ΠΑΡΑΚΕΤΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΣΗ ΝΑΝΟΩΜΑΣΙΔΙΩΝ ΣΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΗ ΦΙΣΟΖΑΝΗ, Ω ΥΟΡΕΙ ΑΠΟΔΕΜΕΤΗ ΥΑΡΜΑΚΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΟΣΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟ ΘΕΑΛΟΝΙΚΗ ΦΟΛΗ ΘΕΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΗΜΩΝ ΣΜΗΜΑ ΦΗΜΕΙΑ ΜΕΣΑΠΣΤΦΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΠΟΤΔΩΝ ΦΗΜΕΙΑ ΚΑΙ ΣΕΦΝΟΛΟΓΙΑ ΠΟΛΤΜΕΡΩΝ ΔΙΠΛΩΜΑΣΙΚΗ ΕΡΓΑΙΑ ΠΑΡΑΚΕΤΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΣΗ ΝΑΝΟΩΜΑΣΙΔΙΩΝ ΣΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΗ ΦΙΣΟΖΑΝΗ, Ω ΥΟΡΕΙ ΑΠΟΔΕΜΕΤΗ ΥΑΡΜΑΚΩΝ ΣΙΣΟΠΟΤΛΟΤ ΑΛΕΞΑΝΔΡΑ, ΦΗΜΙΚΟ ΤΠΕΤΘΤΝΟ: ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘ. Δ. ΜΠΙΚΙΑΡΗ ΘΕΑΛΟΝΙΚΗ 2014

2 ΑΡΙΣΟΣΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟ ΘΕΑΛΟΝΙΚΗ ΦΟΛΗ ΘΕΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΗΜΩΝ ΣΜΗΜΑ ΦΗΜΕΙΑ ΜΕΣΑΠΣΤΦΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΠΟΤΔΩΝ ΦΗΜΕΙΑ ΚΑΙ ΣΕΦΝΟΛΟΓΙΑ ΠΟΛΤΜΕΡΩΝ ΔΙΠΛΩΜΑΣΙΚΗ ΕΡΓΑΙΑ ΣΙΣΟΠΟΤΛΟΤ ΑΛΕΞΑΝΔΡΑ, ΦΗΜΙΚΟ ΠΑΡΑΚΕΤΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΣΗ ΝΑΝΟΩΜΑΣΙΔΙΩΝ ΣΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΗ ΦΙΣΟΖΑΝΗ, Ω ΥΟΡΕΙ ΑΠΟΔΕΜΕΤΗ ΥΑΡΜΑΚΩΝ εκπονόθηκε ςτο Εργαςτόριο Οργανικόσ Φημικόσ Σεχνολογύασ του Σομϋα Φημικόσ Σεχνολογύασ και Βιομηχανικόσ Φημεύασ του Σμόματοσ Φημεύασ του Αριςτοτελεύου Πανεπιςτημύου Θεςςαλονύκησ ΣΡΙΜΕΛΗ ΕΞΕΣΑΣΙΚΗ ΕΠΙΣΡΟΠΗ Καθηγότρια ΕΙΡΗΝΗ ΙΔΕΡΙΔΟΤ- Μϋλοσ εξεταςτικόσ επιτροπόσ Αναπλ. Καθηγητόσ ΔΗΜΗΣΡΙΟ ΜΠΙΚΙΑΡΗ- Επιβλϋπων Καθηγητόσ Αναπλ. Καθηγητόσ ΔΗΜΗΣΡΙΟ ΑΦΙΛΙΑ-Μϋλοσ εξεταςτικόσ επιτροπόσ Η τριμελόσ εξεταςτικό επιτροπό που ορύςτηκε ςύμφωνα με τη Γ..Ε.., για τη κρύςη τησ Διπλωματικόσ Εργαςύασ τησ Σιτοπούλου Αλεξϊνδρασ, Φημικού, ςυνόλθε ςε ςυνεδρύαςη ςτο Αριςτοτϋλειο Πανεπιςτόμιο Θεςςαλονύκησ την / /2014, όπου παρακολούθηςε την υποςτόριξη τησ εργαςύασ με τύτλο Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων και την ενϋκρινε με βαθμό. 2

3 Συντομογραφύεσ CS: Φιτοζϊνη CBCS: 2-(καρβοξυβενζυλο-χιτοζϊνη) CSUC: ςουκινυλο-χιτοζϊνη XRD: Κρυςταλλογραφύα ακτύνων Φ FTIR: Υαςματοςκοπύα υπερύθρου μεταςχηματιςμού Fourier SEM: Ηλεκτρονικό Μικροςκοπύα ϊρωςησ Δυναμικό κϋδαςη Υωτόσ UV-Vis: Υαςματοςκοπύα υπεριϐδουσ-ορατού ΣΡΡ: Σριπολυφωςφορικό νϊτριο DLS: Δυναμικό ςκϋδαςη φωτόσ Tim: Σιμολόλη 3

4 Περιεχόμενα Περίλθψθ... 6 Πρόλογοσ- Σκοπόσ τθσ εργαςίασ Θεωρθτικό μζροσ Ειςαγωγι Νανοτεχνολογία και φαρμακευτικι τεχνολογία Πολυςακχαρίτεσ Χιτοηάνθ Χθμικι τροποίθςθ χιτοηάνθσ Αλκυλίωςθ Παράγωγα χιτοηάνθσ Καρβοξυβενηυλο-χιτοηάνθ(CBCS) Ν-Σουκινυλο-χιτοηάνθ (CSUC) Νανοςωματίδια χιτοηάνθσ Μζκοδοι παραςκευισ νανοςωματιδίων χιτοηάνθσ Γαλακτωματοποίθςθ και διαςταφρωςθ Συνζνωςθ ςταγονιδίων γαλακτϊματοσ Διάχυςθ διαλφτθ γαλακτϊματοσ Αντίςτροφθ μικυλλίωςθ Ιονοτροπικι πθκτωματοποίθςθ και ςυμπλοκοποίθςθ πολυθλεκτρολφτθ Τροποποιθμζνθ ιονοτροπικι πθκτωματοποίθςθ με ριηικό πολυμεριςμό Αποδιαλυτοποίθςθ Ελεγχόμενθ απελευκζρωςθ φαρμάκων /δραςτικϊν ουςιϊν Γενικά για τθν ελεγχόμενθ αποδζςμευςθ Μθχανιςμοί αποδζςμευςθσ από πολυμερικά υλικά Διάχυςθ Διόγκωςθ-διάχυςθ Αποςφνκεςθ Οφκαλμικι απελευκζρωςθ Γενικά για τθν οφκαλμικι χοριγθςθ φαρμάκων Νανοςωματίδια και οφκαλμικι απελευκζρωςθ Νανοςωματίδια χιτοηάνθσ ςτθν οφκαλμικι απελευκζρωςθ Τιμολόλθ Χριςεισ Φυςικοχθμικζσ και φαρμακολογικζσ ιδιότθτεσ Αντενδείξεισ και ανεπικφμθτεσ ενζργειεσ Βαςικζσ αρχζσ μεκόδων Ηλεκτρονικι Μικροςκοπία

5 1.6.2 Δυναμικι ςκζδαςθ φωτόσ (DLS) Φαςματοςκοπία Υπερφκρου με ανάλυςθ Fourier (FT-IR) Κρυςταλλογραφία Ακτίνων Χ (XRD) Ζλεγχοσ ρυκμοφ διάλυςθσ (Dissolution) Φαςματοςκοπία υπεριϊδουσ/ορατοφ (UV/Vis) Πειραματικό μζροσ Υλικά που χρθςιμοποιικθκαν Tροποποίθςθ χιτοηάνθσ Παραςκευι Καρβοξυβενηυλο-χιτοηάνθσ (CBCS) Παραςκευι Σουκυνιλο-χιτοηάνθσ (CSUC) Παραςκευι νανοςωματιδίων Ενκυλάκωςθ Μελζτθ και χαρακτθριςμόσ νανοςωματιδίων Ηλεκτρονικι Μικροςκοπία Δυναμικι Σκζδαςθ Φωτόσ (DLS) Φαςματοςκοπία υπερφκρου μεταςχθματιςμοφ Fourier (FT-IR) Κρυςταλλογραφία ακτίνων Χ (XRD) Ζλεγχοσ ρυκμοφ διάλυςθσ (Dissolution) Φαςματοςκοπία υπεριϊδουσ-ορατοφ (UV-Vis) Αποτελζςματα και ςυηιτθςθ Χαρακτθριςμόσ τθσ τροποποιθμζνθσ χιτοηάνθσ CBCS CSUC Παραςκευι νανοςωματιδίων DLS SEM Απόδοςθ ςε νανοςωματίδια, ικανότθτα φόρτωςθσ και ενκυλάκωςθσ Χαρακτθριςμόσ των ενκυλακωμζνων νανοςωματιδίων με τιμολόλθ με FT-IR XRD Ζλεγχοσ ρυκμοφ διάλυςθσ Συμπεράςματα Προοπτικζσ τθσ παροφςασ μελζτθσ Βιβλιογραφία

6 Περύληψη Η ανεπαρκόσ οφθαλμικό βιοδιαθεςιμότητα των φαρμϊκων (<1%) από τισ ςυμβατικϋσ οφθαλμικϋσ ςταγόνεσ οφεύλεται κυρύωσ ςτα φυςικϊ εμπόδια του οφθαλμού. ε γενικϋσ γραμμϋσ, η οφθαλμικό αποτελεςματικότητα εύναι ςτενϊ ςυνδεδεμϋνη με οφθαλμικό βιοδιαθεςιμότητα του φαρμϊκου, η οπούα μπορεύ να βελτιωθεύ με αύξηςη τησ διεύςδηςησ του φαρμϊκου ςτον κερατοειδό και παρατεύνοντασ το χρόνο παραμονόσ του. Ωσ εκ τούτου, η παρούςα μελϋτη ϋχει ςκοπό να αναπτύξει και να αξιολογόςει νανοςωματύδια χιτοζϊνησ και τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ με τιμολόλη ωσ ςυςτόματα οφθαλμικόσ ελεγχόμενησ απελευθϋρωςησ. Εκτόσ από τη χιτοζϊνη χρηςιμοποιόθηκαν τα παρϊγωγα τησ Ν- (2-καρβοξυβενζυλο)χιτοζϊνησ και ςουκινιλο-χιτοζϊνησ. Σα νανοςωματύδια παραςκευϊςτηκαν με τη μϋθοδο τησ ιονοτροπικόσ πηκτωματοπούηςησ και επιλϋχθηκαν οι βϋλτιςτεσ αναλογύεσ χιτοζϊνησ/δικτυωτικού μϋςου όπωσ τριπολυφωςφορικού νατρύου (Sodium Tripolyphosphate) (ΣΡΡ). Ακολούθηςε μελϋτη και χαρακτηριςμόσ με DLS, SEM, FT-IR, XRD καθϐσ και ϋλεγχοσ του ρυθμού διϊλυςησ. 6

7 Πρόλογοσ- Σκοπόσ τησ εργαςύασ Η παρούςα μεταπτυχιακό εργαςύα εκπονόθηκε ςτο Εργαςτόριο Οργανικόσ Φημικόσ Σεχνολογύασ του τομϋα Φημικόσ Σεχνολογύασ και Βιομηχανικόσ Φημεύασ του Σμόματοσ Φημεύασ του ΑΠΘ. Θα όθελα να ευχαριςτόςω θερμϊ τον επιβλϋποντα καθηγητό μου κ. Δημότριο Μπικιϊρη, Αναπληρωτό Καθηγητό, για την ευκαιρύα που μου ϋδωςε να αςχοληθϐ με αυτό το θϋμα, για τη ςτόριξη που μου παρεύχε και την εμπιςτοςύνη που μου ϋδειξε, την εναςχόληςη και τισ παρατηρόςεισ του τόςο κατα την διϊρκεια των πειραμϊτων όςο και κατα την ςυγγραφό τησ διπλωματικόσ. Ευχαριςτϐ επύςησ τα ϊλλα δύο μϋλη τησ τριμελούσ εξεταςτικόσ επιτροπόσ την κ. Ειρόνη ιδερύδου, Καθηγότρια Φημεύασ, καθϐσ και τον κ. Δημότριο Αχιλιϊ, Αναπληρωτό Καθηγητό Φημεύασ, για τισ εύςτοχεσ παρατηρόςεισ και διορθϐςεισ τησ που ςυνϋβαλαν ςτη βϋλτιςτη παρουςύα και ολοκλόρωςη τησ διπλωματικόσ αυτόσ εργαςύασ. Θα όθελα ςε αυτό το ςημεύο να αναφϋρω και να ευχαριςτόςω την κ. Ελϋνη Παυλύδου, Αναπληρϐτρια Καθηγότρια του Σμόματοσ Υυςικόσ ΑΠΘ για τισ μικροφωτογραφύεσ SEM και τον κ. Φρόςτο Κουκιϐτη, Φημικό τησ εταιρύασ Λουφϊκησ Φημικϊ Α.Ε. για τισ μετρόςεισ δυναμικόσ ςκϋδαςησ φωτόσ. Επύςησ, θα όθελα να ευχαριςτόςω όλα τα παιδιϊ του εργαςτηρύου για τη βοόθεια τουσ και ιδιαύτερα την υποψόφια διδακτόριςα Πανωραύα ιαφϊκα. Σϋλοσ, θα όθελα να ευχαριςτόςω την Εταιρύα Υαρματϋν Α.Ε. για την χορόγηςη του φαρμϊκου ςτο οπούο ςτηρύχθηκε η όλη μελϋτη. κοπόσ τησ εργαςύασ όταν η παραςκευό νανοςωματιδύων καθαρόσ αλλϊ και τροποποιημϋνησ Φιτοζϊνησ ενθυλακωμϋνων με τιμολόλη ωσ βιοςυμβατϐν και βιοαποικοδομόςιμων νανοφορϋων που θα μπορούν να αποδϐςουν το φορτύο τουσ ανϊλογα με το φυςικοχημικό ερϋθιςμα που δϋχονται από τον οργανιςμό. Για την παραςκευό των νανοςωματιδύων χρηςιμοποιόθηκαν διϊφορεσ αναλογύεσ πολυμερούσ/δικτυωτικού μϋςου. Η χιτοζϊνη ϋχει μελετηθεύ ςαν υποςχόμενοσ οφθαλμικόσ φορϋασ λόγω των βλεννοςυγκολλητικϐν τησ ιδιοτότων, που δημιουργούνται από τισ ηλεκτροςτατικϋσ αλληλεπιδρϊςεισ με τα αρνητικϊ φορτιςμϋνα φορτύα τησ βλϋννασ. Επύςησ η χιτοζϊνη ενιςχύει την διαπερατότητα του κερατοειδούσ παροδικϊ λόγω μύα αλληλεπύδραςησ με δομϋσ ιςχυρϐν ςυνδϋςεων. Επύςησ χρηςιμοποιόθηκαν τα παρϊγωγα τησ χιτοζϊνησ 7

8 όπωσ Ν-(2-καρβοξυβενζυλο)χιτοζϊνη και ςουκινιλο-χιτοζϊνη τα οπούα ϋχουν από μύα καρβοξυλικό ομϊδα αλλϊ διαφορετικό δομό και μϋγεθοσ υποκαταςτϊτη. τόχοσ όταν να μελετηθεύ και η επύδραςη του υποκαταςτϊτη ςτη δυνατότητα παραγωγόσ νανοςωματιδύων. Σο φϊρμακο που επιλϋχθηκε εύναι η τιμολόλη, η οπούα χορηγεύται κυρύωσ ςε μορφό ςταγονϐν για τη θεραπεύα του γλαυκϐματοσ. Μόνο 1-3% των ςταγόνων φτϊνει ςτον ενδοοφθαλμικό ιςτό, με αποτϋλεςμα πολύ χαμηλό βιοδιαθεςιμότητα τησ δραςτικόσ ουςύασ. Αυτϊ τα προβλόματα αναμϋνεται να ξεπεραςτούν με την αξιοπούηςη ςυςτημϊτων ελεγχόμενησ απελευθϋρωςησ δραςτικϐν ουςιϐν. 8

9 1. Θεωρητικό μϋροσ 9

10 1.1 Ειςαγωγό Η πετροχημικό βιομηχανύα και η χρόςη των προώόντων τησ για την παραγωγό πολυμερϐν ϋχει επιφϋρει ςημαντικϊ οφϋλη ςτην ανθρωπότητα. Η διευκρύνιςη τησ δομόσ των πολυμερϐν επϋτρεψε τη μελϋτη τησ επύδραςησ τησ μακρομοριακόσ αλυςύδασ ςτισ ιδιότητεσ και οδόγηςε ςτην παραςκευό ςυνθετικϐν πολυμερϐν με προκαθοριςμϋνεσ ιδιότητεσ, ϐςτε να δημιουργηθούν νϋα υλικϊ για την αντιμετϐπιςη ςυγκεκριμϋνων ειδικϐν αναγκϐν. Σο γεγονόσ αυτό προκϊλεςε επανϊςταςη ςτη ςύγχρονη τεχνολογύα, με την παραςκευό μιασ πληθϐρασ ςυνθετικϐν πολυμερϐν ςε διϊφορεσ μορφϋσ, όπωσ πλαςτικϊ, ύνεσ, ελαςτομερό, επιχρύςματα, κόλλεσ και ιατρικϋσ εφαρμογϋσ όπωσ ςε επαναρροφούμενα χειρουργικϊ ρϊμματα, εμφυτεύματα, ςυςτόματα ελεγχόμενησ χορόγηςησ φαρμϊκων [1] Νανοτεχνολογύα και φαρμακευτικό τεχνολογύα την επιςτόμη και την τεχνολογύα, το πρόθεμα νανο (από την ελληνικό λϋξη νϊνοσ) ςημαύνει 10 9 = Ένα νανόμετρο (nm) ιςούται με ϋνα διςεκατομμυριοςτό του μϋτρου, εύναι δηλαδό δεκϊδεσ χιλιϊδεσ φορϋσ μικρότερο από το πϊχοσ μιασ ανθρϐπινησ τρύχασ. Η νανοεπιςτόμη και η νανοτεχνολογύα εύναι όδη ευρϋωσ διαδεδομϋνη ςε πολλούσ τομεύσ όπωσ τη φυςικό, τη χημεύα, τη βιολογύα και την ιατρικό. Ωσ νανοεπιςτόμη ορύζεται η επιςτόμη που αςχολεύται με τη μελϋτη και τη διαχεύριςη υλικϐν ςε ατομικό, μοριακό και μακρομοριακό επύπεδο [2]. Νανοτεχνολογύα εύναι η κατανόηςη και ο ϋλεγχοσ τησ ύλησ ςε διαςτϊςεισ που κυμαύνονται από νανόμετρα (nm) προσ μύα τουλϊχιςτον κατεύθυνςη, όπου μοναδικϊ φαινόμενα ενεργοποιούν καινοτόμεσ εφαρμογϋσ. Η δυνατότητα παραςκευόσ νανοςωματιδύων και νανοςύνθετων υλικϐν ϋδωςε νϋεσ δυνατότητεσ ςτισ εφαρμογϋσ τουσ. Λόγω των φυςικϐν τουσ ιδιοτότων, τα νανοςωματύδια ϋχουν βρει εφαρμογό ςε καλλυντικϊ, απορρυπαντικϊ, φαρμακευτικϊ ςκευϊςματα, βιοαιςθητότρεσ, περιϋκτεσ τροφύμων, ηλεκτρονικϋσ ςυςκευϋσ κ.ϊ. Σα τελευταύα χρόνια, τα 10

11 νανοςωματύδια χρηςιμοποιούνται ςτην ιατρικό για την παραςκευό νανοφορεϐν φαρμϊκων και τμημϊτων RNA και DNA. Η ανϊπτυξη τησ νανοτεχνολογύασ ϋδωςε νϋεσ δυνατότητεσ ςτην παραςκευό ςκευαςμϊτων ελεγχόμενησ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων καθϐσ και νϋεσ δυνατότητεσ ςχεδιαςμού. Σα νανοςωματύδια ωσ ςυςτόματα αποδϋςμευςησ δραςτικϐν ουςιϐν εύναι φορεύσ, ςτην κλύμακα των νανομϋτρων, που χρηςιμοποιούνται για την αποδϋςμευςη φαρμϊκων χαμηλού μοριακού βϊρουσ ό μακρομορύων. Γενικϊ οι νανο φορεύσ αποτελούνται από ςωματύδια με μϋγεθοσ μικρότερο από 1000 nm και με διϊφορα μορφολογικϊ χαρακτηριςτικϊ, όπωσ νανοςφαύρεσ, νανοκϊψουλεσ, νανολιποςϐματα, κτλ [3,4]. Σα νανοςωματύδια ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ παρουςιϊζουν ςημαντικϊ πλεονεκτόματα: (1) Μπορούν να διαπερϊςουν τα μικρότερα τριχοειδό αγγεύα εξαιτύασ του ιδιαύτερα μικρού τουσ μεγϋθουσ και να αποφύγουν την ταχύτατη απομϊκρυνςη από τα φαγοκύτταρα, ϋτςι η παραμονό τουσ ςτην κυκλοφορύα παρατεύνεται ςημαντικϊ. (2) Μπορούν να διαπερϊςουν τόςο τα κύτταρα όςο και τα κενϊ μεταξύ των οργϊνων και να προςεγγύςουν τουσ ιςτούσ ςτόχουσ και τα επιθυμητϊ όργανα όπωσ το όπαρ, τον ςπλόνα, τον πνεύμονασ, το νωτιαύο μυελό και τη λϋμφο. (3) Μπορούν να παρουςιϊςουν ιδιότητεσ ελεγχόμενησ αποδϋςμευςησ λόγω τησ βιοςυμβατότητϊσ τουσ καθϐσ και τησ ευαιςθηςύασ τουσ ςτο ph, και την θερμοκρα ςύα εξαιτύασ των λειτουργικϐν υλικϐν, που χρηςιμοποιούνται. (4) Μπορούν να βελτιϐςουν ςημαντικϊ την δραςτικότητα των φαρμϊκων που φϋρουν, αφού τα προςτατεύουν ςτο εςωτερικό τουσ, και ταυτόχρονα να ελαττϐςουν τισ πιθανϋσ παρενϋργειεσ [5]. Ωσ ςυςτόματα αποδϋςμευςησ δραςτικϐν ουςιϐν τα νανοςωματύδια μπορούν να ενθυλακϐςουν ςτο εςωτερικό ό να ςυγκρατόςουν ςτην επιφϊνειϊ τουσ, εύτε δραςτικϋσ ουςύεσ χαμηλού μοριακού βϊρουσ εύτε μακρομόρια. Μϋχρι ςόμερα τα νανοςωματύδια ϋχουν χρηςιμοποιηθεύ ευρϋωσ για την απόδοςη φαρμϊκων, πολυπεπτιδύων, πρωτεώνϐν, εμβολύων, νουκλεώκϐν οξϋων, γονιδύων κτλ. Με την πϊροδο των χρόνων τα νανοςωματύδια ϋχουν δεύξει τισ ςημαντικϋσ προοπτικϋσ που μπορούν να ϋχουν ςε διϊφορεσ εφαρμογϋσ ςτο χϐρο τησ βιολογύασ, τησ ιατρικόσ και τησ φαρμακευτικόσ [4]. Επύ του παρόντοσ οι ερευνητϋσ που αςχολούνται με το πεδύο των νανοςωματιδύων ωσ 11

12 ςυςτημϊτων αποδϋςμευςησ επικεντρϐνονται κυρύωσ ςτισ παρακϊτω κατευθύνςεισ: (1) ςτην επιλογό και τον κατϊλληλο ςυνδυαςμό των υλικϐν των φορϋων αυτϐν προκειμϋνου να επιτευχθεύ κατϊλληλη ταχύτητα αποδϋςμευςησ του ενεργού ςυςτατικού, (2) ςτην κατϊλληλη τροποπούηςη τησ επιφϊνειασ αυτϐν των φορϋων προκειμϋνου να βελτιωθεύ η ικανότητα ςτόχευςόσ τουσ, (3) ςτην βελτιςτοπούηςη τησ διαδικαςύασ παραςκευόσ νανοςωματιδύων, προκειμϋνου να βελτιωθεύ η ικανότητα αποδϋςμευςησ, η εφαρμογό τουσ ςτην κλινικό πρϊξη και η δυνατότητα παραγωγόσ τουσ ςε εργοςταςιακό κλύμακα, (4) ςτη διερεύνηςη τησ in vivo δυναμικόσ τουσ να αλληλεπιδρούν με ςυγκεκριμϋνα ςτοιχεύα του αύματοσ, με ιςτούσ ςτόχουσ καθϐσ και με όργανα. Σα πολυμερικϊ υλικϊ που χρηςιμοποιούνται για την παραςκευό νανοςωματιδύων θα πρϋπει να εύναι τουλϊχιςτον, βιοςυμβατϊ και ιδανικϊ, βιοαποικοδομόςιμα. Προσ την κατεύθυνςη αυτό ϋχουν χρηςιμοποιηθεύ κατϊ καιρούσ διϊφορα πολυμερικϊ υλικϊ. Μεταξύ αυτϐν το πολυ(γαλακτικό οξύ), το πολυ(γλυκολικό οξύ), η πολυκαπρολακτόνη, διϊφοροι πολυςακχαρύτεσ και ιδιαύτερα η χιτοζϊνη. Μεταξύ αυτϐν των υλικϐν, οι πολυςακχαρύτεσ αποτελούν τα πιο δημοφιλό και διαδεδομϋνα υλικϊ για την δημιουργύα νανοςωματιδύων και την εφαρμογό τουσ ωσ ςυςτόματα αποδϋςμευςησ. 12

13 1.2 Πολυςακχαρύτεσ Οι πολυςακχαρύτεσ εύναι τα πολυμερό των μονοςακχαριτϐν. τη φύςη, οι πολυςακχαρύτεσ ϋχουν διϊφορεσ πηγϋσ αλγινικόσ προϋλευςησ, φυτικόσ προϋλευςησ (π.χ. πηκτύνη, κόμμι γκουϊρ), μικροβιακόσ προϋλευςησ (π.χ. δεξτρϊνη, κόμμι ξανθϊνησ), και ζωικόσ προϋλευςησ (χιτοζϊνη, χονδροώτύνη) [6]. Οι πολυςακχαρύτεσ ϋχουν ϋναν μεγϊλο αριθμό δραςτικϐν ομϊδων, μεγϊλο εύροσ μοριακϐν βαρϐν, διϊφορεσ χημικϋσ ςυςτϊςεισ, που ςυνειςφϋρουν ςτην ποικιλομορφύα των δομϐν και ιδιοτότων τουσ. Η χημικϋσ δομϋσ των πιο ςυνηθιςμϋνων πολυςακχαριτϐν και των ςημαντικότερων παραγϐγων τησ χιτοζϊνησ παρουςιϊζονται ςτον Πύνακα 1.1. Πύνακασ 1.1: Φημικϋσ δομϋσ πολυςακχαριτϐν Φιτοζϊνη Φιτύνη Ταλουρονικό οξύ Ηπαρύνη Θειικό χονδροώτύνη 13

14 Πηκτύνη Πουλλουλϊνη Αμυλόζη Κυκλοδεξτρύνη Καρβοξυμεθυλο χιτοζϊνη Ν-(2- καρβοξυβενζυλο) χιτοζϊνη Ν-ςουκινιλο χιτοζϊνη Από την οπτικό γωνύα των πολυηλεκτρολυτϐν, οι πολυςαχκαρύτεσ κατατϊςςονται ςε πολυηλεκτρολύτεσ και μη-πολυηλεκτρολύτεσ, και οι πολυηλεκτρολύτεσ χωρύζονται περαιτϋρω ςε θετικϊ φορτιςμϋνουσ 14

15 πολυςακχαρύτεσ (χιτοζϊνη) και αρνητικϊ φορτιςμϋνουσ πολυςακχαρύτεσ (αλγινικό οξύ, ηπαρύνη, υαλουρονικό οξύ, πηκτύνη) [7]. Λόγω τησ παρουςύασ διϊφορων ομϊδων ςτισ μακρομοριακϋσ τουσ αλυςύδεσ, οι πολυςακχαρύτεσ μπορούν να τροποποιηθούν εύκολα χημικϊ και βιοχημικϊ, δύνοντασ ϋτςι διϊφορα εύδη παραγϐγων πολυςακχαριτϐν. Ωσ φυςικϊ βιοώλικϊ, οι πολυςακχαρύτεσ εύναι πολύ ςταθερού, μη-τοξικού, υδρόφιλοι και βιοαποικοδομόςιμοι. Οι πόροι τουσ ςτην φύςη εύναι ϊφθονοι και η επεξεργαςύα τουσ ϋχει χαμηλό κόςτοσ. Οι περιςςότεροι φυςικού πολυςακχαρύτεσ ϋχουν υδρόφιλεσ ομϊδεσ όπωσ υδροξύλια, καρβοξύλια και αμινομϊδεσ, οι οπούεσ μπορούν να ςχηματύζουν μη-ομοιοπολικούσ δεςμούσ με βιολογικούσ ιςτούσ,κυρύωσ επιθόλια και τουσ βλεννογόνουσ, ςχηματύζοντασ βιοπροςκόλληςη [8]. Για παρϊδειγμα, η χιτοζϊνη, το ϊμυλο, το αλγινικό οξύ εύναι καλϊ βιοςυγκολλητικϊ υλικϊ. Οι φορεύσ νανοςωματιδύων από βιοςυγκολητικούσ πολυςακχαρύτεσ θα μπορεύ να αυξόςουν το χρόνο παραμονόσ και ςυνεπϐσ την απορρόφηςη των φορτωμϋνων φαρμϊκων. Όλα αυτϊ τα πλεονεκτόματα δύνουν ςτουσ πολυςακχαρύτεσ ϋνα πολλϊ υποςχόμενο μϋλλον ωσ βιοώλικϊ. Για την εφαρμογό των εν λόγω φυςικϐν πολυςακχαριτϐν ωσ φορεύσ φαρμϊκων, ζητόματα αςφϊλειασ, τοξικότητασ και διαθεςιμότητασ ϋχουν απλοποιηθεύ ςε μεγϊλο βαθμό. Σα τελευταύα χρόνια, ϋνασ μεγϊλοσ αριθμόσ μελετϐν ϋχουν διεξαχθεύ ςε πολυςακχαρύτεσ και τα παρϊγωγϊ τουσ για την πιθανό εφαρμογό τουσ ωσ νανοφορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων [6,9,10] Χιτοζϊνη Η χιτοζϊνη, πολυ(β-(1 4)-D-γλυκοζαμύνη, εύναι ϋνα ςυμπολυμερϋσ τησ γλυκοζαμύνησ και τησ Ν-ακετυλο γλυκοζαμύνησ που προϋρχονται από το φυςικό πολυμερϋσ χιτύνη (χόμα 1.1). Η χιτύνη εύναι μύα πολυ(ν-ακετυλογλυκοζαμύνη) και μπορεύ να αποκτηθεύ ςε μη καθαρό μορφό κυρύωσ από καβούρια και κελύφη γαρύδων. Πρόκειται για ϋνα βιοπολυμερϋσ το οπούο ςυντύθεται από ϋνα τερϊςτιο αριθμό ζωντανϐν οργανιςμϐν και μόνο η κυτταρύνη βρύςκεται ςε μεγαλύτερη αφθονύα. Η χιτύνη απαντϊται ςτη φύςη ςε υψηλϐσ διατεταγμϋνεσ κρυςταλλικϋσ μικροινϐδεισ δομϋσ και αποτελεύ δομικό ςυςτατικό των εξωςκελετϐν και αρθρόποδων και των κυτταρικϐν τοιχωμϊτων διϊφορων μυκητϐν και ζυμϐν. 15

16 χόμα 1.1: Φιτύνη και αποακετυλύωςη, υδρόλυςη Για την παραςκευό τησ χιτοζϊνησ, η χιτύνη αποακετυλιϐνεται υπό βαςικϋσ ςυνθόκεσ και δύνει μύα ςυμπολυμερικό αλυςύδα με διϊφορεσ αναλογύεσ γλυκοςυλαμύνησ και Ν-ακετυλογλυκοςιλαμύνησ. Η αποακετυλύωςη γύνεται υπό ιςχυρϊ αλκαλικϋσ ςυνθόκεσ ό με ενζυμικό υδρόλυςη παρουςύα του ενζύμου χιτινικό αποακεταλϊςη. Όταν ο βαθμόσ αποακετυλύωςησ τησ χιτύνησ γύνει πϊνω από 50%, η χιτύνη ονομϊζεται χιτοζϊνη και καθύςταται διαλυτό ςε όξινα διαλύματα. Η διαλυτοπούηςη ςυμβαύνει με πρωτονύωςη των αμινομϊδων των επαναλαμβανόμενων δομικϐν μονϊδων τησ γλυκοζαμύνησ, οπότε και ο πολυςακχαρύτησ μετατρϋπεται ςε πολυηλεκτρολύτη. Οι ςυνηθιςμϋνεσ χιτοζϊνεσ ϋχουν το 70 ϋωσ 90% των επαναλαμβανόμενων ομϊδων αποακετυλιωμϋνεσ. Η χιτοζϊνη εύναι το μοναδικό ψευδο-φυςικό πολυμερϋσ ςτον κόςμο και για αυτό το λόγο βρύςκει πολλϋσ εφαρμογϋσ που βαςύζονται ςτο μοναδικό αυτό χαρακτηριςτικό τησ. Μύα ςημαντικό πρόκληςη ςτην παραγωγό τησ χιτοζϊνησ εύναι ο καθαριςμόσ τησ για ϋνα επαρκϐσ χαμηλό επύπεδο ενδοτοξινϐν, ϋτςι ϐςτε να εύναι κατϊλληλη για βιολογικϋσ και φαρμακευτικϋσ εφαρμογϋσ. Η χιτοζϊνη υψηλόσ καθαρότητασ ϋχει καλό ςυμβατότητα και χαμηλό τοξικότητα, εύναι διαλυτό ςε όξινα διαλύματα λόγω ιονιςμού των αμινομϊδων των επαναλαμβανόμενων δομικϐν μονϊδων τησ γλυκοζαμύνησ, ενϐ εύναι αδιϊλυτη ςε υψηλότερεσ τιμϋσ ph (>4,5) λόγω αποπρωτονύωςησ των αμινϐν. Η χιτοζϊνη μπορεύ να υδρολυθεύ από λυςοζύμεσ, και η αποικοδόμηςη τησ μπορεύ να ελεγχθεύ αλλϊζοντασ 1) την αναλογύα γλυκοζαμύνησ/ν-ακυλο 16

17 γλυκοζαμύνησ, 2) το μόκοσ τησ πλευρικόσ ακυλομϊδασ και 3) το μοριακό βϊροσ. Έχει επύςησ αναφερθεύ ότι η αποικοδόμηςη των προώόντων τησ καθαρόσ χιτοζϊνησ δεν εύναι τοξικϊ, ανοςογόνα ό καρκινογόνα. Σο ενδιαφϋρον για βιοιατρικϋσ και φαρμακευτικϋσ εφαρμογϋσ τησ χιτοζϊνησ ξεκύνηςε κατϊ την δεκαετύα του 1980 και τισ αρχϋσ τησ δεκαετύασ του Με την διϊθεςη νϋων ςτοιχεύων για την βιοςυμβατότητα, η χιτοζϊνη ερευνόθηκε περαιτϋρω τα τελευταύα 20 χρόνια ωσ εξαύρετο βιοαποικοδομόςιμο υλικό για αυτϋσ τισ εφαρμοφϋσ καθϐσ και ςτην ιςτομηχανικό [11]. Η χιτοζϊνη εύναι κατιονικό πολυμερϋσ με pk περύπου 6,3. Έχει την ικανότητα να ςχηματύζει πολυηλεκτρολύτεσ, ενϐ η ικανότητα τησ να δύνει φιλμ με πολύ καλϋσ μηχανικϋσ ιδιότητεσ εύναι αξιοςημεύωτη [12-14]. Ο κατιονικόσ χαρακτόρασ τησ χιτοζϊνησ εύναι μοναδικόσ. Η ικανότητα ςχηματιςμού φιλμ και η βιολογικό τησ δραςτιριότητα την καθιςτϊ κατϊλληλη για μεγϊλο αριθμό εφαρμογϐν (Πύνακασ 1.2). 17

18 Πύνακασ 1.2: Εφαρμογϋσ τησ χιτοζϊνησ Πεδύο Βιοώατρικό Βιοφαρμακευτικό Προςωπικό υγιεινό/καλλωπιςμόσ Επεξεργαςύα λυμϊτων Τρόφιμα Γεωργύα Εφαρμογό Ελεγχόμενη αποδϋςμευςη δραςτικϐν ουςιϐν Φειρουργικϊ ρϊμματα Οδοντικϊ μοςχεύματα Σεχνητό δϋρμα Επανοικοδόμηςη κοκκϊλου Υακού επαφόσ κερατοειδούσ Ανοςοποιητικό Αντικαρκινικό Βακτηριοςτατικό Αιμοςτατικό Αντιθρομβωτικό Ενυδϊτωςη δϋρματοσ Αντιμετϐπιςη ακμόσ Βελτύωςη ελαςτικότητασ μαλλιϐν Μεύωςη ςτατικού ηλεκτριςμού μαλλιϐν τοματικό φροντύδα Κροκιδωτικό για τον καθαριςμό νερού Απομϊκρυνςη μεταλλικϐν ιόντων Απομϊκρυνςη οςμϐν Υυςικό δϋςμευςη λιπιδύων Διαιτητικό ύνα υντηρητικό Παχυντικό μϋςο και ςταθεροποιητόσ ςαλτςϐν Μυκητοςτατικϋσ και αντιβακτηριακϋσ ςυςκευαςύεσ φρούτων Ενύςχυςη αμυντικϐν μηχανιςμϐν ςτα φυτϊ Τποκύνηςη ανϊπτυξησ φυτϐν Επύςτρωςησ ςπόρων για προςταςύα από παγετό Ελεγχόμενη απελευθϋρωςη λιπαςμϊτων και θρεπτικϐν ςυςτατικϐν ςτο ϋδαφοσ 18

19 1.2.2 Χημικό τροπούηςη χιτοζϊνησ Η χιτοζϊνη εύναι διαλυτό μόνο υπό όξινεσ ςυνθόκεσ, γεγονόσ που περιορύζει τισ εφαρμογϋσ τησ. Η περιοριςμϋνη διαλυτότητα τησ χιτοζϊνησ μπορεύ να ξεπεραςτεύ με χημικό τροποπούηςη. Οι χημικϋσ τροποποιόςεισ τησ χιτοζϊνησ γενικϊ βελτιϐνουν την δυνατότητα επεξεργαςύασ τησ καθϐσ και την διαλυτότητα, την αντιμικροβιακό δραςτικότητα και την ικανότητα να αλληλεπιδρϊ με ϊλλεσ ουςύεσ [15]. Η χιτοζϊνη ςτην πρωτονιωμϋνη τησ μορφό διευκολύνει την παρακυτταρικό μεταφορϊ υδρόφιλων φαρμϊκων ςυνδιϊζοντασ την βιοπροςκόλληςη και μια παροδικό διεύρυνςη των ςτενϐν ςυνδϋςεων ςτην μεμβρϊνη, αλλϊ δεν απορροφεύται ςε πιο βαςικϋσ ςυνθόκεσ. Η ανϊγκη για τροποπούηςη τησ χιτοζϊνησ προϋρχεται από την ανϊγκη για παρϊγωγα με αυξημϋνη διαλυτότητα, ιδύωσ ςε ουδϋτερα και βαςικϊ ph. Σο μόριο τησ χιτοζϊνησ προςφϋρει εξαιρετικϋσ δυνατότητεσ χημικόσ τροποπούηςησ καθϐσ περιϋχει πληθϐρα δραςτικϐν ομϊδων, δηλαδό μύα πρωτοταγό αμινομϊδα, καθϐσ και μύα πρωτοταγό και μύα δευτεροταγό υδροξυλομϊδα, όπωσ φαύνεται ςτο χόμα 1.2. χόμα 1.2: Δραςτικϋσ ομϊδεσ ςτην επαναλαμβανόμενη μονϊδα τησ χιτοζϊνησ Κανονικότερα και πιο αναπαραγϐγιμα παρϊγωγα μπορούν να ληφθούν με χρόςη χιτοζϊνησ πολύ υψηλού βαθμού αποακετυλύωςησ [13]. Έχουν πραγματοποιηθεύ και μελετηθεύ πολλϋσ αντιδρϊςεισ χημικόσ τροποπούηςησ τησ χιτοζϊνησ, όπωσ αλκυλύωςη, ακυλύωςη, υδροξυαλκυλύωςη, 19

20 εμβολιαςμού που ειςϊγουν επιλεγμϋνεσ δραςτικϋσ ομϊδεσ ςτην μακρομοριακό αλυςύδα Αλκυλύωςη Η χιτοζϊνη μπορεύ να τροποποιηθεύ χημικϊ με εμβολιαςμό αλκυλομϊδων ςτην αλυςύδα τησ. Η αναγωγικό αλκυλύωςη εύναι η πιο αξιόπιςτη μϋθοδοσ για την εκλεκτικό ειςαγωγό αλκυλομϊδων ςτην αμινομϊδα τησ χιτοζϊνησ. αυτό τη περύπτωςη, η χιτοζϊνη αντιδρϊ με μύα αλδεϗδη ό κετόνη και παρϊγεται μύα ιμύνη (βϊςη του Schiff) η οπούα μετατρϋπεται ςε Ν-αλκυλοπαρϊγωγο με αναγωγό με NaBH4 ό NaBH3CN (χόμα 1.3), ό ακολουθεύ αντύδραςη με αλκυλαλογονύδια. Κϊποια από αυτϊ τα υλικϊ, όπωσ η υδρόφοβα τροποποιημϋνη χιτοζϊνη, ανόκοτν ςτην τϊξη των προςεταιριςτικϐν πολυμερϐν. Εύναι μη υδατοδιαλυτϊ πολυμερό που περιϋχουν μικρό ποςοςτό υδρόφοβων ομϊδων ςτην κύρια αλυςύδα τουσ. ε υδατικϊ μϋςα, εμφανύζουν διαμοριακούσ ό ενδομοριακούσ δεςμούσ που προςδύδουν ϋνα τριςδιϊςτατο δύκτυο, όπωσ μύα φυςικό γϋλη, με αυξημϋνο ιξϐδεσ. Ωςτόςω, αυτϋσ οι υδρόφοβεσ αλληλεπιδρϊςεισ ςυναγωνύζοται με ηλεκτροςτατικϋσ απϐςεισ. ε τϋτοια ςυςτόματα ςχηματύζονται ςυςςωματϐματα και δρουν ωσ αναςτρϋψιμεσ διαςταυρϐςεισ μεταξύ των πολυμερικϐν αλυςύδων [16]. χόμα 1.3: Αλκυλύωςη χιτοζϊνησ με αλδεϗδη ακολουθούμενη από αναγωγό την περύπτωςησ αντύδραςησ με αλκυλαλογονύδια, οι αλκυλομϊδεσ ειςϊγονται ςτο ϊζωτο τησ αμινομϊδασ και ςτα οξυγόνα των υδροξυλομϊδων με προτύμηςη ςτο πρωτοταγϋσ, με ςχηματιςμό Ν,Ο- αλκυλοπαραγϐγων. Με την επιλογό κατϊλληλων ςυνθηκϐν εύναι δυνατόσ ο ϋλεγχοσ του προώόντοσ. Με την προςθόκη χλωροοξικού οξϋοσ ςτην χιτοζϊνη ςε ιςχυρϊ αλκαλικό περιβϊλλον παρϊγεται ωσ κύριο προώόν το Ο-παρϊγωγο, ενϐ ςε μεθανολικό διϊλυμα λαμβϊνεται το Ν-παρϊγωγο όπωσ φαύνεται ςτο χόμα 1.4 [17]. 20

21 χόμα 1.4: Αλκυλύωςη χιτοζϊνησ προσ Ο- και Ν- παρϊγωγο Μύα πολύ ςημαντικό αντύδραςη αλκυλύωςησ τησ χιτοζϊνησ εύναι η καρβοξυμεθυλύωςη. Σα πολυμερό με καρβοξύλια ωσ δραςτικϋσ ομϊδεσ ϋχουν ϋνα μεγϊλο εύροσ βιολογικϐν δραςτηριοτότων. Σα πολυμερό με την ομϊδα NH- CH2-COOH, όπωσ η Ν-καρβοξυμεθυλο-, Ν,Ο- καρβοξυμϋθυλο- και Ν-ςουκκύνιλοχιτοζϊνη, ϋχουν καλό ικανότητα χηλικόσ ςύμπλεξησ λόγω τησ παρουςύασ επιπρόςθετων λειτουργικϐν ομϊδων. Σα ςημαντικότερα καρβοξυμϋθυλοπαρϊγωγα τησ χιτοζϊνησ εύναι τα: Ο-καρβοξυμεθυλο χιτοζϊνη, Ν,Οκαρβοξυμεθυλο χιτοζϊνη, Ν-καρβοξυμεθυλο χιτοζϊνη, και Ν-ςουκκινιλο χιτοζϊνη. Νανοςωματύδια αυτϐν των καρβοξυμεθυλιωμϋνων χιτοζανϐν ϋχουν παραχθεύ μϋςω απλϐν χημικϐν αντιδρϊςεων για διϊφορεσ εφαρμογϋσ όπωσ ελεγχόμενη απελευθϋρωςη φαρμϊκων [15]. 21

22 χόμα 1.5: Αντιδρϊςεισ καρβοξυμεθυλύωςησ τησ χιτοζϊνησ [18] Παρϊγωγα χιτοζϊνησ Σα καρβοξυλιωμϋνα παρϊγωγα τησ χιτοζϊνησ παρουςιϊζουν αυξημϋνη διαλυτότητα ςτο νερό και ςε ϊλλουσ ςχετικούσ διαλύτεσ, γεγονόσ που τα κϊνει πολλϊ υποςχόμενουσ υποψόφιουσ για την απελευθϋρωςη πολλϐν φαρμϊκων που εύναι κατϊ τα ϊλλα ελϊχιςτα διαλυτϊ, βελτιϐνοντασ ϋτςι τον ρυθμό διαλυτοπούηςησ τουσ και την βιοδιαθεςιμότητα. Οι αντιβακτηριακϋσ τουσ ιδιότητεσ εύναι επύςησ βελτιωμϋνεσ ςε ςχϋςη με την χιτοζϊνη, ανούγοντασ ϋτςι τον δρόμο για εφαρμογϋσ που ςχετύζονται με την επούλωςη πληγϐν. Όςον αφορϊ την ιςτομηχανικό, ιδιότητεσ όπωσ η δυνατότητα δημιουργύασ βιοϗλικϐν με προβλϋψιμο μϋγεθοσ πόρων και την δυνατότητα πρόςδεςησ με ανιονικϊ μόριο όπωσ αυξητικούσ παρϊγοντεσ, ϋχουν ωσ αποτϋλεςμα την διερυμϋνη μελϋτη των καρβοξυλιωμϋνων παραγϐγων τησ χιτοζϊνησ ωσ βιοϗλικϊ. Λόγω τησ αυξημϋνησ ικανότητασ ςυγκρϊτηςησ υγραςύασ, τησ βελτιωμϋνησ 22

23 αντιμικροβιακόσ δρϊςησ, τησ αντιοξειδωτικόσ ικανότητασ, την βιοςυμβατότητα και βιοαποικοδομηςιμότητα, τα καρβοξυλιωμϋνα παρϊγωγα τησ χιτοζϊνησ ϋχουν μελετηθεύ ωσ υδρογϋλεσ, βιοαιςθητόρεσ, ςε εφαρμογϋσ βιο-απεικόνιςησ και γονιδιακόσ θεραπεύασ, ςτην ελεγχόμενη απελευθϋρωςη φαρμακευτικϐν ουςιϐν [18] Καρβοξυβενζυλο-χιτοζϊνη(CBCS) Η Ν-(2-καρβοξυβενζυλο) χιτοζϊνη εύναι ϋνα παρϊγωγο τησ χιτοζϊνησ ευαύςθητο ςτισ αλλαγϋσ του ph, και παρϊγεται με την αντύδραςη καρβοξυβενζαλδεϗδησ ακολουθούμενη από αναγωγό του ιμινικού παραγϐγου. Σο ιμινικό παρϊγωγο μπορεύ εύτε να απομονωθεύ εύτε όχι, και να αναχθεύ παρουςύα τησ καρβοξυβενζαλδεϗδησ που δεν ϋχει αντιδρϊςει, οδηγϐντασ ςε μη ξεκϊθαρη χημικό δομό του τελικού προώόντοσ, αλλϊ ςε μύγμα μονο- και διυποκατεςτημϋνων παραγϐγων. Καθϐσ οι φυςικοχημικϋσ και βιολογικϋσ ιδιότητεσ του πολυμερούσ εξαρτϐνται από τη δομό του, για την χρόςη τησ CBCS ςε βιοώατρικϋσ εφαρμογϋσ, η ακριβόσ δομό τησ πρϋπει να εύναι γνωςτό. χόμα 1.6: αντύδραςη παραγωγόσ CBCS Εϊν η CBCS ςυντεθεύ από την αναγωγό του απομονωμϋνουν ιμινικού ενδιϊμεςου εύναι δυνατό να ελεγχθεύ η επύδραςη ςυνθηκϐν όπωσ χρόνοσ, θερμοκραςύα, ςτην διαλυτότητα και τον βαθμό υποκατϊςταςησ τησ ενδιϊμεςησ ιμύνησ και του τελικού προώόντοσ. 23

24 Ν-ουκινυλο-χιτοζϊνη (CSUC) Η Ν-ςουκινυλο-χιτοζϊνη παρϊγεται με την ειςαγωγό ςουκινικϐν ομϊδων ςτην Ν- θϋςη των γλυκοζαμινικϐν μονϊδων. Εύναι διαλυτό ςτο νερό, ϋχει χαμηλό τοξικότητα και εύναι λιγότερο βιοαποικοδομόςιμη ςτο ςϐμα. Μπορεύ να αξιοποιηθεύ ωσ φορϋασ φαρμακευτικϐν ουςιϐν με μακροχρόνια παραμονό ςτο ςϐμα [19]. Εμφανύζει πολλϋσ βιολογικϋσ ιδιότητεσ, όπωσ καλό διαλυτότητα ςε διϊφορα ph, βιοςυμβατότητα και μεγϊλη ςυςτημικό κυκλοφορύα ςε ποντύκια, και η μϋγιςτη ανεκτό δόςη ενδοπεριτοναώκόσ ενϋςεωσ ςε ποντύκια εύναι μεγαλύτερη από 2g/kg. Γι αυτούσ τουσ λόγουσ, ϋχει εφαρμοςτεύ ωσ φορϋασ απελευθϋρωςησ φαρμϊκων όπωσ μικροςφαιρύδια και ςφαιρύδια υδρογϋλησ και ωσ φορϋασ απελευθϋρωςησ γονιδύων, αλλϊ και ωσ ενιςχυτικό τησ διαπερατότητασ των βλεννογόνων [20]. Λόγω τησ παρουςύασ καρβοξυλομϊδων ϋχει διογκωτικό ςυμπεριφορϊ που εξαρτϊται από το ph και εύναι αδιϊλυτη ςε όξινεσ ςυνθόκεσ. Παρουςιϊζει βλεννοςυγκολητικϋσ ιδιότητεσ λόγω τησ υδροφιλύασ τησ που οδηγεύ ςε ςχηματιςμό δεςμϐν υδρογόνου και επαρκό ευκαμψύα τησ πολυμερικόσ τησ αλυςύδασ. Ακόμα, ωσ αρνητικϊ φορτιςμϋνο πολυμερϋσ προςκολλϊται εύκολα ςε φλεγμονϐδεισ ιςτούσ λόγω του μεγϊλου αριθμού θετικϊ φορτιςμϋνων πρωτεώνϐν ςτουσ ελκϐδεισ ιςτούσ [21]. Βρύςκει επύςησ εφαρμογϋσ ςε καλλυντικϋσ ουςύεσ. χόμα 1.7: Ν-ςουκινυλο-χιτοζϊνη Η παραςκευό τησ Ν-ςουκινυλο-χιτοζϊνησ γύνεται με μύα απλό αντύδραςη μεταξύ χιτοζϊνησ και ςουκινικού ανυδρύτη [20,22-25]. Ο βαθμόσ τησ υποκατϊςταςησ μπορεύ να μεταβληθεύ εύκολα αλλϊζοντασ τισ ςυνθόκεσ τησ αντύδραςησ. 24

25 χόμα 1. 8: Αντύδραςη παραςκευόσ Ν-ςουκινυλο-χιτοζϊνησ Πολλού ερευνητϋσ ϋχουν εςτιϊςει ςτην εφαρμογό τησ Ν-ςουκινυλοχιτοζϊνησ ωσ φορϋασ φαρμακευτικϐν ουςιϐν για χημειοθεραπεύεσ. Διαθϋτει πολλϋσ δραςτικϋσ ομϊδεσ, αμινομϊδεσ, καρβοξυλομϊδεσ καθϐσ και πρωτοταγεύσ και δευτεροταγεύσ καρβοξυλομϊδεσ, και η δομό αυτό επιτρϋπει ςτην Ν- ςουκινυλο-χιτοζϊνη να παρουςιϊζει χηλύωςη με διϊφορα ιόντα μετϊλλων [23]. 25

26 1.3 Νανοςωματύδια χιτοζϊνησ Πολλϊ βιομόρια, αν και εύναι πολλϊ υποςχόμενα ςαν θεραπευτικϊ μϋςα, χαρακτηρύζονται από μύα αςτϊθεια λόγω των φυςικοχημικϐν και βιοφαρμακευτικϐν τουσ ιδιοτότων που κϊνουν την χορόγηςη τουσ εξαιρετικϊ δύςκολη. Αυτόσ εύναι ο κύριοσ λόγοσ για τον οπούο η παρεντερικό χορόγηςη εύναι ςυνόθωσ η μοναδικϊ επιλογό. Αυτόσ ο δρόμοσ δύςκολα γύνεται δεκτόσ από τουσ αςθενεύσ καθϐσ εύναι επιθετικόσ και επύπονοσ, και οδηγεύ ςε θεραπευτικό αδιαλλαξύα. Η εύρεςη εναλλακτικϐν λύςεων εύναι μύα μεγϊλη επιςτημονικό πρόκληςη και οι επιςτόμονεσ ϋχουν επικεντρϐςει τισ προςπϊθειεσ τουσ ςτον ςχεδιαςμό κατϊλληλων ςυςτημϊτων χορόγηςησ φαρμϊκων που θα επιτρϋπουν την μη επεμβατικό χορόγηςη μϋςω των βλεννογόνων. Αυτού οι φορεύσ θα πρϋπει να ϋχουν κϊποιεσ ιδιότητεσ όπωσ: ικανότητα ςύνδεςησ με το φϊρμακο, ικανότητα ενύςχυςησ τησ φυςικοχημικόσ ςταθερότητασ και προςταςύα των ενθυλακωμϋνων φαρμϊκων από την ενθυλϊκωςη ωσ την απελευθϋρωςη. ε πολλϋσ περιπτϐςεισ οι φορεύσ αναμϋνεται να ρυθμύζουν το προφύλ απελευθϋρωςησ του φαρμϊκου [26]. Σα νανοςωματύδια ϋχουν προςελκύςει πολλό μεγϊλη προςοχό από την φαρμακευτικό επιςτημονικό κοινότητα, όςον αφορϊ το ςύςτημα αποδϋςμευςησ φαρμϊκου, λόγω τησ προςαρμοςτικότητϊσ του φαρμϊκου ςτη ςτοχοπούηςη ιςτϐν, τησ πρόςβαςησ ςε βαθιϊ μοριακούσ ςτόχουσ και τον ϋλεγχο ςτην απελευθϋρωςη του φαρμϊκου. Σα νανοςωματύδια εύναι ςτερεού κολλοειδεύσ μεταφορεύσ φαρμϊκων, που κυμαύνονται από 10 ϋωσ nm ςε διϊμετρο και αποτελούνται από ςυνθετικϊ, φυςικϊ ό ημι-ςυνθετικϊ πολυμερό, τα οπούα ενθυλακϐνουν τα μόρια του φαρμϊκου. Σα νανοςωματύδια χιτοζϊνησ, λόγω τησ βιοδιαςπαςιμότητασ, τησ βιοςυμβατότητασ, τισ εύκολεσ τεχνικϋσ ςύνθεςησ τουσ και την ευελιξύα ςτην εφαρμογό, ςε ςυνδυαςμό και με την χαμηλό τοξικότητα, προςφϋρουν οριςμϋνα πλεονεκτόματα ςε ςχϋςη με ϊλλουσ, μεταξύ τησ πληθϐρασ πολυμερικϐν φορϋων για την νανοςωματιδιακό αποδϋςμευςη φαρμϊκου. Σα νανοςωματύδια χιτοζϊνησ αποτελούν ϋνα πολλϊ υποςχόμενο όχημα για την ςτοματικό χορόγηςη θεραπευτικϐν μακρομορύων. ε μορφό χαπιού η χιτοζϊνη μπορεύ να μειϐςει την απορρόφηςη λιπϐν και χοληςτερόλησ. Εκτόσ 26

27 απ τη προςταςύα που προςφϋρουν ςτισ φορτωμϋνεσ θεραπευτικϋσ ουςύεσ ενϊντια ςτην όξινη μετουςύωςη και ςτην ενζυμικό αποικοδόμηςη, τα νανοςωματύδια χιτοζϊνησ εμφανύζουν βλεννοπρόςφυςη, ικανό να παρατεύνει τον χρόνο παραμονόσ τουσ ςτο λεπτό ϋντερο. Επιπλϋον, μπορούν να μεςολαβόςουν ςτο ϊνοιγμα των ςφικτϐν ςυνδϋςμων μεταξύ των επιθηλιακϐν κυττϊρων αναςτρϋψιμα, διευκολύνοντασ ϋτςι την παρακυτταρικό μεταφορϊ υδρόφιλων μακρομορύων. Έτςι πολλϋσ μελϋτεσ ϋχουν επικεντρωθεύ ςτην χρόςη νανοςωματιδύων με βϊςη την χιτοζϊνη για την βελτύωςη τησ ςτοματικόσ βιοδιαθεςιμότητασ μακρομοριακϐν παραγόντων [27-30]. Πρόςφατεσ μελϋτεσ ϋχουν αναδεύξει ότι η βλεννοπροςκόλληςη τησ χιτοζϊνησ και η δυνατότητα να ανούγει ςφιχτούσ ςυνδϋςμουσ εξαρτϐνται πολύ από τον βαθμό πρωτονύωςησ τησ. Η τιμό τησ pka των αμινομϊδων τησ εύναι περύπου 6,5 κι ϋτςι η χιτοζϊνη εύναι πρωτονιωμϋνη και ςυνεπϐσ διαλυτό ςε όξινο ph, αλλϊ ςυςςωματϐνεται ςε ουδϋτερο ph. Σο γεγονόσ αυτό υποδεικνύει ότι η χιτοζϊνη μπορεύ να δρϊςει ωσ αποτελεςματικό βλενοπροςκολλητικό μϋςο και ενιςχυτόσ τησ προςρόφηςησ μόνο ςε μύα περιοριςμϋνη περιοχό του λεπτού εντϋρου όπου οι τιμϋσ του ph εύναι κοντϊ ςτην pka ό μικρότερεσ. ε πολλϋσ μελϋτεσ ϋχουν τροποποιηθεύ οι χημικϋσ ιδιότητεσ τησ χιτοζϊνησ προσ βελτύωςη τησ διαλυτότητασ τησ και αύξηςη τησ ικανότητασ τησ να ενιςχύει την προςρόφηςη ςε περιβϊλλον όπου το ph εύναι ουδϋτερο. Αν και τα νανοςωματύδια χιτοζϊνησ εύναι πολλϊ υποςχόμενοι φορεύσ φαρμακευτικϐν ουςιϐν για χορόγηςη μϋςω του ςτόματοσ, δεν ϋχουν διεξαχθεύ ακόμα κλινικϋσ μελϋτεσ. Επιπλϋον, τοξικολογικϊ θϋματα μϋνουν να λυθούν. Αν και η χιτοζϊνη από μόνη τησ θεωρεύται αςφαλόσ για χορόγηςη εκ του ςτόματοσ, οι ιδιότητεσ τησ μπορεύ να αλλϊζουν εντελϐσ μετϊ από χημικό τροποπούηςη. Η τοξικότητα του κϊθε παραγϐγου πρϋπει να αξιολογεύται ξεχωριςτϊ ςε μορφό νανοςωματιδύου και μη. Απαιτούνται επιπλϋον προ-κλινικϋσ μελϋτεσ για να αποδειχτεύ η αποδεκτό αποτελεςματικότητα και η αςφϊλεια των ςυςτημϊτων νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ [31]. Σα νανοςωματύδια χιτοζϊνησ περιγρϊφηκαν πρϐτη φορϊ το 1994 όταν προτϊθηκε η ενδοφλϋβια χορόγηςη τησ 5-φθοροουρακύλησ (αντικαρκινικό φϊρμακο) μϋςω νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ που παρϊχθηκαν με γαλακτοματοπούηςη και διαςταύρωςη [32]. 27

28 1.3.1 Μϋθοδοι παραςκευόσ νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ Οι κύριεσ μϋθοδοι παραςκευόσ νανοςωματύδιων χιτοζϊνησ εύναι: 1. Γαλακτωματοπούηςη και διαςταύρωςη (emulsification and cross-linking) 2. υνϋνωςη ςταγονιδύων γαλακτϐματοσ (emulsion droplet coalescence) 3. Διϊχυςη διαλύτη γαλακτϐματοσ (emulsion solvent diffusion) 4. Αντύςτροφη μικυλλύωςη (reverse micellization) 5. Ιοντικό πηκτωματοπούηςη και ςυμπλοκοπούηςη πολυηλεκτρολύτη (ionic gelation and polyelectrolyte complexation) 6. Σροποποιημϋνη ιοντικό πηκτωματοπούηςη με ριζικό πολυμεριςμό (modified ionic gelation with radical polymerization) 7. Αποδιαλυτοπούηςη (desolvation) το πύνακα 1.3 παρουςιϊζονται οι μϋθοδοι παραγωγόσ νανοφορϋων χιτοζϊνησ καθϐσ και η ςύςταςη τησ μότρασ, όπωσ επύςησ και δευτερογενό υλικϊ που μπορούν να ςυνδιαςτούν με τη χιτοζϊνη προσ παραγωγό νανοςωματιδιακϐν ςυςτημϊτων [26]. Πύνακασ 1.3 Μϋθοδοι που χρηςιμοποιούνται για την παραγωγό νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ και ςύςταςη τησ μότρασ του φορϋα. Μϋθοδοσ παραγωγόσ ύςταςη μότρασ Γαλακτωματοπούηςη και Φιτοζϊνη, γλουτεραλδεϗδη διαςταύρωςη Συνϋνωςη ςταγονιδύων Φιτοζϊνη γαλακτώματοσ Διϊχυςη διαλύτη Φιτοζϊνη γαλακτώματοσ Αντύςτροφη μικυλλύωςη Φιτοζϊνη, γλουτεραλδεϗδη Ιοντικό πηκτωματοπούηςη Φιτοζϊνη, τριφωςφορικό νϊτριο Συμπλοκοπούηςη Φιτοζϊνη, αλγινικό οξύ, αραβικό κόμμι, πολυηλεκτρολύτη καρβοξυμεθυλο-κυτταρύνη, Καραγεννϊνεσ, θειώκό χονδροώτύνη, κυκλοδεξτρύνεσ, θειώκό δεξτρϊνη, πολυ(ακρυλικό οξύ), πολυ-γ-γλουταμινικό οξύ, 28

29 ινςουλύνη, DNA Τροποποιημϋνη ιοντικό πηκτωματοπούηςη με ριζικό πολυμεριςμό Αποδιαλυτοπούηςη Φιτοζϊνη, ακρυλικό οξύ, μεθακρυλικό οξύ, πολυαιθυλενογλυκόλη, πολυαιθϋρασ Φιτοζϊνη Γαλακτωματοπούηςη και διαςταύρωςη Αυτό η μϋθοδοσ όταν η πρϐτη που χρηςιμοποιόθηκε για την παραςκευό νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ. Περιλαμβϊνει την προετοιμαςύα ενόσ γαλακτϐματοσ νερού/ελαύου και την προςθόκη ενόσ διαςταυρωτικού μϋςου όπωσ η γλουταραλδεϗδη τησ οπούασ ο ρόλοσ εύναι η ςκλόρυνςη των ςταγονιδύων. Οι δραςτικϋσ αμινομϊδεσ τησ χιτοζϊνησ διαςταυρϐνονται με ομοιοπολικούσ δεςμούσ με τισ αλδεώδομϊδεσ τησ γλουταραλδεϗδησ, όπωσ φαύνεται ςτο χόμα 1.9, που προςτύθεται μετϊ το ςχηματιςμό του γαλακτϐματοσ, και ςυνεπϐσ μετϊ τη δημιουργύα των νανοςωματιδύων. Σο μϋγεθοσ των ςωματιδύων εξαρτϊται από την ταχύτητα ανϊδευςησ και τον βαθμό τησ διαςταύρωςησ [33,34]. Έχουν αναδειχτεύ αρκετϊ μειονεκτόματα για αυτό τη μϋθοδο, όπωσ την αναγκαιότητα κουραςτικϐν διαδικαςιϐν και την χρόςη ςκληρϐν διαςταυρωτικϐν μϋςων. Η γλουτεραλδεϗδη παραδεύγματοσ χϊριν προκαλεύ τοξικότητα και θϋτει ςε κύνδυνο την ακεραιότητα των φαρμϊκων. υνεπϐσ η εφαρμογό αυτόσ τησ μεθόδου περιορύζεται ςταδιακϊ ςε λιγότερεσ εργαςύεσ. 29

30 χόμα 1.9: χηματικό αναπαρϊςταςη τησ μεθόδου γαλακτοματοπούηςησ και διαςταύρωςησ υνϋνωςη ςταγονιδύων γαλακτϐματοσ Αυτό η μϋθοδοσ προκύπτει από τη μϋθοδο γαλακτωματοπούηςησ και διαςταύρωςησ και πρϐτη φορϊ αναφϋρθηκε για παραγωγό μικροςωματιδύων [35]. Αργότερα η ύδια ερευνητικό ομϊδα χρηςιμοπούηςαν αυτό τη μϋθοδο για την παραςκευό νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ φορτωμϋνα με γαδολύνιο για θεραπεύα του καρκύνου [36]. Η χιτοζϊνη διαλύθηκε ςε υδατικό διϊλυμα γαδολινύου και μύα μικρό ποςότητα του διαλύματοσ προςτύθεται ςε παραφινϋλαιο που περιϋχει γαλακτωματοποιητό. Σο μύγμα αναδεύεται ιςχυρϊ προσ ςχηματιςμό γαλακτϐματοσ νερού/ελαύου, όπωσ φαύνεται ςτο χόμα Παρϊλληλα, ϋνα ϊλλο γαλϊκτωμα νερού/ελαύου παραςκευϊζεται με την προςθόκη NaOH ςε μύα παρόμοια εξωτερικό φϊςη. Σα δύο γαλακτϐματα αναμιγνύονται, οδηγϐντασ ςε ςυνϋνωςη ςταγονιδύων. Αυτό προκαλεύ την ςτερεοπούηςη ςωματιδύων χιτοζϊνησ, με το NaOH να δρα ωσ μϋςο καθύζηςησ. 30

31 χόμα 1.10: χηματικό αναπαρϊςταςη τησ μεθόδου ςυνϋνωςησ ςταγονιδύων γαλακτϐματοσ Αυτό η μϋθοδοσ εκμεταλλεύεται το γεγονόσ ότι όταν δύο γαλακτϐματα με όμοια εξωτερικό φϊςη αναμιγνύονται, τα ςταγονύδια τουσ ςυγκρούονται τυχαύα και ςυνενϐνονται, οδηγϐντασ ςε ςταγονύδια με ομοιόμορφο περιεχόμενο. Μεύωςη τουσ βαθμού αποακετυλύωςησ τησ χιτοζϊνησ αυξϊνει το μϋγεθοσ των ςωματιδύων και μειϐνει την χωρητικότητα των νανοςωματιδύων για φόρτωςη με φϊρμακο, ωσ αποτϋλεςμα τησ μειωμϋνησ ικανότητα ςχηματιςμού ζευγϐν ιόντων και τησ απο-διόγκωςησ Διϊχυςη διαλύτη γαλακτϐματοσ Η τεχνικό διϊχυςησ διαλύτη γαλακτϐματοσ εύναι μύα προςαρμογό τησ αρχικόσ διαδικαςύασ που αναπτύχθηκε για την παραςκευό νανοςωματιδύων ςυμπολυμερούσ γαλακτικού και γλυκολικού οξϋοσ (PLGA) και βαςύζεται ςτην μερικό αναμιξιμότητα ενόσ οργανικού διαλύτη με το νερό [37]. Η μϋθοδοσ για την παραςκευό νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ περιλαμβϊνει την προςθόκη υπό ανϊδευςη μύασ οργανικόσ φϊςησ (διχλωρομεθϊνιο και ακετόνη) που περιϋχει το υδρόφοβο φϊρμακο ςε ϋνα υδατικό διϊλυμα που περιϋχει χιτοζϊνη και ϋναν 31

32 ςταθεροποιητό και παρουςιϊζεται ςτο χόμα 1.11 [38]. Αυτό οδηγεύ ςτον ςχηματιςμό ενόσ γαλακτϐματοσ ελαύου/νερού που ακολούθωσ υπόκειται ςε ομογενοπούηςη με υψηλό πύεςη. Ο οργανικόσ διαλύτησ (διχλωρομεθϊνιο) απομακρύνεται υπό μειωμϋνη πύεςη ςε θερμοκραςύα δωματύου. ε αυτό το ςτϊδιο, η ακετόνη διαχϋεται ςτην υδατικό φϊςη, μειϐνοντασ την διαλυτότητα τησ χιτοζϊνησ και ςυνεπϐσ νανοςωματύδια ςχηματύζονται κατϊ την καταβύθιςη του πολυμερούσ. υνόθωσ προςτύθεται επιπλϋον ποςότητα νερού για να επιτρϋψει την πλόρη διϊχυςη τησ ακετόνησ. Αυτό η μϋθοδοσ εύναι ιδανικό για την ενθυλϊκωςη υδρόφοβων φαρμϊκων όπωσ η κυκλοςπορύνη, με μεγϊλεσ αποδόςεισ εγκλειςμού. Οι παρϊμετροι που επηρεϊζουν τισ τελικϋσ ιδιότητεσ των φορϋων εύναι το μοριακό βϊροσ τησ χιτοζϊνησ, ο ρυθμόσ ομογενοπούηςησ και ο χρόνοσ τησ εξϊτμιςησ και διϊχυςησ. Η παρουςύα τησ ακετόνησ εύναι απαραύτητη, καθϐσ η ϊμεςη διϊχυςη τησ επηρεϊζει την διεπιφϊνεια ελαύου/νερού που ςτιγμιαύα παρϊγει μύα μεγαλύτερη επιφϊνεια και οδηγεύ ςε ςχηματιςμό πολύ μικρότερων ςταγονιδύων. Σα μειονεκτόματα τησ μεθόδου εύναι οι ςκληρϋσ ςυνθόκεσ προετοιμαςύασ, όπωσ οι οργανικού διαλύτεσ και οι ιςχυρϋσ δυνϊμεισ διϊτμηςησ, που λεύπουν από ϊλλεσ μεθόδουσ που θα αναφερθούν παρακϊτω. χόμα 1.11: χηματικό αναπαρϊςταςη τησ μεθόδου διϊχυςησ διαλύτη γαλακτϐματοσ 32

33 Αντύςτροφη μικυλλύωςη Η τεχνικό αυτό αναφϋρθηκε πρϐτη φορϊ το Σα αντύςτροφα μικύλλια εύναι ςταγονύδια νερού/ελαύου και ςχηματύζονται ςε ςύςτημα νερού/ελαύου ςε αντύθεςη με τα ςυνηθιςμϋνα μικύλλια που ςχηματύζονται ςε γαλακτϐματα ελαύου/νερού. την αντύςτροφη μικυλλύωςη, ϋνα μικρογαλϊκτωμα νερού/ελαύου παραςκευϊζεται με τη χρόςη ενόσ λιπόφιλου επιφανειοδραςτικού που διαλύεται ςε κατϊλληλη ποςότητα οργανικού διαλύτη, όπωσ το εξϊνιο. Μύα υδατικό φϊςη που περιϋχει την χιτοζϊνη, γλουτεραλδεϗδη καθϐσ και το φϊρμακο προςτύθονται ςτην οργανικό φϊςη υπό ςυνεχό ανϊδευςη. Όπωσ φαύνεται ςτο χόμα 1.12, ςε αυτό το ςτϊδιο ςχηματύζονται αντύςτροφα μικύλλια. Σα νανοςωματύδια παραλαμβϊνονται μετϊ από εξϊτμιςη του διαλύτη. Αύξηςη του βαθμού διαςταύρωςησ προκαλεύ αύξηςη του μεγϋθουσ των παραγόμενων ςωματιδύων [39,40]. χόμα 1.12: χηματικό αναπαρϊςταςη τησ μεθόδου αντύςτροφησ μικυλλύωςησ ε ςύγκριςη με ϊλλεσ μεθόδουσ γαλακτϐματοσ, η αντύςτροφη μικυλλύωςη ϋχει το πλεονϋκτημα τησ παραγωγόσ πολύ μικρϐν νανοςωματιδύων ~100nm ό και μικρότερα ςε ςχϋςη με τουσ μεγαλύτερουσ φορεύσ (>200nm) που παραλαμβϊνονται από τισ ϊλλεσ τεχνικϋσ. Μειονεκτεύ ςτην δυςκολύα 33

34 απομόνωςησ των νανοςωματιδύων και την ανϊγκη για μεγαλύτερεσ ποςότητεσ διαλύτη [41] Ιονοτροπικό πηκτωματοπούηςη και ςυμπλοκοπούηςη πολυηλεκτρολύτη Όταν η χιτοζϊνη ϋχει υψηλό βαθμό πρωτονύωςησ των αμινομϊδων, εμφανύζει την δυνατότητα ςχηματιςμού υδρογελϐν παρουςύα ςυγκεκριμϋνων πολυανιόντων. Αυτό η διαδικαςύα προκύπτει από τον ςχηματιςμό δια- και ενδομοριακϐν ςταυροδεςμϐν που προκαλούνται από τα ανιονικϊ μόρια [42,43] και ϋχει χρηςιμοποιηθεύ ςτην παραγωγό νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ με ιοντικό πηκτωματοπούηςη ό ςυμπλοκοπούηςη πολυηλεκτρολύτη. Πρϋπει να ςημειωθεύ ότι ο όροσ ιοντικό πηκτωματοπούςη προτιμϊται όταν οι γϋλεσ χιτοζϊνησ ςχηματύζονται με μικρϊ ανιονικϊ μόρια ενϐ η ςυμπλοκοπούηςη πολυηλεκτρολύτη αναφϋρεται όταν χρηςιμοποιούνται ανιονικϊ μακρομόρια [44]. Σα υλικϊ που χρηςιμοποιούνται για την παραγωγό νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ με αυτό τη μϋθοδο εύναι πολυμερό όπωσ θειώκό δεξτρύνη, αλγινικό νϊτριο, καραγεννϊνεσ, αραβικό κόμμι, γλυκομαννϊνη, καρβοξυμεθυλοκυτταρύνη, θειώκό χονδροώτύνη, πηκτύνη, ηπαρύνη, υαλουρονικό οξύ κ.ϊ. υνηθιςμϋνη εύναι η χρόςη τριπολυφωςφορικού νατρύου (ΣΡΡ) που δρα ωσ δικτυωτικό μϋςο τησ χιτοζϊνησ. Ο ςχηματιςμόσ των νανοςωματιδύων λαμβϊνει χϐρα αμϋςωσ μετϊ την προςθόκη διαλύματοσ ΣΡΡ ςτο διϊλυμα χιτοζϊνησ, υπό αργό ανϊδευςη ςε θερμοκραςύα περιβϊλλοντοσ (χόμα 1.13). Η ανϊδευςη πρϋπει να ςυνεχύζεται για 10 λεπτϊ ϐςτε να ςταθεροποιηθούν τα ςωματύδια [45]. Ακολουθεύ φυγοκϋντριςη για παραλαβό των νανοςωματιδύων και επαναδιαςπορϊ τουσ ςε νερό. 34

35 χόμα 1.13: χηματικό αναπαρϊςταςη τησ μεθόδου ιονοτροπικόσ πηκτωματοπούηςησ/ςυμπλοκοπούηςησ πολυηλεκτρολύτη Οι τελικϋσ ιδιότητεσ των νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ εξαρτϐνται από την ταχύτητα ανϊδευςη, το ςκεύοσ ανϊδευςησ και τισ ςυνθόκεσ τησ φυγοκϋντρηςησ ανεξϊρτητα από τα υλικϊ που αποτελούν τη νανοςωματιδιακό μότρα. Η βελτιςτοπούηςη παραγόντων όπωσ οι ςυγκεντρϐςεισ και οι αναλογύεσ μαζϐν, η θερμοκραςύα και ο όγκοσ τησ επαναδιαςπορϊσ εύναι επύςησ ϋνα ςημαντικό ϋργο. την πραγματικότητα, τα νανοςωματύδια που παρϊγονται από ςυμπλοκοπούηςη πολυηλεκτρολύτη μεταξύ δύο αντύθετα φορτιςμϋνων πολυμερϐν υποβϊλλονται ςε αύξηςη μεγϋθουσ με την ενςωμϊτωςη αυξανόμενων ποςοτότων ενόσ από τα πολυμερό. Αντύθετα, η παραγωγό νανοςωματιδύων με ιοντικό πηκτωματοπούηςη οδγηεύ ςτον ςχηματιςμό μικρότερων ςωματιδύων για μεγαλύτερεσ ποςότητεσ διαςταυρωτικού μϋςου [46]. Η πολυδιαςπορϊ των παραγόμενων νανοςωματιδύων επηρεϊζεται επύςησ από την ςυγκϋντρωςη του οξικού οξϋοσ που χρηςιμοποιεύται για την διϊλυςη τησ χιτοζϊνησ και από την θερμοκραςύα ςτην οπούα λαμβϊνει χϐρα η διαςταύρωςη. Σο πιο ςημαντικό πλεονϋκτημα αυτόσ τησ μεθόδου εύναι το υδρόφιλο περιβϊλλον και οι όπιεσ ςυνθόκεσ παραςκευόσ. Η αποφυγό οργανικϐν διαλυτϐν και ιςχυρϐν δυνϊμεων διϊτμηςησ κϊνουν ευκολότερη την ενθυλϊκωςη 35

36 αςταθϐν φαρμϊκων και γι αυτό αυτϋσ οι μϋθοδοι εύναι οι πιο ευρϋωσ χρηςιμοποιούμενεσ για την παραςκευό νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ. Έχει επύςησ βρεθεύ ότι με φυςικό διαςταύρωςη αντύ για χημικό, βελτιϐνεται η βιωςιμότητα των κυττϊρων και η ακεραιότητα των φαρμϊκων [33] Σροποποιημϋνη ιονοτροπικό πηκτωματοπούηςη με ριζικό πολυμεριςμό Αυτό η μϋθοδοσ προκύπτει από την ιονοτροπικό πηκτωματοπούηςη, αλλϊ ειςϊγεται και μύα τροποπούηςη, επειδό η ζελατινοπούηςη τησ χιτοζϊνησ ςυμβαύνει ταυτόχρονα με τον πολυμεριςμό ακρυλικϐν μονομερϐν. Σο πρϐτο βόμα λαμβϊνει χϐρα ςε θερμοκραςύα περιβϊλλοντοσ και ςυμπεριλαμβϊνει την ανϊδευςη ενόσ υδατικού διαλύματοσ μονομερούσ ακρυλικού ό μεθακρυλικού οξϋοσ με ϋνα υδατικό διϊλυμα αντύθετα φορτιςμϋνησ χιτοζϊνησ. ε κϊποιεσ περιπτϐςεισ, προςτύθεται επύςησ πολυαιθυλενογλυκόλη ό πολυαιθϋρασ ςτο μϋςο τησ αντύδραςησ, εύτε ξεχωριςτϊ ςτο διϊλυμα του μονομερούσ ό μετϊ τη μύξη με τη χιτοζϊνη. Όπωσ παρουςιϊζεται και ςτο χόμα 1.14, τα αντύθετα φορτύα τησ χιτοζϊνησ και του ακρυλικού οξϋοσ οδηγούν ςε ιοντικϋσ αλληλεπιδρϊςεισ, ενϐ ο ριζικόσ πολυμεριςμόσ του οξϋοσ εκκινεύται από την προςθόκη υπερθειώκού καλύου. χόμα 1.14: χηματικό αναπαρϊςταςη τησ μεθόδου τροποποιημϋνησ ιοντικόσ πηκτωματοπούηςησ με ριζικό πολυμεριςμό 36

37 Αύξηςη του μοριακού βϊρουσ τησ χιτοζϊνησ αυξϊνει το μοριακό βϊροσ του πολυ(ακρυλικού οξϋοσ) που βρύςκεται ςτα νανοςωματύδια. Επύςησ παρϊμετροι όπωσ η αναλογύα χιτοζϊνησ/ακρυλικϐν μονομερϐν και η ςυγκϋντρωςη του πολυμερούσ ϋχει βρεθεύ ότι επηρεϊζουν τισ φυςικοχημικϋσ ιδιότητεσ των νανοςωματιδύων Αποδιαλυτοπούηςη Η μϋθοδοσ τησ αποδιαλυτοπούηςησ ςυχνϊ αναφϋρεται και ωσ μύα απλό ςυςςωμϊτωςη ό διαχωριςμόσ φϊςησ και περιλαμβϊνει μύα μακρομοριακό ςυςςωμϊτωςη με μερικό αποδιαλυτοπούηςη πλόρωσ διαλυμϋνων μορύων [47]. Η χρόςη αποδιαλυτοποιητικϐν μϋςων για την παραγωγό ςωματιδύων χιτοζϊνησ αναφϋρθηκε πρϐτη φορϊ για την παραγωγό μικρο-φορϋων [48] αλλϊ τϐρα αυτό η μϋθοδοσ εφαρμόζεται ςυχνϊ ςτην παραγωγό νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ. Ο πιο ςυνηθιςμϋνοσ παρϊγοντασ καθύζηςησ εύναι το θειώκό νϊτριο. Η διαδικαςύα εύναι πολύ απλό και όπια αφού περιλαμβϊνει την προςθόκη κατϊ ςταγόνεσ διαλύματοσ θειώκού νατρύου με μεγαλύτερη υδροφιλικότητα ςε ϋνα διϊλυμα χιτοζϊνησ (χόμα 1.15). Καθϐσ το ϊλασ ειςϋρχεται ςτο υδατικό περιβϊλλον του διαλύματοσ τησ χιτοζϊνησ, παρουςιϊζεται μύα βαθμιαύα εξϊλειψη του επιδιαλυτοποιημϋνου νερού γύρω από τη χιτοζϊνη καθϐσ το ϊλασ ϋχει μεγαλύτερη ςυγγϋνεια για το ϊλασ. Αυτό η διαδικαςύα οδηγεύ ςτην καθύζηςη του πολυμερούσ. Αυτό το φαινόμενο παρατηρεύται γιατύ οι αλληλεπιδρϊςεισ νερούϊλατοσ εύναι πιο ευνοώκϋσ ςε ςχϋςη με αυτϋσ που υπϊρχουν μεταξύ νερού και χιτοζϊνησ, κι ϋτςι προκαλεύται η μερικό αποδιαλυτοπούηςη τησ. Οι αλληλεπιδρϊςεισ μεταξύ των μορύων χιτοζϊνησ αυξϊνονται, ςχηματύζοντασ τουσ νανοφορεύσ [47]. 37

38 χόμα 1.15: χηματικό αναπαρϊςταςη τησ μεθόδου αποδιαλυτοπούηςησ Η χρόςη ςταθεροποιητό εύναι πολύ ςυνηθιςμϋνη καθϐσ και η διαςταύρωςη με γλουτεραλδεϗδη, για ςκλόρυνςη των νανοςωματιδύων. Παρϊγοντεσ όπωσ το μοριακό βϊροσ τησ χιτοζϊνησ, η ςυγκϋντρωςη τησ, το ποςό του αντιδιαλύτη και ο ρυθμόσ ανϊδευςησ ϋχει βρεθεύ ότι επηρεϊζουν τα τελικϊ χαρακτηριςτικϊ των νανοςωματιδύων. 38

39 1.4 Ελεγχόμενη απελευθϋρωςη φαρμϊκων /δραςτικών ουςιών Γενικϊ για την ελεγχόμενη αποδϋςμευςη Η ελεγχόμενη αποδϋςμευςη δραςτικϐν ουςιϐν γύνεται όταν ϋνα πολυμερϋσ, φυςικό ό ςυνθετικό, ςυνδιϊζεται κατϊλληλα με ϋνα φϊρμακο ό ϊλλη δραςτικό ουςύα με τϋτοιο τρόπο ϐςτε ό αποδϋςμευςη τουσ να πραγματοποιεύται με ελεγχόμενο τρόπο. Η αποδϋςμευςη τησ δραςτικόσ ουςύασ μπορεύ να εύναι εύτε ςταθερό, εύτε κυκλικό, ό μπορεύ να προκαλεύται από εξωτερικούσ παρϊγοντεσ. ε κϊθε περύπτωςη ο ςτόχοσ εύναι η επύτευξη πιο αποτελεςματικϐν θεραπειϐν, εξαφανύζοντασ ταυτόχρονα την πιθανότητα ελλειπούσ ό υπερβολικόσ δοςολογύασ. Με την ελεγχόμενη αποδϋςμευςη επιτυγχϊνεται αςφαλόσ, παρατεταμϋνη και τοπικό χορόγηςη εκτόσ από φαρμϊκων, γεωργικϐν φαρμϊκων, εντομοκτόνων, αντιοξειδωτικϐν και ϊλλων χημικϐν. Οριςμϋνα πλεονεκτόματα των ςυςτημϊτων ελεγχόμενησ απελευθϋρωςησ εύναι η βελτιςτοπούηςη τησ δοςολογύασ, η παρατεταμϋνη δρϊςη, η χρόςη τησ ελϊχιςτησ απαιτούμενησ δόςησ, η ελαχιςτοπούηςη των παρενεργειϐν, η βελτιωμϋνη φαρμακοκινητικό απορρόφηςη, η καλύτερη ςυμμόρφωςη του αςθενούσ και τϋλοσ το οικονομικό όφελοσ. 39

40 χόμα 1.16: Διϊγραμμα μεταβολόσ τησ ςυγκϋντρωςησ φαρμϊκου ςτο πλϊςμα του αύματοσ με το χρόνο, (α) ςε ςυμβατικό ςκεύαςμα και (β) ςε ςύςτημα ελεγχόμενησ απελευθϋρωςησ Σο ιδανικό ςύςτημα ελεγχόμενησ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων πρϋπει να ϋχει τισ παρακϊτω ιδιότητεσ: Καλό μηχανικό αντοχό Βιοςυμβατότητα Αςφϊλεια για τον αςθενό από περύπτωςη τυχαύασ, μη αναμενόμενησ απελευθϋρωςησ Απλότητα ςτην καταςκευό και την εφαρμογό Ικανότητα να επιτύχει υψηλό εγκλειςμό και ελεγχόμενη αποδϋςμευςη. Αντύςτοιχα τα κύρια μειονεκτόματα εύναι: Η πιθανό τοξικότητα και μη βιοςυμβατότητα του υλικού. Σα παραπροώόντα τησ χημικόσ αποικοδόμηςησ. Η πιθανό απόρριψη τησ φαρμακευτικόσ ουςύασ από το φορϋα. Σο υψηλό κόςτοσ ςε ςχϋςη με τισ παραδοςιακϋσ φαρμακευτικϋσ μεθόδουσ. 40

41 1.4.2 Μηχανιςμού αποδϋςμευςησ από πολυμερικϊ υλικϊ Οι κύριοι μηχανιςμού ελεγχόμενησ αποδϋςμευςησ δραςτικόσ ουςύασ εύναι τρεισ: διϊχυςη, διόγκωςη ακολουθούμενη απο διϊχυςη και αποςύνθεςη. Ανϊλογα με το ςύςτημα, μπορεύ να ςυμβαύνει ϋνασ τρόποσ αποδϋςμευςησ ό και ςυνδιαςμόσ τουσ Διϊχυςη Η διϊχυςη λαμβϊνει χϐρα όταν η δραςτικό ουςύα περνϊ μϋςα από το πολυμερϋσ. Μπορεύ να πραγματοποιεύται μακροςκοπικϊ, μϋςω του πορϐδουσ του πολυμερικού υποςτρϐματοσ, ό ςε μοριακό επύπεδο ανϊμεςα από τισ μακρομοριακϋσ αλυςύδεσ του πολυμερούσ. Τπϊρχουν δύο βαςικϋσ κατηγορύεσ ςυςτημϊτων διϊχυςησ, τα ςυςτόματα τύπου μότρασ (μονολιθικϊ) και τα ςυςτόματα τύπου δεξαμενόσ. Σα ςυςτόματα τύπου μότρασ δεν επηρεϊζονται από ατϋλειεσ τησ πολυμερικόσ μότρασ και παρουςιϊζουν μειούμενο ρυθμό αποδϋςμευςησ, ενϐ τα ςυςτόματα τύπου δεξαμενόσ εύναι ευαύςθητα ςε ατϋλειεσ τησ πολυμερικόσ μότρασ και εμφανύζουν ςταθερό ρυθμό αποδϋςμευςησ. χόμα 1.17: Διαγρϊμματα ρυθμού αποδϋςμευςησ (α) ςυςτόματοσ τύπου μότρασ και (β) ςυςτόματοσ τύπου δεξαμενόσ 41

42 Διόγκωςη-διϊχυςη Ένα από τα πιο ενδιαφϋροντα και χρόςιμα χαρακτηριςτικϊ τησ διόγκωςησ ενόσ πολυμερούσ εύναι ότι αυτό μπορεύ να προκληθεύ από αλλαγϋσ ςτο περιβϊλλον του ςυςτόματοσ ελεγχόμενησ αποδϋςμευςησ. Έτςι, εύναι εφικτό το ςύςτημα να ςχεδιαςτεύ ϋτςι ϐςτε να μην εύναι δυνατό η απελευθϋρωςη τησ δραςτικόσ του ουςύασ ϋωσ ότου βρεθεύ ςτο κατϊλληλο βιολογικό περιβϊλλον. Σϋτοια ςυςτόματα καταςκευϊζονται από υλικϊ τα οπούα παρουςιϊζουν διόγκωςη προκαλούμενη από περιβαλλοντικϊ ερεθύςματα, που ςτην πλειοψηφύα τουσ εύναι υδρογϋλεσ. χόμα 1.18: Αποδϋςμευςη δραςτικόσ ουςύασ από ςύςτημα ευαύςθητο ςε περιβαλλοντικϊ ερεθύςματα Ανϊλογα με το πολυμερϋσ, το ερϋθιςμα μπορεύ να εύναι μεταβολό ςτο ph, τη θερμοκραςύα, την ιονικό ιςχύ, ενϐ το ςύςτημα μπορεύ να ςυρρικνϐνεται εύτε να διογκϐνεται Αποςύνθεςη Σα βιοαποικοδομόςιμα ςυςτόματα ελεγχόμενησ αποδϋςμευςη φαρμϊκων αποτελούνται από υλικϊ τα οπούα αποικοδομούνται μϋςα ςτον ανθρϐπινο οργανιςμό ωσ αποτϋλεςμα μιασ φυςικόσ βιολογικόσ διαδικαςύασ, απαλούφωντασ ϋτςι την ανϊγκη απομϊκρυνςησ τουσ από τον οργανιςμό μετϊ το πϋρασ τησ αποδϋςμευςησ. Σα περιςςότερα βιοαποικοδομόςιμα πολυμερό ςχεδιϊζονται 42

43 ϋτςι ϐςτε η αποςύνθεςη τουσ να γύνεται με υδρόλυςη των πολυμερικϐν αλυςύδων ςε βιολογικϊ αποδεκτϋσ ενϐςεισ. χόμα 1.19: Αποδϋςμευςη δραςτικόσ ουςύασ από ςύςτημα με βιοαποικοδομόςιμη πολυμερικό μότρα Οφθαλμικό απελευθϋρωςη Γενικϊ για την οφθαλμικό χορόγηςη φαρμϊκων Ο οφθαλμόσ εύναι ϋνα όργανο που προςτατεύεται από εξωγενεύσ ουςύεσ και πιϋςεισ με διϊφορα φρϊγματα, και ςυνεπϐσ οι θεραπευτικϋσ φαρμακευτικϋσ ουςύεσ πρϋπει να μεταφερθούν μϋςα από πολλϊ προςτατευτικϊ ςτρϐματα ανεξϊρτητα από την διαδρομό χορόγηςησ που επιλϋγεται. Για την θεραπεύα του εμπρόςθιου τμόματοσ του οφθαλμού (κερατοειδόσ, επιπεφυκότασ, ςκλόροσ χιτϐνασ) ςυνόθωσ χορηγούνται τοπικϊ οφθαλμικϋσ ςταγόνεσ. Μύα οφθαλμικό ςταγόνα, ανεξϊρτητα από τον όγκο τησ, απομακρύνεται γρόγορα μϋςα ςε 5-6 λεπτϊ μετϊ τη χορόγηςη και μόνο ϋνα μικρό ποςοςτό τησ (1-3%) φτϊνει ςτον ενδοοφθαλμικό ιςτό. Έτςι εύναι δύςκολο να χορηγηθεύ και να διατηρηθεύ αρκετό ςυγκϋντρωςη φαρμϊκου ςτην προκερατοειδό περιοχό. Πϊνω από 75% του οφθαλμικού διαλύματοσ που χορηγεύται χϊνεται μϋςω ρινοδακρυώκόσ παροχϋτευςησ και απορροφϊται ςυςτημικϐσ μϋςω του επιπεφυκότα, με αποτϋλεςμα η διαθεςιμότητα του φαρμϊκου να εύναι πολύ χαμηλό. Για να αυξηθεύ η βιοδιαθεςιμότητα και ο χρόνοσ παραμονόσ του φαρμϊκου ςτην οφθαλμικό επιφϊνεια, ϋχουν μελετηθεύ 43

44 διϊφορα ςυςτόματα τοπικόσ εφαρμογόσ, όπωσ ιξϐδη διαλύματα, γαλακτϐματα, αιωρόματα, αλοιφϋσ, υδρογϋλεσ και πολυμερό [49]. χόμα 1.20: Η ανατομύα του οφθαλμού Ο οφθαλμόσ εύναι το πιο εύκολα προςβϊςιμο ςημεύο για τοπικό χορόγηςη φαρμϊκου. Υαρμακευτικϋσ ουςύεσ χρηςιμοποιούνται ςτο οφθαλμικό ςύςτημα για τοπικό δρϊςη ςτην επιφϊνεια ό ςτο εςωτερικό του ματιού. Σο οφθαλμικό ςύςτημα εύναι πολύ ενδιαφϋρον όργανο λόγω των χαρακτηριςτικϐν διϊθεςησ των φαρμϊκων. Για τισ αςθϋνειεσ του ματιού, η τοπικό χορόγηςη εύναι ςυνόθωσ η ιδανικό. Πριν φτϊςει ςτο ανατομικό φρϊγμα του κερατοειδούσ, κϊθε μόριο φαρμϊκου που χορηγεύται μϋςω τησ οφθαλμικόσ οδού διαςχύζει πρϐτα τα προκερατοειδό εμπόδια. Αυτϊ εύναι και τα πρϐτα εμπόδια που καθυςτερούν την ειςαγωγό του φαρμϊκου ςτο μϊτι και αποτελούνται από το υδατοειδϋσ υγρό και τον επιπεφυκότα [50]. Γενικϊ, τα τοπικϊ εφαρμοζόμενα φϊρμακα δεν φθϊνουν το οπύςθιο τμόμα του οφθαλμού (αμφιβληςτροειδόσ, υαλϐδεσ ςϐμα, χοριοειδόσ χιτϐνασ) και ςυνεπϐσ για ςυςτημικό χορόγηςη χρηςιμοποιούνται περιοφθαλμικϋσ ό ενδοφθαλμικϋσ ενϋςεισ. Η δυςκολύα ςτην ειςχϐρηςη των 44

45 φαρμϊκων ςτουσ ιςτούσ-ςτόχουσ ϋχει οδηγόςει ςε αυξημϋνο ενδιαφϋρον ςτα ςυςτόματα ελεγχόμενησ απελευθϋρωςησ φαρμϊκων για το οπύςθιο τμόμα του ματιού. Αυτό η τϊςη κλύνει ςε πολυμερικϊ ςυςτόματα-αποθόκεσ που εμφυτεύονται ό εγχύονται απευθεύασ ςτο υαλϐδεσ ςϐμα με ςκοπό την μακροπρόθεςμη και ςταθερό απελευθϋρωςη τησ φαρμακευτικόσ ουςύασ. Σα κύρια πλεονεκτόματα των οφθαλμικϐν ςυςτημϊτων απελευθϋρωςησ φαρμϊκου εύναι: Ευκολύα και αποφυγό ενϋςιμων φαρμϊκων και απουςύα τησ ανϊγκησ για εκπαιδευμϋνο προςωπικό, αυτοθεραπεύα, βελτιϐνοντασ ϋτςι τη ςυμμόρφωςη των αςθενϐν ςε ςύγκριςη με παρεντερικϋσ οδούσ Καλό ειςχϐρηςη υδρόφιλων φαρμϊκων χαμηλού μοριακού βϊρουσ Άμεςη απορρόφηςη και ταχεύα ϋναρξη τησ δρϊςησ λόγω τησ μεγϊλησ επιφϊνειασ προςρόφηςησ και τησ μεγϊλησ αγγεύωςησ Αποφυγό του ηπατικού μεταβολιςμού πρϐτησ διόδου και ϋτςι δυνατότητα μεύωςησ τησ δοςολογύασ ςε ςύγκριςη με τη χορόγηςη από το ςτόμα. Κϊποια από τα βαςικϊ μειονεκτόματα εύναι αντύςτοιχα: Η μειωμϋνη διαπερατότητα του κερατοειδούσ που οδηγεύ ςε χαμηλό απορρόφηςη των οφθαλμικϐν φαρμϊκων Μεγϊλο ποςοςτό τησ χορηγούμενησ δόςησ περνϊει ςτην δακρυώκό οδό και μπορεύ να προκαλϋςει παρενϋργειεσ Η ϊμεςη απομϊκρυνςη του φαρμϊκου μϋςω το ανοιγοκλεύςματοσ του ματιού και την ροό δακρύων προκαλεύ μικρό διϊρκεια τησ θεραπευτικόσ δρϊςησ δημιουργϐντασ την ανϊγκη για ςυχνό χορόγηςη. Σα ςυςτόματα που χρηςιμοποιούνται για τη χορόγηςη φαρμϊκων ςτο πρόςθιο τμόμα του οφθαλμού εύναι ςταγόνεσ, φακού επαφόσ, ενθϋματα, τϊπεσ του δακρυώκού ςημεύου, υποεπιπεφυκοτικϊ/επιςκλόρια εμφυτεύματα ενϐ για το οπύςθιο μϋροσ του οφθαλμού χρηςιμοποιούνται ενδοώαλϐδη εμφυτεύματα, ςωματιδιακϊ ςυςτόματα με ϋγχυςη και ςταγόνεσ. Κολλοειδεύσ μορφϋσ δοςολογύασ όπωσ τα νανοςωματύδια, τα νανομικύλλια, τα λιποςϐματα και τα μικρογαλακτϐματα ϋχουν διερευνηθεύ για να ξεπεραςτούν διϊφορα ςτατικϊ και δυναμικϊ εμπόδια. 45

46 χόμα 1.21: Οφθαλμικϊ εμφυτεύματα Νανοςωματύδια και οφθαλμικό απελευθϋρωςη Σα νανοςωματύδια ϋχουν ςχεδιαςτεύ ϋτςι ϐςτε να ξεπερϊςουν τα φυςικϊ εμπόδια του οφθαλμού, να αυξόςουν την ειςχϐρηςη του φαρμϊκου ςτο ςημεύοςτόχοσ και να παρατεύνει τα επύπεδα του φαρμϊκου ϐςτε να απαιτούνται λιγότερεσ χορηγόςεισ με μικρότερεσ δοςολογύεσ χωρύσ καμύα τοξικότητα ςυγκριτικϊ με τισ ςυμβατικϋσ ςταγόνεσ [51]. Σα πιο ςυνηθιςμϋνα βιοώλικϊ που χρηςιμοποιούνται εύναι το ςυμπολυμερϋσ γαλακτικού-γλυκολικού οξϋοσ, τα πολυλακτύδια, η ζελατύνη, το αλγινικό οξύ και η χιτοζϊνη. Έωσ τϐρα δεν ϋχουν χρηςιμοποιηθεύ κλινικϊ, ωςτόςω υπόκεινται ςε προ-κλινικϋσ μελϋτεσ αντιαγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παρϊγοντεσ, κορτικοςτεροειδό και αντι-ιώκού παρϊγοντεσ. Η χρόςη νανοςωματιδιακϐν ςυςτημϊτων απελευθϋρωςησ φαρμϊκων ςτον οφθαλμό παρουςιϊζει πολλϊ πλεονεκτόματα και θα βοηθόςει ςτο να ξεπεραςτούν τα εμπόδια που αναφϋρθηκαν προηγουμϋνωσ. Όςον αφορϊ τη χορόγηςη του φαρμϊκου, οι αςθενεύσ θα μπορούν να χορηγούν μόνοι τουσ ςε μορφό ςταγόνων. Η όραςη δεν θα επηρεϊζεται λόγω των μικρϐν διαςτϊςεων του ςυςτόματοσ απελευθϋρωςησ. Οι φαρμακευτικϋσ ουςύεσ προςτατεύονται από μεταβολικϊ ϋνζυμα όπωσ οι πεπτιδϊςεσ και οι νουκλεϊςεσ, ο χρόνοσ παραμονόσ αυξϊνεται καθϐσ και ο χρόνοσ απελευθϋρωςησ. Εφικτό εύναι επύςησ η ςτόχευςη ςε ςυγκεκριμϋνουσ ιςτούσ με αποφυγό ϋτςι πιθανϐν παρενεργειϐν 46

47 και μεύωςη τησ απαιτούμενησ δοςολογύασ. Πιθανό εύναι και η ενύςχυςη τησ ειςχϐρηςησ [52]. Η ςκϋψη πύςω από τη χρόςη των νανοςωματιδύων ςτην τοπικό απελευθϋρωςη εύναι ότι η αύξηςη του χρόνου παραμονόσ και η ςταθερό απελευθϋρωςη του φαρμϊκου οδηγεύ ςε αυξημϋνη ςυγκϋντρωςη και μεγαλύτερησ διϊρκειασ παραμονό ςτο υδατοειδϋσ υγρό ό ςτην ενδοφθαλμικό ςυγκϋντρωςη του φαρμϊκου ςτο ςημεύο-ςτόχοσ. Σα νανοςωματύδια ϋχουν επύςησ μελετηθεύ και για ενδοφθαλμικϋσ εφαρμογϋσ, αφού θεωρητικϊ μπορούν να προςδϐςουν ελεγχόμενη απελευθϋρωςη, να προςτατεύςουν το φϊρμακο από ενζυμικό αποικοδόμηςη και να κατευθύνουν το φϊρμακο ςτο ςημεύο-ςτόχοσ [52] Νανοςωματύδια χιτοζϊνησ ςτην οφθαλμικό απελευθϋρωςη Η χιτοζϊνη ϋχει μελετηθεύ ςαν υποςχόμενοσ οφθαλμικόσ φορϋασ λόγω των βλεννοςυγκολλητικϐν τησ ιδιοτότων, που δημιουργούνται από τισ ηλεκτροςτατικϋσ αλληλεπιδρϊςεισ με τα αρνητικϊ φορτιςμϋνα φορτύα τησ βλϋννασ. Επύςησ η χιτοζϊνη ενιςχύει την διαπερατότητα του κερατοειδούσ παροδικϊ λόγω μύα αλληλεπύδραςησ με δομϋσ ιςχυρϐν ςυνδϋςεων. χόμα 1.22: χηματικό αναπαρϊςταςη τησ βλενοςυγκολλητικόσ φύςησ τησ χιτοζϊνησ λόγω ιςχυρϐν ηλεκτροςτατικϐν ϋλξεων 47

48 Έχει βρεθεύ ότι τα νανοςωματύδια χιτοζϊνησ φορτωμϋνα με κυκλοςπορύνη οδόγηςαν ςε υψηλότερα επύπεδα φαρμϊκου ςτον κερατοειδό και τον επιπεφυκότα ςε ςχϋςη με χορόγηςη μϋςω διαςπορϊσ τησ κυκλοςπορύνησ ςε υδατικό διϊλυμα χιτοζϊνησ [53]. Σα νανοςωματύδια χιτοζϊνησ εμφανύζουν διεύςδυςη ςε επιθηλιακϊ κύτταρα του κερατοειδούσ και του επιπεφυκότοσ μϋςω μύα παρακυτταρικόσ/διακυτταρικόσ οδού. Η μεταφορϊ των νανοςωματιδύων εξαρτϊται από το μϋγεθοσ τουσ. χόμα 1.23: Ιδιότητεσ χιτοζϊνησ που την κϊνουν κατϊλληλο υλικό για εφαρμογϋσ ωσ φαρμακευτικό βιοώλικό Σα τελευταύα χρόνια, τα χαρακτηριςτικϊ και η προοπτικό των νανοφορϋων χιτοζϊνησ για διαβλεννογονικό χορόγηςη φαρμϊκων ϋχουν μελετηθεύ εκτεταμϋνα. Διαφορετικού τύποι νανοςυςτημϊτων χιτοζϊνησ ϋχει βρεθεύ ότι βελτιϐνουν τη μεταφορϊ των φαρμϊκων κατϊ την χορόγηςη μϋςω του βλεννογόνου και κυρύωσ από τουσ οφθαλμικούσ βλεννογόνουσ. Πολλϊ υδρόφοβα και υδρόφιλα φϊρμακα και βιομακρομόρια ϋχουν χορηγηθεύ επιτυχημϋνα ςτο μϊτι με την ειςαγωγό τουσ ςε ςυςτόματα νανο-χιτοζϊνησ. Μύα γενικό κατηγοριοπούηςη των νανοφορϋων χιτοζϊνησ τουσ χωρύζει ςε 48

49 ςυςτόματα με επικϊλυψη χιτοζϊνησ και ςε ςυςτόματα με βϊςη τη χιτοζϊνη, δηλαδό ανϊλογα με το αν η χιτοζϊνη εύναι ςε μορφό επικϊλυψησ ό μότρασ. Εκτόσ από αυτϊ, ϋχουν αναπτυχθεύ νϋεσ γενιϋσ νανοφορϋων χιτοζϊνησ με βελτιωμϋνεσ ιδιότητεσ για οφθαλμικό απελευθϋρωςη. Αυτϋσ ςυμπεριλαμβϊνουν 1) αυτο-οργανωμϋνα νανοςυςτόματα μετϊ από τροποπούηςη τησ χιτοζϊνησ με υδρόφοβεσ ομϊδεσ για βελτύωςη τησ αλληλεπύδραςησ των φορϋων με βιολογικϋσ μεμβρϊνεσ, 2) υβριδικϊ νανοςωματύδια που ςυνδιϊζουν τη χιτοζϊνη με ϊλλα βιοώλικϊ προσ δημιουργύα ςυςτημϊτων με νϋεσ και βελτιωμϋνεσ ιδιότητεσ. το χόμα 1.24 παρουςιϊζονται ςχηματικϊ τα παραπϊνω ςυςτόματα. χόμα 1.24: Κατηγορύεσ νανοφορϋων χιτοζϊνησ Σα χαρακτηριςτικϊ τησ χιτοζϊνησ που την κϊνουν ελκυςτικό υλικό για την οφθαλμικό απελευθϋρωςη εύναι 1) οι όπιεσ ςυνθόκεσ που απαιτούνται για την παραγωγό τουσ, 2) η πιθανότητα δημιουργύασ ομογενϐν ςωματιδύων και ο εύκολοσ ϋλεγχοσ του μεγϋθουσ και του φορτύου τησ επιφϊνειασ, 3) η ικανότητα για ςύνδεςη με διαφορετικούσ τύπουσ δραςτικϐν ενϐςεων και 4) η μεγϊλη ευελιξύα ςτην ειςαγωγό ϊλλων μορύων ςτο νανο-υπόςτρωμα [54]. Οι διαφορϋσ που ϋχουν παρατηρηθεύ μεταξύ τησ διαλυτόσ χιτοζϊνησ και τησ χιτοζϊνησ ςε μορφό νανοςωματδύων μπορούν να προϋρχονται από 49

50 διαφορετικό μηχανιςμό αλληλεπύδραςησ με την οφθαλμικό βλεννογόνο. Για να διευκρινηςτεύ αυτόσ ο μηχανιςμόσ, χιτοζϊνη με φθορύζουςα επιςόμανςη τοποθετόθηκε ςε κουνϋλια ςε μορφό διαλύματοσ και νανοςωματιδιακό, και η ϋνταςη του φθοριςμού ςτον κερατοειδό και ςτον επιπεφυκότα αναλύθηκε με ομοεςτιακό μικροςκοπύα και φθοριςμομετρύα. Σα αποτελϋςματα ϋδειξαν ότι τα νανοςωματύδια χιτοζϊνησ μπορούν να αλληλεπιδρϊςουν ςτενϊ με τα επιθόλια του κερατοειδό και του επιπεφυκότα, εμφανύζοντασ μεγϊλη ςυγκρϊτηςη ςε ςχϋςη με το διϊλυμα χιτοζϊνησ. Μπόρεςαν επύςησ να διειςδύςουν μϋςα ςτο επιθόλιο του κερατοειδό. Γενικϊ τα αποτελϋςματα δεύχνουν τη μεγαλύτερη ςυγγϋνεια τησ χιτοζϊνησ ςτην οφθαλμικό επιφϊνεια όταν εύναι ςε μορφό νανοςωματιδύων, με ϋναν μηχανιςμό ειςαγωγόσ τουσ ςτο επιθόλιο του κερατοειδό που ςυνδιϊζει παρακυτταρικϋσ και διακυτταρικϋσ οδούσ. Αυτό η ςυμπεριφορϊ εύναι διαφορετκό από ϊλλα νανοςωματύδια όπωσ πολυ(αλκυλοκυανοακρυλικϐν) και πολυ(ε-καπρολακτόνησ), τα οπούα διαςχύζουν το επιθόλιο του κερατοειδούσ μόνο μϋςω τησ διακυτταρικόσ οδού. Παρόλα αυτϊ, η παρακυτταρικό οδόσ των νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ μπορεύ να εξηγηθεύ με την παρουςύα και διαλυτόσ χιτοζϊνησ ςτα ςκευϊςματα. Λαμβϊνοντασ υπόψη την ιςχυρό αλληλεπύδραςη των νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ με την οφθαλμικό βλεννογόνο και την ικανότητα τουσ να ειςχωρόςουν ςτα επιθηλιακϊ κύτταρα, εύναι ςημαντικό να αξιολογηθεύ εϊν η χιτοζϊνη μπορεύ να βιοαποικοδομηθεύ και να απομακρυνθεύ από τον οργανιςμό. Γενικϊ εύναι γνωςτό ότι βιοαποικοδομεύται από τη λυςοζύμη ταχϋωσ, η οπούα βρύςκεται ςε υψηλϋσ ςυγκεντρϐςεισ ςτισ βλεννογόνουσ και ςυγκεκριμϋνα ςτην οφθαλμικό [55]. Ένασ από τουσ κύριουσ παρϊγοντεσ που επηρεϊζουν τον ρυθμό βιοαποικοδόμηςησ τησ χιτοζϊνησ εύναι ο βαθμόσ αποακετυλύωςησ, που όςο μικρότεροσ εύναι τόςο γρηγορότερη η ενζυμικό υδρόλυςη [56]. Η βιοαποικοδομηςιμότητα τησ χιτοζϊνησ επιτρϋπει την αςφαλό τησ χορόγηςη και την αποικοδόμηςη τοπικϊ χορηγούμενων μορφϐν τησ. Όπωσ αναφϋρθηκε προηγουμϋνωσ, τα νανοςωματύδια μπορούν να αλληλεπιδρούν και να ειςχωρούν ςτα οφθαλμικϊ επιθηλιακϊ κύτταρα, παρϋχοντασ αυξημϋνη βιοδιαθεςιμότητα των ςυνδεδεμϋνων μορύων. Ωςτόςο, η αποτελεςματικότητα τουσ ωσ φορεύσ οφθαλμικόσ απελευθϋρωςησ ςχετύζεται με τισ φυςικοχημικϋσ τουσ ιδιότητεσ. Έχει βρεθεύ μύα ςχϋςη μεταξύ τησ ϋνταςησ 50

51 αυτόσ τησ μεταφορϊσ και του μεγϋθουσ καθϐσ και των επιφανειακϐν ιδιοτότων του φορϋα, ςε όρουσ φορτύου επιφϊνειασ και ςύςταςησ [57,58]. Η βιοδιαθεςιμότητα διϊφορων φαρμϊκων βελτιϐνεται με επικϊλυψη των νανοφορϋων με χιτοζϊνη, ςε ςχϋςη με μη-επικαλυμϋνουσ φορεύσ. Σα επικαλυμϋνα νανοςυςτόματα με χιτοζϊνη ϋχουν μεγϊλη προοπτικό για την χορόγηςη φαρμϊκων ςτην επιφϊνεια του ματιού, αφού ϋχει παρατηρηθεύ αύξηςη τησ θεραπευτικόσ ικανότητασ. Σα νανοςωματύδια επικαλυμμϋνα με χιτοζϊνη θα μπορούςαν εύτε να διευκολύνουν τη μεταφορϊ του φαρμϊκου ςτισ εςωτερικϋσ δομϋσ του οφθαλμού, ό να δραςουν ωσ δεξαμενό μετϊ την παροχό του φαρμϊκου ςτον κερατοειδό χιτϐνα [59]. Ένα από τα ενδιαφϋροντα χαρακτηριςτικϊ των νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ εύναι η δυνατότητα ειςαγωγόσ ϊλλων βιοπολυμερϐν ςτη δομό τουσ. Η ειςαγωγό ενόσ δεύτερου ςυςτατικού αυξϊνει ςημαντικϊ την ευελιξύα τουσ, οδηγϐντασ ςε φορεύσ με βελτιωμϋνεσ ιδιότητεσ, όχι μόνο ςε όρουσ ςύνδεςησ και απελευθϋρωςησ φαρμϊκων, αλλϊ και ςχετικϊ με την ικανότητα τουσ να αλληλεπιδρούν με βιολογικϋσ επιφϊνειεσ. Έχει υποτεθεύ ότι η τροποπούηςη τησ χιτοζϊνησ με λιπύδια θα μπορούςε να ευνοόςει την αλληλεπύδραςη των φορϋων με κυτταρικϋσ μεμβρϊνεσ. Πολυμερικϊ αμφύφιλα, αποτελούμετα από υδρόφοβα και υδρόφιλα τμόματα, ϋχουν τραβόξει την προςοχό ςτο τομϋα τησ απελευθϋρωςησ φαρμϊκων επειδό μπορούν να ςχηματύςουν αυτο-οργανωμϋνα νανοςωματύδια με μοναδικϋσ φυςικοχημικϋσ ιδιότητεσ, όςον αφορϊ δομικϊ και θερμοδυναμικϊ χαρακτηριςτικϊ [60]. Σα νανοςωματύδια χιτοζϊνησ ενςωματϐνονται ςτο επιθόλιο του κερατοειδούσ για την αντιμετϐπιςη οφθαλμικϐν διαταραχϐν μϋςω ενδοκυττϊρωςησ. Έχει παρατηρηθεύ ότι όταν τα νανοςωματύδια χιτοζϊνησ ενςταλϊζονται τοπικϊ ςτην οφθαλμικό επιφϊνεια, η απορρόφηςη τουσ λαμβϊνει χϐρα ςτον κερατοειδό και τον επιπεφυκότα καθϐσ ειςϋρχονται ςτο επιθηλιακό ςτρϐμα και αφομοιϐνονται από αυτούσ τουσ αδϋνεσ. Αποδύδουν μεγϊλο ποςό του φαρμϊκου ςτο ςημεύο-ςτόχοσ επεκτεύνοντασ την ςύνδεςη τουσ ςτην οφθαλμικό επιφϊνεια και διαμοιρϊζονται ςτουσ οφθαλμικούσ ιςτούσ μϋςω παρακυτταρικϐν οδϐν. Επιπλϋον μελϋτεσ ϋδειξαν ότι τα νανοςωματύδια χιτοζϊνησ παραμϋνουν ςυνδεδεμϋνα με το οφθαλμικό επιθόλιο για μεγαλύτερη 51

52 περύοδο όταν ςυνδιϊζονται με υαλουρονικό οξύ, καθϐσ και τα δύο βιοπολυμερό ϋχουν βλενοςυγκολλητικό φύςη και εκτεταμϋνο χρόνο παραμονόσ ςτον κερατοειδό [61]. το χόμα 1.25 αναπαριςτϊται η παραςκευό νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ με ιοντικό πηκτωματοπούηςη καθϐσ και η πορεύα τουσ ςτουσ οφθαλμικούσ ιςτούσ. χόμα 1.25: Παραςκευό νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ με ιοντικό πηκτωματοπούηςη και η πορεύα τουσ ςτουσ οφθαλμικούσ ιςτούσ 52

53 υμπεραςματικϊ μπορούμε να πούμε ότι: 1. Οι νανοδομϋσ χιτοζϊνησ ϋχουν καλύτερη ςυγκρϊτηςη ςτο μϊτι από τα διαλύματατα χιτοζϊνησ, 2. Διϊφορεσ νανοδομϋσ χιτοζϊνησ μπορούν να παραςκευαςτούν ανϊλογα με τον τύπο του φαρμϊκου, από λιπόφιλα φϊρμακα χαμηλού μοριακού βϊρουσ μϋχρι πεπτύδια μεςαύου μεγϋθουσ και μεγϊλα γονύδια, 3. Διαφορετικϋσ νανοδομϋσ χιτοζϊνησ ϋχουν εμφανύζει δυνατότητα ειςχϐρηςησ ςτα επιθόλια του κερατοειδό και του επιπεφυκότα, 4. Οι δομϋσ αυτϋσ αυξϊνουν αποτελεςματικϊ την διεύςδυςη των φαρμϊκων, 5. Προκαταρκτικϊ δεδομϋνα δεύχνουν καλό ανοχό και δεκτικότητα αυτϐν των δομϐν τοξικολογικϊ [62]. 53

54 1.5 Τιμολόλη Η κατηγοριοπούηςη των δραςτικϐν ουςιϐν, όπωσ καθορύζεται από το ύςτημα Κατηγοριοπούηςησ Υαρμακευτικϐν κευαςμϊτων (Biopharmaceutics Classification System, BCS), αποτελεύ ϋναν οδηγό για την πρόβλεψη τησ απορρόφηςησ μιασ ενεργού ουςύασ ςτο γαςτρεντερικό ςύςτημα όπωσ ορύςτηκε από τον αντύςτοιχο Αμερικανικό Οργανιςμό Σροφύμων και Υαρμϊκων (U.S Food and Drug Administration, FDA) Οι βαςικϋσ αρχϋσ του ςυςτόματοσ BCS ορύςτηκαν από τον Dr. Gordon Amidon, ςτον οπούο και δόθηκε βραβεύο διϊκριςησ τον Αύγουςτο του 2006 από τη Διεθνό Υαρμακευτικό Ομοςπονδύα (International Pharmaceutical Federation-FIP) ςε ςυνϋδριο ςτο αλβαδόρ τησ Βραζιλύασ. Σο ςύςτημα αυτό ϋχει τη δυνατότητα να περιορύζει και ϊρα να κϊνει πιο ςυγκεκριμϋνη και πιο ςύγουρη την πρόβλεψη για την ικανότητα και ευκολύα μορφοπούηςησ ενόσ ςκευϊςματοσ χρηςιμοποιϐντασ τισ παραμϋτρουσ τησ διαλυτότητασ και τησ διαπερατότητασ τησ δραςτικόσ ςτο γαςτρεντερικό ςωλόνα.η κατϊταξη με βϊςη τη διαλυτότητα ςτηρύζεται ςτην Αμερικανικό Υαρμακοποιύα (USP). Η κατϊταξη ςύμφωνα με τη διαπερατότητα τησ δραςτικόσ ςτο γαςτρεντερικό ςύςτημα βαςύζεται ςτη ςύγκριςη με την ενϋςιμη ενδοφλϋβια χορόγηςη. Όλοι αυτού οι παρϊγοντεσ εύναι ιδιαύτερα ςημαντικού, καθϐσ το 85% των δραςτικϐν, με τισ περιςςότερεσ πωλόςεισ ςτην Αμερικό και την Ευρϐπη, αποτελούν ςκευϊςματα τα οπούα χορηγούνται από το ςτόμα. ύμφωνα λοιπόν με το ύςτημα Κατηγοριοπούηςησ Υαρμακευτικϐν κευαςμϊτων (Biopharmaceutics Classification System), οι φαρμακευτικϊ δραςτικϋσ ουςύεσ κατηγοριοποιούνται ωσ εξόσ: Κατηγορύα I Τψηλό Διαπερατότητα, Τψηλό Διαλυτότητα Οι ουςύεσ αυτϋσ παρουςιϊζουν καλό απορρόφηςη. Η ταχύτητα απορρόφηςησ εύναι ςυνόθωσ υψηλότερη ςε ςχϋςη με την ταχύτητα απϋκκριςησ. Κατηγορύα II - Τψηλό Διαπερατότητα, Φαμηλό Διαλυτότητα Η βιοδιαθεςιμότητα αυτϐν των φαρμακευτικϐν ςυςτατικϐν περιορύζεται από την περιοριςμϋνη ταχύτητα διαλυτοπούηςησ. Μια ςυςχϋτιςη μεταξύ τησ in vivo βιοδιαθεςιμότητασ και τησ in vitro διαλυτοπούηςησ εύναι δυνατόν να προςδιοριςτεύ. 54

55 Κατηγορύα III - Φαμηλό Διαπερατότητα, Τψηλό Διαλυτότητα Η απορρόφηςη εύναι περιοριςμϋνη αλλϊ η δραςτικό ουςύα διαλύεται ταχύτατα. Αν δεν εύναι δυνατό η αλλαγό τησ μορφοπούηςησ ςε ςχϋςη με τη διαπερατότητα ό τη χρονικό διϊρκεια παραμονόσ ςτο γαςτρεντερικό ςύςτημα τότε τα κριτόρια τησ κατηγορύασ I μπορούν να εφαρμοςτούν. Κατηγορύα IV - Φαμηλό Διαπερατότητα, Φαμηλό Διαλυτότητα Οι ουςύεσ αυτϋσ παρουςιϊζουν φτωχό βιοδιαθεςιμότητα. υνόθωσ δεν απορροφούνται ικανοποιητικϊ ςτο γαςτρεντερικό ςύςτημα και ςυνόθωσ αναμϋνεται ςημαντικό διακύμανςη αποτελεςμϊτων. Η μηλεώνικό τιμολόλη ((S)-1-(tert-butylamino)-3-[(4-morpholin-4-yl- 1,2,5-thiadiazol-3-yl)oxy]propan-2-ol) εύναι ϋνασ μη-εκλεκτικόσ ανταγωνιςτόσ β- αδρενεργικϐν υποδοχϋων και ενδεύκνυται για τη θεραπεύα του γλαυκϐματοσ, των καρδιακϐν προςβολϐν και τησ υπϋρταςησ. Η μεγϊλη τησ υδατοδιαλυτότητα την κατατϊςςει ςτην κατηγορύα ΙΙΙ, γεγονόσ που υποδεικνύει την παραςκευό φαρμακευτικϐν ςκευαςμϊτων με την μορφό νανοςωματιδύων ϐςτε να βοηθόςει ςτην αύξηςη τησ βιοδιαθεςιμότητασ τησ. χόμα 1.26: το μόριο τησ τιμολόλησ 55

56 χόμα 1.27: Εμπορικϋσ μορφϋσ τησ τιμολόλησ ςε μορφό οφθαλμικϐν ςταγόνων Χρόςεισ και χαπιϐν ε μορφό χαπιού η τιμολόλη χρηςιμοποιεύται για την θεραπεύα υψηλόσ αρτηριακόσ πύεςησ, για την πρόληψη καρδιακϐν προςβολϐν καθϐσ και ημικρανιϐν. την οφθαλμικό τησ μορφό χρηςιμοποιεύται για την θεραπεύα του γλαυκϐματοσ, μειϐνοντασ τη παραγωγό του υδατοειδούσ υγρού μϋςω παρακϐλυςησ των β-υποδοχϋων ςτο βλεφαρικό επιθόλιο. Ο φαρμακολογικόσ μηχανιςμόσ αυτόσ τησ δρϊςησ εύναι ακόμα ϊγνωςτοσ. Ήταν ο πρϐτοσ β- αποκλειςτόσ που εγκρύθηκε για τοπικό χρόςη ςτην θεραπεύα του γλαυκϐματοσ ςτισ ΗΠΑ το Σο γλαύκωμα εύναι μια προοδευτικό οπτικό νευροπϊθεια με χαρακτηριςτικϋσ μεταβολϋσ τησ κεφαλόσ του οπτικού νεύρου και μειϐςεισ ςτην ευαιςθηςύα του αμφιβληςτροειδούσ που οδηγούν ςε απϐλεια τησ όραςησ. Έχει ειπωθεύ ότι υπϊρχουν περύπου 14 εκατομμύρια αςθενεύσ με γλαύκωμα ςτην Ινδύα, 67 εκατομμύρια ϊνθρωποι ςε όλο τον κόςμο και η νόςοσ μετρϊ την δεύτερη θϋςη όςον αφορϊ την τυχαύα τύφλωςη. Για τη θεραπεύα του γλαυκϐματοσ, η καθημερινό χρόςη οφθαλμικϐν διαλυμϊτων διαδραματύζει ςημαντικό ρόλο. Μόλισ διαγνωςτεύ η νόςοσ, η θεραπεύα που απαιτεύται εύναι να ςταματόςει η προοδευτικό βλϊβη και γενικϊ η ιατρικό θεραπεύα εύναι η πρϐτη θεραπευτικό προςϋγγιςη. Οι β-αδρενεργικού ανταγωνιςτϋσ όπωσ η 56

57 μηλεώνικό τιμολόλη ϋχουν ληφθεύ υπόψη για πολλϊ χρόνια, ωσ τα φϊρμακα επιλογόσ ςτισ περιςςότερεσ περιπτϐςεισ γλαυκϐματοσ. Η μηλεώνικό τιμολόλη όταν ο πρϐτοσ β-αδρενεργικόσ αποκλειςτόσ που χρηςιμοποιόθηκε ωσ ανταγωνιςτόσ του γλαυκϐματοσ και μϋχρι ςόμερα επικρατεύ, επειδό κανϋνασ από τουσ νεότερουσ β- αποκλειςτϋσ δεν εύναι πιο αποτελεςματικόσ. Η μηλεώνικό τιμολόλη ϋχει το μεγαλύτερο ρεκόρ τησ αςφϊλειασ και τησ αποτελεςματικότητασ ςε χαμηλότερεσ ενδοφθαλμικϋσ πιϋςεισ και χορηγεύται μϋςω οφθαλμικϐν ςταγόνων μύα ό περιςςότερεσ φορϋσ ανϊ ημϋρα [63]. Ένα κρύςιμο βόμα εύναι να αναπτυχθεύ μύα φόρμουλα για την μηλεώνικό τιμολόλη που να οδηγεύ ςε ϊμεςη απελευθϋρωςη με αποτϋλεςμα την μεύωςη τησ ενδοφθϊλμιασ πύεςησ ςε αςθενεύσ με αρχό του γλαυκϐματοσ Φυςικοχημικϋσ και φαρμακολογικϋσ ιδιότητεσ Η μηλεώνικό τιμολόλη παραςκευϊζεται μϋςω μιασ ςειρϊσ διαφόρων ςυνθετικϐν ςταδύων που αρχύζει με την D-μαννιτόλη και ακετόνη. Ανόκει ςτην κατηγορύα ενϐςεων του θειαδιαζολύου. Σο μοριακό τησ βϊροσ εύναι 432,49g/mol και η pka τησ 9,21. Εύναι μύα λευκό, ϊοςμη και κρυςταλλικό ςκόνη με ςημεύο τόξησ 202 0,5 C. Η μηλεώνικό τιμολόλη εύναι ϋνασ αδρενεργικόσ β-αναςτολϋασ ο οπούοσ εύναι μη-εκλεκτικόσ μεταξύ των β-1 και β-2 αδρενεργικϐν υποδοχϋων. Εύναι αποτελεςματικό ςτη μεύωςη τησ ενδοφθϊλμιασ πύεςησ και χρηςιμοποιεύται ςε αςθενεύσ με γλαύκωμα. Η μηλεώνικό τιμολόλη ενδεύκνυται επύςησ τόςο για τη θεραπεύα τησ υπϋρταςησ (μόνη ό ςε ςυνδυαςμό με ϊλλα θειαζιδικϊ διουρητικϊ) καθϐσ και ςτη μεύωςη τησ καρδιαγγειακόσ θνηςιμότητασ και ςτον κύνδυνο τησ επανεμφρϊξεωσ ςε αςθενεύσ που ϋχουν επιβιϐςει από την οξεύα φϊςη του εμφρϊγματοσ του μυοκαρδύου και οι οπούοι εύναι κλινικϊ ςταθερού. Διατύθενται για δοςολόγηςη από το ςτόμα μϋςω διςκύων και ςε ϋνεςη για οφθαλμικό δοςολόγηςη ωσ διακριτϊ αποςτειρωμϋνα υδατικϊ διαλύματα, τα οπούα εύναι ςυνόθωσ καλϊ ανεκτϊ με τισ περιςςότερεσ ανεπιθύμητεσ ενϋργειεσ οι οπούεσ εύναι όπιεσ και παροδικϋσ. Αποκλεύει τόςο τουσ β-1 όςο και τουσ β-2 αδρενεργικούσ υποδοχεύσ, μειϐνει την ενδοφθϊλμια πύεςη μειϐνοντασ την παραγωγό του υδατικού χυμού ό, ενδεχομϋνωσ, την εκροό. Επύςησ, μειϐνει την 57

58 πύεςη του αύματοσ αναςτϋλλοντασ τουσ αδρενεργικούσ υποδοχεύσ και μεύωνει την εκροό, παρϊγοντασ μια αρνητικό χρονοτροπικό και ινοτροπικό δρϊςη μϋςα από ϋναν ϊγνωςτο μηχανιςμό. Η μηλεώνικό τιμολόλη απορροφϊται ταχϋωσ και πλόρωσ μετϊ από ςτοματικό χορόγηςη. Οι μϋγιςτεσ ςυγκεντρϐςεισ ςτο πλϊςμα του αύματοσ που κυμαύνονται από 10 ng/ml ϋωσ 100 ng / ml επιτυγχϊνονται εντόσ 1 ϋωσ 2,4 ϐρεσ μετϊ εύτε οξεύα ό χρόνια χορόγηςη των 2,5 mg ϋωσ 20 mg μηλεώνικόσ τιμολόλησ δύο φορϋσ ημερηςύωσ. Η βιοδιαθεςιμότητα τησ μηλεώνικόσ τιμολόλησ από του ςτόματοσ αναφϋρεται ότι εύναι 61% ϋωσ 75% ωσ ενδοφλϋβια δόςη αναφορϊσ. Βιοδιαθεςιμότητα μικρότερη από 100% αποδύδεται ςε προηγούμενεσ πρϐτεσ μεταβολικϋσ εκχύλιςεισ από το όπαρ μετϊ την από του ςτόματοσ χορόγηςη και όχι λόγω ατελόσ απορρόφηςη από το γαςτρεντερικό. Η επύδραςη τησ τροφόσ ςτο ρυθμό και την ϋκταςη τησ απορρόφηςησ τησ μηλεώνικόσ τιμολόλησ από το ςτόμα δεν εύναι ςημαντικό Αντενδεύξεισ και ανεπιθύμητεσ ενϋργειεσ Αςθενεύσ με βραδυκαρδύα, κομβικό δυςλειτουργύα, καρδιακό αποκλειςμό μεγαλύτερο από το πρϐτο επύπεδο (εκτόσ από τουσ αςθενεύσ με ϋνα λειτουργικό τεχνητό βηματοδότη), καρδιογενϋσ ςοκ, μη αντιρροπούμενη καρδιακό ανεπϊρκεια, βρογχοςπαςτικό νόςο και ςτην διϊρκεια τησ εγκυμοςύνησ παρουςιϊζουν υπερευαιςθηςύα ςτην τιμολόλη. Οι ανεπιθύμητεσ ενϋργειεσ περιλαμβϊνουν: Οφθαλμικϋσ: Κϊψιμο, τςούξιμο, θολό όραςη, καταρρϊκτησ, ερεθιςμόσ του επιπεφυκότα, κνηςμόσ, μειωμϋνη οπτικό οξύτητα Καρδιαγγειακϋσ: Τπϋρταςη, Βραδυκαρδύα Κεντρικό νευρικό ςύςτημα: κεφαλαλγύα Λούμωξη Κεντρικό νευρικό ςύςτημα: Κόπωςη, ζϊλη, ναυτύα και ϋμετοσ Αναπνευςτικό: δύςπνοια Σα ςυμπτϐματα τησ δηλητηρύαςησ από τιμολόλη περιλαμβϊνουν: καρδιακϋσ διαταραχϋσ, βρογχόςπαςμο, υπογλυκαιμύα και υπερκαλιαιμύα. Σα πιο 58

59 κοινϊ καρδιακϊ ςυμπτϐματα περιλαμβϊνουν υπόταςη και βραδυκαρδύα. Κολποκοιλιακό ανεπϊρκεια, ενδοκοιλιακϋσ διαταραχϋσ τησ αγωγιμότητασ, καρδιογενϋσ ςοκ και αςυςτολύα μπορούν να ςυμβούν με μια ςοβαρό υπερδοςολογύα, ειδικϊ με καταπραώντικϊ φϊρμακα (π.χ. προπρανολόλη). Επιδρϊςεισ ςτο κεντρικό νευρικό ςύςτημα, ςυμπεριλαμβανομϋνου ςπαςμϐν, κϐμα, αναπνευςτικό ανακοπό ϋχουν εμφανιςτεύ με την χρόςη τησ προπρανολόλησ και ϊλλων καταθλιπτικϐν και λιποδιαλυτϐν φϊρμακων. 59

60 1.6 Βαςικϋσ αρχϋσ μεθόδων Για τον χαρακτηριςμό των πολυμερϐν που ςυντϋθηκαν καθϐσ και των νανοςωματιδύων που παραςκευϊςτηκαν, χρηςιμοποιόθηκαν τόςο φυςικοχημικϋσ όςο και φαρμακοτεχνικϋσ μϋθοδοι ελϋγχου. το ςημεύο αυτό κρύνεται ςκόπιμο να παρατεθούν ςυνοπτικϊ οι αρχϋσ λειτουργύασ των κυριότερων μεθόδων χαρακτηριςμού Ηλεκτρονικό Μικροςκοπύα Η ηλεκτρονικό μικροςκοπύα (Electron Microscopy, EM), ωσ μϋθοδοσ για την ϊμεςη απεικόνιςη υπομικροςκοπικϐν δομϐν, ϋχει αποκτόςει ςημαντικό και ςυνεχϐσ αυξανόμενη ςημαςύα τισ τελευταύεσ δεκαετύεσ. Περιλαμβϊνει αρκετϋσ διαφορετικϋσ τεχνικϋσ, όπωσ η τυπικό ηλεκτρονικό μικροςκοπύα διερχόμενησ δϋςμησ (Transmission Electron Microscopy, TEM), η υψηλόσ ανϊλυςησ ηλεκτρονικό μικροςκοπύα (High-Resolution Electron Microscopy, HREM), η υψηλόσ τϊςησ ηλεκτρονικό μικροςκοπύα (High-Voltage Electron Microscory,HVEM), η ηλεκτρονικό μικροςκοπύα ςϊρωςησ (Scanning Electron Microscopy, SEM), η αναλυτικό ηλεκτρονικό μικροςκοπύα (Analytical Electron Microscopy, AEM) κ.λπ. το παρελθόν, ο κεντρικόσ ςτόχοσ τησ χρόςησ τησ ηλεκτρονικόσ μικροςκοπύασ όταν ο προςδιοριςμόσ τησ δομόσ, αλλϊ πρόςφατα ϋχει αποκτόςει όλο και μεγαλύτερη αξύα για την εξϋταςη διαφόρων διεργαςιϐν, όπωσ αλλαγϋσ ςε υλικϊ κατϊ την αλληλεπύδραςη με διϊφορουσ παρϊγοντεσ όπωσ π.χ. θερμότητα, ηλεκτρικϊ και μαγνητικϊ πεδύα, μηχανικό φόρτιςη κ.λπ. Ιδιαύτερο ενδιαφϋρον παρουςιϊζει η μελϋτη των μικρομηχανικϐν διεργαςιϐν τησ παραμόρφωςησ και τησ θραύςησ. Η ηλεκτρονικό μικροςκοπύα μπορεύ να χωριςτεύ ςτισ τεχνικϋσ τησ ηλεκτρονικόσ μικροςκοπύασ διερχόμενησ δϋςμησ και τησ ϊμεςησ απεικόνιςησ των επιφανειϐν. Έτςι η κύρια τεχνικό που χρηςιμοποιεύται για την ϊμεςη εξϋταςη επιφανειϐν εύναι η ηλεκτρονικό μικροςκοπύα ςϊρωςησ (SEM). Μια εςτιαςμϋνη δϋςμη ηλεκτρονύων, με επιταχυντικό διαφορϊ δυναμικού από 0,1 ϋωσ 50 kv, ςαρϐνει γραμμό προσ γραμμό την επιφϊνεια του δεύγματοσ. το προςπύπτων ςημεύο των αρχικϐν ηλεκτρονύων, εκπϋμπονται δευτερογενό 60

61 ηλεκτρόνια, επιπροςθϋτωσ πολλϐν ϊλλων αλληλεπιδρϊςεων τησ δϋςμησ των ηλεκτρονύων με το δεύγμα, όπωσ φαύνεται παρακϊτω. χόμα 1.28: Γενικό ςχεδιϊγραμμα τησ τεχνικόσ SEM. Η ϋνταςη των δευτερογενϐν ηλεκτρονύων εξαρτϊται από την τοπογραφύα τησ επιφϊνειασ, όπωσ τη γωνύα μεταξύ τησ κατεύθυνςησ τησ αρχικόσ δϋςμησ των ηλεκτρονύων και τησ επιφϊνειασ. Ο αριθμόσ των δευτερογενϐν ηλεκτρονύων καθορύζουν τη λαμπρότητα μιασ οθόνησ προβολόσ, η οπούα ελϋγχεται από τον ύδιο γεννότορα ςϊρωςησ όπωσ και η δϋςμη των αρχικϐν ηλεκτρονύων. Έτςι, περιοχϋσ με μεγαλύτερη ϋνταςη δευτερογενϐν ηλεκτρονύων εμφανύζονται λαμπρότερα ςτην οθόνη προβολόσ από ϊλλεσ. Αυτό αποφϋρει εικόνεσ SEM με ϋνα καλό βαθμό διαφορϊσ ςκοτεινού και ςκούρου, μια πολύ καλό ορατότητα των λεπτομερειϐν ςτο χϐρο και μεγϊλο βϊθοσ εςτύαςησ, κατϊ ϋνα παρϊγοντα περύπου εκατό μεγαλύτερο, από ότι ςτην οπτικό-φωτόσ απεικόνιςη. Η μεγϋθυνςη επιτυγχϊνεται από την αναλογύα του μεγϋθουσ τησ οθόνησ προβολόσ ςε ςχϋςη με το μϋγεθοσ τησ επιφανειακόσ περιοχόσ του δεύγματοσ που ςαρϐνεται, και μπορεύ να μεταβληθεύ εύκολα από περύπου 5 ϋωσ υνεπϐσ η διακριτικό ικανότητα τησ SEM βρύςκεται μεταξύ αυτόσ τησ οπτικόσ μικροςκοπύασ φωτόσ και τησ TEM. Η τεχνικό SEM παρουςιϊζει ϋνα βαςικό πλεονϋκτημα, διότι, γενικϊ δεν απαιτούνται ιδιαύτερεσ προετοιμαςύεσ για την πραγματοπούηςη μορφολογικϐν 61

62 εξετϊςεων ςτα δεύγματα. Εν τούτοισ, για μη αγϐγιμα υλικϊ, όπωσ πολυμερό, εύναι αναγκαύα η απόθεςη ενόσ λεπτού αγϐγιμου ςτρϐματοσ μετϊλλου ό ϊνθρακα, με εξϊτμιςη υπό κενό ό βομβαρδιςμό με τα ςωματύδια. Εξαιτύασ τησ αλληλεπύδραςησ τησ αρχικόσ δϋςμησ ηλεκτρονύων και του δεύγματοσ, ϋνασ αριθμόσ και ϊλλων ςημϊτων, εκτόσ τησ εκπομπόσ δευτεροταγϐν ηλεκτρονύων, εύναι δυνατό να εμφανιςτούν, και να αποφϋρουν ςυγκεκριμϋνεσ πληροφορύεσ για το δεύγμα. Πιο ςημαντικό εύναι ο προςδιοριςμόσ των ακτύνων Φ, επιτρϋποντασ ϋτςι την ποιοτικό και ποςοτικό ανϊλυςη των ςτοιχεύων (EDX, Energy Dispersive analysis of X-rays, ανϊλυςη διαςπορϊσ ενϋργειασ των ακτύνων Φ). χόμα 1.29: Αλληλεπιδρϊςεισ μεταξύ τησ προςπύπτουςασ δϋςμησ των ηλεκτρονύων και των μορύων του δεύγματοσ Σο ηλεκτρονικό μικροςκόπιο διαπερατότητασ (High Resolution Transmitting Electron Microscopy HR-TEM) εύναι ϋνα μικροςκόπιο ςτο οπούο μύα δϋςμη ηλεκτρονύων διϋρχεται μϋςα από δεύγμα και κατϊ τη διϋλευςό του αλληλεπιδρϊ με αυτό. Από την μεταξύ τουσ αλληλεπύδραςη προκύπτει εικόνα η οπούα μεγεθύνεται και καταγρϊφεται από το καταγραφικό. Σο HR-TEM ϋχει υψηλότερη ανϊλυςη από τα υπόλοιπα μικροςκόπια οφειλόμενη ςτο μόκοσ 62

63 κύματοσ de Broglie των ηλεκτρονύων. Αυτό δύνει την ικανότητα να εξεταςτούν λεπτομϋρειεσ του δεύγματοσ τόςο μικρϋσ όςο και η διαμόρφωςη των ατόμων. Η αρχό λειτουργύασ του ηλεκτρονικού μικροςκοπύου διαπερατότητασ εύναι η ύδια με την αρχό λειτουργύασ του ηλεκτρονικού μικροςκοπύου ςϊρωςησ με τη διαφορϊ ότι ςτην πρϐτη πραγματοποιεύται διϋλευςη των ηλεκτρονύων μϋςα από το δεύγμα, ενϐ ςτη δεύτερη πραγματοποιεύται ανϊκλαςη των ηλεκτρονύων ςτο δεύγμα. χόμα 1.30: Ηλεκτρονικό μικροςκόπιο SEM τύπου Jeol (JMS-840) Δυναμικό ςκϋδαςη φωτόσ (DLS) Σο μϋγεθοσ των ςωματιδύων και το ζ-δυναμικό τουσ εύναι φυςικϊ μεγϋθη που δύνουν ςημαντικϋσ πληροφορύεσ για τη ςταθερότητα των παραγόμενων γαλακτωμϊτων ό διαςπορϐν. Σο μϋγεθοσ των ςωματιδύων μετριϋται με τη χρόςη τησ δυναμικόσ ςκϋδαςησ φωτόσ (Dynamic Light Scattering DLS). ύμφωνα με την τεχνικό αυτό μετρϊται η διακύμανςη τησ ϋνταςησ του ςκεδαζόμενου φωτόσ ςυναρτόςει του χρόνου, η οπούα οφεύλεται ςτην κύνηςη κατϊ Brownian των ςωματιδύων. Με βϊςη την ανϊλυςη τησ διακύμανςησ τησ ϋνταςησ, υπολογύζεται ο ςυντελεςτόσ διϊχυςησ των ςωματιδύων ο οπούοσ μετατρϋπεται ςε κατανομό μεγϋθουσ. Μύα τυπικό διϊταξη DLS φαύνεται ςτο χόμα. 63

64 χόμα 1.31: Συπικό διϊταξη DLS. Σο φωσ από την πηγό laser φωτύζει το δεύγμα το οπούο βρύςκεται ςτο κελύ-υποδοχϋα. Σο διεςπαρμϋνο φωσ ςυλλϋγεται από δύο ανιχνευτϋσ, από τον ανιχνευτό ο οπούοσ βρύςκεται ςε γωνύα 90ο ςε ςχϋςη με το δεύγμα (ανιχνευτόσ ορθόσ γωνύασ) και από τον ανιχνευτό ο οπούοσ βρύςκεται ςε γωνύα 173ο ςε ςχϋςη με το δεύγμα (ανιχνευτόσ οπύςθιασ γωνύασ). Η θϋςη των δύο ανιχνευτϐν εύναι κατϊλληλη για την επιλογό των ςυνθηκϐν μϋτρηςησ, όπωσ υγρό διαςπορϊσ και ιξϐδεσ διαλύματοσ. Σο ζ-δυναμικό ενόσ ςωματιδύου εύναι το ςυνολικό φορτύο που φϋρει το ςωματύδιο όταν βρύςκεται ςε ςυγκεκριμϋνο μϋςο. Κϊθε ςωματύδιο το οπούο βρύςκεται ςε κατϊςταςη διαςπορϊσ ςε ϋνα διϊλυμα, περιςτοιχύζεται από αντύθετα φορτιςμϋνα ςωματύδια τα οπούα ςχηματύζουν μύα καθοριςμϋνη ςτοιβϊδα. Η ςτοιβϊδα αυτό περιςτοιχύζεται από αντύθετα φορτιςμϋνα ιόντα με διϊφορεσ περιεκτικότητεσ τα οπούα ςχηματύζουν μύα δεύτερη ςτοιβϊδα. Και οι δύο ςτοιβϊδεσ μαζύ αποτελούν μύα διπλό ςτιβϊδα διϊχυςησ η οπούα εύναι ηλεκτρικϐσ ουδϋτερη. Όταν εφαρμόζεται δυναμικό ςτο διϊλυμα διαςπορϊσ, τα ςωματύδια μετακινούνται προσ το αντύθετα φορτιςμϋνο ηλεκτρόδιο ςυνοδευόμενα από την καθοριςμϋνη ςτοιβϊδα και μϋροσ τησ διαχεόμενησ διπλόσ ςτοιβϊδασ. Μετριϋται με την τεχνικό τησ ροομετρύασ laser κατϊ Doppler. ύμφωνα με την τεχνικό αυτό εφαρμόζεται δυναμικό ςε δύο ηλεκτρόδια τα οπούα βρύςκονται βυθιςμϋνα ςτη διαςπορϊ των ςωματιδύων. Σα φορτιςμϋνα ςωματύδια ϋλκονται από τα αντιθϋτωσ φορτιςμϋνα ηλεκτρόδια και μετρϊται η 64

65 ταχύτητα με την οπούα κινούνται προσ τα δύο ηλεκτρόδια, η οπούα εκφρϊζεται ςε μονϊδεσ δύναμησ πεδύου ωσ ηλεκτροφορητικό κινητικότητα. Σο μϋγεθοσ του ζ-δυναμικού αποτελεύ ϋνδειξη τησ ςταθερότητασ του κολλοειδούσ ςυςτόματοσ. Αν όλα τα ςωματύδια ϋχουν υψηλό θετικό ό αρνητικό ζ-δυναμικό, απωθούνται μεταξύ τουσ και το αιϐρημα διατηρεύται ςταθερό. Αν τα ςωματύδια ϋχουν χαμηλό ζ-δυναμικό δεν υπϊρχει δύναμη ικανό να τα απωθόςει ϐςτε να μην ϋρθουν ςε επαφό μεταξύ τουσ, με αποτϋλεςμα να ςυςςωματϐνονται οδηγϐντασ ςε αςταθό διαςπορϊ. ωματύδια με τιμϋσ ζ- δυναμικού υψηλότερεσ του +30mV και μικρότερεσ του -30mV θεωρεύται ότι ςχηματύζουν ςταθερό διαςπορϊ. χόμα 1.32: όργανο μϋτρηςησ μεγϋθουσ ςωματιδύων και ζ-δυναμικού τησ Malvern Φαςματοςκοπύα Υπερύθρου με ανϊλυςη Fourier (FT-IR) Η βαςικό αρχό τησ φαςματοςκοπύασ υπερύθρου εύναι η ολικό ό μερικό απορρόφηςη οριςμϋνων ςυχνοτότων του φωτόσ, όταν αυτό διϋλθει μϋςω ενόσ δεύγματοσ. υνεπϐσ, μετρϐντασ τισ % μεταβολϋσ ςτο υπϋρυθρο φωσ που εξϋρχεται από το δεύγμα ςαν ςυνϊρτηςη του μόκουσ κύματοσ ό τησ ςυχνότητασ, λαμβϊνεται αυτό που καλεύται φϊςμα απορρόφηςησ. Η απορροφημϋνη ακτινοβολύα αντιςτοιχεύ ςτην ενϋργεια που απαιτεύται για δονόςεισ των ατόμων που ςυνιςτούν το μόριο. Άρα, κϊθε διαφορετικό μόριο δύνει το δικό του χαρακτηριςτικό φϊςμα απορρόφηςησ, το οπούο μπορεύ να παρομοιαςτεύ με το δακτυλικό αποτύπωμα του μορύου. 65

66 H υπϋρυθρη ακτινοβολύα που απορροφϊται από ϋνα μόριο ςε ςυχνότητεσ μικρότερεσ των 100 cm -1, μετατρϋπεται ςε ενϋργεια μοριακόσ περιςτροφόσ δεςμϐν (energy of molecular rotation). Αντύςτοιχα η υπϋρυθρη ακτινοβολύα που απορροφϊται από ϋνα μόριο μεταξύ cm -1 μετατρϋπεται ςε ενϋργεια μοριακόσ δόνηςησ δεςμϐν (energy of molecular vibration). χόμα 1.33: Μερικϋσ επιτρεπτϋσ μορφϋσ δονόςεων και κϊμψεων. Η ςυχνότητα ό το μόκοσ κύματοσ μιασ απορρόφηςησ εξαρτϐνται από τισ ςχετικϋσ μϊζεσ των ατόμων, τισ ςταθερϋσ ιςχύοσ δεςμϐν και τη γεωμετρύα των ατόμων. Οι διϊφορεσ θϋςεισ ςτο φϊςμα IR χαρακτηρύζονται ωσ μονϊδεσ μόκουσ κύματοσ, η μονϊδα των οπούων εύναι το cm -1 (κυματαριθμόσ). Τπϊρχουν δύο τύποι μοριακϐν δονόςεων: η δόνηςη τϊςησ και δόνηςη κϊμψησ. Η δόνηςη τϊςησ περιλαμβϊνει τη ρυθμικό κύνηςη κατϊ μόκοσ του ϊξονα του δεςμού, ϋτςι ϐςτε η απόςταςη μεταξύ των ατόμων να αυξϊνεται ό να μειϐνεται υπό μορφό ταλϊντωςησ. Κατϊ τη δόνηςη κϊμψησ παρατηρεύται εύτε μεταβολό ςτη γωνύα δύο δεςμϐν με κοινό ϊτομο, εύτε μετακύνηςη μιασ ομϊδασ ατόμων ωσ προσ το υπόλοιπο του μορύου υπό την προώπόθεςη ότι τα ϊτομα τησ εν κινόςει ομϊδασ μϋνουν ακύνητα το ϋνα ωσ προσ το ϊλλο. Η περιοχό εφαρμογϐν τησ φαςματοςκοπύασ υπερύθρου ϋχει επεκταθεύ ςημαντικότατα τισ τελευταύεσ δεκαετύεσ λόγω τησ ανϊπτυξησ τησ φαςματοςκοπύασ υπερύθρου με μεταςχηματιςμό Fourier. Σούτο οφεύλεται κατϊ κύριο λόγο ςτη θεαματικό ανϊπτυξη των υπολογιςτϐν και ςτη βαθμιαύα χρόςη τουσ και ςε θϋματα φαςματοςκοπύασ. τη ςυνόθη φαςματοςκοπύα υπερύθρου η πολυχρωματικό ακτινοβολύα τησ πηγόσ αναλύεται με χρόςη μονοχρωμϊτορα (πρύςμα ό φρϊγμα) και ανιχνεύεται κατϊ ςυχνότητεσ ν+δν, όπου το Δν καθορύζεται από το εύροσ των ςχιςμϐν του φωτόμετρου. τη φαςματοςκοπύα υπερύθρου με μεταςχηματιςμό Fourier (FTΙR) το ςυμβολόμετρο Michelson, 66

67 γνωςτό όδη από τα τϋλη του 19ου αιϐνα, αποτελεύ το βαςικό τμόμα τησ τεχνικόσ. ύμφωνα με την αρχό των ςυμβολόμετρων Michelson, η ακτινοβολύα αρχικϊ καταφθϊνει ςε κατανεμητό ακτινοβολύασ και οι δύο επιμϋρουσ ακτύνεσ ςυμβϊλλουν μετϊ την ανϊκλαςη τουσ ςε κϊτοπτρο. Η ϋνταςη τησ ακτινοβολύασ μετρϊται ςυναρτόςει τησ μετατόπιςησ του κατόπτρου. Σα λαμβανόμενα ςυμβολογραφόματα (interferogram) δύνουν πληροφορύεσ ςχετικϊ με τη ςυνολικό απορρόφηςη τησ ακτινοβολύασ του δεύγματοσ ανϊ μόκοσ κύματοσ και ϋνταςη ωσ ϊθροιςμα Fourier όλων των φαςματικϐν γραμμϐν. χόμα : Υαςματοφωτόμετρο FTIR Perkin-Elmer Κρυςταλλογραφύα Ακτύνων Χ (XRD) Οι ακτύνεσ-φ ανόκουν ςτην κατηγορύα των ηλεκτρομαγνητικϐν ακτινοβολιϐν και με μόκη κύματοσ μεταξύ 0,1 και 100 Å, βρύςκονται ςτο ηλεκτρομαγνητικό φϊςμα μεταξύ τησ υπεριϐδουσ και τησ ακτινοβολύασ γ. Η παραγωγό τουσ εύναι αποτϋλεςμα τησ διϋγερςησ που υφύςτανται ϊτομα ό ιόντα ςτερεϐν, η οπούα και ςυνοδεύεται από εκπομπό ακτινοβολύασ πολύ μικρού μόκουσ κύματοσ (ακτύνεσ- Φ). 67

68 χόμα 1.35: χηματικό αναπαρϊςταςη ενόσ γωνιομϋτρου Bragg-Brentano δύο κύκλων θ:2θ με κοινό ϊξονα ςτροφόσ, τον ϊξονα του περιθλαςύμετρου. Η λυχνύα Coolidge εύναι η πιο ςυχνϊ χρηςιμοποιούμενη πηγό ακτύνων-φ, οι οπούεσ και παρϊγονται όταν ςτην ϊνοδο προςπϋςουν ηλεκτρόνια που προϋρχονται από το πυρακτωμϋνο νόμα τησ καθόδου με πολύ μεγϊλη ταχύτητα. Σα ηλεκτρόνια ςτη ςυνϋχεια επιταχύνονται μϋςα ςε ηλεκτρικό πεδύο υψηλόσ διαφορϊσ δυναμικού μεταξύ καθόδου και ανόδου, ούτωσ ϐςτε να αποκτόςουν υψηλϋσ ταχύτητεσ. Η βαςικό εξύςωςη που περιγρϊφει την ανϊκλαςη των ακτύνων-φ από τουσ κρυςτϊλλουσ, εύναι η εξύςωςη Bragg: n λ = 2 d ημθ όπου n η τϊξη ανϊκλαςησ, λ το μόκοσ κύματοσ τησ χρηςιμοποιούμενησ ακτινοβολύασ, d η ιςοαπόςταςη των δικτυωτϐν επιπϋδων (hkl) του κρυςτϊλλου που προκαλούν την ανϊκλαςη και θ η γωνύα Bragg, το ςυμπλόρωμα τησ γωνύασ προςπτϐςεωσ. 68

69 χόμα 1.36 Περιθλαςύμετρο ακτύνων Φ τησ εταιρύασ Rigaku Έλεγχοσ ρυθμού διϊλυςησ (Dissolution) Ο ϋλεγχοσ του ρυθμού διϊλυςησ μασ επιτρϋπει να εξετϊςουμε in vitro τον τρόπο αποδϋςμευςησ τησ δραςτικόσ από το φαρμακοτεχνικό ςκεύαςμα και να κϊνουμε μια εκτύμηςη του in vivo ρυθμό απελευθϋρωςησ του φαρμϊκου. Ο ϋλεγχοσ διϊλυςησ ϋγινε για πρϐτη φορϊ το 1897 από τουσ Noyes & Whithney. Αυτού μελϋτηςαν ποςοτικϊ τη διϊλυςη κυλύνδρων βενζοώκού οξϋοσ και χλωριούχου νατρύου, ενϐ περιςτρϋφονταν ςε νερό. Η αρχό τησ μεθόδου βαςύζεται ςτην ειςαγωγό του φαρμακοτεχνικού ςκευϊςματοσ (διςκύου ό κϊψουλασ) μϋςα ςε ϋνα δοχεύο που περιϋχει επαρκό ποςότητα υδατικού διαλύματοσ (το οπούο διϊλυμα αλλϊζει ανϊλογα με την περύςταςη) και με την εφαρμογό ςυνεχούσ ςταθερόσ ανϊδευςησ ςε ςταθερό θερμοκραςύα (37 ο C) μελετϊμε το ρυθμό μεταφορϊσ τησ δραςτικόσ ουςύασ από το φαρμακοτεχνικό ςκεύαςμα ςτο διαλυτικό μϋςο που το περιβϊλλει. Η ανύχνευςη γύνεται με τη χρόςη μιασ αναλυτικόσ μεθόδου, όπωσ υγρό χρωματογραφύα υψηλόσ πύεςησ ό φαςματοςκοπύα υπεριϐδουσ ορατού. Από την πρϐτη μελϋτη διϊλυςησ μϋχρι ςόμερα ϋχουν αναπτυχθεύ πολλϊ ςυςτόματα ελϋγχου τα οπούα θα μπορούςαμε να διαχωρύςουμε με βϊςη τον τρόπο ανϊδευςησ, τη μετϊβαςη από τη ςτερεϊ κατϊςταςη ςτο διϊλυμα ό την προςϋγγιςη τησ κατϊςταςησ κορεςμού. Εμεύσ θεωρούμε ςκόπιμο να αναφϋρουμε τισ δύο βαςικότερεσ ςυςκευϋσ ελϋγχου διϊλυςησ που 69

70 χρηςιμοποιούνται κατϊ κόρον ςόμερα ςε όλα τα εργαςτόρια ποιοτικού ελϋγχου που αναλύουν φϊρμακα. α) ςυςκευϋσ αναδευόμενου υγρού τισ ςυςκευϋσ αυτϋσ επιτυγχϊνεται όρεμη ανϊδευςη παρόμοια με τισ περιςταλτικϋσ κινόςεισ του ςτομϊχου και επαρκόσ για να εξαςφαλύζεται η ομοιόμορφη κατανομό του διαλυόμενου φαρμϊκου ςτο διαλυτικό μϋςο. Ο ςφαιρικόσ πυθμϋνασ ϋχει ιδιαύτερη ςημαςύα για τη ςταθεροπούηςη των διςκύων ό των καψουλϐν. Ειδικϊ μϊλιςτα ςτην περύπτωςη των καψουλϐν, η ςταθεροπούηςη επιτυγχϊνεται και με τη βοόθεια μιασ μεταλλικόσ ςπεύρασ. Πλεονϋκτημα των ςυςκευϐν αυτϐν εύναι η εύκολη και αυτόματη δειγματοληψύα χωρύσ διακοπό τησ λειτουργύασ. Οι ςυςκευϋσ αυτϋσ όμωσ μειονεκτούν ςτισ περιπτϐςεισ που απαιτεύται μεγϊλοσ όγκοσ διαλυτικού μϋςου για να αποφεύγεται η κατϊςταςη κορεςμού. Η ςυςκευό αναδευόμενου υγρού προτεύνεται και από την Αμερικανικό Υαρμακοποιύα για τη δοκιμαςύα διϊλυςησ διςκύων και καψουλϐν και αναφϋρεται ωσ μϋθοδοσ περιςτρεφόμενου πτερυγύου rotating paddle method. χόμα 1.37: υςκευϋσ in vivo και in vitro β) ςυςκευϋσ περιςτρεφόμενησ φαρμακοτεχνικόσ μορφόσ τισ ςυςκευϋσ αυτϋσ η βαςικό ιδϋα εύναι να ϋχουμε τα διςκύα ό τισ κϊψουλεσ υπό ανακύνηςη τοποθετϐντασ τα ςε περιςτρεφόμενο μεταλλικό καλαθύςκο. Οι ςυςκευϋσ περιςτρεφόμενου καλαθύςκου περιγρϊφονται τόςο ςτην Αμερικϊνικη όςο και ςτη Βρετανικό Υαρμακοποιύα, διαφϋρουν όμωσ 70

71 μεταξύ τουσ ωσ προσ το ςχόμα του πυθμϋνα του δοχεύου. την Αμερικϊνικη Υαρμακοποιύα ο πυθμϋνασ εύναι ςφαιρικόσ ενϐ ςτη Βρετανικό εύναι επύπεδοσ. Μειονϋκτημα των ςυςκευϐν αυτϐν αποτελεύ ο μικρόσ βαθμόσ ανϊμιξησ, ενϐ η κύνηςη του διαλυτικού μϋςου εύναι κατϊ πολύ εντονότερη από την αντύςτοιχη ςτο ςτομϊχι. υγκεκριμϋνα, βρϋθηκε ότι η θϋςη δειγματοληψύασ επηρεϊζει τη ςυγκϋντρωςη του φαρμϊκου ςτο διαλυτικό μϋςο. Ένα ακόμη μειονϋκτημα εύναι και ςτην περύπτωςη αυτό ο περιοριςμϋνοσ όγκοσ του υγρού μϋςου διϊλυςησ. Οι παρϊγοντεσ που επηρεϊζουν το ρυθμό διϊλυςησ και τον προςδιοριςμό του εύναι πολλού. Φαρακτηριςτικϊ αναφϋρουμε τουσ παρακϊτω: α) η ςυγκϋντρωςη: Η ςυγκϋντρωςη του φαρμϊκου ςτο διαλυτικό μϋςο πρϋπει να βρύςκεται μεταξύ 10 και 70% τησ ςυγκϋντρωςησ κορεςμού, πρϋπει δηλαδό να υπϊρχει αρκετόσ διαλύτησ για να παραλαμβϊνει το φϊρμακο, ϐςτε ποτϋ να μην επϋρχεται ο κορεςμόσ του. Εύναι προτιμότερο η ςυγκϋντρωςη ςτο διαλύτη να εύναι μεταξύ 10 και 20% (sink conditions), ϐςτε να αποφεύγεται και η επύδραςη του κορεςμού. Διότι, εϊν επϋρχεται κορεςμόσ του διαλύτη λόγω κακού πειραματικού ςχεδιαςμού τησ δοκιμαςύασ, ο ρυθμόσ διϊλυςησ μειϐνεται. β) η θερμοκραςύα: Η θερμοκραςύα επηρεϊζει πολλούσ παρϊγοντεσ, όπωσ τη διαλυτότητα, το ιξϐδεσ, το ςυντελεςτό διϊχυςησ κ.α. Η θερμοκραςύα ςτουσ περιςςότερουσ ελϋγχουσ διϊλυςησ διατηρεύται ςταθερό ςτην υποτιθϋμενη θερμοκραςύα του ςϐματοσ 37 ο C±0,5 ο C εκτόσ από εξεζητημϋνεσ περιπτϐςεισ. γ) η ϋνταςη τησ ανϊδευςησ: Η ϋνταςη τησ ανϊδευςησ επηρεϊζει τη ςτιβϊδα διαχύςεωσ. Πιο ςυγκεκριμϋνα, εντονότερη ανϊδευςη μειϐνει το πϊχοσ τησ ςτιβϊδασ διϊχυςησ και επηρεϊζει την προςϋγγιςη του διαλύτη. δ) η επιφϊνεια διϊλυςησ: Η επιφϊνεια επαφόσ μεταξύ του διαλύτη και του ςτερεού επηρεϊζει ϊμεςα την ποςότητα τησ ουςύασ που διαλύεται ςτη μονϊδα του χρόνου. ε) το ph: Σο pη του διαλύτη επηρεϊζει τη διαλυτότητα και τον ιονιςμό των μορύων ςτη μεςεπιφϊνεια. ςτ) το ιξϐδεσ: Η αύξηςη του ιξϐδουσ του διαλυτικού μϋςου μειϐνει το ρυθμό διϊλυςησ. ζ) η παρουςύα ταςενεργϐν ουςιϐν: Η παρουςύα ταςενεργϐν ουςιϐν εύναι ςημαντικό για 2 λόγουσ. Αφενόσ αυξϊνει τη διαλυτότητα και αφετϋρου αλλϊζει τισ ςυνθόκεσ ςτο μεςεπιφανειακό φραγμό. 71

72 Από τα παραπϊνω γύνεται εμφανϋσ ότι για τον επιτυχό πειραματικό ςχεδιαςμό τησ δοκιμαςύασ του ρυθμού διϊλυςησ, χρειαζόμαςτε ϋνα κατϊλληλο διαλυτικό μϋςο, θερμοςτϊτηςη του ςυςτόματοσ, οριςμϋνη και επαναλόψιμη επιφϊνεια επαφόσ μεταξύ ςτερεού και διαλυτικού μϋςου, ομοιόμορφη κατανομό του φαρμϊκου ςτο διαλυτικό μϋςο, ςυγκϋντρωςη μακριϊ από τον κορεςμό και κατϊλληλη αναλυτικό μϋθοδο. χόμα 1.38: υςκευό ελϋγχου ρυθμού διϊλυςησ Distec2100C Φαςματοςκοπύα υπεριώδουσ/ορατού (UV/Vis) Με τη μϋθοδο τησ φαςματοςκοπύασ UV/Vis λαμβϊνεται το φϊςμα απορρόφηςησ, διϋλευςησ ό ανϊκλαςησ ςτην υπεριϐδη ό/και ςτην ορατό περιοχό του φϊςματοσ. Η απορρόφηςη ορατόσ ό υπεριϐδουσ ακτινοβολύασ από ϋνα ατομικό ό μοριακό ςωματύδιο Μ μπορεύ να θεωρηθεύ ςαν μια διαδικαςύα δύο ςταδύων, το πρϐτο από τα οπούα περιλαμβϊνει την ηλεκτρονιακό διϋγερςη του Μ ςύμφωνα με την εξύςωςη: Μ + hv Μ* 72

73 Σο προώόν τησ αντύδραςησ μεταξύ του Μ και του φωτονύου που εύναι ϋνα ηλεκτρονιακϊ διεγερμϋνο ενδιϊμεςο ςωματύδιο, που ςυμβολύζεται ωσ Μ*. Ο χρόνοσ ημιζωόσ του εύναι μικρόσ και η ύπαρξη του τερματύζεται με μύα από τισ πορεύεσ αποδιϋγερςησ. Η ςυνηθϋςτερη μορφό αποδιϋγερςησ ςυνύςταται ςτη μετατροπό τησ ενϋργειασ που προςλόφθηκε κατϊ τη διϋγερςη ςε θερμότητα. Αποδιϋγερςη μπορεύ να πραγματοποιηθεύ και με διϊςπαςη του Μ* και ςχηματιςμό ενόσ νϋου ςωματιδύου. Η πορεύα αυτό ονομϊζεται φωτοχημικό αντύδραςη. Εναλλακτικϊ, η διαδικαςύα αποδιϋγερςησ μπορεύ να περιλαμβϊνει εκπομπό φθοριςμού ό φωςφοριςμού. υνόθωσ η απορρόφηςη ορατόσ ό υπεριϐδουσ ακτινοβολύασ οφεύλεται ςτη διϋγερςη δεςμικϐν ηλεκτρονύων και κατϊ ςυνϋπεια τα μόκη κύματοσ των απορροφόςεων μπορούν να ςυςχετιςθούν με τουσ τύπουσ των δεςμϐν ςτα εξεταζόμενα ςωματύδια. Έτςιμ η φαςματοςκοπύα μοριακόσ απορρόφηςησ αποτελεύ ϋνα χρόςιμο μϋςο για τη ταυτοπούηςη χαρακτηριςτικϐν ομϊδων ςε ϋνα μόριο. Ωςτόςο, πολύ μεγαλύτερη εύναι η χρηςιμότητα τησ φαςματοφωτομετρύασ ορατού και υπεριϐδουσ ςτον ποςοτικό προςδιοριςμό των ενϐςεων που περιϋχουν τισ ομϊδεσ αυτϋσ. Η φαςματοςκοπύα μοριακόσ απορρόφηςησ ςτηρύζεται ςτη μϋτρηςη τησ διαπερατότητασ Σ, ό τησ απορρόφηςησ Α των διαλυμϊτων, που τοποθετούνται ςε διαφανεύσ κυψελύδεσ οπτικόσ διαδρομόσ b cm. υνόθωσ η ςυγκϋντρωςη c ενόσ αναλύτη που απορροφϊ ςυνδϋεται γραμμικϊ με την απορρόφηςη ςύμφωνα με την εξύςωςη (μαθηματικό ϋκφραςη του νόμου του Beer): Όπου Α εύναι η απορρόφηςη, Σ η διαπερατότητα, ε ο ςυντελεςτόσ τησ γραμμομοριακόσ απορροφητικότητασ, b το μόκοσ τησ διαδρομόσ τησ ακτινοβολύασ ςτην κυψελύδα και c η ςυγκϋντρωςη του διαλύματοσ. Οι όροι P0 και P αναφϋρονται ςτην ιςχύ τησ ακτινοβολύασ μετϊ τη διϋλευςη τησ από τη κυψελύδα που περιϋχει τον διαλύτη και τον αναλυτό αντύςτοιχα. 73

74 χόμα 1.39: Υαςματοφωτόμετρο UV-Vis τησ εταιρύασ Shimatzu (UV-1700) 74

75 2. Πειραματικό μϋροσ 75

76 2.1 Υλικϊ που χρηςιμοποιόθηκαν Φιτοζϊνη υψηλού μοριακού βϊρουσ και βαθμού αποακετυλύωςησ 85%, οξικό οξύ καθαρότητασ 99,7% και τριπολυφωςφορικό νϊτριο καθαρότητασ 98.0% προμηθεύτηκαν από την Aldrich. Η Σιμολόλη με ςημεύο τόξησ C χορηγόθηκε ευγενικϊ από την εταιρεύα Pharmathen S.A. Όλα τα υπόλοιπα αντιδραςτόρια όταν αναλυτικόσ καθαρότητασ. 2.2 Tροποπούηςη χιτοζϊνησ Παραςκευό Καρβοξυβενζυλο-χιτοζϊνησ (CBCS) κόνη χιτοζϊνησ υψηλού μοριακού βϊρουσ (4g) προςτϋθηκε ςταδιακϊ υπό ςυνεχό ανϊδευςη ςε 500mL υδατικού διαλύματοσ οξικού οξϋοσ 0,7% v/v. Μετϊ από πλόρη διϊλυςη, 30mL διαλύματοσ 2-καρβοξυβενζαλδεϏδησ ςε αιθανόλη 17%w/v προςτϋθηκαν κατϊ ςταγόνεσ. Η ποςότητα τησ 2-καρβοξυβενζαλδεϏδησ που χρηςιμοποιόθηκε αντιςτοιχεύ ςε μοριακό αναλογύα 2:1 των δραςτικϐν ομϊδων CHO/NH2. Μετϊ από ανϊδευςη ςε υδρόλουτρο 50 C για 5 ϐρεσ, 20mL υδατικού διαλύματοσ NaBH4 8% w/v προςτϋθηκαν ςτο διϊλυμα τησ αντύδραςησ κατϊ ςταγόνεσ υπό ςυνεχό ανϊδευςη, για να γύνει αναγωγό τησ βϊςησ του Schiff. Η ανϊδευςη ςυνεχύςτηκε για 2 ϐρεσ. Ακολούθηςε καθύζηςη τησ (2- καρβοξυβενζυλο)χιτοζϊνησ με περύςςεια ακετόνησ. Σο παρϊγωγο τησ χιτοζϊνησ καθαρύςτηκε με εμβϊπτιςη ςε ακετόνη για 24 ϐρεσ και διαλυτοποιόθηκε ςε απιονιςμϋνο νερό για 3 μϋρεσ. Ακολούθηςε λυοφιλύωςη για την απομϊκρυνςη τησ υγραςύασ και δημιουργύα πορϐδουσ δομόσ [64]. 76

77 χόμα 2.1: Αντύδραςη τροποπούηςησ τησ χιτοζϊνησ με 2-καρβοξυβενζαλδεώδη Η επιβεβαύωςη τησ τροποπούηςησ τησ χιτοζϊνησ ϋγινε με τη βοόθεια φαςματοςκοπύασ FT-IR και UV-Vis Παραςκευό Σουκυνιλο-χιτοζϊνησ (CSUC) Η παραςκευό τησ CSUC βαςύςτηκε ςτη μϋθοδο των Hirano και Moriyasu [65]. 3 γραμμϊρια χιτοζϊνησ διαλύθηκε ςε υδατικό διϊλυμα οξικού οξϋοσ 6%v/v και το διϊλυμα αραιϐθηκε με 300mL μεθανόλησ. Σο μύγμα αναμύχθηκε μαγνητικϊ για μύα ϐρα. 4 γραμμϊρια ςουκινικού ανυδρύτη διαλύθηκαν ςε 100mL ακετόνησ και το διϊλυμα προςτϋθηκε ςτο διϊλυμα χιτοζανησ ςε 30 λεπτϊ και θερμοκραςύα 25 C. Η αντύδραςη ςυνεχύςτηκε για 18 ϐρεσ ςε θερμοκραςύα δωματύου. Σο ιξϐδεσ διϊλυμα που παραλόφθηκε αραιϐθηκε με 400mL απιονιςμϋνου νερού και το ph ρυθμύςτηκε ςτο 10 με διϊλυμα NaOH 2M. Σο προώον πλύθηκε αρκετϋσ φορϋσ με μύγμα νερού ακετόνησ 50:50, διαλυτοποιόθηκε ςε απιονιςμϋνο νερό για 5 μϋρεσ και τϋλοσ ακολούθηςε λυοφιλύωςη για την απομϊκρυνςη τησ υγραςύασ. 77

78 χόμα 2.2: Αντύδραςη τροποπούηςησ χιτοζϊνησ με ςουκινικό ανυδρύτη 2.3 Παραςκευό νανοςωματιδύων Σα δεύγματα παραςκευϊςτηκαν με την μϋθοδο τησ Ιονοτροπικόσ πηκτωματοπούηςησ. Πραγματοποιόθηκαν δοκιμϋσ με ςταθερό ποςότητα πολυμερούσ τόςο καθαρόσ, όςο και τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ αλλϊ με πϋντε διαφορετικϋσ αναλογύεσ του ταςενεργού, τριπολυφωςφορικού νατρύου (ΣΡΡ) (Sodium Tripolyphosphate). Η μϋθοδοσ βαςύζεται ςτην ηλεκτροςτατικό αλληλεπύδραςη μεταξύ τησ αμινικόσ ομϊδασ τησ χιτοζϊνησ και τησ αρνητικϐσ φορτιςμϋνησ ομϊδασ του πολυανιόντοσ, όπωσ εύναι το τριπολυφωςφορικό και αναφϋρθηκε εκτενϐσ ςτο κεφϊλαιο Σο μϋγεθοσ και το φορτύο τησ επιφϊνειασ των νανοςωματιδύων μπορεύ να αλλϊξει αλλϊζοντασ την αναλογύα τησ χιτοζϊνησ και του ταςενεργού. Για την επύτευξη μιασ υψηλόσ απόδοςησ των νανοςωματιδύων, η κρύςιμη παρϊμετροσ εύναι η επεξεργαςύα τησ χιτοζϊνησ. Αναλυτικότερα, η αναλογύα βϊρουσ του ΣΡΡ πρϋπει να ελϋγχεται και βρϋθηκε ότι πρϋπει να εύναι εντόσ τησ περιοχόσ από 3: 1-6 : 1 [66,67]. Σο μϋςο μϋγεθοσ των νανοςωματιδύων μειϐνεται με την αύξηςη τησ θερμοκραςύασ του διαλύματοσ ςε ςύςτημα ακτινοβόληςησ με υπερόχουσ [68]. Με την μεταβολό των φυςικοχημικϐν ςυνθηκϐν, όπωσ το ρη του μϋςου, λαμβϊνει χϐρα μια φϊςη μετϊβαςησ όγκου. Εύναι πιθανό επύςησ, να ειςαχθούν κϊποιεσ διαρθρωτικϋσ αλλαγϋσ από παραλλαγϋσ τησ ιοντικόσ αντοχόσ, όπωσ π.χ η παρουςύα του KCI ςε χαμηλϋσ και μϋτριεσ ςυγκεντρϐςεισ τονύζει την διόγκωςη και την αδυναμύα τησ χιτοζϊνησ- ΣΡΡ να αλληλεπιδρϊςουν ιοντικϊ, και με τη ςειρϊ του το ςωματύδιο οδηγεύται ςε αποςύνθεςη [69]. 78

79 το αρχικό ςτϊδιο παραςκευόσ νανοςωματιδύων χωρύσ φϊρμακο, για την παραςκευό τησ οργανικόσ φϊςησ διαλύθηκαν 40mg πολυμερούσ CS ςε 20ml διαλύματοσ CH3COOH 3,5mg/mL, ενϐ για την υδατικό φϊςη διαλύθηκαν 20mg, 13 mg, 10 mg, 8 mg, και 5,7 mg ΣΡΡ ςε 20ml νερό αντύςτοιχα για τισ αναλογύεσ CS/ ΣΡΡ 2/1, 3/1, 4/1, 5/1, 7/1 ςε θερμοκραςύα δωματύου. Έπειτα, γύνεται προςθόκη τησ υδατικόσ φϊςησ ςτην οργανικό, ςταγόνα ςταγόνα υπο όπια ανϊδευςη και ακολουθεύ ανϊμειξό τουσ. Αφόνουμε ςε ανϊδευςη για μια ϐρα περύπου. Μετϊ το πϋρασ τησ ανϊδευςησ, ακολουθεύ υπερφυγοκϋντρηςη (30.000rpm για 45 min) ςε ειδικό υπερφυγόκεντρο για να καθιζϊνουν τα νανοςωματύδια. Έπειτα, ςυλλϋχθηκε προςεκτικϊ το υπερκεύμενο υγρό, το οπούο αποχύθηκε ςτα απόβλητα, και το ύζημα αναςυςτϊθηκε και πλύθηκε με απιονιςμϋνο νερό. Η διαδικαςύα επαναλόφθηκε δύο φορϋσ προκειμϋνου να απομακρυνθούν υπολεύμματα ταςενεργού από την επιφϊνεια των νανοςωματιδύων. Μετϊ την δεύτερη αναςύςταςη, η οπούα πραγματοποιόθηκε με την αρχικό ποςότητα νερού, τα ςωματύδια ςυλλϋχθηκαν ςε προζυγιςμϋνο δοχεύο και φυλϊχθηκαν ςτην κατϊψυξη. Η διαδικαςύα αυτό ϋγινε ςε τρεύσ επαναλόψεισ. το τϋλοσ, τα δεύγματα των νανοςωματιδύων που παραςκευϊςτηκαν υπόκεινται ςε λυοφιλύωςη (freeze-drying), η οπούα εύναι μύα διαδικαςύα απομϊκρυνςησ του νερού από ϋνα προώόν μϋςω εξϊχνωςησ και διαςπορϊσ. Αυτό η διαδικαςύα πραγματοποιόθηκε ςε ςυςκευό λυοφιλύωςησ, η οπούα αποτελεύται από ϋνα ςυμπυκνωτό που παγιδεύει νερό και απομακρύνεται ϋτςι από το προώόν, από ϋνα ςύςτημα ψύξησ και ϋνα ςύςτημα κενού για να μειϐνει την πύεςη ϋτςι ϐςτε να διευκολύνεται η διαδικαςύα εξϊχνωςησ. Μετϊ το τϋλοσ τησ λυοφιλύωςησ, ςυλλϋχθηκαν τα νανοςωματύδια ωσ λευκό ξηρό ςκόνη. Ακολουθόθηκε η ύδια διαδικαςύα για τη παραςκευό νανοςωματιδύων CBCS και CSUC. 79

80 Πύνακασ 2.1: Δεύγματα χιτοζϊνησ χωρύσ φϊρμακο ΔΕΙΓΜΑ CS (mg) CH3COOH (ml) CS/TPP 2/1 CS/TPP 3/1 CS/TPP 4/1 CS/TPP 5/1 CS/TPP 7/1 H2O (ml) ΣΡΡ (mg) ΑΝΑΛΟΓΙΑ CS/TPP ΜΕΘΟΔΟ /1 Ionic gelation /1 Ionic gelation /1 Ionic gelation /1 Ionic gelation ,7 7/1 Ionic gelation Πύνακασ 2.2: Δεύγματα CBCS χωρύσ φϊρμακο ΔΕΙΓΜΑ CBCS/TPP 2/1 CBCS/TPP 3/1 CBCS/TPP 4/1 CBCS/TPP 5/1 CBCS/TPP 7/1 CBCS (mg) CH3COOH (ml) H2O (ml) ΣΡΡ (mg) ΑΝΑΛΟΓΙΑ CBCS/TPP ΜΕΘΟΔΟ /1 Ionic gelation /1 Ionic gelation /1 Ionic gelation /1 Ionic gelation ,7 7/1 Ionic gelation 80

81 Πύνακασ 2.3: Δεύγματα CSUC χωρύσ φϊρμακο ΔΕΙΓΜΑ CSUC/TPP 2/1 CSUC/TPP 3/1 CSUC/TPP 4/1 CSUC/TPP 5/1 CSUC/TPP 7/1 CSUC (mg) CH 3COOH (ml) H2O (ml) ΣΡΡ (mg) ΑΝΑΛΟΓΙΑ CSUC/TPP ΜΕΘΟΔΟ /1 Ionic gelation /1 Ionic gelation /1 Ionic gelation /1 Ionic gelation ,7 7/1 Ionic gelation 2.4 Ενθυλϊκωςη Ακολουθόθηκε ακριβϐσ η ύδια διαδικαςύα τησ παραςκευόσ νανοςωματιδύων χωρύσ φϊρμακο, με την διαφορϊ ότι ςτην υδατικό φϊςη πλϋον, ςτα 250ml διαλύματοσ του ςυςτόματοσ προςτϋθηκαν 1mg φαρμϊκου (timolol). Η οργανικό φϊςη παρϋμεινε η ύδια. Με βϊςη τα αποτελϋςματα από τισ μετρόςεισ DLS και SEM των δειγμϊτων χωρύσ φϊρμακο, επιλϋχθηκαν οι βϋλτιςτεσ αναλογύεσ πολυμερούσ/ταςενεργού, οι οπούεσ όταν 2/1, 4/1 και 7/1. Κατϊ τη διϊρκεια τησ παραςκευόσ των νανοςωματιδύων με ενθυλϊκωςη φαρμϊκου, θα πρϋπει να ληφθεύ ιδιαύτερη μϋριμνα κατϊ τη διϊρκεια τησ ανϊδευςησ. Πολύ ϋντονη ανϊδευςη ό μη επαρκόσ, μπορεύ να οδηγόςει πολύ εύκολα ςτην δημιουργύα πλόθουσ ςυςςωματωμϊτων. Η παρατόρηςη τησ επιφϊνειασ των δειγμϊτων ϋγινε με μικροφωτογραφύεσ που λόφθηκαν με τη χρόςη τησ τεχνικόσ SEM. Σϋλοσ, ςτα δεύγματα ϋγινε μελϋτη των φυςικοχημικϐν τουσ χαρακτηριςτικϐν και τησ in vitro μελϋτησ τησ αποδϋςμευςησ τησ δραςτικόσ ουςύασ. 81

82 Πύνακασ 2.4: Δεύγματα χιτοζϊνησ με φϊρμακο ΔΕΙΓΜΑ CS (mg) CH3COOH (ml) H2O (ml) ΣΡΡ (mg) ΑΝΑΛΟΓΙΑ CS/TPP Timolol (mg) ΜΕΘΟΔΟ CS/TPP 2/1 CS/TPP 4/1 CS/TPP 7/ /1 5 Ionic gelation /1 5 Ionic gelation /1 5 Ionic gelation Πύνακασ 2.5: Δεύγματα CBCS με φϊρμακο ΔΕΙΓΜΑ CBCS/TP P 2/1 CBCS/TP P 4/1 CS/TPP 7/1 CBCS (mg) CH3COOH (ml) H2O (ml) ΣΡΡ (mg) ΑΝΑΛΟΓΙΑ CBCS/TPP Timolol (mg) ΜΕΘΟΔΟ /1 5 Ionic gelation /1 5 Ionic gelation /1 5 Ionic gelation Πύνακασ 2.6: Δεύγματα CSUC με φϊρμακο ΔΕΙΓΜΑ CSUC/T PP 2/1 CSUC/T PP 4/1 CSUC/T PP 7/1 CSUC (mg) CH3COOH (ml) H2O (ml) ΣΡΡ (mg) ΑΝΑΛΟΓΙΑ CSUC/TPP Timolol (mg) ΜΕΘΟΔΟ /1 5 Ionic gelation /1 5 Ionic gelation /1 5 Ionic gelation 82

83 2.5 Μελϋτη και χαρακτηριςμόσ νανοςωματιδύων Μετϊ την ολοκλόρωςη του παραςκευαςτικού μϋρουσ, ακολούθηςε η ανϊλυςη των δειγμϊτων με διϊφορεσ τεχνικϋσ, η θεωρύα των οπούων περιγρϊφεται αναλυτικϊ ςτο θεωρητικό μϋροσ τησ παρούςασ εργαςύασ Ηλεκτρονικό Μικροςκοπύα Η μορφολογύα των δειγμϊτων μελετόθηκε με ςαρωτικό ηλεκτρονικό μικροςκόπιο (SEM) του τύπου JEOL JSM 6390 και JEOL JSM 840A εξοπλιςμϋνο με το Oxford EDS-WDS analyser. Για την ανϊλυςη των εικόνων χρηςιμοποιόθηκε το λογιςμικό ImageJ. Η δειγματοληψύα ϋγινε από ςκόνη του αφυδατωμϋνου γαλακτϐματοσ ό τοποθϋτηςη μιασ ςταγόνασ του γαλακτϐματοσ και ξόρανςη τησ. Σα δεύγματα καλύπτονταν με ϋνα ςτρϐμα ϊνθρακα ϐςτε να επιτευχθεύ καλό αγωγό τησ δϋςμησ ηλεκτρονύων. Οι ςυνθόκεσ λειτουργύασ όταν οι εξόσ: τϊςη επιτϊχυνςησ ηλεκτρονύων 20 kv, ϋνταςη ρεύματοσ 75 na και χρονικό διϊρκεια μϋτρηςησ 60 sec Δυναμικό Σκϋδαςη Φωτόσ (DLS) Σο μϋγεθοσ και το ζ-δυναμικό των νανοςωματιδύων προςδιορύςτηκε με τη χρόςη φαςματοςκοπύασ ςυςχϋτιςησ φωτονύου (photon correlation spectroscopy-pcs) και μικροηλεκτροφόρηςη αντύςτοιχα ςε όργανο τησ εταιρεύασ Malvern, μοντϋλο Zsizer Κϊθε δεύγμα υποβλόθηκε ςε 5 ςυνεχόμενουσ κύκλουσ. Σο ζ-δυναμικό των νανοςωματιδύων μετρόθηκε ςε υδατικό διϊλυμα οξικού οξϋοσ 3,5mg/mL αραιωμϋνο 1000 φορϋσ. IR) Φαςματοςκοπύα υπερύθρου μεταςχηματιςμού Fourier (FT- Η λόψη φαςμϊτων υπερύθρου (FT IR) πραγματοποιόθηκε ςε φαςματοφωτόμετρο Perkin Elmer, model Spectrum Προκειμϋνου να καταγραφεύ το φϊςμα, χρηςιμοποιόθηκε μύα μικρό ποςότητα από κϊθε δεύγμα, 83

84 η οπούα αναδεύθηκε καλϊ με ~180 mg βρωμιούχου καλύου (ΚΒr) και λειοτριβόθηκε ςε κατϊλληλο γουδύ. τη ςυνϋχεια ςυμπιϋςτηκε ςε διςκύο με εφαρμογό πύεςησ. Σο φϊςμα υπερύθρου, ωσ φϊςμα απορρόφηςησ, λόφθηκε ςτην περιοχό από 450 ϋωσ 4000 cm 1 με ανϊλυςη 4 cm 1 και με 20 επαναλαμβανόμενεσ ςαρϐςεισ Κρυςταλλογραφύα ακτύνων Χ (XRD) Η λόψη φαςμϊτων περύθλαςησ ακτινϐν Φ χρηςιμοποιόθηκε για την αναγνϐριςη των κρυςταλλικϐν ιδιοτότων (δομό και αλλαγϋσ) μεταξύ των καθαρϐν και παραςκευαςθϋντων υλικϐν. Φρειϊςτηκε μικρό ποςότητα από κϊθε δεύγμα, η οπούα τοποθετόθηκε ςε ειδικό διςκϊκι τησ ςυςκευόσ Mini Flex II τησ εταιρύασ Rigaku. Η μελϋτη με χρόςη ακτινϐν περύθλαςησ Φ πραγματοποιόθηκε ςε θερμοκραςύα δωματύου, ςτην περιοχό 2θ από 5 o ϋωσ 45 o, με βόμα 0,05 degrees και ταχύτητα ςϊρωςησ 0,3 deg/min Έλεγχοσ ρυθμού διϊλυςησ (Dissolution) Σο τελευταύο ςτϊδιο των αναλύςεων που πραγματοποιόθηκαν όταν αυτό τησ μελϋτησ του in vitro ρυθμού διϊλυςησ (αποδϋςμευςησ) τησ δραςτικόσ ουςύασ από την πολυμερικό μότρα. Η μελϋτη αυτό ϋγινε με τη χρόςη τησ ςυςκευόσ Distek 2100C, ενϐ η ανϊλυςη των δειγμϊτων, όπωσ περιγρϊφεται παρακϊτω, ϋγινε με τη βοόθεια ενόσ φαςματοφωτόμετρου UV-Vis τησ εταιρύασ Shimadzu. Η διϊταξη τησ ςυςκευόσ αυτόσ ϋχει 6 θϋςεισ ςτισ οπούεσ μπορούν να ςυνδεθούν αναδευτόρεσ (paddles), ςε περύπτωςη που τα δεύγματα ειςϊγονται ςε μορφό διςκύου και καλαθϊκια (baskets), ςε περύπτωςη που ειςϊγονται ςε κϊψουλεσ ό ςκόνη. Η διϊταξη αυτό επύςησ περιλαμβϊνει ςτροφόμετρο για την ανϊδευςη και θερμοςτϊτη για τον ϋλεγχο τησ θερμοκραςύασ ςτα λουτρϊ (batch). Για την διεξαγωγό του πειρϊματοσ ζυγύςτηκαν όλα τα δεύγματα ϐςτε η ποςότητα του καθενόσ να περιϋχει 1mg τιμολόλησ, παραςκευϊςτηκε ρυθμιςτικό διϊλυμα τεχνητϐν δακρύων με ph=7.4, όμοιο με αυτό του ανθρωπύνου οφθαλμού, ωσ μϋςο διϊλυςησ (dissolution medium). Για την παραςκευό του διαλύματοσ τεχνητϐν δακρύων, ςε 2L νερού διαλύθηκαν 4g όξινο ανθρακικό 84

85 νϊτριο, 0,16g διϋνυδρο χλωριούχο αςβϋςτιο και 13,4g χλωριούχο νϊτριο. Έπειτα τοποθετόθηκαν 50ml του μϋςου διϊλυςησ ςε κϊθε ειδικό δοχεύο (vessel) τησ ςυςκευόσ. Η θερμοκραςύα του λουτρού (και των δοχεύων διϊλυςησ) όταν ςτουσ 37 ο C. Έγινε η ειςαγωγό των δειγμϊτων ςε ειδικό μεμβρϊνη κυτταρύνησ και ςτη ςυνϋχεια ςτουσ καλαθύςκουσ τησ ςυςκευόσ και αφού προγραμματύςτηκε ο αυτόματοσ δειγματολόπτησ, ξεκύνηςε η διαδικαςύα. Οι δειγματολόπτεσ (probes) πρϋπει να περιϋχουν και ειδικϊ φύλτρα, ϐςτε να προςτατευθεύ το ςύςτημα δειγματοληψύασ από πιθανό φραγό των ςωληνϐςεων του ςυςτόματοσ δειγματοληψύασ. ε κϊθε δειγματοληψύα ςύμφωνα με το πρόγραμμα δειγματοληψύασ παραλαμβϊνονται 2ml από το λουτρό. Η ταχύτητα ανϊδευςησ όταν 100 rpm Σο πρόγραμμα δειγματοληψύασ, ςε ϐρεσ, που χρηςιμοποιόθηκε εύναι το εξόσ: 0, 10, 20, 30, 40, 60, 120, 180, 240, 300, 360, 420 και 480 λεπτϊ Φαςματοςκοπύα υπεριώδουσ-ορατού (UV-Vis) Για τη λόψη των φαςμϊτων UV χρηςιμοποιόθηκε το φαςματοφωτόμετρο υπεριϐδουσ ορατού Shimadzu UV/Vis Spectrophotometer Model 1700 ςυνδεδεμϋνο με λειτουργικό UV Probe. Σο ςύςτημα όταν εξοπλιςμϋνο με ορθογϐνιεσ κυψελύδεσ χαλαζύα, οπτικού μόκουσ 1cm. Σα φϊςματα των πολυμερϐν λόφθηκαν ςε διαλύματα 0,005%w/v ςε HCl 0.01M. Η μελϋτη τησ φόρτωςησ φαρμϊκου καθϐσ και του ρυθμού αποδϋςμευςησ ϋγινε με τη δημιουργύα καμπύλησ αναφορϊσ με τη χρόςη πρότυπων διαλυμϊτων τιμολόλησ με ςυγκεντρϐςεισ 0.25, 0.5, 1 και 5ppm. 85

86 3. Αποτελϋςματα και ςυζότηςη 86

87 Absorbance Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων Μετϊ την ολοκλόρωςη του πειραματικού μϋρουσ, ακολούθηςε η ανϊλυςη των δειγμϊτων με διϊφορεσ τεχνικϋσ, την αρχό λειτουργύασ των οπούων εύδαμε αναλυτικϊ ςτο θεωρητικό μϋροσ τησ παρούςησ εργαςύασ, ενϐ ςτο ςημεύο αυτό θα παρουςιαςτούν τα αποτελϋςματα που λόφθηκαν. 3.1 Χαρακτηριςμόσ τησ τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ CBCS H N-(2-καρβοξυβενζυλο)χιτοζϊνη παραςκευϊςτηκε πρϐτη φορϊ από τον Muzzarelli et al. [70] o οπούοσ μελϋτηςε τισ χηλικϋσ τησ ιδιότητεσ. Πιο πρόςφατα, ςυντϋθηκε για να χρηςιμοποιηθεύ ωσ φορϋασ ςε ϋνα ςύςτημα απελευθϋρωςησ φαρμϊκου ςτο παχύ ϋντερο [71]. το χόμα 3.1 παρουςιϊζονται τα φϊςματα FT-IR τησ απλόσ καθϐσ και τησ τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ με 2-καρβοξυβενζαλδεϏδη. CS CBCS Wavenumber (cm -1 ) χόμα 3.1: Υϊςματα FT-IR CS και CBCS το φϊςμα τησ χιτοζϊνησ, οι κορυφϋσ ςτουσ 3400 και 3100 κυματϊριθμουσ αντιςτοιχούν ςτισ ομϊδεσ ΟΗ και ΝΗ2 αντύςτοιχα, και εμφανύζονται ωσ μύα ευρεύα ταινύα λόγω αλληλεπικϊλυψησ, ενϐ ϊλλεσ κορυφϋσ που προϋρχονται από την ομϊδα Ν-Η παρατηρούνται ςτουσ 1640 (δόνηςη 87

88 Absorbance Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων τϊςησ) και 1570 (δόνηςη κϊμψησ) κυματϊριθμουσ. Η απορρόφηςη ςτουσ 1075 οφεύλεται ςτην αςύμμετρη τϊςη τησ γϋφυρασ C-O-C. Η απορρόφηςη ςτουσ 1150 cm -1 εύναι χαρακτηριςτικό τησ αςςύμετρησ δόνηςησ τϊςησ του β-(1-4)γλυκοζιτικού δεςμού [64,72]. το φϊςμα τησ CBCS εμφανύζονται δύο επιπρόςθετεσ κορυφϋσ ςτουσ 1714 και 1750 κυματϊριθμουσ που οφεύλονται αντύςτοιχα ςτη δόνηςη του καρβονυλύου τησ τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ και ςτην δόνηςη του ο-υποκατεςτημϋνου αρωματικού καρβοξυλύου αντύςτοιχα [64]. Η εμφϊνιςη κορυφϐν που αντιςτοιχούν ςτην ομϊδα τροποπούηςησ μασ οδηγεύ ςτο ςυμπϋραςμα ότι οι καρβοξυβενζυλομϊδεσ ϋχουν ειςαχθεύ ςτον ςκελετό τησ χιτοζϊνησ και η τροποπούηςη ϋλαβε χϐρα επιτυχϐσ. το χόμα 3.2 παρουςιϊζονται τα φϊςματα UV τησ χιτοζϊνησ και τησ CBCS. 2.0 CS CBCS Wavelength (nm) χόμα 3.2: Υϊςματα UV CS και CBCS Η χιτοζϊνη δεν παρουςιϊζει απορρόφηςη ςε κανϋνα ςημεύο τησ εξεταζόμενησ υπεριϐδουσ περιοχόσ. H CBCS παρουςιϊζει δύο μϋγιςτα απορρόφηςησ, ςτα 280 και 230 nm, με θεμελιϐδη αυτό ςτα 230nm που αντιςτοιχεύ ςε π π* μετϊβαςη των ςυζυγιακϐν π ηλεκτρονύων τησ 88

89 Absorbance Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων καρβοξυβενζαλδεϗδησ [64], ϋνδειξη απορρόφηςη ςτα 280 nm οφεύλεται ςε n π* μετϊβαςη. επιβεβαύωςησ τησ τροποπούηςησ. Η CSUC το χόμα 3.3 παρουςιϊζονται τα φϊςματα UV τησ χιτοζϊνησ και τησ CBCS. CS CSUC Wavenumber (cm -1 ) χόμα 3.3: Υϊςματα FT-IR CS και CSUC υγκρύνοντασ το φϊςμα τησ χιτοζϊνησ και τησ CSUC, παρατηρούμε ότι ςτο φϊςμα τησ τροποποιημϋνησ με ςουκύνυλο ομϊδεσ εμφανύζεται μύα νϋα κορυφό ςτουσ 1720 cm -1 που αντιςτοιχεύ ςτην καρβονυλικό ομϊδα η οπούα δημιουργόθηκε με την πρόςθεςη του ςουκινικού ανυδρύτη ςτην αντύδραςη. Η ιςχυρότερη απορρόφηςη του πρωτοταγούσ (1660 cm -1 ) και δευτεροταγούσ (1565 cm -1 ) αμιδύου υποδεικνύει την επιτυχύα τησ τροποπούηςησ τησ χιτοζϊνησ, ενϐ παρϊλληλα δικαιολογεύ ότι η αντύδραςη ϋλαβε χϐρα ςτη Ν-θϋςη. το χόμα 3.4 παρουςιϊζεται το φϊςμα UV τησ CSUC. 89

90 Absorbance Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων 0.6 CS CSUC Wavelength (nm) χόμα 3.4: Υϊςματα UV CS και CSUC ε αντύθεςη με τη καθαρό χιτοζϊνη που δεν εμφανύζει κϊποια απορρόφηςη ςτο φϊςμα UV, η CSUC ϋχει ϋνα λmax=265nm. Η εμφϊνιςη αυτόσ τησ απορρόφηςησ οδηγεύ ςτο ςυμπϋραςμα ότι το ςουκινικό (ηλεκτρικό) οξύ ϋχει ειςαχθεύ επιτυχϐσ ςτη μακρομοριακό αλυςύδα τησ χιτοζϊνησ. 90

91 3.2 Παραςκευό νανοςωματιδύων Σα νανοςωματύδια χιτοζϊνησ παραςκευϊζονται εύκολα με την ειςαγωγό του ΣΡΡ ςτο διϊλυμα τησ χιτοζϊνησ υπό μαγνητικό ανϊδευςη, αφού η δημιουργύα των νανοςωματιδύων εξαρτϊται κυρύωσ από τισ ιοντικϋσ αλληλεπιδρϊςεισ μεταξύ χιτοζϊνησ και ΣΡΡ που τελικϊ οδηγούν ςτην μεύωςη τησ διαλυτότητασ τησ χιτοζϊνησ ςτο νερό. Η αναλογύα μεταξύ ΣΡΡ και χιτοζϊνη εύναι κρύςιμη και επιδρϊ ςτο μϋγεθοσ και την κατανομό μεγεθϐν των νανοςωματιδύων. Σα χαρακτηριςτικϊ του μεγϋθουσ των νανοςωματιδύων επιδρούν ςτην βιολογικό τουσ επύδοςη [73]. Γι αυτό το λόγο, πριν την ενθυλϊκωςη του φαρμϊκου, μελετόθηκε η επύδραςη τησ αναλογύασ CS/TPP ςτο μϋγεθοσ των παραγόμενων νανοςωματιδύων με ςκοπό την επιλογό των βϋλτιςτων αναλογιϐν που οδηγούν ςε νανοςωματύδια με μικρό μϋγεθοσ και ςτενό κατανομό μεγεθϐν DLS τα χόματα παρουςιϊζεται η κατανομό μεγϋθουσ ςωματιδύων για διϊφορεσ αναλογύεσ CS/TPP, όπωσ μετρόθηκε με δυναμικό ςκϋδαςη φωτόσ. το Πύνακα 3.1 παρουςιϊζονται τα μεγϋθη των νανοςωματιδύων ςε nm. (α) 91

92 (β) (γ) (δ) 92

93 (ε) χόμα 3.5: Κατανομό μεγϋθουσ νανοςωματιδύων CS με αναλογύεσ CS/ΣΡΡ (a) 2/1, (β) 3/1, (γ) 4/1, (δ) 5/1 και (ε) 7/1 (α) (β) 93

94 (γ) (δ) (ε) χόμα 3.6: Κατανομό μεγϋθουσ νανοςωματιδύων CBCS με αναλογύεσ CBCS/ΣΡΡ (a) 2/1, (β) 3/1, (γ) 4/1, (δ) 5/1 και (ε) 7/1 94

95 (α) (β) (γ) 95

96 (δ) (ε) χόμα 3.7: Κατανομό μεγϋθουσ νανοςωματιδύων CSUC με αναλογύεσ CSUC/ΣΡΡ (a) 2/1, (β) 3/1, (γ) 4/1, (δ) 5/1 και (ε) 7/1 96

97 Πύνακασ 3.1: Μεγϋθη νανοςωματιδύων των δειγμϊτων Δεύγμα Μϋγεθοσ νανοςωματιδύων (nm) CS/TPP 2/1 200 CS/TPP 3/1 220 CS/TPP 4/1 300 CS/TPP 5/1 350 CS/TPP 7/1 320 CBCS/TPP 2/1 200 CBCS/TPP 3/1 210 CBCS/TPP 4/1 250 CBCS/TPP 5/1 300 CBCS/TPP 7/1 190 CSUC/TPP 2/1 150 CSUC/TPP 3/1 350 CSUC/TPP 4/1 300 CSUC/TPP 5/1 280 CSUC/TPP 7/1 240 Παρατηρούμε πωσ ςε όλα τα δεύγματα το μϋγεθοσ των νανοςωματιδύων αυξϊνεται με μεύωςη του περιεχομϋνου ςε ΣΡΡ, δηλαδό με μεύωςη του βαθμού δικτύωςησ. τα δεύγματα με αναλογύα CS/TPP 7/1 παρατηρεύται μεύωςη του μεγϋθουσ αντύ για αύξηςη όπωσ για τισ υπόλοιπεσ αναλογύεσ. ύμφωνα με τoυσ Pan et al. [83] υπϊρχει μύα κρύςιμη αναλογύα μεταξύ χιτοζϊνησ, τροποποιημϋνησ και μη, που ελϋγχει το μϋγεθοσ των νανοςωματιδύων. Σο δικτυωτικό, δημιουργϐντασ ιοντικούσ δεςμούσ με τισ πρωτονιωμϋνεσ αμινομϊδεσ τησ χιτοζϊνησ οδηγεύ ςτη δημιουργύα πιο ςυμπαγϐν νανοςωματιδύων. Εύναι φανερό, ότι η αναλογύα CS/TPP 5/1 και CBCS/TPP 5/1 εύναι η κρύςιμη 97

98 αναλογύα καθϐσ το ΣΡΡ εύναι πολυδραςτικό δικτυωτικό αντιδραςτόριο και μπορεύ να δημιουργόςει 5 ιονικούσ ςταυροδεςμούσ με τισ αμινομϊδεσ τησ χιτοζϊνησ. Η χιτοζϊνη που ϋχει τροποποιηθεύ, ϋχει δεςμευμϋνεσ τισ θϋςεισ τησ αμινομϊδασ με αποτελϋςμα να μην μπορεύ να ςχηματύςει τόςουσ ςταυροδεςμόυσ, με αποτϋλεςμα ςε αυτό την αναλογύα να ϋχει μειωθεύ το μϋγεθοσ των νανοςωματιδύων. Για την ενθυλϊκωςη του φαρμϊκου, επιλϋχθηκαν οι αναλογύεσ 2/1, 4/1 και 7/1, αφού τα νανοςωματύδια που προκύπτουν ϋχουν ικανοποιητικό μϋγεθοσ. Σο μϋγεθοσ των ςωματιδύων εύναι ςημαντικό παρϊμετροσ όςον αφορϊ την ανϊπτυξη ςυςτημϊτων οφθαλμικόσ απελευθϋρωςησ και την ανεκτικότητα του οφθαλμού. Μεγϊλα μεγϋθη ςωματιδύων προκαλούν ϊμεςη παραγωγό δακρύων που οδηγεύ ςε απϐλειεσ ςτη χορηγούμενη δόςη και ςυνεπϐσ χαμηλό βιοδιαθεςιμότητα [74] SEM τα χόματα παρουςιϊζονται οι μικροφωτογραφύεσ SEM των νανοςωματιδύων CS, CBCS και CSUC παραςκευαςμϋνα με διϊφορεσ αναλογύεσ πολυμερούσ/σρρ. (α) (β) 98

99 (γ) (δ) χόμα 3.8: Μικροφωτογραφύεσ SEM των δειγμϊτων (α) CS/ΣΡΡ 2/1, (β) CS/ΣΡΡ 3/1, (γ) CS/ΣΡΡ 4/1, (δ) CS/ΣΡΡ 7/1 (α) (β) (γ) (δ) 99

100 (ε) χόμα 3.9: Μικροφωτογραφύεσ SEM των δειγμϊτων (α) CBCS/ΣΡΡ 2/1, (β) CBCS/ΣΡΡ 3/1, (γ) CBCS/ΣΡΡ 4/1, (δ) CBCS/ΣΡΡ 5/1, (ε) CBCS/ΣΡΡ 7/1 (α) (β) (γ) (δ) χόμα 3.10: Μικροφωτογραφύεσ SEM των δειγμϊτων (α) CSUC/ΣΡΡ 2/1, (β) CSUC/ΣΡΡ 3/1, (γ) CSUC/ΣΡΡ 5/1, (δ) CSUC/ΣΡΡ 7/1 100

101 Οι μικροφωτογραφύεσ SEM επιβεβαιϐνουν την δημιουργύα νανοςωματιδύων ςφαιρικόσ μορφόσ. Σο μϋγεθοσ αυτϐν εύναι παρόμοιο με το μϋγεθοσ που μετρόθηκε από το DLS. τισ μικρογραφύεσ εύναι εμφανϋσ πωσ τα νανοςωματύδια χιτοζϊνησ παρουςιϊςτηκαν ωσ ξεχωριςτϊ ςωματύδια με ςφαιρικό ςχόμα και μϋγεθοσ περύπου 250nm, γεγονόσ που βρύςκεται ςε ςυμφωνύα με τα πειραματικϊ αποτελϋςματα που προϋκυψαν για το μϋγεθοσ των νανοςωματιδύων με τη χρόςη τησ ςκϋδαςησ φωτόσ όπωσ φαύνεται και ςτον Πύνακα 3.1. Ο ϋλεγχοσ του μεγϋθουσ των μικροςωματιδύων εύναι ςημαντικόσ, καθϐσ ϋχει ςημαντικό επύδραςη ςτο ρυθμό διϊςπαςησ τησ μότρασ του πολυμερούσ, τη φόρτωςη του φαρμϊκου και την αρχικό ϋκρηξη απελευθϋρωςόσ του [84]. Eπύςησ, η μορφολογύα των μικροςωματιδύων εξαρτϊται από τον ρυθμό κατακρύμνηςησ του πολυμερούσ και από την εξϊτμιςη του διαλύτη από τη διεπιφϊνεια [85] Απόδοςη ςε νανοςωματύδια, ικανότητα φόρτωςησ και ενθυλϊκωςησ Για να υπολογιςτεύ η απόδοςη ςε νανοςωματύδια (nanoparticle yield) ζυγύςτηκε το δοχεύο ςτο οπούο ειςόχθηκαν τα νανοςωματύδια ϊδειο και μετϊ από το freeze drying, ϐςτε να υπολογιςτεύ η μϊζα των νανοςωματιδύων που παραςκευϊςτηκαν. Για να υπολογιςτεύ ςτη ςυνϋχεια η απόδοςη χρηςιμοποιόθηκε ο εξόσ τύποσ: Ο προςδιοριςμόσ τησ ικανότητασ φόρτωςησ τησ δραςτικόσ ουςύασ (drug loading), δηλαδό του % περιεχόμενο ςε φϊρμακο ςτα δεύγματα, χρηςιμοποιόθηκε ο τύποσ: 101

102 Σο βϊροσ του φαρμϊκου υπολογύςτηκε μϋςω τησ ςυγκϋντρωςησ τησ τιμολόλησ που βρϋθηκε μετϊ από μϋτρηςη UV με χρόςη καμπύλησ αναφορϊσ που παραςκευϊςτηκε με πρότυπα τησ δραςτικόσ ουςύασ. Για να πραγματοποιηθεύ ο υπολογιςμόσ τησ ενθυλϊκωςησ (drug entrapment efficiency) του φαρμϊκου χρηςιμοποιόθηκε ο εξόσ τύποσ: Πύνακασ 3.2: Ποςοςτό % απόδοςησ ςε νανοςωματύδια, περιεχόμενο % ςε φϊρμακο και ικανότητα ενθυλϊκωςησ Δεύγμα Απόδοςη ςε νανοςωματύδια (%) Περιεχόμενο ςε φϊρμακο (%) Ικανότητα ενθυλϊκωςησ (%) CS/TPP 2/1 Tim CS/TPP 4/1 Tim CS/TPP 7/1 Tim CBCS/TPP 2/1 Tim CBCS/TPP 4/1 Tim CBCS/TPP 7/1 Tim CSUC/TPP 2/1 Tim CSUC/TPP 4/1 Tim CSUC/TPP 7/1 Tim

103 το Πύνακα 3.2 παρουςιϊζονται τα αποτελϋςματα τησ απόδοςησ ςε νανοςωματύδια, τησ περιεκτικότητασ ςε δραςτικό των νανοςωματιδύων, όπωσ επύςησ και τησ ικανότητασ ενθυλϊκωςησ των εμβολιαςμϋνων ςυμπολυμερϐν τησ χιτοζϊνησ. Οι παρϊμετροι αυτού καθϐσ και το μϋγεθοσ των νανοςωματιδύων καθορύζονται κυρύωσ από τη ςύςταςη των παραςκευαςθϋντων υλικϐν, καθϐσ και από τη φύςη τησ δραςτικόσ ουςύασ που ενθυλακϐνεται ςε ςυνδυαςμό με τισ πιθανϋσ αλληλεπιδρϊςεισ μεταξύ τησ πολυμερικόσ μότρασ και δραςτικόσ. Ο ρόλοσ του δικτυωτικού εύναι εξύςου ςημαντικόσ. Η απόδοςη ςε νανοςωματύδια μειϐνεται με μεύωςη τησ αναλογύασ δικτυωτικού, ενϐ η ικανότητα ενθυλϊκωςησ δεν παρουςιϊζει κϊποια τϊςη ςε ςχϋςη με την αναλογύα χιτοζϊνησ/σρρ. Η βϋλτιςτη ικανότητα ενθυλϊκωςησ (15,52%) παρατηρεύται ςτο δεύγμα CBCS/TPP 4/1 Tim. Η CBCS ϋχει την καλύτερη απόδοςη και ικανότητα ενθυλϊκωςησ ςε ςχϋςη με την καθαρό χιτοζϊνη και την CSUC, και όπωσ θα εξηγηθεύ ςτο κεφϊλαιο 3.2.4, αυτό μπορεύ να οφεύλεται ςε αλληλεπιδρϊςεισ μεταξύ τησ CBCS και τησ τιμολόλησ Χαρακτηριςμόσ των ενθυλακωμϋνων νανοςωματιδύων με τιμολόλη με FT-IR Εύναι γνωςτό ότι η απελευθϋρωςη του φαρμϊκου εξαρτϊται ςε μεγϊλο βαθμό από την φυςικό κατϊςταςη του φαρμϊκου το οπούο βρύςκεται ενθυλακωμϋνο ό διαςπαρμϋνο ςε μύα πολυμερικό μότρα. Επύςησ από την ϋκταςη των αλληλεπιδρϊςεων με την πολυμερικό μότρα και κυρύωσ από την ικανότητα να ςχηματύςει δεςμούσ υδρογόνου. Σο μόριο τησ τιμολόλησ ϋχει ϋνα υδροξύλιο και μύα δευτεροταγό αμινομϊδα οι οπούεσ θα μπορούςαν να αντιδρϊςουν με τισ δραςτικϋσ ομϊδεσ τισ χιτοζϊνησ. Για να επιβεβαιωθεύ αυτό πϊρθηκαν τα φϊςματα FTIR όλων των δειγμϊτων και παρουςιϊζονται ςτα ακόλουθα διαγρϊμματα. Επύςησ οι χαρακτηριςτικϋσ κορυφϋσ των δραςτικϐν ομϊδων τησ τμολόλησ παρουςιϊζονται ςτον πύνακα

104 Absorbance Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων Timolol API Wavenumber (cm -1 ) χόμα 3.11: Υϊςμα FT-IR τησ τιμολόλησ Πύνακασ 3.3: Αντιςτούχηςη απορροφόςεων FT-IR με τισ δραςτικϋσ ομϊδεσ τησ τιμολόλησ Λειτουργικϋσ ομϊδεσ Κυματϊριθμοι (cm -1 ) OH 3400 >ΝΗ 3315 CH αρωματικϊ, κϊμψη 3050 CH αλειφατικϊ, κϊμψη 2975 C=O 1712 C=C 1600 CH αλειφατικϊ, τϊςη 1450 Ar-CH, κϊμψη ςτο επύπεδο 1443,

105 Absorbance Absorbance Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων CS/TPP 2/1 CS/TPP 4/1 CS/TPP 7/ Wavenumber(cm -1 ) χόμα 3.12: Υϊςματα FT-IR των νανοςωματιδύων CS χωρύσ φϊρμακο CS/TPP 2/1 Tim CS/TPP 4/1 Tim CS/TPP 7/1 Tim Wavenumber (cm -1 ) χόμα 3.13: Υϊςματα FT-IR των νανοςωματιδύων CS με φϊρμακο 105

106 Absorbance Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων 3423 cm cm -1 CS/TPP/Tim CS/TPP 4:1 Timolol Wavenumber (cm -1 ) χόμα 3.14: υγκριτικϊ φϊςματα FT-IR των νανοςωματιδύων CS/ΣΡΡ με φϊρμακο Από το ςυγκριτικό διϊγραμμα όλων των φαςμϊτων ςτο χόμα 3.14 (CS/TPP, Tim και CS/TPP/Tim) υπϊρχουν 2 χαρακτηριςτικϋσ κορυφϋσ οι οπούεσ θα μπορούςαν να αποκαλύψουν εϊν λαμβϊνουν χϐρα δεςμού υδρογόνου. Αυτϋσ εύναι για το δεύγμα CS/TPP ςτα 3423 cm -1 και 3287 cm -1 των υδροξυλικϐν ομϊδων και αμινομϊδων τησ χιτοζϊνησ αντύςτοιχα. Οι ομϊδεσ αυτϋσ ωςτόςο εύναι ακριβϐσ ςτουσ ύδιουσ κυματϊρυθμουσ και ςτο δεύγμα που περιϋχει το φϊρμακο (CS/TPP/Tim). Κατϊ ςυνϋπεια δεν υπϊρχει καμύα μετακύνηςη των κορυφϐν και θα μπορούςε να εξαχθεύ το ςυμπϋραςμα ότι δεν λαμβϊνουν χϐρα δεςμού υδρογόνου. Ωςτόςο, αυτό μπορεύ να οφεύλεται ςτο γεγονόσ ότι το φϊρμακα εύναι ενθυλακωμϋνο ςε μικρό περιεκτικότητα με αποτϋλεςμα να μην μπορεύ να γύνει αιςθητό κϊποια μετατόπιςη. 106

107 Absorbance Absorbance Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων CBCS/TPP 2/1 CBCS/TPP 4/1 CBCS/TPP 7/ Wavenumber (cm -1 ) χόμα 3.15: Υϊςματα FT-IR των νανοςωματιδύων CBCS χωρύσ φϊρμακο CBCS/TPP 2/1 Tim CBCS/TPP 4/1 Tim CBCS/TPP 7/1 Tim Wavenumber (cm -1 ) χόμα 3.16: Υϊςματα FT-IR των νανοςωματιδύων CS με φϊρμακο 107

108 Absorbance Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων Σα ςυγκριτικϊ φϊςματα για την περύπτωςη τησ CBCS παρουςιϊζονται ςτο χόμα το φϊςμα αυτό παρατηρούνται αρκετϋσ μετατοπύςεισ. Τπϊρχει μύα μετατόπιςη των υδροξυλικϐν ομϊδων οι οπούεσ ςτην περύπτωςη του δεύγματοσ CBCS/TPP καταγρϊφονται ςτα 3430 cm -1 και με το φϊρμακο αυτό καταγρϊφεται ςτα 3440 cm -1. Επύςησ, οι καρβοξυλικϋσ ομϊδεσ τησ CBCS εμφανύζονται ςτα 1714 cm -1 και μετατοπύζονται ςτα 1711 cm -1 ςτο δεύγμα που περιϋχει τιμολόλη. Οι μετατοπύςεισ αυτϋσ υποδηλϐνουν ότι υπϊρχουν μερικϋσ αλληλεπιδρϊςεισ μεταξύ των δραςτικϐν ομϊδων του φαρμϊκου και των δραςτικϐν ομϊδων του παραγϐγου. Αυτϋσ μπορεύ να εύναι μεταξύ των καρβοξυλικϐν ομϊδων, των υδροξυλικϐν ομϊδων ό και των αμινομϊδων τησ CBCS και των υδροξυλικϐν ομϊδων ό και των αμινομϊδων του φαρμϊκου. Αυτό επιβεβαιϐνεται και από την μετατόπιςη των δευτεροταγϐν αμινομϊδων του φαρμϊκου από τα 3320 cm -1 ςτα 3264 cm -1 ςτο δεύγμα που περιϋχει CBCS/Timolol. Η δημιουργύα δεςμϐν υδρογόνου πιθανότατα οδόγηςε ςτην βελτιωμϋνη ικανότητα ενθυλϊκωςησ τησ CBCS ςε ςχϋςη με τισ CS και CSUC. CBCS/TPP/Tim CBCS/TPP 4:1 Timolol Wavenumber (α) 108

109 Absorbance Absorbance Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων CBCS/TPP/Tim CBCS/TPP 4:1 Timolol 1711 cm cm Wavenumber (β) χόμα 3.17: υγκριτικϊ φϊςματα FT-IR των νανοςωματιδύων CBCS με φϊρμακο α) ολόκληρη η φαςματικό περιοχό και β) αυτόσ των καρβοξυλικϐν ομϊδων. CSUC/TPP 2/1 CSUC/TPP 4/1 CSUC/TPP 7/ Wavenumber (cm -1 ) χόμα 3.18: Υϊςματα FT-IR των νανοςωματιδύων CSUC χωρύσ φϊρμακο 109

110 Absorbance Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων CSUC/TPP 2/1 Tim CSUC/TPP 4/1 Tim CSUC/TPP 7/1 Tim Wavenumber (cm-1) χόμα 3.19: Υϊςματα FT-IR των νανοςωματιδύων CSUC με φϊρμακο Παρόμοιεσ μετατοπύςεισ παρουςιϊζονται και ςτα φϊςματα CSUC τα οπούα παρουςιϊζονται ςτο χόμα 3.20 το φϊςμα αυτό παρόλο που δεν παρατηρούνται ςημαντικϋσ μετατοπύςεισ ςτην περιοχό των υδροξυλικϐν ομϊδων οι οπούεσ ςτο δεύγμα CSUC/TPP καταγρϊφονται ςτα 3436 cm -1 και με το φϊρμακο ςτα 3434cm -1, εμφανύζονται ςημαντικϋσ μετατοπύςεισ ςτην απορρόφηςη των αμινομϊδων. Έτςι η απορρόφηςη ςτα 3310 cm -1 του καθαρού φαρμϊκου μετατοπύζεται ςτα 3285cm -1 ςτο δεύγμα CSUC/Σim. Επύςησ, οι καρβοξυλικϋσ ομϊδεσ τησ CBCS εμφανύζονται ςτα 1716 cm -1 και μετατοπύζονται ςτα 1708cm -1 ςτο δεύγμα που περιϋχει τιμολόλη. Οι μετατοπύςεισ αυτϋσ υποδηλϐνουν ότι υπϊρχουν μερικϋσ αλληλεπιδρϊςεισ μεταξύ των δραςτικϐν ομϊδων του φαρμϊκου και των δραςτικϐν ομϊδων του παραγϐγου. Αυτϋσ μπορεύ να εύναι μεταξύ των καρβοξυλικϐν ομϊδων,των υδροξυλικϐν ομϊδων ό και των αμινομϊδων τησ CSUC και των υδροξυλικϐν ομϊδων ό και των αμινομϊδων του φαρμϊκου. Αυτό επιβεβαιϐνεται και από την μετατόπιςη των δευτεροταγϐν αμινομϊδων του φαρμϊκου από τα 3310 cm -1 ςτα 3264 cm -1 ςτο δεύγμα που περιϋχει CSUC/Tim. 110

111 Absorbance Absorbance Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων 3436 cm cm -1 CSUC/TPP/Tim CSUC/TPP 4:1 Timolol 3285 cm cm Wavenumber (cm-1) (α) CSUC/TPP/Tim CSUC/TPP 4:1 Timolol 1654 cm cm cm cm Wavenumber (cm-1) (β) χόμα 3.20: υγκριτικϊ φϊςματα FT-IR των νανοςωματιδύων CSUC με φϊρμακο α) ςτην φαςματικό περιοχό των υδροξυλικϐν ομϊδων και αμινομϊδων και β) ςτην περιοχό των καρβοξυλικϐν ομϊδων. 111

112 Intensity (counts) Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων XRD Από το κρυςταλλογρϊφημα ακτύνων Φ για την δραςτικό ουςύα (χόμα 3.21), Σιμολόλη, αποδεικνύεται πωσ εμφανύζει ϋντονη κρυςταλλικότητα, όπωσ και οι περιςςότερεσ δραςτικϋσ ουςύεσ. CS/TPP 2/1 Tim CS/TPP 4/1 Tim CS/TPP 7/1 Tim Timolol API CS theta (degree) χόμα 3.21: Κρυςταλλογραφόματα XRD νανοςωματιδύων CS με φϊρμακο Η καθαρό χιτοζϊνη εμφανύζει δύο χαρακτηριςτικϋσ κορυφϋσ ςε γωνύεσ 2θ 10 και 2θ 20, όπωσ φαύνεται ςτο χόμα 3.21 [75]. Από την ϊλλη, η χιτοζϊνη εμβολιαςμϋνη με ιτακονικό οξύ βρϋθηκε ϊμορφη, λόγω δικτύωςησ με γλουτεραλδεϗδη. Έχει επύςησ αναφερθεύ ότι η διϊλυςη τησ χιτοζϊνησ οδηγεύ ςτην εξαφϊνιςη τησ κορυφόσ ςτισ ~20 [76]. Για τα νανοςωματύδια χιτοζϊνησ με ενθυλϊκωςη τιμολόλησ που παραςκευϊςτηκαν εύναι φανερό πωσ αυτϊ με αναλογύα 2/1 και 4/1 εμφϊνιζουν κρυςταλλικότητα, παρόλο που η καθαρό χιτοζϊνη εύναι ημικρυςταλλικό. Αυτό το γεγονόσ, λογικϊ οφεύλεται ςτη δραςτικό ουςύα που παρϋμεινε ςτην επιφϊνεια των νανοςωματιδύων και δεν ενθυλακϐθηκε, κϊτι που μπορεύ να οφεύλεται ςε μειωμϋνεσ αλληλεπιδρϊςεισ μεταξύ CSUC και Tim. Όςον αφορϊ τα νανοςωματύδια με αναλογύα 7/1, εύναι ϊμορφα, ςτοιχεύο που ςυμφωνεύ με τα αποτελϋςματα του ρυθμού διϊλυςησ. 112

113 Intensity (counts) Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων CBCS TPP 2/1 Tim CBCS TPP 4/1 Tim CBCS TPP 7/1 Tim Timolol API CBCS neat theta (degree) χόμα 3.22: Κρυςταλλογραφόματα XRD νανοςωματιδύων CBCS με φϊρμακο το κρυςταλλογρϊφημα του χόματοσ 3.22 παρατηρεύται ότι η CBCS εύναι λιγότερο κρυςταλλικό από τη καθαρό χιτοζϊνη, με μύα ευρεύα κορυφό ςε γωνύα 2θ=22 που εμφανύζεται και ςε όλα τα δεύγματα με φϊρμακο, ςτα οπούα δεν εμφανύζονται κορυφϋσ του φαρμϊκου. Αυτό υποδεικνύει ότι η τιμολόλη εύναι ϊμορφη ςε όλα τα δεύγματα. Αυτό μπορεύ να οφεύλεται ςτουσ εκτεταμϋνουσ δεςμούσ υδρογόνου που ςχηματύςτηκαν μεταξύ τιμολόλησ και CBCS, όπωσ ςυμπερϊναμε από τη φαςματοςκοπύα FT-IR [77]. 113

114 Intensity (counts) Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων CSUC TPP 2/1 Tim CSUC TPP 4/1 Tim CSUC TPP 7/1 Tim Timolol API CSUC theta (degree) χόμα 3.23: Κρυςταλλογραφόματα XRD νανοςωματιδύων CSUC με φϊρμακο τη περύπτωςη τησ CSUC, χόμα 3.23, δεν παρατηρούμε τη κορυφό ςτισ 10, αλλϊ η κορυφό ςτισ 20 υπϊρχει, εντόσ ευρύτερων ορύων. Έχει αναφερθεύ ότι η κρυςταλλικό ςυμπεριφορϊ τησ CSUC εύναι μικρότερη από τησ καθαρόσ χιτοζϊνησ λόγω τησ χημικόσ τροπούηςησ [78-79]. Για τα νανοςωματύδια CSUC με ενθυλϊκωςη τιμολόλησ που παραςκευϊςτηκαν εύναι φανερό πωσ αυτϊ με αναλογύα 2/1 εμφανύζουν κρυςταλλικότητα, παρόλο που η καθαρό χιτοζϊνη εύναι ημικρυςταλλικό. Αυτό το γεγονόσ, λογικϊ οφεύλεται ςτη δραςτικό ουςύα που παρϋμεινε ςτην επιφϊνεια των ναοςωματιδύων και δεν ενθυλακϐθηκε ενϐ δικαιολογεύ τη χαμηλό αποδϋςμευςη τησ τιμολόλησ. Όςον αφορϊ τα νανοςωματύδια με αναλογύα 4/1 και 7/1, εύναι ϊμορφα, ςτοιχεύο που ςυμφωνεύ με τα αποτελϋςματα του ρυθμού διϊλυςησ. 114

115 3.2.6 Έλεγχοσ ρυθμού διϊλυςησ Η αποτελεςματικότητα μύασ φαρμακευτικόσ θεραπεύασ για τισ περιςςότερεσ οφθαλμικϋσ αςθϋνειεσ περιορύζεται από το μικρό χρόνο παραμονόσ των ςυμβατικϐν φαρμακευτικϐν μορφϐν των φαρμϊκων ςτην οφθαλμικό βλϋννα, λόγω τησ ϊμεςησ απομϊκρυνςησ του φαρμϊκου από την επιφϊνεια του κερατοειδούσ από τη ροό των δακρύων. Για να λυθεύ αυτό το πρόβλημα, προτϊθηκε η οφθαλμικό χορόγηςη φαρμϊκων με τη μορφό νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ [80]. Η τιμολόλη, ωσ β-αδρενεργικόσ αναςτολϋασ μειϐνει τη ενδοφθϊλμια πύεςη. ε αυτόν την διπλωματικό ςτόχοσ μασ όταν η μελϋτη τησ ϊμεςησ αποδϋςμευςησ τησ Σιμολόλησ, ςε διϊςτημα 6 ωρϐν,ϐςτε να μελετηθεύ το προφύλ απελευθϋρωςησ τησ από τα νανοςωματύδια χιτοζϊνησ. Ο ρυθμόσ διϊλυςησ επηρεϊζεται κυρύωσ από δύο παρϊγοντεσ, την κρυςταλλικότητα που μπορεύ να εμφανύςουν τα παραςκευαςθϋντα νανοςωματύδια και το μϋγεθοσ των νανοςωματύδιων. Η ςύγκριςη των προφύλ απελευθϋρωςησ κϊνει εμφανϋσ το γεγονόσ ότι η ενθυλϊκωςη τησ τιμολόλησ ςτα νανοςωματύδια μπορεύ να διατηρόςει την απελευθϋρωςη τησ. Η ελεγχόμενη αποδϋςμευςη του φαρμϊκου από τα νανοςωματύδια εύναι ςημαντικό, αφού μπορεύ να παρατεύνει τη παραμονό του φαρμϊκου ςτην επιφϊνεια του οφθαλμού, αυξϊνοντασ ϋτςι την βιοδιαθεςιμότητα του και το θεραπευτικό φαινόμενο. Η απελευθϋρωςη τησ τιμολολησ από τα νανοςωματύδια ακολουθεύ ϋνα διφαςικό μοτύβο, που χαρακτηρύζεται από μύα αρχικό απότομη απελευθϋρωςη που ακολουθεύται από πιο αργό απελευθϋρωςη. Η απότομη απελευθϋρωςη διόρκηςε 45 λεπτϊ, και κατα τη διϊρκεια αυτόσ τησ χρονικόσ περιόδου απελευθερϐθηκε το 50-60% του φαρμϊκου από τα νανοςωματύδια. Αυτό εύναι ςε ςυμφωνύα με πρόςφατεσ μελϋτεσ για νανοςωματύδια χιτοζϊνησ φορτωμϋνα με δραςτικϋσ ουςύεσ [80-81]. Η αρχικό γρόγορη απελευθϋρωςη μπορεύ να εύναι αποτϋλεςμα τησ ϊμεςησ διϊλυςησ των κρυςτϊλλων φαρμϊκου που βρύςκονται ςτην επιφϊνεια των νανοςωματιδύων ό κοντϊ τησ. Μετϊ την περύοδο εκρηκτικόσ απελευθϋρωςησ, ο ρυθμόσ πϋφτει, αφού ο κυρύαρχοσ μηχανιςμόσ απελευθϋρωςησ αλλϊζει ςε διϊχυςη του φαρμϊκου ςτη μότρα χιτοζϊνησ. Ο ςυνολικόσ ρυθμόσ απελευθϋρωςησ του φαρμϊκου (δηλαδό το κλϊςμα του 115

116 Drug Release (%) Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων περιεχομϋνου ςε φϊρμακο που ελευθερϐνεται ςε ςυγκεκριμϋνο χρόνο) ϋχει τη τϊςη να μεγαλϐνει όςο αυξϊνεται η αναλογύα του φαρμϊκου ςτα νανοςωματύδια. Αυτό βρύςκεται ςε ςυμφωνύα με πρόςφατη μελϋτη νανοςωματιδύων χιτοζϊνησ που περιεύχαν λυςοζύμη [82] και οφεύλεται ςτο μεγαλύτερο πορϐδεσ των νανοςωματιδύων που δημιουργεύται κατϊ τη διϊλυςη του φαρμϊκου CS/TPP 2/1 Tim CS/TPP 4/1 Tim CS/TPP 7/1 Tim Time (min) χόμα 3.24 In vitro ρυθμόσ αποδϋςμευςησ τησ τιμολόλησ από τα νανοςωματύδια CS Ειδικότερα, για τα αποτελϋςματα με την καθαρό χιτοζϊνη, όπωσ φαύνεται ςτο χόμα 3.24, εύναι φανερό πωσ τα νανοςωματύδια με αναλογύα 4/1 εμφανύζουν καλύτερη αποδϋςμευςη ςε ποςοςτό, γεγονόσ που το εξηγεύται από το μικρότερο μϋγεθοσ των νανοςωματιδύων αυτόσ τησ αναλογύασ. Επιπλϋον, ϊμεςη αποδϋςμευςη τησ τιμολόλησ οφεύλεται ςτη δραςτικό ουςύα που επικϊθιςε ςτην επιφϊνεια των νανοςωματιδύων. Προφανϐσ, η αποδϋςμευςη δεν εύναι πολύ μεγϊλη, όμωσ εύναι φανερό η ελεγχόμενη απόδοςη του. 116

117 Drug Release (%) Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων Time (min) CBCS/TPP 2/1 Tim CBCS/TPP 4/1 Tim CBCS/TPP 7/1 Tim χόμα 3.25: In vitro ρυθμόσ αποδϋςμευςησ τησ τιμολόλησ από τα νανοςωματύδια CBCS Όςον αφορϊ τα αποτελϋςματα με την CBCS που παρουςιϊζονται ςτο χόμα 3.25, τα νανοςωματύδια με αναλογύα 2/1 δύνουν μεγαλύτερη αποδϋςμευςη ςε ποςοςτό, γεγονόσ που εξηγεύται από το μικρότερο μϋγεθοσ των νανοςωματιδύων αυτόσ τησ αναλογύασ και την ϊμορφη καταςταςη την οπούα παρουςιϊζουν τα νανοςωματύδια. 117

118 Drug Release (%) Παραςκευό και μελϋτη νανοςωματιδύων τροποποιημϋνησ χιτοζϊνησ, ωσ φορεύσ αποδϋςμευςησ φαρμϊκων CSUC/TPP 2/1 Tim CSUC/TPP 4/1 Tim CSUC/TPP 7/1 Tim Time (min) χόμα 3.26: In vitro ρυθμόσ αποδϋςμευςησ τησ τιμολόλησ από τα νανοςωματύδια CSUC Για τα αποτελϋςματα με την CSUC εύναι πωσ τα νανοςωματύδια με αναλογύα 7/1 δύνουν μεγαλύτερη αποδϋςμευςη ςε ποςοςτό, γεγονόσ που εξηγεύται από την ϊμορφη δομό και το μικρότερο μϋγεθοσ των νανοςωματιδύων αυτόσ τησ αναλογύασ. Από τα αποτελϋςματα, τησ κρυςταλλογραφύασ ακτύνων Φ τα παραςκευαςθϋντα νανοςωματύδια με αναλογύα ςε ΣΡΡ 2/1 και 4/1, εμφανύζουν ϋντονη κρυςταλλικότητα, ςυνεπϐσ ο ρυθμόσ διϊλυςησ τουσ αν και ελεγχόμενοσ εύναι πολύ μικρόσ. H απελευθϋρωςη εύναι ελεγχόμενη και για τισ τρεισ διαφορετικϋσ χιτοζϊνεσ, αλλϊ παρατηρούμε ότι εύναι αρκετϊ μεγαλύτερη ςε ποςοςτό ςτα δεύγματα με CBCS, τα οπούα ςύμφωνα με την μελϋτη XRD εύναι τα μόνα που δε παρουςιϊζουν κρυςταλλικότητα, δηλαδό το φϊρμακο εύναι ϊμορφο κι ϋτςι η διϊλυςη του εύναι πιο εκτεταμϋνη. 118

119 4. Συμπερϊςματα 119