ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Επίδραση του ιστικού παράγοντα και των αιμοπεταλίων στη δράση του παράγοντα της πήξης VIIa ΓΟΥΡΖΙΩΤΗ ΚΑΛΗ Επιβλέπων καθηγητής : Π. ΑΡΖΟΓΛΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007

2 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα ιδιαίτερα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα αναπληρωτή καθηγητή κύριο Π. Αρζόγλου για τη φιλοξενία στο εργαστήριο και τη σημαντική βοήθεια που μου προσέφερε κατά τη διάρκεια του μεταπτυχιακού, με τις γνώσεις και την πείρα του στο αντικείμενο της πήξης του αίματος. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω και τους αναπληρωτές καθηγητές κυρίους Τ. Γιουψάνη και Θ. Γιαννακούρο, που μαζί με τον κύριο Π. Αρζόγλου αποτελούν την τριμελή επιτροπή, για τις γνώσεις και τη βοήθεια που μου προσέφεραν κατά τη διάρκεια του μεταπτυχιακού. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως τη βιολόγο Σοφία Τιλκιρίδου για την άψογη συνεργασία, τη διδάκτορα Στέλλα Παράσχου και την υποψήφια διδάκτορα Ζωή Καρούλια για την πολύτιμη βοήθεια τους, και τέλος τον άντρα μου Γιάννη Μακρή για την αδιάκοπη υποστήριξη και ανοχή που έδειξε όλο αυτό το διάστημα. 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος...6 Εισαγωγή Αιμόσταση Αιμοπετάλια 10 3.Παράγοντες πήξης.13 4.Προθρομβίνη (II) / θρομβίνη (IIa) 18 5.Παράγοντας VII/VIIa Ιστικός παράγοντας (TF) Μηχανισμός της πήξης του αίματος..24 i) Εξωγενής δρόμος (tissue factor pathway)...25 ii) Ενδογενής δρόμος ή σύστημα επαφής (contact activation pathway) Νεότερα δεδομένα για το μηχανισμό της πήξης του αίματος 27 9.Φυσικοί αναστολείς του συστήματος της πήξης 30 αντιθρομβίνη III (ATIII).30 συμπαράγοντας II της ηπαρίνης (HCII) 30 TFPI (tissue factor pathway inhibitor) 30 πρωτεΐνη C. 31 α 2 -μακροσφαιρίνη..31 α 2 -αντιπλασμίνη α 1 -αντιθρυψίνη...31 χιρουδίνη.31 πρωτεΐνη Ζ. 31 Πειραματικό μέρος 31 Α) Αντιδραστήρια-υλικά. 31 Ρυθμιστικό διάλυμα ανασύστασης παραγόντων (Buffer A) Βιολογικά υλικά Βιοχημικά υλικά Όργανα Β) Τεχνικές-Μέθοδοι Ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες 3

4 παρουσία SDS (SDS- PAGE) Διαλύματα για SDS ηλεκτροφόρηση και δημιουργία της πηκτής...36 Ο ρόλος των συστατικών...38 Προετοιμασία πριν την εισαγωγή των δειγμάτων στη συσκευή ηλεκτροφόρησης Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή SDS στη μεμβράνη Τεχνική Western Blotting και διαλύματα απαραίτητα για αυτή Χρωματομετρική μέθοδος προσδιορισμού παραγωγής του FXa.. 43 Γ) Προετοιμασία των βιολογικών υλικών Δ) Αποτελέσματα Επίδραση της ανάδευσης του μίγματος αντίδρασης στην προσδιοριζόμενη προθρομβίνη και θρομβίνη.. 46 α) Κινητική δειγμάτων dvii + TP με και χωρίς ανάδευση και ομογενοποίηση του σχηματιζόμενου θρόμβου κατά την προετοιμασία των δειγμάτων. 46 i) χωρίς ανάδευση. 46 ii) ταυτόχρονη κινητική δειγμάτων με και χωρίς ανάδευση.. 47 β) Κινητική δειγμάτων dix + TP με και χωρίς ανάδευση και ομογενοποίηση του σχηματιζόμενου θρόμβου κατά την προετοιμασία των δειγμάτων Προσπάθεια ανίχνευσης του FXa με ανοσοαποτύπωση, χρησιμοποιώντας Assera X (αντίσωμα έναντι του FX )..49 α) Κινητική δειγμάτων dvii +TP 50 β) Κινητική δειγμάτων dix +TP.51 γ) Κινητική δειγμάτων dix +TP +VIIa δ) Κινητική δειγμάτων dv +VIIa +/- TP.. 52 ε) Κινητική δειγμάτων dix +dvii+tp +/- VIIa Επίδραση του FVIIa στην παραγωγή θρομβίνης, παρουσία θρομβοπλαστίνης (TP) και απουσία αιμοπεταλίων (PLT) 54 4

5 Κινητική δειγμάτων dix+dvii+tp+/-viia Επίδραση της θρομβοπλαστίνης (TP) στο αποτέλεσμα της δράσης του FVIIa α) απουσία αιμοπεταλίων (PLT). 57 i ) Κινητική δειγμάτων dix+dvii+viia+/-tp...58 ii) Κινητική φυσιολογικών δειγμάτων PPP+VIIa+/-TP..59 β) παρουσία αιμοπεταλίων (PLT). 60 Κινητική δειγμάτων PRP+VIIa+/-TP.60 γ) Επίδραση της συγκέντρωσης της θρομβοπλαστίνης (TP) στο αποτέλεσμα δράσης του FVIIa Επίδραση των αιμοπεταλίων (PLT) στο αποτέλεσμα της δράσης του FVIIa, χωρίς την παρουσία περίσσειας θρομβοπλαστίνης (TP).. 63 Κινητική φυσιολογικών δειγμάτων PPP+VIIa και PRP+VIIa Επίδραση των αιμοπεταλίων (PLT) στην παραγωγή θρομβίνης, παρουσία περίσσειας θρομβοπλαστίνης (TP).. 65 Κινητική φυσιολογικών δειγμάτων PPP+TP και PRP+TP Συνδυαστική δράση FVIIa και αιμοπεταλίων (PLT).67 Κινητική φυσιολογικών δειγμάτων PPP-VIIa, PPP+VIIa, PRP-VIIa, PRP+VIIa Μέτρηση του παραγόμενου FXa χρωματομετρικά...68 α) Μελέτη της παραγωγής FXa σε φυσιολογικό πλάσμα PPP, μετά προσθήκη θρομβοπλαστίνης (TP) 68 β) Μελέτη της παραγωγής FXa σε φυσιολογικό πλάσμα PPP μετά προσθήκη θρομβοπλαστίνης (TP) και FVIIa...70 γ) Μελέτη της παραγωγής FXa σε πλάσμα dix μετά την προσθήκη θρομβοπλαστίνης (TP) δ) Μελέτη παραγωγής FXa σε πλάσμα dix μετά προσθήκη θρομβοπλαστίνης (TP) και FVIIa.. 71 Συμπεράσματα από τη μελέτη του παραγόμενου FΧα χρωματομετρικά.72 Συζήτηση.75 Βιβλιογραφία 81 5

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης υπό την επίβλεψη του αναπληρωτή καθηγητή κυρίου Π. Αρζόγλου. Μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων παραγόντων στην παραγωγή α) της θρομβίνης και β) του παράγοντα Xa, με τη μέθοδο ανοσοαποτύπωσης Western Blot και επιπλέον χρησιμοποιήθηκε χρωματομετρική μέθοδος προσδιορισμού του παράγοντα Xa. Οι παράγοντες των οποίων η επίδραση μελετήθηκε είναι ο ιστικός παράγοντας, ο παράγοντας της πήξης VIIa και τα αιμοπετάλια και μάλιστα τα πειράματα επικεντρώθηκαν κυρίως στην επίδραση του ιστικού παράγοντα και των αιμοπεταλίων στη δράση του παράγοντα FVIIa. 6

7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Όλα τα όργανα του ανθρωπίνου σώματος λειτουργούν χάρη στο αίμα που κυκλοφορεί στις αρτηρίες, στις φλέβες και στα τριχοειδή αγγεία. Το αίμα αποτελεί το 1/13 του βάρους του σώματος, επομένως για τον ενήλικα είναι περίπου 5 λίτρα. Το αίμα είναι ζωντανός ιστός που τα κύτταρά του ανανεώνονται συνεχώς από μητρικά κύτταρα του μυελού των οστών και των λεμφαδένων. Είναι ένα εναιώρημα από ερυθρά αιμοσφαίρια, λευκά αιμοσφαίρια και αιμοπετάλια μέσα σε ένα σύνθετο διάλυμα, το πλάσμα. Τα ερυθρά αιμοσφαίρια, που αποτελούν το 45% του όγκου του αίματος, συμβάλλουν στη μεταφορά του οξυγόνου στους ιστούς και στην απομάκρυνση του CO 2 από τους πνεύμονες. Τα λευκά αιμοσφαίρια συμμετέχουν αποτελεσματικά στην άμυνα του οργανισμού, ενώ τα αιμοπετάλια είναι εκείνα που πρώτα φράζουν το σημείο τραυματισμού ενός αγγείου, σχηματίζοντας έναν αιμοστατικό αιμοπεταλιακό θρόμβο, ώστε να σταματήσει η αιμορραγία. Το πλάσμα αποτελεί το 55% του όγκου του αίματος, είναι διαφανές, ωχροκίτρινο υδατικό διάλυμα που περιέχει άλατα, λιποειδή, υδατάνθρακες, βιταμίνες, ορμόνες, αέρια ( O 2,CO 2, N 2 ) και κυρίως πρωτεΐνες. Το πλάσμα μεταφέρει με την κυκλοφορία τις θρεπτικές ουσίες στα κύτταρα και παίρνει από αυτά τα προϊόντα που πρέπει να αποβληθούν και τα μεταφέρει στα όργανα απέκκρισης (νεφρά, ήπαρ, πνεύμονες ). Οι πρωτεΐνες είναι απαραίτητα συστατικά για πάρα πολλές λειτουργίες π.χ. το ινωδογόνο και οι παράγοντες Εικόνα 1. Το ανθρώπινο αίμα 7

8 πήξης εξασφαλίζουν την πήξη του αίματος όταν τραυματιστεί κάποιο αγγείο και όχι μόνο με αποτέλεσμα τη δημιουργία θρόμβου που σταματάει οριστικά την αιμορραγία. Από τα παραπάνω φαίνεται πόσο πολύπλοκη είναι η σύνθεση του αίματος και πόσες σημαντικές λειτουργίες επιτελεί. 1.ΑΙΜΟΣΤΑΣΗ Η αιμόσταση συνίσταται από μια σειρά αλληλοδιάδοχων ενζυμικών αντιδράσεων, με αυτοκαταλυτικούς μηχανισμούς και μηχανισμούς ανάδρασης (feed back) που εξισορροπούνται από τη δράση ανασταλτικών μηχανισμών. Πιο απλά μπορούμε να πούμε ότι η αιμόσταση είναι ένας φυσιολογικός μηχανισμός που αποσκοπεί στην επίσχεση της αιμορραγίας. Σε τρώση αγγείου, ο οργανισμός διαθέτει αιμοστατικό μηχανισμό, ο οποίος περιλαμβάνει 4 στάδια : 1. αγγειοσύσπαση και πίεση του τραυματισμένου αγγείου από το εξαγγειωθέν αίμα 2. προσκόλληση, συσσώρευση των αιμοπεταλίων και σχηματισμό του αιμοπεταλιακού θρόμβου (αρχική αιμόσταση) 3. παραγωγή ινώδους και σχηματισμό του αιμοστατικού θρόμβου 4. συμμετοχή του ινωδολυτικού μηχανισμού. Τα στάδια 1 και 2 αποτελούν την προσωρινή αιμόσταση. Η συστολή των τραυματισμένων ή κομμένων άκρων των αιμορραγούντων αγγείων οφείλεται τόσο σε αντανακλαστικά που ξεκινούν από υποδοχείς του πόνου, όσο και στη δράση ορισμένων ουσιών (σεροτονίνη, κατεχολαμίνες ) που ελευθερώνονται από συγκολλούμενα και καταστρεφόμενα αιμοπετάλια. Ο αρχικός αγγειακός σπασμός, όμως, μετά από μισή ώρα περίπου υποχωρεί και έτσι είναι δυνατό να ξαναρχίσει η αιμορραγία εφόσον δεν έχει επέλθει στο μεταξύ η μόνιμη αιμόσταση (στάδιο 3).Η τελευταία αυτή προϋποθέτει : 8

9 Εικόνα 2. Προσωρινή αιμόσταση i. ο αρχικός αιμοπεταλιακός θρόμβος να συμπληρωθεί χάρη στους παράγοντες πήξης με τη δημιουργία του θρόμβου του ινώδους, μέσα στον οποίο παγιδεύονται και τα υπόλοιπα έμμορφα συστατικά του αίματος (ερυθρός θρόμβος) ii. να επέλθει συρρίκνωση του ερυθρού θρόμβου, η οποία συμβάλλει στη συμπλησίαση των χειλέων του αγγειακού τραύματος. Χωρίς τη συρρίκνωση αυτή ο θρόμβος μένει χαλαρός, δεν έχει σταθερή προσήλωση προς τα αγγειακά τοιχώματα και όταν υποχωρήσει η αρχική αγγειοσυστολή μπορεί να 9

10 ξεπλυθεί από το αίμα. Αργότερα γίνεται εισβολή ινοβλαστών στον ερυθρό θρόμβο, ο οποίος μετατρέπεται προοδευτικά σε ινώδη ιστό. Όπως φαίνεται παραπάνω το τελευταίο στάδιο της αιμόστασης είναι η ινωδόλυση. Ο κύριος λυτικός παράγοντας είναι η πλασμίνη ή ινωδολυσίνη, η οποία διασπά το ινώδες σε πεπτίδια, που αποδομούνται περαιτέρω από άλλες πεπτιδάσες του αίματος. Η πλασμίνη προέρχεται από το ανενεργό πλασμινογόνο το οποίο ενεργοποιείται από α) ιστικής προέλευσης παράγοντες (εξωγενές σύστημα ) όπως η θρυψίνη, η ουροκινάση και β) παράγοντες αιματικής προέλευσης (ενδογενές σύστημα ) όπως η ίδια η θρομβίνη. Η πλασμίνη δε δρα λυτικά μόνο στο δημιουργηθέν ινώδες αλλά επειδή είναι πρωτεολυτικό ένζυμο με ευρύ φάσμα δράσης ανταγωνίζεται και άλλους παράγοντες πήξης (ινωδογόνο, προθρομβίνη, παράγοντες V, VIII, IX, XII ). Γενικά, η πήξη του αίματος αρχίζει όταν αυτό εξέλθει από τα αγγεία και έρθει σε επαφή με μια διαβρεχόμενη επιφάνεια π.χ. γυαλί, δέρμα, τραυματισμένο ενδοθήλιο, ίνες κολλαγόνου, ξένα σώματα. 2.ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΑ Τα αιμοπετάλια είναι δισκοειδείς σχηματισμοί και αποτελούν θραύσματα της μεμβράνης των μεγακαρυοκυττάρων. Ένα μεγακαρυοκύτταρο έχει τη δυνατότητα παραγωγής αιμοπεταλίων,ενώ κάθε αιμοπετάλιο έχει διάρκεια ζωής 9-10 ημέρες. Αποτελούνται από τη μεμβράνη, το επικάλυμμα της μεμβράνης που καλείται γλυκοκάλυκας, τον κυτταρικό σκελετό και το κυτταρόπλασμα. Η μεμβράνη των αιμοπεταλίων περιβάλλεται εξωτερικά από τον γλυκοκάλυκα, ο οποίος συνίσταται από υδατάνθρακες και σιαλικό οξύ, με αρνητικό ηλεκτρικό φορτίο. Η κυρίως μεμβράνη αποτελείται από στιβάδα φωσφολιπιδίων και εσωτερικά από λευκώματα, άλλα από τα οποία παραμένουν στο εσωτερικό της μεμβράνης, ενώ άλλα διαπερνούν τη δίστιβη λιπιδική περιοχή. Η λιπιδική στιβάδα απαρτίζεται εξωτερικά κυρίως από σφιγγομυελίνες, δεν παίρνει μέρος στην αιμόσταση και έχει ουδέτερο ή 10

11 αρνητικό φορτίο, ενώ εσωτερικά από φωσφατιδυλοσερίνες με αρνητικό ηλεκτρικό φορτίο και παίρνει μέρος στην αιμόσταση. Κατά την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, η εσωτερική στιβάδα ξεδιπλώνεται προς τα έξω, αποκαλύπτοντας έτσι τους απαραίτητους υποδοχείς γλυκοπρωτεΐνες που θα πάρουν μέρος στη διαδικασία της αιμόστασης. Ο κυτταρικός σκελετός αποτελείται από συστήματα μικροσωληναρίων και συσταλτές πρωτεΐνες, με τα οποία το αιμοπετάλιο διατηρεί το σχήμα του, αλλά και συμμετέχει στη συστολή του θρόμβου. Το κυτταρόπλασμα είναι γεμάτο από σωματίδια (κοκκία) και άλλες ουσίες 1. τα κοκκία δ ή πυκνά κοκκία, τα οποία περιέχουν ATP, ADP, σεροτονίνη και ιόντα ασβεστίου και μαγνησίου 2. τα α- κοκκία τα οποία περιέχουν ινωδογόνο, φιμπρονεκτίνη, βιτρονεκτίνη, παράγοντα von Willebrand, τους παράγοντες V, VIII, XI, XIII, πρωτεΐνη S, αιμοπεταλιακό παράγοντα 4, αιμοπεταλιακό παράγοντα 3, θρομβοσπονδίνη, β- θρομβογλοβουλίνη, μιτογόνους παράγοντες, αναστολείς της ινωδόλυσης, TFPI και πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη μεμβράνη (π.χ. P-selectin). 3. τα κοκκία λ, τα οποία περιέχουν λυσοσωματικά ένζυμα 4. μιτοχόνδρια και θρομβοξάνη Τα αιμοπετάλια είναι κύτταρα συσταλτά και εκκριτικά, συμμετέχοντας ενεργά σε σημαντικές διαδικασίες της αιμόστασης i. προσκολλώνται και συσσωρεύονται στο σημείο τραυματισμού του αγγείου ii. διευκολύνουν και προάγουν την πήξη του αίματος στη φωσφολιπιδική τους επιφάνεια iii. απελευθερώνουν από τα α και δ-κοκκία σημαντικές για την αιμόσταση ουσίες iv. λαμβάνουν μέρος στη συστολή του θρόμβου Ειδικότερα η φιμπρονεκτίνη, η βιτρονεκτίνη, ο παράγοντας von Willebrand και η P-selectin προάγουν την προσκόλληση των αιμοπεταλίων 11

12 ο αιμοπεταλιακός παράγοντας 4, η θρομβοσπονδίνη και το ινωδογόνο προάγουν τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων το ινωδογόνο και οι παράγοντες V, XI, von Willebrand προάγουν την πήξη του αίματος η θρομβοσθενίνη και ο παράγοντας XIII προάγουν το φαινόμενο της συστολής του θρόμβου και τη σταθεροποίηση του ινώδους αντίστοιχα η σεροτονίνη και η θρομβοξάνη προάγουν την αγγειοσύσπαση Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες τα αιμοπετάλια δεν ενεργοποιούνται κυρίως λόγω του εξωτερικού τους αρνητικού φορτίου και λόγω του δισκοειδούς σχήματος, που καθιστά τους υποδοχείς απρόσιτους. Εικόνα 3. πάνω: ανενεργά αιμοπετάλια, κάτω: ενεργοποιημένα αιμοπετάλια Παρατηρούνται διαταραχές των αιμοπεταλίων όσον αφορά τον αριθμό, τη μορφολογία και την ποιότητά τους. Στις αριθμητικές διαταραχές διακρίνουμε τη 12

13 θρομβοκυττάρωση (PLT> ) και τη θρομβοπενία (PLT< ), στις μορφολογικές τα μεγάλα (giant) και τα μικρά αιμοπετάλια, ενώ οι ποιοτικές διαταραχές αναφέρονται σε λειτουργικές ανωμαλίες, δηλαδή σε βλάβες της προσκόλλησης, της συσσώρευσης και της αντίδρασης απελευθέρωσης (θρομβοπάθειες ). Από τις παραπάνω διαταραχές οι θρομβοπενίες αποτελούν σχετικά συχνό εύρημα στην κλινική πράξη. Μπορεί να οφείλονται σε ανεπαρκή παραγωγή, αυξημένη κατανάλωση ή καταστροφή των αιμοπεταλίων. Θεραπευτικά γίνεται προσπάθεια αντιμετώπισης της υποκείμενης νόσου και μόνο όταν απαιτείται γίνεται μετάγγιση αιμοπεταλίων, λόγω της ανάπτυξης αντισωμάτων μετά από επαναλαμβανόμενη λήψη αιμοπεταλίων από τον πάσχοντα οργανισμό. 3.ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΗΞΗΣ Η ονοματολογία των παραγόντων της πήξης στηρίζεται στη λατινική αρίθμηση I έως XIII (παράγοντας VI δεν υπάρχει ).Ορισμένοι παράγοντες συνηθίζονται να αποκαλούνται και με το όνομά τους, όπως το ινωδογόνο (I), η προθρομβίνη (II), ο ιστικός παράγοντας (TF ή III), τα ιόντα Ca ++ (IV ), η αντιαιμορροφιλική σφαιρίνη Α (VIII:C), η αντιαιμορροφιλική σφαιρίνη Β (IX),ο παράγοντας Hageman (XII) και ο παράγοντας που σταθεροποιεί το ινώδες (XIII). Ο τόπος παραγωγής των περισσοτέρων είναι το ήπαρ.ο TF και ο von Willebrand παράγονται κυρίως στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Οι ποσότητες των παραγόντων που κυκλοφορούν στο αίμα είναι πολύ μικρές ή ελάχιστες. Εξαίρεση αποτελεί το ινωδογόνο. Ο χρόνος ημίσειας ζωής τους ποικίλει από λίγες ώρες (παράγοντας VII 4-6 ώρες και πρωτεΐνη C 3-10 ώρες ), έως λίγες ημέρες (παράγοντας II 3-4 ημέρες και X 1-3 ημέρες ). Οι παράγοντες πήξης διακρίνονται σε ζυμογόνα και συμπαράγοντες. Συμπαράγοντας, στην αιμόσταση, καλείται ο παράγοντας που είναι απαραίτητος για τη δράση ενός ενζύμου. Σε αυτούς ανήκουν ο TF, η 13

14 θρομβομοδουλίνη, οι παράγοντες V και VIII, η Pr-C,η Pr-S, τα υψηλού μοριακού βάρους κινινογόνα (HMWK). Ζυμογόνο καλείται το πρόδρομο ανενεργό ένζυμο, χωρίς βιολογική δραστηριότητα, το οποίο μετατρέπεται σε ένζυμο με τη δράση άλλου ενζύμου. Σε αυτά ανήκουν οι παράγοντες II, VII, IX, X, XI, XII, XIII και η προκαλλικρείνη. Factor Molecular Weight Plasma Concentration (µg/ml) Required for Hemostasis (% of normal concentration) Fibrinogen 330, Prothrombin 72, Factor V 300, Factor VII 50, Factor VIII 300, Factor IX 56, Factor X 56, Factor XI 160, Factor XIII 320, Factor XII 76, Prekallikrein 82, HMWK 108, Πίνακας 1. Οι παράγοντες πήξης 14

15 Cofactor Location Mol Wt Activated by Cofactor for Factor V Plasma 300,000 Thrombin Factor Xa Factor VIII Plasma (bound to vwf) 300,000 Thrombin Factor IXa Tissue factor Cell membranes 40,000 Factor VIIa HMWK Plasma 110,000 Factor XIIa Πίνακας 2. Οι συμπαράγοντες στο μηχανισμό της πήξης Οι βιταμινο-κ εξαρτώμενοι παράγοντες, δηλ. εκείνοι οι οποίοι προκειμένου να ενεργοποιηθούν απαιτούν την καρβοξυλίωση γλουταμινικών ομάδων που περιέχονται στην ανενεργή τους μορφή από τη βιταμίνη Κ, έχουν εξαιρετικά χαμηλή καταλυτική ικανότητα. Η προσθήκη φωσφολιπιδίων (κυτ. μεμβράνης), του συμπαράγοντα και Ca ++, μεγιστοποιεί την καταλυτική τους ικανότητα. Για το λόγο αυτό δρουν με τη μορφή συμπλεγμάτων και όχι μεμονωμένα. Συνοπτικά, οι παράγοντες που επιτείνουν την πήξη του αίματος είναι : 1. οι βιταμινο-κ εξαρτώμενοι ( II, VII, IX, X ) 2. οι παράγοντες επαφής ( XII, XI, προκαλλικρεϊνη, HMWK) 3. οι παράγοντες που αποτελούν υπόστρωμα για τη δράση της θρομβίνης (I, V, VIII, XIII ) 4. ο ιστικός παράγοντας TF και η θρομβομοδουλίνη, που είναι ακέραιες πρωτεΐνες και δεν απαιτούν την ενεργοποίησή τους από άλλο παράγοντα ή σύμπλεγμα. Η ενεργοποίησή τους γίνεται αμέσως μετά την αποκάλυψή τους. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα ιόντα Ca και τα φωσφολιπίδια είναι απαραίτητα για τη λειτουργία των συμπλεγμάτων της ενδογενούς και της εξωγενούς δεκάσης, καθώς και της προθρομβινάσης. Τα ιόντα Ca εκτός των άλλων, μεσολαβούν στη σύνδεση αυτών των συμπλεγμάτων -μέσω τελικών γ-καρβοξυ καταλοίπων των παραγόντων Χα και FIXa - στη φωσφολιπιδική επιφάνεια των αιμοπεταλίων. 15

16 Εικόνα 4. Ανενεργοί παράγοντες πήξης και θέσεις δράσης των πρωτεασών για την ενεργοποίησή τους Το αίμα δεν πήζει κάτω από φυσιολογικές συνθήκες και αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι α) οι παράγοντες κυκλοφορούν στην προπηκτική τους (ανενεργός ) μορφή, β) κυκλοφορούν ανασταλτικοί παράγοντες της πήξης (AT-III, TFPI κ.ά.) και γ) συμμετέχει το σύμπλεγμα της πρωτεΐνης C-άσης (θρομβίνη,θρομβομοδουλίνη, ιόντα Ca ++ και κυτταρική μεμβράνη ), που μαζί με την πρωτεΐνη S ενεργοποιεί την πρωτεΐνη C, η οποία καταστέλλει την ενεργοποίηση της προθρομβίνης. 16

17 Η αιμορροφιλία Α και Β αποτελούν τα πιο γνωστά κληρονομικά αιμορραγικά νοσήματα, που όμως απαντώνται σπάνια. Οι ασθενείς με αιμορροφιλία τύπου Α παρουσιάζουν έλλειψη, μείωση ή μειονεκτική παραγωγή του σημαντικού παράγοντα πήξης VIII. Είναι μία φυλοσύνδετη νόσος η οποία προσβάλει κυρίως τους άντρες. Η νόσος μπορεί να μεταβιβαστεί στα κορίτσια από τον πατέρα. Η κόρη ενός αιμορροφιλικού θα είναι φορέας της νόσου. Η συχνότητα της νόσου είναι 1-2 στις γεννήσεις. Η αιμορροφιλία Β οφείλεται σε ανεπάρκεια του παράγοντα IX. Μεταβιβάζεται με τον ίδιο τρόπο όπως η Α αλλά είναι 5 φορές πιο σπάνια. Ο διαχωρισμός μεταξύ της αιμορροφιλίας Α και Β μπορεί να γίνει μόνο με εξέταση αίματος. Μερικές φορές ονομάζεται και Christmas παίρνοντας έτσι το όνομα του πρώτου ασθενή που διεγνώσθη με τη νόσο αυτή. Η αιμορροφιλία χαρακτηρίζεται ως 'βαριά' όταν οι τιμές του παράγοντα πήξης είναι χαμηλότερες του 1% του φυσιολογικού. Το γεγονός αυτό έχει σαν αποτέλεσμα ξαφνικά αιμορραγικά επεισόδια. Η νόσος είναι 'μέσης βαρύτητας' όταν ο παράγοντας πήξης είναι 1-5% του φυσιολογικού και 'ελαφριά' όταν οι τιμές είναι μεγαλύτερες του 5%. Περίπου το 50% των αιμορροφιλικών ασθενών παρουσιάζουν μέσης βαρύτητας ή βαριάς μορφής αιμορροφιλία και χρειάζονται θεραπεία για την αντιμετώπισης της από κάποιες φορές τον μήνα μέχρι και ελάχιστες φορές το χρόνο. Η θεραπεία των αιμορροφιλικών ασθενών καθώς και των ασθενών με έλλειψη κάποιου άλλου παράγοντα πήξης βασίζεται κατά κανόνα στη θεραπεία υποκατάστασης (υποκατάσταση του υπολειπόμενου παράγοντα). Οι παράγοντες πήξης υποκατάστασης προέρχονται συνήθως από ανθρώπινο πλάσμα και τελευταία με την τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA. Οι παράγοντες πήξης ανθρώπινης προέλευσης φέρουν τον κίνδυνο μετάδοσης ιών ενώ προϊόντα που προκύπτουν από το συνδυασμό ανθρώπινου πλάσματος ή ανασυνδυασμένων παραγόντων πήξης φέρουν τον κίνδυνο ανάπτυξης αντισωμάτων στον ασθενή. Η παρουσία αντισωμάτων σε έναν αιμορροφιλικό ασθενή προκαλεί συγκεκριμένα προβλήματα αφού η οποιαδήποτε ενέσιμη θεραπεία υποκατάστασης εξουδετερώνεται (neutralized) από αυτά και συνεπώς δεν θα έχει καμία επίδραση στο αιμορραγικό επεισόδιο. Από τα τέλη της δεκαετίας του '80 άρχισε η έρευνα και ανάπτυξη ασφαλών εναλλακτικών προϊόντων μη βασισμένα σε ανθρώπινο πλάσμα. Αυτή η 17

18 πρωτοποριακή έρευνα οδήγησε στον ανασυνδυασμένο παράγοντα πήξης (rfviia). Η καινοτόμος εναλλακτική θεραπεία οδήγησε σε υψηλά ποσοστά αποτελεσματικότητας σε εκατοντάδες ασθενείς με αντισώματα και έχει γίνει ο τυπικός τρόπος θεραπείας αυτών των ασθενών. Η θεραπεία με rfviia είναι ανεξάρτητη του τίτλου αντισωμάτων. Όλες οι άλλες διαθέσιμες θεραπείες είναι εξαρτώμενες του παράγοντα. Άλλες εναλλακτικές θεραπείες για τους αιμορροφιλικούς ασθενείς τύπου Α με αντισώματα περιέχουν υψηλές δόσεις FVIII και χοίρειο FVIII (το οποίο συνήθως δεν εξουδετερώνεται από τα ανθρώπινα αντισώματα. 4.ΠΡΟΘΡΟΜΒΙΝΗ (II) / ΘΡΟΜΒΙΝΗ (IIa) Η θρομβίνη δεν είναι ένα φυσιολογικό συστατικό του αίματος αλλά σχηματίζεται από τη μερική πρωτεόλυση του ζυμογόνου της, δηλ. της προθρομβίνης (ΙΙ), από τον ενεργοποιημένο παράγοντα Stuart (Xa), παρουσία του συμπαράγοντα Va. Εικόνα 5. Θρομβίνη Η θρομβίνη είναι μια γλυκοπρωτεΐνη, που παράγεται στην ανενεργό μορφή της την προθρομβίνη, αποκλειστικά στο ήπαρ.αποτελείται από δυο πεπτιδικές αλύσους των 36 και 259 αμινοξέων, που συνδέονται μεταξύ τους με 18

19 δισουλφιδικούς δεσμούς. Τρεις σημαντικές περιοχές έχουν εντοπιστεί στην επιφάνεια του ενζύμου : α) η καταλυτική, που προσφέρει στο μόριο τη δράση πρωτεάση της σερίνης, β) exosite 1, που είναι υπεύθυνο για τη σύνδεση με το υπόστρωμα ( ινωδογόνο ή υποδοχέας θρομβίνης ), γ) exosite 2 που είναι υπεύθυνο για τη δέσμευση με τον αναστολέα αντιθρομβίνη III και την απενεργοποίηση της θρομβίνης. Η θρομβίνη υδρολύει δεσμούς Arg-Gly του ινωδογόνου, απελευθερώνει 2 μόρια ινωδοπεπτιδίου Α και Β και δίνει στο ινωδογόνο την ικανότητα αυτοπολυμερισμού. Είναι ισχυρό πρωτεολυτικό ένζυμο και έχει ομοιότητες με τη θρυψίνη και τη χυμοθρυψίνη. Εικόνα 6. Η δράση της θρομβίνης στο ινωδογόνο Επίσης, ενεργοποιεί τον παράγοντα XIII και την πρωτεΐνη C. Η ενεργοποίηση του παράγοντα XΙΙΙ τον καθιστά ικανό να δράσει σαν τρανσαμινάση και να σχηματίσει δεσμούς μεταξύ καρβόξυλο- και αμινοομάδων δυο διαφορετικών μονομερών του ινώδους, ενισχύοντας τη σταθερότητα του θρόμβου. Η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης C συνεπάγεται την αδρανοποίηση (δρώντας πρωτεολυτικά) των παραγόντων Va και VIIIa, καταστέλλοντας έτσι την ενεργοποίηση της προθρομβίνης σε θρομβίνη. Εντούτοις, η θρομβίνη είναι κάτι παραπάνω από ένα ένζυμο του πλάσματος. Έχει την ικανότητα να διεγείρει τα αιμοπετάλια και να προκαλεί τη συσσώρευσή τους καθώς και την απελευθέρωση των ουσιών των α και δ κοκκίων. Η θρομβίνη,επίσης, έχει πολλές επιδράσεις και σε άλλα κύτταρα 19

20 όπως τα ηπατικά, τα ενδοθηλιακά κ.ά. Ο μηχανισμός με τον οποίο η θρομβίνη ενεργοποιεί τα αιμοπετάλια ή τα άλλα κύτταρα έγινε κατανοητός όταν το 1991 κλωνοποιήθηκε ένας υποδοχέας της θρομβίνης των αιμοπεταλίων, αποκαλύπτοντας ένα νέο μηχανισμό ενεργοποίησης υποδοχέα. Μετά τη σύνδεση με τον υποδοχέα, η θρομβίνη διασπά το αμινοτελικό άκρο, οπότε προκύπτει μια νέα αμινοτελική ακολουθία, η οποία δεσμεύεται στο τρίτο εξωκυττάριο loop του υποδοχέα και το ενεργοποιεί. Η θρομβίνη εκτός από το σημαντικό της ρόλο στην ενεργοποίηση της πήξης, συμμετέχει και στην καταστολή αυτής της διαδικασίας α) αδρανοποιώντας τους παράγοντες V και VIII με την ενεργοποίηση της πρωτεΐνης C και β) παράγοντας ένα αδρανές ενδιάμεσο προϊόν, τη meizothrombin, κατά την υδρόλυση της προθρομβίνης σε θρομβίνη. Έτσι, η θρομβίνη μετατρέπει την ανεξέλεγκτη έκρηξη της διαδικασίας της πήξης σε έκρηξη περιορισμένης έκτασης. 5.ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ VII / VIIa Ο παράγοντας VII ή προκομβερτίνη παράγεται αποκλειστικά στο ηπατοκύτταρο και αποτελεί μια απλή πρωτεϊνική αλυσίδα. Η ενεργοποίησή του επισυμβαίνει αμέσως μετά τη σύνδεσή του με τον ιστικό παράγοντα (TF). Εικόνα 7. Σύμπλεγμα TF/VIIa 20

21 Ο VIIa είναι ένας παράγοντας πήξης που έχει ρόλο κλειδί στην έναρξη της πήξης. Έχει πολύ μικρή ενδογενή πρωτεολυτική δράση, αλλά μετά από τραυματισμό των ιστών ο FVIIa, που κυκλοφορεί φυσιολογικά σε μικρές συγκεντρώσεις στο αίμα, δεσμεύεται ισχυρά στον TF πάνω στα υπενδοθηλιακά κύτταρα.το σύμπλοκο TF/VIIa ενεργοποιεί μόρια VII, τα οποία στη συνέχεια συνδέονται σε διαθέσιμες περιοχές του TF. Ο σχηματισμός του συμπλόκου TF/VIIa ενισχύει τη δραστικότητα του FVIIa κατά φορές και είναι το κλειδί για την έναρξη της πήξης. Στη συνέχεια το σύμπλοκο TF-VIIa ενεργοποιεί άμεσα ή έμμεσα (μέσω ενεργοποίησης του FIX) τον παράγοντα X για να σχηματιστεί τελικά ο FXa. Είναι ευρέως αποδεκτό ότι ο σχηματισμός συμπλόκου μεταξύ VIIa και TF είναι υποχρεωτικό βήμα για την έκφραση της δράσης του VIIa. Εντούτοις, αρκετές μελέτες έδειξαν την ανεξάρτητη από TF ενεργοποίηση του FX από υψηλές δόσεις FVIIa, παρουσία ιόντων Ca μόνο ή ιόντων Ca και φωσφολιπιδίων.οι μελέτες αυτές έδειξαν ότι σε φαρμακολογικές δόσεις ο FVIIa μπορεί να ενεργοποιήσει τον FIX πάνω σε ενεργοποιημένα αιμοπετάλια, απουσία TF. Στη συνέχεια, ο νεοσχηματιζόμενος FIXa, παρουσία FVIIIa, μπορεί να σχηματίσει επιπλέον συμπλέγματα δεκάσης, που ενισχύουν την παραγωγή του FXa και άρα της θρομβίνης.ο Monroe (2004) ανέφερε ένδειξη ότι ο δεσμευμένος σε ενεργοποιημένα αιμοπετάλια FVIIa, μπορεί να ενεργοποιήσει και άμεσα τον FX. Εικόνα 8. Δράση του FVIIa i)στο πλάσμα με τη μορφή VIIa/TF και ii)πάνω στα αιμοπετάλια χωρίς την παρουσία TF 21

22 Με εξαίρεση τους ασθενείς με ήπια μορφή της νόσου, η θεραπεία των αιμορραγικών επεισοδίων στην αιμορροφιλία Α (έλλειψη του FVIII) και στην αιμορροφιλία Β (έλλειψη του FIX) βασίζεται στην λήψη των παραγόντων πήξης που ανεπαρκούν (FVIII και FIX αντίστοιχα) σε ενέσιμη μορφή. Οι παράγοντες αυτοί προέρχονται από δεξαμενές ανθρώπινου πλάσματος ή είναι ανασυνδυασμένοι. Η λήψη σε ενέσιμη μορφή είναι απαραίτητη γιατί οι παράγοντες δεν μπορούν να απορροφηθούν από το αίμα. Ασθενείς με ήπια αιμορροφιλία Α χρησιμοποιούν ως θεραπεία μια ημισυνθετική διουρητική ορμόνη, τη δεσμοπρεσσίνη (deamino-8-d arginine vasopressin-ddavp), η οποία έχει την ιδιότητα να κινητοποιεί τον παράγοντα VIII από τους ιστούς, με συνέπεια την αύξηση στο αίμα έως και τέσσερις φορές. Έτσι, ο ασθενής χρησιμοποιώντας το δικό του παράγοντα VIII απαλλάσσεται από τις παρενέργειες της θεραπείας υποκατάστασης. Μια από τις σοβαρές επιπλοκές της θεραπείας των ασθενών που πάσχουν από αιμορροφιλία Α και Β είναι η ανάπτυξη αντισωμάτων έναντι των εξωγενώς χορηγούμενων παραγόντων. Λύση σε αυτό το πρόβλημα φαίνεται να προσφέρει ο ανασυνδυασμένος παράγοντας VIIa (rviia). Χορηγείται στις περιπτώσεις αιμορροφιλίας Α και Β (είτε εκ γενετής είτε επίκτητης), στην έλλειψη του FVII (σπάνια ασθένεια) και στη θρομβασθένεια Glanzmann. Ο rfviia είναι απαλλαγμένος από ανθρώπινες πρωτεΐνες. Η αμινοξική ακολουθία του είναι ακριβώς η ίδια με αυτή του πλάσματος. Οι μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις είναι ποιοτικά ίδιες με εκείνες του FVIIa του πλάσματος που πρακτικά οι δυο παράγοντες δεν ξεχωρίζουν. Η παραγωγή του γίνεται με έκφραση του παράγοντα σε νεφρικά κύτταρα χάμστερ, ακολουθεί καθαρισμός, που περιλαμβάνει τρεις ιοντο-ανταλλαγές και μια χρωματογραφία immunoaffinity. Μελέτες έδειξαν ότι η χορήγηση του rviia σε αιμορροφιλικούς ασθενείς επιταχύνει την έναρξη παραγωγής θρομβίνης, αυξάνει το ρυθμό παραγωγής της καθώς και τη μέγιστη τιμή της. Επειδή η κατασκευή και σταθερότητα του θρόμβου, όπως υποστηρίζεται, εξαρτάται από την ποσότητα της θρομβίνης, στους αιμορροφιλικούς ασθενείς η μειωμένη ποσότητα θρομβίνης που παράγεται (λόγω έλλειψης των παραγόντων πήξης) έχει ως αποτέλεσμα την κακή κατασκευή του θρόμβου. Η προσθήκη rviia, αν και δεν μπορεί να αντικαταστήσει στο 100% την έλλειψη των παραγόντων, προσφέρει (λόγω 22

23 μεγαλύτερης παραγωγής θρομβίνης ) καλύτερη κατασκευή του θρόμβου και σταθερότητα στις ινωδολυτικές επιδράσεις. 6.ΙΣΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ (TF) Ο ιστικός παράγοντας (FIII ή θρομβοπλαστίνη) είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη, που αποτελείται από τρεις περιοχές (domain). 1. Η μια περιοχή, που βρίσκεται εκτός κυττάρου, δεσμεύει τον FVIIa μέσω protein-protein interactions και από τα δυο μόρια.ο FVIIa αποτελείται από διάφορες περιοχές, μια από τις οποίες, η καρβοξυλιωμένη Gla περιοχή, δεσμεύει υπό την παρουσία ιόντων Ca, αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια. Η δέσμευση των φωσφολιπιδίων στον FVIIa ενισχύει τη σύνδεση αυτού με τον TF. 2. Μια άλλη περιοχή διαπερνά την υδρόφοβη κυτταρική μεμβράνη και 3. η τρίτη περιοχή, η οποία βρίσκεται στο εσωτερικό των κυττάρων και έχει σχέση με τη μετάδοση σημάτων μέσα στο κύτταρο. Εικόνα 9. Ο ιστικός παράγοντας : η εντόπιση και ο ρόλος του 23

24 Υπό φυσιολογικές συνθήκες εντοπίζεται στον υπενδοθηλιακό ιστό των αγγείων, στα αιμοπετάλια, στα λευκά αιμοσφαίρια και σε κύτταρα που περιβάλλουν τα αγγεία (π.χ. ινοβλάστες ) και έρχεται σε επαφή με το αίμα μόνο σε περιπτώσεις αγγειακής βλάβης. Τα κύτταρα του αίματος και τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων δεν εκφράζουν φυσιολογικά τον ιστικό παράγοντα. Όμως, σε βλάβη του αγγειακού τοιχώματος, ο κρυμμένος TF αποκαλύπτεται και η διαδικασία της πήξης ξεκινά, με τη σύνδεσή του με τον FVIIa. Στη συνέχεια το σύμπλοκο TF/VIIa ενεργοποιεί α) μόρια FVII,τα οποία συνδέονται σε διαθέσιμες περιοχές σύνδεσης μορίων TF και β) τους παράγοντες IX και X. Ο TF σχετίζεται με μια οικογένεια πρωτεϊνών, γνωστές ως οικογένεια υποδοχέων κυτταροκινών τύπου II. Οι κυτταροκίνες είναι μικρές πρωτεΐνες που μπορούν να επηρεάσουν τη συμπεριφορά των λευκών αιμοσφαιρίων του αίματος. Η σύνδεση του TF με τον FVIIa έχει βρεθεί επίσης ότι μπορεί να δώσει ενδοκυττάριο σήμα για την έναρξη σχηματισμού νέων αιμοφόρων αγγείων (αγγειογένεση ) και την αναστολή της απόπτωσης των κυττάρων δηλ. του κυτταρικού θανάτου. 7.ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΗΞΗΣ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ Ο καταρράκτης της πήξης της δευτερογενούς αιμόστασης (ή μόνιμης) αποτελείται από δυο δρόμους, τον ενδογενή (ή σύστημα επαφής ) και τον εξωγενή (ή δρόμος του ιστικού παράγοντα), που οδηγούν στο σχηματισμό του ινώδους. Υπήρχε η άποψη ότι ο καταρράκτης της πήξης αποτελείται από δυο ισάξιους δρόμους, που ενώνονται σε ένα κοινό δρόμο. Είναι πλέον αποδεκτό ότι ο κύριος δρόμος για την έναρξη της πήξης του αίματος είναι ο εξωγενής. Οι δυο αυτοί δρόμοι αποτελούν μια σειρά από αντιδράσεις, στις οποίες ένα ζυμογόνο (ανενεργός μορφή του ενζύμου) μιας πρωτεάσης της σερίνης και ο γλυκοπρωτεϊνικός συμπαράγοντάς του ενεργοποιούνται για να μπορέσουν στη συνέχεια να καταλύσουν την επόμενη αντίδραση στον καταρράκτη, καταλήγοντας στο σχηματισμό σταθερού ινώδους. 24

25 Οι παράγοντες πήξης είναι γενικά πρωτεάσες της σερίνης, με μερικές εξαιρέσεις όπως οι FV και ο FVIII, που είναι γλυκοπρωτεΐνες και ο FXIII, που είναι τρανσγλουταμινάση. Οι πρωτεάσες της σερίνης δρουν κόβοντας άλλες πρωτεΐνες σε συγκεκριμένες θέσεις. Ο μηχανισμός της πήξης μπορεί να συνοψιστεί ως εξής : i. Εξωγενής δρόμος (tissue factor pathway) : ο κύριος ρόλος του είναι η παραγωγή θρομβίνης, η οποία είναι το πιο σημαντικό μόριο του καταρράκτη της πήξης από την άποψη των αλληλεπιδράσεων που ασκεί σε πολλά μόρια που συμμετέχουν στη διαδικασία. Ο παράγοντας VIIa κυκλοφορεί στο πλάσμα σε ποσότητα μεγαλύτερη από κάθε άλλο ενεργοποιημένο παράγοντα πήξης. Μετά από αγγειακή βλάβη, αποκαλύπτεται ο ιστικός παράγοντας (TF) του υπενδοθηλίου του αγγείου και σχηματίζει σύμπλοκο με τον FVIIa (TF/VIIa), το οποίο ενεργοποιεί τους παράγοντες IX και X. Η ενεργοποίηση του FVII γίνεται από τη θρομβίνη, τον FXIa, την πλασμίνη, τον FXII, τον FXa και το σύμπλοκο TF/VIIa. Η ενεργοποίηση του FX από το TF/VIIa αναστέλλεται σχεδόν αμέσως από τον TFPI (tissue factor pathway inhibitor). O FXa και ο συμπαράγοντάς του FVa, παρουσία ιόντων Ca και φωσφολιπιδίων, σχηματίζουν την προθρομβινάση,η οποία ενεργοποιεί την προθρομβίνη σε θρομβίνη. Στη συνέχεια η θρομβίνη ενεργοποιεί άλλα μόρια που συμμετέχουν στη διαδικασία της πήξης, συμπεριλαμβανομένων των παραγόντων V και VII. Επίσης, ενεργοποιεί και απελευθερώνει τον FVIII από τον vwf (ο FVIIIa είναι ο συμπαράγοντας του FIXa και μαζί σχηματίζουν την ενδογενή δεκάση, παρουσία ιόντων Ca και φωσφολιπιδίων, που ενεργοποιεί τον FX και έτσι ο κύκλος συνεχίζεται ). ii. Ενδογενής δρόμος ή σύστημα επαφής (contact activation pathway) : σχηματίζεται το αρχικό σύμπλοκο πάνω στο κολλαγόνο από υψηλού μοριακού βάρους κινινογόνα (HMWK),την προκαλλικρεϊνη και τον FXII (Hageman factor). Η προκαλλικρεϊνη μετατρέπεται σε καλλικρεϊνη η οποία στη συνέχεια ενεργοποιεί τον FXII σε FXIIa. Ο FXIIa μπορεί να υδρολύσει επιπλέον καλλικρεϊνη καθώς και να ενεργοποιήσει τον FXI. Επίσης, απελευθερώνει τη βραδυκινίνη (αγγειοδιαστολέας), από τα HMWK.Ο FXIa που προκύπτει, στη συνέχεια ενεργοποιεί τον FIX, παρουσία ιόντων Ca. Ο FIX είναι ένα προένζυμο ( ζυμογόνο ) που περιέχει βιταμινο-κ-εξαρτώμενα-γκαρβοξυγλουταμινικά (gla) υπολείμματα του οπίου η δράση σαν πρωτεάση της 25

26 σερίνης ενεργοποιείται μετά τη σύνδεση των περιοχών gla με ιόντα Ca. Πολλές πρωτεάσες της σερίνης του καταρράκτη της πήξης (II, VII, IX, X) περιέχουν gla περιοχές. Ο FIXa μαζί με τον συμπαράγοντά του FVIIIa, παρουσία ιόντων Ca και φωσφολιπιδίων, σχηματίζουν την ενδογενή δεκάση, η οποία ενεργοποιεί τον FX. Ο μικρής σημασίας ρόλος του συστήματος επαφής στην έναρξη σχηματισμού του θρόμβου αντικατοπτρίζεται από το γεγονός ότι ασθενείς με σοβαρή έλλειψη του FXII, των HMWK και της προκαλλικρεϊνης δεν έχουν σοβαρές αιμορραγικές διαταραχές. Εντούτοις, σε μερικές περιπτώσεις όπως σε υπερλιπιδαιμικές καταστάσεις ή σε βακτηριακή διείσδυση μπορεί να ενεργοποιηθεί η διαδικασία της πήξης, με αποτέλεσμα θρόμβωση, μέσω του συστήματος επαφής. Ενεργοποίηση του ενδογενούς δρόμου συμβαίνει όταν η προκαλλικρεϊνη, τα HMWK, ο FXII και ο FXI εκτεθούν σε αρνητικά φορτισμένη επιφάνεια. Αυτή αποτελεί τη φάση επαφής και μπορεί να συμβεί σαν αποτέλεσμα αλληλεπίδρασης με φωσφολιπίδια ( κυρίως φωσφατυδιλαιθανολαμίνη ) των κυκλοφορούντων λιποπρωτεϊνών, όπως είναι τα χυλομικρά και οι VLDL. Αυτό είναι το υπόβαθρο του ρόλου της υπερλιπιδαιμίας στη δημιουργία μιας προθρομβωτικής κατάστασης. Η ενεργοποίηση του συστήματος επαφής μπορεί επίσης να συμβεί και στην επιφάνεια βακτηρίων. Ο ενδογενής και ο εξωγενής δρόμος της πήξης συγκλίνουν σε ένα κοινό σκοπό : την ενεργοποίηση του FX. Στη συνέχεια, ο FXa μαζί με τον συμπαράγοντά του FVa, παρουσία ιόντων Ca και φωσφολιπιδίων, ενεργοποιούν την προθρομβίνη σε θρομβίνη. Ο κύριος ρόλος της είναι να υδρολύσει δεσμούς Arg-Gly του ινωδογόνου,απελευθερώνοντας 2 μόρια ινωδοπεπτιδίου Α και Β, δίνοντας έτσι στο ινωδογόνο την ικανότητα αυτοπολυμερισμού. Το αποτέλεσμα είναι ο σχηματισμός ασταθούς γέλης ( gel ), η οποία μπορεί να διαλυθεί in vitro με διάλυμα 5Μ ουρίας ή 1% μονοχλωρικού οξέος. Η σταθεροποίηση του ινώδους και άρα του θρόμβου, απαιτεί ιόντα Ca και την ενεργοποίηση του FXIII από τη θρομβίνη. Έτσι το ινώδες γίνεται σταθερό και περισσότερο ανθεκτικό στη δράση της πλασμίνης. 26

27 Εικόνα 10. The coagulation cascade. Legend: HMWK = High molecular weight kininogen, PK = Prekallikrein, TFPI = Tissue factor pathway inhibitor. Black arrow = conversion/activation of factor. Red arrows = action of inhibitors. Blue arrows = reactions catalyzed by activated factor. Grey arrow = various functions of thrombin. 8.ΝΕΟΤΕΡΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΓΙΑ ΤΟ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟ ΤΗΣ ΠΗΞΗΣ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ Μελέτες έχουν δείξει ότι το παραπάνω κλασικό μοντέλο της πήξης του αίματος, με δύο ξεχωριστούς δρόμους, έναν ενδογενή και έναν εξωγενή, δεν αντικατοπτρίζει το τι πραγματικά συμβαίνει στη φύση ή τι συμβαίνει σε πραγματικούς ασθενείς. Η Maureane Hoffman και οι συνεργάτες της υποστηρίζουν ότι τα σύμπλοκα που παίρνουν μέρος στη διαδικασία της πήξης συναρμολογούνται πάνω σε λιπιδικές επιφάνειες που περιέχουν φωσφατιδυλσερίνη. Αυτή η παρατήρηση οδήγησε τους ερευνητές στην υπόθεση ότι ο ρόλος των κυττάρων στην αιμόσταση είναι κυρίως να προσφέρουν μια μεμβρανική επιφάνεια που να περιέχει φωσφατιδυλσερίνη για τον σχηματισμό των προπηκτικών συμπλόκων. 27

28 Έχοντας ως βάση τον κεντρικό ρόλο των κυττάρων στη ρύθμιση των διαδικασιών της πήξης, δημιουργήθηκε ένα μοντέλο αιμόστασης που διακρίνεται σε τρεις φάσεις : τη φάση έναρξης (initiation phase), στην οποία μια μικρή ποσότητα προθρομβίνης ενεργοποιείται πάνω σε κύτταρα που φέρουν TF, τη φάση ενίσχυσης (amplification phase), στην οποία η διαδικασία της πήξης μεταφέρεται από τα κύτταρα που φέρουν TF πάνω στην αιμοπεταλιακή επιφάνεια και τέλος τη φάση πολλαπλασιασμού (propagation phase) όπου μεγάλες πλέον ποσότητες θρομβίνης παράγονται στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων. Εικόνα 11. Το μοντέλο της Μ. Hoffman για τον μηχανισμό της πήξης Σύμφωνα με το μοντέλο που βασίζεται στον κεντρικό ρόλο των κυττάρων στην αιμόσταση, η έκθεση των παραγόντων της πήξης του πλάσματος σε κύτταρα που φέρουν TF επιτρέπει την αρχική ενεργοποίηση των παραγόντων X και IX. Όπως φαίνεται στην παραπάνω εικόνα ο FXa που ενεργοποιείται από το σύμπλοκο TF/VIIa, μπορεί στη συνέχεια να συνδεθεί με μικρές ποσότητες FVa, πάνω στην επιφάνεια κυττάρων που φέρουν TF. Τα σύμπλοκα της προθρομβινάσης (FXa/FVa) μπορούν να ενεργοποιήσουν μικρές ποσότητες προθρομβίνης πάνω στα προαναφερθέντα κύτταρα. Σχεδόν κάθε κύτταρο έχει έστω και μικρή ικανότητα να συμβάλλει στο σχηματισμό προθρομβινάσης στην επιφάνειά του με κύριο εκπρόσωπο τα αιμοπετάλια. Εντούτοις, η μικρή ποσότητα θρομβίνης που παράγεται πάνω στα κύτταρα που φέρουν TF, είναι σημαντική γιατί ενεργοποιεί τους συμπαράγοντες (FV και FVIII). Ο FVIII 28

29 αποκόπτεται από τον παράγοντα von Willebrand και ο FVIIIa δεσμεύεται στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων. Αυτή η θρομβίνη ενεργοποιεί, επίσης, και τα αιμοπετάλια. Τα αιμοπετάλια λειτουργούν και ως επιφάνεια ενεργοποίησης του FXI από τη θρομβίνη, καταργώντας ουσιαστικά την ανάγκη της ύπαρξης του FXII και των άλλων παραγόντων του συστήματος επαφής. Τα αιμοπετάλια μόλις ενεργοποιηθούν καλύπτονται με τους παράγοντες Va, VIIIa, XIa και είναι πλέον έτοιμα να συμβάλλουν στη μεγάλη παραγωγή θρομβίνης. Ο FIX που ενεργοποιήθηκε από το TF/VIIa διαχέεται στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων, ειδικά εάν τα τελευταία είναι κοντά στα κύτταρα που φέρουν τον ιστικό παράγοντα. Το σύμπλοκο FIXa / FVIIIa ενεργοποιεί τον πάνω στα αιμοπετάλια. Στη συνέχεια ο FXa συνδέεται με FVa, σχηματίζοντας σύμπλοκα προθρομβινάσης, τα οποία οδηγούν στην έκρηξη παραγωγής θρομβίνης που είναι απαραίτητη για το σχηματισμό του ινώδους. Σύμφωνα με τα παραπάνω, η M. Hoffman και οι συνεργάτες της υποστηρίζουν ότι οι αιμορροφιλικοί ασθενείς, στους οποίους λείπει είτε ο FVIII είτε ο FIX, αιμορραγούν γιατί στερούνται της ικανότητας παραγωγής FXa πάνω στα αιμοπετάλια, δηλ. δεν έχει τόσο σημασία η συνολική ποσότητα FXa αλλά κυρίως ο τόπος παραγωγής του. Ο FXa που παράγεται από το σύμπλοκο TF/VIIa δε μπορεί να μεταφερθεί πάνω στα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια, επειδή στο πλάσμα κυκλοφορούν πολύ καλοί αναστολείς του FXa, όπως ο TFPI και η ATIII, οπότε ο χρόνος ζωής του FXa στο πλάσμα είναι της τάξης δευτερολέπτων. Αντίθετα, ο FIXa μπορεί εύκολα να διαχυθεί από το πλάσμα στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων, επειδή η ATIII είναι ασθενής αναστολέας του και ο TFPI δεν τον αναστέλλει καθόλου. Η M. Hoffman και οι συνεργάτες της επίσης υποστηρίζουν ότι η χορήγηση υψηλών δόσεων FVIIa στους αιμορροφιλικούς έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση ενός ποσού FX πάνω στα αιμοπετάλια, οπότε και αποκαθίσταται κατά κάποιον τρόπο ο σχηματισμός προθρομβινάσης πάνω στα αιμοπετάλια και άρα η τρίτη φάση (propagation phase) δηλ. η έκρηξη παραγωγής θρομβίνης. Επιπλέον, επειδή το ποσό της παραγόμενης θρομβίνης επηρεάζει και την ποιότητα του θρόμβου, η χορήγηση υψηλών δόσεων FVIIa, εκτός από την μεγάλη παραγωγή θρομβίνης συμβάλλει 29

30 ταυτόχρονα και στην καλή ποιότητα του σχηματιζόμενου θρόμβου (κατασκευή ανθεκτική στη λύση από πλασμίνη ). 9.ΦΥΣΙΚΟΙ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΠΗΞΗΣ Οι φυσικοί αναστολείς είναι πρωτεΐνες του αίματος σε υψηλές συγκεντρώσεις, οι οποίες αποτελούν το 10% των πρωτεϊνών του πλάσματος και δρουν ως αντιπηκτικές αντιθρομβινικές ουσίες, αναστέλλοντας άμεσα ή έμμεσα τη δράση της θρομβίνης. Δρουν είτε 1) δημιουργώντας ένα σταθερό σύμπλεγμα με τη θρομβίνη (όπως η ATIII), είτε 2) αποδομώντας τους παράγοντες Va και VIIIa (όπως η ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C), είτε 3) ενισχύοντας τη δράση της πρωτεΐνης C (όπως η πρωτεΐνη S), είτε 4) απενεργοποιώντας τη συνδεδεμένη με το ινώδες θρομβίνη (όπως η χιρουδίνη), είτε 5) αποδομώντας τον παράγοντα Xa (όπως η πρωτεΐνη Z). Η αντιθρομβίνη III (ATIII) είναι μια γλυκοπρωτεΐνη που συντίθεται στο ήπαρ και τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων. Είναι ο μεγαλύτερος αναστολέας της θρομβίνης. Επίσης αναστέλλει τους παράγοντες XIIa, XIa, Xa, IXa, το σύμπλοκο TF/VIIa και το ινωδολυτικό ένζυμο πλασμίνη. Η δράση της ATIII αυξάνεται σημαντικά από την παρουσία ηπαρίνης (κατά φορές) Ο συμπαράγοντας II της ηπαρίνης (HCII) επίσης αναστέλλει τη θρομβίνη, με μηχανισμό παρόμοιο με αυτό της ATIII αλλά σε αντίθεση με αυτή δεν αναστέλλει άλλους παράγοντες πήξης. Η δράση της επιταχύνεται από την ηπαρίνη. Παρότι ο ακριβής ρόλος του HCII στη ρύθμιση της αιμόστασης δεν είναι τελείως γνωστός, έχει αναφερθεί σύνδεση μεταξύ έλλειψης του παράγοντα αυτού και θρόμβωσης. Ο TFPI (tissue factor pathway inhibitor) παράγεται κυρίως στο ενδοθήλιο και στα μεγακαρυοκύτταρα. Συνδέεται με τον FXa και στη συνέχεια το σύμπλεγμα TFPI/Xa, παρουσία ιόντων Ca, συνδέεται στο σύμπλεγμα TF/VIIa και το αναστέλλει. Η φυσιολογική απουσία της δράσης του TF στο άθικτο ενδοθήλιο και στο πλάσμα αποδίδεται στην παρουσία του TFPI. 30

31 Η πρωτεΐνη C είναι βιταμινο-κ-εξαρτώμενη γλυκοπρωτεΐνη και παράγεται αποκλειστικά στα ηπατοκύτταρα. Ενεργοποιείται από το σύμπλεγμα της πρωτεΐνης C-άσης (θρομβίνη, θρομβομοδουλίνη, ιόντα Ca και κυτταρική μεμβράνη) και δρα πρωτεολυτικά, αδρανοποιώντας τους συμπαράγοντες Va και VIIIa. Η δράση της Pr-C επιτείνεται από την Pr-S. Η α 2 -μακροσφαιρίνη, γλυκοπρωτεΐνη μεγάλου μοριακού βάρους, αναστέλλει την καλλικρεϊνη, αλλά έχει και ισχυρή αντιθρομβινική δράση, μικρότερη όμως της ATIII. Η αντιθρομβινική δράση της αποτελεί το 25% της συνολικής αντιθρομβινικής δράσης του πλάσματος,ενώ η ATIII εξουδετερώνει το 65% της θρομβίνης. Η α 2 -αντιπλασμίνη είναι αναστολέας της πρωτεάσης της σερίνης και αναστέλλει την πλασμίνη, ένα σημαντικό ένζυμο που συμμετέχει στην ινωδόλυση και στην αποδόμηση διάφορων άλλων πρωτεϊνών Η α 1 -αντιθρυψίνη είναι σφαιρίνη που παράγεται στο ήπαρ και αναστέλλει ασθενώς τη θρομβίνη και πιθανώς άμεσα τον FXII. Η χιρουδίνη απενεργοποιεί και την ελεύθερη και τη συνδεδεμένη με ινώδες θρομβίνη και επηρεάζει όλες τις παραμέτρους της αιμόστασης εκτός από το ινωδογόνο, την Pr-C και την ATIII. Η πρωτεΐνη Ζ είναι βιταμινο-κ-εξαρτώμενη γλυκοπρωτεΐνη και ο κύριος ρόλος της είναι η αποδόμηση του παράγοντα Χ, διαδικασία που μπορεί να γίνει από τις ZPI (protein Z-related protease inhibitor), αλλά η παρουσία της πρωτεΐνης Ζ επιταχύνει την αντίδραση κατά 1000 φορές. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α) Αντιδραστήρια-υλικά Για τη μελέτη του συστήματος χρησιμοποιούνται: Ρυθμιστικό διάλυμα ανασύστασης των παραγόντων (buffer B): 31

32 Χρησιμοποιείται σαν φυσιολογικός ορός. Έχει το ίδιο ph και την ίδια ωσμωτική πίεση με αυτή των κυττάρων και χρησιμοποιείται για την ανασύσταση των λυοφυλιωμένων παραγόντων/ τροποποιητών της πήξης του αίματος και ως μέσο αραίωσης και διατήρησης των κυττάρων. Για 100 ml τέτοιου διαλύματος χρειάζονται: 0,2423 gr Tris-HCl 0,8766 gr NaCl ρυθμίζεται το ph με HCl 7,4. Είναι οι τελικές συγκεντρώσεις: 20 mm Tris-HCl 0,15 M NaCl ph 7,4 Βιολογικά υλικά: Χρησιμοποιείται αίμα και πλάσμα φυσιολογικών ανθρώπων. Βιοχημικά υλικά: Χρησιμοποιείται ανασυσταμένος παράγοντας VIIa Novoseven, από τη Novo Nordisk, θρομβοπλαστίνη (TP, kit Thrombomat R1, Biomerieux Sa), rabbit anti-human factor II Serum (προθρομβίνη, Assera II, Diagnostica Stago), antirabbit alkaline phosphatase από Gibso BRL, BCIP (bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) και NBT (Nitro blue tetrazolium liquid) από τη Sigma και το γάλα είναι nonfat dry milk Carnation από την Nestle, France. Όργανα : Φυγόκεντρος τύπου: Sigma-201 M, συσκευή ηλεκτροφόρησης διαστάσεων 10x10 cm, συσκευή για το Blot: semi dry-blot apparatus, Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, αναδευτήρας τύπου : Edmund Buhler Swip KL-2 και vortex. Β) Τεχνικές και μέθοδοι Κατά την ηλεκτροφόρηση οι πρωτεΐνες και άλλα μακρομόρια (DNA, RNA) διαχωρίζονται καθώς κινούνται υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου, 32

33 μέσα από τους πόρους ενός πηκτώματος. Η ταχύτητα μετακίνησης των πρωτεϊνών (U) ή οποιουδήποτε άλλου καθαρού φορτίου εξαρτάται από την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου (Ε), το καθαρό φορτίο του μορίου (Ζ) και από τον συντελεστή τριβής (f) σύμφωνα με τον τύπο U=E*Z /f. Η ηλεκτροστατική δύναμη Εz που κατευθύνει το φορτισμένο μόριο προς το αντίθετα φορτισμένο ηλεκτρόδιο είναι αντίθετη της τριβής fv που εμφανίζεται μεταξύ του μορίου που μετακινείται και του μέσου. Η σταθερά τριβής f εξαρτάται από τη μάζα και το σχήμα του μορίου που μετακινείται καθώς επίσης και από την πυκνότητα και το ιξώδες του μέσου (πήκτωμα) (Gerotziafas G.T., 1999). Ο ηλεκτροστατικός διαχωρισμός γίνεται σχεδόν πάντα σε πηκτή παρά σε υγρό, διότι η πηκτή καταστέλλει τα ρεύματα που δημιουργούνται από μικρές βαθμιδώσεις της θερμοκρασίας (απαραίτητη προϋπόθεση για σωστό διαχωρισμό) και λειτουργεί ως μοριακός ηθμός καθιστώντας έτσι ευκολότερους τους διαχωρισμούς μορίων. Τα μόρια που είναι μικρά σε σχέση με τους πόρους της πηκτής μετακινούνται εύκολα διαμέσου της πηκτής, ενώ τα μεγάλα μόρια μένουν σχεδόν αμετακίνητα. Τα μόρια ενδιάμεσου μεγέθους μετακινούνται μέσα από την πηκτή με διαφορετικές ταχύτητες. Το πήκτωμα μπορεί να είναι από άμυλο ή αγαρόζη κυρίως όμως χρησιμοποιείται το πολυακριλαμίδιο, γιατί παρέχει μεγάλη επαναληψιμότητα αποτελεσμάτων, είναι χημικά αδρανές, διαφανές, σταθερό σε μεγάλο εύρος ρη, θερμοκρασίας και ιοντικής ισχύος και επιπλέον το μέγεθος των πόρων του μπορεί να ποικίλει σημαντικά. Οι πηκτές πολυακριλαμιδίου σχηματίζονται από το συμπολυμερισμό ακρυλαμιδίου (CH 2 =CH-CO-CN 2 ) και Ν,Ν μεθυλενοδισακρυλαμιδίου ή bis ακρυλαμιδίου (CH 2 =CH-CO-Cn-CH 2 -CH-CO-CH=CH 2 ) σε αναλογία 30/1 w/w αντίστοιχα. Το bis ακρυλαμίδιο συνδέει τις μακριές αλυσίδες του πολυμερισμένου ακρυλαμιδίου, σχηματίζοντας έτσι ένα τρισδιάστατο πλέγμα, το μέγεθος των πόρων του οποίου εξαρτάται από το βαθμό πολυμερισμού. Ο πολυμερισμός επιτυγχάνεται μέσω του μηχανισμού των ελευθέρων ριζών που παράγονται από το σύστημα υπερθειικού αμμωνίου (ΑPS) και Ν,Ν,Ν,Ν τετραμέθυλοαιθυλοδιαμίνης (TEMED). Το TEMED προκαλεί την δημιουργία ελευθέρων ριζών από το ΑPS οι οποίες καταλύουν τον πολυμερισμό. Οι πηκτές πολυακριλαμιδίου μπορεί να είναι κυλινδρικές ή επίπεδες, οπότε ο πολυμερισμός γίνεται είτε μέσα σε γυάλινα κυλινδρικά σωληνάκια είτε 33

34 ανάμεσα σε δύο γυάλινες πλάκες. Το σύστημα ηλεκτροφόρησης μπορεί να είναι συνεχές ή ασυνεχές. Στο συνεχές σύστημα χρησιμοποιείται το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα στην πηκτή και στα δοχεία ηλεκτροδίων. Στο ασυνεχές σύστημα διακρίνονται δύο πηκτές, η πηκτή επιστοίβαξης και η πηκτή διαχωρισμού. Υπάρχουν και τρία διαφορετικά ρυθμιστικά διαλύματα ηλεκτροδίων, το διάλυμα ηλεκτροδίων, το διάλυμα πηκτής επιστοίβαξης και το διάλυμα πηκτής διαχωρισμού. Η σύσταση, το ρη και το μέγεθος των πόρων των δύο πηκτών είναι τέτοια, ώστε στην πηκτή επιστοίβαξης τα δείγματα να συμπυκνώνονται και στο τέλος οι πρωτεΐνες να συσσωρεύονται σε στενές ζώνες μεγάλης συγκέντρωσης. Στην πηκτή διαχωρισμού επιτελείται ο διαχωρισμός τους, λόγω διαφορετικής κινητικότητας κάθε πρωτεΐνης. Έτσι επιτυγχάνεται πολύ καλύτερος διαχωρισμός από ότι στο συνεχές σύστημα. Τέλος, η ηλεκτροφόρηση δύναται να γίνει παρουσία ή απουσία αποδιατακτικών μέσων, όπως του απορρυπαντικού SDS (θειικό δωδεκανικό νάτριο) ή της ουρίας. Στην πρώτη περίπτωση (ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες), αποδιατάσσονται οι τυχόν υπομονάδες των πρωτεϊνών λαμβάνοντας τυχαίες διαμορφώσεις και διαχωρίζονται (Gerotziagas G.T., 1999). Στη δεύτερη περίπτωση (ηλεκτροφόρηση κάτω από μη μετουσιωτικές συνθήκες) τα πρωτεϊνικά μόρια διατηρούν άθικτες τις ανώτερες διαμορφώσεις τους και παραμένουν κατά κανόνα δραστικά. Β1) Ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες παρουσία SDS (SDS-PAGE) Με τη μέθοδο αυτή (εικόνα 12) οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται με βάση αποκλειστικά το μοριακό τους βάρος. Το SDS είναι ένα ανιοντικό απορρυπαντικό το οποίο δεσμεύεται πάνω στη ραχοκοκαλιά της πολυπεπτιδικής αλυσίδας με υδρόφοβους δεσμούς. Η δέσμευση γίνεται με σταθερό ποσό SDS ανά μονάδα βάρους πρωτεΐνης (περίπου 1,4 g SDSg πρωτεΐνης) και έχει ως αποτέλεσμα τη διάσπαση όλων των μη ομοιοπολικών δεσμών στο μόριο της πρωτεΐνης, την αποδιάταξή της και τη δημιουργία ενός επιμήκους συμπλόκου SDS πολυπεπτιδικής αλυσίδας με καθαρό αρνητικό φορτίο και περίπου σταθερό λόγο φορτίου ανά μονάδα μάζας πολυπεπτιδίου. 34

35 Εικόνα 12: Συσκευή ηλεκτροφόρησης Συνεπώς το ολικό φορτίο του συμπλόκου εξαρτάται μόνο από το μέγεθος της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και η ηλεκτροφορητική κινητικότητά του στην πηκτή αποκλειστικά από το μοριακό βάρος του πολυπεπτιδίου (Laemmli, 1970). Έτσι, καθίσταται δυνατός ο προσδιορισμός του μοριακού βάρους μιας πρωτεΐνης ή των υπομονάδων αυτής, έπειτα από τη σύγκριση της κινητικότητας με τις κινητικότητες πρωτεϊνών γνωστού μοριακού βάρους (μαρτύρων, εικόνα 13) στις ίδιες συνθήκες ηλεκτροφόρησης. Συγκεκριμένα η κινητικότητα ενός πολυπεπτιδίου στην SDS-PAGE είναι γραμμική συνάρτηση του λογαρίθμου του μοριακού του βάρους. Η μέθοδος χρησιμοποιείται ευρύτατα για την ταυτοποίηση, διαχωρισμό και χαρακτηρισμό πρωτεϊνών ή των υπομονάδων τους, καθώς επίσης για τον έλεγχο ομοιογένειας ενός πρωτεϊνικού κλάσματος. Παρουσιάζει όμως ορισμένους περιορισμούς. Έτσι, πολύ βασικές πρωτεΐνες ή πρωτεΐνες με μεγάλο βαθμό γλυκοσυλίωσης (επειδή δεσμεύουν απορρυπαντικό μόνο στο πρωτεϊνικό τμήμα τους) κινούνται πιο αργά στην πηκτή με αποτέλεσμα να τις ταυτοποιούμε λανθασμένα. Επίσης, λανθασμένο μοριακό βάρος μπορεί να προκύψει και για Εικόνα 13: μάρτυρες 35

36 ορισμένες περιπτώσεις πρωτεΐνών που δεν αποδιατάσσονται πλήρως με το SDS (Gerotziafas G.T., 1999). Η κατακόρυφη συσκευή χρησιμοποιείται κυρίως για ηλεκτροφορήσεις σε πηκτές πολυακριλαμιδίου, ενώ η οριζόντια για πηκτές αγαρόζης. Και στις δύο περιπτώσεις το δείγμα τοποθετείται με τη μορφή ζώνης οπότε τα μακρομόρια (πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα) κατά την κίνησή τους, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου για ορισμένο χρονικό διάστημα καταλαμβάνουν ορισμένες θέσεις στην πηκτή. Λαμβάνεται τελικά ένα σύνολο ζωνών που αντιστοιχούν στα διάφορα μακρομόρια. Συνήθως οι ζώνες γίνονται εμφανείς με την προσθήκη κατάλληλης βαφής ή με κάποια άλλη μέθοδο που μπορεί να στηρίζεται στο φαινόμενο φθορισμού ή στην εκπομπή ακτινοβολίας ισοτόπων κ ά. Β2) Διαλύματα για SDS ηλεκτροφόρηση και δημιουργία πηκτής Για την δημιουργία της πηκτής ηλεκτροφόρησης απαιτούνται δύο διαλύματα, το ένα για την πηκτή διαχωρισμού (seperating gel) και το άλλο για την πηκτή επιστοίβαξης (stacking gel) που εισάγεται στο επάνω μέρος της συσκευής και προκαλεί την επιστοίβαξη του δείγματος για να εισέλθει στη συνέχεια η άλλη πηκτή και να γίνει ο διαχωρισμός. Τα διαλύματα προετοιμάζονται ως εξής (Laemmli, 1970): Πηκτή διαχωρισμού (20 ml): 10 ml για το bottom και 10 ml ως seperating πάνω από το bottom: acrylamide / bis acrylamide 30% / 1% tris-hcl ph 8,9 1,875 M SDS 10% APS 10% TEMED H 2 O δις-απιονισμένο. 36

37 Για τις τελικές συγκεντρώσεις από τα stock διαλύματα απαιτούνται: 6,66 ml ακρυλαμίδιο 4 ml Tris-HCI ph 8,9 1 ml SDS 40 μl Temed 80 μl APS Συμπληρώνεται μέχρι 20 ml με δις-απιονισμένο νερό και χωρίζονται σε δύο μέρη των 10 ml. Τελικά προκύπτει ένα διάλυμα 10 ml seperating και ένα ίδιο διάλυμα bottom 10 ml με τελικές συγκεντρώσεις: 10% w/v ακρυλαμίδιο, Tris-HCl ph 8,9 0,375 M SDS 0, 5% Πηκτή επιστοίβαξης (10 ml): Χρησιμοποιούνται τα ίδια stock διαλύματα, εκτός από το Tris-HCl που χρειάζεται το διάλυμα 0,625 M, ph 6,8. Απαιτείται διάλυμα: 1,66 ml ακρυλαμίδιο 2 ml Tris-HCl ph 6,8 0,5 ml SDS 40 μl TEMED 80 μl APS Γίνεται προσθήκη δις-απιονισμένου νερού και τα 10 ml προστίθενται πάνω από την πηκτή διαχωρισμού. Σε περίπτωση που υπάρχουν φυσαλίδες μπορεί να ανασταλεί η αγωγή του ηλεκτρικού ρεύματος, οπότε για την αποφυγή τους, εισάγεται μια μικρή ποσότητα ισοπροπανόλης πάνω από κάθε στιβάδα. Πάνω από την πηκτή επιστοίβαξης τοποθετείται το χτενάκι, ώστε να δημιουργηθούν οι διαχωριστικές γραμμές και σχηματίζονται τα κενά όπου εισάγονται τα δείγματα με σκοπό να μην αναμειχθούν μεταξύ τους. 37

38 Ρόλος των συστατικών: SDS: αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες ώστε να προκύψουν πολύ-ανιολικές αλυσίδες πολυπεπτιδίων που διαχωρίζονται στη συνέχεια ηλεκτροφορητικά. acrylamide/bis acrylamide: πολυμερίζονται εύκολα με την προσθήκη ενός συστήματος που δημιουργεί ελεύθερες ρίζες. APS (υπερθειικό αμμώνιο): προκαλεί τη δημιουργία ελεύθερων ριζών. Ως εκκινητής του πολυμερισμού προστίθεται πάντα τελευταίο. TEMED: καταλύει την διάδοση των ελευθέρων ριζών στο σύστημα πολυμερισμού και προστίθεται ακριβώς πριν από το APS. Προετοιμασία πριν την εισαγωγή δειγμάτων στη συσκευή ηλεκτροφόρησης Πριν την εισαγωγή των δειγμάτων προστίθεται σε αυτά loading buffer (L.B.) ως χρωστική, ώστε να διαφαίνεται η πορεία τους και η τελικές τους θέσεις. Για την παρασκευή 10 ml L.B. ως stock απαιτούνται: 0,3125 M Tris-HCl ph 6,8 10% w/v SDS 50% v/v glycerol 0,1% w/v bromophenol blue Για να χρησιμοποιηθεί αραιώνεται 5 φορές και προκύπτουν οι τελικές συγκεντρώσεις: 62,5 mm Tris-HCl ph 6,8 2% w/v SDS 10% v/v glycerol 0,02% w/v bromophenol blue 2% μερκαπτοαιθανόλη Η μερκαπτοαιθανόλη χρησιμοποιείται για την αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών και την αποδιάταξη των πρωτεϊνών στις επιμέρους αλυσίδες τους. 38

39 Στο επάνω και κάτω μέρος της συσκευής ηλεκτροφόρησης εισάγεται το running buffer, ώστε να αρχίσει να άγεται το ρεύμα και να μεταφέρει τις αρνητικά πια φορτισμένες πρωτεΐνες στο κάτω μέρος της συσκευής, δηλαδή στην άνοδο. Για την παρασκευή πρότυπου διαλύματος 500 ml χρησιμοποιούνται: 72 gr γλυκερίνης 15 gr Tris-HCl και 5 gr SDS Το SDS προστίθεται τελευταίο, αφού πρώτα ρυθμιστεί το ph 8,8. Με αυτόν τον τρόπο προκύπτει ένα πυκνό διάλυμα το οποίο για να χρησιμοποιηθεί πρέπει να αραιωθεί 10 φορές. Αφού ετοιμαστεί η συσκευή και εισαχθούν τα δείγματα προσεκτικά, το σύστημα τροφοδοτείται με I=25 ma. Όταν τα δείγματα φτάσουν στην πηκτή διαχωρισμού, ρυθμίζεται το σύστημα σε I=35 ma. Μόλις τα δείγματα φτάσουν στο bottom σταματά η τροφοδότηση και ακολουθείται η τεχνική του Western Blotting για να ηλεκτρομεταφερθούν οι πρωτεΐνες στη μεμβράνη και να γίνουν οι παρατηρήσεις. Β3) Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή SDS σε μεμβράνη Η διαδικασία ηλεκτρομεταφοράς των πρωτεϊνών από SDS σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF (immobilon) είναι γνωστή ως Western blotting (εικόνα 14). Βασίζεται στο γεγονός ότι τα σύμπλοκα πρωτεϊνών-sds που είναι αρνητικά φορτισμένα μετακινούνται κατά την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου προς την άνοδο, εξέρχονται από την πηκτή και καθηλώνονται στη μεμβράνη λόγω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Πρωτεΐνες οι οποίες έχουν καθηλωθεί σε μεμβράνη μπορούν να ανιχνευτούν με χρήση αντισωμάτων ή να γίνει προσδιορισμός της αμινοτελικής αμινοξικής αλληλουχίας τους σε 39

40 αυτόματο αναλυτή (στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιείται αποκλειστικά η μεμβράνη PVDF). Εικόνα 14: Προετοιμασία για την τεχνική Western Blotting Β4) Τεχνική Western blotting και διαλύματα απαραίτητα για αυτήν Η τεχνική του Western blot χρησιμοποιείται, επειδή υπάρχουν τα κατάλληλα αντισώματα στα οποία μπορούν να δεσμεύονται οι πρωτεΐνες. Έτσι, μπορούν να μεταφέρονται οι πρωτεΐνες σε μία μεμβράνη για να δεσμευτούν από το αντίσωμα. Το αντίσωμα λόγω του μεγάλου μοριακού βάρους του δεν μπορεί να διαπεράσει την πηκτή. Παρασκευάζονται και χρησιμοποιούνται τα παρακάτω διαλύματα (Gerotziafas G.T., 1999): Transfer buffer: για την παρασκευή 300 ml απαιτούνται: 4,5 gr Tris-HCl 2,3 gr Borate 6 ml 10% SDS Το ph δεν χρειάζεται να ρυθμιστεί και μετά την αραίωση του διαλύματος στον τελικό όγκο είναι 8,58. Το διάλυμα χρησιμοποιείται ως stock και για τη συμμετοχή του στις αντιδράσεις αραιώνεται 10 φορές. Τελικές συγκεντρώσεις: 125 mm Tris-HCl 40

41 125 mm Borate (Boric acid) 0,2 % SDS ph 8,58 PBS: για την παρασκευή 300 ml χρειάζονται: 24 gr NaCl 0,6 gr KCI 4,32 gr Na 2 HPO 4 2H 2 O 0,6 gr KH 2 PO 4 Γίνεται αποστείρωση σε χύτρα και ρυθμίζεται το ph 7,4 και το διάλυμα χρησιμοποιείται αραιωμένο επί 10. Οι τελικές συγκεντρώσεις είναι: 137 mm NaCl 2,68 mm KCI 8,1 mm Na 2 HPO 4 2H 2 O 147 mm KH 2 PO 4 ph 7,4 Alkaline phosphate buffer: για την παρασκευή 100 ml απαιτούνται 5,84 gr NaCl 1 M 2 ml MgCl 2 8,5 M 12,114 gr Tris-HCl 1 M Το ph ρυθμίζεται 9,5 με το Tris και γίνεται προσθήκη NaCl και MgCl 2. Πραγματοποιείται αραίωση 10 φορές και οι τελικές συγκεντρώσεις είναι: 5,84 gr NaCl 2 ml MgCl 2 2,5 M 12,114 gr Tris-HCl ph 9,5 Αφού φτάσουν οι πρωτεΐνες στο bottom της συσκευής, κόβεται το gel που περιέχει τις διαδρομές των πρωτεϊνών. Τοποθετείται ως κάτω στρώση 41

42 στη συσκευή το χαρτί Whatman, αφού πρώτα εμποτιστεί στο transfer buffer. Ύστερα τοποθετείται το ειδικό πλαστικό της συσκευής και μετά η ειδική μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (εμποτισμένη με transfer buffer) όπου μεταφέρονται οι πρωτεΐνες από το gel. Πάνω από τη μεμβράνη τοποθετείται το gel και τέλος ένα ακόμη χαρτί Whatman σε μεγάλο μέγεθος, αφού έχει εμποτιστεί και αυτό σε transfer buffer (εικόνα 15). Εικόνα 15: προετοιμασία για την τεχνική Western Blotting Έχει μεγάλη σημασία να μην υπάρχουν φυσαλίδες, διότι δεν επιτρέπουν τη διέλευση του ρεύματος. Διαβιβάζεται ηλεκτρικό ρεύμα στα 72 ma και χρονομετρείται 1 1/2 ώρα στη συσκευή, όταν πρόκειται για τη θρομβίνη και 1 ώρα όταν πρόκειται για τον FX. Η ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών από το gel στη μεμβράνη βασίζεται στην κίνηση των πρωτεϊνών που είναι συμπλεγμένες με SDS (αρνητικό φορτίο) από την πηκτή προς την μεμβράνη. Όταν, λοιπόν, εφαρμοστεί ηλεκτρικό δυναμικό μεταξύ της πηκτής και της μεμβράνης, εγκλωβίζονται οι πρωτεΐνες στο πλέγμα της πολύ ευαίσθητης μεμβράνης. Αφού μεταφερθούν οι πρωτεΐνες στη μεμβράνη, ακολουθούν τα παρακάτω βήματα: a) Τοποθετείται η μεμβράνη σε διάλυμα γάλακτος 5 % w/v σε PBS (προσθέτονται 2,5 gr γάλα σε σκόνη σε 50 ml PBS) για 45 λεπτά για ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου. Η παραπάνω διαδικασία συμβαίνει για να κορεστεί η μεμβράνη με τις πρωτεΐνες του γάλακτος, ώστε να μην υπάρχουν κενά και το αντίσωμα που εισέρχεται μετά να δεσμεύεται μόνο στη συγκεκριμένη πρωτεΐνη για την οποία προστίθεται. 42

43 b) Αμέσως μετά χύνεται το γάλα και προσθέτονται 2,5 μl αντίσωμα assera II σε 10 ml γάλα 5% w/v σε PBS (αραίωση 1/4000). Γίνεται ανάδευση του διαλύματος με την μεμβράνη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Στη συνέχεια αφήνονται όλη τη νύχτα στο ψυγείο, ώστε να πραγματοποιηθεί δέσμευση στην αντίστοιχη πρωτεΐνη. Εναλλακτικά αναδεύεται η μεμβράνη για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Το αντίσωμα δεσμεύει μόνο τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη για την οποία προστέθηκε. c) Ακολουθούν δύο πεντάλεπτα ξεπλύματα με διάλυμα PBS με tween (0,5 ml tween σε 100 ml διαλύματος PBS). d) Σειρά έχει η επώαση με antirabbit (δευτερεύον αντίσωμα), που δεσμεύει το αντίσωμα και βοηθάει στη χρώση. Προσθέτονται 3 μl antirabbit σε 10 ml του προηγούμενου διαλύματος PBS με γάλα (αραίωση 1/2000) στη μεμβράνη και πραγματοποιείται επώαση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου ή όλη τη νύχτα κάτω από ψύξη. Το antirabbit θα μπορούσαμε να χαρακτηριστεί ως το αντί-αντίσωμα. e) Ξεπλένεται 2 φορές η μεμβράνη για 5 λεπτά την κάθε φορά με PBS και tween f) Στο σημείο που δεσμεύεται το antirabbit παρατηρείται χρώση, επομένως και στο αντίσωμα και στην πρωτεΐνη. Προσθέτονται 30 μl NBT και 20 μl BCIP σε 10 ml alkaline phosphatase buffer. g) Ακολουθεί ανάδευση μέχρι να εμφανιστούν οι ζώνες, ξεπλένεται η μεμβράνη με λίγο νερό και τοποθετείται απαλά στο χαρτί Whatman για παρατήρηση και εξαγωγή συμπερασμάτων. Β5) Χρωματομετρική μέθοδος προσδιορισμού παραγωγής του FXa Στα πειράματα που ακολουθούν έγιναν προσπάθειες ανίχνευσης του παραγόμενου κάθε φορά FXa με τις μεθόδους SDS-PAGE και Western blot, χωρίς όμως αποτέλεσμα. Πιθανόν οι μικρές ποσότητες του παραγόμενου FXa κατά τη διάρκεια των διαδικασιών της πήξης, να αποτελεί τον κύριο 43

44 παράγοντα που καθιστά τις παραπάνω μεθόδους μη αποδοτικές. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιήθηκε χρωματομετρική μέθοδος για την μελέτη της παραγωγής του FXa. Η μέθοδος βασίζεται στην υδρόλυση ενός χρωμογόνου υποστρώματος από τον παραγόμενο FXa. Η απελευθέρωση παρανιτροανιλίνης από το υπόστρωμα ανιχνεύεται και καταγράφεται από τη συσκευή. Χρησιμοποιήσαμε 500μl μίγματος αντίδρασης εκ των οποίων τα 150μl αποτελούν το υπόστρωμα και τα υπόλοιπα 350μl απαρτίζονται από 25μl πλάσμα φτωχό σε αιμοπετάλια είτε φυσιολογικό είτε με έλλειψη του FIX, 100μl θρομβοπλαστίνη, 40μl CaCl 2 και 185μl Buffer B. Στις περιπτώσεις προσθήκης FVIIa (15μl) αφαιρούνται αντίστοιχα 15μl Buffer B. Γ) Προετοιμασία των βιολογικών υλικών Σ αυτή τη διπλωματική εργασία γίνεται μελέτη in vitro της μετατροπής της προθρομβίνης (FII) σε θρομβίνη (FIIa) κατά τον εξωγενή δρόμο, όταν επιδρούν σε αυτόν διάφοροι τροποποιητές της πήξης. Η μελέτη πραγματοποιείται με εξειδικευμένες τεχνικές προσδιορισμού των δύο αυτών παραγόντων της πήξης που βασίζονται στην ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακριλαμιδίου και στην τεχνική της ηλεκτρομεταφοράς πρωτεϊνών από SDS σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης που είναι γνωστή ως Western blotting. Επίσης γίνεται προετοιμασία και επεξεργασία των δειγμάτων αίματος τα οποία προήλθαν από υγιείς ανθρώπους και αποτελούν αντιπροσωπευτικό δείγμα. Για τα πειράματα χρησιμοποιείται ολικό αίμα, αίμα πλούσιο σε αιμοπετάλια (platelet rich plasma, PRP), αίμα φτωχό σε αιμοπετάλια (platelet poor plasma, PPP). i) Για την παρασκευή πλάσματος φτωχού σε αιμοπετάλια απαιτείται συγκεκριμένη διαδικασία. Από αιματολογικό εργαστήριο παραλαμβάνεται ολικό αίμα με αντιπηκτικά άλατα του κιτρικού οξέος που προέρχεται από όσο το δυνατό περισσότερους δότες, ώστε να μπορεί να χαρακτηριστεί ως 44

45 αντιπροσωπευτικό δείγμα, δηλαδή φυσιολογικό. Στη συνέχεια φυγοκεντρούνται τα δείγματα για 20 λεπτά στις 6000 rpm και κρατείται το υπερκείμενο. Για την παρασκευή πλάσματος πλούσιου σε αιμοπετάλια το αίμα φυγοκεντρείται αντίστοιχα στις 1000 rpm για 1 λεπτό. ii) Προετοιμασία δειγμάτων για ηλεκτροφόρηση. Κατά την προετοιμασία των δειγμάτων χρησιμοποιείται το Buffer Β. Επίσης, ο τελικός όγκος σε όλα τα δείγματα που προετοιμάζονται είναι 70 μl και συμπληρώνεται το καθένα με νερό δις απιονισμένο μέχρι 200 μl. Το αρχικό μίγμα αντίδρασης περιλαμβάνει 20μl πλάσμα, 26μl Buffer B, 4μl CaCl 2 και 20μl EDTA στο οποίο μετά την επώαση προστίθενται 130μl δις απιονισμένο νερό. Σε περίπτωση προσθήκης επιπλέον παραγόντων που θέλουμε να εξετάσουμε, προκειμένου ο τελικός όγκος των δειγμάτων να είναι σταθερός στα 200μl, αφαιρείται αντίστοιχη ποσότητα Buffer B. Εάν για παράδειγμα προσθέσω 20μl θρομβοπλαστίνη ή 5μl FVIIa, η ποσότητα του Buffer B μειώνεται αντίστοιχα σε 6μl και 11μl. Να σημειωθεί ότι το αρχικό (stock) διάλυμα του FVIIa είναι 0.545mg/ml και στα πειράματά μας χρησιμοποιήσαμε αραίωση αυτού 1:100 δηλ. 5.45mg/ml. Η αντίδραση ξεκινά με την προσθήκη χλωριούχου ασβεστίου, γιατί απαιτούνται τα ιόντα Ca, τα οποία όμως είναι δεσμευμένα και πρέπει να αποδεσμευτούν. Η βέλτιστη συγκέντρωση ιόντων ασβεστίου είναι τα 4 μl. Η αντίδραση σταματά με την προσθήκη EDTA που δεσμεύει τα ιόντα ασβεστίου. Η συγκέντρωση EDTA που συνήθως χρησιμοποιείται είναι τα 20 μl, καθώς από πρέπει να είναι η πενταπλάσια συγκέντρωση από αυτή των ιόντων ασβεστίου. Στο τέλος προστίθενται τα 130μl νερού δις απιονισμένου. Η βέλτιστη θερμοκρασία επώασης είναι οι 37 βαθμοί Κελσίου στο υδατόλουτρο για τον κάθε σωλήνα που περιέχει δείγμα και αυτές ακριβώς οι συνθήκες ακολουθούνται στην κάθε πειραματική διαδικασία που ακολουθεί. Ακολουθείται η ίδια διαδικασία για την προετοιμασία του κάθε δείγματος. Κάθε φορά αποσπώνται 10 μl από το κάθε δείγμα και προστίθενται σε κάθε eppendorf ξεχωριστά 5 μl loading buffer, 5 μl διςαπεσταγμένο νερό και από 2 μl μερκαπτοαιθανόλη. Αφήνονται τα δείγματα για 2 λεπτά σε κατσαρόλα με νερό που βράζει, για να γίνει πλήρης αποδιάταξη των πρωτεϊνών και φυγοκεντρούνται σε χαμηλές στροφές για την εύκολη παραλαβή των δειγμάτων για την ηλεκτροφόρηση. 45

46 Δ) Αποτελέσματα 1) ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΔΕΥΣΗΣ ΤΟΥ ΜΙΓΜΑΤΟΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΣΤΗΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΠΡΟΘΡΟΜΒΙΝΗ & ΘΡΟΜΒΙΝΗ Κατά την προετοιμασία των δειγμάτων, μετά την προσθήκη του EDTA (προκειμένου να σταματήσει η αντίδραση ), λαμβάνεται ποσότητα του μίγματος αντίδρασης, ώστε με την προσθήκη νερού, χρωστικής LB και μερκαπτοαιθανόλης να σχηματισθεί το τελικό μίγμα, το οποίο στη συνέχεια ηλεκτροφορείται και με την τεχνική της ανοσοαποτύπωσης εμφανίζονται οι κατάλληλες ζώνες (αναλόγως του χρησιμοποιούμενου αντισώματος) πάνω σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η λήψη ποσότητας του μίγματος αντίδρασης μπορεί να γίνει είτε από το υπερκείμενο διάλυμα (πάνω από το σχηματιζόμενο θρόμβο) είτε μετά από ανάδευση και διάλυση του θρόμβου, οπότε και προκύπτει ένα σχετικά ομοιογενές διάλυμα. α) Κινητική δειγμάτων dvii + TP με και χωρίς ανάδευση και ομογενοποίηση του σχηματιζόμενου θρόμβου κατά την προετοιμασία των δειγμάτων Χρησιμοποιήθηκε πλάσμα με έλλειψη του FVII. Κατά την προετοιμασία των δειγμάτων προστέθηκε εξωγενής θρομβοπλαστίνη (TP) σε αραίωση 1:150. Ο χρόνος επώασης κάθε δείγματος στον οποίο αντιστοιχεί η κάθε ζώνη- εμφανίζεται στο σχήμα (με κόκκινο χρώμα είναι ο χρόνος που αντιστοιχεί στα δείγματα με ανάδευση). i) χωρίς ανάδευση (εικόνα 1) 46

47 Κατά την προετοιμασία των δειγμάτων παρατηρείται αρχική εμφάνιση θρόμβου στα 15 min. Στις συνθήκες που μελετώνται παρατηρείται σταδιακή μείωση της προθρομβίνης από τα 15 min και μετά, χωρίς αντίστοιχη αύξηση της θρομβίνης (μικρή ποσότητα θρομβίνης εμφανίζεται σε μεγάλο χρόνο 60 min ) min Εικόνα 1 Η μη εμφάνιση της θρομβίνης σε μικρότερους χρόνους ενδεχομένως να οφείλεται σε κακή αποτύπωση ή ακόμα και σε πιθανό εγκλωβισμό της στο θρόμβο κατά τη διαδικασία της πήξης του πλάσματος. ii) ταυτόχρονη κινητική δειγμάτων με και χωρίς ανάδευση (εικόνα 2) Κατά την προετοιμασία των δειγμάτων παρατηρήθηκε αρχική εμφάνιση θρόμβου στα 20min και για τις δυο σειρές δειγμάτων. Στα δείγματα χωρίς ανάδευση παρατηρείται απότομη μείωση της προθρομβίνης από τα 40min και μετά με ανύπαρκτη εμφάνιση θρομβίνης, ενώ στα δείγματα με ανάδευση παρατηρείται σταδιακή μείωση της προθρομβίνης με αντίστοιχη αύξηση της θρομβίνης. Στα δείγματα με ανάδευση η ποσότητα θρομβίνης και 47

48 προθρομβίνης που εμφανίζεται είναι σαφώς μεγαλύτερη σε σχέση με τα αντίστοιχα δείγματα χωρίς ανάδευση min Εικόνα 2 Η δημιουργία θρόμβου συνεπιφέρει την καθίζηση τόσο της θρομβίνης όσο και της προθρομβίνης, με αποτέλεσμα οι ζώνες που αντιστοιχούν σε αυτές τις πρωτεΐνες να μην είναι ορατές με τη συνήθη διαδικασία Western Blot. Όταν το δείγμα ομογενοποιείται, τη στιγμή που εμφανίζεται μακροσκοπικά ο θρόμβος, προθρομβίνη και θρομβίνη είναι ανιχνεύσιμες με τη μέθοδο που χρησιμοποιείται. β) Κινητική δειγμάτων dix + TP με και χωρίς ανάδευση και ομογενοποίηση του σχηματιζόμενου θρόμβου κατά την προετοιμασία των δειγμάτων (εικόνα 3) Χρησιμοποιήθηκε πλάσμα με έλλειψη του FIX.Κατά την προετοιμασία των δειγμάτων προστέθηκε εξωγενής θρομβοπλαστίνη (TP) σε αραίωση 1:150. Ο χρόνος επώασης κάθε δείγματος στο οποίο αντιστοιχεί κάθε ζώνηεμφανίζεται στο σχήμα (με κόκκινο χρώμα είναι ο χρόνος που αντιστοιχεί στα δείγματα με ανάδευση). 48

49 Κατά την προετοιμασία των δειγμάτων παρατηρήθηκε αρχική εμφάνιση θρόμβου στα 10min. Στις συνθήκες που μελετώνται παρατηρείται και στις δυο σειρές δειγμάτων σταδιακή μείωση της προθρομβίνης και αύξηση της θρομβίνης. Στα δείγματα που προέκυψαν μετά από ανάδευση, η ποσότητα θρομβίνης και προθρομβίνης είναι σαφώς μεγαλύτερη σε σχέση με τα αντίστοιχα δείγματα χωρίς ανάδευση. Συνεπώς και σε αυτή την περίπτωση που μελετάται πλάσμα με έλλειψη του FIX, η δημιουργία θρόμβου συνεπιφέρει εγκλωβισμό μέρους της υπάρχουσας προθρομβίνης και της σχηματιζόμενης θρομβίνης min Εικόνα 3 2) ΠΡΟΣΠΑΘΕΙΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΤΟΥ FΧa ΜΕ ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗ, ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΩΝΤΑΣ ASSERA X ( ΑΝΤΙΣΩΜΑ ΕΝΑΝΤΙ ΤΟΥ FX ). Η ενεργοποίηση του FX σε FXa αποτελεί μέρος του κοινού δρόμου στον καταρράκτη της πήξης, δηλαδή αποτελεί μέρος και του ενδογενούς και του εξωγενούς δρόμου της πήξης. Κατά τον ενδογενή η ενεργοποίηση του FX γίνεται από τον FIXa και κατά τον εξωγενή από το σύμπλεγμα TF/VIIa.Στη συνέχεια ο FXa μαζί με τον FVa, παρουσία Ca ++ και φωσφολιπιδίων, μετατρέπουν την προθρομβίνη σε θρομβίνη. Με τα παρακάτω πειράματα 49

50 γίνεται προσπάθεια ανίχνευσης του χρόνου εμφάνισης του Xa στη διαδικασία της πήξης καθώς και του ποσού μετατροπής του FX σε FXa, προκειμένου να παραχθεί θρομβίνη. α) Κινητική δειγμάτων dvii +TP (εικόνα 4) Χρησιμοποιήθηκε πλάσμα με έλλειψη του FVII. Κατά την προετοιμασία των δειγμάτων προστέθηκε εξωγενώς θρομβοπλαστίνη (TP) σε αραίωση 1:150. Τα τελικά μίγματα αντίδρασης προέκυψαν χωρίς την ανάδευση των αρχικών (δηλ. χωρίς την ομογενοποίηση του σχηματιζόμενου θρόμβου). Ο χρόνος επώασης κάθε δείγματος εμφανίζεται στο σχήμα min Εικόνα 4 Παρατηρήθηκε αρχική εμφάνιση θρόμβου στα 15 min. Στις συνθήκες που αντιπροσωπεύει η εικόνα 4, φαίνεται διαφοροποιημένη η αποτύπωση του FX μετά τα 15 min δηλ. μετά τη μακροσκοπική εμφάνιση του θρόμβου και ουσιαστικά μετά τη μείωση της προθρομβίνης και την αντίστοιχη αύξηση της θρομβίνης, σύμφωνα με τα προηγούμενα πειράματα (1α ) όπου μελετάται σε ίδια δείγματα η παραγωγή θρομβίνης. Δεν φαίνεται να εμφανίζονται ζώνες που να αντιστοιχούν στον FXa. 50

51 β) Κινητική δειγμάτων dix +TP ( εικόνα 5 ) Χρησιμοποιήθηκε πλάσμα με έλλειψη του παράγοντα IX. Κατά την προετοιμασία των δειγμάτων προστέθηκε εξωγενής θρομβοπλαστίνη (TP) σε αραίωση 1:150. Τα τελικά μίγματα αντίδρασης προέκυψαν μετά από ανάδευση των αρχικών και ομογενοποίηση του σχηματιζόμενου θρόμβου. Ταυτόχρονα μελετήθηκαν και δυο δείγματα που περιέχουν καθαρό Xa σε ποσότητες 15μl και 8μl αντίστοιχα, όπως φαίνεται στο σχήμα. Το δείγμα με τα 15μl FXa περιέχει επίσης 5μl LB και 2μl μερκαπτοαιθανόλης (2%), ενώ το δείγμα με τα 8μl FXa περιέχει 7μl H 2 O, 5μl LB και 2μl μερκαπτοαιθανόλη (2%) min Εικόνα 5 Παρατηρείται αρχική εμφάνιση θρόμβου στα 30min (μεγάλος). Η ομογενοποίηση του θρόμβου είναι αρκετά δύσκολη, εκτός από το δείγμα στα 80min. Στο σχήμα δεν φαίνεται να αποτυπώνεται ο FXa (τουλάχιστον στις παραπάνω συνθήκες). Στις ζώνες που αντιστοιχούν στα 5min και 10min η αποτύπωση είναι ελάχιστη ενώ για τα δείγματα που περιέχουν τον FXa η αποτύπωση είναι μηδαμινή. 51

52 γ) Κινητική δειγμάτων dix +TP +VIIa (εικόνα 6) Χρησιμοποιήθηκε πλάσμα με έλλειψη του FIX. Κατά την προετοιμασία των δειγμάτων προστέθηκε εξωγενής θρομβοπλαστίνη (TP) σε αραίωση 1:75 και επιπλέον εξωγενής FVIIa. Τα τελικά μίγματα αντίδρασης προέκυψαν μετά από ανάδευση και ομογενοποίηση του σχηματιζόμενου θρόμβου. Παρατηρήθηκε θρόμβος αρχικά στα 10min, που ήταν ελάχιστος, ενώ στα 15min ήταν εμφανέστατος. Δεν παρατηρούνται σαφείς διαφορές στις ζώνες που αντιστοιχούν στον παράγοντα X. Επίσης, δεν εμφανίζεται ζώνη που να αντιστοιχεί στον FXa min Εικόνα 6 δ) Κινητική δειγμάτων dv +VIIa +/- TP (εικόνα 7) Χρησιμοποιήθηκε πλάσμα με έλλειψη του FV. Κατά την προετοιμασία των δειγμάτων προστέθηκε εξωγενής FVIIa. Στο ίδιο πείραμα μελετάται ταυτόχρονα και η κινητική δειγμάτων ίδιων με τα παραπάνω στα οποία όμως προστέθηκε επιπλέον και εξωγενής θρομβοπλαστίνη (TP) σε αραίωση 1:150. Ο χρόνος που αναγράφεται στο σχήμα με κόκκινο χρώμα αντιστοιχεί στα δείγματα με προσθήκη εξωγενούς TP και με μαύρο σε εκείνα χωρίς εξωγενή TP. Δεν παρατηρήθηκε θρόμβος σε κανένα δείγμα. Όπως προαναφέρθηκε, για να δράσει ο FXa στην προθρομβίνη και να την ενεργοποιήσει σε θρομβίνη 52

53 , σχηματίζει σύμπλεγμα με τον FVa. Οι βιταμινο-κ-εξαρτώμενοι παράγοντες πήξης έχουν εξαιρετικά χαμηλή καταλυτική ικανότητα.προσθήκη φωσφολιπιδίων, Ca ++ και ενός συμπαράγοντα μεγιστοποιεί την καταλυτική ικανότητα. Έτσι, εάν για την πλήρη προθρομβινάση (Xa-Va-Ca ++ - φωσφολιπίδια) ο χρόνος παραγωγής θρομβίνης είναι 1min, για τον FXa μόνο του είναι 2 εβδομάδες. Με το σχηματισμό του συμπλόκου Xa.Va ενδεχομένως να αποκρύπτονται οι αντιγονικές περιοχές σύνδεσης του Xa με το χρησιμοποιούμενο αντίσωμα (Assera X). Για το λόγο αυτό, στην κινητική της εικόνας 7 χρησιμοποιήθηκε πλάσμα απαλλαγμένο από την παρουσία του FV min Εικόνα 7 Παρατηρείται μείωση της έντασης της ζώνης του FX κυρίως στους χρόνους 60 και 40, 60 min. Κάτω από τη ζώνη του FX εμφανίζεται κάποια υποτυπώδης ζώνη, που θα μπορούσε να αντιστοιχεί στον FXa, αλλά δεν παρατηρείται αύξηση της έντασής της, ανάλογη με τη μείωση της έντασης της αντίστοιχης ζώνης του FX. ε) Κινητική δειγμάτων dix +dvii+tp +/- VIIa (εικόνα 8 ) Χρησιμοποιήθηκε πλάσμα με έλλειψη του FIX καθώς και πλάσμα με έλλειψη του FVII. Ίσες ποσότητες από τα δυο είδη πλάσματος αναμίχθηκαν 53

54 και στο μίγμα προστέθηκε θρομβοπλαστίνη (TP ) σε αραίωση 1:150. Σε μια δεύτερη σειρά δειγμάτων, ίδιων με τα παραπάνω, προστέθηκε επιπλέον και FVIIa. Στο σχήμα αποτυπώνεται η ταυτόχρονη κινητική των παραπάνω δειγμάτων. Με κόκκινο χρώμα αναγράφεται ο χρόνος επώασης για τα δείγματα με την προσθήκη FVIIa και με μαύρο εκείνα χωρίς εξωγενή FVIIa. Αρχική εμφάνιση θρόμβου παρατηρείται στα 15min (μεγάλος θρόμβος) στα δείγματα με εξωγενή FVIIa και στα 20min στα δείγματα χωρίς εξωγενή FVIIa, ο οποίος θρόμβος είναι μικρότερος από τον αντίστοιχο της άλλης σειράς δειγμάτων στα 20min min Εικόνα 8 Δεν παρατηρείται μείωση του FX. Η ουσιαστική εμφάνιση των δυο έντονων ζωνών κάτω από τον FX (FXa;;) συμπίπτει χρονικά με (στα 15min και 25min ) με την αρχική σαφή εμφάνιση θρομβίνης στο αντίστοιχο πείραμα (3), όπου μελετάται η παραγωγή θρομβίνης. 3) ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ FVIIa ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΘΡΟΜΒΙΝΗΣ, ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΘΡΟΜΒΟΠΛΑΣΤΙΝΗΣ (TP ) ΚΑΙ ΑΠΟΥΣΙΑ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΩΝ (PLT) Ο FVII φυσιολογικά στον οργανισμό ενεργοποιείται μετά την επαφή του με 54

55 τον ιστικό παράγοντα (TF). Στη συνέχεια το σύμπλοκο TF/VIIa ενεργοποιεί τον FX και τον FIX. Στο παρακάτω πείραμα μελετήθηκε η επίδραση της προσθήκης εξωγενούς FVIIa στην παραγωγή θρομβίνης, σε δείγματα στα οποία προστέθηκε θρομβοπλαστίνη και τα οποία είναι απαλλαγμένα από την παρουσία αιμοπεταλίων. Κινητική δειγμάτων dix+dvii+tp+/-viia (εικόνες 9 και 10) Χρησιμοποιήθηκε πλάσμα με έλλειψη του παράγοντα IX καθώς και πλάσμα με έλλειψη του παράγοντα VII. Ίσες ποσότητες από τα δυο είδη πλάσματος αναμίχθηκαν προκειμένου να προκύψει πλάσμα που να περιέχει όλους τους παράγοντες πήξης. Στο μίγμα αυτό προστέθηκε εξωγενής θρομβοπλαστίνη σε αραίωση 1:150.Σε μια δεύτερη σειρά δειγμάτων ίδιων με τα παραπάνω προστέθηκε επιπλέον και εξωγενής FVIIa. Στο πείραμα αυτό μελετάται η ταυτόχρονη κινητική των παραπάνω δειγμάτων. Ουσιαστικά η κινητική αυτή αποτελεί επανάληψη του παραπάνω πειράματος (2ε), με τη διαφορά ότι στην προκειμένη μελετάται η παραγωγή θρομβίνης και όχι του FX. Στο σχήμα αναγράφεται ο χρόνος επώασης των δειγμάτων (με κόκκινο χρώμα για τα δείγματα με την προσθήκη του FVIIa) min Εικόνα 9 55

56 Παρατηρείται αρχική εμφάνιση θρόμβου στα 10min στα δείγματα με τον εξωγενή FVIIa και στα 15min στα δείγματα χωρίς τον εξωγενή FVIIa. Ο θρόμβος στα δείγματα χωρίς την προσθήκη FVIIa είναι πάντα μικρότερος, διαφορά η οποία μειώνεται μέχρι τα 25min. Η αρχική εμφάνιση θρομβίνης φαίνεται να είναι στους ίδιους χρόνους με την αρχική μακροσκοπική εμφάνιση του θρόμβου κατά την προετοιμασία των δειγμάτων (δηλ. στα 10min και 15min).Κάτω από τη ζώνη που αντιστοιχεί στη θρομβίνη παρατηρούνται έντονες ζώνες, που αν προσμετρηθούν στη θρομβίνη αντικατοπτρίζουν τη μακροσκοπική διακύμανση στην ποσότητα του θρόμβου. Ενδεχομένως να αποτελούν τμήματα της παραγόμενης θρομβίνης, που πιθανόν να προέκυψαν κατά την προσπάθεια ομογενοποίησης του θρόμβου, κατά τη διαδικασία προετοιμασίας των δειγμάτων. Για το λόγο αυτό έγινε επανάληψη του παραπάνω πειράματος (εικόνα 10) με τη διαφορά ότι έγινε ηπιότερη ανάδευση για την ομογενοποίηση του θρόμβου.πράγματι, οι ζώνες που βρίσκονται στην περιοχή κάτω από τη ζώνη της θρομβίνης μειώθηκαν σε ένταση ενώ αντίθετα αυξήθηκαν σε ένταση οι αντίστοιχες ζώνες της θρομβίνης min Εικόνα 10 Στα παραπάνω πειράματα μακροσκοπικά παρατηρείται γρηγορότερη και μεγαλύτερη εμφάνιση θρόμβου στα δείγματα με προσθήκη εξωγενούς FVIIa. 56

57 Στα 25min η διαφορά στην ποσότητα του θρόμβου είναι πολύ μικρότερη. Φαίνεται πως στους παραπάνω χρόνους η προσθήκη εξωγενούς FVIIa σε δείγματα φυσιολογικά, απαλλαγμένα από PLT παρουσία περίσσειας TP, προκαλεί ταχύτερη και μεγαλύτερη παραγωγή θρομβίνης. 4) ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΡΟΜΒΟΠΛΑΣΤΙΝΗΣ (TP) ΣΤΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ FVIIa Ο ιστικός παράγοντας παράγεται κυρίως στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων. Για την πυροδότηση της πήξης αρκεί η αποκάλυψη και η σύνδεση του TF με τον FVII.Στη συνέχεια, το σύμπλεγμα TF/VIIa είναι σε θέση να ενεργοποιήσει και άλλα μόρια FVII, με απώτερο σκοπό την ενεργοποίηση του FX που γίνεται είτε άμεσα είτε μέσω της οδού josso (δηλ. της ενεργοποίησης του FIX ) και τελικά τη μετατροπή της προθρομβίνης σε θρομβίνη.στα παρακάτω πειράματα ελέγχεται η επίδραση της προσθήκης TP στην παραγωγή θρομβίνης, σε δείγματα στα οποία έχει προστεθεί FVIIa. α) απουσία αιμοπεταλίων (PLT) Το πλάσμα που χρησιμοποιείται είναι απαλλαγμένο ή σχεδόν απαλλαγμένο από PLT. Τα πλάσματα με έλλειψη κάποιου παράγοντα πήξης είναι του εμπορίου και εκείνα που περιέχουν όλους τους παράγοντες πήξης είναι από φυσιολογικό αίμα που έχει φυγοκεντρηθεί στις rpm για 20min, ώστε να καθιζάνουν τα PLT και το υπερκείμενο πλάσμα, που χρησιμοποιούμε, να είναι φτωχό σε PLT δηλ.. να είναι PPP (plasma poor platelets). 57

58 i ) Κινητική δειγμάτων dix+dvii+viia+/-tp (εικόνα 11) Χρησιμοποιήθηκε πλάσμα με έλλειψη του FIX καθώς και πλάσμα με έλλειψη του FVII. Ίσες ποσότητες από τα δυο είδη πλάσματος αναμίχθηκαν προκειμένου να προκύψει πλάσμα που περιέχει όλους τους παράγοντες πήξης. Στο μίγμα αυτό προστέθηκε FVIIa. Σε μια δεύτερη σειρά ίδιων δειγμάτων με τα παραπάνω προστέθηκε και θρομβοπλαστίνη (TP) σε αραίωση 1:150. Στο σχήμα αποτυπώνεται η ταυτόχρονη κινητική των παραπάνω δειγμάτων (με κόκκινο χρώμα αναγράφεται ο χρόνος επώασης των δειγμάτων με την εξωγενή TP και με μαύρο εκείνα χωρίς εξωγενή TP) min Εικόνα 11 Παρατηρήθηκε αρχική εμφάνιση θρόμβου ταυτόχρονα και στα είδη δειγμάτων στα 15min (σχεδόν ίδιος θρόμβος). Αντίθετα στα 20min και στα 25min ο θρόμβος στα δείγματα με την εξωγενή TP είναι πολύ μεγαλύτερος σε σχέση με τα αντίστοιχα δείγματα χωρίς εξωγενή TP. Όπως φαίνεται παραπάνω, η θρομβίνη αρχίζει να εμφανίζεται στα 15min και στις δυο σειρές δειγμάτων. Κάτω από τις ζώνες θρομβίνης εμφανίζονται κάποιες ζώνες που αν προσμετρηθούν στη θρομβίνη ( θραύσματα θρομβίνης ;) αντικατοπτρίζουν τη μακροσκοπική διακύμανση του μεγέθους του θρόμβου. 58

59 Έτσι, σύμφωνα με τα παραπάνω, σε δείγματα που περιέχουν όλους τους παράγοντες πήξης, παρουσία περίσσειας FVIIa και απουσία αιμοπεταλίων, η προσθήκη εξωγενούς TP δε φαίνεται να προκαλεί ταχύτερη έναρξη παραγωγής θρομβίνης αλλά τουλάχιστον μέχρι τα 25min συνεισφέρει στη μεγαλύτερη παραγωγή αυτής. ii) Κινητική φυσιολογικών δειγμάτων PPP+VIIa+/-TP (εικόνες 12 και 13) Χρησιμοποιήθηκε φυσιολογικό αίμα φυγοκεντρημένο στις rpm για 20min ώστε να προκύψει πλάσμα απαλλαγμένο από την παρουσία αιμοπεταλίων. Στο πλάσμα αυτό προστέθηκε FVIIa. Σε μια δεύτερη σειρά δειγμάτων ίδιων με τα παραπάνω προστέθηκε και θρομβοπλαστίνη (TP) σε αραίωση 1:150). Ο χρόνος επώασης των δειγμάτων αναγράφεται στο σχήμα (με κόκκινο χρώμα για τα δείγματα με εξωγενή TP και με μαύρο για εκείνα χωρίς εξωγενή TP) min Εικόνα 12 Παρατηρείται αρχική εμφάνιση θρόμβου αλλά και θρομβίνης στα 5min και στις δυο σειρές δειγμάτων. Σαφής εμφάνιση θρομβίνης, όμως, 59

60 παρατηρείται στα 15min στα δείγματα με την εξωγενή TP και στα 10min σε εκείνα χωρίς εξωγενή TP. Ενδεχομένως για το δείγμα με την προσθήκη TP και με χρόνο επώασης 10min δεν έγινε καλή ανοσοαποτύπωση της παραγόμενης θρομβίνης. Για το λόγο αυτό έγινε επανάληψη του παραπάνω πειράματος με διαφορετικούς όμως χρόνους επώασης των δειγμάτων,ώστε να μελετηθούν τα αρχικά στάδια της αντίδρασης (εικόνα 13) min Εικόνα 13 Παρατηρείται αρχική εμφάνιση θρόμβου στα 4min για τα δείγματα χωρίς εξωγενή TP και στα 6min σε εκείνα με εξωγενή TP. Στους χρόνους 8-15min η ποσότητα της παραγόμενης θρομβίνης είναι σχεδόν ίδια. Πιθανόν στα φυσιολογικά δείγματα PPP, παρουσία εξωγενούς VIIa, η προσθήκη περίσσειας TP να καθυστερεί το σχηματισμό θρομβίνης. β) παρουσία αιμοπεταλίων (PLT) Κινητική δειγμάτων PRP+VIIa+/-TP (εικόνα 14) 60

61 Χρησιμοποιήθηκε φυσιολογικό αίμα, που φυγοκεντρήθηκε στις 1000rpm για 5min, ώστε να προκύψει πλάσμα πλούσιο σε PLT. Στο πλάσμα αυτό προστέθηκε FVIIa. Σε μια δεύτερη σειρά δειγμάτων ίδιων με τα παραπάνω προστέθηκε και θρομβοπλαστίνη (TP) σε αραίωση 1:150. Η ομογενοποίηση του θρόμβου κατά την προετοιμασία των τελικών μιγμάτων αντίδρασης είναι πιο δύσκολη σε σχέση με τα αντίστοιχα PPP του προηγούμενου πειράματος. Ο χρόνος επώασης των δειγμάτων αναγράφεται στο σχήμα (με κόκκινο χρώμα για τα δείγματα με την προσθήκη του TP και με μαύρο για εκείνα χωρίς εξωγενή TP). Παρατηρείται αρχική εμφάνιση θρόμβου στα 5min και για τις δυο σειρές δειγμάτων (μικρός θρόμβος). Ο θρόμβος είναι σχεδόν ίσης ποσότητας αντίστοιχα και στα δυο δείγματα σε όλους τους χρόνους. Αρχική εμφάνιση θρομβίνης φαίνεται στα 10min και για τις δυο σειρές δειγμάτων. Στους μετέπειτα χρόνους η ποσότητά της δεν φαίνεται να μεταβάλλεται. Σε φυσιολογικά δείγματα PRP παρατηρώ δραματική μείωση της έντασης στη ζώνη της προθρομβίνης στους αρχικούς χρόνους με αντίστοιχη μετατροπή της σε θρομβίνη. Στα αντίστοιχα φυσιολογικά δείγματα PPP του προηγούμενου πειράματος (4ii) η ζώνη της προθρομβίνης παραμένει σχεδόν αναλλοίωτη με σχετικά μικρότερη μετατροπή της σε θρομβίνη. Μάλλον η ύπαρξη και μόνο των αιμοπεταλίων (στο PRP) εντείνει τη μετατροπή της προθρομβίνης σε θρομβίνη min Εικόνα 14 61

62 Στις συνθήκες που μελετώνται η περίσσεια TP δε φαίνεται να επηρεάζει την παραγωγή θρομβίνης σε φυσιολογικά δείγματα PRP παρουσία περίσσειας VIIa. γ) Επίδραση της συγκέντρωσης της θρομβοπλαστίνης (TP) στο αποτέλεσμα δράσης του FVIIa (εικόνα 15) Χρησιμοποιήθηκε φυσιολογικό αίμα φυγοκεντρημένο στις 6000rpm για 20min, ώστε να προκύψει πλάσμα φτωχό σε αιμοπετάλια (PPP).Τα δείγματα περιέχουν την ίδια ποσότητα εξωγενούς VIIa, αλλά διαφορετικές ποσότητες TP (σε αραίωση 1:75) άρα και διαφορετικές αραιώσεις της TP, οι οποίες αναγράφοντα στο σχήμα. Ο χρόνος επώασης των δειγμάτων είναι σταθερός στα 25min. 1/75 1/90 1/108 1/130 1/155 1/187 1/224 1/269 1/300 Εικόνα 15 Παρατηρείται περίπου ίδιος θρόμβος σε όλα τα δείγματα. Στο σχήμα φαίνεται η ποσότητα της προθρομβίνης και της θρομβίνης να είναι σχεδόν ίδια σε όλα τα δείγματα. Φαίνεται πως σε φυσιολογικά δείγματα PPP παρουσία περίσσειας VIIa η προσθήκη TP (τουλάχιστον στα όρια των αραιώσεων 1/75 1/300) δεν 62

63 επηρεάζει την παραγωγή θρομβίνης σε σταθερό χρόνο 25min. δηλ η περίσσεια VIIa δεν απαιτεί περισσότερο TP για να δράσει. 5) ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΩΝ (PLT) ΣΤΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ FVIIa, ΧΩΡΙΣ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΠΕΡΙΣΣΕΙΑΣ ΘΡΟΜΒΟΠΛΑΣΤΙΝΗΣ (TP) Μελέτες έδειξαν ότι ο FVIIa μπορεί να ενεργοποιήσει τον FIX πάνω σε ενεργοποιημένα PLT, απουσία ιστικού παράγοντα. Τα PLT φέρουν στην επιφάνειά τους εξειδικευμένους υποδοχείς για τη σύνδεση των παραγόντων Xa,Va, IXa, VIIIa, τους οποίους και δεσμεύουν όταν αυτά ενεργοποιηθούν. Πειράματα έδειξαν ότι ο δεσμευμένος σε ενεργοποιημένα PLT παράγοντας IX, παρέχει θέση αλληλεπίδρασης για τον FVIIa. Έτσι, μόλις ο FVIIa δεσμευτεί στον IX και τον ενεργοποιήσει, ο νεοσχηματιζόμενος FIΧa παρουσία FVIIIa μπορεί να σχηματίσει επιπλέον σύμπλοκα δεκάσης, ενισχύοντας την παραγωγή θρομβίνης. Ο FVIIa σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις συνδέεται ασθενώς στην επιφάνεια των PLT. Σε μελέτες φάνηκε ότι ο FVIIa σε πολύ υψηλές δόσεις μπορεί να δεσμευτεί στα PLT και έτσι να συνδεθεί άμεσα με τον δεσμευμένο στην αιμοπεταλιακή επιφάνεια FIX, καθώς και τον FX και να τους ενεργοποιήσει. Κινητική φυσιολογικών δειγμάτων PPP+VIIa και PRP+VIIa (εικόνα 16) Χρησιμοποιήθηκε φυσιολογικό αίμα, που για την παραγωγή πλάσματος φτωχού σε αιμοπετάλια (PPP) φυγοκεντρήθηκε στις 6.000rpm για 20min και για την παραγωγή πλάσματος πλούσιου σε αιμοπετάλια (PRP) φυγοκεντρήθηκε στις 1.000rpm για 5min. Και στα δυο είδη πλάσματος 63

64 προστέθηκε FVIIa. Στο σχήμα αποτυπώνεται η ταυτόχρονη κινητική των παραπάνω δειγμάτων. Ο χρόνος αναγράφεται στο σχήμα, με κόκκινο χρώμα για τα δείγματα PRP και με μαύρο για τα PPP min Εικόνα 16 Παρατηρείται αρχική εμφάνιση θρόμβου στα 8min για τα δείγματα PRP (εμφανής θρόμβος) και στα 15min για τα PPP (θρόμβος μικρότερος του αντίστοιχου PRP). Επίσης, παρατηρήθηκε ότι τα PRP δίνουν πιο πυκνό θρόμβο σε σχέση με τα PPP και ότι η ανάδευση και ομογενοποίηση του θρόμβου στα PPP είναι ευκολότερη σε σχέση με τα PRP. Αρχική εμφάνιση θρομβίνης παρατηρείται στα 15min και για τα δείγματα PPPκαι για τα PRP. Αν οι έντονες ζώνες που εμφανίζονται κάτω από τη ζώνη της θρομβίνης θεωρηθούν ότι είναι θραύσματα της θρομβίνης (που πιθανόν προκύπτουν από την ανάδευση για την ομογενοποίηση του θρόμβου κατά τη διαδικασία προετοιμασίας των δειγμάτων ) τότε στα δείγματα PRP η αρχική εμφάνιση θρομβίνης είναι στα 8min. Η ζώνη της προθρομβίνης στα PPP είναι σχεδόν αναλλοίωτη ενώ στα PRP παρατηρείται σταδιακή μείωση αυτής με αντίστοιχη αύξηση της θρομβίνης. Στο πείραμα αυτό φαίνεται ότι η παραγωγή θρομβίνης είναι σαφώς μεγαλύτερη στα δείγματα PRP σε σχέση με τα αντίστοιχα PPP, συνεπώς η 64

65 παραγωγή θρομβίνης ευνοείται από την ύπαρξη αιμοπεταλίων, παρουσία περίσσειας VIIa. 6) ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΩΝ (PLT) ΣΤΗΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΘΡΟΜΒΙΝΗΣ, ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΠΕΡΙΣΣΕΙΑΣ ΘΡΟΜΒΟΠΛΑΣΤΙΝΗΣ (TP) Ο ιστικός παράγοντας παράγεται κυρίως στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων. Για την πυροδότηση της πήξης αρκεί η αποκάλυψη του ιστικού παράγοντα και η σύνδεσή του με τον FVII, τον οποίο και ενεργοποιεί. Το σύμπλεγμα TF/VIIa αποτελεί το έναυσμα για την ενεργοποίηση των FIX και FX και άρα την παραγωγή θρομβίνης. Σύμφωνα με μελέτες που έχουν γίνει, φαίνεται πιθανό ότι ο διαλυτός FIX ενεργοποιείται αρχικά από το σύμπλοκο TF/VIIa σε σημείο μακριά από τα αιμοπετάλια. Στη συνέχεια ο ενεργοποιημένος FIXa κατευθύνεται στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων.το ενεργοποιημένο αιμοπετάλιο συμμετέχει σε αυτή τη σειρά γεγονότων μέσω της ικανότητας δέσμευσης παραγόντων πήξης σε εξειδικευμένες θέσεις,ώστε τα σύμπλοκα ενίσχυσης της πήξης να προσανατολιστούν σωστά στο χώρο και να προστατευτούν από τους αναστολείς της πήξης που κυκλοφορούν στο πλάσμα. Κινητική φυσιολογικών δειγμάτων PPP+TP και PRP+TP (εικόνα 17) Χρησιμοποιήθηκε φυσιολογικό αίμα, που για την παραγωγή πλάσματος φτωχού σε αιμοπετάλια (PPP) φυγοκεντρήθηκε στις 6.000rpm για 20min και για την παραγωγή πλάσματος πλούσιου σε αιμοπετάλια (PRP) φυγοκεντρήθηκε στις 1.000rpm για 5min. Και στα δυο είδη πλάσματος 65

66 προστέθηκε TP σε αραίωση 1:150. Στο σχήμα αποτυπώνεται η ταυτόχρονη κινητική των παραπάνω δειγμάτων. Ο χρόνος επώασης αναγράφεται στο σχήμα ( με κόκκινο χρώμα για τα PRP και με μαύρο για τα PPP) min Εικόνα 17 Παρατηρείται αρχική εμφάνιση θρόμβου στα 8min για τα PRP (μεγάλος θρόμβος) και στα 15min για τα PPP (θρόμβος μικρότερος του αντίστοιχου PRP).Στα δείγματα PPP ο θρόμβος είναι λιγότερο σταθερός (η ομογενοποίησή του είναι πιο εύκολη ) και κάπως πιο αραιός. Η προθρομβίνη στα PPP παραμένει σχεδόν αναλλοίωτη ενώ στα PRP παρατηρείται μείωση αυτής και αντίστοιχη αύξηση της θρομβίνης. Αρχική εμφάνιση θρομβίνης και στα PPP και στα PRP είναι στα 15min. Αν η ζώνη που εμφανίζεται κάτω από τη θρομβίνη αντιστοιχεί σε θραύσμα αυτής (λόγω της ανάδευσης για την ομογενοποίηση του θρόμβου κατά την προετοιμασία των δειγμάτων) και προστεθεί στη συνολική θρομβίνη, τότε στα PRP η θρομβίνη εμφανίζεται αρχικά στα 8min. Στα δείγματα PRP, σε όλους τους χρόνους, η ποσότητα της παραγόμενης θρομβίνης είναι σαφώς μεγαλύτερη από τα αντίστοιχα PPP. Από τα παραπάνω φαίνεται ότι στα δείγματα PRP ο ρυθμός μετατροπής της προθρομβίνης σε θρομβίνη είναι σαφώς μεγαλύτερος σε σχέση με τα δείγματα PPP, παρουσία περίσσειας TP, δηλ. η παραγωγή θρομβίνης ευνοείται από την ύπαρξη αιμοπεταλίων,παρουσία περίσσειας TP. 66

67 7) ΣΥΝΔΥΑΣΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ FVIIa KAI ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΩΝ (PLT) Τα ενεργοποιημένα PLT προσφέρουν όχι μόνο τη φωσφολιπιδική τους επιφάνεια αλλά και εξειδικευμένες,υψηλής συνάφειας θέσεις δέσμευσης για τους παράγοντες Va, IXa, VIIIa και Xa. Ο VIIa εκτός από τη σύνδεσή του με τον ιστικό παράγοντα για την ενεργοποίηση των FIX και FX στο πλάσμα, μελέτες δείχνουν και την ικανότητά του να ενεργοποιεί - χωρίς να συνδεθεί με τον ιστικό παράγοντα - πάνω στα PLT τους FIX και FX. Κινητική φυσιολογικών δειγμάτων PPP-VIIa, PPP+VIIa, PRP-VIIa, PRP+VIIa (εικόνα 18) Χρησιμοποιήθηκε φυσιολογικό αίμα που φυγοκεντρήθηκε στις 1.000rpm για 5min, ώστε να προκύψει πλάσμα πλούσιο σε PLT (PRP). Το ίδιο αίμα φυγοκεντρήθηκε στις 6.000rpm για 20min, ώστε να προκύψει πλάσμα φτωχό σε PLT (PPP). Σε μια σειρά δειγμάτων PPP προστέθηκε FVIIa ενώ σε μια άλλη όχι. Το ίδιο έγινε και με τα δείγματα PRP. Στο σχήμα αποτυπώνεται η ταυτόχρονη κινητική τεσσάρων (4) ειδών δειγμάτων. Ο χρόνος αναγράφεται στο σχήμα με μαύρο χρώμα για τα δείγματα PPP-VIIa, με μωβ για τα PPP+VIIa, με κόκκινο για τα PRP-VIIa και με μπλε για τα PRP+VIIa min Εικόνα 18 67