ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ Coup-TF ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΕΜΒΡΥΟΓΕΝΕΣΗ ΣΤΟΝ ΑΧΙΝΟ Paracentrotus lividus ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΛΑΜΠΡΙΝΗ Γ.

Transcript

1 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ Coup-TF ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΕΜΒΡΥΟΓΕΝΕΣΗ ΣΤΟΝ ΑΧΙΝΟ Paracentrotus lividus ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΛΑΜΠΡΙΝΗ Γ. ΚΑΛΑΜΠΟΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΤΡΑ 2015

2 Στη μητέρα μου, Ευαγγελία

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Με αφορμή την παρούσα Διδακτορική Διατριβή θα ήθελα να ευχαριστήσω κάποιους ανθρώπους, η συμβολή των οποίων υπήρξε καθοριστική στην ολοκλήρωσή της. Η έρευνα, πηγή έμπνευσης και δημιουργίας, ένας δρόμος δύσκολος μα και τόσο γοητευτικός..που για να μυηθεί σωστά κανείς χρειάζεται ικανούς δασκάλους. Θα ήθελα θερμά να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Κωνσταντίνο Φλυτζάνη γιατί υπήρξε ένας υπέροχος δάσκαλος. Στο πρόσωπό του γνώρισα έναν εξαιρετικά οξυδερκή επιστήμονα με πάθος για την έρευνα και τη ζωή και πραγματικό ενδιαφέρον για τους συνεργάτες του. Τον ευχαριστώ για τα δώδεκα χρόνια συνεργασίας μας και για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε από τα πρώτα βήματα της ερευνητικής μου καριέρας. Για τις αμέτρητες ώρες που, με υπομονή, μου αφιέρωσε προσπαθώντας να αντιμετωπίσουμε κάθε ερευνητικό εμπόδιο που ανέκυπτε. Τον ευχαριστώ ιδιαίτερα γιατί μου επέτρεψε να λειτουργώ ανεξάρτητα και να πειραματίζομαι αυτόνομα και κυρίως γιατί με έμαθε να αντλώ πάντα κάτι θετικό μέσα από τα λάθη μου. Τέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ του οφείλω, γιατί με έμαθε να πιστεύω στις δυνάμεις μου και να αγωνίζομαι για την τελειότητα. Με έμαθε να θέτω στόχους και να τους πετυχαίνω. Η παρουσία του υπήρξε καθοριστική στη διαμόρφωση της επαγγελματικής μου προσωπικότητας. Θα αποτελεί πάντα μέτρο σύγκρισης για τις μελλοντικές μου συνεργασίες. Θα ήθελα να ευχαριστήσω επίσης, την καθηγήτρια κ. Ζαχαροπούλου Αντιγόνη για το συνεχές ενδιαφέρον της για την πρόοδό μου και την υποστήριξή της, καθώς και για τις εξαιρετικά χρήσιμες συμβουλές της που συνέβαλαν ουσιαστικά στην ολοκλήρωση της Διατριβής μου. Ευχαριστώ θερμά τα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς μου επιτροπής, την κ. Καπετανάκη Γιασσεμή, Ερευνήτρια Α, τον καθηγητή κ. Μίντζα Αναστάσιο, τον καθηγητή κ. Κατσώρη Παναγιώτη, τον καθηγητή κ. Μοσχονά Νικόλαο και την αναπλ. καθηγήτρια κ. Παπαχατζοπούλου Αδαμαντία για τις σημαντικές συμβουλές τους τόσο στην επίλυση προβλημάτων που ανέκυπταν κατά τη διάρκεια της έρευνας όσο και στην τελική τροποποίηση του κειμένου της παρούσας Διατριβής. Ευχαριστώ πολύ τους συνεργάτες μου, κ. Πετροπούλου Χριστίνα, κ. Παπαδημητρίου Σοφία, κ. Ψύχου Αλεξία και τη συνεργάτιδα και φίλη κ. Σταμοπούλου Ανδριάνα για τη συμβολή τους στην ολοκλήρωση της παρούσας Διατριβής. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου Μοριακής Βιολογίας, και ιδιαίτερα τον κ. Τσιρώνη Ιωάννη, για την βοήθειά τους όλα τα χρόνια της συνεργασίας μας καθώς και για το ευχάριστο και φιλικό κλίμα που διαμόρφωναν στο εργαστήριο. Θερμά ευχαριστώ το Ίδρυμα Αλέξανδρος Σ. Ωνάσης για την υποτροφία που μου παρήχε με σκοπό την εκπόνηση της Διδακτορικής μου Διατριβής. Επίσης ευχαριστώ τους Dr. Maria Ina Arnone και Valeria Matranga για την ευγενική χορηγία των EpGFPII πλασμιδίου και P. Lividus γενομικής βιβλιοθήκης. Ευχαριστώ πολύ την αδερφή μου, Κατερίνα, για την υποστήριξή της σε κάθε νέα μου προσπάθεια και για τις συμβουλές της σε όλους τους τομείς. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως, τους γονείς μου, τον Γιώργο και την Ευαγγελία, για την αγάπη τους και τη συμπαράστασή τους όλα τα χρόνια της ζωής μου. Για την κατανόηση και την υπομονή τους. Τους ευχαριστώ γιατί στέκονται πάντα στο πλευρό μου, γιατί με στήριξαν στις αποτυχίες μου και γιατί χάρηκαν μαζί μου τις επιτυχίες μου. Τους ευχαριστώ γιατί μου πρόσφεραν περισσότερα απ όσα είχα ανάγκη. Τους ευχαριστώ γιατί μου αφιέρωσαν τη ζωή τους.

4 Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, με επιβλέποντα τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Φλυτζάνη. Για την πραγματοποίηση της Διδακτορικής Διατριβής χορηγήθηκε στην κ. Λαμπρινή Καλαμπόκη Υποτροφία από το Κοινωφελές Ίδρυμα Αλέξανδρος Σ. Ωνάσης. Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή: Επιβέπων: Φλυτζάνης Κωνσταντίνος, Αν. Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Παν/μιο Πατρών, Adjunct Associate Professor, Department of Molecular and Cell Biology, Baylor College of Medicine, Houston Texas Ζαχαροπούλου Αντιγόνη, Ομότιμη Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, Παν/μιο Πατρών Καπετανάκη Γιασσεμή, Ερευνήτρια Α ΙΙΒΕΑΑ Κατσώρης Παναγιώτης, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Παν/μιο Πατρών Μίντζας Αναστάσιος, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Παν/μιο Πατρών Μοσχονάς Νικόλαος, Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Παν/μιο Πατρών Παπαχατζοπούλου Αδαμαντία, Αν. Καθηγήτρια, Τμήμα Ιατρικής, Παν/μιο Πατρών

5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ O Coup-TF, αποτελεί ορφανό μέλος της υπεροικογένειας των υποδοχέων των στεροειδών/θυρεοειδών ορμονών και κατέχει κυρίαρχο ρόλο στην ανάπτυξη των εμβρύων όλων των μεταζώων. Στην παρούσα Διατριβή μελετήθηκε η cisρυθμιστική περιοχή του γονιδίου του, με σκοπό την ένταξή του στο γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο του εμβρύου του αχινού. Με πειράματα in situ υβριδοποίησης βρέθηκε ότι το γονίδιο PlCoup-TF εκφράζεται στο στοματικό εξώδερμα του γαστριδίου και στη βλεφαριδωτή ζώνη στον πλουτέα, στο είδος Paracentrotus lividus. Από παλαιότερα πειράματα είχε βρεθεί ότι το τμήμα της ανοδικής περιοχής που εκτείνεται από το -232 ως το -532 (τμήμα a), είναι απαραίτητο και επαρκές για την έκφραση του γονιδίου αναφοράς (gfp) στη βλεφαριδωτή ζώνη του πλουτέα. Εντός της περιοχής a ανευρέθησαν τρία πιθανά ρυθμιστικά στοιχεία (- 453, -432 και -377) του γονιδίου PlCoup-TF, τα οποία αναγνωρίζονται από πρωτεΐνες εμβρυικού πυρηνικού εκχυλίσματος. Στοχευμένες μεταλλάξεις των στοιχείων αυτών, οδήγησαν σε μείωση της έκφρασης του γονιδίου αναφοράς (στοιχείο -453) και στην εκτοπική έκφρασή του (στοιχεία -432 και -377). Περαιτέρω μελέτη των παραγόντων που αναγνωρίζουν τα στοιχεία αυτά, οδήγησε στο συμπέρασμα ότι ο μεταγραφικός παράγοντας PlElk αναγνωρίζει το στοιχείο και ρυθμίζει θετικά το γονιδίο του PlCoup-TF και ο μεταγραφικός παράγοντας PlOtx αναγνωρίζει το στοιχείο -377 και καταστέλλει την έκφραση του PlCoup-TF στο αντιστοματικό εξώδερμα. Τα αποτελέσματα της παρούσης εργασίας οδήγησαν στην ένταξη του γονιδίου PlCoup-TF και των δύο ρυθμιστών του στο γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο που καθορίζει τη διαφοροποίηση της βλεφαριδωτής ζώνης εντός του εμβρυικού εξωδέρματος.

6 ABSTRACT Coup-TF, an orphan member of the nuclear receptor super family, has a fundamental role in the development of metazoan embryos. The study of the gene's regulatory circuit in the sea urchin embryo will facilitate the placement of this transcription factor in the well-studied embryonic Gene Regulatory Network (GRN). The Paracentrotus lividus Coup-TF gene (PlCoup-TF) is expressed throughout embryonic development preferentially in the oral ectoderm of the gastrula and the ciliary band of the pluteus stage. Two overlapping λ genomic clones, containing three exons and upstream sequences of PlCoup-TF, were isolated from a genomic library. The transcription initiation site was determined and 5 deletions and individual segments of a 1930 bp upstream region were placed ahead of a GFP reporter cassette and injected into fertilized P.lividus eggs. Module a ( 532 to 232), was necessary and sufficient to confer ciliary band expression to the reporter. Comparison of P.lividus and Strongylocentrotus purpuratusupstream Coup-TF sequences, revealed considerable conservation, but none within module a. 5 and internal deletions into module a, defined a smaller region that confers ciliary band specific expression. Putative regulatory cis-acting elements (RE1, RE2 and RE3) within module a, were specifically bound by proteins in sea urchin embryonic nuclear extracts. Site-specific mutagenesis of these elements resulted in loss of reporter activity (RE1) or ectopic expression (RE2, RE3). It is proposed that sea urchin transcription factors, which bind these three regulatory sites, are necessary for spatial and quantitative regulation of the PlCoup-TF gene at pluteus stage sea urchin embryos. Additional experiments led us to the conclusion that transcription factor PlElk binds to the -453 regulatory element and positively regulates PlCoup-TF gene in the ciliary band. Furthermore, PlOtx binds to the -377 regulatory element and negatively regulates PlCoup-TF gene in the aboral ectoderm. These findings lead to the hierarchical positioning of PlCoup-TF within the embryonic GRN.

7 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ Admp: Anti Dorsalizing Morphogenetic Protein An: Animal AP: Activator Protein ASW: Artificial Sea Water Atbf: AT Binding transcription Factor ATF: Animalizing Transcription Factor ATP: Adenosine Triphosphate Blimp: B lymphocyte induced maturation protein-like Bmp2/4: Bone Morphogenetic Protein 2/4 bp: Base pair Bra: Brachyury BSA: Bovine Serum Albumin CBP: Creb Binding Protein cdna: complementary DNA Ci: Curie CIA: Chloroform Isoamyl Alcohol Cons: consensus Coup-TF: Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor Ct: Cycle threshold CTE: Carboxy Terminal Extension CYP: Cytochrome P450 DBD: Dna Binding Domain dd: Double Distilled Dig: Digoxigenin Dlx: Distal-less homeobox DNA: Desoxyribonucleic acid DNase: Deoxyribonouclease Dntp: Deoxyribonoucleoside Triphosphate DTT: Dithiothreitol ECL: ElectroChemiLuminescence EDTA: Ethylenediaminetetraacetic EGF: Epidermal Growth Factor EGTA: Ethylene glycol tetraacetic acid Elf: E-like factor EMSA: Electrophoretic Mobility Shift Assay Endo: Endoderm ERM: Ets Related Molecule

8 EtBr: Ethidium Bromide Ets: E- Twenty Six ETV: Ets Variant FGF: Fibroblast Growth Factor Fgfr: Fibroblast Growth Factor Receptor Fli: Flightless homolog Fos: FBJ osteosarcoma oncogene-like FoxA: Forkhead box Fra: Fos Related Antigen g: grams Gfi1: Growth Factor Independence 1 GFP: Green Fluorescent Protein Gli: Gliotactin GRN: Gene Regulatory Network Gsc: Goosecoid GSK: Glycogen synthase kinase HEPES: 4?(2?Hydroxyethyl)?piperazin?1?ethansulfonic acid HesC: Hairy and Enhancer of split-like HNF: Hepatocyte Nuclear Factor Hox: Homeobox IrxA: Iroquois homeobox A Jun: Jun proto oncogene-like Kb:kilobase kda: kilodalton L.variegatus: Lytechinus Variegatus LBD: Ligand Binding Domain Leu: Leukine MAF: Musculoaponeurotic fibrosarcoma MAP: Mitogen Activated Protein Met: methionine MFSW: Milipore Filtered Sea Water μg: micrograms mg:milligram min: minutes ml: milliliter mm: micromollar mmol: millimolar MMP: Matrix Metalloproteinase MOPS: 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid Msx: Msh Homeobox NaOAc: Sodium Acetate ng: nanogram NGFI: Nerve Growth Factor

9 Nk1: Natural Killer nm: nanometer nm: Nanomollar NP-40: Nonyl phenoxypolyethoxylethanol O.D.: Optical Density OTX: Orthodenticle Homeobox P. lividus: Paracentrotus Lividus P: Pressure PABA: Para Amino Benzoic Acid Pax: Paired Box PBS:Phosphate Buffered Saline PCR: Polymerase Chain Reaction PEA: Polyomavirus Enhancer Activator PEPCK: Phosphoenolpyruvate Carboxykinase PFA: Paraformaldehyde Ph: Potentium Hydrogenii pl: picoliter PMCs: Primary Mesenchyme Cells pmol: picomol PMSF: Phenylmethanesulfonylfluoride PNT: Pointed PPAR: Peroxisome Proliferator Activated Receptor Qpcr: Quantitative PCR RACE: Rapid Amplification of CDNA Ends RAR: Retinoid Acid Receptor RNA: Ribonucleic acid Rpm: Rotations per minutes RT-PCR: Reverse Transcription PCR RXR: Retinoid X Receptor S.purpuratus: Strongylocentrotus Purpuratus SDS: Sodium Dodecyl Sulfate Shh: Sonic Hedgehog SMCs: Secondary Mesenchyme Cells Sp: Specificity Protein 1 SpecI: Small Protein Effector of Cdc42 SV40: Simian vacuolating virus 40 Svp: Seven Up T: Temperature Tbx2/3: T box 2/3 TESS: Transcription Element Search System TFIIB: Transcriptional Factor II B TGF-b: Transforming Growth Factor Beta TR: Thyroid Hormone Receptor

10 trna: Transfer RNA V: Volts VDR: Vitamin D Receptor Veg: Vegetal WMISH: Whole Mount In Situ Hybridization Wnt: Wingless-type MMTV integration site family YB-1: Y-box binding protein

11 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο αχινός ως σύστημα - μοντέλο στην έρευνα Γενικά μορφολογικά χαρακτηριστικά Ο αχινός ως πειραματικό υλικό από το παρελθόν μέχρι σήμερα Γιατί ο αχινός θεωρείται ως ένα από τα σπουδαιότερα πειραματικά υλικά Η εμβρυογένεση στον αχινό 7 Το στάδιο της γονιμοποίησης 7 Το στάδιο των αυλακώσεων 9 Η μορφογένεση του εμβρύου Ο παράγοντας Coup-TF Ο ρόλος των Coup-TFs στους διάφορους οργανισμούς Το γονίδιο Coup-TF H δομή της πρωτεΐνης Coup-TF Mηχανισμοί δράσης του Coup-TF 25 Α) Kαταστολέας 26 B) Eνεργοποιητής Ο Coup-TF στον αχινό 29 Tο γονίδιο Coup-TF στο είδος Strongylocentrotus purpuratus H ρύθμιση του γονιδίου Coup-TF Επιλογή του Coup-TF ως γονίδιο μελέτης Ο ρόλος των γονιδιακών ρυθμιστικών δικτύων (GRN) στην εμβρυϊκή ανάπτυξη Τα γονιδιακά ρυθμιστικά δίκτυα που συμμετέχουν στην εμβρυϊκή ανάπτυξη του αχινού Ο καθορισμός του εξωδέρματος στο έμβρυο του αχινού Ο καθορισμός του ενδομεσοδέρματος στο έμβρυο του αχινού Η μελέτη του γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου που καθορίζει το εξώδερμα στο έμβρυο το αχινού είναι εξαιρετικής σημασίας 55

12 1.4 Σχεδιασμός ενός γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου Ο μεταγραφικός παράγοντας AP Οι παράγοντες Jun και Fos Ο παράγοντας Jun στον αχινό S.purpuratus Οι μεταγραφικοί παράγοντες ETS Μορφή και λειτουργία Καθορισμός της λειτουργικότητας των ETS παραγόντων Οι παράγοντες Pea και Elk στον αχινό Οι μεταγραφικοί παράγοντες Otx Οι παράγοντες Otx στον αχινό Τεχνητή γονιμοποίηση και δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού με τη μέθοδο των μικροενέσεων Η χρήση των γονιδίων αναφοράς στη μελέτη των cis ρυθμιστικών στοιχείων Η χρήση της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) ως γονίδιο αναφοράς 74 ΣΚΟΠΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ 76 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 77 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματόζωο: Aχινός Paracentrotus lividus Συλλογή και συντήρηση ενήλικων ατόμων Συλλογή γαμετών Τεχνητή γονιμοποίηση και δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων Μέθοδος Υλικά Παρατήρηση των μικροενεμένων εμβρύων σε μικροσκόπιο φθορισμού Καλλιέργεια εμβρύων Μέθοδος Υλικά Απομόνωση Εκχυλίσματος Πυρηνικών Πρωτεϊνών Μονιμοποίηση εμβρύων Λειτουργική ανάλυση της ανοδικής περιοχής -213 έως -533 (περιοχή a) 85

13 2.8.1 In Silico ανάλυση της περιοχής a Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για τη δημιουργία ελλειμμάτων στην περιοχή a Διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα Εσωτερικές αφαιρέσεις στην περιοχή a Παρασκευή γραμμικών μορίων για δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού Στοχευμένες αφαιρέσεις των πιθανών ρυθμιστικών στοιχείων -453, -432 και Παρασκευή γραμμικών μορίων για δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού Κατάτμηση με ένζυμα περιορισμού Ηλεκτροφόρηση DNA Ηλεκτροφόρηση RNA Φωτομέτρηση Δειγμάτων RNA και DNA Αντίδραση Λιγάσης Παρασκευή και Μετασχηματισμός Δεκτικών Βακτηρίων 98 Α. Χημικός Μετασχηματισμός 98 Β. Μετασχηματισμός με Ηλεκτροδιάτρηση Επιλογή μετασχηματισμένων αποικιών Ανακαλλιέργεια (Streaking) αποικιών Υγρές καλλιέργειες επιλεγμένων αποικιών Απομόνωση πλασμιδιακού DNA Απόθεμα μετασχηματισμένων βακτηρίων (Stock) Αλληλούχηση των DNAs Σύγκριση νουκλεοτιδικών αλληλουχιών και ανεύρεση αμινοξικών Αλληλουχιών Μικροενέσεις DNA και δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού 106 Μελέτη των παραγόντων PlJun, PlFra, PlElk, PlPea Αναζήτηση αλληλουχιών στις βάσεις δεδομένων RACE και 3 RACE 108

14 2.25 RT-PCR Απομόνωση cdna Έλεγχος ενδογενούς RNA In vitro Μεταγραφή In vitro Μετάφραση Phenol Extraction Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Σήμανση Στοιχείων Απόκρισης με 32 P-γ-ATP Δημιουργία δίκλωνων στοιχείων απόκρισης Αντίδραση Κινάσης SDS Ηλεκτροφόρηση WESTERN BLOT ανάλυση In Situ Υβριδοποίηση In Situ Ιχνηθέτες Ποσοτική PCR (qpcr) 133 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 136 Λειτουργική ανάλυση της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου Coup-TF στον αχινό Paracentrotus lividus Εισαγωγή Παλαιότερα πειράματα Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του Coup-TF στον αχινό P.lividus 140 Λειτουργική ανάλυση της περιοχής a Αναζήτηση in silico πιθανών ρυθμιστικών στοιχείων στην περιοχή a Λειτουργικός ρόλος των ρυθμιστικών στοιχείων του γονιδίου PlCoup-TF Α Διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα στην περιοχή a Β Εσωτερικά ελλείμματα στην περιοχή a Διαγονιδιακά έμβρυα αχινού Στοχευμένες μεταλλάξεις των στοιχείων -453, -432 και

15 3.8 Tα στοιχεία -377, -432 και -453 ρυθμίζουν το γονιδιο του PlCoup-TF Αναζήτηση των μεταγραφικών παραγόντων που προσδένονται στα στοιχεία -377, -432 και Μελέτη των παραγόντων PlJun, PlFra2, PlElk και PlPea Ο παράγοντας PlJun RACE PCR για το μεταγραφικό παράγοντα PlJun Απομόνωση του cdna του γονιδίου PlJun Η έκφραση του παράγοντα PlJun κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη 173 qpcr 173 Ιστοειδική έκφραση του γονιδίου PlJun κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη Ο παράγοντας PlFra RACE για τον παράγοντα PlFra Απομόνωση του cdna PlFra Έκφραση του PlFra2 κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη 181 qpcr 181 Ιστοειδική έκφραση του PlFra2 κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη Ο παράγοντας PLElk Απομόνωση του cdna του παράγοντα PlElk Έκφραση του PlElk κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη 186 RT-PCR 186 qpcr 187 Ιστοειδική έκφραση του PlElk κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη Ο παράγοντας PlPea Απομόνωση του cdna του παράγοντα PlPea 190 Έκφραση του γονιδίου PlPea κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη 192 RT-PCR 192 qpcr 192 Ιστοειδική έκφραση του γονιδίου PlPea κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη Η πρόσδεση των πρωτεϊνών PlElk, PlPea, PlJun, PlFra2, και PlOtx στα στοιχεία απόκρισης -453, -432 και α Παραγωγή των πρωτεϊνών PlJun, PlFra2, PlElk, SpElk και PlPea 196

16 3.15 β Το στοιχείο -453 αναγνωρίζεται από τον παράγοντα PlElk αλλά δεν αναγνωρίζεται από τον παράγοντα PlPea 199 I. H πρόσδεση του παράγοντα PlElk 199 II. Aδυναμία πρόσδεσης του παράγοντα PlPea στο στοιχείο γ Μελέτη πρόσδεσης του παράγοντα AP1 στο στοιχείο απόκρισης Ι) Πειράματα EMSA με πυρηνικό εκχύλισμα 204 ΙΙ) Πειράματα EMSA με in vitro παραγόμενες πρωτεΐνες δ Μελέτη της πρόσδεσης του παράγοντα PlOtx στο στοιχείο απόκρισης ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ο πιθανός ρόλος του PlCoup-TF κατά την εμβρυογένεση H μελέτη των διαγονιδιακών εμβρύων αχινού Ο ρόλος των υποπεριοχών Ι V στη ρύθμιση του PlCoup-TF στο έμβρυοτου αχινού Ο ρόλος των στοιχείων -453, -432 και Ο παράγοντας AP1 δεν συμμετέχει στη ρύθμιση του PlCoup-TF Ο παράγοντας PlElk ρυθμίζει θετικά την έκφραση του PlCoup-TF στηβλεφαριδωτή ζώνη 218 Ποσοτικοποίηση των μεταγράφων PlElk και PlPea 220 Σύγκριση των παραγόντων Elk και Pea μεταξύ των ειδών P.lividus και S.purpuratus Ο παράγοντας PlOtx ως πιθανός καταστολέας του PlCoup-TF στοαντιστοματικό εξώδερμα Ο παράγοντας που αναγνωρίζει το στοιχείο Η ένταξη του PlCoup-TF και των ρυθμιστών του στο γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο του εξωδέρματος Μελλοντικά πειράματα 229 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 231 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 275

17 Εισαγωγή ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Ο αχινός ως σύστημα - μοντέλο στην έρευνα Γενικά μορφολογικά χαρακτηριστικά Το είδος του αχινού που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα της παρούσας εργασίας είναι ο Paracentrotus lividus (P.lividus), ο κοινός πετραχινός (εικόνα 1.1), που απαντάται ευρύτατα στη Μεσόγειο, σε ρηχά νερά και τρέφεται με φωτόφιλα φύκη. Η συστηματική του κατάταξη φαίνεται στον πίνακα 1.1. Ο αχινός είναι ένα θαλάσσιο ασπόνδυλο το οποίο ανήκει στη συνομοταξία των Εχινοδέρμων. Στην ίδια συνομοταξία ανήκουν επίσης τα Αστεροειδή, τα Ολοθουριοειδή, τα Οφιουροειδή και τα Κρινοειδή. Τα βασικά χαρακτηριστικά που διακρίνουν αυτή τη συνομοταξία είναι: α) η ακτινωτή συμμετρία β) ο εσωτερικός σκελετός και γ) το αγγεικό σύστημα νερού Εικόνα 1.1 Ο αχινός P.lividus. Χαρακτηριστικό είναι το χρώμα του χάρη στο οποίο πήρε το όνομά του, lividus, που σημαίνει μολυβδόχρωμος. Ο αχινός έχει πεντακτινωτή συμμετρία, η οποία προκύπτει δευτερογενώς μετά από μια περίοδο αμφίπλευρης συμμετρίας κατά την πρώϊμη οντογένεση και αναπτύσσεται από τη λάρβα η οποία φέρει αμφίπλευρη συμμετρία (Barnes R. D. Zoology, Barnes R. S. K. The invertebrates a new synthesis). Το σώμα του είναι 1

18 Εισαγωγή Πίνακας 1.1 Συνομοταξία Υποσυνομοταξία Ομοταξία: Υφομοταξία: Υπέρταξη: Τάξη Οικογένεια Γένος Είδος : Εχινόδερμα : Ελευθερόζωα : Εχινοειδή : Ενδοκυκλικά : Εχινόμορφα : Καμερόδοντα : Echinidae (Εχινίδες) : Paracentrotus (Παρακεντρωτός) : Paracentrotus lividus (Παρακεντρωτός ο μολυβδόχρωμος) ημισφαιρικό, πεπλατυσμένο στους δύο πόλους (κάψα) και φέρει κινητές, σκληρές άκανθες, μεταξύ των οποίων υπάρχουν οι βαδιστικοί ποδίσκοι και οι ποδολαβίδες. Οι άκανθες κινούνται με μικρούς μύες που βρίσκονται γύρω από τις βάσεις τους. Κάτω από το εξωδερμικό περίβλημα υπάρχει ο ενδοδερμικός σκελετός που αποτελείται από ασβεστολιθικά πινακίδια όπως φαίνεται στην εικόνα 1.2. Τα Eχινόδερμα δεν παρουσιάζουν κεφαλοποίηση, αλλά έχουν στοματικό αντιστοματικό άξονα. Στο κέντρο της στοματικής επιφάνειας βρίσκεται το στόμα, που περιβάλλεται από πέντε συγκλίνοντα δόντια. Η έδρα, οι γεννητικοί πόροι και η μητροπόρος πλάκα βρίσκονται στην αντιστοματική, την περιπρωκτική περιοχή. Εικόνα 1.2 Ο ενδοσκελετός του αχινού. 2

19 Εισαγωγή Ο αχινός ως πειραματικό υλικό από το παρελθόν μέχρι σήμερα Στην πορεία των χρόνων τα Εχινόδερμα και ειδικά ο αχινός έχουν αποτελέσει Εικόνα 1.3 Ο von Baer. 4/embriologia_NOV O/H-Gastrulacaoconceitos_gerais/8_5. htm πολύ σπουδαίο σύστημα μελέτης στους τομείς της αναπτυξιακής, της κυτταρικής και της μοριακής βιολογίας. Μάλιστα ο αχινός έχει αποτελέσει το πρώτο πειραματόζωο που χρησιμοποιήθηκε σε πειράματα αναπτυξιακής βιολογίας. Τα πρώτα πειράματα που περιγράφουν τεχνητή γονιμοποίηση αυγών αχινού και μελέτη της εμβρυϊκής ανάπτυξης πραγματοποιήθηκαν από τους Derbes και von Baer το 1847 (εικόνα 1.3) (Horstadius, 1973). Από τα μέσα του δεκάτου ενάτου αιώνα και μετά, πολλά πειράματα έχουν πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας έμβρυα εχινοειδών. Το 1875 ένας Γερμανός βιολόγος, ο Oskar Hertwig, παρατήρησε την είσοδο ενός σπερματοζωαρίου σε ένα αυγό αχινού και η παρατήρηση αυτή αποτέλεσε την αρχή για την ανακάλυψη του κεντρικού ρόλου του πυρήνα στην ανάπτυξη. Μεταξύ ο Theodor Boveri πραγματοποίησε πολλά πειράματα σε έμβρυα αχινού και κατέληξε στα εξής δύο άγνωστα μέχρι τότε συμπεράσματα: 1) Ένα γονιμοποιημένο αυγό θα πρέπει να έχει ένα συγκεκριμένο αριθμό χρωμοσωμάτων προκειμένου να αναπτυχθεί φυσιολογικά και 2) κάθε ένα από αυτά τα χρωμοσώματα ευθύνεται για συγκεκριμένα χαρακτηριστικά. Μερικές δεκαετίες αργότερα, τα πειράματα του Sven Hörstadius που περιελάμβαναν απομονώσεις κυττάρων και μετεμφυτεύσεις αυτών σε εκτοπικές περιοχές απέδειξαν επαγωγικές επικοινωνίες μεταξύ των βλαστομεριδίων (Horstadius 1939). Τα τελευταία χρόνια διάφοροι ερευνητές ανά τον κόσμο προσπαθούν να κατανοήσουν την ανάπτυξη των αχινών σε μοριακό επίπεδο, κάποιες φορές βασιζόμενοι σε κλασσικές τεχνικές, χρησιμοποιώντας ωστόσο νέα εργαλεία (Ransick and Davidson, 1998). Από τα πειράματα που έχουν πραγματοποιηθεί στα τέλη του εικοστού και στις αρχές του εικοστού πρώτου αιώνα, έχουν κατανοηθεί σε μεγάλο βαθμό οι διαδικασίες που λαμβάνουν χώρα κατά τη μεταγωγή σημάτων από κύτταρο 3

20 Εισαγωγή σε κύτταρο, καθώς και οι μεταγραφικοί ρυθμιστές που ευθύνονται για τον καθορισμό της αναπτυξιακής τύχης των εμβρύων (Oliveri and Davidson, 2004) Γιατί ο αχινός θεωρείται ως ένα από τα σπουδαιότερα πειραματικά υλικά Ο αχινός αποτελεί ένα πειραματικό υλικό που προσελκύει πολλούς ερευνητές και στη σημερινή εποχή. Αυτό οφείλεται σε ένα σύνολο χαρακτηριστικών του που το καθιστούν ως ένα από τα σπουδαιότερα πειραματόζωα και είναι τα εξής: 1) Πληθώρα ατόμων: Απαντάται σε αφθονία στις θάλασσες και η συλλογή του είναι μία εύκολη διαδικασία. 2) Εξωτερική γονιμοποίηση και ανάπτυξη: Τα θηλυκά και αρσενικά άτομα απελευθερώνουν γαμέτες συγχρονισμένα στη θάλασσα προκειμένου να επιτευχθεί η γονιμοποίηση και να ξεκινήσει η ανάπτυξη του εμβρύου. Αυτός ο τρόπος γονιμοποίησης και ανάπτυξης που είναι εξωτερικός καθιστά εύκολη και δυνατή τη συνεχή παρατήρηση των αναπτυσσόμενων εμβρύων. 3) Υψηλή γονιμότητα των ατόμων: Τόσο τα αρσενικά όσο και τα θηλυκά άτομα είναι πολύ γόνιμα. Ένα μόνο θηλυκό μπορεί να παράξει πάνω από 50 εκατομμύρια αυγά κάθε φορά. Αυτό είναι εξαιρετικά σημαντικό καθώς επιτρέπει την in vitro γονιμοποίηση ενός μεγάλου αριθμού ωοκυττάρων και την παραγωγή συγχρονισμένων καλλιεργειών ενός μεγάλου αριθμού εμβρύων. Έτσι, καθίσταται εύκολη η συλλογή υλικού (Leahy, 1986) και η πραγματοποίηση μιας σειράς βιοχημικών και μοριακών διαδικασιών από την απομόνωση πρωτεϊνών μέχρι την κατασκευή γενωμικών και c-dna βιβλιοθηκών κ.ά. 4) Διαφάνεια των εμβρύων: Τα έμβρυα του αχινού είναι διαφανή, Εικόνα 1.4 Γονιμοποιημένο αυγό αχινού υπό μικροσκοπία κατά την εκτέλεση μικροενέσεων. γεγονός που επιτρέπει την άμεση παρατήρηση των αναπτυξιακών διεργασιών 4

21 Εισαγωγή με τη χρήση ενός φωτονικού μικροσκοπίου (Davidson et al., 1982). Επιπλέον, επιτρέπει την εύκολη δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων (εικόνα 1.4) και την πραγματοποίηση πειραμάτων με φθορίζοντα γονίδια αναφοράς, εξάγοντας έτσι συμπεράσματα για την έκφραση ενός γονιδίου, τον ιστοειδικό εντοπισμό μιας πρωτεΐνης και αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών. 5) Πλήρως αλληλουχημένο γονιδίωμα: Η αλληλούχηση του γονιδιώματος του αχινού Strongylocentrotus purpuratus που δημοσιεύτηκε το Νοέμβριο του 2006 (Sodegren et al., 2006) δίνει τη δυνατότητα εύκολης και ταχείας αναζήτησης νέων γονιδίων και ως εκ τούτου μελέτης τους. 6) Απλότητα του γονιδιώματος: Το γονιδίωμα του αχινού αποτελείται από γονίδια, περίπου όσα υπολογίζονται και για τα Σπονδυλωτά. Ωστόσο, τα Εχινόδερμα χώρισαν από τα Χορδωτά πριν το διπλασιασμό του γονιδιώματος καθώς τα περισότερα γονίδιά τους συναντώνται μία μόνο φορά στο γονιδίωμα με αποτέλεσμα πολλά από τα γονίδια που συναντώνται σαν πολλαπλά παράλογα στα σπονδυλωτά να έχουν ένα μόνο ομόλογο στον αχινό. Αυτό συνεπάγεται ότι ο αχινός αποτελεί ένα σύστημα που δεν φέρει προβλήματα αντικατάστασης της λειτουργικότητας ενός μη λειτουργικού γονιδίου από το παράλογό του όπως συμβαίνει συχνά στα Σπονδυλωτά και εξυπηρετεί έτσι μια πολύ σημαντική σύγκριση για τον προσδιορισμό της σπουδαιότητας συντηρημένων γονιδίων και ρυθμιστικών αλληλεπιδράσεων στο γονιδίωμα. 7) Η θέση του αχινού στο φυλογενετικό δέντρο: Τα Εχινόδερμα αποτελούν μία από τις δύο ομάδες των Δευτεροστομίων (η άλλη είναι τα Ημιχορδωτά) η οποία βρίσκεται πολύ κοντά φυλογενετικά σε αυτή των Χορδωτών όπως φαίνεται στην εικόνα 1.5. Η σχέση τους αυτή υποδηλώνει την παρουσία ενός κοινού προγόνου και καθιστά τα Εχινόδερμα ένα εξαιρετικό πειραματικό μοντέλο για μελέτες σχετικές με τη λειτουργία και τη ρύθμιση γονιδίων. Η εύρεση κοινών στοιχείων μεταξύ των αχινών και των Σπονδυλωτών μπορεί να δώσει φως σε πολλά μοριακά μονοπάτια που έλαβαν χώρα κατά την ανάπτυξη στη διάρκεια της εξέλιξης. 5

22 Εισαγωγή Εικόνα 1.5 Φυλογενετικό δέντρο και η θέση των Εχινοδέρμων σε αυτό σε σύγκριση με τους υπόλοιπους οργανισμούς και τον άνθρωπο. Τα Εχινόδερμα ανήκουν στα Δευτεροστόμια και όπως φαίνεται βρίσκονται πολύ κοντά φυλογενετικά με τα Χορδωτά. Sodergren et al.,

23 Εισαγωγή Η εμβρυογένεση στον αχινό H διαδικασία της εμβρυογένεσης είναι πολύ καλά μελετημένη στον αχινό. H γονιμοποίηση είναι εξωτερική και τα γονιμοποιημένα αυγά στον P.lividus περνούν από διάφορα αναπτυξιακά στάδια και καταλήγουν σε αυτό του πλουτέα σε διάστημα δύο ημερών σε θερμοκρασία 18 0 C. Kατόπιν, τα έμβρυα μετατρέπονται σε νύμφες και μεταμορφώνονται σε νεαρούς αχινούς σε διάστημα τεσσάρων περίπου εβδομάδων από τη στιγμή της γονιμοποίησης (Davidson et al., 1982; Davidson, 1986; Gilbert 1985). Άλλα είδη αχινού όπως ο Strongylocentrotus purpuratus ολοκληρώνουν την ανάπτυξή τους με αργότερο ρυθμό, ενώ ο Lytechinus variegatus με γρηγορότερο ρυθμό μιας και ζεί σε πιο ζεστά ύδατα. Το στάδιο της γονιμοποίησης Τα σπερματοζωάρια του αχινού είναι πολύ μικρά και αποτελούνται από την κεφαλή και την ουρά. Η κεφαλή περιέχει το ακρόσωμα, τον πυρήνα και ένα ζεύγος κεντριολίων. Η ουρά περιλαμβάνει εννέα περιφερικούς και δύο κεντρικούς μικροσωληνίσκους. Τα αυγά του αχινού είναι μεγάλα κύτταρα με μέγεθος που κυμαίνεται μεταξύ μικρών, ανάλογα με το είδος. Οι μειωτικές διαιρέσεις που σχετίζονται με την ωογένεση έχουν ολοκληρωθεί ενώ τα αυγά βρίσκονται μέσα στην ωοθήκη. Κάθε αυγό φέρει έναν μικρό, εκκεντρικά τοποθετημένο προπυρήνα και περιέχει σταγονίδια λεκιθίνης και μικρά κυστίδια με λιπίδια και άλλα οργανίδια. Τα οργανίδια αυτά μαζί με τα λιπίδια προμηθεύουν το έμβρυο και την πρώϊμη λάρβα με ενέργεια και τροφή μέχρι να ξεκινήσει να τρέφεται από μόνη της (Scott and Lennarz, 1989). Το ώριμο ωάριο περιβάλλεται από δύο μεμβράνες εξωτερικά της κυτταρικής: α) τη λεκιθική μεμβράνη εσωτερικά και β) το ζελατινώδες περίβλημα εξωτερικά. Το περίβλημα αυτό χρησιμεύει για την ενεργοποίηση του σπερματοζωαρίου κατά τη γονιμοποίηση. Μόρια σε αυτό το περίβλημα προκαλούν την αντίδραση του ακροσώματος στο σπερματοζωάριο και είναι ειδικά για κάθε είδος (Glabe and Vacquier, 1977). 7

24 Εισαγωγή Κατά τη γονιμοποίηση λαμβάνουν χώρα δύο γεγονότα σύντηξης: α) Η σύντηξη των μεμβρανών του σπερματοζωαρίου και του αυγού και β) Η σύντηξη των δύο απλοειδών προπυρήνων τους. Όπως φαίνεται στην εικόνα 1.6 καθώς πλησιάζουν οι μεμβράνες των γαμετών (1), ξεκινά η αντίδραση του ακροσώματος (2), όπου το σπερματοζωάριο πέπτει το ζελατινώδες περίβλημα (3). Κατόπιν, το ακροσωμικό νημάτιο έρχεται σε επαφή με τη λεκιθική μεμβράνη του ωαρίου και δεσμεύεται σε αυτή (4) (Vacquier and Moy, 1977; Giusti et al., 1997; Stears and Lennarz, 1977). Η ακροσωμική πρωτεΐνη bindin μεσολαβεί στην αναγνώριση και στη δέσμευση στον υποδοχέα της, η οποία είναι ειδική για κάθε είδος (Dan, 1967; Franklin, 1970; Levine et al., 1978). Μετά την πρόσδεση στη λεκιθική μεμβράνη, ένα πρωτεολυτικό ένζυμο πέπτει τη μεμβράνη στο σημείο αυτό (5). Στα πρώτα 20 δευτερόλεπτα μετά τη σύντηξη ενεργοποιούνται δύο διαδικασίες που αποτρέπουν την πολυσπερμία και ολοκληρώνονται μέσα στο πρώτο λεπτό. Η πρώτη περιλαμβάνει μία ταχεία αντίδραση αύξησης του δυναμικού της κυτταρικής μεμβράνης του αυγού (Jaffe, 1976; Schuel and Schuel, 1981) και η δεύτερη μία πιο αργή και πιο μόνιμη αντίδραση, της παραγωγής ενός φυσικού φραγμού που σχηματίζεται από την εξωκύττωση των φλοιϊκών κοκκίων (Just, 1919). Τα κοκκία αυτά περιέχουν διάφορα συστατικά προκειμένου να αντεπεξέλθουν στους στόχους τους: α) Πρωτεάσες οι οποίες καταστρέφουν την επαφή μεταξύ της λεκιθικής και της κυτταρικής μεμβράνης και απενεργοποιούν τον υποδοχέα της με αποτέλεσμα να αποτρέπουν την πρόσδεση κάθε νέου σπερματοζωαρίου (Glabe and Vacquier, 1978; Vacquier et al., 1973) Εικόνα 1.6 Η στιγμή της γονιμοποίησης. Στην εικόνα φαίνονται τα στάδια της διαδικασίας τα οποία περιγράφονται αναλυτικά στο κείμενο. Gilbert 2003, Developmental Biology 8

25 Εισαγωγή β) Μουκοπολυσακχαρίτες οι οποίοι ευθύνονται για την ωσμωτική κλίση που δημιουργείται μεταξύ της κυτταρικής και της λεκιθικής μεμβράνης. Η ωσμωτική αυτή κλίση προκαλεί την είσοδο του νερού σε αυτό το χώρο προκαλώντας τη διόγκωση της λεκιθικής μεμβράνης και τη μετατροπή της σε μεμβράνη γονιμοποίησης όπως φαίνεται στην εικόνα 1.7 (Hall, 1978; Foerder and Shapiro, 1977). γ) Ένζυμο περοξειδάσης το οποίο σκληραίνει τη μεμβράνη γονιμοποίησης συνδέοντας τα κατάλοιπα τυροσίνης των γειτονικών πρωτεϊνών, αποτρέποντας την είσοδο ενός άλλου σπερματοζωαρίου (Foerder and Shapiro, 1977; Mozingo and Chandler, 1991). δ) Υαλίνη η οποία σχηματίζει μία σκληρή εξωκυττάρια μεμβράνη γύρω από το αυγό, την υαλώδη μεμβράνη (Hylander and Summers, 1982). Το στρώμα της υαλίνης συγκρατεί τα κύτταρα του αναπτυσσόμενου εμβρύου το ένα κοντά στο άλλο μέχρι να αναπτύξουν τις κυτταρικές συνδέσεις τους στο βλαστίδιο. Αμέσως μετά ξεκινά η δεύτερη διαδικασία σύντηξης, η σύντηξη των προπυρήνων του σπερματοζωαρίου και του ωαρίου. Συνήθως λαμβάνει χώρα λεπτά μετά τη σύντηξη των γαμετών και το αποτέλεσμα είναι η δημιουργία ενός διπλοειδούς ζυγωτικού πυρήνα. Εικόνα 1.7 Γονιμοποιημένο αυγό αχινού υπό μικροσκοπία με εμφανή τη μεμβράνη γονιμοποίησης. ( mages/aab-wallpaper-9-small) Το στάδιο των αυλακώσεων Κατά τη διάρκεια των αυλακώσεων ο μονοκύτταρος ζυγώτης μετατρέπεται σε πολυκύτταρο έμβρυο μέσω μιας σειράς ταχέων και σύγχρονων διαιρέσεων. Στις πρώτες διαιρέσεις δεν αυξάνει το μέγεθος του εμβρύου καθώς το μόνο που συμβαίνει είναι διαίρεση του περιεχομένου του. Καθώς το ένα κύτταρο διαιρείται σε περισσότερα, η αναλογία του όγκου του πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα των βλαστομεριδίων, αυξάνει. Με τις διαιρέσεις αυτές κάθε περιοχή του κυτταροπλάσματος που περιλαμβάνει συγκεκριμένες αναπτυξιακές πληροφορίες διαμερισματοποιείται στα διάφορα κύτταρα του εμβρύου. 9

26 Εισαγωγή Οι διαιρέσεις στο έμβρυο του αχινού είναι ολοβλαστικές και εκτός από μία εξαίρεση, ισομερείς. Oι δύο πρώτες αυλακώσεις (στάδιο τεσσάρων κυττάρων) πραγματοποιούνται κάθετα μεταξύ τους αλλά και οι δύο κατά μήκος του ζωίκού φυτικού άξονα (ζ/φ) (εικόνα 1.8a, b), που ενώνει το ζωικό με το φυτικό πόλο και ο οποίος έχει καθοριστεί πριν τη γονιμοποίηση (Schroeder 1980a, Schroeder 1980b). Έτσι, το έμβρυο χωρίζεται σε τέσσερα ίσα τέταρτα. H τρίτη αυλάκωση (στάδιο οχτώ κυττάρων) πραγματοποιείται κατά μήκος του ισημερινού, κάθετα ως προς τις δύο πρώτες αυλακώσεις και διαχωρίζει ισομερώς το ζωικό από το φυτικό πόλο, χωρίζοντας το έμβρυο σε οχτώ κύτταρα (εικόνα 1.8c). H τέταρτη αυλάκωση (στάδιο 16 κυττάρων) είναι πολύ διαφορετική από τις τρεις προηγούμενες, όπως φαίνεται στην εικόνα 1.8d. Στο μεν ζωϊκό πόλο πραγματοποιείται μεσημβρινά (κατά μήκος του ζ/φ άξονα) και οδηγεί στο σχηματισμό οχτώ ίσων βλαστομεριδίων, τα οποία λέγονται μεσομερίδια, στο δε φυτικό πόλο η διαίρεση είναι παράλληλη του ισημερινού (κάθετη στο ζ/φ άξονα) αλλά άνιση και οδηγεί στο σχηματισμό τεσσάρων μεγάλων βλαστομεριδίων, των μακρομεριδίων και κάτω από αυτά, τεσσάρων μικρών βλαστομεριδίων, των μικρομεριδίων (Davidson et al., 1998, Angerer et al., 2000a, Angerer et al., 2000b). Kατά την πέμπτη αυλάκωση (στάδιο 32 κυττάρων) (εικόνα 1.8e) τα οχτώ μεσομερίδια διαιρούνται κατά μήκος του ισημερινού άξονα και σχηματίζουν δύο περιοχές στο ζωϊκό πόλο, τις an1 και an2. Τα τέσσερα μακρομερίδια διαιρούνται κατά μήκος του ζ/φ άξονα (meridionally), σχηματίζοντας ένα στρώμα από οχτώ κύτταρα. Τα δε μικρομερίδια διαιρούνται και πάλι άνισα για να σχηματίσουν τέσσερα μεγάλα και τέσσερα μικρά μικρομερίδια (Cameron and Davidson, 1991; Okazaki, 1975; Pehrson and Cohen, 1986). 10

27 Εισαγωγή Στην έκτη αυλάκωση (στάδιο 60 κυττάρων) όλα τα κύτταρα (εκτός των μικρών μικρομεριδίων) διαιρούνται κατά μήκος του ισημερινού (εικόνα 1.8f). Επομένως το έμβρυο των 60 κυττάρων αποτελείται, ξεκινώντας από το ζωϊκό προς το φυτικό πόλο, από 16 an1 κύτταρα (δύο σειρές των οχτώ), 16 an2 (δύο σειρές των οχτώ), 8 veg1, 8 veg2 και 12 μικρομερίδια (8 μεγάλα μικρομερίδια και 4 μικρά μικρομερίδια). Εικόνα 1.8 Αυλακώσεις του γονιμοποιημένου αυγού αχινού ως το στάδιο των 60 κυττάρων. Κάθε αυλάκωση πραγματοποιείται σε μία ώρα εκτός από την πρώτη που πραγματοποιείται δύο ώρες μετά τη γονιμοποίηση. Η πρώτη αυλάκωση (a) γίνεται κατά μήκος του άξονα που διέρχεται από το ζωϊκό προς το φυτικό πόλο και οδηγεί στο σχηματισμό δύο κυττάρων (b). H δεύτερη αυλάκωση (b) πραγματοποιείται κατά μήκος του ίδιου με την πρώτη αυλάκωση άξονα, κάθετα όμως προς την πρώτη αυλάκωση και οδηγεί στο σχηματισμό τεσσάρων κυττάρων (c). Η τρίτη αυλάκωση (c) λαμβάνει χώρα κατά μήκος του ισημερινού και οδηγεί στο σχηματισμό οχτώ κυττάρων (d). Η τέταρτη αυλάκωση (d) πραγματοποιείται κατά μήκος του μεσημβρινού στα τέσσερα κύτταρα του ζωϊκού πόλου σχηματίζοντας έτσι τα οχτώ μεσομερίδια και κατά μήκος του ισημερινού στα τέσσερα κύτταρα του φυτικού πόλου σχηματίζοντας τα τέσσερα μακρομερίδια και τα τέσσερα μικρομερίδια (e). Κατά την πέμπτη αυλάκωση (e) που πραγματοποιείται κατά μήκος του ισημερινού στα μεσομερίδια και στα μικρομερίδια και κατά μήκος του μεσημβρινού στα μακρομερίδια δημιουργείται το έμβρυο των 32 κυττάρων (f). Τέλος η έκτη αυλάκωση (f) που πραγματοποιείται κατά μήκος του ισημερινού οδηγεί στο σχηματισμό του εμβρύου των 60 κυττάρων. an: animal, veg: vegetal. Με μπλε χρώμα απεικονίζονται τα κύτταρα που θα σχηματίσουν το εξώδερμα, με κίτρινο το ενδόδερμα, με κόκκινο το μεσόδερμα. Στις παρενθέσεις αναγράφεται ο αριθμός των κυττάρων για κάθε τύπο. Gilbert 2003 Developmental Biology 11

28 Εισαγωγή Το στάδιο του βλαστιδίου ξεκινά από τα 128 κύτταρα και οι διαιρέσεις συνεχίζονται παράγοντας ολοένα και μικρότερα κύτταρα. Τα κύτταρα αρχικά περιβάλλουν μια κεντρική κοιλότητα, το βλαστόκοιλο και στη συνέχεια οργανώνονται σε επιθηλιακά με μόνιμες μεταξύ τους συνδέσεις (εικόνα 1.9). Εικόνα 1.9 Σχηματισμός βλαστιδίου υπό ηλεκτρονική μικροσκοπία. Gilbert 2003 Developmental Biology Ο σχηματισμός του βλαστόκοιλου ξεκινά με την προσκόλληση των βλαστομεριδίων στο στρώμα της υαλίνης και την ταχεία είσοδο νερού που διογκώνει την εσωτερική κοιλότητα (Dan, 1960; Ettensohn and Ingersoll, 1992; Wolpert and Gustafson, 1961). Τα κύτταρα του φυτικού πόλου του βλαστιδίου ξεκινούν να παχαίνουν σχηματίζοντας τη φυτική πλάκα (εικόνα 1.9). Μια μικρή δεσμίδα από μακριές βλεφαρίδες σχηματίζεται στο ζωϊκό πόλο του βλαστιδίου, με τη βοήθεια της οποίας το έμβρυο ξεκινά να στριφογυρίζει μέσα στη μεμβράνη γονιμοποίησης. Στο σημείο αυτό τα κύτταρα του ζωϊκού πόλου εκκρίνουν ένα ενζυμικό σύμπλεγμα με το οποίο το έμβρυο εκκολάπτεται από τη μεμβράνη και ξεκινά να κολυμπάει (Ghiglione et al., 1994; Lepage et al., 1992; Reynolds et al., 1992). Ξεκινώντας από την τελευταία αυλάκωση και το στάδιο του βλαστιδίου, το έμβρυο του αχινού αποτελείται από περιοχές (εικόνα 1.10). Οι περιοχές αυτές διακρίνονται μεταξύ τους καθώς προέρχονται από διαφορετικές κυτταρικές γραμμές, χαρακτηρίζονται από διαφορετικά πρότυπα γονιδιακής έκφρασης και περιλαμβάνουν έναν ή περισσότερους διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους. 12

29 Εισαγωγή Στο στάδιο των 60 κυττάρων διακρίνονται πέντε τέτοιες εμβρυϊκές περιοχές (εικόνα 1.10) (Cameron and Davidson, 1991; Davidson, 1989; Davidson et al., 1998): 1) Η περιοχή των μικρών μικρομεριδίων (μωβ) 2) Η περιοχή των σκελετογόνων μεσεγχυματικών κυττάρων (κόκκινο) 3) Η περιοχή της φυτικής πλάκας- ενδόδερμα (μπλε) και μεσόδερμα (γκρι) 4) Η περιοχή του αντιστοματικού εξωδέρματος (πράσινο) 5) Η περιοχή του στοματικού εξωδέρματος (κίτρινο) Οι υπόλοιπες περιοχές που φαίνονται με λευκό στην εικόνα 1.10 διαφοροποιούνται σε επόμενο αναπτυξιακό στάδιο. Τα τέσσερα μικρά μικρομερίδια πρωτοδημιουργούνται κατά την άνιση πέμπτη αυλάκωση (Cameron et al., 1991; Okazaki, 1975; Pehrson and Cohen, 1986) και θα διαιρεθούν μία ακόμη φορά κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, συμβάλλοντας στον καθορισμό της γαμετικής σειράς και στο σχηματισμό του κοιλοματικού σάκου. Η περιοχή των σκελετογόνων μεσεγχυματικών κυττάρων η οποία προέρχεται από τα μεγάλα μικρομερίδια θα σχηματίσει το σκελετό της λάρβας. Η περιοχή της φυτικής πλάκας αντιστοιχεί στη veg2 περιοχή και κατά τη διάρκεια της γαστριδίωσης θα σχηματίσει το πρόσθιο έντερο, τμήμα του μέσου εντέρου και όλα τα δευτερογενή μεσοδερμικά κύτταρα. Το αντιστοματικό εξώδερμα παράγει ένα οιδηματώδες επιθήλιο από το οποίο θα προκύψει το Εικόνα 1.10 Χάρτης αναπτυξιακής τύχης περιοχών του S.purpuratus στο στάδιο μεσο-αυλάκωσης και στο βλαστίδιο. Α) Στάδιο 60 κυττάρων, έκτη αυλάκωση Β) Μεσεγχυματικό βλαστίδιο, περί τα 250 κύτταρα, εξωτερική πλευρική όψη C) Μεσεγχυματικό βλαστίδιο, όψη από το φυτικό πόλο. Ο: Oral (στοματική), A: Aboral (αντιστοματική). Davidson et al., 1998 εξωτερικό τοίχωμα του ώριμου εμβρύου και της λάρβας εκτός από την περιοχή του στόματος και της βλεφαριδωτής ζώνης. Η περιοχή του στοματικού εξωδέρματος παράγει μία 13

30 Εισαγωγή μεγάλη ποικιλία μορφολογικών δομών και κυτταρικών στοιχείων: το στόμα, το στοματικό κάλυμμα, τη βλεφαριδωτή ζώνη και το μεγαλύτερο τμήμα του νευρικού συστήματος του εμβρύου. Στον πίνακα 1.2 που ακολουθεί αναγράφονται συνοπτικά κατά την πορεία των αυλακώσεων ποιός κυτταρικός ιστός θα προκύψει από τον εκάστοτε κυτταρικό τύπο. Πίνακας 1.2 Ζωϊκός πόλος Μεσομερίδια 2Χ8 an1 ΕΞΩΔΕΡΜΑ 2Χ8 an2 ΕΞΩΔΕΡΜΑ Φυτικός πόλος Μακρομερίδια 8 veg1 ΕΞΩΔΕΡΜΑ ΕΝΔΟΔΕΡΜΑ 8 veg2 ΕΝΔΟΔΕΡΜΑ ΜΕΣΟΔΕΡΜΑ (SMC): Μύες Μικρομερίδια 8 μεγάλα ΜΕΣΟΔΕΡΜΑ (PMC): Σκελετός 4 μικρά ΓΑΜΕΤΙΚΗ ΣΕΙΡΑ Η μορφογένεση του εμβρύου Η μορφογένεση του εμβρύου ξεκινά αμέσως μετά την έναρξη των αυλακώσεων, εδραιώνοντας πολύ γρήγορα τις πρώτες τρεις εμβρυϊκές στοιβάδες. Το ώριμο βλαστίδιο αποτελείται από περίπου 400 κύτταρα τα οποία σχηματίζουν μία σφαίρα αφήνοντας στο κέντρο έναν κενό χώρο, το βλαστόκοιλο. Η μορφή των κυττάρων αυτών διαφέρει στη φυτική πλευρά του εμβρύου όπου είναι πιο πεπλατυσμένα και πιο πεπαχυσμένα (εικόνα 1.11 a). 14

31 Εισαγωγή Το πρώτο μορφογενετικό γεγονός είναι η είσοδος ενός αριθμού μεσεγχυματικών κυττάρων του φυτικού πόλου στο βλαστόκοιλο. Τα πρωτογενή μεσεγχυματικά κύτταρα (PMCs) τα οποία προέρχονται από τα μεγάλα μικρομερίδια και εντοπίζονται στο κέντρο της φυτικής πλάκας (Burke et al. 1991) αρχίζουν να διαφοροποιούνται. Ξεκινούν να εκτείνουν μακριά φιλοπόδια από την εσωτερική τους επιφάνεια (εικόνα 1.11 b) και να χάνουν την επαφή τους με τα γειτονικά τους επιθηλιακά κύτταρα ενώ αυξάνει η συγγένειά τους με την εξωκυττάρια ουσία και το βασικό έλασμα που περιβάλλει το βλαστόκοιλο (Fink and McClay 1985; Amemiya 1989). H κυτταρική αυτή κίνηση ονομάζεται εισβολή. Τα κύτταρα που συμμετέχουν είναι φιαλόμορφα με τη βάση τους προς την πλευρά του βλαστόκοιλου. Σε αυτό το πρώϊμο στάδιο, το έμβρυο ονομάζεται μεσεγχυματικό βλαστίδιο. Τα PMCs που βρίσκονται μέσα στο βλαστόκοιλο μετακινούνται για μια μικρή περίοδο, καταστρέφοντας και επαναδημιουργώντας νέα φιλοπόδια που συνδέονται με το τοίχωμα του βλαστόκοιλου. Τα φιλοπόδια αυτά φαίνεται να παίζουν μεγαλύτερο ρόλο στην εξερεύνηση και στην ανίχνευση του τοιχώματος του βλαστόκοιλου παρά στην κίνηση αυτή καθ αυτή. Τελικά τα PMCs συγκεντρώνονται στο μισό τμήμα του εμβρύου που αντιστοιχεί στο φυτικό πόλο, σε μια μορφή δαχτυλιδιού γύρω από το μελλοντικό αρχέντερο και σχηματίζουν δύο συνοθηλεύματα κυττάρων (τα πλαγιοκοιλιακά συνοθηλεύματα) (εικόνα 1.11 c). Στο σημείο αυτό τα κύτταρα γίνονται στρογγυλά, εξαφανίζουν τα φιλοπόδια τους και σχηματίζουν δύο κυτταρικά συγκύτια (Hodor and Ettensohn, 1998), για να αποτελέσουν τελικά τα κανάλια ανθρακικού ασβεστίου του σκελετού της λάρβας (Benson and Wilt, 1992; Decker and Lennarz, 1998; Ettensohn and Ingersoll, 1992). Καθώς τα PMCs που σχηματίζουν το δαχτυλίδι εγκαταλείπουν τη φυτική πλευρά του βλαστιδίου, τα εναπομείναντα στη φυτική πλάκα κύτταρα κινούνται προκειμένου να καλύψουν τα κενά, επιμηκύνονται και μεταφέρονται προς το βλαστόκοιλο με μία διαδικασία που ονομάζεται εγκόλπωση. Η διαδικασία αυτή διακρίνεται σε δύο φάσεις, την πρωτογενή και τη δευτερογενή εγκόλπωση (Dan and Okazaki, 1956; Gustafson and Kinnander, 1956; Kinnander and Gustafson, 1960; Okazaki, 1956; 1975). 15

32 Εισαγωγή Εικόνα 1.11 Διαδικασία γαστριδίωσης στο έμβρυο του αχινού. a) Εκκολαπτώμενο βλαστίδιο. Τα έμβρυα αποτελούνται από μονόστοιβο επιθήλιο και έχουν σφαιρικό σχήμα. b) Μεσεγχυματικό βλαστίδιο. Τα περισσσότερα PMCs έχουν εισέλθει στο βλαστόκοιλο. Τα PMCs εκτείνουν μακριά φιλοπόδια κατά μήκος του βλαστόκοιλου. c) Έναρξη της πρώϊμης εγκόλπωσης. d) Πρώιμο γαστρίδιο. Η πρώϊμη εγκόλπωση έχει ολοκληρωθεί και τα SMCs εμφανίζονται στην κορυφή του αρχεντέρου. e) Στάδιο μεσο-γαστριδίωσης. f) Ώριμο γαστρίδιο. Μέσα σε λίγες ώρες ένας μικρός αριθμός κυττάρων (περί τα 100 κύτταρα) (Ettensohn, 1984) της φυτικής πλάκας εγκολπώνεται προς το βλαστόκοιλο και ξεκινά η διαδικασία της γαστριδίωσης (εικόνα 1.12 C). Τη στιγμή που πραγματοποιείται η εγκόλπωση, τα κύτταρα της φυτικής πλάκας εκκρίνουν μία θειϊκή πρωτεογλυκάνη με χονδροϊτίνη στο εσωτερικό έλασμα του υαλώδους στρώματος ακριβώς κάτω από αυτά (εικόνα 1.12 C). Αυτό το υδροσκοπικό μόριο προκαλεί την εισροή νερού και τη διόγκωση του εσωτερικού ελάσματος αλλά όχι του εξωτερικού. Αυτό συνεπάγεται τη διόγκωση της φυτικής πλευράς του υαλώδους στρώματος (Lane et al., 1993). Η περιοχή που εισέρχεται εντός του βλαστόκοιλου αποτελεί το αρχέντερο και το άνοιγμα του αρχεντέρου που σχηματίζεται στη φυτική περιοχή του εμβρύου κατά τη γαστριδίωση αποτελεί το βλαστοπόρο (εικόνα 1.12 Α). Ο αχινός είναι δευτεροστόμιο και επομένως ο βλαστοπόρος του θα σχηματίσει την έδρα της λάρβας, αργότερα κατά την ανάπτυξη. 16

33 Εισαγωγή Με το τέλος της αρχικής εισβολής, το αρχέντερο έχει επεκταθεί κατά το ένα τέταρτο έως και το ήμιση της απόστασης ως την απέναντι πλευρά του βλαστόκοιλου (εικόνα 1.11 d). Εν τω μεταξύ, τα SMCs τα οποία αποτελούν τους απογόνους των veg2 βλαστομεριδίων που σχηματίζονται κατά την έκτη αυλάκωση (Cameron et al. 1991; Eικόνα 1.12 Α) Ο βλαστοπόρος Β) Η φυτική πλάκα πριν τη γαστριδίωση C) Μόρια που εκκρίνονται από τα κύτταρα της φυτικής πλάκας τη στιγμή της γαστριδίωσης. Endo 1966; Horstadius 1973), γίνονται ορατά στην κορυφή του αρχεντέρου. Αυτά ξεκινούν να εκτείνουν μακριά φιλοπόδια εντός του βλαστόκοιλου με κατεύθυνση προς το ζωϊκό πόλο του εμβρύου (Dan and Okazaki, 1956; Hardin, 1988; Hardin and McClay, 1990). Μετά από μια μικρή παύση λαμβάνει χώρα η δεύτερη φάση σχηματισμού του αρχεντέρου κατά την οποία το μέγεθός του αυξάνει δραματικά, με μια διαδικασία που καλείται συγκλίνουσα επέκταση, πολλές φορές τριπλασιάζοντας το μήκος του και μετασχηματίζεται σε ένα μακρύ, λεπτό σωλήνα. Το τμήμα του εξωδέρματος στο οποίο προσκολλώνται τα φιλοπόδια των SMCs συμπιέζεται (Dan and Okazaki 1956; Takata and Kominami, 2004) γεγονός που υποδηλώνει την εφαρμογή τάσης από αυτά (εικόνα 1.11 e, f). Η συνέχιση της επιμήκυνσης του εντέρου σταματά μόλις τα φιλοπόδια σπάσουν λόγω διόγκωσης του βλαστόκοιλου (Dan and Okazaki, 1956). Επιπλέον, κυτταρικές διαιρέσεις εξακολουθούν να πραγματοποιούνται παράγοντας περισσότερα ενδοδερμικά και δευτερογενή μεσεγχυματικά κύτταρα καθώς το αρχέντερο επιμηκύνεται (Martins et al., 1998). Καθώς το αρχέντερο επιμηκύνεται τα SMCs απομακρύνονται από την κορυφή του και πέφτουν στο βλαστόκοιλο όπου πολλαπλασιάζονται σχηματίζοντας 17

34 Εισαγωγή τέσσερεις τύπους μη σκελετογόνων μεσεγχυματικών κυττάρων (Ettensohn and Ruffins, 1993) (εικόνα 1.13a, b): 1) χρωμοφόρα κύτταρα (Gibson and Burke, 1985; 1987) 2) κύτταρα του βλαστόκοιλου ( Tamboline and Burke, 1992) 3) σολωμοκύτταρα και 4) μυϊκά κύτταρα του οισοφάγου (Burke and Alvarez, 1988; Ishimoda Takagi et al., 1984) Καθώς η κορυφή του αρχεντέρου πλησιάζει το ζωϊκό πόλο του βλαστόκοιλου, στρέφεται προς την κοιλιακή του πλευρά, που θα αποτελέσει το μελλοντικό στοματικό εξώδερμα, όπου και σχηματίζει σταθερές συνδέσεις με την εσωτερική του επιφάνεια (Hardin and McClay, 1990). Το στοματικό επιθήλιο και τα κύτταρα της κορυφής του αρχεντέρου επικοινωνούν και επάγουν το σχηματισμό μιας οπής, που θα αποτελέσει το στόμα της λάρβας. Εικόνα Μεσοδερμικά κύτταρα του εμβρύου του αχινού. a) Τελικό στάδιο διαφοροποίησης στον πρώϊμο πλουτέα, περίπου 1500 κύτταρα σε πλάγια όψη b) ίδιο στάδιο σε όψη από την πλευρά του στόματος. Τα χρώματα αντιστοιχούν στις περιοχές όπως περιγράφονται στην εικόνα 9. a: anus (έδρα), m:mouth (στόμα). Davidson et al., 1998 c) Πλουτέας με τέσσερεις βραχίονες. Wolpert,

35 Εισαγωγή Λίγο πριν το αρχέντερο έλθει σε επαφή με το μελλοντικό στοματικό εξώδερμα διαφοροποιείται σε πρόσθιο, μέσο και οπίσθιο έντερο μέσω συμπιέσεων του εντερικού σωλήνα στις περιοχές μετάπτωσης από το ένα τμήμα του εντέρου στο άλλο. Στη φάση αυτή της ανάπτυξης το έμβρυο καλείται πρίσμα και λαμβάνει τη μορφή πυραμίδας. Η πλευρά του εμβρύου που περιέχει το στόμα γίνεται επίπεδη και σχηματίζει τη στοματική περιοχή της αναπτυσσόμενης λάρβας. Επίσης, η πλευρά που φέρει το βλαστοπόρο επιπεδώνεται και σχηματίζει την έδρα. Μία δέσμη βλεφαρίδων αναπτύσσεται γύρω από το στόμα και το έμβρυο αρχίζει να επιμηκύνεται κατά μήκος του στοματικού αντιστοματικού άξονα. Καθώς η ανάπτυξη συνεχίζεται, εμφανίζονται στη στοματική περιοχή του εμβρύου δύο βραχίονες, οι στοματικοί βραχίονες. Λίγο αργότερα κάνουν την εμφάνισή τους άλλοι δύο βραχίονες, οι εδρικοί οι οποίοι εκπορεύονται από την περιοχή που συνορεύει το στοματικό εξώδερμα με το αντιστοματικό στην πλευρά της έδρας. Όταν ολοκληρωθεί ο σχηματισμός τους οι εδρικοί βραχίονες είναι μακρύτεροι από τους στοματικούς. Λόγω των αλλαγών που συμβαίνουν στο σώμα της αναπτυσσόμενης λάρβας το γαστρεντερικό σύστημα παίρνει τη μορφή του γράμματος J. Ο στόμαχος μεγεθύνεται και καταλαμβάνει ένα μεγάλο τμήμα στο κέντρο του πλουτέα. Στο σημείο αυτό της ανάπτυξης το έμβρυο καλείται πλουτέας με τέσσερεις βραχίονες. Ακολουθεί μια μακρά περίοδος κατά την οποία το έμβρυο τρέφεται συνεχώς και εξακολουθεί να αναπτύσσεται η λάρβα μέχρι τη στιγμή της μεταμόρφωσης ενός μικροσκοπικού αχινού. 19

36 Εισαγωγή 1.2 Ο παράγοντας Coup-TF Ο Coup-TF (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor) είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας ο οποίος ανήκει στην υπεροικογένεια των υποδοχέων των στεροειδών θυρεοειδών ορμονών. Μέχρι σήμερα δεν έχει βρεθεί κάποιο πρόσδεμα, γι αυτό και οι Coup TFs κατατάσσονται στους ορφανούς υποδοχείς. Πρωτοανιχνεύθηκε στην όρνιθα από όπου πήρε και το όνομά του. Eκεί δρα ως μεταγραφικός παράγοντας ο οποίος προσδένεται στον υποκινητή του γονιδίου της ωαλβουμίνης και το ρυθμίζει θετικά (Pastoric et al., 1986; Bagchi et al., 1987; Wang et al., 1987). O Coup-TF είναι απαραίτητος για τη μεταγραφή του γονιδίου της ωαλβουμίνης και σε in vitro πειράματα (Sagami et al. 1986; Tsai et al. 1987). Ωστόσο, αυτό επιτυγχάνεται όταν Εικόνα 1.14 Φυλογενετικό δέντρο στο οποίο εμπεριέχονται οι Coup-TFs από.σπονδυλωτά και αλληλεπιδράσει με τον μεταγραφικό ασπόνδυλα. h:human, m:mouse, c:chicken, x:xenopus, z:zebrafish, hm:hamster, r:rat, παράγοντα S300-II, ο οποίος δεν d;drosophila, su:sea urchin. Tsai S. et al προσδένεται στο DNA (Sagami et al. 1986; Tsai et al. 1987). Οι Coup-TFs είναι εξαιρετικά συντηρημένοι παράγοντες και βρίσκονται τόσο στα πρωτοστόμια όσο και στα δευτεροστόμια (Qiu et al., 1994α; Mlodzik et al., 1990; Wang et al., 1989; Chan et al., 1992; Matharu and Sweeney, 1992; Fjose et al., 1993; Lutz et al. 1994; Qiu et al., 1994b). Tο φυλογενετικό δέντρο που δείχνει τη σχέση των Coup-TFs στους διάφορους οργανισμούς φαίνεται στην εικόνα H εξαιρετικά συντηρημένη μορφή τους υποδηλώνει και την πιθανή κοινή λειτουργία τους, η οποία φαίνεται να είναι ο καθορισμός του νευρικού συστήματος των οργανισμών κατά την ανάπτυξη. 20

37 Εισαγωγή Ο ρόλος των Coup-TFs στους διάφορους οργανισμούς Στη Drosophila το ομόλογο γονίδιο καλείται seven up (svp) και εκφράζεται στο νευρικό σύστημα της προνύμφης. Η πρωτεΐνη που κωδικοποιεί συμβάλλει στον καθορισμό της τύχης των νευρικών κυττάρων των φωτοϋποδοχέων, αλλά και στην τελική διαφοροποίηση των λιπαρών σωματίων και στην ανάπτυξη των Mαλπιγγιανών σωληναρίων (Mlodzik et al., 1990; Hiromi et al., 1993; Hoshizaki et al., 1994; Kerber et al., 1998). Στο Xenopus laevis ανιχνεύονται τρεις πρωτείνες, οι Coup-TF I, II και III. Oι πρωτείνες αυτές εκφράζονται στο κεντρικό νευρικό σύστημα, στον οφθαλμό και σε μερικούς μεσοδερμικούς ιστούς (van der Wees et al., 1996). Στο zebrafish ανιχνεύονται τρία ομόλογα γονίδια τα svp[44], svp[46] και svp[40] και οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούν εκφράζονται τόσο στο νευρικό σύστημα όσο και στο μάτι και σε μεσοδερμικούς ιστούς (Tsai et al., 1997). Στην όρνιθα ο Coup-TFII έχει μεγάλη ομολογία με τον ανθρώπινο Coup-TFII. Φαίνεται ότι η πρωτεΐνη έχει διπλό ρόλο στη ρύθμιση του γονιδίου της ωαλβουμίνης. Παρουσία στεροειδών ορμονών επάγει την έκφραση του γονιδίου, ενώ απουσία αυτών καταστέλλει την έκφρασή του. Έχει βρεθεί επίσης ότι ο Coup-TFII στην όρνιθα εκφράζεται στον αναπτυσσόμενο νωτιαίο μυελό, σε περιοχές που σχηματίζονται οι κινητικοί νευρώνες, υποδηλώνοντας πιθανή συμβολή του στην ανάπτυξη των νευρώνων αυτών ( Lutz et al., 1994; Cooney et al., 2001). Στον ποντικό, ανιχνεύονται επίσης δύο πρωτείνες, οι Coup-TFI και II. O Coup-TFI παίζει σημαντικό ρόλο στη νευρογένεση, στη ρύθμιση της επικοινωνίας μεταξύ των νευριτών και των στρωματικών κυττάρων, καθώς και στη μυελινοποίηση του νευράξονα, στο σχηματισμό του ιπποκάμπου και του IX γαγγλίου, στην ανάπτυξη του έσω ωτός και στο σχηματισμό του εγκεφαλικού φλοιού (Qiu et al., 1997; Park et al., 2003). O Coup-TFII διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στη ρύθμιση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ μεσεγχύματος και ενδοθηλίου κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του εμβρυϊκού αγγειακού συστήματος (Cooney et al., 2001; Qiu et al., 1995) καθώς και στον καθορισμό των επιθηλιακών κυττάρων σε όργανα που παρατηρείται αλληλεπίδραση μεταξύ μεσεγχύματος και επιθηλίου (Tsai et al., 1997). Στον άνθρωπο έχουν βρεθεί δύο γονίδια αντίστοιχα, τα οποία κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες Coup-TFI και II. O ανθρώπινος hcoup-tfi συμβάλλει 21

38 Εισαγωγή στην καταστολή της έκφρασης της ερυθροποιητίνης, γονιδίων του ιού της ηπατίτιδας και του HIV καθώς και στην ανάπτυξη των νευραξόνων (Pereira et al., 2000; Cooney et al., 1991). Στον αχινό η ακριβής λειτουργία του δεν έχει ακόμη εξακριβωθεί. Ωστόσο, σειρές πειραμάτων αναδεικνύουν τον Coup TF ως παράγοντα απαραίτητο για τον καθορισμό του νευρικού συστήματος στο έμβρυο Το γονίδιο Coup-TF Ομόλογα Coup-TF γονίδια έχουν κλωνοποιηθεί και μελετηθεί σε διάφορα είδη από τη Drosophila μέχρι τον άνθρωπο. Στους πίνακες 1.3 και 1.4 αναγράφονται αντίστοιχα τα ποσοστά ομολογίας μεταξύ των Coup-TF πρωτεϊνών του ανθρώπου και άλλων οργανισμών, καθώς και ο αριθμός των ομολόγων Coup-TF γονιδίων που συναντώνται. Tο γονίδιο Coup-TF αποτελείται σε όλους τους μέχρι σήμερα μελετημένους οργανισμούς από τρία εξώνια, τα δύο δε εσώνια διακόπτουν την κωδική περιοχή του γονιδίου σε συντηρημένες θέσεις. Ωστόσο, έχει βρεθεί ότι ο αχινός, όπως και κάποια άλλα Εχινόδερμα, διαφοροποιείται από αυτό το μοντέλο καθώς το γονίδιο αποτελείται από τέσσερα εξώνια (αδημοσίευτα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας). Συγκεκριμένα, έχει βρεθεί ότι το επιπλέον εξώνιο βρίσκεται μεταξύ πρώτου και δεύτερου εξωνίου και έχει μέγεθος 63nt (εικόνα 1.15). 22

39 Εισαγωγή Πίνακας 1.3 Πίνακας 1.4 Οργανισμός Drosophila Sea urchin Strongylocentrotus purpuratus Zebrafish Chicken Mouse Xenopus Rat Hamster Human Ομόλογο του Coup TF seven up (svp) Sp Coup TF svp 44 svp 46 svp 40 Coup-TFII Coup-TFI Coup-TFII xcoup-tf A xcoup-tfιι / Β xcoup-tfiii / A rcoup-tf I hmcoup-tfi hcoup-tfι hcoup-tfιι Στον πίνακα 1.3 φαίνονται τα ποσοστά ομολογίας των Coup-TF πρωτεϊνών διαφόρων οργανισμών στις περιοχές πρόσδεσης στο DNA (DBD) και πρόσδεσης της ορμόνης (LBD). Η σύγκριση γίνεται ως προς την ανθρώπινη πρωτεϊνη. Στον πίνακα 1.4 παρουσιάζεται ο αριθμός των ομολόγων γονιδίων Coup-TFs στους διάφορους οργανισμούς. 23

40 Εισαγωγή H δομή της πρωτεΐνης Coup-TF H πρωτεΐνη Coup-TF, όπως όλα τα μέλη της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων, αποτελείται σε όλους τους οργανισμούς από πέντε περιοχές (επικράτειες) όπως φαίνεται στην εικόνα 1.15: Περιοχή A/ B η οποία αντιστοιχεί στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης. Περιοχή C η οποία αντιστοιχεί στην επικράτεια πρόσδεσης στο DNA. Περιοχή D η οποία αντιστοιχεί στην ενδιάμεση περιοχή. Περιοχή E που αντιστοιχεί στην επικράτεια πρόσδεσης της ορμόνης και τέλος Περιοχή F που αντιστοιχεί στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης. Tο επιπλέον εξώνιο που εντοπίζεται στον αχινό κωδικοποιεί ένα πεπτίδιο μεγέθους 21 αμινοξέων αμέσως μετά την περιοχή πρόσδεσης στο DNA (εικόνα 1.15). Συγκεκριμένα, με εναλλακτικό μάτισμα των πρώϊμων μεταγράφων Εικόνα 1.15: Η δομή του γονιδίου και της πρωτεΐνης Coup-TF στον αχινό P.lividus. Το επιπλέον εξώνιο (ΙΙ) κωδικοποιεί ένα πεπτίδιο 21αα που εντοπίζεται στην C περιοχή και συγκεκριμένα στην καρβοξυτελική επέκταση (CTE) της περιοχής πρόσδεσης στο DNA (DBD). DBD: DNA Binding Domain, CTE: Carboxy Terminal Extension, LBD: Ligand Binding Domain (Ζ.Ζήνωνος master) κωδικοποιούνται δύο πρωτεΐνες, μία μεγάλη που φέρει το επιπλέον εξώνιο και μία μικρή η οποία δεν το περιέχει και ομοιάζει με τις Coup-TF πρωτεΐνες των άλλων οργανισμών. Το εναλλακτικό αυτό μάτισμα συναντάται για πρώτη φόρα στο γονίδιο 24

41 Εισαγωγή Coup-TF του αχινού P.lividus (αδημοσίευτα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας) και δεν έχει περιγραφεί σε κανέναν άλλο οργανισμό μέχρι σήμερα. H πρωτεΐνη Coup-TF είναι εξαιρετικά συντηρημένη μεταξύ των οργανισμών. Έτσι, μεταξύ του ανθρώπινου Coup-TF και του αντίστοιχου στον αχινό Strongylocentrotus purpuratus υπάρχει ταύτιση αμινοξέων κατά 96% και 92% μεταξύ των επικρατειών πρόσδεσης στο DNA και ορμόνης αντίστοιχα (Vlahou et al.1996; Vlahou et al. 2000). Η 5' μη μεταφραζόμενη περιοχή, και οι περιοχές Α/Β και C της πρωτεΐνης αντιστοιχούν στο πρώτο εξώνιο. Η περιοχή C έχει τη χαρακτηριστική μορφή των δύο δακτύλων ψευδαργύρου C 2 C 2 (εικόνα 1.16). Tο δεύτερο και τρίτο εξώνιο στον αχινό, φέρει την πληροφορία για την περιοχή - γέφυρα (D) που βρίσκεται ανάμεσα στην επικράτεια πρόσδεσης στο DNA και στην επικράτεια πρόσδεσης της ορμόνης (Ε) (εικόνα 1.15). Tέλος, το τρίτο (τέταρτο στον αχινό) εξώνιο φέρει την πληροφορία για το υπόλοιπο τμήμα της περιοχής Ε, το καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης καθώς και την 3' μη μεταφραζόμενη περιοχή (εικόνα 1.15) (Ritchie et al., 1990). Εικόνα 1.16 Δύο δάκτυλοι ψευδαργύρου των υποδοχέων στεροειδών ορμονών Mηχανισμοί δράσης του Coup-TF O Coup-TF δρα ως μεταγραφικός παράγοντας καταστέλλοντας συνήθως τα γονίδια στόχους του. Bιοχημικές μελέτες αποδεικνύουν ότι οι Coup-TFs σχηματίζουν διμερή και προσδένονται με μεγάλη συγγένεια στο στοιχείο απόκρισης του Coup-TF που είναι η ευθεία επανάλληψη GTGTCAAAGGTCA. Ωστόσο, έχουν την ικανότητα να προσδένονται και σε άλλες ευθείες επαναλλήψεις του προτύπου ΑGGTCA που απέχουν μεταξύ τους από 0 έως και 12 νουκλεοτίδια (Cooney et al., 1992). Aυτό αποδεικνύει ότι μπορούν να αλλάζουν στερεοδιάταξη ανάλογα με τη μορφή του στοιχείου απόκρισης (Kliewer et al., 1992). Έχουν περιγραφεί πολλοί τρόποι με τους οποίους η πρωτείνη αυτή ασκεί τη δράση της. 25

42 Εισαγωγή Α) Kαταστολέας O Coup-TF ομοδιμερίζεται ή ετεροδιμερίζεται κυρίως με τον RXR και προσδένεται στην ευθέως επαναλαμβανόμενη ή παλλίνδρομη αλληλουχία AGGTCA. Aν και πρωτοπεριγράφηκε ως ενεργοποιητής του γονιδίου της ωαλβουμίνης της όρνιθας, τις περισσότερες φορές δρα καταστέλλοντας τη μεταγραφή γονιδίων που επάγουν άλλοι πυρηνικοί υποδοχείς ορμονών όπως ο υποδοχέας του ρετινοϊκού οξέος RAR, της θυρεοειδούς ορμόνης TR, της βιταμίνης D, VDR, του περοξεισώματος PPAR και του πυρηνικού παράγοντα 4 του ηπατικού κυττάρου HNF4 (Cooney et al., 1992; Ladias et al., 1992; Leng et al., 1996). Έχουν προταθεί τέσσερις μηχανισμοί μέσω των οποίων ο Coup TF ασκεί την κατασταλτική του δράση (εικόνα 1.17) (Park et al., 2003; Cooney et al., 1993): 1) Aνταγωνίζεται τους άλλους μεταγραφικούς παράγοντες της οικογένειας των υποδοχέων στεροειδών ορμονών για την πρόσδεση στο στοιχείο απόκρισής τους. 2) Συναγωνίζεται με τους άλλους υποδοχείς της οικογένειας για τη δημιουργία ετεροδιμερούς με το μεταγραφικό παράγοντα RXR. Έτσι περιορίζει τον ετεροδιμερισμό του RXR με τους άλλους μεταγραφικούς παράγοντες όπως τον TR και ως εκ τούτου και την ενεργοποιητική τους δράση. 3) Προσδένεται στο στοιχείο απόκρισής του και καταστέλλει άμεσα τα γονίδια στόχους μέσω άμεσης ή έμμεσης αλληλεπίδρασης με τους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Πιθανόν, η καταστολή επιτυγχάνεται μέσω του μηχανισμού αποακετυλίωσης των ιστονών. 4) Πραγματοποιεί ετερόπλευρη (trans) καταστολή κατά την οποία δεν προσδένεται άμεσα στο στοιχείο απόκρισης, αλλά παρεμβάλλεται μεταξύ ενός άλλου πυρηνικού ορμονικού υποδοχέα που βρίσκεται προσδεδεμένος στο DNA και των γενικών μεταγραφικών παραγόντων του υποκινητή, καταστέλοντας έτσι την επαγωγή της μεταγραφής. 26

43 Εισαγωγή Ανταγωνισμός για την πρόσδεση στο στοιχείο απόκρισης. Ανταγωνισμός για το διμερισμό με τον RXR. Ενεργός καταστολή. Ετερόπλευρη καταστολή. Εικόνα 1.17 Μοριακοί μηχανισμοί κατασταλτικής δράσης του Coup-TF. B) Eνεργοποιητής Σπανιότερα, οι Coup-TFs δρουν και ως ενεργοποιητές της μεταγραφής. Για τη δράση τους αυτή έχουν περιγραφεί τρεις μηχανισμοί (εικόνα 1.18) (Park et al., 2003) : 1) Προσδένονται άμεσα στο στοιχείο απόκρισης (π.χ. DR4) και ενεργοποιούν τη μεταγραφή. Mε αυτόν τον τρόπο δρα ο Coup-TFII επάγοντας τη μεταγραφή του γονιδίου CYP7A. 27

44 Εισαγωγή 2) Προσδένονται σε ένα ρυθμιστικό στοιχείο και έμμεσα μέσω άλλων μεταγραφικών παραγόντων (π.χ. HNF4) επηρεάζουν τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων τους (π.χ. PEPCK). 3) Eπάγουν τη μεταγραφή ενός γονιδίου π.χ. NGFI-A, μέσω αλληλεπίδρασης αφενός με άλλον μεταγραφικό παράγοντα όπως τον Sp1 ο οποίος προσδένεται στο στοιχείο απόκρισής του στο DNA, αφετέρου με το γενικό μεταγραφικό παράγοντα TFIIB (Ing et al., 1992). H επαγωγή της μεταγραφής των γονιδίων στόχων συχνά επιτυγχάνεται μέσω αλληλεπίδρασης του Coup-TF με άλλους συνενεργοποιητές. H αλληλεπίδραση πραγματοποιείται στην καρβοξυτελική περιοχή της πρωτείνης Coup-TF και Εικόνα 1.18 Μοριακοί μηχανισμοί δράσης του Coup-TF με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των γονιδίων-στόχων. 1: Άμεση ενεργοποίηση μέσω πρόσδεσής του στο στοιχείο απόκρισης 2: Έμμεση ενεργοποίηση μέσω δράσης του ως βοηθητικού παράγοντα 3: Ενεργοποίηση μέσω αλληλεπίδρασης του με πρωτείνη που προσδένεται στο DNA. Pipaon et al συγκεκριμένα στην επικράτεια πρόσδεσης της ορμόνης (Pipaon et al., 1999). 28

45 Εισαγωγή Ο Coup-TF στον αχινό Tο γονίδιο COUP-TF στο είδος Strongylocentrotus purpuratus Ομόλογο της οικογένειας των γονιδίων Coup-TFs είναι το γονίδιο SpCoup-TF, που έχει απομονωθεί από το είδος του αχινού Strongylocentrotus purpuratus. Το γονίδιο αυτό εμφανίζει μεγάλη ομοιότητα αλληλουχίας με τα γονίδια Coup-TF άλλων ασπόνδυλων και σπονδυλωτών. Έτσι, μεταξύ του ανθρώπινου Coup-TFI και του SpCoup-TF το 96% των αμινοξέων τους που αντιστοιχεί στην επικράτεια πρόσδεσης στο DNA (DBD) είναι κοινό, καθώς και το 92% των αμινοξέων της περιοχής πρόσδεσης της ορμόνης (LBD) (Chan et al., 1992). Το γονίδιο SpCoup-TF εκφράζεται κατά τη διάρκεια της ωογένεσης και τα μετάγραφά του παραμένουν στο ωάριο ως μητρικό mrna. Όπως φαίνεται στην εικόνα 1.19 το μητρικό mrna εντοπίζεται στη μια πλευρά του ωοκυττάρου προς την περιοχή του φλοιού. Το ίδιο συμβαίνει και στο αυγό δηλαδή η συγκέντρωση του mrna εστιάζεται προς τη μία πλευρά του κυττάρου (εικόνα 1.19 Α και Β) (Vlahou et al., 1996). Εικόνα 1.19 Ανίχνευση του μητρικού SpCoup-TF mrna (A) στο ωοκύτταρο και (Β) στο ώριμο ωάριο με in situ υβριδοποίηση (Vlahou et al. 1996). Κατά την αυλάκωση και ξεκινώντας από το στάδιο των δύο κυττάρων, το SpCoup-TF mrna συγκεντρώνεται κυρίως στο ένα από τα δύο βλαστομερίδια και σε γωνία 90 0 ως προς το επίπεδο αυλάκωσης (εικόνα 1.20 G). Κατά τη δεύτερη αυλάκωση το mrna ανιχνεύεται σε δύο από τα τέσσερα βλαστομερίδια (εικόνα 1.20 H). Μετά από δύο ακόμη διαιρέσεις το έμβρυο βρίσκεται στο στάδιο των 16 29

46 Εισαγωγή κυττάρων και το mrna ανιχνεύεται σε 4 από τα 8 μεσομερίδια, σε 2 από τα 4 μακρομερίδια, ενώ ανιχνεύεται λιγότερο στα μικρομερίδια (εικόνα 1.20 J). Όπως φαίνεται στην (εικόνα 1.20 A-E) στο είδος Lytechinus variegatus το Coup- TF mrna εντοπίζεται σε διαφορετικά σημεία, σχετικά με τα επίπεδα αυλάκωσης από ότι το Coup-TF mrna του S.purpuratus. Συγκεκριμένα, στο στάδιο των δύο βλαστομεριδίων, η μεγαλύτερη συγκέντρωση του Coup-TF mrna ανιχνεύεται στο ένα από τα 2 κύτταρα σε γωνία 45 0 ως προς το επίπεδο αυλάκωσης (εικόνα 1.20 B). Μετά τη δεύτερη αυλάκωση, μεγάλη ποσότητα mrna ανιχνεύεται στο ένα από τα τέσσερα βλαστομερίδια, με μικρότερο ποσοστό να ανιχνεύεται στα δύο γειτονικά του (εικόνα 1.20 C). Στα δύο αυτά είδη η θέση του στοματικού\αντιστοματικού άξονα του εμβρύου διαφέρει ως προς το πρώτο επίπεδο αυλάκωσης κατά O εντοπισμός του Coup-TF mrna στα έμβρυα των δύο αυτών ειδών αχινού δείχνει ότι είναι πολύ πιθανό να είναι συνδεδεμένος με την κατεύθυνση που έχει ο στοματικός / αντιστοματικός άξονας του εμβρύου στο στάδιο των δύο κυττάρων (Vlachou et al., 1996). Εικόνα 1.20 Ανίχνευση του Coup-TF mrna σε πρώϊμα αναπτυξιακά στάδια στα είδη Lytechinus variegatus Α-Ε και Strongylocentrotus purpuratus F-J με in situ υβριδοποίηση. Μελετήθηκαν τα στάδια: i) Γονιμοποιημένου αυγού:a, F ii) 2 κυττάρων B, G iii) 4 κυττάρων C, H iv) 8 κυττάρων D, I και v) 16 κυττάρων E, J. (Vlahou et al., 1996) 30

47 Εισαγωγή Στο στάδιο του βλαστιδίου, το SpCoup-TF mrna εντοπίζεται αποκλειστικά στο εξώδερμα, στη μια πλευρά του τοιχώματος του βλαστόκοιλου, την υποτιθέμενη στοματική περιοχή (εικόνα 1.21 A). Στο στάδιο αυτό το ανιχνεύσιμο mrna είναι πιθανόν λιγότερο μητρικό και περισσότερο ζυγωτικό. Από το στάδιο του γαστριδίου και μετά όλα τα μετάγραφα του γονιδίου Coup-TF θεωρούνται ζυγωτικής προέλευσης και ανιχνεύονται στo στοματικό εξώδερμα (εικόνα 1.21 B). Στο στάδιο του πλουτέα, το SpCoup-TF mrna εντοπίζεται καθαρά στα κύτταρα του στοματικού εξωδέρματος που σχηματίζουν τη βλεφαριδωτή ζώνη (που είναι το προϊόν των κυτταρικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των απογόνων των βλαστομεριδίων στο στοματικό και αντιστοματικό εξώδερμα) και στην έδρα (εικόνα 1.21 C και F) (Vlachou et al. 1996). Εικόνα 1.21 Α C: Ανίχνευση με in situ υβριδοποίηση του SpCoup-TF mrna στα εμβρυικά αναπτυξιακά στάδια: A: Bλαστίδιο, B: Γαστρίδιο, C: πλουτέας. Στις εικόνες D, E έχει πραγματοποιηθεί in situ υβριδοποίηση με γονίδια ελέγχου (controls). Συγκεκριμένα, D: SpecI, γονίδιο χαρακτηριστικό για το αντιστοματικό εξώδερμα, Ε: SpCoup-TF νοηματικός ανιχνευτής (Vlahou et al. 1996).F: Ανίχνευση με in situ υβριδοποίηση του LvCoup-TF mrna στον πλουτέα. Στις εικόνες G, H έχει πραγματοποιηθεί in situ υβριδοποίηση με γονίδια ελέγχου (controls). Συγκεκριμένα, G: LpN1.2 γονίδιο χαρακτηριστικό για το ενδόδερμα (έντερο), Η: SpCoup-TF νοηματικός ιχνηθέτης (Vlahou et al. 1996) 31

48 Εισαγωγή Μελέτες που αφορούν τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της πρωτεΐνης σε πρώϊμα εμβρυϊκά στάδια, απέδειξαν ότι η μητρική πρωτεΐνη ανιχνεύεται στο κυτταρόπλασμα και στον πυρηνίσκο του ωοκυττάρου και στο κυτταρόπλασμα μόνο, στο ώριμο αγονιμοποίητο αυγό (εικόνα 1.22 A, B). Μετά τη γονιμοποίηση το μεγαλύτερο μέρος της πρωτεΐνης μεταναστεύει από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Στο στάδιο των δύο κυττάρων και κατά τη μεσόφαση, η πρωτεΐνη Coup-TF ανιχνεύεται στην περιφέρεια του εμβρυϊκού πυρήνα (εικόνα 1.22 C), όπου και παραμένει και σε επόμενα αναπτυξιακά στάδια με ένα μικρό ποσοστό της να ανιχνεύεται και στο κυτταρόπλασμα (εικόνα 1.22 D, E) (Vlahou et al., 2000). Εικόνα 1.22 Ανίχνευση του Coup-TF με ανοσοφθορισμό χρησιμοποιώντας το ειδικό αντίσωμα L έναντι της LBD σε A) ωοκύτταρα, B) αυγά και βλαστομερίδια που βρίσκονται στη μεσόφαση σε έμβρυα C) 2 κυττάρων D) 4 κυττάρων και Ε) 60 κυττάρων. F: Επιφθορισμός σε έμβρυο 16 κυττάρων με ταυτόχρονη χρήση αντισώματος L (a) και Hoechst (b) χρωστικής ειδικής για την ανίχνευση του DNA.(Vlahou et al. 2000). Εικόνα 1.23 Ανίχνευση του Coup-TF με ανοσοφθορισμό χρησιμοποιώντας το αντίσωμα L σε πρώιμα εμβρυϊκά κύτταρα που βρίσκονται στο στάδιο της μίτωσης. Στάδιο Α) 4 κυττάρων Β) 8 κυττάρων C) 16 κυτάρων D) 32 κυττάρων E) 60 κυττάρων F) 16 κυττάρων με αντίσωμα D (έναντι της NH 2 περιοχής (Vlahou et al. 2000). 32

49 Εισαγωγή Κατά τη μιτωτική διαίρεση η πρωτεΐνη Coup-TF βρίσκεται συνδεδεμένη με τη συμπυκνωμένη χρωματίνη. Όπως φαίνεται και στην εικόνα 1.23 A-C, στο στάδιο των 4, 8 και 16 κυττάρων αντίστοιχα ο Coup-TF ανιχνεύεται στα χρωμοσώματα. Στο στάδιο των 16 κυττάρων όμως, τα μικρομερίδια βρίσκονται ακόμη στη φάση της μεσόφασης, οπότε ο Coup-TF ανιχνεύεται στην περιφέρεια του πυρήνα σε αυτά (εικόνα 1.23 C). Όταν και τα μικρομερίδια ξεκινούν τη μίτωση, όπως συμβαίνει στο επόμενο αναπτυξιακό στάδιο των 32 κυττάρων, ο SpCoup-TF ανιχνεύεται πλέον στα συμπυκνωμένα χρωμοσώματα (εικόνα 1.23 D). Στο στάδιο των 60 κυττάρων, ανιχνεύεται σε κάποια κύτταρα στην πυρηνική περιφέρεια ενώ σε άλλα στη συμπυκνωμένη χρωματίνη (εικόνα 1.23 E) (Vlahou et al. 2000). Άρα η πρωτεΐνη Coup-TF πηγαινοέρχεται μεταξύ της πυρηνικής περιφέρειας και των χρωμοσωμάτων κατά τον κυτταρικό κύκλο. Στο στάδιο της λάρβας (12 ημερών) ο Coup-TF ανιχνεύεται σε έναν περιορισμένο αριθμό κυττάρων στη βάση και στην κορυφή των προσθιοπλάγιων και οπίσθιων στοματικών βραχιόνων (εικόνα 1.24 A βέλος, Β και D κεφαλή βέλους). Εικόνα 1.24 Ανίχνευση του Coup-TF στα νευρικά κύτταρα λάρβας S.purpuratus 12 ημερών. Φωτογραφίες από συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού με χρήση των αντισωμάτων L (A C), το οποίο αναγνωρίζει την επικράτεια πρόσδεσης της ορμόνης και N (D), το οποίο αναγνωρίζει την ΝΗ 2 -τελική περιοχή του COUP-TF. Vlahou and Flytzanis (αδημοσίευτα αποτελέσματα) 33

50 Εισαγωγή Eπιπλέον, ανιχνεύεται και σε κύτταρα της βλεφαριδωτής ζώνης στο περίγραμμα της στοματικής επιφάνειας μεταξύ των βραχιόνων (εικόνα 1.24 B, C βέλη) καθώς και στις αναπτυσσόμενες επωμίδες (εικόνα 1.24 D, βέλος). Φαίνεται μάλιστα ότι τα κύτταρα στα οποία εκφράζεται ο Coup-TF αντιστοιχούν σε σεροτονινεργικούς νευρώνες στο στάδιο των 12 ημερών και σεροτονινεργικούς και GABAεργικούς νευρώνες στο στάδιο των 28 έως 35 ημερών (Vlahou και Flytzanis αδημοσίευτα αποτελέσματα). Ο μεταγραφικός παράγοντας SpCoup-TF εντοπίστηκε σε πυρηνικό εκχύλισμα εμβρύων αχινού και φάνηκε ότι σχημάτιζε in vitro ειδικά σύμπλοκα με ένα στοιχείο απόκρισης ορμονών. Αυτό το στοιχείο βρέθηκε στη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου της ακτίνης CyIIIb και ονομάζεται C1R. Το γονίδιο CyIIIb κωδικοποιεί μια ακτίνη κυτταροσκελετικού τύπου η οποία εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα. Η συσσώρευση του CyIIIb mrna ρυθμίζεται στο επίπεδο της μεταγραφής και πρωτοπαρατηρείται 10 ώρες μετά τη γονιμοποίηση, και αυξάνει μέχρι το στάδιο του πλουτέα (Flytzanis et al., 1989). Το γονίδιο της ακτίνης, CyIIIb, εκφράζεται αποκλειστικά στο αντιστοματικό εξώδερμα (Flytzanis et al., 1989). Παλαιότερες μελέτες προτείνουν ότι στο αναπτυσσόμενο έμβρυο αχινού, ο SpCoup-TF προσδένεται στην ευθεία επανάλληψη AGGTCA της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου CyIIIb και καταστέλλει την έκφρασή του στο στοματικό εξώδερμα (Xu et al., 1996) H ρύθμιση του γονιδίου Coup-TF Aν και υπάρχουν πολλές πληροφορίες για το γονίδιο Coup-TF και το ρόλο της πρωτεΐνης ως μεταγραφικού παράγοντα, ωστόσο λίγα είναι γνωστά για τη ρύθμισή του. Mέχρι στιγμής έχουν περιγραφεί τρία μόρια τα οποία επηρεάζουν τη ρύθμιση του γονιδίου αυτού στα θηλαστικά: α) το Sonic Hedgehog, β) οι μεταγραφικοί παράγοντες Ets και γ) το ρετινοϊκό οξύ. O παράγοντας Sonic Hedgehog (Shh) είναι μία πρωτεΐνη η οποία εκκρίνεται από τη νωτοχορδή και απαιτείται για την επαγωγή της υποβλάστης, των κινητικών νευρώνων και άλλων κεντρικών δομών κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη 34

51 Εισαγωγή (Roelink et al., 1994; Chiang et al., 1996). Στον υποκινητή του Coup-TFII στον ποντικό έχει βρεθεί ένα στοιχείο απόκρισης για έναν μεταγραφικό παράγοντα (διαφορετικός από τον Gli ο οποίος είναι γνωστός επαγωγέας γονιδίων στόχων που επηρεάζονται από το Shh) ο οποίος όμως ανήκει και αυτός στο σηματοδοτικό μονοπάτι του Sonic Hedgehog. Φαίνεται ότι το Sonic Hedgehog επάγει τη μεταγωγή σήματος η οποία καταλήγει στην αποφωσφορυλίωση ενός μεταγραφικού παράγοντα απαραίτητου για την ενεργοποίηση του Coup-TFII (Krishnan et al., 1997a; Krishnan et al. 1997b). Oι παράγοντες Ets συγκροτούν μία μεγάλη ομάδα μεταγραφικών παραγόντων και όλοι φέρουν την ίδια περιοχή (περιοχή Ets) με την οποία προσδένονται στο στοιχείο απόκρισης (Wasylyk et al. 1993). Συγκεκριμένα προσδένονται ως μονομερή στην αλληλουχία GGAA/T και ενεργοποιούν τη μεταγραφή των γονιδίων που φέρουν αυτό το στοιχείο απόκρισης. Πολλοί από τους παράγοντες, όπως ο Ets-1 και 2 αλληλεπιδρούν με άλλους συνενεργοποιητές και επάγουν τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων (Wasylyk et al. 1990). Φαίνεται ότι ο παράγοντας Ets-1 επάγοντας μια πληθώρα συνενεργοποιητών αλλά και άλλοι Ets παράγοντες, όπως οι Ets-2, Spi-1, ETV-1 και λιγότερο οι ERM και PEA 3, επάγουν τη μεταγραφή του Coup-TFI στον ποντικό. Άλλωστε, τόσο ο παράγοντας Coup-TF όσο και οι παράγοντες Ets ανιχνεύονται στα ίδια κύτταρα. Mάλιστα, έχει βρεθεί μια ομάδα στοιχείων απόκρισης των Ets παραγόντων στον υποκινητή του Coup-TFI (Salas et al., 2002). Σε μελέτες που έχουν γίνει στον αχινό έχει διαπιστωθεί ότι ο παράγοντας Ets1 δρα ως επαγωγέας για την έκφραση γονιδίων των σκελετογόνων μεσεγχυματικών κυττάρων. Ένα τέτοιο γονίδιο είναι και το Sp-cyp1 το οποίο εκφράζεται στα σκελετογόνα μεσεγχυματικά κύτταρα μόνο παρουσία του παράγοντα Ets1 (Amore and Davidson, 2006). Επιπλέον, η παρουσία του ρετινοϊκού οξέος φαίνεται να επηρεάζει τη μεταγραφή του γονιδίου Coup-TF και μάλιστα να την επάγει. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε in vitro επαγωγή της μεταγραφής των γονιδίων Coup-TFI και Coup- TFII μετά από προσθήκη ρετινοϊδών σε καρκινικά εμβρυϊκά κύτταρα P19 (Qiu et al., 1996). 35

52 Εισαγωγή Επιλογή του Coup-TF ως γονίδιο μελέτης Το γονίδιο Coup-TF έχει προσεγγίσει το ερευνητικό ενδιαφέρον πολλών εργαστηρίων ανά τον κόσμο όπου μελετάται τόσο ο ρόλος της πρωτεΐνης που κωδικοποιεί όσο και η ρύθμισή του. Ειδικά στον αχινό η μελέτη του είναι εξαιρετικής σημασίας όπως αποδεικνύεται από τους κάτωθι λόγους: 1) Συμμετέχει στον καθορισμό του νευρικού συστήματος του αχινού. Το μέχρι σήμερα γνωστό γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο που συμμετέχει στον καθορισμό της βλεφαριδωτής ζώνης (μελλοντικό νευρικό σύστημα), είναι ημιτελές. Επομένως, η μελέτη ενός γονιδίου που εμπλέκεται σε αυτό θα βοηθήσει στην προσπάθεια ολοκλήρωσής του. 2) Εντοπίζεται στο στοματικό εξώδερμα σε πρώϊμα αναπτυξιακά στάδια. Η μεγάλη σημασία του ρόλου του στοματικού εξωδέρματος στον καθορισμό της αναπτυξιακής τύχης των κυττάρων και των τριών βλαστικών δερμάτων συνεπάγεται και τη μεγάλη σημασία που έχει η μελέτη και κατανόηση των γονιδίων που συμμετέχουν σε αυτό. 3) Ενώ υπάρχουν πολλές πληροφορίες για τον Coup-TF σε πολλούς οργανισμούς, στον αχινό ελάχιστα είναι γνωστά για τον παράγοντα αυτόν. Μάλιστα για τη ρύθμισή του τίποτα δεν είναι μέχρι σήμερα γνωστό. 4) Πέρα από το σπουδαίο ρόλο που έχει στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος στον αχινό φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο και στην αναπτυξιακή τύχη και των υπολοίπων κυτταρικών γραμμών. Πειράματα με αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια (morpholinos) έναντι του Coup-TF mrna κατέστειλαν την ανάπτυξη του εντέρου, των σκελετικών στοιχείων και οδήγησαν στη διακοπή της ανάπτυξης στο στάδιο του γαστριδίου (αδημοσίευτα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας). 36

53 Εισαγωγή 1.3 Ο ρόλος των γονιδιακών ρυθμιστικών δικτύων (GRN) στην εμβρυϊκή ανάπτυξη Ο καθορισμός της αναπτυξιακής τύχης των εμβρυϊκών κυττάρων και η περαιτέρω μορφοποίηση των εμβρύων επιτυγχάνεται με τη συντονισμένη δράση δεκάδων ή εκατοντάδων γονιδίων και όχι μερικών μόνο κυρίαρχων για τον εκάστοτε ιστό. Η όλη διαδικασία επιτυγχάνεται με ένα μηχανισμό ο οποίος βασίζεται στην ιστοειδική έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες ειδικούς ως προς τον ιστό και το χρόνο εμφάνισής τους στο έμβρυο. Οι μεταγραφικοί αυτοί παράγοντες αναγνωρίζουν στοιχεία απόκρισης στο DNA τα οποία συνήθως απαντώνται σε ομάδες και αποτελούν τις μονάδες ελέγχου της μεταγραφής των γονιδίων στόχων και κατά συνέπεια της αναπτυξιακής τύχης του εμβρύου. Συνήθως δρουν ως ενισχυτές της μεταγραφής των γονιδίων στόχων αν και κάποιοι από τους παράγοντες έχουν κατασταλτικό ή αποσιωπητικό ρόλο. Το σύνολο των ρυθμιστικών αυτών αληλουχιών αναφέρεται ως cis ρυθμιστική μονάδα. Κάθε cis ρυθμιστική μονάδα είναι συνήθως 300bp ή μεγαλύτερη και περιέχει 10 ή περισσότερα στοιχεία απόκρισης τα οποία αναγνωρίζονται από τουλάχιστον τέσσερις μεταγραφικούς παράγοντες (Small S. et al., 1992; Davidson E., 2001). Στην ουσία κάθε ρυθμιστική μονάδα είναι υπεύθυνη για ένα συγκεκριμένο ιστοειδικό και χρονοειδικό γονιδιακό πρότυπο έκφρασης και ως εκ τούτου πολλαπλές ρυθμιστικές μονάδες ευθύνονται για πιο περίπλοκα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης. Κάθε ρυθμιστική μονάδα ελέγχεται από συγκεκριμένους μεταγραφικούς παράγοντες. Ωστόσο, πολλοί από αυτούς τους παράγοντες ρυθμίζουν και άλλες μονάδες. Έτσι, τα αναπτυξιακά πρότυπα έκφρασης των γονιδίων αναπαρίστανται ως ένα αλληλοεπικαλυπτόμενο γονιδιακό δίκτυο, το οποίο είναι υπεύθυνο για την κυτταρική διαφοροποίηση (Levine M. et al. 2005). Τα γονιδιακά ρυθμιστικά δίκτυα μπορούν να παρομοιαστούν με χάρτες στους οποίους αναγράφεται με λεπτομέρεια ο τρόπος με τον οποίον επηρεάζεται κάθε ρυθμιστική μονάδα από διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες. Έτσι, γίνεται αντιληπτός ο μηχανισμός ενεργοποίησης ή καταστολής των γονιδίων, η ιστοειδική και χρονοειδική τους έκφραση και ως εκ τούτου ο τρόπος με τον οποίο ρυθμίζεται η αναπτυξιακή διαδικασία. Τα τελευταία χρόνια έχει μελετηθεί μια πληθώρα 37

54 Εισαγωγή γονιδιακών ρυθμιστικών δικτύων σε διάφορους οργανισμούς (Christiaen L. et al., 2008; Imai KS et al., 2006; Levine M. et al., 2005) και έχει έτσι αποκωδικοποιηθεί σε μεγάλο βαθμό η διαδικασία της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Η προσπάθεια κατανόησης των δικτύων αυτών οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι ένα ρυθμιστικό δίκτυο απαρτίζεται από υποδίκτυα και ότι το κάθε υποδίκτυο απαρτίζεται από συγκεκριμένη ομάδα γονιδίων (Davidson E. et al. 2006): 1) Υποδίκτυο με γονίδια που αποτελούν τον πυρήνα των ρυθμιστικών δικτύων. Πρόκειται για γονίδια που κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες, άρα είναι ρυθμιστικά και συμμετέχουν στη διαφοροποίηση των τμημάτων του σώματος του οργανισμού. Μεταξύ τους σχηματίζονται πολλές αλληλεπιδράσεις. Χαρακτηριστικό είναι το υποδίκτυο που είναι υπεύθυνο για τον καθορισμό του ενδοδέρματος στον αχινό καθώς και αυτά που ευθύνονται για τον καθορισμό του προσθιοπίσθιου και πλευρικού άξονα, του νευρικού συστήματος και του ανοσοποιητικού. Αναστολή της έκφρασης ενός από αυτά τα γονίδια είναι καταστροφική για την τμηματοποίηση του οργανισμού. 2) Υποδίκτυο με συστήματα μεταγωγής σημάτων τα οποία αλληλεπιδρούν με διάφορα άλλα υποδίκτυα. Περιλαμβάνονται υποδοχείς στους οποίους προσδένονται αυξητικές ορμόνες και δρουν ως ενεργοποιητές παρουσία της ορμόνης και ως καταστολείς απουσία αυτής. Χαρακτηριστικά παραδείγματα είναι το σινιάλο Wnt, ο TGF-β, ο FGF, το hedgehog, το Notch και ο EGF. 3) Υποδίκτυο με παράγοντες διακόπτες που επιτρέπουν ή όχι στο κάθε υποδίκτυο να λειτουργήσει στις εκάστοτε συνθήκες ανάπτυξης και 4) Υποδίκτυο με γονίδια ενδεικτικά τελικής διαφοροποίησης, τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες υπεύθυνες για τη λειτουργία του κάθε κυτταρικού τύπου. Τα προϊόντα τους είναι τελικά και δεν επηρεάζουν άλλα γονίδια. Τέτοια είναι οι πρωτεΐνες που σχηματίζουν το μυϊκό σύστημα, την επιδερμίδα και τα μεταγωγά συστήματα των νευρικών συνάψεων Τα γονιδιακά ρυθμιστικά δίκτυα που συμμετέχουν στην εμβρυϊκή ανάπτυξη του αχινού Στα περισσότερα είδη αχινών η τελική μορφή του ενήλικου ατόμου σχηματίζεται αργά κατά την ανάπτυξη αφ ότου η λάρβα ξεκινήσει να τρέφεται. 38

55 Εισαγωγή Επομένως, η διαδικασία της εμβρυογένεσης απαιτεί την παρουσία ενός γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου, οργανωμένου κατά τέτοιο τρόπο ώστε να εγκαθιστά τα διαφοροποιημένα κύτταρα στη σωστή τους θέση όσο πιο άμεσα γίνεται. Η ανάπτυξη ξεκινά με ένα στερεότυπο πρότυπο αυλακώσεων. Σε απάντηση ενός πλήθους διακυτταρικών μηνυμάτων που λαμβάνουν χώρα στο στάδιο μεταξύ κυττάρων, οι κυτταρικές γραμμές από τις οποίες θα προκύψουν το έντερο, τα σκελετικά στοιχεία και τα λοιπά μεσοδερμικά κύτταρα έχουν μακράν διαφοροποιηθεί από τις υπόλοιπες κυτταρικές γραμμές από τις οποίες θα προκύψει το εξώδερμα της λάρβας (Levine M. et al. 2005). Για πολλά χρόνια το ενδιαφέρον των ερευνητών ήταν στραμμένο στην ανακάλυψη του γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου που συμμετέχει στον καθορισμό του ενδομεσοδέρματος δηλαδή του άξονα κατά μήκος του ζωϊκού/φυτικού πόλου στο έμβρυο του αχινού ενώ ελάχιστα ήταν γνωστά για τα γονίδια που καθορίζουν τη διαφοροποίηση του εξωδέρματος και τη μορφογένεση του εμβρύου κατά μήκος του στοματικού (κοιλιακού)/αντιστοματικού (ραχιαίου) άξονα. Τελευταία ωστόσο, έχουν πραγματοποιηθεί σημαντικές έρευνες στον τομέα αυτό με αποτέλεσμα τα ρυθμιστικά δίκτυα των γονιδίων που συμμετέχουν στον καθορισμό και των τριών κυτταρικών στοιβάδων του εμβρύου του αχινού (εξώδερμα, ενδόδερμα, μεσόδερμα) να έχουν μελετηθεί εκτενέστερα. Η κατανόηση του γονιδιακού δικτύου που καθορίζει το ενδομεσόδερμα έχει βασιστεί κατά κύριο λόγο σε πειράματα στον αχινό S.purpuratus ενώ του δικτύου για τον καθορισμό του εξωδέρματος στον P.lividus. 39

56 Εισαγωγή Ο καθορισμός του εξωδέρματος στο έμβρυο του αχινού Το έμβρυο του αχινού χαρακτηρίζεται από την παρουσία δύο αξόνων, του στοματικού/αντιστοματικού και του άξονα κατά μήκος του ζωϊκού/φυτικού πόλου (εικόνα 1.25). Μόνο ο δεύτερος άξονας καθορίζεται μητρικά. Ο καθορισμός του εξωδέρματος στο έμβρυο του αχινού είναι πολύ λιγότερο μελετημένος συγκριτικά με του ενδομεσοδέρματος. Σε αντίθεση με τον αυτόνομο καθορισμό της πολικότητας του ενδομεσοδέρματος η αντίστοιχη πολικότητα του στοματικού/αντιστοματικού άξονα επιτυγχάνεται σταδιακά. Η πολικότητα αυτή πρωτοανιχνεύεται από τη δεύτερη κιόλας αυλάκωση (Cameron et al., 1990) και παγιώνεται μέχρι το στάδιο του βλαστιδίου. Η πιο πρώϊμη εμφάνιση διαφορετικότητας στην έκφραση των γονιδίων κατά μήκος αυτού του άξονα, εντοπίζεται στο στάδιο του εκκολαπτόμενου βλαστιδίου, ενώ μορφολογική διαφορετικότητα, στο στάδιο του γαστριδίου. Η σταθερότητα της πολικότητας κατά μήκος του στοματικού/αντιστοματικού άξονα βασίζεται στη σωστή ανάπτυξη των κυττάρων κατά μήκος του φυτικού/ζωϊκού πόλου. Η σύνδεση αυτή μεταξύ των δύο αξόνων σχετίζεται αναμφίβολα με τα σινιάλα που ξεκινούν από το φυτικό πόλο μέσω του Wnt μονοπατιού. Εικόνα 1.25 Χάρτης αναπτυξιακής τύχης διαφόρων περιοχών στο είδος S.purpuratus κατά το αναπτυξιακό στάδιο του βλαστιδίου (400 κύτταρα).no: Περιοχή στοματικού εξωδέρματος, N1: Περιοχή βλεφαριδωτής ζώνης, Na: Περιοχή αντιστοματικού εξωδέρματος. Cameron and Davidson, 1991 Κατά μήκος του ζωϊκού/φυτικού πόλου παρατηρείται σταδιακή αύξηση της συγκέντρωσης της β-κατενίνης. Η β-κατενίνη είναι λειτουργική όταν βρίσκεται στον πυρήνα και αφενός καθορίζει τη διαφοροποίηση των μικρομεριδίων, αφετέρου ευθύνεται για τη γέννηση ενός μηχανισμού σηματοδότησης που ξεκινά από το φυτικό πόλο και στοχεύει στον καθορισμό των βλαστομεριδίων προς την αναπτυξιακή τύχη κυττάρων του φυτικού πόλου. Από την άλλη, μεταγραφικοί παράγοντες, ζυγωτικής προέλευσης, που προέχρονται από το ζωϊκό πόλο (ATF: Animalizing Transcription 40

57 Εισαγωγή Factors), με σκοπό τον καθορισμό των βλαστομεριδίων προς την πλευρά του ζωϊκού πόλου, ανταγωνίζονται τη δράση της β-κατενίνης. Οι παράγοντες αυτοί καταστέλλονται από τη β-κατενίνη στην περιοχή του φυτικού πόλου. Τα κύτταρα αυτά θα διαφοροποιηθούν αργότερα προς ενδόδερμα και δευτερογενή μεσεγχυματικά (Angerer L and Angerer 2000). H πυρηνική β-κατενίνη είναι επίσης απαραίτητη για τη διαφοροποίηση του εξωδέρματος κατά μήκος του ζωϊκού/φυτικού άξονα (Wikramanayake and Klein, 1997) ενεργοποιώντας τουλάχιστον έναν καταστολέα που απατείται για τη μετατροπή του αντιστοματικού εξωδέρματος σε στοματικό (Angerer et al. 2001). H δράση της β-κατενίνης αναστέλλεται στο ζωϊκό πόλο λόγω της παρουσίας ενός παράγοντα που την απομακρύνει από τον πυρήνα των κυττάρων καθιστώντας την έτσι μη λειτουργική. Αρχικά, η πολικότητα του εμβρύου κατά μήκος του στοματικού/αντιστοματικού άξονα ερμηνεύτηκε ως αποτέλεσμα της διαφορετικής συγκέντρωσης των μιτοχονδρίων (και άρα και των ριζών Ο - ) στο αυγό, με την περιοχή που περιέχει τα περισσότερα μιτοχόνδρια να αποτελεί το μελοντικό στοματικό εξώδερμα (Coffman et al. 2004). Αργότερα φάνηκε ότι o καθορισμός του στοματικού εξωδέρματος απαιτεί την ενεργοποίηση του γονιδίου nodal από την 6 η αυλάκωση (Duboc et al. 2004). Στην πορεία, βρέθηκαν και άλλα γονίδια καθοδικά του nodal όπως τα bmp2/4, lefty, bra και gsc. Ο κύκλος των υποθέσεων έκλεισε όταν ανακαλύφθηκε ότι η ενεργοποίηση του nodal βασίζεται σε έναν μεταγραφικό παράγοντα τύπου b-zip (βασικό-φερμουάρ λευκίνης), ο οποίος επηρεάζεται από την παρουσία ριζών Ο - (Nam et al. 2007). Η αρχή της μελέτης των γονιδίων που συμμετέχουν στον καθορισμό του εξωδέρματος έγινε μετά το χαρακτηρισμό των TGFb παραγόντων Nodal, Univin και BMP2/4 ως παράγοντες κλειδιά στον καθορισμό του (Duboc V. et al., 2008; Duboc V. et al., 2004; Range R. et al., 2007; Angerer LM. et al., 2000). To εξώδερμα είναι διαμερισματοποιημένο σε τρεις περιοχές κατά μήκος του στοματικού/αντιστοματικού άξονα, στο στοματικό εξώδερμα, στο αντιστοματικό εξώδερμα και στη βλεφαριδωτή ζώνη (εικόνα 1.25). Το γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο που συμμετέχει στον καθορισμό του εξωδέρματος δεν έχει ακόμη ολοκληρωθεί. Ωστόσο, ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων έχει μέχρι σήμερα βρεθεί και η ιεραρχία τους στο ρυθμιστικό δίκτυο του εξωδέρματος φαίνεται στην εικόνα

58 Εισαγωγή Η σηματοδότηση για τον καθορισμό του στοματικού εξωδέρματος ξεκινά από τα κύτταρα του ζωϊκού πόλου που φέρουν τη μεγαλύτερη συγκέντρωση ριζών Ο - (λόγω της ύπαρξης μιτοχονδρίων) και αποτελούν το μελλοντικό στοματικό εξώδερμα. Εκεί ενεργοποιείται η κινάση p38 που με τη σειρά της ενεργοποιεί την έκφραση του nodal. Το σινιάλο Nodal προσλαμβάνεται από τα γειτονικά κύτταρα που θα διαφοροποιηθούν στο στοματικό εξώδερμα. Η πρόσδεση του σήματος στον υποδοχέα του σηματοδοτεί τόσο την ενεργοποίηση του ίδιου του γονιδίου, όσο και των smad πρωτεϊνών, οι οποίες με τη σειρά τους επανενεργοποιούν το nodal (Nam et al. 2007). Ο περιορισμός της έκφρασης του Nodal σε μια ομάδα μόνο κυττάρων του στοματικού εξωδέρματος επιτυγχάνεται με την καταστολή του στο μεν αντιστοματικό εξώδερμα, μέσω του καταστολέα του, Antivin/Lefty, ενός μορίου που παράγεται επίσης από τα κύτταρα του στοματικού εξωδέρματος και διαχέεται στη γειτονική περιοχή μεταξύ των κυττάρων (Duboc et al. 2004), στο δε φυτικό πόλο από έναν άλλον καταστολέα, άγνωστο προς το παρόν. Εκτός από το Nodal, σημαντικοί για τον καθορισμό του εξωδέρματος είναι και οι παράγοντες Gsc και OTX. Ο Gsc συμμετέχει στον καθορισμό, καταστέλλοντας την έκφραση γονιδίων του αντιστοματικού εξωδέρματος στο στοματικό εξώδερμα, ενώ ο OTX επάγει την έκφραση γονιδίων του στοματικού εξωδέρματος. Στο στοματικό εξώδερμα παράγεται και ο BMP2/4 ο οποίος διαχέεται σε μεγαλύτερη απόσταση στα κύτταρα του αντιστοματικού εξωδέρματος και ρυθμίζει θετικά τα γονίδιά του, με κύριο το tbx2/3. Η δράση του καταστέλλεται στο στοματικό εξώδερμα μέσω του καταστολέα του, chordin και στο αντιστοματικό μέσω του Smad6. Μεταξύ του στοματικού και αντιστοματικού εξωδέρματος βρίσκεται η βλεφαριδωτή ζώνη η οποία περιλαμβάνει 3 με 4 σειρές από κυβοειδή κύτταρα που αποτελούν τους πρόδρομους των νευρικών κυττάρων. Η διαφοροποίησή της έπεται της διαφοροποίησης του στοματικού και αντιστοματικού εξωδέρματος και επιτυγχάνεται με κυτταρικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυτταρικών αυτών γραμμών. Η καταστολή της έκφρασης του nodal και του bmp2/4 προκαλεί την εξάπλωση της βλεφαριδωτής ζώνης. 42

59 Εισαγωγή Εικόνα 1.26 Αναπαράσταση του γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου που συμμετέχει στον καθορισμό του εξωδέρματος στο έμβρυο του αχινού. Τα βέλη σημαίνουν θετική ρύθμιση των γονιδίων. Οι γραμμές που καταλήγουν σε κάθετη γραμμή σημαίνουν καταστολή της μεταγραφής. Τα έγχρωμα κουτιά αντιπροσωπεύουν τις ειδικές περιοχές όπως αναγράφονται σε κάθε κουτί. Οι συνδέσεις του nodal και του bmp2/4 με τους άμεσους στόχους τους σημαίνονται με έντονα βέλη. Οι συνδέσεις μεταξύ γονιδίων που είναι υποθετικές ή έμμεσες σημαίνονται με διακεκομμένες γραμμές. Το μπλε κουτί αντιστοιχεί στο στοματικό εξώδερμα, το ροζ κουτί στη βλεφαριδωτή ζώνη και το πράσινο στο αντιστοματικό εξώδερμα. Saudemont A. et al.,

60 Εισαγωγή Όπως αναφέρθηκε για τον καθορισμό του στοματικού εξωδέρματος, πρωταρχικής σημασίας μόριο είναι το Nodal (Duboc V, et al., 2004). Το Νodal είναι ζυγωτικής προέλευσης και πρωτοανιχνεύεται στο στάδιο των 32 κυττάρων, αρχικά διάχυτα στο έμβρυο και αργότερα σε μία μόνο διακριτή περιοχή του εξωδέρματος, το μελλοντικό στοματικό εξώδερμα (εικόνα 1.27). Εικόνα 1.27 Εντοπισμός του ενδογενούς Nodal mrna. a) Μη γονιμοποιημένο αυγό b) στάδιο 32 κυττάρων c) στάδιο 60 κυττάρων d) πρώϊμο βλαστίδιο e) εκκόλαπτόμενο βλαστίδιο f) εκκολαπτόμενο βλαστίδιο με διπλή σήμανση με Nodal και ske-t/tbx1 (σήμα ειδικό για τα πρωτογενή μεσεγχυματικά κύτταρα) g) μεσεγχυματικό βλαστίδιο, εικόνα από το ζωίκό πόλο h) μεσεγχυματικό βλαστίδιο (πλευρική όψη) i) μεσεγχυματικό βλαστίδιο με διπλή σήμανση για το Nodal και coquillette/tbx2/3 (σήμα ειδικό για το αντιστοματικό εξώδερμα) j) μεσεγχυματικό βλαστίδιο με διπλή σήμανση για το Nodal (κόκκινο) και για το vega (πράσινο) k) γαστρίδιο όψη από το φυτικό πόλο l) γαστρίδιο πλευρική όψη. Duboc et al Η υπερέκφρασή του προκαλεί μη ειδική εξάπλωση του στοματικού εξωδέρματος και των γονιδίων που απαντώνται αποκλειστικά σε αυτό όπως των nodal, bmp2/4, chordin, lefty, goosecoid, brachyury, foxa, fgfr1 και nk1 καθώς και όσων απαντώνται τόσο στο στοματικό εξώδερμα όσο και στη βλεφαριδωτή ζώνη. Τέτοια γονίδια είναι τα deadringer, bmp1 και univin. Αντίθετη δράση έχει η υπερέκφραση του Nodal στα γονίδια που απαντώνται αποκλειστικά στη βλεφαριδωτή ζώνη τα οποία είτε ελαχιστοποιεί όπως συμβαίνει με τα wnt8, fgfa και pax2/5/8 ή καταστέλλει όπως τα foxg, egip, onecut/hnf6, gfi1 και otx. Ελαχιστοποίηση επίσης προκαλεί η υπερέκφρασή του, στα γονίδια του αντιστοματικού εξωδέρματος όπως στα nk2.2, tbx2/3, smad6, msx, atbf1, wnt5, admp2, unc4, hox7, dlx και 29D (Saudemont A. et al., 2010). Επομένως, το Nodal επάγει τον καθορισμό του στοματικού εξωδέρματος ρυθμίζοντας θετικά τα γονίδιά του. Από το σύνολο των γονιδίων, τα nodal, lefty, bmp2/4, chordin, goosecoid, nk2.2 και fgfr1 αποτελούν τους άμεσους στόχους του 44

61 Εισαγωγή Nodal. Η καταστολή του nodal με αντινοηματικά morpholinos ή μέσω υπερέκφρασης του καταστολέα του, του Lefty, οδηγεί σε ελαχιστοποίηση της πολικότητας μεταξύ στοματικού/αντιστοματικού εξωδέρματος, σε αποδιοργάνωση των σκελετικών στοιχείων και σε απουσία του στόματος στο ώριμο άτομο. Ενδιαφέρον παρουσιάζει ωστόσο ότι η καταστολή του οδηγεί στην υπο-έκφραση όχι μόνο των γονιδίων του στοματικού εξωδέρματος αλλά και αυτών του αντιστοματικού, συμπεραίνοντας ότι απαιτείται και για τον καθορισμό του αντιστοματικού εξωδέρματος, προφανώς μέσω θετικής ρύθμισης του bmp2/4. Τελικά, το εξώδερμα των εμβρύων στα οποία έχει κατασταλλεί το nodal διαφοροποιείται σε ένα παχύ στρώμα κυβοειδών βλεφαριδωτών κυττάρων τα οποία αντιστοιχούν στα νευρογενή κύτταρα του εξωδέρματος της βλεφαριδωτής ζώνης. Επομένως, πέραν της σημασίας του στον καθορισμό του στοματικού και αντιστοματικού εξωδέρματος, το Nodal έχει και μία άλλη σημαντική δράση, που είναι η καταστολή της διαφοροποίησης της βλεφαριδωτής ζώνης σε μια μεγάλη έκταση του εμβρύου εκτός από αυτή του ζωϊκού πόλου και γύρω από το βλαστοπόρο, ρυθμίζοντας αρνητικά τα γονίδια που απαντώνται σε αυτή. Η καταστολή της δράσης του Nodal στις περιοχές του αντιστοματικού εξωδέρματος και της βλεφαριδωτής ζώνης επιτυγχάνεται με την παρουσία του Lefty (Saudemont A. et al., 2010). Το μόριο BMP2/4 είναι αποκλειστικά ζυγωτικής προέλευσης. Εκφράζεται στο στοματικό εξώδερμα (εικόνα 1.28) καθοδικά του Nodal και διαχέεται στην περιοχή του αντιστοματικού εξωδέρματος όπου ενεργοποιεί τον υποδοχέα του και έπειτα άλλα γονίδια χαρακτηριστικά της κυτταρικής αυτής γραμμής, συμβάλλοντας έτσι στη διατήρηση του αντιστοματικού εξωδέρματος του εμβρύου (Angerer LM, et al. 2000; Saudemont A. et al., 2010). Στο στάδιο του πλουτέα ανιχνεύεται αποκλειστικά στο αντιστοματικό εξώδερμα. Η υπερέκφρασή του προκαλεί εξάπλωση της περιοχής έκφρασης των γονιδίων του αντιστοματικού εξωδέρματος και ως εκ τούτου ελαχιστοποίηση της περιοχής έκφρασης των γονιδίων του στοματικού εξωδέρματος και της βλεφαριδωτής ζώνης. Επομένως ο παράγοντας BMP2/4 επάγει τον καθορισμό του αντιστοματικού εξωδέρματος ρυθμίζοντας θετικά τα γονίδιά του. Από το σύνολο των γονιδίων της περιοχής αυτής, τρία μόνο αποτελούν άμεσους στόχους του BMP2/4, τα tbx2/3, nk2.2 και smad6. 45

62 Εισαγωγή Εικόνα 1.28 Εντοπισμός του ενδογενούς BMP2/4 mrna. lv: πλευρική όψη, vv: όψη από την πλευρά του φυτικού πόλου. F) Πρώϊμο βλαστίδιο,g) Εκκολαπτόμενο βλαστίδιο, H) Μεσεγχυματικό βλαστίδιο I) Πρώϊμο γαστρίδιο J) Πρίσμα G-Ct) Γαστρίδιο. F-J: Lapraz F. et al. 2007, G-Ct: Saudemont A. et al., 2010 Η καταστολή του bmp2/4 προκαλεί καταστολή των γονιδίων του αντιστοματικού εξωδέρματος, εξάπλωση των γονιδίων της βλεφαριδωτής ζώνης ενώ δεν επηρεάζει τα γονίδια του στοματικού εξωδέρματος. Επομένως το BMP2/4 πέραν της θετικής ρύθμισης του αντιστοματικού εξωδέρματος έχει και μία άλλη εξίσου σημαντική δράση, που είναι η καταστολή της έκφρασης των γονιδίων της βλεφαριδωτής ζώνης στην περιοχή του αντιστοματικού εξωδέρματος. Ο περιορισμός της δράσης του BMP2/4 στις περιοχές του στοματικού εξωδέρματος επιτυγχάνεται με την παρουσία των καταστολέων του, Chordin και Smad6 (Saudemont A. et al., 2010). Από το πλήθος των γονιδίων που συμμετέχουν στο γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο του στοματικού εξωδέρματος υπάρχουν κάποια πέραν του nodal και bmp2/4 που διαδραματίζουν εξαιρετικά σημαντικό ρόλο. Η univin είναι πρωτεΐνη μητρικής και ζυγωτικής προέλευσης και εκφράζεται αρχικά διάχυτα στο έμβρυο και αργότερα, στο στάδιο του βλαστιδίου, σε μια περιοχή εξωδερμικών κυττάρων τύπου δαχτυλιδιού. Στο γαστρίδιο εκφράζεται επίσης στο αρχέντερο ενώ στον πλουτέα σε ένα τμήμα της βλεφαριδωτής ζώνης (εικόνα 1.29) (Stenzel P, et al. 1994). Η univin είναι απαραίτητη για τον καθορισμό του εξωδέρματος καθώς καταστολή της οδηγεί σε πρότυπο παρόμοιο της καταστολής του Nodal. Φαίνεται είτε ότι ελέγχει το γονίδιο του nodal ή ότι ετεροδιμερίζονται (Lapraz F. et al. 2006, Saudemont A. et al., 2010). 46

63 Εισαγωγή Εικόνα 1.29 Εντοπισμός του ενδογενούς univin mrna. A) Αυγό Β-C) Εκκολαπτόμενο βλαστίδιο D) Πρώϊμο γαστρίδιο Ε) Πρίσμα Lapraz F. et al Το Goosecoid (Gsc) είναι μητρικής και ζυγωτικής προέλευσης και διαδραματίζει πολύ σπουδαίο ρόλο στον καθορισμό του στοματικού εξωδέρματος (Angerer LM, et al. 2001) Έχει κατασταλτικό ρόλο δράσης και εκφράζεται σε σημαντικές ποσότητες αμέσως μετά την έκφραση του Nodal, αρχικά στο κέντρο του μελλοντικού στοματικού εξωδέρματος και αργότερα αποκλειστικά στην περιοχή γύρω από το στόμα (εικόνα 1.30). Ο ρόλος του είναι διπλός καθώς αφενός επιτρέπει την έκφραση γονιδίων χαρακτηριστικών του στόματος όπως των foxa και brachyoury, αφετέρου καταστέλλει την έκφραση κάποιων γονιδίων του στοματικού εξωδέρματος όπως των wnt8, univin και foxg καθώς και αυτών του αντιστοματικού εξωδέρματος και της βλεφαριδωτής ζώνης (Saudemont A. et al. 2010). Χαρακτηριστικός είναι ο τρόπος δράσης του στο γονίδιο SpecIIa, το οποίο εκφράζεται αποκλειστικά στο αντιστοματικό εξώδερμα. Το γονίδιο αυτό επάγεται από τον OTX στο αντιστοματικό εξώδερμα και καταστέλλεται στο στοματικό εξώδερμα από τον Gsc. Μάλιστα, ο Gsc ανταγωνίζεται με τον Otx για την πρόσδεσή του. Η καταστολή της έκφρασής του είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της γαστριδίωσης και της διαφοροποίησης του αρχεντέρου. Εικόνα 1.30 Εντοπισμός του ενδογενούς Goosecoid mrna. lv: πλευρική όψη, vv: όψη από την πλευρά του φυτικού πόλου. MB: Μεσεγχυματικό βλαστίδιο, EG: Πρώϊμο Γαστρίδιο, A1: Ώριμο γαστρίδιο B1: Πρίσμα Saudemont A. et al., 2010, Α1, B1: Bradham C et al

64 Εισαγωγή Η αναστολή της σύνθεσης της πρωτεΐνης Gsc οδήγησε επίσης στη δημιουργία εμβρύων χωρίς πολικότητα κατά μήκος του στοματικού/αντιστοματικού άξονα. Αντίθετα μάλιστα, τα έμβρυα εμφάνιζαν ακτινωτή μορφολογία χωρίς καθορισμένες στοματικές και αντιστοματικές περιοχές. Πειράματα με αντισώματα έδειξαν ότι όλα τα κύτταρα εξέφραζαν την πρωτείνη Spec1 η οποία και αποτελεί χαρακτηριστικό δείκτη του αντιστοματικού εξωδέρματος ενώ δεν εξέφραζαν EctoV έναν δηλαδή αντιπροσωπευτικό δείκτη του στοματικού εξωδέρματος. Η καταστολή της έκφρασης του Gsc οδήγησε στον καθορισμό του εξωδέρματος προς την αντιστοματική κατεύθυνση. Σημαντικό μόριο στον καθορισμό του αντιστοματικού εξωδέρματος είναι το Tbx2/3. Ο παράγοντας αυτός είναι αποκλειστικά ζυγωτικής προέλευσης και εκφράζεται στο αντιστοματικό εξώδερμα (εικόνα 1.31) (Croce J, et al. 2003a, b). Δρα καθοδικά του BMB2/4 και ρυθμίζει θετικά τα γονίδια του αντιστοματικού εξωδέρματος msx, dlx, irxa και atbf1 (Saudemont A. et al. 2010). Εικόνα 1.31 Εντοπισμός του ενδογενούς Tbx2/3 mrna. lv: πλευρική όψη, vv: όψη από την πλευρά του φυτικού πόλου. MB: Μεσεγχυματικό βλαστίδιο, EG: Πρώϊμο Γαστρίδιο Saudemont A. et al., 2010 D1: Πρίσμα Bradham C. and McClay D Ένας άλλος παράγοντας εξαιρετικά σημαντικός για τη διαφοροποίηση του αντιστοματικού εξωδέρματος είναι ο IrxA. Ο IrxA είναι ζυγωτικής προέλευσης και Εικόνα 1.32 Εντοπισμός του ενδογενούς IrxA mrna. lv: πλευρική όψη, G: Γαστρίδιο. Saudemont A. et al., 2010 MΒ: Μεσεγχυματικό βλαστίδιο Ashby et al εκφράζεται σε μια υποπεριοχή του αντιστοματικού εξωδέρματος στο γαστρίδιο και στη veg1 περιοχή του μεσεγχυματικού βλαστιδίου (εικόνα 1.32) (Howard-Ashby M, et al. 2006). Η καταστολή του προκαλεί έκτοπική έκφραση των γονιδίων της βλεφαριδωτής ζώνης, όπως του onecut/hnf6, συμπεραίνοντας ότι ο IrxA δρα καταστέλλοντας την έκφραση των γονιδίων της βλεφαριδωτής ζώνης στην περιοχή 48

65 Εισαγωγή του αντιστοματικού εξωδέρματος (Saudemont A. et al., 2010). Ο παράγοντας Onecut/hnf6 παίζει κύριο ρόλο στον καθορισμό της βλεφαριδωτής ζώνης. Είναι μητρικής και ζυγωτικής προέλευσης και εκφράζεται αρχικά στο μεγαλύτερο μέρος του εξωδέρματος ενώ αργότερα περιορίζεται στη βλεφαριδωτή ζώνη (εικόνα 1.33) (Otim O, et al., 2004; Poutska AJ et al., 2004). Εικόνα 1.33 Εντοπισμός του ενδογενούς onecut mrna. lv: πλευρική όψη, vv: όψη από την πλευρά του φυτικού πόλου. Saudemont A. et al., 2010 Η καταστολή του προκαλεί είτε μειωμένη έκφραση των γονιδίων της βλεφαριδωτής ζώνης όπως των pax2/5/8, foxg και dri ή πλήρη καταστολή όπως στο γονίδιο gfi1. Επομένως προκύπτει ότι ο παράγοντας Onecut/hnf6 ρυθμίζει θετικά το γονίδιο gfi1 που κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη απαραίτητη για τη διαφοροποίηση της βλεφαριδωτής ζώνης (Saudemont A. et al. 2010). Ένα άλλο μονοπάτι που διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο στον καθορισμό του εξωδέρματος είναι το μονοπάτι Wnt. Το σινιάλο Wnt προέρχεται από το φυτικό πόλο και απαιτείται για τον περιορισμό του στοματικού εξωδέρματος σε συγκεκριμένη περιοχή (εικόνα 1.34). Όταν το Wnt καταστέλλεται μέσω υπερέκφρασης της καντχερίνης, επάγεται η εξάπλωση του ζωϊκού πόλου προς το φυτικό πόλο και το μεγαλύτερο μέρος του εξωδέρματος διαφοροποιείται σε νευροεξώδερμα με σεροτονινεργικούς νευρώνες (Yaguchi S, et al. 2006). Επομένως, το βασικό μοντέλο διαφοροποίησης του εξωδέρματος κατά μήκος του στοματικού/αντιστοματικού άξονα, περιγράφεται στην εικόνα 1.34 και βασίζεται στην επαγωγή του αντιστοματικού εξωδέρματος με μηνύματα BMP2/4 που προέρχονται από το στοματικό εξώδερμα. Η πλευρά του στοματικού εξωδέρματος επομένως παράγει τόσο επαγωγείς του στοματικού και αντιστοματικού εξωδέρματος, όπως το nodal και το BMP2/4 αντίστοιχα, όσο και καταστολείς όπως i) το Lefty το οποίο περιορίζει τη δράση του nodal αποκλειστικά στο στοματικό εξώδερμα και ii) τη 49

66 Εισαγωγή Chordin η οποία αποτρέπει τη δράση του BMP2/4 στο στοματικό εξώδερμα. Βάσει των πιο πάνω η αρχική περιοχή του στοματικού εξωδέρματος μπορεί να θεωρηθεί ως ο οργανωτής του στοματικού/αντιστοματικού άξονα του εμβρύου και να συγκριθεί με τον οργανωτή του Spemann στα σπονδυλωτά. Εικόνα 1.34 Προτεινόμενο μοντέλο καθορισμού του εξωδέρματος μέσω περιορισμού της βλεφαριδωτής ζώνης με τα σινιάλα Nodal και BMP. Μητρικοί παράγοντες όπως ο SoxB1 επάγουν την πρώϊμη έκφραση των γονιδίων της βλεφαριδωτής ζώνης εντός του εξωδέρματος. Η σηματοδότηση του Nodal επάγει τον καθορισμό του στοματικού εξωδέρματος και του στόματος και περιορίζει τη διαφοροποίηση της βλεφαριδωτής ζώνης στην περιοχή αυτή, πιθανόν μέσω της δράσης του Goosecoid καθώς και άλλων καταστολέων. Το Nodal επάγει τον ανταγονιστή του, Lefty, ο οποίος διαχέεται από το στοματικό εξώδερμα στη γειτονική μελλοντική βλεφαριδωτή ζώνη. Εντός του στοματικού εξωδέρματος το Nodal επάγει την έκφραση του bmp2/4 και του ανταγωνιστή του, chordin. Ο παράγοντας Chordin αποτρέπει τη σηματοδότηση του BMP εντός του στοματικού εξωδέρματος και πιθανόν και εντός της βλεφαριδωτής ζώνης. Στο στάδιο του βλαστιδίου συμπλέγματα πρωτεϊνών που περιλαμβάνουν το BMP2/4 και το Chordin διαχέονται προς την αντιστοματική πλευρά του εμβρύου συμβάλλοντας στη διαφοροποίησή της. Στο αντιστοματικό εξώδερμα το BMP2/4 καταστέλλει τη διαφοροποίηση της βλεφαριδωτής ζώνης, κατά έναν τρόπο μέσω επαγωγής του καταστολέα IrxA. Ένα υψηλό ποσοστό ενεργότητας MAP κινάσης, που επάγεται από τη σηματοδότηση του FGFA στο πλευρικό εξώδερμα, φαίνεται να συνεισφέρει στη διατήρηση χαμηλών επιπέδων Nodal και BMP σημάτων στην περιοχή της βλεφαριδωτής ζώνης μέσω φωσφορυλίωσης των Smad1/5/8 και Smad2/3 αναστέλλοντας τη δραστηριότητά τους. Το εξώδερμα που περιβάλλει το βλαστοπόρο διαφοροποιείται σε αντιστοματικό εξώδερμα καθώς λαμβάνει σήματα Wnt τα οποία ανταγωνίζονται το GSK3 και επάγουν το σινιάλο BMP. Saudemont A et al.,

67 Εισαγωγή Ο καθορισμός του ενδομεσοδέρματος στο έμβρυο του αχινού Το γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο που συμμετέχει στον καθορισμό του ενδομεσοδέρματος στο έμβρυο του αχινού είναι πολύ καλά μελετημένο και περιλαμβάνει περί τα 50 γονίδια, τα περισσότερα από τα οποία κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες και τα υπόλοιπα σηματοδοτικά μόρια (Levine M. and Davidson H. E., 2005). Στην εικόνα 1.35 παρουσιάζεται το ρυθμιστικό δίκτυο. Κάθε ομάδα γονιδίων που ευθύνεται για τον καθορισμό ενός διαφορετικού ιστού περιλαμβάνεται σε περιοχή ειδικού χρώματος (οι περιοχές μωβ χρώματος αντιστοιχούν στο σκελετό, πράσινου στο ενδομεσόδερμα, γαλάζιου στο μεσόδερμα και κίτρινου στο ενδόδερμα). Η περιοχή πορτοκαλί χρώματος περιλαμβάνει γονίδια που ευθύνονται για τον καθορισμό ειδικά της οπίσθιας περιοχής του αρχεντέρου. Εικόνα 1.35 Αναπαράσταση του γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου που συμμετέχει στον καθορισμό του ενδομεσοδέρματος στο έμβρυο του αχινού. Τα βέλη σημαίνουν θετική ρύθμιση των γονιδίων. Οι γραμμές που καταλήγουν σε κάθετη γραμμή σημαίνουν καταστολή της μεταγραφής. Τα έγχρωμα κουτιά αντιπροσωπεύουν τις ειδικές περιοχές όπως αναγράφονται σε κάθε κουτί. Οι συνδέσεις μεταξύ γονιδίων που είναι υποθετικές ή έμμεσες σημαίνονται με διακεκομμένες γραμμές (Levine M. and Davidson H. E., 2005) 51

68 Εισαγωγή Όλοι οι ιστοί του ενδομεσοδέρματος προέρχονται από τα εμβρυϊκά κύτταρα που αντιστοιχούν στις περιοχές veg1, veg2 και στα μικρομερίδια. Το πιο σπουδαίο γεγονός στον καθορισμό του ενδομεσοδέρματος είναι η είσοδος της β κατενίνης στον πυρήνα των κυττάρων αυτών. Εκεί συνεργάζεται με έναν μεταγραφικό παράγοντα, τον Tcf1 και ενεργοποιεί τη ρύθμιση των γονιδίων στόχων. Έκτοτε το μονοπάτι συντηρείται με την παρουσία του μηνύματος Wnt8 σχηματίζοντας μία σινιαλο εξαρτώμενη θηλειά (εικόνα 1.36Α). Συγκεκριμένα, το μόριο Wnt8 είναι απαραίτητο προκειμένου να ενεργοποιηθεί η είσοδος της β κατενίνης στον πυρήνα των κυττάρων του φυτικού πόλου και η οποία απαιτείται για την ενεργοποίηση του wnt8. Η είσοδος της β κατενίνης στον πυρήνα πυροδοτεί τα μονοπάτια καθορισμού του ενδομεσοδέρματος. Ένα από τα γονίδια που ενεργοποιούνται είναι το blimp1b το οποίο με τη σειρά του ρυθμίζει θετικά το wnt8 επάγοντας έτσι νέα είσοδο της β κατενίνης στον πυρήνα των κυττάρων και έτσι σχηματίζεται μία δεύτερη αυτοτροφοδοτούμενη θηλειά. Στη δεύτερη αυτή θηλειά συμμετέχει και το μόριο Otx το οποίο ρυθμίζει θετικά το γονίδιο blimp1. Η καταστολή του συγκεκριμένου επιμέρους κυκλώματος στο εξώδερμα γίνεται με τη συμμετοχή του μορίου Groucho το οποίο δεσμεύεται από τον παράγοντα TCF και δρα ως καταστολέας (Smith J. et al., 2007, Levine M. and Davidson H. E. 2005). A Εικόνα 1.36 Α: Επί μέρους δίκτυο που συμμετέχει στον καθορισμό του ενδομεσοδέρματος. Αναλυτικά περιγράφεται στο κείμενο. GSK3: Ένζυμο απαραίτητο για τον καθαρισμό της β- κατενίνης και του οποίου η ενεργότητα αναστέλλεται μετά την πρόσληψη του Wnt8. nb-tcf: Σύμπλεγμα β-κατενίνης και του μεταγραφικού παράγοντα TCF. Smith J. et al.,

69 Εισαγωγή Στον καθορισμό του ενδομεσοδέρματος πολύ σημαντικό ρόλο παίζουν τα μικρομερίδια και συγκεκριμένα τα τέσσερα μεγάλα μικρομερίδια που θα διαφοροποιηθούν στο σκελετό του εμβρύου (εικόνα 1.36Β, lm). Τα κύτταρα των μικρομεριδίων έχουν B καθορίσει την αναπτυξιακή τους τύχη από τη γέννησή τους, δηλαδή από την τέταρτη κιόλας αυλάκωση. Η ενεργοποίηση των γονιδίων τους απαιτεί και πάλι την είσοδο της β- κατενίνης στον πυρήνα των κυττάρων. Ένα από τα πρωταρχικά γονίδια που ενεργοποιούνται είναι το pmar1. H πρωτεΐνη που κωδικοποιεί είναι ένας καταστολέας και το γονίδιο που καταστέλλει κωδικοποιεί έναν δεύτερο καταστολέα, τoν HesC (εικόνα 1.37). Ως αποτέλεσμα ενεργοποιείται μια σειρά γονιδίων τα οποία βρίσκονται υπό τον έλεγχο του HesC και τα οποία σε άλλες κυτταρικές γραμμές καταστέλλονται. Η εν σειρά παρουσία δύο καταστολέων (double negative gate, διπλή αρνητική πύλη) φαίνεται να είναι ένα συνηθισμένο μοτίβο στο γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο. Εικόνα 1.36 Β: Εικόνα εμβρύου μετά την πέμπτη αυλάκωση όπως φαίνεται από το φυτικό πόλο. Μ: Μεσομερίδια, lm: Μεγάλα μικρομερίδια, sm: Μικρά μικρομερίδια. Oliveri P. et al Από τα μικρομερίδια ξεκινούν δύο σήματα που είναι σημαντικά για τον καθορισμό του ενδομεσοδέρματος (εικόνα 1.37D, E). Το πρώτο είναι το Εικόνα 1.37: D: Στοιχεία του εμβρύου ανά περιοχή: πράσινο:μακρομερίδια, κόκκινο: σκελετογόνα μικρομερίδια, μωβ: μικρά μικρομερίδια, κίτρινο: μη σκελετογόνo μεσόδερμα, μπλε: έντερο, καφέ: νευρογενής περιοχή, σκούρο γκρι: αντιστοματικό εξώδερμα, ανοιχτό γκρι: στοματικό εξώδερμα. Στάδια: 6ώρες: Πέμπτη αυλάκωση, 10 ώρες: έβδομη αυλάκωση, 15 ώρες: πρώϊμο βλαστίδιο 24 ώρες: μεσεγχυματικό βλαστίδιο, 55 ώρες: Ώριμο γαστρίδιο με σχηματισμένο σκελετό. E: Διάγραμμα με τις διαδικασίες καθορισμού του ενδομεσοδέρματος περιληπτικά. Τα χρώματα κάθε περιοχής αντιστοιχούν στα χρώματα των περιοχών του εμβρύου. Η δράση των μεταγραφικών παραγόντων σημαίνεται με μαύρες γραμμές ενώ των σινιάλων με μπλε. Oliveri P. et al

70 Εισαγωγή μήνυμα ES (Early Signal) του οποίου η ταυτότητα είναι ακόμη άγνωστη. Το δεύτερο είναι το σινιάλο Delta το οποίο εκκρίνεται από τα μικρομερίδια και δεσμεύεται στον υποδοχέα του, Notch, που βρίσκεται στα γειτονικά veg2 κύτταρα. Το σινιάλο αυτό ευθύνεται για τον καθορισμό του μεσοδέρματος (Sherwood D. et al., 1997, Sherwood D. et al., 1999, Sweet H. et al., 1999, Davidson E. et al., 2003, Oliveri P. et al., 2004). Tο μεταγραφικό σύμπλοκο που ενεργοποιείται από το Notch ενεργοποιεί με τη σειρά του το γονίδιο gcm το οποίο κατόπιν ενεργοποιεί τον εαυτό του αλλά και ένα πλήθος γονιδίων σημαντικών για τον καθορισμό των χρωμοφόρων κυττάρων. Το ενδόδερμα προέρχεται από τη veg1 περιοχή. Στη διαφοροποίησή του ο παράγοντας Krox διαδραματίζει σημαντικό ρόλο. Ο παράγοντας αυτός ενεργοποιεί το γονίδιο otx το οποίο με τη σειρά του ενεργοποιεί μια σειρά γονιδίων χαρακτηριστικών του ενδοδέρματος, όπως το gatae. Κατόπιν, ο GataE επανενεργοποιεί το γονίδιο otx κλειδώνοντας το ενδόδερμα σε μία συνεχώς ενεργοποιημένη κατάσταση (Davidson E. et al., 2002, Yuh C-H et al., 2004). 54

71 Εισαγωγή Η μελέτη του γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου που καθορίζει το εξώδερμα στο έμβρυο του αχινού είναι εξαιρετικής σημασίας Η αποκωδικοποίηση του γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου που καθορίζει το εξώδερμα στον αχινό είναι εξαιρετικής σημασίας για διάφορους λόγους: i) Η διαφοροποίηση και των τριών κυτταρικών γραμμών βασίζεται στη δράση ενός σηματοδοτικού κέντρου που απαντάται στο στοματικό εξώδερμα (Saudemont A. et al. 2010). Η ανάλυση του τρόπου με τον οποίον δρα το σηματοδοτικό αυτό κέντρο είναι απαραίτητη προκειμένου να γίνει κατανοητός ο τρόπος με τον οποίο εγκαθίσταται η πολικότητα του εμβρύου κατά μήκος του στοματικού/αντιστοματικού άξονα. ii) Παρά τις πολύτιμες πληροφορίες που είναι διαθέσιμες μέχρι σήμερα για την εγκατάσταση του στοματικού/αντιστοματικού άξονα κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής ανάπτυξης, ελάχιστα είναι γνωστά για το ρυθμιστικό δίκτυο που ελέγχει τον καθορισμό των τριών βασικών εξωδερμικών περιοχών. Μάλιστα οι μοριακοί μηχανισμοί που συμμετέχουν στην πολικότητα του εμβρύου κατά μήκος του στοματικού/αντιστοματικού άξονα σε φυσιολογικά και μεταλλαγμένα έμβρυα μόλις ξεκίνησαν να διαλευκάνονται (Su YH, et al. 2009). iii) Η μελέτη της διαφοροποίησης του στοματικού/αντιστοματικού άξονα στα Εχινόδερμα συμβάλλει ουσιαστικά στην κατανόηση του μηχανισμού με τον οποίον σχηματίζεται το σώμα των Δευτεροστομίων, αν λάβει μάλιστα κανείς υπ όψιν του τη φυλογενετική θέση των Εχινοδέρμων ανάμεσα στα Δευτεροστόμια. Αυτό άλλωστε επιβεβαιώνεται καθώς τελευταίες μελέτες αποδεικνύουν τη συμμετοχή στο ρυθμιστικό δίκτυο των μορίων Nodal, Univin / Vg1 και BMP2/4, που ανήκουν στην οικογένεια των TGF-beta, τα οποία παίζουν εξαιρετικά σπουδαίο ρόλο και στην ανάπτυξη των σπονδυλωτών (Duboc V, et al. 2004; Range R, et al. 2007; Lapraz F, et al. 2009). iv) Οι βασικές μορφογενετικές αλλαγές όπως η διαφοροποίηση του στόματος, ο σχηματισμός των σκελετικών στοιχείων και η επιμήκυνση των άκρων λαμβάνει χώρα κατά μήκος του στοματικού/αντιστοματικού άξονα. Η κατανόηση επομένως του ρυθμιστικού δικτύου κατά μήκος του άξονα 55

72 Εισαγωγή αυτού δίνει τη δυνατότητα να κατανοηθούν οι μορφολογικές αυτές αλλαγές σε γονιδιακό επίπεδο και να καλυφθεί το χάσμα που μέχρι σήμερα υπάρχει ανάμεσα στην κυτταρική διαφοροποίηση και στον τρόπο με τον οποίον τα γονίδια αλληλεπιδρούν και ρυθμίζουν τη μορφογένεση. 1.4 Σχεδιασμός ενός γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου Ο σχεδιασμός ενός γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου βασίζεται σε πληροφορίες σχετικές με 1) τη χρονική έκφραση των υπό μελέτη γονιδίων, που εξάγονται με πειράματα qpcr 2) την ιστοειδική έκφραση των υπό μελέτη γονιδίων που εξάγονται με πειράματα in situ υβριδοποίησης και σε μια μακρά ανάλυση από την επίδραση που έχει η αποσιώπηση καθενός από τα γονίδια αυτά στα υπόλοιπα γονίδια του δικτύου. Η αποσιώπηση αυτή επιτυγχάνεται με τη χρήση αντινοηματικών ολιγονουκλεοτιδίων (morpholinos) και ο έλεγχος της επίδρασης αυτών γίνεται με in situ υβριδοποίηση των γονιδίων στόχων και με qpcr (Levine M and Davidson E., 2005). Με τον πιο πάνω τρόπο λαμβάνονται μαζικές πληροφορίες για τα γονίδια που συμμετέχουν στον καθορισμό μιας κυτταρικής γραμμής και για τον τρόπο με τον οποίον αυτά αλληλεπιδρούν. Ωστόσο υπάρχει μόνο μία μέθοδος για να εξακριβωθεί η πιστότητα ενός ρυθμιστικού δικτύου και δεν είναι άλλη από την απομόνωση της cis ρυθμιστικής περιοχής κάθε γονιδίου που συμμετέχει στο δίκτυο και την ανακάλυψη των μεταγραφικών παραγόντων που αναγνωρίζουν στοιχεία απόκρισης σε αυτή και ρυθμίζουν τα γονίδια του δικτύου θετικά ή αρνητικά. 56

73 Εισαγωγή 1.5 Ο μεταγραφικός παράγοντας AP1 Ο παράγοντας AP1 (Activator Protein 1) είναι ένας πολύ σημαντικός και πολύ καλά μελετημένος μεταγραφικός παράγοντας. Μέχρι σήμερα έχει μελετηθεί σε κυτταροκαλλιέργειες και όργανα ανθρώπου, σε καρκινικά κύτταρα, στον ποντικό και στην όρνιθα. Σε όλες τις περιπτώσεις δρα ως ενεργοποιητής των γονιδίων στόχων. Τα πρωτεϊνικά συστατικά του κωδικοποιούνται από μία ομάδα γονιδίων γνωστή ως άμεσα πρώϊμα (IE: Immediate Early) γονίδια (Lau et al., 1985) τα οποία συνδέουν βιοχημικές κυτταροπλασματικές αλλαγές που συμβαίνουν ως απάντηση σε εξωκυττάρια σήματα. Οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούν τα γονίδια αυτά προϋπάρχουν και ενεργοποιούνται υπό την επίδραση κάποιου σήματος προκειμένου να εισέλθουν στον πυρήνα και να ρυθμίσουν τα γονίδια - στόχους τους. Το τελικό αποτέλεσμα είναι μία μακράς δράσης απάντηση του κυττάρου όπως είναι ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και η απόπτωση (McMahon et al., 1992). Ο παράγοντας AP1 πρωτοανιχνεύθηκε στο γονίδιο της μεταλλοθειονίνης ΙΙΑ και στον SV40 όπου προσδένεται σε cis ρυθμιστικά στοιχεία του υποκινητή και του ενισχυτή (Lee W. et al., 1987). Δρα ως διμερές, με ενεργοποιητική δράση και συγκροτείται από πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από τα γονίδια των οικογενειών jun και fos (Bohman et al., 1987). Έχει την ικανότητα να σχηματίζει ομοδιμερή συγκροτούμενα από δύο πρωτεΐνες Jun (Jun/Jun) ή ετεροδιμερή συγκροτούμενα από τις πρωτεΐνες Jun και Fos (Jun/Fos). Το στοιχείο απόκρισής του είναι συντηρημένο και πρόκειται για την παλλίνδρομη αλληλουχία 5 TGA G / C TCA 3 (Lee W. et al., 1987). Το ετεροδιμερές προσδένεται με μεγαλύτερη συγγένεια (κατά 10 φορές) στο στοιχείο απόκρισης σε σχέση με το ομοδιμερές. Μελέτες έχουν δείξει ότι το στοιχείο απόκρισης της AP1 αναγνωρίζεται και από την YB-1 πρωτεΐνη η oποία ρυθμίζει θετικά ή αρνητικά τα γονίδια στόχους της (Samuel S. et al., 2005) Οι παράγοντες Jun και Fos Οι μεταγραφικοί παράγοντες Jun και Fos ανήκουν στην οικογένεια πρωτεϊνών τύπου φερμουάρ λευκίνης (bzip) οι οποίες αποτελούνται από μία βασική περιοχή 57

74 Εισαγωγή πρόσδεσης στο DNA αμινοτελικά μιας υδρόφοβης α-έλικας. Η περιοχή τύπου φερμουάρ λευκίνης περιλαμβάνει μια αλληλουχία αμινοξέων, στην οποία σε κάθε έβδομη θέση, βρίσκεται ένα κατάλοιπο λευκίνης (Landshultz WH et al., 1988). Το φερμουάρ λευκίνης ενός πολυπεπτιδίου αλληλεπιδρά με αυτό ενός άλλου σχηματίζοντας ένα διμερές (εικόνα 1.38) (Lewin, Genes VIII έκδοση). Οι Jun πρωτεΐνες έχουν τη δυνατότητα να ομοδιμερίζονται και να ετεροδιμερίζονται με τις Fos ενώ οι Fos πρωτεΐνες δεν έχουν την ικανότητα ομοδιμερισμού (Halazonetis T. et al., 1988). Το σύμπλεγμα AP1 δεν περιορίζεται στο σχηματισμό του μόνο από τα διμερή Jun και Fos καθώς συγκεκριμένοι παράγοντες Jun και Fos δύνανται να σχηματίζουν ετεροδιμερή και με άλλες πρωτεΐνες της μορφής bzip ή όχι. Τέτοιες οικογένειες πρωτεϊνών είναι οι εξής: Πρωτεΐνες οικογένειας bzip : ATF, MAF και NF-E2 (CNC) Οικογένειες πρωτεϊνών χωρίς bzip περιοχή : NFAT, Ets, Smad, Τα διαφορετικά AP-1 διμερή διαφοροποιούνται και ως προς την ικανότητα πρόσδεσης στο στοιχείο απόκρισης και ως προς τη συγγένειά τους με αυτό. Για παράδειγμα το ετεροδιμερές Jun/Fos προσδένεται στο στοιχείο 5 -TGA(G/C)TCA-3 γνωστό ως στοιχείο απόκρισης του TPA (12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate) ή στοιχείο TRE (TPA Response Element) ή AP1 στοιχείο. Αντίθετα, το ετεροδιμερές Jun/ATF αναγνωρίζει το στοιχείο 5 -TGACGTCA-3 γνωστό ως στοιχείο απόκρισης του κυκλικού AMP (CRE) (Nakabeppu et al., 1988; Rauscher et al., 1988). Η μεγάλη συχνότητα με την οποία απαντάται το AP1 στοιχείο απόκρισης στο γονιδίωμα δεν συνεπάγεται ότι οι Jun και Fos πρωτεΐνες ρυθμίζουν όλα αυτά τα γονίδια. Αντίθετα μάλιστα πολλά γονίδια που αποτελούν ρυθμιστικούς στόχους των παραγόντων αυτών δεν περιλαμβάνουν το συντηρημένο AP1 στοιχείο στη ρυθμιστική τους περιοχή (Chinenov Yet al., 2001). Εικόνα 1.38: Οι βασικές περιοχές του μοτίβου bzip συγκρατούνται μαζί εξαιτίας του διμερισμού του παρακείμενου φερμουάρ, καθώς οι υδρόφοβες επιφάνειες των δύο φερμουάρ λευκίνης αλληλεπιδρούν σε παράλληλη διάταξη. Lewin, Genes VIII O ρόλος τους στη ρύθμιση των γονιδίων στόχων ελέγχεται από τμήματα της πολυπεπτιδικής αλυσίδας που βρίσκονται εκτός της βασικής περιοχής πρόσδεσης στο 58

75 Εισαγωγή DNA και του φερμουάρ λευκίνης και αποκαλούνται ενεργοποιητικές περιοχές (HOB, Homology Box Regions). Ο παράγοντας c-fos περιέχει τρεις τέτοιες περιοχές ενώ ο c-jun, δύο. Επίσης απαντώνται και κατασταλτικές περιοχές στην πολυπεπτιδική αλυσίδα του c-fos. Η φωσφορυλίωση συγκεκριμένων αμινοξικών καταλοίπων των περιοχών αυτών άλλοτε επάγει και άλλοτε καταστέλλει την ενεργοποιητική δράση των παραγόντων Jun και Fos (Foletta V. et al., 1996). Οι παράγοντες Jun και Fos έχουν κυτταρικές και ιϊκές ομόλογες πρωτεΐνες. Οι c-jun και c-fos αποτελούν τους κυτταρικούς παράγοντες ενώ οι v-jun και v-fos τους ομόλογους στον ιό του σαρκώματος του ποντικού αντίστοιχα (Maki Y. et al., 1987). Τα ιϊκά ομόλογα δρουν ως ογκοπρωτεΐνες. Το γονιδίωμα του ποντικού περιέχει μια οικογένεια συγγενικών γονιδίων jun: το c-jun, το junb και jund (Ryder K. et al, 1989, Hirai SI et al., 1989). Αντίστοιχα η οικογένεια των γονιδίων fos περιλαμβάνει τέσσερα μέλη: τα c- fos, fosb (Zerial M. et al., 1989), fos related antigen 1 (fra-1) (Cohen DR et al., 1988) και fos related antigen 2 (fra-2) (Nishina H. et al., 1990) Ο παράγοντας Jun στον αχινό S.purpuratus Ελάχιστα είναι γνωστά για τον παράγοντα AP1 στον αχινό. Οι μόνες πληροφορίες που υπάρχουν έχουν εξαχθεί από πειράματα in situ υβριδοποίησης και σχετίζονται με το πρότυπο έκφρασης του παράγοντα Jun στο έμβρυο του αχινού S.purpuratus. Όπως φαίνεται στην εικόνα 1.39 το μετάγραφο Jun ανιχνεύεται σε όλο το έμβρυο στα πρώϊμα στάδια ανάπτυξης και περιορίζεται στα πρωτογενή μεσεγχυματικά κύτταρα και στους απογόνους τους από το στάδιο της έναρξης της γαστριδίωσης κι έπειτα (Ashby M. et al., 2006). Εικόνα 1.39 Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του Sp-Jun όπως προκύπτει από πειράματα in situ υβριδοποίησης. Ashby M., et al.,

76 Εισαγωγή 1.6 Οι μεταγραφικοί παράγοντες ETS Μορφή και λειτουργία Οι ETS μεταγραφικοί παράγοντες απαρτίζουν μία οικογένεια συντηρημένη στην εξέλιξη, με χαρακτηριστική την επικράτεια πρόσδεσης στο DNA, γνωστή ως ETS περιοχή. Το πρώτο μέλος της οικογένειας, αποτελεί το v-ets (E twenty six), το οποίο ανακαλύφθηκε το 1983 στο ρετροϊό Ε26 με τη μορφή ενός σύνθετου gag-mybets ογκογονιδίου που ευθύνεται για την εμφάνιση της ερυθροβλαστικής και μυελοβλαστικής λευχαιμίας στην όρνιθα (Leprince et al., 1983; Klempnauer and Bishop, 1984; Hollenhorst et al.,2004). Αργότερα ανακαλύφθηκαν και οι ομόλογες κυτταρικές πρωτεΐνες (Leprince et al., 1983). Απαντώνται σε όλα τα μετάζωα (Graves and Petersen, 1998; Dednan et al. 1993a, b) με καλύτερα μελετημένους τους παράγοντες των σπονδυλωτών. Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωριστεί 27 μέλη στον άνθρωπο (Hollenhorst et al., 2004), 26 μέλη στον ποντικό (Galang et al. 2004), 10 στον Ceanorhabditis elegans (Hart et al. 2000a, b), 8 στη Drosophila melanongaster (Hsu and Schultz, 2000) και 14 στη Ciona intestinalis (Leveugle et al. 2004; Yagi et al., 2003). Δύο είναι οι πιο σημαντικές και εξαιρετικά συντηρημένες περιοχές των παραγόντων αυτών: α) Η περιοχή ETS μέσω της οποίας προσδένονται στο DNA και β) Η Pointed περιοχή (PNT), που απαντάται μόνο στο 1/3 των μελών όπως φαίνεται στον πίνακα 5, μέσω της οποίας αλληλεπιδρούν με άλλες πρωτεΐνες. Η ETS περιοχή βρίσκεται στο καρβοξυτελικό ή σπανιότερα στο αμινοτελικό άκρο της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και είναι της μορφής winged Έλικα Στροφή Έλικα και αποτελείται από 3 α-έλικες και 4 β-φόρμες (εικόνα 1.40). Εικόνα 1.40 Γενική δομή των Ets πρωτεϊνών. a) a1:πράσινο, a2: μωβ, a3: μπλε, β φόρμες: μπλε. b) Διάγραμμα της δομής των Ets πρωτεϊνών. α έλικες: κόκκινες και β-θηλειές κίτρινες.wang et al

77 Εισαγωγή Πίνακας 1.5 SUBGROUP GENE PNT DOMAIN ACTIVATOR (A) OR REPRESSOR (R) ELF ELF1 A MEF A NERF A / R ELK ELK1 A / R (or TCF) NET R / A SAP1 A ER71 ER71 A# ERF ERF R PE1 A* ERG ERG YES A FEV R^ FLI1 YES A ESE ESE1 YES A / R ESE2 YES A / R ESE3 YES A / R ETS ETS1 YES A ETS2 YES A GABP GABPα YES A PDEF PDEF YES A PU1/SPI PU.1 A SPIB A SPIC A PEA3 E1AF A ER81 A ERM A TEL TEL YES R TEL2 YES R Πίνακας 1.5. Καταμερισμός των ets γονιδίων των διαφόρων υποοικογενειών στον άνθρωπο. Sharrocks 2001; Hollenhorst et al., 2004; *(Bidder et al., 2000); #(De Haro and Janknecht, 2005); ^ (Maurer et al., 2003). Η PNT περιοχή βρίσκεται πάντα στο αμινοτελικό άκρο και έχει τη μορφή Έλικα Θηλειά-Έλικα. Όλα τα μέλη της οικογένειας αναγνωρίζουν μέσω της περιοχής ETS ένα στοιχείο απόκρισης, το στοιχείο πρόσδεσης Ets (EBS, Ets Binding Site), μήκους 10bp, με αλληλουχία πυρήνα GGAA/T. Τα νουκλεοτίδια πέριξ του πυρήνα δεν είναι σταθερά και καθορίζουν την ειδικότητα πρόσδεσης των διαφόρων Ets παραγόντων (Woods et al., 1992). 61

78 Εισαγωγή Τα περισσότερα μέλη ρυθμίζουν θετικά τα γονίδια στόχους τους, κάποια ωστόσο έχουν αρνητική δράση και κάποια άλλα θετική και αρνητική όπως φαίνεται στον πίνακα 1.5 (Sharrocks et al., 2001; Oikawa and Yamada, 2003; Mavrothalassitis and Ghysdael, 2000). Οι παράγοντες ETS διαδραματίζουν σπουδαίο ρόλο σε μια πληθώρα κυτταρικών διεργασιών όπως στην ανάπτυξη, την αύξηση, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση και την καρκινογένεση (Bassuk and Leiden, 1997; Dittmer and Nordheim, 1998; Graves and Petersen, 1998; Sharrocks et al., 1997; Wasylyk et al., 1998) Καθορισμός της λειτουργικότητας των ETS παραγόντων Η λειτουργικότητα των ETS παραγόντων ρυθμίζεται σε διάφορα επίπεδα. Πολλοί από τους παράγοντες αυτούς είναι οι τελικοί στόχοι μιας πλειάδας εξωκυτταρικών μηνυμάτων που μεταφέρονται μέχρι τον πυρήνα με αποτέλεσμα τη φωσφορυλίωσή τους. Έτσι, καθορίζεται η αλληλεπίδρασή τους με άλλες πρωτεΐνες, η πρόσδεσή τους στο DNA και η τοποθέτησή τους στον πυρήνα του κυττάρου (Yordy and Muise-Helmericks, 2000; Tootle and Rebay, 2005). Η φωσφορυλίωση άλλοτε επάγει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων και άλλοτε την καταστέλλει. Συνήθως όμως έχει επαγωγική δράση και στις περισσότερες περιπτώσεις πραγματοποιείται μέσω του μονοπατιού των Ras / MAP κινασών. Πέραν της φωσφορυλιώσεως υφίστανται και άλλες μετα μεταφραστικές τροποποιήσεις όπως γλυκοζυλίωση, ουμπικουϊτινίωση και ακετυλίωση. Πολύ σημαντική επίσης στην ενεργοποίηση ή την καταστολή των γονιδίων στόχων τους είναι και η PNT περιοχή η οποία σε άλλους παράγοντες έχει θετική και Εικόνα 1.41 Ο υποκινητής MMP. Oikawa and Yamada,2003 σε άλλους αρνητική δράση. Η ρυθμιστική δραστηριότητα των ETS παραγόντων βασίζεται επίσης στις αλληλεπιδράσεις τους με άλλες πρωτεΐνες (Li et al., 2000). Οι πρωτεΐνες αυτές μπορεί να έχουν το ρόλο μεταγραφικών παραγόντων ή 62

79 Εισαγωγή συνενεργοποιητών ή καταστολέων. Το αποτέλεσμα της συνεργασίας καθορίζει τη θέση πρόσδεσης στο DNA, τον ενδοκυττάριο καταμερισμό τους και τη μεταγραφική τους ενεργότητα (Li et al., 2000; Verger and Duterque-Coquillaud, 2002). Πολύ συχνή είναι η αλληλεπίδρασή τους με τον παράγοντα AP1, όπως συμβαίνει για παράδειγμα στο γονίδιο της ιστικής μεταλλοπρωτεϊνάσης Ι που ευθύνεται για την αναγέννηση των ιστών και την ογκογένεση (Logan et al., 1996). Η μεταγραφή του γονιδίου επάγεται με τη συνεργατική αλληλεπίδραση των ETS, AP1 και CBP/P300 που δρα ως συνενεργοποιητής όπως φαίνεται στην εικόνα Επίσης ο AP1 αλληλεπιδρά άμεσα και με άλλα μέλη της οικογένειας ETS, όπως αποδεικνύουν in vitro πειράματα. Τέτοια μέλη είναι οι Erg (Buttice et al., 1996), Erm (ή PEA3) (Nakae et al., 1995), Elf και Fli (Bassuk and Leiden, 1995) Οι παράγοντες Pea και Elk στον αχινό Οι παράγοντες Pea και Elk αποτελούν δύο μέλη της οικογένειας των ETS παραγόντων. Πληροφορίες μέχρι σήμερα γι αυτούς υπάρχουν μόνο από πειράματα στο είδος S.purpuratus. Στον αχινό S.purpuratus απαντάται μόνο ένα μέλος της ομάδας των Pea πρωτεϊνών. Η πολυπεπτιδική του αλυσίδα αποτελείται από τέσσερεις εξαιρετικά συντηρημένες περιοχές: την ETS μέσω της οποίας προσδένεται στο DNA, μία όξινη περιοχή κοντά στο αμινοτελικό άκρο, και δύο κατασταλτικές περιοχές εκατέρωθεν της ETS. Λειτουργική ανάλυση της πρωτεΐνης έδειξε ότι πρόκειται για θετικό ρυθμιστή των γονιδίων στόχων της (de Launoit et al., 2000), με σημαντική τη δράση της όξινης περιοχής που δρά σαν πολύ ισχυρός ενεργοποιητής. Όπως φαίνεται από πειράματα qpcr (εικόνα 1.42) ο παράγοντας SpPea ξεκινά ως μητρικής προέλευσης και ο αριθμός των μεταγράφων του αυξάνει συνεχώς μέχρι το μέσο του σταδίου της γαστριδίωσης (40h). Με την ολοκλήρωση της γαστριδίωσης ξεκινά η υποχώρηση των μεταγράφων του ως το τέλος της εμβρυογένεσης (Rizzo F. et al. 2006). 63

80 Εισαγωγή Εικόνα 1.42 Χρονοειδικό πρότυπο έκφρασης του Sp-Pea όπως προκύπτει από πειράματα qpcr. Rizzo F. phd Πειράματα in situ υβριδοποίησης (εικόνα 1.43) έδειξαν ότι το mrna του SpPea δεν ανιχνεύεται ως το στάδιο του βλαστιδίου (21h). Το ενδογενές γονίδιο ξεκινά να εκφράζεται στο μέσο της γαστριδίωσης (36h), στο άκρο του αρχεντέρου και στις 48 ώρες διατηρεί την έκφρασή του στο αρχέντερο αλλά και στο στοματικό εξώδερμα καθώς και στην κορυφαία πλάκα. Στις 72 ώρες όπου ξεκινά η μείωση των μεταγράφων όπως φαίνεται από τα πειράματα με qpcr, το ενδογενές γονίδιο εκφράζεται σε δύο σειρές κυττάρων στην κορυφαία πλάκα και στο έντερο όπου και Εικόνα 1.43 Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του Sp-Pea όπως προκύπτει από πειράματα in situ υβριδοποίησης. Rizzo F. phd 64

81 Εισαγωγή παραμένει και στις 88 ώρες. Ο παράγοντας Elk είναι εξαιρετικά σημαντικός για την επιβίωση του εμβρύου καθώς εμπλέκεται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Sharrocks, 2001; Zhong et al., 2007), την απόπτωση (Townsend et al., 1999; Vickers et al., 2004), την κυτταρική μετανάστευση (Buchwalter et al., 2005) και την κυτταρική διαφοροποίηση (Beitel et al., 1995; Vanhoutte et al., 2001). Αποτελείται από τέσσερεις συντηρημένες περιοχές: την ETS περιοχή, την περιοχή B, μέσω της οποίας αλληλεπιδρά με άλλες πρωτεΐνες όπως τον παράγοντα απόκρισης στον ορό (SRF; Serum Response Factor) (Dalton and Treisman, 1992; Janknecht et al., 1994; Hill et al., 1993; Price et al., 1995; Giovane et al., 1994; Lopez et al., 1994; Shore and Sharrocks, 1994), την περιοχή C που δρα ως ενεργοποιητής της μεταγραφής των γονιδίων στόχων (Janknecht et al., 1994; Marais et al., 1993) και τη D περιοχή που συμμετέχει στη φωσφορυλίωση του ELK μέσω του μονοπατιού των MAP κινασών και επάγει την ενεργοποίησή του (Yang et al., 1998a; Yang et al., 1998b). Στον αχινό ο SpElk απαντάται στο αυγό ως μητρικής προέλευσης σε πολύ χαμηλά επίπεδα. To ζυγωτικής προέλευσης mrna ξεκινά να ανιχνεύεται 10 ώρες Εικόνα 1.44 Χρονοειδικό πρότυπο έκφρασης του Sp-Elk όπως προκύπτει από πειράματα qpcr. Rizzo F. phd 65

82 Εισαγωγή μετά τη γονιμοποίηση και φτάνει τα υψηλότερα επίπεδα στις 14 ώρες. Από αυτό το στάδιο και έπειτα μειώνεται μέχρι το στάδιο των 72 ωρών όπου και παρατηρείται και πάλι μία αύξηση όπως φαίνεται στην εικόνα Πειράματα in situ υβριδοποίησης (εικόνα 1.45) έδειξαν ότι το ενδογενές SpElk mrna ανιχνεύεται διάχυτα στο έμβρυο στο στάδιο των 5 και 13 ωρών μετά τη γονιμοποίηση. Στο μεσεγχυματικό βλαστίδιο (24h) ανιχνεύεται έντονα στη φυτική πλάκα ενώ στο πρώϊμο γαστρίδιο (40h) στο έντερο. Στο ώριμο γαστρίδιο (48h) εντοπίζεται στο στοματικό εξώδερμα και στο έντερο και κυρίως στη στοματική περιοχή και στην κορυφή του αρχεντέρου. Εικόνα 1.45 Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του Sp-Elk όπως προκύπτει από πειράματα in situ υβριδοποίησης. Rizzo F. et al

83 Εισαγωγή 1.7 Οι μεταγραφικοί παράγοντες Otx Τα γονίδια otx απαντώνται σε όλα τα μετάζωα, από την ύδρα μέχρι τα ανώτερα θηλαστικά και τον άνθρωπο. Η εξάπλωση των γονιδίων αυτών στα μετάζωα φαίνεται στην εικόνα Οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούν (Orthodenticle related proteins) είναι μεταγραφικοί παράγοντες που διαδραματίζουν κυρίαρχο ρόλο στην ανάπτυξη της κεφαλής και του κεντρικού νευρικού συστήματος (Klein W and Li X., 1999). Ο πρώτος αντιπρόσωπος των πρωτεϊνών αυτών περιγράφηκε στη Drosophila και είναι η πρωτεΐνη OTD (Orthodenticle) η οποία πρωτοχαρακτηρίστηκε πραγματοποιώντας μεταλλάξεις στο γονίδιο, οι οποίες επηρέαζαν το νευρικό σύστημα της Drosophila (Finkelstein R. et al., 1990). Εικόνα 1.46 Εξάπλωση των otx γονιδίων στα διάφορα φύλα. Οι πρωτεΐνες Otx είναι μεταγραφικοί παράγοντες που προσδένονται στο DNA μέσω μιας εξαιρετικά συντηρημένης ομοιοτικής περιοχής η οποία φέρει μία λυσίνη 67

84 Εισαγωγή στη θέση 9 της έλικας αναγνώρισης της DNA αλληλουχίας (Mau G. et al., 1995). Η παρουσία της λυσίνης στη θέση αυτή είναι ασυνήθης και ευθύνεται για την ειδικότητα με την οποία οι πρωτεΐνες Otx προσδένονται στην αλληλουχία TAATCC/T (Hanes S. D. et al., 1989; Hanes S. D. et al., 1991). Στην ίδια αλληλουχία προσδένονται και άλλες ομοιοτικές πρωτεΐνες όπως οι goosecoid και bicoid (Mau L. G.. et al., 1995; Hanes S. D. et al., 1989, Hanes S. D. et al., 1991;). Η πρόσδεσή τους στα στοιχεία απόκρισης επάγει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων (Finkelstein R. et al. 1994) και φαίνεται να δρουν ως μονομερή στην επίτευξη της μεταγραφικής επαγωγής, χωρίς ωστόσο να αποκλείεται η συνεργασία τους με άλλους συνενεργοποιητές (Klein W. et al. 1999) Οι παράγοντες Otx στον αχινό Οι παράγοντες Otx έχουν μελετηθεί διεξοδικά στον αχινό και συγκεκριμένα στο είδος S.purpuratus. Το γονιδίωμα του αχινού αυτού περιλαμβάνει ένα μόνο οtx γονίδιο με πολλαπλά σημεία έναρξης της μεταγραφής. Όπως φαίνεται στην εικόνα 1.47 το γονίδιο παράγει τέσερα διαφορετικά mrnas, τα α, β1/2 και β3 και κωδικοποιεί δύο πρωτεΐνες τις Otx(α) και Otx(β) ως αποτέλεσμα εναλλακτικού ματίσματος (Li X. et al., 1997; Kiyama T. et al., 1998; Mitsunaga Nakatsubo K. et al., 1998). Εικόνα 46 Εξάπλωση των Otx γονιδίων στα διάφορα φύλα. Εικόνα 1.47 Τα μετάγραφα του γονιδίου otx. Yuh et al.,

85 Εισαγωγή Με πειράματα in situ υβριδοποίησης παρατηρήθηκε ότι: το μετάγραφο α στα πρώϊμα στάδια είναι μητρικής προέλευσης και ανιχνεύεται σε όλο το έμβρυο. Από το στάδιο του βλαστιδίου και μετά είναι ζυγωτικής προέλευσης και εντοπίζεται στο ενδόδερμα (εικόνα 1.48 A) (Yuh et al. 2002), και στο στοματικό εξώδερμα (Li et al. 1997). Από το στάδιο των 24 ωρών και μετά το μετάγραφο δεν ανιχνεύεται. Το μετάγραφο β1/2 είναι μόνο ζυγωτικής προέλευσης και αρχίζει να ανιχνεύεται από το στάδιο του βλαστιδίου. Στα πρώτα στάδια εντοπίζεται στο ενδόδερμα και στο στοματικό εξώδερμα του εμβρύου (εικόνα 1.48 B-D) και στον πλουτέα εντοπίζεται στη βλεφαριδωτή ζώνη και στο έντερο (εικόνα 1.48 E-F) (Yuh et al. 2002). Το β3 μετάγραφο ξεκινά να εκφράζεται από το στάδιο των 10 ωρών διάχυτα στο έμβρυο. Εξακολουθεί να εκφράζεται διάχυτα και στο στάδιο των 17 ωρών (εικόνα 1.48 G), ενώ από εκεί και μετά ξεκινά να εκφράζεται μόνο στη φυτική πλάκα (εικόνα 1.48 H, I). Στην αρχή της γαστριδίωσης περιορίζεται στο αναπτυσσόμενο αρχέντερο και στο εξώδερμα της μίας πλευράς του εμβρύου, που καθορίζει το πιθανό μελλοντικό στοματικό εξώδερμα (εικόνα 1.48 I) (Yuh et al. 2002). Από τη χρονική αυτή στιγμή κι έπειτα η έκφρασή του μειώνεται και παύει να ανιχνεύεται από το στάδιο του πρίσματος και μετά (Yuh et al. 2002). Η έκφραση του otx στο στοματικό εξώδερμα και στο ενδόδερμα στο στάδιο του γαστριδίου έχει επιβεβαιωθεί με παρόμοια πειράματα και στο είδος P.lividus (εικ.1.48 J) (Saudemont A.et al. 2010). Η χρονική έκφραση των μεταγράφων Otxα και Otxβ φαίνεται καθαρά στην εικόνα 1.49 που προέκυψε με πειράματα ανάλυσης προστασίας από την RNAse. Τα α μετάγραφα ανιχνεύονται πριν τη γονιμοποίηση, τετραπλασιάζονται κατά την αυλάκωση (1 με 12 ώρες μετά τη γονιμοποίηση) και μετά ελαττώνονται σημαντικά. Αντίθετα, τα β μετάγραφα δεν ανιχνεύονται στο ωοκύτταρο αλλά ξεκινούν να συσσωρεύονται στα πρώΐμα στάδια της αυλάκωσης (4 ώρες). Η μέγιστη συγκέντρωσή τους ανιχνεύεται στο πρώΐμο γαστρίδιο (36 ώρες) και παραμένουν σε αυτά τα επίπεδα ως το τέλος της εμβρυογένεσης (Li et al.1997). 69

86 Εισαγωγή Καθώς ο αχινός δεν έχει πρόσθιες δομές ή κεφάλι, η Otx πρωτεΐνη έχει αναλάβει άλλο ρόλο. Συγκεκριμένα, η Otx (α) πρωτεΐνη εμπλέκεται στην ιστοειδική και χρονική επαγωγή του χαρακτηριστικού α) για το ενδόδερμα γονιδίου endo16 και β) για το αντιστοματικό εξώδερμα, γονιδίου Spec2a. Επίσης, έχει βρεθεί ότι ο τρόπος με τον οποίον εμπλέκεται στον καθορισμό του ενδομεσοδέρματος είναι μέσω του μονοπατιού Wnt β κατενίνης. J Εικόνα 1.48 A-I) Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του γονιδίου otx όπως προκύπτει από πειράματα in situ υβριδοποίησης στο είδος S.purpuratus. Yuh et al J) Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του otx όπως προκύπτει από πειράματα in situ υβριδοποίησης στο είδος P.lividus. Saudemont et al G: Γαστρίδιο, lv: πλευρική όψη. 70

87 Εισαγωγή Εικόνα 1.49 Χρονικό πρότυπο έκφρασης των μεταγράφων του Sp-Otx όπως προκύπτει από πειράματα ανάλυσης προστασίας από την RNAse. Li et al Πειράματα στα οποία χρησιμοποιήθηκε η κατασταλτική περιοχή της πρωτεΐνης Engrailed συνδεδεμένη με την ομοιοεπικράτεια της περιοχής του SpOtx, έδειξαν ένα ουσιώδη ρόλο του SpOTX(α) στο σχηματισμό του ενδοδέρματος και του αντιστοματικού εξωδέρματος. Συγκεκριμένα, τα έμβρυα που εκφράζουν τη συγκεκριμένη χιμαιρική πρωτεΐνη δεν σχημάτισαν έντερο και κύτταρα του αντιστοματικού εξωδέρματος (εικ. 1.50) (Li et al. 1999). Εικόνα 1.50 A) Μη ενεμένο έμβρυο όπου φαίνεται το αρχέντερο και το στοματικό εξώδερμα (βέλος). Β) Ενεμένο έμβρυο με το χιμαιρικό RNA που φέρει την ομοιοεπικράτεια του Otx με μεταλλαγμένη τη Lys της θέσης 9 και την κατασταλτική Engrailed περιοχή (Li et al. 1999). 71

88 Εισαγωγή 1.8 Τεχνητή γονιμοποίηση και δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού με τη μέθοδο των μικροενέσεων Το αυγό του αχινού αποτελεί το πρώτο μεταξύ όλων των θαλάσσιων οργανισμών στο οποίο πραγματοποιήθηκε εισαγωγή εξωγενούς DNA με τη μέθοδο των μικροενέσεων και δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων (εικόνα 1.51). Για τη διαδικασία αυτή πραγματοποιείται πρώτα τεχνητή γονιμοποίηση των αυγών και ακολούθως έναρξη των ενέσεων, ή το αντίστροφο. Στη διάρκεια μιας ώρας είναι δυνατόν να ενεθούν αυγά (McMahon A. et al., 1984). Η διαδικασία των αυλακώσεων στα αρχικά στάδια πραγματοποιείται στα καθηλωμένα, στο τρυβλίο, έμβρυα. Στο στάδιο του βλαστιδίου ωστόσο τα έμβρυα παράγουν το ένζυμο εκκόλαψης το οποίο διασπά τη μεμβράνη γονιμοποίησης και ξεκινούν να κολυμπούν στο τρυβλίο ως εκκολαπτόμενα βλαστίδια. Έχει παρατηρηθεί ότι τα διαγονιδιακά έμβρυα αναπτύσσονται με βραδύτερο ρυθμό σε σχέση με τα μη ενεμένα καθώς και ότι μικρότερος αριμός αυτών επιβιώνει είτε λόγω των μικροχειρισμών, είτε λόγω της παρουσίας του εξωγενούς DNA. Μάλιστα, ένεση διαλύματος DNA με συγκέντρωση ίση ή μεγαλύτερη των 320μg/ml αποδεικνύεται εξαιρετικά τοξική για την ανάπτυξη των γονιμοποιημένων εμβρύων (McMahon A. et al., 1984). Τα εξωγενή μόρια εισάγονται στο κυτταρόπλασμα κάθε γονιμοποιημένου ή αγονιμοποίητου αυγού. Εκεί με τη δράση ενδογενούς λιγάσης ενώνονται το ένα μετά το άλλο σε ακόμη μεγαλύτερα μόρια σε διάστημα λίγων λεπτών από τη στιγμή της ένεσης. Κατά τη μιτωτική διαίρεση των Εικόνα 1.51 Μικροενέσεις σε έμβρυα αχινού. a) Aγονιμοποίητα αυγά καθηλωμένα σε τρυβλίο petri. Στην επιφάνεια του αυγού φαίνεται η βελόνα, b) Αυγό τη στιγμή της ένεσης, c) Μικροενεμένα γονιμοποιημένα αυγά d) Αυγά μετά τις αρχικές αυλακώσεις που δεν έχουν ακόμη εκκολαφθεί. McMahon et al

89 Εισαγωγή κυττάρων τα μόρια εισάγονται εντός των πυρήνων και ενσωματώνονται τυχαία στο ενδογενές γενετικό υλικό σε θέσεις που υπάρχουν ρήγματα, και αντιγράφονται με τη δράση της DNA πολυμεράσης. Στον αχινό η ενσωμάτωση του ενεμένου DNA επιτυγχάνεται μόνο με τη χρήση γραμμικών μορίων. Τελικά, ως το στάδιο του βλαστιδίου, παράγεται ένας πολύ μεγάλος αριθμός αντιγράφων του εξωγενούς μορίου ο οποίος διατηρείται μέχρι και το στάδιο της λάρβας (Flytzanis C. et al., 1985). Τα διαγονιδιακά έμβρυα που προκύπτουν με αυτόν τον τρόπο είναι μωσαϊκά καθώς ο αριθμός των κυττάρων που περιέχει το εξωγενές DΝΑ εξαρτάται από το στάδιο που αυτό θα ενσωματωθεί στο γονιδίωμα (Flytzanis C. et al., 1985). 1.9 Η χρήση των γονιδίων αναφοράς στη μελέτη των cis ρυθμιστικών στοιχείων Τα γονίδια αναφοράς χρησιμοποιούνται ευρέως σε κυτταροκαλλιέργειες και έμβρυα προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος ρυθμιστικών στοιχείων σημαντικών για την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Τα περισσότερα γονίδια αναφοράς έχουν απομονωθεί από προκαρυωτικούς οργανισμούς και κωδικοποιούν πρωτεΐνες που δεν απαντώνται σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Για περισσότερο από τρεις δεκαετίες το έμβρυο του αχινού αποτελεί σύστημα μοντέλο για τη μελέτη γονιδιακής ρύθμισης στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια. Η μελέτη επιτυγχάνεται με ένθεση τμήματος DNA σε έναν πλασμιδιακό φορέα ανοδικά ενός γονιδίου αναφοράς. Μετά την εισαγωγή της κατασκευής εντός των αυγών ο ρυθμιστικός του ρόλος εκτιμάται βάσει του ποσοτικού και ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του εκάστοτε γονιδίου αναφοράς στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια. Κάποια γονίδια αναφοράς είναι πιο ειδικά για ποσοτικές και κάποια άλλα για ιστοειδικές αναλύσεις. Ιδιαίτερη προσοχή δίνεται στην επιλογή του γονιδίου αναφοράς στην περίπτωση που μελετάται το χρονικό μοντέλο ρύθμισης ενός γονιδίου, δηλαδή το αναπτυξιακό στάδιο που ενεργοποιείται ή καταστέλλεται το γονίδιο αυτό. Σε αυτές τις περιπτώσεις προτιμούνται γονίδια αναφοράς που παράγουν ασταθή προϊόντα ώστε η παρουσία τους να υποδεικνύει μόνο το αναπτυξιακό στάδιο ενεργοποίησης του γονιδίου. 73

90 Εισαγωγή Η χρήση της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) ως γονίδιο αναφοράς Από το 1997 η πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) που έχει απομονωθεί από την υδρομέδουσα Aqueora victoria, χρησιμοποιείται ευρέως ως γονίδιο αναφοράς σε πειράματα που λαμβάνουν χώρα στο έμβρυο του αχινού και στη λάρβα (εικόνα 1.52 Α, Β) (Arnone I. et al., 1997). Το γονίδιο της gfp κωδικοποιεί μια φυσικά φθορίζουσα πρωτεΐνη που δεν απαιτεί υποστρώματα για την ανίχνευσή της. Α) Β) Εικόνα 1.52 Α) Η πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) στην Υδρομέδουσα Aequorea Victoria. Β) Αποτελέσματα φθορισμού μετά από ένεση μιας κατασκευής που φέρει τη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου της ακτίνης CyIIa στο στάδιο του πλουτέα, όπου ανιχνεύεται φθορισμός στα σκελετογόνα μεσεγχυματικά κύτταρα. Το πλασμίδιο GreenLantern χρησιμοποιήθηκε σε πειράματα με έμβρυα αχινού και φέρει το αρχικό γονίδιο της GFP χωρίς μεταλλάξεις (Arnone I. et al., 1997). H GFP που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματά μας είναι η ίδια με αυτή του πλασμιδίου Green Lantern με τη διαφορά ότι φέρει μία μετάλλαξη στη θέση 65 όπου μία σερίνη μεταλλάχθηκε σε θρεονίνη με σκοπό την ενίσχυση του φθορισμού της στα 510nm. H χρήση της GFP ως γονίδιο αναφοράς έχει πολλά πλεονεκτήματα: Επιτρέπει την ανίχνευση του φθορισμού σε ζωντανά έμβρυα και νύμφες 74

91 Εισαγωγή αχινού. Διαχέεται εύκολα μεταξύ κυττάρων που συνδέονται μεταξύ τους με κυτταροπλασματικά κανάλια αναδεικνύοντας έτσι την επικοινωνία τους. Για πρώτη φορά μπορούν να μελετηθούν μετεμβρυϊκά στάδια όπως αυτό της λάρβας καθόσον η GFP μπορεί να παρατηρηθεί και σε αυτά τα στάδια ανάπτυξης. Μπορεί να παρατηρηθεί σε όλες τις περιοχές του εμβρύου. Εμφανίζει μεγαλύτερη ευαισθησία σε σχέση με άλλες πρωτεΐνες αναφοράς, όπως είναι το ένζυμο CAT. Ένα μειονέκτημα στη χρήση της GFP είναι ότι πρόκειται για σταθερή πρωτείνη. Έτσι, η ανίχνευση φθορισμού σε ένα αναπτυξιακό στάδιο είναι δυνατό να αντιπροσωπεύει την έκφραση φθορισμού και σε προηγούμενα αναπτυξιακά στάδια. Δηλαδή, δεν ευνοεί πάντοτε τη χρονοειδική μελέτη έκφρασης. 75

92 Εισαγωγή ΣΚΟΠΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Σκοπός της παρούσης Διατριβής είναι η λειτουργική ανάλυση της cis ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου PlCoup-TF. Aπό πειράματα in situ υβριδοποίησης στον αχινό, βρέθηκε ότι το γονίδιο αυτό εκφράζεται στο στοματικό εξώδερμα του γαστριδίου και στη βλεφαριδωτή ζώνη του πλουτέα. Επίσης από παλαιότερα πειράματα έχει συσχετιστεί ο ρόλος του Coup-TF με τον καθορισμό του νευρικού συστήματος στον αχινό. Με την παρούσα μελέτη επιδιώχθηκε ο χαρακτηρισμός της ανοδικής περιοχής του Pl-Coup-TF και συγκεκριμένα ο εντοπισμός των ρυθμιστικών στοιχείων και των μεταγραφικών παραγόντων εκείνων, που κατευθύνουν την έκφραση του γονιδίου Coup-TF στη βλεφαριδωτή ζώνη (νευρογενής περιοχή) στον αχινό Paracentrotus lividus. Πολλά πειράματα έχουν πραγματοποιηθεί ανά τον κόσμο, με σκοπό την περιγραφή των ρυθμιστικών δικτύων του εξωδέρματος και του ενδομεσοδέρματος στον αχινό. Μέχρι στιγμής το ρυθμιστικό δίκτυο του ενδομεσοδέρματος του αχινού είναι ένα από τα καλύτερα μελετημένα μεταξύ των μεταζώων. Αντίθετα, το γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο του εξωδέρματος δεν είναι τόσο καλά μελετημένο. Η παρούσα μελέτη και συγκεκριμένα, ο χαρακτηρισμός του PlCoup-TF και των ρυθμιστών του, συμβάλλει κατ επέκταση στην προσπάθεια ολοκλήρωσης του γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου του εξωδέρματος στον αχινό. 76

93 Υλικά και μέθοδοι ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Πειραματόζωο Aχινός Paracentrotus lividus Συλλογή και συντήρηση ενήλικων ατόμων Οι αχινοί που χρησιμοποιήθηκαν ως πειραματόζωο ανήκουν στο είδος Paracentrotus lividus (P.lividus) και συλλέγονται από την περιοχή Ρίου Αχαίας. Τα ενήλικα άτομα συντηρούνται σε ενυδρείο με θαλασσινό νερό στους 13 0 C για έναν περίπου μήνα. 2.2 Συλλογή γαμετών Έγινε συλλογή θηλυκών και αρσενικών γαμετών από ενήλικα άτομα αχινού προκειμένου να χρησιμοποιηθούν σε πειράματα i) δημιουργίας διαγονιδιακών εμβρύων και ii) καλλιέργειας αχινών. Τα γυάλινα δοχεία που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το στάδιο καθαρίστηκαν μόνο με απιονισμένο νερό καθώς τα απορρυπαντικά περιέχουν φώσφορο το οποίο επηρεάζει τη φυσιολογική ανάπτυξη των εμβρύων. Τα ενήλικα άτομα δεν διακρίνονται σε θηλυκά και αρσενικά βάσει της εξωτερικής τους εμφάνισης. Η συλλογή των θηλυκών και αρσενικών γαμετών έγινε μετά από τυχαία επιλογή ατόμων και ένεση της περιστοματικής τους περιοχής με 77

94 Υλικά και μέθοδοι ποσότητα 1ml 0,5M KCl. Το KCl προκαλεί σύσπαση του μυοεπιθηλίου του τοιχώματος των γονάδων προκαλώντας ωορρηξία και εκσπερμάτιση. Ακολούθησε γρήγορη ανακίνηση των αχινών, τοποθέτησή τους με τη στοματική περιοχή προς τα κάτω και εμφάνιση των γαμετών εντός ολίγων λεπτών στην περιοχή της έδρας. Ο διαχωρισμός των γαμετών έγινε βάσει του χρώματος καθώς οι θηλυκοί γαμέτες είναι κόκκινοι ενώ οι αρσενικοί άσπροι. Η συλλογή των αυγών έγινε σε διπλά φιλτραρισμένο θαλασσινό νερό (MFSW: Milipore filtered sea water) σε ποτήρι ζέσεως των 75ml τοποθετώντας το θηλυκό άτομο έτσι ώστε η περιοχή της έδρας που φέρει τους θηλυκούς γαμέτες να βυθίζεται στο νερό (τα αυγά καθιζάνουν στον πάτο του ποτηριού λόγω βαρύτητας). Κατόπιν, το νερό αδειάζεται και αντικαθίσταται σιγά σιγά με νέο έως τα 75ml ενώ ταυτόχρονα γίνεται ανάδευση των αυγών. Ακολούθως τα αυγά φιλτράρονται από χειρουργική γάζα ώστε να συγκρατηθούν πιθανά υπολλείμματα σκελετικών στοιχείων. Η υαλώδης μεμβράνη καταστράφηκε με προσθήκη 5 σταγόνων, μετρημένων με πιπέτα Pasteur, 0,5Μ κιτρικού οξέος και το ph ρυθμίστηκε με προσθήκη 17 σταγόνων 1,5Μ Tris-HCl ph 8.0. Τέλος, τα αυγά επαναφιλτραρίστηκαν μέσω χειρουργικής μεμβράνης, με σκοπό να συγκρατηθεί στη γάζα η υαλώδης μεμβράνη. Η συλλογή του σπέρματος έγινε με Pasteur πιπέτα και διατηρήθηκε σε Eppendorf, στον πάγο. Πριν τη γονιμοποίηση το σπέρμα ενεργοποιήθηκε αραιώνοντάς το σε φιλτραρισμένο θαλασσινό νερό σε αναλογία περίπου μία σταγόνα σπέρματος ανά 4ml νερού. 2.3 Τεχνητή γονιμοποίηση και δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων Μέθοδος Για τη δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού συλλέγονται γαμέτες όπως περιγράφηκε προηγουμένως Συλλογή γαμετών. Μικρό μέρος των αυγών 78

95 Υλικά και μέθοδοι μεταφέρεται με πιπέτα Pasteur σε καλυπτρίδα και γονιμοποιείται με μικρή ποσότητα αραιωμένου σπέρματος ώστε να ελεγθεί το ποσοστό γονιμοποίησης στο μικροσκόπιο. Μόνο τα αυγά που γονιμοποιούνται σε ποσοστό μεγαλύτερο του 95% επιλέγονται για τη συνέχιση της διαδικασίας. Κατόπιν μεταφέρονται σε δοχείο μικροσκοπικής παρακολούθησης (watch glass) και παραμένουν σε θερμοκρασία δωματίου καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος. Αντιθέτως το σπέρμα διατηρείται σε στον πάγο. Τα αυγά συλλέγονται από το watch glass κάτω από στερεοσκόπιο με πιπέτα pasteur, της οποίας η άκρη έχει λεπτυνθεί σε φλόγα, ρουφώντας τα με σωληνάκι που έχει προσαρτηθεί στο πίσω μέρος της πιπέτας. Κατόπιν, τοποθετούνται προσεχτικά το ένα πίσω από το άλλο στο καπάκι μικρών τρυβλίων petri που φέρουν φιλτραρισμένο θαλασσινό νερό και έχουν προηγουμένως επεξεργαστεί με θειϊκή πρωταμίνη 2% όπως περιγράφεται πιο κάτω. Τα αυγά έχοντας αρνητικά φορτισμένη μεμβράνη (Jaffe, 1976)προσκολλώνται στη θετικά φορτισμένη θειϊκή πρωταμίνη και έτσι καθηλώνονται στο τρυβλίο και δε μετακινούνται κατά τη διαδικασία των μικροενέσεων. Το τρυβλίο με τα αυγά μεταφέρεται στο ανάστροφο μικροσκόπιο και γίνεται η γονιμοποίηση με μία σταγόνα (μετρημένης με πιπέτας Pasteur) αραιωμένου σπέρματος (1 σταγόνα πυκνού σπέρματος αραιωμένου σε 4ml φιλτραρισμένου θαλασσινού νερού). Αμέσως ξεκινά η διαδικασία των μικροενέσεων καθώς η πάροδος του χρόνου σκληραίνει τη μεμβράνη γονιμοποίησης και καθιστά δύσκολη την είσοδο της μικροβελόνας στα αυγά. Η διαδικασία πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια μικροχειριστήρα σε ανάστροφο μικροσκόπιο Olympus. Τα διαγονιδιακά αυγά επωάστηκαν στους 18 0 C για 48 ώρες ώσπου να φτάσουν στο στάδιο του πλουτέα οπότε και παρατηρήθηκε το πρότυπο έκφρασης της GFP στο μικροσκόπιο φθορισμού. 79

96 Υλικά και μέθοδοι Υλικά Τρυβλία με Θειϊκή Πρωταμίνη Τα καπάκια από τα μικρά τρυβλία petri επεξεργάζονται με Θειϊκή Πρωταμίνη 2% πριν τη διαδικασία των ενέσεων. Τα καπάκια γεμίζονται κατά το 1/3 με διάλυμα Θειϊκής Πρωταμίνης το οποίο και παραμένει για 1 και στη συνέχεια ξεπλένονται καλά με dh 2 O. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται άλλη μία φορά και τα καπάκια αφήνονται να στεγνώσουν. Θειϊκή Πρωταμίνη 2%: Θειϊκή Πρωταμίνη: 2g 100ml ddh 2 O Αποστείρωση του διαλύματος. 2.4 Παρατήρηση των μικροενεμένων εμβρύων σε μικροσκόπιο φθορισμού Τα διαγονιδιακά έμβρυα μικροσκοπήθηκαν στο στάδιο του πλουτέα σε μικροσκόπιο φθορισμού Carl Zeiss και ελέγθηκε το πρότυπο έκφρασης της GFP. Η παρατήρηση και η λήψη φωτογραφιών έγινε σε μεγέθυνση 400Χ. 80

97 Υλικά και μέθοδοι 2.5 Καλλιέργεια εμβρύων Μέθοδος Πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες εμβρύων όγκου 500ml προκειμένου να χρησιμοποιηθούν σε πειράματα: i) in situ υβριδοποίησης ii) απομόνωσης ολικού RNA από διάφορα αναπτυξιακά στάδια και iii) απομόνωσης πυρηνικού εκχυλίσματος. Για την καλλιέργεια, συλλέγονται ωάρια με τη μέθοδο που περιγράφηκε στην προηγούμενη παράγραφο και γονιμοποιούνται τεχνητά. Όταν χρησιμοποιούνται έμβρυα από την καλλιέργεια που ανήκουν σε στάδια πρωϊμότερα του εκκολαπτόμενου βλαστιδίου, όπως σε πειράματα in situ υβριδοποίησης και απομόνωσης ολικού RNA, η γονιμοποίηση των ωαρίων γίνεται παρουσία PABA (παρα-αμινο-βενζοϊκό οξύ) 10mM ph 8.2 (προκειμένου να παραμείνει μαλακή η μεμβράνη γονιμοποίησης και να πραγματοποιούνται εύκολα οι ενέσεις). Συγκεκριμένα, τα ωάρια μεταφέρονται σε 200ml διαλύματος PABA και γονιμοποιούνται προσθέτοντας 10 σταγόνες αραιωμένου σπέρματος (1 σταγόνα σπέρματος με πιπέτα Pasteur αραιώθηκε σε 1 ml MFSW). Το διάλυμα αναδεύεται και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 10. Κατόπιν, αφαιρείται η μεμβράνη γονιμοποίησης με διήθηση του διαλύματος μέσα από μεμβράνη nitex με πόρους διαμέτρου 50μ ή μικρότερους. Ακολούθως προστίθενται 300ml MFSW και η καλλιέργεια μεταφέρεται στους 18 0 C υπό ανάδευση Υλικά Το διάλυμα PABA παρασκευάστηκε ως εξής: PABA 10mM ph 8.3 (Για 200ml δ/τος) PABA : 0.28g MFSW: 200ml 81

98 Υλικά και μέθοδοι 2.6 Απομόνωση Εκχυλίσματος Πυρηνικών Πρωτεϊνών Απομόνωση πυρήνων Η διαδικασία απομόνωσης των πυρήνων ξεκινά από μια καλλιέργεια με 1Χ10 8 έμβρυα. Τα βήματα είναι τα κάτωθι (Calzone et al., 1988 (2): ): 1. Καθίζηση των εμβρύων με φυγοκέντρηση (1500rpm, 3 ) 2. Απομάκρυνση εξωκυττάριου άλατος με επαναιώρηση του ιζήματος με 10-20x τον όγκο των εμβρύων με 1Μ κρύα γλυκόζη 3. Καθίζηση των εμβρύων με φυγοκέντρηση (2500rpm, 3 ) 4. Επαναιώρηση του ιζήματος με όγκους ως προς το ίζημα TEESSDP (Υποτονικό διάλυμα που προκαλεί διάσπαση των πυρήνων) 5. Διατήρηση στους C χωρίς απώλεια της ενεργότητάς τους 6. Σπάσιμο των εμβρύων αφήνοντάς τα σε θερμοκρασία δωματίου και δυνατό κούνημα πολλές φορές ενώ έχουν σχεδόν ολοκληρωτικά ξεπαγώσει. 7. Συλλογή των πυρήνων με φυγοκέντρηση (3000rpm, 10 ) 8. Επαναιώρηση των πυρήνων σε όγκους TEESSDP 9. Επαναφυγοκέντρηση όπως στο βήμα Επανάληψη των επαναιωρήσεων (2-3 φορές) μέχρι το υπερκείμενο να είναι διαυγές. 11. Πλύσιμο των πυρήνων 2-3 φορές με TEESSDP+0.1% NP Επαναιώρηση σε 2-3 όγκους με HEESDGP 13. Μεταφορά σε Oak Ridge σωλήνες Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν παρασκευάστηκαν ως εξής: TEESSDP: HEESDGP: 10 mm Tris-HCl ph:7.4 10mM Hepes ph: 7.9 1mM EDTA 1mM EDTA 1mM EGTA 1mM EGTA 82

99 Υλικά και μέθοδοι 1mM Spermidine Tris HCl 1mM Spermidine Tris HCl 1mM DTT 1mM DTT 0.1mM PMSF 0.1mM PMSF 0.36M Σουκρόζη 10% Γλυκερόλη Εξαγωγή πρωτεϊνών πυρηνικού εκχυλίσματος Τα βήματα απομόνωσης του πυρηνικού εκχυλίσματος είναι τα κάτωθι (Parker C. S.and Topol. Cell (1984) 37: ): 1. Προσθήκη με αργό ρυθμό (1-2 ) 0.1 όγκους ως προς τον όγκο των πυρήνων, 4Μ Θειϊκό Αμμώνιο (διασπά την πυρηνική μεμβράνη, εξάγεται η χρωματίνη και αποδεσμεύει τις πυρηνικές πρωτεΐνες, μη ιστόνες, από τη χρωματίνη). Η προσθήκη γίνεται ενώ το δείγμα αναδεύεται έντονα (vortex) 2. Επώαση στον πάγο για 1 ώρα αναδεύοντας έντονα ανά διαστήματα 3. Κατακρήμνιση της χρωματίνης με υπερφυγοκέντρηση (35000rpm, 1.5 ώρα) 4. Απομάκρυνση του υπερκειμένου (περιέχει τις πυρηνικές πρωτεΐνες) και μεταφορά του σε σωλήνα φυγοκέντρησης 10000rpm. Υπολογισμός του όγκου 5. Προσθήκη 0.3g Θειϊκό Αμμώνιο για κάθε ml υπερκειμένου και απαλή ανάδευση προκειμένου να διαλυθεί 6. Επώαση στον πάγο για 3-18 ώρες 7. Κατακρήμνιση των πρωτεϊνών με φυγοκέντρηση 10000rpm, Διάλυση του ιζήματος σε ελάχιστο όγκο, 0.5x αυτόν του ιζήματος, με Buffer C 9. Ολονύκτια διάλυση σε κορεσμένη ποσότητα Buffer C. 10. Διατήρηση στους C 83

100 Υλικά και μέθοδοι Το διάλυμα που χρσιμοποιήθηκε παρασκευάστηκε ως εξής: Buffer C: 20mM Hepes-KOH ph: mM KCl 0.1mM EDTA 1mM DTT 20% Γλυκερόλη 0.1mM PMSF 0.1% NP Μονιμοποίηση εμβρύων Μονιμοποιήθηκαν τα εξής εμβρυϊκά στάδια: Στάδιο Αυγού στις 0 ώρες Στάδιο 16 κυττάρων στις 4 ώρες Στάδιο Βλαστιδίου στις 10 ώρες Στάδιο Γαστριδίου στις 20 ώρες Στάδιο Πρώϊμου Πλουτέα στις 32.5 ώρες Στάδιο Ώριμου Πλουτέα στις 45 ώρες Ως 0 ώρα ορίζεται η στιγμή της γονιμοποίησης. Τα έμβρυα του επιθυμητού σταδίου συλλέγονται από την καλλιέργεια σε Falcon των 15ml και αφήνονται να καθιζήσουν. Το υπερκείμενο απομακρύνεται και προστίθεται διάλυμα PFA 8% όγκου ίσου με τον όγκο του ιζήματος (η παραφορμαλδεΰδη δρα ως μονιμοποιητικό). Τα έμβρυα αναδεύονται στους 25 0 C για 1h σε αναδευτήρα με ταυτόχρονη αλλαγή θέσεως κάθε 15. Ακολούθως τα έμβρυα ξεπλένονται (το PFA αντικαθίσταται και τα έμβρυα επαναιωρούνται) 1 φορά με ASW και 3 φορές με 100% MeOH και αποθηκεύονται στους C για μελλοντική χρήση. 84

101 Υλικά και μέθοδοι Το διάλυμα PFA παρασκευάστηκε ως εξής: PFA 8% (Για 50ml δ/τος): PFA : 4g ASW: Ως τα 50ml Επώαση στους 65 0 C μέχρι να γίνει διαυγές Επώαση στους 25 0 C μέχρι να κρυώσει EPPS ph 8.0: 20mM στο τελικό δ/μα 2.8 Λειτουργική ανάλυση της ανοδικής περιοχής -213 έως (περιοχή a) Σε παλαιότερα πειράματα η ανοδική περιοχή από το +1 έως το του γονιδίου PlCoup-tf είχε κλωνοποιηθεί στο φορέα έκφρασης EpGFPII (κατασκευή , εικόνα 3.1). Ο φορέας αυτός έχει μέγεθος 4130 bps και διαθέτει τις εξής περιοχές (σχήμα 4 του παραρτήματος) (Arnone I. et al., 1997): 1. Τον πολυσυνδέτη, περιοχή με θέσεις αναγνώρισης για μια σειρά από περιοριστικές ενδονουκλεάσες 2. Το βασικό υποκινητή του γονιδίου endo16 (137 bps), ο οποίος είναι ασθενής, διαθέτει μόνο κουτί ΤΑΤΑ και συνεπώς δεν μπορεί να επάγει από μόνος του την έκφραση του γονιδίου gfp (Arnone et al., 1997). 3. Την περιοχή πρόσδεσης των ριβοσωμάτων (kozac) του γονιδίου της ακτίνης CyIIa (48 bp), στο ίδιο αναγνωστικό πλαίσιο με το γονίδιο της gfp (Arnone et al.1998). 4. Το γονίδιο gfp. Η κατασκευή χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα για την παρασκευή μιας σειράς ελλειμμάτων της ανοδικής περιοχής με PCR, δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού με την κατασκευή που είχε ολόκληρη την ανοδική περιοχή αλλά και τα ελλείμματα αυτής (εικόνες 3.8 και 3.10) και έλεγχο της λειτουργικότητας του 85

102 Υλικά και μέθοδοι εκάστοτε τμήματος της ανοδικής περιοχής μελετώντας το πρότυπο έκφρασης της GFP στο στάδιο του πλουτέα In Silico ανάλυση της περιοχής a Η εύρεση πιθανών ρυθμιστικών στοιχείων στην περιοχή a έγινε χρησιμοποιώντας τα προγράμματα TESS (Transcription Element Search System - και MATInspector. Μια πληθώρα αλληλουχιών, αναγνωρισμένες ως θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων από μελέτες γονιδίων διαφόρων οργανισμών που υπάρχουν σε βάσεις δεδομένων, συγκρίθηκαν με την ανοδική περιοχή -213 έως -532 του γονιδίου PlCoup-tf με το προγράμματα αυτά. Για την αναζήτηση τέθηκε ως περιορισμός η 100% ταυτότητα με την αλληλουχία του πυρήνα των ρυθμιστικών στοιχείων της περιοχής a. Από το πλήθος των μεταγραφικών παραγόντων που προτάθηκαν ως πιθανοί ρυθμιστές του γονιδίου PlCoup-tf επιλέγχθηκαν κάποιοι εξ αυτών προς μελέτη ως πιο πιθανοί, λαμβάνοντας υπ όψιν το ρόλο τους και το πρότυπο έκφρασής τους, όπως έχει περιγραφεί στον αχινό ή σε άλλους οργανισμούς στη βιβλιογραφία Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για τη δημιουργία ελλειμμάτων στην περιοχή a Διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα Δημιουργήθηκαν 5 διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα της περιοχής a (εικόνα 3.8) χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την κατασκευή a. Για τις αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα ζεύγη εκκινητών: Οι εκινητές φέρουν στο 5 άκρο τους τη θέση αναγνώρισης (AGATCT) για το ένζυμο περιορισμού BglII. Ο εκκινητής GFPright υβριδοποιείται καθοδικά της περιοχής πολυαδενυλίωσης της GFP. Οι θέσεις τους σχηματικά παριστάνονται στις 86

103 Υλικά και μέθοδοι εικόνες 3.7 και 3.8. Οι ακριβείς θέσεις υβριδοποίησής τους παρουσιάζονται στα σχήματα 2 και 3 (Παράρτημα). Περιοχή a Έλλειμμα 1 Έλλειμμα 2 Έλλειμμα 3 Έλλειμμα 4 Έλλειμμα 5 Ανοδικός Εκκινητής Rup1: 5 -CTAAGATCTAGCAG GACGAAGGATTTGAG-3 a1: 5 -CTAAGATCTTTTCCA TAGAAGCCTAATCCG-3 a2: 5 -CTAAGATCTATAGAT TAATCCAGAAGTTGC-3 a3: 5 -CTAAGATCTCGGAGA ATAACTTGTGATGTT-3 a4: 5 -CTAAGATCTGTTTGA GCTCCGAATACCAGT-3 a5: 5 -CTAAGATCTTCCGG TCTTCAGAAAGTTCA-3 Καθοδικός Εκκινητής (GFP right) 5 -CTAAGATCTACTGGG TTGAAGGCTCTCAA-3 Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε τελικό όγκο 50μl. Οι συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων στο τελικό διάλυμα ήταν οι εξής (Αντίδραση 1): Υπόστρωμα DNA : 2ng (Κατασκευή a) Buffer 10X : 1Χ Taq DNA πολυμεράση (NEB)(5000u/ml): 2.5 units Εκκινητές (VBC Biotech) : 0.3μΜ Νουκλεοτίδια (NEB) (10mM) : 0.3mM mq H 2 O Για την πραγματοποίηση της PCR εφαρμόστηκε το ακόλουθο πρόγραμμα (Πρόγραμμα 1): Βήμα 1 ο : 94 ο C για 2 Βήμα 2 ο : 94 ο C για 30 Βήμα 3 ο : 60 ο C για 45 87

104 Υλικά και μέθοδοι Βήμα 4 ο : 72 ο C για 45 Βήμα 5 ο : Επιστροφή στο βήμα 2 για 39 κύκλους Βήμα 6 ο : 72 ο C για 10 Βήμα 7 ο : τέλος Τα προϊόντα αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 0.8%. Ο καθαρισμός των προϊόντων PCR από την παρουσία άλλων ουσιών όπως πολυμεράσης και νουκλεοτιδίων έγινε με το QIA quick purification kit (Qiagen). Κατόπιν φωτομετρήθηκαν μετά από αραίωση 1/50 στα 260 και 280nm και υπολογίστηκε η συγκέντρωσή τους. Ακολούθως χρησιμοποιήθηκαν για δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού Εσωτερικές αφαιρέσεις στην περιοχή a Περαιτέρω ανάλυση της περιοχής a επιτεύχθηκε πραγματοποιώντας εσωτερικές αφαιρέσεις (κατασκευές 1 έως 4) εντός της περιοχής a (εικόνα 3.10) με τη μέθοδο της αντίστροφης PCR όπως φαίνεται σχηματικά στην εικόνα Συγκεκριμένα, για την αφαίρεση του κάθε τμήματος σχεδιάστηκαν εκκινητές ανοδικά και καθοδικά του προς αφαίρεση τμήματος. Οι εκκινητές φέρουν στο 5 άκρο τους τη θέση αναγνώρισης για το ένζυμο πολυμερισμού BglII. Τα ζεύγη των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την αντίστροφή PCR είναι τα κάτωθι: 88

105 Υλικά και μέθοδοι Οι αλληλουχίες των καθοδικών εκκινητών έχουν αναγραφεί στην παράγραφο Διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα. Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Διαδοχικά Ανοδικά Ελλείμματα (Αντίδραση 1) με τις εξής διαφορές: GoTaq Flexi DNA πολυμεράση (Promega) :0.25μl (5units/μl) Buffer 5X : 1X στο τελικό διάλυμα Mg 2+ (25mM) : 2.5mM Για την πραγματοποίηση της αντίδρασης εφαρμόστηκε το Πρόγραμμα 1 με τις εξής διαφορές: Βήμα 4: 72 0 C για 3 και 30 Βήμα 5: Επιστροφή στο Βήμα 2 για 29 κύκλους Ανοδικός Εκκινητής Καθοδικός Εκκινητής Εσωτερική Αφαίρεση 1 Εσωτερική Αφαίρεση 2 Εσωτερική Αφαίρεση 3 Εσωτερική Αφαίρεση 4 a1r:5 -CTAAGATCTCGCATT AGGCTTCTATGGAAA-3 a2r:5 -CTAAGATCTTTCAAC AAAATGACACACAAT-3 a3r:5 -CTAAGATCTAACAT CACAAGTTATTCTCCG-3 a4r:5 -CTAAGATCTACTGG TATTCGGAGCTCAAAC-3 a2 a3 a4 a5 Τα προϊόντα αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 0.8%, καθαρίστηκαν με το QIA quick purification kit (Qiagen) και φωτομερήθηκαν στα 260 και 280nm μετά από αραίωση 1/50. Ακολούθησε κατάτμηση των προιόντων με BglII και αντίδραση λιγάσης των γραμμικών πλέον προιόντων με σκοπό την επανακυκλοποίησή τους χρησιμοποιώντας την T4 DNA Λιγάση (NEB). Σχηματικά οι αναμενόμενες κατασκευές αναπαρίστανται στην εικόνα Ο πολλαπλασιασμός των επανακυκλοποιημένων κατασκευών έγινε με μετασχηματισμό δεκτικών βακτηρίων E.coli, με ηλεκτροδιάτρηση. Ακολούθησε 89

106 Υλικά και μέθοδοι επίστρωση 50μl μετασχηματισμένων βακτηρίων σε τρυβλία με LB και αμπικιλλίνη και οι αποικίες επιλέγθηκαν. Οι κλώνοι που φέρουν τις εσωτερικές αφαιρέσεις στην περιοχή a αναγνωρίστηκαν με βακτηριακή PCR και έλεγχο του μεγέθους του προϊόντος, ως εξής: Επιλέχθηκαν τυχαία: 8 αποικίες βακτηρίων από την κατασκευή 1 8 αποικίες από την κατασκευή 2 5 αποικίες από την κατασκευή 3 7 αποικίες από την κατασκευή 4 Κάθε αποικία ανακαλλιεργήθηκε σε τρυβλίο με LB και αμπικιλλίνη ενώ παράλληλα μικρή ποσότητα αυτής μεταφέρθηκε σε 20μl Η 2 Ο και ελέγχθηκε για την επιτυχή δημιουργία των εσωτερικών αφαιρέσεων με αντίδραση PCR. Επαναλήφθηκε η Αντίδραση 1 όπως περιγράφεται στην παράγραφο Διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα με την εξής διαφορά: Ως υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκαν 5μl από τα διαλύματα της κάθε αποικίας στο νερό. Για τον έλεγχο των κατασκευών 1 και 2 χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος εκκινητών Rup1-a4R (ενώ για τις κατασκευές 3 και 4 το ζεύγος Rup1-GFPright (Σχήματα 2 και 3, Παράρτημα). Πραγματοποιήθηκαν και αντιδράσεις ελέγχου χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την κατασκευή a με τα ίδια ζεύγη εκκινητών. Για τις αντιδράσεις ακολουθήθηκαν τα βήματα του Προγράμματος 1. Τα προϊόντα των PCR αντιδράσεων αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1.5%. Ακολούθησε υγρή καλλιέργεια των επιλεγμένων κλώνων και απομόνωση του πλασμιδιακού DNA σύμφωνα με τις οδηγίες του kit Nucleospin Plasmid Quick Pure / Macherey Nagel. Η έκλουση του DNA έγινε σε 50μl διαλύματος ΑΕ. Τα προϊόντα της απομόνωσης φωτομετρήθηκαν στα 260 και 280nm μετά από αραίωση 1/50 και στάλθηκαν για αλληλούχιση (σχήμα 5, παράρτημα). H επιβεβαίωση της πραγματοποίησης των ελλειμμάτων 1 έως 4 έγινε με κατάτμηση των κατασκευών με τα ένζυμα περιορισμού HindIII και BglII. Η αλληλουχία αναγνώρισης του ενζύμου HindIII βρίσκεται εντός του ασθενούς 90

107 Υλικά και μέθοδοι υποκινητή Endo16 ενώ του BglII εντός του ενθέματος μιας και οι εκκινητές φέρουν στο 5 άκρο τους αυτή την αλληλουχία. Αναμένεται επομένως το μέγεθος του μικρού τμήματος μετά τη διπλή αυτή κατάτμηση να αντιστοιχεί στην απόσταση που μεσολαβεί μεταξύ της θέσης αναγνώρισης του ενζύμου HindΙΙΙ και του εκάστοτε καθοδικού εκκινητή που χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία των εσωτερικών αφαιρέσεων. Τα δείγματα επωάστηκαν και με τα δύο ένζυμα περιορισμού ταυτόχρονα παρουσία του buffer 2 στους 37 0 C για 1 ώρα και αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 0.8% Παρασκευή γραμμικών μορίων για δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού Στα επανακυκλοποιημένα πλασμίδια πραγματοποιήθηκε εκ νέου αντίδραση PCR με σκοπό την παρασκευή γραμμικών προϊόντων και τη δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού. Το ζεύγος των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκε ήταν το εξής: Ανοδικός εκκινητής : Rup1 Καθοδικός εκκινητής: GFPright Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα (Αντίδραση 1) με τις εξής διαφορές: GoTaq Flexi DNA πολυμεράση (Promega) : 5μl (5u/μl) Buffer 5X : 1X στο τελικό διάλυμα Mg 2+ (25mM) : 2.5mM Για την πραγματοποίηση της αντίδρασης εφαρμόστηκε το Πρόγραμμα 1. 91

108 Υλικά και μέθοδοι Στοχευμένες αφαιρέσεις των πιθανών ρυθμιστικών στοιχείων -453, -432 και -377 Η περαιτέρω ανάλυση της περιοχής a έγινε πραγματοποιώντας στοχευμένες αφαιρέσεις των πιθανών ρυθιστικών στοιχείων -453, -432 και Αφαιρέθηκαν μεμονωμένα στοιχεία αλλά και ο συνδυασμός των δύο πιο ανοδικών (εικόνα 3.14). Οι αφαιρέσεις πραγματοποιήθηκαν με αντίστροφη PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που πλαισιώνουν το κάθε στοιχείο απόκρισης και φέρουν στο 5 άκρο τους τη θέση αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού BglII. Tα ζεύγη των εκκινητών αναγράφονται στον πίνακα που ακολουθεί: Για τις στοχευμένες αφαιρέσεις των στοιχείων -453, -432 και -377 οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο Εσωτερικές αφαιρέσεις στην περιοχή a. Για την πραγματοποίηση των αντιδράσεων εφαρμόστηκε το πρόγραμμα 1 με διαφορά στα εξής βήματα: Βήμα 3 ο : 48 ο C για 45 Βήμα 5 ο : Επιστροφή στο βήμα 2 για 29 κύκλους Ανοδικός Εκκινητής Καθοδικός Εκκινητής Αφαίρεση στοιχείου Αφαίρεση στοιχείου Αφαίρεση στοιχείου Διπλή αφαίρεση στοιχείων -453/-432 EtsR:5 -CTAAGATCTATTAGG CTTCTATGGAAATT-3 ApR:5 -CTAAGATCTATTA ATGTGTATACTTCC-3 OtxR:5 -CTAAGATCTTCTATT TCAACAAAATGACAC-3 ApF EtsF:5 -CTAAGATCTTATAC ACATTAATGACTCTA-3 ApF:5 -CTAAGATCTACAATC AATAGAAATTATAAA-3 OtxF:5 -CTAAGATCTAGAAG TTGCATGATATTGTT-3 EtsR 92

109 Υλικά και μέθοδοι Για τη διπλή αφαίρεση των στοιχείων -453 και -432 ακολουθήθηκε η αντίδραση 1 όπως περιγράφεται στην παράγραφο Διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα με τις εξής διαφορές: Χρησιμοποιήθηκαν: η Phusion πολυμεράση (High Fidelity DNA polymerase, Finnzymes) (2u/μl) :0.5μl Buffer HF 5X :1X Το πρόγραμμα που ακολουθήθηκε ήταν το εξής: Βήμα 1 ο : 94 ο C για 2 Βήμα 2 ο : 94 ο C για 30 Βήμα 3 ο :50-60 ο C για 45 Βήμα 4 ο : 72 ο C για 3 Βήμα 5 ο : Επιστροφή στο βήμα 2 για 34 κύκλους Βήμα 6 ο : 72 ο C για 10 Βήμα 7 ο : τέλος Τα προϊόντα αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1% καθαρίστηκαν με το QIA quick purification kit (Qiagen) και φωτομετρήθηκαν μετά από αραίωση 1/50. Ακολούθησε κατάτμηση των προϊόντων της PCR με το ένζυμο περιορισμού BglII, απενεργοποίηση του ενζύμου στους 65 0 C για 20 και επανακυκλοποίηση των κατασκευών με αντίδραση λιγάσης χρησιμοποιώντας ένζυμο της εταιρείας NEB. Ακολούθησε μετασχηματισμός σε δεκτικά βακτήρια E.coli και επίστρωση 50μl σε τρυβλία με LB και αμπικιλλίνη. Πραγματοποιήθηκε υγρή καλλιέργεια των επιλεγμένων κλώνων και απομόνωση του πλασμιδιακού DNA σύμφωνα με τις οδηγίες του kit Nucleospin Plasmid Quick Pure / Macherey Nagel. Η έκλουση του DNA έγινε σε 50μl διαλύματος ΑΕ. Η παρουσία των εσωτερικών αφαιρέσεων επιβεβαιώθηκε με κατάτμηση των απομονωμένων κλώνων με BglII και ανάλυση αυτών σε πήκτωμα αγαρόζης 0.8%. Το πλασμιδιακό DNA φωτομετρήθηκε και στάλθηκε για αλληλούχηση (σχήμα 8, παράρτημα). 93

110 Υλικά και μέθοδοι Παρασκευή γραμμικών μορίων για δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού Στα επανακυκλοποιημένα πλασμίδια πραγματοποιήθηκε εκ νέου αντίδραση PCR με σκοπό την παρασκευή γραμμικών προϊόντων και τη δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού. Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν με τις ίδιες παραμέτρους όπως έχουν ήδη περιγραφεί στην περίπτωση γραμμοποίησης των επανακυκλοποιημένων κατασκευών που έφεραν τις εσωτερικές αφαιρέσεις. 2.9 Κατάτμηση με ένζυμα περιορισμού Οι αντιδράσεις κατάτμησης πραγματοποιήθηκαν με ένζυμα περιορισμού και τα αντίστοιχα buffers τους από την εταιρεία NEB σε αναλογία 10units ενζύμου περιορισμού για κάθε 0.5μg DNA. Στις αντιδράσεις όπου τα προϊόντα κατάτμησης χρησιμοποιήθηκαν περαιτέρω για in vitro μεταγραφή δεν χρησιμοποιήθηκε BSA, ακόμη και εάν συστήνεται από την εταιρεία, μιας και μειώνει την απόδοση της μεταγραφής. Οι αντιδράσεις επωάζονται για 1-2 ώρες σε υδατόλουτρο στους 37 0 C Ηλεκτροφόρηση DNA Τα μόρια DNA αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης με συγκέντρωση από 0.8 έως 1.5% ανάλογα με το μέγεθος του DNA που επρόκειτο να αναλυθεί. Στο προς ανάλυση δείγμα προστίθεται χρωστική δείγματος 6Χ σε τελική συγκέντρωση 2Χ. Η μετακίνηση των ζωνών μέσα στο πήκτωμα επιτυγχάνεται με την επίδραση ηλεκτρικού ρεύματος υπό τάση V. Ως διάλυμα ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιείται διάλυμα TBE 0.5-1Χ αντίστοιχα με τη συγκέντρωσή του εντός του πηκτώματος. Οι ζώνες του DNΑ καθίστανται ορατές μετά από έκθεση σε υπεριώδη 94

111 Υλικά και μέθοδοι ακτινοβολία (UV) λόγω της παρουσίας EtBr εντός του πηκτώματος. Στις ηλεκτροφορήσεις χρησιμοποιήθηκαν οι μάρτυρες 1kb και 100bp της εταιρείας NEB Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν παρασκευάστηκαν ως εξής: Πήκτωμα αγαρόζης 1% Χρωστική Δειγμάτων DNA 6Χ (Για 100ml δ/τος) (Για 50ml δ/τος) ddh 2 O :90ml Φικόλη 2.5% : 40ml (20%) TBE 5X :10ml Μπλε της Βρωμοφαινόλης 2.5%: 5ml (0.25%) Αγαρόζη:1gr Κυανούν του ξυλενίου 2.5% : 5ml (0.25%) Το διάλυμα ζεσταίνεται μέχρι EDTA 0.5M :1ml (10mM) να γίνει διαυγές και έπειτα προστίθενται 2.5μl ΕtBr (10mg/ml) Δ/μα Ηλεκτροφόρησης TBE 1X TBE 5X ph: 8.3 (Για 1L) ddh 2 O : 900ml EDTA :4.65g ΤBE 5X: 100ml Βορικό οξύ :27.5gr Tris base :54gr 2.11 Ηλεκτροφόρηση RNA Τα μόρια RNA αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης με συγκέντρωση 1%. Η μετακίνηση των ζωνών μέσα στο πήκτωμα επιτυγχάνεται τροφοδοτώντας το πήκτωμα με τάση ρεύματος ίση με 5V για κάθε 1cm πηκτώματος. Οι ζώνες του RNA καθίστανται ορατές μετά από έκθεση του πηκτώματος σε UV ακτινοβολία λόγω της παρουσίας EtBr στο διάλυμα δείγματος (sample buffer). Στις ηλεκτροφορήσεις χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας, δείγμα που περιείχε τη μεγάλη (28s) και τη μικρή (16s) ριβοσωμική υπομονάδα, που αντιστοιχούν σε μέγεθος ίσο με 3900bp η μεγάλη υπομονάδα και σε 1900bp η μικρή. 95

112 Υλικά και μέθοδοι Προκειμένου να γίνει η ανάλυση του RNA, το δείγμα αναμειγνύεται με ίσο όγκο διαλύματος δείγματος, ζεσταίνεται στους 65 0 C για 5 μεταφέρεται στον πάγο και έπειτα από προσθήκη διαλύματος χρωστικής 6Χ, στο πήκτωμα. Για την ηλεκτροφόρηση RΝΑ χρησιμοποιήθηκαν τα εξής υλικά: Πήκτωμα RNA (Για 50ml) ddh 2 O : 40ml Αγαρόζη: 0.5gr Tο διάλυμα ζεσταίνεται μέχρις ότου να γίνει διαυγές και κατόπιν προστίθενται: 5ml 10X MOPS 9ml Φορμαλδεϋδη MOPS 10X (Για 500ml δ/τος): NaMOPS : 23.13gr 0.5M NaEDTA: 10ml (10mM) 3M NaOAc : 8.33ml (50mM) ph στο 7.0 Διάλυμα Δείγματος 2Χ (Sample Buffer) (Αποθήκευση στους C) Φορμαμίδιο : 300μl Φορμαλδεϋδη: 100μl dh 2 O : 64μl 10X MOPS : 60μl EtBr 10mg/ml : 36μl 96

113 Υλικά και μέθοδοι 2.12 Φωτομέτρηση Δειγμάτων RNA και DNA Τα δείγματα DNA και RNA φωτομετρήθηκαν μετά από αραίωση σε mq Η 2 Ο στα 260 και 280nm. Πραγματοποιήθηκαν αραιώσεις 1/50 και 1/100. Ο μηδενισμός του φωτομέτρου έγινε με mqh 2 O. Ο υπολογισμός των συγκεντρώσεων σε μg/ml γίνεται χρησιμοποιώντας τους τύπους: Συγκέντρωση DNA: O.D. X Αραίωση Χ 50 Συγκέντρωση RNA: O.D. X Αραίωση Χ 40 Η καθαρότητα των δειγμάτων υπολογίζεται με βάση το λόγο O.D. 260 /O.D Χρησιμοποιήθηκαν δείγματα με λόγο μεγαλύτερο του Αντίδραση Λιγάσης Χρησιμοποιήθηκε η T4 DNA Ligase της εταιρείας NEB για τα πειράματα επανακυκλοποίησης των κατασκευών στο φορέα EpGFPII. Στις αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκαν 0.1μg DNA και υπολογίστηκε ώστε ο λόγος j/i να είναι 3. Η αντίδραση επωάζεται στους 18 0 C για 16 ώρες και είναι η εξής: Τελικός όγκος 10μl DNA : 0.1μg 10Χ Buffer Λιγάσης : 1μl (1X) Λιγάση ( u/ml): 1μl (400u) H 2 O Στα πειράματα κλωνοποίησης PCR προϊόντων στο φορέα pgem-teasy χρησιμοποιήθηκε λιγάση και φορέας της εταιρείας Promega σύμφωνα με την αντίδραση: Τελικός όγκος 10μl H 2 O PCR προϊόν : 1μl 97

114 Υλικά και μέθοδοι 2X Buffer : 5μl πλασμίδιο pgem-teasy: 1μl T4 DNA Λιγάση : 1μl 2.14 Παρασκευή και Μετασχηματισμός Δεκτικών Βακτηρίων Ο πολλαπλασιασμός των κυκλικών κατασκευών έγινε με μετασχηματισμό δεκτικών βακτηρίων E.coli. Έλαβαν χώρα αντιδράσεις τόσο χημικού μετασχηματισμού όσο και μετασχηματισμού με ηλεκτροδιάτρηση. Ο τύπος του μετασχηματισμού που εφαρμόστηκε κάθε φορά αναφέρεται στην αντίστοιχη παράγραφο. Οι πορείες που ακολουθήθηκαν ήταν οι εξής: Σε 50μl δεκτικών βακτηρίων προστίθεται 1μλ αντίδρασης λιγάσης. Κατόπιν το διάλυμα των βακτηρίων και της λιγάσης μεταφέρεται: Α. Χημικός Μετασχηματισμός 1. Σε πάγο για 40 min 2. Στους 42 0 C για 1min και 30 sec 3. Σε πάγο για 1min Β. Μετασχηματισμός με Ηλεκτροδιάτρηση Σε ειδική κυβέτα (electroporation cuvettes plus model no 620 2mm gap cuvette) η οποία μεταφέρεται στο μηχάνημα BTX 399 και τροφοδείται με 1660V για 5msec. Ακολουθεί μεταφορά των βακτηρίων σε 1ml, προθερμασμένου στους 37 0 C, υγρό θρεπτικό υλικό LB και παραμονή του για 1 ώρα με ενδιάμεση ανάδευση κάθε 15. Μετά το πέρας της ώρας μία ποσότητα (10-100μl) βακτηρίων επιστρώνεται σε τρυβλία με LB και αμπικιλλίνη και επωάζεται στους 37 0 C για 16 ώρες. Για τη διαδικασία του μετασχηματισμού παρασκευάστηκαν τα κάτωθι ως εξής: I. Δεκτικά Βακτήρια για Χημικό Μετασχηματισμό 98

115 Υλικά και μέθοδοι II. Δεκτικά Βακτήρια για Μετασχηματισμό με Ηλεκτροδιάτρηση III. Υγρό θρεπτικό υλικό LB IV. Τρυβλία με στερεό θρεπτικό υλικό LB V. Τρυβλία με στερεό θρεπτικό υλικό LB και αμπικιλλίνη I. Δεκτικά Βακτήρια για Χημικό Μετασχηματισμό Παρασκευάστηκαν δεκτικά βακτήρια σύμφωνα με τη μέθοδο του χλωριούχου ρουβιδίου ως ακολούθως: 1. Δημιουργούνται μοναδικές αποικίες από βακτήρια E.coli στελέχους DH10B σε τρυβλίο με στερεό θρεπτικό υλικό LB 2. Μία μοναδική αποικία μεταφέρεται σε falcon των 50ml που περιέχει 3ml υγρoύ θρεπτικού υλικού LB και επωάζεται υπό ανάδευση στους 37 0 C για 16 ώρες 3. 1ml από την υγρή καλλιέργεια των 3ml μεταφέρεται σε κωνική φιάλη των 500ml που περιέχει 100ml υγρό θρεπτικό διάλυμα Psi και επωάζεται υπό ανάδευση στους 37 0 C μέχρις ότου η οπτική του απορρόφηση να φτάσει την τιμή 0.48 στα 550nm. (Περίπου σε 1 1/2 ώρα). Ως τυφλό χρησιμοποιείται το θρεπτικό διάλυμα Psi. 4. Η κωνική φιάλη τοποθετείται στον πάγο για 15 προκειμένου να ανασταλλεί ο πολλαπλασιασμός των βακτηρίων. Κατόπιν το περιεχόμενό της διαιρείται σε δύο falcon των 50ml. 5. Ακολουθεί φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο στα g για 5min και απόρριψη του υπερκειμένου. 6. Στα εναπομείναντα ιζήματα προστίθενται συνολικά 0.4 όγκοι TfbI (ως προς την αρχική καλλιέργεια των 100ml) και επαναιωρούνται προσεχτικά με πλαστική αποστειρωμένη πιπέτα των 10ml. 7. Τα βακτήρια παραμένουν στον πάγο για 15min. 8. Ακολουθεί φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο στα g για 5 και απόρριψη του υπερκειμένου. 99

116 Υλικά και μέθοδοι 9. Στα εναπομείναντα ιζήματα προστίθενται συνολικά 0.04 όγκοι TfbII (ως προς την αρχική καλλιέργεια των 100ml) και επαναιωρούνται προσεχτικά με πλαστική αποστειρωμένη πιπέτα των 10ml. 10. Τα βακτήρια παραμένουν στον πάγο για 15 και είτε χρησιμοποιούνται αμέσως για μετασχηματισμό ή αποθηκεύονται στους C. Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν παρασκευάστηκαν ως εξής: Θρεπτικό Υλικό Psi broth (Για τελικό όγκο 250ml) Bacto yeast extract: 1.25 g Bacto tryptone : 5 g Θειικό Μαγνήσιο : 1.25 g ph 7.6 με παστίλιες KOH Αποστείρωση Διάλυμα Tfb I (Για όγκο δ/τος 200ml) Potassium acetate : 0.588g (30mM) Χλωριούχο Ρουβίδιο : 2.42g (100mM) Χλωριούχο Ασβέστιο:0.294g (10mM) Χλωριούχο Μαγγάνιο: 2.0g (50mM) Γλυκερόλη ( 99.7 % ) :30ml (15%v/v) ph 5,8 με αραιωμένο 1N CH3COOH Διηθείται από φίλτρο 0.20μ Διάλυμα Tfb II (Για όγκο δ/τος 100ml) MOPS :0.21g (10mM) Χλωριούχο Ασβέστιο:1.1g (75mM) Χλωριούχο Ρουβίδιο :0.121g (10mM) Γλυκερόλη ( 99.7 % ):15 ml (15%v/v) ph 6.5 με αραιωμένο 1Ν NaOH Διηθείται από φίλτρο 0.20μ 100

117 Υλικά και μέθοδοι II. Δεκτικά Βακτήρια για Μετασχηματισμό με Ηλεκτροδιάτρηση Η πορεία προετοιμασίας δεκτικών κυττάρων για μετασχηματισμό με ηλεκτροδιάτρηση είναι η εξής: 1. Από το τρυβλίο όπου έχουν αναπτυχθεί αποικίες Escherichia coli (DH10B), μεταφέρεται μία αποικία σε αποστειρωμένο σωλήνα (falcon) των 50ml, στο οποίο έχουν προηγουμένως τοποθετηθεί 10ml υγρού θρεπτικού υλικού 2XYT-Broth. Τα βακτήρια αφήνονται να αναπτυχθούν για 16 ώρες στον επωαστικό θάλαμο στους 37 o C υπό ανάδευση. 2. Σε αποστειρωμένη κωνική φιάλη του 1L μεταφέρονται 500ml 2XYT- Broth και 5ml βακτηρίων από την υγρή καλλιέργεια. Η κωνική φιάλη τοποθετείται στον επωαστικό θάλαμο στους 37 o C υπό ανάδευση. 3. Σε τακτά χρονικά διαστήματα, μετράται σε 1ml καλλιέργειας η οπτική απορρόφηση (OD) στα 600nm. Ως τυφλό χρησιμοποιείται 1ml 2XYT- Broth. 4. Όταν η OD 600nm φτάσει στην τιμή 0,6-0,9, η κωνική φιάλη με την καλλιέργεια τοποθετείται απευθείας στον πάγο. Είναι πολύ σημαντικό όλα τα επόμενα βήματα να γίνονται στους 0 ο -4 ο C. 5. Η καλλιέργεια που βρίσκεται στη κωνική μεταφέρεται σε δύο αποστειρωμένες φιάλες φυγοκέντρου (Corning) των 250ml. 6. Οι φιάλες φυγοκεντρούνται στους 4 ο C στα g για 25min. 7. Οι φιάλες τοποθετούνται στον πάγο, απορρίπτεται το υπερκείμενο και προστίθενται 200ml παγωμένου ddh 2 O ώστε να επαναιωρηθούν τα βακτήρια. Το νερό προστίθεται σταδιακά, ώστε να μη δημιουργηθούν συσσωματώματα. 8. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στους 4 ο C στα g για 25min. 9. Οι φιάλες τοποθετούνται στον πάγο, απορρίπτεται το υπερκείμενο και προστίθενται 100ml παγωμένου ddh 2 O ώστε να επαναιωρηθούν τα βακτήρια, όπως παραπάνω. 10. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στους 4 ο C στα g για 25min. 101

118 Υλικά και μέθοδοι 11. Οι φιάλες τοποθετούνται στον πάγο, απορρίπτεται το υπερκείμενο και προστίθενται 20ml παγωμένου διαλύματος 10% glycerol ώστε να επαναιωρηθούν τα βακτήρια, όπως παραπάνω. 12. Το περιεχόμενο των δύο φιαλών μεταφέρεται σε ένα σωλήνα Falcon των 50ml και ακολουθεί φυγοκέντρηση στους 4 ο C στα g για 10min. 13. Ο σωλήνας τοποθετείται στον πάγο, απορρίπτεται το υπερκείμενο και προστίθεται 1ml παγωμένου διαλύματος 10% glycerol ώστε να επαναιωρηθούν τα βακτήρια, όπως παραπάνω. 14. Τα βακτήρια μοιράζονται σε κλάσματα των 50μl σε παγωμένους και αποστειρωμένους σωλήνες eppendorf και στη συνέχεια ψύχονται σε υγρό άζωτο και φυλάσσονται στους -80 o C. Παρασκευάζονται τα εξής διαλύματα: 2XYT-Broth Σε ποτήρι ζέσεως ζυγίζονται: 16g Bacto-tryptone 10g Yeast Extract 10 g NaCl και αναδεύονται μέχρι την πλήρη διάλυση σε 800ml ddh 2 O. Μεταφορά του θρεπτικού υλικού σε ογκομετρικό κύλινδρο και συμπλήρωση με ddh 2 O μέχρι τελικού όγκου 1L. Μεταφορά του θρεπτικού υλικού σε κωνική φιάλη και υγρή αποστείρωση στο αυτόκαυστο (20min, T=121 ο C, P=1,1atm). Aποστειρωμένο ddh20 (1L, 4 o C) 10% glycerol (100ml, 4 C). 102

119 Υλικά και μέθοδοι III. Υγρό θρεπτικό υλικό LB (Για 1L υγρού θρεπτικού) Yeast extract :5g Bacto Tryptone):10gr ddh 2 O Το ph ρυθμίζεται στο 7.5 με 2 παστίλιες NaOH και το δ/μα αποστειρώνεται IV. Τρυβλία με στερεό θρεπτικό υλικό LB (Για 1L υγρού θρεπτικού) Ακολουθείται η προηγούμενη συνταγή με την εξής διαφορά: Προστίθενται 15gr Bacto-agar και μετά Αποστειρώνεται V. Τρυβλία με στερεό θρεπτικό υλικό LB και αμπικιλλίνη (Για 1L υγρού θρεπτικού) Παρασκευάζονται όπως τα τρυβλία χωρίς αμπικιλλίνη με την εξής διαφορά: Στο τέλος της αποστείρωσης το υγρό θρεπτικό αφήνεται να κρυώσει και προστίθεται αμπικιλλίνη σε συγκέντρωση 100mg/L Επιλογή μετασχηματισμένων αποικιών Η επιλογή των μετασχηματισμένων αποικιών έγινε ανάλογα με τον πλασμιδιακό φορέα με τον οποίον μετασχηματίστηκαν και τις ιδιότητες αυτού. Στα πειράματα που χρησιμοποιήθηκε ο φορέας PGEM-TEasy η επιλογή έγινε βάσει του 103

120 Υλικά και μέθοδοι χρώματος μπλε- άσπρο αφού ο φορέας αυτός φέρει το τμήμα lacz του γονιδίου της β γαλακτοσιδάσης. Αντίθετα στα πειράματα που χρησιμοποιήθηκε ο φορέας EpGFPII η επιλογή έγινε τυχαία καθώς ο φορέας αυτός δεν έχει το γονίδιο lacz και όλες οι αποικίες είναι άσπρες Ανακαλλιέργεια (Streaking) αποικιών Από τις αποικίες που αναπτύσσονται μετά το μετασχηματισμό κάποιες επιλέγονται και ανακαλλιεργούνται (streaking) με αποστειρωμένο κρίκο σε τρυβλία με LB και αμπικιλλίνη σε αριθμημένες θέσεις και επωάζονται στους 37 0 C για 16 ώρες Υγρές καλλιέργειες επιλεγμένων αποικιών Πραγματοποιούνται υγρές καλλιέργειες στις αποικίες βακτηρίων που επιλέγονται για ανακαλλιέργεια. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: Σε falcon των 50ml που περιέχει 3ml LB και αμπικιλλίνη σε αναλογία 1:1000 (από stock 100mg/ml μεταφέρεται μία αποικία με αποστειρωμένο κρίκο δίπλα σε φλόγα. Τα βακτήρια επωάζονται στους 37 0 C υπό ανάδευση για 16 ώρες Απομόνωση πλασμιδιακού DNA Το πλασμιδιακό DNA απομονώθηκε από τα μετασχηματισμένα βακτήρια σύμφωνα με τις οδηγίες που αναγράφει το πρωτόκολλο των αντιδραστηρίων Nucleospin Plasmid Quick Pure / Macherey Nagel. Η έκλουση του DNA έγινε είτε 104

121 Υλικά και μέθοδοι σε mqh 2 O είτε σε διάλυμα ΑΕ που παρέχεται από την εταιρεία. Κατά τη διαδικασία της απομόνωσης πραγματοποιήθηκαν όλες οι επιπλέον φυγοκεντρήσεις που προτείνονται στο πρωτόκολλο για καλύτερη απόδοση της αντίδρασης. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στο μέγιστο του χρόνου που προτείνεται στο πρωτόκολλο Απόθεμα μετασχηματισμένων βακτηρίων (Stock) Δημιουργήθηκε απόθεμα από τα μετασχηματισμένα βακτήρια με την επιθυμητή κατασκευή σύμφωνα με την εξής διαδικασία: 1. Δημιουργείται μοναδική αποικία της επιθυμητής, και επωάζεται για 16 ώρες στους 37 0 C 2. Mία αποικία από τις μοναδικές μεταφέρεται σε σωληνάκι με 500μl LB και αμπικιλλίνης (με αναλογία 1:1000) και επωάζεται στους 37 0 C υπό ανάδευση για 16 ώρες 3. Ακολούθως προστίθενται 500μl Freezing medium 2X (ή ίσος όγκος αποστειρωμένης γλυκερόλης 100%) Το Freezing Medium παρασκευάστηκε ως εξής: Freezing Medium 2X (Για 500ml δ/τος) Dipotasium hydrogen phosphate: 6.3gr Na-Citrate : 0.45gr MgSO 4 7Η 2 Ο : 0.09gr Ammonium Sulfate : 0.9gr Potassium dihydrogen phosphate: 1.8gr Glycerol : 44gr Η γλυκερόλη ζυγίζεται σε ποτήρι ζέσεως. Τα αντιδραστήρια διαλύονται σε 400ml ddh 2 O. Το δ/μα ογκομετρείται και συμπληρώνεται ως τα 50ml και αποστειρώνεται. 105

122 Υλικά και μέθοδοι 2.20 Αλληλούχηση των DNAs Τα DNAs αλληλουχήθηκαν με τη μέθοδο Sanger από την εταιρεία VBC. Για κάθε προϊόν στάλθηκαν 2μg προϊόντος και 10μΜ από κάθε εκκινητή που υβριδοποιείται στην επιθυμητή περιοχή. Για τις αντιδράσεις που χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα ο πλασμιδιακός φορέας pgem-teasy χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές M13F και M13R που υβριδοποιούνται εντός του φορέα και παρέχονται από την εταιρεία αλληλούχησης Σύγκριση νουκλεοτιδικών αλληλουχιών και ανεύρεση αμινοξικών αλληλουχιών Συγκρίσεις DNA και αμινοξικών αλληλουχιών μεταξύ διαφόρων ειδών και διαφόρων οργανισμών πραγματοποιήθηκαν στη βάση δεδομένων NCBI ( επιλέγοντας την επιλογή BLAST Μικροενέσεις DNA και δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού Προετοιμασία διαλύματος ένεσης Δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά έμβρυα αχινού χρησιμοποιώντας PCR προϊόντα. Τα μόρια που χρησιμοποιήθηκαν στις μικροενέσεις είναι τα εξής: 1. τα PCR προϊόντα με τα διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα a1, a2, a3, a4, a5 2. τα PCR προϊόντα με τις εσωτερικές αφαιρέσεις 1, 2, 3, 4 3. τα PCR προϊόντα με τις στοχευμένες αφαιρέσεις των στοιχείων -453, -432, και τη διπλή αφαίρεση των στοιχείων -453/ ένεση ελέγχου του PCR προϊόντος με όλη την ανοδική περιοχή a 106

123 Υλικά και μέθοδοι Σε κάθε αυγό ενέθηκαν κατά μέσο όρο 5pl διαλύματος που περιέχει τα εξής: προς έλεγχο PCR DNA : μόρια/pl. Γλυκερόλη 100% :30% στο τελικό διάλυμα DNA συνοδός (carrier): Τετραπλάσια μόρια ως προς το DNA ελέγχου. Ως carrier χρησιμοποιήθηκε γενωμικό DNA από τον αχινό P.lividus μετά από ολονύχτια πεψη 30μg με EcoRV και καθαρισμό του με τη μέθοδο Phenol Extraction. Στην αντίδραση προστέθηκε BSA. Το μέσο Μ.Β. του είναι περίπου 5000bp. mqh 2 O Το διάλυμα μεταφέρεται σε milipore φίλτρα MILEX-HV 0.45μm catalogue number SLHV R04 NL και φυγοκεντρείται στις 6000rpm για 10. Μελέτη των παραγόντων PlJun, PlFra, PlElk, PlPea 2.23 Αναζήτηση αλληλουχιών στις βάσεις δεδομένων Προκειμένου να απομονωθούν τα cdnas των παραγόντων Jun, Fra, Elk και Pea απαιτείται η γώση των αλληλουχιών τους. Δεδομένου ότι η αλληλούχηση του γονιδιώματος του S.purpuratus έχει ολοκληρωθεί, αναζητήθηκαν οι αληλουχίες των cdnas των παραγόντων αυτών στο γονιδίωμα του S.purpuratus χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων NCBI ( και συγκεκριμένα τα ESTs της βάσης. Οι αλληλουχίες που προέκυψαν χρησιμοποιήθηκαν για να βρεθούν οι ομόλογές τους στον αχινό P.lividus χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων (linkhttp://goblet.molgen.mpg.de/cgibin/webapps/paracentrotus2008.cgi?menu=blas t). Ειδικά για τον παράγοντα Fra δεν βρέθηκε εξ αρχής η αλληλουχία στον αχινό S.purpuratus οπότε αναζητήθηκε η αλληλουχία του ανθρώπινου cdna του παράγοντα Fos (ομόλογου του Fra) και αυτή χρησιμοποιήθηκε για την αναζήτηση της ομόλογής της στον S.purpuratus. Ακολούθως η αλληλουχία του S.purpuratus 107

124 Υλικά και μέθοδοι χρησιμοποιήθηκε ως βάση για την εύρεση της ομόλογης αλληλουχίας του cdna του παράγοντα Fra στον P.lividus RACE και 3 RACE Αναζητήθηκαν η 5 αλληλουχία του cdna του γονιδίου PlJun και η 3 αλληλουχία του PlFra χρησιμοποιώντας τις μεθόδους 5 και 3 RACE. Χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα για τις 5 και 3 RACE cdna που είχε παρασκευαστεί από 2μg polya plus mrna ακολουθώντας το πρωτόκολλο 5 RACE και 3 RACE της Ambion αντίστοιχα. Χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές της εταιρείας Ambion και πολυμεράση και buffer της εταιρείας Roche. Πραγματοποιήθηκαν δύο αντιδράσεις PCR (nested), η πρώτη με υπόστρωμα cdna και η δεύτερη με υπόστρωμα το PCR προϊόν της 1 ης αντίδρασης.οι εκκινητές σχεδιάστηκαν με τη βοήθεια του προγράμματος Primer 3. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε τελικό όγκο 25μl και οι συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων στο τελικό διάλυμα ήταν οι εξής: Γονίδιο-RACE/Εκκινητές PlJun 5 RACE PlFra2 3 RACE Ανοδικός εκκινητής 5 Race 5 Race 5 Race Outer inner inner Fra outer Fra inner Καθοδικός εκκινητής Jun 835 Jun 668 Jun Race outer 3 Race inner Οι αλληλουχίες των εκκινητών είναι οι εξής: Jun 835 : 5 GCTCCTGCTTGATGTTTCA 3 Jun 668 : 5 ATAGTGGTTTGCGGGTTGAG 3 Jun 400 : 5 AGGCAAGCTTGAGCATCTGT 3 Fra outer: 5 GAGGAGAGTCCGTCGAGAGAGGA 3 Fra inner: 5 TCTCCAAGCTCCAGCAACAGAAAGA 3 108

125 Υλικά και μέθοδοι Αντίδραση 2 Υπόστρωμα cdna (από polya mrna) (1 η PCR) :0.5μl ή PCR προϊόν 1 ης αντίδρασης (2 η PCR) :1μl ή (Μόνο για το Jun) PCR προϊόν 2 ης αντίδρασης (3 η PCR) :1μl 10X Buffer (Roche) :1X στο τελικό δ/μα Νουκλεοτίδια (10mM) :0.4mM Εκκινητές συμπληρωματικοί στο γονίδιο στόχο :0.6mM Εκκινητές συμπληρωματικοί στην polya ουρά (3 RACE) :1μl ή στον 5 RACE προσδέτη (5RACE) :1μl Taq Fast Start (Roche) (5u/μl) :0.5μl mqh 2 O Για την πραγματοποίηση της PCR εφαρμόστηκε το ακόλουθο πρόγραμμα: Πρόγραμμα 2 Βήμα 1 ο : 95 0 C για 5 Βήμα 2 ο : 95 0 C για 30 Βήμα 3 ο : 60 0 C για 30 Βήμα 4 ο : 72 0 C για 3 Βήμα 5 ο : Επιστροφή στο βήμα 2 για 39 κύκλους Βήμα 6 ο : 72 0 C για 7 Βήμα 7 ο : τέλος Τα προϊόντα των PCR αντιδράσεων αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1.2%, κλωνοποιήθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα pgem-teasy (εικόνα 2.1) και τα προϊόντα της αντίδρασης λιγάσης μετασχηματίστηκαν σε δεκτικά βακτήρια E.coli με ηλεκτροδιάτρηση και την επόμενη μέρα επιλέγχθηκαν οι λευκές αποικίες. 109

126 Υλικά και μέθοδοι Για το γονίδιο PlJun, επιβεβαιώθηκε η παρουσία του 5 άκρου του εντός του φορέα με απομόνωση του πλασμιδιακού DNA από τις αποικίες, μετασχηματισμένες φωτομέτρηση των προϊόντων με αραίωση 1/50 και κατάτμηση ελέγχου με το ένζυμο περιορισμού EcoRI που αναγνωρίζει θέσεις πρόσδεσης δεξιά και αριστερά του ενθέματος. Ακολούθως τα προϊόντα αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1% και κάποια επιλέγχθηκαν να αλληλουχηθούν. Η ένθεση του 3 άκρου του γονιδίου PlFra εντός του πλασμιδιακού φορέα επιβεβαιώθηκε κάνοντας βακτηριακή PCR, λόγω του πολύ μεγάλου αριθμού άσπρων αποικιών. Ελέγχθηκαν 35 μετασχηματισμένες αποικίες αφού προηγουμένως χωρίστηκαν σε εφτά πεντάδες και χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος των εκκινητών Fra inner-3 RACE inner. Κατά τη διαδικασία αυτή κάθε αποικία από το τρυβλίο μετασχηματισμού λαμβάνεται με αποστειρωμένο κρίκο και ανακαλλιεργείται σε νέο τρυβλίο στο οποίο έχουν σχεδιαστεί θέσεις από το 1 έως το 37 και το τρυβλίο επωάζεται στους 37 0 C για 16 ώρες. Η ποσότητα των βακτηρίων που απομένει στον κρίκο μεταφέρεται σε σωληνάκι Eppendorf όπου έχουν προστεθεί 100μl Η 2 Ο. Στην προκειμένη περίπτωση σε κάθε σωληνάκι μεταφέρθηκαν 5 αποικίες και συνολικά ελέγχθησαν εφτά πεντάδες αποικιών. Ανάλογα με το ποσοστό των λευκών αποικιών μπορεί να ελεγθεί μεγαλύτερος αριθμός αποικιών σχηματίζοντας δεκάδες σε κάθε σωληνάκι. Ακολουθεί PCR αντίδραση χρησμοποιώντας ως υπόστρωμα, υλικό από το κάθε σωληνάκι με σκοπό να ελεγχθεί σε ποιά πεντάδα (ή δεκάδα) υπάρχει αποικία που φέρει το πλασμίδιο με το ένθεμα. Εικ.2.1 O Φορέας pgem-t Easy. Aναγνωρίζεται ο πολυσυνδέτης του. 110

127 Υλικά και μέθοδοι Ακολουθήθηκαν τα βήματα του Προγράμματος 2 με τις εξής διαφορές: Βήμα 4:72 0 C για 1 Βήμα 5:Επιστροφή στο βήμα 2 για 34 φορές Βήμα 6:72 0 C για 5 Τα προϊόντα αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1.2% και η πρώτη πεντάδα αποικιών επιλέγχθηκε για περαιτέρω έλεγχο των πέντε κλώνων και επιλογή αυτών που φέρουν το ένθεμα με κατάτμηση ελέγχου με EcoRI. Κάποιες από τις αποικίες που φέρουν το ένθεμα αλληλουχήθηκαν RT-PCR Απομόνωση cdna Τα cdnas των παραγόντων PlJun, PlFra, PlElk και PlPea απομονώθηκαν με RT-PCR χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια της εταιρείας Takara και τα κάτωθι ζεύγη των εκκινητών: Jun Fra Elk Pea Ανοδικός Jun5 Fra-For 5 PlElk 5 PlPea Εκκινητής Καθοδικός Jun3 Fra-Rev 3 PlElk 3 PlPea Εκκινητής Τα ζεύγη των εκκινητών επιλέγχθηκαν με βάση το πρόγραμμα Primer 3. Οι αλληλουχίες των εκκινητών είναι οι εξής: Jun5 :5 TTTGGGAATCCTTAGTCAGTGT 3 Jun3 :5 CATACATGGATTGCTCTATTCG 3 Fra-For:5 CGGAAGCTATTCGTGACTAAGGA 3 Fra-Rev:5 GTTTTGCTCTTCGTTTCCCTTTC 3 5 PlElk:5 ACATCCACCTTTAGAGCACATTC 3 3 PlElk:5 ATTTATACAGGTTTTGCGAGCAG 3 111

128 Υλικά και μέθοδοι 5 PlPea:5 CGACATGGTCTGAAAGTGT 3 3 PlPea:5 CAAAAGGCTATTGAAA 3 Χρησιμοποιήθηκαν RNA υποστρώματα από διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια για το κάθε γονίδιο. Συγκεκριμένα για το PlJun χρησιμοποιήθηκε RNApolyA αυγού, για το PlFra βλαστιδίου ενώ για τα PlElk και PlPea, πλουτέα. RT-PCR (Τελικός όγκος 25μl) (Αντίδραση 3) Υπόστρωμα RΝΑ (total RNA) :100ng Buffer 2X :1X Enzyme mix (units) :1μl Εκκινητές (15μΜ) :0.6μΜ ο κάθε ένας RNAse free H 2 O Ακολουθήθηκε το εξής πρόγραμμα: Βήμα 1 ο : 50 ο C για 30 Βήμα 2 ο : 94 ο C για 2 Βήμα 3 ο : 94 ο C για 30 Βήμα 4 ο : ο C για 30 (Για τους Fra, Elk και Pea: C για 30 ) Βήμα 5 ο : 72 ο C για 45 ( Για τους Elk και Pea: 72 0 C για 2 :30 ) Βήμα 6 ο :Επιστροφή στο βήμα 3 για 39 φορές Βήμα 7 ο : 72 ο C για 10 Βήμα 8 ο : τέλος Ακολούθησε καθαρισμός των PCR προϊόντων, αντίδραση λιγάσης με τον πλασμιδιακό φορέα pgem-teasy, μετασχηματισμός σε δεκτικά βακτήρια E.coli με ηλεκτροδιάτρηση και επιλογή των λευκών αποικιών. Ο έλεγχος για την παρουσία του ενθέματος έγινε για το cdna του PlJun με βακτηριακή PCR λόγω των πολλών άσπρων αποικιών. Ελέγχθησαν 100 αποικίες σχηματίζοντας 10 δεκάδες και χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος των εκκινητών Jun5- Jun3. 112

129 Υλικά και μέθοδοι Ακολούθως επιλέγχθηκε η δεκάδα που φέρει το επιθυμητό τμήμα DNA και πραγματοποιήθηκαν εκ νέου μοναδικές πλέον PCR αντιδράσεις σε βακτηρια ώστε να επιλεγεί συγκεκριμένα ο κλώνος που φέρει το ένθεμα και να απομονωθεί. Πρόκειται για έναν εναλλακτικό τρόπο ελέγχου της ύπαρξης ενθέματος, έναντι αυτού της πλασμιδιακής απομόνωσης με kit. Στη συγκεκριμένη αντίδραση χρησιμοποιήθηκαν ως υπόστρωμα 2.5μl από κάθε πεντάδα ακολουθώντας την Αντίδραση 2. Ο έλεγχος της παρουσίας του cdna των γονιδίων PlFra, PlElk και PlPea εντός του pgem-teasy έγινε με απομόνωση πλασμιδιακού DNA σύμφωνα με το πρωτόκολλο των αντιδραστηρίων Nucleospin Plasmid Quick Pure / Macherey Nagel και κατάτμηση ελέγχου στα προϊόντα με το ένζυμο περιορισμού EcoRI. Οι κλώνοι που έφεραν το ένθεμα φωτομετρήθηκαν μετά από αραίωση 1/50 και αλληλουχήθηκαν Έλεγχος ενδογενούς RNA Μελετήθηκε η ενδογενής έκφραση των γονιδίων PlJun, PlFra, PlElk και PlPea με RT-PCR σε 6 αναπτυξιακά στάδια του αχινού:1) Αυγό 2) 16 κύτταρα 3) Βλαστίδιο 4) Γαστρίδιο 5) Πλουτέας 32.5 ωρών 6) Πλουτέας 45 ωρών. Πραγματοποιήθηκε η αντίδραση όπως έχει ήδη περιγραφεί στην παράγραφο (Αντίδραση 3). Για κάθε στάδιο χρησιμοποιήθηκαν 100ng RΝΑ. Επαναλήφθηκε το Πρόγραμμα 3 όπως εφαρμόστηκε για τα γονίδια PlElk και PlPea με την εξής διαφορά: Bήμα 4: 58 0 C για 30 Τα προϊόντα αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1%. 113

130 Υλικά και μέθοδοι 2.26 In vitro Μεταγραφή Πραγματοποιήθηκε in vitro μεταγραφή των γονιδίων PlJun, PlFra, PlElk και PlPea σύμφωνα με το πρωτόκολλο της εταιρείας Ambion (kit mmessage mmachine). Η πολυμεράση T7 ή Sp6 που χρησιμοποιείται επιλέγεται ανάλογα με την κατεύθυνση που έχει εισαχθεί το γονίδιο αναφοράς στον πλασμιδιακό φορέα. Για τη μεταγραφή χρησιμοποιούνται γραμμικά DNAs μετά από κατάτμηση 5-10μg κυκλικού υποστρώματος με ένζυμα περιορισμού που αφήνουν 5 άκρα μετά τη δράση τους. Συγκεκριμένα ως υποστρώματα χρησιμοποιήθηκαν οι κατασκευές Jun, Fra, Elk και Pea στο φορέα pgem-teasy. Τα ένζυμα περιορισμού που χρησιμοποιήθηκαν για τα συγκεκριμένα υποστρώματα ήταν τα εξής: Jun-pGEM-TEasy: SpeI Fra-pGEM-TEasy: SalI Elk-pGEM-TEasy: NcoI Pea-pGEM-TEasy: NdeI Τα προϊόντα καθαρίζονται και τα DNAs κατακρημνίζονται με τη μέθοδο Phenol Extraction πριν την αντίδραση μεταγραφής. Τελικός όγκος αντίδρασης 20μl: Η 2 Ο απουσία RNAσών 10X transcription buffer: 1X 2X ribonoucleotide mix: 1X Γραμμικό DNA : 1μg 10X enzyme mix : 1X Προκειμένου η σπερμιδίνη να μην κατακρημνίσει το DNA τα αντιδραστήρια προστίθενται στην αντίδραση με τη σειρά που αναγράφονται και στους 25 0 C. Κατόπιν, η αντίδραση επωάζεται στους 37 0 C για 2 ώρες. Η απομάκρυνση πιθανού DNA γίνεται με προσθήκη 1μl DNaseI RNase-free (Roche) και επώαση της αντίδρασης για 15 στους 37 0 C. 114

131 Υλικά και μέθοδοι Η λήξη της μεταγραφής πραγματοποιείται προσθέτοντας στην αντίδραση 115μl DEP H 2 O και 15μl Ammonium Acetate Stop Solution. Ακολουθεί Phenol Extraction και κατακρήμνιση του RNA με ίσο όγκο (ως προς τον όγκο του διαλύματος μετά το Phenol Extraction) Ισοπροπυλικής Αλκοόλης. Το δείγμα παραμένει για 16 ώρες στους C και μετά το πέρας της επώασης το RNA καθαρίζεται με EtOH 70% και διαλύεται σε DEP H 2 O. Επειδή η μετάφραση που θα ακολουθήσει καταστέλλεται από την παρουσία ελεύθερων νουκλεοτιδίων στην αντίδραση, γίνεται απομάκρυνσή τους με δίοδο του υποστρώματος RNA από κολώνα Sephadex G-50 μετά από φυγοκέντρηση στα 1000g για 2. Τα προϊόντα φωτομετρούνται στα 260 και 280nm και αναλύονται σε πήκτωμα φορμαλδεϋδης In vitro Μετάφραση Πραγματοποιήθηκε in vitro μετάφραση των γονιδίων PlJun45, PlFra, PlElk, PlPea και PlCoup-tf. Χρησιμοποιήθηκαν 3 μεταφραστικά συστήματα με σκοπό την εύρεση της αποδοτικότερης μεταφραστικής συσκευής αλλά και αυτής που το ενδογενές σύστημα δεν φέρει όμοια με την παραγόμενη. Έτσι, παρασκευάστηκαν πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας τόσο τη μεταφραστική συσκευή των ερυθροκυττάρων του κουνελιού (rabbit reticulosyte lysate), του Wheat Germ αλλά και το σύστημα T.N.T. το οποίο επιτελεί ταυτόχρονα σε μία αντίδραση τη μεταγραφή και τη μετάφραση και χρησιμοποιεί τη μεταφραστική συσκευή των ερυθροκυττάρων του κουνελιού. Τα συστήματα που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή κάθε πρωτεΐνης ξεχωριστά είναι τα κάτωθι και οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του εκάστοτε πρωτοκόλλου: Πρωτεΐνες Jun, Fra, Pea: Συστήματα wheat germ, rabbit reticulosyte lysate, T.N.T. Συμμετάφραση πρωτεϊνών Jun και Fra: Σύστημα Rabbit reticulosyte lysate Πρωτεΐνη PlElk: Συστήματα wheat germ, rabbit reticulosyte lysate 115

132 Υλικά και μέθοδοι Πρωτεΐνες PlCoup-TF και SpElk: Σύστημα T.N.T. Παρήχθησαν πρωτεϊνες τόσο με κρύα όσο και με ραδιενεργή μεθειονίνη (met 35 ) καθώς επίσης έλαβαν χώρα και αντιδράσεις ελέγχου, δηλαδή χωρίς προσθήκη RNA στην αντίδραση. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε τελικό όγκο 50μl ως ακολούθως: Πρωτόκολλο Wheat Germ: Πρωτόκολλο Rabbit Reticulocyte System: Extract : 25μl Rabit Retic Lysate : 35μl Mείγμα αμινοξέων χωρίς met (1mM): 2μl Mείγμα αμινοξέων χωρίς met (1mM): 0.5μl Mείγμα αμινοξέων χωρίς leu (1mM) : 2μl Mείγμα αμινοξέων χωρίς leu (1mM) : 0.5μl ή met 35 (1200Ci/mmol σε 10mCi/ml): 2μl ή met 35 (1200Ci/mmol σε 10mCi/ml) : 1μl RNA : 2μg RNA : 2μg RNase inhibitor (40units/μl) : 1μl RNase inhibitor (40units/μl) : 1μl K-acetate : 2μl H 2 O H 2 O Eπώαση: 25 0 C για 2 ώρες Επώαση: 30 0 C για 1 1/2 ώρα Το RNA πριν προστεθεί στην αντίδραση θερμαίνεται στους 65 0 C για 5 και ακολούθως μεταφέρεται στον πάγο προκειμένου να καταστραφούν οι δευτεροταγείς δομές που πιθανόν έχει σχηματίσει. 116

133 Υλικά και μέθοδοι Πραγματοποιήθηκε πείραμα in vitro μετάφρασης των πρωτείνών PlJun και PlFra με το σύστημα Rabit Reticulocyte όπου χρησιμοποιήθηκαν διαβαθμίσεις Οξικού Κ και Οξικού Mg Οξικό Κ - 1M 1M Οξικό Mg mM Πρωτόκολλο TNT Lysate : 40μl Μεθειονίνη: 1μl ή met 35 : 2μl DNA : 1μg Επώαση: 30 0 C για 1 1/2 ώρα Σύμφωνα με αυτό το πρωτόκολλο μπορεί να χρησιμοποιηθεί γραμμικό ή κυκλικό υπόστρωμα. Η παραγωγή της PlCoup-TF πρωτεΐνης έγινε χρησιμοποιώντας κυκλικό υπόστρωμα Phenol Extraction Πραγματοποιείται η μέθοδος Phenol Extraction για τον καθαρισμό των δειγμάτων DNA ή RNA από την πιθανή προυσία πρωτεϊνών. Εάν η ποσότητα του δείγματος είναι μικρή (<50μl) προστίθεται Η 2 Ο στο δείγμα. Στο πρώτο βήμα της διαδικασίας γίνεται η καταστροφή των πρωτεϊνών με προσθήκη ίσου όγκου ως προς τον όγκο του δείγματος Φαινόλης και το δείγμα αναδεύεται ισχυρά για 2. Χρησιμοποιείται Φαινόλη ph:8.0 για DNA και ph:6.5 για RNA. 117

134 Υλικά και μέθοδοι Ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών (οργανική φάση) από το DNA/RNA (υδατική φάση) γίνεται με την προσθήκη ίσου όγκου ως προς τον αρχικό Χλωροφορμίου και το δείγμα αναδεύεται ισχυρά για 2. Ακολουθεί φυγοκέντρηση του δείγματος για 5-10 στις 13000rpm οπότε και η υδατική φάση μένει στην επιφάνεια. Η υδατική φάση μεταφέρεται σε νέο Eppendorf όπου προστίθεται ίσος όγκος ως προς τον αρχικό ΧλωροφόρμιοΙσοαμυλικήΑλκοόλη (CIA) και το δείγμα αναδεύεται ισχυρά για 2. Το δείγμα φυγοκεντρείται για 5 στις 13000rpm και η υδατική φάση μένει στην επιφάνεια. Ακολουθεί μεταφορά της υδατικής φάσης σε νέο Eppendorf και προσθήκη Οξικού Νατρίου 3Μ τόσο ώστε στο τελικό διάλυμα να έχει συγκέντρωση ~200mM. Το δείγμα ογκομετρείται και το DNA/ RNA κατακρημνίζεται με προσθήκη δύο όγκων EtOH 100%, αναδεύεται καλά και παραμένει στους C για 10 ώρες (τουλάχιστον 4 ώρες). Μετά το πέρας των 10 ωρών το δείγμα φυγοκεντρείται στις 13000rpm για 20 στους 4 0 C και η EtOH αφαιρείται προσεχτικά με Pasteur πιπέτα. Το εναπομέιναν ίζημα καθαρίζεται με προσθήκη 150μl ΕtOH 70%, καλή ανάδευση για 1 και φυγοκέντρηση στις 13000rpm για 20 στους 4 0 C. Το βήμα επαναλαμβάνεται σε περίπτωση παρουσίας μεγάλης ποσότητας άλατος. Ακολουθεί απομάκρυνση της EtOH, ξήρανση του ιζήματος στον αέρα και διάλυση του DNA/ RNA σε Η 2 Ο έτσι ώστε κατά προσέγγιση η τελική συγκέντρωση να είναι 0.5μg/μl. Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν παρασκευάστηκαν ως εξής: Φαινόλη: Χρησιμοποιείται έτοιμη από το εμπόριο. Χλωροφόρμιο: Χρησιμοποιείται έτοιμο από το εμπόριο CIA:24/1 V/V Χλωροφόρμιο προς Ισοαμυλική αλκοόλη 118

135 Υλικά και μέθοδοι 3M NaOAc: (Για 200ml δ/τος): Ζυγίζονται 81.65g NaOAc και συμπληρώνονται με Η 2 Ο. Το ph ρυθμίζεται στο 6.8 με HAc και συμπληρώνεται ο όγκος του Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Πραγματοποιήθηκαν πειράματα χρησιμοποιώντας in vitro μεταφρασμένες πρωτεΐνες καθώς και πρωτεΐνες πυρηνικού εκχυλίσματος. Μελετήθηκε η ικανότητα πρόσδεσης των πρωτεϊνών Jun, Fra, Elk, Pea, και Coup-TF που παρασκευάστηκαν in vitro καθώς και πρωτεϊνών πυρηνικού εκχυλίσματος σε διάφορα στοιχεία απόκρισης. Συγκεκριμένα: Πρωτεΐνες Στοιχεία Jun/Jun -432 Jun/Fra cons. Jun Fra/Fra cons. AP1 Elk Pea -453 Coup-TF C1R Πρωτεΐνες πυρηνικού -432 εκχυλίσματος C1R 119

136 Υλικά και μέθοδοι Οι αλληλουχίες των στοιχείων φαίνονται στο σχήμα 1 του παραρτήματος. Τα στοιχεία cons. Jun και cons. ΑP1 είναι πρότυπα στοιχεία απόκρισης του παράγοντα AP1 όπως προκύπτει από τη βιβλιογραφία και χρησιμοποιήθηκαν ως πείραμα ελέγχου για τον παράγοντα AP1. Κάθε αντίδραση περιλαμβάνει τα εξής: Τελικός όγκος 10μl Στοιχείο απόκρισης ραδιενεργό με P 32 :1μl με 30000cpm Buffer Πρόσδεσης 5X : 1X Poly da/dt, di/dc (1μg/μl) : 1μl Πρωτεΐνη : 2-4μl Ειδικός ανταγωνιστής : Χ100-X200 ως προς το μη ραδιενεργό δίκλωνο στοιχείο απόκρισης H 2 O Οι αντιδράσεις πραγματοποιούνται στον πάγο όπου και παραμένουν για 20. Ακολούθως προστίθενται 2μl 6X χρωστικής για EMSA και τα προϊόντα αναλύονται σε πήκτωμα ακρυλαμίδης 5%, 0.5Χ TBE σε ένταση ρεύματος 45mA. Η ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων διενεργείται στους 4 0 C. Ακολουθεί μεταφορά των δειγμάτων σε χαρτί whatman και έκθεση σε φωτογραφικό φιλμ. Το πήκτωμα ακρυλαμίδης παρακευάζεται ως εξής: Tελικός όγκος δ/τος 50ml TBE 5X : 5ml Aκρυλαμίδη-Βis ακρυλαμίδη (29.3%-0.7%) : 8.5ml AP 20% : 300μl TEMED : 15μl H 2 O Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν παρασκευάστηκαν ως εξής: Buffer Πρόσδεσης 5X: AP 20%: Hepes (ph:7.9): 90mM Ζυγίζονται 2g AP και συμπληρώνονται KCl : 250mM με 120

137 Υλικά και μέθοδοι DTT : 5mM Η 2 Ο ως τα 10ml MgCl 2 : 15mM Γλυκερόλη : 40% Aκρυλαμίδη-Βis ακρυλαμίδη (29.3%-0.7%): Ζυγίζονται 29.3g Ακρυλαμίδη και 0.7g Bis ακρυλαμίδη και συμπληρώνονται με H 2 O ως τα 100ml. Running Buffer: 0.5X TBE 6X Xρωστική Δειγμάτων EMSA: 0.25% Κυανούν του ξυλενίου 0.25% Μπλε της βρωμοφαινόλης 25% Φικόλη 2.30 Σήμανση Στοιχείων Απόκρισης με 32 P-γ-ATP Δημιουργία δίκλωνων στοιχείων απόκρισης Τα στοιχεία απόκρισης που πρόκειται να ελεγχθούν με EMSA γίνονται δίκλωνα σύμφωνα με την αντίδραση: Τελικός όγκος αντίδρασης 40μl Ολιγονουκλεοτίδιο Forward:1000pmol Ολιγονουκλεοτίδιο Reverse:1000pmol 20X SSC ph:7.0 :2X mqh 2 O 121

138 Υλικά και μέθοδοι Ακολουθεί αποδιάταξη των δευτεροταγών δομών που πιθανόν σχηματίζουν τα ολιγονουκλεοτίδια με επώαση της αντίδρασης στους C για 1 και υβριδοποίηση των ολιγονουκλεοτιδίων μεταξύ τους με επώαση σε υδατόλουτρο στους 70 0 C για 5 και αναμονή πτώσης της θερμοκρασίας στους 35 0 C Αντίδραση Κινάσης Στην αντίδραση χρησιμοποιούνται 10pmol δίκλωνου στοιχείου απόκρισης, 32 P-γ-ATP καθώς και κινάση και το buffer της από την εταιρεία NEB σύμφωνα με την αντίδραση: H 2 O :6μl Δίκλωνο στοιχείο απόκρισης :1μl (10pmol) 32 P-γ-ATP (6.5000Ci/mmol) :1μl 10X Buffer Κινάσης :1μl (1X) Κινάση (2.5X10 6 u/ml) :1μl Η αντίδραση επωάζεται στους 37 0 C για 1 ώρα και προστίθενται 40μl H 2 O. Για τη μέτρηση της ενσωμάτωσης του ραδιενεργού φωσφόρου στο στοιχείο απόκρισης παραλαμβάνεται 1μl από την αντίδραση και προστίθεται σε υγρό σπινθηρισμού. Η υπόλοιπη αντίδραση διαπερνάται από κολώνα Sefadex G-50 με φυγοκέντρηση στα 1000g για 2 ώστε να συγκρατηθούν τα μη ενσωματωμένα νουκλεοτίδια. 1μl από την αντίδραση που διαπέρασε την κολώνα μεταφέρεται σε υγρό σπινθηρισμού και μετρώνται τα cpm τόσο πριν όσο και μετά τη φυγοκέντρηση. Κολώνα Sefadex G-50: Ζυγίζονται 5g Sefadex G-50 (Sigma) και συμπληρώνονται με mqh 2 O ως τα 50ml. Προστίθενται 50μl DEP και το διάλυμα αποστειρώνεται. Για τη δημιουργία των κολωνών, σφαιρίδια από τον πάτο του διαλύματος μεταφέρονται με Pasteur πιπέτα σε μικρά φίλτρα (Μicrospin της Pharmacia Biotech) και φυγοκεντρούνται στα 1000g για

139 Υλικά και μέθοδοι 2.31 SDS Ηλεκτροφόρηση Πραγματοποιήθηκε SDS ηλεκτροφόρηση για τις πρωτεΐνες που παρασκευάστηκαν in vitro προκειμένου να επιβεβαιωθεί η παρουσία τους. Για την ηλεκτροφόρησηση χρησιμοποιούνται πρωτεΐνες που έχουν συντεθεί με met 35. Τα πηκτώματα (άνω και κάτω) παρασκευάστηκαν ως εξής: Κάτω Πήκτωμα ή Πήκτωμα διαχωρισμού: Άνω Πήκτωμα ή Πήκτωμα πακεταρίσματος: (Για 15ml δ/τος) (Για 10ml δ/τος) Tris-HCl 1.5M ph:8.8 :3.75ml Tris-HCl(1M), ph:6.8 :2.5ml ddh 2 O :6ml ddh 2 O :5.5ml Aκρυλαμίδη-Βis ακρυλαμίδη(29:1):5ml Aκρυλαμίδη-Βisακρυλαμίδη(29:1) :2ml SDS 10% :150μl SDS 10% :100μl AP 20% :50μl AP 20% :30μl TEMED :20μl TEMED :10μl Ως buffer ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιήθηκε Running Buffer 1X Running Buffer 5X: Tris-base:30g Γλυκίνη :144g SDS :10g dh 2 O :Ως 2L Για την ανάλυση των πρωτεϊνικών δειγμάτων 10μl πρωτεΐνης αναμείχθηκαν με ίσο όγκο Buffer Δείγματος το οποίο περιέχει 4μέρη SDS Βuffer και 1 μέρος DTT 1M. Τα δείγματα μεταφέρονται στους C για 5 προκειμένου να αποδιαταχτούν δευτεροταγείς δομές των πρωτεϊνών και έπειτα στο πήκτωμα όπου ηλεκτροφορούνται σε θερμοκρασία δωματίου στα 10mA. Ακολουθεί μεταφορά των δειγμάτων σε χαρτί whatman για 1 ώρα και έκθεση σε φωτογραφικό φιλμ. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν παρασκευάστηκαν ως εξής: 123

140 Υλικά και μέθοδοι Tris-HCl 1.5M ph 8.8: Tris-HCl 0.5M ph 6.8: (Για 250ml δ/τος) (Για 250ml δ/τος) Tris-Cl:45.41g Tris-Cl: g dh 2 O:Ως 200ml dh 2 O:Ως 200ml ph με HCl 37% ως 8.8 ph με HCl 37% ως 6.8 dh 2 O: Ως 250ml dh 2 O: Ως 250ml Τα διαλύματα αποστειρώνονται. SDS 10% (Για 1L δ/τος): Ζυγίζονται 10g Sodium Dodecyl Sulfate και συμπληρώνονται με H 2 O ως το 1L. Τα AP 20% και το διάλυμα Ακρυλαμίδης Bis Ακρυλαμίδης έχουν περιγραφεί στην παράγραφο 2.29 SDS Buffer Δείγματος: DTT 1M (Για 10ml δ/τος): (Για 20ml δ/τος) Ζυγίζονται 1.5g DTT 250mM EDTA ph 8 :10ml Η 2 Ο 50% Γλυκερόλη :10ml 1% SDS :0.2g 0.1% Μπλε της Βρωμοφαινόλης:0.02g 2.32 WESTERN BLOT ανάλυση Επιβεβαιώθηκε η παρουσία των πρωτείνών Elk και Coup-TF που συντέθηκαν in vitro αλλά και η παρουσία τους σε πυρηνικό εκχύλισμα με τη μέθοδο Western. Οι πρωτεΐνες αναλύονται σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου (SDS PAGE) όπως περιγράφηκε προηγουμένως και μεταφέρονται σε μεμβράνη PVDF υπό ένταση ρεύματος 200mA. Η μεταφορά γίνεται σε Διάλυμα Μεταφοράς (Transfer Buffer). 124

141 Υλικά και μέθοδοι Ακολουθεί ξέπλυμα της μεμβράνης με 1Χ TBST για 10 και μπλοκάρισμα των πρωτεϊνών με 5% σκόνη γάλακτος σε TBS 1X -0.1% Tween για 1 ώρα στους 37 0 C. Οι μεμβράνες επωάζονται με το 1 0 αντίσωμα για 16 ώρες στους 4 0 C (α-spelk: Μονοκλωνικό αντίσωμα σε αραίωση 1:100 (προσφορά από Dr. Arnone M.I.), α-elk: Πολυκλωνικό αντίσωμα σε αραίωση 1:100, α-coup-tf: Πολυκλωνικό αντίσωμα σε αραίωση 1:500). Γίνονται 3 ξεπλύματα της μεμβράνης με 1Χ TBST διάρκειας 15 το κάθε ξέπλυμα. Οι μεμβράνες επωάζονται με το δεύτερο αντίσωμα (πολυκλωνικό σε αραίωση 1:2000) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και έπειτα ξεπλένονται με TBST 4-5 φορές από 10 το κάθε ξέπλυμα. Οι ζώνες των πρωτεϊνών γίνονται ορατές μετά από έκθεση σε ECL (GenScript) για 1. Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν παρασκευάστηκαν ως εξής: Transfer Buffer: Western Buffer 10X 8 μέρη dh 2 O Tris-Cl :30g 1 μέρος Μεθανόλη Γλυκίνη:144g 1 μέρος Western Buffer 10X dh 2 O : Ως 1L 2.33 In Situ Υβριδοποίηση Στο πρώτο στάδιο της in situ υβριδοποίησης το δείγμα είναι ευαίσθητο στη δράση των RNAσών και ως εκ τούτου χρησιμοποιούνται ρύγχοι και σωληνάκια επεξεργασμένα με DEP (Διαιθυλ-Πυροφωσφορικό). Επίσης στα στάδια στα οποία απαιτείται απομάκρυνση όλου του υπερκειμένου αφαιρείται τόση ποσότητα ώστε να παραμένει όγκος διαλύματος που καλύπτει τα έμβρυα τόσος όσο το πάχος των εμβρύων που έχουν καθιζάνει. Η όλη διαδικασία βασίζεται στην προσθήκη ιχνηθετών σημασμένων με διγοξιγενίνη στα διάφορα στάδια μονιμοποιημένων εμβρύων με σκοπό την υβριδοποίηση αυτών με το ενδογενές mrna (α στάδιο). Η επαγωγή της χρωστικής επιτυγχάνεται με την προσθήκη αντισώματος που φέρει 125

142 Υλικά και μέθοδοι αλκαλική φωσφατάση έναντι της διγοξιγενίνης (β στάδιο) και με την προσθήκη ουσίας BM Purple η οποία διασπάται υπό τη δράση της αλκαλικής φωσφατάσης και προσδίδει στα έμβρυα το χαρακτηριστικό μπλε χρώμα (γ στάδιο). Για την πορεία του πειράματος ακολουθήθηκε πιστά το πρωτόκολλο του Arenas-Mena C. (Arenas- Mena C. et al., 2000) σύμφωνα με τις τροποποιήσεις της Bradham C. Συλλέγεται από όλα τα στάδια ποσότητα μονιμοποιημένων σε MeOH εμβρύων (~150μl) και τα έμβρυα αφήνονται να καθιζήσουν. Ακολουθεί επαναιώρηση των εμβρύων στο ρυθμιστικό διάλυμα PBST αντικαθιστώντας τη μισή ποσότητα MeOH του υπερκειμένου με ίσο όγκο PBST. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται άλλη μία φορά. Στα βήματα που ακολουθούν τα έμβρυα ξεπλένονται πλέον με αντικατάσταση όχι της μισής αλλά όλης της ποσότητας του εκάστοτε διαλύματος και επαναιώρησή τους στο επόμενο διάλυμα. Τα ξεπλύματα που λαμβάνουν χώρα είναι τα εξής: 1. 3 Ξεπλύματα με PBST (200μl το πρώτο ξέπλυμα και από 150μl τα δύο επόμενα) 2. 1 Ξέπλυμα με Διάλυμα Υβριδοποίησης (200μl) 3. 1 Ξέπλυμα με Διάλυμα Υβριδοποίησης (100μl). Στο στάδιο αυτό επιτυγχάνεται η προϋβριδοποίηση. Στη συνέχεια τα έμβρυα επωάζονται σε φούρνο στους 65 0 C για 1.5 ώρα. Στο τέλος της επώασης αφαιρείται ξανά το υπερκείμενο και προστίθεται ο ιχνηθέτης του γονιδίου αναφοράς (100μλ, 3ng/μl) και τα έμβρυα επωάζονται ξανά στους 65 0 C για 16 ώρες. Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν παρασκευάστηκαν ως εξής: 10x PBS (Για 100ml δ/τος) Tween 20% (Για 10ml δ/τος) Na 2 HPO 4 : 1.44g Tween 20: 2ml KH 2 PO 4 : 0.24g DEP H 2 O: 8ml NaCl : 9g DEP H 2 O PBST (Για 50ml δ/τος) ph: x PBS : 5ml (1X PBS) Το δ/μα επεξεργάστηκε με DEP Tween 20%: 250μl (0,1%) και αποστειρώθηκε DEP H 2 O : 44,750ml 126

143 Υλικά και μέθοδοι Διάλυμα Υβριδοποίησης (Για 15ml) 20X SSC ph 5.0 (Για 100ml δ/τος) (Αποθήκευση στους -20 ο C) NaCl : 17,53g Φορμαμιδιο : 7.5ml (50%) Κιτρικό νάτριο: 8,82g 20XSSC ph 5.0 : 3.75ml (5X) DEP H 2 O trna Ζύμης 2.5mg/ml: 300μl (50μg/ml) DEP 1/10 Ηπαρίνη 50mg/ml : 15μl (50μg/ml) ph 5.0 Tween20 20% : 75μl (0.1%) Αποστείρωση Τα RNAs που δεν υβριδοποιήθηκαν μετά το στάδιο της επώασης, απομακρύνονται στα επόμενα ξεπλύματα των εμβρύων που ακολουθούν χρησιμοποιώντας αλάτι SSCT. Το διάλυμα SSC που χρησιμοποιείται σε αυτά τα βήματα έχει ph 7.0. Τα ξεπλύματα γίνονται στους 65 0 C και κάθε διάλυμα που χρησιμοποιείται έχει προηγουμένως προθερμανθεί για 15 στους 65 0 C. Σε κάθε στάδιο χρησιμοποιούνται 100μλ διαλύματος. Η διαδικασία περιλαμβάνει τα εξής βήματα και δεν απαιτεί τη χρήση ρυγχών ειδικών για RNA: 1. Ξέπλυμα με Διάλυμα Υβριδοποίησης για Επανάληψη του προηγούμενου βήματος 3. Ξέπλυμα με Διάλυμα 50/50 Διαλύματος Υβριδοποίησης-Διαλύματος 2Χ SSCT για Ξέπλυμα με Διάλυμα 2X SSCT για Ξέπλυμα με Διάλυμα 0.2Χ SSCT για Ξέπλυμα με Διάλυμα 0.1Χ SSCT για Επανάληψη του προηγούμενου βήματος 8. 3 Ξεπλύματα με διάλυμα TBST σε θερμοκρασία δωματίου (25 0 C). Τα έμβρυα αφήνονται να καθιζήσουν όλα και κατόπιν απομακρύνεται το υπερκείμενο και προστίθεται η νέα ποσότητα του διαλύματος. 9. Το μπλοκάρισμα των πιθανών ανεπιθύμητων θέσεων αναγνώρισης του αντισώματος γίνεται με αντικατάσταση του TBST με διάλυμα Block και επώαση του δείγματος σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. 127

144 Υλικά και μέθοδοι 10. Διάλυση αντισώματος (anti-dig Fab fragments, Roche) σε αναλογία 1/2000 σε διάλυμα Block. Αντικατάσταση του προηγούμενου διαλύματος με 100μl νέου που περιέχει το αντίσωμα. Η αντίδραση επωάζεται στους 4 0 C για 16 ώρες. Συνταγές διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν: 20X SSC ph 7.0 Περιγράφηκε στο προηγούμενο 2Χ SSCT (Για 2ml δ/τος) 20Χ SSC ph 7.0: 200μl (2Χ) στάδιο της in situ. Tween 20% : 10μl (0,1%) Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται στο 7.0 DEP H 2 O : 1790μl 0.2Χ SSCT (Για 2ml δ/τος) 10Χ TBS (Για 100ml δ/τος) 20X SSC ph 7.0:20μl Tris-HCl: 6.1gr Tween 20% : 10μl NaCl : 8.8gr DEP H 2 O : 1970μl H 2 O ph: Χ SSCT (Για 2ml δ/τος) TBST (Για 50ml δ/τος) 20X SSC ph 7.0: 10μl 10X TBS : 5ml (1X TBS) Tween 20% : 10μl Tween20 20%: 250μl (0,1%) DEP H 2 O : 1980μλ H 2 O : ml Διάλυμα Block TBST : 1ml HISS : 20μl BSA : 50μl 128

145 Υλικά και μέθοδοι Στα επόμενα στάδια γίνεται επαγωγή της χρωστικής BM Purple ως ακολούθως: Σε κάθε ξέπλυμα χρησιμοποιείται ποσότητα διαλύματος 200μl Ξεπλύματα των εμβρύων με Διάλυμα TBST 2. 2 Ξεπλύματα με Διάλυμα. Τα έμβρυα αφήνονται στο δεύτερο διάλυμα για αρκετά λεπτά Ξεπλύματα με Διάλυμα Λεβαμισόλης/Tween 20.Τα έμβρυα αφήνονται στο δεύτερο διάλυμα για Αντικατάσταση του προηγούμενου διαλύματος με 100μl BM Purple. Η χρωστική πριν τη χρήση της φυγοκεντρείται για 30 στις στροφές ώστε να καθιζήσουν πιθανά συσσωματώματα. Τα δείγματα επωάζονται στο σκοτάδι στους 25 0 C. Οι ώρες επώασης του κάθε γονιδίου αναφοράς παρουσία χρωστικής είναι οι εξής: COUP-TF: 5ώρες Jun45 : 6 ώρες Fra : 6 ωρες Elk : 6 ωρες Pea : 6 ώρες Ακολουθεί η διακοπή της διαδικασίας χρώσης ως εξής: Χρησιμοποιούνται ποσότητες 200μl από κάθε διάλυμα 1. 3 Ξεπλύματα με διάλυμα TBST/EDTA. Τα έμβρυα αφήνονται στο τελευταίο διάλυμα για Ξεπλύματα με TBST 3. Αντικατάσταση του προηγούμενου διαλύματος με ίσο όγκο Γλυκερόλης/PBS Τα έμβρυα αποθηκεύονται στους 4 0 C ώσπου να φωτογραφηθούν. 129

146 Υλικά και μέθοδοι Συνταγές διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν: AP (Για 50ml δ/τος): TBST/EDTA (Για 10ml δ/τος): 1M Tris-HCl ph 9.5: 5ml TBST: 9ml 5M NaCl : 1ml 0,5M EDTA ph 8.0: 1ml (50mM) 1M MgCl 2 : 2.5ml H 2 O : 41.5ml Διάλυμα Λεβαμισόλης/Tween 20: Διάλυμα Γλυκερόλης/PBS: (Για 200μl δ/τος) (Για 1ml δ/τος) AP : 200μl Γλυκερόλη 100%: 500μl Λεβαμισόλη 1M: 1μλ PBS 10X : 100μl Tween 20 20% : 1μl Η 2 Ο : 400μl 2.34 In Situ Ιχνηθέτες Κατασκευάστηκαν νοηματικοί και αντινοηματικοί ιχνηθέτες για τα εξής mrnas: a) PlCoup-tf b) PlJun c) PlFra 2 d) PlElk e) PlPea Τα cdnas των γονιδίων αναφοράς έχουν κλωνοποιηθεί σε πλασμιδιακούς φορείς που φέρουν θέσεις αναγνώρισης για την RNA πολυμεράση II (Τ7 και Sp6) ανοδικά και καθοδικά του γονιδίου έτσι ώστε ανάλογα με τη φορά κλωνοποίησης του εκάστοτε γονιδίου να παράγεται νοηματικό (sense) και αντινοηματικό (antisense) ολιγονουκλεοτίδιο. Οι κατασκευές γίνονται γραμμικές μετά από 130

147 Υλικά και μέθοδοι κατάτμηση τους με ένζυμα περιορισμού στο 5 άκρο των γονιδίων, προκειμένου για νοηματικό ολιγονουκλεοτίδιο και στο 3 άκρο προκειμένου για αντινοηματικό. Τα ένζυμα περιορισμού επιλέγονται έτσι ώστε να μην αφήνουν ελεύθερα 3 άκρα. Ακολουθεί μεταγραφή των γονιδίων και παρασκευή των ιχνηθετών χρησιμοποιώντας σημασμένη ουρακίλη με διγοξιγενίνη. Το cdna του PlCoup-tf έχει κλωνοποιηθεί στο πλασμίδιο PCRII (εικόνα 2.2) ενώ τα υπόλοιπα γονίδια στο πλασμίδιο pgem-teasy (εικόνα 2.1). Τα προϊόντα (νοηματικά ή Εικ.2.2 Ο φορέας PCRII και ο πολυσυνδέτης του. αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια) της κάθε πολυμεράσης εξαρτώνται από τη φορά με την οποία είναι κλωνοποιημένα τα γονίδια και αναγράφονται αναλυτικά κατωτέρω: Coup-TF Jun45 Fra Elk Pea T7 Νοηματικό Νοηματικό Νοηματικό Αντινοηματικό Αντινοηματικό Sp6 Αντινοματικό Αντινοματικό Αντινοματικό Νοηματικό Νοηματικό Η γραμμοποίηση των κατασκευών (πλασμίδιο και γονίδιο αναφοράς) έγινε με κατάτμηση 10μg από την εκάστοτε κατασκευή χρησιμοποιώντας 40 μονάδες ενεργότητας ενζύμου (units) σε τελικό όγκο αντίδρασης 100μl. Η αντίδραση 131

148 Υλικά και μέθοδοι πραγματοποιήθηκε στους 37 0 C για 3 ώρες. Τα ένζυμα περιορισμού που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα εξής: Γονίδιο/Ιχνηθέτης PlCoup-tf PlJun45 PlFra PlElk PlPea Αντινοηματικό NotI ClaI NcoI NdeI SpeI Νοηματικό HindIII SpeI SalI NcoI NcoI Ο καθαρισμός και η προετοιμασία των γραμμικών κατασκευών για τη μεταγραφή έγιναν με τις μέθοδους φαινόλης/χλωροφορμίου και EtOH 70%. Η τελική διάλυση των νουκλεοτιδίων έγινε σε 20μl DEP H 2 O. Η σήμανση των ιχνηθετών πραγματοποιήθηκε με αντιδραστήρια της Roche εκτός από τον αναστολέα RNAσης που ανήκει στην εταιρεία Promega. Η αντίδραση είναι η κάτωθι και διενεργείται στους 37 0 C για 2.5 ώρες σε επωαστικό θάλαμο: Αντίδραση Σήμανσης RNA ιχνηθετών με Διγοξιγενίνη Υπόστρωμα DNA : 2μg Νουκλεοτίδια (ATP, CTP, UTP, GTP) : 1mM για τα ATP, CTP, GTP : 0,65mM για την UTP Dig-11-UTP : 2μλ RNA πολυμεράση (Sp6 ή T7) : 40units Αναστολέας RNAσης : 20units DEP H 2 O : Ως τελικό όγκο 20μl Το πιθανό DNA καταστρέφεται με προσθήκη στην αντίδραση 2μl DNAσης απουσία RNAσης (Roche) και επώασης στους 37 0 C για 20 σε υδατόλουτρο. Ακολουθεί προσθήκη 30μl DEP H 2 O και διαχωρισμός των ιχνηθετών από τα νουκλεοτίδια που δεν ενσωματώθηκαν κατά τη μεταγραφή, με κολώνες Sephadex G-50. Οι ιχνηθέτες καθαρίζονται με Φαινόλη/Χλωροφόρμιο και διαλύονται σε 40μl DEP H 2 O. 132

149 Υλικά και μέθοδοι Tα δείγματα φωτομετρούνται στα 260 και 280nm και ποσότητα ίση με 500ng από το κάθε δείγμα αναλύεται σε πήκτωμα φορμαλδεύδης. Οι ιχνηθέτες αριώνονται σε διάλυμα υβριδοποίησης σε τελική συγκέντρωση 30ng/μl Ποσοτική PCR (qpcr) Η ποσοτική έκφραση των παραγόντων PlJun, PlFra, PlElk, PlPea και PlCoup-TF στα αναπτυξιακά στάδια αυγού, 16 κυττάρων, βλαστιδίου, γαστριδίου, πλουτέα 32.5 ωρών και πλουτέα 45 ωρών του αχινού P.lividus μελετήθηκε με qpcr. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν αναζητήθηκαν με το πρόγραμμα Primer 3 Plus και επιλέγχθηκαν έτσι ώστε το παραγόμενο προϊόν να έχει μέγεθος nt. Κατόπιν ελέγχθηκαν οι θέσεις τους στο γονιδίωμα του S.purpuratus στη βάση δεδομένων NCBI έτσι ώστε να προτιμηθούν όπου ήταν δυνατό, τα ζεύγη εκείνα στα οποία οι δύο εκκινητές υβριδοποιούνται σε διαφορετικά εξώνια. Τα ζεύγη των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν αναγράφονται στον πίνακα που ακολουθεί: PlJun PlFra PlElk PlPea Ανοδικός JunF 2 FraF 2 ElkF 1 PeaF 1 Καθοδικός JunR 2 FraR 2 ElkR 1 PeaR 1 Οι αλληλουχίες των εκκινητών είναι οι κάτωθι: JunF 2: 5 GGTGAAGGACTTGAAAACACAAA 3 JunR 2: 5 TTGTGCAAGCATAATTGAATC 3 FraF 2: 5 AATGTAGACAGAGGCGTGTTGAT 3 FraR 2: 5 AGTTGTTCTTTCTGTTGCTGGAG 3 ElkF 1: 5 GAAAGGAATCTTGTTCTCCGTCT 3 ElkR 1: 5 GCTCTCCGGTACTACTACGACAA 3 133

150 Υλικά και μέθοδοι PeaF 1: 5 CAGGCTTTATCTTGATGCTCAGT 3 PeaR 1: 5 CTGGATCAACTAAGGGAGAATG 3 Το ολικό RNA του κάθε αναπτυξιακού σταδίου που χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα επεξεργάζεται με 0.5μl DNασηI (10000u/μl), ώστε να μειωθεί η πιθανότητα ο φθορισμός που ανιχνεύει το μηχάνημα να προέρχεται από πρόσμιξη του RNA με DNA, σύμφωνα με το πρόγραμμα: 37 0 C για C για C για 5 Κάθε αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε τριπλέτες και κάθε γονίδιο μελετήθηκε τρεις φορές. Η επιλογή του ζεύγους των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκε για το κάθε γονίδιο έγινε μετά από σύγκριση αυτού με άλλα ζεύγη που είχαν σχεδιαστεί κάνοντας qpcr σε αντιδράσεις χωρίς την παρουσία RNA και συγκρίθηκαν τα Ct τους με αυτές παρουσία RNA. Τελικά επιλέγχθηκαν οι εκκινητές εκείνοι που δίνουν υψηλότερα Ct και διαφορετικά σε σχέση με τα Ct παρουσία RNA, γεγονός που υποδεικνύει το μικρό ποσοστό διμερών. Για τις αντιδράσεις qpcr χρησιμοποιήθηκαν αντιδραστήρια της εταιρείας KAPA (KAPA SYBR GREEN FAST), σύμφωνα με την αντίδραση: Υπόστρωμα RNA (20ng/μl): 1μl QPCRMix : 10μl Εκκινητές (5μM) :200nM BSA (0.1%) : 5μl H 2 O : Ως 20μl 134

151 Υλικά και μέθοδοι Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε μηχάνημα LightCycler της εταιρείας Roche με τις εξής συνθήκες: cdna σύνθεση (κύκλοι: 1) 42 0 C για 5 (20 0 /sec) Απενεργοποίηση της RT (κύκλοι: 1) 95 0 C για 5 (20 0 C/sec) Επανάληψη κύκλων (κύκλοι: 45) Ποσοτικοποίηση 95 0 C για 3 (20 0 C/sec) 60 0 C για 20 (20 0 C/sec) 72 0 C για 2 (20 0 C/sec) (aquisition mode: single) Διαχωρισμός (κύκλοι: 1) 95 0 C (20 0 C/sec) 65 0 C για 15 (20 0 C/sec) 95 0 C (0.1 0 C/sec) (aquisition mode: continuous) Ψύχρανση (κύκλοι: 1) 40 0 C για 30 (20 0 C/sec) Το μηχάνημα ανιχνεύει φθορισμό των παραγόμενων προϊόντων στο τέλος κάθε κύκλου πολυμερισμού και τον υπολογίζει ως τον ελάχιστο κύκλο που ανιχνεύει φθορισμό (Ct). Συγκρίνοντας τα Ct των διαφορετικών αναπτυξιακών σταδίων μπορεί κανείς να συμπεράνει την ποσότητα του προς μελέτη γονιδίου στα στάδια αυτά καθώς υψηλό Ct αντιστοιχεί σε μικρή ποσότητα γονιδίου και το αντίστροφο. Στα αποτελέσματα γίνεται κανονικοποίηση με βάση τα Ct ενός γονιδίου αναφοράς που στην προκειμένη περίπτωση είναι αυτό της ουμπικουϊτίνης. Ως γονίδιο αναφοράς επιλέγεται ένα γονίδιο του οποίου η συγκέντρωση είναι υψηλή σε κάθε αναπτυξιακό στάδιο. Για τις αναλύσεις έχει επιλεγεί το στάδιο του αυγού ως ρυθμιστής. Υπολογίστηκαν τα ΔCt, ΔΔCt και NM (Normalized Ratio). Για τους υπολογισμούς έχει χρησιμοποιηθεί ο τύπος 1.9Ε ΔCt όπου 1.9 η απόδοση της αντίδρασης και ΔCt=Ct γονιδίου στόχου- Ct γονιδίου αναφοράς. 135

152 Αποτελέσματα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Λειτουργική ανάλυση της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου Coup-TF στον αχινό Paracentrotus lividus 3.1 Εισαγωγή Το γονίδιο του Coup-TF είναι ένα εξαιρετικά συντηρημένο γονίδιο και απαντάται σε όλα τα μετάζωα, από την ύδρα μέχρι τα ανώτερα θηλαστικά και τον άνθρωπο, με σημαντικότατο ρόλο στην ανάπτυξη του νευρικού, αλλά και των άλλων συστημάτων του οργανισμού. Ο παράγοντας Coup-TF στον αχινό S.purpuratus εκφράζεται στο εμβρυικό στοματικό εξώδερμα και τη νευρογενή βλεφαριδωτή ζώνη, καθώς και στα διαφοροποιημένα νευρικά κύτταρα της νύμφης. Πειράματα καταστολής της έκφρασής του στον αχινό P.lividus δείχνουν την απαραίτητη συνεισφορά του στη διαφοροποίηση των σεροτονεργικών νευρώνων του εμβρύου (Ι. Τσιρώνης και Κ. Φλυτζάνης, αδημοσίευτα αποτελέσματα), καθώς και στη διαφοροποίηση του πεπτικού και σκελετικού συστήματος. Συνεπώς, μελέτες που συμβάλουν στην αποσαφήνιση του εμβρυικού ρόλου του παράγοντα Coup-TF στον αχινό, όπως ο καθορισμός των μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του γονιδίου Coup-TF με συνέπεια την ένταξή του στο γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο του εξωδέρματος, έχουν μεγάλο ενδιαφέρον για την κατανόηση της εμβρυικής ανάπτυξης των μεταζώων γενικότερα. Στο κεφάλαιο αυτό περιγράφονται τα αποτελέσματα των ερευνών που πραγματοποιήθηκαν προκειμένου να ανακαλυφθεί ο τρόπος ρύθμισης του γονιδίου Coup-TF στον αχινό P.lividus και συγκεκριμένα τα ρυθμιστικά στοιχεία της ανοδικής του περιοχής, οι πιθανοί παράγοντες που προσδένονται σε αυτά και το ιστοειδικό και χρονοειδικό πρότυπο έκφρασης αυτών των παραγόντων στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια του εμβρύου του αχινού. 136

153 Αποτελέσματα Παλαιότερα πειράματα Οι πρώτες πληροφορίες για τον τρόπο ρύθμισης του γονιδίου PlCoup-TF έχουν εξαχθεί από μια σειρά πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν στα πλαίσια της ερευνητικής μου εργασίας κατά τη διάρκεια του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης (Λαμπρινή Καλαμπόκη Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης 2006) και προηγήθηκαν της παρούσης ερευνητικής εργασίας. Στα πειράματα αυτά (Kalampoki LG and Flytzanis C., 2014) απομονώθηκε ένα τμήμα 1932nt της ανοδικής περιοχής του γονιδίου PlCoup-TF και αφού προσδιορίστηκε η θέση του σημείου ενάρξης της μεταγραφής και η δομή του βασικού υποκινητή, μελετήθηκε η παρουσία πιθανών ανοδικών ρυθμιστικών στοιχείων. Για την ανάλυση της ανοδικής ρυθμιστικής περιοχής, δημιουργήθηκαν δύο σειρές κατασκευών χρησιμοποιώντας τον πλασμιδιακό φορέα EpGFPII που φέρει το γονίδιο gfp ως γονίδιο αναφοράς. Ανοδικά του γονιδίου gfp κλωνοποιήθηκαν τα τμήματα της ανοδικής περιοχής που επιλέγχθηκαν να μελετηθούν και οι κατασκευές ενέθηκαν σαν γραμμικό DNA σε γονιμοποιημένα αυγά αχινού και παρατηρήθηκε το ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης της GFP στο αναπτυξιακό στάδιο του πλουτέα. Καθώς η έκφραση του γονιδίου της gfp βρίσκεται υπό τον έλεγχο των πιθανών ρυθμιστικών στοιχείων που υπάρχουν στο εκάστοτε τμήμα ανοδικής περιοχής που μελετάται, το πρότυπο έκφρασης που παρατηρείται παρέχει πληροφορίες για το ρόλο των στοιχείων που εμπεριέχονται στα τμήματα αυτά. Στα αρχικά πειράματα περιλαμβάνονται 7 κατασκευές (εικόνα 3.1 A) εκ των οποίων η πρώτη περιέχει και τα 1932nt της ανοδικής περιοχής του γονιδίου PlCoup-TF, ενώ οι υπόλοιπες αποτελούν διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα της πρώτης. Στη δεύτερη σειρά πειραμάτων (εικόνα 3.2 A) η ανοδική περιοχή διαιρέθηκε σε έξι τμήματα (a-f) κατά τέτοιο τρόπο ώστε κάθε τμήμα να αντιστοιχεί σχεδόν στο κομμάτι της ανοδικής περιοχής που αφαιρείται με κάθε έλλειμμα στην πρώτη σειρά πειραμάτων. Στην προκειμένη περίπτωση κανένα τμήμα που μελετάται δεν φέρει το βασικό υποκινητή του γονιδίου PlCoup-TF. Τα τμήματα κλωνοποιήθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα EpGFPII και ονομάστηκαν κατασκευές a-f. 137

154 Αποτελέσματα Eικ. 3.1 Α) Πρώτη σειρά πειραμάτων. Σχηματική απεικόνιση της ανοδικής περιοχής του γονιδίου PlCoup-TF μεγέθους 1932nt, κλωνοποιημένης στο φορέα EpGFPII ανοδικά της GFP. Επίσης απεικονίζονται οι κατασκευές -1930, -1639, -1398, -781, -532, -232 και -19 (οι αριθμοί αντιστοιχούν σε nt) που περιέχουν διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα της ανοδικής περιοχής και τα οποία παρασκευάστηκαν με PCR χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την κατασκευή με τα 1932nt ανοδικής περιοχής. Η αρίθμηση έχει γίνει από το σημείο έναρξης της μεταγραφής (+1) του γονιδίου PlCoup-TF. B) Εικόνες από μικροσκόπιο φθορισμού διαγονιδιακών εμβρύων αχινού με τις κατασκευές -1639, , -781, -532, Η κατασκευή -532 κατευθύνει την έκφραση της GFP στη βλεφαριδωτή ζώνη μόνο, ενώ οι κατασκευές -1639, -1398, 781 στη βλεφαριδωτή ζώνη και στο μεσέγχυμα. η στο αντιστοματικό εξώδερμα.(kalampoki LG and Flytzanis C. 2014) Οι κατασκευές της πρώτης και της δεύτερης σειράς χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού (εικόνα 3.1 B και 3.2 B αντίστοιχα) και παρατηρήθηκε το πρότυπο έκφρασης της GFP στο αναπτυξιακό στάδιο του πλουτέα. Στην ουσία η πρώτη σειρά πειραμάτων αναδεικνύει ποιά επίπτωση έχει η απουσία των εκάστοτε τμημάτων στο πρότυπο έκφρασης της GFP ενώ η δεύτερη σειρά επιβεβαιώνει τα αποτελέσματα της πρώτης, με το να αναδεικνύει τον τρόπο με τον οποίον επηρεάζει το κάθε τμήμα την έκφραση της GFP. 138

155 Αποτελέσματα Εικ. 3.2 Α) Δεύτερη σειρά πειραμάτων. Σχηματική απεικόνιση των τμημάτων a-f, της ανοδικής περιοχής που απομονώθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την κατασκευή Τα τμήματα a-f κλωνοποιήθηκαν επίσης στο φορέα EpGFPII. Β) Εικόνες από μικροσκόπιο φθορισμού διαγονιδιακών εμβρύων αχινού με τις κατασκευές a-f. H κατασκευή a κατευθύνει την έκφραση της GFP στη βλεφαριδωτή ζώνη ενώ οι a και b στη βλεφαριδωτή ζώνη, το ενδόδερμα και το μεσέγχυμα. Οι κατασκευές d, e και f δεν επάγουν φθορισμό (Kalampoki LG and Flytzanis C. 2014) Από το συνδυασμό των πειραμάτων εξήχθη το συμπέρασμα ότι το τμήμα της ανοδικής περιοχής του γονιδίου PlCoup-tf που εκτείνεται από το -212 ώς το -533 (τμήμα a) φαίνεται να περιέχει στοιχεία απαραίτητα και ικανά να κατευθύνουν την έκφραση του γονιδίου αναφοράς στο στοματικό εξώδερμα. Το συμπέρασμα αυτό συνάδει με την πληροφορία ότι το ενδογενές γονίδιο Coup-TF εκφράζεται στο στοματικό εξώδερμα στον αχινό S.purpuratus (Vlachou et al. 1996) και τα πειράματα που ακολούθησαν εστιάστηκαν στη μελέτη της συγκεκριμένης περιοχής. 139

156 Αποτελέσματα 3.2 Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του Coup-TF στον αχινό P.lividus Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, το πρότυπο έκφρασης του γονιδίου Coup- TF ήταν γνωστό βάσει πειραμάτων in situ υβριδοποίησης στον αχινό S.purpuratus. Καθώς η μελέτη που ακολουθεί αφορά το είδος P.lividus, κρίθηκε σκόπιμη η εξέταση του προτύπου έκφρασης του αντίστοιχου γονιδίου Coup-TF και στο είδος αυτό. Προς το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν πειράματα in situ υβριδοποίησης στα εξής αναπτυξιακά στάδια (εικόνα 3.3): Αυγό, 16 κύτταρα, βλαστίδιο, γαστρίδιο, πλουτέας 32 ωρών και πλουτέας 45 ωρών. Η μελέτη του προτύπου έκφρασης του PlCoup-TF, στα αναπτυξιακά στάδια που μελετήθηκαν, ανέδειξε ότι το mrna ανιχνεύεται σε όλα τα στάδια, από το στάδιο του αυγού, γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία μητρικού mrna. Στο στάδιο των 16 κυττάρων, το mrna ανιχνεύεται σε όλα τα κύτταρα χωρίς συγκεκριμένο ιστοειδικό πρότυπο. Ωστόσο, από το στάδιο του βλαστιδίου και μετά, παρατηρήθηκε περιορισμός ως προς τους ιστούς στους οποίους εκφράζεται το γονίδιο. Πιο συγκεκριμένα, στο βλαστίδιο εκφράζεται μόνο στη μία πλευρά του εμβρύου και συγκεκριμένα στη μισή φυτική πλάκα και στο εξώδερμα που γειτνιάζει με αυτή. Στο Αντινοηµατικό Φυτ. Πλ. Αυγό 16 κύτταρα Βλαστίδιο Γαστρίδιο Στόµα Βλ. Έδρα ζώνη Πλουτέας 32 h Βλ. ζώνη Πλουτέας 45h Νοηµατικό Εικ. 3.3 Πρότυπο έκφρασης του Coup-TF στα αναπτυξιακά στάδια του αχινού P.lividus με πειράματα in situ υβριδοποίησης. Τα αναπτυξιακά στάδια που μελετήθηκαν αναγράφονται στη φωτογραφία. Φυτ. πλ. : Φυτική πλάκα, Βλ. ζώνη: Βλεφαριδωτή ζώνη, Αρχ. : Aρχέντερο 140

157 Αποτελέσματα γαστρίδιο, η έκφρασή του διατηρείται στο μισό έμβρυο και καταλαμβάνει τα κύτταρα του εξωδέρματος και συγκεκριμένα του πιθανού μελλοντικού στοματικού εξωδέρματος. Στο στάδιο του πρώϊμου πλουτέα, το γονίδιο PlCoup-TF εκφράζεται αποκλειστικά στα στοματικό εξώδερμα και ειδικά στη βλεφαριδωτή ζώνη. Επίσης εκφράζεται στην έδρα και στην κορυφή του αρχεντέρου. Ομοίως στον ώριμο πλουτέα εκφράζεται στη βλεφαριδωτή ζώνη και στην έδρα του εμβρύου. Σύγκριση των αποτελεσμάτων αυτών με τα αντίστοιχα από τη βιβλιογραφία για τον αχινό S.purpuratus ανέδειξαν παρόμοιο πρότυπο έκφρασης του γονιδίου σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια, αλλά εν αντιθέσει με τον S.purpuratus δεν φαίνεται διαμερισματοποίηση του μητρικού mrna στο αυγό και στο στάδιο των 16 κυττάρων. Λειτουργική ανάλυση της περιοχής a 3.3 Αναζήτηση in silico πιθανών ρυθμιστικών στοιχείων στην περιοχή a Η ανοδική περιοχή του γονιδίου PlCoup-tf από το +1 έως το -533 (που περιλαμβάνει την περιοχή a) αναλύθηκε με το πρόγραμμα TESS προκειμένου να αναγνωριστούν πιθανά ρυθμιστικά στοιχεία εντός αυτής καθώς και οι μεταγραφικοί παράγοντες που προσδένονται σε αυτά. Η ανάλυση με τη βοήθεια του προγράμματος αυτού βασίζεται στη σύγκριση μεταξύ της υπό μελέτη περιοχής και μιας πληθώρας αλληλουχιών που είναι καταχωρημένες σε βάσεις δεδομένων και έχουν αναγνωριστεί ως θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων από μελέτες γονιδίων διαφόρων οργανισμών. Το πρόγραμμα αυτό (όπως και άλλα ανάλογα) δεν διακρίνει αν η υπό ανάλυση αλληλουχία είναι ρυθμιστική ούτε έχει προς το παρόν τη δυνατότητα να προτείνει μεταγραφικούς παράγοντες ειδικούς για τον συγκεκριμένο οργανισμό. Παρ όλα αυτά, αν κανείς θέσει τα κριτήρια της ανάλυσης σε βαθμό τέτοιο ώστε να λαμβάνει τις αλληλουχίες στοιχείων με τη μέγιστη ομολογία ως προς τα ήδη γνωστά ρυθμιστικά στοιχεία, του δίνεται η δυνατότητα να μελετήσει έναν περιορισμένο αριθμό στοιχείων και να εξακριβώσει με in vivo και in vitro πειράματα αν έχουν λειτουργικό ρόλο στη 141

158 Αποτελέσματα ρύθμιση του γονιδίου που μελετά. Ένα πλήθος μεταγραφικών παραγόντων αναγνωρίστηκαν ως πιθανοί ρυθμιστές του γονιδίου PlCoup-tf μετά την ανάλυση όπως φαίνεται στην εικόνα Λειτουργικός ρόλος των ρυθμιστικών στοιχείων του γονιδίου PlCoup-tf Από το πλήθος των στοιχείων απόκρισης που αναγνωρίστηκαν, με τη βοήθεια του προγράμματος TESS, επιλέχτηκαν κάποια εξ αυτών προκειμένου να ελεγχθεί (με πειράματα EMSA) η ικανότητά τους να αναγνωρίζονται από πρωτεΐνες πυρηνικού εκχυλίσματος που απομονώθηκαν από το στάδιο του βλαστιδίου του αχινού P.lividus. Εξετάστηκαν αρκετά στοιχεία από τα 1932nt της ανοδικής περιοχής του Coup-tf αλλά αυτά που εντοπίζονται εντός των πρώτων 533nt είναι τα εξής: Στοιχείο -453: Πιθανό Ets στοιχείο Στοιχείο -432: Πιθανό Ap1 ή/και octamer στοιχείο Στοιχείο -377: Πιθανό Otx στοιχείο Στοιχείο -205: Πιθανό Otx στοιχείο Στοιχείο -182: Πιθανό Gata-3 στοιχείο AP1 142

159 Αποτελέσματα Εικ.3.4 Η ανοδική περιοχή του γονιδίου PlCoup-tf από το +1 (σημειώνεται με κόκκινο χαρακτήρα) ως το Το κόκκινο βέλος αντιστοιχεί στη θέση -212 όπου ξεκινάει η περιοχή a (-212 έως -533). Στην περιοχή αναγράφονται οι πιθανοί ρυθμιστικοί παράγοντες όπως προτείνονται από την ανάλυση με το πρόγραμμα TESS. Τα στοιχεία που εξετάστηκαν για την ικανότητά τους να αναγνωρίζονται από πρωτεΐνες πυρηνικού εκχυλίσματος σημαίνονται με μπλέ κουτιά. Με κίτρινους χαρακτήρες αναγράφονται οι παράγοντες που πιθανόν τα αναγνωρίζουν. Από αυτά τα στοιχεία, εντός της περιοχής a εντοπίζονται μόνο αυτά των θέσεων - 453, -432 και Οι αλληλουχίες των στοιχείων που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα EMSA παρατίθενται στο σχήμα 1 του παραρτήματος. Όπως φαίνεται στα πειράματα που ακολουθούν τα στοιχεία -453, -432 και -377, που βρίσκονται εντός του τμήματος a, αναγνωρίζονται από πρωτεΐνες πυρηνικού εκχυλίσματος εμβρύων αχινού (εικόνα 3.5 A) και ενδεχομένως έχουν λειτουργικό ρόλο στη ρύθμιση του γονιδίου PlCoup-tf (Kalampoki LG and Flytzanis C. 2014). Όσον αφορά στα στοιχεία -182 και -205, που βρίσκονται καθοδικά του τμήματος a, παρατηρήθηκε επίσης πρόσδεση πρωτεϊνών (εικόνα 3.5 Β και C). Στον πίνακα 3.1 που ακολουθεί αναγράφονται αναλυτικά οι αντιδράσεις με τα στοιχεία απόκρισης που αντιστοιχούν σε κάθε στήλη. Πίνακας 3.1. Αναλυτική αναφορά των αντιδραστηρίων που περιλαμβάνει η κάθε αντίδραση για κάθε στοιχείο απόκρισης που μελετήθηκε. Όπου ΠΕ: Πυρηνικό εκχύλισμα, ΠΡ: In vitro συντιθέμενη πρωτεΐνη, ΕΑ: Eιδικός ανταγωνιστής ΠΕ ΕΑ Χ Χ100 + Χ250 + Χ Χ ΠΡ

160 Αποτελέσματα A) Β) C) Εικ.3.5 Α) Αυτοραδιογραφία αντιδράσεων EMSA για τα στοιχεία απόκρισης -453, -377, -432 και Ν3 (στοιχείο απόκρισης του Coup-TF). B) Αυτοραδιογραφία αντιδράσεων EMSA για το στοιχείο απόκρισης C) Αυτοραδιογραφία αντιδράσεων EMSA για το στοιχείο απόκρισης Τα πειράματα EMSA με τα στοιχεία -453, -432 και -377 (Εικόνα 3.5 Α) έδειξαν τη δημιουργία ειδικών συμπλόκων ύστερα από την προσθήκη πρωτεϊνών πυρηνικού εκχυλίσματος τα οποία εξαφανίζονται μετά την προσθήκη ειδικού ανταγωνιστή. Όπως φαίνεται για τα στοιχεία απόκρισης -453, -377 και Ν3 σχηματίζονται περισσότερα από ένα σύμπλοκα πρωτεϊνών και ιχνηθέτη, γεγονός που μπορεί να εξηγηθεί από την 144

161 Αποτελέσματα παρουσία εντός του πυρηνικού εκχυλίσματος πολαπλών πρωτεΐνών μελών της εκάστοτε οικογένειας μεταγραφικών παραγόντων που αναγνωρίζουν το αντίστοιχο στοιχείο απόκρισης. Τα στοιχεία απόκρισης -182 και -205 αναγνωρίζονται επίσης ειδικά από πρωτεΐνες του πυρηνικού εκχυλίσματος, όπως δείχνουν τα αποτελέσματα πόσδεσης στο DNA (Εικόνα 3.5 B και C). Προκειμένου να εξακριβωθεί η ταυτότητα του στοιχείου -432, δηλαδή αν πρόκειται για AP1 στοιχείο ή για octamer, πραγματοποιήθηκαν περαιτέρω αντιδράσεις EMSA (εκόνα 3.6) χρησιμοποιώντας ως ιχνηθέτη το στοιχείο -432 και ως ειδικούς ανταγωνιστές, αφενός το στοιχείο -432 αφετέρου το στοιχείο +30, ένα άλλο πιθανό octamer στοιχείο. Πειράματα EMSA που πραγματοποιήθηκαν στο παρελθόν χρησιμοποιώντας το στοιχείο απόκρισης +30 με πρωτεΐνες πυρηνικού εκχυλίσματος έδειξαν την παρουσία ειδικής πρόσδεσης στο στοιχείο αυτό. Αναλυτικά οι αντιδράσεις που πραγματοποιήθηκαν για τη διαλεύκανση της ταυτότητας του στοιχείου -432 είναι οι κάτωθι: ΠΕ ΕΑ (-432) (-432) (+30) (+30) ( Χ250) (Χ500) (Χ250) (Χ500) Εικ.3.6 Αυτοραδιογραφία EMSA αντιδράσεων με το στοιχείο Eιδικοί ανταγωνιστές: -432 (στήλες 3 και 4), στοιχείο +30, octamer (στήλες 5 και 6). Π.Ε.: Πυρηνικό εκχύλισμα, Ε.Α.: Ειδικός ανταγωνιστής. 145

162 Αποτελέσματα Όπως φαίνεται από την εικόνα 3.6, το σύμπλοκο που ανιχνεύεται στη στήλη 2, εξαφανίζεται όταν χρησιμοποιηθεί ως ειδικός ανταγωνιστής το στοιχείο -432 (στήλες 3 και 4) ενώ παραμένει όταν ως ειδικός αναταγωνιστής χρησιμοποιηθεί το στοιχείο +30 (στήλες 5 και 6). Επομένως συμπεραίνεται ότι το στοιχείο -432 είναι κατά πάσα πιθανότητα AP1 στοιχείο και όχι octamer. Βάσει αυτών των αποτελεσμάτων και των πληροφοριών από τη βιβλιογραφία για το ρόλο και το πρότυπο έκφρασης όλων των πιθανών ρυθμιστικών παραγόντων που, σύμφωνα με το πρόγραμμα TESS, αναγνωρίζουν στοιχεία απόκρισης στην περιοχή a, πραγματοποιήθηκε διεξοδικότερη μελέτη της περιοχής αυτής διαιρώντας την σε έξι υποπεριοχές (I-VI) κάθε μία εκ των οποίων περιέχει ομάδες πιθανών ρυθμιστικών στοιχείων. Στην εικόνα 3.7 αναπαρίστανται σχηματικά οι έξι υποπεριοχές στις οποίες διαιρέθηκε η περιοχή a και οι ομάδες των πιθανών παραγόντων που αντιστοιχούν σε κάθε μία εξ αυτών. Ets Rup1 a1 a2 a3 a4 a5 A B C D E F I II III IV V VI a1r a2r a3r a4r Εικ.3.7 Σχηματική παράσταση της περιοχής a (-212 έως -533) του γονιδίου PlCOUP-TF. Στο σχήμα φαίνονται οι υποπεριοχές I-VI στις οποίες διαιρέθηκε η περιοχή a. Με κόκκινες και μπλε μικρές γραμμές αναπαρίστανται τα πιθανά ρυθμιστικά στοιχεία που αναγνωρίζονται από τους παράγοντες που αναγράφονται πάνω τους. Με πράσινα βέλη σημειώνονται οι θέσεις των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία των διαδοχικών ανοδικών ελλειμμάτων (a1-a5) που περιγράφονται παρακάτω (παρ. 3.5a). Mε μωβ βέλη αναπαρίστανται οι θέσεις των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με αυτούς που αναπαρίστανται με πράσινα βέλη για τη δημιουργία των εσωτερικών ελλειμμάτων 1-4 (παρ. 3.5b). 146

163 Αποτελέσματα Ο πιθανός ρυθμιστικός ρόλος των στοιχείων μελετήθηκε με τη δημιουργία κατασκευών που φέρουν ως γονιδίο αναφοράς, τη GFP. Στα πειράματα αυτά η προς μελέτη ανοδική περιοχή κλωνοποιείται σε πλασμιδιακό φορέα ανοδικά του γονιδίου της gfp, η οποία ουσιαστικά αντικαθιστά το γονίδιο του οποίου η ρύθμιση μελετάται (στην προκειμένη περίπτωση του PlCoup-tf). Η εκάστοτε κατασκευή (ανοδική περιοχή-gfp) ενίεται σε γονιμοποιημένα αυγά αχινού και παρατηρείται το πρότυπο έκφρασης της GFP στο επιθυμητό εμβρυικό στάδιο. Ως εκ τούτου, το πρότυπο έκφρασης της GFP ουσιαστικά αντικατοπτρίζει το ρόλο των εκάστοτε στοιχείων απόκρισης που πιθανόν περιέχονται στα τμήματα που έχουν επιλεγεί να κλωνοποιηθούν ανοδικά του γονιδίου της. Πειράματα στα οποία χρησιμοποιήται πλήρης ή με ελλείμματα ή με στοχευμένες μεταλλάξεις συγκεκριμένων στοιχείων, η ανοδική περιοχή που μελετάται, οδηγούν σε σημαντικά συμπεράσματα για το ρυθμιστικό ρόλο των υπό μελέτη στοιχείων A) Διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα στην περιοχή a Ο λειτουργικός ρόλος των στοιχείων που βρέθηκαν στην περιοχή a μελετήθηκε δημιουργώντας 6 κατασκευές, τις a και a1 έως a5 που αποτελούν διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα του τμήματος a (εικόνα 3.8). Οι κατασκευές αυτές δημιουργήθηκαν με τη μέθοδο της PCR χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την κατασκευή a η 321 bps ! Rup 1 a endo 16 CyII! GFP a! 1! 2! 3! 4! 5 a1 a2 a3 a4 a5 262 bps a1 endo bps a2 endo bps a3 endo bps a4 endo bps a5 endo 16 CyII! CyII! CyII! CyII! CyII! GFP right GFP GFP right GFP GFP right GFP GFP right GFP right GFP GFP GFP right Εικ.3.8 Σχηματική αναπαράσταση των γραμμικών κατασκευών a και a1-a5. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή της εκάστοτε κατασκευής σημαίνονται με κίτρινα βέλη. Το αριστερό πράσινο κουτί σε κάθε κατασκευή αντιστοιχεί στο τμήμα της ανοδικής περιοχής που περιλαμβάνεται κάθε φορά. Το μέγεθος της περιοχής αναγράφεται με μπλε χαρακτήρες ενώ στα άκρα του κάθε τμήματος αναγράφονται οι θέσεις των νουκλεοτιδίων της ανοδικής περιοχής που περιλαμβάνεται. Η αρίθμηση έχει γίνει βάσει του +1. Το γαλάζιο κουτί αντιστοιχεί στον υποκινητή του γονιδίου endo16 που περιέχεται στον πλασμιδιακό φορέα EpGFPII. Το πορτοκαλί κουτί αντιστοιχεί στην kozak περιοχή του γονιδίου CyIIa της ακτίνης που επίσης περιλαμβάνεται στον πλασμιδιακό φορέα. Καθοδικά του CyIIa έχει τοποθετηθεί το γονίδιο αναφοράς, gfp. 147

164 Αποτελέσματα οποία περιέχει την ανοδική περιοχή από -212 έως -533 (σχήμα 4Α παραρτήματος) κλωνοποιημένη στον πλασμιδιακό φορέα EpGFPII (σχήμα 4Β παραρτήματος) ανοδικά του γονιδίου της GFP. Για την παραγωγή τους διατηρήθηκε σε όλες τις αντιδράσεις σταθερός ο καθοδικός εκκινητής GFPright, ενώ οι ανοδικοί εκινητές Rup1 και a1-a5 (σημαίνονται με κίτρινα βέλη στην εικόνα 3.8) υβριδοποιούνται σε όλο και πιο καθοδικές θέσεις, στην περιοχή a. Οι θέσεις αντιστοιχίας των ανοδικών εκκινητών a1 έως a5 δεν είναι τυχαίες, αλλά έχουν σχεδιαστεί κατά τέτοιο τρόπο ώστε στο τέλος κάθε αντίδρασης PCR, να αφαιρούνται υποπεριοχές που φέρουν συγκεκριμένα στοιχεία απόκρισης. Έτσι, από την κατασκευή a1, για την παρασκευή της οποίας έχει χρησιμοποιηθεί ως ανοδικός εκκινητής ο a1, έχει αφαιρεθεί η υποπεριοχή I (βλ. εικόνα 3.7) και άρα μία ομάδα πιθανών ρυθμιστικών στοιχείων, ενώ από την κατασκευή a2 όπου χρησιμοποιήθηκε ο εκκινητής a2, έχουν αφαιρεθεί οι υποπεριοχές I και II, και ουτω καθεξίς. Στην εικόνα 3.7 φαίνεται η θέση των εκκινητών Rup1 και a1 έως a5 (πράσινα βέλη) και η σχέση τους με τις αντίστοιχες υποπεριοχές I-VI καθώς και με τις ομάδες των πιθανών ρυθμιστικών παραγόντων που περιλαμβάνονται στις υποπεριοχές αυτές. Οι ακριβείς θέσεις υβριδοποίησης των εκκινητών a1-a5 στην αλληλουχία της περιοχής a και του καθοδικού εκκινητή GFPright στην αλληλουχία του γονιδίου της gfp φαίνονται στα σχήματα 2 και 3 του παραρτήματος αντίστοιχα. Στην εικόνα 3.9 φαίνονται τα προϊόντα των PCR αντιδράσεων μετά από ανάλυσή τους σε πήκτωμα αγαρόζης. Εικ.3.9 Ανάλυση των PCR προϊόντων (κατασκευές a και a1 έως a5) σε πήκτωμα αγαρόζης 0.8%. Μ: Μάρτυρας 1kb, Για όλες τις κατασκευές χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα η κατασκευή a και ως καθοδικός εκκινητής ο GFPright. a: 321bps, a1:262bps, a3:122bps, a4:86bps, a5:20bps. 148

165 Αποτελέσματα 3.5. B) Εσωτερικά ελλείμματα στην περιοχή a Διεξοδικότερη μελέτη της περιοχής a πραγματοποιήθηκε δημιουργώντας εσωτερικά ελλείμματα στην περιοχή αυτή. Στην προκειμένη περίπτωση κάθε φορά απαλλείφεται μία μόνο από τις υποπεριοχές II-V (βλ. εικόνα 3.7) και επομένως μία από τις ομάδες των στοιχείων απόκρισης. Δεν πραγματοποιήθηκε εσωτερική αφαίρεση της υποπεριοχής I καθώς ταυτίζεται με το έλλειμμα a1 που περιγράφηκε στην προηγούμενη παράγραφο. Στην εικόνα 3.10 περιγράφονται σχηματικά οι κατασκευές που προέκυψαν μετά την απαλειφή των υποπεριοχών αυτών, τα πιθανά στοιχεία απόκρισης που περιέχει κάθε υποπεριοχή καθώς και τα ζεύγη των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την πραγματοποίηση των εσωτερικών ελλειμμάτων. Η ακριβής θέση υβριδοποίησης των εκκινητών αυτών στην αλληλουχία της περιοχής a καθώς και η σχέση των πιθανών ρυθμιστικών στοιχείων που απαλείφονται σε σχέση με αυτά που πιθανόν απομένουν φαίνονται στο σχήμα 2 του παραρτήματος. Στην εικόνα 3.7 φαίνεται σχηματικά η σχέση των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την πραγματοποίηση του κάθε ελλείμματος με τις εκάστοτε υποπεριοχές. Εικ.3.10 Σχηματική αναπαράσταση των κατασκευών 1, 2, 3 και 4 με τα εσωτερικά ελλείμματα. Οι κατασκευές απεικονίζονται συγκριτικά με τη γραμμική κατασκευή a όπου η περιοχή a είναι πλήρης (και έχει προκύψει μετά από PCR χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την κυκλική κατασκευή a και το ζεύγος των εκκινητών Rup1- GFPright). Με γκρι κουτί απεικονίζεται η περιοχή a που εκτείνεται από το -212 ως το Με μαύρα κουτιά απεικονίζονται οι υποπεριοχές που απαλείφονται και τα πιθανά στοιχεία απόκρισης που περιλαμβάνονται σε αυτές. Στην κορυφή κάθε κουτιού αναγράφονται τα νουκλεοτίδια στα οποία αντιστοιχεί κάθε έλλειμμα καθώς και με πράσινους χαρακτήρες η υποπεριοχή που απαλείφεται. Η απομάκρυνση κάθε υποπεριοχής πραγματοποιήθηκε με αντίστροφη PCR χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την κυκλική κατασκευή a όπως περιγράφεται στο κείμενο και στην εικόνα Με κίτρινα βέλη αναπαρίστανται οι εκκινητές Rup1 και GFPright που χρησιμοποιήθηκαν στο κυκλικό υπόστρωμα, που φέρει την περιοχή a με το εκάστοτε έλλειμμα, προκειμένου να παραγχθούν με PCR γραμμικά μόρια ικανά για μικροενέσεις και δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού. 149

166 BglII CyIIa BglII BglII CyIIa BglII Αποτελέσματα Τα εσωτερικά ελλείμματα δημιουργήθηκαν με τη μέθοδο της αντίστροφης PCR χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την κυκλική κατασκευή a (εικόνα 3.11). Προς το σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν εκκινητές (εικόνα 3.11, μωβ βέλη) που φέρουν στο 5 άκρο τους θέση αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού BglII (εικόνα 3.11, μπλε ουρές) και υβριδοποιούνται εκατέρωθεν του τμήματος που πρόκειται να αφαιρεθεί (εικόνα 3.11 Α, μαύρο κουτί). Το ένζυμο αυτό δεν αναγνωρίζει καμία θέση εντός του ενθέματος ή του πλασμιδιακού φορέα όπως ανέδειξαν οι αλληλουχές τους. Η αλληλουχία του φορέα EpGFPII παρατίθεται στο σχήμα 4Β του παραρτήματος. HindIII CyIIa Αντίστροφη PCR a EpGFPII GFP Endo16 a Κατάτμηση με BglII a EpGFPII GFP Endo16 a Εικ.3.11 Σχηματική αναπαράσταση της κυκλικής κατασκευής a. Το γκρι κομμάτι του κύκλου αντιστοιχεί στο τμήμα a της ανοδικής περιοχής του PlCoup-tf που εκτείνεται από το -212 ως το Με μαύρο κουτί παριστάνεται το εκάστοτε τμήμα της περιοχής a που πρόκειται να αφαιρεθεί. Η αφαίρεση γίνεται με αντίστροφη PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές (μωβ βέλη) που υβριδοποιούνται εκατέρωθεν του τμήματος που θα απαλειφθεί και που φέρουν στο 5 άκρο τους αλληλουχία αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού BglII (μπλε ουρές). Το κίτρινο τμήμα αντιστοιχεί στο βασικό υποκινητή Endo16 και το πράσινο στο γονίδιο της gfp. Στο τέλος κάθε αντίστροφης PCR προκύπτουν γραμμικά μόρια των οποίων τα ελεύθερα άκρα αντιστοιχούν στις θέσεις αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού BglII (μπλε κουτιά). Τα μόρια πέπτονται με το συγκεκριμένο ένζυμο και τα άκρα τους γίνονται κολλώδη. Η επανακυκλοποίηση των γραμμικών μορίων επιτυγχάνεται με αντίδραση λιγάσης κι έτσι παράγονται κυκλικά μόρια με εσωτερικά ελλείμματα. 150

167 Αποτελέσματα Τα ζεύγη των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την απαλειφή των εσωτερικών τμημάτων είναι τα εξής (σχήμα 2, Παράρτημα): a1r-a2: Αφαίρεση υποπεριοχής ΙΙ (67bp) a2r-a3: Αφαίρεση υποπεριοχής ΙΙΙ (53bp) a3r-a4: Αφαίρεση υποπεριοχής ΙV (15bp) a4r-a5: Αφαίρεση υποπεριοχής V (45bp) Τα μόρια που παρήγχθησαν είναι γραμμικά και τα PCR προϊόντα φαίνονται στην εικόνα Το μέγεθος καθενός εξ 5.0kb 4.0kb 3.0kb αυτών αντιστοιχεί στο συνολικό μέγεθος του πλασμιδίου EpGFPII (4130bp) και της περιοχής a (321bp) μείον το μέγεθος της εκάστοτε υποπεριοχής που απαλείφθηκε. Τα ελεύθερα άκρα τους αντιστοιχούν στις θέσεις αναγνώρισης του ενζύμου περιορισμού BglII και έγιναν κολλώδη μετά από κατάτμηση τους με το αντίστοιχο ένζυμο. Τα μόρια επανακυκλοποιήθηκαν με την επίδραση της λιγάσης στα κολλώδη άκρα κι έτσι παρασκευάστηκαν τέσσερις κυκλικές κατασκευές, οι 1, 2, 3 και 4 καθεμία από τις οποίες έφερε και ένα εσωτερικό έλλειμμα (εικόνα 3.10). Οι κατασκευές αυτές μετασχηματίστηκαν σε δεκτικά βακτήρια E.coli με ηλεκτροδιάτρηση και αναγνωρίστηκαν οι κλώνοι με τα ελλείμματα με PCR και έλεγχο του μεγέθους των προϊόντων. Για τον έλεγχο των κυκλικών κατασκευών 1 και 2 χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος εκκινητών Rup1-a4R (σχήμα 2, παράρτημα) ενώ για τις κυκλικές κατασκευές 3 και 4 το ζεύγος Rup1-GFPright (σχήματα 2 και 3, παράρτημα). Πραγματοποιήθηκαν και αντιδράσεις ελέγχου χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την κατασκευή a με τα ίδια ζεύγη εκκινητών. Ο έλεγχος έγινε με βάση το μέγεθος των τμημάτων που αναμένονται μετά την PCR, το οποίο θα ισούται με το μέγεθος της αλληλουχίας που παρεμβάλλεται μεταξύ των εκινητών μείον το μέγεθος του τμήματος που αφαιρέθηκε με την αντίστροφη PCR. Ενδεικτικά παρατίθενται τα αποτελέσματα από τον έλεγχο που πραγματοποιήθηκε για τις κατασκευές 1, 2 και a. Εικ.3.12 Ανάλυση των προϊόντων PCR σε πήκτωμα αγαρόζης 0.8%. Μ: 1kb Στήλη 1: Προϊόν PCR με εκκινητές a1r-a2. Στήλη 2: Προϊόν PCR με εκκινητές a2r-a3. Στήλη 3: Προϊόν PCR με εκκινητές a3r-a4. Στήλη 4: Προϊόν PCR με εκκινητές a4r-a5 151

168 Αποτελέσματα Control α: Από το υπόστρωμα a (EpGFPII + ενθεμα a) με εκκινητές τους Rup1 και a4r παράγεται ένα προϊόν μεγέθους 256bp (εικόνα 3.12, στήλη 1 άνω και κάτω πήκτωμα) ενώ με εκκινητές τους Rup1 και GFPright παράγεται ένα προϊόν μεγέθους 1506bp. Για την κατασκευή 1: Ελέγχθηκαν 8 αποικίες a-h (εικ.3.13 άνω πήκτωμα). Έχει αφαιρεθεί το τμήμα μεταξύ των εκκινητών a1r-a2=67bp. Συνεπώς το μέγεθος του τμήματος που αναμένεται να παραγχθεί μετά από PCR στο κομμάτι a με εκκινητές τους Rup1 και a4r είναι 189bp. Όπως φαίνεται σε όλους τους κλώνους έχει πραγματοποιηθεί το εσωτερικό έλλειμμα. Για την κατασκευή 2: Ελέγχθηκαν 8 αποικίες a-h (εικ.3.13 κάτω πήκτωμα). Έχει αφαιρεθεί το τμήμα μεταξύ των εκκινητών α2rα3=53bp. Συνεπώς το μέγεθος του κομματιού που αναμένεται να παραγχθεί μετά από PCR στο κομμάτι α με εκκινητές τους Rup1 και α4r είναι 203bp. Όλοι οι κλώνοι εκτός από τον d φέρουν το εσωτερικό έλλειμμα. 300bps 200bps Εικ.3.13 Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 1.2% των PCR προϊόντων. Στο άνω πήκτωμα έχουν αναλυθεί τα 8 PCR προϊόντα (a-h) για τον έλεγχο της κατασκευής 1. Η αντίδραση έχει πραγματοποιηθεί με τους εκκινητές Rup1-a4R. Η αντίδραση της πρώτης στήλης αντιστοιχεί στην PCR που πραγματοποιήθηκε με την κατασκευή a και εκκινητές τους Rup1-a4R. M: 100bp. Στο κάτω πήκτωμα έχουν αναλυθεί τα 8 PCR προϊόντα (a-h) για τον έλεγχο της κατασκευής 2. Η αντίδραση έχει πραγματοποιηθεί με τους εκκινητές Rup1-a4R. Η αντίδραση της πρώτης στήλης αντιστοιχεί στην PCR που πραγματοποιήθηκε με την κατασκευή a και εκκινητές τους Rup1-a4R. M: 100bp 300bps 200bps Για περαιτέρω μελέτη επιλέγχθηκαν οι εξής κλώνοι: Από την κατασκευή 1 : Οι κλώνοι a, b, c και d Από την κατασκευή 2 : Οι κλώνοι a, b, c και e. Από τις κατασκευές 3 και 4: Οι κλώνοι a, b και c. 152

169 Αποτελέσματα Ακολούθησε υγρή καλλιέργεια και απομόνωση πλασμιδιακού DNA για κάθε έναν από τους επιλεγμένους κλώνους. H επιβεβαίωση της πραγματοποίησης των εσωτερικών ελλειμμάτων 1 έως 4 έγινε με κατάτμηση των 4 κυκλικών κατασκευών με τα ένζυμα περιορισμού HindIII (θέση αναγνώρισης εντός του υποκινητή Endo16) και BglII (θέση αναγνώρισης εντός του ενθέματος, στα 5 άκρα των εκκινητών). Αναμένεται επομένως να προκύψουν δύο τμήματα μετά τη διπλή κατάτμηση. Ένα τμήμα μικρού μεγέθους (το οποίο αντιστοιχεί στην απόσταση που μεσολαβεί μεταξύ της θέσης αναγνώρισης του ενζύμου HindΙΙΙ και του εκάστοτε καθοδικού εκκινητή που χρησιμοποιήθηκε κατά την αντίστροφη PCR για τη δημιουργία των εσωτερικών ελλειμμάτων) και ένα μεγαλύτερου μεγέθους που αντιστοιχεί στο υπόλοιπο πλαμίδιο. Κάποιοι από τους κλώνους αλληλουχήθηκαν για την επιβεβαίωση κατά πρώτον της δημιουργίας των εσωτερικών ελλειμμάτων και κατά δεύτερον της μη αλλοίωσης της αλληλουχίας της GFP από τις PCR αντιδράσεις. Απο τα αποτελέσματα της αλληλούχησης (σχήμα 5 παραρτήματος) επιλέγχθηκαν οι κλώνοι 1b, 2c, 3c και 4b στα DNA των οποίων πραγματοποιήθηκε αντίδραση PCR με σκοπό να γίνουν γραμμικά ώστε να χρησιμοποιηθούν για τη δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων. Χρησιμοποιήθηκε κοινό ζεύγος εκκινητών για όλες τις αντιδράσεις, το ζεύγος Rup1-GFPright (εικόνα 3.10). Η ακριβής θέση υβριδοποίησης των εκκινητών φαίνεται στα σχήματα 2 και 3 του παραρτήματος. 153

170 Αποτελέσματα 3.6 Διαγονιδιακά έμβρυα αχινού Οι κατασκευές με τα διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα: a1, a2, a3, a4 και a5 (εικόνα 3.8) και με τα εσωτερικά ελλείμματα: 1, 2, 3 και 4 (εικόνα 3.10) χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού με τη μέθοδο των μικροενέσεων. Τα DNAs ενέθηκαν σε γονιμοποιημένα αυγά αχινού και παρατηρήθηκε το ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης της GFP στο αναπτυξιακό στάδιο του πλουτέα. Το πρότυπο αυτό συγκρίθηκε με αυτό της κατασκευής ελέγχου, a, που περιέχει πλήρη την περιοχή a (εικόνα 3.8). Στους πίνακες 3.2 και 3.3 που ακολουθούν παρουσιάζονται τα συγκεντρωτικά αποτελέσματα του ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν στην εκάστοτε κυτταρική στοιβάδα, σε συνάρτηση με την εκάστοτε κατασκευή που χρησιμοποιήθηκε (Α), καθώς και ενδεικτικές εικόνες φθοριζόντων εμβρύων. Σχηματικά, υπό μορφή γραφημάτων, παρατίθενται τα αποτελέσματα αυτά με τα γραφήματα 1 και 3. Στην τελευταία στήλη κάθε πίνακα αναγράφεται το συνολικό ποσοστό εμβρύων που φθορίζουν (ανεξαρτήτως ιστοειδικού προτύπου φθορισμού) και η σχηματική απεικόνισή του, υπό μορφή γραφήματος, παρατίθεται με τα γραφήματα 2 και 4 αντίστοιχα. Αναλυτικός πίνακας με το σύνολο των εμβρύων και το ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης της GFP παρατίθεται στο σχήμα 6 του παραρτήματος. Στην εικόνα 3.7 περιγράφονται σχηματικά οι θέσεις των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή της εκάστοτε κατασκευής και η σχέση τους με τους πιθανούς μεταγραφικούς παράγοντες που προσδένονται στα ρυθμιστικά στοιχεία της ανοδικής περιοχής. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα που ακολουθούν, κάθε διαδοχικό ανοδικό έλλειμμα εντός του τμήματος a, οδηγεί σε σημαντική πτώση του φθορισμού στη βλεφαριδωτή ζώνη και παράλληλη αύξηση σε άλλους ιστούς (πίνακας 3.2). Συγκεκριμένα, το έλλειμμα a1, επάγει την έκφραση της gfp στο ενδόδερμα, δικαιολογώντας έτσι την παρουσία ενός αρνητικού ρυθμιστικού στοιχείου για το ενδόδερμα, εντός της περιοχής -532 έως -474 (υποπεριοχή Ι). Το έλλειμμα a2, εκτός από την αύξηση του φθορισμού στο ενδόδερμα επιφέρει και μία (σχεδόν πενταπλή) πτώση της έκφρασης στη βλεφαριδωτή ζώνη καθώς και μία σημαντική (περίπου τέσσερις φορές) αύξηση στο αντιστοματικό εξώδερμα. Τα αποτελέσματα αυτά συνηγορούν υπέρ της παρουσίας ενός θετικού ρυθμιστικού στοιχείου για τη βλεφαριδωτή ζώνη και ενός αρνητικού για το αντιστοματικό εξώδερμα στο τμήμα -474 έως -387 (υποπεριοχή ΙΙ). Με το έλλειμμα a3, αυξάνει η μη ειδικότητα της έκφρασης του γονιδίου αναφοράς (καθώς 154

171 Αποτελέσματα αυξάνει ο φθορισμός στο μη ειδικό μεσέγχυμα) υποδεικνύοντας πιθανόν την παρουσία κάποιου ρυθμιστικού στοιχείου εντός της περιοχής -387 έως -334 (υποπεριοχή ΙΙΙ). Τα περαιτέρω ελλείμματα a4-a5, επιφέρουν επίσης μη ειδική έκφραση στο μεσέγχυμα, συνηγορώντας υπέρ της απουσίας ρυθμιστικών στοιχείων εντός αυτών των περιοχών (Γράφημα 1, Πίνακας 3.2). Γράφημα a a1 a2 a3 a4 a5 % CB % ENDO %Ab Ect % Mes Γράφημα 1. Απεικόνιση του % ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν στην εκάστοτε κυτταρική στοιβάδα ανάλογα με την κατασκευή που μικροενέθηκε. Τα γραφήματα αντιστοιχούν στη δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων με τις κατασκευές a1 - a5 (Διαδοχικά Ανοδικά Ελλείμματα). Τα αποτελέσματα συγκρίνονται με την κατασκευή a που περιέχει την πλήρη περιοχή a. Η κάθε έγχρωμη μπάρα αντιστοιχεί σε μία κυτταρική στοιβάδα. Το μπλε χρώμα αντιστοιχεί στο στοματικό εξώδερμα, το κόκκινο στο ενδόδερμα, το κίτρινο στο αντιστοματικό εξώδερμα και το πράσινο στο μεσόδερμα. Πίνακας 3.2 Α) %ENDO %AbΕc %Mes %CB %FLU %CB only a a a a a a

172 Αποτελέσματα Β ΒΖ ΒΖ ΒΖ ΒΖ Eνδ. Eνδ. Eνδ. Eνδ. ΑΕ ΒΖ Μ a1 a2 a3 a4 a5 Πίνακας 3.2. Α) Απεικόνιση του % ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν στην εκάστοτε κυτταρική στοιβάδα ανάλογα με την κατασκευή που πραγματοποιήθηκε μικροένεση. Tο εκάστοτε ποσοστό υπολογίστηκε βάσει του συνολικού αριθμού των φθοριζόντων εμβρύων. Ως θετικά για φθορισμό θεωρήθηκαν έμβρυα που είχαν τουλάχιστον δύο φθορίζοντα κύτταρα. Β) Ενδεικτικές φωτογραφίες φθοριζόντων εμβρύων με το μικροσκόπιο φθορισμού. Oι φωτογραφίες δημιουργήθηκαν με προβολή της εικόνας φθορισμού επί της ειικόνας διερχόμενου λευκού φωτός για το αντίστοιχο έμβρυο. ΒΖ: Βλεφαριδωτή ζώνη, Ενδ.: Ενδόδερμα, ΑΕ: Αντιστοματικό εξώδερμα, Μ: Μεσέγχυμα. Γράφημα a a1 a2 a3 a4 a5 % FLU Γράφημα 2. Σχηματική απεικόνιση του % ποσοστού των εμβρύων που εμφανίζουν φθορισμό, συναρτήσει της εκάστοτε κατασκευής και ανεξαρτήτως της κυτταρικής στοιβάδας που εμφανίζεται ο φθορισμός. Συμπληρωματικά προς τα ανοδικά ελλείμματα πραγματοποιήθηκαν τα πειράματα με τις εσωτερικές αφαιρέσεις. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι η εσωτερική αφαίρεση 1 οδηγεί σε σημαντική εκτοπική έκφραση της GFP (αυξάνει κατά δυόμιση φορές η έκφραση στο ενδόδερμα και κατά πέντε φορές στο αντιστοματικό εξώδερμα). Αντιθέτως, παρατηρείται πτώση της έκφρασης στη βλεφαριδωτή ζώνη κατά τρεις 156

173 Αποτελέσματα περίπου φορές σε σύγκριση με την περιοχή a (συγκρίνοντας έμβρυα που παρουσιάζουν φθορισμό αποκλειστικά στη βλεφαριδωτή ζώνη). Το αποτέλεσμα συνηγορεί υπέρ της ύπαρξης εντός της περιοχής αυτής (-453 έως -386, υποπεριοχή ΙΙ) αρνητικών ρυθμιστικών στοιχείων για το αντιστοματικό εξώδερμα και το ενδόδερμα και θετικών για τη βλεφαριδωτή ζώνη. Σε αντίθεση, η αφαίρεση 2, δεν επηρεάζει την έκφραση στη, βλεφαριδωτή ζώνη και το ενδόδερμα, αλλά επάγει σημαντικά την έκφραση του γονιδίου αναφοράς μόνο στο αντιστοματικό εξώδερμα, γεγονός που συνηγορεί υπέρ της παρουσίας εντός της περιοχής αυτής (-387 έως -334, υποπεριοχή ΙΙΙ), ενός αρνητικού ρυθμιστικού στοιχείου για το αντιστοματικό εξώδερμα. Οι υπόλοιπες εσωτερικές αφαιρέσεις (3 και 4) δεν επηρεάζουν με κάποιο τρόπο το πρότυπο έκφρασης, συγκριτικά με αυτό που επάγει ολόκληρη η περιοχή a (Γράφημα 3 και Πίνακας 3.3). Γράφημα a % CB % ENDO %AbEct % Mes Γράφημα 3. Απεικόνιση του % ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν στην εκάστοτε κυτταρική στοιβάδα σε αντιστοιχία με την κατασκευή που μικροενέθηκε. Τα γραφήματα αντιστοιχούν στη δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων με τις κατασκευές 1-4. Τα αποτελέσματα συγκρίνονται με την κατασκευή a που περιέχει ολόκληρη την περιοχή a. Η κάθε έγχρωμη μπάρα αντιστοιχεί σε μία κυτταρική στοιβάδα. Το μπλε χρώμα αντιστοιχεί στο στοματικό εξώδερμα, το κόκκινο στο ενδόδερμα, το κίτρινο στο αντιστοματικό εξώδερμα και το πράσινο στο μεσόδερμα. 157

174 Αποτελέσματα A Πίνακας 3.3 %CB %ENDO %AbEc %Mes %CB %FLU only a Β 1 ΑΕ Ενδ 2 ΒΖ ΑΕ ΒΖ Ενδ Μ 3 4 Πίνακας 3.3. Α) Απεικόνιση του % ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν στην εκάστοτε κυτταρική στοιβάδα ανάλογα με την κατασκευή που μικροενέθηκε. Tο εκάστοτε ποσοστό υπολογίστηκε βάσει του συνολικού αριθμού των φθοριζόντων εμβρύων. Ως θετικά για φθορισμό θεωρήθηκαν έμβρυα που είχαν τουλάχιστον δύο φθορίζοντα κύτταρα. Β) Ενδεικτικές φωτογραφίες φθοριζόντων εμβρύων με το μικροσκόπιο φθορισμού. Oι φωτογραφίες δημιουργήθηκαν με προβολή της εικόνας φθορισμού επί της εικόνας διερχόμενου λευκού φωτός για το αντίστοιχο έμβρυο. Γράφημα % FLU 20 0 a Γράφημα 4 Σχηματική απεικόνιση του % ποσοστού των εμβρύων που εμφανίζουν φθορισμό συναρτήσει της εκάστοτε κατασκευής και ανεξαρτήτως της κυτταρικής στοιβάδας που εμφανίζεται ο φθορισμός. 158

175 Αποτελέσματα Συνοψίζοντας, το ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης της GFP που επιφέρει κάθε μία από τις κατασκευές με τα διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα (a1 - a5) και με τα εσωτερικά ελλείμματα (1 4), συγκρίνεται με το ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης της κατασκευής a, η οποία περιέχει ολόκληρη την περιοχή a (-212 ως -533) της ανοδικής περιοχής του PlCoup-tf. Aπό τους πίνακες που προηγήθηκαν, προκύπτει ότι τα υψηλότερα ποσοστά μεταβολών στην έκφραση της GFP στους εκάστοτε ιστούς (συγκριτικά με το πρότυπο έκφρασης της κατασκευής a), προέρχονται με τις εξής κατασκευές (Kalampoki LG and Flytzanis C. 2014): Aύξηση της έκφρασης της GFP στο ενδόδερμα (από 25% σε 48%) με την κατασκευή a1, από την οποία λείπει η υποπεριοχή Ι. Πτώση της αποκλειστικής έκφρασης της GFP στη βλεφαριδωτή ζώνη με τις κατασκευές a2 και 1, από τις οποίες λείπει η υποπεριοχή ΙΙ. Aύξηση της έκφρασης, με τις κατασκευές a2 και 1, στο αντιστοματικό εξώδερμα (από 8% σε 28% και 41% αντίστοιχα) και στο ενδόδερμα (από 25% σε 30% και 61%) αντίστοιχα. Από τις κατασκευές αυτές λείπει η υποπεριοχή ΙΙ. Πολύ σημαντική αύξηση της έκφρασης της GFP στο αντιστοματικό εξώδερμα (από 8% σε 39%) με την κατασκευή 2, από την οποία λείπει η υποπεριοχή ΙΙΙ. Η μεγαλύτερη πτώση της έκφρασης στη βλεφαριδωτή ζώνη συναντάται με την κατασκευή a5, ωστόσο αυτό είναι αναμενόμενο καθώς έχει απαλλειφθεί ολόκληρη σχεδόν η ρυθμιστική περιοχή. Η επίδραση των κατασκευών στο ποσοστό εκφρασης στο μεσόδερμα δεν λαμβάνεται υπ όψιν καθώς σε βιβλιογραφικές αναφορές φαίνεται να επηρεάζεται η έκφραση στο μεσέγχυμα κατά έναν παράδοξο τρόπο χωρίς να σχετίζεται με ρυθμιστικά στοιχεία που περιλαμβάνονται εντός των περιοχών που μελετώνται. Πιο ειδικά μάλιστα, η αύξηση του ποσοστού έκφρασης σε αυτό τον ιστό συνηγορεί υπέρ της απουσίας ρυθμιστικών στοιχείων ικανών να επηρεάσουν την έκφραση του γονιδίου αναφοράς. 159

176 Αποτελέσματα 3.7 Στοχευμένες μεταλλάξεις των στοιχείων -453, -432 και -377 Η μελέτη του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης της GFP κάθε κατασκευής που χρησιμοποιήθηκε, ανέδειξε την ύπαρξη σημαντικών ρυθμιστικών στοιχείων στις υποπεριοχές II και III. Από το σύνολο των στοιχείων (όπως περιγράφονται στην εικόνα 3.7) επιλέχτηκαν αυτά των θέσεων -377 (πιθανό Οtx στοιχείο), -432 (πιθανό AP1 στοιχείο) και -453 (πιθανό Ets στοιχείο) ως πιο πιθανά να ρυθμίζουν την ιστοειδική έκφραση του PlCoup-tf στο στοματικό εξώδερμα. Τα συγκεκριμένα στοιχεία επιλέχτηκαν έναντι των υπολοίπων καθώς αποτελούν όντως στοιχεία απόκρισης για μεταγραφικούς παράγοντες (όπως αποδείχτηκε με πειράματα EMSA) (εικόνα 3.5). Επιπλέον, οι μεταγραφικοί αυτοί παράγοντες (που προτείνονται από τις βάσεις δεδομένων) είναι υπαρκτοί στον αχινό, καθώς τα γονίδιά τους ανιχνεύονται στο γονιδίωμα του αχινού S.purpuratus. Η βιβλιογραφική μελέτη των παραγόντων αυτών έδειξε πως έχει μελετηθεί διεξοδικά μόνο η οικογένεια των ETS παραγόντων στον αχινό S.purpuratus, μέλη της οποίας μάλιστα εκφράζονται στο στοματικό εξώδερμα στο στάδιο του πλουτέα. Άλλοι παράγοντες, που δύνανται να αναγνωρίζουν πιθανά ρυθμιστικά στοιχεία εντός της περιοχής a, δεν αποκλείονται, αλλά από την ανωτέρω ανάλυση δεν αναμένεται να επηρεάζουν την ιστοειδική έκφραση του PlCoup-TF. Η επιβεβαίωση του ρυθμιστικού ρόλου των στοιχείων στις θέσεις -377, -432 και πραγματοποιήθηκε με μια σειρά πειραμάτων στα οποία πραγματοποιήθηκαν στοχευμένες μεταλλάξεις σε αυτά. Οι κατασκευές με τα μεταλλαγμένα πλέον στοιχεία απόκρισης χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων και το πρότυπο έκφρασης της GFP συγκρίθηκε με αυτό της κατασκευής a που δεν φέρει καμία μετάλλαξη στην ανοδική περιοχή. Πιθανές τροποποιήσεις του προτύπου έκφρασης οφείλονται στις μεταλλάξεις που πραγματοποιήθηκαν κι έτσι μπορούν να εξαχθούν συμπεράσματα για το ρόλο του εκάστοτε στοιχείου. Οι μεταλλάξεις έγιναν με αντικατάσταση βάσεων του πυρήνα των στοιχείων από την αλληλουχία AGATCT που είναι η θέση αναγνώρισης του ενζύμου BglII. Πραγματοποιήθηκαν συνολικά τέσσερις μεταλλάξεις, μία για το κάθε στοιχείο και μία διπλή μετάλλαξη των στοιχείων -453 και - 432, όπου εκτός από τα δύο στοιχεία αφαιρέθηκε και η ενδιάμεση αυτών αλλλουχία, μεγέθους 20nt. Η διπλή μετάλλαξη πραγματοποιήθηκε προκειμένου να εξεταστεί αν τα δύο αυτά στοιχεία αναγνωρίζονται από μεταγραφικούς παράγοντες με συνεργατικό ρόλο στη ρύθμιση του PlCoup-TF, καθώς από τη βιβλιογραφία είναι γνωστό ότι οι παράγοντες 160

177 Αποτελέσματα ETS και ΑP1 (που πιθανόν αναγνωρίζουν αυτά τα στοιχεία) συχνά αλληλεπιδρούν προκειμένου να ρυθμίσουν τα γονίδια στόχους τους. Στην εικόνα 3.14 φαίνονται σχηματικά οι αλληλουχίες των αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στοιχείων απόκρισης. Η πλήρης αλληλουχία των στοιχείων (πυρήνων και πέριξ νουκλεοτιδίων) και η σύγκριση των μεταλλαγμένων με τα αγρίου τύπου φαίνεται αναλυτικά στο σχήμα 7 του παραρτήματος. wt Ets? AP1? Otx? CCGGGAAG AATGACT TTAATCC wt mut Ets? AP1? Otx? CCGGGAAG AATGACT TTAATCC A G ATCT Κατασκευή - 453m wt mut Ets? AP1? Otx? CCGGGAAG AATGACT TTAATCC AATAGAT Κατασκευή - 432m wt mut Ets? AP1? Otx? CCGGGAAG AATGACT TTAATCC AGA_TCT Κατασκευή - 377m wt Double mut Ets? AP1? Otx? CCGGGAAG AATGACT TTAATCC A _ GA _ T Κατασκευή - 453/-432 dm Εικ Σχηματική αναπαράσταση των κατασκευών με τις στοχευμένες μεταλλάξεις των στοιχείων -453, -432 και Η πράσινη γραμμή αντιστοιχεί στην περιοχή a που εκτείνεται από το -212 ως το -533 της ανοδικής περιοχής του γονιδίου PlCoup-tf. Κατά μήκος της γραμμής αναγράφονται οι αλληλουχίες των στοιχείων που μελετώνται στις αντίστοιχες θέσεις. Στην κορυφή κάθε στοιχείου αναγράφονται οι μεταγραφικοί παράγοντες που πιθανόν προσδένονται. Καθώς η ταυτότητα των παραγόντων που προσδένονται στα στοιχεία αποτελεί απλή υπόθεση γι αυτό σημαίνονται με ερωτηματικό. Στην κατασκευή -453m έχει μεταλλαχθεί μόνο το στοιχείο -453, στην κατασκευή -432m έχει μεταλλαχθεί το στοιχείο -432, στο -377m έχει μεταλλαχθεί μόνο το στοιχείο -377 ενώ στην κατασκευή -453/-432dm έχει πραγματοποιηθεί διπλή μετάλλαξη των στοιχείων -453 και Σε κάθε κατασκευή αντιστοιχούν δύο πράσινες γραμμές όπου η επάνω φέρει τις άγριου τύπου αλληλουχίες των στοιχείων ενώ η κάτω τις μεταλλαγμένες. Στο σχήμα επισημαίνονται ακριβώς τα νουκλεοτίδια των στοιχείων που μεταλλάχθηκαν και οι βάσεις που παρέμειναν ίδιες με του αγρίου τύπου σημαίνονται με μπλε γραμμές. wt: wild type, mut: mutant, dm: double mutant 161

178 Αποτελέσματα Οι στοχευμένες μεταλλάξεις πραγματοποιήθηκαν με αντίστροφη PCR με την ίδια διαδικασία όπως και τα εσωτερικά ελλείμματα, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την κατασκευή a και εκκινητές που υβριδοποιούνται εκατέρωθεν των βάσεων των στοιχείων που πρόκειται να αντικατασταθούν. Οι εκκινητές έχουν σχεδιαστεί κατά τέτοιο τρόπο ώστε να φέρουν στο 5 άκρο τους προέκταση που αντιστοιχεί στη θέση αναγνώρισης του ενζύμου BglII. Η επιλογή του ενζύμου δεν είναι τυχαία αλλά είναι το καταλληλότερο καθώς δεν αναγνωρίζει καμία άλλη θέση εντός της κατασκευής a. Τα ζεύγη των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την πραγματοποίηση της κάθε μετάλλαξης είναι τα εξής: ApF- ApR : Για μετάλλαξη του στοιχείου -432 (πιθανό AP1 στοιχείο) OtxF- OtxR: Για μετάλλαξη του στοιχείου -377 (πιθανό Otx στοιχείο) EtsF- EtsR : Για μετάλλαξη του στοιχείου -453 (πιθανό Ets στοιχείο) ApR-EtsF : Για διπλή μετάλλαξη των στοιχείων -453 και -432 Τα προϊόντα των αντίστροφων PCR είναι γραμμικά μόρια DNA. Τα άκρα τους έγιναν κολλώδη μετά από κατάτμηση με το ένζυμο περιορισμού BglII και κατόπιν επανακυκλοποιήθηκαν με αντίδραση λιγάσης και μετασχηματίστηκαν με αυτά δεκτικά βακτήρια E.coli με ηλεκτροδιάτρηση. Οι κλώνοι που φέρουν τις στοχευμένες μεταλλάξεις των στοιχείων -377, -432 και -453 αναγνωρίστηκαν με κατάτμηση των απομονωμένων DNA με BglII και ανάλυση αυτών σε πήκτωμα αγαρόζης. Οι κλώνοι που επιλέγχθηκαν από κάθε κατασκευή με την εκάστοτε σημειακή μετάλλαξη αλληλουχήθηκαν για να επιβεβαιωθεί τόσο η απουσία του στοιχείου απόκρισης όσο και η διατήρηση του σωστού αναγνωστικού πλαισίου και έλλειψη μεταλλάξεων της GFP (σχήμα 8 παραρτήματος). Καθώς το ένζυμο αναγνωρίζει μόνο μία θέση στην κατασκευή (αυτή που αντιστοιχεί στα 5 άκρα των εκκινητών), μετά την κατάτμηση αναμένεται ένα γραμμικό προϊόν το οποίο επιβεβαιώνει την πραγματοποίηση της αντίστροφης PCR και τη μετάλλαξη των στοιχείων. Στο απομονωμένο πλασμιδιακό DNA πραγματοποιήθηκε εκ νέου αντίδραση PCR με σκοπό την παρασκευή γραμμικών προϊόντων, των κατασκευών -453m, -432m, -377m και -453/ 432 dm (εικόνα 3.14) και τη δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων αχινού. Για την αντίδραση αυτή χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος των εκκινητών Rup1 GFPright. 162

179 Αποτελέσματα 3.8 Tα στοιχεία -377, -432 και -453 ρυθμίζουν το γονιδιο του PlCoup-tf Οι κατασκευές -377m, -432m, -453m, και -453/432dm ενέθηκαν σε γονιμοποιημένα αυγά αχινού και μελετήθηκε το πρότυπο έκφρασης της GFP στο αναπτυξιακό στάδιο του πλουτέα. Το ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης κάθε κατασκευής συγκρίθηκε με αυτό της κατασκευής ελέγχου, a. Στον πίνακα 4 αναγράφεται το % ποσοστό των εμβρύων που εκφράζουν τη GFP στον εκάστοτε ιστό, συναρτήσει της κατασκευής που χρησιμοποιήθηκε. Στην τελευταία στήλη αναγράφεται το συνολικό % ποσοστό των εμβρύων που φθορίζουν (ανεξαρτήτου κυτταρικής στοιβάδας). Σχηματικά τα αποτελέσματα αποδίδονται με τα γραφήματα 5 (Ιστοειδικότητα της GFP συναρτήσει των κατασκευών) και 6 (Συνολικό ποσοστό φθορισμού συναρτήσει των κατασκευών). Στο σχήμα 9 του παραρτήματος παρατίθεται ο αναλυτικός πίνακας που περιλαμβάνει τα αποτελέσματα έκφρασης της GFP για κάθε έμβρυο που παρατηρήθηκε. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα, η μετάλλαξη του στοιχείου -453 ενώ δεν επιφέρει αλλαγή στο ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης της GFP, προκαλεί σημαντική πτώση του αριθμού των φθοριζόντων εμβύων. Επιπλέον, η ισχύς του φθορισμού που παρατηρήθηκε σε αυτά τα έμβρυα ήταν πολύ ασθενής συνηγορώντας υπέρ της υπόθεσης ότι το στοιχείο -453 έχει θετικό ρυθμιστικό ρόλο στην έκφραση του PlCoup-tf στη βλεφαριδωτή ζώνη. Αντίθετα, η μετάλλαξη του στοιχείου -432 προκαλεί αύξηση του ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν στο ενδόδερμα (κατά δυόμιση φορές) και στο αντιστοματικό εξώδερμα (κατά έξι φορές) γεγονός που αποδεικνύει το ρόλο του στοιχείου αυτού ως καταστολέα στο αντιστοματικό εξώδερμα και στο ενδόδερμα. Η μετάλλαξη του στοιχείου -377 επέφερε αύξηση (κατά τεσσερισήμιση φορές) του ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν στο αντιστοματικό εξώδερμα, αναδεικνύοντας το ρόλο του επίσης ως καταστολέα του PlCoup-tf σε αυτή αποκλειστικά την κυτταρική γραμμή. Η διπλή μετάλλαξη των στοιχείων -453 και -432, επέφερε σημαντική πτώση του ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν και απώλεια της ειδικότητας έκφρασης του γονιδίου αναφοράς. Μάλιστα, το αποτέλεσμα της διπλής μετάλλαξης συνάδει με το αθροιστικό αποτέλεσμα της μετάλλαξης καθενός εκ των δύο αυτών στοιχείων χωριστά (Γράφημα 5 και Πίνακας 3.4). 163

180 Αποτελέσματα 100 Γράφηµα a -432m Ap -453/ Ap/Ets ,8-453m Ets Otx -377m dm % CB % ENDO %Ab End % Mes Γράφημα 5. Απεικόνιση του % ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν στην εκάστοτε κυτταρική στοιβάδα σε συνάρτηση με την κατασκευή που ενέθηκε. Τα γραφήματα αντιστοιχούν στη δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων με τις κατασκευές -453m, -432m, -377m και -453/-432dm. Τα αποτελέσματα συγκρίνονται με την κατασκευή a που περιέχει την αγρίου τύπου αλληλουχία. Η κάθε έγχρωμη μπάρα αντιστοιχεί σε μία κυτταρική στοιβάδα. Το μπλε χρώμα αντιστοιχεί στο στοματικό εξώδερμα, το κόκκινο στο ενδόδερμα, το κίτρινο στο αντιστοματικό εξώδερμα και το πράσινο στο μεσόδερμα. Α Πίνακας 3.4 %CB %ENDO %AbEc %Mes %CB only %FLU a m /-432dm m m

181 Αποτελέσματα Β 1 2 BZ BZ Eνδ BZ Eνδ ΑΕ ΑΕ ΑΕ -453m -453m -432m -377m -453/-432dm Πίνακας 3.4. Α) Απεικόνιση του % ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν στην εκάστοτε κυτταρική στοιβάδα ανάλογα με την κατασκευή που μικροενέθηκε. Tο εκάστοτε ποσοστό υπολογίστηκε βάσει του συνολικού αριθμού των φθοριζόντων εμβρύων. Ως θετικά για φθορισμό θεωρήθηκαν έμβρυα που είχαν τουλάχιστον δύο φθορίζοντα κύτταρα. Β) Ενδεικτικές φωτογραφίες φθοριζόντων εμβρύων με το μικροσκόπιο φθορισμού. Η φωτογραφία 1 απεικονίζει το έμβρυο της φωτογραφίας 2, όπως ακριβώς φαίνεται στο μικροσκόπιο φθορισμού. Η φωτογραφία αυτή προστέθηκε προκειμένου να φανεί η χαμηλή ένταση φθορισμού της GFP που επέφερε η κατασκευή -453m. Oι φωτογραφίες δημιουργήθηκαν με προβολή της εικόνας φθορισμού επί της εικόνας διερχόμενου λευκού φωτός για το αντίστοιχο έμβρυο. ΒΖ: Βλεφαριδωτή ζώνη, Ενδ.: Ενδόδερμα, ΑΕ: Αντιστοματικό εξώδερμα. Γράφημα a -432 dm(-453/-432) % FLU Γράφημα 6. Σχηματική απεικόνιση του % ποσοστού των φθοριζόντων εμβρύων σε συνάρτηση με την εκάστοτε ενεμμένη κατασκευή. Στον οριζόντιο άξονα αναγράφονται οι κατασκευές που μελετήθηκαν. Συνοψίζοντας, από τα πιο πάνω γραφήματα προκύπτουν τα εξής συμπεράσματα (Kalampoki LG and Flytzanis C. 2014): Η μετάλλαξη του στοιχείου -453 οδήγησε σε σημαντική πτώση του συνολικού ποσοστού των φθοριζόντων εμβρύων. Επίσης παρατηρήθηκε σημαντική πτώση της έντασης του φθορισμού. 165

182 Αποτελέσματα Η μετάλλαξη του στοιχείου -432 επέφερε αύξηση του ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν στο αντιστοματικό εξώδερμα και στο ενδόδερμα, ενώ δεν επηρέασε το πρότυπο έκφρασης στη βλεφαριδωτή ζώνη. Η διπλή μετάλλαξη των στοιχείων -453 και -432 οδήγησε σε σημαντική πτώση του συνολικού ποσοστού των φθοριζόντων εμβρύων καθώς και σε σημαντική ελάττωση της έντασης του φθορισμού. Επιπλέον, παρατηρήθηκε αύξηση του ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν στο αντιστοματικό εξώδερμα και στο ενδόδερμα. Η μετάλλαξη του στοιχείου -377 επέφερε αύξηση του ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν στο αντιστοματικό εξώδερμα. 3.9 Αναζήτηση των μεταγραφικών παραγόντων που προσδένονται στα στοιχεία -377, -432 και -453 Όπως προέκυψε από τις σειρές των πειραμάτων που προηγήθηκαν, τα στοιχεία - 377, -432 και -453 παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του γονιδίου PlCoup-tf στον αχινό Paracentrotus lividus. Προκειμένου να ενταχθεί ο παράγοντας Coup-TF στη σωστή θέση στο ρυθμιστικό δίκτυο του εξωδέρματος κρίνεται απαραίτητη η εύρεση των μεταγραφικών παραγόντων που αναγνωρίζουν τα συγκεκριμένα στοιχεία απόκρισης. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, με τη βοήθεια του προγράμματος TESS, έχουν συγκριθεί οι αλληλουχίες των υπό μελέτη στοιχείων με μια πληθώρα στοιχείων της βάσης δεδομένων των οποίων οι μεταγραφικοί παράγοντες είναι γνωστοί και προτάθηκαν τα εξής: Το στοιχείο -453 αναγνωρίζεται από παράγοντες της οικογένειας ETS Το στοιχείο -432 αναγνωρίζεται από τον παράγοντα AP1 που απαρτίζεται από τις πρωτεϊνες Jun και Fra2 και οι οποίες σχηματίζουν είτε το ετεροδιμερές Jun/Fra2 είτε τα ομοδιμερή Jun/Jun ή Fra2/Fra2 Το στοιχείο -377 αναγνωρίζεται από τον παράγοντα Otx 166

183 Αποτελέσματα 3.10 Μελέτη των παραγόντων PlJun, PlFra2, PlElk και PlPea Ο χαρακτηρισμός (από τις βάσεις δεδομένων) των στοιχείων -432 και -453 ως AP1 και Ets αντίστοιχα, αποτέλεσε αφορμή για τη μελέτη των παραγόντων Jun και Fra2 (ως προσδέτες στο -432) και των Elk και Pea (ως προσδέτες στο -453). Δεδομένου ότι ο Coup-TF εκφράζεται στο στοματικό εξώδεμα, αναμένεται οι θετικοί ρυθμιστές του (που προσδένονται στο -453) να εμφανίζουν παρόμοιο ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης. Αναλόγως, οι παράγοντες που καταστέλλουν την εκτοπική έκφρασή του (που προσδένονται στο -432), αναμένεται να εκφράζονται σε αυτούς τους ιστούς όπου ασκούν την κατασταλτική τους δράση (αντιστοματικό εξώδερμα και ενδόδερμα). Η οικογένεια ETS περιλαμβάνει μια πληθώρα παραγόντων. Επιλέγχθηκαν να μελετηθούν οι Pea και Elk διότι μόνο αυτοί εκφράζονται στο στοματικό εξώδερμα του πλουτέα στο συγγενικό είδος S.purpuratus ενώ όλοι οι υπόλοιποι εκφράζονται σε διαφορετικές κυτταρικές στοιβάδες (Rizzo Fransesca, phd) Ο παράγοντας PlJun RACE PCR για το μεταγραφικό παράγοντα PlJun Προκειμένου να μελετηθεί ο παράγοντας Jun στον αχινό P.lividus θεωρήθηκε απαραίτητη η κλωνοποίηση του cdna και η γνώση της αλληλουχίας του. Προς το σκοπό αυτό αναζητητήθηκε η αλληλουχία του ομολόγου γονιδίου του στο συγγενικό είδος Strongylocentrotus purpuratus του οποίου το γονιδίωμα έχει πλήρως αλληλουχηθεί (Alternate assembly based on NCBI's super-scaffold of Spur_v2.1 available on Oct 18, 2006). Χρησιμοποιώντας την αντίστοιχη αλληλουχία από τον αχινό S.purpuratus και τη μηχανή αναζήτησης BLAST, βρέθηκε η αλληλουχία του cdna του γονιδίου Jun στον αχινό P.lividus (Σχήμα 10, παράρτημα). Πραγματοποιήθηκε 5 RACE PCR για το γονίδιο PlJun και αλληλούχηση του προϊόντος με σκοπό αφενός την ταύτιση της, ανευρισκόμενης στη βάση δεδομένων, 5 UTR περιοχής με αυτή που προέκυψε από την αντίδραση, αφετέρου την εύρεση της 167

184 Αποτελέσματα ακριβούς αλληλουχίας εκατέρωθεν του AUG προκειμένου να γίνει σύνθεση αντινοηματικών ολιγονουκλεοτιδίων (morpholinos) για την ειδική στόχευση και καταστολή (knockdown) της έκφρασης του PlJun σε μελλοντικά πειράματα με έμβρυα αχινού. Τα αρχικά στάδια της αντίδρασης 5 RACE PCR, μέχρι την παρασκευή του ολικού cdna, είχαν πραγματοποιηθεί με παλαιότερα πειράματα (Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης, Λαμπρινή Καλαμπόκη) και ως εκ τούτου στην προκειμένη περίπτωση απομονώθηκε το cdna του PlJun χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το ήδη υπάρχον ολικό cdna. Πραγματοποιήθηκαν 3 αντιδράσεις nested PCR, για κάθε μία εκ των οποίων χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα το προϊόν της προηγούμενης. Χρησιμοποιήθηκαν τρείς εκκινητές ειδικοί για το γονίδιο στόχο (Jun835, Jun668 και Jun400) και δύο ειδικοί για ένα πρόσδεμα (adapter) που βρίσκεται στο 5 άκρο του cdna υποστρώματος (ο δεύτερος εκκινητής χρησιμοποιήθηκε και για την τρίτη nested PCR). Η επιλογή των εκκινητών έγινε με τη βοήθεια του προγράμματος Primer 3 έχοντας ως βάση την αλληλουχία του PlJun της βάσης δεδομένων (σχήμα 11, παράρτημα). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται σχηματικά στην εικόνα 3.15 και τα ζεύγη είναι τα εξής: 1 η PCR : 5 RACE outer primer/ Jun835 primer 2 η PCR : 5 RACE inner primer/ Jun668 primer 3 η PCR : 5 RACE inner primer/ Jun400 primer 5 RACE Outer 5 RACE Inner + 1 Jun 400 Jun 668 Jun 835 Adapter 5 PlJun cdna Εικ Σχηματική παράσταση των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για τις αντιδράσεις των τριών nested PCR που αποτελούν τα τελικά στάδια της 5 RACE PCR. Με γκρι κουτί απεικονίζεται το πρόσδεμα (adapter) που έχει ενωθεί στο 5 άκρο του cdnaτου PlJun. Mε μωβ κουτί απεικονίζεται το 5 άκρο του cdna του PlJun. Με βέλη απεικονίζονται οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν. Για κάθε αντίδραση χρησιμοποιήθηκε ένας ανοδικός εκκινητής που υβριδοποιείται στην αλληλουχία του adapter και ένας καθοδικός που υβριδοποιείται στην αλληλουχία του PlJun cdna. Τα ζεύγη ανοδικού καθοδικού εκκινητού που έχουν το ίδιο χρώμα χρησιμοποιήθηκαν σε κοινή αντίδρση. Ο αριθμός που χαρακτηρίζει τους καθοδικούς εκκινητές αντιστοιχεί στη θέση υβριδοποίησής τους, ως προς το + 1, στην αλληλουχία του PlJun όπως αυτή παρέχεται από τη βάση δεδομένων. 168

185 Αποτελέσματα Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.16, από την τρίτη PCR αντίδραση, προέκυψε ειδικό προϊόν μεγέθους 400nt, όπως αναμενόταν (κόκκινο βέλος). Το πρόσδεμα έχει μέγεθος 45nt κι έτσι δε διαφοροποιεί ουσιαστικά το μέγεθος που αναμένεται. Το προϊόν κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pgem-teasy και πραγματοποιήθηκε κατάτμηση ελέγχου για την ταυτοποίηση της παρουσίας του ενθέματος, χρησιμοποιώντας το ένζυμο περιορισμού EcoRI το οποίο αναγνωρίζει μόνο δύο θέσεις περιορισμού στον πολυσυνδέτη του φορέα, εκατέρωθεν του ενθέματος. Αναμένονται επομένως να παραχθούν δύο ζώνες DNA, μία μεγέθους 3000bp που αντιστοιχεί στο μέγεθος του πλασμιδιακού φορέα και μία 400bp που αντιστοιχεί στο PCR προϊόν. Επιλέγχθηκαν για έλεγχο 5 κλώνοι και η ανάλυση των προϊόντων κατάτμησης σε πήκτωμα αγαρόζης φαίνεται στην εικόνα Ο κλώνος 1 δεν περιέχει τη σωστή κατασκευή καθώς δίνει μία μόνο ζώνη, ενώ οι κλώνοι 2, 3, 4 και 5 φαίνεται να είναι σωστοί αφού παράγουν προϊόντα αναμενόμενων μεγεθών και επιλέγχθηκαν να αλληλουχηθούν. Η αλληλούχηση (σχήμα 12 του παραρτήματος) ανέδειξε ότι οι κλώνοι 3 και 4 έχουν μεγαλύτερη 5 UTR περιοχή συγκριτικά με τους κλώνους 2 και 5 και η διαφορά εντοπίζεται στο 5 άκρο της. Αυτή η διαφορά μεγέθους, ενδεχομένως οφείλεται σε πολλαπλά σημεία έναρξης της μεταγραφής στο γονίδιο PlJun. Επίσης από τη σύγκριση των 4 αλληλουχιών αναγνωρίστηκαν Εικ Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 1.2% του PCR προϊόντος της τρίτης nested PCR αντίδρασης με εκκινητές τους 5 RACE inner Jun400. M: 100bp EcoR I digest 400bps M Εικ Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 1.2%, των βακτηριακών κλώνων 1-5 που περιέχουν ενσωματωμένο στον πλασμιδιακό φορέα pgem-teasy το προϊόν της PCR μεγέθους 400nt, μετά από κατάτμηση τους με EcoRI. Μ: 100bp μικρές διαφορές μεταξύ τους που πιθανόν προέκυψαν από λάθη της Taq πολυμεράσης κατά τον πολλαπλασιασμό τους. Η σύγκριση των κλώνων αυτών με την αλληλουχία του PlJun της βάσης δεδομένων έδειξε την παρουσία 75bp επιπλέον στην αλληλουχία της 169

186 Αποτελέσματα βάσης δεδομένων και η διαφορά εντοπίζεται στο 5 άκρο της 5 UTR περιοχής (σχήμα 12 παραρτήματος). Πιθανόν η διαφορά αυτή να αντικατοπτρίζει και πάλι τα πολλαπλά σημεία έναρξης της μεταγραφής στο γονίδιο PlJun Απομόνωση του cdna του γονιδίου PlJun Απομονώθηκε το cdna του γονιδίου PlJun με RT-PCR χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα ολικό mrna και το ζεύγος των εκκινητών: Jun5 - Jun3. Ο ανοδικός εκκινητής σχεδιάστηκε με βάση την αλληλουχία του προϊόντος της 5 RACE ενώ ο καθοδικός με βάση την αλληλουχία του cdna PlJun από τη βάση δεδομένων. Στην εικόνα 3.18 παρίστανται σχηματικά οι θέσεις των εκκινητών και το αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος και στο σχήμα 11 του παραρτήματος φαίνονται οι ακριβείς θέσεις υβριδοποίησης τους στην αλληλουχία του PlJun cdna. Πραγματοποιήθηκαν τρεις αντιδράσεις χρησιμοποιώντας κλίσεις θερμοκρασιών (50 0 C, C και 58 0 C) με στόχο την επίτευξη της πιο αποδοτικής υβριδοποίησης των εκκινητών στην αλληλουχία - στόχο. + 1 Τ7 5 UTR Jun ATG PlJun (308αα) TAA 3 UTR Jun3 Sp nt Εικ Σχηματική παράσταση των θέσεων των εκκινητών Jun5 και Jun3 που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση της κωδικής περιοχής του PlJun. Οι εκκινητές παριστάνονται με καφέ βέλη και στη βάση τους αναγράφονται οι θέσεις υβριδοποίησής τους στην αλληλουχία στόχο. T7: Υποκινητής της πολυμεράσης Τ7, Sp6: Υποκινητής της πολυμεράσης Sp6. Στο τέλος της αντίδρασης πολυμερισμού αναμένεται ένα προϊόν μεγέθους 2402bp. Στην εικόνα 3.19, φαίνεται η ανάλυση των προϊόντων των RT-PCR αντιδράσεων, σε πήκτωμα αγαρόζης. Και από τις τρεις αντιδράσεις προέκυψαν προϊόντα με το αναμενόμενο μέγεθος (καθώς και κάποια παραπροϊόντα). Για τα πειράματα που ακολούθησαν επιλέγχθηκε το προϊόν της δεύτερης αντίδρασης ( C) καθώς είχε τη μεγαλύτερη συγκέντρωση DΝΑ και σχετικά λίγα παραπροϊόντα. 170

187 Αποτελέσματα Το προϊόν κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pgem-teasy και ελέγχθηκε η παρουσία του ενθέματος σε εκατό κλώνους (10 δεκάδες) με PCR. Χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος των εκκινητών Jun5 - Jun3 που παράγει προϊόν μεγέθους 2400bp (εικ. 3.18). Μόνο η δεκάδα φαίνεται να περιέχει κλώνο με το επιθυμητό προϊόν καθώς ανιχνεύεται μία αχνή ζώνη που αντιστοιχεί στο αναμενόμενο μέγεθος (σημαίνεται με μπλε βέλος στην εικόνα 3.20). M 50 ο C 53,5 o C 58 o C 2400bp Για την επιλογή του κλώνου που φέρει το ένθεμα πραγματοποιήθηκε εκ νέου PCR μεμονωμένα για κάθε έναν από τους δέκα κλώνους (41-50) χρησιμοποιώντας ξανά το ζεύγος των εκκινητών Jun5 - Jun3. Η ανάλυση των προϊόντων φαίνεται στην εικόνα 3.20 (θέσεις: στο πήκτωμα). Μόνο ο κλώνος 45 φαίνεται να περιέχει το cdna PlJun καθώς ανιχνεύεται προϊόν στο αναμενόμενο μέγεθος όπως σημαίνεται με το μπλε βέλος στη φωτογραφία. Το DNA του κλώνου 45 απομονώθηκε και αλληλουχήθηκε. Από το αποτέλεσμα της αλληλούχησης επιβεβαιώθηκε ότι ο κλώνος αυτός περιέχει ένθεμα με όλη την κωδική περιοχή του PlJun και μεγάλο τμήμα της 3 UTR (σχήμα 13, παράρτημα). Επίσης, ταυτοποιήθηκε η πρωτείνη που κωδικοποιεί με τη χρήση της βάσης δεδομένων NCBI (σχήμα 14, παράρτημα) από όπου προέκυψε ότι το μέγεθός της είναι 308αα. Η αμινοξική αλληλουχία συγκρίθηκε με την αντίστοιχη του Strongylocentrotus purpuratus, με την οποία έδειξε ομολογία 93% (σχήμα 15, παράρτημα). Εικ Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 0.8% των προϊόντων PCR στις τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες. Και τα τρία προϊόντα δίνουν μία ζώνη στο επιθυμητό μέγεθος των 2400bp καθώς και άλλες μικρότερες που αποτελούν παραπροϊόντα. M: 1kb 171

188 Αποτελέσματα Μ Μ RT 1 Εικ Αριστερά. Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 0.8% των προϊόντων PCR που πραγματοποιήθηκαν προκειμένου να αναγνωριστεί ο κλώνος με το επιθυμητό προϊόν. Σε κάθε αντίδραση ελέγχθηκαν δέκα κλώνοι. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν με το ζεύγος εκκινητών Jun5 - Jun3 με αναμενόμενο μέγεθος προϊόντων 2400bp. Ζώνη επιθυμητού μεγέθους προέκυψε μόνο από τη δεκάδα η οποία σημαίνεται με το μπλε βέλος. Εικ.3.20 Δεξιά. Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 0.8% των προϊόντων PCR που πραγματοποιήθηκαν προκειμένου να αναγνωριστεί ο κλώνος με το επιθυμητό προϊόν. Στις θέσεις έχουν αναλυθεί τα προϊόντα των PCR αντιδράσεων των δέκα κλώνων της δεκάδας Στις θέσεις 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, ελέγχθηκαν 5 επιπλέον δεκάδες βακτηρίων για τυχόν ανίχνευση του επιθυμητού προϊόντος. Στην τελευταία θέση αναλύθηκε η RT-PCR αντίδραση εικ.3.20 που πραγματοποιήθηκε με το ίδιο ζεύγος βάσεων προκειμένου να χρησιμοποιηθεί ως μάρτυρας. Μ: 1kb 172

189 Αποτελέσματα Η έκφραση του παράγοντα PlJun κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη Προκειμένου να γίνει κατανοητός ο ρόλος του παράγοντα PlJun κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη μελετήθηκε το πρότυπο έκφρασής του (χρονικό και ιστοειδικό) σε έξι αναπτυξιακά στάδια (αυγό, 16 κύτταρα, βλαστίδιο, γαστρίδιο, πρώϊμος πλουτέας 32.h και ώριμος πλουτέας 45h), με qpcr και in situ υβριδοποίηση. qpcr Για την πραγματοποίηση της qpcr χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος εκκινητών: JunF 2 JunR 2 (σχήμα 16, παράρτημα) και το προϊόν που παράγεται έχει μέγεθος 130nt. Όπως φαίνεται από το γράφημα 7 σε όλα τα στάδια ανιχνεύθηκε προϊόν και μάλιστα με σχεδόν σταθερή συγκέντρωση. Πιο συγκεκριμένα, στο στάδιο του αυγού η ποσότητα έχει θεωρηθεί ίση με 1 και όλα τα υπόλοιπα στάδια συγκρίθηκαν ως προς αυτό. Στο στάδιο των 16 κυττάρων παρατηρήθηκε μικρή μείωση της ποσότητας PlJun mrna και μάλιστα αποτελεί το στάδιο με τη χαμηλότερη ανιχνευόμενη ποσότητα (συγκριτικά με όλα τα υπόλοιπα). Στο βλαστιδίο η ποσότητα αυξάνει λίγο για να φτάσει ξανά στο ίδιο, με του αυγού, επίπεδο. Περαιτέρω μικρή αύξηση παρατηρήθηκε στο στάδιο του γαστριδίου και μικρή πτώση στον πρώϊμο πλουτέα, όπου επανέρχεται και πάλι στα επίπεδα του αυγού. Τέλος, στον ώριμο πλουτέα αυξάνει ξανά όπου και αποκτά τα υψηλότερα επίπεδα συγκριτικά με τα άλλα στάδια ανάπτυξης. Γράφημα 7 Αυγό 16 κύτ. Βλαστίδιο Γαστρίδιο Πρώϊµος πλουτέας Ώριµος πλουτέας Γράφημα 7. Απεικόνιση των σχετικών αναλογιών του PlJun mrna στα έξι αναπτυξιακά στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης του αχινού. Το στάδιο του αυγού έχει οριστεί ως ρυθμιστής και η σχετική ποσότητα του PlJun mrna θεωρείται ίση προς 1. Οι σχετικές ποσότητες των υπολοίπων σταδίων συγκρίνονται βάσει αυτής του αυγού. Η εξαγωγή του γραφήματος έγινε με τη χρήση των τιμών NR (Normalized Ratio) 173

190 Αποτελέσματα Ιστοειδική έκφραση του γονιδίου PlJun κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη Η ιστοειδική έκφραση του γονιδίου PlJun κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του αχινού P.lividus μελετήθηκε με in situ υβριδοποίηση (όπως περιγράφεται στο Κεφάλαιο 2). Για τη διεξαγωγή του πειράματος συντέθηκαν δύο RNA ιχνηθέτες σημασμένοι με διγοξιγενίνη, ένας αντινοηματικός (antisense) ο οποίος υβριδοποιείται στο ενδογενές mrna του Jun και είναι υπεύθυνος για τη χρώση των ιστών και ένας νοηματικός (sense) ο οποίος δεν υβριδοποιείται, και αποτελεί το πείραμα ελέγχου. Η σύνθεση των ιχνηθετών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την κατακευή Jun-PGEM- TEasy, η οποία περιέχει όλο το cdna του γονιδίου Jun μεγέθους 2400bp. Η φορά με την οποία κλωνοποιήθηκε το ένθεμα (5 προς 3 με φορά από τον υποκινητή T7 προς τον Sp6) συνεπάγεται την παραγωγή του αντινοηματιού ιχνηθέτη με κατάτμηση της κατασκευής με το ένζυμο ClaI (το οποίο αναγνωρίζει μία θέση εντός του ενθέματος) και in vitro μεταγραφή της γραμμικής πλέον κατασκευής υπό τη δράση της Sp6 πολυμεράσης (Εικ. 3.21). Η παραγωγή του νοηματικού ιχνηθέτη πραγματοποιήθηκε με κατάτμηση της κατασκευής με το έζυμο SpeI (το οποίο αναγνωρίζει επίσης μία θέση στο ένθεμα) και μεταγραφή του, ως γραμμικό πλέον, υπό τη δράση της Τ7 πολυμεράσης. Οι RNA ιχνηθέτες αναλύθηκαν κατόπιν σε πήκτωμα αγαρόζης παρουσία φορμαλδεΰδης. 6.0kb 3.0 M 1 Εικόνα Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης του προϊόντος κατάτμησης με το ένζυμο περιορισμού ClaI που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή του αντινοηματικού ιχνηθέτη. Μ: 1kb Η μελέτη του προτύπου έκφρασης του Jun στα αναπτυξιακά στάδια που μελετήθηκαν (εικόνα 3.22) ανέδειξε ότι ο Jun εκφράζεται διάχυτα στο στάδιο του αυγού γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία μητρικού mrna. Παρόμοιο πρότυπο έκφρασης, δηλαδή σε όλα τα κύτταρα χωρίς συγκεκριμένο ιστοειδικό πρότυπο, ανιχνεύθηκε και στο στάδιο των 16 κυττάρων. 174

191 Αποτελέσματα Ωστόσο, από το στάδιο του βλαστιδίου και μετά παρατηρήθηκε ιστοειδικότητα στην έκφρασή του. Πιο συγκεκριμένα, στο στάδιο του βλαστιδίου, εκφράζεται μόνο στη φυτική πλάκα και συγκεκριμένα στα πρώϊμα μεσεγχυματικά κύτταρα στη θέση που θα σχηματιστεί ο βλαστοπόρος. Στο γαστρίδιο η έκφρασή του διατηρείται στα σκελετογόνα μεσεγχυματικά κύτταρα τα οποία περιβάλλουν τη βάση του αρχεντέρου και σχηματίζουν συγκύτιο. Από τα κύτταρα αυτά θα σχηματιστούν οι μελλοντικές σκελετικές δομές του εμβρύου. Στο επόμενο αναπτυξιακό στάδιο, του πρώϊμου πλουτέα (32h), ο Jun εκφράζεται αποκλειστικά στα σκελετικά στοιχεία των βραχιόνων και του αντιστοματικού εξωδέρματος. Ομοίως στον ώριμο πλουτέα (45h) εκφράζεται στα σκελετικά στοιχεία των βραχιόνων του εμβρύου. Εικ Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του παράγοντα PlJun σε έξι αναπτυξιακά στάδια του αχινού. Λεπτομέρειες για τους ιστούς έκφρασης περιγράφονται στο κείμενο. Πρ. μεσ.: Πρώϊμα μεσεγχυματικά κύτταρα, Σκ. Μεσ.: Σκελετογόνα Μεσεγχυματικά, Σκελ.: Σκελετός εμβρύου 175

192 Αποτελέσματα 3.12 Ο παράγοντας PlFra RACE για τον παράγοντα PlFra2 Προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα PlFra2 απαιτείται η κλωνοποίησή του και η γνώση της αλληλουχίας του. Από τη βιβλιογραφία είναι γνωστό ότι ο παράγοντας AP1 απαρτίζεται από τους μεταγραφικούς παράγοντες Jun και Fos. Αρχικά αναζητήθηκε στη βάση δεδομένων NCBI η αλληλουχία του παράγοντα Fos στον αχινό S.purpuratus αλλά δεν υπήρχε καταχωρημένη καμία αλληλουχία για τον παράγοντα αυτόν στον αχινό. Βρέθηκε ωστόσο ομολογία ανάμεσα στην ανθώπινη πρωτεΐνη Fos και τη Fra2 (Fos Related Antigen) του αχινού S.purpuratus. H Fra2 ανήκει στην οικογένεια των Fos πρωτεϊνών και ετεροδίμερίζεται και αυτή με την πρωτεΐνη Jun σχηματίζοντας τον παράγοντα AP1. Χρησιμοποιώντας την αλληλουχία του cdna του παράγοντα Fra2 από τον αχινό S.purpuratus και τη μηχανή αναζήτησης BLAST, βρέθηκε η αλληλουχία του cdna του γονιδίου Fra2 στον αχινό P.lividus (σχήμα 17Α, παράρτημα). H σύγκριση των δύο αλληλουχιών έδειξε ότι στη βάση δεδομένων του αχινού P.lividus βρίσκεται ένα τμήμα μόνο του ολικού PlFra-2 cdna, το οποίο εκτείνεται από την 5 UTR και περιλαμβάνει μόνο τα 2/3 της κωδικής αλληλουχίας (που αντιστοιχούν σε πρωτεΐνη 253αα, σχήμα 17 παραρτήματος) συγκριτικά με τον SpFra-2 (σχήμα 18 παραρτήματος). Η εύρεση του 3 τμήματος της κωδικής περιοχής και η 3 UTR βρέθηκε με τη μέθοδο της 3 RACE PCR. Τα πρώτα στάδια της αντίδρασης μέχρι την παρασκευή του ολικού cdna είχαν ήδη πραγματοποιηθεί με παλαιότερα πειράματα. Επομένως για την απομόνωση του cdna του PlFra2 πραγματοποιήθηκαν μόνο τα τελικά στάδια των nested PCR. Πραγματοποιήθηκαν 2 αντιδράσεις χρησιμοποιώντας δύο εκκινητές ειδικούς για το Fra2 και δύο ειδικούς για το πρόσδεμα (adapter) στο 3 άκρο του cdna υποστρώματος. Στην εικόνα 3.23 απεικονίζονται σχηματικά οι θέσεις των εκκινητών στην αλληλουχία στόχο, ενώ η ακριβής θέση υβριδοποίησής τους φαίνεται στο σχήμα 17 του παραρτήματος. Οι εκκινητές που υβριδοποιούνται στο γονίδιο Fra2 σχεδιάστηκαν με τη 176

193 Αποτελέσματα βοήθεια του προγράμματος Primer 3 έχοντας ως βάση την αλληλουχία του PlFra2 από τη βάση δεδομένων. Τα ζεύγη των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής: 1 η PCR : Fra outer-3 RACE outer 2 η PCR : Fra inner-3 RACE inner + 1 Fra outer Fra inner 3 RACE inner 3 RACE outer 5 UTR ATG PlFra-2 Ν/ΤΤΤΤΤ-adapter Εικ Σχηματική απεικόνιση των θέσεων των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την εύρεση του 3 άκρου του cdna PlFra2. Πραγματοποιήθηκαν δύο αντιδράσεις, μία που παράγει μεγαλύτερο προϊόν χρησιμοποιώντας τους εκκινητές Fra outer-3 RACE outer και μία χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το προϊόν της πρώτης αντίδρασης με εκκινητές τους Fra inner 3 RACE inner. Mε πράσινο κουτί απεικονίζεται η 5 UTR περιοχή του PlFra2. Με γκρι κουτί απεικονίζεται η κωδική περιοχή του PlFra2 και με μωβ κουτί το πρόσδεμα που έχει προστεθεί στο 3 άκρο των cdnas. Οι εκκινητές παρίστανται με βέλη και οι θέσις τους αναγράφονται κάτω από κάθε εκκινητή. Οι θέσεις έχουν καταμετρηθεί από το +1 του γονιδίου όπως προκύπτει από τη βάση δεδομένων για το PlFra2. Από τη δεύτερη PCR αντίδραση παρήχθη ένα προϊόν μεγέθους 800bp (εικ. 3.24, πράσινο βέλος). Το προϊόν κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pgem-teasy και ελέγχθηκε η παρουσία του ενθέματος σε 35 κλώνους (7 πεντάδες) με PCR χρησιμοποιώντας το ζεύγος των εκκινητών Fra inner- 3 RACE inner. Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.25 Α και οι 7 πεντάδες περιέχουν κλώνους που φέρουν το σωστό ένθεμα. Επιλέχτηκε η πρώτη πεντάδα προκειμένου να αναγνωριστεί ποιός από τους εφτά κλώνους φέρει το ένθεμα με τη βοήθεια κατάτμησης ελέγχου με το ένζυμο περιορισμού EcoRI το οποίο αναγνωρίζει δύο θέσεις στον πολυσυνδέτη του πλασμιδιακού φορέα (εκατέρωθεν του ενθέματος). Αναμένεται επομένως να παραχθούν τουλάχιστον Εικ Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 1.2% των προϊόντων των PCR αντιδράσεων. Η ζώνη που σημαίνεται με πράσινο βέλος έχει μέγεθος 800bp. Η πρώτη PCR αντίδραση επίσης παράγει προϊόν λίγο μεγαλύτερο από αυτό της δεύτερης όπως αναμένεται. Μ: 1kb δύο προϊόντα μετά την κατάτμηση της κατασκευής, ένα μεγέθους 3000bp που αντιστοιχεί 177

194 Αποτελέσματα στο φορέα και ένα μεγέθους 800bp που αντιστοιχεί στο ένθεμα (σε περίπτωση που εντός του ενθέματος δεν υπάρχει θέση αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού EcoRI). A) B) M M kb 0.5kb Εικ Α) Aνάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% των αντιδράσεων PCR που πραγματοποιήθηκαν σε 7 πεντάδες κλώνων (1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35) προκειμένου να ελεγχθεί ποιά από τις πεντάδες που επιλέγχθηκαν περιέχει τον επιθυμητό κλώνο. Η παραγωγή προϊόντος μεγέθους 800bp χρησιμοποιώντας τους εκκινητές Fra inner 3 RACE inner, αντιστοιχεί στο ένθεμα. Σε όλες τις πεντάδες των κλώνων παράγεται το αναμενόμενο προϊόν. M:1kb Β) Κατατμήσεις με EcoRI των κλώνων της πρώτης πεντάδας (πήκτωμα Α) προκειμένου να εντοπιστεί ο κλώνος με το ένθεμα. Η EcoRI αναγνωρίζει δύο θέσεις στον πολυσυνδέτη του πλασμιδιακού φορέα εκατέρωθεν του ενθέματος. Εντός του ενθέματος δεν είναι γνωστό αν υπάρχει αντίστοιχη θέση περιορισμού. Όπως φαίνεται και οι πέντε κλώνοι παράγουν τα ίδια προϊόντα δηλαδή μία ζώνη μεγέθους 3000bp που αντιστοιχεί στον πλασμιδιακό φορέα, και δύο μικρότερες με άθροισμα κατά προσέγγιση 800bp που αντιστοιχούν στο ένθεμα. Συμπεραίνεται επομένως ότι το ένθεμα έχει μία θέση περιορισμού για την EcoRI. M:1kb Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.25 Β και από τους 5 κλώνους παρήχθησαν τρία προϊόντα, ένα μεγέθους 3000bp που αντιστοιχεί στο πλασμίδιο, και δύο μικρότερου μεγέθους, που αντιστοιχούν στο ένθεμα και υποδεικνύουν την ύπαρξη θέσης αναγνώρισης της EcoRI εντός αυτού. Από τους κλώνους επιλέγχθηκαν για αλληλούχηση οι 1 και 4. Το αποτέλεσμα της αλληλούχησης (σχήμα 19, παράρτημα) έδειξε την αλληλουχία της υπόλοιπης κωδικής περιοχής του PlFra2, μέχρι το κωδικόνιο τερματισμού (TAA), καθώς επίσης και την 3 UTR με εμφανές το σήμα για την πολυαδενυλίωση στο 3 άκρο. Βρέθηκε επίσης και η θέση αναγνώρισης του ενζύμου περιορισμού EcoRI μετά το κωδικόνιο τερματισμού (υποδεικνύεται με πράσινο βέλος στο σχήμα 19 του παραρτήματος), επιβεβαιώνοντας την πιο πάνω υπόθεση. 178

195 Αποτελέσματα Απομόνωση του cdna PlFra2 Συνδέοντας in silico τα τμήματα των αλληλουχιών (του 5 από τη βάση δεδομένων και του 3 άκρου από την αλληλούχηση του 3 RACE προϊόντος) ολοκληρώθηκε η αλληλουχία της κωδικής περιοχής του PlFra-2 (σχήμα 20, παράρτημα). Στο σχήμα αυτό παρατίθεται η αλληλουχία της ολοκληρωμένης αλληλουχίας. Η αναζήτηση της αμινοξικής της αλληλουχίας υπέδειξε ότι κωδικοποιείται μία πρωτεΐνη 324αα (σχήμα 23, παράρτημα) με 95% ομολογία ως προς την SpFra-2 (σχήμα 24, παράρτημα). Απομονώθηκε το cdna του γονιδίου PlFra2 με RT-PCR χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα ολικό mrna και το ζεύγος των εκκινητών: FraFor - FraRev. Ο ανοδικός εκκινητής σχεδιάστηκε με βάση την αλληλουχία του PlFra2 από τη βάση δεδομένων ενώ ο καθοδικός με βάση την αλληλουχία του 3 RACE προϊόντος. Στην εικόνα 3.26 παρίστανται σχηματικά οι θέσεις των εκκινητών και το αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος και στο σχήμα 23 του παραρτήματος υποδεικνύονται οι ακριβείς θέσεις υβριδοποίησης στην αλληλουχία στόχο και ο χάρτης περιορισμού της. Τ7 Fra2 F UTR ATG 260 PlFra2 (324αα) TAA 1317 Fra2 R UTR Sp6 1272nt Εικ Σχηματική παράσταση των θέσεων υβριδοποίησης των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση της κωδικής περιοχής του PlFra2. Οι εκκινητές απεικονίζονται με ροζ βέλη στη βάση των οποίων αναγράφεται η θέση που ξεκινά η υβριδιποίηση. Με πράσινο κουτί απεικονίζεται η 5 UTR περιοχή του γονιδίου, με γκρι κουτί η κωδική περιοχή του και με μωβ η 3 UTR. Στο σχήμα υποδεικνύονται και οι θέσεις των κωδικονίων έναρξης και λήξης της μετάφρασης. T7: Υποκινητής της πολυμεράσης Τ7, Sp6: Υποκινητής της πολυμεράσης Sp6. 179

196 Αποτελέσματα Πραγματοποιήθηκαν τρεις αντιδράσεις χρησιμοποιώντας κλίσεις θερμοκρασιών (55 0 C, 58 0 C και 60 0 C) με στόχο την επίτευξη της πιο αποδοτικής υβριδοποίησης των εκκινητών. Στο τέλος της αντίδρασης πολυμερισμού αναμένεται ένα προϊόν μεγέθους 1272bp. Στην εικόνα 3.27 φαίνεται η ανάλυση των προϊόντων των RT-PCR αντιδράσεων, σε πήκτωμα αγαρόζης. Και οι τρεις αντιδράσεις παράγουν προϊόντα με το αναμενόμενο μέγεθος (καθώς και κάποια παραπροϊόντα). Επιλέγχθηκε ωστόσο το προϊόν της δεύτερης αντίδρασης (58 ο C) για τα επόμενα πειράματα καθώς είχε τη μεγαλύτερη συγκέντρωση DΝΑ και σχετικά λίγα παραπροϊόντα. Το προϊόν κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pgem-teasy και ελέγχθηκε η παρουσία του ενθέματος σε έξι κλώνους πέπτοντας το DNA με το ένζυμο περιορισμού EcoRI. Μετά την αντίδραση αναμένονται 3 προϊόντα, ένα μεγέθους 3000bp που αντιστοιχεί στο φορέα και δύο μικρότερα που αντιστοιχούν στο ένθεμα καθώς υπάρχει μία θέση αναγνώρισης για την EcoRI εντός του ενθέματος (σχήμα 23, παράρτημα). Εικ Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 0.8% των RT-PCR προϊόντων που παρήχθησαν από τις τρεις αντιδράσεις με εκκινητές το ζεύγος FraF FraR στις τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες που αναγράφονται. Και οι τρεις αντιδράσεις παράγουν το αναμενόμενο προϊόν μεγέθους 1272bp που σημαίνεται με το πορτοκαλί βέλος. Μ: 1kb Εικ Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% των προϊόντων κατάτμησης με EcoRI των κατασκευασμάτων που απομονώθηκαν από έξι βακτηριακούς κλώνους. Οι κλώνοι 1, 2, 3 και 5 φαίνεται να έχουν την επιθυμητή κατασκευή καθώς μετά την κατάτμηση τους παράγουν τρεις ζώνες όπως αναμένεται, μία μεγάλη μεγέθους 3000bp που αντιστοιχεί στο φορέα και δύο μικρότερες μία 1200bp που υποδεικνύεται με πορτοκαλί βέλος και μία περίπου 100bp (μαύρο βέλος, ελάχιστα διακριτή) και αντιστοιχούν στο ένθεμα. 180

197 Αποτελέσματα Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.28 οι κλώνοι 1, 2, 3 και 5 φέρουν το επιθυμητό ένθεμα καθώς σε αυτούς διακρίνονται τρεις ζώνες (η πιο μικρή δεν διακρίνεται καθαρά στο πήκτωμα). Οι κλώνοι 1, 2 και 5 αλληλουχήθηκαν. Από αυτούς επιλέγχθηκε ο κλώνος 1 για τα πειράματα που ακολούθησαν. Το αποτέλεσμα της αλληλούχησης και οι θέσεις περιορισμού εντός της αλληλουχίας παρατίθενται στο σχήμα 23 του παραρτήματος Έκφραση του PlFra2 κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη Προκειμένου να γίνει κατανοητός ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα Fra2 μελετήθηκε η έκφρασή του κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του αχινού P.lividus. Επιλέγχθηκαν έξι αναπτυξιακά στάδια, αυτά του αυγού, των 16 κυττάρων, του βλαστιδίου, του γαστριδίου, του πρώϊμου πλουτέα (32h) και του ώριμου πλουτέα (45h) στα οποία παρατηρήθηκε η χρονική και ιστοειδική έκφραση του Fra2 με qpcr και in situ υβριδοποίηση αντίστοιχα. qpcr Για την πραγματοποίηση της qpcr χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος εκκινητών: FraF 2 FraR 2 (σχήμα 24, παράρτημα) και αναμένεται προϊόν μεγέθους 130nt. Όπως φαίνεται από το γράφημα 8, για τη σχετική ποσοτικοποίηση, η ποσότητα του ανιχνευόμενου mrna στο στάδιο του αυγού θεωρείται ίση προς 1 και όλα τα υπόλοιπα στάδια συγκρίνονται ως προς αυτό. Γράφημα 8 Αυγό 16 κύτ. Βλαστίδιο Γαστρίδιο Πρώϊµος Ώριµος πλουτέας πλουτέας Γράφημα 8. Απεικόνιση των σχετικών ποσοτήτων του PlFra2 mrna στα έξι αναπτυξιακά στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης του αχινού. Το στάδιο του αυγού έχει οριστεί ως ρυθμιστής και η σχετική ποσότητα του PlFra2 mrna θεωρείται ίση προς 1. Οι σχετικές ποσότητες των υπολοίπων σταδίων συγκρίνονται βάσει αυτής του αυγού. Η εξαγωγή του γραφήματος έγινε με τη χρήση των τιμών NR (Normalized Ratio). 181

198 Αποτελέσματα Στο στάδιο των 16 κυττάρων δεν παρατηρείται καμία μεταβολή ως προς τη συγκέντρωση του ενδογενούς mrna. Σε αυτά τα δύο στάδια μάλιστα, εντοπίζεται η πιο μικρή ανιχνευόμενη ποσότητα. Από το στάδιο του βλαστιδίου, η συγκέντρωση αυξάνει δραματικά και φτάνει να είναι 25 φορές πιο αυξημένη σε σχέση με αυτή των δύο προηγούμενων σταδίων. Από το στάδιο του γαστριδίου προς αυτό του πρώϊμου και του ώριμου πλουτέα το ανιχνευόμενο mrna μειώνεται σταδιακά αλλά και πάλι διατηρεί πολύ πιο υψηλά, σε σχέση με το αυγό και τα 16 κύτταρα, επίπεδα. Ιστοειδική έκφραση του PlFra2 κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη Η ιστοειδική έκφραση του Fra2 κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του αχινού P.lividus μελετήθηκε με in situ υβριδοποίηση (όπως περιγράφεται στο Κεφάλαιο 2). Για τη διεξαγωγή του πειράματος συντέθηκαν δύο RNA ιχνηθέτες σημασμένοι με διγοξιγενίνη, ένας αντινοηματικός (antisense) και ένας νοηματικός (sense) που αποτελεί το πείραμα ελέγχου. Η σύνθεση των ιχνηθετών έγινε χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την κατασκευή Fra2-PGEM-TEasy, η οποία περιέχει όλo το cdna του γονιδίου PlFra2. Η φορά με την οποία κλωνοποιήθηκε το ένθεμα (5 προς 3 με φορά από τον T7 προς τον Sp6 υποκινητή) συνεπάγεται την παραγωγή του αντινοηματικού ιχνηθέτη με κατάτμηση της κατασκευής με το ένζυμο NcoI (εικόνα 3.29) που αναγνωρίζει μία θέση στον πολυσυνδέτη του φορέα ανοδικά του ενθέματος και in vitro μεταγραφή της γραμμικής πλέον κατασκευής υπό τη δράση της Sp6 πολυμεράσης. Η παραγωγή του νοηματικού ιχνηθέτη πραγματοποιήθηκε με κατάτμηση της κατασκευής με το έζυμο SalI που αναγνωρίζει μία θέση στον πολυσυνδέτη του φορέα καθοδικά του ενθέματος και μεταγραφή του, ως γραμμικό πλέον, υπό τη δράση της Τ7 πολυμεράσης. Οι δύο RNA ιχνηθέτες αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης παρουσία φορμαλδεϋδης. M 1 Εικόνα Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης του προϊόντος κατάτμησης με το ένζυμο περιορισμού NcoI που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή του αντινοηματικού ιχνηθέτη. M:1Kb. Προϊόν κατάτμησης: ~ 5kb 182

199 Αποτελέσματα Η μελέτη του προτύπου έκφρασης του PlFra2 στα αναπτυξιακά στάδια που μελετήθηκαν (εικ. 3.30) έδειξε ότι ο παράγοντας αυτός εκφράζεται διάχυτα στο στάδιο του αυγού γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία μητρικού mrna, αν και η ποσότητά του μόλις που ανιχνεύεται. Παρόμοιο πρότυπο έκφρασης, δηλαδή σε όλα τα κύτταρα χωρίς συγκεκριμένο ιστοειδικό πρότυπο και σε μόλις διακριτές ποσότητες, ανιχνεύεται και στο στάδιο των 16 κυττάρων. Ωστόσο, από το στάδιο του βλαστιδίου και μετά παρατηρήθηκε περιορισμός ως προς τους ιστούς στους οποίους εκφράζεται ο PlFra2 καθώς και αύξηση της ανιχνευόμενης ποσότητας mrna. Πιο συγκεκριμένα, στο στάδιο του βλαστιδίου εκφράζεται μόνο στη φυτική πλάκα και συγκεκριμένα στα πρώϊμα μεσεγχυματικά κύτταρα στη θέση που θα σχηματιστεί ο βλαστοπόρος. Στο γαστρίδιο η έκφρασή του διατηρείται στα σκελετογόνα μεσεγχυματικά κύτταρα τα οποία περιβάλλουν τη βάση του αρχεντέρου και σχηματίζουν συγκύτιο. Από τα κύτταρα αυτά θα σχηματιστούν οι μελλοντικές σκελετικές δομές του εμβρύου. Στο επόμενο αναπτυξιακό στάδιο, του πρώϊμου πλουτέα ο PlFra2 εκφράζεται στο σκελετό του εμβρύου. Παρόμοιο πρότυπο έκφρασης παρουσιάζει και στο στάδιο του ώριμου πλουτέα. H ποσοτική διαβάθμιση της ανιχνεύσιμης ποσότητας του Εικ Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του παράγοντα PlFra2 σε έξι αναπτυξιακά στάδια του αχινού. Λεπτομέρειες για τους ιστούς έκφρασης περιγράφονται στο κείμενο. Πρ. Μεσ.: Πρώϊμα Μεσεγχυματικά, Σκ. Μεσ.: Σκελετογόνα Μεσεγχυματικά, Σκελ.: Σκελετός mrna στα διάφορα στάδια ανάπτυξης συμβαδίζει μεταξύ των πειραμάτων qpcr και in 183

200 Αποτελέσματα situ υβριδοποίησης δηλαδή στα δύο πρώτα στάδια ανιχνεύεται πολύ μικρή ποσότητα ενώ στα επόμενα αυξάνει σε σημαντικό βαθμό Ο παράγοντας PlElk Απομόνωση του cdna του παράγοντα PlElk Προκειμένου να μελετηθεί ο παράγοντας Elk στον αχινό P.lividus θεωρήθηκε απαραίτητη η κλωνοποίηση και γνώση της αλληλουχίας του. Προς το σκοπό αυτό αναζητητήθηκε η αλληλουχία του ομoλόγου γονιδίου του στο συγγενικό είδος Strongylocentrotus purpuratus του οποίου το γονιδίωμα έχει πλήρως αλληλουχηθεί (Alternate assembly based on NCBI's super-scaffold of Spur_v2.1 available on Oct 18, 2006)2006). Χρησιμοποιώντας την αλληλουχία αυτή και τη μηχανή αναζήτησης BLAST, βρέθηκε η αλληλουχία του Elk cdna του αχινού P.lividus (σχήμα 25, παράρτημα). Το cdna του γονιδίου PlElk απομονώθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα ολικό mrna και το ζεύγος των εκκινητών: 5 PlElk - 3 PlElk που σχεδιάστηκαν σύμφωνα με την αλληλουχία του PlElk της βάσης δεδομένων. Στην εικόνα 3.31 παρίστανται σχηματικά οι θέσεις των εκκινητών και το αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος. Οι ακριβείς θέσεις υβριδοποίησης στην αλληλουχία του PlElk της βάσης δεδομένων παρατίθενται στο σχήμα 26 του παραρτήματος. Sp UTR PlElk (466αα) 3 UTR 5 PlElk ATG TAA 3 PlElk nt T7 Εικ Σχηματική παράσταση των θέσεων υβριδοποίησης των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση της κωδικής περιοχής του PlElk. Οι εκκινητές απεικονίζονται με καφέ βέλη και στη βάση τους αναγράφονται οι θέσεις υβριδιποίησής τους. Με πράσινο κουτί απεικονίζεται η 5 UTR περιοχή του γονιδίου, με κίτρινο κουτί η κωδική περιοχή του και με μπλε η 3 UTR. Στο σχήμα υποδεικνύονται και οι θέσεις των κωδικονίων έναρξης και λήξης της μετάφρασης. T7: Υποκινητής της πολυμεράσης Τ7, Sp6: Υποκινητής της πολυμεράσης Sp6. 184

201 Αποτελέσματα Πραγματοποιήθηκαν τρεις αντιδράσεις RT- PCR χρησιμοποιώντας κλίσεις θερμοκρασιών (55 0 C, 58 0 C και 60 0 C) με στόχο την επίτευξη της πιο αποδοτικής υβριδοποίησης των εκκινητών. Στο τέλος της αντίδρασης πολυμερισμού αναμένεται ένα προϊόν μεγέθους 1708bp. Στην εικόνα 3.32 φαίνεται η ανάλυση των προϊόντων των RT-PCR αντιδράσεων σε πήκτωμα αγαρόζης. Και τα τρία προϊόντα έχουν το αναμενόμενο μέγεθος και δεν έχουν παραγχθεί παραπροϊόντα. Επιλέγχθηκε το προϊόν της δεύτερης αντίδρασης (58 ο C) για τα επόμενα πειράματα. Το προϊόν κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pgem-teasy και ελέγχθηκε η παρουσία του 2.0kb 1.5kb ενθέματος σε δώδεκα κλώνους με κατάτμηση ελέγχου Εικ Ανάλυση σε πήκτωμα χρησιμοποιώντας το ένζυμο περιορισμού EcoRI. Το αγαρόζης 1% των τριών RT-PCR αντιδράσεων που ένζυμο αυτό αναγνωρίζει δύο θέσεις στον πραγματοποιήθηκαν για την πολυσυνδέτη του φορέα, εκατέρωθεν του ενθέματος, και μία εντός του ενθέματος, όπως προκύπτει από την απομόνωση του PlElk cdna. Χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες για την επίτευξη της πιο αποδοτικής υβριδοποίησης των εκκινητών. Μ: αλληλουχία του PlElk της βάσης δεδομένων. 1kb Επομένως, μετά την αντίδραση αναμένονται 3 προϊόντα, ένα μεγέθους 3000bp που αντιστοιχεί στο φορέα και δύο μικρότερα, που αντιστοιχούν στο ένθεμα. Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.33, ο κλώνος 1 έφερε το επιθυμητό ένθεμα καθώς σε αυτόν διακρίνονται τρεις ζώνες μόνο. Μ kb 1.5kb 1.0kb 0.5kb Εικ Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% 12 βακτηριακών κλώνων μετά από κατάτμηση των απομονωμένων DNA τους με το ένζυμο περιορισμού EcoRI. Πρόκειται για κατάτμηση ελέγχου με σκοπό τον εντοπισμό του κλώνου που περιέχει την επιθυμητή κατασκευή. Όπως φαίνεται ο κλώνος 1 είναι σωστός. Μ: 1kb 185

202 Αποτελέσματα Ο κλώνος 1 στάλθηκε για αλληλούχηση. Στο σχήμα 27 του παραρτήματος παρατίθεται το αποτέλεσμα της αλληλούχησης καθώς και οι θέσεις περιορισμού εντός αυτής. Όπως προκύπτει εντοπίζεται μία θέση EcoRI εντός της αλληλουχίας του PlElk. Από την αλληλουχία αυτή προκύπτει ότι το PlElk cdna κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 466αα (σχήμα 28, παράρτημα) η οποία παρουσιάζει 91% ομολογία με την αντίστοιχη του S.purpuratus (σχήμα 29, παράρτημα) Έκφραση του PlElk κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη Προκειμένου να γίνει κατανοητός ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα PlELK μελετήθηκε η έκφρασή του κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του αχινού P.lividus. Επιλέγχθηκαν έξι αναπτυξιακά στάδια, αυτά του αυγού, των 16 κυττάρων, του βλαστιδίου, του γαστριδίου, του πρώϊμου πλουτέα (32h) και του ώριμου πλουτέα (45h) στα οποία παρατηρήθηκε η χρονική και ιστοειδική έκφραση του PlElk με RT-PCR, qpcr και in situ υβριδοποίηση. RT-PCR Μελετήθηκε η έκφραση του γονιδίου PlElk στα έξι αναπτυξιακά στάδια του εμβρύου του αχινού που προαναφέρθηκαν, με RT-PCR. Για τις αντιδράσεις χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές 5 PlElk και 3 PlElk (εικ. 3.34). Όπως φαίνεται στην εικόνα σε όλα τα στάδια παρατηρήθηκε έκφραση του γονιδίου σε σημαντικές ποσότητες. 2.0kb 1.5kb Εικ Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% των RT- PCR αντιδράσεων με στόχο τη μελέτη της έκφρασης του ενδογενούς PlElk στα αναπτυξιακά στάδια 1) αυγού, 2) 16 κυττάρων, 3) βλαστιδίου, 4) γαστριδίου, 5) πρώϊμου πλουτέα 6) ώριμου πλουτέα. Μ: 1kb 186

203 Αποτελέσματα qpcr Για την πραγματοποίηση της qpcr χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος εκκινητών: ElkF1 ElkR1 (σχήμα 30, παράρτημα) με αναμενόμενο προϊόν μεγέθους 130nt. Όπως φαίνεται από το γράφημα 9 παρατηρήθηκε μία συνεχής αυξομείωση των ανιχνευόμενων ποσοτήτων Elk mrna μεταξύ των διαφόρων αναπτυξιακών σταδίων του αχινού P.lividus. Ωστόσο δεν παρατηρήθηκαν εξαιρετικά μεγάλες αποκλίσεις στις ανιχνευόμενες ποσότητες. Η ποσότητα του PlElk mrna στο στάδιο του αυγού θεωρήθηκε ίση με 1 και όλα τα υπόλοιπα στάδια συγκρίθηκαν ως προς αυτό. Στο στάδιο των 16 κυττάρων παρατηρήθηκε μικρή αύξηση της ποσότητας, ενώ στο στάδιο του βλαστιδίου ακόμη μεγαλύτερη. Μάλιστα στο στάδιο αυτό (βλαστίδιο) παρατηρήθηκε και η υψηλότερη συγκέντρωση του PlElk mrna, σε σύγκριση με όλα τα υπόλοιπα. Στο γαστρίδιο παρατηρήθηκε ελάττωση της ποσότητας και μάλιστα σημειώνονται τα πιο χαμηλά επίπεδα. Στον πρώϊμο πλουτέα παρατηρήθηκε ξανά μικρή αύξηση της συγκέντρωσης και υποχώρηση στον ώριμο πλουτέα. Γράφημα 9 Αυγό 16 κύτ. Βλαστίδιο Γαστρίδιο Πρώϊµος Ώριµος πλουτέας πλουτέας Γράφημα 9. Απεικόνιση των σχετικών ποσοτήτων του PlElk mrna στα έξι αναπτυξιακά στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης του αχινού. Το στάδιο του αυγού έχει οριστεί ως ρυθμιστής και η σχετική ποσότητα του PlΕlk mrna θεωρείται ίση προς 1. Οι σχετικές ποσότητες των υπολοίπων σταδίων συγκρίνονται βάσει αυτής του αυγού. Η εξαγωγή του γραφήματος έγινε με τη χρήση των τιμών NR (Normalized Ratio). 187

204 Αποτελέσματα Ιστοειδική έκφραση του PlElk κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη Η ιστοειδική έκφραση του Elk κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του αχινού P.lividus μελετήθηκε με in situ υβριδοποίηση (όπως περιγράφεται στο Κεφάλαιο 2). Για τη διεξαγωγή του πειράματος συντέθηκαν δύο RNA ιχνηθέτες σημασμένοι με διγοξιγενίνη, ένας αντινοηματικός (antisense) και ένας νοηματικός (sense) που αποτελεί το πείραμα ελέγχου. Η σύνθεση των ιχνηθετών έγινε χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την κατασκευή Elk-PGEM-TEasy, η οποία περιέχει όλo το cdna του γονιδίου PlElk. Η φορά με την οποία κλωνοποιήθηκε το ένθεμα (5 προς 3 με φορά από τον Sp6 υποκινητή προς τον Τ7) συνεπάγεται την παραγωγή του αντινοηματικού ιχνηθέτη με κατάτμηση της κατασκευής με το ένζυμο NdeI που αναγνωρίζει μία θέση στον πολυσυνδέτη του φορέα καθοδικά του ενθέματος και μεταγραφή της γραμμικής πλέον κατασκευής υπό τη δράση της T7 πολυμεράσης. Η παραγωγή του νοηματικού ιχνηθέτη πραγματοποιήθηκε με κατάτμηση της κατασκευής με το έζυμο NcoI που αναγνωρίζει μία θέση στον πολυσυνδέτη του φορέα ανοδικά του ενθέματος και μεταγραφή του, ως γραμμικό πλέον, υπό τη δράση της Sp6 πολυμεράσης. Στην εικόνα 3.35 φαίνεται Α) η κατάτμηση της κατασκευής με τα ένζυμα NdeI και NcoI και Β) η παραγωγή των δύο RNA ιχνηθετών μετά από ανάλυση των προϊόντων μεταγραφής σε πήκτωμα αγαρόζης παρουσία φορμαλδεϋδης. A) B) 5.0kb 3.0 Εικ Α) Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 0.8% των προϊόντων κατάτμησης του κλώνου PlElk-pGEM- TEasy με σκοπό τη γραμμοποίηση του DNA με τα ένζυμα περιορισμού 1) NdeI και 2) NcoI. M:1kb. B) Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης-φορμαλδεΰδης των προϊόντων μεταγραφής των γραμμοποιημένων κατασκευών με τα ένζυμα που προαναφέρθηκαν 1) με την Τ7 πολυμεράση για την παραγωγή αντινοηματικού ιχνηθέτη και 2) με την Sp6 πολυμεράση για την παραγωγή νοηματικού ιχνηθέτη. M: Μάρτυρας ολικό RNA. Σημαίνονται οι 18S και 28S ριβοσωμικές υπομονάδες. 188

205 Αποτελέσματα Η μελέτη του προτύπου έκφρασης του PlElk στα αναπτυξιακά στάδια που μελετήθηκαν (εικόνα 3.36) έδειξε ότι ο παράγοντας PlElk εκφράζεται διάχυτα στο στάδιο του αυγού γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία μητρικού mrna. Παρόμοιο πρότυπο έκφρασης, δηλαδή σε όλα τα κύτταρα χωρίς συγκεκριμένο ιστοειδικό πρότυπο, ανιχνεύεται και στο στάδιο των 16 κυττάρων. Ωστόσο, από το στάδιο του βλαστιδίου κι έπειτα παρατηρήθηκε περιορισμός ως προς τους ιστούς στους οποίους εκφράζεται ο PlElk. Πιο συγκεκριμένα, στο στάδιο του βλαστιδίου εκφράζεται μόνο στη φυτική πλάκα και συγκεκριμένα σε μεγαλύτερη έκταση στη μία πλευρά του εμβρύου. Στο γαστρίδιο η έκφρασή του παρατηρήθηκε στη βάση του αρχεντέρου και σε λίγα κύτταρα του εξωδέρματος. Στο επόμενο αναπτυξιακό στάδιο, του πρώϊμου πλουτέα, ο PlElk εκφράζεται σε τέσσερις ομάδες κυττάρων κάθε μια από τις οποίες βρίσκεται στους δύο βραχίονες του εμβρύου που έχουν σχηματιστεί και στη στοματική καλύπτρα που θα σχηματίσει τους άλλους δύο βραχίονες του πλουτέα. Επίσης ανιχνεύεται έκφραση στη βλεφαριδωτή ζώνη, δηλαδή στην περιοχή που θα σχηματιστούν οι μελλοντικοί νευρόνες του ώριμου πλουτέα. Στο στάδιο του ώριμου πλουτέα ο PlElk διατηρεί την έκφρασή του Εικ Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του παράγοντα PlElk σε έξι αναπτυξιακά στάδια του αχινού. Λεπτομέρειες για τους ιστούς έκφρασης περιγράφονται στο κείμενο. Φυτ. πλ.: Φυτική Πλάκα, Εξώδ.: Eξώδερμα, Βλ. ζώνη: Bλεφαριδωτή ζώνη στους τέσσερις πλέον βραχίονες του εμβρύου καθώς και στη βλεφαριδωτή ζώνη. 189

206 Αποτελέσματα 3.14 Ο παράγοντας PlPea Απομόνωση του cdna του παράγοντα PlPea Μελετήθηκε επίσης το χρονικό και ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του παράγοντα Pea (ο δεύτερος Ets παράγοντας που εκφράζεται στο στοματικό εξώδερμα) στον αχινό P.lividus. Αναζητητήθηκε η αλληλουχία του ομόλογου γονιδίου του στο συγγενικό είδος Strongylocentrotus purpuratus, όπως και για τους άλλους παράγοντες και χρησιμοποιώντας την με τη μηχανή αναζήτησης BLAST, βρέθηκε η αλληλουχία του cdna του γονιδίου Pea στον αχινό P.lividus (σχήμα 31, παράρτημα). Το cdna του γονιδίου PlPea απομονώθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα ολικό mrna και το ζεύγος των εκκινητών: 5 PlPea-3 PlPea που σχεδιάστηκαν σύμφωνα με την αλληλουχία του PlPea της βάσης δεδομένων. Στην εικόνα 3.37 παρουσιάζονται σχηματικά οι θέσεις των εκκινητών και το αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος. Οι ακριβείς θέσεις υβριδοποίησης στην αλληλουχία του PlPea της βάσης δεδομένων παρατίθενται στο σχήμα 32 του παραρτήματος. Sp6 5 UTR ATG PlPea (633αα) TAA 3 UTR T Pea 3 Pea 2378 nt Εικ Σχηματική παράσταση των θέσεων υβριδοποίησης των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση της κωδικής περιοχής του PlPea. Οι εκκινητές απεικονίζονται με μπλε βέλη. Με πράσινο κουτί απεικονίζεται η 5 UTR περιοχή του γονιδίου, με κίτρινο κουτί η κωδική περιοχή του και με ροζ η 3 UTR. Στο σχήμα υποδεικνύονται και οι θέσεις των κωδικονίων έναρξης και λήξης της μετάφρασης. T7: Υποκινητής της πολυμεράσης Τ7, Sp6: Υποκινητής της πολυμεράσης Sp6. Πραγματοποιήθηκαν τρεις αντιδράσεις χρησιμοποιώντας κλίσεις θερμοκρασιών (55 0 C, 58 0 C και 60 0 C) με στόχο την επίτευξη της πιο αποδοτικής υβριδοποίησης των εκκινητών. Στο τέλος της αντίδρασης πολυμερισμού αναμένεται ένα προϊόν μεγέθους 2378bp. Στην εικόνα 3.38 φαίνεται η ανάλυση των προϊόντων των RT-PCR αντιδράσεων σε πήκτωμα αγαρόζης. Και τα τρία προϊόντα έχουν το αναμενόμενο μέγεθος χωρίς να 190

207 Αποτελέσματα έχουν σχηματιστεί παραπροϊόντα. Επιλέγχθηκε ωστόσο το προϊόν της δεύτερης αντίδρασης για τα επόμενα πειράματα καθώς έχει τη μεγαλύτερη συγκέντρωση DΝΑ. Το προϊόν κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pgem-teasy και ελέγχθηκε η παρουσία του ενθέματος σε δώδεκα κλώνους με κατάτμηση ελέγχου, χρησιμοποιώντας το ένζυμο περιορισμού EcoRI. Το ένζυμο αυτό αναγνωρίζει δύο θέσεις στον πολυσυνδέτη του φορέα εκατέρωθεν του ενθέματος και μία εντός του ενθέματος όπως προκύπτει από την αλληλουχία του PlPea της βάσης δεδομένων. Επομένως, μετά την αντίδραση αναμένονται 3 προϊόντα, ένα μεγέθους 3000bp που αντιστοιχεί στο φορέα και δύο μικρότερα, που αντιστοιχούν στο ένθεμα. Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.39 οι κλώνοι 1, 3, 6 και 10 φέρουν το επιθυμητό ένθεμα καθώς σε αυτούς διακρίνονται οι τρεις αναμενόμενες ζώνες. Ο κλώνος 1 επιλέχθηκε και στάλθηκε για αλληλούχηση. Στο σχήμα 33 του παραρτήματος παρατίθεται το αποτέλεσμα της αλληλούχησης καθώς και οι θέσεις περιορισμού εντός αυτής. Όπως προκύπτει, εντοπίζεται μία μόνο θέση EcoRI εντός της αλληλουχίας του PlPea. Από την αλληλουχία αυτή προκύπτει ότι το PlPea cdna κωδικοποεί μια πρωτεΐνη 507αα (σχήμα 34, παράρτημα) η οποία παρουσιάζει 88% ομολογία με την αντίστοιχη του S.purpuratus (σχήμα 35, παράρτημα). 3.0kb 2.0kb Μ Εικ Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% των 3 RT-PCR αντιδράσεων που πραγματοποιήθηκαν για την απομόνωση του PlPea cdna. Χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες για την επίτευξη της πιο αποδοτικής υβριδοποίησης των εκκινητών. Μ: 1kb 3.0kb Εικ Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% 12 βακτηριακών κλώνων μετά από κατάτμηση των απομονωμένων DNA τους με το ένζυμο περιορισμού EcoRI. Πρόκειται για κατάτμηση ελέγχου με σκοπό τον εντοπισμό του κλώνου που περιέχει το επιθυμητό ένθεμα. Επιλέχθηκε ο κλώνος 1. Μ: 1kb 191

208 Αποτελέσματα Έκφραση του γονιδίου PlPea κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη Η έκφρασή του γονιδίου PlPea κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του αχινού P.lividus μελετήθηκε με RT-PCR, qpcr και in situ υβριδοποίηση. Επιλέγχθηκαν έξι αναπτυξιακά στάδια, αυτά του αυγού, των 16 κυττάρων, του βλαστιδίου, του γαστριδίου, του πρώϊμου πλουτέα (32h) και του ώριμου πλουτέα (45h). RT-PCR Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.40 ανιχνεύεται μητρικό PlPea mrna, το οποίο σύντομα αποικοδομήται. Το mrna είναι εμφανώς μειωμένο στο στάδιο των 16- κυττάρων, ενώ στο στάδιο του βλαστιδίου είναι σχεδόν μη ανιχνεύσιμο. Τα ζυγωτικά μετάγραφα συσωρεύονται από το στάδιο του γαστριδίου και μετέπειτα. 3.0kb Μ Εικ Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% των RT-PCR αντιδράσεων με στόχο τη μελέτη του προτύπου έκφρασης του γονιδίου PlPea στα αναπτυξιακά στάδια 1) αυγού, 2) 16 κυττάρων, 3) βλαστιδίου, 4) γαστριδίου, 5) πρώϊμου πλουτέα 6) ώριμου πλουτέα. Μ: 1kb qpcr Για την πραγματοποίηση της qpcr χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος εκκινητών: PeaF1 PeaR1 (σχήμα 36, παράρτημα). Το αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος είναι 130nt. Όπως φαίνεται από το γράφημα 10 η ποσότητα του Pea mrna είναι μεγαλύτερη στα όψιμα αναπτυξιακά στάδια του αχινού P.lividus. Στο στάδιο του αυγού η ποσότητά του θεωρείται ίση με 1 και όλα τα υπόλοιπα στάδια συγκρίνονται ως προς αυτό. Στο στάδιο των 16 κυττάρων η ποσότητα αυξάνει στο διπλάσιο για να παραμείνει σχεδόν στα ίδια επίπεδα και στο στάδιο του βλαστιδίου. Στο γαστρίδιο αυξάνει σημαντικά η ποσότητα 192

209 Αποτελέσματα και συγκεκριμένα τετραπλασιάζεται ως προς το αυγό και αποτελεί το στάδιο με το υψηλότερο επίπεδο PlPea mrna. Στον πρώϊμο πλουτέα παρατηρείται ξανά πτώση της ποσότητας η οποία συνεχίζει και στον ώριμο πλουτέα. Γράφημα 10 Αυγό 16 κύτ. Βλαστίδιο Γαστρίδιο Πρώϊµος Ώριµος πλουτέας πλουτέας Γράφημα 10. Απεικόνιση των σχετικών αναλογιών του PlPea mrna στα έξι αναπτυξιακά στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης του αχινού. Το στάδιο του αυγού έχει οριστεί ως ρυθμιστής και η σχετική ποσότητα του PlPea mrna θεωρείται σταθερή και ίση προς 1. Οι σχετικές ποσότητες των υπολοίπων σταδίων συγκρίνονται βάσει αυτής του αυγού. Η εξαγωγή του γραφήματος έγινε με τη χρήση των τιμών NR (Normalized Ratio). Η ραγδαία απεικοδόμηση του μητρικού PlPea RNA, που παρατηρήθηκε με το πείραμα RT-PCR, δεν είναι εμφανής όταν τα μετάγραφα ποσοτικοποιούνται με τη μέθοδο qpcr. 193

210 Αποτελέσματα Ιστοειδική έκφραση του γονιδίου PlPea κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη Η ιστοειδική έκφραση του γονιδίου Pea κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του αχινού P.lividus μελετήθηκε με in situ υβριδοποίηση. Για τη διεξαγωγή του πειράματος συντέθηκαν δύο RNA ιχνηθέτες σημασμένοι με διγοξιγενίνη, ένας αντινοηματικός και ένας νοηματικός που αποτέλεσε το πείραμα ελέγχου. Η σύνθεση των ιχνηθετών έγινε χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα την κατακευή Pea-PGEM-TEasy η οποία περιέχει το cdna του γονιδίου Pea κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα PGEM-TEasy. Η φορά με την οποία κλωνοποιήθηκε το ένθεμα (5 προς 3 με φορά από τον Sp6 προς τον Τ7 υποκινητή) συνεπάγεται την παραγωγή του αντινοηματικού ιχνηθέτη με κατάτμηση του πλασμιδιακού DNA με το ένζυμο SpeI που αναγνωρίζει μία θέση στο ένθεμα και μεταγραφή του γραμμικού DNA με τη δράση της Τ7 πολυμεράσης. Εικ Α) Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης 0.8% των προϊόντων κατάτμησης της κυκλικής κατασκευής PlElkpGEM-TEasy με σκοπό τη γραμμοποίησή του με τα ένζυμα περιορισμού 1) SpeI και 2) NcoI. M:1kb. Προϊόν: 5.7kb B) Ανάλυση σε πήκτωμα αγαρόζης-φορμαλδεΰδης των προϊόντων μεταγραφής των γραμμοποιημένων κατασκευών με τα ένζυμα που προαναφέρθηκαν 1) με Τ7 για την παραγωγή αντινοηματικού ιχνηθέτη και 2) με Sp6 για την παραγωγή νοηματικού ιχνηθέτη. M: Ολικό RNA όπου σημαίνονται οι 18S και 28S ριβοσωμικές υπομονάδες. 194

211 Αποτελέσματα Η παραγωγή του νοηματικού ιχνηθέτη πραγματοποιήθηκε με κατάτμηση της κατασκευής με το ένζυμο NcoI που αναγνωρίζει μία θέση στον πολυσυνδέτη του φορέα ανοδικά του ενθέματος και μεταγραφή του, ως γραμμικό πλέον, υπό τη δράση της Sp6 πολυμεράσης. Στην εικόνα 3.41 φαίνεται Α) η κατάτμηση των κατασκευών με τα ένζυμα SpeI και NcoI και Β) η παραγωγή των δύο RNA ιχνηθετών μετά από ανάλυση των προϊόντων μεταγραφής σε πήκτωμα αγαρόζης-φορμαλδεϋδης. Η μελέτη του προτύπου έκφρασης του γονιδίου PlPea στα αναπτυξιακά στάδια που μελετήθηκαν (εικόνα 3.42) έδειξε ότι ο παράγοντας αυτός εκφράζεται διάχυτα στο στάδιο του αυγού γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία μητρικού mrna. Παρόμοιο πρότυπο έκφρασης, δηλαδή σε όλα τα κύτταρα χωρίς συγκεκριμένο ιστοειδικό πρότυπο, ανιχνεύεται και στο στάδιο των 16 κυττάρων. Ωστόσο, στο στάδιο του βλαστιδίου το μητρικό mrna φαίνεται να αποικοδομείται καθώς το σήμα που προκύπτει από την υβριδοποίηση του ιχνηθέτη είναι σχεδόν ανύπαρκτο. Η μικρή ποσότητα του ενδογενούς mrna που παρατηρείται ανιχνεύεται πλέον σε μικρή Εικ Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του παράγοντα PlPea σε έξι αναπτυξιακά στάδια του αχινού. Λεπτομέρειες για τους ιστούς έκφρασης περιγράφονται στο κείμενο. Φυτ. πλ.: Φυτική Πλάκα, Εξ.: Eξώδερμα, Αρχ.: Αρχέντερο, Βλ. ζώνη: Βλεφαριδωτή ζώνη μόνο περιοχή της φυτικής πλάκας. Στο γαστρίδιο η έκφρασή του παρατηρείται στη βάση του αρχεντέρου και στο εξώδερμα. Στο επόμενο αναπτυξιακό στάδιο, του πρώϊμου πλουτέα, το γονίδιο εκφράζεται στους δύο βραχίονες του εμβρύου που έχουν σχηματιστεί 195

212 Αποτελέσματα και στη στοματική καλύπτρα που θα σχηματίσει τους άλλους δύο βραχίονες του πλουτέα. Επίσης ανιχνεύεται έκφραση στη βλεφαριδωτή ζώνη, δηλαδή την περιοχή που θα σχηματιστούν οι μελλοντικοί νευρόνες του ώριμου πλουτέα καθώς και στην έδρα. Στο στάδιο του ώριμου πλουτέα το γονίδιο PlPea διατηρεί την έκφρασή του στους τέσσερις πλέον βραχίονες του εμβρύου καθώς και στη βλεφαριδωτή ζώνη Η πρόσδεση των πρωτεϊνών PlElk, PlPea, PlJun, PlFra2, και PlOtx στα στοιχεία απόκρισης -453, -432 και -377 Η επιβεβαίωση της υπόθεσης ότι οι πρωτεΐνες PlElk, PlPea, PlJun, PlFra2, και PlOtx είναι πιθανώς οι μεταγραφικοί παράγοντες που αναγνωρίζουν τα στοιχεία απόκρισης 453, -432, και -377, έγινε με πειράματα EMSA στα οποία χρησιμοποιήθηκαν αφενός πρωτεΐνες που παρήγχθησαν in vitro και αφετέρου πυρηνικά εκχυλίσματα εμβρύων P.lividus α Παραγωγή των πρωτεϊνών PlJun, PlFra2, PlElk, SpElk και PlPea Οι πρωτεΐνες PlJun, PlFra2, PlElk, SpElk, PlPea και PlCoup-TF παρήγχθησαν in vitro χρησιμοποιώντας τα μεταφραστικά συστήματα Wheat Germ (W.G.), Rabbit Reticulocyte system (R.R.) και T.N.T. Συγκεκριμένα, τα συστήματα που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή κάθε πρωτεΐνης ξεχωριστά είναι τα εξής: Πρωτεΐνες PlJun, PlFra2, PlPea: Συστήματα W.G., R.R., T.N.T. Συμμετάφραση πρωτεϊνών PlJun και PlFra2: Σύστημα R.R. Πρωτεΐνη PlElk: Συστήματα W.G., R.R. Πρωτεΐνες PlCoup-TF και SpElk: Σύστημα T.N.T. Παρήγχθησαν πρωτεϊνες τόσο με ραδιενεργή (met-s 35 ) όσο και με μη σημασμένη μεθειονίνη. Χρησιμοποιήθηκε συνδυασμός μεταφραστικών συστημάτων για την παρασκευή ορισμένων εκ των πιο πάνω πρωτεϊνών προκειμένου να βρεθεί ποιό από τα συστήματα συνδυάζει 1) την απουσία κάποιας ενδογενούς πρωτεΐνης που αναγνωρίζει τα στοιχεία απόκρισης -453 και -432 και που θα οδηγούσε σε εσφαλμένα συμπεράσματα 196

213 Αποτελέσματα στα πειράματα EMSA, και 2) τη μέγιστη (ποσοτικά) παραγωγή πρωτεΐνης. Ειδικά για την πρωτεΐνη PlElk, δεν επετεύγχθη η παραγωγή της με το T.N.T.-Τ7 σύστημα, καθώς η φορά με την οποία είχε εισαχθεί το cdna του γονιδίου PlElk στον πλασμιδιακό φορέα pgem-teasy και η αδυναμία αναστροφής του δεν επέτρεπε τη μετάφρασή του από την T7 πολυμεράση του συστήματος. Η πρωτεΐνη PlCoup-TF παρασκευάστηκε in vitro προκειμένου να χρησιμοποιηθεί στα πειράματα EMSA ως πείραμα ελέγχου. Στην εικόνα 3.43 φαίνονται οι παραγόμενες πρωτεΐνες (PlJun, PlFra2, PlElk, PlPea και PlCoup-TF) με τα διάφορα μεταφραστικά συστήματα μετά από ανάλυση σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου-sds (PAGE). Όλες οι πρωτεΐνες φέρουν το αναμενόμενο μέγεθος, δηλαδή: PlJun : 308αα PlFra2 : 324αα PlElk : 466αα PlPea : 633αα PlCoup-TF : 470αα A B Γ Δ Εικ Ανάλυση σε PAGE των in vitro παραγόμενων πρωτεϊνών. Α) Παραγωγή των πρωτεϊνών PlJun και PlFra2 με το σύστημα R.R. 1-3 Παραγωγή πρωτεΐης PlJun: 1) Χωρίς οξικό κάλιο (P.ac) και Οξικό Mg 2+ (Mg Ac), 2) P.ac. 1M: 0.3μl, 3) P.ac. 1M: 0.3μl και MgAc 30mM: 0.7μl. 4-6 Παραγωγή πρωτεΐνης PlFra2 (όπως περιγράφηκε για την πρωτεΐνη Jun). B) Παραγωγή πρωτεΐνης PlElk με το σύστημα R.R.. Γ) Παραγωγή των πρωτεϊνών PlFra2 και PlJun με το σύστημα W.G. 1) Πρωτεΐνη PlFra2. 2) Πρωτεΐνη PlJun. Δ) Μετάφραση πρωτεϊνών με το σύστημα TNT. 1) Μ: Prosieve Colour Marker. 2) Αρνητικό πείραμα ελέγχου όπου χρησιμοποιήθηκε ραδιενεργή μεθειονίνη αλλά δεν προστέθηκε cdna 3) Παραγωγή της πρωτεΐνης PlCOUP-TF. 4) Πρωτεΐνη PlPEA. 5) Πρωτεΐνη PlFra2. 6) Πρωτεΐνη PlJun. 7) Συμμετάφραση πρωτεϊνών PlJun και PlFra2. Το δείγμα 7 έχει αναλυθεί σε διαφορετικό πήκτωμα σε σχέση με τα προηγούμενα. Δεν έχουν αναλυθεί σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου όλες οι in vitro παραγόμενες πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκαν στις αντιδράσεις EMSA. 197

214 Αποτελέσματα Η παρουσία των in vitro παραγόμενων πρωτεϊνών PlElk αλλά και η ύπαρξή τους στο πυρηνικό εκχύλισμα, επιβεβαιώθηκε με Western Blot ανάλυση χρησιμοποιώντας πολυκλωνικά αντισώματα (εικόνα 3.44). Το αντίσωμα για τον παράγοντα PlElk ήταν προσφορά της Dr. Maria Ina Arnone και έχει κατασκευαστεί έναντι του ομολόγου SpElk. Όπως φαίνεται η πρωτεΐνη PlElk ανιχνεύεται τόσο στο πυρηνικό εκχύλισμα (εικονα 3.44, αντίδραση 2), όσο και στο προϊόν μετάφρασης (εικ. 3.44, αντίδραση 3). Οι δύο ζώνες που αναγνωρίζονται, ενδεχομένως να αντιστοιχούν στις δύο ισομορφές του παράγοντα Elk Εικ Western Blot ανάλυση με το ειδικό αντίσωμα έναντι των πρωτεϊνών Elk. 1) Μάρτυρας, 2) Πυρηνικό εκχύλισμα, 3) In vitro παραγόμενη πρωτεΐνη με R.R. 198

215 Αποτελέσματα 3.15 β Το στοιχείο -453 αναγνωρίζεται από τον παράγοντα PlElk αλλά δεν αναγνωρίζεται από τον παράγοντα PlPea I. H πρόσδεση του παράγοντα PlElk Η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα PlElk στο στοιχείο απόκρισης -453 ελέγχθηκε με πειράματα EMSA. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα στα οποία μελετήθηκε τόσο η ικανότητα πρόσδεσης του πυρηνικού εκχυλίσματος του αχινού P.lividus, (εικόνα 3.45, αντιδράσεις 2-5) όσο και της in vitro παραγόμενης πρωτεΐνης PlElk (εικόνα 3.45, αντιδράσεις 6 και 7). Επίσης εξετάστηκε η επίδραση του ειδικού πολυκλωνικού αντισώματος (έναντι του παράγοντα SpElk) στην ικανότητα πρόσδεσης του πυρηνικού εκχυλίσματος στα στοιχεία -453 (εικόνα 3.45, αντίδραση 5) και Cy313 (εικ A, αντίδραση 5). Για την επιβεβαίωση της ειδικότητας της πρόσδεσης χρησιμοποιήθηκε ως πείραμα ελέγχου η πρόσδεση στο στοιχείο απόκρισης Cy313 (η αλληλουχία του παρατίθεται στο σχήμα 1 του παραρτήματος), το οποίο αναγνωρίζεται από τον ομόλογο παράγοντα SpElk (Consales C. and Arnone M., 2002). Το στοιχείο Cy313 φαίνεται να ανταγωνίζεται την πρόσδεση του πυρηνικού εκχυλίσματος του αχινού P.lividus στο στοιχείο -453 (εικόνα 3.45, αντίδραση 4). Εικ EMSA στο στοιχείο απόκρισης Στις αντιδράσεις 6 και 7 χρησιμοποιήθηκε in vitro παραγόμενη πρωτεΐνη PlElk με το σύτημα R.R. Στην αντίδραση 8 χρησιμοποιήθηκε το σύστημα R.R. απουσία mrna. Π.Ε.:Πυρηνικό εκχύλισμα, Ε.Α.: Ειδικός ανταγωνιστής, Αντ.: Αντίσωμα, R.R.: Rabbit Reticulocyte lysate. Επιπλέον, το στοιχείο Cy313 χρησιμοποιήθηκε ως ιχνηθέτης (εικόνα 3.46 Α και Β) και ελέγχθηκε η πρόσδεσή του από πρωτεΐνες του πυρηνικού εκχυλίσματος του Π.E. Ε.Α. Αντ. PlELK Cy (Χ200) (X200) (Χ200) R.R

216 Αποτελέσματα P.lividus (εικόνα 3.46 Α, αντιδράσεις 2-5) και από την in vitro παραγόμενη πρωτεΐνη PlElk (εικόνα 3.46 Β, αντιδράσεις 1-4). Cy313 Π.E. Ε.Α. Αντ. PlELK Cy Cy313 - Cy (X200) (Χ200) R.R. + W.G (X200) (R.R.) (X200) (W.G.)!"!!!!#!!!$!!!%!!!!&!!!'! A B Εικ EMSA με το στοιχείο απόκρισης Cy313. A) Παρουσία πυρηνικού εκχυλίσματος Β) Παρουσία in vitro συντιθέμενης PlElk πρωτεΐνης. Στις αντιδράσεις 1 και 2 του πηκτώματος Β χρησιμοποιήθηκε πρωτεΐνη που παρήγχθη με το σύστημα R.R., ενώ στις αντιδράσεις 3 και 4 με το σύστημα W.G. Π.Ε.:Πυρηνικό εκχύλισμα, Ε.Α.: Ειδκός ανταγωνιστής, Αντ.: Αντίσωμα, R.R.: Rabbit Reticulocyte lysate, W.G.: Wheat germ. Όπως φαίνεται από τις πιο πάνω αντιδράσεις το πυρηνικό εκχύλισμα του αχινού P.lividus περιέχει έναν παράγοντα ο οποίος αναγνωρίζει ειδικά το στοιχείο -453 (εικόνα 200

217 Αποτελέσματα 3.45, αντίδραση 2). Οι δύο ζώνες που προκύπτουν, πιθανόν αντιστοιχούν στις δύο ισομορφές του PlElk. Η πρόσδεση που παρατηρήθηκε είναι ειδική καθώς με την προσθήκη του ειδικού ανταγωνιστή -453 η ένταση του σήματος μειώθηκε (εικόνα 3.45, αντίδραση 3). Η προσθήκη του στοιχείου Cy313 ως ειδικού ανταγωνιστή (εικόνα 3.45, αντίδραση 4), επίσης επέφερε μείωση του σήματος της πρόσδεσης, γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι ο παράγοντας που αναγνωρίζει το στοιχείο αυτό δεν είναι άλλος από τον PlElk. Το συμπέρασμα αυτό επιβεβαιώνεται καθώς η ειδική πρόσδεση μειώνεται μετά την προσθήκη του ειδικού αντισώματος έναντι του SpElk (εικόνα 3.45, αντίδραση 5). Στο ίδιο αποτέλεσμα οδήγησε και η αντίδραση όπου χρησιμοποιήθηκε ειδικά η πρωτεΐνη PlElk, που συντέθηκε in vitro, αντί του πυρηνικού εκχυλίσματος. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ειδική πρόσδεση του παράγοντα στο στοιχείο -453 (εικόνα 3.45, αντίδραση 6) η οποία εξαφανίστηκε με την προσθήκη του στοιχείου -453, ως ειδικού ανταγωνιστή (εικόνα 3.45, αντίδραση 7). Το στοιχείο Cy313, όπως έχει ήδη αναφερθεί, αποτελεί ειδικό στοιχείο απόκρισης του παράγοντα SpElk. H χρήση του επιλέγχθηκε προκειμένου να ελεγχθεί η ικανότητα πρόσδεσης του πυρηνικού εκχυλίσματος και του in vitro συντιθέμενου παράγοντα PlElk στο στοιχείο αυτό με σκοπό να επιβεβαιωθεί και με αυτόν τον τρόπο ότι η ειδική πρόσδεση του πυρηνικού εκχυλίσματος στο στοιχείο -453 προέρχεται από τον παράγοντα Elk. Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.46 Α, το πυρηνικό εκχύλισμα που χρησιμοποιήθηκε περιέχει πρωτεΐνη που αναγνωρίζει το στοιχείο αυτό (αντίδραση 2). Και σε αυτή την περίπτωση ανιχνεύονται δύο ζώνες που φαίνεται να αντιστοιχούν στις δύο ισομορφές του PlElk. Μάλιστα, η πρόσδεση είναι ειδική καθώς η ένταση του σήματος μειώνεται αισθητά μετά την προσθήκη του ίδιου στοιχείου (εικόνα 3.46 Α, αντίδραση 3) αλλά και του στοιχείου -453 ως ειδικών ανταγωνιστών (εικόνα 3.46 Α, αντίδραση 4). Η προσθήκη και του ειδικού αντισώματος έναντι του SpElk επίσης επέφερε εξαφάνιση της ειδικής πρόσδεσης (εικόνα 3.46 Α, αντίδραση 5) υποδηλώνοντας ότι ο παράγοντας που περιέχει το πυρηνικό εκχύλισμα είναι ο PlElk. Οι αντιδράσεις του πηκτώματος Β (εικόνα 3.46) αποδεικνύουν ότι ο παράγοντας PlElk αναγνωρίζει ειδικά το στοιχείο Cy313 (αντιδράσεις 1 και 3) και ότι η πρόσδεση αυτή είναι ειδική καθώς εξαφανίζεται με τη χρήση του ίδιου στοιχείου ως ειδικού ανταγωνιστή (αντιδράσεις 2 και 4). 201

218 Αποτελέσματα Ακολούθως πραγματοποιήθηκαν πειράματα EMSA με το στοιχείο Cy313 και πυρηνικά εκχυλίσματα από τους αχινούς S.purpuratus και P.lividus, με σκοπό τη σύγκριση του προτύπου ανάλυσης των συμπλόκων που δημιουργούνται. Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.47, το πρότυπο ανάλυσης του πυρηνικού εκχυλίσματος του S.purpuratus (3.47 Α) είναι ίδιο με αυτό του P.lividus (3.47 Β). Συγκεκριμένα αναγνωρίστηκαν (και με το πυρηνικό εκχύλισμα του S.purpuratus) δύο σύμπλοκα, ένα ταχύτερης (καφέ βέλος) και ενός βραδύτερης (μπλε βέλος) κινητικότητας, τα οποία εξαφανίζονται παρουσία του ειδικού ανταγωνιστή Cy313 (εικόνα3.47 Α, στήλες 3 και 4) και μειώνεται η ένταση του σήματός τους παρουσία του ειδικού αντισώματος (αντίδραση 5). Εικ EMSA στο στοιχείο απόκρισης Cy313 με πυρηνικό εκχύλισμα S.purpuratus (A) και P.lividus (B). Το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε έχει κατασκευαστεί έναντι του παράγοντα SpElk. 202

219 Αποτελέσματα II. Aδυναμία πρόσδεσης του παράγοντα PlPea στο στοιχείο -453 Η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα PlPea στο στοιχείο απόκρισης -453 ελέγχθηκε με πειράματα EMSA όπου χρησιμοποιήθηκε in vitro παραγόμενη πρωτεΐνη PLPea. Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.48 η ζώνη που εμφανίζεται μετά την προσθήκη του παράγοντα PlPea στο στοιχείο απόκρισης -453 (μπλε βέλος) δεν εξαφανίζεται μετά την προσθήκη του ειδικού ανταγωνιστή. Επίσης παραμένει και στην αντίδραση 4 στην οποία έχει χρησιμοποιηθεί μόνο το μεταφραστικό σύστημα Rabit Reticulocyte lysate χωρίς την προσθήκη RNA υποδηλώνοντας ότι η ζώνη αυτή αποτελεί θόρυβο από κάποια πρωτεΐνη του συστήματος που μη ειδικά αναγνωρίζει το στοιχείο απόκρισης Εικ EMSA με το στοιχείο απόκρισης -453 παρουσία in vitro συντιθέμενης πρωτεΐνης PlPea. Ε.Α.: Ειδκός ανταγωνιστής, R.R.: Rabbit Reticulocyte lysate. 203

220 Αποτελέσματα 3. 15γ Μελέτη πρόσδεσης του παράγοντα AP1 στο στοιχείο απόκρισης Η ικανότητα του παράγοντα AP1 να προσδένεται στο στοιχείο απόκρισης -432 ελέγχθηκε με πειράματα EMSA. Ελέγχθηκε τόσο η ικανότητα πρόσδεσης του πυρηνικού εκχυλίσματος του αχινού P.lividus (εικόνα 3.48) όσο και των in vitro παραγόμενων πρωτεΐνων PlJun/PlFra2 (εικόνες 3.49 και 3.50). Ι) Πειράματα EMSA με πυρηνικό εκχύλισμα Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.49 στο πυρηνικό εκχύλισμα του αχινού P.lividus, περιέχονται πρωτεΐνες που αναγνωρίζουν το στοιχείο -432 (αντίδραση 2). Η μείωση της πρόσδεσης παρουσία των ειδικών ανταγωνιστών -432 (αντίδραση 3), cons AP1 (αντίδραση 4) και cons Jun (αντίδραση 5) καθιστά πιθανό τον παράγοντα AP1 ως αυτόν που αναγνωρίζει το στοιχείο Εικ EMSA με το στοιχείο απόκρισης -432 παρουσία πυρηνικού εκχυλίσματος. Π.Ε.: Πυρηνικό εκχύλισμα, Ε.Α.: Ειδικός ανταγωνιστής. ΙΙ) Πειράματα EMSA με in vitro παραγόμενες πρωτεΐνες Προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι ο παράγοντας AP1 είναι αυτός που αναγνωρίζει το στοιχείο -432, αλλά και να αναγνωριστεί η μορφή του συμπλόκου (δηλαδή αν οι πρωτεΐνες PlJun και PlFra2 σχηματίζουν ομοδιμερές ή ετεροδιμερές), 204

221 Αποτελέσματα πραγματοποιήθηκαν εκ νέου πειράματα EMSA, χρησιμοποιώντας in vitro παραγόμενες πρωτεΐνες. Πραγματοποιήθηκαν EMSA αντιδράσεις χρησιμοποιώντας ως ιχνηθέτες τα στοιχεία cons AP1 (εικόνα 3.50, 1-7), -432 (εικόνα 3.50, 8-14) και το στοιχείο απόκρισης του παράγοντα Coup-TF, C1R (εικόνα 3.50, 15-17) ως πείραμα ελέγχου. Για τα στοιχεία cons AP1 και -432 ελέγχθηκε η πρόσδεση των πρωτεϊνών PlJun και PlFra2 που παρήγχθησαν και με τα τρία μεταφραστικά συστήματα (R.R., W.G. και Τ.Ν.Τ), consap1-432 C1R Π.Ε PlJun PlFra Pl Jun/Fra PlCOUP consap1 Ε.Α (X100) - consap1 (X100) TNT (X100) -432 (X100) - - C1R (X100) - Εικ.3.50 EMSA με in vitro παραγόμενες πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας το σύστημα ΤΝΤ. Ελέγχθησαν τα στοιχεία cons AP1 (1-7), -432 (8-14) και C1R (15-17). O παράγοντας PlCOUP της αντίδρασης 15 παρήγχθη από διαφορετική αντίδραση από αυτόν που χρησιμοποιήθηκε στην αντίδραση 17. Π.Ε.: Πυρηνικό εκχύλισμα, Ε.Α.: Ειδικός ανταγωνιστής. ΤΝΤ: Σύστημα ΤΝΤ απουσία mrna PlJun ή PlFra2. 205

222 Αποτελέσματα προκειμένου να επιτευχθεί η καλύτερη δυνατή απόδοση. Επίσης ελέγχθηκε η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα AP1 ως ομοδιμερούς (PlJun/PlJun και PlFra2/PlFra2) ή ετεροδιμερούς (PlJun/PlFra2). Η ικανότητα πρόσδεσης του ετεροδιμερούς PlJun/PlFra2 ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας τόσο συμμεταφραζόμενες (με το σύστημα rabbit reticulosyte lysate) όσο και αναμεμειγμένες πρωτεΐνες που είχαν μεταφραστεί μεμονωμένα η κάθε μία (με τα συστήματα wheat germ, rabbit reticulosyte lysate και Τ.Ν.Τ.). Στις αντιδράσεις ελέγχθηκε η ικανότητα πρόσδεσης των πρωτεΐνών σε διάφορες συγκεντρώσεις. Ενδεικτικά παρατίθενται αντιδράσεις EMSA στις εικόνες 3.50 και Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.50 δεν παρατηρείται ειδική πρόσδεση των πρωτεΐνών Plun/PlFra2 είτε αυτές χρησιμοποιούνται ως ομοδιμερή ή ως ετεροδιμερή. Οι ζώνες που αναγνωρίζονται είναι θόρυβος όπως αποδεικνύεται με την αντίδραση 7, όπου χρησιμοποιήθηκε μόνο το σύστημα ΤΝΤ χωρίς προσθήκη PlJun ή PlFra2 cdna. Φαίνεται επομένως ότι το σύστημα ΤΝΤ περιέχει κάποιες πρωτεΐνες που αναγνωρίζουν τα στοιχεία cons AP1 και Οι αντιδράσεις αποτελούν πείραμα ελέγχου όπου χρησιμοποιήθηκε το στοιχείο απόκρισης C1R το οποίο αναγνωρίζεται ειδικά από τον παράγοντα Coup-TF. Όπως φαίνεται, πέραν των ζωνών που προκύπτουν λόγω μη ειδικής πρόσδεσης στο στοιχείο C1R από πρωτεΐνες του συστήματος, προκύπτει και ειδική πρόσδεση της πρωτεΐνης Coup-TF στο στοιχείο αυτό, όπως αναμένεται (κόκκινα βέλη). Eξετάστηκε επίσης η ικανότητα πρόσδεσης Εικ EMSA με in vitro παραγόμενες πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας το σύστημα WG. Ελέγχθηκε το στοιχείο Ε.Α.: Ειδικός ανταγωνιστής. W.G.: Σύστημα W.G. απουσία mrna PlJun ή PlFra2. του παράγοντα AP1 στο στοιχείο -432 χρησιμοποιώντας τις πρωτεΐνες PlJun και PlFra2 μετά από μετάφρασή τους με το σύστημα Wheat Germ. Όπως φαίνεται από την εικόνα 206

223 Αποτελέσματα 3.51 δεν παρατηρείται ούτε σε αυτή την περίπτωση ειδική πρόσδεση του παράγοντα AP1 στο στοιχείο απόκρισης Προκειμένου να ελεγχθεί η πρόσδεση του παράγοντα αυτού στο στοιχείο απόκρισης -432 καθώς και στα συντηρημένα στοιχεία cons AP1 και cons Jun πραγματοποιήθηκε μία πλειάδα πειραμάτων όπου χρησιμοποιήθηκαν όλοι οι δυνατοί συνδυασμοί των πρωτεϊνών από τα διάφορα συστήματα σε διάφορες συγκεντρώσεις, όπως προαναφέρθηκε. Σε όλες τις αντιδράσεις προέκυπτε το ίδιο αποτέλεσμα, δηλαδή μη ειδική πρόσδεση του παράγοντα AP1 στα στοιχεία -432, cons AP1 και cons Jun ανεξάρτητα από το εάν ο AP1 χρησιμοποιήθηκε ως ομοδιμερές ή ετεροδιμερές δ Μελέτη της πρόσδεσης του παράγοντα PlOtx στο στοιχείο απόκρισης -377 Η ικανότητα του παράγοντα PlOtx να προσδένεται στο στοιχείο απόκρισης -377 ελέγχθηκε με πειράματα EMSA στα οποία χρησιμοποιήθηκε πυρηνικό εκχύλισμα του αχινού P.lividus (εικ.3.52 A, αντίδραση 2). Για την επιβεβαίωση της ειδικότητας της πρόσδεσης χρησιμοποιήθηκε ως πείραμα ελέγχου, η ικανότητα των στοιχείων -377 και consotx (η αλληλουχία του οποίου παρατίθεται στο σχήμα 1 του παραρτήματος), το οποίο αναγνωρίζεται ειδικά από τον ομόλογο παράγοντα SpOtx (Yuh C. et al., 2001), να ανταγωνίζονται την πρόσδεση του πυρηνικού εκχυλίσματος του αχινού P.lividus (εικόνα 3.52 Α, αντιδράσεις 3 και 4) στο στοιχείο Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε το στοιχείο consotx και ως ιχνηθέτης και ελέγχθηκε η ικανότητά του να αναγνωρίζεται ειδικά από τις πρωτεΐνες του πυρηνικού εκχυλίσματος (εικόνα 3.52 Β, αντίδραση 2). Όπως φαίνεται από τις πιο πάνω αντιδράσεις το πυρηνικό εκχύλισμα του αχινού P.lividus περιέχει έναν παράγοντα ο οποίος αναγνωρίζει ειδικά το στοιχείο -377 (εικόνα 3.52 A, αντίδραση 2). Η πρόσδεση σημαίνεται με κίτρινα βέλη και πιθανόν οι δύο ζώνες που προκύπτουν αντιστοιχούν στις δύο ισομορφές του Otx. Μάλιστα, η πρόσδεση αυτή είναι ειδική καθώς η ισχύς της μειώνεται με την προσθήκη του ειδικού ανταγωνιστή -377 (εικόνα 3.52 A, αντίδραση 3). Η προσθήκη του στοιχείου consotx ως ειδικού ανταγωνιστή (εικόνα 3.52 A, αντίδραση 4), προκαλεί ακόμη μεγαλύτερη μείωση της 207

224 Αποτελέσματα ισχύος της πρόσδεσης, γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι ο παράγοντας που αναγνωρίζει το στοιχείο αυτό δεν είναι άλλος από τον PlOtx. Εικ EMSA με τα στοιχεία απόκρισης -377 (Α) και consotx (B). Π.Ε.: Πυρηνικό εκχύλισμα, Ε.Α.: Ειδικός ανταγωνιστής. Το στοιχείο consotx όπως έχει ήδη αναφερθεί αποτελεί ειδικό στοιχείο απόκρισης του παράγοντα SpOTX. H χρήση του επιλέγχθηκε προκειμένου να ελεγχθεί η ικανότητα πρόσδεσης του πυρηνικού εκχυλίσματος και στο στοιχείο αυτό με σκοπό να επιβεβαιωθεί και με αυτόν τον τρόπο η παρουσία του παράγοντα OTX στο πυρηνικό 208

225 Αποτελέσματα εκχύλισμα που χρησιμοποιήθηκε. Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.52 B, το πυρηνικό εκχύλισμα που χρησιμοποιήθηκε περιέχει πρωτεΐνη που αναγνωρίζει το στοιχείο αυτό (αντίδραση 2). Μάλιστα, η πρόσδεση είναι ειδική καθώς η ισχύς της μειώνεται μετά την προσθήκη του ίδιου στοιχείου (εικόνα 3.52 B, αντίδραση 3) αλλά και του στοιχείου -377 ως ειδικών ανταγωνιστών (εικόνα 3.52 B, αντίδραση 4). Τα αποτελέσματα αυτά συνηγορούν στο ότι ο μεταγραφικός παράγοντας που προσδένεται στο ρυθμιστικό στοιχείο -377 είναι ο PlOtx. 209

226 Συζήτηση ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Το γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο του αχινού περιλαμβάνει μια πληθώρα γονιδίων, τα περισσότερα από τα οποία κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες. Το δίκτυο για το ενδομεσόδερμα είναι πολύ πιο καλά μελετημένο σε σχέση με αυτό του εξωδέρματος. Ωστόσο για την ολοκλήρωση και των δύο δικτύων, εργάζονται πολλά εργαστήρια ανά τον κόσμο. Στην παρούσα εργασία έγινε προσπάθεια να ενταχθεί το γονίδιο του PlCoup-TF και των ρυθμιστών του, στο ρυθμιστικό δίκτυο του εξωδέρματος. Ο Coup-TF αποτελεί έναν μεταγραφικό παράγοντα, με εξαιρετικά σπουδαίο ρόλο για την φυσιολογική εξέλιξη της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Η καταστολή (με knockout πειράματα), των ορθόλογων γονιδίων του, διαφόρων οργανισμών, οδηγεί στο θάνατο των ζώων. Ειδικά στον αχινό, Paracentrotus lividus, η καταστολή του χρησιμοποιώντας morpholinos αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια, ανέστειλε την ανάπτυξη του εμβρύου στο στάδιο του βλαστιδίου (αδημοσίευτα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας). Επομένως, φαίνεται ότι το μητρικό RNA και η πρωτεΐνη επαρκούν για τα πολύ πρώιμα στάδια της εμβρυικής ανάπτυξης, αλλά αργότερα απαιτείται η παρουσία νεοσυντιθέμενου ζυγωτικού RNA. Στον αχινό, όπως και σε όλα τα εχινόδερμα και πολλά άλλα μετάζωα (αδημοσίευτα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας), το γονίδιο PlCoup-TF κωδικοποιεί δύο ισομορφές διαφορετικού μεγέθους ως αποτέλεσμα εναλλακτικού ματίσματος. Μάλιστα βρέθηκε ότι ενώ και οι δύο ισομορφές μετακινούνται εναλλάξ, μεταξύ των χρωμοσωμάτων και της πυρηνικής μεμβράνης στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου, ωστόσο μόνο η μικρή ισομορφή προσδένεται στο DNA (αδημοσίευτα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας). Το πρότυπο έκφρασης της εμβρυϊκής μορφής του Coup-TF (στοματικό εξώδερμα και βλεφαριδωτή ζώνη), η αποκλειστική του παρουσία στα νευρικά κύτταρα της λάρβας και η έλλειψη σεροτονεργικών νευρώνων όταν καταστέλεται στο έμβρυο (αδημοσίευτα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας), είναι αποδεικτικά του σημαντικού ρόλου που έχει στη νευρογένεση στο έμβρυο του αχινού, όπως συμβαίνει 210

227 Συζήτηση και σε πλήθος άλλων οργανισμών. Με την παρούσα εργασία επιδιώχτηκε να αποσαφηνιστεί η ρύθμιση του PlCoup-TF στα όψιμα αναπτυξιακά στάδια του εμβρύου και να τοποθετηθεί ο παράγοντας αυτός στο ρυθμιστικό δίκτυο του εξωδέρματος του αχινού. 4.1 Ο πιθανός ρόλος του PlCoup-TF κατά την εμβρυογένεση Στα είδη των αχινών S.purpuratus και L.variegatus, ο Coup-TF εκφράζεται στη βλεφαριδωτή ζώνη, στο στάδιο του πλουτέα, και στο νευρικό σύστημα, στο ενήλικο άτομο. Λόγω της ιστοειδικής αυτής έκφρασης θεωρείται πιθανός συμμέτοχος στον καθορισμό του νευρικού συστήματος. Ένας από τους στόχους της παρούσας εργασίας ήταν ο έλεγχος της διατήρησης ή μη, του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης και στο έμβρυο του αχινού P.lividus. Από τα πειράματα της in situ υβριδοποίησης διαπιστώθηκε ότι τα μετάγραφα του PlCoup-TF, σε αντίθεση με αυτά των άλλων ειδών, παρουσιάζουν τρεις φάσεις έκφρασης όσον αφορά στην ιστοειδικότητα. Η πρώτη φάση περιλαμβάνει μετάγραφα μητρικής προέλευσης τα οποία εντοπίζονται διάχυτα στο έμβρυο (κεφ.3, εικόνα 3.3, αυγό και 16 κύτταρα). Επομένως, ο μητρικής προέλευσης παράγοντας φαίνεται να συμμετέχει και να επηρεάζει γεγονότα που λαμβάνουν χώρα στα πρώϊμα εμβρυϊκά στάδια σε όλες τις κυτταρικές γραμμές του εμβρύου. Κατά πόσο ο διάχυτα εντοπιζόμενος παράγοντας είναι αποκλειστικά μητρικής ή και εν μέρει ζυγωτικής προέλευσης δεν μπορεί ωστόσο να καθοριστεί. Η δεύτερη φάση έκφρασης, παρατηρείται στο στάδιο του βλαστιδίου και περιλαμβάνει μετάγραφα τα οποία περιορίζονται στο ήμισυ του εμβρύου και συγκεκριμένα στην περιοχή που αντιστοιχεί στο στοματικό εξώδερμα (κεφ.3, εικόνα 3.3, γαστρίδιο). Στην τρίτη φάση, που περιλαμβάνει τα στάδια του πρώϊμου και ώριμου πλουτέα, τα μετάγραφα εντοπίζονται πλέον αποκλειστικά στην έδρα και στη βλεφαριδωτή ζώνη, όπου θα αναπτυχθεί το μελλοντικό νευρικό σύστημα του εμβρύου (κεφ.3, εικόνα 3.3, πλουτέας). Σύγκριση μεταξύ των προτύπων έκφρασης στα τρία είδη αχινού, (S.purpuratus, L.variegatus και P.lividus) αναδεικνύει ότι η ιστοειδική έκφραση του Coup-TF είναι συντηρημένη μόνο στα τελικά στάδια. Αντίθετα, στα πρώϊμα στάδια είναι διαφορετική καθώς οι SpCoup-TF και LvCoup-TF εκφράζονται μόνο στα 211

228 Συζήτηση κύτταρα τα οποία θα διαφοροποιηθούν στο μελλοντικό στοματικό εξώδερμα. Η ποικιλότητα που παρατηρήθηκε στην ιστοειδική έκφραση του PlCoup-TF στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια του αποδίδει πολλαπλούς πιθανούς ρόλους κατά την εμβρυογένεση του αχινού. Και στα τρία είδη όμως, η έκφρασή του στη βλεφαριδωτή ζώνη δείχνει ότι ο σημαντικός του ρόλος στον καθορισμό των νευρικών κυττάρων είναι συντηρημένος. 4.2 H μελέτη των διαγονιδιακών εμβρύων αχινού Τα διαγονιδιακά έμβρυα, που προκύπτουν μετά την εισαγωγή εξωγενούς γενετικού υλικού στο αγονιμοποίητο ωάριο αχινού, εκφράζουν το εκάστοτε διαγονίδιο κατά μωσαϊκό τρόπο. Ο αριθμός των κυττάρων που θα περιέχει το εξωγενές DNA στο τέλος της εμβρυογένεσης, εξαρτάται αποκλειστικά από το στάδιο στο οποίο έχει πραγματοποιηθεί η ενσωμάτωσή του στο ενδογενές γονιδίωμα. Στην περίπτωση που το εισαγόμενο DNA φέρει κάποιο γονίδιο αναφοράς, όπως της GFP, ο αριθμός των κυττάρων τα οποία θα την εκφράσουν, αναγνωρίζεται μέσω του φθορισμού. Όταν η ενσωμάτωση πραγματοποιηθεί στα πολύ πρώϊμα εμβρυϊκά στάδια, ένας μεγάλος αριθμός απόγονων κυττάρων θα φθορίζουν. Eάν η ενσωμάτωση πραγματοποιηθεί σε μετέπειτα στάδια τότε λίγα μόνο κύτταρα θα φθορίζουν. Στην προκειμένη περίπτωση, η σωστή έκφραση του γονιδίου αναφοράς προϋποθέτει την παρουσία φθορισμού σε μια ομάδα συνεχόμενων στον ιστό κυττάρων, μιας και τα κύτταρα του στοματικού εξωδέρματος τα οποία μελετώνται, δεν μεταναστεύουν. 4.3 Ο ρόλος των υποπεριοχών Ι V στη ρύθμιση του PlCoup- TF στο έμβρυο του αχινού Η παρατήρηση των διαγονιδιακών εμβρύων, στα οποία έχουν εισαγχθεί οι κατασκευές a1 a5 και 1 4, οδήγησε στην αναγνώριση σημαντικών ρυθμιστικών στοιχείων του γονιδίου PlCoup-TF, εντός των υποπεριοχών I (-532 έως -473), II (- 473 έως -387) και III (-387 έως -334) (Κεφ.3, Eικ.3.7). Τα συμπεράσματα προέκυψαν μετά από σύγκριση της ιστοειδικής έκφρασης της εκάστοτε κατασκευής, με την ιστοειδική έκφραση της κατασκευής αναφοράς, a. 212

229 Συζήτηση Η απομάκρυνση της υποπεριοχής Ι (-532 έως -473), από τη ρυθμιστική περιοχή του PlCoup-TF (κατασκευή a1), επέφερε αύξηση στο ποσοστό των εμβρύων που εκφράζουν GFP στο ενδόδερμα (Πιν.3.2). Το αποτέλεσμα αυτό συνηγορεί υπέρ της παρουσίας εντός της υποπεριοχής αυτής, ενός αρνητικού ρυθμιστικού στοιχείου με συνέπεια την καταστολή του PlCoup-TF στο ενδόδερμα. Η δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων με τη χρήση των κατασκευών a2 (από την οποία έχουν αφαιρεθεί οι υποπεριοχές Ι και ΙΙ) και 1 (από την οποία έχει αφαιρεθεί μόνο η υποπεριοχή ΙΙ), οδήγησε σε δραματική αύξηση στο ποσοστό των εμβρύων που εκφράζουν τη GFP στο αντιστοματικό εξώδερμα και στο ενδόδερμα και σε σημαντική πτώση στο ποσοστό και την ισχύ του φθορισμού της GFP στη βλεφαριδωτή ζώνη (Πιν.3.2 και Πιν.3.3). Οι παρατηρήσεις αυτές οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι, εντός της υποπεριοχής ΙΙ (που εκτείνεται από το -473 ως το -387) υπάρχουν αρνητικά ρυθμιστικά στοιχεία υπεύθυνα για την καταστολή του PlCoup-TF στο ενδόδερμα και στο αντιστοματικό εξώδερμα και θετικά για την έκφρασή του στη βλεφαριδωτή ζώνη. Η κατασκευή a3, από την οποία έχει απομακρυνθεί και η υποπεριοχή III (επιπλέον των Ι και ΙΙ), επιφέρει μη ειδική έκφραση της GFP και αύξηση της έκφρασής της στο μεσέγχυμα (χαρακτηριστικό της απουσίας εξειδικευμένων ιστοειδικών στοιχείων), συνηγορώντας υπέρ της ύπαρξης εντός αυτής ενός -ή περισσοτέρων- ιστοειδικού ρυθμιστικού στοιχείου. Η κατασκευή 2 (από την οποία έχει αφαιρεθεί μόνο η υποπεριοχή ΙΙΙ), οδηγεί σε δραματική αύξηση των εμβρύων που εκφράζουν τη GFP στο αντιστοματικό εξώδερμα, χωρίς ωστόσο να επηρεάζεται η έκφραση στη βλεφαριδωτή ζώνη (Πιν.3.2 και Πιν.3.3). Φαίνεται λοιπόν, ότι στο τμήμα της ανοδικής περιοχής του PlCoup-TF, που εκτείνεται από το -387 έως το -334 (υποπεριοχή ΙΙΙ), βρίσκεται ένα στοιχείο υπεύθυνο για την ιστοειδικότητα της έκφρασης του PlCOUP-TF στη βλεφαριδωτή ζώνη και ο ρόλος του είναι να καταστέλλει την έκφρασή του στο αντιστοματικό εξώδερμα. Η ανάλυση διαγονιδιακών εμβρύων με τις κατασκευές a4 (από την οποία έχει επιπλέον απαλλειφθεί η υποπεριοχή ΙV) και 3 (από την οποία έχει αφαιρεθεί μόνο η υποπεριοχή ΙV), δεν έδειξε σημαντική μεταβολή στο πρότυπο φθορισμού στις κυτταρικές γραμμές που μελετήθηκαν (Πιν.3.2 και Πιν.3.3). Η πτώση του ποσοστού των εμβρύων που εκφράζουν τη GFP στη βλεφαριδωτή ζώνη, που παρατηρήθηκε με την κατασκευή a4, δεν λαμβάνεται υπ όψιν, καθώς έχει ήδη προκληθεί με την 213

230 Συζήτηση κατασκευή a3 και επομένως αποδίδεται σε στοιχεία που βρίσκονται εντός των αλληλουχιών που λείπουν από την κατασκευή αυτή (a3). Επομένως, η υποπεριοχή IV που εκτείνεται από το -334 ως το -298 δεν φαίνεται να περιέχει ρυθμιστικά στοιχεία του PlCoup-TF. Η χρήση των κατασκευών a5 (από την οποία έχει αφαιρεθεί και η υποπεριοχή V, πλην των Ι-IV) και 4 (από την οποία λείπει μόνο η υποπεριοχή V), επέφερε επιπλέον μείωση του ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν στη βλεφαριδωτή ζώνη (Πιν.3.2 και Πιν.3.3) και ανάλογη αύξηση του ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν σε άλλες κυτταρικές στοιβάδες. Επομένως, η υποπεριοχή V, που εκτείνεται από το ως το -232 δεν φαίνεται να περιέχει ρυθμιστικά στοιχεία του γονιδίου PlCoup-TF. Συνοψίζοντας, από την ανάλυση του προτύπου φθορισμού στις διάφορες κυτταρικές γραμμές των διαγονιδιακών εμβρύων, αναγνωρίστηκαν τα εξής: Στην υποπεριοχή Ι, που εκτείνεται από το -532 ως το -473, υπάρχουν στοιχεία που ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση του PlCoup-TF στο ενδόδερμα. Στην υποπεριοχή ΙΙ, που εκτείνεται από το -473 ως το -387, περιέχονται στοιχεία που ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση του PlCoup-TF στο αντιστοματικό εξώδερμα και στο ενδόδερμα και θετικά στη βλεφαριδωτή ζώνη. Η υποπεριοχή ΙΙΙ, που εκτείνεται από το -387 ως το -334, περιλαμβάνει στοιχεία που ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση του PlCoup-TF στο αντιστοματικό εξώδερμα. Η υποπεριοχή ΙV, που εκτείνεται από -334 ως -298, δεν περιέχει ρυθμιστικά στοιχεία του PlCoup-TF. Η υποπεριοχή V, που εκτείνεται από το -298 ως το -232, επίσης δεν περιέχει ρυθμιστικά στοιχεία του PlCoup-TF. Λαμβάνοντας υπ όψιν όλα τα ανωτέρω αποτελέσματα των ανοδικών και εσωτερικών ελλειμάτων, εξάγεται το συμπέρασμα ότι μια μικρότερη περιοχή εντός του τμήματος a, από το -532 έως το -334 (και πιθανότερα από το -453 έως το -334), είναι αναγκαία και ικανή να καθοδηγήσει την έκφραση του γονιδίου στη βλεφαριδωτή ζώνη στο στάδιο του πλουτέα. Σε αυτή την περιοχή βρίσκονται 214

231 Συζήτηση αναγκαία ρυθμιστικά στοιχεία της ποσοτικής και ιστοειδικής έκφρασης του γονιδίου και μπορεί να θεωρηθεί ως μια απαραίτητη ρυθμιστική μονάδα (regulatory module) που σε συνεργασία με τον βασικό υποκινητή του γονιδίου είναι υπεύθυνη για την έκφραση του PLCoup-TF στη βλεφαριδωτή ζώνη. Αυτή η ρυθμιστική μονάδα, με ελάχιστο μέγεθος 120bp (-453 έως -334), δεν θεωρείται ως η αποκλειστική ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου, μια και η ανάλυση που πραγματοποιήθηκε εστιάστηκε ιστοειδικά (βλεφαριδωτή ζώνη) και χρονικά (στάδιο πλουτέα). Είναι πολύ πιθανό να συμμετέχουν και άλλες ρυθμιστικές μονάδες στην έκφραση του γονιδίου στα άλλα αναπτυξιακά στάδια και σε άλλες κυτταρικές στοιβάδες (πχ. έδρα) ή τελικώς διαφοροποιημένα κύτταρα (πχ. σεροτονεργικοί νευρώνες), χωρίς η παρούσα ανάλυση να μπορεί να τις διακρίνει. Επιπρόσθετα, το γονίδιο PlCoup-TF εκφράζεται κατά την ωογένεση, όπως μαρτυρά η ύπαρξη του μητρικού RNA, αλλά και σε άλλους ιστούς του ενήλικα ατόμου. Ποιές ρυθμιστικές μονάδες είναι υπεύθυνες για την έκφραση του γονιδίου στις ωοθήκες και που βρίσκονται στη ρυθμιστική του περιοχή; 4.4 Ο ρόλος των στοιχείων -453, -432 και -377 O πιθανός ρόλος των στοιχείων -453, -432 και -377, στη ρύθμιση του PlCoup- TF, αναγνωρίστηκε με τη δημιουργία στοχευμένων μεταλλάξεων των στοιχείων αυτών που ακολουθήθηκε από τη μελέτη τροποποίησης του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης της GFP στα αντίστοιχα διαγονιδιακά έμβρυα αχινού. Το στοιχείο -453, το οποίο βρίσκεται στην υποπεριοχή ΙΙ (-473 έως -387) έχει θετικό ρόλο στην έκφραση του PlCoup-TF στη βλεφαριδωτή ζώνη. Το συμπέρασμα αυτό προέκυψε καθώς η στοχευμένη μετάλλαξη του στοιχείου αυτού, επέφερε σημαντική μείωση στο ποσοστό των εμβρύων που εκφράζουν τη GFP αποκλειστικά στη βλεφαριδωτή ζώνη καθώς και δραματική πτώση της έντασης του παρατηρούμενου φθορισμού στη βλεφαριδωτή ζώνη και σημαντική μείωση του συνολικού ποσοστού των φθοριζόντων εμβρύων (Πιν.3.4). Το στοιχείο -432, το οποίο επίσης βρίσκεται στην υποπεριοχή ΙΙ, έχει σαν ρόλο τη διατήρηση της ιστοειδικής έκφρασης του PlCoup-TF αποκλειστικά στη 215

232 Συζήτηση βλεφαριδωτή ζώνη. Aυτό επιτυγχάνεται μέσω καταστολής της έκφρασης του γονιδίου στους άλλους ιστούς (αντιστοματικό εξώδερμα και ενδόδερμα). Το συμπέρασμα αυτό προέκυψε καθώς στοχευμένη μετάλλαξη του στοιχείου -432, επέφερε αύξηση του ποσοστού των εμβρύων που εκφράζουν τη GFP στο αντιστοματικό εξώδερμα και στο ενδόδερμα ενώ δεν επηρέασε το πρότυπο έκφρασης στη βλεφαριδωτή ζώνη (Πιν.3.4). Τα στοιχεία -453 και -432 φαίνεται να δρουν ανεξάρτητα μεταξύ τους, με σκοπό την ενίσχυση και τον περιορισμό της έκφρασης του PlCoup-TF αποκλειστικά στη βλεφαριδωτή ζώνη του εμβρύου. Το συμπέρασμα αυτό προέκυψε καθώς η διπλή μετάλλαξη των στοιχείων οδήγησε σε δραματική μείωση του συνολικού ποσοστού των φθοριζόντων εμβρύων, της έντασης φθορισμού, αλλά και σε αύξηση της έκτοπικής έκφρασης της GFP στο αντιστοματικό εξώδερμα και στο ενδόδερμα (Πιν.3.4). Το αποτέλεσμα αυτό είναι αθροιστικό των αποτελεσμάτων που επάγουν οι μεταλλάξεις για κάθε ένα από τα στοιχεία αυτά χωριστά, υποδεικνύοντας την κατά πάσα πιθανότητα ανεξάρτητη δράση των μεταγραφικών παραγόντων που προσδένονται σε αυτά, παρ όλη τη γειτνίασή των. Το στοιχείο -377, (υποπεριοχή ΙΙΙ, -387 έως -334), δρα κατασταλτικά στην έκφραση του PlCoup-TF στο αντιστοματικό εξώδερμα. Η στοχευμένη μετάλλαξή του, οδήγησε σε σημαντική αύξηση του ποσοστού των εμβρύων που φθορίζουν σε αυτή την κυτταρική γραμή, χωρίς ωστόσο να επηρεάζεται το πρότυπο έκφρασης στη βλεφαριδωτή ζώνη και στο ενδόδερμα (Πιν.3.4). Κατά συνέπεια το στοιχείο -377 αναγνωρίζεται από έναν καταστολέα στο αντιστοματικό εξώδερμα, επιπρόσθετα του καταστολέα που προσδένεται στο στοιχείο Τα αποτελέσματα των στοχευμένων μεταλλάξεων συμφωνούν με τα αποτελέσματα των αντίστοιχων ελλειμάτων και δείχνουν ότι τα τρία αυτά στοιχεία είναι αυτά που απαρτίζουν την αναγκαία και ικανή ρυθμιστική μονάδα για την έκφραση του PlCoup-TF στη βλεφαριδωτή ζώνη του πλουτέα. 216

233 Συζήτηση 4.5 Ο παράγοντας AP1 δεν συμμετέχει στη ρύθμιση του PlCoup-TF Η δημιουργία διαγονιδιακών εμβρύων με τη στοχευμένη μετάλλαξη του στοιχείου -432 έδειξε ότι σε αυτό προσδένεται κάποιος παράγοντας που καταστέλλει την έκφραση του PlCoup-TF στο αντιστοματικό εξώδερμα και ενδόδερμα. Από την in silico ανάλυση της αλληλουχίας του στοιχείου αυτού, προτάθηκε ο ΑΡ1 (ο οποίος απαρτίζεται από τις πρωτεΐνες PlJun και PlFra2), ως ο πιο πιθανός παράγοντας να αναγνωρίζει το στοιχείο αυτό. Η υπόθεση ότι ο ΑΡ1 μπορεί να αναγνωρίζει το στοιχείο -432 ενισχύθηκε και από το γεγονός ότι στο παρακείμενο στοιχείο, -453, προτείνεται (επίσης από την in silico ανάλυση) η πρόσδεση ενός παράγοντα μέλους της οικογένειας Ets, που ως γνωστόν από τη βιβλιογραφία, συχνά αναγνωρίζουν στοιχεία γειτονικά του ΑΡ1, και αλληλεπιδρούν με αυτόν. Ωστόσο, σε όλες τις υπάρχουσες αναφορές ο ρόλος του AP1, είτε αυτός δρα μόνος του είτε σε συνεργασία με παράγοντες Ets, είναι πάντα ενισχυτικός και δεν αναφέρεται κατασταλτική δράση στα γονίδια στόχους του, σε αντίθεση με το ρόλο που του αποδίδεται ως καταστολέας του PlCoup-TF στο αντιστοματικό εξώδερμα και ενδόδερμα στην προκειμένη περίπτωση. Η περαιτέρω μελέτη των παραγόντων PlJun και PlFra2 στην παρούσα εργασία, αποδυνάμωσε ακόμη περισσότερο την υπόθεση του παράγοντα AP1 ως πιθανού προσδέτη στο στοιχείο -432: 1. Oι παράγοντες PlJun και PlFra2 (που απαρτίζουν τον ΑΡ1) συνεκφράζονται i) ιστοειδικά, στο σκελετό του εμβρύου και ii) χρονικά όπως προέκυψε από τα πειράματα της in situ υβριδοποίησης και της qpcr αντίστοιχα, γεγονός που υποδηλώνει τη συγκρότηση του ετεροδιμερούς και στον αχινό. Το πρότυπο έκφρασής τους θα μπορούσε να εξηγήσει έναν πιθανό κατασταλτικό ρόλο στην έκφραση του PlCoup-TF στο σκελετό του εμβρύου αλλά όχι στο ενδόδερμα και στο αντιστοματικό εξώδερμα όπως παρατηρήθηκε. 2. Η ικανότητα πρόσδεσης του παράγοντα AP1 στο στοιχείο -432, μελετήθηκε με πειράματα EMSA. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων έδειξαν ότι ενώ στο πυρηνικό εκχύλισμα του αχινού P.lividus υπάρχει κάποιος 217

234 Συζήτηση μεταγραφικός παράγοντας που αναγνωρίζει ειδικά το στοιχείο αυτό, ωστόσο δεν πρόκειται για τον ΑΡ1, αφού οι in vitro συντιθέμενες πρωτεΐνες (PlJun και PlFra2) δεν προσδένονται στο στοιχείο απόκρισης, ανεξάρτητα από το αν χρησιμοποιήθηκαν ως ομοδιμερή ή ετεροδιμερή. Η αναγνώριση του στοιχείου -432 και η μείωση της πρόσδεσης μετά τη χρησιμοποίηση του συντηρημένου ειδικού ανταγωνιστή (consjun), δεν προσδιορίζουν την ταυτότητα της πρωτεΐνης ως ΑΡ1 καθώς το στοιχείο αυτό διαφέρει σε μία μόνο βάση από το στοιχείο -432 και επομένως η μείωση της πρόσδεσης μετά την προσθήκη του σε περίσσεια είναι αναμενόμενη. Συνεπώς τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η πρωτεΐνη που αναγνωρίζει το στοιχείο -432 δεν είναι ο παράγοντας AP1. Αντίθετα, πρόκειται για μια πρωτεΐνη που καταστέλλει την έκφραση του PlCoup-TF στο ενδόδερμα και στο αντιστοματικό εξώδερμα και επομένως αναμένεται να εντοπίζεται ενδογενώς στους ιστούς αυτούς. 4.6 Ο παράγοντας PlElk ρυθμίζει θετικά την έκφραση του PlCoup-TF στη βλεφαριδωτή ζώνη Από τη σειρά των πειραμάτων με τις στοχευμένες μεταλλάξεις των στοιχείων, προκύπτει ότι ο παράγοντας που προσδένεται στο στοιχείο -453 ενισχύει την έκφραση του PlCoup-TF στη βλεφαριδωτή ζώνη. Αναμένεται επομένως, να εκφράζεται ενδογενώς στους ίδιους, τουλάχιστον, ιστούς με τον PlCoup-TF (βλεφαριδωτή ζώνη και έδρα του εμβρύου) και εκεί να ασκεί τον ενισχυτικό του ρόλο. Από την in silico ανάλυση του στοιχείου -453, προτάθηκε ως πιο πιθανός παράγοντας που αναγνωρίζει το στοιχείο αυτό, να είναι ένα μέλος της οικογένειας ETS. Η επιλογή του πλέον πιθανού από το σύνολο των παραγόντων που έχουν βρεθεί και μελετηθεί στον αχινό (11 ETS παράγοντες στον αχινό S.purpuratus), βασίστηκε στη βιβλιογραφική μελέτη του ιστοειδικού και χρονικού προτύπου έκφρασής τους. Τελικά επιλέχτηκαν να μελετηθούν περαιτέρω δύο παράγοντες, οι Elk και Pea, ως πιο πιθανοί θετικοί ρυθμιστές του Plcoup-TF. Τα αποτελέσματα της μελέτης των δύο αυτών παραγόντων οδήγησαν στα εξής συμπεράσματα: 218

235 Συζήτηση i) Τα πειράματα in situ υβριδοποίησης έδειξαν ότι και οι δύο παράγοντες εκφράζονται στο στοματικό εξώδερμα, στα πρώϊμα στάδια, και στη βλεφαριδωτή ζώνη και στην έδρα του εμβρύου, στο στάδιο του πλουτέα. Το ιστοειδικό και το χρονικό (αποτελέσματα RT-PCR και qpcr) πρότυπο έκφρασής τους μάλιστα συμπίπτει με αυτό του γονιδίου PlCoup-TF ενισχύοντας την υπόθεση ότι πρόκειται για θετικούς ρυθμιστές του. ii) Τα αποτελέσματα των πειραμάτων EMSA έδειξαν ότι το πυρηνικό εκχύλισμα των εμβρύων περιέχει κάποιον παράγοντα που αναγνωρίζει ειδικά το στοιχείο Η μείωση της πρόσδεσης παρουσία του ειδικού για τον Elk στοιχείου Cy313 και παρουσία του ειδικού πολυκλωνικού αντισώματος έναντι του παράγοντα SpElk, υποδηλώνει ότι η πρωτεΐνη που προσδένεται στο στοιχείο -453 είναι η PlElk. Παρόμοια αποτελέσματα έδωσε και η χρήση του στοιχείου Cy313 ως ανιχνευτού, ενισχύοντας την πρόταση του PlElk ως του θετικού ρυθμιστή του γονιδίου. iii) Τα αποτελέσματα των πειραμάτων EMSA στα οποία χρησιμοποιήθηκαν οι in vitro παραγόμενες πρωτεΐνες PlElk και SpElk, δείχνουν την ειδική δέσμευση των παραγόντων αυτών στο στοιχείο Το πρότυπο ανάλυσης του συμπλόκου πρωτεΐνης/στοιχείου -453 ήταν το ίδιο είτε χρησιμοποιήθηκε in vitro παραγόμενη πρωτεΐνη Elk είτε πυρηνικό εκχύλισμα, υποδηλώνοντας ότι η πρωτεΐνη του πυρηνικού εκχυλίσματος του αχινού P.lividus που αναγνωρίζει το στοιχείο -453 είναι ο παράγοντας PlElk. Το αναπτυξιακό πρότυπο έκφρασης του παράγοντα PlPea είναι παρόμοιο με του PlElk και του PlCoup-TF και εν δυνάμει ο παράγοντας PlPea θα μπορούσε και αυτός να προταθεί ως ο θετικός ρυθμιστής του γονιδίου PlCoup-TF. Η έλλειψη όμως ειδικών αντισωμάτων για τον παράγοντα Pea δεν επέτρεψε τον χαρακτηρισμό του συμπλόκου πρόσδεσης στο πυρηνικό εκχύλισμα. Επίσης, δεν παρατηρήθηκε πρόσδεση στο στοιχείο -453 όταν χρησιμοποιήθηκε η in vitro παραγόμενη πρωτεΐνη PlPea. Από τα αποτελέσματα αυτά προκύπτει ότι ο παράγοντας PlElk αλλά όχι ο PlPea είναι ο ενεργοποιητής που αναγνωρίζει το στοιχείο -453, προσδένεται σε αυτό και ρυθμίζει θετικά την έκφραση του PlCoup-TF στη βλεφαριδωτή ζώνη. 219

236 Συζήτηση Ποσοτικοποίηση των μεταγράφων PlElk και PlPea Τα αποτελέσματα των πειραμάτων in situ υβριδοποίησης, RT-PCR και qpcr για το αναπτυξιακό πρότυπο έκφρασης του γονιδίου PlElk συμφωνούν. Όσον αφορά όμως το πρότυπο έκφρασης του γονιδίου PlPea, ενώ τα αποτελέσματα in situ υβριδοποίησης και RT-PCR συμφωνούν και δείχνουν την αποικοδόμηση του μητρικού mrna στο στάδιο του βλαστιδίου, υπάρχει ασυμφωνία των αποτελεσμάτων της ποσοτικοποίησης με qpcr καθώς η αποικοδόμηση του mrna δεν είναι εμφανής. Ωστόσο, το αποτέλεσμα αυτό δεν είναι παράδοξο καθώς η ποσοτικοποίηση γίνεται με εκκινητές οι οποίοι πολλαπλασιάζουν ένα μικρό τμήμα του RNA υποστρώματος (100 έως 130 βάσεις) στο 5 άκρο του και επομένως ανιχνεύουν ακόμη και μερικώς αποικοδομημένο mrna. Σύγκριση των παραγόντων Elk και Pea μεταξύ των ειδών P.lividus και S.purpuratus Η σύγκριση των αμινοξικών αλληλουχιών των παραγόντων Elk και Pea του αχινού P.lividus με αυτές του S.purpuratus, έδειξε ομολογία της τάξης του 91% και 90% αντίστοιχα (Παράρτημα, σχήματα 29 και 35). Επίσης, το πρότυπο έκφρασής τους (ιστοειδικό και χρονικό), όπως προέκυψε από πειράματα in situ υβριδοποίησης και qpcr, είναι ταυτόσημο μεταξύ των δύο ειδών. Σύμφωνα με τα πειράματα αυτά και οι δύο παράγοντες εκφράζονται στη βλεφαριδωτή ζώνη του πλουτέα και στα δύο είδη. Ο παράγοντας Pea εκφράζεται σε πολύ χαμηλά ποσοστά στα αρχικά στάδια της ανάπτυξης, γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία πολύ μικρής ποσότητας μητρικού mrna, τόσο στον P.lividus όσο και στον S.purpuratus. Το ζυγωτικό mrna ξεκινά (και στα δύο είδη) να εκφράζεται στο στάδιο του γαστριδίου όπου εντοπίζονται και τα υψηλότερα επίπεδα. Έκτοτε ο αριθμός των μεταγράφων μειώνεται ως το στάδιο του πλουτέα. Ο παράγοντας Elk ανιχνεύεται ως μητρικός (και στα δύο είδη) και στο βλαστίδιο αυξάνει η συγκέντρωσή του υποδεικνύοντας ότι είναι πλέον ζυγωτικής προέλευσης. Σε αυτό το στάδιο μάλιστα παρατηρείται και η μεγαλύτερη συγκέντρωση των μεταγράφων. Ακολουθεί προσωρινή ελάττωση στο γαστρίδιο και επάνοδος στον πρώϊμο πλουτέα για να μειωθεί εκ νέου στα μετέπειτα στάδια. Η ταύτιση αυτή τόσο σχετικά με την ιστοειδική όσο και με τη χρονική έκφραση των παραγόντων Elk και Pea μεταξύ των δύο ειδών αχινού, υποδηλώνει 220

237 Συζήτηση ότι οι παράγοντες αυτοί είναι εξαιρετικά συντηρημένοι καθώς και ότι έχουν διατηρήσει το ρόλο τους κατά την πορεία της εξέλιξης. 4.7 Ο παράγοντας PlOtx ως πιθανός καταστολέας του PlCoup-TF στο αντιστοματικό εξώδερμα Η στοχευμένη μετάλλαξη του στοιχείου -377 έδειξε ότι στο στοιχείο αυτό προσδένεται κάποιος παράγοντας που καταστέλλει την έκφραση του PlCoup-TF στο αντιστοματικό εξώδερμα. Η ικανότητα ειδικής πρόσδεσης παραγόντων του πυρηνικού εκχυλίσματος του αχινού P.lividus στα στοιχεία -377 και consotx (πρότυπο Otx στοιχείο), έδειξε την παρουσία ενός παράγοντα που αναγνωρίζει με παρόμοιο πρότυπο και τα δύο αυτά στοιχεία. Ο παράγοντας αυτός, φαίνεται να είναι ο PlOtx. H πρότυπη αλληλουχία consotx ασκεί ισχυρότερη ανταγωνιστική δράση έναντι της αλληλουχίας -377 όταν αυτές χρησιμοποιηθούν στην ίδια συγκέντρωση. Το αποτέλεσμα αυτό ισχυροποιεί την υπόθεση του Otx ως παράγοντα πρόσδεσης καθώς αναμένεται να προσδένεται με μεγαλύτερη συγγένεια στο πρότυπο στοιχείο απόκρισής του. Αν και ο πυρήνας και των δύο στοιχείων απόκρισης είναι ταυτόσημος, TAATCC, τα πέριξ νουκλεοτίδια διαφέρουν και μορφοποιούν τη συγγένεια του ως προς το στοιχείο αυτό (οι αλληλουχίες παρατίθενται στο σχήμα 1 του παραρτήματος). Στα πειράματα EMSA μάλιστα, σχηματίστηκαν δύο ζώνες οι οποίες αντιστοιχούν στα σύμπλοκα που σχηματίζουν με τα στοιχεία απόκρισης (-377 και consotx) οι δύο ισομορφές του Otx, Otxα και Otxβ. Ανάλογα πειράματα που έχουν πραγματοποιηθεί στο παρελθόν (Yuh C. et al., 2001) χρησιμοποιώντας in vitro συντιθέμενες πρωτεΐνες ή πυρηνικό εκχύλισμα του S.purpuratus και ως ιχνηθέτη το στοιχείο CII (TAATCC), στοιχείο απόκρισης του Otx το οποίο απαντάται στην ανοδική περιοχή του γονιδίου SpecIIa, έδειξαν παρόμοιο πρότυπο πρόσδεσης των δύο ισομορφών του Otx. Τα αποτελέσματα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα ότι ο παράγοντας PlOtx αναγνωρίζει και προσδένεται στο στοιχείο Aποτελέσματα in situ υβριδοποίησης σε έμβρυα S.purpuratus, δείχνουν ότι το ζυγωτικό mrna (Otx1/2β) ανιχνεύεται αποκλειστικά στο στοματικό εξώδερμα. Από την άλλη, βιβλιογραφικά δεδομένα που αποδίδουν θετικό ρυθμιστικό ρόλο στον Otx 221

238 Συζήτηση σε γονίδια του αντιστοματικού εξωδέρματος (όπως των Spec2a, HpArs) υποδεικνύουν την παρουσία του και στο αντιστοματικό εξώδερμα. Εφόσον τα PlCoup-TF μετάγραφα παύουν να ανιχνεύονται στα κύτταρα που θα διαφοροποιηθούν αργότερα στο αντιστοματικό εξώδερμα, από το στάδιο του βλαστιδίου και μετά (όπως απέδειξαν τα πειράματα της in situ υβριδοποίησης), αναμένεται η καταστολή του σε αυτά τα κύτταρα, να γίνεται σε αυτό το στάδιο και συγκεκριμένα από την ισομορφή β3 του Otx. Η ισομορφή α, που είναι μητρική, βρίσκεται σε ελάχιστη ποσότητα τη συγκεκριμένη χρονική στιγμή και δεν αναμένεται να είναι λειτουργική. Εξάλλου, ανιχνεύεται στο στοματικό εξώδερμα και στο ενδόδερμα. Αντίθετα, η ισομορφή β και συγκεκριμένα η β3, βρίσκεται σε πολύ υψηλά επίπεδα (εισαγωγή, εικ.49) στο στάδιο του βλαστιδίου, στο οποίο ο Otx εκφράζεται σε όλα τα κύτταρα άρα και σε αυτά που θα διαφοροποιηθούν στο αντιστοματικό εξώδερμα, ο Coup-TF εκφράζεται σε άλλους ιστούς, πλην του αντιστοματικού εξωδέρματος. Αν λοιπόν ο παράγοντας Otx ρυθμίζει αρνητικκά το γονίδιο PlCoup-TF στο αντιστοματικό εξώδερμα, αυτό πρέπει να συμβαίνει νωρίς, στο στάδιο του βλαστιδίου, πριν την μορφολογική διαφοροποίηση του εξωδέρματος. Στα επόμενα στάδια τα μετάγραφα PlCoup-TF και Otx ανιχνεύονται στο στοματικό εξώδερμα και επομένως δεν να θεωρηθεί ο Otx ως καταστολέας του PlCoup-TF στο αντιστοματικό εξώδερμα. Στην ανωτέρω ερμηνεία λαμβάνεται ως δεδομένο ότι η πρωτεΐνη Otx βρίσκεται και δρά στα κύτταρα στα οποία ανιχνεύεται το mrna. Η παραδοχή αυτή είναι παρακινδυνευμένη, εφ όσον δεν γνωρίζουμε τον ιστοειδικό εντοπισμό της πρωτεΐνης στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια, το πόσο σταθερή είναι η πρωτεΐνη (δηλ. το ρυθμό αποικοδόμησής της) και το κατά πόσο είναι ενεργή ως μεταγραφικός παράγοντας ανεξαρτήτως κυτταρικού τύπου και αναπτυξιακού σταδίου. Η ερμηνεία της ρύθμισης του PlCoup-TF από τον παράγοντα Otx βασίστηκε επίσης σε βιβλιογραφικά δεδομένα που περιγράφουν το πρότυπο έκφρασης του παράγοντα στο είδος S.purpuratus. Η μοναδική πληροφορία που υπάρχει για το ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του Otx στο είδος P.lividus, είναι ότι στο στάδιο του γαστριδίου ο παράγοντας ανιχνεύεται στο στοματικό εξώδερμα. Μέχρι ωστόσο, να αποσαφηνιστεί η ιστοειδικότητα της έκφρασής του στο στάδιο του πλουτέα και στο είδος αυτό, δεν είναι δυνατό να αναφέρεται με βεβαιότητα ότι ο PlOtx ρυθμίζει το γονίδιο του PlCoup-TF στο αντιστοματικό εξώδερμα. Ωστόσο, τα βιβλιογραφικά δεδομένα που αποδίδουν στον Οtx ενεργοποιητικό ρόλο γονιδίων του αντιστοματικού 222

239 Συζήτηση εξωδέρματος (όπως των Spec2a και HpArs) οδηγούν στο συμπέρασμα ότι κάποια ισομορφή του εκφράζεται και σε αυτή την κυτταρική γραμμή, ή ότι η πρωτεΐνη είναι πολύ σταθερή και ενεργή στο αντιστοματικό εξώδερμα του πλουτέα, πολύ αργότερα από την αποικοδόμηση του mrna. Η in silico ανάλυση του στοιχείου -377 (και της αλληλουχίας που το περιβάλλει), πρότεινε εκτός από τον Otx και τον παράγοντα Gsc ως πιθανό μεταγραφικό παράγοντα που αναγνωρίζει το στοιχείο αυτό. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, ο παράγοντας Gsc δρα ως καταστολέας και εκφράζεται στο στοματικό εξώδερμα του εμβρύου. Αναγνωρίζει ακριβώς την ίδια αλληλουχία με τον Otx και μάλιστα ανταγωνίζεται με αυτόν για την πρόσδεσή του σε ρυθμιστικά στοιχεία γονιδίων του στοματικού εξωδέρματος, καταστέλλοντας έτσι την έκφρασή τους εκεί. Ο εντοπισμός του Gsc αποκλειστικά και μόνο στο στοματικό εξώδερμα αποκλείει την πιθανότητα καταστολής του PlCoup-TF στο αντιστοματικό εξώδερμα (δράση την οποία έχει η πρωτεΐνη η οποία αναγνωρίζει το στοιχείο -377). Ένα άλλο στοιχείο που μειώνει ακόμη περισσότερο την πιθανότητα να είναι ο Gsc ο παράγοντας που αναγνωρίζει το στοιχείο -377, σχετίζεται με το πρότυπο ανάλυσης του συμπλόκου που σχηματίζει με το στοιχείο TAATCC (πυρήνας του στοιχείου -377) σε πειράματα EMSA. Από τη βιβλιογραφία προκύπτει ότι προσδένεται στο στοιχείο απόκρισης TAATCC/T που βρίσκεται ανοδικά του γονιδίου SpecIIa σχηματίζοντας μία μόνο ζώνη συμπλόκου (Angerer L. et al. 2001), γεγονός το οποίο έρχεται σε αντίθεση με τις δύο ζώνες συμπλόκων που παρουσιάζει η πρωτεΐνη του πυρηνικού εκχυλίσματος όταν προσδένεται στο στοιχείο Εκτός από τους παράγοντες Otx και Gsc ένας άλλος παράγοντας, ο GataE, αναγνωρίζει την αλληλουχία TAATCT. Η αλληλουχία αυτή διαφέρει μόνο ως προς ένα νουκλεοτίδιο αν συγκριθεί με το στοιχείο -377 (TAATCC). Ωστόσο, ο παράγοντας αυτός δεν προτείνεται από την in silico ανάλυση ως πιθανό πρόσδεμα του στοιχείου Ο παράγοντας GataE είναι ζυγωτικής προέλευσης, ανήκει στους μεταγραφικούς παράγοντες με επικράτεια πρόσδεσης στο DNA τύπου δακτύλου-zn ++ και έχει κατασταλτική ή επαγωγική δράση. Ο SpGataE δρα σε ένα κομβικό σημείο στο δίκτυο ρύθμισης του ενδομεσοδέρματος, αφού είναι άμεσος ενεργοποιητής των γονιδίων που κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες συμπεριλαμβανομένων των ενδοδερμικών μεταγραφικών παραγόντων foxa, brachyury και Otx. Είναι πιθανόν, ο 223

240 Συζήτηση SpGataΕ να καταστέλλει γονίδια που εκφράζονται στο εξώδερμα και να ενεργοποιεί την έκφραση γονιδίων του ενδομεσοδέρματος. Από πειράματα in situ υβριδοποίησης που έγιναν στον αχινό S.purpuratus (Lee et al. 2004) προέκυψε ότι τα μετάγραφά του εντοπίζονται 15 ώρες μετά τη γονιμοποίηση στα δευτερογενή μεσεγχυματικά κύτταρα και στο στάδιο του μεσεγχυματικού βλαστιδίου στη φυτική πλάκα (ενδομεσόδερμα). Κατά τη γαστριδίωση ανιχνεύεται στην άκρη του αρχεντέρου και στο βλαστοπόρο, ενώ στο πρίσμα στο μέσο και οπίσθιο έντερο και στον πλουτέα στο στομάχι και στους κοιλωματικούς σάκκους. Επομένως, ακόμη και αν ο παράγοντας SpGataE δρα ως καταστολέας, δεν ανιχνεύεται στο αντιστοματικό εξώδερμα σε κανένα αναπτυξιακό στάδιο και συνεπώς δεν μπορεί να δικαιολογήσει πιθανή καταστολή του PlCoup-TF σε αυτή την κυτταρική στοιβάδα. Ένα άλλο στοιχείο που αποκλείει τον GataE είναι πειράματα EMSA (Kiyama et al. 2005) που αποδεικνύουν ότι ο παράγοντας αυτός αν και δημιουργεί σύμπλοκο με το στοιχείο TAATCT δεν αναγνωρίζει το στοιχείο TAATCC (στοιχείο -377). Από τα αποτελέσματα των πειραμάτων της παρούσας εργασίας αποδόθηκε στον Otx κατασταλτικός ρόλος δράσης. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με την πλειοψηφία των μέχρι σήμερα βιβλιογραφικών δεδομένων όπου ο Otx επάγει τα γονίδια στόχους του στις κυτταρικές γραμμές που εκφράζεται. Το γονίδιο Otx κωδικοποιεί τουλάχιστο δύο πρωτεΐνες, την 1 και 2. Δεν είναι ωστόσο γνωστό αν έχουν και οι δύο επαγωγικό ρόλο. Επιπλέον, η παρουσία της Otx3 πρωτείνης στον ποντικό που καταστέλλει τα γονίδια στόχους της αποτελεί μία περίπτωση Otx πρωτεΐνης με αρνητικό ρυθμιστικό ρόλο. Άλλωστε, ένας παράγοντας (όπως και ο Coup-TF) δεν έχει αποκλειστικά θετικό ή αρνητικό ρόλο, αλλά ο ρόλος του εξαρτάται από i) το συνδυασμό των ρυθμιστικών στοιχείων που υπάρχουν στα γονίδια στόχους ii) τον ιστό που εκφράζεται και iii) τη χρονική στιγμή της δράσης του. 224

241 Συζήτηση 4.8 Ο παράγοντας που αναγνωρίζει το στοιχείο -432 Καθώς τα αποτελέσματα των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν απέκλεισαν τον AP1 ως τον παράγοντα που αναγνωρίζει το στοιχείο -432, αναμένεται να βρεθεί ποιός παράγοντας προσδένεται σε αυτό. Η στοχευμένη μετάλλαξη του στοιχείου -432, επέφερε αλλαγή τριών βάσεων στον πυρήνα του στοιχείου (GAC που μετατράπηκαν σε AGA). Ο χαρακτηρισμός μιας αλληλουχίας ως στοιχείου απόκρισης από τις βάσεις δεδομένων δεν σημαίνει οπωσδήποτε ότι το στοιχείο είναι και λειτουργικό, δηλαδή ότι όντως αναγνωρίζεται από κάποιον πράγοντα. Το γεγονός όμως ότι η μετάλλαξή του επέφερε μετατροπή στο φαινότυπο των διαγονιδιακών εμβρύων υποδηλώνει ότι τελικά πρόκειται για λειτουργικό ρυθμιστικό στοιχείο. Ωστόσο, οι βάσεις που μεταλλάχθηκαν ενδέχεται να αποτελούν τμήμα ενός άλλου στοιχείου ανοδικότερα ή καθοδικότερα αυτού καθώς ως γνωστόν σε πολλές περιοχές του DNA τα στοιχεία αλληλεπικαλύπτονται μεταξύ τους. Περαιτέρω in silico ανάλυση οδήγησε στο συμπέρασμα ότι άλλες δύο πρωτεΐνες, οι GCN4 και YB1 πιθανόν να αναγνωρίζουν την αλληλουχία του στοιχείου Ωστόσο, οι πρωτεΐνες αυτές δεν φαίνεται να υπάρχουν στον αχινό καθώς τα ομόλογα γονίδιά τους δεν έχουν μέχρι σήμερα περιγραφεί. Από τα αποτελέσματα των στοχευμένων μεταλλάξεων συμπεραίνει κανείς ότι ο παράγοντας που αναζητάται, αναμένεται να εκφράζεται ενδογενώς στο ενδόδερμα και στο αντιστοματικό εξώδερμα και να καταστέλλει την έκφραση του PlCoup-TF στους ιστούς αυτούς. Πραγματοποιήθηκε λεπτομερής μελέτη των παραγόντων που έχουν προταθεί στα ρυθμιστικά δίκτυα του αχινού αλλά η κατάληξη σε κάποιον, ως πιθανό προσδέτη του στοιχείου -432, υπήρξε εξαιρετικά δύσκολη καθώς ενώ ένα πλήθος παραγόντων παρουσιάζει το επιθυμητό πρότυπο έκφρασης, το στοιχείο που αναγνωρίζουν είναι διαφορετικό από το Ένας μεταγραφικός παράγοντας υποψήφιος να αναγνωρίζει το στοιχείο -432 είναι ο παράγοντας IrxA. Πρόκειται για ομοιοτική πρωτεΐνη ζυγωτικής προέλευσης της οποίας τα μετάγραφα ξεκινούν να ανιχνεύονται από τις 15 ώρες και μετά. Στο μεσεγχυματικό βλαστίδιο ανιχνεύονται στην περιοχή veg1 και από το στάδιο του γαστριδίου στο αντιστοματικό εξώδερμα και στο ενδόδερμα (προφορική επικοινωνία με το εργαστήριο του Dr. Eric Davidson). Κύριος ρόλος του είναι να δρα καθοδικά 225

242 Συζήτηση του BMP2/4 και να καταστέλλει γονίδια χαρακτηριστικά του στοματικού εξωδέρματος σε άλλες περιοχές όπως στο αντιστοματικό εξώδερμα. Ο IrxA δεν έχει μελετηθεί καλά στον αχινό αλλά και σε κανέναν άλλον οργανισμό. Τα μόνα γνωστά δεδομένα μέχρι σήμερα είναι η χρονική και ιστοειδική έκφρασή του καθώς και η επίδρασή του σε γονίδια καθοδικά αυτού, ύστερα από χρήση αντινοηματικών ολιγονουκλεοτιδίων. Επίσης δεν υπάρχουν αρκετές πληροφορίες για τη ρυθμιστική αλληλουχία την οποία αναγνωρίζει στα γονίδια στόχους του. Επομένως, αναμένεται να επιβεβαιωθεί με περαιτέρω πειράματα κατά πόσο ο IrxA αναγνωρίζει το στοιχείο και ρυθμίζει τον PlCoup-TF. 4.9 Η ένταξη του PlCoup-TF και των ρυθμιστών του στο γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο του εξωδέρματος Η αναγνώριση των παραγόντων που ρυθμίζουν (ενεργοποιώντας ή καταστέλλοντας) το γονίδιο PlCoup-TF κατέστησε δυνατή την ένταξη των γονιδίων που τους κωδικοποιούν στο ήδη υπάρχον γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο του εξωδέρματος (Εικ.4.1). Το γονίδιιο PlCoup-TF, εκφράζεται στο στοματικό εξώδερμα και συγκεκριμένα στη βλεφαριδωτή ζώνη στο στάδιο του πλουτέα. Για το λόγο αυτό τοποθετήθηκε στο γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο της βλεφαριδωτής ζώνης (Eικ.4. 1, ροζ κουτί). Στο δίκτυο αυτό προστέθηκαν τρία γονίδια, τα PlCoup-TF, PlElk και PlPea. Τα γονίδια αυτά, αναγράφονται με μαύρα γράμματα και κάθε θετική ρύθμιση αναπαρίσταται με βέλος, η κορυφή του οποίου καταλήγει στο γονίδιο που ρυθμίζεται θετικά, ενώ κάθε αρνητική ρύθμιση αναπαρίσταται με απλή γραμμή. Οι διακεκομμένες γραμμές έχουν τοποθετηθεί για να δηλώσουν τη σύνδεση μεταξύ των γονιδίων. Ο παράγοντας PlElk τοποθετήθηκε και αυτός στην ίδια περιοχή του γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου με τον PlCoup-TF και ως ενεργοποιητής του συνδέθηκε άμεσα με το γονίδιο αυτό με βέλος (Εικ. 4.1, ροζ κουτί). Ο παράγοντας PlPea τοποθετήθηκε και αυτός στην περιοχή της βλεφαριδωτής ζώνης, καθώς ανιχνεύεται ενδογενώς σε αυτήν, αλλά δε συνδέθηκε με κάποιον τρόπο με τον PlCoup-TF αφού όπως φάνηκε από τα πειράματα EMSA δεν προσδένεται στο 226

243 Συζήτηση στοιχείο -453 και επομένως δε συμμετέχει στη ρύθμισή του (τουλάχιστον μέσω αυτού του στοιχείου απόκρισης). Από άλλα πειράματα του εργαστηρίου μας (Ιωάννης Τσιρώνης, αδημοσίευτα αποτελέσματα) βρέθηκε ότι η καταστολή της έκφρασης του PlCoup-TF με τη χρήση morpholinos, οδήγησε σε καταστολή των γονιδίων onecut και dri. Τα δύο αυτά γονίδια είχαν ήδη τοποθετηθεί στο γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο της βλεφαριδωτής ζώνης και συνδεθεί μεταξύ τους κατά τέτοιο τρόπο ώστε ο onecut να ρυθμίζει θετικά το dri. Εφόσον τα δύο αυτά γονίδια εκφράζονται ενδογενώς στη βλεφαριδωτή ζώνη φαίνεται ότι ο Coup-TF, που δρα κατά κύριο λόγο ως καταστολέας, καταστέλλει έναν άλλον καταστολέα R, ο οποίος ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση του onecut. Με το μοτίβο αυτό της διπλής καταστολής επιτυγχάνεται η έκφραση του γονιδίου στόχου μόνο στη συγκεκριμένη κυτταρική γραμμή στην οποία καταστέλλεται ο δεύτερος καταστολέας. Ο παράγοντας Otx είχε ήδη ενταχθεί στο γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο και μάλιστα σε όλους τους τύπους του εξωδέρματος (στοματικό, αντιστοματικό εξώδερμα και βλεφαριδωτή ζώνη). Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας, έδειξαν ότι ο Otx καταστέλλει την έκφραση του PlCoup-TF στο αντιστοματικό εξώδερμα. Γι αυτό τα δύο αυτά γονίδια συνδέθηκαν μεταξύ τους με απλή γραμμή στην περιοχή του αντιστοματικού εξωδέρματος (Eικ. 4.1, πράσινο κουτί). Βάσει του ήδη υπάρχοντος γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου, το γονίδιο του Otx φαίνεται να καταστέλλεται στο αντιστοματικό εξώδερμα (Εικ.4.1). Ωστόσο, διατηρήθηκε ο ρόλος που του αποδόθηκε μέσω της συγκεκριμένης διατριβής ως πιθανός καταστολέας του PlCoup- TF στο αντιστοματικό εξώδερμα, όπως συζητήθηκε παραπάνω, γι αυτό συνδέθηκε με το γονίδιο του PlCoup-TF με διακεκομμένη γραμμή. Παλαιότερα πειράματα ΕMSA που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο έδειξαν ότι ο PlCoup-TF προσδένεται σε ένα στοιχείο απόκρισης που βρίσκεται εντός της καθοδικής περιοχής του. Το αποτέλεσμα αυτό δείχνει ότι ο PlCoup-TF πιθανόν να αυτορυθμίζεται και συγκεκριμένα να αυτοκαταστέλλεται. Η αυτοκαταστολή αυτή αποδόθηκε με απλή γραμμή στο γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο (Εικ 4.1). Ωστόσο, η υπόθεση αυτή απαιτεί περαιτέρω πειράματα προκειμένου να επιβεβαιωθεί. Ο παράγοντας που προσδένεται στο στοιχείο -432 δε βρέθηκε. Ενδεικτικά, έχει προταθεί η πρωτεΐνη IrxA η οποία είχε ήδη τοποθετηθεί στο δίκτυο στην περιοχή του αντιστοματικού εξωδέρματος και σύμφωνα με τη βιβλιογραφία ο ρόλος της είναι 227

244 Συζήτηση να καταστέλλει την έκφραση γονιδίων της βλεφαριδωτής ζώνης, στο αντιστοματικό εξώδερμα. Επειδή δεν έχει αποδειχτεί ακόμη ο ρόλος της και η σύνδεσή της με τον PlCoup-TF γι αυτό τα δύο γονίδια συνδέθηκαν με διακεκομμένη απλή γραμμή, υποδηλώνοντας τον πιθανό κατασταλτικό ρόλο στο γονίδιο του PlCoup-TF, που ωστόσο αναμένεται να αποδειχθεί. Elk Coup-tf R Pea Coup-tf Εικ. 4.1 Το προτεινόμενο ρυθμιστικό δίκτυο του εξωδέρματος στον αχινό μετά την προσθήκη των νέων γονιδίων. Τα γονίδια που προστέθηκαν αναγράφονται με μαύρους χαρακτήρες. Κάθε θετική ρύθμιση δηλώνεται με βέλος και κάθε αρνητική με απλή γραμμή. Προτεινόμενη σύνδεση δηλώνεται με διακεκομμένη γραμμή. Τα νέα γονιδια που προστέθηκαν είναι τα PlCoup-TF, PlElk και PlPea. Επίσης, προτάθηκε νέα σύνδεση με το ήδη υπάρχον στο δίκτυο, γονίδιο Otx. Ο παράγοντας AP1 ο οποίος απαρτίζεται από τις πρωτεΐνες Jun και Fra2, ανιχνεύεται στο σκελετό του εμβρύου, δε φάνηκε να έχει καμία σχέση στη ρύθμιση του PlCoup-TF όπως έδειξαν τα αποτελέσματα των αντιδράσεων EMSA και γι αυτό δεν έχει συνδεθεί στο ρυθμιστικό δίκτυο του εξωδέρματος. Ωστόσο, κανένα από τα δύο γονίδια δεν έχει μέχρι σήμερα μελετηθεί στον αχινό και δεν έχει ενταχθεί σε κάποιο από τα ήδη υπάρχοντα ρυθμιστικά δίκτυα. Βάσει της ιστοειδικής και χρονικής έκφρασής τους, που ανακαλύφθηκε με τα πειράματα της παρούσας εργασίας, μπορούν πλέον και τα δύο αυτά γονίδια να ενταχθούν στο ρυθμιστικό δίκτυο των σκελετογόνων μεσεγχυματικών κυττάρων. Η ένταξή των παραγόντων αυτών θα συμβάλει σε μια πιο άρτια εικόνα του συγκεκριμένου ρυθμιστικού δικτύου. 228

245 Συζήτηση 4.10 Μελλοντικά πειράματα Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να βρεθεί ο τρόπος ρύθμισης του γονιδίου PlCoup-TF με σκοπό την ένταξη του γονιδίου αυτού αλλά και των ρυθμιστών του στο γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο του εξωδέρματος του αχινού. Από την παρούσα μελέτη ανακαλύφθηκε ο παράγοντας PlElk ως θετικός ρυθμιστής του PlCoup-TF στο στοματικό εξώδερμα και πιθανόν ο Otx ως καταστολέας του στο αντιστοματικό εξώδερμα. Για να επιβεβαιωθεί ότι ο Otx είναι η πρωτείνη του πυρηνικού εκχυλίσματος του P.lividus που αναγνωρίζει το στοιχείο - 377, κρίνεται σκόπιμη, αφενός η μελέτη της ιστοειδικότητας της έκφρασής του με πειράματα in situ υβριδοποίησης, αφετέρου, η in vitro σύνθεση της πρωτεΐνης και ο έλεγχος της πρόσδεσης αυτής στο στοιχείο -377, ή και η χρήση ειδικού αντισώματος έναντι του Otx. Ειδικά για τα πειράματα in situ υβριδοποίησης κρίνεται σκόπιμη η παρασκευή ενός ιχνηθέτη που θα αναγνωρίζει και τις τρεις ισομορφές του Otx. Ωστόσο, θα ολοκλήρωνε ακόμη περισσότερο τη μελέτη η επιβεβαίωση της ταυτότητας των παραγόντων που αναγνωρίζουν τα στοιχεία -453, -432 και -377 με λειτουργικά πειράματα όπως τα εξής: 1) Αναχαίτιση της εμβρυϊκής έκφρασης του PlCoup-TF και των ρυθμιστών του με ένεση σε ωάρια, τροποποιημένων αντινοηματικών ολιγονουκλεοτιδίων (morpholinos) και ακολούθως in situ υβριδοποίηση και 2) Αλληλούχιση του mrna εμβρύων στα οποία έχει κατασταλεί ένας μεταγραφικός παράγοντας για την ανακάλυψη των γονιδίων στόχων του. 1. Αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια συμπληρωματικά προς το mrna του οποίου την έκφραση επιθυμούμε να καταστείλουμε, ελαττώνουν δραστικά την μετάφραση του συγκεκριμένου mrna (knock down). Η τεχνική αυτή εφαρμόζεται με μεγάλη επιτυχία σε έμβρυα αχινού. Τα αποτελέσματα της αναχαίτισης της έκφρασης ενός ρυθμιστικού γονιδίου μπορούν να εξακριβωθούν με διάφορους τρόπους. Εάν είναι γνωστά τα γονίδια στόχοι (π.χ. PlCoup-TF), τότε η αναμενόμενη τροποποίηση της έκφρασης κάθε γονιδίου στόχου αναγνωρίζεται ιστοειδικά με in situ υβριδοποίηση και ποσοτικά με qpcr. Με τα πειράματα αυτά δίνεται η δυνατότητα να αναγνωριστεί η επαγωγική ή κατασταλτική δράση των ρυθμιστών ενός γονιδίου. Συγκεκριμένα, η αναχαίτιση με morpholino του επαγωγικού παράγοντα PlElk 229

246 Συζήτηση θα οδηγήσει σε περιορισμό της ιστοειδικής έκφρασης του Coup-TF και άλλων γονιδίων στόχων και μείωση του mrna του. Αντίθετα η αναχαίτιση ενός κατασταλτικού παράγοντα, όπως ο Otx, θα οδηγήσει σε διεύρυνση του πεδίου ιστοειδικής έκφρασης του PlCoup-TF και συνεπαγόμενη αύξηση του mrna. 2. Άλλα άγνωστα γονίδια στόχοι του PlCoup-TF ή ενός ρυθμιστού του, μπορούν επίσης να ανιχνευθούν με αλληλούχιση ολικού RNA (RNA seq), όπου αναγνωρίζονται διαφορές στο σύνολο των εμβρυϊκών μεταγράφων μεταξύ κανονικών εμβρύων και εμβρύων που έχουν ενεθεί με το ειδικό αντινοηματικό ολιγονουκλεοτίδιο. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών θα καταστήσουν δυνατή την εύρεση της θέσης των υπό μελέτη μεταγραφικών παραγόντων (PlCoup-TF και ρυθμιστών του), αλλά και πολλών άλλων στο ρυθμιστικό δίκτυο του εξωδέρματος του εμβρύου του αχινού. 3. Από τα πειράματα EMSA που πραγματοποιήθηκαν για το στοιχείο αποδείχτηκε ότι υπάρχει μία πρωτεΐνη του πυρηνικού εκχυλίσματος που το αναγνωρίζει και προσδένεται με ειδικό τρόπο. Ωστόσο, η ταυτότητα του παράγοντα αυτού δεν έχει ακόμη βρεθεί. Η υπόθεση του IrxA ως πιθανού προσδέτη αναμένεται να επιβεβαιωθεί. Η αλληλουχία του είναι γνωστή από τη βάση δεδομένων με αποτέλεσμα να είναι δυνατή η καταστολή της έκφρασης του γονιδίου PlIrxA με αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια και ο έλεγχος της επίδρασής του στο γονίδιο του Plcoup-TF με in situ υβριδοποίηση του τελευταίου. Εάν όντως η καταστολή του PlIrxA επηρεάζει τον Plcoup-TF θα επιβεβαιωθεί περαιτέρω η ταυτότητά του με απομόνωση του cdna, in vitro σύνθεση της πρωτεΐνης και έλεγχο της ικανότητας αναγνώρισης του στοιχείου -432 με πειράματα EMSA. Εναλλακτικά, η ταυτοποίηση της πρωτεΐνης που αναγνωρίζει το στοιχείο -432, καθώς και των άλλων παραγόντων, μπορεί να πραγματοποιηθεί με καθαρισμό με χρωματογραφία συγγένειας χρησιμοποιώντας το στοιχείο -432, και αλληλούχηση των επιμέρους πεπτιδίων. Καθώς η αλληλουχία του γονιδιώματος του αχινού S.purpuratus είναι πλέον γνωστή είναι δυνατή η σύγκριση της αμινοξικής αλληλουχίας ενός πεπτιδίου με τις ήδη υπάρχουσες στη βάση δεδομένων και η εξαγωγή συμπερασμάτων για την ταυτότητα της πρωτεΐνης. 230

247 Παράρτημα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Σχήμα 1. Αλληλουχίες των στοιχείων απόκρισης που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα EMSA. I (ETS): CCTAATCCGGGAAGTATA CACA II (APOC): TATACACATTAATGACTCTACAATCA III (OTX): GTTGAAATAGATTAATCCAGAAG IV (OTX): AGTTCAAAAGATTACACGAGAA V (GATA): GGAATTGCAGATAAGAAAAAAG VI. cons. Jun: TTGGTGAGTCATATG VII. cons. AP1: CGCTTGATGACTCAGCCGGAA VIII. Cy313: AGTATCAACAGGAAGTAGGTCCTAGCA IX. Ν3: CTAGCGAAAGGTCAGCGGGTCAAATGTTTG X. consotx (Klein element): ATTAATACCTGACTTAATCCGAATATGTGC ΧΙ. Octamer στοιχείο CCAATATACCTCATGAACTTAGC 231

248 Παράρτημα Σχήμα 2. Απεικόνιση της ακριβούς θέσης υβριδοποίησης των εκκινητών (πράσινα και γκρι βέλη) που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των διαδοχικών ανοδικών ελλειμμάτων a1 - a5 καθώς και των εσωτερικών ελλειμμάτων 1 4, στην αλληλουχία της περιοχής a. Στα μπλε κουτιά απεικονίζονται οι πιθανοί μεταγραφικοί παράγοντες που αναγνωρίζουν διάφορα στοιχεία απόκρισης όπως προτείνονται από το πρόγραμμα ΤΕSS. Με καφέ βέλος (στη θέση -212) σημαίνεται το σημείο έναρξης της περιοχής a. Με κεφαλαίο Α (κόκκινο) σημαίνεται το πιο συχνό σημείο έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου PlCoup-tf. Rup1 a1 a1r a2r a2 a3 a3r -212 a4 a4r a5 Otx Gata-3 232

249 Παράρτημα Σχήμα 3. Αλληλουχία του βασικού υποκινητή Endo16 και του γονιδίου της gfp που περιέχονται στον πλασμιδιακό φορέα EpGFPII. Ο εκκινητής GFPright υβριδοποιείται στην polya ουρά της GFP και έχει σημανθεί με ροζ χρώμα. Το 5 άκρο του φέρει την αλληλουχία CTAAGATCT που αποτελεί τη θέση αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού BglII. GFPright primer 233

250 Παράρτημα Σχήμα 4. Αλληλουχία και χάρτης περιορισμού της αλληλουχίας a (A) και του πλασμιδιακού φορέα EpGFPII (Β). A. Αλληλουχία τμήματος a AGCAGGACGAAGGATTTGAGTTAATTTCGATACAAGTTCGTTGTGGAGTGGTATTTCAATTTCCATAGAAGCC TAATCCGGGAAGTATACACATTAATGACTCTACAATCAATAGAAATTATAAAATTGTGTGTCATTTTGTTGAA ATAGATTAATCCAGAAGTTGCATGATATTGTTGTTCGTCTGAGAATATTAACCCGGAGAATAACTTGTGATGT TAAACAAAAAGTTCACGTTTGAGCTCCGAATACCAGTAATTAATTTGCTCTATTATGTTATTGGATTCAACAT CACATTAATTCCGGTCTTCAGAAAGTTCAA Χάρτης περιορισμού τμήματος a 234

251 Παράρτημα B. Αλληλουχία πλασμιδιακού φορέα EpGFPII GGTACCGAGCTCTTACGCGTGAATTCACTAGTAGATCTCCCGGGTTAAACTGTTTGAGTTTCGTCTCCTGATTGTGCTATCAAAGA CAAAGGGGTGTAACTTTACCCCCCTCATCAAGAGCGGAGGGTTAAAtAGAGAAAgACTGGTcgAGGACAgGTCATAATATTGCTAA TTTTTAAGCTTATCATCATGTGTGACGACGACGTCGCCGCTCTTGTCGTCGACAACGGATCTgcggccgccgccaccatgagcaag ggcgaggaactgttcactggcgtggtcccaattctcgtggaactggatggcgatgtgaatgggcacaaattttctgtcagcggaga gggtgaaggtgatgccacatacggaaagctcaccctgaaattcatctgcaccactggaaagctccctgtgccatggccaacactgg tcactaccttcacctatggcgtgcagtgcttttccagatacccagaccatatgaagcagcatgactttttcaagagcgccatgccc gagggctatgtgcaggagagaaccatctttttcaaagatgacgggaactacaagacccgcgctgaagtcaagttcgaaggtgacac cctggtgaatagaatcgagctgaagggcattgactttaaggaggatggaaacattctcggccacaagctggaatacaactataact cccacaatgtgtacatcatggccgacaagcaaaagaatggcatcaaggtcaacttcaagatcagacacaacattgaggatggatcc gtgcagctggccgaccattatcaacagaacactccaatcggcgacggccctgtgctcctcccagacaaccattacctgtccaccca gtctgccctgtctaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtcctgctggagtttgtgaccgctgctgggatcacacatggca tggacgagctgtacaagtgagcggccgcggctcgaggctctagagtcggggcggccggccgcttcgagcagacatgataagataca TTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTA ACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTT TTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGC TCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGC AGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTA ATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGC CGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGA CAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTG TCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAA GCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGAC ACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGG TGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAG CTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTC AAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCA AAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAG TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGA TAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCA GCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCG GGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGT TTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCC TTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGT CATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCT CTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGA AAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTT CACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCA TACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAAT AAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGT GGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCG CCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTT GATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAG TGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCT ATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTGCCATTCGCCATTC AGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCCCAAGCTACCATGATAAGTAAGTAATAT TAAGGTACGGGAGGTACTTGGAGCGGCCGCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGAT AGTACTAACATACGCTCTCCATCAAAACAAAACGAAACAAAACAAACTAGCAAAATAGGCTGTCCCCAGTGCAAGTGCAGGTGCCA GAACATTTCTCTATCGATA Black small characters: GFP coding sequence; green: Endo16 Basal Promoter; red: CyIIa 5 UTR and start of translation; blue: SV40 PolyA 235

252 Παράρτημα Χάρτης περιορισμού πλασμιδιακού φορέα EpGFPII Πολυσυνδέτης του φορέα EpGFPII 236

253 Παράρτημα Σχήμα 5. Αλληλουχία των κατασκευών 1-4, με τα εσωτερικά ελλείμματα 1-4. Παρατίθεται η αλληλουχία του ενθέματος και του γονιδίου της gfp. Αλληλουχία κατασκευής 1 (κλώνος 1b) > _I22_1b-Rup1.ab ABI NNNAAATTAGTCGTTGGGAGGGATTTCATTTCATAGAAGCCTAATCCGAG ATCTATAGATTAATCCAGAAGTTGCATGATATTGTTGTTCGTCTGAGAAT ATTAACCCGGAGAATAACTTGTGATGTTAAACAAAAAGTTCACGTTTGAG CTCCGAATACCAGTAATTAATTTGCTCTATTATGTTATTGGATTCAACAT CACATTAATTCCGGTCTTCAGAAAGTTCAGGATCTCCCGGGTTAAACTGT TTGAGTTTCGTCTCCTGATTGTGCTATCAAAGACAAAGGGGTGTAACTTT ACCCCCCTCATCAAGAGCGGAGGGTTAAATAGAGAAAGACTGGTCGAGGA CAGGTCATAATATTGCTAATTTTTAAGCTTATCATCATGTGTGACGACGA CGTCGCCGCTCTTGTCGTCGACAACGGATCTGCGGCCGCCGCCACCATGA GCAAGGGCGAGGAACTGTTCACTGGCGTGGTCCCAATTCTCGTGGAACTG GATGGCGATGTGAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGCGGAGAGGGTGAAGG TGATGCCACATACGGAAAGCTCACCCTGAAATTCATCTGCACCACTGGAA AGCTCCCTGTGCCATGGCCAACACTGGTCACTACCTTCACCTATGGCGTG CAGTGCTTTTCCAGATACCCAGACCATATGAAGCAGCATGACTTTTTCAA GAGCGCCATGCCCGAGGGCTATGTGCAGGAGAGAACCATCTTTTTCAAAG ATGACGGGAACTACAAGACCCGCGCTGAAGTCAAGTTCGAAGGTGACACC CTGGTGAATAGAATCGAGCTGAAGGGCATTGACTTTAANGAGGATGGAAA CATTCTC Αλληλουχία της gfp της κατασκευής 1 > _K22_1b-GFP.ab ABI NNNNTTCGGAGATCTACGATTTACACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTT AAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAAT TGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCA ATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGT TGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCG GCCGGCCGCCCCGACTCTAGAGCCTCGAGCCGCGGCCGCTCACTTGTACA GCTCGTCCATGCCATGTGTGATCCCAGCAGCGGTCACAAACTCCAGCAGG ACCATGTGGTCTCTCTTTTCGTTGGGATCTTTAGACAGGGCAGACTGGGT GGACAGGTAATGGTTGTCTGGGAGGAGCACAGGGCCGTCGCCGATTGGAG TGTTCTGTTGATAATGGTCGGCCAGCTGCACGGATCCATCCTCAATGTTG TGTCTGATCTTGAAGTTGACCTTGATGCCATTCTTTTGCTTGTCGGCCAT GATGTACACATTGTGGGAGTTATAGTTGTATTCCAGCTTGTGGCCGAGAA TGTTTCCATCCTCCTTAAAGTCAATGCCCTTCAGCTCGATTCTATTCACC AGGGTGTCACCTTCGAACTTGACTTCAGCGCGGGTCTTGTAGTTCCCGTC ATCTTTGAAAAAGATGGTTCTCTCCTGCACATAGCCCTCGGGCATGGCGC TCTTGAAAAAGTCATGCTGCTTCATATGGTCTGGGTATCTGGAAAAGCAC TGCACGCCATAGGTGAAGGTAGTGACCAGTGTTGGCCATGGCACANGGAG CTTTCCA Αλληλουχία κατασκευής 2 (κλώνος 2c) > _E07_2c-Rup1-Rup1.ab ABI NNNNGGTGAGTCGTGTGGAGGGATTTCATTTCCATAGAAGCCTAATCCGG GAAGTATACACATTAATGGCTCTACAATCAATAGAAATTATGAAATTGTG TGTCATTTTGTTGAAAGATCTCGGAGAATAACTTGTGATGTTAAACAAAA AGTTCACGTTTGAGCTCCGAATACCAGTAATTAATTTGCTCTATTATGTT ATTGGATTCAACATCACATTAATTCCGGTCTTCAGAAAGTTCAGGATCTC CCGGGTTAAACTGTTTGAGTTTCGTCTCCTGATTGTGCTATCAAAGACAA AGGGGTGTAACTTTACCCCCCTCATCAAGAGCGGAGGGTTAAATAGAGAA AGACTGGTCGAGGACAGGTCATAATATTGCTAATTTTTAAGCTTATCATC ATGTGTGACGACGACGTCGCCGCTCTTGTCGTCGACAACGGATCTGCGGC CGCCGCCACCATGAGCAAGGGCGAGGAACTGTTCACTGGCGTGGTCCCAA TTCTCGTGGAACTGGATGGCGATGTGAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGC GGAGAGGGTGAAGGTGATGCCACATACGGAAAGCTCACCCTGAAATTCAT CTGCACCACTGGAAAGCTCCCTGTGCCATGGCCAACACTGGTCACTACCT TCACCTATGGCGTGCAGTGCTTTTCCAGATACCCAGACCATATGAAGCAG CATGACTTTTTCAAGAGCGCCATGCCCGAGGGCTATGTGCAGGAGAGAAC 237

254 Παράρτημα CATCTTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACCCGCGCTGAAGTCAAGT TCGAAGGTGACACCCTGGTGAATAGAATCGAGCTGAAAGGCAT Αλληλουχία της gfp της κατασκευής 2 > _G07_2c-GFPpolyAR-GFPpolyAR.ab ABI NNNNCCCGCGCAGATCTACGATTACCCATTTGAGAGGTTTACTTGCTTTA AAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATT GTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAA TAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTT GTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCGG CCGGCCGCCCCGACTCTAGAGCCTCGAGCCGCGGCCGCTCACTTGTACAG CTCGTCCATGCCATGTGTGATCCCAGCAGCGGTCACAAACTCCAGCAGGA CCATGTGGTCTCTCTTTTCGTTGGGATCTTTAGACAGGGCAGACTGGGTG GACAGGTAATGGTTGTCTGGGAGGAGCACAGGGCCGTCGCCGATTGGAGT GTTCTGTTGATAATGGTCGGCCAGCTGCACGGATCCATCCTCAATGTTGT GTCTGATCTTGAAGTTGACCTTGATGCCATTCTTTTGCTTGTCGGCCATG ATGTACACATTGTGGGAGTTATAGTTGTATTCCAGCTTGTGGCCGAGAAT GTTTCCATCCTCCTTAAAGTCAATGCCCTTCAGCTCGATTCTATTCACCA GGGTGTCACCTTCGAACTTGACTTCAGCGCGGGTCTTGTAGTTCCCGTCA TCTTTGAAAAAGATGGTTCTCTCCTGCACATAGCCCTCGGGCATGGCGCT CTTGAAAAAGTCATGCTGCTTCATATGGTCTGGGTATCTGGAAAAGCACT GCACGCCATAGGTGAAGGTAGTGACCAGTGTTGGCCATGG Αλληλουχία κατασκευής 3 (κλώνος 3c) > _A24_3c-Rup1.ab ABI NNAATGAGTCGTTGGGAGGGATTTCATTTCATAGAAGCCTAATCCGGGAA GTATACACATTAATGACTCTACAATCAATAGAAATTATGAAATTGTGTGT CATTTTGTTGAAATAGATTAATCCAGAAGTTGCATGATATTGTTGTTCGT CTGAGAATATTAACCCGGAGAATAACTTGTGATGTTAGATCTGTTTGAGC TCCGAATACCAGTAATTAATTTGCTCTATTATGTTATTGGATTCAACATC ACATTAATTCCGGTCTTCAGAAAGTTCAGGATCTCCCGGGTTAAACTGTT TGAGTTTCGTCTCCTGATTGTGCTATCAAAGACAAAGGGGTGTAACTTTA CCCCCCTCATCAAGAGCGGAGGGTTAAATAGAGAAAGACTGGTCGAGGAC AGGTCATAATATTGCTAATTTTTAAGCTTATCATCATGTGTGACGACGAC GTCGCCGCTCTTGTCGTCGACAACGGATCTGCGGCCGCCGCCACCATGAG CAAGGGCGAGGAACTGTTCACTGGCGTGGTCCCAATTCTCGTGGAACTGG ATGGCGATGTGAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGCGGAGAGGGTGAAGGT GATGCCACATACGGAAAGCTCACCCTGAAATTCATCTGCACCACTGGAAA GCTCCCTGTGCCATGGCCAACACTGGTCACTACCTTCACCTATGGCGTGC AGTGCTTTTCCAGATACCCAGACCATATGAAGCAGCATGACTTTTTCAAG AGCGCCATGCCCGAAGGCTATGTGCAAGAGAGAACCATCTTTTTCAAGAT GACGGGAACTANCAGACCCCGCCTGAAGTCAATTCGAAGGTGACCCCCTG Αλληλουχία της gfp της κατασκευής 3 > _C24_3c-GFP.ab ABI NNNNGGCGCGAGACTTACGATTTACACATTTGTAGAGGTTTACTTGCTTT AAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAAT TGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCA ATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGT TGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGCG GCCGGCCGCCCCGACTCTAGAGCCTCGAGCCGCGGCCGCTCACTTGTACA GCTCGTCCATGCCATGTGTGATCCCAGCAGCGGTCACAAACTCCAGCAGG ACCATGTGGTCTCTCTTTTCGTTGGGATCTTTAGACAGGGCAGACTGGGT GGACAGGTAATGGTTGTCTGGGAGGAGCACAGGGCCGTCGCCGATTGGAG TGTTCTGTTGATAATGGTCGGCCAGCTGCACGGATCCATCCTCAATGTTG TGTCTGATCTTGAAGTTGACCTTGATGCCATTCTTTTGCTTGTCGGCCAT GATGTACACATTGTGGGAGTTATAGTTGTATTCCAGCTTGTGGCCGAGAA TGTTTCCATCCTCCTTAAAGTCAATGCCCTTCAGCTCGATTCTATTCACC AGGGTGTCACCTTCGAACTTGACTTCAGCGCGGGTCTTGTAGTTCCCGTC ATCTTTGAAAAAGATGGTTCTCTCCTGCACATAGCCCTCGGGCATGGCGC TCTTGAAAAAGTCATGCTGCTTCATATGGTCTGGGTATCTGGAAAAGCAC TGCACGCCATAGGTGAAGGTAGTGACCAGTGTTGGCCATGGCACAGGGAG CTT 238

255 Παράρτημα Αλληλουχία κατασκευής 4 (κλώνος 4b) > _E24_4b-Rup1.ab ABI NNNAATCCAGTGTTGGGATGGATTTCATTTCCTAGAAGCCTAATCCGGGA AGTATACACATTAATGACTCTACAATCAATAGAAATTATGAAATTGTGTG TCATTTTGTTGAAATAGATTAATCCAGAAGTTGCATGATATTGTTGTTCG TCTGAGAATATTAACCCGGAGAATAACTTGTGATGTTAAACAAAAAGTTC ACGTTTGAGCTCCGAATACCAGTAGATCTTCCGGTCTCAGAAAGTTCAGG ATCTCCCGGGTTAAACTGTTTGAGTTTCGTCTCCTGATTGTGCTATCAAA GACAAAGGGGTGTAACTTTACCCCCCTCATCAAGAGCGGAGGGTTAAATA GAGAAAGACTGGTCGAGGACAGGTTATAATATTGCTAATTTTTAAGCTTA TCATCATGTGTGACGACGACGTCGCCGCTCTTGTCGTCGACAACGGATCT GCGGCCGCCGCCACCATGAGCAAGGGCGAGGAACTGCTCACTGGCGTGGT CCCAATTCTCGTGGAACTGGATGGCGATGTGAATGGGCACAAATTTTCTG TCAGCGGAGAGGGTGAAGGTGATGCCACATACGGAAAGCTCACCCTGAAA TTCATCTGCACCACTGGAAAGCTCCCTGTGCCATGGCCAACACTGGTCAC TACCTTCACCTATGGCGTGCAGTGCTTTTCCAGATACCCAGACCATATGA AGCAGCATGACTTTTTCAAGAGCGCCATGCCCGAGGGCTATGTGCAGGAG AGAACCATCTTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACCCGCGCTGAAGT CAAGTTCGAAGGTGACACCCTGGTGAATAGAATCGAGCTGAAGGGCATTG ACTT Αλληλουχία της gfp της κατασκευής 4 > _G24_4b-GFP.ab ABI NNNNGGCGGCAGATCTACGATTTACACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTT TAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAA TTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGC AATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAG TTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGCTCGAAGC GGCCGGCCGCCCCGACTCTAGAGCCTCGAGCCGCGGCCGCTCACTTGTAC AGCTCGTCCATGCCATGTGTGATCCCAGCAGCGGTCACAAACTCCAGCAG GACCATGTGGTCTCTCTTTTCGTTGGGATCTTTAGACAGGGCAGACTGGG TGGACAGGTAATGGTTGTCTGGGAGGAGCACAGGGCCGTCGCCGATTGGA GTGTTCTGTTGATAATGGTCGGCCAGCTGCACGGATCCATCCTCAATGTT GTGTCTGATCTTGAAGTTGACCTTGATGCCATTCTTTTGCTTGTCGGCCA TGATGTACACATTGTGGGAGTTATAGTTGTATTCCAGCTTGTGGCCGAGA ATGTTTCCATCCTCCTTAAAGTCAATGCCCTTCAGCTCGATTCTATTCAC CAGGGTGTCACCTTCGAACTTGACTTCAGCGCGGGTCTTGTAGTTCCCGT CATCTTTGAAAAAGATGGTTCTCTCCTGCACATAGCCCTCGGGCATGGCG CTCTTGAAAAAGTCATGCTGCTTCATATGGTCTGGGTATCTGGAAAAGCA CTGCACGCCATAGGTGAAGGTAGTGACCAGTGTTGGCCATGGCACAGGGA GCTTT 239

256 )( ( )*)*)* *)( )( )( *)( )( )* 3 **3 5 5 *3 ** * 8 3 **3 3 * * ** 3 1 *3 * Παράρτημα Σχήμα 6. Αναλυτικός πίνακας με τον αριθμό των εμβρύων που εμφανίζουν το εκάστοτε πρότυπο φθορισμού. Αναγράφονται τα στοιχεία για τις κατασκευές a, a1-a5 και 1-4. Βλεφαριδωτή ζώνη; ενδόδερμα; αντιστοματικό εξώδερμα; μεσέγχυμα.!" #$%&'!% ( )( )( )( ( )( )( )* ( )( )*)( ( )( )*)* ( )*)( )( ( )*)( )* ( )*)*)( ( )*)*)* *)( )( )( *)( )( )* *)( )*)( *)( )*)* *)*)( )( *)*)( )* *)*)*)( *)*)*)* +&, #-./"%, 0, 1( * *5 3 * 318 *9 7 4 * * 1 *3 7 7 *1 *7 6 2 *6 *1 *5 *1 *5* 3! 7( 8 *( * 7 * ** * * 1! * 3 7 *3 3 1* *7 ** 5 3 *21 59 * * 2 4 * * * 58, **1 4( 6 36 *5 3 * 71*, * 63 *( * *6 3* 5 * *22, 3 3( *4 * *( *38, 1 1( ** * *8*, * * *1 *6 * 6 *32, * 2 3 * *1( 240

257 Παράρτημα Σχήμα 7. Αλληλουχία του τμήματος a (-213 έως -532) της ανοδικής περιοχής του PlCoup-tf πριν και μετά τις στοχευμένες μεταλλάξεις των στοιχείων -453 (Ets?, σημαίνεται με κίτρινο χρώμα), -432 (AP?, σημαίνεται με κόκκινο χρώμα), -377 (Otx?, σημαίνεται με πράσινο χρώμα). The wt sequence: -532 AGCAGGACGAAGGATTTGAGTTAATTTCGATACAAGTTCGTTGTGGAGTGGTATTTCAATTTCCATAGAAGCCTAATCCGGGAAGT ATACACATTAATGACTCTACAATCAATAGAAATTATAAAATTGTGTGTCATTTTGTTGAAATAGATTAATCCAGAAGTTGCATGAT ATTGTTGTTCGTCTGAGAATATTAACCCGGAGAATAACTTGTGATGTTAAACAAAAAGTTCACGTTTGAGCTCCGAATACCAGTAA TTAATTTGCTCTATTATGTTATTGGATTCAACATCACATTAATTCCGGTCTTCAGAAAGTTC -213 Otx? TTATAAAATTGTGTGTCATTTTGTTGAAATAGATTAATCCAGAAGTTGCATGATATTGTT wt TTATGAAATTGTGTGTCATTTTGTTGAAATAGAAGA-TCTAGAAGTTGCATGATATTATT Otx? mutant Ets? ATTTCCATAGAAGCCTAATCCGGGAAGTATACACATTAATGACTCTACAATCAATAGAAA wt ATTTCCCTAGCAGCCTAATA--GATCTTATACACATTAATGACTCTACAATCAATAGAAA Ets? mutant AP1? ATTTCCATAGAAGCCTAATCCGGGAAGTATACACATTAATGACTCTACAATCAATAGAAA wt ATTTCCATAGAAGCCTAATCCGGGAAGTATACACATTAATAGATCTACAATCAATAGAAA Ap1? mutant TTTCCATAGAAGCCTAATA GA-TCTACAATCAATAGAAAT double Ets/Ap1? mutant TTTCCATAGAAGCCTAATCCGGGAAGTATACACATTAATGACTCTACAATCAATAGAAAT wt Ets? AP1? 241

258 Παράρτημα Σχήμα 8. Αλληλουχίες των κατασκευών -453m, -432m, -377m και -453/ -432 dm με τις σημειακές μεταλλάξεις των αντίστοιχων στοιχείων. Aλληλουχία της κατασκευής -453m > _M22_1_iv-Rup1.ab ABI NNNNAATGATGTGTGTGGAGGGATTTCATTTCCCTGCAGCCTAATAGATC TTATACACATTAATGACTCTACAATCAATAGAAATTATGAAATTGTGTGT CATTTTGTTGAAATAGATTAATCCAGAAGTTGCATGATATTGTTGTTCGT CTGAGAATATTAACCCGGAGAATAACTTGTGATGTTAAACAAAAAGTTCA CGTTTGAGCTCCGAATACCAGTAATTAATTTGCTCTATTATGTTATTGGA TTCAACATCACATTAATTCCGGTCTTCAGAAAGTTCAGGATCTCCCGGGT TAAACTGTTTGAGTTTCGTCTCCTGATTGTGCTATCAAAGACAAAGGGGT GTAACTTTACCCCCCTCATCAAGAGCGGAGGGTTAAATAGAGAAAGACTG GTCGAGGACAGGTCATAATATTGCTAATTTTTAAGCTTATCATCATGTGT GACGACGACGTCGCCGCTCTTGTCGTCGACAACGGATCTGCGGCCGCCGC CACCATGAGCAAGGGCGAGGAACTGTTCACTGGCGTGGTCCCAATTCTCG TGGAACTGGATGGCGATGTGAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGCGGAGAG GGTGAAGGTGATGCCACATACGGAAAGCTCACCCTGAAATTCATCTGCAC CACTGGAAAGCTCCCTGTGCCATGGCCAACACTGGTCACTACCTTCACCT ATGGCGTGCAGTGCTTTTCCAGATACCCAGACCATATGAAGCAGCATGAC TTTTTCAAGAGCGCCATGCCCGAGGGCTATGTGCAGGAGAGAACCATCTT TTTCNAAGATGACGGGAACTACAAGACCCGCGCTGAAGTCAAGTTCGAAG GTGACA Αλληλουχία της gfp της κατασκευής -453m > _O22_1_iv-GFP.ab ABI NNNTTTTGGAACAGATCTACGATTTACACATTTGTAGAGGTTTACTTGCT TTAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCA ATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAG CAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTA GTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGCTCGAAG CGGCCGGCCGCCCCGACTCTAGAGCCTCGAGCCGCGGCCGCTCACTTGTA CAGCTCGTCCATGCCATGTGTGATCCCAGCAGCGGTCACAAACTCCAGCA GGACCATGTGGTCTCTCTTTTCGTTGGGATCTTTAGACAGGGCAGACTGG GTGGACAGGTAATGGTTGTCTGGGAGGAGCACAGGGCCGTCGCCGATTGG AGTGTTCTGTTGATAATGGTCGGCCAGCTGCACGGATCCATCCTCAATGT TGTGTCTGATCTTGAAGTTGACCTTGATGCCATTCTTTTGCTTGTCGGCC ATGATGTACACATTGTGGGAGTTATAGTTGTATTCCAGCTTGTGGCCGAG AATGTTTCCATCCTCCTTAAAGTCAATGCCCTTCAGCTCGATTCTATTCA CCAGGGTGTCACCTTCGAACTTGACTTCAGCGCGGGTCTTGTAGTTCCCG TCATCTTTGAAAAAGATGGTTCTCTCCTGCACATAGCCCTCGGGCATGGC GCTCTTGAAAAAGTCATGCTGCTTCATATGGTCTGGGTATCTGGAAAAGC ACTGCACGCCATANGTGAAGGTAGTGACCAGTGTTGGCCATGGCACAGGG AGCTTTC Αλληλουχία της κατασκευής -432m (κλώνος 2iv) > R1_B02_2_iv-Rup1.ab ABI NNNTTATTAGCTCGTTGGGAGGGATTTCATTTCCATAGAAGCCTAATCCG GGAAGTATACACATTAATAGATCTACAATCAATAGAAATTATAAAATTGT GTGTCATTTTGTTGAAATAGATTAATCCAGAAGTTGCATGATATTGTTGT TCGTCTGAGAATATTAACCCGGAGAATAACTTGTGATGTTAAACAAAAAG TTCACGTTTGAGCTCCGAATACCAGTAATTAATTTGCTCTATTATGTTAT TGGATTCAACATCACATTAATTCCGGTCTTCAGAAAGTTCAGGATCTCCC GGGTTAAACTGTTTGAGTTTCGTCTCCTGATTGTGCTATCAAAGACAAAG GGGTGTAACTTTACCCCCCTCATCAAGGGCGGAGGGTTAAATAGAGAAAG ACTGGTCGAGGACAGGTCATAATATTGCTAATTTTTAAGCTTATCATCAT GTGTGACGACGACGTCGCCGCTCTTGTCGTCGACAACGGATCTGCGGCCG CCGCCACCATGAGCAAGGGCGAGGAACTGTTCACTGGCGTGGTCCCAATT CTCGTGGAACTGGATGGCGATGTGAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGCGG AGAGGGTGAAGGTGATGCCACATACGGAAAGCTCACCCTGAAATTCATCT 242

259 Παράρτημα GCACCACTGGAAAGCTCCCTGTGCCATGGCCAACACTGGTCACTACCTTC ACCTATGGCGTGCAGTGCTTTTCCAGATACCCAGACCATATGAAGCAGCA TGACTTTTTCAAGAGCGCCATGCCCGAGGGCTATGTGCAGGAGAGAACCA TCTTTTTCCAAGATGACGGGAACTACAAGACCCCCGCTGAAGTCAAGTTC GAAGGTGACACCCTTGTGAAT Αλληλουχία της gfp της κατασκευής -432m > R1_C02_2_iv-GFP.ab ABI NNNNNTTTCCGGCATTACCTCAGCATCATCTTCGTACTTTTTACCNNNNN NTNNGNNTATNAGTTNGTNTTGAATTGGAACGAGAGATAATCATCGGTAT ACTATCGCACCCCTCCTCTCAAATATGAATAGATGAGTCANTAGTATTAG GTGTGATGGCTCTCCANCTAGTATTGCGCAGTGTGCATCCGATATGTCCN TGAGACAGTAGGCCTATAAGCTTGCGACACTTGTATTAGAAGATGCGTCA CAGACTCTATGGTATCTCACCACATTGTCTATACACCTAGTTTATACGTG TGTTCGCAGAAAATTCTGCTCGCATACATAACGTACCTACTGTCCCGATA GCACATCACTCTATGTCGTCGCGAACATCTCTGTCTATGGACTACCCATG AGTGTCCGCTCACAAATTNCTAATAAATCTAAGAACGTAGGTGTGTCTAA ATATATAAGTCGATATAATGTTCGCTCGTTGCTTGTGTTATAATGAGACT TACACTCTGCNCACTACTCTGCNCAGACATCTGAAAATCACATATGTACT CGTATCACACACTGTCAGCCTGTACAACGTTTATTTTACATGCACTCGNC ACTATATTATAGCCCTCTTACTACNCTCGGCGTGTCGTCATAGATATACA TTACATCTAATACACGTCTATACTGTATACTACCTCTTGCAATAAGTATG TATACTTCTGTATAGCGAGTATTAGTGTTACACCAACCGCAACGCAAATC GCTTGCACTCCCGTGATAGTGTCGCGCGAATGTACGAAGCTAGCACTTGA ATCGTCTCTCACTAGCTTGCCAGTACGCCATCCTGATGACGATAATGAAT CCTATTCGACANAGATCGCCTAGTTATCTATGTTCNATTCGAACACTCAT CCTGAACTAGAGCTATATTTGCAATCATGCGTACTCCTTCTGCACTATTT TCATCTTAGGGTTCTGATACCATGTAGAGCCTCGCTAAGGCGACCAGATG AGTAACATCCTCGTGTACATAGATTACCTATATGTATACTTATGTCATTA CCATCACCACTCTTCCCAAGTTAACATATATTTCTGTGCTAGAATTTACA GCTTCTCTCGCCTTTATAGCGAAGTGTCACTCCCTCAATGTTGCTATACT GTACAGTCTATAATATACTAAGATCCTAGACTACCACATCTTTGGTACTC GATATACTCACTGATAGGTATCCCTCTACTGCACATCATTTATCTACACA TTTATGGACAGTGCACAATATGCTGTAGCTATGACAC Αλληλουχία της κατασκευής -377m (κλώνος 12) > _I05_12-Rup1-Rup1.ab ABI NNNTTATGAGTTGTGTGGAGGGATTTCATTTCCATAGAAGCCTAATCCGG GAAGTATACACATTAATGACTCTACAATCAATAGAAATTATGAAATTGTG TGTCATTTTGTTGAAATAGAAGATCTAGAAGTTGCATGATATTATTGTTC GTCTGAGAATATTAACCCGGAGAATAACTTGTGATGTTAAACAAAAAGTT CACGTTTGAGCTCCGAATACCAGTAATTAATTTGCTCTATTATGTTATTG GATTCAACATCACATTAATTCCGGTCTTCAGAAAGTTCAGGATCTCCCGG GTTAAACTGTTTGAGTTTCGTCTCCTGATTGTGCTATCAAAGACAAAGGG GTGTAACTTTACCCCCCTCATCAAGAGCGGAGGGTTAAATAGAGAAAGAC TGGTCGAGGACAGGTCATAATATTGCTAATTTTTAAGCTTATCATCATGT GTGACGACGACGTCGCCGCTCTTGTCGTCGACAACGGATCTGCGGCCGCC GCCACCATGAGCAAGGGCGAGGAACTGTTCACTGGCGTGGTCCCAATTCT CGTGGAACTGGATGGCGATGTGAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGCGGAG AGGGTGAAGGTGATGCCACATACGGAAAGCTCACCCTGAAATTCATCTGC ACCACTGGAAAGCTCCCTGTGCCATGGCCAACACTGGTCACTACCTTCAC CTATGGCGTGCAGTGCTTTTCCAGATACCCAGACCATATGAAGCAGCATG ACTTTTTCAAGAGCGCCATGCCCGAGGGCTATGTGCAGGAGAGAACCATC TTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACCCGCGCTGAAGTCAAG Αλληλουχία της gfp της κατασκευής -377m > _K05_12-GFPpolyAR-GFPpolyAR.ab ABI NNNNCCCGCGCAGATCTACGATTTACACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCT TTAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCA ATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAG CAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTA GTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGCTCGAAG CGGCCGGCCGCCCCGACTCTAGAGCCTCGAGCCGCGGCCGCTCACTTGTA CAGCTCGTCCATGCCATGTGTGATCCCAGCAGCGGTCACAAACTCCAGCA GGACCATGTGGTCTCTCTTTTCGTTGGGATCTTTAGACAGGGCAGACTGG 243

260 Παράρτημα GTGGACAGGTAATGGTTGTCTGGGAGGAGCACAGGGCCGTCGCCGATTGG AGTGTTCTGTTGATAATGGTCGGCCAGCTGCACGGATCCATCCTCAATGT TGTGTCTGATCTTGAAGTTGACCTTGATGCCATTCTTTTGCTTGTCGGCC ATGATGTACACATTGTGGGAGTTATAGTTGTATTCCAGCTTGTGGCCGAG AATGTTTCCATCCTCCTTAAAGTCAATGCCCTTCAGCTCGATTCTATTCA CCAGGGTGTCACCTTCGAACTTGACTTCAGCGCGGGTCTTGTAGTTCCCG TCATCTTTGAAAAAGATGGTTCTCTCCTGCACATAGCCCTCGGGCATGGC GCTCTTGAAAAAGTCATGCTGCTTCATATGGTCTGGGTATCTGGAAAAGC ACTGCACGCCATANGTGAAGGTAGTGACCA Αλληλουχία κατασκευής -453/-432dm (κλώνος 8) GCAGGTGCCAGAACATTTCTCTATCGATAGGTACCGAGCTCTTACGCGTGAATTCGGCTT AGCAGGACGAAGGATTTGAGTTAATTTCGATACAAGTTCGTTGTGGAGTGGTATTTCAAT TTCCATAGAAGCCTAATAGATCTACAATCAATAGAAATTATGAAATTGTGTGTCATTTTG TTGAAATAGATTAATCCAGAAGTTGCATGATATTGTTGTTCGTCTGAGAATATTAACCCG GAGAATAACTTGTGATGTTAAACAAAAAGTTCACGTTTGAGCTCCGAATACCAGTAATTA ATTTGCTCTATTATGTTATTGGATTCAACATCACATTAATTCCGGTCTTCAGAAAGTTCA GGATCTCCCGGGTTAAACTGTTTGAGTTTCGTCTCCTGATTGTGCTATCAAAGACAAAGG GGTGTAACTTTACCCCCCTCATCAAGAGCGGAGGGTTAAATAGAGAAAGACTGGTCGAGG ACAGGTCATAATATTGCTAATTTTTAAGCTTATCATCATGTGTGACGACGACGTCGCCGC TCTTGTCGTCGACAACGGATCTGCGGCCGCCGCCACCATGAGCAAGGGCGAGGAACTGTT CACTGGCGTGGTCCCAATTCTCGTGGAACTGGATGGCGATGTGAATGGGCACAAATTTTC TGTCAGCGGAGAGGGTGAAGGTGATGCCACATACGGAAAGCTCACCCTGAAATTCATCTG CACCACTGGAAAGCTCCCTGTGCCATGGTCAACACTGGTCACTACCTTCACCTATGGCGT GCAGTGCTTTTCAGATACC AAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATC ATGTCTGCTCGAAGCGGCCGGCCGCCCCGACTCTAGAGCCTCGAGCCGCGGCCGCTCACT TGTACAGCTCGTCCATGCCATGTGTGATCCCAGCAGCGGTCACAAACTCCAGCAGGACCA TGTGGTCTCTCTTTTCGTTGGGATCTTTAGACAGGGCAGACTGGGTGGACAGGTAATGGT TGTCTGGGAGGAGCACAGGGCCGTCGCCGATTGGAGTGTTCTGTTGATAATGGTCGGCCA GCTGCACGGATCCATCCTCAATGTTGTGTCTGATCTTGAAGTTGACCTTGATGCCATTCT TTTGCTTGTCGGCCATGATGTACACATTGTGGGAGTTATAGTTGTATTCCAGCTTGTGGC CGAGAATGTTTCCATCCTCCTTAAAGTCAATGCCCTTCAGCTCGATTCTATTCACCAGGG TGTCACCTTCGAACTTGACTTCAGCGCGGGTCTTGTAGTTCCCGTCATCTTTGAAAAAGA TGGTTCTCTCCTGCACATAGCCCTCGGGCATGGCGCTCTTGAAAAAGTCATGCTGCTTCA TATGGTCTGGGTATCTGGAAAAGCACTGCACGCCATAGGTGAAGGTAGTGACCAGTGTTG ACCATGGCACAGGGAGCTTTCCAGTGGTGCAGATGAATTTCAGGGTGAGCTTTCCGTATG TGGCATCACCTTCACCCTCTCCGCTGACAGAAAATTTGTGCCCATTCACATCGCCATCCA GTTCCACGAGAATTG 244

261 Παράρτημα Σχήμα 9. Αναλυτικός πίνακας ιστοειδικής έκφρασης των εμβρύων για τις κατασκευές a, -453m, -432m, -377m και -453/-432dm. Βλεφαριδωτή ζώνη; ενδόδερμα; αντιστοματικό εξώδερμα; μεσέγχυμα. 245

262 Παράρτημα Σχήμα 10. Σύγκριση των αλληλουχιών των γονιδίων PlJun και SpJun με τη μηχανή αναζήτησης BLAST. Στη βάση δεδομένων δίνεται η SpJun αλληλουχία. Query= cjun(906 letters) Database: Pliv_ALL_ESTs_Jan_2007_CAP3d_29589_Clusters.fasta 29,589 sequences; 28,443,132 total letters >Contig1887 Length = 2538 Score = 852 bits (430), Expect = 0.0 Identities = 790/909 (86%), Gaps = 12/909 (1%) Strand = Plus / Plus Query: 1 atggagactcagttctacgaagattcacacaacccgtggctgagcaagaagaaatgcatg 60 Sbjct: 259 atggagactcagttctacgaagattcacataacccgtggatgagcaagaagaagtccatg 318 Query: 61 actctggatctggacgtcggaatgggcaagcgcaaacttacggctgctctgctgtcgacc 120 Sbjct: 319 actctggatctggac------acgggcaagcgcaaacttatggctgccgtgttgtcgact 372 Query: 121 ccagacgttcagatgctcaaactcgcctctcctgaactcgaaaagatgattatttctcag 180 Sbjct: 373 ccagacgtacagatgctcaagcttgcctctcctgaattggaaaagatgattatttctcag 432 Query: 181 caaggcaatatctgtactacaccaacgcctggtcagtttatctccccgaaaaacgttacc 240 Sbjct: 433 cagggcaatatctgtactaccccgacgcctactcagtttatctgcccgaaaaacgttacc 492 Query: 241 gaagagcaggctgccttcgcccagggtttcgtcgaggcactgcagagtcttcatcaacgg 300 Sbjct: 493 gaagagcaggctgccttcgcccagggcttcgtcgaggcactgcagagccttcatcaacgg 552 Query: 301 aatgattctggcgactcggattccgtggtgagcgacgatgaatcgtcgcttgaccagctg 360 Sbjct: 553 aatgattctggagactctgaatccgtggtaagcgacgatgagtcgtctgttgaccagctg 612 Query: 361 gaccttggcccaacaacgacctaccagcagcagatcctcaacactcaaactacgatgtca 420 Sbjct: 613 gaccttgggcctaccaccacctaccagcagcagatcctcaacccgcaaaccactatctcg 672 Query: 421 agtatgaccacgcctgcgacgtcaatgt---acaaccctgcaatgcctacaacaactacg 477 Sbjct: 673 agtatgaccacagccccgacatcgatatacaacaaccctgcaatgcctacaacaacaacg 732 Query: 478 ctgcctggatcaaccgttggtctatcatctcgcaattctatgcccattgactctatggca 537 Sbjct: 733 ctgcctggatcaactgttggtttatcttctcgcaattctatgcccattgactctacagcc 792 Query: 538 atcacacgtggatgggccaattctgaccatatcaagcaggaaccctcgtgcgaagagccc 597 Sbjct: 793 attacccgtggatggggaacagttgaacacatcaagcaggagccagtgtgcgaagagccc 852 Query: 598 cagactgttccagtgtaccacgcttcaattaccgcacccatgtcccccatcgacatggaa 657 Sbjct: 853 cagaccgtcccggtgtaccacgccaccaat---cctcccatgtcacccattgacatggag 909 Query: 658 aaccaggagcgcatcaaggctgagaggaaaaggctcaggaatcgaatcgccgccagcaag 717 Sbjct: 910 acgcaggaacgcatcaaggctgagcgaaaacgactcaggaatcgaatcgcagccagcaag 969 Query: 718 tgccgcaagcgcaagcttgagcgtattgccaggttagaggataaagtgaatgacctgaaa 777 Sbjct: 970 tgccgcaagcgaaagctcgagcgtattgccaggctcgaggataaggtgaaggacttgaaa 1029 Query: 778 acacaaaactctgacttgtcaacgacggccaccaagcttcgagagcaagtttgtgcactg 837 Sbjct: 1030 acacaaaactcagacttatcgacaacggcaaccaagcttcgagagcaagtgtgtgcgctg 1089 Query: 838 aaacagagtgtgatggaacatgtgaagagcggatgtcaagttatgctggcacaacaactg 897 Sbjct: 1090 aagcagagtgtgatggaacatgtaaaaagtggatgtcaagttatgcttgcacaacaactg 1149 Query: 898 gcattttaa 906 Sbjct: 1150 gcattttaa

263 Παράρτημα Σχήμα 11. Αλληλουχία του PlJun cdna όπως δίνεται από τη βάση δεδομένων. Βάσει της αλληλουχίας αυτής σχεδιάστηκαν οι εκκινητές Jun400, Jun668 και Jun835 για την πραγματοποίηση των τριών nested PCR στα τελικά στάδια της 5 RACE PCR. Οι εκκινητές έχουν σημανθεί με κίτρινο χρώμα. Επίσης φαίνονται οι θέσεις των εκκινητών Jun5 και Jun3 (με ροζ χρώμα) που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση ολόκληρης της κωδικής περιοχής του PlJun με RT-PCR. Με πράσινο απεικονίζεται η αλληλουχία έναρξης της μετάφρασης, ATG, και με κόκκινο η αλληλουχία λήξης, TAA. 247

264 Παράρτημα Σχήμα 12. Αλληλουχία του PlJun των κλώνων 2-5 και σύγκρισή τους με την αλληλουχία του cdna του PlJun της βάσης δεδομένων. TATA box 248

265 Παράρτημα Σχήμα 13. Αλληλουχία του PlJun cdna του κλώνου 45 και χάρτης περιορισμού του. Το cdna κλωνοποιήθηκε με φορά 5 προς 3 από την T7 προς την Sp6. 249

266 Παράρτημα Σχήμα 14. Ταυτοποίηση της αμινοξικής αλληλουχίας του PlJun cdna όπως προκύπτει από τη βάση δεδομένων NCBI. Κωδικοποιείται πρωτεΐνη 308αα. 250

267 Παράρτημα Σχήμα 15. Σύγκριση των αμινοξικών αλληλουχιών των πρωτεϊνών PlJun και SpJun. 251

268 Παράρτημα Σχήμα 16. Θέσεις υβριδοποίησης των εκινητών JunF2 (πράσινο χρώμα) και JunR2 (μωβ χρώμα) για την πραγματοποίηση της qpcr Pl_cJun ATATATAATGAGTCAGCGTTGGTGTCGGAAATTCATGCTACGATCATTTCTGTCTGCGAAGAGACGTTCAATTCTCTCGAACCATT TTACTACTTTTACAGGAACCCCCTCTCTGCCACATCATAACCAGACCTGTGACTCAGACTTGAAGCTTGTATACTTGTGAAAGCTC ATAGCTGTTTGTATGTCAGCCGAAAACGGTCGCAAAAAGATGGAGACTCAGTTCTACGAAGATTCACATAACCCGTGGATGAGCAA GAAGAAGTCCATGACTCTGGATCTGGACACGGGCAAGCGCAAACTTATGGCTGCTGTGTTGTCGACTCCAGACGTACAGATGCTCA AGCTTGCCTCTCCTGAATTGGAAAAGATGATTATTTCTCAGCAGGGCAATATCTGTACTACCCCGACGCCTACTCAGTTTATCTGC CCGAAAAACGTTACCGAAGAGCAGGCTGCCTTCGCCCGGGGCTTCGTCGAGGCACTGCAGAGCCTTCATCAACGGAATGATTCTGG AGACTCTGAATCCGTGGTAAGCGACGATGAGTCGTCTGTTGACCAGCTGGACCTTGGGCCTACCACCACCTACCAGCAGCAGATCC TCAACCCGCAAACCACTATCTCGAGTATGACCACAGCCCCGACATCGATATACAACAACCCTGCAATGCCTACAACAACAACGCTG CCTGGATCAACTGTTGGTTTATCTTCTCGCAATTCTATGCCCATTGACTCTACAGCCATTACCCGTGGATGGGGAACAGTTGAACA CATCAAGCGGGAGCCAGTGTGCGAAGAGCCCCAGACCGTCCCGGTGTACCACGCCACCAATCCTCCCATGTCACCCATTGACATGG AGACGCAGGAACGCATCAAGGCTGAGCGAAAACGACTCAGGAATCGAATCGCAGCCAGCAAGTGCCGCAAGCGAAAGCTCGAGCGT ATTGCCAGGCTCGAGGATAAGGTGAAGGACTTGAAAACACAAAACTCAGACTTATCGACAACGGCAACCAAGCTTCGAGAGCAAGT GTGTGCGCTGAAGCAGAGTGTGATGGAACATGTAAAAAGTGGATGTCAAGTTATGCTTGCACAACAACTGGCATTTTAAACTGGAA TATTACAAATTTGACATTTGAACAATAACATTTTATTGCTGAAACATGGTCACTGTGAACTATTGAATCAAGCCATTTGCAGCAGC AGAGACCCGTTAACAATTGCATGACTTTATTGTGATCTTGGTATGCAAATTCATGTTCTGTTTTTAAATATTATGACCCAGAGTTT CACTGTACTGGTTTGCAGTTCCNAAATTTAGATCCGTTTCAAAATTACCAANCATTCTACCACACATGTTAGTATGCAATGTTTAT CAGAAATATGGGGCTGGACCCCCGATAGTATTCCTATTTCTGAAGTTTAGTTCCTATATTTAGTCCAGTTCCAACAATGTTTGGCA CTTATATTATGTTGATTTTGACGATTGTAAATTCATCTATTCCGCCCAGTAAGTGTAGCAAAAAGAAGAGCCCATTAAAAAAGGAA ATTGATTACTTGCCCAGAATTTTGAATTCAGTACTTTGGTAAGAACTTTTAGCGTATAAAATGTTAATACCCTTATTAAAATTGTA CTTCTCCATGCCTAGTCCATTAAAAGTCCAGTTTTTAATGTAGGAATAGAAGGTCATAAAACGTTAGAAAGATTTGTGGATGGTAA AATATCAGAAGAAAGGGGTCAGTGAATTTATGAGATTGTACAGGAAGATAAATTGGTTTATGATGTGAATATTATTATGAAAAAAT GTTGTCTTTCAATTAAGCATACTGGTTTTGAAAAGAAGTTGTATGATCATATTGTGTCAAATAATTCTTGTTTTTCTCAAATTTTA TTTTTTATCATGTCACGTTTGACGTAAAGCATTCTGTGCAAAGAAATATGAGCCTTTTTTCTCTAATAATTTTGTTGATTTATGCA GCTCAAAATTTTTACATTTTTCATTCACAGACCATCAGAGTCAACTACAGTAAAGCTCTGCTAGGAATTACTCAGTATTTTGCAAC CATATGTTTTCAACAGCTCTTCTTTAGAGTAGAGAAACTAGTGCTTTTGTGACAAAATTTTATTTTAACATTTTCTACAAGGTTAA AATTATTTTTGAAAATTACGCAACTCTGCACCATCAATGTTAGACTTGAAAGAAAATTTCAAAATGAAAATGTTATCATGACAACA CCTGTGGTGTATGCCATGGTTTGTTTTATATGTAAAAAATGCCCGTTCTTGCAATACAACTTCAGACAGAACAGTTTTGCCTGAGG AGTTAATGACATACGCATGTTAAAATTGAAATTCATT 252

269 Παράρτημα Σχήμα 17. Α) Η αλληλουχία του PlFra2 cdna της βάσης δεδομένων και Β) η πρωτεΐνη που κωδικοποιεί. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την πραγματοποίηση των δύο nested PCR προκειμένου να βρεθεί το 3 άκρο του cdna σημαίνονται με μωβ χρώμα. Δεξιά από την αλληλουχία αναγράφονται τα ζεύγη των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε αντίδραση. Με πράσινο χρώμα έχει σημανθεί η αλληλουχία έναρξης της μετάφρασης. Α) >Contig3641_March08 GAGATATAACGCGGAGTGCTATCGGGAACACCCCATACACCGCTTGTACGCTCAAACCTG TGACTCATAACTAGTCATCGCTTCAACTCAGAAAAAAAAAACTTCGACCACAATTCGTAG CCGCGGAAGCTATTCGTGACTAAGGAAGTTCACTTTCGTTATCTCATTCAATTCGCAGTT CAACTAAAACAAGAACCCGGGAATTAGCAGCGTTAGAAGACTGCAGTAAGACAGAAATTT TTAAACCTAACTCTGTGATGTACCCAACGGTTACAATGCCTGCCGATGATGGTATTCAGG AACTGTTGACTACTATGGCGTCTGGATGCATGCCCGCTACCAGTGAGGATTATACAGCAT CGGAAGACATCATGGATATATCCAGCTACGCACCAAGCATCAGTAGCCATGTCTCCTCGA TGCCTAACGCTATACCAACATCGGTTATCACCCCAACTACCTCGCTGACTGGTGGCTCTT GGCTCGAACACCCCAACAACATCCACGGGGGTAGCTTCGTGCCCCCCTCTGTCTCCAGCC ACAATGGCTACCACACACCTGCGGTGGTACGGGGAGGTGGCGGACTTGCAGGACAGCACC CACATCATCCTCATCAAAGGATCACTAGAGAGAGGAGTGATATGGACATGTACAGAATGA CACCTTCTTCAGGACCACGTAGAAGGATGAGGGATGATGACGTCAGTAGAAATTTATCTC CTGATGAACGTGAGAAGAGGAGAGTCCGTCGAGAGAGGAATAAACTTGCTGCTGCTAAAT primer FRA 3 RACE outer GTAGACAGAGGCGTGTTGATCATACCAACACTCTAATTAACGAAACTGAAGACTGGGAAG AGAAGAACTCTAACTTAGAACAAGAAATCTCCAAGCTCCAGCAACAGAAAGAACAACTTG primer FRA-3 RACE inner AGTTCATCTTAAAAGCGCACAAAGCCATGTGCCGTAAGAACAAGGTCAACAAAAAAACAG CTACCACAGCCTCTTGCACCACCACTACCACTCGCCACGCCAACACAGTGGCGAGTCT Β) Length: 253 aa 258 atgtacccaacggttacaatgcctgccgatgatggtattcaggaa M Y P T V T M P A D D G I Q E 303 ctgttgactactatggcgtctggatgcatgcccgctaccagtgag L L T T M A S G C M P A T S E 348 gattatacagcatcggaagacatcatggatatatccagctacgca D Y T A S E D I M D I S S Y A 393 ccaagcatcagtagccatgtctcctcgatgcctaacgctatacca P S I S S H V S S M P N A I P 438 acatcggttatcaccccaactacctcgctgactggtggctcttgg T S V I T P T T S L T G G S W 483 ctcgaacaccccaacaacatccacgggggtagcttcgtgcccccc L E H P N N I H G G S F V P P 528 tctgtctccagccacaatggctaccacacacctgcggtggtacgg S V S S H N G Y H T P A V V R 573 ggaggtggcggacttgcaggacagcacccacatcatcctcatcaa G G G G L A G Q H P H H P H Q 618 aggatcactagagagaggagtgatatggacatgtacagaatgaca R I T R E R S D M D M Y R M T 663 ccttcttcaggaccacgtagaaggatgagggatgatgacgtcagt P S S G P R R R M R D D D V S 708 agaaatttatctcctgatgaacgtgagaagaggagagtccgtcga R N L S P D E R E K R R V R R 753 gagaggaataaacttgctgctgctaaatgtagacagaggcgtgtt E R N K L A A A K C R Q R R V 798 gatcataccaacactctaattaacgaaactgaagactgggaagag D H T N T L I N E T E D W E E 843 aagaactctaacttagaacaagaaatctccaagctccagcaacag K N S N L E Q E I S K L Q Q Q 888 aaagaacaacttgagttcatcttaaaagcgcacaaagccatgtgc K E Q L E F I L K A H K A M C 933 cgtaagaacaaggtcaacaaaaaaacagctaccacagcctcttgc R K N K V N K K T A T T A S C 978 accaccactaccactcgccacgccaacacagtggcgagtct 1018 T T T T T R H A N T V A S 253

270 Παράρτημα Σχήμα 18. Σύγκριση των αλληλουχιών των γονιδίων PlFra2 και SpFra2 με τη μηχανή αναζήτησης BLAST. Στη βάση δεδομένων δίνεται η SpFra2 αλληλουχία. 254

271 Παράρτημα Σχήμα 19. Αλληλουχία του 3 άκρου του cdna PlFra2 που προέκυψε από την PCR με εκκινητές το ζεύγος Fra inner 3 RACE inner. Με κόκκινο σημαίνεται η αλληλουχία λήξης της μετάφρασης και με κίτρινο η ουρά πολυαδενυλίωσης. Με πράσινο βέλος σημαίνεται η θέση περιορισμού για το ένζυμο EcoRI που επιβεβαιώνει την υπόθεση της ύπαρξης της αντίστοιχης θέσης εντός της αλληλουχίας. 255

272 Παράρτημα Σχήμα 20. Αλληλουχία του cdna PlFra2 μετά από in silico συνδυασμό του 5 άκρου που βρέθηκε στη βάση δεδομένων και του 3 άκρου που προέκυψε από την αλληλούχηση του προϊόντος της 3 RACE. Με γαλάζιο χρώμα σημειώνονται οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση ολόκληρου του PlFra2 cdna με RT-PCR. Με πράσινο σημειώνεται το κωδικόνιο έναρξης της μετάφρασης και με κόκκινο το κωδικόνιο λήξης. Με κίτρινο σημειώνεται η poly-a ουρά. 256

273 Παράρτημα Σχήμα 21. Αμινοξική αλληλουχία της πρωτεΐνης PlFra2. 257

274 Παράρτημα Σχήμα 22. Σύγκριση των αμινοξικών αλληλουχιών των πρωτεϊνών PlFra2 και SpFra2 258

275 Παράρτημα Σχήμα 23. Αλληλουχία του απομονωμένου με RT-PCR PlFra2 και χάρτης περιορισμού του. Το cdna έχει εισαχθεί με φορά 5 προς 3 από την Τ7 προς την Sp6 πολυμεράση. Pl_Fra2 (1) GCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTC GATTCGGAAGCTATTCGTGACTAAGGAAGTTCACTTTCGTTATCTCATTCAATTCGCAGTTCAACTAAAACAAGAACCCGGGAATT AGCAGCGTTAGAAGACTGCAGTAAGACAGAAATTTTAAACCTAACTCTGTGATGTACCCAACGGTTACAATGCCTGCCGATGATGG TATTCAGGAACTGTTGACTACTATGGCGTCTGGATGCATGCCCGCTACCAGTGAGGATTATACAGCATCGGAAGACATCATGGATA TATCTAGCTACGCACCAAGCATCAGTAGCCATGTCTCCTCGATGCCTAACGCTATACCAACATCGGTTATCACCCCAACTACCTCG CTGACTGGTGGCTCTTGGCTCGAACACCCCAACAACATCCACGGGGGTAGCTTCGTGCCCCCCTCTGTCTCCAGCCACAATGGCTA CCACACACCTGCGGTGGTACGGGGAGGTGGCGGACTTGCAGGACAGCACCCACATCATCCTCATCAAAGGATCACTAGAGAGAGGA GTGATATGGACATGTACAGAATGACACCATCTTCAGGACCACGTAGAAGGATGAGGGATGATGACGTCAGTAGAAATTTATCTCCT GATGAACGTGAGAAGAGGAGAGTCCGTCGAGAGAGGAATAAACTTGCTGCTGCTAAATGTAGACAGAGGCGTGTTGATCATACCAA CACTCTAATTAACGAAACTGAAGACTGGGAAGAGAAGAACTCTACTTTAGAACAAGAGATCTCCAAGCTCCAGCAACAGAAAGAAC AACTTGAGTTCATCTTAGAAGCGCACAAAGCCATGTGCCGTAAGAACAAGGTCAACAAAGAAACAGCTACCACAGCCTCTTGCACC ACCACTACCACTCGCCACGCCAACACAGTGGCGAGTCTGGACACGCCTACCACAGAGGTTGTCACGCCTACTCGACTCTTCAACTT CGCTGGTTTGTCCGAGGGCGTCATGGATGGCACTAATCACTCAACGTCGGGATCATCGTCGTCTTCGTGTGGACGAGAAGCAATGT CAATCAAATCAGAGAACAGCAGCAGTGGTAGTGATATGTCCAGCCCAGAATCTACCCGCCGAACCCTTATCCAACTCTAATATNTG ATATTATTAAAACTGGAATTCAAAGTAAATGGGAGGGGGGGGGGGGGGGGTTCAAGAAAAACATTATAACAATCAATCAGAATACT TATTTCTCGTAGGAAAATTAAAACTTTTAGAAAGACGATTATTCGTTATAAAAGAAAGGGAAACGAAGAGCAAAACAATCACTAGT GAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTA AATAGCTGGC 259

276 Παράρτημα Σχήμα 24. Θέσεις υβριδοποίησης των εκκινητών FraF2 (πράσινο χρώμα) και FraR2 (μωβ χρώμα) που χρησιμοποιήθηκαν για την qpcr Pl_Fra2 (1) GCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCC GCGGGAATTCGATTCGGAAGCTATTCGTGACTAAGGAAGTTCACTTTCGTTATCTCATTCAATTCGCAGTTCAACT AAAACAAGAACCCGGGAATTAGCAGCGTTAGAAGACTGCAGTAAGACAGAAATTTTAAACCTAACTCTGTGATGTA CCCAACGGTTACAATGCCTGCCGATGATGGTATTCAGGAACTGTTGACTACTATGGCGTCTGGATGCATGCCCGCT ACCAGTGAGGATTATACAGCATCGGAAGACATCATGGATATATCTAGCTACGCACCAAGCATCAGTAGCCATGTCT CCTCGATGCCTAACGCTATACCAACATCGGTTATCACCCCAACTACCTCGCTGACTGGTGGCTCTTGGCTCGAACA CCCCAACAACATCCACGGGGGTAGCTTCGTGCCCCCCTCTGTCTCCAGCCACAATGGCTACCACACACCTGCGGTG GTACGGGGAGGTGGCGGACTTGCAGGACAGCACCCACATCATCCTCATCAAAGGATCACTAGAGAGAGGAGTGATA TGGACATGTACAGAATGACACCATCTTCAGGACCACGTAGAAGGATGAGGGATGATGACGTCAGTAGAAATTTATC TCCTGATGAACGTGAGAAGAGGAGAGTCCGTCGAGAGAGGAATAAACTTGCTGCTGCTAAATGTAGACAGAGGCGT GTTGATCATACCAACACTCTAATTAACGAAACTGAAGACTGGGAAGAGAAGAACTCTACTTTAGAACAAGAGATCT CCAAGCTCCAGCAACAGAAAGAACAACTTGAGTTCATCTTAGAAGCGCACAAAGCCATGTGCCGTAAGAACAAGGT CAACAAAGAAACAGCTACCACAGCCTCTTGCACCACCACTACCACTCGCCACGCCAACACAGTGGCGAGTCTGGAC ACGCCTACCACAGAGGTTGTCACGCCTACTCGACTCTTCAACTTCGCTGGTTTGTCCGAGGGCGTCATGGATGGCA CTAATCACTCAACGTCGGGATCATCGTCGTCTTCGTGTGGACGAGAAGCAATGTCAATCAAATCAGAGAACAGCAG CAGTGGTAGTGATATGTCCAGCCCAGAATCTACCCGCCGAACCCTTATCCAACTCTAATATNTGATATTATTAAAA CTGGAATTCAAAGTAAATGGGAGGGGGGGGGGGGGGGGTTCAAGAAAAACATTATAACAATCAATCAGAATACTTA TTTCTCGTAGGAAAATTAAAACTTTTAGAAAGACGATTATTCGTTATAAAAGAAAGGGAAACGAAGAGCAAAACAA TCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGT ATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTGGC 260

277 Παράρτημα Σχήμα 25. Σύγκριση των αλληλουχιών των γονιδίων PlElk και SpElk με τη μηχανή αναζήτησης BLAST. Στη βάση δεδομένων δίνεται η SpElk αλληλουχία. 261

278 Παράρτημα Σχήμα 26. Θέσεις υβριδοποίησης των εκκινητών 5 PlElk και 3 PlElk επί της αλληλουχίας του PlElk cdna της βάσης δεδομένων. 262

279 Παράρτημα Σχήμα 27. Αλληλουχία του PlElk που απομονώθηκε από τον κλώνο 1 και χάρτης περιορισμού του. To cdna έχει κλωνοποιηθεί με φορά 5 προς 3 από την Sp6 προς την Τ7 πολυμεράση. Pl_Elk (1) GCCAGTGATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCG ATTATTTATACAGGTTTTGCGAGCAGGATATTTTTTTTTCACGAAGCTAAGTTTGCTTGTTACTGCAGACCGTTCCAAAAATGGCG GGCCATTATTGTTCTACAATGCAGTCAATGTTATTTGCATGTTCTTGTCTGAGCTGTCTGTTACGACACGAATATCGGCTTCGTTG ACGCAGGCGACAACAGGACGGTCGGTGTGACGGGAACGCCATTTACCGTCAGAGGAGAACTTAATCCATTGCTGACCAACGTGGGA AACTGAAAGGAGGAATTGCCATTAAGTGAAGGACTGAGAGTGAGCGGACTAAGGGTACTCCAGAAGTGGATGGGCACGAGTGGGGT GCCATTTTGACCAAGGAGAGGACTAGCGACCATGATGGGGGTACCAGGGAGGCCTGGTGTATGAGGACCAAAAGCAGAAACAGCAG ATAGAGCACCTGTCGTTGATAAATATGACGGGCTGCTTCCAGGCTTTCCTGTTGATGACATGACGGTCAGTGCCGTTGATGGCTCA GAACCCTTGATGGTTGGTGGTACTGAAAGCTGTAGGGGTCTTGGTTTGTTGGCCAGACTTGAACCAGTGACTAGCGGTGACTCTGC TCTAAAGTGACCACGGTGCCCGTCACTACTGGCAGTTGTCAACGTACTGCAAGGGATCGGCCGACCACCTGTACTGACCAGCTTCG TTTCGCCATTTAATCTAGCTTCTGTAATATATACTTCTTGAACATTCACAGTGACAGCTGGCCTGGACATCATCTCATCAACTTCT CTACGCGCAGACGACGTGGTCCACTGGAACTTCTCACGGTCTGCTTGCTTCGCTAACATTCTCAGCTCACTAGAAGATGGACGAGG CGACCTTGGTACTGGACTTGGAGTGTGGAGCAATCTCTGTGGGCTCTTAGCTGGAGTGGCTCTCCCCCTCTCTTTCTCGTCACTGA TGCTGACATTGGGGCTATTGCTTCTGCTGGCGCTAGGGTAACTGCGAGGGCGATGGTTCGCAGCAGGCACATCCATGCTCTCCATC TTCACTCGGAAAGGAATCTTGTTCTCCGTCTTGACAATCTCAGGGAATGAAACAAACTTATAAACAAATTTCTGTCCCATGACTTT CTTGATAATGTTCTTGTCGTAGTAGTACCGGAGAGCGCGACTGAGCTTGTCGTAATTCATGTTGGTCTTGTTTTTCCTCAAGCCCC ACAATCTAGCCACCTCCTCAGCGTTGAGGAGCTTGAATTCGCCTTCGTTGCCTGTCCAGGTAATCAGGTGCTGTCGGGCTTTGTCC ATCAGCAGCTCCAGAAGAAACTGCCACAGTGTAATGTTGGTCTCCAAACCTTTTGGTTTGATATGCTGCATTTGAATGTTGGGCTT AACGTCTGAGTGAGAGGAGGTGTCCATACTGGTGGTTTCANTATTTTGTGCAGCGACGGCCGCTTCATACGACGTCGACGACACAA TCGAAGAGGTCTGAACAGTACCAGGCTCGAGCTTGATCAGGGGCGGGAGCGGCGGCGTTCTCGATGATGGTTGCACTTCTGACATT TTGATGATTTGGTGTTCGCTTTCCGTCTGTTCGGCGTGCACGTCGTTGTCTCTCTCTCTTGTATACGATCGATCACGGTGTGTTCT CTGAAACGCAGGGTATCTTTTGCCGGGGCCAAAGCTGAAAACTAAATCTTGGAATGTGCTCTAAAGGTGGATGTAATCACTAGTGA ATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGGTCACCTAAAT AGCTGG 263

280 Παράρτημα Σχήμα 28. Αμινοξική αλληλουχία της πρωτεΐνης PlELK. 264

281 Παράρτημα Σχήμα 29. Σύγκριση των αμινοξικών αλληλουχιών των PlELK και SpELK. Pl vs Sp Elk protein >ref NP_ transcription factor Elk [Strongylocentrotus purpuratus] gb AAL transcription factor Elk [Strongylocentrotus purpuratus] Length=454 GENE ID: Elk transcription factor Elk [Strongylocentrotus purpuratus] Score = 768 bits (1983), Expect = 0.0, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 418/466 (89%), Positives = 427/466 (91%), Gaps = 12/466 (2%) Query 1 MSEVQPSSRTPPLPPLIKLEPGTVQTSSIVSSTSYEAAVAAQNIETTSMDTSSHSDVKPN 60 MSE Q SSRTPPLPPLIKLEPGT+QTSSI SSTSYE A+AA NIE TSMD S HSDVKPN Sbjct 1 MSEAQASSRTPPLPPLIKLEPGTIQTSSIASSTSYETAIAAHNIEATSMDIS-HSDVKPN 59 Query 61 IQMQHIKPKGLETNITLWQFLLELLMDKARQHLITWTGNEGEFKLLNAEEVARLWGLRKN 120 IQMQHIKPKGLETNITLWQFLLELLMDKARQHLITWTGNEGEFKLLNAEEVARLWGLRKN Sbjct 60 IQMQHIKPKGLETNITLWQFLLELLMDKARQHLITWTGNEGEFKLLNAEEVARLWGLRKN 119 Query 121 KTNMNYDKLSRALRYYYDKNIIKKVMGQKFVYKFVSFPEIVKTENKIPFRVKMESMDVPA 180 KTNMNYDKLSRALRYYYDKNIIKKVMGQKFVYKFVSFPEIVKTENKIPFRVKMESMDVPA Sbjct 120 KTNMNYDKLSRALRYYYDKNIIKKVMGQKFVYKFVSFPEIVKTENKIPFRVKMESMDVPA 179 Query 181 ANHRPRSYPSVSRSNSPNVSISDEKERGRATPAKSPQRLLHTPSPVPRSPRPSSSELRML RPRSYPSVSRSNSPNVS SDEK++GRATP KSPQRLLHTPSPVPRSPRPSS+ELRML Sbjct 180 TSQRPRSYPSVSRSNSPNVSTSDEKDKGRATPVKSPQRLLHTPSPVPRSPRPSSAELRML 239 Query 241 AKQADREKFQWTTSSARREVDEMMSRPAVTVNVQEVYITEARLNGETKLVSTGGRPIPCS 300 AKQ DREKFQWTT S RRE DEM SRP VTVNVQEVYITEARLNGETKLVSTGGRPIPCS Sbjct 240 AKQVDREKFQWTT-SLRREGDEMFSRPPVTVNVQEVYITEARLNGETKLVSTGGRPIPCS 298 Query 301 TLTTASSDGHRGHFRAKSPLVTGSSLANKPRPLQLSVPPTIKGSEPSTALTVMSSTGKPG 360 T TTASSDG GH RAKSPLVTGSSL NKP+PLQLSVP TIKGSE ST SS GKPG Sbjct 299 TYTTASSDGRTGHLRAKSPLVTGSSLGNKPKPLQLSVPSTIKGSESST-----SSLGKPG 353 Query 361 SSPSYLSTTGALSAVSAFGPHTPGLPGTPIMVASPLLGQNGTPLVPIHFWSTLSPLTLSP 420 SSPSYL GALSA A+G H+P LPGTPIMVASPLLGQNGTPLVPIHFWSTLSPLTLSP Sbjct 354 SSPSYLH-AGALSA--AYG-HSP-LPGTPIMVASPLLGQNGTPLVPIHFWSTLSPLTLSP 408 Query 421 SLNGNSSFQFPTLVSNGLSSPLTVNGVPVTPTVLLSPASTKPIFVS 466 SLN NSSFQFPTLVSNGLSSPLTVNGVPVTPTVLLSPASTKPIFVS Sbjct 409 SLNSNSSFQFPTLVSNGLSSPLTVNGVPVTPTVLLSPASTKPIFVS

282 Παράρτημα Σχήμα 30. Απεικόνιση των θέσεων υβριδοποίησης των εκκινητών ElkF1 (πράσινο χρώμα) και ElkR1 (μωβ χρώμα) που χρησιμοποιήθηκαν για την qpcr. Pl_Elk (1) GCCAGTGATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCG ATTATTTATACAGGTTTTGCGAGCAGGATATTTTTTTTTCACGAAGCTAAGTTTGCTTGTTACTGCAGACCGTTCCAAAAATGGCG GGCCATTATTGTTCTACAATGCAGTCAATGTTATTTGCATGTTCTTGTCTGAGCTGTCTGTTACGACACGAATATCGGCTTCGTTG ACGCAGGCGACAACAGGACGGTCGGTGTGACGGGAACGCCATTTACCGTCAGAGGAGAACTTAATCCATTGCTGACCAACGTGGGA AACTGAAAGGAGGAATTGCCATTAAGTGAAGGACTGAGAGTGAGCGGACTAAGGGTACTCCAGAAGTGGATGGGCACGAGTGGGGT GCCATTTTGACCAAGGAGAGGACTAGCGACCATGATGGGGGTACCAGGGAGGCCTGGTGTATGAGGACCAAAAGCAGAAACAGCAG ATAGAGCACCTGTCGTTGATAAATATGACGGGCTGCTTCCAGGCTTTCCTGTTGATGACATGACGGTCAGTGCCGTTGATGGCTCA GAACCCTTGATGGTTGGTGGTACTGAAAGCTGTAGGGGTCTTGGTTTGTTGGCCAGACTTGAACCAGTGACTAGCGGTGACTCTGC TCTAAAGTGACCACGGTGCCCGTCACTACTGGCAGTTGTCAACGTACTGCAAGGGATCGGCCGACCACCTGTACTGACCAGCTTCG TTTCGCCATTTAATCTAGCTTCTGTAATATATACTTCTTGAACATTCACAGTGACAGCTGGCCTGGACATCATCTCATCAACTTCT CTACGCGCAGACGACGTGGTCCACTGGAACTTCTCACGGTCTGCTTGCTTCGCTAACATTCTCAGCTCACTAGAAGATGGACGAGG CGACCTTGGTACTGGACTTGGAGTGTGGAGCAATCTCTGTGGGCTCTTAGCTGGAGTGGCTCTCCCCCTCTCTTTCTCGTCACTGA TGCTGACATTGGGGCTATTGCTTCTGCTGGCGCTAGGGTAACTGCGAGGGCGATGGTTCGCAGCAGGCACATCCATGCTCTCCATC TTCACTCGGAAAGGAATCTTGTTCTCCGTCTTGACAATCTCAGGGAATGAAACAAACTTATAAACAAATTTCTGTCCCATGACTTT CTTGATAATGTTCTTGTCGTAGTAGTACCGGAGAGCGCGACTGAGCTTGTCGTAATTCATGTTGGTCTTGTTTTTCCTCAAGCCCC ACAATCTAGCCACCTCCTCAGCGTTGAGGAGCTTGAATTCGCCTTCGTTGCCTGTCCAGGTAATCAGGTGCTGTCGGGCTTTGTCC ATCAGCAGCTCCAGAAGAAACTGCCACAGTGTAATGTTGGTCTCCAAACCTTTTGGTTTGATATGCTGCATTTGAATGTTGGGCTT AACGTCTGAGTGAGAGGAGGTGTCCATACTGGTGGTTTCANTATTTTGTGCAGCGACGGCCGCTTCATACGACGTCGACGACACAA TCGAAGAGGTCTGAACAGTACCAGGCTCGAGCTTGATCAGGGGCGGGAGCGGCGGCGTTCTCGATGATGGTTGCACTTCTGACATT TTGATGATTTGGTGTTCGCTTTCCGTCTGTTCGGCGTGCACGTCGTTGTCTCTCTCTCTTGTATACGATCGATCACGGTGTGTTCT CTGAAACGCAGGGTATCTTTTGCCGGGGCCAAAGCTGAAAACTAAATCTTGGAATGTGCTCTAAAGGTGGATGTAATCACTAGTGA ATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGGTCACCTAAAT AGCTGG 266

283 Παράρτημα Σχήμα 31. Σύγκριση των αλληλουχιών των γονιδίων PlPea και SpPea με τη μηχανή αναζήτησης BLAST. Στη βάση δεδομένων δίνεται η SpPea αλληλουχία. PlPea vs. SpPea Score Expect Identities Gaps Strand 1939 bits(2150) /1928(82%) 54/1928(2%) Plus/Plus Query 176 ATGTACAGGCCATCAAGTTTTGACGACGAATCAGATGGATTTTATGATCAGCAGGTACCC 235 Sbjct 1 ATGTATAGGCCATCTAGTTTTGACGACCAGTCAGATGGATTTTATGACCAGCAGGTGCCC 60 Query 236 TTTCTAGACCCTCAGACCGTTCCTGATGTCGATGAAGTCCCAAATTTTGAAACATGTCCT 295 Sbjct 61 TTTCTAGATTCCCAGACTGTTCCTGATGTTGATGAAGTCCCTGATTGTGAAACATGCCCA 120 Query 296 GAAGGAGCAGCATGTGGAAAGGCGAAGGGAGATGATTTGGATAAGGACTCAAAGGAATTG 355 Sbjct 121 GAAGGTGCATCATGTGGAAAATCAAAGGGAGAT---TTGGATCAGGATTCAAAAGAATTA 177 Query 356 TTCCATGATCTGGATCAACTACAGGGAGAATGGTTAGCTGATGATTTTGGCTATGGTCCT 415 Sbjct 178 TTCCATGATCTGGATCAATTACAGGAAGAATGGTTAGCTGATGATTTCGGCTATGGTCCA 237 Query 416 GAGTCTGAACCAGAACAGTACGTGCCTGATTTCCAGTCCGAGAATTTACCACTGAGCATC 475 Sbjct 238 GAGTCCGAACCAGAACAGTATGTGCCTGATTTCCAGTCCGAAAATCTACCCTTGAGCATC 297 Query 476 AAGATAAAGCCTGAACCAAGAAGCCCTGGATACCACAAGCCATGTGCGCACATGAAATCG 535 Sbjct 298 AAGATTAAGCCCGAACCCAGGAGTCCTGGATACCACAAACCATGCGCGCACATGAAATCA 357 Query 536 CCGGCTGCGAGCACCAGCCACCGCCATTTTGATTTTGACAAGTTTGAGCAGAAGTTTGCT 595 Sbjct 358 CCAGCGGCCAGCACCAGCCACCGCCATTTTGATTTTGACAAATTTGAGCAGAAGTTTGCT 417 Query 596 TACGGTGAACAGGTGGTGGTGGACAGCTCATTTGGTAAGCTGGATGGACTCTCTGTTATT 655 Sbjct 418 TACGGGGAACAGGTGCTGGTGGACAACCCCTTCAGTAAACTGGATGGACTCTCTTTGGTC 477 Query 656 ATCCCAGCACCATCTCCGAGCAGTACAGATGATAACCCCAGTCCACCGGGGAGCGCCTGC 715 Sbjct 478 ATCCCTGCACCATCTCCTAGCAGTACAGATGATCATCCCAGTCCACCAGGGAGCGCCTGC 537 Query 716 TCAGATGCTGTAGCACCACAGACCTCTC------CTAAGGGCAACACATCATCTGGGAAG 769 Sbjct 538 TCAGATGCAGTGGCACCACAGAGCTCTCCTGTTACTAAGGGCAACGCATCATCTACAAAG 597 Query 770 AACAGCACCAGCAATGTCAAGGGCCCCTCCAAGACCGCTGGTAGTCCTGCAGCAGGAATG 829 Sbjct 598 AGCACCACTGGCAATGCCAAGGGTTCCACCAAGA------GTA--ACT-CATCAGGGATG 648 Query 830 ATGGAGATGAC---ATCAGGGATGGCATCCCCTTCCATCGATCTGAACCTGAACCGTATC 886 Sbjct 649 GTGGATATGGCCCAAAGAGCCATGGCATCCCCCTCTATCGACCTCAACATGAACCGCATC 708 Query 887 ATCAAGCAGGAGCATCAGGGACCCTCTATGTGTGGCAGGAGCAGCAGCTGTGACGGCAAG 946 Sbjct 709 ATCAAGCAGGAGCATCCGGGGCCATCCATGT---GCAGTAGTAGCTGCAACAAGTCCAAC 765 Query 947 TCTGACGGCAACAACAA---CAACAGCATCTCATCGCCGTCGTCGACTCAGGGTCCGTCC 1003 Sbjct 766 AATGACACCAACAACAATGGCAGCAGCATCTCATCGCCAACGACGCCGCAGGGGCCGTCC 825 Query 1004 TTGAGCCAGATGGTTACCTTCAAGGAGCCGTTGGTCCCAAGTGGAAGCGGGTTTGGACCC 1063 Sbjct 826 ATGTGTCAGATGGTGACATTCAAGGAGCCGCTGTTACCGGGCGGAAGCGGGTTTGGGCCA 885 Query 1064 AATAGCAATCCCTTCAGGGCTCATGGTCCAGGACCAGGTCATGGATTCTTCCTGGATAAG 1123 Sbjct 886 AGTAGCAATCACTTCAGGGCACATGGACCAGGTCCTGGTCCTGGCTTCTTCCTGGATAAG 945 Query 1124 AGTAGGTTCCAGAGGCAGACCTCTGAGCCGTGTTTTGGCAACCTGGCCCATCCTATGGGC 1183 Sbjct AGGTTCCAGAGGCAGACCTCCGAGCCCTGTTTTGGCAACCTGGCCCATCCGATGGGT 1002 Query 1184 TCTGCAGGGAACGCAGGACCAGACTC TGGCGGACCACACCCA

284 Παράρτημα Sbjct 1003 GCTGCAGGGAACTCAGCAGCTGAATCTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAGGACCACATCCA 1062 Query 1226 TTCCAGCGCCAGAACTCAGAGCCTATGTTTATCCCGTTCAAGAACCGAGGAGGACCGTTC 1285 Sbjct 1063 TTCCAGCGTCAGAACTCTGAGCCGGTGTTCCTCCCGTTCAAGAACCGAGTGGGA---TTC 1119 Query 1286 AACCAGTCTCGCTTCAGAGAGACTCTAGTCAAGCAAGAACCTGTGGATTACGGTTACGAA 1345 Sbjct 1120 AATCAAACACGGTTCAGGGAGACTATCGTGAAGCAGGAGCCTGTGGACTATGGCTATGAA 1179 Query 1346 GCTGAGGTGCCACGATCCTTCGGGAATGGATTCCCGCGACAGGAGATGTTCACGCAACGC 1405 Sbjct 1180 GCCGAGGTACCCCGATCCTTTGGGAATGGCTTCCCCCGTCAGGAGATGTTCATGCAACGC 1239 Query 1406 CACTGTAAGGAGGAAGGTGGGCAAGTGGATTGTGGAAGGGCATTCTATGATGATGCTAGC 1465 Sbjct 1240 CACTGCAAGGAGGAAGGCGGGCAAGTGGAATGCGGCAGGGCGTTCTATGATGATGCAAGC 1299 Query 1466 GTCCCAGAAAAAACACCAGAACCACATAATGAGCCGAGACATGAGGTAGTACGAGAAGGT 1525 Sbjct 1300 GTACCGGAAAAGGCTCAAGAACAACACAATGAGCCGAGGCATGAGGTGGTGCGAGAAGGG 1359 Query 1526 CCTCTTTACCACCGACGTGGTTCTCTTCAACTGTGGCAGTTCCTTGTGACGCTGCTGGAA 1585 Sbjct 1360 CCTCTCTACCACAGACGTGGCTCCCTTCAACTCTGGCAGTTCCTTGTAACTCTCCTTGAA 1419 Query 1586 GACCAGTCCAATGGCCACTTCATCGCCTGGACAGGGCGCGGTCTCGAATTCAAACTTATT 1645 Sbjct 1420 GACCAGTCCAACGGGGCCTTCATAGCCTGGACTGGGCGGGGCCTGGAGTTCAAACTCATA 1479 Query 1646 GACCCTGAAGAGGTTGCAAGACGATGGGGCATTCAGAAGAACAGGCCTGCGATGAGCTAC 1705 Sbjct 1480 GACCCAGAAGAGGTTGCAAGACGATGGGGCATTCAGAAGAACCGACCTGCGATGAATTAC 1539 Query 1706 GACAAGCTTTCCCGATCATTGCGATATTACTACGAGAAGGGAATCATGCAGAAGGTGGCC 1765 Sbjct 1540 GATAAGCTATCCCGATCGCTGCGTTACTATTACGAGAAGGGCATCATGCAGAAGGTTGCG 1599 Query 1766 GGGGAGCGCTACGTGTACAAGTTTGTCTGCGACCCGGAGGCTCTTTTCATCATGGCGTTC 1825 Sbjct 1600 GGGGAGCGCTATGTCTACAAGTTTGTTTGCGACCCAGAGGCTCTATTCATCATGGCGTTT 1659 Query 1826 CCTGATGGTCTACACACCCAGCTGAGAGTATCGCTGCCTCCTCCTCATGATCAAAGACAG 1885 Sbjct 1660 CCAGACGGTCTCCACACCCAGCTTAGGGTCTCCCTGCCCCCTCCTCATGACCAAAGGCAG 1719 Query 1886 GCCCAACCTCCTCCTCCTCCTCAGATGAGACCGATCCATCCTAAAGAGGAACCTGGCGTC 1945 Sbjct 1720 CCCCCTCCTCCCAGGCCTTCTCAGATGAGACCGATCCATCCCAAAGAGGAACCGGGCGTT 1779 Query 1946 ATGACCCACGCTCCCCCTCCTCAGCCACCAACCAGAACTGGGAGTAGTGACAACTGTGAC 2005 Sbjct 1780 CTGACCCAC---CCCCCTCCTCAGCCTCCTAGCAGGACGCCGAGCAGCGAAAACTGTGAC 1836 Query 2006 CTTTACGTCCCTGACCTCAGCCATGCGAACCCTTGTATGACCAAGTCATTCTCTGAGGGC 2065 Sbjct 1837 CTCTTTGTCCCTGACCTCAGTCATGCTAACCCCTGCATGACCAAGTCATTCTCTGAAGGC 1896 Query 2066 TGCGTCTA 2073 Sbjct 1897 TGCGTCTA

285 Παράρτημα Σχήμα 32. Θέσεις υβριδοποίησης των εκκινητών 5 PlPea και 3 PlPea επί της αλληλουχίας του PlPea cdna της βάσης δεδομένων. Οι εκκινητές έχουν σημανθεί με μπλε βέλη. 269