ΜΕΤΡΗΣΗ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗΣ ΤΡΟΦΗΣ ΣΤΗ ΜΥΓΑ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΜΕΤΡΗΣΗ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗΣ ΤΡΟΦΗΣ ΣΤΗ ΜΥΓΑ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΤΣΙΤΣΟΥΛΑΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2016

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΜΕΤΡΗΣΗ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗΣ ΤΡΟΦΗΣ ΣΤΗ ΜΥΓΑ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΤΣΙΤΣΟΥΛΑΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: Ν. Α. ΚΟΥΛΟΥΣΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Δ.Σ. ΚΩΒΑΙΟΣ, Ε. ΠΑΠΑΔΟΠΟΥΛΟΥ- ΜΟΥΡΚΙΔΟΥ, Ν.Α. ΚΟΥΛΟΥΣΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ..5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 6 SUMMARY 9 1. ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ταξινόμηση του εντόμου Μορφολογία του εντόμου Ξενιστές του εντόμου Βιολογία του εντόμου Καταγωγή κι εξάπλωση του εντόμου Οικονομική σημασία του εντόμου Έλεγχος του εντόμου Σκοπός της διατριβής ΓΕΝΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Συνθήκες εργαστηρίου Έντομα που χρησιμοποιήθηκαν, υλικά και μέθοδοι εκτροφής Τριχοειδείς σωλήνες πρόσληψης τροφής και κλουβιά που χρησιμοποιήθηκαν Μετρήσεις ημερήσιας κατανάλωσης τροφής ΠΡΟKATAΡΚΤΙΚΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ Περίληψη

4 3.2 Έλεγχος της πειραματικής διάταξης και σύγκριση των συγκεντρώσεων ζάχαρης και πρωτεΐνης στα θρεπτικά διαλύματα Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Αποτελέσματα - Συζήτηση Επίδρασή της υψηλής σχετικής υγρασίας στην ανάπτυξη ωαρίων εντός των ωοθηκών ενηλίκων θηλυκών Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Αποτελέσματα - Συζήτηση ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗΣ ΤΡΟΦΗΣ ΣΤΟ ΣΥΝΟΛΟ ΤΗΣ ΕΝΗΛΙΚΗΣ ΖΩΗΣ ΤΗΣ ΜΥΓΑΣ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Αποτελέσματα - Συζήτηση...77 Παράρτημα φωτογραφιών...98 Βιβλιογραφία

5 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Ευχαριστώ τον επιβλέποντα της μεταπτυχιακής μου διατριβής, αναπληρωτή καθηγητή Εντομολογίας της Σχολής Γεωπονίας, Δασοπονίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης κ. Κουλούση Νικόλαο για την υπόδειξη του θέματος, την καθοδήγησή του κατά τον σχεδιασμό του πειράματος και τις συμβουλές και διορθώσεις του κατά την συγγραφή του κειμένου της διατριβής. Χωρίς την τεράστια υπομονή κι επιμονή που υπέδειξε απέναντί μου δεν θα ήταν ποτέ δυνατή η ολοκλήρωση της παρούσης διατριβής και δεν υπάρχουν επαρκείς χαρακτηρισμοί για το είδος της ευγνωμοσύνης που του οφείλω. Ευχαριστώ τους καθηγητές Γεωπονίας του Α.Π.Θ. κα. Παπαδοπούλου- Μουρκίδου Ευθυμία και κ. Κωβαίο Δημήτριο για την συμμετοχή τους στην εξεταστική επιτροπή. Ιδιαιτέρως ευχαριστώ τον Διδάκτορα Γεωπονίας του Α.Π.Θ κ. Δάμο Πέτρο, για την πολύτιμη βοήθεια του στην στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων και στην συγγραφή της διατριβής καθώς και τον Διδάκτορα Γεωπονίας του Α.Π.Θ κ. Ιωάννου Χαράλαμπο για την συνεχή του συμβολή στην κατάρτιση των πειραμάτων και στην βιβλιογραφική έρευνα καθώς και τον καθηγητή εφαρμοσμένης εντομολογίας του τμήματος Φυτικής Παραγωγής και Αγροτικού Περιβάλλοντος του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας κ. Παπαδόπουλο Νικόλαο για την βοήθειά του στην στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Ευχαριστώ και όλους τους καθηγητές του προγράμματος μεταπτυχιακών σπουδών Φυτοπροστασίας του Α.Π.Θ για την μοναδική ευκαιρία που μου πρόσφεραν μέσω των μεταπτυχιακών μου σπουδών στην επιστημονική εμβάθυνση των θεμάτων φυτοπροστασίας. Τέλος ευχαριστώ τους γονείς μου Ιωάννη και Ελένη Τσίτσουλα όπως και την αδερφή μου Όλγα για την αμέριστη ηθική και υλική συμπαράσταση τους κατά τις μεταπτυχιακές μου σπουδές. Αντί αφιέρωσης, «Φεῦ φεῦ, φρονεῖν ὡς δεινὸν ἔνθα μὴ τέλη λύῃ φρονοῦντι» (Σοφοκλής, Οιδίπους Τύραννος, 316-7) 5

6 Μέτρηση κατανάλωσης τροφής στη μύγα της Μεσογείου ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η μύγα της Μεσογείου αποτελεί σημαντικό εχθρό των εσπεριδοειδών στην Ελλάδα και παγκοσμίως το σημαντικότερο από πλευράς οικονομικής σημασίας είδος της οικογένειας Tephritidae στην παραγωγή φρούτων. Η διατροφή του εντόμου αποτελεί βασικό στοιχείο της συμπεριφοράς του και γι αυτό και της εξελικτικής του απόδοσης. Η μελέτη της διατροφής του εντόμου στο ενήλικο στάδιο της ζωής του παρουσιάζει πρακτικές δυσκολίες σε συνθήκες αγρού και σε συνθήκες εργαστηρίου παρατηρείται έλλειψη αξιόπιστων και υψηλής ακρίβειας μεθόδων μετρήσεων τόσο της συνολικής κατανάλωσης όσο και της κατανομής αυτής στην διάρκεια της ζωής τους. Στην παρούσα εργασία αναπτύχτηκε μια εργαστηριακή μέθοδος που επιτρέπει την λήψη υψηλής ακρίβειας μετρήσεων της καταναλωθείσας τροφής από μεμονωμένα ενήλικα, για το σύνολο της ενήλικης ζωής τους, παρέχοντας αυτήν υπό μορφή διαλυμάτων ζάχαρης και πρωτεΐνης με την χρήση τριχοειδών σωλήνων, ενώ ταυτόχρονα παρεχόταν σε αυτά ad libitum η πρωτεΐνη και η ζάχαρη αντιστοίχως. Με μία σειρά προκαταρκτικών πειραμάτων αποφασίστηκε η ενδεικνυόμενη συγκέντρωση πρωτεΐνης ή ζάχαρης στα τροφικά διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν με την μέθοδο των τριχοειδών σωλήνων. Επιπλέον ελέγχθηκε η αξιοπιστία της πειραματικής διάταξης στην λήψη των μετρήσεων. Στο κύριο πειραματικό μέρος μετρήθηκε η κατανάλωση της τροφής στο σύνολο της ζωής ενηλίκων αρσενικών και θηλυκών. Με βάση τα αποτελέσματα των μετρήσεων κατασκευάστηκαν και παρουσιάζονται 6

7 διαγράμματα επιβίωσης και κατανάλωσης αλλά και τρισδιάστατα μοντέλα παρεμβολής που παρουσιάζουν όχι μόνο την συνολική κατανάλωση αλλά και την κατανομή της στην διάρκεια της ζωής των ενηλίκων καθώς και της ωοπαραγωγής των θηλυκών, συσχετίζοντας την κατανάλωση με την αναπαραγωγή. Η κατανάλωση παρουσίασε διαφορές για τα δύο είδη διατροφής με την ζάχαρη (θρεπτικό διάλυμα ζάχαρης παρεχόμενο με τριχοειδή σωλήνα κι ad libitum παροχή πρωτεΐνης) να λαμβάνει τις υψηλότερες τιμές της στην αρχή της ζωή τους και να μειώνεται σταδιακά ενώ για την πρωτεΐνη (θρεπτικό διάλυμα πρωτεΐνης παρεχόμενο με τριχοειδή σωλήνα κι ad libitum παροχή ζάχαρης) στο μέσο αλλά να μένει σχετικά σταθερά υψηλή τόσο στην έναρξη όσο και στην λήξη της ζωής τους. Η ωοπαραγωγή παρουσίασε μεγαλύτερες τιμές στο μέσο της ζωής των θηλυκών και για τα δύο είδη διατροφής αλλά για διαφορετικά επίπεδα κατανάλωσης. Στα αποτελέσματα για τις πρώτες 30 ημέρες της ενήλικης ζωής τους, εφαρμόστηκε ANOVA επαναλαμβανόμενων μετρήσεων και βρέθηκε ότι το είδος της διατροφής όπως και το φύλο τους επηρέασε την κατανάλωση (p<0,05), όμως η αλληλεπίδραση του είδους της τροφής και του φύλου δεν είχε σημαντική επίδραση στην κατανάλωση, ενώ και η ωοπαραγωγή δεν επηρεάστηκε από το είδος της διατροφής (p>0,05). Η κατανάλωση ζάχαρης ήταν μεγαλύτερη και για τα δύο φύλα σε σχέση με την κατανάλωση πρωτεΐνης για το ίδιο αυτό χρονικό διάστημα. Η ανάλυση εντός των υποκειμένων (within subject analysis) ωστόσο έδειξε σημαντικές αλληλεπιδράσεις σε όλες τις περιπτώσεις, έτσι τα δύο φύλα ανταποκρίθηκαν διαφορετικά στην επίδραση του είδους της διατροφής στην επιβίωσή τους και η ανάλυση Kaplan-Meier 7

8 Log Rank έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών κατανομών επιβίωσης που ελέχθησαν (XSqr=29.128, df=3, sig=0.000, Mantel-Cox statistic test). Με την χρήση τρισδιάστατων μοντέλων εξομαλυμένων επιφανειών παρουσιάζονται οι αλληλεπιδράσεις της κατανάλωσης με την αναπαραγωγή για το σύνολο της ζωής των θηλυκών, αποκαλύπτοντας μια κωδωνοειδή μορφή και για τα δύο είδη διατροφής με αυτήν της πρωτεΐνης να προσομοιάζει περισσότερο μια καμπύλη κανονικής κατανομής (τύπου Gauss), παρέχοντας την δυνατότητα πρόβλεψης της κατανάλωσης και της ωοπαραγωγής σε σχέση με την ηλικία. Η ωοπαραγωγή για την περίπτωση της διατροφής με την πρωτεΐνη περιγράφεται ικανοποιητικά με μια κανονική κατανομή τύπου Lorenz με το μοντέλο αυτό να περιλαμβάνει το 95% της διακύμανσης των δεδομένων. Τέλος, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας ενισχύουν την υπόθεση των διακριτών μεταβολικών σκοπών πρωτεΐνης και ζάχαρης με αυτόν της πρωτεΐνης να σχετίζεται με την αναπαραγωγή και της ζάχαρης με την επιβίωση. Λέξεις κλειδιά: μύγα της Μεσογείου, θρέψη, τριχοειδείς σωλήνες, ζάχαρη, πρωτεΐνη, επιβίωση, ωοπαραγωγή, 8

9 Measurement of food intake in the Mediterranean fruit fly Abstract Mediterranean fruit fly is a major pest of citrus fruits in Greece and worldwide the most important in terms of economic importance species of Tephritidae family in fruit production. Feeding constitutes a key element of this insect s behavior and therefore its evolutionary performance. Study of nutrition in terms of lifetime measurements however is impractical in field trials while under laboratory conditions there is a lack of a reliable and high precision technique capable for counting not only total ingestion but also its distribution through insects lifetime. At the present thesis a laboratory method is developed for obtaining high precision measurements of daily food intake by individual insects for their whole lifetime. Protein or sugar solutions are introduced via microcappilaries to enclosed individual adults of medfly while sugar or protein respectively, are offered to them ad libitum in form of crystals or powder. A series of preliminary tests were conducted for calibrating the method as well as for the determination of concentration of sugar and protein on feeding solutions for further use on lifetime trials. Based on life time results of consumption for 4 cohorts (2 of each diet type and 2 of each sex) event history, longevity and hazard charts were built and presented as well as 3D interpolation models in order to describe the interactions of reproduction (females oviposition) and feeding by age. Results show that the consumption was different for the two different diets. Sugar diet (ingested via microcapillary, while protein was ad libitum offered) consumption peaked to an earlier point and afterwards lowered gradually towards the end of lifetime 9

10 while protein diet (ingested via microcapillary, while sugar was ad libitum offered) peaked during the middle of medflies life time yet was steadily high during early and late period of their lifetime. Oviposition peaked during the middle of their lifetimes regardless of the diet type (sugar or protein) but for different levels of consumption. For the first 30 days of medflies lifetime data were subjected to repeated measures ANOVA and the type of diet and sex had contributed to the difference in diet intake (p<0.05). However, interaction of diet*sex had no significant effect. Egg production rate is lower at the beginning and at the end of the life cycle, while peaks at mid-ages. During these 30 days the type of diet, sugar or protein, had no significant effect on the number of eggs produced by females (p>0.05). Sugar diet consumption was significantly higher for both sexes compared to protein diet consumption for the same period. However, the within subject analysis involved in all cases showed significant interactions. Male and female medfly s responded differently to the effect of diet on longevity and the Kaplan-Meier Log Rank survival analysis showed significant differences between the different survival distributions tested (XSqr=29.128, df=3, sig=0.000, Mantel-Cox statistic test). Using 3D smooth surfaces models in order to present the relations between dietary intake and reproduction (females oviposition) by time (age) for their whole adult lifetime significant relations have been revealed suggesting a bell-shaped response of reproduction on feeding by age for both kind of diet types (sugar and protein) with protein related egg production simulating a Gaussian curve. Indeed, egg production data and especially the 10

11 protein related are very well described according to the Lorenzian type normal distribution function and the model accounts for 95% of the variability of data. Finally, the results of the current thesis support the hypothesis of distinct metabolic purposes of sugar and protein with the latest related to reproduction and sugar related to survival needs. Key-words: Ceratitis capitata, feeding, microcapillaries, sugar, protein, survival, egg production, lifetime 11

12 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 1. ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Ταξινόμηση του εντόμου Η μύγα της Μεσογείου, Ceratitis capitata (Wiedemann), κατατάσσεται στην οικογένεια Tephritidae των Δίπτερων κι ειδικότερα στο άθροισμα Ceratidini. Τα περισσότερα είδη της οικογένειας των Tephritidae είναι φυτοφάγα ενώ ελάχιστα είναι παρασιτοειδή (είδη της υποοικογένειας Tachiniscinae) κι ακόμη λιγότερα σαπροφάγα (είδη της υποοικογένειας Phytalmiinae) (Díaz-Fleischer et al. 2000). Από τα φυτοφάγα είδη περίπου το 35% προσβάλλει καρπούς διαφόρων φυτών, το 40% ανθοκεφαλές φυτών της οικογένειας Asteraceae και τo 25% φύλλα, βλαστούς και ρίζες διαφόρων φυτών (White & Elson-Harris, 1992). Στο σύνολο ωστόσο των περισσοτέρων από 4,200 περιγραφέντων ειδών της οικογένειας των Tephritidae, με την πλειοψηφία τους να είναι φυτοφάγα, λιγότερο από το 1% θεωρούνται ως εχθροί ιδιαίτερης οικονομικής σημασίας (Aluja, 1999). Ιδιαίτερο οικονομικό ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα φυτοφάγα είδη της οικογένειας Tephritidae που προσβάλλουν καρπούς κι αναφέρονται ως μύγες των φρούτων (fruit flies ή καλύτερα, true fruit flies, δεδομένης της χρήσης της κοινής ονομασίας fruit flies και για άλλα δίπτερα που προσβάλλουν καρπούς, πχ Drosophila spp.). Στο γένος Ceratitis όπου κι ανήκει η μύγα της Μεσογείου περιλαμβάνονται περισσότερα από 90 είδη που κατάγονται από τις τροπικές περιοχές της Αφρικής (De Meyer, 2000) με το είδος αυτό να αποτελεί το πλέον πολυφάγο, με περισσότερους από 350 ξενιστές, το πλέον διαδεδομένο με παγκόσμια εξάπλωση κι ως το σημαντικότερο από πλευράς οικονομικής 12

13 σημασίας στην παραγωγή φρούτων διεθνώς (Liquido et al., 1991). Παλαιότερες ονομασίες του είδους που δεν χρησιμοποιούνται πλέον αλλά δύναται να βρεθούν στην βιβλιογραφία είναι Tephritis capitata (Wiedemann), Ceratitis citriperda (McLeay), Ceratitis hispanica (De Breme) και Pardalaspis asparagi (Bezzi). 1.2 Μορφολογία του εντόμου Το ενήλικο έχει μήκος 4-6 mm, πλάτος 1,2-2 mm και χαρακτηριστικό χρωματισμό με μαύρες, καστανές και κίτρινες κηλίδες στο θώρακα και στις πτέρυγες (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 2003). Το χρώμα της κεφαλής είναι υπόλευκο-κιτρινωπό, ενώ οι κεραίες είναι καστανού χρώματος με μικρό αριθμό μαύρων τριχών στο μέσο τους. Τα δύο βασικά άρθρα των κεραιών είναι ερυθροκάστανα και η arista μαύρη. Στην κεφαλή διακρίνεται το ζεύγος των σύνθετων οφθαλμών οι οποίοι έχουν χρώμα λαμπερό πορφυρό, έως σκούρο καστανέρυθρο. Στο πρόσθιο άνω τμήμα της κεφαλής των αρσενικών εντοπίζονται δυο έμμισχες ροπαλοειδείς αποφύσεις χρώματος αργυρότεφρου (Εικόνα 1). Το ανατομικό αυτό χαρακτηριστικό κάνει εύκολο τον διαχωρισμό του φύλου στο είδος. Ο θώρακας είναι στα νώτα μαύρος με ανοιχτόχρωμες κηλίδες ενώ στην κοιλιακή περιοχή κιτρινωπός. Οι πτέρυγες έχουν μήκος 4,5 mm η κάθε μια, είναι περίπου διαφανείς με εγκάρσιες μαύρες ως και καστανές ή ακόμη και κίτρινες ζώνες και κηλίδες. Τα πόδια έχουν κίτρινο-καστανό χρωματισμό κι οι οπίσθιες κνήμες έχουν κίτρινες σκληρές τρίχες. Η κοιλιά έχει κίτρινο ως πορτοκαλί χρωματισμό με δύο καστανέρυθρες εγκάρσιες ζώνες και πολλά λεπτά στίγματα. Το μήκος της είναι λίγο μεγαλύτερο από το πλάτος της στα θηλυκά, στο οπίσθιο άκρο των οποίων προεξέχει ο εκτατός ωοθέτης 13

14 μήκους 0,9-1,3 mm κιτρινέρυθρου ως καστανού (στην άκρη του) χρωματισμού. Τα αυγά είναι λεία, λευκά, στενόμακρα ελλειψοειδούς σχήματος, διαστάσεων 0,9-1,1 x 0,2 mm. Οι προνύμφες του εντόμου έχουν γενικά λευκό ή υπόλευκο χρωματισμό και είναι άποδες με το πρόσθιο μέρος του σώματός τους να είναι στενότερο από το οπίσθιο. Η ανάπτυξή των προνυμφών δύναται να διακριθεί σε 3 προνυμφικά στάδια ανάλογα με το μέγεθός τους αλλά και τα χαρακτηριστικά των στοματικών αγκίστρων. Έτσι η προνύμφη της πρώτης ηλικίας έχει μήκος mm, της δεύτερης mm και της τρίτης 6-10 mm (Papadopoulos, 2004). Οι νύμφες της μύγας της Μεσογείου έχουν σχήμα ελλειψοειδές κοντόχοντρο μήκους περίπου 4.5 mm ενώ το χρώμα τους είμαι γενικά καστανό με παραλλαγές στην απόχρωση (ανοιχτό ως σκούρο) που οφείλονται κατά βάση στην τροφή (ξενιστής) στην οποία αναπτύσσονται (Papadopoulos, 2004). 1.3 Ξενιστές του εντόμου Η μύγα της Μεσογείου είναι ένα από τα πλέον πολυφάγα είδη εντόμων με περισσότερα από 350 είδη - που κατατάσσονται σε περίπου 70 οικογένειες φυτών - να αποτελούν ξενιστές του κι ειδικότερα με το 40% περίπου να ανήκει στις οικογένειες Myrtaceae (6%), Rosaceae (10%), Rutaceae (9%), Spotaceae (9%) και Solanaceae (6%) (Liquido et al., 1991). Το έντομο προσβάλλει ημιώριμους, σχεδόν ώριμους ή και ώριμους καρπούς πολλών δέντρων, θάμνων ή ποωδών φυτών σε τροπικές, υποτροπικές και εύκρατες περιοχές (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 2003). Στην Ελλάδα αποτελεί πιθανώς το σημαντικότερο έντομο - εχθρό των εσπεριδοειδών στην νότια Ελλάδα και στα νησιά όπου ευδοκιμούν και 14

15 καλλιεργούνται τα εσπεριδοειδή ενώ κι άλλα καρποφόρα δένδρα όπως η συκιά, η ροδακινιά, η βερικοκιά, η μηλιά κι η αχλαδιά, αλλά και το αμπέλι (Roditakis et al., 2008). Σ ολόκληρη την Μεσόγειο θεωρείται ως το σημαντικότερο εντομολογικό πρόβλημα στο σύνολο των καρποφόρων δένδρων αλλά κι ειδικότερα των εσπεριδοειδών (Τουρκία, Συρία). Η προτίμηση ως προς τον ξενιστή σε ένα τέτοιο μεγάλο εύρος ξενιστών δεν είναι - ως αναμένεται - ίδια για όλους τους ξενιστές αλλά ποικίλλει ακόμη κι ανάμεσα σε είδη της ίδιας - ταξινομικά - οικογένειας και σχετίζεται όχι μόνο με τα χαρακτηριστικά του ξενιστή, αλλά και με την φυσιολογία του εντόμου και την δυναμική του πληθυσμού του σε δεδομένο χώρο και χρόνο. 1.4 Βιολογία του εντόμου Η μύγα της Μεσογείου είναι πολυκυκλικό είδος που δεν διαπαύει (Christenson and Foote, 1960). Συμπληρώνει 3-7 γενεές το έτος στην Ελλάδα (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 2003) ανάλογα με την περιοχή και τις επικρατούσες κλιματικές συνθήκες κι ιδιαίτερα την θερμοκρασία. Ολόκληρος ο κύκλος ζωής του εντόμου μπορεί να διαρκέσει ημέρες ώστε ακόμη και 8-10 γενεές μπορούν να ολοκληρωθούν στην διάρκεια ενός έτους σε τροπικές περιοχές. Το είδος δεν είναι ανεκτικό σε χαμηλές θερμοκρασίες (κάτω από 5 C) και σε περιοχές της βορειότερης εξάπλωσης του στην Ελλάδα, όπως στην Θεσσαλονίκη, που ο χειμώνας χαρακτηρίζεται από χαμηλές θερμοκρασίες διαχειμάζει είτε ως προνύμφη (L 1 και L 2 προνυμφικά στάδια, μέσα σε καρπούς μήλου, Papadopoulos et al., 1996) είτε ως νύμφη σε προσβεβλημένους καρπούς που είτε δεν συλλέχτηκαν κατά την συγκομιδή κι αφέθηκαν πάνω 15

16 στα δένδρα, ή που έπεσαν στο έδαφος κατά την καλλιεργητική περίοδο ή την συγκομιδή. Σε περιοχές όπου οι χειμερινές θερμοκρασίες είναι υψηλές, όπως για την περίπτωση της Ελλάδας συμβαίνει στην Κρήτη, το είδος μπορεί να διαχειμάζει και υπό το στάδιο του ενηλίκου κι ακόμη να συνεχίζεται αδιάκοπα η αναπαραγωγή του καθ όλη την διάρκεια του χειμώνα (Mavrikakis et al., 2000) όπως συμβαίνει στις ακτές της Βόρειας Αφρικής όπου κατά την διάρκεια του χειμώνα όλα τα στάδια ανάπτυξης είναι παρόντα (Fimiani, 1989 από A.S.Robinson & G.Hooper, 1989). Στην περίπτωση που η διαχείμαση γίνεται στα στάδια της προνύμφης και της νύμφης, τα ενήλικα εμφανίζονται την άνοιξη. Μετά την έξοδό τους διασπείρονται με σκοπό την εύρεση κατάλληλης τροφής που περιέχει σάκχαρα και πρωτεΐνες ώστε αφενός να καλύψουν τις ενεργειακές τους ανάγκες κι αφετέρου να ωριμάσουν αναπαραγωγικά καθώς και να καλύψουν τις ενεργειακά δαπανηρές δραστηριότητες της αναπαραγωγικής/σεξουαλικής τους συμπεριφοράς (Christenson & Foote, 1960). Γενικά, τα ενήλικα Tephritidae προσλαμβάνουν τα απαραίτητα αυτά θρεπτικά συστατικά (σάκχαρα και πρωτεΐνες) από φυτικές πηγές όπως νέκταρ, γύρη και άλλα εκχυλίσματα των φυτών αλλά και από μικροβιακής φύσης πηγές όπως βακτήρια και σπόρια μυκήτων ή μελιτώδη απεκκρίματα κοκκοειδών εντόμων που βρίσκονται συνήθως άφθονα στην φυτική επιφάνεια ή ακόμη και περιττώματα πουλιών (Christenson & Foote, 1960; Drew et al., 1983; Prokopy et al., 1992). Η σεξουαλική συμπεριφορά της Μύγας της Μεσογείου περιλαμβάνει την προσέλκυση των θηλυκών ενηλίκων από τα αρσενικά με τη βοήθεια μιας φερομόνης που εκκρίνουν τα αρσενικά υπό μορφή σταγόνας στο άκρο της 16

17 κοιλιάς τους (calling behaviour). Μάλιστα, προκειμένου να αυξηθεί η αποτελεσματικότητα της προσέλκυσης, πολλά αρσενικά σχηματίζουν μικρές συναθροίσεις (leks) στην κάτω φυλλική επιφάνεια των φυτών ξενιστών τους (συνήθως ένα αρσενικό σε κάθε φύλλο) όπου εντοπίζονται πολλά αρσενικά σε μικρή απόσταση μεταξύ τους ώστε αθροιστικά να ελκύουν σε μεγαλύτερο βαθμό τα θηλυκά στην περιοχή τους (Prokopy & Hendrichs, 1979; Arita & Kaneshiro, 1985; Field et al., 2002). Στην συνέχεια κι αφού κάποιο θηλυκό προσεγγίσει τις συναθροίσεις αυτές των αρσενικών και σταθμεύσει απέναντι από ένα αρσενικό που αρχικά επιλέγει, ακολουθεί μια πολύπλοκη διαδικασία ερωτοτροπίας κατά την οποία το αρσενικό δονεί έντονα τις πτέρυγές του με τέτοιο τρόπο ώστε να κατευθύνει τις οσμές της φερομόνης προς το θηλυκό ώστε την κατάλληλη στιγμή το αρσενικό, με μία αιφνιδιαστική κίνηση, επιτυγχάνει την επαφή με το θηλυκό. Στις περισσότερες ωστόσο περιπτώσεις το έντονα επιλεκτικό θηλυκό απορρίπτει την ερωτοτροπία του αρσενικού και συνεχίζει την αναζήτηση συντρόφου (Whittier et al., 1994). Η διαδικασία της σύζευξης είναι χρονοβόρα κι επιτρέπει στο «κυρίαρχο» θηλυκό την περαιτέρω αξιολόγηση του αρσενικού πριν την τελική αποδοχή και αποθήκευση του σπέρματός του κι εξαρτάται από γενετικούς παράγοντες αλλά κι από την ηλικία, το μέγεθος και την τροφική κατάσταση του αρσενικού (Field et al., 1999). Στην πράξη μόνο κάποια αρσενικά καταφέρνουν να συζευχθούν και μάλιστα πολλές φορές κατά την διάρκεια της ζωής τους (Whittier et al., 1994). Το θηλυκό της Μύγας της Μεσογείου θεωρείται μονογαμικό ωστόσο υπάρχουν αυξανόμενα στοιχεία τόσο από εργαστηριακές όσο και από υπαίθριες έρευνες που υποστηρίζουν ότι ένα ποσοστό των θηλυκών ατόμων συζευγνύεται περισσότερες από μία φορές με 17

18 διαφορετικά αρσενικά (Mossinson & Yuval, 2003; Kraaijeveld et al., 2005). Η διάρκεια της σύζευξης έχει ιδιαίτερη σημασία κι εξαρτάται και από την τροφική κατάσταση του θηλυκού κι ενδεχομένως παρουσιάζει εξελικτικό πλεονέκτημα για το είδος αφού η αυξημένη διάρκεια αυξάνει και την πιθανότητα γονιμοποίησης. Τα αρσενικά «αξιοποιούν» την παρατεταμένη χρονικά σύζευξη εκτός από την μεταφορά σπέρματος και για την μεταφορά σπερματοφόρων ή άλλων «δώρων» θρεπτικής σημασίας προς τα θηλυκά (nuptial gifts), αλλά και για την αφαίρεση σπέρματος τυχόν ανταγωνιστικών αρσενικών που προηγήθηκαν (Field & Yuval, 1999). Έτσι, η επικράτηση του γεννετικού υλικού ενός αρσενικού που πετυχαίνει μια σύζευξη με το θηλυκό δεν είναι δεδομένη (Taylor & Yuval, 1999). Αφού τα θηλυκά συζευχθούν επιτυχώς με κάποιο αρσενικό παύουν να έλκονται από τις οσμές της σεξουαλικής φερομόνης των αρσενικών και πλέον ανταποκρίνονται έντονα στα ερεθίσματα των καρπών-ξενιστών (Jang, 1995). Κατόπιν της γονιμοποίησης και της ωρίμανσης των ωαρίων τους αρχίζουν την αναζήτηση κατάλληλων (δεκτικών ωοτοκίας) ξενιστών και η ωοτοκία γίνεται σε ώριμους (κατά προτίμηση) και ημιώρους καρπούς. Ο εντοπισμός του κατάλληλου ξενιστή στα Tephritidae γίνεται με την αξιοποίηση τόσο οπτικών όσο και οσμητικών ερεθισμάτων των ίδιων των φυτών και των καρπών τους. Για την μύγα της Μεσογείου το κύριο κριτήριο επιλογής του καρπού ξενιστή είναι η όραση (Nakagawa et al., 1978). Ωστόσο το κριτήριο που υπερισχύει κατά την επιλογή/προτίμηση του εντόμου σε έναν συγκεκριμένο καρπόξενιστή δεν είναι πάντα το ίδιο. Εξαρτάται, για παράδειγμα, από την πυκνότητα των καρπών, ώστε όταν η πυκνότητα των καρπών είναι χαμηλή η επιλογή γίνεται με βάση την οσμή ενώ όταν είναι υψηλή γίνεται με βάση τα 18

19 οπτικά ερεθίσματα κι ειδικότερα το σχήμα, το χρώμα και την αντίθεση σε σχέση με το φόντο (contrast) (Katsoyannos, 1989; Fletcher & Prokopy, 1991). Η μύγα της Μεσογείου προτιμά χρώματα όπως το μαύρο, το κόκκινο και το μπλε κυρίως, και πολύ λιγότερο χρώματα όπως το πορτοκαλί και το πράσινο (Katsoyannos et al., 1986; Katsoyannos, 1987). Μετά την αρχική αποδοχή μέσω της όρασης και την στάθμευση του εντόμου στον καρπό επιλογής, το οσμηρό κριτήριο είναι αυτό που επικρατεί. Το έντομο με την οσμή αναγνωρίζει πτητικές (πχ. αιθέρια έλαια) ή μη πτητικές ουσίες του καρπού ή την φερομόνη αποτροπής ωοτοκίας κάποιου άλλου θηλυκού που πιθανώς προηγήθηκε στον καρπό, και οδηγείται στην τελική επιλογή του συγκεκριμένου καρπού ως κατάλληλου για ωοτοκία ή όχι. Ακόμη όμως και μετά την είσοδο του ωοθέτη στον επιλεγμένο καρπό, το έντομο είναι σε θέση να αντιληφθεί ορισμένα ποιοτικά χαρακτηριστικά του καρπού (πχ. περιεκτικότητα σε σάκχαρα) και να απορρίψει ή να αποδεχτεί - αναλόγως - τον συγκεκριμένο καρπό ως ξενιστή. Τέλος, η προηγούμενη εμπειρία από την έναρξη της ενήλικης ζωής - αλλά κι αυτής που αποκτήθηκε κατά την προνυμφική ανάπτυξη - μπορεί να επηρεάσει την επιλογή του ξενιστή (Cooley et al., 1986). Η τροφική κατάσταση του ενηλίκου θηλυκού κι ειδικότερα η επάρκεια σε πρωτεΐνες είναι καθοριστικές για την ωοτοκία. Αν και τα ενήλικα διαθέτουν απόθεμα πρωτεϊνών, που αποκτήθηκε από την διατροφή τους στον ξενιστή κατά την προνυμφική τους ανάπτυξη, πιθανόν αρκετό για μια πρώτη ωοτοκία μετά την σύζευξη - περιορισμένου ωστόσο αριθμού αυγών - η συμπλήρωση της διατροφής τους κατά την ενήλικη ζωή τους με πρωτεΐνες φαίνεται πως - 19

20 μεταξύ άλλων - αυξάνει τον αριθμό των αυγών που μπορεί να εναποθέσουν τα ενήλικα θηλυκά (Ferro & Zucoloto, 1990; Cangussu & Zucoloto, 1994). Η ωοτοκία πραγματοποιείται με τον εκτατό ωοθέτη (Εικόνα 1) με τον οποίο το ενήλικο θηλυκό ανοίγει οπή στον καρπό (νύγμα ωοτοκίας) και εισάγει ένα ή περισσότερα αυγά (μέχρι κι έξι) στο περικάρπιο ή στο μεσοκάρπιο του καρπού και στην συνέχεια σύρει τον ωοθέτη του γύρω από την οπή αρχικά κι ακολούθως σε όλη την επιφάνεια του καρπού ξενιστή ώστε να αποθέσει με αυτόν τον τρόπο ορμόνη αποτροπής ωοτοκίας για την αποφυγή επιλογής του συγκεκριμένου καρπού-ξενιστή από άλλα θηλυκά για ωοτοκία (Prokopy et al., 1978). Αυτό το χαρακτηριστικό της συμπεριφοράς του είδους έχει προσαρμοστική, και υπό την έννοια αυτή, εξελικτική σημασία δεδομένου ότι αποτελεί «γονική επένδυση» αποσκοπώντας στην αύξηση κατά το δυνατό των πιθανοτήτων επιβίωσης των απογόνων μέσω της μείωσης του ανταγωνισμού. Αυτό γίνεται κατανοητό στην περίπτωση που πολλά θηλυκά ωοτοκήσουν στον ίδιο καρπό. Σε αυτήν την περίπτωση όλες οι προνύμφες που θα εκκολαφθούν θα πρέπει να καλύψουν τις τροφικές τους ανάγκες από την ίδια - περιορισμένη μετά από κάποια στιγμή - πηγή τροφής (τον καρπό) με αποτέλεσμα την ένταση του ανταγωνισμού και τον αποκλεισμό ή την στέρηση τροφής σε κάποιους από τους απογόνους. Περαιτέρω, ο ανταγωνισμός των προνυμφών, εντείνεται λόγω τοπικών διαφορών στην σύσταση της τροφής μέσα στον καρπό, τις οποίες οι προνύμφες είναι σε θέση να ανιχνεύουν και - αναλόγως - να κατευθύνονται προς τα μέρη εκείνα του καρπού-ξενιστή τους που έχουν καλύτερη ενεργειακή - κι εν τέλει προσαρμοστική - απόδοση (Zucoloto, 1987; Fernandes-da-Silva & Zucoloto, 1993). Σε ορισμένες περιπτώσεις τα θηλυκά ωοτοκούν και σε σχισμές ή 20

21 τραύματα του φλοιού των καρπών ή σε οπές ωοτοκίας άλλων εντόμων (Papaj et al., 1989). Οι προνύμφες που εκκολάπτονται από τα αυγά αναπτύσσονται τρεφόμενες με την σάρκα του καρπού. Όταν ολοκληρώσουν την προνυμφική τους ανάπτυξη εξέρχονται του καρπού - ο οποίος πλέον βρίσκεται σε κατάσταση σήψης με κατεστραμμένη εσωτερικά την σάρκα του - και πέφτουν στο έδαφος όπου και νυμφώνονται σε σχετικά μικρό βάθος (Τζανακάκης & Κατσόγιαννος, 2003). Αυτή η τροφική δραστηριότητα των προνυμφών αποτελεί και την κύρια βλάβη που προκαλεί το έντομο στους καρπούς και συνεπώς την οικονομική ζημία στην παραγωγή δεδομένου ότι οι προσβεβλημένοι καρποί τελικά καταστρέφονται και συνήθως πέφτουν. Δευτερευόντως, επιπρόσθετη βλάβη στους καρπούς-ξενιστές προκαλείται από την είσοδο παθογόνων μυκήτων και βακτηρίων δια μέσω της οπής ωοτοκίας ενώ κι άλλα είδη εντόμων (πχ δίπτερα του γένους Drosophila και κολεόπτερα του γένους Carpophilus ) ενδέχεται να ωοτοκήσουν στους προσβεβλημένους από την μύγα της Μεσογείου καρπούς, είτε στις οπές ωοτοκίας είτε στα σημεία εξόδου (απολήξεις στοών) των προνυμφών. Η μύγα της Μεσογείου έχει αναγνωριστεί και ως πιθανός φορέας ασθενειών των φυτών αλλά σε εργαστηριακές συνθήκες (Cayol et al., 1994) ενώ έχει αποδειχτεί κι η δυνατότητα μετάδοσης βακτηρίων που προκαλούν ανθρωπονόσους μέσω των φρούτων όπως το Escherichia coli (Sela et al., 2005). Η σημασία ωστόσο της έμμεσης ζημιάς στην φυτική παραγωγή που μπορεί να προκαλέσει η μύγα της Μεσογείου ως φορέας μετάδοσης φυτικών ασθενειών είναι σαφώς πολύ μικρότερη από την άμεση ζημιά που προκαλείται από την τροφική δραστηριότητα των προνυμφών ενώ η 21

22 πρόκληση ασθενειών στους ανθρώπους, μέσω μολυσμένων φρούτων και λαχανικών από βακτήρια που μεταδίδει η μύγα της Μεσογείου δεν έχει αξιολογηθεί. Τα βακτήρια όπως και οι μύκητες ή και τα απεκκρίματα άλλων εντόμων ακόμη και τα περιττώματα πουλιών αποτελούν σημαντικές πηγές πρωτεϊνών κατά την διατροφή των ενηλίκων, που είναι απαραίτητες στα θηλυκά για την ωρίμανση των αυγών πριν την ωοτοκία (όπως ήδη έχει αναφερθεί). Όπως συμβαίνει και με πολλά άλλα είδη εντόμων που φιλοξενούν μεγάλη ποικιλία βακτηριακής μικροχλωρίδας στο πεπτικό τους σύστημα (Dillon & Dillon, 2004) έτσι και στην Μύγα της Μεσογείου έχουν ανιχνευθεί σημαντικοί πληθυσμοί βακτηρίων κυρίως Enterobacteriacea (Behar et al., 2005) τόσο στο πεπτικό σύστημα όσο και στην οισοφαγική κοιλότητα του ενηλίκου (Marchini et al., 2002a; 2002b). Η σημασία των συμβιωτικών αυτών βακτηρίων στα έντομα γενικά, έγκειται στην συμμετοχή τους στον μεταβολισμό του εντόμου ξενιστή τους (Douglas, 1998) αλλά πιθανώς και στην αυξημένη προστασία από φυσικούς εχθρούς και παράσιτα (Oliver, et al., 2003). Ειδικότερα για την μύγα της Μεσογείου εκτός από τον ρόλο τους στον μεταβολισμό, την ανάπτυξη και την αναπαραγωγή οι πληθυσμοί των βακτηρίων μπορούν να έχουν έμμεση επίδραση στην προσαρμοστικότητα του ξενιστή τους (δηλ. της μύγας της Μεσογείου) που οφείλεται στην αύξηση της επιβίωσής του λόγω αποτροπής εγκατάστασης κι ανάπτυξης άλλων παθογόνων βακτηρίων (Behar et al., 2008) καθώς κι εν γένει στην συνολική διάρκεια της ζωής τους (Gavriel, et al., 2008). Ειδικότερα, η προσθήκη βακτηρίων του είδους Klebsiella oxytoca στην τροφή στείρων αρσενικών ενηλίκων που προοριζόταν για χρήση σε 22

23 πρόγραμμα SIT, βελτίωσε την ανταγωνιστικότητα των στείρων αρσενικών σε σχέση με τα άγρια (Gavriel et al., 2010). 1.5 Καταγωγή κι εξάπλωση του εντόμου Η μύγα της Μεσογείου θεωρείται ότι κατάγεται από την υποσαχάρια, υποτροπική Αφρική (White & Elson-Harris, 1992; Gasperi et al., 1991; Kourti et al., 1992; Malacrida et al., 1998). Η εξάπλωσή του στην Μεσόγειο θεωρείται ότι ξεκίνησε αρχικά από την Αίγυπτο, μέσω της κοιλάδας του Νείλου, και στην συνέχεια στα παράλια της Μέσης Ανατολής και της Δυτικής Μεσογείου ή μέσω των δυτικών παραλίων της Αφρικανικής Ηπείρου στην Ισπανία κι από εκεί στις υπόλοιπες χώρες (Παπαδόπουλος, 1998) ενώ η πρώτη καταγραμμένη αναφορά της παρουσίας του πιθανώς να είναι αυτή του 1842 στην Ισπανία (Robinson & Hooper, 1989). Η Μεσόγειος λοιπόν, αποτελεί την πρωταρχική περιοχή εισβολής του είδους δικαιολογώντας έτσι και την κοινή ονομασία του. Στην συνέχεια, και με την ανάπτυξη του διεθνούς εμπορίου φρούτων, η μύγα της Μεσογείου εξαπλώθηκε σε όλο τον πλανήτη ώστε σήμερα να θεωρείται κοσμοπολίτικο είδος με πολλές χώρες να έχουν μόνιμα εγκατεστημένους πληθυσμούς (Ελλάδα, Ισπανία, Ιταλία, Τουρκία, Συρία, Κύπρος, Αίγυπτος, Ισραήλ, Τυνησία, Βραζιλία, Παναμάς, Χαβάη κλπ.), άλλες να θεωρείται πως έχουν περιστασιακές εισβολές (Αργεντινή, Καλιφόρνια και Φλόριντα των ΗΠΑ) ενώ σε κάποιες απλά ανιχνεύεται η παρουσία του λόγω εισαχθέντων με το εμπόριο προσβεβλημένων φρούτων (Αυστρία, Βέλγιο, Γερμανία). 23

24 1.6 Οικονομική σημασία του εντόμου Η μύγα της Μεσογείου είναι το πλέον καταστρεπτικό έντομο-εχθρός φρούτων και λαχανικών στην περιοχή της Μεσογείου κι ειδικότερα στην περιοχή της Μέσης Ανατολής. Για το Ισραήλ, την Ιορδανία, τον Λίβανο, την Συρία και την Παλαιστίνη το κόστος της προσβολής ανέρχεται στα 298 εκατομμύρια δολάρια (περίπου 27% της ετήσιας αξίας των προϊόντων σε τιμές παραγωγού) με τα μέτρα αντιμετώπισης που λαμβάνονται σήμερα, ενώ στην περίπτωση που δεν ληφθούν κανενός είδους μέτρα αντιμετώπισης έχει υπολογιστεί σε περίπου 445 εκατομμύρια δολάρια (περίπου 41 % της ετήσιας αξίας των προϊόντων σε τιμές παραγωγού) (Enkerlin & Mumford, 1997). Αν σε αυτές τις οικονομικές απώλειες προστεθούν και το κόστος αντιμετώπισης και οι απώλειες εσόδων λόγω αποκλεισμού προσβεβλημένων παρτίδων από ξένες αγορές, γίνεται αντιληπτή η σημασία του εντόμου κι η ανάγκη για την καταπολέμησή του σε αυτές τις χώρες της Μεσογείου. Στην Καλιφόρνια των ΗΠΑ, έχει εκτιμηθεί (Anonymous, 1999) πως σε περίπτωση ευρείας προσβολής και μόνιμης εγκατάστασης του είδους, που εντοπίστηκε για πρώτη φορά στην περιοχή το 1975 (Metcalf & Metcalf, 1992) αλλά πιθανόν προϋπήρχε σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα από παλαιότερα (Carey, 1990, 1996) το κόστος μετρούμενο σε απώλειες παραγωγής αλλά και ως κόστος αντιμετώπισης, απώλειας αγορών και απώλειας θέσεων εργασίας θα ξεπερνούσε το 1 δις δολάρια κατ έτος. Στην πολιτεία αυτή περίπου 20 εκατ. δολάρια δαπανώνται ετησίως στο πρόγραμμα αποκλεισμού/καραντίνας της μύγας της Μεσογείου που χρηματοδοτείται από πολιτειακούς και ομοσπονδιακούς πόρους και που δεν αναγνωρίζεται ως «πρόγραμμα ελέγχου» δεδομένης της θέσης αρμόδιας επιστημονικής επιτροπής πως η 24

25 Καλιφόρνια δεν έχει μόνιμα εγκατεστημένο πληθυσμό της μύγας της Μεσογείου (Memorandum from Mediterranean Fruit Fly Science Advisory Panel to CDFA, Sept. 10, 2002). Για την Ελλάδα δεν υπάρχει κάποια ανάλογη εκτίμηση για το κόστος των απωλειών στην παραγωγή που οφείλονται στην μύγα της Μεσογείου ή για το κόστος αντιμετώπισης σε εθνικό επίπεδο. Άλλωστε δεν υπάρχει κρατικά χρηματοδοτούμενο πρόγραμμα αντιμετώπισης όπως γίνεται με τη περίπτωση ενός άλλου - σημαντικότερου για την Ελληνική γεωργία - εντόμου Tephritidae, του δάκου της ελιάς (Bactrocera oleae), για το οποίο υπάρχουν ανάλογες μελέτες. 1.7 Έλεγχος του εντόμου Η αντιμετώπιση της μύγας της Μεσογείου βασίζεται κατά κύριο λόγο στην χημική μέθοδο με την εφαρμογή ψεκασμών καλύψεως με εντομοκτόνα και δευτερευόντως με δολωματικούς ψεκασμούς όπου συνδυάζεται εντομοκτόνο και κάποιο ελκυστικό με εφαρμογές από το έδαφος. Παλιότερα γίνονταν εφαρμογές δολωματικών ψεκασμών κι από αέρος με ψεκαστικά αεροπλάνα όμως πλέον έχουν απαγορευτεί στην Ευρώπη. Τα ολοένα αυξανόμενα προβλήματα από την χρήση των εντομοκτόνων με ψεκασμούς καλύψεως όπως η θανάτωση ωφέλιμων (αρπακτικών και παρασιτοειδών) εντόμων κι η αύξηση έτσι των προσβολών από δευτερευούσης σημασίας εχθρούς (πχ. κοκκοειδή), η ανάπτυξη πληθυσμών ανθεκτικών στα εντομοκτόνα, τα προβλήματα ρύπανσης του περιβάλλοντος, τα προβλήματα υγείας των παραγωγών από την χρήση των εντομοκτόνων μέσω των ψεκασμών καλύψεως αλλά και η ανάγκη για ασφαλή αγροτικά προϊόντα στους 25

26 καταναλωτές, βάσει των ιδιαίτερα χαμηλών ορίων υπολειμμάτων φυτοφαρμάκων (MRLs), προκρίνουν την ανάπτυξη κι εφαρμογή εναλλακτικών των ψεκασμών καλύψεως μεθόδων ελέγχου. Εξάλλου με την χρήση εντομοκτόνων μέσω ψεκασμών καλύψεως επιτυγχάνεται σε μικρό ή μεγάλο βαθμό ο έλεγχος των ενηλίκων, κι έτσι η μείωση του πληθυσμού στην επόμενη γενεά, όχι όμως κι η αντιμετώπιση των προνυμφών στους ήδη προσβεβλημένους καρπούς από ενήλικα που ήδη ωοτόκησαν, ακόμη κι όταν γίνονται εφαρμογές καλύψεως με διασυστηματικά εντομοκτόνα (οργανοφωσφορικά, νεονικοτινοειδή) τα οποία όμως είτε σταδιακά αποσύρονται, είτε περιορίζεται η χρήση τους, είτε έχουν ήδη αποσυρθεί (καρβαμιδικά) από την αγορά των φυτοπροστατευτικών προϊόντων (ΦΠΠ) της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Τα πυρεθροειδή ΦΠΠ από την άλλη, που επίσης χρησιμοποιούνται ευρέως σε ψεκασμούς καλύψεως εναντίον των ενηλίκων, αφενός δεν έχουν διασυστηματική δράση και άρα δεν καταπολεμούν τις προνύμφες, κι αφετέρου η εφαρμογή τους συχνά ακολουθείται από την αύξηση των προσβολών από δευτερεύοντες εχθρούς λόγω θανάτωσης των ωφέλιμων. Εναλλακτικά των ψεκασμών καλύψεως χρησιμοποιείται η μέθοδος ή τεχνική των δολωματικών ψεκασμών για τον έλεγχο του εντόμου. Δεδομένης της σαφώς μικρότερης ποσότητας εντομοκτόνων που απαιτεί, λόγω του στοχευμένου τρόπου και τόπου δράσης, και του συνδυασμού υψηλής αποτελεσματικότητας και σχετικά χαμηλού κόστους, γίνεται κατανοητή κι η έμφαση που δίνεται παρακάτω - στην παρούσα εισαγωγή - στους δολωματικούς ψεκασμούς ως μέθοδο αντιμετώπισης. 26

27 H ανάγκη για συμπλήρωση της τροφής του ενηλίκου με πρωτεΐνες, έχει ως αποτέλεσμα την υψηλή προσέλκυση της μύγας της Μεσογείου, όπως και γενικά των Tephritidae, σε πηγές/υποστρώματα πρωτεϊνικής φύσης που βρίσκονται σε διαδικασία αποσύνθεσης, όπως παρατήρησε πρώτος ο McPhail (1939). Η αποσύνθεση αυτή «μεταφράζεται βιοχημικά» σε διάσπαση των πεπτιδικών δεσμών μεταξύ των αμινοξέων στα πεπτίδια που απαρτίζουν την/τις πολυπεπτιδικές αλυσίδες που στο σύνολο τους συνιστούν την κάθε πρωτεΐνη. Η διάσπαση αυτή γίνεται με την δράση ενζύμων από μικροοργανισμούς (βακτήρια) που βρίσκονται εν αφθονία στην φύση και προσλαμβάνουν έτσι τα απαραίτητα για τις ανάγκες του μεταβολισμού τους αμινοξέα. Επειδή κατά την αποσύνθεση τέτοιων πρωτεϊνικής φύσεως υποστρωμάτων εκλύεται αμμωνία λόγω της αποσύνθεσης των ίδιων των βακτηρίων (Bateman & Morton, 1981; Sivinski & Calkins, 1989), θεωρήθηκε πως η αμμωνία είναι υπεύθυνη για την προσέλκυση των Tephritidae σε τέτοια δολώματα, με τους ερευνητές αρχικά να υποστηρίζουν την χαμηλή ελκυστικότητα της αμμωνίας (McPhail, 1939; Gow, 1954) κι αργότερα την υψηλή ελκυστικότητα της (Prokopy & Economopoulos, 1975;). Οι Bateman & Morton (1981) μελέτησαν την χημική σύσταση των πτητικών ουσιών από υδρολυμένες πρωτεΐνες στο είδος Bactrocera tryoni (Diptera:Tephritidae) χωρίς ωστόσο να καταφέρουν να αναγνωρίσουν κάποιο συγκεκριμένο συστατικό ως υπεύθυνο για την ελκυστικότητα. Ωστόσο εντόπισαν την καλύτερη απόδοση δολωμάτων με οξικό αμμώνιο σε σχέση με ορισμένα υδρολύματα πρωτεϊνών και πως σε χαμηλές τιμές ph πρωτεϊνικών δολωμάτων η προσέλκυση της συγκεκριμένης μύγας οφειλόταν στην εκλυόμενη αμμωνία ενώ σε υψηλές τιμές ph σε άλλες πτητικές ουσίες. 27

28 Περαιτέρω, έρευνες στην μύγα της Μεσογείου για τον έλεγχο της ελκυστικότητας διαφόρων ουσιών όπως αλατούχες ενώσεις αμμωνίας (Baker et al., 1990), αλκυλο-πυραζίνες και οξικό γερανύλιο (Baker et al., 1990), υδρολυμένες πρωτεΐνες (Heath et al., 1994; Katsoyannos and Hendrichs, 1995), ενώσεις αμμωνίας με μεθυλαμίνες και πουτρεσκίνη (Epsky et al., 1995; Heath et al., 2004; Jang et al., 2007) απέδειξαν πως η αμμωνία (Mazor et al., 1987), κι ιδιαίτερα ο ρυθμός έκλυσης της (Mazor et al., 2002), φαίνεται να αποτελούν την βάση της ελκυστικότητας τέτοιων δολωματικών ουσιών. Η απλή αμμωνία, ακόμη και σήμερα, χρησιμοποιείται ως προϊόν αναφοράς σε συγκριτικές μελέτες ελκυστικότητας αλλά και ως φτηνό ελκυστικό σε τροφικές παγίδες σε οπωρώνες. Βάσει αυτής της συμπεριφοράς των ενηλίκων προτάθηκε και η χρήση υδρολυμένων πρωτεϊνών στους δολωματικούς ψεκασμούς (Steiner, 1952) που ως τεχνική για τον έλεγχο των Tephritidae είχε προταθεί από τον Berlese ήδη από τις αρχές του 20 ου αιώνα (1908) στην Ιταλία για την αντιμετώπιση του δάκου της ελιάς (Bactrocera oleae, Diptera:Tephritidae) με απλούστερα ελκυστικά της τότε εποχής (ζαχαρόνερο). Μερικά από τα εμπορικά σκευάσματα υδρολυμένων πρωτεϊνών που χρησιμοποιούνται στην Ελλάδα σε δολωματικούς ψεκασμούς εναντίον της μύγας της Μεσογείου - καθώς κι άλλων φυτοφάγων Tephritidae - είναι το «Dacus Bait 100» και το «NuLure» ενώ παλιότερα παρόμοια σκευάσματα που δεν κυκλοφορούν πλέον στην αγορά ήταν το «Buminal», το «Alma Dacus» και το «Entomosyl». Η μαγιά ενός μύκητα του γένους Torula spp. (Torula yeast) αποτελεί ένα άλλο τροφικό ελκυστικό με εμπορικό ενδιαφέρον που υπό μορφή ταμπλετών προστίθεται στο υγρό του δολώματος σε παγίδες. Ταυτόχρονα, άλλα σκευάσματα με εμπορικό ενδιαφέρον όπως το 28

29 «Εntomela», το «GF-120 TM Naturalyte Fruit Fly Bait» (ελκυστικό συστατικό του ετοιμόχρηστου δολώματος «Success» αν και δεν έχουν πραγματικό τροφικό περιεχόμενο για τα ενήλικα, όπως εν αντιθέσει έχουν οι υδρολυμένες πρωτεΐνες (αμινοξέα που δρουν ως τροφικό ερέθισμα με την επαφή κατά την λήψης τους (Sivinski & Calkins, 1989), έχουν παρόμοια με αυτές δράση λόγω του οσμηρού ερεθίσματος που προκαλούν τα συστατικά τους (ουρία, και προπυλενική γλυκόλη αντίστοιχα) στα ενήλικα Tephritidae. Παράλληλα με την έρευνα για τροφικά ελκυστικά αναπτύχθηκαν και φερομονικά ελκυστικά για την χρήση τους σε παγίδες για την παρακολούθηση της πτήσης του εντόμου αλλά και σε δολωματικούς ψεκασμούς. Σε τέτοια ελκυστικά συμπεριλαμβάνεται η συνθετική παραφερομόνη trimedlure (Beroza et al., 1961) που είναι ισχυρό ελκυστικό για τα αρσενικά, κι η συνθετική παραφερομόνη ceralure (McGovern & Cunnigham, 1987) που έχουν κι εκτεταμένη εμπορικά χρήση, καθώς και άλλα μίγματα ουσιών που εκλύονται από τα ίδια τα έντομα όπως έχουν προσδιοριστεί από σχετικές εργασίες (Jang et al., 1989a; Jang et al. 1989b; Heath et al., 1991; Casana-Giner et al., 2001) όπως πχ. η αιθανόλη με οξικό αιθύλιο και οξικό οξύ, το οξικό γερανύλιο κλπ. Η επιλογή του αποτελεσματικότερου ελκυστικού, υπό την έννοια τροφικού ή φερομονικού, για χρήση σε δολωματικούς ψεκασμούς ή για την παρακολούθηση του πληθυσμού μέσω παγίδων, αποτελεί θέμα συνεχιζόμενης έρευνας και δεν είναι εύκολο να απαντηθεί. Ο συνδυασμός δε, τροφικού και φερομονικού ελκυστικού δεν βρέθηκε να έχει συνεργιστική δράση στην αποτελεσματικότητα παγίδων στον αγρό (Liaropoulos et al., 2004) ενώ μείωσε την ελκυστικότητα του εντομοελκυστικού σε μια άλλη περίπτωση όπου χρησιμοποιήθηκε συνδυασμός της μαγιάς του μύκητα 29

30 Torula με προπυλενική γλυκόλη σε σχέση με την μαγιά του μύκητα μόνο διαλυμένη σε νερό ( Leblanc et al., 2010). Η παρακολούθηση της πτήσης του ενηλίκου γίνεται με την χρήση διαφόρων τύπων παγίδων. Ήδη από τις αρχές του 20 ου αιώνα είχαν αναπτυχθεί οι πρώτες παγίδες για μύγες των φρούτων με δολώματα που συνδύαζαν σάκχαρα και πρωτεΐνες (Gurney, 1925 από Katsoyannos et al.,1999). Σήμερα για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται γυάλινες ή πλαστικές παγίδες τύπου McPhail - καθώς και πολλές παραλλαγές της αυτοσχέδιες ή εμπορικές - με διάλυμα νερού, στο οποίο προστίθενται υγρή υδρολυμένη πρωτεΐνη (3% - 9%) και πιθανώς βόρακας ως συντηρητικό, ή μαγιά από μύκητα του γένους Torula (torula yeast), κι όπου η προσέλκυση γίνεται με τροφικά ελκυστικά (κι αφορά και τα δύο φύλα) ή με παγίδες Jackson (τύπου «δέλτα») ή άλλων τύπων κολλητικών παγίδων (πχ. τύπου ρολού) όπου η προσέλκυση γίνεται με την χρήση συνθετικής παραφερομόνης κι αφορά μόνο τα αρσενικά. Η παρακολούθηση του πληθυσμού της μύγας της Μεσογείου στον οπωρώνα/αγρό με παγίδες αλλά και με οπτικούς ελέγχους επί των καρπών και με δειγματοληψία καρπών (Papadopoulos, et al., 2001) γίνεται για τον προσδιορισμό του καταλληλότερου χρόνου επέμβασης είτε για ψεκασμό κάλυψης είτε πολύ περισσότερο για την εφαρμογή του δολωματικού ψεκασμού. Συμπληρωματικά, τα κλιματολογικά δεδομένα της περιοχής και η πρόγνωση του καιρού που θα ακολουθήσει των εφαρμογών θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη πριν την διενέργεια των δολωματικών ψεκασμών αφού παράγοντες όπως η θερμοκρασία κι η σχετική υγρασία, καθορίζουν τόσο την αποτελεσματικότητα του μίγματος δολώματος κι εντομοκτόνου (όταν 30

31 χρησιμοποιούνται υδρολυμένες πρωτεΐνες) όσο και την παρουσία και δραστηριότητα του εντόμου. Ο καθορισμός του χρόνου της τελευταίας επέμβασης με δολωματικό ψεκασμό εξαρτάται τέλος, και από το εντομοκτόνο που θα χρησιμοποιηθεί κι ειδικότερα από τον χρόνου τελευταίας επέμβασης πριν την συγκομιδή (όπως καθορίζεται από την ετικέτα του). Στις χημικές μεθόδους αντιμετώπισης περιλαμβάνονται κι άλλες περισσότερο φιλικές προς το περιβάλλον τεχνικές. Σε αυτές κατατάσσονται οι εφαρμογές με εντομοκτόνα όπως το lufenuron, που ανήκει στις βενζολουρίες με δράση παρεμπόδισης βιοσύνθεσης χιτίνης που προκαλεί την απόθεση στείρων αυγών από τα ενήλικα (και γι αυτό χαρακτηρίζεται κι ως χημικό στειρωτικό), που έχουν βρεθεί να είναι αποτελεσματικές στον έλεγχο του εντόμου, και μάλιστα με τα οφέλη στην μείωση του πληθυσμού να είναι αθροιστικά σε βάθος χρόνου λόγω της σταδιακής, από έτος σε έτος, μείωσης του πληθυσμού του (Navarro-Llopis et al., 2007). Επίσης η χρησιμοποίηση νεότερων, φυσικής προέλευσης, εντομοκτόνων όπως το spinosad που είναι περισσότερο εκλεκτικό - όχι όμως και πλήρως - ως προς τα ωφέλιμα έντομα σε σχέση με τα πυρεθροειδή ή τα οργανοφωσφορικά (Adan et al., 1996; Vargas et al., 2002a; Williams et al., 2003, Stark et al., 2004), οι αβερμεκτίνες με δράση μείωσης της γονιμότητας στην μύγα της Μεσογείου μικρής ωστόσο αποτελεσματικότητας (Albrecht & Sherman, 1987) και τέλος η εφαρμογή - μέσω κάλυψης των καρπών - ουσιών αποτρεπτικών της ωοτοκίας που βασίζονται σε χημικές ουσίες παρόμοιας φύσης με αυτές της φυσικής ορμόνης αποτροπής ωοτοκίας του ενηλίκου θηλυκού ακόμη και με συστατικά των περιττωμάτων του (Arredondo & Diaz-Fleischer, 2006) μπορούν να συμβάλλουν στον έλεγχο του εντόμου. 31

32 Στην Ελλάδα πολλές από τις παραπάνω δραστικές ουσίες είχαν κατά το παρελθόν έγκριση για χρήση σε ψεκασμούς καλύψεως ή δολωματικούς όπως τα οργανοφωσφορικά malathion, fenthion και dimethoate, το νεονικοτινοειδες imidacloprid ακόμη κι ο εντομοπαθογόνος μύκητας Beauveria bassiana. Ωστόσο, ελάχιστες είναι πλέον εγκεκριμένες για αντιμετώπιση του εντόμου με ψεκασμούς καλύψεως κι αφορούν κατά βάση το πυρεθροειδές deltamethrin με ευρύ φάσμα δράσης και το οργανοφωσφορικό phosmet με έγκριση στα εσπεριδοειδή αλλά και την ροδακινιά και την νεκταρινιά (βάση δεδομένων φυτοπροστατευτικών προϊόντων, υπουργείο Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων, Μάρτιος 2016). Πλήρως εναλλακτικές των χημικών, μέθοδοι αντιμετώπισης της μύγας της Μεσογείου είναι η μαζική παγίδευση, η τεχνική της εξαπόλυσης στείρων εντόμων και η χρησιμοποίηση εντόμων φυσικών εχθρών της μύγας της Μεσογείου ή εντομοπαθογόνων βακτηρίων, νηματωδών, μυκήτων και λοιπόν μικροοργανισμών ή ιών (βιολογική αντιμετώπιση). Η μέθοδος της μαζικής παγίδευσης αφορά στην εγκατάσταση στον αγρό ή τον οπωρώνα ενός πυκνού δικτύου παγίδων για την σύλληψη του μεγαλύτερου δυνατού αριθμού ενηλίκων και βρίσκει εφαρμογή σε ολοένα κι αυξανόμενο βαθμό σε περιοχές της Μεσογείου (Navarro-Lloppis et al., 2008) καθώς βελτιώνονται τα εντομοελκυστικά που χρησιμοποιούνται, μειώνεται το κόστος τέτοιων συστημάτων κι αυξάνεται η ανάγκη για περισσότερο - περιβαλλοντικά - φιλικές τεχνικές αντιμετώπισης. Η αποτελεσματικότητα της μεθόδου στον έλεγχο του εντόμου εξαρτάται από τα χαρακτηριστικά της κάθε παγίδας (πχ είδος, χρώμα, σχήμα, ελκυστικό που περιέχει), από την πυκνότητα του πληθυσμού του εντόμου και από την πυκνότητα ανάρτησης. 32

33 Θεωρείται - γενικά ως μέθοδος - ικανοποιητικής αποτελεσματικότητας σε περιπτώσεις χαμηλής πυκνότητας πληθυσμού ή απομονωμένων πληθυσμών (El-Sayed et al., 2006). Στην Ελλάδα χρησιμοποιείται κατά κύριο λόγο στις βιολογικές καλλιέργειες όπου δεν είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί η χημική μέθοδος (ψεκασμοί κάλυψης ή δολωματικοί). Η τεχνική της εξαπόλυσης στείρων εντόμων (SIT) που αναπτύχθηκε από τον Knipling (1955) έγκειται στην συστηματική εισαγωγή στους φυσικούς πληθυσμούς στειρωμένων αρσενικών μέσω επαναλαμβανόμενων μαζικών εξαπολύσεων. Μακροπρόθεσμα επιτυγχάνεται μείωση ή και εξάλειψη του πληθυσμού της μύγας της Μεσογείου λόγω της σταδιακής επικράτησης στον γενικό πληθυσμό των στείρων εντόμων. Της κάθε εξαπόλυσης προηγείται συνήθως εφαρμογή ψεκασμού κάλυψης ώστε να μειωθεί σημαντικά ο αρχικός φυσικός πληθυσμός και να αυξηθούν οι πιθανότητες επικράτησης των στειρωμένων. Η μέθοδος αυτή θεωρείται και ως η πλέον φιλική προς το περιβάλλον αλλά έχει υψηλό κόστος και απαιτεί εξειδικευμένο προσωπικό κι εγκαταστάσεις ενώ τα οφέλη της δεν είναι άμεσα, όπως με τις άλλες μεθόδους ελέγχου, αλλά φαίνονται σε βάθος χρόνου μέσω της σταδιακής από γενεά σε γενεά, μείωσης του πληθυσμού. Έχει χρησιμοποιηθεί με ικανοποιητικά ως κι άριστα αποτελέσματα για τον έλεγχο του εντόμου σε ΗΠΑ (Καλιφόρνια, Φλόριντα, Χαβάη), Κόστα Ρίκα, Μεξικό, Χιλή, Περού, Αργεντινή, Ισραήλ και Νικαράγουα (Hendrichs, et al., 2002) αλλά όχι στην Ελλάδα. Στην βιολογική αντιμετώπιση περιλαμβάνεται η χρήση φυσικών εχθρών της Μύγας της Μεσογείου δηλαδή αρπακτικών και παρασιτοειδών ειδών. Ειδικότερα, συνίσταται στις τεχνικές κι εργασίες εκείνες που επιτρέπουν την διαχείριση/διατήρηση των πληθυσμών εντόμων εχθρών 33

34 αρπακτικών και παρασιτοειδών της μύγας της Μεσογείου που είναι ιθαγενή στην περιοχή κι εντοπίζονται στον αγρό/οπωρώνα καθώς και στην εισαγωγή μέσω εξαπόλυσης/εξαπολύσεων στον αγρό εντόμων που εκτρέφονται στο εργαστήριο και είναι είτε ιθαγενή είτε εξωτικά της συγκεκριμένης περιοχής. Στην Ελλάδα αναφέρεται η περίπτωση του παρασιτοειδούς Dirhinus gifardii που εισήχθη από το Ισραήλ το 1962 κι εξαπολύθηκε στην νότια ηπειρωτική Ελλάδα χωρίς ωστόσο να ξαναβρεθεί από τότε (Greathead 1976, από Papadopoulos & Katsoyannos, 2003). Καμιά άλλη ανάλογη προσπάθεια δεν έχει αναφερθεί έκτοτε αλλά κατά καιρούς έχουν εντοπιστεί είδη που παρασιτούν την μύγα όπως το Aganaspis daci (Hymenoptera: Eucoilidae) σε παρασιτισμένες νύμφες από προσβεβλημένα σύκα στην Χίο (Papadopoulos & Katsoyannos, 2003 από Ιωάννου, 2005). Στις ΗΠΑ, έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία κάποια παρασιτοειδή υμενόπτερα της οικογένειας των Braconidae όπως το Fopius arisanus, τo Diachasmimorpha longicaudata (Opius longicaudatus), το Diachasmimorpha tryoni, το Diachasmimorpha kraussii, το Fopius vandenboschi (Opius vandenboschi), το Psytallia incise, και το Psyttalia fletcheri (Nakagawa, et al., 1969, Vargas et al., 1999,, Messing & Ramadan, 2000, Vargas et al., 2001, Vargas et al., 2002b; Stibick, 2004). Στην βιολογική αντιμετώπιση περιλαμβάνεται επίσης η αξιοποίηση εντομοπαθογόνων μικροοργανισμών. Στελέχη βακτηρίων όπως το Bacillus thuringiensis (Aboussaid et al., 2010) και μυκήτων όπως τα Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Verticillium lecanii, και Paecilomyces fumosoroseus (Lacey et al., 2001) χρησιμοποιούνται στην πράξη για τον έλεγχο διαφόρων εντόμων μεταξύ των οποίων και διάφορα Tephritidae. Στελέχη από τους μύκητες Μ. anisopliae και Ρ. fumosoroseus έχουν βρεθεί να 34

35 είναι παθογόνα της μύγας της Μεσογείου σε συνθήκες εργαστηρίου (Castillo et al., 2000; Ekesi et al., 2002; Quesada-Moraga et al., 2008). Στελέχη από τους μύκητες Beauveria brongniartii και Β. basiiana βρέθηκαν επίσης να είναι πολύ αποτελεσματικά εναντίον ενηλίκων της μύγας ενώ και μεταβολίτες από τους μύκητες Mucor hiemalis και Penicillium chrysogenum βρέθηκαν να είναι τοξικοί, σε συνθήκες εργαστηρίου (Konstantopoulou & Mazomenos, 2005). Άλλοι μικροοργανισμοί που έχουν αναφερθεί ως εντομοπαθογόνοι της μύγας (σε διάφορα στάδια της ανάπτυξής τους) περιλαμβάνουν τους μύκητες Entomophthora muscae και Entomophthora schizophorae (Uziel et al., 2003) και τους νηματώδεις Steinernema feltiae (Lindegren et al., 1989), S. carpocapsae (Lindegren, 1990), και S. riobrave (Gazit et al., 2000). Καλλιεργητικά μέτρα και πρακτικές και άλλες φυσικές μέθοδοι μπορούν να βοηθήσουν στην μείωση του πληθυσμού ή των προσβολών από την μύγα της Μεσογείου. Στις καλλιεργητικές πρακτικές περιλαμβάνονται τυπικές διαδικασίες που γίνονται ούτως ή άλλως όπως η καλλιέργεια του εδάφους (φρεζάρισμα) για την καταστροφή των ζιζανίων προσδοκώντας παράλληλα την καταστροφή των νυμφών που βρίσκονται σε μικρό βάθος κάτω από την επιφάνεια ή τουλάχιστον την άνοδό τους στην επιφάνεια του εδάφους και την έκθεσή τους έτσι σε φυσικούς εχθρούς τους, αλλά και καλλιεργητικά μέτρα που συχνά παραμελούνται όπως η απομάκρυνση προσβεβλημένων καρπών που μένουν πάνω στο δένδρο ή πέφτουν στο χώμα και τέλος η πρώιμη συγκομιδή. Το περιτύλιγμα των καρπών με χαρτί ή άλλο υλικό συσκευασίας (πχ. φιλμ πολυαιθυλενίου, ημιδιαπερατές μεμβράνες) (Jang, 1990) μπορεί να προστατεύσει τους καρπούς από την ωοτοκία αλλά πρόκειται για δύσκολη 35

36 στην εφαρμογή της τεχνική. Ένα φυτοπροστατευτικό προϊόν με έγκριση και στην χώρα μας (για την αντιμετώπιση όμως της ψύλας της αχλαδιάς, Cacopsylla pyri) είναι ο καολίνης που βασίζεται στην τεχνολογία δημιουργίας φιλμ σωματιδίων πυριτίου επί της φυτικής επιφάνειας, έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στην προστασία των καρπών από προσβολές της μύγας της Μεσογείου (Mazor & Ezer, 2004). Τέλος, η εφαρμογή γιββεριλλικού οξέος (GA) σε ορισμένα εσπεριδοειδή σε συνθήκες εργαστηρίου και αγρού οδήγησε σε αυξημένη αντοχή από προσβολές του εντόμου (Rossler & Greany, 1990). Άλλες μέθοδοι όπως η εμβάπτιση συγκομισθέντων καρπών σε κρύο νερό ή σε ζεστό νερό (Sharp, 1989), η έκθεσή τους σε πεπιεσμένο θερμό αέρα (Armstrong et al., 1995) ή σε χαμηλές θερμοκρασίες αποθήκευσης (Hill et al., 1988), η χρήση ιονίζουσας ακτινοβολίας σε προσβεβλημένους καρπούς (Hallman & Loaharanu, 2002) κι ακόμη η απολύμανση καρπών με την χρήση καπνιστικών εντομοκτόνων έχουν χρησιμοποιηθεί στα πλαίσια μέτρων καραντίνας από αρμόδιες κρατικές υπηρεσίες για την αποτροπή της εξάπλωσης των Tephritidae μέσω του διεθνούς εμπορίου φρούτων και λαχανικών, την προστασία των εξαγωγών τους αλλά και της εγχώριας παραγωγής τους. 1.8 Σκοπός της διατριβής Με την έναρξη της ενήλικης ζωής της μύγας της Μεσογείου τα θηλυκά θα πρέπει με την διατροφή τους να καλύψουν τις διατροφικές ανάγκες των ίδιων αλλά και των αναπτυσσόμενων αυγών εντός των ωοθηκών τους, να συνευρεθούν με το καλύτερο αρσενικό και να εντοπίσουν το κατάλληλο ξενιστή για ωοτοκία, ενώ τα αρσενικά με την διατροφή τους θα πρέπει να 36

37 καλύψουν τις ενεργειακές τους ανάγκες ιδίως όσον αφορά τις εξαιρετικά απαιτητικές σε ενέργεια ανάγκες της αναπαραγωγικής τους συμπεριφοράς (ερωτοτροπία και σύζευξη). Η διατροφή των ενηλίκων λοιπόν επηρεάζει σημαντικά εκτός από την επιβίωση ή γενικά, την διάρκεια ζωής, και την αναπαραγωγική δραστηριότητα (Blay, S. & Yuval, B., 1997; Field, S.A. & Yuval, B., 1999) και άρα την εξελικτική «επιτυχία» τους εν αντιθέσει με άλλα είδη ολομετάβολων εντόμων στα οποία η διατροφή κατά την προνυμφική ανάπτυξη είναι αυτή που καθορίζει εν πολλοίς την εξελικτική απόδοση και την προσαρμοστικότητα τους στα ενήλικα στάδια (Yuval & Hendrichs, 2000). Η μελέτη λοιπόν της διατροφής των ενηλίκων αποτελεί αναπόσπαστο τμήμα της κατανόησης της βιολογίας και της συμπεριφοράς αυτού του εντόμου. Η διατροφή της μύγας της Μεσογείου έχει ερευνηθεί ικανοποιητικά, όπως και συνολικά στις μύγες των φρούτων αλλά σαφώς λιγότερο (Drew & Yuval, 2000), σε σχέση με την εκτεταμένη έρευνα στην σεξουαλική συμπεριφορά ή την ωοτοκία τους (Diaz-Fleischer & Aluja, 2000). Η έρευνα της συμπεριφοράς της διατροφής στις μύγες των φρούτων έχει επικεντρωθεί στα ενδιαιτήματα των εντόμων, την αναζήτηση της τροφής και τέλος στην διατροφή σε σχέση με την ποιότητα της τροφής και την επίδρασή της στην προσαρμοστικότητα των εντόμων (Drew & Yuval, 2000). Ειδικότερα για την μύγα της Μεσογείου η διατροφή έχει μελετηθεί κυρίως σε εργαστηριακές συνθήκες, με τις σχετικές μελέτες να μπορούν να διακριθούν πρωταρχικώς σε αυτές που αφορούν την προνυμφική ανάπτυξη (Zucoloto, 1987; 1991; Krainacker et al., 1987; Nestel et al., 2004a; Nestel et al., 2004b; Nestel & Nemny-Lavy, 2007) και σε αυτές που αφορούν τα ενήλικα (Drew et al., 1983; Chang et al., 2001; Cangussu & Zucoloto, 1992; Cangussu & Zucoloto, 2004; 37

38 Nestel et al., 2005; Plácido-Silva et al., 2006) αλλά και σε συνδυαστικές σε προνυμφική κι ενήλικη ζωή (Chang, 2004). Επιπλέον μπορεί να διακριθεί σε βασική κι εφαρμοσμένη με την δεύτερη να αφορά συγκριτικές μελέτες δολωμάτων - απλών ή συνδυασμών τους με εντομοκτόνα (Nestel et al., 2004) - και φυσικών πηγών τροφής (Prokopy et al., 1992; Drew & Yuval, 2000). Ωστόσο, παρουσιάζεται έλλειμμα στην έρευνα της διατροφής της μύγας της Μεσογείου όσον αφορά την καθημερινή της διατροφή σε επίπεδο ποσοτήτων ή συχνότητας λήψης της με ακριβείς μετρήσεις και για το σύνολο της ενήλικης ζωής. Η καταμέτρηση της καθημερινής διατροφής του εντόμου στο σύνολο της ενήλικης ζωής του και η συσχέτισή της με βιολογικές παραμέτρους όπως η επιβίωση και η ωοτοκία αποτέλεσε το αντικείμενο της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής. Η ακριβής καταμέτρηση της τροφής που λαμβάνουν καθημερινά τα ενήλικα της μύγας της Μεσογείου αποτελεί ωστόσο ένα εξαιρετικά δύσκολο έργο σε φυσικές συνθήκες ενώ στο εργαστήριο δεν υπάρχουν καθιερωμένες μέθοδοι για μια τέτοια ποσοτική προσέγγιση που θα λαμβάνει υπόψη όχι μόνο το σύνολο της διατροφής στην συνολική διάρκεια ζωής των ενηλίκων αλλά και την κατανομή της στον χρόνο σε σχέση μάλιστα με την αναπαραγωγή τους. Μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για ανάλογες μετρήσεις σε άλλα δίπτερα όπως το Drosophila melanogaster υπόκεινται σε περιορισμούς που μειώνουν την ακρίβεια των μετρήσεων (Deshpante et al., 2014) όπως η μέθοδος μέτρησης εκτεινόμενης προβοσκίδας (PE) (Wong et al., 2009), ή ενδεχομένως επιδρούν στην διαδικασία της λήψης ή της αξιοποίησης της τροφής (π.χ. έμμεση μέθοδος προσδιορισμού διατροφής μέσω σήμανσης της με χρωστικές, Wong et al., 2009) ή της αναπαραγωγικής 38

39 δραστηριότητας (πχ. μέθοδος σήμανσης με ραδιενεργά ισότοπα, King & Wilson, 1955). Οι μέθοδοι μετρήσεων της διατροφής που ανέπτυξαν οι Meats & Leighton (2004) στο Bactrocera tryoni (Diptera:Tephritidae) και οι Ja et al. (2007) στο Drosophila melanogaster (Diptera:Drosophilidae) παρά τις επιμέρους διαφορές τους, συνιστώνται στην χρησιμοποίηση τριχοειδών σωλήνων που επιτρέπουν την ακριβή μέτρηση ακόμη κι ελαχίστων όγκων διαλυμάτων θρέψης. Παρά τις αντιρρήσεις για την σημαντική μείωση της διάρκειας ζωής και της ωοτοκίας των ενηλίκων, για την περίπτωση του Drosophila melanogaster τουλάχιστον, που διατρέφονται με αυτήν την μέθοδο σε σχέση με ενήλικα που τρέφονται σε συνήθη τροφή βασιζόμενη σε άγαρ υπό την μορφή γέλης (Bass et al., 2007) που οι Wong et al., (2009) αποδίδουν στην μη ανταπόκριση αυτού του είδους τροφής (σε υγρή μορφή) αλλά και του τρόπου λήψης της (υπό την έννοια της αναγκαίας για την λήψη της από την άκρη του τριχοειδούς σωλήνα θρέψης, προσέγγισης του εντόμου σε ανάποδη κατακόρυφη θέση) σε φυσικές συνθήκες, που ωστόσο οι Deshpante et al. (2014) απέδειξαν ότι δεν έχει σημαντική επίδραση, η μέθοδος αυτή παρουσιάζει τα εξής δύο πλεονεκτήματα. Αφενός επιτρέπει υψηλής ακρίβειας μετρήσεις καταναλωθέντος όγκου θρεπτικών διαλυμάτων κι αφετέρου είναι σχετικά απλή και οικονομική μέθοδος. Η μέθοδος διατροφής με τριχοειδείς σωλήνες (Capillary Feeder, CAFE) λοιπόν αποτέλεσε την προτιμώμενη μέθοδο μέτρησης της διατροφής των ενηλίκων της μύγας της Μεσογείου στην παρούσα διατριβή. Η μέθοδος της διατροφής με την χρήση τριχοειδών σωλήνων εφαρμόστηκε σε μεμονωμένα ενήλικα (αρσενικά και θηλυκά) για την μέτρηση 39

40 της καθημερινής κατανάλωσης ζάχαρης με την πρωτεΐνη να παρέχεται ad libitum και της καθημερινής κατανάλωσης πρωτεΐνης με την ζάχαρη να παρέχεται αυτήν την φορά ad libitum για το σύνολο της ζωής τους. Ερευνήθηκε έτσι, η επίδραση που είχε η εκάστοτε διατροφή στην διάρκεια ζωής των ενηλίκων δεδομένης της παρουσίας εν αφθονία της άλλης, κι ιδιαίτερα για την περίπτωση των θηλυκών στην ωοπαραγωγή τους. 40

41 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 2. ΓΕΝΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Συνθήκες εργαστηρίου Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο Εφαρμοσμένης Ζωολογίας και Παρασιτολογίας (Εντομολογίας) του Τμήματος Γεωπονίας του Α.Π.Θ. κατά τα έτη 2009 και Σε όλη την διάρκεια των πειραμάτων η θερμοκρασία του χώρου ήταν 25±1 C, η σχετική υγρασία του χώρου 55±10% και η φωτοπερίοδος 14:10 (Φ:Σ) με ώρα έναρξης της φωτόφασης στις 07:00 και ώρα λήξης στις 21:00. Ο φωτισμός προερχόταν από λαμπτήρες φθορίου και από τον φυσικό φωτισμό μέσω των παραθύρων του εργαστηρίου. 2.2 Έντομα που χρησιμοποιήθηκαν, υλικά και μέθοδοι εκτροφής Κατά την διενέργεια των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν έντομα που είχαν εκτραφεί στο εργαστήριο για περιορισμένο αριθμό γενεών (από 3 ως 10). Η προέλευση των εντόμων ήταν από τον χώρο του αγροκτήματος του Τμήματος Γεωπονίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης στην περιοχή της Θέρμης (Θεσσαλονίκη). Οι καρποί από τους οποίους συλλέχθηκαν τα αρχικά άτομα του εργαστηριακού πληθυσμού, τον Σεπτέμβριο του 2008, ήταν σύκα, ροδάκινα, βερίκοκα κι αχλάδια. Οι προνύμφες με την ολοκλήρωση της ανάπτυξής τους εξέρχονταν των προσβεβλημένων καρπών που διατηρούνταν σε λεκάνες με άμμο και νυμφώνονταν στην άμμο (Εικόνα 2). Μετά την συλλογή των νυμφών με 41

42 κοσκίνισμα της άμμου ακολουθούσε η τοποθέτησή τους μέσα σε τρυβλία (Εικόνα 3) και στην συνέχεια τα τρυβλία τοποθετούνταν σε κλουβιά όπου κι εξέρχονταν τα ενήλικα. Τα κλουβιά αυτά ήταν ξύλινα, σχήματος κύβου, διαστάσεων 30 x 30 x 30 cm με τις τρεις πλευρές τους να καλύπτονται με συρμάτινο πλέγμα και την τέταρτη από γυαλί (Εικόνα 4). Σε κάθε τέτοιο κλουβί τοποθετούνταν περίπου ενήλικα και των δύο φύλων και της ίδιας ημέρας εξόδου από τις νύμφες, ώστε να έχουν την ίδια ηλικία. Το κλουβί περιείχε τροφή για τα ενήλικα καθώς και δύο κυλινδρικά πλαστικά φιαλίδια με νερό, από τα οποία εξερχόταν ένα σπογγώδες υγρό φυτίλι. Η τροφή για τα ενήλικα αποτελούνταν από μίγμα υδρολυμένης πρωτεΐνης, ζάχαρης και νερού σε αναλογία 1:4:5 και προσφερόταν στα έντομα υπό τη μορφή στερεοποιημένων σταγόνων στην επιφάνεια πλαστικών τρυβλίων Petri διαμέτρου 9 cm. Λίγες μέρες μετά και αφότου είχαν αρχίσει να παρατηρούνται συζεύξεις μεταξύ αρσενικών και θηλυκών, στα κλουβιά τοποθετούνταν επίσης 2 κοίλα πλαστικά ημισφαίρια κόκκινου χρώματος πάχους 1.5 mm και διαμέτρου 5 cm τα ή και μεγαλύτερα διαμέτρου 9 cm οποία χρησιμοποιούνταν ως τεχνητά υποστρώματα ωοτοκίας για τα θηλυκά (Εικόνα 5). Σε κάθε ένα τέτοιο ημισφαίριο είχαν δημιουργηθεί περίπου 50 οπές, 100 για τα μεγαλύτερα, διαμέτρου περίπου 1 mm ομοιόμορφα κατανεμημένες στην επιφάνεια του ημισφαιρίου. Το κάθε ημισφαίριο προσαρμόζονταν στο κάλυμμα πλαστικού τρυβλίου Petri διαμέτρου 5.5 cm στο οποίο είχε δημιουργηθεί οπή διαμέτρου 5 cm ή 8,5 cm αντίστοιχα για τα μεγαλύτερα τρυβλία των 9 cm. Στην βάση των τρυβλίων αυτών υπήρχε χυμός πορτοκαλιού ώστε να διεγείρεται η ωοτοκία αλλά και να διατηρείται υψηλή σχετική υγρασία στον χώρο κάτω από 42

43 το ημισφαίριο ώστε αφενός να ωοτοκούν τα θηλυκά και αφετέρου να μην αφυδατώνονται τα αυγά (Boller, 1985). Τα συζευγμένα πλέον θηλυκά ωοτοκούσαν στις οπές των υποστρωμάτων αυτών (Εικόνα 6) και τα αυγά λαμβάνονταν με την άκρη μαλακού πινέλου ώστε να μεταφερθούν σε ένα έτοιμο υπόστρωμα ανάπτυξης για τις προνύμφες που θα εκκολάπτονταν από τα αυγά. Το υπόστρωμα ανάπτυξης των προνυμφών παρασκευάζονταν από 100 gr ζάχαρης, 100 gr μαγιά μπύρας, 50 gr αλευριού σόγιας, 2 gr μίγματος αλάτων, 8 gr ασκορβικού οξέος, 8 gr κιτρικού οξέος και 1,5 gr προπιονικού νατρίου διαλυμένα σε 500 ml νερού. Το μίγμα αυτό είχε παχύρευστη μορφή και τοποθετούνταν στην επιφάνεια δισκίων από βαμβάκι τα οποία τοποθετούνταν σε αποστειρωμένα τρυβλία Petri διαμέτρου 9 cm (Εικόνα 7). Σε κάθε τέτοιο τρυβλίο τοποθετούνταν επάνω στην τροφή 50 περίπου αυγά κι αφού το τρυβλίο κλεινόταν με το κάλυμμά του, τοποθετούνταν μέσα σε πλαστική διαφανή μεμβράνη ώστε να αποφευχθεί τυχόν απώλεια υγρασίας κι επακόλουθη αφυδάτωση των αυγών. Περισσότερες λεπτομέρειες με την μέθοδο εκτροφής και την ετοιμασία της τροφής δίνονται από τον Boller (1985). Σε περίπου 10 ημέρες (στους 25 C) ολοκληρωνόταν η ανάπτυξη των προνυμφών στο θρεπτικό υπόστρωμα και τα τρυβλία με τις ανεπτυγμένες προνύμφες αφήνονταν ανοιχτά μέσα σε πλαστικές λεκάνες που στην βάση τους είχαν στρώμα άμμου πάχους περίπου 5 mm. Οι προνύμφες είτε έρποντας είτε με σύσπαση και εκτίναξη του σώματός τους, εξέρχονταν από το τρυβλίου και νυμφώνονταν στην άμμο. Με προσεκτικό κοσκίνισμα και ξέπλυμα της άμμου λαμβάνονταν οι νύμφες από τις οποίες, 10 περίπου ημέρες αργότερα, εμφανίζονταν τα ενήλικα της F 1 γενεάς. Με την μέθοδο αυτήν να επαναλαμβάνεται από γενεά σε γενεά αποκτηθήκαν οι πληθυσμοί 43

44 των ενηλίκων που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα της παρούσας διατριβής. 2.3 Τριχοειδείς σωλήνες πρόσληψης τροφής και κλουβιά που χρησιμοποιήθηκαν Η καταμέτρηση της ημερήσιας κατανάλωσης τροφής από ενήλικα της μύγας της Μεσογείου αποτέλεσε το κύριο αντικείμενο της παρούσας διατριβής και για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε μια παραλλαγή της μεθόδου που εφάρμοσαν οι Meats & Leighton (2004) στο Bactrocera tryoni (Diptera:Tephritidae) και οι Ja et al. (2007) στο Drosophila melanogaster (Diptera:Drosophilidae). Γενικά η μέθοδος αυτή βασίζεται στην χρήση τριχοειδών σωλήνων γυάλινης κατασκευής, που περιέχουν σε υγρή μορφή τροφικά διαλύματα που παρέχονται σε μεμονωμένα ενήλικα και η καταμέτρηση της κατανάλωσης γίνεται με την πτώση της στήλης του διαλύματος εντός των τριχοειδών αυτών σωλήνων που είναι κατάλληλα βαθμονομημένοι γι αυτό τον σκοπό. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν τριχοειδείς γυάλινοι σωλήνες μήκους 75 mm και χωρητικότητας 5 μl (5 μl, Nο , plain; Marienfeld Laboratory Glassware, Germany). Τρείς διαφορετικοί τύποι θαλάμων/κλουβιών χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα της παρούσας διατριβής. Δύο από αυτούς αφορούσαν ομαδικούς θαλάμους κι ο τρίτος αφορούσε τα ατομικά κλουβιά στα οποία γινόταν ο εγκλεισμός μεμονωμένων ενηλίκων. Ο ένας τύπος ομαδικών θαλάμων αφορούσε κυβικού σχήματος κλουβιά διαστάσεων 20Χ20Χ20 cm, κατασκευασμένα από Plexiglas έχοντας την πάνω επιφάνεια τους 44

45 υποκατεστημένη από ενσωματωμένο σε αυτά πλαστικό δίχτυ και στην μία κάθετη επιφάνειά τους άνοιγμα κυκλικού σχήματος με πλαστικό κάλυμμα για την εισαγωγή εντόμων και στο οποίο είχε επίσης αντικατασταθεί τμήμα του από πλαστικό δίκτυ. Αυτός ο τύπος ομαδικού θαλάμου χρησιμοποιήθηκε στα προκαταρτικά πειράματα (βλ. κεφάλαιο 3.3). Ο άλλος τύπος ομαδικού θαλάμου που χρησιμοποιήθηκε σε όλα τα άλλα πειράματα αφορούσε ένα ορθογώνιου παραλληλεπίπεδου σχήματος κλουβί διαστάσεων 25Χ35Χ25 cm κατασκευασμένου από Plexiglas (Εικόνες 8-11). Η πάνω επιφάνεια του ήταν αποσπώμενη (λειτουργώντας ως καπάκι του ομαδικού θαλάμου) και στο κέντρο της κόπηκε μια οπή διαμέτρου 15 cm επί της οποίας ενσωματώθηκε πλαστικό δίχτυ. Στην πρόσθια κάθετη πλευρά του μια οπή διαμέτρου 8 cm καλυπτόταν με πλαστικό πώμα με ενσωματωμένο πλαστικό δίχτυ που λειτουργούσε ως εξαερισμός του ομαδικού θαλάμου (Εικόνα 8). Σ αυτούς τους ομαδικούς θαλάμους τοποθετούνταν μέχρι και έξι ατομικά κλουβιά. Τα ατομικά κλουβιά κατασκευάστηκαν από αντεστραμμένα πλαστικά διαφανή ποτήρια χωρητικότητας 400 ml, ύψους 12 cm και διάμετρο 9 και 6,5 cm στην βάση και το επάνω μέρος αντίστοιχα (Εικόνες 12-14). Από την πλευρική επιφάνεια των κλουβιών αυτών αφαιρέθηκε ένα τμήμα διαστάσεων περίπου 5X8 cm κι αντικαταστάθηκε από πλαστικό δίχτυ (τούλι), δημιουργώντας έτσι ένα «παράθυρο» για τον αερισμό του κλουβιού. Στο επάνω μέρος του κλουβιού και στο μέσο του ανοίχτηκε κυκλικό άνοιγμα διαμέτρου 2 cm που χρησίμευε για την εισαγωγή των εντόμων καθώς και μια άλλη μικρότερη οπή διαμέτρου περίπου 1 mm στην οποία στερεωνόταν ένα πλαστικό μικρό χωνί μήκους περίπου 3 cm δια του οποίου εισερχόταν και στερεωνόταν σε κατακόρυφη θέση οι γυάλινοι τριχοειδείς σωλήνες 45

46 χωρητικότητας 5 μl με τους οποίους και γινόταν η παροχή των θρεπτικών διαλυμάτων. Η βάση του κλουβιού προσαρμόστηκε στο κάλυμμα ενός τρυβλίου Petri διαμέτρου 9 cm που αποτέλεσε έτσι την βάση του ατομικού κλουβιού. Στην βάση αυτή προσκολλήθηκε ένα μικρό πλαστικό κυλινδρικό δοχείο ύψους 5 mm και διαμέτρου 8 mm, στο οποίο εισαγόταν ζάχαρη (στην κρυσταλλική της μορφή) ή πρωτεΐνη (υπό μορφή σκόνης) αναλόγως του σκοπού του εκάστοτε πειράματος. Επίσης ανοίχτηκε μια οπή διαμέτρου 1 cm περίπου δια της οποίας περνούσε ένα φυτίλι. Κάτω από το ατομικό κλουβί τοποθετούταν ένα τρυβλίο Petri που γεμιζόταν με νερό και το φυτίλι εμποτιζόταν με την βάση του σ αυτό μεταφέροντας έτσι το νερό στον χώρο εντός του ατομικού κλουβιού για την κάλυψη των αναγκών των ενηλίκων σε νερό. Το νερό αναπληρωνόταν τακτικά - ανά πέντε ημέρες το αργότερο - καθ όλη την διάρκεια των πειραμάτων λόγω απωλειών εξάτμισης. Τα ατομικά κλουβιά κατασκευάστηκαν σε δύο παραλλαγές (Εικόνες 12-13) ανάλογα με τον σκοπό που θα χρησιμοποιούνταν στα πειράματα με βάση την διάκριση σε φύλο. Στην περίπτωση που το ατομικό κλουβί προορίζονταν για τον εγκλεισμό θηλυκών στα οποία εκτός από την κατανάλωση μετρούταν και η ημερήσια ωοτοκία, έγιναν κάποιες αναγκαίες τροποποιήσεις (Εικόνα 13). Έτσι, στην βάση του κλουβιού επί της επιφάνειας του καλύμματος του τρυβλίου, κόπηκε οπή διαμέτρου 5 cm και προσκολλήθηκε πλαστικό ημισφαίριο κόκκινου χρώματος διάτρητο με 50 οπές του ενός περίπου mm. Αυτό αποτελούσε το τεχνητό υπόστρωμα ωοτοκίας των συζευγμένων θηλυκών ομοιάζοντας το σχήμα και την μορφή ενός ώριμου καρπού (υπό φυσικές συνθήκες) κατάλληλου για ωοτοκία. Με την χρήση του τεχνητού 46

47 αυτού υποστρώματος γινόταν δυνατή η λήψη και η ακριβής καταμέτρηση των αυγών του κάθε θηλυκού ξεχωριστά σε καθημερινή βάση. Ακόμη, στο τρυβλίο με το νερό κάτω από το ατομικό κλουβί και ακριβώς κάτω από το ημισφαιρικό πλαστικό υπόστρωμα ωοτοκίας, τοποθετούνταν ένα πλαστικό κυλινδρικό δοχείο χωρητικότητας 7 ml περίπου (Εικόνες 12, 15 και16). Αυτό γεμιζόταν με 5 ml φυσικού χυμού πορτοκαλιού (100% φυσικός χυμός με την προσθήκη 1% σορβικού οξέως ως συντηρητικού) μετά την 5 η ημέρα διατήρησης των ενηλίκων θηλυκών, οπότε κι αναμένονταν οι πρώτες ωοτοκίες από τα θηλυκά, και ανανεωνόταν κάθε δύο ημέρες. Αυτό γινόταν για την πρόκληση ωοτοκίας από τα θηλυκά στα τεχνητά υποστρώματα δεδομένης της αυξημένης προσέλκυσης των ενηλίκων στον χυμό πορτοκαλιού όπως έχει παρατηρηθεί από προηγούμενες εργασίες (Papaj et al., 1989, Katsoyannos et al., 1997 από Ιωάννου, 2005) αλλά και της αύξησης της σχετικής υγρασίας στον χώρο υπό του ημισφαιρικού ομοιώματος (τεχνητού υποστρώματος ωοτοκίας) απαραίτητης για την διασφάλιση της επιβίωσης των εισαχθέντων από τα θηλυκά αυγών (Féron, 1962; Shoukry & Hafez, 1979; Levinson et al., 2003 από Ιωάννου 2005). 2.4 Μετρήσεις ημερήσιας κατανάλωσης τροφής Στα πειράματα όπου μετρήθηκε η κατανάλωση τροφής από μεμονωμένα ενήλικα τα ενήλικα είχαν διαρκώς ελεύθερη πρόσβαση σε νερό και σε μία από τις δύο βασικές πηγές τροφής (πρωτεΐνης ή ζάχαρης) που παρεχόταν εν αφθονία (ad libitum) στο ατομικό κλουβί τους ενώ η άλλη παρεχόταν υπό μορφή διαλύματος με την χρήση τριχοειδών σωλήνων και για 5 ώρες καθημερινά. Μετά την πεντάωρη αυτή δυνατότητα λήψης της δεύτερης 47

48 πηγής τροφής στον χώρο του ατομικού κλουβιού, τα ομαδικά κλουβιά ανοίγονταν και καταγράφονταν η ποσότητα του καταναλωθέντος τροφικού διαλύματος από το κάθε έντομο καθώς κι οι ωοτοκίες των θηλυκών. Η παροχή αλλά κι η ακριβής μέτρηση της κατανάλωσης του τροφικού διαλύματος (είτε περιείχε ζάχαρη είτε περιείχε πρωτεΐνη) γινόταν με την χρήση γυάλινων τριχοειδών σωλήνων χωρητικότητας 5 μl. Κάθε τέτοιος σωλήνας γεμιζόταν με 5 μl τροφικού διαλύματος ενώ ήταν βαθμονομημένος ανά 1 μl κι παρείχε έτσι την δυνατότητα ευθείας αντιστοίχησης του ύψους της στήλης του σωλήνα (σε mm) με την κατανάλωση (Εικόνες 17 και 18). Έτσι με την μέτρηση της στήλης μετά την πεντάωρη παραμονή του σωλήνα στο ατομικό κλουβί κι από τον όγκο διαλύματος που έλειπε (μετρούμενο σε mm) σε σχέση με το αρχικό πλήρες γέμισμα των 5 μl γινόταν και η μέτρηση σε μl της τροφής που κατανάλωσε το ενήλικο κατά το πεντάωρο. Βάση της σύστασης σε ζάχαρη ή πρωτεΐνη του τροφικού διαλύματος γινόταν στην συνέχεια, η αναγωγή της μέτρησης σε μικρογραμμάρια (μg) ή χιλιοστογραμμάρια (mg) και η καταγραφή της ποσότητας που κατανάλωσε το έντομο. Τα αυγά που άφηναν τα έντομα στις οπές ωοτοκίας (Εικόνα 19) αλλά ακόμη και πάνω στην επιφάνεια των τεχνητών υποστρωμάτων (κοίλα ημισφαίρια) ή ακόμη και στην εσωτερική επιφάνεια του ατομικού κλουβιού, λαμβάνονταν με την άκρη μαλακού πινέλου και καταμετρούνταν καθημερινά. 48

49 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο 3. ΠΡΟKATAΡΚΤΙΚΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ 3.1 Περίληψη Δύο σειρές πειραμάτων προηγήθηκαν των βασικών πειραμάτων της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής και γι αυτό χαρακτηρίζονται ως προκαταρκτικά πειράματα. Σκοπός των προκαταρκτικών αυτών πειραμάτων ήταν αφενός η τυποποίηση της πειραματικής διαδικασίας και ο έλεγχος της πειραματικής διάταξης για την πλήρωση βασικών προϋποθέσεων του πειραματισμού κι αφετέρου η επιλογή των κατάλληλων μεταβλητών για το κύριο πειραματικό μέρος της διατριβής που ακολούθησε. Από προηγηθείσα εμπειρία του εργαστηρίου στην μέθοδο διατροφής με την χρήση τριχοειδών σωλήνων διαπιστώθηκε πως οι μετρήσεις είναι αξιόπιστες μόνον εφόσον η σχετική υγρασία εντός των θαλάμων που φιλοξενούν τα τρεφόμενα ενήλικα διατηρείται υψηλή. Έτσι προτάθηκε μία σχετικά απλή πειραματική διάταξη για την διενέργεια των πειραμάτων μέτρησης της κατανάλωσης και διερευνήθηκε η ικανότητα της να εκπληρώνει αυτήν την προϋπόθεση. Ταυτόχρονα, διερευνήθηκε η συγκέντρωση της πρωτεΐνης και της ζάχαρης στο διάλυμα θρέψης που θα ήταν καταλληλότερη να χρησιμοποιηθεί στα κύρια πειράματα καταμέτρησης της τροφής που λάμβαναν τα έντομα μέσω των τριχοειδών σωλήνων καθ όλη την διάρκεια της ενήλικης ζωής τους. Η κατανάλωση αυτή συσχετίστηκε με την ανάπτυξη των ωαρίων εντός των ωοθηκών των θηλυκών την τελευταία ημέρα των παρατηρήσεων αποτελώντας το βασικό κριτήριο επιλογής για τις μετέπειτα - στο κύριο πειραματικό μέρος - χρησιμοποιούμενες συγκεντρώσεις. 49

50 Με ένα δεύτερο πείραμα διερευνήθηκε αν η υψηλή σχετική υγρασία του χώρου διατήρησης και διατροφής των ενηλίκων είχε σημαντική επίδραση σε ένα βασικό αλλά συγχρόνως μετρήσιμο βιολογικό χαρακτηριστικό, αυτό της ανάπτυξης των ωαρίων εντός των ωοθηκών των θηλυκών. 3.2 Έλεγχος της πειραματικής διάταξης και σύγκριση των συγκεντρώσεων ζάχαρης και πρωτεΐνης στα θρεπτικά διαλύματα Εισαγωγή Μια σειρά πειραμάτων προηγήθηκαν του κύριου πειραματισμού με στόχο να διερευνηθεί και να αποφασιστεί η συγκέντρωση της ζάχαρης και της πρωτεΐνης που επρόκειτο να χρησιμοποιηθεί με την μέθοδο των τριχοειδών σωλήνων για την μέτρηση της κατανάλωσης από τα έντομα για το σύνολο της ενήλικης ζωής τους, στο κύριο πειραματικό μέρος της διατριβής. Για ένα μικρό χρονικό διάστημα 15 ημερών (οι πρώτες 15 ημέρες ενήλικης ζωής των δειγμάτων) δοκιμάστηκαν 3 διαφορετικές συγκεντρώσεις διαλυμάτων (5%, 10% και 20% β/ο) για την ζάχαρη και την πρωτεΐνη κατά την θρέψη των ενηλίκων με την μέθοδο των τριχοειδών σωλήνων, ενώ ταυτοχρόνως η πρωτεΐνη και η ζάχαρη αντίστοιχα, παρεχόταν ad libitum σε αυτά. Οι τριχοειδείς σωλήνες με τα θρεπτικά διαλύματα τοποθετούνταν στα ατομικά κλουβιά για πέντε ώρες καθημερινά. Η συνολική κατανάλωση για το χρονικό διάστημα των 15 ημερών στα θηλυκά συσχετίστηκε με τον αριθμό των πλήρως ανεπτυγμένων ωαρίων εντός των ωοθηκών τους την τελευταία ημέρα του πειράματος. 50

51 Η αξιοπιστία των μετρήσεων της μεθόδου διατροφής με την χρήση τριχοειδών σωλήνων επηρεάζεται από την σχετική υγρασία του περιβάλλοντος χώρου όπου λαμβάνει χώρα η διατροφή. Οποιαδήποτε πειραματική διάταξη με αυτήν την μέθοδο οφείλει να εξασφαλίζει περιβάλλον υψηλής σχετικής υγρασίας για να περιοριστούν κατά το δυνατόν οι απώλειες λόγω εξάτμισης στους τριχοειδείς και να λαμβάνονται έτσι ακριβείς μετρήσεις. Για τον σκοπό αυτό διερευνήθηκε, παράλληλα με τις υπό δοκιμή συγκεντρώσεις, η δυνατότητά της πειραματικής διάταξης να διατηρεί σταθερά υψηλή σχετική υγρασία εντός των ομαδικών θαλάμων κατά το πεντάωρο που θα παρεχόταν η τροφή με τους τριχοειδείς σωλήνες Υλικά και μέθοδοι Σε ατομικά κλουβιά όπως περιγράφηκαν στο κεφάλαιο 2.3, εισήχθησαν 20 ενήλικα της μύγας της Μεσογείου ηλικίας μίας ημέρας (1 ης ημέρας της ενήλικης ζωής τους) ανά μεταχείριση (δηλ. 60 συνολικά για την πρωτεΐνη και 60 συνολικά για την ζάχαρη) και αυτά τοποθετήθηκαν ανά 5, σε 4 ομαδικούς θαλάμους από Plexiglas διαστάσεων 25Χ35Χ25 cm ενώ σε κάθε θάλαμο τοποθετήθηκε κι ένα κενό ατομικό κλουβί (συνολικά δηλαδή 6 ατομικά κλουβιά σε κάθε ομαδικό θάλαμο) στο οποίο τοποθετούνταν τριχοειδής σωλήνας με θρεπτικό διάλυμα παρά την απουσία εντόμου για να αποτελέσει τον μάρτυρα της εξάτμισης του θρεπτικού διαλύματος κατά την καταγραφή των μετρήσεων. Για τα θηλυκά έγιναν 3 μεταχειρίσεις με διαλύματα πρωτεΐνης σε 3 διαφορετικές συγκεντρώσεις (5%, 10% και 20% β/ο) που ήταν και οι πρώτες χρονικά και σε αυτές διερευνήθηκε και η ικανότητα της πειραματικής διάταξης να διατηρεί υψηλή την σχετική υγρασία εντός των θαλάμων. Σε αυτές 51

52 η ζάχαρη παρεχόταν ad libitum στα εγκλεισμένα ενήλικα εντός του ενσωματωμένου - για τον σκοπό αυτό - δοχείου γεμίσματος στην βάση του ατομικού κλουβιού (Εικόνες 12-13). Άλλες 3 μεταχειρίσεις έγιναν στα θηλυκά με διαλύματα ζάχαρης σε 3 διαφορετικές συγκεντρώσεις (5%, 10% και 20% β/ο) και με την πρωτεΐνη αυτή την φορά να παρέχεται ad libitum στα εγκλεισμένα ενήλικα. Συμπληρωματικά, έγιναν και 3 μεταχειρίσεις με 3 διαφορετικές συγκεντρώσεις (5%, 10% και 20% β/ο) πρωτεΐνης όπου η ζάχαρη παρεχόταν ad libitum για τον έλεγχο της μεθόδου θρέψης και σε ενήλικα αρσενικά, χωρίς ωστόσο να παρουσιάζονται τα αποτελέσματα αφού - ελλείψει κάποιου σχετικού βιολογικού κριτηρίου - κάτι τέτοιο δεν εξυπηρετούσε τον σκοπό των προκαταρκτικών πειραμάτων. Σε όλα αυτά τα πειράματα η διάρκεια παρατήρησης ορίστηκε σε 15 ημέρες. Τα τροφικά διάλυμα που περιεχόταν στους τριχοειδείς σωλήνες αποτελούταν είτε από κρυσταλλική ζάχαρη είτε από πρωτεΐνη προερχόμενη από μαγιά μπύρας (brewer s yeast). Η συγκέντρωση των δύο αυτών συστατικών στο διάλυμα θρέψης δεν μπορούσε να υπερβαίνει ένα ποσοστό μεγαλύτερου του 25-30% βάρους/όγκου βάσει προηγηθείσας εμπειρίας, δεδομένης της χαμηλής ρευστότητας του διαλύματος θρέψης που θα δυσκόλευε ενδεχομένως την λήψη τους από τα έντομα και για αυτό δεν κρίθηκε σκόπιμη η δοκιμή με συγκεντρώσεις 25% β/ο. Οι τριχοειδείς σωλήνες γεμίζονταν μέσω αναρρόφησης, με τα τροφικά διαλύματα μέχρι το μέγιστο βαθμονομημένο όριο τους, αυτό των 5 μl για τους συγκεκριμένους τριχοειδείς σωλήνες, και στην κορυφή της στήλης τοποθετούνταν παραφινέλαιο (σε απόσταση ενός τουλάχιστον cm από το τροφικό διάλυμα ώστε να μεσολαβεί κενό και να αποκλειστεί η πιθανότητα πόσης του από το 52

53 έντομο) για να περιοριστεί η απώλεια του τροφικού διαλύματος λόγω εξάτμισης (Εικόνες 17 και 18). Κατόπιν, οι τριχοειδείς σωλήνες εισέρχονταν στο χωνί σταθεροποίησης στην περιφέρεια της πάνω επιφάνειας των ατομικών κλουβιών, όπως περιγράφηκε στο κεφάλαιο 2.3 (Εικόνες 12-14), με τέτοιο τρόπο ώστε να προεξέχει κατά 1 περίπου mm από αυτόν και τα ενήλικα να μπορούν να φέρουν σε επαφή τα στοματικά τους μόρια με την παρεχόμενη υγρή τροφή, αφού προσέγγιζαν σε ανάποδη κατακόρυφη θέση τον σωλήνα. Η χρονική διάρκεια παρουσίας/παροχής των διαλυμάτων θρέψης ορίστηκε στις 5 ώρες καθημερινά και γενικά ξεκινούσε στις 12:00 το μεσημέρι και τελείωνε στις 17:00 το απόγευμα. Στην συνέχεια, κι αφού τοποθετούνταν οι τριχοειδείς σωλήνες σε κάθε ατομικό κλουβί, συμπεριλαμβανομένου του κενού ατομικού κλουβιού (μάρτυρας για την εξάτμιση), ο ομαδικός θάλαμος κλείνονταν από πάνω με το καπάκι του και επί αυτού τοποθετούνταν ένα βρεγμένο με νερό Wettex και στην συνέχεια καλυπτόταν με πλαστική μεμβράνη (Εικόνα 8). Με τον τρόπο αυτό αναμενόταν η σχετική υγρασία εντός του καλυμμένου ομαδικού θαλάμου να είναι υψηλή ώστε να περιοριστούν οι απώλειες λόγω εξάτμισης των τροφικών διαλυμάτων εντός των τριχοειδών σωλήνων. Αυτή η απλή μέθοδος ακολουθήθηκε έκτοτε στο σύνολο του πειραματισμού της παρούσας διατριβής και αξιολογήθηκε με μετρήσεις της σχετικής υγρασίας εντός των θαλάμων. Έτσι κι ειδικά για το πρώτο -χρονικά- πείραμα, σε δύο από τους ομαδικούς θαλάμους (διαφορετικούς ανά ημέρα παρατήρησης) τοποθετήθηκαν δύο ψηφιακά υγρασιόμετρα και οι τιμές της σχετικής υγρασίας καταγράφονταν ανά μισάωρο κατά τις 5 ώρες παρουσίας των τροφικών διαλυμάτων για τις 13 από τις 15 ημέρες που διήρκησε το πείραμα (αρχής γεννωμένης της 1 ης 53

54 ημέρας παρατήρησης/εγκλεισμού που ήταν ταυτόχρονα και η 1 η ημέρα της ενήλικης ζωής των εντόμων). Ένα άλλο ψηφιακό υγρασιόμετρο στον χώρο του εργαστηρίου τοποθετημένο παραπλεύρως των ομαδικών θαλάμων και στο ίδιο ύψος με αυτούς αποτέλεσε τον μάρτυρα. Με την παρέλευση του πενταώρου ανοίγονταν οι ομαδικοί θάλαμοι και καταγράφονταν οι μετρήσεις των καταναλωθέντων όγκων των θρεπτικών διαλυμάτων καθημερινά και για τις 15 ημέρες που διήρκησε το κάθε πείραμα. Την τελευταία ημέρα, τα θηλυκά θανατώνονταν σε διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης και με τομή των ωοθηκών τους, λαμβάνονταν και μετρούνταν τα πλήρως ανεπτυγμένα ωάρια εντός τους με την χρήση μικροσκοπίου. Η στατιστική ανάλυση έγινε με την χρήση ANOVA και Kruskal-Wallis one way analysis. Η ανάλυση γραμμικής συσχέτισης χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η σημαντικότητα της συσχέτισης μεταξύ των συγκεντρώσεων των θρεπτικών διαλυμάτων και της ανάπτυξης των ωαρίων Αποτελέσματα - Συζήτηση Στο διάγραμμα 1 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της μέσης συνολικής κατανάλωσης των 20 θηλυκών ανά μεταχείριση, για τις 15 ημέρες που διήρκησε το πείραμα, με 3 διαφορετικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης (5%, 10% και 20% β/ο) στα θρεπτικά διαλύματα των τριχοειδών σωλήνων ενώ η ζάχαρη παρεχόταν ad libitum, και με 3 διαφορετικές συγκεντρώσεις ζάχαρης (5%, 10% και 20% β/ο) όπου η πρωτεΐνη παρεχόταν ad libitum. Επίσης στο διάγραμμα 1 παρουσιάζονται οι μέσοι όροι του αριθμού των ανεπτυγμένων ωαρίων εντός των ωοθηκών τους την τελευταία ημέρα των μετρήσεων, για την κάθε μεταχείριση. 54

55 Η συνολική κατανάλωση πρωτεΐνης διέφερε στατιστικώς σημαντικά όταν η συγκέντρωσή της ήταν 5% (β/ο) στο διάλυμα θρέψης σε σχέση με την κατανάλωση των τροφικών διαλυμάτων στα οποία η συγκέντρωση ήταν 10% (β/ο) και 20% (β/ο) ενώ η συνολική κατανάλωση με θρεπτικά διαλύματα συγκέντρωσης 10% (β/ο) και 20% (β/ο) δεν διέφερε στατιστικώς σημαντικά μεταξύ τους αν και ήταν υψηλότερη στα θηλυκά που διατράφηκαν με το διάλυμα πρωτεΐνης 20% (β/ο) (Διάγραμμα 1). Τα ανεπτυγμένα ωάρια στις ωοθήκες των θηλυκών την τελευταία ημέρα των παρατηρήσεων, ήταν στατιστικώς σημαντικά λιγότερα στα θηλυκά που τράφηκαν με το διάλυμα πρωτεΐνης που είχε συγκέντρωση 5% (β/ο) (p<0,05) σε σχέση με αυτά που τράφηκαν με τα διαλύματα πρωτεΐνης συγκεντρώσεων 10% (β/ο) και 20% (β/ο) ενώ στις 2 αυτές συγκεντρώσεις ο αριθμός των ανεπτυγμένων ωαρίων δεν διέφερε στατιστικώς σημαντικά μεταξύ τους (p>0,05) (Πίνακας 1, Διάγραμμα 1). Η συνολική κατανάλωση ζάχαρης διέφερε στατιστικώς σημαντικά σε όλες τις μεταχειρίσεις (p<0,05). Όσο μεγαλύτερη ήταν η συγκέντρωση της ζάχαρης στα θρεπτικά διαλύματα τόσο μεγαλύτερη ήταν και η κατανάλωσή της. Ο αριθμός των ανεπτυγμένων ωαρίων στις ωοθήκες των θηλυκών επίσης διέφερε στατιστικώς σημαντικά μεταξύ των μεταχειρίσεων (p<0,05), με αυτόν της μέγιστης υπό δοκιμής συγκέντρωσης (20% β/ο) να είναι ο μεγαλύτερος και με αυτόν της μικρότερης (5% β/ο) να είναι ο μικρότερος (Διάγραμμα 1). Στο διάγραμμα 2 παρουσιάζεται η γραμμική συσχέτιση (παλινδρόμηση) μεταξύ της συνολικής κατανάλωσης πρωτεΐνης με τον αριθμό των ανεπτυγμένων ωαρίων και η γραμμική συσχέτιση (παλινδρόμηση) μεταξύ της συνολικής κατανάλωσης ζάχαρης με τον αριθμό των ανεπτυγμένων ωαρίων, 55

56 εντός των ωοθηκών των εγκλεισμένων θηλυκών που διατράφηκαν με την μέθοδο των τριχοειδών σωλήνων στις τρείς διαφορετικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης και ζάχαρης. Στον πίνακα 1 παρουσιάζονται οι σταθερές παράμετροι και οι έλεγχοι σημαντικότητας για κάθε περίπτωση της γραμμικής παλινδρόμησης. Οι διαφορετικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης στα θρεπτικά διαλύματα επηρέασαν σημαντικά την ανάπτυξη των ωαρίων εντός των ωοθηκών των θηλυκών για τις δύο υψηλότερες τιμές συγκέντρωσης, δηλαδή των 10% (β/ο) και 20% (β/ο), αλλά όχι για την χαμηλότερη τιμή συγκέντρωσης των 5% (β/ο). Αντίθετα, η συγκέντρωση της ζάχαρης στα διαλύματα θρέψης δεν παρουσιάζει σημαντική γραμμική συσχέτιση με την ανάπτυξη των ωαρίων για καμία από τις εξεταζόμενες συγκεντρώσεις πλην αυτής του 10% (β/ο) ωστόσο αυτή ήταν οριακή, και σε όλες τις περιπτώσεις η τιμή R-τετράγωνο ήταν μικρή (Πίνακας 1). Συμπερασματικά, κι αφού για την συγκέντρωση της πρωτεΐνης μόνο οι συγκεντρώσεις 10% (β/ο) και 20% (β/ο) συσχετίζονται σημαντικά με την ανάπτυξη των ωαρίων ενώ ακόμη κι ο διπλασιασμός της συγκέντρωσης στο διάλυμα θρέψης από 10% (β/ο) σε 20% (β/ο) δεν επηρεάζει σημαντικά ούτε την κατανάλωση της πρωτεΐνης ούτε και τον αριθμό των ανεπτυγμένων ωαρίων την τελευταία ημέρα των παρατηρήσεων, η επιλογή είτε της μιας είτε της άλλης συγκέντρωσης για το κύριο πειραματικό μέρος της διατριβής δεν έχει σημασία για αυτές τις δυο συγκεντρώσεις. Αντίθετα, η κατανάλωση με την μικρότερη από τις δοκιμαζόμενες συγκεντρώσεις (5% β/ο) δεν συσχετίζεται με την ανάπτυξη των ωαρίων κι επιπλέον οδήγησε σε στατιστικώς σημαντικά μικρότερο αριθμό ανεπτυγμένων ωαρίων, αποκλείοντας έτσι την επιλογή της. Σε ότι αφορά την συγκέντρωση της ζάχαρης, δεν παρατηρήθηκε σημαντική 56

57 συσχέτιση μεταξύ των διαφορετικών συγκεντρώσεων και της ανάπτυξης των ωαρίων κατά συνέπεια η επιλογή οποιασδήποτε από αυτές για το κύριο πειραματικό μέρος παρουσιάζει το ίδιο ενδιαφέρον. Βέβαια η συνολική κατανάλωση ζάχαρης ήταν μεγαλύτερη σε απόλυτες τιμές για την υψηλότερη συγκέντρωση ζάχαρης και απέδωσε τον μεγαλύτερο αριθμό ανεπτυγμένων ωαρίων, σε σχέση με τις άλλες δύο εξεταζόμενες συγκεντρώσεις. Αυτό θα μπορούσε ενδεχομένως να αποδοθεί στην ανάγκη των θηλυκών να ικανοποιήσουν κατά τον δυνατό περισσότερο τις υψηλότερες ενεργειακές τους ανάγκες για την βέλτιστη αξιοποίηση της πρωτεΐνης που στην περίπτωση αυτή παρεχόταν εν αφθονία. Με βάση τα παραπάνω επιλέχθηκε η συγκέντρωση της ζάχαρης 20% (β/ο) στα θρεπτικά διαλύματα των τριχοειδών σωλήνων για το κύριο πειραματικό μέρος της διατριβής, επιδιώκοντας την μεγαλύτερη δυνατή αξιοποίηση της εν αφθονία πρωτεΐνης από τα θηλυκά. Κατ αναλογία και για λόγους σύγκρισης επιλέχθηκε η τιμή 20% (β/ο) για την συγκέντρωση της πρωτεΐνης παρόλο που δεν διέφερε στατιστικώς σημαντικά με την τιμή 10% (β/ο) σε σχέση με το υπό εξέταση βιολογικό κριτήριο, αυτό του αριθμού των ανεπτυγμένων ωαρίων την τελευταία ημέρα των παρατηρήσεων. Όσον αφορά την σχετική υγρασία εντός των ομαδικών θαλάμων κατά το πεντάωρο της παρουσίας των τριχοειδών σωλήνων, οι μετρήσεις παρουσιάζονται στο διάγραμμα 3. Για τις 13 ημέρες των παρατηρήσεων (τις 13 πρώτες από τις 15 συνολικά ημέρες εγκλεισμού και διατροφής των ενηλίκων θηλυκών που διατράφηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης) η σχετική υγρασία εντός των ομαδικών θαλάμων διατηρούταν σταθερά σε υψηλές τιμές (76,9% ±2,5) ξεκινώντας τουλάχιστον μισή ώρα μετά 57

58 την κάλυψη των ομαδικών θαλάμων (στην πράξη ωστόσο σε ελάχιστα λεπτά μετά την τοποθέτηση του βρεγμένου Wettex) και μέχρι το τέλος του πενταώρου, και ήταν περίπου διπλάσια σε σχέση με τον μάρτυρα (39%±1,6). Η πειραματική διάταξη λοιπόν, παρά την απλότητά της, διατηρούσε σταθερά υψηλές τιμές, για το πεντάωρο παροχής της τροφής, τέτοιες που εξασφάλιζαν την ακρίβεια των μετρήσεων κατανάλωσης των εντόμων αφού περιόριζε ικανοποιητικά την εξάτμιση. Στον περιορισμό των απωλειών από τους τριχοειδείς σωλήνες λόγω εξάτμισης συντελούσε βέβαια και η τοποθέτηση παραφινέλαιου στην κορυφή της στήλης όπως περιγράφηκε προηγουμένως στο κεφάλαιο με τα υλικά και τις μεθόδους του πειράματος. 58

59 Πίνακας 1. Σταθερές παράμετροι γραμμικού μοντέλου παλινδρόμησης μεταξύ κατανάλωσης πρωτεΐνης και ζάχαρης σε σχέση με τον αριθμό των πλήρως ανεπτυγμένων ωαρίων εντός των ωοθηκών των διατραφέντων θηλυκών σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης και ζάχαρης αντίστοιχα για τις 15 ημέρες των παρατηρήσεων. συγκέντρωση αποτελέσματα μοντέλου στατιστικής αποτελέσματα ANOVA πρωτεΐνης y=a(s.e.)+b(s.e)x R-Sq F p 5% (β/ο) y = 8.73 (7.942)+ 31.5(18.09 )x 14.5% % (β/ο) y = 1.08(5.047) (6.182) x 79.4% % (β/ο) y = (6.280) (5.932) x 74.4% ζάχαρης y=a(s.e.)+b(s.e)x R-Sq F p 5% (β/ο) y = (0.095) (0.1721)x 14.79% % (β/ο) y = (0.0193)+ 3.32(0.464)x 45.15% % (β/ο) y = (0.0072) (0.461) x 0.42%

60 Διάγραμμα 1. Μέση συνολική κατανάλωση θηλυκών που διατράφηκαν με την χρήση τριχοειδών σωλήνων σε 3 διαφορετικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης (πάνω αριστερά) και ζάχαρης (κάτω αριστερά) έχοντας ad libitum παροχή ζάχαρης και πρωτεΐνης αντίστοιχα, για 15 ημέρες καθώς και μέσος όρος πλήρως ανεπτυγμένων ωαρίων εντός των ωοθηκών τους την τελευταία ημέρα των παρατηρήσεων για την κατανάλωση των δοκιμαζόμενων συγκεντρώσεων πρωτεΐνης (πάνω δεξιά) και ζάχαρης (κάτω δεξιά). Στήλες με διαφορετικό γράμμα, διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά μεταξύ τους για το κάθε γράφημα ξεχωριστά (Tukey s HSD test). 60

61 Διάγραμμα 2. Γραμμική συσχέτιση (παλινδρόμηση) μεταξύ μέσης συνολικής καταναλωθείσης πρωτεΐνης (αριστερά) και ζάχαρης (δεξιά) με τον μέσο όρο πλήρως ανεπτυγμένων ωαρίων εντός των ωοθηκών των εγκλεισμένων θηλυκών που διατράφηκαν για 15 ημέρες με την χρήση τριχοειδών σωλήνων σε 3 διαφορετικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης και ζάχαρης έχοντας ad libitum παροχή ζάχαρης και πρωτεΐνης αντίστοιχα. 61

62 ΣΥ (%) Μ.Ο μεταχείρισης Μ.Ο μάρτυρα 0 ΩΡΕΣ Διάγραμμα 3. Μέσος όρος των παρατηρήσεων της σχετικής υγρασίας (%), ανά μισή ώρα για το πεντάωρο της παρουσίας των τριχοειδών σωλήνων θρέψης εντός των ατομικών κλουβιών, στο εσωτερικό των ομαδικών θαλάμων κατόπιν κάλυψης τους με βρεγμένο Wettex (μεταχείριση), και αυτών του περιβάλλοντος χώρου (μάρτυρας), για τις 13 ημέρες των παρατηρήσεων. 3.3 Επίδρασή της υψηλής σχετικής υγρασίας στην ανάπτυξη ωαρίων εντός των ωοθηκών ενηλίκων θηλυκών Εισαγωγή Η σχετική υγρασία του περιβάλλοντος χώρου μπορεί να επηρεάσει την φυσιολογία των εντόμων κι ειδικά για τα δίπτερα της οικογένειας Tephritidae σε ότι αφορά την διάρκεια της ζωής, την ανάπτυξη των ωαρίων και την ωοπαραγωγή του δάκου της ελιάς (Fletcher et al., 1978; Broufas et al., 2009). Με μια απλή πειραματική διάταξη ελέγχθηκε η επίδραση που θα είχε η 62

63 απαραίτητη για την λήψη ακριβών μετρήσεων, υψηλή σχετική υγρασία του χώρου διατήρησης κατά την πεντάωρη παροχή της τροφής των ενηλίκων στην ανάπτυξη των ωαρίων και συγκεκριμένα, στον αριθμό των πλήρως ανεπτυγμένων ωαρίων εντός των ωοθηκών των ενηλίκων της μύγας της Μεσογείου. Το συγκεκριμένο χαρακτηριστικό επιλέχθηκε ώστε να αποκλειστεί η μέθοδος στην περίπτωση εκείνη που η υψηλή σχετική υγρασία εντός των ομαδικών θαλάμων είχε σημαντική επίδραση (αρνητική ή θετική) σε σχέση με τον μάρτυρα δηλαδή με ενήλικα θηλυκά εντός ομαδικών θαλάμων που δεν θα καλύπτονταν με βρεγμένο Wettex και άρα θα είχαν την ίδια σχετική υγρασία με τον περιβάλλοντα χώρο του εργαστηρίου Υλικά και μέθοδοι Κατά την διάρκεια του πειράματος χρησιμοποιήθηκαν 4 ομαδικοί θάλαμοι κυβικού σχήματος κατασκευασμένοι από Plexiglas διαστάσεων 20Χ20Χ20 cm. Σε αυτά η πάνω επιφάνεια είχε αποκοπεί κι ενσωματώθηκε πλαστικό δίκτυ για τον εξαερισμό τους ενώ στην μια κάθετη πλευρά τους ανοίχτηκε κυκλική οπή διαμέτρου 10 cm για την εισαγωγή των εντόμων κι εφαρμόστηκε πλαστικό καπάκι στο κέντρο του οποίου ένα μέρος του είχε αντικατασταθεί από πλαστικό δίκτυ. Στο εσωτερικό κάθε ομαδικού θαλάμου τοποθετήθηκε κυλινδρικό πλαστικό φιαλίδιο με νερό, από το οποίο εξερχόταν ένα σπογγώδες υγρό φυτίλι, για την κάλυψη των αναγκών τους σε νερό καθώς και δισκίο που περιείχε υπό μορφή στερεοποιημένων σταγόνων τροφή για τα ενήλικα αποτελούμενη από μείγμα πρωτεΐνης, ζάχαρης και νερού σε αναλογία 1:4:5. Σε κάθε ομαδικό θάλαμο τοποθετήθηκαν περίπου 125 ενήλικα θηλυκά ίδιας ηλικίας και ίδιας προέλευσης (γενιάς) την 1 η ημέρα της ενήλικης 63

64 ζωής τους δηλαδή μετά την έξοδο τους από τις νύμφες. Σε 2 από αυτούς κι επί της πάνω επιφάνειάς τους τοποθετούνταν βρεγμένο Wettex και στην συνέχεια καλυπτόταν με πλαστική μεμβράνη για 5 ώρες καθημερινά για τις 8 ημέρες που διήρκησε το πείραμα. Οι άλλοι δύο θάλαμοι δεν καλύπτονταν με βρεγμένο Wettex και είχαν την ίδια σχετική υγρασία με τον περιβάλλοντα χώρο του εργαστηρίου, αποτελώντας έτσι τους μάρτυρες του πειράματος. Το πείραμα διεξήχθη χρονικά ταυτόχρονα με αυτό της προς έρευνας συγκέντρωσης πρωτεΐνης στο θρεπτικό διάλυμα θηλυκών ενηλίκων που αποτέλεσε και τον έλεγχο της πειραματικής διάταξης ως προς την δυνατότητα της να διατηρεί σταθερά υψηλή σχετική υγρασία εντός των ομαδικών θαλάμων κατά το πεντάωρο της παροχής της τροφής (βλ. προηγούμενο κεφάλαιο 3.2), ώστε οι τιμές της σχετικής υγρασίας εντός των ομαδικών θαλάμων (μεταχείριση) και του περιβάλλοντος χώρου (μάρτυρας) είναι ίδιες και γι αυτό. Καθημερινά και για δέκα ημέρες, 40 ενήλικα συνολικά, 20 από κάθε έναν από τους δύο πληθυσμούς (μεταχείριση και μάρτυρας), 10 από κάθε ομαδικό κλουβί, θανατώνονταν σε διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης και με τομή των ωοθηκών τους καταμετρούνταν τα πλήρως ανεπτυγμένα αυγά εντός τους, δηλαδή αυτά στα οποία ο κρόκος (yolk) καταλάμβανε το σύνολο του αυγού (τελικό στάδιο βιτελογένεσης) Αποτελέσματα - Συζήτηση Τα αποτελέσματα των μετρήσεων παρουσιάζονται στο διάγραμμα 4. Από την σύγκριση του μέσου όρου των ανεπτυγμένων ωαρίων στις ωοθήκες 40 θηλυκών (20 από την μεταχείριση και 20 από τον μάρτυρα) ανά ημέρα 64

65 παρατήρησης, δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά ανάμεσα στους δύο πληθυσμούς για κάθε ημέρα ξεχωριστά και για το χρονικό διάστημα του πειράματος (8 ημέρες). Συνεπώς η κάλυψη του ομαδικού θαλάμου με βρεγμένο Wettex και στην συνέχεια με πλαστική μεμβράνη για να επιτευχθεί υψηλή σχετική υγρασία εντός των ομαδικών θαλάμων και να περιοριστούν οι απώλειες λόγω εξάτμισης στους τριχοειδείς σωλήνες με τα θρεπτικά διαλύματα, δεν αναμένεται να επιδράσει αρνητικά ή θετικά και στην ωοπαραγωγή των ενηλίκων. Έτσι η πειραματική διάταξη που χρησιμοποιήθηκε στα προκαταρκτικά πειράματα κρίνεται κατάλληλη και για το κύριο πειραματικό μέρος της διατριβής που ακολουθεί με την μέτρηση των τροφικών αναγκών στο σύνολο της ζωής των ενηλίκων. 65

66 πλήρως ανεπτυμένα ωάρια εντος ωοθηκών (μ.ο +/- τυπ. σφαλμα) ,1 20,35 23,35 24,45 29,75 33,35 27,85 27, ,7 3,3 10,8 7, Ημέρες ΜΕΤΑΧΕΙΡΙΣΗ ΜΑΡΤΥΡΑΣ Διάγραμμα 4. Επίδραση της υψηλής σχετικής υγρασίας (μεταχείριση) στην ανάπτυξη των ωαρίων σε ενήλικα θηλυκά της μύγας της μεσογείου σε σύγκριση με ενήλικα θηλυκά που παρέμειναν υπό την σχετική υγρασία του περιβάλλοντος χώρου του εργαστηριού (μάρτυρας) για τις πρώτες 8 ημέρες της ενήλικης ζωής τους. Οι τιμές στην κάθε στήλη αναφέρονται στον μέσο όρο των πλήρως ανεπτυγμένων ωαρίων 20 ενηλίκων θηλυκών. Οι μπάρες σε κάθε στήλη αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα. 66

67 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο 4. ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗΣ ΤΡΟΦΗΣ ΣΤΟ ΣΥΝΟΛΟ ΤΗΣ ΕΝΗΛΙΚΗΣ ΖΩΗΣ ΤΗΣ ΜΥΓΑΣ ΤΗΣ ΜΕΣΟΓΕΙΟΥ 4.1 Περίληψη Η κατανάλωση της τροφής στο σύνολο της ενήλικης ζωής της μύγας της Μεσογείου αποτελεί το βασικό αντικείμενο της παρούσης διατριβής. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε - όπως έχει ήδη αναφερθεί - μια παραλλαγή της μεθόδου των Meats & Leighton (2004) και των Ja et al. (2007) που συνοψίζεται στην χρήση τριχοειδών σωλήνων για την λήψη της τροφής υπό μορφή διαλυμάτων από τα ενήλικα κι επιτρέπει την λήψη υψηλής ακρίβειας μετρήσεων. Με τα προκαταρκτικά πειράματα τυποποιήθηκε η πειραματική διάταξη που χρησιμοποιήθηκε σε αυτό το πειραματικό μέρος ενώ συγχρόνως αποφασίστηκε και η συγκέντρωση ζάχαρης και πρωτεΐνης που χρησιμοποιήθηκε στα θρεπτικά διαλύματα για την μέτρηση της ημερήσιας και συνολικής κατανάλωσης ενηλίκων για το σύνολο της ζωής τους. Για να μετρηθεί η συνολική αλλά και η καθημερινή κατανάλωση ενηλίκων της μύγας της Μεσογείου χρησιμοποιήθηκαν 4 πληθυσμοί, 2 από κάθε φύλο. Στην κάθε μεταχείριση η μία πηγή τροφής παρεχόταν ad libitum (εν αφθονία) και η άλλη που μετρούνταν μέσω των τριχοειδών σωλήνων. Η καθημερινή κατανάλωση μετρούταν μετά το πέρας του πενταώρου παραμονής της τροφής υπό την μορφή θρεπτικού διαλύματος στους 67

68 τριχοειδείς σωλήνες που περιείχαν είτε πρωτεΐνη είτε ζάχαρη αναλόγως. Στην περίπτωση των θηλυκών μετρούνταν επίσης η ημερήσια ωοπαραγωγή. Με τα αποτελέσματα των μετρήσεων κατασκευάστηκαν διαγράμματα επιβίωσης και κατανάλωσης που παρουσιάζουν όχι μόνο την συνολική κατανάλωση αλλά και την συχνότητά της σε ολόκληρη την διάρκεια της ενήλικης ζωής των δειγμάτων. Επιπλέον διερευνήθηκε η συσχέτιση της κατανάλωσης με την επιβίωση των ενηλίκων, το φύλο τους και - για την περίπτωση των θηλυκών - με την ωοπαραγωγή. 4.2 Εισαγωγή Ο ρόλος της διατροφής στα ζώα γενικώς έγκειται στην κάλυψη των ενεργειακών και μεταβολικών τους αναγκών και στην αναπαραγωγική τους απόδοση. Η διατροφή επιπλέον επηρεάζει καθοριστικά και την διάρκεια της ζωής τους και τον ρυθμό γήρανσης (Lee et al., 2015). Η διατροφή των ενηλίκων στα έντομα της οικογένειας Tephritidae συγκεκριμένα, αποτελείται κατά βάση από υδατάνθρακες και πρωτεΐνες. Οι υδατάνθρακες τροφοδοτούν τις ενεργειακές ανάγκες των ενηλίκων εντόμων όσον αφορά τις κινήσεις τους που περιλαμβάνουν την πτήση, την αναζήτηση τροφής και ξενιστή και τις διαδικασίες ερωτοτροπίας, συμμετέχουν ως δομικά μόρια των κυττάρων τους ή των ιστών τους (πχ. πολυσακχαρίτες όπως η χιτίνη) ή των σημειοχημικών τους (πχ. φερομόνες) κι επιπλέον λειτουργούν κι ως υπόστρωμα για την διαδικασίας της λιπογένεσης (Yuval & Hendrichs, 2000). Ειδικά για τα λιπίδια, που απουσιάζουν από τις φυσικές πηγές τροφής των ενηλίκων, παλαιότερα θεωρείτο πως συνθέτονταν μόνο κατά την προνυμφική ανάπτυξη και πως τα ενήλικα δεν είχαν την ικανότητα 68

69 λιπογένεσης (Langley et al., 1972; Muricio et al., 1973, Nestel et al., 1985 από Yuval, & Hendrichs, 2000) αλλά αργότερα αποδείχτηκε πως τα ενήλικα της οικογένειας Tephritidae, κι ειδικά για τα είδη Anastrepha serpentina (Jacome et al., 1995 από Yuval & Hendrichs, 2000) και Ceratitis capitatα (Nestel et al., 1986; Warburg & Yuval, 1996 από Yuval & Hendrichs, 2000), μπορούν να βιοσυνθέτουν λιπίδια σε την διάρκεια της ζωής τους, εφόσον διατρέφονται ικανοποιητικά. Το είδος των υδατανθράκων στην διατροφή των ενηλίκων της μύγας της Μεσογείου έχει σημαντική επίδραση στην αναπαραγωγή τους, έτσι, θηλυκά που τράφηκαν με γλυκόζη, σακχαρόζη και φρουκτόζη απέδωσαν μεγαλύτερο αριθμό αυγών σε σχέση με αυτά που τράφηκαν με άμυλο ή μαλτόζη (Zucoloto, 1992, από Canato & Zucoloto, 1998) ενώ κάτι τέτοιο φαίνεται να ισχύει και για τις προνύμφες αφού αναπτύσσονται καλύτερα με τροφή που περιέχει γλυκόζη, σακχαρόζη και φρουκτόζη παρά με τροφή που περιέχει μαλτόζη ακόμη κι αν αυτή παρέχονταν σε υψηλή συγκέντρωση (Zucoloto, 1992, από Canato, & Zucoloto, 1998). Οι πρωτεΐνες από την άλλη, κι ειδικά τα συνθετικά τους βιομόρια τα αμινοξέα, λειτουργούν - όπως και σε όλα γενικά τα έμβια - σαν δομικά μόρια των κυττάρων και των οργανιδίων τους, ως καταλύτες ενζυμικών αντιδράσεων κι ως πηγές ενέργειας (συμπληρωματικές ή κατ ανάγκη). Στην περίπτωση των εντόμων της οικογένειας Tephritidae, για όλα τα είδη που οι προνύμφες τους τρέφονται σε καρπούς φρούτων είναι απαραίτητη η διατροφή των ενηλίκων θηλυκών με πρωτεΐνες (χαρακτηρίζονται ως μη-αυτογενή) προκειμένου να ανταποκριθούν στον αναπαραγωγικό τους ρόλο σε αντίθεση με κάποια άλλα είδη της οικογένειας που οι προνύμφες τους διατρέφονται σε σπόρους (γένη Toxotrypana και Chaetostomella) ή σε ανθοκεφαλές (γένος 69

70 Urophora) και τα ενήλικα θηλυκά τους (που χαρακτηρίζονται ως αυτογενή γι αυτό τον λόγο) είναι απαλλαγμένα από αυτήν την ανάγκη για την ανάπτυξη των αυγών τους (Drew & Yuval, 2000). Οι πρωτεΐνες είναι ουσιώδεις για την αναπαραγωγική επιτυχία των Tephritidae, είτε λαμβάνονται μόνο κατά την προνυμφική τους ανάπτυξη είτε και κατά την ενήλικη ανάπτυξή τους, όσον αφορά τα θηλυκά για την ανάπτυξη των ωαρίων και των αυγών τους (Christenson & Foot, 1960; Bateman, 1972; Teran, 1977; Hendrichs et al., 1991; Cangussu & Zucoloto, 1995; Warburg & Yuval, 1996 από Yuval & Hendrichs, 2000) και όσον αφορά τα αρσενικά για την αναπαραγωγική τους επιτυχία (Blay & Yuval, 1997; Yuval et al., 1998, από Yuval & Hendrichs, 2000). Αναλυτικότερα, η πρόσληψη πρωτεϊνών με την διατροφή των ενηλίκων θηλυκών σε όλη την διάρκεια της ζωής τους, οδηγεί σε αύξηση της ωοπαραγωγής στο είδος Ceratitis capitata ενώ στα αρσενικά αυξάνει την πιθανότητα παρουσίας τους στις συναθροίσεις (leks) για την προσέγγιση των θηλυκών κατά την ερωτοτροπία καθώς και στην επίτευξη σύζευξης και ταυτόχρονα μειώνει τις πιθανότητες μιας ακόλουθης επανασύζευξης του θηλυκού που προηγουμένως συζεύχτηκε με κάποιο αρσενικό που διατράφηκε με πρωτεΐνες, με κάποιο άλλο αρσενικό που δεν διατράφηκε με πρωτεΐνες (Blay & Yuval, 1997). Η έλλειψη πρωτεΐνης κατά την διατροφή των ενηλίκων επηρεάζει αρνητικά την ωοπαραγωγή κι ιδιαίτερα μετά την περίοδο προ-ωοτοκίας δηλαδή μετά την 5 η - συνήθως - ημέρα μετά την έξοδο των ενηλίκων (Cangussu & Zucoloto, 1992). Η κατανάλωση πρωτεΐνης από ενήλικα αρσενικά δεν φαίνεται να επηρέασε ωστόσο την διαδικασία προσέλκυσης των θηλυκών (calling) αν και αύξησε (περίπου κατά 2 φορές) την πιθανότητα προσέλκυσης θηλυκών σε 70

71 αυτά σε σχέση με τα μη τρεφόμενα με πρωτεΐνη αρσενικά ενώ και η επίτευξη σύζευξης ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στα πρώτα (Shelly et al., 2002). Θα πρέπει ωστόσο να σημειωθεί πως η παρουσία αμινοξέων (πρωτεϊνών) στην τροφή των ενηλίκων της μύγας της Μεσογείου δεν σχετίζεται με την είσοδο σε αναπαραγωγική ωριμότητα αφού η σύζευξη δεν είναι επιτυχής αν τα ενήλικα δεν είναι αναπαραγωγικά ώριμα, ακόμη κι αν έχουν επαρκώς διατραφεί με πρωτεΐνη τόσο κατά την προνυμφική όσο και κατά την αρχική τους ενήλικη ανάπτυξη (Chang, 2004) όπως και στην περίπτωση του Bactrocera tryoni (Drew, 1987). Τέλος, και σε αντίθεση με την προαναφερθείσα παρατήρηση ότι η πρωτεΐνη στην διατροφή των ενηλίκων αρσενικών της μύγας της Μεσογείου ευνοεί την πιθανότητα σύζευξης σε σχέση με ενήλικα που δεν διατράφηκαν με πρωτεΐνη σε μη-εργαστηριακούς πληθυσμούς (άγρια έντομα), η προσθήκη πρωτεΐνης στην διατροφή ενηλίκων αρσενικών μαζικής εκτροφής (εργαστηριακός πληθυσμός) δεν βελτίωσε την πιθανότητα επιτυχούς σύζευξης τους σε σχέση με άλλα επίσης μαζικής εκτροφής αλλά και άγρια στα οποία δεν προστέθηκε στην διατροφή τους πρωτεΐνη, ενώ δεν επηρέασε ούτε την διάρκεια την ζωής του και για τα θηλυκά, την διάρκεια σύζευξης ή την τάση επανασύζευξης μετά από προηγηθείσα σύζευξη (επιτυχή ή όχι) (Shelly & Kennely, 2002). Για την περίπτωση της προνυμφικής ανάπτυξης της μύγας της Μεσογείου, ενήλικα αρσενικά που κατά την προνυμφική τους ανάπτυξη τράφηκαν σε πλούσιες σε πρωτεΐνη τεχνητές τροφές παρουσίασαν αναπαραγωγικό πλεονέκτημα σε σχέση με αυτά που τράφηκαν σε φτωχότερες σε πρωτεΐνη τεχνητές τροφές (Kaspi et al., 2002 από Nestel & Nemny-Lavy, 2007). Η έλλειψη πρωτεϊνούχων τροφών κατά την προνυμφική 71

72 ανάπτυξη επηρεάζει αρνητικά την διάρκεια του κύκλου ζωής, την έξοδο από τις νύμφες, το μέγεθος των ενηλίκων εντόμων και την ωοπαραγωγή κατά την περίοδο πριν την έναρξη της ωοτοκίας (Zucoloto, 1988 από Placido-Silva et al., 2005). Σε κάποια άλλα είδη της οικογένειας Tephritidae όπως το Anastrepha suspensa η κατανάλωση πρωτεΐνης συσχετίστηκε με μια οριακή αύξηση της παραγωγής φερομόνης που οδήγησε σε αύξηση της πιθανότητας σύζευξης (Sivinski et al., 1994 από Drew & Yuval, 2000), ενώ στο Anastrepha obligua αύξησε σημαντικά το μέγεθος των σιελογόνων αδένων των αρσενικών που παρουσιάζουν για το είδος αυτό σημαντικό ρόλο στην αναπαραγωγική επιτυχία (Ferro & Zuccoloto, 1990). Σε άλλα είδη ωστόσο, της οικογένειας Tephritidae, η λήψη πρωτεΐνης από τα ενήλικα αρσενικά δεν είναι απαραίτητη για την σύζευξη και την γονιμοποίηση των ωαρίων των θηλυκών είτε αυτά συμμετέχουν σε συναθροίσεις (leks)(bactrocera tryoni) είτε όχι (Rhagoletis pomonella) (Drew & Yuval, 2000). Η διατροφή των εντόμων επηρεάζει και την διάρκεια της ζωής αλλά και τον ρυθμό γήρανσης όπως και στα υπόλοιπα ζώα και γι αυτό, και δεδομένου της ευκολίας των παρατηρήσεων στα έντομα σε σχέση με άλλα ανώτερα ζώα ή τον άνθρωπο, έχει τελευταίως τύχει ιδιαίτερης σημασίας στην έρευνα για την κατανόηση των διαδικασιών της γήρανσης. Γενικά παρατηρείται αρνητική συσχέτιση μεταξύ της κατανάλωσης πρωτεϊνών και της διάρκειας ζωής, ωστόσο στις σχετικές εργασίες δεν ερευνάται ξεχωριστά ο ρόλος των πρωτεϊνών και των υδατανθράκων αλλά προτιμάται η αλλαγή της αναλογίας τους στο μεικτό θρεπτικό μέσο. Έτσι, στις περιπτώσεις των Bactrocera tryoni (Fanson et al., 2009), Anastrepha ludens (Carey et al., 2008) από τα 72

73 Tephritidae, η διατροφή σε μια δίαιτα χαμηλή σε πρωτεΐνη και υψηλή σε υδατάνθρακες συσχετίστηκε με μεγάλη διάρκεια ζωής (Lee et al., 2015). Επιπλέον, σε μια άλλη εργασία στο είδος Bactrocera tryoni, εκτός από την παρόμοια παρατήρηση περί μείωσης της διάρκειας ζωής σε υψηλές αναλογίες του λόγου πρωτεΐνη/υδατάνθρακα στην διατροφή του, η ωοπαραγωγή μεγιστοποιήθηκε σε υψηλές αναλογίες πρωτεΐνης/υδατάνθρακα αλλά η διάρκεια ωοπαραγωγής μεγιστοποιήθηκε σε ενδιάμεσες τιμές αυτής της αναλογίας, υποδεικνύοντας και μια ισορροπία μεταξύ της διάρκειας ζωής και του ρυθμού ωοπαραγωγής, πιθανόν οφειλόμενης στην προσαρμογή της κατανάλωσης της τροφής από μεριάς των εντόμων στο είδος της παρεχόμενης τροφής και δη, στην αναλογία πρωτεΐνης και σακχάρων σε αυτήν (Fanson & Taylor, 2012). Ειδικά για την μύγα της Μεσογείου, η επίδραση της πρωτεΐνης στην διάρκεια της ζωής είναι μάλλον αμφιλεγόμενη και μένει να διευκρινιστεί καθώς παρατηρούνται διαφορετικά συμπεράσματα από την σχετική βιβλιογραφία. Έτσι για παράδειγμα, η προσθήκη πρωτεΐνης (πλήρης δίαιτα εν αντιθέσει με δίαιτα μόνο με σάκχαρα) στην διατροφή ενηλίκων θηλυκών μείωσε την διάρκεια της ζωής αλλά αύξησε την ωοπαραγωγή ως ένα είδος ενεργειακού κόστους συμβιβασμό (Carey et al., 1998a) ενώ από την άλλη, η έλλειψη πρωτεΐνης στο διαιτολόγιο των ενηλίκων, οδήγησε σε μικρότερη διάρκεια ζωής (Cangussu & Zucoloto, 1997) ενώ και σε μια άλλη περίπτωση τα ενήλικα που τράφηκαν με μεγαλύτερες ποσότητες πρωτεΐνης ζούσαν περισσότερο (Plácido-Silva et al., 2006). Από τα παραπάνω και δεδομένης της αντίφασης μεταξύ των αποτελεσμάτων των διαφόρων ερευνών, γίνεται αντιληπτή η σημασία της 73

74 αναγνώρισης του ειδικού και ξεχωριστού ρόλου που διαδραματίζουν οι δύο αυτές βασικές πηγές θρέψης (πρωτεΐνες και υδατάνθρακες) στην φυσιολογία της μύγας της Μεσογείου και στην επίδραση που έχει η κατανάλωσή τους στην διάρκεια της ζωής και στην αναπαραγωγή της. Για τον σκοπό αυτό η παρούσα διατριβή δεν περιορίζεται στην απλή καταγραφή, με υψηλή βέβαια ακρίβεια, της συνολικής κατανάλωσης πρωτεΐνης και ζάχαρης ή της χρονικής κατανομής της στο σύνολο της ζωής των ενηλίκων αλλά επιχειρεί να διερευνήσει, παρέχοντας - εναλλάξ - την μία τροφή εν αφθονία και την άλλη υπό μορφή μέτρησης, και τις επιμέρους αλληλεπιδράσεις της κατανάλωσής τους σε σχέση με το φύλο ή την γήρανση του πληθυσμού. 4.3 Υλικά και μέθοδοι Συνολικά 4 διαφορετικοί πληθυσμοί (μεταχειρίσεις) χρησιμοποιήθηκαν 2 ανά πηγή τροφής (ζάχαρη και πρωτεΐνη) και 2 ανά φύλο (αρσενικά και θηλυκά). Το δείγμα για κάθε μεταχείριση ήταν 30 ενήλικα. Μετά την έξοδο των ενηλίκων από το στάδιο της νύμφης, την 1 η ημέρα της ενήλικης ζωής τους, 30 ενήλικα τοποθετήθηκαν σε ατομικά κλουβιά, όπως περιγράφηκαν στο κεφάλαιο 2. Τα ατομικά κλουβιά τοποθετήθηκαν στην συνέχεια σε 6 - ανά μεταχείριση - ομαδικούς θαλάμους κατασκευασμένους από Plexiglas διαστάσεων 25Χ35Χ25 cm, όπως περιγράφηκαν στο κεφάλαιο 2. Σε κάθε ομαδικό θάλαμο τοποθετήθηκαν 6 ατομικά κλουβιά με τα 5 από αυτά να περιέχουν ενήλικα και ένα να παραμένει κενό λειτουργώντας ως μάρτυρας για την μέτρηση της εξάτμισης στους τριχοειδείς σωλήνες. Καθημερινά και για 5 ώρες τοποθετούνταν σε κάθε ατομικό κλουβί τριχοειδής σωλήνας με το κατά περίπτωση θρεπτικό διάλυμα. Στην συνέχεια ο 74

75 ομαδικός θάλαμος καλυπτόταν με το καπάκι του πάνω στο οποίο τοποθετούνταν ένα βρεγμένο Wettex και κατόπιν καλυπτόταν από πλαστική μεμβράνη. Με το πέρας του πενταώρου, οι ομαδικοί θάλαμοι ανοίγονταν και μετρούνταν η κατανάλωση σε όγκο θρεπτικού διαλύματος και για την περίπτωση των θηλυκών η ημερήσια ωοπαραγωγή (αυγά στην εσωτερική επιφάνεια των τεχνητών υποστρωμάτων). Ωστόσο, το σύνολο του χώρου του ατομικού κλουβιού ελεγχόταν για την παρουσία αυγών και σε άλλες θέσεις εκτός της εσωτερικής επιφάνειας του κοίλου υποστρώματος καθώς παρατηρήθηκε - περιορισμένη βέβαια - ωοτοκία ακόμη και στην επιφάνεια της βάσης του κλουβιού ή στην περιφέρεια της κι ακόμη σπανιότερα στις υποτυπώδεις πτυχώσεις του φελλού που χρησιμοποιήθηκε ως πώμα. Για την πρόκληση ωοτοκίας, όπως προαναφέρθηκε στο κεφάλαιο 2, τοποθετούνταν στο τρυβλίο με το νερό κάτω από το ατομικό κλουβί και ακριβώς κάτω από το ημισφαιρικό πλαστικό υπόστρωμα ωοτοκίας, ένα πλαστικό κυλινδρικό δοχείο χωρητικότητας 7 ml περίπου και γεμιζόταν με 5 ml φυσικού χυμού πορτοκαλιού (100% φυσικός χυμός με την προσθήκη 1% σορβικού οξέως ως συντηρητικού) μετά την 5 η ημέρα εγκλεισμού των ενηλίκων θηλυκών και ο χυμός ανανεωνόταν κάθε δύο ημέρες. Από την 5 η και ως την 10 η ημέρα, καθημερινά και με το πέρας της διατροφής και των μετρήσεων, σε κάθε ατομικό κλουβί με θηλυκό εισάγονταν 3 ενήλικα αρσενικά ίδιας ηλικίας και προέλευσης (δηλαδή προέρχονταν από τον ίδιο πληθυσμό διατήρησης) με τα θηλυκά για την επίτευξη σύζευξης. Την επόμενη ημέρα τα αρσενικά εξάγονταν από τα ατομικά κλουβιά πριν την τοποθέτηση των τριχοειδών σωλήνων θρέψης και επανεισάγονταν (όχι απαραίτητα τα ίδια) μετά το πέρας του πενταώρου και των μετρήσεων. Για όσα θηλυκά επιβίωναν της 30 ης ημέρας 75

76 παρατηρήσεων (για την πλειοψηφία δηλαδή) η διαδικασία αυτή επαναλαμβανόταν για το 3ήμερο μετά από την 30 η ημέρα. Η μεταβολή στην συχνότητα της κατανάλωσης της τροφής στο σύνολο του χρόνου των παρατηρήσεων, περιγράφηκε με την βοήθεια διαγραμμάτων γεννήσεων-θανάτων (event history charts) όπως περιγράφονται από τους Carey et al.(1998b). Επιπλέον, ο έλεγχος της επίδρασης του χρόνου, του τύπου της τροφής και του φύλου μέχρι την 30η ημέρα, καθώς και οι μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις, πραγματοποιήθηκε με ανάλυση διακύμανσης ANOVA για συσχετισμένες τιμές ή επαναλαμβανόμενων μετρήσεων (repeated measures ANOVA). Οι επιδράσεις μεταξύ των ατόμων της κάθε μεταχείρισης (between subjects effects) ελέγχθηκαν με το Pillai s test. Η υπόθεση σφαιρικότητας (assumption of Sphericity) ελέγχτηκε με το Mauchly s test για επίπεδο σημαντικότητας 0,05. Επειδή σε κάποιες περιπτώσεις οι διακυμάνσεις των διαφορών μεταξύ κάθε ζεύγους τιμών για κάθε ζεύγος συνθήκων (μεταβλητή) μπορεί να διαφέρουν σημαντικά, παραβιάζοντας την υπόθεση σφαιρικότητας, οι επιδράσεις εντός υποκειμένων (ατόμων) (within subjects effects) ελέγχθηκαν παράλληλα και με τις διορθώσεις που προτείνουν οι Greenhouse & Geisser (1959) και Huynh & Feldt (1976). Ανάλυση συσχετισμένων τιμών εφαρμόστηκε, επίσης, για να ελεγχθεί η επίδραση του χρόνου και της θρέψης καθώς και η αλληλεπίδρασή τους με την ωοπαραγωγή. Η επίδραση της κατανάλωσης της τροφής στην επιβίωση και στην συνάρτηση επιβίωσης και στιγμιαίου κινδύνου (hazard rate) συγκρίθηκε χρησιμοποιώντας την ανάλυση επιβιωσιμότητας Kaplan-Meier και log-rank tests. Τέλος, οι συσχετίσεις μεταξύ ηλικίας, κατανάλωσης τροφής και ωοπαραγωγής, για το σύνολο των δημογραφικών δεδομένων, περιγράφηκαν 76

77 με την μορφή εξομαλυμένων επιφανειών (smooth surfaces) καθώς και με την βοήθεια του μη-γραμμικού μοντέλου κανονικής κατανομής τύπου Lorentz. 4.4 Αποτελέσματα - Συζήτηση Από τις μετρήσεις της κατανάλωσης για το σύνολο της ενήλικης ζωής των εντόμων στις 4 μεταχειρίσεις, κατασκευάστηκε το διάγραμμα 5 όπου παρουσιάζεται η ημερήσια κατανάλωση στην μορφή διαγραμμάτων γεννήσεων-θανάτων (event history charts) για κάθε μεταχείριση ξεχωριστά αλλά ομαδοποιημένη σε 3 κλάσεις κατανάλωσης (0 mg δηλαδή καθόλου κατανάλωση, 0,01-0,1 mg και >0,1 mg για την πρωτεΐνη και 0 mg, 0,01-0,5 mg και >0,5 mg για την ζάχαρη) για λόγους ευκολίας της παρουσίασης των αποτελεσμάτων. Κάθε οριζόντια (νοητή) γραμμή στα διαγράμματα αντιπροσωπεύει την κατανάλωση ενός εντόμου στο σύνολο της ζωής του, με αυτό στην κορυφή του διαγράμματος να αντιπροσωπεύει αυτό που έζησε λιγότερο και αυτό στην βάση να αντιπροσωπεύει εκείνο το ενήλικο έντομο που έζησε περισσότερο. Με βάση τα επιμέρους διαγράμματα στο διάγραμμα 5, προκύπτει ως αρχική παρατήρηση, όσον αφορά την περίπτωση της ζάχαρης (όπου δηλαδή η πρωτεΐνη παρεχόταν εν αφθονία και καταμετρούνταν η κατανάλωση της ζάχαρης) μια σταθερή σχετικά κατανομή της κατανάλωσής της στον χρόνο, ανεξάρτητη από την ηλικία των ενηλίκων. Αν και ήταν υψηλή για όλα τα έντομα τις πρώτες ημέρες μετά τον εγκλεισμό τους δεν μειώθηκε σημαντικά τις επόμενες ημέρες. Αλλά και μεταξύ των δύο φύλων, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές παρά το γεγονός ότι τα αρσενικά έζησαν σχεδόν 77

78 διπλάσιο χρόνο σε σχέση με τα θηλυκά. Και στα αρσενικά η κατανάλωση ήταν υψηλή τις πρώτες ημέρες της ενήλικης ζωής τους. Όσον αφορά την περίπτωση της πρωτεΐνης (όπου δηλαδή η ζάχαρη παρεχόταν εν αφθονία και καταμετρούνταν η κατανάλωση της πρωτεΐνης) η κατανάλωση ήταν μεγαλύτερη στις ενδιάμεσες ηλικίες όσων αφορά την περίπτωση των θηλυκών, ίσως επειδή χρονικά συμπίπτουν με υψηλότερες απαιτήσεις για την κάλυψη των αναπαραγωγικών τους αναγκών αφού τότε παρουσιάστηκε και μεγαλύτερη ωοπαραγωγή (Διάγραμμα 6). Και στην περίπτωση των αρσενικών η κατανάλωση φαίνεται να είναι μεγαλύτερη στις ενδιάμεσες ηλικίες αλλά η συχνότητα αυτής είναι κατανεμημένη σε περισσότερες ηλικιακές κλάσεις. Η κατανάλωση συνολικά λοιπόν, φαίνεται να μην εξαρτάται από την ηλικία ενώ επηρεάζεται από το φύλο για την περίπτωση της πρωτεΐνης και τέλος η κατανάλωση ζάχαρης (όταν η πρωτεΐνη παρεχόταν εν αφθονία) ήταν μεγαλύτερη και για τα δύο φύλα σε σχέση με την κατανάλωση πρωτεΐνης (όταν η ζάχαρη παρεχόταν εν αφθονία). 78

79 ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΘΗΛΥΚΑ ΖΑΧΑΡΗ ΘΗΛΥΚΑ ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΑΡΣΕΝΙΚΑ ΖΑΧΑΡΗ ΑΡΣΕΝΙΚΑ ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΧΡΟΝΟΣ (ΗΜΕΡΕΣ) ΧΡΟΝΟΣ (ΗΜΕΡΕΣ) Διάγραμμα 5. Ομαδοποιημένη κατανάλωση τροφής στο σύνολο της ζωής ενηλίκων της μύγας της Μεσογείου για 4 πληθυσμούς (n=30) που διατράφηκαν με την μέθοδο των τριχοειδών σωλήνων. Κάθε οριζόντια (νοητή) γραμμή αντιπροσωπεύει την επιβιωσιμότητα κάθε ατόμου ξεχωριστά καθώς και την ημερήσια κατανάλωση σε mg (σε 3 κλάσεις κατανάλωσης που αντιπροσωπεύονται από διαφορετικό χρώμα), με αυτήν στην κορυφή να αντιστοιχεί στο πρώτο χρονικά αποβιώσαν και στην βάση στο τελευταίο, ανά μεταχείριση. Πάνω αριστερά παρουσιάζονται τα αποτελέσματα για θηλυκά που διατράφηκαν με θρεπτικό διάλυμα ζάχαρης 20% (β/ό) κι έχοντας εν αφθονία την πρωτεΐνη. Κάτω αριστερά τα αρσενικά που διατράφηκαν με θρεπτικό διάλυμα ζάχαρης 20% (β/ό) κι έχοντας εν αφθονία την πρωτεΐνη. Πάνω δεξιά τα θηλυκά που διατράφηκαν με θρεπτικό διάλυμα πρωτεΐνης 20% (β/ό) κι έχοντας εν αφθονία την ζάχαρη και κάτω δεξιά τα αρσενικά που διατράφηκαν με θρεπτικό διάλυμα πρωτεΐνης 20% (β/ό) κι έχοντας εν αφθονία την ζάχαρη. 79

80 Στο διάγραμμα 6 παρουσιάζεται η ωοπαραγωγή στις 2 μεταχειρίσεις των θηλυκών, υπό μορφή διαγραμμάτων γεννήσεων-θανάτων (event history charts) όπου κάθε οριζόντια (νοητή) γραμμή αντιπροσωπεύει την ωοπαραγωγή ενός θηλυκού στην διάρκεια της ζωής του εκφρασμένη σε 3 κλάσεις (0 αυγά, 1-15 αυγά και >15 αυγά) με αυτό στην κορυφή του διαγράμματος να αντιπροσωπεύει αυτό που έζησε λιγότερο και αυτό στην βάση να αντιπροσωπεύει εκείνο το ενήλικο έντομο που έζησε περισσότερο, για λόγους ευκολίας παρουσίασης. Με βάση τα δύο επιμέρους διαγράμματα στο διάγραμμα 6, δεν φαίνεται να προκύπτει σημαντική διαφορά ανάμεσα σε αυτά που τράφηκαν με πρωτεΐνη (έχοντας εν αφθονία την ζάχαρη) σε σχέση με αυτά που τράφηκαν με ζάχαρη (έχοντας εν αφθονία την πρωτεΐνη), όσον αφορά την έναρξη της ωοτοκίας υπονοώντας μια ανεξάρτητη σχέση του είδους της μετρούμενης τροφής (παρουσία εν αφθονία του άλλου) για αυτό τα χαρακτηριστικό. Η κατανομή της ωοπαραγωγής στον χρόνο παρουσιάζει μικρές διαφορές στις δύο περιπτώσεις αφού για την περίπτωση της ζάχαρης ορισμένα άτομα παρουσιάζουν κενά στην ωοπαραγωγή τους σε σχέση με αυτά της πρωτεΐνης που παρουσιάζουν ένα σταθερότερο αναπαραγωγικό σχέδιο. Και στις δυο περιπτώσεις τα ενήλικα θηλυκά επιβίωσαν για μια περίοδο 5-8 ημερών μετά το πέρας της περιόδου ωοτοκίας και πριν τον θάνατό τους, κι επίσης δεν παρατηρήθηκε κάποιο άτομο που να μην γέννησε καθόλου και στις δυο μεταχειρίσεις. 80

81 ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΩΟΠΑΡΑΓΩΓΗ - ΖΑΧΑΡΗ ΩΟΠΑΡΑΓΩΓΗ - ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΧΡΟΝΟΣ (ΗΜΕΡΕΣ) Διάγραμμα 6. Ομαδοποιημένη ωοπαραγωγή στο σύνολο της ζωής θηλυκών που διατράφηκαν με την μέθοδο των τριχοειδών σωλήνων με διάλυμα ζάχαρης (20% β/ο) (πάνω) και πρωτεΐνης (20% β/ο) (κάτω) έχοντας ad libitum την πρωτεΐνη και την ζάχαρη αντίστοιχα. Σε κάθε διάγραμμα, κάθε οριζόντια (νοητή) γραμμή αντιπροσωπεύει την επιβιωσιμότητα του κάθε θηλυκού ατόμου ξεχωριστά και την ημερήσια ωοτοκία του (σε 3 κλασεις ωοτοκίας, που αντιπροσωπεύονται από διαφορετικό χρώμα) με αυτήν στην κορυφή να αντιστοιχεί στο πρώτο χρονικά αποβιώσαν άτομο και αυτήν στην βάση στο τελευταίο. 81

82 ΜΕΣΗ ΣΥΝΟΛΙΚΗ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗ ΘΗΛΥΚΑ ΦΥΛΟ ΑΡΣΕΝΙΚΑ Διάγραμμα 7. Σύγκριση ανά ζεύγος, της μέσης συνολικής κατανάλωσης τροφής (n=30, ± τυπ. σφ.) (ζάχαρης με το πορτοκαλί χρώμα, πρωτεΐνης με το πράσινο χρώμα) σε σχέση με το φύλο και μέχρι την 30 η ημέρα των παρατηρήσεων. Στήλες με διαφορετικό δείκτη (γράμμα) διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά μεταξύ τους (p<0,05, t-test). Στο διάγραμμα 7 παρουσιάζεται η μέση συνολική κατανάλωση (±τυπικό σφάλμα, n=30) για τις 4 μεταχειρίσεις μέχρι την 30 η ημέρα παρατήρησης ανά φύλο. Και στα δύο φύλα η μέση συνολική κατανάλωση ζάχαρης με την χρήση των τριχοειδών σωλήνων έχοντας εν αφθονία την πρωτεΐνη ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε σχέση με αυτήν της πρωτεΐνης. Επιπλέον, τα αρσενικά κατανάλωσαν μεγαλύτερη ποσότητα ζάχαρης σε σχέση με τα θηλυκά, ωστόσο δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην κατανάλωση πρωτεΐνης μεταξύ αρσενικών και θηλυκών. Στο διάγραμμα 8 παρουσιάζεται η σωρευτική ή αθροιστική πρόσληψη της τροφής κάθε μεταχείρισης για το σύνολο της ζωής τους και οι καμπύλες παρουσιάζουν για την καθεμία περίπτωση τον ρυθμό κατανάλωσης. Για τα 82

83 ΑΘΡΟΙΣΤΙΚΗ ΚΑΤΑΝΑΛΩΣΗ θηλυκά ο ρυθμός πρόσληψης της τροφής δεν διαφέρει σημαντικά για τα δύο είδη τροφής. Για τα αρσενικά όμως η συσσώρευση στην περίπτωση της ζάχαρης (όπου η πρωτεΐνη παρεχόταν εν αφθονία) ήταν αμεσότερη από την περίπτωση της πρωτεΐνης (όπου η ζάχαρη παρεχόταν εν αφθονία) δηλαδή τα αρσενικά συγκέντρωναν μεγαλύτερη ποσότητα της ζάχαρης λίγες ημέρες νωρίτερα σε σχέση με την πρωτεΐνη. Παρόλα αυτά, οι διαφορές ήταν μικρές στις 4 μεταχειρίσεις υποδεικνύοντας πως το είδος της τροφής δεν επηρεάζει τον ρυθμό κατανάλωσης των διαλυμάτων θρέψης μg/ _sugar mg/θηλ-ζαχαρη μg/ _protein mg/θηλ-πρωτεινη 30 μg/ _sugar mg/αρεν - ΖΑΧΑΡΗ 20 μg/ _protein mg/αρεν - ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΧΡΟΝΟΣ (ΗΜΕΡΕΣ) Διάγραμμα 8. Καμπύλες αθροιστικής κατανάλωσης τροφής από αρσενικά και θηλυκά ενήλικα άτομα της μύγας της Μεσογείου που διατράφηκαν με θρεπτικά διαλύματα ζάχαρης και πρωτεΐνης με την χρήση τριχοειδών σωλήνων και για το σύνολο της ενήλικης ζωής τους. 83

84 Στο διάγραμμα 9 παρουσιάζεται η συνάρτηση επιβίωσης και στο διάγραμμα 10 η συνάρτηση στιγμιαίου κινδύνου για τις 4 μεταχειρίσεις. Τα αρσενικά και τα θηλυκά ανταποκρίθηκαν διαφορετικά στην επίδραση της τροφής όσον αφορά την διάρκεια ζωής τους (Πίνακας 2) με την ανάλυση Kaplan-Meier log rank να δείχνει σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών κατανομών επιβίωσης (XSqr=29.128, df=3, sig=0.000, Mantel- Cox test). Ωστόσο στην περίπτωση της διατροφής με πρωτεΐνη (όπου η ζάχαρη παρεχόταν εν αφθονία) η διάρκεια της ζωής στα αρσενικά ήταν μεγαλύτερη σε σχέση με τα θηλυκά. Κατ αντιστοιχία, στην κατανομή του στιγμιαίου κινδύνου δεν αποτυπώνονται σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο μεταχειρίσεων στα θηλυκά αλλά για τα αρσενικά που διατράφηκαν με την ζάχαρη (έχοντας εν αφθονία την πρωτεΐνη) η πιθανότητα θανάτου ήταν μεγαλύτερη σε σχέση με τα αρσενικά που διατράφηκαν με πρωτεΐνη (έχοντας εν αφθονία την ζάχαρη). Πίνακας 2. Ανάλυση επιβίωσης αρσενικών και θηλυκών ενηλίκων της μύγας της Μεσογείου που τράφηκαν με την χρήση τριχοειδών σωλήνων για το σύνολο της ενήλικης ζωής τους με ζάχαρη (έχοντας ad libitum την πρωτεΐνη) (ΘΗΛ-ΖΑΧ, ΑΡΕΝ- ΖΑΧ) και με πρωτεΐνη (έχοντας ad libitum την ζάχαρη) (ΘΗΛ-ΠΡΩΤ, ΑΡΕΝ-ΠΡΩΤ). Mέσος όρος και Διάμεσος Επιβίωσης Μέσος όρος Διάμεσος 95% διάστημα 95% διάστημα εμπιστοσύνης εμπιστοσύνης Τυπικό Ελάχ Μέγ Τυπικό Ελάχ Μέγ Μεταχείριση Υπολογ. σφάλμα όριο όριο Υπολογ. σφάλμα όριο όριο ΘΗΛ-ΖΑΧ ΑΡΕΝ-ΖΑΧ ΘΗΛ-ΠΡΩΤ ΑΡΕΝ-ΠΡΩΤ ΣΥΝΟΛΟ (ανεξ)

85 ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΕΠΙΒΙΩΣΗΣ ΘΗΛ - ΖΑΧΑΡΗ ΑΡΕΝ - ΖΑΧΑΡΗ ΘΗΛ - ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΑΡΕΝ - ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΧΡΟΝΟΣ (ΗΜΕΡΕΣ) Διάγραμμα 9. Επιβίωση ενηλίκων θηλυκών και αρσενικών που διατράφηκαν με τροφικά διαλύματα ζάχαρης ή πρωτεΐνης με την χρήση τριχοειδών σωλήνων έχοντας ad libitum την πρωτεΐνη και την ζάχαρη αντίστοιχα. 85

86 ΣΥΝΑΡΤΗΣΗ ΣΤΙΓΜΙΑΙΟΥ ΚΙΝΔΥΝΟΥ ΘΗΛ - ΖΑΧΑΡΗ ΑΡΕΝ - ΖΑΧΑΡΗ ΘΗΛ - ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΑΡΕΝ - ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΧΡΟΝΟΣ (ΗΜΕΡΕΣ) Διάγραμμα 10. Συνάρτηση στιγμιαίου κινδύνου θηλυκών και αρσενικών που διατράφηκαν με τροφικά διαλύματα ζάχαρης ή πρωτεΐνης με την χρήση τριχοειδών σωλήνων έχοντας ad libitum την πρωτεΐνη και την ζάχαρη αντίστοιχα. 86

87 Στον πίνακα 3 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα των επιδράσεων μεταξύ των ατόμων των μεταχειρίσεων (between subject effects) στην συνολική κατανάλωση τροφής για τις πρώτες 30 ημέρες της ενήλικης ζωής των μυγών της Μεσογείου. Το είδος της τροφής (ζάχαρη ή πρωτεΐνη) όπως και το φύλο (αρσενικά ή θηλυκά) είχαν σημαντική επίδραση στην κατανάλωση τροφής και οι δύο αυτοί παράγοντες συνέβαλαν στην διαφορά αυτής της κατανάλωσης (p<0.05), ενώ η αλληλεπίδραση του είδους της τροφής και του φύλου δεν είχε σημαντική επίδραση όσον αφορά την κατανάλωση (p>0.05). Πίνακας 3. Επιδράσεις μεταξύ των ατόμων των μεταχειρίσεων (between-subject effects) στην συνολική κατανάλωση τροφής από τα ενήλικα της μύγας της Μεσογείου για τις πρώτες 30 ημέρες της ενήλικης ζωής τους (n=30, rep. meas. ANOVA). Type III Sum of df Mean Square F Sig. Squares Intercept τροφή φύλο τροφή * φύλο σφάλμα

88 Πίνακας 4. Έλεγχος των επιδράσεων εντός του δείγματος των ατόμων (withinsubject effect) ως προς την ηλικία τους σε σχέση με την ημερήσια κατανάλωση τροφής (ζάχαρη ή πρωτεΐνη) από ενήλικα της μύγας της Μεσογείου για τις πρώτες 30 ημέρες της ενήλικης ζωής τους για όλες τις μεταχειρίσεις (n=30, rep. meas. ANOVA). Type Sum Squares III df of Mean Square F Sig. Ηλικία Sphericity Assumed Greenhouse- Geisser Huynh-Feldt Ηλικία * είδος τροφής Sphericity Assumed Greenhouse- Geisser Huynh-Feldt Sphericity Assumed Huynh-Feldt Ηλικία * φύλο Greenhouse- Geisser Sphericity Assumed Ηλικία* Είδος τροφής* Greenhouse- Φύλο Geisser Huynh-Feldt Σφάλμα (χρόνος) Sphericity Assumed Greenhouse- Geisser Huynh-Feldt

89 Στον πίνακα 4 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα των επιδράσεων εντός των ατόμων του δείγματος (within-subject effects) όσον αφορά τον χρόνο (ηλικία των ενηλίκων) και τις αλληλεπιδράσεις του με το είδος της τροφής (διατροφή με την χρήση τριχοειδών σωλήνων με διάλυμα πρωτεΐνης όπου η ζάχαρη παρεχόταν ad libitum και διατροφή με την χρήση τριχοειδών σωλήνων με διάλυμα ζάχαρης όπου η πρωτεΐνη παρεχόταν ad libitum ή απλούστερα πρωτεΐνη και ζάχαρη αντίστοιχα) και το φύλο (αρσενικά ή θηλυκά) με βάση τον κάθε φορά χρησιμοποιούμενο στατιστικό έλεγχο που χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της υπόθεσης σφαιρικότητας. Η ηλικία είχε σημαντική επίδραση στην κατανάλωση της τροφής σε όλες τις περιπτώσεις ελέγχου. Η αλληλεπίδραση ηλικίας και είδους τροφής, ηλικίας και φύλου και τέλος της η αλληλεπίδραση ηλικίας, είδους τροφής και φύλου είχε σημαντική επίδραση όταν η υπόθεση σφαιρικότητας ήταν αποδεκτή. Επιπλέον η επίδραση της ηλικίας όπως και η αλληλεπίδραση ηλικίας και είδους τροφής ήταν σημαντική για την κατανάλωση της τροφής με βάση τις διορθώσεις Greenhouse -Geisser και Huynh-Feldt. Όμως η αλληλεπίδραση ηλικίας και φύλου δεν ήταν σημαντική όταν η υπόθεση σφαιρικότητας δεν ήταν αποδεκτή (παραβιαζόταν). Στον πίνακα 5 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα των επιδράσεων μεταξύ των ατόμων κάθε μεταχείρισης (between subject effects) στην συνολική ωοπαραγωγή για τις πρώτες 30 ημέρες της ενήλικης ζωής των μυγών της Μεσογείου. Από αυτά συμπεραίνουμε ότι το είδος της τροφής δεν επηρεάζει σημαντικά τον αριθμό των αυγών ανά θηλυκό (p>0.05). 89

90 Πίνακας 5. Επιδράσεις μεταξύ των ατόμων των μεταχειρίσεων (between-subject effects) στην συνολική ωοπαραγωγή από τα ενήλικα της μύγας της Μεσογείου για τις πρώτες 30 ημέρες της ενήλικης ζωής τους (n=30, rep. meas. ANOVA). Type III Sum of df Mean Square F Sig. Squares Intercept Είδος τροφής σφάλμα Στον πίνακα 6 όμως, που παρουσιάζει τα αποτελέσματα των επιδράσεων εντός των ατόμων του δείγματος (within-subject effects) όσον αφορά τον χρόνο (ηλικία των ενηλίκων θηλυκών) και τις αλληλεπιδράσεις του με το είδος της τροφής (πρωτεΐνη ή ζάχαρη) στην ωοπαραγωγή παρατηρούνται σημαντικές αλληλεπιδράσεις. Η ηλικία όπως και η αλληλεπίδραση ηλικίας και τροφής είχαν σημαντική επίδραση στην ωο παραγωγή των θηλυκών. Από τα παραπάνω συμπεραίνουμε, και μόνο για τις πρώτες 30 ημέρες των μετρήσεων, πως τόσο η κατανάλωση όσο και η ωο παραγωγή επηρεάζονται τόσο από την ηλικία των εντόμων όσο κι από τις αλληλεπιδράσεις με το είδος της τροφής. Παρά το γεγονός πως το είδος της τροφής επηρέασε σημαντικά την κατανάλωση δεν είχε σημαντική επίδραση στην ωοπαραγωγή. 90

91 Πίνακας 6. Έλεγχος των επιδράσεων εντός του δείγματος των ατόμων (withinsubject effect) ως προς την ηλικία τους σε σχέση με την ημερήσια ωοτοκία από ενήλικα της μύγας της Μεσογείου για τις πρώτες 30 ημέρες της ενήλικης ζωής τους για όλες τις μεταχειρίσεις (n=30, rep. meas. ANOVA). Type III Sum df Mean F Sig. of Squares Square Sphericity Assumed Ηλικία Geisser Huynh-Feldt Ηλικία* Είδος τροφής Huynh-Feldt Sphericity Assumed σφάλμα Greenhouse- Sphericity Assumed Greenhouse- Geisser Greenhouse- Geisser Huynh-Feldt

92 Καθώς η επιβίωση των θηλυκών ξεκίνησε να ελαττώνεται μετά την 30 η ημέρα παρατηρήσεων δεν ήταν δυνατή η εφαρμογή μιας αξιόπιστης ανάλυσης επαναλαμβανόμενων μέτρων (repeated measures ANOVA) και γι αυτό χρησιμοποιήθηκε ένα τρισδιάστατο (3D) μοντέλο μη γραμμικής παλινδρόμησης για τον εντοπισμό σημαντικών αλληλεπιδράσεων σε όλη την διάρκεια της ζωής των ενηλίκων των μεταχειρίσεων. Στα διαγράμματα 11 και 12 απεικονίζονται οι σχέσεις μεταξύ της ωοπαραγωγής, της κατανάλωσης της τροφής και της ηλικίας των θηλυκών, σε τρισδιάστατες αναπαραστάσεις με αυτές στο διάγραμμα 11 υπό την μορφή εξομαλυμένων επιφανειών (smooth surfaces) ενώ στο διάγραμμα 12 υπό την μορφή ενός μη-γραμμικού μοντέλου κανονικής κατανομής τύπου Lorentz. Η ωοπαραγωγή και η κατανάλωση τροφής (ζάχαρης και πρωτεΐνης) είναι χαμηλές κατά τις πρώτες ημέρες της ενήλικης ζωής των θηλυκών και λαμβάνουν τις μέγιστες τιμές τους περίπου κατά το μέσο των παρατηρήσεων. Και στις δύο περιπτώσεις των μεταχειρίσεων (ζάχαρη και πρωτεΐνη) παρατηρείται μια σχεδόν κωδωνοειδή μορφή κατανομής ωστόσο στην περίπτωση της πρωτεΐνης σε σχέση με την ωοπαραγωγή (κάτω απεικόνιση στο διάγραμμα 11) προσομοιάζει περισσότερο με μια καμπύλη Gauss. Πράγματι η ωοπαραγωγή ειδικά για την περίπτωση της πρωτεΐνης ανταποκρίνεται σχεδόν πλήρως σε μια κανονική κατανομή τύπου Lorentz, με το μοντέλο να αντιπροσωπεύει το 95% της διακύμανσης των δεδομένων. 92

93 ΩΟΠΑΡΑΓΩΓΗ (ΑΥΓΑ) ΩΟΠΑΡΑΓΩΓΗ (ΑΥΓΑ) eggs eggs sugar intake day eggs eggs protein intake day Διάγραμμα 11. Σχέση μεταξύ χρόνου, κατανάλωσης (mg) και ωοπαραγωγής (αριθμός αυγών) βάσει της 3D παρεμβολής, για ενήλικα θηλυκά που διατράφηκαν με τροφικά διαλύματα ζάχαρης (πάνω) και πρωτεΐνης (κάτω) με την χρήση τριχοειδών σωλήνων έχοντας ad libitum την πρωτεΐνη και την ζάχαρη αντίστοιχα, για το σύνολο της ενήλικης ζωής τους. 93

94 25 model data eggs sugar intake days model data eggs protein intake day Διάγραμμα 12. Σχέση μεταξύ χρόνου, κατανάλωσης (mg) και ωοπαραγωγής (αριθμός αυγών) βάσει λορεντζιανού τύπου μοντέλου, για ενήλικα θηλυκά που διατράφηκαν με τροφικά διαλύματα ζάχαρης (πάνω) και πρωτεΐνης (κάτω) με την χρήση τριχοειδών σωλήνων έχοντας ad libitum την πρωτεΐνη και την ζάχαρη αντίστοιχα, για το σύνολο της ενήλικης ζωής τους. 94

95 Γνωρίζοντας το σχήμα αυτό της ανταπόκρισης της αναπαραγωγής (ωοπαραγωγής) των θηλυκών της μύγας της Μεσογείου στην κατανάλωση της τροφής και σε σχέση με την ηλικία τους, μπορούμε να υποστηρίξουμε την υπόθεση πως το είδος τείνει να καταναλώνει μεγαλύτερες ποσότητες της διαθέσιμης τροφής κατά το μέσο της ενήλικης ζωής του που συμπίπτει χρονικά και με το κρίσιμο «παράθυρο ευκαιρίας» όσον αφορά την αναπαραγωγή τους. Αυτή η τάση είναι εμφανής, σε διαφορετικό βέβαια βαθμό, και για τις δύο περιπτώσεις θρέψης (θρεπτικό διάλυμα ζάχαρης παρεχόμενο με τριχοειδή σωλήνα κι ad libitum παροχή πρωτεΐνης όπως και θρεπτικό διάλυμα πρωτεΐνης παρεχόμενο με τριχοειδή σωλήνα κι ad libitum παροχή ζάχαρης). Στην πράξη, η κατανάλωση μεγαλύτερων ποσοτήτων ζάχαρης έγινε σε νεαρότερες ηλικίες αν και η αναπαραγωγή ξεκίνησε λίγες ημέρες αργότερα. Επιπλέον, η ανάλυση της επίδρασης της κατανάλωσης στην ηλικία και την ωοτοκία αποκάλυψε σημαντικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των τριών αυτών μεταβλητών. Στους πίνακες 7 και 8, παρακάτω, παρουσιάζονται οι στατιστικές αναλύσεις παλινδρόμησης των τρισδιάστατων απεικονίσεων όπως και οι αντίστοιχες αναλύσεις παραλλακτικότητας για την ζάχαρη και την πρωτεΐνη αντίστοιχα. Τα διαγράμματα γεννήσεων - θανάτων αν και χρήσιμα για την πληροφόρηση της κατανομής της ωοπαραγωγής μεταξύ των ατόμων των μεταχειρίσεων, δεν μπορούν να καταδείξουν το σχήμα αυτό της ανταπόκρισης της αναπαραγωγής στην διατροφή ούτε και την σημαντικότητα των όποιων αλληλεπιδράσεων. Αντίθετα, τα μοντέλα μη-γραμμικής παλινδρόμησης υπό την μορφή εξομαλυμένων επιφανειών (smooth surfaces) όπως παρουσιάζονται παραπάνω, αποκαλύπτουν αυτές τις αλληλεπιδράσεις αλλά 95

96 και την γενική εικόνα αυτής της ανταπόκρισης της αναπαραγωγής στην κατανάλωση για την περίπτωση των θηλυκών. Πίνακας 7. Στατιστική ανάλυση μη-γραμμική παλινδρόμησης 3D μοντέλου για την περιγραφή των αλληλεπιδράσεων μεταξύ κατανάλωσης ζάχαρης (έχοντας ad libitum την πρωτεΐνη), ωοπαραγωγής και ηλικίας σε θηλυκά της μύγας της Μεσογείου για το σύνολο της ενήλικης ζωής τους. Συνάρτηση: 3D, Lorentzian f = a/((1+((x-x0)/b)^2)*(1+((y-y0)/c)^2)) R Rsqr Adj Rsqr Standard Error of Estimate Coefficient Std. Error t P x < y a b < c Ανάλυση Διακύμανσης: Διορθωμένη για τον μέσο όρο των παρατηρήσεων: DF SS MS F P Regression < Residual Total

97 Πίνακας 8. Στατιστική ανάλυση μη-γραμμική παλινδρόμησης 3D μοντέλου για την περιγραφή των αλληλεπιδράσεων μεταξύ κατανάλωσης πρωτεΐνης (έχοντας ad libitum την ζάχαρη), ωοπαραγωγής και ηλικίας σε θηλυκά της μύγας της Μεσογείου για το σύνολο της ενήλικης ζωής τους. Συνάρτηση: 3D, Lorentzian f = a/((1+((x-x0)/b)^2)*(1+((y-y0)/c)^2)) R Rsqr Adj Rsqr Standard Error of Estimate Coefficient Std. Error t P x < y < a < b < c < Ανάλυση Διακύμανσης: Διορθωμένη για τον μέσο όρο των παρατηρήσεων: DF SS MS F P Regression < Residual Total

98 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΩΝ Εικόνα 1. Ενήλικο θηλυκό (κάτω μέρος), με τον ωοθέτη σε έκταση (κατόπιν ωοτοκίας) Εικόνα 2. Λεκάνες με άμμο για την νύμφωση των προνυμφών. Οι ανεπτυγμένες προνύμφες με την ολοκλήρωση της ανάπτυξής τους εξέρχονται των δισκίων με την τροφή κι εισχωρούν στο λεπτό στρώμα άμμου όπου και νυμφώνονται. 98

99 Εικόνα 3. Τρυβλία Petri με νύμφες. Εικόνα 4. Κλουβί διατήρησης ενηλίκων της αποικίας 99

100 Εικόνα 5. Τεχνητό υπόστρωμα ωοτοκίας στο εσωτερικό του κλουβιού διατήρησης ενηλίκων της αποικίας. Διακρίνονται επίσης οι δίσκοι με την στερεοποιημένη τροφή ενηλίκων και το κυλινδρικό δοχείο με το νερό. Εικόνα 6. Αυγά στην κάτω επιφάνεια του τεχνητού υποστρώματος από κλουβί διατήρησης ενηλίκων της αποικίας. 100

101 Εικόνα 7. Δίσκοι με την τεχνητή τροφή ανάπτυξης προνυμφών πάνω σε δισκία με βαμβάκι. Εικόνα 8. Πρόσθια όψη ενός σκεπασμένου ομαδικού θαλάμου θηλυκών 101

102 Εικόνα 9. Πλάγια όψη ενός σκεπασμένου ομαδικού θαλάμου θηλυκών. Εικόνα 10. κάτοψη του ομαδικού θαλάμου με ανοιγμένο το κάλυμμα του 102

103 . Εικόνα 11. Εσωτερικό ομαδικού θαλάμου με ανοιγμένο το κάλυμμα της κάθετης πλευράς (με το δίχτυ από τούλι) κατά την παρουσία των τριχοειδών σωλήνων παροχής τροφικού διαλύματος. 103

104 Εικόνα 12. Ατομικός θάλαμος ενηλίκων θηλυκών. 104

105 Εικόνα 13. Ατομικός θάλαμος ενηλίκων αρσενικών. 105

106 Εικόνα 14. Ατομικός θάλαμος ενηλίκου θηλυκού με την παρουσία (στο πάνω μέρος της φωτογραφίας, με φόντο το πώμα του θαλάμου) του τριχοειδούς σωλήνα θρέψης (προεξέχει 1 mm του χωνιού σταθεροποίησης) 106

107 Εικόνα 15. (πάνω) και Εικόνα 16. (κάτω). Κατόψεις του ατομικού κλουβιού θηλυκού ενηλίκου όπου έχει αποσπαστεί το ανώτερο τμήμα από την βάση. Στην βάση βρίσκεται το πλαστικό δοχείο με τον χυμό βυθισμένο στο νερό. Στην κορυφή του ανώτερου τμήματος διακρίνεται ο τριχοειδής σωλήνας με το τροφικό διάλυμα. 107

108 Εικόνα 17. Ο τριχοειδής σωλήνας θρέψης επί του ατομικού θαλάμου. 108

109 Εικόνα 18. Λεπτομέρεια της εικόνας 16. Διακρίνεται η βαθμονόμηση του τριχοειδούς σωλήνα (μαύρη γραμμή) με την οποία γινόταν και η καταμέτρηση του καταναλωθέντος όγκου θρεπτικού διαλύματος (στήλη υποκίτρινου χρωματισμού) ενώ διακρίνεται επίσης και η υπερκείμενη του στήλη με το παραφινέλαιο (διαφανής) που τοποθετούταν για τον περιορισμό της εξάτμισης. 109

110 Εικόνα 19. Αυγά στην κάτω επιφάνεια τεχνητού υποστρώματος ωοτοκίας από ατομικό κλουβί. Εικόνα 20. Θηλυκό ωοτοκεί σε οπή του τεχνητού υποστρώματος. 110

111 Εικόνα 21. Το θηλυκό με το πέρας της ωοτοκίας σύρει τον ωοθέτη του στην επιφάνεια του τεχνητού υποστρώματος με στόχο την απόθεση φερομόνης αποτροπής ωοτοκίας. 111