ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΧΡΟΝΙΑ ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟΣ ΚΑΙ BMP-7 (BONE MORPHOGENIC PROTEIN-7) ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΜΟΡΙΟΥ BMP-7 ΣΤΗΝ ΠΡΟΛΗΨΗ Η ΑΝΑΣΤΡΟΦΗ ΤΗΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ ΤΡΙΓΚΑ Κ. ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ Ιατρός ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΣ ΤΙΤΛΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΠΑΤΡΑ, 2006

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΣΩΤΗΡΟΠΟΥΛΟΥ ΓΕΩΡΓΙΑ Αναπλ. Καθηγήτρια,Εργ.Ανατομίας και Ιστολογίας Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Πατρών,επιβλέπουσα καθηγήτρια ΒΑΡΑΚΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ Καθηγητής-Διευθυντής, Εργ.Ανατομίας και Ιστολογίας Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Πατρών. ΑΣΗΜΑΚΟΠΟΥΛΟΥ ΜΑΡΘΑ Επικ.Καθηγήτρια, Εργ.Ανατομίας και Ιστολογίας Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Πατρών. 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ι.1. Εισαγωγή 5 Σελίδα ΙΙ.1. Χρόνια νεφρική ανεπάρκεια 6 ΙΙ.2. Μηχανισμοί και στάδια ανάπτυξης ίνωσης του νεφρικού ιστού 11 ΙΙ.3. Κυτταρική ενεργοποίηση και φάση βλάβης 13 ΙΙ.4. Ινογενετική φάση 24 ΙΙ.5. Καταστροφική φάση 27 ΙΙΙ. Αυξητικοί παράγοντες που ενέχονται 31 στην ανάπτυξη ίνωσης του νεφρικού ιστού ΙΙΙ.1 Transforming Growth Factor β (TGF-β ) 31 ΙΙΙ.2 Hepatocyte Growth Factor (HGF) 37 ΙΙΙ.3. Το YIN και YANG της ιστικής ινωτικής σηματοδότησης 40 ΙΙΙ.4 Basic-Fibroblast Growth Factor (b-fgf) 42 ΙΙΙ.5. Platelet Derived Growth Factor (PDGF) 43 ΙΙΙ.6 Insulin-like Growth Factor 1 (IGF-1) 45 ΙΙΙ.7. Epidermal Growth Factor (EGF) 46 ΙΙΙ.8. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) 47 ΙV. BMPs, BMP -7 και νεφρός 48 IV.1. Ο ρόλος των BMPs στην ανάπτυξη του νεφρού. 48 IV.2. ΒΜΡ-7 στο νεφρό, ΒΜΡ υποδοχείς και Smads. 54 IV.3 Ρυθμιση της βιολογικής δραστηριότητας 61 της ενδογενούς BMP-7 στους νεφρούς IV.4.. Οξεία νεφρική ανεπάρκεια. 67 IV.5.. Χρόνια νεφρική ανεπάρκεια και μοντέλο εναπομείνοντος νεφρού. 70 IV.6. Διαβητική νεφροπάθεια και BMP-7 72 IV.7. Άλλα είδη βλάβης και εξωγενής χορήγηση ΒΜΡ-7 72 3

4 IV.8. Η δράση του ΒΜΡ-7 σε καλλιέργειες νεφρικών κυττάρων 76 IV.9. Ανταγωνιστές της BMP-7 79 IV10. BMP 7, οστικές και αγγειακές επιπλοκές 80 της χρόνιας νεφρικής νόσο IV.11. Η δράση άλλων BMPs στους νεφρούς 80 IV.12. Η ΒΜΡ-7 εμποδίζει τη νεφρική ίνωση. 84 V. Μελλοντικές προοπτικέs των BMPs 88 VI. Μπορεί να αναστραφεί η νεφρική ίνωση; 88 VII. Συμπεράσματα 90 VIII. Βιβλιογραφία 92 4

5 Εισαγωγή Η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια οφείλεται σε διάφορα αίτια βλάβης του σπειράματος και του διαμεσοσωληναριακού χώρου. Χαρακτηρίζεται ιστολογικά από την παρουσία σοβαρού βαθμού σπειραματικής σκλήρυνσης, ίνωσης του διάμεσου ιστού, ατροφίας των ουροφόρων σωληναρίων και υαλίνωσης των αρτηριδίων. Η αρχική βλάβη του σπειράματος που προκαλείται από διάφορα είδη ερεθισμάτων μπορεί να ακολουθήσει την οδό της αποκατάστασης ή να εξελιχθεί προς σκλήρυνση, διαδικασίες στις οποίες συμμετέχουν κυτταροκίνες και αυξητικοί παράγοντες που προέρχονται από ενδοθηλιακά, μεσαγγειακά, επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα, μονοκύτταρα και ινοβλάστες 1. Ο Transforming Growth Factor-β 1 (TGF-β 1 ) είναι ο κυριότερος αυξητικός παράγοντας που μέσω πολλαπλών μηχανισμών συμμετέχει στην ανάπτυξη σκληρυντικών αλλοιώσεων 2. Προάγει την παραγωγή συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και μειώνει την αποικοδόμησή τους, προκαλεί ενεργοποίηση των μυοϊνοβλαστών, δηλαδή κυττάρων με μεταναστευτικές ιδιότητες που παράγουν κολλαγόνο, συμμετέχει στη διαφοροποίηση των επιθηλιακών σωληναριακών κυττάρων προς ινοβλάστες και ευοδώνει την κυτταρική απόπτωση 3 η οποία οδηγεί στην απογύμνωση του νεφρικού ιστού από τα φυσιολογικά του κύτταρα. Η χρήση αντισωμάτων κατά του TGF-β 1 και αναστολέων του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης σε διάφορα πειραματικά μοντέλα νεφρικής βλάβης έχει 5

6 συμβάλλει στην κατανόηση μηχανισμών που συμμετέχουν στη διαδικασία εξέλιξής της. Σε πειραματικά μοντέλα έχει διαπιστωθεί ότι ο TGF β ευθύνεται για την αυξημένη παρουσία μυοινοβλαστών, την εναπόθεση κολλαγόνου και την απώλεια του σωληναριακού επιθηλίου. Πιο πρόσφατα, ένα μέλος της υπερ-οικογένειας των ΤGF β, η ΒΜΡ7, φάνηκε να εξουδετερώνει την ίνωση που προκαλείται μέσω του TGF β. Οι δραστηριότητα των παραγόντων αυτών ελέγχεται από άλλες πρωτείνες οι οποίες μπορούν να αυξήσουν ή να καταστείλουν τη διέγερση των υποδοχέων των παραγόντων αυτών. Τα BMPs είναι ενδογενή μόρια που προστατεύουν το νεφρό από διάφορα είδη βλάβης όπως γενετικές βλάβες, ανοσολογικές αντιδράσεις, περιβαλλοντικοί παράγοντες, μεταβολικά αίτια και καταστάσεις οξείας ή χρόνιας νεφρικής βλάβης 4. Χρόνια νεφρική ανεπάρκεια Η συχνότητα εμφάνισης της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας (ΧΝΑ) βαίνει διαρκώς αυξανόμενη και φαίνεται ότι τα επόμενα χρόνια θα φτάσει σε επίπεδα επιδημίας. Ο αριθμός των ασθενών που χρήζουν υποκατάσταση της νεφρικής λειτουργίας αυξάνεται κάθε χρόνο, ενώ στις Ηνωμένες Πολιτείες υπολογίζεται ότι μέχρι το έτος 2030, οι ασθενείς με νεφρική ανεπάρκεια τελικού σταδίου (ESRD) θα είναι περίπου 2.24 εκατομμύρια. Επιπλέον, περίπου 11% του πληθυσμού υπολογίζεται ότι έχει έκπτωση της νεφρικής λειτουργίας και οι μισοί από τους ασθενείς αυτούς έχουν ρυθμό σπειραματικής διήθησης (GFR) 6

7 μικρότερο από 60ml/min/1.73m2 (ο φυσιολογικός GFR είναι τουλάχιστον 100ml/min/1.73m2). Παρόμοιες εκτιμήσεις για άλλες χώρες έχουν γίνει τόσο στην Αυστραλία και στην Ιαπωνία όσο και στην Ευρώπη. 5 Η εξέλιξη της ήδη εγκατεστημένης χρόνιας νεφρικής βλάβης εξαρτάται από διάφορους παράγοντες κινδύνου ή δείκτες. Οι μη δυνάμενοι να αποτραπούν παράγοντες είναι το γένος, η φυλή, η ηλικία και το οικογενειακό ιστορικό. Ο κυριότερος παράγοντας ο οποίος μπορεί να αντιμετωπιστεί με φαρμακευτική αγωγή είναι η αρτηριακή υπέρταση. Η λευκωματουρία αποτελεί βασικό δείκτη της βαρύτητας της χρόνιας νεφρικής βλάβης αλλά και σημαντικό και ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα της εξέλιξης της νόσου. Οι ασθενείς με σοβαρού βαθμού λευκωματουρία (>3-5 γρ. ημερησίως) εμφανίζουν γρηγορότερη εξέλιξη της νόσου από αυτούς με ήπια ή μέτρια λευκωματουρία (1-3 γρ. ημερησίως). Ποικίλοι μεταβολικοί παράγοντες, όπως η κακή ρύθμιση του σακχάρου και η υπερλιπιδαιμία συντελούν στην εξέλιξη της διαβητικής νεφροπάθειας στον διαβήτη τύπου Ι και ΙΙ αλλά και στην εξέλιξη της άλλων αιτίων νεφρικής βλάβης. Η ανά τον κόσμο αυξανόμενη επίπτωση της παχυσαρκίας μπορεί να επηρεάσει την εξέλιξη της χρόνιας νεφρικής νόσου. Το κάπνισμα συντελεί επίσης στην έναρξη και την εξέλιξη της χρόνιας νεφρικής νόσου. Παρά την σημαντική πρόοδο στη μελέτη των μηχανισμών που ενοχοποιούνται για την ανάπτυξη της χρόνιας νεφρικής νόσου, οι δυνατότητες για αποτελεσματική παρέμβαση περιορίζονται στην αντιμετώπιση ορισμένων σημαντικών παραγόντων κινδύνου. Ο έλεγχος της αρτηριακής υπέρτασης με αναστολείς του μετατρεπτικού ενζύμου ή με αποκλειστές των υποδοχέων της αγγειοτενσίνης, 7

8 η αντιμετώπιση της υπεργλυκαιμίας στους διαβητικούς, η μείωση της πρωτεϊνουρίας, ο έλεγχος της δυσλιπιδαιμίας και η διακοπή του καπνίσματος αποτελούν τις κυριότερες θεραπευτικές παρεμβάσεις. Η σημαντικότερη παράμετρος η οποία θα έχει ουσιαστική μείωση της επίπτωσης της χρόνιας νεφρικής νόσου είναι η επιθετική πρωτοπαθής και δευτεροπαθής πρόληψη. Για το λόγο αυτό η κατανόηση των μηχανισμών πρόκλησης της βλάβης και εξέλιξής της σε χρόνια νεφρική ανεπάρκεια, θα οδηγήσει σε αποτελεσματικότερους χειρισμούς με σκοπό την καθυστέρηση ή/και την αναστολή της εξέλιξης της χρόνιας νεφρικής νόσου. Αν και τα αίτια της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας είναι πολλά (ανοσολογικά, μεταβολικά, αιμοδυναμικά, κληρονομικές παθήσεις) στις περισσότερες περιπτώσεις εκτός από την σπειραματική βλάβη συνυπάρχει και σημαντικού βαθμού βλάβη του διάμεσοσωληναριακού χώρου (φλεγμονώδης διήθηση, ίνωση και ατροφία). Είναι γνωστό άλλωστε ότι η βαρύτητα των αλλοιώσεων του διαμεσοσωληναριακού χώρου συσχετίζεται καλύτερα με το ρυθμό απώλειας της νεφρικής λειτουργίας. 6 Ο σημαντικότερος παράγοντας που ενοχοποιείται για την εμφάνιση της ίνωσης είναι ο αυξητικός παράγοντας TGF β1. 7 Η οστική μορφογενετική πρωτεϊνη (ΒΜΡ) 7 φαίνεται να εξουδετερώνει την προ ινωτική δραστηριότητα του TGF β1. 7,8 Παρά τις όποιες πρόσφατες θεραπευτικές δοκιμές σε μοντέλα με ποντίκια με οξεία και χρόνια νεφρική ανεπάρκεια τα οποία έχουν επιδείξει την δραστικότητα της ΒΜΡ7 στην αποτροπή της προόδου της νεφρικής ίνωσης και σε μερικές περιπτώσεις, την αναστροφή της νεφρικής ίνωσης, πολλά ερωτήματα σχετικά με τους μοριακούς 8

9 μηχανισμούς και την κλινική σχέση ανάμεσα στον TGF β και στην ΒΜΡ7 παραμένουν. 8 Στον φυσιολογικό νεφρό Ο διάμεσος ιστός μεταξύ των νεφρώνων είναι ελάχιστος Εικόνα 1. Διάμεση ίνωση και ήπια χρόνια φλεγμονή Χρόνια νεφρική ανεπάρκεια Εικόνα 2. 9

10 Εικόνα 3. Οι παθογενετικοί μηχανισμοί που οδηγούν σε χρόνια νεφρική νόσο (ΧΝΝ) συγκλίνουν σε ένα κοινό μονοπάτι που καταλήγει σε προοδευτική διάμεση ίνωση του νεφρού, απώλεια περισωληναριακών τριχοειδών με αποτέλεσμα υποξία του νεφρικού παρεγχύματος και καταστροφή των λειτουργικών νεφρώνων λόγω της σωληναριακής ατροφίας. Τα συχνότερα αίτια είναι :Σακχαρώδης διαβήτης, αρτηριακή υπέρταση, σπειραματονεφρίτιδες, πολυκυστικοί νεφροί. Εικόνα4. Αναλυτικά η προοδευτική εξέλιξη της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας. Η προοδευτική εξέλιξη της χρόνιας νεφρικής νόσου. 10

11 Μηχανισμοί και στάδια ανάπτυξης ίνωσης του νεφρικού ιστού Η σπειραματική σκλήρυνση και η ίνωση του διάμεσου νεφρικού χώρου αναπτύσσονται σταδιακά και εξαρτώνται από τη δράση πολλών παραγόντων που δρούν είτε ευοδόντας είτε αναστέλλοντας τη διαδικασία. Αρχικά παρατηρείται ενεργοποίηση των επιθηλιακών και ενδοθηλιακών κυττάρων. Στη φάση αυτή παρατηρείται ενεργοποίηση των επιθηλιακών σωληναριακών κυττάρων ενώ το ενδοθήλιο των περισωληναριακών τριχοειδών ευνοεί την μετανάστευση μονοπύρηνων στον διάμεσο χώρο. Τα μονοπύρηνα αυτά ωριμάζουν σε μακροφάγα ενώ παράλληλα παρατηρείται και ενεργοποίηση μυοινοβλαστών που αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται στον διάμεσο χώρο. 9 Ακολουθεί απελευθέρωση κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων που ευνοούν την ανάπτυξη ίνωσης (TGF-β, CTGF, ANG-II, ET- 1, PDGF, β FGF, TNF-a, IL-1) και άλλων (HGF, BMP-7, INF-γ) που έχουν αντίθετη δράση. Στη συνέχεια παρατηρείται συσσώρευση των πρωτεινών της θεμέλιας ουσίας που οφείλεται σε αυξημένο ρυθμό σύνθεσης και μειωμένο ρυθμό αποδόμησής λόγω μειωμένης παραγωγής αναστολέων πρωτεασών (MMPs, PAI). 5,6,9 Τέλος επισυμβαίνει κατάλυση της φυσιολογικής αρχιτεκτονικής και ουλοποίηση του νεφρικού ιστού. 11

12 Lancet. 2005 Jan 22-28;365(9456):331-40 Διαγραμματική απεικόνιση των σταδίων της σπειραματοσκλήρυνσης Εικόνα 5. GBM=σπειραματική βασική μεμβράνη; ECM=εξωκυττάρια θεμέλια ουσία. Διαγραμματική απεικόνιση των σταδίων της σωληναροδιάμεσης ίνωσης Εικόνα 6. TBM=σωληναριακή βασική μεμβράνη; ECM=εξωκυττάρια θεμέλια ουσία 12

13 Κυτταρική ενεργοποίηση και φάση βλάβης Κατά την αρχική φάση της νεφρικής βλάβης συμβαίνει ενεργοποίηση των διαφόρων τύπων κυττάρων (ενδοθηλιακών, μεσαγγειακών, επιθηλιακών σωληναριακών και κυττάρων του διάμεσου χώρου) τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στην μετέπειτα εναπόθεση στοιχείων της θεμέλιας ουσίας στο σπείραμα και στο διάμεσο χώρο. Ανεξάρτητα από την αρχική αιτία της σπειραματικής βλάβης, η εξέλιξή της προς σκλήρυνση συνδέεται με μεταβολή των χαρακτηριστικών των ενδοθηλιακών κυττάρων, τα οποία εκφράζουν μόρια προσκόλλησης και επιτρέπουν την είσοδο και τη συσσώρευση αιμοπεταλίων και μονοκυττάρων εντός του σπειράματος και με φαινοτυπική μεταβολή των μεσαγγειακών κυττάρων 10. Η απελευθέρωση κυτταροκινών (IL-1, TNF-α, IL-8, MCP-1) και αυξητικών παραγόντων (PDGF, TGF-β 1 ) από ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα, μονοκύτταρα και αιμοπετάλια, οδηγεί σε περαιτέρω προσέλκυση κυττάρων φλεγμονής στο σπείραμα και ενεργοποίηση των μεσαγγειακών κυττάρων με επακόλουθο υπερπλασία, φαινοτυπικές μεταβολές και αυξημένη παραγωγή συστατικών της θεμέλιας ουσίας 11. Ο PDGF είναι κυρίως υπεύθυνος για την πρόκληση μεσαγγειακής υπερπλασίας, ενώ ο TGF-β 1 για τη μεταλλαγή των μεσαγγειακών κυττάρων προς μυοϊνοβλάστες, η οποία εκδηλώνεται με έκφραση της α-ακτίνης των λείων μυϊκών ινών (α-sma) 1,2,12 (εικόνα 1α, 1β). Επιπλέον, ο TGF-β 1 ενέχεται 13

14 στη διαδικασία ανάπτυξης σπειραματικής σκλήρυνσης, μέσω διέγερσης της σύνθεσης και απελευθέρωσης των συστατικών της θεμέλιας ουσίας (κολλαγόνου Ι, ΙΙΙ, IV και άλλων) και με αναστολή της δράσης των μεταλλοπρωτεϊνασών 2,13. Η ενεργοποίηση των επιθηλιακών σωληναριακών κυττάρων οφείλεται σε τοξική επίδραση του διηθήμενου λευκώματος επί παρουσίας σοβαρού βαθμού λευκωματουρίας, στην παρουσία πρωτεινών-στοιχείων του συμπληρώματος, κυτταροκινών και χημειοτακτικών παραγόντων. 14 Η παρουσία σημαντικής ποσότητας λευκώματος στο διήθημα οδηγεί σε αυξημένη επαναρρόφησή του και απελευθέρωση ενζύμων από τα λυσοσώματα των επιθηλιακών σωληναριακών κυττάρων. Δηλαδή τα επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα εκτίθενται σε βιοενεργά μόρια που προέρχονται από το πλάσμα ή από τα φλεγμονώδη σπειράματα και εμφανίζονται στο σπειραματικό υπερδιήθημα. Για παράδειγμα η τρανσφερρίνη, μία πρωτείνη 77kDa που μπορεί να υπάρχει στο διήθημα αποτελεί πηγή σιδήρου που δημιουργεί καταστροφικές μορφές ριζών οξυγόνου. Η συνάθροιση σιδήρου στα λυσοσώματα των σωληναριακών κυττάρων αποτελεί ένδειξη χρόνιας σπειραματικής βλάβης. 15 Οι πρωτείνες του συμπληρώματος C3a, C5a που εμφανίζονται στο διήθημα σε καταστάσεις με λευκωματουρία, ενεργοποιούν τα σωληναριακά κύτταρα μέσω της εναλλακτικής οδού του συμπληρώματος και προάγουν την προσέλκυση μονοκυττάρων στην περιοχή της βλάβης. 14

15 Εικόνα 7. Μηχανισμοί της χρόνιας σωληναροδιάμεσης ίνωσης σε περιπτώσεις σπειραματονεφριτίδων.το διήθημα που περιέχει πρωτείνες και κυτταροκίνες (προερχόμενες από τα λευκοκύτταρα) ενεργοποιεί την έκκριση κυτταροκινών, αυξητικών παραγόντων και άλλων διαμεσολαβητών στα σωληναριακά κύτταρα.αυτά τα στοιχεία μαζί με πρόιόντα των μακροφάγων (Η ενδοθηλίνη 1, το PAI-1, plasminogen activator inhibitor-1; Ο TIMP-1, tissue inhibitor of metalloproteinases),προκαλούν διάμεση φλεγμονή και ίνωση. 15

16 Τα ενεργοποιημένα σωληναριακά κύτταρα παράγουν μόρια που ευοδώνουν τη φλεγμονώδη αντίδραση του διάμεσου χώρου και προάγουν την εξέλιξη της νεφρικής βλάβης όπως κυτταροκίνες (Monocyte Chemoattractant Protein MCP-1), ενδοθηλίνης-1 (ET-1), και αυξητικών παραγόντων (TGF-β 1 ). Ο MCP-1 συμμετέχει στην προσέλκυση μονοκυττάρων από την κυκλοφορία και στην φλεγμονώδη διήθηση του διάμεσου ιστού, εύρημα αρκετά συχνό σε βιοψίες ασθενών με προοδευτικά εξελισσόμενη βλάβη. Τα μονοκύτταρα αυτά παράγουν κυτταροκίνες και αυξητικούς παράγοντες (PDGF, TGF-β 1 ) που οδηγούν σε περαιτέρω προσέλκυση Τ-λεμφοκυττάρων και μονοκυττάρων στο διάμεσο χώρο, και ενεργοποίηση ινοβλαστών προς μυοϊνοβλάστες. Η παραγωγή ενδοθηλίνης-1 (ET-1) και αγγειοτενσίνης ΙΙ έχει ως συνέπεια την εμφάνιση αγγειοσύσπασης η οποία επιδεινώνει περαιτέρω τη σωληναριακή βλάβη λόγω ισχαιμίας και προάγει την ανάπτυξη ίνωσης του νεφρικού ιστού. Η αγγειοτενσίνη ΙΙ ενεργοποιεί την υπερπλασία/υπερτροφία των λείων μυϊκών και των σωληναριακών κυττάρων και την παραγωγή του TGF-β 1 από επιθηλιακά κύτταρα και ινοβλάστες 21. Η ΕΤ-1 συμβάλλει στη ανάπτυξη σκληρυντικών αλλοιώσεων του διάμεσου ιστού μέσω κοινής οδού με την αγγειοτενσίνη ΙΙ και τον TGF-β 1, αλλά και με την πρόκληση ισχαιμίας λόγω ισχυρής αγγειοσυσπαστικής δράσης 22,23. Η υποξία του σωληναριοδιάμεσου χώρου έχει ως συνέπεια την ενεργοποίηση επιθηλιακών σωληναριακών κυττάρων με έκφραση μορίων προσκόλλησης και την περαιτέρω παραγωγή συστατικών της θεμέλιας ουσίας. 16

17. Εικόνα 8. Πώς δημιουργείται η ίνωση μετά από ιστική βλάβη;η χρόνια φλεγμονή ενεργοποιεί τα μακροφάγα και τα λεμφοκύτταρα, οδηγώντας σε παραγωγή αυξητικών παραγόντων και κυτταροκινών,που προκαλούν σύνθεση κολαγόνου.η εναπόθεση του κολαγόνου είναι αυξημένη όταν η δραστηριότητα των μεταλοπρωτεασών είναι μειωμένη Η διήθηση του διάμεσου χώρου από μονοκύτταρα και μακροφάγα που προέρχονται κυρίως από προσέλκυσή τους από την κυκλοφορία και διαπίδησης μέσω του ενδοθηλίου των περισωληναριακών τριχοειδών, έχει ως συνέπεια την παραγωγή κυτταροκινών, χυμοκινών (π.χ MCP-1) που οδηγούν στην παραγωγή πολλών προ-ινωτικών μορίων. Μόρια προσκόλλησης των λευκοκυττάρων (ICAMs,VCAMs) παίζουν σημαντικό ρόλο στις περισσότερες φλεγμονώδεις αντιδράσεις. Στη χρόνια νεφρική ανεπάρκεια τα σωληνάρια εκφράζουν de novo ή αυξάνουν την έκφρασή των ICAMs,VCAMs. Τα μόρια προσκόλλησης στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων των περισωληναριακών τριχοειδών και οι χυμοκίνες, ευνοούν την μετανάστευση των λευκοκυττάρων στον διάμεσο χώρο. Τα επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα ενέχονται και άμεσα στην ινογενετική διαδικασία. Προ-ινωτικοί 17

18 αυξητικοί παράγοντες όπως οι IGF και TGF-β ενεργοποιούν τη σύνθεση των πρωτεινών της θεμέλιας ουσίας από τα κύτταρα αυτά. Επιπλέον, τα επιθηλιακά κύτταρα των ουροφόρων σωληναρίων, υπό την επίδραση του TGF-β 1, διαφοροποιούνται και αποκτούν χαρακτηριστικά ινοβλαστών, που εκδηλώνονται με την έκφραση βιμεντίνης και ειδικής πρωτεΐνης των ινοβλαστών (fibroblast specific protein, FSP-1) και συμμετέχουν στην παραγωγή συστατικών της θεμέλιας ουσίας. 24 Εικόνα 9. Ο ρόλος των ενεργοποιημένων μακροφάγων στην χρονία φλεγμονή. Τα Μακροφάγα ενεργοποιούνται από κυτταροκίνες που προέρχονται από ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα (ιδιαίτερα IFN-γ) ή από μη ανοσολογικά ερεθίσματα όπως ενδοτοξίνη Εκτός από την ενεργοποίηση των επιθηλιακών σωληναριακών κυττάρων και τη φλεγμονώδη διήθηση του διάμεσου χώρου, λαμβάνει χώρα 18

19 και εμφάνιση μυοινοβλαστών από ενεργοποίηση των εγγενών ινοβλαστών του διάμεσου χώρου. Οι μυοϊνοβλάστες είναι κύτταρα με συσταλτικές και μεταναστευτικές ιδιότητες που εκφράζουν α-sma 12 και παράγουν σημαντικές ποσότητες κολλαγόνου Ι και ΙΙΙ, όπως και άλλων συστατικών της θεμέλιας ουσίας. Σε φυσιολογικές καταστάσεις ανευρίσκονται στο τοίχωμα των αρτηριολίων του νεφρού, ενώ σε ασθενείς με σπειραματονεφρίτιδες ανιχνεύονται στα σπειράματα και στο διάμεσο ιστό (περισπειραματικές και περισωληναριακές περοχές). Οι μυοινοβλάστες έχουν μεγαλύτερη προινωτική δράση από τους ινοβλάστες. Η ακριβής προέλευσή τους δεν είναι γνωστή παρά το γεγονός ότι μπορεί να ποροέρχονται από διαφοροποίηση και /ή πολλαπλασιασμό των εγγενών ινοβλαστών, από μετανάστευση περιαγγειακών κυττάρων και από διαφοροποίηση και μετανάστευση επιθηλιακών σωληναριακών κυττάρων κάτω από την επίδραση του TGF-β. Ο αριθμός των μυοινοβλαστών του διάμεσου χώρου, σχετίζεται άμεσα με την σωληναροδιάμεση ίνωση και η έντονη παρουσία τους αποτελεί δυσμενή προγνωστικό δείκτη για την εξέλιξη της νεφρικής νόσου. Οι ινοβλάστες στον νεφρικό φλοιό έχουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της παραγωγής της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και στη διατήρηση της αρχιτεκτονικής του νεφρικού ιστού. Παράγουν πληθώρα κυτταροκινών, χυμοκινών, αυξητικών παραγόντων και μορίων προσκόλησης, που έχουν σημαντικό ρόλο σε αυτοκρινείς και παρακρινείς αλληλεπιδράσεις και ρυθμίζουν την απάντηση του διάμεσου χώρου στη διαδικασία φλεγμονής και ίνωσης. Επιπρόσθετα εμφανίζουν ενδοκρινική λειτουργία με την παραγωγή ερυθροποιητίνης. Η προέλευσή τους μπορεί να είναι από εγγενείς ινοβλάστες 19

20 του νεφρικού φλοιού αλλά και από αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα ή κύτταρα του στρώματος του μυελό των οστών (stem cells). Οι ινοβλάστες ενεργοποιούμενοι κατά τη διαδικασία της νεφρικής βλάβης, εκφράζουν ένα μυοινοβλαστικό φαινότυπο. Η μετατροπή από μία φάση ηρεμίας σε ενεργοποιημένο πληθυσμό ινοβλαστών επάγεται από: α) παραγωγή αυξητικών παραγόντων [TGF-β1, connective tissue growth factor (CTGF), fibroblast growth factor (FGF) και platelet derived growth factor (PDGF)] με αυτοκρινή ή παρακρινή δράση, β) από την άμεση κυτταρική επαφή (λευκά / μακροφάγα με κύτταρα διάμεσου ιστού), γ) από αλληλεπίδραση μεταξύ πρωτεινών της θεμέλιας ουσίας και ντεγκρίνης και δ) από την έκθεση σε περιβαντολλογικά ερεθίσματα όπως υποξία, αυξημένη γλυκόζη, πρωτείνες συμπληρώματος, τελικά προιόντα όψιμης γλυκοζυλίωσης και οξειδωτικό στρές. 24,25 20

21 Εικόνα 10. Οι φυσιολογικοί ινοβλάστες βρίσκονται μέσα στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία,που αποτελείται από κολλαγόνο τύπου Ι και ινονεκτίνη. Οι ινοβλάστες αλληλεπιδρούν με το μικροπεριβάλλον μέσω ιντεγκρίνων.τυπικά οι ινοβλάστες εμφανίζονται ως επιμήκη κύτταρα με κυτταροσκελετό ακτίνης και βιμεντίνης. Αν και η ανίχνευση των ινοβλαστών μπορεί να αποτελεί πρόκληση γιατί δεν υπάρχουν πολλοί εξειδικευμένοι δείκτες για τους ινοβλάστες,η ινοβλαστική ειδική πρωτείνη 1 (FSP1), είναι ειδική για τους ινοβλάστες των φυσιολογικών ιστών. Ενεργοποιημένοι ινοβλάστες Εικόνα 11. Οι ενεργοποιημένοι ινοβλάστες αποκτούν φαινότυπο, που σχετίζεται με αυξημένη παραγωγή πρωτεινών θεμέλιας ουσίας όπως κολλαγόνο τύπου Ι, tenascin C, φίμπρονεκτίνη και SPARC (secreted protein 21

22 acidic and rich in cysteine). Οι ενεργοποιημένοι ινοβλάστες εκφράζουν α- smooth-muscle actin. Ένας μεγάλος αριθμός αυξητικών παραγόντων όπως ο TGF-β, χυμοκίνες όπως η MCP1 και οι πρωτεάσες που αποδομούν την θεμέλια ουσία,επάγουν την ενεργοποίηση των ινοβάστών. Οι μυοινοβλάστες μπορεί επίσης να προέρχονται από επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα μέσω μίας διαδικασίας που είναι γνωστή ως επιθηλιακή μεσεγχυματική διαφοροποίηση η οποία χαρακτηρίζεται από: 1. Απώλεια επιθηλιακής κυτταρικήςπροσκόλησης; 2. De-novo έκφραση α-smaκαι επαναδιοργάνωση ακτίνης; 3. Ρήξη της σωληναριακής μεμβράνης 4. Αυξημένη κυτταρική μετανάστευση και διείσδυση. 24,25,31 Στη διαδικασία αυτή συμμετέχουν ο TGF-β και η BMP7 μέσω ενεργοποίησης των υποδοχέων τους. Η ενεργοποίηση του υποδοχέα του TGF-β στα επιθηλιακά κύτταρα επάγει την φωσφορυλίωση του Smad2 και Smad3 και την πυρηνική ματαφορά του με το Smad4. Στον πυρήνα, αυτές οι Smad πρωτείνες συνεργάζονται αρμονικά με διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες για να προάγουν την επιθηλιακή-μεσεγχυματική διαφοροποίηση και να καταστέλλουν την μεσεγχυματική επιθηλιακή διαφοροποίηση. Για παράδειγμα, γονίδια των ινοβλαστών όπως αυτά που αποκωδικοποιούν την ινοβλαστική ειδική -πρωτείνη-1 (FSP-1) και το κολλαγόνο είναι σε υπερλειτουργία ενώ ενεργοποίηση του επιθηλιακά -ειδικά -γονίδια είναι σε αδράνεια. Η υποδοχέα της BMP7 επάγει την φωσφορυλίωση των Smad1, Smad5 και Smad8, που μέσα στον πυρήνα προάγει την 22

23 μεσεγχυματική-επιθηλιακή διαφοροποίηση και αντιτίθεται στην επιθηλιακή μεσεγχυματική διαφοροποίηση που προκαλείται από τον TGF-β και που οδηγεί στην ουλοποίηση του νεφρικού ιστού. Η δράση του BMP7 έχει την τάση να διατηρεί τον επιθηλιακό φαινότυπο ενώ ορισμένες πρωτείνες, συμπεριλαμβανομένης της KCP, μπορούν να τροποποιήσουν ολόκληρη αυτή την διαδικασία 24,32. Η προέλευση των ινοβλαστών στην νεφρική ίνωση Σχηματική απεικόνιση των τριών πιθανών μηχανισμών προέλευσης των ινοβλαστών κατά την νεφρική βλάβη. Περίπου 14 15% προέρχεται από τον μυελό των οστών, 36% μέσω τοπικής EMT διαδικασίας, ενώ οι υπόλοιποι πιθανόν προέρχονται από πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών (κάθε προέλευσης).. J. Clin. Invest. 112:1776-1784 (2003). Εικόνα 12. Η εκτεταμένη παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας οφείλεται κυρίως στους μυοινοβλάστες του διάμεσου χώρου πληθυσμό κυττάρων με περισσότερες από μία προελεύσεις, δηλαδή: εγγενείς ινοβλάστες του διάμεσου χώρου,διαφοροποίηση επιθηλιακών κυττάρων των ουροφόρων σωληναρίων, που έχουν υποστεί EMT (Epithelial Mesenchymal Transition), και κύτταρα που προέρχονται από τον μυελό των οστών 23

24 Ινογενετική φάση Η ινογενετική φάση χαρακτηρίζεται από αύξημένη εναπόθεση εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας στο διάμεσο χώρο. Η εναπόθεση της θεμέλιας ουσίας οφείλεται σε αυξημένη σύνθεση και μειωμένη αποδόμηση των συστατικών της. Ένδειξη αυξημένης σύνθεσης πρωτεινών της θεμέλιας ουσίας αποτελούν τα αυξημένα επίπεδα m-rna των υπεύθυνων γονιδίων στους νεφρούς. 9,33 Οι πρωτείνες της θεμέλιας ουσίας πέραν της δομικής στήριξης που προσφέρουν, αντιδρούν με κυτταρικούς υποδοχείς κυρίως της οικογένειας των ιντεγκρινών και μπορούν να επηρεάσουν γειτονικά κύτταρα. H ίνωση του διάμεσου χώρου οφείλεται σε εναπόθεση πρωτεινών όπως αυτές της θεμέλιας ουσίας του διάμεσου χώρου (κολλαγόνο Ι, ΙΙ, V, VII XV, ινονεκτίνη) αλλά και πρωτείνών της θεμέλιας ουσίας που κάτω από φυσιολογικές συνθήκες ανευρίσκονται μόνο στη βασική μεμβράνη των σωληναρίων (λαμινίνη και κολλαγόνο IV). Οι μυοινοβλάστες του διάμεσου χώρου είναι η βασική πηγή των πρωτεινών αυτών. Η ανάπτυξη ίνωσης του διάμεσου χώρου παρουσιάζει μια δυναμική που αλλάζει ανάλογα με το είδος της νεφρικής βλάβης. Η εναπόθεση πρωτεινών είναι αρχικά ασταθής αλλά στη συνέχεια η ανάπτυξη διασυνδετικών γεφυρών προσδίδει σταθερότητα και με συνέπεια την εμφάνιση αντίστασης στη δράση των πρωτεασών. Η διαδικασία σταθεροποίησης δεν είναι επακριβώς γνωστή αλλά φαίνεται ότι περιλαμβάνει ενζυματική τροποποίηση, μέσω γλυκοζυλίωσης, οξείδωσης ή διαγλουταμίνωσης και αλλάγή στη σχέση κολλαγόνου Ι προς ΙΙΙ. Άλλα συστατικά του ινοποιημένου διάμεσου χώρου, περιλαμβάνουν πρωτεογλυκάνες, πολυσακχαρίτες και γλυκοπρωτείνες τα οποία προσδίδουν επιπλέον δομική στήριξη. 24

25 Οι πρωτεογλυκάνες αποτελούν ένα αποθηκευτικό χώρο για αυξητικούς παραγόντες όπως ο b FGF και ο TGF-β. Αυτοί οι παράγοντες βρίσκονται σε ανενεργό μορφή, μπορούν όμως να κινητοποιηθούν άμεσα. Η ντεκορίνη και η διγλυκάνη είναι μικρές πρωτεογλυκάνες που έχουν την ικανότητα να προσδένονται και να απενεργοποιούν τον TGF-β. Το υαλουρονικό συναθροίζεται στον διάμεσο χώρο και ενισχύει την φλεγμονή του διάμεσου χώρου μέσω ενεργοποίησης της παραγωγής MCP-1 και κυτταρικών μορίων προσκόλλησης από τα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα 7,33,34. Ένα σημαντικό βήμα για την επαγωγή της νεφρικής ίνωσης είναι η αναστολή της παραγωγής των πρωτεασών, ενζύμων υπεύθυνων για την αποικοδόμηση των συστατικών της θεμέλιας ουσίας. Ο φυσιολογικός νεφρός παράγει έναν μεγάλο αριθμό πρωτεασών που είναι ειδικές για τις πρωτείνες της θεμέλιας ουσίας. Οι σημαντικότερες είναι οι μεταλλοπρωτεινάσες (MMP), οι πρωτεινάσες της σερίνης (πλασμίνη, καθεψίνη G) αλλά και οι λυσοσωματικές κυστεινικές πρωτεάσες. Οι MMPs περιλαμβάνουν μια μεγάλη οικογένεια ψευδάργυρο και ασβέστιο - εξαρτώμενων ενδοπεπτιδασών. Διαχωρίζονται στις εξής υπομονάδες: κολλαγενάσες διάμεσου χώρου, γελατινάσες, λυσίνες στρώματος, και ελαστάσες. Μπορούν να ενεργοποιηθούν ενζυματικά ή μη ενζυματικά μέσω ενεργών μεταβολιτών του οξυγόνου. Η δράση των MMPs περιλαμβάνει την αποικοδόμηση της θεμέλιας ουσίας και αναστέλλεται κυρίως από τις TIMP 1,2,3,4 (tissue inhibitor of metalloproteinases). Αναστολή της δράσης των ΜΜPs και ενεργοποίηση των ΤΙMPs, με συνέπεια τη συσσώρευση στοιχείων της θεμέλιας ουσίας στο 25

26 διάμεσο ιστό, προκαλείται από διάφορους παράγοντες (TGF-β 1, EGF, PDGF, αγγειοτενσίνη ΙΙ, υποξία), όπως προκύπτει κυρίως από μελέτες ιn vitro 3. Η ινογενετική φάση (MMP matrix metalloproteinase, PA plasminogen activator, TBM tubular basement membrane) Εικόνα 13. Pediatr Nephrol (2000) 15:290 301 Πρόσφατες μελέτες αναδεικνύουν το σημαντικό ρόλο της πλασμίνης στην νεφρική ίνωση. Εκτός από την ικανότητα της να αποικοδομεί την ινική αποικοδομεί και συστατικά της βασικής μεμβράνης και της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ινονεκτίνη, λαμινίνη). Επίσης εμφανίζει έμμεση αποικοδομητική δραστηριότητα μέσω της ικανότητάς της να απενεργοποιεί τις MMPs. 35 Η πλασμίνη ενέχεται σε διάφορες βιολογικές διαδικασίες όπως η μορφογέννηση, η κυτταρική ανάπτυξη, η κυτταρική μετανάστευση, η ιστική αναδιαμόρφωση, η επούλωση της βλάβης, η αγγειογέννεση, και η ίνωση του νεφρικού ιστού. Σημαντικός είναι ο ρόλος του PAI-1 ( plasminogen activator 26

27 inhibitor-1 ) στην εξέλιξη της νεφρικής βλάβης, η έκφραση του οποίου είναι αυξημένη σε διάφορα πειραματικά μοντέλα νεφρικής βλάβης 7,9,25,41. Καταστροφική φάση Οι πρωτείνες της θεμέλιας ουσίας συσσωρευόμενες στο διάμεσο χώρο προκαλούν σημαντική διαταραχή της δομής του χώρου αυτού και της νεφρικής λειτουργίας. Η βαρύτητα των ιστολογικών αλλοιώσεων του σωληναριοδιάμεσου νεφρικού χώρου έχει σημαντική προγνωστική αξία για την εξέλιξη της νεφρικής νόσου 10. Κατά τη διάρκεια ανάπτυξης των σκληρυντικών αλλοιώσεων στα σπειράματα παρατηρείται βαθμιαία απώλεια των φυσιολογικών κυττάρων, διαδικασία για την οποία ενοχοποιείται αυξημένος ρυθμός κυτταρικής απόπτωσης 3. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν τη συμμετοχή της κυτταρικής απόπτωσης στην εξέλιξη της βλάβης και διάφορα ογκογονίδια (bcl-2, bax, Fas και p53) είναι υπεύθυνα για τη ρύθμιση της κυτταρικής απόπτωσης στους ιστούς. Η παρουσία ελεύθερων ριζών οξυγόνου, τοπικής ισχαιμίας και νιτρικού οξειδίου σχετίζεται με ευόδωση της διαδικασίας κυτταρικής απόπτωσης, όπως και η δράση ορισμένων κυτταροκινών (IL-1 και TNF-α) και αυξητικών παραγόντων (PDGF και TGF-β 1 ) 42. Αντίθετα, άλλοι παράγοντες (EGF, IGF-1, HGF και BMP-7) μειώνουν το ρυθμό απόπτωσης διαφόρων τύπων κυττάρων 42,43. Η διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ ερεθισμάτων που 27

28 προάγουν την απόπτωση και παραγόντων που αυξάνουν την επιβίωση των κυττάρων καθορίζει την ευεργετική ή βλαπτική επίδρασή της. Τα νεφρικά σωληνάρια, που καταλαμβάνουν το 80% του νεφρικού όγκου, γίνονται τα τελικά θύματα της καταστροφικής ινογεννητικής διαδικασίας, στην οποία συνέβαλαν και τα ίδια. Η ατροφία των ουροφόρων σωληναρίων είναι χαρακτηριστικό εύρημα της νεφρικής βλάβης προχωρημένου σταδίου. Ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος ή απόπτωση παίζει επίσης ρόλο στην ανάπτυξη της ίνωσης και για το λόγο αυτό οι νέες μελέτες έχουν εστιάσει στη επαγωγή προαποπτωτικών γονιδίων και στην μείωση των ενδογενών αντιαποπτωτικών μηχανισμών. Η σωληναριακή ατροφία ίσως επάγει τον σωληναριακό θάνατο μέσω απόπτωσης και /ή νέκρωσης. Η υποξία φαίνεται ότι επηρεάζει άμεσα την έκφραση γονιδίων με ακόλουθη επαγωγή της ίνωσης. Η επέκταση της ίνωσης στο διάμεσο χώρο έχει ως συνέπεια την μείωση της αιμάτωσης των επιθηλιακών σωληναριακών κυττάρων λόγω συρρίκνωσης των περισωληναριακών τριχοειδών. Εκτός από την απώλεια σωληναρίων, συνοδό ιστολογικό εύρημα που σχετίζεται με την εξέλιξη της νεφρικής νόσου, αποτελεί και η μείωση των περισωληναριακών τριχοειδών. Η ισχαιμία που προκαλείται από απώλεια των περισωληναριακών τριχοειδών, λόγω της επεκτεινόμενης ίνωσης, ακολουθείται από ατροφία και προοδευτική απώλεια των επιθηλιακών σωληναριακών κυττάρων 42. Στην απογύμνωση του νεφρικού παρεγχύματος από εγγενή κύτταρα σημαντικό ρόλο παίζει η παράταση της διαδικασίας κυτταρικής απόπτωσης. 28

29 Ατροφικά σωληνάρια με κυλίνδρους Εικόνα 14. Χρόνια νεφρική ανεπάρκεια.χαρακτηριστική για την ΧΝΑ τελικού σταδίου είναι η βλάβη και στα 4 στοιχεία του νεφρού (σπειράματα, σωληνάρια, διάμεσος χώρος και αγγεία). Μπορούμε να διακρίνουμε τα σκληρυντικά σπειράματα και τα διατεταμένα ατροφικά σωληνάρια που χωρίζονται με ινώδη ιστό και κύτταρα φλεγμονής μεταξύ τους. Σκληρωτικά σπειράματα Εικόνα 15. Το εάν η ενεργοποίηση της νεο-αγγειογένεσης έχει ευεργετική επίδραση στην αναστολή της ίνωσης παραμένει υπό διερεύνηση. Αγγειογενητικοί παράγοντες όπως ο PD-ECGF ίσως κατευθύνουν λαθεμένα την δημιουργία νέων αγγείων σε περιοχές εγκατεστημένης ίνωσης του διάμεσου ιστού με αποτέλεσμα την εξέλιξη της νεφρικής νόσου. 29

30 Αρχική νεφρική προσβολή Μακροφάγα Επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα Ενδοθήλιο Ινοβλάστες/ Περικύτταρα In-situ υπερπλασία διήθηση ενεργοποίηση βλάβη ενεργοποίηση/υπερπλασία μετασχηματισμός αγγειοσύσπαση / ισχαιμία ενεργοποίηση Ενεργοποίηση υπερπλασία μετασχηματισμός μετανάστευση Απελευθέρωση αυξητικών παραγόντων και κυτταροκινών Συσσώρευση συστατικών θεμέλιας ουσίας Εξάλειψη περισωληναριακών τριχοειδών Απώλεια σωληναριακών κυττάρων Χρόνια νεφρική ανεπάρκεια 30

31 Αυξητικοί παράγοντες που ενέχονται στην ανάπτυξη ίνωσης του νεφρικού ιστού Transforming Growth Factor β (TGF-β) Ο TGF-β είναι ένα διμερές πολυπεπτίδιο με μοριακό βάρος 25kD, που αποτελείται από δυο υποομάδες που συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικό δεσμό. Ανήκει στην TGF-β υπερ-οικογένεια που αποτελείται από 30 πρωτείνες (κυττοκίνες, BMPs, GDFs AMH που ρυθμίζουν την ανάπτυξη, διαφοροποίηση, ομοιόσταση, επούλωση τραύματος, τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και την απόπτωση επιθηλιακών και αιμοποιητικών κυττάρων. 9,44 Ο TGF-β παράγεται από διάφορα είδη κυττάρων και ευρίσκεται κυρίως στον ορό και στα αιμοπετάλια από τα οποία απελευθερώνεται μέσω αποδόμησης υπό την μορφή ανενεργού συμπλόκου συνδεδεμένου με την LAP (latency associated protein). Ανευρίσκεται υπό τη μορφή τριών ισομορφών (TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3 ), από τις οποίες ο ΤGF-β 1 είναι η πιο συχνή στον άνθρωπο 45. Κάθε ισομορφή παράγεται σαν πρόδρομη ουσία συνδεδεμένη με το προπεπτίδιό της και μετά την απέκκρισή της αποθηκεύεται στη θεμέλια ουσία σαν σύμπλοκο του TGF-β, του προπεπτιδίου και μιας δεσμευτικής πρωτεΐνης (latent TGF-β 1 binding protein). Η σύνδεση αυτή του TGF-β εμποδίζει τη δέσμευσή του από υποδοχείς, ενώ η αποσύνδεσή του από το σύμπλοκο γίνεται με τη δράση της πλασμίνης και της θρομβοσπονδίνης-1 45. Το σύμπλεγμα TGF-β/LTBP ανευρίσκεται στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία. ΟΙ πρωτεινές πρόσδεσης που έχουν αναγνωρισθεί είναι οι LTBP 1,3,4 και ο TGF-β ενεργοποιείται όταν απομακρύνεται η LTBP με πρωτεόλυση. Το σύμπλοκο LAP-LTBC δεν περνάει φυσιολογικά στο σπειραματικό 31

32 υπερδιήθημα. Παράγοντες που διεγείρουν την παραγωγή του συμπλόκου είναι η αγγειοτενσίνη ΙΙ, ΕΤ-Ι, ισχαιμία, γλυκόζη, ινσουλίνη, κυκλοσπορίνη, ANP, PAF. Η ενεργοποίηση γίνεται με τη δράση των πλασμίνης, τρανσγλουταμινάσης, γλυκοσιδάσης, μεταλλοπρωτεινασών (MMPs), όξινου ph, θρομβοσπονδίνη 1 (TSP-1) αλλά ο ακριβής μηχανισμός παραμένει άγνωστος. Η θρομβοσπονδίνη-1 ενεργοποιεί τον TGF-β, ρυθμίζει την κυτταρική συγκόλληση, προάγει την αγγειογένεση και την ανασύσταση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Οι πρωτεάσες MMP2 ενεργοποιούν τον TGFβ. Η ιντεγκρίνη α1,β6,c που ανευρίσκεται μόνο στα επιθηλιακά κύτταρα, υποδοχείς TGF-β και Smads, επίσης ενεργοποιούν τον TGF-β. Πειραματόζωα με πλήρη έλλειψη της β6 ιντεγκρίνη δεν εμφανίζουν ίνωση. 4,6,9,35 Η ενεργοποίηση του TGF-β διεγείρει τους μηχανισμούς που προκαλούν ίνωση, όπως τη μεταγραφή των γονιδίων που οδηγούν σε αυξημένη παραγωγή στοιχείων της θεμέλιας ουσίας ή αναστέλλουν τα αποικοδομητικά της ένζυμα, τη σύνδεση των υποδοχέων ιντεγκρίνης με την θεμέλια ουσία, τη μεταλλαγή των ινοβλαστών σε μυοινοβλάστες, τη διαφοροποίηση των σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων σε μυοινοβλάστες και τη χημειοταξία των ινοβλαστών και των μυοινοκυττάρων Υποδοχείς του TGF-β ανευρίσκονται στην κυτταρική μεμβράνη των περισσοτέρων τύπων κυττάρων. Πρόκειται για τρεις υποδοχείς (Ι,ΙΙ,ΙΙΙ) υψηλής συγγένειας με τον TGF-β η σύνδεση των οποίων με τον αυξητικό παράγοντα έχει ως συνέπεια την έναρξη ενδοκυττάριων αντιδράσεων φωσφορυλίωσης που οδηγούν σε ενεργοποίηση ειδικών παραγόντων μεταγραφής (Smad) 32

33 στον πυρήνα του κυττάρου 15. Όταν ενεργοποιηθεί ο TGF-β1, προσδένεται σε ένα ετερομερικό σύμπλεγμα υποδοχέων τύπου Ι και ΙΙ. Τα περισσότερα κύτταρα εκφράζουν υποδοχείς TGF-β οι οποίοι επίσης υπάρχουν στα περισσότερα τμήματα του ουροφόρου σωληναρίου και εξουδετερώνονται από ειδικά αντισώματα. Η έκφραση του υποδοχέα τύπου Ι είναι αυξημένη σε νεφρικές παθήσεις, υποδηλώνοντας ότι τα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα αποτελούν στόχο του TGF-β1 στις καταστάσεις αυτές. Μετά την πρόσδεσή του TGF-β στους υποδοχείς σχηματίζεται ένα σύμπλεγμα το οποίο οδηγεί σε κυτταροπλασματικές φωσφορυλιώσεις με σκοπό τη μετάδοση του σήματος στον πυρήνα του κυττάρου. Η μετάδοση γίνεται μέσω των μεταγραφικών ενεργοποιητών της οικογένειας των Smad και των υποδοχέων τους δηλαδή των Rsmads. Η ενεργοποίηση του Smad 4 ακολουθείται από μετάδοση του σήματος στον πυρήνα όπου ελέγχεται η μεταγραφή συγκεκριμένων γονιδίων που ενεργοποιούνται από τον TGF-β1. Τα Smad 2 και 3 ενεργοποιούν επίσης γονίδια εξαρτώμενα από τον TGF-β, ενώ τα Smad 6 και 7 αναστέλλουν τα γονίδια αυτά. Για την επαγωγή της γονιδιακής έκφρασης του TGF-β1 απαιτείται η παρουσία ορισμένων συμπαραγόντων ο κυριότερος των οποίων είναι ο P300 35. Ο HGF καθυστερεί την μετατόπιση και την συνάρθροιση Smad 2 και 3 μέσα στον πυρήνα. 7,35 Αναστολέας της δράσης του TGF-β είναι ο LAP δηλ το Ν- τελικό πεπτίδιο που παραμένει μετά από την απελευθέρωση του ενεργού TGF-β από το ανενεργό σύμπλοκο. Στους αναστολείς ανήκουν επίσης πρωτεογλυκάνες όπως η διγλυκάνη, η ντεκορίνη και μέλη του LTBP (latent TGF-β binding protein). Οι βιολογικές δράσεις του TGF-β επάγονται από τον NFk- B μέσω διέγερσης κυτταρικών υποδοχέων 7,51. 33

34 Ο TGF-β 1 προάγει τη σύνθεση συστατικών της θεμέλιας ουσίας (κολλαγόνου, λαμινίνης κλπ) και αναστέλλει την αποικοδόμηση τους μειώνοντας τη δράση των μεταλλοπρωτεϊνασών ή διεγείροντας την παραγωγή των αναστολέων τους. Επίσης, προάγει την έκφραση της β1- ιντεγκρίνης, αυξάνοντας την ικανότητα προσκόλλησης και μετανάστευσης των κυττάρων, ενεργοποιεί την κυτταρική απόπτωση και τη μετατροπή των ινοβλαστών και των επιθηλιακών σωληναριακών κυττάρων σε μυοινοβλάστες. Τα μεσαγγειακά κύτταρα υπό την επίδρασή του αποκτούν ιδιότητες μυοινοβλαστών που εκδηλώνεται με έκφραση a-sma 9,24,44. Εικόνα 16. O ρόλος του TGF-β στην ιστική ίνωση. J NEPHROL 2004; 17: 496-503 Η παραγωγή του TGF-β 1 στο νεφρικό ιστό πειραματοζώων με υφολική νεφρεκτομή, υπέρταση, διαβητική νεφροπάθεια, αντί-gbm νεφρίτιδα και νεφροτοξικότητα από κυκλοσπορίνη είναι αυξημένη. Η αυξημένη παραγωγή του TGF-β 1 συνοδεύεται από προοδευτική εναπόθεση συστατικών της θεμέλιας ουσίας, ενώ η χορήγηση αντιορού κατά του TGF-β 1 ή ντεκορίνης (συστατικού της θεμέλιας ουσίας που ρυθμίζει και την απελευθέρωση του 34

35 TGF-β 1 ) περιορίζει την ανάπτυξη σκληρυντικών αλλοιώσεων στο νεφρικό ιστό. Έντονη παρουσία του TGF-β 1 έχει διαπιστωθεί στα σπειράματα και στο σωληναριοδιάμεσο νεφρικό χώρο, σε βιοψίες ασθενών με σπειραματονεφρίτιδα 52 και ειδικότερα όταν υπάρχει έκπτωση της νεφρικής λειτουργίας και σημαντικού βαθμού ιστολογικές αλλοιώσεις. Αυξημένη σωληναριακή παραγωγή και απέκκριση του TGF-β 1 στα ούρα έχει διαπιστωθεί σε ασθενείς με σοβαρού βαθμού λευκωματουρία 53,54. Ο TGF-β συνεργάζεται με άλλες κυτταροκίνες και αυξητικούς παράγοντες όπως ο Connective Tissue Growth Factor (CTGF) για την επαγωγή της EMT, την αυξημένη εναπόθεση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και τη συνοδό ινογένηση. Ο ΤGF- β αναστέλλει την παραγωγή HGF και καταστέλλει την έκφραση του στους ινοβλάστες και τα μεσεγχυματικά κύτταρα, υποδηλώνοντας την ύπαρξη αλληλεπιδράσεων ανάμεσα σε αυτούς τους δύο αυξητικούς παράγοντες. 9,35 Από μελέτες πειραματικά προκαλούμενης νεφρικής βλάβης προκύπτει ο σημαντικός ρόλος της αγγειοτενσίνης ΙΙ στην έκφραση και παραγωγή του TGF-β 3 1. Η χορήγηση ανταγωνιστών των υποδοχέων της αγγειοτενσίνης ΙΙ σε πειραματόζωα με υφολική νεφρεκτομή, διαβητική νεφροπάθεια ή υπέρταση συνοδεύεται από μειωμένη έκφραση του TGF-β 1 και αναστολή της εξέλιξης της νεφρικής βλάβης 3. Το κάπνισμα, η αρτηριακή υπέρταση, ο σακχαρώδης διαβήτης και η παχυσαρκία, αυξάνουν τα επίπεδα TGF-β στην κυκλοφορία. Τα αυξημένα επίπεδα TGF-β δρουν συνεργικά με άλλους παράγοντες στην εμφάνιση ορισμένων παθήσεων που σχετίζονται με την εμφάνιση ίνωσης. Ο TGF-β είναι σημαντικός για την ίνωση του νεφρικού ιστού, την πνευμονική ίνωση, την 35

36 ηπατική και καρδιακή ίνωση στην καρδιακή ανεπάρκεια και στις καρδιομυοπάθειες. Ο TGF-β ενοχοποιείται για τουλάχιστο ένα μέρος της μοριακής επεξήγησης των γνωστών επιδημιολογικών συνδέσεων μεταξύ καπνίσματος, υπέρτασης, σακχαρώδους διαβήτη, παχυσαρκίας και παθήσεων που περιλαμβάνουν ιστική ίνωση και ουλοποίηση. 55 Εικόνα 18. Σχηματική απεικόνιση του σηματοδοτικού μηχανισμού της ΤGF-β υπεροικογένειας. Όμο- ή ετερο-διμερικοί προσδέτες, συνδέονται με τους διαμεμβρανικούς υποδοχείς τύπου I και τύπου II. Η διαθεσιμότητα των προσδετών είναι ενισχυμένη ή κατασταλμένη από εκκρινόμενες πρωτείνες που διαντιδρούν με αυτούς. Οι υποδοχείς τύπου I φωσφορυλίώνουν ενδοκυττάριες Smad πρωτείνες σε κατάλοιπα σερίνης και με αυτόν τον τρόπο προάγουν την αλληλεπίδραση με τον κοινό co-smad 4 ή με τα ανασταλτικά Smads 6 και 7. Το ενεργοποιημένο Smad co-smad σύμπλεγμα μεταφέρεται στον πυρήνα και έτσι ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων στόχων. 36

37 Hepatocyte Growth Factor (HGF) O HGF είναι ένα πεπτίδιο με ισχυρή μιτογόνο και αντιαποπτωτική δράση, η οποία σχετίζεται με την αναγεννητική ικανότητα που παρουσιάζουν διάφορα παρεγχυματικά όργανα (π.χ. ήπαρ). Είναι κυρίως ηπατικής προέλευσης και ευρίσκεται στον ορό σε ανενεργό μορφή ως ετεροδιμερές. Πρόκειται για ένα πολυπεπτίδιο, που ανακαλύφθηκε στα τέλη της δεκαετίας του 80, που έχει την ιδιότητα να προάγει τον πολλαπλασιασμό και την αναγέννηση των ηπατοκυττάρων. Η ώριμη μορφή του HGF είναι προσδεμένη σε ηπαρίνη. Πρόκειται για μια ετεροδιμερική γλυκοπρωτείνη που αποτελείται από δύο αλυσίδες (α και β), που συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικό δεσμό. Ο ειδικός σηματοδοτικός υποδοχέας του, η πρωτείνη p 190, εκφράζεται στα επιθηλιακά κύτταρα του εγγύς σωληναρίου. Στους νεφρούς ο HGF παράγεται από μεσαγγειακά και ενδοθηλιακά κύτταρα, από κύτταρα του στρώματος, ινοβλάστες και από μακροφάγα. Δρα μέσω διέγερσης ειδικού υποδοχέα (c-met), προάγει τον πολλαπλασιασμό και την αναγέννηση επιθηλιακών σωληναριακών κυττάρων, αναστέλλοντας τη διαδικασία απόπτωσης και συμμετέχει στην αγγειογένεση ενεργοποιώντας ενδοθηλιακά κύτταρα 66,67. Ο c-met υποδοχέας του εκφράζεται σε όλα τα νεφρικά κύτταρα. Ο HGF και ο ειδικός υποδοχέας του c-met, εκφράζονται στο πρώιμο μετανεφρογεννητικό μεσέγχυμα, και έχουν σημαντικό ρόλο στην νεφρική ανάπτυξη και αλλά και στην αναγέννηση των σωληναριακών κυττάρων μετά από οξεία βλάβη 7,35. 37

38 Η έκφρασή του ελέγχεται από την Sp οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων. Ποιοι είναι όμως οι κυτταρικοί στόχοι του HGF;Ποιο είναι το θεραπευτικό δυναμικό του HGF στην χρόνια νεφρική ίνωση; Ο HGF ρυθμίζει την κυτταρική επιβίωση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την μετανάστευση και την διαφοροποίηση μέσω του c-met πρωτοογκογόνου. Είναι ο ρυθμιστής της νεφρικής κυτταρικής διαφοροποίησης και κατά τη φυσιολογική νεφρογέννηση αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις παίζοντας ρόλο στην σωληναριακή επιδιόρθωση και αναγέννηση μετά από οξεία νεφρική βλάβη. Σε πειραματικά μοντέλα νεφρικής βλάβης έχει δειχτεί ότι είναι ένας ενδογενής αντι-ινωτικός παράγοντας που προλαμβάνει την ιστική ίνωση. Σε χρόνια νεφρική ανεπάρκεια αυξάνει η έκφρασή του ενδογενούς HGF in vivo και σε σωληναριακή βλάβη. Ο HGF είναι υπεύθυνος για τη διαφοροποίηση και για την διατήρηση του σωληναριακού επιθηλιακού φαινοτύπου σε παθολογικές καταστάσεις, προστατεύει τα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα από την απόπτωση και προάγει την αποδόμηση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας μέσω αύξησης της δραστηριότητας των πρωτεασών. Επάγει τον πολλαπλασιασμό των σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων και περιορίζει την ατροφία των σωληναρίων. 31,35,44 Ο αποκλεισμός της σηματοδότησης του HGF με τη χορήγηση ειδικού αντισώματος συνοδεύεται από μείωση της σπειραματικής διήθησης και ταχεία εξέλιξη της ίνωσης σε πειραματικά μοντέλα νεφρικής βλάβης. Αντίθετα, μετά από εξωγενή χορήγηση του HGF διαπιστώθηκε η ευεργετική επίδραση στην εξέλιξη της βλάβης με μείωση της δραστηριότητας του TGF-β1 και αναστολή της εμφάνισης σκληρυντικών αλλοιώσεων. 7,9,35 38

39 Ο HGF φαίνεται ότι περιορίζει τη βαρύτητα της ίνωσης του διάμεσου νεφρικού χώρου σε πειραματόζωα με ετερόπλευρη ουρητηρική απόφραξη, υφολική νεφρεκτομή, διαβητική νεφροπάθεια, νεφροπάθεια από κυκλοσπορίνη ή από λήψη κινέζικων βοτάνων και προστατεύει από τη χρόνια δυσλειτουργία μοσχέυματος. Ο HGF προλαμβάνει την εγκατάσταση και την εξέλιξη της χρόνιας νεφρικής βλάβης αλλά έχει και θεραπευτικά αποτελέσματα σε ήδη εγκατεστημένη ιστική ίνωση. Αναστέλλει την έκφραση της ινονεκτίνης και του κολλαγόνου τύπου Ι, που προκαλείται από τον TGF-β1. Μειώνει τη δραστηριότητα του TGF-β και την παρουσία μυοινοβλαστών στον διάμεσο χώρο 31,41,44. Ο HGF αποτελεί θεραπευτικό στόχο για επιλεκτική αναστολή των ενεργοποιημένων μυοινοβλαστών δηλαδή των κυττάρων που είναι υπεύθυνα για την συνάθροιση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας με εξωγενη χορήγηση πρωτείνης HGF ή του γονιδίου της. Μια σειρά διαγονιδιακών επίμυων που εκφράζουν HGF ανέπτυξαν εξελισσόμενη νεφρική ανεπάρκεια με σωληναριακή υπερπλασία, σπειραματοσκλήρυνση, εκφυλιστικές κύστεις, κακοήθης μετάλλαξη παρά το γεγονός ότι δεν βρέθηκε συσχετισμός με τα επίπεδα του HGF. Χρόνια έκθεση σε HGF επιδεινώνει την νεφρική λειτουργία σε διαβητική νεφροπάθεια και αυτό αποτελεί αντικρουόμενο στοιχείο. Έχει συνεργική δράση με τον αποκλειστή της αγγειοτενσίνης ΙΙ Losartan μειώνοντας έτσι την επαγωγή a-sma 31,35,44. Αύξηση της παραγωγής του HGF-mRNA παρατηρείται σε πειραματόζωα με ετερόπλευρη νεφρεκτομή και αυτό συμβάλλει στην αντιρροπιστική υπερτροφία. Έντονη παρουσία του HGF στους νεφρούς παρατηρείται σε πειραματόζωα με οξεία νεφρική ανεπάρκεια και εξωγενής χορήγησή του 39

40 συνοδεύεται από ταχεία αναγεννητική δραστηριότητα των επιθηλιακών σωληναριακών κυττάρων 43. Το YIN και YANG της ιστικής ινωτικής σηματοδότησης. Η ισορροπία ανάμεσα στους αυξητικούς παράγοντες HGF και TGF-β καθορίζει την πορεία της χρόνιας νεφρικής ίνωσης. Αν το ερέθισμα της βλάβης είναι παροδικό (όπως συμβαίνει μετά από οξύ σύμβαμα) υπερισχύει η σηματοδότηση του HGF. O TGF-β1 σε αυτή την περίπτωση παίζει σημαντικό ρόλο στην αναδιαμόρφωση της θεμέλιας ουσίας για την επιδιόρθωση της βλάβης και προκαλεί καταστολή του HGF μετά την ολοκλήρωση διαδικασίας ίασης. Αν το ερέθισμα είναι χρόνιο, η έκφραση του TGF β1 αυξάνει προοδευτικά ενώ τα επίπεδα HGF αυξάνουν αρχικά και μειώνονται σταδιακά στη συνέχεια. Δηλαδή η διάρκεια της βλάβης φαίνεται να καθορίζει την ισορροπία μεταξύ HGF και TGF-β1. Ο TGF-β1 επάγει μορφολογικές αλλαγές, τα κύτταρα επιμηκύνονται, αποχωρίζονται από τα γειτονικά τους, χάνουν το κυβοειδές σχήμα και την μονή στοιβάδα τους. Η ταυτόχρονη χορήγηση HGF επάγει την επαναδιοργάνωση της σημασμένης e- καντεχερίνης. 31,35,68 Ο HGF επιδρά στη διατήρηση του φαινότυπου των σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων και μειώνει την νεφρική ίνωση. Η εξωγενής χορήγησή του μειώνει την έκφραση της ε- καντεχερίνης στα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα και δημιουργεί μακριές ίνες στα παθολογικά κύτταρα του νεφρού, δημιουργώντας έτσι την δομική βάση για την μορφολογία των μεταλλαγμένων κυττάρων; Η ε-καντεχερίνη είναι ένας υποδοχέας προσκόλλησης των 40

41 σωληναριακών κυττάρων, σημαντικός για τη διατήρηση της ομοιόστασης και της αρχιτεκτονικής των νεφρικών επιθηλίων κυττάρων. Ο TGF-β καταστέλλει την έκφραση της ε- καντεχερίνης ενώ η ταυτόχρονη χορήγηση HGF επαναφέρει την έκφραση της ε- καντεχερίνης σε πειραματικά μοντέλα νεφρικής βλάβης. Ο HGF προλαμβάνει την de novo έκφραση των δεικτών a- SMA των μυοινοβλαστών, περιορίζει τη φαινοτυπική μεταλλαγή των σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων σε μυοινοβλάστες και μειώνει την έκφραση ινονεκτίνης και κολλαγόνου τύπου Ι. 31,35,41,44 O TGF-β1 επάγει την έκφραση της a-sma, ενώ ο HGF αναστέλλει τόσο την de novo έκφραση της a- SMA όσο και την επαγόμενη μέσω του TGF-β1. Η έκφραση του TGF-β και των υποδοχέων του είναι αυξημένη στα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα in vivo, ενώ ο HGF αναστέλλει την έκφρασή τους. Οι HGF και TGF-β αυξάνουν τον CTGF που συνεκφράζεται με τον IGF-1 και τους PDGF, PDGF-BB. Άλλοι αυξητικοί παράγοντες όπως ο EGF (επιδερμικός αυξητικός παράγοντας) και ο IGF-1 (insuline- like GF1) δεν καταστέλλουν την από τον TGF-β επαγόμενη έκφραση της a-sma όσο ο HGF. Ο PDGF έχει ήπια αλλά άμεση επίδραση στους νεφρικούς ινοβλάστες του διάμεσου χώρου διεγείροντας τον πολλαπλασιασμό τους και αυξάνοντας τον αριθμό των ινογεννητικών πρόδρομων κυττάρων. 6,7,41 Οι TGF-β, HGF και IGF-1 ανευρίσκονται στα ούρα σε πρωτεινουρικές καταστάσεις. Η έκκρισή τους με τα ούρα δεν αποδεικνύει και την σπειραματική τους διήθηση, αφού ο IGF-1 και ο TGF-β εκφράζονται επίσης σε σωληναριακά τμήματα και σε άλλες παθήσεις. Αυξημένη έκφραση TGF-β 1 εμφανίζεται σε διαβητική νεφροπάθεια και σε IgA νεφροπάθεια και η εμφάνισή του έχει προγνωστικό χαρακτήρα. 41

42 Εικόνα 19. HGF και TGF- β 1: YIN και YANG της σηματοδότησης στην ιστική ίνωση Θεραπευτικές στρατηγικές που αφορούν την εμπλοκή του HGF.Στην νεφρική ίνωση δεν υπάρχει ισορροπία TGF-b1/ HGF και υπερισχύει η σηματοδότηση του TGF-b1.Έτσι η θεραπευτική στρατηγική θα πρέπει να περιλαμβάνει μείωση της δραστηριότητας του TGF-β1 και /ή χορήγηση HGF Basic-Fibroblast Growth Factor (b-fgf) Ο b-fgf είναι ένα πεπτίδιο με μοριακό βάρος 18kD που παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και οργανογένεση, στην επούλωση των ιστών και στην αιμοποίηση. Ασκεί σημαντική μιτογόνο δράση σε καλλιέργειες μεσαγγειακών, ενδοθηλιακών και επιθηλιακών κυττάρων και ινοβλαστών 1,69. Συμμετέχει στη νεοαγγειογένεση που παρατηρείται κατά τη φάση εξέλιξης της σπειραματικής βλάβης και ενοχοποιείται για την ανάπτυξη μεσαγγειακής υπερπλασίας σε πειραματόωα με μεσαγγειοϋπερπλαστική σπειραματονεφρίτιδα 70. Η χορήγησή του σε καλλιέργειες ποδοκυττάρων έχει 42

43 σαν συνέπεια την εμφάνιση μορφολογικών και λειτουργικών αλλοιώσεων σε αυτά, ενώ η ενδοφλέβια έγχυσή του σε πειραματόζωα με νεφρίτιδα Heymann συνοδεύεται από αύξηση της λευκωματουρίας και εμφάνιση σκληρυντικών αλλοιώσεων στα σπειράματα 9,34,41. Ο b-fgf συμμετέχει και στην παθογένεση της ίνωσης του σωληναριοδιάμεσου νεφρικού χώρου. Έχει διαπιστωθεί αυξημένη παραγωγή του από κύτταρα του διάμεσου ιστού σε καταστάσεις χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας και έντονη έκφρασή του σε επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα μετά από επίδραση νεφροτοξικών παραγόντων. Επιπλέον, προάγει την απελευθέρωση προσχηματισμένου TGF-β 1 (latent TGF-β 1 ) από επιθηλιακά κύτταρα των εγγύς εσπειραμένων σωληναρίων. Platelet Derived Growth Factor (PDGF) O PDGF είναι μια γλυκοπρωτεΐνη με μοριακό βάρος 28-32kD η οποία αποτελείται από δύο πεπτιδικές αλύσους (PDGF-Α και PDGF-Β) που συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς. Απομονώθηκε αρχικά από αιμοπετάλια, αλλά παράγεται από διάφορα είδη κυττάρων, όπως μακροφάγα, ενδοθηλιακά, μεσαγγειακά και λεία μυϊκά κύτταρα 39. Ανευρίσκονται τρεις ισομορφές του αυξητικού παράγοντα (PDGF-ΑΑ, PDGF-ΑΒ και PDGF-ΒΒ) οι οποίες, ενεργοποιώντας συγκεκριμένο υποδοχέα (PDGF-R), εμφανίζουν ποικίλες βιολογικές δράσεις στους ιστούς. Η διέγερση του PDGF-R έχει ως συνέπεια την ενεργοποίηση πρωτεϊνικών κινασών και την επαγωγή συγκεκριμένων γονιδίων που οδηγούν σε σύνθεση DNA. Ο PDGF παίζει σημαντικό ρόλο στην εμβρυογενετική ανάπτυξη των σπειραμάτων και ειδικότερα του μεσαγγείου. Παράγεται και εκφράζεται στα 43

44 μεσαγγειακά κύτταρα. Προάγει την υπερπλασία τους, μέσω ισχυρής μιτογόνου δράσης, αλλά ενέχεται και στην εμφάνιση φαινοτυπικών μεταβολών των μεσαγγειακών κυττάρων προς μυοϊνοβλάστες. 6,7,41 Ο ρόλος του PDGF στην σπειραματική βλάβη έχει μελετηθεί κυρίως στην πειραματικά προκαλούμενη αντι-thy-1 μεσαγγειοϋπερπλαστική σπειραματονεφρίτιδα. Είναι γνωστό ότι η εφ' άπαξ χορήγηση αντισώματος κατά του Τhy-1 αντιγόνου της κυτταρικής μεμβράνης των μεσαγγειακών κυττάρων σε ποντικούς, οδηγεί σε πρόκληση μεσαγγειοϋπερπλαστικής σπειραματονεφρίτιδας, η οποία στη συνέχεια αποκαθίσταται 70. Αρχικά, παρατηρείται "λύση" του μεσαγγείου με απώλεια κυττάρων και υποστρώματος και στη συνέχεια υπερπλασία. Ακολούθως ο αριθμός των μεσαγγειακών κυττάρων μειώνεται προοδευτικά με τη διαδικασία της κυτταρικής απόπτωσης και σε χρονικό διάστημα 4 έως 6 εβδομάδων τα σπειράματα αποκτούν τη φυσιολογική τους αρχιτεκτονική 70. Στην αλληλουχία των μεταβολών αυτών ενέχονται κυτταροκίνες και αυξητικοί παράγοντες (κυρίως PDGF και TGF-β 1 ), που προκαλούν φαινοτυπική μεταβολή των μεσαγγειακών κυττάρων προς μυοϊνοβλάστες, κύτταρα με μικτές ιδιότητες λείων μυϊκών κυττάρων και ινοβλαστών που εκφράζουν α-ακτίνη των λείων μυϊκών ινών 12. Τα κύτταρα αυτά έχουν την ικανότητα να μεταναστεύουν και να παράγουν σημαντικές ποσότητες κολλαγόνου και άλλων συστατικών της θεμέλιας ουσίας. Οι μεταβολές αυτές, όπως προκύπτει από πειραματικά μοντέλα, περιορίζονται με τη χορήγηση ειδικού αντισώματος κατά του PDGF 26. 44