ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...5

Transcript

1 ΑΡΡΙΙΣΤΟΤΕΛΕΙΙΟ ΠΑΝΕΠΙΙΣΤΗΜΙΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΙΚΩΝ ΕΠΙΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΙΑΣ ΕΡΡΓΑΣΤΗΡΡΙΙΟ ΒΙΙΟΧΗΜΕΙΙΑΣ ΤΙΙΛΚΙΙΡΡΙΙΔΟΥ ΣΟΦΙΙΑ ΒΙΙΟΛΟΓΟΣ ΔΙΙΠΛΩΜΑΤΙΙΚΗ ΕΡΡΓΑΣΙΙΑ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΜΗΧΑΝΙΙΣΜΟΥ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ VIIIIa ΣΤΗΝ ΔΙΙΑΔΙΙΚΑΣΙΙΑ ΠΗΞΗΣ ΤΟΥ ΑΙΙΜΑΤΟΣ.. ΕΠΙΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΙΙΣΤΙΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΚΑΙΙ ΤΩΝ ΑΙΙΜΟΠΕΤΑΛΙΙΩΝ.. ΤΡΡΙΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΙΤΡΡΟΠΗ: : ΑΡΡΖΖΟΓΓΛΟΥ Π..,, εεππι ιββλλέέππωνν κκααθθηηγγηηττήήςς,, αανν.. κκααθθηηγγηηττήήςς Χηημμεεί ίααςς ΓΓΙ ΙΑΝΝΑΚΟΥΡΡΟΣΣ Θ..,, αανν.. κκααθθηηγγηηττήήςς Χηημμεεί ίααςς ΓΓΙ ΙΟΥΨΑΝΗΣΣ ΤΤ..,, αανν.. κκααθθηηγγηηττήήςς Χηημμεεί ίααςς ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΙΚΗ

2 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στον επιβλέποντα καθηγητή κ. Αρζόγλου Π., αναπληρωτή καθηγητή Χημείας, για την ανάθεση της παρούσας διπλωματικής άσκησης, καθώς και για την άριστη συνεργασία. Τον ευχαριστώ θερμά για την ευκαιρία που μου έδωσε να εκπονήσω την διπλωματική μου εργασία στο εργαστήριό του, αλλά και για τις γνώσεις και τις συμβουλές που μου παρείχε όλο αυτό το διάστημα. Ιδιαίτερες ευχαριστίες στον κ. Γιουψάνη Τ. και τον κ. Γιαννακούρο Θ., αναπληρωτές καθηγητές Χημείας και μέλη της τριμελούς επιτροπής για το χρόνο που διέθεσαν για την ανάγνωση της παρούσας εργασίας. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στην διδάκτορα Παράσχου Σ., για την βοήθεια και τις συμβουλές της στην ολοκλήρωση αυτής της προσπάθειας. Ευχαριστώ, επίσης, την υποψήφια διδάκτορα Καρούλια Ζ., καθώς, επίσης, και τις διπλωματικές φοιτήτριες Παναγιωτάκη Ρ. και Ταχτζόγλου Α., για τις γνώσεις και τις συμβουλές τους σχετικά με τα υλικά και τις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν για την πραγματοποίηση αυτής της εργασίας. Ένα θερμό ευχαριστώ στη συμφοιτήτριά μου Γουρζιώτη Κ., καθώς και τον διπλωματικό φοιτητή Μαυρίδη Μ. για την αμέριστη ψυχολογική συμπαράσταση και τις ευχάριστες στιγμές στο εργαστήριο. Τέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου και ιδιαίτερα στον σύζυγό μου Κώστα, που με την ψυχολογική στήριξη και την αμέριστη αγάπη τους, μου έδιναν κουράγιο στις δύσκολες στιγμές. 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...5 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 6 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...9 Βιοχημεία της πήξης του αίματος..9 Ενδογενές μονοπάτι..9 Εξωγενές μονοπάτι.10 Κοινό μονοπάτι..11 Επικρατέστερα μοντέλα του μηχανισμού πήξης 13 Ερευνητική ομάδα Mann..13 Ερευνητική ομάδα Roberts..15 Ρόλος των αιμοπεταλίων 19 Παράγοντες πήξης 21 A. Δομή των παραγόντων πήξης που φέρουν πρωτεολυτική δράση 22 Θρομβίνη (FII)...22 Ενεργοποίηση της προθρομβίνης.25 Παράγοντας VII (FVII) 26 Παράγοντας IX (FIX)...27 Παράγοντας X (FX).28 Παράγοντας XI (FXI)...28 Παράγοντας XII (FXII) 29 Προκαλλικρεΐνη...29 B. Συμπαράγοντες πήξης με μη-ενζυμική δράση.30 Παράγοντας V (FV).31 Παράγοντας VIII (FVIII).32 Παράγοντας von Willebrand (vwf).. 34 Ιστικός παράγοντας (TF)..34 Μεγάλου μοριακού βάρους κινινογόνο (HMWK)...35 C. Ινωδογόνο (FI).36 D. Παράγοντας XIII (FXIII).37 Ινωδόλυση 39 Αναστολείς της πήξης..41 Αντιθρομβίνη (ATIII) 41 3

4 Αναστολέας του εξωγενούς δρόμου της πήξης (TFPI)..42 Πρωτεΐνη C (PrC)...42 Πρωτεΐνη S (PrS)...43 Μηχανισμός δράσης του παράγοντα VIIa...45 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 51 A. Υλικά και μέθοδοι.51 Βιοχημικά υλικά 51 Βιολογικά υλικά.51 Πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια (PRP).51 Πλάσμα φτωχό σε αιμοπετάλια (PPP) 52 Απομονωμένα αιμοπετάλια.52 Όργανα μέτρησης..52 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου (PAGE) 52 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS- PAGE) 53 Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από την πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη (Western Blotting).54 Ανοσοανίχνευση 55 Φωτομετρικός προσδιορισμός της δραστικότητας του παράγοντα Xa.56 Σύσταση διαλυμάτων.57 B. Αποτελέσματα...59 I. Μελέτη δράσης του ιστικού παράγοντα Μελέτη της δράσης διαφορετικών συγκεντρώσεων TP σε δείγμα φυσιολογικό και dvii Επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων TP στην παραγωγή Xa (σε δείγμα φυσιολογικό και dvii) Επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων TP σε δείγμα dvii..61 II. Μελέτη δράσης της περίσσειας VIIa Εύρεση βέλτιστης συγκέντρωσης δράσης της περίσσειας VIIa Κινητική δείγματος dix με την επίδρασης περίσσειας και high dose VIIa Επίδραση περίσσειας VIIa στην κινητική δείγματος dix Επίδραση περίσσειας VIIa στην κινητική δείγματος φυσιολογικού και dx.67 4

5 5. Επίδραση περίσσειας VIIa στην κινητική δείγματος dii και φυσιολογικού 69 i. Χρώση Xa..69 ii. Χρώση IIa..70 iii. Κινητική σε dii δείγμα Χρώση IIa Μελέτη της επίδρασης TP, PL και VIIa στην κινητική δείγματος dix Μελέτη της επίδρασης TP, PL στην κινητική δείγματος dix..74 III. Μελέτη της δράσης των αναστολέων πήξης APC και APS Μελέτη της δράσης της περίσσειας VIIa στην αντιμετώπιση του ανασταλτικού ρόλου της APC σε δείγμα dix Μελέτη της δράσης της περίσσειας VIIa στην αντιμετώπιση του ανασταλτικού ρόλου της APC στην κινητική δείγματος dix, με προεπώαση των δειγμάτων Μελέτη της δράσης της περίσσειας VIIa στην αντιμετώπιση του ανασταλτικού ρόλου των APC και APS σε δείγμα dix Μελέτη της δράσης της περίσσειας VIIa στην αντιμετώπιση του ανασταλτικού ρόλου των APC και APS σε δείγμα dix, με προεπώαση των δειγμάτων IV. Προσπάθεια μελέτης του παράγοντα Xa Κινητική φυσιολογικού δείγματος (PRP+PPP) με την προσθήκη περίσσειας VIIa Κινητική φυσιολογικού δείγματος (PRP+PPP) δίχως την προσθήκη περίσσειας VIIa Κινητική σε δείγμα dii και φυσιολογικό με προσθήκη περίσσειας VIIa Κινητική δείγματος dix (φόρτωση δειγμάτων x2) Κινητική δείγματος dix (φόρτωση δειγμάτων x3)..85 V. Χρωματομετρικά πειράματα Παραγωγή Xa σε δείγμα φυσιολογικό και dix Παραγωγή Xa σε δείγμα φυσιολογικό και dix με χορήγηση εξωγενούς Xa Επίδραση TP και VIIa σε δείγμα dix Επίδραση TP και VIIa σε δείγμα PPP..90 5

6 5. Επίδραση TP και VIIa σε δείγμα PRP Επίδραση TP, VIIa και PL σε δείγμα dix ΣΥΖΗΤΗΣΗ.96 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 105 6

7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Βιοχημείας του τμήματος Χημείας Α.Π.Θ. κατά το ακαδημαϊκό έτος Στη διάρκεια αυτή, έγινε προσπάθεια μελέτης του μηχανισμού δράσης του παράγοντα VIIa, καθώς επίσης και του ιστικού παράγοντα, των αιμοπεταλίων και των αναστολέων στην διαδικασία παραγωγής θρομβίνης. Η εργασία, γενικά, χωρίζεται σε δύο επιμέρους τμήματα: Στην μελέτη της επίδρασης του ιστικού παράγοντα, της περίσσειας VIIa και των αναστολέων στην κινητική μετατροπής της προθρομβίνης σε θρομβίνη, σε δείγματα φυσιολογικά και με αιμορροφιλία. Για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων έγινε χρήση της τεχνικής Western Blotting. Στην μελέτη της επίδρασης του ιστικού παράγοντα, της περίσσειας VIIa και των αιμοπεταλίων στην κινητική παραγωγής του παράγοντα Xa σε δείγματα φυσιολογικά και με αιμορροφιλία. Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων έγινε με χρήση χρωματομετρικής μεθόδου, δεδομένου της αδυναμίας μελέτης της παραγωγής Xa (η οποία αντιστοιχεί σε ανάλογη παραγωγή θρομβίνης) με την τεχνική Western Blotting. 7

8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η διαδικασία κατά την οποία το σώμα αποτρέπει την απώλεια αίματος αναφέρεται ως πήξη. Η πήξη περιλαμβάνει το σχηματισμό ενός θρόμβου αίματος (thrombus), ο οποίος αποτρέπει την περαιτέρω απώλεια αίματος από τους κατεστραμμένους ιστούς, τα αγγεία ή τα όργανα. Η πήξη είναι μια πολύπλοκη διαδικασία η οποία επιτυγχάνεται από ένα σύστημα κυτταρικών στοιχείων (θρομβοκυττάρων), τα οποία κυκλοφορούν στο αίμα και χρησιμεύουν για τον σχηματισμό ενός συσσωματώματος κυττάρων στα χείλη των κατεστραμμένων αγγείων και ένα δεύτερο σύστημα που βασίζεται στις ενέργειες των πρωτεϊνών του πλάσματος (παράγοντες πήξης), οι οποίες οδηγούν στο σχηματισμό ενός δικτύου ινικής. Τα δύο συστήματα δρουν σε συνέργια καταλήγοντας στο σχηματισμό του θρόμβου αίματος. Τυχόν διαταραχές σε ένα από τα συστήματα μπορούν να οδηγήσουν σε διαταραχές που καταλήγουν σε περίσσεια ή έλλειμμα παραγόμενου θρόμβου. Τα αιμοπετάλια (θρομβοκύτταρα) εξυπηρετούν τρεις αρχικές λειτουργίες: 1) προσκολλώνται στα κατεστραμμένα αγγεία αίματος (προσκόλληση αιμοπεταλίων), 2) συνδέονται με άλλα αιμοπετάλια σχηματίζοντας συσσωματώματα (συγκόλληση αιμοπεταλίων) και 3) αποτελούν υποστρώματα (τα μόρια στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων λαμβάνουν μέρος σε πολλές αντιδράσεις πήξης) για τις διαδικασίες του καταρράκτη πήξης. Όταν εμφανιστεί μια βλάβη στα αγγεία του αίματος, εκτίθενται ουσίες οι οποίες φυσιολογικά δεν βρίσκονται σε άμεση επαφή με τη ροή του αίματος. Οι ουσίες αυτές (κυρίως το κολλαγόνο και ο παράγοντας von Willebrand), επιτρέπουν στα αιμοπετάλια να προσκολληθούν στην κατεστραμμένη επιφάνεια. Μόλις προσκολληθεί ένα αιμοπετάλιο στην επιφάνεια, απελευθερώνει χημικές ουσίες οι οποίες προσελκύουν πρόσθετα αιμοπετάλια στην κατεστραμμένη περιοχή (συνάθροιση αιμοπεταλίων). Οι δύο αυτές διαδικασίες είναι οι πρώτες αποκρίσεις στην επίσχεση της αιμορραγίας. Το πρωτεϊνικό σύστημα (ο καταρράκτης πήξης) χρησιμεύει για την σταθεροποίηση της δομής του θρόμβου και την περαιτέρω επούλωση της πληγής. Η διαδικασία της πήξης του αίματος και η επερχόμενη διάλυση του θρόμβου, η οποία οδηγεί στην αποκατάσταση του τραυματισμένου ιστού, είναι διαδικασίες απαραίτητες για την επιβίωση. Η αιμόσταση διαχωρίζεται σε τέσσερα σημαντικά 8

9 γεγονότα που εμφανίζονται σε μια καθορισμένη αλληλουχία μετά από την απώλεια της αγγειακής ακεραιότητας (εικόνα 1): Εικόνα 1. Φάσεις επίσχεσης της αιμορραγίας 1. Η αρχική φάση της διαδικασίας είναι αγγειακή συστολή. Αυτό περιορίζει τη ροή του αίματος στην περιοχή του τραυματισμού (αγγειακή φάση). 2. Ακολουθεί η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων από τη θρομβίνη και η συνάθροισή τους στο σημείο του τραυματισμού, όπου διαμορφώνεται ένα προσωρινό, χαλαρό συσσωμάτωμα αιμοπεταλίων. Το πρωτεϊνικό ινωδογόνο 9

10 είναι πρώτιστα αρμόδιο για την υποκίνηση της συγκέντρωσης των αιμοπεταλίων. Η δέσμευση των αιμοπεταλίων επιτυγχάνεται με την έκθεση του κολλαγόνου στο ενδοθήλιο των κατεστραμμένων αγγείων. Κατά την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων απελευθερώνονται ADP, σεροτονίνη και πρωτεΐνες πλάσματος, σημαντικές για τον καταρράκτη πήξης. Επίσης, τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια αλλάζουν τη μορφή τους για να προσαρμοστούν στο σχηματισμό του θρόμβου (αιμοπεταλιακή φάση). 3. Για την επίτευξη της σταθερότητας του αρχικά χαλαρού θρόμβου των αιμοπεταλίων, διαμορφώνεται ένα πλέγμα ινικής, το οποίο σταθεροποιεί και παγιδεύει το συσσωμάτωμα των αιμοπεταλίων. Εάν το συσσωμάτωμα περιέχει μόνο αιμοπετάλια καλείται λευκός θρόμβος, ενώ εάν τα κόκκινα κύτταρα αίματος είναι παρόντα καλείται, κόκκινος θρόμβος (φάση πήξης). 4. Τέλος, ακολουθεί αρχικά η συστολή και, εν συνεχεία, η διάλυση του θρόμβου για την επίτευξη της κανονικής ροής του αίματος μετά από την αποκατάσταση του ιστού. Η διάλυση του θρόμβου πραγματοποιείται μέσω της πλασμίνης. Δύο δρόμοι οδηγούν στο σχηματισμό του δικτύου ινικής: ο ενδογενής και ο εξωγενής δρόμος. Αν και ξεκινούν από ευδιάκριτους μηχανισμούς και οι δύο συγκλίνουν σε ένα κοινό μονοπάτι που οδηγεί στο σχηματισμό του θρόμβου αίματος. Ο σχηματισμός θρόμβου, ως αποτέλεσμα ενός παθολογικού αγγειακού τοιχώματος, ελλείψει ιστικής βλάβης, αποτελεί δράση του ενδογενούς δρόμου. Ο σχηματισμός θρόμβου, ως απόκριση σε ιστική βλάβη, αποτελεί δράση του εξωγενούς δρόμου. Και οι δύο δρόμοι είναι σύνθετοι και περιλαμβάνουν πολυάριθμες και διαφορετικές πρωτεΐνες που καλούνται παράγοντες πήξης. 10

11 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Βιοχημεία της πήξης του αίματος Η διαδικασία της πήξης του αίματος αποτελεί έναν καταρράκτη πρωτεολυτικών αντιδράσεων. Κάθε ένζυμο που μετέχει στο μονοπάτι βρίσκεται στο πλάσμα υπό μορφή ζυμογόνου (ανενεργή μορφή) το οποίο, μέσω της διαδικασίας της πρωτεολυτικής διάσπασης, απελευθερώνεται με την ενεργή μορφή του από το πρόδρομο μόριο. Το μονοπάτι της πήξης του αίματος αριθμεί μια σειρά αντιδράσεων θετικής και αρνητικής ανάδρασης, με τις οποίες επιτυγχάνεται ο έλεγχος της διαδικασίας. Ο απώτερος σκοπός είναι η παραγωγή θρομβίνης, η δράση της οποίας έγκειται στην μετατροπή του ινωδογόνου σε ινική, οδηγώντας στον σχηματισμό του θρόμβου. Η διαδικασία παραγωγής της θρομβίνης μπορεί να διαιρεθεί σε τρεις φάσεις: το ενδογενές και εξωγενές μονοπάτι, τα οποία παρέχουν εναλλακτικές οδούς για την παραγωγή του παράγοντα X και το κοινό μονοπάτι, το οποίο οδηγεί στον σχηματισμό της θρομβίνης (εικόνα 2). Ενδογενές μονοπάτι: Το ενδογενές μονοπάτι ενεργοποιείται όταν το αίμα έρχεται σε επαφή με ενδοθηλιακούς συνδετικούς ιστούς ή με αρνητικά φορτισμένες επιφάνειες που εκτίθενται στην επιφάνεια ως αποτέλεσμα της ιστικής βλάβης. Αποτελεί το σημαντικότερο από τα δύο μονοπάτια όσον αφορά την ποσοτική παραγωγή θρομβίνης, είναι όμως λιγότερο αποτελεσματικό στην ταχύτητα μετατροπής του ινωδογόνου σε ινική, σε σχέση με το εξωγενές μονοπάτι. Στο ενδογενές μονοπάτι μετέχουν: ο παράγοντας Hageman (παράγοντας XII), ο παράγοντας XI, η προκαλλικρεΐνη, το υψηλού μοριακού βάρους κινινογόνο (HMWK) και οι παράγοντες IX και VIII. Το σύμπλεγμα προκαλλικρεΐνης και HMWK έρχεται σε επαφή με τις εκτεθειμένες επιφάνειες και οδηγεί στην ενεργοποίηση του παράγοντα XII. Κατά την ενεργοποίηση, η πρωτεΐνη, υπό μορφή μονής αλυσίδας, της ανενεργής μορφής του παράγοντα XII, διασπάται σε δύο αλυσίδες (50 και 28 kda), οι οποίες παραμένουν ενωμένες μέσω ενός δισουλφιδικού δεσμού. Η ελαφριά αλυσίδα (28 kda) περικλείει την ενεργό περιοχή του μορίου και 11

12 αναφέρεται ως ενεργοποιημένος παράγοντας Hageman (παράγοντας XIIa). Υπάρχουν αποδείξεις ότι ο παράγοντας Hageman μπορεί να αυτοενεργοποιείται (αυτοκαταλυτική διεργασία), επομένως το μονοπάτι είναι αυτό-συντηρούμενο. Ο ενεργοποιημένος παράγοντας XII, με τη σειρά του, ενεργοποιεί την προκαλλικρεΐνη. Η καλλικρεΐνη που παράγεται μπορεί, με τη σειρά της, να ενεργοποιήσει τον παράγοντα XII. Ο παράγοντας XIIa, στο επόμενο βήμα, ενεργοποιεί τον παράγοντα XI. Στην διαδικασία αυτή παίρνει μέρος και το HMWK, το οποίο δεσμευόμενο στον παράγοντα XI, επιταχύνει την καταλυτική διαδικασία. Οι ενεργοποιημένοι παράγοντες XIa, XIIa και καλλικρεΐνη ανήκουν στην κατηγορία των πρωτεασών σερίνης. Ο παράγοντας XIa ενεργοποιεί, με μια αντίδραση που εξαρτάται από το ασβέστιο, τον παράγοντα IX σε IXa. Ο παράγοντας IXa, σε σύμπλεγμα με ιόντα ασβεστίου, φωσφολιπίδια, που παρέχονται από την επιφάνεια των αιμοπεταλίων και τον ενεργοποιημένο παράγοντα VIIIa, ενεργοποιεί τον παράγοντα X σε Xa (το σύμπλεγμα καλείται ενδογενής δεκάση). Επομένως, το ενδογενές μονοπάτι καταλήγει στην ενεργοποίηση του παράγοντα X, μια διαδικασία που, επίσης, πραγματοποιείται μέσω του εξωγενούς δρόμου. Ο ακριβής ρόλος του παράγοντα VIII δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Η παρουσία του στο σύμπλεγμα κρίνεται απαραίτητη, καθώς οι καταστάσεις έλλειψής του οδηγούν σε φαινόμενα αιμορροφιλίας. Ο παράγοντας VIII ενεργοποιείται από την παρουσία θρομβίνης. Εξωγενές μονοπάτι: Το εξωγενές μονοπάτι αποτελεί μια εναλλακτική οδό στην διαδικασία πήξης του αίματος. Οδηγεί στην ταχύτατη ενεργοποίηση του παράγοντα X, με κύριο στόχο την ενίσχυση της λειτουργίας του ενδογενούς δρόμου. Υπάρχουν δύο παράγοντες που παίρνουν μέρος στο εξωγενές μονοπάτι: ο ιστικός παράγοντας (παράγοντας III) και ο παράγοντας VII. Ο ιστικός παράγοντας είναι παρών στα περισσότερα ανθρώπινα κύτταρα, δεσμευόμενος στην επιφάνεια των κυττάρων. Μόλις ενεργοποιηθεί, δεσμεύεται ταχύτατα με τον παράγοντα VII και τον ενεργοποιεί. Εν συνεχεία, το σύμπλοκο ιστικού παράγοντα, ενεργοποιημένου παράγοντα VIIa, ιόντων ασβεστίου και φωσφολιπιδίων οδηγεί στην ταχύτατη ενεργοποίηση του παράγοντα X (το σύμπλοκο καλείται εξωγενής δεκάση). 12

13 Το ενδογενές και εξωγενές μονοπάτι καταλήγουν στην ενεργοποίηση του παράγοντα X και από εκεί σε ένα κοινό μονοπάτι, το οποίο οδηγεί στην παραγωγή της θρομβίνης (παράγοντας IIa). Κοινό μονοπάτι (σχηματισμός θρόμβου): Το αποτέλεσμα στην διαδικασία πήξης του αίματος είναι η παραγωγή θρομβίνης, η οποία οδηγεί στην μετατροπή του ινωδογόνου σε δίκτυο ινικής. Ο ενεργοποιημένος παράγοντας Xa σε σύμπλεγμα με ιόντα ασβεστίου, φωσφολιπίδια και τον ενεργοποιημένο παράγοντα Va, μεταβάλλει πρωτεολυτικά την προθρομβίνη (II) σε θρομβίνη (IIa). Το ινωδογόνο είναι ένα διμερές μόριο διαλυτό στο πλάσμα. Η έκθεση του ινοδωγόνου στη θρομβίνη οδηγεί στην ταχεία πρωτεόλυσή του στα ινοδοπεπτίδια Α και Β και στη δημιουργία του μονομερούς ινώδους. Η θρομβίνη, συγχρόνως, ενεργοποιεί και τον παράγοντα XIII σε XIIIa, ο οποίος με τη σειρά του οδηγεί στον πολυμερισμό των μονομερών ινώδους και στο σχηματισμό του δικτύου ινικής. Το δίκτυο της ινικής, σε συνδυασμό με τα αιμοπετάλια που παγιδεύονται σε αυτό, οδηγούν σε μπλοκάρισμα του κατεστραμμένου αγγείου και στην επίσχεση της αιμορραγίας. Ο καταρράκτης των πρωτεολυτικών αντιδράσεων, με τον διαχωρισμό των τριών μονοπατιών, που οδηγεί στο σχηματισμό του δικτύου ινικής παριστάνεται στην εικόνα 2. Εικόνα 2. Μοντέλο του καταρράκτη των ενζυμικών αντιδράσεων της διαδικασίας πήξης του αίματος. 13

14 Όπως διαπιστώνεται από την παραπάνω εικόνα, το μοντέλο του καταρράκτη των ενζυμικών αντιδράσεων αποτελείται από δύο ανεξάρτητα μονοπάτια, τα οποία καταλήγουν σε ένα κοινό μονοπάτι, με την θρομβίνη να αποτελεί το τελικό προϊόν των αντιδράσεων. Το μοντέλο αυτό εξηγεί ικανοποιητικά τα αποτελέσματα πήξης που παρατηρούνται σε εργαστηριακό επίπεδο. Ο χρόνος προθρομβίνης (prothrombin time, PT) μελετά τους παράγοντες που συμμετέχουν στο εξωγενές μονοπάτι, ενώ ο χρόνος της μερικώς ενεργοποιημένης θρομβοπλαστίνης (partial activated thromboplastin time, aptt) μελετά τους παράγοντες του ενδογενούς μονοπατιού. Παρόλο που το μοντέλο εξηγεί ικανοποιητικά μερικές από τις αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών in vitro, δεν ανταποκρίνεται πλήρως στον μηχανισμό της αιμοστατικής διαδικασίας in vivo. Για παράδειγμα, άτομα με έλλειψη παράγοντα XII, υψηλού μοριακού βάρους κινινογόνο (HMWK) ή προκαλλικρεΐνης, δεν εμφανίζουν κλινικά συμπτώματα αιμορραγιών. Επιπλέον, στην περίπτωση που ο ενδογενής και ο εξωγενής δρόμος ήταν ουσιαστικά ξεχωριστοί, τότε η ενεργοποίηση του παράγοντα X από τον εξωγενή δρόμο θα ήταν σε θέση να αναπληρώσει την έλλειψη του παράγοντα VII ή IX. Ωστόσο, οι παράγοντες VII και IX έχουν πρωτεύοντα ρόλο στην διαδικασία της αιμόστασης, καθώς η έλλειψή τους οδηγεί σε σοβαρά αιμορραγικά επεισόδια (αιμορροφιλία Α και Β, αντίστοιχα), γεγονός που δεν μπορεί να αντισταθμιστεί από τον ανέπαφο εξωγενή δρόμο. Επίσης, παρουσιάζει ενδιαφέρον η περίπτωση έλλειψης του παράγοντα XI, η οποία οδηγεί σε αιμορραγικά επεισόδια, τα οποία διαφοροποιούνται ανάμεσα στους ασθενείς και έχουν ηπιότερη μορφή από τις αιμορροφιλίες Α και Β. 14

15 Επικρατέστερα μοντέλα του μηχανισμού πήξης Είναι πλέον γνωστό ότι οι αντιδράσεις πήξης δεν λαμβάνουν χώρα σε φυσιολογικά διαλύματα, αλλά σε επιφάνειες κυττάρων. Το μοντέλο του καταρράκτη πήξης αποδίδει τον κυρίαρχο ρόλο στους παράγοντες πήξης, με τα κύτταρα να έχουν παθητικό ρόλο. Ο ρόλος των κυττάρων έγκειται στο να παρέχουν επιφάνειες πλούσιες σε φωσφολιπίδια για τον σχηματισμό των συμπλόκων, καταλήγοντας στο συμπέρασμα ότι οι επιφάνειες των κυττάρων που φέρουν παρόμοια λιπιδική σύσταση εμφανίζουν και παρόμοια δράση. Η άμεση σύγκριση αιμοπεταλίων και φωσφολιπιδίων κατέδειξε ότι τα αιμοπετάλια εμφανίζουν πολύπλοκες δραστηριότητες πήξης οι οποίες δεν δύνανται να υποκατασταθούν πλήρως από τα φωσφολιπίδια. Επιπλέον, υπάρχουν στοιχεία που αποδίδουν σημαντικό ρόλο σε πρωτεϊνικά στοιχεία των αιμοπεταλίων, τα οποία συμβάλλουν στον έλεγχο του μηχανισμού πήξης και στην παραγωγή της θρομβίνης. Ερευνητική ομάδα Mann: Σύμφωνα με την ερευνητική ομάδα του καθηγητή Mann 4,21, ο αιμοστατικός μηχανισμός συνδέεται κυρίως με τρία ενζυμικά σύμπλοκα παραγόντων πήξης. Κάθε σύμπλοκο αποτελείται από Κ-βιταμινο εξαρτώμενες πρωτεάσες σερίνης (παράγοντες IXa, Xa και VIIa) σε συνδυασμό με τους συμπαράγοντές τους, συγκεντρωμένα στην φωσφολιπιδική επιφάνεια που παρέχεται από ενεργοποιημένα ή κατεστραμμένα κύτταρα (εικόνα 3). Εικόνα 3. Τα βιταμινο-κ εξαρτώμενα σύμπλοκα και τα συστατικά τους. Παρόλο που για κάθε ενζυμικό σύμπλοκο αντιστοιχεί διαφορετικό υπόστρωμα με διαφορετική πρωτεολυτική δραστηριότητα, εντούτοις τα σύμπλοκα 15

16 φέρουν κοινά χαρακτηριστικά γνωρίσματα. Κατά κύριο λόγο, τα σύμπλοκα είναι λειτουργικά ανάλογα, με δομικές ομολογίες στα συστατικά τους. Όλες οι πρωτεΐνες που παίρνουν μέρος στην διαδικασία απαιτούν πρωτεολυτική ενεργοποίηση για την συμμετοχή τους στην παραγωγή θρομβίνης. Επιπλέον, η συσσώρευση και η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων συμβάλλει στην παροχή των μεμβρανών, οι οποίες φέρουν τις θέσεις δέσμευσης των παραγόντων. Το έναυσμα για την έναρξη της διαδικασίας παραγωγής θρομβίνης παρέχεται από την αλληλεπίδραση του ιστικού παράγοντα, ο οποίος υπό φυσιολογικές συνθήκες δεν εκτίθεται στην επιφάνεια της μεμβράνης, με τον παράγοντα VIIa. Περίπου το 1-2% της συνολικής ποσότητας του παράγοντα VIIa κυκλοφορεί στο αίμα με την ενεργή του μορφή. Ο ιστικός παράγοντας εκτίθεται στην επιφάνεια ως αποτέλεσμα αγγειακής βλάβης. Παρόλο που ο παράγοντας VIIa φέρει όλες τις κατάλληλες προϋποθέσεις για δράση ως πρωτεάση σερίνης, εντούτοις το ενεργό του κέντρο δεν παρουσιάζει πρωτεολυτική δραστηριότητα αν δεν δεσμευτεί προηγουμένως με τον ιστικό παράγοντα. Κατά συνέπεια, ο αδέσμευτος παράγοντας VIIa δεν παρουσιάζει σημαντική δραστηριότητα έναντι των παραγόντων IX ή X, δίχως να προηγηθεί δέσμευση με τον ιστικό παράγοντα. Η δημιουργία του παραπάνω συμπλόκου έχει ως στόχο την προστασία του ενεργού κέντρου του παράγοντα VIIa από την ανασταλτική δράση της αντιθρομβίνης III (AT-III), συμβάλλοντας, ταυτόχρονα, στην ενίσχυση της καταλυτικής δραστηριότητας του ενζύμου, με αποτέλεσμα να αυξάνεται το ποσοστό ενεργοποίησης του παράγοντα Xa κατά τέσσερις φορές. Εικόνα 4. Ο ρόλος των βιταμινο-κ εξαρτώμενων συμπλόκων στην παραγωγή θρομβίνης. 16

17 Το σύμπλοκο VIIa/TF (ενδογενής δεκάση) καταλύει την ενεργοποίηση των παραγόντων IX και X, με τον τελευταίο να αποτελεί αποτελεσματικότερο υπόστρωμα (εικόνα 4). Επομένως, το προϊόν που παράγεται αρχικά από τη δράση της ενδογενής δεκάσης είναι ο παράγοντας Xa. Η ζυμογόνος μορφή του παράγοντα IX είναι ανταγωνιστικό υπόστρωμα με τον παράγοντα X. Εντούτοις, ο παράγοντας Xa που βρίσκεται δεσμευμένος στην μεμβράνη, συμβάλλει στην ενεργοποίηση του παράγοντα IX. Ο παραγόμενος παράγοντας Xa, με τη δέσμευσή του στη μεμβράνη, ενεργοποιεί την παραγωγή μικρών ποσοτήτων θρομβίνης. Η θρομβίνη αυτή είναι απαραίτητη για την έναρξη της διαδικασίας πήξης, δρώντας ως ενεργοποιητής των αιμοπεταλίων και των παραγόντων V και VIII. Ο παραγόμενος VIIIa δεσμεύεται στον παράγοντα IXa, ο οποίος σχηματίστηκε από τη δράση του συμπλέγματος TF/VIIa, και σχηματίζουν μαζί το σύμπλεγμα της ενδογενούς δεκάσης πάνω στη μεμβράνη των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων. Το σύμπλοκο IXa/VIIIa είναι φορές πιο δραστικό στην ενεργοποίηση του παράγοντα X σε σχέση με το σύμπλοκο TF/VIIa. Επίσης, η ταχύτητα ενεργοποίησης του παράγοντα X από το σύμπλοκο της ενδογενούς δεκάσης προηγείται σε μεγάλο βαθμό σε σχέση με την ενεργοποίηση μέσω του συμπλόκου της εξωγενούς δεκάσης. Κατά συνέπεια, η μεγαλύτερη ποσότητα (>90%) του παραγόμενου Xa στην αιμοστατική διαδικασία προέρχεται από το σύμπλοκο IXa/VIIIa. Ο παράγοντας Xa δεσμεύεται με τον παράγοντα Va στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων, σχηματίζοντας το σύμπλεγμα της προθρομβινάσης, καταλύοντας την μετατροπή της προθρομβίνης σε θρομβίνη. Το σύμπλεγμα της προθρομβινάσης είναι 300,000 φορές πιο αποτελεσματικό σε σχέση με τον παράγοντα Xa στην ενεργοποίηση της θρομβίνης. Όπως διαπιστώνεται, η θεωρία Mann προσδίδει κυρίαρχο ρόλο στην παρουσία των ενζυμικών συμπλόκων (τα οποία βρίσκονται σε δυναμική και στοιχειομετρική ισορροπία με τα συστατικά τους) στην διαδικασία παραγωγής της θρομβίνης, με τα αιμοπετάλια και τα κύτταρα να συμβάλλουν, απλώς, στην παροχή των μεμβρανών, οι οποίες φέρουν τις θέσεις δέσμευσης των παραγόντων. Ερευνητική ομάδα Roberts: Η ερευνητική ομάδα του καθηγητή Roberts ανέπτυξε ένα μοντέλο στο οποίο η διαδικασία της πήξης του αίματος ελέγχεται από τα ίδια τα κύτταρα (cell-based model of coagulation) 15. Το μοντέλο αυτό βασίζεται σε πειράματα όπου χρησιμοποιούνται 17

18 κύτταρα, όπως μονοκύτταρα και ινοβλάστες, ως πηγές TF και ενεργοποιημένα αιμοπετάλια ως επιφάνειες δράσης για την παραγωγή θρομβίνης. Στο μοντέλο αυτό, η πήξη του αίματος λαμβάνει χώρα σε τρεις άμεσα συσχετιζόμενες φάσεις: την φάση έναρξης (initiation), την φάση πυροδότησης (priming) και την φάση μεγιστοποίησης (propagation). Καθώς λαμβάνει χώρα η διαδικασία της αιμόστασης, μια ρήξη στο τοίχωμα των αγγείων φέρνει σε επαφή το πλάσμα με κύτταρα-πηγές TF. Ο παράγοντας VII δεσμεύεται με τον TF και ακολουθεί η άμεση ενεργοποίησή του τόσο από πρωτεάσες που λαμβάνουν μέρος στην διαδικασία πήξης όσο και από άλλες. Εν συνεχεία, το σύμπλοκο ενεργοποιημένου παράγοντα VIIa/TF ενεργοποιεί τους παράγοντες IX και X (εικόνα 5). Οι ενεργοποιημένες μορφές των δύο αυτών παραγόντων, αν και ενεργοποιούνται στο ίδιο σημείο, διαδραματίζουν διαφορετικούς και ευδιάκριτους ρόλους στις επικείμενες αντιδράσεις πήξης. Ο παράγοντας Xa μπορεί να ενεργοποιήσει τον παράγοντα V σε κύτταρα πηγές TF (όπως άλλωστε και άλλες πρωτεάσες του κυττάρου). Εάν ο παράγοντας Xa διαχυθεί από το προστατευόμενο περιβάλλον της κυτταρικής επιφάνειας που ενεργοποιήθηκε, θα ανασταλεί ταχύτατα από τη δράση των αναστολέων TFPI (TF pathway inhibitor) και AT (Antithrombin). Εντούτοις, ο παράγοντας Xa παραμένει στην επιφάνεια των TF-κυττάρων και σε συνδυασμό με τον παράγοντα Va οδηγεί στην παραγωγή μικρών ποσοτήτων θρομβίνης. Τα παραγόμενα ίχνη θρομβίνης δεν είναι ικανά να οδηγήσουν σε διάσπαση του ινωδογόνου, διαδραματίζουν, όμως, σημαντικό ρόλο στην περαιτέρω διαδικασία πήξης. Το σύμπλοκο VIIa/TF που παρήχθη αρχικά, αναστέλλεται, εν συνεχεία, από το σύμπλοκο TFPI και Xa. Στην φάση της πυροδότησης, η λιγοστή θρομβίνη που είχε παραχθεί αρχικά δεσμεύεται στα αιμοπετάλια που έχουν προσκολληθεί στο σημείο της βλάβης και τα οποία παραμένουν ενωμένα μέσω της δέσμευσης του παράγοντα von Willebrand με το κολλαγόνο. Η διαδικασία σύνδεσης ενεργοποιεί μερικώς τα αιμοπετάλια και τα κατευθύνει στα σημεία έλκυσης του παράγοντα TF. Η παραγόμενη θρομβίνη οδηγεί σε ενίσχυση της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων. Επιπλέον η θρομβίνη έχει και άλλες δράσεις: i) οδηγεί στην μετατροπή του μερικώς ενεργοποιημένου παράγοντα V στην πλήρη ενεργοποιημένη μορφή του, ii) ενεργοποιεί τον παράγοντα VIII, συμβάλλοντας στην αποδέσμευσή του από τον παράγοντα von Willebrand και iii) ενεργοποιεί τον παράγοντα XI, ο οποίος βρίσκεται δεσμευμένος στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων. Αποτέλεσμα του παραπάνω σταδίου είναι η ενεργοποίηση των 18

19 αιμοπεταλίων, στα οποία δεσμεύονται άμεσα οι συμπαράγοντες Va και VIIIa, καθώς και ο παράγοντας XIa. Εικόνα 5. Κυτταρικό μοντέλο πήξης του αίματος. Στην φάση της μεγιστοποίησης, έχουμε τον σχηματισμό του συμπλόκου IXa/VIIIa με την έλευση του παράγοντα IXa στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων. Ο παράγοντας IXa που παράγεται αρχικά από το σύμπλοκο VIIa/TF μπορεί και διαχέεται στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων, καθώς δεν αναστέλλεται άμεσα από την αντιθρομβίνη ή από άλλους αναστολείς του πλάσματος. Επιπλέον, ο παράγοντας XIa, ο οποίος βρίσκεται στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων, δύναται να οδηγήσει σε περαιτέρω παραγωγή IXa απευθείας πάνω στα αιμοπετάλια. Ο παράγοντας X επιστρατεύεται στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων και ενεργοποιείται από το σύμπλοκο IXa/VIIIa. Το γεγονός αυτό επιτρέπει στον παράγοντα Xa να σχηματίσει ένα προστατευόμενο σύμπλοκο με τον παράγοντα Va, στο οποίο ο παράγοντας Xa προστατεύεται από τη δράση των αναστολέων TFPI και AT, ακόμη και παρουσία της ηπαρίνης. Το σύμπλοκο Xa/Va στην επιφάνεια των 19

20 αιμοπεταλίων οδηγεί στην έκρηξη παραγωγής θρομβίνης, η ποσότητα της οποίας είναι ικανή να σταθεροποιήσει τη δομή του θρόμβου ινικής. Το παραπάνω μοντέλο παρέχει μια ορθολογική εξήγηση της αιμορραγικής διάθεσης σε καταστάσεις αιμορροφιλίας. Το μονοπάτι δράσης του TF παραμένει ανεπηρέαστο σε αιμορροφιλικούς ασθενείς, με την φάση έναρξης και πυροδότησης να λαμβάνουν χώρα κανονικά. Το γεγονός αυτό οδηγεί σε ομαλή ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και δικαιολογεί, πιθανότατα, την τάση των αιμορροφιλικών για επίσχεση της αιμορραγίας μέσω σχηματισμού του αρχικού (λευκού) θρόμβου. Ωστόσο, παρατηρούνται σοβαρά αιμορραγικά επεισόδια σε καταστάσεις αιμορροφιλίας λόγω της απουσίας του παράγοντα πήξης στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων, με συνέπειες στην παραγωγή θρομβίνης και στην αδυναμία δημιουργίας του κόκκινου θρόμβου (θρόμβος πήξεως). Ο παράγοντας Xa, ο οποίος παράγεται από το σύμπλοκο VIIa/TF, αδυνατεί να διαχυθεί στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων εξαιτίας της δράσης των αναστολέων. Ο μοναδικός παράγοντας Xa που μπορεί να συνεργαστεί στο σύμπλοκο της προθρομβινάσης είναι αυτός που παράγεται στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων από το σύμπλοκο IXa/VIIa, σε συνέργια με τον παράγοντα Va. Επομένως, στην αιμορροφιλία παρατηρείται μια αδυναμία ενεργοποίησης του παράγοντα X στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων, γεγονός που οδηγεί σε μειωμένη παραγωγή θρομβίνης στα αιμοπετάλια και στη δημιουργία αναποτελεσματικού θρόμβου. 20

21 Ρόλος των αιμοπεταλίων Στο κυτταρικό μοντέλο πήξης του αίματος τα αιμοπετάλια διαδραματίζουν πρωτεύοντα ρόλο στον έλεγχο και τον εντοπισμό της θέσης παραγωγής θρομβίνης, οδηγώντας στο σχηματισμό του θρόμβου 24. Τα αιμοπετάλια παρέχουν παράγοντες που συμβάλλουν την ενεργοποίηση της προθρομβίνης. Έρευνες κατέδειξαν ότι κατά την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων το ποσοστό ενός συγκεκριμένου λιπιδίου, της φωσφατιδυλοσερίνης, αυξάνεται δραματικά από 2 σε 12% στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων. Έρευνες, επίσης, συνδέουν την παρουσία της φωσφατιδυλοσερίνης με την ικανότητα των αιμοπεταλίων για παραγωγή θρομβίνης. Η έκθεση της φωσφατιδυλοσερίνης στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων κατά την ενεργοποίησή τους, αποτελεί αναγκαίο παράγοντα που συμβάλλει στην ενίσχυση του ρόλου τους στην πήξη του αίματος και ελέγχεται από έναν μηχανισμό ενεργής μεταφοράς, κατά τον οποίο η φωσφατιδυλοσερίνη μεταφέρεται από την εσωτερική στην εξωτερική επιφάνεια της μεμβράνης των αιμοπεταλίων. Παρά το γεγονός ότι ο κύριος ρόλος της φωσφατιδυλοσερίνης θεωρείται η συμβολή της στην δέσμευση των υπομονάδων των καρβοξυ-γλουταμινικών αμινοξέων (Gla) των παραγόντων πήξης με τα ιόντα ασβεστίου, πρόσφατες έρευνες κατέδειξαν ότι πιθανότατα να συμβάλει, δρώντας ως αλλοστερικός τροποποιητής, στην ενίσχυση της διάσπαση της προθρομβίνης. Εικόνα 6. Πρωτεΐνες δέσμευσης στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην πήξη του αίματος (A: κύριοι πρωτεϊνικοί υποδοχείς στην φάση έναρξης, Β: κύριοι πρωτεϊνικοί υποδοχείς στην φάση πυροδότησης της διαδικασίας πήξης του αίματος). Επίσης, έρευνες αποδεικνύουν ότι πρωτεΐνες δέσμευσης στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων ενισχύουν την εξειδίκευση στην παραγωγή θρομβίνης. Έχουν 21

22 καταγραφεί θέσεις δέσμευσης υψηλής αγχιστείας των παραγόντων πήξης με πρωτεΐνες-υποδοχείς στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων (εικόνα 6). Εν κατακλείδι, διαπιστώνεται ο καίριος ρόλος των αιμοπεταλίων στην ενίσχυση και τη ρύθμιση της παραγωγής της θρομβίνης. Η δράση τους επεκτείνεται πέραν της έκθεσης της φωσφατιδυλοσερίνης στην επιφάνεια της μεμβράνης και απαιτεί την παρουσία ειδικών πρωτεϊνικών υποδοχέων, οι οποίοι συμβάλλουν, με τη σειρά τους, στην ρύθμιση της διαδικασίας της πήξης του αίματος. Τα μοντέλα πήξης που βασίζονται στον ρόλο των κυττάρων στην διαδικασία της πήξης, αποτελούν το έναυσμα για την μελέτη εκείνων των μηχανισμών με τους οποίους τα αιμοπετάλια οδηγούν σε έκρηξη της παραγωγής θρομβίνης. 22

23 Παράγοντες πήξης Παρακάτω γίνεται αναφορά στους παράγοντες που συμμετέχουν στην διαδικασία της πήξης του αίματος (πίνακας 1): Zymogens of Serine Proteases Activities Factor XII binds to exposed collagen at site of vessel wall injury, activated by high-mw kininogen and kallikrein Factor XI activated by factor XIIa Factor IX activated by factor XIa in presence of Ca 2+ Factor VII activated by thrombin in presence of Ca 2+ Factor X activated on surface of activated platelets by tenase complex and by factor VIIa in presence of tissue factor and Ca 2+ Factor II activated on surface of activated platelets by prothrombinase complex Cofactors Activities Factor VIII activated by thrombin; factor VIIIa is a cofactor in the activation of factor X by factor Ixa Factor V activated by thrombin; factor Va is a cofactor in the activation of prothrombin by factor Xa Factor III (tissue factor) a subendothelial cell-surface glycoprotein that acts as a cofactor for factor VII Fibrinogen Activity Factor I cleaved by thrombin to form fibrin clot Transglutaminase Activity Factor XIII activated by thrombin in presence of Ca 2+ ; stabilizes fibrin clot by covalent cross-linking Regulatory and other proteins Activities von Willebrand factor associated with subendothelial connective tissue; serves as a brigde between platelet glycoprotein GPIb/IX and collagen Protein C activated to protein Ca by thrombin bound to thrombomodulin; then degrades factors VIIIa and Va Protein S Acts as a cofactor of protein C; both proteins contain gla residues Thrombomodulin protein on the surface of endothelial cells; binds thrombin, which then activates protein C Antithrombin III most important coagulation inhibitor, controls activities of thrombin, and factors IXa, Xa, XIa and XIIa Πίνακας 1. Παράγοντες που συμμετέχουν στην διαδικασία πήξης 23

24 A. Δομή των παραγόντων πήξης που φέρουν πρωτεολυτική δράση Η δομή των ζυμογόνων που φέρουν πρωτεολυτική δράση και λαμβάνουν μέρος στην διαδικασία πήξης του αίματος (όπως οι παράγοντες II (προθρομβίνη), VII, IX, X, XI, XII και καλλικρεΐνη) φαίνεται στην εικόνα 7. Οι πρωτεΐνες εκκρίνονται από τα ηπατοκύτταρα στην κυκλοφορία του αίματος. Περίπου 200 αμινοξέα στο C-τελικό άκρο εμφανίζουν ομολογία με την τρυψίνη και περικλείουν το καταλυτικό κέντρο (Ser, Asp και His) της πρωτεάσης. Επίσης, οι πρωτεΐνες περικλείουν ποικιλία δομών που παρουσιάζουν ομολογία με άλλες πρωτεΐνες, όπως ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (epidermal growth factor, EGF). Οι δομές αυτές φαίνεται να εμπλέκονται στις αλληλεπιδράσεις των πρωτεασών με τα υποστρώματά τους, τους συμπαράγοντες και τους αναστολείς. Εικόνα 7. Δομή των παραγόντων πήξης. Οι παράγοντες II, VII, IX και X εμφανίζουν ομολογία στο N-τελικό άκρο τους. Όλοι, εκτός από την προθρομβίνη, φέρουν δύο ομόλογες EGF δομές, ενώ η προθρομβίνη φέρει δύο kringle δομές. Μετά την απομάκρυνση του σήματος εισόδου 24

25 (signal peptide) μια ειδική καρβοξυλάση, η οποία εδρεύει στο ενδοπλασματικό δίκτυο ή στο σύστημα Golgi, καταλύει την μετατροπή περίπου γλουταμινικών οξέων (Glu) σε γ-καρβοξυ-γλουταμινικά οξέα (Gla), παρακείμενα της δομής Gla (εικόνα 8). Εικόνα 8. γ-καρβοξυλίωση της προθρομβίνης (παράγοντας II). Η δομή Gla πήρε το όνομά της από τα γ-καρβοξυ-γλουταμινικά οξέα, τα οποία προκύπτουν από την καρβοξυλίωση των γλουταμινικών οξέων της συντηρημένης αλληλουχίας. Τα Gla αμινοξέα φέρουν μεγαλύτερη αγχιστεία δέσμευσης με ιόντα ασβεστίου, τα οποία είναι απαραίτητα για την δράση των παραγόντων αυτών. Η σύνθεση των Gla αμινοξέων απαιτεί την παρουσία της βιταμίνης Κ (εικόνα 9). Για το λόγο αυτό, οι παράγοντες II, VII, IX, X αλλά και η πρωτεΐνη C είναι βιταμινο-κ εξαρτώμενοι. Κατά την καρβοξυλίωση, το γλουταμινικό οξύ μετατρέπεται σε γ-καρβοξυγλουταμινικό, παρουσία CO 2, O 2 και βιταμίνης Κ. Η βιταμίνη Κ οξειδώνεται και πρέπει να επανέλθει στην ανηγμένη της μορφή με τη δράση μιας ρεδουκτάσης, προκειμένου να συνεχιστεί ο κύκλος. Η βαρφαρίνη αναστέλλει την αναγωγή της βιταμίνης Κ και, κατά συνέπεια, παρεμποδίζει την ενεργοποίηση των παραπάνω παραγόντων. Εικόνα 9. Ρόλος της βιταμίνης K στη βιοσύνθεση των παραγόντων II, VII, IX και X. Παρακάτω παρουσιάζεται η δράση κάθε παράγοντα χωριστά: 25

26 Θρομβίνη (FII) Το γονίδιο της προθρομβίνης εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 11. Αποτελείται από μια απλή γλυκοπρωτεϊνική αλυσίδα μοριακού βάρους Η προθρομβίνη συντίθεται στο ήπαρ και υφίσταται μετα-μεταφραστική τροποποίηση με τη δράση της βιταμίνης Κ, μέσω της οποίας ενισχύεται η ικανότητα δέσμευσής του μορίου σε μεμβράνες φωσφολιπιδίων. Το μόριό της αποτελείται από 582 κατάλοιπα αμινοξέων και τρεις ολιγοσακχαριδικές αλυσίδες. Η δομή της συνίσταται σε τέσσερις κύριες περιοχές: α) μια Gla-περιοχή στο Ν-τελικό άκρο, β) δύο kringle δομές και γ) την καταλυτική περιοχή (εικόνα 7). Η διαδικασία ενεργοποίησης της προθρομβίνης έχει ως εξής: αρχικά, η προθρομβίνη υφίσταται υδρόλυση του δεσμού Arg-273/Thr-274, από την οποία σχηματίζεται η προθρομβίνη-2. Στη συνέχεια, ακολουθεί δεύτερη υδρόλυση στο δεσμό Arg-323/Ile-324, όπου διαχωρίζεται η α από τη β αλυσίδα της ώριμης και δραστικής θρομβίνης. Η δραστική θρομβίνη (α-θρομβίνη) διαχωρίζεται από το F1+2 κλάσμα της προθρομβίνης. Η α θρομβίνη, εν συνεχεία, μπορεί να υδρολυθεί περαιτέρω στα λιγότερο δραστικά ένζυμα β και γ θρομβίνη. Η θρομβίνη μετατρέπει το ινωδογόνο σε ινική. Επίσης, ενεργοποιεί τους παράγοντες XI, V και VIII. Η διαδικασία αυτή της θετικής ανάδρασης ενισχύει την διαδικασία παραγωγής θρομβίνης. Ο παράγοντας XIII ενεργοποιείται, επίσης, από την θρομβίνη. Ο παράγοντας XIIIa είναι μια τρανσαμινάση η οποία καταλύει τον σχηματισμό των ομοιοπολικών δεσμών μεταξύ των αμινοξέων λυσίνη και γλουταμίνη στο μόριο της ινικής, οδηγώντας στην σταθεροποίηση του πλέγματος της ινικής. Επίσης, η θρομβίνη προάγει την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, μέσω της ενεργοποίησης των υποδοχέων που φέρουν στην επιφάνειά τους. Η θρομβίνη, μέσω της διαδικασίας της αρνητικής ανάδρασης ενεργοποιεί την πρωτεΐνη C, έναν αναστολέα της διαδικασίας πήξης. Η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης C προάγεται με τη δέσμευση της θρομβίνης στην θρομβοδουλίνη, μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη που εκφράζεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η ενεργοποίηση της προθρομβίνης είναι ζωτικής σημασίας στην φυσιολογία και την παθολογία της πήξης. Έχουν αναφερθεί πολλές σπάνιες ασθένειες που οφείλονται στην προθρομβίνη (υποπροθρομβιναιμία). Μια αρκετά σπάνια διαταραχή (>5% σε δυτικούς ασθενείς) αφορά την αντικατάσταση της αδενίνης από την γουανίνη στη θέση στο γονίδιο της προθρομβίνης. Η αλλαγή αυτή στο 26

27 αναγνωστικό πλαίσιο της πρωτεΐνης οδηγεί σε υψηλά επίπεδα παραγωγής, αυξάνοντας τον κίνδυνο θρομβώσεων. Ενεργοποίηση της προθρομβίνης Ο ενεργοποιημένος παράγοντας Xa καταλύει την μετατροπή της προθρομβίνης (παράγοντας II) σε θρομβίνη (παράγοντας IIa) διασπώντας δύο πεπτιδικούς δεσμούς στο ζυμογόνο (εικόνα 10). Η ενεργοποίηση της προθρομβίνης από τον παράγοντα Xa ενισχύεται από την παρουσία του παράγοντα Va, αιμοπεταλίων (ή φωσφολιπιδίων) και ιόντων ασβεστίου (πίνακας 2). Purified Components Relative Rate of Thrombin Generation (1) Prothrombin, Xa, Ca ++ 1 (35 days) (2) Prothrombin, Xa, PL, Ca (17 hours) (3) Prothrombin, Xa, Va, Ca (2.4 hours) (4) Prothrombin*, Xa*, Va, PL, Ca ++ <1000 (>50 min) (5) Prothrombin, Xa, Va, PL, Ca ++ 19,000 (2.5 min) (6) Prothrombin, Xa, Va, platelets, Ca ,000 (10 sec) Πίνακας 2. Ενίσχυση της ενεργοποίησης της προθρομβίνης από την παρουσία του παράγοντα Va και των αιμοπεταλίων (PL:φωσφολιπίδια, Prothrombin* - Xa*:μορφές της προθρομβίνης και του παράγοντα Xa, αντίστοιχα, δίχως την παρουσία Gla-αμινοξέων, των οποίων οι σύνθεση έγινε απουσία της βιταμίνης K). Η παρουσία όλων των παραπάνω (πλήρες σύστημα) ενεργοποιεί την προθρομβίνη σε ρυθμούς 300,000 φορές περισσότερο από την παρουσία μόνο των Xa και Ca ++. Τα φωσφολιπίδια και ο παράγοντας Va ενισχύουν και μεμονωμένα την ενεργοποίηση της προθρομβίνης, έχουν, όμως, συνεργιστική δράση στο πλήρες σύστημα. Η μέγιστη ενεργοποίηση παρατηρείται μόνο όταν η προθρομβίνη και ο παράγοντας Xa περιέχουν Gla-αμινοξέα και φέρουν, επομένως, την ικανότητα δέσμευσης ιόντων ασβεστίου. Η δέσμευση του ασβεστίου αλλάζει την μορφολογία των Gla-δομών των παραγόντων αυτών, επιτρέποντάς τους να αλληλεπιδρούν με επιφάνειες μεμβρανών που παρέχονται είτε από φωσφολιπίδια (in vitro) είτε από αιμοπετάλια (in vivo). Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των παραγόντων του συμπλέγματος της προθρομβινάσης απεικονίζονται σχηματικά στην εικόνα

28 Εικόνα 10. Σύμπλεγμα ενεργοποίησης προθρομβίνης. Το σύνολο των αιμοπεταλίων φέρεται να παρέχει την επιφάνεια όπου λαμβάνει χώρα η ενεργοποίηση της προθρομβίνης στην διαδικασία της αιμόστασης. Η ενεργοποίηση του παράγοντα X από τον IXa και τον συμπαράγοντα VIIIa φέρεται να λαμβάνει χώρα με μηχανισμό παρόμοιο με αυτόν της ενεργοποίησης της προθρομβίνης και, πιθανότατα, να ενισχύεται από την παρουσία αιμοπεταλίων in vivo. Παράγοντας VII (Προκομβερτίνη, FVII) Ο παράγοντας VIIa είναι μια απλή πολυπεπτιδική ένωση μοριακού βάρους και διάρκεια ημιζωής 4 ώρες. Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για τον παράγοντα VII βρίσκεται στο χρωμόσωμα 13. Ο παράγοντας αποτελείται από τέσσερις δομικές περιοχές: μια Gla-περιοχή στο Ν-τελικό άκρο, δύο EGF-περιοχές και μια καταλυτική περιοχή στο C-τελικό άκρο (εικόνα 7). Η κύρια δράση του παράγοντα VIIa έγκειται στην ενεργοποίηση της διαδικασίας πήξης υπό μορφή συμπλόκου με τον ιστικό παράγοντα. Ο παράγοντας VII ενεργοποιείται πρωτεολυτικά και μετατρέπεται σε σερινική πρωτεάση από την θρομβίνη και τους παράγοντες IXa, Xa και XIIa, με υδρόλυση του δεσμού Arg- 152/Ile-153. Η σύνδεση του παράγοντα VII με τον ιστικό παράγοντα γίνεται μέσω της Gla-περιοχής του VII, παρουσία ιόντων ασβεστίου και αρνητικά φορτισμένων φωσφολιπιδίων, σχηματίζοντας το σύμπλοκο της εξωγενούς δεκάσης. Η ενεργοποίηση του παράγοντα VII σε VIIa από τον παράγοντα Xa πραγματοποιείται πολύ γρήγορα, σε αντίθεση με την ενεργοποίηση από τον παράγοντα IXa, η οποία πραγματοποιείται με αργό ρυθμό. 28

29 Κύρια υποστρώματα της δράσης του συμπλόκου VIIa/TF αποτελούν οι παράγοντες X και IX. Η δράση του παράγοντα VIIa αναστέλλεται από την δράση του TFPI, ο οποίος απελευθερώνεται αμέσως μετά την έναρξη της διαδικασίας πήξης. Επίσης, ο παράγοντας VIIa αναστέλλεται, με πολύ αργό ρυθμό, από το σύμπλεγμα αντιθρομβίνης III/ηπαρίνης. Η χρήση του ανασυνδυασμένου παράγοντα VIIa (NovoSeven, eptacog alfa [activated], ATC code B02BD08) χρησιμοποιείται ευρέως για την αντιμετώπιση των καταστάσεων ακατάσχετης αιμορραγίας σε ασθενείς με αιμορροφιλία (Roberts et al, 2004), οι οποίοι έχουν αναπτύξει αντισώματα έναντι των παραγόντων πήξης που βρίσκονται σε έλλειμμα. Η αρχή της χρήσης του ανασυνδυασμένου παράγοντα έγκειται στο γεγονός ότι ενισχύεται η διαδικασία πήξης στις πληγείσες περιοχές όπου η παρουσία του ιστικού παράγοντα είναι επίσης απαραίτητη. Ωστόσο οι O Conell et al (2006) επισημαίνουν τον αυξημένο κίνδυνο θρομβώσεων, πνευμονικών εμβολών και καρδιακών εμφραγμάτων που έγκειται η χρήση του rfviia. Επίσης, και άλλοι ερευνητές εστιάζουν στον κίνδυνο οξειών εγκεφαλικών αιμορραγιών. Παράγοντας IX (Christmas Factor, FIX) Ο παράγοντας IX αποτελείται από μια απλή γλυκοπρωτεϊνική πολυπεπτιδική αλυσίδα 415 αμινοξέων, μοριακού βάρους 56000, ενώ η διάρκεια ημιζωής του είναι ώρες. Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για τον παράγοντα IX εδράζεται στο χρωμόσωμα X. Ο παράγοντας αποτελείται από πέντε δομικές περιοχές: μια Glaπεριοχή στο Ν-τελικό άκρο, δύο EGF-περιοχές, μία AP (activated peptide) περιοχή, η οποία περικλείει το πεπτίδιο ενεργοποίησης και μια καταλυτική περιοχή στο C-τελικό άκρο (εικόνα 7). Ο παράγοντας IX ενεργοποιείται από τον παράγοντα XIa (ενδογενές μονοπάτι) και το σύμπλοκο VIIa/TF (εξωγενές μονοπάτι). Ο ενεργοποιημένος παράγοντας IXa ενεργοποιεί, με τη σειρά του, τον παράγοντα X σε Xa, παρουσία ιόντων ασβεστίου, φωσφολιπιδίων και του συμπαράγοντα VIII. Κύριος αναστολέας του μορίου είναι το σύμπλεγμα αντιθρομβίνης III/ηπαρίνης. Η έλλειψη του παράγοντα IX οδηγεί στην αιμορροφιλία B (Christmas disease). Έχουν καταγραφεί πάνω από 100 μεταλλάξεις του παράγοντα IX, ορισμένες από τις οποίες είναι ασυμπτωματικές, ενώ άλλες καταλήγουν σε αιμορραγικές καταστάσεις. 29

30 Παράγοντας Χ (Stuart-Prower Factor, Thrombokinase, FX) Ο παράγοντας X είναι μια γλυκοπρωτεϊνική ένωση δύο αλυσίδων (μια βαριά και μια ελαφριά με 43 και 16 kda ΜΒ, αντίστοιχα) ενώ η διάρκεια ημιζωής του είναι ώρες. Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για τον παράγοντα X εδράζεται στο χρωμόσωμα 13. Ο παράγοντας αποτελείται από πέντε δομικές περιοχές: μια Gla-περιοχή στο Ν-τελικό άκρο της ελαφριάς αλυσίδας, δύο ομόλογες EGF-περιοχές στην πλευρά της ελαφριάς αλυσίδας, μία AP (activated peptide) περιοχή, η οποία περικλείει το πεπτίδιο ενεργοποίησης, στην πλευρά της βαριάς αλυσίδας και μια καταλυτική περιοχή στο C-τελικό άκρο της βαριάς αλυσίδας (εικόνα 7). Η ενεργοποίηση του παράγοντα X από το σύμπλοκο IXa/VIIIa (ενδογενής δεκάση) και το σύμπλοκο VIIa/TF (εξωγενής δεκάση) γίνεται με την υδρόλυση του δεσμού Arg-52/Ile-53 της βαριάς αλυσίδας προς την πλευρά του C-τελικού άκρου του μορίου. Ο παράγοντας Χα δρα σε συνδυασμό με τον συμπαράγοντα Va (σύμπλεγμα προθρομβινάσης) ενεργοποιώντας την προθρομβίνη σε θρομβίνη, καθώς και τους παράγοντες VII, VIII και V. Κύριοι αναστολείς του παράγοντα X είναι η ATIII και ο TFPI. Περιπτώσεις έλλειψης του παράγοντα X είναι πολύ σπάνιες (1:500,000) και μπορεί να παρατηρούνται μαζί με καταστάσεις επίσταξης (αιμορραγία από τη μύτη), αιμάρθρωσης (αιμορραγία στις αρθρώσεις) και αιμορραγίας του πεπτικού σωλήνα. Παράγοντας XI (plasma thromboplastin antecedent=pta, FXI) Ο παράγοντας ΧΙ είναι μια γλυκοπρωτεΐνη που κυκλοφορεί στο πλάσμα ως ομο-διμερές και σε σύμπλεγμα με το HMWK, ενώ η διάρκεια ημιζωής του είναι περίπου 52 ώρες. Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για τον παράγοντα X εδράζεται στο χρωμόσωμα 13. Αποτελείται από δύο πολυπεπτιδικές αλυσίδες που συνδέονται με δισουλφιδικούς δεσμούς. Κάθε μονομερής αλυσίδα αποτελείται από τέσσερις αλληλοδιάδοχες όμοιες περιοχές (R1, R2, R3, R4) στο N-τελικό άκρο και μια καταλυτική περιοχή στο C-τελικό άκρο (εικόνα 7). Ο παράγοντας XI ενεργοποιείται από τον παράγοντα XIIa, την θρομβίνη και αυτοκαταλυτικά. Αποτελεί μέλος του συστήματος επαφής μαζί με το HMWK, την προκαλλικρεΐνη και τους παράγοντες XII, και IX. Ο παράγοντας XI ενεργοποιεί τον παράγοντα IX σε IXa με εκλεκτική υδρόλυση των πεπτιδικών δεσμών arg-ala και arg- 30

31 val, καθώς επίσης και τους παράγοντες XII, VII και το πλασμινογόνο. Αναστέλλεται από την αντιθρυψίνη και την αντιθρομβίνη ΙΙΙ. Σε καταστάσεις έλλειψης του παράγοντα XI οφείλεται η αιμορροφιλία C. Πρόκειται για αυτοσωμική και υπολειπόμενη διαταραχή. Η αιμορραγική διάθεση είναι μικρή, όμως σε χειρουργικό επίπεδο μπορεί να προκληθεί εκτεταμένη απώλεια αίματος. Χαμηλά επίπεδα του παράγοντα XI παρατηρούνται και σε άλλες διαταραχές, όπως στο σύνδρομο Noonan, ενώ αυξημένα επίπεδα έχουν παρατηρηθεί και σε περιπτώσεις θρομβώσεων. Παράγοντας XII (Hageman Factor, FXII) Ο παράγοντας XII είναι μια απλή πολυπεπτιδική αλυσίδα μοριακού βάρους 80000, ενώ η διάρκεια ημιζωής του είναι ώρες. Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για τον παράγοντα IX εδράζεται στο χρωμόσωμα 5. Το μόριο του παράγοντα XII περιλαμβάνει δύο περιοχές (type I και type II), οι οποίες είναι ομόλογες με τη φιμπρονεκτίνη και βρίσκονται προς το Ν-τελικό άκρο, εναλλάξ με δύο EGF-περιοχές, μια kringle και μια καταλυτική περιοχή στο C- τελικό άκρο, στην οποία υπάρχουν οι δισουλφιδικοί δεσμοί που υδρολύονται από την καλλικρεΐνη (εικόνα 7). Ο παράγοντας XII ενεργοποιεί την προκαλλικρεΐνη και τον παράγοντα XI σε πρωτεάσες σερίνης (καλλικρεΐνη και παράγοντας XIa, αντίστοιχα). Ενεργοποιείται από την επαφή καθώς και από την προκαλλικρεΐνη, όταν βρεθεί μαζί της πάνω στην επιφάνεια επαφής. Η έλλειψη του παράγοντα Hageman είναι μια διαταραχή με αυτοσωμικό και υπολειπόμενο τρόπο κληρονομικότητας (1: ) και εμφανίζεται συχνότερα σε Ασιάτες. Η έλλειψή του δεν προκαλεί αιμορραγική διάθεση, αν και πιθανόν να αυξάνει τον κίνδυνο θρομβώσεων, εξαιτίας της ανεπαρκούς ενεργοποίησης της ινωδολυτικής οδού. Τέλος, η έλλειψή του οδηγεί σε παράταση του χρόνου της μερικώς ενεργοποιημένης θρομβοπλαστίνης (PTT) πάνω από 200 δευτερόλεπτα. Προκαλλικρεΐνη (F.Fletcher) Είναι μια απλή γλυκοπρωτεϊνική αλυσίδα μοριακού βάρους και κυκλοφορεί στο πλάσμα ως σύμπλεγμα με το HMWK. Μετατρέπεται από τη 31

32 ζυμογόνο στην ενεργή μορφή της σερινικής πρωτεάσης με την δράση του παράγοντα XIIa. Τα μόρια της καλλικρεΐνης αποτελούνται, έπειτα από τη δράση του XIIa, από δύο πολυπεπτιδικές αλυσίδες, μια βαριά (MB 43kDa) και μια ελαφριά (MB 36 ή 33kDa) που φέρει καταλυτική δράση, οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς. Ενεργοποιεί τον παράγοντα XII, το πλασμινογόνο, τον παράγοντα IX και το σύστημα κινινών απελευθερώνοντας κινίνες. Αδρανοποιείται από διάφορους αναστολείς, όπως ο C1-ανασταλτής, η A 2 -μακροσφαιρίνη και η αντιθρομβίνη III. B. Συμπαράγοντες πήξης με μη-ενζυμική δράση Στους συμπαράγοντες πήξης ανήκουν οι παράγοντες V και VIII, ο ιστικός παράγοντας και το υψηλού ΜΒ κινινογόνο (πίνακας 3). Οι παράγοντες V και VIII είναι μεγάλες πρωτεΐνες πλάσματος που περικλείουν επαναλαμβανόμενες ακολουθίες (Α1, Α2 και Α3 δομές), οι οποίες παρουσιάζουν ομολογία με την χαλκοπρωτεΐνη του πλάσματος την σερουλοπλασμίνη. Η θρομβίνη συμμετέχει στην ενεργοποίηση των παραγόντων V και VIII, με την ενεργό μορφή (Va και VIIIa, αντίστοιχα) να εμφανίζει 50 φορές μεγαλύτερη δραστηριότητα από τις πρόδρομες μορφές. Cofactor Location Mol Wt Activated by Cofactor for Factor V Plasma 300,000 Thrombin Factor Xa Factor VIII Plasma (bound to vwf) 300,000 Thrombin Factor IXa Tissue factor Cell membranes 40,000 Factor VIIa HMWK Plasma 110,000 Factor XIIa Πίνακας 3. Συμπαράγοντες πήξης. Οι παράγοντες Va και VIIIa δεν φέρεται να έχουν κάποιου είδους ενζυμικής δραστηριότητας. Ο παράγοντας VIII κυκλοφορεί στο πλάσμα δεσμευμένος με τον παράγοντα von Willebrand. Επομένως, σε ασθενή με έλλειψη του παράγοντα von Willebrand παρατηρείται και επακόλουθη μείωση της συγκέντρωσης του παράγοντα VIII στο πλάσμα. Ο ιστικός παράγοντας δεν κυκλοφορεί στο πλάσμα και αποτελεί μια μεμβρανική πρωτεΐνη η οποία απαντά στην επιφάνεια ενεργοποιημένων μονοκυττάρων, ενδοθηλιακών κυττάρων και σε σύμπλοκο με τον παράγοντα VII. 32

33 Παρακάτω παρουσιάζεται η δράση κάθε παράγοντα χωριστά: Παράγοντας V (Proaccelerin, Labile factor, FV) Ο παράγοντας V είναι μια απλή πολυπεπτιδική αλυσίδα μοριακού βάρους περίπου , ενώ η διάρκεια ημιζωής του είναι 12 ώρες (έχουν επίσης αναφερθεί περιπτώσεις διάρκειας ημιζωής πάνω από 36 ώρες). Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για τον παράγοντα V εδράζεται στο χρωμόσωμα 1. Το μόριο του παράγοντα V περιλαμβάνει έξι περιοχές: τρεις A-περιοχές (A1, A2, A3), μια B-περιοχή, η οποία χρησιμεύει για τη σύνδεση μεταξύ της A2 και A3 περιοχής και κατά την ενεργοποίηση αντικαθίσταται από ιόντα ασβεστίου, και δύο C-περιοχές (C1, C2) (εικόνα 11). Εικόνα 11. Δομή του παράγοντα V. Ο παράγοντας V φέρει την ικανότητα δέσμευσης πάνω σε ενεργοποιημένα αιμοπετάλια και ενεργοποιείται από την θρομβίνη. Αποτελεί μέλος του συμπλέγματος της προθρομβινάσης (ο παράγοντας Xa απαιτεί την παρουσία ιόντων ασβεστίου και του συμπαράγοντα Va για την μετατροπή της προθρομβίνης σε θρομβίνη). Ο παράγοντας Va αδρανοποιείται από την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C, η οποία, με τη σειρά της, ενεργοποιείται από την θρομβίνη και την πλασμίνη. Κατά την ενεργοποίηση, ο παράγοντας V χωρίζεται σε δύο αλυσίδες (μια βαριά μοριακού βάρους και μία ελαφριά μοριακού βάρους 73000), οι οποίες συνδέονται μη ομοιοπολικά μεταξύ τους με ιόντα ασβεστίου. Η βαριά αλυσίδα στο N-τελικό άκρο συνδέεται με την προθρομβίνη, ενώ στην περιοχή A3 της ελαφριάς αλυσίδας υπάρχουν πλευρές σύνδεσης του Va με τα φωσφολιπιδικά μόρια της μεμβράνης των κυττάρων. Επίσης, στην ελαφριά αλυσίδα υπάρχουν πλευρές σύνδεσης με την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C, ενώ πλευρές σύνδεσης με τον παράγοντα Xa υπάρχουν και στις δύο αλυσίδες. Είναι γνωστές πολλές κληρονομικές διαταραχές που σχετίζονται με τον παράγοντα V. Η έλλειψη του σχετίζεται με σπάνιες, αλλά ήπιες μορφές 33

34 αιμορροφιλίας (παρα-αιμορροφιλία ή παρα-αιμορροφιλία Owren), με συχνότητα 1: και αυτοσωμικό και υπολειπόμενο τρόπο κληρονομικότητας. Άλλες μεταλλάξεις του παράγοντα V σχετίζονται με περιπτώσεις θρόμβωσης των αγγείων και αποτελούν τις συνήθεις περιπτώσεις θρομβοφιλίας (τάση σχηματισμού θρόμβων αίματος). Η πιο κοινή περίπτωση (παράγοντας V Leiden) οφείλεται σε αντικατάσταση του κατάλοιπου αργινίνης από τη γλουταμίνη στη θέση 506 (R506Q). Όλες οι περιπτώσεις μεταλλάξεων του παράγοντα V (factor V Leiden, factor V Cambridge, factor V Hong Kong) οδηγούν σε αντίσταση έναντι της δράσης της ενεργοποιημένης πρωτεΐνης C ( APC resistance ), με αποτέλεσμα να διατηρεί τη δράση του και να οδηγεί σε αύξηση του ρυθμού παραγωγής θρομβίνης. Παράγοντας VIII (FVIII) Ο παράγοντας VIII είναι μια γλυκοπρωτεΐνη που συντίθεται στο ήπαρ και στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Στην κυκλοφορία του αίματος βρίσκεται συνδεδεμένος με τον παράγοντα von Willebrand (vwf, Factor VIII-related antigen), σχηματίζοντας ένα σταθερό σύμπλοκο γνωστό ως σύμπλεγμα του παράγοντα VIII ή σύμπλεγμα FVIII/vWF. Η διάρκεια ημιζωής του είναι 12 ώρες, ενώ όταν βρίσκεται σε ελεύθερη μορφή η διάρκεια μειώνεται στις 2,4 ώρες, γεγονός που επιβεβαιώνει το ρόλο του vwf στο να σταθεροποιεί τον παράγοντα VIII στην κυκλοφορία. Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για τον παράγοντα VIII εδράζεται στο χρωμόσωμα X. Το μόριο του παράγοντα VIII διακρίνεται σε δύο κύριες πρωτεϊνικές ομάδες, μια βαριά πρωτεϊνική αλυσίδα MB kda και μια διπλή ελαφριά αλυσίδα MB 79 και 80 kda. Το μόριο περιλαμβάνει έξι περιοχές (A1, A2, A3, B, C1, C2). Οι Α- περιοχές είναι ομόλογες μεταξύ τους, με τις Α1 και Α2 να εκτείνονται στο Ν-τελικό άκρο και την Α3 περιοχή να εκτείνεται στο C-τελικό άκρο. Η B-περιοχή είναι συνδετική μεταξύ της A2 και A3 περιοχής και κατά την ενεργοποίηση αντικαθίσταται από ιόντα ασβεστίου. Οι C-περιοχές είναι ομόλογες μεταξύ τους και βρίσκονται στο C-τελικό άκρο (εικόνα 12). Κατά την ενεργοποίησή του από την θρομβίνη και τον παράγοντα Xa, το μόριο του παράγοντα VIII αποχωρίζεται από τον παράγοντα von Willebrand. Αποτελεί συμπαράγοντα του IXa, με τον οποίο αλληλεπιδρά συμβάλλοντας στην ενεργοποίηση του παράγοντα X. Σε ελεύθερη μορφή, όντας μη προστατευμένος από 34

35 τον παράγοντα von Willebrand, ο παράγοντας VIIIa υπόκειται στην πρωτεολυτική επίδραση της ενεργοποιημένης πρωτεΐνης C και αδρανοποιείται (εικόνα 13). Εικόνα 12. Δομή του παράγοντα VIII. Εικόνα 13. Ενεργοποίηση του παράγοντα VIII από την θρομβίνη. Η έλλειψη του παράγοντα VIII οδηγεί στην αιμορροφιλία Α. Παράγοντας VIII που προέρχεται από μεταγγιζόμενο αίμα ή ανασυνδυασμένος παράγοντας VIII χορηγούνται σε αιμορροφιλικούς ασθενείς για την αποκατάσταση της αιμόστασης. Επειδή το μεταγγιζόμενο αίμα που χορηγείτο σε αιμορροφιλικούς ασθενείς οδήγησε σε μετάδοση ασθενειών όπως HIV και ηπατίτιδα, οι φαρμακευτικές εταιρίες, μετά το 1990, έστρεψαν το ενδιαφέρον τους στην παραγωγή ανασυνδυασμένων προϊόντων. 35

36 Παράγοντας von Willebrand (vwf, Factor VIII-related antigen) Ο παράγοντας von Willebrand είναι μια πολυμερής γλυκοπρωτεΐνη που παράγεται κατά κύριο λόγο στο ενδοθήλιο, στα μεγακαρυοκύτταρα και στο συνδετικό ιστό. Κάθε μονομερές του μορίου φέρει ειδικές περιοχές, οι οποίες έχουν διάφορες λειτουργίες, όπως η σύνδεση με τον παράγοντα VIII, καθώς και η δέσμευση με υποδοχείς των αιμοπεταλίων, την ηπαρίνη και το κολλαγόνο. Ο παράγοντας von Willebrand δεν έχει ενζυμική δράση και, επομένως δεν φέρει καταλυτική δραστηριότητα. Η δράση του περιορίζεται στη δέσμευση με άλλες πρωτεΐνες, κυρίως με τον παράγοντα VIII, και συμβάλλει στην συσσώρευση των αιμοπεταλίων (ονομάζεται και συμπαράγοντας συσσώρευσης των αιμοπεταλίων) στην πληγείσα περιοχή. Διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην διαδικασία πήξης του αίματος, καθώς η έλλειψή του (ασθένεια von Willebrand) οδηγεί σε αιμορραγικές καταστάσεις. Επίσης, η έλλειψη του παράγοντα von Willebrand παρατηρείται και σε πολλές άλλες ασθένειες (thrombotic thrombocytopenic purpura, Heyde's syndrome, hemolyticuremic syndrome). Ιστικός παράγοντας (Thromboplastin, FIII) Ο ιστικός παράγοντας είναι μια θερμοευαίσθητη γλυκοπρωτεΐνη και αποτελείται από μια απλή πολυπεπτιδική αλυσίδα μοριακού βάρους Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για τον ιστικό παράγοντα εδράζεται στο χρωμόσωμα 1. Η πρωτεϊνική δομή του ιστικού παράγοντα αποτελείται από τρεις δομικές περιοχές: α) μια εξωκυττάρια περιοχή, η οποία αποτελείται από 219 αμινοξέα και φέρει θέση σύνδεσης (protein-protein interaction) με τον παράγοντα VIIa (η Glaπεριοχή του παράγοντα VIIa δεσμεύεται, παρουσία ιόντων ασβεστίου, με αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια, γεγονός που ενισχύει την δέσμευσή του με τον ιστικό παράγοντα), β) μια μεμβρανική περιοχή, η οποία αποτελείται από 23 υδρόφοβα αμινοξέα και διαπερνά την μεμβράνη και γ) μια ενδοκυττάρια περιοχή, η οποία αποτελείται από 21 αμινοξέα (εικόνα 14). Ο ιστικός παράγοντας ανευρίσκεται σε ενδοθηλιακά κύτταρα, αιμοπετάλια και λευκοκύτταρα, τα οποία φυσιολογικά δεν έρχονται σε επαφή με το πλάσμα και δεν τον εκθέτουν στην κυκλοφορία του αίματος. Το ενδοθήλιο των αγγείων φυσιολογικά δεν εκφράζει δράση ιστικού παράγοντα, παρά μόνο σε καταστάσεις 36

37 βλάβης ή έκθεσης σε παράγοντες φλεγμονής, όπως ο παράγοντας ογκονέκρωσης (TNF-alpha). Άλλοι κυτταρικοί τύποι που εκφράζουν τον ιστικό παράγοντα σε καταστάσεις φλεγμονής είναι τα μονοκύτταρα. Εικόνα 14. Δομικές περιοχές του ιστικού παράγοντα. Ο ιστικός παράγοντας λειτουργεί ως μεμβρανικός υποδοχέας του παράγοντα VIIa. Συνδέεται με τον παράγοντα VII σχηματίζοντας το σύμπλοκο VIIa/TF, πυροδοτώντας την διαδικασία πήξης μέσω του εξωγενούς μονοπατιού. Επίσης, ο ιστικός παράγοντας ανήκει στην οικογένεια των υποδοχέων που ενεργοποιούνται από τις κυτοκινίνες ( cytokine receptor class II family ). Οι κυτοκινίνες αποτελούν μικρά πρωτεϊνικά μόρια που επηρεάζουν την συμπεριφορά των λευκοκυττάρων. Η δέσμευση του ιστικού παράγοντα με τον παράγοντα VIIa πυροδοτεί διάφορες διαδικασίες στο κύτταρο, όπως η δημιουργία νέων αγγείων (αγγειογένεση) και η αναστολή του κυτταρικού θανάτου (απόπτωση). Ο ιστικός παράγοντας, δρώντας ως συμπαράγοντας, έχει μοναδική συμπεριφορά μεταξύ των άλλων συμπαραγόντων (παράγοντες V και VIII), καθώς δεν απαιτεί άλλες διαδικασίες για την ενεργοποίησή του και για την πυροδότηση της πήξης απαιτείται μόνο η σύνδεσή του με τον παράγοντα VII. Μεγάλου Μοριακού Βάρους Κινινογόνο (Williams-Fitzgerald-Flaujeac factor, Fitzgerald factor, HMWK-kallikrein factor, HMWK) Το μεγάλου μοριακού βάρους κινινογόνο ανήκει στην οικογένεια των πρωτεϊνών που καλούνται κινινογόνα και αποτελούν πρόδρομες ουσίες βιολογικών δραστικών κινινών. Αποτελείται από 626 αμινοξέα και έχει μοριακό βάρος kda (ανάλογα με το ποσοστό γλυκοσυλίωσης). Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για το HMWK εδράζεται στο χρωμόσωμα 3. 37

38 Το HMWK ανήκει στους αρχικούς παράγοντες του ενδογενούς μονοπατιού της πήξης, μαζί με τον παράγοντα XII (Hageman factor) και την προκαλλικρεΐνη. Δεν φέρει ενζυμική δραστηριότητα και η δράση του περιορίζεται στο ρόλο του συμπαράγοντα ενεργοποίησης του παράγοντα XII και της προκαλλικρεΐνης. Η παρουσία του είναι απαραίτητη και στην ενεργοποίηση του παράγοντα XI από τον παράγοντα XIIa. Η πλούσια σε ιστιδίνη περιοχή του (αμινοξέα ) είναι αυτή που συμμετέχει κυρίως στην διαδικασία πήξης. Το HMWK αποτελεί πρόδρομο της βραδυκινίνης, ενός παράγοντα αγγειοδιαστολής που απελευθερώνεται μέσω της διαδικασίας θετικής ανάδρασης που προάγεται από την καλλικρεΐνη. Η ύπαρξη του HMWK παρατηρήθηκε το 1970, όταν διαπιστώθηκε ότι ασθενείς με έλλειψη σε κάποιον παράγοντα εμφάνιζαν αυξημένο χρόνο μερικώς ενεργοποιημένης θρομβοπλαστίνης (aptt). Όπως και στην περίπτωση έλλειψης του παράγοντα Hageman, έτσι και σε έλλειψη του HMWK δεν παρατηρούνται αιμορραγικά επεισόδια. C. Ινωδογόνο (FI) Το ινωδογόνο είναι μια γλυκοπρωτεΐνη MB 340 kda που συντίθεται στο ήπαρ και κυκλοφορεί στο πλάσμα σε συγκεντρώσεις 1,5-4 g/l. Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για το ινωδογόνο εδράζεται στο χρωμόσωμα 4. Το μόριο αποτελείται από τρία ζεύγη πολυπεπτιδικών αλυσίδων (Αα, Ββ, γ) οι οποίες συνδέονται ομοιοπολικά μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς (εικόνα 15). Εικόνα 15. Δομή ινωδογόνου. Η θρομβίνη μετατρέπει το ινωδογόνο σε μονομερή ινώδους, αποσπώντας τα ινωδοπεπτίδια Α (16 αμινοξέα) και Β (14 αμινοξέα) από τα Ν-τελικά άκρα των αλυσίδων Αα και Ββ, αντίστοιχα. Η απομάκρυνση των ινωδοπεπτιδίων επιτρέπει στα 38

39 μονομερή ινώδους να σχηματίσουν ένα πλέγμα από μονομερή, τα οποία συνδέονται μεταξύ τους μη ομοιοπολικά (εικόνα 16). Εικόνα 16. Πολυμερισμός ινώδους. Το ινωδογόνο έχει διττό ρόλο: από τη μια πλευρά παρέχει τα μονομερή τα οποία πολυμερίζονται σχηματίζοντας το δίκτυο της ινικής και από την άλλη δρα ως συμπαράγοντας στη συσσώρευση των αιμοπεταλίων, καθώς σχηματίζει γέφυρες μεταξύ των αιμοπεταλίων όταν δεσμεύεται στους υποδοχείς της επιφάνειάς τους. Η υπέρμετρη παραγωγή ινωδογόνου οδηγεί σε θρομβώσεις, ενώ η ελλιπής παραγωγή οδηγεί σε αιμορραγικά επεισόδια. Δυσλειτουργία ή ασθένεια του ήπατος μπορεί να οδηγήσει σε περιορισμένη παραγωγή ινωδογόνου ή σε δυσλειτουργικά μόρια με περιορισμένη δράση (δυσινωδογοναιμία). Στις κληρονομικές διαταραχές που έχουν να κάνουν τόσο με την ποσότητα όσο και με την ποιότητα παραγωγής του ινωδογόνου περιλαμβάνονται: η ανινωδογοναιμία (afibrinogenaemia), η υποινωδογοναιμία (hypofibrinogenaemia), η δυσινωδογοναιμία (dysfibrinogenaemia) και η υπο-δυσινωδογοναιμία (hypodysfibrinogenaemia). D. Παράγοντας XIII (Fibrin stabilizing factor, FXIII) Ο παράγοντας XIII είναι μια γλυκοπρωτεΐνη μοριακού βάρους και φέρει τη δομή τετραμερούς που αποτελείται από δύο α και δύο β υπομονάδες (2Α και 2Β). Τα γονίδια για κάθε υπομονάδα βρίσκονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα (το γονίδιο της α υπομονάδας βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6 και της β υπομονάδας στο χρωμόσωμα 1). Η α υπομονάδα, με μοριακό βάρος περίπου 83000, φέρει καταλυτική δράση, ενώ η β υπομονάδα, με μοριακό βάρος περίπου 76500, δεν εμφανίζει καταλυτική δραστηριότητα και χρησιμεύει για την μεταφορά της α υπομονάδας 39

40 (εικόνα 17). Η διάρκεια ημιζωής του κυμαίνεται σε 5-9 ημέρες. Είναι παρών στο πλάσμα, στα αιμοπετάλια, τα μονοκύτταρα και τα μακροφάγα. Εικόνα 17. Δομή παράγοντα XIII. Η ομοιοπολική σύνδεση των μονομερών ινώδους, η οποία πραγματοποιείται με την δράση του ενεργοποιημένου παράγοντα XIIIa, απαιτείται για την επαρκή σταθεροποίηση της δομής και της ποιότητας του θρόμβου. Η ενεργοποίηση του παράγοντα XIII σε XIIIa γίνεται από την θρομβίνη, η οποία αποκόπτει ένα πεπτίδιο 4 kda στη θέση Arg-36/Gly-37 από το Ν-τελικό άκρο της α αλυσίδας. Ο ενεργοποιημένος παράγοντας XIIIa, παρουσία ιόντων ασβεστίου, καταλύει την αντίδραση τρανσαμίνωσης, η οποία οδηγεί στο σχηματισμό ενός δεσμού ε-(γγλουταμυλ)-λυσίνης μεταξύ των γ αλυσίδων, οι οποίες διαθέτουν γλουταμίνες (αποδέκτες) και των α αλυσίδων, οι οποίες διαθέτουν λυσίνες (δότες), διαφορετικών μονομερών. Επίσης, και άλλες περιοχές συνδέονται μεταξύ τους, σε πιο αργούς ρυθμούς, σταθεροποιώντας ακόμη περισσότερο τη δομή του θρόμβου (εικόνα 18). Εικόνα 18. Καταλυτική δραστηριότητα του παράγοντα XIIIa Η έλλειψη του παράγοντα XIII, η οποία παρατηρείται πολύ σπάνια (1: ), οφείλεται κυρίως σε μεταλλάξεις της α υπομονάδας και μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρά αιμορραγικά επεισόδια. Επίσης, ο συσχετισμός του με μονοκύτταρα και μακροφάγα μπορεί να οδηγήσει στην ανίχνευση κακοηθειών που σχετίζονται με τα κύτταρα αυτά. 40

41 Ινωδόλυση Ινωδόλυση είναι το σύνολο των ενζυμικών αντιδράσεων οι οποίες οδηγούν στη διάλυση του δικτύου της ινικής έπειτα από τη διαδικασία της φυσιολογικής αιμόστασης ή καταλήγουν στην αποδιοργάνωση του δικτύου όταν αυτό τείνει να οργανωθεί στον αυλό των αγγείων κατά την παθολογική διαδικασία της θρόμβωσης. Η ινωδόλυση είναι μια αργή διαδικασία που αποσκοπεί στην μετατροπή ενός ζυμογόνου (πλασμινογόνο) σε πλασμίνη, με την οποία απομακρύνεται η ινική από τα αγγεία, καθώς φέρει δράση ενδοπεπτιδάσης και διασπά το ινώδες σε προϊόντα αποικοδομήσεως (μεγάλα πεπτίδια). Το ινωδολυτικό σύστημα αποτελείται από διάφορους παράγοντες, όπως ζυμογόνα (πλασμινογόνο), ένζυμα-ενεργοποιητές που μετατρέπουν το πλασμινογόνο σε πλασμίνη (ιστικοί ενεργοποιητές) και ένζυμα που υδρολύουν την ινική (πλασμίνη). Η ινωδόλυση, ως σύστημα, εμπεριέχει ακόμη παράγοντες-ένζυμα που αδρανοποιούν την πλασμίνη και ένζυμα ενεργοποίησης του πλασμινογόνου. Οι ενεργοποιητές του πλασμινογόνου διακρίνονται σε: α) ιστικούς ή εξωγενείς (Τissue Type Plasminogen Activators, tpa) που παράγονται στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων και στους οποίους συγκαταλέγεται η στρεπτοκινάση (SK) και β) σε πλασματικούς ή ενδογενείς στους οποίους συγκαταλέγονται η ουροκινάση (UK) και ο παράγοντας XII με την καλλικρεΐνη, οι οποίοι ανήκουν στο σύστημα επαφής (εικόνα 19). Εικόνα 19. Παράγοντες ινωδόλυσης 41

42 Η ενεργοποίηση του πλασμινογόνου σε δραστική πλασμίνη μπορεί να γίνει με δύο τρόπους: α) με άμεση μετατροπή, που καταλύεται από ενεργοποιητές του οργανισμού (ενεργοποίηση μιας φάσης) και β) έμμεσα, με αλληλουχία δύο διαφόρων φάσεων (ενεργοποίηση δύο φάσεων) (εικόνα 20). Υπάρχουν διάφοροι αναστολείς της ινωδόλυσης όπως η Α 2 -αντιπλασμίνη (Α 2 - APL), η Α 2 Μ, η α1-αντιθρυψίνη, ο C1-ανασταλτής του συμπληρώματος, η AT-III και ο TPA-inhibitor(PA-i), η δράση των οποίων αναστέλλει τους ενεργοποιητές του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης, καθώς επίσης και την πλασμίνη. Πλασμινογόνο Στρεπτοκινάση Ιστικός ενεργοποιητής ή ουροκινάση Σύμπλεγμα στρεπτοκινάσης - πλασμινογόνου Ινώδες Πλασμίνη Προϊόντα διασπάσεως Εικόνα 20. Ενεργοποίηση του πλασμινογόνου σε πλασμίνη 42

43 Αναστολείς της πήξης Παρακάτω παρουσιάζονται μερικοί από τους σημαντικότερους αναστολείς της πήξης: Αντιθρομβίνη (Antithrombin III) Η αντιθρομβίνη είναι μια γλυκοπρωτεΐνη MB 59 ή 65 kda που παράγεται στο ήπαρ, ανήκει στις σερπίνες (αναστολείς των πρωτεασών σερίνης) και αδρανοποιεί πολλά ένζυμα του μηχανισμού πήξης του αίματος. Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για την αντιθρομβίνη εδράζεται στο χρωμόσωμα 1, ενώ η διάρκεια ημιζωής της είναι 55 ώρες. Το μόριο της αντιθρομβίνης συγκροτείται από 425 κατάλοιπα αμινοξέων, τρεις δισουλφιδικούς δεσμούς και τέσσερις αλυσίδες υδατανθράκων. Η δομή των περιοχών της AT-III αρχίζει από το N-τελικό άκρο στην περιοχή σύνδεσης με την ηπαρίνη, ακολουθεί μια περιοχή πλούσια σε υδατάνθρακες (CHO) και τελειώνει με την περιοχή σύνδεσής της με τις πρωτεάσες σερίνης (εικόνα 21). Εικόνα 21. Δομή αντιθρομβίνης Η δράση της αντιθρομβίνης εστιάζεται κυρίως στους παράγοντες Χ, IX, II (θρομβίνη), VII, XI και XII. Ο ρυθμός της αναστολής έναντι των παραγόντων αυτών ενισχύεται σημαντικά από την παρουσία της ηπαρίνης. Η αντιθρομβίνη ενώνεται στοιχειομετρικά με τη θρομβίνη 1:1, εξουδετερώνοντας τη δράση της με το σχηματισμό ισομοριακού αλλά αδρανούς συμπλέγματος θρομβίνης-αντιθρομβίνης (Thrombin-Antithrombin complex, T-AT). Μόλις σχηματιστεί το σύμπλεγμα αποσύρεται από την κυκλοφορία μέσα σε λίγα λεπτά, ενώ η ενεργός θρομβίνη διαχωρίζεται από αυτό με πολύ αργούς ρυθμούς, απελευθερώνοντας ταυτόχρονα την θρομβίνη, η οποία δεν φέρει πλέον ανασταλτική 43

44 δράση. Ο ρυθμός αναστολής της θρομβίνης ενισχύεται κατά φορές με την παρουσία της ηπαρίνης. Η έλλειψη αντιθρομβίνης είναι μια σπάνια κληρονομική διαταραχή η οποία συνοδεύεται από καταστάσεις θρομβώσεων και πνευμονικών εμβολισμών. Οι ασθενείς αντιμετωπίζονται με αντιπηκτικά και, σπανιότερα, με χορήγηση αντιθρομβίνης. Αναστολέας του εξωγενούς δρόμου της πήξης (Tissue factor pathway inhibitor, TFPI) Ο TFPI είναι μια απλή πολυπεπτιδική αλυσίδα μοριακού βάρους , ανάλογα με το βαθμό πρωτεόλυσης της C-τελικής περιοχής και παράγεται κυρίως στο ενδοθήλιο των αγγείων. Ο ανασταλτής αυτός δεν είναι σερπίνη αλλά αποτελεί μέλος της οικογένειας των ανασταλτών πρωτεασών σερίνης τύπου Kunitz. Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για την δράση του TFPI εδράζεται στο χρωμόσωμα 2. Ο TFPI δεσμεύει τον παράγοντα Xa, εξουδετερώνοντας παράλληλα την ενζυμική του δραστικότητα, καταλήγοντας στο σχηματισμό του συμπλέγματος TFPI/Xa με μια ασβεστιο-εξαρτώμενη αντίδραση. Σε δεύτερη φάση το σύμπλεγμα TFPI/Xa συνδέεται στο σύμπλεγμα VIIa/TF με έναν μηχανισμό που απαιτεί το μόριο του παράγοντα Xa να έχει μια ασβέστιο-εξαρτώμενη δομή. Πρωτεΐνη C (Protein C, PrC) Η πρωτεΐνη C μαζί με την πρωτεΐνη S αποτελούν μέλη ενός από τους πιο αποτελεσματικούς μηχανισμούς αναστολής του μηχανισμού της πήξης, του αντιπηκτικού δρόμου του συστήματος της πρωτεΐνης C. Η πρωτεΐνη C έχει MB 62 kda και ημιδιάρκεια ζωής σχεδόν όμοια με αυτή του παράγοντα VII (10 ώρες). Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για την δράση της πρωτεΐνης C εδράζεται στο χρωμόσωμα 2. Η δομή του μορίου συνίσταται από μια Gla-περιοχή στο Ν-τελικό άκρο, ακολουθούν δύο EGF-περιοχές και την καταλυτική περιοχή στο C-τελικό άκρο (εικόνα 22). Η πρωτεΐνη C είναι μια βιτάμινο-κ εξαρτώμενη πρωτεάση σερίνης, η οποία ενεργοποιείται από το σύμπλεγμα θρομβίνης-θρομβοντουλίνης στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων του τοιχώματος των αγγείων. Η ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C 44

45 (activated protein C, APC) που προκύπτει, εμποδίζει την εξέλιξη της πήξης αδρανοποιώντας τους παράγοντες Va και VIIIa. Η δράση αυτή μεγιστοποιείται παρουσία της πρωτεΐνης S (συμπαράγοντας), ιόντων ασβεστίου και φωσφολιπιδίων. Συνεπώς, το σύστημα των δύο ανασταλτικών ουσιών (πρωτεΐνες C και S) δρα παρεμποδίζοντας το σχηματισμό των ενζυμικών συμπλεγμάτων της ενδογενούς δεκάσης και της προθρομβινάσης. Εικόνα 22. Αναστολείς της πήξης Η έλλειψη της πρωτεΐνης C είναι μια σπάνια κληρονομική διαταραχή που σχετίζεται με την εμφάνιση βαριάς ή όχι θρομβοφιλικής διάθεσης. Η ομόζυγη έλλειψή της είναι θανατηφόρα από τις πρώτες μέρες ή εβδομάδες της κύησης. Η αντίσταση στην ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C, η οποία μπορεί να είναι κληρονομήσιμη ή επίκτητη, οφείλεται στην ανικανότητα της πρωτεΐνης C να αδρανοποιεί τους παράγοντες V ή/και VIII. Πρωτεΐνη S (Protein S, PrS) Η πρωτεΐνη S είναι επίσης βιτάμινο-κ εξαρτώμενη και παράγεται στο ήπαρ και στα ενδοθηλιακά κύτταρα, ανευρίσκεται όμως και στα α-σωματίδια των αιμοπεταλίων. Η πρωτεΐνη S έχει MB 52 kda και συγκέντρωση στο πλάσμα 7 μg/ml. Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο για την δράση της πρωτεΐνης S εδράζεται στο χρωμόσωμα 3. Η δομή του μορίου συνίσταται από μια Gla-περιοχή στο Ν-τελικό άκρο, τέσσερις EGF-περιοχές και μια περιοχή αποτελούμενη από ένα μακρύ κατάλοιπο 392 αμινοξέων στο C-τελικό άκρο (εικόνα 22). Η πρωτεΐνη S βρίσκεται στην κυκλοφορία 45

46 σε δύο μορφές: μια ελεύθερη μορφή και μία σε σύμπλεγμα με την πρωτεΐνη του συμπληρώματος C4b. Η πρωτεΐνη S έχει κυρίως αντιπηκτική δράση, δρώντας ως συμπαράγοντας της πρωτεΐνης C στην αδρανοποίηση των παραγόντων πήξης Va και VIIIa. Η πρωτεΐνη S σε σύμπλεγμα με την πρωτεΐνη C αναστέλλει τον παράγοντα Va κατά φορές περισσότερο. Μόνο η ελεύθερη μορφή φέρει τη δράση του συμπαράγοντα. Επιπρόσθετα, στη διάρκεια της πήξης η πρωτεΐνη S τροποποιεί (περιορίζει) τη μεγιστοποίηση της αναστολής της θρομβίνης από το σύμπλεγμα ATIII-ηπαρίνης, σχηματίζοντας τριμοριακό σύμπλεγμα με τη θρομβίνη και την ATIII, αντιδρώντας άμεσα με την ηπαρίνη. Την ίδια στιγμή, η πρωτεΐνη C προφυλάσσει την αδρανοποίηση της θρομβίνης από την ATIII. Αυτή η εποπτική δραστηριότητα της πρωτεΐνης S είναι τόσο χαρακτηριστική στη διατήρηση των ισορροπιών στις αντιδράσεις της πήξης, που φανερώνει ότι, εάν η παρουσία των ανασταλτών είναι τόσο σημαντική ώστε να παρεμποδίζει τη φυσιολογική αιμόσταση, η πρωτεΐνη αυτή παρεμβαίνει και, έτσι, η θρομβίνη επιφέρει υδρόλυση του ινωδογόνου. Η έλλειψη της πρωτεΐνης S είναι μια σπάνια διαταραχή η οποία δύναται να οδηγήσει σε αυξημένο κίνδυνο θρομβώσεων. 46

47 Μηχανισμός δράσης του παράγοντα VIIa Ο ανασυνδυασμένος παράγοντας VIIa αρχικά χρησιμοποιήθηκε για την θεραπεία αιμορροφιλικών ασθενών με αιμορραγικά επεισόδια που φέρουν αναστολείς έναντι των παραγόντων VIII και IX. Σήμερα, υπάρχει μια γενικότερη παραδοχή για την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια της δράσης της περίσσειας VIIa σε ασθενείς με αιμορροφιλία. Αποτελέσματα από αδημοσίευτες έρευνες και κλινικές εφαρμογές υποδεικνύουν την αποτελεσματικότητα της δράσης του rviia σε πληθώρα αιμορραγικών καταστάσεων, καθώς και σε μη-αιμορροφιλικούς ασθενείς. Το γεγονός αυτό οδήγησε στη χρήση του όρου παγκόσμιος και γενικός αιμοστατικός παράγοντας. Πιθανότατα ο όρος αυτός να είναι αδόκιμος, καθώς ο παράγοντας VIIa δεν είναι πάντοτε αποτελεσματικός σε όλες τις αιμορραγικές καταστάσεις, αν και σε ορισμένες περιπτώσεις η δράση του ήταν σωτήρια σε σοβαρές αιμορραγικές καταστάσεις που θα οδηγούσαν σε απώλεια του ατόμου 27. Πολλαπλά ερωτήματα που αφορούν την αναγκαιότητα χρήσης του παράγοντα VIIa απαιτούν περαιτέρω έρευνα, περικλείοντας τόσο τον μηχανισμό δράσης όσο και την αποτελεσματικότητα της δόσης και την ασφάλεια χρήσης. Εκατοντάδες έρευνες έχουν γίνει, κατά καιρούς, από διάφορες ερευνητικές ομάδες και εργαστήρια στην προσπάθεια κατανόησης του μηχανισμού δράσης του παράγοντα VIIa. Παρακάτω, αναφέρονται μερικά από τα σημαντικότερα αποτελέσματα που έχουν κατά καιρούς δημοσιευτεί. Σύμφωνα με την ερευνητική ομάδα Mann 4,20,21, το ενεργό κέντρο του παράγοντα VIIa εκφράζεται μόνο όταν δεσμευτεί με τον ιστικό παράγοντα, με τον αδέσμευτο παράγοντα VIIa να μην φέρει πρωτεολυτική δράση έναντι των παραγόντων IX και X. Με βάση τα πειραματικά αποτελέσματα τόσο σε φυσιολογικό αίμα όσο και σε συνθετικό πλάσμα, διαπιστώνεται ότι ο παράγοντας VIIa μόνος του, δίχως την παρουσία ιστικού παράγοντα και παρουσία είτε φωσφολιπιδίων είτε αιμοπεταλίων, δύναται να οδηγήσει σε παραγωγή θρομβίνης. Εντούτοις, το σύμπλοκο TF/VIIa είναι 10 4 φορές αποτελεσματικότερο σε σχέση με τη δράση του ελεύθερου παράγοντα VIIa 7. Σύμφωνα και με τις παρατηρήσεις της ομάδας Komiyama 18, ο ιστικός παράγοντας αυξάνει την αποτελεσματικότητα του παράγοντα VIIa, ενισχύοντας την πρωτεολυτική του δράση έναντι των υποστρωμάτων FIX και FX 10 4 φορές περισσότερο. Επίσης, το σύμπλοκο TF/VIIa είναι 5-6 * 10 4 φορές δραστικότερο έναντι του VIIa στην μείωση του χρόνου πήξης και, κατά συνέπεια, στην ενίσχυση 47

48 της φάσης έναρξης. Επίσης, η ερευνητική ομάδα του καθηγητή Butenas 6,8, εκτός από την TF-εξαρτώμενη δράση του rviia, υποστηρίζει ότι η παρουσία των φωσφολιπιδίων και των αιμοπεταλίων ενισχύει σημαντικά τον αιμοστατικό ρόλο του παράγοντα VIIa. Με βάση τα εργαστηριακά αποτελέσματα ο παράγοντας VIIa αποτελεί ικανό αιμοστατικό παράγοντα και δύναται να οδηγήσει στην παραγωγή IXa και Xa στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων, μόνο υπό την παρουσία του ιστικού παράγοντα. Σύμφωνα λοιπόν με την ομάδα Mann, ο ιστικός παράγοντας είναι απαραίτητος για την επίσχεση της αιμορραγίας σε καταστάσεις αιμορροφιλίας. Η παρουσία των αιμοπεταλίων στο σημείο τραυματισμού, απλώς ενισχύει τη δράση του rviia, με τον συνδυασμό ιστικού παράγοντα-αιμοπεταλίων (TF-PL) να επιφέρει τη βέλτιστη δράση. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ομάδας Mann 5, ο σχηματισμός του δραστικού συμπλέγματος της εξωγενούς δεκάσης (TF/VIIa) περιορίζεται από τον ανταγωνισμό μεταξύ του ζυμογόνου VIIa και του δραστικού παράγοντα VIIa για τη θέση δέσμευσης στον ιστικό παράγοντα. Επομένως, σε συνθήκες κορεσμού φωσφολιπιδίων, η συγκέντρωση του παράγοντα VIIa πρέπει να είναι συγκρίσιμη με αυτή της ζυμογόνου μορφής για τον επιτυχή ανταγωνισμό δέσμευσης με τον ιστικό παράγοντα, με απώτερο σκοπό την παραγωγή ικανοποιητικής ποσότητας θρομβίνης σε καταστάσεις αιμορροφιλίας. Σε δείγματα με έλλειψη παράγοντα VII, η χορηγούμενη δόση rviia είναι 10 φορές μικρότερη (λόγω απουσίας ανταγωνισμού με τον ζυμογόνο VII) από την απαιτούμενη δόση. Η ερευνητική ομάδα του Butenas 7 υποστηρίζει την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα της υψηλής δόσης VIIa λόγω της ικανότητας επιμερισμού της δράσης του στο σημείο τραυματισμού. Η δράση της περίσσειας VIIa περιορίζεται στα σημεία έκλυσης του ιστικού παράγοντα, όπου πραγματοποιείται η έναρξη των αντιδράσεων πήξης και στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων, ως σημείο συγκέντρωσης των παραγόντων πήξης και μέγιστης παραγωγής θρομβίνης. Με βάση τα αποτελέσματα και άλλων ερευνητών, όπως η ομάδα του καθηγητή Γ. Γεροτζιάφα 10,11, μελετήθηκε η αποτελεσματικότητα της δράσης της περίσσειας VIIa σε καταστάσεις θρομβοπενίας. Διαπιστώθηκε ότι η χορήγηση rviia (90μg/kg) οδήγησε σε επίσχεση της αιμορραγίας, σε μείωση των χρόνων προθρομβίνης (PT) και μερικώς ενεργοποιημένης θρομβοπλαστίνης (aptt) και σε βελτίωση της συνοχής του παραγόμενου θρόμβου. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι χρόνοι 48

49 PT και aptt αντιπροσωπεύουν τον χρόνο υστέρησης στην φάση έναρξης και όχι την συνολικά παραγόμενη θρομβίνη. Η μείωση των χρόνων πήξης καταδεικνύει ότι είτε ο rviia μόνος του είτε η αρχικώς παραγόμενη θρομβίνη στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων, οδηγούν σε πλήρη ενεργοποίηση του περιορισμένου αριθμού των διαθέσιμων αιμοπεταλίων και σε ταχεία παραγωγή θρομβίνης. Προφανώς, η παρουσία rviia οδηγεί σε αποτελεσματική αιμόσταση, ενισχύοντας την αρχική παραγωγή θρομβίνης και την ενεργοποίηση των διαθέσιμων αιμοπεταλίων και καταλήγει σε ταχύτερο σχηματισμό θρόμβου, δίχως όμως να οδηγεί σε αύξηση της παραγόμενης θρομβίνης. Περαιτέρω έρευνες της ίδιας ομάδας (αδημοσίευτα δεδομένα) σε δείγματα φτωχά σε αιμοπετάλια (PPP), φυσιολογικών ατόμων, ατόμων με αιμορροφιλία καθώς και με θρομβοπενία, κατέδειξαν ότι η παρουσία της περίσσειας VIIa μειώνει τον χρόνο αρχικής ενεργοποίησης της θρομβίνης. Αξίζει να σημειωθεί ότι η περίσσεια VIIa δεν έχει καμία επίδραση σε δείγμα με έλλειψη παράγοντα VIII, ακόμη και με την παρουσία ιστικού παράγοντα. Η δράση του rviia είναι TF-εξαρτώμενη και ενισχύει την ταχύτητα σχηματισμού του θρόμβου ινικής, δίχως να τροποποιεί τη σταθερότητά του. Τα αποτελέσματα της έρευνας είναι συναφή με τα αποτελέσματα των ομάδων van t Veer και Butenas, με βάση τα οποία υποστηρίζεται ότι ο rfviia ενισχύει την παραγωγή θρομβίνης με TF-εξαρτώμενη δράση. Το γεγονός ότι η δράση της περίσσειας VIIa είναι TF-εξαρτώμενη και ότι δεν παρατηρείται καμία αύξηση στα επίπεδα της παραγόμενης θρομβίνης ενισχύει την ασφάλεια της θεραπείας με rviia ασθενών με θρομβοπενία. Σύμφωνα με την ερευνητική ομάδα Roberts 9,14, υποστηρίζεται ότι η περίσσεια VIIa, δίχως την παρουσία του ιστικού παράγοντα και σε μεγάλες συγκεντρώσεις δύναται να ενεργοποιήσει τον παράγοντα IX στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων. Ο υδατοδιαλυτός παράγοντας IX ενεργοποιείται αρχικά από το σύμπλοκο TF/VIIa, σε σημείο που απέχει από την επιφάνεια των αιμοπεταλίων και έπειτα μεταφέρεται, ως ενεργοποιημένος παράγοντας IXa, στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων. Το ενεργοποιημένο αιμοπετάλιο συμμετέχει παρέχοντας εξειδικευμένες θέσεις δέσμευσης των παραγόντων πήξης. Στην περίπτωση της περίσσειας VIIa, ο rviia μπορεί να δεσμευτεί και σε θέσεις πλην του ιστικού παράγοντα. Ο rviia πιθανότατα να δεσμεύεται στον FIX στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων, καθώς σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις δεσμεύεται μαζί του σθεναρά. Από τα πειραματικά αποτελέσματα προκύπτει ότι ο παράγοντας IXa δεσμεύεται πιο 49

50 σθεναρά στα αιμοπετάλια σε σχέση με τον X. Με την προσθήκη περίσσειας VIIa ο παράγοντας IX δεσμεύεται με την ίδια σταθερά της ο παράγοντας IXa, γεγονός που αιτιολογεί την ενεργοποίησή του από τον παράγοντα VIIa. Επίσης, υπάρχουν ενδείξεις ότι ο rviia δεσμευμένος σε ενεργοποιημένα αιμοπετάλια μπορεί να ενεργοποιήσει άμεσα τον παράγοντα X. Σύμφωνα με το κυτταρικό μοντέλο πήξης που υποστηρίζει η ομάδα Roberts, το μονοπάτι δράσης του ιστικού παράγοντα θα πρέπει να παραμένει ανέπαφο ώστε να επιτευχθεί η αρχική ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων με τη δράση των μικρών ποσοτήτων θρομβίνης, η οποία παράγεται στα κύτταρα που εκλύουν ιστικό παράγοντα. Επιπλέον, το μοντέλο προβλέπει την ύπαρξη άμεσης σχέσης μεταξύ της παραγόμενης θρομβίνης και της συγκέντρωσης του παράγοντα VIIa 27. Επίσης, οι Lisman and De Groot 19 υποστηρίζουν την αναγκαιότητα της ύπαρξης του άθικτου μονοπατιού του ιστικού παράγοντα για την αποτελεσματική δράση των φαρμακευτικών δόσεων του rviia, ο οποίος δεσμεύεται στα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια και ενεργοποιεί άμεσα τον παράγοντα Xa, ενισχύοντας την θεωρεία της ομάδας Roberts. Υποστηρίζουν ακόμη ότι η ενίσχυση της παραγωγής θρομβίνης από τον rviia δεν συμβάλλει μόνο στην αποτελεσματικότητα σχηματισμού του θρόμβου, αλλά ενισχύει και την σταθερότητά του έναντι της πλασμίνης, σε πλάσμα με έλλειψη παράγοντα VIII. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σύμφωνα με τα αποτελέσματα έρευνας της ομάδας Roberts 13, οι παράγοντες IX και X που ενεργοποιούνται από το σύμπλοκο TF/VIIa διαδραματίζουν ξεχωριστό ρόλο στην διαδικασία πήξης. Ο ενεργοποιημένος παράγοντας IXa δεν απαιτείται για την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων αλλά για την βέλτιστη παραγωγή θρομβίνης, όπου μέσω του σχηματισμού του συμπλόκου με τον παράγοντα VIIIa καταλήγει σε περαιτέρω παραγωγή Xa. Αντιθέτως, ο κύριος ρόλος του παράγοντα Xa έγκειται στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, συμβάλλοντας στην αρχική παραγωγή της θρομβίνης, η οποία ενεργοποιεί τα αιμοπετάλια. Επίσης, η περίσσεια VIIa δύναται να βελτιώσει τη δομή του θρόμβου και να μειώσει το ρυθμό σχηματισμού του σε καταστάσεις αιμορροφιλίας 29. Οι καταστάσεις αιμορροφιλίας οδηγούν στο σχηματισμό τροποποιημένων δομών θρόμβου, με τις ίνες να είναι πιο παχιές και πιο επιρρεπείς στη δράση της πλασμίνης. Διαπιστώνεται ότι η δομή του αιμορροφιλικού θρόμβου είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του παράγοντα IX, με τις ίνες να γίνονται πιο παχιές και να είναι λιγότερο ανθεκτικές στη λύση όσο μειώνεται η συγκέντρωση του παράγοντα IX. Η δομή αυτή του αιμορροφιλικού 50

51 θρόμβου δύναται να αποκατασταθεί μερικώς παρουσία περίσσειας VIIa, οδηγώντας σε βελτίωση της δομής, με ίνες πιο λεπτές που μοιάζουν με φυσιολογικές, και σε σταθερότητα του θρόμβου. Επίσης, πρέπει να σημειωθεί ότι η περίσσεια VIIa δεν παρακάμπτει πλήρως το ρόλο του παράγοντα IX, αλλά αποκαθιστά το σχηματισμό θρόμβου τόσο ώστε να παρέχει αποτελεσματική αιμόσταση. Συγκεντρωτική παράθεση των αποτελεσμάτων των ερευνητικών ομάδων: 1. Η ερευνητική ομάδα των Butenas και Mann υποστηρίζει ότι η αιμοστατική επίδραση της περίσσειας VIIa σε άτομα με αιμορροφιλία ή σε συνθετικά πλάσματα είναι άμεσα εξαρτώμενη από τον ιστικό παράγοντα (TF) 7. Ο προτεινόμενος αυτός μηχανισμός διαφέρει από την άποψη της ερευνητικής ομάδας Roberts που υποστηρίζει ότι η περίσσεια VIIa, απουσία του ιστικού παράγοντα, δύναται να οδηγήσει στην παραγωγή του παράγοντα Xa στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων. Οι διαφορές μεταξύ των δύο εργαστηρίων οφείλονται, σύμφωνα με την ομάδα του Butenas, σε διαφορές στον σχεδιασμό των πειραμάτων και την προετοιμασία των πρωτεϊνικών παρασκευασμάτων. Αντιθέτως, η ομάδα Roberts 25 υποστηρίζει ότι οι διαφορές οφείλονται στην χρήση κυττάρων που εκλύουν ιστικό παράγοντα ως ερέθισμα για την έναρξη της διαδικασίας πήξης από την ομάδα Roberts, σε αντίθεση με τη χρήση ιστικού παράγοντα που περικλείεται σε μεμβράνες φωσφολιπιδίων από την ομάδα Mann. 2. Η ερευνητική ομάδα Mann αναφέρει ότι η ζυμογόνος μορφή του παράγοντα VII, σε μοντέλο συνθετικού πλάσματος, ανταγωνίζεται με τον παράγοντα VIIa στη δέσμευση με τον ιστικό παράγοντα πάνω σε μεμβράνες φωσφολιπιδίων. Επιπλέον, οι van t Veer et al 28 υποστηρίζουν ότι η δράση της περίσσειας VIIa σε καταστάσεις αιμορροφιλίας έγκειται στην αναίρεση της αναστολής του ζυμογόνου VII στην δράση του συμπλόκου TF/VIIa. Εν αντιθέσει, η ομάδα Roberts υποστηρίζει ότι δεν παρατηρείται επίδραση του ζυμογόνου παράγοντα VII στην παραγωγή θρομβίνης στο κυτταρικό μοντέλο πήξης. Στο κυτταρικό μοντέλο πήξης, η αιτία της αιμορροφιλίας εστιάζεται στην αδυναμία παραγωγής του παράγοντα Xa στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων, οδηγώντας παράλληλα σε αδυναμία παραγωγής θρομβίνης 16. Η περίσσεια VIIa δρα κυρίως ενισχύοντας τον ρυθμό παραγωγής θρομβίνης στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων και όχι αντισταθμίζοντας την αναστολή του ζυμογόνου VII στη δράση του συμπλόκου TF/VIIa. 51

52 3. Η ερευνητική ομάδα του καθηγητή Butenas υποστηρίζει ότι η δράση της περίσσειας VIIa, σε καταστάσεις αιμορροφιλίας, ενισχύει την παραγωγή Xa μέσω του συμπλόκου TF/VIIa, ενισχύοντας την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων. Σύμφωνα με την ομάδα Roberts, αν και το σύμπλοκο TF/VIIa είναι απαραίτητο για την έναρξη της πήξης, με το που ενεργοποιηθούν τα αιμοπετάλια, η περίσσεια VIIa δεσμεύεται στην επιφάνειά τους και αποκαθιστά την απουσία του συμπλόκου των παραγόντων IXa/VIIIa, οδηγώντας στην παραγωγή Xa και στην ενίσχυση της παραγωγής θρομβίνης. Υποστηρίζει ότι η ενεργοποίηση του παράγοντα X από το σύμπλοκο TF/VIIa δεν αντισταθμίζει την αδυναμία παραγωγής Xa από το σύμπλοκο IXa/VIIIa 16. Το γεγονός αυτό οφείλεται κυρίως στην δράση των αναστολέων που εμποδίζουν την μετακίνηση του παράγοντα Xa από την επιφάνεια των κυττάρων που εκφράζουν τον ιστικό παράγοντα προς την επιφάνεια των αιμοπεταλίων. 4. Η ομάδα Roberts υποστηρίζει ότι το μονοπάτι δράσης του ιστικού παράγοντα παραμένει ανέπαφο στους αιμορροφιλικούς ασθενείς και θεωρείται υπεύθυνο για την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, αιτιολογώντας την τάση, αρχικά, των αιμορροφιλικών για προσωρινή επίσχεση της αιμορραγίας, με το σχηματισμό του λευκού θρόμβου, αλλά και την μετέπειτα έντονη αιμορραγική διάθεση. 5. Οι διαφορές μεταξύ των δύο ερευνητικών ομάδων εκτείνονται και στην αποτελεσματικότητα της δόσης της περίσσειας VIIa. Η δοσολογία της TFεξαρτώμενης δράσης του παράγοντα VIIa, σύμφωνα με την ομάδα του Butenas, είναι μικρότερη σύμφωνα με αυτή που χρησιμοποιείται ευρέως θεραπευτικά. Επιπλέον, και η ομάδα Mann υποστηρίζει ότι δεν υπάρχει άμεση εξάρτηση μεταξύ συγκέντρωσης VIIa και παραγόμενης θρομβίνης. Η αποτελεσματική ποσότητα του VIIa είναι αυτή η οποία είναι ικανή να υπερκεράσει τον ανταγωνισμό με την ζυμογόνο μορφή VII. Αντιθέτως, σύμφωνα με την ομάδα Roberts, η αυξανόμενη δοσολογία του παράγοντα VIIa ενισχύει την αιμοστατική του δράση, σε αντίθεση με την θεωρία της ομάδας του Butenas, όπου η αυξανόμενη δοσολογία θεωρείται ανώφελη και οδηγεί σε σπατάλη χρημάτων. 6. Τέλος, τα μοντέλα, παρά τις διαφωνίες τους, συγκλίνουν στις εξής απόψεις: α) η παρουσία του ιστικού παράγοντα είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της πήξης, καθώς οδηγεί στο σχηματισμό της αρχικής ποσότητας θρομβίνης, η οποία συμβάλλει στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και β) στην αναγκαιότητα της παρουσίας των κυτταρικών επιφανειών για την συγκέντρωση των παραγόντων πήξης. 52

53 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ A. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ o o o o o o o o o Βιοχημικά υλικά Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν τα εξής υλικά: Τεχνητά πλάσματα με έλλειψη σε παράγοντες πήξης: Deficient II (dii), Deficient VII (dvii), Deficient IX (dix), Deficient X (dx), της εταιρείας Diagnostica Stago, Γαλλία. Αντισώματα έναντι της θρομβίνης (Rabbit Anti-human factor II Serum, Assera II) και του παράγοντα Χ (Rabbit Anti-human factor X Serum, Assera X), της εταιρείας Diagnostica Stago, Γαλλία. Αντι-αντίσωμα (Anti-rabbit alkaline phosphate) της εταιρείας Gibso, BRL. Θρομβοπλαστίνη (TP, Recombinant Human Tissue Factor Thromboplastin, DADE INNOIN ), της εταιρείας Dade Behring. Ανασυνδυασμένος παράγοντας FVIIa (NovoSeven ), της εταιρείας Novo Nordisk, Δανία. Υποστρώματα αλκαλικής φωσφατάσης, BCIP/NBT (bromo-4-chloro-3- indolyl phosphate Nitro Blue), της εταιρείας Sigma. Nonfat dry milk Carnation, από την εταιρεία Nestle France. Χρωμογόνο υπόστρωμα προσδιορισμού του παράγοντα Xa (MAPA-Gly-ArgpNA), της εταιρείας Diagnostica Stago, Γαλλία. Αναστολείς της πήξης: ενεργός πρωτεΐνη C και S (APC και APS, αντίστοιχα), της εταιρείας Diagnostica Stago, Γαλλία. Βιολογικά υλικά i. Πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια (Platelet reach Plasma, PRP) Το πλούσιο σε αιμοπετάλια πλάσμα παραλαμβάνεται έπειτα από φυγοκέντρηση ολικού αίματος φυσιολογικών ατόμων για 10min στα 150g. Κατά τη φυγοκέντρηση απομακρύνονται τα υπόλοιπα κύτταρα του αίματος, εκτός από τα αιμοπετάλια, τα οποία παραλαμβάνονται από το υπερκείμενο και χρησιμοποιούνται αυθημερόν. 53

54 ii. Πλάσμα φτωχό σε αιμοπετάλια (Platelet poor Plasma, PPP) Το φτωχό σε αιμοπετάλια πλάσμα παραλαμβάνεται έπειτα από φυγοκέντρηση ολικού αίματος φυσιολογικών ατόμων για 20min στα 2000g. Κατά τη φυγοκέντρηση απομακρύνονται όλα τα υπόλοιπα κύτταρα του αίματος μαζί με τα περισσότερα αιμοπετάλια, παραλαμβάνοντας, έτσι το υπερκείμενο στο οποίο περιέχεται ένας μικρός αριθμός αιμοπεταλίων (PPP). iii. Απομονωμένα αιμοπετάλια Τα απομονωμένα αιμοπετάλια παρελήφθησαν από το εργαστήριο Βιοχημείας του Πανεπιστημίου Λάρισας, με τη συμβολή της υποψήφιας διδάκτορα Ζ. Καρούλια. o o o o ΟΡΓΑΝΑ ΜΕΤΡΗΣΗΣ Συσκευή ηλεκτροφόρησης (10x10) του Ινστιτούτου Max Planc, Βερολίνο. Συσκευή Western Blotting TE-70, Semi-Dry Blotter apparatus, Hoeffer Scientific Instruments, San Francisco. Φυγόκεντρος τύπου Sigma-201M. Αναδευτήρας τύπου Edmund Buhler Swip KL-2 και συσκευή τύπου Vortex. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου (PAGE) Ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών ενός δείγματος πραγματοποιείται καθώς οι πρωτεΐνες, ως φορτισμένα μόρια, κινούνται διαμέσου των πόρων ενός πηκτώματος υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η ταχύτητα των πρωτεϊνών (v) εξαρτάται από την τάση του ηλεκτρικού πεδίου (E) και το φορτίο της πρωτεΐνης (q) σύμφωνα με την εξίσωση: v = E * q / f όπου ο παράγοντας της εξίσωσης f (σταθερά τριβής) εκφράζει την εξάρτηση από τη μάζα και το σχήμα της πρωτεΐνης, καθώς και το ιξώδες του πηκτώματος μέσα στο οποίο κινείται η πρωτεΐνη. 54

55 Ο σχηματισμός των πηκτών πολυακρυλαμιδίου βασίζεται στον πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου (CH 2 =CH-CO-NH 2 ) και του N,N μεθυλενοδισακρυλαμιδίου ή bisακρυλαμιδίου (CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH-CO-CH-CH 2 ) που συνδέει τις αλυσίδες του πρώτου. Με τον τρόπο αυτό, δημιουργείται ένα πολυμερές πλέγμα που διαθέτει πόρους, το μέγεθος των οποίων εξαρτάται από το βαθμό πολυμερισμού και τη συγκέντρωση των μονομερών στο διάλυμα. Η δημιουργία του πλέγματος γίνεται μέσω του μηχανισμού δημιουργίας ελεύθερων ριζών με την προσθήκη του υπερθειικού αμμωνίου (APS), για την έναρξη του μηχανισμού και του φωτοχημικού καταλύτη τετραμεθυλοαιθυλενοδιαμίνη (TEMED) για την διάδοσή του. Το σχήμα των πηκτωμάτων πολυακρυλαμιδίου μπορεί να είναι κυλινδρικό ή επίπεδο, ανάλογα με τον τύπο της συσκευής όπου πραγματοποιείται ο πολυμερισμός. Η ηλεκτροφόρηση μπορεί να είναι συνεχής ή ασυνεχής. Στη συνεχή ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα για την πηκτή και τα δοχεία των ηλεκτροδίων. Στην ασυνεχή ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικά πηκτώματα, η πηκτή επιστοίβαξης, η οποία είναι υπεύθυνη για την συμπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγματος σε μια πολύ λεπτή στοιβάδα, και την πηκτή διαχωρισμού, η οποία είναι υπεύθυνη για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών σε λεπτές ζώνες κατά την κίνησή τους μέσα στην πηκτή. Τα ρυθμιστικά διαλύματα των δύο πηκτωμάτων είναι διαφορετικά ως προς το ph και τη σύστασή τους και επίσης, το διάλυμα των ηλεκτροδίων διαφέρει σε σύσταση από τα προηγούμενα. Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου μπορεί να γίνει απουσία ή παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων, όπως το απορρυπαντικό SDS (θειικό δωδεκανικό νάτριο) και η ουρία. Σε συνθήκες απουσίας των αποδιατακτικών παραγόντων (μη μετουσιωτικές συνθήκες) οι πρωτεΐνες διατηρούν τις ανώτερες διαμορφώσεις τους, ενώ παρουσία των αποδιατακτικών παραγόντων (μετουσιωτικές συνθήκες) οι πρωτεΐνες αποδιατάσσονται και λαμβάνουν τυχαίες διαμορφώσεις. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Σύμφωνα με την τεχνική αυτή επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος. Στην ηλεκτροφόρηση αυτή χρησιμοποιείται ως αποδιατακτικό μέσο το θειικό δωδεκανικό νάτριο (SDS). Το SDS εκτός του ότι αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες, δεσμεύεται πάνω σε αυτές μέσω υδρόφοβων δεσμών, 55

56 ανεξάρτητα της ιονικής ισχύος, σε εντελώς καθορισμένα ποσά κατά βάρος (1,4gr SDS/gr πρωτεΐνης). Τα σύμπλοκα που σχηματίζονται από την αλληλεπίδραση με το SDS είναι επιμήκη, με σαφή και καθορισμένη δομή και φέρουν καθαρό αρνητικό φορτίο. Επειδή το φορτίο ανά μονάδα μάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναμικές ιδιότητες είναι συνάρτηση μόνο του μοριακού βάρους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων είναι μοναδική συνάρτηση του μοριακού βάρους. Το σύστημα χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση, το διαχωρισμό και τον χαρακτηρισμό των πρωτεϊνών ή των υπομονάδων τους. Η ηλεκτροφόρηση, στην παρούσα εργασία, έγινε σε επίπεδες πηκτές πάχους 1,5mm και μήκους 12cm σε συσκευές ηλεκτροφόρησης του Ινστιτούτου Max Planc του Βερολίνου. Το σύστημα αποτελείτο από την πηκτή διαχωρισμού, την πηκτή επιστοίβαξης και τις θέσεις υποδοχείς των δειγμάτων, οι οποίες δημιουργήθηκαν με τη βοήθεια πλαστικής οδοντωτής μήτρας που αφαιρείται πριν τον πολυμερισμό της πηκτής επιστοίβαξης. Τα δείγματα πριν εισαχθούν στο πήκτωμα επιστοίβαξης διαλύονται στο ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων. Επίσης, τα δείγματα θερμαίνονται για 3min στους C, ώστε να αποδιαταχθούν πλήρως και να διευκολυνθεί η δημιουργία συμπλόκων SDS-πρωτεΐνης. Η β-μερκαπτοαιθανόλη (1% v/v) που χρησιμοποιείται ανάγει τους τυχόν δισουλφιδικούς δεσμούς που υπάρχουν, ώστε να διαχωριστούν οι πρωτεΐνες από τις υπομονάδες τους. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε σε σταθερή ένταση ρεύματος 25mA μέχρι την πλήρη είσοδο των δειγμάτων στην πηκτή διαχωρισμού και 35mA μέχρι ο δείκτης να φτάσει στο τέλος της πηκτής. Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από την πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη (Western Blotting) Η ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF βασίζεται στην κίνηση των πρωτεϊνών, οι οποίες βρίσκονται υπό τη μορφή συμπλόκου με το SDS και είναι αρνητικά φορτισμένες, από την πηκτή στην μεμβράνη κατά την εφαρμογή διαφοράς δυναμικού, καταλήγοντας έτσι στον εγκλωβισμό τους στο πλέγμα της μεμβράνης. Η τοποθέτηση στη συσκευή ηλεκτρομεταφοράς γίνεται ανάμεσα σε δυο χαρτιά Whatman 3MM με τη μεμβράνη προσαρμοσμένη στο θετικό πόλο και την 56

57 πηκτή στον αρνητικό. Η επαφή μεταξύ της πηκτής και της μεμβράνης πρέπει να είναι άμεση δίχως την παρεμβολή φυσαλίδων που παρεμποδίζουν τη διέλευση του ηλεκτρικού ρεύματος. Πριν τη διαδικασία της ηλεκτρομεταφοράς η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και η πηκτή επωάζονται σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (Transfer Buffer), ενώ στην περίπτωση της μεμβράνης PVDF προηγείται της διαδικασίας ένα στάδιο εμβάπτισης της μεμβράνης σε διάλυμα 100% μεθανόλης (εικόνα 23). Εικόνα 23. Τεχνική Western Blotting και ανοσοανίχνευσης Η διάρκεια της ηλεκτρομεταφοράς στην περίπτωση μελέτης της θρομβίνης είναι 1 ώρα και 30 λεπτά, ενώ στην περίπτωση μελέτης του παράγοντα Xa είναι 1 ώρα υπό σταθερή ένταση ρεύματος 72 ma. Η συσκευή που χρησιμοποιήθηκε ήταν το μοντέλο TE-70 Semi-Dry Blotter της εταιρείας Hoeffer. Ανοσοανίχνευση Η τεχνική της ανοσοανίχνευσης επιτρέπει τον εντοπισμό μιας πρωτεΐνης, η οποία βρίσκεται καθηλωμένη σε μεμβράνη με τη χρήση αντισωμάτων. Η τεχνική βασίζεται στην αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης-αντιγόνου με το αντίσωμά της, βασισμένη στην απόλυτη ειδίκευση μεταξύ αντιγόνου-αντισώματος (εικόνα 23). Ο εντοπισμός της πρωτεΐνης γίνεται με τη χρήση ενός δεύτερου αντισώματος (αντι-αντίσωμα) το οποίο αναγνωρίζει και δεσμεύεται εξειδικευμένα στο πρώτο 57

58 αντίσωμα. Το δεύτερο αντίσωμα (αντι-αντίσωμα) είναι συζευγμένο με ένα ένζυμοδείκτη. Η προσθήκη του υποστρώματος του ενζύμου δίνει χαρακτηριστική χρωμοαντίδραση, επιτρέποντας, με τον τρόπο αυτό, τον εντοπισμό του αντιγόνου πάνω στη μεμβράνη. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν τα πολυκλωνικά αντισώματα έναντι της θρομβίνης και του παράγοντα Xa (Assera II και Assera X, αντίστοιχα), ενώ το δεύτερο αντίσωμα είναι συζευγμένο με το ένζυμο αλκαλική φωσφατάση. Η όλη διαδικασία της ανοσοανίχνευσης έχει ως εξής: Αρχικά η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης επωάζεται υπό συνεχή ανάδευση για 1h σε διάλυμα κορεσμού (5% γάλα σε PBS), με απώτερο σκοπό τον κορεσμό της μεμβράνης με την καζεΐνη του γάλακτος, ώστε να αποφευχθούν οι μηεξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις του αντισώματος με την μεμβράνη. Ακολουθεί επώαση της μεμβράνης με το αντίσωμα έναντι της θρομβίνης ή του παράγοντα Xa, υπό αραίωση 1:4000 σε 10ml διαλύματος κορεσμού, με συνεχή ανακίνηση για 2h σε θερμοκρασία δωματίου ή για 16h στους 4 0 C. Ακολουθούν δύο πλύσεις των 5 min με διάλυμα πλύσης (PBS/Tween), ώστε να απομακρυνθούν τα μη συνδεδεμένα μόρια και να διασπαστούν οι μηεξειδικευμένοι δεσμοί. Εν συνεχεία, ακολουθεί επώαση με το δεύτερο αντίσωμα (αραίωση 1:2000 σε 10ml διαλύματος κορεσμού), υπό συνεχή ανάδευση για 1h σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθούν δύο πλύσεις των 5 min με διάλυμα πλύσης (PBS/Tween). Τέλος, ακολουθεί χρωμοαντίδραση, η οποία επιτυγχάνεται με την προσθήκη 20μl BCIP (Bromochloroindolyl phosphate) και 40μl NBT (Nitro Blue Tetrazolium) σε 10μl διαλύματος αλκαλικής φωσφατάσης, υπό ανάδευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος μέχρι την εμφάνιση των ζωνών στην μεμβράνη. Ακολουθεί πλύση της μεμβράνης 2 φορές με ddh 2 O, στέγνωμα και φύλαξη σε σκοτεινό χώρο. Φωτομετρικός προσδιορισμός της δραστικότητας του παράγοντα Xa Στη φωτομετρία χρησιμοποιούνται μόρια ή τμήματα μορίων που μπορούν να διεγερθούν από την απορρόφηση του φωτός και ονομάζονται χρωμοφόρα ή χρωμογόνα. Η βάση χρησιμότητας της φωτομετρίας απορρόφησης, ως αναλυτικής 58

59 μεθόδου, είναι ο νόμος Beer (A=ecd), σύμφωνα με τον οποίο η απορροφητικότητα είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της ουσίας που απορροφά το φως. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν κατάλληλα χρωμογόνα υποστρώματα τα οποία υδρολύονται από τον παράγοντα Xa και απελευθερώνουν pna (π-νιτρο-ανιλίνη), οπότε μετράται η αύξηση της απορροφητικότητας στα 405 nm. Το φωτόμετρο που χρησιμοποιήθηκε ήταν το EOS 880 της εταιρείας CGA Strumenti Scintifici. Η δημιουργία του παράγοντα Xa μετράται ως εξής: σε σωλήνα Eppendorf προστίθενται 25μl πλάσματος, ποσότητες θρομβοπλαστίνης (TP), παράγοντα VIIa, παράγοντα Xa (εξωγενής χορήγηση) αιμοπεταλίων (PL) και 150μl υποστρώματος, ενώ προστίθεται ανάλογη ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος Α (Buffer B), ώστε ο τελικός όγκος αντίδρασης να είναι 500μl. Η αντίδραση ξεκινάει με την προσθήκη ιόντων ασβεστίου (40μl CaCl 2 ). Στα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν πλάσματα φυσιολογικών ατόμων πλούσια και φτωχά σε αιμοπετάλια και τεχνητά πλάσματα με έλλειψη του παράγοντα IX. Επίσης, ανάλογα με τις συνθήκες του πειράματος, έλειπαν είτε η θρομβοπλαστίνη είτε ο παράγοντας VIIa είτε τα αιμοπετάλια είτε συνδυασμός αυτών. Το δείγμα αναρροφάται στο φωτόμετρο, όπου μετράται η αύξηση της απορροφητικότητας στο 405 nm κάθε 30sec για 17min στους 37 0 C. Η αύξηση της απορροφητικότητας είναι ανάλογη με το σχηματισμό του παράγοντα Xa, ο οποίος υδρολύει το υπόστρωμα (MAPA-Gly-Arg-pNA) με ταυτόχρονη απελευθέρωση pna. Σύσταση των διαλυμάτων: Πηκτή επιστοίβαξης (Stacking gel): για τον πολυμερισμό: 5% ακρυλαμίδιο 0,2% bis-ακρυλαμίδιο 0,5% w/v SDS 125mM Tris-HCl (ph 6,8) 0,08% w/v APS 0,2% v/v TEMED Πηκτή διαχωρισμού (Separating gel): 10% ακρυλαμίδιο 0,27% bis-ακρυλαμίδιο 59

60 για τον πολυμερισμό: 0,5% w/v SDS 375mM Tris-HCl (ph 8,9) 0,08% w/v APS 0,2% v/v TEMED Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων (Running Buffer): 25mM Tris-HCl (ph 8,3) 192mM γλυκίνη 0,1% w/v SDS Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων: 10% v/v γλυκερόλη 2% w/v SDS 60mM Tris-HCl (ph 6,8) 0,025% w/v κυανού της βρωμοφαινόλης Ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (Transfer Buffer): 12,5mM Tris-Βορικό 0,02% w/v SDS ph 8,5 Διάλυμα κορεσμού: 5% γάλα σε PBS PBS: 137mM NaCl 2,68mM KCl 8,1mM Na 2 HPO 4 Διάλυμα αλκαλικής φωσφατάσης: 100mM Tris-HCl 100mM NaCl 5mM MgCl 2 1,47mM KH 2 PO 4 ph 9,5 Ρυθμιστικό διάλυμα Α (Buffer B): 0,02M Tris-HCl (ph 7,4) 0,15M NaCl 60

61 B. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ I. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΙΣΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ 1. Μελέτη δράσης διαφορετικών συγκεντρώσεων ΤΡ σε δείγμα φυσιολογικό και dvii Στο παρακάτω πείραμα έγινε προσπάθεια να μελετηθεί η δράση του ιστικού παράγοντα, με τη χρήση διαφορετικών αραιώσεων TP, σε δείγμα με έλλειψη παράγοντα VII (dvii) και σε φυσιολογικό (10μl dix + 10μl dvii). Αξίζει να σημειωθεί, με βάση τα υπάρχοντα δεδομένα, ότι η δράση του ιστικού παράγοντα ενισχύεται με την παρουσία του παράγοντα VII. Ο χρόνος επώασης των δειγμάτων είναι 15 min μl dvii 20μl φυσ 20μl dvii 20μl φυσ 20μl dvii 20μl φυσ 20μl dvii 20μl φυσ 20μl dvii 20μl φυσ 20μl TP (1:150) 20μl TP (1:150) 20μl TP (1:200) 20μl TP (1:200) 20μl TP (1:300) 20μl TP (1:300) 20μl TP (1:400) 20μl TP (1:400) 20μl TP (1:500) 20μl TP (1:500) 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB Εικόνα 1. Ανοσοαποτύπωση της μετατροπής της προθρομβίνης σε θρομβίνη, μετά την προσθήκη διαφορετικών συγκεντρώσεων TP, σε δείγμα dvii και φυσιολογικό. 61

62 60 50 % FIIa dvii dix + dvii /15 1/20 1/30 1/40 1/50 Αραιώσεις TP Σχήμα 1. Γράφημα με τη μορφή στηλών συγκριτικής απεικόνισης της δράσης διαφορετικών συγκεντρώσεων TP στην παραγωγή θρομβίνης σε δείγμα dvii και φυσιολογικό. Στο παραπάνω γράφημα παρατηρείται ότι στο φυσιολογικό δείγμα για τις ακραίες τιμές των αραιώσεων η δράση της TP στην παραγωγή θρομβίνης είναι μεγαλύτερη, ενώ στις μεσαίες τιμές η δράση είναι εμφανώς μικρότερη. Σχετικά με το δείγμα με έλλειψη παράγοντα VIIa, η αύξηση στην τιμή των αραιώσεων TP είναι αντιστρόφως ανάλογη με την δράση της. 2. Επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων TP στην παραγωγή Xa (σε δείγμα φυσιολογικό και dvii) Στο παρακάτω πείραμα έγινε προσπάθεια να μελετηθεί η δράση του ιστικού παράγοντα, με τη χρήση διαφορετικών αραιώσεων TP, σε δείγμα με έλλειψη παράγοντα VII (dvii) και σε φυσιολογικό (10μl dix + 10μl dvii). Η διαφορά με το προηγούμενο πείραμα είναι ότι έγινε προσπάθεια μελέτης της ενεργοποίησης του παράγοντα Xa. Ο χρόνος επώασης των δειγμάτων είναι 15 min. 62

63 μl dvii 20μl dvii 20μl dvii 20μl dvii 20μl dvii 20μl φυσ 20μl φυσ 20μl φυσ 20μl φυσ 20μl φυσ 20μl TP (1:150) 20μl TP (1:200) 20μl TP (1:300) 20μl TP (1:400) 20μl TP (1:500) 20μl TP (1:150) 20μl TP (1:200) 20μl TP (1:300) 20μl TP (1:400) 20μl TP (1:500) 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB Εικόνα 2. Ανοσοαποτύπωση της μετατροπής του παράγοντα X σε Xa, μετά την προσθήκη διαφορετικών συγκεντρώσεων TP, σε δείγμα dvii και φυσιολογικό. Με βάση την εικόνα της ανοσοαποτύπωσης δεν είμαστε σε θέση να προσδιορίσουμε την ενεργοποίηση του παράγοντα X, καθώς η ζώνη εμφάνισης του Χα δεν είναι ορατή. 3. Επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων TP σε δείγμα dvii Σε συνέχεια των προηγούμενων πειραμάτων μελετήθηκε η επίδραση μεγαλύτερου εύρους συγκεντρώσεων ιστικού παράγοντα σε δείγμα dvii. Ο χρόνος επώασης των δειγμάτων είναι 40 min μl dvii 20μl dvii 20μl dvii 20μl dvii 20μl dvii 20μl dvii 20μl dvii 20μl dvii 20μl dvii 20μl dvii 20μl TP (1:75) 20μl TP (1:100) 20μl TP (1:150) 20μl TP (1:200) 20μl TP (1:250) 20μl TP (1:300) 20μl TP (1:350) 20μl TP (1:400) 20μl TP (1:500) 20μl TP (1:600) 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 6μl BB 63

64 Εικόνα 3. Ανοσοαποτύπωση της μετατροπής της προθρομβίνης σε θρομβίνη, μετά την προσθήκη διαφορετικών συγκεντρώσεων σε δείγμα dvii % FIIa dvii 0 1/75 1/100 1/150 1/200 1/250 1/300 1/350 1/400 1/500 1/600 Αραιώσεις TP Σχήμα 2. Γράφημα με τη μορφή στηλών απεικόνισης της δράσης διαφορετικών συγκεντρώσεων TP στην παραγωγή θρομβίνης σε δείγμα dvii. Στο παραπάνω γράφημα παρατηρείται ότι στις ακραίες αραιώσεις TP η δράση σε σχέση με τις μεσαίες αραιώσεις είναι μεγαλύτερη. Ενώ σε προηγούμενο πείραμα παρατηρήθηκε ότι η αύξηση στην τιμή των αραιώσεων TP είναι αντιστρόφως ανάλογη με την δράση της, εδώ φαίνεται να παρουσιάζει το ίδιο προφίλ με το φυσιολογικό δείγμα, μόνο που το εύρος των αραιώσεων είναι μεγαλύτερο. 64

65 II. ΜΕΛΕΤΗ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΣΣΕΙΑΣ VIIa 1. Εύρεση βέλτιστης συγκέντρωσης δράσης της περίσσειας VIIa Για την εύρεση της βέλτιστης συγκέντρωσης δράσης του παράγοντα VIIa χρησιμοποιήθηκε δείγμα με έλλειψη του παράγοντα IX (dix). Στα δείγματα έγινε σταδιακά προσθήκη διαφόρων ποσοτήτων VIIa από διαφορετικές αραιώσεις του αρχικού (stock) διαλύματος. Ο χρόνος επώασης των δειγμάτων είναι 10 min. Η συγκέντρωση του stock διαλύματος είναι 0,545 mg/ml. Στο 1 ο θυγατρικό δείγμα (αραίωση 1:10) η συγκέντρωση VIIa είναι 54,5 μg/ml και στο 2 ο θυγατρικό (αραίωση 1:100) η συγκέντρωση είναι 5,45 μg/ml. In vivo, η φαρμακευτική δόση (high dose) που χρησιμοποιείται για την άμεση αντιμετώπιση αιμορραγιών είναι 1,44 mg/l ή 1,44 μg/ml. Στα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο για τα 50μl δείγματος η επίτευξη της high dose γίνεται με την προσθήκη 13,21μl VIIa από το 2 ο θυγατρικό δείγμα μl dix 20μl dix 20μl dix 20μl dix 20μl dix 20μl dix 20μl dix 20μl dix 20μl dix 20μl dix 10μl TP 10μl TP 10μl TP 10μl TP 10μl TP 10μl TP 10μl TP 10μl TP 10μl TP 10μl TP 9,75μl VIIa(1:1000) 13μl VIIa(1:1000) 3,25μl VIIa(1:100) 6,5μl VIIa(1:100) 9,75μl VIIa(1:100) 13μl VIIa(1:100) 3,25μl VIIa(1:10) 6,5 μl VIIa(1:10) 9,75μl VIIa(1:10) 13μl VIIa(1:10) 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 4μl CaCl 2 6,25μl BB 3μl BB 12,5μl BB 9,5μl BB 6,25μl BB 3μl BB 12,5μl BB 9,5μl BB 6,25μl BB 3μl BB Εικόνα 1. Ανοσοαποτύπωση της μετατροπής της προθρομβίνης σε θρομβίνη σε δείγμα dix με την προσθήκη διαφορετικών συγκεντρώσεων FVIIa. 65

66 80,00 70,00 60,00 50,00 % FIIa 40,00 30,00 20,00 1/1000 1/100 1/10 10,00 0,00 3,25μl VIIa 6,5μl VIIa 9,75μl VIIa 13μl VIIa Ποσότητα VIIa Σχήμα 1. Γράφημα με τη μορφή στηλών συγκριτικής απεικόνισης της δράσης διαφορετικών αραιώσεων FVIIa στην παραγωγή θρομβίνης σε δείγμα dix. Με βάση τα αποτελέσματα του γραφήματος παρατηρείται ότι η αραίωση 1:1000 δεν δίνει αξιόλογα αποτελέσματα στις μικρές συγκεντρώσεις VIIa. Η δράση του VIIa είναι εμφανής τόσο στην αραίωση 1:100 όσο και στην 1:10, με ελάχιστες διαφορές μεταξύ των δύο αραιώσεων σε όλες τις συγκεντρώσεις VIIa που χρησιμοποιήθηκαν. Σύμφωνα με τα παραπάνω, για την μελέτη της δράσης της περίσσειας VIIa θα χρησιμοποιείται στα πειράματα η αραίωση 1:100 (2 ο θυγατρικό), με μια μέση ποσότητα των 5μl. 2. Κινητική δείγματος dix με την επίδραση περίσσειας και high dose VIIa Στο παρακάτω πείραμα μελετήθηκε η επίδραση τόσο της περίσσειας όσο και της high dose VIIa στην κινητική δείγματος dix. Μελετήθηκε η κινητική των δειγμάτων για χρόνους 5, 10, 15, 20 και 25 min. Στόχος του πειράματος είναι η εύρεση εάν η δράση της high dose VIIa, η οποία φέρει κλινική εφαρμογή για την άμεση αντιμετώπιση αιμορραγιών, παρουσιάζει εμφανείς διαφορές με την δράση της περίσσειας VIIa. 66

67 Περίσσεια VIIa 20μl dix 10μl TP 5μl VIIa 4μl CaCl 2 11μl BB High dose VIIa 20μl dix 10μl TP 13μl VIIa 4μl CaCl 2 3μl BB Εικόνα 2. Ανοσοαποτύπωση της κινητικής μετατροπής της προθρομβίνης σε θρομβίνη, σε δείγμα dix, μετά την ενεργοποίηση του εξωγενούς δρόμου με την προσθήκη περίσσειας και high dose FVIIa % FIIa μl VIIa 13μl VIIa χρόνος επώασης Σχήμα 2. Γράφημα με τη μορφή στηλών συγκριτικής απεικόνισης της δράσης περίσσειας και high dose FVIIa στην κινητική παραγωγής θρομβίνης σε δείγμα dix. 67

68 Με βάση τα αποτελέσματα του γραφήματος παρατηρείται ότι ενώ στους αρχικούς χρόνους επώασης η δράση της high dose VIIa είναι σχετικά μικρή, καθώς όμως αυξάνεται ο χρόνος, η δράση γίνεται σαφώς μεγαλύτερη. Διαπιστώνεται, επομένως ότι η φαρμακευτική δόση που χρησιμοποιείται για την αντιμετώπιση των αιμορραγιών είναι αποτελεσματική μετά τα 20min του πειράματος, ενώ στα αρχικά στάδια η χορήγηση περίσσειας VIIa, που χρησιμοποιείται σε όλα τα πειράματα της παρούσας εργασίας, κρίνεται πιο αποτελεσματική. 3. Επίδραση περίσσειας VIIa στην κινητική δείγματος dix Στο παρακάτω πείραμα μελετήθηκε η επίδραση της περίσσειας VIIa στην κινητική δείγματος dix. Για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων έγινε συγκριτική παράθεση της κινητικής του δείγματος για χρόνους 5, 10, 15, 20 και 25 min, με και δίχως περίσσεια VIIa. -VIIa 20μl dix 20μl TP 5μl VIIa 4μl CaCl 2 1μl BB +VIIa 20μl dix 20μl TP 0μl VIIa 4μl CaCl 2 6μl BB Εικόνα 3. Ανοσοαποτύπωση της κινητικής μετατροπής της προθρομβίνης σε θρομβίνη, σε δείγμα dix, μετά την ενεργοποίηση του εξωγενούς δρόμου με και δίχως την προσθήκη FVIIa. 68

69 60 50 % FIIa VIIa + VIIa χρόνος επώασης Σχήμα 3. Γράφημα με τη μορφή στηλών συγκριτικής απεικόνισης της δράσης FVIIa στην κινητική παραγωγής θρομβίνης σε δείγμα dix. Με βάση τα αποτελέσματα του γραφήματος παρατηρείται ότι ενώ στα 5 πρώτα λεπτά η περίσσεια VIIa δεν παρουσιάζει αξιόλογη δράση στην κινητική παραγωγής θρομβίνης, στους χρόνους που ακολουθούν η δράση αυξάνεται με κορύφωση στα 25 min. 4. Επίδραση περίσσειας VIIa στην κινητική δείγματος φυσιολογικού και dx Στο παρακάτω πείραμα μελετήθηκε η επίδραση της περίσσειας VIIa στην κινητική δείγματος dx και φυσιολογικού (10μl dix + 10μl dx). Μελετήθηκε η κινητική των δειγμάτων για χρόνους 5, 10, 15, 20 και 25 min. Στόχος του πειράματος είναι η εύρεση εάν η δράση της περίσσειας VIIa δρα απευθείας στην ενεργοποίηση της μετατροπής της θρομβίνης σε θρομβίνη, δίχως την παρουσία του παράγοντα X. dx 20μl dx 20μl TP 5μl VIIa 4μl CaCl 2 1μl BB φυσιολ 20μl φυσ 20μl TP 5μl VIIa 4μl CaCl 2 1μl BB 69

70 Εικόνα 4. Ανοσοαποτύπωση της κινητικής μετατροπής της προθρομβίνης σε θρομβίνη, σε δείγμα dx και φυσιολογικό, μετά την ενεργοποίηση του εξωγενούς δρόμου με την προσθήκη FVIIa % FIIa dx dx+dix χρόνος επώασης Σχήμα 4. Γράφημα με τη μορφή στηλών συγκριτικής απεικόνισης της δράσης FVIIa στην κινητική παραγωγής θρομβίνης σε δείγμα dx και φυσιολογικό. Με βάση το παραπάνω γράφημα διαπιστώνεται ότι η περίσσεια VIIa δεν έχει αξιόλογη δράση στην κινητική παραγωγής της προθρομβίνης σε θρομβίνη, καθώς 70

71 ελλείψει του παράγοντα Χ η περίσσεια VIIa δεν μπορεί από μόνη της να ενεργοποιήσει τον εξωγενή δρόμο και να οδηγήσει στην παραγωγή θρομβίνης. Αντιθέτως, η δράση της περίσσειας VIIa είναι εμφανής στο φυσιολογικό δείγμα. 5. Επίδραση περίσσειας VIIa στην κινητική δείγματος dii και φυσιολογικού Χρώση Xa: Στο παρακάτω πείραμα μελετήθηκε η επίδραση της περίσσειας VIIa στην κινητική δείγματος dii και φυσιολογικού (10μl dii + 10μl dix). Μελετήθηκε η κινητική των δειγμάτων για χρόνους 5, 10, 15, 20 και 25 min. Στόχος του πειράματος είναι η εύρεση εάν η περίσσεια VIIa δρα απευθείας στην παραγωγή θρομβίνης (IIa) ή στρέφεται πρώτα στην ενεργοποίηση του παράγοντα X σε Xa. dιι 20μl dii 20μl TP 5μl VIIa 4μl CaCl 2 1μl BB φυσιολ 20μl φυσ 20μl TP 5μl VIIa 4μl CaCl 2 1μl BB Εικόνα 5. Ανοσοαποτύπωση της κινητικής μετατροπής του παράγοντα X σε Xa,, σε δείγμα dii και φυσιολογικό, μετά την προσθήκη FVIIa. 71

72 60 50 % Xa dii φυσιολ χρόνος επώασης Σχήμα 5. Γράφημα με τη μορφή στηλών συγκριτικής απεικόνισης της δράσης FVIIa στην κινητική παραγωγής Xa σε δείγμα dii και φυσιολογικό. Με βάση το παραπάνω γράφημα, διαπιστώνεται ότι σε δείγμα με έλλειψη παράγοντα II η περίσσεια VIIa συμβάλλει σε μεγαλύτερη ενεργοποίηση του παράγοντα Xa, σε σχέση με το φυσιολογικό δείγμα, καθώς η ποσότητα Xa που ενεργοποιείται δεν καταναλώνεται περαιτέρω στην ενεργοποίηση της θρομβίνης. Χρώση ΙΙα: Για την καλύτερη αξιολόγηση των προηγούμενων αποτελεσμάτων, κρίθηκε απαραίτητη η επανάληψη του πειράματος με χρώση θρομβίνης. Χρησιμοποιήθηκαν τα ίδια δείγματα και η κινητική έγινε για τους ίδιους χρόνους. dιι 20μl dii 20μl TP 5μl VIIa 4μl CaCl 2 1μl BB φυσιολ 20μl φυσ 20μl TP 5μl VIIa 4μl CaCl 2 1μl BB Στην παρακάτω εικόνα παρατηρείται η ίδια ζώνη τόσο στο δείγμα με έλλειψη παράγοντα II (dii) όσο και στο φυσιολογικό, με την ζώνη στο dii δείγμα να είναι ελάχιστα πιο έντονη. Το γεγονός αυτό, ίσως να προβληματίζει, καθώς κρίνεται οξύμωρο σε dii δείγμα στο οποίο γίνεται χρώση με αντίσωμα έναντι θρομβίνης να 72

73 έχουμε την εμφάνιση της παραπάνω ζώνης. Θα μπορούσε, βέβαια, να θεωρηθεί ότι η πρωτεΐνη που δεσμεύεται στο αντίσωμα να παρουσιάζει αγχιστεία ως προς αυτό και ελλείψει της θρομβίνης να δεσμεύεται εξ ολοκλήρου πάνω σε αυτό (δεν υπάρχει ανταγωνισμός με την IIa ως προς το αντίσωμα). Στο φυσιολογικό δείγμα (50% dii + 50% dix) λόγω του ανταγωνισμού με την ελάχιστη θρομβίνη που παράγεται από το dix η ζώνη είναι λιγότερο έντονη Εικόνα 6. Ανοσοαποτύπωση της κινητικής μετατροπής της προθρομβίνης σε θρομβίνη, σε δείγμα dii και φυσιολογικό, μετά την ενεργοποίηση του εξωγενούς δρόμου με την προσθήκη FVIIa. Κινητική σε dii δείγμα Χρώση IIa: Σε συνέχεια των παραπάνω, κρίθηκε σκόπιμο να μελετηθεί η κινητική δείγματος dii, με και χωρίς την προσθήκη περίσσειας VIIa, και να γίνει χρώση της θρομβίνης. Μελετήθηκε η κινητική του δείγματος για χρόνους 5, 10, 15, 20 και 25 min. -VIIa 20μl dii 20μl TP 0μl VIIa 4μl CaCl 2 6μl BB +VIIa 20μl φυσ 20μl TP 5μl VIIa 4μl CaCl 2 1μl BB 73

74 Εικόνα 7. Ανοσοαποτύπωση της κινητικής μετατροπής της προθρομβίνης σε θρομβίνη, σε δείγμα dii, δίχως και με την προσθήκη FVIIa Και εδώ, όπως στο προηγούμενο πείραμα, έχουμε την εμφάνιση της ίδιας ζώνης, γεγονός που ενισχύει τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας. 6. Μελέτη της επίδρασης TP, PL και VIIa στην κινητική δείγματος dix Στο παρακάτω πείραμα έγινε προσπάθεια μελέτης της συνδυασμένης δράσης της θρομβοπλαστίνης (TP), των αιμοπεταλίων (PL) και της περίσσειας VIIa στην κινητική παραγωγής θρομβίνης σε δείγμα dix. Μελετήθηκε η κινητική των δειγμάτων για τους χρόνους 5, 10, 15 και 25 min. Στην περίπτωση της παρουσίας TP, PL και VIIa είχαμε εμφάνιση θρόμβου στα 5min, στην περίπτωση της παρουσίας PL και VIIa είχαμε εμφάνιση πολύ μικρού θρόμβου στα 10min, ενώ στην παρουσία TP και VIIa είχαμε εμφάνιση θρόμβου στα 25min. +TP+PL+VIIa 20μl dix 10μl TP (1:75) 10μl PL 10μl VIIa 4μl CaCl 2 0μl BB -TP+PL+VIIa 20μl dix 0μl TP (1:75) 10μl PL 10μl VIIa 4μl CaCl 2 10μl BB +TP-PL+VIIa 20μl dix 10μl TP (1:75) 0μl PL 10μl VIIa 4μl CaCl 2 10μl BB 74

75 Εικόνα 8. Ανοσοαποτύπωση της κινητικής παραγωγής θρομβίνης σε δείγμα dix, σε συνδυασμό με τη δράση TP, PL και περίσσειας VIIa %FIIa χρόνος επώασης +TP+PL+VIIa -TP+PL+VIIa +TP-PL+VIIa Σχήμα 6. Γράφημα με τη μορφή στηλών συγκριτικής απεικόνισης της κινητικής παραγωγής θρομβίνης σε δείγμα dix, υπό της επίδραση της δράσης TP, PL και περίσσειας VIIa. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα μπορούμε να καταλήξουμε στην εξής σειρά σπουδαιότητας των παραγόντων TP, PL και VIIa, οι οποίοι οδηγούν στην παραγωγή θρομβίνης σε dix σύστημα (ελλιπές σύστημα): TP+PL+VIIa > TP+VIIa > PL+VIIa. Γνωρίζουμε, βέβαια, ότι ο παράγοντας VIIa δρα σε συνδυασμό με τον 75

76 ιστικό παράγοντα και μετά καταλήγει στα αιμοπετάλια, όπου έχουμε και την μέγιστη παραγωγή θρομβίνης. Στο συγκεκριμένο πείραμα διαπιστώνεται ότι μπορεί να υπάρξει απευθείας δράση της περίσσειας VIIa πάνω στα αιμοπετάλια (τα οποία δεν φέρουν υποδοχείς VII) οδηγώντας σε ανάλογη ενεργοποίηση της θρομβίνης που παρατηρείται με τη δράση του συμπλόκου TF/VIIa. 7. Μελέτη της επίδρασης TP, PL στην κινητική δείγματος dix Στο πείραμα που ακολουθεί, όπως και στο προηγούμενο, έγινε προσπάθεια μελέτης της συνδυασμένης δράσης της θρομβοπλαστίνης (TP) και των αιμοπεταλίων (PL), δίχως όμως την παρουσία της περίσσειας VIIa, στην κινητική παραγωγής θρομβίνης σε δείγμα dix. Μελετήθηκε η κινητική των δειγμάτων για τους χρόνους 10, 15 και 25 min. Στην περίπτωση της παρουσίας TP, και PL είχαμε εμφάνιση θρόμβου στα 15min, ενώ στην περίπτωση της παρουσίας μόνο PL ή μόνο TP δεν είχαμε εμφάνιση θρόμβου μέχρι τα 25min. +TP+PL 20μl dix 10μl TP (1:75) 10μl PL 0μl VIIa 4μl CaCl 2 10μl BB -TP+PL 20μl dix 0μl TP (1:75) 10μl PL 0μl VIIa 4μl CaCl 2 20μl BB +TP-PL 20μl dix 10μl TP (1:75) 0μl PL 0μl VIIa 4μl CaCl 2 20μl BB Εικόνα 9. Ανοσοαποτύπωση της κινητικής παραγωγής θρομβίνης σε δείγμα dix, σε συνδυασμό με τη δράση TP, και PL, δίχως την παρουσία περίσσειας VIIa. 76

77 25 20 % FIIa χρόνος επώασης +TP+PL -TP+PL +TP-PL Σχήμα 7. Γράφημα με τη μορφή στηλών συγκριτικής απεικόνισης της κινητικής παραγωγής θρομβίνης σε δείγμα dix, υπό της επίδραση της δράσης TP, PL. Όπως και στο προηγούμενο πείραμα, έτσι και εδώ μπορούμε να καταλήξουμε στην εξής σειρά σπουδαιότητας: TP+PL > PL > TP. Διαπιστώνεται, επομένως, ότι οι παράγοντες επηρεάζουν το ίδιο την παραγωγή θρομβίνης και δίχως την παρουσία VIIa. Η περίσσεια VIIa καταλήγει στο ίδιο προφίλ παραγωγής θρομβίνης, με τη διαφορά ότι η παραγωγή θρομβίνης ξεκινά γρηγορότερα και οδηγούμαστε σε μεγαλύτερες ποσότητες. 77

78 III. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΑΝΑΣΤΟΛΕΩΝ ΠΗΞΗΣ APC, APS 1. Μελέτη της δράσης της περίσσειας VIIa στην αντιμετώπιση του ανασταλτικού ρόλου της APC σε δείγμα dix Στο παρακάτω πείραμα έγινε προσπάθεια μελέτης του ανασταλτικού ρόλου της ενεργού πρωτεΐνης C (APC) σε δείγμα dix και κατά το πόσο η δράση της περίσσειας VIIa μπορεί να αναιρέσει αυτή την αναστολή. Η φυσιολογική συγκέντρωση της APC στο πλάσμα είναι 3-5 μg/ml ( 4 μg/ml). Για τις ανάγκες του πειράματος χρησιμοποιήθηκαν ποσότητες APC 1, 2, 3, 4 και 5 φορές πάνω από το φυσιολογικό. Ο χρόνος επώασης των δειγμάτων είναι 30 min. dix + APS (1,2,3,4,5x) 20μl dix 10μl TP (1:75) 0μl VIIa 4μl CaCl 2 16μl BB dix + APS (1,2,3,4,5x) 20μl dix 10μl TP (1:75) 5μl VIIa 4μl CaCl 2 5μl BB Εικόνα 1. Ανοσοαποτύπωση του ανασταλτικού ρόλου της APC σε δείγμα dix και της επίδρασης της περίσσειας VIIa. Με βάση τα αποτελέσματα του παρακάτω γραφήματος παρατηρείται ότι για τις μικρές ποσότητες της APC (1x, 2x) η περίσσεια VIIa αποκαθιστά τον ανασταλτικό της ρόλο. Στις μεγαλύτερες ποσότητες η δράση της περίσσειας VIIa είναι πάλι ικανοποιητική με ιδιαίτερη έμφαση στο γεγονός ότι κρίνεται 78

79 αποτελεσματική μέχρι και για ποσότητα APC 4 φορές πάνω από το φυσιολογικό, όπου η παραγωγή θρομβίνης είχε ανασταλεί % FIIa VIIa + VIIa μl APC 2μl APC 4μl APC 6μl APC 8μl APC 10μl APC Προσθήκη APC Σχήμα 1. Γράφημα με τη μορφή στηλών συγκριτικής απεικόνισης ανασταλτικού ρόλου της APC σε δείγμα dix και της επίδρασης της περίσσειας VIIa. 2. Μελέτη της δράσης της περίσσειας VIIa στην αντιμετώπιση του ανασταλτικού ρόλου της APC στην κινητική δείγματος dix, με προεπώαση των δειγμάτων Το πείραμα που ακολουθεί είναι παρόμοιο με το προηγούμενο με τη διαφορά ότι προηγήθηκε προεπώαση για 30 min των δειγμάτων με την APC πριν την έναρξη της κινητικής αντίδρασης. Η ποσότητα της APC που χρησιμοποιήθηκε είναι 3 φορές πάνω από το φυσιολογικό. Μελετήθηκε η κινητική των δειγμάτων για χρόνους 5, 10, 15, και 30 min. dix + APS (3x) 20μl dix 10μl TP (1:75) 0μl VIIa 4μl CaCl 2 16μl BB dix + APS (3x) 20μl dix 10μl TP (1:75) 5μl VIIa 4μl CaCl 2 11μl BB Με βάση τα αποτελέσματα που ακολουθούν, παρατηρείται ότι στην περίπτωση που προηγηθεί προεπώαση των δειγμάτων με την APC, ο ανασταλτικός 79

80 της ρόλος είναι μεγαλύτερος, με την θρομβίνη να εμφανίζεται μόλις στο 30 min. Επίσης, διαπιστώνεται ότι η περίσσεια VIIa αδυνατεί να ανατρέψει την αναστολή Εικόνα 2. Ανοσοαποτύπωση του ανασταλτικού ρόλου της APC σε δείγμα dix, με προεπώαση των δειγμάτων, και της επίδρασης της περίσσειας VIIa. % FIIa χρόνος επώασης dix+apc(3x)-viia dix+apc(3x)+viia Σχήμα 2. Γράφημα με τη μορφή στηλών συγκριτικής απεικόνισης ανασταλτικού ρόλου της APC σε δείγμα dix και της επίδρασης της περίσσειας VIIa, με προεπώαση των δειγμάτων. 80

81 3. Μελέτη της δράσης της περίσσειας VIIa στην αντιμετώπιση του ανασταλτικού ρόλου των APC και APS σε δείγμα dix Στο παρακάτω πείραμα έγινε προσπάθεια μελέτης με του ανασταλτικού ρόλου της ενεργού πρωτεΐνης C (APC) και της ενεργού πρωτεΐνης S (APS) σε δείγμα dix και κατά το πόσο η δράση της περίσσειας VIIa μπορεί να αναιρέσει αυτή την αναστολή. Η φυσιολογική συγκέντρωση της APS στο πλάσμα είναι 25 μg/ ml. Για τις ανάγκες του πειράματος χρησιμοποιήθηκαν ποσότητες APC και APS 1, 2, και 3 φορές πάνω από το φυσιολογικό. Ο χρόνος επώασης των δειγμάτων είναι 30 min. dix +APC +APS 20μl dix 5μl TP (1:37,5) 0μl VIIa 4μl CaCl 2 21μl BB dix +APC +APS 20μl dix 5μl TP (1:37,5) 5μl VIIa 4μl CaCl 2 16μl BB dix +APC -APS 20μl dix 5μl TP (1:37,5) 5μl VIIa 4μl CaCl 2 16μl BB Με βάση τα αποτελέσματα που ακολουθούν, παρατηρείται ότι στην περίπτωση απουσίας της περίσσειας VIIa, η συνδυασμένη δράση των APC και APS οδηγεί σε μερική αναστολή στην παραγωγή θρομβίνης, για ποσότητες 3 φορές πάνω από το φυσιολογικό. Στην περίπτωση της παρουσίας της περίσσειας VIIa, περιορίζεται πλήρως η ανασταλτική δράση των APC και APS στις ποσότητες 3 φορές πάνω από το φυσιολογικό. Τέλος, παρουσία μόνο της APC, η περίσσεια VIIa, αποτρέπει την όποια αναστολή στην παραγωγή θρομβίνης Εικόνα 3. Ανοσοαποτύπωση του ανασταλτικού ρόλου των APC και APS σε δείγμα dix και η επίδραση της περίσσειας VIIa. 81

82 % FIIa dix+apc+aps-viia dix+apc+aps+viia dix+apc-aps+viia Σχήμα 3. Γράφημα με τη μορφή στηλών συγκριτικής απεικόνισης του ανασταλτικού ρόλου των APC και APS σε δείγμα dix και η επίδραση της περίσσειας VIIa. 4. Μελέτη της δράσης της περίσσειας VIIa στην αντιμετώπιση του ανασταλτικού ρόλου των APC και APS σε δείγμα dix, με προεπώαση των δειγμάτων Το πείραμα που ακολουθεί είναι παρόμοιο με το προηγούμενο με τη διαφορά ότι προηγήθηκε προεπώαση για 30 min των δειγμάτων με τις APC και APS πριν την έναρξη της κινητικής αντίδρασης. Οι ποσότητες των APC και APS που χρησιμοποιήθηκαν είναι 1, 2, και 3 φορές πάνω από το φυσιολογικό. Μετά την προεπώαση ακολούθησε επώαση των δειγμάτων για άλλα 30 min. dix +APC +APS 20μl dix 5μl TP (1:37,5) 0μl VIIa 4μl CaCl 2 21μl BB dix +APC +APS 20μl dix 5μl TP (1:37,5) 5μl VIIa 4μl CaCl 2 16μl BB dix +APC -APS 20μl dix 5μl TP (1:37,5) 5μl VIIa 4μl CaCl 2 16μl BB Με βάση τα αποτελέσματα που ακολουθούν, παρατηρείται ότι στην περίπτωση που προηγηθεί προεπώαση των δειγμάτων με APC και APS, επιτυγχάνεται πλήρης αναστολή στην παραγωγή θρομβίνης. Επίσης, διαπιστώνεται ότι η περίσσεια VIIa αδυνατεί να ανατρέψει την αναστολή. Στην περίπτωση της 82

83 επίδρασης μόνο της APC, η περίσσεια VIIa φαίνεται να περιορίζει μερικώς την αναστολή στην παραγωγή της θρομβίνης Εικόνα 4. Ανοσοαποτύπωση του ανασταλτικού ρόλου των APC και APS σε δείγμα dix, με προεπώαση των δειγμάτων και η επίδραση της περίσσειας VIIa % FIIa dix+apc+aps -VIIa dix+apc+aps +VIIa dix+apc-aps +VIIa Σχήμα 4. Γράφημα με τη μορφή στηλών συγκριτικής απεικόνισης του ανασταλτικού ρόλου των APC και APS σε δείγμα dix και η επίδραση της περίσσειας VIIa, με προεπώαση των δειγμάτων. 83

84 IV. ΠΡΟΣΠΑΘΕΙΑ ΜΕΛΕΤΗΣ ΤΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ Xa 1. Κινητική φυσιολογικού δείγματος (PRP + PPP) με προσθήκη περίσσειας VIIa Στο παρακάτω πείραμα μελετήθηκε η επίδραση της περίσσειας VIIa σε δείγμα φυσιολογικό (PPP + PRP), με χρώση του παράγοντα X. Μελετήθηκε η κινητική των δειγμάτων για χρόνους 8, 15, 25, 35, 45 και 60 min. Στο δείγμα πλούσιο σε αιμοπετάλια (PRP) είχαμε μακροσκοπική εμφάνιση θρόμβου αίματος στα 8 min, ενώ για το φτωχό σε αιμοπετάλια δείγμα (PPP) ο θρόμβος σχηματίστηκε στα 15 min. PPP 20μl PPP 20μl TP 5μl VIIa 4μl CaCl 2 1μl BB PRP 20μl PRP 20μl TP 5μl VIIa 4μl CaCl 2 1μl BB Εικόνα 1. Ανοσοαποτύπωση της κινητικής μετατροπής του παράγοντα X σε Xa,, σε δείγμα φυσιολογικό PPP και PRP, μετά την προσθήκη FVIIa. Δυστυχώς, δεν παρατηρείται καμία ζώνη που να αντιπροσωπεύει τον ενεργοποιημένο παράγοντα Xa. Πιθανών, η παραγόμενη ποσότητα να είναι ελάχιστη και να μην μπορεί να ανιχνευθεί από το ειδικό αντίσωμα. Επίσης, υπάρχει και το ενδεχόμενο το θραύσμα που απομακρύνεται κατά την μετατροπή του παράγοντα X σε Xa να αποτελεί και το επιτόπιο που αναγνωρίζεται από το αντίσωμα, καθιστώντας δυσμενή την ανίχνευσή του με την μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης. Μπορεί, βέβαια, 84

85 να ενεργοποιούνται εγκαίρως και οι αναστολείς του συστήματος, εμποδίζοντας με τη σειρά τους τον εντοπισμό του ενεργοποιημένου παράγοντα Xa στην μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. 2. Κινητική φυσιολογικού δείγματος (PRP + PPP) δίχως την προσθήκη περίσσειας VIIa Ως συνέχεια του προηγούμενου πειράματος, έγινε προσπάθεια να μελετηθεί η κινητική ενεργοποίησης του παράγοντα Χα σε φυσιολογικό δείγμα φτωχό (PPP) και πλούσιο (PRP) σε αιμοπετάλια, αντίστοιχα. Μελετήθηκε η κινητική των δειγμάτων για χρόνους 8, 15, 25, 35, 45 και 60 min, δίχως την προσθήκη του παράγοντα VIIa. PPP 20μl PPP 20μl TP 0μl VIIa 4μl CaCl 2 6μl BB PRP 20μl PRP 20μl TP 0μl VIIa 4μl CaCl 2 6μl BB Εικόνα 2. Ανοσοαποτύπωση της κινητικής μετατροπής του παράγοντα X σε Xa,, σε δείγμα φυσιολογικό PPP και PRP, δίχως την προσθήκη FVIIa. Όπως ήταν αναμενόμενο, με βάση και το προηγούμενο πείραμα, δεν παρατηρείται ζώνη που να αντιπροσωπεύει τον ενεργοποιημένο παράγοντα Xa. 85