ΧΡΗΣΤΟΣ Γ. ΜΠΑΚΑΒΟΣ. Χημικός

Transcript

1 ΧΡΗΣΤΟΣ Γ. ΜΠΑΚΑΒΟΣ Χημικός ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ d 0 /d 3 Ν-ΥΔΡΟΞΥΣΟΥΚΙΝΙΜΙΔΥΛΕΣΤΕΡΩΝ ΤΟΥ π- ΜΕΘΟΞΥΒΕΝΖΟΪΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΚΑΙ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥΣ ΣΤΗΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΒΙΟΓΕΝΩΝ ΑΜΙΝΩΝ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ ΜΕ ΤΗΝ ΜΕΘΟΔΟ ΙΣΟΤΟΠΙΚΗΣ ΑΡΑΙΩΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ ΔΙΑΤΡΙΒΗ για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος ΠΑΤΡΑ 2014

2 CHRISTOS G. BAKAVOS CHEMIST N-HYDROXYSUCCINIMIDYL p-methoxybenzoate AS SUITABLE DERIVATIZATION REAGENT FOR ISOTOPIC DILUTION ASSAY OF BIOGENIC AMINES IN FOOD MSc Thesis PATRAS 2014

3 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ Τμήμα Χημείας ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: Σχεδιασμός & Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων» ΧΡΗΣΤΟΣ Γ. ΜΠΑΚΑΒΟΣ Χημικός Υποβλήθηκε στο Τμήμα Χημείας Τομέας Οργανικής Χημείας, Βιοχημείας & Χημείας Φυσικών Προϊόντων Επιβλέπων: Κωνσταντίνος Αθανασόπουλος, Επίκ. Καθηγητής Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή: Κωνσταντίνος Αθανασόπουλος, Επίκ. Καθηγητής Διονύσιος Παπαϊωάννου, Καθηγητής Θεόδωρος Τσέλιος, Επίκ. Καθηγητής

4 UNIVERSITY OF PATRAS Department of Chemistry INTERDEPARTMENTAL PROGRAM OF POSTGRADUATE STUDΙES «MEDICINAL CHEMISTRY: Drug Design & Development» CHRISTOS G. BAKAVOS CHEMIST It was submitted in the Department of Chemistry Section of Organic Chemistry, Biochemistry and Natural Products Chemistry Supervisor: Constantinos Athanassopoulos, Assist. Professor Evaluation Committee: Constantinos Athanassopoulos, Assist. Professor Dionissios Papaioannou, Professor Theodore Tselios, Assist. Professor

5 Στην οικογένειά μου...

6 9

7 Περιεχόμενα ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΓΕΝΙΚΑ ΓΙΑ ΤΙΣ ΒΙΟΓΕΝΕΙΣ ΑΜΙΝΕΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΒΙΟΓΕΝΩΝ ΑΜΙΝΩΝ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Ιονισμός ηλεκτροψεκασμού Διάσπαση προκαλούμενη από σύγκρουση (Collision Induced Dissociation, CID) Τετραπολικός Αναλυτής Μαζών Διαδοχική Φασματομετρία Μαζών-Τριπλό Τετράπολο (Triple-Quadrupole) Διαδοχική Φασματομετρία Μαζών ΜS/MS (Tandem Mass Spectrometry) Τεχνική MRM (Multiple Reaction Monitoring) Φασματομετρία Μαζών Ισοτοπικής Αραίωσης (SID-MS) ΣΚΟΠΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗΣ (tagging reagents) Σύνθεση του d 3-4-μεθoξυβενζοϊκού οξέος Σύνθεση των Ν-υδροξυηλεκτριμιδυλεστέρων του d 0 /d 3-4-μεθoξυβενζοϊκού οξέος ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ (stock solutions) Παρασκευή διαλυμάτων των d 0- και d 3-4-MBA παραγωγοποιημένων αμινών ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΒΑ ΓΙΑ ΕΜΠΟΡΙΚΑ ΔΙΑΘΕΣΙΜΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ d 0 - ΚΑΙ d 3-4-MBA ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΑΜΙΝΩΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΒΑ ΜΕ ΤΗΝ ΜΕΘΟΔΟ LC-MS/MS ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ

8 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα Μεταπτυχιακή Εργασία εκπονήθηκε στο ερευνητικό εργαστήριο Συνθετικής Οργανικής Χημείας του Τομέα Οργανικής Χημείας, Βιοχημείας και Φυσικών Προϊόντων του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών και στο εργαστήριο Ενόργανης Ανάλυσης του Τμήματος Χημείας και Χημικής Τεχνολογίας του Πανεπιστημίου της Καλαβρίας στα πλαίσια του Διατμηματικού Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων» υπό την επίβλεψη του Επίκουρου Καθηγητή κ. Κων/νου Αθανασόπουλου. Πρώτον από όλους θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Κων/νο Αθανασόπουλο, για την υπόδειξη του συγκεκριμένου θέματος, καθώς επίσης για την πολύτιμη βοήθειά του και την άριστη συνεργασία που διατηρήσαμε το χρόνο αυτό. Επίσης, τους καθηγητές Fabio Mazzotti, Anna Napoli και Giovanni Sindona που με δέχτηκαν και με φιλοξένησαν στο εργαστήριό τους στο Πανεπιστήμιο της Καλαβρίας. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ακόμα τα μέλη της εξεταστικής επιτροπής τον Καθηγητή του Τμήματος Χημείας κ. Δ. Παπαϊωάννου και τον Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Χημείας κ. Θ. Τσέλιο για τις εποικοδομητικές διορθώσεις τους στο παρόν κείμενο. Επιπλέον, τα μέλη της επιτροπής LLP/Erasmus για την τρίμηνη υποτροφία που μου παρείχαν και την υποστήριξη όλο το διάστημα της πρακτικής άσκησης. Ιδιαίτερη αναφορά θα ήθελα να κάνω στις συνεργάτιδες, την προπτυχιακή Διονυσία Πεπέ, την μεταπτυχιακή Νίκη Δήμα και την υποψήφια διδάκτορα Τόνια Αντωνίου για τη βοήθεια που μου παρείχαν κατά την εκπόνηση αυτής της εργασίας καθώς και για το φιλικό και φιλόξενο κλίμα στο εργαστήριο όλο αυτό το χρονικό διάστημα. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τον διδάκτορα Γιώργο Μαγουλά για τη βοήθεια και τη συνεργασία στο εργαστήριο. 11

9 Τέλος, θέλω να εκφράσω τις πιο θερμές ευχαριστίες μου στους γονείς μου Γιώργο και Μαρία και για τη στήριξη, εμπιστοσύνη, αγάπη, ηθική και υλική συμπαράσταση που δείχνουν όλα αυτά τα χρόνια. 12

10 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ AcOEt BA Cad CE CH 3 COOH (CH 3 ) 2 CO CH 3 OH CID Οξικός αιθυλεστέρας Βιογενείς αμίνες Καδαβερίνη Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση Οξικό οξύ Ακετόνη Μεθανόλη Διάσπαση προκαλούμενη από σύγκρουση DCC N,N -δικυκλοεξυλοκαρβοδιιμίδιο ESI-MS Φασματομετρία μαζών με ιονισμό ηλεκτροψεκασμού FCC GC Χρωματογραφία στήλης ταχείας ανάπτυξης Αέρια Χρωματογραφία H HCOOH Him ΗOSu HPLC LC LOD LOQ MALDI-MS Ώρες Μυρμηγκικό οξύ Ισταμίνη N-υδροξυηλεκτριμίδιο Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Επίδοσης Υγρή Χρωματογραφία Κατώτερο όριο ανίχνευσης Κατώτερο όριο ποσοτικοποίησης Φασματομετρία μαζών με ιονισμό εκρόφησης με λέϊζερ υποβοηθούμενος από μήτρα ΜeCN MRM Ακετονιτρίλιο Τεχνική σάρωσης πολλαπλών αντιδράσεων min Λεπτά NMR Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού 13

11 PhMe Pea Put QqQ RT ΤFA THF TLC TOF Trm Tyr SID-MS Spd Spm UV 4-MBA-BA Συντονισμού Toλουόλιο Φαινυλαιθυλαμίνη Πουτρεσκίνη Τριπλό-τετράπολο Θερμοκρασία δωματίου Τριφθοροξικό οξύ Τετραϋδροφουράνιο Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας Αναλυτής Μαζών τύπου χρόνου-πτήσης Τρυπταμίνη Τυραμίνη Φασματομετρία μαζών με ισοτοπική αραίωση Σπερμιδίνη Σπερμίνη Φασματοσκοπία υπεριώδους Παραγωγοποιημένες με 4-μεθοξυβενζοϊκό οξύ βιογενείς αμίνες 14

12 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΓΕΝΙΚΑ ΓΙΑ ΤΙΣ ΒΙΟΓΕΝΕΙΣ ΑΜΙΝΕΣ Οι Βιογενείς Αμίνες (ΒΑ) είναι οργανικές, βασικές, αζωτούχες ενώσεις που παράγονται με ενζυμική δράση στα ωμά και κατεργασμένα τρόφιμα κυρίως με την αποκαρβοξυλίωση των αμινοξέων και την αμίνωση και τρανσαμίδωση των αλδεϋδών και κετονών. 1 Η χημική δομή τους μπορεί να είναι: αλειφατική (πουτρεσκίνη, καδαβερίνη, σπερμίνη, σπερμιδίνη), αρωματική (τυραμίνη, φαινυλαιθυλαμίνη) ή/και ετεροκυκλική (ισταμίνη, τρυπταμίνη). Οι αμίνες πουτρεσκίνη, σπερμίνη, σπερμιδίνη και καδαβερίνη είναι απαραίτητα συστατικά των κυττάρων και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη λειτουργία των νουκλεϊκών οξέων και στην πρωτεϊνοσύνθεση ενώ πιθανότατα συμβάλλουν και στην σταθεροποίηση των μεμβρανών. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα η βιοσύνθεση των ΒΑ είναι απαραίτητη καθώς είναι πρόδρομες ενώσεις για την σύνθεση διαφόρων ορμονών, αλκαλοειδών, νουκλεïκών οξέων και πρωτεϊνών. Επίσης, μερικές από τις ΒΑ είναι νευροδιαβιβαστές, ενώ άλλες όπως η πουτρεσκίνη και η σπερμίνη απαιτούνται για κρίσιμες βιολογικές λειτουργίες. Στα προκαρυωτικά κύτταρα, η βιοσύνθεση των ΒΑ σχετίζεται κυρίως με αμυντικούς μηχανισμούς. 2 Εικόνα 1: Δομή βιογενών αμινών που απαντώνται στη φύση. 15

13 1.2 ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΒΙΟΓΕΝΩΝ ΑΜΙΝΩΝ ΣΕ ΤΡΟΦΙΜΑ Βιογενείς αμίνες απαντώνται σχεδόν σε όλα τα τρόφιμα που περιέχουν πρωτεΐνες ή ελεύθερα αμινοξέα και υπόκεινται σε συνθήκες που εμπλέκουν μικροβιακές ή βιοχημικές δράσεις. Η συνολική ποσότητα δε των διαφόρων αμινών που σχηματίζονται, εξαρτάται από τη φύση των τροφίμων και των παρόντων μικροοργανισμών. Οι βιογενείς αμίνες απαντούν σε μια μεγάλη ποικιλία τροφίμων που περιλαμβάνει τα εξής: γαλακτοκομικά προϊόντα, κρέατα, ψάρια, μπύρες, κρασιά, φρούτα, ξηρούς καρπούς και σοκολάτα. Στα τρόφιμα που δεν έχουν υποστεί ζύμωση, η παρουσία βιογενών αμινών υποδηλώνει την παρουσία κάποιου ανεπιθύμητου μικροοργανισμού. Γι αυτό το λόγο, το ποσοστό των αμινών στα τρόφιμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης μικροβιακής αλλοίωσης. Τα επίπεδα της ισταμίνης, πουτρεσκίνης και καδαβερίνης συνήθως αυξάνονται κατά τη διάρκεια της αλλοίωσης των ψαριών και του κρέατος, ενώ αντίθετα αυτά της σπερμίνης και σπερμιδίνης μειώνονται. 3 Σε δείγματα αλιευμάτων έχουν εντοπιστεί διάφορες ΒΑ όπως ισταμίνη, πουτρεσκίνη, καδαβερίνη, τυραμίνη, σπερμίνη και σπερμιδίνη. Ενδεικτικά της φρεσκάδας των αλιευμάτων είναι τα επίπεδα των αμινών όπως τριμεθυλαμίνη και διμεθυλαμίνη. Στα φρούτα, στους χυμούς και στα λαχανικά απαντώνται διάφορες ΒΑ σε ποικίλες συγκεντρώσεις, με την πουτρεσκίνη να παίζει το σημαντικότερο ρόλο. Τέλος αναφορικά με τη σοκολάτα και παράγωγά της δείκτη αποτελεί η φαινυλαιθυλαμίνη (συστατικό κόκκων του κακάο). Στα τρόφιμα που έχουν υποστεί ζύμωση, είναι λογικό ότι η παρουσία πολλών ειδών μικροοργανισμών εντείνει την παραγωγή βιογενών αμινών. Στα περισσότερα προϊόντα, στα οποία περιέχονται γαλακτικά βακτήρια, εμφανίζονται αυξημένα επίπεδα πουτρεσκίνης, καδαβερίνης, ισταμίνης και τυραμίνης. Παραδείγματος χάρη η παραπάνω ποικιλία ΒΑ εντοπίζεται σε πολλά είδη τυριών. Το αξιοσημείωτο είναι ότι τα επίπεδα της ισταμίνης και της τυραμίνης ποικίλουν όχι μόνο στους διαφορετικούς τύπους τυριών αλλά και σε διαφορετικές παρτίδες του ίδιου τύπου. Αμίνες όπως αγματίνη, καδαβερίνη, αιθανολαμίνη, ισταμίνη, 16

14 πουτρεσκίνη και τυραμίνη παράγονται σε μεγαλύτερες ποσότητες κατά την αλκοολική ζύμωση στις μπύρες και τα κρασιά. 1.3 ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ Ενώ οι βιογενείς αμίνες είναι απαραίτητες για πολλές βιολογικές λειτουργίες, η κατανάλωση τροφίμων με μεγάλη περιεκτικότητα σε ΒΑ μπορεί να έχει τοξικές συνέπειες. Μετά την κατανάλωση ενός τροφίμου, μόνο μικρές ποσότητες από τις περιεχόμενες ΒΑ μπορούν να μεταβολιστούν στο έντερο προς φυσιολογικά λιγότερο δραστικές μορφές, μέσω της δράσης των ενζύμων αμινοξειδάση (μονοαμινοξειδάση ΜΑΟ) και διαμινοξειδάση. Η ισταμίνη επιπλέον μπορεί να εξουδετερωθεί με μεθυλίωση (μέσω της δράσης των μεθυλοτρανσφερασών) ή/και με ακετυλίωση. Σε κάθε περίπτωση, η κατανάλωση τροφίμων που περιέχουν μεγάλες ποσότητες ΒΑ μπορεί να οδηγήσει στην εισαγωγή τους στη συστημική κυκλοφορία και να προκαλέσει την έκκριση αδρεναλίνης, νοραδρεναλίνης και γαστρικού υγρού, λόγω διαφόρων παραγόντων (π.χ ανεπαρκής αποτοξίνωση, γενετικοί λόγοι και ανασταλτικοί παράγοντες ορισμένων φαρμάκων ή αλκοόλ. Επίσης, αυξημένα επίπεδα ΒΑ μπορούν να επιφέρουν ταχυκαρδία, αρρυθμία, ημικρανίες, αυξημένο σάκχαρο και αυξημένη αρτηριακή πίεση. Επιπλέον σε ασθενείς με τη νόσο του Parkinson, σχιζοφρένεια και κατάθλιψη έχουν παρατηρηθεί υψηλά επίπεδα ΒΑ. Οι πιο διαβόητες τροφικές δηλητηριάσεις που έχουν προκληθεί από βιογενείς αμίνες είναι κυρίως συνδεδεμένες με την ισταμίνη. Αυτές οι δηλητηριάσεις προκλήθηκαν μετά από την κατανάλωση τυριών ή ψαριών. Εντούτοις, η οριστικοποίηση των τοξικών επιπέδων των βιογενών αμινών στα τρόφιμα είναι μια εξαιρετικά δύσκολη διαδικασία, καθώς εξαρτάται από διάφορα ατομικά χαρακτηριστικά. Η ανθρώπινη ευαισθησία ποικίλει ανάλογα με τις ατομικές δυνατότητες αποτοξίνωσης μέσω ενζύμων που εμπλέκονται στον μεταβολισμό των βιογενών αμινών, όπως είναι η μεθυλοτρανσφεράση της ισταμίνης ή άλλα λιγότερα ειδικά, όπως π.χ. η μονοαμινοξειδάση (ΜΑΟ) και η διαμινοξειδάση 2. Το 17

15 νομικά ανώτερο αποδεκτό όριο για την ισταμίνη ορίζεται στα 100 mg/kg στα τρόφιμα, στα 2 mg/l στα αλκοολούχα ποτά και ιδιαίτερα για τα αλιεύματα δεν επιτρέπεται να υπερβαίνει τα mg/kg. 3 Επίσης τοξικές τιμές για την τυραμίνη και την φαινυλαιθυλαμίνη θεωρούνται τα mg/kg και 30 mg/kg αντίστοιχα. Γενικότερα ως ανώτερη τιμή περιεκτικότητας αμινών στα τρόφιμα θεωρούνται τα 1000 mg/kg, καθώς η υπέρβασή της είναι επικίνδυνη για την υγεία. Το όριο αυτό υπολογίστηκε με βάση τις δηλητηριάσεις από ισταμίνη που συνδέθηκαν με την συγκέντρωση των αμινών στο φαγητό. Η απόκλιση στα όρια τοξικότητας της ισταμίνης στα διάφορα τρόφιμα μπορεί να οφείλεται στην απουσία ή στην παρουσία άλλων συνεργικών βιογενών αμινών όπως η πουτρεσκίνη και η καδαβερίνη ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Οι βιογενείς αμίνες μπορούν όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως να χαρακτηριστούν ειδικοί δείκτες της φρεσκάδας των τροφίμων, της διάρκειας ζωής (shelf life), της υγιεινής ποιότητας, της ασφάλειας καθώς και χημικοί δείκτες της ακατάλληλης επεξεργασίας των τροφίμων ή/και των κακών συνθηκών συντήρησής τους. Αυτό εξηγεί την ραγδαία αύξηση του αριθμού των άρθρων που δημοσιεύθηκαν τα τελευταία χρόνια στην βιβλιογραφία και επικεντρώνονται στον προσδιορισμό των ΒΑ στα τρόφιμα. Επίσης δίνει και το ερέθισμα για την αναζήτηση νέων, οικονομικότερων και λιγότερο πολύπλοκων τεχνικών ανάλυσής τους. Τα δύο κυριότερα μειονεκτήματα της ανάλυσης των ΒΑ στα τρόφιμα είναι τα εξής: η πολυπλοκότητα των δειγμάτων και τα χαμηλά επίπεδα συγκεντρώσεων των αναλυτών στα διάφορα δείγματα. Εξαιτίας της παρουσίας ανεπιθύμητων και δυνητικά παρεμποδίζουσων ενώσεων στα δείγματα, απαραίτητο και πολύ σημαντικό στάδιο είναι η εκχύλιση του δείγματος με τους κατάλληλους διαλύτες. Στην βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί πολλοί τέτοιοι διαλύτες όπως το υδροχλωρικό οξύ, το τριχλωροξικό οξύ, το υπερχλωρικό οξύ, το 18

16 μεθανοσουλφονικό οξύ καθώς και οργανικοί διαλύτες όπως πετρελαϊκός αιθέρας κ.ά. Πολλές μέθοδοι που έχουν δημοσιευτεί στην βιβλιογραφία, είναι βασισμένες στην χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC), στην υγρή χρωματογραφία (LC), στην αέρια χρωματογραφία (GC), σε βιολογικά τεστ (assays) και στην τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (capillary electrophoresis). H Χρωματογραφία Λεπτής Στιβάδας είναι απλή διαδικασία και δεν απαιτεί ειδικό εξοπλισμό, αλλά σε όλα τα δημοσιευμένα άρθρα το μεγαλύτερο πρόβλημα εντοπίζεται στην σχετικά μεγάλη διάρκεια της ανάλυσης ή/και στην ανακρίβεια των αποτελεσμάτων ( ημιποσοτική μέθοδος). Η Αέρια Χρωματογραφία δεν χρησιμοποιείται συχνά για ποσοτικοποίηση των ΒΑ. Η Τριχοειδής Ηλεκτροφόρηση (CE) με ανίχνευση φθορισμού είναι μια πολύ δημοφιλής μέθοδος εξαιτίας της μεγαλύτερης ευαισθησίας που εμπεριέχει η μέθοδος σε σύγκριση με τις μεθόδους που συνοδεύονται με ηλεκτροχημική ανίχνευση και ανίχνευση υπεριώδους. Τέλος, τα τεστ, που χρησιμοποιούν βιοαισθητήρα, παρουσιάζουν πολλά πλεονεκτήματα όπως, χαμηλό κόστος, σύντομο χρόνο ανάλυσης, απλότητα στην χρήση και δυνατότητα εφαρμογής εκτός εργαστηριακού χώρου. Μεταξύ των δημοσιευμένων μεθόδων, η πιο δημοφιλής για τον διαχωρισμό και την ποσοτικοποίηση των ΒΑ, είναι η Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Επίδοσης (HPLC) σε συνδυασμό με παραγωγοποίηση προ- ή μετα- τον διαχωρισμό. Οι ΒΑ που απαντώνται στα διάφορα δείγματα τροφίμων έχουν χαμηλή UV απορρόφηση και η έλλειψη κατάλληλων χρωμοφόρων ομάδων στην δομή τους ή η χαμηλή συγκέντρωσή τους καθιστούν εξαιρετικά πολύπλοκη την ανίχνευση και τον αναλυτικό προσδιορισμό τους. Το πρόβλημα αυτό μπορεί να παρακαμφθεί με προ- στήλης παραγωγοποίηση με φθορίζουσες ομάδες. 5 Ως αντιδραστήρια επισήμανσης συνήθως χρησιμοποιούνται τα εξής: ισοθειοκυανικός φαινυλεστέρας (PITC), 2-(υπερφθοροοκτυλο)ισοκυανικός αιθυλεστέρας, ο-φθαλαλδεΰδη (ΟΡΑ) 6, 3-(4-χλωροβενζοϋλο)-κινολινο-2- αλδεΰδη 7, 5-φουρανοϋλοκινολινο-3-αλδεΰδη (FQ), 9-19

17 φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλο-χλωρίδιο (Fmoc-Cl), 4-χλωρο-3,5- δινιτροτριφθοροτολουόλιο (CNBF), 5-(διμεθυλαμινο)ναφθαλενο-1- σουλφονυλοχλωρίδιο (Dansyl-Cl) 8, βενζοϋλοχλωρίδιο, 3,5- δινιτροβενζοϋλοχλωρίδιο και 4-φαινυλο-3Η,3 Η-σπειρο[φουρανο-2,1- ισοβενζοφουρανο-3.3 -διόνη (fluorescamine). Η ανίχνευση πρωτοταγών αμινών έχει επιτευχθεί από τον O. Busto et al χρησιμοποιώντας τον 6-αμινοκινολυνο-Ν-υδροξυηλεκτριμιδυλο-καρβαμικό εστέρα (AQC) 9 και από τον V. Lozanov et al με τη χρήση του Ν-(9- φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλο)-ηλεκτριμιδίου. 10 Επίσης, προσδιορισμός με LC με παραγωγοποίηση μετά από τη στήλη έχει αναφερθεί από τον L. Hlabangana et al χρησιμοποιώντας 1,2-ναφθοκινονο-4-σουλφονικό οξύ. 11 Ωστόσο, οι συνθήκες παραγωγοποίησης είναι ισχυρά εξαρτώμενες από τη δομή των βιογενών αμινών. Σε μεγάλο αριθμό δημοσιεύσεων έχει παρατηρηθεί έλλειψη σταθερότητας των παραγωγοποιημένων αναλόγων καθώς και στενά μήκη κύματος ανίχνευσης, κακή επαναληψιμότητα, χαμηλή ευαισθησία και εκλεκτικότητα, χρονοβόρα επισήμανση, χρονοβόρες αναλυτικές διαδικασίες και τέλος παρεμβολές στο χρωματογράφημα. Επιπλέον, ο σχηματισμός των παραγώγων φθορισμού συνοδεύεται απροσδόκητα από πολλαπλά προϊόντα από μία και μόνο αμίνη ανάλογα με τα χαρακτηριστικά του προς ανάλυση δείγματος. Για να αντιμετωπιστούν αυτά τα προβλήματα των συμβατικών μεθόδων ανίχνευσης, εφαρμόστηκε η μικκυλιακή ηλεκτροκινητική χρωματογραφία βασισμένη στο φαινόμενο της πολυφωτονικής διέγερσης φθορισμού (multiphoton excitation fluorescence MPEF) μετά από παραγωγοποίηση των βιογενών αμινών με Ν-(4-αμινοβουτυλο)-Ναιθυλοϊσολουμινόλη παρουσία χηλικών ενώσεων του χαλκού ως ενισχυτών χημειοφωταύγειας. 12 Ωστόσο, και σε αυτή την περίπτωση, παρατηρείται χαμηλή εκλεκτικότητα. Τα τελευταία έτη, έχουν αναπτυχθεί πολλοί ενζυμικοί αισθητήρες για ανάλυση βιογενών αμινών με τη μέθοδο της βιο-αναγνώρισης ως εναλλακτική 20

18 λύση στις κλασσικές χρωματογραφικές μεθόδους. 13 Τα πλεονεκτήματα τους είναι το χαμηλό κόστος τους και οι πολύ σύντομοι χρόνοι ανάλυσης. Ωστόσο, υστερούν σε εκλεκτικότητα και παρουσιάζουν ισχνή ευαισθησία. 14 Μόνο η ολική περιεκτικότητα ΒΑ μπορεί να προσδιοριστεί ενώ η ακρίβεια της μεθόδου απαιτείται να αξιολογηθεί με μια δεύτερη πιο αξιόπιστη μέθοδο, πριν τη χρήση του αισθητήρα σε ένα νέο δείγμα τροφίμου. Στις μέρες μας, ο σχεδιασμός νέων μεθοδολογιών που υπόσχονται γρήγορη και αξιόπιστη ανάλυση σε δείγματα διαφόρων τροφίμων εξακολουθεί να είναι δύσκολος. Οι μεθοδολογίες, που βασίζονται στην Φασματομετρία Μάζας αποτελούν ένα γρήγορο και ευαίσθητο εργαλείο για την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό μεταβολιτών, αμινοξέων, πρωτεϊνών και μεταμεταφραστικών τροποποιήσεών τους. Η φασματομετρία μαζών με ιονισμό ηλεκτροψεκασμού (ESI-MS) είναι μια αρκετά αξιόπιστη μέθοδος για την ανίχνευση και την ανάλυση των μεταβολιτών. 15,16 Προκειμένου να αυξηθεί η ακρίβεια και η πιστότητά της, έχουν αναπτυχθεί αναλυτικά πρωτόκολλα LC-MS/MS υπό συνθήκες MRM (Σάρωση Πολλαπλών Αντιδράσεων (Multiple Reaction Monitoring)) χρησιμοποιώντας σταθερά επισημασμένα ανάλογα ως εσωτερικά πρότυπα. 17,18 Για χαμηλές συγκεντρώσεις αναλυτών, η υψηλή αξιοπιστία επιτυγχάνεται με τη μέθοδο της ισοτοπικής αραίωσης (Stable Isotope Dilution SID). 19,20 Οι παραπάνω τεχνικές ανάλυσης χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία και θα εξηγηθούν περαιτέρω στις επόμενες παραγράφους Ιονισμός ηλεκτροψεκασμού O ιονισμός ηλεκτροψεκασμού (ESI) είναι μια τεχνική που έχει εφαρμογή σε ένα ευρύ φάσμα δειγμάτων υγρής φάσης και είναι ιδιαίτερα δημοφιλής στον προσδιορισμό βιομορίων μεγάλου Μ.Β.. Επίσης, αποτελεί την πιο επιτυχημένη διασύνδεση για εφαρμογές τύπου LC/MS και CE/MS. Παρά το γεγονός ότι η έννοια του ηλεκτροψεκασμού προτάθηκε από τον Malcom Dole το 1968, η 21

19 ανάπτυξη της μεθόδου ESI-MS πιστώνεται στον John Fenn, ο οποίος τιμήθηκε με το βραβείο Νόμπελ Χημείας 2002 για την εν λόγω συνεισφορά. Ο ιονισμός ηλεκτροψεκασμού είναι μια διαδικασία που παράγει ένα λεπτό εκνέφωμα φορτισμένων σταγονιδίων υπό την επίδραση ενός ισχυρού ηλεκτρικού πεδίου. Η εξάτμιση του διαλύτη μετατρέπει τα φορτισμένα σταγονίδια σε ιόντα αέριας φάσης. Μια απλοποιημένη διάταξη ESI παρουσιάζεται στην Εικ. 2. Το διάλυμα του αναλύτη, αφού αναμειχθεί σε ένα κατάλληλο μίγμα διαλυτών, ρέει διαμέσου ενός τριχοειδούς σωλήνα από ανοξείδωτο χάλυβα του οποίου η άκρη διατηρείται σε υψηλό δυναμικό της τάξης των 3-4 kv, έναντι ενός αντισταθμιστικού ηλεκτροδίου αντίθετης πολικότητας. Ο διαλύτης συνήθως συνίσταται από ένα 1:1 μίγμα Η 2 Ο/ΜeCN (v/v) και τυπικά περιέχει <1% CH 3 COOH, HCOOH ή TFA. Η διαφορά δυναμικού παράγει ένα ηλεκτροστατικό πεδίο. Η εξάτμιση των φορτισμένων σταγονιδίων συντελείται με τη βοήθεια ροής θερμού αζώτου. Κατά τη διαδικασία αποδιαλύτωσης των σταγονιδίων, μέρος των διαλυμένων ιόντων απελευθερώνονται στην ατμόσφαιρα και στην συνέχεια οδηγούνται από την περιοχή ατμοσφαιρικής πίεσης προς το υψηλό κενό του αναλυτή μαζών μέσω μιας σειράς σταδίων όπου επιτυγχάνεται μείωση της πίεσης. Δύο σχέδια της περιοχής μεταφοράς είναι τα πιο κοινότυπα στις εμπορικές εκδόσεις μιας πηγής ESI: το πρώτο αποτελείται από θερμαινόμενο μεταλλικό ή υάλινο τριχοειδές μήκους μερικών εκατοστών (Εικ. 3) και το δεύτερο αποτελείται από κάτοπτρα μικρής οπής (Εικ. 4)

20 Εικόνα 2: Απλοποιημένο σχηματικό διάγραμμα ιονισμού ESI. (Principles and Practice of Biological Mass Spectrometry, Wiley-Interscience, 2001) Εικόνα 3: Απεικόνιση του θερμαινόμενου τριχοειδούς μιας πηγής ESI. (Principles and Practice of Biological Mass Spectrometry, Wiley-Interscience, 2001) 23

21 Εικόνα 4: Απεικόνιση πηγής ESI που χρησιμοποιεί κάτοπτρα. (Principles and Practice of Biological Mass Spectrometry, Wiley-Interscience, 2001) Η ανάλυση με τη μέθοδο ΕSI-MS μπορεί να εφαρμοστεί είτε υπό θετικό ή αρνητικό ιονισμό, ανάλογα με τη φύση των προς ανάλυση ενώσεων. Η πολικότητα των ιόντων επιλέγεται από την πολικότητα του ζεύγους τριχοειδέςαντισταθμιστικό ηλεκτρόδιο. Χαρακτηριστικό των φασμάτων μάζας ESI είναι ο σχηματισμός των ψευδομοριακών ιόντων του αναλύτη. Η θραυσμάτωση, εάν είναι επιθυμητή, μπορεί να επιτευχθεί στην περιοχή μεταφοράς των ιόντων της πηγής ESI με αύξηση της διαφοράς δυναμικού στον κώνο δειγματοληψίας ακολουθούμενη από σύγκρουση με άτομα ή μόρια αδρανούς αερίου (Ar, He). Αυτή η διαδικασία είναι γνωστή ως διάσπαση προκαλούμενη από σύγκρουση (collision induced dissociation, CID). 24

22 1.4.2 Διάσπαση προκαλούμενη από σύγκρουση (Collision Induced Dissociation, CID) Στην διάσπαση προκαλούμενη από σύγκρουση (CID) τα πρόδρομα ιόντα συγκρούονται με άτομα ή μόρια αδρανούς αερίου, όπως άζωτο, αργό, ήλιο και θραυσματώνονται. Κατά τη σύγκρουση, ένα μέρος της κινητικής ενέργειας μετατρέπεται σε δονητική/περιστροφική ενέργεια του μητρικού ιόντος. Εάν η εσωτερική ενέργεια που αποκτήθηκε είναι αρκετά υψηλή, το πρόδρομο ιόν θα κατακερματιστεί αρκετά γρήγορα με αποτέλεσμα τα ιόντα-θραύσματα (fragment ions) να μην είναι παρατηρήσιμα στο φάσμα μάζας. Ανάλογα με τον τύπο του αναλυτή μαζών συνδυάζεται ένας από τους 2 παρακάτω τύπους διεργασίας CID (α) υψηλής ενέργειας CID (με ενέργεια σύγκρουσης της τάξης των kev) ή (β) χαμηλής ενέργειας CID (της τάξης <100 ev). Χαμηλής ενέργειας CID εφαρμόζεται σε όργανα με αναλυτές μαζών όπως το τετράπολο (quadrupole) και η παγίδα ιόντων (ion trap). Υψηλής ενέργειας CID είναι χαρακτηριστική για τα όργανα με αναλυτή μάζας τύπου χρόνου-πτήσης (time-of-flight TOF). Τα φάσματα μάζας που προκύπτουν από υψηλής ενέργειας CID είναι συχνά πολύπλοκα, με άφθονα εσωτερικά και χαμηλής μάζας ιόντα-θραύσματα. Παρ όλη την πολυπλοκότητα τέτοιων φασμάτων, το πλεονέκτημα της μεθόδου είναι ο εύκολος προσδιορισμός του πρόδρομου ιόντος. Σε αντίθεση, τα χαμηλής ενέργειας CID φάσματα περιέχουν μόνο λίγα ιόντα-θραύσματα καθώς και ελλιπείς πληροφορίες για το σαφή προσδιορισμό του πρόδρομου ιόντος Τετραπολικός Αναλυτής Μαζών Το φασματόμετρο μάζας αναλύει τα ιόντα βάσει των αναλογιών m/z (μάζα/φορτίο) αντί για την πραγματική μάζα τους. Η πολλαπλή φόρτιση των αναλυτών κατά τον ιονισμό ηλεκτροψεκασμού κατέστησε δυνατή την ανάλυση ενώσεων υψηλής μάζας, ακόμη και με τα συνήθη φασματόμετρα μάζας με περιορισμένο εύρος μαζών. Τα τετραπολικό φίλτρο μάζας είναι μια σχετικά μικρή 25

23 συσκευή που μπορεί να ρυθμιστεί ώστε να επιτρέπει τη διέλευση ιόντων με πολύ περιορισμένο εύρος m/z. Τα υπόλοιπα ιόντα με υψηλότερο ή χαμηλότερο m/z θα εκτροχιαστούν χωρίς να καταφέρουν να φτάσουν στον ανιχνευτή. Το φάσμα μάζας προκύπτει έπειτα από σάρωση σε όλο το επιθυμητό εύρος m/z και την ποσοτική ανίχνευση των ιόντων που περνούν το φίλτρο για κάθε συγκεκριμένο λόγο m/z. Εικόνα 5: Απεικόνιση τετραπολικού αναλυτή μαζών Διαδοχική Φασματομετρία Μαζών-Τριπλό Τετράπολο (Triple- Quadrupole) Ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο όργανο διαδοχικής φασματομετρίας μαζών (MS/MS), ειδικά σε βιοαναλυτικές δοκιμασίες, είναι το τριπλό-τετράπολο (QqQ). Χρησιμοποιείται συχνά σε συνδυασμό με υγρή χρωματογραφία (LC) για την ποσοτική ανάλυση μορίων χαμηλής περιεκτικότητας σε πολύπλοκα μίγματα. Το πρώτο τετράπολο του QqQ είναι ρυθμισμένο να επιτρέπει τη διέλευση μόνο ενός συγκεκριμένου λόγου m/z. Όμως όταν το δείγμα είναι αρκετά περίπλοκο, για παράδειγμα τα σωματικά υγρά όπως ο ορός αίματος ή τα ούρα, η 26

24 αποτελεσματικότητα του χρωματογραφικού διαχωρισμού συχνά δεν είναι αρκετά υψηλή και η επιθυμητή ένωση μπορεί να συνεκλουστεί με ποικιλία μορίων εντός του προεπιλεγμένου εύρους m/z. Όλες αυτές οι παρεμβολές θα οδηγηθούν και στο δεύτερο τετράπολο. Στα περισσότερα όργανα με τριπλό-τετράπολο το δεύτερο τετράπολο είναι στην πραγματικότητα ένα οχτάπολο ή εξάπολο, αλλά παρ όλα αυτά συνήθως συμβολίζεται ως τετράπολο για ιστορικούς λόγους. Στο δεύτερο "τετράπολο" λαμβάνει χώρα θραυσμάτωση με χαμηλής ενέργειας CID. Το τρίτο τετράπολο είναι επίσης ρυθμισμένο να επιτρέπει τη διέλευση σε ένα συγκεκριμένο m/z, το οποίο είναι συνήθως ένα γνωστό τμήμα της ένωσης που αποτελεί το αντικείμενο της έρευνας. Αυτή η διαδικασία φιλτραρίσματος δύο σταδίων παρέχει υψηλή εξειδίκευση ακόμη και για πολύπλοκα δείγματα και σχετικά γρήγορους χρωματογραφικούς διαχωρισμούς. Ο πολύ γρήγορος κύκλος του QqQ (10 έως 50 ms) το καθιστά ιδιαίτερα χρήσιμο για πολύπλοκες και υψηλής απόδοσης αναλύσεις (high throughput). Εικόνα 6: Απεικόνιση διαδοχικής φασματομετρίας μαζών σε αναλυτή τύπου τριπλό-τετράπολο (QqQ) Διαδοχική Φασματομετρία Μαζών ΜS/MS (Tandem Mass Spectrometry) Η μεγάλη δημοτικότητα της τεχνικής MS/MS μπορεί να αποδοθεί σε μεγάλο βαθμό στην εμφάνιση το 1978 του τριπλού-τετραπόλου. Είναι μια τεχνική όπου λαμβάνονται πληροφορίες σχετικά με τη δομή των μορίων του δείγματος 27

25 χρησιμοποιώντας πολλαπλά στάδια επιλογής και διαχωρισμού μαζών. Μια προϋπόθεση είναι τα μόρια του δείγματος να μπορούν να μεταφερθούν στην αέρια φάση, να ιονιστούν ανέπαφα και να μπορούν να υπεισέλθουν σε προβλέψιμες αντιδράσεις μετά το πρώτο στάδιο επιλογής μαζών. Πολυσταδιακές τεχνικές MS/MS, ή MS n, μπορεί να πραγματοποιηθούν επιλέγοντας αρχικά και απομονώνοντας το πρόδρομο ιόν (MS 2 ), στην συνέχεια θρασμαυτώνοντας και απομονώνοντάς το σαν ένα πρωτεύον ιόν-θραύσμα (MS 3 ), στην συνέχεια θρασμαυτώνοντας και απομονώνοντάς το σαν ένα δευτερεύον ιόν-θραύσμα (MS 4 ), και ούτω καθεξής για όσο χρονικό διάστημα συλλέγονται χρήσιμες πληροφορίες ή το σήμα είναι ανιχνεύσιμο. Μια ποικιλία από τεχνικές σαρώσεις MS/MS περιγράφονται στη βιβλιογραφία, αλλά οι τέσσερις πιο συχνές είναι η σάρωση πρόδρομου ιόντος (precursor ion), η σάρωση πολλαπλών αντιδράσεων (product ion), που αναφέρεται επίσης και ως multiple-reaction-monitoring, MRM), απώλειας ουδέτερου μορίου (neutral loss), και η σάρωση επιλεγμένης αντίδρασης (single-reaction-monitoring). H τεχνική MRM χρησιμοποιείται για τη συλλογή δομικών πληροφοριών όσο το δυνατόν περισσότερων διαφορετικών μορίων του δείγματος. Στην τεχνική precursor ion και neutral loss, ο στόχος είναι η ανίχνευση μιας ορισμένης κατηγορίας μορίων με μία κοινή λειτουργική ομάδα, όπως π.χ: φωσφοπεπτίδια ή διαφορετικές κατηγορίες λιπιδίων. Η τεχνική SRM χρησιμοποιείται καθολικά σε συνδυασμό με χρωματογραφικό διαχωρισμό για την ποσοτικοποίηση μιας συγκεκριμένης ένωσης σε ένα πολύπλοκο (συχνά βιολογικό) δείγμα

26 Εικόνα 7: Απεικόνιση των βασικών αρχών: α) τεχνική σάρωσης πολλαπλών αντιδράσεων (MRM), β) τεχνική σάρωσης πρόδρομου ιόντος, γ) τεχνική σάρωσης επιλεγμένης αντίδρασης (SRM) και δ) τεχνική σάρωσης απωλεσθέντος ουδέτερου μορίου.(desiderio, D. M. & Nibbering, N. M. M. (2007). Mass Spectrometry: Instrumentation, Interpretation, and Applications. (R. Ekman, & J. Silberring, & A.M. Westman-Brinkmalm, & A.Kraj, Eds.). New Jersey: John Wiley & Sons Inc., page 90) 29

27 Τεχνική MRM (Multiple Reaction Monitoring) Στην τεχνική MRM, χρησιμοποιούνται δύο στάδια φιλτραρίσματος μαζών με τη βοήθεια ενός τριπλού-τετραπόλου. 23 Στο πρώτο στάδιο (Q1), προεπιλέγεται ένα πρόδρομο ιόν, το οποίο θραυσματώνεται με την διαδικασία CID στο δεύτερο στάδιο (Q2). Στο τελευταίο στάδιο (Q3), αντί της καταγραφής ενός πλήρους φάσματος, όπου θα φαίνονται όλα τα πιθανά ιόντα-θραύσματα που προέρχονται από τον πρόδρομο ιόν, λαμβάνονται πληροφορίες μόνο για ένα μικρό αριθμό επιλεγμένων θυγατρικών ιόντων. Η στοχευμένη ανάλυση MRM αυξάνει δραματικά το χαμηλότερο όριο ανίχνευσης, π.χ. όσον αφορά τα πεπτίδια έως και 100 φορές σε σύγκριση με την πλήρη σάρωση των ιόντων-θραυσμάτων. Η τεχνική αυτή σε συνδυασμό με φασματομετρία μαζών ισοτοπικής αραίωσης (SID-MS) χρησιμοποιώντας ένα τριπλό-τετράπολο είναι μια ισχυρή μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό τόσο διαφόρων πρωτεϊνών-στόχων όσο και μικρών μορίων. Εικόνα 8: Απεικόνιση της τεχνικής MRM σε αντιπαράθεση με την κλασσική τεχνική όπου λαμβάνεται φάσμα πλήρους σάρωσης. 30

28 1.4.5 Φασματομετρία Μαζών Ισοτοπικής Αραίωσης (SID-MS) Η πρώιμη μέθοδος ισοτοπικής αραίωσης ήταν μια μορφή ραδιοϊχνηθέτησης που χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της διαλυτότητας του θειούχου μολύβδου και χρωμικού μολύβδου το 1913 από τους George de Hevesy και Friedrich Adolf Paneth. 24 Επιπρόσθετα, την δεκαετία του 1930, ο βιοχημικός David Rittenberg καινοτόμησε με τη χρήση της ισοτοπικής αραίωσης πάνω σε λεπτομερείς μελέτες του μεταβολισμού των κυττάρων. Η μέθοδος της ισοτοπικής αραίωσης αναπτύχθηκε περαιτέρω από τον George de Hevesy ο οποίος τιμήθηκε με το βραβείο Νόμπελ Χημείας το Εικόνα 9: Απεικόνιση ενδεικτικού φάσματος της μεθόδου SID-MS. Στην σύγχρονη φασματομετρία μαζών ισοτοπικής αραίωσης (SID-MS) επιτυγχάνονται ταυτόχρονες ποσοτικές αναλύσεις σε πολύπλοκα μίγματα. Για να γίνουν εφικτές, η παραπάνω τεχνική συνδυάζεται με την τεχνική MRM. Προϋποθέσεις είναι η ύπαρξη: α) δυο μορφών των προς ανάλυση ενώσεων στο δείγμα οι οποίες θα έχουν συγκεκριμένη διαφορά μαζών, αυτό συνήθως 31

29 επιτυγχάνεται με παραγωγοποίηση των προς ανάλυση ενώσεων με ένα αντιδραστήριο ιχνηθέτησης που περιέχει κάποιο σταθερό ισότοπο π.χ. 2 Η, 13 C, 15 N κλπ. και β) μιας τεχνικής φασματομετρίας μαζών που να ανιχνεύει τα ιόντα αναφοράς (χαρακτηριστικό της ποσότητας) και τα αναγνωριστικά ιόντα (μοναδικό χαρακτηριστικό της ένωσης), τα οποία είναι καθοριστικά στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Αυτό επιτυγχάνεται με την τεχνική MRM. Oι αναλυόμενες ενώσεις ιχνηθετούνται με συγκεκριμένο αντιδραστήριο, το οποίο έχει δύο ισομορφές ( ελαφρύ και βαρύ ) και μας δίνει την απαραίτητη διαφορά μαζών. Στο προς ανάλυση δείγμα, το οποίο έχει παραγωγοποιηθεί με το ελαφρύ αντιδραστήριο, προστίθεται γνωστή ποσότητα εσωτερικού προτύπου, το οποίο αποτελείται από όλες τις προς ανάλυση ενώσεις ιχνηθετημένες με το βαρύ αντιδραστήριο. Τα ιόντα αναφοράς προέρχονται από το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης, είναι κοινά για όλες τις ενώσεις που αναλύονται και χρησιμοποιούνται για την ποσοτικοποίηση. Η ποσοτικοποίηση γίνεται συγκρίνοντας την αναλογία των σημάτων μεταξύ των ιόντων αναφοράς που προέρχονται από την ιχνηθέτηση με το ελαφρύ αντιδραστήριο και αυτών που προέρχονται από αυτή με το βαρύ αντιδραστήριο. Τα αναγνωριστικά ιόντα είναι χαρακτηριστικά για τους αναλύτες και αφορούν την ανίχνευσή τους στο δείγμα. 32

30 2. ΣΚΟΠΟΣ Οι ΒΑ αποτελούν απαραίτητα συστατικά των κυττάρων και παίζουν σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση της λειτουργίας των νουκλεϊκών οξέων, στην πρωτεϊνοσύνθεση και πιθανότατα στην σταθεροποίηση των μεμβρανών. Παρ όλα αυτά, η κατανάλωση τροφίμων με μεγάλη περιεκτικότητα σε ΒΑ μπορεί να έχει και τοξικές συνέπειες. Έρευνες έχουν δείξει ότι μπορούν να επιφέρουν ταχυκαρδία, αρρυθμία, ημικρανίες, αυξημένο σάκχαρο και αυξημένη αρτηριακή πίεση. Επίσης η νόσος του Parkinson, η σχιζοφρένεια και η κατάθλιψη έχουν συσχετιστεί με αυξημένα επίπεδα ΒΑ στο αίμα των ασθενών. Οι ΒΑ μπορούν επιπρόσθετα να χαρακτηριστούν ειδικοί δείκτες της φρεσκάδας των τροφίμων, της διάρκειας ζωής (shelf life), της υγιεινής ποιότητας, της ασφάλειας καθώς και χημικοί δείκτες της ακατάλληλης επεξεργασίας των τροφίμων ή/και των κακών συνθηκών συντήρησής τους. Όλα τα παραπάνω συνηγορούν στην ραγδαία αύξηση του αριθμού των άρθρων που δημοσιεύθηκαν τα τελευταία χρόνια σχετικά με την ανίχνευση ΒΑ στα τρόφιμα. Με δεδομένο την ανάγκη για νέες, οικονομικότερες και λιγότερο πολύπλοκες τεχνικές ανάλυσης τους, θεωρήσαμε ενδιαφέρουσα τη μελέτη και ανάπτυξη μιας νέας μεθόδου που θα επιτρέπει την ταυτόχρονη ανίχνευση και ποσοτικοποίηση όλων των περιεχόμενων ΒΑ σε ένα δείγμα τροφίμου. Θεωρήσαμε ότι μια τέτοια κατάλληλη τεχνική θα πρέπει να περιλαμβάνει το συνδυασμό SID-MRM. Επίσης θα πρέπει να παρέχει ταυτόχρονη και γρήγορη ανάλυση και να μπορεί να εφαρμοστεί ένα εύκολο πρωτόκολλο δειγματοληψίας και παραγωγοποίησης. Τα αντιδραστήρια παραγωγοποίησης θα πρέπει να πληρούν τις παρακάτω προϋποθέσεις: α) εύκολη σύνθεση και σε όσο το δυνατόν λιγότερα βήματα, β) οικονομικά και εμπορικά διαθέσιμα πρόδρομα, τουλάχιστον για το ελαφρύ αντιδραστήριο και γ) εκλεκτική παραγωγοποίηση των πρωτοταγών αμινομάδων των ΒΑ για την αποφυγή πολύπλοκων φασμάτων. Γι αυτούς τους λόγους και με βάση πρότερη εμπειρία του εργαστηρίου μας θεωρήσαμε ως κατάλληλους ιχνηθέτες τους d 0 /d 3 -Ν-υδροξυηλεκτριμιδυλεστέρες του π-μεθοξυβενζοϊκού οξέος, αφού η σύνθεσή του ελαφρού αντιδραστηρίου μπορεί να γίνει σε μόλις ένα βήμα με ενεργοποίηση του εμπορικά διαθέσιμου π- 33

31 ανισικού οξέος, ενώ το βαρύ αντιδραστήριο σε δύο στάδια από το π- υδροξυβενζοϊκό οξύ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3.1 ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗΣ (tagging reagents) Σύνθεση του d 3-4-μεθoξυβενζοϊκού οξέος Αντ/ρια Μ.Β mmol g ml d 4-138, , hydroxybenzoic acid K 2 CO ,76 27,9 - CD 3 I ,75 - acetone 58, ,791 Πειραματική διαδικασία Σε αναδευόμενο αιώρημα Κ 2 CO 3 σε άνυδρη ακετόνη προστίθενται σε θερμοκρασία δωματίου το 4-υδροξυβενζοϊκό οξύ και το CD 3 I. Το προκύπτον μίγμα τίθεται σε συνθήκες βρασμού κατ αντιρροή για 4 ώρες. Αφού το σύστημα επανέλθει σε θερμοκρασία δωματίου, το αδιάλυτο Κ 2 CO 3 φιλτράρεται και το διήθημα συμπυκνώνεται μέχρι ξηρού. Στο υπόλειμμα προστίθεται υδατικό διάλυμα κιτρικού οξέος 5% και AcOEt και η υδατική φάση εκχυλίζεται 2 φορές επιπλέον με AcOEt. Στην συνέχεια, οι οργανικές φάσεις ξηραίνονται με Na 2 SO 4 34

32 και συμπυκνώνονται δίνοντας 1,24 g κρυσταλλικού προϊόντος. Ανακρυστάλλωση με μίγμα διαλυτών (CH 3 ) 2 CO/CH 3 OH έδωσε 1,01 g λευκού κρυσταλλικού προϊόντος. Απόδοση: 65% Σύνθεση των Ν-υδροξυηλεκτριμιδυλεστέρων του d 0 /d 3-4- μεθoξυβενζοϊκού οξέος Αντ/ρια Μ.Β mmol g ml d d 0 -p-anisic acid 152,15 5 0, d ,12 5 0, methoxybenzoic acid HOSu 138,2 7,5 0, DCC 144,94 5,5 1, THF 58, ,5 0,889 Πειραματική διαδικασία Σε παγωμένο στους 0 ο C του 4-μεθoξυβενζοϊκού οξέος σε άνυδρο THF προστίθεται το Ν-υδροξυηλεκτριµίδιο και ακολουθεί στάγδην προσθήκη διαλύματος του DCC σε 2 ml THF. Το προκύπτον διάλυμα αναδεύεται στην ίδια θερμοκρασία για 30 λεπτά και στην συνέχεια σε θερμοκρασία δωματίου ολονυκτίως. H καταβυθισμένη ουρία διηθείται και πλένεται επί του ηθμού 3 φορές με 7 ml παγωμένου THF. To διήθημα συμπυκνώνεται μέχρι ξηρού και ο d 0- ενεργός εστέρας 26 λαμβάνεται έπειτα από καθαρισμό με FCC σε μίγμα διαλυτών PhMe/AcOEt (9:1). Απόδοση: 1,0 g (80%). 35

33 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3 ) : (δ) 8.04 (2H, d, J = 8.8 Hz, Η 3, Η 4 ), 6.93 (2H, d, J = 8.8 Hz, Η 1, Η 2 ), 2.84 (4H, s, Η 5-8 ) 3.2 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ (stock solutions) Παρασκευή διαλυμάτων των d 0- και d 3-4-MBA παραγωγοποιημένων αμινών Για την παρασκευή των απαιτούμενων εσωτερικών πρότυπων διαλυμάτων ετοιμάστηκαν αρχικά διαλύματα των προς ανάλυση ΒΑ [ισταμίνη (Him), φαινυλαιθυλαμίνη (Pea), τυραμίνη (Tyr), τρυπταμίνη (Trm), πουτρεσκίνη (Put), καδαβερίνη (Cad), σπερμιδίνη (Spd) και σπερμίνη (Spm)] σε συγκέντρωση 400 mg/l. 36

34 Σχήμα 1: Γενική αντίδραση παραγωγοποίησης των αναλυόμενων αμινών. Αυτές είναι οι βέλτιστες συνθήκες για την πλήρη ακυλίωση (ή διακυλίωση) των πρωτοταγών αμινομάδων των ΒΑ. Πρωτόκολλο παραγωγοποίησης Σε 1 ml προτύπου διαλύματος αμίνης προστίθενται 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος βορικών 0.4M, 1 ml d 0 -εστέρα (διάλυμα 1% w/v σε διοξάνη), 1 ml διοξάνη και το προκύπτον μίγμα αφήνεται σε σκοτεινό μέρος για 60 λεπτά στους 65 ο C. Έπειτα φυγοκεντρείται σε 2500 rpm για 5 λεπτά και το υπερκείμενο 37

35 διηθείται από ηθμό 0,2mm (Millipore Co., Bedford, MA, USA). Η παραπάνω διαδικασία ακολουθείται και για τις d 3-4-MBA παραγωγοποιημένες αμίνες. 3.3 ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΒΑ ΓΙΑ ΕΜΠΟΡΙΚΑ ΔΙΑΘΕΣΙΜΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: Σε 5,0g αλεσμένου δείγματος τροφίμου προστίθενται 25mL διαλύματος HCl 0.1 Μ, στη συνέχεια το μίγμα αναδεύεται σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά και έπειτα φυγοκεντρείται. Η παραπάνω διαδικασία εκχύλισης επαναλαμβάνεται 2 φορές. Στη συνέχεια λαμβάνονται 250μL από το προκύπτον μίγμα και παραγωγοποιούνται με τον d 0 - ενεργό εστέρα προσθέτοντας 250μL ρυθμιστικού διαλύματος βορικών (ph=10,6) και 100 μl αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης (1% w/v διάλυμα σε διοξάνη). Ακολουθεί δυνατή ανακίνηση του μίγματος και το προκύπτον διάλυμα αφήνεται σε σκοτεινό μέρος για 60 λεπτά στους 65 ο C. Η παραπάνω διαδικασία ακολουθείται και για την παραγωγοποίηση γνωστού μίγματος ΒΑ συγκέντρωσης 1ppm με τον d 3 - ενεργό εστέρα. Το διάλυμα που προκύπτει είναι το εσωτερικό πρότυπο της ανάλυσης και χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση των ΒΑ στα αναλυόμενα δείγματα μετά από προσθήκη 100μL στο παραγωγοποιημένο προς ανάλυση δείγμα. 38

36 Εικόνα 10: Πορεία δειγματοληψίας και ανάλυσης των διαφόρων δειγμάτων τροφίμων. 3.4 ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ MALDI MS ΚΑΙ MS/MS. 1 μl μίγματος του κάθε αναλύτη και α-κυανο-4- υδροξυκινναμικού οξέος (0.3% σε TFA) τοποθετείται πάνω στο πλακίδιο-maldi, αποδιαλυτώνεται σε θερμοκρασία δωματίου και αναλύεται. Τα φάσματα μαζών 39

37 λήφθηκαν στο όργανο 5800 MALDI-TOF-TOF Analyzer (AB SCIEX) το οποίο είναι εξοπλισμένο με λέιζερ νεοδυμίου-ύτριου-αλουμινίου και έχει ακρίβεια μέτρησης μαζών της τάξης των 5 ppm. Στην τεχνική MALDI MS, τα φάσματα καταγράφονται έπειτα από περίπου 4000 ακτινοβολήσεις λέιζερ με ρυθμό παλμού λέιζερ 400 Hz. Ενώ για την τεχνική ΜS/MS ο αριθμός των απαιτούμενων ακτινοβολήσεων λέιζερ είναι περίπου 5000 με ρυθμό 1000 Hz. Η ενέργεια πρόσκρουσης είναι της τάξης του 1 kv και η πίεση του κελιού σύγκρουσης 10-6 Torr. Οι αναλύσεις LC-MS έγιναν σε όργανο Thermo Scientific UHPLC το οποίο είναι συνδεδεμένο με ένα τριπλό-τετράπολο TSQ Quantum Vantage (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). O χρωματογραφικός διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε στήλη ανάστροφης φάσης C 18 Kinetex (2,1 x 50mm, μέγεθος σωματιδίων 1,9μm, Phenomenex, Torrance, CA). Τα μίγματα έκλουσης ήταν: διαλύτης Α (Η 2 Ο, 0.1% φορμικό οξύ), διαλύτης Β (ακετονιτρίλιο).από 10% Β έως 98% Β σε 8 λεπτά, 2 λεπτά σε ισοκρατικό μίγμα 98% Β, από 98% έως 10% Β σε 2 λεπτά. Ο χρόνος εξισορρόπησης της στήλης είναι 2 λεπτά. Ο ρυθμός ροής είναι στα 0.35 ml/min και η ποσότητα του δείγματος που αναλύεται είναι 10μL. Όλες οι θέσεις βαλβίδων και οι παράμετροι του οργάνου ελέγχονται από το λογισμικό Xcalibur (Thermo Fisher Scientific). Οι αναλύσεις φασματομετρίας μαζών εκτελέστηκαν σε αναλυτή μαζών τριπλό-τετράπολο συνδεδεμένο με θερμαινόμενη πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (HESI II) και πραγματοποιήθηκαν σε λειτουργία θετικού ιόντος. Εφαρμόστηκαν οι ακόλουθες συνθήκες: Τάση ψεκασμού 4,8 kv, θερμοκρασίες ψεκαστήρα και τριχοειδούς 200 και 300 C αντίστοιχα. Το αέριο σύγκρουσης που χρησιμοποιήθηκε ήταν αργό σε πίεση 1,5 mtorr στο χώρο σύγκρουσης (Q2). Οι παράμετροι S-lens και η ενέργεια σύγκρουσης (CE) έχουν βελτιστοποιηθεί για την κάθε ένωση ξεχωριστά. Η τεχνική (MRM) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των αναλυτών. Ο προσδιορισμός των ΒΑ πραγματοποιήθηκε αναλύοντας δύο συγκεκριμένες μάζες ανά ένωση, η πρώτη για την ποσοτικοποίηση και η δεύτερη για την επιβεβαίωση (Πίν. 1). Η επεξεργασία των δεδομένων και ο έλεγχος του οργάνου 40

38 διεξήχθησαν με τη βοήθεια του λογισμικού Xcalibur. Ο συνολικός χρόνος της ανάλυσης LC-MS/MS ήταν 10 λεπτά. Πίνακας 1. Παρατηρούμενα ιόντα και βελτιστοποιημένες παράμετροι του οργάνου. Παραγόμενα Παραγωγοποιημένος Αρχικά ιόντα ιόντα αναλύτης m/z m/z CE Him Pea Tyr Trm Put Cad Spd Spm S Lens Το κατώτερο όριο ανίχνευσης (LOD) και το κατώτερο όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) υπολογίστηκαν με τις παρακάτω εξισώσεις σύμφωνα με τις οδηγίες της IUPAC και της Επιτροπής της Αμερικανικής Χημικής Εταιρείας για την Περιβαλλοντική Αναλυτική Χημεία. S LOD = S RB + 3 RB S LOQ = S RB + 10 RB όπου S LOD είναι το σήμα στο όριο ανίχνευσης, S LOQ είναι το σήμα στο όριο ποσοτικοποίησης, S RB είναι το σήμα του τυφλού διαλύματος και σ RB είναι η 41

39 τυπική απόκλιση για το τυφλό διάλυμα. Οι συγκεντρώσεις υπολογίστηκαν από την πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης. 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1 ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ d 0 - ΚΑΙ d 3-4-MBA ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΑΜΙΝΩΝ Η τεχνική MALDI είναι κατάλληλη για την ανάλυση βιομορίων σε πολύπλοκα δείγματα λόγω της υψηλής ευαισθησίας της, της υψηλής ανεκτικότητας στα άλατα και σε άλλες προσμίξεις και παρέχει ένα ευρύ φάσμα μάζας με μικρό βαθμό θραυσμάτωσης. Ωστόσο, αυτή η τεχνική δεν αποτελεί επιλογή για την άμεση ανάλυση ενώσεων με χαμηλό μοριακό βάρος (ΜΒ<500 Da), επειδή στην συγκεκριμένη φασματική περιοχή παρεμβάλλονται ο χημικός θόρυβος και οι μάζες των μοριακών ιόντων της μήτρας που δυσχεραίνουν την ερμηνεία του φάσματος. Γι αυτό το λόγο, αρκετά καλύτερα αποτελέσματα λαμβάνονται μετά από την παραγωγοποίηση αυτών των μορίων. Αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει αύξηση στις εντάσεις του σήματος εξαιτίας της βελτίωσης της αποτελεσματικότητας ιονισμού, του καλύτερου χρωματογραφικού διαχωρισμού καθώς και την ενσωμάτωση των σταθερών ισοτόπων σε συγκεκριμένες θέσεις καθιστώντας έτσι την ποσοτική ανάλυση πιο αξιόπιστη. Η παραγωγοποίηση εξασφαλίζει τη μετατόπιση των αναλυόμενων μαζών (mass shift) σε μεγαλύτερο φασματικό εύρος (μεγαλύτερα ΜΒ) επιτυγχάνοντας πρώτον την διαφοροποίηση των αναλυόμενων ιόντων από εκείνα που προέρχονται από τις παρεμβολές της μήτρας και δεύτερον τον σαφή προσδιορισμό της κάθε ένωσης που υπάρχει στο μίγμα. Μια καλή στρατηγική για την ανάλυση των βιογενών αμινών με τις τεχνικές MALDI, LC-MS και MS/MS είναι η χρήση μιας απλής και αποτελεσματικής αντίδρασης παραγωγοποίησης, η οποία προσθέτει μια ετικέτα (tag) στον αναλύτη προκειμένου να επιτευχθεί η επιθυμητή μετατόπιση μάζας. Η παραγωγοποίηση των ΒΑ, οι οποίες φέρουν πολλές λειτουργικές ομάδες, καταλήγει συχνά σε ατελείς αντιδράσεις προκύπτοντας έτσι μίγμα παραγώγων 42

40 που δυσκολεύουν την ποσοτικοποίηση. Για να ξεπεραστούν αυτές οι αναλυτικές δυσκολίες, αναπτύχθηκε μια μέθοδο εκλεκτικής παραγωγοποίησης με τη χρήση του Ν-υδροξυηλεκτριμιδυλεστέρα του π-μεθoξυβενζοϊκού οξέος (4-MBA-OSu). O Ν-υδροξυηλεκτριμιδυλεστέρας αντιδρά εκλεκτικά με πρωτοταγείς αμίνες με αποτέλεσμα το σχηματισμό του αντίστοιχου αμιδικού δεσμού. Οι 4-MBA-BΑ θα πρέπει να παρέχουν τη χαρακτηριστική θραυσμάτωση της αμιδικής ομάδας σε πειράματα MS/MS. Επίσης για να εφαρμοστεί η τεχνική MRM κάθε παράγωγο θα πρέπει να δίνει ένα αναγνωριστικό ιόν (identification ion) χαρακτηριστικό της αναλυόμενης ΒΑ καθώς και ένα κοινό ιόν αναφοράς (reporter ion) χαρακτηριστικό για τον ιχνηθέτη (tag). Στην περίπτωση μας τα ιόντα αναφοράς d 0 και d 3 φέρουν m/z και 138.1, αντίστοιχα. Εικόνα 11. Φάσματα MALDI MS/MS των d 0-4-MBA παραγώγων των ΒΑ. 43

41 Οι προκαταρκτικές μελέτες του πέρατος της αντίδρασης παραγωγοποίησης σε μίγμα που περιέχει όλες της προς ανάλυση ΒΑ, της εκλεκτικότητας της αντίδρασης, αλλά και του εντοπισμού των κατάλληλων ιόντων για εφαρμογή της τεχνικής MRM έγιναν με MALDI-MS ως εξής: Ένα κλάσμα του μίγματος που περιέχει τις σημασμένες BA αναλύθηκε με MALDI MS όπως φαίνεται στην Εικ. 11. Το 4-MBA-OSu προσθέτει 134,0 Da στη μητρική μάζα κάθε αμίνης για να δώσει σήματα m/z ([C 13 H 15 N 3 O 2 +H] +, Δppm=2.9), ([C 16 H 17 NO 2 +H] +, Δppm=3.0), m/z (([C 16 H 17 NO 3 +H] +, , ([C 18 H 18 N 2 O 2 +H] +, Δppm=3.1), ([C 20 H 24 N 2 O 4 +H] +, Δppm=2.8), ([C 21 H 26 N 2 O 4 +H] +, Δppm=3.1), ([C 23 H 31 N 3 O 4 +H] +, Δppm=3.0), ([C 26 H 38 N 4 O 4 +H] +, Δppm=2.9) στο φάσμα μάζας MALDI-TOF. Σχηματίστηκαν μονο-υποκατεστημένα 4-MBA παράγωγα των Him, Pea, Tyr, Trm ενώ παρατηρήθηκαν δι-υποκατεστημένα παράγωγα των Put, Cad, Spm και Spd. Η σύγκριση των φασμάτων CID (1 kev) των παραγωγοποιημένων αμινών έδειξαν ότι η εισαγωγή της ομάδας 4-MBA οδήγησε στο αναμενόμενο μοτίβο θραυσμάτωσης. Τα επιθυμητά 4-MBA θραύσματα εμφανίστηκαν στα 135,05 και 138,07 Da αντιστοίχως. Αξιοσημείωτο είναι ότι και άλλες κορυφές του φάσματος προσδίδουν δομικές αποδείξεις για τις παραγωγοποιημένες ΒΑ, όπως θα δούμε παρακάτω. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα φάσματα CID (1 kev) των d 0 - και d 3-4- MBA παραγώγων των αρωματικών και ετεροαρωματικών αμινών απέδωσαν δύο κύριες κορυφές ιόντων παρέχοντας πληροφορίες για την ίδια την αμίνη [(BA- Η 2 )+Η] + και το σχετικό ιόν [BA+Η-16] +. Για παράδειγμα, στην περίπτωση της ισταμίνης (m/z ) η κορυφή του ιόντος m/z αντιστοιχεί σε [(Him- Η 2 )+Η] +, ενώ το [Him+Η-16] + (m/z 95.06) προκύπτει από την απελευθέρωση του 4-μεθοξυβενζαμιδίου (Εικ. 12Α, 12Β). Στην Εικ. 12C εμφανίζονται οι κορυφές των ιόντων ποσοτικού προσδιορισμού σε m/z 135,05 και 138,07 Da. Η ένταση των κορυφών αυτών με ενέργεια πρόσκρουσης 1 kev αντικατοπτρίζει την ύπαρξη των παραγωγοποιημένων BA. 44

42 O O + H HN NH N O H O + H N NH N Εικόνα 12. Φάσματα MALDI MS/MS των (A) d 0-4-MBA-Him, (B) d 3-4-MBA- Him και (C) d 0 -/d 3-4-MBA-Him μίγμα (1:1). 45

43 O OH + N H H N O O O O N H m/z m/z O OH + N H N H H N O O O O N H H N + H m/z m/z Εικόνα 13. Φάσματα MALDI MS/MS των (A) d 0-4-MBA-Put και (B) d 0-4- MBA-Spd. 46

44 Ο σχηματισμός των θραυσμάτων [Put+H-16] + (m/z 72.09), [4-MBA-Put+H- 16] + (206.14) και [(4-MBA) 2 -Put+H-108] + (m/z ) αντιπροσωπεύει το κύριο μοτίβο θραυσμάτωσης που παρατηρήθηκε σε MS/ MS φάσματα του παραγώγου της πουτρεσκίνης (m/z 357) (Εικ. 13Α). Παρά το γεγονός ότι, οι δευτεροταγείς αμίνες δεν ευνοούν την ακυλίωση που θα οδηγούσε σε παράγωγα με μεγάλο μοριακό βάρος, τα φάσματα MS/MS της καδαβερίνης, της σπερμιδίνης και της σπερμίνης είναι πιο πολύπλοκα. Το φάσμα MS/MS της παραγωγοποιημένης σπερμιδίνης (m/z ) δείχνει, εκτός από τα ιόντα [Spd+Η-16] + (m/z 129,15), [4-MBA-Spd+Η-16] + (263,20), [(4-ΜΒΑ) 2 -Spd+Η- 108] + (m/z ), [(4-ΜΒΑ) 2 -Spd+Η-18] + (m/z 396,27), τον σχηματισμό ακόμα δύο ιόντων με m/z 192,12 και 206,14. Αυτά τα ιόντα προκύπτουν από μια α- διάσπαση, η οποία λαμβάνει χώρα στο άζωτο της δευτεροταγούς αμίνης. Τα παρατηρούμενα ιόντα διαφέρουν κατά 14 Da, υποδεικνύοντας τα διαφορετικά μήκη των υδρογονανθρακικών αλυσίδων που συνδέονται με τη δευτεροταγή αμίνη (Εικ. 13Β). 4.2 ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΒΑ ΜΕ ΤΗΝ ΜΕΘΟΔΟ LC-MS/MS Στα πειράματα ESI MS/MS τα παράγωγα των d 0 - και d 3-4-MBA-BΑ διασπώνται στη θέση του δεσμού μεταξύ του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης και της αμίνης και παράγουν τα χαρακτηριστικά θραύσματα (m/z 135 και 138) που προέρχονται από το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης. Στα φάσματα ESI- MS/MS εμφανίζονται και άλλες κορυφές θραυσμάτων τα οποία είναι απολύτως αναγνωρίσιμα. Αυτό υποδεικνύει ότι πέρα απο την ποσοτικοποίηση είναι εφικτός και ο ταυτόχρονος προσδιορισμός της επισημασμένης αμίνης υπό συνθήκες MS/ MS. Επιπλέον, η εκλεκτική και ειδική διάσπαση των παραγώγων των BA επιτρέπει την άμεση ανάλυση της ισοτοπικής αναλογίας των BA με την τεχνική MRM και γι αυτό προχωρήσαμε στην ποσοτική ανάλυση. Εκτός από τα ιόντα αναφοράς m/z 135 (m/z 138) επιλέχθηκε και ένα δεύτερο ιόν χαρακτηριστικό για 47

45 την κάθε αμίνη ούτως ώστε να επιτευχθεί υψηλότερη εξειδίκευση στην ανάλυση (Πίν. 1, σελ.40). Η αντίδραση παραγωγοποίησης είναι απλή και διεξάγεται υπό ήπιες συνθήκες. Το πείραμα περιλαμβάνει: i) την σύνθεση του εσωτερικού προτύπου, ii) την εκχύλιση των αναλυτών από εμπορικά διαθέσιμα δείγματα, iii) προσθήκη του εσωτερικού προτύπου στο μίγμα της αντίδρασης παραγωγοποίησης του δείγματος και ανάλυση LC-MS/MS. Το εσωτερικό πρότυπο συντέθηκε με παραγωγοποίηση των αναλυόμενων ΒΑ με τον d 3 -εστέρα. Η καμπύλη βαθμονόμησης σχεδιάστηκε τρεις φορές χρησιμοποιώντας κάθε φορά έξι διαλύματα διαφορετικών συγκεντρώσεων και παρατηρήθηκε καλή γραμμικότητα. Οι συγκεντρώσεις των d 0 -παραγωγοποιημένων ΒΑ στα πρότυπα διαλύματα κυμαίνονταν από 5 έως 200 μg/κg, ενώ η συγκέντρωση του εσωτερικού προτύπου ήταν 50 ppb. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός, αν και σύντομος σε διάρκεια, ήταν απαραίτητος για την απομάκρυνση της περίσσειας του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης. Οι παραγωγοποιημένοι αναλύτες διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας εκλούτες Η 2 O/MeCN και η διαδικασία είχε διάρκεια 10 λεπτών. 48

46 Εικόνα 14. Χρωματογράφημα LC-MS/MS σε συνθήκες MRM για όλες τις παραγωγοποιημένες ΒΑ. Η αξιοπιστία της μεθόδου επιβεβαιώνεται από τις αναλυτικές παραμέτρους της ακρίβειας που υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας εμπλουτισμένα δείγματα τα οποία παρασκευάσθηκαν με προσθήκη γνωστής ποσότητας των αναλυτών σε τυφλά διαλύματα. Σε δύο σημεία που εξετάστηκαν (Πίν. 2), τα οποία αντιπροσωπεύουν τα όρια της καμπύλης βαθμονόμησης, οι τιμές ακρίβειας κυμαίνονταν από 98% έως 105%. 49

47 Πίνακας 2. Αναλυτικές παράμετροι ακρίβειας και ανάκτησης. Ακρίβεια % Ακρίβεια % Recovery Αναλύτης 1.2mg/Kg (A) 12mg/Kg (B) % Spm Put Cad Spd Tyr Pea Him Trm Η διαδικασία ανάκτησης των αναλυτών είναι απλή, οι αναλύτες εκχυλίζονται με οξινισμένο νερό. Το ποσοστό της ανάκτησης των αναλυτών είναι μεγαλύτερο από 76% (Πίν. 2). Οι καλές τιμές επαναληψιμότητας (RSD%), σε όλες τις περιπτώσεις που εξετάστηκαν ήταν κάτω από 12%, επιβεβαιώνει την εγκυρότητα της προτεινόμενης μεθόδου. Η μέθοδος εφαρμόστηκε για την ανάλυση εκχυλισμάτων από δείγματα εμπορικά διαθέσιμων τροφίμων. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων σε δείγματα κρέατος, τυριού και αλιεύματος παρουσιάζονται στον Πίν

48 Πίνακας 3. Ποσότητες ΒΑ (ppm) σε εμπορικά διαθέσιμα δείγματα τροφίμων. Αναλύτης Τυρί RSD% Κρέας RSD% Αλίευμα RSD% Spm Put Cad Spd Tyr Pea Him Trm Όλα τα δείγματα που αναλύθηκαν περιείχαν και τις οκτώ ΒΑ που μελετήθηκαν. Οι υψηλότερες συγκεντρώσεις που παρατηρήθηκαν για την τυραμίνη και την ισταμίνη ήταν 78,58 mg/kg και 58,10 mg/kg. Οι δύο αυτές τιμές εντοπίστηκαν στο δείγμα τυριού και αντιστοιχούν στο 50% και στο 37% του συνολικού ποσού των BA στο τυρί. Αυτά τα επίπεδα είναι παρόμοια με εκείνα που αναφέρονται στη βιβλιογραφία. Το συνολικό επίπεδο των BA σε όλα τα δείγματα τροφίμων που αναλύθηκαν δεν υπερβαίνει τα 160 mg/kg. Επιπλέον, το άθροισμα των αγγειοδραστικών αμινών (Tyr, Ηim, Trm, Pea) βρέθηκε κάτω από 145 mg/kg. Θετικό ήταν το γεγονός ότι οι δύο ποσότητες ήταν χαμηλότερες από 1000 mg/kg (σύνολο των αμινών στα τρόφιμα), διότι η υπέρβαση της τιμής αυτής θεωρείται επικίνδυνη για την υγεία. Τέλος, στον παρακάτω πίνακα φαίνονται οι υπολογιζόμενες αναλυτικές παράμετροι LOD, LOQ και οι τυπικές αποκλίσεις τους. 51