ΑΣΚΗΣΗ 15 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΥΝΘΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΡΟΣΤΑΓΛΑΝΔIΝΗΣ G/Η2(EC ) ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΑ Α549

Transcript

1 ΑΣΚΗΣΗ 15 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΥΝΘΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΡΟΣΤΑΓΛΑΝΔIΝΗΣ G/Η2(EC ) ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΑ Α549 Εισαγωγή Η συνθάση του ενδοϋπεροξειδίου της προσταγλανδίνης Η2 (PTGS, prostaglandin-endoperoxide synthase) είναι επίσης γνωστή και ως συνθάση των προσταγλανδινών G2 και Η2 (Prostaglandin G2/ H2 synthase) ή κυκλοξυγονάση (COX, cyclooxygenase). Είναι ένζυμο το οποίο συμμετέχει στο μονοπάτι βιοσύνθεσης των προσταγλανδινών το οποίο αποτελεί τμήμα του μεταβολισμού των φωσφολιπιδίων. Η PTGS βρίσκεται σε δύο ισομορφές: μία ιδιοσυστατική (PTGS1/COX1) και μία επαγώμενη (PTGS2/COX2), οι οποίες διαφέρουν στη ρύθμιση της έκφρασης και κατανομής στους ιστούς (βλ. Κεφάλαιο 6). Η PTGS1 γενικά καταλύει την παραγωγή προστανοειδών, για τις φυσιολογικές διεργασίες που απαιτούν στιγμιαία, συνεχή ρύθμιση (π.χ. αιμοστασία), ως απόκριση σε ορμονικά ερεθίσματα. Το γονίδιο PTGS2, που ενεργοποιείται στη λοίμωξη και στη φλεγμονή, κωδικοποιεί το επαγόμενο ισοένζυμο παραγωγής προστανοειδών. Η PTGS2 χρησιμοποιεί ως αρχικό υπόστρωμα το αραχιδονικό, το οποίο απελευθερώνεται από τα φωσφολιπίδια των μεμβρανών όπου βρίσκεται εστεροποιημένο, με την ενζυμική δράση της φωσφολιπάσης Α 2. Η PTGS2 μετατρέπει το αραχιδονικό σε προσταγλανδίνη Η2 σε μια αντίδραση δύο βημάτων: την αντίδραση της κυκλοξυγονάσης (COX), η οποία μετατρέπει το αραχιδονικό σε προσταγλανδίνη G2 (PGG 2 ) και στην αντίδραση της υπεροξειδάσης, κατά την οποία η PGG 2 ανάγεται σε προσταγλανδίνη Η2 (PGH 2 ). Η αντίδραση κυκλοξυγονάσης λαμβάνει χώρα σε ένα υδρόφοβο δίαυλο στον πυρήνα του μεμβρανικού ενζύμου. Η αντίδραση της υπεροξειδάσης λαμβάνει χώρα σε ένα ενεργό κέντρο αίμης b (συμπαράγοντας) που βρίσκεται στην επιφάνεια της πρωτεΐνης. Η PTGS2 είναι το κυρίως υπεύθυνο ισοένζυμο για την παραγωγή των φλεγμονωδών προσταγλανδινών. 314

2 Σχήμα 15.1 Αντιδράσεις που καταλύει η διλειτουργική PTGS2. Η PTGS είναι μεμβρανική πρωτεΐνη που βρίσκεται κυρίως στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Στη δομή της (Σχήμα 15.2) κυριαρχούν οι α-έλικες. Έχει μια περιοχή που ομοιάζει με τη δομή του EGF (EGF-like domain), μια περιοχή δέσμευσης με τη μεμβράνη και μια καταλυτική περιοχή. Στην καταλυτική περιοχή, η Ser 530 ακετυλιώνεται από το ακετυλοσαλικυλικό οξύ (ασπιρίνη i ), με αποτέλεσμα η ακετυλίωση να εμποδίζει την πρόσβαση του αραχιδονικού οξέος στο ενεργό κέντρο. Υδρόφοβες ομάδες σε συγκεκριμένες πλευρές των α-ελίκων επιτρέπουν τη σύνδεση με τη μεμβράνη και σχηματίζουν ένα υδρόφοβο δίαυλο που οδηγεί στο ενεργό κέντρο της κυκλοξυγονάσης. Αυτό επιτρέπει στα μόρια, όπως στα λιπαρά οξέα, να φθάσουν άμεσα στο ενεργό κέντρο από το εσωτερικό της διπλοστιβάδας. Το ένζυμο είναι δομημένο έτσι, ώστε τα ενεργά κέντρα να είναι γειτονικά επιτρέποντας στο προϊόν της πρώτης αντίδρασης (PGG2) να κινηθεί απευθείας στο ενεργό κέντρο της υπεροξειδάσης. i Ασπιρίνη είναι η εμπορική ονομασία του φαρμάκου με δραστική ουσία το ακετυλοσαλικυλικό οξύ, το οποίο παρασκευάσθηκε στο τέλος του 19 ου αιώνα από την φαρμακοβιομηχανία Bayer. 315

3 Σχήμα 15.2 Δομή του διμερούς της PTGS2. Κάθε μονομερές διαθέτει δύο ενεργά κέντρα, ένα κέντρο κυκλοξυγονάσης και ένα υπεροξειδάσης. Η αίμη δεσμεύεται ισχυρά στο ενεργό κέντρο υπεροξειδάσης. Τα υποστρώματα και μερικοί αναστολείς δεσμεύονται στο ενεργό κέντρο κυκλοξυγονάσης. Οι PTGS1 και PTGS2 είναι στόχοι των μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων (ΜΣΑΦ), συμπεριλαμβανομένων της ασπιρίνης, της ιμπουπροφένης κ.α. Η ασπιρίνη μπορεί να αδρανοποιήσει το ένζυμο μη αναστρέψιμα (μη αντιστρεπτή αναστολή) μέσω ακετυλίωσης της Ser530 στο ενεργό κέντρο του ενζύμου με δράση κυκλοξυγονάσης όπως προαναφέρθηκε. Αναστολή των PTGS με ΜΣΑΦ μειώνει την οξεία φλεγμονή, τον πόνο και τον πυρετό, ενώ η μακροχρόνια χρήση αυτών των φαρμάκων μειώνει θανατηφόρα επεισόδια θρόμβωσης, όπως επίσης και την ανάπτυξη καρκίνου π.χ. του παχέος εντέρου. Γίνεται προσπάθεια οι νέοι αναστολείς των PTGS να είναι εκλεκτικοί για την PTGS2 και όχι για την PTGS1, κυρίως για την αποφυγή ανεπιθύμητων ενεργειών όπως γαστρεντερικές επιπλοκές και εξέλκωση. Αυξημένη έκφραση της PTGS2 συνδέεται επίσης με αυξημένη κυτταρική προσκόλληση, φαινοτυπικές αλλαγές, αγγειογενεσία και αντίσταση στην κυτταρική απόπτωση. Καθαρισμός μεμβρανικών πρωτεϊνών Ο καθαρισμός μεμβρανικών πρωτεϊνών είναι πιο απαιτητική διαδικασία από ότι ο καθαρισμός διαλυτών πρωτεϊνών (βλ. Κεφάλαιο 2.2). Το αρχικό στάδιο της διαλυτοποίησης της πρωτεΐνης με τη χρήση κατάλληλων απορρυπαντικών είναι και το κρίσιμο στάδιο. Τα απορρυπαντικά που χρησιμοποιούνται στην απομόνωση μεμβρανικών πρωτεϊνών πρέπει να πληρούν ορισμένες προϋποθέσεις, μεταξύ άλλων, να μην καταστρέφουν τη δομή των πρωτεϊνών και την ενζυμική δραστικότητα (αν πρόκει- 316

4 ται για μεμβρανικά ένζυμα) και να μπορούν να απομακρυνθούν μετά τον καθαρισμό. Επιπλέον, είναι διαφορετική η προσέγγιση για διαμεμβρανικές πρωτεΐνες σε σύγκριση με περιφερικές μεμβρανικές πρωτεΐνες. Για την τελευταία περίπτωση, μπορεί να αρκεί η αλλαγή των ιοντικών συνθηκών του ρυθμιστικού διαλύματος (π.χ. αύξηση του ph) για την αποδέσμευση της πρωτεΐνης από τις μεμβράνες. Ωστόσο, γενικά, απαιτείται η χρήση απορρυπαντικού για την πλήρη διαλυτοποίηση της πρωτεΐνης. Στην παρούσα άσκηση παρουσιάζεται η πορεία διαλυτοποίησης και μερικού καθαρισμού της PTGS2 από κύτταρα A549 ενεργοποιημένα με LPS (βλ. Άσκηση 1). Το απορρυπαντικό που χρησιμοποιείται είναι το Tween 20, ένα αφόρτιστο απορρυπαντικό της σειράς Tween (Σχήμα 2.19). H PΤGS2 διαλυτοποιείται από το κλάσμα μικροσωμάτων των κυττάρων και υποβάλλεται σε σειρά χρωματογραφικών διαχωρισμών όπως χρωματογραφία ανιοντανταλλαγής και μοριακή διήθηση. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι απαιτείται η συνεχής παρουσία του απορρυπαντικού κατά τη διάρκεια της διαδικασίας καθαρισμού. Η αρχική διαλυτοποίηση επιτυγχάνεται με συγκέντρωση Tween 20 1%, ενώ σε όλα τα ακόλουθα χρωματογραφικά στάδια η συγκέντρωση του Tween 20 μειώνεται στο 0.1%. Αντιδραστήρια-Διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα Α: 1% Tween 20 σε 80mM Tris HCl, ph 8.0, 300mM διαιθυλοκαρβαμικό νάτριο (sodium diethyldithiocarbamate, DDC) και 500mM EDTA. Ρυθμιστικό διάλυμα Β: 0.1% Tween 20 σε 80mM Tris HCl, ph 8.0 και 300mM DDC. Ρυθμιστικό διάλυμα Γ: 0.1% Tween 20, σε 80mM Tris HCl, ph 8.0, 300mM DDC και 100mM NaCl. Ρυθμιστικό διάλυμα Δ: 0.1% Tween 20, σε 80mM Tris HCl, ph 8.0, 300mM DDC και 100mM NaCl, 10mM μεθυλο-a-d-γλυκοπυρανοζίτη. Πειραματική πορεία 1. Ομογενοποιήματα ενεργοποιημένων κυττάρων Α549 (για την καλλιέργεια κυττάρων Α549, την επίδραση LPS και ομογενοποίηση, βλ. Άσκηση 1) φυγοκεντρούνται σε 10,000 xg στους 4 o C για 20min. 2. Το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης υποβάλλεται σε υπερφυκοκέντρηση σε 100,000 x g στους 4 o C για 2 ώρες. Στο ίζημα παραλαμβάνεται το κλάσμα των μικροσωμάτων. 3. Το κλάσμα των μικροσωμάτων εναιωρείται στο ρυθμιστικό διάλυμα Α για 45min. 4. Ακολουθεί δεύτερη υπερφυγοκέντρηση σε 100,000 xg στους 4 o C για 90min. 5. Το υπερκείμενο συμπυκνώνεται με speedvac και τοποθετείται σε στήλη ανιοντανταλλαγής DE

5 χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό διάλυμα Β (εξισορρόπησης). 6. Το συστατικά που κατακρατήθηκαν στη στήλη εκλούονται με ρυθμιστικό διάλυμα B και βαθμίδωση συγκέντρωσης 0-100mM NaCl, οπότε παραλαμβάνονται κλάσματα (δείγματα σε σωλήνες). 7. Στα κλάσματα της στήλης προσδιορίζεται η ενζυμική ενεργότητα PTGS2 και συμπυκνώνονται. 8. Τα συμπυκνωμένα κλάσματα με ενεργότητα PTGS2 καθαρίζονται από στήλη μοριακής διήθησης Sephadex G-200 με το ρυθμιστικό διάλυμα Β. 9. Συλλέγονται κλάσματα, στα οποία προσδιορίζεται η ενζυμική ενεργότητα σε PTGS Τα ενεργά σε PTGS2 κλάσματα συμπυκνώνονται και υποβάλλονται και πάλι σε χρωματογραφία στήλης Lens Culinaris lectin Sepharose 4B με 50ml ρυθμιστικoύ διαλύματος εξισορρόπησης Γ. 11. Ακολουθεί έκλουση των κατακρατηθέντων συστατικών με το ρυθμιστικό διάλυμα Δ, κατά την οποία παραλαμβάνονται 10 κλάσματα. 12. Τα ενεργά κλάσματα ενώνονται και γίνεται συμπύκνωση με υπερδιήθηση σε φίλτρα Amicon- Ultra ειδικά για καθαρισμό και συμπύκνωση πρωτεϊνών. Προσδιορισμός ενζυμικής ενεργότητας υπεροξειδάσης Αρχή μεθόδου Η μέθοδος ανίχνευσης και προσδιορισμού της ενεργότητας υπεροξειδάσης της PTGS2 είναι φωτομετρική και βασίζεται στην οξείδωση της N,N,N*,N*-τετραμεθυλο-p-φαινυλενοδιαμίνης (TMPD) στους 37 ο C. Η εκκίνηση της αντίδρασης γίνεται με την προσθήκη του υποστρώματος υπεροξείδιου του υδρογόνου (ή αραχιδονικού) και καταγράφεται η αύξηση της απορρόφησης του μίγματος της αντίδρασης στα 611 nm. Αντιδραστήρια-διαλύματα N,N,N*,N*-τετραμεθυλο-p-φαινυλενοδιαμίνη, (N,N,N*,N*-tetramethyl-p-phenylenediamine, TMPD) Ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης: 0.1M Tris HCl, ph 8.0, 1mM EDTA, 1mM αιματίνης, 0.2mM TMPD. Υπόστρωμα: τελική συγκέντρωση 100mM υπεροξειδίου του υδρογόνου ή αραχιδονικού Ακετυλοσαλικυλικό οξύ 318

6 Σχήμα 15.3 Αντίδραση οξείδωσης του συνθετικού υποστρώματος TMPD από δράση υπεροξειδάσης. Το TMPD είναι άχρωμο ενώ το οξειδωμένο TMPD + σκούρο κυανό. Πειραματική πορεία Σε μια γυάλινη κυψελίδα ορατού φάσματος τοποθετούνται 2.8mL ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης και προστίθενται 100μL από κάθε κλάσμα που εκλούεται σε κάθε βήμα από τις στήλες. Η εκκίνηση της αντίδρασης γίνεται με την προσθήκη 100μL του υποστρώματος. Ακολουθεί άμεση επιτόπια ανάδευση και τοποθέτηση της κυψελίδας στο φωτόμετρο εντός μισού λεπτού από την εκκίνηση της αντίδρασης. Οι τιμές της απορρόφησης του μίγματος της αντίδρασης καταγράφονται κάθε μισό λεπτό και για 4 περίπου λεπτά, μέχρι να καταγραφούν συνολικά 7 τουλάχιστον τιμές. Σχεδιάζεται γράφημα απορρόφησης συναρτήσει χρόνου (min) για κάθε δείγμα. Η δραστικότητα της υπεροξειδάσης υπολογίζεται με βάση τον συντελεστή απόσβεσης (extinction coefficient) Ε= Μ -1 cm -1 σε μια στοιχειομετρία αντίδρασης στην οποία 2 mol ΤΜPD οξειδώνονται ανά mol υδροϋπεροξειδίου που ανάγεται. Για να επιβεβαιωθεί ότι μετράται ειδικά η ενεργότητα της PTGS, γίνεται και προσδιορισμός των δραστικών κλασμάτων μετά από προεπώαση των κλασμάτων με 10mM ασπιρίνη για 45min για πλή- 319

7 ρη αναστολή της PTGS. Συμπληρώνεται ο πίνακας καθαρισμού του ενζύμου Πίνακας καθαρισμού Βήμα καθαρισμού Ολική δραστικότητα (nmol O 2 / min) Ολική πρωτεΐνη (mg) Ειδική δραστικότητα (nmol O 2 / min/mg) Καθαρισμός (x φορές) * Υπερκείμενο 10,000xg Μικροσώματα (ίζημα 100,000xg) Χρωματογραφία ανιοντανταλλαγής (DE-53) Χρωματογραφία μοριακής διήθησης (Sephadex-G200) Χρωματογραφία στήλης σε Lens Culinaris lectin Sepharose 4B *To αποτέλεσμα αυτής της στήλης είναι το πηλίκο της διαίρεσης της ειδικής ενεργότητας του ενζύμου σε κάθε βήμα καθαρισμού ως προς την αρχική ειδική ενζυμική ενεργότητα (ειδική ενεργότητα υπερκειμένου 10,000xg). Ο προσδιορισμός των ολικών πρωτεϊνών σε κάθε κλάσμα γίνεται με τη μέθοδο Bradford, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο πρωτεΐνη ορρού βοός. Βιβλιογραφία Dong L, Vecchio AJ, Sharma NP, Jurban BJ, Malkowski MG, Smith WL (2011) Human cyclooxygenase-2 is a sequence homodimer that functions as a conformational heterodimer. J Biol Chem, 286: Kukk K, Järving R, Samel N (2012) Purification and characterization of the recombinant human prostaglandin H synthase-2 expressed in Pichia pastoris. Protein Expression and Purification, 83: Johnson JL, Wimsatt J, Buckel SD, Dyer RD, Maddipati KR (1995) Purification and characterization of Prostaglandin H Synthase-2 from Sheep Placental Cotyledons. Arch Biochem Biophys, 324: