα απυ θοβμηέκηνδζδ βζα ηαείγδζδ ηςκ ενοενχκ. Παναηδνείηαζ ιζα πθήνδξ αζιμθοηζηή δνάζδ ζηα δείβιαηα ιε 20 ιg/ml, 50 ιg/ml, 100 ιg/ml ηαζ 200 ιg/ml ναικμθζπζδίςκ ζηδ ½ χνα. ηδκ εζηυκα 23 ηαζ 24 πανμοζζάγμκηαζ ηα ζςθδκάηζα αζςνήιαημξ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ ιε ακηίζημζπεξ ζοβηεκηνχζεζξ ναικμθζπζδίςκ ιεηά ηδκ επχαζδ 1 χναξ ηαζ έπεζηα απυ θοβμηέκηνδζδ βζα ηαείγδζδ ηςκ ενοενχκ. Παναηδνείηαζ ιζα πθήνδξ αζιμθοηζηή δνάζδ ζηα δείβιαηα ιε 20 ιg/ml, 50 ιg/ml, 100 ιg/ml ηαζ 200 ιg/ml ναικμθζπζδίςκ ζηζξ 2 χνεξ. ηδκ εζηυκα 25 πανμοζζάγμκηαζ ηα ζςθδκάηζα αζςνήιαημξ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ ιε ακηίζημζπεξ ζοβηεκηνχζεζξ ναικμθζπζδίςκ ιεηά ηδκ επχαζδ 2 ςνχκ ηαζ έπεζηα απυ θοβμηέκηνδζδ βζα ηαείγδζδ ηςκ ενοενχκ. ηδκ εζηυκα 26 πανμοζζάγμκηαζ ηα ζςθδκάηζα αζςνήιαημξ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ ιε ακηίζημζπεξ ζοβηεκηνχζεζξ ναικμθζπζδίςκ ιεηά ηδκ επχαζδ 4 ςνχκ ηαζ έπεζηα απυ θοβμηέκηνδζδ βζα ηαείγδζδ ηςκ ενοενχκ. Παναηδνείηαζ ιζα πθήνδξ αζιμθοηζηή δνάζδ ζηα δείβιαηα ιε 4 ιg/ml ηαζ 5 ιg/ml ναικμθζπζδίςκ ζηζξ 4 χνεξ. ηδκ εζηυκα 27 πανμοζζάγμκηαζ ηα ζςθδκάηζα αζςνήιαημξ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ ιε ακηίζημζπεξ ζοβηεκηνχζεζξ ναικμθζπζδίςκ ιεηά ηδκ επχαζδ 6 ςνχκ ηαζ έπεζηα απυ θοβμηέκηνδζδ βζα ηαείγδζδ ηςκ ενοενχκ. Παναηδνείηαζ ιζα πθήνδξ αζιμθοηζηή δνάζδ ζημ δείβια ιε 3 ιg/ml ναικμθζπζδίςκ ζηζξ 6 χνεξ. ηδκ εζηυκα 28 πανμοζζάγμκηαζ ηα ζςθδκάηζα αζςνήιαημξ ενοενχκ αζιμζθαζνίςκ ιε ακηίζημζπεξ ζοβηεκηνχζεζξ ναικμθζπζδίςκ ιεηά ηδκ επχαζδ 24 ςνχκ ηαζ έπεζηα απυ θοβμηέκηνδζδ βζα ηαείγδζδ ηςκ ενοενχκ.

87 Απελεςθέπωζη αιμοζθαιπίνηρ Α(540 nm ) Παναηδνείηαζ υηζ υθα ηα δείβιαηα ηαζ μ ανκδηζηυξ ιάνηοναξ πμο δεκ πενζέπεζ ναικμθζπίδζα πανμοζζάγμοκ πθήνδ αζιμθοηζηή δνάζδ θυβς πθήνδξ ηαηαζηνμθήξ ηςκ ενοενχκ ιε ημ πέναζια 24 ςνχκ. ημ δζάβναιια 18 παναηδνείηαζ ιία απυημιδ αφλδζδ ηδξ εθεφεενδξ αζιμζθαζνίκδξ ηαζ πθήνδ αζιυθοζδ απυ ηα πνχηα 30 θεπηά ζε υθα ηα δείβιαηα ιε ζοβηέκηνςζδ ναικμθζπζδίςκ άκς ηςκ 20 ιg/ml, αημθμοεεί ημ δείβια ιε ζοβηέκηνςζδ ναικμθζπζδίςκ 10 ιg/ml ιε πθήνδ αζιυθοζδ ζηδ 1 χνα, ηα δείβιαηα ιε ζοβηέκηνςζδ ναικμθζπζδίςκ 4-5 ιg/ml ιε πθήνδ αζιυθοζδ ζηζξ 4 χνεξ ηαζ ημ δείβια ιε ζοβηέκηνςζδ ναικμθζπζδίςκ 3 ιg/ml ιε πθήνδ αζιυθοζδ ζηζξ 6 χνεξ. Σα δείβιαηα ιε ζοβηέκηνςζδ ναικμθζπζδίςκ ηάης ηςκ 2 ιg/ml αημθμοεμφκ ηδκ αζιυθοζδ πμο πανμοζζάγεηαζ ζημκ ανκδηζηυ ιάνηονα πμο δεκ θένεζ ναικμθζπίδζα. 0,25 0,2 0,15 0,1 0, λεπηά 30 λεπηά 1 ώρα 2 ώρες 4 ώρες 6 ώρες 1 ημέρα 2 ημέρες Χπόνορ επώαζηρ 0 μg 0,5 μg 1 μg 2 μg 3 μg 4 μg 5 μg 10 μg 20 μg 50 μg 100 μg 200 μg Γηάγξακκα 18: Απειεπζέξωζε αηκνζθαηξίλεο κε ηελ επίδξαζε ξακλνιηπηδίωλ θαηά ηε δηάξθεηα ηνπ ρξόλνπ ημ δζάβναιια 19 παναηδνείηαζ υηζ ζε ιζηνυ πνμκζηυ δζάζηδια έςξ 6 χνεξ υζμ πενκάεζ μ πνυκμξ, ηυζμ ιεβαθχκεζ δ αζιμθοηζηή δνάζδ ηαζ αολάκεηαζ πζμ απυημια δ ηαιπφθδ υζμ αολάκεηαζ δ ζοβηέκηνςζδ ναικμθζπζδίςκ ζημ δείβια. ε ιεβάθμ πνμκζηυ δζάζηδια πάκς απυ 24 χνεξ

88 Αποππόθηζη αιμοζθαιπίνηρ (540 nm ) οπάνπεζ πθήνδ αζιμθοηζηή δνάζδ ακελανηήηςξ ζοβηέκηνςζδξ ναικμθζπζδίςκ. 0,25 0,2 0,15 0,1 0, , Ραμνολιπίδια (μg) λεπηά 30 λεπηά 1 ώρα 2 ώρες 4 ώρες 6 ώρες 1 ημέρα 2 ημέρες Γηάγξακκα 19: Απνξξόθεζε αηκνζθαηξίλεο ζε δηαθνξεηηθέο ρξνληθέο ζηηγκέο ζε δείγκαηα κε δηαθνξνπνίεζε ηεο ζπγθέληξωζεο ηωλ ξακλνιηπηδίωλ οιπεναζιαηζηά, παναηδνείηαζ παεμθμβζηή αζιμθοηζηή δνάζδ ζε αζχνδια ενοενμηοηηάνςκ ακ δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ είκαζ έςξ 3 ιg/ml εκχ ακ δ ζοβηέκηνςζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ είκαζ ηάης απυ 2 ιg/ml δεκ παναηδνείηαζ παεμθμβζηή αζιμθοηζηή δνάζδ. 16. Ακίπκεοζδ φπανλδξ πνςηεσκχκ ζημ παναζηεφαζια ναικμθζπζδίςκ Τ. thermophilus ημ μπμίμ εβπφεδηε ζηα ημοκέθζα Γζα ηδκ παναβςβή ελεζδζηεοιέκςκ ακηζζςιάηςκ έκακηζ ηςκ ναικμθζπζδίςκ δζενεοκήεδηε δ πζεακή πανμοζία πνςηεσκχκ ζημ παναζηεφαζια ηςκ ναικμθζπζδίςκ Τ. thermophilus πμο εκέεδηε ζηα ημοκέθζα ιε δθεηηνμθυνδζδ ημο εηποθίζιαημξ ζε πδηηή πμθοαηνοθαιζδίμο ηαζ ιεηέπεζηα ιε πνχζδ ιε ιπθε ηδξ ημοιάζδξ (coomassie brilliant blue). Δπεζδή ηα απμηεθέζιαηα ήηακ ανκδηζηά, πναβιαημπμζήεδηε κέα δθεηηνμθυνδζδ ημο εηποθίζιαημξ ζε πδηηή πμθοαηνοθαιζδίμο ηαζ φζηενα πνχζδ ιε κζηνζηυ άνβονμ πμο είκαζ ιζα πζμ εοαίζεδηδ ιέεμδμξ ακίπκεοζδξ πνςηεσκχκ. Σα απμηεθέζιαηα ήηακ ανκδηζηά.

89 Οζ ιεηνήζεζξ πναβιαημπμζήεδηακ ζε 20 ιl ηαζ 50 ιl παναζηεοάζιαημξ ναικμθζπζδίςκ ηαζ ιε ιάνηονα ιμνζαηχκ αανχκ απυ kda έςξ kda. οιπεναζιαηζηά, ημ παναζηεφαζια ναικμθζπζδίςκ πμο εκέεδηε ζηα ημοκέθζα δεκ πενζείπε πνςηεΐκεξ ιεβέεμοξ άκς ηςκ kda. 17. Ακίπκεοζδ φπανλδξ ακηζζςιάηςκ ζε μνυ ημοκεθζμφ έκακηζ ναικμθζπζδίςκ Τ. thermophilus ιε δμηζιαζία ηδθίδαξ (dot blot) Γζα ηδκ παναβςβή ελεζδζηεοιέκςκ ακηζζςιάηςκ έκακηζ ηςκ ναικμθζπζδίςκ πνδζζιμπμζήεδηακ ςξ αζμακηζδναζηήνεξ ημοκέθζα ζηα μπμία έβζκε εκδμιοσηά έβποζδ ηςκ ναικμθζπζδίςκ Τ. thermophilus ιε ιδ πθήνεξ ακμζμεκζζποηζηυ ημο Freund. Γζα ηδκ ακίπκεοζδ ηςκ ακηζζςιάηςκ έκακηζ ηςκ ναικμθζπζδίςκ, αημοθμφεδζε θθεαμηέκηδζδ ηαζ θήρδ αίιαημξ απυ ηα ημοκέθζα. ηδ ζοκέπεζα πναβιαημπμζήεδηε απμιυκςζδ ημο μνμφ απυ ημ αίια ηαζ πνήζδ ημο ζε δμηζιαζία ηδθίδαξ υπμο πνμζηέεδηε ζε επζθεβιέκεξ εέζεζξ βζα ηδ δδιζμονβία πζεακήξ ακμζμακηίδναζδξ υπμο παναηδνήεδηακ ηα παναηάης απμηεθέζιαηα. Δηθόλα 29: Μεκβξάλεο ληηξνθπηηαξίλεο νη νπνίεο πεξηέρνπλ: Α) Αξλεηηθόο κάξηπξαο, Β) Αξλεηηθόο κάξηπξαο παξνπζία ξακλνιηπηδίωλ θαη απνπζία νξνύ, Γ) Αξλεηηθόο κάξηπξαο απνπζία ξακλνιηπηδίωλ θαη παξνπζία νξνύ, Γ) Γείγκα 50 κg ξακλνιηπηδίωλ παξνπζία νξνύ κε αξαίωζε 1:2000 Δ) Γείγκα 50 κg ξακλνιηπηδίωλ παξνπζία νξνύ κε αξαίωζε 1:1000 Ε) Γείγκα 50 κg ξακλνιηπηδίωλ παξνπζία νξνύ κε αξαίωζε 1:500 Ζ εζηυκα 29 ιαξ δείπκεζ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ δμηζιαζίαξ ηδθίδαξ ζε δείβιαηα 50 ιg ναικμθζπζδίςκ πανμοζία δζαθμνεηζηχκ αναζχζεςκ ημο μνμφ. Παναηδνείηαζ δδιζμονβία ηδθίδαξ δδθαδή ακμζμαπμηφπςζδ ηδξ ακμζμακηίδναζδξ ηςκ ακηζζςιάηςκ ιε ηα ναικμθζπίδζα Τ. thermophilus ζηα δείβιαηα Γ, Δ ηαζ Ε, δ έκηαζδ ηδξ μπμίαξ αολάκεηαζ υζμ ιζηναίκεζ δ αναίςζδ μνμφ.

90 οιπεναζιαηζηά, μ μνυξ πμο απμιμκχεδηε απυ ηα ημοκέθζα πενζέπεζ ακηζζχιαηα πμο ακαβκςνίγμοκ ηα ναικμθζπίδζα Τ. thermophilus ςξ ακηζβυκα ηαζ ακηζδνμφκ ιε αοηά δδιζμονβχκηαξ ακμζμζοιπθέβιαηα. 18. Όνζμ ακίπκεοζδξ ακηζζςιάηςκ βζα ακίπκεοζδ ναικμθζπζδίςκ Τ. thermophilus ιε δμηζιαζία ηδθίδαξ (dot blot) Σμ εθάπζζημ υνζμ ακίπκεοζδξ ηςκ ακηζζςιάηςκ έκακηζ ηςκ ναικμθζπζδίςκ, πνμζδζμνίζηδηε ιε ηδ πνήζδ ημο μνμφ ζε δμηζιαζία ηδθίδαξ υπμο πνμζηέεδηε ζε επζθεβιέκεξ εέζεζξ ιε δζαθμνεηζηή πμζυηδηα ναικμθζπζδίςκ ζε ηάεε εέζδ βζα ηδ δδιζμονβία πζεακήξ ακμζμακηίδναζδξ ηαζ παναηδνήεδηακ ηα παναηάης απμηεθέζιαηα. Δηθόλα 30: Μεκβξάλεο ληηξνθπηηαξίλεο νη νπνίεο πεξηέρνπλ: Α) Αξλεηηθόο κάξηπξαο, Β) Αξλεηηθόο κάξηπξαο παξνπζία ξακλνιηπηδίωλ θαη απνπζία νξνύ, Γ) Αξλεηηθόο κάξηπξαο απνπζία ξακλνιηπηδίωλ θαη παξνπζία νξνύ, Γ) Γείγκα 1 κg ξακλνιηπηδίωλ παξνπζία νξνύ κε αξαίωζε 1:2000 Δ) Γείγκα 5 κg ξακλνιηπηδίωλ παξνπζία νξνύ κε αξαίωζε 1:2000 Ε) Γείγκα 10 κg ξακλνιηπηδίωλ παξνπζία νξνύ κε αξαίωζε 1:2000 Ζ εζηυκα 30 ιαξ δείπκεζ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ δμηζιαζίαξ ηδθίδαξ ζε δείβιαηα 1 ιg, 5 ιg ηαζ 10 ιg ναικμθζπζδίςκ πανμοζία ίδζαξ αναίςζδξ ημο μνμφ. Παναηδνείηαζ δδιζμονβία ηδθίδαξ δδθαδή ακμζμαπμηφπςζδ ηδξ ακμζμακηίδναζδξ ηςκ ακηζζςιάηςκ ιε ηα ναικμθζπίδζα Τ. thermophilus ζηα δείβιαηα Γ, Δ ηαζ Ε, δ έκηαζδ ηδξ μπμίαξ αολάκεηαζ υζμ ιεβαθχκεζ δ πμζυηδηα ναικμθζπζδίςκ. οιπεναζιαηζηά, ηα ακηζζχιαηα έκακηζ ηςκ ναικμθζπζδίςκ Τ. thermophilus πμο απμιμκχεδηακ έπμοκ ορδθή εοαζζεδζία ακαβκχνζζδξ έςξ ηαζ 1 ιg ναικμθζπίδζα.

91 19. Ακίπκεοζδ ακμζμακηίδναζδξ ακηζζςιάηςκ έκακηζ θζπανχκ μλέςκ ηαζ άθθςκ μοζζχκ Μεηά ηδκ εφνεζδ ακηζζςιάηςκ ζημκ μνυ ημο ημοκεθζμφ έκακηζ ηςκ ναικμθζπζδίςκ δζενεοκήεδηε δ ελεζδίηεοζδ ηςκ ακηζζςιάηςκ ιε πνήζδ ημο μνμφ ζε δμηζιαζία ηδθίδαξ έκακηζ ζοζηαηζηχκ ηςκ ναικμθζπζδίςκ αθθά ηαζ άθθςκ θζπανχκ μλέςκ ηαεχξ ηαζ ηδξ ζαπςκίκδξ ηαζ ηδξ αθαμοιίκδξ. Δηθόλα 31: Μεκβξάλεο ληηξνθπηηαξίλεο νη νπνίεο πεξηέρνπλ: Α) Αξλεηηθόο κάξηπξαο, Β) Θεηηθόο κάξηπξαο παξνπζία ξακλνιηπηδίωλ, Γ) Γείγκα ζαπωλίλεο, Γ) Γείγκα αιβνπκίλεο, Δ) Γείγκα ξακλόδεο, Ε) Γείγκα πδξνμπδεθαλνϊθνύ νμένο, Ζ) Γείγκα πδξνμπβνπηπξηθνύ νμένο, Θ) Γείγκα πδξνμπελληαλνϊθνύ νμεόο, I) Γείγκα επηαλνϊθνύ νμένο, K) Γείγκα ελληαλνϊθνύ νμένο, Λ) Γείγκα ελδεθαλνϊθνύ νμένο, Μ) Γείγκα δεθαεπηαλνϊθνύ νμένο (νιεϊθνύ νμένο), Ν) Γείγκα πδξνμπδωδεθαλνϊθνύ νμένο Ζ εζηυκα 31 ιαξ δείπκεζ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ δμηζιαζίαξ ηδθίδαξ ζε δείβιαηα ζαπςκίκδξ, αθαμοιίκδξ, ναικυγδξ, οδνμλοδεηακμσημφ μλέμξ, οδνμλοαμοηονζημφ μλέμξ, οδνμλοεκκζακμσημφ μλευξ, επηακμσημφ μλέμξ, εκκζακμσημφ μλέμξ, εκδεηακμσημφ μλέμξ, δεηαεπηακμσημφ μλέμξ (μθεσημφ μλέμξ), οδνμλοδςδεηακμσημφ μλέμξ πανμοζία ίδζαξ αναίςζδξ ημο μνμφ. Παναηδνείηαζ δδιζμονβία ηδθίδαξ δδθαδή ακμζμαπμηφπςζδ ηδξ ακμζμακηίδναζδξ ηςκ ακηζζςιάηςκ ιε ηα δείβιαηα Γ ηαζ Ε πανμοζία δδθαδή ζαπςκίκδξ πμο είκαζ ιζα ζοββεκήξ μοζία ηςκ ναικμθζπζδίςκ ηαζ πανμοζία οδνμλοδεηακμσημφ μλέμξ πμο είκαζ ηφνζμ ζοζηαηζηυ ηςκ ναικμθζπζδίςκ Τ. thermophilus.

92 οιπεναζιαηζηά, ηα ακηζζχιαηα πμο απμιμκχεδηακ ακαβκςνίγμοκ εηηυξ απυ ηα ναικμθζπίδζα Τ. thermophilus, ηδ ζαπςκίκδ ηαζ ημ οδνμλοδεηακμσηυ μλφ ςξ ακηζβυκα ηαζ ακηζδνμφκ ιε αοηά δδιζμονβχκηαξ ακμζμζοιπθέβιαηα ημ μπμίμ ιπμνεί κα ζδιαίκεζ πςξ δ ακηζβμκζηυηδηα ημο ναικμθζπζδίμο ιπμνεί κα μθείθεηαζ ηονίςξ ή ηαζ μθμηθδνςηζηά ζηα θζπανά μλέα πμο πενζέπεζ. 20. Ακίπκεοζδ ναικμθζπζδίςκ ζε ελςηοηηάνζμ οβνυ ηαθθζενβεζχκ T. Thermophilus ηαζ E. Coli ιε ηδ πνήζδ ηςκ παναπεέκηςκ ακηζζςιάηςκ Λυβς ηδξ ιεβάθδξ εοαζζεδζίαξ ηςκ ακηζζςιάηςκ πμο πανήπεδζακ ηαζ ιπμνμφκ κα ακαβκςνίγμοκ ιέπνζ ηαζ 1 ιg ναικμθζπζδίςκ δζενεοκήεδηε δ απεοεείαξ δνάζδ ηςκ ακηζζςιάηςκ έκακηζ οπενηεζιέκμο ηαθθζένβεζαξ απυ πέκηε ηαθθζένβεζεξ T. thermophilus ιε δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ 50 mm, 25 mm, 10 mm, 5 mm ηαζ 0,5 mm ζε ηάεε ηαθθζένβεζα ηαζ απυ πέκηε ηαθθζένβεζεξ Δ. coli ιε δζαθμνμπμίδζδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ 50 mm, 25 mm, 10 mm, 5 mm ηαζ 0,5 mm ζε ηάεε ηαθθζένβεζα ακηίζημζπα βζα ηδ δδιζμονβία πζεακήξ ακμζμακηίδναζδξ βζα ηδ δδιζμονβία ακμζμζοιπθέβιαημξ ιε ηα ναικμθζπίδζα ημο οπενηείιεκμο οβνμφ ηαζ παναηδνήεδηακ ηα παναηάης απμηεθέζιαηα. Οζ ηαθθζένβεζεξ επςάζηδηακ βζα 24 χνεξ ηαζ έβζκε θήρδ 50 ιl οπενηεζιέκμο απυ ηάεε ηαθθζένβεζα. Ζ εζηυκα 32 ιαξ δείπκεζ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ δμηζιαζίαξ ηδθίδαξ ζε δείβιαηα οπενηεζιέκμο ηαθθζένβεζαξ T. thermophilus 50 mm, 25 mm, 10 mm, 5 mm ηαζ 0,5 mm ζοβηέκηνςζδξ θςζθμνζηχκ ηαζ ζε δείβιαηα οπενηεζιέκμο ηαθθζένβεζαξ E.coli 50 mm, 25 mm, 10 mm, 5 mm ηαζ 0,5 mm ζοβηέκηνςζδξ θςζθμνζηχκ.

93 Δηθόλα 32: Μεκβξάλεο ληηξνθπηηαξίλεο νη νπνίεο πεξηέρνπλ: Α) Αξλεηηθόο κάξηπξαο, Β) Θεηηθόο κάξηπξαο παξνπζία ξακλνιηπηδίωλ, Γ) Γείγκα ππεξθεηκέλνπ θαιιηέξγεηαο T. thermophilus 50 mm ζπγθέληξωζεο θωζθνξηθώλ, Γ) Γείγκα ππεξθεηκέλνπ θαιιηέξγεηαο T. thermophilus 25 mm ζπγθέληξωζεο θωζθνξηθώλ, Δ) Γείγκα ππεξθεηκέλνπ θαιιηέξγεηαο T. thermophilus 10 mm ζπγθέληξωζεο θωζθνξηθώλ, Ε) Γείγκα ππεξθεηκέλνπ θαιιηέξγεηαο T. thermophilus 5 mm ζπγθέληξωζεο θωζθνξηθώλ, Ζ) Γείγκα ππεξθεηκέλνπ θαιιηέξγεηαο T. thermophilus 0,5 mm ζπγθέληξωζεο θωζθνξηθώλ, Θ) Γείγκα ππεξθεηκέλνπ θαιιηέξγεηαο E. coli 50 mm ζπγθέληξωζεο θωζθνξηθώλ, I) Γείγκα ππεξθεηκέλνπ θαιιηέξγεηαο E. coli 25 mm ζπγθέληξωζεο θωζθνξηθώλ, K) Γείγκα ππεξθεηκέλνπ θαιιηέξγεηαο E. coli 10 mm ζπγθέληξωζεο θωζθνξηθώλ, Λ) Γείγκα ππεξθεηκέλνπ θαιιηέξγεηαο E. coli 5 mm ζπγθέληξωζεο θωζθνξηθώλ, Μ) Γείγκα ππεξθεηκέλνπ θαιιηέξγεηαο E. coli 0,5 mm ζπγθέληξωζεο θωζθνξηθώλ Παναηδνείηαζ δδιζμονβία ηδθίδαξ δδθαδή ακμζμαπμηφπςζδ ηδξ ακμζμακηίδναζδξ ηςκ ακηζζςιάηςκ ιε ναικμθζπίδζα οπενηείιεκμο οβνμφ ηαθθζένβεζαξ Τ. thermophilus ζηα δείβιαηα Γ, Γ, Δ, Ε ηαζ Ζ ακελανηήηςξ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηςκ θςζθμνζηχκ ηδξ ηαθθζένβεζαξ αθθά ηαζ ιε ναικμθζπίδζα οπενηείιεκμο οβνμφ ηαθθζένβεζαξ Δ. coli ζηα δείβιαηα Θ ηαζ Μ ιε ζοβηέκηνςζδ θςζθμνζηχκ 50 mm ηαζ 0,5 mm. οιπεναζιαηζηά, ηα ακηζζχιαηα πμο απμιμκχεδηακ ιπμνμφκ κα ακαβκςνίζμοκ ναικμθζπίδζα Τ. thermophilus απυ οπενηείιεκμ οβνυ ηαθθζένβεζαξ υβημο ιυθζξ 50 ιl ακελανηήηςξ ζοβηέκηνςζδξ θςζθμνζηχκ ηαεχξ ηαζ ναικμθζπίδζα άθθμο ααηηδνίμο υπςξ ημ Δ. coli ζε ιεβαθφηενμ υβημ ηςκ 50 ιl οπενηεζιέκμο οβνμφ ηαθθζένβεζαξ. Αοηυ ζδιαίκεζ πςξ ηα ακηζζχιαηα πμο πανήπεδζακ ιπμνμφκ κα πνδζζιμπμζδεμφκ ςξ δζαβκςζηζηή ιέεμδμξ βζα ηδκ εφνεζδ ναικμθζπζδίςκ ηαηεοεείακ απυ ηαθθζένβεζεξ.