«ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΔΙΑΣΠΟΡΑΣ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA spp., ΣΕ ΖΩΑ, ΤΡΟΦΙΜΑ ΖΩΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΚΑΙ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥΣ ΣΤΗ ΔΗΜΟΣΙΑ ΥΓΕΙΑ»

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΛΟΙΜΩΔΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΙΤΙΚΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΛΟΙΜΩΔΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ «ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΔΙΑΣΠΟΡΑΣ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA spp., ΣΕ ΖΩΑ, ΤΡΟΦΙΜΑ ΖΩΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΚΑΙ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥΣ ΣΤΗ ΔΗΜΟΣΙΑ ΥΓΕΙΑ» ΘΕΟΦΙΛΟΣ Θ. ΠΑΠΑΔΟΠΟΥΛΟΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ, M.Sc., M.P.H. ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2015

2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΛΟΙΜΩΔΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΙΤΙΚΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΛΟΙΜΩΔΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ «ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΔΙΑΣΠΟΡΑΣ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA spp., ΣΕ ΖΩΑ, ΤΡΟΦΙΜΑ ΖΩΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΚΑΙ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥΣ ΣΤΗ ΔΗΜΟΣΙΑ ΥΓΕΙΑ» ΘΕΟΦΙΛΟΣ Θ. ΠΑΠΑΔΟΠΟΥΛΟΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ, M.Sc., M.P.H. ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Λοιμωδών Νοσημάτων του τμήματος Κτηνιατρικής της Σχολής Επιστημών Υγείας του Α.Π.Θ. σε συνεργασία με το Ινστιτούτο Κτηνιατρικών Ερευνών Θεσσαλονίκης του Εθνικού Ιδρύματος Αγροτικής Έρευνας (ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε.), την Εθνική Σχολή Δημόσιας Υγείας (Ε.Σ.Δ.Υ.), το Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς Σαλμονελών-Σιγκελών στη Βάρη, το Κτηνιατρικό Εργαστήριο Αναφοράς Σαλμονελών στη Χαλκίδα και το WHO Reference Laboratory for Salmonella phagetyping και το England & Wales Reference Laboratory for Salmonella - Health Protection Agency, Colindale, London,UK Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Ε. Πετρίδου Επίκουρη Καθηγήτρια Επιβλέπουσα Α. Βατόπουλος Καθηγητής Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Α. Ζδράγκας Ερευνητής Α Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής [1]

4 [2]

5 Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή Ευανθία Πετρίδου Επίκ. Καθηγήτρια Τμήμα Κτηνιατρικής ΑΠΘ Αλκιβιάδης Βατόπουλος Καθηγητής Εθνική Σχολή Δημόσιας Υγείας Αντώνιος Ζδράγκας Ερευνητής Α ΕΛΓΟ-ΔΗΜΗΤΡΑ (πρώην ΕΘΙΑΓΕ) Νικόλαος Μαλισσιόβας Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής ΑΠΘ Αγγελική-Ρόδη Μπουριέλ Καθηγήτρια Τμήμα Κτηνιατρικής ΠΘ Δανιήλ Σεργκελίδης Επίκ. Καθηγητής Τμήμα Κτηνιατρικής ΑΠΘ Γεώργιος Φιλιούσης Λέκτορας Τμήμα Κτηνιατρικής ΑΠΘ [3]

6 Θεόφιλος Παπαδόπουλος Α.Π.Θ. «ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΔΙΑΣΠΟΡΑΣ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA spp., ΣΕ ΖΩΑ, ΤΡΟΦΙΜΑ ΖΩΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΚΑΙ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥΣ ΣΤΗ ΔΗΜΟΣΙΑ ΥΓΕΙΑ» «Η έγκριση της Διδακτορικής Διατριβής από την Κτηνιατρική Σχολή του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα» (Νόμος 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2). [4]

7 Στη μητέρα μου Σοφία για όλα όσα μου προσέφερε και συνεχίζει να μου προσφέρει [5]

8 [6]

9 1 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ-ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γενικά για τις σαλμονέλες Ιστορικά στοιχεία Χαρακτηριστικά των σαλμονελών Αντιγονική σύσταση Ταξινόμηση του γένους Salmonella Σαλμονέλα και Δημόσια Υγεία Σαλμονέλωση στον άνθρωπο-τρόποι μετάδοσης Σαλμονέλωση στα ζώα-τρόποι μετάδοσης Θεραπεία σαλμονελώσεων Αντοχή σαλμονελών στα αντιμικροβιακά Τυποποίηση σαλμονελών Γενικά για την τυποποίηση Φαινοτυπικές μέθοδοι τυποποίησης σαλμονελών Οροτυποποίηση (Serotyping) Λυσιτυπία- (Phagetyping) Φαινότυπος αντοχής - (Resistant type) Βιοτυπία- (Biotyping) Μοριακές μέθοδοι - (Molecular typing methods) Γενικά για τις μοριακές μεθόδους Ανάλυση Πλασμιδιακού γενώματος - (Plasmid profile analysis) Ριβοτυπία- (Ribotyping) Ηλεκτροφόρηση εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου - (Pulsed Field Gel Electrophoresis PFGE) Πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος- (Multilocus Sequence Typing MLST) Πολυτοπική ανάλυση μεταβλητών επαναλήψεων νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis - MLVA) Αλληλούχιση ολόκληρου γενώματος (Whole Genome Sequencing WGS) Επιδημιολογικά δεδομένα Αίτια αύξησης επίπτωσης των σαλμονελώσεων Συχνότητα, ορότυποι και αντιμικροβιακή αντοχή στελεχών που απομονώθηκαν από τον άνθρωπο Ορότυποι και αντιμικροβιακή αντοχή στελεχών που απομονώθηκαν από τα ζώα Συχνότητα, ορότυποι και αντιμικροβιακή αντοχή στελεχών που απομονώθηκαν από τρόφιμα [7]

10 1.5 Επιδημικά ξεσπάσματα από τροφιμογενείς λοιμώξεις ΜΕΡΟΣ ΔΕΥΤΕΡΟ-Η ΔΙΚΗ ΜΑΣ ΕΡΕΥΝΑ Ερευνητικοί στόχοι ΥΛΙΚΑ Υλικά-Υποστρώματα μεταφοράς στελεχών από τα Εργαστήρια Αναφοράς Ζωμός Trypticase Soy Broth Διάλυμα γλυκερόλης Υλικά-Υποστρώματα ανακαλλιέργειας Σαλμονελών MacConkey agar Trypticase Soy Agar Μελέτη της ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά Υδατικό διάλυμα NaCl Υπόστρωμα Mueller-Hinton Στελέχη αναφοράς Μητρικά Διαλύματα των αντιμικροβιακών ουσιών Ηλεκτροφόρηση εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) Θολωσίμετρο Ρυθμιστικό διάλυμα εναιώρησης - (Cell Suspension Buffer-CSB) Πηκτή αγαρόζης Μήτρες-Εκμαγεία - plugmolds Πρωτεϊνάση Κ (proteinase K) Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης - (Lysis Buffer) Ρυθμιστικό διάλυμα Tris EDTA - (TE) Ενδονουκλεάσες περιορισμού - (Restriction endonucleases) Πρότυπα στελέχη αναφοράς - Δείκτες μοριακών βαρών- (Molecular weight laders) Γέλη ηλεκτροφόρησης Διάταξη ηλεκτροφόρησης Συνθήκες ηλεκτροφόρησης Χρώση πηκτής αγαρόζης Φωτογράφιση της πηκτής αγαρόζης Πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος (Multilocus Sequence Typing- MLST) Εκχύλιση του DNA των στελεχών Μέτρηση της ποσότητας του απομονωθέντος DNA Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης - PCR PCR mix [8]

11 Διάταξη PCR- θερμοκυκλοποιητής Ηλεκτροφόρηση προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης PCR product purification Αλληλούχιση των γονιδίων βασικού μεταβολισμού Διάταξη αλληλούχισης - Sequencing platforms Ορισμός MLST τύπων Λυσιτυπία Θρεπτικός ζωμός - (Double strength nutrient broth) Θρεπτικό υπόστρωμα-(nutrient agar) Συλλογή φάγων ΜΕΘΟΔΟΙ Λήψη και μεταφορά των στελεχών από τα εργαστήρια αναφοράς Ανακαλλιέργεια και καθαροποίηση των στελεχών Μελέτη αντοχής στις αντιμικροβιακές ουσίες Παρασκευή ενοφθαλμίσματος Προετοιμασία μητρικών διαλυμάτων αντιμικροβιακών ουσιών Εφαρμογή της μεθόδου Ανάγνωση του αποτελέσματος Ηλεκτροφόρηση Εναλλασσόμενου Ηλεκτρικού πεδίου (PFGE) In situ προετοιμασία του γονιδιακού DNA In situ πέψη του DNA Ηλεκτροφόρηση Εναλλασσόμενου Ηλεκτρικού Πεδίου (PFGE) Ανάλυση των PFGE ηλεκτροφορητικών προτύπων - στατιστική ανάλυση Λυσιτυπία Πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος - (Multilocus Sequence Typing-MLST) Στατιστική ανάλυση ΣΤΕΛΕΧΗ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ SALMONELLA SER. ENTERITIDIS Αντιμικροβιακή αντοχή Ηλεκτροφόρηση εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου (PFGE) Ενδονουκλεάση περιορισμού XbaI Υποβολή στη βάση δεδομένων Pulse Net Ενδονουκλεάση περιορισμού BlnI [9]

12 Μελέτη κλωνικότητας με ζεύγος ενζύμων περιορισμού(composite data set) XbaI-BlnI Πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος-(multilocus Sequence Typing-MLST) Συζήτηση SALMONELLA SER. TYPHIMURIUM Αντιμικροβιακή αντοχή Ηλεκτροφόρηση εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου (PFGE) Υποβολή στη βάση δεδομένων Pulse Net Πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος - (Multilocus Sequence Typing-MLST) Συζήτηση SALMONELLA SER. HADAR Αντιμικροβιακή αντοχή Ηλεκτροφόρηση εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου (PFGE) Υποβολή παλσότυπων στο Pulse Net Λυσιτυπία (Phage typing) Συνδυασμός PFGE-λυσυτιπίας-φαινοτύπου αντοχής Συζήτηση SALMONELLA SER. INFANTIS Αντιμικροβιακή αντοχή Ηλεκτροφόρηση εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου (PFGE) Συζήτηση SALMONELLA SER. VIRCHOW Αντιμικροβιακή αντοχή και μοριακή τυποποίηση Συζήτηση ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ-ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ Συμπεράσματα Προτάσεις ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ [10]

13 6.1 Δημοσιεύσεις Ανακοινώσεις ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [11]

14 [12]

15 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΕΙΚΟΝΩΝ ΕΙΚΟΝΑ 1: ΣΑΛΜΟΝΕΛΑ ΣΕ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ-ΑΝΑΠΑΡΑΣΤΑΣΗ ΕΙΚΟΝΑ 2: ΑΝΤΙΓΟΝΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΣΑΛΜΟΝΕΛΩΝ ΕΙΚΟΝΑ 3: ΧΑΡΤΗΣ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗΣ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΠΡΩΤΟΒΑΘΜΙΑ ΚΑΙ ΔΕΥΤΕΡΟΒΑΘΜΙΑ ΦΡΟΝΤΙΔΑ ΥΓΕΙΑΣ ΣΤΗΝ ΕΥΡΩΠΗ ΓΙΑ ΤΟ ΕΙΚΟΝΑ 4: ΒΗΜΑΤΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΕΝΑΛΛΑΣΣΟΜΕΝΟΥ ΗΛΕΚΤΡΙΚΟΥ ΠΕΔΙΟΥ (PFGE) ΕΙΚΟΝΑ 5: ΣΧΗΜΑΤΙΚΗ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΜΕ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΟ ΠΡΟΦΙΛ ΚΑΤΑ MLVA ΕΙΚΟΝΑ 6: ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΛΥΣΙΤΥΠΙΑΣ ΕΙΚΟΝΑ 7: ΧΑΡΤΗΣ ΜΕ ΤΙΣ ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΟΠΟΙΕΣ ΑΠΟΜΟΝΩΘΗΚΑΝ ΤΑ ΣΤΕΛΕΧΗ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ [13]

16 [14]

17 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ ΠΙΝΑΚΑΣ 1: ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΤΙΚΟΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΕΣ ΕΙΔΩΝ ΚΑΙ ΥΠΟΕΙΔΩΝ ΣΑΛΜΟΝΕΛΩΝ ΠΙΝΑΚΑΣ 2: ΣΥΧΝΟΤΕΡΟΙ ΟΡΟΤΥΠΟΙ ΣΑΛΜΟΝΕΛΩΝ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΩΝ ΑΠΟ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ ΣΤΗΝ ΕΥΡΩΠΗ ΤΟ 2011 ΚΑΙ ΤΟ ΠΙΝΑΚΑΣ 3: ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΣΑΛΜΟΝΕΛΩΝ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΩΝ ΑΠΟ ΒΟΟΕΙΔΗ ΣΕ ΧΩΡΕΣ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΗΣ ΤΟ ΠΙΝΑΚΑΣ 4: ΣΥΧΝΟΤΕΡΟΙ ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΤΡΟΦΙΜΟΓΕΝΩΝ ΕΠΙΔΗΜΙΩΝ ΣΤΗΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ ΕΝΩΣΗ ΤΑ ΕΤΗ 2011 ΚΑΙ ΠΙΝΑΚΑΣ 5: ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΕΡΕΥΝΑ ΠΙΝΑΚΑΣ 6: ΓΟΝΙΔΙΑ ΠΟΥ ΜΕΛΕΤΗΘΗΚΑΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΠΟΛΥΤΟΠΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ (MLST) ΠΙΝΑΚΑΣ 7: ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ ΚΑΙ ΓΟΝΙΔΙΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) ΠΙΝΑΚΑΣ 8: ΓΟΝΙΔΙΑ ΚΑΙ ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΒΑΣΙΚΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ ΠΙΝΑΚΑΣ 9: ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΙΣ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΟΜΑΔΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗ ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΕΜΦΑΝΙΣΗΣ ΑΝΤΟΧΗΣ ΠΙΝΑΚΑΣ 10: ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ ΜΕ ΦΑΓΟΥΣ ΠΙΝΑΚΑΣ 11: ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΑΛΜΟΝΕΛΩΝ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΟΝ ΟΡΟΤΥΠΟ ΚΑΙ ΤΗΝ ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΠΙΝΑΚΑΣ 12: ΣΤΕΛΕΧΗ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΜΕΛΕΤΗ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΟΝ ΟΡΟΤΥΠΟ ΚΑΙ ΤΟ ΕΤΟΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΠΙΝΑΚΑΣ 13: ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΑΛΜΟΝΕΛΩΝ ΠΟΥ ΑΠΟΜΟΝΩΘΗΚΑΝ ΑΠΟ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑ ΚΑΙ ΚΑΙ ΑΝΗΚΟΥΝ ΣΤΟΥΣ 5 ΟΡΟΤΥΠΟΥΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΑΥΤΗΣ [15]

18 ΠΙΝΑΚΑΣ 14: ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. ENTERITIDIS ΠΙΝΑΚΑΣ 15: ΕΥΡΩΠΑΪΚΑ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΑ ΠΡΟΤΥΠΑ (ΠΑΛΣΟΤΥΠΟΙ) ΠΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΤΗΚΑΝ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. ENTERITIDIS ΠΟΥ ΜΕΛΕΤΗΘΗΚΑΝ, Η ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΚΑΙ Η ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΤΟΥΣ ΠΙΝΑΚΑΣ 16: ΑΝΑΛΥΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΒΑΣΙΚΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. ENTERITIDIS ΠΙΝΑΚΑΣ 17: ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. TYPHIMURIUM ΠΙΝΑΚΑΣ 18: ΕΥΡΩΠΑΪΚΟΙ ΠΑΛΣΟΤΥΠΟΙ ΠΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΤΗΚΑΝ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. TYPHIMURIUM ΠΟΥ ΜΕΛΕΤΗΘΗΚΑΝ, Η ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΚΑΙ Η ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΤΟΥΣ ΠΙΝΑΚΑΣ 19: ΑΝΑΛΥΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΒΑΣΙΚΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. TYPHIMURIUM ΠΙΝΑΚΑΣ 20: ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. HADAR ΠΙΝΑΚΑΣ 21: ΕΥΡΩΠΑΪΚΑ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΑ ΠΡΟΤΥΠΑ (ΠΑΛΣΟΤΥΠΟΙ) ΠΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΤΗΚΑΝ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. HADAR ΠΟΥ ΜΕΛΕΤΗΘΗΚΑΝ, Η ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΚΑΙ Η ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΤΟΥΣ ΠΙΝΑΚΑΣ 22: ΛΥΣΙΤΥΠΟΙ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. HADAR ΠΙΝΑΚΑΣ 23: ΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΥ ΑΝΤΟΧΗΣ, ΛΥΣΙΤΥΠΟΥ ΚΑΙ ΠΑΛΣΟΤΥΠΟΥ ΓΙΑ ΤΗ SALMONELLA SER. HADAR ΠΙΝΑΚΑΣ 24: ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. INFANTIS [16]

19 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ ΣΧΗΜΑ 1: ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΣΑΛΜΟΝΕΛΩΝ ΣΧΗΜΑ 2: ΚΑΤΑ ΚΕΦΑΛΗΝ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΑΝΑ ΗΜΕΡΑ ΣΕ ΕΥΡΩΠΑΪΚΕΣ ΧΩΡΕΣ ΤΟ ΣΧΗΜΑ 3: ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΚΡΟΥΣΜΑΤΩΝ ΣΑΛΜΟΝΕΛΩΣΗΣ ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ ΤΟ ΣΧΗΜΑ 4: ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΟΡΟΤΥΠΩΝ ΣΑΛΜΟΝΕΛΩΝ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΩΝ ΑΠΟ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ ΣΤΗΝ ΕΥΡΩΠΗ ΤΟ ΣΧΗΜΑ 5: ΣΥΧΝΟΤΕΡΟΙ ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΤΡΟΦΙΜΟΓΕΝΩΝ ΕΠΙΔΗΜΙΩΝ ΣΤΗΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ ΈΝΩΣΗ ΤΑ ΕΤΗ,,, 2011 ΚΑΙ ΣΧΗΜΑ 6: ΥΠΕΥΘΥΝΑ ΤΡΟΦΙΜΑ ΣΤΙΣ ΤΡΟΦΙΜΟΓΕΝΕΙΣ ΕΠΙΔΗΜΙΕΣ ΣΤΗΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ ΈΝΩΣΗ ΤΟ ΣΧΗΜΑ 7: ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΠΙΔΗΜΙΩΝ ΑΠΟ ΑΥΓΑ ΚΑΙ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΑΥΓΩΝ ΣΤΗΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ ΈΝΩΣΗ ΤΟ ΣΧΗΜΑ 8: ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΑΠΟ ΛΑΧΑΝΙΚΑ ΣΤΗΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ ΈΝΩΣΗ ΤΟ ΣΧΗΜΑ 9: ΡΑΒΔΟΓΡΑΜΜΑ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΜΕΛΕΤΗ ΑΝΑ ΟΡΟΤΥΠΟ ΚΑΙ ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΣΧΗΜΑ 10: ΡΑΒΔΟΓΡΑΜΜΑ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΜΕΛΕΤΗ ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΟΝ ΟΡΟΤΥΠΟ ΚΑΙ ΤΟ ΕΤΟΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΣΧΗΜΑ 11: ΔΕΝΔΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. ENTERITIDIS ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΠΕΨΗ ΑΠΟ ΤΟ ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΟ ΕΝΖΥΜΟ XBAI ΣΧΗΜΑ 12: ΔΕΝΔΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. ENTERITIDIS ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΠΕΨΗ ΑΠΟ ΤΟ ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΟ ΕΝΖΥΜΟ BLNI ΣΧΗΜΑ 13: ΣΥΝΔΙΑΣΤΙΚΟ ΔΕΝΔΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. ENTERITIDIS ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΠΕΨΗ ΑΠΟ ΤΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΑ ΕΝΖΥΜΑ BLNI & XBAI [17]

20 ΣΧΗΜΑ 14: ΔΕΝΔΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. ENTERITIDIS ΠΟΥ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΑΝ ΣΕ ΠΟΛΥΤΟΠΙΚΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΜΕΤΑΒΛΗΤΩΝ ΠΕΡΙΟΧΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ ΣΧΗΜΑ 15: ΔΕΝΔΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. TYPHIMURIUM ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΠΕΨΗ ΑΠΟ ΤΟ ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΟ ΕΝΖΥΜΟ XBAI ΣΧΗΜΑ 16: ΔΕΝΔΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. TYPHIMURIUM ΠΟΥ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΑΝ ΣΕ ΠΟΛΥΤΟΠΙΚΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΜΕΤΑΒΛΗΤΩΝ ΠΕΡΙΟΧΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ ΣΧΗΜΑ 17: ΔΕΝΔΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. HADAR ΣΧΗΜΑ 18: ΔΕΝΔΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. INFATIS ΣΧΗΜΑ 19: ΔΕΝΔΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΤΕΛΕΧΩΝ SALMONELLA SER. VIRCHOW [18]

21 Πρόλογος Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν διερεύνηση της διασποράς των πέντε σημαντικότερων για τη Δημόσια Υγεία οροτύπων σαλμονελών στη χώρα μας, από το 2007 έως και το στον άνθρωπο, στα ζώα και στα τρόφιμα ζωικής προέλευσης και η αξιολόγηση της μεταξύ τους επιδημιολογικής συσχέτισης με βάση φαινοτυπικές και μοριακές μεθόδους. Στο πρώτο μέρος της διατριβής γίνεται βιβλιογραφική ανασκόπηση όσον αφορά τις σαλμονέλες γενικά, την οικολογία τους και τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά τους, καθώς και τις μεθόδους τυποποίησης και υποτυποποίησης. Αναφέρονται ειδικά οι μοριακές και οι φαινοτυπικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στο πλαίσιο της επιδημιολογικής επιτήρησης και τέλος γίνεται ιδιαίτερη αναφορά στην επιδημιολογία των σαλμονελώσεων στην κοινότητα, στα ζώα και στα τρόφιμα όπως επίσης παρουσιάζονται τα δεδομένα αντοχής στις αντιμικροβιακές ουσίες. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής περιγράφονται τα υλικά και οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της έρευνας, παρουσιάζονται και σχολιάζονται οι επιμέρους μελέτες με τα αποτελέσματά τους ανά ορότυπο και μετά από μια πιο γενική συζήτηση διατυπώνονται τα συμπεράσματα. Για την επίτευξη των επιστημονικών στόχων της διατριβής, προγραμματίστηκαν και πραγματοποιήθηκαν οι εξής επιμέρους μελέτες: Καταγραφή όλων των στελεχών σαλμονελών που απομονώθηκαν στη χώρα μας την περίοδο και ταυτοποιήθηκαν από τα επίσημα εργαστήρια αναφοράς ως σαλμονέλες, καθορισμός και λήψη των στελεχών που συμπερηλήφθηκαν στη μελέτη. Έλεγχος της ευαισθησίας/ αντοχής των σαλμονελών αυτών στα αντιβιοτικά. [19]

22 Γενοτυπικός χαρακτηρισμός, έλεγχος κλωνικότητας των στελεχών με εφαρμογή της ηλεκτροφόρησης σε παλλόμενο πεδίο (Pulsed Field Gel Electrophoresis- PFGE). Φαινοτυπικός χαρακτηρισμός - έλεγχος κλωνικότητας με εφαρμογή λυσιτυπίας (Phagetyping). Μοριακός χαρακτηρισμός - έλεγχος κλωνικότητας με εφαρμογή Πολυτοπικής αλληλούχισης μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος (Multilocus Sequence Typing- MLST). Υποβολή των δεδομένων στις Ευρωπαϊκές και παγκόσμιες βάσεις δεδομένων των αποτελεσμάτων και σύγκρισή τους με αντίστοιχα στελέχη της Ευρώπης και του υπόλοιπου κόσμου, Pulsenet-Europe, MLST/Salmonella enterica. Η διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Λοιμωδών Νοσημάτων του τμήματος Κτηνιατρικής της Σχολής Επιστημών Υγείας του Α.Π.Θ.. Τμήμα της παρούσας διατριβής εκπονήθηκε στο Ινστιτούτο Κτηνιατρικών Ερευνών Θεσσαλονίκης (ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε.), ενώ κάποια επιμέρους τμήματα πραγματοποιήθηκαν στο World Health Organization - Reference Laboratory for Salmonella phagetyping και στο England & Wales Reference Laboratory for Salmonella - Health Protection Agency, Colindale, London,UK. Η ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής δε θα ήταν ίσως εφικτή χωρίς τη συνεισφορά κάποιων ανθρώπων στους οποίους θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου. Ευχαριστώ βαθύτατα την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Ευανθία Πετρίδου, η οποία ήταν συνέχεια δίπλα μου όλα αυτά τα χρόνια, τόσο ως πρώην μέλος της Συμβουλευτικής Επιτροπής, όσο και ως μετέπειτα επιβλέπουσά μου. Την ευχαριστώ επίσης θερμά γιατί με την υπομονή, την επιμονή της, το αμείωτο ενδιαφέρον της και ιδιαίτερα με τις ουσιαστικές και εποικοδομητικές διορθώσεις της στη συγγραφή του κειμένου της διατριβής, συνέβαλε καθοριστικά στην επιτυχή ολοκλήρωσή της σε σύντομο χρονικό διάστημα. [20]

23 Αισθάνομαι πολύ τυχερός που συμμετείχε στη Συμβουλευτική Επιτροπή ο Ερευνητής Α και Διευθυντής του ΙΚΕΘ του ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε. κ. Αντώνιος Ζδράγκας, ο οποίος με την συνεργασία μας συνετέλεσε ουσιαστικά στην ολοκλήρωση του σημαντικότερου τμήματος του πειραματικού μέρους της διατριβής στο ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε. Αισθάνομαι ειλικρινά την ανάγκη να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στο πρόσωπό του για τις αμέτρητες ώρες που αφιέρωσε στη συνεχή καθοδήγησή μου, σε όλα τα στάδια εκπόνησης της διατριβής. Τον ευχαριστώ επίσης θερμότατα για την ψυχολογική στήριξη που μου παρείχε και τη συνεχή ενθάρρυνση όλα αυτά τα χρόνια. Ήταν ιδιαίτερη τιμή για μένα η συμμετοχή του Καθηγητή Μικροβιολογίας της ΕΣΔΥ και Διευθυντή του Εθνικού Εργαστηρίου Αναφοράς Σαλμονελών-Σιγκελών κ. Αλκιβιάδη Βατόπουλου, ως μέλους της Συμβουλευτικής Επιτροπής. Τον ευχαριστώ θερμά για την ουσιαστική συμβολή του στην ιδέα και στον αρχικό σχεδιασμό της διατριβής, για την εξασφάλιση βακτηριακών νοσοκομειακών στελεχών από την τράπεζα στελεχών της ΕΣΔΥ, για την επιστημονική καθοδήγηση καθώς και για τις χρήσιμες παρατηρήσεις και συμβουλές του. Ευχαριστώ επίσης θερμά, τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Δανιήλ Σεργκελίδη, μέλος της Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής, τόσο για τις εύστοχες διορθώσεις του, όσο και για τη στήριξη,τις πολύ εποικοδομητικές συζητήσεις και τη συνεργασία που είχαμε όλα αυτά τα χρόνια γύρω από το θέμα της διατριβής, αλλά και ευρύτερα στα θέματα Υγιεινής Τροφίμων. Θερμές ευχαριστίες εκφράζω στην Καθηγήτρια Μικροβιολογίας και Διευθύντρια του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας του Τμήματος Κτηνιατρικής του Π.Θ. κ. Αγγελική-Ρόδη Μπουριέλ, μέλος της εξεταστικής επιτροπής, για τα θετικά της σχόλια και τις εύστοχες παρατηρήσεις της. Αισθάνομαι επίσης την ανάγκη να ευχαριστήσω θερμά τον Καθηγητή Μικροβιολογίας του Ιατρικού Τμήματος του Α.Π.Θ. και Διευθυντή του Α Εργαστηρίου Μικροβιολογίας Α.Π.Θ. κ. Νικόλαο Μαλισιόβα που δέχθηκε να [21]

24 συμμετάσχει στην Επταμελή Εξεταστική Επιτροπή αλλά και για τα θετικά του σχόλια και παρατηρήσεις του. Τον Λέκτορα Μικροβιολογίας του Κτηνιατρικού Τμήματος του Α.Π.Θ. κ. Γεώργιο Φιλιούση μέλος της εξεταστικής επιτροπής, ευχαριστώ ιδιαίτερα για τις καίριες παρατηρήσεις και επισημάνσεις του στο κείμενο της παρούσας διατριβής. Ευχαριστίες οφείλω στην συνταξιοδοτηθείσα καθηγήτρια κ. Ελευθερία Χατζοπούλου, και πρώην επιβλέπουσά μου, που μου ανέθεσε το θέμα της διατριβής. Θερμότατα ευχαριστώ επίσης, την κ. Μαρία Πασιώτου, πρώην Δντρια του Κτηνιατρικού Εργαστηρίου Χαλκίδας για την εξασφάλιση των βακτηριακών στελεχών απομονωμένων από τρόφιμα και ζώα, καθώς και τις κ. Γεωργία Μανδηλαρά Επιστημονική Συνεργάτιδα της ΕΣΔΥ και Μαρία Λαμπίρη πρώην Διευθύντρια του Εθνικού Κέντρου Αναφοράς Σαλμονελών για την εξασφάλιση των νοσοκομειακών βακτηριακών στελεχών καθώς και του στελέχους αναφοράς για την PFGE. Ταυτόχρονα, θα ήθελα να ευχαριστήσω την κ. Σοφία Μπελιμπασάκη, πρώην Δντρια του Ινστιτούτου Κτηνιατρικών Ερευνών Θεσσαλονίκης (ΙΚΕΘ) του ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε. και την κ. Σμαράγδα Σωτηράκη, Ερευνήτρια Α του ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε. οι οποίες συνετέλεσαν, σε μια πολύ δύσκολη στιγμή της ζωής μου, στην μετακίνησή μου στο Ινστιτούτο για την ολοκλήρωση σημαντικού τμήματος της διατριβής, όπως και τον Γεώργιο Βαφέα και όλο το προσωπικό του ΙΚΕΘ, για την άψογη συνεργασία μας και την εξασφάλιση ενός ιδανικού εργασιακού περιβάλλοντος. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω προσωπικά τον τέως Νομάρχη και νυν Δήμαρχο Φλώρινας κ. Ιωάννη Βοσκόπουλο, την κ. Άννα Καρακούλα, Δντρια Προσωπικού της Περιφέρειας Δυτικής Μακεδονίας, τον Διευθυντή μου και Διευθυντή Αγροτικής Οικονομίας και Κτηνιατρικής της Περιφερειακής Ενότητας Φλώρινας κ. Αθανάσιο Αλτίνη, τα μέλη του Υπηρεσιακού Συμβουλίου Υπαλλήλων Περιφέρειας Δυτικής Μακεδονίας, τα μέλη του [22]

25 Υπηρεσιακού Συμβουλίου τεως Νομαρχίας Φλώρινας, την κ. Αναστασία Τσάτσου Εκτελεστική Γραμματέα Περιφέρειας Δυτικής Μακεδονίας καθώς και τον κ. Γεώργιο Δακή τέως Περιφερειάρχη Περιφέρειας Δυτικής Μακεδονίας για τις άδειες Υπηρεσιακής Εκπαίδευσης που μου χορήγησαν, χωρίς τις οποίες η ολοκλήρωση της διατριβής και ιδιαίτερα του πειραματικού μέρους θα ήταν αδύνατη. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω, ιδιαίτερα, τους συναδέλφους στο Κτηνιατρικό Γραφείου Αμυνταίου κ. Γεώργιο Μπούρη και Κωνσταντίνο Ρώσσιο για την ανοχή, την υπομονή και την συμπαράστασή τους κατά τη διάρκεια των τακτικών μου απουσιών από την Υπηρεσία, για την ολοκλήρωση του πειραματικού μέρους της διατριβής. Θα ήταν επίσης παράλειψή μου να μην ευχαριστήσω το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών ΑΠΘ για τις υποτροφίες που μου χορήγησε για να μεταβώ στο Εργαστήριο Αναφοράς του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας για τη Λυσιτυπία των Σαλμονελών και Εργαστηρίου Αναφοράς Σαλμονελών για το Ηνωμένο Βασίλειο στο Colindale στα πλαίσια της διατριβής αυτής. Ιδιαίτερες ευχαριστίες στο προσωπικό του Τμήματος Διεθνών Σχέσεων του Α.Π.Θ. για την οργάνωση της μετάβασής μου στο εξωτερικό. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τη Dr. Kathy Grant, Δντρια, καθώς και όλο το προσωπικό του Laboratory of Gastrointestinal Pathogens, Colindale, London UK για τη αποδοχή και τη βοήθειά τους κατά τη διάρκεια της πολύμηνης παρουσίας μου στο εργαστήριο τους. Προσωπικές ευχαριστίες το Dr. Satheesh Nair και τη Dr. Tansy Peters, επιβλέποντες μου στο Λονδίνο, για την βοήθειά τους κυρίως όμως για την εκπαίδευσή μου στη χρήση πρωτοπόρων μοριακών τεχνικών. Επίσης, την κ. Elizabeth de Pinna Δντρια του Salmonella Reference Service για την εφαρμογή της λυσιτυπίας, την Dr. Marie-Anne Chattaway για τη βοήθειά της στην εφαρμογή της Multi Locus Sequence Typing, καθώς και τους Steve Cornell και Martin Day για τη βοήθειά τους στην οροτυποποίηση και την μελέτη της αντιμικροβιακής αντοχής. [23]

26 Θερμά ευχαριστώ και τον κουμπάρο και φίλο μου Πέτρο Μητσιάδη για την φιλοξενία που απλόχερα μου παρείχε όλο αυτό το διάστημα της πολύμηνης παραμονής μου στο Λονδίνο. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον John Wain, Professor of Medical Microbiology at the University of East Anglia, για τις εποικοδομητικές συζητήσεις που είχαμε σε σχέση με τη διατριβή μου και την υποτυποποίηση των σαλμονελών, τον Ian Fisher, Senior Epidemiologist στο Laboratory of Gastrointestinal Pathogens, για την βοήθειά του στην κατανόηση της επιδημιολογίας των σαλμονελώσεων, καθώς και την Dr. Ida Luzzi Δντρια στο Istituto Superiore di Sanità για τη βοήθειά της και τη συνεργασία κατά τη διάρκεια παραμονής μου στο Εργαστήριο της στη Ρώμη. Τους φίλους μου Δήμητρα Παρδάλη Λέκτορα Παθολογίας Ζώων Συντροφιάς, Ελένη Μαλισσιόβα Καθηγήτρια Εφαρμογών στο ΑΤΕΙΘ, Εμμανουήλ Καλαϊτζάκη, Λέκτορα Παθολογίας Παραγωγικών Ζώων, Ηλία Χαληγιάννη υπ. Διδάκτορα του Τμήματος Ιατρικής Α.Π.Θ. και Κωνσταντίνα Κυριάζογλου, βιολόγο, ευχαριστώ θερμά για τις συμβουλές τους καθώς και την συμπαράστασή τους όλο αυτό το διάστημα. Θερμές ευχαριστίες επίσης στους φίλους μου Αβραάμ-Κωνσταντίνο Νίκου και Ιωάννη Φουρκιώτη για τη βοήθειά τους στην ηλεκτρονική διαμόρφωση του τελικού κειμένου. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω ανώνυμα όλους τους φίλους και γνωστούς που με στήριξαν ψυχολογικά και να ζητήσω προκαταβολικά συγνώμη αν ξέχασα κάποιον. [24]

27 1 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ-ΕΙΣΑΓΩΓΗ [25]

28 1.1 Γενικά για τις σαλμονέλες Ιστορικά στοιχεία Η ιστορία των σαλμονελώσεων συνδέεται, στα πρώτα στάδια, με την ιστορία του τυφοειδούς πυρετού [1, 2]. Ο Ιπποκράτης είχε περιγράψει εμπύρετο νόσημα, η συμπτωματολογία του οποίου έμοιαζε με αυτήν του τυφοειδούς πυρετού. Ο Ρωμαίος Antonius Musa φημιζόταν γιατί είχε θεραπεύσει με κρύα λουτρά τον αυτοκράτορα Αύγουστο, ο οποίος πιθανώς έπασχε από το νόσημα. Ο Thomas Willis περιέγραψε το 1687 με αρκετή ακρίβεια το νόσημα που αργότερα αναγνωρίστηκε ως τυφοειδής πυρετός [2]. Στη Γαλλία στις αρχές του 19ου αιώνα καταγράφηκε για πρώτη φορά η σύνδεση της ελκωτικής εντερίτιδας του ανθρώπου με κάποιο λοιμογόνο παράγοντα, στον οποίο αργότερα αποδόθηκε η ασθένεια τυφοειδής πυρετός. Το 1885, οι Salmon και Smith απομόνωσαν για πρώτη φορά τη Salmonella Cholera-suis από χοίρους [3]. Στη συνέχεια ανακαλύφθηκαν και άλλοι ορότυποι της σαλμονέλας από τους Gaffky και Paak το 1885, τον Gartner το 1888, τον Rettger το 1900 και άλλους. Το όνομα σαλμονέλα δόθηκε από τον Lignieres το 1900 προς τιμή του Daniel Elmer Salmon, του πρώτου κτηνίατρου στον οποίο απονεμήθηκε διδακτορικό δίπλωμα στην Κτηνιατρική σχολή του πανεπιστημίου Cornell-USA. Η ονομασία αυτή υιοθετήθηκε διεθνώς από το 1933 [4-6] Χαρακτηριστικά των σαλμονελών [26]

29 Τα βακτήρια του γένους Salmonella είναι Gram αρνητικά βακτήρια που ανήκουν στην οικογένεια Enterobacteriaceae (Εικόνα 1). Έχουν διαστάσεις 0,7-1,5 2,0-5,0 μm και είναι κινητά καθώς περιβάλλονται από μικρό αριθμό περίτριχων μαστιγίων, με εξαίρεση τις Salmonella Gallinarum και Salmonella Pullorum που είναι ακίνητες. H Salmonella αναπτύσσεται σε ένα εύρος θερμοκρασιών που κυμαίνεται μεταξύ 2-54 C. Ανάπτυξη κάτω από τους 7 C έχει σπάνια παρατηρηθεί σε καλλιέργειες, δεν έχει παρατηρηθεί όμως, σε τρόφιμα. Παρόμοια δεδομένα υπάρχουν και σε θερμοκρασίες άνω των 48 C. Η άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης είναι στους 37 C [6]. Εικόνα 1: Σαλμονέλα σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο-αναπαράσταση- πηγή CDC Οι σαλμονέλες παρουσιάζουν έντονη βιοχημική δρατηριότητα. Όλα τα είδη του γένους διασπούν τη γλυκόζη, με παραγωγή αερίου και οξέος. Εξαίρεση αποτελεί η Salmonella ser. Typhi, η οποία διασπά τη γλυκόζη χωρίς την παραγωγή αερίου. Είναι αερόβια ή προαιρετικά [27]

30 αναερόβια μικρόβια, ασπορογόνα και χωρίς έλυτρο. Εξαίρεση αποτελούν οι Salmonella ser. Typhi, Salmonella ser. Paratyphi και Salmonella ser. Dublin, οι οποίες διαθέτουν ένα περίβλημα που μοιάζει με έλυτρο [4, 5, 7]. Αναλυτικά τα βιοχημικά χαρακτηριστικά των σαλμονελών παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα. (Πίνακας 1) Πίνακας 1: Διαφοροποιητικοί χαρακτήρες ειδών και υποειδών σαλμονελών -πηγή[7] Αντιγονική σύσταση Οι σαλμονέλες έχουν τα σωματικά αντιγόνα Ο και τα βλεφαριδικά αντιγόνα Η. Τα σωματικά αντιγόνα Ο είναι λιποπολυσακχαρίτες και παρουσιάζουν ανθεκτικότητα στο βρασμό επί 2 ½ ώρες, στην αιθυλική αλκοόλη και στα αραιά οξέα. Τα βλεφαριδικά αντιγόνα Η, τα οποία είναι πρωτεϊνικής φύσης, είναι θερμοευαίσθητα. Τα σωματικά αντιγόνα [28]

31 σημειώνονται με αραβικούς αριθμούς, ενώ τα βλεφαριδικά αντιγόνα είτε με αραβικούς αριθμούς, είτε με γράμματα του λατινικού αλφαβήτου. Τα διάφορα στελέχη των σαλμονελών μπορεί να περιέχουν περισσότερα του ενός αντιγόνα Ο και Η. Εκτός των αντιγόνων Ο και Η μερικές σαλμονέλες έχουν και ένα άλλο αντιγόνο το αντιγόνο Vi. Το αντιγόνο αυτό είναι επιφανειακό και επειδή αρχικά θεωρήθηκε πως σχετίζεται με την αυξημένη λοιμογόνο δύναμη (virulence) του στελέχους πήρε το όνομα Vi [8, 9]. (Εικόνα 2) Θα πρέπει επίσης να αναφερθεί πως στα βλεφαριδικά αντιγόνα Η μπορεί να παρατηρείται ποικιλία φάσεως, να εμφανίζουν δηλαδή δύο φάσεις. Τα περισσότερα στελέχη παρουσιάζουν και τις δύο φάσεις, ωστόσο ο ένας τύπος είναι κοινός σε λίγα μόνο είδη σαλμονελών και αποτελεί το βλεφαριδικό αντιγόνο της «φάσεως 1 ή της ειδικής φάσεως». Ό άλλος τύπος του βλεφαριδικού αντιγόνου, είναι κοινός σε πολλά είδη σαλμονελών και αποτελεί τη «φάση 2 ή μη ειδική φάση». Οι φάσεις αυτές είναι συνήθως αναστρέψιμες. Οι σαλμονέλες που βρίσκονται μόνο σε μια φάση ονομάζονται «μονοφασικές» ενώ αυτές που βρίσκονται και στις δύο φάσεις «διφασικές» [8]. Εικόνα 2: Αντιγονική σύσταση σαλμονελών - πηγή CDC [29]

32 1.1.4 Ταξινόμηση του γένους Salmonella Αρχικά η ονοματολογία του γένους Salmonella βασίστηκε στην πρόκληση ή όχι συγκεκριμένης κλινικής νόσου (Salmonella typhi) ή παρόμοιας νόσου (Salmonella paratyphi A, B και C). Άλλοτε βασίστηκε στην πρόκληση της συγκεκριμένης νόσου σε συγκεκριμένο ξενιστή (Salmonella typhi-murium, Salmonella cholerae-suis, Salmonella abortusovis). Μετά την διαπίστωση πως οι περισσότεροι ορότυποι δεν έχουν ειδικότητα στους ξενιστές, αλλά μπορούν να προσβάλλουν περισσότερα είδη ζώων οι ονομασίες δόθηκαν με βάση τον τόπο, στον οποίο έγινε η απομόνωση για πρώτη φορά του συγκεκριμένου είδους (Salmonella london, Salmonella panama). Αργότερα, το 1968, αποφασίστηκε να συγχωνευθούν οι ονομασίες αυτές σε μια λέξη, έτσι ώστε τα ονόματα να πάρουν τη μορφή Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Salmonella abortusovis, χωρίς όμως αυτά να σημαίνουν το είδος της σαλμονέλας (με βάση κάποια αντιγονικά χαρακτηριστικά όπως σε άλλα βακτήρια), με αποτέλεσμα εσφαλμένα να θεωρούνται είδος και να γράφονται με πλάγια γραφή [8]. Σήμερα, το γένος Salmonella περιλαμβάνει μόνο δύο είδη (2.659 ορότυποι), τις Salmonella enterica και Salmonella bongori. Η Salmonella enterica περιλαμβάνει 6 υποείδη: Salmonella enterica subsp. enterica, Salmonella enterica subsp. salamae, Salmonella enterica subsp. arizonae, Salmonella enterica subsp. diarizonae, Salmonella enterica subsp. houtenae και Salmonella enterica subsp. indica [8-11]. Το είδος Salmonella enterica subsp. enterica αντιπροσωπεύει ποσοστό [30]

33 μεγαλύτερο από το 99% των στελεχών σαλμονέλας που απομονώνονται από ανθρώπους και θερμόαιμα ζώα παγκοσμίως [11, 12]. Στο Σχήμα 1 ο χαρακτηρισμός σε είδη και υποείδη( τμήμα i) γίνεται με βάση βιοχημικούς και ορολογικούς χαρακτήρες, ενώ ο διαχωρισμός μεταξύ τυφοειδών και μη τυφοειδών στελεχών βασίζεται στην πρόκληση της κλινικής ασθένειας του τύφου (τμήμα ii). Ο τυφοειδής και ο παρατυφοειδής πυρετός χαρακτηρίζονται από οξεία διάρροια, από ταχύτατη εξέλιξη της νόσου και συστηματική εντόπιση εκτός γαστρεντερικού. Ο διαχωρισμός σε ορότυπους (τμήμα iii) γίνεται μετά από συγκόλληση με συγκεκριμένους αντιορούς των σωματικών αντιγόνων (Ο) και των αντιγόνων δύο φάσεων του μαστιγίου (Η1 και Η2). Στο υποείδος Salmonella enterica subsp. enterica έχουν περιγραφεί πάνω από 46 Ο, 85 Η και 1 Vi (αντιγόνο κάψας) με περισσότερους από συνδυασμούς, ενώ άλλοι περίπου έχουν περιγραφεί για τα υπόλοιπα υποείδη Salmonella enterica μαζί με την Salmonella bongori [9, 12].Αναλυτικά η ταξινόμηση των σαλμονελλών παρουσιάζεται στο παρακάτω σχήμα (Σχήμα 1) [9, 12] Σχήμα 1: Ταξινόμηση σαλμονελών- πηγή [9,12] [31]

34 1.2 Σαλμονέλα και Δημόσια Υγεία Σαλμονέλωση στον άνθρωπο-τρόποι μετάδοσης Στον άνθρωπο, το βακτήριο κατά κύριο λόγο προκαλεί δύο διαφορετικά σύνδρομα, που περιγράφονται ως γαστρεντερίτιδα και συστηματική νόσος. Οι ορότυποι Salmonella ser. Typhi και Salmonella ser. Paratyphi A, B, C είναι προσαρμοσμένοι στον άνθρωπο και προκαλούν τον τυφοειδή και τον παρατυφοειδή πυρετό, αντίστοιχα. Πρόκειται για δύο νοσήματα τα οποία μοιάζουν μεταξύ τους, ίσως ο ορότυπος Salmonella ser. Paratyphi να προκαλεί ηπιότερη κλινική εικόνα, με υψηλό πυρετό, στομαχικούς πόνους, απώλεια της όρεξης, αδυναμία και κεφαλαλγίες. Αν δεν γίνει έγκαιρα θεραπεία με τα κατάλληλα αντιβιοτικά, οι ασθενείς παρουσιάζουν πυρετό για αρκετές εβδομάδες, και ένα ποσοστό περίπου 20% καταλήγει εξαιτίας επιπλοκών. Κύρια αιτία μόλυνσης από τους συγκεκριμένους ορότυπους είναι η κατανάλωση νερού ή φαγητού που έχει επιμολυνθεί από κόπρανα ασθενών [6, 13]. Οι περισσότεροι ορότυποι ωστόσο, εκτός των προσαρμοσμένων, έχουν ένα ευρύ φάσμα ξενιστών και ονομάζονται μη προσαρμοσμένοι ορότυποι ή ορότυποι τροφιμογενών λοιμώξεων. Τυπικά, τα στελέχη που ανήκουν στους μη προσαρμοσμένους ορότυπους προκαλούν γαστρεντερίτιδα, χωρίς επιπλοκές. Η εξέλιξη μπορεί να είναι σοβαρή αν προσληφθούν νεαρά άτομα ή άτομα τρίτης ηλικίας ή άτομα ανοσοκατεσταλμένα ή ασθενείς με παθήσεις του αιμοποιητικού συστήματος. Στις περιπτώσεις αυτές, μπορεί να παρατηρηθεί [32]

35 βακτηριαιμία και τελικά σηψαιμία με κίνδυνο κατάληξης των ασθενών [14]. Δεξαμενή του βακτηρίου στη φύση είναι ο εντερικός σωλήνας των ζώων (κατοικίδιων και άγριων), με αποτέλεσμα πηγές μόλυνσης να θεωρούνται τα τρόφιμα τόσο ζωικής όσο και φυτικής προέλευσης. Η μετάδοση συχνά συμβαίνει όταν ο μικροοργανισμός μολύνει τις εγκαταστάσεις επεξεργασίας τροφίμων και αφήνεται να πολλαπλασιαστεί μέσα στο τρόφιμο, όπως σε συνθήκες υψηλών θερμοκρασιών συντήρησης ή διασταυρούμενης μόλυνσης με έτοιμα προς κατανάλωση τρόφιμα [15]. Η μετάδοση του μικροοργανισμού μέσω κατοικιδίων, απευθείας επαφής με αρρώστους, ενδονοσοκομειακά, μέσω νερού ή μολυσμένων υγρών αποτελούν τις λιγότερο συνηθισμένες οδούς μόλυνσης [16]. Η μόλυνση ξεκινά με την πρόσληψη μολυσματικής δόσης του μικροοργανισμού ικανής να προσβάλλει το γαστρεντερικό σύστημα. Το γαστρεντερικό σύνδρομο αποτελεί μία οξεία διαρροϊκή νόσο με διάρκεια 4-7 ημέρες. Τα συμπτώματα ποικίλουν και περιλαμβάνουν διάρροια, πυρετό, και κοιλιακό άλγος [15, 17, 18]. Σε μερικούς ανθρώπους (παιδιά, ανοσοκατεσταλμένους), η ασθένεια μπορεί να εξελιχθεί έως την κατάληξη του ασθενούς μετά από οξεία σηψαιμία και εντοπίσεις σε διάφορα όργανα όπως ο σπλήνας, το ήπαρ, το ουροποιητικό σύστημα και ο εγκέφαλος [6, 14]. Σε μικρό ποσοστό μπορεί να παρουσιαστούν δευτερογενείς επιπλοκές αυτοάνοσης αιτιολογίας όπως αρθρίτιδες, ή σύνδρομο Reiter, ένα σύνδρομο χρόνιας μορφής που χαρακτηρίζεται από πόνο στις αρθρώσεις, διαταραχές στην όραση και επώδυνη ούρηση [6, 19-21]. [33]

36 Η απέκκριση των βακτηρίων με τα κόπρανα συνεχίζεται για κάποιους μήνες, συνήθως έως τρεις, μετά την κλινική ίαση. Ασθενείς μολυσμένοι από μη τυφοειδή σαλμονέλα μπορούν να παραμείνουν φορείς για χρόνια, σε ποσοστό περίπου 0,1%. Σε χρόνια ασθενείς, είναι δυνατή η πρόκληση επιπλοκών, όπως η περικαρδίτιδα, η οστεομυελίτιδα και η αρθρίτιδα, όπως ήδη αναφέρθηκε [15, 17, 18]. Σε διερεύνηση που έγινε στις Η.Π.Α., μετά από την εκδήλωση επιδημίας από Salmonella ser. Enteritidis σε 217 επιβεβαιωμένα κρούσματα, αποκαλύφθηκε πως το 29% των ασθενών παρουσίασε αρθρίτιδα, το 3% σύνδρομο Reiter και το 10% αρθρίτιδα και στοματικά έλκη [22]. Η διάγνωση γίνεται με την απομόνωση του μικροοργανισμού από κλινικά δείγματα. Η θεραπεία με αντιμικροβιακές ουσίες είναι προτιμότερη να γίνεται μόνο στις περιπτώσεις σοβαρής νόσου ή σε ύπαρξη σοβαρού κινδύνου μετατροπής της λοίμωξης σε συστηματική [14, 16]. Η σαλμονέλωση μπορεί να προκληθεί στον άνθρωπο μετά από την κατανάλωση οποιασδήποτε τροφής. Η μολυσματική δόση εκτιμάται στα c.f.u., αν και με βάση επιδημιολογικά δεδομένα έχουν αναφερθεί και δόσεις λίγων κυττάρων, ικανές να προκαλέσουν λοίμωξη. Το αν θα προκληθεί νόσος εξαρτάται τόσο από το ίδιο το βακτήριο, όσο και από τον ξενιστή αλλά και από το τρόφιμο μέσω του οποίου αυτό προσλαμβάνεται [6]. Για ευπαθείς ομάδες, η μολύνουσα δόση μπορεί να μειωθεί σε μικροβιακά κύτταρα, ενώ υπάρχουν αναφορές πως έστω και 15 κύτταρα μπορούν να προκαλέσουν λοίμωξη [21]. Ιδιαίτερα τα τρόφιμα υψηλής περιεκτικότητας σε λίπος και πρωτεΐνες όπως το τυρί, ακόμα κι αν περιέχουν μικρό αριθμό κυττάρων σαλμονέλας, είναι δυνατό να προκαλέσουν λοίμωξη, γιατί οι πρωτεΐνες και το λίπος δρουν [34]

37 προστατευτικά για τα βακτηριακά κύτταρα, από τα οξέα του στομάχου [11]. Τον σημαντικότερο κίνδυνο για τη Δημόσια Υγεία αποτελεί η κατανάλωση μολυσμένων αυγών, τόσο στις ΗΠΑ όσο και στην Ευρώπη [14]. H Salmonella ser. Enteritidis μπορεί να βρεθεί στο εσωτερικό άθικτων αυγών, τα οποία αν καταναλωθούν ωμά ή ατελώς ψημένα μπορούν να προκαλέσουν νόσο. Η μόλυνση μπορεί να οφείλεται στην προσβολή των ωοθηκών, των κατά τα άλλα κλινικώς υγιών ορνίθων, από το βακτήριο. Επίσης, τα αυγά μπορεί να επιμολυνθούν από το μολυσμένο εντερικό περιεχόμενο ορνίθων κατά τη δίοδο από την αμάρα, ενώ οι μικροοργανισμοί μπορούν να διεισδύσουν στη συνέχεια εντός του αυγού μέσω ρωγμών του κελύφους. Αρκεί ένα μόνο μολυσμένο αυγό σε μια παρτίδα μαγιονέζας για να προκληθεί σημαντική τροφιμογενής λοίμωξη [23]. Σοβαρό πρόβλημα επίσης, παρουσιάζεται από την κατανάλωση κρέατος και προϊόντων του, μολυσμένων με σαλμονέλα. Ειδικότερα στα κρεοπαραγωγά ορνίθια κατά τη φάση του εκσπλαχνισμού μολύνεται όλη η γραμμή σφαγής από τη συσκευή που διενεργεί τον εκσπλαχνισμό, με αποτέλεσμα τη διασπορά της μόλυνσης σε χιλιάδες σφάγια. Παρόμοια διασπορά μπορεί να συμβεί και σε γραμμές σφαγής μηρυκαστικών ή χοίρων. Όλα τα παραπάνω έχουν ως συνέπεια τη μεταφορά του μικροοργανισμού στην οικιακή κουζίνα και μέσω διασταυρούμενων επιμολύνσεων (μαγειρικά σκεύη, σπόγγοι κουζίνας, πετσέτες κουζίνας) την επιμόλυνση τροφίμων που θα καταναλωθούν ωμά ή άλλων που είναι ήδη μαγειρεμένα [24] [35]

38 Τα λαχανικά και τα φρούτα μπορούν επίσης να είναι επιμολυσμένα, όταν χρησιμοποιείται λίπασμα απο περιττώματα μολυσμένων ζώων. Σπανιότερα, είναι δυνατή η πρόκληση λοίμωξης και από άμεση επαφή των ανθρώπων με ζώα που πάσχουν από σαλμονέλωση, είτε αυτά παρουσιάζουν κλινικά συμπτώματα, είτε όχι [7]. Γενικά, η σαλμονέλωση δεν είναι τροφική δηλητηρίαση, όπως πιστεύεται, αλλά τροφιμογενής λοίμωξη. Ο λόγος είναι πως μία βακτηριακής μορφής τροφική δηλητηρίαση προκαλείται από την κατανάλωση βακτηριακής τοξίνης, η οποία σχηματίζεται μέσα στο τρόφιμο. Αντίθετα, η βακτηριακής μορφής τροφιμογενής λοίμωξη αναφέρεται σε ασθένειες τροφικής προέλευσης, οι οποίες προκαλούνται από την είσοδο στο σώμα μέσω του πεπτικού με μολυσμένες τροφές, βακτηρίων, και στην αντίδραση του σώματος στην παρουσία ή τα προϊόντα του μεταβολισμού τους. Η σαλμονέλα του τυφοειδούς πυρετού προκαλεί τροφιμογενή λοίμωξη κατά την οποία το τρόφιμο μεταφέρει απλώς τη σαλμονέλα, ενώ άλλες σαλμονέλες προκαλούν τροφιμογενείς λοιμώξεις κατά τις οποίες το τρόφιμο μπορεί να λειτουργήσει ως μέσο καλλιέργειας για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό τους σε αριθμούς που θα αυξήσουν τις πιθανότητες μόλυνσης του καταναλωτή από αυτές [4, 15, 17, 18]. [36]

39 1.2.2 Σαλμονέλωση στα ζώα-τρόποι μετάδοσης Η νόσος προσβάλλει όλα τα είδη των κατοικίδιων ζώων, όμως τα νεαρά και τα έγκυα ζώα είναι τα πιο ευαίσθητα [25]. Σε μερικά είδη ζώων, ορισμένοι ορότυποι σαλμονελών μεταδίδονται είτε ενδομητριαία είτε βλαστικώς (κάθετη μετάδοση) [26]. Το μολυσμένο φαγητό και νερό είναι συνήθως το όχημα μέσω του οποίου γίνεται η είσοδος του μικροοργανισμού στον ξενιστή. Τα παραγωγικά ζώα συνήθως μολύνονται με την κατανάλωση μολυσμένης ζωοτροφής ή νερού, τα οποία δεν έχουν υποστεί την κατάλληλη επεξεργασία (αποστείρωση ή χλωρίωση) ή όταν η ζωοτροφή, το νερό και το περιβάλλον διαβίωσής τους επιμολυνθούν από περιττώματα τρωκτικών, άγριων πτηνών ή αρθροπόδων, που μπορούν να εισέλθουν στις κτηνοτροφικές μονάδες. Το ρόλο του μηχανικού φορέα, εκτός από τα ζώα και τα έντομα, παίζει και ο άνθρωπος, που με τα υποδήματα και τα διάφορα σκεύη μπορεί να μεταφέρει τον μικροοργανισμό από θάλαμο σε θάλαμο, μέσα στην ίδια εκμετάλλευση [7]. Οι μολυσμένες ζωοτροφές αποτελούν την κύρια πηγή εισόδου των νέων οροτύπων του μικροοργανισμού στις εκτροφές των παραγωγικών ζώων, όπου στη συνέχεια διασπείρεται μέσω φορέων αλλά και με άλλες οδούς. Κατά τη διαδικασία παραγωγής ζωοτροφών, γίνεται χρήση συστατικών προερχόμενων από διάφορα μέρη του κόσμου με προφανή συνέπεια την παρουσία σε αυτά πολλών «εξωτικών» στελεχών. Τα στελέχη αυτά εγκαθίστανται στην εκτροφή, διασπείρονται στα ζώα και μολύνουν και το περιβάλλον [25]. Η κακή διαχείριση των αποβλήτων, που προέρχονται από σφαγεία, μονάδες παραγωγής ζωοτροφών ή εγκαταστάσεις επεξεργασίας [37]

40 τροφίμων μπορεί να συμβάλλει στη μόλυνση των άγριων πτηνών, των τρωκτικών και των σκύλων που διαβιούν στην περιοχή, τα οποία με τη σειρά τους μπορούν να επιμολύνουν τα επιφανειακά νερά, το έδαφος και τους αγρούς, με συνέπεια την επέκταση της μόλυνσης σε ακόμα περισσότερα ζώα. Ειδικότερα, τα ορνίθια κρεοπαραγωγής μπορούν να μολυνθούν κατά την πρώτη μέρα τοποθέτησης τους στο πτηνοτροφείο, εάν μεταξύ διαδοχικών εκτροφών των σμηνών δε γίνουν οι κατάλληλες απολυμάνσεις και δεν παραμείνουν οι θάλαμοι κενοί για το απαραίτητο χρονικό διάστημα (υγειονομικό κενό), με αποτέλεσμα το περιβάλλον να διατηρηθεί μολυσμένο. Τα μολυσμένα ορνίθια αποβάλλουν με τα κόπρανά τους σημαντικές ποσότητες μικροβιακών κυττάρων, που μολύνουν τη στρωμνή του πτηνοτροφείου. Από τη στρωμνή, τα υγιή ορνίθια προσλαμβάνουν μεγάλους αριθμούς σαλμονελών και με αυτόν τον τρόπο διασπείρεται η μόλυνση σε ολόκληρο το θάλαμο. Τα ορνίθια κρεοπαραγωγής και ωοπαραγωγής μπορεί να είναι ήδη μολυσμένα πριν φτάσουν στο πτηνοτροφείο, λόγω της κάθετης μετάδοσης της σαλμονέλας στις συστηματικές λοιμώξεις, όταν λόγω του αποικισμού της γεννητικής οδού των σμηνών αναπαραγωγής από το μικροοργανισμό μολύνονται τα αυγά και κατ επέκταση οι νεοσσοί. Αυτό όμως που κυρίως συμβαίνει είναι η μόλυνση της εξωτερικής επιφάνειας του κελύφους των αυγών, κατά τη δίοδό τους από την αμάρα ή μετά τη γέννησή τους όταν έρθουν σε επαφή με μολυσμένα κόπρανα ή με άλλα μολυσμένα αυγά. Στη συνέχεια, μέσα στις εκκολαπτικές μηχανές, είναι δυνατή η οριζόντια μόλυνση των νεοσσών από τα μολυσμένα κελύφη των αυγών, καθώς και αερογενώς μέσω της μολυσμένης σκόνης [27, 28]. [38]

41 Οι προσαρμοσμένοι στα πτηνά ορότυποι Salmonella ser. Gallinarum και Salmonella ser. Pullorum προκαλούν δύο σοβαρά λοιμώδη νοσήματα, τον τύφο των ορνίθων και τη λευκή διάρροια των νεοσσών, τα οποία προσβάλλουν κυρίως τις όρνιθες, τις ινδόρνιθες, τους φασιανούς, τις μελεαγρίδες, μπορούν όμως να προσβάλλουν και άλλα είδη κατοικίδιων και άγριων πτηνών. Οι μολυσμένες, από τον προσαρμοσμένο ορότυπο Salmonella ser. Dublin, αγελάδες μπορεί να εμφανίσουν πυρετό, βλενοαιμορραγική διάρροια, σηψαιμία, νεκρωτική εντερίτιδα, πνευμονία και τέλος υψηλά ποσοστά θνησιμότητας. Ο ορότυπος Salmonella ser. Choleraesuis στους χοίρους μπορεί να προκαλέσει σηψαιμία, πνευμονία και εντεροκολίτιδα. Στα ιπποειδή, η Salmonella ser. Abortusequi προκαλεί αποβολές. Στα πρόβατα και στις αίγες ο προσαρμοσμένος ορότυπος Salmonella ser. Abortusovis μπορεί να προκαλέσει επίσης αποβολή κατά τους δύο τελευταίους μήνες της κυοφορίας και τη γέννηση θνησιγενών αμνών και εριφίων, αντίστοιχα. Στους σκύλους οι λοιμώξεις από σαλμονέλα είναι συνήθως ασυμπτωματικές [26, 29]. Γενικά, ο χρόνος επώασης κυμαίνεται μεταξύ 6 και 48 ωρών, συνήθως όμως είναι στις ώρες και εξαρτάται κύρια από τη λοιμογόνο δόση, από τη λοιμογόνο δύναμη του στελέχους καθώς και από την ευαισθησία του ξενιστή [6]. Στα συχνότερα κλινικά συμπτώματα περιλαμβάνεται εντερική νόσος, που συνοδεύεται από αιματηρή ή υδαρή διάρροια και πυρετό, παρατηρούνται όμως και άλλες λιγότερο συχνές κλινικές εκδηλώσεις όπως οξεία σηψαιμία, αποβολές, αρθρίτιδες και αναπνευστική νόσος. Τα κλινικά συμπτώματα καθώς και οι αλλοιώσεις δεν είναι παθογνωμονικά. Πολλά ζώα, ειδικά τα πτηνά και οι χοίροι μπορεί παρά τη λοίμωξη να μην εκδηλώσουν κλινικά συμπτώματα [39]

42 φαίνεται όμως, ότι διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διασπορά της νόσου μεταξύ των σμηνών και των εκτροφών και έτσι αποτελούν και τις πηγές των τροφιμογενών λοιμώξεων [7, 25, 26]. Η σαλμονέλα δε φαίνεται να πολλαπλασιάζεται σημαντικά στο φυσικό περιβάλλον, δηλαδή εκτός του εντερικού σωλήνα των ανθρώπων και των ζώων. Μπορεί όμως, να επιβιώνει για αρκετές εβδομάδες στο νερό, και για αρκετά χρόνια στο έδαφος, εφόσον όμως υπάρχουν ευνοϊκές συνθήκες θερμοκρασίας, υγρασίας και τιμής ph [7]. [40]

43 1.2.3 Θεραπεία σαλμονελώσεων Οι κινολόνες (κυρίως η σιποφλοξασίνη) θεωρούνται συνήθως ως το φάρμακο πρώτης επιλογής για τη θεραπεία των σαλμονελώσεων στους ενήλικες [15, 17, 18, 30]. Είναι αρκετά αποτελεσματικά αντιμικροβιακά, μπορούν να χορηγούνται από το στόμα, απορροφούνται ικανοποιητικά χωρίς να είναι ιδιαίτερα ακριβά. Οι κεφαλοσπορίνες τρίτης γενεάς (κεφοταξίμη, κεφτριαξόνη) χρησιμοποιούνται στα παιδιά ως φάρμακο πρώτης επιλογής αλλά και στις περιπτώσεις πολύ σοβαρών λοιμώξεων στους ενηλίκους [14, 31]. Άλλες αντιμικροβιακές ουσίες όπως η χλωραμφαινικόλη, η αμπικιλίνη και ο συνδυασμός τριμεθοπρίμης με σουλφομεθοξαζόλη χρησιμοποιούνται εναλλακτικά, αλλά παρουσιάζουν αρκετά συχνά παρενέργειες. Τα πολυανθεκτικά στελέχη σαλμονελών, τα οποία παρουσιάζουν συνδυαστικά αντοχή στις κεφαλοσπορίνες τρίτης γενεάς και τις κινολόνες μπορούν μέχρι τώρα να αντιμετωπιστούν με άλλες ουσίες όπως η ιμιπενέμη οι οποίες κατά κανόνα είναι περισσότερο τοξικές και πιο ακριβές [14, 15, 17, 18]. Τα αντιβιοτικά είναι μία από τις πιο συχνά συνταγογραφούμενες κατηγορίες φαρμάκων στην ιατρική. Όμως το 50% των ουσιών αυτών είτε δεν χρειάζεται να χορηγηθούν στους ασθενείς, είτε δεν είναι αποτελεσματικές για τη λοίμωξη για την οποία συνταγογραφήθηκαν. Στην Ελλάδα, η κατανάλωση των αντιβιοτικών είναι πολύ υψηλή και ειδικά σε επίπεδο πρωτοβάθμιας φροντίδας η χώρα μας καταλαμβάνει την πρώτη θέση, με διαφορά, μεταξύ των χωρών μελών της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Ιδιαίτερα ανησυχητικό θεωρείται το γεγονός ότι η τάση αυτή δε φαίνεται να αλλάζει, παρά τις περικοπές στη συνταγογράφηση των τελευταίων ετών Στο χάρτη του σχήματος 2 με ερυθρό χρώμα [41]

44 παρουσιάζονται οι χώρες με την υψηλότερη κατανάλωση αντιβιοτικών. Τα νούμερα αντιπροσωπεύουν τις ημερήσιες δόσεις (Defined daily doses per inhabitants per day). (σχήμα 2 και εικόνα 2) [32]. Εικόνα 3: Χάρτης κατανάλωσης αντιβιοτικών στην πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια φροντίδα υγείας στην Ευρώπη για το πηγή [32] Σχήμα 2: Κατά κεφαλήν κατανάλωση αντιβιοτικών ανά ημέρα σε Ευρωπαϊκές χώρες το πηγή [32] [42]

45 1.2.4 Αντοχή σαλμονελών στα αντιμικροβιακά Η χρήση των αντιβιοτικών αποτελεί σε όλο τον κόσμο τον πιο σημαντικό παράγοντα που οδηγεί στην ανάπτυξη της αντιμικροβιακής αντοχής. Η αντοχή αυτή φαίνεται πως οφείλεται κυρίως στην υπερχρησία των αντιμικροβιακών ουσιών από γιατρούς, υγειονομικό προσωπικό και ασθενείς [33] και επισυμβαίνει μέσα στα νοσοκομεία, αλλά και στην κοινότητα μέσω της πρωτοβάθμιας φροντίδας υγείας. Τα αντιβιοτικά στα παραγωγικά ζώα χορηγήθηκαν στο παρελθόν στην Ευρώπη, αλλά εξακολουθούν να χορηγούνται σε άλλες χώρες, ως αυξητικοί παράγοντες. Αν και είναι δύσκολο να συγκριθεί η κατανάλωση των αντιμικροβιακών ουσιών ανάμεσα στους ανθρώπους και στα ζώα, φαίνεται πως μεγαλύτερες ποσότητες καταναλώνονται στην κτηνιατρική [34, 35]. Η ευρεία χρήση των αντιμικροβιακών παραγόντων, εκτός του τομέα της ιατρικής είναι πολύ ανησυχητική, δεδομένης της εμφάνισης στους ανθρώπους στελεχών βακτηρίων, τα οποία έχουν αποκτήσει, με τη συγκεκριμένη χρήση, αντοχή σε αντιμικροβιακές ουσίες [36]. Ο δεύτερος λοιπόν σημαντικότερος παράγοντας για την ανάπτυξη της αντιμικροβιακής αντοχής είναι η εξάπλωση των ανθεκτικών στελεχών στον άνθρωπο μέσω της αλυσίδας διατροφής [37]. Βακτήρια όπως η σαλμονέλα τα οποία ευθύνονται για την πρόκληση τροφιμογενών λοιμώξεων, αποκτούν ακόμα μεγαλύτερη σημασία για τη Δημόσια Υγεία όταν εμφανίζουν ανθεκτικότητα στα αντιμικροβιακά καθώς η χορηγούμενη αντιμικροβιακή αγωγή μπορεί να καταστεί αναποτελεσματική με σοβαρό κίνδυνο για την υγεία του [43]

46 ασθενούς [38]. Η ιδιαίτερη σημασία που αποδίδεται στη μελέτη της αντοχής των σαλμονελών στα αντιμικροβιακά αντικατοπτρίζεται στη δημοσίευση και ευρεία τήρηση και εφαρμογή πρωτοκόλλων για την παρακολούθησή της, τόσο στην Αμερική όσο και στην Ευρώπη, από ισχυρούς διεθνείς οργανισμούς όπως το Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), το European Committee on Antimicrobial Susceptibility (EUCAST), το Centers for Disease Control and Prevention (CDC) καθώς και το European Centers for Disease Control and Prevention (ECDC) [37, 39, 40]. Η σημασία της αντοχής στα αντιμικροβιακά ενισχύεται περαιτέρω από το γεγονός πως παρακολουθείται επίσημα η αντοχή στελεχών σαλμονελών που απομονώνονται τόσο από ανθρώπους, όσο από ζώα και τρόφιμα στην Ευρωπαϊκή Ένωση [38].(Εικόνα 3) [32] Στις αρχές του 1990 παρατηρήθηκε σε στελέχη απομονωμένα από κλινικά ασθενείς ανθρώπους η εμφάνιση ανθεκτικότητας ταυτόχρονα στην αμπικιλίνη, στη χλωραμφαινικόλη και στο συνδυασμό τριμεθοπρίμης+σουλφομεθοξαζόλης. Ειδικότερα, ο λυσίτυπος DT104 της Salmonella ser. με αντοχή στις παραπάνω ουσίες και επιπλέον στη στρεπτομυκίνη και στην τετρακυκλίνη (ACSSuT), άρχισε να αναφέρεται πολύ συχνά τόσο στην Ευρώπη [41] όσο και στην Αμερική [42, 43]. Παρατηρήθηκε κλωνική διασπορά του λυσίτυπου αυτού και αποκαλύφτηκε πως η ανθεκτικότητα στις παραπάνω αντιμικροβιακές ουσίες οφειλόταν σε γονίδια, τα οποία βρίσκονταν στο χρωμόσωμα και συνεπώς η εξάπλωσή τους δεν εξαρτώνταν από τους κοινούς μηχανισμούς μεταφοράς αντοχής [31]. Παράλληλα, από το 1988 και μετά, άρχισαν να αναφέρονται στελέχη που παρήγαγαν εκτεταμένου φάσματος β-λακταμάσες [44]

47 (Extended Spectrum Beta-Lactamases, ESBLs), με αποτέλεσμα την εμφάνιση αντοχής σε αντιβιοτικά με λακταμικό δακτύλιο, κυρίως δηλαδή σε πενικιλλίνες, κεφαλοσπορίνες και μονομπακτάμες. Τέτοια στελέχη απομονώθηκαν από χώρες της Βόρειας και Δυτικής Αφρικής, της Νότιας Αμερικής, της μέσης Ανατολής, της Ανατολικής Ευρώπης, τις ΗΠΑ, τη Ρωσία, την Ινδία, την Τουρκία και την Ελλάδα [31]. Η ανθεκτικότητα οφείλεται στην παραγωγή β-λακταμασών (ESBLs τάξεων κυρίως Α και C κατά Ambler) από τα βακτήρια, ουσιών οι οποίες υδρολύουν τον αμιδικό δεσμό του λακταμικού αντιβιοτικού και αναστέλλουν τη δράση του, ενώ τα γονίδια που κωδικοποιούν την παραγωγή αυτή βρίσκονται σε πλασμίδια [31]. Ταυτόχρονα άρχισαν να αναφέρονται στελέχη στο Ηνωμένο Βασίλειο με ανθεκτικότητα σε χαμηλές συγκεντρώσεις σιπροφλοξασίνης (MICs, >0.25 µg/ml), μιας ουσίας που ανήκει στις κινολόνες, γεγονός που συνδέθηκε με την εισαγωγή της ενροφλοξασίνης στην κτηνιατρική [44, 45]. Οι κινολόνες δρουν αναστέλλοντας τη δράση του ενζύμου DNA γυράση, με αποτέλεσμα τη διακοπή της διαδικασίας αντιγραφής του DNA που οδηγεί ουσιαστικά στο θάνατο του βακτηρίου [31]. Κλινικές παρατηρήσεις έδειξαν πως η ανθεκτικότητα στο ναλιδιξικό οξύ οδηγεί σε μειωμένη ανταπόκριση στη χορήγηση σιπροφλοξασίνης στους ασθενείς [46] με αποτέλεσμα να μειωθεί το όριο ευαισθησίας (clinical breakpoint) από 1-2 μg/ml σε 0,25 μg/ml ή και 0,064 μg/ml [46-48]. Η αντοχή στο ναλιδιξικό οξύ δηλαδή μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης πρόγνωσης για την αρχόμενη ανθεκτικότητα στη σιπροφλοξασίνη [14]. Η αντοχή πάντως στη σιπροφλοξασίνη κυμάνθηκε στην Ευρώπη σε ποσοστά μικρότερα του 6% το 2012 [38], στις ΗΠΑ στο 3% [37], ενώ υψηλά ποσοστά έχουν παρατηρηθεί σε στελέχη από την Ασία 22,7% και [45]

48 την Αφρική 20,5%. Ακόμα όμως και αυτά τα χαμηλά ποσοστά στην Ευρώπη είναι ιδιαίτερα σημαντικά, γιατί οι κινολόνες είναι τα φάρμακα πρώτης γραμμής για τη θεραπεία των σαλμονελώσεων [14, 15, 17, 18]. Τελευταία έχει παρατηρηθεί η εμφάνιση στελεχών σαλμονελών ανθεκτικών στις κεφαλοσπορίνες ευρέως φάσματος. Οι κεφαλοσπορίνες είναι αντιμικροβιακές ουσίες οι οποίες δρουν παρεμποδίζοντας το μηχανισμό σύνθεσης του κυτταρικού τοιχώματος του βακτηρίου. Τα ανθεκτικά στελέχη συνθέτουν τις λεγόμενες β-λακταμάσες, οι οποίες προκαλούν διάσπαση του β-λακταμικού δακτυλίου των κεφαλοσπορινών και άρα αδυναμία δράσης τους [31]. Η ανθεκτικότητα στις ουσίες αυτές είναι χαμηλή σε γενικές γραμμές στην Ευρώπη, το 2000 κυμάνθηκε στο 0,6% ενώ [49] μέχρι και το 2012 παρέμεινε σε χαμηλά επίπεδα μικρότερα δηλαδή του 2% [38], ενώ στις ΗΠΑ το αντίστοιχο ποσοστό για το έτος 2013 κυμάνθηκε στο 3% [37]. Σε άλλα μέρη του κόσμου η ανθεκτικότητα στις κεφαλοσπορίνες κυμάνθηκε στο 4,8% στη Νότια Αμερική, 2,1% στην Αφρική και 1,5% στην Ασία [38]. Φαίνεται πάντως πως η ανθεκτικότητα ειδικά στις κεφαλοσπορίνες τρίτης γενιάς θα αποτελέσει πολύ σοβαρό πρόβλημα τα επόμενα χρόνια καθώς οι ουσίες αυτές είναι τα φάρμακα εκλογής στη θεραπεία των σαλμονελώσεων στα παιδιά. Η πολυανθεκτικότητα αποτελεί στις μέρες μας ένα μεγάλο πρόβλημα που εμφανίζεται σε πολλούς μικροοργανισμούς γενικότερα και ειδικότερα στις σαλμονέλες. Για παράδειγμα στέλεχος Salmonella ser. με αντοχή σε αμπικιλίνη, χλωραμφαινικόλη, γενταμυκίνη, καναμυκίνη, στρεπτομυκίνη, σουλφοναμίδες, τετρακυκλίνη και χαμηλή δόση σιπροφλοξασίνης προκάλεσε το έτος 2000 μία επιδημία σε 5 χώρες στην Ευρώπη με περισσότερα από 350 [46]

49 κρούσματα [50]. Συνήθως, ως πολυανθεκτικά ορίζονται τα στελέχη τα οποία εμφανίζουν ανθεκτικότητα σε τρεις ή και περισσότερες αντιμικροβιακές ουσίες διαφορετικών τάξεων. Αν και έχει επιχειρηθεί τα τελευταία χρόνια, τουλάχιστον σε Ευρωπαϊκό επίπεδο, η ανεύρεση αντικειμενικών δείκτών που που θα ορίζουν την ανθεκτικότητα και την πολυανθεκτικότητα, αυτοί δεν έχουν γίνει αποδεκτοί από όλους [51]. Πολυανθεκτικά στελέχη στην Ευρώπη παρατηρούνται και μεταξύ άλλων οροτύπων όπως στη Salmonella ser. Hadar (36%) και στη Salmonella ser. Virchow (37%) [49]. Στην Ευρώπη τα ποσοστά πολυανθεκτικών στελεχών είναι χαμηλά (<2%) [48, 52], ενώ στις ΗΠΑ το ποσοστό αυτό για το 2013, κυμάνθηκε στο 5% [37]. [47]

50 [48]

51 1.3 Τυποποίηση σαλμονελών Γενικά για την τυποποίηση Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται για να διευκρινιστεί η κλωνικότητα των μικροβιακών στελεχών (isolates) και συνεπώς η πιθανή εμπλοκή τους στην επιδημία καλείται «μικροβιακή τυποποίηση». Ως υποτυποποίηση των βακτηρίων ορίζεται η διαδικασία με την οποία τα βακτήρια κατατάσσονται σε υπότυπους μετά το επίπεδο είδους ή υποείδους [53]. Είναι προφανές πως οι λοιμώξεις στον άνθρωπο θα οφείλονται σε παρόμοιους υπότυπους με αυτούς που απομονώνονται από την πηγή της μόλυνσης σε σχέση με άλλους μη συνδεόμενους επιδημιολογικά [54]. Η μικροβιακή τυποποίηση είναι η κύρια προσέγγιση βάσει της οποίας γίνεται η επιδημιολογική επιτήρηση των τροφιμογενών λοιμώξεων στην Ευρώπη [55]. Η βασική αρχή στηρίζεται στη σύγκριση των υπότυπων των στελεχών, τα οποία προκάλεσαν μία λοίμωξη και υπότυπων των στελεχών απομονωμένων για παράδειγμα από ζώα, τρόφιμα ή περιβάλλον που δυνητικά θα μπορούσαν να προκαλέσουν τη νόσο [56]. Με αυτόν τον τρόπο λοιμώξεις στον άνθρωπο που προκλήθηκαν από υπότυπους οι οποίοι απομονώθηκαν αποκλειστικά από μια πηγή μόλυνσης μπορούν να συνδεθούν επιδημιολογικά, ενώ στην περίπτωση που οι υπότυποι αυτοί ήταν παρόντες σε περισσότερες από μια πηγές, η διερεύνηση είναι πιο σύνθετη [57]. Η εφαρμογή της υποτυποποίησης στη Salmonella προϋποθέτει: έναν αριθμό στελεχών ανθρώπινης προέλευσης αλλά και μη ανθρώπινης όσο το δυνατόν πιο αντιπροσωπευτικής σε [49]

52 σχέση με τον κίνδυνο έκθεσης των ανθρώπων στο συγκεκριμένο βακτήριο με βάση τις οδούς μετάδοσης, επιλογή κατάλληλων μεθόδων υποτυποποίησης για τον κάθε ορότυπο ξεχωριστά με βάση τα επιδημιολογικά δεδομένα της κάθε περίπτωσης έναν σταθερό τρόπο επεξεργασίας των πληροφοριών αυτών έτσι ώστε να γίνεται σύνδεση των υπότυπων που βρίσκονται στους ανθρώπους με αυτούς από τις δυνητικές πηγές μόλυνσης. Ο κύριος στόχος όμως, τη τυποποίησης είναι ένας: η έγκαιρη και σωστή ανίχνευση των πηγών των λοιμώξεων με βασικό σκοπό την προστασία της Δημόσιας Υγείας Φαινοτυπικές μέθοδοι τυποποίησης σαλμονελών Οροτυποποίηση (Serotyping) Η οροτυποποίηση είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος για την τυποποίηση των σαλμονελών. Η οροτυποποίηση βασίζεται στην αντιγονική ποικιλομορφία της εξωτερικής λιποπρωτεϊνικής μεβράνης (O antigens), του μαστιγίου (H1 & H2 antigens), των αντιγόνων Vi (Vi antigens) και στο γεγονός πως ο ορός αντιδρά με αντιγόνα επιφάνειας. Το σχήμα που έχει επικρατήσει και καθιερωθεί διεθνώς για την ταξινόμηση των σαλμονελών είναι αυτό που προτάθηκε από τους White- Kauffman-Le Minor [8]. Μολονότι έχουν περιγραφεί περισσότεροι από ορότυποι στις σαλμονέλες, οι σημαντικοί για τη Δημόσια Υγεία ορότυποι είναι [50]

53 σχετικά λίγοι. Συνεπώς, η οροτυποποίηση για τους πιο συχνά απομονούμενους ορότυπους (πχ. Salmonella ser. ή Salmonella ser. Enteritidis) έχει σημασία μόνο για τη βασική επιδημιολογική διερεύνηση, αν στη συνέχεια δεν ακολουθήσουν και άλλες μέθοδοι, ενώ αντίθετα στην περίπτωση απομόνωσης λιγότερο συχνών οροτύπων η εφαρμογή της είναι πολύτιμη [58]. Παρά την ευρεία χρησιμοποίησή της η παραδοσιακή οροτυποποίηση παρουσιάζει αρκετά μειονεκτήματα. Συγκεκριμένα βασίζεται στην χρήση ιδιαίτερα ακριβών ορών, είναι μέθοδος που απαιτεί πολύ χρόνο και ειδικά εκπαιδευμένο προσωπικό, είναι καθαρά φαινοτυπική μέθοδος και τέλος αναφέρονται, πολλές φορές, στελέχη τα οποία αδυνατεί να τυποποιήσει [59]. Όλα τα παραπάνω έχουν ως αποτέλεσμα η χρήση της να εμφανίζει περιορισμένο εύρος και αξιοπιστία. Παρόλα τα μειονεκτήματα που αναφέρθηκαν, η οροτυποποίηση μπορεί να χρησιμοποιείται ως πρώτο βήμα στις επιδημιολογικές μελέτες και στη διερεύνηση επιδημιών, ακριβώς όμως επειδή παρέχει περιορισμένες πληροφορίες, πρέπει να χρησιμοποιείται πάντα σε συνδυασμό με άλλες μεθόδους [58]. Οι προαναφερόμενοι περιορισμοί οδήγησαν τους ερευνητές στην αναζήτηση εναλλακτικών μεθόδων για τη διερεύνηση των επιδημιών με βάση κυρίως την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR), αν και συνήθως αυτές περιορίζονταν σε έναν και μόνο ορότυπο [60-62]. Διάφοροι ερευνητές έχουν προτείνει διαφορετικές προσεγγίσεις διερεύνησης με τη χρήση μοριακών μεθόδων, όπως με χρήση της Ηλεκτροφόρησης Εναλλασσόμενου Ηλεκτρικού Πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis) [63], της ριβοτυπίας (Ribotyping) [64] και της Πολυτοπικής Αλληλούχισης Μεταβλητών Περιοχών Γονιδιώματος [51]

54 (Multilocus Sequence Typing - MLST), με την τελευταία να προσφέρει ιδιαίτερα σημαντική βοήθεια και να προτείνεται ως εναλλακτική ακόμα για τον καθορισμό των οροτύπων [12] Λυσιτυπία- (Phagetyping) Η λυσιτυπία (Phagetyping) είναι η πιο παραδοσιακή μέθοδος υποτυποίησης των σαλμονελών και στηρίζεται σε φαινοτυπικά χαρακτηριστικά [65]. Με τη συγκεκριμένη μέθοδο τα στελέχη ενός συγκεκριμένου ορότυπου διαχωρίζονται σε λυσίτυπους (phagetypes) με βάση την ποιοτική αντίδρασή τους σε ένα σύνολο ειδικών για τον συγκεκριμένο ορότυπο φάγων. Τα σχήματα που χρησιμοποιούνται έχουν σχεδιαστεί για διάφορους ορότυπους [66-69]. Η μέθοδος αυτή είναι οικονομική και δεν απαιτεί τη χρήση ακριβού εξοπλισμού. Δυστυχώς όμως, μόνο ένας μικρός σχετικά αριθμός εργαστηρίων αναφοράς, τα οποία διαθέτουν τους φάγους αυτούς, μπορούν να εφαρμόσουν τη μέθοδο αυτή [70]. Η λυσιτυπία απαιτεί μεγάλη εμπειρία στην μετάφραση των αποτελεσμάτων καθόσον, η αντίδραση με τους φάγους είναι ποιοτική και δεν τη διακρίνει η επαναληψιμότητα [71]. Αν και η λυσιτυπία είναι ένα πολύτιμο εργαλείο στη διάκριση των στελεχών που παρουσιάζουν λιγότερο κοινά προφίλ η μέθοδος αυτή δεν είναι χρήσιμη στις περιπτώσεις κοινών λυσίτυπων [72]. Παρόλα αυτά η λυσιτυπία αποτελεί ακόμα ένα πολύτιμο εργαλείο για την αρχική εκτίμηση των δυνητικών διαδρομών μεταξύ των στελεχών που απομονώνονται, ιδιαίτερα στις περιπτώσεις των Salmonella ser. Enteritidis και Salmonella ser.. Επιπλέον, όταν η λυσιτυπία συνδυάζεται και με τη μελέτη [52]

55 των φαινοτύπων αντοχής ή άλλες μεθόδους υποτυποποίησης, είναι πολύτιμη για τη διερεύνηση επιδημιών [73-75] Φαινότυπος αντοχής - (Resistant type) Η μέθοδος αυτή ορίζει το αντιμικροβιακό προφίλ του στελέχους σε σχέση με ένα σύνολο αντιμικροβιακών ουσιών. Ο φαινότυπος αντοχής που προκύπτει δεν χρησιμοποιείται μόνο για την επιλογή της κατάλληλης αντιμικροβιακής θεραπείας, αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί και σαν επιδημιολογικός δείκτης. Αν και για πολλά χρόνια η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε ως μέθοδος υποτυποποίησης με σκοπό την επιδημιολογική συσχέτιση μεταξύ των στελεχών, τα τελευταία χρόνια η χρήση της για το σκοπό αυτό περιορίζεται όλο και περισσότερο [76]. Μεγάλο της πλεονέκτημα είναι ότι, όπως και η λυσιτυπία, είναι χαμηλού κόστους και δεν απαιτεί ειδικό εξοπλισμό για την εφαρμογή της. Πολλά πρωτόκολλα χρήσης της έχουν αναπτυχθεί τόσο για την εφαρμογή της όσο και για τον χαρακτηρισμό με κοινό τρόπο των στελεχών με βάση τα αποτελέσματα που προκύπτουν [39, 51]. Η ανθεκτικότητα στις αντιμικροβιακές ουσίες, κάποιες φορές, καθορίζεται από μεταλλάξεις σε γονίδια που εντοπίζονται στα χρωμοσώματα [77] και άρα είναι σχετικά σταθερές. Συνήθως όμως, οι παράγοντες αντοχής είναι συστατικά πλασμιδίων, μεταθετόνιων και νησιδίων γονιδιώματος και μπορούν εύκολα να μεταφερθούν από στέλεχος σε στέλεχος ίδιου ή διαφορετικού είδους [78]. Συνεπώς η αστάθεια των παραγόντων αυτών μειώνει τη χρήση της και άρα την εφαρμογή της μεθόδου για επιδημιολογικούς σκοπούς. Επιπρόσθετα μεγάλα μειονεκτήματα αποτελούν οι διαφορετικές εκτιμήσεις για το [53]

56 σύνολο των αντιβιοτικών που χρησιμοποιούνται, οι διαφορετικές μέθοδοι μέτρησης που χρησιμοποιεί το κάθε εργαστήριο, κυρίως όμως οι διαφορές στα κριτήρια που χρησιμοποιεί το κάθε εργαστήριο για το χαρακτηρισμό των στελεχών ως ευαίσθητα ή ανθεκτικά [79], ειδικά αν λάβουμε υπ όψιν πως αυτά αναθεωρούνται από καιρό σε καιρό [80]. Οι διαφορές αυτές παρατηρούνται κυρίως μεταξύ των εργαστηρίων που χειρίζονται στελέχη ανθρώπινης προέλευσης και αυτών που εξετάζουν στελέχη από ζώα και τρόφιμα [48, 81]. Συνεπώς, αν και η χρήση των φαινοτύπων αντοχής χρησιμοποιήθηκε στο παρελθόν μεταξύ άλλων και ως μέθοδος τυποποίησης για τη διερεύνηση επιδημιών, η χρήση της πρέπει να γίνεται με προσοχή, κυρίως λόγω της αστάθειας των γενετικών στοιχείων που καθορίζουν το φαινότυπο αντοχής, τα οποία κατά τη μεταφορά τους από τα ζώα και τα τρόφιμα στον άνθρωπο μπορεί να οδηγήσουν σε λανθασμένα συμπεράσματα Βιοτυπία- (Biotyping) Η βιοτυπία είναι μια φαινοτυπική μέθοδος που βασίζεται στη διαφοροποίηση των μικροβιακών ειδών ανάλογα με τα υποστρώματα που χρησιμοποιούν για το μεταβολισμό και την ανάπτυξή τους. Χρησιμοποιείται κυρίως για τον προσδιορισμό του είδους των μικροοργανισμών (ταυτοποίηση) και λιγότερο για τον χαρακτηρισμό κάτω από το επίπεδο του είδους. Εκμεταλλευόμενοι τις μικρές διαφοροποιήσεις που παρατηρούνται στις βιοχημικές αντιδράσεις μεταξύ στελεχών του ίδιου είδους, κάποιες φορές μπορούμε να [54]

57 χρησιμοποιήσουμε τη βιοτυπία και σαν τυποποιητική μέθοδο, με μικρή βέβαια διακριτική ικανότητα [53] Μοριακές μέθοδοι - (Molecular typing methods) Γενικά για τις μοριακές μεθόδους Οι μοριακές μέθοδοι τυποποίησης έχουν σαν στόχο τη σύγκριση του γενετικού υλικού των μικροβιακών στελεχών που εμπλέκονται σε μια επιδημία, και ιδιαίτερα του χρωμοσώματός τους, και την ανάδειξη των μεταξύ τους γενετικών σχέσεων. Επειδή στο μικροβιακό χρωμόσωμα υπάρχουν αλληλουχίες αρκετά συντηρημένες ώστε να χαρακτηρίζουν ένα μικροβιακό είδος ή και γένος, αλλά και αλληλουχίες που παρουσιάζουν αρκετά μεγάλη ποικιλομορφία, οι μέθοδοι που αναλύουν το χρωμόσωμα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων, αλλά και για το διαχωρισμό του είδους σε κλώνους με επιδημιολογική σημασία [53]. Με δεδομένη την οικουμενικότητα των προβλημάτων Δημόσιας Υγείας, που προκαλούν οι μεγάλες μετακινήσεις ατόμων, ζώων και αγαθών, οι επιδημίες αποκτούν συχνά διεθνή ή και παγκόσμια συνιστώσα και συνεπώς υπάρχει μια ολοένα αυξανόμενη ανάγκη για ανταλλαγή δεδομένων σε διεθνές επίπεδο. Ένα σημαντικά χρήσιμο κριτήριο λοιπόν στην αξιολόγηση μίας μοριακής μεθόδου τυποποίησης είναι και η ικανότητά της να δημιουργεί δεδομένα ικανά να αποθηκευτούν, δημιουργώντας έτσι ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων. Οι βάσεις αυτές είναι προσβάσιμες στην διεθνή επιστημονική κοινότητα [55]

58 αλλά και επιτρέπουν την εύκολη και ακριβή ανταλλαγή δεδομένων μεταξύ των αρμόδιων Υπηρεσιών Δημόσιας Υγείας [53]. Οι μοριακές τεχνικές μπορούν να καταταγούν σε τρεις βασικές κατηγορίες: 1. Σε αυτές με βάση τη μελέτη τμημάτων DNA των βακτηρίων, 2. Σε αυτές που βασίζονται στην αλληλούχιση του DNA των βακτηρίων, 3. Σε αυτές που χρησιμοποιούν τον υβριδισμό του DNA των βακτηρίων. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι μέθοδοι που χρησιμοποιούν την ανίχνευση διαφορών στα τμήματα του DNA, οι οποίες προκύπτουν είτε μετά από τη δράση περιοριστικών ενζύμων, είτε μετά από την ενίσχυση τμημάτων DNA. Στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν μέθοδοι που αναλύουν τις νουκλεοτιδικές ακολουθίες των περιοχών στόχων, ενώ στην τελευταία κατηγορία ανήκουν αυτές που χρησιμοποιούν το μικροδορυφoρικό DNA [82]. Η πλειοψηφία των μεθόδων που χρησιμοποιούνται για τις σαλμονέλες έχουν βάση την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR), κατά την οποία ενισχύονται εκατομμύρια φορές οι περιοχές στόχοι. Οι κυριότερες από αυτές είναι η Random PCR amplification of polymorphic DNA (RAPD), η Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC) fingerprinting (IS200-PCR), η Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) και η Fluorescent AFLP [83]. Οι περισσότερο χρησιμοποιούμενες μέθοδοι όμως από τα Εργαστήρια Αναφοράς της Ευρωπαϊκής Ένωσης για την υποτυποποίηση των στελεχών σαλμονελών προερχόμενων από ανθρώπους, ζώα και τρόφιμα είναι οι εξής: [56]

59 η Ηλεκτροφόρηση Εναλλασσόμενου Ηλεκτρικού Πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE), η Πολυτοπική Ανάλυση Επαναλήψεων Μεταβλητών Περιοχών Γονιδιώματος (Multiple Locus Variable-number tandem repeat Analysis - MLVA), η Ριβοτυπία (Ρibotyping), η Ανάλυση Πλασμιδιακού γενώματος (Plasmid Profile Analysis) η Πολυτοπική Αλληλούχιση Μεταβλητών Περιοχών Γονιδιώματος (Multi Locus Sequence Typing - MLST) και η Αλληλούχιση Ολόκληρου του Γενώματος (Whole Genome Sequencing -WGS) [58] Ανάλυση Πλασμιδιακού γενώματος - (Plasmid profile analysis) Η μελέτη του πλασμιδιακού περιεχομένου ήταν η πρώτη μοριακή μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για την τυποποίηση βακτηριακών στελεχών. Η μέθοδος συνίσταται στην απομόνωση του πλασμιδιακού DNA των υπό μελέτη στελεχών και στη σύγκριση του αριθμού και των μεγεθών τους, μετά από ηλεκτροφόρησή τους σε πήκτωμα αγαρόζης. Όταν τα πλασμίδια έχουν πολύ μεγάλο μέγεθος ( kb), ο διαχωρισμός τους με ηλεκτροφόρηση είναι δύσκολος, οπότε η πέψη τους με κάποια περιοριστική ενδονουκλεάση πριν την ηλεκτροφόρηση διευκολύνει τη σύγκριση [53]. Όμως, επειδή ανταλλαγές πλασμιδίων μπορούν να γίνουν τόσο μεταξύ βακτηρίων ίδιου ή διαφορετικού είδους [84] αλλά και επειδή όμοια ηλεκτροφορητικά πρότυπα (παλσότυποι) πλασμιδίων μπορεί να παρατηρηθούν μεταξύ διαφορετικών βακτηρίων [66], η μέθοδος δείχνει [57]

60 να έχει περιορισμένη αξιοπιστία. Πολύ δε περισσότερο όταν διαφορετικά πλασμίδια μπορούν να εμφανίσουν παρόμοια ηλεκροφορητικά πρότυπα [85], ενώ στις περπτώσεις που απουσιάζουν τα πλασμίδια τα βακτήρια δεν μπορούν να τυποποιηθούν [86] Ριβοτυπία- (Ribotyping) Το ριβοσωματικό RNA έχει ήδη αναφερθεί ως ένα πολύ χρήσιμο «βιολογικό» ρολόι για την φυλογενετική ταξινόμηση των μικροοργανισμών, φέρει όμως και αλληλουχίες χρήσιμες στην τυποποίηση (ριβοτυπία). Η μέθοδος βασίζεται στην πέψη του γενετικού υλικού με κάποιο συνηθισμένο περιοριστικό ένζυμο, οπότε προκύπτει μεγάλος αριθμός θραυσμάτων. Τα θραύσματα ηλεκτροφορούνται σε πηκτή αγαρόζης και μεταφέρονται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Southern blot). Στη συνέχεια, πραγματοποιείται υβριδισμός με σημασμένο ανιχνευτή, ειδικό για τα γονίδια του ριβοσωματικού RNA. Με τον τρόπο αυτό αναδεικνύεται ο αριθμός των αντιγράφων των γονιδίων του ριβοσωμικού RNA, ο οποίος διαφέρει μεταξύ διαφορετικών στελεχών με αποτέλεσμα να αποτελεί ένα χρήσιμο εργαλείο υποτυποποίησης [53]. Η εφαρμογή της μεθόδου στο εργαστήριο είναι αρκετά περίπλοκη και απαιτεί εξειδικευμένο προσωπικό. Η συγκρισιμότητα των αποτελεσμάτων μεταξύ των εργαστηρίων είναι περιορισμένη και οποιαδήποτε έστω μικρή αλλαγή στο πρωτόκολλο μπορεί να επηρεάσει τα αποτελέσματα [87]. Για να ξεπεραστεί αυτό έχουν αναπτυχθεί από τη βιομηχανία αυτόματα συστήματα εφαρμογής της μεθόδου (RiboPrinter), [58]

61 τα οποία μπορούν να εξετάσουν ταυτόχρονα μεγάλο αριθμό στελεχών, με υψηλό όμως κόστος [87, 88]. Η ριβοτυπία έχει δώσει εξαιρετικά καλά αποτελέσματα σε κάποιους ορότυπους σαλμονελών [88-93], όμως κάποιοι ερευνητές διαπίστωσαν μικρή διακριτική ικανότητα για άλλους [86, 93] Ηλεκτροφόρηση εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου - (Pulsed Field Gel Electrophoresis PFGE) Την τελευταία δεκαετία η Ηλεκτροφόρηση Εναλλασσόμενου Ηλεκτρικού Πεδίου (PFGE) αποτέλεσε το πιο χρήσιμο εργαλείο για την υποτυποποίηση των σαλμονελών και ταυτόχρονα είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για το σκοπό αυτό [94]. Αναφέρεται από πολλούς ως gold standard [95] για την υποτυποποίηση των σαλμονελών, ενώ η διακριτική ικανότητα των άλλων μεθόδων συγκρίνεται συνήθως σε μελέτες με αυτήν της PFGE. H PFGE χρησιμοποιεί ενδονουκλεάσες περιορισμού (restriction enzymes), οι οποίες αναγνωρίζουν σπάνιες θέσεις και τέμνουν το DNA του βακτηριακού κυττάρου στις θέσεις αυτές, έτσι ώστε να δημιουργηθούν θραύσματα DNA, συνήθως μεγέθους από kb, τα οποία μπορούν να διαχωριστούν σε πηκτή αγαρόζης εφαρμόζοντας μεταβλητά ηλεκτρικά πεδία σε φορά και διεύθυνση [76]. Η ανταλλαγή και η σύγκριση αυτών των ηλεκτροφορητικών προτύπων (παλσοτύπων), όταν προκύπτουν με βάση καθορισμένα πρωτόκολλα, μπορεί να οδηγήσει σε ανταλλαγή δεδομένων μεταξύ εργαστηρίων σε πραγματικό χρόνο, με αποτέλεσμα την έγκαιρη ανίχνευση των επιδημιών από τις Υπηρεσίες προστασίας της Δημόσιας Υγείας [82, 96-98]. Με τον τρόπο [59]

62 αυτό η PFGE καθίσταται ένα χρήσιμο εργαλείο για την επιδημιολογική επιτήρηση. (Εικόνα 4) Εικόνα 4: Βήματα εφαρμογής ηλεκτροφόρησης εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου (PFGE) - πηγή [82] Παρόλα τα πλεονεκτήματά της, η μέθοδος έχει και αρκετά μειονεκτήματα. Είναι αρκετά περίπλοκη και χρονοβόρα, απαιτεί εξειδικευμένο προσωπικό και εξοπλισμό και δεν είναι αυτοματοποιημένη [83]. Η Ηλεκτροφόρηση Εναλλασσόμενου Ηλεκτρικού Πεδίου (PFGE) φαίνεται πως είναι η μέθοδος με την μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα στην υποτυποποίηση των σαλμονελών. Πολλές μελέτες έχουν επιβεβαιώσει την χρησιμότητά της στην επιδημιολογική διερεύνηση και την ταυτοποίηση του υπευθύνου στελέχους σαλμονέλας σε μια επιδημία [99-102]. Σε κάποιες περιπτώσεις πάντως η μέθοδος δεν είναι αρκετά διακριτική και έτσι μπορεί να ομαδοποιήσει στελέχη μη σχετιζόμενα επιδημιολογικά ειδικότερα αν χρησιμοποιείται σε ορότυπους με υψηλή γενετική ομοιογένεια, όπως η Salmonella ser. Enteritidis [70, ], ή [60]

63 λυσίτυπους όπως ο DT104 της Salmonella ser. [65, 109]. Στις περιπτώσεις αυτές η χρήση ενός και μόνον ενζύμου (πχ. XbaI) στην PFGE μειώνει αισθητά τη διακριτική ικανότητα της μεθόδου, όμως ο συνδυασμός ηλεκτροφορητικών προτύπτων που προκύπτουν μετά από πέψη από άλλα ένζυμα (πχ. BlnI, SpeI) μπορεί να αυξήσει την αξία της μεθόδου για τη διαφοροποίηση ιδιαίτερα ομοιογενών πληθυσμών σαλμονελών [110]. Πολλές προσπάθειες έχουν γίνει για να καθοριστούν κριτήρια, τα οποία θα είναι ευρέως αποδεκτά για τον ορισμό των επιδημιολογικά σχετιζόμενων στελεχών. Σύμφωνα με τον πιο δημοφιλή ορισμό [111] τα ηλεκτροφορητικά πρότυπα τα οποία διαφέρουν σε έως και τρεις ζώνες θα πρέπει να θεωρούνται ως επιδημιολογικά στενά σχετιζόμενα, ενώ αυτά τα που διαφέρουν έως και 6 ζώνες, ως πιθανόν επιδημιολογικά σχετιζόμενα, τουλάχιστον σε επιδημίες που επισυμβαίνουν μέσα στους χώρους νοσοκομείων. Διαφορετικές προσεγγίσεις έχουν προταθεί από άλλους ερευνητές [94] σε σχέση με σημειακές επιδημίες, όμως γενικά δεν υπάρχουν αντικειμενικά κριτήρια για την ερμηνεία των ηλεκτροφορητικών προτύπων (παλσότυπων). Φαίνεται πως τα κριτήρια δεν μπορούν να ισχύουν καθολικά και, κάθε περίπτωση είναι διαφορετική, καθώς εξαρτάται από την ενδογενή κλωνικότητα του κάθε ορότυπου σαλμονέλας, αλλά και από το εύρος της γεωγραφικής και χρονικής κατανομής των στελεχών που μελετώνται. [61]

64 Πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος- (Multilocus Sequence Typing MLST) Η Πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος (MLST) εξετάζει την αλληλουχία πολλαπλών γονιδίων του λεγόμενου βασικού μεταβολισμού (house keeping genes). Τα γονίδια αυτά κωδικοποιούν πρωτεΐνες οι οποίες είναι θεμελιώδεις για την επιβίωση του βακτηριακού κυττάρου, οπότε η δομή τους είναι πολύ σταθερή, γιατί οι οποιεσδήποτε μεταλλάξεις συνήθως θα σήμαιναν απώλεια της σύνθεσης των πρωτεϊνών αυτών και άρα θάνατο του βακτηριακού κυττάρου [82]. Τα γονίδια που παρουσιάζουν έστω και μία διαφορά στην αλληλουχία τους θεωρούνται διαφορετικά αλλήλια. Ο συνδυασμός των αλληλίων που διαθέτει κάθε στέλεχος που απομονώνεται συνιστά το προφίλ αλληλίων του και το κατατάσσει σε έναν τύπο (sequence type). Επειδή υπάρχουν πολλά πιθανά αλλήλια για κάθε γενετικό τόπο, είναι απίθανο πανομοιότυπα προφίλ αλληλίων να έχουν προκύψει τυχαία. Έτσι, στελέχη με τα ίδια αλλήλια θεωρούνται μέλη του ίδιου κλώνου [53]. Η μέθοδος είναι αντικειμενική και την χαρακτηρίζουν υψηλά ποσοστά επαναληψιμότητας και ικανότητας τυποποίησης. Κύριο επίσης πλεονέκτημα είναι πως η ανταλλαγή δεδομένων μεταξύ των εργαστηρίων γίνεται με βάση μια ακολουθία αριθμών. Επειδή όμως τα γονίδια του βασικού μεταβολισμού υπόκεινται σε μικρή εξελικτική πίεση, η δημιουργία και επικράτηση μικρομεταλλάξεων στο γένωμά τους είναι αργή, καθιστώντας τη μέθοδο εξαιρετική για τη μελέτη της φυλογενετικής εξέλιξης των οργανισμών, καθώς και στις μακροεπιδημιολογικές μελέτες που παρακολουθούν τη μακροχρόνια [62]

65 εξελικτική πορεία των διαφόρων κλώνων του μικροοργανισμού, ενώ αντίθετα η χρήση της για τη διερεύνηση επιδημιών είναι περιορισμένη [53, 76]. Επιπρόσθετα, επειδή η βασική αρχή της στηρίζεται στις διαφορές έστω μιας βάσης στο γένωμα απαραίτητη προϋπόθεση για την εφαρμογή και την αυξημένη αξιοπιστία της είναι η λήψη δεδομένων αλληλούχισης υψηλής ποιότητας [85]. Ήδη υπάρχουν εκτεταμένες διεθνείς βάσεις δεδομένων, προσβάσιμες από το διαδίκτυο για πολλούς μικροοργανισμούς και ειδικότερα για τη σαλμονέλα. ( Senterica). Η αξιοποίηση τέτοιων βάσεων είναι μεγάλο πλεονέκτημα της μεθόδου, διότι με τον τρόπο αυτό η επικοινωνία και η ανταλλαγή δεδομένων μεταξύ των εργαστηρίων περιορίζεται στην απλή ανταλλαγή κάποιων αριθμών, οι οποίοι μπορούν να ερμηνευθούν με τον ίδιο τρόπο από όλους. Η μικρή διακριτική ικανότητα της μεθόδου για ορισμένους ορότυπους έχει αναφερθεί από πολλούς ερευνητές όταν μελετώνται γονίδια του βασικού μεταβολισμού [76, 99, ]. Για την αύξηση της διακριτικής ικανότητας της μεθόδου, πολλοί ερευνητές πρότειναν την αλληλούχιση άλλων γονιδίων τα οποία υπόκεινται σε μεταλλαγές πιο γρήγορα, σε συνδυασμό πάντα με τα γονίδια του βασικού μεταβολισμού [71, 76, 115, 116]. Φαίνεται όμως πως σε πολύ λίγες περιπτώσεις η μέθοδος αύξησε σε αποδεκτό βαθμό τη διακριτική της ικανότητα [76, 117, 118]. Επειδή οι μεταλλαγές στα ένζυμα του βασικού μεταβολισμού εμφανίζονται σε σχετικά μεγάλα χρονικά διαστήματα και δεν υφίστανται εξωτερικές πιέσεις επιλογής, η MLST παρακολουθεί την μακρόχρονη [63]

66 πορεία του μικροβιακού κλώνου. Συνεπώς είναι κατάλληλη για μακροχρόνιες παρατηρήσεις, ενώ γενικά δεν είναι κατάλληλη για την παρακολούθηση βραχύχρονων επιδημικών επεισοδίων [53] Πολυτοπική ανάλυση μεταβλητών επαναλήψεων νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis - MLVA) Η Πολυτοπική ανάλυση μεταβλητών επαναλήψεων νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (MLVA) εκμεταλλεύεται τις δυνατότητες του πολυμορφισμού των παράλληλα επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών DNA των βακτηρίων. Μια σειρά από καλά επιλεγμένους και χαρακτηριζόμενους (από άποψη μεταλλάξεων και πολυμορφίας) τόπους, ενισχύεται με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), έτσι ώστε το μέγεθος του κάθε τόπου να μπορεί να μετρηθεί [82]. Από αυτό το μέγεθος, ο αριθμός των επαναλαμβανόμενων μονάδων σε κάθε τόπο μπορεί να συγκριθεί με άλλους πρότυπους, η σύγκριση αυτή μπορεί να εξαχθεί ως συμπέρασμα με τη μορφή ενός αριθμητικού κωδικού (Εικόνα 5). [64]

67 Εικόνα 5: Σχηματική απεικόνιση στελεχών με διαφορετικό προφίλ κατά MLVA- πηγή [82] Ως μέθοδος η MLVA έχει σημαντικά πλεονεκτήματα μιας και είναι σχετικά φθηνή, απλή, ταχεία, δεν απαιτεί εξειδικευμένο εξοπλισμό και επιτρέπει την ανταλλαγή δεδομένων μεταξύ των εργαστηρίων με εξαιρετική ακρίβεια [72, 119], ενώ ειδικά για τις σαλμονέλες προσφέρει μεγάλη διακριτική ικανότητα [65, 119]. Φαίνεται όμως πως για τον κάθε ορότυπο απαιτείται ξεχωριστό πρωτόκολλο αφού δεν έχει περιγραφεί ως τώρα κάποιο κατάλληλο για όλους [120], ενώ διεθνώς δύο πρωτόκολλα έχουν υιοθετηθεί κυρίως, ένα για τη Salmonella ser. [121] και ένα για τη Salmonella ser. Enteritidis [72]. Πολλοί ερευνητές αναφέρουν πως οι επαναλαμβανόμενες αυτές μονάδες αλλάζουν σχετικά γρήγορα ακόμα και κατά τη διάρκεια μιας επιδημίας [72, 122, 123] με αποτέλεσμα να θεωρείται πως είναι ακατάλληλη για μακροεπιδημιολογικές μελέτες [82, 123]. Παρόλα αυτά, η μέθοδος αυτή φαίνεται να είναι ιδιαίτερα χρήσιμη ακόμα και όταν [65]

68 χρησιμοποιείται για στελέχη που απομονώνονται κατά τη διάρκεια ευρύτερων χρονικών διαστημάτων, ειδικά όταν εφαρμόζεται παράλληλα με την PFGE, όπως για παράδειγμα παρατηρήθηκε για τη Salmonella ser. [65]. Παρόμοιες παρατηρήσεις αναφέρονται και από άλλους ερευνητές για τη Salmonella ser. Enteritidis [124, 125] ή και άλλους ορότυπους [126] Αλληλούχιση ολόκληρου γενώματος (Whole Genome Sequencing WGS) Η αλληλούχιση ολόκληρου του μικροβιακού γενώματος (Whole Genome Sequencing-WGS), μια μέθοδος που αναπτύχθηκε τα τελευταία χρόνια, είναι μια προσέγγιση πολλά υποσχόμενη. Εφαρμόζεται τόσο στις σαλμονέλες [ ], όσο και σε άλλα βακτήρια όπως Escherichia. coli [ ], Vibrio spp. [ ], καθώς και άλλα [ ]. Συνίσταται στην αλληλούχιση όλου του γενώματος του βακτηρίου, στην αποθήκευση των δεδομένων και στη συνέχεια στην ανάλυσή τους κάθε φορά, είτε συνολικά, είτε εν μέρει. Η μέθοδος αυτή είναι γρήγορη και απαιτεί ειδικό εξοπλισμό ώστε να γίνεται αυτόματα [58]. Κύριο πλεονέκτημα της είναι η αποθήκευση όλων των δεδομένων αλληλούχισης και η προσαρμογή και εξαγωγή τους αργότερα ανάλογα με τη μελέτη (MLST τύπος, παλσότυπος, γονίδια αντοχής σε αντιβιοτικά κλπ.). Προς το παρόν, η μέθοδος είναι αρκετά ακριβή και εφαρμόζεται σε ελάχιστα εξειδικευμένα εργαστήρια με κύριο μειονέκτημά της την ανάγκη για διαχείριση, ανάλυση, αποθήκευση και κυρίως μετάφραση κολοσσιαίων ποσοτήτων δεδομένων βιοπληροφορικής [145]. Φαίνεται πως μελλοντικά η μέθοδος αυτή θα αποτελέσει τη μέθοδο εκλογής για [66]

69 την τυποποίηση των μικροβίων, για την ανίχνευση γενετικών στοιχείων τα οποία θα διαφοροποιούν τα στελέχη κάθε φορά ή για την βελτιστοποίηση άλλων τυποποιητικών τεχνικών [54]. [67]

70 [68]

71 1.4 Επιδημιολογικά δεδομένα Αίτια αύξησης επίπτωσης των σαλμονελώσεων Κάθε χρόνο περίπου περιστατικά, νοσηλείες και 400 θάνατοι αποδίδονται στις σαλμονέλες στις Η.Π.Α., με κόστος που υπερβαίνει τα 2,6 δισεκατομμύρια δολάρια [146, 147]. Στην Ευρωπαϊκή Ένωση τα δηλωμένα κρούσματα ανέρχονται σε κάθε χρόνο, ενώ το κόστος υπερβαίνει τα 3 δις ευρώ [148]. Όμως, ο αριθμός των κρουσμάτων είναι ενδεικτικός, γιατί οι περισσότερες των περιπτώσεων δε δηλώνονται, είτε γιατί ο ασθενής δεν επισκέπτεται το γιατρό, είτε γιατί δε λαμβάνονται δείγματα για εργαστηριακή ανάλυση, είτε τέλος γιατί τα δεδομένα δε φτάνουν στο κέντρο αναφοράς. Με βάση αυτά τα δεδομένα το C.D.C. υπολογίζει πως ο πραγματικός αριθμός των τροφιμογενών σαλμονελώσεων προσεγγίζει το 1.4 εκατομμύριο [149]. Ανάλογες παρατηρήσεις για υποδήλωση κρουσμάτων έχουν αναφερθεί και για τη χώρα μας από τις Υπηρεσίες Ελέγχου [150]. Τις τελευταίες δεκαετίες η αύξηση των λοιμώξεων από σαλμονέλες απασχολεί ιδιαίτερα την επιστημονική κοινότητα παγκοσμίως, όπως και τις περισσότερες Υγειονομικές Υπηρεσίες. Η αύξηση αυτή αφορά κυρίως στις σαλμονελώσεις που εκδηλώνονται με τη μορφή τροφιμογενούς λοίμωξης. Ειδικότερα, η αύξηση της συχνότητας αποδίδεται σήμερα στη μεγαλύτερη κατανάλωση ζωικών τροφίμων, στη βιομηχανοποίηση της παραγωγής τροφίμων και ζωοτροφών και στην τεράστια αύξηση του διαμετακομιστικού εμπορίου ζώων και τροφίμων ζωικής προέλευσης [53]. Η αύξηση αυτή συνδυάζεται με τη διασπορά και ανακατανομή των διαφόρων οροτύπων σε περιοχές που προηγουμένως δεν υπήρχαν. Γι [69]

72 αυτό, οι σαλμονελώσεις θεωρούνται εδώ και πολλά χρόνια, και θα συνεχίσουν να θεωρούνται και στο μέλλον, ως ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα της Δημόσιας Υγείας [4, 6] Συχνότητα, ορότυποι και αντιμικροβιακή αντοχή στελεχών που απομονώθηκαν από τον άνθρωπο Η σαλμονέλα παραμένει τα τελευταία χρόνια ο πιο κοινός αιτιολογικός παράγοντας τροφιμογενών επιδημιών στην Ευρωπαϊκή Ένωση (Ε.Ε.). Το 2012, περιπτώσεις επιβεβαιωμένων κρουσμάτων σαλμονέλωσης σε ανθρώπους αναφέρθηκαν στην Ευρωπαϊκή Ένωση των 27 κρατών, το κυμάνθηκαν στα , ενώ το 2012 αποδόθηκαν στις σαλμονέλες 61 θάνατοι [81]. Παρατηρήθηκε μια στατιστικά σημαντική τάση μείωσης κατά την περίοδο της επίπτωσης της νόσου στην κοινότητα κατά περίπου 30% γεγονός που αποδίδεται από τις υπηρεσίες της Ευρωπαϊκής Ένωσης στην ορθή εφαρμογή των προγραμμάτων εκρίζωσης [81, 148]. Ο συνολικός αριθμός των περιστατικών βαίνει μειούμενος συνεχόμενα από το 2004 και μετά, κατά μερικές χιλιάδες περιστατικά κάθε χρόνο: από περιπτώσεις το 2004 σε το και το 2012 [81, 151]. Στην Ελλάδα, το 2012 αναφέρθηκαν 404 κρούσματα σαλμονέλωσης σε ανθρώπους με τον αριθμό τους να κυμαίνεται σε αυτά τα επίπεδα τα τελευταία χρόνια με εξαίρεση το, όταν ανήλθαν στα 792 και το στα 297. Η χώρα μας καταλαμβάνει μια από τις τελευταίες θέσεις στην Ευρώπη σε αριθμό κρουσμάτων ανά πληθυσμού, με ποσοστό που κυμαίνεται στο 3,6, ενώ ο μέσος όρος της Ευρωπαϊκής Ένωσης ανέρχεται στο 22,2. Η διασπορά των κρουσμάτων [70]

73 σαλμονέλωσης στην Ευρώπη για το 2012 παρουσιάζεται στο παρακάτω σχήμα [81]. (Σχήμα 3) Σχήμα 3: Διασπορά κρουσμάτων σαλμονέλωσης σε ανθρώπους το πηγή [81] Όπως και τα προηγούμενα χρόνια, έτσι και το 2012 οι δύο πιο συχνοί ορότυποι σαλμονελών στην Ευρωπαϊκή. Ένωση ήταν η Salmonella ser. Enteritidis και η Salmonella ser., οι οποίες αντιπροσωπεύουν το 41.3% και 22.1% αντίστοιχα, όλων των οροτύπων που απομονώθηκαν από άνθρωπο [81], ενώ ακολούθησαν η Salmonella ser., monophasic 1,4,[5],12:i:-, η οποία αναφέρεται ξεχωριστά από το με 7,2% και η Salmonella ser. Infantis με 2,5% [38] (Σχήμα 4, Πίνακας 2). [71]

74 Σχήμα 4: Κατανομή οροτύπων σαλμονελών απομονωμένων από ανθρώπους στην Ευρώπη το πηγή [81] Η επίπτωση της Salmonella ser. Enteritidis μειώθηκε σε σχέση με το 2011 κατά 5,8%, ενώ μείωση κατέγραψε και η Salmonella ser., όμως αν αθροιστούν τα ποσοστά της με αυτά της Salmonella ser. monophasic 1,4,[5],12:i:-, τότε προκύπτει μια αύξηση της τάξης του 2,8%. Η Salmonella ser. Infantis κατέγραψε μια αύξηση της τάξης του 14,5% την ίδια χρονική περίοδο [81](Πίνακας 2). Πίνακας 2: Συχνότεροι ορότυποι σαλμονελών απομονωμένων από ανθρώπους στην Ευρώπη το 2011 και το πηγή [81] [72]

75 Τα υψηλότερα ποσοστά αντοχής για τις σαλμονέλες που απομονώθηκαν από ανθρώπους στην Ευρωπαϊκή Ένωση το 2012 παρατηρήθηκαν στις τετρακυκλίνες (30 %, N=15.233), στις σουλφοναμίδες (28,9 %, N=14.582), στην αμπικιλλίνη (27,6 %, N=18.972) και στη στρεπτομυκίνη (23,6 %, N=16.643) ενώ χαμηλότερα ποσοστά αντοχής παρατηρήθηκαν στο ναλιδιξικό οξύ (14,4%. Ν=16.689). Παρατηρήθηκαν επίσης υψηλά ποσοστά πολυανθεκτικών στελεχών, 28,9% συνολικά [38]. Για τις τέσσερις πρώτες αντιμικροβιακές ουσίες τα ποσοστά αντοχής ήταν υψηλά ειδικά για τους ορότυπους Salmonella ser. και Salmonella ser. monophasic 1,4,[5],12:i:-, με αποτέλεσμα αυτή η υψηλή αντοχή να προβάλεται στο συνολικό ποσοστό. Η ανθεκτικότητα στα αντιμικροβιακά εκλογής για τη θεραπεία των σαλμονελώσεων ήταν χαμηλότερη και κυμάνθηκε στο 5,1% για τη σιπροφλοξασίνη και στο 1,1% για την κεφοταξίμη, ενώ η συνδυαστική αντοχή στις παραπάνω ουσίες κυμάνθηκε στο 0,2%. Η αντοχή στις κινολόνες πάντως ήταν υψηλότερη στα στελέχη της Salmonella ser. Enteritidis σε σύγκριση με τις Salmonella ser. και Salmonella ser., monophasic 1,4,[5],12:i:- [38]. Η εμφάνιση ανθεκτικών στελεχών με ταυτόχρονη αντοχή στις φθοροκινολόνες και της τρίτης γενιάς κεφαλοσπορίνες είναι μια σοβαρή εξέλιξη, η οποία οδηγεί σε σοβαρό περιορισμό των δυνατοτήτων για την αποτελεσματική αντιμετώπιση των ανθρώπινων λοιμώξεων [152]. Στην Ελλάδα, για το 2012, μεταξύ όλων των στελεχών σαλμονελών απομονωμένων από ανθρώπους η αντοχή κυμάνθηκε στο 20,8% για την αμπικιλλίνη (Ν=106), 5,9% για τη κεφοταξίμη (Ν=34), 5,6% για τη [73]

76 χλωραμφαινικόλη (Ν=72), 0% για τη σιπροφλοξασίνη (Ν=106), 100% για τη γενταμυκίνη (Ν=34), 4,2% για την καναμυκίνη (Ν=72), 6,8% για το ναλιδιξικό οξύ (Ν=73), 18,1% για τη στρεπτομυκίνη (Ν=72), 22,2% για τις τετρακυκλίνες (Ν=72) και 6,7% για την τριμεθοπρίμη (Ν=30) [38, 153]. Θα πρέπει να αναφερθεί πως η παρουσία πολυανθεκτικών στελέχων κυμάνθηκε στο 28.9% (Ν=3.900) στην Ευρωπαϊκή Ένωση για το 2012, ενώ το 51,3% (Ν=6.923) των στελεχών ήταν ευαίσθητα σε όλες τις αντιμικροβιακές ουσίες που δοκιμάστηκαν. Αντοχή συνδυαστικά τόσο στη σιπροφλοξασίνη, όσο και στην κεφοταξίμη, των φαρμάκων εκλογής δηλαδή για τη θεραπεία των σαλμονελώσεων αναφέρθηκε σε ποσοστό 0,2% των στελεχών (Ν=27) [38]. Παρατηρήθηκαν συνολικά μεγάλες διακυμάνσεις στην αντοχή, τόσο μεταξύ των διάφορων οροτύπων, όσο και μεταξύ των διαφόρων κρατών. Πάνω από τα μισά στελέχη που μελετήθηκαν ήταν ευαίσθητα σε όλα τα αντιβιοτικά που εξετάστηκαν, ενώ το 28,9% των στελεχών ήταν πολυανθεκτικά. Αυτό φαίνεται να οφείλεται τόσο στις διαφορές μεταξύ των πληθυσμών των σαλμονελών στα διάφορα κράτη, όσο κυρίως και στις διαφορές στον τρόπο μέτρησης και καταγραφής της αντοχής στα αντιμικροβιακά. Ειδικά σε κάποιες περιπτώσεις ακόμα και διαφορές στον τρόπο δειγματοληψίας μπορούν να δικαιολογήσουν από χώρα σε χώρα τις εξαιρετικά ακραίες τιμές, όπως για παράδειγμα την υποβολή δεδομένων αντοχής μόνο από στελέχη απομονωμένα από ασθενείς [38] ή από έναν και μόνο ορότυπο. [74]

77 1.4.3 Ορότυποι και αντιμικροβιακή αντοχή στελεχών που απομονώθηκαν από τα ζώα Πολλές Ευρωπαϊκές χώρες εφαρμόζουν προγράμματα καταπολέμησης των σαλμονελώσεων στα εκτρεφόμενα ζωικά είδη. Προγράμματα εφαρμόζονται ανάλογα με τη χώρα σε πατρογονικά σμήνη, κρεοπαραγωγά ορνίθια, όρνιθες ωοπαραγωγής, ινδόρνιθες, χήνες, πάπιες, χοίρους, βοοειδή και αιγοπρόβατα [81]. Στα πατρογονικά σμήνη πτηνών η επιτήρηση διήνυσε το 2012 το 6ο χρόνο εφαρμογής στην Ευρωπαϊκή Ένωση. Καθορίστηκε με βάση τους Ευρωπαϊκούς κανονισμούς 2160/2003 και 200/ που έχουν σαν στόχο τη μείωση του επιπολασμού των οροτύπων Salmonella ser. Enteritidis, Salmonella ser., Salmonella ser. Infantis, Salmonella ser. Virchow και Salmonella ser. Hadar αθροιστικά σε ποσοστό μικρότερο του 1% στις χώρες μέλη. Από το και μετά η Salmonella ser., monophasic 1,4,[5],12:i:- θεωρείται ξεχωριστός ορότυπος και αναφέρεται αυτοτελώς ενώ συμπεριλαμβάνεται στους ορότυπους για τους οποίους προβλέπει επιτήρηση ο κανονισμός. Συνολικά η επίπτωση των σαλμονελώσεων γενικά στα πατρογονικά σμήνη ορνίθων, για το 2012, ανήλθε στο 2% περίπου, ενώ το 2011 κυμάνθηκε στο 1,9%. Σε ό,τι αφορά όμως τους ορότυπους για τους οποίους έχει τεθεί στόχος μείωσης η επίπτωσή τους κυμάνθηκε στο 0,4% το 2012, από 0,6% το 2011 και 0,7% το. Η επίπτωση των σημαντικότερων ορότυπων ήταν 0,2% για τη Salmonella ser. Enteritidis, 0,095% για τη Salmonella ser. Infantis, και 0,045% για τη Salmonella ser.. Στην Ελλάδα το ποσοστό των μολυσμένων από [75]

78 σαλμονέλες πατρογονικών σμηνών κυμάνθηκε στο 5,1% το 2012 (Ν=256), ενώ το ποσοστό των 5 ορότυπων στόχων κυμάνθηκε στο 1,2%, γεγονός που φανερώνει την αδυναμία επίτευξης του στόχου να μειωθεί σε επιπεδα μικρότερα του 1%. Αναλυτικά η επίπτωση της Salmonella ser. Enteritidis κυμάνθηκε στο 0,4%, της Salmonella ser. στο 0,4% και της Salmonella ser. Hadar στο 0.4% (συνολικά 1,2%). Εκτός από την Ελλάδα το στόχο αυτό δεν κατάφεραν να τον κατακτήσουν η Κύπρος, η Πολωνία, η Αυστρία, η Τσεχία και η Ουγγαρία [81]. Στις όρνιθες αυγοπαραγωγής στην Ευρωπαϊκή Ένωση με βάση τους παραπάνω κανονισμούς έχει τεθεί ως στόχος η συνεχής μείωση του ποσοστού της Salmonella ser. Enteritidis και της Salmonella ser. κάθε νέα χρονιά σε κάθε μέλος ξεχωριστά, με τελικό στόχο το ποσοστό να πέσει κάτω από 2%. Το 2012 η παρουσία των σαλμονελών στις όρνιθες αυγοπαραγωγής ανήλθε στο 3,2% (Ν=37.743) από 4,2% το 2011, καταγράφοντας μια μείωση της τάξης του 23,8%. Το συνολικό ποσοστό των δύο οροτύπων Salmonella ser. Enteritidis και Salmonella ser. ανήλθε στο 1,3% από 1,5% το 2011, καταγράφοντας και αυτό μια μείωση, όμως σε κάποιες χώρες τα ποσοστά αυτά ήταν πολλαπλάσια με ενδεικτική την περίπτωση της Κύπρου στην οποία ανήλθε στο 13,7%. Η επίπτωση συνολικά στην Ε.Ε. για το 2012 της Salmonella ser. Enteritidis, που ήταν ο συχνότερος ορότυπος, κυμάνθηκε στο 1% ενώ της Salmonella ser. στο υπόλοιπο 0,3%. Σε κάποιες χώρες, όπως στην Ιταλία, στη Φινλανδία και στη Γαλλία η Salmonella ser. ήταν συχνότερη. Στην Ελλάδα αντίστοιχα, η συχνότητα παρουσίας των σαλμονελών στα πατρογονικά σμήνη ορνίθων κυμάνθηκε στο 5,7% (Ν=454) συνολικά το 2012, ενώ για τη Salmonella [76]

79 ser. Enteritidis ανήλθε στο 0,9% και για τη Salmonella ser. στο 0,2% [38, 48]. Στα παχυνόμενα ορνίθια σύμφωνα με τους Ευρωπαϊκούς κανονισμούς 2160/2003 και 200/ έχει τεθεί ως στόχος η μείωση του επιπολασμού των οροτύπων Salmonella ser. Enteritidis και Salmonella ser., αθροιστικά, σε ποσοστό μικρότερο του 1% στις χώρες μέλη. Ο επιπολασμόςτων σαλμονελών στα παχυνόμενα ορνίθια ανήλθε ποσοστιαία στο 3,1% για το 2012 (Ν=8.776), όμοια με το 2011 [38, 48]. Η παρουσία όμως των ορότυπων στόχων ήταν χαμηλότερη και κυμάνθηκε στο 0,3% για το 2012 από 0,3% το 2011, 0,4% το και 0,9% το [52, 81, 154]. Η επίπτωση της Salmonella ser. Enteritidis ανήλθε στο 0,2% ενώ της Salmonella ser. στο 0,1%. Στην Ελλάδα απομονώθηκαν σαλμονέλες από το 0,3% (Ν=6.485) των δειγμάτων από παχυνόμενα ορνίθια αλλά οι δύο ορότυποι στόχοι δεν απομονώθηκαν. Συνολικά στην Ε.Ε. για το 2012, οι 5 συχνότεροι ορότυποι στις όρνιθες (συμπεριλαμβανομένων πατρογονικών σμηνών, ορνίθων ωοπαραγωγής και ορνιθίων κρεοπαραγωγής) ήταν η Salmonella ser. Enteritidis με 28,96% (Ν=1253), η Salmonella ser. Infantis με ποσοστό 18,05% (Ν=781), η Salmonella ser. Mbandaka με ποσοστό 5,48% (Ν=237), η Salmonella ser. Tenessee με ποσοστό 4,69% (Ν=203) και η Salmonella ser. Kentucky με ποσοστό 3,88% (Ν=168). Η Salmonella ser. κατέλαβε την 7η θέση με ποσοστό 3,72% (Ν=161) ενώ η Salmonella ser., monophasic 1,4,[5],12:i:- κατέλαβε την 16η θέση με συχνότητα 0,92% (Ν=40). Διαφορετική ήταν η εικόνα στις ινδόρνιθες όπου οι συχνότεροι ορότυποι ήταν η Salmonella ser. Derby 25.15% (N=172), η Salmonella ser. Stanley με 11,4% (Ν=78) και η Salmonella ser. Kentacky με 8,63% (Ν=59) [52, 81, 154]. [77]

80 Η συχνότητα παρουσίας των σαλμονελών στους χοίρους κυμάνθηκε κατά μέσο όρο στο 6,3% (N=2.690) το 2012, ενώ το 2011 στο 4,3% (N=542) [48, 81]. Μεγάλες διακυμάνσεις παρατηρήθηκαν στα ποσοστά απομόνωσης από χώρα σε χώρα που σε επίπεδο εκτροφών κυμάνθηκαν από 0%-15% και σε επίπεδο ζώων μεταξύ 1,4% και 36,4%. Οι κυριότεροι ορότυποι που απομονώθηκαν από τους χοίρους το 2012 ήταν η Salmonella ser. με 35.49% (N=515), η Salmonella ser., monophasic 1,4,[5],12:i:- με 29.01% (N=421), η Salmonella ser. Derby με 19,3% (Ν=280), η Salmonella ser. Infantis με 3,1% (Ν=45) και η Salmonella ser. Livingstone με 1,52% (Ν=22). Η Salmonella ser. Enteritidis κατέλαβε την 12η θέση με συχνότητα 0,69% (Ν=10) [81]. Η συχνότητα απομόνωσης σαλμονελών στα βοοειδή το 2012 παρουσίασε μεγάλες διακυμάνσεις από χώρα σε χώρα και ήταν κατά μέσο όρο 2,4% (Ν=3504) για το 2012, από 3,2% (Ν=565) το 2011 [81, 155]. Μεγάλες διαφοροποιήσεις παρατηρήθηκαν ανάλογα με την προέλευση των δειγμάτων και κυμάνθηκαν από 0%-15% σε επίπεδο εκτροφών, 0% ως 4% στα ζώα και περίπου στο 6,2% σε επίπεδο σφαγείου. Οι συχνότερα απομονωθέντες ορότυποι και εδώ ήταν η Salmonella ser. με 55,33% (N=166), η Salmonella ser. Dublin με 22% (Ν=66), η Salmonella ser., monophasic 1,4,[5],12:i:- με 9,67% (N=29), η Salmonella ser. Enteritidis με 2,67% (Ν=8) και η Salmonella ser. Mondevideo με 1,67% (Ν=5) [81]. Η συχνότητα παρουσίας πολυανθεκτικών στελεχών μεταξύ αυτών που απομονώθηκαν από παραγωγικά ζώα ανήλθε σε υψηλά επίπεδα στην Ευρωπαϊκή Ένωση κατά τη διάρκεια του Ειδικότερα στα παχυνόμενα ορνίθια η συχνότητα πολυανθεκτικών στελεχών σε εννέα χώρες συνολικά ανήλθε στο 46,4%, με τα υψηλότερα ποσοστά να [78]

81 αναφέρονται στη Γερμανία (65%) και στη Ρουμανία (64%) ενώ από την άλλη 37,7% των στελεχών (Ν=615) ήταν πλήρως ευαίσθητα στα αντιβιοτικά. Στις όρνιθες αυγοπαραγωγής η συχνότητα πολυανθεκτικών στελεχών ήταν κατά μέσο όρο 46,4% (Ν=757) με τα υψηλότερα ποσοστά να καταγράφονται στην Ουγγαρία, 73,1% και στη Ρουμανία 61%, στη Ρουμανία ειδικότερα βρέθηκαν και 8 στελέχη (1%) τα οποία ήταν ανθεκτικά στις 8 από τις 9 αντιμικροβιακές ουσίες. Η συχνότητα των ευαίσθητων στα αντιμικροβιακά στελεχών ήταν 38,9% (Ν=635) με τα υψηλότερα ποσοστά στην Ιρλανδία (81,6%) και τα χαμηλότερα στην Ουγγαρία (7,4%) [38] (πίνακας 3). Στους χοίρους, στις επτά χώρες που έγιναν επίσημες μελέτες, η παρουσία πολυανθεκτκών στελεχών το 2012 ανήλθε κατά μέσο όρο στο 60,1% (Ν=696), με το μεγαλύτερο ποσοστό να αναφέρεται στη Γερμανία με 76,9% και το χαμηλότερο στη Δανία με 34,2%, ενώ 26,2% των στελεχών ήταν ευαίσθητα με το υψηλότερο ποσοστό να καταγράφεται στην Εσθονία (64,3%) [38] (πίνακας 3). Τέλος δεδομένα από έξι χώρες στα βοοειδή αναφέρουν τη συχνότητα παρουσίας πολυανθεκτικών στελεχών σε ποσοστό 34,2% (Ν=67) με τα υψηλότερα ποσοστά να καταγράφονται σε Ιρλανδία (58,3%) και Βέλγιο (50%) ενώ το 52% (Ν=102) των στελεχών ήταν ευαίσθητα σε όλες τις αντιμικροβιακές ουσίες που δοκιμάστηκαν [38] (Πίνακας 3). [79]

82 Πίνακας 3: Ανθεκτικότητα στελεχών σαλμονελών απομονωμένων από βοοειδή σε χώρες της Ευρώπης το πηγή [38] Αντιμικροβιακή Ουσία Όρνιθες (%) Χοίροι (%) Βοοειδή (%) Κύπρος, Ελλάδα, Λουξεμβούργο, Σλοβενία, Ισλανδία Ελλάδα Αυστρία, Ισλανδία Αυστρία Αmpicillin ,5-45,5 0 Cefotaxime Chlorampenicol 0-3, Ciprofloxacin 0-77, Gentamycin 0-29, ,3 Nalidixic acid 0-77,8 13,9 0-2,5 0 Sulfonamides Tetracycline 0-77,8 8,3 0-22, Συχνότητα, ορότυποι και αντιμικροβιακή αντοχή στελεχών που απομονώθηκαν από τρόφιμα. Τα κριτήρια καταλληλόλητας των τροφίμων που κυκλοφορούν στην Ευρώπη σε σχέση με τις σαλμονέλες καθορίζονται από τους Ευρωπαϊκούς Κανονισμούς 2073/2005, 1441/2007 και 1086/2011 [81]. Οι κανονισμοί απαιτούν την απουσία σαλμονέλας ανά 25 γραμμάρια τρόφιμου γενικά, με κάποιες διαφοροποιήσεις στον αριθμό των δειγμάτων, ανάλογα με την κατηγορία του τρόφιμου. Οι διαφοροποιήσεις αυτές καθορίζουν επίσης και τον τρόπο δειγματοληψίας σε μονά δείγματα (single samples) ή παρτίδες (batches). [80]

83 To 2012 τα υψηλότερα ποσοστά συχνότητας παρουσίας των σαλμονελών αναφέρθηκαν στο νωπό μιττωτό (λεπτοτεμαχισμένο κρέας) και στα νωπά προϊόντα μιττωτού πουλερικών με τα ποσοστά να κυμαίνονται γύρω από το 8,7% για τα μεμονωμένα δείγματα και 5,7% στις παρτίδες με μεγάλες διακυμάνσεις μεταξύ των χωρών μελών (0% - 48,5%). Στο νωπό μιττωτό και στα αντίστοιχα προϊόντα από μιττωτό όλων των άλλων ζώων που προορίζονται για τη διατροφή του ανθρώπου (κυρίως βοοειδών, αιγών, προβάτων και χοίρου) τα αντίστοιχα ποσοστά κυμάνθηκαν στο 1,6% (2% στα δείγματα και 0,9% σε επίπεδο παρτίδας) [81]. Αν και τα ποσοστά αυτά ήταν αρκετά υψηλά, θα πρέπει να αναφερθεί πως είναι προϊόντα νωπά τα οποία θα υποστούν θερμική επεξεργασία πριν καταναλωθούν, με συνέπεια να περιορίζεται ο κίνδυνος μόλυνσης του ανθρώπου. Ειδικά στο κρέας από παχυνόμενα ορνίθια η συχνότητα παρουσίας της σαλμονέλας ανήλθε στο 4,1% και κυμάνθηκε από 0% στην Ισλανδία μέχρι και 29,3% στην Ουγγαρία. Στο χοιρινό κρέας η παρουσία της σαλμονέλας κυμάνθηκε συνολικά περί του 0,7%, με τα υψηλότερα ποσοστά να καταγράφονται στο Βέλγιο 10,8% και στην Ισπανία 7.8% σε επίπεδο σφαγείου, στην Πολωνία 1,1% σε επίπεδο εργαστηρίου επεξεργασίας, ενώ στα έτοιμα προς κατανάλωση τρόφιμα με βάση το χοιρινό κρέας το ποσοστό ανήλθε συνολικά στο 0,6%. Στο βόειο κρέας η παρουσία της σαλμονέλας ανήλθε στο 0,3%, με τα μεγαλύτερα ποσοστά στα σφαγεία να καταγράφονται στην Ισπανία με 11,6%, ενώ στα έτοιμα προς κατανάλωση προϊόντα βόειου το ποσοστό αυτό πέφτει στο 0,6% [81]. Θα πρέπει όμως να αναφερθεί πως η εικόνα μπορεί να μην είναι τελείως ξεκάθαρη δεδομένου ότι κάθε χώρα διεξάγει την επιτήρηση σε διαφορετικά σημεία (σφαγεία, εργαστήρια επεξεργασίας, σημεία [81]

84 πώλησης), ενώ ακόμα και το είδος των δειγμάτων μπορεί να διαφέρει (κρέας, δέρμα λαιμού, μηροί, ολόκληρο κοτόπουλο κλπ), με αποτέλεσμα τα ποσοστά να επηρεάζονται αντίστοιχα. Η συχνότητα παρουσίας των σαλμονελών σε άλλα τρόφιμα ζωικής προέλευσης, όπως τα δίθυρα μαλάκια, εχινόδερμα, χιτωνοφόρα και θαλάσσια γαστερόποδα ανήκθε στο 1,8%, ενώ στα λαχανικά το ποσοστό παρουσίας στη λιανική ήταν στη Δανία στο 9,1%, στη Γερμανία σε <0,1% και στα σημεία επεξεργασίας λαχανικών στο 0,7% αντίστοιχα [81]. Η παρουσία σαλμονελών σε τρόφιμα ζωικής προέλευσης, τα οποία προορίζονται να καταναλωθούν ωμά αποτελεί θέμα αιχμής εξαιτίας του κινδύνου που εγκυμονούν για τη Δημόσια Υγεία. Στα έτοιμα προς κατανάλωση προϊόντα μιττωτού η συχνότητα παρουσίας των σαλμονελών στις χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης ήταν μικρότερη και κυμάνθηκε γύρω στο 0,2% για τα μεμονωμένα δείγματα και στο 0,5% για τις παρτίδες, ενώ στα προϊόντα από αυτούσια τεμάχια κρέατος στο 1,5% για τα μεμονωμένα δείγματα. Σε άλλα τρόφιμα, όπως το βούτυρο και τα τυριά η παρουσία κυμάνθηκε γύρω στο 0,6% ενώ στα τεμαχισμένα φρούτα και λαχανικά στο 0,4%. Στα αυγά, η παρουσία των σαλμονελών ανήλθε κατά μέσο όρο στο 0,1% περίπου, με τα ποσοστά να κυμαίνονται από 0% ως και 7% σε κάποιες περιπτώσεις, ανάλογα με την προέλευση των αυγών. Πολύ σημαντικό στοιχείο αποτελεί η μη ανίχνευση σαλμονέλας στους χυμούς φρούτων, στις φύτρες σπόρων, σε ξηρούς καρπούς και στα τρόφιμα που απευθύνονται σε ειδικές ομάδες πληθυσμού όπως οι παιδικές τροφές και τα διαιτητικά προϊόντα [81]. Στην Ελλάδα η συχνότητα παρουσίας της σαλμονέλας στο ορνίθειο κρέας ανήλθε στο 19,6% (N=11), όταν εξετάστηκαν δείγματα [82]

85 προερχόμενα από σφαγεία, και στο 9,7% (Ν=3) των δειγμάτων από εργαστήρια επεξεργασίας ορνίθειου κρέατος, ενώ δεν υπάρχουν διαθέσιμα επίσημα στοιχεία για την παρουσία στα καταστήματα λιανικής πώλησης. Σε ό,τι αφοράτα έτοιμα προς κατανάλωση προϊόντα από ορνίθειο κρέας ενώ δεν εξετάστηκαν δείγματα το 2012 το 2011 η συχνότητα παρουσίας κυμάνθηκε γύρω στο 0,8%. Επίσημα στοιχεία για τα αυγά, το κρέας ινδορνίθων και το χοιρινό κρέας δεν αναφέρονται, ενώ η παρουσία σαλμονελών σε δείγματα από έτοιμα προς κατανάλωση τρόφιμα με βάση το χοιρινό κρέας κυμάνθηκε γύρω στο 7,7% για το 2011 [52, 81, 155]. Για το βόειο κρέας δεν υπάρχουν στοιχεία για την παρουσία σαλμονελών τόσο σε επίπεδο σφαγείου όσο και σε επίπεδο εργαστηρίου επεξεργασίας και λιανικής πώλησης, πάντως κατά το έτος 2011 αναφέρεται πως δεν απομονώθηκε σαλμονέλα από δείγματα βόειου κρέατος σε επίπεδο λιανικής [81, 155]. Αξιοσημείωτο είναι τέλος, πως η παρουσία σαλμονελών στα δίθυρα μαλάκια (κυρίως μύδια) στη χώρα μας ανήλθε στο 0,6% (Ν=6) στα εργαστήρια επεξεργασίας [81]. Στο κρέας των πουλερικών οι ορότυποι που απομονώθηκαν συχνότερα στην Ευρωπαϊκή Ένωση για το 2012 ήταν η Salmonella ser. Infantis με ποσοστό 45,81% (Ν=339), η Salmonella ser. Enteritidis με ποσοστό 13,38% (Ν=99), η Salmonella ser. Kentucky με 9,05% (Ν=67), η Salmonella ser. Paratyphy B με ποσοστό 5,27% (Ν=39) και τέλος η Salmonella ser. Java με ποσοστό 4,19% (Ν=31) [81]. Η ανθεκτικότητα στα αντιμικροβιακά των στελεχών αυτών κυμάνθηκε από 1,6% έως 10% για την αμπικιλλίνη, 1,6%-100% για τη σιπροφλοξασίνη, 0%-2,5% για τη γενταμυκίνη, 0%-3,3% για τη χλωραμφαινικόλη, 17,5%-100% για το ναλιδιξικό οξύ, 67,2%-100% για τις σουλφοναμίδες και 18,2%-100% για την τετρακυκλίνη, ενώ δεν βρέθηκαν [83]

86 ανθεκτικά στελέχη στην κεφοταξίμη [81]. Θα πρέπει όμως να σημειωθεί πως μόνο η Αυστρία, η Σλοβενία και η Ισπανία ανέφεραν αποτελέσματα αντοχής σαλμονελών απομονωμένων από το κρέας πουλερικών. Στο χοίρειο κρέας η εικόνα ήταν εντελώς διαφορετική. Εδώ κυριάρχησε η Salmonella ser. με ποσοστό 47,08% (Ν=322), η Salmonella ser. Derby με ποσοστό 15,94% (Ν=109) και η Salmonella ser., monophasic 1,4,[5],12:i:-, με ποσοστό 15,79% (Ν=108) [81]. Η ανθεκτικότητα των στελεχών αυτών παρουσίασε μεγάλες διακυμάνσεις, από 43,3% έως 57,9% για την αμπικιλλίνη, 0%-5,6% για τη κεφοταξίμη, 15,8%-25,5% για την χλωραμφαινικόλη, 10,4% -10,5% για το ναλιδιξικό οξύ, 57,9%-70,3% για τις σουλφοναμίδες και 68,4%-86,3% για την τετρακυκλίνη, ενώ δεν βρέθηκαν ανθεκτικά στελέχη στη σιπροφλοξασίνη και στη γενταμυκίνη. Και εδώ θα πρέπει να σημειωθεί πως μόνο η Αυστρία και η Ισπανία ανέφεραν αποτελέσματα αντοχής σαλμονελών απομονωμένων από χοίρειο κρέας. Στο βόειο κρέας η εικόνα που κυριάρχησε το 2012 είναι παρόμοια με το χοίρειο καθώς η Salmonella ser. καταλαμβάνει την πρώτη θέση με ποσοστό 39,4% (Ν=24), η Salmonella ser. Derby κατατάσσεται δεύτερη με ποσοστό 16,39% (Ν=10) και η Salmonella ser., monophasic 1,4,[5],12:i:- τρίτη με ποσοστό 11,48% (Ν=7) [81]. Η ανθεκτικότητα των στελεχών αυτών παρουσίασε μεγάλες διακυμάνσεις, από 11,4%-33,3% για την αμπικιλλίνη, 0%-5,6% για τη κεφοταξίμη, 0%-2,5% για την χλωραμφαινικόλη, 0%-11,1% για τη σιπροφλοξασίνη, 11,1%-13,6% για το ναλιδιξικό οξύ, 0%-2,3% για τη γενταμυκίνη, 5,9%-61,1% για τις σουλφοναμίδες και 5,1%-44,4% για την τετρακυκλίνη [38]. Αξίζει ιδιαίτερη αναφορά το γεγονός ότι μόνο δύο [84]

87 χώρες παρείχαν στοιχεία για την αντοχή στελεχών σαλμονελών απομονωμένων από το βόειο κρέας, η Ολλανδία και η Ισπανία. Η συχνότητα παρουσίας πολυανθεκτικών στελεχών μεταξύ αυτών που απομονώθηκαν από κρέας πουλερικών ανήλθε συνολικά στο 64% (Ν=255) και ειδικότερα στο 34% στην Τσεχία, στο 65% στη Γερμανία, στο 23% στην Ιρλανδία και 86% στη Ρουμανία ενώ τα στελέχη που ήταν ευαίσθητα κυμάνθηκαν συνολικά γύρω στο 29,3% (Ν=117), από 6,9% στη Ρουμανία έως και 72,9% στην Ιρλανδία. Για το χοίρειο κρές υπάρχουν διαθέσιμα στοιχεία από επτά χώρες και η πολυανθεκτικότητα μεταξύ των στελεχών αυτών ανήλθε κατά μέο όρο στο 51% (Ν=274) και ειδικότερα από 13,6% στην Εσθονία έως και 59,4% στην Ιρλανδία. Ως πλήρως ευαίσθητα αναφέρονται περίπου το 33,8% των στελεχών (Ν=182), με το υψηλότερο ποσοστό στην Εσθονία με 86,4% και το χαμηλότερο στην Ιρλανδία με 21,7% [38]. [85]

88 1.5 Επιδημικά ξεσπάσματα από τροφιμογενείς λοιμώξεις Πολλές επιδημίες σαλμονελώσεων έχουν καταγραφεί τις τελευταίες δεκαετίες σε παγκόσμιο επίπεδο. Οι περισσότερες από αυτές οδήγησαν στα νοσοκομεία με γαστρεντερίτιδα εκατοντάδες χιλιάδες καταναλωτές και στοίχισαν τη ζωή σε αρκετούς από αυτούς. Ταυτόχρονα, σημειώθηκαν τεράστιες οικονομικές απώλειες οι οποίες προέκυψαν από το κόστος νοσηλείας, ανάκλησης προϊόντων, και, κυρίως από τις χαμένες ημέρες εργασίας όλων των ασθενών. Παλαιότερα οι επιδημίες συνέβαιναν σε περιορισμένο χώρο και χρόνο και περιορίζονταν στα όρια μιας μικρής κοινότητας ανθρώπων, η οποία κατανάλωνε κάποιο μολυσμένο τρόφιμο μια δεδομένη στιγμή. Με την αλλαγή όμως, του τρόπου παραγωγής, διακίνησης και κατανάλωσης των τροφίμων και με τη βιομηχανοποίησή τους τα τελευταία χρόνια, οι επιδημίες έπαψαν να είναι τοπικού χαρακτήρα και κάποιες φορές ξεπέρασαν και τα σύνορα των κρατών. Η μεγαλύτερη και σοβαρότερη επιδημία από σαλμονέλες καταγράφεται στο διάστημα από 22 Μαρτίου 1985 έως 8 Απριλίου 1985 στις ΗΠΑ, με επιβεβαιωμένα κρούσματα και 12 τουλάχιστον θανάτους. Η επιδημία αυτή για την οποία ενοχοποιήθηκε η Salmonella ser., προκλήθηκε από την κατανάλωση γάλακτος που προερχόταν από μία μολυσμένη φάρμα, εξαπλώθηκε σε πολλές πολιτείες και υπολογίζεται πως επηρέασε τουλάχιστον καταναλωτές [156]. Από τις πιο σοβαρές καταγεγραμένες επιδημίες ήταν αυτή από παγωτό στις ΗΠΑ, το Το Σεπτέμβριο και τον Οκτώβριο του 1994, [86]

89 από την κατανάλωση μολυσμένου με Salmonella ser. Enteritidis παγωτού καταγράφηκαν 2014 κρούσματα, από τα οποία τουλάχιστον 150 επιβεβαιώθηκαν και 30 νοσηλεύθηκαν σε νοσοκομεία. Υπολογίζεται πως η επιδημία αυτή επηρέασε συνολικά περίπου ανθρώπους [157]. Μεταξύ Απριλίου και Σεπτεμβρίου του 1993 καταγράφηκε στην Γερμανία μια επιδημία σαλμονέλωσης η οποία αποδόθηκε σε μολυσμένη πάπρικα, που ήταν συστατικό σε τσίπς τηγανιτής πατάτας. Από τα 1000 κρούσματα που αναφέρθηκαν σε όλη τη Γερμανία φαίνεται πως επηρεάστηκαν κυρίως παιδιά κάτω των 14 χρόνων. Το αξιοσημείωτο της συγκεκριμένης επιδημίας ήταν πως ενοχοποιήθηκαν τουλάχιστον 3 ορότυποι σαλμονελών [158]. Ανάλογης έντασης επιδημία με τουλάχιστον 529 επιβεβαιωμένα κρούσματα και 8 θανάτους έπληξε 43 πολιτείες των ΗΠΑ το, ενώ κρούσμα σημειώθηκε και στον Καναδά. Αποδόθηκε σε μολυσμένο με Salmonella ser. Infantis φυστικοβούτυρο και πάστα φυστικοβούτυρου, ένα πολύ διαδεδομένο έδεσμα στη χώρα αυτή και βάση για την παρασκευή ευρείας γκάμας τροφίμων [159]. Άλλοτε πάλι, όπως σε επιδημία στις ΗΠΑ το, ενοχοποιήθηκαν πιπεριές και ντομάτες, συστατικά φρέσκιας σάλτσας που έπληξε 43 πολιτείες, καθώς και τον Καναδά. Ενοχοποιήθηκε η Salmonella ser. Saintpaul, με επιβεβαιωμένα κρούσματα, 203 νοσηλείες και 1 θάνατο [160]. Το, 228 εκατομμύρια αυγά ανακλήθηκαν στις ΗΠΑ εξαιτίας της Salmonella ser. Enteritidis σε μια γιγάντια για τα παγκόσμια δεδομένα επιχείρηση. Ενδείξεις μόλυνσης αυγών υπήρξαν μετά από κρούσματα σε ένα εστιατόριο, με το Pulsenet ( το επίσημο δίκτυο [87]

90 επιδημιολογικής επιτήρησης στις ΗΠΑ) να απομονώνει παρόμοιους παλσότυπους και από πτηνοτροφεία αλλά και από πολλαπλά τρόφιμα που περιείχαν στα συστατικά τους αυγά από συγκεκριμένα πτηνοτροφεία. Επίσης, παρόμοιοι παλσότυποι απομονώθηκαν από ανθρώπους με αποτέλεσμα να δοθεί σήμα για επικείμενη επιδημία και να γίνει ανάκληση και απόσυρση εκατομμυρίων ύποπτων αυγών [161]. Μεταξύ των ετών 2011 και 2013, 710 κρούσματα αναφέρθηκαν από επιδημία σε 10 Ευρωπαϊκές χώρες μεταξύ αυτών στην Αυστρία, Σλοβακία, Τσεχία, Γερμανία, Ουγγαρία, Βέλγιο και Ηνωμένο Βασίλειο που οφείλονταν στη Salmonella ser. Stanley. Η επιδημιολογική διερεύνηση ανέδειξε τις ινδόρνιθες και τα προϊόντα τους ως υπέυθυνο τρόφιμο [162]. Στις υπηρεσίες της Ε.Ε. κάθε χρόνο φθάνει πλήθος αναφορών για επιδημικά συμβάματα τροφιμογενών λοιμώξεων για τα οποία ενοχοποιούνται κάθε φορά πολλά τρόφιμα. Συνολικά, κατά το 2012, καταγράφηκαν τροφιμογενείς επιδημίες σημειώνοντας μείωση της τάξης του 5% σε σχέση με το 2011 όταν αναφέρθηκαν [81] (Πίνακας 4, Σχήμα 5). Κατά τη διάρκεια των επιδημιών αυτών, νόσησαν πολίτες από αυτούς νοσηλεύθηκαν και 41 κατέληξαν (0,07% των κρουσμάτων) [81]. [88]

91 Πίνακας 4: Συχνότεροι αιτιολογικοί παράγοντες τροφιμογενών επιδημιών στην Ευρωπαϊκή Ένωση τα έτη 2011 και πηγή [81]. Σχήμα 5: Συχνότεροι αιτιολογικοί παράγοντες τροφιμογενών επιδημιών στην Ευρωπαϊκή Ένωση τα έτη,,, 2011 και πηγή [81]. Η πλειοψηφία των τροφίμων στα οποία αποδόθηκαν οι 763 επιβεβαιωμένες τροφιμογενείς επιδημίες για το 2012 ήταν τρόφιμα ζωικής προέλευσης (Σχήμα 6). Όπως και τα προηγούμενα χρόνια τα αυγά [89]

92 και τα προϊόντα τους κατέλαβαν την πρώτη θέση ανάμεσα στα υπεύθυνα τρόφιμα αφού ενοχοποιήθηκαν για 168 επιδημίες (22%) ενώ στη δεύτερη θέση κατατάχθηκαν τα ανάμικτα τρόφιμα υπεύθυνα για 119 επιδημίες (15,6%) και στην τρίτη τα ιχθηρά και τα ιχθυοσκευάσματα με 70 (9,2%). Σχήμα 6: Υπεύθυνα τρόφιμα στις τροφιμογενείς επιδημίες στην Ευρωπαϊκή Ένωση το πηγή [81]. Μεταξύ των 168 επιδημιών στις οποίες ενοχοποιήθηκαν τα αυγά και τα προϊόντα τους, η Salmonella ser. Enteritidis ήταν ο συχνότερος αιτιολογικός παράγοντας σε ποσοστό που ανήλθε στο 66,7% ενώ η Salmonella ser. ενοχοποιήθηκε για το 6,5% (Σχήμα 7). Συνολικά οι σαλμονέλες ευθύνονταν για το 93,5% των επιδημιών το έτος 2012 [81]. [90]

93 Σχήμα 7: Αιτιολογικοί παράγοντες επιδημιών από αυγά και προϊόντα αυγών στην Ευρωπαϊκή Ένωση το πηγή [81]. Η σαλμονέλες διατήρησαν υψηλό ποσοστό ως αιτιολογικού παράγοντα τροφιμογεών επιδημιών και στις υπόλοιπες κατηγορίες τροφίμων, με ποσοστά που κυμάνθηκαν γύρω στο 21% για τα ανάμικτα τρόφιμα, στο 11,4% στα ψάρια και τα ιχθυοσκευάσματα και στο 8,6% στα οστρακόδερμα και τα μαλάκια. Ιδιαίτερα αξιοσημείωτη είναι η υψηλή συμμετοχή των σαλμονελών στην πρόκληση επιδημιών προκαλούμενων από κατανάλωση τροφίμων μη ζωικής προέλευσης όπως για παράδειγμα των λαχανικών με ποσοστά που κυμάνθηκαν γύρω στο 23,1% [81]. (Σχήμα 8). [91]

94 Σχήμα 8: Αιτιολογικοί παράγοντες από λαχανικά στην Ευρωπαϊκή Ένωση το πηγή [81]. Ο αριθμός των επιδημιών που αποδόθηκαν στις σαλμονέλλες το 2012 (συνολικά 1553) παρουσίασε σταθερή μείωση της τάξης του 18%, σε σχέση με τον αντίστοιχο αριθμό του (συνολικά 1.888). Η μείωση αυτή ακολούθησε την αντίστοιχη μείωση των παρατηρούμενων στην Ευρώπη κρουσμάτων σαλμονέλωσης σε ανθρώπους στο ίδιο χρονικό διάστημα [81, 148]. [92]

95 2 ΜΕΡΟΣ ΔΕΥΤΕΡΟ-Η ΔΙΚΗ ΜΑΣ ΕΡΕΥΝΑ [93]

96 [94]

97 2.1 Ερευνητικοί στόχοι Ο κύριος στόχος της έρευνας μας ήταν: Η διερεύνηση της διασποράς των πέντε σημαντικότερων για τη Δημόσια Υγεία οροτύπων σαλμονελών (Salmonella ser. Enteritidis, Salmonella ser., Salmonella ser. Infantis, Salmonella ser. Virchow και Salmonella ser. Hadar) στη χώρα μας από το 2007 έως και το στον άνθρωπο, στα ζώα και στα τρόφιμα ζωικής προέλευσης και η αξιολόγηση της μεταξύ τους επιδημιολογικής συσχέτισης με βάση φαινοτυπικές και μοριακές μεθόδους. Για την επίτευξη των επιστημονικών στόχων της διατριβής, προγραμματίστηκαν και πραγματοποιήθηκαν οι εξής επιμέρους μελέτες: Καταγραφή όλων των στελεχών σαλμονελών που απομονώθηκαν στη χώρα μας την περίοδο και ταυτοποιήθηκαν από τα επίσημα εργαστήρια αναφοράς ως σαλμονέλες, καθορισμός και λήψη των στελεχών που συμπερηλήφθηκαν στη μελέτη. Έλεγχος της ευαισθησίας/ αντοχής των σαλμονελών αυτών στα αντιβιοτικά. Γενοτυπικός χαρακτηρισμός, έλεγχος κλωνικότητας των στελεχών με εφαρμογή της ηλεκτροφόρησης σε παλλόμενο πεδίο (Pulsed Field Gel Electrophoresis- PFGE). Φαινοτυπικός χαρακτηρισμός - έλεγχος κλωνικότητας με εφαρμογή λυσιτυπίας (Phagetyping). [95]

98 Μοριακός χαρακτηρισμός - έλεγχος κλωνικότητας με εφαρμογή Πολυτοπικής αλληλούχισης μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος (Multilocus Sequence Typing- MLST). Υποβολή των δεδομένων στις Ευρωπαϊκές και παγκόσμιες βάσεις δεδομένων των αποτελεσμάτων και σύγκρισή τους με αντίστοιχα στελέχη της Ευρώπης και του υπόλοιπου κόσμου, Pulsenet- Europe, MLST/Salmonella enterica. [96]

99 2.2 ΥΛΙΚΑ Υλικά-Υποστρώματα μεταφοράς στελεχών από τα Εργαστήρια Αναφοράς Ζωμός Trypticase Soy Broth Χρησιμοποιήθηκε ζωμός Trypticase Soy Broth (Merck, KGaA, Germany) για την ανακαλλιέργεια και μεταφορά των στελεχών από τα εργαστήρια αναφοράς, με την παρακάτω σύνθεση (ανά λίτρο υποστρώματος): Casein peptone (pancreatic) 17 g Soya peptone (papain digest.) 3 g Sodium chloride 5 g Dipotassium hydrogen phosphate 2,5 g Glucose 2,5 g To ph ήταν 7,3 ± 0,2 στους 37 C. Για την παρασκευή του αναμιγνύονταν 30 g έτοιμης σκόνης σε 1 lt απεσταγμένου νερού, μέχρι να επιτευχθεί πλήρης διάλυση της σκόνης. Ακολουθούσε αποστείρωση του υλικού σε αυτόκαυστο στους 121 C για 15 min και μετά την πτώση της θερμοκρασίας του στους 45 C σε υδατόλουτρο, ακολουθούσε διανομή 500μl, υπό άσηπτες συνθήκες, σε αποστειρωμένα φιαλίδια τύπου eppendorf χωρητικότητας 1,7 ml. Τα φιαλίδια τύπου eppendorf χρησιμοποιήθηκαν για την ανακαλλιέργεια και μεταφορά των στελεχών από τα εργαστήρια αναφοράς. Η διατήρηση γίνονταν στους 4 C. [97]

100 Διάλυμα γλυκερόλης Χρησιμοποιήθηκε εμπορικό διάλυμα γλυκερόλης 85%. Μετά από προσθήκη απεσταγμένου νερού και ανάμιξη παρασκευάστηκε μητρικό διάλυμα 30%. Ακολουθούσε αποστείρωση του υλικού σε αυτόκαυστο στους 121 C για 15 min και μετά την πτώση της θερμοκρασίας του στους 45 C σε υδατόλουτρο και συντήρηση υπό ψύξη στους 4 C. Το διάλυμα αυτό χρησιμοποιήθηκε σε προσθήκη 1:1 στα αποστειρωμένα φιαλίδια τύπου eppendorf έτσι ώστε η συγκέντρωση στο τελικό διάλυμα να ανέλθει στο 15% Υλικά-Υποστρώματα ανακαλλιέργειας Σαλμονελών MacConkey agar Χρησιμοποιήθηκε το υπόστρωμα MacConkey agar (Becton & Dickinson, Cockeysville, MD, USA) για την ανακαλλιέργεια και καθαροποίηση των στελεχών που λήφθηκαν από τα εργαστήρια αναφοράς με την ακόλουθη σύσταση: Pancreatic digest of gelatin 17g Peptones (meat and casein) 3g Lactose 10g Bile Salts 1,5g Sodium Chloride 5 g Agar 13,5 g Neutral Red 0,03 g Crystal Violet 1 mg [98]

101 To ph ήταν 7,2 ± 0, 3 στους 25 C. Για την παρασκευή του αναμιγνύονταν 50 g έτοιμης σκόνης με 1 lt απεσταγμένου νερού σε θερμοκρασία βρασμού για να επιτευχθεί η πλήρης διάλυση της σκόνης. Ακολουθούσε αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 C για 15 min. Μετά την αποστείρωση και την πτώση της θερμοκρασίας του στους 45 C σε υδατόλουτρο, ακολουθούσε διανομή ανά 20-25ml περίπου σε αποστειρωμένα τρυβλία τύπου Petri διαμέτρου 90mm. Μετά από δοκιμαστική επώαση στους 37 C για ώρες τα επιμολυσμένα απορρίπτονταν, ενώ τα υπόλοιπα διατηρούνταν στους 4 C Trypticase Soy Agar Χρησιμοποιήθηκε το υπόστρωμα Trypticase Soy Agar (Merck, KGaA, Germany) για την ανακαλλιέργεια των στελεχών και την εφαρμογή της Ηλεκτροφόρησης Εναλλασσόμενου Ηλεκτρικού Πεδίου (PFGE). Το υπόστρωμα είχε την παρακάτω σύσταση. Casein peptone (pancreatic) 15 g Soya peptone (papain) 5 g Sodium chloride 5 g Agar 15 g To ph του ζωμού ήταν 7,3 ± 0, 2 στους 25 C. Για την παρασκευή του αναμιγνύονταν 40 g έτοιμης σκόνης με 1 lt απεσταγμένου νερού σε θερμοκρασία βρασμού για να επιτευχθεί η πλήρης διάλυση της σκόνης. Ακολουθούσε αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 C για 15 min. Μετά την αποστείρωση και την πτώση της θερμοκρασίας του στους 45 C σε υδατόλουτρο, ακολουθούσε διανομή ανά ml περίπου σε αποστειρωμένα τρυβλία τύπου Petri διαμέτρου 90 mm. Μετά από [99]

102 δοκιμαστική επώαση στους 37 C για ώρες τα επιμολυσμένα απορρίπτονταν, ενώ τα υπόλοιπα διατηρούνταν στους 4 C Μελέτη της ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά Υδατικό διάλυμα NaCl Χρησιμοποιήθηκε υδατικό διάλυμα NaCl για την παρασκευή του αρχικού εναιωρήματος βακτηρίων με σύνθεση: NaCl 8,5 g Απεσταγμένο νερό έως 1000 ml Μετά τη διάλυση του NaCl σε 1 lt απεσταγμένου νερού σε θερμοκρασία βρασμού για να επιτευχθεί η πλήρης διάλυση, ακολουθούσε διανομή σε γυάλινα σωληνάρια των 20 ml με μεταλλικό πώμα ανά 10 ml και έπειτα αποστείρωση του υλικού σε αυτόκαυστο στους 115 C για 10 min. Η διατήρησή τους μέχρι τη χρησιμοποίηση γινόταν στους 4 C Υπόστρωμα Mueller-Hinton Χρησιμοποιήθηκε το υπόστρωμα Mueller-Hinton (Beckton Dickinson, Cοckeysville, MD, USA) για τον έλεγχο της ευαισθησίας των σαλμονελών σε 20 αντιμικροβιακές ουσίες, με τη μέθοδο διάχυσης του αντιβιοτικού σε άγαρ [40]. Το υπόστρωμα είχε την παρακάτω σύνθεση (ανά λίτρο υποστρώματος): Beef extract 2g [100]

103 Caseine Hydrolsate Starch Agar 17,5 g 1,5 g 17 g To ph ήταν 7,3 ± 0,2 στους 25 C. Για την παρασκευή του αναμιγνύονταν 38 g έτοιμης σκόνης με 1 lt απεσταγμένου νερού, μέχρι να επιτευχθεί η πλήρης διάλυση της. Ακολουθούσε διανομή του ανά 100 ml σε φιαλίδια με βιδωτό πώμα και αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 C για 15 min. Μετά την αποστείρωση και την πτώση της θερμοκρασίας του θρεπτικού υποστρώματος στους 45 C, σε υδατόλουτρο, προστίθετο κατάλληλη ποσότητα μητρικού διαλύματος αντιβιοτικού. Μετά από ανακίνηση γινόταν διανομή ml σε τρυβλία πετρί διαμέτρου 90 mm. Μετά την πήξη του υποστρώματος, τα τρυβλία διατηρούνταν στους 4 C για διάστημα το πολύ 2 ημερών Στελέχη αναφοράς Ως στελέχη αναφοράς για τη μελέτη της ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά χρησιμοποιήθηκαν τα στελέχη Staphylococccus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC και Pseudomonas aeruginosa ATCC Μητρικά Διαλύματα των αντιμικροβιακών ουσιών Χρησιμοποιήθηκαν σκόνες αντιβιοτικών σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: (Πίνακας 5). Η διάλυσή τους έγινε σε μητρικά [101]

104 διαλύματα H2O ή κατάλληλου διαλύτη με βάση τη δραστικότητα (potency) της κάθε ουσίας, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πίνακας 5: Αντιμικροβιακές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα έρευνα ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΤΗΣ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΑ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ BREAKPOINT 1 Amikacin dh20 Ak Ampicillin trihydrate 3 Cefotaxime sodium salt MG/LT PBS pa, A , 128 dh20 Ct Ceftriaxone dh20 Cn Cefuroxime sodium salt dh20 Cf Cephalexin dh20 Cx Cephradine dh20 Cr Chloramphenicol 35mlEtOH/15ml dh20 C Ciprofloxacin dh20 C, pcp , Colistin sulfate salt dh20 Co Furazolidone ph=8 buffer Fu Gentamicin sulfate 13 Kanamycin disulfate salt 14 Nalidixic acid sodium salt dh20 G dh20 K dh20 Nx Neomycin sulfate dh20 Ne Spectinomycin dh20 Sp Streptomycin sulfate salt dh20 ps1, S 777 8, Sulfathiazole dh20 Su Tetracycline dh20 pt, T , Trimethoprim dh20 Tm [102]

105 2.2.4 Ηλεκτροφόρηση εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) Θολωσίμετρο Χρησιμοποιήθηκε το θολωσίμετρο DEN-1A (Biosan) για τον έλεγχο της θολερότητας του εναιωρήματος των σαλμονελών Ρυθμιστικό διάλυμα εναιώρησης - (Cell Suspension Buffer-CSB) Το ρυθμιστικό διάλυμα Cell Suspension Buffer, που χρησιμοποιούνταν για την παρασκευή του αρχικού εναιωρήματος βακτηρίων παρασκευάζονταν από τα παρακάτω υλικά: EDTA 0.5M ph8.0 (UltraPure, Invitrogen) Tris 1M ph 8.0 (UltraPure, Invitrogen) Distilled Water (UltraPure, DNase/RNase-Free, Invitrogen) 10 ml 20 ml 70 ml Πηκτή αγαρόζης Χρησιμοποιήθηκε αγαρόζη υψηλής καθαρότητας Seakem Gold (Lonza) για την παρασκευή των εκμαγείων (blocks) αγαρόζης σε συγκέντρωση 1% κ.β. [103]

106 Μήτρες-Εκμαγεία - plugmolds Χρησιμοποιήθηκαν ειδικές μήτρες - εκμαγεία πολυστυρενίου (Disposable Plug Molds Biorad) με 10 φρεάτια η κάθε μία. Η μήτρα έφερε ενσωματωμένο ένα ειδικό έμβολο με δυνατότητα απόσπασης έτσι ώστε να προωθήσει τα μεμονωμένα εκμαγεία της αγαρόζης από τα φρεάτια σε σωληνάρια Πρωτεϊνάση Κ (proteinase K) Χρησιμοποιήθηκε Proteinase K Solution (20 mg/ml)(ambion ) για την πέψη των πρωτεϊνών Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης - (Lysis Buffer) Tris ph 8.0 (UltraPure, Invitrogen) EDTA 0.5M ph 8.0 (UltraPure, Invitrogen) N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sigma) Distilled Water (UltraPure,DNase/RNase-Free,Invitrogen) 50 ml 25 ml 25 ml 400 ml Στο διάλυμα λύσης ανά 5 ml προστέθηκαν 25 μl Proteinase K Solution (Ambion ) κατά τη στιγμή της χρησιμοποίησης. [104]

107 Ρυθμιστικό διάλυμα Tris EDTA - (TE) Tris ph 8.0 (UltraPure, Invitrogen) EDTA 0.5M ph 8.0 (UltraPure, Invitrogen) Distilled Water (UltraPure,DNase/RNase-Free, Invitrogen) 10 ml 2 ml 400 ml Ενδονουκλεάσες περιορισμού - (Restriction endonucleases) Χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω ενδονουκλεάσες μαζί με τους διαλύτες τους όπως περιλαμβάνονται στη συσκευασία [96]. XbaI (15 units/μl) (Takara) 2000 units BlnI (10 units/μl) (Takara) 500 units Πρότυπα στελέχη αναφοράς - Δείκτες μοριακών βαρών-(molecular weight laders) Χρησιμοποιήθηκε το στέλεχος Salmonella enterica ser. Braenderup ATCC H9812 ως δείκτης μοριακών βαρών και ταυτόχρονα ως πρότυπο αναφοράς για τη διευθέτηση των ηλεκτροφορητικών προτύπων (normalization) των στελεχών σαλμονελών, που βρίσκονταν σε διαφορετικές πηκτές αγαρόζης [96] Γέλη ηλεκτροφόρησης Για την παρασκευή της γέλης ηλεκτροφόρησης (100 ml) χρησιμοποιούνταν διάλυμα Tris/Boric Acid/EDTA (TBE) και αγαρόζη: [105]

108 TBE 10X (Biorad) 5 ml Distilled Water (UltraPure, DNase/RNase-Free, Invitrogen) 95 ml SeaKem Gold (Lonza ) 1g Διάταξη ηλεκτροφόρησης Η διάταξη ηλεκτροφόρησης CHEF-DR III system (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA) χρησιμοποιήθηκε για την ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο πεδίο Συνθήκες ηλεκτροφόρησης Οι συνθήκες ηλεκτροφόρησης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: (συστηνόμενες από το δίκτυο Pulsenet Europe [96]) Initial time Final time Voltage Included Angle Run time 2.2 sec 63.8 sec 6V 120 o 19h Χρώση πηκτής αγαρόζης Η χρώση της γέλης ηλεκτροφόρησης γινόταν με διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου (10 μg/ml, Invitrogen). [106]

109 Φωτογράφιση της πηκτής αγαρόζης Χρησιμοποιήθηκε η αυτόματη διάταξη GelDoC -It 310 Imager Πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος (Multilocus Sequence Typing- MLST) Το σχήμα για την πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος στη Salmonella enterica χρησιμοποιεί τμήματα του γενετικού υλικού, τα οποία περιλαμβάνουν επτά γονίδια του βασικού μεταβολισμού (Πίνακας 6). Χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο που περιλαμβάνει τα επτά γονίδια όπως αναφέρονται στη διεθνή βάση MLST: Πίνακας 6: Γονίδια που μελετήθηκαν κατά την Πολυτοπική Ανάλυση Νουκλεοτιδικής Αλληλουχίας (MLST) thra (aspartokinase+homoserine dehydrogenase) pure (phosphoribosylaminoimidazole carboxylas) suca (alpha ketoglutarate dehydrogenase) hisd (histidinol dehydrogenase) aroc (chorismate synthase) hemd (uroporphyrinogen III cosynthase) dnan (DNA polymerase III beta subunit) Εκχύλιση του DNA των στελεχών Χρησιμοποιήθηκε το εμπορικό kit εκχύλισης βακτηριακού υλικού QIAamp DNA Mini kit. [107]

110 Μέτρηση της ποσότητας του απομονωθέντος DNA Χρησιμοποιήθηκε το μηχάνημα NanoDrop 2000 Spectrophotometer της εταιρείας Thermo-Scientific σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης - PCR Για την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω εκκινητές (Πίνακας 7). [108]

111 (PCR) Πίνακας 7: Εκκινητές και γονίδια για την Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Γονίδιο thra F thra R1 pure F pure R suca F suca R hisd F hisd R aroc F aroc R hemd F hemd R dnan F dnan R Εκκινητής GTCACGGTGATCGATCCGGT GTGCGCATACCGTCGCCGAC ATGTCTTCCCGCAATAATCC TCATAGCGTCCCCCGCGGATC AGCACCGAAGAGAAACGCTG GGTTGTTGATAACGATACGTAC GAAACGTTCCATTCCGCGCAGAC CTGAACGGTCATCCGTTTCTG CCTGGCACCTCGCGCTATAC CCACACACGGATCGTGGCG ATGAGTATTCTGATCACCCG ATCAGCGACCTTAATATCTTGCCA ATGAAATTTACCGTTGAACGTGA AATTTCTCATTCGAGAGGATTGC PCR mix Για την κάθε PCR χρησιμοποιήθηκε το παρακάτω μίγμα: 2X Platinum PCR Super Mix High Fidelity (Invitrogen) PrimerF PrimerR dh2o DNA 20 ul 1 ul 1 ul 17 ul 1 ul [109]

112 Διάταξη PCR- θερμοκυκλοποιητής Χρησιμοποιήθηκε ο αυτόματος θερμοκυκλοποιητής PCR Veriti 384-Well Thermal Cycler της εταιρείας Applied Biosystems Ηλεκτροφόρηση προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης Για την επιβεβαίωση της μεγέθυνσης των τμημάτων DNA που ενισχύθηκαν έτσι ώστε να οδηγηθούν στο επόμενο στάδιο σε αλληλούχιση, χρησιμοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση των προϊόντων ενίσχυσης. Για την επιβεβαίωση αυτή χρησιμοποιήθηκαν: UltraPure Agarose (Invitrogen ) σε συγκέντρωση 1% στη γέλη Ethidium Bromide (EtBr) Dye for DNA and RNA Detection TrackIt 1 Kb plus DNA Ladder (Invitrogen ) BlueJuice Gel Loading Buffer (10X) (Invitrogen ) PCR product purification Χρησιμοποιήθηκε το USB ExoSAP-IT PCR Product Cleanup σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή Αλληλούχιση των γονιδίων βασικού μεταβολισμού Η αλληλούχιση των γονιδίων βασικού μεταβολισμού έγινε χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές όπως περιγράφονται στη διεθνή βάση (Πίνακας 8) [110]

113 Πίνακας 8: Γονίδια και εκκινητές για την αλληλούχιση των γονιδίων βασικού μεταβολισμού Γονίδιο thra sf thra sr pure sf pure sr hisd sf hisd sr aroc sf aroc sr hemd sf hemd sr dnan sf dnan sr suca F suca R Εκκινητής αλληλούχισης ATCCCGGCCGATCACATGAT CTCCAGCAGCCCCTCTTTCAG CGCATTATTCCGGCGCGTGT CGCGGATCGGGATTTTCCAG GTCGGTCTGTATATTCCCGG GGTAATCGCATCCACCAAATC GGCACCAGTATTGGCCTGCT CATATGCGCCACAATGTGTTG GTGGCCTGGAGTTTTCCACT GACCAATAGCCGACAGCGTAG CCGATTCTCGGTAACCTGCT CCATCCACCAGCTTCGAGGT AGCACCGAAGAGAAACGCTG GGTTGTTGATAACGATACGTAC Διάταξη αλληλούχισης - Sequencing platforms Χρησιμοποιήθηκε η διάταξη αλληλούχισης τα μηχανήματα και ABI Genetic Analyser Platform 3130XL (Applied Biosystems) Ορισμός MLST τύπων Η επεξεργασία των δεδομένων αλληλούχισης πραγματοποιήθηκε με χρήση του λογισμικού Sequence Scanner Software v1.0 (Applied Biosystems). Ακολούθως για τον καθορισμό των MLST τύπων έγινε [111]

114 υποβολή των δεδομένων στη βάση Λυσιτυπία Θρεπτικός ζωμός - (Double strength nutrient broth) Χρησιμοποιήθηκε ζωμός Double strength nutrient broth (Difco) για την παρασκευή του αρχικού διαλύματος βακτηρίων με σύνθεση: Bacto dehydrated nutrient broth (Difco) 20 g NaCl 8.5 g Απεσταγμένο νερό ως 1000 ml Μετά τη διάλυση της σκόνης του υποστρώματος ακολουθούσε διανομή σε γυάλινα σωληνάρια των 20 ml με μεταλλικό πώμα, ανά 10 ml και έπειτα αποστείρωση του υλικού σε αυτόκαυστο στους 115 C για 10 min. Η διατήρησή τους μέχρι τη χρησιμοποίηση γινόταν στους 4 C Θρεπτικό υπόστρωμα-(nutrient agar) Χρησιμοποιήθηκε το υπόστρωμα Nutrient agar (Difco) με την παρακάτω σύσταση. Bacto dehydrated nutrient broth (Difco) 20 g NaCl 8.5 g Bacto agar dyhydrated (Difco) 13 g Απεσταγμένο νερό έως 1000 ml Για την παρασκευή του αναμιγνύονταν 41.5 g έτοιμης σκόνης με 1 lt απεσταγμένου νερού σε θερμοκρασία βρασμού για να επιτευχθεί η [112]

115 πλήρης διάλυση της σκόνης. Ακολουθούσε αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 C για 15 min. Μετά την αποστείρωση και την πτώση της θερμοκρασίας του στους 45 C σε υδατόλουτρο, ακολουθούσε διανομή ανά 30 ml περίπου σε αποστειρωμένα τρυβλία τύπου Petri διαμέτρου 90 mm. Μετά από δοκιμαστική επώαση στους 37 C για ώρες, τα επιμολυσμένα απορρίπτονταν, ενώ τα υπόλοιπα διατηρούνταν στους 4 C Συλλογή φάγων Χρησιμοποιήθηκαν εναιωρήματα των εννέα φάγων που χρησιμοποιούνται στο Κέντρο Αναφοράς του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (WHO) για τη λυσιτυπία των σαλμονελών, Salmonella Reference Service, Laboratory of Gastrointestinal Pathogens, Public Health England, Colindale, London, UK (former Health Protection Agency).(Εικόνα 6) Εικόνα 6: Εφαρμογή λυσιτυπίας [113]

116 [114]

117 2.3 ΜΕΘΟΔΟΙ Λήψη και μεταφορά των στελεχών από τα εργαστήρια αναφοράς Για τη μεταφορά των σαλμονελών από τα εργαστήρια αναφοράς χρησιμοποιούνταν ο ζωμός TSYE broth. Συγκεκριμένα ποσότητα 5-10 μl από το κάθε στέλεχος μεταφερόταν, με χρήση μικροβιακού κρίκου, από την τράπεζα στελεχών των παραπάνω εργαστηρίων σε φιαλίδιο τύπου eppendorf, που περιείχε 500 μl ζωμό Trypticase Soy broth. Ακολούθως, τοποθετούνταν στον επωαστικό κλίβανο, σε θερμοκρασία 37 C για ώρες. Μετά την ανάπτυξη του στελέχους στο θρεπτικό ζωμό (θόλωση), προσθέτονταν ίση ποσότητα αποστειρωμένου διαλύματος γλυκερόλης 30 %, έτσι ώστε η αναλογία της γλυκερόλης στο τελικό διάλυμα να φτάσει περίπου στο 15%. Ακολουθούσε συντήρηση σε συνθήκες βαθιάς κατάψυξης (-80 C) Ανακαλλιέργεια και καθαροποίηση των στελεχών. Για την ανακαλλιέργεια και διερεύνηση τυχόν επιμόλυνσης των στελεχών χρησιμοποιούνταν το θρεπτικό υλικό MacConkey agar (Becton & Dickinson, CoCkeysville, MD, USA). Από το εναιώρημα των βακτηρίων μετά από απόψυξη γινόταν σπορά στο υπόστρωμα, με τη βοήθεια μικροβιολογικού κρίκου, και ακολουθούσε επώαση σε θερμοκρασία 37 C για ώρες. Αναζητούνταν οι τυπικές αποικίες της σαλμονέλας, ενώ γινόταν εκτίμηση ενδεχόμενης επιμόλυνσης από άλλα βακτήρια. Στη συνέχεια 2-3 τυπικές αποικίες ενοφθαλμίζονταν σε τρυβλίο με Trypticase [115]

118 Soy Agar (Merck, KGaA, Germany). Από το τρυβλίο αυτό λαμβάνονταν βακτήρια για την εφαρμογή όλων των τεχνικών που χρησιμοποιήθηκαν (μελέτη αντιμικροβιακής αντοχής, ηλεκτροφόρηση εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου, λυσιτυπία, πολυτοπική ανάλυση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας) ενώ λαμβανόταν ικανή ποσότητα για την εκ νέου διατήρηση των στελεχών στους -80 C Μελέτη αντοχής στις αντιμικροβιακές ουσίες Όλα τα στελέχη των σαλμονελών εξετάστηκαν ως προς την ανθεκτικότητά τους με τη μέθοδο διάχυσης των αντιμικροβιακών στο άγαρ, χρησιμοποιώντας διαλύματα αντιμικροβιακών ουσιών ενσωματωμένα στο θρεπτικό υπόστρωμα [39, 40]. Σε κάθε έλεγχο τα στελέχη Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC και Pseudomonas aeruginosa ATCC χρησιμοποιούνταν ως στελέχη αναφοράς Παρασκευή ενοφθαλμίσματος Από καθαρή 24ωρη καλλιέργεια σαλμονέλας στο υπόστρωμα Trypticase Soy agar λαμβανόταν 4-5 αποικίες οι οποίες εναιωρούνταν σε 10 ml στείρου υδατικού διαλύματος 0,85% NaCl. Στη συνέχεια, μετά από προσεκτική ανακίνηση, ρυθμιζόταν η θολερότητα, με τη χρήση θολωσίμετρου και προσθήκη κατάλληλης ποσότητας του παραπάνω υδατικού διαλύματος, στο 0,5 της κλίμακας Mc Farland, με βάση την [116]

119 οποία γινόταν η εκτίμηση του πληθυσμού των βακτηρίων, περίπου 10 4 cfu/ 1ml Προετοιμασία μητρικών διαλυμάτων αντιμικροβιακών ουσιών Για την παρασκευή του μητρικού διαλύματος λαμβάναμε υπόψιν την δραστικότητα (potency) της αντιμικροβιακής ουσίας σύμφωνα με τον παρακάτω μαθηματικό τύπο. Volume (ml) = Weight (mg) x Potency (mg/g) / Concentration (mg/l) Η σκόνες των αντιμικροβιακών ουσιών διαλύονταν σε κατάλληλο διαλύτη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, με τη συγκέντρωσή τους να ρυθμίζεται στα 2 mg/ ml. Ακολούθως κατανέμονταν σε φιαλίδια τύπου eppendorf σε ποσότητα 100 μl και αποθηκεύονταν σε συνθήκες κατάψυξης -20 C μέχρι τη χρήση τους Εφαρμογή της μεθόδου Σε φιαλίδια που περιείχαν 100 ml αποστειρωμένο Mueller Hinton agar, θερμοκρασίας περίπου 45 C, γίνονταν προσθήκη κατάλληλης ποσότητας διαλύματος χρήσης αντιβιοτικού, ακολουθούσε προσεκτική ανακίνηση και διανομή ανά ml σε τρυβλία τύπου petri των 90mm. Τα τρυβλία αφήνονταν να στεγνώσουν και αποθηκεύονταν στους 4 C μέχρι τη χρήση τους. Στην εξωτερική επιφάνεια του τρυβλίου γινόταν σήμανση με αριθμούς σε 36 θέσεις και ακολουθούσε ενοφθαλμισμός με μικροπιπέτα ποσότητας περίπου 1 μl από το εναιώρημα των βακτηριακών κυττάρων. Στις τρείς τελευταίες θέσεις γινόταν ενοφθαλμισμός των στελεχών αναφοράς. Για κάθε ομάδα στελεχών που [117]

120 εξετάζονταν χρησιμοποιούνταν 25 τρυβλία, 24 με αντιμικροβιακές ουσίες και ένα ως θετικός μάρτυρας, χωρίς δηλαδή την προσθήκη αντιβιοτικού. Τα τρυβλία, αφού στέγνωναν, αναστρέφονταν και ακολουθούσε επώαση στους 37 C για ώρες Ανάγνωση του αποτελέσματος Η ανάγνωση του αποτελέσματος γινόταν με βάση την ανάπτυξη ή όχι του κάθε στελέχους στη συγκεκριμένη συγκέντρωση της αντιμικροβιακής ουσίας. Συγκρινόταν επίσης με την ανάπτυξη ή όχι στο τρυβλίο με θετικό μάρτυρα, στο οποίο δεν είχε ενσωματωθεί αντιμικροβιακή ουσία. Ο χαρακτηρισμός «ευαίσθητο» ή «ανθεκτικό» γινόταν με βάση την ανάπτυξη ή όχι στο θρεπτικό υπόστρωμα. Ο χαρακτηρισμός της συχνότητας ακολούθησε τον παρακάτω πίνακα. (Πίνακας 9) Πίνακας 9: Χαρακτηρισμός αντοχής στις αντιμικροβιακές ουσίες ομάδων στελεχών με βάση τη συχνότητα εμφάνισης αντοχής. Χαρακτηρισμός Σπάνια <0.1% Πολύ χαμηλή >0.1% 1% Χαμηλή >1% 10% Μέση >10% 20% Υψηλή >20% 50% Πολύ υψηλή >50% 70% Εξαιρετικά υψηλή >70% [118]

121 2.3.4 Ηλεκτροφόρηση Εναλλασσόμενου Ηλεκτρικού πεδίου (PFGE) In situ προετοιμασία του γονιδιακού DNA Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για την in situ προετοιμασία του γονιδιωματικού DNA των σαλμονελών και τον εγκλεισμό του σε εκμαγεία (blocks) αγαρόζης, αποτελεί μια τροποποίηση της μεθοδολογίας που προτυποποιήθηκε από τους Ribot και συν. στο CDC [163]. Συγκεκριμένα, μετά από ανακαλλιέργεια των στελεχών σε κοινό θρεπτικό υπόστρωμα, 3-4 αποικίες διαλύονταν ομοιογενώς με τη βοήθεια μικροβιακού κρίκου μιας χρήσης σε 5 ml διαλύματος cell suspension buffer. Μετά από προσεκτική εναιώρηση ρυθμιζόταν η οπτική πυκνότητα στο 0,5 της κλίμακας McFarland με τη βοήθεια του θολωσίμετρου. Ακολουθούσε μεταφορά 200 μl σε αποστειρωμένα φιαλίδια τύπου eppendorf. Στο εναιώρημα γινόταν προσθήκη 10 μl διαλύματος πρωτεϊνάσης Κ και αναμιγνυόνταν με 200 μl διαλύματος αγαρόζης 2% κ.β θερμοκρασίας 55 C. Το μίγμα του εναιωρήματος των κυττάρων και της αγαρόζης τοποθετούνταν σε ειδικές μήτρες που παρέμεναν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για περίπου 30 min προς στερεοποίηση για το σχηματισμό των εκμαγείων της αγαρόζης. Στη συνέχεια τα στερεοποιημένα εκμαγεία απομακρύνονταν με ειδικό έμβολο και τοποθετούνταν σε φιαλίδια για την πραγματοποίηση της λύσης των εγκλεισμένων βακτηριακών κυττάρων των σαλμονελών. Τα δύο εκμαγεία, από κάθε στέλεχος που σχηματιζόταν, εμβαπτίζονταν σε 5 ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης, το οποίο περιείχε 25 μl διαλύματος πρωτεϊνάσης Κ. Η λύση πραγματοποιούνταν σε υδατόλουτρο, σε θερμοκρασία 55 C υπό κίνηση, για περίπου 4 ώρες. [119]

122 Ακολουθούσε η διαδικασία απομάκρυνσης της πρωτεϊνάσης Κ, καθώς και των πρωτεϊνικών συγκριμάτων από τα εκμαγεία αγαρόζης με τη διαδικασία των διαδοχικών πλύσεων, δύο φορές σε απεσταγμένο νερό και τέσσερις φορές σε διάλυμα TE σε θερμοκρασία 55 C. Ακολούθως τα εκμαγεία τοποθετούνταν σε 5 ml διαλύματος ΤΕ και αποθηκεύονταν στους 4 C μέχρι να χρησιμοποιηθούν In situ πέψη του DNA Πριν από τη διαδικασία της πέψης τα εκμαγεία της αγαρόζης τεμαχίζονταν σε τμήματα κατάλληλου μεγέθους και παρέμεναν για 15 min σε θερμοκρασία δωματίου σε 200 μl διαλύματος το οποίο περιείχε 10% M buffer σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια απομακρύνονταν το διάλυμα και τοποθετούνταν εκ νέου άλλα 200 μl του ίδιου διαλύματος στο οποίο επιπλέον είχαν προστεθεί 3 μl XbaI (45 units) ή 3 μl BlnI (30 units) και 3 μl BSA. Επιπρόσθετα, κάθε φορά στην ίδια διαδικασία υποβάλλονταν και 4 εκμαγεία από το πρότυπο στέλεχος Salmonella ser. Braederup H9812 μόνο όμως με το XbaI. Τα φιαλίδια τοποθετούνταν στους 37 C για τουλάχιστον 2 ώρες έτσι ώστε να ολοκληρωθεί πέψη με τη δράση του περιοριστικού ενζύμου τόσο για τα υπό μελέτη στελέχη όσο και για το πρότυπο στέλεχος Ηλεκτροφόρηση Εναλλασσόμενου Ηλεκτρικού Πεδίου (PFGE) Για το διαχωρισμό των θραυσμάτων (προϊόντων πέψης) του γονιδιωματικού DNA που προέκυπτε από τη δράση των ενζύμων περιορισμού XbaI ή BlnI και κατ επέκταση για τον προσδιορισμό των [120]

123 ηλεκτροφορητικών προτύπων (παλσότυπων) των σαλμονελών, διενεργούνταν ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο. Σε κατάλληλη διάταξη ηλεκτροφόρησης τα προϊόντα της πέψης διαχωρίζονταν σε πηκτή αγαρόζης 1% κβ σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ 0,5Χ, υπό σταθερή τάση 220V και μεσοδιάστημα γραμμικού χρόνου μεταστροφής από 2,2 ως 63,8 sec (linear switch time rump), γωνία πεδίου 120 o, στους 14 C για 19 ώρες. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πηκτές της αγαρόζης χρωματίζονταν για τουλάχιστον 15 min σε διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου 5 μg/ml σε H2O με απαλή ανακίνηση και στη συνέχεια αποπλένονταν σε H2O για 30 min, έτσι ώστε να απομακρυνθούν τα υπολείμματα χρωστικής. Ακολουθούσε έκθεση των ηλεκτροφορημμάτων σε υπεριώδη ακτινοβολία ( nm) και ψηφιακή αποτύπωσή τους με σύστημα ανάλυσης εικόνας GelDoC -It 310 Imager. Κατά την ηλεκτροφόρηση, το γονιδιωματικό DNA κάθε στελέχους αναλυόταν σε ζώνες ανάλογα με το μέγεθος των θραυσμάτων που προέκυπταν από τη δράση του περιοριστικού ενζύμου XbaI. Τέλος, με βάση το πρότυπο στέλεχος ως δείκτη μοριακών βαρών αναγνωρίζονταν και συγκρίνονταν (normalization) τα ηλεκτροφορητικά πρότυπα του DNA των στελεχών των σαλμονελών. Για τον ορότυπο Salmonella ser. Enteritidis, εκτός από πέψη με το περιοριστικό ένζυμο XbaI, η ίδια διαδικασία επαναλήφθηκε χρησιμοποιώντας 30 units του περιοριστικού ενζύμου BlnI (AvrII) Ανάλυση των PFGE ηλεκτροφορητικών προτύπων - στατιστική ανάλυση. Τα ηλεκτροφορητικά πρότυπα (παλσότυποι) του DNA των στελεχών μετά την ψηφιακή τους καταγραφή, επεξεργάζονταν με τη [121]

124 χρήση του λογισμικού προγράμματος Fingerprinting II version 3.0 (Bio- Rad Laboratories, Inc., USA) και Bionumerics 6.1 (Sant Martens, Belgium). Η ομαδοποίηση επιτυγχανόταν με τη μέθοδο των ροπών χρησιμοποιώντας το συντελεστή συσχέτισης του Dice, καθώς και με την ανάλυση κατά συστάδες με τη μη σταθμισμένη μέθοδο ομάδων ζευγών, με αριθμητικούς μέσους όρους (unweighted pair group method with arithmetic average, UPGMA). Χρησιμοποιήθηκαν ως συντελεστές ανοχής (tolerance- παραλλακτικότητα θεώρησης δύο μπαντών ως ταυτοσήμων) η τιμή 1,5% καθώς και ως συντελεστής βελτιστοποίησης (optimization, ανοχή κατακόρυφης μετακίνησης ολόκληρου του μοτίβου των θραυσμάτων στην πηκτή αγαρόζης) η τιμή 1,5% Λυσιτυπία Τα στελέχη των σαλμονελών ανακαλλιεργούνταν και ενοφθαλμίζονταν σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα Double strength nutrient broth και αφήνονταν να αναπτυχθούν όπως αναφέρθηκε παραπάνω για τη μελέτη της αντιμικροβιακής αντοχής. Ακολούθως ποσότητα περίπου 3 ml από το βακτηριακό εναιώρημα κατέκλυε την επιφάνεια τρυβλίου με Nutrient agar, με χρήση αποστειρωμένης πιπέτας και στη συνέχεια η περίσσεια απορριπτόταν. Τα τρυβλία αφήνονταν να στεγνώσουν για μερικά λεπτά και στη συνέχεια πραγματοποιούνταν η προσθήκη ποσότητας περίπου 10 μl του αραιωμένου εναιωρήματος χρήσης των φάγων σε συγκεκριμένες θέσεις χρησιμοποιώντας ειδική διάταξη ενοφθαλμισμού. (Εικόνα 6) [122]

125 Τα τρυβλία στη συνέχεια αφήνονταν να στεγνώσουν και τοποθετούνταν σε επωαστικό κλίβανο θερμοκρασίας 37 C για ώρες. Η ανάγνωση των αντιδράσεων με τους φάγους γινόταν με τη βοήθεια λαμπτήρα πυρακτώσεως. Οι αντιδράσεις με τους φάγους εκτιμήθηκαν και βαθμολογήθηκαν με βάση τις θετικές και αρνητικές αντιδράσεις καθώς και το μέγεθος των πλακών αντίδρασης, με βάση τον παρακάτω πίνακα. (Πίνακας 10) Πίνακας 10: Ποιοτική εκτίμηση αντιδράσεων με φάγους Clear Lysis (Confluent Lysis) Opaque Lysis Plaque size CL OL L= Large CL. OL. N= Normal <CL <OL S= Small SCL (Semi-confluent Lysis) m= Minute <SCL μ= Micro +++ Over 100 plaques plaques plaques plaques plaques plaques 1-5 plaques - no plaques Ακολούθως το συνολικό αποτέλεσμα του συνδυασμού λύσης με φάγους καταγραφόταν και συγκρινόταν με πρότυπους λυσίτυπους του Εργαστηρίου Αναφοράς του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας για τη λυσιτυπία των σαλμονελών Salmonella Reference Service, Laboratory of Gastrointestinal Pathogens, Public Health England, Colindale, London, UK (former Health Protection Agency) έτσι ώστε να καθοριστεί ο λυσίτυπος των στελεχών. [123]

126 2.3.6 Πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος - (Multilocus Sequence Typing-MLST) Για την πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος σε πρώτο στάδιο πραγματοποιούνταν απομόνωση του DNA από το υπό εξέταση στέλεχος. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνταν το εμπορικό kit QIAamp DNA Mini kit. Συγκεκριμένα, μετά την ανάπτυξη των βακτηριακών καλλιεργειών σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα Double strength nutrient broth, 1,5 ml της καλλιέργειας μεταφερόταν σε μικροσωληνάρια τύπου eppendorf, όπου τα βακτηριακά κύτταρα συλλέγονταν με φυγοκέντρηση (8.000 x g για 5 min). Τα κύτταρα του ιζήματος στη συνέχεια υφίσταντο την επεξεργασία των σταδίων λύσης, δέσμευσης του βακτηριακού γονιδιωματικού DNA στις μικροστήλες, έκπλυσης και αποδέσμευσής του ακολουθώντας τις συστηνόμενες οδηγίες. Η μέτρηση της ποσότητας του βακτηριακού DNA γινόταν με τη βοήθεια φωτόμετρου (NanoDrop 2000) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τέλος, το βακτηριακό DNA συλλεγόταν σε αποστειρωμένα σωληνάρια τύπου eppendorf και αποθηκευόταν στους - 18 C μέχρι τη χρήση του. H ενίσχυση των επτά τμημάτων που προσδιορίζουν τα γονίδια του βασικού μεταβολισμού με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) πραγματοποιούνταν σύμφωνα με πρότυπη μεθοδολογία σε 40 μl του μίγματος της αντίδρασης [12]. Για την εκτέλεση των αντιδράσεων της PCR, σύμφωνα με τα υλικά, χρησιμοποιήθηκε ο αυτόματος θερμοκυκλοποιητής PCR Veriti 384-Well Thermal Cycler της εταιρείας Applied Biosystems. Οι συνθήκες της διαδικασίας αντιγραφής του DNA ήταν: [124]

127 o ένας κύκλος αρχικής αποδιάταξης του DNA στους 96 C για 50 sec o 29 κύκλοι που ο καθένας περιλάμβανε τρία στάδια: α) αποδιάταξη στους 96 C για 10 sec, β) πρόσδεση των εκκινητών στο DNA στόχο στους 58 C για 1 min, και γ) επιμήκυνση των εκκινητών στους 72 C για 1 min o ένας τελευταίος κύκλος επιμήκυνσης στους 72 C για 2 min. Ακολουθούσε ψύξη στους 4 C. Τα προϊόντα της PCR αναλύονταν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1,5% (w/v), παρουσία του δείκτη μοριακών βαρών Quick-Load 100 bp DNA Ladder (NEB). Η διαδικασία αυτή γινόταν για την επιβεβαίωση της ενίσχυσης των συγκεκριμένων περιοχών που αντιστοιχούσαν στα γονίδια του βασικού μεταβολισμού. Ως ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιούνταν το TAE 1X. Στις θέσεις υποδοχής της πηκτής τοποθετούνταν 9 μl προϊόντος PCR αφού είχε προηγηθεί η ανάμιξή του με 4 μl χρωστικής κυανού της βρωμοφαινόλης. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιούνταν σε συσκευή οριζόντιας ηλεκτροφόρησης (Bio-Rad Laboratories, Inc) με σταθερή τάση λειτουργίας 110V για 90 min. Τέλος, η πηκτή αγαρόζης χρωματιζόταν για 30 min με βρωμιούχο αιθίδιο 5 μg/ml και ξεπλενόταν σε dh2o για 30 min με απαλή ανακίνηση, για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα χρωστικής. Ακολουθούσε έκθεση της πηκτής αγαρόζης σε υπεριώδη ακτινοβολία σε τράπεζα φθορισμού (White/UV transluminator, UPV) και ψηφιακή αποτύπωσή της με σύστημα ανάλυσης εικόνας UV Foto/Phoresis I (Fotodyne, USA). Ο προσδιορισμός του μεγέθους των προϊόντων γινόταν με τη χρήση κλίμακας Quick-Load 100 bp DNA Ladder (NEB). Μετά την [125]

128 επιβεβαίωση της παρουσίας των προϊόντων PCR ακολουθούσε καθαρισμός του προϊόντος από τυχόν υπολείμματα εκκινητών με χρήση του ExoSAP-IT PCR Product Cleanup με την ανάμιξη: o 2 ul ExoSap o 20 ul PCR product και επώαση στους 37 C για 30 min και ακολούθως στους 80 C για 10 min. Μετά από αυτήν τη διαδικασία οδηγούνταν στη διάταξη αλληλούχισης ABI Genetic Analyser Platform 3130XL (Applied Biosystems) για προσδιορισμό της ακολουθίας των βάσεων. Μετά την εξαγωγή των αποτελεσμάτων αλληλούχισης ακολουθούσε επεξεργασία των δεδομένων με χρήση του λογισμικού Sequence Scanner Software v1.0 (Applied Biosystems). Ως πρότυπο για τον ακριβή προσδιορισμό της αλληλουχίας των βάσεων των γονιδίων βασικού μεταβολισμού χρησιμοποιήθηκε το στέλεχος Salmonella ser. Typhi strain CT18. Ακολούθως τα δεδομένα αλληλούχισης υποβάλλονταν στη βάση δεδομένων MLST για τη Salmonella enterica ( με σκοπό τον προσδιορισμό του Sequencing Type και τη σύγκριση με τα άλλα στελέχη που έχουν υποβληθεί Στατιστική ανάλυση Η ανάλυση των δεδομένων έγινε σε προσωπικό ηλεκτρονικό υπολογιστή, με τη χρήση του στατιστικού προγράμματος Microsoft Excel. Για τον προσδιορισμό των στατιστικά σημαντικών διαφορών όπου χρειάστηκε χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία χ 2 (Pearson chi-square), καθώς [126]

129 και η δοκιμασία t-test. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας καθορίστηκε στο p<0,05. Για την PFGE χρησιμοποιήθηκαν τα στατιστικά προγράμματα Fingerprinting II version 3.0 (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA) και Bionumerics 6.1 (Sant Martens, Belgium).. [127]

130 [128]

131 2.3.8 ΣΤΕΛΕΧΗ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ Για τις ανάγκες της παρούσας διατριβής μελετήθηκαν συνολικά 532 στελέχη σαλμονελών τα οποία προέρχονταν από: Κλινικά υγιή και ασθενή ζώα Τρόφιμα ζωικής προέλευσης Κλινικά ασθενείς ανθρώπους Τα στελέχη αυτά που απομονώθηκαν στη χώρα μας την περίοδο στα πλαίσια των επισήμων ελέγχων και της επιδημιολογικής επιτήρησης, ταυτοποιήθηκαν από τα επίσημα εργαστήρια αναφοράς ως σαλμονέλες και ανήκουν στους ορότυπους Salmonella ser. Enteritidis, Salmonella ser., Salmonella ser. Hadar, Salmonella ser. Infantis και Salmonella ser. Virchow. Οι ορότυποι αυτοί είναι οι πιο σημαντικοί σύμφωνα με τους Ευρωπαϊκούς Κανονισμούς για τη Δημόσια Υγεία και έχουν τεθεί στόχοι μείωσης του επιπολασμού τους από την Ευρωπαϊκή Ένωση τόσο στην κοινότητα, όσο και στους ζωικούς πληθυσμούς (ΕΚ 1003/2005). Στους πίνακες και στα σχήματα που ακολουθούν παρουσιάζονται αναλυτικά τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν (Πίνακας 11, Πίνακας 12, Σχήμα 9, Σχήμα 10). Πίνακας 11: Στελέχη σαλμονελών που χρησιμοποιήθηκαν σε σχέση με τον ορότυπο και την κατηγορία προέλευσης. Ορότυπος Human Animal Food Σύνολο Salmonella ser. Enteritidis Salmonella ser Salmonella ser. Hadar Salmonella ser. Infantis Salmonella ser. Virchow Σύνολο [129]

132 Salmonella ser. Enteritidis Salmonella ser. Salmonella ser. Hadar Salmonella ser. Infantis Human Animal Food Σύνολο Salmonella ser. Virchow 69 Σύνολο Σχήμα 9: Ραβδόγραμμα στελεχών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη ανά ορότυπο και κατηγορία προέλευσης. Πίνακας 12: Στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη με βάση τον ορότυπο και το έτος απομόνωσης. Ορότυπος 2007 Σύνολο Salmonella ser. Enteritidis Salmonella ser Salmonella ser. Hadar Salmonella ser. Infantis Salmonella ser. Virchow Σύνολο [130]

133 Salmonella ser. Enteritidis Salmonella ser. Salmonella ser. Hadar Salmonella ser. Infantis Salmonella ser. Virchow Σύνολο ΣΎΝΟΛΟ Σχήμα 10: Ραβδόγραμμα στελεχών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη σε σχέση με τον ορότυπο και το έτος απομόνωσης [131]

134 [132]

135 Η λήψη των στελεχών έγινε από: A. Το Κτηνιατρικό Εργαστήριο Χαλκίδας Το Κτηνιατρικό Εργαστήριο Χαλκίδας αποτελεί το Εθνικό Κτηνιατρικό Κέντρο Αναφοράς των Σαλμονελών. Σε αυτό προωθούνται, σύμφωνα με την κείμενη νομοθεσία, όλα τα στελέχη των σαλμονελών που απομονώνονται στα πλαίσια των αυτοελέγχων, όπως και των Επίσημων, Ελέγχων στην Ελλάδα. Σε όλα τα στελέχη τα οποία προωθούνται στο παραπάνω Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς διενεργείται επιβεβαίωση και οροτυποποίηση σύμφωνα με το σχήμα Kuafman and White. B. Το Κεντρικό Εργαστήριο Δημόσιας Υγείας - Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Σαλμονελών- Σιγκελών στη Βάρη. Στο Κεντρικό Εργαστήριο Δημόσιας Υγείας προωθούνται, σύμφωνα με την κείμενη νομοθεσία όλα τα στελέχη των σαλμονελών, τα οποία απομονώνονται στα νοσοκομεία της χώρας μας και εκεί διενεργείται οροτυποποίηση στα πλαίσια της επιδημιολογικής επιτήρησης Η διαδικασία επιλογής που ακολουθήθηκε περιλάμβανε τα εξής στάδια: Αρχικά αναζητήθηκαν τα στελέχη τα οποία απομονώθηκαν από ζώα και τρόφιμα από το Κτηνιατρικό Εργαστήριο Χαλκίδας. Αφού έγινε καταγραφή ανά έτος και περιοχή, λήφθηκαν όλα τα στελέχη των πέντε αυτών οροτύπων τα οποία απομονώθηκαν τα έτη 2007-, με εξαίρεση των ορότυπο Enteritidis για τον οποίο λήφθηκαν στελέχη για τα έτη -, συνολικά δηλαδή 252 στελέχη. [133]

136 Στη συνέχεια αναζητήθηκαν και καταγράφηκαν τα στελέχη από το Κεντρικό Εργαστήριο Δημόσιας Υγείας. Από εκεί λήφθηκαν όλα τα στελέχη των οροτύπων Hadar, Infantis και Virchow από το 2007-, καθώς και ικανός αριθμός στελεχών των οροτύπων Enteritidis και απομονωμένων αντιπροσωπευτικά, όσο ήταν δυνατόν, από διάφορες περιοχές της Ελλάδας την παραπάνω χρονική περίοδο, δηλαδή συνολικά 280 στελέχη. Θα πρέπει να αναφερθεί πως δεν λήφθηκαν τα στελέχη που ανήκουν στη μονοφασική Salmonella ser., αφενός γιατί από το Κεντρικό Εργαστήριο Αναφοράς των Σαλμονελών και Σιγκελών πραγματοποιούνταν ξεχωριστή μελέτη και αφετέρου γιατί η επιτήρηση για τον ορότυπο αυτό διενεργείται ξεχωριστά από την EFSA και το ECDC από το και μετά. Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται οι σαλμονέλες που συνολικά οροτυποποιήθηκαν και ανήκουν στους ορότυπους της παρούσας μελέτης στο Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς Σαλμονελών προερχόμενες από τα νοσοκομεία της Ελλάδας από το 2007 έως και το. (Πίνακας 13) Πίνακας 13: Στελέχη σαλμονελών που απομονώθηκαν από νοσοκομεία και και ανήκουν στους 5 οροτύπους της μελέτης αυτής. Ορότυποι σαλμονελών 2007 Salmonella ser. Enteritidis Salmonella ser Salmonella ser. Hadar Salmonella ser. Infantis Salmonella ser. Virchow Σύνολο [134]

137 Στην παρακάτω εικόνα (Εικόνα 7) επισημαίνονται με στίγματα οι νομοί της χώρας που συμπεριλαμβάνονται στην παρούσα διατριβή. Εικόνα 7: Χάρτης με τις περιοχές από τις οποίες απομονώθηκαν τα στελέχη της παρούσας διατριβής. [135]

138 [136]

139 2.4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ [137]

140 [138]

141 2.6.1 SALMONELLA SER. ENTERITIDIS Αντιμικροβιακή αντοχή Η μελέτη της αντιμικροβιακής αντοχής στη Salmonella ser. Enteritidis ανέδειξε αντοχή κατά κύριο λόγο στο ναλιδιξικό οξύ, ένα αντιβιοτικό που ανήκει στις κινολόνες πρώτης γενιάς. Συγκεκριμένα, τα ποσοστά αντοχής ήταν 25% για τα στελέχη από ανθρώπους, 26% για τα στελέχη από ζώα και μόνο 5,9% για τα στελέχη από τρόφιμα. Δύο από τα συνολικά 175 στελέχη βρέθηκαν ανθεκτικά στην αμπικιλλίνη, και από ένα σε γενταμυκίνη, καναμυκίνη, στρεπτομυκίνη, σπεκτινομυκίνη, τετρακυκλίνη, κεφτριαξόνη και κεφοταξίμη, ενώ βρέθηκαν τρία πολυανθεκτικά στελέχη. Η αντοχή στο ναλιδιξικό οξύ ήταν υψηλότερη στα στελέχη από ανθρώπους και ζώα σε σχέση με τα απομονωμένα από τα τρόφιμα, ενώ δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην αντοχή στο ναλιδιξικό οξύ μεταξύ των στελεχών από ζώα και ανθρώπους. Η συχνότητα των πολυανθεκτικών στελεχών ήταν χαμηλή και κυμάνθηκε στο 1.7%. Αναλυτικά η αντιμικροβιακή αντοχή των στελεχών παρουσιάζεται στον πίνακα που ακολουθεί (Πίνακας 14). [139]

142 Πίνακας 14: Αντιμικροβιακή αντοχή στελεχών Salmonella ser. Enteritidis Αντιμικροβιακή Συγκέντρωση Άνθρωπος (%) Ζώα (%) Τρόφιμα (%) Σύνολο (%) ουσία n=84 n=77 n=17 n=175 Ampicillin 8mg 2 2,4 0 0,0 0 0,0 2 1,1 Ampicillin 128 mg 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Chlopamphenicol 8mg 0 0,0 1 1,3 0 0,0 1 0,6 Colomycin 8mg 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Gentamycin 4mg 0 0,0 1 1,3 0 0,0 1 0,6 Neomycin 8mg 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Kanamycin 16mg 0 0,0 1 1,3 0 0,0 1 0,6 Streptomycin 16mg 0 0,0 1 1,3 0 0,0 1 0,6 Streptomycin 128mg 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Sulfonamide 64mg 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Spectinomycin 64mg 0 0,0 1 1,3 0 0,0 1 0,6 Tetracycline 8mg 0 0,0 1 1,3 0 0,0 1 0,6 Tetracycline 128mg 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Trimethoprim 2mg 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Furazolidone 8mg 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Nalidix acid 16mg 21 25, ,0 1 5, Ciprofloxacin 0.125mg 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Ciprofloxacin 1mg 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Amikacin 4mg 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Cefalexin 16mg 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Cephradine 16mg 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Cefuroxime 16mg 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Ceftriaxone 1mg 0 0,0 1 1,3 0 0,0 1 0,6 Cefotaxime 1mg 0 0,0 1 1,3 0 0,0 1 0,6 [140]

143 Ηλεκτροφόρηση εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου (PFGE) Ενδονουκλεάση περιορισμού XbaI Με την εφαρμογή της Ηλεκτροφόρησης εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου (PFGE) μετά από πέψη με το περιοριστικό ένζυμο XbaI [164] αναδείχθηκαν 45 διαφορετικοί παλσότυποι μεταξύ των 175 συνολικά στελεχών. Οι παλσότυποι και η ταξινόμησή τους παρουσιάζονται στο δενδρόγραμμα ακολουθεί (Σχήμα 11). [141]

144 ( p ) ( ) ( ) [ ] XbaIEnteritidis XbaIEnteritidis 100 SEROVAR VRI id CATEGORY PLACE YEAR R-TYPE stpfge type XbaI 154 PELLA C G Nx T Cn Ct Unnamed KERKYRA SENTXB DODEKAN Unnamed FTHIOTIDA Unnamed KORINTHIA Unnamed DODEKAN Unnamed RETHYMNO Nx Unnamed KORINTHIA Unnamed FOOD KAVALA Unnamed THES/NIKI Nx Unnamed PIERIA Unnamed FOOD THES/NIKI Unnamed FTHIOTIDA Unnamed EVROS S K Nx SENTXB DODEKAN Nx Unnamed DODEKAN Nx Unnamed FOKIDA Unnamed KERKYRA Unnamed KILKIS SENTXB KILKIS Nx SENTXB IMATHIA SENTXB PIERIA Nx SENTXB PIERIA Nx SENTXB FOOD THES/NIKI SENTXB SENTXB KERKYRA Nx SENTXB ILEIA Nx SENTXB RETHYMNO Nx SENTXB RETHYMNO Nx SENTXB FOOD KERKYRA Nx SENTXB THES/NIKI SENTXB THES/NIKI SENTXB KILKIS Nx SENTXB IOANNINA SENTXB ATTIKI Nx SENTXB RETHYMNO Nx SENTXB AITOLOAKAR SENTXB AITOLOAKAR SENTXB FOKIDA SENTXB KERKYRA SENTXB AITOLOAKAR SENTXB KERKYRA SENTXB LAKONIA Nx SENTXB LAKONIA Nx SENTXB DODEKAN Nx SENTXB KERKYRA Nx SENTXB DODEKAN Nx SENTXB KYKLADES SENTXB THES/NIKI SENTXB FOOD SENTXB DODEKAN SENTXB DODEKAN SENTXB LEYKADA SENTXB DODEKAN SENTXB DODEKAN SENTXB AITOLOAKAR SENTXB DODEKAN SENTXB FTHIOTIDA Nx SENTXB AITOLOAKAR SENTXB DODEKAN SENTXB FOOD IOANNINA SENTXB THES/NIKI Nx SENTXB KORINTHIA SENTXB IMATHIA SENTXB ARKADIA Nx Sp Tm SENTXB FTHIOTIDA SENTXB KERKYRA SENTXB KERKYRA SENTXB KERKYRA SENTXB MESSINIA SENTXB FOKIDA Nx SENTXB DODEKAN SENTXB DODEKAN SENTXB LAKONIA Unnamed DODEKAN Nx SENTXB KERKYRA Unnamed LAKONIA SENTXB KILKIS SENTXB SENTXB ATTIKI SENTXB FOOD SENTXB FOOD SENTXB FOOD SENTXB THES/NIKI SENTXB THES/NIKI SENTXB ILEIA SENTXB Nx SENTXB ATTIKI SENTXB SENTXB SENTXB VIOTIA SENTXB FTHIOTIDA Nx SENTXB KERKYRA SENTXB DODEKAN Nx SENTXB LESVOS SENTXB FOOD SENTXB SENTXB PIERIA SENTXB ILEIA SENTXB SENTXB KERKYRA Nx SENTXB LAKONIA SENTXB VIOTIA SENTXB DODEKAN SENTXB DODEKAN SENTXB THES/NIKI Unnamed Unnamed FOOD THES/NIKI Unnamed FOKIDA Unnamed FTHIOTIDA Unnamed FOKIDA Unnamed HALKIDIKI Unnamed ARKADIA Unnamed Unnamed EVOIA Nx Unnamed Unnamed KERKYRA Nx Unnamed FTHIOTIDA Nx Unnamed DODEKAN Nx Unnamed FTHIOTIDA Unnamed ATTIKI Unnamed ATTIKI Unnamed LAKONIA Unnamed AITOLOAKAR Nx Unnamed Unnamed LESVOS Unnamed KERKYRA Nx Unnamed RETHYMNO Nx Unnamed THES/NIKI Unnamed RETHYMNO Nx Unnamed IOANNINA Unnamed LAKONIA Unnamed Unnamed DODEKAN Unnamed DODEKAN Unnamed DODEKAN Unnamed Unnamed IMATHIA Unnamed ATTIKI Unnamed DODEKAN Unnamed DODEKAN Unnamed DODEKAN Unnamed IOANNINA SENTXB FOOD EVOIA SENTXB DODEKAN A SENTXB FOOD EVOIA SENTXB FOOD IOANNINA SENTXB FOOD IOANNINA SENTXB ARKADIA SENTXB KORINTHIA SENTXB IOANNINA SENTXB IOANNINA SENTXB LAKONIA SENTXB DODEKAN SENTXB FOOD SENTXB AITOLOAKAR A Nx SENTXB FOOD EVROS SENTXB KERKYRA Nx SENTXB DODEKAN Unnamed IOANNINA SENTXB THES/NIKI SENTXB ARKADIA SENTXB DODEKAN SENTXB DODEKAN SENTXB FTHIOTIDA SENTXB EVOIA Unnamed THES/NIKI Unnamed KORINTHIA Unnamed LESVOS Unnamed IRAKLEIO Unnamed AXAIA Unnamed LESVOS Unnamed LAKONIA Unnamed LAKONIA Unnamed DODEKAN Nx Unnamed0036 Σχήμα 11: Δενδρόγραμμα στελεχών Salmonella ser. Enteritidis μετά από πέψη από το περιοριστικό ένζυμο XbaI. [142]

145 Υποβολή στη βάση δεδομένων Pulse Net Τα στελέχη του ορότυπου Enteritidis, μετά από υποβολή στην Ευρωπαϊκή Βάση παλσοτύπων (Pulsenet-Europe) για τις σαλμονέλες και συγκρίθηκαν με τους 30 συχνότερους στην Ευρώπη. Μεταξύ των στελεχών, εννέα παλσότυποι ταυτοποιήθηκαν με αντίστοιχους Ευρωπαϊκούς και έλαβαν όνομα με βάση την επίσημη ονομασία [98]. Ο κυρίαρχος παλσότυπος ήταν ο SENTXB.0001 (55 στελέχη, 31.4%) και παρουσιάστηκε τα έτη, και σε όλες τις κατηγορίες απομονώσεων (τρόφιμα, ζώα, άνθρωπος). Αναλυτικά ο παλσότυπος αυτός παρουσιάστηκε σε 4 στελέχη που απομονώθηκαν από τρόφιμα (23,5%), σε 21 από ζώα (26%) και σε 30 ανθρώπινης προέλευσης (35,7%). Ο δεύτερος σε συχνότητα παλσότυπος ήταν ο SENTXB.0005 (29 στελέχη, 16.6%) και παρουσιάστηκε επίσης τα έτη, και σε όλες τις κατηγορίες απομονώσεων. Οι υπόλοιποι παλσότυποι της Ευρωπαϊκής βάσης δεδομένων (Pulsenet-Europe) που συναντήσαμε ήταν οι SENTXB.0010, SENTXB.0002, SENTXB.0040, SENTXB.0023, SENTXB.0004, SENTXB.0007, SENTXB Συνολικά 109 από τα 175 στελέχη (62.3%) κατατάχτηκαν στους 30 συχνότερους παλσότυπους, σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή βάση. Στελέχη που ανέδειξαν αυτόν τον παλσότυπο παρουσίασαν διαφορετικό φαινότυπο αντοχής σε κάποιες περιπτώσεις. Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται οι παλσότυποι που παρατηρήθηκαν η αντιστοίχησή τους με Ευρωπαϊκούς, η προέλευση και η συχνότητά τους (Πίνακας 15). [143]

146 Πίνακας 15: Ευρωπαϊκά ηλεκτροφορητικά πρότυπα (παλσότυποι) που παρουσιάστηκαν μεταξύ των στελεχών Salmonella ser. Enteritidis που μελετήθηκαν, η προέλευση και η συχνότητά τους. PulseNet Europe profile N (%) Ετος Προέλευση SENTXB (31.4) 2007: -, : 34, : 15, 30 H, 21 A, 4 F : 6 SENTXB (16.6) 2007: -, : 16, : 7, 10 H, 15 A, 4 F : 6 SENTXB (5.7) 2007: -, : 5, : 5, 1 H, 5 A, 4 F : - SENTXB (3.4) 2007: -, : 2, : 3, 2 H, 4 A : 1 SENTXB (2.3) 2007: -, : 2, : 1, 2 H, 2 F : 1 SENTXB (1.1) : 1, : 1 2 H SENTXB (0.6) : 1 1 A SENTXB (0.6) : 1 1 H SENTXB (0.6) : 1 1 H 66 (37.7) : 25, : 27, : 34 H, 29 A, 3 F Άλλα 14 H= άνθρωποι, A= ζώα, F= τρόφιμα [144]

147 Ενδονουκλεάση περιορισμού BlnI Για τον ορότυπο Enteritidis χρησιμοποιήθηκε επίσης η ηλεκτροφόρηση εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου μετά από πέψη από το ένζυμο περιορισμού BlnI, το οποίο χρησιμοποιείται ως δευτερεύον ένζυμο στις περιπτώσεις επιδημιών. Στην περίπτωση αυτή αναδείχθηκαν 48 διαφορετικοί παλσότυποι με κυρίαρχο τον SENTBL.0007 (61 στελέχη, 34.9%). Ο κυρίαρχος παλσότυπος παρουσιάστηκε σε στελέχη που προέρχονταν τόσο από ανθρώπους, όσο και από ζώα και τρόφιμα ζωικής προέλευσης, αλλά και σε καθένα από τα έτη που απομονώθηκαν τα στελέχη αυτά. Στο παρακάτω δενδρόγραμμα (Σχήμα 12) παρουσιάζονται τα στελέχη που μελετήθηκαν με βάση το περιοριστικό ένζυμο BlnI. [145]

148 ( p ) ( ) ( ) [ ] BlnIEnteritidis BlnIEnteritidis 100 SEROVAR VRI id CATEGORY PLACE YEAR R-TYPE st PFGE type BlnI 727 KERKYRA Nx KERKYRA PELLA C G Nx T Cn Ct DODEKAN DODEKAN DODEKAN FTHIOTIDA DODEKAN Nx FTHIOTIDA KERKYRA Nx KILKIS THES/NIKI KILKIS Nx IMATHIA KERKYRA LAKONIA Nx DODEKAN KERKYRA ATTIKI ATTIKI THES/NIKI Nx ATTIKI KORINTHIA KORINTHIA EVOIA Nx FOOD DODEKAN KERKYRA Nx VIOTIA LAKONIA DODEKAN FTHIOTIDA Nx DODEKAN FOKIDA KERKYRA DODEKAN Nx AITOLOAKAR FTHIOTIDA FOKIDA DODEKAN FOKIDA AITOLOAKAR Nx DODEKAN FOOD THES/NIKI Nx PIERIA HALKIDIKI PIERIA KORINTHIA IMATHIA ILEIA ARKADIA KERKYRA Nx LESVOS KERKYRA KERKYRA KERKYRA MESSINIA LAKONIA VIOTIA DODEKAN DODEKAN FOKIDA Nx LAKONIA AITOLOAKAR A Nx DODEKAN Nx THES/NIKI LAKONIA FOOD KAVALA DODEKAN Nx ATTIKI FOOD FOOD FOOD ATTIKI ILEIA Nx DODEKAN THES/NIKI RETHYMNO Nx RETHYMNO Nx FOOD KERKYRA Nx THES/NIKI THES/NIKI AITOLOAKAR FOKIDA KERKYRA AITOLOAKAR KERKYRA KYKLADES LEYKADA FTHIOTIDA KILKIS PIERIA Nx PIERIA Nx FOOD THES/NIKI FOOD THES/NIKI AITOLOAKAR AITOLOAKAR THES/NIKI Nx DODEKAN DODEKAN DODEKAN Nx KERKYRA Nx DODEKAN Nx LAKONIA Nx LESVOS LAKONIA FTHIOTIDA Nx DODEKAN Nx DODEKAN Nx IMATHIA IOANNINA RETHYMNO Nx RETHYMNO Nx LAKONIA THES/NIKI KORINTHIA THES/NIKI DODEKAN LESVOS ARKADIA EVOIA DODEKAN IOANNINA FOOD EVOIA IOANNINA DODEKAN DODEKAN FOOD IOANNINA FTHIOTIDA ARKADIA EVROS S K Nx ILEIA KILKIS Nx IOANNINA ATTIKI Nx RETHYMNO Nx RETHYMNO Nx ARKADIA Nx Sp Tm FOOD DODEKAN A FOOD IOANNINA FOOD IOANNINA THES/NIKI FOOD EVROS DODEKAN DODEKAN DODEKAN AXAIA LESVOS DODEKAN IOANNINA FTHIOTIDA Nx IOANNINA IRAKLEIO LAKONIA FTHIOTIDA FOOD EVOIA FOOD THES/NIKI LAKONIA KORINTHIA KERKYRA Nx 0048 Σχήμα 12: Δενδρόγραμμα στελεχών Salmonella ser. Enteritidis μετά από πέψη από το περιοριστικό ένζυμο BlnI. [146]

149 Μελέτη κλωνικότητας με ζεύγος ενζύμων περιορισμού(composite data set) XbaI-BlnI Ακολούθως έγινε σύγκριση και μελέτη της κλωνικότητας των στελεχών με συνδυασμό των δύο παραπάνω ενζύμων περιορισμού. Η επεξεργασία έγινε με το στατιστικό πρόγραμμα Bionumerics της εταιρείας Applied Maths με χρήση ισοδύναμης στάθμισης μεταξύ των δύο παραπάνω ενζύμων. Αυτή τη φορά αναδείχθηκαν ογδόντα τρία (83) διαφορετικοί συνδυαστικοί παλσότυποι, με συχνότερο τον Comp.0031 ο οποίος προέκυπτε από το συνδυασμό SENTXB.0001-SENTBL.0007 και ο οποίος εμφανιζόταν σε 21 από τα 175 στελέχη (12%). Ακολουθούσαν ο Comp.0032 (SENTXB.0005-SENTBL.0007) με 17 στελέχη (9.7%) και ο Comp.0025 (SENTXB.0001-SENTBL.0012) με 13 στελέχη (7.4%). Ο συνδυαστικός παλσότυπος Comp.0031 αναδείχθηκε από 21 συνολικά στελέχη, 13 από ανθρώπους, 7 προερχόμενα από πουλερικά και 1 από τρόφιμα ζωικής προέλευσης. Τα στελέχη ανθρώπινης προέλευσης προέρχονταν από Κέρκυρα, Λακωνία, Φωκίδα, Μεσσηνία, Αιτωλοακαρνανία και Δωδεκάνησα. Τα στελέχη από πουλερικά προέρχονταν από Κιλκίς, Θεσσαλονίκη, Κορινθία και Ημαθία, ενώ στο στέλεχος από τρόφιμα δεν αναφέρθηκε ο τόπος δειγματοληψίας. Ο παραπάνω παλσότυπος απομονώθηκε τα έτη, και. Ο συνδυαστικός παλσότυπος Comp.0032 αναδείχθηκε από 17 συνολικά στελέχη, 9 από ανθρώπους (Βοιωτία, Φθιώτιδα, Κέρκυρα, Δωδεκάνησα, Λακωνία), 7 από πουλερικά (Αττική, Πιερία, Ηλεία) και 1 από τρόφιμα ζωικής προέλευσης. Ο παλσότυπος αυτός απομονώθηκε τα έτη, και. Ο συνδυαστικός παλσότυπος Comp.0025 αναδείχθηκε από 13 συνολικά στελέχη, 8 από ανθρώπους [147]

150 (Αιτωλοακαρνανία, Φωκίδα, Κέρκυρα, Κυκλάδες Λευκάδα, Δωδεκάνησα), 4 από πουλερικά (Ηλεία, Ρέθυμνο, Θεσσαλονίκη) και 1 από τρόφιμα ζωικής προέλευσης (Κέρκυρα). Αναλυτικά η κατανομή των στελεχών παρουσιάζεται στο παρακάτω δενδρόγραμμα (Σχήμα 13). [148]

151 XbaI-BlnI BlnIEnteritidis XbaIEnteritidis 100 SEROVAR VRI id CATEGORY PLACE YEAR R-TYPE PPFGE type XbaI PFGE type BlnI PFGE type CMPS IRAKLEIO. Unnamed0032. Unnamed FOOD IOANNINA EVOIA. SENTXB0010. SENTXB FTHIOTIDA. Unnamed FOOD THES/NIKI. Unnamed FOOD EVOIA IOANNINA. SENTXB0010. SENTXB DODEKAN. SENTXB IOANNINA. Unnamed0025. SENTXB DODEKAN. SENTXB IOANNINA ARKADIA EVOIA. SENTXB0002. SENTXB0002. Unnamed DODEKAN. SENTXB LAKONIA FTHIOTIDA Nx. SENTXB0023. SENTXB KORINTHIA. SENTXB FOOD. SENTXB DODEKAN A. SENTXB FOOD IOANNINA. SENTXB FOOD IOANNINA. SENTXB FOOD EVROS. SENTXB DODEKAN. Unnamed DODEKAN. Unnamed DODEKAN. Unnamed THES/NIKI. SENTXB DODEKAN. Unnamed FTHIOTIDA DODEKAN Nx Nx. Unnamed0016. Unnamed ATTIKI. SENTXB FOOD. SENTXB FOOD. SENTXB FOOD. SENTXB THES/NIKI. SENTXB THES/NIKI. SENTXB DODEKAN Nx. Unnamed ILEIA Nx. SENTXB RETHYMNO Nx. SENTXB RETHYMNO Nx. SENTXB FOOD KERKYRA THES/NIKI Nx. SENTXB0001. SENTXB AITOLOAKAR. SENTXB FOKIDA. SENTXB KERKYRA. SENTXB AITOLOAKAR. SENTXB KYKLADES. SENTXB LEYKADA. SENTXB FTHIOTIDA. SENTXB DODEKAN. Unnamed KERKYRA THES/NIKI. Unnamed0011. SENTXB DODEKAN. SENTXB KERKYRA FOKIDA. Unnamed0009. Unnamed KILKIS. SENTXB KILKIS Nx. SENTXB IMATHIA. SENTXB KERKYRA. SENTXB LAKONIA Nx. SENTXB THES/NIKI. SENTXB FOOD. SENTXB DODEKAN. SENTXB DODEKAN. SENTXB DODEKAN. SENTXB AITOLOAKAR. SENTXB DODEKAN. SENTXB DODEKAN. SENTXB THES/NIKI Nx. SENTXB KORINTHIA. SENTXB IMATHIA. SENTXB KERKYRA. SENTXB KERKYRA. SENTXB KERKYRA. SENTXB MESSINIA. SENTXB FOKIDA Nx. SENTXB Nx. SENTXB ATTIKI. SENTXB SENTXB VIOTIA. SENTXB FTHIOTIDA Nx. SENTXB KERKYRA. SENTXB DODEKAN Nx. SENTXB FOOD. SENTXB SENTXB PIERIA ILEIA. SENTXB0005. SENTXB SENTXB KERKYRA Nx. SENTXB LAKONIA. SENTXB VIOTIA. SENTXB DODEKAN. SENTXB DODEKAN. SENTXB DODEKAN. Unnamed DODEKAN KERKYRA Nx Nx. SENTXB0001. SENTXB LAKONIA Nx. SENTXB DODEKAN Nx. SENTXB EVOIA Nx. Unnamed0014. Unnamed DODEKAN KERKYRA Nx Nx. Unnamed0008. Unnamed FTHIOTIDA. Unnamed ATTIKI. Unnamed ATTIKI. Unnamed LAKONIA. Unnamed AITOLOAKAR Nx. Unnamed Unnamed LESVOS. Unnamed KERKYRA Nx. Unnamed FOOD THES/NIKI THES/NIKI Nx. Unnamed0013. Unnamed Unnamed FOKIDA. Unnamed FTHIOTIDA. Unnamed FOKIDA. Unnamed HALKIDIKI. Unnamed ARKADIA. Unnamed Unnamed PIERIA RETHYMNO KORINTHIA Nx. Unnamed0006. Unnamed0021. Unnamed FOOD KAVALA. Unnamed THES/NIKI LAKONIA. Unnamed0012. SENTXB KILKIS Nx. SENTXB IOANNINA ATTIKI Nx. SENTXB0001. SENTXB RETHYMNO Nx. SENTXB ARKADIA ILEIA Nx Sp Tm. SENTXB0001. SENTXB0005. SENTXB ARKADIA. SENTXB EVROS RETHYMNO S K Nx Nx. SENTXB0004. Unnamed PIERIA Nx. SENTXB PIERIA Nx. SENTXB FOOD THES/NIKI. SENTXB AITOLOAKAR. SENTXB AITOLOAKAR. SENTXB DODEKAN. SENTXB DODEKAN. SENTXB KILKIS. SENTXB0005. SENTXB0005. SENTXB FOOD IOANNINA. SENTXB THES/NIKI KORINTHIA. Unnamed0030. Unnamed LAKONIA. Unnamed DODEKAN ATTIKI Nx. Unnamed0017. Unnamed LESVOS. SENTXB DODEKAN AITOLOAKAR Nx A Nx. SENTXB0007. SENTXB RETHYMNO THES/NIKI IOANNINA LAKONIA Nx. Unnamed0020. Unnamed0020. Unnamed0022. Unnamed IMATHIA. Unnamed LESVOS. Unnamed AXAIA LESVOS. Unnamed0033. Unnamed FTHIOTIDA. SENTXB LAKONIA. Unnamed LAKONIA. Unnamed KORINTHIA. Unnamed DODEKAN DODEKAN. Unnamed0024. Unnamed KERKYRA Nx. SENTXB DODEKAN. Unnamed KERKYRA FTHIOTIDA Nx. SENTXB0040. Unnamed PELLA KERKYRA C G Nx T Cn.. Unnamed0001. SENTXB Σχήμα 13: Συνδιαστικό δενδρόγραμμα στελεχών Salmonella ser. Enteritidis μετά από πέψη από τα περιοριστικά ένζυμα BlnI & XbaI. [149]

152 [150]

153 Πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος- (Multilocus Sequence Typing-MLST) Οκτώ από τα στελέχη τα οποία παρουσίασαν διαφορετικό ηλεκτροφορητικό προφίλ τόσο με το περιοριστικό ένζυμο XbaI, όσο και με το BlnI μελετήθηκαν με βάση την πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος. Η MLST ακολουθήθηκε πιλοτικά για να διαπιστωθεί η δυνατότητα σύγκρισης των στελεχών με βάση αυτή τη μέθοδο. Τα 8 συνολικά στελέχη που επιλέχθηκαν για να μελετηθούν με βάση τη μέθοδο αυτή ανήκαν σε 8 διαφορετικούς παλσότυπους, με ποσοστά ομοιότητας από 77% έως και 95% με βάση το περιοριστικό ένζυμο XbaI. Τα 5 από τα στελέχη αυτά απομονώθηκαν από ανθρώπους, ενώ 3 απομονώθηκαν από πτηνά. Πέντε από τα στελέχη αντιστοιχούσαν σε 5 διαφορετικούς Ευρωπαϊκούς παλσότυπους ενώ τα άλλα 3 δεν αντιστοιχούσαν σε κανέναν από αυτούς. Αφού έγινε αλληλούχιση των 7 γονιδίων του βασικού μεταβολισμού [12], οι αλληλουχίες υποβλήθηκαν στη διεθνή βάση MLST τύπων για τη Salmonella enterica. Διαπιστώθηκε πως και τα οκτώ στελέχη που μελετήθηκαν ανήκαν στον τύπο ST11, δηλαδή όλα τα στελέχη που μελετήθηκαν ενώ κατατάχτηκαν σε διαφορετικό παλσότυπο παρουσίαζαν τον ίδιο MLST τύπο. Στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 16) και στο παρακάτω σχήμα (Σχήμα 14) παρουσιάζονται η ανάλυση γονιδίων βασικού μεταβολισμού των στελεχών Salmonella ser. Enteritidis της παρούσας διατριβής, καθώς και οι MLST τύποι που προέκυψαν. [151]

154 Πίνακας 16: Ανάλυση γονιδίων βασικού μεταβολισμού των στελεχών Salmonella ser. Enteritidis. VRI id ISOLATE ARοC DNAN HEMD HISD PURE SUCA THRA ΜLST type Σχήμα 14: Δενδρόγραμμα στελεχών Salmonella ser. Enteritidis που υποβλήθηκαν σε πολυτοπική αλληλούχιση μεταβλητών περιοχών γονιδιώματος. [152]