ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI SCHOOL OF AGRICULTURE POSTGRADUATE STUDIES PROGRAMME SCIENCE OF HORTICULTURE

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΩΝ ΟΠΩΡΟΚΗΠΕΥΤΙΚΩΝ «ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΙΑΦΟΡΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΤΗΝ ΥΑΛΩΣΗ, ΒΛΑΣΤΟΓΕΝΕΣΗ ΚΑΙ ΡΙΖΟΒΟΛΙΑ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ (Ole europe L.) IN VITRO» Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΧΡΥΣΟΒΑΛΑΝΤΟΥ Π. ΑΝΤΩΝΟΠΟΥΛΟΥ Γεωπόνος MSc ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΟΡΤΕΣΣΑ ΗΜΑΣΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΩΝ ΟΠΩΡΟΚΗΠΕΥΤΙΚΩΝ «ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΙΑΦΟΡΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΤΗΝ ΥΑΛΩΣΗ, ΒΛΑΣΤΟΓΕΝΕΣΗ ΚΑΙ ΡΙΖΟΒΟΛΙΑ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ (Ole europe L.) IN VITRO» Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΧΡΥΣΟΒΑΛΑΝΤΟΥ Π. ΑΝΤΩΝΟΠΟΥΛΟΥ Γεωπόνος MSc ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΟΡΤΕΣΣΑ ΗΜΑΣΗ (ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ) (ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ) ΙΩΑΝΝΗΣ ΘΕΡΙΟΣ (ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ) ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΟΙΚΟΝΟΜΟΥ (ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ) ΗΜΗΤΡΙΟΣ ΒΟΓΙΑΤΖΗΣ (ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ) ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΤΣΙΡΑΚΟΓΛΟΥ (ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ) ΕΛΕΥΘΕΡΙΟΣ ΕΛΕΥΘΕΡΙΟΥ (ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ) ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ ΣΚΑΛΤΣΟΓΙΑΝΝΗΣ (ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ) ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

3 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI SCHOOL OF AGRICULTURE POSTGRADUATE STUDIES PROGRAMME SCIENCE OF HORTICULTURE «THE EFFECT OF VARIOUS PARAMETERS ON HYPERHYDRICITY, SHOOT PRODUCTION AND ROOTING OF OLIVE (Ole europe L.) IN VITRO» PhD THESIS CHRYSOVALANTOY P. ANTONOPOULOU Agriculturist MSc SUPERVISOR KORTESSA DIMASSI Professor THESSALONIKI 2009

4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να εκφράσω τις θερµές µου ευχαριστίες στην καθηγήτρια της Γεωπονικής Σχολής κ. Κ. ηµάση για τη βοήθειά της στην επιλογή του θέµατος, καθώς και για την πολύ χρήσιµη καθοδήγηση και υποστήριξη που µου προσέφερε σε όλα τα στάδια εκπόνησης της παρούσας διατριβής. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους κ. Ι. Θεριό και κ. Α. Οικονόµου, µέλη της τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής, για την ανάγνωση της διατριβής και τις χρήσιµες επισηµάνσεις τους για τη συνολική βελτίωσή της. Οφείλω να ευχαριστήσω τις κυρίες Σ. Κουτή και Β. Τσακιρίδου, τεχνικό προσωπικό του εργαστηρίου δενδροκοµίας, για την πολύτιµη βοήθεια τους. Ευχαριστώ, επίσης, τους µεταπτυχιακούς φοιτητές του εργαστηρίου, καθώς και τη διεύθυνση και το προσωπικό του Αγροκτήµατος του Α.Π.Θ. για τη βοήθειά τους, όποτε αυτή χρειάστηκε. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά το σύζυγο µου και την οικογένεια µου, για τη συµπαράσταση και κατανόηση που έδειξαν κατά το διάστηµα πραγµατοποίησης της διδακτορικής µου διατριβής. I

5 Αφιερώνεται στο σύζυγο µου Χρήστο και στα ανίψια µου Αθανάσιο και Φωτεινή II

6 ΠΙΝΑΚΑΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΩΝ ΒΑ Βενζυλαδενίνη (6-benzyldenine) Εικ. Εικόνα GA 3 Γιββερελικό οξύ (Gibberellic cid) ΙΑΑ Ινδολυλοοξικό οξύ (Indole-3-cetic cid) ΙΒΑ Ινδολυλοβουτυρικό οξύ (Indole-3-butyric cid) MS Θρεπτικό υπόστρωµα Murshige και Skoog (1962) NAA Ναφθαλινοοξικό οξύ (α-nphthlenecetic cid) OM Θρεπτικό υπόστρωµα Olive Medium (Rugini, 1984) Πίν. Πίνακας Ποικ. Ποικιλία Σχ. Σχήµα TDZ Thidizuron [N-phenyl-N-(1,2,3-thidizol-yl)ure] WPM Θρεπτικό υπόστρωµα Woody Plnt Medium (McCown nd Lloyd, 1981) III

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ Η ελιά Χονδρολιά Χαλκιδικής In vitro καλλιέργεια της ελιάς Στάδια µικροπολλαπλασιασµού της ελιάς Στάδιο 0: Μεταχείριση µητρικών φυτών α Έκφυτα από µητρικά φυτά υπαίθρου β Έκφυτα από µητρικά φυτά θερµοκηπίου Στάδιο Ι: Εγκατάσταση in vitro καλλιέργειας α Απολύµανση εκφύτων β Οξείδωση εκφύτων γ Τέλος Σταδίου Ι Στάδιο ΙΙ: Σχηµατισµός νέων βλαστών α Σύνθεση θρεπτικού υποστρώµατος β Ρυθµιστικές ουσίες αύξησης γ Συνθήκες καλλιέργειας και επανακαλλιέργεια δ Επιµήκυνση βλαστών Στάδιο ΙΙΙ: Ριζοβολία µικροβλαστών α Ρυθµιστικές ουσίες αύξησης β Πρόσθετοι µέθοδοι προώθησης της ριζοβολίας Στάδιο IV: Εγκλιµατισµός φυταρίων Απόδοση στον αγρό Υάλωση Συµπτώµατα υάλωσης σε ανατοµικό και µορφολογικό επίπεδο Συµπτώµατα υάλωσης σε φυσιολογικό επίπεδο Συµπτώµατα υάλωσης σε βιοχηµικό επίπεδο Παράγοντες που επηρεάζουν την υάλωση και αντιµετώπιση της Σχετική υγρασία α Μείωση in vitro σχετικής υγρασίας IV

8 3.4.1β Υποστρώµατα διπλής φάσης Θερµοκρασία και φως α Μείωση θερµοκρασίας β Αύξηση έντασης φωτός Αιθυλένιο Έλλειψη οξυγόνου Πηκτικοί παράγοντες θρεπτικού υποστρώµατος Συγκέντρωση µακροστοιχείων και ιχνοστοιχείων α Αναλογία ΝΗ + 4 /ΝΟ β Επίδραση υπόλοιπων ιόντων Σάκχαρα θρεπτικού υποστρώµατος ph θρεπτικού υποστρώµατος Ρυθµιστικές ουσίες αύξησης α Κυτοκινίνες β Αυξίνες γ Γιββερελλικό οξύ Απολυµαντικές ουσίες Ανάκαµψη υαλωµένων καλλιεργειών Πρόληψη υάλωσης Σκοπός της διδακτορικής διατριβής ΠΕΙΡΑΜΑ Ι. In vitro εγκατάσταση εκφύτων διαφόρων ποικιλιών ελιάς Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και µέθοδοι In vitro εγκατάσταση διαφόρων ελληνικών και ξένων ποικιλιών ελιάς In vitro εγκατάσταση της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής Αποτελέσµατα In vitro εγκατάσταση διαφόρων ελληνικών και ξένων ποικιλιών ελιάς In vitro εγκατάσταση της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής Συζήτηση In vitro εγκατάσταση διαφόρων ελληνικών και ξένων ποικιλιών ελιάς In vitro εγκατάσταση της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής V

9 Παράρτηµα πινάκων και σχηµάτων Πειράµατος Ι ΠΕΙΡΑΜΑ ΙΙ. Παράγοντες που επηρεάζουν την υάλωση και τον in vitro σχηµατισµό νέων βλαστών ελιάς της ποικιλίας. Χονδρολιά Χαλκιδικής Περίληψη Εισαγωγή Είδος και συγκέντρωση µακροστοιχείων θρεπτικού υποστρώµατος ph θρεπτικού υποστρώµατος Ρυθµιστικές ουσίες αύξησης Κυτοκινίνες Αναστολέας αύξησης dikegulc Αναστολείς αιθυλενίου Άγαρ και βερµικουλίτης Είδος φωτισµού Υλικά και µέθοδοι Είδος και συγκέντρωση µακροστοιχείων θρεπτικού υποστρώµατος ph θρεπτικού υποστρώµατος Κυτοκινίνες Συνδυασµός κυτοκινινών και GA Αναστολέας αύξησης dikegulc Αναστολείς αιθυλενίου Άγαρ και βερµικουλίτης Είδος φωτισµού Αποτελέσµατα Είδος και συγκέντρωση µακροστοιχείων θρεπτικού υποστρώµατος ph θρεπτικού υποστρώµατος Κυτοκινίνες (είδος, συγκέντρωση) Εµβάπτιση εκφύτων σε διάλυµα κυτοκινίνης ΒΑ Συνδυασµός ΒΑ και GA ιάρκεια έκθεσης εκφύτων στην κυτοκινίνη ΒΑ του θρεπτικού υποστρώµατος Αναστολέας αύξησης dikegulc Αναστολείς αιθυλενίου VI

10 Άγαρ και βερµικουλίτης Συνεχής έκθεση των εκφύτων σε διάφορους φωτισµού ή στο σκοτάδι Έκθεση επί µία εβδοµάδα σε διάφορους φωτισµού ή στο σκοτάδι και µεταφορά στο λευκό φως Συζήτηση Είδος και συγκέντρωση µακροστοιχείων θρεπτικού υποστρώµατος ph θρεπτικού υποστρώµατος Κυτοκινίνες (είδος, συγκέντρωση, τρόπος εφαρµογής) Συνδυασµός ΒΑ και GA Αναστολέας αύξησης dikegulc Αναστολείς αιθυλενίου Άγαρ και βερµικουλίτης Είδος φωτισµού Παράρτηµα σχηµάτων Πειράµατος ΙΙ ΠΕΙΡΑΜΑ ΙΙΙ. Επίδραση αυξινών και µερικής συσκότισης της βάσης των µικροβλαστών ελιάς στην in vitro ριζοβολία και στον εγκλιµατισµό της ποικ. Χονδρολιά Χαλκιδικής Περίληψη Εισαγωγή Στάδιο IΙΙ: In vitro ριζοβολία των µικροβλαστών Αυξίνες Επίδραση της µερικής συσκότισης Υλικά και µέθοδοι Αποτελέσµατα Συζήτηση Παράρτηµα σχηµάτων Πειράµατος ΙΙΙ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ VII

11 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ Σελ. Πίνακας 1. Σύνθεση θρεπτικού υποστρώµατος Olive Medium (ΟΜ) (Rugini, 1984) 10 Πίνακας 1.1. Η επίδραση της απολύµανσης στην in vitro υάλωση και εγκατάσταση εκφύτων ελιάς της ποικιλίας Αµφίσσης, τα οποία προήλθαν από ώριµους και νεανικούς βλαστούς υπαίθρου Πίνακας 1.2. Η επίδραση της απολύµανσης στην in vitro υάλωση και εγκατάσταση εκφύτων ελιάς της ποικιλίας Γαλάτιστας, τα οποία προήλθαν από ώριµους και νεανικούς βλαστούς υπαίθρου Πίνακας 1.3. Η επίδραση της απολύµανσης στην in vitro υάλωση και εγκατάσταση εκφύτων ελιάς της ποικιλίας Κορωνέικη, τα οποία προήλθαν από ώριµους και νεανικούς βλαστούς υπαίθρου Πίνακας 1.4. Η επίδραση της απολύµανσης στην in vitro υάλωση και εγκατάσταση εκφύτων ελιάς της ποικιλίας Λαδολιά Πατρών, τα οποία προήλθαν από ώριµους και νεανικούς βλαστούς υπαίθρου Πίνακας 1.5. Η επίδραση της απολύµανσης στην in vitro υάλωση και εγκατάσταση εκφύτων ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής, τα οποία προήλθαν από ώριµους και νεανικούς βλαστούς υπαίθρου Πίνακας 1.6. Η επίδραση της απολύµανσης στην in vitro υάλωση και εγκατάσταση εκφύτων ελιάς της ποικιλίας Mnznillo, τα οποία προήλθαν από ώριµους και νεανικούς βλαστούς υπαίθρου Πίνακας 1.7. Η επίδραση της απολύµανσης στην in vitro υάλωση και εγκατάσταση εκφύτων ελιάς της ποικιλίας Αµφίσσης, τα οποία προήλθαν από νεανικούς βλαστούς µητρικών φυτών θερµοκηπίου Πίνακας 1.8. Η επίδραση της απολύµανσης στην in vitro υάλωση και εγκατάσταση εκφύτων ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής, τα οποία προήλθαν από νεανικούς βλαστούς µητρικών φυτών θερµοκηπίου Πίνακας 1.9. Η επίδραση της απολύµανσης στην in vitro υάλωση και εγκατάσταση εκφύτων ελιάς της ποικιλίας Arbequin, τα οποία προήλθαν από νεανικούς βλαστούς µητρικών φυτών θερµοκηπίου VIII

12 Πίνακας Η επίδραση της απολύµανσης στην in vitro υάλωση και εγκατάσταση εκφύτων ελιάς της ποικιλίας FS-17, τα οποία προήλθαν από νεανικούς βλαστούς µητρικών φυτών θερµοκηπίου Πίνακας Η επίδραση της απολύµανσης στην in vitro υάλωση και εγκατάσταση εκφύτων ελιάς της ποικιλίας Picul, τα οποία προήλθαν από νεανικούς βλαστούς µητρικών φυτών θερµοκηπίου Πίνακας Η επίδραση του είδους του εκφύτου στην in vitro εγκατάσταση εκφύτων ελιάς της ποικ. Χονδρολιά Χαλκιδικής Πίνακας 2.1. Ιδιότητες βερµικουλίτη (Θεριός, 1996) IX

13 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σελ. Σχήµα 1.1. Επίδραση του είδους του εκφύτου στο ποσοστό υαλωµένων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα 2.1. Επίδραση του είδους του θρεπτικού υποστρώµατος και της συγκέντρωσης των µακροστοιχείων στο ποσοστό υαλωµένων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα 2.2. Επίδραση του είδους του θρεπτικού υποστρώµατος και της συγκέντρωσης των µακροστοιχείων στον αριθµό των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα 2.3. Επίδραση του είδους του θρεπτικού υποστρώµατος και της συγκέντρωσης των µακροστοιχείων στο µήκος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα 2.4. Επίδραση του είδους του θρεπτικού υποστρώµατος και της συγκέντρωσης των µακροστοιχείων στο νωπό βάρος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα 2.5. Επίδραση του είδους του θρεπτικού υποστρώµατος και της συγκέντρωσης των µακροστοιχείων στο ξηρό βάρος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα 2.6. Επίδραση της τιµής του ph του θρεπτικού υποστρώµατος στο ποσοστό υαλωµένων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα 2.7. Επίδραση της τιµής του ph του θρεπτικού υποστρώµατος στον αριθµό των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα 2.8. Επίδραση της τιµής του ph του θρεπτικού υποστρώµατος στο µήκος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα 2.9. Επίδραση της συγκέντρωσης της κυτοκινίνης του θρεπτικού υποστρώµατος στο ποσοστό υαλωµένων βλαστών/έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης της κυτοκινίνης του θρεπτικού υποστρώµατος στον αριθµό των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" X

14 Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης της κυτοκινίνης του θρεπτικού υποστρώµατος στο µήκος των νέων βλαστών/έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης της κυτοκινίνης του θρεπτικού υποστρώµατος στο νωπό βάρος των νέων βλαστών/έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης της κυτοκινίνης του θρεπτικού υποστρώµατος στο ξηρό βάρος των νέων βλαστών/έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης της κυτοκινίνης ΒΑ και της χρονικής διάρκειας της εξωτερικής εφαρµογής της στο ποσοστό υαλωµένων βλαστών/έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης της κυτοκινίνης ΒΑ και της χρονικής διάρκειας της εξωτερικής εφαρµογής της στον αριθµό των νέων βλαστών/έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης της κυτοκινίνης ΒΑ και της χρονικής διάρκειας της εξωτερικής εφαρµογής της στο µήκος των νέων βλαστών/έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης της κυτοκινίνης ΒΑ και της χρονικής διάρκειας της εξωτερικής εφαρµογής της στο νωπό βάρος των νέων βλαστών/έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της συγκέντρωσης της κυτοκινίνης ΒΑ και της χρονικής διάρκειας της εξωτερικής εφαρµογής της στο ξηρό βάρος των νέων βλαστών/έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της κυτοκινίνης ΒΑ και του γιββερελλικού οξέος (GA 3 ) στο ποσοστό των υαλωµένων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της κυτοκινίνης ΒΑ και του γιββερελλικού οξέος (GA 3 ) στον αριθµό των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της κυτοκινίνης ΒΑ και του γιββερελλικού οξέος (GA 3 ) στο µήκος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της κυτοκινίνης ΒΑ και του γιββερελλικού οξέος (GA 3 ) στο νωπό βάρος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" XI

15 Σχήµα Επίδραση της κυτοκινίνης ΒΑ και του γιββερελλικού οξέος (GA 3 ) στο ξηρό βάρος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στην κυτοκινίνη (ΒΑ 2 mg l -1 ) και στη συνέχεια του γιββερελλικού οξέος (GA 3 ) στο ποσοστό των υαλωµένων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στην κυτοκινίνη (ΒΑ 2 mg l -1 ) και στη συνέχεια του γιββερελλικού οξέος (GA 3 ) στον αριθµό των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στην κυτοκινίνη (ΒΑ 2 mg l -1 ) και στη συνέχεια του γιββερελλικού οξέος (GA 3 ) στο µήκος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στην κυτοκινίνη (ΒΑ 2 mg l -1 ) και στη συνέχεια του γιββερελλικού οξέος (GA 3 ) στο νωπό βάρος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στην κυτοκινίνη (ΒΑ 2 mg l -1 ) και στη συνέχεια του γιββερελλικού οξέος (GA 3 ) στο ξηρό βάρος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων Dikegulc του θρεπτικού υποστρώµατος στο ποσοστό υαλωµένων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων Dikegulc του θρεπτικού υποστρώµατος στον αριθµό νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων Dikegulc του θρεπτικού υποστρώµατος στο µήκος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων Dikegulc του θρεπτικού υποστρώµατος στο νωπό βάρος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων Dikegulc του θρεπτικού υποστρώµατος στο ξηρό βάρος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" XII

16 Σχήµα Επίδραση των αναστολέων του αιθυλενίου στο ποσοστό υάλωσης των βλαστών ελιάς της ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση των αναστολέων του αιθυλενίου στον αριθµό των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς της ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση των αναστολέων του αιθυλενίου στο µήκος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς της ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση των αναστολέων του αιθυλενίου στο νωπό βάρος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς της ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση των αναστολέων του αιθυλενίου στο ξηρό βάρος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς της ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της παραµονής των εκφύτων σε υπόστρωµα µε άγαρ και µε βερµικουλίτη, καθώς και η εναλλαγή των υποστρωµάτων, στο ποσοστό υαλωµένων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της παραµονής των εκφύτων σε υπόστρωµα µε άγαρ και µε βερµικουλίτη, καθώς και η εναλλαγή των υποστρωµάτων, στον αριθµό των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της παραµονής των εκφύτων σε υπόστρωµα µε άγαρ και µε βερµικουλίτη, καθώς και η εναλλαγή των υποστρωµάτων, στο µήκος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της παραµονής των εκφύτων σε υπόστρωµα µε άγαρ και µε βερµικουλίτη, καθώς και η εναλλαγή των υποστρωµάτων, στο νωπό βάρος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση της παραµονής των εκφύτων σε υπόστρωµα µε άγαρ και µε βερµικουλίτη, καθώς και η εναλλαγή των υποστρωµάτων, στο ξηρό βάρος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα Επίδραση του είδους του φωτισµού στο ποσοστό υάλωσης των βλαστών ελιάς της ποικ. ''Χονδρολιά Χαλκιδικής'' (Συνεχής έκθεση στα διάφορα φώτα ή στο σκοτάδι) Σχήµα Επίδραση του είδους του φωτισµού στον αριθµό νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς της ποικ. ''Χονδρολιά Χαλκιδικής'' (Συνεχής έκθεση στα διάφορα φώτα ή στο σκοτάδι) XIII

17 Σχήµα Επίδραση του είδους του φωτισµού στο µήκος νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς της ποικ. ''Χονδρολιά Χαλκιδικής'' (Συνεχής έκθεση στα διάφορα φώτα ή στο σκοτάδι) Σχήµα Επίδραση του είδους του φωτισµού στο νωπό και ξηρό βάρος των νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς της ποικ. ''Χονδρολιά Χαλκιδικής'' (Συνεχής έκθεση στα διάφορα φώτα ή στο σκοτάδι) Σχήµα Επίδραση του είδους του φωτισµού στο ποσοστό υάλωσης των βλαστών ελιάς της ποικ. ''Χονδρολιά Χαλκιδικής'' (1 εβδοµάδα στους µονοχρωµατικούς φωτισµούς ή στο σκοτάδι και µεταφορά στο λευκό φως) Σχήµα Επίδραση του είδους του φωτισµού στον αριθµό νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς της ποικ. ''Χονδρολιά Χαλκιδικής'' (1 εβδοµάδα στους µονοχρωµατικούς φωτισµούς ή στο σκοτάδι και µεταφορά στο λευκό φως) Σχήµα Επίδραση του είδους του φωτισµού στο µήκος νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς της ποικ. ''Χονδρολιά Χαλκιδικής'' (1 εβδοµάδα στους µονοχρωµατικούς φωτισµούς ή στο σκοτάδι και µεταφορά στο λευκό φως) Σχήµα Επίδραση του είδους του φωτισµού στο βάρος νέων βλαστών/ έκφυτο ελιάς της ποικ. ''Χονδρολιά Χαλκιδικής'' (1 εβδοµάδα στους µονοχρωµατικούς φωτισµούς ή στο σκοτάδι και µεταφορά στο λευκό φως) Σχήµα 3.1. Επίδραση των αυξινών ΙΒΑ και ΝΑΑ, καθώς και της µερικής συσκότισης της βάσης των εκφύτων, στο ποσοστό της in vitro ριζοβολίας της ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα 3.2. Επίδραση των αυξινών ΙΒΑ και ΝΑΑ, καθώς και της µερικής συσκότισης της βάσης των εκφύτων της ελιάς, στον αριθµό των ριζών/ βλαστό της ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα 3.3. Επίδραση των αυξινών ΙΒΑ και ΝΑΑ, καθώς και της µερικής συσκότισης της βάσης των εκφύτων της ελιάς, στο µήκος των ριζών/ βλαστό της ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" Σχήµα 3.4. Επίδραση των αυξινών ΙΒΑ και ΝΑΑ, καθώς και της µερικής συσκότισης της βάσης των εκφύτων της ελιάς, στο ποσοστό της in vivo επιβίωσης των φυταρίων της ελιάς ποικ. "Χονδρολιά Χαλκιδικής" XIV

18 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΕΙΚΟΝΩΝ Σελ. Εικόνα 1.1. Έκφυτο ελιάς ενός γονάτου Εικόνα 1.2. Περιορισµένη έκπτυξη πλευρικών οφθαλµών εκφύτου ελιάς της ποικιλίας Arbequin Εικόνα 1.3. Υάλωση εκφύτου και νέου βλαστού ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής Εικόνα 1.4. Σχηµατισµός νέων βλαστών σε έκφυτο ελιάς ενός γονάτου της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής Εικόνα 1.5. Σχηµατισµός νέων βλαστών σε έκφυτο ελιάς δύο γονάτων της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής Εικόνα 2.1. Σχηµατισµός νέων βλαστών ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής σε πλήρες θρεπτικό υπόστρωµα ΟΜ Εικόνα 2.2. Σχηµατισµός νέων βλαστών ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής σε θρεπτικό υπόστρωµα ΟΜ µε ph 5, Εικόνα 2.3. Σχηµατισµός νέων βλαστών ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής σε θρεπτικό υπόστρωµα ΟΜ παρουσία 2 mg l -1 ζεατίνης Εικόνα 2.4. Σχηµατισµός νέων βλαστών ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής σε θρεπτικό υπόστρωµα ΟΜ παρουσία 2 mg l -1 κυτοκινίνης ΒΑ Εικόνα 2.5. Σχηµατισµός νέων βλαστών ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής σε θρεπτικό υπόστρωµα ΟΜ παρουσία 0,4 mg l -1 κυτοκινίνης TDZ Εικόνα 2.6. Σχηµατισµός νέων βλαστών ελιάς µετά από εµβάπτιση της βάσης του εκφύτου της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής σε διάλυµα 100 mg l -1 κυτοκινίνης ΒΑ για 1 min Εικόνα 2.7. Σχηµατισµός νέων βλαστών ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής σε θρεπτικό υπόστρωµα ΟΜ παρουσία 100,5 µμ dikegulc Εικόνα 2.8. Σχηµατισµός νέων βλαστών ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής σε θρεπτικό υπόστρωµα ΟΜ παρουσία 10 µμ AgNO Εικόνα 2.9. υσµενής επίδραση της εφαρµογής 30 µm CoCl 2 στο σχηµατισµό νέων βλαστών ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής XV

19 Εικόνα υσµενής επίδραση της εφαρµογής σαλικυλικού οξέος στο σχηµατισµό νέων βλαστών ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής Εικόνα In vitro καλλιέργεια εκφύτων ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής σε υπόστρωµα βερµικουλίτη εµποτισµένο µε θρεπτικό διάλυµα ΟΜ Εικόνα υσµενής επίδραση της υψηλότερης συγκέντρωσης άγαρ (10 g l -1 ) στο σχηµατισµό νέων βλαστών ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής Εικόνα Σχηµατισµός νέων βλαστών ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά µετά από συνεχή έκθεση σε κίτρινο φωτισµό Εικόνα 3.1. Μικροβλαστοί ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής πριν εγκατασταθούν in vitro στο υπόστρωµα ριζοβολίας Εικόνα 3.2. Εξαγωγή νέου φυταρίου ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής από στερεό θρεπτικό υπόστρωµα ριζοβολίας Εικόνα 3.3. In vitro ριζοβολία µικροβλαστού ελιάς της ποικιλίας Χονδρολιά Χαλκιδικής σε θρεπτικό υπόστρωµα ½ΟΜ παρουσία 1 mg l -1 NAA και µετά από µερική συσκότιση της βάσης του XVI

20 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ 1.1 Η Ελιά Η ευρωπαϊκή ελιά (Ole europe L.) αποτελεί πηγή βρώσιµου λαδιού και επεξεργασµένων βρώσιµων καρπών. Ανήκει στην τάξη Oleles και στην οικογένεια Olecee. Το γένος Ole περιλαµβάνει περίπου 30 είδη, από τα οποία µόνο το είδος Ole europe L. παρουσιάζει εµπορικό ενδιαφέρον και το οποίο απαρτίζεται από πολλές οµάδες και από 2600 ποικιλίες. Είναι υποτροπικό είδος, αειθαλές και υπεραιωνόβιο. Σήµερα, η ελιά καλλιεργείται παγκοσµίως σε µια έκταση περίπου 100 εκατ. στρεµµάτων, το 60% της οποίας αποτελεί την κύρια καλλιέργεια. Η παραδοσιακή περιοχή της ελαιοκαλλιέργειας είναι η λεκάνη της Μεσογείου, περιλαµβάνοντας το 95% των ελαιώνων παγκοσµίως και στην οποία παράγονται το 97% του ελαιόλαδου και το 75% των επιτραπέζιων ελιών παγκοσµίως (Therios, 2009). Η Ελλάδα κατέχει την 3 η θέση µεταξύ των ελαιοπαραγωγών χωρών του κόσµου και οι ελαιώνες καλύπτουν το 14,1% των καλλιεργούµενων εκτάσεών της (Θεριός, 2005). Η καλλιέργεια της ελιάς παίζει σηµαντικό κοινωνικοοικονοµικό και οικολογικό ρόλο. Λόγω της ανθεκτικότητάς της στην ξηρασία και της προσαρµοστικότητάς της σε ξηρά και άγονα εδάφη αξιοποιεί περιοχές όπου δε θα µπορούσαν να καλλιεργηθούν άλλα οπωροφόρα είδη, ενώ παράλληλα προσφέρει απασχόληση και ικανοποιητικό εισόδηµα στο ντόπιο πληθυσµό. Οι εξαγωγές ελαιόλαδου και επιτραπέζιων ελιών είναι σηµαντική πηγή εισοδήµατος για τη χώρα µας. Τα τελευταία 30 χρόνια, κυρίως λόγω της προώθησης της µεσογειακής διατροφής, η παραγωγή και η κατανάλωση ελαιόλαδου έχουν αυξηθεί. Στο άµεσο µέλλον δεν αναµένεται αλλαγή σε αυτήν την τάση, αν λάβουµε υπόψη την πρόσφατη εισαγωγή ή αύξηση της ελαιοκαλλιέργειας και της κατανάλωσης ελαιόλαδου σε χώρες όπως είναι η Ιαπωνία, η Αυστραλία, η Κίνα και η Νότια Αφρική. Η µεγάλη ζήτηση σε ελαιόλαδο και επιτραπέζιες ελιές απαιτεί εντατικά προγράµµατα καλλιέργειας, αλλά και την παραγωγή µεγάλου αριθµού δενδρυλλίων, τόσο για την εγκατάσταση νέων όσο και για αντικατάσταση των παλαιοτέρων. Τα νέα δένδρα θα πρέπει να είναι υγιή, όµοια µε τις µητρικές ποικιλίες και να παρουσιάζουν ταχεία είσοδο στην καρποφορία. Επιπλέον, καθώς η ελαιοκαλλιέργεια µετατρέπεται 1

21 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ από τις παραδοσιακές χειρονακτικές µεθόδους σε µηχανικές, το φυτικό υλικό θα πρέπει να αναπτυχθεί κατά τέτοιο τρόπο ώστε να ικανοποιήσει τις µελλοντικές ανάγκες. Θα χρειαστεί, επίσης, η επιλογή κλώνων οι οποίοι θα καρποφορούν νωρίς, θα παρουσιάζουν ανθεκτικότητα σε ασθένειες, θα επιτρέπουν τη µηχανική συγκοµιδή και θα παράγουν ποιοτικό λάδι και καρπό. Η ελιά σήµερα πολλαπλασιάζεται µε σπόρο και εµβολιασµό και φυλλοφόρα µοσχεύµατα. Ο πολλαπλασιασµός όµως µε σπόρο δε συνιστάται, γιατί οι ποικιλίες της ελιάς αφενός µεν δεν αναπαράγονται πιστά (ετεροζυγωτία), αφετέρου δε τα παραγόµενα φυτά - σπορόφυτα χαρακτηρίζονται από πολύ µακρά περίοδο νεανικότητας, που έχει ως συνέπεια µεγάλη καθυστέρηση στην είσοδό τους σε καρποφορία. Εντούτοις, ο τρόπος αυτός χρησιµοποιείται ευρέως για την παραγωγή σπορόφυτων υποκειµένων, στα οποία θα εµβολιαστούν αργότερα οι καλλιεργούµενες ποικιλίες ελιάς, αλλά και σε προγράµµατα γενετικής βελτίωσης (Rugini, 1986). Επίσης, η ελιά µπορεί να πολλαπλασιαστεί αγενώς µε µοσχεύµατα (φυλλοφόρα και σκληρού ξύλου), παραφυάδες, σφαιροβλάστες, εµβολιασµό και υπό ασηπτικές συνθήκες µε τη µέθοδο της ιστοκαλλιέργειας. Ο πολλαπλασιασµός µε µοσχεύµατα είναι ευρέως διαδεδοµένος για την παραγωγή αυτόρριζων φυτών, µειονεκτεί όµως στο γεγονός ότι αρκετές ποικιλίες δε ριζοβολούν εύκολα (π.χ. η Καλαµών ), ενώ απαιτεί και ειδικές εγκαταστάσεις (υδρονέφωση). Ο πολλαπλασιασµός µε έρριζες παραφυάδες ή σφαιροβλάστες χρησιµοποιείται σε πολύ µικρή κλίµακα σήµερα, καθώς κατά τη συλλογή τους µπορεί να προκληθούν τραυµατισµοί στα µητρικά φυτά, ενώ και τα παραγόµενα δενδρύλλια έχουν έντονα νεανικά χαρακτηριστικά και καθυστερούν σηµαντικά να µπουν σε καρποφορία (Ποντίκης, 2000). Ο πολλαπλασιασµός µε εµβολιασµό χρησιµοποιείται σήµερα για ποικιλίες που ριζοβολούν δύσκολα µε µοσχεύµατα, ωστόσο µπορεί να γίνει µόνο από άτοµα µε γνώση και εµπειρία. Η ιστοκαλλιέργεια (ή µικροπολλαπλασιασµός ή in vitro καλλιέργεια) είναι µια νέα σχετικά και δυναµική τεχνική µαζικού πολλαπλασιασµού µε ιδιαίτερες δυνατότητες. Η τεχνική αυτή µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την ταχεία παραγωγή υγιών φυτών ελιάς, ακόµη και ποικιλιών που πολλαπλασιάζονται δύσκολα µε µοσχεύµατα, καθώς και στη γενετική βελτίωση και τη διατήρηση του γενετικού υλικού της ελιάς (Rugini, 1986, Rugini, 1990). Τα τελευταία χρόνια έγινε αξιόλογη προσπάθεια προς αυτές τις κατευθύνσεις, µε αντικειµενικούς στόχους το γρήγορο και εύκολο πολλαπλασιασµό 2

22 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ επιλεγµένων γενοτύπων και την παραγωγή φυτών ανθεκτικών σε βιοτικούς και αβιοτικούς παράγοντες κ.ά. (Brtolozzi κ.ά., 2001, Mencuccini, 2003, Sghir κ.ά., 2005, Fodle κ.ά., 2006). Παρά τις προσπάθειες όµως που καταβάλλονται, υπάρχουν ακόµα αρκετά προβλήµατα που αφορούν τους παράγοντες και τις συνθήκες που ρυθµίζουν την in vitro ανάπτυξη των εκφύτων της ελιάς. 1.2 Χονδρολιά Χαλκιδικής Η συγκεκριµένη ποικιλία καλλιεργείται στη Β. Ελλάδα, ιδιαίτερα στην περιοχή της Χαλκιδικής, και έχει πολύ µεγάλο καρπό, ο οποίος µπορεί να φθάσει και να υπερβεί τα 10 g. Χρησιµοποιείται για την παραγωγή κυρίως πράσινων ελαιών και η ποσότητα που πλεονάζει για εξαγωγή ελαιολάδου. Πρόκειται για ποικιλία αυτόστειρη, η οποία επικονιάζεται από τις ποικιλίες Αµφίσσης, Μεγαρίτικη, Κορωνέικη, Mnznillo και Gordles. Είναι ευπαθής σε προσβολές του εντόµου Dcus olee ( άκος) (Θεριός, 2005). Η Χονδρολιά Χαλκιδικής πολλαπλασιάζεται κυρίως µε φυλλοφόρα µοσχεύµατα, παρουσιάζοντας µέτρια ως υψηλά ποσοστά ριζοβολίας (Porlingis και Therios, 1976), αλλά και µε εµβολιασµό. Τα τελευταία χρόνια γίνονται προσπάθειες για το µαζικό πολλαπλασιασµό της (Γρηγοριάδου, 2003, Ζακυνθινός κ.ά., 2007), µε σκοπό την αύξηση του αριθµού των παραγόµενων δενδρυλίων, καθώς από ένα αρχικό έκφυτο µπορούµε να πάρουµε χιλιάδες νέα φυτά, αλλά και τη µείωση του χρόνου και του χώρου παραγωγής των φυτών. Επιπλέον, ο µικροπολλαπλασιασµός πραγµατοποιείται σε ελεγχόµενες συνθήκες, µε αποτέλεσµα την παραγωγή υγιών φυτών, του ιδίου γενότυπου µε την ποικιλία της ελιάς. 3

23 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ 2. In vitro καλλιέργεια της ελιάς Νέα φυτά ελιάς υπό ασηπτικές συνθήκες είναι δυνατό να παραχθούν µε τρεις τρόπους (Hicks, 1980): 1. Από προϋπάρχοντες βλαστοφόρους οφθαλµούς (ή καταβολές οφθαλµών µεριστώµατα), οι οποίοι υποχρεώνονται να βλαστήσουν και να πολλαπλασιαστούν. 2. Μέσω της οργανογένεσης. Ο σχηµατισµό οργάνων (βλαστοί, φύλλα, άνθη) από µη οργανωµένους ιστούς (κυτταροκαλλιέργειες, κάλλοι). 3. Με το σχηµατισµό σωµατικών εµβρύων. Τα έµβρυα αυτά, όπως και τα κανονικά, µπορούν να αναπτυχθούν και να δώσουν νέα φυτά. Συγκριτικά µε τις παραδοσιακές µεθόδους πολλαπλασιασµού της ελιάς µε µοσχεύµατα και εµβολιασµό, τα πλεονεκτήµατα της ιστοκαλλιέργειας είναι τα εξής: Μαζικός πολλαπλασιασµός ποικιλιών ή κλώνων καθ όλη τη διάρκεια του έτους, ανάλογα µε τη ζήτηση της αγοράς. Παραγωγή υγιών φυτών, απαλλαγµένων από ιώσεις, µε σταθερά µορφολογικά και αγρονοµικά χαρακτηριστικά, σε σύντοµο χρονικό διάστηµα. Σωµατικός πολλαπλασιασµός ποικιλιών που ριζοβολούν δύσκολα. Περιλαµβάνει τεχνικές για την παραγωγή υγιών φυτών από ιωµένα µητρικά φυτά, π.χ. καλλιέργεια επάκριου µεριστώµατος και µικροεµβολιασµός (Frhni κ.ά., 2006). Είναι δυνατή η εµπορία φυτικού υλικού σε διεθνές επίπεδο, καθώς και η µεταφορά γενετικού υλικού χωρίς να χρειάζεται να υποστεί περιόδους καραντίνας. Ωστόσο, για την εφαρµογή της ιστοκαλλιέργειας απαιτούνται ειδικές εγκαταστάσεις και εξοπλισµός, καθώς και εξειδικευµένο επιστηµονικό προσωπικό, ανεβάζοντας το οικονοµικό κόστος. Το γεγονός αυτό αποτελεί εµπόδιο στη διάδοση της τεχνικής στα φυτώρια, αν και οι Zuccherelli και Zuccherelli (2002) αναφέρουν ότι ένας µεγάλος αριθµός ποικιλιών ελιάς µπορεί να πολλαπλασιαστεί in vitro µαζικά και οικονοµικά. Άλλο ένα εµπόδιο αυτής της τεχνικής αποτελεί η συµπεριφορά των µικροπολλαπλασιασµένων φυτών στον αγρό, σε σχέση µε τα εµβολιασµένα ή τα αυτόρριζα φυτά. 4

24 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ 2.1 Στάδια µικροπολλαπλασιασµού της ελιάς Ο µικροπολλαπλασιασµός της ελιάς είναι µια διαδικασία πολλαπλών σταδίων, η οποία ξεκινάει µε την κοπή µοσχευµάτων από µητρικά φυτά-δότες και την in vitro εγκατάσταση των εκφύτων και ολοκληρώνεται όταν τα νέα ριζοβοληµένα φυτάρια µεταφερθούν και εγκατασταθούν επιτυχώς σε in vivo συνθήκες. Ο Murshige (1974) πρότεινε τη διαίρεση του µικροπολλαπλασιασµού σε τρία στάδια. Καθώς όµως η µέθοδος βελτιώθηκε προστέθηκαν και άλλα στάδια, καταλήγοντας σήµερα σε πέντε απαραίτητα στάδια για έναν πετυχηµένο µικροπολλαπλασιασµό: Στάδιο 0: Μεταχείριση µητρικών φυτών (δότες εκφύτων) Στάδιο Ι: Εγκατάσταση της in vitro καλλιέργειας Στάδιο ΙΙ: Σχηµατισµός νέων βλαστών Στάδιο ΙΙΙ: Ριζοβολία µικροβλαστών Στάδιο IV: Εγκλιµατισµός των νέων φυτών. Στις αρχές της δεκαετίας του 1990, λίγες ποικιλίες ελιάς µπορούσαν να πολλαπλασιαστούν in vitro, ειδικά όταν τα έκφυτα προέρχονταν από ώριµα δένδρα. Στην προσπάθεια δηµιουργίας ενός αποτελεσµατικού πρωτοκόλλου µικροπολλαπλασιασµού της ελιάς παρουσιάστηκαν αρκετά προβλήµατα, µεταξύ των οποίων: 1) η δυσκολία δηµιουργίας ασηπτικών καλλιεργειών, όταν τα έκφυτα προέρχονται από φυτά από το ύπαιθρο ή το θερµοκήπιο, 2) η οξείδωση των φυτικών ιστών που ακολουθεί την προετοιµασία των εκφύτων, και 3) η δυσκολία εγκατάστασης in vitro καλλιεργειών που παρουσιάζουν ορισµένες ποικιλίες ελιάς. Από τα µέσα της δεκαετίας του 1990 και µετά, αν και έχει σηµειωθεί πρόοδος, ωστόσο ο µικροπολλαπλασιασµός της ελιάς δεν µπορεί να εφαρµοστεί ακόµη ευρέως σε εµπορική κλίµακα (Fbbri κ.ά., 2004) Στάδιο 0: Μεταχείριση µητρικών φυτών Η συλλογή βλαστών από τα µητρικά φυτά δότες αποτελεί το πρώτο βήµα για την έναρξη του in vitro πολλαπλασιασµού της ελιάς. Η επιλογή των µητρικών φυτών πρέπει να γίνεται προσεκτικά, µε βάση τα φαινοτυπικά τους χαρακτηριστικά, τη γενετική τους σταθερότητα και την υγεία τους. Τα φυτά-δότες µπορούν να καλλιεργούνται στο ύπαιθρο ή σε θερµοκήπιο. 5

25 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ 2.1.1α Έκφυτα από µητρικά φυτά υπαίθρου Η έναρξη του µικροπολλαπλασιασµού µε έκφυτα τα οποία προέρχονται από ώριµα δένδρα υπαίθρου είναι δύσκολη και χρονοβόρα, κυρίως λόγω του υψηλού ποσοστού µόλυνσης και της έντονης οξείδωσης των φυτικών ιστών η οποία παρουσιάζεται µετά την εγκατάσταση της in vitro καλλιέργειας. Το φαινόµενο της οξείδωσης έχει διαπιστωθεί ότι µπορεί να µειωθεί όταν τα έκφυτα προέρχονται από βλαστούς που παρουσιάζουν νεανικά χαρακτηριστικά, όπως είναι οι παραφυάδες και οι βλαστοί που σχηµατίζονται από γροθάρια και σφαιροβλάστες, τα οποία καλλιεργούνται κάτω από ηµι-ασηπτικές συνθήκες (Cñs κ.ά., 1992). Είναι όµως σηµαντικό να αναφερθεί ότι, όταν χρησιµοποιείται αυτό το είδος εκφύτου, το στάδιο της νεανικότητας µπορεί να διαρκέσει ακόµη και µετά την φύτευση των νέων φυτών στον αγρό, οπότε να καθυστερήσει και η έναρξη καρποφορίας για ένα ή περισσότερα χρόνια β Έκφυτα από µητρικά φυτά θερµοκηπίου Προκειµένου να αυξηθεί το ποσοστό των υγιών εκφύτων ελιάς συνιστάται να χρησιµοποιούνται µητρικά φυτά σε γλάστρες που διατηρούνται µέσα σε θερµοκήπιο. Τα µητρικά φυτά πρέπει να προέρχονται από εµβολιασµό της επιθυµητής ποικιλίας επάνω σε σπορόφυτα. Επίσης, πρέπει να λαµβάνονται φυτοπροστατευτικά µέτρα, ενώ φυτά µε έντονη µυκητολογική, βακτηριακή ή ιολογική µόλυνση θα πρέπει να αποµακρύνονται Στάδιο Ι: Εγκατάσταση in vitro καλλιέργειας Ο σκοπός του Σταδίου Ι είναι η έναρξη της ασηπτικής καλλιέργειας και η ανεύρεση του πλέον κατάλληλου θρεπτικού υποστρώµατος για την εγκατάσταση της δεδοµένης καλλιέργειας. Για τα ξυλώδη είδη, το στάδιο ανάπτυξης του εκφύτου συµβάλλει σηµαντικά στην επιτυχία του µικροπολλαπλασιασµού. Όσον αφορά την ελιά, τα καλύτερα έκφυτα για την έναρξη της in vitro καλλιέργειας είναι οι τρυφεροί βλαστοί της κορυφής και τα µοσχεύµατα 1 γονάτου (1-2 cm σε µήκος) τα οποία προέρχονται από ζωηρούς βλαστούς, µετά την έναρξη της βλάστησης. Περιστασιακά χρησιµοποιούνται µοσχεύµατα 2 ή 3 γονάτων (Fbbri κ.ά., 2004). 6

26 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ 2.1.2α Απολύµανση εκφύτων Η απολύµανση του φυτικού υλικού πριν την in vitro εγκατάσταση της καλλιέργειας της ελιάς αποτελεί βασικό στάδιο της συνολικής τεχνικής. Η εµβάπτιση σε διαλύµατα αιθανόλης συνιστάται να αποφεύγεται, καθώς οι ιστοί αφυδατώνονται. Ανάλογα µε το βαθµό της µόλυνσης του µητρικού υλικού µπορεί να χρησιµοποιηθεί το υποχλωριώδες νάτριο (NClO) σε διάφορες συγκεντρώσεις. Πριν την εφαρµογή της απολύµανσης, συνιστάται το ξέπλυµα των εκφύτων µε τρεχούµενο νερό βρύσης για περίπου 30 λεπτά (Fbbri κ.ά., 2004) β Οξείδωση εκφύτων Η ελιά είναι ένα ξυλώδες είδος το οποίο από τη φύση του περιέχει υψηλή συγκέντρωση φαινολών, µε αποτέλεσµα οι ιστοί των εκφύτων να νεκρώνονται λόγω της έντονης οξείδωσης που παρατηρείται µετά την κοπή και την in vitro εγκατάστασή τους. Συνιστάται η προσθήκη στο θρεπτικό υπόστρωµα αντιοξειδωτικών ενώσεων και η συχνή επανακαλλιέργεια των εκφύτων σε νέο θρεπτικό υπόστρωµα (Fbbri κ.ά., 2004) γ Τέλος Σταδίου Ι Μετά τη χηµική απολύµανση, τα έκφυτα εγκαθίστανται σε δοκιµαστικούς σωλήνες για 4-6 εβδοµάδες, µε σκοπό τον εντοπισµό παθογόνων µικροοργανισµών που δεν αντιµετωπίστηκαν µε την απολύµανση. Μετά το πέρας αυτής της περιόδου, τα έκφυτα αναπτύσσουν µικροβλαστούς 2-3 cm, οι οποίοι µπορούν να χρησιµοποιηθούν στο Στάδιο ΙΙ Στάδιο ΙΙ: Σχηµατισµός νέων βλαστών Για την πλειονότητα των ξυλωδών ειδών, ο σχηµατισµός νέων βλαστών επιτυγχάνεται γενικά µε την ανάπτυξη µασχαλιαίων και επίκτητων οφθαλµών, ως αποτέλεσµα του ερεθίσµατος των εξωγενών κυτοκινινών. Αρχικά, βλαστάνουν οι µασχαλιαίοι οφθαλµοί, ενώ αργότερα εµφανίζονται οι επίκτητοι οφθαλµοί, κυρίως στο κάτω τµήµα των βλαστών. Οι βλαστοί της ελιάς χαρακτηρίζονται από έντονη κυριαρχία της κορυφής, η οποία επηρεάζει τον τρόπο ανάπτυξής τους και η οποία δεν µειώνεται µε την εφαρµογή κυτοκινινών. Ως συνέπεια, ο σχηµατισµός νέων βλαστών µέσω του ερεθίσµατος µασχαλιαίων και επίκτητων οφθαλµών δεν είναι επαρκής, και ο 7

27 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ πολλαπλασιασµός των βλαστών επιτυγχάνεται κυρίως µε την επανακαλλιέργεια επιµηκυσµένων βλαστών των πρώτων γονάτων. Ο ρυθµός δηµιουργίας των νέων βλαστών ποικίλλει ανάλογα µε το γενότυπο και, όπως συµβαίνει στα περισσότερα ξυλώδη φυτά, αυξάνεται µε την πρόοδο των διαδοχικών επανακαλλιεργειών. Ωστόσο, ορισµένες ποικιλίες ελιάς δεν κατορθώνουν να προσαρµοστούν ικανοποιητικά in vitro και ο ρυθµός βλαστογένεσης αρχίζει να µειώνεται κατά τις επανακαλλιέργειες (Fbbri κ.ά., 2004) α Σύνθεση θρεπτικού υποστρώµατος Γενικά, ένα θρεπτικό υπόστρωµα µικροπολλαπλασιασµού αποτελείται από ανόργανα άλατα (µακρο- και ιχνοστοιχεία), βιταµίνες, υδατάνθρακες και άγαρ. Συγκεκριµένοι ρυθµιστές αύξησης (εξωγενείς ορµόνες) προστίθενται στη συνέχεια στα διάφορα στάδια του µικροπολλαπλασιασµού. Όσον αφορά την ελιά, δηµιουργήθηκε ένα συγκεκριµένο θρεπτικό υπόστρωµα (ως προς τα ανόργανα άλατα, τις βιταµίνες και τα αµινοξέα) µε βάση την ανάλυση των ανόργανων στοιχείων των βλαστών που προέρχονταν από καλλιέργεια υπαίθρου (Πίνακας 1) (Rugini, 1984). Το υπόστρωµα αυτό ονοµάστηκε Olive Medium (ΟΜ) και αποτέλεσε σηµαντικό βήµα για τη βελτίωση του µικροπολλαπλασιασµού της ελιάς και της δηµιουργίας βλαστών. Η επιλογή του κατάλληλου θρεπτικού υποστρώµατος εξαρτάται από την ποικιλία ελιάς που επιθυµούµε να καλλιεργήσουµε. Η αρχική ή µε µικρές τροποποιήσεις σύνθεση του θρεπτικού υποστρώµατος ΟΜ είναι αποτελεσµατική για µια µεγάλη οµάδα ποικιλιών ελιάς (Rugini, 1990, Chri κ.ά., 2002, Grcí-Ferriz κ.ά., 2002, Chincone κ.ά., 2006). Για µια ικανοποιητική αύξηση, η ελιά χρειάζεται ΝΟ και ΝΗ 4 ιόντα και γλουταµίνη. Η σχέση C/N πρέπει να είναι περίπου 1/11 για να σχηµατιστούν βλαστοί καλής ποιότητας (Rugini, 1984, Rm και Pontikis, 1990, Rugini, 1990). Υπάρχουν ποικιλίες ελιάς οι οποίες αντέδρασαν καλύτερα σε άλλα υποστρώµατα εκτός από το ΟΜ (Lev κ.ά., 1994, Chri-Rkhis κ.ά., 1999, Dimssi, 1999, Grigoridou κ.ά., 2002, Roussos και Pontikis, 2002, Binet κ.ά., 2007). Όσον αφορά την πηγή χορήγησης άνθρακα, έχει βρεθεί ότι σε σχέση µε τη σακχαρόζη, η µαννιτόλη (ένας από τους σηµαντικότερους υδατάνθρακες του µεταβολισµού της ελιάς) µπορεί να αυξήσει το ρυθµό βλαστογένεσης, να βελτιώσει τη 8

28 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ γενική ποιότητα και οµοιοµορφία των µικροβλαστών και να µειώσει το σχηµατισµό κάλλου στη βάση των βλαστών (Lev κ.ά., 1994, Zcchini και De Agzio, 2004). Η ελιά καλλιεργείται in vitro κυρίως σε στερεό θρεπτικό υπόστρωµα. Οι στερεοποιητικοί παράγοντες που χρησιµοποιούνται είναι το άγαρ (0,5-0,8%) ή υποκατάστατά του (π.χ. Gelrite, Phytgel TM ) σε συγκεντρώσεις 0,2-0,3%. Σύµφωνα µε τον Rugini (1990), η µικρή συγκέντρωση σε άγαρ και ο επαρκής αερισµός των δοχείων καλλιέργειας συµβάλλει στην καλή ανάπτυξη των καλλιεργειών. Το ph του θρεπτικού υποστρώµατος ρυθµίζεται στο 5,7-5,8 πριν την αποστείρωση. Πρόσφατα, έχει δοκιµαστεί µε ενθαρρυντικά αποτελέσµατα µια νέα µέθοδος µικροπολλαπλασιασµού της ελιάς σε υγρό θρεπτικό υπόστρωµα (Temporry Immersion System) (Γρηγοριάδου, 2003, Grigoridou κ.ά., 2005, Lmbrdi κ.ά., 2006) β Ρυθµιστικές ουσίες αύξησης Μεταξύ των διαφόρων κυτοκινινών, η ζεατίνη έχει δώσει τα καλύτερα αποτελέσµατα στο µικροπολλαπλασιασµό της ελιάς (Rugini, 1990, Lev κ.ά., 1994, Chri κ.ά., 2002, Zcchini και De Agzio, 2004). Η συγκεκριµένη ορµόνη εφαρµόζεται σε διάφορες συγκεντρώσεις µόνη της (συνήθως 1-4 mg l -1 ) ή σε συνδυασµό µε άλλους ρυθµιστές αύξησης. Όσον αφορά τις υπόλοιπες κυτοκινίνες, συνήθως δίνουν χαµηλά ποσοστά έκπτυξης µασχαλιαίων οφθαλµών στην in vitro καλλιέργεια της ελιάς. Συγκεκριµένα, η 6- βενζυλαδενίνη (ΒΑ) παράγει κοντούς, λεπτούς βλαστούς και συχνά άφθονο κάλλο (Rugini, 1990). Λαµβάνοντας υπόψη όµως το υψηλό κόστος της ζεατίνης, γίνονται προσπάθειες για την επίτευξη συνδυασµών ρυθµιστών αύξησης για την έκπτυξη των µασχαλιαίων οφθαλµών, συµπεριλαµβανόµενων εκτός των προηγούµενων και της κινητίνης, της θειδιαζουρόνης (TDZ), του γιββερελλικού οξέος (GA 3 ), του ινδολυλοβουτυρικού οξέος (ΙΒΑ) και γάλακτος καρύδας (Dimsi-Theriou, 1994, Grigoridou κ.ά., 2002, Peixe κ.ά., 2007). 9

29 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ Πίνακας 1. Σύνθεση θρεπτικού υποστρώµατος Olive Medium (ΟΜ) (Rugini, 1984) Μακροστοιχεία mg l -1 KNO NH 4 NO C(NO 3 ) 2 4H 2 O 600 CCl 2 2H 2 O 440 KCl 500 MgSO 4 7H 2 O 1500 KH 2 PO Μικροστοιχεία FeSO 4 7H 2 O 27,8 N 2 EDTA 37,5 MnSO 4 4H 2 O 22,3 H 3 BO 3 12,4 ZnSO 4 7H 2 O 14,3 N 2 MoO 4 2H 2 O 0,25 CuSO 4 5H 2 O 0,25 CoCl 2 6H 2 O 0,025 KI 0,83 Βιταµίνες Μυο-ινοσιτόλη 100 Θειαµίνη-HCl 0,5 Πυριδοξίνη- HCl 0,5 Νικοτινικό οξύ 5,0 Βιοτίνη 0,05 Φολικό οξύ 0,5 Αµινοξέα Γλυκίνη 2,0 Γλουταµίνη

30 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ 2.1.3γ Συνθήκες καλλιέργειας και επανακαλλιέργεια Οι ασηπτικές καλλιέργειες διατηρούνται σε θαλάµους ανάπτυξης φυτών, όπου οι ιδανικές συνθήκες για την ελιά είναι: ο C, 16 ώρες φωτοπερίοδος και ένταση φωτός µmol m -2 s -1 (Rugini και Fedeli, 1990, Rugini, 1990). Ανάλογα µε τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά της κάθε ποικιλίας, οι καλλιέργειες των µικροβλαστών µεταφέρονται σε νέο θρεπτικό υπόστρωµα κάθε 4-7 εβδοµάδες, µε σκοπό να διατηρήσουν ικανοποιητική ικανότητα δηµιουργίας νέων βλαστών δ Επιµήκυνση βλαστών Μερικές ποικιλίες ελιάς σχηµατίζουν πολύ κοντούς µικροβλαστούς για να µπορέσουν να χρησιµοποιηθούν απευθείας για ριζοβολία. Σε αυτή την περίπτωση, χρειάζεται ένα στάδιο επιµήκυνσης (δηλ. ένα ενδιάµεσο στάδιο µεταξύ των σταδίων ΙΙ και ΙΙΙ). Η επιµήκυνση των βλαστών της ελιάς επιτυγχάνεται συνήθως µε τη µεταφορά τους σε ένα νέο θρεπτικό υπόστρωµα ΟΜ, στο οποίο έχει προστεθεί GA 3 (αποστειρωµένη µε φίλτρο). Μετά από 3-4 εβδοµάδες, όταν οι µικροβλαστοί έχουν επιµηκυνθεί κατά 4-5 γόνατα είναι έτοιµοι για ριζοβολία (Fbbri κ.ά., 2004) Στάδιο ΙΙΙ: Ριζοβολία µικροβλαστών Η επιλογή οµοιόµορφων µικροβλαστών, καθώς και η αποµάκρυνση κακοσχηµατισµένων και µολυσµένων, πρέπει να προηγηθεί του σταδίου ΙΙΙ. Η in vitro ριζοβολία επιτυγχάνεται συνήθως σε υποστρώµατα µε µικρή συγκέντρωση ανόργανων αλάτων, όπως ⅓ ή ¼ MS και ½ ΟΜ (Rugini, 1990) α Ρυθµιστικές ουσίες αύξησης Η σύνθεση του θρεπτικού υποστρώµατος και η εφαρµογή της αυξίνης είναι πολύ σηµαντικοί παράγοντες για την προαγωγή της ριζοβολίας της ελιάς. Όσον αφορά τις ενώσεις που προάγουν τη ριζοβολία, τόσο το ινδολυλο-3-βουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) όσο και το α-ναφθαλινοοξικό οξύ (ΝΑΑ) έχουν αποδειχθεί ότι είναι οι πιο αποτελεσµατικές αυξίνες για την επαγωγή ριζοβολίας. Το ΙΒΑ χορηγείται σε συγκεντρώσεις 2-3 mg l -1, ενώ το ΝΑΑ, καθώς προκαλεί πιο έντονη διέγερση απ ότι το ΙΒΑ, συνήθως εφαρµόζεται σε συγκέντρωση 1 mg l -1 (Rugini, 1990). 11

31 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ 2.1.4β Πρόσθετοι µέθοδοι ενίσχυσης της ριζοβολίας Μετά από σχετικές έρευνες, διάφορες επιπρόσθετες µέθοδοι έχουν προταθεί για τη βελτίωση του µικροπολλαπλασιασµού ποικιλιών ελιάς που ριζοβολούν δύσκολα. Για παράδειγµα, έχει διαπιστωθεί η αποτελεσµατικότητα της συσκότισης της βάσης των µικροβλαστών (Rugini κ.ά., 1993, Mencuccini, 2003), της προσθήκης πολυαµινών στο θρεπτικό υπόστρωµα ριζοβολίας (Rugini κ.ά., 1997) και τη χρήσης εκχυλίσµατος από σφαιροβλάστες ελιάς (φυσικές αυξίνες) (Rm και Pontikis, 1990, Roussos και Pontikis, 2002). Επίσης, βλαστοί αρκετών ποικιλιών ελιάς ριζοβόλησαν µε τραυµατισµό της βάσης τους και στη συνέχεια µόλυνσής τους µε το βακτήριο Agrobcterium rhizogenes (Rugini, 1986). Εναλλακτικά µε τη συµβατική προσθήκη αυξινών στο θρεπτικό υπόστρωµα ριζοβολίας, οι µικροβλαστοί µπορούν να εµβαπτισθούν σε διάλυµα αυξίνης υπό ασηπτικές συνθήκες και να εγκατασταθούν απευθείας σε υπόστρωµα το οποίο δεν περιέχει ορµόνες (Brtolini κ.ά., 1990, Rugini και Fedeli, 1990, Chri κ.ά., 2002, Peixe κ.ά., 2007). Λόγω της επιπρόσθετης όµως εργασίας και του αυξηµένου κινδύνου επιµόλυνσης των εκφύτων, είναι προτιµότερο η µέθοδος της εµβάπτισης να εφαρµόζεται µόνο όταν το στερεό θρεπτικό υπόστρωµα δεν δίνει αποδεκτά και σταθερά ποσοστά ριζοβολίας Στάδιο IV: Eγκλιµατισµός φυταρίων Τρεις µε πέντε εβδοµάδες µετά την έναρξη του σταδίου ριζοβολίας, οι ριζοβοληµένοι µικροβλαστοί είναι έτοιµοι για τον in vivo εγκλιµατισµό τους. Η διαδικασία αυτή είναι κρίσιµη λόγω της δραστικής αλλαγής των συνθηκών καλλιέργειας (υγρασία, ένταση φωτός, ασηψία), κατά τη µετάβαση των φυταρίων από το in vitro στο in vivo περιβάλλον. Το πρόβληµα εντείνεται από τη συγκεκριµένη ανατοµία των φύλλων που σχηµατίζονται in vitro, η οποία τα κάνει πιο ευαίσθητα στην αποκοπή, καθώς και όχι επαρκώς λειτουργικά ώστε να γίνουν αυτότροφα. Στην ελιά, για παράδειγµα, σε φυτά των ποικιλιών Nocellr del Belice και Nocellr Etne, τα οποία παρήχθησαν in vitro, τα φύλλα τους παρουσίασαν µείωση στο πάχος και στη διάµετρο των κεντρικών ηθµαγγειωδών δεσµίδων σε σχέση µε τα φύλλα φυτών υπαίθρου. Η επιδερµίδα των φύλλων έχει λεπτή εφυµενίδα, η πυκνότητα των στοµατίων είναι µικρή, ενώ το δρυφακτοειδές παρέγχυµα αποτελείται µόνο από µια 12

32 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ στρώση κυττάρων, αντί για 3 µε 4 που έχουν φυσιολογικά. Αυτές οι διαφορές είναι πιο έντονες στην ποικιλία Nocellr del Belice (Cozz κ.ά., 1997). Επιπροσθέτως, το in vitro παραγόµενο ριζικό σύστηµα έχει ιστολογικο-ανατοµικά χαρακτηριστικά που δεν το καθιστούν πολύ λειτουργικό, όταν µεταφέρεται σε οργανικά υποστρώµατα. Η υψηλή σχετική υγρασία είναι απαραίτητη για έναν επιτυχηµένο εγκλιµατισµό φυταρίων ελιάς, αλλιώς µπορεί να παρουσιάσουν φυλλόπτωση. Στη συνέχεια τα φυτάρια µεταφέρονται σε διάφορα µείγµατα τύρφης, βερµικουλίτη, περλίτη, εδάφους και άµµου. Στην αρχή της σκληραγώγησης η υγρασία και η θερµοκρασία θα πρέπει να είναι υψηλές, ενώ προς το τέλος η σχετική υγρασία σταδιακά µειώνεται. Μετά το πέρας του σταδίου εγκλιµατισµού, τα φυτά ελιάς παραµένουν στο φυτώριο για ένα περίπου χρόνο, πριν τη µεταφορά τους στην τελική τους θέση στο χωράφι (Fbbri κ.ά., 2004) Απόδοση στον αγρό Οι πρώτοι ελαιώνες που φυτεύτηκαν µε φυτά τα οποία προήλθαν από µικροπολλαπλασιασµό άρχισαν πρόσφατα να καρποφορούν, παράγοντας ικανοποιητικής ποιότητας ελαιόλαδο. Μέχρι σήµερα, λίγες εργασίες έχουν γίνει σχετικά µε τα γενετικά και αγρονοµικά χαρακτηριστικά των φυτών ελιάς που προήλθαν από ιστοκαλλιέργεια (Grcí-Férriz κ.ά., 2002, Lev et l. 2002, Brito κ.ά. 2003, Lev κ.ά. 2003, Sntos κ.ά. 2003). Ωστόσο, χρησιµοποιώντας µοριακούς δείκτες διαπιστώθηκε σταθερότητα στα µορφολογικά και γενετικά χαρακτηριστικά των in vitro πολλαπλασιασµένων δένδρων σε σχέση εκείνα του µητρικού φυτού. Επιπρόσθετα, οι ερευνητές συµφωνούν ότι µετά τη φύτευση στο χωράφι, τα δένδρα ελιάς που προήλθαν από µικροπολλαπλασιασµό δεν παρουσιάζουν νεανικά χαρακτηριστικά και αρχίζουν να καρποφορούν τη 2 η µε 3 η βλαστητική περίοδο αύξησης (Lev et l. 2002, Mencuccini και Pollcci, 2003). Αντίθετα, πάνω από 2 χρόνια νεανικότητας παρατηρήθηκαν στην περίπτωση φυτών που πολλαπλασιάστηκαν in vitro µε έκφυτα τα οποία προήλθαν από παραφυάδες ή από σωµατικά έµβρυα της ποικιλίας Cnino (Rugini κ.ά., 2006). 13

33 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ 3. Υάλωση Η υάλωση είναι µια φυσιολογική ανωµαλία, η οποία εµφανίζεται αρκετά συχνά στο µικροπολλαπλασιασµό. Χαρακτηρίζεται από την υγρή, ηµιδιαφανή και διογκωµένη εµφάνιση βλαστών και φύλλων που σχηµατίστηκαν in vitro. Κάτω από ορισµένες ασηπτικές καλλιεργητικές συνθήκες και µετά από µια περίοδο καλλιέργειας, µπορούν να παρατηρηθούν µεγάλες µορφολογικές ανωµαλίες τόσο σε ιστούς όσο και σε όργανα των φυτών. Ο in vitro πολλαπλασιασµός υαλωµένων βλαστών ή φυταρίων γίνεται δύσκολος, καθώς η ικανότητα επιβίωσής τους µπορεί να µειωθεί σηµαντικά και να νεκρωθούν είτε µέσα στα δοχεία καλλιέργειας είτε κατά τη διάρκεια του εγκλιµατισµού σε in vivo συνθήκες. Στον εµπορικό µικροπολλαπλασιασµό έχουν παρατηρηθεί κατά καιρούς απώλειες µεγαλύτερες του 60% (Pâques, 1991). Ο γενότυπος, η σύνθεση του υποστρώµατος, η µεταχείριση των νεαρών βλαστών και οι συνθήκες του in vitro περιβάλλοντος είναι µερικοί από τους παράγοντες οι οποίοι συµβάλλουν στην εκδήλωση αυτού του φαινοµένου. εδοµένου ότι οι παράγοντες είναι αρκετοί και µάλιστα αλληλεπιδρούν µεταξύ τους, η υάλωση δεν είναι τελείως προβλέψιµη και δεν είναι εύκολο να βρεθεί λύση για όλες τις περιπτώσεις. 3.1 Συµπτώµατα υάλωσης σε ανατοµικό και µορφολογικό επίπεδο Η υάλωση µπορεί να παρατηρηθεί σε καλλιέργειες βλαστών και γονάτων, καθώς και σε βλαστούς που αναγεννήθηκαν από κάλλο, όλων των φυτικών ειδών. Ωστόσο, η ένταση και η συχνότητα εµφάνισης του φαινοµένου ποικίλλει ευρέως µεταξύ των διαφόρων γενοτύπων. Το σύνδροµο του υαλώδους βλαστού χαρακτηρίζεται από διάφορα επίπεδα σοβαρότητας. Αρχικά, µόνο ένα τµήµα του βλαστού ή µόνο 1-2 φύλλα (ειδικά εκείνα που είναι σε επαφή µε το υπόστρωµα) µπορούν να επηρεαστούν. Στις πιο σοβαρές περιπτώσεις, οι υαλωµένοι βλαστοί έχουν µικρά µεσογονάτια διαστήµατα και οι κορυφές τους νεκρώνονται. Οι βλαστοί συνήθως διογκώνονται και έχουν ανοιχτό πράσινο χρώµα, ενώ τα φύλλα έχουν µια διάφανη, υγρή ή υαλώδη όψη. Σε ορισµένα φυτά, όπως παρατηρήθηκε και µε τα έκφυτα της ποικιλίας της ελιάς Χονδρολιά Χαλκιδικής, τα φύλλα παχύνονται, ρυτιδώνουν ή συστρέφονται, γίνονται πιο σκουροπράσινα και πιο εύθρυπτα από τα κανονικά. 14

34 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ Οι υαλωµένοι βλαστοί δεν επιµηκύνονται φυσιολογικά, παρατηρείται εξασθένηση της κυριαρχίας της κορυφής και σχηµατίζονται πυκνές και κοντές συστάδες βλαστών. Επίσης, ο βλαστοί µε έντονα συµπτώµατα υάλωσης δε σχηµατίζουν επίκτητες ρίζες ή δίνουν µικρά ποσοστά ριζοβολίας. Ωστόσο, υπάρχουν και εξαιρέσεις, όπως οι υαλωµένοι βλαστοί του Pinus rdit, οι οποίοι ριζοβόλησαν ικανοποιητικά, αλλά τα φυτάρια δεν ήταν τόσο εύρωστα όσο εκείνα που προήλθαν από κανονικούς βλαστούς (Aitken-Christie και Jones, 1985). Τα ανατοµικά χαρακτηριστικά των υαλωµένων βλαστών και φύλλων αλλάζουν και µπορούν να παρατηρηθούν διάφοροι τύποι ανώµαλων δοµών. Τα φύλλα των υαλωµένων βλαστών έχουν λεπτή εφυµενίδα και επιδερµίδα, µη φυσιολογικά στοµάτια και µικρή ποσότητα κηρού στην εφυµενίδα (Ziv, 1991, Mjd κ.ά., 2001). Επίσης, οι χλωροπλάστες των υαλωµένων φύλλων έχουν µη κανονική δοµή και χαµηλή περιεκτικότητα σε χλωροφύλλη (Werker και Leshem, 1987). Μικροσκοπικές µελέτες έδειξαν υπερτροφία της εντεριώνης και των κυττάρων του φλοιού των υαλωµένων βλαστών, ενώ δε γίνεται κανονική ξυλοποίηση των τραχεΐδων και των αγγείων (Vieth κ.ά., 1983, Vieitez κ.ά., 1985). Καθώς τα κύτταρα έχουν σχετικά µειωµένα επίπεδα κυτταρίνης, οι πλαστικές ιδιότητες των κυτταρικών τοιχωµάτων τους αλλάζουν, µε αποτέλεσµα τα κύτταρα να χάνουν τη λειτουργικότητα και το σχήµα τους. Τα φυτικά κύτταρα που στερούνται κυτταρίνης και λιγνίνης έχουν πιο πλαστικά κυτταρικά τοιχώµατα, οπότε και τείνουν να απορροφούν περισσότερο νερό. Ως αποτέλεσµα, οι ιστοί φαίνονται εξωτερικά υγροί και τανύονται. Η αυξηµένη διάχυση νερού µέσα στα κύτταρα προκαλεί και τη ρήξη των κυτταρικών τοιχωµάτων των υαλωµένων φύλλων (Bornmn και Vofelmnn, 1984). Η µελέτη υαλωµένων φύλλων της ποικ. Χονδρολιάς Χαλκιδικής έδειξε ότι το δρυφακτοειδές παρέγχυµα περιορίζεται σε ένα στρώµα, οι µεσοκυττάριοι χώροι είναι µεγαλύτεροι, ιδίως στο σπογγώδες παρέγχυµα, και φέρουν µεγαλύτερο αριθµό στοµατίων. Επιπλέον, χαρακτηριστική ήταν η συσσώρευση µιας βλεννώδους ουσίας στους µεσοκυττάριους χώρους, κυρίως στην περιοχή του δρυφακτοειδούς παρεγχύµατος. Η ίδια ουσία παρατηρήθηκε κοντά στα κατώτερα επιδερµικά κύτταρα (Γρηγοριάδου, 2003, Grigoridou κ.ά., 2007). 15